(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性高分子を光応答性化合物（光刺激により構造変化をおこし親水性-疎水性を制御しえる化合物）で修飾し、得られた両親性高分子の形成するナノ粒子内に目的蛋白質（ペプチドを含む）を取り込む工程を含むことを特徴とする光刺激による包埋蛋白質（ペプチドを含む）の制御方法。
【請求項２】
ナノ粒子が、粒径50-100nmである、請求項１の制御方法。
【請求項３】
ナノ粒子が、多糖プルランである、請求項２の制御方法。
【請求項４】
光応答性化合物が、スピロピラン基である請求項１-３の何れか一に記載の制御方法。
【請求項５】
制御が、光刺激によっておこなわれ、これにより蛋白質のリフォールディングが制御される請求項１-４の何れか一に記載の制御方法。
【請求項６】
制御によって、ナノ粒子内に取り込まれた包埋蛋白質（ペプチドを含む）について以下の少なくとも一の機能を達成する請求項１-５の何れか一に記載の制御方法。
１）蛋白質（ペプチドを含む）の生体内運搬、
２）蛋白質（ペプチドを含む）の保存・安定化、
３）蛋白質（ペプチドを含む）の精製、
４）酵素・基質反応性の制御、
５）抗原・抗体反応の制御。
【請求項７】
請求項１-５の何れか一に記載の制御方法で調製される蛋白質（ペプチドを含む）包埋ナノ粒子を含有する製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナノ粒子を利用した蛋白質の生理的機能の制御手段に関する。詳しくは、親水性高分子を光応答性化合物（光刺激により構造変化をおこし親水性-疎水性を制御しえる化合物）で修飾し、得られた両親性高分子の形成するナノ粒子内に目的蛋白質（ペプチドを含む）を取り込む工程を含むことを特徴とする光刺激による包埋蛋白質（ペプチドを含む）の制御方法に関する。さらに詳しくは、この制御手段を利用したナノ粒子内に取り込まれた包埋蛋白質（ペプチドを含む）について以下の少なくとも一の機能を達成することに関する。
１）蛋白質（ペプチドを含む）の生体内運搬、
２）蛋白質（ペプチドを含む）の保存・安定化、
３）蛋白質（ペプチドを含む）の精製、
４）酵素・基質反応性の制御、
５）抗原・抗体反応の制御。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術の研究課題の中心が遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へと急速に展開してきている。細胞内におけるタンパク質はそれが単独で機能している訳ではなく、多種多様なタンパク質因子、核酸、低分子種や細胞膜成分等の協調した相互作用のもとで進行し、さらにそれらの総和として生物学的機能が営まれているものと考えられている。ポストゲノム計画の中心課題の一つは、これらの多種多様な個々のタンパク質因子について、それらの複合体としての構造と機能との関係を解析することである。ここから得られる成果は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学から応用としての医薬の開発・生産に至る広い分野に極めて重要な知見を提供することになろう。
【０００３】
遺伝子操作による人工機能蛋白質の創生や、ポストゲノム研究における新規蛋白質の機能解析に関連して、蛋白質のフォールディング制御・細胞内封入体からの目的蛋白質の回収に関する研究の重要性は高い。生体において蛋白質のフォールディングを制御している分子シャペロンはin vitroにおいても有効だが、入手が困難なことから一般的な手法の開発が望まれている。変性剤によって可溶化した変性蛋白質は、透析〔S. M. West, J.B. Chaudhuri, J. A. Howell, Biotechnology and Bioengineering, 1998, 57(5),590-599〕などにより変性剤を希釈することである程度のフォールディングが成されるがその効率は悪い。
【０００４】
これまでに変性剤希釈の際、凝集を抑制する添加剤として、界面活性剤〔Shobha Tandon, Paul M. Horowits, The Journalof Biological Chemistry, 1986, 261(33), 15615-15681〕〔Shobha Tandon, Paul M.Horowits, The Journal of Biological Chemistry, 1987, 262(10), 4486-4491〕〔GustavoZardeneta, Paul M. Horowits, The Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(9),5811-5816〕、スクロース〔P. Valax, G. Georgiou, in protein folding , G. Georgiou, Ed.,ACS Symposium series, Washington D. C., 1991, 470, pp97〕、シクロデキストリン〔N.Karuppiah, A. Sharma, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 211, 60-66〕、トリフルオロエタノール〔K. Shiraki, K. Nishikawa, Y. Goto, J. Mol. Biol., 1995, 245, 180-194〕、〔PatriziaPolverino de Laureto, Martina Donadi, Elena Scaramella, Erica Frare, AngeloFontana, Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1548, 29-37〕、L-アルギニン〔H. Lilie, E.Schwarz, R. Rudolph, Curr. opin. Biotechnol., 1999, 9, 497-501〕〔 J. Buchner, R.Rudolph, Bio/Technology, 1991, 9, 157-162〕〔Urich Brinkman, Johannes Buchner,Tra Pastan, Proc. Natl. Acdd. Sci. USA, 1992, 89, 3075-3079〕〔F. Pecorari, A. C.Tissot, A. Plucktun, J. Mol. Biol., 1999, 285, 1831-1843〕〔Kouhei Tsumoto,Katsutoshi Shinoki, Hidemasa Kondo, Makoto Uchikawa, Takeo Juji, Izumi Kumagai,Journal of Immunological Methods, 1998, 219, 119-129〕、プロリン〔Fan-Guo Meng,Yong-Doo Park, Hai-Meng Zhou, The International Journal of Biochemistry andCell Biology, 2001, 33, 701-709〕、グリセロール〔Fan-Guo Meng, Yong-Doo Park, Hai-MengZhou, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2001, 33,701-709〕のような低分子化合物やPEO〔Jeffrey L. Cleland, Theodore W. Randolph, The Journal ofBiological Chemistry, 1992, 267(5), 3147-3153〕〔Jeffrey L. Cleland, ChesterHedgepeth, Daniel I. C. Wang, The Journal of Biological Chemistry, 1992,267(19), 13327-13334〕、ポリアミノ酸〔Jeffrey L. Cleland, Daniel I. Wang, in Biocatalistdesign for stability and specificity, M. Himmel, Ed., ACS Symposium Series,Washington D. C., 1993, pp 151-166〕〔Jeffrey L. Cleland, in Protein foliding invivo and in vitro, Jeffrey L. Cleland, Ed., ACS Symposium Series, Washington D.C., 1993, 526, pp 1〕、ヘパリン〔Fan-Guo Meng, Yong-Doo Park, Hai-Meng Zhou, TheInternational Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2001, 33, 701-709〕のような水溶性高分子が報告されている。
【０００５】
Gellmanらは界面活性剤とシクロデキストリン〔 David Rozema, Samuel H. Gellman, J. Am. Chem. Soc.1995, 117, 2373-2374〕〔David Rozema, Samuel H. Gellman, Biochemistry, 1996, 35,15760-15771〕〔David L. Daugherty, David Rozame, Peter E. Hanson, Samuel H.Gellman, The Journal of Bioligical Chemistry, 1998, 273(51), 33961-33971〕を用いた分子シャペロン類似のtwo-step systemを報告している。この系においてサイクロアミロース〔Sachiko Machida, Setsuko Ogawa, Shi Xiaohua,Takeshi Takada, Kazutoshi Fujii, Kiyoshi Hayashi, FEBS Letters, 2000, 486,131-135〕もシクロデキストリンと同様の効果を示す報告もある。
【０００６】
本発明者は、親水性の多糖類に数Wt％の疎水基をグラフト状に導入した疎水化多糖〔K. Akiyoshi, S. Degichi, H. Tajima, T.Nishikawa, J. Sunamoto, Macromolecules, 1997, 30, 857-861〕〔K. Akiyoshi, J. Sunamoto,Supermolecular science, 1996, 3, 157-163〕〔T. Nishikawa, K. Akiyoshi, J.Sunamoto, Macromolecules, 1997, 27, 7654-7659〕〔T. Nishikawa, K. Akiyoshi, J.Sunamoto, Journal of American Chemistry Society, 1996, 118, 6110-6115〕〔K.Akiyoshi, T. Nishikawa, S. Shichibe, J. Sunamoto, Chem. Lett., 1995, 707-708〕からなるナノ微粒子が蛋白質のホストとして機能すること、そしてシクロデキストリンを用いることで分子シャペロン類似の機能を有することを明らかにしてきた〔KazunariAkiyoshi, Yoshihiro Sasaki, Junzo Sunamoto, Bioconjugate Chemistry, 1999,10(3), 321-324〕。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ナノ粒子を利用した蛋白質（ペプチドを含む）の生理的機能の制御手段を提供することである。つまり、ナノ粒子を利用して、蛋白質等の生理機能を可逆的に制御するためのより簡便な手段を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ナノ粒子の性状について種々検討の結果、親水性と疎水性の可逆的変化を制御するための手段として光刺激を利用することを検討し、この光刺激により応答する会合性分子の動的会合制御を利用すれば、蛋白質に対する分子シャペロン機能と同等の機能が達成できることを見出し本発明を完成した。
つまり、本発明は、
「
１．親水性高分子を光応答性化合物（光刺激により構造変化をおこし親水性-疎水性を制御しえる化合物）で修飾し、得られた両親性高分子の形成するナノ粒子内に目的蛋白質（ペプチドを含む）を取り込む工程を含むことを特徴とする光刺激による包埋蛋白質（ペプチドを含む）の制御方法
２．ナノ粒子が、粒径50-100nmである、前項１の制御方法。
３．ナノ粒子が、多糖プルランである、前項２の制御方法。
４．光応答性化合物が、スピロピラン基である前項１-３の何れか一に記載の制御方法。
５．制御が、光刺激によっておこなわれ、これにより蛋白質のリフォールディングが制御される前項１-４の何れか一に記載の制御方法。
６．制御によって、ナノ粒子内に取り込まれた包埋蛋白質（ペプチドを含む）について以下の少なくとも一の機能を達成する前項１-５の何れか一に記載の制御方法。
１）蛋白質（ペプチドを含む）の生体内運搬、
２）蛋白質（ペプチドを含む）の保存・安定化、
３）蛋白質（ペプチドを含む）の精製、
４）酵素・基質反応性の制御、
５）抗原・抗体反応の制御。
７．前項１-５の何れか一に記載の制御方法で調製される蛋白質（ペプチドを含む）包埋ナノ粒子を含有する製剤。
８．前項７の製剤の製造方法。」
からなる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のナノ粒子の調製法は広く公知である。例えばＷＯ００／１２５６４（高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法）に開示がある。それによると、第１段階反応は、炭素数１２-５０の水酸基含有炭化水素またはステロールと、ＯＣＮ-Ｒ1-ＮＣＯ（式中、Ｒ1は炭素数１-５０の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数１２-５０の水酸基含有炭化水素またはステロールが１分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。第２段階反応は、前記第１段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数１２-５０の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。この第２段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。
【００１０】
本発明の光応答性化合物（光刺激により構造変化をおこす化合物）での修飾は、上記炭素数１２-５０の水酸基含有炭化水素またはステロールが１分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物の代わりに、フォトクロミズムに伴って親水性・疎水性の可逆変換や大きな構造変化を引起す化合物が利用される。その代表的な化合物は本発明の実施例で示したスピロピランであるがこれに限定されない。例えば、アゾベンゼン基やトリフェニルメタン基が例示される。
【００１１】
使用されうる親水性の多糖類としては、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群より選択される１種以上である。
【００１２】
光応答性化合物置換親水性多糖類の合成は、親水性多糖類としてプルランを利用した場合、分子量108,000のプルランに100単糖あたり光応答性化合物が１-２０個、好ましくは１-１０個、より好ましくは１-５個置換）が例示される。得られる疎水化高分子の性状は、蛋白質のサイズや疎水性の程度により、光応答性化合物及びコレステロール又炭化水素の置換量を換え変更可能である。疎水性をコントロールするためには、光応答性化合物に加えて、炭素数１０-３０、好ましくは炭素数１２-２０程度のアルキル基を少量導入することも好適である。組合せの調製は、粒子径、光応答性（感受性）、可溶化性等を実験的繰り返しにより確認し、達成可能である。
【００１３】
本発明で使用するナノ粒子は、粒径50-100nmである。
【００１４】
ナノ粒子への目的蛋白質（ペプチドを含む）の取り込みは、目的蛋白質の変性状態あるいは未フォールデイング状態のものとナノ粒子を接触させ行う。無細胞蛋白質合成系を利用した包埋法においては、ｍＲＮＡの存在する相に共存させる。例えば、ｍＲＮＡの約１-１０００μｇに対して１-０．０１ｍｇのナノ粒子を添加する。但し、この添加量は、蛋白産生量との比率、取込み効率を考慮し、随時変更可能である。細胞蛋白質合成系においては、分泌型であればそのまま或は化学的変性剤との共存下でナノ粒子と接触させる。また、非分泌型或は細胞内での凝集体化がおこるものであれば、細胞を破壊し、凝集体等を化学的変性剤で可溶化した後、ナノ粒子と接触させる。その使用適量は、対象蛋白質等の量・分子量によって適宜実験的繰り返しにより決定されるが、一般的には、対象蛋白質等の重量：ナノ粒子重量＝１：０．１-１０の比率で、好適には１：１-５である。
【００１５】
本発明の蛋白質合成系とは、広く遺伝子工学技術を応用した蛋白質合成手段及び天然の蛋白質合成手段をも対象とし、合成される蛋白質等が凝集等により変性してしまう、或は細胞内に封入された状態にあるものなど、蛋白質等の変性-リフォールデイングが可能な全てを意味する。
【００１６】
本発明の典型的な系は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等の自体公知の宿主を利用し遺伝子組換え技術によって形質転換した系による蛋白質等の合成である。
【００１７】
形質転換は、自体公知の手段が広く応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。
【００１８】
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス属菌（Streptomyces）および枯草菌（Bacillussubtilis）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（DrosophilaS2）およびスポドプテラＳｆ９（SpodopteraSf9）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞等がある。
【００１９】
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等がある。
【００２０】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。かくして、培養により目的とする蛋白質等が形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地中に本発明のナノ粒子を存在させナノ粒子中に蛋白質等を取込む。蛋白質等が形質転換体の細胞内に生成される場合（分泌されない状態）、細胞内に封入された状態（凝集体化した状態）、或は既にフォールディングされた状態では、まず細胞を溶解し及び／若しくは蛋白質等を化学変性剤で可溶化し、次いで、ナノ粒子と接触させてナノ粒子中に蛋白質等を取込ませた後、これを回収する。
【００２１】
以上のようにして、ナノ粒子に取り込まれた蛋白質等は、ナノ粒子を分離し、蛋白質個々の性状におうじた安定化及び生理的条件下で、その使用目的に応じて調製される。つまり包埋された蛋白質等が、光刺激でナノ粒子の性状・構造が変化することで、遊離され、リフォールディングにより生理活性を取り戻す。この制御手段は、例えば以下のような蛋白質等の制御に利用される。好適な蛋白質としては、公知のTPA、IFN（α、γ等）、CSF（M-、GM-等）、血液凝固因子（例えば、第VIII、IX、XIII因子等）が例示されるが、これに限定されない。
【００２２】
１）蛋白質（ペプチドを含む）の生体内運搬
これは、所謂、ターゲティング治療に関する。目的蛋白質を、粒子内に包埋し、経口或は注射によって生体内に蛋白質等包埋ナノ粒子を投与し、粒子を目標組織、目標細胞、癌細胞等に移動させ、目標部位に到着後、光刺激により粒子構造を変化させ、包埋蛋白質等を遊離させ、リフォールディング後に生物活性を発揮させるというものである。この方法で、活性タンパク質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。簡便には、腸内の特別の部位での蛋白質等の活性化のために経口投与し、そしてそれに続く光照射で腸内のターゲット部位での活性化を達成する。注射薬としては、ナノ粒子の表面を目標組織・細胞との親和性を考慮した修飾を施し、例えばモノクローナル抗体等、その親和性により目標部位に蛋白質等包埋ナノ粒子を集積させ、その後光刺激により粒子構造を変化させ、包埋蛋白質等を遊離させ、リフォールディング後に生物活性を発揮させるというものである。この方法で、活性タンパク質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。
【００２３】
２）蛋白質（ペプチドを含む）の保存・安定化
フォールディングの状態で、安定性に乏しい蛋白質等の安定化のための手段としても好ましい結果を導く。蛋白質等を主成分とする製剤には、医薬品、化粧品、食品等様々のものがある。目的とする蛋白質等が、放置すれば不可逆的に変性・凝集を起こす場合、本ナノ粒子の中に目的蛋白質等を閉じ込め、用事、光刺激で目的蛋白質等を遊離させ、目的の生理学的機能を発揮させる。
【００２４】
３）蛋白質（ペプチドを含む）の精製
目的の蛋白質等が遺伝子工学的に生産される場合、蛋白質等の合成後、細胞外分泌されずインクリュージョンボディーの状態になる場合に有効である。細胞を溶解し変性剤で目的蛋白質等を変性させ、ナノ粒子中に取込み、回収し、その後、適当な生理的条件下で光刺激を与えてナノ粒子の構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。無細胞タンパク質合成手段或は分泌系の細胞内蛋白質合成手段にあっては、合成系にナノ粒子を共存させ、合成されてくる蛋白質等をナノ粒子内に連続的に取込み、その後、ナノ粒子を分離回収して、適当な生理的条件下で光刺激を与えてナノ粒子の構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。
【００２５】
４）酵素・基質反応性の制御
酵素又は基質を、ナノ粒子内に包埋させておけば、酵素反応の制御が用事まで可能である。ナノ粒子内に包埋された酵素又は基質は、不活性状態として、相手側との交差が制御される。例えば、試薬として一体化製剤として製品化した場合に、光刺激を受けて初めてナノ粒子が構造を変化させ、包埋目的酵素又は基質を遊離させ、その結果、酵素反応が初めて開始できる系にしておけば、製剤の効率化・簡略化が達成できる。また、酵素の保存安定性の確保のためにナノ粒子内に酵素を包埋しておき、用事光刺激で目的酵素をナノ粒子から遊離させて反応系におくことも可能である。
【００２６】
５）抗原・抗体反応の制御
抗原又は抗体を、ナノ粒子内に包埋しておけば、抗原・抗体反応の制御が可能である。抗原抗体反応を利用した試薬、医薬において、用事光刺激で目的抗体又は抗原をナノ粒子から遊離させて反応系におくことも可能である。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
【実施例１】
親水性の多糖類であるプルランを使い、これにスピロピラン基を導入したスピロピラン置換プルラン(SpP)を合成した。
【００２９】
（試料）
Acetone (Wako pure chemical industry. Ltd., 特級)
1-(β-Carboxyethyl)-3',3'-dimethyl-6-nitrospiro(iodorine-2',2'[2H-1]benzopyran(Spi-COOH)((株)環境化学センター)
N,N'-dicyclocarbodiimide(DCC) (Peptide instutute. Inc.)4-Dimethylaminopyridine(DMAP) (Wako pure chemical industry. Ltd., 特級)Dimethyl Sulfoxide(DMSO), dehydrated (Wako pure chemical industry. Ltd. 有機合成用)
Pullulan (Hayashibara biochemical laboratories. Inc.)
【００３０】
（SpPの合成）
SpPの合成スキーム及び構造式を以下に示す。式中、Ｒで示したのがスピロピラン基で、紫外光（UV）・可視光（VIS）の照射や熱によって構造を変化させる化合物である（化１）。この化合物は種々の有機溶媒中で、UV照射により、シス体(閉環型、Spiro型)からトランス体への変換が起こり、同時にノニオン性から両性イオン状態(開環型、Mer型)となる。これは可視領域に強い吸収を持ち、メロシアニン型色素の分子構造で準安定状態とされ、熱を加える事によりSpiro型に戻る。また、Mer型の吸収帯の波長光で刺激する事によってもSpiro型に戻る。このような性質をフォトクロミズム(photochromism)と言う。
【００３１】
【化１】
0004100499.tif 000002
【００３２】
プルラン（Mw=108,000）を一晩70℃で減圧乾燥させた。これを70℃で一晩減圧乾燥させ、frame dryしたナス型フラスコに1.00g（glucoseunit 6.18mmol）秤取し、そこへDehydrated DMSOを20ml加え、窒素気流下、常温で2時間撹拌を行い溶解させた。
別のよく乾燥させたナス型フラスコにスピロピランのカルボン酸誘導体（Spi-COOH）(run1,2, 587mg, 1.54mmol、run3,1174mg, 3.08mmol)、DCC (run1,2, 318mg, 1.54mmol、run3 636mg, 3.08mmol)を秤取し、DehydratedDMSOを10ml加え、窒素気流下、室温で2時間撹拌した。
【００３３】
プルラン溶液にDMAPを30mg加えた後、スピロピラン溶液を加え、窒素気流下、35℃で40時間撹拌した。溶液の色は濃い紫色であった。反応終了後、反応溶液を過剰のアセトンに対して混合し、再沈殿による精製を行った。得られた化合物は薄紫色の固体であった。構造の確認及び置換率の決定はIRスペクトル(ShimazuFT-IR 8100S)、1HNMR(JOEL 400MHz)、元素分析によって行なった。(収率：run1 85.5%, run2 85.0%, run3-a43.2%, run3-b 47.2%)
【００３４】
以上の結果より、親水性の多糖プルランに100単糖あたり0.4、1.4、2.8、6.8個のスピロピラン基を導入したスピロピラン置換プルラン(SpP)（Spiropyranbearing pullulan）(SpP  0.4, 1.4, 2.6, 6.8)の合成に成功した。以下、100単糖あたりX個のスピロピランが導入されたSpPをSpPXと呼ぶ。
【００３５】
【実施例２】
スピロピラン置換プルラン(SpP)の会合挙動
実施例１で合成したSpPの水溶液中におけるフォトクロミズムや会合挙動について検討した。
【００３６】
（試料）
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES)(Wako purechemical industry. Ltd.)
Hydrochloride(HCl)(Wako pure chemical industry. Ltd.,精密分析用)
Sodium chloride(NaCl)( Wako pure chemical industry. Ltd.)
Spiropyran bearing pullulan(SpP  0.4, 1.4, 2.6, 6.8)(実施例１で合成)
【００３７】
（溶液の調製）
SpPの薄紫色固体を暗所において、buffer(100mM HEPES、pH7.5)に対して加熱撹拌(50℃)することで溶解させ、不純物を取り除くため得られた水溶液をフィルター(Sterileacrodisk 25, Gelman science, pore size: 1.2μm, 0.45μm, 0.2μm)を用いて濾過し、常温まで放置した。
【００３８】
〔SEC-MALS(Multi angle laser light sccatering)〕
SEC-MALS及びRapid MALSの測定をした。SEC-MALSとは、SECによって分離された成分について、RIによる検出とMALSによる検出を行う事で、溶出時間に対応した各濃度について、18角度の光散乱強度を解析することによって、各成分のMw（重量平均分子量）および、Rw（重量平均半径）を測定する事が出来る。RapidMALSではカラムにガードカラム(プレカラム)を用いる事で、カラムとの相互作用を最小限に抑えつつ、サンプルの濃度勾配を作り出す方法で、短時間（測定時間数分程度）で解析することが出来る。
【００３９】
（Rapid MALS、DLSによる会合挙動の評価）
SpPの水溶液中における会合挙動についてRapid MALS法やDLS測定よって検討を行なった。Rapid MALS測定には、TOSOH CCDP dualpump、TOSOH RI-8010 RI detector、Wyatt tech. co. DAWN-E MALS detectorからなるシステムを用い、カラムはTOSOHSWXLのガードカラム、流速は1.0ml/min、溶離液は100mM HEPES、100mM NaCl、pH7.5を用いた。サンプルはSpP1.4の薄紫色固体を、暗所において、50℃、30minの加熱撹拌をする事で溶離液に溶解させ、その後遮光したまま室温まで放冷することで調製した。光刺激は、UV照射を8WUV lamp(254nm)(UVP, 8 watt handheld model UVM-18)、VIS照射を８W White lightlamp(UVP, 8 watt handheld model UVM-18)を用いて行った。測定サンプルの濃度は、0.25-2.5mg/ml、injectionvolumeは、適当なピークの大きさになるように10-100μlで行った。サンプルをカラムにアプライする際に、フィルター(0.45μm)を用いて濾過した。サンプルの屈折率増分dn/dcは、Wyatttech. co. Optilab DSP interferometric refractometerによって測定した値を用いた。
【００４０】
動的光散乱（DLS）測定には、Otsuka Electronics Co., Ltd., DLS-700を用いた。光源の波長は633nmのHe-Neレーザーで、温度は25.0±0.2℃で行った。サンプルはSpP1.4の薄紫色固体を、暗所において、50℃、30minの加熱撹拌をする事で緩衝液(100mMHEPES, pH7.5)に溶解させ、その後遮光したまま室温まで放冷することで調製した。得られた溶液はフィルター(0.45μm)を用いて濾過した。光刺激は、UV照射を8WUV lamp(254nm)(UVP, 8 watt handheld model UVM-18)、VIS照射を８W White lightlamp(UVP, 8 watt handheld model UVM-18)を用いて行った。
【００４１】
SpP水溶液の調製
種々の置換率のSpP（0.4、1.4、2.8、6.8）の水への溶解性は、0.4-2.8のものは数mg/mlのとき少しの加熱撹拌することで溶解し、6.8のものはほとんど溶解しなかった。原料プルランは水に溶解することから、これは、スピロピランの疎水性のため置換率の高いものでは、水への溶解性が低くなったと考えられる。
【００４２】
SpPのフォトクロミズム
SpP1.4の水溶液中で示すフォトクロミズムについて、UV・VIS吸収スペクトルを追跡することによって検討した。UV測定にはペルチェ式温度制御装置を装備したUVspectrophotometer (Hitachi, U-3300)を用いた。光刺激は、UV照射を8W UV lamp (UVP, 8 watthandheld model UVM-18)、VIS照射を8W White light lamp (UVP, 8 watt handheld modelUVM-18)を用いて行なった。
サンプル調製時、溶液の色は薄い赤色で、515nmにλmaxを持つUVスペクトルが得られた(MerＩ型)。これにUV照射するとλmaxが535nmに長波長シフトした(MerＩＩ型)。また、MerＩに可視光照射すると、溶液の薄い赤色は速やかに消失し、閉環型のUVスペクトルが得られた(Spiro型)。これより、SpPは3種の状態を行き来するフォトクロミズムを示すことがわかった。これをまとめると、水溶液中におけるSpPのフォトクロミズムは次のような相関が確認された。
【００４３】
まず、サンプル調製時においてスピロピランは開環型(MerＩ)であり、これは25℃暗所において数時間安定であった。これにVIS照射すると、10分以内にSpiro型への構造変化が起こる（１）。そして、このSpiro構造を加熱すると速やかにMerＩに戻った（２）。これは逆フォトクロミズムである。また、Spiro型を暗所において放置すると、180分ほどでMerＩに戻った（３）。これにより、SpPは25℃暗所において、MerＩが最も安定な種であることが示唆される。Spiro型にUV照射すると10分ほどでMerＩＩになった（４）。これにVIS照射するとこれは240分ほどかかってSpiro型へ戻った（５）。MerＩにUV照射することでも5分ほどでMerＩＩになり（６）、これを加熱すると、速やかにMerＩへ戻った（７）。MerＩＩは、MerＩに比べλmaxが長波長シフトしていることや、（５）の構造変化の速度が非常に遅いこと（スピロピランの開環型は分子同士がスタック構造をとるとき、スピロ型への構造変化を著しく阻害する。これは、開環型は平面構造であり、スピロ型は立体構造であるためである）から、スピロピラン分子同士のスタッキングによる会合が起こっていることが示唆される。
【００４４】
SpPの会合挙動
サンプル調製時(MerＩ)のSpP1.4についてのRapid MALSの解析結果から、Mw=1.54×106(g/mol)、Mw/Mn=1.64±0.17、Rw=79.2 (nm)であることがわかった。主鎖となる原料のプルランはMw=1.08×105 (g/mol)であることから、SpPは水溶液中において10数分子が会合していることが示唆された。CHP集合体が分子量約45万、会合数が4ほどであることから比べると、かなり大きな会合体を形成していることがわかる。また、室温、暗所においてこの会合体は安定であった(スピロピラン分子も安定)。
【００４５】
MerＩにVIS照射（0, 1, 5, 10, 30, 60, 90min）したとき（１）、SpP1.4の会合体は分子量、粒径は多少小さくなり、10数分子ほどの会合体を形成している。このとき会合体の密度は多少大きくなっている。このSpiro型を室温、暗所に放置(0-180min)すると除々にMerＩへと変化するが（３）、このとき会合体はほとんど変化しなかった。次に10minのVIS照射によりSpiro型にした種にUV照射すると（４）、会合体は10-30minをピークにして分子量、粒径ともに大きくなった。データ間にばらつきはあるが、最大で分子量約400万（SpPの会合数は約40）ほどであった。このあと、除々に会合体は小さくなっていった。次にMerＩにUV照射すると（６）、（４）のときと同様に会合体は多少大きくなっていき、その後小さくなっていったが、（４）ほど大きな変化は見られなかった。そして、MerＩにVIS照射(10min)することでSpiroにしてから、UV照射(10min)することでMerＩＩにして、その後VIS照射すると（５）、はじめ分子量350万ほどであった会合体は、除々に小さくなっていき、240minほどで分子量約170万ほどになった。これは、スピロピラン分子同士のスタッキングによる会合構造(MerＩＩ)からSpiro構造への変換が遅いという結果とも一致している。DLSによる結果より、RapidMALSによるものと同様の挙動を示していることが示唆される。濃度が高くなるとSpP微粒子は多少大きくなるようである。
【００４６】
以上の結果をまとめると、SpPは10数分子から数10分子が集まってヒドロゲルナノ微粒子を形成し、光刺激によって可逆的な会合挙動の変化をすることがわかる。UV照射によって会合体が大きくなったり小さくなったりするのは、架橋領域のスピロピランの性質が変化することによるものであると考えられる。
【００４７】
【実施例３】
SpPを用いて、蛋白質のリフォールディング効率を向上させること、またそこから得られるSpPと蛋白質の相互作用に関する知見を得ることを目的として検討した。モデル酵素としてはCSを用いた。コントロールとして疎水化多糖-シクロデキストリンのシステムについても検討を行なった。
【００４８】
（試料）
Acethyl-CoA(Wako pure chemical industry. Ltd., 生化学用)
Choresterol bearing pullulan108-1.2(CHP108-1.2)(Synthesized in this labo.)
Dimethyl sulfoxide(DMSO) (Wako pure chemical industry. Ltd., 特級)
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB) (Wako pure chemical industry. Ltd.,SH基定量用)
(±)Dithiothreitol(DTT) (Wako pure chemical industry. Ltd., SH基酸化防止用)
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate(EDTAゲNa)(Wako pure chemical industry. Ltd.)
Guanidine hydrochloride(GuHCl) (Wako pure chemical industry. Ltd., 生化学用)
Hydrochloride(HCl) (Wako pure chemical industry. Ltd., 精密分析用)
Hydroxypropyl-β-cyclodexitrin(HP-β-CD)(日本食品化工(株))
Oxaloacetic acid(Wako pure chemical industry. Ltd.)
Phenol(Wako pure chemical industry. Ltd., 特級)
Sodium chloride(NaCl) (Wako pure chemical industry. Ltd.)
Spiropyran bearing pullulan1.4(SpP1.4) (Synthesized in this labo.)
Sulfonic acid(Wako pure chemical industry. Ltd., 精密分析用)
Tris[hydroxymethyl]aminomethane(Trizma base) (Sigma chemical co.)
Tris[hydroxymethyl]aminomethane hydrochloride(Trizma) (Sigma chemical co.)
以上の試薬の中で購入したものは精製せずそのまま用いた。また本実験を通してbufferとして、150mM Tris-HCl、0.75mM EDTA、pH7.6を用いた。
【００４９】
（SpP溶液、CHP溶液の調製）
SpP溶液は、SpP1.4の薄紫色固体を暗所において、bufferに対して30min加熱撹拌(50℃)することで溶解させ、不純物を取り除くため得られた水溶液をフィルター(Sterileacrodisk 25, Gelman science, pore size: 1.2μm, 0.45μm, 0.2μm)を用いて濾過し、暗所下、常温まで放置することで調製した。
【００５０】
〔Citrate Synthase(CS)〕
CSは、解糖および脂肪酸の分解によって生じたをTCAサイクルへ導くための初発段階の酵素で、アセチル-CoAとオキサロ酢酸からクエン酸を合成する反応を触媒する。反応はアセチル-CoAのメチル基のカルボアニオンとオキサロ酢酸のアルドール縮合である。
CSはホモ二量体の蛋白質であり、サブユニットは活性を持たない。また、サブユニット内に5つのシステイン残基を有するが、ジスルフィド結合は形成されていない。CSは4次構造の研究におけるモデル蛋白質としてその物理化学的特性、アミノ酸の一次配列、立体構造、活性点、基質結合部位などが詳細に検討されてきた。
【００５１】
（CS溶液調製）
CS(From porcine heart, MWsubunit=50,000)溶液はRocheから購入した懸濁液をbufferに対して溶解させることで調製した。濃度の定量は、280nmにおける吸光度を測定することによって行なった(ε280nm=1.75ml・cm/mg)。
また、CSの変性溶液は、1.0mg/ml CS、6M GuHCl、40mM DTTになるようにbufferに溶解させ、25℃で1hインキュベーションすることによって得た。
【００５２】
（活性測定）
CSの酵素活性の測定は基質溶液(23μM、19μg/ml Acetyl-CoA、0.5mM、66μg/ml、Oxialoacetic acid、0.12mM、48μg/ml、DNTB)0.76mlとCS溶液15μlを速やかに混合し、5s程撹拌した後、下記の反応で生じるメルカプチドイオンの濃度増加を412nmの吸光度を追跡した。吸光度が一次の傾きによって増加するが、この傾きを天然状態のそれと比較することで活性回復率を見積もった。
【００５３】
（リフォールディング実験）
CSは6M GuHCl溶液中においてほぼランダムコイルに近い状態まで変性する。このとき酵素活性は有さない。DTTはCSの持つジスルフィド結合を形成していないシステイン残基の非生産的なジスルフィド形成を抑制するための還元剤である。このCS変性溶液をbuffer、種々の濃度のSpP1.4溶液、およびCHP溶液(1.0mg/ml)で50倍に希釈することでリフォールディングを行わせ、希釈開始後(CHP系ではCD添加後)の酵素活性を測定した。また、コントロールとしてSpPの原料であるプルランやスピロピランのカルボン酸誘導体を用いてリフォールディング実験を行なった。SpPを用いた系では、スピロピランのコンフォメーションがCSのリフォールディングに与える効果を検討するためにVIS(Whitelight)照射やUV(254nm)照射を行った。光刺激には、UV照射を8W UV lamp (UVP, 8 watt handheld modelUVM-18)、VIS照射を8W White light lamp (UVP, 8 watt handheld model UVM-18)を用いて行なった。CHPを用いた系では、CS変性溶液をCHP溶液で希釈した後30min放置し、その後HP-β-CD(40mM)を添加してからの酵素活性を測定した。
【００５４】
（化学変性CSのリフォールディング制御）
SpPのシャペロン作用・コンフォメーション依存性
SpPがCSのリフォールディングに与える影響を検討するにあたって、まず天然状態のCSにSpPが与える影響について検討した。 Spiroのものは10minのVIS照射をしてからCS溶液と混合し、MerＩは遮光、MerＩＩは10minのUV照射をしてから混合し、その後も照射を続けたものである。SpP存在下、非存在下におけるCSの活性の変化がないことから、SpPナノ微粒子は、天然状態のCSと相互作用しない、または、複合化のような相互作用があったとしても、酵素活性には影響を与えないということが示唆された。（表１）
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* 変性化 CS 溶液 ([CS]=1.0mg/ml, 6M GuHCl, 400mM DTT) は種々の溶液で50倍希釈された。緩衝液 : 150mM Tris-HCl, 0.75mM EDTA, pH7.6.
【００５５】
CSのリフォールディングにおけるSpPの効果について検討した。Spiro、MerＩの２つのコンフォメーションについてリフォールディング実験を行なった。用いた系は、変性溶液のCS濃度1.0mg/ml、希釈倍率は50倍、SpP濃度は1.0mg/mlである。SpiroはSpP溶液調製後、可視光照射(10min)し、変性CS溶液と混合後も可視光照射し続けた。MerＩ型では、遮光条件下で行った。また、プルラン(1.0mg/ml)やSpi-COOH(87.7μM、1.0mg/mlのSpP1.4のスピロピランユニットと同濃度)のシャペロン活性についても評価した。
【００５６】
プルランやSpi-COOHにシャペロン活性は見られなかった。この系において自発的なリフォールディングは30%ほどであり、70%ほどのCSは正常なフォールディングやアセンブリーを成しえず、凝集したものと推察される。SpPを用いた系では、最大活性回復を示したのがMerＩであり60％ほどであった。それに次いで、Spiroが45％ほどであった。この二つの活性回復速度は、自発的なものと比べて遅く、相互作用が示唆される結果となった。また、SpP系においては活性回復速度が自発的なものに比べ遅いことからSpPナノ微粒子とCSのリフォールディング中間体との相互作用が示唆された。（表１、図２）
【００５７】
次に、フォールディングの経過に伴って、このSpPナノ微粒子のナノ空間の性質を光刺激することによって変化させることで、シャペロン作用がどのように変化するかについて検討した(図２)。
リフォールディング初期にSpiroであったもので、すぐに遮光し除々にMerＩにしたものでは自発的なものが35%ほどであるのに対して55％ほどであり、Spiro→Spiroの45％に比べて大きな活性回復を示した。Spiroで30minほど放置してから遮光したのはSpiro→Spiroとほぼ同様であった。
【００５８】
リフォールディング初期にMerＩであったものについてであるが、すぐにSpiroにしたものでは65％ほどでMerＩ→MerＩとほぼ同様であった。MerＩで30minほどおいてからSpiroにしたものでは非常に大きな活性回復が見られ、80％ほどであった。
【００５９】
【発明の効果】
本検討では、化学変性状態にあるCSのリフォールディングの系における、SpPのシャペロン作用について検討した。その結果、
1)変性蛋白質にフォールディングに適したナノ空間を提供するとともに、複合化・放出を自発的に行なう
2)光刺激することによってフォールディングを行なうナノ空間を、"よりフォールディングに適した環境"にすることが可能である
といった特性を持つ人工分子シャペロンとして機能することが見出された（図３）。
すなはち、蛋白質とのアフィニティーを光刺激により制御し、フォールディングを促進しえることが明らかになった。この系では光刺激の程度・間隔などによって種々の蛋白質に対して適した環境を提供することが可能となることが期待される。また、細胞内封入体からリフォールディングの系や、生体外翻訳システムなどへの応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】SpP1.4のフォトクロミズム（UV・VIS吸収スペクトル変化）を示す。
【図２】SpP系の分子シャペロン作用の時間変化（活性回復の時間変化）を示す。
【図３】光応答性人工分子シャペロンの作用機構を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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