(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中に核酸プローブを加えてこれらを反応させる過程と、該試料溶液中に標的核酸が存在する場合に得られる、核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造を検出する過程とを有する核酸ハイブリッド体の検出方法であって、
該検出方法における核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造を検出する過程は、
二重らせん構造を介した相互作用により検出可能な変化を起こす、２種の試薬物質を、前記試料溶液中に共存させて、
標的核酸が存在する場合に形成される、核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造を介して起こる、前記２種の試薬物質間の相互作用に基づく変化を測定して、二重らせん構造を検出する手法を用いており、
前記検出手法で利用される２種の試薬物質は、いずれも、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物であり、
かつ、該２種の試薬物質は、それぞれ、リンカーを介して、核酸プローブの２つの末端に結合されており、
前記２種の試薬物質間の相互作用に基づく変化は、該２種の試薬物質間における電荷移動に基づく変化であり、
該２種の試薬物質間における電荷移動は、ハイブリッド体中の二重らせん構造を構成する塩基対のスタッキングを介して行われ、
該電荷移動に際して、前記ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種の一方は、電子受容体として機能し、一方、残る１種は、前記電子受容体として機能するピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の１種に対する電子供与体として機能し、
前記ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種は、インターカレーターとして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造に挿入され、
該２種の試薬物質間における電荷移動は、前記電子供与体を選択的に光励起することにより誘起され、
前記電子供与体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物は、
下記一般式［Ａ１］：
【化２６】
0004114958.tif 000049
［Ａ１］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩化合物、および
下記一般式［Ａ２］：
【化２７】
0004114958.tif 000050
［Ａ２］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニルピリリウム塩化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物であり、
前記電子受容体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物は、
下記一般式［Ａ３］：
【化２８】
0004114958.tif 000051
［Ａ３］
（式中、Ｘは、Ｏ、またはＳであり、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム塩化合物、及び、それらのチオピリリウム化合物；および
下記一般式［Ａ４］：
【化２９】
0004114958.tif 000052
［Ａ４］
（式中、Ｘは、Ｏ、またはＳであり、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４，６−トリフェニルピリリウム塩化合物、及び、それらのチオピリリウム化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物またはチオピリリウム化合物である
ことを特徴とする核酸ハイブリッド体の検出方法。
【請求項２】
前記電子受容体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物として、
下記一般式［Ａ３’］：
【化３０】
0004114958.tif 000053
［Ａ３’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム塩化合物；および
下記一般式［Ａ４’］：
【化３１】
0004114958.tif 000054
［Ａ４’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４，６−トリフェニルピリリウム塩化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物を用いている
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電子供与体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物として、
下記一般式［Ａ１’］：
【化３２】
0004114958.tif 000055
［Ａ１’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩化合物を用いている
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記２種の試薬物質間の相互作用に基づく変化は、光学的に検出可能である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記２種の試薬物質間の相互作用に基づく変化は、光照射により検出可能となる
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸とのハイブリダイズのための配列を有する標的核酸検出用プローブであって、
少なくとも、該核酸プローブには、
該核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造の検出において利用される、
形成される前記ハイブリッド体における二重らせん構造を介する相互作用により検出可能な変化を生じる、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種が、それぞれ、リンカーを介して、核酸プローブの２つの末端に結合されており、
前記ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種間の相互作用に基づく変化は、該ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種間における電荷移動に基づく変化であり、
該ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種間における電荷移動は、ハイブリッド体中の二重らせん構造を構成する塩基対のスタッキングを介して行われ、
該電荷移動に際して、前記ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種の一方は、電子受容体として機能し、一方、残る１種は、前記電子受容体として機能するピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の１種に対する電子供与体として機能し、
前記ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種は、インターカレーターとして、前記核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造に挿入され、
該ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の２種間における電荷移動は、前記電子供与体を選択的に光励起することにより誘起され、
前記電子供与体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物は、
下記一般式［Ａ１］：
【化３３】
0004114958.tif 000056
［Ａ１］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩化合物、および
下記一般式［Ａ２］：
【化３４】
0004114958.tif 000057
［Ａ２］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニルピリリウム塩化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物であり、
前記電子受容体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物は、
下記一般式［Ａ３］：
【化３５】
0004114958.tif 000058
［Ａ３］
（式中、Ｘは、Ｏ、またはＳであり、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム塩化合物、及び、それらのチオピリリウム化合物；および
下記一般式［Ａ４］：
【化３６】
0004114958.tif 000059
［Ａ４］
（式中、Ｘは、Ｏ、またはＳであり、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４，６−トリフェニルピリリウム塩化合物、及び、それらのチオピリリウム化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物またはチオピリリウム化合物である
ことを特徴とする核酸ハイブリッド体検出用プローブ。
【請求項７】
前記電子受容体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物として、
下記一般式［Ａ３’］：
【化３７】
0004114958.tif 000060
［Ａ３’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム塩化合物；および
下記一般式［Ａ４’］：
【化３８】
0004114958.tif 000061
［Ａ４’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４，６−トリフェニルピリリウム塩化合物
からなる群から選択されるピリリウム化合物を用いている
ことを特徴とする請求項６に記載の核酸プローブ。
【請求項８】
前記電子供与体として機能する、１種のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物として、
下記一般式［Ａ１’］：
【化３９】
0004114958.tif 000062
［Ａ１’］
（式中、Ｙ-は、ＣｌＯ4-、またはＩ-を示す）で表される２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩化合物を用いている
ことを特徴とする請求項６または７に記載の核酸プローブ。
【請求項９】
該核酸プローブに結合されている、前記電子受容体として機能する、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の１種において生じる、
前記ハイブリッド体における二重らせん構造を介する相互作用に因る、前記電荷移動に基づく検出可能な変化は、
光学的に検出可能である
ことを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【請求項１０】
該核酸プローブに結合されている、前記電子受容体として機能する、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の１種において生じる、
前記ハイブリッド体における二重らせん構造を介する相互作用に因る検出可能な変化は、
光照射により検出可能となる
ことを特徴とする請求項６〜９のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウイルス、微生物、動植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の塩基配列を検出、同定、もしくは各種塩基配列における変異の有無を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の分析技術の発達により種々の変異遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子中の塩基が部分的に欠失したものや塩基が点突然変異を起こしたものがあり、それによって蛋白質に変異が生じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明らかにされてきている。現在のところ、これらの遺伝病は、症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を用いた免疫的な方法により発見されることが主流であるが、早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に遺伝子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が指摘されている。
【０００３】
また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定においても利用しうる。
【０００４】
従来は、分離した細菌の形態学的性状および生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかかる上に、検査法の違いによって性状の判定が異なったり、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異なる等の問題があった。
【０００５】
そこで、近年、特に、細菌感染症における原因細菌の検出や同定の分野において、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法を用いる試みがなされてきている。この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、その部分の塩基配列とホモロジーの高い塩基配列が、対象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブリダイゼーション法によって調べ、サンプル中に問題となる細菌が存在するか否かを判定する方法である。
【０００６】
また、近年、核酸の特定配列の新しい検出方法として、ＰＣＲ法も用いられるようになってきている。この方法は、検出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、増幅された特定配列の有無を検出することで、標的核酸の検出が可能となる。ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は向上し、ハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されている。
【０００７】
しかし、ＰＣＲ法では調べたい特定配列が明らかな場合に、その増幅に最適なプライマーを選定することにより、初めて特定配列の有無を調べることができるもので、プライマーが非特異的に標的核酸に結合したり、本来なら増幅されない配列が作製されることが多々ある。また、ある標的核酸中の欠損のような遺伝子異常は、その長さを解析することにより情報を得ることができるが、点突然変異のような長さに変化が現れないような異常に対しては知る術もないという欠点を持つ。
【０００８】
したがって、ハイブリダイゼーション法が完全にＰＣＲ法に置き換えられるというわけではなく、ハイブリダイゼーション法による簡便な遺伝子検出法もやはり必要とされていた。
【０００９】
ハイブリダイゼーション反応では、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとがお互いの相補的な配列の部分で水素結合によりハイブリッド体を形成する。ハイブリダイゼーション反応において、相補的な配列間で正確にハイブリッド体を形成させるためには、反応の温度、イオン強度を最適に選ぶ必要がある。つまり、温度が高すぎると、プローブと相補的配列をもつ核酸とが結合できず、逆に低すぎると、プローブが非特異的に核酸に結合してしまう。さらに、より正確さを期するために、溶液の塩濃度を下げて、或いはまた、溶液の温度を上げて、不安定な水素結合を除き、非特異的に結合したプローブやミスマッチしているプローブを洗い流すことが重要となる。従って、適当な反応条件、洗浄条件の設定には、かなりの試行錯誤が必要になる。
【００１０】
遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマッチをも除去する精度が更に要求される。
【００１１】
ハイブリダイゼーション反応は、従来は標的核酸をニトロセルロースのような担体に固定させた状態で行われてきた。しかし、この方法は極めて操作が煩雑であるため、溶液中でのハイブリダイゼーションのような簡便な方法の開発が期待されてきた。従来のような核酸の固定化を行わない方法における最大の課題は、標的核酸に結合しているプローブと、結合していない過剰なプローブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ分離）というところにある。さらに、この場合にも、上述の固定化核酸を用いたハイブリダイゼーション反応と同様に、プローブの非特異的吸着やミスマッチを除くための適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題となる。
【００１２】
Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブとのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されている（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡプローブを、分析検体中のＤＮＡと接触させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中のＤＮＡに、プローブの塩基配列に対応する塩基配列が存在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一本鎖のプローブに結合させた蛍光物質が、二本鎖になったことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大することがその検出の原理となっている。
【００１３】
ところが、これらの方法では、検体中に蛋白質等の夾雑物が含まれていて、それがプローブＤＮＡに非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバックグランドを上昇させる原因となるため、あらかじめこれらの夾雑物を完全に除去するという煩雑な作業が必要となる。また、プローブＤＮＡの非特異的吸着、及び、塩基のミスマッチによる擬ハイブリッド体は他の溶液系の場合と同様、それをあらかじめ除去する操作が必要である。さらに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプローブ濃度が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変異を測定する上で必要となる。
【００１４】
エネルギ−移動を利用したハイブリッド体検出方法としてＧａｒｄｕｌｌｏは３通りの方法を提案している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５．８７９０−８７９４）。これらはいずれもエネルギー供与体としてフルオレセイン、アクリジンオレンジ、エネルギー受容体としてローダミンを用いたもので、（ｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドとそれに相補的で５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、（ｉｉ）５’をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、（ｉｉｉ）５’をローダミンで標識したオリゴヌクレオチドのアクリジンオレンジ存在下での相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。この方法は、近接する蛍光発色団の励起光と蛍光が重なり合っている場合に、供与体の励起状態エネルギーが近接する受容体に転移される現象であり、その結果として供与体の寿命の減少、供与体の蛍光のクエンチング及び受容体の蛍光強度の増強などが見られる。ハイブリダイゼーションの有無を溶液のまま判定できるという点では一連の煩雑な操作を一挙に省ける点で画期的な方法といえるが、感度的に既存のハイブリダイゼーションに比べて数オーダー低く、実用化のためには蛍光団の改良や検出系の飛躍的な進歩が望まれていた。
【００１５】
また、最近、ＤＮＡの二本鎖に二種類の色素を遊離の状態で混合した時に、これらの色素間でＤＮＡを介した電荷移動が検出されたという報告がある（Ｊ．Ａｍｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，３６５６−３６６０）。それは、蛍光を持つ電子供与体（エチジウムブロマイド、あるいは、アクリジンオレンジ）にそれぞれの励起波長に対応する波長の光を照射すると、もうひとつの色素（電子受容体；Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，７−ｄｉａｚａｐｙｒｅｎｉｕｍｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）存在下では、その蛍光強度が減少するというもので、両色素がインターカレーターと考えられていることから電子がＤＮＡの二重らせんを介して電子供与体から電子受容体の方へ流れているというものである。しかし、その変化の程度は非常に小さいものであり、ハイブリッド体の検出に利用しうるほどの感度ではない。さらに、これらの色素は遊離の状態でも蛍光を有し、蛍光強度の変化を検出しても、バックグランドとしての色素の蛍光を常に考慮する必要がある。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従来のような標的核酸を固定したハイブリダイゼーション法はもちろん、Ｂ／Ｆ分離を必要としない蛍光偏光解消のような方法においても、プローブの非特異吸着やミスマッチの発生を防止する、あるいは発生した非特異吸着やミスマッチを除去するための煩雑な処理が必要である場合が多い。しかも、これらの操作の最適条件はプローブの長さ、或いは、それぞれの塩基配列によって異なるため、それぞれの場合で条件を検討し、設定していく必要がある。特に、ミスマッチしている塩基のプローブ上の位置もハイブリッド体の安定性に影響を与える重要な因子となり、その位置によってはミスマッチしているハイブリッド体を除去できない場合も生じるため、ミスマッチの可能性を考慮して、ハイブリダイゼーション反応の条件を個々のケースに応じて設定するという更に煩雑な作業が必要となる。
【００１７】
電荷移動を利用する溶液中の検出系は、標的核酸を固定する場合や、Ｂ／Ｆ分離を必要とする系に比べて簡便な方法ではあるものの、その感度は非常に低く、実用に供せられるほどのものではない。さらに、従来例で用いられている色素は遊離の状態でも蛍光を有し、蛍光強度の変化を検出しても、それが電子供与体と電子受容体とのＤＮＡを介した相互作用なのか、溶媒による単なるクエンチングなのか、あるいは夾雑物の存在による影響なのか判定することは困難である。また、従来例のように電子供与体及び電子受容体が遊離の状態で存在していると、二重らせんの構造の有無に関係なく、両者間での相互作用が起こってしまい、バックグランドが上昇してＳ／Ｎ比が悪くなるという問題がある。
【００１８】
本発明は、以上のような従来技術における問題に鑑みなされたものであり、遊離の色素による問題を解決するために電子供与体、あるいは電子受容体の少なくとも一方をプローブに結合させ、核酸を介さない相互作用を排除し、ハイブリッド体の検出においてＢ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された工程からなり、良好な測定感度を得ることができる標的核酸の検出方法、及びそれに用いるプローブを提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ミスマッチしているハイブリッド体が存在する場合でも所望のハイブリッド体のみを正確に検出できる標的核酸の検出方法、及びそれに用いるプローブを提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸ハイブリッド体の検出方法は、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物塩が二本鎖核酸を介して電荷移動を起こすことに注目してなされたものであり、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物、及び、ピリリウム化合物以外の試薬物質からなる電子供与体、電子受容体のセットをプローブの少なくとも一方に結合させて、試料溶液中に該プローブを加えて反応させ、該試料溶液中に標的核酸が存在する場合に得られるプローブと標的核酸とのハイブリッド体の二重らせん構造を検出するものである。
【００２１】
本発明の方法は、ハイブリッド体形成にともなう二重らせん構造の形成を検出するものであり、Ｂ／Ｆ分離が不要である。さらに、本発明においては、正確な二重らせん構造のみ検出できる条件を設定することで、非特異吸着やミスマッチが生じていてもそのまま所望の核酸ハイブリッド体の形成が検出可能となり、測定精度を向上させることが可能である。なお、本発明は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションなど核酸が規則的な二重らせん構造を形成する場合に適用される。
【００２２】
更に、試薬物質をプローブに結合することにより、核酸を介さない試薬物質間の相互作用を排除することができ、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。また、遊離の状態と核酸結合時とではその蛍光特性が大きく変化するようなピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物を用いることにより、遊離、あるいはプローブに結合したピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物由来の蛍光のバックグランドを除外できる。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２４】
本発明で利用されるピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物は下記一般式［Ｉ］で表すことができる。
【００２５】
【化５】
0004114958.tif 000002
上記一般式［Ｉ］において、
【００２６】
【化６】
0004114958.tif 000003
は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅである。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げることができる。
【００２７】
Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００２８】
Ｒ3 は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ1 −、−Ｌ2 −Ｌ3 −または−Ｌ4 −Ｌ5 −Ｌ6 −であり、Ｌ1 〜Ｌ6 はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ4 −（Ｒ4 はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００２９】
−Ｌ−としては、下記一般式 [II] 、[III] 、[IV]、 [Ｖ] または[VI]で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００３０】
【化７】
0004114958.tif 000004
（上記一般式[II]中、Ｚは水素原子または置換もしくは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙げることができる。
【００３１】
【化８】
0004114958.tif 000005
（上記一般式[III] 中、ｎは０、１または２であり、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３２】
【化９】
0004114958.tif 000006
（上記一般式[IV]中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３３】
【化１０】
0004114958.tif 000007
【００３４】
【化１１】
0004114958.tif 000008
上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示したものを挙げることができる。
【００３５】
一般式［Ｉ］のＲ3 におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5 （Ｒ5 は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ5 の複素環としては、
【００３６】
【化１２】
0004114958.tif 000009
（Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子または窒素原子を、Ｙ- はアニオンを表わす）等から誘導された基を挙げることができ、その置換基としては、例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げることができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例えば
【００３７】
【化１３】
0004114958.tif 000010
等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げることができる。また、置換もしくは未置換芳香環としてはアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基等を挙げることができる。
【００３８】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００３９】
Ｙ- はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ4-、過塩素酸イオン、ＨＯ3 ＳＣＨ2 ＣＯＯ- 、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００４０】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。
【００４１】
標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬の一方または両方を一般式［Ｉ］の化合物から選択して利用することができる。核酸の検出においては、一般式［Ｉ］の化合物として、インターカレーターとして核酸の二重らせん構造に挿入されるものが好ましい。
【００４２】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3 で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及び６位のいずれかがＲ3 で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3 で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００４３】
電荷移動による変化を検出する場合においては、例えば、一般式［Ｉ］の化合物の中で電子供与性基を有するものが電子供与体として利用できる。そのような化合物としては、ピリリウム環またはピリリウム類似環の置換基を構成するアリール基として、低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等で置換されたアリール基を有するもの等を挙げることができ、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。この置換アリール基は、ピリリウム環あるいはピリリウム類似環に直接置換されていてもよいし、例えば低級アルキル基を置換して、低級アルアルキル基を構成するものでもよい。この電子供与体として利用できる化合物の一例を、後述の表１に示す。これらの化合物の中では、特に２−メチル−４、６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩、または２−メチル−４、６−ビス−（４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム塩を好ましいものとして挙げることができる。
【００４４】
表１の化合物に対して電子受容体となり得る化合物としては、例えば後述の表２に示す化合物を挙げることができる。
【００４５】
しかしながら、表１の化合物が電子供与体で、表２の化合物が電子受容体と規定されるものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれの酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、例えば、表１の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方を、あるいは表２の化合物群の中から電子供与体と電子受容体の両方が選ばれることも十分に有り得る。更に、表１の化合物の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを、表２の性質を示すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電子受容体のセットを設定することも可能である。
【００４６】
更に、電子供与体と電子受容体のセットを他の試薬系から選定し、メディエーター、センシタイザーとしてピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物を用いることも可能である。
【００４７】
エネルギー移動の場合には、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことが最も重要である。両者が二本鎖核酸に挿入される結果、エネルギー供与体とエネルギー受容体が近接することがエネルギー移動を引き起こすと考えられる。したがって、核酸との相互作用様式により供与体と受容体のセットの目安をつけることはできない。しかし、電子供与性基を持つピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物（表１に記載）は二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるので、エネルギー供与体として有利であると推定される。それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。また、エネルギー移動の場合も電荷移動の場合と同様、エネルギー供与体とエネルギー受容体の両方をピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物から選んでもよいし、ピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物とピリリウム化合物以外の試薬物質のセットを選ぶこともできる。
【００４８】
溶液中のハイブリダイゼーション反応の場合には、核酸がある長さで二本鎖を形成すれば、二重らせん構造をとることが期待される。本発明は、ハイブリッド体の有する二重らせん構造を利用して検出可能な変化を起し得る試薬物質を用い、該試薬物質の化学的変化を測定することで二重らせん構造の形成を検出する方法で、試薬物質の少なくともひとつにピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用い、且つ該試薬物質の少なくともひとつがプローブに結合されているような方法である。
【００４９】
ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物は
（ａ）二重らせん構造自体と反応（相互作用）して変化を起すもの、
（ｂ）二重らせん構造を介して相互作用する２種以上の試薬物質のうちの少なくともひとつであって、該相互作用に基づく変化を検出可能なもの
などが利用できる。
【００５０】
（ａ）の試薬物質としてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用いる場合は、プローブに該ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を結合し、該プローブと試料溶液とを反応させ、試料中に標的核酸が含まれている場合に形成するプローブと標的核酸とのハイブリッド体の有する二重らせん構造を、プローブに結合したピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物、あるいは核酸の構成成分の変化によって検出する。ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物と二重らせん構造との反応による変化の検出は、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の変化自体が測定可能である場合には、この変化を測定することで行い、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の変化が検出可能な別の変化を誘導するものであれば、この別の変化を測定することで行う。さらに核酸構成成分の変化を検出する場合には、核酸をヌクレオシドに分解し、直接ＨＰＬＣで分析したり、変化したヌクレオシドに対する抗体を作製し、該抗体等で検出することもできる。
【００５１】
二重らせん構造と相互作用するピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物としては、例えば、二重らせん構造を構成している核酸等の物質と反応して、それ自身が、あるいは核酸の構成成分側が検出可能な化学変化や構造的変異を起こすものや、これらの変化を、反応系に加えた第３の物質との反応により検出可能な変化を誘導して検出する方法が利用できる。
【００５２】
この相互作用としては、例えば、二重らせん構造をとる核酸の構成成分とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物との間の電荷移動などが利用できる。この場合、プローブに結合したピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物は、核酸塩基対に対し電子供与体または電子受容体となり得る物質が利用される。この相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後におけるピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物、核酸の構成成分、または、これらの物質と相互作用しうる第３の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００５３】
この電荷移動に基づく相互作用としては、後述の（ｂ）の試薬物質の場合と同様に、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｎｄの場合とが考えられ、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介した電荷移動や、二重らせん構造への変化に伴うピリリウム化合物或いはピリリウム類似化合物、及び核酸の構成成分である電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく電荷移動が利用できる。
【００５４】
なお、二重らせん構造とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物での電荷移動が起こりにくい場合には、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーとして仂く物質を介在させてもよい。また、ピリリウム化合物以外のものをプローブに試薬物質として結合し、メディエーターあるいはセンシタイザーとしてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を利用することも可能である。
【００５５】
本発明においてはピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造と反応できる位置に配置されて、これらの相互作用が生じる必要がある。ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造と反応可能な位置に配置される方式としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込まれる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置される場合等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であるプローブと標的核酸とによって形成されたハイブリッド体の二重らせん構造に特異的に配置されることが本発明を効果的にするものである。
【００５６】
この場合のピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物としてインターカレーターを用いることは、二重らせん構造との反応をより安定なものとすることができる点でより好ましい。
【００５７】
これらの中では、後述の（ｂ）の場合と同様に、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。
【００５８】
二重らせん構造とピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物の相互作用の変化を検出する方法として、電子供与体の変化を検出する場合と電子受容体の変化を検出する方法がある。電子受容体の変化を検出する方法は、その検出手段に応じていくつかの種類に分類できる。
【００５９】
例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或いは、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、ＥＰＲにおけるスピン解消法も有効な検出手段である。更に、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起こし検出することも可能である。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。
【００６０】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体の変化で相互作用を検出しても良い。そして、基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利用できる。
【００６１】
ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造に対する電子供与体である場合は、これが光によって活性化されて電子を放出し電荷移動が開始される場合のほか、第三の物質として、電子供与体である試薬物質を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。
【００６２】
さらに、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物が二重らせん構造に対する電子受容体である場合は、これを活性化して、それに誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、何らかの開始剤であってもよい。
【００６３】
また、先に述べたように、第三の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーとして仂く物質が介在しても良い。また、試薬物質としてピリリウム化合物以外のものを用いる場合には、メディエーターあるいはセンシタイザーとしてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を利用することも可能である。
【００６４】
（ａ）のプローブに結合するピリリウムまたはピリリウム類似化合物としては、核酸の酸化還元電位に近い酸化還元電位を持つような化合物が利用できる。具体的には、電子供与体としては、表１に示すような電子供与性基を有する化合物、電子受容体としては、例えば、表２に挙げるような化合物が利用できる。しかし、このことは、表１に示す化合物を電子供与体、表２に示す化合物を電子受容体と規定するものではない。核酸の酸化還元電位との相対的な関係で決まるものである。したがって、表１に示す化合物の中から、電子供与体と電子受容体のセットを、表２の化合物の中から電子供与体と電子受容体のセットを選ぶことも十分可能である。このような化合物のなかで、特に、電子供与体としては、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム  アイオダイド、２，６−ジフェニル−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニルピリリウム  アイオダイド、電子受容体としては、２，６−ジフェニル−４−メチルピリリウム  アイオダイド、２，４，６−トリフェニルピリリウム  アイオダイド、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム  アイオダイド、及び、それらのチオピリリウム化合物を挙げることができる。また、電子供与体と電子受容体のセットをピリリウム化合物、及び、ピリリウム類似化合物と他の試薬物質との組み合わせとして選ぶこともできる。
【００６５】
次に、（ｂ）の試薬物質を用いる方法について説明する。この（ｂ）の試薬物質としてピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を用いる方法は、一本鎖から二本鎖、つまり、二重らせんへの構造変化にともない、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を含む二種以上の試薬物質間の電荷移動により起る変化を測定することでハイブリッド体を検出するものである。電荷移動による検出には、ピリリウム化合物またはピリリウム類似化合物を含む二種以上の試薬物質が必要で、その中には、少なくとも電子供与体と電子受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリッド体形成前後における電子供与体、電子受容体、または、これらの物質と相互作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００６６】
電子供与体と電子受容体の相互作用として、いわゆるｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者には、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重らせん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｎｄ）では、核酸を構成する塩基、リン酸部分、或いは、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられる。いずれの場合もそれらの相互作用が、二重らせんを形成したことに由来するものであればその形態はなんら限定されない。
【００６７】
核酸塩基間のスタッキングを介する場合とは、二重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子供与体と電子受容体の距離が本来相互作用できないほど離れている時、電子供与体から放出された電子が、核酸塩基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々隣接する核酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体にまで電子を到達させるというものである。また、逆に、電子受容体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それが連鎖的に行われて最終的に電子供与体から電子が奪い取られるという機能も成り立つ。つまり、核酸塩基対が電荷移動におけるメディエーターとして機能している。
【００６８】
これに対し、電子供与体と電子受容体の近接効果に基づく場合とは、二重らせん構造の形成によって電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用が可能な程度に近くなる場合のことを言う。例えば、電子供与体と電子受容体の両方が存在しても、溶液中でこれらの化合物の距離が十分に離れているような一本鎖の状態のときにはこれらが相互作用を起さないで、標的核酸とハイブリダイズして二重らせん構造が形成されてはじめて電子供与体と電子受容体が近接した場合に、これらの相互作用が生じるように設定すれば、二重らせん構造の形成をこれらの相互作用が生じたかどうかによって検出できる。
【００６９】
なお、二重らせん構造を介した電子供与体と電子受容体の間での電荷移動が起こりにくい場合には、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いはセンシタイザーと称される物質を介在させてもよい。
【００７０】
上記のように、本発明においては電子供与体と電子受容体を二重らせん構造と反応できる位置に配置させ、相互作用が生じさせる必要がある。試薬物質が二重らせん構造と反応可能な位置に配置させる方法としては、インターカレーターのように核酸塩基対の間に入り込ませる場合、二重らせん構造の溝に埋め込ませる場合、または、二重らせん構造に寄り添う形で配置させる等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であるプローブと標的核酸とによって形成されたハイブリッド体の二重らせん構造に特異的に配置させることが本発明にとって本質的に必要なことである。
【００７１】
これらの中で、インターカレーターは、スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有利である。つまり、インターカレーターは、一般には、電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じような距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例えば、電子供与体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由して、一直線に電子受容体に向かって流れ得る。或いは、この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用い、二重らせん構造を挟んだ反対側に電子受容体を配置すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基対から電子を引き抜き、この電子の引き抜きが他の核酸塩基対間に次々と生じて最終的に電子供与体から電子を引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。これらの点を考慮すると、スタッキングを介する電荷移動の場合には、電子供与体、電子受容体のうち、少なくともひとつがインターカレーターであることが好ましく、両者が共にインターカレーターである場合には、さらに電荷移動効率を上げることが可能であるのでより好ましい。また、インターカレーターは二重らせん構造を安定化させ、その融解温度を上昇させることが知られており、電子供与体や電子受容体がインターカレーターであることは、プローブと標的核酸間のハイブリッド体を安定化させるという点でも有利である。
【００７２】
二重らせん形成に伴う二種以上の試薬物質の相互作用の変化を検出する方法として、電子受容体の変化を検出する方法がある。この方法は、その検出手段に応じていくつかの種類に分類できる。電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペクトルの出現、或いは、変化としてとらえることもできる。電荷移動の結果、溶液が着色、変色するような系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失する反応を利用できる。また、電子受容体が電荷移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出するという方法も利用できる。この時、変化した物質に、後から第三の物質を加え、両者の化学反応により化学発光を起こし検出することも可能である。第三の物質として酵素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光による検出方法が利用できる。
【００７３】
検出方法として、電子受容体の変化の他に、電子供与体の変化を検出して、相互作用を検出しても良い。そして、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられる方法のほとんどがそのまま適用できる。蛍光物質を電子供与体として用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の量子収率が減少するものを用いて、蛍光消光のような直接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさらにいくつかの反応と組み合わせて可視化する方法も利用できる。
【００７４】
本発明では、電子供与体が光等によって活性化されて電子を放出し電荷移動が開始する場合のほか、第三の物質として、電子供与体を刺激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。
【００７５】
さらに、電子受容体の方を活性化して、それに誘起されて電子が電子受容体から引き抜かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、何らかの開始剤があってもよい。
【００７６】
また、先に述べたように、電子供与体、電子受容体の他に、第三の物質として、電荷移動を仲介するようなメディエーター、或いは、センシタイザーと称される物質が介在しても良い。そして、これらの物質が二重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合していない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良い。
【００７７】
上述してきたような本発明の（ｂ）の方法で用いる試薬物質として、電子供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物としては表１に挙げるような化合物、電子受容体としては表２に示した化合物を挙げることができる。しかし、このことは、表１に示す化合物を電子供与体、表２に示す化合物を電子受容体と規定するものではない。電子供与体と電子受容体はそれぞれ酸化還元電位等により相対的に決まるものであり、一義的には決められない。したがって、表１に示す化合物の中から、電子供与体と電子受容体のセットを、表２の化合物の中から電子供与体と電子受容体のセットを選ぶことも十分可能である。このような化合物の中で、特に、電子供与体としては、２，４-ビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニル）-６-メチルピリリウム  アイオダイド、２，６-ジフェニル-４-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニルピリリウム  アイオダイド、電子受容体としては、２，６-ジフェニル-４-メチルピリリウム  アイオダイド、２，４，６-トリフェニルピリリウム  アイオダイド、２，６-ビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノフェニル）-４-フェニルピリリウム  アイオダイド、及び、それらのチオピリリウム化合物を挙げることができる。
【００７８】
ピリリウム以外の試薬物質としては、スピンラベル化剤として、例えば、４，４-Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ-Ｎ-ｏｘｙｌ（ＤＤＸＸＬ）または、その誘導体、２，２，５，５-Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ-Ｎ-ｏｘｙｌ（ＰＲＯＸＬ）または、その誘導体を挙げることができる。
【００７９】
蛍光性インターカレーターとしてはそれぞれの誘導体を含み、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポリフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）等を挙げることができる。
【００８０】
また、他の一般的な蛍光色素としてはそれぞれの誘導体を含み、シアニン、アズレン、三核色素、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン、リボフラビン等を挙げることができる。
【００８１】
電子受容体と電子供与体の関係は、両者の酸化還元電位の関係で決まるものである。従って、本発明においては、電子供与体または電子受容体として一般に定義された物質が、その定義のとおりに用いられるのではなく、２種以上の試薬物質の個々の組合せにおいて、電子供与体及び電子受容体となり得る物質を適宣選択して用いる。
【００８２】
また、ピリリウム化合物、あるいはピリリウム類似化合物を電子供与体、あるいは、電子受容体として用いるのではなく、センシタイザーとして利用することも可能である。
【００８３】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合には二種以上の試薬物質には、少なくともエネルギー供与体とエネルギー受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互作用は、例えばハイブリット体形成前後におけるエネルギー受容体、エネルギー供与体、または、これらの物質と相互作用しうる第三の物質の化学構造の変化、電子状態の変化、或いはまた、変化した物質に由来する信号の変化として検出される。
【００８４】
相互作用としてエネルギー移動を利用する場合にはエネルギー供与体の蛍光強度の減少、エネルギー受容体の蛍光強度の増大によりハイブリッド体を検出することができる。このような場合には二本鎖形成に伴って、プローブ上のエネルギー供与体とエネルギー受容体の距離が一本鎖の場合より距離が短くなり、相互作用が可能になってエネルギー移動が起こると考えられる。
【００８５】
エネルギー移動開始剤としては光が主に利用される。
【００８６】
エネルギー移動に用いられる試薬物質としては、エネルギー供与体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことを目安に選択することができる。ピリリウム化合物の中で、電子供与性基を持つピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物（表１に記載）は二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、励起状態が安定であると考えられるので、エネルギー供与体として有利であると推定される。そして、それぞれの蛍光エネルギーレベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好ましい。このようなエネルギー供与体、あるいは、エネルギー受容体となるような試薬物質の例を挙げると、蛍光性インターカレーターとしてはそれぞれの誘導体を含み、アクリジン、アントラセン、ピレン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポルフィリン、チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾールイエロー（ＹＯＹＯ）等を挙げることができる。
【００８７】
また、他の一般的な蛍光色素としてはそれぞれの誘導体を含み、シアニン、アズレン、三核色素、ダンシル、フルオレセイン、エオシン、ローダミン、リボフラビン等を挙げることができる。
【００８８】
これら電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体を本発明で用いる場合、電子供与体及び電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の、これらの一方または両方が反応系で何も結合していないフリーな状態で存在していると、二重らせん構造の有無に関係なく、両者間での相互作用が起こってしまい、バックグランドが上昇してＳ／Ｎ比が悪くなることがあるので、これらの一方または両方をプローブに結合させて用いるのが正確な検出をする上で好ましい。電子供与体や電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のプローブへの結合は、必要に応じて、例えば、（ＣＨ2 ）n のようなリンカーを介して行い、その際これらの相互作用が最も効率よくなされるようにこれらの位置関係等を配慮する。
【００８９】
最も望ましい形態としては、電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の両方がプローブに結合している場合であり、その場合には、相互作用する試薬物質間の位置関係が明瞭となるため、その相互作用の制御をプローブでのこれらの位置関係によって行うことができるので有利である。この場合、電子供与体を電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のプローブ上での距離は、用いる電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、近接効果を利用する場合には、電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の距離は、ハイブリッド体である二重らせん構造形成時に２０〜１２０オングストロームであることが好ましく、５０〜８０オングストロームであることがより好ましい。また、二重らせん構造を介した電荷移動を行う場合には、これらの距離は、それぞれの試薬物質が引き起こすＤＮＡの巻き戻し等の構造変化を考慮することが重要であり、その範囲は２０〜１２０オングストロームであることが好ましい。しかし、この距離は電子供与体と電子受容体が共にインターカレーターの場合、及び、どちらか一方あるいは共に主溝や副溝に入り込む場合とでは異なり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。ただし、短すぎる時には、核酸との相互作用を介さずに、電子供与体と電子受容体間での電荷移動が起こるため、より好ましくは、５０〜８０オングストロームであるといえる。
【００９０】
尚、プローブの長さは、標的核酸との良好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した二重らせん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選択される。電子供与体と電子受容体或いはエネルギ供与体、エネルギー受容体の両方をプローブに結合させる場合でこれらが近接していると二重らせん構造の存在しない場合でも相互作用を起こし得るものである場合には、両者の距離を考慮してプローブ長は決定されるが、その長さは、例えば、８塩基長以上、好ましくは１２塩基長以上とされる。
【００９１】
しかしながら、二重らせん構造の安定化には、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列ではより安定な二重らせん構造が形成される。また、ＫＣｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。また、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与する。従って、これらの安定化因子を適宜利用することによって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能である。
【００９２】
また、電子供与体、あるいは、電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体の性質もプローブ選定上考慮しなければならない因子である。これらの試薬物質がインターカレーターである場合、二重らせんのどの配列にも同じ確率では入り込むのではなく、Ｇ−Ｃ塩基対を好むものと、Ａ−Ｔ塩基対を好むもの等それぞれの試薬物質によりその性質は異なる。したがって、プローブの配列の選定にはプローブと標的核酸とで構成される二重らせんの安定性のほかに、このような試薬物質の性質を加味することが重要である。
【００９３】
電子供与体と電子受容体との相互作用に基づく変化は、不可逆的なものであることが望ましい。すなわち、検出に供せられる電子供与体、或いは、電子受容体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積して検出することも可能であり、その場合感度の点で有利である。
【００９４】
電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体を本発明で用いる形態としては、一方のみプローブに結合している場合には、
ａ）プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時にもう一方も反応系に存在させておき、形成後相互作用を起こさせても、
ｂ）プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成後にもう一方を反応系に添加して、相互作用を起こさせてもよい。
【００９５】
両方ともプローブに結合している場合には、プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる際に、すでに両方とも反応系中に存在しており、二重らせん構造の形成後、相互作用を起こさせることとなる。
【００９６】
プローブに電子供与体と電子受容体或いはエネルギー供与体、エネルギー受容体のセットであるピリリウム化合物、あるいは、ピリリウム類似化合物を含む試薬物質を結合させる形態として、本発明では、
ａ）プローブの一方に電子供与体或いはエネルギー供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を結合させ、二重らせんと特異的に相互作用するような電子受容体、エネルギー受容体を遊離の状態で加えても、
ｂ）プローブの一方に電子受容体或いはエネルギー受容体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を結合させておき、二重らせんを特異的に相互作用するような電子供与体、エネルギー供与体を遊離の状態で加えても、
ｃ）プローブの一方に電子供与体又はエネルギー供与体である試薬物質を結合させておき、二重らせん構造特異的に相互作用するような電子受容体又はエネルギー受容体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を遊離の状態で加えても、
ｄ）プローブの一方に電子受容体、エネルギー受容体である試薬物質を結合させておき、二重らせん構造特異的に相互作用するような電子供与体、エネルギー供与体であるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物を遊離の状態で加えても、
ｅ）電子供与体と電子受容体、エネルギー供与体とエネルギー受容体のセットである２種類のピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物の両方をプローブに結合させても、
ｆ）電子供与体と電子受容体、エネルギー供与体とエネルギー受容体のセットであるピリリウム化合物あるいはピリリウム類似化合物と他の試薬物質の組みの両方をプローブに結合させてもよい。
【００９７】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
［１］２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート［化合物ａ］の合成
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更に７０％過塩素酸水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）から再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート［化合物ａ］を得た。
【００９８】
［２］スピンラベル化剤であるＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）を結合させた２０量体オリゴヌクレオチドプローブの作製
（１）４−アミノヘキシルアミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル（４−アミノヘキシルアミノ−ＴＥＭＰＯ）の合成
４−オキソ−ＴＥＭＰＯの０．５ｍｍｏｌｅとヘキサメチレンジアミン二塩酸塩５ｍｍｏｌｅをメタノール３０ｍｌに溶解し、これにシアノ化ホウ素ナトリウム０．４ｍｍｏｌｅ、モレキュラーシーブ３Ａを加えて室温下２４時間攪拌して反応させた。次に、反応溶液をグラスフィルターで濾過しモレキュラーシーブを除去し、続いて濾液から溶媒を減圧下で除去した。次に得られた残留物に１Ｎ塩酸３０ｍｌを加えて溶解した後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で洗浄後、減圧下でクロロホルムを減圧下で留去した。得られた残留物に水を加え不溶物を濾過して得た濾液を再度減圧下で溶媒を留去し赤色の油状物を得た。
【００９９】
（２）オリゴヌクレオチドの合成
標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ  ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。５′未満ジメトキシトリチル基は自動合成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりである。
【０１００】
５′−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′
（３）スピンラベルオリゴヌクレオチドプローブの合成
上記（２）の工程で、合成したオリゴヌクレオチド（１μｍｏｌｅ）をＣＰＧサポートに結合させたままガスタイトシリンジに移した。以下の反応はシリンジ内で行なった。ＣＰＧサポートにカルボニル−Ｎ，Ｎ′−ジイミダゾール（ＣＤＩ）５０ｍｇを溶解したジオキサン１ｍｌを加え室温下１時間放置した。ジオキサンで洗浄後減圧乾燥し、続いて４−アミノヘキシルアミノ−ＴＥＭＰＯのＤＭＳＯ溶液（０．２Ｍ  ０．４ｍｌ）を加え５５℃で２４時間放置した。ＤＭＳＯ、ジオキサン、メタノールの順で洗浄し減圧乾燥した。
【０１０１】
常法に従って濃アンモニア水によるスピンラベルオリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護を行ないＲＰＬＣによって精製した。
【０１０２】
［３］ＴＥＭＰＯプローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［２］で作製されたＴＥＭＰＯが導入されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。次に、この反応液に化合物ａを最終濃度５μＭになるように加え、以下に示すＥＳＲスペクトルの測定に供した。また、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡを用いずに上記と同様の操作を行い、ＥＳＲスペクトルの測定用のサンプル（プローブ単独）を得た。
【０１０３】
［４］ＥＳＲスペクトルの測定
ＥＳＲ測定は一つのサンプルにつき２０分間隔でスイープし、それを１００分間にわたって続けた。そして、強度比、および、線幅の時間変化を追った。ＥＳＲは日本電子社製、測定には、人工石英の扁平セルを用いた。
【０１０４】
ＥＳＲおよび光照射装置は以下の設定で行なった。
【０１０５】
0004114958.tif 000011
光照射装置
モノクロメーター    ５８０ｎｍ
Ｐｏｗｅｒ  ｓｕｐｐｌｙ    ８８．５Ｖ−８９Ｖ／２２Ａ
図１にＥＳＲシグナル強度比の経時変化、線幅の経時変化を示す。図１からわかるように、プローブ単独の場合には、光照射しても強度比及び線幅に変化は見られなかった。また、化合物ａ／プローブ／Ｍ１３ｍｐ１８の場合にも、光照射しなかった場合には、強度比、線幅に変化は見られなかった。
【０１０６】
これに対し、化合物ａ／プローブ／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに化合物ａとＤＮＡとが結合した時の吸収極大値である５８０ｎｍの光を照射した場合、時間と共にＥＳＲの強度比は減少した。また、線幅に変化が観測されなかったことから、ＥＳＲでの強度変化が化学変化によるものではないといえる。従って、プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡによって形成された二重らせん構造を介して化合物ａからプローブに結合させたＴＥＭＰＯへ電荷が移動した結果、ＴＥＭＰＯのスピンが解消されたことが確認された。つまり、Ｂ／Ｆ分離なしに、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体が検出できたことになる。
実施例２  ＨＰＬＣによる核酸塩基の変化の検出
［１］３′末端に化合物ａが結合したプローブの作製
（１）化合物ａのエステル化
化合物ａ４．３ｇ、カルボキシベンツアルデヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈殿を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、２−（４−カルボキシスチリル）−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート、［化合物ｂ］を得た。
【０１０７】
化合物ｂ１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌する。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈殿を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥する。得られた活性エステル体［化合物ｃ］をそのまま核酸との反応に用いた。
【０１０８】
（２）オリゴヌクレオチドの合成
実施例１と同様の配列を持つオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成機で合成した。オリゴヌクレオチドにはその有効な配列のほかに、後に、電子供与体、あるいは、電子受容体を結合させるためのリンカーとして５′末端にチオールリンカー、３′末端にアミノリンカーを結合させた。リンカーの結合にはそれぞれグレンリサーチ社の試薬５′チオール−モディファイヤー  Ｃ６、及び、アミノ−モディファイアー  ｄＴを用いた。ＣＰＧサポートからの切り出し、脱保護、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製は同社指定の方法により行なった。
【０１０９】
（３）化合物ｃとオリゴヌクレオチドとの反応
（２）で合成したオリゴヌクレオチド（１０Ｄ260 ）を含む０．８ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ｐＨ＝７．０）に化合物ｃ１ｍｇを含むアセトニトリル溶液０．２ｍｌを加え４０℃で２４時間放置した。ファルマシア社製ＮＡＰカラムで粗精製の後ＨＰＬＣで精製し、３′末端に化合物ａが結合したプローブ［化合物ｄ］を得た。
【０１１０】
［２］ハイブリッド体の吸収スペクトル
次に、この反応液の吸収スペクトルを測定した。３′末端標識プローブ［化合物ｄ］のみの吸収極大は、化合物ａの吸収極大である５４０ｎｍを示したが、プローブ・Ｍ１３ｍｐ１８のハイブリッド体は、吸収極大が５８０ｎｍにシフトした。このことは、化合物ａがインターカレーターであることを示すものである。
【０１１１】
［３］ハイブリッド体への光照射
そこで、励起波長として５８０ｎｍの可視光を、キセノンランプにバンドパスフィルターを組み合わせて照射した。照射時間は５分から５分間隔で２０分まで変化させた。
【０１１２】
［４］ＨＰＬＣによるヌクレオシド分析
光照射後のサンプルにＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅIII （宝酒造社製）、及び、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を加えて３７℃にて反応させ、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体の二本鎖部分を分解してヌクレオシドにした。
【０１１３】
次に、ヌクレオシドをＨＰＬＣにて分離した。逆相系のカラム（Ｗａｃｏｓｉｌ  和光純薬社製）を使用し、１０ｍＭトリエチルアミンアセテート溶液を含むメタノールのグラジエント（１０−４０％）にて溶出した。
【０１１４】
保持時間１０分以内にデオキシヌクレオシド４種（ｄＡ，ｄＧ，ｄＣ，ｄＴ）はすべて溶出された。そのほかに、１３分に２５０ｎｍ、１９分に２８０ｎｍの吸収極大を持つ未知のピークが検出された。更に、その量は１０分までは照射量に比例して増大し、その後は一定となった。
【０１１５】
対照実験として、未標識プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体の溶液についても同様の実験を行った。照射するキセノンランプの照射時間を５分から２０分まで変化させて測定したが、これらの２つのピークは観測されなかった。未標識プローブと標識プローブとのＨＰＬＣのピーク強度の比較から、この未知のヌクレオシドはＧ−Ｃ塩基対が変化したものと考えられた。
【０１１６】
また標識プローブを用いても、ハイブリッド体に光照射を行わなかったサンプルではやはりこの２つのピークは見られなかった。
実施例３  標識抗体との電荷移動によるハイブリッド体の検出
［１］標識抗体の作製
（１）抗体の作製
実施例２で得られた未知化合物２種を抗原として、常法に従いマウスを用いて抗体を作製した。
【０１１７】
（２）４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートの合成
Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｅ］を合成した。
【０１１８】
（３）抗体の標識
化合物ｅ４．３ｇ、カルボキシベンツアルデヒド２ｇ、７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還流した後、析出した沈殿を集め、上記エタノール／エーテルの混合系から再結晶させて、４−（４−カルボキシスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｆ］を得た。
【０１１９】
化合物ｆ１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌する。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈殿を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥する。得られた活性エステル体［化合物ｇ］を抗体のアミノ基と反応させて、標識抗体を作製した。
【０１２０】
［２］ハイブリッド体の検出
実施例２で作製した３′末端に化合物ａが結合したプローブ［化合物ｄ］とＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体に５８０ｎｍの可視光を１０分間照射した。このハイブリッド体に［１］で作製した標識抗体を反応させた。
【０１２１】
このサンプルに再び、５８０ｎｍの可視光を照射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観測した。その結果、標識抗体を反応させる前に観測された６４０ｎｍの蛍光は消光し、かわりに４５０ｎｍに新たに、蛍光が現れた。このことは、ハイブリッド体に挿入された化合物ａと標識抗体上の化合物ｅの間で、電荷移動が起こったものと考えられる。
実施例４  ２種のピリリウム色素を結合したプローブによるＤＮＡハイブリッド体の検出
［１］３′末端に化合物ａ、５′末端に化合物ｅが結合したプローブの作製
（１）化合物ｅのスチリル化
上記化合物ｂの合成法と同じ方法により化合物ｅと、４−アミノベンツアルデヒドから、４−（４−アミノスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレートを合成した［化合物ｈ］。
【０１２２】
無水マレイン酸１９６ｍｇを１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、化合物ｈ４５０ｍｇのクロロホルム溶液２ｍｌを加えた後１時間室温化で攪拌した。混合液を１５℃まで冷却し析出した沈殿を集めた。このマレイン酸付加物中間体［化合物ｉ］をそのまま次の反応に用いた。
【０１２３】
無水酢酸１０ｍｌに酢酸ナトリウム（無水）１ｇを加え溶解し、続いて化合物ｉ２５０ｍｇを加え激しく攪拌して溶解させた後、９０℃で３０分間攪拌を続けた。混合溶液を室温まで冷却し２０ｍｌ氷水に注ぎ、析出物を集め水で３回洗った後乾燥した。エタノールから再結晶して、４−（４−マレイミジルスチリル）−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート［化合物ｊ］を得た。
【０１２４】
（２）化合物ｈのオリゴヌクレオチドの５′末端への導入反応
３′末端に化合物ａが結合したオリゴヌクレオチド［化合物ｄ］を含んだ０．８ｍｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ｐＨ＝７．０）に化合物ｊ１ｍｇのアセトニトリル溶液０．２ｍｌを加え４０℃で２４時間放置した。ファルマシア社製ＮＡＰカラムで粗精製の後ＨＰＬＣで精製した。これにより両末端ピリリウム色素標識オリゴヌクレオチドプローブ［化合物ｋ］を得た。
【０１２５】
［３］５′末端に化合物ｊが結合したプローブの作製（対照実験用）
両末端標識プローブ作製法と同様にして、３′末端に化合物ａが結合していないオリゴヌクレオチドを用いて、５′末端だけが化合物ｅで標識されたプローブを作製した［化合物ｌ］。
【０１２６】
［４］両末端標識プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の形成反応
上記［２］で作製された両末端に電子供与体と電子受容体が結合されたオリゴヌクレオチドプローブの０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＫＣｌ中で８０℃に加熱し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。
【０１２７】
［５］蛍光スペクトルの測定
次に、この反応液に化合物ａがＤＮＡに結合した時の吸収極大値である５８０ｎｍの可視光を、キセノンランプにバンドパスフィルターを組み合わせて照射した。蛍光の測定には大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて行った。
【０１２８】
化合物ｌとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体は、いずれの領域にも蛍光を持たなかった。それに対し、化合物ｋとＭ１３ｍｐ１８とのハイブリッド体は化合物ａに由来する６４０ｎｍの蛍光が消失し、代わりに４５０ｎｍに蛍光が出現した。このことは、化合物ａから化合物ｅに電荷が移動したものと考えられる。
【０１２９】
このスペクトルを図２に示す。
実施例５  １種のピリリウム色素を結合したプローブによるＤＮＡハイブリッド体の検出
実施例１と同様な方法により３′末端に化合物ａが結合したプローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体を作製した。これに、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−４−フェニルピリリウム  アイオダイド［化合物ｍ］を最終濃度が５μＭとなるように加えた。
【０１３０】
あらかじめ、化合物ｍとＤＮＡとの相互作用を調べた。化合物ｍは遊離の状態とＤＮＡ溶液中では、化合物ａと同様、吸収スペクトルの長波長変化を示し、インターカレーターと思われるが、その蛍光はＤＮＡ溶液中でも小さい。
【０１３１】
プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体に化合物ａの励起波長である５８０ｎｍの光を照射したところ、化合物ａがＤＮＡと相互作用して発する６４０ｎｍの蛍光は消光し、７２０ｎｍにあらたに蛍光が出現した。これは、化合物ａから化合物ｍへのエネルギー移動がおこったためと考えられる。
【０１３２】
【表１】
0004114958.tif 000012
【０１３３】
【表２】
0004114958.tif 000013
【０１３４】
【表３】
0004114958.tif 000014
【０１３５】
【表４】
0004114958.tif 000015
【０１３６】
【表５】
0004114958.tif 000016
【０１３７】
【表６】
0004114958.tif 000017
【０１３８】
【表７】
0004114958.tif 000018
【０１３９】
【表８】
0004114958.tif 000019
【０１４０】
【表９】
0004114958.tif 000020
【０１４１】
【表１０】
0004114958.tif 000021
【０１４２】
【表１１】
0004114958.tif 000022
【０１４３】
【表１２】
0004114958.tif 000023
【０１４４】
【表１３】
0004114958.tif 000024
【０１４５】
【表１４】
0004114958.tif 000025
【０１４６】
【表１５】
0004114958.tif 000026
【０１４７】
【表１６】
0004114958.tif 000027
【０１４８】
【表１７】
0004114958.tif 000028
【０１４９】
【表１８】
0004114958.tif 000029
【０１５０】
【表１９】
0004114958.tif 000030
【０１５１】
【表２０】
0004114958.tif 000031
【０１５２】
【表２１】
0004114958.tif 000032
【０１５３】
【表２２】
0004114958.tif 000033
【０１５４】
【表２３】
0004114958.tif 000034
【０１５５】
【表２４】
0004114958.tif 000035
【０１５６】
【表２５】
0004114958.tif 000036
【０１５７】
【表２６】
0004114958.tif 000037
【０１５８】
【表２７】
0004114958.tif 000038
【０１５９】
【表２８】
0004114958.tif 000039
【０１６０】
【表２９】
0004114958.tif 000040
【０１６１】
【表３０】
0004114958.tif 000041
【０１６２】
【表３１】
0004114958.tif 000042
【０１６３】
【表３２】
0004114958.tif 000043
【０１６４】
【表３３】
0004114958.tif 000044
【０１６５】
【表３４】
0004114958.tif 000045
【０１６６】
【表３５】
0004114958.tif 000046
【０１６７】
【表３６】
0004114958.tif 000047
【０１６８】
【表３７】
0004114958.tif 000048
【０１６９】
【発明の効果】
本発明の標的核酸の検出方法は、Ｂ／Ｆ分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で不可欠であった過剰なプローブの除去、非特異吸着を除くための煩雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が不要となった。
【０１７０】
更に、正確なハイブリッド体でのみ信号変化が観測されるように試薬物質を選択することで、反応系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な二重らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出することが可能となる。
【０１７１】
また電子供与体、エネルギー供与体として用いるピリリウム或いはピリリウム類似化合物は、プローブに結合された一本鎖状態、或いは、遊離状態で用いる場合に、無蛍光であるという特徴があるため、従来の検出試薬に比べ高感度な検出が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の［４］におけるＥＳＲスペクトルを示す図
【図２】実施例４の［５］における蛍光スペクトルを示す図
【図１】
0004114958.tif 000063
【図２】
0004114958.tif 000064