(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ下記式（１）で表されるシアンヒドリンを対応するアミドに変換する能力を有する微生物であって、ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ｃｒ４株（生命研条寄第６５９６号）又はロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ａｍ８株（生命研条寄第６５９５号）である微生物。
【化１】
0004185607.tif 000009
（式中、Ｒ１は炭化水素基又は複素環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい）
【請求項２】
請求項１記載の微生物又はその処理物を下記式（１）で表されるシアンヒドリンに作用させ、対応するアミドに変換させるアミド化合物の製造方法。
【化２】
0004185607.tif 000010
（式中、Ｒ１は炭化水素基又は複素環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい）
【請求項３】
シアンヒドリンがメチルチオ基を有するα−シアンヒドリンである請求項２記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項４】
シアンヒドリンが２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルである請求項２記載のアミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニトリルからアミドを得るのに有用な微生物、及びその微生物を用いたアミド化合物の製造方法に関する
【０００２】
【従来の技術】
アミド及びその誘導体は、様々な分野で利用される有用な化合物であり、例えば、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドを加水分解して得られる２−ヒドロキシ−４−酪酸は、家畜、特に家禽の飼育に、含硫アミノ酸類の不足を補う目的で添加される飼料添加物として利用されている。
【０００３】
近年、微生物又は微生物より抽出した酵素の作用を利用して、ニトリルからアミドを生産する方法が提案されている。微生物としては、例えば、バチルス（Bacillus）属、バクテリジューム（Bacteridium ）属、ミクロコッカス（Micrococcus ）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物（特公昭６２−２１５１９号公報）、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）属、ノカルジア（Nocardia）属に属する微生物（特公昭５６−１７９１８号公報）、シュードモナス（Pseudomonas ）属に属する微生物（特公昭５９−３７９５１号公報）、ロドコッカス（Rhodococcus ）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物（特開昭６１−１６２１９３号公報）、フサリウム（Fusarium）属に属する微生物（特開昭６４−８６８８９号公報）、アシネトバクター（Acinetobacter ）属に属する微生物（特開平２−１５４６９２号公報）などが提案されている。
【０００４】
また、ニトリルからアミドを生成する方法として、キサントバクター（Xanthobacter）属を用いる方法( 特開平２−１５４６９２号公報）、クレブシエラ（Klebsiella）属を用いる方法（Arch.Microbiology ，Vol ．156   ｐ．231 −238(1991））、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア(Erwinia) 属、ツカムレア(Tukamurella) 属、ゴルドナ（Gordona ）属、モルガネラ（Morganella）属、プロテウス（Proteus ）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、ミクロアスカス（Microascucs ）属、キャンディダ（Camdida ）属、パントエア（Pantoea ）属を用いる方法（特開平５−１５３８４号公報）、シトロバクター（Citrobacter ）属を用いる方法（特開平５−３０９８３号公報）、リゾビウム（Rhizobium ）属を用いる方法（特開平５−２３６９７７号公報）、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属を用いる方法（特開平６−１４７８６号公報）などが知られている。しかし、これらの方法は、いずれも生産性が低く、工業的に効率よくアミドを生成させることが困難である。
【０００５】
特開平４−４０８９９号公報には、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルから２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドを製造する方法に関して、ロドコッカス（Rhodococcus ）属、コリネバクテリウム（Coynebacterium）属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属の微生物を用いることが開示されている。この文献の実施例には、ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous ）ＡＴＣＣ  ３３２７８が反応４０時間で４００ｍＭの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルから２−ヒドロキシ−4 −メチルチオ酪酸アミドを最大２５３ｍＭ（濃度３７．７ｇ/ Ｌ、収率６３％）生成することが記載されている。しかし、この方法では、アミド生産速度が１ｇ/ Ｌ・ｈｒ以下と極めて低く、生産効率及び経済性を向上できない。
【０００６】
また、ＷＯ９８/ ３２８７２には、ロドコッカス（Rhodococcus ）属  strain５２及び５６ｗｔが２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルから２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドを生産することが記載され、生産方法の詳細も記載されている。しかし、この方法では反応開始後一時間以内の菌体の比活性が乾燥菌体１ｇ当たり１００μｍｏｌ/ ｍｉｎ・ｇ- ｄｒｙｃｅｌｌと極めて低く、生産効率の改善が未だ不十分である。
【０００７】
なお、一般に、微生物の水和活性及びアミドへの変換効率は、ニトリルの構造が複雑化するほど小さくなる。そのため、構造が複雑なニトリルから高い効率及び速度でアミドを生成させることが困難である。
【０００８】
【本発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ニトリルから対応するアミドを効率よく高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物及びそれを用いたアミド化合物の製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ニトリルの構造が複雑であっても、高い生産速度でアミドを生成できる新規な微生物及びそれを用いたアミド化合物の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するため鋭意検討の結果、ニトリルからアミド化合物を高い生産性で生成する能力を有する新種の微生物を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の微生物は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を含む新種の微生物である。この微生物は、通常、ニトリルをアミドに変換する能力を有している。前記微生物はロドコッカス（Rhodococcus ）属に属する微生物、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ．Ｃｒ４株（生命研条寄第６５９６号）、ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ．Ａｍ８株（生命研条寄第６５９５号）などであってもよい。さらに、本発明には、前記微生物又はその処理物をニトリルに作用させアミドに変換させるアミド化合物の製造方法も含まれる。前記ニトリルは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルなどのシアンヒドリンなどであってもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列を含み、機能（ニトリルからアミドを生成する機能）が共通する微生物である限り、野生株、変異株、又は細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００１３】
前記塩基配列を有する微生物は、多数のニトリル分解菌を土壌より分離することにより得ることができる。特にニトリルからアミドへの変換能力の高い菌株としてロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株及びロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ａｍ８株が例示できる。これらの微生物は、それぞれ、生命研条寄第６５９６号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５９６号）、生命研条寄第６５９５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５９５号）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株は岡山県岡山市の畑土より採取した土壌から分離された菌株である。この菌株の分離方法としては選択培地での培養による集積法を用いた［選択培地の組成：ペンテンニトリル  ０．１ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．４ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０１ｇ、ビタミン混液０．１ｍｌ、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ  ０．１ｍｇ、ＦｅＳＯ4   ０．１ｍｇ、蒸留水  １００ｍｌ、ｐＨ６．０］。なお、前記ビタミン混液の組成は、蒸留水１リットル中：ビオチン  １００ｍｇ、パントテン酸カルシウム  ２０ｍｇ、イノシトール  １００ｍｇ、ニコチン酸  ２０ｍｇ、ピリドキシン  ＨＣｌ  ２０ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸  １０ｍｇ、リボフラビン  １０ｍｇ、葉酸  ０．５ｍｇであった。
【００１４】
また、ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ａｍ８株は岐阜県岐阜市の水田より採取した土壌から分離された菌株である。この菌株の分離方法としては、前記Ｃｒ４株と同様に前記組成の培地による集積法を用いた。
【００１５】
前記菌株は、双方ともに好気性のグラム陽性の桿菌であり、細胞壁組成にメソジアミノピメリン酸を含み、ミコール酸組成がＣ40-48 であった。このような菌学的性質より、前記両菌株は、バージェイの細菌分類書（Bergey's  manual  of  determinative   bacteriology,   ninth   edition ，１９９４）に従って、ロドコッカス（Rhodococcus ）属に属する微生物であることが明らかとなった。
【００１６】
また、前記両菌株について、１６Ｓ  リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を決定した。この塩基配列は、具体的には、前記両菌株よりＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応する１６ＳｒＤＮＡの塩基を慣用のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって増幅し、シークエンサーにより決定した。両菌株から得られた塩基配列は全く同一であった。決定された塩基配列を配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。さらに、得られた塩基配列に基づいてデータベース検索を行い、前記両菌株と類縁菌との相同性を調べた。その結果を表１及び２に示す。
【００１７】
【表１】
0004185607.tif 000002
【００１８】
【表２】
0004185607.tif 000003
【００１９】
さらに、前記相同性の結果に基づいて系統樹を作成した。結果を図１に示す。
前記両菌株の塩基配列は、表１及び２に示すように、ロドコッカス（Rhodococcus ）属の他の種とは９９．３％以下の相同性を示した。従って、前記両菌株は全く新種の微生物であることが明らかとなった。
【００２０】
前記微生物は、ニトリルからアミド化合物を生成させるのに有用である。
ニトリルは、特に制限されず、広い範囲のニトリル化合物から選択できる。代表的なニトリルは、例えば、式ＲＣＮ又はＲＣＯＣＮで表わすことができる（式中、Ｒは脂肪族炭化水素基、脂環族炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基を示し、これらの基はさらに置換基を有していてもよい）。ニトリルには、ポリニトリル類も含まれる。すなわち、前記脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基は一価の基に限らず、二価以上の多価基であってもよい。
【００２１】
前記脂肪族炭化水素基には、例えば、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル基などのＣ1-12アルキル基、好ましくはＣ1-6 アルキル基など）、前記アルキル基に対応するアルキレン基（Ｃ1-12アルキレン基など）などの飽和脂肪族炭化水素基；アルケニル基（ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニルなどのＣ2-12アルケニル基など）、前記アルケニル基に対応する２価の基、アルキニル基（エチニル、２−プロピニルなどのＣ2-12アルキニル基など）などの不飽和脂肪族炭化水素基などが含まれる。
【００２２】
脂環族炭化水素基には、シクロアルキル基（例えば、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル基などのＣ3-10シクロアルキル基など）、前記シクロアルキル基に対応するシクロアルキレン基などの飽和脂環族炭化水素基；シクロアルケニル基（シクロペンテニル、シクロヘキセニル基などのＣ3-10シクロアルケニル基など）、前記シクロアルケニル基に対応する２価の基などの不飽和脂環族炭化水素基などが含まれる。
【００２３】
芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル、ナフチルなどのＣ6-14アリール基、前記アリール基に対応するアリーレン基などが例示できる。
複素環基には、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択された少なくとも１つの原子をヘテロ原子として含む複素環基が含まれる。複素環基は、芳香族性複素環基、非芳香族性複素環基、縮合複素環基のいずれであってもよい。
【００２４】
前記複素環基に対応する複素環としては、例えば、ピロリン、ピロール、ピペリジン、ピペラジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアゾール、キノリンなどの窒素原子含有複素環；テトラヒドロフラン、フラン、ピランなどの酸素原子含有複素環；テトラヒドロチオフェン、チオフェンなどの硫黄原子含有複素環；チアゾリン、チアジアゾリン、チアゾール、チアジン、モルホリンなどの窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれた少なくとも２つのヘテロ原子を有する複素環などが挙げられる。
【００２５】
Ｒで示されるこれらの基は、さらに、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピルなどのＣ1-5 アルキル基など）、アリール基（フェニル、トリル、クロロフェニル、ナフチルなどのＣ6-14アリール基など）、オキソ基、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシなどのＣ1-5 アルコキシ基など）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシなど）、メルカプト基、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ、エチルチオなどのＣ1-5 アルキルチオ基など）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオなどのＣ6-14アリールチオ基など）、カルボキシル基、エステル基（例えば、メトキシカルボニルなどのＣ1-6 アルコキシカルボニル基；アセトキシなどのＣ2-12アシルオキシ基など）、アシル基（例えば、アセチル、ベンゾイルなどのＣ2-12アシル基）、アミノ基、モノまたはジ置換アミノ基（例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノなどのモノまたはジ−Ｃ1-5 アルキルアミノ基）、ニトロ基などの置換基を有していてもよい。置換基の個数は、例えば、１〜４程度である。
【００２６】
脂肪族ニトリルには、例えば、炭素数２〜６程度の飽和又は不飽和脂肪族ニトリル（アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリルなどの飽和モノニトリル類；マロニトリル、アジポニトリルなどの飽和ジニトリル類；アクリロニトリル、メタクリロニトリル、シアン化アリル、クロトンニトリルなどの不飽和ニトリル類）などが含まれる。脂肪族ニトリルには、炭素数３〜８程度のピルボニトリル、例えば、アセチルニトリル、エチルカルボニトリルなどのＣ1-4 アルキルカルボニトリル；ビニルカルボニトリル、アリルカルボニトリルなどのＣ2-5 アルケニル−カルボニトリルなども含まれる。
【００２７】
脂環族ニトリルには、例えば、炭素数４〜１０程度の飽和脂環族ニトリル［シアノＣ4-8 シクロアルカン（シアノシクロペンタン、シアノシクロヘキサンなど）などの飽和脂環族ニトリル、シアノ−Ｃ4-8 シクロアルケン（シアノシクロペンテン、シアノシクロヘキセンなど）などの不飽和脂肪族ニトリルなど］などが含まれる。脂環族ニトリルには、炭素数４〜１２程度のカルボニトリル類、例えば、Ｃ4-8 シクロアルカンカルボニトリル（シクロペンタンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリルなど）、Ｃ4-8 シクロアルケンカルボニトリル（シクロペンテンカルボニトリル、シクロヘキセンカルボニトリルなど）なども含まれる。
【００２８】
芳香族ニトリルには、例えば、ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−及びｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−及びｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−及びｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−及びｐ−トルベンゾニトリル、２，４−ジクロロベンゾニトリル、アニソニトリル、α−ナフトニトリル、β−ナフトニトリル、フェニルカルボニトリル、ナフチルカルボニトリルなどのＣ6-14芳香族モノニトリル；フタロニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、フタロイルジニトリルなどのＣ6-14芳香族ジニトリルなどが含まれる。芳香族ニトリルには、例えば、フェニルアセトニトリル、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトニトリル、ｐ−メトキシフェニルアセトニトリル、ベンジルアセトニトリル、ベンゾイルアセトニトリル、ベンジルカルボニトリル、フェネチルカルボニトリルなどのＣ7-14アラルキル基を有するニトリルなども含まれる。
【００２９】
複素環式ニトリルには、ヘテロ原子を含む５又は６員複素環基を有するニトリル化合物、例えば、２−チオフェンカルボニトリル、シアノチオフェン、シアノチアピラン、チアピランカルボニトリルなどのヘテロ原子として硫黄原子を含む５〜６員複素環式ニトリル；シアノフラン、シアノピラン、フランカルボニトリル、ピランカルボニトリルなどのヘテロ原子として酸素原子を含む５〜６員複素環式ニトリル；シアノピリジン、シアノピラジン、シアノピペリジン、ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルなどのヘテロ原子として窒素原子を含む５〜６員複素環式ニトリル；シアノチアゾール、シアノジオキソラン、シアノモルホリン、トリアジンカルボニトリルなどの２つ以上のヘテロ原子を含む５〜６員複素環式ニトリルなどが含まれる。また、前記複素環式ニトリルは複素環にベンゼンなどの芳香族環が縮合した縮合環式ニトリル（例えば、５−シアノインドール、２−シアノクマロン、２−シアノキノリン、２−シアノベンゾモルホリンなど）であってもよい。
【００３０】
好ましいニトリルとしては、アミノ基、ヒドロキシル基などを置換基として有する前記ニトリル類が挙げられる。特に、アミノニトリル（例えば、アミノアセトニトリル、α−アミノプロピオニトリル、α−アミノブチロニトリルなどのα−アミノニトリル；３−アミノプロピオニトリルなどのβ−アミノニトリルなど）、シアンヒドリンが好ましい。
【００３１】
シアンヒドリンとしては、例えば、下記式（１）
【００３２】
【化２】
0004185607.tif 000004
【００３３】
（式中、Ｒ1 は炭化水素基又は複素環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい）
で表される化合物が例示できる。
【００３４】
前記Ｒ1 で示される炭化水素基、複素環基及びこれらの基が有していてもよい置換基としては、前記Ｒについての説明箇所で述べた脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、複素環基及びこれらが有していてもよい置換基などが挙げられる。
【００３５】
好ましいＲ1 には、例えば、前記Ｒの説明箇所で述べた炭素数１〜１２（好ましくは１〜６）程度のアルキル基、炭素数２〜１２程度のアルケニル基、炭素数２〜１２程度のアルキニル基、炭素数３〜１０程度のシクロアルキル基、炭素数６〜１４程度のアリール基、及びＣ7-10アラルキル基（フェニルメチル、２−フェニルエチル、１−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル基など）などが含まれる。
【００３６】
シアンヒドリンの炭素数は、例えば２〜１８、好ましくは３〜１２、さらに好ましくは３〜８程度である。シアンヒドリンには、例えば、α−シアンヒドリン、β−シアンヒドリン、γ−シアンヒドリンなどが含まれる。
【００３７】
α−シアンヒドリンとしては、例えば、下記式（２）
【００３８】
【化３】
0004185607.tif 000005
【００３９】
（式中、Ｒ2 、Ｒ3 は、同一又は異なって、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、Ｒ2 とＲ3 は隣接する炭素原子と共に環を形成していてもよい。但し、Ｒ2 とＲ3 は同時に水素原子ではない）
で表わされる化合物が例示できる。
【００４０】
前記Ｒ2 、Ｒ3 で示される炭化水素基及びこの炭化水素基が有していてもよい置換基としては、前記Ｒについての説明箇所で述べた脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基及びこれらの基が有していてもよい置換基などが挙げられる。好ましいＲ2 、Ｒ3 には、例えば、前記好ましいＲ1 などから選ばれた基が含まれる。
【００４１】
Ｒ2 とＲ3 が隣接する炭素原子と共に環を形成する場合の前記環としては、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル環などの炭素数３〜１０程度のシクロアルカン環などが挙げられる。
【００４２】
α−シアンヒドリンの具体的な例として、例えば、ヒドロキシアセトニトリル、ラクトニトリル、ヒドロキシメチルチオアセトニトリル、アセトンシアンヒドリン、２−メチルチオラクトニトリル、ヒドロキシジメチルチオアセトニトリル、２−ヒドロキシブチロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル、２−ヒドロキシ−２−メチルブチロニトリル、２−ヒドロキシ−３−メチルブチロニトリル、２−ヒドロキシ−３−メチルチオブチロニトリル、２−ヒドロキシペンタンニトリル、２−ヒドロキシヘキサンニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオヘキサンニトリル、２−ヒドロキシオクタンニトリルなどの飽和脂肪族α−シアンヒドリン；２−ヒドロキシ−３−ブテンニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−３−ブテンニトリルなどの不飽和脂肪族α−シアンヒドリン；２−ヒドロキシ−シクロヘキサンアセトニトリル、シクロペンタノンシアンヒドリン、シクロヘキサノンシアンヒドリンなどの脂環式α−シアンヒドリン；１−シアノ−１−ヒドロキシベンゼン、マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−３−フェニルブチロニトリル、２−ヒドロキシ−３−フェニル−４−メチルチオブチロニトリルなどの芳香族α−シアンヒドリンなどが挙げられる。
【００４３】
β−シアンヒドリンとしては、例えば、３−ヒドロキシプロパンニトリル、３−ヒドロキシ−３−メチルチオプロパンニトリル、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシ−４−メチルチオニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシ−４−メチルチオヘキサンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルなどの３−ヒドロキシＣ3-8 アルカンニトリル；３−ヒドロキシプロパンカルボニトリル、３−ヒドロキシブタンカルボニトリルなどの３−ヒドロキシＣ3-8 アルカンカルボニトリル；１−シアノ−２−ヒドロキシシクロペンタン、１−シアノ−２−ヒドロキシシクロヘキサンなどの１−シアノ−２−ヒドロキシＣ3-8 シクロアルカン；３−ヒドロキシシクロペンタンカルボニトリル、３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボニトリルなどの３−ヒドロキシＣ3-8 シクロアルカンカルボニトリル；ｏ−シアノフェノール、２−シアノナフトール、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、３−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリル、３−ヒドロキシ−４−メチルチオ−４−フェニルブチロニトリルなどの芳香族β−シアンヒドリンが例示できる。
【００４４】
γ−シアンヒドリンとしては、例えば、４−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヒドロキシヘキサンニトリルなどの４−ヒドロキシＣ3-8 アルカンニトリル；３−ヒドロキシヘキサンカルボニトリルなどの３−ヒドロキシＣ3-8 アルカンニトリル；４−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリルなどの芳香族γ−シアンヒドリンなどが挙げられる。
【００４５】
好ましいニトリルには、α−シアンヒドリン（ラクトニトリル、アセトンシアンヒドリンなどの炭素数３〜８程度の脂肪族α−シアンヒドリンなど）、特にメチルチオ基を有するα−シアンヒドリン（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルなど）などが含まれる。
【００４６】
前記ニトリルは慣用の方法で得ることができる。例えば、脂肪族ニトリルは、ハロゲン化アルキル又は硫酸ジアルキルにシアン化カリウムなどのシアン化アルカリ等を反応させることにより製造できる。芳香族ニトリルは、例えば、アミンをジアゾ化した後、シアン化銅（Ｉ）を反応させる方法などにより製造することができる。
【００４７】
ニトリルのうち、特に、α−シアンヒドリンは、アルデヒド又はケトンにシアン化水素を作用させる方法、アルデヒド又はケトンと亜硫酸水素ナトリウムとの付加物に、シアン化カリウムなどのシアン化アルカリ等を作用させる方法などにより製造できる。また、β−シアンヒドリンは、エポキシドとシアン化水素とを反応させることによって製造できる。
【００４８】
本発明では、前記微生物の菌体又はその処理物を、前記ニトリルに作用させて、対応するアミド化合物に変換する。前記微生物は、好ましくは、例えば、液体培地または平板培地上にて培養した菌体を採取し、必要に応じて固定化菌体、粗酵素、固定化酵素等の菌体処理物を調製してニトリル化合物に作用させる。
【００４９】
前記微生物を培養する際の培地としては、微生物が通常資化し得るグルコース、フルクトース、スクロース、デキストリン、デンプン等の糖類、グリセロール、ソルビトール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィン等の炭化水素類などから選択された少なくとも一種の炭素源；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の窒素源；硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、塩化コバルト等の無機栄養素や金属を含有する培地、又はこれらの培地に酵母エキス、肉エキス等の天然有機窒素源を添加した培地などを用いることができる。
【００５０】
前記培地には、必要に応じて、微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、反応生成物であるアミドの生成能力を高める因子（誘導源や金属）などを添加してもよい。
【００５１】
前記誘導源としては、例えば、各々の微生物に適したアセトニトリル、イソバレロニトリル、イソブチロニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル化合物、また、アセトアミド、プロピオアミド等のアミド化合物が含まれる。
【００５２】
これらの誘導源及び金属は一種又は二種以上組み合わせて使用できる。また、前記培地は、液体培地、固体培地（平板培地など）などであってもよい。
微生物の培養は、生育可能な条件下であればよく、例えば、培地のｐＨは、通常、ｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ４〜１０、さらに好ましくはｐＨ５〜８程度であり、培養温度は、例えば、５〜６０℃、好ましくは1 ０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。培養は、微生物の活性が最大となるまで培養すればよく、その期間は、例えば、１０時間〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度である。微生物の培養は、嫌気性又は好気性条件下のいずれで行ってもよいが、好気性条件下で行うのが好ましい。
【００５３】
前記微生物の培養物からの菌体の採取は、慣用の方法、例えば遠心分離法などにより行うことができる。また、菌体の破砕は、例えば、ホモジナイザーなどにより機械的に行ってもよく、超音波などを用いて行ってもよい。
【００５４】
前記微生物は、生菌体として用いてもよく、菌体処理物として用いてもよい。前記処理物としては、菌体に種々の処理を施したもの、例えば、菌体破砕物、アセトン処理物、凍結乾燥物、菌体からの抽出物［酵素（粗酵素又は精製酵素）など］などが含まれる。これらの菌体又は菌体処理物は、例えば、ポリアクリルアミドゲル法、含流多糖ゲル法（カラギーナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの慣用の方法により固定化して用いてもよい。
【００５５】
ニトリルからアミドへの変換は、得られた菌体又は処理物を含む水又は緩衝液などと、菌体又は処理物を含む基質（ニトリル化合物）の有機溶媒（ｎ−ヘキサン、酢酸エチルなどの非水溶性溶媒）溶液とを含む二相系における反応により行ってもよく、また、菌体又は処理物を含む水又は緩衝液の懸濁液に、基質（ニトリル化合物）の緩衝液溶液又は水溶性有機溶媒（エタノールなど）溶液を直接添加、混合する単相系の反応により行ってもよい。前記基質（ニトリル化合物）は完全に溶解していなくてもよい。
【００５６】
反応系の前記菌体又は菌体処理物の濃度は、例えば、０．０１〜７０重量％、好ましくは０．０５〜３０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％程度である。基質濃度は、例えば、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜６０重量％程度、さらに好ましくは５〜５０重量％程度である。
【００５７】
反応温度は反応が進行する程度であればよく、例えば、０〜６０℃、好ましくは５〜５０℃、さらに好ましくは１０℃〜４０℃程度である。例えば、水溶性有機溶媒を添加した系においては、反応系の温度が０℃以下であってもよい。反応ｐＨは、例えば、３〜１２、好ましくは４〜１０、さらに好ましくは５〜８程度である。反応時間は、例えば１分〜１００時間、好ましくは５分〜５０時間、さらに好ましくは３０分〜３０時間程度である。
【００５８】
前記のような反応により、前記ＲＣＮ、ＲＣＯＣＮで表されるニトリル化合物は、対応するＲＣＨ2 ＮＨ2 、ＲＣＯＣＨ2 ＮＨ2 （式中、Ｒは前記に同じ）で表されるアミド化合物に変換される。例えば、ニトリルとして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを用いると、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドが得られる。
【００５９】
得られたアミド化合物は、慣用の方法により分離精製できる。例えば、反応液を濃縮、イオン交換、電気透析、抽出、晶析、膜分離、遠心分離などの分離手段に供したり、反応液から菌体を遠心分離、膜分離などによって除去した後、前記分離手段に供する方法などにより、目的化合物であるアミド化合物を分離することができる。
【００６０】
また、得られたアミド化合物からは、カルボン酸を製造することもできる。例えば、本発明によって得られた２−ヒドロキシアミドなどのアミド化合物を、特開平１０−１７９１８３号公報に記載されている方法などに従って加水分解することにより、２−ヒドロキシカルボン酸などのカルボン酸が製造できる。特開平１０−１７９１８３号公報には、微生物をニトリルに作用させて対応するアミドを生成させ、このアミドを塩基（水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物など）の存在下で加水分解して対応するカルボン酸の塩を生成させ、さらにこのカルボン酸の塩を電気透析して対応するカルボン酸と塩基とを生成することが開示されている。この方法と本発明の微生物によるアミド化合物の製造方法とを組み合わせて用いると、ニトリルの水和触媒として硫酸を用いることなく重硫酸アンモニウムなどの副生成物を伴なわずにカルボン酸を得ることもできる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の新規な微生物は、特定の塩基配列を有するので、ニトリルをアミドに変換する能力に優れ、変換反応に対する（反応活性及び選択性）が高い。また、ニトリル化合物の構造が複雑であっても、高い生産速度で対応するアミド化合物を生成できる。さらに、前記微生物をニトリル化合物に作用させると、効率よく高い生産性でアミド化合物を製造できる。
【００６２】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６３】
反応生成物の定量は、高速液体クロマトグラフィー［カラム：J'sphere  ＯＤＳ−Ｍ８０（４．６×２５０ｍｍ、ＹＭＣ（株）社製）］を用いて下記条件で行った。
【００６４】
移動相：０．１重量％リン酸：アセトニトリル：メタノール＝８：１：１
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：２１０ｎｍ
カラム温度：４０℃
実施例１
（Ａ）培養
ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株及びロドコッカス（Rhdococcus）ｓｐ．Ａｍ８株を下記の条件で培養した。
（１）培地組成（単位：ｗ/ ｖ）
クロトンアミド                ０．５％
酵母エキス                    ０．２％
ペプトン                      ０．０２％
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム    １．５％
硫酸マグネシウム５水塩        ０．０５％
塩化コバルト６水塩            ２×１０-5％
硫酸第二鉄７水塩              ２×１０-5％
脱イオン水                    残部
ＰＨ  ６．８
（２）培養条件
斜面培地から１白金耳のロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株及びロドコッカス（Rhdococcus）ｓｐ．Ａｍ８株の菌体を採取し、これらの菌体をそれぞれ、上記の組成の液体培地５０ｍｌを入れて滅菌した坂口フラスコに植菌し、３７℃で３日間、好気条件下で振盪培養した。培養終了後、液体培地から菌体を遠心分離により集菌して、湿菌体を得た。
（Ｂ）反応
５０ｍＬビーカーに上記湿菌体０．２５ｇと０．０５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６．０）２３．７５ｇとを仕込み、攪拌しながら１０℃に冷却した。前記混合液が１０℃になったところで２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル１．９６ｇを加え、１２０分間反応させた。反応終了後、いずれの菌体の場合においても、反応液中の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを完全に消費していた。また、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドの生成量は、いずれも８９．７g ／Ｌであり、収率はほぼ１００％であった。また、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミド生成速度は４５g ／L ・ｈｒであり、乾燥菌体１ｇ当たりの比活性は７８００μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｇ- ｄｒｙｃｅｌｌであった。
【００６５】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１は、ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５９６号）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
配列番号２は、ロドコッカス（Rhdococcus）ｓｐ．Ａｍ８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５９５号）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のロドコッカス（Rhodococcus ）属に属する新種の微生物と類縁菌との１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性に基づく系統樹を示す図である。
【図１】
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