(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞仲介免疫応答または体液性免疫応答の誘発用の製薬組成物であって、
ａ．少なくとも一つの異種抗原を担持し、酵母微生物、酵母スフェロプラスト、酵母細胞質及び酵母ゴーストよりなる群から選ばれる酵母媒介物と、
ｂ．製薬上許容され得る賦形剤と、
を含む製薬組成物。
【請求項２】
前記酵母媒介物は前記異種抗原をコードする核酸分子で形質転換され、かつ該酵母媒介物は前記異種抗原を発現している請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項３】
前記酵母媒介物内に前記異種抗原が挿入されている請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項４】
前記酵母媒介物は少なくとも二つの異種抗原を担持する請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項５】
前記抗原は、ウィルス抗原、哺乳動物細胞の表面分子、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、外部寄生体抗原、癌抗原、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれる請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項６】
前記酵母媒介物は異種成分をさらに備え、該成分は、選ばれた細胞型を該酵母媒介物の標的にさせることが可能な方式で酵母媒介物の外膜上に位置している請求項１乃至５のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項７】
前記酵母媒介物は酵母を吸着できる細胞型を標的にする請求項６に記載の製薬組成物。
【請求項８】
前記細胞型が、結合細胞、樹枝状細胞、内皮細胞、上皮細胞、顆粒球起源の細胞、造血幹細胞、肝細胞、リンパ球、筋芽細胞、筋細胞、ニューロン、好中球、肺細胞、胸腺細胞、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれる請求項７に記載の製薬組成物。
【請求項９】
前記酵母媒介物は、酵母微生物、および酵母スフェロプラストよりなる群から選ばれる請求項１乃至８のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１０】
前記酵母媒介物は酵母微生物である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
前記酵母媒介物は、サッカロミセスSaccharomyces、カンジダCandida、クリプトコックスCryptococcus、ハンゼヌラHansenula、クルイベロミセスKluyveromyces、ピキアPichia、ロドトルラRhodotorula、スキゾサッカロミセスSchizosaccharomycesおよびヤロウィアYarrowiaよりなる群から選ばれる属の酵母由来である請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１２】
前記酵母媒介物は、サッカロミセスSaccharomyces、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenula、ピキアPichia、およびスキゾサッカロミセスSchizosaccharomycesよりなる群から選ばれる属の酵母由来である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１３】
前記酵母媒介物は、サッカロミセス・セレヴィシエSaccharomyces cerevisiae、カンジダ・アルビカンスCandida albicans、ハンゼヌラ・ポリモルファHansenula polymorpha、ピキア・パストリスPichia pastoris、およびスキゾサッカロミセス・ポンベSchizosaccharomyces pombeよりなる群から選ばれる種の酵母由来である請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１４】
前記酵母媒介物は、サッカロミセス・セレヴィシエSaccharomyces cerevisiaeの酵母由来である請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１５】
前記酵母媒介物は非病原性酵母由来である請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、アジュバント、担体、またはそれらの混合物をさらに備える請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、生物学的応答変更因子をさらに備える請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の製薬組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の製薬組成物を吸着した単離細胞であって、該細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹枝状細胞、組織球、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、ミグログリア、好中球、破骨細胞、及び網膜内皮系細胞よりなる群から選ばれる単離細胞。
【発明の詳細な説明】
本発明は、少なくとも部分的には、米国国立衛生研究所が授与する助成金第AI74747号の下での政府援助によってなされた。該政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、酵母系搬送媒介物（搬送ビヒクル）と、様々な化合物を様々な細胞型へと搬送するためのそれらの用途とに関するものである。本発明の酵母媒介物は、例えば、薬物搬送媒介物、遺伝子搬送媒介物または免疫調節性媒介物として用いることができる。
発明の背景
ワクチンは、保健医療産業に利用できる最も費用効果的な手段の一つである。しかし、病原体による感染、癌、遺伝的欠陥、およびその他の免疫系の障害によるものを包含する様々な疾患に対する、安全かつ効果的なワクチンやアジュバントを開発する緊急の必要性が残存する。例えば、Rabinovichら（1994）、Science、265：1401〜1404は、経口的に投与することができ、好ましくは生涯の早期に、数回投与することを要するにすぎない、安全かつ熱安定的なワクチンに対する必要性が依然として存在すると述べている。個体を一種類より多くの疾患から防御できる組合せワクチンや、アジュバントを必要とせず、粘膜の免疫を誘発できるワクチンも好適である。現在まで、あるとしても非常に少数のワクチンが、これらの基準のすべてを満たすにすぎない。
サブユニットワクチンは、組換えＤＮＡ技術によってその開発が可能となったが、限られた免疫原性を示すにすぎないため、現在までは期待を裏切っている。その一例は、いくつかのＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）サブユニットワクチンの最近の臨床試験であって、ワクチンの薬効が限られているばかりでなく、免疫された個体が、その後ＨＩＶと接触したときに疾患の加速度的進行を示す場合があるために、中止されている［例えば、Cohen（1994）、Science、264：1839；およびCohen（1994）、Science、264：1660を参照されたい］。サブユニットワクチンの一つの短所は、死滅ウイルスや組換え生ウイルスのワクチンもそうであるが、強い体液性免疫応答は刺激するようであるのに、防御的な細胞性免疫を誘発できないことである。1994年国際エイズコンファレンスでの大多数の結論は、臨床でのワクチンに現在欠けている、ＨＩＶの感染力を予防または軽減するための、細胞障害性Ｔ細胞仲介応答に対する必要性が残存するということであった。加えて、現在までに試験されたＨＩＶワクチンは、ＨＩＶの一次感染が生じる粘膜表面で免疫を誘発できないでいる。
更に、米国での使用が認可された唯一のアジュバントは、アルミニウム塩である水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムであって、いずれも細胞仲介免疫を刺激しない。加えて、アルミニウム塩配合物は、凍結または凍結乾燥することができず、そのようなアジュバントは、すべての抗原で効果的なわけではない。
酵母は、前述のＨＩＶワクチンの試験で試験されたもののうちいくつかを包含する、サブユニットタンパク質ワクチンの生産に用いられている。酵母は、免疫化の前に動物に与えて、非特異的な方式で免疫応答を発動する（すなわち、食作用とともに補体やインターフェロンの生産も刺激する）試みもなされている。結果は不明瞭であり、そのようなプロトコルは、防御細胞性免疫を発生しなかった［例えば、Fattal-Germanら（1992）、Dev．Biol．Stand．、77：115〜120：Bizziniら（1990）、FEMS Microbiol．Immunol．、２：155〜167を参照されたい］。
ワクチンに加えて、多くの遺伝子や薬物療法が、可能な限り最大の利得を確保するための効率的かつ特異的な搬送媒介物を必要とする。適切な搬送媒介物の欠如は、遺伝子療法の適用に対する主要な障害物であり、多くの薬物の治療的潜在能力を著しく限定する。例えば、最近の報告は、遺伝子療法への適用について診療機関で現在試験中であるアデノウイルスベクターが、望ましくない免疫や炎症性応答を刺激し、望ましい方式で組み込まれるとは思われないことを示している［例えば、Engelhardtら（1994）、Human Gene Therapy、５：1217〜1229、ならびにそれに引用された参考文献を参照されたい］。
そのようにして、例えばワクチンの場合のように、免疫応答を刺激するためにも、または、例えば自己免疫応答もしくは過剰炎症性応答のような、望ましくない免疫応答を抑制するためにも、効果的に免疫を調節する組成物に対する必要性が残存する。改良された遺伝子および薬物搬送媒介物に対する必要性も残存する。
発明の概要
本発明は、酵母に担持される化合物は、アジュバントに対する必要性なしに細胞仲介免疫を触発するという、驚異的な発見を包含する。その限りで、本発明は、背景の項で列挙した基準を満たす、酵母に基づくワクチンを包含する。すなわち、ある免疫応答を調節できる少なくとも一種類の化合物を担持する非病原性酵母を含む、本発明の酵母媒介物は、（ａ）体液性免疫とともに、細胞仲介免疫も刺激するのに有効であり、（ｂ）安全であり、（ｃ）貯蔵寿命が長く（すなわち長期間の貯蔵に安定的であり）、（ｄ）経口的に投与でき、（ｅ）あるとしても非常に僅かなブースター免疫化を必要とするにすぎず、（ｆ）多種類の化合物を担持するよう加工できるという点で、組合せワクチンであることができ、（ｇ）アジュバントを必要とせず、そして（ｈ）粘膜表面で免疫を誘発できる。
本発明は、疾患から生物を防御する方法であって、酵母部分と、該疾患から該生物を防御できる化合物とを有する、酵母媒介物を含む組成物を該生物に投与する工程を含む方法を包含する。そのような化合物は、酵母部分によって担持され、かつそれとは異種である。防御するのに好適な生物は、動物および植物を包含する。酵母媒介物は、酵母を吸着できる細胞型へと化合物を送達することも、または望みの細胞型へと化合物を選択的に送達するよう加工することもできる。組成物は、生体内または生体外で投与できる。
本発明の酵母媒介物に含ませるのに好適な化合物は、核酸分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、無機の防御化合物、その他の有機の防御化合物、およびそのような化合物の混合物を包含する。本発明の酵母媒介物は、化合物の性質に応じて、遺伝的欠陥、感染性作用因によって生じる疾患、およびその他の代謝性疾患を包含する、様々な疾患から生物を防御する化合物を包含できる。
本発明の好適な酵母媒介物は、ある生物の免疫応答を調節することができる。そのような酵母媒介物は、防御免疫応答を刺激するようにも、有害な免疫応答を抑制するようにも設計できる。そのような酵母媒介物は、体液性免疫応答ばかりでなく、細胞仲介免疫応答も刺激するため、特に役立つ。その限りで、本発明の好適な方法は、動物における細胞仲介免疫応答を調節する方法であって、該動物における免疫応答を調節できる、本発明の酵母媒介物を含む組成物を該動物に投与する工程を含む方法である。
本発明は、所与の（すなわち望みの）細胞型へと化合物を搬送する方法であって、酵母部分と該化合物とを有する酵母媒介物を含む組成物を、該細胞型を含む細胞の集団へと投与する工程を含む方法も包含する。該化合物は、該酵母部分によって担持され、かつそれとは異種であり、該酵母媒介物は、該細胞型を該化合物の標的にさせることができる。該細胞集団は、生物、例えば植物または動物を含むことができる。該組成物は、インビボ、エクスビボ（ex vivo）またはインビトロで投与できる。
本発明の一実施態様は、所与の細胞型へと化合物を搬送する方法であって、該化合物を発現できる異種核酸分子で形質転換した酵母媒介物を含む組成物を、該細胞型を含む細胞集団に投与する工程を含む方法である。この実施態様では、酵母媒介物は、所与の細胞型と融合し、そのために該化合物を該細胞型へと搬送することができる。
本発明には、所与の細胞型内に核酸分子を移転する方法であって、該核酸分子で形質転換した酵母媒介物を含む組成物を、該細胞型を含む細胞集団に投与する工程を含み、ここで、該媒介物は、該細胞型と融合し、かつそれに核酸分子を移転することができる方法も包含される。この方法は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで達成でき、一実施態様では、遺伝子療法を行うことができる。
本発明は、所与の細胞型を異種化合物も担持する酵母媒介物の標的にさせることを該成分ができるような方式で、該酵母媒介物の外膜に定置された異種成分を有する、酵母媒介物を含む組成物も包含する。好適な実施態様では、酵母媒介物を、異種成分および／または異種化合物をコードする一種類もしくはそれ以上の核酸分子で、該成分および／または化合物が該酵母媒介物によって発現されるような方式で、形質転換する。
本発明には、少なくとも二種類の異種化合物を担持する、疾患から生物を防御できる酵母媒介物を含む組成物も包含される。該化合物は、好ましくは、該化合物をコードする一種類またはそれ以上の核酸分子で形質転換した酵母媒介物によって発現させる。一実施態様では、該化合物は免疫応答を調節することができ、うち一種類は、好ましくは、生物学的応答変更因子である。好適な実施態様では、該酵母媒介物は、所与の細胞型を該酵母媒介物の標的にさせることを該成分ができるような方式で、該酵母媒介物の外膜に定置された異種成分も含む。
本発明は、（ａ）それとは異種である少なくとも一種類の化合物を有する該酵母媒介物と、（ｂ）製薬上許容され得る賦形剤とを含む組成物も包含する。そのような酵母媒介物は、好ましくは、遺伝子搬送媒介物、薬物搬送媒介物および／または免疫調節性酵母媒介物である。
本発明には、二塩基アミノ酸プロセシング部位を有する異種前駆体タンパク質を生産できる酵母菌株を含む、酵母媒介物も包含される。そのような酵母菌株は、前駆体タンパク質を少なくとも一種類の切断タンパク質へと正確にプロセシングできる。
本発明の別の実施態様は、疾患に対する防御免疫応答を誘発できる、本発明の酵母媒介物の能力を試験する方法であって、該試験が代用動物モデル（すなわち、代用動物を含むモデル）で実施される方法である。そのような方法は、（ａ）処理動物を生成するために防御免疫応答を誘発できる能力について試験しようとする化合物を発現する、異種核酸分子で形質転換した酵母媒介物を含む組成物で、該動物を処理する工程と；（ｂ）同じ化合物を発現する（好ましくは、該化合物をコードする核酸分子で腫瘍を形質転換したために）、未処理動物には致死的であるような腫瘍細胞を該処理動物に投与する工程と；（ｃ）該腫瘍細胞を投与する工程の間、該処理動物が生存するか否かを決定する工程とを含む。処理動物の生存は、酵母媒介物が疾患に対する防御免疫応答を誘発できることを示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の酵母媒介物を投与したマウスから単離したＴ細胞の、インビトロでの増殖を示すグラフを包含する。
図２は、本発明の酵母媒介物を投与したマウスから単離した血清のウエスタンブロットを示す。
図３は、本発明の酵母媒介物を投与したマウスから発生した細胞傷害性Ｔ細胞による、選択的致死を示すグラフを包含する。
発明の詳細な説明
本発明は、酵母に基づく搬送媒介物（本明細書では、酵母媒介物とも称される）と、細胞への化合物のインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロでの送達（搬送）のためのそれらの用途とを包含する。酵母媒介物が、他の搬送媒介物には共有されない一定の利点を有する、特に役立つ搬送媒介物であることは、本発明の驚異的な一面であり、本発明者らは、本発明以前の、搬送媒介物としての酵母のいかなる利用も知らない。
酵母に基づく本発明の搬送媒介物は、組換えおよび／または古典的遺伝学的手法を用いた操作の簡易性、自然状態で酵母細胞に吸着する細胞を化合物の標的にさせ得る能力、ならびに他の望みの細胞型を化合物の標的にさせるように酵母を遺伝学的に加工できる能力を包含するが、それらに限られない、数多くの利点を有する。好適な実施態様では、そのような酵母媒介物は、望みの細胞型と結合かつ融合してシンシチウムを形成し、そのため高率の標的細胞へと効果的な方式で、化合物を搬送することができる。非病原性酵母菌株は、安全な搬送媒介物も意味し、サッカロミセス・セレヴィシエSaccharomyces cerevisiaeをはじめ、多数の酵母菌株が、食料品の用途のためのＧＲＡＳ（すなわち安全であると一般的に認められたもの）であるとして、米国食品医薬品局によって指定されている。本発明の酵母媒介物は、下記に詳しく考察するとおり、経口を包含する様々な経路を用いて投与することができる。
酵母媒介物は、一種類またはそれ以上の化合物を担持でき、遺伝子療法を行い、ならびに／または一種類かそれ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡ分子をコードできる、一種類またはそれ以上の核酸分子を担持するように遺伝学的に加工できることからも、好都合である。酵母媒介物は、該酵母媒介物内に、該酵母の膜表面で、酵母の膜の両端にかけて、該酵母の周縁細胞質内に、そしてそれらの組合せで化合物を担持できる。その限りで、該化合物のうち少なくとも数種類は、少なくとも媒介物がその標的または作用部位（例えば血流、間質組織もしくは細胞）に到達するまで酵母媒介物に結合して留まり、その時点で、該酵母媒介物に担持された化合物は、少なくとも部分的には、媒介物から放出され（すなわち漏出し）得ることが可能となる。
本発明の酵母媒介物の、特に驚異的であり、かつ非常に有意義である一つの利点は、免疫応答を調節（すなわち調整）する実施態様に用いたとき、動物への抗原保有酵母媒介物の投与が、該抗原に対する体液性免疫応答はもとより細胞仲介免疫応答も、有害な副作用を見かけ上生じることもなく形成するように、動物を誘導することである。そのような特性は、死滅微生物（例えば細菌もしくはウイルス）、サブユニットワクチン、ウイルスまたは細菌性媒介物、およびアジュバントを含むワクチンを用いて、大した成果も得られずに盛んに探求されてきた。理論によって拘束される訳ではないが、酵母媒介物の酵母部分は、アジュバントとして作用して、抗原に応答して免疫を刺激し、また酵母は、実際に抗原を担持しているため、（例えば抗体生産によって示されるような）抗原に対するクラスIIＭＨＣ仲介免疫はもとより、（例えば、抗原を標的にできる細胞傷害性Ｔ細胞の生産によって示されるような）クラスＩＭＨＣも働かせることができると考えられる。本明細書で用いられる限りで、抗原とは、生物に投与したとき、免疫応答を形成し、好ましくは防御応答を招くことができるいかなる化合物も指すことに留意すべきである。抗原は、免疫原および寛容原を包含できる。
その上、本発明の酵母媒介物は、他のアジュバントに付随するような重大な副作用を、見かけ上生じない。サッカロミセス・セレヴィシエの酵母菌株に挿入されたＨＩＶｇｐ１６０遺伝子を含む本発明の酵母媒介物を投与された、免疫不全の（例えばＳＣＩＤ）マウスでさえ、酵母媒介物によって有害な作用を受けることがない。この知見は、免疫適格の個体はもとより、免疫不全の個体も疾患から防御するために、本発明の酵母媒介物を用いることに関して特に重要である。
更に、下記に詳しく考察するとおり、本発明の酵母媒介物は、防御免疫応答を刺激する（すなわち誘発、生成および／または強化する）ばかりでなく、過剰活性の、または有害な免疫応答を抑制する（すなわち緩和、阻害または遮断する）ようにも免疫応答を調節することができる。それらが加工された方式に応じて、本発明の酵母媒介物は、体液性免疫に比して優先的に細胞仲介免疫を強化または増幅することも、あるいはその逆もできる。
本発明の一実施態様は、酵母部分と、ある疾患からある生物を防御できる化合物とを含む酵母媒介物を含む組成物を、該生物に投与することによって、該疾患から該生物を防御する方法である。用語「ある」または「ある一つの」の実態は、該実態の一つまたはそれ以上を指すことに留意すべきである。その限りで、用語「ある」（または「ある一つの」）、「一つまたはそれ以上の」および「少なくとも一つの」は、本明細書では相互可換的に用いることができる。本発明によれば、化合物は、該媒介物の酵母部分によって担持されるが、本明細書でやはり酵母媒介物と称されるものの特徴は、該化合物を担持していることである。酵母媒介物（より詳細には酵母部分）が担持する化合物は、該媒介物の酵母部分とは異種であって、それは、該化合物が、該媒介物の該酵母部分の生産に用いられた酵母の菌株（すなわち種、亜種）とは異なる種もしくは亜種の、酵母またはその他の生物に由来することを意味する。そのような化合物は、該媒介物の生産に用いられた酵母菌株中に天然には見出されない有機または無機の化合物であってよく、好適実施態様では、該媒介物の生産に用いられた酵母菌株とは異種である核酸分子、および／またはそのような核酸分子がコードする化合物（例えばＲＮＡ分子もしくはタンパク質）であることができる。下記に更に詳しく考察するとおり、ある疾患から防御され得る生物は、そのような疾患に感受性である生物であり、好ましくは、動物および植物を包含する。
本明細書で用いられる限りで、本発明の酵母媒介物は、酵母部分と、該酵母部分が担持する化合物との双方を含む。本発明の酵母媒介物の酵母部分とは、望みの化合物をある動物または植物に搬送するのに用い得る、いかなる酵母菌株またはその派生体も指す。その限りで、酵母媒介物の酵母部分は、無傷（intact）の酵母微生物（すなわち、細胞壁を包含するそのすべての構成要素を有する酵母細胞）、酵母スフェロプラスト（すなわち、細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母細胞質（すなわち、細胞壁と核とを欠く酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核および細胞質を欠く酵母細胞）、または酵母膜粒子を包含できるが、それらに限られない。酵母ゴーストは、代表的には、透過可能にさせたか、または溶解させた細胞を再密閉することによって形成され、その細胞の少なくともいくつかの小器官を含むことは可能であるが、必要ではない。酵母膜粒子とは、望みの化合物を担持するが、天然の核または細胞質を欠く酵母膜を指す。該膜は、いかなる大きさであることもでき、天然の酵母膜の大きさから、当業者に公知の音波処理その他の膜破裂法と、その後の再密閉とによって形成した微粒子までの範囲の大きさを包含する。化合物は、膜の内側、膜の表面、またはそれらの組合せに担持できる（すなわち、化合物は、酵母膜粒子の膜の内側と外側との双方、および／または膜の両端にまたがって存在できる）。好適な酵母膜粒子は、無傷であるか、破裂させたか、または破裂させて再密閉した酵母の膜であって、膜の表面にか、または、少なくとも部分的には、膜に埋没させて、少なくとも一種類の望みの化合物を含有する。酵母膜粒子の一例は、その表面にか、または、少なくとも部分的には、膜に埋没させて、感染性作用因の抗原を担持する結果、該酵母膜粒子は、動物に投与されたときに、該感染性作用因に対する望みの（すなわち防御性）免疫応答を刺激する。
本発明の酵母媒介物を形成するには、いかなる酵母菌株も用いることができる。酵母は、三つの分類群：すなわち子嚢菌類、担子菌類および不完全菌類のうち一つに属する単細胞の微生物である。病原性の酵母菌株、またはその非病原性の突然変異株は、過去において、アジュバントまたは生物学的応答変更因子として用いられ、本発明に従って用いることができるが、非病原性の酵母菌株が好ましい。酵母菌株の好適な属は、サッカロミセスSaccharomyces、カンジダCandida、クリプトコックスCryptococcus、ハンゼヌラHansenula、クルイベロミセスKluyveromyces、ピキアPichia、ロドトルラRhodotorula、スキゾサッカロミセスSchizosaccharomycesおよびヤロウィアYarrowiaを包含するが、サッカロミセス、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびスキゾサッカロミセスがより好ましく、サッカロミセスが特に好ましい。酵母菌株の好適な種は、サッカロミセス・セレヴィシエSaccharomyces cerevisiae、カールスバーグコウボSaccharomyces carlsbergensis、カンジダ・アルビカンスCandida albicans、カンジダ・ケフィルCandida kefyr、カンジダ・トロピカリスCandida tropicalis、クリプトコックス・ラウレンチイCryptococcus laurentii、クリプトコックス・ネオフォルマンスCryptococcus neoformans、ハンゼヌラ・アノマラHansenula anomala、ハンゼヌラ・ポリモルファHansenula polymorpha、クルイベロミセス・フラジリスKluyveromyces fragilis、クルイベロミセス・ラクチスKluyveromyces lactis、クルイベロミセス・マルキシアヌス変種ラクチスKluyveromyces marxianus var．lactis、ピキア・パストリスPichia pastoris、ロドトルラ・ルブラRhodotorula rubra、スキゾサッカロミセス・ポンベSchizosaccharomyces pombeおよびヤロウィア・リポリチカYarrowia lipolyticaを包含する。これらの種の多くは、前述の種内に含まれるとされる様々な亜種、タイプ、サブタイプ等々を包含することを認識すべきである。より好適な酵母の種は、サッカロミセス・セレヴィシエ、カンジダ・アルビカンス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリスおよびスキゾサッカロミセス・ポンペを包含する。サッカロミセス・セレヴィシエは、操作するのが比較的容易であり、ＧＲＡＳであるため、特に好適である。本発明の一実施態様は、特に高いコピー数にまでプラスミドを複製できる酵母菌株、例えばサッカロミセス・セレヴィシエのcir株である。
本発明の酵母媒介物は、動物または植物を疾患から防御できる多様な化合物を担持できる。本明細書で用いられる限りで、また下記に更に詳しく考察するとおり、動物または植物を疾患から防御できる化合物は、動物または植物に投与されたときに、疾患が発生するのを予防すること、および／または疾患の症状もしくは原因を治癒もしくは緩和することができる化合物である。疾患とは、生物のあらゆる部分の正常な健康からのあらゆる逸脱を意味し、その限りで、疾患の症状が明白である状態はもとより、逸脱（例えば感染、遺伝子の突然変異等）が生じているが、症状は未だ明白ではない状態も包含できる。本発明の酵母媒介物は、動物または植物を苦しめる一つまたはそれ以上の疾患と戦うための化合物を搬送する媒介物として、特に役立つ。動物または植物をそれから防御しようとする疾患の例は、感染、遺伝的欠陥、または他の代謝障害を包含するが、それらに限られない。そのような分類群の疾患は、細胞の異常な増殖（例えば、良性もしくは悪性の新生物、過形成性症候群）、退化的過程および／または免疫学的欠陥、ならびにその他の多数の障害を招くことができる。
本発明の一実施態様は、感染性作用因によって生じる疾患から生物を防御するための酵母媒介物の用途である。感染性作用因は、生物（好ましくは動物または植物）に感染し、疾患を生じることができるいかなる作用因であることもできる。そのような疾患は、急速にか、または長期間の後に発症し得る。本発明の酵母媒介物を用いて生物をそれに対して防御するのに適した感染性作用因は、ウイロイド、プリオン、ウイルス、細菌、真菌（酵母を包含する）、原生動物（例えばアメーバ、鞭毛虫類および胞子虫類）、蠕虫類ならびに外部寄生生物を包含するが、これらに限られない。一種類より多くの感染性作用因に対して動物を防御することは、本発明の範囲内にある。いくつかの感染性作用因は、これらの分類群の一つに明確に分類されていないが、そのような感染性作用因も本発明に包含されることにも留意しなければならない。
好適な酵母媒介物は、動物の、例えば耳、皮膚、腸、免疫、神経、口／歯、生殖、呼吸および／または尿路の系統を損傷する感染性作用因による感染から動物を防御することができる。そのような感染性作用因は、アデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、コロナウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ミクソウイルス、腫瘍ウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス、植物ウイルス、コウジカビAspergillus、ブルギアBrugia、カンジダ、クラミジアChlamydia、コクシジウム、クリプトコックスCryptococcus、犬糸状虫Dirofilaria、淋菌Gonococcus、ヒストプラズマHistoplasma、レーシュマニアLeishmania、マイコバクテリウムMycobacterium、マイコプラズマMycoplasma、ゾウリムシParamecium、百日咳菌Pertussis、マラリア原虫Plasmodium、肺炎球菌Pneumococcus、ニューモシスチスPneumocystis、リケッチアRickettsia、サルモネラ菌Salmonella、赤痢菌Shigella、ブドウ球菌Staphylococcus、連鎖球菌Streptococcus、トキソプラズマToxoplasmaおよびコレラ菌Vibriocholerae、ならびに免疫不全であるか、さもなければ免疫抑制された動物に日和見感染を生じる、その他の感染作用因も包含するが、これらに限られない。更に、好適な感染作用因は、汽水、食品汚染物および創傷中に見出されるその他の有害微生物を包含する。
本発明の酵母媒介物を用いて生物をそれから防御するのに好適なウイルスは、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フラビウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳ（呼吸器シンシチウム）ウイルス、レトロウイルスおよび水痘ウイルスを包含する。
レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスが、より好適であり、白血病、向リンパ性（lymphotrophic）、肉腫およびレンチウイルスは、より一層好適であるが、その他の免疫不全または腫瘍ウイルスも同様である。生物をそれから防御するのに特に好適な向リンパ性ウイルスは、向Ｔリンパ性ウイルス、例えばヒトＴ細胞向リンパ性ウイルス（ＨＴＬＶ、例えばＨＴＬＶ１やＨＴＬＶ２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）およびネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）を包含する。特に好適なレンチウイルスは、ヒト（ＨＩＶ）、サル（ＳＩＶ）、ネコ（ＦＩＶ）およびイヌ（ＣＩＶ）の免疫不全ウイルスであり、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２が、より一層好適である。
別の実施態様は、動物をその他の疾患、例えば、遺伝的および／または代謝的欠陥によって生じる疾患から防御するための本発明の酵母媒介物の用途である。本発明の酵母媒介物は、遺伝的欠陥を矯正するために、遺伝子を含む核酸分子またはその一部を適切な細胞型へと移転することができる。本明細書で用いられる限りで、遺伝的欠陥は、生殖系統に影響する突然変異とともに、体細胞突然変異、例えば、多くの形態の癌、自己免疫疾患、および他の免疫不全障害を生じる欠陥を包含する。本発明の酵母媒介物は、一定の細胞型に対する酵母の天然の性癖を用いること、および／または、適切である限り、追加の細胞型を酵母媒介物の標的にさせることによって、いかなる遺伝的欠陥も矯正するのに用いることができる。生物をそれから防御しようとする遺伝的欠陥は、血液（凝固）因子障害、遺伝的欠陥と結合した癌（腫瘍遺伝子の活性化、腫瘍抑制遺伝子機能の喪失を包含する）、嚢胞性線維症、ゴーシェー病、ヘモグロビン異常症（例えばサラセミアや鎌状赤血球貧血症）、高コレステロール血症、レッシュ・ナイハン症候群、筋萎縮症、シグナル形成タンパク質障害、テイ・サックス病、およびそのような欠陥の合併（すなわちそれらの混合や組合せ）を包含するが、それらに限られない。本明細書で用いられる限りで、遺伝子療法は、望みの遺伝子の発現の「スイッチを入れる」方法とともに、有害な遺伝子発現の「スイッチを切る」方法も包含する。その限りで、遺伝子療法は、遺伝子発現の脱調節や、機能的コーディング領域の喪失から生じる遺伝的欠陥を矯正するために、望みの細胞型への調節領域および／またはコーディング領域の導入を包含する。
本発明の酵母媒介物を用いて動物をそれから防御しようとする追加的疾患は、アレルギー、貧血、自己免疫疾患（例えば糖尿病、多発性硬化症、リウマチ様関節炎）、癌、心血管疾患、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、造血障害、免疫不全疾患、免疫増生疾患、免疫抑制障害、炎症性疾患、黄疸、骨髄抑制障害、同種移植片または異種移植片の拒絶反応、敗血症ショック、その他の免疫学的欠陥、およびそれらの組合せを包含するが、それらに限定されない。これらの疾患の多くは、急性または慢性であることができる。本発明の酵母媒介物を用いて生物をそれから防御できる個々の疾患の例は、本明細書に開示されている。そのような例は、その限りであるにすぎないものとし、本発明の適切に設計された酵母媒介物が動物または植物をそれに対して防御できる、多様な疾患を限定するものではないことに留意しなければならない。
動物を疾患から防御するために、本発明の酵母媒介物に包含できる多様な化合物が存在し、ある酵母媒介物が一種類またはそれ以上のそのような化合物を含有できることは、本発明の範囲内にある。そのような化合物は、様々な化学構造のものであることができ、また様々な機能を有することができる。生の酵母媒介物を用いるときは、該酵母を実質的に傷つけない化合物を選ぶことが重要であることに留意しなければならない。
一実施態様では、本発明の酵母媒介物に担持させるのに適した化合物は、核酸分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、無機防御化合物、または他の有機防御化合物の化学構造を有する化合物を包含する。
本発明の核酸分子化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体であることができ、調節領域および／またはコーディング領域を含む遺伝子やその部分とともに、アンチセンス核酸分子、三つ組形成核酸分子、リボザイム、および／または核酸に基づく薬物のような防御化合物として機能できるオリゴヌクレオチド（代表的には約６０未満〜約９０個のヌクレオチド）も包含できるが、それらに限られない。核酸に基づく薬物は、天然のか、または修飾された核酸で構成される薬物を包含するが、それらに限定されない。そのような薬物は、例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的展開（ＳＥＬＥＸ）の技術を用いた、結合パートナーによる核酸分子の無作為試料の選択的ふるい分け（それには、そのような結合パートナーと作用し合える薬物が望ましい）によって特定できる（例えばTuerkら（1990）、Science、249：505〜510を参照されたい）。核酸分子化合物は、一種類もしくはそれ以上の防御ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質化合物をコードする核酸分子（すなわち、そのような核酸分子のＲＮＡ転写体）を包含できる。そのような核酸分子は、そのような防御ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質化合物へと発現できるような方式で、酵母媒介物へと形質転換（すなわち挿入）される。酵母細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子を細胞へと挿入できるいかなる方法によっても達成できる。形質転換の手法は、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合法を包含するが、それらに限られない。形質転換した核酸分子は、当業者に公知の手法を用いて、酵母の染色体に組み込むか、または染色体外ベクターに維持することができる。そのような核酸分子を担持する酵母媒介物の例は、本明細書に詳しく開示されている。
本明細書で用いられる限りで、ペプチドは、約３０以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含むが、タンパク質は、約３０より多いアミノ酸のアミノ酸配列を含み、タンパク質は多量体であることができる。ペプチドやタンパク質は、自然状態でも、または合成によっても誘導体化することができ、そのような修飾は、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリセロホスファチジルイノシトールの付加を包含できるが、それらに限られない。ペプチドやタンパク質は、当業者に公知の手法によって、例えば電気穿孔法、リポソーム融合法または浴音波処理によって、本発明の酵母媒介物に直接挿入するか、または、本明細書に開示されるとおり、酵母媒介物へと形質転換された核酸分子によって、生産できる。ペプチドやタンパク質は、抗体、酵素、調節タンパク質および毒素を包含するが、それらに限られない数多くの形式のものであることができる。
本発明の炭水化物や脂質の化合物は、それぞれ、糖や脂肪酸の基を有する。無機の防御化合物は、炭素部分を含まない、動物を疾患から防御できる化合物を包含し、そのような化合物は、本明細書では、無機薬物とも称され、公知の（例えば古典的）化合物とともに、新規化合物も包含する。有機防御化合物は、ここまでに開示されたものばかりでなく、その他の有機化合物、例えば、代表的には微生物または合成によって作られる有機薬物も包含する。そのような化合物は、抗生物質、ビタミン、ステロイド、抗炎症性化合物、抗ヒスタミン、抗高血圧剤、αおよびβアドレナリン作動性阻害剤、ならびにアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を包含するが、それらに限定されない。
酵母媒介物を、炭水化物、脂質その他の有機防御化合物を生産するよう遺伝学的に加工できることは、本発明の範囲内にある。これに代えて、そのような化合物や無機防御化合物を、例えば拡散または能動輸送によって、酵母媒介物中に挿入することもできる。挿入した酵母媒介物は、直前に開示した方式で挿入した酵母媒介物ばかりでなく、上記に開示したもののような公知の手法を用いて、拡散分子、ペプチドおよび／またはタンパク質を挿入したものも包含することを理解しなければならない。
本発明によれば、酵母媒介物に含まれる化合物は、様々な機能を有することができる。本発明の酵母媒介物は、好ましくは、免疫応答を刺激できる化合物、免疫応答を抑制できる化合物、有毒化合物、遺伝子の転写を阻害できる化合物、遺伝子の翻訳を阻害できる化合物、感染性作用因が子孫を生産できる能力を阻害できる化合物、欠陥遺伝子と置き換えられ得る化合物（そのようなタンパク質や、そのようなタンパク質のミメトープをコードできる核酸分子を包含する）、および／または生物学的応答変更因子（例えば、サイトカイン、例えばリンホカインやモノカイン、およびその他の成長調節因子）、ならびにそれらの混合物を含む。そのような化合物の例は、抗生物質、抗体、抗真菌化合物、抗原、抗寄生体化合物、アンチセンス化合物、抗ウイルス化合物、化学療法剤、サイトカイン、成長調節因子（成長の刺激剤と抑制剤との双方を包含する）、除草剤、ホルモン、免疫抑制剤、核酸に基づく薬物（例えばＤＮＡもしくはＲＮＡに基づく薬物）、コーディング領域を含む核酸分子、調節配列を含む核酸分子、ヌクレオシド類似体、その他のオリゴヌクレオチド、ペプチド類似体、ペプチド、殺虫剤、前駆薬剤（例えば、作用部位で活性化される化合物）、その他のタンパク質、リボザイム、ステロイド、毒素および／またはビタミンを包含するが、それらに限定されない。
本発明は、他の化合物に結合し、その限りで結合パートナー化合物と呼ばれる化合物を担持する酵母媒介物を包含する。結合パートナー化合物の例は、抗原と抗体、クラスＩやクラスIIのＭＨＣ分子とそのそれぞれのペプチド、Ｔ細胞受容体とそのそれぞれの抗原、その他の受容体とそのそれぞれのリガンド、および核酸分子と、そのような分子の一定の核酸配列に結合する調節タンパク質を包含するが、それらに限定されない。結合パートナー複合体、例えば抗原−抗体複合体は、第一の結合パートナーと第二の結合パートナーとからなるが、本明細書で用いられる限りで、結合パートナーの番号の指定は、第一結合パートナーが第二結合パートナーに結合できなければならないという限定のため以外は、本筋ではない（例えば、抗原または抗体のいずれが第一結合パートナーとして標識されるかは、もう一方の化合物が第二結合パートナーとして標識される限り、問題ではない）。ある複合体では、追加のパートナーも包含される。
化合物として本発明の酵母媒介物に含ませるのに好適な第一結合パートナーは、ウイルス抗原、哺乳動物細胞の表面分子、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、外部寄生体抗原、癌抗原、ならびに／またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの特異的部位に結合するタンパク質を包含する。好適な第一結合パートナーに結合できる第二結合パートナー、好適な第一もしくは第二結合パートナーをコードする核酸分子、および／または好適な第一もしくは第二結合パートナーの生産を遮断できるオリゴヌクレオチド（例えば、結合パートナーの転写および／もしくは翻訳を阻害できるアンチセンス、リボザイムならびに／または三つ組形成複合体）も好適である。本発明の酵母媒介物に含めるのに特に好適な化合物は、ウイルス抗原、癌抗原、哺乳動物細胞の表面受容体、そのような受容体のリガンド、ならびにそのような化合物をコードする核酸分子、および／またはそのような化合物の生産を遮断するオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明の酵母媒介物に用いるためのウイルス抗原の例は、免疫不全ウイルス（例えばＨＩＶ、ＲＩＶ）のｅｎｖ、ｇａｇ、ｒｅｖ、ｔａｒ、ｔａｔ、ヌクレオキャプシドタンパク質および逆転写酵素；ＨＢＶ表面抗原およびコア抗原；ＨＣＶ抗原；インフルエンザヌクレオキャプシドタンパク質；パラインフルエンザヌクレオキャプシドタンパク質；ヒト乳頭腫１６型Ｅ６およびＥ７タンパク質；エプスタイン・バーウイルスＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２およびＥＢＮＡ−２；ヘルペスＬＡＡおよび糖タンパク質Ｄ；ならびに他のウイルスからの類似タンパク質を包含するが、それらに限定されない。
本発明の酵母媒介物に用いるための癌抗原の例は、ＭＡＧＦ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｖ、ＭＡＲＴ１、ＢＣＲ−ａｂ１、ならびにｐ５３、ｒａｓ、ｍｙｃおよびＲＢ−１の突然変異株発癌形態を包含するが、それらに限定されない。
本発明の酵母媒介物に用いるための哺乳動物細胞の表面分子の例は、ＭＨＣ抗原、抗体およびＴ細胞受容体、ならびに他の受容体およびそれらのリガンド、例えばＦａｓおよびＦａｓリガンド、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＮＣＡＭ、Ｐ選択およびＶＣＡＭを包含する。
本発明の酵母媒介物に含ませるのに好適なその他の抗原化合物は、上記に開示したような、適切かつ好適な感染性作用因に由来する抗原である化合物、ならびに上記に開示したような、追加の疾患に関連する化合物、例えば腫瘍抗原を包含する。追加の好適化合物は、望ましくないか、または有害な免疫応答、例えば、アレルゲン、自己免疫抗原、炎症性作用因、ＧＶＨＤ、ある種の癌、敗血症ショック抗原、および移植拒絶反応に関与する抗原から生じるようなそれを抑制できる化合物（タンパク質性化合物を包含する）である。そのような化合物は、抗ヒスタミン、シクロスポリン、コルチコステロイド、ＦＫ５０６、有害な免疫応答の形成に関与するＴ細胞受容体に対応するペプチド、Ｆａｓリガンド（すなわち、細胞性Ｆａｓ受容体に結合し、そのためアポトーシスを誘導する化合物）、寛容化またはアネルギーを起こすようにして提示される適切なＭＨＣ複合体、Ｔ細胞受容体、ならびに、好ましくは細胞性および／または体液性免疫を強化もしくは抑制できる生物学的応答変更因子と組合せた、自己免疫抗原を包含するが、それらに限定されない。上記の、タンパク質性である化合物のいずれかをコードする核酸分子もまた、好適な化合物として包含される。
本発明の特に好適な酵母媒介物は、そのような媒介物を投与された動物での免疫応答を調節できる化合物を担持するそれである。本明細書で用いられる限りで、免疫応答を調節できる化合物は、特に酵母媒介物の一部として投与したときに、その生物に、望みの（すなわち防御的な）免疫応答を刺激するか、または有害である（すなわち損傷もしくは害を与える）免疫応答を抑制するよう免疫応答を調節できる化合物である。調節は、主として細胞仲介性の免疫応答と、主として体液性のそれとを切り換えられる能力も含む。免疫応答を調節する化合物は、無機または有機化合物を包含でき、好ましくは、タンパク質と、そのようなタンパク質をコードする核酸分子とを包含する。酵母媒介物は、特に、本発明の酵母媒介物が細胞仲介免疫とともに体液性免疫も刺激できるという、本発明者らによる発見を考え合わせると、免疫応答を調節するのに充分適している。酵母媒介物に担持される抗原性化合物が、クラスＩＭＨＣに基づく経路を通じて処理される理由は未だ知られていないが、細胞仲介免疫を刺激できるというような酵母媒介物の同定は、極めて好都合である。
本発明の特に好適な実施態様は、感染、特にウイルス感染に対して生物を防御するための酵母媒介物の用途である。そのような酵母媒介物に包含するのに好適な化合物は、ウイルス表面タンパク質および／もしくはウイルスコアタンパク質（構造的および非構造的タンパク質を包含する）のようなウイルス抗原、ならびに／またはそのような抗原をコードする核酸分子、および／もしくはそのような抗原の生産を遮断できるオリゴヌクレオチドである。特に好適なウイルス抗原（またはそれに対応する核酸分子）は、免疫不全および／または腫瘍ウイルスのウィルス抗原、より好ましくはＨＩＶ（例えばＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）、ＨＴＬＶ（例えばＨＴＬＶ−１もしくはＨＴＬＶ−２）、ＦＩＶまたはＦＬＶのウィルス抗原を包含する。
本発明の酵母媒介物は、生物学的応答の変更因子化合物、またはそのような変更因子を（例えば、そのような変更因子をコードする遺伝子を担持することによって）生成できる能力も保有する。少なくとも一種類の抗原と、少なくとも一種類の生物学的応答変更因子化合物を包有する酵母媒介物が好適である。生物学的応答変更因子は、免疫応答を調節できる化合物である。一定の生物学的応答変更因子が防御免疫応答を刺激できるのに対して、他のものは、有害な免疫応答を抑制できる。一定の生物学的応答変更因子が細胞仲介免疫応答を優先的に強化するのに対して、他のものは、体液性免疫応答を優先的に強化する（すなわち、体液性免疫に比して高いレベルの細胞性免疫が存在する免疫応答を刺激できるか、またはその逆ができる）。免疫応答の刺激または抑制を測定するため、および細胞性免疫応答を体液性免疫応答から区別するために、当業者に公知の多数の手法が存在する。
適切な生物学的応答変更因子は、サイトカインおよびその他の成長調節因子、例えば、それらに限定されないが、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、および／またはトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）を包含する。酵母媒介物がＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γを発現（すなわち生産）し、好ましくは分泌できることは、細胞仲介免疫を優先的に強化するが、酵母媒介物がＩＬ−４、ＩＬ−５および／またはＩＬ−１０を発現し、好ましくは分泌できることは、体液性免疫を優先的に強化する。
本発明の一つの利点は、本発明の酵母媒介物が、望みの細胞型を標的にして、それによって基本的にすべての細胞型のうちの選ばれたサブセットのみへと、化合物を搬送できることである。すなわち、酵母媒介物は、例えば、望みの細胞型（すなわち標的細胞型）には存在するが、他の細胞型（すなわち非標的細胞型）には基本的に不在ではない、細胞表面分子を認識できるという酵母媒介物の能力に基づいて、それらの化合物を望みの細胞型には送達できるが、基本的にはその他の細胞型に搬送できない。すなわち、酵母媒介物は、選ばれた細胞型を選択的に認識できる。一実施態様では、本発明の酵母媒介物に担持された化合物をそのような細胞型へと搬送するために、一定の細胞型によって吸着されるという酵母細胞の固有の能力が頼りにされる。本明細書で用いられる限りで、用語「吸着」とは、本発明の酵母媒介物を、例えばエンドサイトーシスまたは食作用によって取り込める、与えられた細胞型の能力を指す。別の実施態様では、酵母媒介物を遺伝学的に加工して、様々な追加の細胞型を化合物の標的にさせる。
本発明の一実施態様は、所与の（すなわち望みの、または選ばれた）細胞型へと化合物を搬送する方法であって、該細胞型を含む細胞集団に、該細胞型を該化合物の標的にできる本発明の酵母媒介物を含有する組成物を投与することによる方法である。細胞集団とは、培養体中の細胞、組織または器官を指し、この場合、該組成物を試験管内で投与する。細胞集団は、生物、好ましくは動物または植物を指すこともでき、この場合は、該組成物をインビボおよび／またはエクスビボで投与する。
本明細書で用いられる限りで、細胞型とは、細胞の分類群（例えばリンパ球、筋細胞、上皮細胞等々）を指し、単細胞、細胞凝集体、組織および器官を包含できる。媒介物の酵母部分が担持する化合物は、酵母部分とは異種である。多数の適切かつ好適な化合物を、ここまでに開示してある。
別の用途のために加工されない限り、本発明の酵母媒介物は、酵母を自然状態で吸着する細胞型へと化合物を搬送することができる。酵母が自然状態で標的にする細胞型は、顆粒球−単核球系統の細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を包含するが、それらに限定されない。顆粒球−単核球系統の細胞の例は、樹枝状細胞、組織球、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、その他のマクロファージ（肺胞や脾臓の遊離および定着マクロファージを包含する）、ミクロダリア、好中球、破骨細胞および細網内皮系細胞を包含するが、それらに限定されない。これらの酵母媒介物は、これらの媒介物が、動物の上皮領域に位置する細胞を標的にできるため、粘膜の免疫の刺激に特に好適である。その限りで、これらの酵母媒介物は、上皮組織に作用する疾患、例えばウイルス感染や、子宮頸管癌、結腸癌および一定の肺癌を包含するが、それらに限定されない上皮癌から動物を防御するのに特に適している。
本発明の追加の酵母媒介物は、一つまたはそれ以上の細胞型へと化合物を搬送するように加工される。そのような酵母媒介物は、酵母媒介物の外膜に（すなわち、酵母媒介物の外膜に全体的にか、または膜内に少なくとも部分的に埋没させて）定置された異種成分を、該成分が、所与の細胞型を酵母媒介物の標的にできるようにして含有する。そのような成分は、該媒介物の生産に用いた酵母の種または亜種とは異なる種もしくはタイプのものである。好適な異種成分は、送達のための標的にされる、所与の細胞型の表面に定置されたある要素（例えば受容体、抗原または他の細胞表面の実体）の結合パートナーである。そのような要素は、好ましくは、送達のための標的にされない細胞型上には、不在であるか、または少量見出されるにすぎない。
本発明の異種成分含有酵母媒介物を用いて標的にするのに好適な細胞型は、結合組織細胞、樹枝状細胞、内皮細胞、上皮細胞、顆粒球−単核球起源の細胞、造血幹細胞、肝細胞、リンパ球、筋芽細胞、筋細胞、ニューロン、好中球、肺細胞、胸腺細胞、およびそれらの組合せを包含する。標的にするのに好適なリンパ球は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を包含する。標的とするのに好適な上皮細胞は、生殖器、腸、腎、粘膜および肺の細胞を包含する。標的とするのに特に好適な細胞型は、ＣＤ４またはＣＤ８細胞マーカーをその細胞表面で発現する細胞を包含し、ＣＤ４を発現する細胞がより一層好適である。ＣＤ４細胞マーカーを有する細胞は、ヘルパーＴ細胞、マクロファージおよび細網内皮細胞を包含し、ＣＤ８細胞マーカーを有する細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞を包含する。
本発明の酵母媒介物に含ませるのに適した異種成分は、一定の細胞型の表面に見出される要素に選択的に結合する抗体、アシアロ糖タンパク質（シアル酸の基を欠く糖タンパク質）、補体Ｃ３ｄタンパク質、Ｆａｓリガンド、融合誘導因子、Ｔ細胞受容体、その他の受容体、受容体リガンド（例えば抗原、サイトカインおよび成長因子）、トランスフェリン、ウイルス表面タンパク質（例えば、ウイルスがそのそれぞれの宿主細胞に感染できるようにするウイルスタンパク質）、その他の細胞表面タンパク質、およびそれらの混合物を包含するが、それらに限定されない。好適な異種成分は、抗体、Ｆａｓリガンド、受容体リガンドおよびウイルス表面タンパク質を包含し、Ｆａｓリガンドおよびウイルス表面タンパク質が特に好適である。
好適な実施態様では、選ばれた細胞型を標的にする異種成分を有する酵母媒介物は、該成分を生産（すなわち発現）することができ、望みの細胞型を媒介物の標的にさせるのに適した方式で、該成分を該媒介物の外膜に定置することができる。そのような酵母媒介物は、該成分をコードする核酸分子で形質転換された媒介物である。該核酸分子は、該成分が酵母媒介物によって発現され得るようにして、該酵母媒介物に定置される；例えば、該核酸分子は、転写制御配列に機能的に結合（連結）される。酵母媒介物中で異種核酸分子を発現させる方法は、本明細書中に開示してある。
本発明の好適な酵母媒介物は、該媒介物に担持される化合物を送達しようとする細胞型と融合し、そのため、該細胞型への化合物の特に効率的な送達を実施することができる。そのような酵母媒介物は、標的細胞型の細胞膜との融合を実施できる異種成分を含有する。本明細書で用いられる限りで、標的細胞型との酵母媒介物の融合とは、標的細胞型の細胞膜と融合して、シンシチウム形態へと導くことができる、酵母細胞膜の能力を指す。本明細書で用いられる限りで、シンシチウムは、細胞の合体によって形成された原形質の多核塊体である。数多くのウイルス表面タンパク質（ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスおよびアデノウイルスのような免疫不全ウイルスのそれを包含する）、および他の融合誘導因子（例えば、卵と精子との融合に関与するそれ）が、二膜間の（すなわち、ウイルス膜と哺乳動物の細胞膜との間、または哺乳動物の細胞膜どうしの間の）融合を実施できることが示されている。例えば、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１という異種成分をその表面に生成する酵母媒介物は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球と融合できる。それ自身では融合できない異種成分と、例えばＨＩＶｇｐ４１タンパク質にトランスフェリンを結びつけることによって、融合を誘導できる成分との複合体を形成することによって、所与の細胞型と融合できる酵母媒介物の生産に用いることができる異種成分の数を増加させることは、本発明の範囲内にある。
一実施態様では、ある酵母菌株を、天然には他の酵母菌株によって標的にされる細胞を標的にさせるか、またはある種の病原性酵母菌株に対するワクチンにさせるように遺伝学的に加工する。例えば、カンジダまたはクラミジアの抗原をコードする核酸分子は、カンジダまたはクラミジアの抗原が、発現され、かつサッカロミセス・セルヴィシエの膜に組み込まれるように、サッカロミセス・セレヴィシエ菌株内に遺伝学的に加工することができる。得られる酵母媒介物は、動物に投与されたとき、それぞれカンジダまたはクラミジアの感染に対して、細胞仲介免疫応答や体液性免疫応答などの防御免疫応答を刺激することができる。
本発明の酵母媒介物は、当業者に公知の方法を用いて形成することができる。酵母媒介物は、挿入しようとする化合物に適した様々な手法を用いて、化合物に挿入することができる。例えば、これまで開示したとおり、無機化合物および多数の有機化合物は、拡散および／または能動輸送によって酵母媒介物に挿入できる。ペプチドやタンパク質は、リポソーム融合、電気穿孔法または浴音波処理によって酵母媒介物内に挿入できる。
本発明の好適な酵母媒介物は、遺伝学的に加工された（すなわち組換えによって形成された）酵母媒介物である。そのような媒介物は、本発明のＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質化合物をコードできる一種類またはそれ以上の核酸分子で形質転換される。酵母媒介物は、酵素および／または他の因子をコードする核酸分子を用いても形質転換し、そのため、そのような媒介物が本発明の他の化合物（例えば抗生物質またはビタミン）を生成するのを可能にすることができる。本発明のある種の酵母媒介物は、与えられた生物へと送達しようとする化合物をコードする核酸分子、および所与の細胞型を該媒介物の標的にさせることができる異種成分をコードする核酸分子で形質転換される。一実施態様では、この化合物と異種成分とは、同じタンパク質（例えば、ウイルスの表面抗原ワクチンであって、そのようなウイルスによる感染に対して感受性のある細胞型を標的にさせたもの）である。
酵母媒介物の酵母部分の形質転換は、公知の手法を用いて達成することができ、その例は本明細書に開示されている。化合物および異種成分を生成できる酵母媒介物は、無傷の酵母微生物、および酵母スフェロプラストを包含するが、それらに限定されない。酵母細胞質、酵母ゴーストおよび酵母膜粒子の媒介物も、酵母微生物または酵母スフェロプラストを望みの核酸分子で形質転換し、その中にＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質の化合物を生成し、更に、この微生物またはスフェロプラストを、当業者に公知の手法を用いて操作して、望みの化合物を含有する細胞質、ゴーストまたは膜粒子の媒介物を形成することによって、組換え的に生成することができる。
一実施態様では、酵母微生物またはスフェロプラストの膜に輸送され得るタンパク質へと、該酵母微生物またはスフェロプラストが発現できる核酸分子で形質転換した、無傷の酵母微生物またはスフェロプラストを培養することによって、膜粒子の媒介物を形成する。次いで、そのような形成菌株を公知の手法に付して、望みの化合物を含有する酵母膜を単離する。そのような化合物の例は、ウイルスの表面タンパク質、および通常は膜表面に見出されるその他のタンパク質を包含する。酵母膜粒子は、免疫応答を調節するのに特に役立つ。
本発明の酵母媒介物へと形質転換される核酸分子は、一つもしくはそれ以上の遺伝子、またはその部分を包含できる。そのような核酸分子は、部分的もしくは全体的なコーディング領域、調節領域、またはそれらの組合せ、ならびに、転写されたときに、タンパク質生産に干渉できる領域を含むことができる。酵母菌株の一つの利点は、多数の核酸分子を担持し、かつ多数の異種ＲＮＡおよび／またはタンパク質化合物を生産できるそれらの能力である。その限りで、本発明の酵母媒介物は、一種類より多くの疾患から動物を防御するか、またはその他の用途のために一種類より多くの化合物を担持するように、設計することができる。本発明の酵母媒介物によって生産されるのに好適な化合物の数は、約１〜約５であり、約２〜約５の化合物がより好適である。特に好適であるのは、下記の遺伝子の分類群を包含する：ワクチンをコードする遺伝子、生物学的応答変更因子をコードする遺伝子、および望みの細胞型を標的にするのに適した異種成分をコードする遺伝子である。
酵母媒介物中で核酸分子によってコードされるペプチドまたはタンパク質は、完全長のタンパク質であるか、またはアミノ酸が、削除（例えばタンパク質の断端版）、挿入、倒置、置換および／もしくは誘導体化（例えば、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）という足場による繋留）された結果、修飾されたタンパク質が天然のタンパク質のそれに実質的に類似する生物学的機能を有する、機能的に等価のタンパク質であることができる。修飾は、タンパク質に対する直接的修飾、あるいは、例えば、無作為であるか、もしくは標的化された突然変異を実施するための古典的または組換えＤＮＡの手法を用いた、タンパク質をコードする遺伝子に対する修飾を包含するが、それらに限定されない当技術に公知の手法によって達成することができる。機能的に等価のタンパク質は、タンパク質の生物学的活性を測定するよう設定されたアッセイを用いて、選ぶことができる。
本発明の酵母媒介物におけるＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質化合物の発現は、当業者に公知の手法を用いて、達成できる。簡単に述べると、望みの化合物をコードする核酸分子を、宿主酵母細胞中に形質転換されたときに、該核酸分子の構成的発現または調節的発現のいずれかを実施できるように、該核酸分子を転写制御配列に機能的に連結されるようにして、発現ベクターに挿入する。一種類またはそれ以上の化合物をコードする核酸分子は、一つまたはそれ以上の転写制御配列に機能的に結合された、一種類またはそれ以上の発現ベクターであることができる。
本明細書では、組換え分子とは、発現ベクター上の少なくとも一つの転写制御配列に機能的に結合された、核酸分子を指す。本明細書では、発現ベクターとは、宿主細胞を形質転換することができ、機能的に結合された核酸分子の発現を実施できるＤＮＡまたはＲＮＡベクターを指す。そのようなベクターは、やはり好ましくは、それらの固有の特徴性に応じて高コピー数または低コピー数のいずれかまで、宿主細胞内で複製できる。
生産されるタンパク質の量を制御できる転写制御配列は、転写の開始、延長および終結を制御する配列を包含する。特に重要な転写制御配列は、転写の開始を制御する配列、例えばプロモーターおよび上流活性化配列である。適切ないかなる酵母プロモーターも本発明に用いることができ、様々なそのようなプロモーターが当業者に公知である。サッカロミセス・セレヴィシエでの発現に好適なプロモーターは、下記の酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを包含するが、それらに限定されない：アルコール脱水素酵素Ｉ（ＡＤＨ１）またはII（ＡＤＨ２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸異性化酵素（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ；トリオースリン酸脱水素酵素としてＴＤＨ３とも呼ばれる）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧＡＬ７）、ＵＤＰガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ1（ＣＹＣ１）および酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）。ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨやＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーターのようなハイブリッドプロモーターがより好適であり、細胞中のグルコース濃度が低いとき（例えば約０．１〜約０．２％）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨがより一層好適である。同様に、エンハンサーとも呼ばれる多数の上流活性化配列（ＵＡＳ）が公知である。サッカロミセス・セレヴィシエでの発現に好適な上流活性化配列は、下記のタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳを包含するが、それらに限定されない：ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０、ならびにＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化されるその他のＵＡＳ。ＡＤＨ２というＵＡＳが特に好適である。ＡＤＨ２というＵＡＳはＡＤＲ１遺伝子産物によって活性化されるため、異種遺伝子をＡＤＨ２というＵＡＳに機能的に結合させたときは、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現させるのが好ましい。サッカロミセス・セレヴィシエでの発現に好適な転写終結配列は、α因子、ＧＡＰＤＨおよびＣＹＣ１遺伝子の終結配列を包含する。
メチル栄養性酵母で遺伝子を発現するのに好適な転写制御配列は、アルコール酸化酵素やギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子の転写制御領域を包含する。
本発明に用いられる核酸分子は、固有または異種分泌配列ばかりでなく、適切である限り、膜横断繋留配列も包含できる。例えば、生物学的応答変更因子化合物を分泌することは好適であるが、酵母媒介物膜に異種成分を繋ぎ留めることが好適である。そのような配列の選択および利用は、当業者に公知の手法を用いて達成できる。
本発明の組換え酵母媒介物の形成に効果的な条件は、酵母菌株を培養できる効果的な培地を包含する。効果的な培地は、代表的には、同化できる炭水化物、窒素およびリン酸源とともに、適切な塩類、無機質、金属その他の栄養素、例えばビタミンや成長因子を含む水性培地である。培地は、複合栄養素を含んでよく、あるいは規定された最小培地であってもよい。本発明の酵母菌株は、バイオリアクター、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートを包含するが、それらに限定されない様々な容器で培養できる。培養は、酵母菌株に適切な温度、pHおよび酸素含有量で実施する。そのような培養条件は、充分に当業者の技量の範囲内にある［例えば、Guthrieら（編者）（1991年）、Methods in Enzymology、第194巻、Academic Press、米国サンジエゴを参照されたい］。
酵母媒介物は、本明細書に開示された方法を包含する、当業者に公知の手法によって回収することができる。酵母媒介物は、当業者に公知の多くの手法を用いて、本発明の組成物中に配合することができる。例えば、酵母媒介物含有組成物は、凍結乾燥法、または液体窒素もしくはドライアイスとの接触によって乾燥することができる。酵母媒介物を含む組成物は、例えば製パンまたは醸造の操作に用いられる酵母に対して実施されるとおり、ケーキまたは錠剤に酵母を充填することによって調製することもできる。
酵母媒介物を生物に投与するには、乾燥組成物を経口送達に用いることができる。酵母媒介物は、製薬上許容され得る賦形剤、例えば該媒介物を投与しようとする生物が耐容する等張緩衝液と混合することもできる。そのような賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、ハンク液その他の水性の生理学的均衡塩類溶液を包含する。非水性媒介物、例えば固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドを用いてもよい。その他の有用な配合物は、増粘剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含有する懸濁液を包含する。賦形剤は、少量の添加物、例えば等張性や化学的安定性を高める物質も含有できる。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびトリス緩衝液を包含するが、防腐剤の例は、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールを包含する。標準的配合物は、液体の注射可能物、または注射のための懸濁液もしくは溶液として適切な液体に溶解できる固体のいずれかであることができる。したがって、液体でない配合物では、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブミンおよび／または防腐剤を含むことができ、投与の前に、滅菌水または生理食塩水をこれに加えることができる。
本発明の一つの特別な利点は、酵母媒介物が、アジュバントまたは担体のような免疫強化剤とともに投与される必要がないことであって、それは、この媒介物自体の酵母部分が、そのようなものとして機能すると思われるからである。しかし、この特徴は、本発明の組成物における免疫強化剤の使用を予め排除するわけではない。その限りで、一実施態様では、本発明の組成物は、一種類またはそれ以上の酵母媒介物、ならびに一種類もしくはそれ以上のアジュバントおよび／または担体を含むことができる。
アジュバントは、代表的には、特定の抗原に対する動物の免疫応答を一般的に増強する物質である。適切なアジュバントは、フロインドアジュバント；他の細菌の細胞壁成分；アルミニウム系塩類；カルシウム系塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質；ウイルスコートタンパク質；他の細菌に由来する製剤；γインターフェロン；ブロック共重合体アジュバント、例えばハンターのTitermaxなるアジュバント（CytRx，Inc.、米国ジョージア州Norcross）；Ribiアジュバント（米国マサチューセッツ州Hamilton、Ribi ImmunoChem Research，Inc.より入手可能）；およびサポニンやそれらの誘導体、例えばQuil A（デンマーク国、Superfos Biosector A/Sより入手可能）を包含するが、それらに限定されない。
担体は、代表的には、投与された動物での治療組成物の半減期を延長する化合物である。適切な担体は、重合体の制御放出配合物、生物分解性移植体、リポソーム、油類、エステルおよびグリコールを包含するが、それらに限定されない。
本発明は、動物、または培養物中の細胞への本発明の酵母媒介物を含む組成物の搬送を包含する。そのような組成物は、動物にはインビボまたはエクスビボのいずれでも搬送でき、あるいは細胞にはインビトロで搬送できる。本明細書で用いられる限りで、インビボ搬送とは、酵母媒介物を含む組成物の動物への直接投与を指す。そのような投与は、標的細胞型の部所への全身、粘膜および／または近位への投与であることができる。インビボで酵母媒介物を投与する経路の例は、経耳、気管支、生殖路、吸入、経鼻、経眼、経口、非経口、直腸、局所、経皮、および尿路の経路を包含する。経耳搬送は点耳剤を包含でき、経鼻搬送は点鼻剤を包含でき、経眼搬送は点眼剤を包含できる。経口搬送は、口を通じて摂取され得る固体や液体を包含できる。非経口搬送は、皮内、筋内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、動脈カテーテルおよび静脈カテーテルの経路を包含できる。経口搬送が好適であるが、それは、特に経口搬送は粘膜免疫の発生に役立ち、酵母媒介物を含む組成物は、例えば錠剤またはカプセルとして、経口搬送のために容易に調製することができ、更には食料および飲料製品中に配合されるからである。粘膜免疫を調節する投与のその他の経路も、特にウイルス感染、上皮癌、免疫抑制性疾患、および上皮領域に影響するその他の疾患の治療には、好適である。そのような経路は、気管支、皮内、筋内、経鼻、その他の吸入、直腸、皮下、局所、経皮、経膣および尿路の経路を包含する。
酵母媒介物のエクスビボ搬送とは、動物から取り出した細胞集団を、該酵母媒介物が標的細胞型によって吸着されるような条件下で、本発明の酵母媒介物を含む組成物に接触させる工程と、接触させた細胞を動物に戻す工程とを包含する方法を指す。そのような搬送法は、造血および免疫応答に関与する細胞の治療ばかりでなく、腫瘍の治療にも特に役立つ。
酵母媒介物のインビトロ搬送とは、培養物中の細胞集団（組織または器官も包含できる）への本発明の酵母媒介物の搬送を指す。そのような方法は、特定の酵母媒介物がインビボもしくはエクスビボでか、または研究プロジェクトで有効であるか否かを決定するのに特に役立つ。エクスビボで治療される細胞は、培養物として維持するか、または動物に移転することができる。
組成物を調製し、かつこれらの経路を経由して投与する方法は、当業者には周知である。本発明の組成物は、組成物の用途に応じた効果的な方式で投与される。例えば、動物を疾患から防御するために、本発明の組成物は、動物に、該組成物が該動物を該疾患から防御できるよう効果的な方式で投与される。本発明の組成物は、疾患を予防するために、疾患の前に動物もしくは植物に投与するか、および／または疾患を治療するために、疾患の開始後に動物に投与することができる。例えば、本発明の酵母媒介物は、予防用薬剤（予防薬）として、および／または免疫治療用薬剤として用いることができる。
組成物を効果的な方式で投与するのに許容され得るプロトコルは、個別投与量のサイズ、投与量の回数、投与量投与の頻度、および投与の様式を包含する。そのようなプロトコルの決定は、当業者が実施することができる。適切な一回投与量は、適切な期間にわたって一回またはそれ以上投与したときに、酵母媒介物が担持する化合物を、効果的に搬送できる投与量である。例えば、本発明の酵母媒介物の好適な一回投与量は、該組成物を投与しようとする生物の体重１kgあたり約１ｘ１０5〜約５ｘ１０7個の酵母細胞の等価量である。酵母媒介物組成物の「ブースター」は、好ましくは、酵母媒介物が担持する化合物が、もはや効果的に機能しなくなったときに投与する。例えば、生物の免疫応答がもはや効果的に調節されなくなったならば、望みの免疫応答を調節できる、本発明の組成物の一回またはそれ以上の追加投与量を投与することができる。そのような組成物は、最初の投与の約２週間ないし数年後に投与できる。好適な投与スケジュールは、生物の体重１kgあたり約１ｘ１０5〜約５ｘ１０7個の酵母細胞の等価量の組成物を、約１〜約６ケ月の期間に約１〜約４回投与するスケジュールである。本発明の酵母媒介物を動物に投与する方法の例を、実施例のセクションに提供する。
本発明の一実施態様は、所与の細胞型内に核酸分子を移転する方法である。そのような方法は、該核酸分子で形質転換した酵母媒介物を含む組成物に、該細胞型を有する細胞集団を投与する工程を包含する。酵母媒介物は、好ましくは、該細胞型と融合することができ、そのため、核酸分子を該細胞型へと移転する（すなわち搬送する）。そのような移転は、細胞集団が培養物中に維持されるならば、インビトロでか、または細胞集団が生物、例えば動物または植物を含むならば、インビボおよび／もしくはエクスビボで達成できる。
好適な実施態様では、核酸分子の移転は遺伝子療法を有効にする。すなわち、核酸分子は遺伝学的欠陥を矯正できる。遺伝子療法を有効にする組成物は、例えば、宿主ゲノム内への遺伝子の組込みを行い得ること、融合した細胞をヘテロカリオンとして維持すること、または標的細胞型中で遺伝子を安定的に維持するためのその他の機序を用いることによって、標的細胞型での安定的遺伝子療法を行い得るよう遺伝学的に加工された、酵母媒介物を含む。そのような組成物は、他の遺伝子搬送用媒介物のために開発されたそれのような手法を用いて、インビボまたはエクスビボで生物に投与される。酵母の搬送用媒介物は、遺伝子療法を行うために、望みの遺伝子を移転しようとする細胞とのシンシチウムが形成でき、本明細書で開示したとおり、特定の細胞型を標的にさせられるため、有利である。例えば、嚢胞性線維症を招く遺伝的欠陥は、肺の外層の近位に位置する最終的に分化した細胞を標的にさせた、機能的なＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜横断伝導度調節因子）遺伝子を担持する酵母媒介物を用いて、矯正してよい。体液中に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子は、特定の細胞型を標的にさせる必要がないことも留意しなければならない。
本発明の酵母媒介物組成物は、動物をそれから防御するように本発明の酵母媒介物を設計できる、いかなる疾患にも感受性であるいかなる動物も包含する、適切ないかなる動物にも投与することができる。治療するのに好適な動物は、脊椎動物および節足動物を包含し、哺乳類、両生類、鳥類、魚類および昆虫がより好適である。治療するのにより一層好適な動物は、ヒト、霊長類、伴侶動物（すなわちペット類）、および農業上重要な動物（すなわち家畜）を包含し、ヒト、無尾のサル、ネコ、ウシ、イヌ、フェレット、ゴリラ、ウマ、マウス、サル、ブタ、ウサギ、ラットおよびヒツジが特に好適である。
本発明の酵母媒介物は、例えば、種子または胚芽を酵母媒介物含有組成物に接触させるか、または酵母媒介物とアグロバクテリウムAgrobacteriumとを融合させることによって、植物、好ましくは被子植物、より好ましくは農作物に投与することもできる。農作物の例は、それらの花、果実、植物体または種子を求めて栽培される植物、例えばリンゴ、オオムギ、豆類、ニンジン、サクランボ、トウモロコシ、ブドウ、豆果、オレンジその他の柑橘類の果実、モモ、大豆、トマトおよびコムギを包含する。別の実施態様では、例えばウイロイド、ウイルスその他の病原体による感染を治療するためか、または除草剤もしくは殺虫剤を投与するために、本発明の酵母媒介物を植物に投与する。例えば、ブドウをフィロキセラから防御するために、本発明の酵母媒介物をブドウに投与することができる。
本発明は、本発明の酵母媒介物を含む様々な新規組成物を包含する。一組成物は、（ａ）該酵母媒介物とは異種である一種類またはそれ以上の化合物を有する（すなわち含む）酵母媒介物と、（ｂ）製薬上許容され得る賦形剤とを含有する。そのような組成物は、本明細書に開示された方法を用いて、該化合物を生物にか、または培養物中の細胞に搬送するのに用いることができる。そのような組成物は、異種化合物を担持する新規酵母菌株が、本発明者らの知るところでは、賦形剤と併用されたことがないことから、新規である。その上、そのような組成物は、本発明までは、搬送用媒介物として酵母を用いることが、当技術では認識されなかったため、自明ではなかった。適切な化合物、酵母媒介物および賦形剤は、本明細書中に開示してある。酵母媒介物の例は、遺伝子搬送用媒介物（すなわち、遺伝子療法を行うための核酸分子を担持する酵母媒介物）、薬物搬送用媒介物（すなわち、無機または小型の有機化合物、例えば、それらに限定されないが、抗生物質、ステロイド、他の古典的薬物、ＲＮＡに基づく薬物を担持する酵母媒介物）、ならびに免疫調節用酵母媒介物（すなわち、免疫応答を調節できる、本明細書に開示されたいかなる様々な化合物も担持する酵母媒介物）を包含するが、それらに限定されない。
本発明の別の組成物は、（ａ）酵母媒介物の外膜に定置された異種成分であって、与えられた細胞型を該成分が該酵母の標的にさせ得るようにして定置されている成分と、（ｂ）異種化合物とを有する（すなわち含む）酵母媒介物を含む。適切な異種成分と異種化合物とは、本明細書に開示されている。そのような酵母媒介物は、一種類より多くの異種成分、および／または一種類より多くの異種化合物を包含できる。そのような組成物は、賦形剤、アジュバント、および／または担体を包含するが、それらに限定されないその他の成員も含有できるが、それらの例は、本明細書に開示されている。
好ましくは、この（これらの）異種成分及び異種化合物は、それぞれ、該酵母媒介物によって生産される。そのような酵母媒介物は、異種成分をコードする核酸分子と異種化合物とによって、該酵母が該異種成分および異種化合物（ＲＮＡまたはタンパク質化合物であってよい）を発現できるようにして、形質転換される。別の好適な酵母媒介物は、異種成分を発現することができ、遺伝子療法を実施できる核酸分子も担持している酵母媒介物（すなわち遺伝子搬送用媒介物）である。
本発明の別の実施態様は、疾患から動物を防御できる、少なくとも二種類の異種化合物を担持する酵母媒介物を含有する組成物である。適切な化合物は本明細書に開示されている。そのような組成物は、賦形剤、アジュバントおよび担体のようなその他の成員も含有できる。酵母媒介物は、ある種の細胞型を該媒介物の標的にさせ得る異種成分も含有できる。この実施態様に包含される酵母媒介物は、一種類またはそれ以上の異種化合物を生産できる、形質転換された酵母媒介物を包含する。
好ましくは、異種化合物のうち少なくとも一種類は、免疫応答を調節できる化合物、例えば、免疫応答を刺激できる化合物、または免疫応答を抑制できる化合物である。一好適実施態様は、抗原と生物学的応答変更因子とを担持する酵母媒介物である。別の好適実施態様は、抗原と、生物学的応答変更因子と、所与の細胞型を該酵母媒介物の標的にすることができる異種成分とを担持する酵母である。
本発明の一実施態様は、二塩基アミノ酸プロセシング部位を有する異種前駆体タンパク質を生産できる酵母菌株を含む酵母媒介物であって、該酵母菌株が、該前駆体タンパク質を少なくとも一種類の切断タンパク質へと正しくプロセシングできる酵母媒介物である。そのような前駆体タンパク質の例は、成熟の過程での一段階として、二塩基アミノ酸エンドプロテアーゼによる切断を必要とする、多数のホルモン前駆体タンパク質やウイルスエンベロープ前駆体タンパク質を包含する。そのような前駆体タンパク質の例（免疫不全ウイルス、向リンパ球ウイルス、肝炎ウイルスおよびヘルペスウイルスの前駆体タンパク質を包含するが、それらに限定されない）は、米国特許願第08/088,322号明細書［前掲］中に与えられ、その限りで、本明細書に組み込まれる。
酵母は、米国特許願第08/088,322号明細書［前掲］中に、二塩基アミノ酸プロセシング部位を有する異種前駆体タンパク質の切断を実施できることが示された、Ｋｅｘ２と呼ばれるタンパク質を生産する。その限りで、ウイルスエンベロープ前駆体タンパク質を発現できる酵母菌株は、そのような前駆体タンパク質の切断を実施し、該酵母の膜上に成熟エンベロープタンパク質を発現することができる。異種前駆体タンパク質を生産できる本発明の酵母媒介物は、異種のＫｅｘ２様エンドプロテアーゼ、例えば、該異種前駆体タンパク質を自然的に切断するプロテアーゼを生産するように、遺伝学的に加工することもできる。そのような酵母媒介物は、機能的な酵母Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼをもはや生産しないように加工することができるが、それを必要とするわけではない。そのような酵母媒介物の生産に関する詳細は、米国特許願第08/088,322号明細書［前掲］に開示されている。本発明に従って用いると、そのような酵母媒介物は、感染性作用因に対する免疫応答を刺激することができる。
免疫応答を誘発できるという本発明の酵母媒介物の能力の一例は、下記のとおりである。ウイルス表面前駆体タンパク質、例えばＨＩＶｇｐ１６０で形質転換された酵母媒介物は、動物に投与したとき、アジュバントを含有する必要なしに、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する細胞仲介および体液性の応答をともに誘発する。Ｔ細胞の増殖性応答（ヘルパーＴ細胞の発動を示す）と、強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞活性（細胞仲介免疫を示す）とがともに観察され、酵母媒介物は、クラスＩおよびクラスIIＭＨＣの経路の双方を通じての抗原の提示へと導き得るという考えを裏付ける。ＨＩＶに対して動物を防御するのに用いるのに特に好適な酵母媒介物は、ＡＦＹ４３５−ｇｐ１６０−ＳＦ２（ｃ）、すなわちＨＩＶ−１SF2のｇｐ１６０前駆体エンベロープタンパク質を発現するように加工された無傷のサッカロミセス・セレヴィシエ細胞、およびＡＦＹ４３５−ｇｐ１６０−ＳＦ２（ｓ）、すなわち別途にＡＦＹ４３５−ｇｐ１６０−ＳＦ２（ｃ）と等価であるスフェロプラストを含む。そのような実施態様の詳細は、実施例のセクションに開示されている。
本発明の別の実施態様は、癌細胞を殺す免疫応答を刺激できる酵母媒介物である。そのような酵母媒介物は、実質的に癌細胞上または中にのみ見出されるにすぎない、突然変異しために癌を生じるタンパク質（例えばｒａｓ）を包含する、タンパク質またはそのペプチドを含有（かつ、好ましくは発現）する。動物に投与したとき、そのような酵母媒介物は、該酵母媒介物が担持するタンパク質またはそのペプチドに対応するタンパク質を発現する細胞、すなわち癌細胞を殺すことができる免疫応答を誘導する。
本発明のある種の酵母媒介物は、有害な免疫応答を抑制または緩和するのに特に有用である。一実施態様では、本発明の酵母媒介物は、その膜表面に、動物での有害な免疫応答の形成に関与する細胞上に存在する、Ｔ細胞受容体に対応する適切なペプチドを発現する。該動物へのそのような酵母媒介物の投与は、Ｔ細胞受容体を発現する細胞を標的にする細胞傷害性Ｔ細胞の生成を招き、それによって、そのような細胞が生起する免疫応答を抑制する。適切なペプチドを同定する方法、およびそのような応答を実施するためのその他の搬送用媒介物の用途は、例えば、Bourdetteら（1994）、J．Immunol．、152：2510〜2519；およびChouら（1994）、J．Immunol．、152：2520〜2529に開示されている。酵母媒介物は、強い細胞仲介応答ばかりでなく、体液性応答も生起できるために、そのような方策には特に役立つ。類似の方策は、罹患した個体の免疫系を欺瞞するように寄生体、腫瘍またはウイルスが誘導する、有害な、または無効な免疫応答を緩和するために、すなわち有害および／もしくは非防御的な抗体の生産に関与するＴ細胞またはＢ細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導できる酵母媒介物を用いることによって、採用することができる。
別の実施態様では、本発明の酵母媒介物は、その細胞膜上にＦａｓリガンドを発現し、その限りで、Ｆａｓ（ＣＤ９５）と呼ばれる分子を発現する細胞を殺すことができる。Ｆａｓは、活性化Ｔリンパ球を包含するある種の細胞型、および白血病やリンパ腫の細胞を包含する癌細胞に見出される糖タンパク質である［例えば、Sudaら（1993）、Cell、75：1,169〜1,178を参照されたい］。標的細胞型を殺すために、Ｆａｓリガンドに対する搬送用媒介物として酵母を用いることは、例えば、Ｆａｓリガンドは、それらが自然状態で提示されるのに類似する方式、すなわち、細胞膜上、例えば細胞傷害性Ｔ細胞上に見かけ上凝集される方式で提示され得るため、好都合である。
本発明の別の実施態様は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子をその細胞膜上に発現する酵母媒介物である。例えば、バキュロウイルスで空位および複合ＭＨＣ分子を発現させるために用いられるのに類似の手法を用いて、インビトロで挿入できる空位のＭＨＣ分子や、ペプチドと複合させたＭＨＣ分子を酵母介物に担持させることは、本発明の範囲内にある［例えば、Sternら（1992）、Cell、68：465〜477を参照されたい］。そのような酵母媒介物は、免疫応答を調節するのに、例えば、自己免疫およびその他の有害な免疫応答に関与するＴ細胞を削除または不活性化するのに、用いることができる。
本発明は、酵母媒介物を試験できる代用動物モデルを用いて、疾患から動物を防御できる、本発明の酵母媒介物の能力を試験する方法も包含する。好適な代用動物は、齧歯類および霊長類を包含する。一実施態様では、該方法は、比較的廉価な実験動物、例えば齧歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ウサギ）に免疫応答を誘発できる酵母媒介物の能力を決定することが、たとえ該動物が、防御するよう該酵母媒介物が設計された疾患に感受性でなくとも（すなわち、疾患の症状が通常は発生しない動物であっても）可能である。この方法を用いると、例えば、ＨＩＶｇｐ１６０を発現する酵母媒介物が、ｇｐ１６０を移入した細胞を殺せるＴ細胞を生成するように、動物を誘導できるか否かを決定するために、該動物を試験することができる。
その限りで、本発明は、代用動物を含むモデルで、疾患に対して防御免疫応答を誘発できる、本発明の酵母媒介物の能力を試験する方法を包含する。該方法は、（ａ）防御免疫応答を誘発できる能力について試験しようとする化合物を発現する、異種核酸分子で形質転換した酵母媒介物を含む組成物を代用動物に投与して、それによって、処置動物（すなわち、該組成物を投与された動物）を生成する工程と；（ｂ）該処置動物に、同じ異種核酸分子で形質転換した、未処置動物（すなわち、処置動物と同じ種の動物）には致死的である腫瘍細胞を投与する工程と；（ｃ）処置動物が処置の工程に生存するか（すなわち、腫瘍細胞の投与にも拘らず生存するか）否かを決定する工程とを包含する。処置動物の生存は、試験しようとする酵母媒介物が、該疾患に対して防御免疫応答を誘発できることを示す。この方法によれば、遺伝学的に加工した腫瘍細胞は、代用標的として機能している。例えばＨＩＶの場合、腫瘍細胞は、ヒトでは、ＨＩＶに対する細胞仲介応答や体液性応答を刺激できる、本発明の酵母媒介物に対する標的である、ＨＩＶ感染Ｔ細胞の代用品として機能している。本明細書で用いられる限りで、「腫瘍細胞」という用語は、一種類またはそれ以上の腫瘍細胞を指し、充実腫瘍を指すことができる。
特に好適な実施態様では、該方法は、ＨＩＶｇｐ１６０を発現できる酵母媒介物を動物に投与する工程を包含する。次いで、ＨＩＶｇｐ１６０を生産するよう加工した、ナイーブな（未処置の）動物に投与すると、該動物での腫瘍（例えば、マウスに対する線維肉腫細胞または黒色腫細胞）の致死的であり得る増殖を導く腫瘍細胞（例えば、ＨＩＶｇｐ１６０遺伝子の発現を許す方式で、該遺伝子で形質転換した腫瘍細胞）を、該酵母媒介物を投与した動物に導入する。そのような動物での腫瘍細胞の増殖が阻害されるという知見は、該酵母媒介物が、問題の化合物を発現した細胞（この場合は、ｇｐ１６０および／またはプロセシングされたｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する腫瘍細胞）を殺せる免疫応答を刺激したことを示す。下記の実験結果は、例示の目的で提供され、発明の範囲を限定することはないものとする。
実施例
以下の実施例に用いられる分子生物学および細胞生物学技術は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al．，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989；およびGuthrie et al．，（eds.）、同書、に記載されている。
実施例１
この実施例は、本発明の特定の酵母媒介物の生成を記載する。
S.cerevisiae AFY435-gp160-SF2は、S.cerevisiae GPY60:pα/envとも表され、米国特許出願第08/088,322号の実施例１に記載されたようにして産生した。簡単に述べると、HIV-1SF2のgp160前駆体エンベロープタンパク質（約825アミノ酸）をコードするエンベロープ（env）遺伝子（Sanchez-Pescador et al．，1985，Science 227，484-492）を、α因子シグナルおよび約86アミノ酸のリーダーセグメントをコードする核酸配列に連結してα−リーダー／env遺伝子フラグメント（α／env）を形成した。この中で、env遺伝子のシグナル配列は、Brake et al．，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．81，4642-4646において上皮細胞成長因子遺伝子がα因子シグナルおよびリーダー配列に結合されるのと同様の方法によって、α因子シグナルおよびリーダー配列によって置き換えられていた。このα因子セグメントは、α−Ｆリーダーとも表され、そのカルボキシル末端に二塩基性アミノ酸プロセシング部位をも含んでいた。このα／env融合遺伝子は、S.cerevisiae ADH2/GAPDHプロモーターおよびα因子転写終結配列に作動可能に連結されており、他の酵母シャトル発現ベクター配列と結合して、pBS8とも表される組換え分子pα／envを形成した。組換え分子pα／envは、酵母（２μ）および細菌の複製制御配列、ならびにアンピシリン耐性（Amp）をコードする細菌の遺伝子、および栄養要求性leu2-dおよび野性型URA3酵母遺伝子を有している。
組換え分子pα／envを、いくつかのS.cerevisiaeの株（GPY60株、Baker et al．，1988，Cell 54，335-344に記載されたMat α pep4::URA3 prb leu2 his4 ura3 trp1株を含む）に形質転換した。形質転換した株をS.cerevisiae GPY60:pα/envもしくはS.cerevisiae AFY435-gp160-SF2と表す。無傷の（intact）酵母細胞AFY435-gp160-SF2を含む酵母媒介物を、AFY435-gp160-SF2(c)と表した。AFY435-gp160-SF2のスフェロプラストを含む酵母媒介物を、AFY435-gp160-SF2(s)と表した。
米国特許出願第08/088,322号の実施例１はまた、（ａ）S.cerevisiae AFY435-gp160-SF2が、HIV-1 gp160前駆体エンベロープタンパク質を産生したこと、および哺乳動物細胞がgp160をプロセシングするのと同様の方法により、インビボで、gp160をgp120およびgp41にプロセシングし得たこと、ならびに（ｂ）S.cerevisiae AFY435-gp160-SF2が、少なくとも一部の切断されたgp120タンパク質およびgp41タンパク質を、その細胞表面上で発現したことを示している。
実施例２
この実施例は、本発明の酵母媒介物が、動物における細胞仲介性ならびに体液性免疫応答を刺激し得ることを示す。
Ａ．酵母媒介物
無傷の細胞およびHIV-1SF2のgp160前駆体エンベロープタンパク質を発現するように操作したスフェロプラストS.cerevisiae酵母媒介物を、それらがHIVに対する細胞仲介性および／または体液性免疫を刺激する能力についてマウスで試験した。特に、S.cerevisiae AFY435-gp160-SF2(c)およびS.cerevisiae AFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物（実施例１に記載したように産生した）を、以下の対照と同様にテストした：無傷のS.cerevisiae細胞AFY433-ベクター(c)およびS.cerevisiaeスフェロプラストAFY433-ベクター(s)、これらは、AFY433-ベクター(c)およびAFY433-ベクター(s)が、gp160を含むベクターではなくベクター単独によって形質転換されているという点を除いてそれぞれAFY435-gp160-SF2(c)およびAFY435-gp160-SF2(s)に匹敵した。
Ｂ．動物への酵母媒介物の投与ならびに脾臓細胞およびリンパ節細胞の回収
１群あたり２匹のBalb/cマウス、５群に、全部で３週間にわたり週に一回、以下を含む100マイクロリットル（μｌ）の注射緩衝液（1.4Mのソルビトール、5mMの塩化マグネシウム、10mMのTris,pH7.4）を、腹腔内注射した：第１群（マウス１および２）には、なにも行わず；第２群（マウス３および４）には、約２×107のAFY433-ベクター(c)細胞を含む緩衝液；第３群（マウス５および６）には約２×107のAFY433-ベクター(s)スフェロプラストを含む緩衝液；第４群（マウス７および８）には、約２×107のAFY435-gp160-SF2(c)細胞を含む緩衝液；および第５群（マウス９および１０）には、約２×107のAFY435-gp160-SF2(s)スフェロプラストを含む緩衝液。３回目の免疫後14日目に、すべてのマウスを炭酸ガス吸入により屠殺した。
血液を、心臓穿刺によってマウスから取得し、室温で凝固させた。血清をウエスタンブロットおよび免疫沈降分析に用いた。
脾臓細胞および腸間膜リンパ節（LN）細胞を無菌状態で取得し、単一細胞懸濁物を、器官をナイロンメッシュスクリーンから穏やかに押し出すことにより取得した。個々のマウスからの脾臓細胞およびリンパ節細胞をプールし、TCM組織培養培地（7.5％ウシ胎児血清、L-グルタミン、L-ピルビン酸、ビタミン、非必須アミノ酸、ゲンタマイシンおよび2-メルカプトエタノールを補充したRPMI1640（Life Technologies，Gaithersburg，MDから入手可能））に再懸濁した。表１に示すように、いかなるマウスからの細胞の回収率にも明らかな違いはなかった。
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脾臓細胞およびリンパ節細胞を、均等に３群に分けた。第１群は洗浄してDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（Life Technologiesから入手可能）に再懸濁し、ペトリ皿に入れてそこにヤギ抗マウス免疫グロブリンを吸着させた。氷上で約30分間インキュベーションした後、非接着細胞（約90％のＴ細胞）を穏やかに取り除き、洗浄して、Ｔ細胞の富化した脾臓細胞およびリンパ節細胞としてＴ細胞増殖アッセイに用いるためにTCMに再懸濁した。そのような細胞の回収を、表１の「Ig接種後」という項目の欄に示す。第２群の細胞は、放射線照射細胞としてＴ細胞増殖アッセイに用いるため、γ線照射（2000R）した。第３群の細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の生成のため、なにも処置しなかった。
すべての実験において、データは、各測定点について３回の測定につき平均±標準偏差として計算した。増殖アッセイについては、データは刺激指数（stimulation index：S.I.）として表し、ここで、S.I.が100とは、免疫しなかったマウスから得たＴ細胞で観察された増殖に等しい。したがって、S.I.が150とは、バックグラウンドより50％高い応答を示す。CTLアッセイについては、データはバックグラウンド、または同時に、死滅を考慮に入れた補正された細胞溶解として表される。
Ｃ．組換えワクシニアウイルスによる細胞の感染
約１×106個のP815マウス白血病細胞を、約１×106プラーク形成単位（pfu）のβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えワクシニアウイルス（Vac-lac）とともに、あるいは約１×106pfuのHIV gp160-SF2を発現する組換えワクシニアウイルス（Vac-SF2；Dr．D．Kuritzkes，University of Colorado Health Sciences Center，Denver，COから入手可能）とともに一晩TCM中でインキュベーションし、それぞれ、P815-Vac-lacおよびP815-Vac-SF2と表される感染した細胞を産生した。同様に、約１×106個のBC10MEマウス線維芽細胞を、約１×106pfuのβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えワクシニアウイルス（Vac-lac）とともに、あるいは約１×106pfuのHIV gp160-SF2を発現する組換えワクシニアウイルス（Vac-SF2）とともに一晩TCM中でインキュベーションし、それぞれ、BC10ME-Vac-lacおよびBC10ME-Vac-SF2と表される感染した細胞を産生した。これらの感染した細胞を遠心分離によりペレット化し、TCMに再懸濁した。増殖アッセイには、感染したBC10ME細胞を50℃に30分間加熱して、いかなる生存ウイルスをも不活化し、抗原含有細胞リゼート源を提供した。CTLアッセイには、感染したP815細胞の細胞質を100μCiのNa251CrO4で標識し、TCMで５×104/mlに希釈した。
Ｄ．体液性免疫応答の刺激
gp160を発現する本発明の酵母媒介物を投与したマウスにおける体液性免疫応答刺激を検出するため、Ｔ細胞増殖アッセイを以下のように行った。Ｔ細胞を富化した脾臓細胞およびリンパ節細胞を、実施例２Ｂに記載したように生成し、TCMで４×106細胞/mlに希釈した。分画せず放射線照射した脾臓細胞およびリンパ節細胞を、実施例２Ｂに記載したように産生し、TCMで４×106細胞/mlに希釈した。各細胞タイプの終濃度が約２×106細胞/mlとなるように、同じマウス由来の富化したＴ細胞および放射線照射細胞を１：１で混合した。100μｌのＴ細胞混合物を、各ウェルが、表２に示すようなTCM中の複数の濃度の抗原または分裂促進物質（mitogen）100μｌを含む96ウェルの丸底プレートのそれぞれのウェルに入れた。
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アッセイは３重に設定し、Ｔ細胞増殖はチミジンの取り込みによって評価した；第３日目および６日目に、25μｌの3HTdR（40μCi/ml）を各ウェルに添加した。約18時間後に、ウェルをグラスファイバーフィルターに採取してシンチレーションカウンターで計測した。
Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表３に示す。
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表３に示す増殖データにおいて、全てのマウスが、抗CD3抗体および抗TCR抗体ならびにコンカナバリンＡによって与えられた分裂促進刺激に同等に応答したということに注意することが重要である。これらの分裂促進物質は、各マウスから同数の応答Ｔ細胞が培養物に添加されたかどうかを評価するために、アッセイに含まれた。マウス３由来の細胞を含むウェルでいかなる刺激に対しても応答がなかったのは未知の理由による。
Ｔ細胞増殖アッセイの結果のいくつかを図１にも示す。図１Ａは、HIVのIIIb株由来のgp120タンパク質（すなわち、gp120-IIIbタンパク質）に応答した第３日目のＴ細胞増殖結果を示す。図１Ｂは、Vac-SF2に感染したBC10ME細胞由来のリゼートに応答した第３日目のＴ細胞増殖結果を示す。図１Ｃは、gp120-IIIbタンパク質に応答した第６日目のＴ細胞増殖結果を示す。図１Ｄは、Vac-SF2に感染したBC10ME細胞由来のリゼートに応答した第６日目のＴ細胞増殖結果を示す。図１Ｅは、無傷のAFY433ベクター対照酵母（すなわち、S.cerevisiae AFY433ベクター(c)）に応答した第３日目のＴ細胞増殖結果を示す。図１Ｆは、無傷のAFY433ベクター対照酵母に応答した第６日目のＴ細胞増殖結果を示す。
HIV gp160-SF2を発現する生きた無傷の酵母で免疫したマウス（マウス７および８）またはHIV gp160-SF2を発現するスフェロプラストで免疫したマウス（マウス９および１０）由来のＴ細胞は、gp120に応答して増殖したが、免疫しなかった動物（マウス１および２）もしくは生きた無傷の対照酵母で免疫した動物（マウス３および４）またはスフェロプラストで免疫した動物（マウス５および６）は、gp120に応答した増殖をしなかった；表３および図１Ａ〜１Ｄ参照。マウス７、８、９および１０から単離したＴ細胞は、精製タンパク質（表３および図１Ａおよび１Ｃ参照）またはgp160-SF2をコードする組換えワクシニアウイルスに感染した細胞のリゼート（表３および図１Ｂおよび図１Ｄ参照）のいずれかの形態としてのHIV gp160に応答した。応答は、第３日目と第６日目に観察された。マウスは、HIVのSF2株から誘導したgp160に対して免疫化されたが、それらのＴ細胞は、HIV IIIb株から単離されたgp120タンパク質に対して、低いが顕著な応答を示したという点に特に注目すべきである。
図１Ｅおよび１Ｆに示した結果は、免疫化したマウス（すなわち、マウス３、４、５、６、７、８、９および１０）のそれぞれから単離したＴ細胞が、用量依存的に無傷の対照AFY433−ベクター(c)酵母に応答したということを示す。第６日目の応答は非常に高かった。そのようなＴ細胞はまた、AFY433−ベクター(s)ならびにAFY435-gp160-SF2(c)およびAFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物にも応答した；表３参照。
AFY433−ベクター(c)、AFY433−ベクター(s)、AFY435-gp160-SF2(c)およびAFY435-gp160-SF2(s)を投与したことに対してマウスによって生成された全体的な免疫応答は、当業者に公知の技術を用いて、各マウスから収集した血清のウエスタンブロット分析により測定した。結果を図２に示す。簡単に述べると、レーン１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１は、AFY435-gp160-SF2酵母リゼート由来の約100μｇのタンパク質をそれぞれ挿入したゲルのレーンを示し；一方、レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０は、約100μｇのAFY433−ベクター酵母リゼートをそれぞれ挿入したゲルのレーンを示す。番号付けしたレーンを以下のマウス由来の血清試料を用いてブロットした：レーン１、マウス１由来；レーン２および３、マウス２由来；レーン４および５、マウス３由来；レーン６および７、マウス４由来；レーン８および９、マウス５由来；レーン１０および１１、マウス６由来；レーン１２および１３、マウス７由来；レーン１４および１５、マウス８由来；レーン１６および１７、マウス９由来；ならびにレーン１８および１９、マウス１０由来。レーン２０および２１は、gp120融合タンパク質で免疫化したウサギから収集した抗血清を用いてブロットした。この研究は、免疫化したマウスが、種々の酵母が誘導したタンパク質に対する抗体を創生したこと、そしてマウス血清によって認識されるタンパク質のパターンが、そのマウスが無傷の酵母で免疫されたかスフェロプラストで免疫されたかに依存することを示した。マウス７、８、９および１０によって生成されるgp160に対する体液性免疫応答は、他の酵母抗原に対して生成された抗血清のバックグラウンド反応性が高かったため、ならびにこの実験で酵母リゼートから回収したgp160が比較的低量だったので、ウエスタンブロットによって区別することができなかった。
まとめると、マウスの全身に誘導された酵母媒介物は、その酵母媒介物によって運ばれた異種タンパク質に応答して増殖し得るＴ細胞の産生を含む、その酵母媒介物のタンパク質に対する活発な免疫応答を刺激した。
Ｅ．細胞仲介性免疫応答の刺激
CTLアッセイは、gp160を発現する本発明の酵母媒介物を投与したマウスにおける細胞仲介性免疫応答刺激を検出するために行われた。CTLは、当業者に公知の技術により生成した。簡単に述べると、約40×106個の、分画も放射線照射もしていない脾臓細胞およびリンパ節細胞を、総容量10mlのTCMに約１×107のAFY435-gp160-SF2(c)および約１×107のAFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物の入ったフラスコに入れ、７日間培養した。フラスコは二重に設定し、一方には、培養期間の開始からＴ細胞成長因子源として、コンカナバリンＡで刺激したラット脾臓細胞（CAS）由来の無細胞上清５％を入れた。第５日目に、すべてのフラスコに５％のCASを添加した。CTLを、ficoll/hypaque密度勾配遠心分離によって採取し、使用のためTCMに再懸濁した。
標準的な技術にしたがって、CTLアッセイを行った。簡単に述べると、CTLを、TCMで約２×107細胞/mlおよび約１×107細胞/mlの濃度に希釈した。100μｌのCTLと100μｌの51Cr標識標的細胞とを、三重に、96ウェルＶ底プレート内で混合した。細胞溶解は、37℃で４時間インキュベーションした後の放射活性クロムの標的細胞からの放出によって測定した。
CTLを、５つの標的細胞集団についてアッセイした：P815、P815-Vac-Lac、P815-Vac-SF2、BC10MEおよびBC10ME-gp160-IIIb（gp160-IIIbを発現するように操作されたトランスフェクションされたBC10ME細胞）。溶解のパーセント値は、２つのエフェクター：標的（E:T）比での、各CTL−標的細胞の組み合わせについて得た。CTLアッセイの標準的な方法を用いて、データは、P815-Vac-SF2についてはP815-Vac-Lacの非特異的溶解について、BC10ME-gp160-IIIbについてはBC10MEの非特異的溶解について、補正した。結果を表４に示す。
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AFY435-gp160-SF2(c)およびAFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物で免疫したマウスから生成されたCTLは、gp160-SF2を発現する細胞を死滅させることができ、そして非常に少なくではあるが、gp160-IIIbを発現する細胞を死滅させることができる。死滅は、E:T比の点からみると、E:T比が高いほど、より多くの標的細胞が死滅するという用量応答性を示した。AFY435-gp160-SF2(c)およびAFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物で免疫したマウスから生成されたCTLによるP815-Vac-SF2細胞の死滅を図３に示す。図３Ａおよび３Ｂは、CASをそれぞれ第５日目および第１日目に添加した別々のアッセイの結果を示す。
マウス３および５から誘導したCTLについてデータがないのは、これらのフラスコからはほとんど細胞が回収されなかったからである。にもかかわらず、データは、無傷の酵母および／または異種タンパク質を発現する酵母から誘導したスフェロプラストを用いて、インビトロおよびインビボでＴ細胞を感作し、その異種タンパク質を発現している細胞を死滅させることができることを確信させる。
この制御された研究で得られた結果は、初期の試験的実験において得られた結果とよく相関する。初期のアッセイでは、AFY435-gp160-SF2(c)またはAFY435-gp160-SF2(s)酵母媒介物のいずれかで免疫化したマウスから生成されたCTLは、P815-Vac-SF2細胞を死滅させることができたが、一方、免疫化しなかったマウスから誘導したCTLは、死滅させることができなかった。試験的および制御された研究のどちらにおいても、死滅の程度は同様であり、無傷の酵母を用いて注射した動物は、スフェロプラストを用いて注射したマウスより強いCTLを生じたようであった。
Ｆ．この実施例で報告する結果は、本発明の酵母媒介物がマウスＴ細胞を感作して異種タンパク質に応答させることができるということを示している。例えば：
（ａ）HIVエンベロープタンパク質gp16-SF2を発現している酵母媒介物を腹腔内注射したマウスの脾臓細胞およびリンパ節細胞から単離したＴ細胞は、gp160-SF2をコードする組換えワクシニアウイルスに感染した細胞の抽出物に応答してインビトロで増殖した。免疫しなかったマウスまたはベクターＤＮＡは含むがgp160-SF2をコードするＤＮＡは含まない組換え酵母で免疫したマウスから誘導したＴ細胞は、そのような細胞抽出物に応答して増殖しはしなかった。
（ｂ）HIVエンベロープタンパク質gp160-SF2を発現している酵母媒介物で免疫したマウス由来の脾臓細胞およびリンパ節細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞前駆体を含み、これは、インビトロの刺激の後、gp160-SF2をコードする組換えワクシニアウイルスに感染した細胞を特異的に死滅させることができた。免疫しなかったマウスまたはベクターＤＮＡは含むがgp160-SF2をコードするＤＮＡは含まない酵母で免疫したマウスから誘導したＴ細胞は、gp160-SF2で感作したCTL前駆体を含んでいなかった。
（ｃ）HIVエンベロープタンパク質gp160-SF2を発現している酵母媒介物で免疫したマウス由来のＴ細胞はまた、異なるHIVクレード、IIIb（LAI）から誘導した精製gp120タンパク質に低いが顕著に応答して増殖した。これらの動物から誘導したCTLはまた、gp120-IIIbを発現している細胞とも明白な交差反応性を示した。これらの結果は、HIV gp160タンパク質を発現している酵母媒介物は、別のHIV単離物のgp160タンパク質との交差反応性免疫を誘導し得ることを示唆する。
（ｄ）無傷のAFY435-gp160-SF2酵母から誘導したスフェロプラストを注射したマウスは、gp160-SF2タンパク質のみならずgp120-IIIbタンパク質に対しても増殖および細胞傷害性アッセイにおいて応答し、そのことは、スフェロプラストを無傷の酵母の代わりに免疫化に用いることができることを示唆する。
（ｅ）無傷の酵母またはスフェロプラストによる免疫は、アジュバントの投与を必要としなかった。無傷の酵母またはスフェロプラストを腹腔内注射したマウスは、注射を繰り返しても、いかなる不都合な効果も示さなかった。
まとめると、Ｔ細胞増殖性応答が引き出されただけでなく（ヘルパーＴ細胞の感作を示す）、CTL活性（細胞仲介性免疫を示す）もまた誘導された。CTL活性の感作は、免疫系による酵母の独特の操作（無傷の酵母およびスフェロプラストに関して示された）が、クラスII（ヘルパーＴ細胞に対して）およびクラスＩ（CTL前駆体に対して）を介した抗原提示を導くことを示唆する。両タイプのＴ細胞の感作は、アジュバント不在下で起こり、そのことは、酵母媒介物がそれら自身のアジュバントとして機能し得ることを示唆する。さらに、免疫したマウスが、本来の酵母またはスフェロプラストの注射に際して典型的なアジュバント反応（すなわち、望ましくない副作用）を示さなかったことは、本発明の酵母媒介物の安全性を示すものである。
実施例３
この実施例は、本発明の酵母媒介物が安全であり、免疫傷害（immunocompromised）動物においてさえ、例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球のどちらも不全であるSCIDマウスにおいてさえ、安全であることを示す。
２匹のCB.17scidマウス（Jackson Labs，Bar Harbor，MEから入手可能）に、100μｌの注射緩衝液中の約２×107のAFY435-gp160-SF2(c)を腹腔内注射した。さらに２匹のCB.17scidマウスに、100μｌの注射緩衝液中の約２×107のAFY435-gp160-SF2(s)を腹腔内注射した。免疫したマウスを、１０日の期間にわたり毎日モニターしたが、注射した部位で、もしくは全体的な健康の変化にも、不都合な反応は示さなかった。
注射後１０日目にマウスを炭酸ガス吸入により屠殺した。腹膜灌流を、５mlの滅菌PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて行った。各マウス由来の約200μｌの灌流物を、富化培地（rich medium）（例えば、酵母馬鈴薯デキストロース培地）あるいは酵母増殖のための選択的規定培地を含む別々のペトリ皿に塗布した。このペトリ皿を室温で７日間インキュベーションしたが、その間酵母の生長は観察されなかった。注射に用いた酵母調製物の試料が入っていた対照のペトリ皿は生長を示し、このことは、マウスが生きた酵母を注射されたことを示す。
実施例４
この実施例は、本発明の酵母媒介物が、大きな霊長動物において安全であり、抗原特異的Ｔ細胞増殖を刺激することを示す。
Ａ．マカーク（Macaque）サルのワクチン接種
９匹のブタオザル（pig-taled macaque）（Macaca nemestrina）に、スケジュールに従ってワクチン接種した。このスケジュールでは、数組のブタオザルに、３週間にわたって毎週HIV gp160-SF2糖タンパク質を発現しているか発現していない１×107個の、またくは５×107個の組換え酵母を注射した。１匹のマカークザルを注射しない対照とした。用いたワクチン接種プロトコールを表５に示す。ワクチン接種は、実施例３に記載したプロトコールにしたがって行った。ワクチン接種は第１日目に腹腔内に投与した。ワクチンは、第８日目に右腕に1/2は筋肉内にそして1/2は皮下に投与した。ワクチンは、第１５日目に左腕に1/2は筋肉内にそして1/2は皮下に投与した。注射した部位には不都合な反応は観察されなかった。
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Ｂ．マカークザルリンパ球の単離
約７mlの末梢血液を、各免疫時に各サルから収集した。２mlを凝固させて、抗gp160-SF2抗体の存在を検出するためのELISAおよびウエスタンブロット分析に用いるための血清を得た。残りの５mlを、Ｔ細胞増殖アッセイおよびCTLアッセイ用の末梢血単核細胞（PBMC）の単離のために用いた。この５mlの血液を防腐剤を含まないヘパリンと直ちに混合し、7.5％の熱で不活化したウシ胎児血清、L-グルタミン、L-ピルビン酸、非必須アミノ酸、ビタミン、ゲンタマイシンおよび2-メルカプトエタノールを補充したRPMI1640からなる組織培養培地（TCM）で1:1に希釈した。希釈した細胞を、95％Histiopaque 1077：5％RPMI 1640上に注意深く重層した。PBMCを界面から取り出し、２回洗浄して、インビトロアッセイに用いるためTCMに再懸濁した。
最後にワクチン接種してから約６９日後に、動物を屠殺し、その時に末梢血液、腋窩リンパ節および脾臓を回収した。約50mlの血液を各動物から取得し、腋窩リンパ節と脾臓を採取した。細胞懸濁物を脾臓およびリンパ節から、器官を細片に切断し、その後Dounceホモジナイザーを用いて破砕することにより調製した。単核細胞を直前に記載したように単離した。すべての細胞操作は、凝固を防ぐため防腐剤を含まないヘパリンの存在下で行った。
Ｃ．Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞増殖アッセイは、実施例２に記載した方法に従って各動物から単離したPBMCを用いて行った。マカークザルの末梢血液単核細胞（PBMC）の上清を５μg/mlコンカナバリンＡ（Con A）存在下で24時間刺激し、それをサルのＴ細胞のＴ細胞成長因子源としてＴ細胞増殖アッセイに用いた。
最初のワクチン接種前に動物から得たPBMC、リンパ節細胞および脾臓細胞は、分裂促進刺激に活発に応答し（Con AおよびPHAに対する刺激指数>50）、そしてHIV gp160-SF2を発現しない熱処理した組換え酵母（“酵母-”）またはHIV gp160-SF2を発現している組換え酵母（“酵母+”）に応答した（S.I.<5）（データは示していない）。第１回目のワクチン接種の約２週間後、ワクチンレシピエントから単離した細胞は、生きた、または加熱した酵母に対して、ワクチン接種しなかったサル＃９と比べて、明らかに用量依存性に（投与した酵母の数の増加に基づいて）増強された増殖応答を示した。単離したマカークザルリンパ球をＴ細胞成長因子の存在下で２日間または４日間インキュベーションした。屠殺後にマカークザルのPBMC集団、リンパ節細胞集団および脾臓細胞集団を用いて行ったこれらの増殖アッセイの結果を、表６に示す。データは、１分間あたりのカウント±標準偏差として示されるS.I.値を計算するために用いられるバックグラウンド増殖とともに、刺激指数±標準偏差として表される。
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表６のデータに見られるように、最後のワクチン接種の６９日後に、酵母-または酵母+をワクチン接種したサルから単離したPBMC、リンパ節細胞および脾臓細胞の集団は、それぞれ用量依存的に酵母抗原に応答する能力を保持していた。重要なのは、酵母-ではなく酵母+をワクチン接種したサルからのリンパ球集団もまた、精製gp120-SF2（酵母およびCHO由来）に応答し、それにより観察されたＴ細胞増殖が抗原特異的であることが示された。したがって、この結果は、対照酵母-および酵母+はどちらもサルにおいてＴ細胞応答を誘導することを示す。しかし、酵母+単独では、gp120-SF2特異的Ｔ細胞応答を誘導する。まとめると、この結果は、霊長類を用いた大きな動物おける本発明の酵母媒介物の安全性と効率を確認するものである。
これらの実験は、免疫不全動物においてさえ、本発明の酵母媒介物が安全であることを示す。
本発明の種々の実施態様を詳細に記載してきたが、当業者がこれらの実施態様の変更および適合化を想起するのは明らかである。しかし、そのような変更および適合化は、以下の請求項に記載するように、本発明の範囲内にあることが明確に理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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