(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に対する処置の効果を評価する方法であって、下記を含む当該方法：
バーシカンプロモーター又は血管内皮成長因子プロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を用意し；
該処置を該トランスジェニック動物に施与し；そして
該レポーター遺伝子の発現を評価し、
それにより、該処置を皮膚に対するその効果につき評価する。
【請求項２】
前記の処置が、前記のトランスジェニック動物の皮膚に化合物を塗布することにより投与される該化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のトランスジェニック動物を、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット及びトランスジェニックマウスよりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記のバーシカンプロモーター又は血管内皮成長因子プロモーターが、ヒトのバーシカンプロモーター又は血管内皮成長因子プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記のレポーター遺伝子を、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記の処置のその後の施与を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記のレポーター遺伝子の発現を対照値と比較することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記のトランスジェニック動物が、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子を含み、第１の皮膚代謝関連プロモーターが第２の皮膚代謝関連プロモーターと異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
レポーター遺伝子の発現の評価のステップを、動物の生きている間に少なくとも一回反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記のステップの最初の及びその後の反復を、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることのできる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
最初の及びその後の反復を生きている動物で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バーシカンプロモーター又は血管内皮成長因子プロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
非ヒトトランスジェニック動物におけるトランスジーンの発現の分析方法であって、下記を含む当該分析方法：
生きているトランスジェニック動物を用意し；
その生きているトランスジェニック動物において、バーシカンプロモーター又は血管内皮成長因子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の存否を評価し；
それにより、トランスジーンの発現を分析する。
【請求項１４】
レポーターがＧＦＰである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
評価のステップを、動物の生きている間に少なくとも一回反復する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
この発明は、皮膚の健康、加齢又は外観に関係する遺伝子のプロモーター(例えば、バーシカン、ＶＥＧＦ又はＭＭＰプロモーター)と結合されたレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック動物及び皮膚に対する処置例えば化合物の効果の評価におけるかかる動物の利用方法に関係する。
【０００２】
発明の要約
本願発明者は、レポーター遺伝子に結合された皮膚の新陳代謝のプロモーターを含む少なくとも一つの構築物を有するトランスジェニック動物が、皮膚の健康若しくは外観の増進に利用するための毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)等の処置又は化合物の投与を評価するために利用できることを発見した。
【０００３】
従って、この発明は、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)等の処置又は化合物の投与を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。この方法は、下記を含む：
【０００４】
皮膚の代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子(好ましくは、ヒトのレポーター)を有するトランスジェニック動物を用意し；
【０００５】
処置をこのトランスジェニック動物又はその組織に施与し；そして
【０００６】
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、この処置の皮膚に対する効果を評価する。
【０００７】
この処置(例えば、化合物の投与)を、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得た組織(例えば、細胞)に施与することができる。
【０００８】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果を、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物から得た組織において評価することができる。
【０００９】
好適具体例において、評価は、共焦点顕微鏡を用いるシグナル(例えば、蛍光シグナル)の検出を含む。
【００１０】
好適具体例において、このレポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。最初の及びその後の反復の両方とも、生きている動物について、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００１１】
好適具体例において、この処置は、化合物の投与を含み、その化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚又は皮下注射)することにより投与することができる。好適具体例においては、この化合物を、適当な送達用ビヒクル(例えば、界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤、例えばＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与することができる。
【００１２】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば、無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【００１３】
好適具体例において、プロモーターは、トランスジェニック動物に対して異種性である(即ち、プロモーターは、他の種に由来する)。他の好適具体例においては、プロモーターは、トランスジェニック動物と同じ種に由来する。特に好適な具体例においては、皮膚代謝関連プロモーターは、ヒトの皮膚代謝関連プロモーターである。
【００１４】
特に好適な具体例において、皮膚代謝関連プロモーターは：膜貫通蛋白質又は細胞外マトリクスの成分をコードする遺伝子由来のプロモーター(例えば、プロテオグリカンプロモーター例えばバーシカンプロモーター)；皮膚で発現されるプロテアーゼ例えばマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)由来のプロモーター、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８又はＭＭＰ９プロモーター；血管機能に影響を及ぼす遺伝子由来のプロモーター例えば血管内皮成長因子プロモーター；ヒアルロナンシンターゼプロモーター(例えば、ヒアルロナンシンターゼ１プロモーター、ヒアルロナンシンターゼ２プロモーター又はヒアルロナンシンターゼ３プロモーター)；皮膚で発現されるコラゲナーゼのプロモーター、例えばＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくはＭＭＰ９)プロモーター；又は好中球エラスターゼプロモーターである。
【００１５】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００１６】
好適具体例においては、処置を、レポーター遺伝子評価の評価の前に反復施与する。
【００１７】
好適具体例においては、この処置は、化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与する。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は他の皮膚にダメージを与える処理)の前に、照射中に又は照射後に投与する。
【００１８】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【００１９】
好適具体例において、このトランスジェニック動物は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含む(ここに、第２の皮膚代謝関連プロモーターは、第１の皮膚代謝関連プロモーターとは異なる)。この第１のプロモーターに結合されたレポーター遺伝子は、第２のプロモーターに結合されたレポーター遺伝子と同じであっても異なってもよい。例えば、このトランスジェニック動物は：バーシカンプロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及び血管内皮成長因子プロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができ；バーシカンプロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及びヒアルロナンシンターゼプロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができ；ヒアルロナンシンターゼプロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及び血管内皮成長因子プロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができ；マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)プロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及びＭＭＰ２若しくはＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができ；マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)プロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及び好中球エラスターゼプロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができ；又はＭＭＰ２若しくはＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターに結合された第１のレポーター遺伝子及び好中球エラスターゼプロモーターに結合された第２のレポーター遺伝子を含むことができる。好適具体例において、トランスジェニック動物は、２つの構築物(両方ともアップレギュレートされる)を含むことができる。好適具体例において、トランスジェニック動物は、２つの構築物(両方ともダウンレギュレートされる)を含むことができる。
【００２０】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現の評価を含む。
【００２１】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【００２２】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【００２３】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
【００２４】
バーシカンプロモーター(好ましくはヒトのもの)に結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
【００２５】
処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)}を施与し又は化合物をトランスジェニック動物若しくはその動物由来の組織に投与し；そして
【００２６】
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、この処置を皮膚の加齢に対するその効果について評価する。
【００２７】
この処置(例えば、化合物の投与)は、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)は、トランスジェニック動物に由来する組織(例えば、細胞)に施与することができる。
【００２８】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果は、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物由来の組織において評価することができる。
【００２９】
好適具体例において、評価は、共焦点顕微鏡を用いてシグナル(例えば、蛍光シグナル)を検出することを含む。
【００３０】
好適具体例において、レポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に、少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。最初の及びその後の反復の両方とも、生きている動物において、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００３１】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、その化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚若しくは皮下注射)することにより投与される。好適具体例において、この化合物を、適当な送達用ビヒクル例えば界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤(例えば、ＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与する。
【００３２】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【００３３】
特に好適な具体例において、バーシカンプロモーターは、ヒトのバーシカンプロモーターである。
【００３４】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００３５】
好適具体例においては、この処置を、反復して、好ましくはレポーター遺伝子評価の評価の前に施与する。
【００３６】
好適具体例においては、この処置は化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例においては、この化合物を、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与する。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は他の皮膚にダメージを与える処置)の前、照射中又は照射後に投与する。
【００３７】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理トランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【００３８】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００３９】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【００４０】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【００４１】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
【００４２】
マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーター(好ましくはヒトのもの)に結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
処置をそのトランスジェニック動物又はそれから得た組織に施与し；そして
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、その処置の皮膚の加齢に対する効果について評価する。
【００４３】
この処置(例えば、化合物の投与)は、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得られた組織(例えば、細胞)に施与する。
【００４４】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果を、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物から得た組織において評価することができる。
【００４５】
好適具体例において、評価は、共焦点顕微鏡を用いるシグナル(例えば、蛍光シグナル)の検出を含む。
【００４６】
好適具体例において、レポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。この最初の及びその後の反復の両方を、生きている動物において、例えば、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００４７】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、この化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚若しくは皮下注射)することにより投与される。好適具体例において、この化合物は、適当な送達用ビヒクル例えば界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤(例えば、ＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて、投与される。
【００４８】
好適具体例において、このトランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【００４９】
特に好適な具体例においては、マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターは、ヒトのマトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターである。
【００５０】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例において、このレポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００５１】
好適具体例において、この処置を、反復して、好ましくはレポーター遺伝子評価の評価の前に施与する。
【００５２】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例において、この化合物は、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与される。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は、他の皮膚にダメージを与える処置)の前、照射中又は照射後に投与する。
【００５３】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【００５４】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００５５】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【００５６】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をこのトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【００５７】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
【００５８】
血管内皮成長因子プロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
そのトランスジェニック動物に処置を施与し；そして
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、その処置の皮膚の加齢に対する効果を評価する。
【００５９】
この処置(例えば、化合物の投与)は、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得られた組織(例えば、細胞)に施与する。
【００６０】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果を、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物から得られた組織において評価することができる。
【００６１】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【００６２】
好適具体例において、レポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。この最初の及びその後の反復の両方は、生きている動物において、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００６３】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、その化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚又は皮下注射)することにより投与される。好適具体例において、この化合物を、適当な送達用ビヒクル例えば界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤(例えば、ＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与する。
【００６４】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、トランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【００６５】
特に好適な具体例においては、血管内皮成長因子プロモーターは、ヒトの血管内皮成長因子プロモーターである。
【００６６】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００６７】
好適具体例においては、処置を、反復して、好ましくは、レポーター遺伝子評価の評価の前に施与する。
【００６８】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例においては、この化合物を、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与する。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、ＵＶ照射(又は、他の皮膚にダメージを与える処置)の前、照射中又は照射後に、トランスジェニック動物に投与する。
【００６９】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を、対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【００７０】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【００７１】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【００７２】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【００７３】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
【００７４】
ヒアルロナンシンターゼプロモーター(好ましくは、ヒトのもの)に結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
このトランスジェニック動物に処置を施与し；そして
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、この処置を皮膚の加齢に対するその効果について評価する。
【００７５】
この処置(例えば、化合物の投与)は、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得られた組織(例えば、細胞)に施与する。
【００７６】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果は、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物から得られた組織において評価することができる。
【００７７】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【００７８】
好適具体例において、レポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。最初の及びその後の反復の両方とも、生きている動物について、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００７９】
好適具体例において、この処置は、化合物の投与を含み、その化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚又は皮下注射)することにより投与することができる。好適具体例においては、この化合物を、適当な送達用ビヒクル(例えば、界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤、例えばＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与することができる。
【００８０】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【００８１】
特に好適な具体例において、ヒアルロナンシンターゼプロモーターは、ヒトのヒアルロナンシンターゼプロモーターである。
【００８２】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００８３】
好適具体例においては、この処置を、反復して、好ましくは、レポーター遺伝子評価の評価前に施与する。
【００８４】
好適具体例においては、この処置は、化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与する。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は他の皮膚にダメージを与える処理)の前に、照射中に又は照射後に投与する。
【００８５】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【００８６】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現の評価を含む。
【００８７】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【００８８】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【００８９】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
ＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーター(好ましくは、ヒトのもの)に結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
このトランスジェニック動物又はそれから得られた組織に処置を施与し；そして
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、この処置を皮膚の加齢に対するその効果について評価する。
【００９０】
この処置(例えば、化合物の投与)を、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得た組織(例えば、細胞)に施与することができる。
【００９１】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果を、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくはトランスジェニック動物から得た組織において評価することができる。
【００９２】
好適具体例において、評価は、共焦点顕微鏡を用いるシグナル(例えば、蛍光シグナル)の検出を含む。
【００９３】
好適具体例において、このレポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。最初の及びその後の反復の両方とも、生きている動物について、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【００９４】
好適具体例において、この処置は、化合物の投与を含み、その化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚又は皮下注射)することにより投与することができる。好適具体例においては、この化合物を、適当な送達用ビヒクル(例えば、界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤、例えばＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与することができる。
【００９５】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば、無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。
【００９６】
特に好適な具体例において、ＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターは、ヒトのＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターである。
【００９７】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【００９８】
好適具体例においては、この処置を、反復して、好ましくは、レポーター遺伝子の評価の評価前に施与する。
【００９９】
好適具体例においては、この処置は、化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与する。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は他の皮膚にダメージを与える処理)の前に、照射中に又は照射後に投与する。
【０１００】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【０１０１】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【０１０２】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【０１０３】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の処置をトランスジェニック動物に施与することを含む。この第２の処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、又は毛の除去(例えば、摘み取り、剃り又は脱毛剤を塗布することによる)を含んでよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この第２の処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。処置に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、第２の処置の存在下で測定することができ、適宜、この第２の処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【０１０４】
他の面において、この発明は、処置{例えば、毛の除去(例えば、摘み取り又は剃ることによる)又は化合物の投与}を皮膚に対するその効果について評価する方法を特徴とする。その方法は、下記を含む：
好中球エラスターゼプロモーター(好ましくはヒトのもの)に結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を用意し；
処置をそのトランスジェニック動物又はそれから得た組織に施与し；そして
レポーター遺伝子の発現を評価し、それにより、その処置の皮膚の加齢に対する効果について評価する。
【０１０５】
この処置(例えば、化合物の投与)は、生きている動物に施与することができる。他の具体例においては、この処置(例えば、化合物の投与)を、トランスジェニック動物から得られた組織(例えば、細胞)に施与する。
【０１０６】
この処置(例えば、化合物の投与)の効果を、生きているトランスジェニック動物、死んだトランスジェニック動物又は生きている若しくは死んだトランスジェニック動物から得た組織において評価することができる。
【０１０７】
好適具体例において、評価は、共焦点顕微鏡を用いるシグナル(例えば、蛍光シグナル)の検出を含む。
【０１０８】
好適具体例において、レポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。この最初の及びその後の反復の両方を、生きている動物において、例えば、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【０１０９】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、この化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚若しくは皮下注射)することにより投与される。好適具体例において、この化合物は、適当な送達用ビヒクル例えば界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤(例えば、ＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて、投与される。
【０１１０】
好適具体例において、このトランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１１１】
特に好適な具体例においては、好中球エラスターゼプロモーターは、ヒトの好中球エラスターゼプロモーターである。
【０１１２】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例において、このレポーター遺伝子は、べータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１１３】
好適具体例において、この処置を、反復して、好ましくはレポーター遺伝子評価の評価の前に施与する。
【０１１４】
好適具体例において、この処置は化合物の投与を含み、この方法は、更に、この化合物のトランスジェニック動物への少なくとも一回の後続の投与を含む。好適具体例において、この化合物は、トランスジェニック動物に、少なくとも１、２、３週又は４週間の期間にわたって投与される。この化合物は、一定のレベルで又は種々のレベルの範囲で投与することができる。好適具体例において、この化合物を、トランスジェニック動物に、ＵＶ照射(又は、他の皮膚にダメージを与える処置)の前、照射中又は照射後に投与する。
【０１１５】
好適具体例において、この方法は、更に、レポーター遺伝子の発現を対照値(例えば、未処理のトランスジェニック動物におけるレポーター遺伝子の発現レベル)と比較することを含む。
【０１１６】
好適具体例において、この方法は、更に、第２の皮膚代謝関連プロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現を評価することを含む。
【０１１７】
好適具体例において、この化合物は：化粧品用であり；無毒性の物質であり；少なくとも一の管轄区においてヒト用の薬又は化粧品用途について認可されている物質であり；レチノイド若しくはその誘導体であり；ＴＧＦβであり；又はＴＧＦαである。
【０１１８】
好適具体例において、この方法は、更に、処置(この化合物以外のもの)をトランスジェニック動物に施与することを含む。この処置は、皮膚を傷つけ若しくはダメージを与え、皮膚細胞を殺すものであってよく、一般的に、皮膚の望ましくない状態を誘導する。この処置は、水、乾燥剤、刺激物、刺激剤、光又はＵＶ照射を加えることであってよい。この化合物に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現は、この処置の存在下で測定することができ、適宜、この処置の非存在下で見られる応答と比較することができる。
【０１１９】
他の面において、この発明は、ここに記載の非ヒトトランスジェニック動物例えばバーシカンプロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物を特徴とする。
【０１２０】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１２１】
特に好適な具体例において、バーシカンプロモーターは、ヒトのバーシカンプロモーターである。
【０１２２】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１２３】
他の面において、この発明は、マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物(例えば、マウス)又はそれから得られた組織を特徴とする。
【０１２４】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１２５】
特に好適な具体例において、マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターは、ヒトのマトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターである。
【０１２６】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１２７】
他の面において、この発明は、血管内皮成長因子プロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物(例えば、マウス)又はそれから得られた組織を特徴とする。
【０１２８】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１２９】
特に好適な具体例において、血管内皮成長因子プロモーターは、ヒトの血管内皮成長因子プロモーターである。
【０１３０】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１３１】
他の面において、この発明は、ヒアルロナンシンターゼプロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物(例えば、マウス)又はそれから得られた組織を特徴とする。
【０１３２】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１３３】
特に好適な具体例において、ヒアルロナンシンターゼプロモーターは、ヒトのヒアルロナンシンターゼプロモーターである。
【０１３４】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１３５】
他の面において、この発明は、ＩＶ型コラゲナーゼプロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物(例えば、マウス)又はそれから得られた組織を特徴とする。
【０１３６】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１３７】
特に好適な具体例において、ＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターは、ヒトのＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーターである。
【０１３８】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１３９】
他の面において、この発明は、好中球エラスターゼプロモーターに結合されたレポーター遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物(例えば、マウス)又はそれから得られた組織を特徴とする。
【０１４０】
好適具体例において、トランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１４１】
特に好適な具体例において、好中球エラスターゼプロモーターは、ヒトの好中球エラスターゼプロモーターである。
【０１４２】
好適具体例において、レポーター遺伝子は、比較的容易に検出することのできる産物例えば酵素(例えば、有色の又は発光性の産物を生成する酵素)をコードする。特に好適な具体例においては、レポーター遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子であってよい。
【０１４３】
他の面において、この発明は、ここに記載のプロモーター−レポーター遺伝子構築物を特徴とする。
【０１４４】
他の面において、この発明は、組織中のＧＦＰの存在又は分布の分析方法を特徴とする。この方法は、下記を含む：
ＧＦＰを含む組織試料(例えば、組織切片)を用意し；
蛍光放射又は蛍光放射の欠如を評価又は検出し、該検出ステップを、水溶液での洗浄又は固定前に行い、
それにより、組織中のＧＦＰを分析する。
【０１４５】
好適具体例においては、組織を、検出ステップの前に凍結する。その試料は、検出の前には、固定剤と接触させない。
【０１４６】
好適具体例において：この組織は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニックのミニブタ、モルモット、ラット又はマウス例えば無毛若しくはヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスに由来し；ＧＦＰは、ＧＦＰをコードするトランスジーン配列から又はトランスジーン制御エレメント(例えば、トランスジーンプロモーター又はエンハンサー)の制御下で発現される。
【０１４７】
好適具体例において、プロモーターは、ヒトのプロモーターである。
【０１４８】
好適具体例において、検出は、試料の顕微鏡(例えば、蛍光顕微鏡又はエピ蛍光顕微鏡)を用いる検査を含む。
【０１４９】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【０１５０】
ここに記載の動物は、この方法において、用いることができる。
【０１５１】
他の面において、この発明は、毛嚢(例えば、毛嚢の外側毛根鞘)においてレポーター分子を発現している動物の毛周期のステージの測定方法を特徴とする。この方法は、レポーター発現の存否を評価又は検出することを含み、該発現の存在は発育中の毛周期(生長期)と関係し、非存在は休止中の毛周期(休止期及び退行期)と関係する。
【０１５２】
好適具体例において、レポーター分子は、毛嚢(例えば、外側毛根鞘)で発現されるプロモーターの制御下にある。
【０１５３】
好適具体例において、プロモーターは、ヒトのプロモーターである。
【０１５４】
好適具体例において、レポーター分子は、ＧＦＰである。
【０１５５】
好適具体例において：動物は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニックのミニブタ、モルモット、ラット又はマウス例えば無毛若しくはヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスである。
【０１５６】
ここに記載の動物は、この方法において、用いることができる。
【０１５７】
好適具体例において、プロモーターは、ＶＥＧＦプロモーター、バーシカンプロモーター又は他のここに記載のプロモーターである。
【０１５８】
他の面において、この発明は、傷の治癒の分析方法を特徴とする。この方法は：レポーター分子をＶＥＧＦプロモーターの制御下で発現する動物を用意し、傷におけるレポーター分子の存否を検出し、それにより、傷の治癒を分析することを含む。
【０１５９】
好適具体例において、検出ステップが報告される。
【０１６０】
好適具体例において、動物、その動物由来の組織を処置にかける(例えば、化合物の投与)。かかる具体例においては、この方法を用いて、傷の治癒に対するこの処置の効果を評価することができる。処置した患者又は組織からの結果を未処理の患者又は組織と比較することは望ましいであろう。
【０１６１】
好適具体例において、レポーター分子は、ＧＦＰである。
【０１６２】
好適具体例において：動物は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニックのミニブタ、モルモット、ラット又はマウス例えば無毛若しくはヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスである。
【０１６３】
ここに記載の動物は、この方法において、用いることができる。
【０１６４】
好適具体例において、プロモーターは、ヒトのプロモーターである。
【０１６５】
他の面において、この発明は、ＧＦＰトランスジーンを有するトランスジェニック動物におけるＧＦＰ発現の分析方法を特徴とする。この方法は、下記の：
その動物又はその動物に由来する組織中のＧＦＰの存否を評価し又は検出する第１のステップ；及び(適宜)
その動物又はその動物に由来する組織中のＧＦＰの存否を評価し又は検出する第２のステップ；を含み、そして
それにより、ＧＦＰ発現を分析する。
【０１６６】
好適具体例において(この方法及びここに開示した他の方法において)、ＧＦＰは、赤色シフトしたＧＦＰである。
【０１６７】
好適具体例において：動物は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニックのミニブタ、モルモット、ラット又はマウス例えば無毛若しくはヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスである。ここに記載の動物は、この方法において、用いることができる。
【０１６８】
好適具体例において、少なくとも１、５、１０、２０、３０又は６０、１８０、３６５日が、第１のステップと第２のステップの間で経過する。
【０１６９】
好適具体例において、組織は、皮膚組織である。
【０１７０】
好適具体例において、検出ステップは、生きている動物において実施する。
【０１７１】
好適具体例において、プロモーターは、ヒトのプロモーターである。
【０１７２】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【０１７３】
他の面において、この発明は、トランスジーンのトランスジェニック動物(例えば、トランスジェニックマウス又はブタ)における発現の分析方法を特徴とする。この方法は、下記を含む：
生きているトランスジェニック動物を用意し；
トランスジーン配列によりコードされ又はトランスジーン制御エレメント(例えば、プロモーター又はエンハンサー)の制御下にあるレポーター遺伝子(例えば、ＧＦＰ)の存否を評価又は検出し；
それにより、トランスジーンの発現を分析する。
【０１７４】
好適具体例において：動物は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニックのミニブタ、モルモット、ラット又はマウス例えば無毛若しくはヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスである。ここに記載の動物は、この方法において、用いることができる。
【０１７５】
好適具体例において、レポーターは、ＶＥＧＦプロモーター又は他のここに記載のプロモーターの制御下にある。
【０１７６】
好適具体例において、プロモーターは、ヒトのプロモーターである。
【０１７７】
好適具体例において、プロモーターは、皮膚で発現されるものである。
【０１７８】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【０１７９】
好適具体例において、組織は、皮膚組織である。
【０１８０】
好適具体例において、検出ステップは、生きている動物において実施する。
【０１８１】
好適具体例において、この方法は、動物の生きている間に、少なくとも一回反復される。この方法の最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。
【０１８２】
他の面において、この発明は、生きている動物における遺伝子発現の評価方法を特徴とする。この方法は下記を含む：
レポーター遺伝子例えばＧＦＰ(例えば赤色シフトＧＦＰ)を含むトランスジーンを有する生きているトランスジェニック動物を用意し；
この生きているトランスジェニック動物におけるレポーター分子(例えば、ＧＦＰ)の存否を評価又は検出し、それにより、この生きている動物における遺伝子発現を評価する。
【０１８３】
好適具体例において、レポーター遺伝子をコードする配列は、予め選択したプロモーター(例えば、ヒトのプロモーター)の制御下にある。この予め選択したプロモーターは、皮膚代謝関連プロモーター例えば：膜貫通蛋白質又は細胞外マトリクスの成分をコードする遺伝子由来のプロモーター(例えば、プロテオグリカンプロモーター例えばバーシカンプロモーター)；皮膚で発現されるプロテアーゼ例えばマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)由来のプロモーター、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８又はＭＭＰ９プロモーター；血管機能に影響を及ぼす遺伝子由来のプロモーター例えば血管内皮成長因子プロモーター；ヒアルロナンシンターゼプロモーター(例えば、ヒアルロナンシンターゼ１プロモーター、ヒアルロナンシンターゼ２プロモーター又はヒアルロナンシンターゼ３プロモーター)；皮膚で発現されるコラゲナーゼのプロモーター、例えばＭＭＰ２又はＭＭＰ９(好ましくはＭＭＰ９)プロモーター；又は好中球エラスターゼプロモーターであってよい。
【０１８４】
ＶＥＧＦプロモーターは、好適なプロモーターである。好適具体例において、このプロモーターは、炎症性血管形成又は新生物生長においてアップレギュレート又はダウンレギュレートされるものである。
【０１８５】
好適具体例において、動物は、非ヒトトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、トランスジェニックミニブタ、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックラット又はトランスジェニックマウス、例えば無毛マウス、ヌードマウス、老化促進マウス例えばＳＡＭマウス(Takeda等,1991,L.Am.Geriatr.39:911-919参照)又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウスであってよい。最も好適な動物は、マウスである。
【０１８６】
好適具体例においては、処置を、レポーター遺伝子発現の評価の前、評価中又は評価後の何れかにおいて動物に施与する。この処置は、化合物の投与であってよい。この化合物は：それをトランスジェニック動物の皮膚に塗布することにより；全身投与することにより；経口投与することにより；又は注射(好ましくは、皮膚又は皮下注射)することにより投与することができる。好適具体例においては、この化合物を、適当な送達用ビヒクル、例えば界面活性剤又は皮膚の透過性を増大させる薬剤(例えば、ＳＤＳ又はＤＭＳＯ含有配合物)を用いて投与することができる。
【０１８７】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【０１８８】
好適具体例において、評価は、シグナル(例えば、蛍光シグナル)の共焦点顕微鏡を用いる検出を含む。
【０１８９】
好適具体例において、このレポーター遺伝子の発現の評価のステップは、動物の生きている間に少なくとも一回反復される。このステップの最初の及びその後の反復は、１、１０、３０、６０、９０、１８０、３６５又は７００日に分けることができる。最初の及びその後の反復の両方とも、生きている動物について、例えば共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。
【０１９０】
この発明の方法は、完全な動物を用いてイン・ビボで、又はイン・ビトロで即ちここに記載のトランスジェニック動物由来の組織(例えば、皮膚)若しくは細胞を用いて、好ましくは皮膚代謝プロモーター／レポーター遺伝子構築物でトランスフォームした細胞由来の皮膚細胞若しくは組織を用いて実施することができる。
【０１９１】
ここで用いる場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の少なくとも一つの細胞好ましくは本質的にすべての細胞がトランスジーンを含む動物例えば非ヒト哺乳動物例えばミニブタ、モルモット又はゲッ歯類(例えば、マウス若しくはラット)である。トランスジーンは、例えばマイクロインジェクション、トランスフェクション又は感染(例えば、組換えウイルスを用いる感染)により、細胞に直接導入することができ又は、その細胞の前駆細胞に導入することにより間接的に導入することができる。用語遺伝子操作は、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は、染色体内に組み込まれ得るが、或いは、染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。
【０１９２】
トランスジェニック動物は、例えば、トランスジーンに関してヘテロ接合であってもホモ接合であってもよい。
【０１９３】
ここで用いる場合、用語「ゲッ歯類」は、系統発生論のゲッ歯目のすべてのメンバーをいう。
【０１９４】
ここで用いる場合、用語「レポーター遺伝子」は、皮膚代謝関連プロモーターの下流にその発現がこのプロモーターの制御下になるように融合された核酸配列をいう。レポーター遺伝子は、通常、活性が容易に測定できる蛋白質をコードする。例えば、レポーター遺伝子は、その細胞中で自然には見出されないアッセイ可能な酵素をコードする遺伝子(例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ等)であってよい。
【０１９５】
ここで用いる場合、用語「皮膚代謝関連プロモーター」は、皮膚において転写的に活性なプロモーターをいう。それは、皮膚特異的である必要はない。このプロモーターが天然において見出される遺伝子は、皮膚の維持又は適当な機能に関与する遺伝子であり得る。例えば、その遺伝子は、細胞外マトリクスの部分である蛋白質、細胞外マトリクスの維持若しくは分解に関与する蛋白質、又は皮膚への栄養の供給に関与する蛋白質をコードする遺伝子であってよい。
【０１９６】
ここで用いる場合、「化合物の動物への投与」は、治療剤を動物又は細胞に分配し、送達し又は塗布することをいう。投与は、局所的投与、非経口又は経口経路、筋肉注射、皮下／皮内注射、静脈注射、口腔投与、鼻腔内又は気道経路による経皮的送達又は投与によるものであってよい。最も好適な投与は、局所的投与又は皮下若しくは皮内注射である。
【０１９７】
この発明の方法は、化合物のそれらの皮膚への効果についての迅速且つ効率的な評価を可能にする。
【０１９８】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳しい説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【０１９９】
発明の詳しい説明
プロモーター
この発明の方法は、化合物を、皮膚に対するその効果について評価することを可能にする。この発明の方法を用いて、化合物を、皮膚の健康又は外観に対するその効果(例えば、化粧品としての使用)について評価することができる。皮膚に対する効果は、通常、皮膚代謝関連プロモーターの制御下での遺伝子の発現に対する効果として測定される。かかるプロモーターには、皮膚(例えば、真皮又は上皮)の成分である産物；皮膚の水和若しくは栄養摂取に影響を及ぼす産物；皮膚の成分の合成若しくは分解を促進する産物；皮膚の血管系に影響を及ぼす産物；毛嚢代謝に影響を及ぼす産物；皮膚の腺構造に影響を及ぼす産物；皮下筋肉組織に栄養を及ぼす産物；脂肪組織に影響を及ぼす産物；又は皮膚神経に影響を及ぼす産物の発現を制御するものが含まれる。
【０２００】
この発明の方法は、化合物を、皮膚の外観又は健康に関連するパラメーター例えば皮膚の弾力性、皮膚のしわが寄る傾向、皮膚の液体(例えば、水又は油)を保持する能力、皮膚のダメージ(例えば、光又はＵＶ誘導されたダメージ)に抵抗し若しくは回復する能力、毛嚢の代謝(成長周期又は色素沈着を含む)、皮下筋肉の緊張状態及び機能、又は皮膚神経による神経伝達に対する効果について評価するのに有用である。一般に、これらのパラメーターに対する効果は、例えば、これらのパラメーターの何れかに影響を及ぼす産物をコードする遺伝子に正常に結合されたプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の発現に対する効果により、間接的に評価される。
【０２０１】
かかる皮膚代謝関連プロモーターの例には、バーシカンプロモーター；マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーター；血管内皮成長因子プロモーター；ヒアルロナンシンターゼプロモーター；ＭＭＰ２若しくはＭＭＰ９(好ましくは、ＭＭＰ９)プロモーター；及び好中球エラスターゼプロモーターが含まれる。
【０２０２】
バーシカンプロモーターは、Naso M.F.等(1994)J.Biol.Chem.269(52):32999-33008(この内容を、参考として本明細書中に援用する)に記載されたバーシカン遺伝子の発現を調節する。バーシカンは、皮膚の真皮及び上皮で発現される大きいモジュールのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。バーシカンは、細胞外マトリクスと結合したまま多量の水と結合することができ、それ故、皮膚を水和して満たすことができる。従って、この遺伝子のアップレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０３】
マトリクスメタロプロテイナーゼプロモーターは、マトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子の発現を調節する。このマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)は、Mauch C.等(1994)Arch.Dermatol.Res.287:107-114に記載された細胞外マトリクスプロテアーゼのファミリーに属する。この名称が暗示するように、これらのマトリクスメタロプロテイナーゼは、例えば皮膚の真皮及び上皮における細胞外マトリクスの分解に関与している。従って、この遺伝子のダウンレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０４】
血管内皮成長因子プロモーターは、例えばTischer E.(1991)J.Biol.Chem.266(18):11947-11954(その内容を、参考として本明細書中に援用する)に記載された血管内皮成長因子遺伝子の発現を調節する。この血管内皮成長因子は、血管内皮細胞に対する有糸分裂誘発因子であり、結果として、それは、皮膚の下の微小血管系の増殖及び増大した血管透過性へと導くことができる。増大した微小血管系及び血管透過性は、皮膚の一層優れた栄養摂取(例えば、一層優れた栄養物の真皮及び上皮への送達)及び水和を可能にする。従って、この遺伝子のアップレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０５】
ヒアルロナンシンターゼ(ＨＡＳ１−３)プロモーターは、Itano N.等(1996)BBRC 222:816-820；Watanabe K.(1996)J.Biol.Chem.271(38):22945-22948；及びSpicer A.P.(1997)J.Biol.Chem.272(14):8957-8961(これらの内容を、それぞれ、参考として本明細書中に援用する)に記載されたヒアルロナンシンターゼ(ＨＡＳ１−３)遺伝子の発現を調節する。ヒアルロナンシンターゼは、その名称が暗示するように、ヒアルロナン(直鎖状の非分枝性グリコサミノグリカン)の合成に関与する酵素である。ヒアルロナンは、バーシカンに結合し、一般に、他のプロテオグリカンに対するアンカーとして作用し、プロテオグリカン「ネットワーク」の安定化へと導く。結果として、ヒアルロナンは、(バーシカンと同様に)皮膚の水和及び充填を援助することができる。従って、この遺伝子のアップレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０６】
ＩＶ型コラゲナーゼプロモーターは、Huhtala P.(1991)J.Biol.Chem.266(25):16485-16490(その内容を、参考として本明細書中に援用する)に記載されたＩＶ型コラゲナーゼ遺伝子の発現を調節する。ＩＶ型コラゲナーゼは、細胞外マトリクスプロテアーゼファミリーの他のメンバーであり、例えば、皮膚の真皮及び上皮の細胞外マトリクスの様々な成分の分解に関与している。従って、この遺伝子のダウンレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０７】
好中球エラスターゼプロモーターは、Takahashi H.(198)J.Biol.Chem.263(29):14739-14747(その内容を、参考として本明細書中に援用する)に記載された好中球エラスターゼ遺伝子の発現を調節する。好中球エラスターゼは、例えば、皮膚の真皮及び上皮の細胞外マトリクスの殆どの蛋白質成分(エラスチンを含む)を開裂させることのできる強力なセリンプロテアーゼである。従って、この遺伝子のダウンレギュレーションを生じる化合物は、好適である。
【０２０８】
トランスジェニック動物
この発明の方法において用いることのできるトランスジェニック動物には、非ヒト哺乳動物例えばブタ例えばミニブタ若しくはモルモット；又はゲッ歯類例えばマウス若しくはラット例えば無毛マウス(例えば、Begona M.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:7717-7721に記載されている)、ヌードマウス、老化促進マウス(例えば、Takeda等(1991)L.Am.Geriatr.Soc.39:911-19に記載されている)、又は加速された加齢の表現型を示すトランスジェニック変異体マウス(該動物においては、少なくとも一つの好ましくは本質的にすべての細胞がトランスジーンを含んでいる)が含まれる。これらのトランスジェニック動物は、トランスジーンについてホモ接合であってもヘテロ接合であってもよい。マウスが、好適な被験動物である。
【０２０９】
トランスジェニック動物の構築
トランスジェニック動物(例えば、マウス)の作製方法は、当分野で公知である。一つのアプローチを、以下に記載する。
【０２１０】
胚の注入／移植
胚操作及びマイクロインジェクションの手順は、例えば、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,ニューヨーク、1986)(その内容を、参考として本明細書中に援用する)に記載されている。マウスの接合体を、妊娠ウマ血清(ＰＭＳ)を用いて、及び４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピンで過剰排卵にした６週齢の雌から採取することができる。処理した雌を雄と一緒に置き、翌朝腟栓を調べる。偽妊娠の雌を発情につき選択して、不妊確定のために精管切除された雄と一緒に置き、レシピエントとして用いる。接合体を集めて、丘細胞を除去する。その上、胚細胞を収穫することができる。前核胚を、雄と交配させた雌マウスから回収する。雌を妊娠ウマ血清ＰＭＳで処理して濾胞成長を誘導し、ヒト絨毛性ゴナドトロピンｈＣＧで処理して排卵を誘発する。胚を、ダルベッコ改変リン酸緩衝塩溶液(ＤＰＢＳ)中に回収して、１０％ウシ胎児血清を補ったダルベッコ改変必須培地(ＤＭＥＭ)中に維持する。
【０２１１】
トランスジーン構築物のマイクロインジェクションは、顕微鏡に取り付けた標準的なマイクロマニピュレーターを用いて実施することができる。例えば、典型的には、胚を、マイクロインジェクションの間中、油下の１００マイクロリットルのＤＰＢＳ液滴中に保持する。ＤＮＡ溶液を、雄性前核にマイクロインジェクションする。上首尾のインジェクションを、前核の膨潤によりモニターする。組換えＥＳ細胞を、同様の技術を用いて胚細胞に注入することができる。注入の直後に、胚を、レシピエントの雌(例えば、精管切除した雄マウスと交配させた成熟マウス)に移す。一般的プロトコールにおいては、レシピエントの雌を麻酔し、横側腰部切開を行って卵管を露出させ、胚をその卵管の膨大部域に移す。体壁を縫合して皮膚を傷用クリップを用いて閉じる。
【０２１２】
標的構築物の存在についてのスクリーニング
トランスジェニック動物は、誕生後に、標準的プロトコールによって同定することができる。尾組織からのＤＮＡを、標的構築物の存在について、サザーンブロット及び／又はＰＣＲを用いてスクリーニングすることができる。モザイクであることが明らかな子孫を、次いで、それらが生殖細胞系列に標的の構築物を有すると考えられるならば、ホモ接合のトランスジェニック動物を生成するために互いに交配させる。子孫が生殖細胞系列伝達を有するか否か不明の場合には、それらを親又は他の系統と交配させることができ、子孫をヘテロ接合性についてスクリーニングする。ヘテロ接合体を、そのＤＮＡのサザーンブロット及び／又はＰＣＲ増幅により同定する。
【０２１３】
ヘテロ接合体を、次いで、互いに交配させてホモ接合のトランスジェニック子孫を生成することができる。ホモ接合体は、この交配の産物であるマウス並びに既知のヘテロ接合体であるマウス及び野生型マウスからの等量のゲノムＤＮＡのサザーンブロッティングにより同定することができる。サザーンブロットをスクリーニングするためのプローブは、上記のようにデザインすることができる。
【０２１４】
トランスジェニック子孫を同定して特性決定する他の手段は、当分野で公知である。例えば、ノーザンブロットを用いて、レポーター遺伝子をコードする転写物の存否についてｍＲＮＡを調べることができる。更に、ウエスタンブロットを用いて、これらの子孫の様々な組織におけるトランスジーンの発現レベルを、そのトランスジーンによりコードされる蛋白質に対する抗体を用いて又はマーカー遺伝子産物(この遺伝子が発現される場合)に対する抗体を用いてウエスタンブロットを調べることにより評価することができる。最後に、トランスジーン産物の存否を探すための適当な抗体を用いて、子孫からの様々な細胞のイン・シトゥー分析(例えば、細胞を固定して抗体で標識する)及び／又はＦＡＣＳ(蛍光活性化細胞ソーティング)分析を行うことができる。
【０２１５】
他のトランスジェニック動物
他のトランスジェニック動物をこの発明の方法において用いることができる。様々な動物についての作製方法が、当分野では公知である。トランスジェニックブタの作製のためのプロトコールは、White及びYannoutsos,Current Topics in Complement Research:64th Forum in Immunology,pp.88-94；米国特許第５，５２３，２２６号；米国特許第５，５７３，９３３号；ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５０７１；及びＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４７４４に見出すことができる。トランスジェニックラットの作製のためのプロトコールは、Bader及びGanten,Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,補遺3:S81-S87,1996に見出すことができる。トランスジェニックウシの作製のためのプロトコールは、Transgenic Animal Technology. A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編,Academic Press,Inc.に見出すことができる。トランスジェニックヒツジの作製のためのプロトコールは、Transgenic Animal Technology. A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編,Academic Press,Inc.に見出すことができる。すべての特許及び参考文献は、本明細書中に参考として援用する。
【０２１６】
レポーター遺伝子
この発明の方法は、少なくとも部分的に、皮膚代謝に関与する遺伝子のプロモーターへのレポーター遺伝子の結合に基づいている。レポーター遺伝子は、検出可能な産物好ましくは比較的容易に検出し得るもの(例えば、蛍光性の遺伝子産物)又は有色生成物の形成により測定することのできる反応を触媒する産物をコードする任意の遺伝子であってよい。例えば、レポーター遺伝子は、酵素例えば検出可能な生成物(例えば、有色の又は発光性の生成物)を生成する酵素をコードすることができる。レポーター遺伝子は当分野で公知であり、ベータガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光蛋白質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子は、例えば、Sambrook,J.,Fritsh,E.F.及びManiatis,T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,ニューヨーク、1989に記載されている。
【０２１７】
実施例
実施例１：トランスジーンの構築
トランスジーンを構築するために、ヒトのバーシカンプロモーターの８３９ｂｐの断片(ヌクレオチド−５５９〜＋２８０；転写開始部位は＋１)をヒトのゲノムＤＮＡから公知のＰＣＲベースの技術を用いて得た。このバーシカンプロモーター断片を、図１に示したように、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩでの消化により線状化したｐＮＡＳＳ２βベクター(Clontech)に挿入した。このベクターは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(lacZ)並びにポリアデニル化シグナルを含む。このベクターは又、トランスジーンの高レベルの発現の機会を最適化するために、ＲＮＡスプライシング用ドナー及びアクセプター配列をも含んでいる。前核インジェクションのための線状化トランスジーンＤＮＡ断片を得るために、このベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ酵素で開裂させた。この線状化トランスジーンＤＮＡ断片は、４７３２ｂｐの長さを有する。
【０２１８】
実施例２：トランスジェニックマウスの生成
この線状化トランスジーンＤＮＡ断片を、ＤＢＡ２×Ｃ５７ＢＬ６(ＤＢＦ１)マウス(Charles River,Boston)の受精卵母細胞に注入し、これらの卵を偽妊娠養育母に移植した。子孫(Ｆ０)を、ヒトバーシカンプロモーター断片の染色体への組込みについてサザーンブロッティングにより試験した。簡単にいえば、ゲノムＤＮＡを、３週齢のマウスの尾から単離して、ＢａｍＨＩ又はＰｓｔＩ制限酵素で消化した。これらのＤＮＡ断片をゲル上で分離し、次いで、ナイロン膜上にトランスファーした。これらの膜に、トランスジェニックマウスの生成に用いたヒトバーシカントランスジーンの１．３ＢＰＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をハイブリダイズさせた。７つの独立の系統が、サザーン分析により、トランスジーンの挿入を示した。このトランスジーンのコピー数は、１つから１０以上まで変化した。
【０２１９】
実施例３：β−ガラクトシダーゼ組織化学
様々な発生のステージ(Ｅ１１．５ｄ〜Ｅ１７．５ｄ)からの採取したマウス胚を、ＰＢＳ中で０．５％グルタルアルデヒドを用いて、胚のステージに依って３０分〜１２時間にわたって固定し、３０％シュークロースに移し、次いで、ＯＣＴ(Tissue Tek,カリフォルニア)コンパウンド中で凍結した。１５μｍ厚の切片を調製してスライドガラス上に載せた。これらの切片を、同じ固定液中で５分間再固定し、ＰＢＳで一回洗ってから洗剤洗浄溶液で１０分間洗った。染色を、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ(Sigma)、１０ｍＭフェロシアニド及び１０ｍＭフェリシアニドを含む反応緩衝液中で行った。インキュベーションを、３７℃で３〜６時間にわたって行った。ＰＢＳでの洗浄の後に、切片を、検鏡板に固定するか又はエオシンで対比染色した。成体組織については、同じ固定液を用いてマウスを潅流し、所望の臓器を切開して後固定し、シュークロースに浸し、その後、ＯＣＴコンパウンドにて凍結した。皮膚組織については、５ｍｍの背中の皮膚組織区画のストリップを１５分間〜１時間にわたって固定し、上記のようにＸ−ｇａｌで３〜６時間にわたって染色した。洗浄後、これらの皮膚組織ストリップをパラフィン中に包埋し、ミクロトームを用いて８μｍの切片に切った。
【０２２０】
実施例４：イン・シトゥーハイブリダイゼーション
３’末端標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いる放射性のイン・シトゥーハイブリダイゼーションを、当分野で公知の方法を用いて行った。イン・シトゥーシグナルの特異性を、幾つかの切片と標識したオリゴヌクレオチドとを過剰の未標識オリゴヌクレオチドの存在下でハイブリダイズさせることにより試験した。
【０２２１】
トランスジーンの発現パターンを、ｌａｃＺと外因性マウスバーシカンプローブを用いるトランスジェニック胚切片(Ｅ１３．５)のイン・シトゥーハイブリダイゼーションにより試験した。何れかのプローブを用いて、発生中の肢芽、腎臓、脳及び軟骨における発現を観察した。Ｅ１３．５、Ｅ１５．５、Ｅ１７．５胚、７日、４０日目の新生児及び４ヶ月(成体)のトランスジェニックマウス切片について、β−ガラクトシダーゼ組織化学によりｌａｃＺの発現も調べた。強い間充織での発現が、腎臓、脳、軟骨及び肢芽(Ｅ１３．５ｄ)で認められた。発現レベルは、誕生まで一定のままであった。７日齢のマウスにおいて、β−ガラクトシダーゼ染色は、胚組織と比べて減少し、成体組織においては、殆ど発現が認められなかった。他の組織と対照的に、３０日齢のマウス由来の真皮の乳頭状突起(生長期の毛周期)は、再び強いβ−ガラクトシダーゼ染色を示し、第２毛周期中β−ガラクトシダーゼの同じレベルの発現を続けた。
【０２２２】
皮膚組織において、毛芽(将来の毛嚢における真皮乳頭状突起)は、Ｅ１５．５ｄで強いβ−ガラクトシダーゼ活性を発現し、生後７日目まで(第１毛周期中)発現を続けた。Ｅ１５．５ｄ〜新生児皮膚の真皮繊維芽細胞においては、随時的なβ−ガラクトシダーゼ染色も認められた。しかしながら、７日齢の皮膚組織においては、β−ガラクトシダーゼ染色は、減少した。
【０２２３】
実施例５：ＵＶ照射
ＵＶＡでの照射を、近接して配列した５つのＰＵＶＡランプを用いて行った。この配列から３０ｃｍの位置でのエネルギー出力をＵＶＡ検出器を用いて測定した。
【０２２４】
４日齢のバーシカントランスジェニックマウスの背中の皮膚を３０Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡで照射した。背中の皮膚のバイオプシー試料を２４時間後にβ−ガラクトシダーゼ染色のために処理し、未処理のトランスジェニックマウスからの対照用皮膚と比較した。β−ガラクトシダーゼ組織化学は、ＵＶＡ照射した皮膚の上皮において、対照と比較して増大したβ−ガラクトシダーゼ染色を示した。
【０２２５】
実施例６：ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウス
ヒトＶＥＧＦ遺伝子発現のイン・ビボでの調節機構を解明するために、ヒトＶＥＧＦのプロモーター領域の３ｋｂｐの断片により駆動されるグリーン蛍光蛋白質レポーター構築物(図２に示してある)を含むトランスジェニックマウスを作製した。この構築物を、イン・ビトロで機能的であることを、培養ヒトケラチノサイトにおけるトランスフェクションアッセイにより確認した。ＶＥＧＦ−ＧＦＰについての３つの独立のトランスジェニック系統が得られ、ＰＣＲ分析により確認した。構成的な内皮発現(及びケラチノサイト誘導性ＶＥＧＦの負傷した皮膚における発現)を調べるために、２ｍｍの皮膚パンチを背中の皮膚に作り、バイオプシー試料を４８時間後に集めた。組織を、直ちに、４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を蛍光及び共焦点顕微鏡により調べた。ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニック系統は、明るいＧＦＰ蛍光を、上皮及び上部真皮の下の新生微小血管ネットワークにおいて(及び、随時、一層深い真皮で)示した。ある組織では、毛嚢も又、陽性であった。負傷した組織では、連続的なＧＦＰ発現が、上皮の傷の縁で認められたが、ケラチノサイト発現は、負傷してない領域では見られず、これは、ＶＥＧＦ発現の傷の治癒における誘導性を確認するものである。ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニック系統から調製した初代ケラチノサイト培養も又、培養の３日後に、ＧＦＰ蛍光を示した。まとめると、これらの結果は、ＧＦＰがイン・ビトロ及びイン・ビボのＶＥＧＦ発現を調べるための潜在的に有用な道具であるということを示している。この仕事を、以下に、一層詳細に記載する。
【０２２６】
トランスジェニックマウスの皮膚においてヒト血管内皮成長因子プロモーターに駆動されるグリーン蛍光蛋白質の発現のダイナミックな変化を、下記のように分析した。
【０２２７】
トランスジェニックマウスを用いる遺伝子発現の研究は、最もしばしば、３つの古典的レポーター遺伝子−ｌａｃＺ(β−ガラクトシダーゼ)、ルシフェラーゼ又はＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)の一つを利用する。レポーター遺伝子活性の検出は、通常、組織を組織化学的染色のために(ｌａｃＺの場合)又はルシフェラーゼ及びＣＡＴについての複雑なアッセイのために動物から取り出すことを必要とする(これは、生きている動物における遺伝子調節の変化を見る可能性を排除し又は少なくとも複雑にする)。
【０２２８】
最近、別の蛍光レポーター分子のグリーン蛍光蛋白質(ＧＦＰ)(Chalfee M,Tu Y,Euskirchen G,Ward WW及びPrasher DC: Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science 263:802-5,1994)又は改変ＧＦＰ(ＥＧＦＰ)（Zhang G,Gurtu V及びKain SR: An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells, Biochem Biophys Res Commun 227:707-11,1996）が開発された。ＧＦＰは本来的に蛍光性であるので、そのシグナルは、処理しなくても見ることができる(Misteli T及びSpector DL: Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology, Nat Biotechnol 15:961-4,1997)。ＧＦＰが上皮で誘導されると、遺伝子発現の変化を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、動物を犠牲にせずに観察することができる。ここでは、悪性腫瘍組織でのイン・ビボの血管形成及び血管透過性を誘導する血管形成因子であるヒト血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)のプロモーターを用いて、ＧＦＰを、トランスジェニックマウスの皮膚におけるレポーター遺伝子として発現させる。ＶＥＧＦの上皮性ケラチノサイトにおける発現は、治癒しつつある上皮の傷の縁においてアップレギュレートされること及びホルボールエステル(例えば、ＴＰＡ)の局所適用によってもアップレギュレートされることが示された。
【０２２９】
トランスジェニックマウスにおけるヒトＶＥＧＦ−ＧＦＰの遺伝子活性の変化の表示におけるＧＴＰの発現及び応答性を以下に記載する。それらの発現パターンは、内因性ＶＥＧＦのものと一致し、ＧＦＰ誘導された蛍光が局在化され得て且つ切り出した後に何らの処理もされてない無傷の組織において共焦点顕微鏡を用いて可視化され得るということを示している。
【０２３０】
トランスジーン構築物
ＧＣリッチなＶＥＧＦプロモーターのＰＣＲベースの増幅は、しばしば困難であるので、ＶＥＧＦゲノムクローンの５．０ｋｂ断片(ヒトＶＥＧＦの５’フランキングＤＮＡを含む)を、ヒトのゲノムライブラリー(Clontech、カリフォルニア)から、ＲＴ−ＰＣＲにより得た５００ｂｐのｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて単離した。同定されたクローンを制限消化により分析し、次いで、２４５３ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ａｇｅｌ断片(−２２７１〜＋９１)(Tischer E,Mitchell R,Harman T,Silva M,Gospodarowicz D,Fiddes JC及びAbraham JA: The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 266:11947-54,1991)をアガロースゲルから切り出した。このプロモーター断片を、ＧＦＰベクター(ＥｃｏＲＩ及びＸｍａｌ切断ｐＥＧＦＰ−１)に挿入した。発現効率を最大にするために、１６ｓ／１９ｓスプライスドナー及びアクセプターシグナルをも、このプロモーターとＧＦＰ遺伝子との間に挿入した。
【０２３１】
ＧＦＰベクターのイン・ビトロ発現
その結果生成したトランスジーン(哺乳動物発現ベクター中)を、先ず、培養ヒトケラチノサイトにトランスフェクトして、選択した遺伝子領域がＶＥＧＦ発現をプロモートすることを確認した。初代ヒトケラチノサイトにＢＥＧＦ−ＧＦＰベクター又はＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰ対照用ベクター(ｐＥＧＦＰ−Ｎ１；Clontech)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションに、ポリブレン及びＤＭＳＯ法を用いた。
【０２３２】
トランスジェニックマウスの生成
前核注入のための線状化断片を、ＥｃｏＲＩ及びＡｆＩＩＩを用いて切り出した(これは又、ポリアデニル化シグナル配列をも含んだ)。このトランスジーン断片を、次いで、ＤＢＡ２×Ｃ５７Ｂ１６(ＤＢＦ１)マウス(Charles River Laboratories,Boston,マサチューセッツ在)の受精卵母細胞に注入し、それらの卵を偽妊娠養育母に移植した。その子孫(Ｆ０)を、ゲノムＰＣＲにより、トランスジーンの染色体への組込みについて調べた。すべての実験を、Ｆ１又はＦ２子孫のマウスについて行った。
【０２３３】
無傷の皮膚組織の共焦点顕微鏡観察のために、ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスを、トランスジェニック創出動物(founder)をＳＫＨ−１無毛マウス(Charles River Laboratories)と交配させることにより、無毛の遺伝的バックグラウンドで生成した。こうして、雄の半接合トランスジェニックマウス(ｖ／−ＨＨ)を雌の無毛マウス(−／−ｈｈ)と交配させて、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ無毛マウスのＦ２世代(ｖ／−ｈｈ)を得た(ＰＣＲ検出及びそれらの無毛の表現型により容易に選択できる)。
【０２３４】
ＧＦＰ検出用の組織標品及びエピ顕微鏡観察溶液は、ＧＦＰ発現部位からＧＦＰ誘導された蛍光を洗い去り又は拡散させた。最後に、新たに切開した未固定の組織ブロックを、直ちに、クリオスタットを用いて、１２μｍ厚の凍結切片に切った。切片作製直後に、細工用媒質又は拡張スライドストーレージを用いずに、ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ二重励起及びエミッションフィルタークロマ*ＶＴ）を用いてエピ蛍光顕微鏡観察を行って、ＧＦＰ誘導された蛍光シグナルを組織の自己蛍光から識別した。
【０２３５】
創傷及びＴＰＡ処理手順
皮膚の傷を、２ｍｍのバイオプシー用パンチを用いて、若い成体トランスジェニックマウス(４〜６週齢)の毛を剃った背中の皮膚に作った。４８時間後に、正常の及び負傷した組織を採取して直ちにドライアイス上で凍結した。
【０２３６】
ＴＰＡによるＶＥＧＦｍＲＮＡの誘導のために、アセトン中の５μｇのＴＰＡの単一投与量を、トランスジェニックマウスの背中の皮膚に局所的に塗布し、皮膚バイオプシー試料を１２時間後に採取した。
【０２３７】
すべての動物の手順は、MGH Animal Care and Use Committeeの認可を受けたものである。
【０２３８】
抗−ＶＥＧＦ及び抗−ＧＦＰ免疫組織化学
トランスジェニックマウスの皮膚の凍結切片を、４％パラホルムアルデヒドでＰＢＳ(ｐＨ７．２)中で、室温で５分間固定した。免役組織化学的染色を、スライドマウント切片にて、製造業者(Vector Labs.英国)により記載されたようにＡＢＣ法を用いて行い、ＤＡＢを着色物質として用いるペルオキシダーゼ反応により可視化した。抗−ＧＦＰ抗血清をClontechから購入した。
【０２３９】
共焦点顕微鏡検査
共焦点顕微鏡観察のために、カバーガラスを直接組織上に置いた。切片又は無傷の皮膚試料を、バンドパスフィルター５３０／３０ｎｍを有するＬｅｉｃａＴＣＳＮＴ４Ｄ共焦点顕微鏡システムを用いて分析し、波長５１５〜５４５ｎｍの放射を検出した。核を可視化するために、切片を、５μｇ／ｍｌの７−アミノアクチノマイシンＤ(Sigma，米国)溶液で、２０分間周囲温度で対比染色し、フルオロマウント−Ｇ(Southern Biotechnology,アラバマ在)を用いて検鏡板に固定した。
【０２４０】
ヒトケラチノサイトにおけるＶＥＧＦプロモーター駆動されたＧＦＰの発現
内因性ＶＥＧＦのための機能的プロモーター活性の領域は十分特性決定されていないので、先ず、ヒトのＶＥＧＦの２．５ｋｂの５’−フランキングＤＮＡをＧＦＰ哺乳動物ベクターに挿入し、トランスフェクトされた初代ヒトケラチノサイト培養をモニターした。対照用培養にＣＭＶプロモーター駆動のＧＦＰベクターをトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−ＧＦＰ蛍光が、先ず、トランスフェクションの４８時間後に可視化されたが、これらの細胞の少しのパーセンテージしか可視化されなかった。ＣＭＶ−ＧＦＰ蛍光は、２４時間以内に可視化されたが、ほぼすべての細胞が陽性であった。このＶＥＧＦ−ＧＦＰシグナルの強度は、ＣＭＶ−ＧＦＰ対照と同じであり、これは、この構造がイン・ビトロ培養系で機能的であるということを確認した。(ヒトのサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)の最初期プロモーターで駆動されるＧＦＰでトランスフェクトされた培養ケラチノサイト(陽性対照)及びＶＥＧＦ−ＧＦＰでトランスフェクトされた培養ケラチノサイトにおける蛍光は、トランスフェクションの４８時間後に観察された。)
【０２４１】
トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰの発現
３０匹の創出マウスにおいて、トランスジーンの染色体への組込みについて陽性の４つの系統がＰＣＲ分析により検出された。これらの系統の３つは、尾の組織のエピ蛍光顕微鏡検査により評価した場合に、検出可能なＧＦＰ誘導された蛍光シグナルを上皮において示した(陰性の野生型マウスと比較)。新生トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ発現(蛍光)を、ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの尾由来の新鮮な未固定の組織において及び陰性の野生型の同腹子に由来する同様の組織において測定した。蛍光は又、新生ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスから得た組織{肺(蛍光は、肺胞に見られる)；脳の側脳室(蛍光は、側方上皮において観察された)；及び脊椎軟骨；(心臓上皮)を含む}においても測定した。ＶＥＧＦプロモーターの発現パターンを、これらの３つの系統のＦ１新生児において評価した。肺、腎臓及び脳(前に、イン・シトゥーハイブリダイゼーション研究によりＶＥＧＦを発現することが示されている)を、ＧＦＰ蛍光について調べるために選んだ。予想されるように、肺胞及び脳の側脳室壁におけるＧＦＰ発現が観察された。腎臓の糸球体においてＧＦＰシグナルを検出することは、困難であった。ＧＦＰ蛍光は又、発生中の軟骨組織(例えば、脊椎軟骨)の軟骨細胞においても検出可能であった。
【０２４２】
ＧＦＰは、治癒しつつある傷の縁において発現される
刺激されてない正常の上皮性ケラチノサイトは弱いＧＦＰ蛍光しか示さなかったので、我々は、ＶＥＧＦ駆動されるＧＦＰの傷の治癒中の誘導可能性を調べた。皮膚バイオプシーの４８時間後に、かさぶたの下の治癒しつつある負傷した上皮は、隣接する負傷してない上皮と比較して、非常に強く且つ明瞭な蛍光シグナルを示した。この蛍光シグナルは、抗−ＧＦＰ及び抗−ＶＥＧＦ免疫組織化学により隣接する切片で検出されるＶＥＧＦ／ＧＦＰ発現と相関した。ＧＦＰ発現は、皮膚の傷の治癒により誘導された。(ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスを、パンチバイオプシーにより負傷させた。その傷からの組織を蛍光顕微鏡検査による評価のために採取した。(ａ)バイオプシーの４８時間後に治癒しつつある傷の縁において、強い蛍光がかさぶたの下の上皮において観察された。(ｂ)隣接する切片は、抗−ＧＦＰ抗体と反応した。(ｃ)隣接する切片は、抗マウスＶＥＧＦ抗体で免疫染色された。対照用切片を、正常のヤギ血清で処理した。かさぶたにおいて認められた非特異的ペルオキシダーゼ染色がｂ及びｃにおいても見られた。)
【０２４３】
ＧＦＰのＴＰＡ処理による誘導
上皮ＧＦＰのホルボールエステル塗布による誘導も試験した。蛍光シグナルの蓄積がＴＰＡをトランスジェニック皮膚に塗布した１２時間後に認められたが、アセトン単独では基礎レベルのＧＦＰ発現しか見られなかった。このシグナルは、ケラチノサイトのサイトゾル又は核よりも上皮の基底外側面に局在するようであった。抗−ＧＦＰ免疫染色は、基底細胞サイトゾル中にシグナルを生成し、これは、ＧＦＰが基底細胞に起源を有すること及び少なくともＧＦＰ蛋白質の部分がこの細胞内に残っていることを示した。
【０２４４】
ＧＦＰの共焦点顕微鏡検査による直接的検出
ＧＦＰ蛍光シグナルを一層正確に局在化させるために、新鮮な凍結切片を固定して、核対比染色のために７−ＡＡＤとインキュベートし、レーザー共焦点顕微鏡下で検査した。予想されるように、最も拡散性のＧＦＰはこの手順の間に失われるが、傷の治癒により誘導された上皮性の発現は影響されないままであった。随時的な蛍光が、負傷してない上皮で検出可能であったが、そこでは、蛍光は、我々の観察では、基底細胞の外に局在して見えた。固定して強く洗浄した後でさえ、毛嚢の外側毛根鞘におけるＧＦＰ誘導された蛍光は、不変のままであった。一層高倍率では、これらの毛嚢において、蛍光性ＧＦＰシグナルが核マーカーと完全に同時局在し、毛嚢ＧＦＰがこの核内に安定に留まっていることを示唆しているのが見られる。これは又、脊椎軟骨中の軟骨細胞についても当てはまることであった。
【０２４５】
無傷の皮膚の上皮におけるＧＦＰの共焦点顕微鏡検査による直接的検出
ＧＦＰが生きているＧＦＰトランスジェニックマウスの皮膚において検出され得る可能性を試験するために、切開した無毛の皮膚を、共焦点イメージングにより直接調べた。これらの生きている上皮の水平の光学的切片は、明るい蛍光を示した。同等の凍結切片は、この蛍光が基底細胞に由来することを示した。一層高い倍率は、ＧＦＰがケラチノサイトの周囲の細胞外空間に局在していることを示した。Ｘ−Ｚ共焦点イメージングは、このシグナルが上皮の基底層内にあることを確認した。無傷の皮膚におけるＧＦＰ発現の共焦点顕微鏡検査による検出。新鮮な未固定のトランスジェニックマウスの皮膚のバイオプシーを行い、直ちに、走査レーザー共焦点顕微鏡検査により評価した。これらの上皮の水平光学的切片は、個々の上皮細胞の周囲で蛍光を示す。核を示すために７−ＡＡＤで対比染色した同等の皮膚領域の凍結切片は、真皮−上皮接合部で蛍光を示した。この共焦点Ｘ−Ｚイメージは、この蛍光が基底ケラチノサイトに近いことを示している。
【０２４６】
この仕事は、ヒトＶＥＧＦプロモーターにより駆動されるＧＦＰの発現パターンが空間的に及び時間的にｍＲＮＡ検出で見られるものと同じであることを示している。
【０２４７】
皮膚の上皮でＧＦＰを発現しているトランスジェニックマウスの繁殖に由来する幼若マウスは、単純なエピ蛍光顕微鏡検査により、サザーンブロッティング又はゲノムＰＣＲの一層単調で退屈な手順を用いずに容易に選択した。
【０２４８】
切片中でＧＦＰ誘導された蛍光の検出には、たとえ新鮮な未処理の組織ブロックが明るい蛍光を放射しても、初期の困難があった。様々な手順を試験した後に、水溶液処理が直接ＧＦＰ蛍光を洗い去ることが見出された。これは、組織ブロックを凍結切片にする前に固定することにより部分的に克服された(もっとも、最初に上皮性ケラチノサイト中に存在しているような幾つかの部位の蛍光は、やはり失われ又はその染色パターンは変化したが)。固定は、皮膚の微小血管系においてＧＦＰにより生成されるものと区別し得ない蛍光を誘導した。この部位の蛍光は、未固定の組織においては見られなかったし、ＶＥＧＦ発現は、イン・シトゥーハイブリダイゼーション法を用いる研究では微小血管系においては報告されていない。従って、最初のＧＦＰシグナルを保存する最も効率的な方法は、新たに切開した皮膚を直ちにＯＣＴコンパウンドを用いずに凍結切片にし、次いで、それを、迅速に蛍光顕微鏡検査により検査することである。この予想外の困難は、何故に今まで上首尾のＧＦＰトランスジェニックマウスの報告が非常に少なかったのかを説明することができる。
【０２４９】
顕著なＶＥＧＦ発現は、イン・シトゥーハイブリダイゼーションにより肺及び脳の側脳室において報告されている。ＶＲＧＦ−ＧＦＰマウス組織の評価は、これらの発見を確認する。腎臓の糸球体が蛍光を発し得なかったのは、これらのトランスジェニックマウスの生成のためにここで用いたＶＥＧＦＤＮＡの２．２ｋｂの５’−フランキング領域に組織特異的応答エレメントが欠如しているためか又は検出閾値より低いシグナルのためであろう。
【０２５０】
１週齢の幼若マウス由来の皮膚において、正常の上皮性ケラチノサイトは、基底レベルのＧＦＰ発現を示したが、他方、毛嚢の外側毛根鞘では、明るい蛍光が観察された。一層高齢のマウスの皮膚は、毛嚢において同等のＧＦＰ発現を示さなかったので、これらの毛嚢におけるＶＥＧＦ発現は、毛周期依存性であり得る。脊椎で見られて前に報告された毛嚢及び軟骨細胞における蛍光は、特に印象的であった。これらのシグナルは、肺又は脳で認められたものより一層強くさえあった。レーザー共焦点観察は、これらの場所のＧＦＰが核内に限られていることを示した。この核局在性は、見かけのシグナルが(核に局在しているので)、組織の処理中に、蛍光性生成物の拡散を減じることは有りそうであるということを強めることができる。幾つかの組織において核に局在するのに他の組織ではそうでない理由は説明されないままであるが、核局在性コンセンサス配列をトランスジーン内に含むことは有用であり得るということは示唆される。
【０２５１】
傷の治癒モデルの間の及びＴＰＡ処理後のＧＦＰ蛋白質の誘導可能性をここに示すが、これは、レポーターＧＦＰ発現パターンが高度にＶＥＧＦプロモーター依存性であることを確認するものである。又、これらのデータは、キイロショウジョウバエ胚で報告されたような遅い発色団形成のために蛍光シグナル生成において可能な遅延に関する懸念を排除した。(Davis I,Girdham CH,O'Farrell PH「A nuclear GFP that marks nuclei in living Drosophila embryos; material supply overcomes a delay in the appearance of zygotic fluorescence」Dev.Biol.170:726-9(1995))。この困難を予想して、ＧＦＰの赤色シフトした変異型をこれらの研究用に選択したところ、皮膚並びにもっと内部の組織において、発色団の正しい折り畳みが起きるようである。ＧＦＰが皮膚において、長期の遺伝子発現をモニターするためにこのレポーターを使用する能力を邪魔する延長された半減期を有し得るという懸念もあった。一層高齢のトランスジェニックマウスの皮膚の毛嚢における蛍光の消失は、ＧＦＰ蛋白質が妥当な半減期を有することを示している。
【０２５２】
ＧＦＰシグナルの検出のためのレーザー共焦点顕微鏡検査による無傷の皮膚の評価は、ＧＦＰが上皮において容易に検出されることを示している。これらの結果は、イン・ビボでの長期の遺伝子発現の非侵襲的監視のためのＧＦＰトランスジェニックマウスの潜在的利用を示唆している。この生きているマウスの皮膚の顕微鏡検査による評価の技術は、既に使われている。トランスジェニックＧＦＰレポーター遺伝子の利用と組み合わせた場合、このシステムは、慣用のトランスジェニックレポーター遺伝子を有する動物を用いる方法を超える大きな利点を有する(何故なら、それは、用いる動物の数を減じ、単純な監視システムを利用し、そして同一個体における遺伝子発現の変化の長期間の監視を可能にするからである)。我々のトランスジェニックマウスの皮膚におけるＧＦＰの上首尾のイン・ビボ発現は、有用な監視用及びスクリーニング用のツールを提供することにより、皮膚におけるＶＥＧＦ遺伝子発現の理解を容易にするであろう。その利用は、ＶＥＧＦ発現を含むと考えられる表現型を有するマウスと交配させる場合に、特に魅力的である。このモデルは又、老化のプロセスにおける皮膚のホメオスタシスに焦点を合わせた研究においても有利であろう。
【０２５３】
実施例７：トランスジェニックマウスの皮膚及び毛真皮乳頭状突起におけるヒト          のバーシカンプロモーター活性の発生及び齢に関係した変化
ヒトバーシカンの特に皮膚組織における時間空間的な発現パターンを更に研究するために、ヒトバーシカンのコア蛋白質の機能的プロモーターにより駆動されるｌａｃＺレポーター構築物を含むトランスジェニックマウスを生成し、その結果生成したトランスジェニックマウス(胚、新生児から成体ステージまで及ぶ)に由来する組織切片をβ−ガラクトシダーゼ組織化学により調べた。
【０２５４】
トランスジーンの構築
機能的なヒトバーシカンプロモーター(転写開始部位を＋１として、−５５９〜＋２８０)の８３９ｂｐの断片{エキソン１；(Naso MF,Zimmermann DR及びIozzo RV,「Characterization of the complete genomic structure of the human versican gene and functional analysis of its promoter」,J.Biol.Chem.269:32999-3008(1994))を含む}をヒトのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲベースの技術により得て、正しい配列を直接配列決定により確認した。ｐＮＡＳＳ２βベクター(Clontech)をポリアデニル化シグナルを伴うβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(ｌａｃＺ)源として用いた。このベクターは又、トランスジーンの高レベルの発現の機会を最適化するために、ＲＮＡスプライスドナー及びアクセプター配列をも含有した。バーシカンプロモーター断片を、スプライスドナー／アクセプター配列の前にＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて挿入した。前核注入用に線状化したトランスジェニックＤＮＡを、４７３２ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ１断片として得た。
【０２５５】
トランスジェニックマウスの生成
この線状化構築物を、ＤＢＡ２×Ｃ５７ＢＬ６(ＤＢＦ１)マウス(Charles River,Boston)の受精卵母細胞に注入し、これらの卵を偽妊娠養育母に移植した。子孫(Ｆ０)を、ヒトバーシカンプロモーター構築物の染色体への組込みについてサザーンハイブリダイゼーションにより試験した。こうして、ゲノムＤＮＡを、３週齢のマウスの尾から単離して、ＢａｍＨＩ又はＰｓｔＩ制限酵素で消化した。ナイロン膜上の分画したＤＮＡ断片に、トランスジェニックマウスの生成に用いたヒトのバーシカントランスジーンの１．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をハイブリダイズさせた。７つの独立の系統が、サザーン分析により、トランスジーンの挿入及び単一挿入から１０以上までの異なるコピー数を示している。
【０２５６】
β−ガラクトシダーゼ組織化学
初期から中期のステージ(Ｅ１１．５ｄ〜Ｅ１５．５ｄ)から採取したマウス胚を、ＰＢＳ中で０．５％グルタルアルデヒドを用いて、そのステージに依って３０分〜１２時間にわたって固定し、３０％シュークロースに移し、次いで、ＯＣＴコンパウンド中で凍結した。切片を１５μｍ厚に切ってスライドガラス上に載せた。これらの切片を、同じ固定液中で５分間再固定し、ＰＢＳで一回洗ってから洗剤洗浄溶液で１０分間洗った。染色反応を、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ(Sigma)、１０ｍＭフェロシアニド及び１０ｍＭフェリシアニドを含む反応緩衝液中で行った。インキュベーションを、３７℃で３〜６時間にわたって行った。ＰＢＳでの洗浄の後に、切片を、検鏡板に固定するか又はエオシンで対比染色した。成体組織については、同じ固定液を用いてマウスを潅流し、所望の臓器を切開して後固定し、シュークロースに浸し、その後、ＯＣＴコンパウンドにて凍結した。一層良好な形態を保存するために、幾つかの初期〜中期胚(Ｅ１１．５ｄ〜Ｅ１５．５ｄ)をパラフィン切片用に処理した。皮膚組織については、５ｍｍの背中の皮膚組織区画のストリップを１５分間〜１時間にわたって固定し、Ｘ−ｇａｌ染色を３〜６時間にわたって行った。洗浄後、ブロックをパラフィン包埋のために処理し、ミクロトームを用いて８μｍの切片に切った。
【０２５７】
イン・シトゥーハイブリダイゼーション
イン・シトゥーハイブリダイゼーションのための胚組織を新たに調製した４％パラホルムアルデヒド(ＤＥＰＣ処理したＰＢＳ中)で固定し、脱水し、ＲＮアーゼフリー条件下で標準的パラフィン包埋プロトコールにて処理した。ジゴキシゲニン標識した非放射性のイン・シトゥーハイブリダイゼーションを、前に記載されたように、Ｅ１３．５ｄ胚の８μｍパラフィン切片にて行った(Kishimoto J,Cox H,Deverne EB及びEmson PC「Cellular Localization of Putative Odorant Receptor Messenger RNAs in Olfactory and Chemosensory Neurons - A Non Radioactive Insitu Hybridization Study」Molecular Brain Research 23:33-39(1994))。ｌａｃＺのｃＤＮＡ及びマウスのバーシカンアンチセンスプローブをＰＣＲにより調製して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ(Stratagene)中にサブクローン化した。ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブをＲＮＡ標識キット(Boehringer)を用いて製造業者の指示に従って調製した。スライドガラス上のパラフィン切片を迅速にキシレンで脱ろうして、１００％、９０％、７０％エタノールにより脱水し、０．１ＭＰＢＳ(ｐＨ７．５)で洗い、その後、０．２Ｎ塩酸で１０分間処理した。切片を０．０２％ペプシン(０．２ＮＨＣｌ中)で３７℃で３０分間処理し、その後、この酵素を４％パラホルムアルデヒドで不活性化した。０．２％グリシン溶液(ＰＢＳ中)中で３回すすいだ後に、スライドガラスを０．２５％無水酢酸(０．１Ｍトリエタノールアミン／０．９％ＮａＣｌ中)で１０分間室温でアセチル化し、部分的に、７０、８０、９０％エタノールにより脱水して簡単に乾燥させた。約０．１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブ(使用前に沸騰して変性させたもの)をハイブリダイゼーション緩衝液(５０％脱イオン化ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、１×デンハート溶液)に加え、スライドガラスをカバーガラス下で５５℃で１６〜１８時間インキュベートした。これらのカバーガラスを注意して取り除き、切片を２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間室温で洗い、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６０℃で２回洗った(各３０分)。ハイブリダイズしたプローブを可視化するための免疫組織化学的手順は、アルカリホスファターゼ結合体化抗体を用いた(製造業者の指示による)。比色分析用の反応を、ニトロブルーテトラゾリウム(Boehringer)を及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート(Boehringer)加えることにより開始し、６〜２４時間室温でインキュベートした。スライドガラスをグリセリンゼリーを用いて検鏡板に固定し、４℃に維持した。
【０２５８】
３’末端標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いる放射性のイン・シトゥーハイブリダイゼーションを前に記載されたようにして行った(Kishimoto J,Keverne EB,Hardwick J,Emson PC,「Localization of nitric oxide synthase in the mouse olfactory and vomeronasal system: a histochemical,immunological and in situ hybridization study」European J.of Neuroscience 5:1684-1694(1993))。マウスバーシカンアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブの配列は、5'-CCGTTCTGGGCCACCAAGACAGTCGTCTCC-3',5'-TGACCGCCCCGATATCCAAACAAGCCTGTT-3'(SEQ ID NO:＿),5'-TCCGACAGCCAGCCGTAATCGCATTGGTCA-3'(SEQ ID NO:＿)であった。幾つかの切片は、標識したオリゴヌクレオチドとイン・シトゥーシグナルの特異性をチェックするための過剰の未標識の同じオリゴヌクレオチドの存在下でハイブリダイズした。
【０２５９】
細胞培養
トランスジェニックマウスの皮膚の繊維芽細胞の初代培養のために、新生トランスジェニックマウスの皮膚を剥ぎ取って０．２５％トリプシン中で１８時間インキュベートした。引き抜いた上皮シートと真皮をコラゲナーゼにより更に１時間消化した。細胞を１０％ＦＣＳを加えたＭＥＤＭ培地(GIBCO)に広げ、細胞を、トリプシン処理後、３日毎に継代接種した。β−ガラクトシダーゼ組織化学のために、培養した繊維芽細胞を０．２％グルタルアルデヒド(ＰＢＳ中)で２分間固定し、その後、洗浄剤溶液で５分間洗浄し、染色反応を１８時間３０℃で行った。反応を停止した後に、細胞を、５μｇ／ｍｌの７−アミノアクチノマイシンＤ(SIGMA、米国)溶液を用いて室温で２０分間対比核染色してから、ＰＢＳで洗い、フルオロマウント(Southern Biotechnology,アラバマ)を用いて検鏡板に固定した。
【０２６０】
無毛バーシカン−ｌａｃＺトランスジェニックマウスの生成
バーシカンプロモーター活性の齢関連変化を調べるために毛嚢誘導ｌａｃＺ発現を排除すべく、無毛の遺伝的バックグラウンドのバーシカン−ｌａｃＺトランスジェニックマウスを、生成した創出動物をＳＫＨ−１無毛マウス(Charles River Laboratories,ボストン)と交配させることにより得た。例えば、雄の半接合トランスジェニックマウス(ｖ／−ＨＨ)を雌の無毛マウス(−／−ｈｈ)と交配させて、トランスジーン陽性の幼若マウス(ｖ／−Ｈｈ)をゲノムＰＣＲにより選択し、次いで、それらを再び無毛マウスに戻し交配して何匹かのバーシカン−ｌａｃＺ無毛マウス(ｖ／−ｈｈ)のＦ２世代を得た(これらは、ＰＣＲ検出と無毛の外観の組合せにより容易に選択することができる)。
【０２６１】
バーシカン−ｌａｃＺトランスジェニックマウスの生成
全部で２７匹の創出マウスの内、６つの陽性の系統が、トランスジーン挿入についてのＰＣＲとサザーンブロッティング分析の両方により検出された。このトランスジーンのコピー数は、細胞当たり１コピー乃至２０を超えるコピー数であった。これらを更に、尾の皮膚にＸ−ｇａｌ組織化学反応を用いることにより、ｌａｃＺ染色についてスクリーニングした。尾におけるｌａｃＺ染色の強さは、トランスジーンのコピー数と相関しなかった(２つの系統において)。Ａ４６８１(１〜２コピー)及びＡ４６８８(２０コピーより多数)は、尾の毛において同様の強いｌａｃＺ染色を示したが、Ａ４６７９(やはり、２０コピーより多数を有する)は、尾においてのみ明るい染色を示した。トランスジェニック系統Ａ４６８１を、尾の皮膚の染色が最も強く且つ優れた繁殖習性を有するので、更なる研究のために選択した。すべての更なる分析を、ＤＢＡ／２系統との交配により誘導したＦ１〜Ｆ３子孫について行った。
【０２６２】
胚組織におけるｌａｃＺ発現の分布
強いｌａｃＺ染色が、前肢及び後肢の発生(Ｅ１３．５)において、間充織凝縮の領域内で及び外胚葉においても観察された。この外胚葉での発現は、肢の先端に限られた。放射性標識したアンチセンスオリゴを用いるイン・シトゥーハイブリダイゼーションは、肢芽の凝縮間充織において同様の内因性マウスバーシカンｍＲＮＡ発現を示した。
【０２６３】
Ｅ１５．５の胚において、強いｌａｃＺ染色が、腎臓の糸球体の間充織、嗅上皮、舌の間充織及び筋肉並びに顎下腺においても観察された。軟骨周囲の軟骨膜細胞、血管、後脳及び前脳の発生中の縁、平滑筋も又、陽性であった。
【０２６４】
肢以外の予想される発現パターンは、ジゴキシゲニン非放射性イン・シトゥーハイブリダイゼーションにより、ｌａｃＺ及び内因性マウスバーシカンプローブをトランスジェニック胚切片(Ｅ１３．５)に用いて、並びに対照用センスプローブを用いて確認された。ｍＲＮＡ発現が、腎臓、嗅上皮、上腕軟骨において、及び脊椎軟骨において観察され、これは、妥当な発現パターン及びこのトランスジェニックマウスの発現のタイミングを確認した。
【０２６５】
胚の皮膚におけるヒトバーシカンの活性
ｌａｃＺ発現を、Ｅ１３．５、Ｅ１４．５、Ｅ１５．５及びＥ１７．５胚由来の発生中の皮膚について、Ｘ−ｇａｌ組織化学により調べた。Ｅ１３．５ｄにおいては、後肢及び前肢を除いて全身の外胚葉において本質的に染色は認められなかった(随時的な痕跡的なｌａｃＺ染色が、凝縮の最初期ステージらしい単一の間充織細胞で見出された)。髭の原基は、既に、このステージでｌａｃＺ染色を示した。Ｅ１４．５において、外胚葉性プラコード(毛栓)の下に付着した凝縮した間充織細胞は、明らかにｌａｃＺ陽性であり、これは、完全に陰性の周囲の散在する間充織細胞と非常に対照的であった。位相差顕微鏡写真は、個々のβ−ｇａｌ陽性の凝縮した間充織細胞を示した。これらの陽性部位の数は、肺組織全体の矢状−中期(sagittal-mediaeval)胚切片当たり４〜５であった。Ｅ１５．５においては、これらの毛栓下の陽性の凝縮間充織は、一層強くなり且つ容積(即ち、細胞数)が増していた。Ｅ１７．５においては、ｌａｃＺ陽性の真皮の乳頭状突起の数及び強度は、劇的に増大する(やはり、大いに、将来の真皮乳頭状突起内に限られている)。大部分はやはり間充織細胞内に限られているが、少数の上皮性プラコード(即ち、上皮性ケラチノサイト)自身は、ｌａｃＺ染色を示した。
【０２６６】
トランスジェニックマウスの皮膚における毛周期依存性のヒトバーシカン活性
ｌａｃＺ染色を、新生、７日齢、１４日齢、２８日齢、４０日齢から４月齢までのトランスジェニックマウスの皮膚切片で調べた。後期胚の皮膚の毛真皮乳頭状突起細胞における強いｌａｃＺ染色が、新生の皮膚に進んだが、これは最初の生長毛周期中継続する。強い染色は、毛真皮乳頭状突起細胞に限られた。興味深いことに、７齢(中期〜後期生長ステージ)に、比較的強い染色が、内側毛根鞘においても認められた。しかしながら、後期生長ステージにおいては、ｌａｃＺ染色は、再び真皮乳頭状突起細胞に限られた。一層後期の休止期の毛においても、ｌａｃＺ染色は、棍毛においては認められない。第２毛周期においては、生長中の真皮乳頭状突起(第２生長毛周期)は、再び、強いｌａｃＺ染色を示し、第２生長毛周期の後には毛の真皮乳頭状突起におけるｌａｃＺ活性が殆ど完全に長い休止期毛周期を通じて減少した。
【０２６７】
培養繊維芽細胞におけるヒトバーシカン活性
新生トランスジェニック系統の真皮の繊維芽細胞から得られた初代真皮繊維芽細胞培養は、ある細胞集団で毛クランプの中心でのみｌａｃＺ染色を示した(明らかに真皮乳頭状突起)。すべての強く染色された細胞は丸い形状であったので、これらは、毛真皮乳頭状突起由来であろう。しかしながら、最初の継代接種後、陽性細胞の形状は、変化して丸い形状に限られなくなった(継代接種２では、樹状プロセスを有する典型的な繊維芽細胞様細胞を含んだ)。これらの陽性細胞の集団(最初の継代接種後、少なくとも第６継代接種まで維持)を、我々は、培養したが、幾つかの細胞は、決められた継代接種中、細胞総数を明確に示す対比核染色では、完全に染色されなかった。概数の陽性細胞は、５０％を超えなかった。染色の強さは、継代と共に徐々に弱まった。
【０２６８】
トランスジェニックマウスの皮膚におけるヒトバーシカン活性の齢関連変化
ｘ−ｇａｌ染色の反応時間を１８時間に増すことは、幼若乃至成体のトランスジェニックマウスの毛真皮乳頭上突起以外の一層上層の真皮における一層強い染色を示した。この長期インキュベーション条件下の新生マウス皮膚においては、毛嚢(無毛マウスは、第１周期においてのみ正常の毛を有する)を有する真皮の殆どは、明瞭に検出し得る染色を示した。若いマウスの皮膚は、単離された繊維芽細胞に由来する拡散した染色のみを上層真皮に選択的に示し、一層高齢のマウスは、かすかな染色を示しただけであり、これは、ヒトバーシカンプロモーター活性のトランスジェニックマウス皮膚における齢関連性減少を示している。
【０２６９】
実施例８：生きている動物におけるレポーター遺伝子発現の評価
方法：
共焦点顕微鏡検査
生きているトランスジェニックマウスの無傷の皮膚全体を共焦点顕微鏡を用いて調べるために、無毛ＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスを腹腔内注射によりアベルチンで麻酔した。それらをペトリ皿上に直接仰臥位で置いた。その背中の皮膚に上記と同様にしてＴＰＡ又はアセトン処理を行い、処理した領域をインクで印してその皮膚の位置確認を容易にした。これらのマウスの切片又は無傷の皮膚を、ＬｅｉｃａＤＭＩＲＢＥ倒立顕微鏡及びＬｅｉｃａＴＣＳＮＴ４Ｄ共焦点顕微鏡システム(波長５１５〜５４５ｎｍの放射を検出するバンドパスフィルター５３０／３０ｎｍ装着)を用いて分析した。
【０２７０】
生きている無毛トランスジェニックマウスの無傷の皮膚の上皮におけるＧＦＰの共焦点顕微鏡検査による直接検出
ＧＦＰの誘導が生きているＶＥＧＦ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの皮膚において直接検出されるか否かを調べるために、トランスジェニック無毛マウス(同じ個体)のアセトン又はＴＰＡ塗布した皮膚を、麻酔状況下で共焦点イメージングにより直接調べた。正常の生きている上皮の水平光学切片は、検出可能な蛍光を示し、ＴＰＡで処理した皮膚は、１２時間後に、蛍光陽性領域の増加を示した。非トランスジェニック野生型同腹子は、検出可能な特異的蛍光を示さなかった。ＴＰＡ処理した皮膚の一層高い倍率は、ＧＦＰがケラチノサイトの周囲の細胞外空間に局在していることを示した。Ｘ−Ｚ共焦点イメージングは、このシグナルが上皮の基底層内にあることを確認した。
【０２７１】
ＧＦＰシグナルの検出についての生きているトランスジェニックマウスの無傷の皮膚のレーザー共焦点顕微鏡による評価は、ＧＦＰが上皮において容易に検出されることを示している。これらの結果は、イン・ビボでの長期の遺伝子発現の非侵襲的監視のためのＧＦＰトランスジェニックマウスの潜在的利用を示唆している。トランスジェニックＧＦＰレポーター遺伝子を顕微鏡(例えば、共焦点顕微鏡)による評価の技術と組み合わせた場合には、そのシステムは、慣用のトランスジェニックレポーター遺伝子を有する動物を用いる方法を超える大きな利点を有する(何故なら、それは、用いる動物の数を減じ、単純な監視システムを利用し、そして同一個体における遺伝子発現の変化の長期間の監視を可能にするからである)。
【０２７２】
ＧＦＰのトランスジェニックマウス皮膚における上首尾なイン・ビボ発現は、有用な監視用及びスクリーニング用のツールを提供することにより、炎症性及び新生物性皮膚疾患等におけるＶＥＧＦ遺伝子発現の調節の理解を与える。それは、ＶＥＧＦ発現を含む表現型を有するマウスと交配させる場合に、特に魅力的である。この新規な実験法は、ＶＥＧＦ遺伝子の調節についてのイン・ビボでの研究を可能にするであろう。このトランスジェニック動物についてのＧＦＰレポーターシステムは、老化のプロセスにおける皮膚のホメオスタシスに焦点を合わせた研究においても有利であろう。
【０２７３】
実施例９：ヒトＭＭＰ９のトランスジェニック
ＭＭＰ９(ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ)は、細胞外マトリクス(ＥＣＭ)成分を分解することのできる多くのマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)の一つである。この酵素(ＭＭＰ９)は、ＩＶ及びＶ型コラーゲン、ゼラチン並びにエラスチンを分解することが知られている。それは又、光老化を引き起こすＵＶＢによって誘導されることも示されている。(Fisher,G.J.,Nature 379,335,1996)。この遺伝子の５’フランキング領域(配列位置−６７０から＋１の転写開始部位まで)は、ＨＴ１０８０細胞においてレポーター遺伝子(ＣＡＴ)の発現を駆動するのに十分である。(Sato,H.,Oncogene 8:395,1993)。
【０２７４】
トランスジーンの構築
トランスジーンを構築するために、ヒトＭＭＰ９プロモーターの７３３ｂｐの断片(ヌクレオチド−７１４〜＋１９；転写開始部位を＋１とする)をヒトのゲノムＤＮＡから、公知のＰＣＲベースの技術を用いて得た。２つの異なるレポーター遺伝子ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(ｌａｃＺ)及びグリーン蛍光蛋白質(ＧＦＰ)遺伝子を、構築のために用いた。
【０２７５】
ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子(ｌａｃＺ)を用いる構築のために、ＭＭＰ９プロモーター断片を改変ｐＮＡＳＳｂｅｔａベクター(Clontech)中に挿入したが、それは、好中球エラスターゼプロモーターを挿入されており、ＢｇｌＩＩ部位を有し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩによる制限により線状化される。前核注入用のトランスジーンＤＮＡ断片を得るために、このベクターを、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させた。この線状化されたトランスジーンＤＮＡの長さは、４６３０ｂｐであった。
【０２７６】
グリーン蛍光蛋白質(ＧＦＰ)遺伝子を用いる構築のために、同じＭＭＰ９プロモーター断片をｐＥＧＦＰ−１−ＳＶに挿入した。これは、スプライスドナー／アクセプターを有するように改変されたｐＥＧＦＰ−１ベクター(Clontech)に基づくベクターで、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩによる制限により線状化された。前核注入用のトランスジーンＤＮＡ断片を得るために、このベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｆｌＩＩで開裂させた。この線状化されたトランスジーンＤＮＡの長さは、１９２８であった。
【０２７７】
トランスジェニックマウスの生成
この線状化トランスジーンＤＮＡ断片を、無毛マウス(ＳＫＨ１；Charles River,Boston)の受精卵母細胞中に注入した。これらの卵を、偽妊娠養育母中に移植した。これらの子孫(Ｆ０)を、ｌａｃＺ又はＧＦＰ断片の染色体への組込みについてサザーンブロッティングにより試験した。ｌａｃＺトランスジーンの検出のために、尾から抽出したゲノムＤＮＡをＮｃｉＩで消化してゲル上で分離し、その後、ナイロン膜上にトランスファーした。このＮｃｉＩ消化したトランスジーンＤＮＡ断片をプローブとして用いた。２つの独立の系統が、トランスジーンの挿入を示した。ＧＦＰトランスジーンの検出のために、尾のゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｃＩＩで消化した。２つの独立の系統が、トランスジーンの挿入を示した。
【０２７８】
ベータ−ガラクトシダーゼ組織化学
創出動物(Ｆ０)から得られたＦ１マウスを、ベータ−ガラクトシダーゼ組織化学に用いた。２週齢のマウスの後肢の骨を、０．５％グルタルアルデヒド(ＰＢＳ中)で３０分間固定した。ＰＢＳで３回洗い、洗浄剤で１回洗った後に、この組織を、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ(Sigma)、１０ｍＭフェロシアニド及び１０ｍＭフェリシアニドを含む反応緩衝液と３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーションの後に、青色の染色がトランスジーンを有するＦ１マウスにおいて認められたが、トランスジーンを持たない兄弟においては染色は認められなかった。これらは、ＭＭＰ９が２週齢のマウスの肢の骨において発現することがイン・シトゥーハイブリダイゼーションにより示された報告(Reponen,P.,Journal of Cell Biology 124,1091,1994)と一致する。
【０２７９】
実施例１０：ヒト好中球エラスターゼのトランスジェニックマウス
好中球エラスターゼは、広範囲の蛋白質を攻撃することのできる強力なセリンプロテアーゼの一つである。この酵素を欠く無毛マウスは、ＵＶＢ照射により引き起こされる光老化の徴候の一つである弾力繊維症を患わない(Starcher,B.,Connective Tissue Research,31,133,1995)。それ故、好中球エラスターゼは、光老化において重要な役割を演じると考えられる。
【０２８０】
トランスジーンの構築
このトランスジーンを構築するために、ヒト好中球エラスターゼプロモーターの１２９９ｂｐの断片(ヌクレオチド−１２８０〜＋１９；転写開始部位を＋１とする)を、ヒトゲノムＤＮＡから当分野で公知のＰＣＲベースの技術を用いて得た。この好中球エラスターゼプロモーター断片を、ｐＮＡＳＳｂｅｔａベクター(Clontech)に挿入し、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩによる制限により線状化した。前核注入用のトランスジーンＤＮＡ断片を得るために、このベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで開裂させた。この線状化したトランスジーンＤＮＡの長さは、５１７１ｂｐであった。
【０２８１】
同等物
当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する同等物を認識し、又は日常的実験を用いて確認することができる。かかる同等物は、請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトバーシカン−ＬａｃＺトランスジーン構築の図式表示である。
【図２】  血管内皮成長因子−グリーン蛍光蛋白質[ＶＥＧＦ−ＧＦＰ]トランスジーン構築物の図式表示である。
【図３】  ５０６９ｂｐのＭＭＰ９プロモーター−ＧＦＰ構築物のヌクレオチド配列の描写である。
【図４】  ７３８３ｂｐのＭＭＰ９プロモーター−Ｇａｌ構築物のヌクレオチド配列の描写である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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