(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域と３'末端の間の領域へ、
（ａ）薬剤反応性プロモーターの下流に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有する、外来遺伝子の発現カセット、
（ｂ）プロモーターの下流に薬剤反応性転写活性化遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤反応性転写活性化遺伝子の発現カセット、および
（ｃ）プロモーターの下流に薬剤制御転写サイレンサー遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤制御転写サイレンサー遺伝子の発現カセット
が、それぞれ挿入された構造を有し、薬剤によって外来遺伝子の発現が制御されることを特徴とする組換えアデノウイルスベクターＤＮＡであって、前記薬剤がテトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体である組換えアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項２】
外来遺伝子の発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ１欠失領域へ挿入されたものである、請求項１に記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項３】
薬剤反応性転写活性化遺伝子の発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ３欠失領域へ挿入されたものである、請求項１に記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項４】
Ｅ１遺伝子産物を発現しない、請求項１〜３のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項５】
（ｂ）に記載のプロモーターがサイトメガロウイルス由来プロモーターである、請求項１〜４のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項６】
（ｃ）に記載のプロモーターがＥＦ−１αプロモーターである、請求項１〜４のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項７】
薬剤反応性転写活性化遺伝子が逆テトラサイクリン反応性転写活性化因子遺伝子であり、薬剤制御転写サイレンサー遺伝子がテトラサイクリン制御転写サイレンサー遺伝子である、請求項１〜６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを含む、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターＤＮＡを導入した、請求項８に記載の組換えウイルスベクターを製造するためのパッケージング細胞。
【請求項１０】
２９３細胞由来である、請求項９に記載のパッケージング細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の細胞を培養し、生成するウイルス粒子を回収する工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組換えアデノウイルスベクターの製造方法。
【請求項１２】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現を調節する方法。
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）の哺乳動物または哺乳動物細胞へ薬剤を投与する工程
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを含む、遺伝子治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外来遺伝子の発現が調節可能なアデノウイルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類細胞において外来遺伝子発現系が調節されることは、遺伝子治療の有効性と安全性、および細胞生物学における遺伝子機能の研究にとって好ましい。適当な調節系の重要な特徴として、1）低い基礎発現、2）高い誘導発現、3）迅速な反応時間、4）発現の調節（機能の分析にとって重要）が挙げられる。
【０００３】
これまでに、いくつかのタイプの外来遺伝子の発現調節が可能な哺乳類発現系が開発されている。（１）テトラサイクリン誘導発現系（Gossen, M. and Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 5547-5551; Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 268, 1766-1769）、（２）エクジソン誘導発現系（No, D., Yao, T. P. and Evans, R. M. (1996) Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 3346-3351）、（３）ミフェプリストン誘導発現系（Tsai, S. Y., O'Malley, B. W., DeMayo, F. J., Wang, Y. and Chua, S. S. (1998) A novel RU486 inducible system for the activation and repression of genes. Adv. Drug Deliv. Rev., 30, 23-31; Wang, Y., O'Malley, B. W. J., Tsai, S. Y. and O'Malley, B. W. (1994) A regulatory system for use in gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 8180-8184）、（４）ラパマイシン誘導発現系（Amara, J. F., Clackson, T., Rivera, V. M., Guo, T., Keenan, T., Natesan, S., Pollock, R., Yang, W., Courage, N. L., Holt, D. A. and Gilman, M. (1997) A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 10618-10623; Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L. and Crabtree, G. R. (1996) Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature, 382, 822-826; Magari, S. R., Rivera, V. M., Iuliucci, J. D., Gilman, M. and Cerasoli, F. J. (1997) Pharmacologic control of a humanized gene therapy system implanted into nude mice. J. Clin. Invest., 100, 2865-2872; Rivera, V. M., Clackson, T., Natesan, S., Pollock, R., Amara, J. F., Keenan, T., Magari, S. R., Phillips, T., Courage, N. L., Cerasoli, F. J., Holt, D. A. and Gilman, M. (1996) A humanized system for pharmacologic control of gene expression. Nat Med., 2, 1028-1032）。それらのうち、テトラサイクリン誘導発現系は、最も広く用いられている。２つのタイプの系、tet-offおよびtet-onが、外来遺伝子発現を調節するために用いられている（Gossen, M. and Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 5547-5551; Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 268, 1766-1769）。テトラサイクリン反応性転写活性化因子（tTA）を用いるtet-off系では、テトラサイクリンの存在下で転写のスイッチは切られる（Gossen, M. and Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 5547-5551）。対照的に、逆テトラサイクリン反応性転写活性化因子（rtTA）を用いるtet-on系では、テトラサイクリンの存在下で転写のスイッチが入る（Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 268, 1766-1769）。このように、tet-offおよびtet-on系はそれぞれ、外来遺伝子発現の負と正の制御を提供する。
【０００４】
調節された哺乳類発現系を細胞に輸送する方法は、その用途にとって重要な決定因子である。組み換え型アデノウイルスベクターとテトラサイクリン制御発現因子の組み合わせはこの目的に関して魅力的な戦略である。アデノウイルスベクターは、高い力価まで容易に増殖させることができ、インビトロとインビボの双方において広範囲の細胞タイプに外来遺伝子を効率的に輸送することができる（Benihoud, K., Yeh, P. and Perricaudet, M. (1999) Adenovirus vectors for gene delivery. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 440-447; Kovesdi, I., Brough, D., Bruder, J. and Wickham, T. (1997) Adenoviral vectors for gene transfer. Curr. Opin. Biotechnol., 8, 583-589）。これまでに、本発明者らは、アデノウイルス媒介tet-offおよびtet-on系の機能の比較を行い、tet-on系を含むアデノウイルスベクターの調節は、tet-off系を含むアデノウイルスベクターよりかなり低い（多くは20倍未満）ことを示した（Mizuguchi, H. and Hayakawa, T. (2002) The tet-off system is more effective than the tet-on system for regulating transgene expression in single adenoviral vector. J. Gene Med. in press）。アデノウイルス媒介tet-on系による外来遺伝子発現の最高レベルは、アデノウイルス媒介tet-off系のレベルより10倍以上低い。tet-on系は、遺伝子発現を正に制御するため好ましく、これらの制限を克服する方法を開発することが重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、薬剤により外来遺伝子の発現を効率的および簡便に制御できる新規アデノウイルスベクターを開発することにある。さらに、本発明は、該ベクターを用いた非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現を制御する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために下記の如く鋭意研究を行い、テトラサイクリン調節遺伝子発現系(tet-on系)のより高い調節された活性を示す新規アデノウイルスベクター系の開発を行った。
【０００７】
まず本発明者らは、E1欠失領域、E3欠失領域、およびE4と3'ITRの間の領域に、外来遺伝子を含むアデノウイルス媒介三重遺伝子発現系を開発した。rtTAおよびテトラサイクリン制御転写サイレンサー（tTS）発現カセット（Freundlieb, S., Schirra-Muller, C. and Bujard, H. (1999) A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J. Gene Med., 1, 4-12）をそれぞれ、E3欠失領域、およびE4と3'ITRの間の領域とに導入して、tet-反応性プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子をE1欠失領域に導入した。この改変によって、改良されたtet-on系を含む単一のアデノウイルスベクターは、外来遺伝子が高度に調節された発現（細胞のタイプに応じて60〜2,500倍以上）を示すことが見出された。
【０００８】
上記の如く本発明者らは、薬剤により外来遺伝子の発現を効率的に制御できる新規アデノウイルスベクターを開発し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は3つの遺伝子を発現させるカセットを1つのベクターに導入したものであり、従来の3つの遺伝子を別々のベクターで発現させていた場合と比べて、外来遺伝子の発現制御を効率的かつ簡便に行うことができる。また、本発明のベクターを用いることにより、非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞において外来遺伝子の発現を効率的に制御することが可能である。
【００１０】
即ち本発明は、薬剤により外来遺伝子の発現を効率的および簡便に制御できる新規アデノウイルスベクター、並びに、該ベクターを用いた非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現を制御する方法に関し、より具体的には、
〔１〕  アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域と３'末端の間の領域へ、
（ａ）薬剤反応性プロモーターの下流に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有する、外来遺伝子の発現カセット、
（ｂ）プロモーターの下流に薬剤反応性転写活性化遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤反応性転写活性化遺伝子の発現カセット、および
（ｃ）プロモーターの下流に薬剤制御転写サイレンサー遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤制御転写サイレンサー遺伝子の発現カセット
が、それぞれ挿入された構造を有し、薬剤によって外来遺伝子の発現が制御されることを特徴とする組換えアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔２〕  外来遺伝子の発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ１欠失領域へ挿入されたものである、〔１〕に記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔３〕  薬剤反応性転写活性化遺伝子の発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ３欠失領域へ挿入されたものである、〔１〕に記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔４〕  Ｅ１遺伝子産物を発現しない、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔５〕  （ｂ）に記載のプロモーターがサイトメガロウイルス由来プロモーターである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔６〕  （ｃ）に記載のプロモーターがＥＦ−１αプロモーターである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔７〕  薬剤がテトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔８〕  薬剤反応性転写活性化遺伝子が逆テトラサイクリン反応性転写活性化因子遺伝子であり、薬剤制御転写サイレンサー遺伝子がテトラサイクリン制御転写サイレンサー遺伝子である、〔７〕に記載の組換えアデノウイルスベクターＤＮＡ、
〔９〕  〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを含む、組換えアデノウイルスベクター、
〔１０〕  〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターＤＮＡを導入した、〔９〕に記載の組換えウイルスベクターを製造するためのパッケージング細胞、
〔１１〕  ２９３細胞由来である、〔１０〕に記載のパッケージング細胞、
〔１２〕  〔１０〕または〔１１〕に記載の細胞を培養し、生成するウイルス粒子を回収する工程を含むことを特徴とする、〔９〕に記載の組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
〔１３〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現を調節する方法、
（ａ）〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）の哺乳動物または哺乳動物細胞へ薬剤を投与する工程
〔１４〕  〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のアデノウイルスベクターＤＮＡを含む、遺伝子治療用組成物、を提供するものである。
【００１１】
なお、本発明において「ベクター」とは、宿主内で外来遺伝子を発現させるためのＤＮＡをパッケージングした「ウイルス粒子」と定義し、ウイルス粒子に含まれる該ＤＮＡを「ベクターＤＮＡ」と定義する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、薬剤により外来遺伝子の発現を効率的に制御できる組換えアデノウイルスベクターDNA（本明細書においては、単に「ベクターDNA」と記載する場合あり）を提供する。本発明の好ましい態様においては、薬剤の添加に応答して外来遺伝子の発現がオンになり、薬剤濃度の上昇に伴い、外来遺伝子の発現レベルが上昇する。
【００１３】
本発明のベクターDNAは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域と３'末端の間の領域へ、それぞれ下記の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の遺伝子発現カセットが挿入された構造を有する。本発明のベクターDNAは、薬剤によって外来遺伝子の発現の制御が可能である。
（ａ）薬剤反応性プロモーターの下流に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有する、外来遺伝子の発現カセット。
（ｂ）プロモーターの下流に薬剤反応性転写活性化遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤反応性転写活性化遺伝子の発現カセット。
（ｃ）プロモーターの下流に薬剤制御転写サイレンサー遺伝子が機能的に結合した構造を有する、薬剤制御転写サイレンサー遺伝子の発現カセット。
【００１４】
本発明において「外来遺伝子」とは、細胞内で発現を調節したい所望の遺伝子を言う。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、外来遺伝子として、対象となる疾患の治療用遺伝子を用いることができる。
【００１５】
本発明のベクターDNAは、外来遺伝子、薬剤反応性転写活性化遺伝子、および薬剤制御転写サイレンサー遺伝子が1つのアデノウイルスベクターDNAへ、それぞれの遺伝子が発現可能な状態で挿入された構造を有することを特徴とする。これにより、3つの遺伝子を別々のベクターを用いて発現させるより簡便であり、さらに、外来遺伝子の発現も効率的に制御できる特段の効果を有する。
【００１６】
アデノウイルスは、線状二本鎖DNAをゲノムとして持ち、その両末端には、逆方向末端配列 (Inverted terminal repeat; ITR)が存在し、複製起点を含んでいる。アデノウイルスベクターは、主に下記のような特徴を有する（水口, 早川、バイオ医薬品の品質・安全性評価(LIC出版), p.383-393, 2001）。
（１）種を問わず多くの種類の細胞へ遺伝子導入することができ、これまで知られているベクターの中でも最も遺伝子導入効率の良いものの１つである。
（２）増殖停止期の細胞に対しても効率良く遺伝子導入ができる。
（３）インビボの組織への直接の遺伝子導入にも適している。
（４）高タイター(1011 PFU/ml以上)のウイルスが比較的容易に得られる。
（５）物理化学的に安定であり、遠心により濃縮が可能である。
（６）比較的大きな外来遺伝子（最大約8.1 kb）を挿入することできる。
（７）ウイルスゲノムは核内では染色体外DNAとして存在し、宿主の染色体に組み込まれる頻度は低いため、遺伝子毒性（外来遺伝子が宿主染色体に組み込まれることによる細胞の癌化など）を引き起こす可能性が極めて低い。
【００１７】
アデノウイルスゲノムに含まれる遺伝子は初期遺伝子であるＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４と、後期遺伝子のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５に大別される。上記Ｅ１遺伝子は、ウイルスタンパク質の合成を誘導する働きをしており、この遺伝子が欠損したベクターは、理論上Ｅ１遺伝子産物を発現していない細胞では増殖できない。
【００１８】
通常、遺伝子治療用として用いられるアデノウイルスベクターは、ウイルスタンパク質の合成を誘導する初期遺伝子であるＥ１領域へ外来遺伝子が挿入された構造を有し、その結果、Ｅ１遺伝子産物が生産されない。従って、理論的にはＥ１遺伝子産物をトランスに供給できない通常の細胞では、増殖することができず、安全性が高いと考えられている。従って、本発明のベクターDNAは、好ましくはE1遺伝子産物を発現しないように構築されたものである。
【００１９】
また、Ｅ３領域はウイルスの増殖には必須ではなく、通常、外来遺伝子の挿入サイズの上昇を目的に除かれることが多い。
【００２０】
従って、本発明の上記Ｅ１領域は、好ましくはＥ１遺伝子上の一部または全部のＤＮＡが欠失したものであり、より好ましくはＥ１遺伝子産物が産生されないような欠失を有するＥ１領域である。また、本発明の上記Ｅ３領域は、Ｅ３遺伝子上の一部または全部のＤＮＡが欠失したものであることが好ましい。
【００２１】
本発明においては、Ｅ１遺伝子上の一部または全部のＤＮＡが欠失したＥ１領域を、特に「Ｅ１欠失領域」と記載する。同様に、Ｅ３遺伝子上の一部または全部のＤＮＡが欠失したＥ３領域を、特に「Ｅ３欠失領域」と記載する。また、本発明のベクターDNAは、外来遺伝子、薬剤反応性転写活性化遺伝子、および薬剤制御転写サイレンサー遺伝子が1つのアデノウイルスベクターDNAへ、それぞれの遺伝子が発現可能な状態で上記に記載した領域へ挿入された構造を有する限り、アデノウイルスゲノムのDNAにおいて、欠失、置換、挿入等を有するものであってもよい。
【００２２】
上記Ｅ１欠失領域において、欠失するDNA領域は、正確に規定されるものではないが、当業者においては、アデノウイルスゲノムのE1領域の342-3523 bpを欠失する、または354-3824bpを欠失する、あるいは459-3510 bpを欠失するベクターDNAを好適に使用することができる。また、Ｅ３欠失領域においても、欠失するDNA領域を正確に規定することは困難であるが、通常、アデノウイルスゲノムのE3領域の27865-30995 bpを欠失する、または28133-30818 bpを欠失するベクターDNAが一般的に用いられる。なお、本明細書においてアデノウイルスゲノム上の位置を示す番号は、the National Center for Biotechnology Information GeneBankのアクセッション番号：M73260/M29978の塩基配列に基づく。
【００２３】
本発明において「E4領域と3'末端の間の領域」とは、より具体的には、E4遺伝子をコードするプロモーター配列（E4遺伝子はアデノウイルスゲノムの左側から右側にコードされているためプロモーター配列が最も3'末端になる）と3'末端に存在するITRのはじめのDNAまでの間の領域を指す。該領域は通常、35610-35832 bpであるが、この数字に正確に規定されるものではない。
【００２４】
本発明において上記（ａ）の外来遺伝子の発現カセットは、該外来遺伝子が薬剤の転写に応答して発現し得るように構築される。通常、プロモーターの下流に外来遺伝子が機能的に結合した構造を有する。本発明において「機能的に結合した」とは、プロモーターの転写の活性化に伴い、下流の遺伝子の発現が誘導されるようにプロモーターと下流の遺伝子が結合していることを言う。本発明の上記（ａ）の遺伝子発現カセットにおいては、「薬剤反応性転写因子」が結合し得る、応答エレメントを有することが好ましく、通常、該薬剤反応性転写因子が応答エレメントへ結合することにより、外来遺伝子の転写が制御される。
【００２５】
本発明において「薬剤反応性転写活性化因子」は、薬剤存在下で外来遺伝子の発現を制御する応答エレメントに特異的に結合し、外来遺伝子の発現を活性化するものと定義される（該因子をコードする遺伝子を「薬剤反応性転写活性化因子遺伝子」あるいは「薬剤反応性転写活性化遺伝子」と記載する）。本発明における「薬剤」がテトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体である場合には、本発明の「薬剤反応性転写因子」として、例えば、逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子(rtTA; Reverse tetracycline-controlled transactivator)を好適に使用することができる。また、上記応答エレメントとしては、例えばTREを示すことができる。TREはtetO（tetオペロン）を含む42bp配列が7回反復した構造を有するDNA配列である。
【００２６】
また、テトラサイクリン非存在下において、ベーサルな転写活性が変化している改良型rtTAが知られている(国際公開番号 WO 00/75347; 国際公開番号 WO 00/75362; Urlinger S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 7963-7968)。本発明においては上記薬剤反応性転写活性化因子として、このような公知の改良型rtTAも好適に使用することができる。また、本発明の薬剤反応性転写活性化因子は、野生型rtTAまたは上記の公知の改良型rtTAに限定されず、当業者によってさらに該rtTAに適宜改変を施したrtTAを用いることも可能である。
【００２７】
本発明において「薬剤制御転写サイレンサー遺伝子」は、薬剤の非存在下で外来遺伝子の発現を制御する応答エレメントに特異的に結合し、外来遺伝子の発現を抑制するものと定義される。該遺伝子は、薬剤非存在下における外来遺伝子の発現（バックグラウンド）を下げる目的で利用される。本発明における「薬剤」がテトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体である場合には、本発明の「薬剤制御転写サイレンサー遺伝子」としては、例えば、テトラサイクリン制御転写サイレンサー(Tetracycline-controlled transcriptional silencer; tTS)を好適に使用することができる。
【００２８】
本発明における上記テトラサイクリン誘導体としては、具体的には、ドキソサイクリン(doxycycline)、アンハイドロテトラサイクリン(anhydrotetracycline)、ミノサイクリン(minocycline)等を例示することができる。また、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体以外の薬剤としては、例えば、エクジソン、ミフェプリストン(mifepriston)、ラパマイシン等を示すことができる。
【００２９】
また、本発明における「薬剤」がエクジソンである場合には、本発明の薬剤反応性転写因子として、例えば、RXRとVgEcRとの融合タンパク質(RXR : Retinoid X receptor、VgEcR : VP16/ecdysone receptor fusion gene)を挙げることができる。「薬剤」がミフェプリストンである場合には、本発明の薬剤反応性転写因子として、例えば、GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD融合タンパク質(GAL4 DBD : Yeast GAL4 DNA binding domain、hPR-LBD : Truncated human progesterone receptor ligand binding domain、p65-AD : Human p65 activation domain from NF-kB)を挙げることができる。また、「薬剤」がラパマイシンである場合には、本発明の薬剤反応性転写因子として、例えば、ZFHD1/3xFKBP融合タンパク質(3xFKBP : Three tandemly repeated copies of human FKBP12 protein、ZFHD1 : Human DNA binding domain composed of two zinc finger domains from the human transcription factor Zif268, joined to a homeodomain derived from the human transcription factor Oct-1)を挙げることができる。
【００３０】
本発明における上記プロモーターは、発現させたい外来遺伝子の種類、および外来遺伝子を導入する細胞の種類等を考慮して、当業者においては公知のプロモーターから適宜選択して使用することができる。具体的には、サイトメガロウイルス(CMV)由来プロモーター、EF-1αプロモーター、βアクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス由来（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＴＫプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＲαプロモーター等を例示することができるが、特にこれらに制限されない。
【００３１】
本発明のアデノウイルスベクターDNAは、通常、アデノウイルスゲノムが有するファイバーと呼ばれるタンパク質をコードするDNAを含む。アデノウイルスは、252個のカプソメアよりなる正20面体構造をしており、そのうち頂点にある12個は、ペントンベースとファイバーからなる突起構造をしたペントンと呼ばれる。アデノウイルスの細胞内への浸入は、ファイバーがCAR(coxsackievirus-adenovirus receptor)と呼ばれるアデノウイルス受容体に結合することにより起こることが知られている。従って、アデノウイルスは、CARを発現しない細胞（例えば、気道上皮細胞、平滑筋細胞、T細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、神経膠腫細胞等）、もしくはCARの発現が乏しい細胞へは通常、感染することはできない。本発明者らは、アデノウイルスファイバーを改変することにより、CARを発現しない細胞もしくは発現が乏しい細胞にも感染することが可能なアデノウイルスベクターを開発した(Mizuguchi, H., et. al., Gene Therapy 8: 730-735, 2001)。該アデノウイルスベクターの改変ファイバーは、ファイバーノブのＨＩループへ外来ペプチドが挿入された特徴を有する。
【００３２】
本発明の好ましい態様においては、アデノウイルスベクターの細胞への感染力を高めるために、本発明のベクターDNAは、上記の（１）および／または（２）のように改変されたファイバーをコードするDNAを含むものであってもよい。上記外来ペプチドとしては、感染させたい細胞（組織）の表面に存在するタンパク質と特異的に結合する、あるいは親和性を有するペプチドであれば特に制限されず、通常、感染させたい細胞の表面上のヘパリン硫酸またはαvインテグリンと結合し得る（親和性を有する）ペプチドである。
【００３３】
上記外来ペプチドとして具体的には、Arg-Gly-Asp(RGD)、Asn-Gly-Arg(NGR)、またはLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(K7)モチーフを含むポリペプチドを挙げることができる。例えば、インテグリンとの親和性を有するRGD配列をファイバーに組み込んだベクターは、CARを発現しない細胞に対してもRGD-インテグリン経由で効率良く感染することが知られている。
【００３４】
本発明のアデノウイルスベクターDNAは、公知のアデノウイルスゲノムを有するベクタープラスミド（本明細書においては単に、「ベクタープラスミド」と記載する場合あり）を利用して、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロライゲーションでのプラスミド構築に基づく方法により作製することができるが、この方法に制限されない。該方法は、9〜11 bp以上を認識する制限酵素であるI-Ceu IとPI-Sce Iを利用し、E1欠失領域への外来遺伝子の挿入をインビトロライゲーションで行うことにより、改変ウイルスベクターDNAを作製する方法である。本発明のベクターDNAの基となる上記ベクタープラスミドは、通常、E1（または、E1/E3もしくはE1/E3/E4）領域を除く全てのアデノウイルスゲノムを持っており、E1欠失領域に3つのユニークサイトであるI-Ceu I, Swa I, PI-Sce I部位を有している。シャトルプラスミドは、通常、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を持ち、当業者においては、プロモーターカセットが予め挿入された公知の種々のシャトルプラスミドを利用することができる（水口ら、細胞工学, Vol. 18, p.1824-1827, 1999）。本発明においては、シャトルプラスミドとして、遺伝子発現単位の両端にI-Ceu IとPI-Sce I部位を有しているものを好適に利用することができる。
【００３５】
外来遺伝子はシャトルプラスミド上のプロモーターの下流へクローニングされた後、例えばI-Ceu IとPI-Sce I部位を利用してベクタープラスミド上のE1（欠失）領域へ容易に挿入することができる。
【００３６】
同様に、本発明の薬剤反応性転写活性化遺伝子、および薬剤制御転写サイレンサー遺伝子は、シャトルプラスミド上のプロモーターの下流へそれぞれクローニングされた後、E3領域、E4領域と3'末端の間の領域への挿入は、それぞれClaIもしくはCsp45I、または、XbaI、AvrII、NheIもしくはSpeI部位を利用して該シャトルプラスミドから切り出され、アデノウイルスベクタープラスミド上のそれぞれE3領域、またはE4領域と3'末端の間の領域へ挿入される。本発明においては、外来遺伝子、薬剤反応性転写活性化遺伝子、および薬剤制御転写サイレンサー遺伝子がそれぞれプロモーターの下流に機能的に連結され、発現可能となった状態のこれらの遺伝子を含むDNA断片を「発現カセット」と呼ぶ。
【００３７】
また、本発明のベクターDNAを作製するための上記アデノウイルスベクタープラスミドは、本発明の上記発現カセットを容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。該クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。これにより、アデノウイルスゲノムをコードするベクターDNA中の当該制限酵素部位に本発明の上記「発現カセット」を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。これらのクローニングサイトの設計および構築は、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて行うことが可能である。本発明のベクターDNAは、上記発現カセットを含む以外に、アデノウイルスゲノムにコードされる遺伝子以外の遺伝子またはDNA断片を有していてもよい。
【００３８】
本発明のアデノウイルスベクターDNAの作製は、より具体的には、後述の実施例に記載された方法で行うことができるが、この方法に限定されるものではない。
【００３９】
また、本発明にベクターにおけるファイバーの改変は、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術によって実施することができる。例えば、ファイバー分子への外来ペプチドの挿入に最適な部位（例えば、HIループ）をコードしたゲノムDNA上に、ユニークな制限酵素部位を挿入し、1ステップのインビトロライゲーションで挿入したい任意のペプチド配列に相当する合成オリゴDNAをファイバー遺伝子領域に導入することにより、容易にファイバーが改変されたベクターDNAを作製することができる。より具体的には、後述の実施例に記載された方法で作製することができるが、この方法に特に限定されない。
【００４０】
さらに本発明のアデノウイルスベクターDNAを含む組換えアデノウイルスも、本発明に含まれる。本発明においては、該アデノウイルスを「アデノウイルスベクター」あるいは単に「ウイルスベクター」と記載する。
【００４１】
本発明のパッケージング細胞（本発明のウイルスベクターを作製するため宿主細胞）としては、本発明のウイルスベクターが産生され得る細胞であれば、特に制限されない。本発明のベクターDNAが、E1遺伝子産物が発現しないように構築されたものである場合、本発明のパッケージング細胞の由来となる宿主細胞は通常、アデノウイルスの複製に必要な該ウイルスゲノムにコードされているE1遺伝子を含み、該遺伝子産物をトランスに供給できる細胞である。このような細胞として具体的には、２９３細胞、ＰＥＲ細胞等を例示することができる。
【００４２】
本発明のベクターDNAの細胞への導入方法としては、当業者において周知の遺伝子導入方法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、あるいはリポフェクタミン（lipofectamine, GIBCO BRL）、フュージン（Fugene, Bohringer Mannheim）、スーパーフェクト（SuperFect, Qiagen）等を用いることができる。本発明のベクターDNAは、大腸菌において薬剤選択を可能にするためのアンピシリンやナカマイシン耐性遺伝子を必要に応じて含むことができる。
【００４３】
本発明のウイルスベクターを導入したパッケージング細胞は、適当な条件にて培養を行い、培養上清中または細胞（核）内に放出されるウイルス粒子を回収することにより、目的のアデノウイルスベクターを調製することができる。
【００４４】
本発明のアデノウイルスベクターの調製は、当業者においては、周知の方法によって実施することができる。また、市販のキットを利用することもできる。アデノウイルスベクターの調製は、通常、主に（１）ウイルスの増殖とウイルス液の調製、（２）ウイルス精製・濃縮、の工程から成る。具体的には、上記（１）の工程は、以下のようにして行うことができる（鐘ヶ江ら、実験医学別冊 新訂 新遺伝子工学ハンドブック改訂第3版、p.202-209）が、下記方法に特に限定されない。まず、ウイルス液を293細胞へ感染させ、37℃で3〜5日培養し、凍結融解または超音波破砕する。次いで低速遠心(3krpm, 10分)にて上清を分取し、分注した後、急速凍結させ-80℃で保存する。また、上記（２）の工程は、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、ウイルス液を293細胞へ感染させ、37℃で3〜5日培養し、超音波破砕する。次いで高速遠心(10krpm, 10分)にて上清を分取する。段差勾配遠心(25krpm, 2時間)を行い、ウイルスバンドを分取する。次いで2回目の段差勾配遠心(35krpm, 3時間)を行い、ウイルスバンドを分取し透析後、分注して急速凍結する。調製されたウイルスベクターの力価は、適宜、周知の方法によって測定することができる。
【００４５】
また、回収したアデノウイルスは実質的に純粋になるように精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全タンパク質のうち、ウイルスベクター由来のタンパク質の割合が50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。
【００４６】
本発明のパッケージング細胞により生産されたアデノウイルスベクターは、広範囲の研究・医療分野に有用に用いられる。例えば、遺伝子治療やモデル動物の作製において目的の遺伝子をex vivo または in vivo で発現させるためのベクターとして用いられる。また、抗原タンパク質や免疫機能を高めるタンパク質を発現させるためのワクチンとしても有用である。また、遺伝子機能を解析するための インビトロ 遺伝子導入ベクターとしても有用である。また、該ベクターを、目的のタンパク質を製造するために用いることもできる。また、cDNA発現ライブラリーのように、不特定のcDNA分子種を発現するライブラリーの作製用ベクターとしても有用である。
【００４７】
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用として、直接投与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、タンパク質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
【００４８】
本発明のウイルスベクターは、薬学的に許容される所望の媒体と共に組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を阻害しない材料である。例えば本発明のウイルスベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などで適宜希釈して組成物とすることができる。また本発明のウイルスベクターを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。
【００４９】
上記のようにして得られたウイルスベクターまたは該ベクターを含む組成物を非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞へ導入することで、ウイルスベクターが持つ外来遺伝子を該動物または動物細胞で発現させることができる。
【００５０】
本発明のウイルスベクターにより発現させることが可能なタンパク質としては、天然または人工タンパク質であるかを問わず、所望のタンパク質を挙げることができる。天然のタンパク質としては例えば、分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、酵素、ペプチド等を挙げられる。人工タンパク質としては、例えば、キメラ毒素などの融合タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子等が挙げられる。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加したタンパク質であってもよい。また、アンチセンスRNA分子またはRNA切断型リボザイム等を発現させることにより、細胞における発現が望ましくない遺伝子について、その発現を抑制する、または遺伝子産物の機能を抑制することもできる。
【００５１】
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いることにより、本発明のウイルスベクターは、遺伝子治療用ベクターとすることが可能である。また、外来遺伝子として感染症に関する細菌もしくはウイルスの抗原をコードする遺伝子を用い、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導することも可能である。即ち、DNAワクチンとして本発明のベクターを利用することができる。
【００５２】
本発明のウイルスベクターは、非ヒト哺乳動物または動物細胞へ導入されるのに十分な量（有効量）を投与される。「十分な量」とは、本発明において、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的にもたらすように動物または細胞へ遺伝子が導入される量を言う。
【００５３】
本発明のベクターの投与により細胞に導入された外来遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、RNAプロテクションアッセイ等により検出することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCR等による検出は in situ でも行うことが可能である。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、RIA、ELISA、プルダウンアッセイ等により行うことができる。さらに、遺伝子導入の検出を容易にするため、発現させるタンパク質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼ、またはGFP(Green Fluorescent Protein)をコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに特に制限されない。
【００５４】
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、投与するベクター量は約105 pfuから約1012 pfuの範囲内であるとよい。より好ましくは、投与するベクターの量は約107 pfuから約1010 pfuの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約108 pfuから約109 pfuの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。
【００５５】
また本発明は、上記のようにして作製される、本発明のベクターDNAを含む細胞、または本発明のベクターDNAを含む非ヒト哺乳動物も本発明に含まれる。
【００５６】
さらに本発明は、非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現を調節する方法を提供する。本方法は、本発明のアデノウイルスベクターDNAを導入した非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞を提供する工程（工程（ａ））、および、工程（ａ）で提供される哺乳動物または哺乳動物細胞へ薬剤を投与する工程を含む。
【００５７】
本方法においては、上記非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞として、外来遺伝子の発現を調節したい所望の動物または細胞を使用することができる。例えば、本方法によって外来遺伝子の発現調節が有用と考えられる非ヒト哺乳動物として、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ハムスター、ブタ、ネコ、ウシ、ヤギ等を挙げることができる。また、哺乳動物細胞としては、特にヒト由来の細胞が有用であるが、本発明の哺乳動物細胞としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ハムスター、ブタ、ネコ、ウシ、ヤギ由来の細胞を使用することができる。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５９】
[実施例１]  ベクターの構築
（１）ベクタープラスミドpAdHM48の構築
本発明者らは、独自の制限部位、XbaI部位を、プラスミドにおいてクローニングしたアデノウイルスゲノムのE4と3'ITRの間の領域に導入した。より新しいベクタープラスミドpAdHM48は、E1欠失領域（△bp342〜3523）、E3欠失領域（△bp27865〜30995）、およびE4と3'ITRの間の領域（アデノウイルスゲノムのbp35811）にそれぞれ、I-CeuI/SwaI/PI-SceI、Csp45I、およびXbaI部位を含む（図１、２）。
【００６０】
ベクタープラスミドpAdHM48は、下記のように構築した。アデノウイルスゲノムの右末端（35464〜右端）を含むpGEM-ITRのEcoRI/XbaI断片（Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1999) A simple method for constructing E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector. Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017）を、pGEM-ITRのClaIまたはEciI部位をXbaI部位に変更後のEcoRI/XbaI断片とライゲーションすると、pGEM-ITR1が得られた。次に、pGEM-ITR1のBamHI部位およびpGEM-ITRのEciI部位をそれぞれ、ClaIおよびXbaI部位に変更した後、pGEM-ITR1のClaI/XbaI断片とpGEM-ITRのClaI/XbaIとのライゲーションによって、pGEM-ITR2を構築した。pGEM-ITR2のAvrII/ClaI断片を、pEco-ITR15のAvrII/ClaI断片にライゲーションして、pAdHM19のPacI部位をClaI部位に変更した後、pGEM7Zf(+)（プロメガ社、マディソン、アメリカ）にpAdHM19のEcoRI/PacI断片をクローニングして、pEco-ITR16を得た。
【００６１】
次いで、pHM15のEcoRI/BamHI断片とpEco-ITR16のEcoRI/BamHI断片とのライゲーションによりpHM15-ITR16を構築した。最後にpAdHM19のCsp45I/XbaI断片と、pHM15-ITR16のCsp45I/SpeI断片とのライゲーションによりpAdHM48を構築した。アデノウイルスゲノムの右端のClaI部位は、オリゴヌクレオチド(5'-CGTTAATTAA-3'／配列番号：１)を用いることによってPacI部位に変更した。pAdHM48は、E1欠失領域（Δbp342-3523）にI-CeuI、SwaI、およびPI-SceI部位を有し、E3欠失領域（△bp27865〜30995）にCsp45I部位、ならびにE4と3'ITRの間の領域（アデノウイルスゲノムのbp 35811）にXbaI部位を有する完全なE1/E3欠失アデノウイルスゲノムを有する（図１、２）。
【００６２】
（２）シャトルプラスミドpHM15の構築
目的の遺伝子をE4と3'ITRの間の領域に導入する補助として、多クローニング部位の両端でXbaI/AvrII/NheI/SpeI部位を含むシャトルプラスミドpHM15も構築した。XbaI、AvrII、NheI、およびSpeIは、適合性の付着末端を形成するため、AvrII、NheI、およびSpeI部位と共にXbaI部位をpAdHM48のXbaI部位へのクローニングに用いることができる。従って、インビトロライゲーションに基づく簡単なプラスミド構築によって、外来遺伝子をE1およびE3欠失領域、ならびにE4と3'ITRの間の領域に挿入することができる。
【００６３】
シャトルプラスミドpHM15は、下記のように構築した。pHM5のXbaI部位（Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1999) A simple method for constructing E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector. Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017）を殺して、次にI-CeuI/SphI消化プラスミドをオリゴヌクレオチド1（5'-TCTAGACCTAGGGCTAGCACTAGTGCGGCCGCCATG-3'／配列番号：２）および2（5'-GCGGCCGCACTAGTGCTAGCCCTAGGTCTAGATTAG-3'／配列番号：３）と共にライゲーションして、pHM14を得た。EcoRI/PI-SceI消化pHM14をオリゴヌクレオチド3（5'-AATTCCAGCTGGGGCCCACTAGTGCTAGCCCTAGGTCTAGAGTGC-3'／配列番号：４）および4（5'-TCTAGACCTAGGGCTAGCACTAGTGGGCCCCAGCTGG-3'／配列番号：５）と共にライゲーションするとpHM15が得られた。pHM15は、多クローニング部位の両端にXbaI/AvrII/NheI/SpeI部位を含む（図１、２）。
【００６４】
（３）組換えアデノウイルスベクターの構築
pAdHM48を用いて、本発明者らは、ルシフェラーゼ（tet-反応性プロモーターによって発現する）、rtTA（CMVプロモーターによって発現する）、およびtTS（EF-1αプロモーターによって発現する）発現カセットが、E1欠失領域、E3欠失領域、およびE4と3'ITRの間の領域にクローニングされるルシフェラーゼ発現アデノウイルスベクター、Ad-rtTA-tTS-Lを作製した（図１、２）。
【００６５】
本発明者らは、アデノウイルスゲノムの組換えを回避するためにAd-rtTA-tTS-Lにおいて異なるタイプのP(A)を用いた。ルシフェラーゼ発現に関してはBGH P(A)を、rtTA発現に関してはSV40 P(A)を、tTS発現に関してmRBG P(A)を用いた。AdOn-L4は、E1およびE3欠失領域においてそれぞれ、ルシフェラーゼ（Tet-反応性プロモーターによって発現する）およびrtTA（CMVプロモーターによって発現する）発現カセットを含む対照ベクターである（Mizuguchi, H. and Hayakawa, T. (2002) The tet-off system is more effective than the tet-on system for regulating transgene expression in single adenoviral vector. J. Gene Med. in press）。Ad-rtTA-IRES-tTS-Lは、rtTAとtTS発現カセットをE3欠失領域においてIRESを用いる二シストロン構築物として含む。IRES配列によって二つ以上の遺伝子を結合すると、単一のプロモーターから効率よく発現させることができる（Mountford, P. S. and Smith, A. G. (1995) Internal ribosome entry site and dicistronic RNAs in mammalian transgenesis. Trends Genet., 11, 179-184）。他のタイプのベクターとして、本発明者らは、AdBI-rtTA-LとAd-tTS-BI-rtTA-Lを作製し、そのいずれもrtTAとルシフェラーゼを発現するためにtet-反応性エレメントに基づく双方向プロモーターを利用するものである。二つのタイプの遺伝子産物の同時調節は、一つの中心的なTREエレメントによって得ることができ、これらは２つの最小のCMVプロモーターの間に存在する（Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M. and Bujard, H. (1995) Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res., 23, 3605-3606）。Ad-tTS-BI-rtTA-Lは、E4と3'ITRの間の領域にtTS発現カセットを含む。
【００６６】
アデノウイルスベクターは、既に記載された改良インビトロライゲーション法によって下記のように構築した（Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1998) Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583; Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1999) A simple method for constructing E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector. Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017）。pAdHM48-rtTA-tTS-Lの構築に関しては、ヒト伸長因子-1α（EF-1α）プロモーター/tTS遺伝子/最小のウサギβグロビン（mRBG）P(A)を含む発現カセットをpHM15に挿入し、得られたプラスミドpHM15-tTSのAvrII断片をpAdHM48のXbaI部位に挿入して、pAdHM48-tTSを得た。次に、pHM13にCMVプロモーター／イントロンA／rtTA遺伝子／SV40P(A)をクローニングしたpHM13-rtTA（Mizuguchi, H., Kay, M. A. and Hayakawa, T. (2001) In vitro ligation-based cloning of foreign DNAs into the E3 as well as E1 deletion region for generation of recombinant adenovirus vector. BioTechniques, 30, 1112-1116）をClaIによって消化して、Csp45I消化pAdHM48-tTSとライゲーションして、pAdHM48-rtTA-tTSを得た。最後に、tet-反応性プロモーター（TRE/CMV）／ルシフェラーゼ遺伝子／ウシ成長ホルモン（BGH）P(A)をpHM5にクローニングしたpHM5-TREL2をI-CeuIおよびPI-SceIによって消化して、I-CeuI/PI-SceI消化pAdHM48-rtTA-tTSと共にライゲーションすると、pAdHM48-rtTA-tTS-Lが得られた（図１、２）。
【００６７】
pAdHM4-BI-rtTA-Lは、BGHP(A)／ルシフェラーゼ遺伝子／双方向tet-反応性プロモーター（pBI（クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）に由来）／rtTA遺伝子／SV40 P(A)のカセットを、pAdHM4のE1欠失領域（I-CeuI-PI-SceI部位）（Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1998) Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583）に挿入することによって構築した。pAdBI-rtTA-Lは、ルシフェラーゼと、tet-反応性エレメント（TRE）が２つの最小のCMVプロモーターの間に存在する一つの双方向tet-反応性プロモーターからのrtTAを発現することができる（Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M. and Bujard, H. (1995) Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res., 23, 3605-3606）。その結果、双方向tet-反応性プロモーターは、TREにおけるtet-オペレータ配列に対するrtTAの結合がなければサイレントとなる。
【００６８】
AdHM19-rtTA-IRES-tTS-Lは、CMVプロモーター／イントロンA／rtTA遺伝子／脳心筋炎ウイルスの5'非翻訳領域に由来する内部リボソーム流入部位（IRES）／tTS遺伝子／SV40P(A)およびTRE／CMV／ルシフェラーゼ遺伝子／BGH P(A)を、pAdHM19のE3（Csp45I部位）およびE1欠失領域（I-CeuI/PI-SceI部位）に挿入することによって構築した。
【００６９】
pAdHM48-tTS-BI-rtTA-Lは、BGH P(A)／ルシフェラーゼ遺伝子／双機能tet-反応性プロモーター／rtTA遺伝子／SV40 P(A)のカセットをpAdHM48-tTSのE1欠失領域（I-CeuI/PI-SceI部位）に挿入することによって構築した。
【００７０】
本実施例で用いたアデノウイルスベクターの構造の比較を表１に示す。
【００７１】
【表１】
0004183972.tif 000002
【００７２】
[実施例２]  ヒト細胞におけるルシフェラーゼの制御された発現
第一に、ルシフェラーゼ産生に及ぼすドキソサイクリンの用量依存性を、AdOn-L4、AdBI-rtTA-L、Ad-rtTA-IRES-tTS-L、Ad-tTS-BI-rtTA-L、またはAd-rtTA-tTS-Lを形質導入したSK HEP-1細胞と比較した（図３）。これまでに、AdOn-L4はルシフェラーゼの比較的低い調節された産生を媒介することが知られている（Mizuguchi, H. and Hayakawa, T. (2002) The tet-off system is more effective than the tet-on system for regulating transgene expression in single adenoviral vector. J. Gene Med. in press）。AdOn-L4による調節係数（最大産生値と最小産生値（ベーサル活性値）の比）は6.6（MOI＝5）、および15.5（MOI＝50）であった。双方向プロモーターを含むアデノウイルスベクター（AdBI-rtTA-LおよびAd-tTS-BI-rtTA-L）は、ルシフェラーゼ産生を調節することができなかった。Ad-rtTA-IRES-tTS-Lが媒介するルシフェラーゼ産生の調節は、AdOn-L4より少なかった。対照的に、Ad-rtTA-tTS-Lは、厳密に調節されたルシフェラーゼ産生を媒介した。Ad-rtTA-tTS-Lによる調節係数は、310（MOI＝5）および2515（MOI＝50）であった。Ad-rtTA-tTS-Lによるルシフェラーゼ産生のバックグラウンドレベルは、AdOn-L4の場合と比較して2〜6倍減少し、Ad-rtTA-tTS-Lによる誘導レベルは、AdOn-L4の場合と比較して30倍以上増加した。
【００７３】
上記の結果が他の細胞タイプにも適用できるか否かを調べるために、HeLaおよびECV304細胞にそれぞれのベクターを形質導入し（MOI＝5、50）、バックグラウンド（最小）および誘導されたルシフェラーゼ産生を測定した（図４）。HeLaおよびECV304細胞における調節可能なルシフェラーゼ産生パターンは、SK HEP-1細胞のパターンと類似であった。AdOn-L4を形質導入した細胞はいずれもより低いレベルのルシフェラーゼ産生調節を示したが、Ad-rtTA-tTS-Lを形質導入した細胞は、厳密に調節された方法で高レベルのルシフェラーゼ産生を示した。AdBI-rtTA-LおよびAd-tTS-BI-rtTA-Lも同様に、発現を調節することができなかったが、Ad-tTS-BI-rtTA-Lを形質導入した（MOI＝50）ECV304細胞は、低いレベルの調節を示した。Ad-rtTA-IRES-tTS-Lは、AdOn-L4と比較してHeLa細胞における調節を改善しなかったが、ECV304細胞における調節をわずかに改善した。Ad-rtTA-IRES-tTS-Lを形質導入したECV304細胞におけるルシフェラーゼのバックグラウンドレベルは、AdOn-L4を形質導入した細胞の場合より9〜15倍低かったが、Ad-rtTA-IRES-tTS-Lを形質導入した細胞のルシフェラーゼ誘導活性は、AdOn-L4を形質導入した細胞の活性より低かった。
【００７４】
次に、本発明者らは、AdOn-L4またはAd-rtTA-tTS-Lを形質導入した細胞における誘導ルシフェラーゼ産生を、CMVプロモーター／エンハンサー駆動ルシフェラーゼ発現カセット（Ad-L2）を含むアデノウイルスベクターを形質導入した細胞と比較した（図５）。CMVプロモーター／エンハンサーは、外来遺伝子発現のために最も広く用いられており、高レベルの外来遺伝子発現を誘導することが知られている。Ad-rtTA-tTS-Lは、SK HEP-1、HeLa、およびECV304細胞において類似またはより高いレベルのルシフェラーゼ産生を媒介した。対照的に、AdOn-L4は、Ad-L2より全ての細胞タイプにおいて10倍以上低いルシフェラーゼ産生を媒介した。これらの結果から、目的の遺伝子、rtTA、およびtTS遺伝子をそれぞれ、E1欠失領域、E3欠失領域、および3'ITR近傍領域に含むアデノウイルスベクターは、tet-off系を含むアデノウイルスベクターより外来遺伝子発現の活性化の高いレベル（調節）を示すことが示唆された。
【００７５】
[実施例３]  改変ファイバーをコードするDNAを含むアデノウイルスベクターDNAの構築
ベクタープラスミドpAdHM15、-16、-17および-18を以下のようにして構築した。５型アデノウイルスゲノムの右端（アデノウイルスゲノム27331 bpからゲノムの右端まで（△27865〜30995））を含むpEco-ITR1(Mizuguchi, H. and Kay, M.A. (1999) Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum. Gene Ther. 9, 2013-2017)をApaIおよびMunIによって切断し、そしてAatIIとBsaI部位の間にAgeIとMunI部位とを有し、PvuIIとBst1107I部位との間が欠失しているpBR322由来プラスミドであるpBR-AM2のApaI/MunI断片とライゲーションした。得られたプラスミドpBR-AM3は、アデノウイルスゲノム（31905〜32825）を含んでいる。次に、pBR-AM3のApaI/AseI断片、pBR-AM3のApaI/BsmAI断片、pBR-AM3のBsaAI断片、およびオリゴヌクレオチド5（5'-AACAGGAGACACAACTTCGAACATCGATCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACAT-3'／配列番号：６）および6（5'-TAATGTAGTTGTGGCCAGACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGGATCGATGTTCGAAGTTGTGTCTCC-3'／配列番号：７）を用いて４片のライゲーションを行い、pBR-AM4を得た。pEco-AM4は、pBR-AM4のHpaI/MunI断片とpEco-ITR5のHpaI/MunI断片とをライゲーションすることによって構築し、後者は５型アデノウイルスゲノムの右端を含む（ゲノムの27331 bp〜右端（△28133〜30818））。最後に、pAdHM2の誘導体である(Mizuguchi, H. and Kay, M. A. (1998) Hum. Gene Ther. 9, 2577-2583) pAdHM2-1のSrfI/ClaI断片、およびpEco-AM4のSrf/ClaI断片をライゲーションすることによってpAdHM15-1を構築し、その後オリゴヌクレオチドA（5'-CGTTAATTAA-3'／配列番号：１）を用いて、アデノウイルスゲノムの右端でのClaI部位をPacI部位に変更した（最終プラスミドはpAdHM15）。pAdHM16、-17、および-18は、同じようにして構築した。pAdHM15、-16、-17、および-18は、E1欠失領域にI-CeuI、SwaI、およびPI-SceI部位を有し、およびアデノウイルスゲノムの32679〜32680位の間（ファイバータンパク質のトレオニン残基456位〜プロリン547位）にCsp45Iおよび／またはClaI（ダムメチル化）部位を有する完全なE1/E3欠失アデノウイルスゲノムを有する。
【００７６】
細胞表面上でインテグリン（αｖβ３およびαｖβ５）に対して高い親和性で結合するRGD-4CペプチドCDCGRDCFC（配列番号：８）に対応する外来オリゴヌクレオチドによってベクタープラスミドを構築するために(Arap, W., et. al., (1997) Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science 279, 377-380; Pasqualini, R., et. al., (1997) Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nat. Biotechnol. 15, 542-546; Koivunen, E., et al., (1995) Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes: ligand specificities of the RGD-directed integrins. Biotechnology 13, 265-270)、pAdHM15をCsp45I/ClaIによって切断し、オリゴヌクレオチド7（5'-GGAAGTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTG-3'／配列番号：９）および8（5'-CGCAGAAACAGTCTCCGCGGCAGTCACACTT-3'／配列番号：１０）にライゲーションした。次に、ライゲーションしたDNAをDH5αに形質転換すると、pAdHM15-RGDが得られた。
【００７７】
さらに、NGRペプチドCNGRCVSGCAGRC（配列番号：１１）をファイバーノブ上に有するアデノウイルスベクターは、オリゴヌクレオチド9（5'-CGGCTGCAACGGCCGCTGCGTGAGCGGCTGCGCCGGCCGCTG-3'／配列番号：１２）および10（5'-CGCAGCGGCCGGCGCAGCCGCTCACGCAGCGGCCGTTGCAGC-3'／配列番号：１３）を上記pAdHM15のClaI部位に挿入することにより作製した。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、外来遺伝子の発現制御を行うことができるアデノウイルスベクターが提供された。本発明のベクターDNAは3つの遺伝子を発現させるカセットを1つのベクターに挿入された構造を有することを特徴としており、従来の3つの遺伝子を別々のベクターで発現させていた場合と比べて、外来遺伝子の発現制御を効率的かつ簡便に行うことができる。本発明のベクターを用いることにより、非ヒト哺乳動物または哺乳動物細胞において外来遺伝子の発現を効率的に制御することが可能であり、遺伝子治療等において非常に有用である。
【００７９】
さらに、本発明のベクターは、動物個体の組織内で目的遺伝子を直接発現させてその機能を解析する等の研究用ツールとしても有用である。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  三重遺伝子発現系を含むアデノウイルスベクターの構築戦略を示す図である。XbaI-消化pAdHM48をAvrII-消化pHM15-tTSとライゲーションした。得られたプラスミドpAdHM48-tTSをCsp45Iによって消化して、ClaI消化pHM13-rtTAとライゲーションした。次に、得られたプラスミドpAdHM48-tTS-rtTAをI-CeuIおよびPI-SceIによって消化して、I-CeuIおよびPI-SceI消化pHM5-TREL2とライゲーションした。得られたプラスミドpAdHM48-tTS-rtTA-LをPacIによって消化して、293細胞にトランスフェクトすると、改善されたtet-on系を有する組換え型アデノウイルスベクターが得られる。
【図２】  図１の続きの図である。
【図３】  SK HEP-1細胞における様々なアデノウイルス媒介tet-on系におけるルシフェラーゼ産生を示す図である。SK HEP-1細胞にAdOn-L4、AdBI-rtTA-L、Ad-rtTA-IRES-tTS-L、Ad-tTS-BI-rtTA-L、またはAd-rtTA-tTS-Lを形質導入して（A：MOI＝5、B：MOI＝50）、培地のみ、またはドキソサイクリンの様々な濃度を含む培地と共に培養した。48時間培養後、細胞におけるルシフェラーゼ産生を決定した。非形質導入細胞におけるルシフェラーゼ産生は、0.5±0.2 pg/10５個であった。それぞれの値は、3〜4実験の平均値±SDを表す。
【図４】  HeLaおよびECV304細胞における様々なアデノウイルス媒介tet-on系におけるルシフェラーゼ産生を示す図である。HeLa（A-1、A-2）およびECV304（B-1、B-2）細胞にAdOn-L4、AdBI-rtTA-L、Ad-rtTA-IRES-tTS-L、Ad-tTS-BI-rtTA-L、またはAd-rtTA-tTS-L（A-1、B-1：MOI＝5；A-2、B-2：MOI＝50）を形質導入した。ドキソサイクリンを含まない（白いカラム）、およびドキソサイクリン（10４ ng/ml）と共に（斜線のカラム）細胞を48時間培養した。48時間培養後、細胞におけるルシフェラーゼ産生を決定した。非形質導入HeLaおよびECV304細胞におけるルシフェラーゼ産生はそれぞれ、4.6±2.2および0.7±0.1 pg/10５個であった。それぞれの値は、5実験の平均値±SDを表す。
【図５】  AdOn-L4、Ad-rtTA-tTS-L、またはAd-L2を形質導入した細胞における誘導ルシフェラーゼ産生の比較を示す図である。SK HEP-1(A)、HeLa（B）およびECV304（C）細胞にAdOn-L4、Ad-rtTA-tTS-L、またはAd-L2を形質導入して（MOI＝5または50）、ドキソサイクリンを含まずに、またはドキソサイクリン（10４ ng/ml）と共に培養した。48時間後、細胞におけるルシフェラーゼ産生量を決定した。AdOn-L4およびAd-rtTA-tTS-Lの場合、最大誘導ルシフェラーゼ産生を示した。非形質導入細胞におけるルシフェラーゼ産生は図３および４に示されている。それぞれの値は、5実験の平均値±SDを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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