(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコン系反応チャンバを備える、マイクロスケールでの化学反応を実行するための反応器であって、前記反応チャンバが、スロットを有するスリーブ状に形成され、前記スロットが、反応流体を直接的に又はチューブを介して挿入するために使用されることを特徴とする反応器。
【請求項２】
前記反応チャンバは少なくとも１つの光学的ウィンドウを備える、請求項１に記載の反応器。
【請求項３】
前記反応チャンバは複数の接合シリコン体から成る、請求項１または２に記載の反応器。
【請求項４】
前記接合シリコン体はポリシリコンおよびバルク・シリコンから構成される、請求項３に記載の反応器。
【請求項５】
前記ポリシリコンとして、ドープ・ポリシリコンが加熱に利用され、そして、バルク・シリコンが対流冷却に利用される、請求項４に記載の反応器。
【請求項６】
前記反応チャンバは１対の光学的ウィンドウおよびこの光学的ウィンドウのそれぞれに近接配置された加熱手段を有する、請求項１から５の何れか１つに記載の反応器。
【請求項７】
前記光学的ウィンドウ窒化シリコンから構成される、請求項６に記載の反応器。
【請求項８】
前記加熱手段は、ポリシリコンとしてのドープ・ポリシリコンからなるヒータを備える、請求項６に記載の反応器。
【請求項９】
前記反応チャンバの前記スロットは複数の側面を有する構造を備えている、請求項１から６の何れか１つに記載の反応器。
【請求項１０】
前記反応チャンバは少なくとも１つの光学的ウィンドウを備える、請求項１に記載の反応器。
【請求項１１】
前記スロットに挿入できるように構成されたインサートをさらに有し、前記インサートは少なくとも１つの光学的ウィンドウを有する、請求項１０に記載の反応器。
【請求項１２】
少なくとも前記インサート前記光学的ウィンドウは試験ストリップを備える、請求項１１に記載の反応器。
【請求項１３】
前記反応チャンバは手で保持されるバッテリで動作する計器に挿入できるように構成される、請求項１から１２の何れか１つに記載の反応器。
【請求項１４】
前記反応チャンバは、配列された複数の反応チャンバのアレイを備えるように構成した計器に挿入できるように構成される、請求項１から１２の何れか１つに記載の反応器。
【請求項１５】
配列された前記複数の反応チャンバは動作的に、配列された複数のマイクロインジェクタを介してマイクロ電気泳動アレイに結合している、請求項１４に記載の反応器。
【請求項１６】
配列された前記複数の反応チャンバは前記マイクロ電気泳動アレイに直接的に結合している、請求項１５に記載の反応器。
【請求項１７】
配列された前記複数の反応チャンバはシリコンで構成され、かつ、前記マイクロ電気泳動アレイはガラスで構成されている、請求項１５又は１６に記載の反応器。
【請求項１８】
前記光学的ウィンドウに近接して配置された光学検出器をさらに有する、請求項２に記載の反応器。
【請求項１９】
前記光学検出器に結合されたデータ読み出し装置と、前記データ読み出し装置および前記反応チャンバに結合された計器コントローラとをさらに有する、請求項１８に記載の反応器。
【請求項２０】
前記スロット内に配置されるように構成されたインサートをさらに有しており、前記反応チャンバ内の前記インサート中に、前記反応流体が直接的に又はチューブを介して挿入される、請求項１に記載の反応器。
【請求項２１】
前記反応チャンバは前記スロットに近接した少なくとも１つの光学的ウィンドウと、前記光学的ウィンドウに近接して配置されたヒータとを備える、請求項１に記載の反応器。
【請求項２２】
前記チューブは反応流体を挿入するために、前記スロット内に配置されている、請求項１に記載の反応器。
【発明の詳細な説明】
合衆国政府は、ローレンスリバモア国立研究所の業務のために合衆国エネルギ局とカリフォルニア大学との間の契約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−４８に準じた本発明に関する権利を有する。
発明の背景
本発明は、加える反応物質およびその結果生じる生成物の化学反応の制御および検出のための計器に関し、とくに反応パラメータの精細な制御を必要とするマイクロスケールでの化学反応を実行するための集積化された微細組立ての計器に関し、さらにとくには、高いスループットのマイクロ反応ユニット用の個別チャンバから成るインラージ（inlarge）アレイとして利用できる化学反応用の反応チャンバとしてのシリコン依存形（silicon-based）のスリーブデバイスに関する。
熱の制御およびサイクリングを通して化学合成を行うための現在の計器は、一般に、非常に大形（天板）で効率が良くなく、大きな熱質量（例えば、アルミニウムの塊）を加熱および冷却して動作することが多い。近年、シリコンおよびシリコンに基づいた（snlicon-based）材料（例えば、シリコン、窒化物、多結晶シリコン）から反応チャンバを設計し構成することで、それらの計器を小形化することに努力が傾注されており、それらの材料を使用することでヒータやシリコンを通る対流を介した冷却機構が集積化されている。
微細組立ての技術は現在良く知られており、その技術にはスパッタリング、電気容着、低圧蒸着、写真平版、およびエッチングなどがある。微細組立てのデバイスは通常、シリコンやガリウム・ヒ化物といった結晶状の基板上に形成されるが、ガラスやある種のポリマなどの非結晶状の材料上に形成してもよい。結晶状デバイスの形状は精細に制御できる。それはエッチングされた表面は殆ど結晶面であり、結晶状材料は高温での融解などのプロセス、アノード結合、またはフィールドによりアシストされた方法によって結合できるからである。
また、モノリシックな微細組立て（microfablication）技術によって、現在、マイクロリットルからナノリットルの量のガラス、液体、および固体を扱うポンプ、バルブ、ヒータ、ミキサ、および検出器を含む、電気的、機械的、電気機械的、光学的、化学的、および熱的デバイスの生産が可能である。同様に、光学的導波プローブおよび超音波たわみ波センサを現在ではマイクロスケールで製造することができる。これらの微細組立てデバイスをシングルシステムに集積化するには、マイクロスケールの反応器を用いた分析計器をバッチ製造することを考慮する必要がある。かかる集積化したマイクロ計器は生化学的、無機的または有機的化学反応に適用して生物工学的な処理および検出のみならず、生体的および環境的な診断を実施してもよい。
このような集積化した計器の動作は簡単に自動化されるとともに、分析を本来の位置で行うことができるから、汚染の度合いは非常に低い。このようなデバイスのサイズは本質的に小さいので、加熱および冷却を極めた迅速に行うことができる。また、これらのデバイスに必要な電力は非常に低く、バッテリによって電源供給でき、電磁的、静電容量的、誘導的、または光学的な結合によっても電源供給できる。
微細組立ての反応計器は、その体積が小さいこと、および、体積に対する表面面積の比が高いことによって、反応パラメータの制御の度合いを高くすることができる。ヒータは温度をサイクリングまたはランピングさせることができ、一方、配座構造のソノケミカルおよびソノフィジカルな変化は超音波トランスデューサによって生じさせることができ、さらに、重合体は光学的放射線を入射させることで発生させることができる。
合成反応、とくにポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）のような合成チェーン反応は格別に微細組立て反応計器に適している。ＰＣＲによって、有機物のＤＮＡ（またはＲＮＡ）の単一モジュールを１０６〜１０９のファクタだけ選択的に増幅することができる。この精巧に確立された手法を用いるには、オリジナルのＤＮＡターゲットモジュール、特定のＤＮＡプライマ、デオキシヌクレオチド・トリホスファターゼ、および、ＤＮＡポリメラーゼ酵素およびコファクタ（cofactors）の存在下で加熱（変性）および冷却（アニーリング）を繰り返す必要がある。この各サイクルによって、ターゲットＤＮＡ塩基配列が倍増し、このターゲット塩基配列が指数関数的に累積することになる。
このＰＣＲの手法を実施するには、１）ターゲットＤＮＡ分子を原抽出物中に解放するためのサンプルの処理、２）酵素、バッファ・デオキシリボヌクレオチド・トリホスファターゼ（ｄＮＴＰＳ）、およびアリゴヌクレオチド・プライマを含む水溶液の添加、３）２つまたは３つの温度間（例えば９０〜９６、７２、および３７〜５５℃）で反応混合の熱サイクリング、および４）増幅されたＤＮＡの検出が必要である。このＰＣＲ手法には、反応生成物の精製および表面曲げプライマの取込みといった中間のステップを置いてもよい。
標準的なＰＣＲの実験室レベルでの技術に関する問題は、試薬をある容器から別の容器に移動させる間に、このＰＣＲ反応が、以前の実験やほかの汚染物質といった、無関係なＤＮＡのシングル汚染分子の導入によって汚染される、または、入り込むことがあるということである。また、標準的な実験室技術で使用されるＰＣＲ反応容積は典型的には５０マイクロリットルのオーダである。典型的な熱サイクルは４段階から成る。すなわち、サンプルを第１の温度まで加熱すること、このサンプルの温度を第１の温度に保持すること、このサンプルを第２の低い温度まで冷却すること、およびそのサンプル温度をその低い温度に保持すること、である。通常、熱サイクルを構成するこれら４段階の各段階には約１分の時間が必要であり、このため、例えば４０サイクルを完了するには約３時間が必要である。したがって、標準的な実験室の手法で通常使用される容積は大きいことから、試薬をある容器から別の容器に移動させる間の汚染の確率に加えて、所要時間の問題があり、前記ＰＣＲの手法を実行する能力のあるマイクロ計器が要求されることは明白である。
近年、このＰＣＲ反応を実行するためのサイクリング時間は、毛管内でＰＣＲ反応を起こさせ、強制エアヒータを使用して管を加熱することによって、減少している。また、集積化された微細組立て反応器は本来の位置で化学反応できるように発展してきており、これはとくに高精密な熱サイクリングを必要とする生化学反応に有利であり、とくにＰＣＲなどのＤＮＡを用いた操作に有利で、その理由はマイクロ計測のディメンジョンが小さいので、サイクリング時間の迅速性が促進されるからである。この微細組立て反応器は、１９９２年８月３１日に出願された名称が「微細組立て反応器」（同一の被譲渡人に譲渡されている）の同時係属の米国特許出願番号第０７／９３８，１０６号で説明され、クレームされている。同様に、光学的に加熱され、または、光学的に識別されたマイクロ反応チャンバは、例えば上述した同時係属出願番号第０７／９３８，１０６号の集積化微細組立て反応器に利用することができ、このチャンバは化学反応器の用途として発達したもので、１９９５年６月１３日に出願された名称が「サンプル検出手段を備えたダイオードレーザ加熱マイクロ反応チャンバ」（同一の被譲渡人に譲渡されている）の同時係属の米国特許出願番号第０８（ＩＬ−９１２１）号で説明され、クレームされている。
本発明は、電力および温度均一性の観点から非常に効率が良いことが示された、特定ジオメトリのシリコン依存形のマイクロ反応器に向けられたものである。本発明に係るマイクロ反応器は、広義には化学反応用のシリコン依存形のスリーブデバイスの範疇に入るもので、上記参照の同時係属出願に係る反応器システムのいずれかにおいて効果的に利用できる。本発明では、加熱用にドープ・ポリシリコンおよび対流冷却用にバルク・シリコンを利用している。本発明によれば、マルチパラメータ、検出ウィンドウのサイズの同時変更、本来位置での検出、反応容積、熱的均一性、ならびに加熱および冷却速度の使用、制御が可能になる。さらに、本発明によれば、個別の反応チャンバからなる大きなアレイを使用でき、高いスループットのマイクロ反応ユニットを実現できる。
発明の要約
本発明の目的は、改善された化学反応チャンバを提供することである。
本発明の別の目的は、化学反応器用シリコン依存形のスリーブデバイスを提供することである。
本発明の別の目的は、ドープ・ポリシリコンおよびバルク・シリコンを組み合わせて使用する化学反応チャンバを提供することである。
本発明の別の目的は、ドープ・ポリシリコンおよびバルク・シリコンを組み合わせて使用する化学反応チャンバを提供し、熱的および光学的な特性に融通性を与え、小形および大形の計器にインプリメンテーション可能にすることである。
本発明の別の目的は、均一加熱でありながら、低い電力条件とするため、シリコンおよび窒化シリコンの臨界比を加熱材料（例えば液体）の容積に組み合わせたシリコン依存形の反応スリーブを提供することである。
本発明の別の目的は、反応混合物を収容した反応スリーブに２次チューブ（例えばプラスチック）を導入でき、これにより、いかなる潜在的な材料の不適合性問題を軽減することである。
本発明の別の目的は、個別反応チャンバのアレイを提供して高いスループットのマイクロ反応ユニットを実現することである。
本発明の別の目的は、集積化ヒータ付きの、シリコン依存形のスリーブタイプの反応チャンバを使用する手持ちタイプの計器を提供することである。
本発明の別の目的は、自動検出およびフィードバック制御の機構を備えた反応チャンバを提供することである。
本発明の別の目的は、反応チャンバ内での反応の人工知能による制御に備えることである。
本発明の別の目的は、反応チャンバのフィードバック制御としてパルス幅変調を提供することである。
本発明の他の目的および利点は以下の説明および添付の図面から明らかになる。基本的に、本発明は、化学反応用のシリコン依存形のスリーブである。本発明は、加熱用のポリシリコンと対流冷却用のバルク・シリコンとを組み合わせて使用する化学反応チャンバを含んでいる。この反応スリーブは、均一加熱でありながら、低い電力条件とするため、シリコンおよび窒化シリコンの臨界比を加熱材料（例えば液体）の容積に組み合わせている。この反応スリーブはまた、反応混合物を収容し、これにより、いかなる潜在的な材料の不適合性問題を軽減する２次チューブの反応スリーブへの導入を考慮している。本発明は、上記参照の同時係属出願番号第０７／９３８，１０６号の上記参照した集積化微細組立て反応器、および、上記参照の同時係属出願番号第０８（ＩＬ−９１２１）号の光学的集積化によるマイクロ反応チャンバの上記参照の延長上にある。このシリコン依存形のスリーブ反応チャンバは、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）および／または他のＤＮＡ反応（ligoseチェーン反応など）、または他の合成的、熱的サイクルを用いた反応といった、有機的、無機的、または生化学的反応の合成または処理のための化学反応システムに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、電源／制御装置内に取り付けられた微細組立ての化学反応計器の部分的に切除された斜視図を示す。
図２は、図１の反応計器の概略図である。
図３は、微細組立ての反応チャンバ用の加熱および検出の配置を概略的に示す図である。
図４は、本発明にしたがって作られた微細組立てのシリコン依存形スリーブ反応チャンバの一実施例を示す図である。
図５は、マイクロ電気泳動アレイに動作的に結合された、図４のスリーブ反応チャンバのアレイを示す図である。
図６は、図４と類似のスリーブマイクロ反応チャンバの別の実施例に係る拡大された端部の図である。
図７は、隔離されたヒータ・バージョンで固定ウィンドウの構造を使って図６の拡大断面の実施例（断面）を示す図である。
図８は、隔離されていないヒータ・バージョンで可変ウィンドウの構造を使って図６の同一の拡大断面の別実施例（断面）を示す図である。
図９は、反応を変えるためのインサートとして、図６の反応チャンバを利用した手で保持する計器（ＰＣＲ  ｍａｎ）の図である。
図１０Ａおよび１０Ｂは、数百の個別制御のシリコン依存形マイクロ反応チャンバを利用する熱サイクリング計器を示す図である。
図１１は、高スループットＤＮＡ増幅、サンプル操作、および電気泳動のシステムの概略図である。
図１２は、トップ／カバー開放の光学的ウィンドウを備えた反応チャンバ用のインサート／ライニングの実施例を示す図である。
図１３は、反応チャンバのインサート／ライナの外部充填を示す図である。
図１４は、図９の手持ち計器（ＰＣＲ  ｍａｎ）で光学的に検出された「試験ストリップ」として、ウィンドウ上または反応流体中での直接的な特定生成物の検出用の固定化試薬／プローブを示す図である。
図１５および１６は、図６のマイクロ反応チャンバと共に用いる光学的検出システムの概要を示す図である。
図１７は、人工知能フィードバックシステムに集積化検出を使用した概要図である。
図１８は、tris（2,2’bipyridyl）ruthenium（II）（TBR）およびtripropylamine（TPA）のための電気化学酸化および化学還元反応を示す図である。
図１９は、電気化学発光（ＥＣＬ）によって検出および定量化に対するＤＮＡをタグ付けし、および分離する方法を示す図である。
図２０は、電圧を上げて、次いで下げたときのセル電圧およびＥＣＬの強度対時間の変化を示す図である。
図２１は、薄いフィルム状のアノードを有したマイクロ機械加工によるＥＣＬセルと、関連するフォトダイオード検出器との実施例の図である。
図２２は、電気的リード線を有する図２１のＥＣＬセルの拡大断面図である。
図２３〜３０は、図２１に示したＥＣＬセルを製造するための組立てプロセスの説明図である。
図３１は、ＩＴＯ電極の抵抗を減らすガラスにＩＴＯを、このＩＴＯ上にＡｌを使用する実施例の図である。
好適な実施例の説明
本発明は、マイクロ加工されたシリコン依存形（snlicon-based）のスリーブ化学反応チャンバに関し、この反応チャンバは加熱用のドープ・ポリシリコンや対流冷却用のバルク・シリコンといったヒータを組み合わせたものである。このマイクロ反応チャンバは高スループットのマイクロ反応ユニット向けのアレイや、手で保持するユニットにおいて使用できる。このマイクロ反応チャンバは、均一な加熱をさせながらも、電源条件を低く抑えるために、加熱材料の容積とシリコンおよび窒化シリコンの臨界比を組み合わせたものである。このマイクロ反応チャンバは、反応混合物を含有する反応スリーブ内に２次チューブ（例えばプラスチック製）を挿入することができるようになっており、これにより、潜在的な材料の不適合性を緩和することができる。本発明は、電源および温度均一性の面から非常に効果的であることが分かったシリコン依存形のマイクロ反応器の特定の幾何学関係を利用している。この説明されるマイクロ加工反応器に関する特定の実施例は、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）や他の化学反応で使用する熱サイクル計器として実験的に使用され、また熱駆動の化学反応器に依る現在の商用器具よりも優れていることが判明している。本発明に係るシリコン依存形のスリーブ反応チャンバは、前記参照の同時係属の出願番号０７／９３８，１０６号に記載の微細組立てがなされた装置に搭載の反応チャンバの代わりに利用でき、また前記参照の同時係属の出願番号０８／（ＩＬ−９１２１）号に記載の集積ヒータおよび検出配置と共に利用でき、したがって、これらの同時係属出願に記載の微細組立ての化学反応装置の拡張構成を成すものである。
微細組立ての化学反応計器および集積化加熱／検出配置を理解するために、本発明に係るスリーブ反応チャンバの実施例を説明するに先立って、前記２件の参照した同時係属出願の微細組立ての化学反応器および集積化加熱／検出配置について説明する。
図１は、符号１０で概略表される微細組立ての化学反応計器の実施例を示しており、その計器には符号１１で概略表された凹部が示されており、その中には、微細組立ての反応機器の、符号１２で概要を示す電源／コントロール装置が設けられている。皮下針１３が示されており、この針はシリコンゴムのウィンドウ１４を通って反応計器１０に試料を挿入している。この反応は、計器１０内のコイルＬＣＬと磁気コイルとの誘導結合や、コンデンサＣ３のプレートとプレート１６、１７の間の静電容量結合や、さらには計器１０内の共振回路（図２参照）と高周波アンテナ１８との間の電磁結合によって制御される。
図１に示す計器１０の概要を図２に示す。計器１０は３つの試薬室１９、２０、２１を備え、これらは例えば、ＤＮＡプライマ、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド、ならびに磁気ビード（magnetic  beads）といった検出タグ付け分子を収容することができる。目標ＤＮＡ分子は、皮下針１３（図１参照）などをシリコンゴムまたはほかの種類の材料から成るウィンドウを通して挿入することにより、試薬チャンバ１９に入れられる。この反応物質チャンバ１９、２０、２１はそれぞれ、狭い中央領域（図示せず）を有するチャンネル２２、２３、２４によって反応チャンバ２５に結合されている。典型的なチャンバ１９〜２１および２５の容積はマイクロリットル〜ナノリットルの範囲にある。チャンネル２２〜２４はラム波ポンプＬＷ１、ＬＷ２、ＬＷ３をそれぞれ備え、チャンバ１９〜２１の反応物質をチャンネル２２〜２４を通して矢印の方向にくみ上げ、反応チャンバ２５に注入するようになっている。このラム波ポンプはチャンネル２２〜２４それぞれのいずれかの壁または複数の壁に設置してもよい。このラム波ポンプＬＷ１、ＬＷ２、およびＬＷ３はコンデンサＣ１、Ｃ２、およびＣ３にそれぞれ結合している。チャンネル２２〜２４の狭い中央領域の両端に表面張力によってチャンバ１９〜２１の反応物質が、ポンピングが開始されるまでの間に反応チャンバ２５に流れ込むという事態が防止される。チャンネル２２〜２４の内部表面をその表面張力が上がるように処理してもよく、これにより、ラム波ポンプが起動していないときに試薬が流れ出るのを確実に抑えることができる。
この反応チャンバ２５はラム波トランスデューサＬＷＣおよびヒータＨＣを備えてもよい。このラム波トランスデューサＬＷＣはインダクタＬＣＬ（図１に同様に示す）に結合されている。このヒータＨＣはインダクタＬＣＨおよびコンデンサＣＣＨから成る共振回路に結合されている。このラム波トランスデューサＬＷＣは、チャンバ２５において接続矢印２６で示されるように、アジテータ、ミキサ、またはソノケミカルインデューサとして機能する。
チャンネル２７によって反応チャンバ２５が検出チャンバ２８に結合される。このチャンネル２７はラム波ポンプＬＷＤＰを備えており、このポンプはインダクタＬＤＰおよびコンデンサＣＤＰから成る共振回路に接続されている。この検出チャンバ２８はラム波センサＬＷＤを備えておりこのセンサがコンデンサＣＤに接続されている。
ラム波トランスデューサは高い機械的Ｑ値を有しており、交流電圧周波数の狭い帯域によってのみ電源供給することができる。このラム波ボンプ（ＬＷ１、ＬＷ２、ＬＷ３）およびラム波センサ（ＬＷＤ）は、ラム波トランスデューサ（ＬＷ１、ＬＷ２、ＬＷ３，およびＬＷＤ）を共振周波数においてプレート（たとえば図１のプレート１６および１７の如き）間に電界を発生させることによって静電容量的に電源供給される。しかし、このトランスデューサのＱ値は高いため、課せられる電界の周波数がトランスデューサの共振周波数に近いときにのみそのトランスデューサは任意の振幅で振動する。同様に、ラム波ミキシング用のチャンバトランスデューサＬＷＣは、トランスデューサＬＷＣの機械的共振周波数にてコイル（図１の１５）によって発生される交流周波数の磁界によって与えられる。このヒータＨＣおよびラム波ポンプＬＷＤＰは、アンテナ（図１の１８）から共振回路ＣＣＨおよびＬＣＨ、および共振回路ＣＤＰおよびＬＤＰにそれぞれ電磁波を向けることによって起動する。この入射電磁照射の周波数は、ポンプＬＷＤＰを起動させるには、トランスデューサＬＷＤＰの機械的共振周波数に一致していなければならない。この入射する電磁照射の周波数は、ヒータＨＣを起動させるには、電気的エレメントＣＨ、ＬＣＨおよびＨＣの共振周波数に一致していなければならない。
ＰＣＲ反応は、例えば、ポンプＬＷ１、ＬＷ２、およびＬＷ３を起動することによって各チャンネル２２、２３および２３を通って反応チャンバ２５に矢印の方向に沿ってチャンバ１９、２０および２１の試薬をポンピングすることで開始される。たとえば２０から４０の一連の熱サイクルが次いで開始され、各サイクルの間に反応チャンバ２５の反応物の温度は例えば５５℃から９６℃になり、次いで５５℃に戻る。この反応チャンバ２５の温度は、ヒータＨＣとともにコンデンサＣＣＨおよびインダクタＬＣＨから構成される回路の共振周波数に相当する周波数で入射する電磁信号の電力によって決定される。反応チャンバ２５のラム波デバイスＬＷＣは、矢印２６で示すように、アジテータまたはミキサとして機能し、試薬を混合し、反応を促進させる。
この熱的サイクリングが完了すると、反応チャンバ２５の内容物はラム波パーム（perm）ＬＷＤＰによってチャンネル２７を通り、矢印の方向に沿って検出チャンバ３８にポンピングされる。この検出チャンバはラム波センサＬＷＤを利用している。これに代えて、検出チャンバ２８は光学的ウィンドウを備えていてもよく、試験は蛍光に基づく又は吸収に基づく光学スペクトロスコピーによって行っても良い。
図３は、図１および２の微細組立て反応器に組み込むことができる加熱/検出配置を示している。図３に示すように、概略的には符号３０で示す、小形化された微細に組み立てられた計器の、ＰＣＲチャンバなどの化学反応チャンバが断面図で示されており、例えばパイレックス（Pyrex）から成るハウジング３２に形成され、また内部にシリコン・インサート３３および３４を備えたチャンバを有しており、また、チャンバは入り口３５と出口３６を有している。二つの異なるエネルギ（光）源からのエネルギがハウジング３２に向けられており、一方のエネルギ源３７は赤外線（ＩＲ）源であり、もう一方のエネルギ源３８は紫外線（ＵＶ）源である。このＩＲ源１７はチャンバ３１内の溶液のバルブを通して均一に熱を照射する。ＵＶ源１８は可視（Vis）スペクトルにて反応生成物の蛍光を誘因し、反応チャンバ３１を画成するハウジング３２の外部に置かれた可視（Vis）検出器３９によって検出することができる。ハウジング３２はＵＶおよび／または可視スペクトルに透明な材料で構成しなければならない。この反応チャンバ自体に連続励起（加熱）および検出システムを内蔵することにより、その反応チャンバ内のサンプルの存在を確認することができ、図２の微細組立て反応器の二重の反応および検出チャンバ２５および２８を合併することができ、したがってこれによりコンポーネントを減らして組立てコストを下げることができる。
本発明の実施例は、図４および５に概略示すものであり、符号４０に概略示す微細組立ての反応器を必要とし、この反応器が、２つの接着したシリコンパーツで構成され、符号４０で概略示す化学反応チャンバとしてのシリコン依存形のスリーブを有し、かつ、以下に詳細に示す如く、加熱用のドープ・ポリシリコンおよび対流冷却用のバルク・シリコンを利用している。このスリーブ４１はスロットまたは開口４２を有し、これに、符号４３で示す反応流体が皮下針４４から反応チャンバに注入されるか、または、別の反応混合物を収容した別のチューブ４５が挿入される。このチューブ４５は例えば、プラスチック、または反応混合物について不活性である他の材料で形成され、これにより、潜在的な材料の不適合性問題を軽減することができる。このスリーブはまた開口４７を備えており、この開口に光学的ウィンドウ４８が位置しており、このウィンドウは例えば窒化シリコン、酸化シリコン、またはポリマで形成されている。このシリコンスリーブ反応チャンバ４１は、加熱用のドープ・ポリシリコンおよび対流冷却用のバルク・シリコンを有しており、均一な加熱であって、しかも電源条件を低くするために、シリコンおよび窒化シリコンの臨界比と加熱する材料（例えば液体）の容積とを組み合わせている。
図６はマイクロ反応チャンバの拡大図であり、図４の実施例と類似しているが、２つのウィンドウを利用したものである。符号５０で大略示される図６の反応チャンバは、符号５３で示す如く、合わせて接着された２枚のシリコンウェーハまたは基板５１および５２から成り、その内部にスロットまたは開口５４を画成するように構成されている。ウェーハ５１および５２のそれぞれは窒化シリコンの層５１′および５２′を有し、この層がそれぞれ符号５５および５６で概略示す如くウィンドウを画成している。ウェーハ５１のウィンドウ５５は窒化シリコンから構成され、またヒータ６７を備えており、このヒータは均一な加熱を行うためのヒータ５７の端に沿って延びる電気的なリード線５８および５９を有している。ウェーハ５２のウィンドウ５６は図６に示していないヒータを有しており、このヒータは図７および図８のいずれかに示したように、金属コンタクト６０および６１によって固定されている。窒化シリコンの層５１′および５２′は非常に薄く（１μｍ）、バルク・シリコンのウェーハ５１および５２の上に真空めっきされている。バルク・シリコンのウェーハ５１および５２がエッチングされて開口またはスロット５４を形成するときに、符号５５および５６に示す如く、この窒化シリコンだけでウィンドウを成している。ヒータ５７は例えば、ウィンドウ５５を通過するエネルギに対して透明である。
図７は、図６の円６２で示したように、シリコンウェーハ５２およびウィンドウ５６の断面の実施例を非常に拡大した図である。図７に示す如く、符号６３で表されるシリコンウェーハ５２の断面はバルクまたは単一の結晶シリコンから成り、低い（１００〜５００ＭＰａ）応力の窒化シリコン膜またはウィンドウ６４（図６の５２′）に接しており、これがさらにドープ・ポリシリコン・ヒータ６５および金属コンタクト６０および６１に接している。図７の実施例は分離されたヒータバージョンの固定ウィンドウを備えている。
図８は、円６２で表された、シリコンウェーハ５２およびウィンドウ５６の断面の別の実施例を大きく拡大した図である。図８に示す如く、符号６６で表されるシリコン基板５２の断面はバルクまたは単一の結晶シリコンから成る。図７の実施例のように、低い（１００〜５００ＭＰａ）応力の窒化シリコン膜またはウィンドウ６９（図６の５２′）はシリコン断面６６に接しており、ドープ・ポリシリコン・ヒータ７０はウィンドウ膜６９に接しており、さらに金属コンタクト７１がヒータ７０に取り付けられている。この図８の実施例は非分離のヒータのバージョンを備えている。このチャンバに関するウィンドウサイズは変化させて熱的均一性およびこの反応チャンバへの光学的アクセスを保証することができる。
一例として、このシリコンウェーハまたは基板５１および５２は５〜５０ｍｍの長さ、２〜１０ｍｍの幅、０．１〜１．０ｍｍの厚さを有し、５〜５００ｍｍ２の断面積のスロット５４を有する。スロット５４は６枚の側面を持った（six-sided）構成として示されているが、丸形、長方形、正方形、矩形、または他の構成にしてもよい。ウィンドウ５５および５６は０．１〜１ｍｍの長さ、０．１〜５０ｍｍの幅、０．１〜１０μｍの厚さのサイズを有し、窒化シリコンに加え、酸化シリコン、シリコン、またはポリマで構成してもよい。図７のドープ・ポリシリコン・ヒータ６５は０．０５〜５μｍの厚さを有し、０．０５〜５μｍの厚さを有する図８のヒータ７０を備える。図６および７の金属コンタクト６０〜６１および６１′は金またはアルミニウムで構成することができ、０．０１〜５μｍの厚さを有し、また、金またはアルミニウムから成る、０．０１〜５μｍの厚さを有する図示の金属コンタクト７１を有する。シリコンウェーハまたは基板５１のヒータ５７は０．０５〜５μｍの厚さのドープ・ポリシリコンから成り、金またはアルミニウムから成る電気的リード線またはコンタクト５８および５９を備える。
このバルク・シリコン、ポリシリコン、窒化シリコンを使用することで、各チャンバの熱的および光学的特性を設計する上でのフレキシビリティが得られる。これにより、小形の計器（図９）または大形の計器（図１０）において個別に制御され、熱的に隔離された反応室を提供することが可能になる。
図９は、小形の熱サイクリング、バッテリ駆動、手持ちで低電力、フィードバック制御のＰＣＲ用計器の実施例であり、この計器は図４および６のそれらのように、微細組立てによるシリコン依存形の反応チャンバを用いており、この計器は、反応チャンバの熱的均一性および温度精度、チャンバの温度ランプレート、および試薬に接する材料の生体適合性を発展させたものである、として説明できる。
図９に示すように、手持ちでバッテリ駆動の計器、すなわち符号７５で概略示す小型「ＰＣＲ  ｍａｎ」は、圧力調整の電気的コンタクトのコントローラ・ホルダ、すなわちハウジング７６を備え、例えば「ステータス」ウィンドウ７８を含む各種の指示器をその上に有するコントロール・フェイス・プレート７７を有した３×５インチに形成されている。このホルダ７６はサーモカップルを用いた温度フィードバック制御回路、ヒータエレクトロニクス、コンピュータインターフェイス、および電源コネクタを備えており、以下にそれらの詳細を述べる。このホルダ７６は４個の９ボルト・バッテリの如くの、符号７９で示されるバッテリを備えており、その上端にはホルダ（３個のスロットを示す）に反応チャンバ挿入するためのスロット８０を備えており、そのスロットに集積化ヒータ（図６に示すように）を有するシリコン依存形の反応チャンバ８１、８２、８３および８４が矢印８５で示すように挿入される。この反応チャンバ８１〜８４は、構成されたときに、各種の試薬または化学物質を収容することができ、ホルダ又はコントローラ７６のスロット８０を介して手持ち計器７５に選択的に挿入することができる。
この計器を使用することで、反応混合物の熱サイクルを迅速にかつ周期的に制御することができる。シリコンまたは類似の半導体基板の熱伝導特性の寄与によって、熱の立ち上がりおよび立ち下がり特性が迅速化し、運転に要する電力が少なくて済む。シリコンはその熱特性が独特、すなわち熱伝導度が高いが、シリコン、窒化シリコン、酸化シリコン、ポリマ、および他の材料の組み合わせによって、熱的均一性および低い動作電力を可能にする熱伝導および断熱の組み合わせが提供される。
説明した微細組立ての反応器の図６に示すような特定の実施例は、ＰＣＲおよび他の化学反応、生化学的プロセス、微生物学的プロセス、およびインキュベータに用いる熱サイクリング計測として使用することができる。以下に示すように、本発明に係る反応チャンバは、熱的駆動の化学反応に使用している現在の商用計器よりも優れている。
図９の計器及びこれに使用している、図４および６に図示した如くのマイクロ反応チャンバを実験的に検証する間に、数種類の異なるサイズに設計したＰＣＲ反応チャンバを集積（ＩＣ）タイプのシリコン処理のステップを使って組み立てた。この一般化した組立ては以下のようであった。３インチの丸い、０．５ｍｍ厚さで単一の結晶シリコン（ＳＣＳ）ウェーハが以下の方法で処理された。すなわち、低応力（２００〜３００ＭＰａ）の窒化シリコン（ＳｉｘＮｙ）はウェーハ（１．０〜２．０μｍの厚さ）上に全体的に低圧化学真空蒸着（ＬＰＣＶＤ）された。反応チャンバ用のホトリソグラフ・パターンおよびこれに続く処理ステップは以下の順序で採用された。１）窒化シリコンはその反応チャンバ領域上にリアクティブ・イオン・エッチング（ＲＩＥ）され、２）ＳＣＳは窒化シリコンのチャンバ容積を規定する背面にエッチングされ、３）このウェーハはパターン化され、そして、反応チャンバの設計に応じて、窒化シリコンは化学的に窒化膜の領域を除く部分、または、全体領域がエッチング除去され、４）残りの窒化シリコン膜（反応チャンバ反対の側）は多結晶シリコン（ポリシリコン）で厚さ３０００オングストロームにＬＰＣＶＤ蒸着され、５）そのポリシリコンは次いでボロンで１区画当たり５０〜２００オームの抵抗値まで高温ドープされ、そして、６）アルミニウムまたは金の薄膜の金属コンタクトが蒸着されてヒータのジオメトリを決めた。
各ウェーハ可能な限り、ジオメトリおよび所望の容積に応じて、多くの反応チャンバを有する。各ウェーハのエッチングした窪みが２重ヒータ反応チャンバの１／２を構成する。処理されたウェーハは続いて結束され、両サイドにヒータを備えた閉じたチャンバを形成する。
この反応チャンバは、２枚のウェーハの間に直接に低温硬化ポリイミドの薄いフィルムを蒸着すること、または、共晶金属結合などのほかの結合法によって、互いに結合することができる。各２重ヒータチャンバを切り分ける設計の場合、高精密のコンピュータ制御のシリコン鋸を使った。このチャンバは次いで脱イオン化水で繰り返し水洗され、乾燥させてシラン処理を施した。
この反応チャンバは、圧力調整された電子的コンタクトホルダに挿入された。このホルダはコントローラを構成する電気的コンポーネントのプレキシガラスのバックボードの一部を成す。このコントローラのエレクトロニクスはアナログまたはデジタルのいずれでも良く、フィードバック制御機構としてパルス幅変調のようなプロセスを用いることができる。バックボードは３×５インチで、サーモカップルを用いた温度フィードバック制御回路、ヒータエレクトロニクス、コンピュータインターフェース、および電源コネクタから構成した。この回路は８〜３２ボルトで動作するように設計した。熱の校正は、流体の温度をシリコン測定用のタイプＫのサーモカップルのそれに相関させることで行った。一度校正すると、反応流体を直接測定することなく、自動で、フィードバック制御の熱サイクリング動作を行うことができた。この熱サイクラ出力はアップル社のApple Centris 650コンピュータに供給され、このコンピュータがプロファイルの累積に加えて、熱サイクルをリアルタイムに表示する。４個の９ボルトバッテリで計器全体を２．５時間以上にわたって連続的に駆動する能力があった。
典型的なＰＣＲは、種々の条件下で熱的にサイクリングされたアリコート間での均一性を保証するため、スケールアップした主混合物としてセットアップした。試薬量は５０ｕｌに理想的な量に基づき決めた。主混合物は概略、以下のものを含んだ。すなわち、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１．５〜３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｕＭの各デオキシヌクレオチド、又は、８００ｕＭ  ｄＮＴＰ  トータル、０．５ｕＭの２つのオリゴヌクレオチド・プライマのそれぞれ、２５ユニット／ｍｌのAmpliTag（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、および、５０ｕｌ反応当たり指定コピー数でのターゲット鋳型である。いくつかのβグロビン用の鋳型は、シングルストランドＤＮＡとして、人間のβグロビン遺伝子の部分のＭ１３バクテリオファージクローンから加えた。ＣＦ鋳型は、培養細胞系ＨＬ６０、ＧＭ０７４６０、またはＧＭ０８３４５から引き出した人間のゲノミックの２重ストランドであった。各反応混合物は同一の主混合物から分取され、本発明に係る計器およびPerkin-Elmer社のGeneAmp（登録商標）９６００熱サイクラで熱サイクリングされた。両方の熱サイクラで熱サイクリングされた反応物は、トリス・ボラード緩衝液を使って３％  ＮｕＳｅｉｖｅ、１％  Ｓｅａｋｅｍ  アガロース（ＦＭＣ社）に基づき分別した。このゲルは臭化エチジウムで着色され、３０２ｎｍのＵＶ光を照射した状態で写真にとった。
最初は一回使用で使い捨てタイプの反応チャンバを着想したのであるが、この反応チャンバは、この強い性質かつ安定した特性を考慮すると、繰り返し使用にも供することができる。
本発明に係る「ＭＥＭＳ」に基づいた熱サイクリング計器は、ウイルス性、細菌性、および人間のゲノミック性の鋳型を含む各種のＰＣＲシステムで試験された。同様に、反応チャンバ設計およびコントローラの計測の両方における各種変更もインプリメントされ、評価された。微細組立ての熱サイクラからの熱サイクルに対するコントローラ出力がリアルタイム表示され、この表示によると、１５ボルト入力（平均１．２ワット）で、５℃／秒を超える加熱速度が達成されることが示された。冷却はこれよりも若干遅く（２．５℃／秒）、この主な原因は反応チャンバがプレキシグラスの計器ボードの内部に保持されているためである。＋／-０．５℃の精度が目標温度で保持される。より高い加熱および冷却の速度を得ることができた。
行った実験によれば、図９に示した計器と商用の計器との両方でＰＣＲプロセスの定量的性質が判明した。これらの実験は、２３、２５、２７、２９、および３１サイクルで両方の上記計器から１０５個の開始コピーのβグロビンＰＣＲから５μＬのアリコートを除去するものであった。これらのアリコートは引き続き、アガロースゲル電気泳動法の元で処理された。両計器からデータ結果は実質的に同一であった。人間のゲノミック（ＨＬ６０）ＤＮＡから直接得られたβグロビンの２６８-ｂｐターゲットの増幅から出た同一の定量的ゲル電気泳動シリーズが実行された。
多重ＰＣＲは、最近の最も新しい、解析的にパワフルなＤＮＡ増幅技術の１つと考えられる。この技法を行うには、反応チャンバ内部で精密かつ均一な温度制御が必要になる。本発明者は、本発明に係る計器を用いてこれを達成した。
例えば、嚢胞性線維（ＣＦ）症に関連した特定の突然変異のポストＰＣＲ検出は、簡単なナイロンに基づく試験ストリップで、逆ドット・ボロット技法を使って識別することができる。この試験ストリップは、関心ある突然変異シーケンスを含む特定の固定化したＤＮＡプローブを有している。この多重ＰＣＲ増幅生成物は検体と一緒に、これを通して簡単な試薬に入れられる。仮に結合が生じ、ＤＮＡが洗浄ステップの後も保持されるならば、ＤＮＡビオチン・ストレプタビディン・酵素複合体（DNA-biotin-streptavidin-enzyme complex）は基板で処理したときに色が変わる。この商用および図９に示す計器によるＰＣＲの増幅結果は、準備されたＣＦ用の逆ドット・プロット検体によりフォローされる、
上記参照の実験結果と以前の結果から、一つの側面に寄せたヒータを備えた前述した同時係属の出願のものと比較して、種々のサイズおよび構成を有したこのシリコン依存形の反応チャンバは、ＰＣＲといった化学反応を低い要求の電力で遂行する能力を有する。
上述した実験結果の重要性は、まず始めに、バッテリ動作で、手で保持してＰＣＲ増幅を遂行できること、そして、複雑な生物物質および病気を簡単な試薬を用いたターゲット検出により、図９に図示したような計器で遂行できるという点にある。
ＰＣＲタイプ適合のシリコン依存形のマイクロ反応チャンバにおいて迅速な温度サイクリングと熱的均一性とが可能になったことで、ヒドリダイゼーションと酵素動力学に対する理解を与えることができると考えられる。例えば、温度制御の重要性はＰＣＰプロセスにおいて最高の要件で、とくに、複合体系が増幅されるときにはそうである（例えば、人間のゲノミックＤＮＡ、多重増幅）。この温度制御の精密さと熱的均一性とはバランスする必要がある。計器を真に小形化し、または、高いスループットの計測装置を構築するために微細組立ての反応チャンバの利点を享受するには、図１０Ａ、１０Ｂ、および１１に示すように、制御エレメントをユニット毎のスケールに関して集積化する必要ある。また、使用する各種の材料の熱的特性をバランスさせて制御効率と熱的信頼性とを共に得る必要がある。シリコン・ベースの材料は熱的特性、ヒータを集積化する能力、およびフィードバック制御の必須要件を与えことができるので、これを用いた製造を行うことで、高度な並列性、自動化、およびバッチ処理能力の利点を得ることができる。
図１０Ａ〜１０Ｂおよび１１はシステムのアプローチを図示するもので、高いスループット、高効率の熱サイクラ計器、サンプル操作、および電気泳動モジュールを組み合わせている。この電気泳動モジュールはまた、ガラスまたはシリコンを使って微細機械加工することができる。この計器は本質的にハイブリッドにでき、すなわち、図５の実施例でわかるように、シリコン依存形の反応チャンバと、両基板またはメンバの利点を享受する小形のガラス電気泳動モジュールとである。ＤＮＡ生成をリアルタイムに検出することの利点によって、オペレータはゲルの結果を見るために待機しているよりもむしろ、反応中のＰＣＲ効率について知ることができるようになる。これにより、まだ増幅されていないサンプルの電気泳動ゲルを実行する上で無駄な時間を無くすることができ、ＤＮＡ塩基配列決定の生産性向上に大いなる助けとなる。
図１０Ａおよび１０Ｂは、符号９０で概略示される熱サイクリング計器を表し、この計器はフェースプレート９２を有したハウジング９１を備え、このフェースプレートは図９の手で保持する計器のフェースプレートと同様に、「ステータス」ウィンドウ９３を含む各種のインジケータをその表面に備える。このハウジングはヒンジ付き天板９４を有し、この下に個別制御のシリコン依存形のマイクロ反応チャンバ９６のアレイ９５を位置させ、チャンバ９６は例えば図４及び６に図示したタイプで形成することができる。図１０Ｂに示すアレイ９５には図示を簡単にするために１００個のチャンバのみを持たせているが、計器９０は３８４個のマイクロ反応チャンバ９５を有するように設計される。
図１１は、図１０Ａ〜１０Ｂの計器を利用した、高スループットのＤＮＡアプリケーション、サンプル操作、および電気システムの概要を表しており、該当する参照符号が対応するコンポーネントを示している。３８４個の個別制御ＰＣＲ反応チャンバ９６′（５個のみ示す）のアレイ９５′は動作的に、符号９７で概略示される自動サンプル入力／出力アセンブリに結合されている。この結合には、符号９８および９９で概略示される２セットのマイクロインジェクタが使用される。アセンブリ９７のマイクロインジェクタのセット９８とアレイ９５との間のサンプル入力／出力機能はダブル矢印１００により示され、一方、マイクロインジェクタのセット９８および９９の間のかかる機能はダブル矢印１０１により示される。マイクロインジェクタのセット９９は個々のマイクロ電気泳動チャンネル１０３から成るアレイ１０２に動作的に結合している。このインジェクタによる入力／出力システムは真空または界面動電のパワーにより反応チャンバ９６から試薬サンプルをロードし、自動的またはロボット工学的に電気泳動チャンネル１０３まで移動し、圧力または逆向きフィールドの界面動電インジェクションにより試薬をそれらのチャンネルにアンロードして電気泳動分離させる。この電気泳動モジュールも同様に微細機械加工により形成できる。シリコンは反応チャンネルに適しており、ガラスは電気泳動に適している。
電気泳動チャンネル１０３はガラス基板で形成されており、それぞれ直接に図４に示すタイプのシリコン反応チャンバに結合しており、これにより、図５に示すように、電気泳動チャンネル１０３のアレイ１０２に直接に結合した反応チャンネル９６′のアレイ９５を生成している。
図１２に示す如く、アプリケーションの中には、適宜な反応に適合することが知られている材料から成る反応チャンバ用の着脱可能／パーマネントなライン／インサートを使用すると、それらのライン／インサートを使い捨てにしてもよいので、全体のコストを下げることができるものもある。同様に考えられるのは、シリコン依存形の反応チャンバの表面用変性剤で、これを使用すれば、ラインに対する共有および／または他の結合を増強することができる。この例は有機／活性シラン、ポリイミド、テフロン、ポリセリン（polytheylene）、ほかのポリマなどである。
図１２は、光学的ウィンドウ１０６を有する反応チャンバ用の、符号１０５で概略表されるインサート／ライナの実施例を示している。このインサート／ライナ１０５は６枚の側面の（six-sided）ハウジング１０７とトップ／カバー１０８とを有する。この６枚側面のハウジング１０７は例えば、図６の実施例の反応チャンバ５０の開口５４に挿入され、ウィンドウ１０６が図６のウィンドウ５５または５６の一方と一列に並ぶように構成される。このハウジング１０７はプラスチックまたは前述した他の適合する材料で構成される。インサート／ライナ１０５のウィンドウ１０６には試験ストリップ１０９が付けられており、図１４については以下に説明される。
図１３は、符号１１０で概略示される外部の流体素子間（interfludic）結合を介して図１２の反応チャンバのインサート／ライナ１０５の外部充填を図示している。流体素子結合の例には、シリンジ針、ピペット先端部、および溶融シリカ毛管またはガラスまたはポリマの管が挙げられる。
生成物の生成および特殊性を光学的にまたは他の検出法（他のマイクロベースの検出法）で検出するためのプローブを有するウィンドウ（または試験ストリップ）の表面固定化は図１４のようになされ、同図は図１２の試験ストリップ１０９の拡大図である。このような試験ストリップは図４または６の反応チャンバのウィンドウに持たせることができる。図１２の１０６のように、ウィンドウ上に直接に存する、または、図１２の反応チャンバのインサート／ライナ１０５内の反応流体の内部に存する特定の生成物を検出するための固定化試薬／プローブは、試験ストリップ１０９を使って、図９のＰＣＲｍａｎ、すなわち手持ちタイプの計器で光学的に検出できる。このウィンドウの実際の内部表面は特定ターゲットまたは生生物検出プローブ用の固定化表面として使用することが可能で、または、このウィンドウはチャンバ内部の固定化／検出表面を観察するために用いることが可能である。
図１５及び１６は光学的検出用の２通りのセットアップ法の概略を図示している。図１５のセットアップ法はレーザ／ｃｃｄバージョンであり、一方、図１６のセットアップ法は図９のＰＣＲｍａｎ（手で保持するの計器）内にインプリメンテーションするための定電力動作を可能にするようになっている。
図１５に示すように、ウィンドウ１２１および制御エレクトロニクス１２２を有する反応チャンバ１２０に関する光学的検出の配置には、関心検出波長を通過させる干渉フィルタまたはバンドパスフィルタなどの光学フィルタ１２３、ＣＣＤ１２４、符号１２５で概略表されるデジタル画像、焦点用光学系１２６、レフレクタ／スプリッタ１２７、およびアルゴンイオンレーザ１２８が含まれる。この動作は以下のようである。このレーザは生成物検出に関連する蛍光指示薬染料励起する。蛍光信号はＣＣＤ１２４によりモニタされる。このため、吸収スペクトルが同様に使える。
図１６のシステムは、ウィンドウ１２１′を有する反応チャンバ１２０′用の光学検出システムを小形化したもので、制御エレクトロニクス１２２′は２つのフィルタ１３０および１３１、固体状態検出器１３２、および青ＬＥＤ１３３から成る。このフィルタ１３０および１３１は、エミッション（すなわち６００ｎｍロングパス）を選択するバンドパスまたはロングパス、および、４８８ｎｍ±１０ｎｍのような関心励起波長を選択するバンドパスのいずれかである。この励起バンドパスは、例えば、ＬＥＤの典型的な広帯域エミッションから選択するように使用できる。図１６の検出システムの動作は以下のようである。ＬＥＤ出力は蛍光指示薬染料の励起源（または吸収）としての４８８±１０ｎｍの波長にフィルタリングされる。固体状態検出器も同様に、検出波長（＞６００ｎｍ）のみを受光するようにフィルタリングされ、すなわち吸収検出器として機能する。
人工知能はＤＮＡを生成し、それが完成した場合、仮にそれが機能したならば、どの位のサイクルを実行したらよいか、生産を上げるためのパラメータの調整などを決める方法である。図１７に概略的に示すようなリアルタイムの検出システムを使って、集積化された検出構造を用いた人工知能フィードバックシステムを提供できる。図１７のシステムは、ウィンドウ１３６を有した反応チャンバ１３５、ＤＮＡ製造に関して本来の位置での検出のための検出器１３７、反応チャンバ１３５用の計器コントローラ１３８、およびデータ読み出しシステム１３９を備え、このデータ読み出しシステムが検出器１３７からデータを矢印１４０で示す如く受けて、制御データをコントローラ１３８に矢印１４１で示す如く供給する。このデータ読み出しシステム１３９は、どの位の量のＤＮＡを製造するのか、開始コピー番号、反応完了などの情報を提供する。よく知られている光学的なモニタ装置を使ってＤＮＡ製造を定量化することによって、本システムはサイクリング時間およびサイクル数を調整し、検出に必要な最適サイクル数を作り出すことができ、本プロセスを迅速化できる。同様に、所望の蛍光信号、すなわち生成物濃度を検出するために必要なサイクル番号を決めることによって、本システムは全部の開始コピー番号または不明の開始サンプルの濃度を計算することが可能になる。これにより、自動化された濃度計算が可能になる。リアルタイムに定量的な情報を使うことで、本システムによってターゲット温度、ホールド時間、およびランプレート（ramp rates）といった反応パラメータを調整することができる。
増幅されたＤＮＡを検出するための微細組立ての電気化学発光セルを図１８〜３１に関連して以下に説明することとし、これらの図により設計、組立て、およびその試験を述べる。マイクロセルは、図９で説明しかつ上述した如く、ＰＣＲマイクロ計器の検出ユニットとして設計される。このセルは微細機械加工されたシリコンおよびガラスの直立アセンブリであり、図に示すように薄いフィルム電極を有している。
電気化学発光によるＤＮＡ検出は、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅から開始し、その濃度を検出可能なレベルまで上昇させる。次いで、それがトリス（tris）（2,2’bipyridyl）テルニウム（ＩＩ）（ＴＢＲ）で標識化される（labeled）。酸化ＴＢＲは還元（reduction）したときに発光する（青色）。酸化は電気化学的に電極表面で生じ、したがって、電気化学発光（ＥＣＬ）と呼ばれる光放射が生じる。ＴＢＲには比較的低い酸化電位（数ボルト）が必要で、可視光（６２０ｎｍ）で高いＥＣＬ効率を有する。これはマイクロセンサのアプリケーションにとって魅力的で、それは可視放射はシリコンフォトダイオードで簡単に検出でき、そのフォトダイオードはシリコンの微細機械加工セルに集積化可能であるからである。還元は電気化学的または化学的に生じるもので、いずれの場合でも光は放射される。例えば、酸化トリプロピラミン（tripropylamine）（ＴＰＡ）は電子を酸化ＴＢＲに容易に移動させ、ＴＢＲは化学発光する。両方の酸化は同一電極で生じるので、比較的大きい濃度の両種が非常に近接して生成することができ、これにより、ＴＢＲが単独で溶液中に存在する場合よりも、所定ＴＢＲ濃度に対して高い光強度になる。アノードに生じるＴＢＲの電気化学的酸化および化学的還元反応は図１８に概略図示されている。ＴＢＲの電気化学的還元は同様にカソードでも生じる。自由ＴＢＲではなく、ＴＢＲで標識化されたＤＮＡのみを酸化させるために、この２つのＴＢＲを分離する必要がある。これを実現する１つの方法は、比結合（specific binding）が高い免疫プロテイン（抗体−抗原）を使って行う方法である。
一例を図１９に示しており、ビオチンプライマがターゲットＤＮＡの１本のストランドの５′エンド上に形成され、ＴＢＲがコンプリメンタリ・ストランドの５′エンドにタグ付けされる。ＰＣＲプロセスの間に、ＤＮＡの２重ストランドがビオチンで生成され、ＴＢＲはいずれかのエンド上に標識化される。このビオチンで標識化したＤＮＡは次いで、表面がアビジン（ビオチンに対する抗体）でコーティングされているアノードの助力によって電気化学セルに案内される。選択的な結合が生じ、その後でセル中の溶液が洗い流され、どの自由（free）ＴＢＲも除去される。さて、ＤＮＡに結合したＴＢＲ、つまり抗体−抗原結合を介して今度はアノードに付着したＴＢＲは、添加されたＴＰＡと共に酸化され、続いて生じる発光の強度が存在するＤＮＡの量に依存する。
ＥＣＬマイクロセルは、図２１〜３１に関連して以下に詳述するように、微細機械加工されたシリコンおよびガラスの多重層アセンブリである。３５μＬ〜８５μＬにわたる溶液容量を持ったセルがシリコンで設計され、組み立てられている。ｅ−ビーム堆積させた、ゴールドの、薄いフィルムによりセルのカソードが形成される。アノードも同様に薄いフィルムである。実験はインジウム・すず酸化物（ＩＴＯ）およびプラチナの両方でなされた。ＩＴＯは可視光に対して透明であり、このため、ガラス上に堆積させたとき、アセンブリの一番上の層を形成するもので、この層を通して放射光がフォト検出器（図２２参照）によって検知される。このアセンブリはまた、微細機械加工された流体充填ポート（図２２参照）を含んでいる。これらの層は、、Epotek  ４００といった低温硬化ポリイミドを使って組み立てられかつ結合された。
ＥＣＬ実験を自由ＴＢＲ、すなわちＤＮＡ無しのマイクロセルで行った。セルはＴＰＡ＋ＴＢＲの溶液で満たされ、２次電子倍増管（ＰＭＴ）を放射検出のセルの一番上のガラス層に近接して置いた。酸化されるＴＰＡおよびＴＢＲの反応によって生成される化学発光は両方の化学物質の濃度に依存する。これらの実験では、ＴＰＡの濃度を一定（５０ｍＭ）に保持する一方で、ＴＢＲのそれを可変にした。溶液は以下のように用意した。すなわち、１ｇのヘキサヒドレート（hexahydrate）塩化物を５０ｍＭのＴＰＡに溶解し、５ｍＭのＴＢＲを作った。このＴＢＲは次いで別の５．０ｍＭのＴＰＡで希釈し、一セットの試験溶液を生成した。この試験溶液のＴＢＲ濃度は０．１ｎＭ〜５ｍＭに及ぶ。ＥＧ＆Ｇ社のポテンショスタット、モデルＰＡＲＣ２７３を使用してＴＰＡ＋ＴＢＲ溶液のボルタモグラム（voltammograms）を生成した。この両溶液はＩＴＯおよびゴールドの薄いフィルム電極を有するマイクロセル、およびプラチナ線電極を有するさらに従来タイプの電気化学セルに入れた。ボルタモグラムからＥＣＬが生じる酸化電位が決定され、この電位が薄いフィルムのカソードおよびアノード間のｄｃバイアスとして印加された。放射光はHamamatsu MT社のモデルＲ９２８を６００Ｖのバイアスとして使って測定された。図２０は測定光強度とｍＭ当たりのＴＢＲ濃度に対する電極電圧との間の関係を示すもので、同図ではセル電圧およびＥＣＬ強度の変化を時間軸に対してとっている。ドット・ダッシュ・ドット線で表示するように、セル電圧は上昇し、そして下降する。両方向にて、電圧は、ＥＣＬ強度が最大になるＴＢＲの酸化電位を通過する。これまで実行された試験では、アノード材料としてのＩＴＯフィルムを備えたマイクロセルを使って測定されたＴＢＲの最も低い濃度は、１μＭであった。プラチナのアノードを使った場合、測定ＴＢＰ濃度は１ｎＭと低かった。比較的高抵抗のＩＴＯフィルムはＴＰＡのための酸化電流を制限すると考えられ、したがって感度を低下させている。図３１に関連して説明されるように、ＩＴＯフィルム上にアルミニウムのような薄いフィルム材料を蒸着することで、感度は改善できることがわかった。また、図２１の実施例におけるように分離するのではなく、シリコンのフォトダイオードをマイクロセルに集積することに努力は傾注されている最中である。
図２１は、符号１４０で概略表される、薄いフィルムを備えた微細機械加工ＥＣＬと、ＥＣＬセル１４０に隣接して位置しているシリコン（Ｓｉ）のフォトダイオード１４１との実施例を示している。ＥＣＬセル１４０は図２２に拡大断面で示す。このセル１４０は１対のシリコンメンバ１４２および１４３を備え、そのメンバ間に電極１４４を位置させ、この電極を金（Ａｕ）、プラチナ（Ｐｔ）または銀（Ａｇ）、ＩＴＯ層１４５、およびガラス層またはスライド１４６から構成できる。シリコンメンバ１４２は反応チャンバ１４７を有し、またメンバ１４３は、記号によって示したように検体がチャンバ１４７に向けられ、また、矢印１５１および１５２で示したようにチューブ又はライン１４９、１５０を通してそこから回収する１対の充填ポート１４８（図２２参照）を有する。図２２で分かる如く、充填ポート１４８間に位置する、シリコンメンバ１４３の中央領域１５３は、ＩＴＯ層１４５およびガラススライド１４６と共に、ウィンドウを画成し、このウィンドウにより、これを通り抜けてフォトダイオード１４１に向かうフォトン１５４で示すように、チャンバ１４７内部での反応を検出することができる。電気的リード線１５５および１５６が電源から電極１４４およびＩＴＯ層１４５にそれぞれ接続されており、一方、フォトダイオード１４１が電気的にリード線１５７および１５８を介して電源に接続されている。
図２３〜３０は、図２１および２２の実施例に類似のＥＣＬセルの実施例に係る組立てを図示するものである。この組立てプロセスは以下のように実行される。
１．シリコンのブロック１６０をコーティングして窒化シリコン（図２３参照）の層１６１を形成する。
２．フォトレジストの層１６２を層１６１上に蒸着する（図２４参照）。
３．上記層１６２をパターン化し、そこに開口１６３を形成する写真平版プロセスを実行する（図２５参照）。
４．上記開口１６３の下の窒化シリコン層１６１の領域１６１′をＲＩＥエッチングにより除去する（図２６参照）。
５．シリコンブロック１６０の領域をＫＯＨエッチングにより除去して反応チャンバ１６４を形成し、残りのフォトレジスト１６２を除去する（図２７参照）。
６．例えばゴールドの層を、薄いフィルム蒸発によってブロック１６０およびチャンバ１６４の上側表面全体に蒸着し、電極１６５を形成する（図２８参照）。
７．別のシリコン１６６のブロックを窒化シリコンの層１６７でコーティングし、開口１６８および１６９をそこにＲＩＥエッチングにより形成し、そして１対の充填ポート１７０および１７１を微細機械加工による手法によって形成し、ブロック中に、窒化シリコンでコーティングしたブロック１６６が電極１６５に接着される（図２９参照）。
８．電極１７２を形成するＩＴＯの層をガラスの層または側面１７３上に堆積し、そして窒化シリコン層１６７に接着する（図２９参照）。
９．電気的リード線１７４および１７５をゴールド電極１６５およびＩＴＯ電極１７２に固定し、図２１のフォトダイオードなどの、電気的リード線１７７および１７８を有する検出器１７６をガラス層１７３に接着し、さらに窒化シリコンでコーティングしたシリコンブロック１６０を電気的リード線１８０および１８１を有するマグネット１７９上に位置させる（図３０参照）。
ＩＴＯ電極１７２の抵抗を減らすために、薄いフィルム状のアルミニウム１８２（図３１参照）をＩＴＯ層または電極１７２上に堆積させ、その後で、これを窒化シリコンでコーティングしたシリコンブロック１６６に接着することができる。
以上で、本発明により、手で保持するタイプの計器または大形の高いスループットの計器で使用できるシリコン依存形のマイクロ反応チャンバを提供できることが説明された。さらに、本発明により、インサート／ライナ、試験ストリップ、光学的検出、およびマイクロ反応チャンバの自動制御も提供できる。したがって、本発明はＰＣＲおよび他の化学反応の技術状態を実質的に進めるものとなる。
本発明の原理を例示しかつ説明するために特定の実施例、材料、パラメータなどを述べてきたが、これは限定を意図したものではない。当業者には修正や変更は欲すれば明らかであろうから、本発明は添付のクレームの範囲によってのみ限定されるものであることを念のため付記しておく。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図３１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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