(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量トロンビン阻害薬を含む透析液。
【請求項２】
低分子量トロンビン阻害薬を含む透析濃縮物。
【請求項３】
（ａ）低分子量トロンビン阻害薬を含む製剤、および（ｂ）透析濃縮物を含む、透析に使用するための部品キット。
【請求項４】
透析が血液透析である、請求項１に記載の透析液、請求項２に記載の濃縮物、または請求項３に記載の部品キット。
【請求項５】
トロンビン阻害薬がペプチドを基にした低分子量トロンビン阻害薬、アミノ酸を基にした低分子量トロンビン阻害薬、および／またはペプチド類似体を基にした低分子量トロンビン阻害薬、またはこれらのいずれかのプロドラッグである、請求項１若しくは４に記載の透析液、または請求項２若しくは４に記載の濃縮物、または請求項３若しくは４に記載の部品キット。
【請求項６】
トロンビン阻害薬がイノガトランもしくはメラガトラン、またはそのプロドラッグである、請求項５に記載の透析液、濃縮物、または部品キット。
【請求項７】
請求項１、４、５若しくは６に記載の透析液または請求項２、４、５若しくは６に記載の濃縮物の製造方法であって、低分子量トロンビン阻害薬（またはそのプロドラッグ）を含む製剤および透析液、または透析濃縮物を混合することを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明はトロンビン阻害薬、特に低分子量トロンビン阻害薬の新規使用法に関する。
緒言
血液透析は腎機能不全、または腎不全患者の血液から老廃物および毒素を取り除く方法である。血液は、人工動静脈ろうまたは短期もしくは永久体内カテーテルのいずれかにより循環から取り除き、循環に戻し、そして“人工腎臓”、または透析器を通過する。
【０００２】
透析器はデザインおよび性能が様々であるが、すべて透析膜および透析液を含む。この液には必須電解質塩、および塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび酢酸を含む緩衝液が含まれていてもよい。濃度は電解質不均衡を正常に戻すために（時には患者ごとにそれぞれ）注意深く選択する。
【０００３】
透析液はまた、グルコース、炭酸水素ナトリウム、乳酸およびＥＤＴＡを含んでいてもよく、滅菌発熱性物質除去蒸留水を使用して、濃縮保存溶液（透析濃縮物）を注意深く制御して希釈することにより調製するか、またはそのまま使用できる形状で提供してもよい。
【０００４】
透析では、毒素を透析膜を通る拡散により取り除き、血液を正常状態に戻す。しかし、該方法は規則的な間隔で反復しなければならない（例えば、４〜６時間の１期間を週に２〜３回）。
【０００５】
慢性腎不全患者の血液透析において、透析膜上および血液経路中に発生する自然な血液凝固過程が、不充分なろ過および／または透析期間の早すぎる終了などの重大な問題を起こす。
【０００６】
この問題の予防のために最も広く使用され、現在利用可能な方法には抗凝固薬の非経口的ボーラス量の前投与がある。抗凝固薬は、未分画（ＵＨ；分子量約５，０００〜３０、０００）または低分子量（ＬＭＷＨ；分子量約４，０００）の形状で使用するヘパリンであってもよい。ヘパリンの静脈内ボーラス投与は一般に透析開始前に行う。
【０００７】
ヘパリンの前投与は上記のような問題を緩和することができるが、決して完全に満足できる解決法ではなく、実際、別の面倒な問題がしばしば見られる。例えば、出血および透析膜上や血液経路中に凝固を起こす過剰投与または過少投与を避けるために、個々の患者に使用することができるヘパリンの効果的な量は、力価検定により予め決定しなければならない。従って、誤った用量がひどい出血や透析期間の早すぎる終了を起こすことがある。さらに、該化合物が透析フィルターから漏れ、その抗凝固作用が透析過程中に低下して、透析ろうまたはカテーテルの血栓性閉塞を招くことがある。さらに、慢性腎不全患者の３％ほどがヘパリン誘発血小板減少症になることが知られ、何人かの患者はヘパリン誘発大理石骨病になることがある。また、低分子量ヘパリンは高価である（普通のヘパリンより１０倍まで高価である）。
【０００８】
従って、代わりとなる方法が必要であり、その方法は透析、特に血液透析中により安全、より確かでより有効な抗凝固作用を提供することができる。
先行技術
国際特許出願ＷＯ９４／２９３３６は、一般的および具体的に、トロンビン阻害薬として、従って抗凝固薬として有効な化合物を開示する。具体的に述べられたトロンビン阻害薬にはＨＯＯＣ−ＣＨ2−（Ｒ）Ｃｇｌ−Ａｚｅ−Ｐａｂ−Ｈがあり、それはまたメラガトラン（ｍｅｌａｇａｔｒａｎ）としても既知である（ＷＯ９４／２９３３６およびそのなかの略語リストを参照されたい）。血液透析は、開示された化合物が有効であると記載されている多くの適用項目中の一つとして挙げられている。
【０００９】
フランス特許出願ＦＲ２  ６８７  ０７０はとりわけヘパリンナトリウムを含む透析濃縮物を開示する。低分子量トロンビン阻害薬の使用については記載されていない。
発明の開示
驚くべきことに、血液透析のような透析の前、および／または透析中に低分子量トロンビン阻害薬を添加することにより上記の問題を解決できることを発見した。
本発明の初めの態様に従って、透析、特に血液透析による治療が必要な患者のかかる治療に用いる薬物製造における低分子量トロンビン阻害薬の使用法を提供し、上記の方法ではトロンビン阻害薬を透析液中に提供する。
【００１０】
“透析による治療が必要な”患者の治療という用語により、例えば、腎合併症患者の治療的、および／または予防的処置（すなわち透析中に（少なくとも部分的に体外であってもよい）治療的および／または予防的抗凝固作用を提供する）を含み、腎合併症および／または、慢性および／または急性腎不全を含む、腎不全を引き起こすことのできる疾患の患者の治療的および／または予防的処置を含む。該用語はまた、臓器障害、重い代謝障害および／または死を引き起こすことのできる化合物による中毒患者の治療的および／または予防的処置を含む。
【００１１】
とりわけ、驚くべきことに、低分子量トロンビン阻害薬を透析液中に提供するとき、それらは透析膜を自由に通過し、従って高度に予測可能、再現可能、および安定な膜の患者側の抗凝固薬の濃度を、全透析期間中、患者に提供することができる。
【００１２】
低分子量トロンビン阻害薬は、このように透析にそのまま使用できる（すなわち、透析液中に阻害薬を溶解、または分散させることにより透析器でそのまま使用できる、）透析液の部品として提供することができる。しかし、本発明者らは低分子量トロンビン阻害薬を透析濃縮物の部品として提供することを提案し、その濃縮物は透析液の部品として使用する前に適切な方法で希釈することになっている。
【００１３】
好都合にも、低分子量トロンビン阻害薬は、標準透析、例えば血液透析濃縮物と共に使用できる。“標準”透析濃縮物という用語は当業者に既知の、一般に（例えば商業的に）利用できるどのような濃縮物も含むが、また透析濃縮物として利用できる、すなわち、そのような使用法を可能にするために必要な性質を授ける組成物を含む、どのような医薬組成物も含むであろう。当業者は、透析濃縮物として製剤を使用可能にするために必要な性質には、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水による希釈時に、適切な透析液が形成可能な性質が挙げられるということを認めるであろう。そのようにして得られた溶液は、２７０〜３００，好ましくは２８０〜２９５ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度であってもよく、主な内因性に蓄積されたイオンは透析液に一括輸送し、内因性に取り除かれたイオンは反対の方向に一括輸送するような、溶液と血液間のイオンのモルグラジエントを提供できるであろう。得られた透析液は従って、１３５〜１４２ｍｍｏｌ／ＬのＮａ+イオン、０〜２ｍｍｏｌ／ＬのＫ+イオン、１．２５〜２ｍｍｏｌ／ＬのＣａ+イオン、０．５〜１ｍｍｏｌ／ＬのＭｇ+イオン、１０７〜１１５ｍｍｏｌ／ＬのＣｌ-イオンを含んでいてもよく、またＥＤＴＡおよび乳酸だけでなく、２〜３５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸イオン、０〜３８ｍｍｏｌ／ＬのＨＣＯ-3イオン、０〜６ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含んでいてもよい。当業者は、適切な濃縮物はまた酸および／またはアルカリ緩衝液であってもよく、他の成分を含んでいてもよいことを認識するであろう。それらの成分は、得られた溶液に先に記載したような性質を授けるための使用が可能であり、および／または液の蓄積などの、腎不全と関連することがある問題を回避することができる。
【００１４】
従って、低分子量トロンビン阻害薬を含む透析濃縮物は、当業者に既知の技術に従い、トロンビン阻害薬、またはそのような阻害薬を含む製剤と透析濃縮物の他の成分を混合することにより調製することができる。得られた濃縮物は既知の技術に従って、標準透析器で使用することができる。
低分子量トロンビン阻害薬を含む透析濃縮物はトロンビン阻害薬を含む形状で透析に使用するために提供してもよく、または（ａ）低分子量トロンビン阻害薬を含む製剤、および（ｂ）透析濃縮物を含む、透析に使用する部品キットとして提供してもよい。
【００１５】
低分子量トロンビン阻害薬は、例えば阻害薬自体（例えば、固形状）として、透析濃縮物とたやすく混合できる製剤のそのような部品キット中で使用するために提供してもよく、または阻害薬が溶解または均一に分散した濃縮物を得るために濃縮物と混合することができる、薬剤的に受容できるキャリア中に予め溶解、または分散させてもよい。
部品キットにおいて使用するための適切な透析濃縮物は、好ましくは先に記載したものを含むが、また他の部品キットの成分中で使用されるものと同じ、または異なるトロンビン阻害薬の量を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の他の態様に従って、低分子量トロンビン阻害薬を含む透析濃縮物を提供する。
“低分子量トロンビン阻害薬”という用語を当業者は理解するであろう。該用語にはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において実験的に検出可能な程度にトロンビンを阻害し、２，０００未満、好ましくは１，０００未満の分子量を持つ物質（例えば、化合物）のどのような組成物、または本発明においてはそのような組成物／化合物のプロドラッグも含まれるということを理解することができる。
【００１７】
好ましい低分子量トロンビン阻害薬にはペプチド‐、アミノ酸‐、および／またはペプチド類似体を基礎にした低分子量トロンビン阻害薬が挙げられる。
“ペプチド‐、アミノ酸‐、および／またはペプチド類似体を基礎にした低分子量トロンビン阻害薬”という用語は、１〜４のペプチド結合を持ち、および／または１０００未満の分子量を持つトロンビン阻害薬、および、本発明においてはトロンビン阻害薬のプロドラッグを含むということを当業者はよく理解するであろう。そして該用語は、以下の文書に開示された化合物だけでなく、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎ．（１９９４）５，４１１中のＣｌａｅｓｓｏｎによる総説に記載の化合物（活性トロンビン阻害薬および活性トロンビン阻害薬のプロドラッグ、適宜）も含み、それらの文書は米国特許第４３４６，０７８号；国際特許出願ＷＯ９３／１１１５２，ＷＯ９５／２３６０９，ＷＯ９３／０５０６９，ＷＯ９７／４６５７７，ＷＯ９８／０１４２２，ＷＯ９５／３５３０９，ＷＯ９６／２５４２６，ＷＯ９４／２９３３６，ＷＯ９３／１８０６０，ＷＯ９５／０１１６８，ＷＯ９７／２３４９９，ＷＯ９７／０２２８４，ＷＯ９７／４６５７７，ＷＯ９６／３２１１０，ＷＯ９８／０６７４０，ＷＯ９７／４９４０４，ＷＯ９８／５７９３２、ＷＯ９９／２９６６４、ＷＯ９６／３１５０４，ＷＯ９７／１１６９３，ＷＯ９７／２４１３５およびＷＯ９７／４７２９９；およびヨーロッパ特許出願６４８  ７８０，４６８  ２３１、５５９  ０４６、６４１  ７７９，１８５  ３９０，５２６  ８７７，５４２  ５２５，１９５  ２１２，３６２  ００２，３６４  ３４４，５３０  １６７，２９３  ８８１，６８６  ６４２，６６９  ３１７，６０１  ４５９，６２３  ５９６，７９６  ２７１および８０９  ６５１であり、それらすべての文書中の開示は参照として本明細書に包含する。
【００１８】
ペプチドを基礎にした好ましい低分子量トロンビン阻害薬には“ガトラン（ｇａｔｒａｎｓ）”として集合的に既知の化合物がある。名を挙げることのできる個々のガトランには、ＨＯＯＣ−ＣＨ2−（Ｒ）Ｃｈａ−Ｐｉｃ−Ｎａｇ−Ｈ（イノガトランとして既知；国際特許出願ＷＯ９３／１１１５２およびそのなかの略語リストを参照されたい）およびＨＯＯＣ−ＣＨ2−（Ｒ）Ｃｇｌ−Ａｚｅ−Ｐａｂ−Ｈ（メラガトランとして既知；国際特許出願ＷＯ９４／２９３６６およびそのなかの略語リストを参照されたい）、そして本明細書においてはメラガトランのプロドラッグ（例えばＷＯ９７／２３４９９を参照されたい）がある。とりわけ好ましいトロンビン阻害薬にはメラガトランがあげられる。
【００１９】
トロンビン阻害薬、またはトロンビン阻害薬を含む透析濃縮物は適切な量を（濃縮物の場合、適切な量の水（例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水）で希釈後に）透析液に提供することができ、全透析期間にわたり制御された透析膜通過速度で患者に薬物が送達できるであろう。このことは透析液の入口の管への一定の注入を含んでいてもよい。
【００２０】
透析濃縮物中の低分子量トロンビン阻害薬および／または透析液の適切な濃度は、使用するトロンビン阻害薬（および／またはその阻害薬のプロドラッグ）、治療する疾患の重症度および治療する患者の特質に依存するであろうが、非発明的に決定することができる。使用することのできる低分子量トロンビン阻害薬およびプロドラッグの適切な濃度は、一旦平衡に達すると、治療が必要な期間にわたり、トロンビン阻害薬の平均血漿中濃度が、０．００１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５〜２０μｍｏｌ／Ｌおよびとりわけ０．００９〜１５μｍｏｌ／Ｌの範囲になる濃度を含む。イノガトランおよびそのプロドラッグの適切な濃度は平均血漿中濃度が０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、および好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／Ｌの範囲になるような濃度である；メラガトランおよびそのプロドラッグの適切な濃度は平均血漿中濃度が０．０１〜５μｍｏｌ／Ｌ、そして好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌの範囲になるような濃度である。
【００２１】
低分子量トロンビン阻害薬の最大血漿中濃度は用いた透析液、および／または透析濃縮物中の薬物の濃度からたやすく測定することができる。定常状態平衡（その時点で血液および透析液中の濃度が等しく、両方向において透析膜を横切る時間が等しい速さで経過する）に到達する時間は、使用する透析膜の性質、透析器のフローレベル、および使用するトロンビン阻害薬の物理的および化学的性質を含む因子に依存するであろう。
【００２２】
透析治療を受ける患者の疾患の重症度に依存して、（透析期間の開始前６０分までを含む）初期にボーラス量のトロンビン阻害薬を投与することが好ましく、それにより透析期間中の早い時期に起こってもよい透析フィルターまたは血液経路の血栓性閉塞を緩和する。しかし、そのような治療は本発明に従った使用法の実行に必須ではない。
【００２３】
本発明の他の態様に従って、透析、特に血液透析が必要な患者、好ましくはヒト患者の治療方法を提供し、そのような治療には低分子量トロンビン阻害薬を含む透析液を使用した透析を行うことを含む。
【００２４】
本明細書に記載の発明は、透析に使用するための現在利用できる抗凝固法に比べ、より安全、より確実、より再現可能、より経済的およびより有効な方法で透析、例えば血液透析が必要な患者における凝血を軽減することができるという好都合な点を持ち、従ってこれらの技術に関連した問題を解決することができる。本発明はまた、透析中だけでなく、透析と透析の間にこれらの好都合な点を提供することができる。
実施例
本発明は以下の実施例により説明するが、決してそれらに限定されるものでない。
実施例１
開放シングルパス系でのメラガトランのろ過−透析シミュレーション
ＬｕｎＤｉａ  Ｐｒｏ６００（Ｇａｍｂｒｏ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）透析フィルターをＧａｍｂｒｏＡＫ−１００（Ｇａｍｂｒｏ）透析装置に連結し、ＢｉｏｓｏｌＡ２０１．５グルコース（Ｐｈａｒｍａｌｉｎｋ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）濃縮物（希釈１：３５）から調製した透析液を１５分間注入した。実験装置を図１に示した。透析液は膜の片側（ここではドナー側として示す）を５００ｍＬ／分の流量で通過した。同時に、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む液を膜の患者側（ここではレシピエント側として示す）から２５０ｍＬ／分で注入し、再循環させずに廃棄した。膜の両側の流れは逆方向であった。
次にポンプを停止し、１：３５に希釈後に最終濃度約０．２μＭになるようにメラガトラン３ｍｇ／Ｌ（７μＭ）を含む濃縮物の新しい袋と交換した。ポンプを同じスピードで再スタートさせたが、透析液はフィルターユニットを通って平行する回路から別の経路に流した。フィルター潅流は時間ゼロにおいて再開し、サンプルは５分間にわたり、予め決めた時点で、位置Ａ（レシピエント側出口）、位置Ｂ（ドナー側出口）および位置Ｃ（ドナー側入口）の管から集めた。
液体クロマトグラフィー／質量分析法（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ＢＡ−２１６）を使用してサンプル（約５ｍＬ）における、メラガトランの存在を分析した。定量限界（１０ｎＭ）未満の値はゼロにセットした。
約５分後に実験的定常状態に到達し、その時ドナー側の入口Ｃでのメラガトランの濃度は約１８０ｎＭに達した（図２を参照されたい）。同時に、ドナー側の出口Ｂにおけるメラガトランの濃度は約５０ｎＭで横ばいになった。このことはドナー側でのメラガトランの濃度は約１３０ｎＭだけ低下したことを示唆した。
レシピエント側では、メラガトランの濃度は５分後に約１３０ｎＭでプラトーに増加し、この濃度はドナー側での低下に匹敵した。これらの発見は膜両側の逆平行の流れと一致した；この実験中に膜のレシピエント側に絶えず流入する新鮮な水は、初めにドナー側の出口末端の低濃度メラガトランに曝され、次に入口に向かって増大する濃度に曝された。結果として、膜を横切る拡散グラジエントは約５０ｎＭで、両側における端から端までの膜の長さにそったグラジエントは１３０ｎＭであった；該グラジエントは逆平行の流れのために、ドナー側では１８０から５０ｎＭに低下し、レシピエント側では１３０から０ｎＭに増大した。
実施例２
閉鎖系再循環におけるメラガトランのろ過‐透析シミュレーション
１５Ｌの食塩水およびマグネチックスターラを含むタンクにより液を再循環させるためにレシピエント側を閉鎖する以外は、実施例１に記載の方法と同様に実験を行った。実験は１２０分間継続し、予め決めた時点でサンプルを集めた。サンプル採取位置ＢおよびＣは先の実験と同様であった。しかし、この場合、サンプル採取位置Ａはタンク下流のレシピエント側のフィルター入口であった。
実施例１のように、ドナー側の透析液入口Ｃにおけるメラガトラン濃度は５分以内に約１８０ｎＭでプラトーに達し、実験中一定であった（図４を参照されたい）。
レシピエント側の濃度が低いとき、ドナー側の入口Ｃおよび出口Ｂの間のグラジエントは約１３０ｎＭであった。メラガトランがタンクに蓄積するにつれて、このグラジエントは指数的に減少した。約２時間後、系は平衡になり、このグラジエントは消失した；ドナー側の入口および出口は約１８０ｎＭの等しいメラガトラン濃度を示した。同時に、タンク内のメラガトラン濃度は増大し、ドナー側に比較していくらか遅延して１８０ｎＭで横ばいになった。このことは、メラガトランが透析膜を通過することを示唆した。
実施例３
ブタでの試験
本研究の目的は、腎臓機能を持たない麻酔したブタによる短期実験期間中、透析中に透析液により投与したメラガトランが凝固を防ぎ、フィルター機能を維持できるか否かを試験することであった。
【００２５】
もし観察されると本発明の方法の実用性に関して意味のある結論を引き出すことを妨げるであろう、非常に初期の血液経路およびフィルターの血栓性閉塞を避けるために、これらの実験での体外血液循環の開始直前にメラガトランのボーラス量を静脈内投与した。
材料と方法
それぞれ５９および５７ｋｇの２匹のＳｗｅｄｉｓｈ  Ｌａｎｄ  Ｒａｃｅブタを使用した。麻酔は、Ｋｅｔａｍｉｍｏｌ（登録商標）（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＤｏｒｍｉｃｕｍ（登録商標）（１〜２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して導入し、続いて、約２０分後にＤｉｐｒｉｖａｎ（登録商標）（８０〜１６０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を投与して、挿管し、Ｓｅｒｖｏ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ９００Ｃ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｅｌｅｍａ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、２〜３％Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ，Ｋｉｓｔａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む空気で１５回／分換気した。
【００２６】
血液ガスおよび血液ｐＨをモニター（ＡＢＬ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ６２５，Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）し、一回換気量の変化により正常範囲（ｐＨ７．３８〜７．４８；ｐＣＯ2１０〜１２ｋＰａ；ｐＯ2４．５〜５．８ｋＰａ）に調節した。リンゲル液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐｊｏｈｎＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を２０ｍＬ／ｋｇ／時間以上で耳静脈に注入し、液の消失を代償した。温度は外部暖房により３９℃に維持した。心電図（ＥＣＧ）はＶ３およびＶ５位に対応した針電極を使用してモニターした。
【００２７】
麻酔したブタに、外側側腹部アプローチを使用して腎動脈および静脈の両側結紮を行った。その後創傷をとじ、動物を仰向けに置いた。透析装置に連結するために、２本のカテーテル（Ｋｉｍａｌ，Ｋ４１／３Ｂ／ＬＬ，Ｕｘｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌｎｄ）を右大腿動脈および静脈に挿入した。動脈カテーテルは透析フィルターに血液を提供する（遠心性血液経路）ために使用し（遠心性血液経路）、静脈カテーテルは透析フィルターから血液を受け入れるために使用した（求心性血液経路）。一本のポリエチレンカテーテル（ＩｎｔｒａｍｅｄｉｃＰＥ‐２００，Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を動脈（ブタＡでは右伏在動脈およびブタＢでは上腕動脈）に挿入し、血圧（ＭＡＰ）記録（トランスデューサー  Ｐｅｔｅｒ  ｖｏｎ  Ｂｅｒｇ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｋｉｒｃｈｓｅｅｏｎ／Ｅｇｌｈａｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および血液サンプル、ｐＨおよび血液ガス測定を行った。
【００２８】
透析開始前に、Ｇａｍｂｒｏ  ＡＫ−１００（Ｇａｍｂｒｏ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）血液透析装置を使用して、１：３５に希釈したＢｉｏｓｏｌ  Ａ２０１．５グルコース（Ｐｈａｒｍａｌｉｎｋ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）透析濃縮物を１５分間、ＬｕｎＤｉａ  Ｐｒｏ  ６００  透析フィルター（Ｇａｍｂｒｏ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）の両側に注入した（図５を参照されたい）。透析濃縮物にはメラガトラン（３５μＭ；従って希釈後は１μＭになる）を補足した。流速は、別々のポンプを使用して、膜の透析液側では５００ｍＬ／分に、そして血液側では２５０ｍＬ／分に調節した。透析膜の両側で圧を測定した（トランスデューサー  Ｐｅｔｅｒ  ｖｏｎ  Ｂｅｒｇ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ）。
遠心性および求心性血液経路の連結の前に、フィルタークリアランスをモニターするために耳静脈にイオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（登録商標），Ｎｙｃｏｍｅｄ  ＡＢ，Ｌｉｄｉｎｇｏ，Ｓｗｅｄｅｎ）２０ｍＬ（３００ｍｇ／ｍＬ）を投与した。透析開始２分前に、ボーラスとして右伏在動脈からメラガトラン０．１５μｍｏｌ／ｋｇを投与した。
血液経路を連結し、メラガトランボーラス量を投与２分後に、透析を開始し、３時間行った。次に、方法を中断して血液経路を分離し、血液の代わりに食塩水を注入することによりフィルターおよび血液経路を洗浄し、血塊の存在を肉眼的にチェックした。
血流力学的変数を７Ｄ  Ｇｒａｓｓポリグラフ（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）でモニターし、オーダーメイドシステムＰｈａｒｍ‐Ｌａｂ５．０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａＲ＆Ｄ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）でサンプル採取した。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、エカリン（ｅｃａｒｉｎ）凝固時間（ＥＣＴ）および血漿中のメラガトラン量測定のために、特定の時点で１２アリコートの血液を、０．１３Ｍクエン酸ナトリウムを１容量含むプラスチックチューブに採取した。直ちに遠心（１０，０００ｇ、５分間）した後、血漿を回収し、分析前に−２０℃で保存した。血漿中のイオヘキソール量測定のために、血液をヘパリン処理した試験管に採取し、遠心（１０，０００ｇ、５分間）して、分析前に−２０℃で保存した。
血漿中のイオヘキソール量は液体クロマトグラフィーおよび質量分析法（ＢＡ−２８５，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａＲ＆Ｄ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して定量した。
クエン酸血漿３０μＬのＥＣＴは、勧告に従って、ＴＡＳ装置（血栓溶解評価系（Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ），Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）および適切な固体試薬試験カードを使用して測定した。
ＡＰＴＴはＫＣ１０  Ａ  ｍｉｃｒｏ  ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ（Ａｍｅｌｕｎｇ，Ｌｅｍａｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。クエン酸血漿２５μＬはＰＴＴ‐Ａｕｔｏｍａｔｅ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）２５μＬと３分間インキュベートした。凝固は０．０２５ＭＣａＣｌ2（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して開始し、凝固開始までにかかった時間を測定した。
血漿および透析液中のイオヘキソール量は、Ｒｅａｎａｌｙｚｅｒ  ＰＲＸ９０（Ｐｒｏｖａｌｉｄ  ＡＢ  Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（Ｓａｈｌｇｒｅｎ'ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）で測定した。
結果
２匹のブタにおいて、３時間の透析治療を首尾よく行った。一方のブタでは、遠心性血液経路の圧は約２７５ｍｍＨｇで安定し、他方のブタでは約２５０から３７５ｍｍＨｇへの小さな上昇が見られた。透析後、フィルターおよび管を食塩水で１５分間にわたり洗浄して血液を除き、処置中肉眼的に見られる血栓が形成されなかったことを示した。
【００２９】
イオヘキソールのクリアランスは、ろ過におけるどのような変化もモニターするために、透析期間中３０分毎に繰り返し測定した（図６を参照されたい）。イオヘキソールのクリアランスは２つの実験で約１５０ｍＬ／分であった。透析液中のイオヘキソールの量は、透析期間を通して３０分毎の血漿中濃度に比例した（それぞれｒ2＝０．９２５，ｐ＜０．００１およびｒ2＝０．９５２，ｐ＜０．００３）。このことはろ過機能が３時間の透析中完全に維持されていることを示した。
メラガトラン０．１５Ｍ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス投与２分後の透析開始時に、ブタ血漿（遠心性血液）中メラガトラン濃度は両方のブタで約０．９〜１μＭであった（図７を参照されたい）。この濃度は速やかに減衰し、透析の初めの３０分間をこえると、約０．２５μＭで横ばいになった。この後、血漿中濃度はだいたい一定であった。メラガトランｉ．ｖ．ボーラス投与後すぐの透析開始時に採取した本当に初めのサンプルを除いては、透析出口の濃度は血液側より約０．２μＭ高かった。希釈前の透析濃縮物中のメラガトラン濃度はそれぞれ３３．７および３４．９μＭであった。従って、透析出口での濃度は透析入口で予測された１μＭより明らかに低かった。このことは、これらの実験条件下では、急性の無尿症ブタにおける平衡状態が１時間以内に生じることを示唆する。
【００３０】
以前の研究（メラガトランをｓ．ｃ．投与した健常人で行った）のように、ＴＡＳ装置（図８を参照されたい）を使用したベッドサイドエカリン凝固時間（ＥＣＴ）はメラガトラン誘発トロンビン阻害の薬力学的測定尺度となり、血漿中の薬物濃度を密接に反映した。
【００３１】
ＥＣＴ時間とメラガトラン濃度との直線的関係とは対照的に、ＡＰＴＴ時間はメラガトラン濃度の対数に比例した。２匹のブタ間のＡＰＴＴ値のより大きい相対的差において、このことを示した（図９を参照されたい）。
結論
メラガトランは血液透析中の体外クロット形成を防ぐために有効である。透析液中に適切な濃度のメラガトランを提供することにより、全透析期間中、メラガトランが安定な抗血栓作用を示すレベルを得ることができる。このことは、本発明の新規方法の有効性を示す。明らかに、透析液によるメラガトランのような低分子量トロンビン阻害薬の投与は、全透析期間中有効な血漿中濃度を提供し、体外クロット形成を防ぎ、期間中最適なフィルター機能を維持する。
実施例４
患者での試験
透析液中の３種の異なる濃度のメラガトランによるオープンクロスオーバー試験を行う。腎不全のために長期血液透析治療を受けている６人の患者に、無作為な順番で治療を行う。比較のために、各患者に１期間、通常量のＬＭＷＨを皮下投与する。透析液中のメラガトラン濃度は、定常状態での患者の血漿中濃度が約０．２，０．３および０．４μＭになるように選択する。実施例３のブタでの試験から得られた結果を有効な濃度についての最終的な決定に使用する。
【００３２】
本試験は、透析液からろ過により血液透析患者へメラガトランを投与する可能性に関する予備的データ、および透析フィルターの凝固の予防におけるかかるデータを提供する。また、メラガトランの有効濃度に関する予備的データおよび確立されたＬＭＷＨ療法との比較も提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、血液透析シミュレーション実験（開放シングルパス系）の図式的描写であり、図中Ａ，ＢおよびＣは試料採取点である。
【図２】  図２は、入口Ｃ（白四角、実線）、ドナー側の出口Ｂ（黒丸、点線）、およびレシピエント側の出口Ａ（白丸、破線）における低分子量トロンビン阻害薬、メラガトラン濃度の時間に対するプロットを示す。線は指数関数に一致する。
【図３】  図３は、血液透析シミュレーション実験（閉鎖系再循環）の図式的描写であり、Ａ，ＢおよびＣは採取点である。
【図４】  図４は、入口Ｃ（白四角、実線）、ドナー側の出口Ｂ（黒丸、細かい破線）、およびレシピエント側の入口（ｉｎｌｅｔ）Ａ（白丸、破線）における低分子量トロンビン阻害薬、メラガトラン濃度の時間に対するプロットを示す。線は指数関数に一致する。
【図５】  図５は、ヒトでの血液透析装置の図式的描写を示し、実施例３のブタでの試験はこれを基にした。
【図６】  図６は、透析期間中の血漿中（上のグラフ）および透析液中（下のグラフ）のイオヘキソールのクリアランスの、時間に対するプロットを示す（ブタでの試験）。
【図７】  図７は、透析期間中の遠心性ブタ動脈血および透析液出口におけるメラガトラン濃度のプロットを示す（ブタでの試験）。
【図８】  図８は、メラガトラン誘発トロンビン阻害の程度を示す、透析期間中のＴＡＳ−ＥＣＴ時間のプロットを示す（ブタでの試験）。
【図９】  図９は、メラガトラン誘発トロンビン阻害の程度を示す、透析期間中のＡＰＴＴ時間のプロットを示す（ブタでの試験）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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