(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマー。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
配列表の配列番号３に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）から成る核酸から成る請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
配列表の配列番号４に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマー。
【請求項５】
配列表の配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、請求項４記載のプライマー。
【請求項６】
配列表の配列番号６に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）から成る核酸から成る請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のプライマーと、請求項４ないし６のいずれか１項に記載のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを調べることによりウナギ種を鑑定することから成るウナギ種の鑑定方法。
【請求項８】
増幅された前記ＤＮＡを制限酵素で消化し、消化により得られる制限断片長を調べることにより行う請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記制限酵素は、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩから成る群より選ばれる１又は２以上の制限酵素である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＨｉｎｆＩによる消化と、ＭｂｏIIとＲｓａＩとによる消化を行い、各消化により生じる制限断片長を調べる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項３記載のプライマーをフォワード側プライマーとして用い、請求項６記載のプライマーをリバース側プライマーとして用いて行う請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のプライマーと、請求項４ないし６のいずれか１項に記載のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡをＨｉｎｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断片長を調べることによりウナギがAnguilla japonicaか否かを鑑定する方法。
【請求項１３】
請求項３記載のプライマーをフォワード側プライマーとして用い、請求項６記載のプライマーをリバース側プライマーとして用いる請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウナギの種を鑑定するために用いられる核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種の鑑定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本産のウナギは、学名がAnguilla japonica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フランス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のあるA. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. australis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等がある。
【０００３】
養鰻業は、ウナギの稚魚（シラス）を養殖することにより行われている。シラスは市販のものを購入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入している場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖しても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外見上、区別がつかない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、外見上区別がつかないシラスの段階においてもウナギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定手段を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子増幅法を利用して、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定領域を増幅し、増幅された断片を調べることによりウナギの種を鑑定することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、第１の核酸プライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る、第２の核酸プライマーを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを調べることによりウナギ種を鑑定することから成るウナギ種の鑑定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡをＨｉｎｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断片長を調べることによりウナギがAnguilla japonicaか否かを鑑定する方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定の領域を遺伝子増幅法により増幅する。この増幅には、第１の核酸プライマーと第２の核酸プライマーが用いられる。
【０００８】
第１の核酸プライマーは、配列表の配列番号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号１に示される配列から成る核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。
【０００９】
第２の核酸プライマーは、配列表の配列番号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列又は該連続する１５塩基以上から成る塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列から成る核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよい。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号４に示される配列から成る核酸又はその相補鎖のいずれと同じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することができる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素部位を導入することも可能である。例えば、下記実施例で具体的に記載される第２の核酸プライマーであるＴＷ１１は、５’末端から２７番目のアデニンを意図的にシトシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を導入している。
【００１０】
なお、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要がある。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列から成るプライマーを用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号４に示される塩基配列と同一又は相同な配列から成る核酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配列番号１に示される配列と同一又は相同な配列から成る核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとしては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列から成るプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸鎖とその相補鎖は、バックボーンの５’→３’方向が逆になっており、一方、明細書における塩基配列は５’側を左側（上流側）に記載するように決められているから、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する場合、元の核酸鎖の下流側（３’側）と相補的な領域が上流側（５’側）に記載される。
【００１１】
本発明のウナギ種の鑑定方法では、上記第１及び第２のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて遺伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの一領域を増幅する。増幅される領域は、ウナギのミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子内の領域である。本発明の方法により増幅可能な、Anguilla japonica のミトコンドリアのチトクロムｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番号７に示す。また、各種ウナギの当該領域の塩基配列と、制限酵素部位を図１及び図２に示す。なお、図１及び図２中、A. japonica 以外のウナギの配列は、A. japonica と異なる部位のみ記載してある。また、制限酵素の切断部位が矢印で示されていないものは、japonica以外の種において制限酵素部位が存在するものである。図２は図１の続きである。
【００１２】
配列番号１に示される配列は、図１に示される第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。また、配列番号４に示される配列は、図２に示される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したものである。第１及び第２のプライマーを用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによって挟まれた領域が増幅される。
【００１３】
ウナギのシラスから、遺伝子増幅法の鋳型として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法をも採用することができる。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げることができる。第１法では、先ず、シラスを液体窒素で凍結し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。第２法では、シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。なお、試料はシラスに限定されるものではなく、成鰻や蒲焼き等、どのような成育段階のものや加工された食品であっても構わない。
【００１４】
遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこの分野において周知であり、それらのいずれをも用いることが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例にも、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
【００１５】
次いで、増幅されたＤＮＡを分析することにより、ウナギ種を鑑定する。図１及び図２に示すように、ウナギの種類により、増幅領域の塩基配列が異なっている。従って、例えば増幅領域の全塩基配列を決定することにより、ウナギ種を容易に同定することができる。あるいは、増幅領域中には制限酵素部位が含まれるので、いわゆる制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法により種の鑑定を行うことも可能である。さらに、日本産ウナギと外国産ウナギの区別を行うことも重要な鑑定業務であるが、例えば、１５６ｎｔや３７８ｎｔのようにjaponicaのみが他の外国産の種と異なる塩基を有している部位が存在するので、このような部位の塩基が何であるかを調べることによって日本産ウナギと外国産ウナギの識別が可能になる。これは、ミスマッチプローブ又はミスマッチプライマーを用いた公知の点突然変異検出法により行うことができる。
【００１６】
上記のうち、ＲＦＬＰ法は、簡便、迅速で、かつ、日本産と外国産の識別にも種の同定にも用いることができるので、好ましい方法である。以下、ＲＦＬＰ法についてさらに説明する。
【００１７】
図１及び図２に示されるように、増幅領域には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩの制限酵素部位が含まれるので、これらの制限酵素を用いてＲＦＬＰを行うことにより種の鑑定を行うことができる。また、下記実施例で用いられるプライマーＴＷ１１は、japonicaの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるように、上記の通り人為的に塩基を置換している。これらのうち、ＨｉｎｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔＩは、japonicaの切断部位のみが外国産ウナギの切断部位と異なっているので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれか一方を用いることにより、日本産と外国産との識別が可能である。また、(1)ＨｉｎｆＩと、(2)ＭｂｏIIとＲｓａＩとをそれぞれ別個に用い、それぞれにおいて得られる消化断片の大きさから種を同定することも可能である。例えば、下記実施例において用いられる、配列番号３で示される塩基配列から成る第１プライマー（ＴＷ６、配列番号７の１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイズ）と、配列番号６で示される第２プライマー（ＴＷ１１、配列番号７の３７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハイブリダイズ）とを用いて増幅を行った場合には、下記表１に示されるサイズの断片を指標として種の同定を行うことができる。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１からわかるように、ＨｉｎｆＩで消化した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるのは日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いることができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用いて調べ、外国産であることが判明した試料についてのみＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定することもできる。
【００２０】
なお、ＲＦＬＰ法自体はこの分野において周知であり、例えば消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫外線を照射して泳動バンドの位置を調べることにより、消化断片のサイズを調べることができる。また、ゲル電気泳動により消化産物のサイズを測定する場合、通常分子量マーカーが用いられるが、本発明の方法では、予想される泳動パターンが数種類しかないため、種のわかっているウナギのＤＮＡを上記のように増幅し、消化したものを分子量マーカーに代えて対照として用いることもできる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
１．ＤＮＡ試料の調製
各種ウナギのシラスを液体窒素で凍結後、別個に乳鉢を用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投入した。洗浄用バッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M NaCl 1.0 ml、蒸留水45.5 ml を混合して調製）０．５ｍｌを加え、すりつぶし、５分間遠心分離した。上澄み液をデカンテーションで捨て、ＳＴＥバッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M NaCl 1.0 ml、10% SDS 0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合して調製）０．５ｍｌとProteinase K溶液（10 mg/ml) ４０μｌを加え、５６℃で３０分間消化した。消化物をボルテックスミキサーで撹拌後、５分間遠心分離し、１００μｌの上清を取り、９８℃、１０分間加熱処理して酵素を失活させた。このうち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
【００２３】
２．  ＰＣＲ
市販のＰＣＲキット及び装置を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライマーとしては、上記したＴＷ６及びＴＷ１１を用いた。
【００２４】
蒸留水                          14.8μｌ
10xGA バッファー（Mg2+ 1.5 mM)   2.0μｌ
2.5 mM dNTP                      1.6μｌ
25μＭ  各プライマー             0.4μｌ
Taq ポリメラーゼ（5U/ μｌ）     0.2μｌ
ＤＮＡ                           1.0μｌ
【００２５】
ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、６０℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工程を３５サイクル行った。
【００２６】
３．  ＲＦＬＰ
各ＰＣＲ産物６μｌ、１０ｘバッファー１．５μｌ、各制限酵素０．７５μｌ及び蒸留水６．７５μｌから成る混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることにより消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％アガロースゲル電気泳動にかけた。
【００２７】
４．  結果
結果を図３ないし図５に示す。図３ないし図５より、ＨｉｎｆＩ又はＰｓｔＩで消化することにより、日本産か外国産かを識別することができることがわかる。また、ＭｂｏIIとＲｓａＩとで消化することにより、各種類に応じて種々のパターンが得られ、これらとＨｉｎｆＩ消化において得られる断片長の情報とを組み合わせることにより、８種のウナギ種の同定が可能であることがわかる。
【００２８】
実施例２
一尾のウナギシラスについて、制限酵素としてはＨｉｎｆＩ及びＰｓｔＩだけを用い、かつ、電気泳動では分子量マーカーを用いずにjaponicaのＤＮＡを同様に増幅、消化したものを対照として用いること以外は実施例１と同様な操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaと同じ位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaであることが鑑定できた。
【００２９】
実施例３
実施例２とは異なる一尾のウナギシラスについて、実施例２と同じ操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaとは異なる位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaではないことが鑑定できた。
【００３０】
実施例４
実施例３において、japonicaではないことがわかった試料の増幅産物を、実施例１と同様にＭｂｏIIとＲｓａＩで消化し、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。ただし、分子量マーカーは用いず、japonica、marmorata 及びanguillaのＤＮＡを同様に増幅し、消化したものを対照として用いた。その結果、試料の泳動パターンはjaponicaと同じであった。このため、試料はreinhardtiであることが同定できた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、外見的には区別できなかったシラス等を用いてウナギの種の鑑定を行うことが初めて可能になった。従って、本発明は、養鰻分野に大いに貢献するものと期待される。
【００３２】
【配列表】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により増幅される、各種ウナギのミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵素部位を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＨｉｎｆＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＰｓｔＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図５】本発明の実施例において得られた、各種ウナギについての、ＭｂｏII／ＲｓａＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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