(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルティエレラ（Mortierella）属SAM2197株（FERM BP-6261）微生物を培養開始時の炭素源濃度が４重量％以上の培地中で培養して、アラキドン酸又はこれを含有する脂質を生成せしめ、そしてアラキドン酸を採取することを特徴とするアラキドン酸の製造方法。
【請求項２】
モルティエレラ（Mortierella）属SAM2197株（FERM BP-6261）微生物を培養開始時の炭素源濃度が４重量％以上の培地中で培養して、アラキドン酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてアラキドン酸を含有する脂質を採取することを特徴とするアラキドン酸を含有する脂質の製造方法。
【請求項３】
培養開始時の炭素源濃度が８重量％以上である、請求項１又は２に記載のアラキドン酸又はこれを含有する脂質の製造方法。
【請求項４】
モルティエレラ（Mortierella）属SAM2197株（FERM BP-6261）。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、該微生物を用いた醗酵法によるアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸及びそれらを含有する脂質の製造方法並びに該微生物を含む動物用飼料に関する。
背景技術
アラキドン酸（５、８、１１、１４−エイコサテトラエン酸）や、ジホモ−γ−リノレン酸（８、１１、１４−エイコサトリエン酸）、エイコサペンタエン酸（５、８、１１、１４、１７−エイコサペンタエン酸）は、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン等のエイコサノイドの前駆体となり得るほか、その脂肪酸自身のもつ生理活性からも注目されている。例えばエイコサペンタエン酸は血栓防止作用あるいは脂質低下作用に基づいて健康食品や医薬品として市販されている。
またアラキドン酸は、近年、ドコサヘキサエン酸と同じく母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報告がある（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research」，Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-264）。さらに、胎児の身長や脳の発育における重要性が報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077（1993）, Lancet, 344, 1319-1322（1994））。
このようなアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸の製造方法としては、モルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を使用して、従来よりも高収率で得る方法が開発されている（特公平７−３４７５２、特開平６−１５３９７０、特開平８−２１４８９３、Chapter 4 in Industrial Applications of Single Cell Oil, ed. by D.J. Kyle and C. Ratledge, American Oil Chemists’Society, Illinois, 1992、ＷＯ９６／２１０３７、特公平７−２２５１３、特公平７−１２３１５、特開平１−２４３９９２）。
しかしながらここで使用されているモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物は、いずれも高グルコース濃度に対する耐性が低く、実際の通気攪拌培養での工業生産ではグルコースの濃度が２重量％〜４重量％となるようにグルコースの流加培養を実施しているのが現状であり、製造工程が煩雑になってしまうという問題点があった。また従来アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸に使用されているモルティエレラ（Mortierella ）属モルティエレラ亜属（Subgenus Mortierella）に属する微生物は、γ−リノレン酸の製造に用いられているモルティエレラ（Mortierella ）属マイクロムコール亜属（Subgenus Micoromucor）に属する微生物と比較して、明らかに菌の生育度（培地あたりの乾燥菌体重量）が低く、その結果、培地当たりで得られる高度不飽和脂肪酸を含有する脂質の生産量は低いものであった（例えば、モルティエレラ亜属に属するMortierella  alpinaの生育度が２２．５g/Lに対して、マイクロムコール亜属に属するMortierella  ramanniana  var. angulispora の生育度は７９g/Lに達している（Chapter 5, Chapter 7 in Industrial Applications of Single Cell Oil, ed. by D.J. Kyle and C. Ratledge, American Oil Chemists’Society, Illinois, 1992））。
モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物のアラキドン酸の生産性に関して、これまでに、例えば特開平６−１５３９７０の実施例では、初発グルコース濃度２％、培養７日間で４．０９g/Lのアラキドン酸が生産されることが、また特開平８−２１４８９３の実施例では、初発グルコース濃度４．３％、培養３日間で２．３g/Lのアラキドン酸が生産されることが、それぞれ開示されている。
炭素源の濃度を高めた培地用いた例としては、「Chapter 4 in Industrial Applications of Single Cell Oil, ed. by D.J. Kyle and C. Ratledge, American Oil Chemists’Society, Illinois, 1992」の実験結果では、初発デキストロース濃度９．８％、培養７日間で１．５g/L、初発デキストロース濃度９．８％、培養１６日間で９．１g/Lのアラキドン酸が生産されているが、初発デキストロース濃度が高いため特に菌の生育が悪く、培養７日目でのアラキドン酸生産量はわずか１．５g/Lと低く、生産量を確保するために培養日数を１６日間としている。
また、ＷＯ９６／２１０３７の実施例では、初発グルコース濃度１０%、培養８日間で５．３g/Lのアラキドン酸が生産されているが、高グルコース濃度に対する菌の生育阻害を抑制する目的で、pHコントロール、塩類添加などの手法を駆使しており、煩雑な操作が必要である。
このように、微生物を用いた醗酵法による物質の生産では、一般に生産性を高めようとする場合には微生物の生育量を増やすか、微生物当たりの生産量を増やすなどの方法が取られる。微生物生育のための栄養源となる炭素源の濃度を高めることは微生物の生育量を増やすことにつながり、出来るだけ高い炭素源の濃度での培養が好ましい。しかし一方で、炭素源の濃度を高くすることは、微生物の生育にとって浸透圧の関係で過酷な条件となり、炭素源の濃度を高くすることは微生物の生育を抑制することになってしまう。
前述の、初発のグルコース濃度を高めた場合には菌の生育が悪くなり７日間の培養ではアラキドン酸の生産量は１．５ｇ／Ｌ程度しか得られ例や、初発のグルコース濃度を高めるためにpHコントロールや塩類添加などを行って培地の調整を行っている例は、微生物を用いた醗酵法による物質生産の難しさを示している例と見ることもできる。
従って、高濃度の炭素源に対する耐性があり、初発のグルコース濃度を高めた培地中でも十分な生育度を有する微生物を見出し、これを用いてアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸を簡便な操作で効率良く、かつ大量に製造する方法を開発することが望まれていた。
発明の開示
従って本発明は、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を利用して、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸又はそれらを含有する脂質の効率的な製造方法、並びに高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物、及び該微生物を含有する動物用飼料を提供しようとするものである。
本発明者等は、上記の目的を達成するために種々研究した結果、高濃度の炭素源に対する耐性があり、培養開始時の炭素源濃度を高めた培地中でも菌の生育度が高く、その結果としてアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸又はそれらを含有する脂質の生産性が高まったモルティエレラ属に属する微生物を見いだし本発明を完成した。
より具体的には、pH制御、無機塩類添加などの煩雑な操作を駆使せず、炭素源としてグルコース、窒素源として酵母エキスなどを用いた単純な培地で、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸の生産に従来使用されているモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物（Mortierella alpina IFO 8568）では菌の生育度が低下する炭素源濃度である４重量％以上、より特徴的には、ほとんど菌の生育が認められない炭素源濃度である８重量％以上、さらには１１％以上であっても菌の生育度が高く、その結果としてアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸又はそれらを含有する脂質の生産性が高まったモルティエレラ属に属する新しい微生物を見いだし本発明を完成した。
従って本発明は、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を培養開始時の炭素源濃度が４重量％以上の培地中で培養して、アラキドン酸又はこれを含有する脂質を生成せしめ、そしてアラキドン酸又はこれを含有する脂質を採取することを特徴とするアラキドン酸又はこれを含有する脂質の製造方法を提供する。
即ち、本発明によれば、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、培養開始時の炭素源濃度が４重量％以上の培地中で培養することにより、８日間の培養で７ｇ／Ｌ以上のアラキドン酸を製造することが出来る。培養開始時の炭素源濃度をさらに高めるとともに培養中に炭素源を流加することによりアラキドン酸の生産性を更に向上させることが出来る。例えば、培養開始時の炭素源濃度を８重量％以上とすると約１０ｇ／Ｌ以上のアラキドン酸を製造でき、培養開始時の炭素源濃度を１１重量％以上とすることにより、約１４ｇ／Ｌ以上のアラキドン酸を製造できる。これは、これまで知られていたモルティエレラ属の微生物を用いたアラキドン酸の生産性５．３ｇ／Ｌ（WO96／21037）の約３倍の生産性である。
本発明はまた、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を、Δ５不飽和化酵素阻害剤を含有する培地中で培養して、ジホモ−γ−リノレン酸又はこれを含有する脂質を生成せしめ、そしてジホモ−γ−リノレン酸又はこれを含有する脂質を採取することを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸又はこれを含有する脂質の製造方法を提供する。
本発明はまた、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を、２０℃以下で培養して、エイコサペンタエン酸又はこれを含有する脂質を生成せしめ、そしてエイコサペンタエン酸又はこれを含有する脂質を採取することを特徴とするエイコサペンタエン酸又はこれを含有する脂質の製造方法を提供する。
本発明はまた、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を含んでなる動物用飼料を提供する。
本発明はまた、高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）を提供する。
発明の実施の形態
本発明で使用される高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物とは、モルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物であって、培養開始時の炭素源濃度が４％以上、好ましくは８％以上、より好ましくは１１％以上で、培養開始時の窒素源濃度が２％以上である液体培地を用いて通気撹拌培養により常法に従って培養を２〜１２日間、好ましくは５〜１２日間、より好ましくは５〜１０日間行ったとき、培地あたり、アラキドン酸を７ｇ／Ｌ以上生産できる能力を有する微生物である。
このような特徴を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を用いることによって、培養条件や培地への添加物によっては、アラキドン酸の他、ジホモ−γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸も従来より高収率で得ることができる。
なおモルティエレラ（Mortierella ）属には、モルティエレラ亜属（Subgenus Mortierella）とマイクロムコール亜属（Subgenus Micoromucor）があることが知られており、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸の製造にはモルティエレラ亜属（Subgenus Mortierella）に属する微生物が望ましい。
またモルティエレラ亜属（Subgenus Mortierella）には、アルピナ区（Section  Alpina ）、フィグロフィラ区（Section  Hygrophila ）、モルティエレラ区（Section Mortierella ）、シュマッカリ区（Section  Schmuckeri ）、シンプレックス区（Section  Simplex）、スピノサ区（Section  Spinosa）、スチロスポラ区（Section  Stylospora ）等があることが知られており、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸の製造にはアルピナ区（Section  Alpina ）に属する微生物が望ましい。
またアルピナ区（Section  Alpina ）にはアルピナ（alpina）種やアリアセア（alliacea）種等があることが、フィグロフィラ区（Section  Hygrophila ）にはエロンガタ（elongata）種やミヌティッシマ（minutissima ）種等があることが、モルティエレラ区（Section  Mortierella）にはポリセファラ（polycephala ）種等があることが、スチロスポラ区（Section  Stylospora ）にはバーティシラタ（verticillata）種等があることが知られている。
具体的な菌株としては、例えば本発明者らによって土壌から分離され、ブダペプト条約に基き工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、１９９７年３月３日に、菌株Mortierella sp.ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１号）として国際寄託された微生物を使用することができる。
Mortierella  sp.  ＳＡＭ２１９７株は下記の菌学的性質を有する。
培養性状（２５℃、５日間、暗黒下で培養）
ＬｃＡ培地（Glucose 1g, KH2PO4 1g,MgSO4・7H2O 0.2g, KCl 0.2g, NaNO3 2g, Yeast extract 0.2g, Agar 13g, Distilled Water 1,000ml, pH 6.5〜7.0）：
コロニーの直径は６５mm。コロニーは白色。わずかに気生菌糸を形成する。
コーンミール寒天培地（Difco社、カタログ番号：０３８６−０２−２）：
コロニーの直径は５０mm。ややバラの花弁状を呈する。コロニーは白色。わずかに気生菌糸を形成する。
形態学的特徴
気生菌糸から胞子のう柄を形成する。胞子のう柄は長さ６０〜１２０μｍ。胞子のう柄は分岐しない。胞子のう柄は基部から先端に向けて先細るが胞子のう直下の所でわずかに幅を増す。胞子のう柄基脚部はしばしば不規則な形態に膨大する。胞子のう柄の先端に無色の胞子のうが形成される。胞子のうが離脱した胞子のう柄の先端には明瞭なカラーが観察される。胞子のうは数個あるいは多数の胞子のう胞子を含む。
多数の胞子のう胞子を含む胞子のうは亜球形で、直径は約１５μｍ、胞子のう胞子は、単細胞で楕円形、無色、長さ３〜５μｍ、幅１．５〜２．５μｍ。数個の胞子のう胞子を含む胞子のうは不規則な形態をとる。楕円形、亜球形あるいは不規則な形態の壁の薄い厚膜胞子を形成する。
上記の結果から、ＳＡＭ２１９７株は、Mortierella属Mortierella亜属に属するものと同定された。
本発明の高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物は、以下に示す培養条件及び培養方法で培養することができる。
本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、クエン酸、コーンスターチ等の一般的に使用されているものがいずれも使用できるが、特にグルコース、フラクトース、マルトース、グリセロール、クエン酸、コーンスターチが好ましい。
窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源等の一般的に使用されているものを用いることができる。この他必要に応じて微量栄養源として用いる、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化マグネシウム、塩化カリウム等の無機塩及びビタミン等全て一般的に使用されているものがいずれも使用できる。
また本発明においては、培地中に目的とするアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸の基質を添加することにより、該高度不飽和脂肪酸の蓄積を促進することもできる。この基質として、例えば、ヘキサデカン若しくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸若しくはリノール酸のごとき脂肪酸又はその塩、例えばナトリウム塩若しくはカリウム塩、又は脂肪酸エステル、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル；又はオリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類を単独で、又は組み合わせて使用できる。しかし、これらに限られるものではない。基質の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよく、この場合には必要に応じてさらに添加量を増加させる。
上記の炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン及び／又は基質等の培地成分は、培養開始前の培地及び／又は培養中の培養液に添加することができる。これらの成分は一度に添加することもでき、又は連続的に、若しくは複数回に分けて経時的に添加することもできる。これらの培地成分は各々単独で、又は予め混合して添加することができる。これらの培地成分の内、無機塩類、ビタミン類及び／又は基質等の培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はなく、一般的に使用される範囲で用いればよい。
一方、炭素源は、培養開始時の培地中の炭素源濃度を４重量％以上、好ましくは８重量％以上、より好ましくは１１重量％以上とする。これによって培養操作の簡素化をはかることができるようになり、さらに培養中の培養液に添加する場合にも、炭素源を２重量％以上、好ましくは４重量％以上、より好ましくは６重量％以上の濃度で流加することが可能となることから、更に効率良く菌の増殖並びに目的とする高度不飽和脂肪酸の生産を行うことができる。
また窒素源の総添加量は、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の濃度とするのが良い。また培養開始時の培地中の窒素源濃度は２重量％以上とすることができ、また培養途中の培養液に窒素源を流加することもできる。
培養温度は５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けて目的とする高度不飽和脂肪酸を生産せしめる。このような温度管理により、生成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の比率を上昇せしめることができる。培地のpHも特に制御する必要はなく、通常用いるpHの範囲である４〜１０、好ましくは６〜９として通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。特に液体培地を用いた通気撹拌培養は、目的とする高度不飽和脂肪酸を効率よく製造するのに好ましい。培養は通常２〜１２日間、好ましくは５〜１２日間、より好ましくは５〜１０日間行う。
培養温度を培養開始時よりあるいは培養途中より２０℃以下にすることでエイコサペンタエン酸を産生することができる。また、エイコサペンタエン酸の前駆体であるα−リノレン酸あるいはα−リノレン酸を含有する脂質（例えば、亜麻仁油、シソ油など）を培地に添加すればエイコサペンタエン酸が効率的に産生されるし、培養温度を２０℃以下にすることで、さらに生産性が向上する。
固体培養で培養する場合は、固形物重量に対して５０〜１００重量％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好ましくは前記の温度において、３〜１４日間培養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無機塩類、微量栄養源を加えることができる。
またジホモ−γ−リノレン酸の生産量を増加せしめるためには、本発明の微生物をΔ５不飽和化酵素阻害剤の存在下で培養するのが好ましい。Δ５不飽和化酵素阻害剤としては、セサミン、セサミノール、エピセサミン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、２，６−ビス−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン又は２−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン等のリグナン類化合物；ピペロニルブトキサイド；クルクミン；胡麻油；落花生油；香辛性植物、例えばタラゴン（Tarragon）、イノンド種子（Dill Seed）、パセリ（Parsley）、ウコン（Turmeric）、ナツメグ（Nutmeg）等からの抽出物；五加皮の抽出物；桐木の抽出物；白果樹皮の抽出物；ヒハツの抽出物；細辛の抽出物；胡麻油、胡麻油製造過程の副産物（例えば胡麻種子の脱脂粕、胡麻油の脱臭スカム等）、胡麻種子等からの抽出物などを使用することができる。
なお、胡麻油、胡麻油製造過程の副産物（例えば胡麻種子の脱脂粕、胡麻油の脱臭スカム等）、胡麻種子等からの抽出物は、胡麻油とは実質的に非混和性であり且つΔ５不飽和化酵素阻害活性を有する成分を抽出・溶解することのできる種々の有機溶剤を用いて調製することができる。このような有機溶剤として、例えばアセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メタノール、エタノール等を挙げることができる。また溶媒抽出だけでなく水蒸気蒸留や分子蒸留等によって分離されたものも抽出物に含まれる。また上記香辛性植物からの抽出物は、常用の溶剤（例えばジクロロメタン、エタノール、メタノール、エチルエーテル等）を用いて調製することができる。
上記Δ５不飽和化酵素阻害剤の培地への添加量はおよそ次の通りである。胡麻油又は落花生油、あるいはこの両者の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。上記胡麻油、胡麻油製造過程の副産物（例えば胡麻種子の脱脂粕、胡麻油の脱臭スカム等）、胡麻種子等からの抽出物を添加する場合、その添加量は培地に対して３×１０-3〜３×１０-1重量％である。
また、セサミン、セサミノール、エピセサミン、エピセサミノール等のリグナン類化合物を添加する場合、その添加量（これらの２種類以上を組み合わせて使用する場合はその合計量）は、培地に対して１×１０-3〜１×１０1重量％である。これらの添加物類は生産微生物を接種する前又はその直後の培地に加えてもよく、又は培養を開始した直後の培地に加えてもよく、あるいは両時点で加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は複数回に分けて間欠的に添加してもよい。
このようにして培養して、菌体内にアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を大量に含有する脂質が生成蓄積される。
目的とする高度不飽和脂肪酸は、培養によって脂質を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、または培養終了後の培養液若しくはその殺菌した培養液、またはそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物から常法に従って得ることができる。液体培地を使用した場合には、培養菌体から、例えば、次のようにして目的とする高度不飽和脂肪酸の採取を行う。
培養終了後、培養液より遠心分離及び／又は濾過等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。該菌体は好ましくは、水洗、破砕、乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができ、好ましくはヘキサンを用いて抽出する。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃度の高度不飽和脂肪酸を含有した脂質が得られる。また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
上記のようにして得られた脂質中には、各種高度不飽和脂肪酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含まれている。これらを直接分離することもできるが、低級アルコールとのエステル、例えばジホモ-γ-リノレン酸メチル、アラキドン酸メチル、エイコサペンタエン酸メチル等として分離するのが好ましい。このようなエステルにすることにより、他の脂質成分から容易に分離することができ、また、培養中に生成する他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸等（これらも、高度不飽和脂肪酸のエステル化に際してエステル化される）から容易に分離することができる。例えば、高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを得るには、前記の抽出脂質を無水メタノール−塩酸５〜１０％、ＢＦ3−メタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜２４時間処理するのが好ましい。
前記の処理液から高度不飽和脂肪酸メチルエステルを回収するにはヘキサン、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するのが好ましい。次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより主として脂肪酸エステルからなる混合物が得られる。こうして得られる脂肪酸エステルの混合物には、目的とする高度不飽和脂肪酸メチルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル、γ-リノレン酸メチルエステル等の脂肪酸メチルエステルが含まれている。
これらの脂肪酸メチルエステル混合物から高度不飽和脂肪酸メチルエステル、すなわち本来の目的としてのジホモ-γ-リノレン酸メチルエステル、アラキドン酸メチルエステル、エイコサペンタエン酸メチルエステルを単離するには、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々向流分配クロマトグラフィー等を単独で、又は組み合わせて使用することができる。
こうして単離された各種高度不飽和脂肪酸メチルから高度不飽和脂肪酸を得るには、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。
また、高度不飽和脂肪酸をそのメチルエステルを経ないで採取するには、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、この分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法により抽出・精製することができる。
本発明の高濃度の炭素源に耐性を有するモルティエレラ（Mortierella ）属に属する微生物を培養することによって得られる脂質は、種々の動物用飼料又は食品などの製品に利用することができる。脂質を製品に利用するにあたっては、培養菌体から採取した脂質またはそれを精製して得られる脂質を使用することができるが、該脂質を菌体培養によって製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、または培養終了後の培養液若しくはその殺菌した培養液、またはそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物、または培養液もしくは菌体から該油脂を採取した後の該油脂を含有する残渣も使用することができる。
本発明は、本発明の微生物の菌体を配合した動物用飼料に関する。本発明の動物用飼料としては、ドッグフードやキャットフードなどのペットフード、鶏などの家禽のための飼料、豚や牛などの家畜のための飼料、養魚用飼料などが挙げられる。また、脂質を産生、蓄積した微生物の菌体は、脂質が菌体内に保護されているため酸化されにくく、また加熱殺菌にも安定であるため好ましく、培養菌体から脂質を採取した後の残渣も、本発明の脂質の他に蛋白質や灰分、炭水化物などを含んでいるため好ましい。なお動物用飼料は、本発明の微生物菌体のほか、他の原料と組み合わせて加工することもできる。
さらに、本発明の微生物の菌体及びそれから得られる脂質は動物用飼料添加物としても使用できる。
さらに、脂質を産生、蓄積した培養菌体または培養液を含んでなる微小餌料生物用餌料として用いることもできる。従来、魚貝類や甲殻類の養殖において、種苗（稚仔魚）生産には、微小餌料生物（シオミズツボワムシ、ブラインシュリンプなどの動物プランクトン）が用いられており、稚仔魚の養殖には先ずこれらの微小生物を養殖する必要がある。これらの微小生物を養殖する場合には、後にそれを餌料として摂取する稚仔魚の栄養要求性を考えて微小餌料生物に与える餌料が決められる。脂質を含有する培養菌体または培養液を微小餌料生物に与えることにより、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を含有し、稚仔魚の栄養要求性を満足できる微小餌料生物が得られる。
この他、上記の微小餌料生物を含有する魚介類用餌料とすることもできる。
本発明で得られる脂質は、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を強化した家禽卵の生産に利用すること、並びにアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を強化した卵黄油の製造に利用することもできる。アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を強化した家禽卵は、上述の動物飼料を採卵用家禽、特に鶏に与え飼育することによって産生される。また該家禽卵、特に卵黄から常法にしたがって油脂を抽出することによって、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を強化した卵黄油が得られる。またこの卵黄油を乳児用調製乳、未熟児用調製乳、幼児用食品、妊産婦用食品に添加することもできる。
脂質、好ましくはトリグリセリド油を含有する乳児用調製乳、未熟児用調製乳、幼児用食品、妊産婦用食品、老人用食品、栄養補助食品、健康食品等の食品に本発明で得られる脂質を利用することもできる。本発明の食品は、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸を補うことを目的とし、健康維持等に用いられる。その形態は、固形、あるいは液状の食品ないしは嗜好品のいずれであってもよい。
例えば油脂を含む食品として肉、魚、ナッツ等の油脂を含む天然食品、中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等を挙げることができるが、油脂を含む食品に限定しているわけではなく、例えばパン、めん類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐およびその加工品などの農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、味噌などの発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージなどの畜農食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺんなどの水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料等を挙げることができる。
食品に用いる場合には、所定量の脂質を、食品原料とともに配合し、一般の製造法により加工製造することができる。その配合量は剤形、食品の形態性状により異なるが、一般には食品全量に対して０．００１〜５０重量％が好ましいが特に限定されるものではない。
本発明で得られる脂質はまた、脂質を含有する機能性食品とすることもできる。機能性食品は、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸が有する生理活性機能を発揮することを目的とし、機能低下した状態を健康状態に戻し維持するための、あるいは機能低下を予防するための食品である。
形態としては散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、経腸栄養剤等の形態であっても、また例えば蛋白質（蛋白質源としてはアミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン等の蛋白質が最も広く使用されるが、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物等の他、アミノ酸単体の混合物も使用される）、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸が配合された自然流動食、半消化態栄養食および成分栄養食等の形態、あるいは前記飲食品の形態であってもよい。
機能性食品、栄養補助食品は、脂質を用いて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、経腸栄養剤等の形態を有する飲食品として製造することができる。この際、脂質とともにいずれの栄養成分あるいは機能性成分を配合してもよい。また医師の指示に基づく栄養士の管理下に、病院給食の調理の際に本発明で得られる脂質を加え、その場で調整した食事を、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及び／又はエイコサペンタエン酸の供給を必要としている患者に与えることもできる。
実施例
次に、実施例によりこの発明を具体的に説明する。
実施例１． 高濃度の炭素源に対する耐性の評価
（１）グルコース１％、酵母エキス０．５％、（２）グルコース２％、酵母エキス１％、（３）グルコース３％、酵母エキス１．５％、（４）グルコース４％、酵母エキス２％、（５）グルコース５％、酵母エキス２．５％、（６）グルコース８％、酵母エキス１．６％を含む培地（pH６．３）１０mlを５０mlエルレンマイヤーフラスコにそれぞれ入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）をCzapek寒天培地（０．２％NaNO3、０．１％K2HPO4、０．０５％MgSO4・H2O、０．０５％KCl、０．００１％FeSO4・7H2O、３％Sucrose、２％寒天、pH６．０）スラントに植菌し、胞子形成スラントを調製した。胞子形成スラントに滅菌水８mlを入れ、攪拌した後、胞子溶液を１００μl植菌した。
レシプロシェーカー（１１０rpm）により２８℃で６日間培養した。培養後、濾過により菌体を回収し、十分水洗した後、１０５℃で２時間乾燥させ、乾燥菌体重量を求め生育度（ｇ／Ｌ）を算出した。得られた乾燥菌体２０mgに塩化メチレン２ml、無水メタノール−塩酸（１０％）２mlを加え、５０℃で３時間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ml、水１mlを加えて、２回抽出し溶剤を遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。表１にその結果を示す。
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初発グルコース濃度を高める程生育度が向上しており、高濃度の炭素源に対し耐性を有していることがわかり、また初発グルコース濃度が４％以上での、アラキドン酸の生産性の向上が確認された。
実施例２． 初発グルコース濃度を高めた場合のアサキドン酸の生産量の評価
（１）グルコース６%、酵母エキス２%、大豆油０．２％及びアデカノール０．０１％を含む培地（pH  ６．３）（２）グルコース８%、酵母エキス２%、大豆油０．２％及びアデカノール０．０１％を含む培地（pH  ６．３）、（３）グルコース１１%、酵母エキス２%、大豆油０．２％及びアデカノール０．０１％を含む培地（pH６．３）５Lを１０Lジャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）の前培養液１００mlを植菌し、通気量１vvm、攪拌数３００rpm、培養温度２８℃で、８日間の通気攪拌培養を行った。
培養２日目、培養３日目、培養４日目に２．０％グルコースを添加した。培養終了後、実施例１と同様の操作により、培地１Ｌ当り（１）４２．３ｇ、（２）６０．５ｇ、（３）８３．１ｇの乾燥菌体を得た。実施例１と同様に、乾燥菌体２０mgから加水分解、メチルエステル化、及び抽出を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。アラキドン酸の全脂肪酸に対する割合（％）は（１）４０．７、（２）３９．４、（３）４１．７であり、アラキドン酸の生産量（培地あたりのアラキドン酸量）は（１）７．１ｇ／Ｌ、（２）９．８ｇ／Ｌ、（３）１４．３ｇ／Ｌであった。初発グルコース濃度を高める程アラキドン酸の生産量は向上し、初発グルコース濃度１１％では１４．３ｇ／Ｌにまで向上した。
実施例３． 実施例４および実施例５のためのコントロール
グルコース６％及び酵母エキス２％を含む培地（pH６．０）１００mlを５００mlエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１で用いたモルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）の胞子溶液１００μlを植菌し、レシプロシェーカー（１１０rpm）により２８℃で８日間振盪培養した。培養後、濾過により菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥し、乾燥菌体３１２０mgを得た。この菌体より、クロロホルム−メタノール−水の一相系の溶媒を用いるBligh & Dyeｒの抽出によって油脂を抽出し、６２４mgの油脂が得られた。
この油脂を無水メタノール−塩酸（１０％）を用いて５０℃にて３時間処理することによってメチルエステル化し、エーテルで抽出して、得られた脂肪酸メチルの組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果、パルミチン酸メチル１３．３％、ステアリン酸メチル６．１％、オレイン酸メチル１５．７％、リノール酸メチル７．２％、γ−リノレン酸メチル４．３％、ジホモ−γ−リノレン酸メチル４．７％、アラキドン酸メチル４２．１％であり、エイコサペンタエン酸は検出されなかった。これを培地当りの生産量に換算するとジホモ−γ−リノレン酸は０．２９ｇ／Ｌ、アラキドン酸は２．６３ｇ／Ｌであった。
この混合物脂肪酸メチルについて、さらにカラムクロマトグラフィーによって分離し、γ−リノレン酸メチル、ジホモ−γ−リノレン酸メチル、アラキドン酸メチル画分をそれぞれ分取し、ロータリーエバポレーターによって溶剤を留去した結果、精製されたγ−リノレン酸メチル、ジホモ−γ−リノレン酸メチル、アラキドン酸メチルをそれぞれ２４．１mg、２６．４mg、及び２３６．４mg得た。
実施例４． Δ５不飽和化酵素阻害剤添加によるジホモ−γ−リノレン酸の生産
グルコース６％及び酵母エキス２％及び胡麻油２％を含む培地（pH６．０）２mlを１０mlエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１で用いたモルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）の胞子溶液５０μlを植菌し、レシプロシェーカー（１５０rpm）により２８℃で８日間振盪培養した。培養終了後、実施例１と同様に濾過、水洗、乾燥、加水分解、メチルエステル化、及び抽出を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。その結果、培地あたり乾燥菌体が３１．２ｇ／Ｌ、ジホモ−γ−リノレン酸が１．４１ｇ／Ｌ、アラキドン酸が０．８７ｇ／Ｌの生産が認められた。この結果から明らかなように、Δ５不飽和化酵素阻害作用を有する胡麻油を培地に添加することにより、アラキドン酸の生産が押さえられ、ジホモ-γ-リノレン酸が大量に生産された。
実施例５． 低温培養によるエイコサペンタエン酸の生産
グルコース６％及び酵母エキス２％を含む培地（pH  ６．０）２mlを１０mlエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１で用いたモルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１）の胞子溶液５０μlを植菌し、レシプロシェーカー（１５０rpm）により２８℃で２日間振盪培養した後、培養温度を１２℃に下げさらに６日間培養した、培養終了後、実施例１と同様に濾過、水洗、乾燥、加水分解、メチルエステル化、及び抽出を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。
その結果、パルミチン酸メチル１１．７％、ステアリン酸メチル５．８％、オレイン酸メチル１２．１％、リノール酸メチル６．４％、γ−リノレン酸メチル４．７％、ジホモ−γ−リノレン酸メチル４．９％、アラキドン酸メチル３８．１％、エイコサペンタエン酸メチル６．１％であり、エイコサペンタエン酸が低温培養により生産できることが確かめられた。
ＰＣＴ規則第１３規則の２に規定する寄託された微生物への言及及び国際寄託当局
国際寄託当局
名  称    工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名    日本国３０５，茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託された微生物
名  称    Mortierella sp. ＳＡＭ２１９７
寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６１
寄託日    １９９７年３月３日