(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうち、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生がほぼ同時期に出現するがこれら以外の種の幼生は出現しない海域の海水表層において採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生が、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のいずれであるかを判別する方法であって、
完全個体の状態にあるズワイガニ(C. opilio) の幼生を認識しかつ完全個体の状態にあるベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生を認識しないモノまたはポリクローナル抗体を用いて、採取した完全個体の状態にある検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と反応させると共に、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に結合反応が起こっているかどうかを免疫組織染色法または蛍光抗体法により確認すること、そしてその確認の結果、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていることが判明したとき（つまり陽性であるとき）はその幼生はズワイガニ(C. opilio) の幼生であると判定し、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていないことが判明したとき（つまり陰性であるとき）はその幼生はベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生であると判定すること、
ここで、前記のモノクローナル抗体は、免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の脾臓からＢ細胞を含んだ細胞懸濁液を採取し、そのＢ細胞とミエローマ細胞とをミエローマ細胞用培地に懸濁させて両細胞を融合させることによりハイブリドーマを得ると共に培養し、選択培地を用いてハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ、さらにズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行うことによりズワイガニ(C. opilio) の幼生に対するモノクローナル抗体を得、これをクローン化して目的とするハイブリドーマを得、このハイブリドーマをin viro またはin vivo で培養すること、により製造したものであること、
前記のポリクローナル抗体は、
（イ）免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の採血を行って抗血清を得ること、
（ロ）さらに、そのようにして得た抗血清とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体とを混合して反応させることにより、ズワイガニ(C. opilio) の幼生の体表面とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の体表面とに共通して存在する抗原に結合する抗体を前記の抗血清から除去して、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のうち前者のズワイガニ(C. opilio) の幼生のみに特異的に結合する抗体である抗ズワイガニ幼生ポリクローナル抗体を作製すること、
により製造したものであること、
を特徴とする、ズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうちのズワイガニ(C. opilio) の幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生とを判別する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、海水中に浮遊する甲殻類幼生であるズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうちのズワイガニ(C. opilio) の幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生とを判別する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
日本海の代表的な重要水産資源生物となっているズワイガニ(C. opilio) は、昭和４０年代を境にその漁獲高が減少の一途を辿っている。これは、底引き網漁法による過剰な漁獲が原因となって、生息海域の個体数が減少してきたためであると考えられる。数値をあげてもう少し説明すると、ズワイガニ(C. opilio) の漁獲量は、１９８５年の３５００トン強から減少を続け、１９９２年には１９５０トンを切り、その後はやや回復して２７００〜２９００トン台で推移していると報告されている。
【０００３】
ベニズワイガニ(C. japonicus)も主に日本海で漁獲されているが、日本海におけるベニズワイガニ(C. japonicus)の漁獲量は、１９８３〜１９８４年に５３０００トンのピークに達したものの、それ以降は減少し、１９９１年以降には２２０００〜２８０００トン台で推移していると報告されている。
【０００４】
ズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)の資源量は、採集器具による漁獲結果から推定されているが、より迅速な生育状態に関する情報が必要である。このような観点から、曳航式深海用ビデオカメラを用いてズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)の漁場における分布を直接に計測する実験についての報告もなされている。
【０００５】
上記の方法はすでに成長したズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)の成体を追跡するものであるが、本出願人は、資源管理としては、幼生の段階でのズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)に着目して資源量の予測を行うことの方がより重要であると考えている。このときには、海水中に浮遊している甲殻類幼生を採取して、ズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生（殊に商品価値の高いズワイガニ(C. opilio) の幼生）の同定および定量を行うことになる。
【０００６】
海水中に浮遊する甲殻類幼生がズワイガニ(C. opilio) 幼生であるかベニズワイガニ(C. japonicus)幼生であるかどうかを判別する方法については、現在のところ、そのような検討自体がなされていないものと信じられる。もし幼生の段階で判別しようとすれば、その方法としては、たとえば、（イ）甲殻類の幼生の外部形態を観察して判別する方法、（ロ）甲殻類の幼生をＤＮＡ分析により判別する方法、が考えられる。なお、前者の（イ）の判別方法については、「日本水産学会誌、Vol. 42, No. 5, p. 533-542」に報告があることが判明した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、海洋生物資源として重要な生物であるズワイガニ(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)（殊にズワイガニ(C. opilio) ）の乱獲による資源量の減少が懸念されている状況下においては、これらの資源量推定、産卵場の推定および保護海域の設定のため、ズワイガニ(C. opilio) 幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)幼生の識別判定技術を確立することが必要となるであろう。
【０００８】
甲殻類を幼生の段階で判別する方法のうち、上記（イ）の外部形態を観察して判別する方法については、ズワイガニ(C. opilio) 幼生は、ズワイガニ(C. opilio) と比べて商品価値が劣るベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生と非常に類似した形態を有しているため、両種の識別を光学あるいは電子顕微鏡を用いて形態に基いて行うことは極めて困難である。しかも、両種は生息域が重複している上、産卵時期および孵化時期もほぼ同時期にあたるため、両種が混在する野外サンプルからズワイガニ(C. opilio) 幼生のみを識別する方法が必要であるが、そのような識別を可能にする方法は難しいと言わざるをえない。
【０００９】
甲殻類を幼生の段階で判別する方法のうち、上記（ロ）のＤＮＡ分析による種の識別については、識別自体は可能であると思われるが、
・ＤＮＡ分析にあたっては、１個体ずつ検体をすり潰し、別々に塩基配列や電気泳動を分析する必要があるため、分析に多大の時間と高価な分析装置を要すること、
・上記のように個々の検体をすり潰して破壊するため、成長段階、大きさなどの付帯情報の入手が困難となること、
・保存のためにホルマリン固定した試料では、時間と共にＤＮＡが分解されるため、長期保存が困難であること、つまり、長く保存したサンプルの分析が困難となること、
などの問題点がある。そのため、ＤＮＡ分析による種の識別法は、たとえ可能であっても、実用的な手法とは言いがたい。
【００１０】
本発明は、このような背景下において、海水中に浮遊する甲殻類幼生であるズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうちのズワイガニ(C. opilio) の幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生とを、簡便、迅速、正確、客観的に、しかも完全個体の状態で（破壊しないで）判別し、かつホルマリン等で固定した後でも判別することのできる方法を提供すること、を目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の判別方法（ズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうちのズワイガニ(C. opilio) の幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生とを判別する方法）は、
ズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうち、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生がほぼ同時期に出現するがこれら以外の種の幼生は出現しない海域の海水表層において採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生が、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のいずれであるかを判別する方法であって、
完全個体の状態にあるズワイガニ(C. opilio) の幼生を認識しかつ完全個体の状態にあるベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生を認識しないモノまたはポリクローナル抗体を用いて、採取した完全個体の状態にある検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と反応させると共に、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に結合反応が起こっているかどうかを免疫組織染色法または蛍光抗体法により確認すること、そしてその確認の結果、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていることが判明したとき（つまり陽性であるとき）はその幼生はズワイガニ(C. opilio) の幼生であると判定し、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていないことが判明したとき（つまり陰性であるとき）はその幼生はベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生であると判定すること、
ここで、前記のモノクローナル抗体は、免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の脾臓からＢ細胞を含んだ細胞懸濁液を採取し、そのＢ細胞とミエローマ細胞とをミエローマ細胞用培地に懸濁させて両細胞を融合させることによりハイブリドーマを得ると共に培養し、選択培地を用いてハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ、さらにズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行うことによりズワイガニ(C. opilio) の幼生に対するモノクローナル抗体を得、これをクローン化して目的とするハイブリドーマを得、このハイブリドーマをin viro またはin vivo で培養すること、により製造したものであること、
前記のポリクローナル抗体は、
（イ）免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の採血を行って抗血清を得ること、
（ロ）さらに、そのようにして得た抗血清とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体とを混合して反応させることにより、ズワイガニ(C. opilio) の幼生の体表面とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の体表面とに共通して存在する抗原に結合する抗体を前記の抗血清から除去して、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のうち前者のズワイガニ(C. opilio) の幼生のみに特異的に結合する抗体である抗ズワイガニ幼生ポリクローナル抗体を作製すること、
により製造したものであること、
を特徴とするものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１３】
《判別の対象物と判別の目的》
ズワイガニ属(Chionoecetes)には、ズワイガニ(Chionoecetes opilio) 、ベニズワイガニ(Chionoecetes japonicus)、オオズワイガニ(Chionoecetes bairdi) 、トゲズワイガニ(Chionoecetes angulatus)、和名のないChionoecetes tanneriの５種がある（「続“越前がにの世界、その生活史と生態”、福井県発行、発行日：１９９８年３月３０日」を参照）。ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生は、他の属の甲殻類幼生とは大きさや形態が相違しているので、甲殻類幼生がズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生であるか他の属の幼生であるかは、容易に識別できる。
【００１４】
そして、ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生に関しては、ズワイガニ(C. opilio) 幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)幼生との鑑別が必要な海域ではそれら以外の種の幼生は出現しないので（オオズワイガニはベーリング海、トゲズワイガニはベーリング海、Chionoecetes tanneriはカナダの太平洋側）、採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生が、「ズワイガニ(C. opilio) またはベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生」であるか、「それら以外のズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生」であるかについても、特に問題は生じない。問題を生ずるのは、ズワイガニ(C. opilio) 幼生やベニズワイガニ(C. japonicus)幼生が出現する日本海のような海域で採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生が、「ズワイガニ(C. opilio) 幼生」であるか、「ベニズワイガニ(C. japonicus)幼生」であるかの点にある。
【００１５】
さて、ズワイガニ(C. opilio) 幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)幼生とは、海水の表層部分にしかも同時期に出現する上（成体の棲息深さは相違するが）、非常に類似した形態を有しているため、形態だけでこれらの幼生の種を識別することは困難である。これらの幼生に関しては、卵から孵化した段階のものをプレゾエア、孵化後４０〜６０分で脱皮した幼生を第Ｉ期ゾエア、さらに２０〜３０日後に脱皮した幼生を第II期ゾエア、さらに２０〜３０日後に脱皮した幼生をメガロッパ、さらに２０〜３０日後に脱皮したものを稚ガニと呼ぶ。つまり、孵化してから稚ガニになるまでのプランクトンとしての生活期間は３ケ月以内であると考えられている。なお、成体の漁期は、県によっても異なるが、１１月〜３月である。
【００１６】
本発明において判別の対象に供するものは、ズワイガニ属(Chionoecetes)に属する種のうち、ズワイガニ幼生(C. opilio) およびベニズワイガニ(C. japonicus)幼生がほぼ同時期に出現するがこれら以外の種の幼生は出現しない海域の海水表層において採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生の個体であり、判別の目的は、そのズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生がズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のいずれであるかを判別することにある。
【００１７】
《判別、判定の方法》
本発明においては、完全個体の状態にあるズワイガニ(C. opilio) の幼生を認識しかつ完全個体の状態にあるベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生を認識しないモノまたはポリクローナル抗体を用いて、採取した完全個体の状態にある検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と反応させると共に、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に結合反応が起こっているかどうかを免疫組織染色法または蛍光抗体法により確認する。判別に用いるモノまたはポリクローナル抗体については、後述する。
【００１８】
そしてその確認の結果、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていることが判明したとき（つまり陽性であるとき）はその幼生はズワイガニ(C. opilio) の幼生であると判定し、その検体ズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生と前記抗体との間に前記の結合反応が起こっていないことが判明したとき（つまり陰性であるとき）はその幼生はベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生であると判定する。
【００１９】
《ポリクローナル抗体の作製》
上記のズワイガニ(C. opilio) 幼生のポリクローナル抗体は、
（イ）免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の採血を行って抗血清を得ること、
（ロ）さらに、そのようにして得た抗血清とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体とを混合して反応させることにより、ズワイガニ(C. opilio) の幼生の体表面とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の体表面とに共通して存在する抗原に結合する抗体を前記の抗血清から除去して、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のうち前者のズワイガニ(C. opilio) の幼生のみに特異的に結合する抗体である抗ズワイガニ幼生ポリクローナル抗体を作製すること、
により製造される。以下、さらに詳細に説明する。
【００２０】
〈免疫工程〉
マウス、ラットなどの哺乳動物を、予め種の知られているズワイガニ(C. opilio) 幼生の完全個体そのものを抗原として用いて免疫する。ホルマリン固定された幼生の場合は、予め生理食塩水で洗浄してホルマリンを除去する。投与手段としては、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射などが採用され、場合により皮内注射も採用される。最終免疫後３〜１０日目に哺乳動物の採血を行い、抗血清（ポリクローナル抗体）を得る。
【００２１】
〈抗体の作製〉
そして、上記のように免疫源であるズワイガニ(C. opilio) 幼生個体を用いて抗血清を得た後、その抗血清とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体とを混合して反応させることにより、ズワイガニ(C. opilio) の幼生の体表面とベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の体表面とに共通して存在する抗原に結合する抗体を前記の抗血清から除去する。これにより、ズワイガニ(C. opilio) の幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生のうち前者のズワイガニ(C. opilio) の幼生のみに特異的に結合する抗体である抗ズワイガニ幼生ポリクローナル抗体が得られる。
【００２２】
《モノクローナル抗体の作製》
上記のズワイガニ(C. opilio) 幼生のモノクローナル抗体は、以下に述べるＢ細胞調製工程、細胞融合工程、スクリーニング工程、クローニング工程、ハイブリドーマ培養工程、さらに必要に応じて分離精製工程の各工程を順に実施することにより得られる。すなわち、免疫源であるズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体を抗原として用いて哺乳動物を免疫した後、その哺乳動物の脾臓からＢ細胞を含んだ細胞懸濁液を採取し、そのＢ細胞とミエローマ細胞とをミエローマ細胞用培地に懸濁させて両細胞を融合させることによりハイブリドーマを得ると共に培養し、選択培地を用いてハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ、さらにズワイガニ(C. opilio) の幼生の完全個体およびベニズワイガニ(C. japonicus)の幼生の完全個体を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行うことによりズワイガニ(C. opilio) の幼生に対するモノクローナル抗体を得、これをクローン化して目的とするハイブリドーマを得、このハイブリドーマをin viro またはin vivo で培養すること、により製造される。以下、さらに詳細に説明する。
【００２３】
〈Ｂ細胞調製工程〉
マウス、ラットなどの哺乳動物を、予め種の知られているズワイガニ(C. opilio) 幼生を抗原として用いて免疫する。ホルマリン固定された幼生の場合は、予め生理食塩水で洗浄してホルマリンを除去する。投与手段としては、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射などが採用され、場合により皮内注射も採用される。最終免疫後３〜１０日目に、哺乳動物の脾臓からＢ細胞を含んだ細胞懸濁液を採取する。
【００２４】
〈細胞融合工程〉
前工程で採取したＢ細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とをそれぞれ公知のミエローマ細胞用培地に懸濁する。ついで両者を混合し、適当な融合促進剤の存在下に融合させる。Ｂ細胞とミエローマ細胞の混合比は、１：１〜２０：１とすることが多いが、必ずしもこの範囲内に限られない。細胞融合促進剤としては、たとえば分子量１０００〜７５００のポリエチレングリコールが用いられる。
【００２５】
ここでミエローマ細胞としては、上述のＢ細胞調製工程で用いた被免疫動物と同種の動物由来のもので、かつハイブリドーマ選択培地で生育できず、しかもそれ自身が抗体を分泌しないものを用いることが好ましい。このようなミエローマ細胞はすでに市販されているので（たとえばマウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-653 など）、これを用いるのが簡便である。
【００２６】
Ｂ細胞とミエローマ細胞との細胞融合はランダムに起きるので、目的のハイブリドーマを選別する必要がある。そこで上記操作の後、融合促進剤を洗浄除去し、ミエローマ細胞用培地に懸濁したハイブリドーマの 0.1〜 0.5mlずつをたとえば９６ウェルプレートに撒き、培養する。培養中、ＨＡＴ培地などの公知の選択培地を添加し、その割合を徐々に高める。最終的には同様にして、さらに選択培地をハイブリドーマ培地と交換する。このような培地交換により、ハイブリドーマ以外の細胞は死滅する。
【００２７】
〈スクリーニング工程、クローニング工程〉
ハイブリドーマのスクリーニングは、培養液中の抗体のズワイガニ(C. opilio) 幼生またはベニズワイガニ(C. japonicus)幼生との反応性を調べることにより行うことができる。
【００２８】
反応性の確認は、免疫組織染色法または蛍光抗体法による。免疫組織染色法は、後に実施例の個所で具体例を述べる。蛍光抗体法によるときは、培養液の一部をズワイガニ(C.opilio) 幼生またはベニズワイガニ(C. japonicus)幼生に加えてインキュベートし、洗浄し、ついで蛍光ラベルを付した二次抗体を加えてインキュベートしたものを、蛍光顕微鏡にて検鏡することにより判断する。
【００２９】
これにより、ズワイガニ(C. opilio) 幼生に対するモノクローナル抗体を産生する複数種のハイブリドーマを同時にスクリーニングすることができる。
【００３０】
スクリーニングしたハイブリドーマは、限界希釈法によりクローン化する。これにより、目的とするハイブリドーマが作製できる。
【００３１】
〈ハイブリドーマ培養工程〉
前工程で作製したハイブリドーマを in vitro または in vivoで培養すれば、目的のモノクローナル抗体を生産することができる。
【００３２】
in vitroでの培養は、たとえば、数個のハイブリドーマの９６ウェルプレートでの培養からはじめ、しだいに培養規模を上げることにより行うことができ、これにより培養液中にモノクローナル抗体が分泌、蓄積される。
【００３３】
また、in vivo での培養は、予めプリスタン（2, 6, 10, 14−テトラメチルペンタデカン）処理したＢＡＬＢ／ｃマウスまたはヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種することにより実施でき、これにより１０〜２０日後にはモノクローナル抗体を含む腹水が蓄積される。
【００３４】
〈分離精製工程〉
培養物または腹水からのモノクローナル抗体の分離精製は、通常の物理化学的手段によって行うことができるが、分離精製を省略して培養物または腹水のままであるいはそれを適当に希釈して用いることもでき、また簡単な分離精製により得た粗モノクローナル抗体を用いることもできる。
【００３５】
《作用》
上記のモノまたはポリクローナル抗体を含む培養液、腹水または血清をズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生（ズワイガニ(C. opilio) 幼生またはベニズワイガニ(C. japonicus)幼生）に加えてインキュベートし、さらに試薬を加えて免疫組織染色法または蛍光抗体法にて確認することにより、そのズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生がモノまたはポリクローナル抗体に反応するかどうか（幼生と抗体との間に結合反応が起こっているかどうか）が正確に判定される。すなわち、採取したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生が陽性であるとき（幼生と抗体との間に結合反応が起こっていることが判明したとき）はその幼生はズワイガニ(C. opilio) 幼生であると判定でき、一方陰性であるとき（幼生と抗体との間に結合反応が起こっていないことが判明したとき）はその幼生はベニズワイガニ(C. japonicus)幼生であると判定できる。
【００３６】
この場合、ホルマリン固定したズワイガニ属(Chionoecetes)の幼生試料を用いても、種の判別が可能である。特に免疫組織染色法を採用するときは、経時的変化のない比較対照用の標本を作製しておくことができるので有利である。
【００３７】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明をさらに説明する。以下においては、幼生と抗体との間に結合反応が起こっていることが確認された場合を「陽性」とし、そうでない場合を「陰性」とした。
【００３８】
実施例１
《ズワイガニ属の幼生サンプルの採取と固定》
日本栽培漁業協会小浜事業所において１９９９年（平成１１年）３月１０日に孵化し、ゾエアＩ期に変態したズワイガニ第Ｉ期ゾエア幼生と、富山水産試験場において２０００年（平成１２年）２月１４日に孵化し、ゾエアＩ期に変態したベニズワイガニ第Ｉ期ゾエア幼生とを使用した。いずれも、採取直後に直ちに５重量％濃度のホルマリン水溶液で固定し、保存したものをサンプルとした。
【００３９】
《ポリクローナル抗体の作製》
（抗ズワイガニ血清の調製）
免疫原であるズワイガニ幼生２００個体を0.25mlのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに等量のコンプリートアジュバント（半井化学株式会社製）を混合し、乳化させた。
【００４０】
本実験では、実験動物として４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）（静岡実験動物協同組合）を用い、作製した乳化物を２週間ごとにマウスの皮下に 0.5ml／個体の割合で投与した。２ケ月間かけて計４回免疫を行った後、尾部より採血を行った。マウス血液は１０００rpm で１０分間遠心分離を行った。これにより、抗血清を得た（「ＰＺ−１」と名付けた）。
【００４１】
（免疫染色キットを用いたズワイガニ幼生に対する抗血清の反応）
市販の免疫染色キットを用い、マウス抗血清の反応特異性およびネガティブコントロールへの非特異的反応の有無を調べ、本キットの反応条件がズワイガニ幼生の免疫染色に適するかどうかを検討した。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
抗血清ＰＺ−１の反応性                    
反応性#  
幼  生        ＰＺ−１##  マウス正常血清
ズワイガニ            ＋            ＋
ベニズワイガニ        ＋            ＋      
#   ＋：陽性、−：陰性
##  １００倍に希釈して使用
【００４３】
その結果、ネガティブコントロールとしてマウス正常血清を用いたズワイガニ幼生に非特異的反応が観察されたので、本キットの反応条件はズワイガニ幼生の免疫染色には適さないことが明らかとなった。
【００４４】
そこで、このような非特異的反応を抑制するために、ブロッキング溶液および洗浄液の検討を行い、ズワイガニ幼生の免疫染色における最適条件を検討した。さらに、陽性であることを示す茶褐色の呈色はズワイガニ幼生やベニズワイガニ幼生の体色と同色であり、陽性かどうかの判定を困難にしている。そのため、発色溶液についても検討を行い、ズワイガニ幼生を特異的に識別可能な免疫染色法の確立を試みた。
【００４５】
（ブロッキングの検討）
ブロッキング剤として、今回キット付属のウマ正常血清とブロックエース（雪印乳業株式会社製）を用い、免疫染色の前段階において、 0.5、１、２、３、４％の濃度段階で、４℃、overnight の条件にて、幼生にブロッキング処理を施した。さらに、ブロッキングの効果を高めるために、ブロッキング操作と同濃度のウマ正常血清およびブロックエースを用いて、抗体やアビジン−ビオチン化酵素複合体を希釈して用いた。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
免疫染色におけるブロッキング剤の検討#  
ブロッキング剤            非特異的反応## 
の濃度（％）      ブロックエース  ウマ正常血清
0                 ＋              ＋
0.5               ＋              ＋
1.0               ＋              ＋
2.0               ＋              ＋
3.0               ＋              ＋
4.0               ±              ＋    
#   一次抗体としてマウス正常血清を使用し、ネガ
ティングコントロールへの非特異的反応を抑制す
るための検討
##  発色の濃さで判断
＋：非特異的反応、−：弱い非特異的反応
【００４７】
最適のブロッキング溶液、種類、そして濃度について検討を行った結果、本操作のみでは完全に非特異的反応を抑制することは不可能であった。しかしながら、４％のブロックエースを用いた場合にのみ、非特異的反応による発色が若干抑制されたため、以降の検討においては、これをカニ幼生のブロッキングに用いた。
【００４８】
（洗浄液の検討）
洗浄液の検討では、ＤＡＢ−過酸化水素混合溶液の添加による発色操作の直前の洗浄時に、洗浄液として 0, 0.025, 0.05 ％(v/v) のTween20 を含む蒸留水を用いて洗浄し、その後の発色を観察した。結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
洗浄液にTween20 を添加することによる非特異的反応の抑制#  
反応性## 
添加濃度            ＰＺ−１           マウス正常血清    
（％）    ズワイガニ  ベニズワイ    ズワイガニ  ベニズワイ
幼生        ガニ幼生      幼生        ガニ幼生  
0             ＋          ＋            ±          ±
0.025         ＋          ＋            −          −
0.050         ＋          ＋            −          −    
#   一次抗体として１００倍希釈ＰＺ−１を使用
##  発色の濃さで判断  ＋：非特異的反応、−：弱い非特異的反応
【００５０】
発色操作直前における洗浄液について検討した結果、ベニズワイガニ幼生に観察された非特異的反応は、 0.025％および0.05％のTween20 を添加した洗蒸留水で完全に抑制されることが明らかになった。
【００５１】
（発色法の検討）
発色液であるＤＡＢ−過酸化水素にNiCl2 を加えた場合、発色は青色を呈する。そこで、0.08, 0.16, 0.32％(w/v) のNiCl2 を添加した発色液を用いて、陽性と陰性との明確な区別ができるかを検討した。
【００５２】
カニ幼生の体色が茶褐色であるため、観察による陽性の判定が難しいことがある。そこで、NiCl2 を添加した発色液の検討を行った。結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
発色液にNiCl2 を添加することによる免疫染色の明瞭さの検討  
反応性#  
ＮｉＣｌ2         ＰＺ−１           マウス正常血清    
（％）    ズワイガニ  ベニズワイ    ズワイガニ  ベニズワイ
幼生        ガニ幼生      幼生        ガニ幼生  
0.08          ＋          −            −          −
0.16        ＋＋          −            −          −
0.32        ＋＋＋        −            ±          −    
#   ＋＋＋：極めて明瞭（青黒色）、＋＋：明瞭（青色）、
＋：やや明瞭（茶褐色）、±：不明瞭、−：陰性反応
【００５４】
その結果、NiCl2 を添加することにより陽性であることを示す青色系の呈色が観察され、特に0.32％のNiCl2 添加群ではズワイガニ幼生が鮮明な青黒色（濃い青色）を呈し、ネガティブコントロールでは非特異的反応が観察されなかったので、両者を明確に区別することが可能であった。従って、以降のズワイガニ幼生識別のための免疫染色においては、0.32％のNiCl2 を添加した発色液を使用することとした。
【００５５】
なお、0.64％のNiCl2 添加群では陽性であることを示す最も鮮明な呈色が観察されたが、ベニズワイガニ幼生に対してわずかながら非特異的反応が観察された。
【００５６】
以上の検討結果から、ブロッキングには４％のブロックエース、洗浄液には0.05％のTween20 を添加した蒸留水を使用することにより、ズワイガニ幼生に対して陽性であることを検出する反応系が確立された。
【００５７】
（免疫染色法の検討）
免疫染色には、VECTASTAIN Elite ABC MOUSE IgG KIT (VECTASTAIN) を用い、次のようにして検討を行った。
１．まず、ズワイガニ幼生およびベニズワイガニ幼生を９６ウエル平板プレートの各ウエルに５個体ずつ入れた。
２．反応は、まずＰＢＳで１００倍に希釈したＰＺ−１（一次抗体）５０μＬを幼生の入ったウエルに添加し、抗体をズワイガニ幼生の体表面に反応させた（室温、１時間）。
３．ＰＺ−１を吸引して取り除き、幼生を５０μＬの蒸留水で５分間洗浄した後、５０μＬのビオチン化抗マウス抗体（二次抗体）を一次抗体に反応させた（室温、１時間）。
４．反応後、ビオチン化抗マウス抗体を取り除き、再度蒸留水で幼生を洗浄した（室温、１時間）。前述と同様の洗浄操作を施した後、予め作製したアビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素溶液を添加し、二次抗体に結合したアビジンに結合させた（室温、１時間）。
５．再度、洗浄操作を行った後、ペルオキシダーゼ基質であるジアミノベンチジンテトラハイドロクロライド（ＤＡＢ）と過酸化水素水とを混合した発色液を５０μＬ添加し、茶褐色の発色を行った。
６．陽性かどうかの判定は、目視あるいは実体顕微鏡によって観察を行った。
７．なお、ネガティブコントロールとしては、ＰＺ−１の代わりに、１００倍に希釈したマウス正常血清５０μＬを一次抗体として用いた。
【００５８】
免疫染色によるズワイガニ幼生の識別の最適な条件が得られたので、最後に、ＰＺ−１の反応特異性の検討を行った。その結果、ＰＺ−１は免疫原であるズワイガニ幼生に陽性を示すと共に、ベニズワイガニ幼生に対して交差反応を示した。この結果から、ＰＺ−１は特異性が低く、ズワイガニ幼生とベニズワイガニ幼生の体表面に共通して存在する抗原に結合する抗体が含まれると考えられた。そこで、ＰＺ−１とベニズワイガニ幼生とを予め反応させ、ＰＺ−１から抗「共通抗原」抗体を除去したＰＺ−２を作製し、このＰＺ−２について反応特異性を再度検討した。
【００５９】
（ズワイガニ幼生に特異的な抗体の作製）
抗体作製においては、ＰＢＳで１００倍希釈した１００μＬのＰＺ−１に約２００個体のベニズワイガニ幼生を混合し、４℃、overnight の条件で除去操作を行った。得られた抗体（ＰＺ−２）は、その反応特異性を、上記の検討結果から得られた最適条件に従って免疫染色法によって調べた。結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
ＰＺ−２の反応性                          
反応性#  
幼  生        ＰＺ−１##    ＰＺ−２### 
ズワイガニ            ＋            ＋
ベニズワイガニ        ＋            −      
#   ＋：濃い茶褐色に呈色（陽性）、
−：陰性
##  １００倍に希釈して使用
### ベニズワイガニ幼生を用い、４℃、overnight で
抗共通抗原抗体を除去後、１００倍希釈にて使用
【００６１】
その結果、ズワイガニ幼生にのみ陽性であることが観察され、これらの結果から、抗ズワイガニ幼生ポリクローナル抗体が作製できた。
【００６２】
《ズワイガニを特異的に識別可能なモノクローナル抗体の作製》
ハイブリドーマを作製しておけば、均質なモノクローナル抗体を大量かつ半永久的に得ることが可能である。そこで、ズワイガニを特異的に識別可能なモノクローナル抗体と、この抗体を生産するハイブリドーマの作製を試みた。
【００６３】
先の「《ポリクローナル抗体の作製》の（抗ズワイガニ血清の調製）」の説明の個所で述べた方法に従い、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に２ケ月間免疫を行った後、常法に従ってハイブリドーマを作成した。すなわち、マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞とを１０：１の割合で混合し、ポリエチレングリコールにより細胞融合させた後、ＨＡＴ選択による融合細胞の選択培養とクローニングを経て、モノクローナル抗体ＭＺ−１を生産するハイブリドーマを樹立した。
【００６４】
一次抗体として、ハイブリドーマ上清を反応に供した。免疫染色は、先の「《ポリクローナル抗体の作製》の（免疫染色法の検討）」の説明の個所で述べた検討で得られた条件を用いて行った。なお、ネガティブコントロールとして、ミエローマ培養上清を用いた。
【００６５】
本試験で樹立したハイブリドーマ１株から得られたモノクローナル抗体ＭＺ−１を改変免疫染色法によってズワイガニの体表面に反応させた結果、体表面に青色の発色が観察された。一方でベニズワイガニ幼生あるいはネガティブコントロールには発色は認められず、モノクローナル抗体ＭＺ−１はズワイガニ幼生に特異的であることが確認された。結果を表６に示す。
【００６６】
【表６】
モノクローナル抗体ＭＺ−１の反応性                      
反応性#  
幼  生        ＭＺ−１##    ネガティブコントロール### 
ズワイガニ            ＋                  −
ベニズワイガニ        −                  −              
#   ＋：陽性、−：陰性
##  ハイブリドーマ培養上清を使用
### ミエローマ培養上清を一次抗体の代わりに使用
【００６７】
【発明の効果】
上記のモノまたはポリクローナル抗体を用いることにより、海水中に浮遊する甲殻類幼生であるズワイガニ属(Chionoecetes)に属する幼生がズワイガニ(C. opilio) 幼生およびベニズワイガニ(C. japonicus)幼生のうちのいずれかであるかを、簡便、迅速、正確かつ客観的に、しかも完全個体の状態で（破壊しないで）、かつホルマリン等で固定した後であっても、判別することができる。すなわち、上記抗体を用いた判別方法において、採取したズワイガニ属(Chionoecetes)に属する幼生と抗体との間に結合反応が起こっていることが判明したとき（陽性であるとき）はその幼生がズワイガニ(C. opilio) 幼生であると判定でき、一方幼生と抗体との間に結合反応が起こっていないことが判明したとき（陰性であるとき）はその幼生はベニズワイガニ(C. japonicus)幼生であると判定できる。
【００６８】
よって、本発明によれば、従来困難であったズワイガニ(C. opilio) 幼生とベニズワイガニ(C. japonicus)幼生との判別を行うことが可能となるので、ズワイガニ(C. opilio) またはベニズワイガニ(C. japonicus)（殊にズワイガニ(C. opilio) ）の生態系の把握、海洋生物資源の分布や量の把握を行うことができる。