(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハナビラタケの溶媒抽出物であって、主成分として、β−１，３−グルカン（６分岐）を含有することを特徴とするハナビラタケ抽出物。
【請求項２】
８０℃〜１２５℃の熱水による溶媒抽出物であることを特徴とする請求項１のハナビラタケ抽出物。
【請求項３】
０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水による溶媒抽出物であることを特徴とする請求項１のハナビラタケ抽出物。
【請求項４】
ハナビラタケを、８０℃〜１２５℃の熱水によって抽出処理し、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得ることを特徴とするβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法。
【請求項５】
ハナビラタケを、０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水によって抽出処理し、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得ることを特徴とするβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法。
【請求項６】
アルカリ水は、苛性アルカリ２〜２０重量％濃度のものであることを特徴とする請求項５の取得方法。
【請求項７】
アルカリ水は、１〜１０重量％の尿素が添加されているものであることを特徴とする請求項６の取得方法。
【請求項８】
ハナビラタケを、８０℃〜１２５℃の熱水によって一段もしくは多段の抽出処理を行い、次いで０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水によって一段もしくは多段の抽出処理を行うことで、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得ることを特徴とするβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法。
【請求項９】
請求項１ないし３のいずれかのハナビラタケ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする生体賦活性組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし３のいずれかのハナビラタケ抽出物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ハナビラタケ抽出物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、抗腫瘍活性等の生理活性を有するものとして、各種の生体賦活組成物や医薬品等に有用な、ハナビラタケの菌体の抽出物と、これを有効成分とする生体賦活組成物、並びに抗腫瘍剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
従来より、自然界に自生する、ないしは育生する各種の菌体きのこを利用して機能性食品や飲料、あるいは医薬品とすることについての試みが数多くなされてきている。実際に、いくつかのものについては、技術としても実用化されてきている。
【０００３】
しかしながら、古くから民間療法等としてこれら菌体の有効性についての論及がなされてきているものの、その実際の作用効果については不明瞭なものが多く、しかも有効成分についての特定もなされていない例が少なくないのが実情である。
もちろん、自然界に存在する天然物には、いまだに未知の物質も多く、この点においては、今後も積極的な探索的検討が進められるべきである。特に、菌体きのこ由来の多糖類が提供されて以来、改めて多糖類と生理作用との関係が注目されている状態においてはその検討は重要な課題になっている。
【０００４】
一方、この出願の発明者らは、幻のきのこと呼ばれているハナビラタケ(Sparassis Crispa Fr.)に注目してきた。このハナビラタケはカラマツに生えるきのこであって、非常に僅少なきのこであるが、歯ごたえがよく、何よりも、その純白の色合いと、葉牡丹のような形態が、フランス料理界等から注目されているものである。しかしながら、このハナビラタケは成長が遅く、人工栽培は非常に困難であるとされていた。実際に、発明者らも、カラマツの大鋸屑を主成分とする菌床に、様々な栄養を添加して、栽培を試みたが、発茸までに、４ケ月程度かかり、産業的な栽培を行うことが出来なかった。
【０００５】
しかし、最近になって、発明者らは、比較的短期間で栽培可能な新しい栽培法とそのための技術的手段を確立することができた。
だが、このような栽培法の確立にもかかわらず、ハナビラタケの本質的な特徴の解明とその利用については今後の課題として残されていたのである。何よりも大きな課題は、食材としてのハナビラタケのもつ生理作用への影響について明らかにし、前記のとおりの従来技術の限界を克服し、ハナビラタケのもつ機能性を最大限に引出してこれを活用するとのことであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するためになされたものであって、まず第１には、ハナビラタケの溶媒抽出物であって、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有することを特徴とするハナビラタケ抽出物を提供する。
また、この出願の発明は、第２には、溶媒が８０℃〜１２５℃の熱水である前記のハナビラタケ抽出物を、第３には、溶媒が０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水である前記のハナビラタケ抽出物を提供する。
【０００７】
そして、この出願の発明は、第４には、ハナビラタケを、８０℃〜１２５℃の熱水によって抽出処理し、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得ることを特徴とするβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法を提供する。
第５には、ハナビラタケを、０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水によって抽出処理し、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得るβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法を、第６には、アルカリ水は、苛性アルカリ２〜２０重量％濃度のものである方法を、第７には、アルカリ水は、１〜１０重量％の尿素が添加されているものである方法を提供する。
また、この出願の発明は、第８には、ハナビラタケを、８０℃〜１２５℃の熱水によって一段もしくは多段の抽出処理を行い、次いで０℃〜２０℃の冷アルカリ水または５０℃〜７５℃の熱アルカリ水によって一段もしくは多段の抽出処理を行うことで、主成分としてβ−１，３−グルカン（６分岐）を含有する抽出物を得るβ−１，３−グルカン（６分岐）の取得方法を提供する。
さらに、第９には、前記第１ないし第３のいずれかの発明のハナビラタケ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする生体賦活性組成物を、第１０には、前記第１ないし第３のいずれかのハナビラタケ抽出物を有効成分として含有する抗腫瘍剤をも提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は前記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
ハナビラタケそのものについては天然のものでもよいし、あるいは人工栽培により得られたものであってもよい。人工栽培は、たとえばこの出願の発明者らがすでに開発した方法として実施することができ、この方法により得られたものを用いてもよい。すなわち、この方法は、短期間でハナビラタケを栽培するための手段として、カラマツ材を成分とする大鋸屑又はチップもしくはこれらを含む混合物を水の存在下で加熱し、熱水可溶成分を除去した後、栄養成分を加えて作成したハナビラタケ人工栽培用の菌床によって栽培する方法である。この方法によれば、およそ２ヶ月半で、収穫可能なハナビラタケの子実体を得ることができる。
【０００９】
たとえば以上のとおりのハナビラタケより、この発明の抽出物を得るに際しては、あらかじめ細断して小塊ないし粉末としておくことが望ましい。細断後の大きさについては特に限定はないが、より小さな大きさとしておくことが抽出を容易とする。また、必要に応じて、抽出に先立って脱脂処理する。この脱脂処理は、たとえば有機溶媒あるいは有機溶媒と水との混合液と接触させることによって可能とされる。クロロホルム等のハロゲン化炭化水素とアルコール並びに水との混合液による脱脂処理である。
【００１０】
ハナビラタケは、この発明においては溶媒を用いて抽出することになる。溶媒としては水系溶媒または非水系溶媒が使用される。なかでも水系溶媒がより適当である。ここで水系溶媒とは、水もしくは水を主とした水性溶液溶媒であることを意味している。たとえば水そのもの、あるいはアルカリや他の塩基性物質を添加したアルカリ水、アルコール等とも相溶性のある有機溶媒を加えた水性溶媒、酸や酸性物質を添加した酸性水などである。なかでも、この発明においては、水あるいはアルカリ水が好適なものの一つとして例示される。
【００１１】
また、非水系溶媒としては、たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の極性有機溶媒が好ましく使用される。
水により抽出する場合には、熱水抽出とするのがさらに好ましい。この場合の熱水の温度は、一般的には８０〜１２５℃、さらに好ましくは９５〜１２２℃の範囲のものとする。アルカリ水は、たとえば０〜２０℃程度の冷アルカリ水、あるいは５０〜７５℃程度の熱アルカリ水として用いることが考慮される。
【００１２】
抽出は、多段階で行ってもよく、また、異なる水系溶媒を用いた多段処理として行ってもよい。たとえば、
１）多段階の熱水抽出
２）多段階のアルカリ水抽出
３）一段もしくは多段の熱水抽出と、残渣分のさらなる一段もしくは多段のアルカリ水抽出、
等々の手順による抽出が考慮される。
【００１３】
水系溶媒の使用量については特に限定はないが、対象とするハナビラタケの重量、あるいは抽出残渣や沈殿物の重量と、精製・洗浄等の後処理の負担を考慮して定めることが好ましい。一般的には、被抽出対象としてのハナビラタケや沈殿、抽出残渣の重量に対して、５〜５０倍重量の水系溶媒を用いることが考慮される。
【００１４】
アルカリ水により抽出する場合には、アルカリは、たとえばＮａＯＨ、ＫＯＨ等の苛性アルカリを２〜２０重量％濃度としたものや、あるいはさらに、溶媒補助剤や変性剤として、たとえば尿素を１〜１０重量％濃度で添加したもの等として用いることができる。
実際の抽出処理は、たとえば後述の実施例を参考として適宜に手順や条件等を変更して実施することができる。
【００１５】
抽出により得られるこの発明の溶媒抽出物は、主成分として多糖類グルカンを含有している。そしてさらにこの発明においては、主成分としてのグルカンが、β−１，３−グルカンであることを特徴とする抽出物が提供される。たとえば、後述の実施例等として、６分岐のβ−１，３−グルカンを主体とするもの、分子量としては２００万程度までのものが提供される。グルカン、特にβ−１，３−グルカンは、近年、その生体内での作用が注目されている物質であることから、そしてまた、この発明は、食用きのことしてのハナビラタケの抽出物としてこのβ−１，３−グルカンを主成分とする抽出物を提供することから、この抽出物の有用性は極めて高いものとなる。
【００１６】
そこで、この発明においては、ハナビラタケ抽出物を有効成分とする生体賦活性組成物を提供する。この場合の生体賦活性の概念は広い意味を有しており、たとえば、いわゆる機能性食品や機能性飲料、健康食品、健康飲料と呼ばれるものから、医薬品までも含むものである。
ハナビラタケ抽出物は、通常の添加物との組成物として、液状物、固型物、粉末等の各種形態の組成物とすることができる。医薬品とする場合も同様であって、経口の錠剤や粉末、座薬、経口液剤、あるいは注射液等の各種形態であってよい。
【００１７】
たとえば実際に、生体賦活組成物としての有効性は、この発明のハナビラタケ抽出物が示す抗腫瘍活性としても説明することができる。つまり、この発明においては、前記のハナビラタケ抽出物を有効成分とする抗腫瘍剤が提供されるのでもある。
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの発明について説明する。
【００１８】
【実施例】
（実施例１）
ハナビラタケ(Sparassis crispa Fr.)をヤゲンにて粉末とした。次いで風乾粉末２５ｇを、クロロホルム：メタノール：水＝２００：２００：６０の重量比の混合物を用いて、室温で、２日間脱脂処理した。
脱脂処理後の固形物を空気乾燥し、オートクレーブ中において、５００ｍｌの熱水を用いて２時間の熱水抽出を行い、抽出物（試料１）を得た。
さらに抽出残渣を、オートクレーブ中において５００ｍｌの熱水を用いて２時間熱水抽出し、抽出物（試料２）を得た。
熱水抽出物として前記の試料１および２を一緒にして、多量のエタノール（４ｌ）を添加し、５０００ｒｐｍで５分間攪拌して沈殿を生成させ、沈殿物を２００ｍｌの水に超分散機により溶解させ、さらに等量のエタノール（２００ｍｌ）を添加して繊維状の沈殿物と上清を得た。
沈殿物はエタノール、アセトン処理した脱水乾燥し、熱水抽出物Ａ−１、４６１ｍｇを得た。また、上清は濃縮後凍結乾燥して熱水抽出物Ａ−２、４１５ｍｇを得た。
【００１９】
グルコースを標準物質とするフェノール硫酸法により測定された糖含量と、ＢＳＡを標準物質としてＢＣＡ法により測定されたタンパク含量は、各々、次のとおりであった。
＜糖含量＞
抽出物Ａ−１  ６４％
抽出物Ａ−２  ３４％
＜タンパク含量＞
抽出物Ａ−１  １．４％
抽出物Ａ−２  ２８％
粗抽出物であるため、脱水状況にもよるが、糖含量とタンパク含量とは合計で１００％にはなっていない。
【００２０】
また、糖組成について、２Ｎ−トリフルオロ酢酸にて完全加水分解し、還元、アセチル化後に、ガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果は、次の表１のとおりであった。粗多糖であるためか、マンノース、ガラクトースが若干検出されている。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
以上の結果より、熱水抽出物は、多糖としてグルカンを主成分として含有していることが確認された。
（実施例２）
実施例１において、抽出物としての試料２を得た後の残渣に、１０％ＮａＯＨ／５％尿素添加の５００ｍｌアルカリ水（４℃）を加えて、２日間抽出処理し、抽出物（試料３）を得た。
【００２３】
透析の後に、エタノール沈殿、脱水および乾燥処理して冷アルカリ抽出物Ｂ、４．９７ｇを得た。
実施例１と同様にして糖含量、タンパク含量および糖組成を分析した。その結果は表２のとおりであり、多糖グルカンを主成分とすることが確認された。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
（実施例３）
実施例２において、抽出物としての試料３を得た後の残渣に対し、１０％ＮａＯＨ／５％尿素添加の５００ｍｌ熱アルカリ水（６５℃）を加えて、１時間抽出処理した。抽出物（試料４）を得た。
透析の後に、エタノール沈殿、脱水および乾燥処理して熱アルカリ抽出物Ｃ、１ｇを得た。
【００２６】
実施例１と同様にして糖含量、タンパク含量および糖組成を分析した。その結果は表３のとおりであり、多糖グルカンを主成分することが確認された。
【００２７】
【表３】
0004183326.tif 000004
【００２９】
（実施例４）
実施例１〜３の抽出物について、主成分グルカンの特定を行った。
【００３０】
前記の熱水抽出物Ａ−１およびＡ−２、冷アルカリ水抽出物Ｂ、熱アルカリ水抽出物Ｃの各々について、コンゴーレッドと結合してメタクロマジーを示すかどうか評価した。グルカンがβ−１，３−グルカンの場合はラセン構造をとり、コンゴーレッドと結合してメタクロマジーを示すからである。図１は、その結果を示したものである。
【００３１】
図１より、０．１Ｎ−ＮａＯＨの条件下では Blankと比較して著しく高波長側に極大吸収が変化していることがわかる。前記いずれの抽出物もβ−１，３−グルカンを含有していることが特徴的に示されている。
また、図２、図３および図４は、熱水抽出物Ａ−１、冷アルカリ水抽出物Ｂ、熱アルカリ水抽出物Ｃの、ＤＭＳＯ−ｄ6 中での13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【００３２】
６０〜１００ｐｐｍに存在する主要ピークは、いずれも６分岐β−１，３−グルカンに容易に帰属できるシグナルである。特に、８５ｐｐｍ付近にシグナル３本が分裂したように観察されるのは、６分岐グルカンの特徴を良く表わしている。また、このなかで、中央シグナルが最も強く現れているが、これは分岐度が１／３以下であることを表わしている。
【００３３】
以上のことから、ハナビラタケ抽出物のグルカンは、β−１，３−グルカン（６分岐）であることが確認される。
（実施例５）
実施例２および３において得られた冷アルカリ水抽出物Ｂおよび熱アルカリ水抽出物ＣについてＶＤＨ反応について評価した。
【００３４】
レンチナンの抗腫瘍作用解析の過程で、レンチナンが抗腫瘍効果を発揮する系統のマウスではＶＤＨ反応が認められることがすでに報告されている。ＶＤＨ反応とは、vascular dilation and hemorrphage 反応のことであり、マウスの耳介の血管透過性の亢進と出血反応である。今回、ハナビラタケ多糖画分の抗腫瘍効果を検討する過程で、ＶＤＨ反応を示すことが明らかとなったので、これを表４に例示した。観察は、肉眼、腫瘍投与１１日目のみに行った。
【００３５】
今回の観察では、前記抽出物ＢおよびＣは低濃度でも強いＶＤＨ反応として、抗腫瘍効果を示している。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
（実施例６）
実施例１〜３において得られた抽出物について抗腫瘍効果について評価した。その結果を表５に示した。この表５は、サルコーマ固形皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す。１群１０匹で行っている。マウスあたり２０，１００、または５００マイクログラムを腫瘍移植後、７，９，１１日目に腹腔内に投与した。表には完全退縮マウスの数、腫瘍重量の平均、標準偏差、抑制率（％）、有意差を示してある。熱水抽出物Ａ−１、冷アルカリ水抽出物Ｂおよび熱アルカリ水抽出物Ｃでは総べての濃度で強い抗腫瘍効果を示した。特にＨＡの１００マイクログラム投与ではすべてのマウスから腫瘍は消失した。ハナビラタケでは５００μｇでは効果を示したが、以下の濃度では全く活性が認められなかった。腫瘍重量が大きかったため、この２群についてはサイズの測定だけをおこなったので、重量に関するデータは掲載していない。粗熱水抽出物がこの濃度で抗腫瘍活性を示したことは、ハナビラタケが多量の抗腫瘍グルカンを含有していることの証である。
【００３８】
【表５】
0004183326.tif 000006
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって生理活性をもつグルカン、特にβ−１，３−グルカンを主成分として含有するハナビラタケ抽出物が提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例としてのハナビラタケ抽出物のコンゴーレッドとの結合にともなうメタクロマジーの観察結果を示した図である。
【図２】熱水抽出物Ａ−１のＮＭＲスペクトル図である。
【図３】冷アルカリ水抽出物ＢのＮＭＲスペクトル図である。
【図４】熱アルカリ水抽出物ＣのＮＭＲスペクトル図である。
【図１】
0004183326.tif 000007
【図２】
0004183326.tif 000008
【図３】
0004183326.tif 000009
【図４】
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