(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質、プロテアーゼおよび含水塩を固相状態で混合してなる固相状態の酵素反応原料組成物を、上記含水塩中の結晶水が遊離する温度未満の温度に保持することを特徴とする酵素反応原料組成物の貯蔵方法。
【請求項２】
基質がＮ−置換アミノ酸とアミノ酸低級アルキルエステルである請求項１に記載の酵素反応原料組成物の貯蔵方法。
【請求項３】
酵素がサーモライシン様プロテアーゼである請求項１または２に記載の酵素反応原料組成物の貯蔵方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを用いた酵素反応による物質生産において、あらかじめ基質と酵素を混合して調製した酵素反応原料組成物を、酵素を安定した状態で保持し、かつ酵素反応を抑制する貯蔵方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼはタンパク質、ポリペプチド等を加水分解する酵素であるが、本酵素の逆反応を利用したペプチドの合成にも使用されている。しかし、プロテアーゼは、水溶液中では自己消化、または変性等により失活しやすいことが知られている。例えば、人工甘味料アスパルテームの合成に用いられているサーモライシン様プロテアーゼは、溶液中での活性の維持にはカルシウムイオンの存在が必要とされている。しかしながら、カルシウムイオンの存在により装置内部でのスケーリング発生の危険性が大きく、反応システムに障害を及ぼす可能性がある。
【０００３】
一方、酵素反応に際しては、粉末状の基質と酵素、さらに必要に応じて添加物を混合した後に反応を開始する。このとき、基質、酵素等の粉末の飛散による作業者の喉、目、粘膜等に炎症を引き起こす危険性がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、原料組成物調製時の作業者への悪影響を回避するために予め大量に調製した酵素と基質を含む原料組成物から、酵素反応を行う際に、必要量を採取および使用することで原料組成物の調製回数を少なくし、貯蔵中の酵素反応を抑制し、かつ酵素を安定した状態で保持することができる、プロテアーゼを用いた酵素反応に使用する酵素を含む出発原料組成物の貯蔵方法を提供することである。
【０００５】
本発明者は上記目的を達成すべく検討を重ねた結果、アミノ酸粉末１およびアミノ酸粉末２を混合し、これに含水塩および酵素を加えて調製した固体状態（粉末状態）の反応原料組成物は、粉末状態で遊離の水を含まないために、含水塩の離水温度以下の温度に保持すれば酵素反応は起こらず、また、酵素も失活することなく安定に保持されることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、基質、プロテアーゼおよび含水塩を固相状態で混合してなる固相状態の酵素反応原料組成物を、上記含水塩中の結晶水が遊離する温度未満の温度に保持することを特徴とする酵素反応原料組成物の貯蔵方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明における酵素反応原料組成物は、プロテアーゼを触媒として基質を脱水縮合させてペプチドを合成する酵素反応に使用されるものである。この酵素反応原料組成物は、基質、プロテアーゼ（酵素）および含水塩を含むのであるが、これらを水の存在しない固体状態で混合して得られる固体状態の原料組成物である。含水塩は、水の発生源として使用される。
【０００８】
本発明においては使用する基質は、水溶性であれば特に限定されない。例えば、Ｎ−置換アミノ酸、アミノ酸低級アルキルエステルなどが挙げられる。これらのアミノ酸の置換基およびアミノ酸エステルの低級アルキル基は、酵素反応によって合成されるペプチドとなる置換基やアルキル基であり、特に限定されない。  以下では、プロテアーゼを用いたペプチド合成の例として、報告例の多い人工甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ＺＡＰＭと略記）の合成を例に説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【０００９】
ＺＡＰＭの合成における基質は、Ｎ−置換アミノ酸のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下ＺＡと略記）およびアミノ酸低級アルキルエステルのＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ＰＭと略記）である。ここで、ＺＡ及びＰＭの混合比（モル比）は特に限定されないが、ＺＡ／ＰＭが０．１〜１．５程度が好ましい。
【００１０】
本発明で使用する含水塩は、後述する粉末状態の酵素反応原料組成物を調製し、貯蔵した後、酵素反応を実施する際の水発生物質として使用するものであり、酵素の活性および酵素反応を阻害しない、酵素反応の温度近辺で離水するものが好ましく、例えば、ＮａＣＯ3・１０Ｈ2Ｏ（結晶水中の３Ｈ2Ｏが離水する温度は３２℃、９Ｈ2Ｏが離水する温度は３５℃）、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ（５Ｈ2Ｏの離水温度は３５．１℃）などが挙げられる。酵素反応において、反応を、使用する含水塩が結晶水を遊離する温度（離水温度）以上の温度で行うと、含水塩は結晶水を遊離し、遊離水が溶剤となり、基質、塩および酵素が溶解した粘稠な液体（液状の連続体）となり、反応が進行する。含水塩の使用量は特に限定されないが、基質濃度をできるだけ高くし、反応収率を高めるために、好ましくは５Ｍ以上（遊離水基準）の濃度になる量を使用することが望ましい。
【００１１】
また、本発明に用いるプロテアーゼは、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテアーゼなども使用できる。酵素濃度は、高率の反応収率が得られるように適宜決めればよく、特に限定されない。
【００１２】
本発明の反応原料組成物は、前記の基質、含水塩および酵素をいずれも粉末状で所定の割合で、含水塩から結晶水が遊離しない温度で固体状態で均一に混合する。混合は、例えば、羽根型撹拌機、Ｖ型混合機、Ｗ型混合機、球型混合機や振とう器などを用いて混合されるが、混合手段は特に限定されない。得られる反応原料組成物は固体状（粉末状）である。
【００１３】
本発明では、上記の反応原料組成物は、それに含まれる含水塩の離水温度未満の温度で貯蔵することが必要である。また、反応原料組成物を輸送する場合も同様である。離水温度未満の温度で貯蔵することにより、反応原料組成物には水が含まれないので、酵素反応は抑制（実質的に反応は生じない）され、また酵素を失活させる物質も含まれないので、酵素も安定に保持される。
【００１４】
上記の温度で貯蔵された反応原料組成物は、酵素反応を実施する際に必要量が採取され、反応器中で用いた含水塩の離水温度以上であるが、酵素の最適使用温度近辺、一般的には４０〜６０℃の温度で混合して離水および反応を行わせる。上記温度では反応原料組成物は均一に混合され、粘稠な液体状態となる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
容器中でＰＭ（Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）粉末  ２１５ｇ（１．０ｍｏｌ) およびＺＡ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸）粉末  ２６５ｇ（１．０ｍｏｌ）にＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ  ５００ｇおよびサモアーゼ（大和化成株式会社製）５０ｇを加え、２０℃、振とう器を用いて均一に混合した。
得られた反応原料組成物を２０℃で保存し、１ヶ月おきにサンプリングして５０重量％メタノール水溶液で希釈し、組成をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分析した。１１ヶ月間ＺＡＰＭは全く検出されず、貯蔵中に合成反応が起こっていないことを確認した。
【００１６】
また、１ヶ月おきにサンプリングした反応原料組成物を、５０℃に調整した温浴槽中の反応容器に入れて攪拌し、８時間反応後の反応液組成をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分析し、ＺＡＰＭの収率を求めた。
調製直後の反応原料組成物を用いた場合のＺＡＰＭの収率を酵素活性１００とする各貯蔵月のＺＡＰＭ収率から求めた酵素の相対活性を図１に示した。１１ヶ月間の活性低下は小さく、１１ヶ月後の残存活性は９２％、ＺＡＰＭ収率は８７％であった。
【００１７】
実施例２
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ  ５００ｇをＮａＣＯ3・１０Ｈ2Ｏ  ２５０ｇに代える以外は実施例１と同様にして反応原料組成物の調製、貯蔵、および酵素反応を実施した。結果は実施例１と同様、貯蔵１１ヶ月間ＺＡＰＭは検出されず、貯蔵中の合成反応が起こっていないことを確認した。また、貯蔵中の酵素活性の低下は小さく、１１ヶ月後の残存活性は８８％、ＺＡＰＭ収率は７９％であった。
【００１８】
【発明の効果】
以上の本発明によれば、反応原料組成物を一度に大量に調製し、これを使用した含水塩の離水温度未満の温度に保持することで、反応原料組成物を安定に貯蔵及び輸送することができる。従って、本発明により、反応原料組成物の調製回数を減らし、該組成物調製時の基質、酵素等の飛散粉末による作業者の喉、目、粘膜等に炎症を引き起こす危険性を低減させることが可能となる。また、本発明における反応原料組成物は粉末状であり、水相液に比べ、体積が小さいため貯蔵や輸送にかかるコストも低減させることができる。
【００１９】
また、貯蔵中の反応原料組成物を必要時に必要量取り出して含水塩の離水温度以上の温度条件で反応を行うと、該離水温度未満の温度では酵素反応は起こらないが、含水塩の結晶水が遊離し、これが反応系に供給され、反応原料組成物を液化させ、均一な混合が可能となり、効率よく酵素反応を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１における酵素反応原料組成物の保存期間と酵素活性の保持状態を示す。
【図１】
0004056781.tif 000002