【事件の表示】
　特許第６３３８２３５号発明「低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　特許第６３３８２３５号の請求項１ないし８に係る特許を維持する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６３３８２３５号の請求項１ないし８に係る特許（以下、「本件特許」という。）についての出願は、平成２５年１１月２２日に出願され、平成３０年５月１８日にその特許権の設定登録がされ、同年６月６日に特許掲載公報が発行された。その後、その特許に対し、同年１２月５日に特許異議申立人浜俊彦は特許異議の申立てを行った。
第２　本件発明
　本件特許に係る発明は、それぞれ、その特許請求の範囲の請求項１ないし８に記載された事項により特定される以下のとおりのものである。
【請求項１】　低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】　前記低分子化抗体がｓｃＦｖ抗体、ラクダ科動物由来ＶＨＨ抗体又はサメ由来ＩｇＮＡＲ抗体である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】　前記低分子化抗体がラクダ科動物由来ＶＨＨ抗体である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】　前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】　低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程、選別された低分子化抗体をコードするＤＮＡを発現させて低分子化抗体を得る工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体の製造方法。
【請求項６】　前記低分子化抗体がｓｃＦｖ抗体、ラクダ科動物由来ＶＨＨ抗体又はサメ由来ＩｇＮＡＲ抗体である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】　前記低分子化抗体がラクダ科動物由来ＶＨＨ抗体である、請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】　前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
（以下、これらの請求項に係る各発明をそれぞれの請求項の番号に対応させて「本件発明１」、「本件発明２」、・・・「本件発明８」といい、また、これらの発明をまとめて「本件発明」という場合がある。）
第３　申立理由の概要
　特許異議申立人浜俊彦は、以下の証拠を提出し、請求項１、２、４ないし６及び８に係る特許は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してされたものであり、また、請求項１ないし８に係る特許は、甲第１号証、甲第２号証又は甲第３号証に記載された発明に、他の証拠に記載された発明又は技術常識若しくは周知技術を組み合わせることにより当業者が容易に発明をすることができたものであるから同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、本件特許を取り消すべきものである旨主張する。
　甲第１号証；Nucleic Acids Res, 2010，Vol.38, e193.
　甲第２号証；Methods, 2013-March-15, Vol.60, No.1, pp.99-110.
　甲第３号証；2018年10月29日に異議申立人が印刷した、第８６回日本生化学会大会、演題番号２Ｐ−３７５の抄録が記載されたウエブページ（http://member.jbsoc.or.jp/jbs2013/index.php?t_no=2P-375+%282T14p-13%29btn_syousai=on）の印刷物。
　甲第４号証；Nat Biotech, 2010, Vol.28, pp.965-969.
　甲第５号証；Barbas, C. F. III外編、Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, pp.3.8-3.9, 3.17.
（以下、これらの証拠を順に「引用例１」、・・・「引用例５」という。）
第４　引用例の記載及び引用発明（下線は当審で付与。）
１　引用例１
　引用例１には以下の事項が記載されている。
(１)　表題
　「in vitroスクリーニングの回避 − 抗体ディスプレイ及びin silico候補選択に適用される次世代シーケンシング技術」（１ページ）
(２)　「ABSTRACT（要約）」
　「近年、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって提供される前例のないＤＮＡ配列解析能力がゲノム研究に革命をもたらした。イルミナ社のシーケンシングプラットフォームと多様性を２つのＣＤＲ３に限定するように設計されたｓｃＦｖライブラリーを組み合わせることにより、１．９×１０７を超える配列が生成した。このアプローチは、ライブラリーの多様性についての詳細な分析を可能にし、２種の標的との結合による選択過程における実質的にすべてのｓｃＦｖの配列情報、及びこれら濃縮プロセスの全体像を提供した。最も出現頻度の高い重鎖ＣＤＲ３配列を使用して、ラウンド３からｓｃＦｖをレスキューするためのプライマーを設計した。配列の出現頻度に基づく同定は、最も有力なｓｃＦｖと古典的なin vitroスクリーニングでは見逃された大切な候補を回収した。したがって、ＮＧＳとディスプレイ技術を組み合わせることにより、面倒で時間のかかる事前スクリーニングを回避又は補完することができ、ライブラリー設計と抗体レパートリーの理解を向上させるために、選択プロセスについての貴重な洞察を得ることができる。」（１ページ）
(３)　「MATERIALS AND METHODS（材料と方法）」
ア　「Library construction（ライブラリー構築）」
　「ヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列は、ＰＣＲによってＮＥＢ由来のJurkat、HeLa及びHEK293細胞のヒトゲノムから増幅された。フラグメントは、ＣＤＲ３挿入物、ヒトＦＲ４配列、及びＶＨのための制限部位NcoI/XhoI及びＶＬのためのSalI/NotIを導入するためにＰＣＲ（付録のデータ）によって拡張された。これらの制限部位はファージミドベクターpNDS1へのクローニングに用いた。pHEN1ファージミドベクター(21)に由来するpNDS1ベクター。クローニング部位は、ＶＨクローニングのための制限酵素部位NcoI/XhoI及びＶＬクローニングのためのSalI/NotIに隣接する(Gly4Ser)3リンカー配列を含む。・・・ＣＤＲ３挿入物は、任意の機能的ｓｃＦｖの発現を損なうフレームシフトを導入する。・・・ＣＤＲ３は４〜１０残基でランダム化された。得られたカセットは、ＣＤＲ３配列及び長さの両方において人工的な多様性を創出する。オリゴをビオチン化し(Microsynth)、消化されたインサートをStreptaBeads (Dynal)を用いて精製した。」（２ページ左欄下から２１行〜右欄５行）
イ　「Phage selection（ファージ選択）」
　「TG1細胞を、２ｘＴＹＡＧ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２％グルコース）培地中３７℃(240rpm)で増殖させた。ＯＤ600＝０．４〜０．５において、３７℃(100rpm)で１時間、M13K07ヘルパーファージによる超感染により、ＡＥ１ライブラリーを回収した。次いで培養培地を２ｘＴＹＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に交換し、TG1を３０℃(280rpm)でo/n増殖させた。ファージを単離し、２０％ＰＥＧ-８０００/２．５Ｍ ＮａＣｌ(Sigma)の1/3 v/vで２回沈殿させて培養上清から濃縮し、ＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＴＥ緩衝液に対して透析し、TG1細胞に感染させて滴定した。ファージ（１０１２ｐｆｕ）は、３％(w/v)スキムミルクを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックされ、５Ｅ３に対する選択のためのラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体で被覆した免疫チューブ(Nunc)及びヒトインターフェロンγ（ｈＩＦＮγ）に対する選択のためストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(Invitrogen)上で選択解除された。選択解除されたファージは、１０μｇ／ｍｌの抗マウスＴＬＲ４ラットモノクローナル抗体５Ｅ３で被覆した免疫チューブ又は２００ｎＭのビオチン化ｈＩＦＮγで被覆したストレプタビーズ(Invitrogen)のいずれかで２時間（ＲＴ）インキュベートした。ＰＢＳ/０．１％ Tween-20で５回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄することにより非特異的ファージを除去した。結合したファージは１０ｍＭトリエチルアミンＴＥＡ(Sigma)で溶出し、１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４(Sigma)で中和された。溶出液を１０ｍｌの指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞に添加し、３７℃(100rpm)で１時間インキュベートした。感染されたTG1の試料は選択結果を力価測定するために連続希釈された。残りの感染されたTG1を２ｘＴＹＡＧ寒天バイオアッセイプレート上に広げた。３０℃で一晩インキュベートした後、細菌を２ｘＴＹ培地でこすり落とし、試料を１７％グリセロール中で−８０℃で保存した。その後のラウンドのパニングのために、１０１０ｐｆｕを使用した。」（２ページ右欄１５〜４９行）
ウ　「Screening ELISA（ＥＬＩＳＡスクリーニング）」
　「個々のクローンを、９６穴プレート中の２ｘＴＹＡＧ培地で増殖させた。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を用いて３０℃(150rpm)で一晩ｓｃＦｖ発現を誘導した。ｓｃＦｖを含有する上清をＥＬＩＳＡで使用して、５Ｅ３に対するそれらの結合特異性及び親和性を評価した。９６穴 MaxiSorpプレート(Nunc)は５０ｎｇ／ウェルの５Ｅ３又はラットアイソタイプ抗体で一晩（４℃）被覆された。上清及びアッセイプレートをＰＢＳ／３％ミルクで１時間（ＲＴ）ブロックした。アッセイプレートをＰＢＳ／０．０５％ Tween-20で３回洗浄した後、ｓｃＦｖを含む５０μｌのブロックされた上清をウェルに移し、室温で２時間インキュベートした。ｓｃＦｖの結合は、マウス抗ｃｍｙｃ抗体及び抗マウスＩｇＧＦｃγ−ＨＲＰ抗体で検出した。このアッセイをＴＭＢ基質(Sigma)で展開し、反応をＨ２ＳＯ４ ２Ｎで停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。」（３ページ左欄３０〜４５行）
(４)　「RESULTS（結果）」
ア　「Generation of a scFv library with diversity restricted to CDR3（多様性がＣＤＲ３に限定されたｓｃＦｖライブラリーの作製）」
　「免疫グロブリン分子の２つの相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は抗原結合部位の中心を形成し、他の相補性決定領域（ＣＤＲ）がしばしば結合エネルギーに寄与するのに対し、ＣＤＲ３領域の多様化は抗原特異的抗体を生み出すのに十分である(22-24)。したがって、
我々は、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３にのみ多様性が導入された、限られた数のヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子に基づくヒトｓｃＦｖのライブラリーを作製した。
長さが９〜１５アミノ酸の重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲのＩＭＧＴの定義による）をコードする多様な配列を７つのＶＨアクセプターフレームワークに導入した(25)。同様に、８〜１１アミノ酸のＣＤＲ３をＶＬアクセプターフレームワークにクローニングした。ＡＥ１と命名された７×１０
９
形質転換体からなるライブラリーは、多様化された重鎖及び軽鎖可変領域をファージミドベクターpNDS1に組み合わせることによって得られ、これは、M13糸状バクテリオファージ表面でのｓｃＦｖ発現及びディスプレイを可能にした(7)。
イ　「Next generation sequencing of the antibody library and selection rounds（抗体ライブラリーと選択ラウンドの次世代シーケンシング）」
　「
ＡＥ１ライブラリーを、ラット抗マウスＴＬＲ４モノクローナル抗体５Ｅ３(26)に対する抗イディオタイプｓｃＦｖフラグメントの同定に使用した。免疫チューブ上に固定化された５Ｅ３に対する古典的なパニングを３ラウンド行い、選択した。
　現在、イルミナ社のシーケンシングプラットフォームはリード長が約７６ｂｐである(15)。我々の研究では、偏りを避けるために、全てのクローンに共通の領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。重鎖に関して、プライマーはＦＲ４に特異的で、決定された配列はＣＤＲ３全体をカバーし、ほとんどの場合、ＶＨファミリーを同定するのに十分なＦＲ３配列情報を提供した（図１Ａ）。・・・
ファージミドＤＮＡを、ＡＥ１ライブラリー及び各ラウンドでの選択後に回収された細菌から単離した。次いで、ｓｃＦｖコード領域を、４塩基配列タグを導入したプライマーを用いて増幅し、これにより、同じイルミナチャンネルによる、ライブラリー及び異なる選択ラウンドからのＤＮＡ断片の同時固相配列決定が可能となった。
重鎖及び軽鎖について、それぞれ合計6 635 657及び8 896 028の塩基配列が読まれ、１０億塩基を超える塩基の配列が決定された（表１）
ウ　「Sequence evolution during phage selection against 5E3（５Ｅ３によるファージ選択過程での配列の進化）」
　「標的５Ｅ３へのファージ結合の選択の間、ラウンド１、ラウンド２及びラウンド３の後に回収されたファージ粒子の数は、それぞれ１．８×１０５、３．４×１０５及び１．１×１０５であった。したがって、後の選択ラウンドで存在する異なる配列の最大数は最初のラウンドの出力によって制限され、この場合は１０５の範囲内にある。ＮＧＳを使用して、ＶＨについて３．５×１０５〜６．４×１０５のリード、ＶＬについて１０６より大きなリードが、各選択ラウンド後に得られた（表１）。このように、各ラウンドで配列決定されたクローンのこの非常に大きな割合は、プロセス全体を通して個々のＶＨ及びＶＬ配列の出現頻度と進化の前例のない見解を提供した。
　・・・
　また、
ラウンド３の後に、２８１５〜３７０１７倍で存在していた１０個の最も頻度の高いＶＨ
ＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４
配列の濃縮プロファイルも確認した（図４Ａ）。
エ　「Hit identification by classical primary target binding screening（古典的な標的結合スクリーニングによる候補の同定）」
　「
ファージ選択において古典的に行われているように、ラウンド３の後、９６個のクローンを選び、培地へのｓｃＦｖ分泌を誘導して、標的５Ｅ３に対する特異的な結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ｓｃＦｖを精製し、用量反応実験でその特異性を確認するために、陽性クローンを配列決定し、大量に増殖させた。５Ｅ３対しナノモルオーダーの結合ＥＣ
５０
を有する６つのｓｃＦｖが同定された（図５）。
我々はＡＥ１ライブラリーと各選択ラウンド後におけるこれらのクローンのＶＨ
ＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４
配列とＶＬ
ＣＤＲ３-ＦＲ４
配列の出現頻度を求めた。
オ　「ScFv rescue via VHCDR3 amplification（ＶＨＣＤＲ３増幅によるＳｃＦｖのレスキュー）」
　「スクリーニングによって同定された６つのｓｃＦｖのＶＨＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４配列は、すべて、シーケンシングデータで同定することができ、そしてラウンド３後の出現頻度と対応付けることができた（図５）。クローンＤ１１、Ｄ６及びＤ４に対応する配列が、１０個の最も出現頻度の高い配列の中に見出され、また、最も高い見かけの親和性を有するＤ１１は選択の過程で最も濃縮された（図４）。しかし、ラウンド３の後に見いだされるいくつかの配列は、ＥＬＩＳＡスクリーニングでは同定されなかった。特に、ラウンド３後に、全ての配列の６％近くを占め２番目に出現頻度の高い配列であるクローン＃２は、同定されなかった（図４）。我々は、これらのクローンが見逃された理由が、テストしたｓｃＦｖの数が限られているためであるのか、又は、ＥＬＩＳＡスクリーニングによる同定を妨げるいくつかの特徴があるためであるのかについて、理解したかった。そこで、我々はＰＣＲ増幅により６つの出現頻度の高いＶＨＣＤＲ３配列を有するｓｃＦｖをレスキューした。これらには、スクリーニングによって同定された３つのｓｃＦｖ（5E3R-1、5E3R-3及び5E3R-6）、並びに、同定されなかった３つのｓｃＦｖ（5E3R-2、5E3R-4及び5E3R-5、図４Ａ）が含まれた。完全なｓｃＦｖ配列又はこれらの高頻度ＶＨＣＤＲ３を有する配列をラウンド３後に回収するために、ｓｃＦｖコード領域の上流と下流に位置するプライマーと組み合わせて、これら６つのＶＨＣＤＲ３に特異的な相補オリゴヌクレオチドプライマー対を設計し使用した（図１Ｂ）。増幅産物をpNDS1ベクターにクローニングし、レスキューされた各ｓｃＦｖの１０個の独立したクローンの配列を決定した。すべてのクローンはＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ３の同じペアを含み、これは、観察された２つのＶＨＣＤＲ３とＶＬＣＤＲ３配列のパラレルな濃縮は主に単一クローンの濃縮によるもので、様々なＶＬＣＤＲ３配列と組み合わせたＶＨＣＤＲ３を有する種々のｓｃＦｖによるものではなかったことを示唆する。これらのレスキューされた６つのｓｃＦｖを発現させ、異なるフォーマットのＥＬＩＳＡを用いて標的５Ｅ３への結合について試験した。最初に我々は、選択プロセスと同じ状況での結合状態を試験するために、ファージの表面に提示されたｓｃＦｖを用いてＥＬＩＳＡを行った。分泌されたｓｃＦｖとの結合も、細菌上清又はペリプラズム画分を使用して試験した。ここで、後者の調製物は、より濃縮された粗ｓｃＦｖの供給源を提供する。最後に、各クローンを大規模に発現させ、固定化金属イオンクロマトグラフィーを用いてペリプラズム空間から精製し、定量化し、完全性と純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで検証した。次に、見かけの結合親和性を決定するために、精製したｓｃＦｖの用量反応実験を行った。異なるフォーマットと素材を用いたこれらの実験の結果を表２に要約する。選択プロセスによる濃縮と一致するようにファージ上に提示した実験では、全てのｓｃＦｖは５Ｅ３に結合した。対照的に、粗上清又はペリプラズム調製物による実験では、5E3R-1、5E3R-3及び5E3R-6クローンのｓｃＦｖのみが陽性シグナルを示し、このことは、5E3R-2、5E3R-4及び5E3R-5クローンがスクリーニングステップで同定されなかった理由を説明する。これらの３���のｓｃＦｖは、大規模生産後の低い収率に反映されているように、おそらく十分に発現又は分泌されなかった（表２）。興味深いことに、5E3R-4と5E3R-5はｓｃＦｖ形式では５Ｅ３と結合し、ＥＣ５０はそれぞれ２．３及び１４０ｎＭであった。可溶性ｓｃＦｖとして、5E3R-2はいかなるシグナルも与えず、これは標的への結合のためファージが必要であることを示唆している。これらの結果は、ＶＨＣＤＲ３配列頻度に基づくレスキューアプローチを用いることにより、ＥＬＩＳＡ法で同定された最良のｓｃＦｖ候補を得、さらに重要なことに、古典的スクリーニングアプローチを行わずに見逃した２つのさらなる候補を得ることができた。」（６ページ右欄１０行〜９ページ左欄３行）
カ　「Bypassing primary screening（一次スクリーニングの回避）」
　「このアプローチをさらに検証するために、他のターゲットに対し同じ手順を適用した。ＡＥ１ライブラリーを、可溶性ビオチン化ｈＩＦＮγに対し、３ラウンドのファージ選択を行った。各ラウンドの結果をシーケンシングし、ＶＨＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４領域をカバーする１００万を超えるリードを得た。予想したとおり、一度しか出現しない配列の数は減少し、複数回出現する配列の頻度はラウンド３の後に２５％に達するまで増加し、選択が行われたことが示された（表１）。ＶＨファミリーは、９５％を超える配列について同定することができ、この場合、ＶＨ１についての明らかな濃縮が観察された（図２Ｃ）。ＶＨＣＤＲ３の長さの分布は、５Ｅ３に対する選択で観察されたものと異なっており、この例では、異なるＣＤＲの長さが標的依存的に優先的に濃縮されたことを示した（図３Ｅ−Ｇ）。次に、ラウンド３の後に、それぞれのＶＨＣＤＲ３配列に対応するプライマーを使用したオーバーラップＰＣＲにより、最も頻度の高い１０個のクローンをレスキューした（図４Ｂ）。結合特性を特徴付けるために、これらのレスキューされたｓｃＦｖは可溶性形態で発現するか、又は繊維状バクテリオファージの表面に提示された。全ての候補は、ファージ又は精製ｓｃＦｖを用い、特異的な方法でｈＩＦＮγと結合した（表２）。しかし、細胞上清又はペリプラズム調製物をＥＬＩＳＡで試験した場合、４つの候補（IFNR-1、2、8及び9）はシグナルを示さず、これらの候補は一次スクリーニングの工程で同定されなかったことを示している。さらに、この第２の実験は、無作為に選んだクローンを事前にスクリーニングすることなく、抗体候補を回収できることを示した。加えて、それらの高い出現頻度を考慮して繰り返しスクリーニングされていたが標準的なスクリーニングアプローチでは見逃されていたであろう、最も濃縮されたクローンのかなりの割合（１０個中４個）が、このアプローチで同定できた。」（９ページ左欄５行〜右欄３行）
(５)　「DISCUSSION（考察）」
　「我々は、事実上、全てのＶＨＣＤＲ３及びＶＬＣＤＲ３配列のファージディスプレイ選択プロセス中の進化を追跡することが可能であることを初めて説明する。ＥＬＩＳＡスクリーニングによって同定されたヒットの配列とＶＨＣＤＲ３及びＶＬＣＤＲ３の頻度を比較することにより、いくつかのクローンでは見かけの結合親和性と濃縮が相関することを我々は見出した。しかし、一次スクリーニング中にいくつかの高度に濃縮されたクローンが見逃され、そしてこれらの『失われた』クローンがコードする抗体が有用な候補であることは明らかであった。
　近年、各工程（すなわち、ライブラリー生成、選択及びスクリーニング）を最適化又は単純化することにより、in vitro進化アプローチを改善するために多くの努力が費やされてきた。例えば、ハイスループット抗体アレイスクリーニングを用いることにより、選択ラウンドを劇的に減らすことができ、場合によっては省略することさえできることが示された(32)。ここでは、ＮＧＳプラットフォームの能力を用い、一次スクリーニングを完全に回避することが可能で、このことは、より関連性のあるアッセイにおいて詳細な特徴付けに直接進むために最も頻繁な配列に焦点を合わせる。さらに、古典的なＥＬＩＳＡスクリーニングによって同定されなかった標的特異的ｓｃＦｖは、それらの頻度に基づいて同定できる。この論文に記載された全てのｓｃＦｖは、ファージ上に提示された場合、標的と結合することができ、そしてファージＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを与える（表２）。標的との結合により駆動されるファージ選択プロセス中にそれらが濃縮されたので、このことは予想される。しかし、マイクロタイタープレート上での最適ではない増殖条件により、これらのｓｃＦｖの発現が十分ではないことから、かなりの割合のクローンが古典的可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて陰性であった。対照的に、我々は、配列決定及び頻度分析に基づいてレスキューされたすべてのクローンが、より最適な曝気及び増殖条件で、より大きな培養容量から可溶性ｓｃＦｖとして発現され、精製され得ることを示した。さらに、これらの精製ｓｃＦｖの大多数は、用量応答ＥＬＩＳＡにおいて、ナノモル範囲のＩＣ５０で陽性であった（表２）。ｓｃＦｖの初期の親和性にかかわらず、機能的に関連するエピトープに結合するために標的タンパク質上のエピトープ範囲を最大にするために広範なｓｃＦｖを回収することが重要であることから、選択プロセスからより多くの候補を同定する能力は重要である。」（９ページ右欄２６行〜１０ページ左欄１０行）
(６)　図とその説明文
ア　図４
　「図４　上位１０配列の頻度と進化。５Ｅ３(A)、ｈＩＦＮγ(B)に対するラウンド３後に最も多く存在した１０個のＶＨＣＤＲ３配列の頻度。ＩＭＧＴ命名法によるＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列とその長さ及びＶＨファミリーを示す。ＶＨＣＤＲ３配列及び頻度に基づいてレスキューされたクローンであるとともにＥＬＩＳＡによるスクリーニングでも同定された配列が示される。」（８ページ）
２　引用発明１
　上記１の下線部より、引用例１には、「重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３にのみ多様性が導入された、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子に基づくヒトｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリーＡＥ１を構築し、ラット抗マウスＴＬＲ４モノクローナル抗体５Ｅ３に対するパニングを３ラウンド行い、選択されたクローンからｓｃＦｖを分泌させ、標的５Ｅ３に対する特異的な結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングすることにより、標的に対しナノモルオーダーの結合ＥＣ５０を有する６種類のｓｃＦｖを同定するとともに、イルミナ社の次世代シーケンシングプラットフォームを用いて上記ライブラリー及び各選択ラウンド後のｓｃＦｖのＣＤＲ３の塩基配列を決定し、ラウンド３後に最も出現頻度の高い１０個のＶＨＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４配列を特定し、かつ、それらの濃縮プロファイルについても確認する（図４）、抗原特異的ｓｃＦｖ抗体のスクリーニング方法。」についての発明（以下、「引用発明１」という。）が記載されているものと認められる。
３　引用例２
　引用例２には以下の事項が記載されている。
(１)　表題
　「抗体発見を支援するためのファージディスプレイライブラリーの詳細な配列決定」
(２)　ABSTRACT（要約）
　「ファージディスプレイライブラリー及びin vitro選択プロセスの両方における抗体配列の分析のための次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の使用は、ここ数年でますます普及している。ここでは、ＤＮＡの調製、シーケンシング及びデータ解析のために開発された方法を紹介する。重要なパラメータは、公に利用可能なツールと組み合わせて使用されるハイスループット抗体配列分析用に設計された新しいソフトウェアを開発することでもあった。我々の方法の例として、異なる重鎖ＣＤＲ３多様化戦略を使用して生成された５つのｓｃＦｖライブラリーの広範な分析からのデータを提供する。この結果は、ライブラリーの設計が正しいことを確認するだけでなく、標準ＤＮＡシーケンシングアプローチによって容易に同定されない品質の差異を明らかにする。読み取り回数が非常に多いため、選択プロセス後に広範なシーケンスカバレッジが可能である。さらに、サンプルを多重化することができるため、コストは減少し、ＮＧＳの実行ごとに多くの情報が得られる。２つの抗原に対するファージディスプレイ選択後に得られた結果の例を使用した、頻度及びクラスタリング分析は、標的抗原に特異的であることが示された新規抗体断片を同定した。要約すると、ここに記載された方法は、ＮＧＳ分析がどのようにして複雑な抗体ライブラリーの品質管理を高め、抗体発見プロセスを容易にするかを実証する。」
(３)　「1. Introduction（序論）」
　「ここでは、イルミナGAIIx及びHiSeqシーケンサーと、ファージディスプレイを用いた抗体検出の様々なステップで適用した抗体に合わせたシーケンシングデータ解析手法の組合せについて説明する（図１）。最初に、
多様化戦略を用いて生成された一連の抗体ライブラリー
我々は、標的抗原に対するいくつかのファージディスプレイ選択ラウンドのアウトプットをプロセス中の抗体配列の頻度の進展に沿うように広範に配列決定した。分析後、データを用いて選択ラウンドから回収する濃縮された抗体配列を同定するのに使用し、抗原結合について試験した。
(４)　「2. Materials and Methods（材料と方法）」
ア　「2.1 Libraries（ライブラリー）」
　「この研究では、天然ヒト抗体レパートリーにおけるそれらの表現及びｓｃＦｖフォーマットにおけるそれらの安定性に基づいて選択された
限られた数のヒト抗体可変ドメイン生殖系列遺伝子を用いて構築された、ヒトｓｃＦｖを含む５つのファージミドライブラリーを使用した。
すべてのライブラリーにおいて、多様性は重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ３に限定され、可変鎖のすべてのフレームワーク（ＦＲ）、ＣＤＲｌ及びＣＤＲ２配列はヒト生殖系列配列（図２）に既知であり、同一である。
（ii）３人の健康なヒトドナーからのＰＣＲによって回収された天然のＣＤＲＨ３配列を挿入することによって、半合成ライブラリーＡＤ１（１．５×１０
１０
の形質転換体）を生成し、ＣＤＲＬ３はライブラリーＡＥ１と同じ合成多様性を含む；
(５)　「3. Results（結果）」
ア　「3.1 Preparation of samples for NGS（ＮＧＳ用サンプルの調製）」
　「
この研究で使用されたｓｃＦｖライブラリーは、ＶＨ及びＶＬのみのＣＤＲ３において多様化され、他のＣＤＲ及びフレームワーク領域は、ヒト生殖系列配列と同一である。ＣＤＲ３は、イルミナシーケンサーで得られる１００ｂｐの長さの単一の読み取りでカバーすることができる。
イ　「3.3 Sequence analysis（配列解析）」
　「ＮＧＳデータの分析に利用可能なソフトウェアは、主にＮＧＳの主なアプリケーションの１つとして残っているゲノムの組立てに専念している。したがって、Microsoft SQL ServerをベースにしたソフトウェアであるN2GSAbを開発し、抗体可変配列の解析に専念した。このソフトウェアは、品質管理ＦＡＳＴＱ生データファイルを使用して、標準デスクトップコンピュータで約１０分で＞１０７個のシーケンスを処理できる。N2GSAbは以下のタスクを実行する： （ｉ）それぞれの頻度に従ってソートされた配列のリストの生成； （ii）Ｖ生殖系列遺伝子同定； （iii）全てのリーディングフレームにおけるＤＮＡのタンパク質配列への翻訳； （iv）正しいリーディングフレームにおけるＣＤＲ３の同定； （ｖ）それらの頻度を有する唯一のＣＤＲ３のリストの生成； （vi）ＣＤＲ３の長さの決定。分析中に実行される手順については、『材料と方法』の項で詳しく説明している。アウトプットＣＳＶファイルはExcelで視覚化し、分析の目的に応じてさらに処理することができる（下記参照）。」（１０５ページ左欄２〜１８行）
ウ　「3.5 Following sequence enrichment during selection（選択中の配列濃縮の追跡）」
　「原則として、
選択プロセス中、標的に特異的なｓｃＦｖを提示するファージは、徐々に保持され、濃縮され、非特異的ファージは洗い流される。
ＡＤ１ライブラリーをモノクローナル抗体５Ｅ３に対する抗イディオタイプ候補を生成するために用いた[12,19]。両方の選択において、１０
６
以上の配列が得られ、３ラウンドのそれぞれについて分析された。
５Ｅ３に対する３ラウンドの選択後の単一のＣＤＲＨ３配列の劇的な濃縮であり、これは全配列の４７％を表していた
エ　「3.6 Identification of candidates（候補の特定）」
　「古典的アプローチでは、選択ラウンドからのランダムな個々の候補を結合アッセイ又は機能アッセイで試験する（図１）。スクリーニング能力及びアッセイの複雑さに応じて、数百から数千の候補を評価することができる。明らかに、最も富化された配列は、特に、ＡＤ１ライブラリーを用いた５Ｅ３での選択に関して上記のように選択ラウンドを支配する少数の配列が優勢である場合に、繰り返し選択され、試験される。さらに、ファージディスプレイ選択の限界は、発現されたｓｃＦｖの毒性及び細菌増殖の差などの他の因子が、標的抗原に対する高い親和性を有するｓｃＦｖを提示しないファージの増幅をもたらし得ることである[3,4,24,25]。
　代わりに、
ＮＧＳ分析に基づけば潜在的な候補を選択することができる。候補を同定するための第１の簡単なアプローチは、標的に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする可能性のある最も頻繁に、したがって、最も濃縮された配列を選択することである。
あまり頻繁でない配列を考慮し、候補のより多様性を評価するために、濃縮されたＣＤＲＨ３パターンを同定するためのクラスタリング分析を行った。
オ　「3.7 Clone rescue（クローンのレスキュー）」
　「短い読み取り長さのために、分析はｓｃＦｖの小さな部分に対して行われ、ＣＤＲＬ３又はＶＬ生殖細胞系列に関する情報を提供しない。しかし、ＣＤＲＨ３配列は、２ステップＰＣＲアプローチ（図２Ｃ）によって選択ラウンドからｓｃＦｖ全体を増幅及び回収するための特異的オリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。次いで、増幅されたｓｃＦｖをファージミド又は発現ベクターにクローニングし、サンガー法を用いて完全に配列決定することができる。単一のＶＨが複数のＶＬとの組合せで見出される可能性があるので、異なる組合せが見いだされるかどうかを決定するためにいくつかのコロニーを配列決定すべきである。次いでｓｃＦｖを産生及び精製して、ＥＬＩＳＡ又は他のアッセイによって標的特異的結合を評価することができる。
我々は、モノクローナル抗体５Ｅ３に対するライブラリーＡＤ１を用いて３回目の選択で見出されたクラスター番号１及び５の主要なＣＤＲＨ３配列を表す２つのｓｃＦｖをレスキューした（表２）。
両方のｓｃＦｖは、発現され、固定化された金属イオン親和性クロマトグラフィーを用いて、そのＣ末端ヒスチジンタグを介して精製された。これらのｓｃＦｖの特異性をＥＬＩＳＡによって試験した
両方のｓｃＦｖは５Ｅ３に特異的に結合し、対照抗体には結合せず、それらがさらに特性決定できる抗イディオタイプ候補であることを示唆している。これらの結果は、標的特異的抗体が、ＮＧＳデータの分析に基づいて同定及び回収され得ることを実証する。
(６)　「4. Discussion（考察）」
　「古典的ファージディスプレイ法で同定されるためには、抗体断片は、抗体の最終的使用に必ずしも関連しない選択基準を満たさなければならない。抗体フラグメントは、バクテリオファージの表面での表示と一致しなければならず、スクリーニング目的のためにマイクロプレート形式で可溶性フラグメントとして発現され、ＩｇＧとして再構築されたときにその特性を保持する必要があり、これは最終用途に最も一般的に使用される形態である。選択プロセス中に濃縮されているが、スクリーニングによって同定することができなかったいくつかの配列は、発現され、精製され、優れた標的結合能力を有することが示されている[12]。したがって、
ＮＧＳに基づいた選択及びレスキュー手順は、抗体発見プロセス（図１）における代替的かつ相補的な経路を表す。
(７)　図又は表とその説明文
ア　図１
　「図１　ファージディスプレイによる抗体発見プロセス及びＮＧＳの可能な適用。古典的アプローチでは、
ファージ上に提示された抗体断片のライブラリーを標的に対する複数の選択ラウンドで使用し、標的へのファージ結合の累進的な濃縮をもたらす。
ＮＧＳデータ分析後に得られた頻度及びクラスタリング情報に基づいて、潜在的な標的特異的候補物を回収し、活性について試験することができる
イ　表２
　「表２　ＩＦＮγに対してＡＥｌライブラリー及びモノクローナル抗体５Ｅ３に対してＡＤ１ライブラリーを使用した第３ラウンドの選択のためのＣＤＲＨ３配列のクラスター化。
　各選択の５つの最も頻繁なクラスターが表される。アミノ酸はそれらの化学的特性により色分けされる。・・・」（１０７ページ）
４　引用発明２
　上記３の下線部より、引用例２には、「多様性が重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３に限定されたヒトｓｃＦｖを含むＡＤ１半合成ファージディスプレイライブラリーについて、標的抗原であるモノクローナル抗体５Ｅ３に特異的なｓｃＦｖを提示するファージが濃縮され非特異的ファージは洗い流される３ラウンドの選択プロセスを実施し、各選択プロセスの終了後に、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術を使用して標的に特異的に結合したｓｃＦｖのＣＤＲＨ３の塩基配列を決定し、ラウンド３後には塩基配列のクラスタリング分析と主要な塩基配列を決定するとともに、その出現頻度順に順位づけを行い、出現頻度の多い５つのクラスター化された主要な塩基配列を表２に示すとともに、最も頻繁に出現する配列を選択する、標的抗原特異的ｓｃＦｖ抗体のスクリーニング方法。」の発明（以下、「引用発明２」という。）が記載されているものと認められる。
５　引用例３
　引用例３自体は、本件特許の出願後に異議申立人が印刷したウエブページの印刷物であるものの、これと同内容の事項が、本件特許の出願前に頒布された刊行物に記載されていたか、電気通信回線を通じて公衆に利用可能となっていたと仮定して、以下に引用例３についての検討を行う。
　引用例３には以下の事項が記載されている。
(１)　タイトル
　「抗原免疫動物から構築したアルパカＶＨＨ抗体ファージライブラリからの抗原特異的抗体の単離と機能解析」
(２)　抄録本文
ア　目的
　「抗体医薬や臨床診断薬で使用されている抗体は、通常ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ抗体は、製造過程において動物細胞やハイブリドーマを使用する必要があり高コストである。この問題を解決する１つの方法として、本研究では、自然界に存在する抗体で最小の抗原認識ドメイン構造を持つラクダ科動物由来ＶＨＨ抗体に注目し、抗原免疫動物由来の抗体ファージライブラリを使った免疫抗原特異的な抗体の単離を試みたので報告する。」
イ　結果・考察
　「アルパカの免疫にはモデル抗原として、精子由来タンパク質であるIzumo sperm-egg fusion protein 1 precursorのＮ末端フラグメント及びキャリアータンパク質として一般的に使用されているＫＬＨを用いた。免疫後のアルパカ血清から重鎖抗体を分離精製し、抗原に対して重鎖抗体力価が上昇している事を確認した。その後、採血を行いアルパカ末梢血リンパ球由来のｍＲＮＡを基に、ファージディスプレイ技術を用いて、１０７の多様性を持つＶＨＨ抗体ライブラリを構築した。この免疫ライブラリを用いて抗原に対してバイオパニングを行ったところ、わずか１ラウンドで抗原特異的結合活性を持つファージの濃縮を確認した。１ラウンド後のライブラリから単離したクローンの特異性を解析したところ、驚くべきことに約５割が抗原特異的なクローンであった。現在、単離クローンの配列解析をはじめ、ＶＨＨ抗体の特性解析を行っているところである。さらにナイーブライブラリから得られた抗体との親和性等の観点からも、免疫ライブラリの有用性について議論したい。」
ウ　結論
　「ナイーブライブラリに比べ、免疫ライブラリでは、バイオパニングの際の濃縮効率も高く、目的抗原に対して確実に抗体を単離する場合に非常に有効であると考えられる。本研究において、免疫ライブラリから単離されたＶＨＨ抗体の特性を明らかにすることでＶＨＨ抗体の産業的な応用に貢献できると思われる。」
６　引用発明３
　上記５より、引用例３には、「Izumo sperm-egg fusion protein 1 precursorのＮ末端フラグメントで免疫されたアルパカ由来のＶＨＨ抗体ファージライブラリーを構築し、このライブラリーを用いて前記抗原に対してバイオパニングを１ラウンド行い、抗原特異的結合活性を持つファージを濃縮する方法。」についての発明（以下、「引用発明３」という。）が記載されているものと認められる。
７　引用例４
　引用例４には以下の事項が記載されている。
(１)　表題
　「スクリーニングではなく、形質細胞の可変領域遺伝子レパートリーの分析により得たモノクローナル抗体」
(２)　要約の項
　「抗原特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び抗体フラグメントの単離は、不死化Ｂ細胞１，２又は組換え抗体ライブラリー３−６のハイスループットスクリーニングに頼る。我々は、ハイスループットＤＮＡ配列決定及びバイオインフォマティクス分析を用いて、免疫マウスの骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）由来の抗体可変領域（Ｖ）遺伝子レパートリーを調査することにより、スクリーニング工程を回避した。不死化することができないＢＭＰＣは、循環する抗体の大半を産生する。我々は、ＢＭＰＣのＶ遺伝子レパートリーが免疫後に高度に偏り、最も豊富な配列が全レパートリー中の〜１％から＞１０％の間の出現頻度となることを見出した。我々は、最も豊富な可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子をそれらの相対頻度に基づいてペアにし、自動遺伝子合成を用いてそれらを再構築し、組換え抗体を細菌又は哺乳類細胞で発現させた。３つの抗原のうちの１つで免疫化した６匹のマウスからこのようにして生成された抗体は、圧倒的に抗原特異的であった（２１／２７又は７８％）。高い血清力価を有するマウスから生成されたものは、ナノモルの結合親和性を有した。」
(３)　本文の項
ア　「我々は、スクリーニングを必要とせずに、抗体単離のための簡単で迅速な方法を開発した。我々は、ハイスループットＤＮＡ配列決定を利用して、免疫マウスからの完全に分化した成熟Ｂ細胞である抗体分泌ＢＭＰＣのｍＲＮＡ転写産物から誘導されたＶＬ及びＶＨ遺伝子レパートリーを解析した。バイオインフォマティクス分析の後、いくつかの豊富なＶＬ及びＶＨ遺伝子配列を各免疫マウスのレパートリー内で同定することができた。ＶＬ及びＶＨ遺伝子は、レパートリー内のそれらの相対頻度に従ってペアにされた。抗体遺伝子は、自動液体ハンドリングロボットによるオリゴヌクレオチド及びＰＣＲアセンブリによって迅速に合成された。組換え抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び全長ＩｇＧとして細菌及び哺乳動物系で発現された（図１）。最後に、得られた抗体が抗原特異性が圧倒的に（２１／２７又は７８％）特異的であることを確認し、スクリーニングなしでｍＡｂの迅速かつ直接的な単離を可能にすることが確認された。」（９６５頁右欄７〜２１行）
イ　「我々のアプローチは、動物の循環する免疫グロブリンの大部分の合成を担うＢ細胞の集団であるＢＭＰＣの抗体レパートリーを調査することを利用している１６。我々はマウスでこの方法を検証したが、同じアプローチがヒトを含む霊長類に容易に拡大できないと考える理由はない。さらに、これらの状況でＢＭＰＣは依然として偏りを生じる可能性があるので、この技術はウイルスや細菌病原体などのより複雑な抗原による抗体発見のために拡張することが可能である。」（９６８頁左欄下から７行〜右欄２行）
８　引用例５
　引用例５の「Section 1, Phage Display（第１節　ファージディスプレイ）」、「Chapter 3, Antibody Libraries（第３章　抗体ライブラリー）」には以下の事項が記載されている。
(１)　「ANTIBODY LIBRARIES（抗体ライブラリー）」
ア　「Immune Versus Nonimmune Libraries（免疫対非免疫ライブラリー）」
　「原則として、非常に大きなナイーブ又は半合成確立ライブラリーは、免疫を必要とせず、又はライブラリー構築に関わる研究者を必要とせずに、所望の特異性の高親和性抗体の選択の可能性を提供する。・・・しかしながら、もし有用な親和性の抗体がそのようなライブラリーから簡単に単離できないか、特定の分子に対する一定範囲の抗体を望む場合には、免疫がベストの選択かもしれない。」（3.8ページ下から２行〜3.9ページ８行）
イ　「Species for Immune Libraries（免疫ライブラリーのための種）」
　「抗体に治療目的が要求される場合には、ヒトライブラリーは明白な選択である。」（3.9ページ１９〜２０行）
第５　判断
１　本件発明１
(１)　新規性について
ア　本件発明１と引用発明１とを対比する。前記第２に示した本件発明の請求項１及び２の記載より、引用発明１におけるｓｃＦｖは本件発明１における低分子化抗体の一種である。また、本件特許の明細書（以下、単に「本件明細書」という。）の段落【００１５】に、「相互作用検出プロセスとしては、ファージディスプレイ法・・・が挙げられる。このプロセスは１回のみ行ってもよく、複数回行ってもよい。例えばファージディスプレイにおけるパニング工程は、１回のみ行ってもよく、複数回行うこともできる。」と記載されていることから、引用発明１におけるラット抗マウスＴＬＲ４モノクローナル抗体５Ｅ３に対するパニングを３ラウンド行う工程は、本件発明１における抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程に相当し、本件明細書の段落【００１８】に、「大規模配列解析は、従来公知の方法に従い行うことができ、例えば・・・ギガシーケンサーなどの大量の塩基配列情報を処理できるＤＮＡシーケンサーを用いることにより行うことができる。このようなシーケンサーとしては、イルミナ社製の次世代ＤＮＡシーケンサーMiSeqが挙げられる。」と記載されていることから、引用発明１におけるイルミナ社の次世代シーケンシングプラットフォームを用いた塩基配列決定は、本件発明１における大規模配列解析による塩基配列決定に相当する。そうしてみると、両発明は、「低分子化抗体の可変領域を含む、脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、及び、大規模配列解析により前記塩基配列の出現頻度を求める工程を含む、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。」の点で一致し、脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて、本件発明１が抗原免疫された脊椎動物のライブラリー、いわゆる免疫ライブラリーを使用するのに対し、引用発明１は重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３にのみ多様性が導入されたライブラリー、いわゆる合成ライブラリーを使用する点で相違し（相違点１）、また、本件発明１が大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、及び前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を有するのに対し、引用発明１では、大規模配列解析によりライブラリーと相互作用検出プロセス後の低分子化抗体のＣＤＲ３の塩基配列を決定し、３回目の相互作用検出プロセス後に最も出現頻度の高い１０個のＶＨＣＤＲ３配列を特定している点で相違する（相違点２）。
イ　本件発明１と引用発明２とを対比する。前記アで示した本件発明及び本件明細書の記載より、両発明は、「低分子化抗体の可変領域を含む、脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、及び、大規模配列解析により前記塩基配列の出現頻度を求める工程、当該出現頻度を利用して低分子化抗体を選別する工程を含む、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。」の点で一致し、脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて、本件発明１がいわゆる免疫ライブラリーを使用するのに対し、引用発明２は半合成ライブラリーを使用する点で相違し（相違点１）、また、出現頻度を利用して低分子化抗体を選別する工程について、本件発明１では、前記プロセスの前後で出現頻度を比較し、出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を有するのに対し、引用発明２では、ラウンド３後に最も頻繁に出現する塩基配列を選択する工程を有する点で相違する（相違点２’）。
ウ　小活
　前記ア及びイのとおり、本件発明１と引用発明１又は引用発明２には上述した相違点があることから、本件発明１が引用例１に記載された発明又は引用例２に記載された発明であるということはできない。
(２)　進歩性について
ア　引用例１又は引用例２を主引用例とする場合
　本件発明１と引用発明１の相違点２及び本件発明１と引用発明２の相違点２’は、いずれも、低分子化抗体の選別において、大規模配列解析による塩基配列の出現頻度を相互作用プロセスの前後で比較し、出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体として選別する工程が、引用発明１及び引用発明２には記載されていないというものであることから、これらの相違点をまとめて検討する。
　引用発明１では、イルミナ社の次世代シーケンシングプラットフォームを用いてライブラリー及び各選択ラウンド後のｓｃＦｖのＣＤＲ３の塩基配列を決定し、ラウンド３後に最も出現頻度の高い１０個のＶＨＦＲ３-ＣＤＲ３-ＦＲ４配列を特定し、かつ、それらの濃縮プロファイルについても確認しているところ、その結果は、「ラウンド１及びラウンド２の後に増加して最も多くなった配列＃３を除いて、ほとんどの場合、ラウンド３の選択後に主要な濃縮が観察された（図４Ａ）。これらのトップ１０の配列はラウンド３の後の全配列の１７％超を占め、また、３つの最も豊富な配列は１４％で」あった（前記第４の１(４)ウ）ことから、配列＃１や配列＃２を有する抗体は、配列＃３を有する抗体と比較して、配列の出現頻度が一定以上上昇したものと認められる。ここで、引用例１では、「ラウンド３の後に見いだされるいくつかの配列は、ＥＬＩＳＡスクリーニングでは同定されなかった。特に、ラウンド３後に、全ての配列の６％近くを占め２番目に出現頻度の高い配列であるクローン＃２は、同定されなかった（図４）。」ことから、その理由を理解するために、「我々はＰＣＲ増幅により６つの出現頻度の高いＶＨＣＤＲ３配列を有するｓｃＦｖをレスキューし」、「これらのレスキューされた６つのｓｃＦｖを発現させ、異なるフォーマットのＥＬＩＳＡを用いて標的５Ｅ３への結合について試験した」ところ、「可溶性ｓｃＦｖとして、5E3R-2はいかなるシグナルも与えず、これは標的への結合のためファージが必要であることを示唆している」と記載されている（前記第４の１(４)オ）。ここで、上記記述のうち、「２番目に出現頻度の高い配列であるクローン＃２」は配列＃２のことであり、また、「5E3R-2」は、表４Ａより、２番目に出現頻度の高い配列であるクローン＃２、すなわち、配列＃２のことである。そうしてみると、引用例１には、ライブラリー及び各選択ラウンド後のｓｃＦｖのＣＤＲ３の塩基配列を決定し、ラウンド３後に配列の出現頻度が一定以上上昇した抗体（配列＃１及び配列＃２を有する抗体）の中で、配列＃２を有する抗体は、単独では標的５Ｅ３と結合することができなかったこと、すなわち、抗原に特異的な抗体ではなかったことが記載されている。
　このように、引用発明１では、相互作用検出プロセスの最終段階の後における塩基配列の出現頻度を大規模配列解析により求めているものの、当該プロセスの最終段階の後に配列の出現頻度が一定以上上昇した抗体には、抗原に特異的な抗体ではない抗体が含まれていることから、引用例１に接した当業者は、「相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する」ことにより、「抗原特異的低分子化抗体」をスクリーニングすることが可能となると理解するものではなく、引用例１には、塩基配列の出現頻度を相互作用検出プロセスの前後で比較し、かつ、前記プロセスの前後で塩基配列の出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別することにより、抗原特異的低分子化抗体をスクリーニングするという技術思想が開示されているものとは認められない。
　また、引用例２には、大規模配列解析を利用した低分子化抗体の選別について、「ＮＧＳ分析に基づけば潜在的な候補を選択することができる。候補を同定するための第１の簡単なアプローチは、標的に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする可能性のある最も頻繁に出現する、したがって、最も濃縮された配列を選択することである。」（前記第４の３(５)エ）と、相互作用検出プロセス後に最も出現頻度が高いものを選別することが明記されている一方、引用例２には、相互作用プロセスの前後で塩基配列の出現頻度を比較して、出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体として選別するという技術思想は記載も示唆もされていない。
　さらに、引用例３ないし５には、抗体のライブラリーや抗原抗体間の相互作用検出プロセス後の抗体について、大規模配列解析によってその塩基配列を検討することは記載も示唆もされていない。
　このように、引用例１ないし５には、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニングに際して、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を抗原抗体間の相互作用検出プロセスの前後で比較する工程、及び前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を含めることについての記載も示唆もない。
イ　引用例３を主引用例とする場合
　本件発明１と前記第４の６に示した引用発明３とを対比すると、両発明は、「低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程を含む抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。」の点で一致するものの、本件発明１が大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、及び前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を有するのに対し、引用発明３はこれらの工程を有しない点で相違する。
　そして、引用例１ないし５には、相互作用プロセスの前後で塩基配列の出現頻度を比較して、出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体として選別する点が記載も示唆もされていないことは、上記アにおいて述べたとおりである。
ウ　本件発明の効果について
　本件明細書には「本発明で発現頻度の向上により見出された抗体は、結合性により見出された抗体よりも優れた結合特性を有していた。従って、発現頻度による複数の抗体の選別により、複数の優れた特異性を有する抗体が得られることが明らかになった。」（段落【００１２】）、「低分子化抗体の可変領域をコードする塩基配列において、プロセス前後で出現頻度が上昇したものを本発明では選択する。これにより、抗原に対する高い特異性を有する低分子化抗体を多数獲得することができる。」（段落【００１９】）と記載されており、このことは、実施例１の「（８）特異的抗体配列候補の選択方法」の項において、「パニング後の出現数上位８配列の内、ＶＨＨ抗体のホールマーク配列（・・・）を有する、パニング前後で出現頻度が５０倍以上向上した２つの配列（I_1R_013、I_1R_038）を選んだ（表１）。」（段落【００４８】）と記載されている配列について、「（１１）活性測定」の項において、「I_1R_013とI_1R_038は抗原であるIZUMO1PFFに強固に結合することが明らかとなった。しかし出現頻度のスクリーニング前後の出現頻度の増加が少なかったI_1R_003は抗原と結合しなかった（図２）。」（段落【００５３】）と記載されていることからも裏付けられているように、本件発明１は、引用発明１ないし３と相違する構成を採用することによる有利な効果を有している。
エ　小活
　したがって、本件発明１は、引用例１に記載された発明、引用例２に記載された発明又は引用例３に記載された発明に、他の証拠に記載された発明又は技術常識若しくは周知技術を組み合わせることにより当業者が容易に発明をすることができたということはできない。
(３)　特許異議申立人の主張について
ア　申立人は、引用例１の図４には、パニングのラウンド１の前後、ラウンド２の後、ラウンド３の後の塩基配列の出現頻度が比較され、クローンＤ１１、Ｄ６及びＤ４が富化されたことが確認されているので、本件発明１と引用例１に記載された発明の間に相違点はない旨を主張する。しかし、図４の折れ線グラフからクローン＃１〜＃１０で示された塩基配列の出現頻度を読み取ることはできるものの、引用例１には各パニング工程前後でのこれらの塩基配列の出現頻度を比較することは記載されていないし、申立人が富化されたことが確認されているというクローンＤ１１等は、通常のパニング工程により富化されたものであって塩基配列の出現頻度を比較することにより特定されたクローンではない。したがって、申立人の上記主張は失当である。
イ　申立人は、引用例２に「増加する頻度で見出される配列のサブセットの濃縮及び全体的な多様性の劇的な減少が観察された（図８）」と記載されている（前記第４の３(５)ウ）ことが、パニング前後の配列出現頻度の比較された結果であることから、本件発明１と引用例２に記載された発明の間に相違点はない旨を主張する。しかし、申立人が指摘する図８は、特定の塩基配列についてのパニング前後の出現頻度を示したものではなく、申立人が指摘する引用例２の記述から、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニングに際して、大規模配列解析による塩基配列の出現頻度をパニング前後で比較し、出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別することが記載ないし示唆されているということはできない。したがって、申立人の上記主張を採用することはできない。
２　本件発明２ないし８
　本件発明２ないし４は本件発明１をさらに特定する発明であり、本件発明５は、本件発明１において特定された各工程に、選別された低分子化抗体をコードするＤＮＡを発現させて低分子化抗体を得る工程を追加して抗原特異的低分子化抗体の製造方法とする発明であり、本件発明６ないし８は、上記本件発明５をさらに特定する発明であるが、前記１のとおり、本件発明１が新規性及び進歩性を有するものであることから、本件発明２ないし８に新規性又は進歩性欠如の拒絶の理由があるということはできない。
３　まとめ
　以上のとおり、本件発明１ないし８は、引用例１ないし３に記載された発明ではなく、また、引用例１ないし５に記載された発明並びに技術常識及び周知技術から当業者が容易に発明をすることができたものではない。
第６　むすび
　したがって、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては、本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成３１年４月２３日（２０１９．４．２３）