(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子と、該標的遺伝子に対し相補的な塩基配列およびその３’末端に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニンとチミンもしくはウラシル、又はグアニンとシトシンの組み合わせからなり、ｎは５以上の整数を表す）を有するオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせた後、前記繰り返し配列を構成するヌクレオチドの標識体及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼを用いて前記繰り返し配列を付加伸長させることを特徴とするオリゴヌクレオチドの標識方法。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼが、テルムス・アクアティクス（Thermusaquaticus）、テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorlis）及びピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）よりなる群から選ばれる微生物由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識体が、ラジオアイソトープで標識又は標識化合物で修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
標識化合物がジゴキシゲン、フルオレセイン（Fluorescein）、ローダミン（Rhodamine）及びアビジン（Avidin）・ビオチン（Biotin）よりなる群より選ばれる標識化合物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付加伸長させる反応を、３０〜７５℃又は５０〜７０℃の一定温度で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
付加伸長させる反応を５５℃及び７２℃の反復処理する工程で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子と、該標的遺伝子に対し相補的な塩基配列を有する請求項１ないし６のいずれかに記載の方法で標識したオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることを特徴とする該標的遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は合成オリゴヌクレオチドの標識方法に関する。更に詳細には、５’側に任意の塩基配列及び３’末端に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは塩基の個数を表す）を有するオリゴヌクレオチドに、ラジオアイソトープ（ＲＩ）で標識又は標識化合物で修飾したヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで付加伸長させることからなる該オリゴヌクレオチドの標識法およびその利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
合成オリゴヌクレオチドは近年分子生物学のあらゆる分野に応用されている。特に標識した合成オリゴヌクレオチドは、ある特定の配列をもった遺伝子を検出する際に最も簡便に調製できるプローブとして汎用されている。プローブを用いた遺伝子の検出感度は、一義的にはプローブに取り込まれた個々の標識化合物が発するシグナルの強さ及び標識化合物の数によって決まる。したがって、生体内あるいは細胞内に微量に存在する特定遺伝子を検出するには高感度のプローブを効率よく作用させる必要がある。
【０００３】
ＲＩは標識化合物として最も強いシグナルを示すが、「放射線を発生するために特別な設備を必要とする」あるいは「有効期間が短い」等の理由により汎用性に欠ける。非ＲＩの標識化合物として、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）やローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）といった蛍光を発する標識化合物（Ｄｉｒｋｓら（１９９１）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １９４，  ３１０−３１５）、抗体と反応するビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を介した酵素学的発色系の標識化合物（Ｌａｎｇｅｒら（１９８１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８，  ６６３３−６６３７）等が挙げられるが、これらのシグナルはＲＩ程強くない。近年、シグナル強度がＲＩに匹敵する非ＲＩの標識化合物としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が注目を浴びている（Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔ．１８３−１９４）。
【０００４】
従来、合成オリゴヌクレオチドの標識には、酵素や色素などの標識化合物又はＲＩ標識されたアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを化学合成する際に化学修飾する方法（Ｐｉｅｌｅｓｓら（１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８，  ４３５５−４３６０）、デオキシヌクレオチド・トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）もしくはジデオキシヌクレオチド・トリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ）の標識体をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の酵素反応によってオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するテイリング法（Ｓｃｈｍｉｚら（１９９１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９２，  ２２２−２３１）及び光化学反応でビオチンを共有結合させるフォトビオチン法（Ｆｏｒｓｔｅｒら（１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３，  ７４５−７６１）等が使用されてきた。
【０００５】
一般に、テイリング法を用いた場合の検出感度は、取り込まれる標識分子の数に依存する。例えば、ＴｄＴは、平均的して数十塩基の長さのテイル（尾）を付加する（Ｓｃｈｍｉｔｚら（１９９１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９２，  ２２２−２３１）。この方法により得られるオリゴプローブを用いてノーザンブロットハイブリダイゼーション又はサザンブロットハイブリダイゼーションを行った場合には、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡを１ｐｇまで検出することができる。
【０００６】
さらに微量のものを検出する場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉら  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  ４８７−４９１）が使用される。ＰＣＲ法は、微量に存在する標的遺伝子の遺伝子断片を１組以上のプライマーを用いて増幅させ、この増幅した遺伝子断片を検出することによって標的遺伝子の存在を明らかにする方法である。したがって、組織などに存在する微量の標的遺伝子を検出するには非常に有効な方法と言える。しがしながら、この方法では遊離した遺伝子断片を検出するために、例えば、プローブを組織に直接作用させるノーザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションとは異なり、標的遺伝子の局在を明らかにすることはできない。また、ＰＣＲ法に関しては、増幅させる遺伝子の部位によっては増幅効率が低く高感度を得られない場合があることや特定のＲＮＡの存在をＰＣＲ法で証明するには逆転写反応を要し間接的な証明しかできない等、問題点が指摘される。
【０００７】
前述したように、非ＲＩで標識したプローブを用いて目的遺伝子を高感度に検出するには、多量に標識化合物をオリゴヌクレオチドに取り込ませる必要がある。しかしながら、このようなプローブを使用したときには、ハイブリダイゼーションにあずかる配列部位の割合が小さくなり、立体障害を起こすためにハイブリダイゼーション効率が落ちるという問題を生じることがある。特にイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）による組織内の特定の遺伝子を検出する際には、プローブが組織の中へ浸透していかなければならないために、プローブのサイズは極めて重要である。
【０００８】
また、従来の酵素反応を用いたオリゴヌクレオチドの標識法は、非特異反応が高くイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションには適さない。すなわち、オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、例えば、ＴｄＴを用いて標識化合物が結合したｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰをオリゴヌクレオチドの５’又は３’側に付加しようとすれば、この酵素は３塩基以上の核酸に非特異的にｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを付加する活性を持っているために、組織又は細胞内に存在する目的以外の核酸断片をも標識してしまい、その結果、非特異反応が生じることになる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来の方法は、予め標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる方法であるために、感度を高めるための標識化合物の取り込み量とハイブリダイゼーションの反応性との間に矛盾がある。特に、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションにおいては反応性の低下が問題となる。
【００１０】
本発明は、５’側に検出しようとする遺伝子に対し相補的なオリゴヌクレオチドを有し、３’側に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を有するオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＩで標識又は標識化合物で修飾したヌクレオチドを用いて鋳型非依存的に標識する方法を提供することを目的としている。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、上記のオリゴヌクレオチドを標識する方法を利用し、組織、細胞又はウイルス等の特定遺伝子の検出方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、上記方法により標識した標識オリゴヌクレオチド、及び該標識オリゴヌクレオチドを用いて、組織、細胞又はウイルス等の特定遺伝子の検出方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、上記の方法により標識した標識オリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＰＣＲ法により特定遺伝子を検出するためのプローブの作製方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、テルムス・アクアテイクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼが、ＡＴの繰り返し配列からなるオリゴマーを短時間で伸長させる酵素活性を有することを発見し、更に、５’側にｐＵＣ１９プラスミドの一部の塩基配列を有し、３’側に該繰り返し配列を有するオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及びジゴキシゲニン標識したデオキシウラシル・トリフォスフェート（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）を含む混液中、一定温度で反応させることにより、該オリゴヌクレオチドの３’側に標識ＡＵの繰り返し配列からなる長鎖が付加されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
従って、本発明は、ｐＵＣ１９の一部の塩基配列及びＡＴの繰り返し配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識する方法及び該方法によって得られる標識オリゴヌクレオチドを包含する。
【００１６】
また、本発明は、上記方法及び標識オリゴヌクレオチドを用いて、組織、細胞又はウイルス等に導入されたｐＵＣ１９又は外来遺伝子を含むｐＵＣ１９を検出することによる、特定遺伝子を検出する方法を包含する。
【００１７】
また、本発明は、５’側に任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることによる、該配列に対し相補的な配列を有する遺伝子を検出する方法を包含する。
【００１８】
又、本発明は、上記方法により得られる標識オリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＰＣＲ法により、特定遺伝子を検出するためのプローブを作製する方法を包含する。以下に、本発明について更に詳述する。
【００１９】
本発明の方法及び標識オリゴヌクレオチドは、５’側に任意の塩基配列を有し、３’側に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を有するオリゴヌクレオチド、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドの標識体により特徴づけられる。
【００２０】
本発明を構成するオリゴヌクレオチドは、化学的合成法、例えば、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、同装置のプロトコールに従った方法によって合成される。得られたオリゴヌクレオチドの脱保護とレジンからの切り出しは、アンモニウム法により実施される。脱保護レジンから切り出された粗オリゴヌクレオチドの精製は、核酸を精製する際に通常使用される方法、例えば、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を適宜選択して行うことができる。
【００２１】
また、オリゴヌクレオチドは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らが述べている一般的な遺伝子のクローニング法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，１９８９）又はＰＣＲなどの遺伝子組換え技術により調製することが出来る。
【００２２】
標的遺伝子と特異的に結合させるためのオリゴヌクレオチドの５’側配列は、特異的にハイブリダイズする長さであればどのような鎖長でも良い。好ましくは、５’側の塩基が１５個以上であるオリゴヌクレオチドが使用される。
【００２３】
（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは塩基の個数を表す）は、少なくとも４塩基以上を必要とする。好ましくは、５〜２０塩基、更に好ましくは、２０塩基以上を有するオリゴヌクレオチドが使用される。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドを標識する方法は、サザーンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブイリダイゼーション及びイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション等において標的遺伝子を検出する際に使用される。
【００２５】
すなわち、本発明の方法は、標的遺伝子と５’側に該標的遺伝子に対し相補的な塩基配列及び３’側にＡＴ又はＡＵの繰り返し配列を有するオリゴヌクレオチドとを常法に従ってハイブリダイズした後、ヌクレオチド標識体及びＤＮＡポリメラーゼ存在下で、該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末側に、標識したＡＴ又はＡＵの繰り返し配列を伸長させることによって標的遺伝子を検出する方法の中で使用される。
【００２６】
また、本発明の方法により得られる標識オリゴヌクレオチドは、プローブとして従来の方法と同様に特定遺伝子を検出するのに利用される。
【００２７】
ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、及びフィロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼから選択されるが、好ましくは、テルムス・サーモフィルス由来の該ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【００２８】
標識ヌクレオチドとしては、32Ｐ，3Ｈ，35Ｓ等から選択されるラジオアイソトープで標識又はフルオレセイン，ローダミン，テキサスレッド等から選択される標識化合物で修飾したヌクレオチドが使用される。好ましくは、ジゴキシゲニン標識したヌクレオチドが使用される。
【００２９】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’側がＡＴの繰り返し配列である場合は、標識Ａ及びＴ又はＵが使用され、ＧＣの繰り返し配列の場合は、標識Ｇ及びＣが使用される。
【００３０】
ＤＮＡポリメラーゼ反応は、３０〜７５℃の一定温度で行われる。好ましくは、５０〜７０℃の一定温度で行われる。また、通常のＰＣＲにおいて使用されるアニーリング温度５５℃と伸長反応温度７２℃で反復処理を行うことによっても伸長反応を行うことが出来る。標識した繰り返し配列の鎖長は、標的遺伝子の量又は使用する反応系に応じ、適宜、反応時間を調節することにより変えることが出来る。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によると、オリゴヌクレオチドの３’側を標識する方法及び標識オリゴヌクレオチド並びに該標識法及び標識ヌクレオチドを利用することにより、特定遺伝子を検出する方法が提供される。
【００３２】
例えば、本発明のオリゴヌクレオチド標識法によると、オリゴプローブの標識化合物の取り込み量は一般的に使用されているＴｄＴに比べて数倍から数十倍優れており、それに伴いノーザンブロットハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法による遺伝子検出感度を従来法に比べて数倍から数十倍上げることが可能である。
【００３３】
また、本発明の方法によれば、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションにおいて組織の中でオリゴプローブの標識を行えるので、プローブの組織浸透性を妨げることなく、該プローブを標的遺伝子に結合させた後、高感度に標識することが可能である。イン・サイチュ・ポリメラーゼ・連鎖反応（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ）法と比較した場合、一定温度で反応が行えるため、特殊な装置は必要としない。また鋳型非依存的にオリゴプローブの標識を行えるため、標的遺伝子にオリゴプライマーをアニールさせた後、鋳型依存的に標識化合物を取り込ませるＰｒｉｍｅｄ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）と異なり、プライマーの設計によって標識効率が変わることはない。特定の配列を有するＲＮＡの存在を明らかにする場合にも、オリゴプローブは直接ＲＮＡに結合できるため、逆転写反応を必要としない。本発明の方法は標的遺伝子とオリゴプローブは結合したままなので組織内の遺伝子の局在を調べるのに適している。以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明する。
【００３４】
【実施例】
実施例１；ＡＴ繰り返し配列が自己伸張することの証明
オリゴヌクレオチドがセルフプライミングによって伸張することを配列表の配列番号１から３に記載のオリゴヌクレオチドを用いて調べた。配列番号：１に記載のオリゴヌクレオチド（１ｐｍｏｌｅ/μｌ）５μｌ又は配列番号：２及び３に記載のオリゴヌクレオチド（各１ｐｍｏｌｅ/μｌ）各５μｌの計１０μｌに、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ（各２ｐｍｏｌｅ／μｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）の混合液５μｌ、テルムス・アクアティクス由来のＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、テルムス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、ΔＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、サーモコッカス・リトラリス由来であるＶｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）のいずれかを各２．５ユニット（Ｕ）及びそれぞれの酵素に添付の１０ｘ緩衝液５μｌを加えた反応液に水を加えて全量を５０μｌにした後３０℃、３０分間反応させた。反応産物は２％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色によってオリゴヌクレオチドの長さを調べた（図２）。配列番号：２及び３の混合ではプライマーは伸張せず、配列番号：１ではプライマーは伸張したことからプライマー同士がアニーリング、伸張、フレームシフトを起こして伸張するのでなく、セルフプライミングによって伸張することが明らかになった。
【００３５】
実施例２：オリゴヌクレオチドへのＡＴ繰り返し配列の付加
オリゴヌクレオチドプローブのＡＴ繰り返し配列の付加反応（テイリング反応）をオリゴヌクレオチドの濃度を変えて調べた。使用したオリゴヌクレオチドは配列表の配列番号：４に記載の塩基配列を有する。１０ｐｍｏｌｅ／μｌの該オリゴヌクレオチドを蒸留水で１０倍希釈列を作製し、これら各５μｌに、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）各０．２ｍＭと２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）及び５０ｍＭ  塩化カリウムの混液に溶解したテルムス・アクアティクス由来のＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）２．５Ｕを含む反応溶液４５μｌを加えた全５０μｌを６５℃、６時間反応させた。反応産物は２％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色によってオリゴヌクレオチドの濃度差によるテイリング効率を調べた（図３）。オリゴヌクレオチドのテイリング効率はオリゴヌクレオチド濃度が薄いほど良く、５０ｐｍｏｌｅ／５０μｌで約２，０００塩基、５ｐｍｏｌｅ／５０μｌで約１０，０００塩基以上のＡＴ繰り返し配列が付加された。
【００３６】
実施例３：テイリング反応の経時的変化
オリゴヌクレオチドプローブのテイリング反応を経時的に調べた。オリゴヌクレオチドは実施例２と同じものを使用した。１０ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴヌクレオチド５μｌに上記の反応溶液４５μｌを加えた全５０μｌを６５℃で任意の時間反応させた後サンプリングし、電気泳動を行うまでの間、室温で保存した。反応産物は２％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色によってオリゴヌクレオチドの長さを調べた（図４）。オリゴヌクレオチドの長さは反応後３０分で５００塩基の鎖長に達した。
【００３７】
実施例４：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｄＴのテイリング効率の比較
オリゴヌクレオチドプローブのテイリング効率をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＴｄＴとで比較した。オリゴヌクレオチドは実施例２と同じものを使用した。標識化合物にはＤＩＧを使用し、テイリング効率はＤＩＧ核酸検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用い、そのプロトコールに従って調べた。  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼの場合、５０ｐｍｏｌｅ  オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．１９ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．０１ｍＭ  ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  を含む５０μｌを６５℃で３０分間反応させた。
【００３８】
ＴｄＴの場合、５０ｐｍｏｌｅオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．１９ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．０１ｍＭ  ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２ｍＭ  塩化コバルト、１００ｍＭ  カコジル酸カリウム（ｐＨ７）、０．２ｍＭ  ＤＴＴに溶解した１５Ｕ  ＴｄＴ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を含む５０μｌを３７℃で９０分間反応させた。反応産物は１０倍希釈列を作製後、その５μｌをドットブロットし、ＤＩＧ標識されたオリゴヌクレオチドを検出した。その結果を図５に示す。テイリング効率はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた方がＴｄＴを用いたよりも１０倍以上高かった。
【００３９】
実施例５：ハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの標識
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリダイゼーション後、ＤＩＧ標識し、標識されたオリゴヌクレオチドの検出感度を調べた。使用したオリゴヌクレオチドは実施例１と同じものであり、標的遺伝子としてプラスミドｐＵＣ１９を使用した。標識オリゴヌクレオチドの検出はＤＩＧ核酸検出キットを用い、そのプロトコールに従って行った。プラスミドｐＵＣ１９はアルカリ変性によって一本鎖にしてからメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にドットブロットした。プレハイブリダイゼーションを４０℃、６０分間行った後、１０ｐｍｏｌｅ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液で４０℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。４０℃に保った２×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ溶液で２回、４０℃に保った０．１×ＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳ溶液で２回メンブレンを洗った後Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファーで平衡化した。続いて１００μＭ  ｄＡＴＰ、９５μＭ  ｄＴＴＰ、５μＭ  ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、２．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．３）及び５０ｍＭ  塩化カリウムを含む１ｍｌの反応溶液中で６５℃、３時間反応させた。
【００４０】
実施例６：マウス白血病ウイルスＲＮＡの検出における従来法と本発明法の比較
マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を感染させた線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞及び非感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞からＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社）を用いてＲＮＡを抽出した。感染細胞から抽出したＲＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡ分解酵素を含まない滅菌蒸留水で３倍希釈列を作製し、非感染細胞から抽出したＲＮＡと共に１％ホルムアルデヒド変性ゲルで１００ボルト、３時間泳動した。泳動後ゲルのＲＮＡは、一般に行われるノーザンブロッティング法により、室温、一晩、陽荷電ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）に転写した。ＤＩＧイージーハイブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で６５℃、３時間プレハイブリダイズ後，配列番号：５に示す塩基配列からなる３ｐｍｏｌｅ／ｍｌの５‘末端ジゴキシゲニン標識したオリゴプローブを含むＤＩＧイージーバイブで６５℃、一晩ハイブリダイズした。フィルターの洗浄を、２ｘＳＳＣで６５℃、５分間を２回、０．１ｘＳＳＣで６５℃、１５分間を２回行った。フィルターの一片は洗浄後室温で風乾し、一片は△Ｔｔｈ反応緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．９，１．５ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭ塩化カリウム、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン；ＴＯＹＯＢＯ社）で６５℃、１５分間平衡化した。伸長反応は５０Ｕ／ｍｌ  △Ｔｔｈポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社），０．２ｍＭｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、０．０１ｍＭ  ＤＩＧ−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含む△Ｔｔｈ反応緩衝液で６０℃、３時間浸漬することにより行った。反応終了後、フィルターの洗浄を、２ｘＳＳＣで６５℃、５分間を２回、ＰＢＳで６５℃、５分間を１回行った。洗浄後のフィルターは前述の風乾したフィルターと共にＤＩＧ洗浄緩衝液（１００ｍＭマレイン酸，１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．３％ツイーン２０；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で１分間平衡化し、ブロッキング液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）に室温、６０分間軽度に振とうしながら浸漬した。次に、１５０ｍＵ／ｍｌのアルカリフォスファーターゼ標識抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含むブロッキング液に室温３０分間浸漬した。フィルターの洗浄をＤＩＧ洗浄緩衝液で室温１５分間を２回行い、検出バッファー（１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．５，１００ｍＭ塩化ナトリウム；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で平衡化した。ＤＩＧ標識核酸検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて検出した。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴヌクレオチドのテイリング反応を模式的に示す図。オリゴヌクレオチドはＡＴ繰り返し配列の部分で自己アニーリングし、続いてＤＮＡポリメラーゼによってｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）の付加が行われる。この付加によってオリゴヌクレオチドのＡＴ繰り返し配列の部分は伸長した後解離し、以降自己アニーリングと伸長、解離を繰り返すことを示す。
【図２】オリゴヌクレオチドがセルフプライミングで伸長することを示す写真。
【図３】オリゴヌクレオチドの濃度とテイリング効率との関係を示す写真。
【図４】付加されるテイルの長さと反応時間との関係を示す写真。
【図５】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｄＴのオリゴヌクレオチドへの標識効率を示す写真。
【図６】オリゴヌクレオチドの５’末端にジゴキシゲニンを標識する従来の標識法と本発明の標識法によりマウス白血病ウイルスＲＮＡを検出した結果を示す写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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