(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに配列特異的に標的mRNAを切断する、標的mRNAの標的配列と相同な配列からなるセンス鎖と該センス鎖の配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなるショートヘアピンRNA（shRNA）であって、センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基長が19〜29であり、センス鎖の5’末端に１個〜３個のG（グアニン）からなるオーバーハング塩基を有し、該オーバーハング塩基の５’側に三リン酸が結合したshRNA。
【請求項２】
請求項１に記載のshRNAの鋳型DNAを含み該shRNAを発現するベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のshRNAまたは請求項２に記載のベクターを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに抑制する遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
請求項１に記載のshRNAまたは請求項２に記載のベクターを細胞に導入することを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をin vitroでインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに抑制する方法。
【請求項５】
請求項１に記載のshRNAまたは請求項２に記載のベクターであって、標的配列がウイルスの遺伝子配列またはノンコーディング領域であるshRNAまたはベクターを有効成分として含む、ウイルス感染症の予防および／または治療のためのインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導しない医薬組成物。
【請求項６】
標的配列がHIVの遺伝子配列またはノンコーディング領域である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現をインターフェロンを誘導することなく、配列特異的に抑制（サイレンシング）する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、その配列特異的にｍＲＮＡが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象であり、生物共通の核酸レベルの防御システムであることが報告されている（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：８３４−８４３，２００１等参照）。ＲＮＡｉにおいては、ｄｓＲＮＡがダイサー（Ｄｉｃｅｒ）の作用によりプロセッシングされｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が形成され、ｓｉＲＮＡがガイドＲＮＡとしてターゲット配列を認識し、ターゲットｍＲＮＡを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。
ＲＮＡｉ法は、遺伝子の発現制御による遺伝子機能解析、遺伝子の発現制御機構の解明、ＲＮＡｉによる遺伝子治療等に利用を目的に種々の検討が行われている。
ＲＮＡｉに関して、ｄｓＲＮＡによるインターフェロン（α、β）の発現誘導と、細胞障害が報告されている（Ｋ．Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  ２００４；１７７：１３２−ｌ３８：Ｓ．Ｐｅｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００４）７２：１０３−１１１：Ｃ．Ａ．Ｓｌｅｄｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２４  Ａｕｇｕｓｔ  ２００３：Ｄ．Ｈ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２２，Ｎｕｍｂｅｒ  ３，３２１−３２５，２００４：Ａ．Ｊ．Ｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３４，ｎｕｍｂｅｒ  ３，２６３−２６４，２００４：Ｓ．Ｐ．ＰＥＲＳＥＮＧＩＥＶ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ（２００４），１０：１２−１８：Ｋ．Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，１７２：６５４５−６５４９，２００４を参照）。例えば、ｄｓＲＮＡがＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３（ＴＬＲ３）を介して認識され、配列特異的な遺伝子の発現だけではなく、ＴＬＲ３によりＩ型インターフェロンの発現が誘導され、配列非特異的にＲＮＡを分解する２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼを誘導することが報告され、またｄｓＲＮＡ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）がｓｉＲＮＡにより活性化されＩＦＮ−βの発現をアップレギュレートすることが報告されている。
このように、現行のＲＮＡｉ法においては、ｄｓＲＮＡによるインターフェロンの発現誘導でインターフェロン反応が引き起こされること、あるいは細胞障害を起こしてしまうという問題点がある。ｄｓＲＮＡを実験用試薬として用いる場合、非特異的な発現抑制のため、用いたｄｓＲＮＡの効果を正確に評価できないという問題点があり、さらに医薬として用いる場合、非特異的な発現抑制や細胞障害により投与被験体に副作用をもたらすという問題点があった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、インターフェロンの発現を誘導し、かつ細胞障害をもたらすという副作用のないＲＮＡｉ試薬および医薬の提供を目的とする。
本発明者らは、上記問題に鑑み、インターフェロンの発現を誘導せずにＲＮＡｉを引き起こすｄｓＲＮＡの開発について鋭意検討を行った。その結果、ループ構造を有するｓｈＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端に１個または複数のＧからなるオーバーハングを設けることにより、ｓｈＲＮＡがインターフェロンの発現を誘導せず、非特異的なＲＮＡ分解や細胞障害を引き起こさないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
［１］  インターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに配列特異的に標的ｍＲＮＡを切断する、標的ｍＲＮＡの標的配列と相同な配列からなるセンス鎖と該センス鎖の配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなるｓｈＲＮＡであって、センス鎖の５’末端に１個または複数のＧからなるオーバーハング塩基を有するｓｈＲＮＡ。
［２］  センス鎖の５’末端のＧからなるオーバーハング塩基の数が１〜１０個である［１］のｓｈＲＮＡ。
［３］  センス鎖の５’末端のＧからなるオーバーハング塩基の数が１〜３個である［２］のｓｈＲＮＡ。
［４］  センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基長がｌ５〜５０である［１］〜［３］のいずれかのｓｈＲＮＡ。
［５］  ［１］〜［４］のいずれかのｓｈＲＮＡの鋳型ＤＮＡを含み該ｓｈＲＮＡを発現するベクター。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかのｓｈＲＮＡを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに抑制する遺伝子発現抑制剤。
［７］  ［１］〜［５］のいずれかのｓｈＲＮＡを細胞に導入することを含む、細胞における標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに抑制する方法。
［８］  ［１］〜［５］のいずれかのｓｈＲＮＡを有効成分として含む、標的配列を含む遺伝子またはノンコーディング領域が関与する疾患の予防および／または治療のためのインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導しない医薬組成物。
［９］  標的配列がウイルスの遺伝子配列またはノンコーディング領域であって、疾患がウイルス感染症である、［８］の医薬組成物。
［１０］  標的配列がＨＩＶの遺伝子配列またはノンコーディング領域である、［９］の医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０２１９６０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＲＮＡの塩基配列を示す図である。
図２は、テンプレートＤＮＡの構造を示す図である。
図３は、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳによるＩＦＮ−βの誘導およびＣＰＥの検討の結果を示す写真である。Ａは、ウエスタンブロットによるＩＦＮ−βの検出の結果を示し、Ｂは、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ導入による細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ＣＰＥ）を示す。
図４は、ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳの塩基配列を示す図である。
図５は、ｓｈＲＮＡ５’オーバーハングのＩＦＮ誘導への影響を示す写真である。Ａは、ＣＰＥの結果を示し、Ｂはウエスタンブロットの結果を示し、ＣはＥＬＩＳＡの結果を示す。
図６は、ｓｈＬｕｃ２の標的配列およびｓｈＬｕｃ２の構造を示す図である。ＡはｓｈＬｕｃ２の標的配列を示し、ＢはｓｈＬｕｃ２の構造を示す。
図７は、５’オーバーハングの塩基数依存的なＩＦＮ−β誘導を示す写真である。
図８は、ｐｐｐ−ＧＧｓｈＤＩＳによる抗ＨＩＶ効果を示す図である。
図９は、ホタルルシフェラーゼを標的としたｐｐｐ−ｓｈＬｕｃ６の構造を示す図である。
図１０は、脱リン酸化したｓｈＬｕｃ６の構造を示す図である。
図１１は、ウエスタンブロットによるＩＦＮβ産生確認試験の結果を示す写真である。
図１２は、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮβ産生確認試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、２本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が用いられる。２本鎖構造は、１本のＲＮＡ鎖中にセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される。ショートヘアピンＲＮＡは、細胞内または生体内でプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡが産生される。本発明のｓｈＲＮＡは少なくともセンス鎖の５’末端にオーバーハングを有し、該オーバーハングは、１〜２０、好ましくは１〜１５もしくは１〜１０、さらに好ましくは１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５もしくは１〜４、特に好ましくは、１〜３、２もしくは１のＧ（グアニン）からなる配列からなる。Ｇの数が多過ぎる場合は、オーバーハング部分が４重鎖構造を形成することによりｄｉｃｅｒに認識されなくなることがある。Ｇの適切な数は、Ｇからなるオーバーハングを付加した本発明のｓｈＲＮＡを細胞に投与して、遺伝子発現抑制効率およびインターフェロンおよび／または細胞障害の誘導の程度を測定することにより容易に決定することができる。また、Ｇからなるオーバーハング塩基の５’側には、三リン酸（ｐｐｐ）が結合していてもよい。また、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＵＵが挙げられる。なお、本発明において、オーバーハングとは、ｓｈＲＮＡの一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。
２本鎖部分は、ＲＮＡ干渉によりノックダウンしようとする標的遺伝子の配列またはノンコーディング領域に含まれる特定の標的配列にハイブリダイズし得る配列を有するＲＮＡ鎖（センス鎖）および該配列に相補的なＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が相補的に結合した構造を有する。
本発明のｓｈＲＮＡにおいて、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端がループ（ヘアピンループ配列）を介して連結されている。ヘアピンループ配列は限定されないが、５〜１２塩基からなるＵＵで始まる配列、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号１）が挙げられる。そのほかのループ配列としては、Ｌｅｅ  ＮＳ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５００−５０５、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１６，９４８−９５８、Ｓｕｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，５５１５−５５２０、Ｐａｕｌ  ＣＰ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５０５−５０８、Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７等に記載の配列からなるループを採用することができる。
本発明のｓｈＲＮＡは、センス鎖の５’末端のオーバーハング塩基、センス鎖、ループ配列、アンチセンス鎖を少なくとも含み、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に結合している構造を有し、さらに上記のように、アンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング塩基を有していてもよい。オーバーハング塩基を有する部位、ループ部位は、２本鎖構造をとらないが、本発明においては、ＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖からなる２本鎖部分を含むので、２本鎖ＲＮＡという場合がある。
標的遺伝子は、本発明のｓｈＲＮＡを投与しようとする生物体由来の遺伝子または生体に感染し生体内部に存在するウイルス、細菌、真菌、原生動物等の遺伝子等である。生物体由来の遺伝子としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、発生に関与する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、その他疾患を引き起こす疾患に関与した遺伝子等が挙げられる。また、ウイルス、細菌としてはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、腸管出血性大腸菌、結核菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、緑膿菌、腸球菌、カンジダ、溶連菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒スピロヘータ、クラミジア・トラコマチス等が挙げられる。本発明のｓｈＲＮＡの標的遺伝子またはノンコーディング領域の特定の標的配列の塩基数は、限定されず、１５〜５００塩基の範囲で選択される。好ましくは１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５もしくは１５〜３０塩基、さらに好ましくは２０〜３５塩基、さらに好ましくは１９〜３０塩基、特に好ましくは１９〜２９塩基もしくは２８塩基である。ｓｈＲＮＡの長さが長くなると、インターフェロン反応が誘発されやすくなるという報告もあるが（特開２００３−２１９８９３号公報）、本発明のｓｈＲＮＡは、センス鎖の５’末端にＧからなるオーバーハング塩基を付加することにより、インターフェロン反応が抑制されているので、標的配列が長くなっても、インターフェロン反応は誘導しない。標的遺伝子またはノンコーディング領域中の標的配列は、例えば標的遺伝子により適宜発現抑制効果の大きい部分を選択すればよい。本発明のｓｈＲＮＡと標的配列は、同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、本発明のｓｈＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のｓｈＲＮＡを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｈＲＮＡを試薬としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件あるいは高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２〜１６時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。また、本発明のｓｈＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列は、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８もしくは９９％以上の配列相同性を有する。
本発明のｓｈＲＮＡは、化学合成や、プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。化学合成による合成は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有し自己相補性を有するＲＮＡ１本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。また、プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを用いた合成は、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートＤＮＡを合成しＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを転写すればよい。ｓｈＲＮＡのセンス鎖の５’末端にＧからなるオーバーハング配列を付加するためには、プロモーターの末端にＧからなる配列を付加すればよい。この際、ＤＮＡ配列には、適宜ターミネーター等を含ませる。ターミネーター配列として例えば、ＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）配列を用いればよい。プロモーターとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する場合、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられ、ベクターに本発明の２本鎖ＲＮＡのテンプレートＤＮＡを導入し、該ベクターを生体内に投与して生体内で２本鎖ＲＮＡを合成する場合、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、ｐＢＡｓｉベクター、ｐＳＵＰＥＲベクター等を用いればよく、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。なお、本発明のｓｈＲＮＡの合成にＴ７プロモーター等を用いた場合、Ｇからなる配列の存在によりＴ７プロモーターが活性化され、ｓｈＲＮＡの製造効率が高まるという利点もある。
本発明のｓｈＲＮＡは、発現を抑制しようとする被験体に導入する。被験体は限定されず、細胞、組織、個体である。被験体として用いる個体としては、インターフェロン反応の誘導が起こり得る動物が挙げられる。動物に対しては、病気の予防、治療用医薬として用いることができる、さらに、本発明のｓｈＲＮＡは、研究用試薬として用いることができ、この場合本発明のｓｈＲＮＡは、遺伝子発現抑制剤、ＲＮＡｉ試薬等として用いることができる。本発明のｓｈＲＮＡを試薬として用いた場合、ｓｈＲＮＡを細胞に導入することにより、細胞における標的配列を含む標的遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに抑制することができる。本発明でｉｎ  ｖｉｔｒｏという場合、生体内に投与する場合以外を含む、例えば、試験管内での細胞や組織にｓｈＲＮＡを導入する場合も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｈＲＮＡを導入するという。
本発明のｓｈＲＮＡを疾患の治療または予防に用いる場合の疾患は、該ｓｈＲＮＡにより発現を抑制しようとする遺伝子に関与する疾患である。具体的には、ＡＰＣ遺伝子（大腸癌）、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２遺伝子（乳癌）等の癌遺伝子が関与する癌、ＰＳ１遺伝子（アルツハイマー）、ＬＰＬ遺伝子（高脂血症）、ＩＮＳ／ＩＮＳＲ遺伝子（糖尿病）等の種々の遺伝子の転写異常が関与する神経変性症等が挙げられる。本発明のｓｈＲＮＡの治療対象となる癌としては、例えば、食道がん、胃がん、大腸がん、肝細胞がん、膵がん、胆管がん、乳がん、肺がん、肺腺がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮体がん、子宮頚がん、鼻咽喉がん、甲状腺がん、卵巣がん、皮膚がん、白血病、骨髄腫、リンパ腫、リンパ肉腫等が含まれる。これらの癌も関連癌遺伝子の発現を抑制すればよい。また、ウイルスや細菌等の微生物の感染症の場合、ウイルス遺伝子や細菌遺伝子の発現を抑制すればよい。ウイルス、細菌としてはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、腸管出血性大腸菌、結核菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、緑膿菌、腸球菌、カンジダ、溶連菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒スピロヘータ、クラミジア・トラコマチス等が挙げられる。これらの全または部分的なゲノム配列と遺伝子情報は公知であり、該ゲノムおよび遺伝子情報に従って、標的配列を選択することができる。
本発明のｓｈＲＮＡの導入方法としては、被験体が細胞や組織の場合、細胞や組織と同時に培養することにより導入することができる。その他、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。被験体が動物個体の場合、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することができる。また、特定の部位に投与する場合、ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位にデリバリーしてもよい。ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があり、投与しようとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。ドラッグデリバリーシステムとしては、例えば、キャリアとしてリポソーム、エマルジョン、ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。投与は、医薬的に許容され得る希釈剤またはキャリアと混合して行うことが望ましい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。導入するｓｈＲＮＡの量は、予防、治療しようとする疾患の種類、重篤度、被検体の年齢、体重等により適宜決定することができるが、疾患部の細胞１個当たり少なくとも、１コピーのｓｈＲＮＡが導入されるような量が好ましい。
本発明において、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現を抑制（サイレンシング）するとは、遺伝子の発現をその遺伝子またはノンコーディング領域のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のｓｈＲＮＡを導入しない場合に対して、１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上あるいは２０％以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、遺伝子またはノンコーディング領域のｍＲＮＡまたはタンパク質の産生量をｓｈＲＮＡ導入前後で比較すればよい。ｍＲＮＡの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定等により測定することができる。また、本発明のｓｈＲＮＡは、細胞や個体に導入しても該細胞、個体でインターフェロン反応を引き起こさないことを特徴とする。インターフェロンを誘導しないとは、インターフェロンαまたはβの発現を誘導しないことをいい、インターフェロンの合成のみならず、インターフェロンが関与するパスウェイを活性化しないことを含む。インターフェロンの発現が１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上、２０％または１０％以上抑制される場合も含まれる。インターフェロン反応の有無は、インターフェロン自体またはインターフェロンのｍＲＮＡの産生を測定することに決定することができる。この測定には、上記のようにノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定を行えばよい。さらに、本発明のｓｈＲＮＡは、細胞や個体に導入しても該細胞や、個体の細胞に細胞障害を誘導しないことを特徴とする。一般的に二本鎖ＲＮＡを投与した場合、ｄｓＲＮＡ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化により、細胞障害を誘導し得るが、本発明のｓｈＲＮＡはＰＫＲを活性化することがなく細胞障害を誘導することもない。ここで、細胞障害とは、細胞が正常の機能を発揮しないか、あるいは増殖が抑制される程度障害を受けていることをいい、アポトーシス、ネクローシス等の細胞死を含む。本発明において、細胞障害を誘導しないとは、細胞障害を全く誘導しない場合のみならず、センス鎖の５’末端にＧからなる配列を付加しない２本鎖ＲＮＡを導入した場合に比べ、細胞障害を起こす細胞の数が７５％以下、５０％以下、２０％以下、または１０％以下である場合を含む。細胞障害が誘導されたか否かは、細胞を観察し細胞変性効果（ＣＰＥ）が出現したかどうかを調べることによりわかり、また、細胞の代謝活性を測定したり、トリパンブルー等の色素排除アッセイにより判断することができる。本発明のｓｈＲＮＡは、インターフェロン誘導および細胞障害の両方を誘導しないか、またはインターフェロン誘導または細胞障害のいずれかを誘導しない。上記のように本発明において、「インターフェロンおよび／または細胞障害を誘導せずに」とは、誘導が完全に阻害される場合だけではなく、誘導が減じられる場合も含む。また、インターフェロンおよび／または細胞障害の誘導の阻害も試験系や被験体によって、程度が異なってくることがあるが、少なくとも一つの系または被験体においてインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導しなければ、本発明のインターフェロンおよび／または細胞障害を誘導しないｓｈＲＮＡに含まれる。
本発明は、さらに本発明のｓｈＲＮＡを生物体に投与して、該生物体において標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域の発現をインターフェロンの発現を誘導せずに抑制する方法、本発明のｓｈＲＮＡを動物に投与して、標的配列を含む標的遺伝子またはノンコーディング領域が関与する疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する方法を包含する。さらに、本発明は、本発明のｓｈＲＮＡの標的配列を含む標的遺伝子が関与する疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する医薬の製造のための使用も包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
インターフェロン非誘導型ｓｈＲＮＡの合成
（１）ｓｈＲＮＡ（ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ）の合成
ＨＩＶ−１（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １）のＤＩＳ（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ）の塩基配列から、ｓｈＲＮＡ（ｓｈＤＩＳ）を合成した。ｓｈＲＮＡの配列は図１に示す。図１に示すように、ＨＩＶ−１ＤＩＳに対するｓｈＲＮＡ（ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ）は、５’末端から三リン酸、ＧＧ、センス鎖（５’−ＧＧＣＵＵＧＣＵＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧ−３’；配列番号３）、ループ配列（５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’；配列番号１）、アンチセンス鎖、ＵＵとなっている。
ｓｈＲＮＡの合成方法は、Ｔ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号４）を付加したｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列を有する２本鎖ＤＮＡ（図２）を用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７−ＦｌａｓｈＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳＦ３５０７）により合成した。図２に示すように、５’末端からＴ７プロモーター、センス鎖、ループ配列、アンチセンス鎖、ＵＵとなっておる。このＤＮＡを用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、図１に示すｓｈＲＮＡが合成される（配列番号５）。図２においては、センス鎖のみ記してあり、これに相補的なアンチセンス鎖が結合している。配列番号５の配列は、標的配列としてＨＩＶ−１のＤＩＳを用いた場合であり、センス鎖の部分はいかなる標的配列であってもよい。
（２）ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳのインターフェロンβ誘導能の評価
ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳをＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞に導入し、そのインターフェロンβ（ＩＦＮ  β）誘導能を試験した。
まず、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を６ウェルプレートに１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまき、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）。培養後、培地をすべて取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）８００μｌを滴下した。ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ（４００、２００、１００、５０、２５ｐｍｏｌ）にＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え（ｓｈＲＮＡ：Ｒｅａｇｅｎｔ＝１μｇ：３μＬ）、２００μＬに調整し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ−Ｒｅａｇｅｎｔ複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、１．５時間培養し、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳを細胞へ導入した。これと同時にＩＦＮ  β誘導のコントロールとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１．８、０．９μｇ）も同様の方法で細胞へ導入した。培養後ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞をＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）により洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）１ｍＬを滴下した。その後１２時間培養した。培養後、細胞を回収し、細胞内のＩＦＮ  βの発現をウエスタンブロット法により解析した（図３Ａ）。この際、コントロールとして、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いた。図中、Ｎ．Ｃ．は何も導入していないサンプルを示す。
また、上記と同様の方法でｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳを導入し、４８時間培養後、細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ＣＰＥ）を顕微鏡にて観察した（図３Ｂ）。
図３Ａに示すように、コントロールであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ではＩＦＮ−βが誘導されたのに大して、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳはどの導入量においてもＩＦＮ−βの誘導は認められなかった。また、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳを２００、４００ｐｍｏｌ導入した系において、ＣＰＥが確認できた。これらの結果より、このｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳはＩＦＮを誘導しないことがわかった。さらに、ＰＫＲ／２−５０ＡＳは誘導される可能性があることが示唆された。
（３）ｓｈＲＮＡ（ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳ）の合成
ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳにおいてはＩＦＮ  βの誘導は認められなかった。そこで異なるタイプのｓｈＲＮＡ（ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳ）を合成した（図４）。このｐｐｐ−ｓｈＤＩＳはｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳの５’末端ｏｖｅｒｈａｎｇのＧＧが欠損しているものである。これら２つのタイプのｓｈＲＮＡについてＩＦＮβの誘導能について検討した。
ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳの合成方法は、Ｔ７プロモーターの塩基配列を（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号４）から（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’；配列番号６）に変更することで合成した。合成は（１）と同様にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７−ＦｌａｓｈＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳＦ３５０７）により合成した。Ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳは、５’末端から三リン酸、センス鎖、ループ配列（５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’；配列番号１）、アンチセンス鎖、ＵＵとなっている。
（４）ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳのインターフェロンβ誘導能の評価
ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳまたはｐｐｐ−ｓｈＤＩＳをＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞に導入し、そのＩＦＮ  β誘導能を試験した。
まず、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を６ウェルプレートに１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまき、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）。培養後、培地をすべて取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）８００μｌを滴下した。ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳまたはｐｐｐ−ｓｈＤＩＳ（２００、１００、５０ｐｍｏｌ）にＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え（ｓｈＲＮＡ：Ｒｅａｇｅｎｔ＝１μｇ：３μＬ）、２００μＬに調整し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたｓｈＤＩＳ−Ｒｅａｇｅｎｔ複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、１．５時間培養し、ｓｈＤＩＳを細胞へ導入した。培養後ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞をＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）により洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）１ｍＬを滴下した。４８時間培養後、細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ＣＰＥ）を顕微鏡にて観察した（図５Ａ）。
また、上記と同様の方法でｐｐｐＧＧ−ｓｈＲＮＡまたはｐｐｐ−ｓｈＤＩＳを導入し、１２時間培養後、細胞を回収し、細胞内のＩＦＮ  βの発現をウエスタンブロット法により解析し（図５Ｂ）、また同時に培養上清を回収しＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ  βの発現を解析した（図５Ｃ）。図中、Ｎ．Ｃ．は何も導入しないサンプルである。
図５Ａに示すように、５’オーバーハング塩基数を変化させてＣＰＥを観察した結果、ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳではｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳと比べてＣＰＥが多く観察された。また、図５ＢおよびＣに示すように、ＩＦＮ誘導能を評価した結果、ｐｐｐ−ｓｈＤＩＳではＩＦＮ−βが誘導され、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳではＩＦＮ−βは誘導されなかった。これは細胞内（Ｂ）、細胞外（Ｃ）共に同じ結果であった。これらの結果から、ｓｈＲＮＡによるＩＦＮ誘導は５’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。
【実施例２】
【０００７】
５’オーバーハングの検討
（１）ｓｈＬｕｃ２の合成
上記の結果から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼで合成したｓｈＲＮＡのＩＦＮ誘導能は５’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。そこで新たに５’オーバーハングの塩基数を０、１、２、３個のｓｈＲＮＡを合成し、この可能性について検討した。さらにｓｈＲＮＡの標的配列の依存性を合わせて検討するために標的をＨＩＶ−１からＦｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対するものに変更した（ｓｈＬｕｃ２）。図５にその標的配列と４つのタイプのｓｈＬｕｃ２の塩基配列を示す。
これら４つのタイプのｓｈＬｕｃ２の合成は、（１）と同様にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７−ＦｌａｓｈＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳＦ３５０７）により合成した。また５’オーバーハングの制御はＴ７プロモーターの塩基配列を変更することにより行った。それぞれのＴ７プロモーターの塩基配列は、ｐｐｐ−ｓｈＬｕｃ２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’；配列番号６）、ｐｐｐＧ−ｓｈＬｕｃ２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’；配列番号７）、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＬｕｃ２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号４）、ｐｐｐＧＧＧ−ｓｈＬｕｃ２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’；配列番号８）とした。
（２）  ｓｈＬｕｃ２のインターフェロンβ誘導能の評価
ｓｈＬｕｃ２をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞に導入し、そのインターフェロンβ（ＩＦＮβ）誘導能を試験した。
まず、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を６ウェルプレートに１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまき、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）。培養後、培地をすべて取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）８００μｌを滴下した。４つのタイプのｓｈＬｕｃ２（２００ｐｍｏｌ）にＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ加え（ｓｈＲＮＡ：Ｒｅａｇｅｎｔ＝１μｇ：３μＬ）、２００μＬに調整し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたｓｈＬｕｃ２−Ｒｅａｇｅｎｔ複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、１．５時間培養し、ｓｈＬｕｃ２を細胞へ導入した。培養後ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞をＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）により洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）１ｍＬを滴下した。その後１２時間培養した。培養後、細胞を回収し、細胞内のＩＦＮ  βの発現をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法により解析した（図６）。
図６に示すように、ＩＦＮ誘導の５’オーバーハング依存性を検討した結果、５’オーバーハングの塩基数が少ないほどＩＦＮが誘導されることが確認された。また、標的配列には依存しないことも確認された。
実施例１および２からＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで合成したｓｈＲＮＡによるＩＦＮ誘導は５’オーバーハングによって規定されていることが示された。また、ＰＫＲ／２−５０ＡＳについては５’オーバーハングの違いでは影響を受けないことが示唆された。
【実施例３】
【０００８】
ｐｐｐ−ＧＧｓｈＤＩＳよる抗ＨＩＶ−１効果の検討
ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳ（ＤＩＳはＨＩＶゲノム中の機能的ノンコーディング配列）またはＬａｃＺを標的としたコントロールＲＮＡ（ＬａｃＺ）をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞に導入し、ＨＩＶ−１発現プラスミドであるｐＮＬ４−３を導入し、抗ＨＩＶ−１効果の検討を行った。
まず、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を１２ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルでまき、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）。培養後、培地をすべて取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、ｌ００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）４００μｌを滴下した。ｐｐｐＧＧ−ｓｈＤＩＳまたはＬａｃＺ（２５、１２．５、６．２５ｐｍｏｌ）にＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え（ｓｈＲＮＡ：試薬＝１μｇ：３μＬ）、１００μＬに調整し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたｓｈＤＩＳ：試薬複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、１．５時間培養し、ｓｈＤＩＳを細胞へ導入した。培養後ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞をＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）により洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）１ｍＬを滴下した。ＦｕｇｅｎＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ）ＤＮＡ：試薬＝１μｇ：３μＬ）とＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え室温で５分間インキュベートした。さらにｐＮＬ４−３（１００ｎｇ）を加え、５０μｌに調整し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベートしたｐＮＬ４−３：試薬複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、４８時間培養後、培養上清を回収し、ｐ２４抗原量を測定した（図８）。図８に示すように、ｐｐｐ−ＧＧｓｈＤＩＳによるＨＩＶ−１抑制効果は、Ｐ．Ｃ．と比較して約７０％の減少が得られた。また、コントロールＲＮＡであるＬａｃＺ導入によるｐ２４量の減少は確認されなかったため、ｓｈＲＮＡ導入による細胞障害が引き起こす抗ウイルス効果ではないことが示唆された。
【実施例４】
【０００９】
ｓｈＬｕｃ６の検討
（１）  ｓｈＬｕｃ６の合成
実施例２の結果から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼで合成したｓｈＲＮＡのＩＦＮ誘導能は５’オーバーハングの塩基数に依存している可能性が示唆された。そこで新たに５’オーバーハングの塩基数を０、１、２または３個のｓｈＲＮＡを合成し、この可能性について検討した。さらにｓｈＲＮＡの標的配列の依存性を合わせて検討するために標的をＨＩＶ−１からホタルルシフェラーゼに対するものに変更した（ｓｈＬｕｃ６）。下ににホタルルシフェラーゼを標的とした標的配列を示す。
Ｌｕｃ：５’−ＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＣＡＡＧＡ−３’    （配列番号９）
これら４つのタイプのｓｈＬｕｃ６の合成は、実施例２と同様にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７−ＦｌａｓｈＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳＦ３５０７）により合成した。また５’オーバーハングの制御はＴ７プロモーターの塩基配列を変更することにより行った。それぞれのＴ７プロモーターの塩基配列は、ｐｐｐ−ｓｈＬｕｃ６（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’；配列番号１０）、ｐｐｐＧ−ｓｈＬｕｃ６（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’；配列番号１１）、ｐｐｐＧＧ−ｓｈＬｕｃ６（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号１２）、ｐｐｐＧＧＧ−ｓｈＬｕｃ６（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’；配列番号１３）とした。図９にＩＦＮ誘導能評価に用いたｓｈＲＮＡの構造を示す。５’オーバーハングの塩基数を０、１、２および３のもちょを構築した。  さらに、ＩＦＮ産生を誘導している因子を同定するため、ＣＩＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８８１１４）による脱リン酸化処理を行ったｓｈＬｕｃ６を構築した（図１０）。
（２）  ｓｈＬｕｃ６のインターフェロンβ誘導能の評価
ｓｈＬｕｃ６をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞に導入し、そのインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）誘導能を試験した。
まず、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルでまき、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）。培養後、培地をすべて取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）４００μｌを滴下した。４つのタイプのｓｈＬｕｃ６（１００ｐｍｏｌ）にＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ加え（ｓｈＲＮＡ：試薬＝１μｇ：３μＬ）、２００μＬに調整し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたｓｈＬｕｃ６−試薬複合体をＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞へ滴下し、１．５時間培養し、ｓｈＬｕｃ６を細胞へ導入した。培養後ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞をＲＰＭＩ−１６４０（含１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）により洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（含１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）１ｍＬを滴下した。その後１２時間培養した。培養後、細胞内のＩＦＮ−βの発現をウエスタンブロット法により解析した。図１１にウエスタンブロットによるｓｈＬｕｃ６のＩＦＮ−β誘導能の検討の結果を示す。ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞にｓｈＬｕｃ６（１００ｐｍｏｌ）を導入し、導入１２時間後に細胞内タンパク質を回収しウエスタンブロットによりＩＦＮ−βの検出を行った結果である。
また、培養上清中のＩＦＮ−βの発現をＥＬＩＳＡにより解析した。図１２にＥＬＩＳＡによるｓｈＬｕｃ６のＩＦＮ−β誘導能の検討の結果を示す。ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞にｓｈＬｕｃ６（１００ｐｍｏｌ）を導入し、導入１２時間後に培養上清を回収しＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−βの検出を行った結果である。Ｎ．Ｃ．は何も導入していないサンプルを示す。
５’末端にＧ残基を２つ以上付加したタイプのｓｈＲＮＡではＩＦＮ−β産生は確認されなかった。この結果は、ＤＩＳを標的とした場合と相関性が得られた。よって、標的配列が異なってもＩＦＮ産生の回避が行われたため、同ＲＮＡの有用性が期待される。さらに、ＣＩＰ処理によりＩＦＮ産生を回避したことから、本研究においてＩＦＮを誘導する因子は三リン酸であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
実施例に示すように、ｓｈＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端に１個または複数のＧからなるオーバーハングを設けることにより、ｓｈＲＮＡを導入した細胞においてインターフェロンの発現が誘導されることがない。このため、本発明のｓｈＲＮＡをＲＮＡｉの研究用試薬として用いた場合、インターフェロン反応による非特異的な遺伝子発現の抑制や細胞障害が起こることなく、ｓｈＲＮＡによる配列特異的なＲＮＡ干渉による遺伝子またはノンコーディング領域（ノンコーディング配列）の発現の抑制を正確に調べることができる。また、本発明のｓｈＲＮＡをＲＮＡｉ医薬として用いた場合、生体内でインターフェロン反応による非特異的な遺伝子発現や細胞障害による副作用を引き起こすことがなく、安全かつ効果的な医薬として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００１１】
配列番号１から８：合成
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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