(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法であって、
細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に、治療剤の候補となる化合物を付与し、そして
当該治療剤が、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを調べ、当該機能が抑制される場合に治療剤として選択する
ことを含む前記方法。
【請求項２】
上記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記治療剤の候補となる化合物が細胞においてトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを、トランスロコンの変性タンパク質の小胞体から細胞質への輸送機能が抑制されるか否かを指標にして調べる、請求項１または２の方法。
【請求項４】
上記細胞においてトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドが、Ｓｅｃ６１ｐ複合体を構成する、Ｓｅｃ６１α、β、γの各サブユニットのいずれかである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞においてトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を有するＳｅｃ６１αサブユニット  タンパク質、そのアリル、又は、上記アミノ酸配列において１ないし複数のアミノ酸配列が置換、変更若しくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつＳｅｃ６１αサブユニットのトランスロコン構成成分としての機能を有するタンパク質、から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患が、ポリグルタミン病、パーキンソン病、多系統萎縮症、アルツハイマー病、家族性筋萎縮性側索硬化症、プリオンタンパク質の蓄積が関与する疾患である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患がポリグルタミン病であり、そして、伸長ポリグルタミンの発現によって、上記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法に使用するための、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体であって、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有するように処理されている、前記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体。
【請求項９】
細菌、酵母、並びにショウジョウバエの成虫原基及び個体、から選択される、請求項８に記載の細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経性疾患の治療用化合物のスクリーニング方法、前記スクリーニング方法に用いるための細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体（以下、本明細書中「細胞等」という場合がある）のモデル系、及び前記スクリーニング方法によって得られた化合物を含む、医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経変性疾患
「神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」は、原因不明の代謝障害により、疾患ごとに決まった種類の神経細胞群が、進行性の変性・脱落を生じる結果、様々な神経・精神症状を呈する一群の疾患、を意味する。神経変性疾患の中には、大脳皮質をおかすアルツハイマー病（ＡＤ）、主として中脳黒質が障害されるパーキンソン病（ＰＤ）など、極めて頻度が高くほとんどが孤発性である（すなわち遺伝性を示さない）もの、そしてポリグルタミン病のように、個々の疾患としては比較的稀であるが様々な病型が存在し、そのすべてが遺伝性を示すものなど、多種多様な疾患が含まれる。近年、ポジショナルクリーニングなどの強力な分子遺伝学的研究法が進歩し、ハンチントン病をはじめとするポリグルタミン病、家族性アルツハイマー病、家族性筋萎縮性側索硬化症など、数多くの単一遺伝子病型の神経変性疾患の病因遺伝子が明らかにされつつある。しかし産物タンパク質には機能不明なものが多く、いまだその代謝障害の本態は原因不明と言わざるを得ない。そして、神経変性疾患の原因遺伝子産物である特定のタンパク質が何らかの構造異常を生じ、主としてβ−シート構造をとる凝集物を形成していく過程で、新たな異常機能を獲得し、細胞死を招来するのではないかとの展望が急速に開けつつある。
【０００３】
詳細には、多くの神経変性疾患において、異常構造、即ち、非折り畳みポリペプチドが、多くは不溶性封入体として細胞内に蓄積し、そして、疾患の病理発生に決定的な役割を果たしている。タンパク質の正常な折り畳みを阻止する突然変異によって引き起こされる神経変性疾患の種類の数は非常に多い。変性タンパク質の細胞内封入体は、家族性筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びにポリグルタミン鎖の伸長によって誘導されるいくつかのポリグルタミン病（例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ））を含む、多くの神経性疾患の特徴となっている。
【０００４】
これらの神経変性疾患の全てにおいて、独特の異常ポリペプチド群の蓄積に因って、特定の神経集団の病理及び結果としての死が生じる（参考文献１）。多くの観察は、これらの種々の型の封入体は、共通のメカニズムを介して生じ、そして同様の宿主反応を顕在化させることを示唆している。重要な経路の一つとして、これらの封入体の全ては、ユビキチン−プロテアソーム分解系及びさらに分子シャペロン群の成分を含んでいる。これらは、非折り畳みポリペプチドの集積に対して真核細胞を防御する、２種の主要なシステムである（１）。
【０００５】
事実、神経変性疾患の一種である、ポリグルタミン病では伸長されたポリグルタミンの一時的な発現により、ユビキチン−プロテアソームのほぼ完全な阻害が引き起こされる（２、３）。ユビキチン依存性タンパク質分解は、細胞分裂及びアポトーシスのような基本的な細胞事象を制御するのに中心的な役割を果たしている。よって、最近の多くの研究は、タンパク質凝集と細胞非制御及び細胞死とを関連付けるメカニズムの可能性を示唆している（２、３）。しかしながら、これらの病原的な、封入体媒介性の、プロテアーゼ群によって誘導される神経細胞死の基礎をなす実行メカニズムは、あまり解明されていない。特に、非折り畳みタンパク質の神経毒への関与についての遺伝学的証拠についてはほとんどわかっていない。
【０００６】
ポリグルタミン病
神経変性疾患の一種、「ポリグルタミン病」は原因遺伝子の同定により新たに提唱された疾患群で、原因遺伝子の翻訳領域内にあるポリグルタミンをコードするＣＡＧリピートが、患者において特異的に明らかにされた疾患である。疾患の数は年々増加し、２００１年９月頃までに、９つの遺伝性神経変性疾患、すなわち、ハンチントン病（ＨＤ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、マチャド−ジョセフ（Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）病（ＭＪＤ、ＳＣＡ３ともよばれる）、脊髄小脳失調症（Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ）１型（ＳＣＡ１）、２型（ＳＣＡ２）、６型（ＳＣＡ６）、７型（ＳＣＡ７）、１７型（ＳＣＡ１７）が同定されている。これらの疾患は、病因遺伝子そのものの転写レベル、翻訳レベルには異常が生じないことが示されており、ポリグルタミン鎖による何らかの神経細胞に対する障害性が疾患発症機構に関与していると考えられている。これらのポリグルタミン病においては、伸長ＣＡＧリピート長と発症年齢の間に負の相関関係が認められること、３５リピート前後が発症の閾値と考えられること（ＳＣＡ６を除く）など、多くの共通性があり、普遍的な神経変性機構が存在すると考えられている。
【０００７】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をモデルとして用いた遺伝学的手法によって、ポリグルタミンによる神経変性を抑制する方法が提案されている。そのうちのひとつは、変性タンパク質の再折り畳みにかかわる分子シャペロンＨＳＰ７０（先行文献２９）又はＨＳＰ４０（３０）の過剰発現によるものである。しかしながら、分子シャペロンＨＳＰ７０又はＨＳＰ４０の過剰発現は、変性タンパク質が産生された際の一般的な保護法であり、そのため、作用の特異性と保護効果がそれほど強くないという問題点がある。さらに、これに代わる薬剤の開発は困難である。別の手法は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるサベロイルアニリド  ヒドロキサム酸（ｓａｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ：ＳＡＨＡ）を用いるものである。ポリグルタミンの発現が引き起こす細胞内事象として、転写活性の抑制とプロテアソームによるタンパク質活性の低下が知られている。ＳＡＨＡの利用は、ポリグルタミンの発現が遺伝子の転写を抑制するという観察に基づき、転写活性を抑制するヒストンデアセチラーゼを阻害することによって転写の低下を抑えようとするものである（３１）。
【０００８】
しかしながら、本発明前、プロテアソームにおけるタンパク質分解活性の低下の神経変性における意義は明らかにされていなかった。よって、この観点から神経変性疾患の機構を解明し、治療へ結びつけるというアプローチもほとんどされていなかった。
【０００９】
小胞体の構造・機能とトランスロコン
小胞体（Ｅｎｄｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｍ：ＥＲ）は、真核細胞の細胞質内に網目状に広がる細胞内膜系の一種である。小胞体には、リボソームを結合しタンパク質合成を行う粗面小胞体とリボソームを結合していない滑面小胞体とが存在し、両者は連続している。このうち主に粗面小胞体は、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、ゴルジ体、リソソーム、小胞体自体などのタンパク質が合成される。シグナル認識粒子（ＳＲＰ）受容体、Ｓｅｃ６１ｐ複合体（Ｓｅｃ６１ｐ  ｃｏｍｐｌｅｘ）などから成るトランスロコン（小胞体の「タンパク質輸送チャンネル」又は「タンパク質透過チャンネル」）、シグナルペプチダーゼなどが存在し、翻訳と共訳したリボソームの小胞体膜への結合、タンパク質の膜透過、シグナル鎖の切断、オリゴ糖トランスフェラーゼによるＮ結合型糖鎖の付加などがおこなわれ、分泌タンパク質は小胞体内腔から細胞膜へと輸送される。
【００１０】
真核生物における小胞体のトランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）は、３種の膜貫通サブユニット、Ｓｅｃ６１α、Ｓｅｃ６１β及びＳｅｃ６１γからなるＳｅｃ６１ｐ複合体のオリゴマーを主な構成要素とする（９，１０）。Ｓｅｃ６１ｐ複合体は、ヒト、酵母等の真核生物で広くその存在が知られている。さらに、Ｓｅｃ６１ｐ複合体のαサブユニットは大腸菌のＳｅｃＹと、そして、γサブユニットはＳｅｃＥと相同性を示す。Ｓｅｃ６１ｐ複合体は、小胞体内腔において、分泌性の前タンパク質の移動による小胞体への移入、並びに、小胞体関連タンパク質の分解「小胞体関連分解」（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ＥＲＡＤ）による分解されたタンパク質の小胞体外への移出の双方に必要であることが知られている（１１）。
【００１１】
さらに、小胞体内腔にはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が存在し、新生ポリペプチドの分子内、分子間ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）の形成を触媒し、タンパク質の折り畳み（フォールディング）、多量体形成を含む会合体形成に関与する。小胞体内腔には、またＢｉＰ（ＧＲＰ７８）、エンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ、ＧＲＰ９４）、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）などの分子シャペロンが存在し、新生ポリペプチドの折り畳み、会合体形成を促進し、異常なタンパク質（変性タンパク質）が小胞体から搬出されないように、品質管理を行っている。一方、小胞体には後述する独自のタンパク質分解系（特に、ユビキチン−プロテアソーム系）が存在し、異常タンパク質は速やかに分解される。（「分子細胞生物学辞典」  ｐ．４７９右欄−ｐ．４８０左欄）
ユビキチン−プロテアソーム系
細胞内のタンパク質分解系としては、主にリソソーム分解系、カルパイン系、ユビキチンを介在するプロテアソーム分解系（ユビキチン−プロテアソーム系）などが知られている。特にユビキチン−プロテアソーム系は、１．生化学的に不可逆的反応であること、２．迅速に標的となるタンパク質を認識し分解する系であること、に特徴付けられる。ユビキチン化は機能的に多くの細胞内現象に関わることが知られており、特に細胞内シグナル伝達、細胞周期、細胞膜受容体介在生エンドサイトーシス、転写、オルガネラ合成、精子形成調節などに関与している。
【００１２】
ユビキチンは、真核生物に普遍的に存在するアミノ酸７６個からなるタンパク質である。ユビキチンによるタンパク質の翻訳後修飾は蛋白質分解の標識となる。ユビキチン化によりマルチユビキチン鎖が結合した標的タンパク質は、ＡＴＰ依存性プロテアーゼである２６Ｓプロテアソームの１９Ｓキャップに存在するＲｐｎ１０／Ｓ５ａという分子に認識され、２０Ｓを構成するα７β７サブユニットで分解を受ける。ユビキチン−プロテアソーム系の生化学的反応についての研究の近年の発展は目覚ましく、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１；Ｕｂａ）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２；Ｕｂｃ）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３；Ｕｂｒ）が分子クローニングされ、一部の標的タンパク質においては、特異的なユビキチンかに関与する酵素が明らかにされている。
【００１３】
本発明前、多くの神経変性疾患において、異常タンパク質が、多くは不溶性封入体として細胞内に蓄積することが観察されていたが、タンパク質分解を含む小胞体の機能との関連はほとんど解明されていなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、
細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に、治療剤の候補となる化合物を付与し、そして
当該治療剤が、細胞においてトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを調べ、当該機能が抑制される場合に治療剤として選択する
ことを含む、ことを特徴とする。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、上記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する。
【００１６】
本発明の方法は、好ましくは、上記治療剤の候補となる化合物がトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを、トランスロコンの変性タンパク質の小胞体から細胞質への輸送機能が抑制されるか否かを指標にして調べる。
【００１７】
本発明の方法は、好ましくは、上記トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドが、Ｓｅｃ６１ｐ複合体を構成する、Ｓｅｃ６１α、β、γの各サブユニットのいずれかである。
【００１８】
本発明の方法は、より好ましくは、上記小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患がポリグルタミン病であり、そして、伸長ポリグルタミンの発現によって、上記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する。
【００１９】
本発明はまた、前記スクリーニング方法に使用するための、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体（以下、本明細書中「細胞等」と記載する場合がある）を提供することを目的とする。本発明の細胞等は、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有するように処理されている、ことを特徴とする。
【００２０】
本発明はさらに、前記スクリーニング方法によって得られた化合物を含む、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。本発明の医薬組成物に含まれる化合物は、好ましくは核酸である。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意研究に勤めた結果、神経細胞の死及び変性のメカニズムを解明し、本願発明を想到した。
【００２２】
先ず、神経変性疾患のモデルとして、ショウジョウバエの複眼を構成する各個眼中の特定の細胞中で、ショウジョウバエゲノムの大半を網羅した個々の遺伝子を過剰発現させ、神経細胞の死及び変性の過程に関与する遺伝子の新規なスクリーニングを行った。
【００２３】
前記スクリーニングにおいて、神経変性疾患に関与する遺伝子として、トランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）を構成するＳｅｃ６１ｐ複合体中のＳｅｃ６１αのショウジョウバエの真正同族体（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）（ＤＳｅｃ６１α）をコードする、ｅｎｄｄ２遺伝子を同定し、そして特性付けした。Ｓｅｃ６１αは、小胞体関連分解（「ＥＲＡＤ」）の必須成分である。Ｄｓｅｃ６１αの機能喪失実験により、伸張されたポリグルタミン媒介性のプロテアソーム阻害によって引き起こされる神経細胞の死及び変性に、トランスロコンが必要であることを明らかにした。これらの結果は、伸張ポリグルタミンによるプロテアソーム阻害がトランスロコンを欠陥のあるものとし、それにより分解されなかったタンパク質群のＳｅｃ６１αによる誤った移動を引き起こすことを示している。
【００２４】
本発明前は、数多くの研究は、神経変性疾患の例えばポリグルタミン病における、タンパク質凝集の可能性のある役割及びプロテアソームタンパク質分解に焦点があてられてきた（２、３）。本発明者らは、プロテアソーム阻害によって誘引される細胞死シグナル伝達経路に、トランスロコン、特に、Ｓｅｃ６１α機能が関与していることを見出した。これにより、本発明では、ポリグルタミン毒性とトランスロコンとの関連性を初めて分析した。ハエにおけるポリグルタミン疾患モデルは、マチャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）、ハンチントン病等のモデルを含む。ポリグルタミン鎖の伸長したヒトＭＪＤ／ＳＣＡ３遺伝子の短縮型又はヒトハンチントン遺伝子の短縮型の発現は、晩発性進行性変性及び光受容体神経細胞の喪失を顕在化させる（１６、１７）。ポリグルタミン誘導性の神経細胞の喪失は、ショウジョウバエにおけるカスパーゼ依存性細胞死経路によって大きく影響されない（１６、１７）。
【００２５】
神経変性疾患の治療用化合物のスクリーニング方法
よって、本発明は、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、
細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体に、治療剤の候補となる化合物を付与し、そして
当該治療剤が、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを調べ、当該機能が抑制される場合に治療剤として選択する
ことを含む、ことを特徴とする。
【００２６】
（１）小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患
真核細胞は、誤って折り畳まれた又は非集合の分泌性タンパク質を小胞体から除くための複雑な分解装置を有している。タンパク質は小胞体／前ゴルジ区画中に保持され、そして次いで、細胞質内のユビキチン−プロテアソームシステムによって加水分解される。これは、タンパク質が小胞体から細胞質へ戻る逆行性移動を必要とし、当該移動は小胞体中のトランスロコンの中心的な成分であるＳｅｃ６１αによって媒介される（１１）。本発明において、「小胞体関連分解」とは、このように、小胞体において誤って折り畳まれた又は非集合の分泌性あるいは膜タンパク質（以下、本明細書中、総称して「変性タンパク質」ということがある）を分解するシステムをいう。
【００２７】
ポリグルタミン病を含むいくつかの神経変性疾患においては、上記小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の蓄積による細胞内封入体の形成を導き、これが、発病に寄与すると考えられている（１１）。例えば、限定されるわけではないが、以下のような疾患が、「変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患」に含まれる。
【００２８】
【表１】
0004093537.tif 000002
特に、本願明細書中の実施例に記載されたポリグルタミン病の他にも、例えば、パーキンソン病では、ユビキチン−リガーゼ  Ｐａｒｋｉｎの基質であるＰａｅｌ受容体が、ＥＡＲＤによって分解され、ユビキチン−プロテアソームシステムの能力が減少すると、神経毒を示すと考えられている。細胞性のＰａｅｌ受容体は神経細胞死を効率的に起こしうる（１９）。また、ＢＳＥ、スクレイピーまたはクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）等の神経変性疾患の必須因子である、プリオンタンパク質（ctmＰｒＰ）の膜貫通型は、正常な状態ではユビキチン−プロテアソームシステムによって迅速に分解される。しかしながら、ある条件下で、ctmＰｒＰは分解を免れ、小胞体から主に細胞質に輸送され、その場において疾患を誘因すると考えられている（２０、２１）。
【００２９】
Ｐａｅｌ受容体とctmＰｒＰの双方のケースにおいて、神経に毒性のこれらのタンパク質の移動は、Ｓｅｃ６１αを含むトランスロコンを介している可能性がある。これらは、細胞性障害を避ける場合には、ＥＲＡＤ装置を厳密に制御する必要があることを示している。ＥＲＡＤシステムに関与するプロテアソーム機能が無効であると、潜在的に毒性である、誤って折り畳まれた又は非集合分泌性タンパク質が、細胞質中に蓄積しうる。
【００３０】
よって、本発明の対象となる疾患は、限定されるわけではないが、好ましくは、ポリグルタミン病、パーキンソン病、多系統萎縮症、アルツハイマー病、家族性筋萎縮性側索硬化症、プリオンタンパク質の蓄積が関与する疾患（クロイツェルフェルト−ヤコブ病、Gerstmann−Straussler症候群及び狂牛病（ＢＳＥ）を含む）である。より好ましくは、ポリグルタミン病である。
【００３１】
（２）スクリーニングのモデルとなる細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体
本発明のスクリーニング方法では、細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体（以下、本明細書中総称して、「細胞等」ということがある。）に、治療剤の候補となる化合物を付与する。
【００３２】
小胞体関連分解に関与するトランスロコンは、ヒト、酵母等の真核生物で広くその存在が知られている。さらに、Ｓｅｃ６１ｐ複合体のαサブユニットは大腸菌のＳｅｃＹと、そして、γサブユニットはＳｅｃＥと相同性を示す。
【００３３】
よって、本発明のスクリーニングに使用可能なモデル系としての細胞等は、特に限定されず、細菌（例えば、大腸菌、乳酸菌）、酵母（例えば、発芽酵母、分裂酵母）等の単細胞であってもよい。または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）、ショウジョウバエ（例えば、Ｓ２細胞、ＢＧ２細胞）等由来の培養細胞も使用可能である。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。限定されるわけではないが、好ましくは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｎｅｕｒｏ２ａ等の神経細胞由来の培養物である。また、酵母細胞も、取り扱いの簡便性等の理由により有用である。
【００３４】
あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。例えば、ショウジョウバエ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ）、マウス、ラット等由来のものが使用可能である。病態モデルを良く反映しうる等の観点より、ショウジョウバエの個体及び成虫原基が好ましい。
【００３５】
限定されるわけではないが、本発明において、細胞等は、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する。細胞内封入体を有するように、細胞等に人為的に処理を施してもよい。このように、本発明のスクリーニング方法に使用するために人為的に処理を施した細胞等も本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
例えば、細胞等を組換え発現ベクターで形質転換し、細胞封入体に含まれるタンパク質を過剰発現させてもよい。当業者は、タンパク質の過剰発現は細胞等の種類に応じて公知の方法に従って、適宜行うことができる。しかしながら、神経変性疾患に関与する変性タンパク質の蓄積はしばしば細胞にとって致死的であるため、発現は恒常的ではなく制御可能な一過性であるか、あるいは、例えば個体等の場合、異所発現とすることが好ましい。
【００３７】
「過剰発現」という用語は、本明細書において、できるだけ最も一般的な意味で使用される。変性タンパク質が、天然レベル即ち、形質転換していない同じ系統の細胞において見られるより有意に及び検出可能に高い（例えば、２０％高い）レベルで生産される場合に、細胞において「過剰発現」されると言われる。細胞における分子の過剰発現は、伝統的な突然変異及び選択手法、並びに遺伝子操作法の両方を介し、達成することができる。
【００３８】
「異所発現」という用語は、本明細書において、例えば、異所的に発現されるペプチド又はタンパク質が、天然には全く（又は検出可能に）発現されない胚、器官、組織、個体の空間的ポイントで生産される、即ち前記ペプチド又はタンパク質が前記ポイントで過剰発現されるという意味で、過剰発現の特別な実現を意味する。特に好ましい異所発現は、選択されたポイントでのみ機能的レベルに達し、そして個体等全体でそうならないものである。この好ましい異所発現は、恒常的発現と対照的である。
【００３９】
限定されるわけではないが、プラスミドなどの組換え発現ベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、上述した細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体等に導入される。
【００４０】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００４１】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を過剰発現しうる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）が含まれる。昆虫用発現ベクターとしては、上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＳ）として１ないし複数ののＧＡＬ４−結合部位を生じるｐＵＡＳＴ発現ベクター（Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ博士、ハーバード大学、米国より入手可能）、あるいはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（ｐＢＳＳＫ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５等が使用可能である。ｐＵＡＳＴ又はｐＢＳＳＫがなどが好ましい。哺乳動物用発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＥＦＢＯＳ等が使用可能である。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法のモデル系となる細胞等に、上記発現ベクターを形質転換することにより、変性タンパク質を過剰発現させることが可能である。モデル細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。タンパク質の過剰発現のために、強力なプロモーター等を使用することが好ましい。しかしながら、神経変性疾患に関与する変性タンパク質の蓄積はしばしば細胞によって致死的であるため、プロモーターは恒常的ではなく、制御可能な誘導性なもの、例えば、ｐＥＴ−２１等が好ましい。
【００４３】
細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００４４】
ベクターにおいて、タンパク質の過剰発現のために、強力なプロモーターを使用することが好ましい。しかしながら、神経変性疾患に関与する変性タンパク質の蓄積はしばしば細胞によって致死的であるため、プロモーターは恒常的ではなく、局所発現を誘導しうるもの、例えば、ｐＵＡＳＴと組織特異的なＧａｌ４発現ベクター、あるいは、制御可能な誘導性なもの、例えば、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ、ｐｃＤＮＡ４／Ｔ０等が好ましい。
【００４５】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００４６】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、例えば、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＵＡＳＴ又はｐＢＳＳＫ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００４７】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４８】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００４９】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００５０】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００５１】
例えば、限定されるわけではないが、本発明の実施例９では、ポリグルタミン病の原因とされる伸長ポリグルタミン（Ｑ１６、Ｑ６０、Ｑ１５０）をコードする核酸配列をｐＵＡＳＴ発現ベクターに結合し、ショウジョウバエの神経細胞で過剰発現させた。ｐＵＡＳＴ発現ベクターは、ＧＡＬ４の存在下でのみ挿入遺伝子の発現が可能なので、特定のプロモーターの制御下でＧＡＬ４を発現する駆動プラスミド（実施例９では、ａｃｔｉｎ５Ｃプロモーターの制御下でＧＡＬ４を発現するｐＷＡＧＡＬ４）と組合せることにより、プロモーターが働く特定の条件下でのみ伸長ポリグルタミンが強制発現される。
【００５２】
また、神経変性疾患に関するショウジョウバエの個体モデルとして、例えば、ＭＪＤモデルハエ（ＵＡＳ−ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８）、ハンチントン病モデルハエ（ＧＭＲ  ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  １２０Ｑ）（いずれも、Ｎａｎｃｙ  Ｂｏｎｉｎｉ氏、ペンシルベニア大学、米国；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｚｉｐｕｒｓｋｙ氏、ＵＣＬＡ、米国、等より入手）が知られている。
【００５３】
さらに、ポリグルタミン以外の神経変性疾患の原因とされる異常タンパク質のアミノ酸配列、核酸配列も公知であり、当業者は本明細書の記載に基づいて、同様に、細胞等が所期の変性タンパク質の細胞内封入体を有するように、人為的な処理を施し、所期の神経変性疾患のモデル系とすることが可能である。例えば、ヒトのα−Synucleinについては、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，  ３９４−３９８  （２０００）（３３）に、ヒトのＴａｕタンパク質については、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３，  ７１１−７１４  （２００１）（３４）に開示されている。
【００５４】
さらに、細胞等が「小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有する」状態は、ユビキチン−プロテアソーム活性を阻害する薬剤、例えば、ラクタシスチン、ＭＧ１３２等を細胞等に投与することにより、増強させることが可能である。限定されるわけではないが、薬剤は、好ましくは、神経変性疾患の治療剤の候補化合物と同時、あるいはそれより６時間ないし２４時間程度前に、１μＭないし５μＭ、好ましくは２０μＭ程度投与する。
【００５５】
（３）治療剤の候補化合物の付与
本発明のスクリーニング方法では、上記細胞等に治療剤の候補となる化合物を付与する。
【００５６】
治療剤の候補となる化合物は、トランスロコン構成タンパク質又はペプチドの機能に影響を与えうると予測される化合物で、特に限定されず、ＤＮＡ又はＲＮＡである核酸、タンパク質、ペプチド、あるいはキフネンシン等の有機化合物などが含まれる。
【００５７】
トランスロコン構成タンパク質又はペプチド（タンパク質等）の機能への影響は、トランスコロンタンパク質等を直接又は間接的に抑制するものであっても、あるいは、トランスコロンタンパク質等をコードする遺伝子に直接又は間接的に作用し、遺伝子の転写、翻訳、翻訳後修飾等の各工程を抑制するものであってもよい。好ましくは、トランスコロン構成タンパク質等をコードする遺伝子に直接又は間接的に作用する核酸、より好ましくは、トランスコロン構成タンパク質等をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ、ヘアピンループＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、もしくはオリゴデオキシヌクレオチドである。
【００５８】
本発明において、トランスロコン構成タンパク質又はペプチドの機能が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う変性神経疾患に関与することが明らかにされた。よって、当業者は、トランスロコン構成タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子配列に基づき、本発明のスクリーニング方法を用いて、これらを抑制する二本鎖ＲＮＡ、ヘアピンループＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡの配列をスクリーニングすることが可能である。
【００５９】
二本鎖ＲＮＡ、ヘアピンループＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、最も好ましくは１０００塩基以上の長さである。導入の技術上の簡便性等の観点より、好ましくは１００００塩基以下、より好ましくは５０００塩基以下である。限定されるわけではないが、二本鎖ＲＮＡ、ヘアピンループＲＮＡは、哺乳類細胞では１９塩基のステムループを持つものが好ましく、ショウジョウバエや線虫では５００塩基以上のものが好ましい。これらは、公知の方法により合成することが可能である。
【００６０】
候補化合物の細胞等への導入は、化合物の種類に応じ、公知の方法により適宜行うことが可能である。例えば、培養細胞の場合、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ６１８８−９７，  （２００２）（２８）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８，  （２００１）（３５）に記載の方法により行うことが可能である。さらに、例えば、個体において、特定の細胞、器官、組織等において、神経変性が観察される場合、候補化合物を当該特定の細胞等に特異的に付与することが望ましい。このような手法は公知であり、例えば、ショウジョウバエの場合には、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，８９６−８９８，（２０００）（３６）等の文献に記載されている。
【００６１】
（４）トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制
本発明者らは、トランスロコン構成タンパク質又はペプチドの機能が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う変性神経疾患に関与することを初めて見出した。よって、本発明のスクリーニング方法では、候補治療剤がトランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを調べ、当該機能が抑制される場合に治療剤として選択する、ことを特徴とする。
【００６２】
「トランスロコン」とは、小胞体の「タンパク質輸送チャンネル」又は「タンパク質透過チャンネル」とも言われ、小胞体内腔において、分泌性の前タンパク質の移動による小胞体への移入、並びに、小胞体関連分解により分解されたタンパク質の小胞体外への移出の双方に必要とされるものである。「トランスロコン」は、Ｓｅｃ６１ｐ複合体及びシグナル認識粒子（ＳＲＰ）受容体などから成る。特に、主な構成要素であるＳｅｃ６１ｐ複合体は、３種の膜貫通サブユニット、Ｓｅｃ６１α、Ｓｅｃ６１β及びＳｅｃ６１γからなるオリゴマーである（９、１０）。Ｓｅｃ６１ｐ複合体は、ヒト、マウス等の哺乳動物、酵母等の真核生物で広くその存在が知られている。例えば、ヒトのＳｅｃ６１αは登録番号ＡＡＫ２９０８３として、Ｓｅｃ６１βは登録番号Ｌ２５０８５として、Ｓｅｃ６１γは登録番号ＮＭ＿０１４３０２として寄託されている。さらに、Ｓｅｃ６１ｐ複合体のαサブユニットは大腸菌のＳｅｃＹと、そして、βサブユニットはＳｅｃＥと相同性を示す。
【００６３】
本発明の方法は、好ましくは、上記トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドが、Ｓｅｃ６１ｐ複合体を構成する、Ｓｅｃ６１α、β、γの各サブユニットのいずれかである。限定されるわけではないが、このうちＳｅｃ６１αサブユニットは、トランスロコンの変性タンパク質の小胞体から細胞質への輸送機能に最も関与していると考えられている（９、１０、１１）。よって、本発明において、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドは、好ましくは、αサブユニットである。
【００６４】
Ｓｅｃ６１αタンパク質のアミノ酸配列及びコード遺伝子の塩基配列は公知である。本明細書中の配列表において配列番号４及び５は各々ヒト及び酵母由来のＳｅｃｃ６１αタンパク質のアミノ酸配列を記載している。さらに、本発明において、ショウジョウバエより新たに単離されたＤＳｅｃ６１αタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３として、コード遺伝子の塩基配列を配列番号１として、記載した。本発明において、Ｓｅｃ６１αタンパク質とは、非限定的に、典型的には配列番号３、４又は５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００６５】
しかしながら、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。よって、本発明において、Ｓｅｃ６１αタンパク質は、配列番号３ないし５に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００６６】
また、一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異体タンパク質も本発明のＳｅｃ６１αタンパク質に含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９））に記載の部位特異的突然変異誘発法等が使用可能である。
【００６７】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。あるいは、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）やＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）のような遺伝子配列解析ソフトを用いて、配列情報を比較し、決定することが可能である。
【００６８】
本明細書では、配列番号３ないし５において各々ショウジョウバエ、ヒト、酵母のＳｅｃ６１αタンパク質のアミノ酸配列を、そして、配列番号１においてショウジョウバエＳｅｃ６１αタンパク質（ＤＳｅｃ６１α）をコードするＤＮＡ配列が開示されている。当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応などの遺伝子工学的手法により、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（アリル）を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質またはポリペプチドも、本発明のスクリーニング方法に利用可能である。
【００６９】
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
【００７０】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０−５６９，１９８９；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７−１２２，１９９０；  Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３，１９９１）及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３−１１７７，１９８９）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３９２−３９６，１９９２；  Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６，１９９２）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ＪＣ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，ｐ．１８７４−１８７８）及びＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７−１２０２，１９８８）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００７１】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列に対して、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００７２】
同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４））に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１及び非同一に対し０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，  １４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティ及び各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００７３】
本発明では、上記トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が、治療剤の候補化合物によって、抑制されるか否かを調べる。
本発明では、変性タンパク質（伸長ポリグルタミン）がユビキチン−プロテアソーム機能に影響することによって細胞性タンパク質分解システムを変化させ、そして、変化したプロテアソーム活性は、細胞質中の非折り畳みタンパク質の蓄積を誘因し、これが細胞生存率に影響する、というメカニズムが示された。なお、後述する実施例９では、ショウジョウバエの細胞におけるプロテアソーム活性は、伸長ポリグルタミンの過剰発現によってその長さに応じて減少された（図１３）。しかしながら、ショウジョウバエの細胞における、伸長ポリグルタミン及びラクタシスチンのプロテアソーム阻害効果は、ＤＳｅｃ６１αタンパク質の減少によって影響されなかった（図１３）。よって、当該実施例では、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が抑制されても、プロテアソーム活性自体は回復しなかった。よって、本発明の方法は、好ましくは、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制するか否かを、トランスロコンの変性タンパク質の小胞体から細胞質への輸送機能が抑制されるか否かを指標にして調べる。
【００７４】
「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能の抑制」は、例えば、候補化合物を付与した細胞等に蓄積したＥＲＡＤによって分解されるべきタンパク質の量を測定することによって調べることができる。酵母、培養細胞等の場合には、細胞溶解物から総タンパク質を抽出したものを電気泳動してよい。泳動する総タンパク質は、好ましくは、抗β−チューブリン抗体等によって、同量のタンパク質が装填されることを確認する。例えば、プロテアソーム阻害剤の存在下では、ＥＲＡＤによって分解されるべきタンパク質が、細胞質にユビキチン化された状態で蓄積する。これに候補化合物を付与した場合は、付与していない対照の細胞と比較して、細胞質におけるユビキチン化されたタンパク質の量が減少する（例えば、１０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは３０％）と考えられる。このような場合、「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が抑制されている」と判断することが可能である。
【００７５】
例えば、図１５では、ショウジョウバエの培養細胞において、伸長ポリグルタミン又はラクタシスチンによって誘導されたユビキチン化タンパク質の蓄積が、Ｄｓｅｃ６１α  ｍＲＮＡの発現レベルがｄｓＲＮＡの処理によって下方制御されると、ｄｓＲＮＡ処理を行わなかった対照と比較して、著しく減少した。よって、使用されたｄｓＲＮＡは、「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制」し、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための化合物となりうることが示された。他の化合物についてもｄｓＲＮＡと同様の実験を行うことにより、当該化合物が治療用として有効か否かを調べることができる。
【００７６】
あるいは、例えば、実施例９の図１４では、ショウジョウバエの複眼において、伸長ポリグルタミンによってユビキチン化タンパク質の蓄積を生じさせた。ハエの目を切除し総タンパク質を抽出した。培養細胞等の場合と同様に電気泳動を行い、ユビキチン化タンパク質の定量により、「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能の抑制」を調べた。このように、個体、又は個体の一部の組織、器官、細胞等において伸長ポリグルタミンによってユビキチン化タンパク質の蓄積を生じさせたものをモデル系として使用することも可能である。
【００７７】
また、上記細胞、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体が、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を有しない、正常な場合であっても「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が抑制」されるか否かを調べることが可能である。具体的には、例えば、ＥＲＡＤによって分解されることが既に明らかにされているタンパク質であるＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）とその変異体△Ｆ５０８  ＣＦＴＲ（Ｃｅｌｌ  ８３，  ｐ．１２１−１２７，  １９９５，  Ｗａｒｄ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ）の量を免疫ブロッティング等で定量することができる。
【００７８】
あるいは、細胞等に蓄積したユビキチン化タンパク質の量ではなく、候補化合物の付与によって、変性タンパク質の細胞内封入体に起因する表現型が回復するか否かを、「トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が抑制」されるか否かの指標としてもよい。候補化合物は、個体、変性タンパク質の細胞内封入体に起因する表現型が観察される特定の細胞、器官、組織等に付与するのが好ましい。
【００７９】
例えば、ショウジョウバエの複眼において、伸長ポリグルタミンの強制過剰発現を行うと、明らかな目の神経変性の兆候が観察される。候補化合物の付与によって、このような神経変性の兆候が改善されるか否かを観察してもよい。
【００８０】
なお、実施例７では、ＤＳｅｃ６１α遺伝子の２種類の突然変異体ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｃ６１αEP(2)2567のトランスヘテロ接合体における、伸長ポリグルタミンの過剰発現による影響を調べた。当該トランスヘテロ接合体では、ＤＳｅｃ６１αの遺伝子量が野生型よりも減少していると思われるが、神経変性の表現型、特に色素の喪失及び光受容体変性を部分的にしかしながら有意に抑制した（図１０ｆ）。限定されるわけではないが、この結果は、ＤＳｅｃ６１α遺伝子の機能が完全ではなく（ホモ）、部分的に抑制される（ヘテロ）と好ましい可能性を示す。よって、本発明の治療用化合物は、トランスロコン、特にＤＳｅｃ６１αの機能を抑制、好ましくは部分的に抑制するものであってもよい。
【００８１】
神経変性疾患治療用の医薬組成物
本願発明はさらに、本発明のスクリーニング方法によって得られた治療用化合物を含む、小胞体関連分解が関与する変性タンパク質の細胞内封入体を伴う神経変性疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明のスクリーニング方法では、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能を抑制する化合物が単離される。本発明において、トランスロコンを構成するタンパク質又はペプチドの機能が抑制されると、神経変性疾患に起因する変性（非分解）タンパク質の細胞質への移動が制御され、実際に神経変性に伴う表現型が改善されることが観察された。よって、本発明のスクリーニング方法によって得られた化合物は、神経変性疾患の治療に有効である。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、スクリーニングされた化合物を治療上有効な量を含む。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能な医薬組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術的範囲内において行い得る。
【００８４】
本発明の組成物の用量用法は、化合物の種類、作用、例えば、患者の症状の性質及び／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
【００８５】
参考文献
以下の文献は参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
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32.  「分子細胞生物学辞典」  ｐ．４７９右欄−ｐ．４８０左欄
33.  Feany M.B. and Bender W.W.  A Drosophila model of Parkinson's diseases.  Nature 404, 394-398 (2000)
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36.  Kennerdell, J.R., et al.,  Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA.  Nature Biotech. 17, 896-898 (2000)
【００８６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８７】
材料及び手法
本明細書中の実施例において、特に記載しない場合、以下の材料及び手法を用いた。
【００８８】
１．ハエのストック
全ての一般的なハエのストック及びＧＡＬ４系は、ショウジョウバエのストックセンター（例えば、Ｂｌｏｏｍｉｎｇ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ等）より入手した。ハエの培養及び掛け合わせは、標準的なプロトコール（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｄ．）、１９９８）に従って、２５℃で行った。
【００８９】
ｒｈ３−ＧＡＬ４系は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（米国）ののＣｌａｕｄｅ  Ｄｅｓｐｌａｎ教授より入手した。この系は、目の前方区画におけるＲ７光受容体細胞の約３０％においてＧＡＬ４タンパク質を強く発現する（７）。ｒｈ３  ｍＲＮＡの発現は、有糸分裂後のＲ７光受容体神経細胞に限定されている（２２）。ＵＡＳ−ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８及びＧＭＲ  ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  １２０Ｑハエは、いずれも、Ｎａｎｃｙ  Ｂｏｎｉｎｉ氏（ペンシルベニア大学、米国）及びＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｚｉｐｕｒｓｋｙ氏（ＵＳＬＡ、米国）等より入手した。
【００９０】
先行文献１６及び１７に記載されているように、ｇｌａｓｓ遺伝子プロモーター構築物を用いて、発生中の目に指向して目的の遺伝子の発現させた場合、伸長ポリグルタミンタンパク質は、成虫ハエにおいて粗造な目の表現型及び色素細胞の喪失を誘導した。これらの表現型の重度は、ハエの日齢が上がるにつれ加速し、そして、それは完全な浸透度をもって成功裏に再現可能であった。これらのハエは１５又は３０日齢になるまで、維持及び飼育した。
【００９１】
２．組織学
先行技術文献２３に記載されているように、ハエを準備し、電子顕微鏡スキャンニング、半薄切片、トルジンブルー染色及びアクリジンオレンジ染色を行った。全ての像は、Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ｐｌｕｓ蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で調べた。成虫目の光学顕微鏡像のために、ハエに麻酔をかけ、ＡｘｉｏＣａｍデジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を装備したＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ１０００顕微鏡（ニコン）で調べた。
【００９２】
３．プラスミド構築体
発現プラスミドは、上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＳ）として５つのＧＡＬ４−結合部位を生じるｐＵＡＳＴ発現ベクター（Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ博士、ハーバード大学、米国より入手）、あるいはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（ｐＢＳＳＫ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築した。
【００９３】
本明細書中の実施例では、ショウジョウバエの細胞へのトランスフェクション及びトランスジェニックハエの作成には、ｐＵＡＳＴ構築物を使用し、そして、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作成にはｐＢＳＳＫプラスミドを使用した。ＥＳＴクローンＬＰ０２７８４からの、全長ｃＤＮＡに相当するＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１α  ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片を、ｐＵＳＡＴのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＵＡＳＴ−ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１αを作成した。ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１αの同じ断片をｐＢＳＳＫのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にも挿入し、ｐＢＳＳＫ−ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１αを作成した。
【００９４】
先行技術文献２３に記載のｐＣａｓｐｅＲ−ｈｓ−ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）からのＥＧＦＰ  ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＢＳＳＫの同じ制限酵素部位に挿入し、ｐＢＳＳＫ−ＥＧＦＰとした。
【００９５】
理化学研究所  脳科学総合研究センター  病因遺伝子研究グループ  グループディレィター  貫名信行  先生より入手したｔＮｈｔｔ−Ｑ１６−ＥＧＦＰ、ｔＮｈｔｔ−Ｑ６０−ＥＧＦＰ及びｔＮｈｔｔ−Ｑ１５０−ＥＧＦＰをｐＵＡＳＴの同じ部位（ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ）に挿入し、各々ｐＵＡＳＴ−ｈｔｔ１６ＱＥＧＦＰ、ｐＵＡＳＴ−ｈｔｔ６０ＱＥＧＦＰ及びｐＵＡＳＴ−ｈｔｔ１５０ＱＥＧＦＰを作成した（１８）。
【００９６】
ｐＵＡＳＴ−ＧＦＰは、京都大学の丹羽博士より入手した（２４）。ａｃｔｉｎ５Ｃプロモーターの制御下でＧＡＬ４を発現する駆動プラスミドｐＷＡＧＡＬ４は、国立遺伝学研究所の広海教授より入手した。ｐＣａｓｐｅＲ−ｈｓ−ｌａｃＺは、先行術文献２５に記載のように作成した。
【００９７】
４．細胞培養
ショウジョウバエＳＬ２細胞（Ｓ２細胞）（日本医科大学の程博士より入手）を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５ｍｇ／ｍｌペプトン（Ｄｉｆｃｏ）を含むシュナイダーのショウジョウバエ培地（ＧＩＢＣＯ）中、２７℃で培養した。ショウジョウバエの神経細胞株、ＢＧ２−ｃ６は（ＢＧ２細胞）（２７）は、日本医科大学の程博士によって提供され、上記培地中、２７℃で培養した。
【００９８】
細胞死分析のために、Ｓ２細胞とＢＧ２細胞を２４ウェルプレート中で培養し（１×１０5細胞／ウェル）た。次いで、これらの細胞をＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を用いて、種々の量のプラスミド、並びにａｃｔｉｎ５Ｃプロモーターの制御下でＧＡＬ４タンパク質を発現する２ｎｇのｐＷＡＧＡＬ４でトランスフェクトした。
実施例１  神経細胞の死及び変性に影響する新規な遺伝子を同定のためのスクリーニング
変性タンパク質の蓄積を含む神経変性の基礎的メカニズムを評価するための一つのアプローチは、神経細胞の死または変性に寄与しうる遺伝子のゲノムからの単離である。本発明では、この目的のためにショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を使用した。
【００９９】
具体的には、神経細胞の死及び変性に影響する新規な遺伝子を同定するために、本発明者らは、機能獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）スクリーニングを行った（図１ａ）（４、５）。ＧＡＬ４／ＵＡＳシステムを広範囲に用いて、ハエにおいて遺伝子の異所発現を強制的に起こした（６）。
【０１００】
本実施例において用いた異所性発現スクリーニングのためのＧＳベクターは、Ｐ因子に基づく遺伝子検索システム（ＧＳシステム）によるものであり、例えば先行技術文献５に記載されたように鳥羽らによって確立されたものである。ＧＳベクターは、コアプロモーターに隣接して上流活性化配列（ＵＡＳ）エンハンサーを２コピー含んでいる。そのうち、１コピーずつをベクターの各末端の末端逆繰返し配列の近傍に有しており、直接転写が生じるような方向で配置されている。これは、組織特異的プロモータの制御下でＧＡＬ４を発現するトランス遺伝子を持つ系統と交配した場合、ＵＡＳに最も近い下流の内因性遺伝子の発現を誘導すると考えられる。この型のスクリーニングでは、分子の発現量が神経細胞の生存又は死に影響を与えるであろうと予測される。ベクター隣接ＤＮＡのＧＡＬ４依存性強制発現によって誘因される、表現型の変化に基づいて遺伝子を検出する。本システムは、機能獲得スクリーニングのために既に使用されている他のシステムよりも、格段に効率がよい（５）。
【０１０１】
本実施例では先ず、発現が減少した場合よりもむしろ増加した場合に、有糸分裂後の終分化した神経における細胞死又は変性を誘導する遺伝子をスクリーニングした。分化、細胞分裂、又は形態形成の過程に関与する発生中の組織又は細胞において、ＧＡＬ４が広範囲に発現している場合、誘導された遺伝子は、これらの細胞死と非関連の事象を阻害又は増強することによって、２次的に細胞死を誘導する可能性がある。そこで、本発明におけるスクリーニングでは、成虫複眼の有糸分裂後の光受容体神経細胞中の特定のサブセット、即ちＲ７細胞においてＧＡＬ４活性因子を発現するｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ３−ＧＡＬ４（ｒｈ３−ＧＡＬ４）系を選択した（７）。
【０１０２】
具体的な、スクリーニング方法は、下記の通りである。
第一のスクリーニングとして、目の成虫原基でＧＡＬ４を発現するＧＭＲ−ＧＡＬ４ハエ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）をＧＳ系群と掛け合わせ、小さい目又は致死の表現型を示す特定の系群を同定した。この一次スクリーニングによって、複眼の縮小を指標にして効率よく細胞死誘導因子を含む系統を絞り込むことが可能になる。
【０１０３】
次いで、ｗ1118；；ｒｈ３−ＧＡＬ４遺伝子型の雌を、第一のスクリーニングからのＧＳコレクションからの各個々の系の雄と掛け合わせた。各Ｆ１子孫の雌を孵化から１０日間標準的な培地中で維持した。遺伝的スクリーニングのための培養及び掛け合わせは、２５℃で行った。後述するように、成虫の頭（１０日齢）を固定し、水平切片（１μｍ）のためにエポン中に包埋した。これらの半薄（ｓｅｍｉ−ｔｈｉｎ）の切片をトルジンブルーで染色し、光学顕微鏡で検査した。ｒｈ３プロモーターによって誘導されるＧＡＬ４タンパク質は、全ての個眼中の約半分のＲ７光受容体細胞で発現した。よって、同じ焦点面内での他の個眼との比較によって、ＧＳベクターの挿入そのものが、Ｒ７光受容体細胞の欠損又は変性を誘因するという可能性は排除される。
【０１０４】
Ｒ７光受容体細胞の除去又は変性のいずれかを産生する株をスコアし、維持し、そして、これらの表現型の再現性を調べるために再度掛け合わせた。系群の約０．２％がＲ７細胞の生存率に影響を与える表現型を産生した。これらの株をｅｎｄｄ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：神経死及び変性のエフェクター）系群として再命名し、番号を振り直した（図１ｂ）。ｅｎｎｄｄ系群のうち、特にｅｎｄｄ２GS2002系は、ｒｈ３−ＧＡＬ４と掛け合わせると、Ｒ７細胞を伴わない個眼が生じた（図２）。なお、現在では、約５０００のＧＳ系群がスクリーニングされている。
【０１０５】
実施例２  ｅｎｄｄ２GS2002系を用いた過剰発現実験
ｅｎｄｄ２が細胞死を誘導するような一般的な能力を有するか否か調べるために、ｅｎｄｄ２GS2002系を用いた過剰発現実験を行った。次いで、ｅｎｄｄ２GS2002ハエを他のＧＡＬ４駆動体群と掛け合わせることによって異所発現を行った（図３ａ−ｆ）。
【０１０６】
ＧＭＲ−ＧＡＬ４を用いた目の成虫原基において（図３  ｅ及びｆ）、後部領域におけるｅｎｄｄ２が異所発現されていた。その結果、成虫の表現型としては、野生型と比較して目の大きさが小さくなり、そして、アクリジンオレンジによって検出される大量の死亡した細胞が存在した。これらは、細胞死を誘導する能力もｅｎｄｄ２遺伝子産物の機能に含まれることを示唆している。
【０１０７】
実施例３  ｅｎｄｄ２GS2002ハエ中のＧＳベクター挿入体のゲノム上の配置の決定
本実施例において、ＧＳベクター挿入体のゲノム上の配置を決定した。ｅｎｄｄ２GS2002ハエ中のＧＳベクターへの単一の挿入体より２つの別個の転写物が得られた（図４）。ＧＳベクターは、２コピーのＵＡＳ配列を含んでいるので、ｅｎｄｄ２GS2002系中のＧＳベクターは、２方向に転写を誘導し、少なくとも２種類のタンパク質を産生することが可能である。
【０１０８】
配列分析は先行技術文献５に記載されている方法に、若干の修正を加えて、ＧＳベクターによって誘導される転写物の分析を行った。簡単には、ＧＡＬ４誘導転写物を分析するために、ＧＳベクター挿入系群を、ｈｓ−ＧＡＬ４系群と掛け合わせた。Ｆ１第三齢幼虫のハエに３７℃で１時間、熱ショックを与えた。ポリ（Ａ）+  ＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてハエ幼虫から単離した。
【０１０９】
以下の配列：
【０１１０】
【化１】
５’−ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’
（配列番号６）
を有するＮｏｔＩ部位近接オリゴ（ｄＴ）プライマーを用い、１μｇのｍＲＮＡを全容量３０μｌ中で逆転写した。反応混合物１μｌを用いて、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素混合物（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）によるＰＣＲによって、５’Ｐ及び３’Ｐ転写物の双方を増幅した。
【０１１１】
ＰＣＲは、全容量５０μｌで、上流プライマーとして以下の配列：
【０１１２】
【化２】
５’Ｐ−特異的プライマー
５’−ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  Ｇ−３’
（配列番号７）
又は
【０１１３】
【化３】
３’Ｐ−特異的プライマー
５’−ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡ−３’
（配列番号８）
を有する合成ヌクレオチドを。そして、下流プライマーとして、以下の配列
【０１１４】
【化４】
５’−ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＧＧ−３’
（配列番号９）
を有する合成ヌクレオチドを使用した。ＰＣＲの反応は以下のような熱サイクルプログラムで行った：９４℃（６０秒）、次いで、９４℃（１５秒）、６５℃（６分）及び７２℃（１０分）を２８サイクル。そして、チューブを４℃に維持した。
【０１１５】
増幅されたＰＣＲ断片を精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。回収された転写物を配列決定した。ＢＤＧＰ（http://www.fruitfly.org/blast/）及びＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）データベースに対するＢＬＡＳＴ用いて分析し、候補となる遺伝子を同定した。同時に、ＧＳベクターのＰ因子に近接するゲノムＤＮＡ領域を、標準的な逆ＰＣＲプロトコールによってＧＳ系群から回収した（http://www.fruitfly.org/about/methods/inverse.pcr.html）。
【０１１６】
上記のように、ｅｎｄｄ２GS2002株中で誘導された転写物の部分配列に基づいて配列分析を行った結果、ｅｎｄｄ２GS2002アリルのＧＳベクターが、Ａｄｍａｓら（８）によって予測されたショウジョウバエゲノム中の遺伝子群である、ＣＧ９５３９及びＣＧ９５３７の間に挿入されたことが示された。ＣＧ９５３９とＣＧ９５３７は、ショウジョウバエゲノムプロジェクト（８）によって明らかにされたように、２６Ｄ６に細胞学的にマッピングされた予想された遺伝子である。また、ｅｎｄｄ２の他のアリル（ｅｎｄｄ２GS2158）では、ＣＧ９３５７の第一イントロンにＧＳベクターが挿入されており、全長ＣＧ９５３９の発現の誘引のみ可能であった（図４）。
【０１１７】
実施例４  ＣＧ９５３９及びＣＧ９５３７の配列決定
ＣＧ９５３９については、発現された転写物の部分配列を含む発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ：ＥＳＴ）クローンＬＰ０２７８４をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、配列を分析した結果、ＣＧ９５３９の全長ｃＤＮＡであると考えられた。
【０１１８】
ＥＳＴクローン、ＬＤ３１５３７を完全配列決定した結果、ＣＧ９５３７遺伝子の誘導転写物の一部分に相当することがわかった。別のＥＳＴクローン、ＧＨ０６４６６も完全配列決定した結果、ＣＧ９５３７の３’配列を含むことが見出された。ＧＨ０６４６６の３’断片をＬＤ３１５３７の５’断片に、固有のそして共通するＳｍａＩ部位で融合し、全長ＣＧ９５３７  ｃＤＮＡを作成した。
【０１１９】
これらのクローンの塩基配列をダイデオキシ配列決定法によって決定した。その結果、ＣＧ９５３９の全長ｃＤＮＡの予測されるアミノ酸配列は、ヒトＳｅｃ６１α（寄託番号ＡＡＫ２９０８３）（配列番号４）及び酵母Ｓｅｃ６１（ＮＰ０１３４８２）（配列番号５）と、各々８９％及び５６％の同一性を示した（図５）。よって、ＣＧ９５３９遺伝子は、Ｓｅｃ６１αのショウジョウバエ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）をコードしていると予測され、本発明者らは、ＣＧ９５３９遺伝子によって産生されるタンパク質を「ＤＳｅｃ６１α」と命名した。そして、ＣＧ９５３７は新規タンパク質をコードしていることが示された。
【０１２０】
ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１α遺伝子は登録番号ＡＢ０６２６７０として登録されており（配列番号１）、ＣＧ９５３７の塩基配列は登録番号ＡＢ０６２６７１として、いずれも２００１年１２月４日にＮＣＢＩに登録された（配列番号２）。ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１α遺伝子のコードするショウジョウバエＳｅｃ６１αタンパク質「ＤＳｅｃ６１α」も、ＢＡＢ７８５１８（配列番号３）として２００１年１２月４日にＮＣＢＩに登録された。
【０１２１】
実施例６  ｅｎｄｄ２GS2002挿入体と表現型との関連
本実施例では、ｅｎｄｄ２GS2002挿入体の直ぐ３’側の遺伝子が、観察された表現型に本当に関与しているのかを調べた。具体的には、ＣＧ９５３９又はＣＧ９３３７のいずれかの対応するｃＤＮＡを、ＵＡＳトランスジェニックベクター中に挿入し、そして、初期段階のハエ胚にマイクロインジェクションしてトランスジェニックハエを作製した。
【０１２２】
トランスジェニックハエの作成は、以下のように行った。ＧＡＬ４／ＵＡＳシステムを用いて、ハエにおいてＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１α及びＣＧ９５３７の異所的発現を行った。ｐＵＡＳＴ−ＣＧ９５３９／ＤＳｅｃ６１α及びｐＵＡＳＴ−ＣＧ９５３７をｗ1118．；Ｄｒ／ＴＭＳ，Ｓｂ  Ｐ［ｒｙ＋，Δ２−３］胚にインジェクションし、先行技術文献２６に記載されたようにトランスジェニックハエを作製した。少なくとも各トランスジェニック構築体について少なくとも３つの独立した形質転換株を得た。ショウジョウバエの交配は、２５℃で標準的な手法に従って行った。
【０１２３】
その結果、ＵＡＳ−ＣＧ９５３９のトランスジェニック系は、ＧＭＲ−ＧＡＬ４又はｒｈ３−ＧＡＬ４の存在下で、ｅｎｄｄ２GS2002系及びｅｎｄｄ２GS2158系の表現型をほぼ再現したが、ＵＡＳ−ＣＧ９５３７のトランスジェニック系はしなかった（Ｆｉｇ６．ａ−ｊ）。これらのデータは、ｅｎｄｄ２系の複眼中のＧＳベクターからの遺伝子発現によるＲ７光受容体神経細胞の除去が、主にＣＧ９５３９転写物の活性に主に起因することを示す。
【０１２４】
実施例６  ショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡ干渉
本実施例では、神経細胞の死及び変性の誘導における、ショウジョウバエＳｅｃ６１αの機能を調べるために、培養細胞における機能喪失実験を行った。ショウジョウバエの神経細胞系においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は標的遺伝子産物のノックダウンに有効であることが知られている（１２、１３）。本実施例において、合成ｄｓＲＮＡ、並びにＵＡＳベクター（１４、１５）によって伸長したヘアピン−ループＲＮＡとして発現されたｄｓＲＮＡの双方を用いて、ＤＳｅｃ６１αタンパク質発現のノックダウンを行った。
【０１２５】
先ず、ｄｓＲＮＡの産生のために、各ｐＢＳＳＫプラスミドを鋳型とし、特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって、Ｔ７及びＴ３の双方のプロモータ配列が近接した、各ｃＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ用の特異的なプライマーは以下の配列を有する。
【０１２６】
【化５】
５’−ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’
（配列番号１０）
５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’
（配列番号１１）
増幅された断片を精製し、これを鋳型として標準的なプロトコールによって、Ｔ７又はＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡ合成を行った。合成されたＲＮＡをエタノール沈殿し、定量し、そして、各々より同量を混合して、６０℃で１０分間加熱し、そして、３７℃で３０分間冷却することによってアニーリングした。得られたｄｓＲＮＡをアガロースゲル上で電気泳動し、純度及び長さを確証した。
【０１２７】
一方、頭部対頭部（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）逆向き繰返し配列構築体を作成するために、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ部位を付加した断片（ＯＲＦのヌクレオチド１０１−１０００）を、ｐＵＡＳＴのＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。次いで、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を付加した他の断片（ＯＲＦのヌクレオチド２０１−１０００）を同じｐＵＡＳＴプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位に挿入してｐＵＡＳＴ−ＤＳｅｃ６１α  ｄｓＲＮＡを作成した。
【０１２８】
ＲＮＡ干渉実験では、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を用いて、種々の量のｄｓＲＮＡをトランスフェクトした。その結果、合成ｄｓＲＮＡ、及びＵＡＳベクターによる伸長ヘアピンーループＲＮＡのいずれも、細胞培養においてＤＳｅｃ６１αの特異的な阻害剤として機能した（図７）。
【０１２９】
次に、ＲＮＡ干渉によってＤＳｅｃ６１αの機能を調べた。各トランスフェクション用混合物は、ｈｓｐ７０プロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼをコードする、ｐＣａｓｐｅＲ−ｈｓ−ｌａｃＺ  ２０ｎｇをレポータープラスミドとして含んだ。トランスフェクションから２４時間後、先行技術文献に記載されたように、細胞に３７℃で熱ショックを与え、２７℃で２４時間培養した。次いで、細胞を３００μｌの１×リポーター溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解した。各溶解物を先行技術文献２５に記載されたように、１ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む反応混合物中でβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。β−ガラクトシダーゼ活性の大きさは、分光蛍光計（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ９６０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて４０５ｎｍの吸光度で測定した。
【０１３０】
上記の方法で、種々の刺激によって誘導された細胞死におけるＤＳｅｃ６１αの機能を調べた。Ｎ−グリコシル化の阻害剤であり、迅速な変性タンパク質応答（ＵＰＲ）を誘導するチュニカマイシンによって誘導される神経細胞死は、ＤＳｅｃ６１αトランスロコン遺伝子のＲＮＡｉによっては弱毒化されなかった（図８）。しかしながら、細胞におけるタンパク質分解システムの重度の破壊を引き起こす、プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンは、神経細胞死を誘導するために、ＤＳｅｃ６１α遺伝子を必要とする（図８及び９）。実験した細胞死を引き起こす他の刺激（スタウロスポリン、シクロヘキシミド、及びエクジソン）は、同じ条件下でＤＳｅｃ６１αの機能を必要としなかった（図８）。よって、これらのデータは、プロテアソーム機能の破壊、その結果として生じうる細胞質内への変性タンパク質の蓄積によって誘導される、神経細胞死にＤＳｅｃ６１αが要求されることを示唆する。
【０１３１】
実施例７  Ｄｓｅｃ６１αにおける突然変異ハエ、ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｖ６１αEP(2)2567の同定
Ｄｓｅｃ６１α遺伝子の機能喪失実験のために、Ｄｓｅｃ６１αにおける突然変異ハエ（ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｖ６１αEP(2)2567）を得た。
【０１３２】
具体的には、先ず、ＤＳｅｃ６１α遺伝子の突然変異系の候補として、ショウジョウバエゲノムデータベース（バークレーショウジョウバエゲノムプロジェクト）検索により、既知のＰ−因子挿入系統であるＰ５６０（ｌ（２）ｋ０４９１７）及びＥＰ（２）２５６７  Ｐ−因子株が、ｅｎｄｄ２遺伝子領域に存在することが判明した。
【０１３３】
これらの致死系におけるＰ−因子の挿入部位は、ＤＳｅｃ６１α遺伝子の第一イントロン中に存在することが見出された。Ｐ−因子復帰変異株は、標準的な遺伝学技術（例えば、、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｄ．）、１９９８に記載）によって作成され、そして、観察された表現型とＰ−因子挿入との関連が、Ｐ−因子の切り出しによって確認された（データ示さず）。前述のＰ５６０及びＥＰ（２）２５６７株は、Ｄｓｅｃ６１αの低形態（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）アリルであると推定された。なぜなら、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＤＳｅｃ６１αのｍＲＮＡの量がこれらの株のトランスヘテロ接合の幼虫で有意に減少していることが明らかにされたからである（データ示さず）。
【０１３４】
本発明者らは、これらの株をＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｃ６１αEP(2)2567と命名した。ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｃ６１αEP(2)2567のトランスヘテロ接合体について表現型分析を行った。伸長ポリグルタミン（７８繰り返し）を伴う短縮型ＭＪＤタンパク質を継続的に発現するハエは、孵化より３０日の時点でより重度の粗造の目及び色素の喪失を伴う、目の衰退を示した（図１０ｂ）。また、ハンチントン遺伝子中の１２０のＣＡＧ繰り返しを伴う第一エキソンを発現するハエにおいて、個眼の非正常な形態に寄与する、広範な光受容体の変性が観察された（図１０ｅ）。対照的に、ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｃ６１αEP(2)2567のトランスヘテロ接合体によるＤＳｅｃ６１αの遺伝子量の減少は、２種の異なるポリグルタミン発現ハエにおけるこれらの表現型、特に色素の喪失及び光受容体変性を部分的にしかしながら有意に抑制した（図１０ｆ）。
【０１３５】
さらに、Ｐ−因子致死系ＥＰ（２）２５６７は、ＣＧ９５３７の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）にＰ−因子が挿入されており、これにより致死性が決定されるが、Ｐ５６０及びＥＰ（２）２５６７の致死性を補足することができた。このことは、ＤＳｅｃ６１αP560及びＤＳｅｃ６１αEP(2)2567がＣＧ９５３９に近接するＣＧ９５３７遺伝子の突然変異アリルではないことを示唆する。ＤＳｅｃ６１α領域の既知の染色体欠損体は存在しない。
【０１３６】
実施例８  ＤＳｅｃ６１αの発現のノックダウンによる、伸長ポルグルタミン誘導の神経細胞死の抑制
ＥＧＦＰ（１８）に融合させた、伸長ポリグルタミン領域（１７、６０及び１５０繰り返し）を含むヒト  ハンチントンの第一エキソンを、ショウジョウバエの神経細胞系で過剰発現させた。その結果、ＥＧＦＰ蛍光によって示されるようにショウジョウバエの神経細胞中のポリグルタミン凝集のレベルは、過剰発現されたポリグルタミン繰り返しの長さに依存した。６０又は１５０のポリグルタミン繰り返しのトランスフェクションから７２時間後、ショウジョウバエの神経細胞は細胞死に至るような変化を示した。１７のポリグルタミン繰り返しは示さなかった（図１１、上パネル）。
【０１３７】
ＤＳｅｃ６１α  ｄｓＲＮＡのコトランスフェクションによる同遺伝子の発現のノックダウンは、伸長ポルグルタミンに誘導された神経細胞死を有意に抑制した（図１１  下パネル）。しかしながら、これらの条件下において、ポリグルタミンを含む細胞内凝集の量に変化はないようであった（データは示さず）。これは、ＤＳｅｃ６１αトランスロコンは、ポリグルタミンの翻訳又は凝集体の形成のいずれかには関与しない可能性を示唆している。まとめると、これらのデータは、ＤＳｅｃ６１αトランスロコンは、伸長ポリグルタミン誘導神経細胞死及び変性に関与していることを示した。
【０１３８】
実施例９  ポリグルタミン誘導神経変性とユビキチン−プロテアソーム機能との関連性
本実施例では、ポリグルタミン誘導神経変性とユビキチン−プロテアソーム機能との関連性を調べた。
【０１３９】
先ず、ポリグルタミン疾患に関する２種の双方のハエモデル（ＭＪＤ及びハンチントン病）において、２６Ｓプロテアソーム  サブユニットの部分的な喪失は、目の神経変性の兆候を明らかに増強した（図１２ａ−ｈ）。
【０１４０】
さらに、ユビキチン化されたタンパク質の検出のために、Ｓ２細胞を６−ウェルプレート中で培養し（５×１０5細胞／ウェル）た。ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を用い、種々の量のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、示された量のラクタシスチン（Ｔｏｙｏｂｏ）を、直ちに培地に加えた。トランスフェクションより２４時間後、細胞をＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。麻酔したハエよりハエの目を注意深く切開し、ＳＤＳ試料緩衝液中に溶解した。全ての試料を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより分離し、そして、抗−ユビキチンマウス抗体（１：２５０，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）及び抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１０００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて免疫ブロッティングを行った。ＥＣＬプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってシグナルを可視化した。
【０１４１】
プロテアソーム活性は、Ｓ２細胞の溶解物において、蛍光測定用レポーターである、アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）（２８）に結合した合成ペプチド基質を用いて分析した。Ｓ２細胞は６−ウェルプレート（５×１０5細胞／ウェル）中で培養し、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を用いて種々の量のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、ラクタシスチン（Ｔｏｙｏｂｏ）を直ちに培地に加えた。トランスフェクションより２４時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして、緩衝液Ｈ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．６）中に溶解し、３０分間氷上に静置した。細胞溶解物を遠心によって回収し、そして上清を用いてタンパク質濃度及び酵素活性を決定した。溶解物（２５μｌ）に、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＡＭＣ（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ、ペプチド研究所、大阪）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０及び１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）の５０μＭ溶液を２５０μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、分析した。ＡＭＣの量は、３８０ｎｍ励起波長及び４６０ｎｍ蛍光波長を用い、分光蛍光計（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ  ９６０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって測定した。酵素活性を、タンパク質濃度によって標準化し、対照溶解物における活性に対する％として表現した。
【０１４２】
その結果、ショウジョウバエの細胞におけるプロテアソーム活性が、伸長ポリグルタミンの過剰発現によってその長さに応じて減少された（図１３）。これは、２６Ｓプロテアソーム  サブユニットの部分的喪失による、目の神経変性の兆候を示す図１２の観察結果と一致する。しかしながら、ショウジョウバエの細胞における、伸長ポリグルタミン及びラクタシスチンのプロテアソーム阻害効果は、ＤＳｅｃ６１αタンパク質の減少によって影響されなかった（図１３）。
【０１４３】
一方、ショウジョウバエの目における伸長ポリグルタミンによって誘導されたユビキチン化タンパク質の蓄積は、ＤＳｅｃ６１α突然変異アリルに関してトランスヘテロ接合体であるハエでは顕著に減少していた（図１４）。さらに、ＤＳｅｃ６１α  ｍＲＮＡの発現レベルがそのｄｓＲＮＡ処理によって下方制御されているショウジョウバエの培養細胞においても、同様の結果が観察された（図１５）。
【０１４４】
これらのデータは、伸長ポリグルタミンの神経変性メカニズムは、非分解のユビキチン結合性タンパク質の蓄積を導きうるような、ショウジョウバエのプロテアソーム機能の阻害を含むことを示唆している。詳細には、ポリグルタミンによるユビキチン化タンパク質の分解の減少は、天然のＤＳｅｃ６１αの機能、即ち、小胞体から細胞質へのタンパク質の移動、の喪失に起因しうることを示唆している。これらの観察は、ポリグルタミン毒性の可能性のあるメカニズムを提供しうる。即ち、伸長ポリグルタミンがユビキチン−プロテアソーム機能に影響することによって細胞性タンパク質分解システムを変化させ、そして、変化したプロテアソーム活性は、細胞質中の非折り畳みタンパク質の蓄積を誘因し、これが細胞生存率に影響しうる、というメカニズムである。
【０１４５】
本発明は、タンパク質凝集及び非折り畳みタンパク質に起因する神経細胞の死及び変性の、非常に重要な洞察を提供する。ユビキチン−プロテアソームシステムは、小胞体を含む全ての細胞性成分に由来する種々のタンパク質を分解するのに寄与する。本明細書中の記載は、タンパク質凝集又は伸長ポリグルタミン等によって、プロテアソーム機能が阻害された場合において、潜在的な神経細胞死機能を伴う非分解タンパク質の供給源の一つは小胞体であることを示唆している。
【０１４６】
ユビキチン−リガーゼ  Ｐａｒｋｉｎの基質であるＰａｅｌ受容体は、ＥＡＲＤによって分解されると考えられており、ユビキチン−プロテアソームシステムの能力が減少すると、神経毒を示す。細胞性のＰａｅｌ受容体は神経細胞死を効率的に起こしうる（１９）。ＢＳＥ、スクレイピーまたはクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）等の神経変性疾患の必須因子である、プリオンタンパク質（ctmＰｒＰ）の膜貫通型は、正常な状態ではユビキチン−プロテアソームシステムによって迅速に分解される。しかしながら、ある条件下で、ctmＰｒＰは分解を免れ、小胞体から主に細胞質に輸送され、その場において疾患を誘因すると考えられている（２０、２１）。Ｐａｅｌ受容体とctmＰｒＰの双方のケースにおいて、神経に毒性のこれらのタンパク質の移動は、Ｓｅｃ６１αを含むトランスロコンを介している可能性がある。これらの実施例は、細胞性障害を避ける場合には、ＥＲＡＤ装置を厳密に制御する必要があることを示している。ＥＲＡＤシステムに関与するプロテアソーム機能が無効であると、潜在的に毒性である、誤って折り畳まれた又は非集合分泌性タンパク質が、細胞質中に蓄積しうる。
【０１４７】
Ｓｅｃ６１トランスロコンは、変性タンパク質の細胞質への移動を制御することによって、ポリグルタミン疾患等の神経変性障害において重要な役割を果たしている。よって、Ｓｅｃ６１αを含むＥＲＡＤシステムの特異的な制御因子は、いくつかの重度のヒト神経変性疾患の処置における、価値のある治療剤を提供する。
【０１４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａは、Ｒ７光受容体細胞における細胞死及び変性を誘因する遺伝子を同定するためのスクリーニング方法を示す。本発明のスクリーニングでは、遺伝子型ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４の雌をＧＳ系群のコレクションからの個々の系からの雄と掛け合わせた。各Ｆ１子孫の雌を孵化から１０日齢まで育てた。成虫頭（１０日齢）を固定し、水平切片のためにエポン中に包埋した。ショウジョウバエの複眼ではこの切片中において、各個眼は通常Ｒ１−Ｒ６細胞（灰色丸で示す）、及びＲ７細胞（白丸で示す）を有する。ｒｈ３プロモーターによって駆動されたＧＡＬ４タンパク質は、全ての個眼において有糸分裂後のＲ７光受容体細胞の約３０％において発現したが、Ｒ１−Ｒ６細胞では発現しなかった。よって、ＧＳベクターによって提供されるＵＡＳ配列の下流の未知の遺伝子が、Ｒ７細胞においてのみＧＡＬ４／ＵＡＳシステムによって過剰発現されていると考えられる。次いで、除去されたＲ７光受容体細胞又は変性されたＲ７光受容体細胞のいずれかを産生する系をスコアし、そしてｅｎｄｄ系群と命名した。図１ｂは、誤発現スクリーニングに起因するＲ７細胞形態の典型的な変化を示す。未知の遺伝子が過剰発現された場合、Ｒ７細胞の表現型は２つの型に分類される：Ｒ７細胞がほとんど完全に失われたもの（感桿分体（ｒｈａｂｄｏｍｅｒｅ）の除去）、並びにＲ７細胞の変性を示すもの（除去ではなく感桿分体の形態異常）。
【図２】図２は、本発明のスクリーニングによって得られたｅｎｄｄ２系群の個眼の表現型を示す。ｒｈ３−ＧＡＬ４と掛け合わせると、ｅｎｄｄ２はＲ７細胞を有しないいくつかの個眼を含んだ。以下のような遺伝子型が示される：ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２G2002。ｅｎｄｄ２の異所発現は、種々の組織において細胞死を誘導する。
【図３】図３のａ−ｆは、ｅｎｄｄ２の異所発現は目の大きさを減少させ、ショウジョウバエの目の広範囲において細胞死を誘導することを示す。複眼の光学顕微鏡画像（ａ，ｂ）及び走査電子顕微鏡画像（ｃ，ｄ）第三齢幼虫の目原基のアクリジンオレンジ染色画像（ｅ，ｆ）図に示された遺伝子型は以下の通りである：野生型（ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋：ａ，ｃ，ｅ）、及びＧＭＲ−ＧＡＬ４＋ｅｎｄｄ２（ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２GS2002：ｂ，ｄ，ｆ）。
【図４】図４は、ｅｎｄｄ２アリルが２つの候補遺伝子を産生することを示す。ｅｎｄｄ２系群で過剰発現している遺伝子を同定するために、ｅｎｄｄ２GS2002をｈｓ−ＧＡＬ４系と掛け合わせた。熱ショックをかけたＦ１幼虫からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離し、そして、ＧＳベクターからの転写物を、ベクター特異的プライマー及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（右パネル）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ｅｎｄｄ２アリルによって駆動される２つの遺伝子のゲノム上の構造も示した。ＣＧ９５３９及びＣＧ９５３７転写物を、ｅｎｄｄ２GS2002及びｅｎｄｄ２GS2158をの挿入部位とともに示す（バー＝１ｋｂ）。
【図５】図５は、ｅｎｄｄ２は小胞体関連トランスロコンタンパク質であるＳｅｃ６１αのショウジョウバエ相同体をコードすることを示す。ショウジョウバエＳｅｃ６１α（ＤＳｅｃ６１α；ＡＢ９５３９）ヒトＳｅｃ６１α（ｈＳｅｃ６１α；ＡＦ３４６６０２）サッカロマイセス・セレビシエＳｅｃ６１α（Ｓ．ｃ．Ｓｅｃ６１；Ｕ１９１０４）の各々の推定アミノ酸配列。両側の番号はアミノ酸残基位置を示す。全てのＳｅｃ６１αファミリータンパク質において保存されるアミノ酸は、陰をつけたボックスで示す。黒棒は、ＳＭＡＲＴデータベースを用いたＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）の逆位特異的ＢＬＡＳＴによって予測された、ＤＳｅｃ６１αの推定膜貫通（ＴＭ）ドメインを示す。
【図６】図５のａ−ｊは、ｅｎｄｄ２系群によって示される表現型はＣＧ９５３９の過剰発現によって再現されるが、ＣＧ９５３７によっては再現されないことを示す。複眼の走査電子顕微鏡画像（ａ−ｅ）及び半薄切片画像（ｆ−ｊ）遺伝子型は以下の通りである：（ａ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋、（ｂ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２GS2002、（ｃ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２GS2158、（ｄ）ｗＵＡＳ−ＣＧ９５３７／Ｘ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋、（ｅ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ−ＣＧ９５３９／＋、（ｆ）ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／＋、（ｇ）ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２GS2002、（ｈ）ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／ｅｎｄｄ２GS2158、（ｉ）ｗＵＡＳ−ＣＧ９５３７／Ｘ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／＋、（ｊ）ｗ；ｒｈ３−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ−ＣＧ９５３９／＋。
【図７】図７は、ショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）実験の戦略及び結果を示す。合成ｄｓＲＮＡ、又はＵＡＳベクターによって伸長ヘアピンーループＲＮＡとして発現されたｄｓＲＮＡを用いて、ＤＳｅｃ６１αタンパク質発現をノックダウンした。簡単には、ＵＡＳ−ＦＬＡＧ−タグ  ＤＳｅｃ６１α、ＵＡＳ−Ｍｙｃ−タグ  ＳＣＡＴ（対照としてＧＦＰの変異体の一種）、及びｐＷＡＧＡＬ４を、各々ＤＳｅｃ６１α合成ｄｓＲＮＡとともにショウジョウバエＳ２細胞中にコトランスフェクションした（左パネル）。トランスフェクションから２４時間後、細胞を回収し、抗−ｍｙｃマウス抗体（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）及び抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１０００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて免疫ブロッティングを行った。ＤＳｅｃ６１αタンパク質発現のみが特異的に減少した（右パネル）。ｄｓＲＮＡ発現ベクターを用いて同様の結果が得られた（データは示さず）。
【図８】図８は、細胞においてプロテアソーム活性の阻害を誘因するラクタシスチンによって誘導される神経細胞死にＤＳｅｃ６１α遺伝子が必要とされることを示す。ｄｓＲＮＡ（ＥＧＦＰ及びＤＳｅｃ６１αに関し２５ｎｇ）をショウジョウバエＢＧ２神経細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、培地に試薬を加えた（チュニカマイシン  １０μｇ／ｍｌ；スタウロスポリン  １μＭ；シクロヘキシミド  １μｇ／ｍｌ；エクジソン  １０μＭ；ラクタシスチン  ２０μＭ）。次いで細胞を２４時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性の相対量を対照実験の細胞における量と比較することによって、細胞生存率を決定した（平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、用量依存的にラクタシスチンによって誘導される神経細胞死にＤＳｅｃ６１α遺伝子が必要とされることを示す。合成ｄｓＲＮＡ（ＤＳｅｃ６１α  ｄｓＲＮＡの２５ｎｇ）又はｄｓＲＮＡ発現ベクター（ＵＡＳ−ＤＳｅｃ６１α  ｄｓＲＮＡの１０ｎｇ）をショウジョウバエＳ２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ラクタシスチンを培地に加えた（１、５、２０及び５０μＭ）。次いで細胞を２４時間インキュベーションした。β−ガラクトシダーゼ活性の相対量を対照実験の細胞における量と比較することによって、細胞生存率を決定した。
【図１０】図１０は、ＤＳｅｃ６１αは、ショウジョウバエにおける伸長ポリグルタミン誘導神経細胞死及び変性に要求されることを示す。（ａ−ｆ）ポリグルタミン疾患の種々のショウジョウバエモデルの目の変性表現型が、ＤＳｅｃ６１α遺伝子の突然変異体中では改善される。複眼の光学顕微鏡画像（ａ−ｃ）及び半薄切片画像（ｄ−ｆ）（孵化より３０日後）。遺伝子型：（ａ、ｄ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋、（ｂ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ−ＭＪＤ（Ｍ）／＋、（ｃ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４  ＤＳｅｃ６１αP560／ＤＳｅｃ６１αEP(2)2567；ＵＡＳ−ＭＪＤ（Ｍ）／＋、（ｅ）ｗ；＋／＋；ＧＭＲ−ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ１２０Ｑ／＋、（ｆ）ｗ；ＤＳｅｃ６１αP560／ＤＳｅｃ６１αEP(2)2567；ＧＭＲ−ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ１２０Ｑ／＋。
【図１１】図１１は、伸長ポリグルタミンによって誘導される神経細胞死がＤＳｅｃ６１α遺伝子ノックダウン細胞中で弱毒化されたことを示す。（上パネル）ＥＧＦＰに融合させたヒトのハンチントンの第一エキソンと伸長されたポリグルタミン（各ｈｔｔＱ１７、ｈｔｔＱ６０及びｈｔｔＱ１５０は、それぞれ１７、６０及び１５０のポリグルタミンの繰り返しを有する）をコードするプラスミド（各型につき２００ｎｇ）を、２００ｎｇの駆動プラスミドｐＷＡＧＡＬ４とともに、ショウジョウバエＢＧ２神経細胞中で過剰発現させた。トランスフェクションから２４時間後、ＧＦＰ陽性細胞を示す蛍光を調べた。数は、蛍光凝集体を含むＧＦＰ陽性細胞の集団の割合を示す。（下パネル）伸長ポリグルタミンをコードするプラスミド（各型につき５ｎｇ）を２５ｎｇの合成ｄｓＲＮＡ（ＥＧＦＰ又はＤＳｅｃ６１α）、２ｎｇの駆動プラスミドｐＷＡＧＡＬ４とともに、ショウジョウバエＢＧ２神経細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、β−ガラクトシダーゼ活性の相対量を対照実験の細胞における量と比較することによって、細胞生存率を決定した（平均±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、２６Ｓプロテアソーム  サブユニットの部分的喪失と目の神経変性の関連性を示す。ポリグルタミン疾患の双方のハエモデル（ＭＪＤ及びハンチントン病）において、２６Ｓプロテアソームサブユニットの部分的な欠損は、目における神経変性の表現型を明らかに増強した（図１２ａ−ｈ）。複眼の光学顕微鏡画像（ａ−ｄ）及び半薄切片画像（ｅ−ｈ）（孵化より１５日後）。遺伝子型：（ａ、ｅ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋、（ｂ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ−ＭＪＤ（Ｍ）／＋、（ｃ）ｗ；ＧＭＲ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ−ＭＪＤ（Ｍ）／Ｐｒｏ２６1、（ｄ、ｈ）ｗ；＋／＋；Ｐｒｏ２６1／＋、（ｆ）ｗ；＋／＋；ＧＭＲ−ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ１２０Ｑ／＋、（ｇ）ｗ；＋／＋；ＧＭＲ−ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ１２０Ｑ／Ｐｒｏ２６1。
【図１３】図１３は、ショウジョウバエの細胞におけるプロテアソーム活性を示す。伸長ポリグルタミンをコードするプラスミド（ｈｔｔＱ１７、ｈｔｔＱ６０及びｈｔｔＱ１５０を各々８００ｎｇ）を、２００ｎｇの駆動プラスミドｐＷＡＧＡＬ４と共にショウジョウバエＳ２細胞中に過剰発現させた。他のＳ２細胞をラクタシスチン（１，５及び２０μＭ）で処理した。トランスフェクションから２４時間後、プロテアソーム活性（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの切断活性；キモトリプシン様）を測定した。いくつかのケースにおいて、３０ｎｇのＵＡＳ−ＤＳｅｃ６１α  ｄｓＲＮＡを２００ｎｇの駆動プラスミドｐＷＡＧＡＬ４とともにトランスフェクトした。プロテアソーム活性酵素活性を、対照溶解物の活性の％として表現した。
【図１４】図１４は、ショウジョウバエの目におけるユビキチン化タンパク質の蓄積を示す。ショウジョウバエの目における伸長ポリグルタミンによって誘導されるユビキチン化タンパク質の蓄積は、ＤＳｅｃ６１α突然変異アリルのトランスヘテロ接合体のハエでは顕著に減少した。図中に示された遺伝子型の各ハエ（孵化より１日後）から各々１８個のハエの目を注意深く切除し、抗−ユビキチン（αＵｂ）抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。抗β−チューブリン（αｂｅｔａ−チューブリン）抗体によって決定されるように、同量のタンパク質が装填された。
【図１５】図１５は、  細胞溶解物の抗−ユビキチン（αＵ）抗体を用いた免疫ブロッティングを示す。伸長ポリグルタミン又はラクタシスチンによって誘導されたユビキチン化タンパク質の蓄積は、ＤＳｅｃ６１α  ｍＲＮＡの発現レベルがｄｓＲＮＡの処理によって下方制御されているショウジョウバエ細胞では著しく減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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