(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６レセプター遺伝子の下流に、５個のアミノ酸をコードする遺伝子配列を介してインターロイキン−６をコードする遺伝子が結合された、インターロイキン−６レセプターとインターロイキン−６の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２】
インターロイキン−６レセプターのアミノ酸配列のＣ末端に、５個のアミノ酸からなるペプチドを介してインターロイキン−６のアミノ酸配列がＮ末端側から結合された、インターロイキン−６レセプターとインターロイキン−６の融合蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン−６レセプター（以下、ＩＬ−６レセプターと略する）とインターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と略する）の融合蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学を用いると、天然ではそれぞれ別の蛋白質として存在する２種類の蛋白質を１本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質として発現させることができる。例えば、本来別の蛋白質として存在する抗体のＨ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域を融合蛋白質として発現させる例が報告されている（Houston ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，p5879 ，1988年参照）。融合蛋白質として発現させると、蛋白質間での解離が起こりにくいために安定であるという利点がある。
【０００３】
融合蛋白質を作製する場合、通常は２種類の蛋白質の間にリンカー配列と称するペプチド配列を挿入する。リンカー配列は、２種類の蛋白質が独自に本来の立体構造をとれるように、それ自体が高次構造をとらないことが重要である。
【０００４】
リンカー配列としていろいろな配列が報告されているが、代表的な配列としてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇはグリシン残基、Ｓはセリン残基）がある  （Alfthan ら、Protein Engineering 、8 、p725、1995年参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
シグナル伝達蛋白質であるｇｐ１３０は発現しているが、ＩＬ−６レセプターを全く発現しないか、または少量しか発現しない標的細胞にＩＬ−６の刺激を伝えるためには、ＩＬ−６のみならず可溶性であるＩＬ−６レセプターの細胞外領域が必須である。これまでＩＬ−６レセプターの細胞外領域の薬効が調べられてきたが、報告されている薬効の中で、骨髄幹細胞増幅効果と血小板増多効果は、医薬品としての用途開発が期待される（Sui ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92、p2859 、1995年参照、特願平８−３１６６４９参照）。
【０００６】
ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質として、リンカー配列に１３個のアミノ酸であるＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥ（Ｒはアルギニン残基、Ｇはグリシン残基、Ｓはセリン残基、Ｖはバリン残基、Ｅはグルタミン酸残基）を用いたものが報告されている（Fischer ら、Nature  Biotech.、15、p142、1997年参照）。  このＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質は、両蛋白質間での解離が起こりにくいために安定で、しかもＩＬ−６の刺激を効果的に伝達し得るものとして期待されるが、これを医薬品として体内に投与する場合には、１３個のアミノ酸から構成されるリンカー配列が独自の立体構造をとるために高い抗原性を有している可能性が強く、不適当である。
【０００７】
一般的に、リンカー配列の抗原性はリンカー配列のアミノ酸数が少ないほど低い。しかしながら、上記以外にＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質に関する報告はなく、より少ないアミノ酸数のリンカー配列を用いたＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質が発現可能であるか、更には両者が正しく結合して標的細胞にＩＬ−６の刺激を伝達し得るか否かは不明である。
【０００８】
そこで本発明の目的は、遺伝子工学的に発現可能で標的細胞にＩＬ−６の刺激を伝達し得、しかもこれまで報告された融合蛋白質以上に抗原性を低減したＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するためになされた本発明は、ＩＬ−６レセプター遺伝子の下流に、１個以上５個以下のアミノ酸をコードする遺伝子配列を介してＩＬ−６をコードする遺伝子が結合された、ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質をコードする遺伝子であり、更にはＩＬ−６レセプターのアミノ酸配列のＣ末端に、１個以上５個以下のアミノ酸から成るペプチドを介してＩＬ−６のアミノ酸配列がＮ末端側から結合された、ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質である。以下、本発明の融合蛋白質を詳細に説明する。
【００１０】
ＩＬ−６レセプターは、本来は膜蛋白質であり、全長４６８アミノ酸残基で構成され、細胞外領域、膜貫通領域そして細胞内領域に大別される（Yamasakiら、Science 、241 、p825、1988年参照）。細胞外領域は、更にイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に大別されるが、サイトカインレセプター領域は７つのβシートから構成されるバレル（樽）用の構造体が短いリンカーで２個つながった構造体である。なお、ＩＬ−６レセプターが活性を示すためには、サイトカインレセプター領域が必須であることが知られている（Yawataら、 EMBO   J.、12、p1705 、1993年参照）。
【００１１】
本発明のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質を構成するＩＬ−６レセプター部分としては、細胞外領域全体であっても良いし、サイトカインレセプター領域部分のみのいずれであっても良い。より具体的に、使用するアミノ酸残基の配列は、細胞外領域全体の発現例（Yasukawaら、J.  Biochem.、108 、p673、1990年）、そしてサイトカインレセプター領域の発現例（Vollmer ら、 J. Immunol. Methods、199 、p47 、1996年）等を参考にして決定することができる。
【００１２】
ＩＬ−６は、全長２１２アミノ酸残基で構成される分泌型蛋白質（Hiranoら、Nature、324 、p731、1986年参照）で、４つのαヘリックスから構成されるが、活性を示すためには４つのαヘリックス全てが必要であることが知られている。従って、本発明のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質においても、４つのαヘリックス全てを含むＩＬ−６を用いる。より具体的に、使用するアミノ酸残基の配列は、ＩＬ−６の発現例（Yasukawaら、Biotech.  Lett. 12、p419、1990年）等を参考にして決定することができる。
【００１３】
本発明のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質においては、１個以上５個以下のアミノ酸配列を有するリンカー配列を使用する。リンカー配列のアミノ酸配列としては、標的細胞に対して本発明の融合蛋白質がＩＬ−６の刺激を伝達し得れば特に制限されないが、抗原性が高いアミノ酸残基、即ち構成原子数の多いアミノ酸残基であるリジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基は使用しない方が好ましい。このような好ましいリンカー配列として、ＳＳＥＬＶ（Ｓはセリン残基、Ｅはグルタミン酸残基、Ｌはロイシン残基、Ｖはバリン残基）を例示できる。該リンカー配列は、実施例に記載したように、標的細胞に対してＩＬ−６の刺激を伝達し得るリンカー配列である。
【００１４】
以上に説明した本発明の融合蛋白質を製造するには、通常、融合蛋白質をコード（暗号化）する遺伝子を調製し、これを適当な宿主細胞に導入して発現させれば良い。該遺伝子は、発現しようとするアミノ酸残基に合わせて全長のＩＬ−６レセプターや全長のＩＬ−６をコードする遺伝子から通常の方法により調製することが可能である。またリンカー配列については、例えば市販の遺伝子合成装置を用いることで容易に調製できる。これら遺伝子断片の連結は、市販の制限酵素等を用いて行えば良いが、このためには各遺伝子断片に制限酵素による連結部を導入しておくことが好ましい。
【００１５】
本発明のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質を発現するための宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）や大腸菌等、特に制限はないが、その培養操作が容易である、融合蛋白質の発現制御が容易である、融合蛋白質の発現量が充分である、融合蛋白質を、活性を発現し得ない状態に折り畳まれた状態で発現しない、発現した融合蛋白質が宿主細胞が有する酵素で分解されない、等の条件を満たす宿主細胞が好ましく、このような好ましい例としてピキア・パストリス種の酵母（Pichia  pastoris）を例示することができる。ピキア・パストリス種の酵母はメタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で、ＣＨＯ細胞等に代表される動物細胞と比較して安価かつ容易に培養できる利点がある。
【００１６】
宿主細胞で本発明のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質を発現するためには、該融合蛋白質をコードする遺伝子にプロモーターやターミネーター、エンハンサー等と呼ばれる、通常の遺伝子工学で使用される特殊な遺伝子を宿主細胞により適宜選択して付加し、これを宿主細胞に導入して培養後、適当な時期に融合蛋白質をコードする遺伝子の転写を開始させれば良い。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明を更に詳細に説明するため、以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  ピキア・パストリス種の酵母でのＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質発現用プラスミドの調製（その１）
ＩＬ−６レセプター領域を含む配列としてＩＬ−６レセプターのＮ末端１１６番目のグルタミン酸残基から３４４番目のロイシン残基までの計２２９アミノ酸配列をコードする遺伝子、リンカー配列としてＳＳＥＬＶの５アミノ酸（Ｓはセリン残基、Ｅはグルタミン酸残基、Ｌはロイシン残基、Ｖはバリン残基）をコードする遺伝子、ＩＬ−６領域を含む配列としてＩＬ−６のＮ末端１番目のアラニンから１８５番目のメチオニン残基までの計１８５アミノ酸をコードする遺伝子を上流側（５' 側）からこの順序で含む発現プラスミド、ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６を以下のようにして構築した。
【００１９】
プライマーｐ６ＲＡＢ１１６Ｂ２（配列：５′―ＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧ−３′）とプライマーｐ３４４ＦＵＦ（配列：５′―ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧ−３′）を用いて、  ＩＬ−６レセプターのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡをＸｂａＩで切断した後、ＸｈｏＩで切断し、末端をクレノウフラグメントで平滑化し、さらにＡｖｒＩＩで切断したピキア・パストリス種の酵母用発現プラスミドｐＰＩＣ９（インビトロジェン社製）に挿入することにより、プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬを得た。
【００２０】
次に、プライマーｐＩＬ６Ｂ（配列：５′―ＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣ−３′）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列：５′−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣ−３′）を用いて、ＩＬ−６のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００２１】
増幅されたＤＮＡをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断した後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬに挿入することにより、ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質発現用プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６を得た。得られたｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６の構造を図１に示す。
【００２２】
ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６のインサートのＤＮＡ配列を配列番号１に示す。また、該ＤＮＡ配列がコードするＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号１の遺伝子において、第６８８〜７０２番目のＴＣＧＡＧＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧがリンカー配列をコードする部分であり、配列番号２のアミノ酸配列において、第２３０〜２３４番目の５つのアミノ酸配列がリンカー配列である。なお、配列番号１の遺伝子配列は１２６０塩基であるが、その中には終止コドンが入っているため、配列番号２のアミノ酸配列の数は４１９となる。
【００２３】
なおプラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６は、形質転換体選別用のアンピシリン耐性遺伝子と、融合蛋白質をコードする遺伝子の転写を開始するためのプロモーターを含んでいる。
【００２４】
実施例２  ピキア・パストリス種の酵母でのＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質発現用プラスミドの調製（その２）
ＩＬ−６レセプター領域を含む配列としてＩＬ−６レセプターの１１６番目のグルタミン酸残基から３４４番目のロイシン残基までの計２２９アミノ酸をコードする遺伝子、ＩＬ−６領域を含む配列としてＩＬ−６のＮ末端１番目のアラニンから１８５番目のメチオニン残基までの計１８５アミノ酸をコードする遺伝子を上流側（５' 側）からこの順序で含む発現プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２を以下のように構築した。
【００２５】
プライマーｐ１１６ＤＦＵ（配列：５′−ＣＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡＧ−３′）とプライマーｐ６ＲＡ１１６Ｂ２（配列：５′―  ＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧ−３′）を用いて、ＩＬ−６レセプターのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００２６】
また、プライマー６ＤＦＵ（配列：５′―ＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＣＴＣＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡＡＡ−３′）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列：５′−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣ−３′）を用いて、ＩＬ−６のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００２７】
増幅された２つの断片を混合し、さらにプライマーｐ６ＲＡ１１６Ｂ２とプライマーｐＩＬ６Ｆを用いてＰＣＲにより１つのＤＮＡ断片を増幅した。
【００２８】
このＤＮＡをＮｏｔＩで切断した後、ＸｈｏＩで切断し、末端をクレノウフラグメントで平滑化し、さらにＮｏｔＩで切断したピキア・パストリス種の酵母用発現プラスミドｐＰＩＣ９（インビトロジェン社製）に挿入することにより、プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２を得た。
【００２９】
ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２のインサートのＤＮＡ配列は，配列番号１中の下線部を欠失したものに相当する。また、該ＤＮＡ配列がコードするＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号２中の下線部を欠失したものに相当する。
【００３０】
実施例３  形質転換体の作製
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株（インビトロジェン社製）から、Ｃｒｅｇｇ  Ｊ．  Ｍ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、ｐ３３７６、１９８５年参照）及び特開平２−１０４９２０号に記載の方法に従ってスフェロプラストを調製し、ＢｇｌＩＩによって線状化したｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６又はｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２で形質転換した。
【００３１】
すなわち、ＧＳ１１５をＯＤ６００が１になるまでＹＰＤ培地５０ｍＬ中、３０℃で振とう培養した後、菌を集め、スフェロプラストを作製し、発現プラスミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別した。
【００３２】
試験管を用いてクローンをＢＭＧＹ培地３ｍＬ中、３０℃で２４時間培養した。その後、菌を集め、ＢＭＭＹ培地にサスペンドし、メタノールを加えてＰａｏｘプロモーターを誘導し、３０℃で２４時間培養した。培養を開始してから４時間後と１６時間後に、メタノールを０．５％加えた。最後に上清を集め、実施例４に示す生物活性評価法により、培養上清中のＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質の活性を測定した。
【００３３】
実施例４  ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質の生物活性評価
発現したＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質の生物活性は、ＢＡＦ１３０細胞を用いて調べた。ＢＡＦ１３０は、本来ヒトｇｐ１３０蛋白質を発現していないマウス細胞ＢＡＦ（Hatakeyamaら、Cell、63、p154、1989年参照）にヒトｇｐ１３０蛋白質をコードする遺伝子を導入して形質転換させ、当該蛋白質を発現させた細胞であり、ＩＬ−６レセプター及びＩＬ−６の共存下で増殖する。
ＢＡＦ細胞の懸濁液を、９６穴プレートに２×１０4細胞／穴となるように加えて、各種濃度に希釈した実施例３の培養上清を添加した。２日後、ＢＡＦ１３０細胞の増殖を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて調べた。結果を図２に示す。
【００３４】
図２から明らかなように、ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６で形質転換されたクローンの培養上清中にはＢＡＦ１３０を増殖させる活性が見いだされた。一方、ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２で形質転換されたクローンの培養上清中にはＢＡＦ１３０を増殖させる活性は見いだされなかった。
【００３５】
このことから、アミノ酸配列ＳＳＥＬＶをリンカー配列として有するＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質は標的細胞を刺激し得るが、リンカー配列を有さないＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質は刺激し得ないことが分かる。
【００３６】
【発明の効果】
ＩＬ−６レセプターのアミノ酸配列のＣ末端に、１個以上５個以下のアミノ酸から成るペプチドを介してＩＬ−６のアミノ酸配列が続くＩＬ−６レセプターとＩＬ−６の融合蛋白質は、標的細胞に対してＩＬ−６のシグナルを伝達して刺激し得る。しかも、従来知られた１３個のリンカー配列を有する融合蛋白質に比較して抗原性が十分に低い。従って、体内に投与する医薬品として開発することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で作製した発現ベクターｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６の構造を示す図である。図中、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、３' ＡＯＸ１はアルコールオキシダーゼ遺伝子の下流配列を、ＨＩＳ４はヒスチジン合成遺伝子を、３' ＡＯＸＴＴはターミネーターを、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６レセプター遺伝子を、Ｓはシグナル配列をコードする遺伝子を、５' ＡＯＸはプロモーター配列を含むアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流領域をそれぞれ示す。
【図２】図２は、実施例４に示した方法で、ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６で形質転換された任意のクローン４種（白丸 、白菱形 、白四角、白三角）とｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６−２で形質転換された任意のクローン４種（黒丸、黒菱形 、黒四角、黒三角）の培養上清中のＢＡＦ１３０を増殖させる効果を調べたときの結果（参照波長を６００ｎｍとしたときの４０５ｎｍの吸光度）を示すものである。
【配列表】
0004196422.tif 000002
0004196422.tif 000003
0004196422.tif 000004
【図１】
0004196422.tif 000005
【図２】
0004196422.tif 000006