(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液調製物中の微生物を不活化する方法であって、次の順序で、
a）任意の順序で、
i）次式
0004047374.tif 000039
［式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4は独立してOおよびNHからなる群から選ばれ、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、zは2〜6の整数である）からなる群から選ばれ、それぞれ4、5'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7は、独立してHおよび(CH2)vCH3（ここで、vは0〜5の整数である）からなる群から選ばれる］で表されるプソラレン化合物またはその塩、および次式
0004047374.tif 000040
[式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4は独立してOおよびNHからなる群から選ばれ、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、zは2〜6の整数である）からなる群から選ばれ、それぞれ4、4'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7は、独立してHおよび(CH2)vCH3（ここで、vは0〜5の整数である）からなる群から選ばれる］で表されるプソラレン化合物またはその塩からなる群から選ばれる化合物、
ii）該化合物を光活性化するための光活性化手段、および
iii）核酸を有する病原体で汚染されている疑いのある血液調製物、
を用意し、
b）該化合物を血液調製物に添加し、そして
c）該病原体を不活性化するために該化合物を光活性化する、
各段階を含んでなる方法。
【請求項２】
病原体が単細胞および多細胞の生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の生物がバクテリア、真菌、マイコプラズマおよび原生動物を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
病原体がウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
血液調製物が血小板調製物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血小板調製物が緩衝生理食塩水からなる合成媒体中にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
合成媒体を血小板調製物に添加する前に、血小板調製物中に30〜40％の血漿が保持されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
合成媒体が塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムの水溶液からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
合成媒体が、45〜100mM塩化ナトリウム、8〜15mMクエン酸ナトリウム、20〜35mM酢酸ナトリウム、5〜7mM一塩基性リン酸ナトリウム、および14〜22mM二塩基性リン酸ナトリウムを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物を血小板調製物に添加する前には、該化合物が15.8mM塩化ナトリウムの水溶液中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血液調製物が血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
光活性化手段が180nmと400nmの間の波長を含む1〜30mW/cm2の強度の電磁放射スペクトルを発生することができる光活性化装置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物を0.1〜250μMの最終濃度となるまで血液調製物に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分子酸素の濃度を制限することなく段階ｃ）を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２種の前記化合物が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が段階ｃ）の前に溶液中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液が水、食塩水、または緩衝生理食塩水からなる合成媒体を含むものである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が5'-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,4',8-トリメチルプソラレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が4'-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が段階ｃ）の前に乾燥製剤中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレン化合物を合成する方法であって、
a）4'-(ω-ヒドロキシ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、
b）4'-(ω-ヒドロキシ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して、4'-(ω-メタンスルホニルオキシ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、
c）4'-(ω-メタンスルホニルオキシ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンをアジ化ナトリウムで処理して、4'-(ω-アジド-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、そして
d）4'-(ω-アジド-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを還元して、次式
0004047374.tif 000041
［式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4はOであり、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、zは2〜6の整数である）からなる群から選ばれる］で表される4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレン化合物を製造する、
各工程を含んでなる方法。
【請求項２６】
4'-(ω-アミノ-2-オキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンが4'-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンである、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
工程d）において、4'-(4-アジド-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンをトリフェニルホスフィンで還元する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
次式
0004047374.tif 000042
で表される化合物である、請求項25に記載の合成方法により製造されたプソラレン化合物。
【請求項２９】
次式
0004047374.tif 000043
［式中、R1は、-(CH2)-O-(CH2)x-O-(CH2)z-NH2（式中x＝ｚであり、xは２〜５の整数である）からなる群から選ばれる］で表されるプソラレン化合物を合成する方法であって、
a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンからなる群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、
b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンをHO(CH2)xO(CH2)zOHで処理して4'-(ω-ヒドロキシ-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレン（式中n＝x＋3）を製造し、
c）4'-(ω-ヒドロキシ-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して、4'-(ω-メタンスルホニルオキシ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、
d）4'-(ω-メタンスルホニルオキシ-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンをアジ化ナトリウムで処理して、4'-(ω-アジド-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、そして
e）4'-(ω-アジド-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを還元して、上記式の4'-(ω-アミノ-2,n-ジオキサ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する、
各工程を含んでなる方法。
【請求項３０】
4'-(12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ)ドデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンを合成する方法であって、
a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンからなる群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、
b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンをジエチルグリコールで処理して4'-(7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサ)ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、
c）4'-(7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサ)ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して4'-(7-メタンスルホニルオキシ-2,5-ジオキサ)ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、
d）4'-(7-メタンスルホニルオキシ-2,5-ジオキサ)ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを1,4-ジアミノブタンで処理して4'-(12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ)ドデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する、
各工程を含んでなる方法。
【請求項３１】
4'-(ω-アミノ-2-アザ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを合成する方法であって、
a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンからなる群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、
b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを1,ω-ジアミノアルカンで処理して、次式
0004047374.tif 000044
［式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4はNHであり、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、zは2〜6の整数である）からなる群から選ばれる］で表される4'-(ω-アミノ-2-アザ)アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３２】
4'-(14-アミノ-2,6,11-トリアザ)デトラデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンを合成する方法であって、
a）-4,5',8-トリメチルプソラレン-4'-カルボキサルデヒドを用意し、
b）-4,5',8-トリメチルプソラレン-4'-カルボキサルデヒドをスペルミンおよび還元剤で処理して4'-(14-アミノ-2,6,11-トリアザ)テトラデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３３】
5'-(ω-アミノ-2-アザ)アルキル-4,4',8-トリメチルプソラレンを合成する方法であって、
a）5'-クロロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレン、5'-ブロモメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンおよび5'-ヨードメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンからなる群から選ばれる5'-ハロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンを用意し、
b）5'-ハロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンを1,ω-ジアミノアルカンで処理して、次式
0004047374.tif 000045
［式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4はNHであり、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、zは2〜6の整数である）からなる群から選ばれる］で表される5'-(ω-アミノ-2-アザ)アルキル-4,4',8-トリメチルプソラレンを製造する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３４】
次式
0004047374.tif 000046
［式中、R1は、-(CH2)w-O-(CH2)z-NH2および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2（ここで、R2およびR3は独立してOおよびNHからなる群から選ばれ、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、そしてzは2〜6の整数である）からなる群から選ばれ、
R5、R6およびR7は、Hおよび(CH2)vCH3（ここで、vは0〜5の整数である）からなる群から独立して選ばれる］
で表されるプソラレン化合物またはその塩。
【請求項３５】
置換基R1が-CH2-O-(CH2)2-NH2であり、そして置換基R5、R6およびR7がすべてCH3である、請求項34に記載の化合物。
【請求項３６】
置換基R1が-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2であり、そして置換基R5、R6およびR7がすべてCH3である、請求項34に記載の化合物。
【請求項３７】
次式
0004047374.tif 000047
［式中、R1は、-(CH2)w-R2-(CH2)z-NH2、-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)z-NH2、および-(CH2)w-R2-(CH2)x-R3-(CH2)y-R4-(CH2)z-NH2（ここで、R2、R3およびR4は独立してOおよびNHからなる群から選ばれ、wは1〜5の整数であり、xは2〜5の整数であり、yは2〜5の整数であり、そしてzは2〜6の整数である）からなる群から選ばれ、
R5、R6およびR7は、Hおよび(CH2)vCH3（ここで、vは0〜5の整数である）からなる群から独立して選ばれる］
で表されるプソラレン化合物またはその塩。
【請求項３８】
置換基R1が-CH2-NH-(CH2)4-NH2であり、そして置換基R5、R6およびR7がすべてCH3である、請求項37に記載の化合物。
【請求項３９】
置換基R1が-CH2-O-(CH2)2-NH2であり、そして置換基R5、R6およびR7がすべてCH3である、請求項37に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規なプソラレン（psoralen）、および血液産物の機能に重大な影響を与えることなく、または変異原性を示すことなく、紫外線の存在下で血液産物中の病原体を不活性化する増強された能力を有する新規なプソラレンの合成法を提供する。
背景
血液供給物内の病原体汚染は世界中で今なお重大な医学的問題である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関する改良された試験方法は輸血関連疾患の発生率を著しく低下させたが、これらのウイルスの輸血関連伝染の症例が知れ渡ったため、大衆は血液供給物の安全性への信頼を失いつつある。
例えば、ＨＣＶに関する血液試験の最近の導入は、このウイルスの伝染を減少させるであろう。しかし、この試験は感染の可能性がある血液ユニットの検出に関して６７％の感受性しか持たない。ＨＣＶは輸血関連肝炎の９０％に関与している。Melnick,J.L.,Abstracts of Virological Safety aspects of Plasma,Cannes,November 3-6（1992）（p.9）。上記の試験をした場合、感染の可能性は輸血される3300ユニットにつき１ユニットであると推定される。
同様に、ＨＩＶ−１およびＨＢＶに関するより感受性が高く、真剣で論理的なアッセイが実施されているが、これらの病原体はそれでもセロネガティブな血液ドナーによって伝染されうる。International Forum:Vox Sang 32:346（1977）。Ward,J.W.ら，N.Engl.J.Med.,318:473（1988）。全輸血関連肝炎の10%および重篤な黄疸症例の25%は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBasAG）陰性ドナーによって伝染されたＨＢＶによるものである。現在までに、ＨＩＶ−１に対する抗体に関して前試験で陰性であった血液のレシピエントのうち、１５例の輸血関連ＨＩＶ感染が疾病防除センター（ＣＤＣ）によって報告されている。
さらに、他のウイルス、細菌、および作用物質は所定手順としては試験されず、輸血の安全性に対する考えうる脅威として残る。Schmunis,G.A.,Transfusion 31:547-557（1992）。さらに、試験はドナー集団に侵入しているかもしれない、将来出てくる未知の病原体に対しては血液供給物の安全性を保証してくれず、感受性のある試験が実施できるようになる前に輸血関連伝染を引き起こす。
セロコンバージョン試験が十分なふるい（screen）であるとしても、これらの試験は適用するには実際的でないかもしれない。例えば、ヒトにおけるサイトメガロウイルス（CMV、ヘルペスウイルスの１種）およびパルボB19ウイルスはごく普通に見受けられる。これらのウイルスが健康な免疫応答性の成人に存在すると、殆ど必ず無症候性のセロコンバージョンをもたらす。集団のこれほど多くの部分がセロポジティブなので、陽性ユニットの排除は血液供給の実質的制限をもたらす。
血液産物によるウイルス性疾患の伝染を排除する別のアプローチは、輸血産物中の病原体を不活性化する手段を開発することである。血液産物中の感染性病原体を不活性化する効果的な技術の開発は、血液供給物の安全性を向上させ、そして恐らく、最近導入されたHIV-2試験等の低頻度病原体に関する新規試験の導入速度を遅くする可能性を提供する。最終的には、除染技術は血液産物のコストを有意に低下させ、そして欠乏している血液産物の入手可能性を増大させるであろう。
有用であるためには、そのような不活性化法はi）血液産物の輸血目的である機能に悪影響を与えてはならない、ii）血液産物中に存在する病原体を完全に不活性化しなければならない、およびiii）血液産物のレシピエントに悪影響を与えてはならない。赤血球を含まない血液産物においてウイルス性作用物質を不活性化または除去する方法がいくつか報告されている。しかし、これらの技法の殆どは重要な血液産物である血小板の機能維持と全く両立しない。これらの技法の例は、熱（Hilfenhous,J.ら，J.Biol.Std.70:589（1987））、溶剤／洗浄剤処理（Horowitz,B.ら，Transfusion 25:516（1985））、ガンマ線照射（Moroff,G.ら，Transfusion 26:453（1986））、β-プロピオラクトンと組み合わせた紫外線（UV）照射（Prince A.M.ら，Reviews of Infect.Diseases 5:92-107（1983））、ヘマトポルフィリンと組み合わせた可視レーザー光線（Matthews J.L.ら，Transfusion 28:81-83（1988）；North J.ら，Transfusion 32:121-128（1992））、光活性染料アルミニウムフタロシアニンおよびメロシアニン540の使用（Sieber F.ら，Blood 73:345-350（1989）；Rywkin S.ら，Blood 78（Suppl 1）352a（Abstract）（1991））またはＵＶ単独（Proudouz,K.N.ら，Blood 70:589（1987））である。
他の方法は、紫外線の存在下でプソラレン等のフロクマリン（furocoumarin）を用いてウイルス性作用物質を不活性化する。プソラレンはフラン環とクマリンの線形融合によって形成される三環式化合物である。プソラレンは二本鎖核酸の塩基対の間に入り込むことができ、長波長紫外線（UVA）を吸収するとピリミジン塩基への共有結合付加物を形成する。G.D.Ciminoら，Ann.Rev.Biochem.54:1151（1985）；Hearstら，Quart.Rev.Biophys.17:1（1984）。第２のピリミジンがプソラレン-ピリミジン一付加物に隣接して、かつ反対側の鎖に存在すると、第２の光子の吸収は鎖間の架橋として機能する二付加物の形成をもたらしうる。S.T.Isaacsら，Biochemistry 16:1058（1977）；S.T.Isaacsら，Trends in Photobiology（Plenum）pp.279-294（1982）；J.Tessmanら，Biochem.24:1669（1985）；Hearstら，米国特許第4,124,598号、第4,169,204号および第4,196,281号。これらは参照としてここに組み入れている。
共有結合したプソラレンはＤＮＡ複製の抑制剤として作用し、したがって複製過程を停止させる可能性を有する。このＤＮＡ結合能力により、プソラレンは病原体を含まない血液供給物を作成し、維持するにあたっての固有の問題を解決することに関連して特に興味深い。数個の公知のプソラレンがいくつかの血液産物においてウイルスを不活性化することが示されている。H.J.Alterら，The Lancet（ii:1446）（1988）；L.Linら，Blood 74:517（1989）（血小板濃縮物の除染）；G.P.Wiesehahnら，米国特許第4,727,027号および第4,748,120号（これらは参照としてここに組み入れている）は、8-メトキシプソラレン（8-MOP）および照射を組み合わせた使用を記述している。P.Morelら，Blood cells 18:27（1992）は300μg/mlの8-MOPを紫外線を用いた10時間の照射と組み合わせると、ヒト血清中のウイルスを効果的に不活性化できると示している。8-MOPおよびアミノメチルトリメチルプソラレン（AMT）を用いた同様の研究が、他の研究者によって報告されている。Dodd RYら，Transfusion 31:483-490（1991）；Margolis-Nunno,H.ら，Thromb Haemostas 65:1162（Abstract）（1991）。実際、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶを含む広範な微生物の光不活性化が、本発明に用いる条件とは異なる条件下で、また以前から知られているプソラレンを用いて、確立された。［Hanson,C.V.,Blood Cells:18:7-24（1992）；Alter,H.J.ら，The Lancet ii:1446（1988）；Margolis-Nunno,H.ら，Thromb Haemostas 65:1162（Abstract）（1991）。］
プソラレンの光不活性化は、ウイルスを不活性化するプソラレンの能力が、完全な不活性化が起こるという安全限界を保証するのに十分な場合のみ実行可能である。他方、プソラレンは血液産物に害を与えるものであってはならない。ここまで述べてきた方法は、公知のプソラレンを用いて適用した時、血液産物に害を与えるのを避けるために困難で、かつ高価な手順を必要とする。たとえば、いくつかの化合物とプロトコールは、照射の間に生じる酸素遊離基による血液産物への害を予防するため、光に暴露する前に反応から分子性酸素を除去することを必要としてきた。L.Linら，Blood 74:517（1989）；Wiesehahnの米国特許第4,727,027号参照。これは費用と時間のかかる手順である。
最後に、光化学的除染（PCD）に用いられるいくつかの良く知られている化合物は、望ましくない変異原性を示す。これはウイルスを殺す能力が増加するにつれ増加するように見える。すなわち、公知化合物がウイルスの不活性化に効果的であればあるほど、その化合物はレシピエントに害を与え、したがってin vivo使用のための産物の不活性化系においてはどの箇所でも有用性が減少する。
使用対象の血液産物に重大な害を与えること無く、および酸素を除去する必要無しに、病原体を不活性化する改良された能力および低い変異原性を示し、それによって血液除染法において病原体の安全で完全な不活性化を保証する、新規なプソラレン化合物が必要とされている。
発明の概要
本発明は、新規なプソラレン、および変異原性と関連しない、紫外線の存在下で病原体を不活性化する増強された能力を有する新規なプソラレンの合成法を提供する。本発明はまた、in vivoおよびin vitroで使用される健康関連産物中の、特に血液産物中および合成媒体中の血液産物中の病原体を不活性化する新規なおよび公知の化合物の使用方法を提供する。
本発明は、血小板調製物中の病原体を不活性化する方法を意図する。この方法は、下記の順序で、ａ）任意の順序で、i）4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび5'-第一級アミノ置換プソラレンを含む群由来の化合物、ii）該化合物を光活性化するための光活性化手段、およびiii）核酸を有する病原体に汚染されている疑いのある血液調製物を用意し、ｂ）該化合物を該血液調製物に添加し、そしてｃ）該病原体を不活性化するために該化合物を光活性化する、ことを含んでなる。他の態様は、病原体が単細胞および多細胞性生物（例えばバクテリア、真菌、マイコプラズマおよび原生動物、等）を含む場合、または該病原体がウイルスを含む場合、を包含する。該血液調製物は血小板または血漿を含んでいてもよい。
ある態様において、上記の病原体不活性化法の光活性化手段は、180nmと400nmの間の波長を含む所定の強度の電磁線スペクトルを発生することができる光活性化装置を含んでなる。ある態様において、その強度は1〜30mW/cm2である。さらに別な態様において、血液調製物は上記の強度に1秒から30分間暴露される。別の態様では、電磁線スペクトルは320nmと380nmの間の波長を含む。
上記方法の別の態様において、血液調製物は合成媒体中に入れられている。さらに別の態様では、化合物は血液調製物に最終濃度が.1〜250μM、特に10〜150μMとなるように添加される。別の態様において、上記の段階ｃは分子酸素の濃度を制限せずに実施される。
本発明の１つの態様において、4'-第一級アミノ置換プソラレンは、-（CH2）u-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）z-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）z-NH2，および-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）y-R4-（CH2）z-NH2（ここでR2、R3およびR4は独立にしてOおよびNHを含む群から選ばれ、uは１〜10の整数であり、wは１〜５の整数であり、xは２〜５の整数であり、yは２〜５の整数であり、そしてzは２〜６の整数である）を含む群から選ばれる4'炭素原子上の置換基R1、およびｂ）Hおよび（CH2）vCH3（ここでvは０〜５の整数である）を含む群から独立して選ばれる、それぞれ4、5'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7を含むものまたはその塩が意図される。
別の態様において、5'-第一級アミノ置換プソラレンは、ａ）-（CH2）u-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）z-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）z-NH2，および-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）y-R4-（CH2）z-NH2（ここでR2、R3およびR4は独立してOおよびNHを含む群より選ばれ、uは１〜10の整数であり、wは１〜５の整数であり、xは２〜５の整数であり、yは２〜５の整数であり、そしてzは２〜６の整数である）を含む群から選ばれる5'炭素原子上の置換基R1、およびｂ）Hおよび（CH2）vCH3（ここでvは０〜５の整数である）を含む群から独立して選ばれる、それぞれ4、4'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、〔ただしR1が-（CH2）u-NH2を含む群から選ばれる場合、R7は（CH2）vCH3であり、そしてR5、R6およびR7が（CH2）vCH3である場合、uは３〜10の整数である〕、を含むものまたはその塩が意図される。ある態様においては、少なくとも２つのこれらの化合物が存在する。別の態様においては、この化合物は段階ｃの前に溶液中に存在し、この溶液は水、生理食塩水、または合成媒体を包含することができる。ある態様において、合成媒体はさらに酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを包含することができる。さらに別の態様において、合成媒体はマンニトールおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに包含することができる。別の態様において、合成媒体は酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸塩、およびリン酸ナトリウムを包含する。
上記方法の１つの態様において、段階ｂの前に該合成媒体は第１の血液バッグに入れられ、前記の血小板調製物は第２の血液バッグに入れられる。他の態様において、合成媒体は第１の血液バッグから第２の血液バッグへ無菌連結を経て急送することにより、段階ｂで該血小板調製物に加えられる。
さらに別の態様において、上記の化合物は5'-（4-アミノ-2-オキサ）ブチル-4,4',8-トリメチルプソラレンまたは4'-（4-アミノ-2-オキサ）ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを包含する。
１つの態様において、本発明の不活性化法はさらに、該血小板調製物を静脈内注入により動物に投与する段階（ｄ）を含む。別の態様において、上記化合物は段階ｃの前、乾燥製剤中に存在する。別の態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡで、二本鎖または一本鎖である。
本発明は、血小板調製物中の病原体を不活性化する別の方法を意図する。この方法は、下記の順序で、ａ）任意の順序で、i）4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび5'-第一級アミノ置換プソラレンからなる群より選ばれる化合物を包含する合成媒体、ii）該化合物を光活性化するための光活性化手段、およびiii）核酸を有する病原体に汚染されている疑いのある血小板調製物を用意し、ｂ）該合成媒体を該血小板調製物に添加し、そしてｃ）該血小板調製物の生物活性を有意に変更すること無く、実質的に全ての該病原体核酸の複製を妨げるために該化合物を光活性化する、ことを含んでなる。別の態様において、本発明は血小板調製物中の病原体を不活性化する方法を意図する。この方法は、下記の順序で、ａ）任意の順序で、i）第１の血液バッグに入れられた、緩衝化生理食塩溶液および4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび5'-第一級アミノ置換プソラレンからなる群より選択された低い変異原性を示す化合物を包含する合成媒体、ii）該化合物を光活性化するための光活性化手段、およびiii）第２の血液バッグに入れられた、核酸を有する病原体に汚染されている疑いのある血小板調製物を用意し、ｂ）該第１の血液バッグから該第２の血液バッグへ無菌連結手段により該合成媒体を急送することにより、合成媒体を該血小板調製物に添加し、そしてｃ）該血小板調製物の生物活性を有意に変更すること無く、実質的に全ての該病原体核酸の複製を妨げるために該化合物を光活性化する、ことを含んでなる。
本発明はまた、本発明のいくつかの化合物の合成法を意図する。１つの態様において、本発明は下記の工程を含んでなる4'-（ω-アミノ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、ａ）4'-（ω-ヒドロキシ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、ｂ）4'-（ω-ヒドロキシ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して、4'-（ω-メタンスルホニルオキシ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、そしてｃ）4'-（ω-メタンスルホニルオキシ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンをアジ化ナトリウムで処理して、4'-（ω-アジド-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、そしてｄ）4'-（ω-アジド-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを還元して、4'-［（ω-アミノ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。この合成法の１つの態様において、4'-（ω-アミノ-2-オキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンは、4'-（4-アミノ-2-オキサ）ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンである。別の態様では、工程（ｄ）において4'-（4-アジド-2-オキサ）ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンはトリフェニルホスフィンを用いて還元される。本発明はさらに上記の合成法によって製造された、4'-（4-アミノ-2-オキサ）ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを包含するプソラレン化合物を意図する。
本発明は、-（CH2）-O-（CH2）x-O-（CH2）z-NH2（式中x=z）を含む群から選ばれる4'炭素原子上の置換基R1、およびHおよび（CH2）vCH3（式中vは０〜５の整数である）を含む群から独立して選ばれる、それぞれ4'、5'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7を有する、別のプソラレン化合物の合成法を意図する。この合成法は以下の工程を含んでなる。すなわち、a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを含む群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンをHO（CH2）xO（CH2）zOHで処理して4'-（ω-ヒドロキシ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレン（式中n=x+3）を製造し、；c）4'-（ω-ヒドロキシ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して4'-（ω-メタンスルホニルオキシ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、d）4'-（ω-メタンスルホニルオキシ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンをアジ化ナトリウムで処理して、4'-（ω-アジド-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、そしてe）4'-（ω-アジド-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを還元して4'-（ω-アミノ-2,n-ジオキサ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。別の態様において、本発明は下記の工程を含んでなる、4'-（12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ）ドデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを含む群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンをジエチレングリコールで処理して、4'-（7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサ）ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、c）4'-（7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサ）ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを塩基および塩化メタンスルホニルで処理して4'-（7-メタンスルホニルオキシ-2,5-ジオキサ）ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造し、d）4'-（7-メタンスルホニルオキシ-2,5-ジオキサ）ヘプチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを1,4-ジアミノブタンで処理して4'-（12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ）ドデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。
さらに別の態様において、本発明は下記の工程を含んでなる、4'-（ω-アミノ-2-アザ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレン、4'-ブロモメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンおよび4'-ヨードメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを含む群から選ばれる4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを用意し、b）4'-ハロメチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを1，ω-ジアミノアルカンで処理して4'-（ω-アミノ-2-アザ）アルキル-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。別の態様において、本発明は下記の工程を含んでなる、4'-（14-アミノ-2,6,11-トリアザ）テトラデシル-4,5',8-トリメチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）4,5',8-トリメチルプソラレン-4'-カルボキサルデヒドを用意し、b）4,5',8-トリメチルプソラレン-4'-カルボキシアルデヒドをスペルミンおよび還元剤で処理して4'-（14-アミノ-2,6,11-トリアザ）テトラデカン-4,5',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。
本発明はまた、下記の工程を含んでなる、5'-（ω-アミノ-2-アザ）アルキル-4,4',8-トリメチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）5'-クロロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレン、5'-ブロモメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンおよび5'-ヨードメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンを含む群から選択される5'-ハロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンを用意し、b）5'-ハロメチル-4,4',8-トリメチルプソラレンを1，ω-ジアミノアルカンで処理して5'-（ω-アミノ-2-アザ）アルキル-4,4',8-トリメチルプソラレンを製造する工程である。別の態様は、下記の工程を含んでなる、4,8-ジアルキル-5'-ブロモメチル-4'-メチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）4,8-ジアルキル-7-（1-メチル-2-オキソプロピルオキシ）プソラレンを用意し、d）四塩化炭素中で4,8-ジアルキル-4',5'-ジメチルプソラレンを攪拌して4,8-ジアルキル-5'-ブロモメチル-4'-メチルプソラレンを得る工程である。さらに別の態様は、下記の工程を含んでなる、4,8-ジアルキル-4'-ブロモメチル-5'-メチルプソラレンの合成法を意図する。すなわち、a）4,8-ジアルキル-7-（1-メチル-2-オキソプロピルオキシ）プソラレンを用意し、d）塩化メチレン中で4,8-ジアルキル-4',5'-ジメチルプソラレンを攪拌して4,8-ジアルキル-4'-ブロモメチル-5'-メチルプソラレンを得る工程である。
本発明は下記の式を有する化合物またはその塩を意図する：
0004047374.tif 000002
本発明はまた、以下のものを包含してなるプソラレン化合物またはその塩を意図する。すなわち、ａ）-（CH2）u-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）z-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）z-NH2，および-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）y-R4-（CH2）z-NH2（ここでR2、R3およびR4は独立してOおよびNHを含む群から選ばれ、uは１〜10の整数であり、wは１〜５の整数であり、xは２〜５の整数であり、yは２〜５の整数であり、そしてzは２〜６の整数である）を含む群から選ばれる4'炭素原子上の置換基R1、およびｂ）Hおよび（CH2）vCH3（ここでvは０〜５の整数である）を含む群から独立して選ばれる、それぞれ4、5'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7である。本発明はこの化合物のいくつかの態様を意図する。それらは、置換基R1が-CH2-O-（CH2）2-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物；置換基R1が-CH2-O-（CH2）2-O-（CH2）2-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物；置換基R1が-CH2-O-（CH2）2-O-（CH2）2-NH-（CH2）4-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物；置換基R1が-CH2-NH-（CH2）3-NH-（CH2）4-NH-（CH2）3-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物を含む。
別の態様において、本発明は以下のものを包含してなるプソラレン化合物またはその塩を意図する。すなわち、a）-（CH2）u-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）z-NH2，-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）z-NH2，および-（CH2）w-R2-（CH2）x-R3-（CH2）y-R4-（CH2）z-NH2（ここでR2、R3およびR4は独立してOおよびNHを含む群から選ばれ、uは１〜10の整数であり、wは１〜５の整数であり、xは２〜５の整数であり、yは２〜５の整数であり、そしてzは２〜６の整数である）を含む群から選ばれる5'炭素原子上の置換基R1、およびｂ）Hおよび（CH2）vCH3（ここでｖは０から５の整数である）を含む群から独立して選ばれる、それぞれ4、4'および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7〔ただし、R1が-（CH2）u-NH2である場合、R7は（CH2）vCH3であり、そしてR5、R6およびR7が（CH2）vCH3である場合、uは３〜10の整数である〕である。本発明はこの化合物のいくつかの態様を意図する。それらは、置換基R1が-CH2-NH-（CH2）4-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物；および置換基R1が-CH2-0-（CH2）2-NH2であり、そして置換基R5、R6、およびR7がすべてCH3である化合物を含む。
最後に、本発明は合成血小板保存用媒体のいくつかの態様を意図する。ある態様において、合成血小板保存用媒体は45-100mM塩化ナトリウム；4-5mM塩化カリウム；10-15mMクエン酸塩；20-27mM酢酸ナトリウム；0-2mMグルコース；0-30mMマンニトール；約20mMリン酸ナトリウム；2-3mM塩化マグネシウムおよび濃度が約.1〜250μMの、4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび5'-第一級アミノ置換プソラレンからなる群から選ばれるプソラレンを含む水溶液からなる。別の態様において、血小板保存用合成媒体は45-100mM塩化ナトリウム；8-15mMクエン酸塩；20-35mM酢酸ナトリウム；約26mMリン酸ナトリウム；および濃度が約.1〜250μMの、4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび5'-第一級アミノ置換プソラレンからなる群から選ばれるプソラレンを含む水溶液からなる。具体的には、この媒体の一態様は86mM塩化ナトリウム；10mMクエン酸塩；30mM酢酸ナトリウム；約26mMリン酸ナトリウムおよび濃度が約.1〜250μMの4'-（4-アミノ-2-オキサ）ブチル-4,5',8-トリメチルプソラレンを包含する。
本発明はまた、4'-第一級アミノ置換プソラレンおよび血小板のin vivo使用に適する水溶液からなる、抗ウイルス特性を有する組成物を意図する。ある態様において、この組成物はさらに酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含む合成媒体を包含する。別の態様において、上記合成媒体はさらにマンニトールおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも１つの成分を包含する。別の態様において、本発明は5'-第一級アミノ置換プソラレンおよび血小板のin vivo使用に適する水溶液からなる、抗ウイルス特性を有する組成物を意図する。ある態様において、この組成物はさらに酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含む合成媒体を包含する。別の態様において、上記合成媒体はさらにマンニトールおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも１つの成分を包含する。
図面の説明
図１は、ブロモメチル-トリアルキルプソラレンの２つの異性体の化合物合成図を詳しく示す。
図２は、いくつかの4'-第一級アミノ置換プソラレンの化合物合成図を詳しく示す。
図３は、いくつかの4'-第一級アミノ置換プソラレンの化合物合成図を詳しく示す。
図４は、4'位でアルキル鎖によってプソラレンに結合した末端アミンを有するいくつかのプソラレンの化合物合成図を詳しく示す。
図５は、いくつかの5'-第一級アミノ置換プソラレンの化合物合成図を詳しく示す。
図６は、本発明の装置の一態様の斜視図である。
図７は、図６に記載の装置の線２−２に沿った断面図である。
図８は、図６に記載の装置の線３−３に沿った断面図である。
図９は、図６に記載の装置の線４−４に沿った断面図である。
図１０Ａは、本発明の化合物８、１３および１４の合成経路および化学構造を示す図である。
図１０Ｂは、本発明の化合物２、４および７の合成経路および化学構造を示す図である。
図１０Ｃは、本発明の化合物１、５、６、９および１０の合成経路および化学構造を示す図である。
図１０Ｄは、本発明の化合物１２および１５の合成経路および化学構造を示す図である。
図１０Ｅは、本発明の化合物３の合成経路および化学構造を示す図である。
図１０Ｆは、本発明の化合物１６および１７の合成経路および化学構造を示す図である。
図１１は、本発明の化合物１〜３が光活性化された時の、Ｒ１７の対数死滅（log kill）への濃度の効果を示す。
図１２は、本発明の化合物３〜６が光活性化された時の、Ｒ１７の対数死滅への濃度の効果を示す。
図１３は、本発明の化合物２および６が光活性化された時の、Ｒ１７の対数死滅への濃度の効果を示す。
図１４は、本発明の化合物６および１８が光活性化された時の、Ｒ１７の対数死滅への濃度の効果を示す。
図１５は、本発明の化合物１６が光活性化された時の、Ｒ１７の対数死滅への濃度の効果を示す。
図１６は、照射量ジュール/cm2（ワット秒/cm2）を変化させた場合の、本発明の化合物６に対するＲ１７の対数力価への効果を示す。
図１７は、照射量ジュール/cm2を変化させた場合の、本発明の化合物７、９および１０に対するＲ１７の対数力価への効果を示す。
図１８は、照射量ジュール/cm2を変化させた場合の、本発明の化合物７および１２に対するＲ１７の対数力価への効果を示す。
図１９は、照射量ジュール/cm2を変化させた場合の、本発明の化合物１５に対するＲ１７の対数力価への効果を示す。
図２０は、照射量ジュール/cm2を変化させた場合の、本発明の化合物１７に対するＲ１７の対数力価への効果を示す。
図２１は、本発明の化合物２および６の合成媒体中の濃度を変化させた場合の効果を示す。
図２２Ａは、現在血液銀行で使用されている標準血液産物分離法を図式的に示す。
図２２Ｂは、図２２Ａに示すように調製された血小板濃縮物に合成媒体が導入される、本発明の一態様を示す。
図２２Ｃは、図２２Ｂに示すように合成媒体を用いて希釈された血小板濃縮物に特に適用される、本発明の除染法の一態様を示す。
図２３Ａは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物２を用いた処理（PCD）を、血小板数により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２３Ｂは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物２を用いた処理（PCD）を、血小板凝集により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２３Ｃは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物２を用いた処理（PCD）を、ＧＭＰ−１４０発現により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２３Ｄは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物２を用いた処理（PCD）を、ｐＨにより測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２４Ａは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物６を用いた処理（PCD）を、血小板凝集により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２４Ｂは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物６を用いた処理（PCD）を、血小板凝集により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２４Ｃは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物６を用いた処理（PCD）を、ＧＭＰ−１４０発現により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２４Ｄは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物６を用いた処理（PCD）を、ｐＨにより測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２５Ａは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１７を用いた処理（PCD）を、血小板数により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２５Ｂは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１７を用いた処理（PCD）を、血小板凝集により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２５Ｃは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１７を用いた処理（PCD）を、ＧＭＰ−１４０発現により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２５Ｄは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１７を用いた処理（PCD）を、ｐＨにより測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２６Ａは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１８を用いた処理（PCD）を、血小板数により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２６Ｂは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１８を用いた処理（PCD）を、血小板凝集により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２６Ｃは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１８を用いた処理（PCD）を、ＧＭＰ−１４０発現により測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
図２６Ｄは、第１日目の対照（C1）、５日間保存された対照（D5）、紫外線単独処理（uv）および紫外線ならびに濃度100μMの化合物１８を用いた処理（PCD）を、ｐＨにより測定される血小板機能に及ぼすそれらの効果によって比較するグラフである。「ｎ」は、データ上のポイントによって表される実験数を示す。
発明の説明
本発明は、新規なプソラレン類及び紫外線の存在下で病原体を不活性化する高い能力を有する新規なプソラレン類の合成方法を提供する。これら新規なプソラレン類は、多種多様な病原体に対して有効である。本発明は、in vivo及びin vitroで用いられる健康関連製品中の病原体を、特に血液製剤中の病原体を、血液製剤機能に大きく影響することも突然変異誘発性を示すこともなしに不活性化するため、新規及び既知の化合物を用いる方法も提供する。
本発明の不活性化方法は、in vitro又はin vivoで用いる前の血液製剤中の病原体、特にウィルスを不活性化する方法を提供する。従来のアプローチとは対照的に、この方法は短い照射時間を要するだけで分子状酸素の濃度を制限する必要がない。
本発明の説明を次の節に分ける：Ｉ）光活性化装置、II）化合物合成、III）核酸への化合物の結合、IV）汚染物の不活性化、及びＶ）処理される物質の生化学的特性の保存。
Ｉ．光活性化装置
本発明は、光活性化、具体的には光反応性核酸結合性化合物の光活性化のための装置及び方法を意図している。本発明は、ユニット内に組み込まれた安価な電磁線の線源を有する装置を意図している。広くは、本発明は、光反応性化合物を処理するための光活性化装置であって、ａ）適切な波長の電磁線を供給して少なくとも１種の光反応性化合物の光活性化を起こす手段；ｂ）光活性化の間、該電磁線供給手段との固定された関係において複数のサンプルを支持するための手段；及びｃ）光活性化の間、該サンプルの温度を望ましい温度範囲内に維持するための手段、を含む装置を意図している。本発明は、ａ）１又は２以上の光反応性化合物を含有する複数のサンプル容器を電磁線の蛍光源との固定された関係において支持すること；ｂ）該複数のサンプル容器を電磁線で同時に照射して少なくとも１種の光反応性化合物の光活性化を起こすこと；及びｃ）光活性化の間、該サンプルの温度を望ましい温度範囲内に維持すること、を含む方法も意図している。
本発明の装置の１つの態様の主要な特徴には、Ａ）サンプル容器を支持するための手段との固定された関係における紫外線の安価な線源、Ｂ）速やかな光活性化、Ｃ）大きなサンプル処理量、Ｄ）照射サンプルの温度制御、及びＥ）固有の安全性が含まれる。
Ａ．電磁線源
多くの紫外線の線源をプソラレン類での除染手順にうまく用いることができる。例えば、幾つかのグループは、General Electric Ｆ２０Ｔ１２−ＢＬＢ型蛍光ＵＶＡ電球によりサンプルを上方及び下方から照射しながら、電気ファンで光を横切って緩やかに風を送ってその領域を冷却した。Alter,H.J.ら，The Lancet,24:1446（1988）。他のグループは、サンプルを含有するペトリ皿のカバーと直接接触させてウィルスサンプル上に配置した、ロンドンのP.W.Allen Co.により製造されたＡ４０５−ＴＬＧＷ／０５型長波長紫外ランプを用いて、室温で運転した。これら条件下でサンプルに届く全強度は、ペトリ皿において１．３×１０15光子／秒ｃｍ2（又は０．７ｍＷ／ｃｍ2又は０．０００７Ｊ／ｃｍ2秒）であった。Hearst,J.E.とThiry,L.,Nucleic Acids Research,4:1339（1977）。しかしながら、何らかの型の光活性化装置に限定するつもりはないが、本発明は、以下の通り、光活性化装置についての幾つかの好ましい改良を意図している。
本発明の好ましい光活性化装置は、サンプル容器を支持するための手段との固定された関係において紫外線の安価な線源を有する。紫外線は、電磁線スペクトルの一部を占めるエネルギーの一形態である（電磁線スペクトルは宇宙線から電波にまで及ぶ）。紫外線は、多くの天然線源及び人工線源から生じることができる。紫外線の線源に依っては、それに他の（非紫外）型の電磁線（例えば、可視光）が随伴することがある。
波長の点で特有のタイプの紫外線がここに記載されている。波長は、ここではナノメーター（ｎｍ；１０-9メーター）によって表される。ここでの目的のために、紫外線は約１８０ｎｍ〜４００ｎｍに及ぶ。線源がフィルター又は他の手段によって特定の波長（例えば、３２０ｎｍ）を下回る照射ができないときは、それはその波長で下端“カットオフ”を有すると言われる（例えば、３００ナノメーターの波長カットオフ）。同様に、線源が特定の波長（例えば、３６０ｎｍ）を下回る照射しかできないときは、それはその波長で上端“カットオフ”を有すると言われる（例えば、３６０ナノメーターの波長カットオフ）。
あらゆる光化学反応について、何らかの有害な副反応を排除するか又は最小限にすることが望まれる。これら副反応のあるものは、光活性化操作中に存在し得る内因性発色団の励起により起こり得る。核酸とプソラレンしか存在しない系においては、内因性発色団は核酸塩基自体である。光活性化方法を３２０ｎｍより大きな波長に制限すると、３１３ｎｍを越えては核酸による吸収が殆ど全くなくなるので、直接の核酸損傷が最小になる。
ヒトの血清又は血漿中で、例えば、核酸は典型的には他の生体成分と一緒に存在している。生物学的流体が正にタンパク質であるなら、３２０ｎｍカットオフは副反応を最小限にするのに妥当であろう（芳香族アミノ酸は３２０ｎｍをより上を吸収しない）。生物学的流体が他の分析物を含むなら、光の特定の波長に感受性である成分があり得る。これら内因性成分の存在から見て、狭い範囲内の特異でかつ望ましい波長での照射ができ、かくして血液成分の損傷を避けることができるように、本発明の装置を設計しようとするものである。望ましい波長の好ましい範囲は３２０〜３５０ｎｍである。
市販の照射源を選ぶことによってかなりの選択性を達成できる。例えば、典型的な蛍光管は（３６０ｎｍ辺りを中心とする幅広いピークの）３００ｎｍから４００ｎｍを上回る波長までを発するが、ＢＬＢ型蛍光ランプは４００ｎｍを上回る波長を除去するように設計されている。しかしながら、これは上端カットオフを備えるだけである。
好ましい態様においては、本発明の装置は追加のフィルター手段を含む。１つの態様においては、このフィルター手段は、一片のコバルトガラスの如きガラスカットオフフィルターを含む。１つの態様においては、このフィルター手段は、ペンシルバニア州DuryeaのShott Glass Technologies,Inc.から入手可能なＢＫ−７ガラスである。他の態様においては、このフィルター手段は、電磁スペクトルの特定の範囲だけを透過するＣｏ（ＮＯ3）2の水溶液の如き液体フィルター溶液を含む。この塩溶液は３２０〜４００ｎｍの透過窓をもたらす。好ましい態様においては、Ｃｏ（ＮＯ3）2の水溶液をＮｉＳＯ4と組み合わせて用いて、採用した蛍光源又はアーク発生源の発光スペクトルの３６５ｎｍ成分を除去する。このＣｏ−Ｎｉ溶液は、高エネルギー線源の直接光に１０時間露光した後でさえも驚くほど十分にその初期透過率を保存する。
用いる特定のフィルターにより本発明が限定されることは意図していない。幾つかの無機塩及びガラスが必要な要件を満足する。例えば、硫酸第二銅は、紫外だけを分離しようとする場合に赤外を除去するのに非常に有用な一般的フィルターである。強力な線源中におけるその安定性は至極良好である。当業者には他の塩が知られている。アパーチュア又はレフレクターランプも特定の波長及び強度を達成するのに用いることができる。
照射に関して紫外線がここで記述される場合、それは強度束（平方センチメーター当たりのミリワット数又は“ｍＷｃｍ-2”又はＪ／ｃｍ2秒）により表示される。“出力”はここでは電磁線の放射（yes又はno；on又はoff）並びに照射のレベルの両方を包含するものと定義される。好ましい態様においては、強度は４箇所で、つまり照射平面の各側について２箇所で監視される。
好ましい紫外線の線源は蛍光源である。蛍光はルミネセンスの特殊なケースである。ルミネセンスは、物質による電磁線の吸収及び異なる波長の電磁線へのエネルギーの変換を包含する。蛍光で、その電磁線により励起された物質は、特定量の電磁線を放射することによりその基底状態に戻る。これまで、蛍光源は、光活性化に役立てるにはあまりに強度が低過ぎると考えられてきたが、１つの態様では、本発明は蛍光源を用いて、今まで高価な設備でしか達成できなかった結果を達成する。
ここで用いる場合、固定された関係とは、サンプル照射中のサンプルと光源の間の固定された距離及び幾何学的配置を含むものと定義される。距離とは、光源と支持されているサンプルの間の距離のことである。点光源からの光強度はその点光源からの距離の二乗に反比例することが知られている。従って、光源からの距離の僅かな変化が強度に激烈な影響を有し得る。強度の変化は光活性化結果に影響を与え得るから、距離の変化は本発明の装置では避けられる。このことが再現精度及び反復精度を与えるのである。
幾何学的配置とは、光源の位置付けのことである。例えば、光源をサンプルホルダーの周囲に多くのやり方で（その横に、その下方に、輪状にする等して）配置することが考えられる。本発明の好ましい態様で用いられる幾何学的配置は、速やかな光活性化のために適切な強度の均一な露光を可能にする。本発明の好ましい装置の幾何学的配置は、１個の点光源とは対立するものとして線形ランプの複数光源を包含する。加えて、幾つかの反射面と幾つかの吸収面がある。この複雑な幾何学的配置の故に、照射すべきサンプルの位置に相対するランプの場所及び数の、強度変化をもたらすであろう変化が避けられることになる。
Ｂ．速やかな光活性化
本発明の好ましい態様の光源は、速やかな光活性化を可能にする。本照射装置の強度特性は、多くの組の複数サンプルを処理する必要があり得るという予想に好都合であるように選択された。この予想では、１５分又はそれ未満の露光時間が実用的目標である。
本発明の装置を設計するに際して、好ましい装置の機素の相対位置を約１５分の照射時間を可能にするように最適化した結果、３２０〜３５０ナノメーターの波長について測定したときに、約１ｍＷｃｍ-2（０．００１Ｊ／ｃｍ2秒）より大きな強度束がサンプル容器に与えられる。
Ｃ．大きな数のサンプルの処理
先に述べたように、本発明の光活性化装置の他の重要な特徴は、それらが大きな数のサンプルを処理できることである。これに関して、本発明の装置の１つの機素は、複数の血液バッグを支持する手段である。本発明の好ましい態様においては、この支持手段は、２列の光源の間に配置された血液バッグ支持体を含む。広く用いられている市販のバッグを受け入れることにより、本発明の装置で、好都合な大きな数のサンプルの処理が可能になる。
Ｄ．温度制御
先に述べたように、本発明の光活性化装置の重要な特徴の１つは温度制御である。温度制御は、露光時のサンプルにおけるサンプル温度がその結果に劇的に影響を与え得るので重要である。例えば、核酸内の第２構造を促進する条件も、核酸に対する多くのプソラレン誘導体の親和定数を高め得る。HydeとHearst,Biochemistry,17,1251（1978）。これら条件は、溶媒組成及び温度の両方が混ざったものである。一本鎖５ＳリボソームＲＮＡでは、低温での照射は５ＳｒＲＮＡへのＨＭＴの共有結合性付加を４℃で２０℃に比較して２倍高める。Thompsonら，J.Mol.Biol.147:417（1981）。合成ポリヌクレオチドでは、プソラレン結合が温度に誘発されて更に増加することさえ報告されている。Thompsonら，Biochemistry,21,1363（1982）。
Ｅ．固有の安全性
紫外線は重い熱傷を起こし得る。露光の性質に依っては、それは発癌性でもあり得る。本発明の好ましい態様の光源はユーザーから遮蔽されている。これは、市販の手持ち式紫外光源並びに大きくて高い強度の光源とは対照的である。好ましい態様においては、この照射源は、輻射エネルギーの透過を遮る材料でできたハウジング（例えば、不透明ハウジング）内に収納されている。照射がユーザーにまで通過することはない。このことで、ユーザーのための固有の安全性に備えている。
II．化合物合成
Ａ．一般の光活性化化合物
“光活性化化合物”（又は“光反応性化合物”）は、電磁線に応答して化学変化を起こす化合物のファミリーを規定する。表１は、光活性化化合物の一部を列挙したものである。
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ここに記載した光反応性化合物の好ましい種は、一般的にはフロクマリン類と言われる。特に、本発明は、線状であるプソラレン類、つまり［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オン、又は６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のβ−ラクトン］：
0004047374.tif 000004
として記載される化合物を意図している。この式で中央の芳香族部分に付いている２つの酸素残基は１，３方向であり、更にフラン環部分は二環式クマリン系の６位に連結している。プソラレン誘導体は、線状フロクマリンの３、４、５、８、４’又は５’位における置換から誘導される。
８−メトキシプソラレン（文献では種々の名称、例えばキサントトキシン、メトキサレン、８−ＭＯＰで知られている）は、比較的低い核酸への光活性化結合性と以下の実験の節に記載するエイムスアッセイにおける低い突然変異誘発性とを有する天然に存在するプソラレンである。４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（ＡＭＴ）は、最も反応性の核酸結合性プソラレン誘導体の１つであって、３．５ＤＮＡ塩基対当たり１までのＡＭＴ付加物を与える。S.T.Isaacs,G.WiesehahnとL.M.Hallick,NCI Monograph 66:21（1984）。しかしながら、ＡＭＴはかなりのレベルの突然変異誘発性も示す。安全で完璧な病原体の不活性化を確保するために、８−ＭＯＰ及びＡＭＴの両方の最良の特性、つまり低い突然変異誘発性と高い核酸結合親和性とを有する新規なグループのプソラレン類が望まれた。本発明の化合物は、そのような化合物になるようにデザインされた。
“４’−１級アミノ置換プソラレン類”は、２〜２０炭素の全長を有する炭化水素鎖によりプソラレンの４’位に連結されたＮＨ2基を有するプソラレン化合物として定義され、それら炭素のうち０〜６がＮＨ又はＯにより独立に置換され、そして各置換点は他の置換点から少なくとも２炭素分だけ離れており、そしてプソラレンから少なくとも１炭素分だけ離れている。４’−１級アミノ置換プソラレン類は、プソラレンの４，５’及び８位に追加の置換基を有していてもよい。前記置換基には、次の基、つまりＨ及び（ＣＨ2）nＣＨ3（ｎ＝０〜６）が含まれるがこれらに限定されない。
“５’−１級アミノ置換プソラレン類”は、１〜２０炭素の全長を有する炭化水素鎖によりプソラレンの５’位に連結されたＮＨ2基を有するプソラレン化合物として定義され、それら炭素のうち０〜６がＮＨ又はＯにより独立に置換され、そして各置換点は他の置換点から少なくとも２炭素分だけ離れており、そしてそのプソラレンから少なくとも１炭素分だけ離れている。５’−１級アミノ置換プソラレン類は、プソラレンの４，４’及び８位に追加の置換基を有していてもよい。前記置換基には、次の基、つまりＨ及び（ＣＨ2）nＣＨ3（ｎ＝０〜６）が含まれるがこれらに限定されない。
Ｂ．プソラレン類の合成
本発明は、本発明の新規な化合物の合成方法、並びに既知の中間体の新規な合成方法を意図している。具体的には、これら新規化合物は、モノ、ジ又はトリアルキル化された４’−又は５’−１級アミノ置換プソラレン類である。この節で説明するスキームの数例を図１０Ａ〜１０Ｆに示す。参照し易くするために、ここで説明するプソラレン誘導体に用いられる名称を表２に記載する。図１０Ａ〜１０Ｆには化合物１〜１８の構造も描かれている。この節（“Ｂ．プソラレン類の合成”と題された節）において化合物を特定するために用いられるローマ数字はスキーム１〜６と相関するだけで、表２又は図１０Ａ〜１０Ｆに列挙した化合物の番号とは相関しないことに留意すること。
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本発明の多くの化合物の合成に有用な中間体の合成を最初に記載することが最も筋道に叶っている。本発明は、４，５’，８−トリメチル−４’−１級アミノ置換プソラレン類又は４，４’，８−トリメチル−５’−１級アミノ置換プソラレン類に限定されないが、幾つかの重要な中間体には、トリ及びテトラメチルプソラレン類、つまり４’−ハロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン類及び５’−ハロメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン類が含まれる。これら重要な中間体の調製は、困難な課題を提示している。
中間体の調製
４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（４’−ＣＭＴ）及び４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（４’−ＢｒＭＴ）の従来の合成は、市販されているか（ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich Chemical Co.）又は以下に他のアルキル化プソラレンについて記載する４工程で調製することができる４，５’，８−トリメチルプソラレン（５’−ＴＭＰ）から出発する。大過剰（２０〜５０当量）の発癌性が高くかつ揮発性のクロロメチルメチルエーテルを用いて５’−ＴＭＰを４’−ＣＭＴに転化する。クロロメチルメチルエーテル又はブロモメチルメチルエーテルでの４，５’，８−トリアルキルプソラレン類のハロメチル化は、Hearstへの米国特許第４，１２４，５９８号に記載されている。このブロモ化合物、つまり４’−ＢｒＭＴは、多少揮発性が劣るブロモメチルメチルエーテルを用いて同じく調製される。所望の中間体が３０〜６０％の収率で得られるに過ぎない。５’−クロロメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（５’−ＣＭＴ）及び５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（５’−ＢｒＭＴ）は、異性体の出発化合物、つまり４，４’，８−トリメチルプソラレン（４’−ＴＭＰ）を用いて同じく調製される［Kaufmanへの米国特許第４，２９４，８２２号；McLeodら，“Synthesis of Benzofuranoid Systems.I.Furocoumarins,Benzofurans and Dibenzofurans,”Tetrahedron Letters 237（1972）］。以下の合成説明において言及する幾つかの図面は、１より多い化合物を表象する構造を明示するために用いられるローマ数字を含む。この番号付け方式は、上の表２の幾つかの具体的な化合物を特定するのに用いた番号付け方式とは別のものであるので、混同してはならない。
ここに記載するのは、反応条件の注意深い制御により、同じプソラレン前駆体からブロモメチル−トリアルキルプソラレン類のいずれの異性体をも合成できるようにする大きく改良された操作である。図１を参照のこと。図１において、Ａ1及びＡ2は、Ｈ及び１〜６の炭素原子を有するアルキル鎖を含む群から独立に選ばれる。典型的な塩基性条件下での４，８−ジアルキル−７−ヒドロキシクマリンと２−クロロ−３−ブタノンとの反応で、４，８−ジアルキル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシクマリン（Ｉ）が得られる。この物質は、ＮａＯＨ水溶液中で加熱することにより環化して４，８−ジアルキル−４’，５’−ジメチルプソラレン（II）になる。溶媒中でこの四置換プソラレンとＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を室温から１５０℃までで処理すると、用いる条件に依って４’位又は５’位でブロム化が起こる。過酸化ジベンゾイルの如き触媒を添加してもよいが、必須ではない。用いる溶媒が還流している四塩化炭素であれば、４，８−ジアルキル−５’−ブロモメチル−４’−メチルプソラレン（IV）が５０％又はそれを越える収率で得られる。塩化メチレンを室温で用いれば、４，８−ジアルキル−４’−ブロモメチル−５’−メチルプソラレン（III）が≧８０％収率で得られる。他の溶媒中でベンジル性ブロム化を行って、異性体生成物の１つを、単独で又は混合物中で生じさせることができる。これら溶媒には１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、ブロモトリクロロメタン及びベンゼンが含まれるが、これらに限定されない。
４’−置換プソラレン類の合成の一般的スキーム
下位の線状プソラレン類の合成に目を転ずると、４，５’，８−トリアルキルプソラレン類は次のようにして作ることができる。４，８−ジアルキルクマリン類を２−アルキルレゾルシノール類と３−オキソアルカン酸エステルからペックマン反応により調製する（Organic Reactions Vol VII,Chap 1,Adamsら編，Wiley,NY,（1953））。そのヒドロキシ基をアリル化試薬、つまりＣＨ2＝ＣＨＸ−ＣＨ（Ｒ）−Ｙ〔Ｘはハライド又は水素であり、Ｙはハライド又はスルホネートであり、そしてＲはＨ又は（ＣＨ2）vＣＨ3（ｖは０〜４の整数である）である〕で処理する。得られたアリルエステルのクライゼン転位で４，８−ジアルキル−６−アリル−７−ヒドロキシクマリンが得られる。このクマリンを４，５’，８−トリアルキルプソラレン類に、以前に記載された操作（即ち、Benderら，J.Org.Chem.44:2176（1979）；Kaufman，米国特許第４，２３５，７８１号及び４，２１６，１５４号を参照のこと、これらは参照によりここに組み入れられるものとする）の１種と類似する操作を用いて転化する。４，５’，８−トリメチルプソラレンは天然物であるので市販されている（ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich Chemical Co.）。
５’−置換プソラレン類の合成の一般的スキーム
４，４’，８−トリアルキルプソラレン類も、上記の４，８−ジアルキル−７−ヒドロキシクマリン類から出発する２工程で調製することができる。このクマリンを塩基性条件下でα−クロロケトンで処理して４，８−ジアルキル−７−（２−オキソアルコキシ）クマリンを得る。この中間体の４，４’，８−トリアルキルクマリンへの環化は塩基性水溶液中で加熱するこにより起こる。
アルキル基が（ＣＨ2）2〜（ＣＨ2）10の群から選ばれる長鎖４’−（ω−ハロアルキル）トリアルキルプソラレン類（ここでは、長鎖４’−ＨＡＴＰという）は、フリーデル・クラフト条件下で他で説明されている通りに調製することができる（OlahとKuhn,J.Org.Chem.,1964,29,2317；Friedel-Crafts and Related Reactions,Vol.II,Part 2,Olah編，Interscience,NY,1964,p749）。ハロメチル中間体とアミンとの反応（例えば、Hearstら，米国特許第４，１２４，５９８号）及びアルコールとの反応（例えば、Kaufman，米国特許第４，２６９，８５２号）は記載されているが、長鎖１級アミンの生成に関しては２つの初期の報文があるに過ぎない。それらは４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンとＨ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2（ｎ＝２、４、６）との反応（Lee,B.ら，“Interaction of Psoralen-Derivatized Oligodeoxyribonucleoside Methylphosphonates with Single-Stranded DNA”,Biochemistry 27:3197（1988））及びＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2（Goldenberg,M.ら，“Synthesis and Properties of Novel Psoralen Derivatives”,Biochemistry 27:6971（1988））との反応を記載している。得られた化合物の核酸光反応についての有用性についてはこれまで報告されていない。これら物質の低突然変異誘発性の如き特性は、これまでに調製されたＡＭＴの如き化合物について分かっていることに基づけば意外である。
図２に幾つかの合成ルートを示す。４’−ＨＡＴＰ〔ｗは１〜５の数であり；Ａ1、Ａ2及びＡ3は、Ｈ及び（ＣＨ2）vＣＨ3（ｖは０〜５の数である）を含む群から独立に選ばれ；そしてＸ＝Ｂｒ、Ｃｌ又はＩである〕から出発して、１８炭素原子長より短いか又は等しい過剰のビスヒドロキシ化合物、つまりＨＯ−（Ｂ）−ＯＨ〔Ｂは、アルキル鎖（例えば、ＨＯ−（Ｂ）−ＯＨが１，３−プロパンジオール）、モノエーテル（例えば、ジエチレングリコール）又はポリエーテル（例えば、テトラエチレングリコール）のいずれかである〕及びハロメチルより長い炭素鎖用の塩基と、ニートで又はアセトンの如き溶媒と共に２０〜８０℃で反応させて、（ω−ヒドロキシアルコキシ）アルキルプソラレンを得る。この末端ヒドロキシ基は種々の条件下でアミノ基に転換することができる（例えば、Larock,“Comprehensive Organic Transformations”,VCH Publischers,NY,1989を参照のこと）。特に、塩化メタンスルホニル（ＣＨ3ＳＯ3Ｃｌ）の存在下でこのヒドロキシ基をメタンスルホン酸のエステル（構造VI）に転化することができる。続いて、これを還流エタノール中でアジドに転化することができ、そしてそのアジドを最終アミン、つまり構造VII（例は、化合物２、４及び７である）に還元することができる。ここに記載した方法は、還元のためにトリフェニルホスフィン及び水をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で用いるものであるが、他の方法が意図されている。
構造VIIの調製の好ましい方法では、４’−ＨＡＴＰと保護されたアミン（例えば、フタルイミド基）を含有する１級線状アルコールとの末端位置での反応であって、ＤＭＦの如き適する溶媒中での２５〜１５０℃での反応を用いてＶを得る。次いで、このアミンを標準的条件下〔例えば、フタルイミド基を脱保護するためのヒドラジン又はＭｅＮＨ2水溶液（ベンジルヒドラジンの如き高級アルキルヒドラジン類も意図されている）〕で脱保護してVIIを得る。
逆に、構造VIをジアミン、つまりＨ2Ｎ−（Ｂ’）−ＮＨ2〔Ｂ’は、アルキル鎖（例えば、１，４−ブタンジアミン）、モノエーテル（例えば、３−オキサ−１，５−ペンタンジアミン）又はポリエーテル（例えば、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミン）である〕と反応させて最終生成物、つまり化合物VIII（この構造群の化合物の例は、化合物８、13及び14である）を得ることができる。この反応は還流しているアセトニトリル中で過剰のジアミンで行われるが、他の溶媒及び温度も同じく可能である。
炭素鎖がプソラレン環の４’位に、オキシアルキル基［Ｏ（ＣＨ2）w］によってというよりもむしろアミノアルキル基［ＮＨ（ＣＨ2）w］によって連結されている幾つかの最終化合物が望まれる。これら化合物の合成経路を図３に示す。この窒素と末端窒素の間の連結基がＣＨ2下位単位と酸素だけを含有して他の窒素を含有しない（構造Ｘ）（例は、化合物１、５、６、９、10及び11である）ときは、この生成物は４’−ＨＡＴＰ及び構造IXの適切なジアミンから都合よく調製することができる。この方法は、構造XIIのポリアミン〔例えば、ノルスペルミジン又はスペルミン（ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich Chemical Co.から市販されている）〕から出発して、その鎖の中に２を越える窒素を含有する最終生成物（構造XIII）（例は、化合物12及び15である）にも適用できるが、この場合には、異性構造体もかなりの量で生成する。構造XIIIの好ましい調製方法は、構造XIIのポリアミン及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムの如き還元剤でのプソラレン−４’−アルカナール（XI）の還元的アミノ化である。この還元的アミノ化は、化合物Ｘの合成にも適用できる。これらカルボキサルデヒド体（carboxaldehydes）（構造XI，ｗ＝０）は、これまで、４’−ハロメチル化合物を加水分解してから得られた４’−ヒドロキシメチル化合物を酸化することにより調製されてきた（Isaacsら，J.Labelled Cmpds.Radiopharm.,1982,19,345）。これら化合物は、ホルムアミドとＰＯＣｌ3での又は酸中でのヘキサメチレンテトラミンでの４’−ヒドリド化合物のホルミル化によっても都合よく調製することができる。長鎖アルカノールは、４’−ＨＡＴＰ化合物から、末端ハロ基のアルデヒド官能基への転化により調製することができる（例えば、Durst,Adv.Org.Chem.6:285（1969））。
他の最終生成物は、アルキル鎖によってプソラレンに連結された末端アミンを有する。図４に示すように、これら化合物（構造XIV）（例は、化合物３である）は、１）４’−ＨＡＴＰをフタルイミドカリウム又はアジ化カリウムと反応させてから先のように、例えばヒドラジンで所望のアミンにフリー化することによるか、又は２）４’−ＨＡＴＰをシアノ化合物に転化した後に、例えばＮａＢＨ4−ＣＦ3ＣＯ2Ｈで還元することによるかのいずれかにより調製される。
４，５’，８−トリアルキルプソラレン類の４’−アミノ官能化−４，５’，８−トリアルキルプソラレン類への転化の説明は、４位及び／又は８位が水素だけで置換され、かくして４’−１級アミノ置換−５’，（４又は８）−ジアルキルプソラレン類及び４’−１級アミノ置換−５’−アルキルプソラレン類が得られる場合に等しく十分に当てはまる。
５’誘導体の合成
上に記載したのと同一条件下で、以下にスキーム５に詳記するように、４，４’，８−トリアルキルプソラレン類又は４，４’，８−トリアルキル−５’−メチルプソラレン類を５’−（ω−ハロアルキル）−４，４’，８−トリアルキルプソラレン類（ここでは、５’−ＨＡＴＰと呼ぶ）に転化することができる（修飾型についてはKaufman，米国特許第４，２９４，８２２号及び４，２９８，６１４号を参照のこと）。
４，４’，８−トリアルキルプソラレン類の５’−１級アミノ置換−４，４’，８−トリアルキルプソラレン類への転化の説明は、４位、４’位及び／又は８位が水素で置換されただけであるために４位、４’位及び／又は８位でアルキル基を有する５’−１級アミノ置換−ジアルキルプソラレン類及び５’−１級アミノ置換−アルキルプソラレン類が得られる場合に等しく十分に当てはまる。
４’−１級アミノ−及び５’−１級アミノプソラレン類の合成の上の説明は、非線状クマリン類、具体的にはイソプソラレン類又はアンゲリシン類に拡張することができる。従って、４’−ハロメチルアンゲリシン類（XIX）及び５’−ハロメチルアンゲリシン類（XX）をそれらの線状同等物と類似したやり方で調製することができる。上に提示した合成経路の類法により、そのアルキル連結基が１又は２以上の酸素又は窒素原子を含有する４’−（ω−アミノ）アルキルアンゲリシン類及び５’−（ω−アミノ）アルキルアンゲリシン類の合成を想定することができる。
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III．核酸への化合物の結合
本発明は、ウィルス核酸及び細菌核酸を含む（しかしこれらに限定されない）核酸に新規及び既知の化合物を結合させることを意図している。核酸に光活性化化合物を結合させるための本発明の１つのアプローチは、光結合である。光結合は、光活性化波長の光の存在下での光結合性化合物の結合として定義される。光結合性化合物は、光活性化波長の光の存在下で核酸に結合する化合物である。本発明は、本発明の光結合性化合物で光結合させる方法を意図している。
光結合のための本発明の方法の１つの態様は、次の工程を包含する：ａ）本発明の光結合性化合物を提供する工程；及びｂ）該光結合性化合物を光活性化波長の電磁線の存在下で核酸と混合する工程。
更に、本発明は、核酸を修飾する方法であって、次の工程を包含する方法を意図している：ａ）本発明の光結合性化合物及び核酸を提供する工程；及びｂ）該光結合性化合物を該核酸に光結合させて、化合物：核酸複合体を形成する工程。本発明の化合物が複製を阻止する何らかの方法に限定されることを意図しないが、前記の化合物：核酸複合体の構造は、該化合物が結合している領域において必要なポリメラーゼが機能するのを阻止することにより、該核酸の複製を阻止するのに役立つものと考えられる。
IV．病原体の不活性化
本発明は、血液製剤を使用する前に、血液製剤を光活性化化合物で処理しそして照射して汚染病原体核酸配列を不活性化することを意図している。
Ａ．一般の不活性化
“不活性化”という用語は、ここではある単位の病原体の核酸を変質させて複製できないその単位の病原体にすることと定義される。これは、所与のサンプル中に存在する全ての病原体単位を複製できないようにする“完全不活性化”とも、存在する殆どの病原体単位を複製できないようにする“実質的不活性化”とも別のものである。化合物の“不活性化能力”は、その化合物が所与の化合物濃度又は線量で達成できる不活性化のレベルと定義される。例えば、１００μＭの仮想化合物Ｘが５logのＨＩＶウィルスを不活性化したのに対して、同じ実験条件下で同じ濃度の化合物Ｙが１logのウィルスしか不活性化しなかったとしたら、化合物Ｘは化合物Ｙよりも良好な“不活性化能力”を有することになる。
ある“不活性化”方法が“完全不活性化”を達成できるかできないかを判断するには、具体例を考察することが役立つ。細菌培養物は、その培養物の一定量を新たな培養プレートに移して増殖させたときに、一定時間経過後でも検出できない場合は、不活性化されたと言われる。信号を検出できる最小数の生育可能細菌をプレートに適用しなければならない。最適な検出方法では、この最小数は１細菌細胞である。最適さが劣る検出方法では、信号を認識できるように塗布する細菌細胞の最小数は１よりずっと大きくてもよい。この検出方法で、それを下回るとその“不活性化方法”が完全に有効であると考えられる（そしてそれを上回ると“不活性化”が実に部分的にしか有効でない）“限界値”が定まる。
Ｂ．潜在的病原体の不活性化
検出方法及び限界値の同じ考察が、核酸についての不活性化方法の感度限界を定める際に存在する。やはり“不活性化”は、ある単位の病原体を複製できないようにすることを意味する。
ヒトにより用いられる材料についての不活性化方法の場合には、in vivoであろうとin vitroあろうと、その検出方法は、理論的には、その材料に曝された結果としての疾患での感染のレベルの測定であると解釈することができる。次いで、それを下回るとその不活性化方法が完全であるその限界値は、その材料と接触したために疾患が発生するのを阻止するのに十分である不活性化のレベルであると解釈される。この実践的シナリオでは、本発明の方法が“完全不活性化”をもたらすことは必須ではないことが認識される。換言すると、生育可能部分が疾患を起こすのに不十分である限り“実質的不活性化”というのが妥当であろう。かくして、残存している病原体の生育可能部分が疾患を起こすには不十分であるときは、“実質的に全て”の病原体が不活性化されている。本発明の不活性化方法は病原体内の核酸を実質的に不活性にする。１つの態様においては、この不活性化方法は、血液製剤中の病原体核酸を実質的に不活性にする。
本発明の化合物が病原体を不活性化する何らかの方法に限定されることを意図しないが、不活性化は、病原体核酸へのプソラレン類の光誘発結合から生じるものと考えられる。更に、本発明の不活性化方法が核酸の性質によって限定されることを意図しておらず、この不活性化方法が（ＤＮＡであろうとｍＲＮＡであろうとその他のものであろうと）全ての形態の核酸を実質的に不活性にすることを意図している。
光活性化化合物を用いて核酸を修飾すると、病原体核酸（ＤＮＡでも、ｍＲＮＡでも、その他のものであってもよい）と光活性化化合物との相互作用が、好ましくはその病原体の複製を阻止するので、もしヒトが処理された病原体に曝されても、感染は起こらないであろう。
“合成媒体”は、ここでは水性合成血液又は血液製剤貯蔵媒質と定義される。１つの態様においては、本発明は、緩衝生理食塩水を含む合成媒体中の血液製剤を不活性化することを意図している。この方法は、血液製剤への有害性を軽減しかつずっと低濃度で光活性化化合物を使用することを可能にする。
このプソラレン光不活性化方法は、単一操作により血液中に存在する核酸に基づく病原体を不活性化する。かくして、それは、細菌、原生動物、及びウィルスをも取り除く潜在力を有している。もしも効果的な除染方法がエイズ流行の到来前に利用可能であったなら、ＨＩＶ伝染を伴う輸血は起きなかったであろう。プソラレンに基づく除染は、含まれる病原体の如何を問わず、血液サプライから全ての病原菌を取り除く潜在力を有している。更に、プソラレンに基づく除染は、採取及び処理後の血液製剤を滅菌する能力を有しており、血小板濃縮物の場合には、低レベル細菌汚染の問題を解決でき、長い保存寿命をもたらすことができよう。Morrow J.F.ら，JAMA 266:555-558（1991）；Bertolini F.ら，Transfusion 32:152-156（1992）。
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１又は２以上のプソラレン誘導体により光化学的に不活性化されたウィルスの一覧表を表３に示す（Hanson,C.V.,Blood Cells 18:7（1992）の表１から）。この文献で、ピコナウィルスはプソラレン類がウィルス増殖中に存在した場合にのみ光不活性化されることが指摘された。この一覧表は全部を網羅したものではなく、プソラレン類が不活性化できる多種多様な病原体の単なる代表に過ぎない。本発明は、ここに記載した化合物によるこれら及び他のウィルスの不活性化を意図している。本発明の化合物は、特にＨＩＶウィルスの如きエンベロープウィルスを不活性化するのによく適している。
Ｃ．病原体を不活性化するための光不活性化化合物の選択
ある化合物が本発明の光化学的除染（ＰＣＤ）方法に有用であるか否かを決めるためにそれを評価するには、次の２つの重要な特性を考慮すべきである：１）病原体を不活性化するその化合物の能力、及び２）その突然変異誘発性。病原体を不活性化する化合物の能力は、幾つかの方法により測定することができる。１つの技術は、バクテリオファージスクリーン、つまり試験化合物の核酸結合性を測定するアッセイを行うことである。このタイプのスクリーン、つまりｒ−１７スクリーンは以下の実施例１２に詳細に記載されている。ｒ−１７スクリーンが不活性化活性を示すなら、それはウィルスを不活性化するその化合物の能力を直接的に試験するのに有用である。直接ウィルス不活性化スクリーンを行う１つの方法は、無細胞ＨＩＶについての実施例１３に詳細に記載されている。
Ｒ１７バクテリオファージスクリーンは、ＨＩＶ不活性化能力並びに他の多くのウィルスに対する化合物の不活性化能力を前もって知らせるものであると考えられる。Ｒ１７が選ばれるのは、それが非常に不活性化し難い病原体と考えられるからである。それは小さな一本鎖ＲＮＡファージである。それにより本発明が効果を生じる何らかの手段に限定されることを意図しないが、短い核酸片は、長い核酸片よりも高頻度のプソラレン付加物の形成を要するので、不活性化するのがより難しいと考えられる。更に、一体鎖ＲＮＡ病原体は、プソラレン類が二本鎖核酸での場合のように塩基対の間に介在することも、鎖間架橋として機能する二価付加物（diadduct）を形成することもできないので、より不活性化し難い。かくして、Ｒ１７の不活性化が達成されるときは、これら同じ条件下で多くのウィルス及び細菌の不活性化が起こるものと期待される。
無細胞ＨＩＶスクリーンは、ｒ−１７スクリーンで陽性の試験結果が得られた所与の化合物が現実にウィルスを不活性化するのに効果的に作用することを確かめることにより、ｒ−１７スクリーンを補足する。かくして、化合物がｒ−１７スクリーンにおいて活性を示したなら、次にそれをこのウィルス不活性化スクリーンで試験する。
本発明の方法に用いる化合物を試験する際に重要である第２の特性は、突然変異誘発性である。最も広く用いられる突然変異誘発物質／発癌性物質スクリーニングアッセイは、Ａｍｅｓ試験である。このアッセイはD.M.MaronとB.N.AmesによりMutation Research 113:173（1983）に記載されており、具体的なスクリーンは以下の実施例17に詳細に記載されている。Ａｍｅｓ試験には、増殖がヒスチジン依存性でありそして通常のＤＮＡ修復酵素を欠いている幾つかの独特なねずみチフス菌の株を用いる。この細菌をヒスチジンから非依存性にする正常な突然変異の頻度（即ち、自発的復帰突然変異の頻度）は低い。この試験は、この復帰突然変異頻度への化合物の影響を評価できるようにするものである。
幾つかの物質は単独では突然変異誘発性ではないが、代謝作用により突然変異誘発物質に転化されるので、試験すべき化合物を肝臓抽出物と一緒にアガープレート上で細菌と混合する。この肝臓抽出物は、動物内での代謝作用様の作用を示すのに役立つ。コントロールプレートは、細菌とその抽出物だけを有する。
これら混合物をインキュベートする。細菌の増殖を（もしあれば）コロニーを数えることによりチェックする。陽性のＡｍｅｓ試験は、化合物を含有する混合物を有するプレート上のコロニーの数が、対応するコントロールプレート上のその数を大きく上回る試験である。
このようにしてＡｍｅｓ試験で既知の発癌性物質をスクリーニングすると、約９０％が陽性である。既知の非発癌性物質を同様にスクリーニングすると、約９０％が陰性である。
以下の表４に示すように、新規化合物（Ｘ）を潜在的血液光除染化合物として評価することができる。ＸをまずステップＩで評価する。実施例１２に示すように、Ｘをｒ−１７アッセイにおいて４〜３２０μＭの数種の異なる濃度でスクリーニングする。もしその化合物が、ｒ−１７スクリーンにおいていずれかの濃度でｒ−１７の１log不活性化（log死滅）より大きな不活性化活性を示すのなら、次いでその化合物を実施例１３に示すように無細胞ＨＩＶアッセイでスクリーニングする。もしその化合物が、無細胞ＨＩＶアッセイにおいてＨＩＶの１log不活性化（log死滅）より大きな不活性化活性を示すのなら、次いでその化合物とＡＭＴをＡｍｅｓアッセイでスクリーニングする。最後に、もしその化合物がＡｍｅｓアッセイでＡＭＴが示すよりも低い突然変異誘発性を示すのなら、その新規化合物は病原体の不活性化に有用な物質として同定される。
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これら指示に従うことにより、どの化合物が本発明の方法に用いるのに適切であるかを迅速に決めることができる。
Ｄ．光不活性化のための化合物の送り込み
本発明は、ここに記載した化合物を不活性化方法に送り込める幾つかの異なる製剤及びルートを意図している。この節は単に説明のためのものであって、本発明を、本化合物を導入する何らかの形態又は方法に限定するつもりはない。
本発明の化合物は、幾つかの形態で不活性化方法に導入することができる。これら化合物は、水、食塩水、“SterilyteTM3.0”（内容物は以下の実験の節の初めに記載されている）のような合成媒体又は他の種々の媒体中の水溶液として導入することができる。これら化合物は、更にアジュバントを有するか又は有さない、乾燥形態として提供することもできる。
これら新規化合物は、多くの異なるルートにより提供することもできる。例えば、この化合物を製造時点で血液バッグの如き反応容器に導入してもよい。また、物質を反応容器の中に入れた後に、滅菌されるその物質にこの化合物を添加してもよい。更に、これら化合物を単独で導入しても、幾つかの異なる化合物の“カクテル”又は混合物で導入してもよい。
Ｖ．処理される物質の生化学的特性の保存
in vivoで使用される血液製剤を処理する場合、使用される方法及び化合物を開発する際に２つの要因が極めて重要である。第１に、使用される方法又は化合物が処理される物質のin vivo活性を変えはしないかということを問わなければならない。例えば、血小板輸血は血小板減少性出血症を有する患者のための十分に確立された有効な治療である。しかしながら、使用される除染処理が血小板凝固活性を大きく低下させるなら、その治療は実用的価値を有さない。プソラレン類は、その反応を血液及び血液製剤の生化学的特性の保持に適合する温度で行うことができるので、不活性化操作に有用である。Hanson,C.V.,Blood Cells 18:7（1992）。全てとは言えないがプソラレン類及びその方法は、除染処理される物質の生物活性を大きく低下させることなしに除染するであろう。従来の化合物及び手順は、照射中に生成する酸素ラジカルからの血液製剤の損傷を防ぐために、露光前及び露光中に反応液から分子状酸素を除去することを必要とした。L.Linら，Blood 74:517（1989）；Wiesehahnへの米国特許第４，７２７，０２７号を参照のこと。本発明は、酸素の存在下で、血液製剤を調製する間の活性を破壊することなく、血液製剤を除染するのに用いることができる。更に、本発明の方法では分子状酸素の濃度を低下させる必要がない。本発明では、本発明の方法により除染された血液製剤のサンプルの試験結果が、血液製剤機能についての既知のアッセイにおいて正常に機能する血液製剤のサンプルの試験結果と同程度であるなら、血液製剤のin vivo活性は破壊されていないか又は大きく低下していないと考える。例えば、血小板に関する場合、本発明の方法により処理されて５日間貯蔵された血小板のｐＨが、それらを処理しないで５日間貯蔵したものと実質的に同じであるなら、in vivo活性は破壊されていないか又は大きく低下していない。“実質的に同じ”ｐＨとは、その値がその特定のデータポイントの近辺の誤差の範囲内に入ることを意味している。
第２の要因は、使用される化合物が治療される患者に対して毒性又は突然変異誘発性であるかどうかということである。“低い突然変異誘発性を示す化合物”とは、以下の実験の節に記載するＡｍｅｓアッセイにおいて２５０μＭを下回る濃度でそれを試験したときに、ＡＭＴよりも突然変異誘発性が劣る化合物と定義される。本発明の不活性化化合物及び方法は、それらが突然変異誘発性とは結び付かない病原体不活性化能力を示すので、特に有用である。本化合物は、突然変異誘発性の上昇を伴うことなく力強い病原体不活性化を示す。光不活性化手順において試験したＡＭＴの如き広く知られた化合物は、病原体不活性化能力と突然変異誘発作用の間の結び付きを示すと考えられ、それは今までのところ不可分であると思われる。
病原体不活性化能力が突然変異誘発性と結び付いていないことによる何らかの理論に本発明が限定されることを意図しないが、結び付きがないことは、プソラレン上で置換された基の長さ、及びその化合物上の電荷の位置の結果として生じていると仮定される。突然変異誘発性化合物の一方又は両方の末端上の正電荷が、ＤＮＡのリン酸主鎖と非共有結合的相互作用を有すると仮定される。これら相互作用は、光の存在からの独立性（“暗結合”と呼ばれる）を生み出すと推定される。理論的には、そのプソラレンはそれによりポリメラーゼがＤＮＡを開く（Opening UP）のを立体的にブロックし、突然変異誘発性を生じさせる。対照的に、本発明の化合物は、長い置換基上に正電荷又は中性電荷を保有している。これら置換基は、暗結合の間、ＤＮＡからフリーになるのがずっと容易である立体バリヤーを形成して、ポリメラーゼを通過できるようにする。かくして、突然変異誘発性が生じないのである。
実験
以下の実施例は、本発明の一定の好ましい態様及び側面を説明するのに資するものであって、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実験の開示では次の略号を用いる：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（ノルマル）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｋｇ（キログラム）；Ｌ（リッター）；ｍＬ（ミリリッター）；μＬ（マイクロリッター）；ｃｍ（センチメーター）；ｍｍ（ミリメーター）；μｍ（マイクロメーター）；ｎｍ（ナノメーター）；Ｊ（ジュール、ワット秒でもある、図１１、１３〜２０ではジュール又はＪはジュール／ｃｍ2のことであることに留意のこと）；℃（摂氏での度）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＥＡＡ（アセト酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＨＯＡｃ（酢酸）；Ｗ（ワット）；ｍＷ（ミリワット）；ＮＭＲ（Varian Gemini 200 MHzフーリエ変換分光計で室温で得られた核磁気共鳴スペクトル）；m.p.（融点）；ＵＶ（紫外光）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾イーグル培地）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清）；ＬＢ（ルリア肉汁）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン・四酢酸）；フォルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）；食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）。更に、本発明の化合物の合成を記載する実施例においては、示した収率は、通し合成のものではなくその工程だけの収率である。
参照を容易にするために、本発明の幾つかの化合物に１〜１８の番号を付した。この整理番号は、表２において付されており、それら構造を図１０Ａ〜１０Ｆに示している。これら整理番号は、この実験の節を通して用いられている。
本発明の化合物を酸付加塩の形で単離する際、その酸は、好ましくは、少なくとも通常の治療的用量で無毒でありかつ薬学的に許容可能であるアニオンを含有するように選ばれる。この好ましいグループに含まれる代表的な塩は、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩若しくは二酒石酸塩、及びマレイン酸塩である。他の酸も同じく適しており必要に応じて用いることができる。例えば、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、サリチル酸、ビスメチレンサリチル酸、プロピオン酸、グルコン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、桂皮酸、シトラコン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、イタコン酸、グリコール酸、ベンゼンスルホン酸、及びスルファミド酸も酸付加塩形成酸として用いることができる。
以下の１つの実施例では、ＨＥＰＥＳ緩衝液に言及している。この緩衝液は、８．０ｇの１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｇの２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．２０３ｇの１ｍＭ ＭｇＣｌ2（６Ｈ2Ｏ）、１．０ｇの５．６ｍＭグルコース、１．０ｇの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ミズーリ州セントルイスのSigmaから入手可能）、及び４．８ｇの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ミズーリ州セントルイスのSigmaから入手可能）を含有する。
以下の１つの実施例では、リン酸緩衝合成媒質を血小板処理のために配合している。これは、次の試薬を２リッターの蒸留水中で混合することにより１工程で配合することができ、ｐＨ平衡溶液（例えば、ｐＨ７．２）ができる。
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次いで、この溶液を混合して、滅菌濾過（０．２ミクロンフィルター）して冷凍する。
本発明に有用なもう１つの合成媒質は、次の試薬を含有する。
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ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を１つの実施例で用いて幾つかの化合物によるウィルス不活性化が完全であるかどうかを測定する。ＰＣＲは、ゲノミックＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度をクローニング又は精製することなしに高める方法である。K.B.Mullisら，米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号を参照のこと。なお、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。標的配列を増幅するためのこの方法は、大過剰の２本のオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に導入してから、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序で熱サイクルを行うことからなる。これら２本のプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を行うには、この混合物を変性してからこれらプライマーを標的分子内のそれらの相補配列にアニーリングする。アニーリングに続いて、それらプライマーをポリメラーゼで伸長させて新たな対の相補鎖を形成する。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長のこれら工程を多数回繰り返して（即ち、変性、アニーリング及び伸長が１“サイクル”を構成し、多数の“サイクル”を行うことができる）所望の標的配列の高濃度の増幅されたセグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、互いのプライマーの相対位置によって決まるので、この長さは制御可能なパラメーターである。この方法の繰り返し側面によって、この方法はその発明者達によって“ポリメラーゼ連鎖反応”と言われるのである。標的配列の所望の増幅されたセグメントがその混合物中で（濃度の点で）優勢な配列になるので、それらは“ＰＣＲ増幅された”と言われる。
ＰＣＲで、ゲノミックＤＮＡ中の特定の標的配列の１コピーを幾つかの異なる方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチニル化プライマー取り込み後のアビジン酵素結合検出；増幅されたセグメント内への32Ｐ標識三リン酸デオキシヌクレオチド、例えばｄＣＴＰ又はｄＡＴＰの取り込み）により検出可能なレベルにまで増幅することが可能である。ゲノミックＤＮＡに加えて、あらゆるオリゴヌクレオチド配列を適切な組のプライマー分子で増幅することができる。
ＰＣＲ増幅方法は、特定の標的配列の約１０-8Ｍのプラトー濃度に達することが知られている。典型的な反応容量は６×１０11二本鎖産物分子の収量に相当する１００μｌである。
ＰＣＲはポリヌクレオチド増幅手順である。認められる増幅要因は、行ったＰＣＲのサイクル数（ｎ）及び、各サイクル中のプライミング及び伸長効率の関数である、各サイクルにおける複製の効率（Ｅ）に関係する。増幅は、高濃度のＰＣＲ産物ができるまでは式Ｅnに従うものと観察されてきた。これら高濃度（約１０-8Ｍ／ｌ）では、複製の効率が驚くほど悪くなる。これは、おそらく、ＰＣＲ産物の長い相補鎖による短いオリゴヌクレオチドプライマーの置き換わりによるものであろう。１０-8Ｍを超過する濃度では、プライミング反応中に互いを見つけ合う２本の相補性ＰＣＲ増幅産物鎖の速度が十分に速くなり、これがＰＣＲ操作の伸長工程の前か又はそれと並行して起こる。これが遂にはプライミング効率の低下を招き、従って、サイクル効率の低下を招くのである。ＰＣＲのサイクルを続けると、ＰＣＲ産物分子の増加は衰えてゆく。ＰＣＲ産物は最後にはプラトー濃度に達する。
この実験の節で用いるポリヌクレオチドプライマーの配列は次の通りである。
0004047374.tif 000011
共通のフォワードプライマーとしてのＤＣＤ０３で、これら対は長さ１２７、３２７及び１０７２ｂｐのアンプリコン（amplicon）を生じる。これらオリゴは、５種の異なるｄＨＢＶ単離物（ＤＨＢＶ１、ＤＨＢＶ３、ＤＨＢＶ１６、ＤＨＢＶ２２、及びＤＨＢＶ２６）間に完全に保存された領域並びにサギＨＢＶ（ＨＨＢＶ４）から選ばれた。
以下の実施例は、本発明の一定の好ましい態様及び側面を説明するのに資するものであって、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１
上述のように、本発明は、光反応性核酸結合性化合物の光活性化のための装置及び方法を意図している。この実施例では、光活性化装置は、本発明の方法に従う血液製剤の除染について説明されている。この装置は次の手段を含む：ａ）適切な波長の電磁線を供給して少なくとも１種の光反応性化合物の光活性化を起こす手段；ｂ）光活性化の間、該電磁線供給手段との固定された関係において複数の血液製剤を支持するための手段；及びｃ）光活性化の間、該血液製剤の温度を望ましい温度範囲内に維持するための手段。
図６は、上で挙げた特徴を取り込んだ装置の１態様の透視図である。この図は、その一部が取り除かれた不透明ハウジング（100）を示しており、それは一定の波長の光だけを通すプレート集成体（103，104）の間に配置された複数の表象的な血液製剤含有手段（102）の上方及び下方に一列の電球（101）を含有している。これらプレート集成体（103，104）は後でより詳しく説明する。
電源（示していない）に連結可能であるこの電球（101）は、電磁線の線源として役立つ。特定の電球の型に限定されないが、この態様では工業標準規格に応じてデュアル・ビピン・ランプ（dual bipin lamp）が配置されている。
ハウジング（100）はラッチ（105）により開けることができるので、血液製剤を正しく配置することができる。図６に示すように、このハウジング（100）は、閉めると電球（101）からの照射を完全に包む。照射の間、ユーザーは、安全覗き窓（106）から見ることにより装置が作動していること確認することができる。この覗き窓は、ユーザーに向けて紫外光透過しない。
このハウジング（100）は、例えば、メインスイッチ、カウントダウンタイマー、及び時間メーターを含む、制御盤（107）上の幾つかの電子部品の取付台としても役立つ。便宜上、メインスイッチはカウントダウンタイマーに電線で繋がっており、そのカウントダウンタイマーは、時間メーターと電磁線の線源に並列に電線で繋がっている。カウントダウンタイマーで、ユーザーは所望のレベルの露光に照射時間をプリセットすることができる。時間メーターは、電磁線の線源により供給される総照射時間の記録を保持する。この特徴で、電球（101）を監視すること及びそれらの出力が速やかな光活性化に必要な最低レベル以下に低下する前にそれらを取り替えることが可能になる。
図７は、図６に示した装置を線分２−２に沿って切断した断面図である。図７は、ハウジング（100）を開けたときの電球（101）の配置を示している。レフレクター（108A，108B）は、各列の電球（101）を完全に取り囲んでいる。血液製剤含有手段（102）は、上方（103）及び下方（104）プレート集成体（例えば、BK-7ガラス，ペンシルバニア州DuryeaのShott Glass Technologies,Inc.）の間に配置されている。各プレート集成体は、上方（103A，104A）及び下方（103B，104B）プレートから構成される。プレート集成体（103，104）は、血液製剤含有手段（102）により作られる空間を供給するように設計されたヒンジ（109）でつながっている。上方プレート集成体（103）は、下方プレート集成体（104）の下方プレート（10B4）により支持された血液製剤含有手段（102）の上部のちょうど上に止りをもたらす。
デテクター（110A，110B，110C，110D）は、都合よくは、プレート集成体（103，104）のプレート（103A，103B，104A，104B）の間に配置することができる。それらを制御盤（107）に電線で繋がっているプリント回路板（111）に電線で繋ぐことができる。
図８は、図６に示した装置を線分３−３に沿って切断した断面図である。６の血液製剤含有手段（102）（例えば、TeflonTM血小板ユニットバッグ）が固定された関係において一列の電球（101）の上方に配置されている。血液製剤の温度は、ファン（112）単独で又は、より好ましくは冷却源（示していない）に連絡した冷却入口（114）及び出口（115）を有する熱交換器（113）を用いることによって制御することができる。
図９は、図６に示した装置を線分４−４に沿って切断した断面図である。図９は、この装置の好ましい態様の温度制御アプローチをよりはっきりと示している。上方プレート集成体プレート（103A，103B）及び下方プレート集成体プレート（104A，104B）各々が、それぞれ温度制御チャンバー（103C，104C）を作っている。ファン（112）は、チャンバー（103C，104C）内及びチャンバー間に空気を循環させることができる。熱交換器（113）を用いると、その循環空気が冷やされてプレート（103A，103B，104A，104B）の間を通過する。
実施例２
４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンの合成
この実施例では、４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンの３工程合成を記載する。この合成はブロモメチル化工程なしで行われ、このことで既知の合成方法よりも安全なものとなっている。
工程１：３−クロロ−２−ブタノン（２９．２ｍＬ，０．２８９mol）を、アセトン（５００ｍＬ）中の７−ヒドロキシ−４，８−ジメチルクマリン（５０．００ｇ，０．２６３mol）及び粉末化Ｋ2ＣＯ3（５４ｇ，０．３９１mol）の機械攪拌懸濁液に添加した。そのスラリーを１５時間還流した後、溶媒を飛ばした。塩を除くために、この固体を１．２Ｌの水中で攪拌し、濾過し、そして母液のｐＨが中性（ｐＨ５〜７）になるまで水で洗浄した。その褐色濾液を沸騰メタノール（１５０ｍＬ）中に溶かし、室温まで冷やしすと粘稠なペーストが生成したので氷冷メタノールで洗浄して殆どの褐色不純物を除去し、４，８−ジメチル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシクマリン（６７．７ｇ，９９．０％収率）をくすんだ白色固体として得た。融点９５〜９６℃。ＮＭＲ：ｄ 1.57（d,J=6.7Hz,3H），2.19（s,3H），2.39（s,6H），4.73（q,J=6.9Hz,1H），6.17（s,1H），6.63（d,J=8.8Hz,1H），7.38（d,J=8.9Hz,1H）。
工程２：４，８−ジメチル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシクマリン（６７．５ｇ，０．２６０mol）、１０％ＮａＯＨ水溶液（１１４ｍＬ，０．２８６mol）及び水（９００ｍＬ）の懸濁液を７０〜８５℃で２〜４時間加熱した。次いで、この混合液を室温まで冷やした。固体を濾過してから母液が無色となりｐＨが中性（ｐＨ５〜７）になるまで冷やした水（１．５Ｌ）で洗浄した。生成物を風乾及び減圧乾燥して、４，４’，５’，８−テトラメチルプソラレン（５６．３ｇ，８９．５％）を白色固体として得た。ｍｐ１９７〜１９９℃。ＮＭＲ：ｄ 2.19（s,3H），2.42（s,3H），2.51（s,3H），2.56（s,3H），6.23（s,1H），7.40（s,1H）。
工程３：乾燥４，４’，５’，８−テトラメチルプソラレン（１０．００ｇ，４１．３mmol）を室温で塩化メチレン（１８０ｍＬ）中に溶かした。Ｎ−ブロモスクシンイミド（８．０９ｇ，４５．３mmol）を添加し、その反応混合液を４．５時間攪拌した。溶媒を完全に除いて得られた固体を水（２００ｍＬ）と共に０．５〜１時間攪拌し、濾過し、そして追加の水（約５００ｍＬ）で低温で磨り潰してスクシンイミド副生成物を除いた。この粗生成物（即ち、４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン）をＰ2Ｏ5が入った真空デシケーター内で乾燥してから最少量の沸騰トルエン（２００〜３００ｍＬ）で再結晶して、淡黄色固体の４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（１０．２ｇ）を得た。その母液の溶媒を飛ばして再びトルエン（６０ｍＬ）で再結晶して、第２晶を得た（１．０８ｇ，合わせた収率＝８５．１％，＞９９％純度（ＮＭＲによる））。ｍｐ２０６〜２０７℃。ＮＭＲ：ｄ 2.50（s,3H），2.54（d,J=1.2Hz,3H），2.58（s,3H），4.63（s,2H），6.28（見掛けq,J=1.3Hz,1H），7.59（s,1H）。
実施例３
５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレンの合成
この実施例では、５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレンの３工程合成を記載する。実施例２に記載した合成のように、この方法はブロモメチル化を要さないので、従来の既知の合成スキームを改良したものである。
４，４’，５’，８−テトラメチルプソラレン（２．３３ｇ，９．５９mmol）（合成は実施例２の工程１及び２に記載した）を四塩化炭素（１００ｍＬ）中で溶けるまで還流した。次いで、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１．８８ｇ，１０．５mmol）及び過酸化ベンゾイル（８０ｍｇ）を添加してこの混合液を１５時間還流した。室温まで冷えたら、塩化メチレン（１００ｍＬ）を添加して固体を溶かし、その溶液を水（４×１５０ｍＬ）次いで食塩水で洗浄し、そして無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒を飛ばし、５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン、４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン、及び４’，５’−ビス（ブロモメチル）−４，８−ジメチルプソラレンの混合物（３．０ｇ，粗生成物）を1Ｈ ＮＭＲにより測定してそれぞれ５５／２５／２０の比率で得た。５’−ブロモメチル化合物の1Ｈ ＮＭＲ：ｄ 2.29（s,3H），2.52（d,J=1.2Hz,3H），2.60（s,3H），4.64（s,2H），6.27（見掛けd,J=1.2Hz,1H），7.51（s,1H）。４’，５’−ビス（ブロモメチル）化合物の1Ｈ ＮＭＲ：ｄ 2.54（d,J=1.1Hz,3H），2.60（s,3H），4.65（s,4H），6.30（見掛けq,J=1.1Hz,1H），7.67（s,1H）。
実施例４
４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩（化合物２）および関連化合物（化合物４）の合成
この実施例において、化合物２の二つの合成方法が記載される。第一の方法を以下のようにして行った。
工程１：  ４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（3.09g、9.61mmol）、（合成が実施例２に記載されている）、およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド（4.05g、21.2mmol）を乾燥ジメチルホルムアミド（65mL）中で攪拌した。乾燥Ｎ2ガスを反応混合物に穏やかに吹き込んだ。その反応混合物を4.5時間にわたって100℃に加熱し、次に室温に冷却し、そして数時間にわたって冷凍庫に入れた。結晶性生成物を濾過し、そしてMeOH、続いてH2Oで洗浄した。固体をMeOH（100mL）で更にすり砕いて不純物を除去した。粗生成物を空気乾燥させ、そしてCHCl3（150mL）に溶解した。活性炭およびシリカゲルを添加して脱色し、そしてCHCl3を完全に除去した。得られる白色の生成物、４’−［４−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（1.56g、収率37.5％）はNMRおよびHPLCの両方により純度99％以上であった。mp224-225℃ NMR（CDCl3）δ2.37（s,3H）；2.47（s,3H）；2.48（s,3H）；3.78（s,4H）；4.59（s,2H）；6.22（s,1H）；7.42（s,1H）；7.50（m,4H）
工程２：  ４’−［４−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（1.56g、3.61mmol）を室温でテトラヒドロフラン（75mL）中で懸濁させた。メチルアミン（40％の水溶液、25mL、290mmol）を懸濁液に添加し、そして一夜攪拌した。溶媒およびメチルアミンを完全に除去した。得られる固体を0.3NのHCl水溶液（25mL）に入れた。その酸懸濁液を40mLのCHCl3で３回すすぎ、次に20％のNaOH水溶液でpH11にした。CHCl3（3x60mL）を使用して生成物（即ち、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン）を塩基性にした層から抽出した。合わせたCHCl3層をH2O（100mL）、続いて食塩水（100mL）で洗浄し、次に無水Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮して４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン、mp139-141℃を得た。純度はNMRにより99％より大きかった。NMR（CDCl3）δ2.50（s,6H）；2.58（s,3H）；2.90（t,J=5.27Hz,2H）；3.53（t,J=5.17Hz,2H）；4.66（s,2H）；6.25（s,1H）；7.61（s,1H）  ４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンを無水エタノール（150mL）に溶解し、エーテル（10mL）中のHClの1.0Mの溶液を添加し、そしてその懸濁液を冷凍庫中で一夜冷却した。濾過し、エーテルで洗浄した後、固体を真空乾燥させて淡黄色の結晶（0.76g、収率62％）、mp235-236℃を得た。
また、メチルアミンではなくヒドラジンまたはブチルアミンを使用して、工程２を行い得る。ブチルアミンを使用する方法は大規模な合成に好ましい。何となれば、過剰のメチルアミンが気化のために必要とされるが、それはブチルアミンに当てはまらないからである。ブチルアミンを使用する方法を以下のようにして行った。フタルイミド28.3gをプロパノール中でｎ−ブチルアミンで脱保護した。次にその粗反応溶液をHClで処理して生成物を沈殿させた。こうして、１−プロパノール285mL中の反応混合物をHClガスで処理してpH２にした。その混合物を５℃で0.5時間攪拌し、次に濾過し、冷溶媒（3x15mL）で洗浄して粗４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン20.5g（収率92％）を得た。
ヒドラジンを使用する方法を以下のようにして行った。フタルイミド前駆体（６モル）をヒドラジンで脱保護し、濃縮そして酸−塩基抽出後に、粗アミンを二塩化エチレン30L中で得た。これにHClガス（0.14Kg）を、温度を15〜25℃に保って40分間にわたって分散管により添加した。得られたスラリーを更に１時間攪拌した。固体をブフナーロートで回収した。空気乾燥機中で80℃で２時間乾燥させた後、粗４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン0.945Kgを得た。イソプロパノール7.5Kgと水1.88Kgとの混合物中の生成物0.94Kgを30分間還流させ、次に熱時濾過した。その溶液を１時間にわたって室温に冷却し、次に0.5時間15〜20℃に冷却した。固体をブフナーロートで回収し、次に冷却イソプロパノール（0.3L）で洗浄した。湿った固体をガラストレーに移し、そして約75℃で11.5時間真空下（>28分）に乾燥させた。水分含量は0.5％であった。収量は0.758Kg（収率81％）であった。４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンは分析上純粋であった。残留イソプロパノールはNMRにより約1700ppmであった。
第一の方法は、その高収率および高純度のために本発明の好ましい実施態様である。
第二の方法は、上記のように市販の４，５’，８−トリメチルプソラレンからの４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンの調製で開始する。４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩の合成は４工程で行われる。
工程１：  ４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（550mg、1.99mmol）およびエチレングリコール（6.8mL、121.9mmol）をアセトン（6mL）中で3.5時間50〜60℃に加熱した。２時間加熱した後、白色の懸濁液は透明な淡黄色の溶液に変化した。アセトンおよびエチレングリコールをロートエバポレーターで除去し、水（50mL）を残渣に添加した。得られた懸濁液を濾過し、冷水で洗浄し、次に真空オーブン中で乾燥させて４’−（４−ヒドロキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン574mg（96％）を得た。NMR（CDCl3）δ2.51（s,6H）；2.58（s,3H）；3.62（t,J=4.5Hz,2H）；3.78（t,J=4.9Hz,2H）；4.70（s,2H）；6.26（d,J=1.1Hz,1H）；7.61（s,1H）
工程２：  ４’−（４−ヒドロキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（574mg、1.9mmol）をN2雰囲気下で10℃以下でCH2Cl2（6mL）に溶解した。トリエチルアミン（359mg、3.55mmol）を添加した。メタンスルホニルクロリド（305mg、266mmol）を、温度を10℃未満に保って徐々に滴下した。添加を完結した後、その混合物を更に15分間攪拌し、次にそれを室温で10時間攪拌した。その反応した懸濁液に、CH2Cl2（45mL）を添加し、その混合物を水（3x20mL）で洗浄し、次に無水Na2SO4で乾燥させた。30℃以下で濃縮し、続いて真空乾燥させて４’−［（４−メタンスルホニルオキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレンを黄色の固体（706mg、98％）、mp138-140℃として得た。ＮＭＲ δ2.51（s,3H）；2.52（d,3H）；2.58（s,3H）；2.99（s,3H）；3.77（m,2H）；4.39（m,2H）；4.71（s,2H）；6.26（s,1H）；7.62（s,1H）
工程３：  ４’−［（４−メタンスルホニルオキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（706mg、1.86mmol）およびアジ化ナトリウム（241mg、3.71mmol）を、95％のエチルアルコール（5mL）中で８時間還流させた。その反応溶液を冷却し、冷水（55mL）を添加した。灰白色の固体を濾過し、冷水で洗浄した。真空乾燥させた後、アジド（即ち、４’−（４−アジド−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン）を淡黄色の固体（575mg、95％）、mp105-106℃として得た。NMR：δ2.51（s,6H）；2.58（s,3H）；3.41（t,J=4.9Hz,2H）；3.67（見掛けt,J=4.9Hz,2H）；4.70（s,2H）；6.26（s,1H）；7.66（s,1H）
工程４：  ４’−（４−アジド−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（1.65g、5.03mmol）をテトラヒドロフラン（10mL）に溶解した。トリフェニルホスフィン（1.59g、6.08mmol）および６滴の水を上記の溶液に添加した。室温で一夜攪拌した後、淡黄色の溶液を濃縮した。残渣をCHCl3（90mL）に溶解し、0.3NのHCl水溶液（30mL、次に2x5mL）で抽出した。合わせたHCl層を飽和するまで慎重にK2CO3で処理した。その塩基溶液をCHCl3（3x60mL）で抽出した。合わせたCHCl3層を水60mLで洗浄し、食塩水60mLで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。濃縮し、そのアミンを真空乾燥させた後、黄色の固体（1.25g、82％）として得た。mp139-141℃;NMR δ2.48（s,6H）；2.55（s,3H）；2.89（t,J=6Hz,2H）；3.52（t,J=6Hz,2H）；4.64（s,2H）；6.22（s,1H）；7.59（s,1H）
そのアミンを無水エタノール（40mL）に添加し、そしてエチルエーテル中の1NのHCl 20mLを添加した。５℃で一夜放置した後、沈殿を濾過し、エーテルですすいで化合物２、mp236℃（分解）1.25gを得た。13C NMR：8.54，12.39，19.18，38.75，62.26，65.80，108.01，112.04，112.42，112.97，116.12，125.01，148.76，153.97，154.37，155.76，160.34
分析C17H20ClNO4としての計算値：C,60.45;H,5.97;N,4.15実測値C,60.27;H,5.88;N,4.10
工程１と同等に４’−CMTを１，３−プロパンジオールと反応させ、工程４まで同様に進めて、４’−（５−アミノ−２−オキサ）ペンチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（化合物４）、mp212-214℃（分解）を同様に調製した。遊離塩基のNMR：δ1.73（pent,J=6.4Hz,2H），2.45（s,6H），2.51（s,3H），2.78（t,J=6.2Hz,2H），3.54（t,J=6.2Hz,2H），4.59（s,2H），6.18（s,1H），7.54（s,1H）
実施例５
５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（化合物18）の合成
この実施例は化合物18の合成を記載する。アセトニトリル（130mL）中のＮ−メチルホルムアニリド（16.0mL、0.134モル）の攪拌溶液に、オキシ塩化リン（12.5mL、0.134モル）を添加し、次に４，４’，８−トリメチルプソラレン（5.0g、21.9mmol）（Mc Leodら，Tetrahedron Letters No.3:237（1972）に記載されている）を添加した。その温度を氷／水槽を使用してプソラレンの添加中０〜10℃に保った。そのスラリーをドリエライト（drierite）乾燥管で水分から保護して50℃で２日間攪拌した。その反応混合物を室温に冷却し、次に氷／水浴中で冷却した。アセトニトリルをデカントして除き、次に氷／水（150mL）をオレンジ色のスラリーに添加し、１時間攪拌した。オレンジ色の固体を濾別し、冷水ですすぎ、次に冷アセトニトリルですすいだ。粗生成物を再結晶化し、ジクロロエタン（600mL）中で活性炭で脱色して４，４’，８−トリメチル−５’−プソラレンカルボキシアルデヒド（3.59g、64.0％）を、淡黄色−オレンジ色の固体、昇華温度250℃以上、分解温度300℃より高温のものとして得た。1H NMR（CDCl3）：2.54（d,J=1Hz,3H），2.64（s,3H），2.68（s,3H），6.32（見掛けd,J=1Hz,1H），7.75（s,1H），10.07（s,1H）
４，４’，８−トリメチル−５−プソラレンカルボキシアルデヒド（7.50g、29.3mmol）を200プルーフEtOH（250mL）中で攪拌した。ホウ水素化ナトリウムを添加し、そのスラリーを一夜攪拌した。氷水（150mL）および10％のNaCO3水溶液（50mL）を添加してその反応を停止した。45分間攪拌した後、沈殿を濾別し、濾液が中性（pH5-7）になるまで水でそそいだ。生成物を真空デシケーター中でP2O5で乾燥させて５’−ヒドロキシメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（7.46g、98.5％）を淡黄色の固体、mp244-245℃として得た。1H NMR（CDCl3）：1.97（t,J=6Hz,1H），2.31（s,3H），2.51（d,J=1Hz,3H），2.58（s,3H），4.79（d,J=6Hz,2H），6.25（見掛けd,J=1Hz,1H），7.49（s,1H）
ジクロロエタン（500mL）中の５’−ヒドロキシメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（15.42g、59.7mmol）の攪拌した氷／水冷却スラリーに、三臭化リン（6.17mL、65.7mmol）を滴下して添加した。その反応を水分から保護し、室温で一夜攪拌した。その混合物を氷／水300mLで１時間攪拌した。その固体を濾別し、乾燥させ、熱トルエンに溶解し、ひだ付き濾紙で濾過し、そしてストリッピングして５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（3.43g）を得た。反応溶媒（ジクロロエタンおよび水）を分離し、水層をジクロロエタンで３回抽出した。有機層を合わせ、食塩水ですすぎ、乾燥させ（無水Na2SO4）、そして真空下でストリッピングして生成物、正味の５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（13.13g、合わせた収率86.4％）を淡黄色の固体、mp201-202℃として得た。
1H NMR（CDCl3）：2.29（s,3H），2.52（d,J=1Hz,3H），2.60（s,2H），4.64（s,2H），6.27（見掛けd,J=1Hz,1H），7.51（s,1H）
N2をその溶液に吹き込みながら、Ｎ−ヒドロキシエチルフタルイミド（3.00g、15.5mmol）をDMF（5mL）に60-64℃で溶解した。ヨウ化ナトリウム（0.01g、0.067mmol）および５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（1.00g、3.11mmol）を添加し、そのスラリーをこれらの条件下で一夜攪拌した。その濃厚な黄色の反応混合物を室温に冷却し、氷／水槽中で冷却し、濾過し、氷冷MeOHですすいで粗生成物（1g）を得た。固体をジクロロエタン（100mL）中で再結晶化して４，４’，８−トリメチル−５’−［２−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチルプソラレン（0.68g、50.8％）を、灰白色の固体、mp225-228℃として得た。1H NMR（CDCl3）：2.26（s,3H），2.46（s,3H），2.51（d,J=1Hz,3H），3.87（m,4H），4.64（s,2H），6.26（見掛けd,J=1Hz,1H），7.42（s,1H），7.64（多重線，4H）
４，４’，８−トリメチル−５’−［４’−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチルプソラレン（1.61g、3.73mmol）をTHF（40mL）および40重量％のメチルアミン水溶液（20mL、257mmol）と共に一夜攪拌した。溶媒をストリッピングし、そして残渣を希HCl水溶液とジクロロメタンとの間に分配した。水層をジクロロメタンでもう数回すすぎ、次にK2CO3で塩基性にした。塩基層をジクロロメタンで３回抽出した。その塩基からの合わせた有機抽出物を食塩水で振とうし、次に乾燥させ（無水Na2SO4）、そしてストリッピングして５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（0.71g、63.4％）、mp126-129℃を得た。1H NMR（CDCl3）：2.30（s,3H），2.51（s,3H），2.58（s,3H），2.91（t,J=5Hz,2H），3.59（t,J=5Hz,2H），4.64 s,2H），6.25（s,1H），7.50（s,1H）
上記のアミン（0.71g、2.36mmol）を熱エタノールに溶解し、ジエチルエーテル中の1MのHCl（3mL、3mmol）で酸に変換し、活性炭で脱色し、冷却し、回収した。その固体を再度活性炭で脱色し、ストリッピングして５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩（0.39g、49.3％の収率）を白色の固体、mp235-236℃として得た。（注：この物質のその他の調製はかなり低い融点を有するが、同じNMRスペクトルを有する生成物を生じた）。1H NMR（d6-DMSO）：2.32（s,3H），2.45（s,3H），2.50（s,3H），3.00（m,2H），3.71（t,J=5Hz,2H），4.71（s,2H），6.33（s,1H），7.79（s,1H），8.15（br）13C NMR（d6-DMSO）：7.93，8.57，19.01，38.74，62.66，66.28，108.22，112.42，113.69，115.34，116.06，125.60，149.38，150.95，154.26（暫定的に２個の炭素），160.26
実施例６
４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩（化合物７）の合成
この実施例において、化合物７の合成が記載される。４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩の合成は４つの工程で進行する。
工程１：  ４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（589mg、2.13mmol）、ジエチレングリコール（15.4g、145mmol）およびアセトン（13mL）を11.5時間還流させた。その反応溶液を濃縮してアセトンおよびジエチレングリコールの一部を除去した。得られた淡褐色の溶液に、CHCl3（40mL）を添加し、次に水で数回洗浄した。CHCl3層を無水Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮して４’−（７−ヒドロキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン781mg（約100％）を得た。NMR δ2.46（d,3H），2.47（s,3H），2.51（s,3H），3.58-3.67（m,8H），4.67（s,2H），6.18（s,1H），7.57（s,1H）
工程２：  ４’−（７−ヒドロキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（781mg、2.25mmol）をN2流のもとに10℃未満でCH2Cl2（2.5mL）に溶解した。トリエチルアミン（363mg、3.59mmol）を添加した。メタンスルホニルクロリド（362mg、3.16mmol）を徐々に滴下して温度を10℃未満に保った。添加を完結した後、その混合物を更に15分間、10℃未満に保った。その混合物を室温で一夜攪拌し、次にCH2Cl2（50mL）を添加した。その溶液を水（3x60mL）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、そして30℃以下で濃縮した。真空乾燥後、淡褐色のシロップ［４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン］437mg（76％）を得た。NMR δ250（s,3H）2.51（s,3H），258（s,3H），3.01（s,3H），3.66（m,4H），3.77（t,J=4.6Hz,2H），4.37（t,J=6Hz,2H），4.69（s,2H），6.25（s,1H），7.61（s,1H）
工程３：  ４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（288mg、0.678mmol）およびアジ化ナトリウム（88.2mg、1.36mmol）を95％のエチルアルコール３mL中で８時間還流させた。その反応溶液を冷却し、冷水（50mL）を添加した。水層を流し去った。粗物質をChromatotron（Harrison Research社、Palo Alto、CA）によるクロマトグラフィー（クロロホルム溶離液を用いるシリカゲル）により精製し、そして真空乾燥させて淡黄色のシロップ、４’−（７−アジド−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（123mg、49％）を得た。NMR δ2.50（s,6H），2.57（s,3H），3.39（t,J=5.2Hz,2H），3.68（m,6H），4.70（s,2H），6.24（s,1H），7.62（s,1H）
工程４：  ４’−（７−アジド−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（122mg、0.33mmol）、トリフェニルホスフィン（129mg、0.49mmol）および数滴の水をテトラヒドロフラン（2mL）に溶解した。淡黄色の透明な溶液を終末にわたって室温で攪拌した。出発物質はTLCにより検出されなかった。その反応溶液を濃縮し、そして残渣をCHCl3（20mL）に溶解した。その溶液を0.15NのHCl水溶液（10mL、次に2x5mL）で抽出し、HCl層を20％のNaOH水溶液の添加によりpH13にした。塩基性溶液をCHCl3（3x15mL）で抽出した。合わせたCHCl3層を水洗し、無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮し、そして真空乾燥させて生成物、４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン63.9mg（56％）を得た。TLCは一つのスポットのみを示した。NMR δ2.50（s,3H）；2.50（s,3H）；2.57（s,3H）；2.86（t,J=5.3Hz,2H）；3.50（t,J=5.3Hz,2H）；3.63（s,4H）；4.70（s,2H）；6.24（s,1H）；7.62（s,1H）m.p.170-173℃  その固体を無水エタノールに溶解し、次にエチルエーテル中1MのHClを添加し、その懸濁液を濾過し、そして生成物をエーテルですすぎ、乾燥させた。
実施例７
４’−（12−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物８）の合成
４’−（12−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩の合成は実施例５、方法２、工程２の生成物から一つの工程で進行する。アセトニトリル８mL中の４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（108mg、0.253mmol）の溶液をアセトニトリル2.8mL中の１，４−ジアミノブタン（132mg、1.49mmol）の溶液に徐々に添加した。８時間還流させた後、出発物質はTLCにより残っていなかった。その反応溶液を室温に冷却し、CHCl3（25mL）および1NのNaOH（25mL）溶液を添加した。層を分離し、CHCl3（2x10mL）を使用して水層を洗浄した。HCl水溶液（0.3N、3x10mL）を使用して合わせた有機層から生成物を抽出した。HCl層をpH13まで20％のNaOH水溶液で処理した。次に、合わせた塩基性層をCHCl3（3x20mL）で抽出した。CHCl3層を飽和NaCl水溶液（10mL）で洗浄し、次に無水Na2SO4で乾燥させた。濃縮及び真空乾燥後に、生成物、４’−（12−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩63mg（60％）を得た。NMR δ1.45（m,2H），2.49（s,6H），2.55（s,3H），2.58（t,2H），2.66（t,J=5.6Hz,2H），2.76（m,4H），3.55-3.61（m,6H），4.68（s,2H），6.22（s,1H），7.61（s,1H）
実施例８
４’−（２−アミノエチル）−４，５’，８−トリメチルプソラレン塩酸塩（化合物３）の合成
４’−（２−アミノエチル）−４，５’，８−トリメチルプソラレンの合成は一つの工程で進行する。THF ２mL中のトリフルオロ酢酸（296mg、2.60mmol）をTHF ２mL中のホウ水素化ナトリウム（175mg、4.63mmol）の攪拌懸濁液に室温で10分間の期間にわたって添加することによりトリフルオロアセトキシホウ水素化ナトリウムをつくった。得られた懸濁液をTHF ２mL中の４’−シアノメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（Kaufmanら，J.Heterocyclic Chem.19:1051（1982））（188mg、0.703mmol）の懸濁液に添加した。その混合物を室温で一夜攪拌した。水数滴を反応した淡黄色の透明溶液に添加して過剰の試薬を10℃未満で分解した。得られた混合物を濃縮し、そして1NのNaOH水溶液（30mL）を添加した。クロロホルム（30mL、次に10mL、5mL）を使用して、得られたアミンを抽出した。合わせたCHCl3層を飽和NaCl溶液で洗浄した。次にそのアミンを0.3NのHCl水溶液（10、５、５mL）中に抽出し、酸層を20％のNaOH水溶液でpH13にした。CHCl3（3x10mL）を使用して合わせた塩基層からアミンを抽出し、次に水（2mL）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。濃縮及び真空乾燥後に、アミンをNMRにより95％より高い純度の固体として得た。
NMR δ2.45（s,3H）；2.47（s,3H）；2.53（s,3H）；2.78（t,J=6.6Hz,2H）；3.00（t,J=6.5Hz,2H）；6.20（s,1H）；7.44（s,1H）
その固体を無水エタノールに溶解した。ジエチルエーテル（1N、１mL）中の塩化水素の溶液を添加した。その懸濁液を濾過して化合物３、淡紫色の固体（32.7mg、収率15％）、m.p.>237℃（分解）を得た。
実施例９
４’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物６）
４’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩の合成は、以下のように一つの工程で進行する。アセトニトリル30mL中の４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（188mg、0.68mmol）の溶液をアセトニトリル７mL中の１，４−ジアミノブタン（120mg、1.4mmol）の溶液に添加した。一夜攪拌した後、その溶媒を減圧で除去した。クロロホルム（10mL）および1NのNaOH（10mL）を残渣に添加し、その混合物を振とうし、分離した。水溶液をCHCl3更に2x10mLで抽出し、合わせた抽出物を水ですすいだ。次に生成物を0.3NのHCl水溶液でCHCl3溶液から抽出し、次に酸性層を濃NaOH溶液でpH12にした。塩基溶液をCHCl3で抽出し、次にこれを水ですすぎ、Na2SO4で乾燥させ、そして減圧で濃縮してアミンを遊離塩基として得た。NMR（CDCl3）；δ1.33（m,3H），1.52（m,4H），2.47（s,3H），2.49（d,J=1.1Hz,3H），2.54（s,3H），2.68（q,J=6.5Hz,4H），3.86（s,2H），6.21（見掛けd,J=1.1Hz,1H），7.60（s,1H）
無水EtOH約６mLに溶解した遊離塩基をエーテル中のHClの溶液（1.0M、３mL）で処理した。得られたHCl塩を濾過し、無水EtOHですすぎ、真空下で乾燥させて化合物６  150mg（55%）、m.p.290℃（分解）を得た。分析C19H26Cl2N2O3・H2Oとしての計算値：C,54.42；H,6.73；N,6.68実測値：C,54.08；H,6.45；N,6.65
下記の化合物を同様に調製し、合成の相違を注記した。
a）４’−（４−アミノ−２−アザ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物１）、mp320-322℃（分解）この合成において、エチレンジアミンをジアミンとして使用した。
b）４’−（５−アミノ−２−アザ）ペンチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物５）、mp288℃（分解）遊離塩基のNMR：d 1.33（br s,3H），1.66（pent,J=6.8Hz,2H），2.47（s,3H），2.50（d,J=1Hz,3H），2.55（s,3H），2.6-2,85（m,4H），3.89（s,2H），6.22（見掛けd,J=1Hz,1H），7.62（s,1H）
この合成につき、１，３−ジアミノプロパンをジアミンとして使用した。
c）４’−（７−アミノ−２−アザ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物10）、mp300℃（分解）遊離塩基のNMR：d 1.22（br s），1.3-1.6（m）合計9H,2.44（s），2.50（s），合計9H，2.63（m,4H），6.17（s,1H），7.56（s,1H）ここでは、１，５−ジアミノペンタンをジアミンとして使用した。
実施例10
５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物17）
５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩の合成は、以下のようにして一つの工程で進行する。アセトニトリル30mL中の５’−クロロメチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン（190mg、0.68mmol）の懸濁液を、アセトニトリル７mL中の１，４−ジアミノブタン（120mg、1.4mmol）の溶液に添加した。室温で一夜攪拌した後、溶媒を減圧で除去した。クロロホルム（10mL）および1NのNaOH（10mL）を残渣に添加し、その混合物を振とうし、分離した。水層を更にクロロホルム2x10mLで抽出し、合わせた抽出物を水ですすいだ。次に生成物をクロロホルム溶液から0.3NのHCl水溶液で抽出し、次に酸性層を濃NaOH溶液でpHを約12にした。塩基懸濁液をCHCl3で抽出し、次にこれを水ですすぎ、Na2SO4で乾燥させ、減圧で濃縮した。
CHCl3：EtOH：Et3N（9:1:0.25）を用いて残渣をシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分を合わせ、溶媒をストリッピングして遊離アミンを得た。
NMR（CDCl3）：δ1.35（m,3H）；1.49（m,4H）；2.22（s,3H）；2.46（d,J=1.1Hz,3H）；2.51（S,3H）；2.65（m,4H）；3.88（s,2H）；6.1７（見掛けd,1Hz）；7.40（s,1H）
無水EtOH（約６mL）に溶解した遊離塩基をエーテル中のHCl溶液（1.0M、約３mL）で処理した。得られたHCl塩を濾過し、無水EtOHですすぎ、真空下で乾燥させて生成物、５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩、m.p.288℃（分解）100mg（36.3％）を得た。
エチレンジアミンをジアミンとして使用した以外は、５’−（４−アミノ−２−アザ）ブチル−４，４’，８−トリメチルプソラレン二塩酸塩（化合物16）を同じ方法で調製した。遊離塩基のNMR：δ1.83（br s,3H），2.27（s,3H），2.51（s,3H），2.58（s,3H），2.74（m,2H），2.87（m,2H），3.95（s,2H），6.24（s,1H），7.46（s,1H）
実施例11
４’−（14−アミノ−２，６，11−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン四塩酸塩（化合物15）
４’−（14−アミノ−２，６，11−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン四塩酸塩の合成は、以下のように一つの工程で進行する。メタノール10mL中のスペルミン（Aldrich,Milwaukee、WI）0.5g（2.5mmol）の溶液に、HClの5Nのメタノール性溶液（濃HClをMeOHで5Nに希釈）を添加してpH５−６に調節し、続いて４，５’，８−トリメチルプソラレン−４’カルボキシアルデヒド0.128g（0.5mmol）、NaBH3CN 20mg（0.3mmol）およびMeOH ３mLを添加した。その反応混合物を室温で一夜攪拌した。5Nのメタノール性HClの溶液をpH２未満まで添加し、メタノールを減圧で除去した。残渣を約100mLの水に吸収させ、CHCl325mLずつで３回すすいだ。水溶液を濃NaOHでpH>10にし、CHCl325mLずつで３回抽出した。これらの最終抽出物を合わせ、水洗し、乾燥させ（Na2SO4）、そして蒸発させてNMRにより95％以上の純度のアミンの遊離塩基を得た。
NMR（CDCl3）：d 1.31（m,5H），1.45（pent,J=3.41Hz,4H），1.65（m,4H），2.46（s,3H），2.49（d,J=1.14Hz,3H），2.66（m,15H），3.85（s,2H），6.21（s,1H）m7.60（s,1H）
遊離アミンを無水エタノールに溶解し、HCl（無水、エチルエーテル中1N）を添加した。塩酸塩を濾過し、無水エタノールで洗浄し、真空下で室温で乾燥させて生成物、４’−（14−アミノ−２，６，11−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルプソラレン四塩酸塩80.2mgを淡黄色の固体として得た。
実施例12
r-17バクテリオファージアッセイをこの実施例において使用して病原不活化効率を予測し、そして本発明の光反応性結合化合物の核酸結合を測定した。r-17アッセイにおいて、バクテリオファージをそれぞれの試験化合物と共に溶液に入れ、次に照射した。ファージがその後バクテリアを感染し、そしてそれらの増殖を抑制する能力を測定した。バクテリオファージを、その比較的利用可能な核酸につき選択し、培養増殖抑制が試験化合物により核酸損傷を正確に反映するようにした。試験化合物への核酸結合に関するバクテリオファージアッセイは、有効な病原不活化を示しそうな化合物を同定するための安全かつ安価な操作を提供する。先の実験は、r-17アッセイが同様の化合物に対するHIV-1感受性を正確に測定することを支持する。
r-17を約5x1011の力価のHfr3000バクテリア中で増殖させた。（r-17およびHfr3000は、Washington,D.C.にあるAmerican Tissue Culture Collection（ATCC）から入手した）。r-17ファージ株をダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中15％のウシ胎児血清の溶液に添加して109/mLの最終ファージ濃度を得た。アリコート（0.5mL）を、1.5mLのふたがパチンと閉まる（snap-top）ポリエチレンチューブに移した。水、エタノールまたはジメチルスルホキシドの0.80-8.0mM中で調製した試験化合物原液のアリコート（0.004-0.040mL）をチューブに添加した。化合物を４μM〜320μMの濃度で試験した。（AMTはConcord、CAにあるHRI社から市販されており8-MOPはSt.Louis、MOにあるSigmaから市販されている）。チューブを実施例１に記載された光装置に入れ、そして１〜10分間照射した。滅菌した13mLの希釈チューブを調製した。それぞれの試験化合物はルリア（Luria）ブロース（LB）0.4mLを含む一つのチューブおよびLBブロース0.5mLを含む５つのチューブを必要とした。希釈液をつくるために、ファージおよび試験化合物の照射溶液のアリコート0.100mLを培地0.4mLの第一希釈チューブに添加し、次にこの溶液0.020mLを培地0.5mL（1:25）の第二チューブに添加した。次に第二溶液を残りのチューブに連続希釈（1:25）した。それぞれの希釈試料に、一夜培養したHfr3000バクテリア0.050mLを添加し、溶融LBトップアガー３mLおよび混合物質をLBブロースプレートに注いだ。トップアガーが硬化した後、プレートを37℃で一夜インキュベートした。次にプラーク形成単位を翌朝カウントし、そして光処理後に残っているファージの力価を希釈係数に基いて計算した。
下記の対照を実験した。ファージが試験化合物で処理されず、かつ照射されなかった“ファージのみ”（下記の表中“出発力価”として掲載される）；ファージが試験化合物の不在下で照射された“UVのみ”；そしてファージ／試験化合物溶液が、希釈され、塗布される前に照射されなかった“暗所”対照。
下記の表５は、化合物１を前記R17プロトコルに従って試験した三つの異なる実験を示す。実験１〜３中の対照試料に関する値（太字の値）の比較は、“UVのみ”対照も“暗所”対照もバクテリア死滅を殆ど生じないことを示す（せいぜい、0.3logが“UVのみ”対照中で死滅し、0.1logが“暗所”対照中で死滅した）。
“UVのみ”対照を本発明のその他の化合物と共に多くの同様の実験で繰り返し、一貫して有意の死滅を示さなかった。（データは示されていない）。こうして、“UVのみ”対照は以下の表および図中に示されていないが、それをこの実施例において実験毎に行った。“暗所”対照につき、本発明の種々の化合物を用いる多くの試験後に、プソラレンの４’位の置換の型にもかかわらず、実験上有意なバクテリア不活化が暗所で観察されなかった。（データは示されていない）。例えば、表５中で、実験１は暗所中で化合物１により0.1logの死滅を示す。対照的に、化合物１が丁度１分間照射される場合、力価のこの得られる低下は>6.7logである。それ故、“暗所”対照をその後試験した化合物につき実験せず、また実験された場合には以下の表および図に示されない。
0004047374.tif 000012
下記の表６−９、および図11-13は本発明の４’−一級アミノ−置換プソラレン化合物の幾つかに関するR17アッセイの結果を示す。表７および８中のデータをそれぞれ図11および12に表す。４’−一級アミノ−置換プソラレン化合物と同様の５’位に置換基を有する本発明の５’−一級アミノ−置換プソラレン化合物を、この実施例において上記されたようにして種々の濃度でまた試験し、匹敵する不活化効率を示すことが示される。これらの化合物に関する結果を下記の図14および15に示す。
プソラレン環の４’位に置換基を有する本発明の化合物は、以下に示されるようにR17を死滅するのに活性であることが判明した。
0004047374.tif 000013
0004047374.tif 000014
0004047374.tif 000015
0004047374.tif 000016
表７において、本発明の化合物は8-MOPよりも極めて高いR17不活化効率を示すことが明らかである。表７および図11に示されるように、化合物１は本発明の活性の小さい化合物の一つである。化合物２および３の両方がそれぞれの濃度の点で化合物１より高いlog不活化を示す。これらの結果は、本発明の化合物が一般に8-MOPよりも極めて活性であることを支持する。
また、本発明の化合物はAMTと同様または良好なR17不活化効率を有する。表７および８並びに図11〜15中、本発明の全ての化合物はAMTに匹敵するレベルでR17log不活化を達成する。化合物２および３（表６、図11）、化合物５および６（表６、図12）、並びに化合物16（図15）はAMTよりもかなり高い不活化効率を示す。
また、本発明の化合物をUV線の種々の線量につき一定の濃度で試験した。DMEM中のR17のアリコート（上記のようにして調製した）0.6mLを含む1.5mLのチューブの３組を調製した。試験化合物を所望の濃度で添加し、試料を攪拌した。次に試料を、3.0J/cm2に達するまで1.0J/cm2の間隔で照射した。それぞれ1.0J/cm2の間隔で、100μLをそれぞれの試料から除去し、第一の対応する希釈チューブに入れ、次に５つの連続希釈を、この実施例において上記されたようにして、それぞれの試験化合物につき全て３つの照射線量で行った。
次にHfr3000バクテリア50μLをそれぞれのチューブに添加し、トップアガー３mLを添加し、そしてチューブ内容物を攪拌した。それぞれのチューブ内容物をそれ自体のLBプレートに注入し、そしてプレートを37℃で一夜インキュベートした。プラークを翌朝に目視検査によりカウントした。
幾つかの４’−一級アミノ−置換プソラレン化合物および５’−一級アミノ−置換プソラレン化合物の結果を図１６〜２０に示す。このデータは、本発明の化合物がR17を不活化するそれらの能力の点でAMTに匹敵することを更に支持する。更に、化合物６（図16）、10（図17）、12（図18）、15（図19）、並びに化合物17（図20）の全てがR17を不活化するのにAMTよりも活性であった。
実施例13
本発明の幾つかの化合物の病原不活化効率を、無細胞ウイルス（HIV）を不活化する化合物の能力を調べることにより評価した。無細胞HIVの不活化を以下のようにして行った。
R17アッセイのように、下記の表10および11に掲載された化合物の小アリコートを、表に示された濃度で、合計0.5mLまで株HIV-1に添加した。株HIV-1（105-107プラーク形成単位/mL）はDMEM/15％のFBS中にあった。試験アリコート0.5mLを24ウェルのポリスチレン組織培養プレートに入れ、実施例１の装置と同様の装置で１分間にわたって320-400nm（20mW/cm2）で照射した。ここで使用した光活性化装置は、前もって試験し、実施例１の装置に匹敵する露光を生じることがわかった。（データは示されていない）。対照は、HIV-1株のみ、HIV-1＋UVAのみ、およびUVAを行わない、HIV-1＋最高濃度の試験したそれぞれのプソラレンを含んだ。照射後、ミクロタイタプラークアッセイにより感染性について分析するまで、全ての試料を-70℃で凍結して貯蔵した。本発明の化合物で処理した試料中の残留HIV感染性を測定するためのアリコートを取り出し、培養した。
残留HIV感染性を、MT-2感染性アッセイを使用して分析した。（Hanson,C.V.,Crowford-Miksza,L.およびSheppard,H.W.,J.Clin.Micro 28:2030（1990）に、以前に記載されている）。アッセイ培地は１mL当たりストレプトマイシン100μg、100Uのペニシリン、ゲンタマイシン50μg、およびアンフォテリシンＢ１μg、１mL当たり15％のFBSおよびポリブレン（Sigma Chemical社、St-Louis、MO）２μgを含む85％のDMEM（高グルコース濃度）であった。不活化操作からの試験試料および対照試料を50％のアッセイ培地および50％の正常なヒト貯蔵血漿中で希釈した。試料を96ウェルプレート（Corning Glass Works, Corning、N.Y.）中で直接に連続希釈した。プレートを30秒間振動振盪器上で混合し、そして５％のCO2雰囲気中37℃で１〜18時間インキュベートした。MT-2細胞（0.025mL）［国立衛生研究所AIDS Research and Reference Reagent Program,Rockville,Mdから入手し得る、クローンα-4（カタログ番号237）］をそれぞれのウェルに添加して80,000細胞／ウェルの濃度を得た。５％のCO2中37℃で更に１時間のインキュベーション後に、1.6％のSea Plaqueアガロース（FMC Bioproducts,Rockland,Maine）を含み、38.5℃に予め温めたアッセイ培地0.075mLをそれぞれのウェルに添加した。プレートを、幾つかのプレートが蓄積するまで数分間にわたって37℃に保ち、次にプレートキャリヤー中で10℃に予め冷却した遠心分離機中で600xgで20分間遠心分離した。遠心分離により、細胞単層がアガロース層のゲル化の前に形成した。プレートを５％のCO2中で37℃で５日間インキュベートし、そしてそれぞれのウェルに、食塩加リン酸緩衝液（pH7.4）中50μg/mLのプロピジウムヨウ化物（Sigma Chemical社）0.05mLを添加することにより染色した。24〜48時間後に、赤色の蛍光染色ミクロプラークを、そのプレートを8,000μW/cm2304nmUV線ボックス（Fotodyne社、New Berlin,Wis）に置くことにより可視化した。プラークを立体顕微鏡によりx20〜x25の倍率でカウントした。結果を下記の表10および11に示す。“n”は、データ点が平均である実験の番号を表す。
結果は、本発明の化合物がHIVを不活化するのに有効であることを支持する。実際に、64μM以上の化合物の濃度に関するデータは、化合物２および３がAMT（これは従来最も活性な抗ウイルスプソラレンの一つであると考えられていた）よりかなり活性であることを示唆する。低濃度では、化合物６はAMT（32μMで2.5log）よりも高いlogのHIV（32μMで3.1log）を死滅させることができる。表９に掲載されたその他の化合物はAMTと同じ範囲の不活化効率を示す。
0004047374.tif 000017
0004047374.tif 000018
実施例14
この実施例は、本発明の化合物を使用して、Ｂ型肝炎ウイルスのモデルであるアヒルＢ型肝炎ウイルス（DHBV）の不活化に関するプロトコルを記載する。
アヒル卵黄中のDHBVを2x107粒子／mLの最終濃度まで血小板濃厚液（PC）に添加し、15分間以上穏やかに揺動することにより混合した。プソラレンS-70、S-59およびAMTを35、70及び100mMの濃度でTeflonTMミニバッグ中でPCの３mLのアリコートに添加した。プソラレンを添加しなかった対照を含む試料を、１J/cm2の増加量で混合して、5J/CM2のUVAで照射した。照射後、白血球および血小板を遠心分離によりウイルスから分離した。DHBVを含む上澄みを、0.5％のドデシル硫酸ナトリウム、20mMのトリス緩衝液（pH8.0）、および5mMのEDTAを含む緩衝液中の50μg/mLのプロテイナーゼＫを用いて55℃で一夜消化した。試料をフェノール−クロロホルム及びクロロホルムで抽出し、続いてエタノールで沈殿させた。次に精製DNAをそれぞれの試料からの106のDHBVゲノムの開始投入量でPCR増幅反応に使用した。プライマー対DCD03/DCD05（127bp）、DCD03/DCD06（327bp）およびDCD03/DCD07（1072bp）を使用して、PCRアンプリコンを生じた。100mlの反応当たり0.2mMのそれぞれのデオキシリボヌクレオシド5'-三リン酸（dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP）、0.5mMのそれぞれのプライマー、および0.5単位のTaqポリメラーゼを含む標準PCR緩衝液中でPCRを行った。30サイクルの増幅を下記の熱プロフィールで行った。95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で１分間。増幅に続いて72℃で７分間インキュベートして完全長生成物を得た。［λ-32P］dCTPを100ml当たり10mCiの量で添加して、得られる生成物を検出し定量化した。生成物を変性ポリアクリルアミドスラブゲルによる電気泳動により分離し、カウントした。所定の反応におけるシグナルの不在をDHBVの有効な不活化を示すものと解した。
結果は、小さいアンプリコンが試験した全てのプソラレンにつきプソラレン濃度の関数として次第に増大する不活化を示すことを示した。同じ濃度では、S-59およびS-70はAMTよりも良好に小さいアンプリコンのPCRを抑制した。1072bpのアンプリコンにつき、PCRの完全抑制がS-59およびS-70の全ての濃度で観察され、一方、プソラレンを含まない試料は強いシグナルを生じた。AMTは70及び100mMのレベルで1072bpのアンプリコンのPCR増幅を抑制したが、シグナルはAMTが35mMの最終濃度で使用された時は検出できなかった。
実施例15
実施例13において、本発明の化合物を、DMEM/15％FBS中でウイルスを不活化するそれらの能力につき試験した。この実施例では、化合物を100％の血漿および主として合成媒体の両方で試験して、本発明の方法が培地の特別な型に制限されないことを示す。
合成媒体中の試料につき、標準ヒト血小板の濃厚液を遠心分離して血漿を分離した。次に血漿の85％をとり出し、そして20mMの酢酸ナトリウム、２mMのグルコース、４mMのKCl、100mMのNaCl、10mMのクエン酸Na3、20mMのNaH2PO4/Na2HPO4、および２mMのMgCl2を含む合成媒体（“SterilyteTM3.0”と称する）と交換した。HIVで感染されたH9細胞を85％のSterilyteTM3.0血小板濃厚液または標準ヒト血小板濃厚液（濃厚液当たり2.5x107の細胞）、最終濃度5x105細胞/mLに添加した。血小板濃厚液をTeflonTM変性FL20またはTeflonTMミニバッグ（American Fluoreseal社、Silver Springs,MD）に入れ、示された濃度で、図２１に示された化合物の一つで処理し、次に実施例１の装置と同様の装置で５J/cm2（血漿試料につき）または２J/cm2（85％のSterilyteTM3.0試料につき）に関して320-420nm（20mW/cm2）で照射した。ここで使用した光活性化装置を先に試験して、実施例１の装置に匹敵する露光を生じることがわかった（データは示されていない）。本発明の化合物で処理された試料中の残留HIV感染性の測定用のアリコートを取り出し、培養した。
血漿中の試料実験につき、HIVで感染されたH9細胞を標準ヒト血小板濃厚液（濃厚液当たり2.5x107細胞）、最終濃度5x105細胞/mLに添加した。HIV汚染血小板濃縮液（５mL）のアリコートを水ジャケット付きパイレックス（Pyrex）チャンバーに入れた。チャンバーを前もってシリコンで内部に被覆した。血小板濃厚液を下記の表10および11に掲載した化合物の一つで、表に掲載された濃度で処理し、次に実施例１の装置と同様の装置で１分間で320-400nm（20mW/cm2）で照射した。ここで使用した光活性化装置を先に試験して、実施例１の装置に匹敵する露光を生じることがわかった（データは示されていない）。本発明の化合物で処理された試料中の残留HIV感染性の測定用のアリコートを取り出し、培養した。残留HIV感染性を、MT-2感染性アッセイを使用して血漿および85％のSterilyteTM3.0試料の両方につき分析した。（上記の実施例13に詳述され、またHanson,C.V.ら，J.Clin.Micro 28:2030（1990）に既に記載されている）。結果を図２１に示す。
結果は、本発明の化合物が血漿および合成媒体の両方中でHIVを不活化するのに有効であることを支持する。図18と19を比較して、不活化曲線は同じようであり、両方とも化合物の64μMの濃度で約５logの不活化を達成する。しかしながら、合成媒体中の不活化を、血漿中の同じ不活化を行うのに必要とされた量よりも３J/cm2少ない２J/cm2の照射のみにより行った。こうして、そのデータから、合成媒体は本発明の不活化方法を促進することが明らかである。
実施例16
この実施例において、本発明の光反応性核酸結合化合物によるバクテリア不活化を、その後のバクテリアの複製能の関数として測定した。グラム陰性バクテリアを、不活化するのに一層困難なバクテリア株の代表として選んだ。
バクテリア、シュードモナスの株を無菌ループによりLBに接種し、シェーカー中で37℃で一夜増殖させた。610nmにおける１ODが5x108コロニー形成単位（cfu）/mLであるという概算に基いて、培養の1:10希釈を分光光度計（シマズにより製造）で測定した。バクテリア培養物を約106/mLの最終バクテリア濃度までDMEM中15％のウシ胎児血清の溶液に添加した。アリコート（0.8mL）を1.5mLのふたがパチンと閉まるポリエチレンチューブに移した。水、エタノールまたはジメチルスルホキシド中で0.80-8.0mMで調製された試験化合物原液のアリコート（0.004-0.040mL）をチューブに添加した。化合物を16μMの濃度で試験した。チューブを、実施例１に記載されたような光装置に入れ、1.3J/cm2、1.2J/cm2、及び最後に2.5J/cm2で合計５J/cm2について照射した。150μLをそれぞれのパルス期間後に試験のために取り出した。無菌の13mLの希釈チューブを調製した。それぞれの試験化合物はLBブロース0.4mLを含む一本のチューブ、及びLBブロース0.5mLを含む４本のチューブを必要とした。希釈液をつくるために、ファージおよび試験化合物の照射溶液の0.050mLアリコートを培地0.5mLの第一希釈チューブに添加し、次にこの溶液0.050mLを培地0.5mLの第二チューブに添加した（1:10）。次に第二溶液を残りのチューブに連続希釈した（1:10）。初期の試料100μLおよびそれぞれの希釈液をLBアガープレートに別々に塗布し、37℃で一夜インキュベートした。次にコロニー形成単位を翌朝にカウントし、光処理後に残っているファージの力価を希釈係数に基いて計算した。
下記の対照を実験した。バクテリアが試験化合物で処理されず、かつ照射されない“バクテリアのみ”（下記の表中に“出発力価”として掲載される）；バクテリアが試験化合物の不在下で照射された“UVのみ”。暗所対照は、上記の実施例12に示された理由のためにここで行われなかった。
結果は以下のとおりであった。バクテリアの出発力価は6.5logであった。５J/cm2の照射後に、試験した種々の化合物に関するlog死滅は以下のとおりであった。8-MOP-1.9log、AMT-5.2log、化合物2->5.5、化合物6->5.5。これらの結果から、本発明の化合物はグラム陰性バクテリアを不活化するのにAMTおよび8-MOPの両方よりも有効であることが明らかである。
実施例17
上記の実施例において、本発明のプソラレンは病原、例えば、バクテリア（シュードモナス）、バクテリオファージ（R17）およびウイルス（HIVおよびDHBV）を不活化するのに有効であることが実証された。本発明の化合物が病原を不活化する方法に限定されることを目的としないが、不活化は病原の核酸へのプソラレンの光誘発結合により生じるものと考えられる。先に説明されたように、AMTはその病原不活化効率および低濃度で暗所で突然変異誘発作用を伴うことの両方につき知られている。対照的に、従来試験された8-MOPの如き活性の小さいプソラレンは、かなり小さい突然変異誘発性を示す。この実施例は、光結合および突然変異誘発性が本発明の化合物において関連する現象ではないことを立証する。本発明のプソラレンは最小の突然変異誘発性のみを示すとともに格別の病原不活化効率を有する。
この実施例において、本発明の化合物を、エイムス  アッセイを使用してそれらの暗所突然変異誘発性につき試験する。MaronおよびAmesにより詳しく記載されたようなサルモネラ突然変異誘発試験に使用した操作は正確には以下のとおりであった。Maron,D.M.およびB.N.Ames,Mutation Research 113:173（1983）。それぞれの操作に関する簡単な説明をここに示す。試験株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1537およびTA1538をAmes博士から入手した。TA97a、TA98、TA1537およびTA1538はフレームシフト試験株である。TA100およびTA102は塩基置換試験株である。受理後に、それぞれの株を種々の条件下で培養して株に特異性の遺伝子型を確かめた。
この研究に使用した標準サルモネラ試験株は増殖にヒスチジンを必要とする。何となれば、それぞれの試験株はヒスチジンオペロン中に異なる型の突然変異を含むからである。ヒスチジン突然変異に加えて、これらの試験株は、突然変異原を検出するそれらの能力を大きく増大する、以下に記載されるその他の突然変異を含む。
ヒスチジン依存性：  ヒスチジンに対する要求を、それぞれの株をまずビオチンのみで補給された最小グルコースプレートに線条接種し、次にビオチンおよびヒスチジンで補給された最小グルコースプレートに線条接種することにより試験した。全ての株はヒスチジンの不在下で株の増殖を欠如するようになった。
rfa突然変異：  バクテリアの表面を覆うリポ多糖の部分損失を生じ、こうして大きな分子に対する透過性を増大する突然変異を、試験株で塗布された線条接種された栄養アガープレートをクリスタル  バイオレットに露出することにより確かめた。最初にそれぞれの培養物100μLを溶融最小トップアガー２mLに添加し、栄養アガープレートに注いだ。次にクリスタルバイオレットで飽和された無菌濾紙ディスクをそれぞれのプレートの中央に置いた。37℃で16時間のインキュベーション後に、プレートを刻み、そしてバクテリア増殖のない透明な領域がディスクのまわりに見られ、rfa突然変異を確かめた。
uvrB突然変異：  この研究に使用した３種の株は欠損UV修復系（TA97a、TA98、TA100、TA1537およびTA1538）を含む。この形質を、株を栄養アガープレートに線条接種し、プレートの半分を覆い、そしてプレートの露出側を殺菌ランプで照射することにより試験した。インキュベーション後に、増殖がUV照射から遮蔽されたプレートの側にのみ見られた。
R-因子：  試験株（TA97a、TA98、TA100およびTA102）は、突然変異原に対するそれらの感受性を増大するpKM101プラスミドを含む。また、プラスミドはバクテリアにアンピシリン耐性を与える。株をアンピシリンの存在下で増殖させることによりこれを確かめた。
pAQ1：  株TA102はまた、突然変異原に対するそれらの感受性を更に増大するpAQ1プラスミドを含む。また、このプラスミドはテトラサイクリン耐性をコードする。このプラスミドの存在につき試験するために、TA102を、ヒスチジン、ビオチン、およびテトラサイクリンを含む最小グルコースプレートに線条接種した。プレートを37℃で16時間インキュベートした。株は正常な増殖を示し、pAQ1プラスミドの存在を示した。
遺伝子型試験に使用したのと同じ培養物を再度培養し、アリコートを調節された条件下で凍結した。培養物を遺伝子型につき再度試験して凍結永久物を調製する際の操作に関する遺伝子型の適合度を確かめた。
株を用いて行った最初の試験は、株のそれぞれについて自発復帰突然変異の範囲を測定することであった。それぞれの突然変異誘発実験により、ヒスチジン依存性に対する試験株の自発復帰突然変異を測定し、プレート当たりの自発復帰突然変異体の数として表した。これはバックグラウンド対照として利用できた。陽性突然変異誘発対照を、その株に適した診断突然変異原（TA98について5mg/プレートの２−アミノフルオレン、及びTA100について1.5mg/プレートのアジ化ナトリウム）を使用することによりそれぞれの試験株のために採用した。
全ての実験について、プレインキュベーション操作を使用した。この操作において、それぞれの試験株の一つのバイアルを解凍し、この培養液20μLを６mlのオキソイド栄養ブロース#2に添加した。この溶液を37℃で10時間振とうした。プレインキュベーション操作において、この一夜培養液0.1mLを無菌試験管の必要数のそれぞれに添加した。半分のチューブにAroclor1254誘導ラット肝臓プエキス（Molecular Toxicology社、Annapolis、MD）、並びにMgCl2、KCl、グルコース−６−ホスフェート、NADPおよびリン酸ナトリウム緩衝液（Sigma、St.Louis、Missouri）を含む10％のS-9溶液0.5mLを添加した。その他の半分のチューブに、0.2Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）の0.5mLをS-9混合物（S-9試料）の代わりに使用した。最後に、試験化合物０、0.1、0.5、１、５、10、50、100、250または500μg/mLのいずれかを含む試験溶液0.1mLを添加した。その混合物0.7mLを攪拌し、次に37℃で20分間振とうしながらプレインキュベートした。振とう後、ヒスチジンおよびビオチンで補給した溶融トップアガー２mLをその混合物0.7mLに添加し、直ちに最小グルコースアガープレートに注入した（ベースアガーの容積は20mLであった）。トップアガーを30分間にわたって固化させ、次にプレートを逆さにし、37℃で44時間インキュベートした。インキュベーション後に、それぞれのプレートの上の復帰突然変異体コロニーの数をカウントした。結果が下記の表12（A）〜18（B）に見られる（“n”はそれぞれのデータ点について行われた反復実験の数を表す）。
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MaronおよびAmes（1983）は、試験から生じたデータの統計的処理に関して相反する見解を記載している。これに鑑みて、この実施例はバックグラウンドより上の復帰突然変異体の数の２倍以上の増加（表中の太字）、並びに薬剤に対する投与量依存性突然変異誘発応答を特徴とする突然変異誘発性の簡単なモデルを採用する。
8-MOPに関して、検出された唯一の突然変異誘発応答は500μg/プレートでTA102中の弱い塩基置換突然変異原であった（表13（B））。
はっきりと対照的に、AMT（表12（A）および12（B））は、TA97aおよびTA98中５〜10μg/プレートで、TA1537中５μg/プレートで、並びにTA1538中１μg/プレートでフレームシフト突然変異誘発性を示した。AMTは有意な塩基置換突然変異を示さなかった。
化合物１を調べると、検出された唯一の突然変異誘発応答はS9の存在下の５μg/プレートにおけるTA1538中の弱いフレームシフト突然変異原であった。また、化合物１はS9の不在下でのみTA100株中の突然変異を示した。また、化合物２はTA98およびTA1537中でS9の存在下で弱いフレームシフト突然変異誘発性を示した。化合物３および４は突然変異誘発性を示さなかった。化合物６は塩基置換突然変異誘発性を有していなかったが、250μg/プレート以上の濃度でS9の存在下でTA98中でフレームシフト応答を示した。また、それはS9の存在下でTA1537中で50μg/プレートで応答を示した。化合物18は株TA90およびTA1537中でS9の存在下で高濃度で弱い応答のみを示した。その応答はS9の不在下で高かったが、AMTの応答より依然としてかなり下回っており、これは非常に低い濃度（５μg/プレート）で突然変異誘発性を示した。
このデータから、本発明の化合物は、エイムス試験により規定されるように、AMTよりも小さい突然変異誘発性であることが明らかである。同時に、これらの化合物は、実施例12および16に示されるように、8-MOPよりも非常に高い不活化効率を示す。これらの二つの因子は、本発明の化合物がAMTおよび8-MOPの両方の最良の特徴、即ち、高い不活化効率および低い突然変異誘発性を併有することを支持する。
実施例18
実施例15において、本発明の化合物は合成媒体中で病原を不活化する能力を示した。この実施例は、合成媒体および本発明の化合物が導入され、そして血液中の病原を不活化するのに使用し得る方法を記載する。図２２Ａは、血液バンク中に現在使用される通常の血液生産分離アプローチを図示する。３つのバックを可撓性チューブにより組込んで血液移入セット（200）（例えば、Baxter,Deerfield、Illから市販されている）をつくる。血液を第一バッグ（201）に吸引した後、全セットを遠心分離機（例えば、SorvallTMスイングバケット遠心分離機、Dupont）により処理して第一バッグ（201）中に充填赤血球および血小板に富む血漿を得る。血漿を第一バッグ（201）からチューブを通って第二バッグ（202）に圧出させる（例えば、血漿圧出のためのFenwallTM装置を使用する）。次に第一バッグ（201）を脱着し、二つのバッグセットを遠心分離して血小板濃厚液および血小板不足血漿を作る。後者を第二バッグ（202）から第三バッグ（203）に圧出する。
図２２Ｂは、合成媒体および光活性化化合物が図２２Ａのようにして調製された血小板濃厚液に導入される本発明の実施態様を図示する。二つのバッグセット（300）を血小板濃厚液バッグ（202）（“P.C.”として示される）と無菌的にドッキングする。無菌ドッキングは当業界で公知である。例えば、D.W.C.Spencerの米国特許第4,412,835号（参考として本明細書に含まれる）を参照のこと。また、米国特許第4,157,723号および同第4,265,280号（参考として本明細書に含まれる）を参照のこと。無菌ドッキング装置は市販されている（例えば、テルモ、日本）。
二つのバッグセット（300）のバッグの一つ（301）は本発明の合成媒体製剤（“STERILYTE”として示される）を含む。図２２Ｂに示された第二工程において、血小板濃厚液を無菌連結装置により第一血液バッグから第二血液バッグに圧出して血小板濃厚液を合成媒体バッグ（301）に移すことにより、血小板濃厚液を合成媒体を混合する。光活性化化合物は、製造の時点で添加された合成媒体を含むバッグ（301）であってもよい。また、化合物が製造の時点で血液回収バッグ（図２２Ａ、201）に添加される場合には、化合物は回収の時点で血液と混合し得る。化合物は乾燥形態であってもよく、または血液の管理に適合性の溶液中にあってもよい。
図２２Ｃは、図２２Ｂのように合成媒体で希釈された血小板濃厚液に特別に適用される、本発明の除染アプローチの一つの実施態様を概略的に示す。この実施態様において、血小板を合成媒体バッグ（301）に移した。光活性化化合物は血液回収バッグ（201）に既に導入されており、または合成媒体バッグ（301）中に存在する。次に血小板を無菌連結装置（図示されていない）により合成媒体バッグに圧出し、または合成媒体を血小板バッグに圧出する。次に血小板濃厚液および合成媒体の混合物を含むバッグ（301）（これはUV線透過性および本発明に適したその他の特性を有する）を装置（例えば、上記の実施例１に記載された装置）に入れ、照射する。
光処理後に、除染された血小板を合成媒体バッグ（301）から二つのバッグセット（300）の貯蔵バッグ（302）に移す。貯蔵バッグは市販されている貯蔵バッグ（例えば、CutterからのCLXバッグ）であってもよい。
図２２Ｄは本発明の除染アプローチの一つの実施態様を図示し、これは光処理後に処理物質から光不活化化合物を除去するための捕獲装置を含む。本発明は、光不活化化合物を除去するための捕獲装置に使用し得る幾つかの吸着剤を意図しており、下記のものが除外されずに掲載される。アンバーライトXAD-4（Roam and Haas社、Croydon,Surry,UKから入手し得る）（“急性薬物中毒用の樹脂ヘモパーフュージョン”、Arch Intern Med 136:263（1976））；アンバーライトXAD-7（“急性肝不全におけるヘモパーフュージョン用のアルブミン被覆アンバーライトXAD-7樹脂”、Artificial Organs,3:20（1979）；アンバーライト200、アンバーライトDP-1、アンバーライトXAD-2、アンバーライトXAD-16；活性炭（“薬物中毒における活性炭ヘモパーフュージョン”、British J.Hospital Med.49:493（1993）；シリカ（“ヘモパーフュージョンおよびプラズマパーフュージョン用の吸着剤としての逆相シリカゲル効率のIn vitro研究”、Clinical Toxicology 30:69（1992））。一つの実施態様において、本発明は化合物を除去するための濾過装置と連係して作用する吸着物質を意図している。
実施例19
この実施例は血小板機能に関する本発明の化合物および方法の影響の分析に関する。血小板の生存度および機能の４つの指標を使用した。1）GMP-140発現；2）pHの維持；3）血小板凝集、及び4）血小板カウント。
これらの４つの指標を使用して血小板機能に関する本発明の化合物および除染の方法の効果を測定するために、４種の試料を、試験されるそれぞれの化合物について調製し、二つは対照試料であり、二つは化合物を含む。３単位のヒト血小板を、サクラメント血液センター、サクラメント、CAから入手した。これらをそれぞれ無菌条件下で50mlの遠心管に移し、次にそれぞれの単位のアリコートを50mlの無菌遠心管の第二の組に移した。血小板濃厚液（PC）を含むそれぞれの遠心管に化合物原液のアリコートを添加して、100μMの化合物の最終濃度に達した。この実験で試験した化合物は化合物２（PC４mlに添加された10mMの原液36μL）、化合物６（PC16.8mlに添加された9.8mMの原液173.5μl）、化合物17（PC18mlに添加された１mMの原液2.0ml）および化合物18（PC16mlに添加された2.0mMの原液0.842ml）であった。試料をピペットで静かに上下させて混合した。次にそれぞれの試料のアリコート（３mlまたは８ml）を二つの無菌TeflonTMMedi-bagTM（American Fluoroseal社、Silver Springs、MD）（現在、West Company,Lionville、PAにより所有されている）に移した。試料を、３mlまたは８mlの容量を有する二つの異なるサイズのバッグの一つの中で処理した。両方のバッグはほぼ同じ表面積対体積比を有し、そして先の実験は、二つのバッグが試料の照射中にはぼ同じ性質を示すことを示した（データは示されていない）。試験したそれぞれの化合物について、化合物を含まない二つの対照試料を、化合物試料が取り出された50mlの遠心管の第一組の同じものからの血小板濃厚液（８mlのバッグを使用する場合には17ml、３mlのバッグを使用する場合には４ml）のアリコートを再度取り出し、前記のようにMedibagに分けることにより調製した。化合物を含むMedibagのそれぞれの対の一つ、および対照Medibagのそれぞれの対の一つを、上記の実施例１に記載された装置で５ジュール/cm2で照射した。次に、全ての実験Medibagおよび対照Medibagを５日間にわたって貯蔵用の血小板シェーカーに入れた。同じ実験を数回繰り返して、以下に説明される、図２３〜２６のグラフ中に表されたデータ点の数である“n”により表されるように、統計上更に意味のあるデータを得た。また、図２３〜２６中で、“C1”は１日目の未処理の対照を表し、“D5”は５日貯蔵後の未処理の対照を表し、“uv”は紫外線のみで処理された試料を表し、そして“PCD”は紫外線および本発明の化合物で処理された試験試料を表す。
１日目に対照試料に関するデータを得るために、約３mlを３ユニットのそれぞれの残りの容積から取り出し、二本の1.5mlチューブに分けた。これらの試料を下記のようにしてpHについて試験した。また、血小板カウントを、以下に記載されたようにして1:3の希釈で測定した。それぞれのユニットからの残留血小板濃厚液をSorval RC3B（Dupont社、Wilmington、Delaware）中で3800rpm（3000g）で10分間回転させて血小板をペレットにした。次に血漿を凝集アッセイに使用するために２本の50ml無菌チューブ（一つは１日目用であり、その他は５日日用に４℃で貯蔵される）にデカントした。
1）GMP-140発現
血小板が活性化されるようになった時、p-セレクチン（p-selectin）と称されるα顆粒膜糖タンパク質（GMP140）は血小板表面で露出されるようになる。新鮮で、正常の刺激されていない血小板の５％未満がフローサイトメトリーにより検出可能なGMP140レベルを発現する。一般に、M.J.Metzelaar,ヒト血小板に関する活性化マーカーの発現に関する研究（Thesis 1991）を参照のこと。
GMP140を測定するために、血小板に富む血漿の少量のアリコートを、GMP140結合抗体またはイソ型対照マウスIgGを含むHEPES緩衝液に入れる。CD62は、GMP140に結合する市販のモノクローナル抗体（Sanbio,Uden、オランダ；Caltag Labs、San Francisco、CA、およびBecton Dickinson,Mountain View、CAから入手し得る）である。室温で15分間のインキュベーション後に、FITC（Caltag Laboratories,So.San Francisco、CA）に接合されたヤギF（ab'）2抗マウスIgGを飽和量でチューブに添加し、室温（RT）で15分間インキュベートする。最後に、細胞を食塩加リン酸緩衝液中１％のパラホルムアルデヒド中で希釈し、FACSCANTM（Becton Dickinson,Mountain View、CA）で分析する。フォルボールミリステートアセテート（PMA）を2x10-7Mの最終濃度で試験系に添加することにより、陽性対照をつくる。
この実施例において、CD62を使用して血小板活性化に対する本発明の幾つかの化合物の存在下における照射の影響を測定した。抗体をHEPES緩衝液（10μLの抗体［0.1mg/ml］：2.49mLの緩衝液）と混合し、使用前に-40℃で50μLのアリコート中で貯蔵した。陽性対照は、10μLのCD62、８μLのPMAおよび2.482mLのHepes緩衝液からなっていた。また、５倍に濃縮したマウスIgG1対照（0.05mg/ml）（Becton Dickinson,Mountain View、CA #9040）を使用した。抗体をHEPES緩衝液（20μLの抗体：2.48mlの緩衝液）中で希釈し、-40℃で貯蔵した。フォルボールミリステートアセテート（PMA）（Sigma,St-Louis、MO）を-40℃で貯蔵した。使用の時点で、これをDMSOに溶解した（使用時の濃度は10μg/mLであった）。
１％のパラホルムアルデヒド（PFA）（Sigma,St-Louis、MO）を、パラホルムアルデヒド10gをPBS１リットルに添加することにより調製した。これを70℃に加熱し、溶液が透明になるまで3MのNaOHを直ちに滴下して添加した。その溶液を冷却し、pHを1NのHClで7.4に調節した。これを濾過し、貯蔵した。
処理後の血小板濃厚液試料の各処理は、Hepes緩衝液中で1:3に希釈された血小板濃厚液５マイクロリットルを、抗体CD62および適当な試薬を含むそれぞれの微小遠心管に添加し、攪拌により非常に穏やかに混合するものであった。次に試料を室温で15分間インキュベートした。
ヤギ抗マウスIgG-FITC（HEPES緩衝液中1:10に希釈）をそれぞれのチューブに添加し（５マイクロリットル）、そしてその溶液を穏やかな攪拌により混合した。試料を室温で更に15分間インキュベートした。次に、PBS中１％のPFA１mlを各チューブに添加し、穏やかに攪拌した。血小板をFACSCANTMで分析した。結果を図２３Ｃ、２４Ｃ、２５Ｃ、および２６Ｃに示す（図２３は化合物２に対応し、図２４は化合物６に対応し、図２５は化合物17に対応し、また図２６は化合物18に対応する）。明らかに、試験した４種の化合物のうちの３種、２、６、および17は、５日目の未処理の対照（D5）と、光およびプソラレン化合物（PCD）の両方で処理された試料との間に差を殆ど示さず、または全く示さなかった。化合物18のみが上記の対照よりも顕著な増加を示した。しかし、その値は陽性対照値よりも依然としてかなり下回っていた。
2）pHの維持
濃厚液中の血小板のpHの変化は、それらの形態学的特徴および輸血後のそれらの生存度を変化し得る。Moroff,G.ら，“20〜24℃における血小板濃厚液の貯蔵中のpHの変化に影響する因子”，VoxSang.42:33（1982）。血小板が正常に機能するpHの範囲は約6.0〜6.5から7.6までである。Stack,G.およびE.L.Snyder,“血小板濃厚液の貯蔵”，Blood Separation and Platelet Fraction-ation 99,107（1991）。試料のpHを測定するために、CIBA-CORNING 238pH／血液ガス分析装置を使用した（CIBA-CORNING、Norwood、MA）。それぞれの試料からの少量の血小板濃厚液をpH／血液ガス分析装置に導入した。
pHの測定を全ての試料について０時および貯蔵の５日後に行った。図２３Ｄ、２４Ｄ、２５Ｄおよび２６Ｄは、暗所対照、照明対照および実験照明＋化合物に関するpH結果を示す棒グラフである。これらのグラフは、化合物のいずれか一種の存在下における照射後の血小板濃厚液試料のpHが、pH6.5よりも上を維持することを示す。すなわち、血小板は、本発明の化合物を使用する光不活化処理後の貯蔵血小板に許容可能なpHを維持する。
3）凝集
血小板凝集を、血小板試料が凝集の刺激に対して示す光透過率の変化により測定する。全血液  アグレゴメーター（Whole Blood Aggregometer）（Chrono-Log社、Havertown、PA、型式560VS）を使用して血小板凝集を測定した。それぞれの試料中の血小板数を、測定毎に一定になるように調節した。型式F800 Sysmex細胞カウンター（トーア医療エレクトロニクス、神戸、日本）を使用して血小板試料中の血小板カウントを測定し、自己血漿を使用して血小板カウントを300,000/mLの血小板濃厚液に調節した。
この操作のため、全ての試料を活性化のために37℃で30分間にわたってキャップ付きのプラスチックチューブ中でインキュベートした。アグレゴメーターを37℃に温めた。光チャンネルを血小板凝集測定に使用した。アグレゴメーターの磁気速度を600/分にセットした。処理のための試料として取り出されなかった、得られたユニットからの残っている血小板濃厚液を、微小遠心分離機を用いて高速（14,000g）で５分間遠心分離して、実験試料のための自己の血小板不足血漿のコンテナを得た。
最初に、自己の血小板不足血漿0.45mlを食塩水0.5mlと一緒にガラスキュベットに添加し、PPPチャンネルに入れた。次に試料血小板濃厚液0.45mlおよび食塩水0.5mlを試料チャンネル中のガラスキュベット（小さい磁石を含む）に添加した。１分後に、ADPおよびコラーゲン試薬（10μl）のそれぞれを試料キュベットに添加した。ADPの最終濃度は10μMであり、またコラーゲンの最終濃度は５μg/mlであった。血小板凝集を約８〜10分間または最高の読み取り値に達するまで記録した。
結果が図２３Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、および２６Ｂに見られる。100％の凝集ラインは、レコーダーを０にセットしたレベルである。０％の凝集ラインは、ADPおよびコラーゲンを添加する前に血小板が透過するレベルである。試料に関する凝集値を、最高凝集値を全範囲の％として取ることにより測定する。試験した４種の化合物のうちの３種が、化合物で処理された試料と５日間貯蔵された未処理の試料との間で凝集レベルの差を殆ど示さず、または全く示さなかった。化合物２は、１日目の対照から約８％の、凝集の小さな減少を示した。化合物およびuvで処理された試料に関する凝集は、uvのみの試料に関する凝集と同じであった。これは、試験した除染化合物が本発明の方法に使用される時に血小板凝集に有意な効果を有しないことを支持する証拠である。
4）カウント
Sysmex細胞カウンターを使用して血小板試料中の血小板カウントを測定した。試料を血液バンク食塩水中で1:3に希釈した。
血小板カウント測定の結果が図２３Ａ、２４Ａ、２５Ａ、および２６Ａに見られる。各化合物について、試料は５日目の対照と５日目の処理試料との間で血小板カウントの低下を殆ど示さず、または全く示さない。重要なことに、化合物６、17および18で処理された試料は、全て光単独で処理された試料より高い血小板カウントを示す。例えば、化合物６で処理された試料は５日目の対照に等しいカウントを有していたが、紫外線のみで処理された試料は血小板カウントの約33％の減少を示した。従って、本発明の化合物による処理は血小板カウントの維持と適合するだけでなく、それは紫外線暴露により生じるカウントの低下を実際に防止することが明らかである。
実施例２０
後にin vivoで使用する血液除染のための好ましい化合物は、血液のレシピエントにとって変異原性であってはならない。この実験の第１の部分では、アミノメチルトリメチルプソラレンと比較した遺伝子毒性レベルを測定するため、数個の化合物をスクリーニングした。第２の部分では、マウス網状赤血球における小核形成を捜すことにより、本発明の数個の化合物のin vivo染色体異常誘発性を測定した。
１）遺伝子毒性
哺乳動物細胞培養物は、化学薬品の染色体異常誘発の可能性を評価するための有益な道具である。そのような試験において、細胞はラットS-9代謝活性化系（S-9）を用いて、または用いないで化学薬品に暴露し、その後、（遺伝子毒性スクリーニングのため）細胞生存または（染色体異常アッセイのため）染色体構造の変化について調べる。
In vitro遺伝子毒性および染色体異常試験のため、チャイニーズハムスター卵巣（CHO;ATCC CCL 61 CHO-K1、プロリン要求性）細胞を用いた。CHO細胞は比較的少数の染色体（2n=20）および速い増殖速度（培養条件により、約12〜14時間）を有するため、細胞発生試験に広く使用されている。細胞を5%CO2の雰囲気下で、約37℃で、対数増殖を維持するため15%ウシ胎児血清（FBS）、２mM L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含有するMcCoy 5a培地で培養した。この培地は、S-9を用いない場合、細胞を試験化合物に暴露する際にも使用した。細胞培養物を維持し、そしてT-75またはT-25フラスコを用いて細胞暴露を実施した。
サンプル化合物の各々を、１、３、10、33、100、333および1000μg/mlの７つの希釈度で試験した。化合物を完全なMcCoy 5a培地に添加した。化合物を加えた後、細胞を暗中で約37℃で約３時間培養した。次に、試験化合物を含有する培地を吸引し、細胞を約37℃のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、そして新鮮な、完全なMcCoy 5a培地を加えた。陽性対照はメチルメタンスルホネートであった。溶剤対照は培養培地を用いて希釈したジメチルスルホキシドであった。代謝活性化を用いたアッセイ（下記参照）については、活性化混合物もまた溶剤対照に添加した。次に、培養物を回収する前に、それらをさらに約12時間インキュベートした。回収の約2.5時間前に、コルヒチン（最終濃度0.4μg/ml）を添加した。
コルヒチンで約2.5時間処理してから、細胞を回収した。細胞スクレーパー（かき落とすへら）を用いて、細胞をフラスコの表面から剥がした。得られた細胞懸濁液を遠心にかけ、上清を吸引し、４mlの0.075M KCIの低張溶液を細胞に15分間、約37℃で添加した。細胞を遠心にかけ、上清を吸引し、メタノール：酢酸（3:1）の固定液に懸濁した。固定液を３回交換した後、全てのフラスコ由来の細胞を用いて風乾スライドを調製した。位相差顕微鏡を用いて、各フラスコ由来の最初のスライドに関する細胞密度および分裂中期（metaphase）特性をモニターした。各フラスコから適切な細胞密度を有する少なくとも２個のスライドを調製した。3%ギムザを用いて細胞を20分間染色し、脱イオン水を用いてすすぎ、キシレンに通した。カバースリップをPemountを用いてマウントした。次に、各試験化合物のどれくらいの濃度が毒性用量となるかを決定するため、スライドを調べた。
これらの結果の分析は、ＡＭＴは30μg/mlの濃度で遺伝子毒性であることを示した。対照的に、化合物２および６は、ＡＭＴの毒性用量の３倍以上である100μg/mlの濃度で初めて遺伝子毒性となった。
この実験では、本発明の化合物とは異なった構造を有するプソラレン化合物8-アミノメチル-4,4',5'-トリメチルプソラレンも試験され、10μg/mlの濃度で毒性であることが示された。8-置換アミノメチル化合物および類似の構造体は本発明の方法には適さないかも知れないが、それらは別の目的に有用である。極端な毒性と組み合わせられた、これらの化合物の核酸複製を妨げる能力を考慮すると、該化合物は、例えば癌などの制御されない細胞増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに使用できるであろう。
２）小核アッセイプロトコール
化合物２、６、１７および１８用に種々の濃度の生理食塩水を調製した。次に、雄Balb/cマウスに0.1mlの化合物溶液を尾静脈から注射した。各用量レベルにつき少なくとも３匹のマウスに注射を行なった。生理食塩水のみを陰性対照として使用した。陽性対照として、シクロホスファミド（cycloPP）を30mg/kgの用量で投与した。実験群では、注射を１日１回４日間繰り返した。陽性対照群では、第３日に１回のみサンプルを投与した。第５日に各被験動物から数マイクロリットルの血液を採血し、スライドガラスに塗沫した。細胞を無水メタノールで固定し、スライドラックに保存した。
分析のため、細胞をアクリジンオレンジで染色し、蛍光顕微鏡のもとで（i）赤血球5000個あたりの網状赤血球の数、および（ii）網状赤血球1000個あたりの小核を有する網状赤血球の数を数えることにより可視化した。網状赤血球はＲＮＡが存在するため、赤色蛍光によって識別された。小核はＤＮＡが存在するため、緑色蛍光によって識別された。次に、網状赤血球の百分率（%PCE）を計算した。網状赤血球の百分率の増加によって表される赤血球頻度の低下は、骨髄毒性の指標である。小核を有する網状赤血球の百分率（%PCE with MN）も計算した。小核を有する網状赤血球の百分率の増加は、染色体異常誘発性の尺度である。
最初の結果を測定してから、用量レベルを上げて実験を繰り返した。用量レベルは、（i）小核形成が観察されるまで；または（ii）骨髄毒性が観察されるまで；または（ii）致死量に到達するまで上げられるか；または（iv）５g/kgの用量が投与された。化合物２、６、１７および１８のそれぞれを用いたアッセイについては、骨髄毒性の徴候または小核形成が全く現れないうちに、急性致死量に到達した。実験の結果は下記の表２０に示されている。この表から明らかなように、試験した用量では、どの化合物についても骨髄毒性は観察されなかった。本発明の各化合物を用いて処理した場合の網状赤血球パーセントの値は、陰性対照の値に近いままであった。これは、陽性対照に観察される、骨髄毒性による赤血球の枯渇を表す約2〜2.5%のPCE/RBCの低下と対照的である。また、本発明の化合物はいずれも染色体異常誘発性を示さなかった。
0004047374.tif 000032
実施例２１
実施例１３に、本発明の化合物および方法を用いた無細胞ＨＩＶウイルスの不活性化が示されている。本実施例は、本発明の化合物を用いた細胞結合（cell-associated）ＨＩＶの不活性化を示す。
HIV IIIBに慢性的に感染したH9細胞を使用した。（H9/HTLV-III-B NIH 1983 Cat.#400）。この細胞の培養物を、２mM L-グルタミン、200u/mlペニシリン、200μg/mlストレプトマイシンおよび9%ウシ胎児血清（Intergen Company,Purchase,NY）を補充した高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地で維持した。維持のため、培養物を週１回、密度が3x105細胞/mlから4x105細胞/mlとなるように分割し、分割の約４日後に必要に応じ3.3%炭酸水素ナトリウムを添加した。インキュベーション手順のため、分割の３日後に細胞を使用した。細胞は400gx10分で培養培地からペレット化し、上清を捨て、そして細胞を1〜5日齢のヒト血小板濃縮物（PC）（pH7.5〜6.5）に濃度が2x106細胞/mlとなるように再懸濁した。PCを感染させた細胞培養物のアリコートをプソラレンを含まない暗対照、プソラレンを含まないUVA単独対照、プソラレン暗対照、およびプソラレン＋UVA実験サンプルとした。各プソラレンの濃縮したフィルター滅菌原液（水溶液）を、最終濃度150mMをもたらす適切なアリコートに希釈した。（化合物18の10mM原液を約67倍に希釈し、化合物２の２mM原液を約13倍に希釈した）。室温での30分の平衡化期間の後、各暗対照の0.5mlをクリオバイアルにとり、暗中に-80℃で保存した。UVA照射のため、プソラレンを含まないアリコートの8mlおよび各プソラレン含有アリコートの8mlを、修正Fl 20 TeflonTMバッグ（全表面積が92cm2となるように修正された；The West Co.,Phoenixvill,PA）に、バッグのポリプロピレン開口部の１つに取り付けられたプラスチックの使い捨て10ml注射器で導入した。これは0.17cmの平均行路長（path length）を与えた。次に、４℃に設定した循環冷凍水浴に連結した実施例１に記載の装置を用いて、バッグを全暴露が３ジュール/cm2となるように照射した。上記水浴はバッグ内の温度を約22〜25℃に維持する。暴露の間、血小板振とう機（Helmer Labs,Noblesville,IN）を用いて装置を振とうした。暴露後、新しい注射器を用いてバッグに残っている未使用の開口部からバッグの内容物を取り出し、分析まで-80℃で暗中に保存するためクリオバイアルに入れた。
保存サンプルを37℃で融解し、次に、Hanson,C.V.,Crawford-Miksza,L.およびSheppard,H.W.,J.Clin.Micro 28:2030（1990）が記述するように、および上記の実施例13に記載のように、ＨＩＶ微小プラークアッセイを用いて滴定した。ただし、以下の修正を加えた。すなわち、プレーティングの前に各サンプルから血餅の除去を実施した。血餅除去後の標的容量４mlのプレーティングが望まれたので、サンプルの過剰分（６ml）をポリプロピレンチューブに移し、最終容量60mlに希釈した。不活性化手順由来の試験サンプルおよび対照サンプルを、アッセイ培地50%およびプールされた正常なヒト血漿50%を用いて希釈した。サンプルを96ウエルプレート（Corning Glass Works,Corning,N.Y.）中で直接連続希釈した。発振振とう機を用いてプレートを30秒間混合し、次に37℃で5% CO2雰囲気下で1〜18時間インキュベートした。ＭＴ−２細胞（0.025ml）〔クローンα-4、国立衛生研究所AIDS研究および基準試薬プログラム、Rockvill,Md.より入手可能（カタログ番号237）〕を各ウエルに加え、１ウエルあたり細胞80,000個の濃度とした。37℃で5% CO2雰囲気下でさらに１時間インキュベートした後、1.6% SeaPlaqueアガロースゲル（FMC Bioproducts,Rockland,maine）を含有する、あらかじめ38.5℃に温めた0.075mlのアッセイ培地を各ウエルに加えた。数個のプレートが集まるまでプレートを2〜3分間37℃に保ち、次にプレートキャリアーを用いて、600 x gで20分間、あらかじめ10℃に冷却しておいた遠心機で遠心した。遠心機では、アガロース層のゲル化の前に細胞単層が形成された。プレートを５日間37℃で5% CO2雰囲気下でインキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩溶液（pH7.4）に溶かした0.05mlの50μg/mlヨウ化プロピジウム（Sigma Chemical Co.）を各ウエルに添加することにより染色した。24〜48時間後に、プレートを8,000μW/cm2304nm紫外線ボックス（Fotodyne,Inc.,New Berlin,Wis.）上に載せることにより、赤色蛍光に染められた微小プラークを可視化した。立体顕微鏡を用いて、x20からx25の倍率でプラークを数えた。
結果は以下の通りであった。すなわち、化合物２（150μM）は、３ジュール/cm2の照射後、>6.7logのＨＩＶを不活性化した（０log不活性化の暗対照および明対照と比較して；開始log力価6.1プラーク形成単位/ml）。同一濃度および照射時間で、化合物１８は>7.2logのＨＩＶを不活性化した（０logの暗対照および0.1logの明対照に比較して；開始log力価6.6）。この実施例は、本発明の化合物が細胞関連ウイルスの不活性化に効果的であることを支持する。
実施例２２
この実施例は、以下のin vitro血小板機能アッセイによって測定される新規な合成媒体組成物の評価に関係する。すなわち、1）pHの維持；2）血小板凝集（「Agg」）および3）GMP140発現である。これらの試験の各々のアッセイについては、先に記述してある。
0004047374.tif 000033
S 2.19、S 2.22、S 3.0およびS 4.0の４つの組成物を調製した。これら合成媒体組成物の組成を表２１に示す。
血小板が豊富なヒト血漿（PRP）１ユニットをSacramento血液銀行より得た。これを室温で６分間4000rpmで遠心し、ユニットプレス（unit press）に移した。備え付けの輸送ラインを使用して、血漿をユニットから急送し、約9.4mlの残留血漿を残した。
このユニットを１時間静置し、その後穏やかにこね回し、血小板を再懸濁させた。0.6mlの懸濁液に2.4mlの血漿を戻し入れ、全量をTeflonTMミニバッグに移した。翌日、再構築したユニットをpHおよび他の試験についてアッセイし、以下の結果を得た。
0004047374.tif 000034
次に、血小板保存用合成媒体を光除染を行なって、または行なわないで評価するために残りのユニットを使用した。該ユニット由来のアリコート（0.8ml）を試験管に入れた各組媒体成物（3.2ml）に加えた。各混合物の3mlをTeflonTMミニバッグに移した（最終血漿濃度20%）。
５日後、上に記述した一群の試験を用いて血小板機能をアッセイした。各合成媒質組成物の結果を下記の表２２に示す。
0004047374.tif 000035
２mMのグルコースを含有する合成媒体（すなわちS 2.22）は、グルコースを含有しない合成媒体（すなわちS 2.19）よりも、GMP140および凝集によって測定される血小板機能を良く維持するように思われた。
上記の所見を確認するため、これらの組成物およびグルコースを含有しない他の組成物（3.0および4.0）を用いて、実験を繰り返した（「n」は繰り返し実験の数を示す）。保存の前と後に、光除染と組み合わせて、血小板機能を評価した。結果の概略を下記の表４、５および６に示す。
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本発明は上に示し、記述した操作の詳細、化合物、組成物、方法または手順と全く同じものに限定されないことが理解されるべきである。これらの修正および等価物が当業者には明らかだからである。ここに記載した特許の全ては、参照として組み入れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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