(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＩＶ薬に対する感受性を決定するための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントと、機能的インジケータ遺伝子とを含む耐生試験ベクターを宿主細胞に導入すること；
（ｂ）（ａ）で得られた宿主細胞を培養すること；
（ｃ）ターゲット宿主細胞において、その発現が、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントに依存する前記機能的インジケータ遺伝子の発現を測定すること；及び
（ｄ）（ｃ）で測定した前記機能的インジケータ遺伝子の発現を、抗ＨＩＶ薬の非存在下で工程（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定される前記機能的インジケータ遺伝子の発現と比較すること
を含み、
試験濃度の抗ＨＩＶ薬が、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）で存在する、方法。
【請求項２】
前記耐性試験ベクターが、ゲノムウイルスベクターのＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記耐性試験ベクターが、サブゲノムウイルスベクターのＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者の抗ＨＩＶ薬に対する耐性を決定する方法であって、
（ａ）抗ＨＩＶ薬に対する薬剤感受性の標準曲線を作成すること；
（ｂ）請求項１に記載の方法に従って患者の抗ＨＩＶ薬に対する感受性を決定すること；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定した抗ＨＩＶ薬に対する感受性を、工程（ａ）で決定した標準曲線と比較し、ここで、抗ＨＩＶ感受性の低下が、患者の抗ＨＩＶ薬に対する耐性の出現を示すこと
を含む方法。
【請求項５】
前記耐性試験ベクターが、ＨＩＶのＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記耐性試験ベクターが、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｎｅｆをコードするＤＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、機能的ウイルス配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、抗ＨＩＶ薬の標的である１種類のタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、一または複数の抗ＨＩＶ薬の標的である２種類以上のタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者の抗ＨＩＶ薬に対する耐性を決定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法に従って、第１の時点で、患者の抗ＨＩＶ薬に対する感受性を決定し、ここで、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントを前記患者から第１の時点で獲得すること；
（ｂ）後の時点で、同一患者の抗ＨＩＶ薬に対する感受性を決定すること；および
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で決定した抗ＨＩＶ薬に対する感受性を比較し、ここで、前記第１の時点と比較した際の前記後の時点での抗ＨＩＶ薬に対する感受性の低下が、患者の抗ＨＩＶ薬に対する耐性の出現または進行を示すこと
を含む方法。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が耐性試験ベクター宿主細胞であり、耐性試験ベクター宿主細胞から濾過した上清を用いて、耐性試験ベクターウイルス粒子を前記ターゲット宿主細胞に感染させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的インジケータ遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記機能的インジケータ遺伝子が、大腸菌（E.coli）のＩａｃＺ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲット宿主細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ターゲット宿主細胞が、ヒトＴ細胞白血病細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット宿主細胞が、ジャーカット（Jurkat）細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターゲット宿主細胞が、Ｈ９細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターゲット宿主細胞が、ＣＥＭ細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ターゲット宿主細胞が、ヒト胎児腎臓細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲット宿主細胞が、２９３細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントと、その発現が、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントに依存する機能的インジケータ遺伝子とを含む耐性試験ベクター。
【請求項２４】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、抗ＨＩＶ薬の標的である１種類のタンパク質をコードする、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項２５】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、一または複数の抗ＨＩＶ薬の標的である２種類以上のタンパク質をコードする、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項２６】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶ遺伝子を含む、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項２７】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶのＤＮＡを含む、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項２８】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｎｅｆをコードするＤＮＡを含む、請求項２７に記載の耐性試験ベクター。
【請求項２９】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む、請求項２６に記載の耐性試験ベクター。
【請求項３０】
前記機能的インジケータ遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項３１】
請求項２３に記載の耐性試験ベクターでトランスフェクトされたパッケージング宿主細胞。
【請求項３２】
哺乳類動物の宿主細胞である、請求項３１に記載のパッケージング宿主細胞。
【請求項３３】
ヒトの宿主細胞である、請求項３１に記載のパッケージング宿主細胞。
【請求項３４】
ヒト胎児腎臓細胞である、請求項３１に記載のパッケージング宿主細胞。
【請求項３５】
２９３細胞である、請求項３１に記載のパッケージング宿主細胞。
【請求項３６】
機能的インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウイルスベクターと、ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントを含むパッケージングベクターとを含む、請求項２３に記載の耐性試験ベクター。
【請求項３７】
抗ＨＩＶ薬候補化合物の生物学的有効性を評価するための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントと機能的インジケータ遺伝子とを含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入すること；
（ｂ）（ａ）で得られた宿主細胞を培養すること；
（ｃ）ターゲット宿主細胞において、その発現が、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントに依存する前記機能的インジケータ遺伝子の発現を測定すること；及び
（ｄ）工程（ｃ）で測定した前記機能的インジケータ遺伝子の発現を、抗ＨＩＶ薬候補化合物の非存在下で工程（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定される前記機能的インジケータ遺伝子の発現と比較すること
を含み、
試験濃度の抗ＨＩＶ薬候補化合物が、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）で存在する、方法。
【請求項３８】
前記耐性試験ベクターが、ＨＩＶのＤＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記耐性試験ベクターが、ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌをコードするＤＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、抗ＨＩＶ薬の標的である１種類のタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、一または複数の抗ＨＩＶ薬の標的である２種類以上のタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントが、ＨＩＶ遺伝子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
抗ＨＩＶ薬に対する感受性を決定するための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントと機能的インジケータとを含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入すること；
（ｂ）（ａ）で得られた宿主細胞を培養すること；
（ｃ）ターゲット宿主細胞において、その変化が、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントに依存する前記機能的インジケータを測定すること；及び
（ｄ）（ｃ）で測定した前記機能的インジケータの測定値を、抗ＨＩＶ薬の非存在下で工程（ａ）〜（ｃ）を行ったときの前記機能的インジケータの測定値と比較すること
を含み、
試験濃度の抗ＨＩＶ薬が、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）で存在する、方法。
【請求項４４】
前記機能的インジケータが、ＤＮＡ構造を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記機能的インジケータが、ＲＮＡ構造を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
抗ＨＩＶ薬候補化合物の生物学的有効性を評価するための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントと機能的インジケータとを含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入すること；
（ｂ）（ａ）で得られた宿主細胞を培養すること；
（ｃ）ターゲット宿主細胞において、その変化が、前記ＨＩＶ患者由来の逆転写に関与するＨＩＶセグメントに依存する前記機能的インジケータを測定すること；及び
（ｄ）工程（ｃ）で測定した前記機能的インジケータの測定値を、抗ＨＩＶ薬候補化合物の非存在下で工程（ａ）〜（ｃ）を行ったときに測定される前記機能的インジケータの測定値と比較すること
を含み、
試験濃度の抗ＨＩＶ薬候補化合物が、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）で存在する、方法。
【請求項４７】
前記機能的インジケータが、ＤＮＡ構造を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記機能的インジケータが、ＲＮＡ構造を含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウィルス感染を治療するための有効な薬物投与計画を評価するのに用いられる抗ウィルス剤の感受性及び耐性試験に関する。本発明は、さらに、これらの新規抗ウィルス剤感受性及び耐性試験を実施するための新規ベクター、宿主細胞及び組成物に関する。また、本発明は、候補薬剤の、選択されたウィルスの配列及び／又はウィルスのタンパク質を抑制する能力についてのスクリーニングにも関する。より具体的には、本発明は、まず患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターの構築に組換えＤＮＡ技術を用い、次にこの耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し、抗ウィルス剤の存在下における標的宿主細胞でのインジケータ遺伝子産生物の発現又は抑制を決定することに関する。また、本発明は、既存の抗ウィルス剤と比較したときに異なるパターンの耐性を有する抗ウィルス剤を識別する手段及び方法にも関する。また、本発明は、潜在的な治療薬の生物学的有効性を識別及び評価するための方法及び組成物にも関する。本発明は、より具体的には、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ及び肝炎を含む様々なウィルス性疾患を治療するための最適な治療のための薬物投与計画を提供するのに有用な薬剤感受性及び耐性試験に関する。
発明の背景
ウィルスの薬剤耐性
ウィルス性疾患の化学療法及び化学予防への抗ウィルス性化合物の使用は、抗菌性抗生物質に関する５０年を超える経験と比較すると、感染性疾患の分野における比較的新しい進展である。抗ウィルス性化合物の設計は、ウィルスが多くの独特の問題を提示するため、簡単ではない。ウィルスは細胞内で複製しなければならず、しばしば宿主細胞の酵素、巨大分子、及び細胞小器官をウィルス粒子の合成に用いる。したがって、安全かつ有効な抗ウィルス性化合物は細胞の機能とウィルスに特異的な機能とを高い効率で区別することができなければならない。加えて、ウィルスの複製の性質のため、ウィルス単離体の抗ウィルス性化合物に対するイン・ビトロでの感受性の評価は生活細胞からなる複雑な培養系（例えば、組織培養）において実施しなければならない。このような検定システムからの結果は、用いられる組織培養細胞の型及び検定の条件によって大きく変化する。これらの複雑性にも関わらず、５種類の逆転写酵素阻害剤ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、１種類の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤ネビルピン、３種類のプロテアーゼ阻害剤サキナビル、リトナビル及びインジノビルの９種類の薬剤がＡＩＤＳの治療に認可されており、かつネルフィナビル、デラビリジン、ＶＸ−４７８及び１５９２のような幾つかのさらなる抗ウィルス剤候補が近年開発されている。
ウィルスの薬剤耐性が高率のウィルス複製及び突然変異頻度をもたらす実質的な問題である。薬剤耐性変異体は、ポックスウィルスについてはチオセミカルバゾンで（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ及びＷａｙ（１９６６）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｐａｔｈｏｌ．４７，１４４−５１）、ポリオウィルスについてはグアニジンで（Ｍｅｌｎｉｃｋら（１９６１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３４，５５７）、インフルエンザＡウィルスについてはアマンタジンで（Ｏｘｆｏｒｄら（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２６，８２−８３；Ｃｏｃｈｒａｎら（１９６５）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １３０，４２３−４２９）及び単純ヘルペスウィルスについてはヨードデオキシウリジンで（Ｊａｗｅｔｚら（１９７０）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １７３，２８２−２９１）最初に認められた。現在までに、様々な抗ウィルス剤に対する約７５種類のＨＩＶ薬剤耐性変異体が同定されている（Ｍｅｌｌｏｒｓら（１９９５）Ｉｎｔｎｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｎｅｗｓ，補遺及びＣｏｎｄｒａ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０，８２７０−８２７６）。
ウィルスの小さくかつ効率的なゲノムが最も重要なヒトウィルス性病原体の分子遺伝学、構造及び複製サイクルの集中的な研究の役に立っている。結果として、抗ウィルス剤の活性及びそれに対する耐性の両者についての部位及び機構が他のクラスの薬剤のいかなるものよりも正確に特徴付けられている（Ｒｉｃｈｍａｎ（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，４０１−４０７）。耐性変異体が出現する可能性は、少なくとも４つの因子：１）そのウィルスの突然変異の頻度；２）特定の抗ウィルス剤に関するウィルス標的部位の内因性変異性；３）抗ウィルス剤の選択圧；及び４）ウィルスの複製の規模及び割合の作用である。第１の因子に関しては、そのゲノムの複製が校正機構を欠く一本鎖ＲＮＡで、突然変異の頻度は複製サイクル当たりに塩基対当たり約３×１０−５である（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６，１−２０；Ｍａｎｓｋｙら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，５０８７−９４；Ｃｏｆｆｉｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７，４８３−４８９）。したがって、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のもののような単一の１０キロ塩基ゲノムは、平均で、３つの子ウィルスゲノム毎に１つの突然変異を有することが予想される。第２の因子については、特定の抗ウィルス剤に応じたウィルス標的部位の内因性変異性は耐性変異体の可能性に大きな影響を及ぼす。例えば、ジドブジン（ＡＺＴ）は、イン・ビトロ及びイン・ビボにおいて他の認可されたチミジン類似体ｄ４Ｔ（スタブジン）よりも容易にＨＩＶの逆転写酵素における突然変異を選択する。
抗ウィルス剤の作用の、おそらくは回避不可能な結果の１つは、それが薬剤耐性変異体を選択するのに十分な選択圧をウィルスの複製に付与することである（Ｈｅｒｒｍａｎｎら（１９７７）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２８４，６３２−７）。第３の因子に関しては、薬剤への露出が増加するに従い、ウィルスの集合の複製に対する選択圧が増加して薬剤耐性変異体のより迅速な出現を促進する。例えば、より高用量のＡＺＴはより低用量のものよりも迅速に薬剤耐性ウィルスを選択する傾向にある（Ｒｉｃｈｍａｎら（１９９０）Ｊ．ＡＩＤＳ．３，７４３−６）。この耐性変異体に対する選択圧は、有意の水準のウィルスの複製が維持される限りそのような変異体が生じる可能性を増大させる。
第４の因子、ウィルス集団の複製の規模及び割合は、耐性変異体の出現の可能性に対する重大な結果を生じる。多くのウィルス感染は、高速のウィルスターンオーバーを伴う高水準のウィルスの複製を特徴とする。これは、Ｂ型及びＣ型肝炎ウィルスに加えてＨＩＶでの慢性感染に特に当てはまる。ＡＺＴ耐性の出現の可能性はＣＤ４リンパ球数が減少しているＨＩＶ感染患者において増大し、このＣＤ４リンパ球数の減少はＨＩＶの複製水準の増加に関連する（同書）。
高水準のウィルスは予め存在する変異体の確率を高める。選択圧が存在しない状態で無作為に出現する、それ以前から存在するサブ集団の生存及び選択的増殖の結果、耐性集団が出現することが示されている。全てのウィルスは基線突然変異率を有する。ＨＩＶ感染の間に約１０１０個の新しいビリオンが毎日生じるという見積もり（Ｈｏら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，１２３−１２６）を用いると、ヌクレオチド当たり１０−４ないし１０−５の突然変異率で、ＨＩＶ感染の間のあらゆる時点でほとんどの突然変異が予め存在することが保証される。ＨＩＶに感染した個体のサブ集団に薬剤耐性変異体が実際に存在するという証拠が蓄積されている（Ｎａｊｅｒａら（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０，１４７９−８８；Ｎａｊｅｒａら（１９９５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９，２３−３１）。薬剤耐性ピコルナウィルス変異体が約１０−５の割合で予め存在することも書類で十分に立証される（Ａｈｍａｄら（１９８７）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．８，２７−３９）。
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は致死的なヒトの疾患であり、一般に、絶えず人類を冒すより未曾有の重い疾患の１つであると考えられる。世界的に、ヒト免疫疾患ウィルス（ＨＩＶ）に感染した個体及びＡＩＤＳ症例の数は情け容赦なく増加し、この流行病の経過を抑制する努力は、ある者が信じるところでは、有効性が限られている。２つの型のＨＩＶ：ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が現在認知されている。１９９４年１２月３１日の時点で、１，０２５，０７３件のＡＩＤＳ症例が世界保健機構に報告されている。これは症例全体のほんの一部にすぎず、ＷＨＯは、１９９４年後期現在、診断中のもの、過小報告及び報告の遅れを考慮し、かつＨＩＶ感染の見積もられた数に基づいて、全世界に４５００万を超える累積ＡＩＤＳ症例が存在するものと見積もっている（Ｍｅｒｔｅｎｓら（１９９５）ＡＩＤＳ  ９（Ｓｕｐｐｌ  Ａ），Ｓ２５９−Ｓ２７２）。ＨＩＶは北米、欧州及びサハラ以南のアフリカにおいて流布し始めてから、１億９５００万人を超える男性、女性及び子供が感染しているものと見積もられている（同書）。このＡＩＤＳ流行病の顕著な特徴の１つは最近２０年以内のその世界的な流布であり、今日では約１９０ヶ国がＡＩＤＳ症例を報告している。ＷＨＯによる世界的なＨＩＶ感染の見積もりは驚異的なものである。２０００年には成人ＡＩＤＳ症例の推定累積総数はほぼ１０００万件である。２０００年には、成人におけるＨＩＶ関連の死亡の累積数は３００万名程度の現在の総数から８００万名を超えるまでに増加するものと推定される。
ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、２つの同一のＲＮＡ分子を有する複相ゲノムを含む包被レトロウィルスである。ＨＩＶの分子構造は図１ａに示されるように（５′）Ｕ３−Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ−Ｕ５（３′）である。このＵ３、Ｒ、及びＵ５配列は末端反復配列（ＬＴＲ）を形成し、これは感染宿主におけるウィルスゲノム及び時には隣接細胞の遺伝子の発現を促進する調節要素である。ウィルスＲＮＡの内部領域は構造タンパク質：ｇａｇ（ｐ５５、ｐ１７、ｐ２４及びｐ７コアタンパク質）、ｐｏｌ（ｐ１０プロテアーゼ、ｐ６６及びｐ５１逆転写酵素並びにｐ３２インテグラーゼ）及びｅｎｖ（ｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質）をコードする。ｇａｇはウィルスのプロテアーゼによって３もしくは４つの構造タンパク質に開裂されるポリタンパク質前駆体をコードし；Ｐｏｌは逆転写酵素（ＲＴ）並びにウィルスプロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし；ｅｎｖはウィルスの膜貫通及び外部糖タンパク質をコードする。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はゲノムＲＮＡとして発現し、これに対してｅｎｖ遺伝子はスプライスされたサブゲノムＲＮＡとして発現する。ｅｎｖ遺伝子に加えて、これらのウィルスの複製及び生物学的活性に寄与するスプライスされたサブゲノムＲＮＡによって生じる他のＨＩＶ遺伝子が存在する。これらの遺伝子には：ウィルス及び幾つかの細胞の遺伝子の発現を活性化するタンパク質をコードするｔａｔ；スプライスされていないか、又は１回スプライスされたウィルスｍＲＮＡの発現を促進するタンパク質をコードするｒｅｖ；特定の条件下でのウィルスの産生を調節するものと思われるミリストイル化タンパク質をコードするｎｅｆ；標的細胞に感染するウィルス粒子の能力に影響を及ぼすもののウィルスの発現又は細胞と細胞との接触による伝染に影響を及ぼすものとは思われないタンパク質をコードするｖｉｆ；ビリオン関連タンパク質をコードするｖｐｒ；及びウィルス粒子の細胞外放出を促進するものと思われるタンパク質をコードするｖｐｕが含まれる。
ウィルスの薬剤耐性の問題をＡＩＤＳよりも如実に例証する疾患はない。ヌクレオシド及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤について薬剤耐性ＨＩＶ単離体が同定されている。ＡＺＴ及び他の逆転写酵素阻害剤はウィルスの複製を約９０％減少させるだけであるため、ＡＺＴに対して耐性のＨＩＶ単離体の出現は驚くべきことではない。薬剤処理の選択圧の存在下における高率のウィルスの複製は薬剤耐性変異体の出現にとって理想的な条件をもたらす。高レベルでウィルスが複製する感染の後期段階の患者は、ＡＺＴ処理で、感染の早期段階の者よりも迅速に耐性ウィルスを生じる（Ｒｉｃｈｍａｎら（１９９０）Ｊ  ＡＩＤＳ  ３，７４３−６）。ＡＺＴに対する耐性の出現の最初の記述は薬剤感受性の進行的かつ段階的な低下を認めていた（Ｌａｒｄｅｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，１７３１−１７３４）。これは、感受性の低下に寄与する逆転写酵素の遺伝子における複数の突然変異の認識によって説明された（Ｌａｒｄｅｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１１５５−１１５８）。これらの突然変異は、感受性が低下した表現型に輪をかけて寄与し、あるいは相乗作用的に寄与さえした（Ｋｅｌｌａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，１９３４−１９３８）。このような突然変異の累積的な獲得は感受性の進行的な低下を生じた。類似の効果が非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤で見られている（Ｎｕｎｂｅｒｇら（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５，４８８７−４８９２；Ｓａｒｄａｎｎａら（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７，１７５２６−１７５３０）。プロテアーゼ阻害剤の研究により、薬剤の感受性が低下したＨＩＶ株の選択が数週間以内に生じることが見出されている（Ｈｏら（１９９４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６８，２０１６−２０２０；Ｋａｐｌａｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，５５９７−５６０１）。最近の研究はプロテアーゼ阻害剤が逆転写酵素阻害剤よりも強力であることを示しているが、それでもやはり耐性が生じている（Ｃｏｎｄｒａら、前出並びに第３回レトロウィルス及び日和見感染症会議報告（Ｒｅｐｏｒｔ  ３ｒｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、１９９６年３月）。治療量以下の薬剤レベルは、それが投薬の減少、薬物の相互作用、他の因子による吸収不良もしくはバイオアビリティーの低下、又は患者が勝手に決めた休薬日（ｓｅｌｆ−ｉｍｐｏｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｈｏｌｉｄａｙｓ）によって生じたものであろうとなかろうと、全てウィルスの複製の増加並びに突然変異及び耐性の機会化の増加を可能にする（同書）。
薬物処理の選択圧は予め存在する変異体の増殖を可能にする。完全に抑制的な抗ウィルス剤活性が存在しない状態でウィルスの複製を継続することにより、ＡＺＴ及びＨＩＶのプロテアーゼ阻害剤について記述されているように、複数の突然変異の累積的な獲得が自然に生じる可能性がある。実際、異なる薬剤に対して耐性であるウィルス変異体の増殖が観察されている（Ｌａｒｄｅｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，１７３１−１７３４；Ｌａｒｄｅｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１１５５−１１５８；Ｃｏｎｄｒａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，５６９）。例えばＨＩＶでのように多くのウィルス感染における耐性の出現が回避不可能であることから、耐性ウィルスの集団に対抗して治療を最適化するように戦略を設計しなければならない。薬剤不足に対する薬剤耐性の寄与を確認することは、薬剤耐性を生じる可能性がより高いものと思われる患者が彼らの予後を劣悪なものとする傾向にある他の混乱因子を有する可能性がより高いため、困難な問題である（Ｒｉｃｈｍａｎ（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０，９０１−９０５）。加えて、患者は異なる感受性を有するウィルスの混合物を有する。
Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）
ＨＢＶは、全世界で約２億名の患者を悩ます急性及び慢性肝炎の原因物質である。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  Ａ．Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇｉｅｎｅ（１９８２）７６，７１１−７１８。成人の生活において獲得されたＨＢＶの感染はしばしば臨床的には不顕性であり、大抵、急激に感染した成人はその疾患から完全に回復し、ウィルスを一掃する。しかしながら、希に、急性肝疾患は患者が劇症肝炎で死亡するほど重いものであることがある。急激に感染した成人の僅かな割合、おそらくは５ないし１０％は、持続的にウィルスに感染し、様々な重篤性の慢性肝疾患を発症するようになる。しかしながら、新生児期に伝染したＨＢＶ感染はほとんど一掃されることがなく、そのような子供の９０％を超える者は慢性的に感染した状態になる。ＨＢＶは、通常、アフリカ及びアジアの非常に人口が密集する地域において、感染した母親から新生児に伝播するため、全世界で数億人の人々がその一生の大部分ＨＢＶに持続的に感染した状態で様々な程度の慢性肝疾患を患い、それが肝硬変及び肝細胞カルチノーマ（ＨＣＣ）の発症の危険性を大きく増大させる。実際、ＨＣＣの危険性は慢性肝炎を患う患者で１００倍に増加し、誕生時に感染した男性におけるＨＣＣの生涯危険率は４０％に達する。Ｂｅａｓｌｅｙ  ＲＰら、Ｌａｎｃｅｔ（１９８１）２，１１２９−１１３３。したがって、世界の人口の大きな割合がこれらのＨＢＶ感染の後者の合併症を患い、それにより死亡している。抗−ＨＢＶ薬の開発が長い間待ち望まれているが、ＨＢＶの極度に狭い宿主範囲によって妨げられている：ＨＢＶは主としてヒト及びチンパンジーの肝臓において複製し、実験動物又は培養細胞においては複製しない。Ｔｉｏｌｌａｉｓ，ＰらＮａｔｕｒｅ（ロンドン）（１９８５）３１７，４８９−４９５。
Ｂ型肝炎ウィルスは緻密なゲノム構造を有するＤＮＡウィルスである；それが小さく、環状で、３２００塩基対であるにもかかわらず、ＨＢＶのＤＮＡは４組のウィルス産生物をコードし、複雑な多成分構造を有する。ＨＢＶはそのゲノムの節約を４つの重複遺伝子：Ｓ、Ｃ、Ｐ、及びＸからタンパク質をコードする効率的な戦略に依存することにより達成する。ＨＢＶは動物ウィルス、ヘパドナウィルス群の１つであり、１型ヘパドナウィルスに分類される。類似のウィルスはマーモット、地リス及び樹木リス、及びペキンアヒルの特定の種に感染する。ＨＢＶを含む全てのヘパドナウィルスは、１）３つの異なる形態学的形状が存在し、２）全ての構成ウィルスがＨＢＶのエンベロープ及びヌクレオカプシド抗原の機能的及び構造的対応物であるタンパク質を有し、３）肝臓内で複製するが肝臓外部位にも存在可能であり、４）ＲＮＡ及びＤＮＡの両者に依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性を有する内在性ＤＮＡポリメラーゼを有し、５）それらのゲノムは部分的に二本鎖の環状ＤＮＡ分子であり、６）急性及び慢性肝炎並びに肝細胞カルチノーマに関連し、かつ７）それらのゲノムの複製はＲＮＡ中間体を介して行われ、そのＲＮＡ中間体はウィルスの内在性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いてレトロウィルスに見られるものに類似する方法でＤＮＡに逆転写されるという特徴を共有する。感染した肝細胞の核において、部分的に二本鎖のＤＮＡはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換される。ウィルスＤＮＡの転写は宿主のＲＮＡポリメラーゼによって達成され、それにより、開始部位は異なるものの全て共通のポリアデニル化シグナルで終止する数種類のＲＮＡ転写体が生じる。これらのＲＮＡのうちの最も長いものは、幾つかのウィルス性タンパク質のメッセージとしてだけではなく、それらのウィルスのプレゲノムとしても作用する。ウィルス性タンパク質はこれらのプレゲノムＲＮＡから翻訳され、これらのタンパク質及びＲＮＡプレゲノムはビリオン内にパッケージ化されて肝細胞から分泌される。ＨＢＶはイン・ビトロで培養することが困難ではあるが、幾つかの細胞でＨＢＶのＤＮＡを形質導入してその結果ＨＢＶ粒子をイン・ビトロで産生することに成功している。
ＨＢＶには３つの粒子状形態：球状もしくは長い糸状形態のいずれかとして現れる非感染性の２２ｎｍ粒子、及び本来の感染性Ｂ型肝炎ビリオンを代表する４２ｎｍ二重殻球状粒子がある。エンベロープタンパク質ＨＢｓＡｇはＨＢＶのＳ遺伝子の産生物であり、ビリオンの外面及びより小さな球状及び管状構造に見出される。Ｓ遺伝子のオープンリーディングフレームの上流はプレ−Ｓ遺伝子オープンリーディングフレーム、プレ−Ｓ１及びプレ−Ｓ２であり、これらは重合ヒト血清アルブミン用のＨＢＳ表面上の受容体及び肝細胞受容体用の結合部位を含むプレ−Ｓ遺伝子の産生物をコードする。本来の４２ｎｍビリオンは、穏やかな洗浄剤で破壊して２７ｎｍヌクレオカプシドコア粒子を単離することが可能である。このコアは、Ｃ遺伝子によってコードされる２つのヌクレオカプシドタンパク質を含んでなる。Ｃ遺伝子はコア及びプレコア（ｐｒｅｃｏｒｅ）領域を決定する２つの開始コドンを有する。このヌクレオカプシドコアの表面上に発現する主要抗原はこのコア領域によってコードされ、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれる。Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、同じＣ遺伝子から、プレコアＡＴＧで開始することにより産生される。
ＨＢＶのＤＮＡの複製及び修復を指示するＤＮＡポリメラーゼもこのヌクレオカプシドコア内にパッケージ化される。このＤＮＡポリメラーゼは、ＨＢＶの遺伝子の第３の、かつ最も長い遺伝子であるＰ遺伝子によってコードされる。この酵素はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮＡ依存性逆転写酵素活性の両者を有し、同様にプレゲノムＲＮＡの有効なキャプシド形成に必要である。第４の遺伝子Ｘは小さな非粒子会合タンパク質をコードし、このタンパク質はウィルス及び細胞の両者の遺伝子の転写をトランス活性化できることが示されている。
ＨＢＶの複製はかなり十分に理解されてはいるが、ＨＢＶの感染の早期段階は十分に定義されてはいない。細胞の受容体及びビリオン上の結合部位は適切な組織培養検定なしには研究することができない。この問題に取り組む試みにおいて、抗−ＨＢＶ薬を評価するために特定の細胞系、ヒト肝芽腫細胞Ｈｕｈ（ＨＢ６１１）（Ｕｅｄａ，Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１６９，２１３−２１６）及びＨｅｐＧ２細胞（Ｇａｌｌｅ，Ｐ，Ｒ．及びＴｈｅｉｌｍａｎｎ，Ｌ．Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．（１９９０）４０，１３８０−１３８２）が開発されている。
最近、ＨＢＶの分子変種に注目が集まっている。ＨＢＶのゲノム全体にわたって変化が生じ、ウィルス性タンパク質を発現しないＨＢＶの臨床的単離体は個々の遺伝子座における突然変異、あるいは複数の遺伝子座における突然変異にさえ起因するものと考えられている。例えば、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、又はその両者を欠く変種が記述されている。２つの変異体に注目が集まっている。その第１のものは重い慢性ＨＢＶ感染症を患う特定の患者に見出される。これらの患者は、プレコア領域にそのウィルスがＨＢｅＡｇをコードすることができないようにする変化を有するＨＢＶ変異体に感染していることが見出された。このような患者において最も一般的に遭遇する突然変異はＧからＡへの一塩基置換であり、これはプレ−Ｃ遺伝子の第２コドンから最後のコドンにおいてヌクレオチド１８９６で生じる。この置換の結果、ＴＧＧトリプトファンコドンの停止コドン（ＴＡＧ）による置換が生じ、これがＨＢｅＡｇの翻訳を妨げる。このようなＨＢｅＡｇを分泌することができないプレコア変異体を保持する患者は、急速に肝硬変に進行し、かつ抗ウィルス療法に容易には応答しない重い肝疾患を患う傾向にある。
ＨＢＶ変異体の第２の範疇はエスケープ変異体からなり、この変異体においてはグリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換がＨＢｓＡｇの全てのサブタイプに共通の免疫優性ａ決定基の１４５位に生じる。このＨＢｓＡｇにおける変化は重大な立体配座の変化につながり、これが抗−ＨＢｓ抗体による中和活性の喪失を生じる。
現在利用可能なウィルス耐性検定
ウィルスの薬剤感受性の定義は、一般に、所定のパーセンテージのウィルスの複製を阻害する抗ウィルス剤の濃度であるものと理解される（例えば、抗ウィルス剤のＩＣ50はウィルスの複製の５０％を阻害する濃度である）。したがって、ウィルスの薬剤感受性の低下は、抗ウィルス剤がその抗ウィルス剤に耐性である変異体ウィルスを選択している証である。ウィルスの薬剤耐性は、一般に、時間の経過に伴う所定の患者におけるウィルスの薬剤感受性の低下として定義される。臨床的な状況においては、ウィルスの薬剤耐性は、ある患者において抗ウィルス剤の有効性が低下していること、又はもはや臨床的に有効ではないことにより立証される。
現時点で研究者及び臨床医が抗ウィルス剤の感受性及び耐性を評価するのに利用することができる手段は不適切である。抗ウィルス剤に対するＨＩＶの耐性及び感受性を決定するための古典的な試験は複雑であり、時間がかかり、高価であり、かつ全ての患者の各々からの病原体ウィルスの培養を必要とする危険なものである（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０，８６８−８７１；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，４９７−５００）。この手順においては、まず患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養して既知の感染多重度（ｍｏｉ）のウィルス貯蔵物を確立し、それにより生成したウィルス貯蔵物を標的指示細胞系の感染に用いる。次に、その結果生じるウィルスの複製の群発を、典型的には、抗ウィルス剤の存在下又は存在しない条件下において、細胞培養におけるウィルス抗原の産生を決定することにより測定する。このような試験は熟練研究者の管理の下でのみ信頼して行うことが可能であり、試験する各々の薬剤について患者当たり数千ドルの経費で、実施に２ないし３ヶ月を要する可能性がある。さらに、ＨＩＶ患者の中にはそのＰＢＭＣから十分なｍｏｉのウィルス貯蔵物を確立することができない者がおり、このＨＩＶ耐性の古典的試験は全てのＨＩＶ感染個体に対して行うことは不可能である。より重要なことには、培養におけるウィルスの継代によりウィルス貯蔵物を生成する過程において、ウィルスそれ自体の特徴が変化する可能性があり、したがって患者のウィルスの本当の性質が不明瞭になることがある。このため、この古典的な試験の適用は臨床試験での傾向に関する情報の収集に制限されており、所定の患者のためにあつらえられた抗ウィルス療法に用いることができる予測的な分析には役立っていない。これらの制限にも関わらず、この古典的試験には２つの重要な性質がある：これは評価中の薬剤に特有のものであり、かつ患者自身のウィルスの表現型、すなわち、ウィルスの複製の５０％を阻害する薬物の濃度（ＩＣ50）に関する情報をもたらす。
この古典的試験を改善する多くの試みがなされているが、これらの各々には深刻な欠点がある。これらの試験の第１の型は、患者自身のウィルスの特徴を全く決定せず、むしろ感染の経過を独立して測定する非特異的なものとして説明することができる。これらの試験の中には、ＨＩＶ疾患の進行の証である、患者のＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定するもの（Ｇｏｅｄｅｒｔら（１９８７）ＪＡＭＡ  ２５７，３３１−３３４）、ウィルス抗原の水準を測定するもの（例えば、ｐ２４コア抗原（Ａｌｌａｉｎら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１７，１１１４−１１２１））、並びにウィルスのＲＮＡ及びＤＮＡの水準を測定するもの（例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応及び分岐ＤＮＡ検定（Ｐｉａｔａｋら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４９−１７５４；Ｕｒｄｅａ（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９，７２５−７２６）がある。このような非特異的試験の主な不利な点は、それらがウィルスの薬剤耐性それ自体に関する情報をもたらすものではなく、むしろこの情報を患者の疾患の見かけの経過から推定しようと試みるものであることである。加えて、ウィルスの薬剤耐性以外の多くの因子が検討中のパラメーターの水準に影響を及ぼす可能性がある。換言すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞数、ｐ２４抗原の水準及びＨＩＶのウィルスＲＮＡの水準は、薬剤耐性以外の理由により、疾患の過程で変化することがある。
別の改変された古典的試験は、抗ウィルス剤の標的であるウィルス遺伝子を増幅する。この試験においては、所定の患者からのウィルス遺伝子を増幅した後、ＨＩＶの生物学的に活性なプロウィルスクローンに組換える。このプロウィルスクローンをヒト細胞にトランスフェクトして既知のｍｏｉを有するウィルス貯蔵物を生成する。このウィルス貯蔵物は、その後、標的指示細胞系の感染に用いることができる。この古典的試験の方法で、次に、抗ウィルス剤の存在下又はそれが存在しない条件下において、ウィルス抗原の生成を決定する。Ｋｅｌｌａｍ及びＬａｒｄｅｒ（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏ．３８，２３−３０に記述されるこのような検定の１つは、患者からの逆転写酵素をコードする配列をＰＣＲ増幅した後、それを相同組換えによりプロウィルスＤＮＡに導入し、除去された逆転写酵素遺伝子を含む完全なウィルスゲノムを再構築することを包含する。次いで、このようなクローンから生じた組換えウィルスをＴ細胞系において培養し、その薬剤感受性をＨｅＬａ  ＣＤ４＋プラーク減少検定（ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）において試験する。しかしながら、このクラスの試験は薬剤耐性を決定するのにウィルスの培養を依然として必要とし、したがって、困難であり、冗長であり、かつ経費がかかり、有害なウィルス培養物を扱うのに実験室の研究者を必要とする。さらに、培養プロセスの過程でウィルスそれ自体の変化が伴うため、それに応じて結果が不正確である可能性がある。
第２のクラスの試験は、患者のＨＩＶの遺伝型に関する特定の情報をもたらすことを試み、その最終目標はこの遺伝型の情報をウィルスの薬剤耐性表現型と相関させることである。実際、逆転写酵素及びプロテアーゼ遺伝子のようなウィルス遺伝子内での特定のアミノ酸の置換が、それぞれ、逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害剤に対する特定の水準のウィルスの耐性に対応することが示されている（Ｌａｒｄｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７５，９５１−９５７）。このような検定に関連する主な欠点は、それが間接的なものであり、第１の突然変異の効果に追加され、もしくはそれに対抗することが示されている第２の突然変異によって混乱する可能性があることである。これは、阻害剤の存在下又はそれが存在しない条件下における遺伝子産生物の活性を最終的に決定する所定のウィルスポリペプチド内の全てのアミノ酸残基の複雑な相互作用である。したがって、ＨＩＶゲノムにおける潜在的なアミノ酸変化の数を考慮すると、所定の遺伝子型の薬剤耐性又は感受性を解釈するのに膨大かつ非実用的な大きさのデータベースが必要となる。
第３のクラスの試験、最近開発された細菌ベースの検定は、細菌発現ベクターに挿入されている分子的にクローン化されたウィルス遺伝子（具体的には、逆転写酵素遺伝子）を用いる。細菌性ＤＮＡポリメラーゼＩを欠く大腸菌の特殊な株を形質転換する際、このクローン化された逆転写酵素遺伝子は選択された成長条件下での細菌の成長を救済することが可能である。自身の成長を逆転写酵素に依存する大腸菌の作製において、そのウィルス遺伝子の活性に対する特定の逆転写酵素阻害剤の効果を確認することができる（ＰＣＴ出願ＷＯ第９５／２２６２２号）。しかしながら、この取り組みに関する主な欠点は、その阻害剤が細胞膜を通して輸送されてヒト細胞によるものとは異なる方法で細菌によって代謝される可能性があり、結果として、その逆転写酵素の真の代謝阻害剤の濃度がその細菌における濃度と、感染の標的である関連したヒト細胞におけるであろう濃度とが著しく異なる可能性、あるいは真の阻害剤が全く存在しない可能性がある。実際、ヌクレオシドの代謝はヒトと細菌細胞とでは顕著に異なることが知られている。この取り組みの別の大きな欠点は、この検定が逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するものの、逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖転移又はＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を測定しないことである。このため、これらの他の活性に対して少なくとも部分的に作用する抗ウィルス性化合物は、この検定においてはその十分な阻害活性を示さない。この取り組みに関するさらに別の困難性は、それが成長ベースの試験であることである；このため、阻害剤（例えば、ヌクレオシド類似体）が逆転写酵素に対するその効果以外の理由で細菌の成長をも阻止する場合には、それをこの系において適切に試験することはできない。
ウィルスベクター
ウィルスベクター、特にレトロウィルスベクターは、レトロウィルスベクターが標的細胞に感染して標的細胞のゲノムに組み込まれる高い効率のため、哺乳類動物細胞の改変に用いられている。哺乳類動物細胞のゲノムに挿入されるそれらの能力のため、遺伝子治療における使用についてレトロウィルスに多くの注目が集まっている。レトロウィルスベクターに関する詳細及びそれらの使用は、欧州特許出願ＥＰＡ  ０  １７８  ２２０号、米国特許４，４０５，７１２号、ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７９４３号、米国特許４，９８０，２８９号、米国特許５，４３９，８０９号及びＰＣＴ出願ＷＯ８９／１１５３９号を含む特許及び特許公開に見出すことができる。これらの特許及び刊行物の教示は参照してここに組み込まれる。
レトロウィルスベクター技術を重要視した結果の１つはパッケージング細胞系の開発である。レトロウィルスの使用に関する主な問題は複製適格レトロウィルスが蔓延する可能性である。このため、処理してもビリオンにすることができないヘルパーベクターの産生に対する必要性が存在する。結果として、パッケージング欠陥ベクター及びパッケージング細胞系が開発された。パッケージング欠陥ベクター及びパッケージング細胞系に関する詳細は、米国特許５，１２４，２６３号、欧州特許出願公開０３８６  ８８２号、ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１９７９８号、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０８４５４号、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０３１４３号、米国特許４，６５０，７６４号、米国特許４，８６１，７１９号及び米国特許５，２７８，０５６号を含む特許及び特許公開に見出すことができ、これらの開示は参照してここに組み込まれる。
本発明の目的は、患者におけるウィルス集団が所定の処方薬剤に対して耐性であるかどうかを示すことが可能な薬剤感受性及び耐性試験を提供することにある。本発明の別の目的は、それ以前の一連の治療過程の後に所定の薬剤又は複数の薬剤に対して耐性になっている患者のための治療のための投与計画の中で医師が１以上の薬剤を置き換えることを可能にする試験を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、ウィルス感染症の治療に有効な薬剤措置の選択を可能にする試験を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、臨床及び研究用途の薬剤感受性及び耐性の、安全で、標準化され、安価で、迅速で、正確で、かつ信頼性の高い検定を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、特定のウィルス遺伝子及び／又はウィルス性タンパク質に対して、特にウィルスの薬剤耐性及び交差耐性の点で作用する候補薬剤化合物の生物学的有効性を評価するための試験及び方法を提供することにある。また、ウィルスの薬剤耐性及び感受性を評価するための手段及び組成物を提供することも本発明の目的である。本発明のこの目的及び他の目的は本明細書全体から明らかであろう。
発明の要約
本発明の目的は、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現を測定し；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータ遺伝子の発現を、抗ウィルス剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合に測定されるインジケータ遺伝子の発現と比較することを包含する抗ウィルス剤に対する感受性を決定するための新規試験であって、抗ウィルス剤の試験濃度は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする新規試験によって達成される。
また、本発明は、（ａ）抗ウィルス剤に対する薬剤感受性の標準曲線を作成し；（ｂ）上述の感受性試験を用いて患者における抗ウィルス剤感受性を決定し；及び（ｃ）工程（ｂ）における抗ウィルス剤感受性を工程（ａ）において決定した標準曲線と比較することを包含する、患者における抗ウィルス剤耐性を決定するための方法であって、抗ウィルス剤感受性の低下が患者における抗ウィルス剤耐性の出現を示す方法をも提供する。
本発明はさらに、（ａ）第１の時点で、患者由来セグメントが該時点で患者から獲得される上記方法に従って患者における抗ウィルス剤感受性を決定し；（ｂ）後の時点で同じ患者の抗ウィルス剤感受性を決定し；並びに（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において決定した抗ウィルス剤感受性を比較することを包含する、患者における抗ウィルス剤耐性を決定するための方法であって、第１の時点と比較した後の時点での抗ウィルス剤感受性の低下が患者における抗ウィルス剤耐性の出現又は進行を示す方法を提供する。
本発明の検定は、ウィルス性タンパク質又は機能的なウィルスの配列をコードする、その各々が抗ウィルス剤の標的であり得るウィルス遺伝子がその薬剤の有効性を低下させるような突然変異を受けているかどうかを医師が判断することを可能にする。特には、本発明の新規検定は、ウィルスが特定の抗ウィルス剤に対して耐性になっているかどうかを決定することを可能にする。さらに、本発明は、組み合わせ治療の薬剤感受性及び耐性を医師が判断することを可能にする。加えて、この検定は、特定の薬剤（１種もしくは複数）又は薬剤の組み合わせを試験し、かつこれらの薬剤が単独で、もしくは組み合わせで１以上のウィルス遺伝子及び／又はウィルス性タンパク質を阻害するかどうかを決定することにより、予測的に治療措置を変更することを可能にする。本発明は、医師が治療を最適化することを可能にする特定の抗ウィルス剤（１種もしくは複数）又は薬剤の組み合わせの治療上の効率を評価するための、安全で、より安価で、より信頼性が高く、より迅速で、かつより有効な薬剤感受性及び耐性検定を提供することにより、現在利用可能な検定を上回る高い利点を提供する。本発明の検定は、薬剤の開発の全ての段階：１）候補化合物の前臨床評価の間での；２）新薬の臨床評価の間での；３）薬剤耐性の問題を克服するのに有効な治療措置の設計を可能にする患者の治療の間での；及び４）認可された実験薬剤を使用する過程での耐性の蔓延を評価する疫学的監視の一部としての耐性及び感受性の評価を可能にする高い利点を有する。
本発明は薬剤感受性及び耐性を評価する方法及び組成物に向けられており、これには、ａ）患者由来セグメントの抗ウィルス剤に対する感受性及び耐性を決定する検定方法；ｂ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターを含む組成物；並びにｃ）この耐性試験ベクターを有する宿主細胞が含まれる。本発明はさらに、本発明の薬剤感受性及び耐性検定において用いられるベクター及び宿主細胞を構築する組成物及び方法に向けられている。
本発明の一面において、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現を測定し；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータ遺伝子の発現を、抗ＨＩＶ剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合に測定されるインジケータ遺伝子の発現と比較することを包含する抗ＨＩＶ剤に対する感受性を決定するための方法であって、試験濃度の抗ＨＩＶ剤は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする方法が提供される。
本発明の一面において、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータを測定し、ここで該インジケータはＤＮＡもしくはＲＮＡ構造であり；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータの測定を、抗ＨＩＶ剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合のインジケータの測定と比較することを包含する抗ＨＩＶ剤に対する感受性を決定するための方法であって、試験濃度の抗ＨＩＶ剤は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする方法が提供される。
本発明の一面において、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現を測定し；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータ遺伝子の発現を、抗ＨＢＶ剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合に測定されるインジケータ遺伝子の発現と比較することを包含する抗ＨＢＶ剤に対する感受性を決定するための方法であって、試験濃度の抗ＨＢＶ剤は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする方法が提供される。
本発明の一面において、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータを測定し、ここで該インジケータはＤＮＡもしくはＲＮＡ構造であり；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータの測定を、抗ＨＢＶ剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合のインジケータの測定と比較することを包含する抗ＨＢＶ剤に対する感受性を決定するための方法であって、試験濃度の抗ＨＢＶ剤は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする方法が提供される。
また、本発明は、（ａ）抗ＨＩＶ剤に対する薬剤感受性の標準曲線を作成し；（ｂ）上述の感受性試験を用いて患者における抗ＨＩＶ剤感受性を決定し；及び（ｃ）工程（ｂ）における抗ＨＩＶ剤感受性を工程（ａ）において決定した標準曲線と比較することを包含する、患者における抗ＨＩＶ剤耐性を決定するための方法であって、抗ＨＩＶ剤感受性の低下が患者における抗ＨＩＶ剤耐性の出現を示す方法をも提供する。
また、本発明は、（ａ）抗ＨＢＶ剤に対する薬剤感受性の標準曲線を作成し；（ｂ）上述の感受性試験を用いて患者における抗ＨＢＶ剤感受性を決定し；及び（ｃ）工程（ｂ）における抗ＨＢＶ剤感受性を工程（ａ）において決定した標準曲線と比較することを包含する、患者における抗ＨＢＶ剤耐性を決定するための方法であって、抗ＨＢＶ剤感受性の低下が患者における抗ＨＢＶ剤耐性の出現を示す方法をも提供する。
また、本発明は、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現を測定し；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータ遺伝子の発現を、抗ウィルス剤候補化合物が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合に測定されるインジケータ遺伝子の発現と比較することを包含する抗ウィルス剤候補化合物の生物学的有効性を評価するための方法であって、抗ウィルス剤の試験濃度候補化合物は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在する方法をも提供する。
また、本発明は、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータを測定し、ここで該インジケータはＤＮＡもしくはＲＮＡ構造であり；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータの測定を、抗ウィルス剤候補化合物が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合のインジケータの測定と比較することを包含する抗ウィルス剤候補化合物の生物学的有効性を評価するための方法であって、抗ウィルス剤の試験濃度候補化合物は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在する方法をも提供する。
患者に由来するウィルスセグメント（１つもしくは複数）（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ等）及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターは、さらに、患者に由来するものではない１以上のセグメントを含んでいてもよい。態様の１つにおいて、この耐性試験ベクターは、１以上の遺伝子に欠失があってもよいゲノムウィルスベクターから構築される。例えば、ＨＩＶの場合、耐性試験ベクターにおいてｅｎｖが欠失しており、この耐性試験ベクターは完全なウィルスのｍＲＮＡの発現及び処理特性を別の方法で保存する。あるいは、耐性試験ベクターは、典型的に抗ウィルス剤の標的である１つもしくは２、３のウィルス遺伝子のみを含むことが可能なサブゲノムウィルスベクターから構築される。例えば、ＨＢＶの場合、ＨＶＢのＤＮＡ複製及びウィルス粒子の形成に必要な特定の構造的及び酵素的機能をコードする１以上のＨＢＶ遺伝子（すなわち、Ｃ、Ｓ及びＸ遺伝子）を耐性試験ベクターから欠失させることが可能であり、この耐性試験ベクターは完全なウィルスのｍＲＮＡの発現及び処理特性を別の方法で保存する。耐性試験ベクターは、さらに、抗ウィルス標的遺伝子の発現のための特定のウィルス本来のエンハンサー／プロモーター又は外来エンハンサー／プロモーターのいずれかを含む。
標的細胞における耐性試験ベクター中のインジケータ遺伝子の発現は、最終的には、患者由来セグメント配列の作用に依存する。このインジケータ遺伝子は機能的であっても非機能的であってもよい。非機能的インジケータ遺伝子の場合、このインジケータ遺伝子は、患者由来セグメントの１以上の産生物の作用によってそれが機能的インジケータ遺伝子に変換されるまで、耐性試験ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞においては有効に発現しない。態様の１つにおいて、このインジケータ遺伝子は、順序の入れ替わったプロモーター、すなわち、そのインジケータ遺伝子と同じ転写配向ではあるもののそのインジケータ遺伝子のコーディング配列に先行するのではなくそれに続くプロモーターを用いることにより非機能化されている。加えて、この非機能的インジケータ遺伝子の配向はウィルスのプロモーター又はＬＴＲの配向とは反対である。このため、この非機能的インジケータ遺伝子のコーディング配列は、順序の入れ替わったプロモーターによってもウィルスのプロモーターによっても転写され得ない。ＨＩＶの場合、逆転写の結果としてこのインジケータ遺伝子が再配置され、そのために順序の入れ替わったプロモーターがインジケータ遺伝子の配列に先行し、その結果機能的に発現し得る。ＨＢＶの場合、このインジケータ遺伝子はＨＢＶの複製の間のゲノムの環状化の結果として再配置される。第２の態様においては、インジケータ遺伝子は、順序の入れ替わったコーディング領域、すなわち、コーディング領域の５′部分がコーディング領域の３′部分に先行するのではなくそれに続くインジケータ遺伝子コーディング領域を用いることにより非機能化されている。この配置では、機能的インジケータ遺伝子の産生物を生じることが可能なｍＲＮＡは発現しない。ＨＩＶの場合、逆転写の結果としてこのインジケータ遺伝子が再配置され、そのためにこのインジケータ遺伝子の５′コーディング領域が３′コーディング領域に先行し、その結果インジケータ遺伝子が機能的に発現し得る。ＨＢＶの場合、このインジケータ遺伝子はＨＢＶの複製の間のゲノムの環状化の結果として再配置される。第３の態様においては、インジケータ遺伝子は、反転したイントロン、すなわち、インジケータ遺伝子の転写配向とは反対の転写配向でインジケータ遺伝子のコーディング配列に挿入されたイントロンを用いることにより非機能化されている。加えて、このインジケータ遺伝子それ自体は、ウィルスのプロモーターとは反対に配向された全転写単位を有する機能的プロモーターを有する。このため、この非機能的インジケータ遺伝子は、ＨＩＶの場合のウィルスＬＴＲ又はＨＢＶエンハンサー−プロモーターによって転写されるには誤った配向であり、かつ、反転したイントロンをスプライシングによって適切に切除することができないためそれ自身のプロモーターによっては機能的に転写され得ない。しかしながら、レトロウィルス及びヘパドナウィルス、特にはＨＩＶ及びＨＢＶの場合、ウィルスプロモーターによる転写の結果ｍＲＮＡが形成され、そこではスプライシングによる反転したイントロンの除去が起こり得る。レトロウィルスにおいては、その結果生じるスプライスされた転写体の逆転写及びその結果生じるプロウィルスの宿主細胞染色体への組み込みの結果として、このインジケータ遺伝子はそれ自身のプロモーターによって機能的に転写され得る。ＨＢＶにおいては、生じるスプライスされた転写体の逆転写及び宿主細胞におけるゲノムＤＮＡの環状化の結果として、このインジケータ遺伝子はそれ自身のプロモーターによって機能的に転写され得る。
非機能的インジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターは、粒子ベースの検定又は非粒子ベースの検定のいずれかにおける耐性試験の実施に用いることができる。粒子ベースの検定は、複製が不完全であり、耐性試験ベクター宿主細胞によって産生される耐性試験ベクターウィルス粒子に基づく。この耐性試験ベクターウィルス粒子の産生に必要なトランス作用性因子はパッケージング宿主細胞にトランスフェクトされているパッケージング発現ベクターによってもたらされる。対照的に、非粒子ベースの検定は、パッケージング発現ベクターが存在しない条件下における単一の宿主細胞の耐性試験ベクターでのトランスフェクトによって行われる。
機能的インジケータ遺伝子の場合、この機能的インジケータ遺伝子は耐性試験ベクターがトランスフェクトされた第１の宿主細胞（ここでは耐性試験ベクター宿主細胞と呼ぶ）において有効に発現する。このため、この耐性試験ベクター宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の機能は患者由来セグメントに依存しない。しかしながら、第２の宿主細胞（ここでは標的宿主細胞と呼ぶ）において発現するこのインジケータ遺伝子の能力は耐性試験ベクター宿主細胞における機能的耐性試験ベクターウィルス粒子の産生に依存する。したがって、標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の活性は患者由来セグメントの活性に依存する。
別の側面において、本発明はＨＩＶ／ＡＩＤＳ又はＨＢＶに対する抗ウィルス剤感受性及び耐性試験に向けられている。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ抗ウィルス剤感受性及び耐性試験において用いられる本発明特有の耐性試験ベクターが、耐性試験ベクター宿主細胞に加えて同定される。さらに別の側面において、本発明は肝炎に対する抗ウィルス剤感受性及び耐性試験に向けられている。同様に、ＨＢＶの場合、ＨＢＶ抗ウィルス剤感受性及び耐性試験において用いられる本発明特有の耐性試験ベクター（同様に、ここでは耐性試験ベクター系と呼ばれる）が、耐性試験ベクター宿主細胞に加えて同定される。
さらに別の側面において、本発明は、ウィルス性疾患を治療するための潜在的な治療用抗ウィルス性化合物の生物学的有効性の同定及び評価のために提供される。さらに別の側面において、本発明は、薬剤感受性を評価するために１以上のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に向けられている。別の側面において、本発明は、患者に由来するウィルス遺伝子（１つもしくは複数）及びインジケータ遺伝子を含む新規耐性試験ベクターに向けられている。
図の簡単な説明
図１．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示。ウィルスタンパクは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子により３つの読取り枠の各々の中にコードされている。ＲＮＡはウィルスＤＮＡから転写され、ウィルスおよび細胞酵素によってプロセシングされて、ゲノミックウィルスＲＮＡとｍＲＮＡの両方を生じる。ウィルスのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）のＵ３、ＲおよびＵ５要素が示されている。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を含むＨＩＶゲノミックウィルスベクターの一般化された図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲ領域、３）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ５領域、４）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子のコード領域、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｃ．５’から３’までの方向に次の要素を含むＨＩＶゲノミックウィルスベクターの一般化された図式的表示：１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲ領域、３）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ５領域、４）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子のコード領域、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を含むＨＩＶサブゲノムウィルスベクターの一般化された図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲ領域、３）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ５領域、４）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコード領域、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｅ．５’から３’までの方向に次の要素を含むＨＩＶサブゲノムウィルスベクターの一般化された図式的表示：１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター、、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲ領域、３）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ５領域、４）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコード領域、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
図２．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序の入れ替わったプロモータ（ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含む非機能性インジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターの図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳとｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ）あるいはＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳとｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲ領域、３）ＬＴＲと反対の転写方向を有する挿入されたＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（以下Ｔ７プロモーターと称する）を含むＨＩＶ−ＬＴＲのＵ５領域、４）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子のコード領域、５）患者の配列アクセプタ部位に挿入された患者由来の単数または複数の断片、６）欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入されたインジケータ遺伝子カセット、ならびに７）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｃ．２（ａ）に述べられている耐性試験ベクター中の非機能性インジケータ遺伝子（順序の入れ替わったプロモータ）の、逆転写酵素による機能性インジケータ遺伝子への変換を示す図式的表示。機能性インジケータ遺伝子への変換は、インジケータ遺伝子コード領域に関連したＴ７プロモーターの位置変更から生じる。図３．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．各々がＨＩＶ  ＬＴＲ  Ｕ３領域から転写された、スプライシングされたサブゲノミックｍＲＮＡとして発現されるｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆ遺伝子を提供する、パッケージング発現ベクターｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’の図式的表示。
Ｃ．各々がＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターから転写された、スプライシングされたサブゲノミックｍＲＮＡとして発現されるｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆ遺伝子を提供する、パッケージング発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’の図式的表示。
Ｄ．ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターからの転写によってアンホトロピックＭＬＶ  ｅｎｖ遺伝子産物を提供する、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａ［ｐＣＸＡＳ（４０７０Ａｅｎｖ）］の図式的表示。
図４．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を含む、順序が入れ替わったコード領域を持つ、非機能性インジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターの一般化された図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳとｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）あるいは最初のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳとｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）患者の配列アクセプタ部位に挿入された患者由来の単数または複数の断片、５）欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入された、ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域を含む最初のインジケータ遺伝子カセット、６）欠失３’ＨＩＶ−ＬＴＶ  Ｕ３領域に挿入された、ルシフェラーゼ遺伝子の３’コード領域を含む２番目のインジケータ遺伝子カセット、ならびに７）３’ＨＩＶ−ＬＴＲのＲおよびＵ５領域。
Ｃ．４（ａ）に述べられている耐性試験ベクター中の非機能性インジケータ遺伝子（順序が入れ替わったコード領域）の、逆転写酵素による機能性インジケータ遺伝子への変換を示す図式的表示。逆転写と鎖転移後に、ルシフェラーゼ３’コード領域は３’ＬＴＲから５’ＬＴＲにコピーされ、スプライシングされて機能性ルシフェラーゼコード領域を生じることができるｍＲＮＡの転写が可能となる。
図５．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、逆向きのイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターの一般化された図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳとｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）あるいは最初のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳとｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）患者の配列アクセプタ部位に挿入された患者由来の単数または複数の断片、５）欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入されたインジケータ遺伝子カセット、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｃ．５（ａ）に述べられている耐性試験ベクター中の非機能性インジケータ遺伝子（逆向きのイントロン）の、逆転写酵素による機能性インジケータ遺伝子への変換を示す図式的表示。インジケータ遺伝子カセットの全体的な転写方向は最初のＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびウィルスＬＴＲの方向と反対であるのに対し、人工イントロンの方向は後者の要素と同じである。第二のＣＭＶエンハンサー−プロモーターによるインジケータ遺伝子の転写は、この方向では逆向きのイントロンをスプライシングすることができないので、機能性転写産物の産生を導かない。しかし、５’ウィルスＬＴＲあるいは最初のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターによるインジケータ遺伝子の転写は、ＲＮＡスプライシングによる逆向きイントロンの除去を導く。ただし、生じる転写産物がアンチセンス方向を有しているので、インジケータ遺伝子はまだ機能的には発現されない。この転写産物を逆転写し、生じたプロウィルスＤＮＡを組込んだあと、逆向きのイントロンは既に除去されているので、インジケータ遺伝子は第二のＣＭＶエンハンサー−プロモーターによって機能的に転写されうる。
図６．Ａ．ＨＩＶ−１のＤＮＡゲノム構造の図式的表示が上の（ａ）と（ｂ）に示されている。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターの一般化された図式的表示：１）ＨＩＶ−ＬＴＲのＵ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１とｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１）あるいは最初のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１とｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲのＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）ウィルスＬＴＲと反対の転写方向を有する、欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入された機能性インジケータ遺伝子カセット、ならびに５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。
Ｃ．インジケータ遺伝子カセットの転写方向がウィルスＬＴＲと同じである機能性インジケータ遺伝子カセット（ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２とｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２）を含む耐性試験ベクターの一般化された図式的表示。
図７．Ａ．耐性試験ベクター、ｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡおよびｐＣＧ−ＣＸＡＴ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡを用いた薬剤感受性の例証。データは、標的宿主細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子活性をＡＺＴの不在下あるいは５ｍＭ  ＡＺＴの存在下での相対光度単位（ＲＬＵ）として示している。
Ｂ．耐性試験ベクターである、ＡＺＴ処置前およびＡＺＴ処置後の「被検」患者由来セグメントを含むｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡによって実施される薬剤感受性および耐性試験。耐性試験ベクターは、ゲノミックインジケータ遺伝子のウィルスベクター、ｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡから誘導される。データは、標的宿主細胞中のルシフェラーゼ遺伝子活性のパーセント阻害対ＡＺＴ濃度（ｌｏｇ１０）として表わされている。ｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡは黒い四角で示されている。ＡＺＴ処理前の患者由来セグメントを含むｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡは黒丸で、ＡＺＴ処理後のものは黒い三角で示されている。
Ｃ．耐性試験ベクターである、生物学的に活性なプロウィルスクローン、ｐＮＬ４−３から誘導された逆転写酵素断片を含むｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡによって実施される薬剤感受性および耐性試験。データは、標的宿主細胞中のルシフェラーゼ遺伝子活性のパーセント阻害対ネビラピン濃度（ｌｏｇ１０）として表わされ、黒い四角で示されている。
Ｄ．耐性試験ベクターである、生物学的に活性なプロウィルスクローン、ｐＮＬ４−３から誘導されたプロテアーゼ断片を含むｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡによって実施される薬剤感受性および耐性試験。データは、標的宿主細胞中のルシフェラーゼ遺伝子活性のパーセント阻害対インジナビール濃度（ｌｏｇ１０）として表わされ、黒い四角で示されている。
図８．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。プレゲノミックＲＮＡを実線で示す。直接反復配列（ＤＲ）を閉じた長方形で示す。カプシド被包シグナル配列の位置を（（）で示す。Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子を開いた長方形で示す。末端タンパク（ＴＰ）、スペーサー、ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素（ｐｏｌ／ＲＴ）、およびＰ遺伝子のリボヌクレアーゼＨ領域が示されている。Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ翻訳開始の部位はシャドーの入った三角形で示されている。Ｂ．インジケータ遺伝子カセットと、５’から３’までの方向に次の要素を持つ逆向きイントロンを含む、耐性試験ベクター系の成分であるサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域とＤＲ１および５’（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）インジケータ遺伝子ＯＲＦが逆向きイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶポリアデニレーション（ｐＡ）シグナル領域を含むＨＢＶゲノムの領域。
Ｃ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された機能性インジケータ遺伝子カセットを含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態のサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ−）の図式的表示。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、患者由来セグメントを含む耐性試験ベクター系の成分であるパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＰＸの一例の図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンから３’ｐＡシグナルまでにわたる、Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子を含むＨＢＶゲノムの領域。パッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＰＸのＣ遺伝子は、プレ−Ｃ  ＯＲＦ配列を含まず、Ｓタンパクを発現しないように（翻訳開始部位のＸが示すように）修飾されている。
Ｅ．インジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングプラスミド、ｐＰＫ−ＣＰＸを含む耐性試験ベクター系と同時トランスフェクトされる、Ｓ遺伝子タンパクを提供する付加的なパッケージングベクター、ｐＰＫ−Ｓの図式的表示。
Ｆ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ逆向きイントロを備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域とＤＲ１および５’（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）患者由来のＰ遺伝子断片を含むＨＢＶゲノムの領域内のインジケータ遺伝子カセット（逆向きイントロンを含む）、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの領域。
Ｇ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された、機能性インジケータ遺伝子カセットと患者由来のＰ遺伝子断片を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態の耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）の図式的表示。
Ｈ．耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）と同時トランスフェクトされる、Ｃ、ＳおよびＸ遺伝子タンパクを提供するパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸの図式的表示。
図９．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．非機能性インジケータ遺伝子カセットを含むＨＢＶインジケータ遺伝子のウィルスベクターの図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。正プライマー（Ｐｆ）と逆プライマー（Ｐｒ）の結合部位の位置と方向は、パッケージング宿主細胞をトランスフェクトするために用いる線形のベクターにおいて機能的な増幅単位を構成しない。Ｐｒ結合部位は、プレゲノミックＲＮＡのスプライシングによって生じる連結配列にとどくようにデザインされる。
Ｃ．１０Ｂに述べられているインジケータ遺伝子ウィルスベクターのｒｃ−ＤＮＡ形態の図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。ＰｆおよびＰｒプライマー結合部位の位置と方向は、ｒｃ−ＤＮＡ形態の正鎖ＤＮＡ成分、およびパッケージング宿主細胞において生成されるウィルス粒子内でのＨＢＶ  ＤＮＡ複製によって生じるベクターのｃｃｃＤＮＡ形態の正鎖と負鎖のＤＮＡ成分において、機能的増幅単位を構成する。Ｐｒ結合部位はプレゲノミックＲＮＡのスプライシングによって構築される。
Ｄ．非機能性インジケータ遺伝子カセットを含むＨＢＶインジケータ遺伝子のウィルスベクターの図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。ＰｆおよびＰｒ結合部位の位置と方向は、パッケージング宿主細胞をトランスフェクトするために用いる線形のベクターにおいて機能的な増幅単位を構成するが、Ｐｆ結合部位は、スプライシングされない線形ベクターにおけるエキソヌクレアーゼ検出プローブ（プローブ）の結合部位に隣接しない。Ｐｆ、Ｐｒおよびプローブ結合部位のこの配置は、効率的なエキソヌクレアーゼ検出単位を構成しない。
Ｅ．図９Ｄに述べられているインジケータ遺伝子ウィルスベクターのｒｃ−ＤＮＡ形態の図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。ＰｆおよびＰｒ結合部位の位置と方向は、パッケージング宿主細胞でのＨＢＶ  ＤＮＡ複製によって生じるベクターのｒｃ−ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ形態における機能的な増幅単位を構成する。Ｐｆ結合部位の位置は、ベクターのｒｃ−ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ形態においてはエキソヌクレアーゼ検出プローブ（プローブ）の結合部位のすぐ近くに生じる。Ｐｆ、Ｐｒおよびプローブ結合部位のこの配置は、効率的なエキソヌクレアーゼ検出単位を構成する。
Ｆ．ＨＢＶインジケータ遺伝子のウィルスベクターの図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。正プライマー（Ｐｆ）と逆プライマー（Ｐｒ）の結合部位の位置と方向は、パッケージング宿主細胞をトランスフェクトするために用いる線形のベクターにおいて機能的な増幅単位を構成しない。
Ｇ．１０Ｆに述べられているインジケータ遺伝子ウィルスベクターのｒｃ−ＤＮＡ形態の図式的表示。標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプライマー結合部位が示されている。ＰｆおよびＰｒプライマー結合部位の位置と方向は、ｒｃ−ＤＮＡ形態の正鎖ＤＮＡ成分、およびパッケージング宿主細胞において生成されるウィルス粒子内でのＨＢＶ  ＤＮＡ複製によって生じるベクターのｃｃｃＤＮＡ形態の正鎖と負鎖のＤＮＡ成分において、機能的増幅単位を構成する。
図１０．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序が入れ替わったプロモーターを備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター系の成分である、サブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域とＤＲ１および５’（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）プロモーター領域がインジケータ遺伝子ＯＲＦの３’側、すなわち下流に位置するように構築された非機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。患者由来のＰ遺伝子断片を含む耐性試験ベクター系の成分であるパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＰＸが図８Ｄに、またＳパッケージングベクター、ｐＰＫ−Ｓが図８Ｅに示されている。
Ｃ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された機能性インジケータ遺伝子カセットを含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態のサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ−）の図式的表示。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序の入れ替わったプロモーターを備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域およびＤＲ１と５’コピー（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）、（４）患者由来セグメントを含むＰ遺伝子、（５）インジケータ遺伝子ＯＲＦ、（６）内部リボソームのエントリー部位（ＩＲＥＳ）、（７）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。Ｃ、ＳおよびＸ遺伝子を提供するパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸは耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）と同時トランスフェクトされ、図８Ｈに示されている。
Ｅ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された、機能性インジケータ遺伝子カセットと患者由来のＰ遺伝子断片を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態の耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）の図式的表示。
図１１．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序の入れ替わったプロモーターと翻訳開始部位を備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター系の成分である、サブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ−（ＰＳＡＳ−）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）翻訳開始部位が欠如しているインジケータ遺伝子ＯＲＦ、（４）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）、（５）ＤＲ２、プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドン、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域。患者由来セグメントを含む耐性試験ベクター系の成分であるパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸが図８Ｄに、またＳパッケージングベクター、ｐＰＫ−Ｓが図８Ｅに示されている。
Ｃ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された機能性インジケータ遺伝子カセットを含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態のサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ−）の図式的表示。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序が入れ替わったプロモーターを備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ＋）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）翻訳開始部位が欠如しているインジケータ遺伝子ＯＲＦ、（４）患者由来セグメントを含むＰ遺伝子、（５）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）、（６）ＤＲ２、プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドン、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域。Ｃ、ＳおよびＸ遺伝子を提供するパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸは、耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ＋）と同時トランスフェクトされ、図８Ｈに示されている。
Ｅ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された、機能性インジケータ遺伝子カセットと患者由来のＰ遺伝子断片を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態の耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ＋）の図式的表示。
図１２．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序の入れ替わったコード領域を備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター系の成分である、サブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ−（ＰＳＡＳ−）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）プロモーター領域およびコード領域の５’部分が、コード領域の残りの３’部分の３’側、すなわち下流に位置するように構築された非機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。患者由来のＰ遺伝子断片を含む耐性試験ベクター系の成分であるパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸが図８Ｄに、またＳパッケージングベクター、ｐＰＫ−Ｓが図８Ｅに示されている。
Ｃ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された機能性インジケータ遺伝子カセットを含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態のサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ−）の図式的表示。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ、順序が入れ替わったコード領域を備えた非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）逆方向のスプライスアクセプタ配列から始まるインジケータ遺伝子ＯＲＦの３’部分、（４）患者由来セグメントを含むＰ遺伝子、（５）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）、（６）逆方向のスプライスドナー配列で終わるインジケータ遺伝子ＯＲＦの５’部分、（７）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。Ｃ、ＳおよびＸ遺伝子を提供するパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸは、耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）と同時トランスフェクトされ、図８Ｈに示されている。
Ｅ．ＨＢＶウィルス複製の結果として構築された、機能性インジケータ遺伝子カセットと患者由来のＰ遺伝子断片を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態の耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）の図式的表示。
図１３．Ａ．ＨＢＶのＲＮＡプレゲノム構造の図式的表示。
Ｂ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ機能性インジケータ遺伝子カセットを含む耐性試験ベクター系の成分である、サブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター成分、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、および３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。患者由来のＰ遺伝子断片を含む耐性試験ベクター系の成分であるパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＰＸが図８Ｄに、またＳパッケージングベクター、ｐＰＫ−Ｓが図８Ｅに示されている。
Ｃ．機能性インジケータ遺伝子を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態のサブゲノミックインジケータ遺伝子ウィルスベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）の図式的表示。
Ｄ．５’から３’までの方向に次の要素を持つ機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）の一般化された図式的表示：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＤＲ１と５’を含むＨＢＶゲノムの５’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）、（３）機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）患者由来セグメントを含むＰ遺伝子、（５）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは除去されている）。Ｃ、ＳおよびＸ遺伝子を提供するパッケージングベクター、ｐＰＫ−ＣＳＸは、耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）と同時トランスフェクトされて、図８Ｈに示されている。
Ｅ．機能性インジケータ遺伝子を含む、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態の耐性試験ベクター、ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）の図式的表示。
発明の詳細な説明
ここに記述される発明がより十分に理解され得るように、以下の説明を述べる。
本発明は、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現を測定し；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータ遺伝子の発現を、抗ウィルス剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合に測定されるインジケータ遺伝子の発現と比較することを包含する新規薬剤感受性及び耐性検定であって、抗ウィルス剤の試験濃度は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在する検定を提供する。
本発明の一面において、（ａ）患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを宿主細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を培養し；（ｃ）標的宿主細胞におけるインジケータを測定し、ここで該インジケータはＤＮＡもしくはＲＮＡ構造であり；及び（ｄ）工程（ｃ）からのインジケータの測定を、抗ウィルス剤が存在しない条件下において工程（ａ）−（ｃ）を行なった場合のインジケータの測定と比較することを包含する抗ウィルス剤に対する感受性を決定するための方法であって、抗ウィルス剤の試験濃度は工程（ａ）−（ｃ）；工程（ｂ）−（ｃ）；又は工程（ｃ）に存在することを特徴とする方法が提供される。
また、本発明は、（ａ）抗ウィルス剤に対する薬剤感受性の標準曲線を作成し；（ｂ）上述の感受性試験のいずれかを用いて患者における抗ウィルス剤感受性を決定し；及び（ｃ）工程（ｂ）における抗ウィルス剤感受性を工程（ａ）において決定した標準曲線と比較することを包含する、患者における抗ウィルス剤耐性を決定するための方法であって、抗ウィルス剤感受性の低下が患者における抗ウィルス剤耐性の出現を示す方法をも提供する。
また、本発明は、（ａ）第１の時点で、患者由来セグメントが該時点で患者から獲得される上記方法のいずれかに従って患者における抗ウィルス剤感受性を決定し；（ｂ）後の時点で同じ患者の抗ウィルス剤感受性を決定し；並びに（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において決定した抗ウィルス剤感受性を比較することを包含する、患者における抗ウィルス剤耐性を決定するための方法であって、第１の時点と比較した後の時点での抗ウィルス剤感受性の低下が患者における抗ウィルス剤耐性の出現又は進行を示す方法をも提供する。
本発明の検定は、抗ウィルス剤感受性及び耐性が関心事であるあらゆるウィルス性疾患に用いることが可能であり、これらのウィルス性疾患には、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルスイルス、水痘帯状庖疹ウィルス、他のヒトヘルペス（ＨＩＶ）ウィルス、インフルエンザＡウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウィルス、ライノウィルス、及びヒトパピローマウィルスが含まれる。前述のものは現時点で利用可能な抗ウィルス剤化学療法が存在する特定のウィルスを代表するものであり、ウィルスの科であるレトロウィルス科、ヘルペスウィルス科、オルソミクソウィルス科、ニューモウィルス科及びヘパドナウィルス科を表す。本発明の検定は、他のウィルス科内のウィルスから生じるウィルス感染に加えて、これらの科内の他のウィルスによる感染から生じる他のウィルス感染症に用いられるであろう。加えて、本発明の薬剤感受性及び耐性試験は、現在利用可能な治療が存在しないウィルス性疾患を治療するための化合物のスクリーニングに有用である。
本発明の薬剤感受性及び耐性試験において試験することができるウィルスの構造、生活環及び遺伝的要素は当該技術分野における通常の技術を有する者には公知である。例えば、レトロウィルスの救済及び感染性に必要なウィルス遺伝子に加えてレトロウィルスの生活環を理解することは、本発明の実施に有用である。レトロウィルスに感染した細胞は、複相ＲＮＡゲノムを有する膜ウィルスを脱落する。このウィルスにはエンベロープ糖タンパク質（これは、感染性の宿主範囲を決定する役目を果たす）が点在しており、感染のために細胞の原形質膜の細胞受容体に結合する。受容体に結合した後、このウィルスは内部に移行し、その宿主細胞の細胞質を通過する際に脱コートする。核に到達する途上又は核内のいずれかで、ウィルスのコアに存在する逆転写酵素分子が二本鎖ＤＮＡプロウィルスの合成、ｔＲＮＡ分子がゲノムのウィルスＲＮＡに結合することにより刺激される合成を誘発する。次に、この二本鎖ＤＮＡプロウィルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そこで、ウィルスのコア粒子にパッケージ化される、ウィルス性タンパク質及びビリオンゲノムＲＮＡをコードする両ｍＲＮＡの転写鋳型としての役目を果たす。感染細胞から外部に出る途中、コア粒子は細胞質を通過して移動し、新たに感染した細胞の原形質膜の内側に結合して出芽し、それらを用いてウィルスによってコードされたエンベロープ糖タンパク質遺伝子の産生物を含む膜の管を得る。この感染サイクル−逆転写、転写、翻訳、ビリオンの組み立て、及び出芽−は、感染の蔓延に伴って何度も繰り返される。
ウィルスＲＮＡ及び、結果として、プロウィルスＤＮＡは、ウィルスの生活環を成功裏に完了させるのに重要な幾つかのシス作用性要素をコードする。ビリオンＲＮＡはその３′末端にウィルスプロモーターを坦持する。複製の妙技はそのウィルスプロモーターをプロウィルスゲノムが逆転写される際にそのゲノムの５′末端に配置する。このウィルスパッケージング部位は５′レトロウィルスＬＴＲのすぐ３′側に位置する。このレトロウィルスの生活環はウィルスによってコードされたトランス作用性因子を必要とする。ウィルスＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）−逆転写酵素もウィルスのコア内に含まれ、かつウィルスの生活環にとって重要なものであり、その生活環においてゲノムＲＮＡの一体化した中間体プロウィルスＤＮＡへの変換をもたらす。ウィルスエンベロープ糖タンパク質、ｅｎｖ、は非感染細胞へのウィルスの結合及びウィルスの蔓延に必要である。また、転写トランス活性化因子、いわゆるトランスアクチベーターも存在し、これは一体化した親プロウィルスの転写の水準を調節する役目を果たし得る。典型的には、複製適格（非欠陥）ウィルスは自己充足しており、これらのトランス作用性因子の全てをコードする。それらの欠陥対応物は自己充足していない。
ヘパドナウィルスのようなＤＮＡウィルスの場合、生活環及び感染に必要なウィルス遺伝子を理解することは本発明の実施に有用である。ＨＢＶの侵入のプロセスは十分には定義されてない。ＨＢＶの複製ではＲＮＡ中間体鋳型が用いられる。感染細胞において、複製の第１工程は非対称リラックス環状ＤＮＡ（ｒｃ−ＤＮＡ）の共有結合によって閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）への変換である。感染肝細胞の核内で生じるこのプロセスは、ＤＮＡ正鎖合成及びＤＮＡ末端のライゲーションの完了を包含する。第２の工程において、このｃｃｃＤＮＡは宿主のＲＮＡポリメラーゼによって転写され、３．５ｋＢのＲＮＡ鋳型（プレゲノム）を生じる。このプレゲノムはウィルスのコア内でタンパク質と複合体を形成する。第３工程は、ウィルスによってコードされたＰタンパク質逆転写酵素を用いるプレゲノムＲＮＡのコピーによる第１の負センスＤＮＡ鎖の合成を包含する。このＰタンパク質はマイナス鎖ＤＮＡプライマーとしての役目も果たす。最後に、Ｐタンパク質ＤＮＡポリメラーゼ活性及びプライマーとしてのウィルスＲＮＡのオリゴマーを用いて第１のＤＮＡ鎖をコピーすることにより、第２の正センスＤＮＡ鎖の合成が生じる。また、プレゲノムは主要構造コアタンパク質のｍＲＮＡも転写する。
以下の流れ図は本発明において用いることができる様々なベクター及び宿主細胞のうちの特定のものを示す。全てを包括することは意図されていない。
0004183749.tif 000002
宿主細胞
パッケージング宿主細胞  −  パッケージング発現ベクターでトランスフェクト
耐性試験ベクター宿主細胞  −  耐性試験ベクターがトランスフェクトされているパッケージング宿主細胞
標的宿主細胞  −  耐性試験ベクター宿主細胞によって産生された耐性試験ベクターウィルス粒子で感染させようとする宿主細胞
耐性試験ベクター
「耐性試験ベクター」は、まとめると患者由来セグメント及びインジケータ遺伝子を含むＤＮＡ又はＲＮＡを有する１つ以上のベクターを意味する。耐性試験ベクターが２つ以上のベクターを含む場合、患者由来セグメントが一方のベクターに含まれ、インジケータ遺伝子が異なるベクターに含まれ得る。このような２つ以上のベクターを含む耐性試験ベクターは明確にするためにここでは耐性試験ベクター系と呼ばれるが、それでも耐性試験ベクターであると理解される。したがって、耐性試験ベクターのＤＮＡ又はＲＮＡは１つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に含まれ得る。態様の１つにおいて、耐性試験ベクターは患者由来セグメントをインジケータ遺伝子ウィルスベクターに挿入することにより作製される。別の態様において、耐性試験ベクターは、患者由来セグメントはパッケージングベクターに挿入し、これに対してインジケータ遺伝子は第２のベクター、例えばインジケータ遺伝子ウィルスベクターに含めることにより作製される。ここで用いられる場合、「患者由来セグメント」は、様々な手段を用いて患者から直接得られる１つ以上のウィルスセグメントを指す。この様々な手段は、例えば、感染した患者の細胞（例えば、末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）、血清又は他の体液中に存在するウィルスＤＮＡ又はウィルスＲＮＡから調製される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる患者由来セグメントの集団の分子クローニング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ウィルスセグメントが患者から「直接得られる」場合には培養によってウィルスを継代することなくそれが得られ、ウィルスが培養されている場合には、最少数の継代により培養物中の変異体の選択を本質的に排除する。「ウィルスセグメント」という用語は、抗ウィルス剤の標的である遺伝子産生物（例えば、タンパク質）をコードするあらゆる機能的ウィルス配列又はウィルス遺伝子を指す。ここで用いられる「機能的ウィルス配列」という用語は機能的活性を有するあらゆる核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、例えば、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化部位、ｔａｒ及びＲＲＥのようなトランス作用性因子の作用部位、パッケージング配列、一体化配列、又はスプライシング配列を指す。薬剤が２つ以上の機能的ウィルス配列又はウィルス遺伝子産生物を標的とする場合、これらのウィルス遺伝子の各々に対応する患者由来セグメントが耐性試験ベクターに挿入される。２種以上の抗ウィルス剤が標的とする２つ以上の異なる機能的ウィルス配列又はウィルス遺伝子産生物が評価される組み合わせ治療の場合には、各々の機能的ウィルス配列又はウィルス遺伝子産生物に対応する患者由来セグメントが耐性試験ベクターに挿入される。患者由来セグメントは、インジケータ遺伝子ウィルスベクター又は、例えば、ここに記述されるような用いられる特有の構成に依存するパッケージングベクターの独自制限部位又は患者配列受容部位と呼ばれる指定された位置に挿入される。
ここで用いられる場合、「患者由来セグメント」はヒト及び様々な動物種から誘導されるセグメントを包含する。このような種には、チンパンジー、ウマ、ウシ、ネコ及びイヌが含まれるがこれらに限定されるものではない。
患者由来セグメントは幾つかの代替クローン化技術のいずれかを用いて耐性試験ベクターに組み込むこともできる。例えば、プラスミド主鎖及び患者由来セグメントの両者へのクラスＩＩ制限部位の導入によるクローン化又はウラシルＤＮＡグリコシラーゼプライマークローン化（参考文献）。
患者由来セグメントは、分子クローニングもしくは遺伝子増幅のあらゆる方法又はそれらの改変法により、以下に説明されるように耐性試験ベクターに導入しようとする患者由来セグメントの末端に患者配列受容部位を導入することによって得ることができる。例えば、ＰＣＲのような遺伝子増幅法においては、患者配列受容部位に対応する制限部位をそのＰＣＲ反応において用いられるプライマーの末端に組み込むことができる。同様に、ｃＤＮＡクローン化のような分子クローニング法においては、前記制限部位を第１もしくは第２鎖ｃＤＮＡ合成に用いられるプライマーの末端に組み込むことが可能であり、あるいはＤＮＡのプライマー修復のような方法においては、それがクローン化されたＤＮＡであろうとクローン化されていないＤＮＡであろうと、前記制限部位をその修復反応に用いられるプライマーに組み込むことができる。患者配列受容部位及びプライマーは患者由来セグメントの表出を改善するように設計される。設計された患者配列受容部位を有する数組の耐性試験ベクターは、１つの耐性試験ベクター単独では表出不足である、患者由来セグメントの表出をもたらす。
耐性試験ベクターは、（以下に説明される）インジケータ遺伝子ウィルスベクターを、患者配列受容部位を導入し、患者由来セグメントを増幅もしくはクローン化し、かつ増幅もしくはクローン化した配列をインジケータ遺伝子ウィルスベクターの患者配列受容部位に正確に挿入することによって改変することにより調製する。耐性試験ベクターはインジケータ遺伝子ウィルスベクターから構築され、このインジケータ遺伝子ウィルスベクターは各々以下に説明されるゲノムウィルスベクターもしくはサブゲノムウィルスベクター及びインジケータ遺伝子カセットから誘導される。次に、この耐性試験ベクターを宿主細胞に導入する。あるいは、耐性試験ベクター（これは、耐性試験ベクター系とも呼ばれる）は、患者配列受容部位をパッケージングベクターに導入し、患者由来セグメントを増幅もしくはクローン化し、かつ増幅もしくはクローン化された配列をパッケージングベクターの患者配列受容部位に正確に挿入し、及びこのパッケージングベクターをインジケータ遺伝子ウィルスベクターと共にトランスフェクトすることにより調製する。
好ましい態様の１つにおいては、耐性試験ベクターを以下に定義されるパッケージング発現ベクターと共にパッケージング宿主細胞に導入して、ここでは「粒子ベースの試験」と呼ばれる薬剤耐性及び感受性試験において用いられる耐性試験ベクターウィルス粒子を生成させることができる。代わりの好ましい態様においては、耐性試験ベクターをパッケージング発現ベクターが存在しない条件下において宿主細胞に導入して、ここでは「非粒子ベースの試験」と呼ばれる薬剤耐性及び感受性試験を実施することができる。ここで用いられる場合、「パッケージング発現ベクター」は、パッケージングタンパク質（例えば、コア及びエンベロープポリペプチドのような構造タンパク質）、トランス作用性因子、又は複製欠陥レトロウィルスもしくはヘパドナウィルスが必要とする遺伝子のような因子をもたらす。このような状況においては、複製適格ウィルスゲノムは、それがそれ自体では複製することができないような様式で弱まる。これは、パッケージング発現ベクターが、弱められたゲノムを含む細胞内に存在する欠陥ウィルスゲノムを救済するのに必要なトランス作用性又はミッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を産生することはできるものの、その弱められたゲノムがそれ自身を救済することは不可能であることを意味する。
インジケータ又はインジケータ遺伝子
「インジケータ又はインジケータ遺伝子」は、直接もしくは反応を介してのいずれかで、測定可能であるかもしくは顕著な特徴、例えば、色もしくは測定可能な波長の光、又はインジケータとして用いられるＤＮＡもしくはＲＮＡの場合には特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ構造の変化もしくは生成を生じるタンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ構造をコードする核酸を指す。インジケータ遺伝子の好ましい例は、ベータ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、例えばホトニス・ピラリス（Ｐｈｏｔｏｎｉｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）（ホタル）又はレニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ウミシイタケ）のいずれかからのルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子、アルカリホスファターゼをコードする大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子、緑蛍光タンパク質及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする細菌ＣＡＴ遺伝子である。インジケータ遺伝子の追加の好ましい例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は、例えば成長因子、サイトカイン及び細胞表面抗原（例えば、それぞれ成長ホルモン、Ｉｌ−２又はＣＤ４）を含む蛍光活性化細胞選択（ＦＡＣＳ）のような検定によって容易に測定される分泌タンパク質又は細胞表面タンパク質である。「インジケータ遺伝子」は、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むものとも理解される。哺乳類動物細胞の適切な選択可能マーカーの例は、ジヒドロホレート還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン又は大腸菌ｇｐｔである。インジケータ遺伝子の前述の例の場合、インジケータ遺伝子及び患者由来セグメントは不連続であり、すなわち、別個の分離した遺伝子である。幾つかの場合には、患者由来セグメントをインジケータ遺伝子として用いることもできる。患者由来セグメントが抗ウィルス剤の標的である２つ以上のウィルス遺伝子に対応するそのような態様の１つにおいては、それらのウィルス遺伝子のうちの１つがインジケータ遺伝子としても役立ち得る。例えば、ウィルスプロテアーゼ遺伝子は、色素生産性基質を開裂するその能力、又は不活性チモーゲンを活性化し、それが次に色素生産性基質を開裂するその能力であって、それにより各々の場合において色反応が生じる能力のため、インジケータ遺伝子として役に立ち得る。上述のインジケータ遺伝子の例の全てにおいて、インジケータ遺伝子は「機能的」又は「非機能的」のいずれであってもよいが、各々の場合において、標的細胞におけるインジケータ遺伝子の発現は最終的に患者由来セグメントの作用に依存する。
機能的インジケータ遺伝子
「機能的インジケータ遺伝子」の場合、インジケータ遺伝子は患者由来セグメントとは無関係に以下に定義される「パッケージング宿主細胞／耐性試験ベクター宿主細胞」において発現可能であってもよいが、機能的インジケータ遺伝子は機能的耐性試験ベクター粒子の生成及びそれらの標的宿主細胞への有効な感染なくしては以下に定義される標的宿主細胞において発現することはできない。機能的インジケータ遺伝子の態様の１つにおいては、制御要素及び指示タンパク質をコードする遺伝子を含むインジケータ遺伝子カセットが、インジケータ遺伝子ウィルスベクターに、そのウィルスベクター本来の、又は外来のエンハンサー／プロモーターと同じ、もしくは反対の転写配向で挿入される。ＨＩＶ又はＨＢＶの場合の機能的インジケータ遺伝子の一例では、インジケータ遺伝子及びそのプロモーター（ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーター）が、それぞれＨＩＶ−ＬＴＲもしくはＨＢＶエンハンサー−プロモーター、又はそのウィルスベクターに伴うＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーターと同じ、もしくは反対の転写配向で配置される。
非機能的インジケータ遺伝子
代わりに、インジケータ遺伝子は「非機能的」であってもよく、そこではインジケータ遺伝子は、それが患者由来セグメントの１以上の産生物の作用によって機能的インジケータ遺伝子に変換されるまで、耐性試験ベクターがトランスフェクトされ、耐性試験ベクター宿主細胞と呼ばれるパッケージング宿主細胞では有効に発現しない。インジケータ遺伝子は、本発明に従い、遺伝子操作によって非機能的になる。
１．順序の入れ替わったプロモーター  態様の１つにおいて、インジケータ遺伝子はプロモーターの位置によって非機能的にされ、そこでは、そのプロモーターはインジケータ遺伝子と同じ転写配向であるものの、インジケータ遺伝子コーディング配列に先行するのではなくその後に続く。この誤配置プロモーターは「順序の入れ替わったプロモーター」と呼ばれる。この順序の入れ替わったプロモーターに加えて、非機能的インジケータ遺伝子の配向はそのウィルスベクター本来の、もしくは外来のプロモーター／エンハンサーとは反対である。このため、非機能的インジケータ遺伝子のコーディング配列は順序の入れ替わったプロモーターによってもウィルスプロモーターによっても転写され得ない。非機能的インジケータ遺伝子及びその順序の入れ替わったプロモーターは１以上のウィルス性タンパク質の作用によって機能的になる。ＨＩＶの場合の順序の入れ替わったプロモーターを伴う非機能的インジケータ遺伝子の一例では、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ここではＴ７プロモーターと呼ばれる）が５′ＬＴＲにインジケータ遺伝子と同じ転写配向で配置される。このインジケータ遺伝子は、そのインジケータ遺伝子カセットがＴ７プロモーターの上流に配置されているため、Ｔ７プロモーターによっては転写され得ない。この耐性試験ベクター内の非機能的インジケータ遺伝子は標的細胞の感染の際に逆転写酵素により機能的インジケータ遺伝子に変換されるが、これは、５′ＬＴＲから３′ＬＴＲにコピーされることによりインジケータ遺伝子コーディング領域に対してＴ７プロモーターが再配置されることにより生じる。ＨＩＶインテグラーゼによりこの修復されたインジケータ遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれた後、標的細胞によって発現した核Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがそのインジケータ遺伝子を転写する。ＨＢＶの場合の順序の入れ替わったプロモーターを伴う非機能的インジケータ遺伝子の一例では、エンハンサー−プロモーター領域がインジケータ遺伝子の下流、すなわち３′側に共に同じ転写配向で配置される。このインジケータ遺伝子は、そのインジケータ遺伝子カセットが上流に配置されているため、エンハンサー−プロモーターによっては転写され得ない。この耐性試験ベクター内の非機能的インジケータ遺伝子は、逆転写及びＨＢＶインジケータ遺伝子ウィルスベクターの環状化によって、エンハンサー−プロモーターがインジケータ遺伝子コーティング領域に対して上流に再配置されることにより、機能的インジケータ遺伝子に変換される。
順序の入れ替わったプロモーターは、標的宿主細胞内で転写され得るいかなる真核性もしくは原核性プロモーターであってもよい。好ましくは、このプロモーターはサイズが小さく、ウィルスの複製を攪乱することなくウィルスゲノムへの挿入を可能にするものである。より好ましくは、サイズが小さく、かつ標的宿主細胞に導入された単一のサブユニットＲＮＡポリメラーゼによって転写され得るプロモーター、例えばバクテリオファージプロモーター、が用いられる。このようなバクテリオファージプロモーター及びそれらの同族ＲＮＡポリメラーゼの例には、Ｔ７、Ｔ３及びＳｐ６ファージのものが含まれる。核局在化配列（ＮＬＳ）をＲＮＡポリメラーゼに結合し、そのＲＮＡポリメラーゼの発現を、修復されたインジケータ遺伝子をそれらが転写することが必要とされることがある核に局在化することができる。このようなＮＬＳは、ＳＶ４０Ｔ抗原のような核に移送されるあらゆるタンパク質から得ることができる。ファージＲＮＡポリメラーゼが用いられる場合には、一般にキャップが形成されていない転写体を翻訳するため、ＥＭＣウィルス５′非翻訳領域（ＵＴＲ）のような内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をインジケータ遺伝子の前に追加することができる。ＨＩＶの場合には、順序の入れ替わったプロモーターそれ自体は、ＬＴＲの機能が破壊されない限り、逆転写の過程で３′ＬＴＲにコピーされる５′ＬＴＲ内のいかなる位置にも導入可能であり、好ましくはＬＴＲのＵ５及びＲ部分、最も好ましくはＵ５及びＲの機能的に重要で高度に保存される領域の外に導入される。ＨＢＶの場合には、順序の入れ替わったプロモーターは、ＨＢＶのＤＮＡ複製に必要なシス作用性要素を破壊しないあらゆる位置に配置することができる。遮断配列を、トランスフェクト産物（ＤＮＡ連鎖）による非機能的インジケータ遺伝子の不適切な発現が存在するに違いない耐性試験ベクターの末端に追加することができる。上述の順序の入れ替わったＴ７プロモーターのＨＩＶ例においては、このような遮断配列は、ＤＮＡ連鎖から生じるブロックリードスルー転写は遮断するが、順序の入れ替わったＴ７プロモーターの逆転写の過程での５′ＬＴＲから３′ＬＴＲへの再配置から生じる転写は遮断しないように位置するＴ７転写ターミネーターからなり得る。
２．順序の入れ替わったコーディング領域  第２の態様においては、インジケータ遺伝子は、そのインジケータ遺伝子の５′及び３′コーディング領域の相対位置によって非機能的にされており、その相対位置では３′コーディング領域が５′コーディング領域に続くのではなくそれに先行している。この誤配置コーディング領域は「順序の入れ替わったコーディング領域」と呼ばれる。非機能的インジケータ遺伝子の配向はそのウィルスベクター本来の、もしくは外来のプロモーター／エンハンサーと同じであっても反対であってもよい。これは、いずれの配向の場合であっても機能的インジケータ遺伝子をコードするｍＲＮＡが生じるためである。この非機能的インジケータ遺伝子及びその順序の入れ替わったコーディング領域は、患者由来セグメントの１以上の産生物の作用によって機能的になる。ＨＩＶの場合の順序の入れ替わったコーディング領域を伴う非機能的インジケータ遺伝子の第２の例では、会合したプロモーターを伴う５′インジケータ遺伝子コーディング領域が３′ＬＴＲ  Ｕ３領域に、及び３′インジケータ遺伝子コーディング領域がそのＨＩＶゲノムの上流位置に配置され、各々のコーディング領域はそのウィルスのＬＴＲと同じ転写配向を有する。これらの例の両者において、５′及び３′コーティング領域にはそれぞれスプライス供与及び受容配列が会合していてもよく、これらの配列は異種もしくは人工スプライシングシグナルであってもよい。このインジケータ遺伝子は、順序の入れ替わったコーディング領域が機能的にスプライスされた転写体の形成を妨げるため、会合したプロモーター又はウィルスプロモーターのいずれによっても機能的に転写され得ない。この耐性試験ベクター内の非機能的インジケータ遺伝子は、標的細胞の感染の際の逆転写によって機能的インジケータ遺伝子に変更されるが、これは、３′ＬＴＲが５′ＬＴＲにコピーされることによって５′及び３′インジケータ遺伝子コーディング領域が他のものに対して再配置されることから生じる。ＨＢＶの場合の順序の入れ替わったコーディング配列を伴う非機能的インジケータ遺伝子の一例では、３′インジケータ遺伝子コーディング領域がそのインジケータ遺伝子のエンハンサー−プロモーター及び５′コーディング領域の上流、すなわち５′側に配置される。このインジケータ遺伝子の５′及び３′コーディング領域の転写配向は他のものと同じであり、かつインジケータ遺伝子ウィルスベクターと同じである。しかしながら、耐性試験ベクター内でインジケータ遺伝子の５′及び３′コーディング領域の順序が変更されている（すなわち、５′コーディング領域が３′コーディング領域の下流にある）ため、スプライスされて機能的インジケータ遺伝子のコーディング領域を生じることが可能なｍＲＮＡが転写されない。逆転写及びインジケータ遺伝子ウィルスベクターの環状化の後、このインジケータ遺伝子の３′コーディング領域はエンハンサー−プロモーター及び５′コーディング領域の下流、すなわち３′側に配置され、それによりスプライスされて機能的インジケータ遺伝子のコーディング領域を生じることが可能なｍＲＮＡの転写が可能になる。
３．反転イントロン  第３の態様においては、インジケータ遺伝子は、「反転イントロン」、すなわち、このインジケータ遺伝子とは反対の転写配向でこのインジケータ遺伝子のコーディング領域に挿入されているイントロンを用いることによって非機能化されている。このインジケータ遺伝子自体、連結したプロモーターを含むインジケータ遺伝子カセットの全体の転写配向はウィルスの制御要素とは反対であり、これに対して人工イントロンの配向はウィルスの制御要素と同じである。このインジケータ遺伝子のそれ自体に連結したプロモーターによる転写は、この配向では反転イントロンがスプライスされ得ないため、機能的な転写体の生成につながらない。しかしながら、ウィルスの制御要素によるこのインジケータ遺伝子の転写は、生じる転写体がアンチセンス配向を有するためにインジケータ遺伝子は依然として機能的に発現することはないものの、ＲＮＡスプライシングによる反転イントロンの除去をもたらす。この転写体の逆転写及び生じたレトロウィルスＤＮＡの組み込み、又はヘパドナウィルスＤＮＡの環状化の後には、反転イントロンが既に除去されているため、インジケータ遺伝子はそれ自身に連結したプロモーターを用いて機能的に転写され得る。この場合、インジケータ遺伝子それ自体が、ウィルスの制御要素と反対に配向された全転写単位を有するそれ自身の機能的プロモーターを含んでいてもよい。このように、非機能的インジケータ遺伝子はウィルスの制御要素によって転写されるには誤った配向にあり、かつ反転イントロンがスプライシングによっては適切に切除され得ないためそれ自体のプロモーターによっては機能的に転写され得ない。しかしながら、レトロウィルス、特にはＨＩＶ、及びヘパドナウィルス、特にはＨＢＶの場合には、ウィルスプロモーター（ＨＩＶ  ＬＴＲ又はＨＢＶエンハンサー−プロモーター）による転写の結果、スプライシングによる反転イントロンの除去が生じる。その結果生じるスプライスされた転写体の逆転写及びその結果生じるプロウィルスの宿主細胞染色体への組み込み又はＨＢＶベクターの環状化の結果、インジケータ遺伝子がそれ自身のプロモーターによって機能的に転写され得る。イントロンを除去するためのスプライス供与及び受容部位からなる反転イントロンは、インジケータ遺伝子の翻訳を途絶させるため、好ましくは、インジケータ遺伝子のコーディング領域に位置する。スプライス供与体及び受容体はいかなるスプライス供与体及び受容体であってもよい。好ましいスプライス供与体−受容体はＣＭＶ  ＩＥスプライス供与体及びヒトアルファグロビン遺伝子の第２エクソンのスプライス受容体（「イントロンＡ」）である。
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−構築
ここで用いられる場合、「インジケータ遺伝子ウィルスベクター」は、インジケータ遺伝子及びその制御要素並びに１以上のウィルス遺伝子を含むベクター（１つもしくは複数）を指す。このインジケータ遺伝子ウィルスベクターは遺伝子カセット及び以下に定義される「ウィルスベクター」から組み立てられる。インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化配列、転写ターミネーター、又は他の調節配列をさらに含んでいてもよい。加えて、インジケータ遺伝子ウィルスベクターは機能的であっても非機能的であってもよい。抗ウィルス剤の標的であるウィルスセグメントがこのインジケータ遺伝子ウィルスベクターに含まれない場合、それらは第２のベクターに付与される。「インジケータ遺伝子カセット」はインジケータ遺伝子及び制御要素を含む。「ウィルスベクター」は以下のものの幾つか又は全てを含むベクターを指す：遺伝子産生物をコードするウィルス遺伝子、制御配列、ウィルスパッケージング配列、及び、レトロウィルスの場合には、一体化配列。このウィルスベクターは、１以上のウィルスセグメントであって、その１以上が抗ウィルス剤の標的であり得るウィルスセグメントをさらに含んでいてもよい。ウィルス遺伝子を含むウィルスベクターの２つの例をここでは「ゲノムウィルスベクター」及び「サブゲノムウィルスベクター」と呼ぶ。「ゲノムウィルスベクター」は、１以上のウィルス遺伝子を欠失させてそのウィルスを複製不適格としてもよいが、完全なウィルスのｍＲＮＡの発現及び処理特性を別の方法で保存するベクターである。ＨＩＶ薬剤感受性及び耐性試験の態様の１つにおいて、ゲノムウィルスベクターはＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、及びｎｅｆ遺伝子を有する（ｅｎｖの幾らか、大部分又は全ては欠失している）。「サブゲノムウィルスベクター」は、抗ウィルス剤の標的（１つもしくは複数）であるタンパク質をコードし得る１以上のウィルス遺伝子のコーディング領域を含むベクターを指す。ＨＩＶの場合、好ましい態様はＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含むサブゲノムウィルスベクターである。ＨＢＶの場合、好ましい態様はＨＢＶのＰ遺伝子を含むサブゲノムウィルスベクターである。ＨＩＶの場合、ＨＸＢ２（Ｆｉｓｈｅｒら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２０，３６７−３７１）及びＮＬ４−３（Ａｄａｃｈｉら，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５９，２８４−２９１）がウィルスベクターの構築に用いられるプロウィルスクローンの２つの例である。ＨＢＶの場合、多数の完全長ゲノム配列が特徴付けられており、ＨＢＶウィルスベクターの構築に用いることができる：ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）Ｍ５４９２３号、Ｍ３８６３６号、Ｊ０２２０３号及びＸ５９７９５号。ウィルスコーディング遺伝子は本来のエンハンサー／プロモーターの制御の下にあっても、外来のウィルス性もしくは細胞性エンハンサー／プロモーターの制御の下にあってもよい。ＨＩＶ薬剤感受性及び耐性試験に対する好ましい態様は、ゲノムもしくはサブゲノムウィルスコーディング領域をＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域の本来のエンハンサー／プロモーター又はＣＭＶ最初期（ＩＥ）エ���ハンサー／プロモーターの制御下に配置することである。ＨＢＶ薬剤感受性及び耐性試験に対する好ましい態様は、ゲノムもしくはサブゲノムウィルスコーディング領域をＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサー／プロモーターの制御下に配置することである。抗ウィルス剤（１種もしくは複数）の標的であるか、又はその標的であるタンパク質をコードする１以上のウィルス遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターの場合、このベクターは患者配列受容部位を含む。患者由来セグメントはこのインジケータ遺伝子ウィルスベクター内の患者配列受容部位に挿入され、それは上述の耐性試験ベクターと呼ばれる。
「患者配列受容部位」はベクター内の患者由来セグメントを挿入するための部位であり、その部位は：１）部位特異的突然変異誘発によってベクターに導入された独自の制限部位；２）ベクターに自然に発生した独自の制限部位；又は３）代替クローン化法（例えば、ＵＤＧクローン化）を用いて患者由来セグメントを挿入することができる選択された部位であり得る。態様の１つにおいては、この患者配列受容部位はインジケータ遺伝子ウィルスベクターに導入される。患者配列受容部位は、好ましくは、抗ウィルス剤の標的であるウィルス性タンパク質のコーディング領域内、又はその近傍に位置する。患者配列受容部位の導入に用いられるウィルス配列は、好ましくは、その位置に見出されるアミノ酸コーディング配列に変化を生じないように、又は控えめな変化が生じるように選択される。好ましくは、患者配列受容部位は、患者由来セグメントの導入を容易にするため、そのウィルスのゲノムの比較的保存された領域内に配置される。あるいは、患者配列受容部位は機能的に重要な遺伝子又は調節配列の間に配置される。患者配列受容部位を比較的保存されたウィルスゲノム内の領域に、又はその近傍に配置し、患者由来セグメントへの対応する制限部位の導入に用いられるプライマーによる初回刺激を可能にすることもできる。患者由来セグメントの表出をさらに改善するため、そのようなプライマーを変性プールとして設計してウィルスの配列の不均一性を調整することが可能であり、又はそれが多重塩基対形成能力を有するデオキシイノシン（Ｉ）のような残基を組み込んでいてもよい。同じであるか、もしくは重複する制限部位間隔を決定する患者配列受容部位を有する数組の耐性試験ベクターを薬剤耐性及び感受性試験において一緒に用いて、所定の患者配列受容部位と等しい内部制限部位を含む患者由来セグメントの表出を得ることが可能であり、このため、それらはいずれか耐性試験ベクター単独においても表出不足である。
宿主細胞
耐性試験ベクターは宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は哺乳類動物の細胞である。好ましい宿主細胞は、ウィルス感染の原理的な標的であるヒトの組織及び細胞から誘導される。ＨＩＶの場合、これらにはヒト細胞、例えば、ヒトＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、及び他の細胞が含まれる。ＨＢＶの場合、適切な宿主細胞には肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、一次ヒト肝細胞、偽型ＨＢＶに感染し得る哺乳類動物の細胞、及び他の細胞が含まれる。ヒトから誘導された宿主細胞は、抗ウィルス剤が細胞に効率的に侵入し、細胞の酵素機構によってその抗ウィルス剤の代謝的に関連する形態に変換されることを保証する。宿主細胞は、ここでは、「パッケージング宿主細胞」、「耐性試験ベクター宿主細胞」、又は「標的宿主細胞」と呼ばれる。「パッケージング宿主細胞」は、耐性試験ベクターのようなここで用いられる複製欠陥ウィルスベクターが耐性試験ベクターウィルス粒子を産生するのに必要とするトランス作用性因子及びウィルスパッケージングタンパク質をもたらす宿主細胞を指す。このパッケージングタンパク質は、耐性試験ベクターそれ自体、パッケージング発現ベクター（１つもしくは複数）、又はその両者に含まれるウィルス遺伝子の発現によってもたらされ得る。パッケージング宿主細胞は１以上のパッケージング発現ベクターがトランスフェクトされている宿主細胞であり、これに耐性試験ベクターがトランスフェクトされた場合には、ここでは「耐性試験ベクター宿主細胞」と呼ばれ、時にはパッケージング宿主細胞／耐性試験ベクター宿主細胞と呼ばれることもある。ＨＩＶのパッケージング宿主細胞として用いるのに好ましい宿主細胞には、２９３ヒト胎児腎臓細胞（２９３，Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）、ＢＯＳＣ２３（Ｐｅａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０，８３９２，１９９３）、ｔｓａ５４及びｔｓａ２０１細胞系（Ｈｅｉｎｚｅｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，３７３８，１９８８）、ＨＢＶについてはＨｅｐＧ２（Ｇａｌｌｅ及びＴｈｅｉｌｍａｎｎ，Ｌ．Ａｒｚｈｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｙ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．（１９９０）４０，１３８０−１３８２）が含まれる。（Ｈｕｈ，Ｕｅｄａ，Ｋら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＊１９８９）１６９，２１３−２１６）。「標的宿主細胞」は、インジケータ遺伝子の発現もしくは阻害が行われる耐性試験ベクター宿主細胞によって生じた耐性試験ベクターウィルス粒子に感染させようとする細胞を指す。標的宿主細胞として用いるのに好ましい宿主細胞には、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）（ＡＴＣＣ  Ｔ１Ｂ−１５２）、Ｈ９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７６）、ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）、ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ  Ｔ１Ｂ−１６１）、及びそれらの誘導体を含むヒトＴ細胞白血病細胞系が含まれる。
薬剤感受性及び耐性試験
本発明の薬剤感受性及び耐性試験は１以上の宿主細胞において行うことができる。ウィルスの薬剤感受性は、インジケータ遺伝子の発現の所定のパーセンテージが阻害される抗ウィルス剤の濃度として決定される（例えば、抗ウィルス剤のＩＣ50はインジケータ遺伝子の発現の５０％が阻害される濃度である）。所定の抗ウィルス剤の薬剤感受性についての標準曲線は、標準的な実験ウィルスセグメントであるか又は薬剤未経験（ｄｒｕｇ−ｎａｔｉｖｅ）の患者（すなわち、いかなる抗ウィルス剤も投与されたことのない患者）からのウィルスセグメントについて、本発明の方法を用いて作成することができる。それに対応して、ウィルスの薬剤耐性は、薬剤感受性をその所定の標準と比較することによる、又は同じ患者において全期間にわたって連続的に測定することによる、インジケータ遺伝子の発現の阻害の増加（すなわち、インジケータ遺伝子の発現の減少）によって決定される所定の患者についてのウィルスの薬剤感受性における低下である。
第１のタイプの薬剤感受性及び耐性試験においては、パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクターをトランスフェクトし、かつ発現ベクター（１つもしくは複数）をパッケージ化することにより調製される第１の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）により耐性試験ベクターウィルス粒子を生成させる。次に、この耐性試験ベクターウィルス粒子を用いて、インジケータ遺伝子の発現が測定されている第２の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させる。機能的又は非機能的インジケータ遺伝子のいずれの場合においても、このような耐性試験ベクターがトランスフェクトされているパッケージング宿主細胞を含む２細胞系（これは耐性試験ベクター宿主細胞と呼ばれる）及び標的細胞を用いる。機能的インジケータ遺伝子はパッケージング宿主細胞のトランスフェクトの際に効率的に発現し、本発明の試験を実施するのに標的宿主細胞を耐性試験ベクター宿主細胞上清で感染させることを必要とする。順序の入れ替わったプロモーター、順序の入れ替わったコーディング領域、又は反転イントロンを伴う非機能的インジケータ遺伝子はパッケージング宿主細胞のトランスフェクトの際に効率的に発現することはなく、そのため、標的宿主細胞の感染は耐性試験ベクター宿主細胞及び標的宿主細胞による同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）又は耐性試験ベクター宿主細胞上清を用いる標的宿主細胞の感染のいずれかによって達成することができる。第２のタイプの薬剤感受性及び耐性試験においては、単一の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）が標的宿主細胞としての役目も果たす。パッケージング宿主細胞をトランスフェクトして耐性試験ベクターウィルス粒子を生成させ、かつこれらのパッケージング宿主細胞の幾つかをその耐性試験ベクター粒子による感染の標的にもする。単一の型の宿主細胞を用いる薬剤感受性及び耐性試験は、順序の入れ替わったプロモーター、順序の入れ替わったコーディング領域、又は反転イントロンを伴う非機能的インジケータ遺伝子を含むウィルス耐性試験ベクターで可能である。このようなインジケータ遺伝子は第１の細胞のトランスフェクトの際には効率的に発現することがないが、第２の細胞の感染の際にのみ効率的に発現し、それにより評価中の抗ウィルス剤の効果を測定する機会をもたらす。機能的インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを用いる薬剤感受性及び耐性試験の場合には、同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）手順も、単一の細胞型を用いる耐性及び感受性試験も、標的細胞の感染には用いることができない。機能的インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターは、標的宿主細胞の感染に、耐性試験ベクター宿主細胞からの濾過された上清を用いる２細胞系を必要とする。
ＨＩＶの場合の本発明の態様の１つにおいて、粒子ベースの耐性試験は、ゲノムウィルスベクターから誘導される耐性試験ベクター、すなわち、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａ（ｐＣＸＡＳ−４０７０Ａｅｎｖとも呼ばれる）で同時トランスフェクトされているｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｓＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、及びｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２−ＡＡを用いて行われる。あるいは、粒子ベースの耐性試験は、サブゲノムウィルスベクターから誘導される耐性試験ベクター、すなわち、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａ及びｐＬＴＲ−ＨＩＶ３′又はｐＣＭＶ−ＨＩＶ３′のいずれかで同時トランスフェクトされているｐＬＳ−ＩｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｓＰＣ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、及びｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを用いて行うことができる。ＨＩＶの場合の本発明の別の態様においては、非粒子ベースの耐性試験が、上述の耐性試験ベクターの各々を用いて、パッケージング発現ベクターが存在しない条件下での選択された宿主細胞のトランスフェクトにより行われる。
粒子ベースの感受性及び耐性試験の場合、パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクター及びパッケージング発現ベクター（１つもしくは複数）をトランスフェクトすることにより調製される第１の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）によって、耐性試験ベクターウィルス粒子が生成する。この耐性試験ベクターウィルス粒子は、次に、インジケータ遺伝子の発現が測定されている第２の宿主細胞（標的宿主細胞）の感染に用いられる。第２のタイプの粒子ベースの感受性及び耐性試験においては、単一の宿主細胞型（耐性試験ベクター宿主細胞）が両方の目的を果たす：所定の培養物中のパッケージング宿主細胞のあるものをトランスフェクトして耐性試験ベクターウィルス粒子を生成させ、かつ同じ培養物中の宿主細胞のあるものがそれによって生じる耐性試験ベクター粒子による感染の標的である。単一の宿主細胞型を用いる耐性試験は、順序の入れ替わったプロモーターを伴う非機能的インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターで可能である。これは、そのようなインジケータ遺伝子が許容的宿主細胞の感染の際には効率的に発現し、同じ宿主細胞型の形質転換の際には効率的に発現することがなく、それにより評価中の抗ウィルス剤の効果を測定する機会をもたらすためである。同様の理由で、２種類の細胞型を用いる耐性試験は、第２の細胞型に第１の細胞型の上清から得られるウィルス粒子を感染させる代わりに２種類の細胞型を同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）することにより行うことができる。
非粒子ベースの感受性及び耐性試験の場合、耐性試験はパッケージング発現ベクターが存在しない条件下で単一の宿主細胞に耐性試験ベクターをトランスフェクトすることにより行う。非粒子ベースの耐性試験は、順序の入れ替わったプロモーター、順序の入れ替わったコーディング領域又は反転イントロンのいずれかを伴う非機能的インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを用いて行う。これらの非粒子ベースの耐性試験は、パッケージング発現ベクターが存在しない条件下で単一の宿主細胞型に耐性試験ベクターの各々をトランスフェクトすることにより行う。これらの耐性試験ベクター内に含まれる非機能的インジケータ遺伝子は宿主細胞のトランスフェクトの際に効率的に発現することはないが、非ウィルス粒子ベースの逆転写から生じる検出可能なインジケータ遺伝子の発現が存在する。逆転写及び鎖転移の結果、順序の入れ替わった非機能的インジケータ遺伝子の順序が変更されていない機能的インジケータ遺伝子への変換が生じる。逆転写が各耐性試験ベクター内に含まれるｐｏｌ遺伝子の発現に完全に依存するため、抗ウィルス剤を、それらの耐性試験ベクター内に含まれる患者由来セグメントによってコードされるｐｏｌ遺伝子産生物を阻害するそれらの能力について試験することができる。ＨＩＶの場合、逆転写及び鎖転移の結果、非機能的インジケータ遺伝子の機能的インジケータ遺伝子への変換が生じる。逆転写が各耐性試験ベクター内に含まれる患者由来セグメントの発現に完全に依存するため、抗ウィルス剤を、それらの耐性試験ベクター内に含まれる患者由来セグメントによってコードされる遺伝子産生物を阻害するそれらの能力について試験することができる。
パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクター及び適切なパッケージング発現ベクター（１つもしくは複数）をトランスフェクトして耐性試験ベクター宿主細胞を生成させる。逆転写酵素阻害剤ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ及び３ＴＣ、並びにプロテアーゼ阻害剤サキナビル、リトナビル及びインジナビルをそれらの組み合わせに加えて含む個々の抗ウィルス剤を、パッケージング宿主細胞の個々のプレートに、それらのトランスフェクトの時点に、適切な濃度範囲で添加する。トランスフェクトの２４ないし４８時間後、標的宿主細胞を、耐性試験ベクター宿主細胞又は耐性試験ベクター宿主細胞の濾過した上清から得られる耐性試験ベクターウィルス粒子で感染させる。抗ウィルス剤の各々又はそれらの組み合わせを、感染に先立って、もしくは感染の時点で標的宿主細胞に添加して、形質転換の間存在する、所定の薬剤（１種もしくは複数）の同じ最終濃度を達成する。
同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）により、又は濾過したウィルス上清を用いて感染させた標的宿主細胞におけるインジケータ遺伝子の発現又は阻害の決定は、インジケータ遺伝子の発現の検定により、例えばインジケータ遺伝子がホタルｌｕｃ遺伝子である場合にはルシフェラーゼの活性を測定することにより行う。所定の抗ウィルス剤の存在下において耐性試験ベクターウィルス粒子の所定の調製品を用いて感染させた標的宿主細胞について観察されたルシフェラーゼの活性における、抗ウィルス剤（１種もしくは複数）が存在しない条件下での対照実験と比較しての減少は、一般にシグモイド曲線としての抗ウィルス剤の濃度の対数に関連する。この阻害曲線を用いて、耐性試験ベクター内に存在する患者由来セグメントによってコードされるウィルス標的産生物に対するその薬剤もしくは薬剤の組み合わせの見かけの阻害濃度（ＩＣ）を算出する。
１個の細胞の感受性及び耐性試験の場合、宿主細胞に耐性試験ベクター及び適切なパッケージング発現ベクター（１つもしくは複数）をトランスフェクトし、耐性試験ベクター宿主細胞を生成させる。個々の抗ウィルス剤もしくはそれらの組み合わせを、トランスフェクトした細胞の個々のプレートに、それらのトランスフェクトの時点に適切な濃度範囲で添加する。トランスフェクトの２４ないし７２時間後、細胞を集め、ホタルルシフェラーゼの活性について検定する。この培養物中のトランスフェクト細胞はインジケータ遺伝子を効率的に発現しないため、培養物中のトランスフェクト細胞、それに加えて培養物中の重感染細胞はインジケータ遺伝子の発現の標的宿主細胞としての役目を果たし得る。所定の抗ウィルス剤（１種もしくは複数）の存在下で形質転換された細胞について観察されたルシフェラーゼの活性における、抗ウィルス剤（１種もしくは複数）が存在しない条件下での対照実験と比較しての減少は、一般にシグモイド曲線としての抗ウィルス剤の濃度の対数に関連する。この阻害曲線を用いて、耐性試験ベクター内に存在する患者由来セグメントによってコードされるウィルス標的産生物に対する薬剤もしくは薬剤の組み合わせの見かけの阻害濃度（ＩＣ）を算出する。
抗ウィルス剤／薬剤候補
試験系に添加される抗ウィルス剤は、その抗ウィルス剤の標的に応じて選択された時期に添加される。例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、及びネルフィナビルを含むＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の場合には、それらに耐性試験ベクターがトランスフェクトされる時点に適切な濃度範囲で、パッケージング宿主細胞の個々のプレートに添加される。また、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は感染の時点にも添加され、形質転換の間に添加されるものと同じ最終濃度を達成する。ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ及びネバリピンを含むＨＩＶ逆転写酵素阻害剤は、耐性試験ベクターによる感染の時点に試験濃度で、標的宿主細胞の個々のプレートに添加される。あるいは、抗ウィルス剤は検定を通して存在していてもよい。試験濃度は、典型的には約０．１ｎＭないし約１００（Ｍであり、以下の薬剤の各々についてより具体的には：ＡＺＴ、約１ｎＭないし約５（Ｍ；ｄｄＩ、約１ｎＭないし約２５（Ｍ；３ＴＣ、約１ｎＭないし約５０（Ｍ；ｄ４Ｔ、約１ｎＭないし約２５（Ｍ；及び、ネバリピン、約１ｎＭないし約１００（Ｍである濃度範囲から選択される。
本発明の別の態様においては、抗ウィルス性化合物候補を本発明の薬剤感受性及び耐性試験において試験する。抗ウィルス性化合物候補を、適切な濃度及びその抗ウィルス剤候補のタンパク質標的に応じた選択された時点で、試験系に添加する。あるいは、２種以上の抗ウィルス性化合物候補を試験することが可能であり、又は認可された抗ウィルス剤、例えばＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、サキナビル又はリトナビル、もしくはインジノビルのような臨床試験中の化合物との組み合わせで抗ウィルス性化合物候補を試験することができる。抗ウィルス剤候補の有効性は、インジケータ遺伝子の発現又は阻害を測定することにより評価する。この態様の別の側面においては、薬剤感受性及び耐性試験をウィルス変異体のスクリーニングに用いることができる。既知の抗ウィルス剤又は抗ウィルス剤候補のいずれかに対する耐性変異体を同定した後、その変異体を単離してそのＤＮＡを分析する。このようにしてウィルス耐性変異体のライブラリーを構築することができ、これは抗ウィルス剤候補を単独で、もしくは組み合わせてスクリーニングすることを可能にする。
一般的な材料及び方法
ベクターの構築、並びに細胞のトランスフェクト及び感染に用いられる技術の大部分は当該技術分野において広範に実施されているものであり、ほとんどの開業者は特定の条件及び手順を説明する標準的な資材に習熟している。しかしながら、便宜上、以下の段落が指針として役立ち得る。
「プラスミド」及び「ベクター」は文字及び／又は数字が続く小文字のｐで示される。ここでの出発プラスミドは市販されているか、もしくは無制限に公的に利用可能であるもののいずれかであり、又は利用可能なプラスミドから公開されている手順に従って構築することができる。加えて、記述されるものと等価のプラスミドが当該技術分野において公知であり、通常の技術を有する技術者には明らかである。
本発明のベクターの構築は、当該技術分野において十分理解されている標準的なライゲーション及び制限技術を用いる（Ａｕｓｕｂｅｌら，（１９８７）分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ又は分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．におけるＭａｎｉａｔｉｓら，（１９９２）を参照のこと）。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成オリゴヌクレオチドを開裂し、あつらえ、所望の形態に追い込む。合成ＤＮＡを含む全てのＤＮＡ構築体の配列をＤＮＡ配列分析により確認した（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４，５４６３−５４６７）。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡにおける特定の配列、制限部位、でのみ作用する制限酵素を用いるＤＮＡの酵素的開裂を指す。ここで用いられる様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子及び他の必要条件は通常の技術を有する技術者に公知である。分析のためには、典型的には１（ｇのプラスミド又はＤＮＡ断片が約２単位の酵素と共に約２０（ｌのバッファー溶液中で用いられる。あるいは、ＤＮＡ基質の完全な消化を保証するため、過剰の制限酵素が用いられる。変動も許容され得るが、約３７℃で約１時間ないし２時間のインキュベーション時間が利用可能である。各々のインキュベーションの後、フェノール／クロロホルムで抽出することによりタンパク質を除去し、続いてエーテル抽出を行ってもよく、かつ水性画分からエタノールを用いる沈殿により核酸を回収する。所望であれば、標準技術を用いるポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により開裂した断片のサイズ分離を行うことができる。サイズ分離の一般的な記述は酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５：４９９−５６０（１９８０）に見出される。
制限開裂した断片は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）の大断片を用いて、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下において、２０℃で約１５ないし２５分のインキュベーション時間を用いて、５０ｍＭトリス（ｐｈ７．６）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  ＤＴＴ及び５−１０ｍＭ  ｄＮＴＰ中で処理することにより平滑末端化することができる。このクレノウ断片は５′粘着末端を埋めはするが、たとえ４種類のｄＮＴＰが存在しても、突出する３′単鎖を崩してならしてしまう。所望であれば、ｄＮＴＰのうちのその粘着末端の性質によって指示される制限内の１種のみを供給することにより、すなわち選択されたｄＮＴＰを用いて、選択的修復を行うことができる。クレノウで処理した後、その混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させる。適切な条件下においてＳ１ヌクレアーゼ又はＢａｌ−３１で処理することにより、あらゆる一本鎖タンパク質の加水分解が生じる。
ライゲーションは１５−５０（ｌの容量で以下の標準的な条件及び温度の下で行う：２０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０℃で４０ｍＭ  ＡＴＰ、０．０１−０．０２（ワイス（Ｗｅｉｓｓ））単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」ライゲーション用）又は１４℃で１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３−０．６（ワイス）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション用）のいずれか。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、３３−１００（ｇ／ｍｌ）の総ＤＮＡ濃度（５−１００ｍＭの総末端濃度）で行なわれる。分子間平滑末端ライゲーション（通常、１０−３０倍モル過剰のリンカーを用いる）は１ｍＭの総末端濃度で行われる。
「一過性発現」は形質転換の約１日ないし２週間以内の非増幅発現を指す。特に望ましい異種タンパク質の一過性発現の最適時間は、例えば利用することができるあらゆるトランス作用性因子、翻訳制御機構及び宿主細胞を含む幾つかの因子に応じて変化し得る。一過性発現は、トランスフェクトされているプラスミドが機能する、すなわちそれが転写及び翻訳されている場合に生じる。この期間に、細胞に侵入しているプラスミドＤＮＡは核に移送される。このＤＮＡは組み込まれていない状態にあり、核内で遊離している。細胞に取り込まれたプラスミドの転写はこの期間に生じる。トランスフェクトに続いて、プラスミドＤＮＡは細胞分裂により分解もしくは希釈される。細胞染色質内での無作為の統合が生じる。
一般に、宿主細胞に適合する種から誘導されるプロモーター及び制御配列を含むベクターが特定の宿主細胞と共に用いられる。原核生物の細胞と共に用いるのに適するプロモーターには、説明として、ベータ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の機能的細菌プロモーターも適している。原核生物に加えて、酵母培養物のような真核微生物を用いることもできる。多くの他の株が一般に利用可能ではあるが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわちパン酵母が最も一般的に用いられる真核微生物である。哺乳類動物の宿主細胞におけるベクターからの転写を制御するプロモーターは、様々な源、例えば、ポリオーマ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び、好ましくは、サイトメガロウィルスのようなウィルスのゲノムから、又は異種哺乳類動物プロモーター、例えば、ｂ−アクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルスの複製起点をも含むＳＶ４０制限断片として都合よく得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく得られる。もちろん、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもここでは有用である。
ここで用いられるベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいてもよい。選択遺伝子は、そのベクターをトランスフェクトした宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。哺乳類動物の細胞に適する選択可能マーカーの例には、ジヒドロホレート還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、アデノシン脱アミノ酵素遺伝子及びグルタミン合成酵素遺伝子が含まれる。このような選択可能マーカーが哺乳類動物の宿主細胞にうまく移送されると、その形質転換宿主細胞は選択圧の下におかれても生存することができる。選択措置には広範に用いられる２つの異なる範疇が存在する。第１の範疇は、細胞の代謝及び補足された培地とは無関係に成長能力を欠く変異細胞系の使用に基づく。第２の範疇は優性選択と呼ばれ、これは、あらゆる細胞型において用いられ、かつ変異細胞系の使用を必要としない選択体系を指す。これらの体系は、典型的には、薬剤を用いて宿主細胞の成長を停止させる。新規遺伝子を有する細胞は薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、この選択を生き延びる。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，１４２２）、又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，４１０−４１３）が用いられる。上述の３つの例では、それぞれ適切な薬剤ネオマイシン（Ｇ４１８もしくはゲンチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性を伝達するのに真核性の制御の下にある細菌遺伝子が用いられる。
「トランスフェクト」は、宿主細胞にＤＮＡを導入し、それにより機能的な発現であろうと他の方法であろうとそのＤＮＡを発現させることを意味する；また、このＤＮＡは染色体外要素として複製しても、染色体の統合によって複製してもよい。他の方法で提供されない限り、ここで宿主細胞の形質転換に用いられる方法はＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４５７のリン酸カルシウム共沈殿法である。トランスフェクトのための代わりの方法は、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション及び微粒子銃法（Ｋｒｉｇｌｅｒ（１９９０）遺伝子の伝達及び発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）である。
宿主細胞は本発明の発現ベクターでトランスフェクトし、プロモーターの誘発、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適するように改変した通常の栄養培地において培養することができる。宿主細胞は、グルタミンを添加し、かつ抗生物質を含まないＦ１２：ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））５０：５０において培養する。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に関して従来用いられるものであり、通常の技術を有する技術者には明らかである。
以下の例は、単に本発明の実施について現在知られる最良の態様を説明するものであるが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。全ての参考文献は参照して明確に組み込まれる。
実施例１
患者由来セグメントと順序の入れ替わったプロモーターを備えた非機能性インジケーター遺伝子を含む耐性試験ベクターを用いた、ＨＩＶ薬剤感受性および耐性試験
インジケーター遺伝子ウィルスベクター−構築
順序の入れ替わったプロモーターを備えた非機能性インジケーター遺伝子を含むインジケーター遺伝子ウィルスベクターを、抗ウィルス薬の標的であるウィルス遺伝子を含むＨＩＶゲノミックおよびサブゲノムウィルスベクターを用いてデザインした。インジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＰは、ゲノミックウィルスベクター、ｐＬＧおよびｐＣＧに基づく；各々がＨＩＶのｅｎｖ遺伝子に欠失を有している。ゲノミックインジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰとｐＣＧ−ｌｕｃＰＰから誘導される耐性試験ベクターは、患者由来セグメントを挿入するための患者配列アクセプタ部位を含み、アンホトロピックＭＬＶ  ４０７０Ａ  ｅｎｖ遺伝子産物をコードするパッケージング発現ベクターと共に使用される。インジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰは、サブゲノムウィルスベクター、ｐＬＳおよびｐＣＳに基づく；各々はＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子だけをコードする。サブゲノミックインジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰとｐＣＳ−ｌｕｃＰＰから誘導される耐性試験ベクターは、患者由来セグメントを挿入するための配列アクセプタ部位を含み、ＨＩＶ  ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆ遺伝子をコードする第一のパッケージング発現ベクターおよびアンホトロピックＭＬＶ  ４０７０Ａ  ｅｎｖ遺伝子産物をコードする第二のパッケージングベクターと共に使用される。
ＨＩＶウィルスベクター−ゲノミックおよびサブゲノミック
生物学的に活性なプロウィルスクローン、ＨＸＢ２（Ｆｉｓｈｅｒら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２０、３６７−３７１）の配列を用いてＨＩＶウィルスベクターをデザインした。２種類のウィルスベクターをデザインした：ｅｎｖのような単一遺伝子中に欠失を有するが、さもなければ完全なウィルスのｍＲＮＡ発現およびプロセシング特性を保存しているゲノミックウィルスベクター、ならびにｇａｇ−ｐｏｌのような、代表的に感受性および耐性試験の特異的標的となる１個または数個の遺伝子だけを含むか、あるいは全くウィルス遺伝子を欠如しているサブゲノムウィルスベクター。どちらの種類のベクターも、インジケーター遺伝子カセットを挿入するためのウィルスゲノム内の独自の制限部位ならびに患者配列アクセプタ部位、すなわち患者由来のＨＩＶ配列を挿入することができる、抗ウィルス標的遺伝子（例えばｐｏｌ）の近くあるいはその中の付加的な独自の制限部位を有する。さらに、両方の種類のベクターを、ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域の天然エンハンサー−プロモーターあるいはＣＭＶ直前（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）（ＩＥ）領域からの異種エンハンサー−プロモーターのいずれかを取り込むようにデザインした。プラスミドＤＮＡの構築には標準的な方法を使用する（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。合成ＤＮＡを組み込んだＤＮＡ構築物の配列はすべてＤＮＡ塩基配列分析によって確認される（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４、５４６３−５４６７）。
ＨＩＶ配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ  ＫＳ（＋）プラスミドクローニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のポリリンカーに挿入された、ＨｐａＩからＸｂａＩまでの制限断片上のＨＸＢ２プロウィルスＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＨＩＶ（Ｐａｇｅら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４、５２７０−５２７６）から得られる。このプロウィルスクローンは、プロウィルス組込みの部位から特性付けられていないフランキングヒトＤＮＡを含むので、プラスミドｐＢＳ−ＨＩＶを鋳型として使用し、２段階の部位定方向突然変異生成を用いてそのような配列を取り除く。第一段階では、５’から３’の方向に次の配列を含むオリゴヌクレオチド１を用いて、５’ＬＴＲに隣接するヒト配列を取り除く：１）左側Ｕ３領域内の、組込まれたプロウィルスの最初の１８ヌクレオチドに相補的な配列、２）６ヌクレオチドＳｍａＩ部位、および３）ポリリンカーおよびファージＴ３プロモーターを越えてすぐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）中の領域に相補的な１８ヌクレオチド配列。第二段階では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド２を用いて５’ＬＴＲに隣接するヒト配列を取り除く：１）ＬａｃＺ遺伝子内の、ＰｖｕＩ部位を越えてすぐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）中の領域に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）６ヌクレオチドＸｂａＩ部位、および３）右側Ｕ５領域内の、組込まれたプロウィルスの最後の１８ヌクレオチドに相補的な配列。生じるプラスミドをｐＢＳ−ＨＸＢ２と称する。
抗ウィルス標的遺伝子の発現のためにエンハンサー−プロモーターとしてＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域を用いるゲノミックおよびサブゲノムウィルスベクター（図１）は、各々、１段階の部位定方向突然変異生成によってプラスミドｐＢＳ−ＨＸＢ２から誘導される。ｅｎｖ遺伝子に欠失しているゲノミックウィルスベクターｐＬＧは、次の配列を含む（５’から３’まで）オリゴヌクレオチド３を用いて調製する：１）ｅｎｖ遺伝子内のＨＸＢ２の７６２６位から７６４３位までに相補的な１８ヌクレオチド配列（ＨＸＢ２に関する座標はすべてＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号Ｋ０３４５５を参照する）、２）８ヌクレオチドＮｏｔＩ部位、および３）ｅｎｖ遺伝子内のＨＸＢ２の６３８４位から６４０１位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ遺伝子に欠失しているサブゲノムウィルスベクターｐＬＳは、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド４を用いて調製する、１）ｅｎｖ遺伝子内のＨＸＢ２の７６２６位から７６４３位までに相補的な１８ヌクレオチド配列、２）８ヌクレオチドＮｏｔＩ部位、および３）ｖｉｆ遺伝子内のＨＸＢ２の５１０９位から５１２６位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。
抗ウィルス標的遺伝子の発現のためのエンハンサー−プロモーターとしてＣＭＶ  ＩＥ領域を用いるゲノミックおよびサブゲノムウィルスベクターは、プラスミドｐＬＧおよびｐＬＳから誘導され、各々ｐＣＧおよびｐＣＳと称する（図１）。ゲノミックウィルスベクターｐＣＧは２段階で調製される。第一段階では、２つのＤＮＡ断片から中間プラスミドを調製する：１）プラスミドｐＬＧをＳｍａＩで消化し、そのベクターをアルカリホスファターゼで処理して調製した１１．２ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＶＬ−１（以下に述べる）をＳｍａＩで消化して調製したＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターを含む０．９ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲと同じ転写方向にＣＭＶ  ＩＥ領域を含むプラスミドを、制限酵素切断地図の作製によって同定する。第二段階では、この中間プラスミドから部位定方向突然変異生成によってプラスミドｐＣＧを調製し、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド５を用いて、Ｒ領域の冒頭部分の転写開始を生じさせることができる位置で、５’−ＬＴＲ  Ｒ領域にＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターを連結する：１）Ｒ領域の冒頭部分の、ＨＸＢ２の４５５位から４７２位までに相補的な１８ヌクレオチド配列、および２）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターの−１８位から−１位までに相補的な１８ヌクレオチド配列（座標はＢｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１、５２１−５３０を参照する）。サブゲノムウィルスベクターｐＣＳはプラスミドｐＣＧから誘導され、２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した９．１ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
ゲノミックインジケーター遺伝子ウィルスベクター−順序の入れ替わったプロモーター
インジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰとｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ、およびそれらから誘導される耐性試験ベクターは、５’から３’までの方向に次の要素を含む（図２Ｂ）：ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ）あるいはＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｒ領域、３）ＬＴＲと反対の転写方向を有する挿入されたＴ７プロモーターを含むＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ５領域、４）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、欠失ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子のコード領域、５）欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入されたインジケーター遺伝子カセット、ならびに６）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。同じインジケーター遺伝子カセットがｐＬＧ−ｌｕｃＰＰとｐＣＧ−ｌｕｃＰＰに挿入され、次の要素を含む：１）内部リボソームがエントリーすることのできるＥＭＣ  ５’−ＵＴＲ領域、２）ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子の完全なコード領域、および３）Ｔ７転写ターミネーター。インジケーター遺伝子はＨＩＶ−ＬＴＲあるいはＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターと反対の転写方向を持ち、それ故これらの要素によって機能的に転写されえない。インジケーター遺伝子カセットはＴ７プロモーターの上流に位置するので、インジケーター遺伝子はＴ７プロモーターによっても転写されない。逆転写と鎖転移後、Ｔ７プロモーターは５’ＬＴＲから３’ＬＴＲにコピーされ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって新たに創造されたＴ７プロモーターからのインジケーター遺伝子の機能的転写が可能となる（図２Ｃ）。
インジケーター遺伝子カセットを含むプラスミドｐｌｕｃＰＰは３段階で調製される。第一段階では、ＥＭＣ  ５’−ＵＴＲ要素とＴ７転写ターミネーターを備えた独自のＮｏｔＩ部位によって近接されたカセットを含むプラスミドｐＶＬ−ＥＭＣ／Ｔ７を２つのＤＮＡ断片から調製する；１）プラスミドｐＶＬ（以下に述べる）をＮｏｔＩで消化し、そのベクターをアルカリホスファターゼで処理して調製した３．０ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＴＭ１（Ｍｏｓｓら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、９１−９２）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド６と７をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＮｏｔＩによる消化によって調製した、ＥＭＣ  ５’ＵＴＲおよびＴ７ターミネーターを含む０，８ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド６および７は各々ＮｏｔＩ制限部位を組込んでいる。第二段階では、哺乳類発現ベクターｐＶＬ−１（以下に述べる）に挿入されたホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を含むプラスミドｐＶＬ−ｌｕｃを、２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＶＬ−１をＮｒｕＩとＢｇｌＩＩで消化して調製した４．１ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＧＥＭ−ｌｕｃ（ウィスコンシン州マディスンのプロメガ社、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド８と９をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＮｒｕＩとＢｇｌＩＩによる消化によって調製した、完全なルシフェラーゼコード領域を含む１．７ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド８および９は、各々ＮｒｕＩとＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ制限部位を組込んでいる。第三段階では、ＥＭＣ  ５’−ＵＴＲ要素とＴ７転写ターミネーターの間に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を含むプラスミドｐｌｕｃＰＰを、２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＶＬ−ＥＭＣ／Ｔ７をＮｃｏＩとＳａｌＩで消化して調製した３．８ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＶＬ−ｌｕｃをＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化して調製した、完全なルシフェラーゼコード領域を含む１．７ｋＢのＤＮＡ断片。
プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰは２段階で調製される。第一段階では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１０を用いて、部位定方向突然変異生成によりプラスミドｐＬＧ中の上流のＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ５領域にファージＴ７プロモーターを挿入して、プラスミドｐＬＧ−Ｔ７を調製する：１）Ｕ５領域内のＨＸＢ２の５５２位から５６９位までに相補的な１８ヌクレオチド配列、２）Ｔ７プロモータに相補的な２０ヌクレオチド配列、ならびに３）Ｕ５領域内のＨＸＢ２の５３４位から５５１位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。第二段階では、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＧ−Ｔ７をＮｏｔＩで消化し、生じるベクターをアルカリホスファターゼで処理して調製した１１．２ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐｌｕｃＰＰをＮｏｔＩで消化して調製したルシフェラーゼインジケーター遺伝子カセットを含む２．５ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲと反対の転写方向を有するウィルスベクターに挿入されたインジケーター遺伝子カセットを含む、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰに対応するクローンを制限酵素切断地図の作製によって同定する。
プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰは２段階で調製される。第一段階では、オリゴヌクレオチド１０を用いた部位定方向突然変異生成により、プラスミドｐＣＧ中の上流のＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ５領域にファージＴ７プロモーターを挿入してプラスミドｐＣＧ−Ｔ７を調製する。第二段階では、プラスミドＰＣＧ−ｌｕｃＰＰを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＣＧ−Ｔ７をＮｏｔＩで消化し、生じるベクターをアルカリホスファターゼで処理して調製した１１．７ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐｌｕｃＰＰをＮｏｔＩで消化して調製したルシフェラーゼインジケーター遺伝子カセットを含む２．５ｋＢのＤＮＡ断片。ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターおよびウィルスＬＴＲと反対の転写方向を有するウィルスベクターに挿入されたインジケーター遺伝子カセットを含む、ｐＣＧｌｕｃＰＰに対応するクローンを制限酵素切断地図の作製によって同定する。
サブゲノミックインジケーター遺伝子ウィルスベクター−順序の入れ替わったプロモーター  インジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰとｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ、およびそれらから誘導される耐性試験ベクターは、５’から３’までの方向に次の要素を含む（図２Ｂ）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ）あるいはＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｒ領域、３）ＬＴＲと反対の転写方向を有する挿入されたＴ７プロモーターを含むＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ５領域、４）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコード領域、５）インジケーター遺伝子カセット、６）ウィルスパッケージング配列を含むＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子からのＲＲＥ要素、ならびに７）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰのインジケーター遺伝子カセットは、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＰにおけるものと同じである。後者のベクターについては、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰとｐＣＳ−ｌｕｃＰＰのインジケーター遺伝子は、逆転写と鎖転移によってＴ７プロモーターが５’ＬＴＲから３’ＬＴＲにコピーされるまでは機能的に転写されえない（図２Ｃ）。
プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰは２段階で調製される。第一段階では、プラスミドｐＬＳの上流のＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ５領域に挿入されたファージＴ７プロモーターを含むプラスミドｐＬＳ−Ｔ７を、２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した９．１ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＬＧ−Ｔ７をＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した、挿入されたＴ７プロモーターを含むＲ５領域を備えたＨＩＶ−ＬＴＲを含む０．８のＤＮＡ断片。第二段階では、プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳ−Ｔ７をＮｏｔＩで消化し、生じるベクターをアルカリホスファターゼで処理して調製した９．９ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐｌｕｃＰＰをＮｏｔＩで消化して調製したルシフェラーゼインジケーター遺伝子カセットを含む２．５ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲと反対の転写方向を持つウィルスベクターに挿入されたインジケーター遺伝子カセットを含む、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰに対応するクローンを、制限酵素切断地図を作製して同定する。
プラスミドｐＣＳ−ｌｕｃＰＰを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１１．６ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧ−Ｔ７をＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した、挿入されたＴ７プロモーターを有するＲ５領域に融合されたＣＭＶ  ＩＥプロモーターを含む１．３のＤＮＡ断片。
耐性試験ベクター−構築
耐性試験ベクターは次の方法によって調製される：１）ｐｏｌ遺伝子の中あるいは近くに、患者配列アクセプタ部位と称される独自の制限部位を導入することにより、インジケーター遺伝子ウィルスベクター、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰを修飾する、２）感染患者の血清あるいは細胞中に存在するウィルスＲＮＡあるいはＤＮＡから調製した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いたＰＣＲにより、ＨＩＶプロテアーゼおよび逆転写酵素に対応する患者由来セグメントを増幅する、そして３）増幅された配列を患者配列アクセプタ部位においてインジケーター遺伝子ウィルスベクター内に正確に挿入する（図２Ｂ）。４つのインジケーター遺伝子ウィルスベクターの各々に、部位定方向突然変異生成によって２組の患者配列アクセプタ部位を導入する。最初の組の患者配列アクセプタ部位は、プロテアーゼコード領域全体と逆転写酵素コード領域の大部分を含む間隔を定義するＨｐａＩ部位とＳａｌＩ部位から成り、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳを生じる。２番目の組の患者配列アクセプタ部位は、同じ間隔を定義するＰｖｕＩ部位とＢａｍＨＩ部位から成り、各々プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを生じる。一定の患者配列アクセプタ部位と同じ内部制限部位を含む患者由来セグメントの発現を改善するために、一部の耐性試験では、同じ制限部位間隔を定義する耐性試験ベクターの同族対（例えばｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳとｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから誘導されるもの）を一緒に使用し、その結果いずれかの耐性試験ベクター単独では過少発現されることになる。
プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳは、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰを鋳型として用いた部位定方向突然変異生成の３つの連続的段階によって調製される。最初の２段階は、２つの新しい制限部位を導入することを目的とし、その内のひとつ（ＨｐａＩ）は各々のインジケーター遺伝子ウィルスベクターに独自のであり、もうひとつ（ＳａｌＩ）は既にインジケーター遺伝子ウィルスベクター中に存在している。第三段階は、各々のベクター中の既存のＳａｌＩ部位を欠失して、導入されたＳａｌＩ部位を独自のにすることを目的とする。段階１では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１１を用いて、ＨＩＶプロテアーゼの成熟コード領域のすぐ上流の２２４３位にＨｐａＩを導入する：１）ＨＸＢ２の２２４９位から２２６６位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）ｇａｇタンパク配列をこの位置に変化させずに残し、保存的なアミノ酸変化（ＰｈｅからＶａｌへ）を導入する、６ヌクレオチドＨｐａＩ部位、および３）ＨＸＢ２の２２２５位から２２４２位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。段階２では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１２を用いて、４１９０位のＨＩＶ逆転写酵素のカルボキシ末端コード領域にＳａｌＩ部位を導入する：１）ＨＸＢ２の４１９６位から４２１３位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）逆転写酵素タンパク配列をこの位置に変化させずに残す６ヌクレオチドＳａｌＩ部位、および３）ＨＸＢ２の４１７２位から４１８９位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。段階３では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１３を用いて、ＨＸＢ２の５７８５位のｖｐｒコード領域内に既存のＳａｌＩ部位を欠失する：１）ＨＸＢ２の５７９１位から５８０８位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）ＳａｌＩ部位を切断するが、ｖｐｒタンパク配列をこの位置に変化させずに残す６ヌクレオチド配列ＧＣＣＧＡＣ、３）ＨＸＢ２の５７６７位から５７８４位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。
プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳは、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳから次のようにして誘導される。プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１２．９ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化して調製した１１．１ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。プラスミドｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１１．６ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＳ−ｌｕｃＰＰをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢは、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰを鋳型として用いて、４つの連続的な段階の部位定方向突然変異生成によって調製される。最初の２段階は２つの新しい制限部位（ＰｖｕＩとＢａｍＨＩ）を導入することを目的とし、その各々は既に各インジケーター遺伝子ウィルスベクター中に存在している。第三および第四段階は、各々のベクター中の既存のＰｖｕＩとＢａｍＨＩ部位を欠失して、新たに導入された部位を独自のにすることを目的とする。段階１では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１４を用いて、ＨＩＶプロテアーゼの成熟コード領域のすぐ上流の２２２１位にＰｖｕＩを導入する：１）ＨＸＢ２の２２２７位から２２４４位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）ｇａｇおよびｐｏｌ前駆体タンパク配列をこの位置に変化させずに残す、６ヌクレオチドＰｖｕＩ部位、および３）ＨＸＢ２の２２０３位から２２２０位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。段階２では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１５を用いて、４２１２位のＨＩＶ逆転写酵素のカルボキシ末端コード領域にＢａｍＨＩ部位を導入する：１）ＨＸＢ２の４２１８位から４２３５位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）逆転写酵素タンパク配列をこの位置に変化させずに残す６ヌクレオチドＢａｍＨＩ部位、および３）ＨＸＢ２の４１９４位から４２１１位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。段階３では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１６を用いて、２４１３位のｂ−ラクタマーゼコード領域（座標はジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、アクセス番号Ｘ５２３３１参照）内の既存のＰｖｕＩ部位を欠失する：１）ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｉｔ  ＫＳ（＋）の２３９５位から２４１２位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）ＰｖｕＩ部位を切断するが、ｂ−ラクタマーゼタンパク配列をこの位置に変化させずに残す６ヌクレオチド配列ＣＡＡＴＣＧ、および３）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）の２４１９位から２４３６位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。段階４では、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド１７を用いて、ＨＸＢ２の８４７４位のＨＩＶ  ｒｅｖコード領域内の既存のＢａｍＨＩ部位を欠失する：１）ＨＸＢ２の８４８０位から８４９７位に相補的な１８ヌクレオチド配列、２）ＢａｍＨＩ部位を切断するが、ＨＩＶ  ｒｅｖタンパク配列をこの位置に変化させずに残す６ヌクレオチド配列ＧＧＡＴＴＣ、および３）ＨＸＢ２の８４５６位から８４７３位までに相補的な１８ヌクレオチド配列。
プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢは、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから次のようにして誘導される。プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１２．９ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＰをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを３つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化して調製した１１．１ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して調製した０．５ｋＢのＤＮＡ断片、および３）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化して調製した０．８ｋＢのＤＮＡ断片。プラスミドｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１１．６ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＳ−ｌｕｃＰＰをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
ＨＩＶプロテアーゼおよび逆転写酵素コード領域に対応する患者由来セグメントを、ＨＩＶ感染患者の血清から分離したウィルスＲＮＡを用いて、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅する。以下に述べるように２つのＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用する、最初の方法（Ｐｉａｔａｋら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９、１７４９−１７５４）では、分離酵素、モロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（マリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＢＲＬ社）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（カナダ、オンタリオ州ロッシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ））を、各々ｃＤＮＡの調製とＰＣＲ反応のために使用する。第二の方法（Ｍｕｌｄｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２、２９２−３００）では、単一酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ合成とＰＣＲ反応の両方を実施する。オリゴヌクレオチド１８と１９、オリゴヌクレオチド２０と２１から成る２対のプライマーを用いて、各々ＨｐａＩ／ＳａｌＩとＰｖｕＩ／ＢａｍＨＩ患者アクセプタ部位を含むインジケーター遺伝子ウィルスベクターに正確に挿入することができる患者由来セグメントを増幅する。
最初のプライマー対を組込んだ４つの耐性試験ベクターの最初のセットは、次の２つのＤＮＡ試料から構築される：１）ＨｐａＩとＳａｌＩで消化したプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳから調製したベクターＤＮＡ、および２）ＨＩＶ−感染個体の血清から分離したウィルスＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド１８と１９をプライマーとして使用したＲＴ−ＰＣＲ、およびその後のＨｐａＩとＳａｌＩによる消化によって調製した２．０ｋＢの増幅ＤＮＡ産物。２番目のプライマー対を組込んだ４つの耐性試験ベクターの第二のセットは、次の２つのＤＮＡ試料から構築される：１）ＰｖｕＩとＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから調製したベクターＤＮＡ、および２）ＨＩＶ−感染個体の血清から分離したウィルスＲＮＡを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド１８と１９をプライマーとして使用したＲＴ−ＰＣＲ、およびその後のＰｖｕＩとＢａｍＨＩによる消化によって調製した２．０ｋＢの増幅ＤＮＡ産物。オリゴヌクレオチド１８、１９、２０および２１は各々ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を有している。生じる８つの耐性試験ベクターの各々に対応するプラスミドＤＮＡが、特定患者の血清中に存在するＨＩＶウィルスの擬似種の代表的サンプルを確実に含むようにするため、特定耐性試験ベクターの構築において得られる少なくとも１００個の独立した大腸菌形質転換体をプラスミドＤＮＡの調製のために使用する。
患者由来セグメントの発現を改善するため、第三および第四セットの耐性試験ベクターは、各々オリゴヌクレオチド１８、１９、２０および２１の配列に基づく、オリゴヌクレオチド２２、２３、２４および２５と称される部分的変性ＰＣＲプライマープールを用いて調製される。各々のプライマープールは、ロスアラモスＨＩＶ配列データベース（Ｍｙｅｒｓら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ１９９３、ニューメキシコ州ロスアラモス、ロスアラモス・ナショナル・ラボラトリー（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、ＮＭ））に列記されている種々の患者分離物間で配列変動を示す、親プライマーの３’末端に位置する１８ヌクレオチドポジションの各々に１個以上のヌクレオチド塩基（Ｇ、Ａ、ＴあるいはＣ）を含むように合成される。４つの耐性試験ベクターの第三のセットは、オリゴヌクレオチド２２と２３を用いて調製した増幅患者配列を有する、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳから調製したベクターを用いて構築される；４つの耐性試験ベクターの第四のセットは、オリゴヌクレオチド２４と２５を用いて調製した増幅患者配列を有する、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから調製したベクターを用いて構築される。オリゴヌクレオチド２２、２３、２４および２５は各々ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を有している。
宿主細胞−調製
パッケージング宿主細胞および耐性試験ベクター宿主細胞
耐性試験ベクターは、ウィルスパッケージングタンパクを発現するパッケージング宿主細胞から、耐性試験ベクター宿主細胞を調製するために使用される。パッケージングタンパクは、耐性試験ベクター自体に含まれるウィルス遺伝子の発現によって、パッケージング発現ベクターによって、あるいはその両方によって提供されうる。パッケージング宿主細胞の一時的あるいは安定なトランスフェクションを用いてパッケージングタンパクを生成することができる。アンホトロピックＭＬＶ  ｅｎｖ遺伝子産物をコードするパッケージング発現ベクターは、ヒト標的細胞に効率的に感染することができる耐性試験ベクターウィルス粒子の、耐性試験ベクター宿主細胞における産生を可能にする。プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから誘導される耐性試験ベクターは、ｅｎｖを除くすべてのＨＩＶ遺伝子をコードし、耐性試験ベクター宿主細胞を生成するために使用される。アンホトロピックＭＬＶ  ４０７０Ａ  ｅｎｖ遺伝子産物をコードするｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａパッケージング発現ベクターは、耐性試験ベクター宿主細胞における耐性試験ベクターウィルス粒子の産生を可能にする、前述のゲノミックベースの耐性試験ベクターと共に使用される。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから誘導される耐性試験ベクターは、ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物だけをコードし、耐性試験ベクター宿主細胞を調製するために使用される。ｅｎｖを提供するｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａ、ならびに各々がＨＩＶ  ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆ遺伝子を提供するｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’あるいはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’パッケージング発現ベクターのいずれかが、耐性試験ベクター宿主細胞における耐性試験ベクターウィルス粒子の産生を可能にする、前述のサブゲノミックベースの耐性試験ベクターと共に使用される。
プラスミドｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’およびｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’は、各々ゲノミックウィルスベクターｐＬＧとｐＣＧからｇａｇ−ｐｏｌコード領域の大部分を取り除くことによって誘導される。プラスミドｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’（図３Ｂ）は、次の配列（５’から３’まで）を含むオリゴヌクレオチド２６と共に、プラスミドｐＬＧを鋳型として用いる部位定方向突然変異生成によって調製される：１）ｐｏｌ遺伝子内のＨＸＢ２の４７１２位から４７２９位までに相補的な１８ヌクレオチド配列、および２）ｇａｇ遺伝子内のＨＸＢ２の９２５位から９４２位に相補的な１８ヌクレオチド配列。プラスミドｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’（図３Ｃ）は２つのＤＮＡ断片から調製される：１）プラスミドｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’をＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した６．８ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＣＧをＳｍａＩとＣｌａＩで消化して調製した１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
プラスミドｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａ（図３Ｄ）は２つのＤＮＡ断片から構築される：１）ｐＶＬ−２哺乳類発現ベクターをＮｒｕＩとＢｇｌＩＩで消化して調製した４．３ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＣＲＩＰａｍｇａｇ−２（ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、６４６０）を鋳型として、またオリゴヌクレオチド２７と２８をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＮｒｕＩとＢｇＩＩＩによる消化によって調製したＭＬＶ４０７０Ａ  ｅｎｖ遺伝子産物（ヌクレオチド３７〜２００１、座標はジーンバンク、アクセス番号Ｍ３３４６９参照、Ｏｔｔら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｏｌ．６４、７５７−７６６）の完全なコード領域を含む２．０ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド２７は、独自のＮｒｕＩ部位とそれに続く哺乳類の翻訳開始に関するコンセンサス配列（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６６、１９８６７−１９８７０）を有するのに対し、オリゴヌクレオチド２８は独自のＢｇｌＩＩ部位を有している。
哺乳類発現ベクターｐＶＬ−２は５’から３’方向に次の要素を含む：ＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＣＭＶ  ＩＥ第一エクソンスプライシングドナー、ヒト（１グロビン第二エクソンスプライシングアクセプタ、クローニング部位ポリリンカー、ＳＶ４０  Ｔ抗原遺伝子のポリアデニレーション部位、およびＳＶ４０の複製起点。プラスミドｐＶＬ−２は次のような４段階で構築される。第一段階では、クローニング部位ポリリンカーとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）のファージＴ７およびＴ３プロモーターを、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｒｕＩ、ＡｐａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、およびＢｓｓＨＩＩ制限部位を含むクローニング部位ポリリンカーで置換することによってプラスミドｐＶＬを調製する。ｐＶＬは２つのＤＮＡ断片から構築される：１）プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）をＢｓｓＨＩＩで切断し、生じるベクターをアルカリホスファターゼで処理することによって調製した３．０ｋＢのベクター断片、および２）オーバーラップオリゴヌクレオチド２９と３０をアニーリングし、クレノーＤＮＡポリメラーゼで延長し、さらにＢｓｓＨＩＩで消化して調製したＤＮＡ断片。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）プラスミド地図（ジーンバンクアクセス番号Ｘ５２３２７）に関して５’から３’の順にＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏＩ部位までを含むプラスミドを、制限酵素切断地図分析によって同定する。第二段階では、プラスミドｐＶＬから、ＣＭＶＩＥエンハンサー−プロモーターと第一エクソンスプライシングドナー、およびヒト（１グロビン第二エクソンスプライシングアクセプタを挿入することによって中間プラスミドを調製する。この中間プラスミドは３つのＤＮＡ断片から調製される：１）プラスミドｐＶＬをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化することによって調製した３．０ｋＢのベクター断片、２）ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１、５２１−５３０）からのＰｓｔＩ  ｍ−断片を含むプラスミドｐＣＭ５０２７を鋳型とし、オリゴヌクレオチド３１と３２をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩによる消化によって調製した、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター−エンハンサーおよび第一エクソンスプライシングドナー（ヌクレオチド−６７４から−１９、座標はＢｏｓｈａｒｔら（同上）参照）を含む０．９ｋＢのＤＮＡ断片、および３）プラスミドｐｐＳＶａＨＰ（Ｔｒｅｉｓｍａｎら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０、７４２８−７４３２）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド３３と３４をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩによる消化によって調製したヒト（１グロビン第二エクソンスプライシングアクセプタ（ヌクレオチド６８０８から６９１６、座標はジーンバンク、アクセス番号Ｊ００１５３参照）を含む０．１ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド３１、３２、３３および３４は、各々の末端にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有している。第三段階では、この中間プラスミドにＳＶ４０  Ｔ抗原ポリアデニレーション部位を挿入することによってプラスミドｐＶＬ−１を調製する。プラスミドｐＶＬ−１は２つのＤＮＡ断片から調製される：１）中間プラスミドをＢｇｌＩＩとＮｈｅＩで切断して調製した４．０ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＳＶ２（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１、３２７−３４１）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド３５と３６をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＢｇｌＩＩとＮｈｅＩによる消化によって調製したＳＶ４０  Ｔ抗原ポリアデニレーション部位（ＳＶ４０のヌクレオチド２７７０から２５３３、座標はＲｅｄｄｙら（１９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００、４９４−５０２参照）を含む０．２ｋＢのＤＮＡ断片オリゴヌクレオチド３５は、各々の末端に独自のＢｇｌＩＩとＮｈｅＩ制限部位を有している。第四段階では、プラスミドｐＶＬ−１にＳＶ４０の複製起点を挿入することによってプラスミドｐＶＬ−２を調製する。プラスミドｐＶＬ−２は２つのＤＮＡ断片から調製される：１）プラスミドｐＶＬ−１をＮｈｅＩとＸｈｏＩで消化して調製した４．２ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＳＶ２を鋳型とし、オリゴヌクレオチド３７と３８をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＮｈｅＩとＳａｌＩによる消化によって調製したＳＶ４０の複製起点（ＳＶ４０のヌクレオチド５７２５から５５７８、同上）を含む０．２ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド３７と３８は、各々の末端に独自のＮｈｅＩとＳａｌＩ制限部位を有している。
標的宿主細胞
プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢから誘導される耐性試験ベクターを用いて実施される耐性試験のために使用される標的宿主細胞は、ヒト胚腎細胞系統２９３およびジャーカット白血病性Ｔ細胞系統（マリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ））から調製される。各々の細胞系統は、突然変異生成体ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする発現ベクターで安定にトランスフェクトされる。この突然変異生成体は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端までのフレーム内に融合されたＳＶ４０  Ｔ抗原の核位置決定シグナル（ＮＬＳ）を含み、その細胞核内への移送と細胞核内での機能を可能にする（Ｌｉｅｂｅｒら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、８４８５−８４９３）。耐性試験ベクター中の非機能性インジケーター遺伝子は、標的細胞が感染した時に逆転写酵素によって機能性インジケーター遺伝子に変換される。これはインジケーター遺伝子コード領域に関するＴ７プロモーターの位置変更から生じる。修復されたインジケーター遺伝子がＨＩＶインテグラーゼによって標的細胞の染色体に組込まれたあと、標的細胞によって発現される核Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、インジケーター遺伝子を機能的に転写することができる。
ヒトや他の哺乳類の細胞および細胞系統において、ＮＬＳに連結された突然変異生成体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現を指示するためにはプラスミドｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳを用いる。ｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳは３つのＤＮＡ断片から調製される：１）プラスミドｐＶＬ−２をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化して調製した４．３ｋＢのベクター断片、２）プラスミドｐＴ７−Ｇ１（Ｄｅｎｇら（１９９４）Ｇｅｎｅ  １４３、２４５−２４９）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド３９と４０をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＮｒｕＩとＢｇｌＩＩによる消化によって調製されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基３４から８８３（ヌクレオチド２６７から２８１７、座標はジーンバンク、アクセス番号Ｍ３８３０８参照、ＧｒａｃｈｅｖとＰｌｅｔｎｅｖ（１９８４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１０、８２４−８４３）をコードする、２．６ｋＢのＤＮＡ断片、および３）オーバーラップオリゴヌクレオチド４１と４２をアニーリングし、クレノーＤＮＡポリメラーゼで延長して、さらにＥｃｏＲＩとＮｒｕＩで消化して調製した、ＳＶ４０  Ｔ抗原の最初の３個のアミノ酸をコードし、その後に、ＮＬＳを含むＳＶ４０の大型Ｔ抗原のアミノ酸１１８から１３３（Ｌｉｅｂｅｒら、同上）が続く、合成ＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド３９、４０、４１、４２は、各々ＮｒｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＮｒｕＩ制限部位を有している。
プラスミドｐＶＬ−Ｎｅｏは、同時トランスフェクションによるヒトや他の哺乳類細胞および細胞系統の安定なトランスフェクタントの確立のための選択的マーカーとして用いられる。ｐＶＬ−Ｎｅｏはネオマイシンリン酸転移酵素の発現を指令し、抗生物質Ｇ４１８に耐性を与える。プラスミドｐＶＬ−Ｎｅｏは２つのＤＮＡ断片から調製される：１）プラスミドｐＶＬ−２をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化して調製した４．３ｋＢのベクター断片、および２）プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１、３２７−３４１）を鋳型とし、オリゴヌクレオチド４３と４４をプライマーとして用いるＰＣＲと、その後のＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩによる消化によって調製した完全なＮｅｏコード領域（Ｔｎ５トランスポゾン配列のヌクレオチド１５５１から２３４５、座標はジーンバンク、アクセス番号Ｕ００００４、Ｂｅｃｋら（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９、３２７−３３６）を含む０．８ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド４３は、独自のＥｃｏＲＩ部位とそれに続く哺乳類の翻訳開始に関するコンセンサス配列を有するのに対し、オリゴヌクレオチド４４は独自のＢｇｌＩＩ部位を有する。
ｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰは、リン酸カルシウム共沈殿法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｃｅｌｌ  １６、７７７）による２９３細胞内への安定なトランスフェクション、ならびに電気穿孔法（ｉｒｖｉｎｇら、（１９９１）ｃｅｌｌ  ６４，８９−９０１）によるジャーカット細胞内への安定なトランスフェクションによって導入される。２９３細胞は、１ｇ／Ｌグルコース、１０％ドナー子ウシ血清（ティシュー・カルチャー・バイオロジックス（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を補足したＤＭＥＭ培地（ＪＲＨバイオサイエンシズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））中に保持する。ジャーカット細胞は、１０％胎仔ウシ血清（アーヴィン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中に保持する。２９３細胞とジャーカット細胞についてのトランスフェクションカクテルは、各々、１０：１から２０：１までの質量比で１０μｇのｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰと選択可能なマーカー、ｐＶＬ−Ｎｅｏとの混合物を含む。トランスフェクションの２４〜４８時間後、抗生物質Ｇ４１８（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ社（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．））を含む同じ培地中に細胞を再プレーティングする。Ｇ４１８に耐性な個々の２９３細胞クローンを、２週間後に選択プレートから直接採取し、展開して分析する。Ｇ４１８に耐性な独立したジャーカット細胞クローンを、薬剤選択の２〜３週間後に限界希釈によって得、展開して分析する。
Ｇ４１８耐性の２９３およびジャーカット細胞クローンを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて細胞によって合成した定常状態のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ特異的ｍＲＮＡのレベルを定量することにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現レベルに関してスクリーニングする。次に、Ｔ７プロモーターがルシフェラーゼ遺伝子の転写を指令する、プラスミドｐＥＭＣＬｕｃｂｇＡｎ（Ｄｅｎｇら（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０９、１９３−２０１）による一時的なトランスフェクションにおいてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ特異的転写を支持する能力を測定することにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの至適レベルを発現する２９３およびジャーカット（ジャーカット）細胞クローンを同定する。最も高いレベルのルシフェラーゼ遺伝子発現を支持する２９３およびジャーカットクローンをその後の使用のために選択する；これらを各々２９３／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞およびジャーカット／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞と称する。
薬剤感受性および耐性試験
耐性試験は、２種類の宿主細胞あるいは１種類の宿主細胞のいずれかを用いて、インジケーター遺伝子ウィルスベクターに基づく耐性試験ベクター、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳあるいはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢによって実施される。最初のタイプの耐性試験では、耐性試験ベクターとパッケージング発現ベクターでパッケージング宿主細胞をトランスフェクトすることによって調製される最初の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）により、耐性試験ベクターウィルス粒子が生成される。次に耐性試験ベクターウィルス粒子を用いて、インジケーター遺伝子の発現を測定する第二の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させる。２番目の種類の耐性試験では、単一の宿主細胞タイプ（耐性試験ベクター宿主細胞）が両方の目的を果たす：特定培養中のパッケージング宿主細胞の一部がトランスフェクトされて耐性試験ベクターウィルス粒子を生成し、同じ培養中の宿主細胞の一部が、そのようにして生成された耐性試験ベクター粒子による感染の標的となる。単一宿主細胞種を用いる耐性試験は、順序の入れ替わったプロモーターを持つ非機能性インジケーター遺伝子を含む耐性試験ベクターに関して可能である：そのようなインジケーター遺伝子は、許容宿主細胞の感染時には効率的に発現されるが、同じ宿主細胞種のトランスフェクションの際には効率的に発現されず、従って、評価対象である抗ウィルス薬の効果を測定する機会を提供する。同様の理由から、２つの細胞種を用いる耐性試験は、２番目の細胞種を最初の細胞種の上清から得られたウィルス粒子で感染させる代わりとして、２つの細胞種を同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）することによって実施してもよい。
感受性および耐性試験−２細胞
耐性試験ベクター宿主細胞は、２９３細胞系統、ｔｓａ５４またはｔｓａ２０１細胞系統（Ｈｅｉｎｚｅｌら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、３７３８）、あるいはＢＯＳＣ  ２３細胞系統（Ｐｅａｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０、８３９２）のいずれかをパッケージング宿主細胞として用いる、耐性試験ベクターと適当なパッケージング発現ベクターの同時トランスフェクションによって調製される。患者由来セグメントをｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢに挿入することによって構築される耐性試験ベクターを、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと同時トランスフェクトし、患者由来セグメントをｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢに挿入することによって調製される耐性試験ベクターを、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと、ｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’またはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’のいずれかと同時トランスフェクトする。ジャーカット（ジャーカット）／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞を標的宿主細胞とし用いる。
パッケージング宿主細胞を、ＤＭＥＭ培地、１ｇ／Ｌグルコース、１０％ドナー子ウシ血清中で増殖させ、３日ごとに１：１０希釈で継代接種する。トランスフェクションの４８時間前に、１０ｃｍプレート当り１×１０6細胞の割合で細胞をプレーティングする。各々の耐性試験ベクター５〜１０ｍｇと適当なパッケージング発現ベクターを用いるリン酸カルシウム共沈殿法によって細胞をトランスフェクトし、耐性試験ベクター宿主細胞を生成する。逆転写酵素阻害因子、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔおよび３ＴＣ、プロテアーゼ阻害因子、サキナビール、リトナビールおよびインディナビール、ならびにそれらの組合せを含めた個々の抗ウィルス薬を、適当な濃度範囲で、それらのトランスフェクションの際にトランスフェクトされた細胞の個々のプレートに加える。トランスフェクションの２４〜４８時間後に、標的宿主細胞を、耐性試験ベクター宿主細胞と、あるいは耐性試験ベクター宿主細胞の濾過した上清から得られたウィルス粒子と同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）することによって感染させる。各々の抗ウィルス薬あるいはそれらの組合せを感染時に標的宿主細胞に加えて、トランスフェクションの間に存在する単数または複数の特定薬剤の同じ最終濃度を達成する。
同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）による感染の場合には、２４〜４８時間前にトランスフェクションによって調製した耐性試験ベクター宿主の１０ｃｍプレートから培地を取り出し、０．５〜１．０×１０6のジャーカット／Ｔ７ＲＮＡＰ×ＮＬＳ標的細胞を、適当な濃度の抗ウィルス薬を含むジャーカット細胞培地中でプレートに加える。標的細胞を耐性試験ベクター宿主細胞と共に２４時間同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）し、その後取り出して、適当な濃度の抗ウィルス薬を含むジャーカット細胞培地での２回目の同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）のための、新鮮調製した耐性試験ベクター宿主細胞に加える。２４時間後、２回目の同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）から標的宿主細胞を分離し、遠心分離によって収集し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ルシフェラーゼ活性について検定する。濾過した上清による感染については、２４〜４８時間前にトランスフェクションによって調製した耐性試験ベクター宿主細胞の１０ｃｍプレートから培地を取り出す。採取の際に０．４５ｍｍフィルターを通して培地を濾過し、−７０℃で冷凍して、形質導入の前に解凍する。ジャーカット／Ｔ７ＲＮＡ−℃ＮＬＳ細胞（０．５〜１．０×１０6）をジャーカット細胞培地と濾過した上清の等量混合物５ｍｌに加え、８ｍｇ／ｍｌのポリブレン（ミズーリ州セントルイスのシグマ社（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）と適当な濃度の抗ウィルス薬を作製する。感染後２４〜４８時間目に、標的宿主細胞を遠心分離によって収集し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、インジケーター遺伝子の発現に関して検定する。同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）あるいは濾過したウィルス上清によって感染させた標的宿主細胞を、記述されているように（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）分子生物学における現在のプロトコール、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ））ホタルルシフェラーゼ活性に関して検定する。抗ウィルス薬の不在下で実施した対照に比べて、単数または複数の特定抗ウィルス薬の存在下で、耐性試験ベクターウィルス粒子の特定製剤で感染させた標的宿主細胞に関して認められるルシフェラーゼ活性の低下は、一般にＳ字状曲線としての抗ウィルス薬濃度の対数に関連する。この阻害曲線を用いて、耐性試験ベクター中に存在する患者由来セグメントによってコードされるウィルス標的物質に関して、その薬剤あるいは薬剤の組合せの見掛け上の阻害濃度（ＩＣ）が計算される。
感受性および耐性試験−細胞１
耐性試験ベクター宿主細胞は、２９３／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞あるいはジャーカット／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞をパッケージング宿主細胞として用いる、耐性試験ベクターと適当なパッケージング発現ベクターの同時トランスフェクションによって調製される。患者由来セグメントをｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢに挿入することによって構築される耐性試験ベクターを、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと同時トランスフェクトし、患者由来セグメントをｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢに挿入することによって調製される耐性試験ベクターを、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと、ｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’またはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’のいずれかと同時トランスフェクトする。
各々の耐性試験ベクター５〜１０ｍｇと適当なパッケージング発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトし、耐性試験ベクター宿主細胞を生成する。２９３／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞をリン酸カルシウム共沈殿法によってトランスフェクトし、ジャーカット／Ｔ７ＲＮＡＰ−ＮＬＳ細胞を電気穿孔法によってトランスフェクトする。個々の抗ウィルス薬を、適当な濃度範囲で、それらのトランスフェクションの際にトランスフェクトされた細胞の個々のプレートに加える。トランスフェクションの２４〜７２時間後に、遠心分離によって細胞を採集し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄して、前述したようにホタルルシフェラーゼ活性について検定する。培養中のトランスフェクトされた細胞はインジケーター遺伝子を効率的に発現しないので、培養中の重感染細胞と同様に、培養中のトランスフェクトされた細胞はインジケーター遺伝子発現についての標的宿主細胞として用いることができる。抗ウィルス薬の不在下で実施した対照に比べて、単数または複数の特定抗ウィルス薬の存在下でトランスフェクトした標的宿主細胞に関して認められるルシフェラーゼ活性の低下は、一般にＳ字状曲線としての抗ウィルス薬濃度の対数に関連する。この阻害曲線を用いて、耐性試験ベクター中に存在する患者由来セグメントによってコードされるウィルス標的物質に関して、その薬剤あるいは薬剤の組合せの見掛け上の阻害濃度（ＩＣ）が計算される。
実施例２
患者由来セグメントと順序の入れ替わったコード領域を有する非機能性インジケータ遺伝子とを含む耐性試験ベクターを使用したＨＩＶ薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−構築
患者配列アクセプタ部位、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢを有するゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター並びに、それらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図４）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｐｕ、欠失ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）欠失ｅｎｖ遺伝子に挿入される、ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域を含む１番目のインジケータ遺伝子カセット、５）欠失３’ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域に挿入される、ルシフェラーゼ遺伝子の３’コード領域を含む２番目のインジケータ遺伝子カセット、および６）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域。ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳは、各々のＨＸＢ２の第２２４３ヌクレオチドおよび第４１９０ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌｌ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢは、各々のＨＸＢ２の第２２２１ヌクレオチドおよび第４２１２ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む（詳細は実施例１を参照のこと）。１番目のインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域（アミノ酸１から４４６）、および３）ＣＭＶ  ＩＥスプライスドナー。２番目のインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）＿−グロビン遺伝子第２エキソンスプライスアクセプタ、２）ルシフェラーゼ遺伝子の３’コード領域（アミノ酸４４７から５５０）、および３）ＳＶ４０ポリアデニル化部位。ルシフェラーゼ５’および３’コード領域の転写方向は互いに同じで、１番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびウィルスＬＴＲの方向とは反対方向である。しかしながら、ルシフェラーゼ５’および３’コード領域は耐性試験ベクター内では順序が入れ替わっているので（すなわち、５’コード領域は３’コード領域の後続である）、スプライシングされて機能性ルシフェラーゼコード領域を形成することができるｍＲＮＡは転写されない。逆転写および鎖転移後に、ルシフェラーゼ３’コード領域が３’ＬＴＲから５’ＬＴＲまでコピーされ、スプライシングされて機能性ルシフェラーゼコード領域を形成するｍＲＮＡが転写される（図４Ｃ）。
患者アクセプタ部位、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−Ｈｓ、ｐＬｓ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃｐｃ−ＰＢを有するサブゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター、並びにそれらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図４Ｂ）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子からのコード領域、４）ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域を含む１番目のインジケータカセット、５）ウィルスパッケージング配列を含むＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のＲＲＥ要素、６）欠失３’ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域に挿入される、ルシフェラーゼ遺伝子の３’コード領域を含む２番目のインジケータ遺伝子カセット、および７）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５。ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳは、各々のＨＸＢ２の２２４３位および４１９０位ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌＩ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢは、各々のＨＸＢ２の２２２１位および４２１２位ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む。１番目のインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域（アミノ酸１から４４６）、および３）ＣＭＶ  ＩＥスプライスドナー。２番目のインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）（−グロビン遺伝子第２エキソンスプライスアクセプタ、２）ルシフェラーゼ遺伝子の３’コード領域（アミノ酸４４７から５５０）、および３）ＳＶ４０ポリアデニル化部位。ルシフェラーゼ５’および３’コード領域は耐性試験ベクターでは置換されているので、逆転写および鎖転移が生じて未置換ルシフェラーゼ５’および３’コード領域を形成し、スプライシングされて機能性ルシフェラーゼコード領域を形成することができるｍＲＮＡが転写されるはずである（図４Ｃ）。
１番目のインジケータ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＶＬ−ｌｕｃ５’を３つの段階で調製する。最初の２つの段階では、ＣＭＶ  ＩＥスプライスドナーおよび（−グロビン遺伝子スプライスアクセプタからなるｐＶＬ−１に含有される人工イントロンに部位定方向突然変異生成を実施し、消化の結果５’および３’末端が人工イントロンの開始部位および末端部位と正確に対応するＤＮＡ断片を産生する制限部位を形成する。段階１において、以下の配列（５’から３’）を含むオリゴヌクレオチド４５を使用して、ｐＬＶ−１を用いて部位定方向突然変異生成を実施する：１）ＣＭＶ  ＩＥスプライスドナーの上流に位置する１８ヌクレオチド配列、２）ＳｎａＢＩ制限部位の最初の半分に対応するＴＡＣトリヌクレオチド、および３）人工イントロンの始めの１８ヌクレオチド配列。イントロンの最初の３つのヌクレオチドの配列はＧＴＡであるので、得られるプラスミドｐＶＬ−ＳｎａＢＩは、消化の結果、平滑ＤＮＡ末端としてイントロンの５’配列を放出するＳｎａＢＩ制限部位を含む。段階２において、以下の配列（５’から３’）を含むオリゴヌクレオチド４６を使用して、ｐＶＬ−ＳｎａＢＩを用いて部位定方向突然変異生成を実施する：１）人工イントロンの末端部分の１８ヌクレオチド配列、２）ＰｖｕＩＩ制限部位の最後の半分に対応するＣＴＧトリヌクレオチド配列、および３）＿−グロビンスプライスアクセプタの後続の１８ヌクレオチド配列。イントロンの最後の３つのヌクレオチドの配列はＣＡＧであるので、得られるプラスミドｐＶＬ−ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩは、消化の結果、平滑ＤＮＡ末端としてイントロンの３’配列を放出するＰｖｕＩＩ制限部位を含む。第三段階において、以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＶＬ−Ｌｕｃ５’を調製する：１）プラスミドｐＶＬ−ｌｕｃをＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化し、得られるベクターをクレノウＤＮＡポリメラーゼおよびアルカリホスファターゼで処理することにより調製される５．３ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＶＬ−ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩをＳｎａＢＩおよびＳｍａＩで消化することにより調製されるＣＭＶ  ＩＥスプライスドナーを含む０．１ｋＢのＤＮＡ断片。ルシフェラーゼコード領域に正しい方向で挿入されるＣＭＶ  ＩＥスプライスドナーを含むｐＶＬ−ｌｕｃ５’に対応するクローンは、制限マッピングにより同定される。
２番目のインジケータ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＶＬ−ｌｕｃ３’を３つの段階で調製する。段階１において、ｐＢＳ−ＨＸＢ２の３’ＬＴＲがサブクローニングされるプラスミドｐＢＳ−ＬＴＲを以下の２つのＤＮＡ断片から調製する：１）プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化することにより調製される３．０ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）ｐＢＳ−ＨＸＢ２をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化することにより調製される３’ＬＴＲを含む０．８ｋＢのＤＮＡ断片。段階２において、ルシフェラーゼの３’コード領域と、その後続のＳＶ４０ポリアデニル化部位とを含み、欠失３’ＬＴＲに挿入されるプラスミドｐＢＳ−ＬＴＲ−ｌｕｃ３’を以下の２つの断片から調製する：１）ｐＢＳ−ＬＴＲをＥｃｏＲＶで消化し、得られたベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製される３．５ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＶＬ−ｌｕｃをＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化し、次いで得られた断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理することにより調製される３’ルシフェラーゼコード領域およびＳＶ４０ポリＡ部位を含む０．５ｋＢのＤＮＡ断片。正しい方向（すなわち、３’ＬＴＲの転写方向と反対方向）に挿入される３’ルシフェラーゼコード領域を有するクローンは制限マッピングにより同定される。第三段階において、以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＶＬ−ｌｕｃ３’を調製する：プラスミドｐＢＳ−ＬＴＲ−ｌｕｃ３’をＥｃｏＲＶで消化し、次いで得られたベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製される４．０ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＶＬ−ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩをＰｖｕＩＩおよびＳｍａＩで消化することにより調製される（−グロビン遺伝子第２エキソンスプライスアクセプタを含む０．１ｋＢのＤＮＡ断片。ルシフェラーゼコード領域に正しい方向で挿入される（−グロビン第２エキソンスプライスアクセプタを含み、ｐＶＬ−ｌｕｃ３’に対応するクローンは制限マッピングにより同定される。
プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢは同じ３つの段階手順により調製される。段階１において、以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢを調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを各々のＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＬＧをＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製される０．８ｋＢのＤＮＡ断片。段階２において、以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ５’−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃ５’−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃ５’−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃ５’−ＰＢを調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢを各々の消化し、得られたベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）ｐＶＬ−ｌｕｃ５’をＮｏｔＩで消化することにより調製される１番目のインジケータ遺伝子カセットを含む２．５ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲｓの転写方向と反対の転写方向でウィルスベクターに挿入される１番目のインジケータ遺伝子カセットを含むクローンは制限マッピングにより同定される。段階３において、以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢを調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ５’−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃ５’−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃ５’−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃ５’−ＰＢを各々のＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＶＬ−ｌｕｃ３’をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化することにより調製される２番目のインジケータ遺伝子カセットを含む１．１ｋＢのＤＮＡ断片。
以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢを各々調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢのいずれかを各々のＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧをＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製される１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
耐性試験ベクター−構築
実施例１に記載した抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＩＶゲノムおよびサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったコード領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを作成した。
実施例１に記載した手順により、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＳｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢから耐性試験ベクターを調製する（図４Ｂ）。オリゴヌクレオチド１８および１９、並びにオリゴヌクレオチド２２および２３を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳまたはｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳから調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。オリゴヌクレオチド２０および２１、並びにオリゴヌクレオチド２４および２５を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢまたはｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢから調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。
薬剤感受性および耐性試験
以下のように、実施例１に記載した手順により耐性試験を実施する。プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢから調製される耐性試験ベクターは機能性ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を欠失しており、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと併用して使用される。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢから調製される耐性試験ベクターはＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物のみをコードし、ｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０ＡおよびｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’またはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’パッケージング発現ベクターのいずれかと併用して使用される。２つの宿主細胞種を使用して実施される耐性試験において、２９３細胞系統、ｔｓａ５４細胞系統、ｔｓａ２０１細胞系統またはＢＯＳＣ  ２３細胞系統をパッケージング宿主細胞として使用し、未改変ジャーカット細胞を標的細胞として使用する。これらの耐性試験ベクター内に含有される、コード領域の順序の入れ替わった非機能性インジケータ遺伝子は、パッケージング宿主細胞のトランスフェクションの結果、効率的に発現されないので、標的宿主細胞の感染は、パッケージング宿主細胞との共存培養またはパッケージング宿主細胞上清のウィルスの使用のいずれかにより実施される。同様の理由で、これらの耐性試験ベクターを用いて実施される耐性試験は、単一の宿主細胞種を使用してもよい。単一の宿主細胞種を使用した耐性試験は、２９３、ｔｓａ５４、ｔｓａ２０１、ＢＯＳＣ  ２３またはジャーカット細胞を使用して実施される。
実施例３
患者由来セグメント（類）と逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータ遺伝子とを含む耐性試験ベクターを使用したＨＩＶ薬剤感受性試験および耐性試験
実施例１に記載した抗ウィルス標的遺伝子を含む、ＨＩＶゲノムおよびサブゲノムウィルスベクターを使用して、逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータを含む耐性試験ベクターを作成した。
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−逆方向のイントロン
患者配列アクセプタ部位、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを有するゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター並びに、それらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図５）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｐｕ、欠失ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）欠失ｅｎｖに挿入されるインジケータ遺伝子カセット、５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳは、各々のＨＸＢ２の２２４３位ヌクレオチドおよび４１９０位ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌＩ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢは、各々のＨＸＢ２の２２２１位ヌクレオチドおよび４２１２位ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む（詳細は実施例１を参照のこと）。インジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）逆方向の人工イントロンにより分断されるルシフェラーゼ遺伝子のコード領域、および３）ＳＶ４０  ポリアデニル化配列。インジケータ遺伝子カセットの全体の転写方向は、１番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびウィルスＬＴＲｓの転写方向と反対方向であるが、人工イントロンの方向は後者の要素と同じである。逆方向のイントロンはこの方向でスプライシングされ得ないないので、２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターによりインジケータが転写されても機能性転写物を産生しない、しかしながら、５’ウィルスＬＴＲまたは１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーターによりインジケータ遺伝子が転写されると、ＲＮＡスプライシングにより逆方向のイントロンが離脱されるが、得られた転写物はアンチセンス方向であるので、インジケータ遺伝子は依然として機能的に発現されない。この転写物の逆転写および得られるプロウィルスＤＮＡの組込みにより、逆方向のイントロンは予め離脱されているので（図５Ｃ）、インジケータ遺伝子は２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターにより機能的に転写され得る。
患者配列アクセプタ部位、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを有するサブゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター、並びにそれらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図５Ｂ）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコード領域、４）インジケータ遺伝子カセット、５）ウィルスパッケージング配列を含むＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のＲＲＥ要素、６）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳは、各々のＨＸＢ２の２２４３位および４１９０位ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌＩ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢは、各々のＨＸＢ２の２２２１位および４２１２位ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む。インジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）逆方向の人工イントロンにより分断されるルシフェラーゼ遺伝子のコード領域、および３）ＳＶ４０ポリアデニル化配列。ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩゲノムウィルスベクターの場合と同様に、逆方向のイントロンが離脱され、逆転写およびプロウィルスの組込みが生じても（図５Ｃ）、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩのインジケータ遺伝子は機能的に転写され得ない。
ｐＶＬ−ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩの人工イントロンが逆方向でルシフェラーゼコード領域に挿入される、インジケータ遺伝子カセットを含むプラスミドｐＶＬ−ＬｕｃＩＩは以下の２つのＤＮＡ断片から調製される：１）ｐＶＬ−ｌｕｃをＥｃｏＲＶで消化し、得られるベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製される５．８ｋＢのベクターＤＮＡ、および２）ｐＶＬ−ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩをＳｎａＩおよびＰｖｕＩＩで消化することにより調製される人工イントロン配列に正確に対応する０．２ｋＢのＤＮＡ断片。ルシフェラーゼコード領域に逆方向で挿入される人工イントロンを含むｐＶＬ−ｌｕｃＩＩに対応するクローンは、制限マッピングにより同定される。
以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＤＰ−ＰＢを各々の消化し、得られたベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）ｐＶＬ−ｌｕｃＩＩをＮｏｔＩで消化することにより調製されるルシフェラーゼインジケータ遺伝子カセットを含む３．２ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲｓの転写方向と反対の転写方向でウィルスベクターに挿入される正しいｐｌｕｃＩＩインジケータ遺伝子カセットを含むクローンは、制限マッピングにより同定され、耐性試験ベクターを調製するために使用される。
以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを各々調製する：１）プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを各々のＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）プラスミドｐＣＧをＳｍａＩおよびＣｌａＩで消化することにより調製される１．３ｋＢのＤＮＡ断片。
耐性試験ベクター−構築
実施例１に記載した手順により、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢから耐性試験ベクターを調製する（図５Ｂ）。オリゴヌクレオチド１８および１９、並びにオリゴヌクレオチド２２および２３を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳまたはｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳから調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。オリゴヌクレオチド２０および２１、並びにオリゴヌクレオチド２４および２５を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢまたはｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢから調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。
薬剤感受性および耐性試験
以下のように、実施例１に記載した手順により耐性試験を実施する。プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢから調製される耐性試験ベクターは機能性ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を欠失しており、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａを併用して使用される。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢから調製される耐性試験ベクターはＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物のみをコードし、ｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０ＡおよびｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’またはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’パッケージング発現ベクターのいずれかを併用して使用される。２つの宿主細胞種を使用して実施される耐性試験において、２９３細胞系統、ｔｓａ５４細胞系統、ｔｓａ２０１細胞系統またはＢＯＳＣ  ２３細胞系統をパッケージング宿主細胞として使用し、未改変ジャーカット細胞を標的細胞として使用する。これらの耐性試験ベクター内に含有され、逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータ遺伝子は、パッケージング宿主細胞のトランスフェクションの結果、効率的に発現されないので、標的宿主細胞の感染は、パッケージング宿主細胞との共存培養またはパッケージング宿主細胞上清のウィルスの使用のいずれかにより実施される。同様の理由で、これらの耐性試験ベクターを用いて実施される耐性試験は、単一の宿主細胞種を使用してもよい。単一の宿主細胞種を使用した耐性試験は、２９３、ｔｓａ５４、ｔｓａ２０１、ＢＯＳＣ  ２３またはジャーカット細胞を使用して実施される。
実施例４
患者由来セグメント（類）および非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した非粒子性ＨＩＶ薬剤感受性および耐性試験
薬剤感受性および耐性試験
実施例１、２および３に記載したように、順序の入れ替わったプロモーター、順序の入れ替わったコード領域または逆方向のイントロンのいずれかを有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用して、非粒子性耐性試験を実施する。これらの非粒子性耐性試験は、パッケージング発現ベクターの不在下で、単一の宿主細胞を各耐性試験ベクターでトランスフェクションすることにより実施される。これらの耐性試験ベクター内に含有される非機能性インジケータは宿主細胞をトランスフェクションしても効率的に発現されないが、非ウィルス粒子性逆転写によって検出可能なインジケータ遺伝子の発現が生ずる。逆転写および鎖転移によって、順序の入れ替わった非機能性インジケータ遺伝子は置換されない機能性インジケータ遺伝子に転換する。逆転写は各耐性試験ベクター内に含有されるｐｏｌ遺伝子の発現に完全に依存するので、耐性試験ベクター内に含有される患者由来セグメントによりコードされるｐｏｌ遺伝子産物を阻害する能力について、抗ウィルス剤を試験することができる。非粒子性耐性試験は、実施例１に記載した一般的な手順に以下の改良を加えて実施される：１）耐性試験ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる、２）トランスフェクション直後に、適当な濃度の抗ウィルス剤またはそれらの組み合わせをトランスフェクションされた宿主細胞の個々の培養物に加える、３）トランスフェクションの２４から７２時間後に宿主細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性について検定する。抗ウィルス剤（類）の不在下で実施された対照試験と比較して、所定の抗ウィルス剤または抗ウィルス剤類の存在下で所定の耐性試験ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞について観察されたルシフェラーゼ活性の低下を使用して、耐性試験ベクター内に含有される患者由来セグメントによりコードされるウィルス標的遺伝子産物に対する、当該薬剤または薬剤の組み合わせの見掛け上の阻害定数（Ｋｉ）を産出する。
耐性試験ベクター−構築
順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを用いる非粒子性耐性試験のために、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＨＳまたはｐＣＳ−ｌｕｃＰＰ−ＰＢを使用して、実施例１に記載したように耐性試験ベクターを調製する。各耐性試験ベクターを細胞質Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞（例えば、２９３／Ｔ７ＲＮＡＰまたはジャーカット／Ｔ７ＲＮＡＰ細胞）にトランスフェクションさせる。実施例１に記載するように、ヒトおよび他の哺乳類細胞および細胞系統において細胞質ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させるプラスミドｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰを使用して、２９３細胞およびジャーカット細胞の安定を得るトランスフェクションにより、かかる宿主細胞を調製する。以下の２つのＤＮＡ断片からｐＶＬ−Ｔ７ＲＮＡＰを構築する：１）ほ乳類発現ベクターｐＶＬ−２をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化することにより調製される４．３ｋＢのベクター断片、および２）鋳型としてのプラスミドｐＴ７−Ｇ１およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチド４７および４０を使用したＰＣＲを実施し、次いでＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化することにより調製されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ヌクレオチド１６６から２８１５、ジーンバンクの寄託番号Ｍ３８３０８で与えられる同等なもの、グラチェフ（Ｇｒａｃｈｅｖ）およびプレツネフ（Ｐｌｅｔｎｅｖ）（１９８４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１０，８２４−８４３）の全長のコード領域を含む、２．６ｋＢのＤＮＡ断片。オリゴヌクレオチド４７は、独自のＥｃｏＲＩ部位と、その後続の、真核細胞の翻訳開始のためのコンセンサス配列を組み入れるが（例えば、コザック（Ｋｏｚａｋ）（１９９１）ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２２６，１９８６７−１９８７０）、オリゴヌクレオチド４０は独自のＢｇｌＩＩ部位を組み入れる。
順序の入れ替わったコード領域または逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータを含む耐性試験ベクターを用いる非粒子性耐性試験のために、実施例１に記載するように、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＨＳ、ｐＣＳ−ｌｕｃＰＣ−ＰＢ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳまたはｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを使用して耐性試験ベクターを調製する。各耐性試験ベクターを２９３、ｔｓａ５４、ｔｓａ２０１、ＢＯＳＣ２３またはジャーカット細胞にトランスフェクションさせる。
実施例５
患者由来セグメント（類）および機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用したＨＩＶ薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−機能性インジケータ遺伝子
患者配列アクセプタ部位、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２を有するゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター並びに、それらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図６）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｐｕ、欠失ｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子のコード領域、４）欠失ｅｎｖに挿入されるインジケータ遺伝子カセット、５）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−Ｈｓ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２は、各々のＨＸＢ２の２２４３位ヌクレオチドおよび４１９０位ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌＩ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２は、各々のＨＸＢ２の２２２１位ヌクレオチドおよび４２１２位ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む（詳細は実施例１を参照のこと）。各プラスミドのインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域、および３）ＳＶ４０ポリアデニル化配列。ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１は、ウィルスＬＴＲｓまたは１番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターと反対の転写方向でベクターに挿入されるが（図６Ｂ）、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２のインジケータ遺伝子カセットは同じ方向でベクターに挿入される（図６Ｃ）。
患者配列アクセプタ部位、プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２を有するサブゲノムインジケータ遺伝子ウィルスベクター、並びにそれらから誘導される耐性試験ベクターは、各々５’から３’方向の以下の要素を含む（図６）：１）ＨＩＶ−ＬＴＲ  Ｕ３領域（ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２）または１番目のＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター（ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２）、２）ＨＩＶ−ＬＴＲ  ＲおよびＵ５領域、３）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコード領域、４）インジケータ遺伝子カセット、５）ウィルスパッケージング配列を含むＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のＲＲＥ要素、６）３’ＨＩＶ−ＬＴＲ。ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２は、各々のＨＸＢ２の２２４３位および４１９０位ヌクレオチドに独自のＨｐａＩおよびＳａｌＩ患者配列アクセプタ部位を含む；ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ２は、各々のＨＸＢ２の２２２１位および４２１２位ヌクレオチドに独自のＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ患者配列アクセプタ部位を含む。各プラスミドのインジケータ遺伝子カセットは以下を含む：１）２番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーター、２）ルシフェラーゼ遺伝子の全長のコード領域、および３）ＳＶ４０ポリアデニル化配列。ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１のインジケータ遺伝子カセットは、ウィルスＬＴＲｓまたは１番目のＣＭＶエンハンサー−プロモーターと反対の転写方向でベクターに挿入されるが（図６Ｂ）、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２のインジケータ遺伝子カセットは同じ方向でベクターに挿入される（図６Ｃ）。
ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２を各々以下の２つのＤＮＡ断片からプラスミドから調製する：１）ｐＬＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＬＧ−ｌｕＩＩ−ＰＢ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳ、ｐＣＧ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ、ｐＬＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢ、ｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＨＳおよびｐＣＳ−ｌｕｃＩＩ−ＰＢを各々のＮｏｔＩで消化し、得られたベクターをアルカリホスファターゼで処理することにより調製されるベクターＤＮＡ、および２）ｐＶＬ−ｌｕｃをＮｏｔＩで消化することにより調製されるルシフェラーゼインジケータ遺伝子カセットを含む３．０ｋＢのＤＮＡ断片。ウィルスＬＴＲｓに対して両方の方向の転写方向で所定のウィルスベクターに挿入されるインジケータ遺伝子カセットを含むクローンは制限マッピングにより同定される（例えば、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１およびｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２）。
耐性試験ベクター−構築方法
実施例１に記載した抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＩＶゲノムおよびサブゲノムウィルスベクターを使用して、機能性インジケータを含む耐性試験ベクターを作成した。実施例１に記載する手順により、上記のプラスミド（図６）から耐性試験ベクターを調製する。オリゴヌクレオチド１８および１９、並びにオリゴヌクレオチド２２および２３を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−Ｈｓ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１またはｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１から調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。オリゴヌクレオチド２０および２１、並びにオリゴヌクレオチド２４および２５を用いて調製され、増幅された患者配列を使用して、プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１またはｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１から調製されるベクターを用いて耐性試験ベクターを構築する。
薬剤感受性および耐性試験
以下のように、実施例１に記載する手順により耐性試験を実施する。プラスミドｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＧ−ｌｕｃ−ＰＢ−２から調製される耐性試験ベクターは機能性ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を欠失しており、パッケージング発現ベクターｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０Ａと併用して使用される。プラスミドｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１、ｐＬＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−１、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＨＳ−２、ｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−１およびｐＣＳ−ｌｕｃ−ＰＢ−２から調製される耐性試験ベクターはＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物のみをコードし、ｐＶＬ−ｅｎｖ４０７０ＡおよびｐＬＴＲ−ＨＩＶ３’またはｐＣＭＶ−ＨＩＶ３’パッケージング発現ベクターのいずれかと併用して使用される。２９３細胞系統、ｔｓａ５４細胞系統、ｔｓａ２０１細胞系統またはＢＯＳＣ２３細胞系統をパッケージング宿主細胞として使用し、未改変ジャーカット細胞を標的細胞として使用して、２つの宿主細胞種を用いて耐性試験を実施する。機能性インジケータ遺伝子を含むこれらの耐性試験ベクターまたは他の耐性試験ベクターによる標的細胞の感染は、実施例１に記載するように、耐性試験ベクターインジケータ宿主細胞から得られる濾過後の上清の耐性試験ベクターウィルス粒子による感染手順を使用して実施される。順序の入れ替わったプロモーターまたは逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターを含む耐性試験ベクターとは異なり、機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターは、一般にトランスフェクションされたパッケージング宿主細胞中でインジケータ遺伝子を発現することができる、感染後の標的宿主細胞とトランスフェクション後のパッケージング宿主細胞との間のインジケータ遺伝子の発現を識別することは困難と思われるので、従って共存培養手順および単一の細胞種を使用する耐性試験のどちらも、機能性インジケータ遺伝子を有する耐性試験ベクターを使用する標的細胞の感染に容易には適合させられない。
本明細書に引用される全ての論文および特許出願は、各個々の論文または特許出願が特別且つ独立に参照として組み入れられることが必要であるように、完全な形の参照としてここに組み入れられる。
本発明が関係する当業者にあきらかなように、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、例えば他のウィルスの薬剤感受性および耐性試験を実施するために、特に上記に開示したものとは異なる形態で本発明を実施してもよい。従って、上記の本発明の個々の実施態様は例示的なものであると考えられるべきで、限定的なものと考えられるべきではない。本発明の範囲は上記の記載に含まれる実施例に限定されるのではなく、添付の請求の範囲内に記載されているものである。
実施例６
患者由来セグメント（類）および機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用したＨＩＶ薬剤感受性および耐性試験
薬剤感受性および耐性試験
２つの宿主細胞種を使用して、共に実施例５に記載するｐＣＧ−ｌｕｃ−２と同様のインジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２およびｐＣＧ−ＣＸＡＴ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２に基づいた耐性試験ベクターを用いて耐性試験を実施する。ｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２の場合には、インジケータ遺伝子カセットはイントロンＡ（上記のＣＭＶ／α−グロビンイントロン）を欠損し、ポリアデニル化シグナルを含有せず、後続の３’Ｕ５配列がこの構築物中では削除されたという点で、インジケータ遺伝子ウィルスを改変した。後続のＵ５はＳＶ４０ポリＡシグナルおよび複製起点領域と順序が入れ替わった。インジケータ遺伝子カセットはＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびＴＫポリアデニル化シグナル領域の後続に人工イントロンを含むという点で、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＧ−ＣＸＡＴ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２はｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２と異なっていた。パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクターおよびパッケージング発現ベクターをトランスフェクションすることにより調製された１番目の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）により、耐性試験ベクターウィルス粒子を作成した。次いで、耐性試験ベクターウィルス粒子を使用して、インジケータ遺伝子の発現を測定する２番目の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させた。
ＡＺＴ薬剤感受性／耐性試験
機能性ルシフェラーゼ遺伝子カセットを含む耐性試験ベクターｐＣＧ−ｌｕｃ−２を構築し、耐性試験ベクターＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクションした。耐性試験ベクターは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤ＡＺＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）に感受性または耐性を示す「試験用」患者由来逆転写酵素配列を含む。耐性試験ベクターＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクションさせることにより作成される耐性試験ベクターウィルス粒子を使用して、ＡＺＴの不在下またはＡＺＴの漸増下（約０．０００１μＭから１０００μＭ）のいずれかで増殖させた標的宿主細胞を感染させた。薬剤の存在下において感染標的宿主細胞中に産生されるルシフェラーゼ活性の量を、薬剤不在下において感染標的宿主細胞中に産生されるルシフェラーゼの量と比較した。薬剤耐性を、薬剤不在下で検出されるルシフェラーゼ活性を５０％阻害するために必要な薬剤の量として測定した（５０％阻害濃度、ＩＣ50）。薬剤阻害パーセントを薬剤濃度の対数値に対して作図することにより、ＩＣ50を測定した。
宿主細胞（２９３）を直径１０ｃｍの培養皿に播種し、２，３日間の平板培養後に耐性試験ベクタープラスミドＤＮＡおよびエンベロープ発現ベクターｐＣＸＡＳ（４０７０Ａ−ｅｎｖ）をトランスフェクションした。リン酸カルシウム沈殿手法を使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクションから１から２４時間後に、ＤＮＡ沈殿物を含む細胞培養培地を新鮮な培地と交換した。トランスフェクションから１から４日後に耐性試験ベクターウィルス粒子を含む細胞培養培地を採取し、０．４５−ｍｍフィルターを通過させてから−８０℃にて保存した。製造業者（エスアイエーシー（ＳＩＡＣ）社、メリーランド州フレデリック）が記載するようなＥＩＡ法により、採取した細胞培養培地中のＨＩＶカプシドタンパク質（ｐ２４）量を測定した。感染の６から４８時間前に、ＡＺＴを含まない細胞培養培地中または１００μＭから０．００００５μＭまで連続２倍希釈したＡＺＴを含む細胞培養培地中で標的細胞（２９３および２９３／Ｔ）を平板培養した。感染中はＡＺＴ濃度を維持した。標的宿主細胞にトランスフェクションされた耐性試験ベクター宿主細胞上清９０μｌを接種した。見掛け上、トランスフェクション（ＤＮＡを含まない）またはエンベロープ発現プラスミドＤＮＡ（ｐＣＸＡＳ（４０７０Ａ−ｅｎｖ））を含まない耐性試験ベクタープラスミドを含むトランスフェクションの細胞培養培地を使用して対照感染を実施した。接種の１から２４時間後に、新鮮な培地を各ウェルに添加した。１２から３６時間後に、培地を新鮮な培地と全て交換した。感染より１から３日以上経過してから、培地を除去し、細胞溶解緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を各ウェルに添加した。細胞溶解物を溶解緩衝液で１００倍希釈し、ルシフェラーゼ活性について希釈した各細胞溶解物を検定した（図７Ａ）。以下の等式を使用してＡＺＴの阻害効果を測定した：
ルシフェラーゼ阻害％＝１−（ＲＬＵｌｕｃ［ＡＺＴ］÷ＲＬＵｌｕｃ）
（式中、ＲＬＵｌｕｃ［ＡＺＴ］はＡＺＴ存在下における感染細胞のルシフェラーゼ活性の相対光学単位であり、ＲＬＵｌｕｃはＡＺＴ不在下における感染細胞のルシフェラーゼ活性の相対光学単位である）。ルシフェラーゼ活性の阻害パーセントを薬剤濃度の対数値に対して作図することによるデータから作成されたＳ字状曲線からＩＣ50値を得た。ＡＺＴの阻害曲線を（図７Ｂ）に示す。
ネビラピン（Ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）薬剤感受性／耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２に基づいた耐性試験ベクターは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤ネビラピン（（ＢＩ−ＲＧ−５８７、ベーリンガー  インゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ）社）に感受性を示す生物学的活性なプロウィルスクローンｐＮＬ４−３から誘導される逆転写酵素配列を含む。宿主パッケージング細胞のトランスフェクションおよび宿主標的細胞の感染は、上記のＡＺＴ薬剤感受性／耐性試験について記載したように実施した。０．０００１μＭから１００μＭの濃度範囲のネビラピンを使用して、ネビラピン感受性／耐性を評価した。ＡＺＴについて上記し、図７Ｃに示すように、ネビラピンの阻害曲線を測定した。
インディナビア（Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）薬剤感受性／耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＧ−ＣＸＣＮ（Ｆ−ｌｕｃＰ）２に基づいた耐性試験ベクターは、プロテアーゼ阻害剤インディナビア（ＭＫ−６３９、メルク（Ｍｅｒｋ）社）に感受性を示す生物学的活性なプロウィルスクローンｐＮＬ４−３から誘導されるプロテアーゼ配列を含む。宿主パッケージング細胞のトランスフェクションおよび宿主標的細胞の感染は、プロテアーゼ阻害剤インディナビアがトランスフェクションされたパッケージング宿主細胞培養物並びに感染させた標的宿主細胞培養物中に含有された以外は、上記のようにＡＺＴ薬剤感受性／耐性試験について記載したように実施した。１．５ｐＭから３μＭの濃度範囲のインディナビアを使用して、インディナビア感受性／耐性を評価した。ＡＺＴについて上記し、図７Ｄに示すように、インディナビアの阻害曲線を測定した。
実施例７
患者由来セグメント（類）および逆方向のイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した肝炎薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ベクター−構築
抗ウィルス薬剤の標的（類）であるウィルス遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを作成した。インジケータウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）はサブゲノムウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶに基づいている。インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、逆方向のイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子カセットおよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全てを含むが（すなわち、（ＤＲ１、５’εＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ｐＡ）、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要なトランス−作用型の構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）を欠損している（図８Ｂ）。Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子並びに患者配列アクセプタ部位はパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸ（以下の図８Ｄ）およびｐＰＫ−Ｓ（以下の図８Ｅ）内に含有される。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは、耐性試験ベクター系を構成する。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）は、５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムおよびＤＲ１の５’領域並びに被包形成シグナル領域（ε）の５’コピー（プレ−ＣＯＲＦ翻訳開始コドンは削除される）、（３）インジケータ遺伝子ＯＲＦが逆方向のイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子、および（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶポリアデニル化（ｐＡ）シグナル領域を含むＨＢＶゲノム領域。非機能性インジケータ遺伝子発現カセットは、５’から３’方向に配列された以下の要素の一部または全てを含む：（１）転写エンハンサー−プロモーター領域、（２）イントロン、（３）逆方向のイントロンを含むインジケータ遺伝子、（４）転写ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＳＶ４０）、（ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子）。インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と反対である（図８Ｂ）。しかしながら、インジケータ遺伝子ＯＲＦ内のイントロンは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
２番目の実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ＋）は、逆方向のイントロンを含む非機能性インジケータ遺伝子カセット、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全ておよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルスの粒子形成に必要なトランス−作用型構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）の一部または全てを含む（図８Ｆ）。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ＋）由来の耐性試験ベクターは、患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＸと併用して使用される（図８Ｈ）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターはまた、Ｐなどのパッケージング機能の一部または全部を提供する。インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要である構造活性および酵素活性は、追加のパッケージングベクター（類）ｐＰＫ−ＣＳＫを使用して提供される（以下の図８Ｈ）。本実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ＋）は５’から３’の方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域並びにＤＲ１および５’ε（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）、（３）Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子並びに患者由来Ｐ遺伝子セグメントを含んでもよいＨＢＶゲノム領域内に配置され、逆方向のイントロンを含むインジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ε  ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノム領域。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ＋）内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と反対方向である（図８Ｆ）。しかしながら、インジケータ遺伝子ＯＲＦ内のイントロンは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
トランスフェクションした細胞において、パッケージングベクター（図８Ｄ、８Ｅおよび８Ｈ）は、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要であるが、耐性試験ベクターおよびインジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されない構造機能および酵素機能をトランス型で提供する。ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ−）などのインジケータ遺伝子ウィルスベクターがｐＰＫ−ＣＰＸなどのパッケージングベクターと共存トランスフェクションされる実施態様において、これらのベクターの組み合わせが耐性試験ベクター系を構成し、患者由来のＰ遺伝子セグメントを挿入するための患者配列アクセプタ部位を含むのはパッケージングベクターである（上記）。パッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンから３’ｐＡシグナルに及び、Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子を含むＨＢＶゲノム領域。パッケージングベクターのＣ遺伝子は、プレ−Ｃ  ＯＲＦ配列を含まない、および／または発現しないように、またＳタンパク質を発現しないように改変される（上記）。
ＨＢＶにおいて、Ｃおよび／またはＰタンパク質をコードするＲＮＡがシス型で優先的にパッケージングされ、結果としてＣおよびＰタンパク質をコードしない非機能性インジケータ遺伝子または非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターＲＮＡを含む耐性試験ベクターの効率的なパッケージングを妨害するであろう。パッケージングベクターから産生されるＲＮＡの被包化を防止し、耐性試験ベクターまたは非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターＲＮＡの被包化効率を改良するには２つの段階が取られる。第１に、パッケージングベクターにより産生されるＲＮＡは５’被包化シグナル領域（ε）を含まない（図８Ｄ、８Ｅおよび８Ｈ）。第２に、Ｃ遺伝子および／またはＰ遺伝子パッケージング機能が耐性試験ベクターまたは非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供される場合には、Ｃおよび／またはＰ遺伝子産物を発現しない、ｐＰＫ−ＳまたはｐＰＫ−ＣＳＫなどのパッケージングベクターが使用される（図８Ｅおよび８Ｈ）。
耐性試験ベクター−構築
１）患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）と呼ばれる独自の制限部位をＰ遺伝子領域に導入することにより、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ（ＰＳＡＳ−）を改変し、２）感染患者の血清または細胞に含有されるウィルスＤＮＡを増幅することにより、例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼのようなＨＢＶ薬剤の標的に相当する患者由来セグメントを増幅することにより、および３）増幅した配列を患者配列アクセプタ部位のインジケータ遺伝子ウィルスベクターに正確に挿入することにより、耐性試験ベクターを調製する（図８Ｆ）。別の方法として、１）患者配列アクセプタ部位をＰ遺伝子に導入することにより、パッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸを改変し、２）感染患者の血清または細胞中に含有されるウィルスＤＮＡを使用して増幅することにより、例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼのようなＨＢＶ薬剤の標的に相当する患者由来のセグメントを増幅することにより、および３）増幅した配列を患者配列アクセプタ部位のパッケージングベクターに正確に挿入することにより、耐性試験ベクター系を調製する（図８Ｄ）。一実施態様において、５’ＰＳＡＳはＰタンパク質のスペーサーとＲＴドメインの境界付近に位置し（Ｓタンパク質翻訳開始部位のすぐ下流）、３’ＰＳＡＳはＰタンパク質のＲＮａｓｅ  ＨドメインのＣ末端付近に位置する。患者由来のＰ遺伝子セグメントを患者配列アクセプタ部位に挿入することにより、ＴＰおよびスペーサードメインはベクターＰ遺伝子配列によりコードされるが、逆転写酵素／ポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈドメインは患者由来セグメントによりコードされる、キメラＰ遺伝子配列が形成される（図８Ｄおよび８Ｅ）。
ＨＢＶにおいて、全Ｓ遺伝子ＯＲＦはＰ遺伝子ＯＲＦと重なるが、異なる読み枠を使用して発現される（ナーザル  エム（Ｎａｓｓａｌ，Ｍ．）およびシャラー  エッチ（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｈ．）（１９９３）トレンド  イン  マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１，２２１〜２２８）。このように、患者から得られるＨＢＶ  Ｐ遺伝子配列（逆転写酵素およびＲＮａｓｅ  Ｈドメイン）も、対応する患者Ｓ遺伝子配列を含む。３つのＳ遺伝子ＯＲＦ（プレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２およびＳ）翻訳開始部位を排除し、および／または枠内の停止コドンをｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）またはｐＰＫ−ＣＰＫベクター内に導入することにより、重なっているＳ遺伝子ＯＲＦの患者由来のＳ遺伝子領域の発現は防止される（図８Ｆおよび８Ｄ）。Ｓ遺伝子発現は、十分に特徴付けられているＳ遺伝子産物を提供するセパレートパッケージングベクターを使用して、トランス型で提供される（図８Ｅおよび８Ｈ）。Ｓ遺伝子の発現を排除する改変は、Ｐ遺伝子の末端タンパク質（ＴＰ）またはスペーサードメインによりコードされる重なったアミノ酸配列に変更を加えることなく実施される。
薬剤感受性および耐性試験
１種の宿主細胞または２種の宿主のいずれかを使用して、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）に基づいた耐性試験ベクターまたはインジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸに基づいた耐性試験ベクター系を用いて、薬剤感受性および耐性試験を実施する。ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ＋）などの耐性試験ベクターおよびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸによる、またはｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＩＩ−（ＰＳＡＳ−）などのインジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびｐＰＫ−ＣＰＸなどのパッケージングベクターを含む患者由来セグメント（すなわち、耐性試験ベクター系）によるパッケージング宿主細胞の共存トランスフェクションは、逆方向のイントロンのスプライシングの結果として、機能性インジケータ遺伝子を含む被包化インジケータ遺伝子「プレゲノム」ＲＮＡを含むＨＢＶウィルス粒子を産生する（図８Ｂおよび８Ｃ）。
抗ウィルス薬剤の不在下または抗ＨＢＶ薬剤（例えば、ＨＢＶ  Ｐタンパク質逆転写酵素またはポリメラーゼ阻害剤）の漸増濃度下のいずれかにおいて維持された一連のパッケージング宿主細胞培養物について反復トランスフェクションを実施する。抗ＨＢＶ薬剤の存在下または不在下においてパッケージング宿主細胞を２，３日間まで維持した後、宿主パッケージング細胞溶解物中または宿主パッケージング細胞培養培地を採取することにより得られる単離ＨＢＶ粒子中のいずれかにおいて直接薬剤感受性または耐性の程度を評価することができる。別の方法を使用して、細胞溶解物および単離ＨＢＶ粒子中の薬剤感受性および耐性を評価することができる。
一細胞検定法と呼ばれる一実施態様において、抗ウィルス薬剤の存在下または不在下において、トランスフェクションしたパッケージング宿主細胞中の、例えばルシフェラーゼ活性のようなインジケータ遺伝子の発現を測定することにより薬剤感受性または耐性を評価する。所定の抗ウィルス薬剤または薬剤の組み合わせの存在下においてトランスフェクションした細胞について観察されたルシフェラーゼ活性の低下を抗ウィルス薬剤（類）の不在下における対照試験と比較したものは、一般にＳ字状曲線として抗ウィルス薬剤の濃度の対数値と相関する。
二細胞検定法と呼ばれる２番目の実施態様において、ＨＢＶ粒子またはＨＢＶ粒子ＤＮＡで各々の感染またはトランスフェクションを行った後、標的宿主細胞中の、例えばルシフェラーゼ活性のようなインジケータ遺伝子の発現を測定することにより、薬剤感受性または耐性を評価する。パッケージング宿主細胞から得られるＨＢＶウィルス粒子を使用して、標的宿主細胞を感染させ、またはこれらの粒子のＤＮＡを使用して標的宿主細胞をトランスフェクションさせる。感染またはトランスフェクション時に、適当な濃度の抗ウィルス薬剤を細胞培養物に加える。感染またはトランスフェクションから２，３日までに、標的宿主細胞を溶解し、インジケータ遺伝子の発現を測定する。例えば、ＨＢＶ  Ｐタンパク質の逆転写酵素（−鎖ＤＮＡ）またはＤＮＡポリメラーゼ（＋鎖ＤＮＡ）活性のいずれかを阻害することにより、ＨＢＶの複製を阻害する薬剤の存在下においてトランスフェクションまたは感染させた細胞について、インジケータ遺伝子の発現の低下を、薬剤の不在下において実施される対照試験と比較して観察する。
ＤＮＡ構造指標検定法と呼ばれる第３の実施態様において、トランスフェクションされたパッケージング宿主細胞内、またはパッケージング宿主細胞により産生されるウィルス粒子内に生じたＨＢＶ  ＤＮＡ複製程度を測定することにより、薬剤感受性または耐性を評価する。トランスフェクションされた宿主細胞において、ＨＢＶサブゲノムウィルスベクターが転写され、ＲＮＡ転写物が「プレゲノム」ＲＮＡとしてパッケージングされる。ウィルス成熟中に、プレゲノムＲＮＡは、全長のマイナス鎖と部分的なプラス鎖ＤＮＡコピーからなる弛緩した環状のゲノムＤＮＡ（ｒｃ−ＤＮＡ）に変換される。その後の段階において、ｒｃ−ＤＮＡは、共有結合による閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換される。ＨＢＶ  ＤＮＡの複製を測定するために、プレゲノムＲＮＡをスプライシングし、このスプライシングされたＲＮＡをｒｃ−ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ形態に変換させることにより形成されるＨＢＶ  ＤＮＡ構造を増幅するための増幅プライマーが作成される。
ＨＢＶ粒子内で正しい増幅標的構造が形成されるには、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製が失敗することなく完了することにより、ｒｃ−ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡが形成される必要がある。ＨＢＶ  ＤＮＡの複製（逆転写およびＤＮＡポリメラーゼ活性）を阻害する抗ウィルス薬剤はＤＮＡの標的配列の形成を制限し、これにより多数の定量的な増幅検定法を使用して増幅されたＤＮＡ産物の低下として測定され得る。一実施例において（図１０Ｂ）、ＨＢＶ配列と同じ転写方向でインジケータ遺伝子ＯＲＦに挿入されるイントロン配列により、逆プライマー（Ｐｒ）の結合部位は２つの成分に分離される。前進プライマー（Ｐｆ）のプライマー結合部位は、ＤＲ２およびＤＲ１＊配列により配置されるウィルスベクター領域内に位置づけられる。直線ＨＢＶベクターにおいて、ＰｆおよびＰｒプライマーは反対方向のＤＮＡ合成をさせ、互いに対して外向きに向けられる。この場合には、Ｐｒプライマーは上流方向にＤＮＡ合成をさせ（（ε）の５’コピー方向、Ｐｆプライマーは下流方向にＤＮＡ合成をさせる（３’（ε）方向。このような配列のプライマーおよび鋳型は直線インジケータ遺伝子ウィルスベクター内に機能的増幅単位を構成しない。さらに、Ｐｒ結合部位はスプライシングされていない直線ベクター内では全長ではなく、従ってＰｒは標的ＤＮＡにアニーリングされない。一方、ＰｆおよびＰｒプライマーは、成熟したビリオンに見られる弛緩した環状のＨＢＶ  ＤＮＡ中で互いに対して内側方向をとり、ＲＮＡプレゲノムのスプライシングは全長のＰｒプライマー結合部位を作成している。両プライマーは、ここではｒｃ−ＤＮＡのプラス鎖コピー内およびｃｃｃＤＮＡのプラスまたはマイナス鎖内で、ＤＲ１の１本鎖コピーに向かってＤＮＡ合成をさせる。このような配列のプライマーおよび鋳型は機能性増幅単位を構成する（図１０Ｃ）。
ＤＮＡ配列インジケータ検定法の別の実施態様において（図９Ｄ）、増幅させたＤＮＡの産生ではなく、増幅酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を測定する（シー  ヘイド（Ｃ．Ｈｅｉｄ）ら、１９９６年。ゲノム  リザーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６：９８６〜９９４）。ＰｆおよびＰｒ結合部位により配置される増幅後のＤＮＡ鋳型領域に結合することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの核溶解切断をモニタリングすることにより、５’エキソヌクレアーゼ活性を測定する。この検定法の実施は、上流プライマー（Ｐｆ）の３’端とオリゴヌクレオチドプローブの５’端との近接性に依存する。Ｐｒプライマーが延在されるとき、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性がオリゴヌクレオチドプローブ切断するように、オリゴヌクレオチドプローブの５’端と置き換わる。イントロンの目的は、スプライシングされていない標的鋳型のプローブオリゴヌクレオチドの検出可能なエキソヌクレアーゼ消化を本質的に排除するために、Ｐｆ結合部位をエキソヌクレアーゼプローブ配列の５’端から十分に距離をおいて配置させることである。スプライシングによるイントロンの除去は、プローブの５’結合部位のすぐ上流のＰｆ結合部位の３’端に位置づける作用をする。後者の再配列により、増幅後の標的鋳型のエキソヌクレアーゼ活性の定量的検出が可能になる（図１Ｅ）。
薬剤スクリーニング
逆方向のイントロンを有する非機能性インジケータ遺伝子カセットを含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびパッケージングベクター（類）を使用して、薬剤スクリーニングを実施する。トランスフェクションされたパッケージング宿主細胞において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターはインジケータ遺伝子を含み、被包化能力を有する（ε＋）ＲＮＡ転写物を産生する。パッケージングベクター（類）は、耐性試験ベクターにより提供されないが、ウィルスＤＮＡの複製および粒子形成に必要なウィルスの構造および／または酵素機能をトランス型で提供する。パッケージング宿主細胞の共存トランスフェクションの結果、インジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびパッケージングベクターは、逆方向のイントロンのスプライシングの結果として、機能性インジケータ遺伝子を含む、被包化遺伝子ウィルスベクター「プレゲノム」ＲＮＡを含むＨＢＶウィルス粒子を生ずる。
薬剤のスクリーニングは以下のように実施される：インジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびパッケージングベクターＤＮＡを使用して、パッケージング宿主細胞をトランスフェクションさせる。抗ウィルス化合物（例えば、候補として、ＨＢＶ  Ｐタンパク質逆転写酵素またはポリメラーゼ阻害剤）の不在下または存在下のいずれかで維持された一連のパッケージング宿主細胞培養物に対して、反復トランスフェクションを実施する。候補の抗ウィルス薬剤の存在下または不在下において、パッケージング宿主細胞を７日まで維持した後、パッケージング宿主細胞溶解物または宿主パッケージング細胞培養培地を採取することにより得られる単離ＨＢＶ粒子中で直接ＤＮＡの複製阻害程度を評価する。上記のＤＮＡ検出またはインジケータ遺伝子活性方法のいずれかを使用して、抗ＨＢＶ薬剤候補の可能性を評価することができる。
実施例８
患者由来セグメント（類）および順序の入れ替わったプロモーターを含む非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した肝炎薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−構築
抗ウィルス薬剤の標的（類）であるウィルス遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを作成した。インジケータウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）はサブゲノムウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶに基づいている。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）は、順序の入れ替わったプロモーターを含む非機能性インジケータ遺伝子カセットおよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全てを含むが（すなわち、ＤＲ１、５’εＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ｐＡ）、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要なトランス−作用型の構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）を欠損している（図１０Ｂ）。Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子並びに患者配列アクセプタ部位はパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸ内に含有される（実施例７に記載、図８Ｄ参照）。Ｓ遺伝子はパッケージングベクターｐＰＫ−Ｓ内に含有される（実施例７に記載したように、図８Ｅ参照）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは、耐性試験ベクター系を構成する。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）は、５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムの５’領域およびＤＲ１および５’ε（プレ−ＣＯＲＦ翻訳開始コドンは削除される）、（３）プロモーター領域が３’、すなわちインジケータＯＲＦの下流、に位置づけされるように作成された非機能性インジケータ遺伝子カセット、および（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノム領域（プレＣ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）。非機能性インジケータ遺伝子発現カセットは、５’から３’方向に配列された以下の要素の一部または全てを含む：（１）内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、（２）逆方向のイントロンを含んでもよいインジケータ遺伝子、（３）、転写ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＳＶ４０、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子、ＳＶ４０）（４）エンハンサー−プロモーター領域。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクター内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と反対または同じである。インジケータ遺伝子ＯＲＦ内がイントロンを含む場合には、イントロンは転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
２番目の実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、逆方向のプロモーター領域を含む非機能性インジケータ遺伝子カセット、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全ておよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルスの粒子形成ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）に必要なトランス−作用型構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）の一部または全てを含む（図１０Ｄ）。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）から誘導される耐性試験ベクターは、患者配列アクセプタ部位を含み、パッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＸと併用して使用される（図８Ｈ）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターはまた、Ｐなどのパッケージング機能の一部または全部を提供する。さらに、本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要である構造活性および酵素活性は、追加のパッケージングベクターを使用して提供される。本実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ（ＰＳＡＳ＋）は５’から３’の方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＨＢＶゲノムおよびＤＲ１の５’領域並びに５’ε（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）、（３）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）、（４）患者由来のセグメントを含むＰ遺伝子（５）インジケータ遺伝子ＯＲＦ（６）内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、および（７）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクター内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と逆または前方方向である。インジケータ遺伝子が逆方向のイントロンを含む場合には、イントロンは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
耐性試験ベクター−構築
実施例８に記載するように、抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを作成した。患者由来セグメント（ＰＤＳ）を含むＰ遺伝子を挿入するための患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含むように、インジケータ遺伝子ウィルスベクターまたはパッケージベクターを改変する（実施例７に記載、図８Ｄおよび８Ｆ参照）。患者由来のＳ遺伝子の発現は、実施例７に記載するように、排除される。（図８Ｄ）。十分に特徴づけられたＳ遺伝子産物を提供するセパレートパッケージングベクターを使用して、均一なＳ遺伝子の発現をトランス型で提供する（図８Ｅ）。
薬剤感受性および耐性試験
１種の宿主細胞または２種の宿主のいずれかを使用して、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ＋）に基づいた耐性試験ベクターまたはインジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸに基づいた耐性試験ベクター系を用いて、薬剤感受性および耐性試験を実施する。パッケージング宿主細胞の共存トランスフェクションの結果、耐性試験ベクターおよびパッケージングベクターにより、またはインジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびパッケージングベクター（すなわち、耐性試験ベクター系）により、非機能性インジケータ遺伝子を含む被包化インジケータ遺伝子「プレゲノム」ＲＮＡを含むＨＢＶウィルス粒子を作成する。ＨＢＶ  ＤＮＡの複製過程中に、トランスフェクションされた宿主細胞内で、順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を機能性インジケータ遺伝子に転換する（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
実施例７に記載するように、薬剤感受性および耐性試験を実施する（上記）。トランスフェクションまたは感染させた宿主細胞内のインジケータ遺伝子の発現量を測定することにより、種々の抗ウィルス薬剤に対する患者由来の逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性の耐性または感受性を測定することができる。別の方法として、生じたＨＢＶ  ＤＮＡの複製量を定量することにより、耐性または感受性を測定してもよい。後者は、定量的ＤＮＡ増幅検定法を使用して実施され得る。この種の検定方法の一実施例において、（図９Ｆおよび９Ｇ）逆プライマー（Ｐｒ）のプライマー結合部位は５’εの下流領域に配置される。前進プライマー（Ｐｆ）のプライマー結合部位は、ＤＲ２およびＤＲ１＊配列により配置される領域内に位置づけられる。直線ＨＢＶベクターにおいて、ＰｆおよびＰｒプライマーは反対方向のＤＮＡ合成をさせる。この場合には、Ｐｒプライマーは上流方向にＤＮＡ合成をさせ（５’εの方向で、Ｐｆプライマーは下流方向にＤＮＡ合成をさせる（３’ε方向。このようなプライマー構成は、トランスフェクションに使用されるウィルスベクターの直線コピー内に機能的増幅単位を構成しない。一方、ＰｆおよびＰｒプライマーは、成熟したビリオンに見られるｒｃ−ＤＮＡ中で互いに向かい合う方向をとる。両プライマーは、ここではｒｃ−ＤＮＡのプラス鎖コピー内のＤＲ１の１本鎖コピーに向かってＤＮＡ合成をさせる。このような配列のプライマーおよび鋳型は機能性増幅単位を構成する。
薬剤スクリーニング
順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを使用した薬剤スクリーニングは、本質的に上記の実施例７に記載したように実施される。
実施例９
患者由来セグメントおよび順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始部位を含む非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した肝炎薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター
抗ウィルス薬剤の標的（類）であるウィルス遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始部位ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳを有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを作成した。インジケータウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ−（ＰＳＡＳ−）はサブゲノムウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶに基づいている。インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始領域を含む非機能性インジケータ遺伝子カセットおよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全てを含むが（すなわち、ＤＲ１、５’ε、ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ｐＡ）、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要なトランス−作用型の構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）を欠損している（図１１Ｂ）。Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子並びに患者配列アクセプタ部位はパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸ内に含有される（実施例７、図８Ｄ）。Ｓ遺伝子はパッケージングベクターｐＰＫ−Ｓ内に含有される（実施例７、図８Ｅ）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ−（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは、耐性試験ベクター系を構成する。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ−（ＰＳＡＳ−）は、５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＤＲ１および５’εを含むＨＢＶゲノムの５’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは削除される）、（３）翻訳開始部位を欠損するインジケータ遺伝子ＯＲＦ、および（４）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）（５）ＤＲ２、機能性プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンＤＲ１＊、３’ε、３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域。非機能性インジケータ遺伝子発現カセットは、５’から３’方向に配列された以下の要素の一部または全てを含む：（１）枠内翻訳開始部位を含まないインジケータ遺伝子ＯＲＦ、（２）転写ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子、ＳＶ４０）、（３）、エンハンサー−プロモーター領域。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦーＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ−）内では、インジケータ遺伝子発現カセットの転写方向は、ＨＢＶ配列要素と同じである。インジケータ遺伝子ＯＲＦがイントロンを含む場合には、イントロンは転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
２番目の実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始領域を含む非機能性インジケータ遺伝子カセット、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全ておよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルスの粒子形成ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ＋）に必要なトランス−作用型構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）の一部または全てを含む（図１１Ｄ）。インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要な構造および酵素活性は、追加のパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＸを使用して提供される（実施例７に記載、図８Ｅ参照）。Ｃ、ＳおよびＸはパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＸ内に含有される（実施例７に記載、図８Ｈ参照）。本実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＰＴＩＳ（ＰＳＡＳ＋）は５’から３’の方向の以下の要素を含む（図１１Ｄ）：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）ＤＲ１および５’εを含むＨＢＶゲノムの５’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）、（３）翻訳開始部位を欠損するインジケータ遺伝子ＯＲＦ、（４）患者由来のセグメントを含むＰ遺伝子、（５）エンハンサー−プロモーター領域（順序の入れ替わったプロモーター）（６）ＤＲ２、プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドン、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクター内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。インジケータ遺伝子が逆方向のイントロンを含む場合には、イントロンは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じである。
耐性試験ベクター−構築
実施例７に記載するように、抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを作成した。患者由来セグメント（ＰＤＳ）を含むＰ遺伝子を挿入するための患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含むように、インジケータ遺伝子ウィルスベクターまたはパッケージベクターを改変する（実施例７に記載、図８Ｄおよび８Ｆ参照）。患者由来のＳ遺伝子の発現は、実施例７に記載するように、排除される。十分に特徴づけられたＳ遺伝子産物を提供するセパレートパッケージングベクターを使用して、均一なＳ遺伝子の発現をトランス型で提供する（図８Ｅ）。
薬剤感受性および耐性試験
実施例７および８に記載する手順により、薬剤感受性および耐性試験を実施する。ＨＢＶ複製中に、非機能性インジケータ遺伝子を機能性インジケータ遺伝子に転換する（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。
薬剤スクリーニング
順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを使用した薬剤スクリーニングは、本質的に実施例７および８（上記）に記載したように実施される。
実施例１０
患者由来セグメントおよび順序の入れ替わったコード領域を含む非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した肝炎薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−抗ウィルス薬剤の標的（類）であるウィルス遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったコード領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを作成した。インジケータウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ−）はサブゲノムウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶに基づいている。インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、順序の入れ替わったコード領域を有する非機能性インジケータ遺伝子カセット、およびＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全てを含むが（すなわち、ＤＲ１、５’ε、ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ｐＡ）、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要なトランス−作用型の構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）を欠損している（図１２Ｂ）。Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子並びに患者配列アクセプタ部位はパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸ内に含有され、Ｓ遺伝子はパッケージングベクターｐＰＫ−Ｓ内に含有される（実施例７、図８Ｄおよび８Ｅ）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは、耐性試験ベクター系を構成する。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ−）は、５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＤＲ１および５’εを含むＨＢＶゲノムの５’領域（プレ−ＣＯＲＦ翻訳開始コドンは削除される）、（３）プロモーター領域およびコード領域の５’部分がコード領域の残りの３’部分の３’側、すなわち下流に位置づけされるように作成される非機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）。非機能性インジケータ遺伝子発現カセットは、５’から３’方向に配列された以下の要素の一部または全てを含む：（１）スプライスアクセプタ配列内にコードされるイントロンの３’領域、（２）インジケータ（レポーター）ＯＲＦまたは選択マーカーＯＲＦの３’領域、（３）転写ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＨＣＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子、ＳＶ４０）、（４）エンハンサー−プロモーター領域、（５）インジケータ遺伝子ＯＲＦの５’領域、（６）スプライスドナー配列から開始するイントロンの５’領域。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクター内では、インジケータ遺伝子発現カセットは転写方向が、ＨＢＶ配列要素と同じかまたは反対である。インジケータ遺伝子ＯＲＦがイントロンを含む場合には、イントロンはＨＢＶ配列要素に対して同じ方向に配向される。
２番目の実施態様において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、順序の入れ替わったコード領域を含む非機能性インジケータ遺伝子カセット、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全ておよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルスの粒子形成ｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）に必要なトランス−作用型構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）の一部または全てを含む（図１２Ｄ）。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）から誘導される耐性試験ベクターは、患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含み、パッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＫと併用して使用される（実施例７に記載、図８Ｈ参照）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターはパッケージング機能の一部または全てを提供してもよい。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要な構造および酵素活性は、追加のパッケージングベクターを使用して提供される。本実施例において、非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターは５’から３’の方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）プレ−ＣＯＲＦ翻訳開始コドンのすぐ下流のＨＢＶゲノム領域並びにＤＲ１および５’ε、（３）Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子の一部または全てを含んでもよいＨＢＶゲノム領域を含むインジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノム領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ開始コドンは排除されている）。非機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（ＮＦ−ＩＧ）ＰＣＲ（ＰＳＡＳ＋）内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じか、または反対である。インジケータ遺伝子が逆方向のイントロンを含む場合には、イントロンは、ＨＢＶ配列要素に対して同じ方向に配向される。
耐性試験ベクター−構築
実施例７に記載するように、抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったコード領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを作成した。患者由来セグメント（ＰＤＳ）を含むＰ遺伝子を挿入するための患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含むように、インジケータ遺伝子ウィルスベクターを改変する（実施例７に記載、図８Ｄおよび８Ｆ参照）。患者由来のＳ遺伝子の発現は、実施例７に記載するように、排除される。十分に特徴づけられたＳ遺伝子産物を提供するセパレートパッケージングベクターを使用して、均一なＳ遺伝子の発現をトランス型で提供する（図８Ｅ）。
薬剤感受性および耐性試験
実施例７および８に記載する手順により、薬剤感受性および耐性試験を実施する。ＨＢＶ複製中に、非機能性インジケータ遺伝子を機能性インジケータ遺伝子に転換する（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。
薬剤スクリーニング
順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを使用した薬剤スクリーニングは、本質的に実施例７および８（上記）に記載したように実施される。
実施例１１
患者由来セグメントおよび機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した肝炎薬剤感受性および耐性試験
インジケータ遺伝子ウィルスベクター−構築
抗ウィルス薬剤の標的（類）であるウィルス遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、機能性インジケータを含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを作成した。インジケータウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）はサブゲノムウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶに基づいている。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）は、機能性インジケータ遺伝子カセット、およびＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全てを含むが（すなわち、ＤＲ１、５’ε、ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ｐＡ）、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要なトランス−作用型の構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）を欠損している（図１４Ｂ）。Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子並びに患者配列アクセプタ部位はパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸ内に含有され、Ｓ遺伝子はパッケージングベクターｐＰＫ−Ｓ内に含有される（以下に記載、図８Ｄおよび８Ｅ）。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＰＸは、耐性試験ベクター系を構成する。機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）は、５’から３’方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサープロモーター領域、（２）ＤＲ１および５’εを含むＨＢＶゲノムの５’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは削除される）、（３）機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’ε、３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノムの３’領域（プレ−Ｃ  ＯＲＦ翻訳開始コドンは排除される）。インジケータ遺伝子発現カセットは、５’から３’方向に配列された以下の要素の一部または全てを含む：（１）転写エンハンサー−プロモーター領域、（２）イントロン、（３）インジケータ遺伝子ＯＲＦまたは選択マーカーＯＲＦ、（４）転写ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＳＶ４０）または一方向性（ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子）。インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と同じ、または反対である。
２番目の実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、機能性インジケータ遺伝子カセット、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製に必要なシス作用性調節要素の全ておよびＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルスの粒子形成ｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）に必要なトランス−作用型構造機能および酵素機能を提供するＨＢＶ遺伝子配列（すなわち、Ｃ、Ｐ、Ｓ、Ｘ遺伝子）の一部または全てを含む（図１３Ｄ）。インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）から誘導される耐性試験ベクターは、患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含み、パッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＫと併用して使用される。本実施態様において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターはまたパッケージング機能の一部または全部を提供する。インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ＨＢＶ  ＤＮＡの複製およびウィルス粒子形成に必要な構造および酵素活性は、追加のパッケージングベクターｐＰＫ−ＣＳＸを使用して提供される（実施例７に記載、図８Ｈ参照）。本実施例において、機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターは５’から３’の方向の以下の要素を含む：（１）ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー−プロモーター領域、（２）プレ−ＣＯＲＦ翻訳開始コドンのすぐ下流のＨＢＶゲノム領域並びにＤＲ１および５’ε、（３）Ｃ、Ｐ、ＳおよびＸ遺伝子の一部または全てを含むＨＢＶゲノム領域内の機能性インジケータ遺伝子カセット、（４）ＤＲ２、ＤＲ１＊、３’εおよび３’ＨＢＶ  ｐＡシグナル領域を含むＨＢＶゲノム領域。インジケータ遺伝子ウィルスベクター内では、インジケータ遺伝子発現カセットは、転写方向がＨＢＶ配列要素と反対か、または同じである。
耐性試験ベクター−構築
実施例７に記載するように、抗ウィルス標的遺伝子を含むＨＢＶサブゲノムウィルスベクターを使用して、順序の入れ替わったプロモーターを有する非機能性インジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを作成した。患者由来セグメント（ＰＤＳ）を含むＰ遺伝子を挿入するための患者配列アクセプタ部位（ＰＳＡＳ）を含むように、インジケータ遺伝子ウィルスベクターまたはパッケージングベクターを改変する（実施例７に記載、図８Ｄおよび８Ｆ参照）。患者由来のＳ遺伝子の発現は、実施例７に記載するように、排除される（図８Ｄ参照）。十分に特徴づけられたＳ遺伝子産物を提供するセパレートパッケージングベクターを使用して、均一なＳ遺伝子の発現をトランス型で提供する（図８Ｅ）。
薬剤感受性および耐性試験
機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ＋）に基づいた耐性試験ベクターまたはインジケータ遺伝子ウィルスベクターｐＣＳ−ＨＢＶ（Ｆ−ＩＧ）（ＰＳＡＳ−）およびパッケージングベクター（類）に基づいた耐性試験ベクター系を用いて、薬剤感受性および耐性試験を実施する。トランスフェクションされたパッケージング宿主細胞において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターは、機能性インジケータ遺伝子カセットを含み、被包形成能力を有する（ε＋）ＲＮＡ転写物を産生する。パッケージングベクター（類）は、機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターにより提供されないが、ウィルスＲＮＡの複製および粒子形成に必要なウィルスの構造機能および／または酵素機能をトランス型で提供する。パッケージング宿主細胞の共存トランスフェクションの結果、インジケータ遺伝子ウィルスベクターおよびパッケージングベクターは、機能性インジケータ遺伝子カセットを含む被包化インジケータ遺伝子ウィルスベクター「プレゲノム」ＲＮＡを含むＨＢＶウィルス粒子を作成することができる。
この実施例において、インジケータ遺伝子ウィルスベクターは機能性インジケータ遺伝子カセットを含み、従ってＨＢＶ  ＤＮＡが複製されなくてもトランスフェクションされた細胞中でインジケータ遺伝子活性を生ずることができる（図１３）。機能性インジケータ遺伝子の場合には、パッケージング宿主細胞中に産生されるウィルスを採取し、粒子（または粒子状ＤＮＡ）を使用して、標的宿主細胞を感染（またはトランスフェクション）させることにより、薬剤によるＨＢＶ  ＤＮＡ複製阻害を評価することができる。別の方法として、インジケータとしてＤＮＡを使用することにより、パッケージング宿主細胞から単離されたウィルス中で直接ＤＮＡの複製を測定することができる。ＨＢＶ  ＤＮＡの複製を阻害する薬剤は、「成熟した」ｒｃ−ＤＮＡ形状の機能性インジケータ遺伝子ウィルスベクターを含むウィルス粒子の形成を減少させる。結果として、機能性インジケータ遺伝子は、感染／トランスフェクション中に標的宿主細胞に効率的に移動させられず、これらの細胞中のインジケータ遺伝子ウィルスベクターｃｃｃＤＮＡおよびインジケータ遺伝子活性は低減される。二細胞検定法における標的宿主細胞内でのインジケータ遺伝子発現の検出は、実施例７に記載するように実施される。ウィルス粒子中のｒｃ−ＤＮＡの検出は、実施例８に記載し、図９Ｆおよび９Ｇに例示するように、インジケータとしてＤＮＡを使用して実施される。
薬剤スクリーニング
順序の入れ替わったプロモーターおよび翻訳開始領域を有する非機能性インジケータ遺伝子を含むインジケータ遺伝子ウィルスベクターを使用した薬剤スクリーニングは、本質的に実施例７および８（上記）に記載したように実施される。
オリゴヌクレオチド
0004183749.tif 000003
0004183749.tif 000004
0004183749.tif 000005
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：キャポン，ダニエルJ.およびクリストスJ.ペトロポーローズ
（ii）発明の名称：抗ウィルス剤感受性及び耐性を決定するための組成物及び方法並びに抗ウイルス剤のスクリーニング
（iii）配列の数：４７
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：クーパー・アンド・ダンハム  ＬＬＰ
（B）通り：１１８５  アヴェニュー・オブ・ジ・アメリカズ
（C）市：ニューヨーク
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：１００３６
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：Patent Inリリース＃1.0，バージョン＃1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
（B）登録番号：２８，６７８
（C）参照／ドケット番号：５０１３０−Ａ−ＰＣＴ／ＪＰＷ／ＡＫＣ
（ix）電信情報：
（A）電話：２１２−２７８−０４００
（B）テレファックス：２１２−３９１−０５２６
（２）配列認識番号：１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１：
0004183749.tif 000006
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２：
0004183749.tif 000007
（２）配列認識番号：３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３：
0004183749.tif 000008
（２）配列認識番号：４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４：
0004183749.tif 000009
（２）配列認識番号：５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：５：
0004183749.tif 000010
（２）配列認識番号：６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：６：
0004183749.tif 000011
（２）配列認識番号：７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：７：
0004183749.tif 000012
（２）配列認識番号：８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：８：
0004183749.tif 000013
（２）配列認識番号：９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：９：
0004183749.tif 000014
（２）配列認識番号：１０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１０：
0004183749.tif 000015
（２）配列認識番号：１１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１１：
0004183749.tif 000016
（２）配列認識番号：１２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１２：
0004183749.tif 000017
（２）配列認識番号：１３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１３：
0004183749.tif 000018
（２）配列認識番号：１４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１４：
0004183749.tif 000019
（２）配列認識番号：１５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１５：
0004183749.tif 000020
（２）配列認識番号：１６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１６：
0004183749.tif 000021
（２）配列認識番号：１７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１７：
0004183749.tif 000022
（２）配列認識番号：１８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１８：
0004183749.tif 000023
（２）配列認識番号：１９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１９：
0004183749.tif 000024
（２）配列認識番号：２０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２０：
0004183749.tif 000025
（２）配列認識番号：２１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２１：
0004183749.tif 000026
（２）配列認識番号：２２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２２：
0004183749.tif 000027
（２）配列認識番号：２３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２３：
0004183749.tif 000028
（２）配列認識番号：２４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２４：
0004183749.tif 000029
（２）配列認識番号：２５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２５：
0004183749.tif 000030
（２）配列認識番号：２６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２６：
0004183749.tif 000031
（２）配列認識番号：２７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２７：
0004183749.tif 000032
（２）配列認識番号：２８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２８：
0004183749.tif 000033
（２）配列認識番号：２９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：２９：
0004183749.tif 000034
（２）配列認識番号：３０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３０：
0004183749.tif 000035
（２）配列認識番号：３１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３１：
0004183749.tif 000036
（２）配列認識番号：３２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３２：
0004183749.tif 000037
（２）配列認識番号：３３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３３：
0004183749.tif 000038
（２）配列認識番号：３４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３４：
0004183749.tif 000039
（２）配列認識番号：３５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３５：
0004183749.tif 000040
（２）配列認識番号：３６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３６：
0004183749.tif 000041
（２）配列認識番号：３７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３７：
0004183749.tif 000042
（２）配列認識番号：３８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３８：
0004183749.tif 000043
（２）配列認識番号：３９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：３９：
0004183749.tif 000044
（２）配列認識番号：４０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４０：
0004183749.tif 000045
（２）配列認識番号：４１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４１：
0004183749.tif 000046
（２）配列認識番号：４２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４２：
0004183749.tif 000047
（２）配列認識番号：４３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４３：
0004183749.tif 000048
（２）配列認識番号：４４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４４：
0004183749.tif 000049
（２）配列認識番号：４５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４５：
0004183749.tif 000050
（２）配列認識番号：４６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４６：
0004183749.tif 000051
（２）配列認識番号：４７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：４７：
0004183749.tif 000052
【図１Ａ】
0004183749.tif 000053
【図１Ｂ】
0004183749.tif 000054
【図１Ｃ】
0004183749.tif 000055
【図１Ｄ】
0004183749.tif 000056
【図１Ｅ】
0004183749.tif 000057
【図２Ａ】
0004183749.tif 000058
【図２Ｂ】
0004183749.tif 000059
【図２Ｃ】
0004183749.tif 000060
【図３Ａ】
0004183749.tif 000061
【図３Ｂ】
0004183749.tif 000062
【図３Ｃ】
0004183749.tif 000063
【図３Ｄ】
0004183749.tif 000064
【図４Ａ】
0004183749.tif 000065
【図４Ｂ】
0004183749.tif 000066
【図４Ｃ】
0004183749.tif 000067
【図５Ａ】
0004183749.tif 000068
【図５Ｂ】
0004183749.tif 000069
【図５Ｃ】
0004183749.tif 000070
【図６Ａ】
0004183749.tif 000071
【図６Ｂ】
0004183749.tif 000072
【図６Ｃ】
0004183749.tif 000073
【図７Ａ】
0004183749.tif 000074
【図７Ｂ】
0004183749.tif 000075
【図７Ｃ】
0004183749.tif 000076
【図７Ｄ】
0004183749.tif 000077
【図８Ａ】
0004183749.tif 000078
【図８Ｂ】
0004183749.tif 000079
【図８Ｃ】
0004183749.tif 000080
【図８Ｄ】
0004183749.tif 000081
【図８Ｅ】
0004183749.tif 000082
【図８Ｆ】
0004183749.tif 000083
【図８Ｇ】
0004183749.tif 000084
【図８Ｈ】
0004183749.tif 000085
【図９】
0004183749.tif 000086
0004183749.tif 000087
【図１０】
0004183749.tif 000088
0004183749.tif 000089
【図１１】
0004183749.tif 000090
0004183749.tif 000091
【図１２】
0004183749.tif 000092
0004183749.tif 000093
【図１３】
0004183749.tif 000094
0004183749.tif 000095