(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩と、Ｘ１１Ｌおよびアミロイドβタンパク質（Ａβ）の前駆体タンパク質（βＡＰＰ）を共発現する細胞を調製する工程、
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
（２）当該細胞に被験化合物を接触させる工程、
（３）当該被験化合物によって、当該細胞からのアミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生が阻害されるか否かを測定する工程
を含む、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩と、Ｘ１１Ｌ、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の前駆体タンパク質（βＡＰＰ）およびＸＢ５１を共発現し得る細胞を含有することを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
【請求項３】
アミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩の使用。
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩を含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害剤。
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
【請求項５】
配列番号：２で表される塩基配列を含有する遺伝子または配列番号：４で表される塩基配列を含有する遺伝子を含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害剤。
【請求項６】
Aβ関連疾患の予防・治療剤である請求項４または５記載の剤。
【請求項７】
アルツハイマー病の予防・治療剤である請求項４または５記載の剤。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩とＸ１１Ｌとの複合体またはその塩。
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質もしくはその塩とＸ１１Ｌとアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）との複合体またはその塩。
（ａ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号：１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、Ｘ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミロイドβタンパク（Aβ）の産生を阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病患者脳の病理学的特徴として、神経細胞の脱落に加えて、老人斑、神経原線維変化の蓄積が知られている。これらのうち、アルツハイマー病における最初期の病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がAβであることから、Aβの産生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深くかわっていると考えられている。Aβは前駆体タンパク質（βAPP）からβ-セクレターゼとγ-セクレターゼにより切断され産生される。β-セクレターゼについては、既に新規アスパラギン酸プロテアーゼであることが同定された（Neuron 27, 419-422, 2000）。一方、γ-セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（FAD）原因遺伝子、プレセニリンあるいはプレセニリンを含む複合体がその活性発現に関与していることが明らかにされている（Neuron 27, 419-422, 2000）。また、最近、プレセニリンと複合体を形成し、βAPPのプロセシングに関与する新規膜貫通型糖蛋白質としてニカストリン（Nicastrin）が報告された(Nature 407, 48-54, 2000)。
ＸＢ３１α遺伝子は、鈴木利治らのグループによって単離されたが（荒木陽一、富田進、鈴木利治［2001］第７４回日本生化学会大会10月25-28日京都; Genebank/EBI Data Bank: AF438482）、その機能は明らかにされていない。
ＸＢ３１β遺伝子は、かずさＤＮＡ研究所の小原収らのグループによって単離されたが（Nucleic Acids Res, 28, 331-332, 2000; HUGE cDNA clone KIAA0726）、その機能は明らかにされていない。
ＸＢ３１αおよびＸＢ３１βは、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、アミノ末端側の細胞外ドメインには、２つのカドヘリン−様モチーフと１つのＣａ2+結合サイトを有する。約１００アミノ酸からなる細胞内ドメインは、Ｘ１１Ｌ結合サイトと酸性アミノ酸に富む領域を有する。
ＸＢ３１α遺伝子は、スプライシングの違いにより２種類のタンパク質ＸＢ３１α１とＸＢ３１α２を発現する。ＸＢ３１α１は、ＸＢ３１α２のアミノ末端側の１０アミノ酸をコードする１つのエクソンを欠失している以外のアミノ酸配列はＸＢ３１α２と完全に一致する。ＸＢ３１αとＸＢ３１βは、アミノ酸レベルで約５５％の相同性を示す。
Ｘ１１ＬはＰＩドメインとＰＤＺドメインを有しており、ＰＩドメインを介してβAPPと複合体を形成し、この複合体が解離することによりAβの産生が増加することが報告されている（The Journal of Biological Chemistry, 274, No.4, 2243-2254, 1999、The Journal of Biological Chemistry, 275, No.17, 13056-13060, 2000）。
ＸＢ５１はＸ１１Ｌと結合することにより、Ｘ１１ＬとβAPPとの複合体が解離し、Aβの産生が増加することが報告されている（The Journal of Biological Chemistry, 275, No.30, 23134-23138, 2000）。
しかしながら、ＸＢ３１αまたはβがＸ１１ＬおよびβAPPと複合体を形成すること、Ｘ１１ＬとＸＢ３１αまたはβおよびβAPPとの解離により、Aβの産生が増加することは全く知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このようにAβの産生に関する詳細なメカニズムが明らかにされていなかったために、Aβの産生を阻害し、アルツハイマー病を効果的に予防・治療する化合物のスクリーニング方法は報告されていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、
（１）ＸＢ３１αまたはβがＸ１１ＬおよびβAPPと複合体を形成すること、
（２）Ｘ１１ＬがＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと解離することにより、Aβの産生が増加することをはじめて見い出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）ＸＢ３１αまたはβを用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）ＸＢ３１αまたはβおよびＸ１１Ｌを用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの複合体を用いる上記（２）記載のスクリーニング方法、
（４）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌおよびアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）との複合体を用いる上記（４）記載のスクリーニング方法、
（６）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、アミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）およびＸＢ５１を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）との複合体、およびＸＢ５１を用いる上記（６）記載のスクリーニング方法、
（８）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（９）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子およびＸ１１Ｌ遺伝子を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１０）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子、Ｘ１１Ｌ遺伝子およびアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１１）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子、Ｘ１１Ｌ遺伝子、アミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）遺伝子およびＸＢ５１遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、アミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）およびＸＢ５１を共発現し得る細胞を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１３）Aβの産生量を指標とする上記（１）〜（１２）記載のスクリーニング方法、
（１４）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害する化合物もしくはＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である上記（１）〜（１３）記載のスクリーニング方法、
（１５）アミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）とＸ１１Ｌとの解離を阻害する化合物もしくはβAPPとＸ１１Ｌとの結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である上記（１）〜（１３）記載のスクリーニング方法、
（１６）ＸＢ３１αまたはβおよびアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）と、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害する化合物、もしくはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進する化合物、またはその塩のスクリーニング方法である上記（１）〜（１３）記載のスクリーニング方法、
（１７）Ｘ１１ＬとＸＢ５１との結合を阻害する化合物、もしくはＸ１１ＬとＸＢ５１との解離を促進する化合物、またはその塩のスクリーニング方法である上記（１）〜（１３）記載のスクリーニング方法、
（１８）Aβ関連疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法である上記（１）〜（１７）記載のスクリーニング方法、
（１９）アルツハイマー病の予防・治療薬のスクリーニング方法である上記（１）〜（１７）記載のスクリーニング方法、
（２０）ＸＢ３１αが配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記（１）〜（７）記載のスクリーニング方法、
（２１）ＸＢ３１βが配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記（１）〜（７）記載のスクリーニング方法、
（２２）Ｘ１１Ｌが配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記（２）〜（７）記載のスクリーニング方法、
（２３）βAPPが配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記（４）〜（７）記載のスクリーニング方法、
（２４）ＸＢ５１が配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記（６）または（７）記載のスクリーニング方法、
（２５）ＸＢ３１α遺伝子が配列番号：２で表される塩基配列を含有する遺伝子である上記（８）〜（１１）記載のスクリーニング方法、
（２６）ＸＢ３１β遺伝子が配列番号：４で表される塩基配列を含有する遺伝子である上記（８）〜（１１）記載のスクリーニング方法、
（２７）Ｘ１１Ｌ遺伝子が配列番号：６で表される塩基配列を含有する遺伝子である上記（９）〜（１１）記載のスクリーニング方法、
（２８）βAPP遺伝子が配列番号：８で表される塩基配列を含有する遺伝子である上記（１０）または（１１）記載のスクリーニング方法、
（２９）ＸＢ５１遺伝子が配列番号：１０で表される塩基配列を含有する遺伝子である上記（１１）記載のスクリーニング方法、
（３０）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、アミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）およびＸＢ５１を共発現し得る細胞を含有することを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３１）上記（１）〜（２９）のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記（３０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られるアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩、
（３２）上記（１）〜（２９）のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記（３０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られるアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
（３３）Aβ関連疾患の予防・治療剤である上記（３２）記載の医薬、
（３４）アルツハイマー病の予防・治療剤である上記（３２）記載の医薬、
（３５）哺乳動物に対して、上記（１）〜（２９）のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記（３０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られるアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするAβの産生阻害方法、
（３６）Aβ関連疾患の予防・治療方法である上記（３５）記載の方法、
（３７）アルツハイマー病の予防・治療方法である上記（３５）記載の方法、
（３８）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害方法、
（３９）ＸＢ３１αまたはβおよびアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）と、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害方法、
（４０）Aβ関連疾患の予防・治療方法である上記（３８）または（３９）記載の方法、
（４１）アルツハイマー病の予防・治療方法である上記（３８）または（３９）記載の方法、
（４２）アミロイドβタンパク質（Aβ）の産生を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするためのＸＢ３１αまたはβの使用、
（４３）ＸＢ３１αまたはβを含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害剤、
（４４）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子を含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害剤、
（４５）Aβ関連疾患の予防・治療剤である上記（４３）または（４４）記載の剤、
（４６）アルツハイマー病の予防・治療剤である上記（４３）または（４４）記載の剤、
（４７）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの複合体またはその塩、および
（４８）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとアミロイドβタンパク質（Aβ）の前駆体タンパク質（βAPP）との複合体またはその塩を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＸＢ３１αは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ＸＢ３１αと略記する）である。
本発明で用いられるＸＢ３１βは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ＸＢ３１βと略記する）である。
本発明で用いられるＸ１１Ｌは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、Ｘ１１Ｌと略記する）である。
本発明で用いられるβAPPは、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、βAPPと略記する）である。
本発明で用いられるＸＢ５１は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ＸＢ５１と略記する）である。
ＸＢ３１α、ＸＢ３１β、Ｘ１１Ｌ、βAPPまたはＸＢ５１（以下、本発明で用いられるタンパク質と略記する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００７】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、各配列番号で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
各配列番号で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、各配列番号で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【０００８】
実質的に同質の活性としては、ＸＢ３１αまたはβの場合はＸ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性などが、Ｘ１１Ｌの場合はＸＢ３１αまたはβやβAPPとの結合活性などが、βAPPの場合はＸ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性などが、ＸＢ５１の場合はＸ１１Ｌとの結合活性などが挙げられる。
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、上記の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【０００９】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、▲１▼各配列番号で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼各配列番号で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼各配列番号で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼各配列番号で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、活性が消失しない限り、特に限定されない。
具体的には、ＸＢ３１αには、（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＸＢ３１α１と、（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第７１番目と７２番目に１０アミノ酸が挿入されたＸＢ３１α２が存在する。
【００１０】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するＸＢ３１αをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００１１】
本発明で用いられるタンパク質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１２】
本発明で用いられるタンパク質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、それらタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明で用いられるタンパク質またはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，  ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明で用いられるタンパク質またはそのの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。タンパク質の合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられるタンパク質を構成し得るペプチドまたはアミノ酸残基と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられるタンパク質を精製単離することができる。上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１９】
本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子は、各タンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該遺伝子としては、本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子としては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるＸＢ３１αをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ３１αと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
本発明で用いられるＸＢ３１βをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ３１βと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
【００２０】
本発明で用いられるＸ１１Ｌをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号：６で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するＸ１１Ｌと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
本発明で用いられるβAPPをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するβAPPと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
本発明で用いられるＸＢ５１をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号：１０で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ５１と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
【００２１】
各配列番号で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、各配列番号で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ３１αをコードする遺伝子としては、配列番号：２で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ３１βをコードする遺伝子ＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するＸ１１Ｌをコードする遺伝子としては、配列番号：６で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するβAPPをコードする遺伝子としては、配列番号：８で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するＸＢ５１をコードする遺伝子ＤＮＡとしては、配列番号：１９で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
【００２２】
本発明で用いられるタンパク質を完全にコードする遺伝子のクローニングの手段としては、本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明で用いられるタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
遺伝子の塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする遺伝子は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該遺伝子はその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明で用いられるタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該遺伝子断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明で用いられるタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】
このようにして、タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３０】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明で用いられるタンパク質を生成せしめることができる。
【００３１】
上記培養物から本発明で用いられるタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３２】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明で用いられるタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３３】
〔Aβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法は、
（１）ＸＢ３１αまたはβを用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）ＸＢ３１αまたはβおよびＸ１１Ｌ（好ましくは、ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの複合体）を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１ＬおよびβAPP（好ましくは、ＸＢ３１αまたはβとＸ１１ＬとβAPPとの複合体）を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、βAPPおよびＸＢ５１（好ましくは、ＸＢ３１αまたはβとＸ１１ＬとβAPPとの複合体、およびＸＢ５１）を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（６）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子およびＸ１１Ｌ遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子、Ｘ１１Ｌ遺伝子およびβAPP遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（８）ＸＢ３１αまたはβ遺伝子、Ｘ１１Ｌ遺伝子、βAPP遺伝子およびＸＢ５１遺伝子を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（９）ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、βAPPおよびＸＢ５１を共発現し得る細胞を用いることを特徴とするAβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、Aβの産生量を指標とすることができる。
Aβとしては、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列からなるAβ40、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるβ42、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列からなるβ43などが挙げられる。
より具体的には、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下または非存在下におけるAβの産生量を測定し、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
Aβの測定法には種々の方法が用いられるが、Aβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ方法が用いられる。
Aβ特異的抗体としては、ポリクローナル抗体を用いても良いが、例えば、ＢＡＮ５０、ＢＮＴ７７、ＢＳ８５、ＢＡ２７、ＢＣ０５（Biochemistry, 34, 10272-10278, 1995）または６Ｅ１０、４Ｇ８などのモノクローナル抗体を用いても良い。とりわけ、ＢＡ２７およびＢＣ０５は、それぞれAβ40およびAβ42/43に選択的な抗体であるため、これらの抗体、あるいは同様な選択性を有する抗体を用いれば、Aβ40の産生を阻害する化合物、Aβ42/43の産生を阻害する化合物、あるいはAβ40およびAβ42/43いずれの産生も阻害する化合物を選択することが可能となる。
さらに、分泌型βAPP量はAβの産生を間接的に反映すると考えられることから、分泌型βAPP量を免疫沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法などの免疫化学的方法で検出しても良い。
ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、βAPPおよびＸＢ５１を共発現し得る細胞としては、これらの遺伝子を含有するベクターで形質転換した形質転換体を用いることができるが、他にIMR-32、PC12h、Neuro-2a、SK-N-SHなどの細胞株、またはβAPPとPS-1/2を導入したHEK-293などの細胞株を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法（Ａ）においては、例えば、試験化合物の存在下におけるAβ産生量が、試験化合物の非存在下におけるAβ産生量に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少している試験化合物をAβの産生を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。また、コントロールとして、ＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、βAPPおよび（または）ＸＢ５１を発現していない細胞を用いて、試験化合物の存在下におけるAβ産生量を測定することもできる。
【００３５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるＸＢ３１αまたはβ、Ｘ１１Ｌ、βAPPおよびＸＢ５１、またはそれらをコードする遺伝子、またはそれらを共発現し得る細胞を含有するものである。
上記した本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物は、
（１）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進することにより、
（２）βAPPとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、βAPPとＸ１１Ｌとの結合を促進することにより、
（３）ＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害するか、化合物、もしくはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進することにより、
（４）Ｘ１１ＬとＸＢ５１との結合を阻害するか、Ｘ１１ＬとＸＢ５１との解離を促進することにより、Aβ（特に、Aβ40）の産生を阻害する化合物またはその塩である。
【００３６】
上記したスクリーニング方法で得られた化合物またはそれから誘導される化合物は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
上記した本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、Aβの産生を効率良く阻害することができるので、Aβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として使用することができる。
本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を含有する医薬は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。
また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【００３７】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０.１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３８】
本発明で用いられるＸＢ３１αまたはβを含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、ＸＢ３１αまたはβを１回量として、通常０.００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明で用いられるＸＢ３１αまたはβをコードする遺伝子を含有する医薬は、前記のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【００３９】
〔治療方法〕
本発明は、
（１）ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害方法、
（２）ＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進することを特徴とするアミロイドβタンパク質（Aβ）の産生阻害方法を提供する。
この方法は、Aβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療方法として有用である。
ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進する手段としては、前記したスクリーニング方法で得られる、ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの結合を促進する化合物またはその塩を投与することなどが挙げられる。
ＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進するする手段としては、前記したスクリーニング方法で得られる、ＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの解離を阻害するか、またはＸＢ３１αまたはβおよびβAPPと、Ｘ１１Ｌとの結合を促進する化合物またはその塩を投与することなどが挙げられる。
【００４０】
〔ＸＢ３１αまたはＸＢ３１βを含有する医薬〕
ＸＢ３１αまたはβは、Ｘ１１ＬとβAPPと複合体を形成することにより、Aβの産生を抑制することができるので、ＸＢ３１αまたはβ、あるいはＸＢ３１αまたはβをコードする遺伝子は、Aβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として有用である。
ＸＢ３１αまたはＸＢ３１βをAβ関連疾患の予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って実施すればよい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ＸＢ３１αまたはβを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
【００４１】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに無菌的に充填される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
ＸＢ３１αまたはＸＢ３１βの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０.１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、ＸＢ３１αまたはＸＢ３１βの１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４２】
ＸＢ３１αまたはＸＢ３１βをコードする遺伝子を用いる場合、該遺伝子を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該遺伝子は、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。製剤化は、前記したＸＢ３１αまたはＸＢ３１βを含有する製剤と同様に行うことができる。
該遺伝子の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４３】
〔新規複合体〕
ＸＢ３１αまたはβとＸ１１Ｌとの複合体、およびＸＢ３１αまたはβとＸ１１ＬとβAPPとの複合体またはその塩は新規であり、上記した本発明のスクリーニングに有用である。
複合体の塩としては、前記した本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
【００４４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００４５】
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｈｓｅ          ：ホモセリン
【００４６】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ2−Bzl      ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００４７】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
ＸＢ３１αのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］
ＸＢ３１αをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：３］
ＸＢ３１βのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］
ＸＢ３１βをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：５］
Ｘ１１Ｌのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］
Ｘ１１Ｌをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：７］
βAPPのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：８］
βAPPをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：９］
ＸＢ５１のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１０］
ＸＢ５１をコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：１１］
Aβ40のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１２］
Aβ42のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１３］
Aβ43のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００４９】
参考例１  ＸＢ３１α１ ｃＤＮＡおよびＸＢ３１β ｃＤＮＡのクローニング
クローニングに用いたYeast two-hybridシステムは、富田らの方法（J. Biol. Chem. 274, 2243-2254, 1999）およびLeeらの方法（J. Biol. Chem. 275, 23134-23138, 2000）を使用した。pGBT9hX11L-N+PIプラスミド、ヒトX11様タンパク質（hX11L）の第１２９〜５５５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードするcDNAをヒト脳MATCHMAKER cDNAライブラリー（CLONTECH）由来のX11L結合蛋白質をコードするcDNAを単離するためのベイトとして使用した。陽性クローンの塩基配列を解析したところ、単離されたヒトcDNAクローン31は、3’末端にポリＡシグナルが付加した1.5kbを含んでいた。得られたクローン31の5’塩基配列（〜200bp）をプローブとして用いてλgt11ヒト脳cDNAライブラリー（CLONTECH）をスクリーニングし、より5’末端側領域を含むクローンを得た。同様の操作でcDNAスクリーニングを３回繰り返して、新規蛋白質の全長を含む５つの部分cDNAを取得した。ヒトXB31α1（hXB31α1）cDNAの全長は、これら５つのクローンを連結することによりpcDNA3に再構築し、pcDNA3-hXB31α1を作製した。得られたcDNAは2.9kbpのコーディング領域を含む5.0kbp以上であった。そして、HUGE (A Database of Human Unidentified Gene-Encoded Large Protein Analyzed by Kazusa cDNA Project) Protein Database (Kikunoら、Nucleic Acid Res. 28, 331-322, 2000)で、２種の同様のcDNAが検索できた。そこで、取得できたcDNAをhXB31α1（Genebank/EBI Data Bank:AF438482）と、２種のHUGE cDNAをそれぞれhXB31α2(KIAA0911)およびhXB31β(KIAA0726)と名づけた（図１）。hXB31α2 cDNAは、hXB31α1のＮ末部分に１０アミノ酸が付加した９８１アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、hXB31α1 cDNAとhXB31α2 cDNAはスプライシング変異体であることが分かった。hXB31β cDNAは、hXB31α1と５５％の相同性を有する９６８アミノ酸からなる蛋白質hXB31βをコードしていた。
XB31β cDNAクローンはかずさＤＮＡ研究所から入手し、pcDNA3にサブクローニングして、発現ベクターpcDNA3-hXB31βを作製した。また、これらのN末端にFLAG tag(DYKDDDK)を付加したFLAG-hXB31α1 in pcDNA3および FLAG-hXB31β in pcDNA3を作製し、以下の実験に用いた。
【００５０】
参考例２  ＸＢ３１α１とＸＢ３１βのノーザンブロット解析
Human multiple tissue Northern blots（CLONETECH社）を購入し、ExpressHyb Hybridization Solution（CLONETECH社）を用いマニュアルに従ってハイブリダイゼーションを行った。XB31α1およびXB31βのための具体的なプローブは、それぞれXB31α1の第８７１から９７１番目のアミノ酸をコードするcDNAおよびXB31βの第８８１から９６８番目のアミノ酸をコードするcDNAから作製した。プローブを[α-32P]dCTPおよびランダムオリゴヌクレオチド（High prime DNA Labeling Kit; Roch Diagostics）を用いて、鋳型cDNAを放射線標識した。
結果を図２に示したとおり、XB31α1およびXB31βが脳で強く発現していることが分かった。
【００５１】
参考例３  抗体の産生
ウサギポリクローナル抗体UT-83は、hXB31α1 Ｃ末端１８残基（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第９５４番目〜９７１番目）のN末端にCysを付加した１９アミノ酸残基からなるペプチド10mgをHemocyanin(SIGMA) 10mgにカップリングしてウサギに免疫（Primary injection+Booster x2）して得た。得られた抗血清はSulfo-Link Gel(Pierce)で抗原ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラムで精製した（最終抗体濃度  0.16mg/ml IgG。本願明細書中、希釈率を指定したものは全てこの溶液を希釈して用いている）。
ウサギポリクローナル抗体BS-7は、hXB31β  Ｃ末端１４残基（配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第９５４番目〜９６８番目）のN末端にCysを付加した１５アミノ酸残基からなるペプチド10mgをHemocyanin(SIGMA) 10mgにカップリングしてウサギに免疫（Primary injection+Booster x2）して得た。得られた抗血清はSulfo-Link Gel(Pierce)で抗原ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラムで精製した（最終抗体濃度  0.84mg/ml IgG。本願明細書中、先希釈率を指定したものは全てこの溶液を希釈して用いている）。
【００５２】
参考例４  ＸＢ３１α１およびＸＢ３１βのウエスタンブロット解析
（１）抗体の交差性検討
COS7細胞にhXB31α１、hXB31β in pcDNA3をそれぞれ10μg (プラスミドDNA) (6cm dish1枚1x107cellsあたり)をLipofectAMINE(GIBCO BRL)を用いて、トランスフェクションした。方法はメーカーのInstruction Manualに従った。トランスフェクション４８時間後、細胞をPBS（組成：10mM Sodium Phosphate buffer pH7.4, 150mMNaCl）で２回洗浄した後、100μl cell lysis buffer(組成：0.5％TritonX-100, 0.05％β-Mercaptoethanol, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM NaVO4, 125mM Sucrose, 25mM Tris-acetate pH8.0), 10μl  Protease inhibitor Mix（P.I.mix, 組成：5mg/ml Leupeptin, PepstatinA, Chymostatin in DMSO）を加え、細胞を可溶化した。氷上で３０分インキュベートした後、12000rpm 10min遠心して、上清を取り可溶化成分を回収した。
回収した可溶化成分はTCA沈澱法を用いたMicroLowry法により、蛋白定量を行い、可溶化成分を1レーンあたり５０μg（タンパク質）滴下し、SDS-PAGEを行った後、メンブランに転写したのち、抗hXB31α1抗体 UT-83(1/1000), 抗hXB31β抗体 BS-7(1/500)を用いてブロットを行った。2次抗体として抗ウサギIgG, peroxidase-linked species-specific whole antibody(from donkey) (Amersham Pharmacia Biotechnologies社) 1:5000を使用した。検出はECL Detection System(Amersham Pharmacia Biotechnologies社)を用い、メーカーのinstruction manualに従い、操作を行った。結果を図３および図４に示したとおり、抗XB31α1抗体UT-83および抗XB31β抗体BS-7は、hXB31α1およびhXB31βをそれぞれ特異的に認識していることが確認された。
（２）組織可溶化
組織化溶化は、C57BL/6J マウス, 8週齢, オスより各部位を採取し、5倍容の組織抽出緩衝液(1％SDS, 4M Urea, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 20mM Tris pH8.0)を加え、DounceA ホモジナーザーで２０ストロークした後、15000xg, 10min, 4℃で遠心し、可溶化された上清を回収した。この上清をTCA沈澱法を用いたMicroLowry法により蛋白定量し、粗可溶化成分を1レーンあたり５０μg（タンパク質）滴下し、SDS-PAGEを行った後、メンブランに転写したのち、抗hXB31α1抗体 UT-83(1/1000)、抗Mint2 抗体(Transduction Labs, 1/1000)を用いて、ブロットを行った。2次抗体としてUT-83は、抗ウサギ IgG, peroxidase-linked species-specific whole antibody(from donkey) (Amersham Pharmacia Biotechnologies社) 1:5000, anti-Mint2は、 抗マウス IgG, peroxidase-linked species-specific whole antibody(from sheep) (Amersham Pharmacia Biotechnologies社) 1:5000を使用した。検出はECL Detection System(Amersham Pharmacia Biotechnologies社)を用い、メーカーのinstruction manualに従い、操作を行った(部位の略号は以下の通りである。Br;脳,  Ht;心臓,  Lu;肺,  Li;肝臓,  Kid;腎臓, Mus;筋, Ob;嗅球,  CC;大脳皮質,  ST;線状体,  Hip;海馬,  Ce;小脳,  Mid;中脳,  Th;視床,  Pons;橋,  Sci;座骨神経)。
結果を図５および図６に示した。図５からhXB31α1とhX11Lが共に脳で強く発現していることが分かった。また、図６からhXB31α1とhX11Lが脳の各種組織、特に大脳皮質、線状体、海馬、視床で強く発現していることが分かった。
【００５３】
実施例１  XB31α/βとX11Lの共役免疫沈降
COS7細胞にLipofectAMINE PLUS (GIBCO BRL)を用いて、各３μgのhXB31α1 または hXB31β  および（または） hX11L in pcDNA3  の各コンストラクトのプラスミドをトランスフェクションした。総DNA量は6μgに統一するため、トランスフェクション(-)の場合には空ベクターpcDNA3を加えた。トランスフェクション48時間後、P.I mixを含むice-cold PBS (組成：10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.4, 150mMNaCl + 5μg/ml ロイペプチン, ペプスタチン, ケモスタチン)で細胞を洗浄し、 CHAPS Lysis Buffer (10mM CHAPS, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.4, 150mM NaCl + 5μg/ml ロイペプチン, ペプスタチンＡ, ケモスタチン)を 6cm Dish （3x106細胞相当）につき１ml加えて細胞を可溶化した。可溶化した細胞は、30分間・4℃で穏和に攪拌した後、12000rpm 10min 4℃で遠心し、上清を免疫沈降（ IP）に用いた。IPは可溶化上清１mlに対し、UT-83 10μl(1.6μg IgG), UT-30 5μl(1.9μg IgG), BS-7 5μl(4μg IgG) ,コントロール用ウサギ非免疫IgG  8μl(4μg IgG)を加え、４℃で2時間攪拌した。その後、CHAPS Lysis Buffer中の 50％ProteinG-Sepharoseを100μl加え、さらに4℃で2時間攪拌した。樹脂を遠心により回収しCHAPS Lysis Bufferで３回洗浄した。この樹脂に対し、15μl  5x SDS Sample Buffer (43％(v/v)グリセロール(和光純薬（株）), 16％(w/v)SDS(和光純薬（株）), 64ng/ml ブロモフェノールブルー(和光純薬（株）), 5mM EDTA, 0.22M Tris-HCl pH6.8), 15μl  8M 尿素を加え、攪拌後、５分間煮沸して、樹脂に結合した成分を可溶化した。遠心後、この上清成分を6％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEはLammliの常法に従った。SDS-PAGE後、メンブランに転写し、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットは前述の方法で行った。検出に用いた１次抗体濃度は、各々UT-83 1/1000(抗XB31α1抗体), BS-7 1/500（抗体XB31β抗体）, UT-30 1/1000(抗X11L抗体)で行った。結果を図７および図８に示したとおり、hXB31α1とhX11Lが細胞内で結合し、それぞれの抗体により共沈殿してくることが分かった。
【００５４】
実施例２  結合ドメインの決定
XB31α1およびXB31βの細胞質ドメインをGSTと融合させたGST-細胞質ドメイン融合タンパク質またはGST蛋白質のみを結合しているグルタチオンビーズと、hX11L由来の蛋白質構成物を発現しているCOS細胞の全細胞可溶化物とインキュベーションした。ビーズに付着した蛋白質構成物を溶出後X11Lアミノ末端ポリクローナル抗体UT29を用いてウエスタンブロット解析で検出した（図９〜１０）。図９および図１０から、XB31α1およびXB31βはX11LのPIドメイン（図１１）と結合することが分かった。
【００５５】
実施例３  培養神経細胞におけるXB31αおよびX11Lの分布
C57BL/6J マウス胎生１６日目胎仔胚より調製した 大脳皮質神経細胞を初期培養開始後12日目 （DIV12)に、以下の方法でXB31αおよびX11Lの共蛍光抗体免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。
具体的には、poly-Ｌ-リジンで被覆したカバーガラス上に生育したDIV12の細胞をP.I. mix (組成は前述)を含むice-cold PBS で洗浄した後、4％(w/v) パラホルムアルデヒド(ナカライ社)、4％(w/v) シュークロース(和光純薬（株）)を含む  PBS中で室温、１０分間インキュベートし細胞を固定した。その後、0.1％(v/v)TritonX-100(Wako社) を含むPBSで室温、５分間インキュベートし、透過処理を行った。その後、PBSで2回洗浄インキュベートし、3％ (w/v)BSA を含むPBSで室温１０分間インキュベートして、ブロッキングを行った。さらにPBSで２回洗浄したのち、1％(w/v)BSAを含むPBS中の１次抗体溶液（１次抗体溶液  抗Mint2抗体(Transduction Labs 1/100), 抗XB31α1抗体(UT-83 1/100)）を加え,４℃・３時間インキュベートを行った。
インキュベート後、PBSで３回、各５分づつ室温でインキュベートしつつ、洗浄し、1％(w/v)BSAを含むPBS中の２次抗体溶液〔抗マウスIgG, Goat, Alexa Flour488 Highly-cross absorbed(Molecular Probes社) 1:100, 抗ウサギIgG, Goat, Alexa Flour568 Highly-cross absorbed(Molecular Probes社) 1:100〕を加え、室温１時間incubateを行った。
この後、PBSで３回、各１０分づつ室温でインキュベートしつつ、洗浄し、Immumount(SHANDON-RIPSHOW社)でMountを行い、標本を作成した。標本はLSM510(Carl Zeiss社)共焦点レーザー顕微鏡で観察した。各波長で観察した画像は共局在を示すため、Merge画像を作製した（図１２）。図１２から、XB31αとX11Lはマウス神経細胞内で共局在する事が分かった。
【００５６】
実施例４  成体マウス脳組織のおけるXB31αおよびX11Lの分布
C57BL/6J 6週令オスマウスを0.2Ｍ リン酸緩衝液 pH7.5に溶解した 4％(w/v) パラホルムアルデヒド(ナカライテスク電顕グレード) で灌流固定した後、脳を採取した。この脳をさらに0.2Ｍ リン酸緩衝液 pH7.5に溶解した4％(w/v)  パラホルムアルデヒドで一晩で後固定した後、30％(w/v) シュークロースを含む PBS中に浸し後固定液を置換した。この脳をTissue Tek OCT Compound中に凍結包埋し、クライオスタットを用いて20μmの切片を調製した。この切片をPBSでよく洗浄した後、0.1％(v/v)TritonX-100 を含むPBS中ので５分間室温でインキュベートすることにより、透過処理を行った。PBSで３回洗浄後、0.3％(v/v) H2O2 を含むPBS中 で室温５分間処理し、内在性peroxidaseのQuencing を行った。さらに3％(w/v)BSA を含むPBS 中で室温１０分間インキュベートして、ブロッキングを行った。PBSで２回洗浄したのち、1％(w/v)BSAを含むPBSに溶解した１次抗体溶液（抗Mint2抗体(Transduction Labs 1/100), 抗XB31α1抗体(UT-83 1/100)）を加え、４℃・３時間インキュベートを行った。
コントロールとして一次抗体を含まない1％(w/v)BSAを含むPBSを用いて同様の操作を行った。  インキュベート後、PBSで３回、各５分づつ室温で洗浄し、1％(w/v)BSAを含むPBS中の２次抗体溶液〔抗マウスIgG, Goat, Alexa Flour488 Highly-cross absorbed(Molecular Probes社) 1:500, 抗ウサギIgG, Goat, Alexa Flour568 Highly-cross absorbed(Molecular Probes社) 1:500 〕を加え、室温１時間インキュベートを行った。
この後、PBSで３回、各１０分づつ室温で洗浄し、Immumount(SHANDON-RIPSHOW社)でMountを行い、標本とした。標本はLSM510(Carl Zeiss社)共焦点レーザー顕微鏡で観察した。各波長で観察した画像は共局在を示すため、Merge画像を作製した（図１３）。図１３において、(a-d)は海馬、(e-h)は大脳皮質、(i-l)は小脳の染色像を示す。海馬においてX11LとXB31αは、CA3領域のピラミダルニューロン等で共局在した。大脳皮質においては、第５層の神経でX11LとXB31α1は、強く発現しており共局在していた。小脳においては、プルキンエ細胞はX11Lを発現していないが、XB31αは発現していた。これらのことから、X11LとXB31αの両方を発現している神経細胞では、両タンパク質は共局在していることが明らかになった。
【００５７】
実施例５  APPとX11L間の結合性に対するXB31α/βの効果
図１４に示したような組み合わせ(＋は発現ベクターでトランスフェクションを行ったものを示し、−は空ベクターpcDNA3でトランスフェクションしたものを示す)で293細胞に各３μg(Total 9μg/６cm dish  １枚あたり)のプラスミドDNAをLipofectAMINE2000(GIBCO BRL)用いてトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後、実施例１と同様にして２９３細胞を可溶化し、共役免疫沈降(IP)を行った。IPに用いた抗体量はCHAPS Lysate 1mlに対し、G369 血清4μl, 22C11 (1mg/ml IgG) 20μlを用いた。G369はβAPPの細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体を、22C11はβAPPの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を示す。結果を図１４に示した。図１４から、XB31α1およびXB31βはβAPPとX11Lとの結合を強化することが明らかになった。
【００５８】
実施例６  βAPPのパルス・チェイス解析
２９３細胞に対し、LipofectAMINE2000(GIBCO BRL)を用い10cm Dish 1枚あたり以下のDNA用量と組み合わせでTransfectionを行った。
A. APP(4μg)
B. APP(4μg), X11L(0.5μg)
C. APP(4μg), X11L(0.5μg), FLAG XB31α1 (13.5μg)
D. APP (4μg), FLAG XB31α1 (13.5μg)
総DNA量を等しくするために計18μgとなるように、空のpcDNA3を加えた。
トランスフェクション後48時間経過した293細胞をメチオニンを含まないDMEM (DMEM(-); GIBCO BRL社)で２回洗浄して、φ6cm dish(Total 1.0x107cells)にまき直し、新鮮なDMEM(-)3.5mlを培地としている293細胞に、最終濃度0.4mCi/mlとなるように102μlのL-[35S] in vitro cell labeling mix (Pharmacia Biotech AGQ0080)を加え、37℃・5％CO2インキュベータで１５分インキュベートし、生成タンパク質をラベルした。その後、100μlの100xメチオニン(GIBCO BRL社)を加え、アイソトープの取り込みを停止させ、通常培地(10％FCS添加DMEM)に培地を交換し、37℃・5％CO2インキュベータに移し、インキュベートを開始した。細胞は0, 1, 2, 4, 8時間後にインキュベータより取り出した。その後、293cellをPBS（組成：10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.4, 150mMNaCl）で２回洗浄した後、100μl細胞抽出用緩衝液(組成：0.5％TritonX-100, 0.05％β-メルカプトエタノール, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM NaVO4, 125mM シュークロース, 25mM Tris-acetate pH8.0), 10μl  プロテアーゼ阻害剤混合液（組成：5μg/ml ロイペプチン, ペプスタチンＡ,ケモスタチン in DMSO）を加え、細胞を可溶化した。氷上で３０分インキュベートした後、12000rpm 10min遠心して、上清を取り可溶化成分を回収した。
回収した細胞可溶化成分は抗体G369(Antigen:APP細胞質ドメイン)を用い、培地は22C11(APP細胞外ドメイン/ CHEMICON社)を用いてそれぞれ免疫沈降を行った。具体的には、細胞可溶化緩衝液中の細胞可溶化成分100μlに対し、100μl Mix▲１▼(2.2％ SDS, 5.44M 尿素, 100mM Tris-HCl pH7.4)を加え、５分間煮沸し、タンパク成分を変性させた。その後750μl Mix▲２▼(6.7％ NP-40, 0.4M NaCl, 26mM EDTA, 200mM Tris-HCl pH7.4)、350μl  Mix▲３▼(10ng/ml ロイペプチン, ペプスタチン,ケモスタチン in DDW)を順次加えた後、G369抗体4μlを加え、４℃ O/Nで 攪拌して抗原抗体反応を進行させた。そののち、リンス液(0.1％TrotonX-100, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.4)に懸濁した25％ProteinG-sepharose/25％ Sepharose-CL4B(Pharmacia Biotech)を ５０μl 加え、４℃ ３時間、攪拌した。樹脂成分を3000rpm・5分間・4℃遠心して沈澱、これを回収した。回収した樹脂は非特異的結合を除く目的で、洗浄液I (0.1％ TritonX-100, 1M NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.4)、洗浄液II (0.05％SDS, 1％TritonX-100, 5mM EDTA, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH7.4), リンス液(組成は前述)で、順次洗浄した。その後、樹脂に15μl 5x SDS Sample Buffer (43％グリセロール(和光純薬（株）), 16％SDS(和光純薬（株）), 64ng/ml ブロモフェノールブルー(和光純薬（株）), 5mM EDTA, 0.22M Tris-HCl pH6.8), 15μl 8M 尿素を加え、攪拌後、５分間煮沸して、樹脂についている成分を可溶化した。遠心後、この上清成分を6％ポリアクリルアミドゲルを用い、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGEはLammliの常法に従った。SDS-PAGE後、ゲルを乾燥し、BAS2000 imaging system(FUJI)によりタンパク質に取り込まれた放射活性を定量した（図１５）。定量結果は時間０のimAPPのシグナル強度を１として相対強度でグラフ上にプロットした（図１６）。
図１５および図１６に示すとおり、βAPPとX11Lを共発現させると、βAPPの代謝安定化が見られた。さらにXB31α1を発現させると、XB31α1はβAPPの代謝を劇的に安定化した。また、XB31α1の単独発現ではβAPP代謝に影響が見られなかったことから、XB31α1はX11Lを介してβAPPの代謝を安定化する方向に制御していることが分かった。これは図１３で示したXB31α1がβAPPとX11Lの結合を強化する結果と一致する。
【００５９】
実施例７  サンドイッチELISA(sELISA)によるAβの定量
２９３細胞に対し、LipofectAMINE2000(GIBCO BRL)を用い6cm Dish 1枚あたり以下のDNA用量と組み合わせでトランスフェクションを行った。
A. APP(3μg)
B. APP(3μg), X11L(0.3μg)
C. APP(3μg), X11L(0.3μg), FLAG XB31α1 (5.7μg)
D. APP (3μg), FLAG XB31α1 (5.7μg)
総DNA量を等しくするために計9μgとなるように、空のpcDNA3を加えた。トランスフェクション48時間後、培地を回収し、J.Biol.Chem. 274 2243-2254, 1999に記載の方法によりsELISAを行い、培地中のAβｘ-40（図１７）, Aβｘ-42（図１８）の値を定量した。
図１７から明らかなとおり、βAPPにX11Lを共発現させるとAβ40の抑制効果が認められた。ここにさらにXB31α1を発現させるとAβ40産生をさらに抑制した。XB31α1の単独発現ではAβ産生に影響が見られなかったことから、XB31α1はX11Lを介してβAPP代謝を安定化し、結果としてAβ産生を低下させていると考えられる。
以上の実験結果から、図１８に示すとおり、XB31α1またはβがβAPPおよびX11Lと複合体を形成することにより、Aβ（特に、Aβ40）の産生を抑制していることが分かった。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、効率良くアルツハイマー病の予防・治療薬をスクリーニングすることができる。
【００６１】
【配列表】
0004056248.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＢ３１ファミリー蛋白質の構造の概要図を示す。
【図２】ＸＢ３１α１とＸＢ３１βのノーザンブロット解析の結果を示す。ｐｒｏｂｅは使用したプローブを示す。ＸＢ３１αはＸＢ３１α１を示す。β−ａｃｔｉｎはβ−アクチンを示す。Heartは心臓、Brainは脳、Placentaは胎盤、Lungは肺、Liverは肝臓、Skeletal muscleは平滑筋、Kindneyは腎臓、Pancreasは膵臓を示す。数値はｍＲＮＡの大きさ（kb）を示す。
【図３】ＸＢ３１α１とＸＢ３１βのウエスタンブロット解析の結果を示す。ｂｌｏｔ  ＵＴ８３はＸＢ３１α１ポリクローナル抗体ＵＴ８３を、ｂｌｏｔ  ＢＳ７はＸＢ３１βポリクローナル抗体ＢＳ７を用いた時の結果を示す。数値は分子量(kDa)を示す。バンドはＸＢ３１α１およびＸＢ３１βの検出位置を示す。
【図４】ＸＢ３１α１のウエスタンブロット解析の結果を示す。ｂｌｏｔ  ＵＴ８３はＸＢ３１α１ポリクローナル抗体ＵＴ８３を示す。−は抗原ペプチドが存在しない場合を、Ｈは抗原ペプチド（40nM）が存在する場合を示す。数値は分子量を示す。バンドはＸＢ３１α１の検出位置を示す。
【図５】マウスの各組織におけるＸＢ３１α１およびＸＢ３１βの発現をウエスタンブロット解析した結果を示す。Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−ＸＢ３１αは抗ＸＢ３１α１抗体をブロットした場合を示す。Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−Ｘ１１Ｌは抗Ｘ１１Ｌ抗体をブロットした場合を示す。Brは脳、Htは心臓、、Luは肺、Liは肝臓、Kidは腎臓、Musは筋肉を示す。バンドはそれぞれＸＢ３１αおよびＸＢ３１βの存在を示す。ＸＢ３１αはＸＢ３１α１を示す。
【図６】マウス脳の各部分におけるＸＢ３１α１およびＸＢ３１βの発現をウエスタンブロット解析した結果を示す。Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−ＸＢ３１αは抗ＸＢ３１α１抗体をブロットした場合を示す。Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−Ｘ１１Ｌは抗Ｘ１１Ｌ抗体をブロットした場合を示す。OBは嗅球、CCは大脳皮質、STは線条体、Hipは海馬、Ceは小脳、Midは中脳、Thは視床、Ponsは橋、Sciは坐骨神経を示す。バンドはそれぞれＸＢ３１αおよびＸＢ３１βの存在を示す。ＸＢ３１αはＸＢ３１α１を示す。
【図７】ＸＢ３１α１とＸ１１Ｌとの共役免疫沈降を行った結果を示す。＋はＸＢ３１αまたはＸ１１Ｌを発現させた場合、−は発現させていない場合を示す。ＸＢ３１αはＸＢ３１α１を示す。ａｎｔｉ−ＸＢ３１αは抗体ＸＢ３１α１抗体を示す。ａｎｔｉ−Ｘ１１Ｌは抗体Ｘ１１Ｌ抗体を示す。control IgGは非免疫動物由来のコントロール用免疫グロブリンを示す。LyasteはＣＯＳ細胞の可溶化物を示す。バンドはそれぞれＸＢ３１α１およびＸ１１Ｌの存在を示す。
【図８】ＸＢ３１βとＸ１１Ｌとの共役免疫沈降を行った結果を示す。＋はＸＢ３１βまたはＸ１１Ｌを発現させた場合、−は発現させていない場合を示す。ａｎｔｉ−ＸＢ３１βは抗ＸＢ３１β抗体を示す。ａｎｔｉ−Ｘ１１Ｌは抗体Ｘ１１Ｌ抗体を示す。control IgGは非免疫動物由来のコントロール用免疫グロブリンを示す。LyasteはＣＯＳ細胞の可溶化物を示す。バンドはそれぞれＸＢ３１βおよびＸ１１Ｌの存在を示す。
【図９】ＸＢ３１α１とＸ１１Ｌの結合におけるＸ１１Ｌ結合ドメインを同定した結果を示す。ｃｒｕｄｅはhX11L由来蛋白質構成物を発現しているＣＯＳ細胞の全細胞可溶化物を示す。XB31αはGST-XB31α細胞質ドメイン融合蛋白質を結合しているグルタチオンビーズを用いた場合の結果を示す。ＧＳＴはGST蛋白質のみを結合しているグルタチオンビーズを用いた場合の結果を示す。XB31αはXB31α1を示す。X11Lは全長X11Lを示す。ＮはhX11Lのアミノ末端ドメインを示す。Ｎ＋ＰＩはhX11LのＰＩドメインを結合したhX11Lのアミノ末端ドメイン示す。数値は標準蛋白質の分子量（kDa）を示す。
【図１０】ＸＢ３１βとＸ１１Ｌの結合におけるＸ１１Ｌ結合ドメインを同定した結果を示す。ｃｒｕｄｅはhX11L由来蛋白質構成物を発現しているＣＯＳ細胞の全細胞可溶化物を示す。XB31βは、GST-XB31β細胞質ドメイン融合蛋白質を結合しているグルタチオンビーズを用いた場合の結果を示す。ＧＳＴはGST蛋白質のみを結合しているグルタチオンビーズを用いた場合の結果を示す。X11Lは全長X11Lを示す。ＮはhX11Lのアミノ末端ドメインを示す。Ｎ＋ＰＩはhX11LのＰＩドメインを結合したhX11Lのアミノ末端ドメイン示す。数値は標準蛋白質の分子量（kDa）を示す。
【図１１】X11L（全長X11L）、Ｎ＋ＰＩ（hX11LのＰＩドメインを結合したhX11Lのアミノ末端ドメイン）およびＮ（hX11Lのアミノ末端ドメイン）の構造を示す。
【図１２】ＸＢ３１αとＸ１１Ｌのマウス大脳皮質ニューロンにおける局在性および、それをMerge画像で現した結果を示す。
【図１３】ＸＢ３１αとＸ１１Ｌのマウス脳の各組織における局在性およびそれをMerge画像で現した結果を示す。Hippocampus CA3は海馬CA3領域、Cerebral Cortexは大脳皮質、Cerebellar Cortexは小脳を示す。
【図１４】XB31α１またはXB31βとβAPPおよびX11Lとの結合をＨＥＫ２９３細胞を用いて調べた結果を示す。ＡはG369（抗βAPP抗体）を、Ｂは22C11（βAPPの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体）を用いてウエスタンブロット解析した結果を示す。ＡＰＰはβＡＰＰを、ＸＢα１はＸＢα１を、ＦＬＡＧ ＸＢ３１βはＦＬＡＧとＸＢ３１βの融合蛋白質を示す。＋は各蛋白質の発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した場合を示す。−はｐｃＤＮＡ３ベクターを導入した場合を示す。ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−ＡＰＰはＧ３６９（抗βAPPポリクローナル抗体）を、ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−Ｘ１１ＬはＵＴ２９（抗X11Lポリクローナル抗体 [Journal og Biological Chemistry 274, 2243-2254. 1999]）を、ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−ＸＢ３１αはＵＴ８３(抗XB31αポリクローナル抗体)を、ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−ＦＬＡＧは抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロット解析した結果を示す。
【図１５】ＨＥＫ２９３細胞を用いてβAPPの細胞内代謝におけるXB31α１およびＸ１１Ｌの影響を調べた結果を示す。Ｃｈａｓｅ［ｈ］は細胞をパルス標識後の測定時間を示す。ＡＰＰ／Ｖｅｃｔｏｒ／ＶｅｃｔｏｒはβＡＰＰ発現プラスミドのみを、ＡＰＰ／ｈＸ１１Ｌ／ＶｅｃｔｏｒはβＡＰＰ発現プラスミドおよびｈＸ１１Ｌ発現プラスミドを、ＡＰＰ／ｈＸ１１Ｌ／ＸＢ３１α１はβＡＰＰ発現プラスミド、ｈＸ１１Ｌ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドを、ＡＰＰ／Ｖｅｃｔｏｒ／ＸＢ３１α１はβＡＰＰ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した場合の結果を示す。ｍＡＰＰは成熟βＡＰＰの存在を、ｉｍＡＰＰは前駆体βＡＰＰの存在を示す。
【図１６】図１５の定量結果において、時間０のｉｍＡＰＰのシグナル強度を１とした相対強度をグラフ上にプロットした図である。横軸は測定時間、縦軸はｉｍＡＰＰの相対強度を示す。ＡＰＰ／Ｖｅｃｔｏｒ／ＶｅｃｔｏｒはβＡＰＰ発現プラスミドのみを、ＡＰＰ／ｈＸ１１Ｌ／ＶｅｃｔｏｒはβＡＰＰ発現プラスミドおよびｈＸ１１Ｌ発現プラスミドを、ＡＰＰ／ｈＸ１１Ｌ／ＸＢ３１αはβＡＰＰ発現プラスミド、ｈＸ１１Ｌ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドを、ＡＰＰ／Ｖｅｃｔｏｒ／ＸＢ３１αはβＡＰＰ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した場合の結果を示す。
【図１７】ＡＰＰ、ｈＸ１１Ｌ、ＸＢ３１α１を共発現させた場合のＡβ４０およびＡβ４２の生産量を調べた結果を示す。縦軸はＡβ４０またはＡβ４２の生産量（ｐＭ）を示す。横軸のＡＰＰはβＡＰＰ発現プラスミドのみを、ＡＰＰ／ｈＸ１１ＬはβＡＰＰ発現プラスミドおよびｈＸ１１Ｌ発現プラスミドを、ＡＰＰ／ｈＸ１１Ｌ／ＸＢ３１αはβＡＰＰ発現プラスミド、ｈＸ１１Ｌ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドを、ＡＰＰ／ＸＢ３１αはβＡＰＰ発現プラスミドおよびＸＢ３１α１発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した場合を示す。
【図１８】ｈＸ１１ＬとＸＢ３１αの相互作用によるＡβ産生機構の概略図を示す。ＮＰＴＹおよびＮＰはそれぞれＸ１１ＬのＰＩドメインとの結合部位を示す。Supressionは抑制していること、no supressionは抑制していないこと、Generation of Aβは、Aβ40が産生すること、Enhanceは強化すること、Interactionは結合すること、Stronger Supressionは強い抑制、Stabilization of APP metabolismはＡＰＰの代謝安定化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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