(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白質：
（ａ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２０〜６３１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３１１〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡを含有する組換えべクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えべクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から請求項１または２記載のＤＮＡによってコードされる蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性ラッカーゼ、耐熱性ラッカーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換えべクター、該組換えべクターを有する形質転換体、該形質転換体を用いた耐熱性ラッカーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラッカーゼは、ポリフェノールオキシダーゼ、ウルシオールオキシダーゼとも呼ばれ、酸素の存在下、フェノール性化合物を酸化する酵素である。さらに、ラッカーゼは、リグニン分解作用、ウルシオールやラッコールなどのフェノール性化合物、ｐ−フェニレンジアミンなどの芳香族アミン、タンパク質などの酸化重合作用を有するため、例えば、毒性の強いフェノール性化合物や芳香族アミンを含む廃液の処理、環境汚染物質の解毒化、パルプ製造処理等におけるリグニンの除去、人工漆の製造、コンクリート混和剤の合成、ココア、コーヒーおよび紅茶の褐変処理、化粧品用メラニン製造、食品のゲル化剤、臨床検査試薬、漂白剤としての利用など多くの産業分野への利用が期待されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。
【０００３】
ラッカーゼおよびポリフェノールオキシダーゼは、一般に自然界に広く存在しており、微生物起源のものも多く知られている。その生産菌としては、ピクノポラス・コクシネウス、コリオラス・ヴエルシカラー、トラメテス・エスピーＨａｌなどの担子菌類、ボツチリス・シネレアなどの不完全菌類に属する糸状菌などが知られている（例えば、非特許文献２および３参照）。これらの菌は、培養時の生育速度が非常に遅く、概して大量培養が困難である。また、これらの菌由来のラッカーゼの生産性を向上させるためには、遺伝子操作や変異体の作製が必要となるが、菌類が有する複雑な生活環や、イントロンの存在などの遺伝子構造の複雑さ、糖タンパク質であるため生育速度が早い原核生物を宿主とした発現が難しいなど、多大な労力を必要とする。このような理由から、菌類より安定かつ安価にラッカーゼを大量生産することは非常に困難であった。また、これらの酵素は、概して熱安定性が低く（＜６０℃）、毒性廃液の処理、パルプ製造処理におけるリグニンの除去など夏期の屋外での使用には不適であった。
【０００４】
以上の理由より、産業上において利用するためには、耐熱性に優れ、遺伝子操作や変異体の作製が容易な原核生物由来のラッカーゼまたはポリフェノールオキシダーゼが望まれていた。
【０００５】
このような問題点を解決するために、本発明者らは、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属する土壌分離菌が、耐熱性の新規ラッカーゼを菌体内に生産することを見出し、この耐熱性ラッカーゼおよびその製造方法について既に特許を出願している（特許文献２参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Haglund C, Levin L, Forchiassin F, Lopez M, Viale A.; Rev Argent Microbiol., 34(3):157-62(2002)
【非特許文献２】
Gomez-Alarcon G, Lahoz R, Saiz-Jimenez C.; Microbiologia. 1986., 2(2): 97-103
【非特許文献３】
Hess J, Leitner C, Galhaup C, Kulbe KD, Hinterstoisser B, Steinwender M, Haltrich D.; Appl Biochem Biotechnol. 2002., 98-100: 229-41
【特許文献１】
特開２００１−２４５６５４号公報
【特許文献２】
特開２００２−１７１９６８号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の発明により、耐熱性に優れ、遺伝子操作や変異体の作製の容易な原核生物由来のラッカーゼが得られ、その精製も容易に行うことが可能となった。しかしながら、本酵素が菌体内酵素であり、産生が少量であるために、生産効率が非常に悪く、ラッカーゼの大量生産が困難であるという問題点は依然として未解決であった。本発明は、以上のとおりの事情を鑑みてなされたものであり、上記の耐熱性ラッカーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作材料と、この材料を用いた耐熱性ラッカーゼの製造方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究の結果、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属する土壌分離菌が産生する耐熱性ラッカーゼの遺伝子を単離し、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を解明することにより、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白質：
（ａ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２０〜６３１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質。
〔２〕  上記〔１〕の蛋白質をコードするＤＮＡ。
〔３〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３１１〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
〔４〕  上記〔２〕または〔３〕のＤＮＡを含有する組換えべクター。
〔５〕  上記〔４〕の組換えべクターを含む形質転換体。
〔６〕  上記〔５〕の形質転換体を培地中で培養し、培養物から上記〔１〕の蛋白質を採取することを特徴とする上記〔１〕の蛋白質の製造方法。
〔７〕  上記〔１〕の蛋白質を、変性剤および還元剤に接触させることを含む、上記〔６〕記載の方法。
〔８〕  上記〔１〕の蛋白質を、変性剤および還元剤に接触させることを含む、上記〔１〕の蛋白質の単離および／または精製方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、熱安定性に優れ、ラッカーゼ活性（すなわち、酸素の存在下、フェノール性化合物を酸化する）を有する、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。また、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜１９のアミノ酸配列は、天然型ラッカーゼには存在しない。したがって、該ラッカーゼは、該配列が切断されることにより成熟型となると考えられる。
【００１１】
本発明における「耐熱性」とは、後述する酵素電極法で活性を測定した場合、ｐＨ７．０の緩衝液中で約７０℃までの温度で１０分間保持したとき、８０％以上（好ましくは９０％以上）の残存活性（３０℃のときの活性を１００％とする）を示す性質をいう。
【００１２】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、熱安定性に優れ、ラッカーゼ活性を有する限り、上記配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような変異体は、自然または人工の突然変異により生じた突然変異体の中からスクリーニングすることができ、或いは耐熱性ラッカーゼ遺伝子を用いて部位特異的突然変異誘発を導入することによって得ることができる。当業者であれば、部位特異的突然変異誘発に際してラッカーゼ活性を保持する変異を容易に予測することができる。例えば、保存的置換（conservative substitution）として知られるアミノ酸置換（例えば、アラニンからセリン、アルギニンからリシンへの置換等）等が挙げられる。また、本発明の耐熱性ラッカーゼの場合、上述した配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜１９のアミノ酸配列はラッカーゼ活性に必須ではないので、この領域でのアミノ酸の欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾は、通常、ラッカーゼ活性に影響しないものと考えられる。
【００１３】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列としては、例えば、
（１）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中Ｎ末端のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が欠損したもの、
（２）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮまたはＣ末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列が付加したもの、
（３）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列が付加したもの、
などが挙げられる。
【００１４】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、そのアミノ酸組成の違いにより異なる分子量を有していてもよいが、好ましくは約６８．７ｋＤａの分子量（配列表配列番号１からの推定）を有する。また、その成熟型は、約６６．７ｋＤａの分子量（配列表配列番号１のアミノ酸番号２０〜６３１からの推定）を有する。
【００１５】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、活性中心に４つの銅イオン（Ｃｕ2+）を有する銅タンパク質である。
銅タンパク質中に含まれるＣｕ2+は、分光学的、ＥＳＲ的に大きく３種に区別される。すなわち、青色を呈しＥＳＲで検出されるタイプＩＣｕ2+、フリーなＣｕ2+と類似の挙動を示し、ＥＳＲで検出されるタイプIIＣｕ2+、２つのＣｕ2+から構成され、反強磁性相互作用によりＥＳＲで検出されないタイプIIIＣｕ2+に区別される。
耐熱性ラッカーゼが活性型となるには、それら全てのタイプのＣｕ2+の配位が必要であると考えられる。該Ｃｕ2+が配位する位置は、他のラッカーゼのアミノ酸配列との比較により、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中、タイプＩＣｕ2+が５９０番目のシステイン残基（Ｃｙｓ）、５１１、５９５番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）、タイプIIＣｕ2+が１４５、５１４番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）、２つのタイプIIIＣｕ2+が１４７、１８５、１８７、５１６、５８９、５９１番目のヒスチジン残基であると推定される。
【００１６】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、好ましくは以下の酵素学的性質を有する。
【００１７】
（ａ）作用
フェノール性化合物を酸化する。例えば、カテコール、レゾルシノール、ハイドロキノン、ピロガロール、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、クレゾール、グアヤコール、L-チロシン、p-フェニレンジアミン、p-トルイジンおよびL-アスコルビン酸を酸化することができる。
【００１８】
（ｂ）至適反応ｐＨ
３０℃でカテコールを基質としたときの活性を指標とすると、本発明の酵素の反応に好適なｐＨは４．０〜６．０であり、至適反応ｐＨは約４．５である。
【００１９】
（ｃ）安定ｐＨ範囲
３０℃で２０時間保持した後の残存活性を指標とすると、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲は６．５〜１０．５である。すなわち、ｐＨ６．５〜１０．５、３０℃で２０時間保持した場合、８０％以上の残存活性（ｐＨ８．０のときの活性を１００％とする）を示す。
【００２０】
（ｄ）至適反応温度
ｐＨ４．５の緩衝液中でカテコールを基質としたときの活性を指標とすると、本発明の酵素の反応に好適な温度は２５〜７０℃であり、至適反応温度は約５０℃である。
【００２１】
（ｅ）熱安定性
ｐＨ７．０の緩衝液中で１０分間保持した後の残存活性を指標とすると、本発明の酵素は約７０℃まで安定である。すなわち、ｐＨ７．０、約７０℃までの温度で１０分間保持した場合、８０％以上の残存活性（３０℃のときの活性を１００％とする）を示す。
【００２２】
（ｆ）７０℃での熱安定性
ｐＨ７．０の緩衝液中で７０℃にて保持した後の残存活性を指標とすると、本発明の酵素は１時間まで安定である。すなわち、７０℃の温度で１時間までの時間保持した場合、８０％以上の残存活性（７０℃で保持する前の活性を１００％とする）を示す。
【００２３】
（ｇ）基質特異性
ｐＨ４．５の緩衝液中で３０℃で反応させたときの活性を指標とすると、本発明の酵素は、カテコール、レゾルシノール、ハイドロキノン、ピロガロール、クレゾール、グアヤコール、p-フェニレンジアミン、p-トルイジン、L-チロシン、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、L-アスコルビン酸を酸化する。
【００２４】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、上記の配列的および酵素学的特徴を有する限り、その由来は特に限定されない。したがって、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、あるいは異種（すなわち、外来の）耐熱性ラッカーゼ遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものもすべて包含される。好ましくは放線菌、より好ましくはストレプトミセス属に属する細菌、特に好ましくはストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）、就中ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２６）由来のもの（これらの細菌から単離される耐熱性ラッカーゼ遺伝子が導入された形質転換体由来のものも包含する）である。
【００２５】
本発明の耐熱性ラッカーゼの好ましい起源であるストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株は、本発明者らによって土壌から分離された細菌であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に２０００年９月８日付で国内寄託され、受託番号として、生命研菌寄第１８０２６号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２６）を付されている菌株である。また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基にした系統樹分析から、本菌株は、ストレプトミセス・ラベンデュラエ・エスエスピー・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae ssp. lavendulae）と近縁であることがわかっている。
【００２６】
人工的に突然変異体を作製する方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。当該方法を用いて配列表配列番号１に示される塩基配列に任意の変異をもたらすことによって、上記特徴を具備する変異耐熱性ラッカーゼを得ることができる。
【００２７】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、（１）該酵素を産生する組織または細胞を原料として抽出精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術により耐熱性ラッカーゼを発現するように操作された細胞から精製する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
【００２８】
天然の耐熱性ラッカーゼ産生細胞からの耐熱性ラッカーゼの単離および／または精製は、例えば以下のようにして行うことができる。天然の耐熱性ラッカーゼ産生菌（例えば、ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株）を、適当な培地、好ましくはポリペプトン−酵母エキス培地〔ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、硫酸鉄０．００１％、硫酸銅０．０００１％（ｐＨ７．０）〕中で培養し、対数増殖期にある菌体の培養液からラッカーゼ活性画分（耐熱性ラッカーゼを分泌する細胞の場合は培養上清、ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株のように耐熱性ラッカーゼを菌体内に蓄積する細胞の場合は、細胞を適当な緩衝液中、超音波処理や界面活性剤処理によって破砕した後、遠心分離等を行うことにより得られる可溶性画分）を分離回収して、該画分から蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより、耐熱性ラッカーゼを精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
化学合成による本発明の耐熱性ラッカーゼの製造は、例えば、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件下で再生（renaturation）させることにより行うことができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様においては、本発明の耐熱性ラッカーゼは、該酵素をコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離および／または精製することにより製造することができる。
【００３１】
耐熱性ラッカーゼ遺伝子のクローニングは、以下の方法により行うことができる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、上記のような手段により該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法を用いて決定する。あるいはペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン分解法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡライブラリーから、コロニー（若しくはプラーク）ハイブリダイゼーション法などによって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングする。
【００３２】
また、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
【００３３】
目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、ＥＭＢＬやＧｅｎＢａｎｋなどの一般に利用可能なデータベース上に登録されたＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）クローンなどのＤＮＡ断片の中から、該公知遺伝子の塩基配列とホモロジーを有するクローンを検索し、抽出されたクローンの塩基配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（若しくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
【００３４】
また、上記のストラテジーとは別に、本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法を用いて直接クローニングすることができる。すなわち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（若しくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、増幅断片が耐熱性ラッカーゼのコード領域をカバーするような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、常法に従ってＰＣＲを行うことにより、耐熱性ラッカーゼのコード領域を含むＤＮＡ断片を増幅することができる。このような方法は、配列既知の耐熱性ラッカーゼと分子進化上、同一の起源を有する耐熱性ラッカーゼ遺伝子のクローニングにおいて特に有用である。例えば、ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株由来の耐熱性ラッカーゼと分子進化上、同一の起源を有すると推定される他の細菌由来の耐熱性ラッカーゼ遺伝子をクローニングする場合、配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８を含むＤＮＡ断片と高度に相同性を有するＤＮＡ断片を増幅し得るようなセンスおよびアンチセンスプライマーを構築してＰＣＲ法を実施すればよい。
【００３５】
また、目的の耐熱性ラッカーゼと高度な相同性を有する耐熱性ラッカーゼのＤＮＡ配列が未知の場合でも、例えば、５'上流領域の比較的保存されている幾つかの配列をセンスプライマー、３'下流領域の比較的保存されている幾つかの相補鎖配列をアンチセンスプライマーとして、ＰＣＲを行うことにより、該耐熱性ラッカーゼ遺伝子をクローニングすることができる。この際、耐熱性ラッカーゼ遺伝子全部をコードするＤＮＡの増幅断片ではなく、その一部を含むＤＮＡの増幅断片が得られることもあるが、この場合、当該ラッカーゼ活性を有する細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、該増幅断片をプローブとして用いて、サザン法等のハイブリダイゼーション法により、該酵素をコードするＤＮＡを直接クローニングすることができる。
【００３６】
上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法などの公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
【００３７】
本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡとしては、
（i）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ii）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸配列２０〜６３１からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（iii）上記（i）または（ii）のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
【００３８】
好ましくは、
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号２６６〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列中塩基番号３１１〜２１５８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつラッカーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡである。
【００３９】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。
【００４０】
上記（ｃ）のＤＮＡとしては、例えば、
（i）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡの５'または３'末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
（ii）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡの５'末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
（iii）上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡの５’または３’末端にＴｒｘ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
などが挙げられる。
【００４１】
上記（ｄ）のＤＮＡとしては、例えば、
（i）細菌由来のラッカーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ii）放線菌由来のラッカーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（iii）ストレプトミセス属由来のラッカーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
などが挙げられる。
【００４２】
本発明の遺伝子はいかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーから調製されるゲノムＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡ等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡは、配列表配列番号２に示される塩基配列を基にして、化学的に合成されるＤＮＡであってもよい。
【００４４】
本発明はまた、本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、宿主が細菌の場合、大腸菌由来のｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）等のｐＥＴ系ベクター、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１等のｐＧＥＸ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等のｐＢＲ系ベクター、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター等、枯草菌由来のｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等、放線菌由来のｐＩＪ７０２、ｐＳＫ1、ｐＳＫ２、ＳＣＰ２、ＳＣＰ１．２、ｐＧＡ４８２、ｐＭＣＸｐｒｅｓｓ、または酵母由来のｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等が例示される。また、ウイルスベクターとしては、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などのパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）などのレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００４５】
特に、本発明の組換えベクターは、耐熱性ラッカーゼをコードする遺伝子を機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、それにコードされる蛋白質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、耐熱性ラッカーゼまたはその各サブユニットをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーターなどのウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシンなどの薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入される耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
【００４６】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびShine-Dalgarno（ＳＤ）配列を包含する。
【００４７】
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、耐熱性ラッカーゼ  ｍＲＮＡの５'側および３'側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。
【００４８】
また、形質転換体の培地中に耐熱性ラッカーゼを分泌させる場合において、挿入される耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターが好ましく使用される。取得を目的として耐熱性ラッカーゼを培地中へ分泌させるためには本発明の発現ベクターはシグナル配列を機能的に含有していることが好ましい。当該シグナル配列は宿主細胞の蛋白質の分泌機構が認識できるものであれば特に限定されないが、宿主細胞が放線菌の場合、本発明の耐熱性ラッカーゼをコードする遺伝子とその由来を同じくするストレプトマイセス属のものが好ましい。該シグナル配列は細胞内のプロテアーゼにより切断除去されて成熟蛋白質が細胞外に分泌される。
【００４９】
本発明の形質転換体は、本発明の耐熱性ラッカーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。宿主細胞は使用する組換えベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、当分野で通常使用される天然に存在する細胞あるいは人工的に作製された変異体細胞若しくは組換え体細胞等種々の細胞が利用できる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞等種々の細胞が利用できる。好ましくは細菌、特に大腸菌（例えばＢＬ２１、ＪＭ１０９、ＤＨ５、ＨＢ１０１等）、枯草菌、シュードモナス属細菌（例えばシュードモナス・フルオレセンス等）、ストレプトミセス属細菌（例えばストレプトミセス・リビダンス等）、シュードストレプトミセス属細菌、アセトバクター属細菌等が挙げられる。
【００５０】
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場合は、Cohen らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69,2110 (1972)）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., 168、 111 (1979) ）、コンピテント法（J. Mol. Biol., 56, 209 (1971) ）等によって、酵母の場合は、Hinnenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927 (1978)）、リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等によって、動物細胞の場合は、Grahamの方法（Virology, 52, 456 (1973)）等によって、また昆虫細胞の場合は、Summers らの方法（Mol. Cell. Biol.3, 2156-2165 (1983)）等によって、それぞれ形質転換することができる。
【００５１】
本発明の耐熱性ラッカーゼは、好ましくは上記のようにして調製される耐熱性ラッカーゼ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から耐熱性ラッカーゼを回収することによって製造することができる。
【００５２】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）等〕を含んでいてもよい。
【００５３】
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
【００５４】
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)）等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばBurkholder最少培地（Bostian. K.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）が挙げられ、そのｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５５】
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（Science, 122, 501 (1952)）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Virology, 8, 396 (1959) ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am. Med. Assoc., 199、 519 (1967) ）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５６】
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５７】
耐熱性ラッカーゼの単離および／または精製は、ラッカーゼ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。本発明の好ましい態様においては、耐熱性ラッカーゼは細胞質と細胞外（すなわち、培地）の両方に存在する。
【００５８】
培養物の培地中に存在する耐熱性ラッカーゼは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなど）、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。なかでも、収率の観点からは、イオン交換クロマトグラフィーを用いることが好ましい。
【００５９】
一方、細胞質に存在する耐熱性ラッカーゼは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００などの界面活性剤処理等により、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過等によりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離および／または精製することができる。
【００６０】
また、宿主として大腸菌などを用いた場合、大腸菌由来のタンパク質と非特異的Ｓ−Ｓ結合が形成されることがあり、性質が変化することがあるため、このような宿主から耐熱性ラッカーゼを製造あるいは単離および／または精製する際には、当該耐熱性ラッカーゼを変性剤および還元剤と接触させることが好ましい。耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を接触させることで、上記非特異的Ｓ−Ｓ結合をはずすことができる。また、変性剤および還元剤を接触させた後も本発明の耐熱性ラッカーゼは活性を保持することができる。すなわち、このような処理を施した後も後記活性測定方法により活性が確認される。
【００６１】
ここでいう「変性剤」とは、タンパク質の変性を引き起こす物質をいい、例えば、尿素、塩酸グアニジンなどが挙げられ、好ましくは尿素が挙げられる。上記方法における変性剤の使用濃度は、通常、２〜８Ｍである。変性剤の濃度が２Ｍ未満であると、非特異的Ｓ−Ｓ結合を十分にはずすことができない可能性があり、一方、８Ｍを超えると耐熱性ラッカーゼが過度に変性し、失活してしまう可能性がある。
【００６２】
ここでいう「還元剤」とは、タンパク質中に存在するＳ−Ｓ結合をはずすことができる物質をいい、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、亜硫酸塩化合物、アスコルビン酸などが挙げられ、好ましくは２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが挙げられる。上記方法における還元剤の使用濃度は、通常、１〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。還元剤の濃度が１ｍＭ未満であると、非特異的Ｓ−Ｓ結合を十分にはずすことができない可能性があり、一方、１００ｍＭを超えると耐熱性ラッカーゼが過度に変性し、失活してしまう可能性がある。
【００６３】
耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を接触させる温度は、特に限定されないが、酵素の熱による失活を防ぐという点から、通常０〜２０℃、好ましくは０〜５℃である。また、接触時間も特に限定されないが、Ｓ−Ｓ結合の切断に要するのに充分な時間をかけるという点から、通常１０分から２４時間、好ましくは３０分〜２時間である。
【００６４】
耐熱性ラッカーゼに変性剤および還元剤を接触させる方法としては、例えば、変性剤および還元剤を含む溶液中に耐熱性ラッカーゼを混合する方法、耐熱性ラッカーゼを含む溶液に変性剤および還元剤を同時または別々に混合する方法、変性剤か還元剤の一方を含む溶液に耐熱性ラッカーゼおよびもう一方を同時または別々に混合する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、混合する際は、接触効率の点からゆるやかに撹拌しながら行うことが好ましい。
【００６５】
耐熱性ラッカーゼと変性剤および還元剤との接触は、特に限定されず、上記タンパク質の各種分離方法を行う前後に行ってもよく、上記分離方法において変性剤および還元剤を含む溶液を使用することによって行ってもよい。好ましくは、Ｓ−Ｓ結合に起因するラッカーゼの性質の変化により、各種クロマトグラフィーへの悪影響が生じることがあることから、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなど）を行う前に接触させるか、あるいは各種クロマトグラフィーにおいて変性剤および還元剤を含む溶出液を使用して接触させることが挙げられ、より好ましくはイオン交換クロマトグラフィーを行う前に接触させることが好ましい。また、当該接触は、上記分離方法の前後に複数回繰り返して行ってもよい。
【００６６】
このように本発明の耐熱性ラッカーゼと変性剤および還元剤を接触させることにより、本発明の耐熱性ラッカーゼの性質を変化し得る非特異的Ｓ−Ｓ結合をはずすことができ、宿主として大腸菌を用いた場合であってもストレプトミセス・ラベンデュラエＲＥＮ−７株が生産するラッカーゼと同様の性質を有する耐熱性ラッカーゼを製造または単離および／または精製することができる。
【００６７】
また、上述したように、本発明の耐熱性ラッカーゼは、活性中心に４つの銅イオン（Ｃｕ2+）を有する銅タンパク質であるので、宿主の培地や上記単離および／または精製方法に使用する透析液、溶離液などに、１μＭ〜１ｍＭの銅イオン（Ｃｕ2+）を含有させるようにしてもよい。
【００６８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって何ら本発明の範囲を限定するものではない。
なお、実施例中、ラッカーゼ活性は下記の酵素電極法または比色法で測定した。また、塩基配列解析は以下の方法で行った。
【００６９】
〔酸素電極法〕
全容量が５ｍｌの基質溶液（５ｍＭ  カテコールを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を３０℃で１０分間保持して温度を均一にした後、適当に希釈した酵素液（２０〜１００μｌ）を加え反応を開始した。活性は、反応の進行に伴う酵素消費量の初速度より求めた。溶存酸素量の測定は、クラーク型酸素電極（YSI model 5300 biological oxygen monitor）を用いた。３０℃で空気と平衡状態にある水中の溶存酸素量は２２８μＭとした。以上の条件で１分間に１μｍｏｌの酸素を消費する酵素活性を１単位とした。
【００７０】
〔比色法〕
全容量が５ｍｌの基質溶液（５ｍＭカテコールを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を３０℃で１０分間保持して温度を均一にした後、適当に希釈した酵素液（２０〜１００μｌ）を加え、３０分間反応させた。活性は、反応の進行に伴う基質カテコールの酸化により生成するｏ−ベンゾキノンの４７５ｎｍでの吸光度の増加より求めた。以上の条件で１分間に基質溶液１ｌあたり吸光度を０．００１増加させる酵素活性を１単位とした。
【００７１】
〔塩基配列解析〕
プラスミド０．２〜０．５μｇを鋳型とし、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃２４０秒のＰＣＲ反応を行った。上記反応物をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列を解析した。
【００７２】
実施例１  耐熱性ラッカーゼ遺伝子のクローニング
（１）ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株ゲノムＤＮＡの調製
ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２６）を培養し、培養液からろ過によって菌体約１ｇ回収し、ゲノムＤＮＡを公知の方法（D.A. Hopwood et al. Genetic manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, ppl0, The John Innes Foundation (1985)）により調製した。
【００７３】
（２）ＰＣＲによる耐熱性ラッカーゼ遺伝子の部分増幅
種々のラッカーゼ間で保存性の高いアミノ酸配列より、表１に示すセンスプライマー（１Ｆ）、アンチセンスプライマー（２Ｒ）を合成した。
【００７４】
【表１】
0004056369.tif 000002
【００７５】
ストレプトミセス・ラベンデュラエ  ＲＥＮ−７株ゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを鋳型とし、表１の１Ｆ（配列表配列番号３）、２Ｒ（配列表配列番号４）およびKOD plus（東洋紡績株式会社製）を用いて、９７℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃９０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅された約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（東洋紡績株式会社製）のＳｍａ  Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡績株式会社製）を形質転換させた。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、塩基配列解析を行った結果、塩基配列より推測されるアミノ酸配列が既知のラッカーゼと相同性を示した。従って、増幅されたＤＮＡ断片が耐熱性ラッカーゼ遺伝子の一部をコードすると推測された。
【００７６】
（３）サザンブロット解析
（２）のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片１０ｎｇをAlkPhos Direct Labellingand Detection（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、アルカリフォスファターゼを直接ＤＮＡ断片に標識した。
【００７７】
上記で調製したゲノムＤＮＡ３μｇを制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで電気泳動した後、Hybond-Ｎ+（アマシャムファルマシアバイオテク社製）にVacuGene XL Vacuum Blotting System（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて転写した。このメンブレンに、上述のアルカリフォスファターゼで標識したプローブを６０℃にて一晩ハイブリダイズさせた後、６０℃で１０分の洗浄を３回行い、さらに室温で５分の洗浄を２回行った。AlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたＣＤＰ−Ｓｔａｒによる化学発光を検出した結果、約２．３ｋｂｐの陽性バンドを得た。
【００７８】
（４）Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによる耐熱性ラッカーゼ遺伝子全長の取得
上記で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。これにLigation High（東洋紡績社製）を加え、１６℃で一晩インキュベートした。セルフライゲーションさせたＤＮＡ断片２０ｎｇを鋳型とし、表１に示したプライマー（Ｉｎｖ  Ｆ：配列表配列番号５、Ｉｎｖ  Ｒ：配列表配列番号６）およびＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１５０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００７９】
得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ  Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。形質転換した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、塩基配列解析を行った。既に配列解析済みの１ｋｂｐのＤＮＡ断片と重ね合わせた結果、サザンブロット解析で陽性を示したＳｍａ  Ｉ消化の２．３ｋｂｐの断片は、２，３１８ｂｐからなることが判明した（配列表配列番号２）。該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示す。また、この配列中に１，８９６ｂｐ（配列表配列番号２の塩基番号２６６番目から２，１６１番目）からなるオープンリーディングフレームが見出され、耐熱性ラッカーゼは６３１アミノ酸残基からなる（配列表配列番号１）と推定された。また、該アミノ酸配列中アミノ酸番号２０のＡｌａからアミノ酸番号３７のＶａｌまでが別途決定した天然型耐熱性ラッカーゼのＮ末端アミノ酸配列（特許文献２参照）と完全に一致したことから、得られたＤＮＡ断片はラッカーゼ遺伝子であることが判明した。
【００８０】
実施例２  耐熱性ラッカーゼ発現プラスミドの構築
実施例１で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片１０ｎｇと鋳型として、表１に示したプライマー（ｍａｔｕｒｅ  ＮＴ：配列表配列番号７、ｍａｔｕｒｅ  ＣＴ：配列表配列番号８）およびＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、６２℃３０秒、６８℃１２０秒、１５サイクル、９７℃１５秒、６８℃１５０秒、２５サイクルのＰＣＲを行った。なお、ｍａｔｕｒｅ  ＮＴはＥｃｏＲ  Ｉ切断サイトを含み、ｍａｔｕｒｅ  ＣＴはＸｈｏ  Ｉ切断サイトを含む（表１参照）。
【００８１】
得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ  Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。形質転換させた大腸菌により、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＸｈｏ  Ｉで切断し、アガロースゲルで電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）ＥｃｏＲ  ＩとＸｈｏ  Ｉサイトに挿入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（宝酒造社製）を形質転換させ、これをｐＧＥＸ−ＲＥＮ７  ｍａｔｕｒｅ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳとした。
【００８２】
実施例３  大腸菌での耐熱性ラッカーゼの製造および精製
（１）大腸菌の培養
実施例２で作成した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地６ｍｌに植菌後、３７℃で一晩前培養を行った。前培養液から１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むTerrific broth培地１００ｍｌに植菌後、２０℃で２４時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収し、３０ｍｌの１ｐｐｍ硫酸銅を含むＰＢＳに懸濁し、超音波破砕した。遠心分離により菌体残渣を取り除き、上清を粗酵素液とした。この粗酵素液中に含まれるラッカーゼ活性を上述の酵素電極法により測定したところ、培養液１リットル当たり２００単位であった。
【００８３】
（２）ラッカーゼの精製
上記（１）の粗酵素液をＰＢＳで平衡化したグルタチオンセファロース４ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出画分をＰＢＳに対して一晩透析した。透析後の酵素液にジチオスレイトールを１ｍＭとなるように加えた後、Prescission Protease（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、４℃で一晩酵素反応した。これをグルタチオンセファロース４ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、カラム素通りおよび洗浄画分を回収した。得られた酵素溶液に硫酸アンモニウムを加え塩析した。沈殿を遠心分離により回収し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したHiload 26/60 Superdex 200 pg（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロマトグラフィーにかけることにより精製ラッカーゼを得た。
【００８４】
実施例４  耐熱性ラッカーゼ発現プラスミドの構築
実施例１で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（宝酒造社製）で完全分解し、アガロースゲルで電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて約２．３ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片１０ｎｇを鋳型として、表１に示したプライマー（ＯＲＦ  ＮＴ：配列表配列番号９、ＯＲＦ  ＣＴ：配列表配列番号１０）およびＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃１２０秒、１サイクル、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１８０秒、３０サイクル、６８℃９０秒、１サイクルのＰＣＲを行った。なお、ＯＲＦ  ＮＴはＮｄｅ  Ｉ切断サイトを含み、ＯＲＦ  ＣＴはＢａｍＨＩ切断サイトを含む（表１参照）。
【００８５】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｄｅ  ＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲルで電気泳動した後、Gen Elute Gel Purification Kit（シグマアルドリッチ社製）を用いて約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。得られた断片をｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅ  ＩとＢａｍＨＩサイトに挿入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（宝酒造社製）を形質転換させ、これをｐＥＴ−ＲＥＮ７  ＯＲＦ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳとした。
【００８６】
実施例５  大腸菌での耐熱性ラッカーゼの製造および精製
（１）大腸菌の培養
実施例４で作成した形質転換体をｐＨ７．３に調整した５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地６ｍｌに植菌後、３０℃で１５時間程度前培養を行った。前培養液から１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むTerrific broth培地１００ｍｌに植菌後、２５℃、１００ｒｐｍで２４時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収し、５０ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離により菌体残渣を取り除き、上清を１ｐｐｍの硫酸銅を含む５Ｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃、一晩透析し、これを粗酵素液とした。この粗酵素液中に含まれるラッカーゼ活性を上記の酸素電極法により測定したところ、培養液１Ｌ当り２３０単位であった。
【００８７】
（２）ラッカーゼの精製
上記（１）で得られた粗酵素抽出液５０ｍｌを７０℃、３０分間熱処理した。不溶物を遠心分離により取り除いた後、得られた上清４５ｍｌに尿素を６Ｍ、２−メルカプトエタノールを２０ｍＭになるように加え、ｐＨ８．５、総タンパク質量が１ｍｇ程度になるように調整し、氷上で１時間緩やかに撹拌した。これを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に透析して希釈することにより、尿素と２−メルカプトエタノールを除去した。透析後の酵素溶液を４℃で一晩空気酸化させた。得られた酵素液を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、１〜５００ｍＭ塩化カリウムの直線的濃度勾配で溶出して、ラッカーゼ活性画分を回収することにより精製ラッカーゼを得た。この精製ラッカーゼの活性を上述の酵素電極法により測定したところ、培養液１リットル当たり６０単位であった。
【００８８】
実施例６
実施例５の（２）の工程において、２−メルカプトエタノールの代わりにジチオスレイトールを用いた以外は同様に行い、精製ラッカーゼを得た。この精製ラッカーゼの活性を上述の酵素電極法により測定したところ、培養液１リットル当たり６０単位であった。
【００８９】
実施例７
実施例５で得られた精製ラッカーゼは、以下の性質を示した。
【００９０】
（１）至適反応ｐＨ
上記酵素の活性をｐＨ３．５〜７．０の種々の条件下で、上記酸素電極法に準じて測定した。各ｐＨにおける酵素の相対活性（最大活性値を１００％とした相対値）を図２に示す。該酵素の反応に好適なｐＨは４．０〜６．０であり、至適反応ｐＨは約４．５であった。
【００９１】
（２）安定ｐＨ範囲
該酵素をｐＨ３．５〜１１．０の種々の条件下、３０℃で２０時間保持した後、上記比色法に準じて活性を測定した。各ｐＨにおける残存活性（ｐＨ８．０のときの活性を１００％とする）を図３に示す。該酵素の安定ｐＨ範囲は３０℃で６．５〜１０．５であった。すなわち、ｐＨ６．５〜１０．５、３０℃で２０時間保持した場合、８０％以上の残存活性を示した。
【００９２】
（３）至適反応温度
該酵素の活性を、３０〜７５℃の種々の温度で、上記比色法に準じて測定したところ、該酵素の反応に好適な温度は２５〜７０℃であり、至適反応温度は約５０℃であった。
【００９３】
（４）熱安定性
該酵素を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で２０〜９５℃の種々の温度にて１０分間保持した後、上記酵素電極法に準じて活性を測定した。各温度における残存活性（３０℃のときの活性を１００％とする）を図４に示す。該酵素はｐＨ７．０で１０分間保持した場合、７０℃まで安定であった。すなわち、ｐＨ７．０、約７０℃までの温度で１０分間保持した場合、８０％以上の残存活性を示した。
【００９４】
（５）７０℃での熱安定性
該酵素を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で７０℃にて３０分〜４時間保持した後、上記酵素電極法に準じて活性を測定した。各保持時間における残存活性（７０℃で保持する前の活性を１００％とする）を図５に示す。該酵素は７０℃の温度で１時間まで安定であった。すなわち、７０℃の温度で１時間までの時間保持した場合、８０％以上の残存活性を示した。
【００９５】
（６）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより該酵素の分子量を測定したところ、分子量は約７３ｋＤａであった。
【００９６】
（７）アミノ末端のアミノ酸配列
エドマン分解法により該酵素のアミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、該アミノ酸配列は、Thr Asp Ile Ile Gluであった。
【００９７】
（８）基質特異性
上記酵素を用い、各基質（カテコール、レゾルシノール、ハイドロキノン、ピロガロール、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、クレゾール、グアヤコール、L-チロシン、p-フェニレンジアミン、p-トルイジン、L-アスコルビン酸）を５ｍＭの濃度（L-チロシンは１ｍＭとした）で含む溶液中での酵素活性を、上記酸素電極法に準じて測定したところ、該酵素は全ての化合物を酸化した。なかでもピロガロールを最もよく酸化した。
【００９８】
（９）阻害剤の影響
上記酵素の活性を上記比色法に準じて測定したところ、該酵素の活性は１ｍＭの濃度のL-システイン塩酸塩、DL-ジチオスレイトール、アジ化ナトリウムによって完全に阻害された。また、１ｍＭの濃度のコウジ酸によって７０％程度阻害された。
【００９９】
（１０）金属塩の影響
各金属塩（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、MnCl2、CaCl2、KCl、NaCl）０．２ｍＭを含む溶液中で上記酵素の活性を上記比色法に準じて測定したところ、該酵素の活性は、いずれの金属塩によっても大きな影響を受けないことがわかった。
【０１００】
【発明の効果】
本発明によれば、耐熱性ラッカーゼを遺伝子工学的に大量製造することができる。
【０１０１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【０１０２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】耐熱性ラッカーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。
【図２】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各ｐＨにおける活性を示す図である。
【図３】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各ｐＨにおける安定性を示す図である。
【図４】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの各温度における安定性を示す図である。
【図５】実施例５で得られた耐熱性ラッカーゼの７０℃における安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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