(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原に対する免疫応答を高める分子アジュバントであって、該免疫原に機能的に連結された標的リガンドを含み、それによって該分子アジュバントの抗原提示細胞との結合が該抗原提示細胞を活性化して、該抗原提示細胞の抗原提示経路への該免疫原の運送に作用する、分子アジュバント、ここで該標的リガンドのアミノ酸配列は、ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号１）である、分子アジュバント。
【請求項２】
標的リガンドおよび免疫原を含む、配列ＹＫＱＧＧＦＬＧＬＹＳＦＫＰＭＰＬａＲを有する、請求項１の分子アジュバント。
【請求項３】
該標的リガンドと該免疫原とがスペーサー部分によって連結されている、請求項１の分子アジュバント。
【請求項４】
該免疫原がペプチド、グリコペプチド、ホスフォペプチド、リポペプチド、タンパク質、グリコタンパク質、ホスフォタンパク質、リポタンパク質、カルボハイドレート、核酸および脂質からなる群より選択される物質の少なくとも１種を含む、請求項１の分子アジュバント。
【請求項５】
該免疫原がペプチドを含む、請求項４の分子アジュバント。
【請求項６】
該ペプチドがヒト・ムチン−１のエピトープを含む、請求項４の分子アジュバント。
【請求項７】
該免疫原がタンパク質を含む、請求項４の分子アジュバント。
【請求項８】
該タンパク質が血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）を含む、請求項７の分子アジュバント。
【請求項９】
式ＳＡＡ−Ｋ−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）−ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（ＳＡＡコンジュゲート配列番号８）を有する、請求項８の分子アジュバント。
【請求項１０】
該免疫原が腫瘍特異的抗原を含む、請求項１の分子アジュバント。
【請求項１１】
免疫応答を高めることを望む対象において、免疫原に対する該免疫応答を高める組成物であって、生物的に適合する培地に請求項１の分子アジュバントを含む該組成物。
【請求項１２】
液素性免疫応答を誘発する、請求項１１の組成物。
【請求項１３】
該抗原提示細胞が単球、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群より選択される、請求項１１の組成物。
【請求項１４】
抗原含有病原物による感染を起こしやすい宿主において抗原提示細胞仲介免疫応答を引き出すための請求項１１の組成物であって、該免疫原が該免疫応答を引き出すのに効果的な量で該病原物の抗原を含有する、該組成物。
【請求項１５】
腫瘍関連抗原に対する免疫応答を引き出すための請求項１１の組成物であって、該腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を有する宿主に投与され、該免疫原が該免疫応答を引き出すのに効果的な量で該腫瘍関連抗原を含有する、該組成物。
【請求項１６】
請求項１の分子アジュバントの免疫原的効果量で非ヒト動物を免疫し、
ｂ）該動物の血清から抗体を単離し、
ｃ）該単離抗体を回収することを含む、免疫原に対する抗体を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
３５ｕ.ｓ.ｃ.§２０２（ｃ）の下に、米国政府が本明細書に記載された発明について一定の権利を有することを確認する。この発明のある部分は、米国保健研究所の資金、許可番号ＣＡ５７３６２およびＣＡ３６７２７によってなされた。
同じ所有者で継続中の米国特許出願番号０８／２９９，２８５の開示はここに引用することにより合体される。
発明の分野
本発明は、ワクチンおよび獲得免疫の刺激についての分野に関する。特に、本発明は、抗原提示細胞に特殊な抗原を運び、望む免疫応答を産生するこれらの細胞にシグナルを同時に運ぶように設計された新規の組成物を提供する。
発明の背景
いくつかの刊行物は、本発明と関係する技術状態を充分に述べるため、この出願では丸括弧内の数字で参照している。これら参照のための引用文は明細書の最後に記載している。これらいずれの刊行物の開示は参照として挙げることにより本明細書に組み入れる。
生物体における後天的な特異免疫の基礎は、自己抗原基質と非自己抗原基質を区別する能力である。哺乳類の免疫システムは、自己と非自己を区別のための主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）として知られる細胞表面分子を用いる。ＭＨＣ分子には二つのクラスが存在する。クラスＩ分子は体内のすべての有核細胞に見られる。クラスＩＩ分子は主に免疫応答の生成に関係する細胞で見付かる。ほとんどの特異的免疫応答は、ＭＨＣ分子に関連するペプチドあるいはタンパク質誘導体に対して生じる。
ＭＨＣ分子の構造は小さなペプチド、グリコペプチド、ホスホペプチドなどに自然に結合するものである。ＭＨＣ分子の重要な機能の一つは、ＭＨＣ分子を発現する細胞において、発現された成熟タンパク質の製造産物から誘導されるペプチドに結合することと、免疫システム展示のため細胞表面にこれらを輸送することである。このように、ＭＨＣ分子には免疫応答システムを通常の細胞タンパク質の中で代表的なペプチドに露出する作用がある。この過程は、自己を学ぶときである発生の間に起きる。そして生物の一生の中で継続される。異なった機能である免疫の寛容性によって、生体はＭＨＣに付随する“自己”ペプチドと反応することがない。
細胞への非自己タンパク質の導入の結果、ＭＨＣ分子に付随する新しく異なったペプチドが出現する。これらは免疫応答の結果、“非自己”として認識される。例えば細胞のウイルス性感染は、ＭＨＣ分子（通常はクラスＩ  ＭＨＣ）と共同して抗原提示細胞の表面で発現するウイルス性ペプチドの生成をもたらす。細胞表面にＭＨＣ分子とともに存在するウイルス性ペプチドはしばしば異物として認識され、免疫応答が起きることになる。数種の自己ペプチドへの寛容性が失われたならば、あるいは免疫応答が宿主の生体内で通常のペプチドと交差反応するウイルス性あるいは他の異物タンパク質に対して作られたならば、自己免疫疾患が起きる。
細菌性感染あるいは外来性の原因による他の侵襲の場合、新しいタンパク質や化合物は生体内に入る。免疫応答に関係するいくつかの細胞には異質生体あるいはタンパク質を食する作用がある。これらの免疫細胞はタンパク質産物を減成し（処理する）、そして誘導ペプチドはＭＨＣ分子と共同して細胞表面で発現される。そこは特異的適応的免疫応答が新規な非自己成分に対して生ずる場所である。この活性は抗原処理・提示と呼ばれ、この活性を仲介する細胞は抗原提示細胞（ＡＰＳ）と呼ばれる。マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞や他の関連細胞を含む様々な型の免疫細胞がこの機能を実行する。
抗原のみでは、免疫応答の構築にしばしば不十分である。時々、抗原は、ＡＰＣと応答リンパ球との間、あるいはこれら細胞と周囲の環境に存在する可溶性因子との間におけるリガンド−レセプターの相互作用によって仲介される“シグナル”を伴って存在しなければならない。その可溶性因子には、サイトカインおよび感染あるいは侵襲の部位に通常存在する他の炎症仲介物（補体、キニン、他の成長因子やサイトカイン因子）が含まれる。そのシグナルが本来ポジティブであれば、リンパ球の増殖や適当な免疫応答を作る結果となり、本来ネガティブであれば、応答リンパ球のアポトーシスと恐らくその抗原に対する免疫寛容性をもたらす。抗原提示は、ヘルパーＴ細胞あるいはサイトカインの配列を分泌する他の型の細胞の存在下でしばしば生じる。これらば誘導される免疫応答型に影響を与えるか、またはそれを決定する。細胞レベルにおいて、特異的免疫応答は、種々の型の抗原提示細胞、ヘルパーＴリンパ球、他の型の制御細胞および応答リンパ球（抗体応答のためのＢ細胞、細胞応答のためのＴ細胞）を含む混合した細胞の環境下で生ずる。Ｔ細胞によるペプチドの直接的な認識もまた、同種のＭＨＣが直接的に異物のように認識される同種移植のような、いくつかの型の細胞で生ずる。
抗原処理と特異的抗原に対する免疫応答型におけるその効果
抗原が処理・提示されるメカニズムおよび生ずる免疫応答の型（抗体対細胞）を決定するパラメーターは、多くの抗原について現在あまりよく知られていない。異なる型の免疫応答を作ることができる異なるクラスのＡＰＣが存在すると考えられている。通常、エンドサイトーシスにより取り込まれる外生の抗原に対するＡＰＣ誘導応答は、クラスＩＩＭＨＣの状況にて免疫システムへ付加されて、Ｂ細胞と相互作用するヘルパーＴ細胞の補填をもたらし、最終的に抗体応答を作り出す。対照的に、細胞由来の内性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に関連し、細胞障害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）や遅延型過敏症（ＤＴＨ）Ｔ細胞を含む細胞活性を作り出す。これらのメカニズムには重要な例外がある。例えば、外生ペプチドと反応性のある多くのＣＴＬについて発表されており、免疫細胞の含まれるインビトロの培地に添加された特異的ペプチドに対するＣＴＬを生ずる可能性がある。
他の因子が生ずる免疫応答の型を決定することがある。例えば、ＭＨＣ（クラスＩ、クラスＩＩのいずれか）とのペプチド関連の性質は免疫応答の型に影響を与える重要な因子である。クラスＩＭＨＣ分子の場合、ペプチド関連物に対し特異的に結合するモチーフがある（Rammenseeら，Ann.Rev.Imm．11：213,1993）。結合モチーフはH-2 Kd,Kk,Ddとして確立されており、他のマウスやヒトのＭＨＣにおいても然りである。クラスＩＩＭＨＣとの親和性を決定するペプチドの配列のパラメーターもまた存在する。そのため、個体が行える免疫システム応答でのペプチドの型は、個体内で発現するＭＨＣ分子の形態や構造が確立されている免疫発生遺伝子型や表現型によって部分的に決定される。
要約すると、抗原変化に対応して生体内で生ずる免疫応答の型は、個体の免疫遺伝的背景、抗原への先感作、抗原の露出経路と形態、生体の年令と性別や他の因子を含む無数の因子による寄与の結果である。特異的なＴ細胞認識を含む、ほとんどすべての獲得免疫応答は、超抗原への応答は明らかに例外であるが、ＭＨＣ分子の溝に結合するペプチドと結合できる小さなペプチドに対して直接的である。ＭＨＣと結合するペプチドに対する細胞免疫反応（Ｔヘルパー反応、ＣＴＬ、ＤＴＨ）は、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞に対する抗原の提示を通して生ずる。
腫瘍ワクチン
癌細胞は腫瘍関連抗原として知られる異常分子を発現する。免疫システムは、同種移植が拒絶されるのと同様の方法で腫瘍細胞を拒絶するために、“異物”といった構造を認識することと、それらに対する特異的免疫応答を実行することの可能性を有する。このことは、癌関連抗原を基にした活性特異的免疫治療薬（ＡＳＩ）（癌“ワクチン”）の開発に興味ある根拠を提供する。
化学的発癌物質、紫外線照射あるいはウイルスによる、げっ歯類の腫瘍における初期の研究では、二次腫瘍変化の免疫学的拒絶の誘導が示された。自然発生腫瘍についてのその後の研究では、これらの動物は腫瘍の免疫仲介的拒絶を誘導することができないことが示された。多数のヒトの腫瘍関連抗原は特徴づけられているが、これらほとんどは通常の細胞内でもまた発現している。それゆえ、そのような分子に対する免疫学的寛容性は、そのような抗原に対する応答を刺激することを難しくする。さらに、自己分子に対する強力な免疫応答の誘導は自己免疫障害の進展の結果かもしれないという懸念がある。腫瘍特異的抗原は自然発生癌においてめったに検出されないため、腫瘍関連抗原を基にした通常の癌用の活性特異的治療の発展へのアプローチは悲観的に見られている。
にもかかわらず、特に腫瘍免疫学とＡＳＩの開発への興味は強く主張されている。ＡＳＩへのアプローチに最近興味が持たれるのに少なくとも四つの理由がある。一番目に、細胞仲介免疫応答は癌の免疫学的拒絶において、かぎ因子として認識される。Ｔ細胞は主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関連して処理されたペプチドを認識する。そのため細胞内タンパク質は細胞仲介応答に対するペプチド標的を生ずることができる。さらに、抗原処理と提示はＴ細胞認識において決定的な工程であるため、自己タンパク質の癌関連改変（翻訳処理前や発現レベルにおいて）は癌細胞における新規なペプチドフラグメントを提示する結果となるのかもしれない。二番目には、遺伝子内の腫瘍特異点変異はいくつかの動物の癌やヒトの癌において特徴づけられている。これらいくつかの変異は、Ｔ細胞による認識のため新しいエピトープを産生する結果となるＭＨＣ分子に結合する新規なペプチドフラグメントを生ずる。この処理は、そういった変異を持つ癌細胞に対する、特異免疫応答の誘導を可能とする。三番目に、サイトカイン、変異抗原および他の手段を用いて免疫応答をうまく処理すると、弱い免疫原性抗原を発現する腫瘍の場合でさえ腫瘍拒絶を時々もたらすことがある。四番目に、ひどい免疫欠損をともなういくつかの個体は通常の集団よりも腫瘍の発生率が高くなり、それは免疫システムが腫瘍除去に重要な役割を果すことを示唆する。
さまざまな方法が通常の免疫応答、特に興味深い非抗原基質あるいは弱抗原基質に対する応答を刺激するのに利用されている。例えば、完全フロイントやリビのようなアジュバンドはこの目的のために長く利用されてきた。これらのアジュバンドは一般的免疫応答を刺激するリポポリサッカライドといった成分を含有する油性溶液を含む。その油はペプチドのような可溶性抗原を包み込み、それにより体内における可溶性抗原の減成を防ぎ、食作用や抗原提示細胞の細胞膜の通過を促進すると考えられている。
弱抗原ペプチドやタンパク質の免疫原性を刺激するアプローチは、よい免疫原として知られているキャリアータンパク質と弱抗原を組み合わせている。通常のキャリアータンパク質は、キーホールかさ貝類のヘモシアニン、にわとりのガンマグロブリン、ウシ血清アルブミンを含む。あるいはまた、弱抗原の免疫原性はグルタールアルデヒドのような架橋試薬を使った方法で弱抗原を大きな凝集体にすることにより促進され得る。これらいずれの方法も、強抗原と対をなす弱抗原が一般的免疫応答を促進するであろうという考えに基づいている。同様の方法においては、固相合成樹脂およびペプチド合成法が、高分岐複合体形成のために繰り返しペプチドを合成するのに用いられるであろう。さらに、このアプローチへの基盤は抗体生産を刺激するために、免疫システムの非常にまれな（とても非自己的な）状況で抗原を提示することである。
また他のアプローチでは、弱抗原であるタンパク質やペプチドはラテックスのビーズや合成樹脂のような固体粒子に接着する。このアプローチの目的はマクロファージによる抗原の食作用を促進することである。その上、ペプチドとタンパク質は、リポソームキャリアーの“非自己的”特徴からして、抗原提示細胞の膜の通過を促進するため、食作用を促進するため、そして一般的免疫応答を刺激するためリポソームでカプセル化される。
上記で述べたアプローチは、弱抗原性あるは非抗原性基質の免疫原性を刺激することに成功する頻度が様々である。しかしながら、それらは一般的免疫の刺激のみを供し、免疫システム細胞（抗原提示細胞のような）の特別の集団を標的として作られていない。さまざまな病状において効果的な治療上の介入について望まれる目標は、抗原提示細胞の集団をタンパク質やペプチドを使って明確に標的とする方法を供することであり、興味ある抗原を学習するため、それらの細胞を刺激することであり、効果的で特異な状況における免疫システムにそれを提示することである。知る限りでは、そういったシステムは未だ可能となっていない。
発明の要約
本発明は、抗原提示細胞に特殊な抗原を運び、望む免疫応答を産生するこれらの細胞にシグナルを同時に運ぶように設計された新規の組成物を提供する。本発明の組成物は、“ＡＰＣ標的活性化抗原”と本明細書中で呼ぶことがある。
本発明の一つの点によると、これらのＡＰＣ標的活性化抗原は、抗原提示細胞により仲介される免疫応答を引き出すものであって、抗原提示細胞の特徴的決定因子に特異的に結合する少なくとも一つの標的部分に機能的に連結された少なくとも一つの抗原部分を含んでいる。本発明の目的において、用語“機能的に連結された”は、各部分がその企図する機能を保持するような方法で、部分が連結されていることを一般的に意味する。このことは特に標的部分に関し、この部分は抗原提示細胞の特徴的決定因子に結合するように設計されている。
本発明による標的のために検討された抗原提示細胞には、これらに限定されるものではないが、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞およびいくつかのＴ細胞が含まれる。本発明の好ましい実施態様において、選択されたＡＰＣについての特徴的決定因子は細胞表面レセプターであり、ＡＰＣ標的抗体の標的部分はレセプターに結合するリガンドである。特に好ましくは、細胞表面レセプターが免疫調節性レセプターである。適当な細胞表面レセプターには、これらに限定されないが、Ｃ５ａレセプター、ＩＦＮγレセプター、ＣＤ２１（Ｃ３ｄ）レセプター、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）レセプターおよびＣＤ２３（ＦｃεＲII）レセプターが含まれる。
本発明の一つの例示的なＡＰＣ標的抗原は、Ｃ５ａレセプターに結合するように設計され、標的部分がＣ５ａレセプターリガンドであり、これは好ましくはＣ５ａのＣ末１０残基に対応するＣ５ａペプチド同族体である。本発明の他の例示的組成物は、ＩＦＮγレセプターに結合するよう設計され、ＩＦＮγレセプターリガンド、好ましくはＩＦＮγのＮ末３９残基に対応するＩＦＮγのペプチド同族体である標的部分を含む。
本発明のＡＰＣ標的抗原の抗原性部分は、基本的にいかなる抗原性物質も含み、限定するものでないが、それにはペプチドやタンパク質、グリコペプチドやグリコタンパク質、ホスフォペプチドやホスフォタンパク質、リポペプチドやリポタンパク質、カルボハイドレート、核酸および脂質がある。ＡＰＣ標的抗原は１以上の抗原性部分を含むと共に、１以上の標的部分を含む。さらに、これらの部分はいくつかの状態において機能的に連結される。例えば、“Ｔ”が標的部分、“Ａｇ”が抗原性部分を表すとすると、本発明のＡＰＣ標的抗原は下記のように示される。
Ａｇ−Ｔ；
Ｔ−Ａｇ；
Ｔ1−Ａｇ−Ｔ2；
Ｔ1−［Ａｇ］n−Ｔ2
（式中、［Ａｇ］nは多数の抗原を表す）
上記した一般式の例には下記のものを含む。
Ａｇ−Ｃ５ａアゴニスト ペプチド；
ＩＦＮγペプチド−Ａｇ；
ＩＦＮγペプチド−［Ａｇ］n−Ｃ５ａアゴニスト ペプチド
本発明の他の点によると、本発明のＡＰＣ標的抗原を用いるための方法が提供される。それには、標的リガンドで抗原提示細胞を活性化する方法および抗原提示細胞仲介免疫応答をその応答が望まれる対象において誘発する方法が含まれる。このような処置の必要な患者を免疫化またはワクチン接種する一般的方法、および研究手段としての利用または診断目的のための前決定抗原に特異的な抗体を産生する方法は、本発明の範囲内にあると考えられるべきである。
本発明の組成物および方法の数多くの特徴および利点は、以下に詳細に記述される。
【図面の簡単な説明】
図１は、表示したペプチド構成体で免疫されたマウスにおいて産生した抗体力価を表すグラフである。放射免疫検定法で測定され、125Ｉ−ヤギアンチ−マウス抗体結合の量と、ＭＵＣ１エピトープペプチドでコートされたミクロタイター・ウエル中でインキュべートされたマウス血清の希釈ファクターとの関係を示す。
図２は、ペプチド３（ＹＫＱＧＧＦＬＧＬＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ）（配列番号２）および４（ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲＫＱＧＧＦＬＧＬ）（配列番号５）によって免疫される前と後に採取されたマウス血清における抗体力価の増加を表すグラフである。放射免疫検定法で測定され、125Ｉ−ヤギアンチ−マウス抗体結合の量と、ＭＵＣ１エピトープペプチドでコートされたミクロタイター・ウエル中でインキュベートされたマウス血清の希釈ファクターとの関係を示す。ペプチド３および４は、２つの部分、標的リガンドおよび免疫反応が望まれる抗体を含む。
図３は、ペプチド３（ＹＫＱＧＧＦＬＧＬＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ）（配列番号２）で免疫された後のマウスにおいて産生する抗体クラスおよびサブクラスの力価を表す。家兎アンチ−マウスＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭを用いてＥＬＩＳＡで測定され、ヤギアンチ家兎コンジュゲート・ペルオキシダーゼで処理され、４０５ｎｍでモニターされたｐ−ニトロフェニルホスフェート開裂を用いて検定された。
図４は、ペプチド３（ＹＫＱＧＧＦＬＧＬＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ）（配列番号２）で免疫されたマウスからの血清における抗体サブクラスの結合特異性を表すグラフである。ＭＵＣ１エピトープペプチドでコートされたミクロタイター・ウエルに対する結合および家兎アンチマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＭでの検定を用いてＥＬＩＳＡにより測定され、ヤギアンチ家兎コンジュゲート・ペルオキシダーゼで処理され、４０５ｎｍでモニターされたｐ−ニトロフェニルホスフェート開裂を用いて検定された。
発明の詳細な説明
ワクチンおよび他の免疫刺激剤を開発するのに主な障害は、抗原提示細胞により容易に取り込まれ、保持されるべきいくつかの抗原の無能力である。ＡＰＣによる抗原の取り込みは、効果的な免疫応答を刺激するために必須のステップである。なぜなら、抗原がＡＰＣにより保有され、主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）と共にＡＰＣの表面に提示された後においてのみ、免疫系は抗原を認識するからである。
樹状細胞、単球、マクロファージおよびＢ細胞を含むＡＰＣが、免疫応答を仲介する多くの分子にとっての機能的レセプターを有していることは知られている。本発明において、これらのレセプターに結合するリガンドが弱い免疫原性抗原にコンジュゲートされ得ること、例えば、ＡＰＣの抗原提示経路に抗原を運び、ＡＰＣの抗原提示能力を同時に活性化するようにすることを発見した。このように、これらのコンジュゲートは、ＡＰＣ表面におけるレセプターに結合し、生物的シグナルを導入し、そしてＡＰＣにより内面に取り込まれる。これによって、コンジュゲートの抗原性部分が、ＡＰＣの同時活性化と共にＡＰＣの抗原提示経路に運ばれる。
上記のコンジュゲートは、“分子アジュバント”または“ＡＰＣ標的活性化抗原”と本明細書では言及されることがある。本発明のＡＰＣ標的活性化抗原は抗原提示細胞の１以上のタイプにより仲介される免疫応答を誘発するように設計されている。従って、ＡＰＣ標的活性化抗原は、選択された抗原提示細胞タイプの少なくとも一つの特徴的決定因子に特異的に結合する標的化および活性化部分に連結する少なくとも一つの抗原性部分を含んでいる。この結合はＡＰＣ標的抗原の内部化によりなされ、ＡＰＣ表面での抗原部分の提示をもたらす。本発明の目的において、“抗原性部分”は、免疫応答を生じることが望まれているいかなる物質をも意味する。選択された抗原性部分は、通常の手段で免疫応答を誘発し得ることもあり、し得ないこともある。
用語“決定因子”は、何かの本質を同定または決定する因子を与えると云う広い意味で用いられる。抗原提示細胞について用いられたときは、“決定因子”は、本発明の分子アジュバントの標的リガンド部分による特異的結合に関与する抗原提示細胞上の部位を意味する。
用語“特徴的決定因子”は、抗原提示細胞の特定の集団を同定し、それを他の抗原提示細胞の集団と識別するのに働くエピトープ（またはエピトープのグループ）を意味する。細胞関連決定因子には、例えば膜結合タンパク質またはグリコタンパク質などの細胞膜成分、細胞表面抗原、組織適合性抗原または膜レセプターが含まれる。
用語“特異的結合”は、標的リガンド部分と本発明によって活性化しようとする抗原提示細胞集団の特徴的決定因子との相互作用を意味し、他の細胞に存在する決定因子を実質的に除外する。
本発明の例示的組成物を合成し、その物が上述のメカニズムに合致してＡＰＣ仲介免疫応答を誘発することを示す。例えば、抗原性エピトープは、多くのＡＰＣ類の表面に存在するＣ５ａレセプターに結合し得るＣ５ａデカペプチドアゴニストのアミノ末端にコンジュゲートした。このようなＣ５ａアゴニストにコンジュゲートしたヒトＭＵＣ１（細胞表面関連ムチン）のエピトープを接種したマウスは、ＭＵＣ１エピトープに対する明確な抗体力価を示し、これは、イソ型のＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを有する特異的抗体の高力価を含む。（１）ＭＵＣ１エピトープのみ、（２）Ｃ５ａアゴニストのみ、（３）非コンジュゲートＭＵＣ１エピトープおよびＣ５ａアゴニストを共に、（４）ＭＵＣ１エピトープにコンジュゲートしたＣ５ａアゴニストをＣ５ａの生物活性をブロックするような方法で接種したマウスは、顕著な特異的免疫応答を表さなかった。これらの結果は実施例１に詳細に述べる。同様の結果がＣ５ａアゴニストの１２ｋＤａポリペプチド、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）に対するコンジュゲートで観測され、これを実施例２に詳記する。これらのデータは本発明の実行可能性を表しており、これは、抗原をＡＰＣに運び、同時にリガンド部分によるＡＰＣを活性化するように、レセプター結合リガンドの使用することである。
以下に詳細を述べるように、Ｃ５ａレセプターはＡＰＣで発現される多くのレセプターの一つにすぎない。本発明は、ＡＰＣにおけるシグナル形質導入を仲介する他のレセプターに対する選択性を有する種々のリガンドの使用を含む。このリガンドは、生じた免疫応答の本質に影響するＣ５ａアゴニスト、すなわち液素性、細胞性、Ｔｈ１、Ｔｈ２などと共に、あるいは単独で用いられる。ワクチンおよび他の免疫治療剤は、かかる標的部分からつくられ、この部分はＡＰＣの特殊な集団に対する抗原部分を標的とし、これらまたは他の種々の免疫調節経路に関与する細胞を同時に活性化するように働く。
本発明の標的抗原の製造および利用についての好ましい実施態様は、以下に詳記する。特殊な化合物や試薬について記述しても、それは説明の目的のためであって、本発明を限定するものではない。特別に記載しない生物的、分子的または組み換えのＤＮＡ技術は標準的な方法で実施される。これは、例えばAusubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley & Sons，Inc.,1995に一般的に記載されている。
Ｉ．ＡＰＣ標的活性化抗原の製造
Ａ．成分の選択
抗原提示細胞はその表面に既知リガンドについて種々のレセプターを有する。リガンドのこれらレセプターとの結合は免疫または耐性応答を刺激するシグナル形質導入をもたらす。これらのレセプターの多くは細胞中に内部化され、リサイクルすることが知られている。他のものも同じことをすると考えられている。このように、これらのレセプターは、ＡＰＣに抗原を運び、同時にシグナルを活性化するのに理想的な標的である。
上記したようにＡＰＣはいくつかの細胞タイプを含み、それらにはマクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、いくつかのＴ細胞および他のあまり特徴化されていない細胞がある。ＡＰＣのこれらの相違するクラスは免疫応答の相違するタイプを生じ得ると考えられている。従って、ＡＰＣの特殊な集団に普遍的であるレセプターを標的とすることにより、特定の希望する免疫応答が得られるであろう。本発明において標的として考えられるレセプターの例示およびその選択根拠を下記する。これらのＡＰＣレセプターは、下記の評価基準に基づき本発明における使用にとって特に適当である。それらはＡＰＣ上で発現するレセプターである；レセプターはリガンドとの結合に際して内部化される；レセプターは細胞内にこれらの細胞による抗原処理・提示に影響するシグナルを伝達し得る；レセプターのいくつかはＴｈ１タイプ細胞性応答のシグナル化に関与すると考えられており、また他のものはＴｈ２タイプ液素性応答を生じると予測されている。下記の例示は、本発明の実施に望ましい標的レセプターの型を制限的に示すものでなく、単に代表例を挙げるだけである。他のレセプターまたは抗原提示細胞の他の細胞−表面特徴的決定因子が本発明の標的抗原についての標的として用いられる。レセプターおよび他の特徴的決定因子は免疫応答に直接的に関与することを要しない。
Ｃ５ａレセプター。このレセプターは本発明での使用に好ましい。これはＰＭＮ、マクロファージ、樹状細胞、平滑筋細胞およびいくつかのマスト細胞に存在する。多くの生物活性がＣ５ａによるものであり、主に炎症および免疫応答に関連している。好ましい実施態様によると、本発明は標的リガンドとしてのＣ５ａの能力に基づいている。この能力は、その同族レセプターに特異的に結合し、マクロファージ、単球、樹状細胞などの抗原提示細胞をＧタンパク質仲介シグナル伝達経路を通して活性化するものである。シグナル形質導入に続いて、レセプター／リガンド複合体が内部化される樹状細胞の場合、Ｃ５ａがＴｈ１タイプ応答を引き起こすことを明らかにする。
ＩＦＮγレセプター。インタフェロンγレセプターは、マクロファージ、単球、樹状細胞、他のＡＰＣ、いくらかのＢ細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮および結腸癌細胞で発現される。このレセプターへのＩＮＦγ結合は、マクロファージおよび樹状細胞の活性化、Ｂ細胞の分化、および多くの細胞タイプでのＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子の発現を誘発する。レセプターはシグナル形質導入経路に関与する。ＩＦＮγは活性Ｔ細胞によって体内で、特にＴｈ１タイプ応答の生成の際に、主に産生される。これはまた、ＭＨＣクラスＩ関連抗原の認識に続いてＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球によって、およびＴＮＦαや細菌産物で刺激されたナチュラル・キラー細胞によっても産生される（Barclay et al.1993）。
ＣＤ２１（Ｃ３ｄレセプター）。ＣＤ２１はＣ３ｄ補体フラグメントのレセプターである。これはＥpstein−Ｂarrウイルスのレセプターであり、重要なインタフェロンαレセプターのようでもある（Barclay et al.、前出）。ＣＤ２１は、Ｂ細胞、小胞性樹状細胞、他のＡＰＣ、咽頭および頭部の上皮、およびいくつかの胸腺細胞で発現される。これは、Ｂ細胞の活性化および増殖にシグナル形質導入メカニズムを通して関与し、これらの細胞による抗原提示活性における増加に関連している。
ＣＤ６４（ＦｃγＲＩレセプター）。ＣＤ６４は、ＩｇＧに高い親和性のレセプターであり、単量体ＩｇＧに結合する唯一の既知レセプターである（Barclay et al.、前出）。このレセプターは、マクロファージ、単球および他のＩＦＮγ処理の免疫細胞集団にみられる。ＩｇＧ１結合部位はＣＨ２ドメインに存在する。ＩＦＮγはこのレセプターの発現を高く調節し、該レセプターは抗体依存細胞仲介細胞障害反応およびこれらの細胞による食細胞性活性に関与する。
ＣＤ２３（ＦｃεＲIIレセプター）。ＣＤ２３はＩｇＥに低親和性のレセプターである（好塩基球およびマスト細胞にみられる高親和性ＩｇＥレセプターに関係しない）。これは、いくつかのＢ細胞集団、マクロファージ、好酸球、血小板および樹状細胞上にみられる（Barclay et al.、前出）。ＣＤ２３はマクロファージおよび好酸球によるＩｇＧ依存細胞仲介細胞障害および食作用を仲介し、ＩｇＥ免疫複合体の結合は、Ｐ５９ｆｙｎチロシンキナーゼを含むシグナル形質導入メカニズムを通して、いくつかのＡＰＣによる抗原処理・提示の効率を増加する。
上記したように、本発明のＡＰＣ標的抗原は、少なくとも一つの抗原性部分と少なくとも一つの標的部分を含む。標的部分は、ＡＰＣ上の選択されたレセプターについての自然発生リガンドあるいはかかるリガンドの同族体や誘導体から誘導することができる。例えば、Ｃ５ａレセプターは本発明の実施における使用に好ましいレセプターである。自然発生Ｃ５ａは、本発明のＡＰＣ標的活性化抗原における標的部分として用いられる。しかし、生来のＣ５ａは、望ましくない副作用であるかも知れない無数の前炎症応答を誘発し得るので、標的部分としての使用に好ましくない。本発明の特に好ましい実施態様では、応答選択方法においてＣ５ａレセプター結合およびシグナル形質導入が可能であるＣ末Ｃ５ａアゴニスト同族体が用いられる。このようなアゴニストは米国特許出願０８／２９９，２８５に一般的に詳記されており、この全開示を本明細書に合体する。
本発明での利用に好ましいＣ５ａＣ末デカペプチドアゴニストの例は、ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号１）である。このデカペプチドは自然発生Ｃ５ａの強力なアゴニストであり、その小さいサイズから合成が容易で溶解性があるので、自然発生Ｃ５ａよりも好ましい。さらに、これらの立体配座的に片寄ったタンパク質は、血清カルボキシペプチダーゼ消化に対して安定であり、一定レベルの生物選択性を発現し、無胸腺マウスにおいて高濃度で非毒性であることを示す。
自然発生インタフェロンγのペプチド同族体も本発明における利用が考えられる。ＩＦＮγのアミノ末３９アミノ酸に対応するペプチドが生来のＩＦＮγと結合について競合することを示す。このドメインに対する抗体は生物活性をブロックし、初めの１０アミノ末残基の除去は生物活性を喪失せしめる。このことは、ＩＦＮγの、この同族レセプターとの結合が分子のこの部分により仲介されることを示唆している。従って、ＡＰＣ発現ＩＦＮγレセプターを発現するＡＰＣに抗原を運ぶのに、このドメインに基づくペプチドを用いることが考えられる。この点について、ヒトおよびマウスＩＦＮγは絶対的に、結合および活性において特異的な種であることに注意すべきである。このように、マウスにおけるＡＰＣ仲介免疫応答を刺激するには、マウスペプチドが用いられ、同様にヒトにおけるＡＰＣ仲介免疫応答を刺激するためには、ヒトペプチドが用いられる。マウスＩＦＮγ３９アミノ酸ペプチド同族体は以下の配列からなる。
0004125784.tif 000002
ヒトＩＦＮγ３９アミノ酸ペプチド同族体は以下の配列からなる。
0004125784.tif 000003
本発明の使用に考慮される他のリガンドは補体のＣ３ｄＧ成分である。この成分は、Ｃ３ｄ前駆体（Ｃ３の９５５−１３０５残基；Swissprot accession p01024）からタンパク質分解性開裂により誘導される３４８残基フラグメントである。Ｃ３ｄＧはＣ３ｄ（１００２−１３０３残基）とＣ３ｇ（９５５−１００１残基）とに変換し得る。Ｃ３ｄＧおよびＣ３ｄは非アクチベーター表面に関連し、マクロファージおよび他抗原提示細胞による食作用のためのオプソニンとして働く。Ｃｄ２１はＣ３ｄＧおよびＣ３ｄレセプターである。
上記したリガンドは、本発明の実施に好ましいリガンドのタイプを例示したものである。しかし、他のリガンドも本発明のＡＰＣ標的抗原の標的部分として用い得ることは、当業者に理解できるであろう。それらには、既知のリガンドおよび今後発見あるいは開発されるリガンドが含まれる。抗体およびそのフラグメントもＡＰＣ特異細胞表面抗原を標的するのに用い得る。
本発明の抗原性部分として選択される抗原のタイプは、免疫応答または抗体産生を希望するすべてのペプチド、ポリペプチドまたはその誘導体であり得る。それには、限定するものでないが、ペプチド、ポリペプチド（すなわちタンパク質）およびグリコペプチド、ホスホペプチドなどの誘導体が含まれる。レセプター標的部分とコンジュゲートし得る合成ペプチドおよびポリペプチド誘導体や同族体、あるいは他の類似の化合物が本発明で使用され得る。さらに、これらのペプチド、タンパク質および誘導体は、相違するタイプの免疫応答を生むために単一のエピトープまたは複数のエピトープを含み得る。実際、タンパク質全体が標的部分にコンジュゲートすると、このタンパク質は多数のエピトープを含むようであり、このエピトープが溶媒条件の依存性およびタンパク質の２次的および３次的構造に対するその作用を変化せしめ得る。カルボハイドレート、核酸および他の非タンパク物質も抗原性部分として用い得る。これらの物質のペプチドおよびタンパク質標的部分への結合について既存の方法が用いられる。
本発明の好ましい実施態様において、抗原性部分は現在用いられている免疫条件で弱い抗原性または非抗原性である物質を含む。多くの腫瘍関連抗原は、抗原も正常細胞により発現されるので、このカテゴリーに入る。従って、これらの分子に対する免疫耐容性が該抗原に対する応答を刺激するのを困難にしている。このカテゴリーに入る他のタンパク質は、一つの種（例えばヒト）から自然発生のタンパク質、他種で抗体を産生するのが望まれるが、他種での抗体産生が起きにくいものであるタンパク質を含む。
一つのよく特徴の分かった腫瘍抗原は、種々のアデノカルチノーマ、例えば肺癌、膵癌、乳癌および前立腺癌によって高く過発現され、かつ識別的にグリコシル化される細胞表面関連ムチンである。アデノカルチノーマによるＭＵＣ１の異常なグリコシル化は、このコアタンパク質へのある種の血液グループカルボハイドレート抗原の追加、および正常の上皮細胞により産生されるこのタンパク質の形態に露出されないコアタンパク質上のモノクローナル抗体で検出されているエピトープの露出をもたらす。ヒトムチン−１（ＭＵＣ１）の全長ｃＤＮＡ配列は、いくつかの明白なドメインを有する平均の長さ約１２００のアミノ酸（タンデム繰り返し対立遺伝子による）を有するコードされたタンパク質を現す。明白なドメインは、アミノ末シグナルペプチド、変性配列を含むいくつかの繰り返しにはさまれた多様な同一２０アミノ酸タンデム繰り返しでつくられる大きいドメイン、３１アミノ酸の疎水性のスパンドメイン、カルボキシル終末における６９アミノ酸の細胞質ドメインである。ＭＵＣ１について今日記述されている最もよく特徴の明らかな腫瘍関連エピトープはタンデム繰り返しドメインである。これにはカルボキシレート構造およびタンパク質構造が含まれる。ＭＣＵ１腫瘍関連エピトープはよく特徴化されており、それで、既存の方法を用いて腫瘍ワクチンを産生するのに使用することが提唱されている。本発明の例示的な組成物は、強力な腫瘍ワクチンとしての本発明の可能性を表すために、下記に記述されるように本発明のＡＰＣ−１標的抗原の抗原性部分として、ＭＵＣ１エピトープを含む。
Ｈ−２ＫbタイプのクラスＩ分子に結合すると予測されるＭＵＣ１エピトープは、ＹＫＱＧＧＦＬＧＬ（配列番号６）のＭＵＣ１の近接膜領域に配列相同を有する。
ＭＵＣ１タンデム繰り返し体は配列ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＲＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（配列番号７）を有する。
本発明のＡＰＣ標的抗原を含む成分は個々につくり、次いでコンジュゲートすることができる。例えば、上記のＣ５ａアゴニストなどの小さいペプチドアゴニストは、ペプチド合成方法によりつくられて、自然発生の生物源から精製されたタンパク質とコンジュゲートされる。他方、組み換え法による発現用につくられたタンパク質が用いられ得る。さらに、ペプチド成分含有の標的抗原（すなわち、ペプチドレセプターリガンドにコンジュゲートしたペプチド抗原性エピトープ）は、既知の方法により、さらに詳細に下記するペプチド合成化学によりタンデム中に合成され得る。最後に、２種の大きいポリペプチド部分（すなわち大きいリガンドに結ばれた大きいポリペプチド抗原）を含む本発明の標的抗原は、組み換え技法によってつくることができる。例えば２つの成分をコードするＤＮＡ分子は、組み換え手段により一緒に連結され、次いでコンジュゲート融合タンパク質として発現される。これら種々のタイプの組成物をつくる方法はさらに後に詳記する。
Ｂ．ペプチド
本発明に必要なオリゴペプチドは、既存のペプチド合成法に合わせて、１以上のアミノ酸残基の縮合を経て種々のペプチド合成法によって製造される。好ましくは、ペプチドはApplied Biosystems Model 430Aペプチド合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）で行われるような標準的固相法によって合成される。ペプチドおよびペプチド様体を合成する他の方法は、固相法または液相内であって、既存の技術でよく知られている。固相合成が用いられたときは、Ｃ末アミノ酸は不溶性のレジン支持体に連結しており、この支持体はＣ末アミノ酸中のカルボキシル基と反応することにより引き離れ得る結合を生じることができるものである。一つの好ましい不溶性レジン支持体は、ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）レジンである。他の有用なレジンには、限定するものでないが、いくつかのＮ−メチル含有ペプチドの合成のためのフェニルアセタミドメチル（ＰＡＭ）レジン（このレジンは固相合成のＢｏｃ法と共に用いられる）、およびＣ末アミド基を有するペプチドをつくるためのＭＢＨＡ（ｐ−メチルベンツヒドリルアミン）レジンがある。
ペプチド合成過程において、分枝鎖のアミノおよびカルボキシル基は、よく知られる保護基を用いて、必要に応じて保護／脱保護される。好ましい実施態様において、Ｎα−アミノ基は、塩基活性９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基またはｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基によって保護される。Ｆｍｏｃ合成に合わせた側鎖官能基は以下のような保護基で保護され得る。アルギニン（２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、アスパラギン（Ｏ−ｔ−ブチルエステル）、リジン（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、セリンおよびチロシン（ｔ−ブチル）。ペプチドおよびその誘導体についての他の保護基を利用する修飾方法は当業者に明らかであろう。
Ｃ．タンパク質
本発明に使用される全長のタンパク質は既知方法に従って種々の方法で製造することができる。タンパク質は、適応な源、例えばヒトまたは動物の培養細胞または組織から、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣおよびイムノアフィニティ精製法などの種々の方法によって精製される。しかし、サンプル中のタンパク質の量にしばしば限度があるので、従来の精製法が本発明において好ましくないことがある。
タンパク質をコードする核酸分子の利用性が既存のビトロ発現法を用いて、タンパク質の産生を可能にする。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子は、適当なインビトロ転写ベクター、例えばインビトロ転写のためのｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５にクローンされ、次いで適当な細胞フリー翻訳系、例えばコムギ胞芽または家兎網状赤血球において細胞フリー翻訳がなされる。インビトロ転写および翻訳系は市販されており、例えばPromega Biotech，Madison，Wisconsin or BRL，Rockville，Marylandから得ることができる。
別法として、好ましい実施態様により、選択されたペプチドまたはタンパク質は適当な原核生物または真核生物系での発現により産生される。例えば、本発明のペプチドまたはタンパク質成分をコードするＤＮＡ分子または全合成標的抗原は、Ｅ.coliなどの細菌細胞における発現に適したプラズマベクター中に、あるいは昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルスベクター中に挿入される。これらのベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡ発現に必要な調節エレメントを含有する。このエレメントは宿主細胞におけるＤＮＡ発現が可能なように位置されている。発現に必要なこのような調節エレメントには、プロモーター配列、転写開始配列および選択的にエンハンサー配列がある。
組み換え原核生物または真核生物系において遺伝子発現により製造されたペプチドおよびタンパク質は、既知の方法によって精製される。好ましい実施態様において、市販の発現／分泌系を用いることができ、それによって組み換えタンパク質が発現され、次いで宿主細胞から分泌され、培養地から容易に精製される。発現／分泌ベクターを用いないときは、組み換えタンパク質に特異的に結合する抗原との免疫性相互作用によるなどのアフィニティ単離によって、組み換えタンパク質を精製する別の方法がある。これらの方法はペプチドおよびタンパク質を単離するのに普通に使用される。
Ｄ．別個につくられたタンパク質および／またはペプチドの連結
別の実施態様において、本発明のタンパク質および／またはペプチド成分は別個に合成され、次いで当業者に知られている標準的方法を用いて、コンジュゲートされる。例えば、合成ペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＦ）を用いてタンパク質に化学的にカップルされる。この試薬は、ペプチド中のアミノ−およびカルボキシ−末チオール基をタンパク質中のリジン側鎖とクロス連結する。別法として、合成ペプチドは、普通のクロス連結剤であるグルタルアルデヒドを用いてタンパク質にカップルされ得る。ペプチドをタンパク質に化学的にカップルする他の方法は、カルボジイミドおよび１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ＥＤＣ）の使用を通してである。実施例２に詳記するように、この方法はＣ５ａＣ末デカペプチド同族体を血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）にコンジュゲートするのに用いられた。２種のタンパク質を一緒に結び付ける方法も利用できる。
本発明のペプチドおよびタンパク質は、上記した方法で製造され、標準的な方法で分析される。例えば、既知の方法に従って、これらのペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列分析、マススペクトル分析またはアミノ酸組成分析にかけられる。
Ｅ．発明の一般式および例示的組成物
本発明のＡＰＣ標的抗原は、１以上の抗原性部分および同時に１以上の標的部分を含有する。さらに、これらの部分はいくつかの方法で機能的に連結することができる。例えば、“Ｔ”が標的部分、“Ａｇ”が抗原性部分を表すとすると、本発明のＡＰＣ標的抗原は下記のように示される。
Ａｇ−Ｔ；
Ｔ−Ａｇ；
Ｔ1−Ａｇ−Ｔ2；
Ｔ1−［Ａｇ］n−Ｔ2
（式中［Ａｇ］nは多数の抗原を表す）
上記した一般式の例には下記のものを含む。
Ａｇ−Ｃ５ａアゴニスト ペプチド
ＩＦＮγペプチド−Ａｇ；
ＩＦＮγペプチド−［Ａｇ］n−Ｃ５ａアゴニスト ペプチド
本発明の他の代表的組成物には次のものを含む：
ＭＵＣ１クラスＩ結合エピトープ−Ｃ５ａアゴニストＣ末ペプチド、
ネズミまたはヒトＩＦＮγペプチド−ＭＵＣ１クラスＩ結合エピトープ、
ネズミまたはヒトＩＦＮγペプチド−ＭＵＣ１タンデム繰り返し、
ＭＵＣ１クラスＩエピトープ−Ｃ３ｄＧペプチド、
ＳＡＡ−Ｋ−Ａｈｘ−Ｃ５ａＣ末ペプチド（Ａｈｘ＝εアミノヘキサン酸）。
本発明のＡＰＣ標的活性化抗原が大きいまたは複合抗原の挿入に適用されることは、当業者は分かるであろう。例えば、抗原と標的部分との間に“スペーサー”（上記の例示的化合物におけるＫ−Ａｈｘスペーサー部分など）を挿入することでなされる。このような化学的修飾は生化学者にはよく知られている。
II．ＡＰＣ標的活性化抗原の使用
本発明のＡＰＣ標的活性化抗原はヒトおよび動物の臨床使用に広い可能性を有する。上記したように、ワクチンおよび他の免疫治療薬の開発についての障害は、特定の抗原が抗原提示細胞に取り込まれ、そして保持される能力を欠いていることにある。本発明の組成物は、抗原提示細胞への抗原の運送を容易にし、その際に運送メカニズム（例えば、標的部分として生物的シグナルを形質導入し得るレセプターリガンドの使用）が抗原提示経路を同時に活性化する。このように本発明は、抗原提示細胞に存在するレセプターのためのリガンドに共有結合するペプチド抗原または抗原性構造を特異的に標的とし得るワクチンまたは他の免疫治療薬の開発を可能にする。選択性により、ＡＰＣの特定の集団に結合し、それを活性化するリガンドに連結した抗原は、免疫応答を生じるのみでなく、生じた免疫反応の性質に影響を与えることができると考えられる。抗体をもたらす免疫応答、細胞性、Ｔｈ１またはＴｈ２応答は、それぞれ選択的に生じる。ワクチンもまた、このような標的部分の配列でもって開発され得る。この部分によってワクチンは、選択された抗原またはＡＰＣのいくつかの集団に対する抗原を標的とし、同時に種々の免疫調節経路に関与するこれらの、および他の細胞を活性化する。
種々の特殊な抗原に対する抗体あるいは細胞仲介免疫応答を生じる能力は、広い一般的な適用性があり、そして本発明のＡＰＣ標的抗原はこれらの目的について非常に有用であると考えられる。例えば、抗体反応が種々のウイルス性または細菌性感染に対して保護し得ることが示されており、抗体がヒトまたは動物の生活に悪影響を及ぼす種々の毒素または毒性化合物を不活性することが知られている。種々の細胞仲介免疫応答は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に対する保護を提供し、いくつかの抗腫瘍反応において何らかの役割を演じる。種々の抗原提示細胞、および抗原を提示するためにこれらの細胞が刺激される状態（種々のリガンド−レセプター相互作用により仲介される共−刺激）が上記応答の本質を決定づける主要な因子であると考えられる。
本発明の標的抗原は、癌関連抗原に基づく活性特異的免疫治療薬（すなわち癌“ワクチン”）の開発において特定の利用性を有する。例えば、強い細胞仲介免疫応答（Ｔｈ１細胞および／または細胞毒性Ｔリンパ球を含む）の誘導が種々の形態の癌に対する最も効果的な保護を提供する。本発明のＡＰＣ標的抗原を用いてワクチン化する戦略はこのタイプの応答を誘導するように設計される。この点について、ある種のサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＦＮγ）での刺激が特定の抗原についてのＴｈ１タイプ応答を、Ｔｈ２タイプ応答よりも非常に上まわって誘導することが知られている。
臨床使用される抗癌ワクチンの開発に向けた過程として、本発明の組成物は腫瘍抗原でＡＰＣの特定の集団を刺激し、抗腫瘍免疫応答の作用を測定する効果を調べる研究手段として利用される。この点について、本適用が特定の腫瘍特異的抗原Ｍｕｃｉｎ−１のエピトープを含む標的抗原を例示することに注意すべきである。
腫瘍により産生された化合物と同様の化合物でもって患者を免疫化しようとする従来の腫瘍ワクチンは、限定的な価値しかないことは知られており、おそらく進行する腫瘍がそれぞれの宿主において免疫原性の欠如のために選択されたこと（例えば、宿主が存在する腫瘍抗原に耐容性である）によるのであろう。このように、効果的な腫瘍ワクチンを製造しようとの試みの主要な一つは、腫瘍関連抗原に対する免疫的耐容性に反作用する薬剤を産生することである。上記のＡＰＣ標的抗原の一つの目的は、免疫化個体にその腫瘍に対する応答を誘導することであり、この応答は同種移植の拒絶があった個体においてみられるものと類似のものである。換言すると、最終目標は、腫瘍を破壊し得る腫瘍に対する自己免疫反応を誘導することである。腫瘍抗原に対する耐容性を調節する免疫的パラメーターはよく分かっていない。しかし、本明細書に記載の組成物は、この耐容性に反作用する可能性を有し、そして腫瘍拒絶を仲介する特異的免疫応答を誘導する。
本発明の標的抗原は、免疫診断薬または免疫治療薬として用いられる抗体の製造に広い有用性がある。免疫診断の目的には、疾患または他の病的状態に関連する生物的分子の検出および測定のための種々の定量的および定性的方法に広く用いられる。よく理解されていないとの理由で、従来の手段を用いてある種の生物分子に対する抗体を産生することはしばしば困難である。本発明の組成物は、弱い抗原性または非抗原性物質に対する抗体を製造するために動物を誘導する別の手段を提供する。この点についての本発明の組成物の利用性は、血清アミロイド−Ａと関連づけて、下記の実施例２に明示する。体内におけるこのタンパク質の出現および豊富さは、全身的な炎症ストレスに強く相関する。このストレスは定量化するのが難しい状態である。ＳＡＡレベルについての定量的アッセイは、一般的な全身的炎症の優れた指標と考えらえる。従って、ヒト以外におけるタンパク質に対する抗体を産生せしめることは利点がある。このタンパク質は、従来の手段を用いては抗体を特に産生し難いものであることが知られている。実施例２に記述したように、Ｃ５ａペプチドリガンドにコンジュゲートしたＳＡＡを含む標的抗原は、コンジュゲート分子を注射されたマウスにおいて顕著な抗体応答を生じた。同様に、所望の弱い抗原性または非抗原性成分を含む標的抗原は、免疫診断薬としての利用のために、実験動物における特異的抗体を産生せしめるのに使用される。
免疫治療薬として使用される抗体も本発明の組成物を用いて産生される。一つの例として、局所的および全身的炎症応答を調節するために補体カスケードを低調節または阻害し得る薬剤を開発することには、近年大きい関心がもたれている。この目的のために、カスケードの初期で活性であるＣ３ａコンベルターゼが補体阻害のための理想的標的を提供する。Ｃ３ａコンベルターゼは、ペプチドＣ３を２成分、Ｃ３ａおよびＣ３ｂに開裂し、その結果を完了するためにＣ３における開裂部位に到達し得なければならない。Ｃ３ａ−Ｃ３ｂ開裂に向けられる抗体は、Ｃ３ａコンベルターゼが開裂部位に到達するのを阻止し、それによって補体カスケードの初期過程を阻害するのに効果的であると考えられる。このような抗体は、Ｃ３ａ／Ｃ３ｂ開裂部位含有の短いペプチド配列を抗原性部分として含む本発明の標的抗原を用いて産生され得る。この配列は、本明細書で例示したＣ５ａＣ末デカペプチドアゴニストなどの適当な標的部分にコンジュゲートすることができる。このようにして、有害な炎症状態の処置のための免疫治療薬（例えばＣ３ａコンベルターゼ活性を阻止する抗体）を産生するのに有用となるであろう。
下記の実施例は本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を詳しく明示するためのものであり、いかなる意味においても限定を意図するものでない。
実施例１
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の採集と活性化およびマウスにおける免疫応答の刺激についてのムチンエピトープ（ＭＵＣ１／Ｃ５ａアゴニスト）コンジュゲートの評価
Ｃ５ａレセプターは、単球、マクロファージ、樹状細胞および他の細胞タイプを含む数多くの抗原提示細胞に存在する。この実施例において、自然因子のＣ末作用領域に対応するＣ５ａデカペプチドアゴニスト同族体に機能的に連絡したムチンエピトープ（ＭＵＣ１）を含む合成ペプチドについて、ＡＰＣを活性化し、それによってマウスでの免疫応答を刺激する能力が評価された。この評価は、抗原提示細胞中で内部化し、再循環するＣ５ａレセプターの既知性質に基づき、それでもって抗原を運送する理想的な候補物として作用し、同時にＡＰＣにおけるシグナルを活性化する。Ｃ５ａレセプターはマクロファージ、単球および樹状細胞上で特に共通であるので、Ｃ５ａレセプターを結合するＣ５ａアゴニスト同族体の使用はこれらのＡＰＣの優先的な活性化をもたらすと考えられる。
ｉ．略号。特記しない限り、アミノ酸残基についての単一文字表記として次のものを用いる。アラニンはＡ、アルギニンはＲ、アスパラギンはＮ、アルパラギン酸はＤ、システインはＣ、グルタミンはＱ、グルタミン酸はＥ、グリシンはＧ、ヒスチジンはＨ、イソロイシンはＩ、ロイシンはＬ、リジンはＫ、メチオニンはＭ、フェニルアラニンはＦ、プロリンはＰ、セリンはＳ、スレオニンはＴ、トリプトファンはＷ、チロシンはＹ、バリンはＶ。大文字はＬ−アミノ酸異性体を、小文字はＤ−アミノ酸異性体を表す。
ii．ペプチド合成、精製および特徴化。下記のペプチドは、標準的固相法によりApplied Biosystems(Foster City，CA）model 430 Aペプチド合成機で合成され、前に記述されている特徴（７）が明らかにされた。
（１）ヒトムチン−１（ＭＵＣ１）の抗原性“近接膜”（ＪＭ）エピトープ、ＹＫＱＧＧＦＬＧＬ（配列番号６）；
（２）Ｃ５ａＣ末デカペプチドアゴニスト同族体、ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号１）；
（３）ＪＭエピトープがアミノ末に位置し、Ｃ５ａペプチドがカルボキシル末に位置する合成ペプチド、ＹＫＱＧＧＦＬＧＬＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号２）；
（４）ＭＵＣ１のＪＭエピトープがカルボキシ末に位置し、Ｃ５ａ同族体がアミノ末に位置する合成ペプチド、ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲＫＱＧＧＦＬＧＬ（配列番号５）。
ペプチド３はＣ５ａ生物活性を保持し、ペプチド４はその活性を保持していない。何故ならＣ５ａ同族体の生物学的に重要なカルボキシル末端はムチンエピトープの存在によりブロックされているからである。ペプチド４は、免疫目的のためにこれらのペプチドの効力に対するＣ５ａ生物活性の重要性を決定づけるのに対照として働く。
合成は、Ｏ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）レジンで０.２５ｍｍｏｌの規模でおこなわれた（０.８８ｍｅｑ／ｇ置換）。Ｎα−アミノ基を塩基活性９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護した。側鎖官能基を次のように保護した。Ａｒｇ（Ｐｍｃまたは２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、Ａｓｐ（Ｏｔ−ブチルエステル）、Ｃｙｓ、ＧｌｎおよびＨｉｓ（Ｔｒｔすなわちトリチル）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃすなわちｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＳｅｒおよびＴｙｓ（ｔ−ブチル）。合成は、Ｃ末残基（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ））をＨＭＰレジンに過剰のＮ−Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の存在下に、カップリング触媒として４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と共にカップリングすることで始めた。ペプチド鎖伸長はＮＭＰ中の５０％ピペリジンでの反復Ｆｍｏｃ脱保護により、次いで２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）の存在下でのレジンカップリングによって遂行された。
レジンからの側鎖の脱保護および開裂は、一段階アセトリシス反応において、８４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、６％フェノール、２％エタンジチオール、４％チオアニソールおよび４％水の溶液中で１.５時間、室温でペプチド−レジンを撹拌することによりなされた。遊離ペプチドはこの溶液から冷ジエチルエーテルを加えることにより沈澱した。混合物をscinteredガラスBuchnerろうと（中程度多孔）で濾過し、ペプチド／レジンを冷エーテルで２回洗って、チオール・スカベンジャーを除去した。ろうと中のペプチド／レジンを１０％酢酸２０−３０ｍｌアリコットと共に撹拌し、次いで濾過することによりペプチドを抽出した。抽出アリコットを合わせ、凍結し、乾燥凍結すると、粗製ペプチドの粉末が得られた。
Ｃ18−結合シリカを充填したカラム上で予備的分析的逆相ＨＰＬＣでペプチドを精製した。この方法の詳細は（４）に記載されている。すべてのペプチドはアミノ酸組成解析法および高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）によって特徴が明らかにされた。
iii．動物モデル。本実施例で用いたマウスの種類は同系交配の雌６−１２令のＣ５７Ｂ１６（Ｈ−２b）およびＢａｌｄ／ｃ（Ｈ−２d）であり、Jackson labs（Bar Harbor，Maine)から入手した。Ｈ−２  ｈａｐｌｏタイプと異なるこれらの２種は、観察された抗体応答が１種または他種のマウスにおける抗原処理に重要なＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子のタンパク質配列を特徴とするユニーク免疫原性エピトープの選択または生成の結果でないことを示すために本実施例で用いた。これらの研究に選択したＭＵＣ１ペプチドは、Ｃ５７Ｂ１６マウスのＨ−２Ｋb分子に結合し得るモチーフを含んでいた。従って、このクラスＩ分子結合モチーフ（Ｂａｌｂ／ｃ）を欠いた種類のマウスも、これらのペプチドの抗原提示性に対するクラスＩ結合モチーフの比較寄与度を決定するために調べた。
iv．免疫方法。前免疫した血清をマウスから得、次いでＲＩＢＩアジュバント（ＭＲＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）（Sigma Immunochemicals）と共に表示するペプチド１００μｇを腹腔内投与して免疫化した。同じ注射を用いて２週間隔で２回動物の免疫を強化した。３回の免疫化後に血清を採取した（６週間目）。
v．血清抗体応答の解析。放射イムノアッセイのために、免疫化の前と後のいくつかの時点で、９６−ウエルマイクロタイター・プレート（Dynatech Laboratories，Inc.）でアンチペプチド抗体を測定した。ホスフェート緩衝塩液中の１００μｇ／ｍｌの適当なペプチドのｐＨ７．４の溶液５０μでプレートを一夜４℃でコートした。ＰＢＳ中の５％乾燥ミルクでｐＨ７．４で少なくとも２時間インキュベートしてウエルをブロックした。アンチペプチド抗体力価を血清の段階希釈法を用いて測定した。ｐＨ７.４の０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで洗浄緩衝液血清を希釈し、各希釈液５０μｌを３７℃１時間インキュベートした。ウエルから取り出し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗い、125Ｉ−ヤギ・アンチマウスＡｂ５０μｌ（１−２×１０4ｃｐｍ／ウエル）を加え、１時間２５℃でインキュベートした。洗浄後に特殊放射活性をガンマ計量器（1272 CliniGamma，LKB）で測定した。
アンチペプチド抗体イソタイプ力価を９６ウエルマイクロタイター・プレートで実施した酵素連絡イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ｐＨ７.４でＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌの適当なペプチドでコートし、一夜インキュベートした。ウエルをＰＢＳ中５％乾燥ミルクでｐＨ７.４で少なくとも２時間ブロックした。アンチペプチド力価を上記した血清の段階希釈法を用いて測定した。プレートを４回洗浄した後、家兎アンチ・マウスＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭ（Zymed）の１：１００希釈液５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗い、ペルオキシダーゼ（Zymed）にコンジュゲートした１：５００ヤギアンチ家兎５０μｌを３７℃で１時間インキュベートした。再び、プレートを洗浄緩衝液で４回洗い、１０％ジエタノールアミン（Sigma）中の１ｍｇ／ｍｌ、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma）５０μｌ、ｐＨ９.４を加えて、結合酵素を検出した。０.５Ｍ水酸化ナトリウム５０μｌの添加で反応を停止し、吸収値（Ａ405）をTitertek Multiskan（Flow Laboratories，Irvine，Scotland）で測定した。
vi．実験群。実験群は下記の通りである。
Ａ群．ペプチド（１）で免疫したマウス
Ｂ群．ペプチド（２）で免疫したマウス
Ｃ群．ペプチド（１）＋ペプチド（２）で免疫したマウス
Ｄ群．ペプチド（３）で免疫したマウス
Ｅ群．ペプチド（４）で免疫したマウス
実験結果を図１および２に示す。図から分かるように、Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ群のマウスは、ＭＵＣ１エピトープ（Ａ群）、Ｃ５ａアゴニストペプチド（Ｂ群）、ＭＵＣ１エピトープとＣ５ａアゴニストペプチド、但しコンジュゲートされていない（Ｃ群）またはＮ末よりもむしろＣ末でＣ５ａアゴニストペプチドとコンジュゲートしたＭＵＣ１エピトープ（それによりＣ５ａ生物活性をブロックする）（Ｅ群）の接種に対する抗体応答に評価し得るほどの増加を生じなかった。本発明のＭＵＣ１エピトープ／Ｃ５ａアゴニストペプチドコンジュゲートを接種したマウス（Ｄ群）のみが評価し得る抗体応答を生じた。さらに、この刺激は顕著であった。この結果から、明らかなようにコンジュゲートＭＵＣ１エピトープ／Ｃ５ａアゴニストペプチドの接種がいずれかのペプチドの単独、両ペプチドを一緒ではあるがコンジュゲートしないもの、反対方向でコンジュゲートされたペプチドでの接種に比して、一般的免疫応答を刺激するのに非常に効果的であった。
これらの結果を基にいくつかの重要な結論が導かれる。Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ１６マウスのいずれもがペプチド３に対する抗体応答を表したことは、抗原提示効果がＭＨＣｈａｐｌｏタイプにより制限を受けないことを示唆する。免疫応答がペプチド４あるいはペプチド１および２でも生じないで、ペプチド３で実質的な応答が起きたことは、作用がペプチドのＣ５ａ部分により仲介されることおよび免疫応答が抗原ペプチドおよびＣ５ａ仲介活性シグナルの抗原提示細胞への同時運送の結果であることを示唆する。
免疫マウスで産生されたアンチペプチド抗体のイソタイプが測定され（図３）、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂからなることが分かった。これは、免疫原性ペプチドがＴ細胞依存応答を起こすことを示唆している。この応答は一般的に抗原の処理および提示を必要とする。図４は、ペプチド３に対する抗体応答が本研究の抗原部分であったＭＵＣ１エピトープに特異的な抗体を高率で含むことを示している。
実施例２
ＡＰＣの採取と活性化およびラットにおける免疫応答の刺激のための血清アミロイドＡ／Ｃ５ａペプチドコンジュゲートの評価
血清アミロイドＡは、肝臓によって起こされる急性相ストレス反応タンパク質である。他の急性相タンパク質と一緒に、ＳＡＡは保護手段として全身的炎症ストレスに対する反応において分泌される。ＳＡＡは、定量化が非常に難しい現象である一般的な全身的炎症の優れた指標であるので、興味深い。ＳＡＡの血清レベルは全身的炎症応答の上り下りに平行的に見られるので、このペプチドの血清レベルの定量は炎症を知る効果的な手段を提供するであろう。これを遂行する一つの方法は、ＥＬＩＳＡアッセイなどの定量に用いられるであろうＳＡＡに対する抗体の開発である。しかし、ＳＡＡはそれに対する抗体を産生するのが特に難しかった。この実施例では、Ｃ５ａＣ末同族体コンジュゲートＳＡＡ（実施例１）の抗原産生細胞の活性化およびラットにおける抗体反応の産生についての能力を検討する。
ｉ．タンパク質およびペプチドの製造。Ｃ末Ｃ５ａ同族体Ｋ−Ａｈｘ−ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号８）（Ａｈｘはアミノヘキサン酸であり、直鎖の脂肪族スペーサー部分である）を実施例１のように製造する。脂肪族スペーサー部分は、重要なレセプター結合Ｃ５ａ同族体をアミノ末端についているかさばったタンパク質から分離するために、導入される。
血清アミロイドＡはＣ５ａペプチド同族体に、下記の方法によりコンジュゲートされた。ＳＡＡ（１００μｇ）を５０倍モル過剰の水溶性カルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジイド（ＥＤＣ）と、ホスフェート緩衝塩液２００μｌ中で、ｐＨ７.５室温で３０分間反応せしめた。５０倍モル過剰のペプチド（Ｋ−Ａｓｘ−ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号８））および１００倍モル過剰の塩基ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）をこの溶液に加えた。水を溶液に加えて、反応混合物を４００μｌとした。この溶液を一夜室温で撹拌し、次いで凍結乾燥して乾燥粉末とした。粉末を水で適当な容量に希釈し、動物に接種するのに用いる保存用混合物を製造した。
ii．実験方法。ホスフェート緩衝塩液中のＳＡＡ／Ｃ５ａペプチドコンジュゲートを含む接種をＲＩＢＩアジュバントと共に、あるいはアジュバントなしでラットの腹腔内に注射した。最初の注射から２および５週間後に強化注射が与えられた。最初の注射から７週間後にラットを殺し、実施例１記載のように、アンチムチン抗体産生を血清力価から調べた。
顕著なアンチＳＡＡ抗体の産生がＲＩＢＩアジュバント添加および不添加のいずれの接種のラット群においてもみられた。プレート・アッセイから溶出したアンチＳＡＡ抗体のゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによる視覚化で、アンチＳＡＡ抗体力価は、ＲＩＢＩアジュバントなしのＳＡＡ／Ｃ５ａペプチドコンジュゲートを接種したラットにおいて、アジュバントなしの同じ接種に比して、基本的に同じであるか、またはやや高いようであった。このように、Ｃ５ａペプチド同族体を含む抗原性コンジュゲートは大きいタンパク質に対する抗体、また実施例１に記載したような小さいタンパク質フラグメントに対する抗体を産生するのに有用である。さらに、この方法を用いてアンチＳＡＡ抗体をうまく産生し得ることは、弱い抗原性または非抗原性のペプチドまたはタンパク質に対する抗体を産生する目的にとって特に意味がある。
実施例３
ヒトＫappaレセプターの予測アミノ末領域からのペプチドκＲ（３３−５２）に特異的な部位方向性中和抗体の産生および特徴化
ヒト・オピオイドペプチドホルモンのレセプターは多くの細胞タイプについて記述されている。μ、κおよびδリガンドのレセプターは、正常の組織および細胞ラインから誘導されたゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。かなりの相同性がμ、κおよびδレセプターに存在しているが、レセプターのＮ末領域は例外である。ヒトＫappaレセプターのＮ末領域（アミノ酸残基１−１００）は比較的親水性であり、細胞膜表面に露出されると予測される。２０残基ペプチド［κＲ（３３−５２）］が選択されて、ペプチド特異的ポリクローン抗原に向けた位置をつくるのに用いられた（５）。
分子アジュバントを用いて家兎中にポリクローナル抗血清、κＲエピトープにコンジュゲートしたＣ５ａ−アゴニストペプチドの製造方法を下記する。ヒトＫappaレセプター（κＲ）の予測細胞外領域に生じた結果的ポリクローナル抗血清の結合特異性および生物活性についても下記する。
ｉ．標的免疫原の構築。立体配座的に偏在する補体フラグメント・アゴニスト同族体ペプチド（ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ）（配列番号１）のＮ末に共有結合したκＲ（３３−５２）（ＦＰＧＷＡＥＰＤＳＮＧＳＡＧＳＥＤＡＱＬ）（配列番号９）からなるペプチド構築体は、実施例１および以前に報告されている方法（７）によって合成された。
ii．アンチ−κＲ（３３−５２）抗血清およびペプチド特異的ＥＬＩＳＡの製造。完全フロイント・アジュバント（GIBCO,Grand Island,NY）中のＦＰＧＷＡＥＰＤＳＮＧＳＡＧＳＥＤＡＱＬＹＳＦＫＰＭＬａＲ構築体（配列番号１０）５００μｇを皮下注射して家兎を免疫化した。その日を０日とし、３０日および６０日に不完全フロイント・アジュバントで強化注射を行った。血清を最初の免疫化から７５日に採取始めた。
アンチペプチド抗体の存在は、前に記述されているように（８）、遊離κＲ（３３−５２）ペプチド利用のペプチド特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。アンチκＲ（３３−５２）および正常家兎γ−グロブリン（ＲＧＧ）を使用に先立ってタンパク質Ａセファローズクロマトグラフィー（Sigma)(８)により精製した。
iii．細胞および培養条件。神経芽細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＨＴＢ１１）、管状乳房細胞癌腫Ｔ４７Ｄ（ＨＴＢ１３３）、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病（ＴＩＢ１５２）、Ｕ９３７組織リンパ腫（ＣＲＬ１５９３）、ＴＨＰ１ヒト単球（ＴＩＢ２０２）、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞ＳＫＷ６.４（ＴＩＢ２１５）および（ＴＩＢ１９０）（American Type Culture Collection，Rockville，MD）を、１０％胎牛血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＬ−グルタミン、２ｍＭピルビン酸Ｎａ、５０Ｕペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ヒト・ノイロン前駆体細胞ＮＴ２（Stratagene，La Jolla，CA）を上記のように補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。すべての培養物を３７℃で７.５％ＣＯ2の湿室中インキュベートした。
末梢血誘導の単核細胞は、正常な男女のボランティアから得て、Ｆicoll−Ｈypaque（ｔｍ）密度逐次遠心分離で単離し、次いで、プラスチック接着によりマクロファージのために高められた。
iv．フローサイトメトリー。１％牛腓血清および０.１％ナトリウム・アジド（染色緩衝液）を含むＰＢＳ中の細胞（１×１０6）の単色フローサイトメトリーは、３０分間４℃で２０％正常ヒト血清の存在下であらかじめ保った。細胞を洗浄し、次いでアンチκＲ（３３−５２）またはＲＧＧで３０分間４℃でインキュベートし、洗い、次いでアンチ家兎ＩｇＧのＰＩコンジュゲート・ロバ（Ｆａｂ’）２フラグメント（Zymed，S．San Francisco，CA）でもって３０分間４０℃でラベルした。二元色分析のために、ＦＩＴＣコンジュゲート・アンチＣＤ３またはアンチＣＤ１４（Pharmingen，San Diego，CA）を第２段階に入れた。細胞（１×１０4）をＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson，Mountain View，CA）で分析し、前に記載のＣell Ｑuestソフトウエアーでデータを解析した。
ｖ．細胞増殖の測定。末梢血単核細胞を3Ｈ−チミジンでの培養基に２日目に入れ、１８時間後に細胞をガラス繊維フィルターに取り、シンチレーション・カウントにかけた。実験を３回行い、各サンプルを３回繰り返した。
vi．ＩｇＧ分泌の測定。培養上清液中のＩｇＧの比較レベルを前に記載（８）の間接ＥＬＩＳＡにより測定した。ＰＢＭＣ培養からの上清液を１０日後に収集し、ＩｇＧの存在について調べた。数字は３回サンプルからの平均ＣＰＭ±標準偏差を表す。実験は少なくとも３回行われた。
vii．アンチ−κＲペプチドアンチ血清の特徴化。κＲ（３３−５２）ＹＳＦＰＭＰＬａＲ構築体（配列番号１０）で免疫化した家兎の血清および正常家兎の血清を、ＥＬＩＳＡ中のプレート結合κＲ（３３−５２）（配列番号９）を認識する能力について調べた。その結果によると、κＲ（３３−５２）ＹＳＦＰＭＰＬａＲ構築体（配列番号１０）で免疫化した家兎からの血清は、用量依存的に遊離のκＲ（３３−５２）（配列番号９）ペプチドに結合した。力価は約１０5であった。一方、免疫していない家兎からの血清はこのタンパク質に結合しなかった。免疫および非免疫家兎の血清細胞をタンパク質Ａ−セファローズ・クロマトグラフィーにかけ、κＲ（３３−５２）（配列番号９）特異的抗体についてカラム溶出液を調べた。その結果、遊離のκＲ（３３−５２）（配列番号９）に結合したκＲ（３３−５２）（配列番号９）ＹＳＦＰＭＰＬａＲ構築体（配列番号１０）で免疫化した家兎のタンパク質Ａ精製抗体は０.１ｎｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で検出された。他方、ＰＧＧは遊離ペプチドに結合しなかった。多くの採血からの結果によると、ＥＤ50力価は１−１０ｎｇ／ｍｌであった。このことは、ＫＲ（３３−５２）ＹＳＦＰＭＰＬａＲ（配列番号１０）で免疫化した家兎が高力価のκＲ（３３−５２）ペプチド特異抗体を含有していたことを示す。
viii．アンチ−Ｒ（３３−５２）抗体のヒトκＲ発現細胞との結合。ポリクローナルアンチκＲ（３３−５２）抗体がκＲ発現細胞に結合しているかどうかを決めるために、様々な単核細胞ラインおよび正常ヒト単核細胞について最初にκレセプター特異的ｍＲＮＡの存在をＲＴ−ＰＣＲで調べた。ノイロン細胞ラインＮＴ２、Ｕ９３７、Ｊurkat、Ｔ４７Ｄ、正常ヒトＰＢＭＣおよび富化ヒトマクロファージから単離したＲＮＡサンプルをクローン化κＲおよびＢ−アクチンの３’領域に特異的な５’−センスおよび３’−アンチセンス・プライマーでのＲＴ−ＰＣＲにかけた。すべての細胞ラインまたは細胞フラクションは、Ｔ４７Ｄ細胞ラインを除き、用いたプライマー配列から予測されるように（５）、κレセプター特異的ＰＣＲ産生物にポジティブであった。
アンチκＲ（３３−５２）がκＲ特異的ｍＲＮＡ発現細胞に結合するかどうかを測定する実験がなされた。いくつかの細胞ラインについての単色フローサイトメトリー分析の結果を表２に示す。フローサイトメトリー測定は、マクロファージ（Ｕ９３７）、Ｔリンパ球（Ｊurkat）およびＢリンパ球（ＳＫＷ６.４およびＣＥＳＳ）に代表されるヒト細胞ラインで行われた。結果によるとアンチκＲ（３３−５２）はすべての３細胞タイプに結合した。アンチκＲ（３３−５２）は正常ＲＧＧ（ＭＦＩ＝３８）に比して最も大きい程度に（ＭＦＩ＝２３１）Ｕ９３７細胞に結合した。ここで云うＭＦＩは蛍光強度を意味する。Ｊurkatラインに対するアンチκＲ（３３−５２）とＲＧＧ結合の比較はＭＦＩについて約３倍の相違（ＭＦＩ＝１８とＭＦＩ＝６）を表した。同じ結果が２つのＢリンパ球様細胞ライン（ＳＫＷ６.４とＣＥＳＳ）でも得られた。ＳＫＷ６.４ラインに対するアンチκＲ（３３−５２）およびＲＧＧ結合の比較はＭＦＩについて約３倍の相違（ＭＦＩ＝１９とＭＦＩ＝６）を表した。ノイロン細胞ラインもアンチκＲ（３３−５２）と特異的に結合し、ＲＧＧに比してＭＦＩに３倍の相違を示した。最後に、ヒト乳房癌腫細胞ライン（Ｔ４７Ｄ）からのκＲ特異的ｍＲＮＡの発現の欠如に基づいて、フローサイトメトリー分析により、この細胞ラインのアンチκＲ（３３−５２）に結合する能力について調べた。Ｔ４７細胞でのκＲ発現の欠如は、アンチκＲ（３３−５２）とＲＧＧがこれらの細胞にほとんど同じように結合したことから確認された。ポジティブ対照として、アンチκＲ（３３−５２）およびＲＧＧについて追加のヒトマクロファージ様細胞ライン（ＴＨＲ１）に結合する能力を調べた。この細胞ラインとのアンチκＲ（３３−５２）およびＲＧＧ結合の比較は、ＭＦＩについて顕著な相違（ＭＦＩ＝１９０とＭＦＩ＝８）を表す。これらの結果からヒトκＲに対するアンチκＲ（３３−５２）の特異性が確認された。
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無傷のヒトＰＢＭＣの分析は、これらの細胞が“κ−様”ＲについてのｍＲＮＡを発現することを示した（５）。二色フローサイトメトリー分析を、アンチκＲ（３３−５２）の正常ヒトマクロファージ（ＣＤ１４＋）およびＴリンパ球（ＣＤ３＋）との結合を調べるために用いた。マクロファージもＴリンパ球アンチκＲ（３３−５２）抗体に結合することが認められた。アンチκＲ（３３−５２）およびＲＧＧについてＣＤ１４＋ＰＢＭＣとの結合を調べた。その結果、アンチκＲ（３３−５２）は正常ＲＧＧに比してＣＤ１４＋細胞に１５倍強く結合した（ＭＦＩ＝３２０とＭＦＩ＝２１）。アンチκＲ（３３−５２）はＣＤ３＋細胞とも結合するが（ＭＦＩ＝１９とＲＧＧのＭＦＩ＝３）、ＣＤ１４＋細胞よりも小さい。この結果は、アンチκＲ（３３−５２）が正常ＰＢＭＣ誘導単核細胞および単核細胞ラインと結合することを表している。これはκＲ−特異ｍＲＮＡを発現する。
ix．インビトロでのアンチκＲ（３３−５２）抗体によるリンパ球増殖のＵ５０、４８８Ｈ仲介抑制の中和。公表の研究結果によると、インビトロ免疫応答のオピオイドペプチド誘発調節は特殊なレセプター−リガンド相互作用を介して起きる。特に、κＲ−選択アゴニストＵ５０、４８８ＨはヒトＰＢＭＣ培養によるＳＡＣ誘発リンパ球増殖を抑制することができる（６）。Ｕ５０、４８８Ｈによるリンパ球活性の阻害がκＲ選択アンタゴニストｎｏｒ−ＢＮＩによって逆転されることも示されている。アンチκＲ（３３−５２）がκＲ選択アンタゴニストして作用し、そしてＵ５０、４８８仲介抑制を中和化できるかを決定するために、ＰＢＭＣ培養物をＳＡＣおよびＵ５０、４８８Ｈの添加に先立って種々の濃度のタンパク質Ａ精製アンチκＲ（３３−５２）で前インキュベートした。Ｕ５０、４８８ＨはＳＡＣ誘発リンパ球増殖を用量依存的に抑制する（５）。最大の抑制は、Ｕ５０、４８８Ｈを濃度１０-6Ｍで用いたときに得られた。ＰＢＭＣ培養物を種々の濃度のアンチκＲ（３３−５２）（１−５０μｇ／ｍｌ）と共に前インキュベートし、次いでＵ５０、４８８ＨプラスＳＡＣを加え、増殖を培養第３日目に測定した。アンチκＲ（３３−５２）は、ＳＡＣ誘発リンパ球増殖のＵ５０、４８８Ｈ仲介抑制を用量依存的に中和することが分かった。一方、正常ＲＧＧの同じ濃度ではκＲ選択アゴニスト仲介免疫抑制を阻害しなかった。
ＳＡＣがＴおよびＢリンパ球の増殖を誘発することが知られているので、同様の実験をＴ細胞マイトジェンＰＨＡで行った。アンチκＲ（３３−５２）はマイトジェン誘発Ｔ細胞増殖を抑制するＵ５０、４８８Ｈの能力を中和することもできた。Ｕ５０、４８８Ｈ（１０-6Ｍ）はＰＨＡ誘発Ｔ細胞増殖を８５％抑制した。この抑制はアンチκＲ（３３−５２）で細胞を予めインキュベートすることにより逆転される。正常ＲＧＧでのＰＢＭＣの前インキュベートはＴ細胞増殖のＵ５０、４８８Ｈ仲介抑制をブロックしなかった。
アンチκＲ（３３−５２）はリンパ球増殖を直接的に調節しないようである。アンチκＲ（３３−５２）でのＰＢＭＣの共培養は、マイトジェンなしでは、培地対照より以上に細胞を刺激しない。さらに、アンチκＲ（３３−５２）とＰＨＡまたはＳＡＣとの併用は、マイトジェンのみのＰＢＭＣ培養に比して細胞増殖の増大をもたらさなかった。
ｘ．インビトロでのアンチκＲ（３３−５２）抗体によるＩｇＧ合成のＵ５０、４８８Ｎ仲介抑制の中和。リンパ球増殖に加えてＵ５０、４８８ＨはヒトＰＢＭＣ培養におけるＳＡＣ誘導ＩｇＧ合成の強力な阻害剤である（６）。アンチκＲ（３３−５２）がＩｇＧ合成の抑制を中和し得たかどうかを決定するために、ＰＢＭＣをアンチκＲ（３３−５２）で予めインキュベートし、次いでＵ５０、４８８ＨとＳＡＣを添加し、ＩｇＧレベルを１０日目に測定した。その結果、Ｕ５０、４８８Ｈは１０-8Ｍおよび１０-7ＭでＩｇＧ合成を夫々６７％および８５％阻害した（５）。培養へのアンチκＲ（３３−５２）の添加はＳＡＣ誘発ＩｇＧ合成抑制を用量依存的に中和した。一方、正常ＲＧＧの同じ濃度では抑制の中和化は認められなかった。
アンチκＲ（３３−５２）抗体の特異性を調べるために、ＰＢＭＣを特異抗体またはＲＧＧと共にインキュベートし、次いでＵ５０、４８８Ｈまたはμレセプター選択アゴニスト（ＤＡＧＯ）で共培養し、ＩｇＧ産生をＥＬＩＳＡで測定した。その結果、アンチκＲ（３３−５２）は、Ｕ５０、４８８ＨＳＡＣ誘発ＩｇＧ合成の仲介阻害を中和するが、ＩｇＧ合成のＤＡＧＯ仲介抑制を中和し得なかった。
このことは、結合リンパ球およびマクロファージに加えて、アンチκＲ（３３−５２）がκＲ選択アゴニスト（Ｕ５０、４８８Ｈ）の能力を中和し得るが、μＲ選択アゴニスト（ＤＡＧＯ）に能力を中和し得ないことを表している。さらに、抗体はリンパ球増殖および抗体合成に対する分化の両方において顕著な阻害を示した。この結果はさらにヒトＫappaレセプターについてのアンチκＲ（３３−５２）の特異性を表す。
上記の抗体結合のデータから分かるように、κレセプター配列にコンジュゲートした分子アジュバントのＣ５ａアゴニスト形態を用いた家兎で生じた部位配向ポリクローナル抗体は、ヒトκレセプターに特異的なｍＲＮＡを発現する正常なヒト細胞および細胞ラインに結合することができた。ノイロン細胞ライン（ＮＴ２）、正常血液誘導ＣＤ１４＋単球、単球様細胞ライン（Ｕ９３７およびＴＨＰ１）、正常血液誘導ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＴ細胞ライン（Ｊｕｒｋａｔ）、およびヒトＢ細胞ライン（ＳＫＷ６.４およびＣＥＳＳ）のフローサイトメトリー分析は、すべてアンチκＲ（３３−５２）により特殊な状態で結合されることを示した。アンチκＲ（３３−５２）は、ヒトκレセプターのｍＲＮＡを発現しないことが測定された細胞ラインと結合しなかった。
アンチκＲ（３３−５２）は、リンパ球活性のκＲ選択的アゴニスト（Ｕ５０、４８８Ｈ）仲介阻害を特異的に中和することが分かった。抗血清は用量依存的に次のもののＵ５０、４８８Ｈ仲介阻害を中和することが分かった：１）ＳＡＣ誘発リンパ球増殖、２）ＰＨＡ誘発リンパ球増殖、および３）ＳＡＣ誘発ＩｇＧ合成。一方、ＳＡＣ誘発ＩｇＧ産生のＤＡＧＯ仲介抑制はアンチκＲ（３３−５２）により影響されなかった。これらの結果は、この部位配向ポリクローナル抗血清がＰＢＭＣについてのヒトκＲと相互作用をすることを示唆する。この結果から、ポリクローナルアンチκＲ（３３−５２）抗体はκＲの露出Ｎ末領域と相互作用をする。この抗血清はＵ５０、４８８Ｈ仲介リンパ球活性を効果的にブロックするが、マクロファージまたはリンパ球を活性化しなかった。
アンチ−κオピオイドレセプター抗体は例を上記したが、Ｃ５ａアゴニスト・ペプチドのμおよびΔ特異的ペプチドに対応するペプチドとのコンジュゲーションは、μおよびΔエピトープに対する特異的抗体の生成を成功せしめる。
実施例４
エピトープＣ５ａアゴニスト構築体とエピトープＫＬＨコンジュゲートの免疫原性の比較
下記の実験は、本発明の分子アジュバントの強さとペプチドエピトープに対する免疫応答を高めるために広く用いられている方法とを比較するために、実施された。マウスにおいてＭＵＣ１エピトープアゴニスト構築体およびキーホール・リンペット・ヘモシアミン（ＫＬＨ）に対する応答を直接的に比較した。結果を表２に要約する。
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同様の実験を家兎において行った。家兎で用いた免疫原はκ−およびμ−オピオイド、夫々ＦＰＧＷＡＥＰＤＳＮＧＳＥＤＡＱＬ（配列番号９）およびＧＤＬＳＤＰＣＧＮＲＴＮＬＧＧＲＤＳＬ（配列番号１１）であった。相違する免疫原を含む２つの組成物を注射した家兎で産生した血清抗体力価および抗体サブタイプを比較した。
ｉ．ペプチドコンジュゲート。スペーサーとして作用するアラニン残基と共にエピトープのＮ末に合成的に加えたリジン残基を通して、エピトープをＫＬＨにコンジュゲートした。この実験においてグルタルデヒドをコンジュゲーションに作用せしめるために用いた。今一つの場合、実施例１に記載した固相ペプチド合成的方法を用いて、エピトープをＣ５ａアゴニストＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（配列番号１）のＮ末に連結した。
ii．家兎についての免疫化方法。コンピート・フロインド・アジュバント（GIBCO，Grand Island，NY）におけるエピトープ−ＫＬＨおよびエピトープ−ＹＳＦＫＰＭＰＬａＲ（エピトープ−配列番号１）構築体のいずれかの５００μｇを家兎に皮下注して免疫した。不完全フロインド・アジュバントにおいて強化注射を３０日および６０日目に行った。血清を免疫後６０日に採取した。
iii．抗体測定。ペプチドエピトープに特異的な家兎ＩｇＧの存在を前に記述されているように（８）ＥＬＩＳＡで測定した。
エピトープＣ５ａアゴニストで免疫した家兎は、オピオイド・レセプター・ペプチドエピトープに特異的なＩｇＧＡｂｓを高力価で生成した。担体タンパク質ＫＬＨにコンジュゲートとしたオピオイド・レセプター・エピトープで免疫した家兎も、その注射した抗体特異的エピトープを高力価で産生した。これらの結果は、デカペプチドＣ５ａアゴニストが、非げっ歯類において誘発特異的アンチペプチド抗体でエピトープにコンジュゲートした大分子量タンパク質、ＫＬＨと同様に効果的であったことを表している。
参照文献
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本発明の特定の好ましい実施態様を上記し、特に例示したが、これは本発明をこれらの実施態様に限定するものではない。下記の請求項の範囲および精神から離れることなく、様々な修飾をなすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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