(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネの第３染色体の短腕における０〜１１．２マップ単位の位置に存在する遺伝子マーカーを指標として、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネを選抜する、イネの選抜方法。
【請求項２】
前記選抜方法において、遺伝子マーカーが、イネの第３染色体の短腕における０〜７．９マップ単位の位置に存在する遺伝子マーカーである、請求項１記載のイネの選抜方法。
【請求項３】
前記選抜方法において、遺伝子マーカーが、ＲＦＬＰマーカーおよび／または増幅遺伝子マーカーである、請求項１または２に記載のイネの選抜方法。
【請求項４】
前記選抜方法において、増幅遺伝子マーカーが、配列番号１で表されるＳＳＲ配列を含む増幅遺伝子マーカーである、請求項１〜３のいずれかに記載イネの選抜方法。
【請求項５】
配列番号１で表されるＳＳＲ配列を含む遺伝子領域の遺伝子増幅産物を得るためのセンスプライマーが、配列番号２で表されるヌクレオチド鎖であり、同アンチセンスプライマーが、配列番号３で表されるヌクレオチド鎖である、請求項４記載のイネの選抜方法。
【請求項６】
イネの遺伝子から配列番号１で表されるSSR配列を含む遺伝子領域の遺伝子増幅産物を、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネを選抜する指標として得るための、配列番号２で表されるヌクレオチド鎖および配列番号３で表されるヌクレオチド鎖からなる、遺伝子増幅用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の形質を有する植物の選抜方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
種子繁殖性の植物は、種子の発芽により生長を開始する。特に、作物植物においては、種子を播種する環境条件における発芽性が、栽培上、問題になる場合がある。種子が播種される環境条件下において、個体間にばらつきがなく、高率で斉一に、かつ、播種後、早期のうちに発芽すること、更に、それに続く旺盛な初期生育が認められる、高度の発芽性を有することが、作物植物として理想的である。このような、高度の発芽性を有する品種の育成を目的として、従来から、種子を湿潤条件下で実際に発芽させて調査する、発芽力検定が行われていた。また、作物の栽培にあたっては、種子の播種される環境条件が、その作物植物にとって好ましくない場合、例えば、高温、低温、高塩濃度のような、環境ストレス下においても、なお、発芽、生長することが要求される場合がある。そのため、播種の環境ストレス下における、高度の発芽性を有する作物植物を作出するための品種改良が試みられている。
【０００３】
具体的な例としては、寒冷地において、イネの直播栽培を行う場合の、イネの発芽性の改良が挙げられる。熱帯に起源を有するイネの発芽の最適温度は、約３０℃である。長年の品種育成により、現在では、冷涼な気候の高緯度地方においても、イネの栽培が行われているが、この場合、苗代で育苗を行うことにより、播種期に低温に晒されることを、可能な限り回避することが必要である。このような苗代による栽培は、直播栽培に比べると手間がかかり、作付け密度も、直播に比べると粗にならざるを得ず、イネの収率にも限界がある。直播を可能にするためには、高度の発芽性を有する品種を開発して、たとえ、発芽時に低温に晒されても、植物体が生長し、その後も旺盛に発育する手段を提供することが必要となる。
【０００４】
イネの低温下での発芽性については、複数の遺伝子が関与すること、また、発芽性に優れる系統は、初期の生育性にも優れることが報告されている（佐々木、（１９７４）、北海道立農試報告Ｎｏ．２４：５−３７）。また、多くの遺伝資源から、低温下での発芽性に優れるイネ品種のスクリーニングも行われている（小高、安部（１９８８）、農業技術４３（４）：１６５−１６８）。現在、わが国では、高度の発芽性を有する母本から、栽培品種への導入が、鋭意すすめられつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、現在行われている、種子の発芽力検定を行うには、種子を収穫して、これを実際に発芽させることが必要である。よって、この発芽力検定においては、発芽力の評価と選抜に多くの時間を要し、さらに、種子の発芽力は、植物の生育条件、特に、種子の登熟環境に影響されるため、年次間の誤差が生じ、正確な形質の評価を行うことが困難な場合があった。また、高度の発芽性を有する品種を育成するために行う発芽力試験では、種子の調製、発芽のための施設と発芽条件の設定、経時的な調査など、多大な労力と時間を必要とする。
【０００６】
そのために、高度の発芽性を有する品種の育成を行うに際して、多数の種子検体についても、それぞれの発芽性を、安定的、効率的、かつ、簡便に選抜する手段の確立が望まれている。
【０００７】
近年、多くの作物植物において、遺伝子マーカーを用いた遺伝子解析により、容易にゲノムの特定領域の構造を調査することが可能となり、育種における、種々の形質の選抜を、目的形質遺伝子の近傍に位置する遺伝子マーカーを用いることにより、行うことができることが報告されている（特開２０００−２７９１７０号公報、特開平１１−８９５８３号公報、特開平１０−１２７２９０号公報、特開平１０−８４９６５号公報等）。
【０００８】
本発明の目的は、イネの生育初期の段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便に、選抜するために、イネの寒冷に対する発芽性に関与する遺伝子（以下、発芽性遺伝子ともいう）に対する遺伝子マーカーを見出し、この遺伝子マーカーを用いる、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネの選抜方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネの選抜を可能とする、遺伝子マーカーについての検討を行った。その結果、イネの寒冷に対する高度の発芽性を発現する遺伝子に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標とすることにより、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネを選抜することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、イネの第３染色体の短腕における０〜１１．２マップ単位の位置に存在する遺伝子マーカーを指標として、寒冷に対する高度の発芽性を有するイネを選抜する、イネの選抜方法（以下、本選抜方法ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
本発明における、「高度の発芽性」とは、少なくとも、発芽から、生長初期における生長の程度が、その植物の標準的な生長の程度よりも高度であることを意味する。また、ここで「高度」とは、生長のスピードが速いこと、通常では、発芽から生長初期の生長が抑制されるストレス環境においても、そのストレスに対して抵抗性を示し、生長を行うこと等を意味する。「ストレス環境」とは、本発明においては、低温を意味することとする。
【００１２】
上述したように、本選抜方法の対象は、イネである。
【００１３】
本発明において用いる、ｃＭ（センチモルガン）とは、乗換え率の単位（交差単位）であり、同一染色体上の遺伝子間の遺伝的距離を表す単位である。１ｃＭは、２つの遺伝子間に１％の頻度で交差が起こる場合の両遺伝子間の距離を示し、１マップ単位(map unit)と等しい。よって、この数値が小さいほど、遺伝子の乗換えが起こる頻度が小さく、一般的には、２つの遺伝子の染色体上の距離が近いこと、すなわち、２つの遺伝子の連鎖が強いことを意味している。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。本発明は、未だ、本体が明らかとなっていない「発芽性遺伝子」に連鎖する遺伝子マーカー、すなわち、発芽性遺伝子に対応して何らかの変化を示すイネの遺伝子のマーカーを見出して、この遺伝子マーカーを指標として、寒冷に対する高度の発芽性を形質として有するイネを選抜する、植物の選抜方法である。
【００１５】
遺伝子マーカーは、発芽性遺伝子に対応する何らかの変化を、多型として検出することができる遺伝子マーカーであることが好適である。例えば、特定の制限酵素に対応する制限パターンの差異を指標として、多型を検出可能な方法として、ＲＦＬＰ法により検出するＲＦＬＰマーカー[Botstein,D,et al.,(1980)AM.J.Hum.Genet.32:314-331] 、ＡＦＬＰ法により検出するＡＦＬＰマーカー[Zabeau,M.and P.Vos(1993)European Patent Apprication,EP0534858) 、ＲＬＧＳ法により検出するＲＬＧＳマーカー[Hatada,I. et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9523-9527]等が例示可能である。特に、イネにおいては、多数のＲＦＬＰマーカーが見出され[Harushima,Y. et al.,(1998)Genetics 148:479-494]、ＲＦＬＰ法が、一般的な方法として挙げられる。
【００１６】
また、多型の存在する遺伝子領域を、ＰＣＲ法等の遺伝子領域を増幅させて、得られた遺伝子増幅産物の塩基長の差異で、多型による遺伝子型の異同を検出可能な方法も用いることができる。特に、遺伝子増幅産物による検出を行う場合には、多型頻度が高い、ＳＳＲ(Simple sequence repeats) 領域[Powell,W.et al.,(1996) Trends Plant Sci 1:215-222、McCouch,SR.et al.,(1997)Plant Mol Biol 35:89-99]を、本発明で用いる遺伝子マーカーを選択する場合の指標とすることが好適である。ＳＳＲ領域は、既存のソフトウエアで検索を行うことができる〔例えば、「ＳＳＲＩＴ」(http://ars-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl) 等〕。
【００１７】
本選抜方法における、発芽性遺伝子と連鎖する遺伝子マーカーは、可能な限り、発芽性遺伝子との遺伝的距離が近いことが、発芽性遺伝子との連鎖の信頼性が高く好適である。具体的には、発芽性遺伝子と２０ｃＭ以内の領域が好適であり、特に好適には、同１１．２ｃＭ以内、極めて好適には、同７．９ｃＭ以内の領域である。
【００１８】
上記の２０ｃＭ以内の遺伝子領域としては、ＡＰ０００６１５、ＡＣ０９７６２７、ＡＣ０９８６９５、ＡＣ０９９７３９、ＡＣ０９８６９３、ＡＣ０９９３９９等（イネゲノム研究プログラムhttp://rgp.dna.affrc.go.jp、ＣＣＷイネゲノム研究コンソーシアムhttp://www.genome.clemson.edu/projects/rice/ccw/等）を挙げることができる。
【００１９】
上述した遺伝子領域内で、イネの表現型として、寒冷に対する高度の発芽性が認められるか否かを指標として、多型の有無を検討することにより、目的とする遺伝子マーカーを見出すことができる。
【００２０】
例えば、本発明において用いられ得る、イネのＲＦＬＰマーカーとしては、例えば、Ｃ８１４ｂ、Ｓ１４７３、Ｒ１７１３、Ｓ１５５４、Ｃ１１５３、Ｃ７２１、Ｃ５６７、Ｓ１７１４、Ｒ１４６８Ａ、Ｃ７２５等（イネゲノム研究http://rgp.dna.affrc.go.jp）が挙げられ、中でも、Ｃ８１４ｂが好適である。
【００２１】
また、例えば、上記の遺伝子領域ＡＰ０００６１５内の増幅遺伝子マーカーを１種または２種以上、本選抜方法で用いる場合、その中の少なくとも１種を、配列番号１で表される塩基配列のＳＳＲ配列を含む遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとすることが好適である。このＳＳＲ配列を含む遺伝子領域は、イネにおける寒冷に対する高度の発芽性の形質の有無に応じて、塩基長が変化することが認められており（実施例参照）、非常に好適な増幅遺伝子マーカーである。
【００２２】
特定の遺伝子領域を、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法で増幅させて、増幅遺伝子マーカーとする場合、増幅を行う鋳型遺伝子の５’末端と３’末端に対して、実質的に相補的な、遺伝子増幅反応を行うための遺伝子増幅用プライマーが必要である。かかる遺伝子増幅用プライマーの選択は、目的とする遺伝子領域を、遺伝子増幅反応で増幅可能なものである限り、特に限定されず、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応を、一般的に行う際における、プライマー選択基準に基づき選択することができる。
【００２３】
例えば、配列番号１で表される塩基配列のＳＳＲ配列を含む遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとする場合には、センスプライマーとして、配列番号２で表されるヌクレオチド鎖とすることが好適な態様として挙げることができる。また、アンチセンスプライマーとしては、配列番号３で表されるヌクレオチド鎖とすることを好適な態様として挙げることができる。
【００２４】
配列番号１と配列番号２で表されるヌクレオチド鎖は、共に、報告されているイネの遺伝子の塩基配列に対して相補的な配列のヌクレオチド鎖であり、後述する実施例に示すように、これらのヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅反応のセンスプライマーとアンチセンスプライマーとして用いることが好適である。しかしながら、例えば、これら連続する３０塩基全体を用いなくても、少なくとも、これらの配列のうち、少なくとも、連続する１５塩基が、鋳型遺伝子における遺伝子増幅反応の開始点において相補的であれば、プライマーの全ての部分が鋳型遺伝子と、完全に相補的である必要はない（センスプライマーであれば、５’末端側１５塩基以上が配列番号１の配列と一致し、アンチセンスプライマーであれば３’末端側１５塩基以上が配列番号２の配列と一致することが好適である）。また、このような条件を満たす、遺伝子増幅用プライマーの全塩基長は、５０塩基以下程度であることが、一般的である。
【００２５】
このように、配列番号１にかかわるセンスプライマーと、配列番号２にかかわるアンチセンスプライマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、被験イネの発芽性遺伝子に応じて、異なる塩基長を与える増幅遺伝子マーカーが得られる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。ただし、この実施例の記載により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕  ＲＦＬＰ分析
寒冷に対する高度の発芽性が認められる品種のイネ（Italica Livorno)と、寒冷に対する通常の発芽性が認められる品種のイネ（はやまさり）の緑葉から、ＣＴＡＢ法により、ＤＮＡを抽出した。ここで行ったＣＴＡＢ法は、マーレイ・トンプソン法[Murray,H.G. and Thompson,W.F.(1980)Nucleic.Acid Res.8:4321-4325) の改変法であり、各々の緑葉の凍結組織をホモジネートして、これから、ＤＮＡを抽出した。
【００２７】
得られたＤＮＡを用いて、ＲＦＬＰ分析を行った。このＲＦＬＰ分析に用いられた、ＲＦＬＰマーカーは、イネゲノムプログラムにより開発されたものである[Harushima,Yら(1998)Genetics 148-494] 。
【００２８】
また、ＲＦＬＰ分析の手法は、常法[Kurata,N.et al.,(1994)Nature Genet.8:365-372]に従って行った。すなわち、ＤＮＡは、８種類の制限酵素（BamHI ，BglII ，EcoRV ，HindIII ，ApaI，DraI，EcoRI ，KpnI）で消化し、消化したＤＮＡを、０．６％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ナイロンメンブレン（ロシュ社製）へ、サザンブロッティングを行った。サザンハイブリダイゼーションおよび検出は、ＥＣＬシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により行った。
【００２９】
およそ、１０００種類のＲＦＬＰマーカーを解析したところ、約１００種類のＲＦＬＰマーカーで、上記の２品種間における、多型が認められた。
これらの約１００種類の、多型が認められたＲＦＬＰマーカーと、発芽性遺伝子との遺伝的連鎖関係を明らかとする遺伝解析を、以下のように行った。
【００３０】
まず、低温に対する高度の発芽性を有するイネ品種である「Italica Livorno 」と、通常の発芽性が認められているイネ品種である「はやまさり」との交雑Ｆ１に、「はやまさり」を戻し交配した、ＢＣ１Ｆ１世代から、単粒系統法により、組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代を作出した。
【００３１】
この組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代の発芽性の評価は、従来から行われている種子を用いる発芽力検定（低温下）により行った。
すなわち、発芽力検定を、温度条件を１５℃として行い、その発芽率により、各系統の発芽性を評価した。
【００３２】
また、各系統の緑葉から、上述した条件で、ＤＮＡを抽出して、これについて、ＲＦＬＰ分析を行った。
ＲＦＬＰマーカーとしては、上述の多型を示した１００種類のマーカーを用いた。ＲＦＬＰマーカーの遺伝子型と発芽率の連鎖関係を解析したところ、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂ[Harushima,Yら(1998)Genetics 148-494] が発芽性遺伝子に連鎖していることが明らかとなった。第１表と第１図に、ＲＦＬＰマーカーを用いたＲＦＬＰ分析の結果と、低温条件下における発芽性についての関係を示した（第１図において、黒棒は、Italica Livorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統数を表す）。
【００３３】
【表１】
0004100541.tif 000002
第１表と第１図により、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂによる遺伝子型分析のパターンが、「Italica Livorno 」の場合には、低温における高度の発芽性が認められ、同「はやまさり」の場合には、通常の発芽性が認められた。
【００３４】
この結果、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂは、発芽性遺伝子と強く連鎖しており、高度の発芽性を有するイネを選択するためのＲＦＬＰマーカーとして好適であることが判明した。
【００３５】
ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂは、イネの第３染色体の１１．２に位置するＲＦＬＰマーカーである。連鎖解析の結果、発芽性遺伝子は、このＣ８１４ｂ近傍から短腕末端部に存在することが示された。すなわち、Ｃ８１４ｂと発芽性遺伝子は、１１．２ｃＭ以内の連鎖関係にあることが明らかとなった。
【００３６】
〔実施例２〕  ＰＣＲマーカーによる分析
（１）イネゲノム研究プログラムの公開データー（http://rgp.dna.affrc.go.jp）を用いて、上記実施例１において、発芽性遺伝子と連鎖していることが判明した、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂの座乗する染色体領域近傍の塩基配列である、ＡＰ０００６１５の情報を得た。この塩基配列における、ＳＳＲ配列〔イネにおいて、多型を得やすい繰り返し配列であることが知られている：McCouch,SR.et al.,(1997)Plant.Mol.Biol.35:89-99 〕を、ＳＳＲ検索ソフトウエア「ＳＳＲＩＴ」(http://ars-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl) を用いて、配列番号１に示すＳＳＲ配列〔（ＴＡ）２１（ＴＧ）１２〕の情報を得た。次いで、この配列番号１記載のＳＳＲ配列近傍の、イネ遺伝子における塩基配列を基に、このＳＳＲ近傍領域を、ＰＣＲ法により増幅可能なＰＣＲプライマーを、コンピューターソフトウエア「Oligo4.04 」(National Bioscience社製）を用いて設計し、下記の塩基配列のオリゴヌクレオチド（配列番号２，３）を、ＤＮＡシンセサイザー（System plus ：ベックマン社製）で合成した〔アール・エル・レンジャー等の方法(R.T.Letsinger,W.B.Lursford,J.Am.Chem.Society.98,3655)に従う〕。
【００３７】
センスプライマー：ＡＧＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡ（配列番号２）
アンチセンスプライマー：ＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧ（配列番号３）
【００３８】
これらのＰＣＲプライマーを、実施例１に記載した要領で、被験イネの緑葉から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行い、配列番号１で示すＳＳＲ配列近傍の遺伝子増幅産物を調製して、被験イネ毎のこの遺伝子増幅産物の塩基長の差異を検出することにより、この増幅遺伝子マーカーが、発芽性遺伝子に連鎖した遺伝子であるか否かを検討した。本例において、ＰＣＲ反応は、ウイリアムズ(Williams)らの方法に従い、反応混液を調製し、ジーン・アンプＰＣＲ９７００（パーキンエルマー社製）とｉサイクラー（バイオラッド社製）を用いて、ＤＮＡの増幅を行った[Theor.Apple.Genet.82,489-498(1990)]。このＰＣＲ反応より得られたＤＮＡ増幅産物の検出は、ＰＣＲ反応が終了した反応液に、泳動用色素液を添加し、電気泳動装置（フォーラックサブマリン電気泳動装置：日本エイドー社製）を用い、１８０Ｖで、約９０分間通電し、泳動終了後、０．５μg/mlエチジウムブロマイド溶液に、２０分間浸漬することにより行った。なお、泳動用バッファーとしては、ＴＢＥバッファーを用い、ゲルは、１．５または２％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社製：タイプＩ）を、ＴＢＥバッファーに溶解して調製した。写真撮影は、上述のエチジウムブロマイドで染色したゲルを、軽く水洗し、透過型紫外線照明装置の上に置き、紫外線を照射して撮影した。その結果を、第２図に示す（レーン１：はやまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レーン２：Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、Ｍ：分子マーカー（Φ×１７４-HaeIII ））。
【００３９】
第２図により、寒冷に対する高度の発芽性を有する、Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンドは、約７５０bp、通常の発芽性を有する、はやまさりのＤＮＡ増幅産物のバンドは、約７２０bpであり、両ＤＮＡ増幅産物の塩基長は、明らかに異なっており、電気泳動像において、明確な識別が可能であることがわかった。
【００４０】
（２）次に、実施例１において行った、組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代の発芽性の評価を、低温下（１５℃）で行い、この発芽性の評価結果と、上述のＰＣＲプライマー（配列番号２，３）を用いて、各々の系統の緑葉から抽出したＤＮＡの遺伝子増幅反応を、上記（１）に準じて行い、遺伝子型を明らかにし（第３図：レーン１：はやまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レーン２：Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、レーン３〜１２：組換え自殖系統のＤＮＡ増幅産物のバンド、Ｍ：分子マーカー（Φ×１７４-HaeIII ））、得られたＤＮＡ増幅産物（増幅遺伝子マーカー）の塩基長と、発芽性の連鎖関係を検討した。その結果を、第２表と第４図に示す（第４図において、黒棒は、Italica Livorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統数を表す）。
【００４１】
【表２】
0004100541.tif 000003
この結果、▲１▼Italica Livorno 型の増幅断片を示す系統の平均発芽率は、４２．８％であるのに対し、はやまさり型の増幅断片を示す系統の平均発芽率は、２０．６％であり、約２倍の明らかな差異が認められた。▲２▼発芽率が５０％を超える、高度の寒冷に対する発芽性を示す系統は、組換え自殖系統において１３．１％（１２２系統中１６系統）存在したが、その１６系統のうちの７５％は、Italica Livorno 型の増幅断片を示した。
【００４２】
この結果により、配列番号２，３で表される塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって得られる増幅遺伝子マーカーは、高度の寒冷に対する発芽性を有するイネの系統を選抜するマーカーとなり得ることが示唆された。
【００４３】
ＡＰ０００６１５は、ＲＦＬＰマーカーＳ１５５４を含む領域であることが知られており、このＳ１５５４は、イネの第３染色体の７．９に位置するＲＦＬＰマーカーである。つまり、ここで用いた増幅遺伝子マーカーと発芽性遺伝子とは、７．９ｃＭ以内の連鎖関係にあることが明らかとなった。
【００４４】
（３）この増幅遺伝子マーカーによる、高度の発芽性を有するイネの選抜の汎用性を検討するために、他品種のイネ（全て、寒冷に対する発芽性は、通常程度であることが認められている：きたいぶき，きらら３９７，ほしのゆめ，彩，農林２０号，キタアケ）について、上記（１）（２）と同様の、配列番号２，３で表される塩基配列の遺伝子増幅用プライマーを用いて、ＰＣＲ法を行うことにより得た、遺伝子増幅産物の塩基長を検討した。その結果（電気泳動像）を、第５図に示す（レーン１：Italica Livorno ，レーン２：はやまさり，レーン３：きたいぶき，レーン４：きらら３９７，レーン５：ほしのゆめ，レーン６：彩，レーン７：農林２０号，レーン８：キタアケ，Ｍ：分子マーカー（Φ×１７４-HaeIII ））。第５図において、被験系統の増幅遺伝子マーカーの塩基長は同一ではなかったが、通常の寒冷に対する発芽性の系統に由来する、いずれのマーカーも、高度の寒冷に対する発芽性が認められているItalica Livorno の増幅遺伝子マーカーの塩基長とは異なっていた。
【００４５】
このことにより、配列番号２，３で表される塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって、遺伝子増幅産物として得られる増幅遺伝子マーカーは、高度の寒冷に対する発芽性を有するイネの系統を選抜するマーカーとなり得ることが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、イネの生育初期の段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便に、選抜するために、イネの発芽性に関与する遺伝子に対する遺伝子マーカーが見出され、この遺伝子マーカーを用いる、寒冷に対して高度の発芽性を有するイネの選抜方法が提供される。
【００４７】
【配列表】
0004100541.tif 000004
0004100541.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＦＬＰマーカーを用いたＲＦＬＰ分析の結果と、低温条件下における発芽性についての関係を示したグラフを表した図面である。
【図２】はやまさりと、Italica Livorno の、本発明にかかわる遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す図面である。
【図３】組換え自殖系統の、本発明にかかわる遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す図面である。
【図４】増幅遺伝子マーカーの塩基長と、低温条件下における発芽性との関係を示したグラフを表した図面である。
【図５】複数の品種のイネについての、本発明にかかわる遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す図面である。
【図１】
0004100541.tif 000006
【図２】
0004100541.tif 000007
【図３】
0004100541.tif 000008
【図４】
0004100541.tif 000009
【図５】
0004100541.tif 000010