(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿蛋白溶液からα２プラスミンインヒビター（以下、α２PIと称することがある）を分離回収する工程において、下記の（a）ないし（c）の一連の工程を含むことを特徴とするα２PIの製造方法。
（a）α２PIを含有するコーンのエタノール分画法のフラクションIを出発材料とし、この上清をリジンセファロースを担体とするクロマトグラフィーに通液して、α２PIを含有する血漿蛋白溶液からプラスミノーゲンを除去する工程。
（b）さらに、上記（a）の工程を経た血漿蛋白溶液をプラスミノーゲンとの結合を利用したアフィニティクロマトグラフィーに供し、α２PIを精製する工程。
（c）さらに、疎水性リガンドを有する担体に上記（a）および（b）の工程を経たα２PIを含有する溶液を展開し、α２PIをゲルに吸着させ、これを溶出する工程。
【請求項２】
前記工程（c）のα２PIのゲルへの吸着・溶出過程において、α２PIを含有する血漿蛋白溶液に終濃度０．５〜３．０Mの塩化ナトリウムを添加し、疎水性リガンドを有する担体と結合させた後、塩化ナトリウム濃度を徐々にもしくはステップワイズで低下させることにより、疎水性リガンドに結合したα２PIを溶出・回収する工程を含む請求項1記載のα２PIの製造方法。
【請求項３】
分離精製後のα２PIを含有する溶液に、熱安定化剤を添加し調製した該溶液を凍結乾燥後、感染性夾雑ウイルスの不活化を目的とする凍結乾燥加熱工程をさらに含む請求項１または２記載のα２PIの製造方法。
【請求項４】
熱安定化剤が、ヒトアルブミン、クエン酸イオン源、炭水化物及びアミノ酸より選択される請求項３記載のα２PIの製造方法。
【請求項５】
凍結乾燥加熱工程が、60℃またはそれ以上の温度で、２４時間またはそれ以上の期間加熱する条件で実施される請求項３記載のα２PIの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、α2プラスミンインヒビター(以下、α2ＰＩと称することがある)の製造方法に関する。より詳細には、α2ＰＩを含有する血漿または血漿画分から、夾雑蛋白質含量が低減されたα2ＰＩを極めて簡便に大量生産し得る製造方法及びウイルス感染の危険性に対してより安全性の高い製剤を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
α2ＰＩは諸井と青木により単離精製されたセリンプロテアーゼ阻害活性を有する分子量６７,０００の糖蛋白質で、プラスミンを阻害することにより生理的な線溶の阻止因子として働く(Ｍｏｒｏｉ Ｍ ａｎｄ Ａｏｋｉ Ｎ, Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,１５９,ｐ.５９５６-５９６５(１９７６))。
先天的なα2ＰＩ欠損患者では、生体内でα2ＰＩが欠損すると血管損傷部位に生じた血栓の溶解作用に対する抵抗性が失われ、損傷血管が修復前に血栓が溶解し再出血することになる。後天的にも、重篤な肝臓疾患やＤＩＣ(DisseminatedIntravascular Coagulation Syndrome:播種性血管内凝固症候群)あるいは血栓溶解療法に伴って、α2ＰＩが低下し出血を起こし易くなる(出血傾向)ことが知られている。このような出血に対してα2ＰＩを補充すると血栓症を誘発することなく効果的に出血を防止できることが報告されており(Ｗｅｉｔｚ Ｊ.Ｉ. ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.,９１,ｐ.１３４３-１３５０(１９９３))、α2ＰＩ濃縮製剤の臨床応用が期待されている。
【０００３】
従来のα2ＰＩの精製法では実験室スケールの調製には適していても非常に多くの精製ステップを踏むため煩雑で且つかなりの時間を費やし、これを工業スケールでの調製に応用するには再現性や収率等に関して多くの問題点を含んでいた。例えば、世界で最初にα2ＰＩの単離に成功した諸井、青木らが実施した方法は、血漿からリジンセファロース、硫安分画、プラスミノーゲンセファロース、最後にハイドロキシアパタイトといった多くのクロマトグラフィーを組み合わせたもので非常に煩雑で時間のかかる方法であった(Ｍｏｒｏｉ Ｍ ａｎｄ Ａｏｋｉ Ｎ, Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,１５９,ｐ.５９５６-５９６５(１９７６))。さらに、上記のクロマトグラフィーにＤＥＡＥセファデックス、コンカナバリンＡ等のクロマトグラフィーあるいは分子ふるい(ゲル濾過)クロマトグラフィーを組み合わせた方法も報告されているが(Ｗｉｍａｎ Ｂ.,Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８０,ｐ.３９５-４０７(１９８１)、)なお同様の問題を含むものであった。
上記以外にも、α2ＰＩに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用したイムノアフィニティーを利用した精製法が報告されているが(Ｓｕｍｉ Ｙ ｅｔ ａｌ., Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１０２,ｐ.１０３３-１０４１(１９８９))、これらイムノアフィニティー精製の欠点として、目的物質吸着後の溶出の際の好適な方法を見出し難く、α2ＰＩにダメージを与える可能性が否定できない。また、α2ＰＩは血中に高濃度で存在するため、治療薬として必要な量をイムノアフィニティーカラムで精製しようとするとゲル容量の増大が予想され多大な困難が生じることが危惧される。
【０００４】
また、本願発明のα2ＰＩの原材料となるヒト血漿もしくは血漿画分については、例えば肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)等の血液を媒介として感染するウイルス混在の危険性は、スクリーニング技術の進歩によりその可能性が激減したとは言え完全には否定できず、α2ＰＩ製剤のこれら夾雑ウイルスの不活性化工程についても対策を構じる必要があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上述の問題点に鑑みα2ＰＩを分離取得する方法について鋭意研究し種々の方法を検討した結果、血漿から得られたα2ＰＩ含有画分の溶液を物質の疎水性の違いにより分離する疎水クロマトグラフィーを用いてα2ＰＩの精製を試みたところ、高純度のα2ＰＩを吸着溶出画分に良好に分離することができる知見を得、これを基に新規な調製方法をもたらす本願発明を完成するに至った。当該調製方法を適用した場合、従来の方法に比べて極めて簡便に且つ効率的にα2ＰＩを工業的規模で調製することができる。
さらに、製剤の感染性夾雑ウイルスの不活性化を目的として、調製したα2ＰＩ溶液に各種熱安定化剤を添加してこれを凍結乾燥し乾燥加熱処理を施した場合、α2ＰＩの性状に顕著な変化を生じることなくウイルス不活化処理が可能であるとの知見を得、安全なα2ＰＩ製剤を供し得る本願発明を達成した。
【０００６】
本願発明は、血漿もしくはα2ＰＩを含有する血漿画分からα2ＰＩを分離調製する方法、及び感染性夾雑ウイルスの不活化処理が施された安全なα2ＰＩ製剤を提供する方法に関する。本願発明の方法の主な利点は、α2ＰＩの血漿またはα2ＰＩを含有する血漿画分からの分離精製に適用し得る方法の簡便さである。本願発明の出発原材料は、Ｃｏｈｎのエタノール分画法により得られる画分またはα2ＰＩを含む濃縮物、中でもコーンのエタノール分画のフラクションＩの上清が好ましく、他の蛋白質が最初に分取されたこれらの画分の再生物を包含する。以下の記述においては便宜上、フラクションＩの上清を出発原材料例として例示して説明するが、これは本願発明を限定するものではない。
【０００７】
本願発明においては、好ましい態様として先ず前述のフラクションＩ中に含有されるプラスミノーゲンを除去する。この目的のために、例えば、フラクションＩの上清を必要とあらば適当な緩衝液に溶解し、プラスミノーゲンに親和性を有するリジンをリガンドとするリジンセファロースカラムに通過させ、プラスミノーゲンを吸着・除去し、素通り画分としてα2ＰＩ含有溶液を得る。かくして得られるプラスミノーゲン除去後溶液に対して、プラスミノーゲンとα2ＰＩとの親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィー(プラスミノーゲンセファロースカラム)もしくはプラスミノーゲンとα2ＰＩの結合部位であるプラスミノーゲンのリジンバインディングサイトＩ(ＬＢＳＩ)を調製し担体と結合させたアフィニティークロマトグラフィー(ＬＢＳＩセファロースカラム)の工程を行なう。この際、平衡化は２５ｍＭクエン酸バッファー(ｐＨ７.５)で行ない、溶出にはそのバッファーに１０ｍＭのεアミノカプロン酸を添加した緩衝液が好適な例となる。
【０００８】
前記溶出画分を用いて次の工程に進む。
前記溶出画分を、蛋白質の疎水性の違いにより分離する疎水クロマトグラフィーに供する。疎水クロマトグラフィーのリガンドとしてはブチル、オクチル、フェニル、エーテル等の各種疎水基が使用可能であり、α2ＰＩを含有する前記溶出画分をリガンドと接触させる。この工程では種々の条件を採用することができ、上記リガンドとの接触はバッチ法または連続クロマト法で実施することができる。最適な態様としては、前記疎水性リガンドを結合した各種担体をクロマトグラフィーのカラムに充填し、試料を通液後、吸着した所望のα2ＰＩを溶出させる。なお、疎水性リガンドを結合した各種担体は、ブチルトヨパール(東ソー社)、フェニルセファロース(ファルマシア社)等の商品名で市販されており、これらを簡便に利用することができる。
【０００９】
一般に、疎水性リガンド結合担体を０.５〜３.０Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ６.５〜８.０のベースバッファー中で平衡化する。次に、疎水性リガンド結合担体を担体１容量に対して溶液約５〜５００容量の割合で、α2ＰＩを含む前記溶液と接触させ、担体に吸着させる。通液後、疎水性リガンド結合担体を前記ベースバッファーで洗浄する。この際の洗浄溶液の量は一般に疎水性リガンド結合担体の容量当り約３〜１０容量である。
α2ＰＩは、ベースバッファー中の塩化ナトリウム濃度を減少させたグラジエント溶出、場合によってはステップワイズ法を用いた溶出によって好適に分取される。
【００１０】
α2ＰＩを含有する溶液の前記疎水性リガンド結合担体からの溶出に引続き、さらに、例えばＤＥＡＥセファデックス、ＱＡＥセファデックス等のアニオン交換媒体(陰イオン交換樹脂)との接触によって免疫グロブリンＧが主体である夾雑蛋白質を除去する工程を実施することが推奨される。例えば、ＱセファロースＦＦ(ファルマシア社)カラムを使用した場合、塩化ナトリウムの濃度を増加させたグラジエント溶出、場合によってはステップワイズ法を用いた溶出によって、樹脂に吸着していたα2ＰＩのみを好適に分離することができる。上述の、従来にない簡便な方法によりα2ＰＩの夾雑蛋白との分離が可能となり最終的に９０％以上の純度のα2ＰＩを得ることができる。
【００１１】
α2ＰＩ濃縮物は、治療、診断または他の用途のために製薬学的調合剤に処方することができる。静脈内投与のための調合剤に対しては、組成物を、通常、生理学的に適合し得る物質例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み且つ生理学的条件に適合し得る緩衝されたｐＨを有する水溶液中に溶解する。また、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製剤の形態を採ることも考慮され得る。なお、静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。
【００１２】
α2ＰＩ濃縮製剤は、肝炎ウイルス、ＨＩＶ等の夾雑ウイルス非感染性であることが要求される。この点においては、該製剤は夾雑ウイルス感染の危険性を減ずるために、例えば、低温加熱処理殺菌により、即ちα2ＰＩ濃縮製剤を夾雑ウイルス非感染性にするのに十分な時間と温度に、例えば２４時間またはそれ以上、好適には９６時間以上の期間、６０℃またはそれ以上の温度で加熱することによって処理することができる。この熱処理期間中のα2ＰＩを安定化するために、各種熱安定化剤、例えば、ヒトアルブミン、クエン酸イオン源、炭水化物及びアミノ酸等が単独であるいは組み合わされて添加され混在させられる。該加熱処理はα2ＰＩ含有溶液に対してまたはα2ＰＩ含有溶液を凍結乾燥処理したものの何れにに対しても施すことができるが、その効果の観点から、凍結乾燥製剤に対する処理が好ましい態様である。
【００１３】
かくして、本願発明により、血漿もしくはα2ＰＩを含有する血漿画分から工業的スケールでα2ＰＩを簡便に分離調製する方法、並びに感染性夾雑ウイルスの不活化処理が施された安全なα2ＰＩ製剤を提供することが可能となった。
以下に、調製例及び実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明は何等これらに限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
実施例の記述に先立ち、本願発明において実施されたα2ＰＩ量の検定方法について概説する。
プラスミンに対する発色基質を用いることによりα2ＰＩのプラスミン阻害能力を評価した。プラスミンによるペプチドＳ-２２５１(Ｈ-Ｖａｌ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ-ｐＮＡ)の加水分解は４０５nmの吸収を増加させる。この増加を室温において連続的に測定し単位時間当りの加水分解量を算出する。α2ＰＩの有無における吸収の直線的変化を時間と共に比較する。次いで、プラスミンおよびα2ＰＩが１：１の化学量論的に反応する事実とプラスミンの既知量に基づき、阻害剤としてのα2ＰＩの量を評価した(Wiman B, Method in Enzymology, 80,p.395-407)。
【００１５】
調製例 １
(コーンのフラクションＩ上清からの調製)
血漿プールからコーンの分画法に従いフラクションＩを調製し、その上清からα2ＰＩを精製した。先ず、そのフラクションＩの上清を２５ｍＭクエン酸バッファー(ｐＨ７.５)で平衡化したリジンセファロースカラムに通液し、素通りさせてプラスミノーゲンを吸着・除去した。次に、その素通り画分に対してプラスミノーゲンとα2ＰＩとの親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィー(ＬＢＳＩセファロースカラム)の工程を行なった。平衡化は２５ｍＭクエン酸バッファー(ｐＨ７.５)で行ない、溶出にはそのバッファーに１０ｍＭのεアミノカプロン酸を添加したものを用いた。かくして得られたα2ＰＩ含有溶液を次の疎水クロマトグラフィーの工程に供した。
【００１６】
実施例 １
コーンのフラクションＩをリジンセファロース及びＬＢＳＩセファロースを用いて精製を行なった後のα2ＰＩ溶液(調製例１で得られた溶液)に、終濃度２.５Ｍの塩化ナトリウムを添加して通液サンプルとし、ブチルトヨパール(東ソー社)を用いた疎水クロマトグラフィーを実施した。
ベースバッファーは０.０５Ｍトリス/２.５Ｍ塩化ナトリウムバッファー(ｐＨ７.５)とし、当該緩衝液で平衡化したブチルトヨパールゲルに前記サンプルを通液し、前記ベースバッファーで充分に洗浄した。その後、０.０５Ｍトリス/１.５Ｍ塩化ナトリウムバッファー(ｐＨ７.５)で吸着成分の溶出を行ない、さらに、０.０５Ｍトリスバッファー(ｐＨ７.５)によって溶出した。なお、ゲルの再生は６Ｍの尿素を用いて行なった。
今回のクロマトパターンと各ピークのＳＤＳ-ＰＡＧＥのパターンを図１及び図２に示した。図中、画分Ａは素通り画分、画分Ｂは１.５Ｍ塩化ナトリウム含有溶液溶出画分、画分Ｃは塩化ナトリウム非含有溶液溶出画分及び画分Ｄはゲル再生用溶液溶出画分である。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥの成績から、素通り画分にはＩｇＧが、１.５Ｍ塩化ナトリウム画分にはα2ＰＩが、塩化ナトリウム非含有画分には分解を受けたフィブリノーゲンが主として存在することが確認された。また、段階的溶出(ステップワイズ)ではなく、２.５〜０Ｍ塩化ナトリウムグラジエント溶出で展開しても、同様のクロマトパターンが得られた。
【００１７】
実施例 ２
(ＱセファロースＦＦを用いたα2ＰＩの精製)
実施例１の疎水クロマトゲルを用いたクロマトグラフィーにより得られたα2ＰＩ溶液を５０ｍＭトリス/７５ｍＭ塩化ナトリウムバッファー(ｐＨ８.０)で透析し、同バッファーで平衡化したＱセファロースＦＦカラム(ファルマシア社)に通液した。充分洗浄した後、５０ｍＭトリス/１５０ｍＭ塩化ナトリウムバッファー(ｐＨ８.０)で、所望のα2ＰＩを溶出した。かくして得られたα2ＰＩ標品のＳＤＳ-ＰＡＧＥの成績を図３に示す。
また、１０ＬのコーンのフラクションＩ上清からＬＢＳＩセファロースでのアフィニティークロマトグラフィー(ステップ１)、ブチルトヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー(ステップ２)、及びＱセファロースＦＦでの陰イオン交換クロマトグラフィー(ステップ３)の各々のクロマトグラフィーによりα2ＰＩを精製した際の成績を表１にまとめる。
【００１８】
【表１】
0004105249.tif 000002
【００１９】
本願発明の好適な実施態様である前述のステップ１からステップ３の各工程を実施することにより、不純物を殆ど含まない(図３参照のこと)α2ＰＩを３０％以上の収率で得ることができた。
【００２０】
実施例 ３
(フェニルセファロースを用いたα2ＰＩの精製)
ブチルトヨパールの代わりにフェニルセファロース(ファルマシア社)を用いて精製を試みた。平衡化には５０ｍＭトリス/２Ｍ塩化ナトリウムバッファー(ｐＨ７.５)を用い、α2ＰＩを含む溶液に終濃度２Ｍの塩化ナトリウムを添加してカラムに通液した。
溶出は２〜０Ｍ塩化ナトリウムグラジエントにより行なった。その結果は、実施例１のブチルトヨパールを用いた場合と同様の溶出パターンを示した。溶出部分に非常に非活性の高い部分が分離回収され、分離にはブチルトヨパールのみでなくその他の疎水性のゲルが使用可能であることが示された。
【００２１】
実施例 ４
(凍結乾燥加熱によるウイルス不活化効果)
実施例２で得られたα2ＰＩ溶液を蛋白質濃度が１％になるように限外濾過で濃縮した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム/０.１Ｍ塩化ナトリウム/２.５％グリシンバッファー(ｐＨ７.５)で透析後、α2ＰＩを種々の濃度で凍結乾燥し、その後感染性夾雑ウイルス不活化を目的とする６５℃９６時間もしくは１４４時間の加熱処理を行なった。成績を表２に示す。
【００２２】
【表２】
0004105249.tif 000003
【００２３】
本願発明のα2ＰＩ製剤は、６５℃９６時間の条件での加熱処理後においても９５％以上のα2ＰＩ活性を保持しており失活の程度はごく僅かであった。また、ＨＰＬＣ等の分析から加熱処理前後でα2ＰＩの性状には顕著な差は認められなかった。
【００２４】
同時にＨＣＶ(Ｃ型肝炎ウイルス)のモデルウイルスであるＢＶＤＶ(牛ウイルス性下痢症ウイルス)の培養液を、前出の凍結乾燥前の組成のα2ＰＩ溶液に１／１０容量スパイク後、凍結乾燥して６５℃１４４時間までの加熱を行なった。経時的にバイアルを抜取り、溶解して該溶液を段階希釈しこれらを感受性細胞である例えばＢＴ細胞に接種してプラーク形成に基づく５０％感染終末点(ＴＣＩＤ50)法によってウイルス不活化を評価した。結果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
0004105249.tif 000004
【００２６】
ＨＣＶのモデルウイルスであるＢＶＤＶは、凍結乾燥から２４時間以上の加熱工程全体で１０5(TCID50/ml)以上の不活化が達成されることが確認され、本願発明の調製方法によって調製されたα2ＰＩ標品はＣ型肝炎ウイルス等夾雑ウイルスに対する安全性が高いことが結論される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  血漿画分を出発原料とし、ＬＢＳＩセファロースカラムにより部分精製したα2ＰＩ含有溶液を、疎水クロマトグラフィー(ブチルトヨパールカラム)に通液した場合のクロマトグラムを示す図である。
【図２】  α2ＰＩ含有溶液を疎水クロマトグラフィー(ブチルトヨパールカラム)に通液して得られる各種ピークのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる解析結果を示す電気泳動図(図面代用写真)である。
【図３】  α2ＰＩ含有溶液を疎水クロマトグラフィー(ブチルトヨパールカラム)に通液して得られるα2ＰＩ含有溶出画分を、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー(ＱセファロースＦＦカラム)に通液して得られた画分のＳＤＳ-ＰＡＧＥによる解析結果を示す電気泳動図(図面代用写真)である。
【図１】
0004105249.tif 000005
【図２】
0004105249.tif 000006
【図３】
0004105249.tif 000007