(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１で表される化合物群から選択される化合物。
【化１】
0004116332.tif 000018
（ここで、
（１）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は２−フルオロフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（２）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は３−フルオロフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（３）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−フルオロフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（４）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は３−ブロモフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（５）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（６）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は１−ナフチル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（７）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はメチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は３−ブロモフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（８）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はメチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（９）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はメチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−アミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（１０）Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−アミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（１１）Ｒ異性体であって、Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（１２）Ｒ異性体であって、Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は１−ナフチル、Ｒ４は２−ジメチルアミノエチル、Ｒ５−Ｒ８は水素である。
（１３）Ｒ異性体であって、Ｒ１はベンジル、Ｒ２はエチル、Ｒ２’は水素、Ｒ３は４−ブロモフェニル、Ｒ４は２−アミノエチル、Ｒ５、Ｒ６及びＲ８は水素、Ｒ７は塩素である。）
【請求項２】
ＫＳＰ阻害剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＫＳＰキネシン活性に関連する細胞増殖性疾患または病気の治療に使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
疾患または病気が、ガン、異常増殖、再狭窄、心臓肥大、免疫異常及び炎症からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、ＫＳＰキネシン活性に関連する細胞増殖性疾患または病気を有するヒト以外の患者を治療する方法。
【請求項６】
疾患または病気が、ガン、異常増殖、再狭窄、心臓肥大、免疫異常及び炎症からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＫＳＰキネシンと請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を接触させることを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＫＳＰキネシンの阻害方法。
【請求項８】
ＫＳＰキネシンモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
（ａ）キネシンと、生体活性物質候補と、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を結合させるステップと、
（ｂ）キネシンの活性に対する、生体活性物質候補の影響を測定するステップ、
を備える方法。
【請求項９】
ＫＳＰキネシンと結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）キネシンと、生体活性物質候補と、標識された請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を結合させるステップと、
（ｂ）生物活性物質候補とキネシンの結合を測定するステップ、
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、有糸分裂キネシンKSPの阻害剤であり、ガン、異常増殖、再狭窄、心臓肥大、免疫異常、炎症等の細胞増殖性疾患の治療に有用であるキナゾリノン誘導体に関する。
【０００２】
【発明の背景】
抗マラリア性を有していることで知られているアジアの植物から、キナゾリンアルカロイドである3-[s-ケト-ガンマ-(3-ヒドロキシ-2-ピペリジル)-プロピル]-4-キナゾロンの構造が明らかになったことにより、１９５０年代初めに、キナゾリン誘導体の医薬品化学に関する関心が高まった。更なる抗マラリア剤を捜し求めて、様々な置換キナゾリンが合成された。特に重要なのは、2-メチル-3-o-トリル-4-(3H)-キナゾリノン誘導体の合成であった。メタカロンとという名前で知られているこの化合物は、マラリア原虫に対しては効果がなかったが、強力な催眠剤であることがわかった。
【０００３】
メタカロンの導入と、その催眠効果の発見以来、キナゾリノン系の化合物の薬理作用が研究されてきた。現在では、キナゾリノン並びにその誘導体に、催眠、鎮静、鎮痛、抗痙攣、鎮咳、抗炎症作用等の、幅広い生物学的特性があることがわかっている。
【０００４】
キナゾリノン誘導体の生物学的利用に関しては、様々な記載がなされている。例えば、米国特許5,147,875号には、気管支拡張作用を有する2-(置換フェニル)-4-オキソキナゾリンが記載されている。また、米国特許3,723,432号, 3,740,442号および3,925,548号には、抗炎症剤として有用な1-置換-4-アリール-2(lH)-キナゾリノン誘導体類が記載されている。さらに、ヨーロッパ特許公報EP 0 056 637 B1には、高血圧の治療に用いられる。4(3H)-キナゾリノン誘導体類が記載されている。ヨーロッパ特許公報EP 0 884 319 Al には、神経変性、精神異常、麻薬およびアルコールによって引き起こされる中枢神経系ならびに末梢神経系異常の治療に用いられるキナゾリン-4-オン誘導体の薬剤組成が記載されている。
【０００５】
キナゾリノンは、ガンを含む細胞増殖性異常の治療に用いられる、増え続ける治療薬の一種である。例えば、ＰＣＴ ＷＯ 96/06616には、血管滑面細胞増殖を阻害するキナゾリノン誘導体を含む薬剤組成が記載されている。PCT WO 96/19224では、これと同じキナゾリノン誘導体を用いて、糸球体間質細胞増殖を阻害する。米国特許4,981,856号、5,081,124号および5,280,027号では、キナゾリノン誘導体を用いて、デオキシウリジン１リン酸のメチル化を触媒し、DNA合成に必要なチミジン１リン酸を生成する酵素である、チミジル酸生成酵素を阻害する。米国特許5,747,498号および5,773,476号では、チロシンレセプターキナーゼの過剰活性あるいは不適当な活性を特徴とするガンの治療にキナゾリノン誘導体を用いている。米国特許5,037,829号では、（1H-アゾ-l-イルチル）置換キナゾリン組成を、上皮細胞に生じるガンの治療に用いている。ＰＣＴ ＷＯ 98/34613は、新血管形成を軽減し、悪性腫瘍を治療するのに有用なキナゾリノン誘導体を含む組成を記載している。米国特許5,187,167号は、抗腫瘍活性を有するキナゾリン-4-オン誘導体を含む薬剤組成を記載している。
【０００６】
ガンの治療に用いられる他の治療薬には、タキサンやビンカ・アルカロイドがある。タキサンおよびビンカ・アルカロイドは、様々に細分化された細胞組織中に存在する微小管に作用する。微小管は、有糸分裂紡錘体の主要構成要素である。有糸分裂紡錘体は、細胞分裂により生じた２つの娘細胞の各々に、ゲノムの複製を分配する役割を果たす。これらの薬剤で有糸分裂紡錘体が破壊されることにより、ガン細胞の分裂を阻害して、ガン細胞死を誘発する、と推測される。一方、微小管は、神経処理プロセスにおける細胞内輸送の経路を含む、他の細胞組織を形成する。これらの薬剤は、有糸分裂紡錘体を特異的に標的とするわけではないため、副作用があり、その効果は限られたものである。
【０００７】
ガンの治療に用いられる薬剤の投与による副作用を軽減することが可能になれば、治療上大きな意味を持つため、これらの薬剤の特異性を向上させることに多大なる関心が集まっている。従来、ガン治療の目覚しい進歩は、新規な機構で作用する治療薬の開発に結びついてきた。この例として、タキサンやカンプトセシン類のトポイソメラーゼＩ阻害剤が挙げられる。このような観点から、有糸分裂キネシンは、新しい抗がん剤として魅力的な標的である。
【０００８】
有糸分裂キネシンは、有糸分裂紡錘体の組み立てと機能に不可欠な酵素であるが、神経処理プロセス等においては、通常、他の微小管組織のようには働かない。有糸分裂キネシンは、有糸分裂のすべての段階で本質的な役割を果たす。この酵素は、ATPの加水分解により放出されるエネルギーを、微小管に沿った細胞運搬の指向性移動を推進する物理的な力に変換する「分子モータ」である。この仕事に十分な触媒領域は、約３４０個のアミノ酸からなる小さな組織である。有糸分裂の間、キネシンは、微小管を組織化し、有糸分裂紡錘体である双極性構造を形成する。キネシンは、紡錘体微小管に沿った染色体の移動と、有糸分裂の所定の段階に結びついた有糸分裂紡錘体における構造変化とを仲介する。有糸分裂キネシン機能を実験的に混乱させることにより、有糸分裂紡錘体の奇形や機能障害が引き起こされ、場合によっては、その結果、細胞周期の停止や細胞死が起こる。
【０００９】
KSPは、同定されている有糸分裂キネシンの一種である。KSPは、逆行性ホモ二量体からなる双極性ホモ四量体を構成するプラス端指向性微小管モータの進化保存キネシン亜属に属する。有糸分裂の間、KSPは、有糸分裂紡錘体の微小管に結合する。KSPに対する抗体をヒト細胞中にマイクロインジェクションすることにより、前中期における紡錘体の極分離を妨げ、その結果、単極性紡錘体が形成され、有糸分裂を停止させ、プログラムされた細胞死を誘発する。KSP並びにヒト以外の生物の体内に存在するキネシンは、逆行性微小管をたばねて、互いに滑走させて、紡錘体の２つの極を分離させる。KSPは、さらに、後期Ｂにおいて、紡錘体の伸張を仲介し、紡錘体極に微小管を集める役割を果たすと考えられる。
【００１０】
ヒトKSP(HsEg5とも称する)は、[Blangy, et al., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio et al., J.  Cell Biol., 135:339-414 (1996); Blangy, et al., J Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Whitehead and Rattner, J. Cell Sci., 111:2551-61 (1998); Kaiser, et al., JBC 274:18925-31 (1999); GenBank受理番号： X85137, NM004523 and U37426]に記載され、また、KSP遺伝子フラグメント(TRIP5)に関しては、[Lee, et al., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); GenBank受理番号： L40372]  に記載されている。さらに、ゼノプス（ツメガエル属のカエル）KSP同族体(Eg5)並びにショウジョウバエKLP61 F/KRP1 30に関しても報告されている。
【００１１】
有糸分裂キネシンは、新規な有糸分裂化学療法剤の発見並びに開発における魅力的なターゲットである。従って、本発明は、有糸分裂キネシンKSPの阻害に有用な方法並びに組成を提供することを目的とする。
【００１２】
【発明の概要】
上記の目的に従い、本発明は、増殖性細胞疾患の治療に利用可能な組成並びに方法を提供する。この組成とは、KSP阻害剤、特にヒトKSP阻害剤である。
【００１３】
本発明は、KSPキネシンを阻害するための方法、KSPキネシンの阻害に有用な化合物に関する。本発明では、以下に示す化合物群から選択される化合物が用いられる。
【００１４】
【化１０】
0004116332.tif 000002
【００１５】
ここで、
R1は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R2およびR2’は、水素、アルキル、オキサアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから独立に選択され、あるいは、R2およびR2’は結合して、３員環ないし７員環を形成し、
R3は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、オキサアルキル、オキサアルキルアリール、置換オキサアルキルアリール、R15O-、並びに、R15-NH-から選択され、
R3'は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、並びに、R15-NH-から選択され、
R3''は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R4は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、並びに、R16-アルキレン-から選択され、
R5、R6、R7およびR8は、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、フルオロアルキル、ニトロ、ジアルキルアミノ、アルキルスルフォニル、アルキルスルホンアミド、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアリール、アルキルチオ、カルボキシアルキル、カルボキサミド、アミノカルボニル、アリール、並びに、ヘテロアリールから独立に選択され、
R15は、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R16は、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、N-ヘテロシクリル、並びに、置換N-ヘテロシクリルから選択される。
【００１６】
本発明の化合物を利用した治療に効果がある疾患並びに異常には、ガン、異常増殖、再狭窄、心臓肥大、免疫異常、炎症等が挙げられる。
【００１７】
本発明は、さらに、KSPキネシンに結合する化合物、例えば、本発明の化合物の結合を置換する、あるいは、結合と競争する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、標識された本発明の組成と、KSPキネシンと、少なくとも一つの生体活性物質候補とを結合させるステップと、KSPキネシンに対する前記生体活性物質候補の結合を測定するステップと、を備える。
【００１８】
また、本発明は、KSPキネシン活性のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。この方法は、本発明の組成と、KSPキネシンと、少なくとも一つの生体活性物質候補とを結合させるステップと、KSPキネシン活性対する前記生体活性物質候補の影響を測定するステップと、を備える。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、有糸分裂キネシンのモジュレーターであるキナゾリノン中心構造に基づく、新規な化合物群に関する。他のキネシン（例えば、輸送キネシン）に影響を与えることなく、有糸分裂キネシンを阻害あるいは調節することにより、細胞増殖を特異的に阻害することができる。すなわち、本発明は、有糸分裂キネシン機能を混乱させることにより、有糸分裂紡錘体の奇形あるいは機能障害を引き起こし、その結果、細胞周期を止め、細胞死をもたらすという現象を利用したものである。ヒトKSPキネシンを阻害する方法は、本発明の阻害剤を、KSPのフラグメントと変異体とを含むKSPキネシン、特に、ヒトKSPキネシンに接触させるステップを備える。ここで、阻害とは、例えば、KSPキネシンのATP加水分解活性の阻害、および/あるいは、紡錘体形成活性の阻害であり、これにより、有糸分裂紡錘体が破壊される。あるいは、減数分裂紡錘体を破壊するようにしてもよい。
【００２０】
本発明は、細胞増殖に関係する異常の治療に用いられる、有糸分裂キネシン、特に、KSPの阻害剤およびモジュレーターを開発することを目的とする。従来、新しい機構で働く治療薬を同定することにより、一種の細胞増殖性異常であるガンの治療効果が飛躍的に向上してきた。これには、例えば、微小管形成過程で作用すると考えられるタキサン系薬剤のみならず、カンプトセシン系のトポイソメラーゼI阻害剤も含まれる。本明細書に記載される組成並びに方法は、異なった選択性を有し、これらに限定されるものではないが、ガン、異常増殖、再狭窄、心臓肥大、免疫異常、炎症を含む、細胞増殖性疾患の治療に好適に用いられる。従って、本発明は、以下の化合物を用いる方法に関する。
式１ａに示すキナゾリノンアミド
【００２１】
【化１１】
0004116332.tif 000003
【００２２】
式１ｂに示すキナゾリノンスルホンアミド
【００２３】
【化１２】
0004116332.tif 000004
【００２４】
並びに、式１ｃおよび１ｄに示すキナゾリノンアミン
【００２５】
【化１３】
0004116332.tif 000005
【００２６】
【化１４】
0004116332.tif 000006
【００２７】
ここで、
R1は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R2およびR2’は、水素、アルキル、オキサアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから独立に選択され、あるいは、R2およびR2’は結合して、３員環ないし７員環を形成し、
R3は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、オキサアルキル、オキサアルキルアリール、置換オキサアルキルアリール、R15O-、並びに、R15-NH-から選択され、
R3'は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、並びに、R15-NH-から選択され、
R3''は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R4は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、並びに、R16-アルキレン-から選択され、
R5、R6、R7およびR8は、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、フルオロアルキル、ニトロ、ジアルキルアミノ、アルキルスルフォニル、アルキルスルホンアミド、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアリール、アルキルチオ、カルボキシアルキル、カルボキサミド、アミノカルボニル、アリール、並びに、ヘテロアリールから独立に選択され、
R15は、アルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、置換アルキルアリール、置換ヘテロアリール、並びに、置換アルキルヘテロアリールから選択され、
R16は、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、N-ヘテロシクリル、並びに、置換N-ヘテロシクリルから選択される。
【００２８】
先に示した属並びにその亜属に含まれるすべての化合物は、キネシン阻害剤として有効であるが、その化合物がすべて新規な化合物であるわけではない。特に、尿素類（すなわち、R3がR15NHである化合物)に関しては、コレシストキニン活性を変える薬剤として、米国特許5,756,502号に開示されている。特許請求の範囲から特定の化合物を除外したのは、機能的には発明の概念の一部であるが、本発明の範囲と無関係な理由で特許性がない対象に対する主張を避けるという、出願人の意図によるものである。
【００２９】
定義
アルキルは、直鎖、分岐、環状炭化水素構造並びにその組み合わせを含む。低級アルキルは、１ないし５の炭素原子を含むアルキル基である。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、s-およびt-ブチルが挙げられる。アルキル基は、C20以下であることが望ましい。アルキル基がC13以下であることが、さらに望ましい。シクロアルキルは、アルキルの一種であり、３ないし１３の炭素原子を含む環状炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、ノルボルニル、アダマンチルが挙げられる。また、アルキルは、アルカニル、アルケニル、並びに、アルキニル残基を意味し、これには、シクロヘキシルメチル、ビニル、アリル、イソプレニル等が含まれる。アルキレンは、アルキルと同様の残基を意味するが、二つの結合点を持つ。アルキレンの例としては、エチレン(-CH2CH2-)、プロピレン(-CH2CH2CH2-)、ジメチルプロピレン(-CH2C(CH3)2CH2-)、シクロヘキシルプロピレン(-CH2CH2CH(C6H13)-)が挙げられる。所定数の炭素原子を有するアルキル残基の名称を挙げた場合には、同数の炭素原子を有する幾何異性体をすべて含むものとする。例えば、「ブチル」には、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、t-ブチルが含まれ、「プロピル」には、n-プロピルとイソプロピルが含まれる。
【００３０】
アルコキシあるいはアルコキシルは、酸素を介して親構造に結合する、１ないし８の炭素原子を含む直鎖、分岐、環状構造の基、並びに、それらの組み合わせを意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピロキシが挙げられる。低級アルコキシは、１ないし４の炭素原子を含む同様の基である。
【００３１】
アシルは、カルボニル官能基を介して親構造に結合する、１ないし８の炭素原子を含む直鎖、分岐、環状構造の基、並びに、飽和、不飽和、芳香族、並びに、それらの組み合わせを意味する。親構造に対する結合点がカルボニルのままである限り、アシル残基中の一つあるいは複数の炭素を、窒素、酸素、あるいは、イオウに置き換えたものでもよい。例としては、アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルが挙げられる。低級アシルは、１ないし４の炭素原子を含む同様の基である。
【００３２】
アリールおよびヘテロアリールは、O、N、あるいはSから選択された０ないし３のヘテロ原子を含む、５員環あるいは６員環の芳香族あるいはヘテロ芳香族環を意味する。あるいは、O、N、あるいはSから選択された０ないし３のヘテロ原子を含む、９員環あるいは１０員環のバイサイクリック芳香族あるいはヘテロ芳香族環系を意味する。また、あるいは、O、N、あるいはSから選択された０ないし３のヘテロ原子を含む、１３員環あるいは１４員環のトリサイクリック芳香族あるいはヘテロ芳香族環系を意味する。６員環ないし１４員環の芳香族炭素環の例としては、ベンゼン、ナフタレン、インダン、テトラリン、フルオレンが挙げられ、５員環ないし１０員環の芳香族ヘテロ環の例としては、イミダゾール、ピリジン、インドール、チオフェン、ベンゾピラノン、チアゾール、フラン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、ピリミジン、ピラジン、テトラゾール、ピラゾールが挙げられる。
【００３３】
アルキルアリールは、アリール部がアルキル残基を介して親構造に結合する残基を意味する。この例としては、ベンジル、フェネチル、フェニルビニル、フェニルアリル等が挙げられる。オキサアルキルおよびオキサアルキルアリールは、１ないし複数のメチレンが酸素に置換された、アルキルおよびアルキルアリール残基を意味する。オキサアルキルおよびオキサアルキルアリール残基の例としては、エトキシエトキシエチル(3,6-ジオキサオクチル)、ベンジルオキシメチル並びにフェノキシメチルが挙げられる。一般に、ポリエチレングリコール等のグリコールエーテルも、このグループにはいる。アルキルヘテロアリールは、ヘテロアリール部がアルキル残基を介して親構造に結合する残基を意味する。この例としては、フラニルメチル、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチル等が挙げられる。
【００３４】
ヘテロ環は、１ないし４の炭素原子が、酸素、窒素、イオウ等のヘテロ原子に置換された、シクロアルキルあるいはアリール残基を意味する。本発明の範囲内のヘテロ環の例としては、イミダゾリン、ピロリジン、ピラゾール、ピロール、インドール、キノリン、イソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ベンゾフラン、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール（一般に、置換基として存在する場合、メチレンジオキシフェニルと称される）、テトラゾール、モルホリン、チアゾール、ピリジン、ピリダジン、チオフェン、フラン、オキサゾール、オキサゾリン、イソキサゾール、ジオキサン、テトラヒドロフラン等が挙げられる。“N-ヘテロシクリル”は、置換残基として用いられる、窒素を含むヘテロ環を意味する。ヘテロシクリルという単語は、ヘテロシクリルの一部であるヘテロアリールも含んでいる。N-ヘテロシクリル残基の例としては、4-モルホニリル、4-チオモルホニリル、1-ピペリジニル、1-ピロリジニル、3-チアゾリジニル、ピペラジニル、4-(3,4-ジヒドロベンゾキサジニル)等が挙げられられる。また、置換ヘテロシクリルの例としては、4-メチル-1-ピペラジニルおよび4-ベンジル-1-ピペリジニルが挙げられる。
【００３５】
置換アルキル、アリール、並びに、ヘテロアリールは、水素原子が、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキレンジオキシ（例えば、メチレンジオキシ）、フルオロアルキル、カルボキシ(-COOH)、カルボアルコキシ(すなわち、アルコキシRCOO-)、カルボキシアルキル(-COOR)、カルボキサミド、スルフォンアミドアルキル、スルフォンアミドアリール、アミノカルボニル、ベンジルオキシカルボニルアミノ(CBZ-アミノ)、シアノ、カルボニル、ニトロ、ジアルキルアミノ、アルキルアミノ、アミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルフォニル、アルキルスルフォンアミド、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルフォニル、アミジノ、フェニル、ベンジル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、フェノキシ、ベンジルオキシ、あるいは、ヘテロアリールオキシで置換された、アルキル、アリール、あるいは、ヘテロアリールを意味する。本発明の目的を達成するために、置換アルキルは、さらに、オキサアルキル残基、すなわち、１ないし複数の炭素原子が酸素で置換されたアルキル残基を含む。
【００３６】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、あるいは、ヨウ素の何れかを意味する。ただし、フッ素、塩素、あるいは、臭素が望ましい。ジハロアリール、ジハロアルキル、トリハロアリール等は、同一または異なった複数のハロゲンで置換されたアリールおよびアルキルを意味する。例えば、4-クロロ-3-フルオロフェニルは、ジハロアリールの一つである。
【００３７】
本明細書に記載する化合物のうち多くが、１ないし複数の不斉中心（例えば、R2およびR2’が結合した炭素）を有し、光学異性体、ジアステレオマー、絶対的な原子空間配置(R)-あるいは(S)-という形で定義可能な他の立体異性体を生じさせる。本発明には、ラセミ混合物、光学的純体、中間混合物を含む、このような可能な異性体全てが含まれる。光学活性(R)-および(S)-異性体は、キラルシントンあるいはキラル剤を用いて生成してもよいし、あるいは、周知の手法を用いて、分離するようにしてもよい。本明細書に記載される化合物が、オレフィン性二重結合あるいは他の幾何不斉中心を有する場合、特に記載しない限り、その化合物には、EおよびZ幾何異性体が含まれる。また、互変異性型も、これに含まれる。
【００３８】
必要に応じて、結晶化等により分離可能なジアステレオ異性体塩あるいは錯体を形成する、結晶化、ガス液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等により分離可能なジアステレオ異性体誘導体を形成する、一つの光学異性体をその光学異性体特異性試薬と選択的に反応、例えば、酵素酸化あるいは還元させた後、変性光学異性体と非変性光学異性体とを分離する、あるいは、例えば、キラル配位子が結合したシリカのようなキラル担体やキラル溶媒の存在下等のキラル環境でのガス液体クロマトグラフィーあるいは液体クロマトグラフィー等の、当業者に周知の方法で、R-異性体とS-異性体を分離するようにしてもよい。上述した分離手法の何れかで所望の光学異性体を他の化学構造体に換えた場合、所望の光学異性型を遊離するステップが必要な場合もある。光学活性試薬、基質、触媒または溶媒を用いて不斉合成を行う、あるいは、不斉形質転換により一つの光学活性体を別の光学活性体に換えることにより、所定の光学活性体を合成するようにしてもよい。図４に、光学活性出発物質からの合成の例を示す。
【００３９】
当業者に容易に理解されるように、２つの隣接するR2基が、融合して環状構造を形成するものでもよい。融合した環状構造が、ヘテロ原子を含むものでもよいし、１ないし複数の置換基"R".で置換されたものでもよい。さらに、シクロアルキル（すなわち、飽和環状構造）に関しては、各炭素位置が、２つの置換基RおよびR'をもつものでもよい。
【００４０】
構造式１ａ、１ｂ、１ｃ並びに１ｄを考慮に入れ、ただし、構造式１ａを中心に考えた場合、R1は、水素、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルキルアリール、および、置換アルキルアリールから選択されることが望ましい。
【００４１】
R1は、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、ナフチル、および置換フェニルから選択されることが望ましい。
【００４２】
R1を、水素、エチル、プロピル、メトキシエチル、ナフチル、フェニル、ブロモフェニル、クロロフェニル、メトキシフェニル、エトキシフェニル、トリル、ジメチルフェニル、クロロフルオロフェニル、メチルクロロフェニル、エチルフェニル、フェネチル、ベンジル、クロロベンジル、メチルベンジル、メトキシベンジル、シアノベンジル、ヒドロキシベンジル、テトラヒドロフラニルメチル、および(エトキシカルボニル)エチルか選択することが望ましい。
【００４３】
R2が水素、アルキルあるいは置換アルキルであることが望ましい。当業者に容易に理解されるように、構造１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄは、R2が結合した炭素に、潜在的なキラル中心を有する。すわち、R2位置は、２つの置換基R2およびR2’を持つことが可能である。R2およびR2'基は、同一でもよいし、異なっていてもよい。異なっている場合には、組成がキラルになる。R2およびR2'が異なる場合、単一の非水素R2基のみを用いるのが望ましい。本発明は、純粋な光学異性体と、ラセミ混合物を含む光学異性体の混合物の利用を検討するものである。ただし、一般には、ほぼ光学的に純粋なユートマーの利用が好ましい。
【００４４】
さらに、R2が、水素、低級アルキルおよび置換低級アルキルから選択され、R2’が水素であることが望ましい。もっとも望ましくは、R2を、水素、メチル、エチル、プロピル、メチルチオエチル、アミノブチル、(CBZ)アミノブチル、シクロヘキシルメチル、ベンジルオキシメチル、メチルスルフィニルエチル、メチルスルフィニルメチル、ヒドロキシメチル、ベンジル、並びにインドリルメチルから選択する。
【００４５】
さらに、R3を、アルキル、置換アルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アリール、置換アリール、置換オキサアルキルアリール、R15O-およびR15-NH-から選択し、R15がアルキル、アリールおよび置換アリールから選択することが望ましい。
【００４６】
R3がR15NHでない場合には、R3をC1ないしC13アルキル、置換低級アルキル、フェニル、ナフチル、１ないし複数のハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、メチレンジオキシ、あるいは、トリフルオロメチルで置換したフェニル、ビフェニリル、ベンジル、フェノキシメチル、ハロフェノキシメチル、フェニルビニル、ヘテロアリール、低級アルキルで置換したヘテロアリール、並びに、ベンジルオキシメチルから選択することが望ましい。
【００４７】
R3がR15NHでない場合、もっとも望ましくは、R3を、エチル、プロピル、クロロプロピル、ブトキシ、ヘプチル、ブチル、オクチル、トリデカニル、(エトキシカルボニル)エチル、ジメチルアミノエチル、ジメチルアミノメチル、フェニル、ナフチル、ハロフェニル、ジハロフェニル、シアノフェニル、ハロ(トリフルオロメチル)フェニル、クロロフェノキシメチル、メトキシフェニル、カルボキシフェニル、エチルフェニル、トリル、ビフェニリル、メチレンジオキシフェニル、メチルスルフォニルフェニル、メトキシクロロフェニル、クロロナフチル、メチルハロフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ブチルフェニル、ペンチルフェニル、メチルニトロフェニル、フェノキシメチル、ジメトキシフェニル、フェニルビニル、ニトロクロロフェニル、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ビス(トリフルオロメチル)フェニル、ベンジルオキシメチル、ベンジル、フラニル、ベンゾフラニル、ピリジニル、インドリル、メチルピリジニル、キノリニル、ピコリニル、ピラゾリル、並びに、イミダゾリルから選択する。
【００４８】
R3がR15NHの場合には、R15を低級アルキル、シクロヘキシル、フェニル、並びに、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、あるいは、低級アルキルチオで置換したフェニルから選択することが望ましい。
【００４９】
R3がR15NHである場合、もっとも望ましくは、R15が、イソプロピル、ブチル、シクロヘキシル、フェニル、ブロモフェニル、ジクロロフェニル、メトキシフェニル、エチルフェニル、トリル、トリフルオロメチルフェニル、あるいは、メチルチオフェニルである。
【００５０】
R4を、アルキル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および、R16-アルキレン-から選択し、R16をアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、並びに、N-ヘテロシクリルから選択することが望ましい。
【００５１】
R4を、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロヘキシル、ヒドロキシ、低級アルコキシあるいは低級アルキルで置換されたフェニル、ベンジル、ヘテロアリールメチル、ヘテロアリールエチル、ヘテロアリールプロピル、並びに、R16-アルキレン-から選択し、ここで、R16が、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ(低級アルキル)アミノ、低級アルコキシ、あるいは、N-ヘテロシクリルであることが望ましい。
【００５２】
もっとも望ましくは、R4をメチル、エチル、プロピル、ブチル、シクロヘキシル、カルボキシエチル、カルボキシメチル、メトキシエチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ジメチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、ジエチルアミノエチル、ジエチルアミノプロピル、アミノプロピル、メチルアミノプロピル、2,2-ジメチル-3-(ジメチルアミノ)プロピル、1-シクロヘキシル-4-(ジエチルアミノ)ブチル、アミノエチル、アミノブチル、アミノペンチル、アミノヘキシル、アミノエトキシエチル、イソプロピルアミノプロピル、ジイソプロピルアミノエチル、1-メチル-4-(ジエチルアミノ)ブチル、(t-Boc)アミノプロピル、ヒドロキシフェニル、ベンジル、メトキシフェニル、メチルメトキシフェニル、ジメチルフェニル、トリル、エチルフェニル、(オキソピロリジニル)プロピル、(メトキシカルボニル)エチル、ベンジルピペリジニル、ピリジニルエチル、ピリジニルメチル、モルホニリルエチル モルホニリルプロピル、ピペリジニル、アゼチジニルメチル、アゼチジニルプロピル ピロリジニルエチル、ピロリジニルプロピル、ピペリジニルメチル、ピペリジニルエチル、イミダゾリルプロピル、イミダゾリルエチル、(エチルピロリジニル)メチル、(メチルピロリジニル)エチル、(メチルピペリジニル)プロピル、(メチルピペラジニル)プロピル、フラニルメチル、並びに、インドリルエチルから選択する。
【００５３】
また、R5が水素あるいはハロゲンであり、R6が水素、メチルあるいはハロゲンであり、R7が水素、ハロゲン、メチルあるいはトリフルオロメチルであり、R8が水素あるいはハロゲンであることが望ましい。
【００５４】
特に好適な例では、R1がベンジルあるいはハロベンジルであり、R2がエチルおよびプロピルから選択され、R2’が水素、R3が置換フェニル、R3'が置換フェニル、R3''が置換フェニル、R4が-(CH)mOHあるいは-(CH2)pR16であり、ここで、mは２あるいは３、pは１ないし３で、R5が水素、R6が水素、R7がハロゲン、R8が水素、R16がアミノ、プロピルアミノ、並びに、アゼチジニルから選択される。
【００５５】
構造式１ｂのスルフォンアミドを主に考えた場合、R1を、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、および、置換フェニルから選択し、R2を水素および低級アルキルから選択し、R2’が水素であり、R3'を、C1ないしC13アルキル、フェニル、ナフチル、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、メチレンジオキシ、あるいは、トリフルオロメチルで置換されたフェニル、ビフェニリル、並びに、ヘテロアリールから選択し、R4を低級アルキル、シクロヘキシル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、あるいは、低級アルキルで置換されたフェニル、ベンジル、ヘテロアリールメチル、ヘテロアリールエチル、ヘテロアリールプロピル、ヘテロアリールエチル、ヘテロアリールプロピル、並びに、R16-アルキレンから選択し、ここで、R16がジ(低級アルキル)アミノ、(低級アルキル)アミノ、アミノ、低級アルコキシ、あるいは、N-ヘテロシクリル、特に、ピロリジノ、ピペリジノあるいはイミダゾリルであることが望ましい。
【００５６】
構造式１ｂのスルフォンアミドを主に考えた場合、もっとも望ましくは、R1を、低級アルキル、ベンジル、置換ベンジル、並びに、置換フェニルから選択し、R2が水素あるいは低級アルキルであり、R2’が水素、R3を置換フェニルおよびナフチルから選択し、R4がR16-アルキレン-、R7が水素、フルオロ、メチル、あるいは、クロロであり、R5、R6およびR8が水素であり、R16を、ジ(低級アルキルアミノ)、(低級アルキル)アミノ、アミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、イミダゾリル、並びに、モルホリノから選択する。
【００５７】
構造式１ｃおよび１ｄのアミンを主に考えた場合、R1を水素、低級アルキル、置換低級アルキル、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、ナフチル、並びに、置換フェニルから選択し、R2を水素、低級アルキル、および、置換低級アルキルから選択し、R2’が水素であり、R3''をC1ないしC13アルキル、置換低級アルキル、フェニル、ナフチル、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、メチレンジオキシ、あるいは、トリフルオロメチルで置換されたフェニル、ビフェリニル、ベンジル、並びに、ヘテロシクリルから選択し、R4を低級アルキル、シクロヘキシル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、あるいは、低級アルキルで置換されたフェニル、ベンジル、置換ベンジル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールメチル、ヘテロアリールエチル、ヘテロアリールプロピル、並びに、R16-アルキレンから選択し、ここで、R16がジ(低級アルキル)アミノ、(低級アルキル)アミノ、アミノ、低級アルコキシ、あるいは、N-ヘテロシクリルであることが望ましい。
【００５８】
構造式１ｃおよび１ｄのアミンを主に考えた場合、R1を低級アルキル、ベンジル、置換ベンジル、並びに、置換フェニルから選択し、R2が水素あるいは低級アルキルであり、R2’が水素であり、R3''を置換フェニル、ヘテロシクリル、並びに、ナフチルから選択し、R4を置換ベンジル、ヘテロシクリル、並びに、R16-アルキレン-から選択し、R6およびR7を、水素並びにハロから選択し、R5およびR8が水素であり、R16をジ(低級アルキルアミノ)、(低級アルキル)アミノ、アミノ、ピロリジニル、ピペリジニル、イミダゾリル、並びに、モルホニリルから選択することが、もっとも望ましい。(式１ｄのように)R3''が存在する場合には、ハロフェニル、ポリハロフェニル、トリル、ジメチルフェニル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニル、シアノフェニル、トリフルオロメチルフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、ビス(トリフルオロメチル)フェニル、カルボキシフェニル、t-ブチルフェニル、メトキシカルボニルフェニル、ピペリジニル、並びに、ナフチルから選択することが、もっとも望ましい。
【００５９】
本発明の組成は、当業者に周知の手法を用いて、以下に概要を示すような方法で合成される。例えば、本明細書に引例として組み込まれるAger et al., J. of Med. Chem.,20:379-386(1977)では、芳香族第一級アミンを用いたN-アシルアントラニル酸の酸触媒濃縮によりキナゾリノンを生成する。あるいは、本明細書にすべて引例として組み込まれる米国特許5,783,577号、5,922,866号、並びに、5,187,167号に記載の方法で、キナゾリノンを生成するようにしてもよい。
【００６０】
本発明の組成は、図１、２、４および５に示すように生成される。式１ｄの化合物も、図１に示すものと類似の方法で生成される。ただし、最終ステップのハロゲン化アシルは、ハロゲン化アルキルに置き換えられる。
【００６１】
本発明の組成は、種々の用途で利用可能である。当業者に容易に理解可能なように、有糸分裂を様々な方法で改変可能である。すなわち、有糸分裂経路における所定の構成成分の活性を増加させる、あるいは、減少させることにより、有糸分裂に影響を与えることができる。つまり、所定の構成成分を阻害する、あるいは、活性化することによって平衡を乱し、有糸分裂に影響を与える（崩壊させる）こともできる。同様なアプローチで、減数分裂を改変することも可能である。
【００６２】
望ましくは、本発明の組成を用いて、有糸分裂紡錘体形成を調節し、有糸分裂における長期細胞周期を停止させる。本明細書で、「調節」とは、紡錘体形成を増大・減少させる等、有糸分裂紡錘体形成を改変することを意味する。また、「有糸分裂紡錘体形成」とは、有糸分裂キネシンにより微小管を双極性構造にすることを意味する。「有糸分裂紡錘体機能障害」は、有糸分裂停止と単極性紡錘体形成を意味する。
【００６３】
本発明の組成は、有糸分裂キネシンであるKSPに結合し、および／あるいは、その活性を調節するのに、有用である。他の生物由来のKSPキネシンも利用可能であるが、KSPがヒトKSPであることが望ましい。ここで、調節とは、紡錘体極分離を増加あるいは減少させることにより、有糸分裂紡錘体極の奇形を引き起こし、すなわち、紡錘体極を外に広げ、あるいは、有糸分裂紡錘体の形態学的混乱を引き起こす。KSPには、KSPの変異体および/あるいはフラグメントも含まれる。本明細書に全体が引例として組み込まれる、1999年10月27日出願の米国特許出願「細胞増殖モジュレーターのスクリーニング方法並びに細胞増殖状態診断方法」(米国特許出願09/428,156号)参照のこと。さらに、他の有糸分裂キネシンを本発明に用いるようにしてもよい。ただし、本発明の組成は、KSPに特異的である。
【００６４】
活性を定量するために、KSPあるいは本発明に従う化合物を、拡散させることなく、独立したサンプル受容領域を有する不溶性支持体（例えば、マイクロタイタープレート、アレイ等）に結合させる。不溶性支持体は、本発明の組成が結合可能ないかなる組成でもよく、可溶性物質から容易に分離可能で、全般的なスクリーニング法と互換可能なものである。このような支持体の表面は、堅固な凝集性でも多孔性でもよく、任意の使い勝手のよい形状であればよい。適当な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、膜、ビーズ等が挙げられる。これらは、通常、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、テフロン（商標）等で形成される。少量の試薬とサンプルを用いて、多数の検定を同時に行うことができるため、マイクロタイタープレートおよびアレイが特に便利である。本発明の薬剤並びに全体的な方法と互換可能であり、組成の活性を維持し、非拡散型である限りは、組成の結合方法は特に限定されない。望ましい結合方法としては、(タンパク質が支持体に結合する際に、配位子結合部位と活性化シーケンスのいずれをも立体的に妨害しない)抗体を利用する方法、「粘着性の」あるいはイオンを含む支持体に直接結合させる方法、化学的架橋、並びに、表面上でタンパク質あるいは薬剤を合成する方法等が挙げられる。タンパク質あるいは薬剤を結合させた後、過剰の未結合材料を洗い落とす。次に、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、あるいは、他の無害なタンパク質あるいはその一部を用いてインキュベーションを行うことにより、サンプル受容領域をブロックするようにしてもよい。
【００６５】
本発明の抗有糸分裂薬剤のみを用いて、有糸分裂キネシン、特にKSPの活性を調節するようにしてもよい。この場合、本発明の有糸分裂薬剤をKSPに結合させて、KSP活性の定量を行う。ここで、キネシン活性は、当業者に周知のものであり、一つのキネシン活性でも複数のキネシン活性でもよい。キネシン活性には、ATP加水分解への影響力、微小管結合、滑走および重合/解重合（微小管動力学への影響）、紡錘体の他のタンパク質への結合、細胞周期制御に関係するタンパク質への結合、キナーゼ、プロテアーゼ等の他の酵素に対する基質としての作用、ならびに、紡錘体極分離のような特定のキネシン細胞活性が含まれる。
【００６６】
運動性障害の検定方法は、当業者に周知である[例えば、Hall, et al. (1996), Biophys. J., 71: 3467-3476、Turner et al., 1996, AnaL Biochem. 242 (1):20-5、Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70(l): 418-29、Shirakawa et al., 1995, J. Exp. BioL 198: 1809-15、Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444-53、Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 72S参照]。
【００６７】
ATPase加水分解活性を求めるための当業者に周知の方法を用いることもできる。溶液に基づく検定を行うことが望ましい。本明細書に全体が引例として組み込まれる1999年5月18日出願の米国出願09/314,464に、このような検定法が詳述されている。あるいは、従来知られている方法を用いてもよい。例えば、キネシンから放出されるPiを定量してもよい。具体的な例で説明する。0.3M PCA (過塩素酸)およびマラカイトグリーン試薬(8.27 mM モリブデン酸ナトリウムII、0.33 mMマラカイトグリーンシュウ酸塩、並びに、0.8 mM Triton X-1 00)を用いて、以下の手順でATPase加水分解活性の検定を行う。0.3Mの冷PCA 90mL中で反応溶液10mLを急冷する。リン酸標準溶液を用いて、データを無機リン酸放出量(mM)に変換する。PCAですべての反応溶液とリン酸標準溶液を急冷した後、マイクルタイタープレート等の対象穴にマラカイトグリーン試薬を100mL加える。１０ないし１５分間混合物を展開した後、650nmでプレートの吸光度を測定する。リン酸標準溶液を用いた場合には、吸光度の測定値をmM Pi 値に変換し、時間に対してプロットできる。当業者に周知のATPase検定には、さらに、ルシフェラーゼ検定も含まれる。
【００６８】
また、キネシンモーター領域のATPase活性を用いて、調節剤の効果をモニターすることができる。微小管の不在下でキネシンのATPase検定を行うこともできるし、微小管の存在下でATPase検定を行うこともできる。このような検定では、様々な種類の調節剤を検出可能である。調節剤の効果が微小管並びにATPの濃度と無関係なものでも、キネシンATPaseに対する薬剤の効果がATP濃度、微小管濃度、あるいは、その両方を増加させることにより減少するものでもよい。さらには、逆に、調節剤の効果がATP濃度、微小管濃度、あるいは、その両方を増加させることにより増加するものでもよい。
【００６９】
生体外でKSPの生化学活性を調節する薬剤を生体内でスクリーニングするようにしてもよい。生体内でこのような薬剤をスクリーニングする方法には、細胞周期分配、細胞生死判別、細胞存在判定、形態、活性、分配、あるいは、有糸分裂紡錘体量の検定が挙げられる。フローサイトメトリー等を用いて細胞集団の細胞周期分配をモニターする方法は、細胞生死判別法として当業者に周知である。例えば、本明細書に全体が引例として組み込まれる、１９９９年１０月２２日出願の米国特許出願「細胞増殖モジュレーターのスクリーニング方法並びに細胞増殖状態診断方法」(米国特許出願 09/428,156号)参照のこと。
【００７０】
上述した検定法に加えて、紡錘体の形成と奇形をモニターする微視的方法も、当業者に周知である(例えば、Whitehead and Rattner (1998), J. Cell Sci. 111:2551-61、Galgio et al, (1996) J. Cell biol., 135:399-414参照)。
【００７１】
本発明の組成は、KSPキネシンを阻害する。阻害を表す指標の一つがIC50値である。これは、KSP活性を50%減少させる組成濃度として定義される。組成のIC50値が約1mM未満であることが望ましい。好ましくは、IC50値が約100mM未満、より好ましくは、IC50値が約10mM未満、もっと好ましくは、IC50値が約1mM未満、特に好ましくは、IC50値が約100nM未満、最も好ましくは、IC50値が約10nM未満である。IC50値の測定は、ATPaseを定量することにより行う。
【００７２】
阻害を表す別の指標は、Ki値である。IC50値が約1mM未満の化合物に対して、Ki値あるいはKd値は、キナゾリノンとKSPとの相互作用を示す解離定数として定義される。化合物のKi値が約100mM未満であることが望ましい。好ましくは、Ki値が10mM未満、より好ましくは、Ki値が約1mM未満、特に好ましくは、Ki値が約100nM未満、最も好ましくは、Ki値が約10nM未満である。化合物のKi値は、三つの仮定に基づいて、IC50値から求められる。第一の仮定は、その酵素に結合する化合物分子がたった一つだけであり、協同しない。第二の仮定は、活性酵素と試験対象化合物の濃度が既知である（すなわち、生成物は有意の量の不純物や不活性形を含まない）。第三の仮定は、酵素-阻害剤複合体の酵素率は０である。率データ（すなわち、化合物濃度）は、以下の式で適合させる。
【００７３】
【数１】
0004116332.tif 000007
【００７４】
ここで、Vは測定率、Vmaxは遊離酵素の割合、I0は阻害剤濃度、E0は酵素濃度、Kdは酵素-阻害剤複合体の解離定数である。
【００７５】
阻害を表すさらに別の指標は、GI50値である。これは、細胞成長率を50%減少させる化合物濃度として定義される。化合物のGI50値が約1mM未満であることが望ましい。好ましくは、GI50値が約20mM未満、より好ましくは、GI50値が約10mM未満、もっと好ましくは、GI50値が約1mM未満、さらに好ましくは、GI50値が100nM未満、最も好ましくは、GI50値が約10nM未満である。GI50値の測定は、細胞増殖検定により行う。
【００７６】
本発明の組成は、細胞増殖性疾患の治療に用いられる。本明細書に記載の方法並びに組成で治療可能な疾患は、以下に限定されるものではないが、ガン（詳しくは、後述する）、自己免疫疾患、関節炎、拒絶反応、炎症性腸疾患、外科手術、血管形成術等の医療行為により誘発された増殖等が含まれる。細胞が高増殖状態あるいは低増殖状態（異常な状態）にあるわけではないが、治療を必要とする場合もありえる。例えば、創傷治癒の過程で、細胞は「正常に」増殖をしているが、増殖の増強が望ましい場合もある。また、農業分野においては、上述したように、細胞は「正常な」状態にあるが、穀物の成長を直接促進させることにより、あるいは、穀物の成長に悪影響を与える植物や生物の成長を阻害することにより、増殖を調節して穀物の生産を増大させることが望ましい場合も考えられる。従って、本発明は、上記のような異常や状態の何れかに陥っている、あるいは、陥る可能性のある細胞あるいは個体に適用される。
【００７７】
本明細書に記載の組成並びに方法は、皮膚ガン、乳ガン、脳腫瘍、子宮頸ガン、睾丸ガン等の充実性腫瘍の治療に、特に有用であると、思われる。本発明の組成並びに方法で治療可能なガンの例としては、以下に限定されるものではないが、心臓：腫瘍（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、奇形腫、肺：気管支原性肺ガン（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺ガン）、肺胞（細気管支）ガン、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、胃腸：食道（扁平上皮細胞ガン、腺ガン、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（悪性腫瘍、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管ガン、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺ガン、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺ガン、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、尿生殖路：腎臓（腺ガン、ウィルム腫瘍[腎石灰沈着症]、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮ガン、移行上皮ガン、腺ガン）、前立腺（腺ガン、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎生期ガン、奇形ガン、絨毛ガン、肉腫、間質細胞ガン、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）、肝臓：肝臓ガン（肝細胞ガン)、胆管ガン、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、骨：骨原性肉腫(骨肉腫)、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫(細網細胞肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣細胞腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫)、婦人科：子宮（子宮内膜ガン）、子宮頸管（子宮頸ガン、前腫瘍子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣ガン[漿液性嚢胞腺ガン、ムチン性嚢胞腺ガン、未分類ガン]、顆粒膜-包膜細胞腫、セルトリ-ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮ガン、上皮内ガン、腺ガン、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞ガン、扁平上皮ガン、ブドウ状肉腫[胎児性横紋筋肉腫]、ラッパ管（ガン）、血液系：血液（骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、脊髄増殖症候群、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫]、皮膚：悪性黒色腫、基底細胞ガン、扁平上皮ガン、カポジ肉腫、奇胎形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、並びに、副腎：神経芽細胞腫が挙げられる。すなわち、本明細書で用いられる「ガン細胞」という言葉は、上述のいずれかに冒されている細胞を意味する。
【００７８】
従って、本発明の組成は細胞に投与される。本明細書中で用いられる「投与」という言葉は、本発明の有糸分裂薬剤を、治療に有効な投与量、培養細胞あるいは患者の細胞に投与することを意味する。ここで、「治療に有効な投与量」とは、投与によって効果を生み出す分量を意味する。正確な投与量は、治療の目的によって異なるが、当業者は、周知の手法でこれを決めることができる。当業者に周知のように、全身に作用させるか、局所的な作用に留めるか、また、年齢、体重、健康状態、性別、食習慣、投与時間、薬剤の相互作用、条件の厳密性に関して調節が必要となるであろうが、当業者は、ルーチン実験を行うことにより、このような調節を行うことができる。また、本明細書で用いられる「細胞」という言葉は、有糸分裂あるいは減数分裂を変更可能な任意の細胞を意味する。
【００７９】
本発明の「患者」には、人間のみでなく、哺乳動物を初めとする他の動物、さらには、他の生物も含まれる。すなわち、本発明の方法は、ヒトの治療にも、獣医分野にも適用可能である。望ましくは、患者は哺乳動物であり、最も望ましくは、患者はヒトである。
【００８０】
所望の薬理活性を有する有糸分裂薬剤を、生理的に許容可能な担体に担持させて、患者に投与するようにしてもよい。後述するように、投与法にしたがって、化合物は、様々に成形可能である。この場合、治療活性化合物の濃度は、約0.1ないし100重量%の範囲で決められる。薬剤を単独で投与するようにしてもよいし、あるいは、放射線治療や他の化学療法薬のような他の治療法と組み合わせて投与してもよい。
【００８１】
薬剤組成を、調剤的に許容可能な塩のような水溶性の形態に成形することが望ましい。これには、酸添加塩と塩基添加塩の両方が含まれる。「調剤的に許容可能な酸添加塩」は、遊離塩基の生物学的効力を保持し、生物学的な意味においても他の意味でも望ましくないものではない塩を意味する。添加される酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸でも、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、琥珀酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸でもよい。「調剤的に許容可能な塩基添加塩」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等の無機塩基由来の塩が含まれる。特に望ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、および、マグネシウム塩である。調剤的に許容可能な無毒の有機塩基由来の塩には、第一級、第二級、第三級アミン、天然置換アミン等の置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン等である。
【００８２】
薬剤組成は、顆粒、錠剤、丸薬、座薬、カプセル、懸濁液、軟膏、ローション等、様々な形態に成形可能である。経口あるいは局所使用に適した薬剤用有機あるいは無機担体および/あるいは希釈剤を用いて、治療活性化合物を含む組成を成形するようにしてもよい。当業者に周知の希釈剤には、水性媒体、植物および動物性油脂がある。助剤として、安定剤、湿潤剤や乳化剤、浸透圧調節塩、pH調節緩衝液、皮膚浸透エンハンサ等を用いてもよい。また、薬剤組成に、血清アルブミン等の運搬体タンパク質、緩衝液、微結晶性セルロース、乳糖、とうもろこしや他の澱粉等の充填剤、結着剤、甘味料や他の香料添加剤、色素、ポリエチレングリコールから選択される一ないし複数の成分を含むようにしてもよい。このような添加剤は当業者に周知であり、様々な形態で用いられる。
【００８３】
本発明の有糸分裂剤の投与は、様々な方法で行われる。例としては、これらに限定されるものではないが、経口投与、皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、肺内投与、膣内投与、直腸投与、眼内投与が挙げられる。創傷や炎症の治療の場合には、有糸分裂剤を溶液あるいはスプレーの形で直接塗布してもよい。
【００８４】
本発明の化合物を用いて、KSPキネシンに結合する化合物のスクリーニングを行う場合には、KSPを支持体に結合させた後、本発明の化合物（すなわち、有糸分裂剤）を加えて、測定を行う。あるいは、本発明の化合物を支持体に結合させた後、KSPを加えるようにしてもよい。新規な結合剤として利用可能な化合物には、特定の抗体や、ケミカルライブラリのスクリーニングで同定された人工結合剤や、ペプチド類似体等がある。ヒト細胞に対する毒性の低い候補薬剤のスクリーニング検定に大きな関心が集まっている。この目的で、標識生体外タンパク質-タンパク質結合検定、電気泳動度測定、タンパク質結合の免疫検査、(リン酸化測定等の)機能検査等、様々な検定が行われる。
【００８５】
KSPへの有糸分裂剤の結合は、種々の方法で測定可能である。有糸分裂剤（本発明の化合物）を蛍光物質あるいは放射性物質で標識し、直接結合を測定する方法も望ましい。例えば、KSPの全部または一部を固体の支持体に結合させて、標識した有糸分裂剤（例えば、本発明の化合物の少なくとも一つの原子を検出可能な同位体に置き換えた化合物）を加え、過剰の試薬を洗い落とし、固体支持体上に残っている標識化合物の量を測定する。当業者によく知られているような種々の手法で、ブロッキングや洗浄を行うようにしてもよい。
【００８６】
ここで、「標識」とは、放射性同位体、蛍光タグ、酵素、抗体、磁性粒子等の粒子、化学発光タグ、所定の結合分子等の検出可能な信号として作用するラベルで、直接あるいは間接的に化合物を標識することを意味する。所定の結合分子の例としては、ビオチンとストレプトアビジンのペアや、ジゴキシンとアンチジゴキシンのペアが挙げられる。所定の結合分子の場合、通常は、相補的な分子を、周知の手法に従って、上述した検出可能な分子で標識する。ラベルは、直接的あるいは間接的に検出可能な信号を与えるものであればよい。
【００８７】
一つの成分のみを標識するようにしてもよい。例えば、キネシンタンパク質の場合、125Iを用いてチロシン部位を標識するようにしてもよいし、発蛍光団で標識するようにしてもよい。あるいは、異なったラベルを用いて、複数の成分を標識するようにしてもよい。例えば、タンパク質を125Ｉで標識して、有糸分裂剤を発蛍光団で標識するものでもよい。
【００８８】
本発明の化合物を競争剤として用いて、候補薬剤のスクリーニングを行うようにしてもよい。「生体活性候補薬剤」、「候補薬剤」、並びに、本明細書で用いられる、それに類似する言葉は、タンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、多糖類等、その生体活性が試験対象となる任意の分子を意味する。これらの薬剤は、細胞増殖の表現型、あるいは、核酸シーケンスとタンパク質シーケンスの両方を含む細胞増殖シーケンスの表現を、直接的または間接的に変更可能なものでもよい。また、細胞増殖タンパク質結合および/あるいは活性の変更をスクリーニングするようにしてもよい。このようなスクリーニングは、微小管の存在下または不在下で行われる。タンパク質結合あるいは活性をスクリーニングする場合には、特定のタンパク質に結合することが既にわかっている化合物、例えば、微小管等の高分子構造体やATP等のエネルギー源を除外することが望ましい。内因性の自然な状態で細胞増殖タンパク質に結合しない候補薬剤を、ここでは、「外因性」薬剤と呼ぶことにするが、そのような候補薬剤の検定を行うようにしてもよい。外因性薬剤は、KSPに対する抗体を除外したものであることが望ましい。
【００８９】
多数の化学種が候補薬剤になりえるが、一般的には、有機分子、好ましくは、分子量が100ダルトンより大きく、約2,500ダルトン未満の小さな有機化合物が候補薬剤である。候補薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基、特に、水素結合並びに親油性結合を有し、少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、エーテル、あるいは、カルボキシル基、好ましくは、少なくとも二つの官能基を備える。候補薬剤が、周期性炭素あるいは環状へテロ構造体、および/あるいは、上記の官能基の一つあるいは複数で置換された芳香族あるいはポリ芳香族構造体を備えるものでもよい。ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン誘導体、類似構造体、あるいはその組み合わせ等を含む生体分子も候補薬剤になりえる。特に、ペプチドが好ましい。
【００９０】
合成あるいは天然化合物のライブラリ等の、様々な母集団から候補薬剤が選択される。ランダム化オリゴヌクレオチド発現等、様々な有機化合物や生体分子のランダムおよび指向性合成に、多数の手段を利用可能である。あるいは、細菌、菌類、植物ならびに動物の抽出物として得られる天然化合物のライブラリを利用可能であり、容易に作成可能である。さらに、天然あるいは合成化合物のライブラリ並びに化合物を、周知の化学的、物理的、生化学的手段を用いて、容易に修飾可能である。既存の薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性あるいはランダムな化学的修飾を施して、類似構造体を生成するようにしてもよい。
【００９１】
競争的なスクリーニング検定は次のような工程で行われる。まず、KSPと候補薬剤とを結合させた第一サンプルを作成する。第二サンプルには、有糸分裂剤と、KSPと、候補薬剤とをいれる。このスクリーニングは、微小管の存在下で行ってもよいし、不在下で行ってもよい。両方のサンプルにおいて、候補薬剤の結合を測定する。その変化、すなわち、二つのサンプル間の結合の相違は、KSPに結合可能で、その活性を調節可能な薬剤の存在を示している。したがって、第二サンプルにおける候補薬剤の結合が第一サンプルと異なっている場合、その候補薬剤はKSPに結合可能であると判定される。
【００９２】
競争的な結合を検定することによって、候補薬剤の結合を測定する方法も好適である。この場合には、抗体、ペプチド、結合剤、配位子等、KSPに結合することがわかっている結合体を競争剤として用いる。所定の状況下では、候補薬剤と結合体との間に結合の競争が起こり、結合体が候補薬剤に置き換わることもありえる。
【００９３】
処理としては、まず、候補薬剤を標識し、候補薬剤あるいは競争剤、あるいはその両方をKSPに加え、結合に十分な時間放置する。最適な活性を促進する任意の温度、通常は4ないし40℃の温度で、インキュベーションを行うようにしてもよい。
【００９４】
インキュベーションの時間は、最適な活性が得られるように選択すればよいが、迅速なハイ・スロープット・スクリーニングが可能になるように、最適化してもよい。通常は、0.1ないし1時間で十分である。過剰の試薬を除去あるいは洗い流した後、第二の成分を加える。標識成分の存在あるいは不在により結合を測定する。
【００９５】
処理の一例として、最初に競争剤を加え、続いて、候補薬剤を加えてもよい。競争剤が置換されることは、候補薬剤がKSPに結合している、すなわち、候補薬剤が、KSP活性に結合し、これを調節する能力があることを示している。この場合、どちらの成分を標識してもよい。競争剤が標識されている場合には、洗浄溶液中のラベルの存在から、候補薬剤が競争剤に置き換わったことがわかる。逆に、候補薬剤が標識されている場合には、支持体上のラベルの存在から、候補薬剤が競争剤に置き換わったことがわかる。
【００９６】
あるいは、別の処理の例として、最初に候補薬剤を加え、インキュベーションと洗浄を行った後、競争剤を加えるようにしてもよい。競争剤による結合が存在しなければ、候補薬剤が高親和性でKSPに結合していることがわかる。この場合、候補薬剤が標識されていれば、支持体上のラベルの存在と、競争剤の結合の不在とから、候補薬剤がKSP結合能力を有していると判定できる。
【００９７】
KSPの結合部位を特定することも望ましい。結合部位は、様々な手法で特定可能である。例えば、いったんKSPを有糸分裂剤に結合させた後、KSPを切断あるいは修飾する。この操作を繰り返して、結合に必要な成分を特定する。
【００９８】
KSP活性を調節可能な候補薬剤をスクリーニングすることにより、調節の検定を行う。これは、候補薬剤をKSPに結合させ、KSPの生物学的活性の変化を定量するというステップで行われる。したがって、この場合には、候補薬剤は、KSPに結合し（これが、不要な場合もあるが）、生物学的活性あるいは生化学的活性を変化させるものでなければならない。スクリーニング法には、前述したように、細胞周期分配、細胞生死判別あるいは細胞存在、形態、活性、分配、あるいは、有糸分裂紡錘体量の変化に基づく、細胞の生体外スクリーニング法も、生体内スクリーニング法も含まれる。
【００９９】
あるいは、分別スクリーニングにより、天然KSPには結合可能であるが、修飾KSPには結合不能な薬剤を同定するようにしてもよい。
【０１００】
正の対照群と負の対照群を検定に用いるようにしてもよい。統計的に有意な結果を得るためには、すべての対照群や試験サンプルで測定を少なくとも三度行うことが望ましい。サンプルのインキュベーションを行う場合には、薬剤がタンパク質に結合するのに十分な時間、インキュベーションを続ける。インキュベーション終了後、サンプルを洗浄して、非特異的に結合した薬剤を取り除き、通常は標識されている結合薬剤の量を測定する。たとえば、放射線同位体でラベルした場合には、サンプルをシンチレーション・カウンタにかけて、結合化合物を定量するようにしてもよい。
【０１０１】
種々の他の試薬をスクリーニング検定に用いてもよい。これらの試薬の例としては、最適なタンパク質-タンパク質結合の促進、および/あるいは、非特異的、すなわち、バックグラウンドの相互作用の削減に用いられる、塩、アルブミン等の中性タンパク質、界面活性剤等が挙げられる。また、プロテアーゼ（タンパク分解酵素）阻害剤、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）阻害剤、抗細菌剤等、検査効率を高めるような試薬を用いてもよい。複数の成分の混合物を用いる場合には、必要な結合が形成されるような順番で、各成分を添加すればよい。
【０１０２】
以下の実施例は、上述した発明がより明らかになるように説明するものであり、本発明の好適な実施の形態を詳述するものである。ただし、これらの実施例は、なんら本発明を限定するものではなく、例示に過ぎない。本明細書で参照したすべての文献は、その全体が引例として組み込まれる。
【０１０３】
実施例
略語および定義
以下に、本明細書で用いられる略語ならびに用語の意味を記載する。
Ac    =    アセチル
BNB  =    4-ブロモメチル-3-ニトロ安息香酸
Boc    =    t-ブチルオキシカルボニル
Bu    =    ブチル
c-    =    シクロ
CBZ  =    カルボベンゾキシ=ベンジルオキシカルボニル
DBU  =    ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデス-7-エン
DCM  =    ジクロロメタン=塩化メチレン=CH2Cl2
DCE  =    ジクロロエチレン
DEAD  =    ジエチルアゾジカルボン酸エステル
DIC  =    ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA  =    N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMAP  =    4-N,N-ジメチルアミノピリジン
DMF  =    N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO  =    ジメチルスルホキシド
DVB  =    1,4-ジビニルベンゼン
EEDQ  =    2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン
Et      =    エチル
Fmoc  =    9-フルオレニルメトキシカルボニル
GC    =    ガス・クロマトグラフィー
HATU  =    O-(7-アザベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸エステル
HMDS  =    ヘキサメチルジシラザン
HOAc  =    酢酸
HOBt  =    ヒドロキシベンゾトリアゾール
Me    =    メチル
mesyl  =    メタンスルホニル
MTBE  =    メチル t-ブチル エーテル
NMO  =    酸化N-メチルモルホリン
PEG  =    ポリエチレングリコール
Ph    =    フェニル
PhOH  =    フェノール
PfP    =    ペンタフルオロフェノール
PPTS  =  ピリジニウムp-トルエンスルフォン酸エステル
Py      =  ピリジン
PyBroP  =  ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸エステル
rt    =    室温
sat=d  =    飽和
s-    =    第二級
t-    =    第三級
TBDMS  =  t-ブチルジメチルシリル
TES  =    トリエチルシラン
TFA  =    トリフルオロ酢酸
THF  =    テトラヒドロフラン
TMOF  =  トリメチルオルト蟻酸エステル
TMS  =  トリメチルシリル
tosyl  =  p-トルエンスルホニル
Trt    =  トリフェニルメチル
【０１０４】
実施例１
化合物の合成
【０１０５】
一般的な合成を図１および図２に示す。
【０１０６】
ステップ１：N-ブチリルアントラニル酸
アントラニル酸(1)(0.5mole、68.5g)およびジメチルホルムアミド(250mL)を、温度計、滴下漏斗、効率的な磁気攪拌棒を備えた500mLの三つ口丸底フラスコに入れた。次に、混合溶液の温度が40℃を超えないような速度で、塩化ブチリル(0.55mole、57.1mL)を、フラスコ内の溶液に滴下した。けん濁液を、少なくとも３時間、室温でよく攪拌した。混合溶液を水(2000mL)に注ぎ、さらに１時間攪拌した。沈殿した生成物をろ過して集め、冷水で洗って、P205を用いて、減圧下で乾燥させ、化合物2(67.3g、65%)を得た。
【０１０７】
ステップ２：2-プロピル-3,1-[4H]ベンゾキサジン-4-オン
磁気攪拌棒、（真空注入口付き）クライゼン蒸留ヘッド、温度計を備えた500mL丸底フラスコで、化合物2(51.8g、0.25mole)を、無水酢酸(180mL)に溶解させた。フラスコをオイル・バスに入れ、よく攪拌しながら、ゆっくりと、170ないし180℃まで加熱した。生成した酢酸を大気圧でゆっくりと飛ばした。蒸留装置のヘッド温度をモニターすることにより、形質転換の進行度合いを測定した。次に、反応混合物を60℃まで冷却し、減圧(約20mmHg)蒸留により、過剰の無水酢酸を除いた。残留物を冷却し、生成物を結晶化した。得られた生成物をn-ヘキサン(75mL)を用いて粉砕し、ろ過、単離することにより2-プロピル-3,1-[4H]ベンゾキサジン-4-オン(3)(29.3g、62%)を得た。上述の処理により得られた化合物3は、充分な純度を有し、直接次のステップに用いることができた。
【０１０８】
ステップ３：2-プロピル-3-ベンジルキナゾリン-4-オン
化合物３(28.4g、0.15mole)およびベンジルアミン(17.5mL、0.16mole)を、250mL丸底フラスコに入れ、クロロホルム(50ml)で６時間還流した。化合物3を完全に溶かした後、クロロホルムを減圧で飛ばした。残留物をクライゼン蒸留ヘッドと磁気攪拌棒とを備えたフラスコに入れ、エチレングリコール(100mL)とNaOHペレット(0.60g)とを加えた。フラスコをオイル・バスにつけて、よく攪拌しながら、130から140℃に再加熱した。生成した水を蒸留して除去しながら、その温度に５時間保った。反応完了後、透明溶液を室温まで冷やし、一晩放置して、生成物を沈殿させた。3%HCl水溶液を加えて、懸濁液のpHを７から８に合わせた。結晶をろ別し、冷水で洗って、イソプロピルアルコール（あるいは、アセトン）で再結晶させて、2-プロピル-3-ベンジルキナゾリン-4-オン(化合物4)(28.0g、67%)を得た。
【０１０９】
ステップ４：2-(l'-ブロモプロピル)-3-ベンジルキナゾリン-4-オン
温度計、滴下漏斗、効率的な磁気攪拌棒を備えた250mLの三つ口丸底フラスコに化合物4(27.8g、0.10mole)を入れ、無水酢酸ナトリウム(10.0g)および氷酢酸(130mL)を加えた。酢酸(10mL)に溶解した臭素(16.0g、0.10mole)を、上記溶液に、40℃で１ないし２時間かけて滴下した。滴下終了後、混合溶液を水(1500mL)に注ぎ、室温で、１ないし２時間攪拌した。沈殿生成物2-(l'-ブロモプロピル)-3-ベンジルキナゾリン-4-オンをろ過・単離し、温水で洗って、残った微量の酢酸を除き、少量のイソプロピルアルコールで洗浄した。それを乾燥して、化合物5(33.0g、92%)を得た。
【０１１０】
ステップ５：2-[l'-(N,N-ジメチルエチレンジアミノ)プロピル]-3-ベンジルキナゾリン-4-オン
化合物５(10.7g、0.03mole)およびN,N-ジメチルエチレンジアミン(6.6mL、0.06mole)を無水エタノール(60mL)に溶かして、６時間加熱還流した。反応完了後、溶媒を減圧下で飛ばした。残留物をジクロロメタン(150mL)に溶かして、3%NaOH水溶液(約10ないし20mL)で洗浄した。MgSO4を用いて有機層を乾燥させ、減圧下で乾固させた。シリカゲルの短パッド上でCHC13-MeOH-アンモニア水の90:10:0.1溶離液を用いたフラッシュ・クロマトグラフィーを行うことにより、残った油状物質を精製した。これにより、所望の化合物(5)2-[l'-(N,N-ジメチルエチレンジアミノ)プロピル]-3-ベンジルキナゾリン-4-オン(6)(6.0g、55%)を得た。
【０１１１】
ステップ６：2-[l'-(N-4-フルオロベンゾイル)-(N,N-ジメチルエチレンジアミノ)プロピル]-3-ベンジルキナゾリン-4-オン
HPLC用CHCl3(0.5mL)を用いて、化合物５(1.822g、5.0mmol)の原液を作成した。2.0mL容量フラスコで、HPLC用1,2-ジクロロエタン(2.0mL)を用いて、塩化p-フルオロベンゾイル(160.2mg, 1mmol)の原液を作成した。さらに、HPLC用1,2-ジクロロエタンを用いて、トリエチルアミン(0.5M、2.0mL)溶液を作成した。自動リキッド・ディスペンサーBeckman Biomet 2000を用いて、各溶液を100mLずつ、ガラス製反応容器にピペット分注した。メカニカル・シェーカを用いて、反応混合物を振とうさせ、超音波水槽で超音波にあて、室温で一晩インキュベーションした。混合物をCHCl3(300mL)で希釈し、5%NaHCO3水溶液と水とで洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、化合物６(65%)を得た。生成した化合物の純度を調べるために、CH2Cl2-エタノール-濃縮アンモニア水の100:10:1溶離液を用いて、TLCで解析した。
【０１１２】
実施例２および３
一般構造式１ｄで示される化合物の合成
【０１１３】
【化１５】
0004116332.tif 000008
【０１１４】
alkylene（アルキレン）、Resin（樹脂）
無水溶媒は、すべて、SureSeal（登録商標）容器入りで、アルドリッチ・ケミカル社から購入した。試薬のうちの大部分も、アルドリッチ・ケミカル社から購入した。略号：DCM：ジクロロメタン、DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン、DMF：N,N-ジメチルホルムアミド、TES：トリエチルシラン、TFA：トリフルオロ酢酸。４×６アレイのアルミニウム合成ブロックに収容され、テフロン（商標）で裏打ちされたゴム膜で密閉した１５×７５mmスクリューキャップ付き丸底バイアルで、アレイ合成を行った。試薬を加え、一チャンネルあるいはマルチチャンネル・ピペッターを用いて、水性抽出を行った。その後、Whatman/Polyfiltronics２４穴、10mLろ過ブロックを用いて、ろ過した。Labconco Vortex-エバポレーターを用いて、あるいは、４×６窒素マニホールドでスイープすることにより、アレイから揮発物質を蒸発させた。
【０１１５】
実施例２（単一化合物の固相合成）
ステップ１）1,3-ジアミノプロパントリチル樹脂(Novabiochem、1.2mmol/g)(0.20g, 0.24mmol)を秤量して、スクリューキャップ付きバイアルに入れ、DMFとクロロホルムの1:1混合物を3mL加えた。DIEA(0.130mL、0.72mmol)と（実施例１で得られた）2-(1’-ブロモプロピル)-3-ベンジルキナゾリン-4-オン(0.188g、0.48mmol)とを加えた。バイアルを密閉し、70℃に加熱し、一晩振とうした。樹脂をろ別し、洗浄して(３×DCM、２×MeOH、１×DCM、２×エーテル)、減圧下で乾燥させた。樹脂27mgを5:5:90TFA:TES:DCMで１５分間処理し、処理した混合物をろ過、乾固して、8mg(収率：64%)のキナゾリン−ジアミン中間物質を得た。LCMS解析の結果、80%以上の純度があった。
【０１１６】
ステップ２）ステップ１で生成した樹脂を、3mLのDCMで膨潤させて、DIEA(0.130mL、0.72mmol)および臭化4-ブロモベンジル(0.12g、0.48mmol)を加えた。バイアルを密閉し、一晩振とうした。一部をとってLCMS解析を行った結果、混合物中の出発物質と生成物の比率が約1:1であった。DIEA0.130mLと臭化4-ブロモベンジル0.12gを加え、70℃で８時間混合物を振とうした。得られた樹脂をろ別し、（上述したように）洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０１１７】
ステップ３）ステップ２で生成した樹脂を、5:5:90TFA:TES:DCM溶液に入れて、３０分間ずつ２度振とうし、ろ別した。ろ液を一緒にして、乾固させ、140mgのオレンジ色の油状物質を得た。この物質を逆相分取HPLC(グラディエント：アセトニトリル−水)で精製して、モノTFA塩27mg(３ステップでの収率：17%)を得た。
【０１１８】
実施例３(複数の化合物のコンビナトリアル合成)
ステップ１）1,2-ジアミノエタントリチル樹脂(Novabiochem、0.95mmol/g)(200g、1.9mmol)と1,3-ジアミノプロパントリチル樹脂(Novabiochem、1.14mmol/g)(2.0g、2.28mmol)を、各々、別々の10mLポリプロピレンガラス管(Bio-Rad)に入れた。DMF4mLと、クロロホルム4mLと、３当量のDIEA(それぞれ、1.0mLおよび1.2mL)と、２当量の（実施例１で得られた）2-(1’-ブロモプロピル)-3-ベンジルキナゾリン-4-オン(それぞれ、1.5gおよび1.8g)を、各々の樹脂に加えた。混合物を70℃で一晩振とうした。各混合物を洗浄して(３×DCM、２×MeOH、１×DCM、２×エーテル)、減圧下で乾燥させた。一部をとって解析した結果、それぞれ、純度90%以上の所望のキナゾリン−ジアミンの存在が確認された。
【０１１９】
ステップ２）キナゾリノンエチル-ジアミン樹脂(105mg、0.10mmol)をアレイの最初の２列のバイアル各々に入れ、キナゾリノンプロピル-ジアミン樹脂(88mg、0.10mmol)をアレイの最後の２列のバイアル各々に入れた。DIEA(0.131mL、0.75mmol)を各バイアルに加えた。別のアミンをアレイの最初の２列の各バイアルに加え、一方、アレイの最後の２列に対してはDIEAを繰り返し加えた。反応ブロックを、70℃で一晩振とうした。先が細くなっているゲルチップを装着したマルチチャンネル・ピペットを用いて、各バイアルから液体分を除去し、残った樹脂を洗浄して(２×DCM、１×MeOH、１×DCM)、減圧下で乾燥させた。
【０１２０】
ステップ３）10:5:85TFA:TES:DCM溶液2mLを各バイアルに加えた。反応ブロックを４５分間振とうし、生成混合物をフィルターブロックに移して、ろ過し、0.75mL DCMで二度洗浄した。溶液を乾固させて、黄色から赤色の油状物質を得た。得られた高粘度の油状物質をエーテルを用いて二度粉砕して、DCMに溶かし、4M HClジオキサン溶液で処理することにより、黄褐色から白色の粉状あるいは無定形固体として、HCl塩(化合物あたりの塩の数はわからない)を得た。LCMS解析の結果、どの化合物も75%以上の純度であった。
【０１２１】
実施例４−６
６種類のラセミ化合物キナゾリノンをキラル・クロマトグラフィーにより、その光学異性体に分離した。これらの化合物のうち３つのキラル・クロマトグラフィーに関して、説明する。
実施例４
【０１２２】
【化１６】
0004116332.tif 000009
【０１２３】
カラム- Chiralpak AD、250×4.6mm(Diacel Inc.)。サンプル濃度- 0.5mg/mL EtOH。条件 - 60% EtOHヘキサン溶液で１５分間。光学異性体1は4.5分で溶離、光学異性体2は4.9分で溶離。
実施例５：
【０１２４】
【化１７】
0004116332.tif 000010
【０１２５】
カラム- Chiralcel OJ、250×4.6mm(Diacel Inc.)。サンプル濃度- 0.5mg/mL EtOH。条件 - 10% EtOHヘキサン溶液で１５分間。(R)-光学異性体は８．４分で溶離、(S)-光学異性体は９．６分で溶離。
実施例６：
【０１２６】
【化１８】
0004116332.tif 000011
【０１２７】
カラム - Chiralpak AD、250×4.6mm(Diacel Inc.)。サンプル濃度- 0.5mg/mL EtOH。条件 - 70% EtOHヘキサン溶液で１５分間。光学異性体１は６．５分で溶離、光学異性体２は８．８分で溶離。
【０１２８】
以下の表に、上述の処理で分離された３種類の化合物のラセミ体と光学異性体のIC50活性を示す。３種類の化合物のいずれの場合も、一つの光学異性体が、他の光学異性体よりも有意に大きな活性を有する。独立キラル合成により、より活性な光学異性体がR光学異性体であると思われる。
【０１２９】
【表１】
0004116332.tif 000012
0004116332.tif 000013
【０１３０】
実施例７および８
以下の２つの化合物を、図4に示す経路で、単一の光学異性体として合成した。データから、より活性な光学異性体がR光学異性体であることがわかる。
【０１３１】
【表２】
0004116332.tif 000014
【０１３２】
実施例９
酒石酸を用いた再結晶によるキラルの分離
【０１３３】
実施例１で得られた中間体Aを、分離することにより図４に示す最初の５つのステップの代替物になる中間体Bに変換可能である。その変換処理を、以下のスキームで示す。
【０１３４】
【化１９】
0004116332.tif 000015
【０１３５】
イソプロピルアルコールとメタノールの混合溶液中で、1.1当量のD-酒石酸とBとの混合物を加熱し、その後、室温まで冷却することにより、BのR光学異性体を選択的に結晶化することができる。
実施例９： X = Cl, R = H
【０１３６】
100mLの沸騰メタノール中で、100mLの沸騰イソプロピルアルコールに溶解させたラセミ中間体B(1.5g)を、0.8gのD-酒石酸と混合した。得られた混合物を室温までゆっくりと冷却した。一晩放置後、固形物をろ別し、酢酸エチルとヘキサンで洗浄し、空気乾燥した。乾燥固体(0.8g)を50mLイソプロピルアルコールと50mLメタノールの沸騰混合溶液に溶解し、室温までゆっくりと冷却した。一晩放置後、得られた固体をろ別し、酢酸エチルとヘキサンで洗浄し、空気乾燥した。次に、乾燥固体に飽和ジカルボン酸ナトリウムを加えて、３０分間攪拌し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機物をMgSO4を用いて乾燥し、ろ過して、乾固させた。生成した透明油状物質の重さは345mgであった。一部をS-Mosherアミドに変換して、生成物を1HNMRで測定したところ、キラル純度は95%以上であった。D- およびL-酒石酸の両方を用いて上述の処理により得られた物質から、図４の残りのステップに従って、以下の光学異性的に純粋な化合物を生成した。
【０１３７】
【表３】
0004116332.tif 000016
【０１３８】
キナゾリノンKSP阻害剤で処理した細胞集団における有糸分裂停止の誘発
以下のようにして、DNA含有量を測定することにより細胞周期のステージを求めるFACS解析を行った。10cmの皿にSkov-3細胞(ヒト卵巣ガン)を1:10に分割して植え付け、5%ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI 1640媒体を用いて、亜集団まで成長させた。10nMパクリタキセル、400nM キナゾリノン1、200nM キナゾリノン2、あるいは、0.25%DMSO(化合物の媒体)のいずれかで、２４時間、細胞を処理した。次に、5mM EDTAを含むPBSで細胞をプレートから洗い流して、ペレットにし、1% FCSを含むPBSで一度洗浄し、4℃の85%エタノール中で一晩固定させた。解析をする前に、細胞をペレットにし、一度洗浄して、１ミリリットル中に10μgのヨウ化プロピジウムと250μgのリボヌクレアーゼ(RNAse)Aとを含む溶液で37℃、３０分間染色した。Becton-Dickinson FACScanを用いてフローサイトメトリー分析を行い、一サンプルあたり10,000細胞のデータをModfitプログラムで解析した。
【０１３９】
キナゾリノン化合物のみでなく、周知の抗有糸分裂剤であるパクリタキセルも、細胞集団をG0/G1細胞周期ステージ(DNA含有量：2n)からG2/M細胞周期ステージ(DNA含有量：4n)に移行させた。この類の他の化合物でも同様の効果が見られた。
【０１４０】
キナゾリノンKSP阻害剤の投与による単極性紡錘体形成
G2/M累積の性質を調べるために、ヒト腫瘍細胞株Skov-3(卵巣)、HeLa(子宮頸部)、および、A549(肺)を、一穴あたり4,000細胞(SKOV-3&HeLa)あるいは一穴あたり8,000細胞(A549)の密度で、９６穴プレートに植え付け、２４時間固着させて、種々の濃度のキナゾリノン化合物で２４時間処理した。細胞を4%ホルムアルデヒドで固定して、(蛍光標識した二次抗体を用いて認識される)抗チューブリン抗体および(DNAを染色する)Hoechst色素で染色した。
【０１４１】
目視検査の結果、キナゾリノン化合物が有糸分裂の前中期ステージで細胞周期を停止させることがわかった。DNAが濃縮され、紡錘体形成が開始されるが、細胞周期が停止した細胞では、一様に単極性紡錘体が観察された。これは、紡錘体の極分離が阻害されていることを示している。抗KSP抗体のマイクロインジェクションによっても、有糸分裂が停止され、細胞周期が停止した細胞では単極性紡錘体が観察される。
【０１４２】
キナゾリノンKSP阻害剤で処理した腫瘍細胞株における細胞増殖の阻害
９６穴プレートの一穴あたり１０００ないし２５００細胞の密度で(密度は細胞株によって異なる)９６穴プレートに細胞を植え付け、２４時間、固着、成長させた。その後、種々の濃度の薬剤で４８時間処理した。各化合物を添加した時間をT0とする。薬剤として3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)(I.S> 特許No. 5,185,450) (Promega製品カタログ#G3580参照。CeIlTiter 96（登録商標）AQueous 一溶液細胞増殖の検定)を用いたテトラゾリウム検定を行い、T0における生細胞数と４８時間化合物に露出後に残った細胞数とを数えた。４８時間後に残った細胞数を薬剤添加時の生細胞数と比較することにより、成長阻害を算出した。
【０１４３】
媒体のみ(0.25% DMSO)で処理した対照群の４８時間後の細胞成長を100%として、各化合物で処理したサンプル群の細胞成長をこれと比較した。キナゾリノンKSP阻害剤は、以下の腫瘍型のヒト腫瘍細胞株における細胞増殖を阻害した。肺ガン(NCI-H460、A549)、乳ガン(MDA-MB-231、MCF-7, MCF-7/ADR-RES)、結腸ガン(HT29、HCT15)、卵巣ガン(SKOV-3, OVCAR-3)、白血病(HL-60(TB)、K-562)、中枢神経系腫瘍(SF-268)、腎臓ガン(A498)、骨肉腫(U2-OS)、ならびに、子宮頸ガン(HeLa)。さらに、マウスの腫瘍細胞株(B16、黒色腫)もキナゾリノン化合物の存在下で成長阻害された。
【０１４４】
化合物濃度(μM )に対して処理群中の細胞成長率をプロットすることにより、Gi50値を算出した。各化合物に関して算出されたGi50 値は、対照群と比較して50%だけ成長が阻害された場合の概算濃度を示す。すなわち、以下の式で表される濃度を示す。
１００×[(Treated48 - T0) / (Control48 - T0)]=５０
【０１４５】
すべての化合物の濃度を二度ずつ測定し、対照群は１２穴の平均を取る。同様のレイアウトの96-穴プレートおよびGi50 算出スキームが、米国立がん研究所(Monks, et al., J. NatI. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)参照)で用いられている。ただし、国立がん研究所で行われている細胞計量では、MTSは用いられておらず、他の方法で計量が行われている。
【０１４６】
IC50の算出：
ATPase検定によりKSP 活性に関する各組成のIC50値を測定する。この検定に用いられる溶液１は、3mM ホスホエノールピルビン酸カリウム(Sigma P-7127)、2mM ATP (Sigma A-3377)、1mM IDTT (Sigma D-9779)、5mM パクリタキセル(Sigma T-7402)、10ppm消泡剤289(Sigma A-8436)、25mM ピペス（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）/KOH pH 6.8(Sigma P6757)、2mM MgC12(VWR JT400301)、および、1mM EGTA(Sigma E3889)を含む。また、溶液２は、1mM NADH(Sigma N8129)、0.2mg/ml BSA(Sigma A7906)、ピルビン酸キナーゼ7U/ml、L-乳酸デヒドロゲナーゼ10U/ml(Sigma P0294)、100nM KSPモーター領域、50mg/ml微小管、1mM DTT(Sigma D9779)、5mMパクリタキセル(Sigma T-7402)、10ppm 消泡剤289(Sigma A-8436)、25mM ピペス/KOH pH 6.8(Sigma P6757)、2mM MgC12(VWR JT4003-01)、および、1mM EGTA(Sigma E3889)を含む。溶液１を用いて、９６穴マイクロタイタープレート(Corning Costar 3695)で、組成の連続希釈(８ないし１２倍希釈)を行う。連続希釈により、各穴の溶液１の容量は、50mlになる。各穴に50mlの溶液２を加えて、反応を開始させる。この処理には、マルチチャンネル・ピペッターを用い、手動操作で行ってもよいし、自動液体処理装置を用いてもよい。次に、マイクロタイタープレートをマイクロプレート吸光度測定装置にいれ、動モードで、各穴の340nmのおける吸光度を複数回測定した。ATPaseの割合に比例する測定変化率を化合物濃度の関数としてプロットする。非線形適合プログラム(例えば、Grafit 4)を用いて、下記の４パラメータ式で得られたデータを適合させて、標準IC50 値を求める。
【０１４７】
【数２】
0004116332.tif 000017
【０１４８】
ここで、yは測定率で、xは化合物の濃度を示す。
キナゾリノン化合物は、パクリタキセルのような他の化学療法薬に対する耐性を有する、P-糖タンパク質を表現する(マルチドラッグ耐性MDR+としても知られる)細胞株(MCF-7/ADR-RES、HCT1 5)を含む様々な細胞株の成長を阻害する。すなわち、キナゾリノンは、細胞増殖を阻害する抗有糸分裂性を有し、薬剤耐性腫瘍細胞株によるMDR+の過剰表現の耐性対象とはならない。
【０１４９】
この類の他の化合物も、GI50値は異なるが、細胞増殖を阻害することがわかった。試験を行ったキナゾリノン化合物のGI50 値は、200nMから最大試験濃度以上までばらついた。このことから、KSP活性を阻害する化合物の大部分は生化学的に細胞増殖を阻害したが、最大試験濃度(通常、約20mM)における細胞成長の阻害率は50%未満であった。試験を行った化合物のうち多くの化合物では、GI50値が10mM未満であり、GI50 値が1mM未満のものもあった。ガンの臨床治療（ガン化学療法）に適用され成功を収めている抗増殖性化合物のGI50値は、非常にばらついている。例えば、A549細胞では、パクリタキセルのGI50値が4nM、ドキソルビシンのGI50値が63nM、5-フルオロウラシルのGI50値が1mM、ヒドロキシウレアのGI50値が500mMである(米国立がん研究所のデータに準拠する。Developmental Therapeuticプログラム、http://dtp.nci.nih.gov/)。したがって、実質的に任意の濃度で細胞増殖を阻害する化合物が有用であると考えられる。ただし、GI50値が1mM未満の化合物が望ましい。さらに言えば、GI50値が20mM未満の化合物が望ましい。もっと望ましい化合物は、GI50値が10mM未満の化合物である。GI50値が1mM未満の化合物等、より小さなGI50値の化合物も望ましいと考えられる。本発明のキナゾリノン化合物の内いくつかは、200nM以下から10nM以下のGI50値で、細胞増殖を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組成を生成するための一般的な合成スキームを示す図。
【図２】キナゾリノンKSP阻害剤を合成するための合成経路を示す図。
【図３】キナゾリノンKSP阻害剤の化学構造を示す図。
【図４】ほぼ純粋な単一光学異性体の合成経路を示す図。
【図５】スルホンアミド５(a)、カルバミン酸エステル５(b)、尿素５(c)、および、アミン５(d)の合成経路を示す図。
【図１】
0004116332.tif 000019
【図２】
0004116332.tif 000020
【図３−１】
0004116332.tif 000021
【図３−２】
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【図３−３】
0004116332.tif 000023
【図３−４】
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【図３−５】
0004116332.tif 000025
【図３−６】
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【図３−７】
0004116332.tif 000027
【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図３−１７】
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【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
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【図３−２１】
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【図３−２２】
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【図３−２３】
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【図３−２４】
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【図３−２５】
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【図３−２６】
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【図３−２７】
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【図３−２８】
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【図３−２９】
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【図３−３０】
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【図３−３１】
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【図３−３２】
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【図３−３３】
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【図３−３４】
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【図３−３５】
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【図３−３６】
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【図３−３７】
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【図３−３８】
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【図３−３９】
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【図３−４０】
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【図３−４１】
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【図３−４２】
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【図３−４３】
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【図３−４４】
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【図３−４５】
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【図３−４６】
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【図３−４７】
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【図３−４８】
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【図３−４９】
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【図３−５０】
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【図３−５１】
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【図３−５２】
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【図３−５３】
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【図３−５４】
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【図３−５５】
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【図３−５６】
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【図３−５７】
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【図３−５８】
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【図３−５９】
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【図３−６０】
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【図３−６１】
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【図３−６２】
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【図３−６３】
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【図３−６４】
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【図３−６５】
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【図３−６６】
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【図３−６７】
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【図３−６８】
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【図３−６９】
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【図３−７０】
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【図３−７１】
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【図３−７２】
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【図３−７３】
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【図３−７４】
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【図３−７５】
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【図３−７６】
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【図３−７７】
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【図３−７８】
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【図３−７９】
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【図３−８０】
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【図３−８１】
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【図３−８２】
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【図３−８３】
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【図３−８４】
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【図３−８５】
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【図３−８６】
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【図４】
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【図５】
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