(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の触媒活性を有する触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の生殖系列中に、前記配列が抗体可変部多様化を受けるように挿入する工程と、
（ｃ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項２】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記機能的触媒単位が完全な酵素の一部を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記機能的触媒単位が不活性化酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列配列がノックアウトされるか又は除去される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記内因的生体触媒が抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記内因的生体触媒が加水分解酵素である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
生成触媒抗体の前記同定する工程がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択されるプロセスである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記配列がヒト起源である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記配列と前記生成触媒抗体とがヒト起源である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
所望の触媒活性を有する触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の生殖系列中に、前記配列が抗体可変部多様化を受けるように挿入する工程と、
（ｃ）前記動物を免疫原によって免疫感作する工程と、
（ｄ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項１３】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記機能的触媒単位が完全な酵素の一部を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記機能的触媒単位が不活性化酵素である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列配列がノックアウトされるか又は除去される、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記内因的生体触媒が抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記内因的生体触媒が加水分解酵素である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記配列がヒト起源である、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
前記配列と前記生成触媒抗体とがヒト起源である、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫原がＴＳＡ及び所望の触媒作用の部位において前記所望の触媒活性の基質に組み込まれたＴＳＡから成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原が酵素阻害剤及び所望の触媒作用の部位において前記所望の触媒活性の基質に組み込まれた酵素阻害剤から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫原が自殺基質阻害剤及び所望の触媒作用の部位において前記所望の触媒活性の基質に組み込まれた自殺基質阻害剤から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
生成触媒抗体の前記同定がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択される少なくとも１つのプロセスである、請求項１２記載の方法。
【請求項２６】
所望の触媒活性を有するキメラ触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の生殖系列中に、前記配列が抗体可変部多様化を受けるように挿入する工程と、
（ｃ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を選択する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項２７】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記機能的触媒単位が完全な酵素又は完全な酵素の一部である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記機能的触媒単位が不活性化酵素である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列がノックアウトされるか又は除去される、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記内因的生体触媒が抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記内因的生体触媒が加水分解酵素である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
生成触媒抗体の前記同定がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択されるプロセスである、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
前記配列がヒト起源である、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記配列と前記生成触媒抗体とがヒト起源である、請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
所望の触媒活性を有するキメラ触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の生殖系列中に、前記配列が抗体可変部多様化を受けるように挿入する工程と、
（ｃ）前記動物を免疫感作する工程と、
（ｄ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項３８】
前記キメラ触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
複数個の異なる機能的触媒単位又はそれらの成分が動物の生殖系列に組み込まれる、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記機能的触媒単位又はそれらの成分が免疫グロブリン可変部イントロン配列によって分離される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
１回の反復の生成物をコードする配列が次回の反復によって動物の生殖系列中に組み込まれる配列である、反復的に繰り返されるプロセスをさらに含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記配列が、発現されたときに、免疫グロブリン鎖のアミノ末端に融合される、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫グロブリン鎖が可変部を欠失している、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記機能的触媒単位が完全な酵素又は完全な酵素の一部である、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
前記機能的触媒単位が不活性化酵素である、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列配列がノックアウトされるか又は除去される、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
前記内因的生体触媒が抗体である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記内因的生体触媒が加水分解酵素である、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
生成触媒抗体の前記同定がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択されるプロセスである、請求項３７記載の方法。
【請求項５１】
前記配列がヒト起源である、請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
前記配列と前記生成触媒抗体とがヒト起源である、請求項３７記載の方法。
【請求項５３】
所望の触媒活性を有する触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の抗体遺伝子座中に挿入する工程と、
（ｃ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項５４】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
所望の触媒活性を有する触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の抗体遺伝子座中に挿入する工程と、
（ｃ）前記動物を免疫原によって免疫感作する工程と、
（ｄ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程と、
を含む上記方法。
【請求項５６】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
所望の触媒活性を有するキメラ触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の抗体遺伝子座中に挿入する工程と、
（ｃ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程と、
を含む上記方法。
【請求項５８】
前記キメラ触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
所望の触媒活性を有するキメラ触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素から機能的触媒単位の配列を選択する工程と、
（ｂ）前記配列を非ヒト動物の抗体遺伝子座中に挿入する工程と、
（ｃ）前記動物を免疫感作する工程と、
（ｄ）前記所望の触媒活性を有する生成触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項６０】
前記キメラ触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
生成触媒抗体を同定する前記工程が、機能的触媒活性をコードするトランスジェニック配列の修飾された結合性質をｉｎ  ｖｉｖｏ選択することからなる、請求項５９記載の方法であって、前記配列がキメラ抗体−酵素融合をコードする上記方法。
【請求項６２】
生成触媒抗体を同定する前記工程が、機能的触媒活性をコードするトランスジェニック配列の修飾された結合性質をｉｎ  ｖｉｖｏ選択することからなる、請求項５９記載の方法であって、前記抗体と酵素配列とがヒト起源である上記方法。
【請求項６３】
生成触媒抗体を同定する前記工程が、機能的触媒活性をコードするトランスジェニック配列の修飾された結合性質をｉｎ  ｖｉｖｏ選択することからなる、請求項５９記載の方法であって、前記配列が可変部多様化を受ける上記方法。
【請求項６４】
内因的抗体産生が除去されている動物内で前記選択が生ずる、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記動物がマウスである、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
前記配列がキメラ酵素融合をコードする、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
前記配列がヒト起源である、請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
所望の触媒活性を有する触媒抗体の生成方法であって、
（ａ）酵素の機能的触媒ドメインをコードする配列を選択する工程と、
（ｂ）機能的触媒ドメインをコードする前記配列を、前記配列が抗体可変部又はＴ細胞レセプターの多様化を受けるように細胞の遺伝子配列中に挿入する工程と、
（ｃ）前記細胞又はその子孫を培養して抗体可変部又はＴ細胞レセプターの多様化を開始させ、１以上の仮想触媒抗体を生成する工程と、
（ｄ）前記所望の触媒活性を有するそれら前記生成仮想触媒抗体を同定する工程であって、前記所望の触媒活性は前記酵素の活性と異なっていてもよい、
を含む上記方法。
【請求項６９】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
前記機能的触媒ドメインが完全な酵素又は完全な酵素の一部である、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
前記機能的触媒ドメインが不活性化酵素である、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列配列がノックアウトされるか又は除去される、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
生成仮想キメラ抗体−酵素融合触媒抗体の前記選択がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択される少なくとも１つのプロセスである、請求項６８記載の方法。
【請求項７５】
前記配列がヒト起源である、請求項６８記載の方法。
【請求項７６】
前記配列が抗体遺伝子座中に挿入される、請求項６８記載の方法。
【請求項７７】
前記触媒抗体がキメラ抗体−酵素融合分子からなり、かつ前記多様化が非ヒト動物のｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項６８記載の方法。
【請求項７８】
前記触媒抗体が加水分解活性を有する、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記配列が酵母人工染色体中に挿入される、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
前記機能的触媒ドメインが完全な酵素又は完全な酵素の一部である、請求項７７記載の方法。
【請求項８１】
前記機能的触媒ドメインが不活性化酵素である、請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
前記配列が動物の生殖系列中にトランスジェニック的に挿入され、内因的生体触媒の生殖系列配列がノックアウトされるか又は除去される、請求項７７記載の方法。
【請求項８３】
生成仮想キメラ抗体−酵素融合触媒抗体の前記選択がスクリーニング、選択及び単離から成る群から選択される少なくとも１つのプロセスである、請求項７７記載の方法。
【請求項８４】
前記配列がヒト起源である、請求項７７記載の方法。
【請求項８５】
前記配列が抗体遺伝子座中に挿入される、請求項７７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は広範囲には、生殖系列（germline）配列の変化した動物を用いた、新規な触媒、特に高い代謝回転速度（turnover rate）の酵素又は生体触媒の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は酵素の特定領域（specificity region）の迅速な進化又は多様化を促進する方法に関する。この方法を用いて、機能的触媒単位又はそのかなりな部分を生殖系列の抗体遺伝子座にコーディングすることによる触媒活性を有する抗体を製造することができる。さらに一層詳しくは、本発明は抗体遺伝子座内の酵素配列の配置及びセグメント化に関する。
発明の背景
この１０年間に、触媒活性を有する有用な抗体の製造に研究が向けられている。このような抗体は一般に触媒酵素又はアブザイムとして知られている。非触媒反応速度に比べて強化された代謝回転速度を有する触媒抗体は多くの研究グループによって報告されている（本明細書に援用される、Ｓｕｚｕｋｉ等，“アブザイム研究における最近の進歩”，１１５（４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２３〜８（１９９４）、本明細書に援用される、Ｔｉｔｍａｓ等，“抗体触媒作用（antibody catalyzed）第１アミド加水分解”，４７（２〜３）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７７〜９０（１９９４）を参照のこと）。本明細書に援用される、ＳｃｈｏｃｈｅｔｍａｎとＭａｓｓｅｙの米国特許第５，０３７，７５０号と第５，１５６，９６５号も参照のこと、この特許は少なくとも１種類の反応物の少なくとも１種類の生成物への転化を含む化学反応速度を高める方法を教示する。
或る場合には、非触媒反応速度に比べて大きな速度強化が得られている（本明細書に援用される、Ｔｈｏｒｎ等，“ハプテンチャージの戦略的使用による抗体触媒作用の大きな速度促進”，３７３Ｎａｔｕｒｅ，２２８〜３０（１９９５）を参照のこと）。しかし、今までは、伝統的な実験室方法を用いて、触媒抗体によって高効率の特異的触媒作用を生じるための一般的な手段は見いだされていない。
触媒抗体を製造するための伝統的な実験室方法は、遷移状態類似体（ＴＳＡ）の使用によるものである（本明細書に援用される、ＫｉｍとＫａｌｌｅｎｂａｃｈへの米国特許第４，７９２，４４６号を参照のこと）。ＴＳＡは反応物分子の不安定な中間体構造の安定な模倣体である。動物は、ＴＳＡと結合することができるために反応物の遷移状態を安定化して、所望の生成物の形成を触媒することができる抗体を産生すると期待して、ＴＳＡによって免疫感作される。次に、所望の触媒活性を分析することによって、ハイブリドーマをスクリーニングする。
非常に多くのケースにおいて触媒抗体の発生を妨げている圧倒的な問題は、高い代謝回転速度の無いことである。稀な場合を除いて、触媒抗体は天然に見い出される同様な酵素よりも数オーダー緩慢な触媒である。
しかし、最近、触媒抗体の製造に選択方法が用いられている（本明細書に援用される、Ｓｍｉｌｅｙ等，“栄養要求性大腸菌の相補性による組合せｃＤＮＡライブラリーからの生合成反応のための触媒抗体の選択：オロテート脱炭酸の抗体”，９１（１８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８３１９〜２３（１９９４）；及び本明細書に援用される、Ｊａｎｄａ等，“組合せ抗体ライブラリーからの触媒機構に関する直接選択”，９１（７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２５３２〜６を参照のこと）。このような方法は、比較的面倒なスクリーニング方法の代わりに、選択圧力（selection pressure）を用いて所望の性質を有する抗体を単離している。例えば、細胞増殖因子の形成を触媒する触媒抗体を、このような増殖因子の細胞栄養要求性において選択することができる。
分子及び細胞生物学の進歩は、多様な動物の生殖系列遺伝子構成を変える能力を研究者に与えている。遺伝子の一部、遺伝子全体及び／又は染色体領域を選択的に欠失又は付加させることができる。最近、これらのトランスジェニック／ノックアウト（knock-out）方法を用いて、他の種においてヒトタンパク質を産生させている。特に、齧歯類においてヒト抗体を産生させることが可能になっている（本明細書に援用される、Ｇｒｅｅｎ等，“ヒトＩｇＨ鎖及びＬ鎖ＹＡＣによって修飾したマウスからの抗原特異的ヒトモノクローナル抗体”，７（１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３〜２１（１９９４）；本明細書に援用される、Ｌｏｎｂｅｒｇ等，“４種類の異なる遺伝子修飾を含むマウスからの抗原特異的ヒト抗体”，３６８（６４７４）Ｎａｔｕｒｅ，８５６〜９（１９９４）；本明細書に援用される、Ｔａｙｌｏｒ等，“多様なヒト配列Ｈ鎖及びＬ鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス”２０〜２３Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２８７〜９５（１９９２）を参照のこと）。国際特許ＷＯ９１／１０７４１；ＷＯ９４／２５５８５；及びＷＯ９２／０３９１８も、ヒト配列のＨ鎖及びＬ鎖免疫グロブリンの多様化（diversity）を考察しており、本明細書に援用される。齧歯類においてヒト抗体を産生させる可能性は、免疫原性の低い治療抗体の産生の制御を可能にする。
酵素的に適切な（enzymatically relevant）構造と補因子とに対する抗体結合アフィニティを高めるための触媒抗体の伝統的方法の延長として、トランスジェニック動物が生殖系列抗体の金属イオン結合能を高めるために用いられている。金属イオンは種々な酵素の補因子として用いられ、トランスジェニックマウスがより効果的に金属カチオンを結合するように作成された（本明細書に援用される、Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋ等，１９９３，“生殖系列抗体レパートリーの化学的可能性の増強”９０（９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，４００８〜１１；本明細書に援用される、ＷＯ９４／２５５８６を参照のこと）。
本発明では、これまでの研究でおこなわれていた結合の促進ではなく、機能的触媒単位を動物の生殖系列組成中に組み込んで、酵素活性の特異性決定領域をコードする配列が免疫グロブリンの可変領域と同様な形式で多様化されるようにすることを出願人は提案する。このようなアプローチは低い代謝回転速度又は低い触媒活性の問題を解決する。
発明の要約
したがって、本発明は、動物の生殖系列抗体配列に機能的触媒ドメイン及び／又は構造をコードする配列を移植するために、トランスジェニック／ノックアウト生殖系列変更技術を用いる新規な方法を提供する。
本発明の１態様によると、機能的触媒ドメイン及び／又は構造をコードするこのような配列は、所望の触媒機能（例えば、ペプチド結合の加水分解）を有するが、所望の触媒抗体とは異なる特異性を有する既知酵素の配列である。
本発明のさらに他の態様では、移植される機能的酵素の特異性領域をコードする配列を、抗体のＣＤＲ領域に対応するように、動物の生殖系列中に挿入して、酵素の特異性領域の迅速な進化／多様化を促進する。本発明は、高い突然変異速度の他の（非抗体）染色体領域（例えば、Ｔ細胞レセプター遺伝子配列）中に機能的触媒単位又は酵素をトランスジェニック挿入することにも関する。
そして、本発明のさらに他の態様では、方法はキメラ抗体／酵素構造の種々なアレイを提供する。酵素配列の配置及びセグメント化は数多くの抗体／酵素構造の作成を可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、“Ｉｇ遺伝子再構成を仲介するリコンビナーゼのＤＮＡ認識配列。１２塩基対又は２３塩基対スペーサーによって分離された保存ヘプタマー（７ｂｐ）及びノナマー（９ｂｐ）配列がＶ及びＪエクソン又はＶ、Ｄ及びＪエクソン（Ｈ鎖座中）に隣接して配置される。リコンビナーゼがこれらの領域を認識し、非コーディング介在ＤＮＡのループを形成して、これらのループを切断することによって、エクソンを一緒にして、エクソンを結合させると考えられる。或いは、エクソンを逆位に続く、切断及び連結のプロセスによって結合させることができる。”３０２Ｎａｔｕｒｅ５７５（１９８３）を示す。
図２は、免疫グロブリンの不変ドメインと可変ドメインの構造の比較を示す、１〜７で標識されたβ鎖は同じトポロジーと、類似した構造とを有する。可変ドメインには２個の余分なβ鎖が存在する。これらの鎖の間のループは超可変部ＣＤＲ２を含有する。残りのＣＤＲ部はβ鎖２と４３及び鎖６と７を結合するループ中のバレルの同じ端部に存在する。不変ドメインと可変ドメインの両方において、ジスルフィド結合が１シート中の鎖２と他方のシート中の鎖６とを架橋する。
図３は、四本鎖シートに対して充填された１枚の三本鎖βシートから構成される圧縮逆平行βバレル（compressed antiparallelβ barrel）に折り畳まれた免疫グロブリンの不変ドメインの図である（ａ）。トポロジー線図（ｂ）はこの折り畳み体（fold）の結合Ｇｒｅｅｋキーモチーフ（key motif）を示す。
図４は、キモトリプシンのドメイン構造のトポロジー線図である。鎖はＧｒｅｅｋキーモチーフに折り畳まれ、その後に六本鎖逆平行βバレルとして配置されるヘアピンモチーフが続く。
図５は、（ａ）ｐＶＨＬＹＳｎｅｏと（ｂ）ｐＪＨＬＹＳｈｙｇの作成の線図である。
図６は、（ａ）ｐＶＫＬＹＳｎｅｏと（ｂ）ｐＪＫＬＹＳｈｙｇの作成の線図である。
図７は、不活性Ｈ鎖座に関してはホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｈ鎖微小座（miniloci）を含有する子（progeny）を産生するマウスの異種交配（crossing）を示す流れ図である。
図８は、不活性なＨ鎖座とＬ鎖座に関してホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｈ鎖微小座を含有する子を産生するマウスの異種交配を示す流れ図である。
図９は、不活性なＬ鎖座に関してはホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｌ鎖κ微小座を含有する子を産生するマウスの異種交配を示す流れ図である。
発明の詳細な説明
本発明を適切に理解するためには、下記定義が必要である：
・触媒エンジン（catalytic engine）は反応速度を変えることができる機能的触媒単位である。
・進化の開始点は、所望の性質をコードする若しくは有する配列（若しくは前記配列によってコードされるタンパク質）、又はこのような性質（例えば、触媒活性）を備えた配列若しくはタンパク質に密接に関連する配列（若しくは前記配列によってコードされるタンパク質）として定義される。
本明細書に援用される、ＷｏｈｌｓｔａｄｔｅｒへのＷＯ９３／１９１７０に開示されるように、進化の開始点を利用して、高い代謝回転速度酵素及び／又は他の生体触媒（biocatalyst）（例えば、リボザイム）を産生させることができる。広い意味では、酵素及び／又は他の生体触媒は２つの機能性（functionality）：触媒作用を駆動する触媒中心（触媒エンジン）と、基質又は酵素の反応物選択性を決定する周囲特異性領域とを有すると考えられる。経験的に、機能的触媒ドメイン又は触媒エンジンは異なる特異性の酵素に共通することが判明している（本明細書に援用される、Ｂｒａｎｄｅｎ等，“タンパク質構造への序論”，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９１）を参照のこと）。この経験的データは、機能的触媒ドメイン又は触媒エンジンを維持し、特異性ドメインを進化させて、新しい基質のための酵素を作り出すことが、異なる触媒機能性単位を進化させるよりも効果的であることを示唆している。効果的な生体触媒は特異性化学的部位の正確な構造的配向（structural orientation）を必要とし、反応物基質との複雑な連続した時間的及び空間的相互作用をしばしば必要とする（本明細書に援用される、Ｗａｌｓｈ，“酵素反応機構”，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９７９）を参照のこと）。特定の分子構造への簡単な結合は種々な異なる分子によっておこなわれることができる。このことは抗体によって最も良く例示される。多くの、かなり異なる抗体配列／構造が同じ抗原エピトープへ高度にアフィニティ結合することができる。さらに経験的な証拠は、機能的触媒単位を作成するために必要とされる緊縮で複雑な必要条件が触媒作用をおこなうことができる化学的／構造的コンホーメーションの数を制限するが、多くの異なる化学的／構造的コンホーメーションが実質的に同様な結合アフィニティを与えることができることを示唆している。例えば、異なるタンパク質が実質的に同様な機能的触媒機構を発達させる。このような酵素の第１級アミノ酸配列は関連がないとしても、これらの配列も集中的に（convergently）同じ触媒機構を発達させる（Ｂｒａｎｄｅｍ参照）。この発達データは、比較的大きく制限されたセットの化学的／構造的コンホーメーションのみが高効率触媒単位を形成することができるので、新しい特異性の生体触媒を作成するには存在する機能的触媒単位を用いて、特異性決定領域を発達させて、所望の基質特異性を得ることが発達的に効果的であることを実証する。本発明は、動物の生殖系列抗体配列を機能的触媒単位若しくは機能的触媒単位の実質的に全て又は酵素をコードするように変えることによって、触媒活性を有する抗体を作成する効率の増強にある。
多様な異なる遷移状態類似体が合成され、実験動物の免疫感作に用いられている。異なる形状相補的構造及び電荷相補的構造と共に触媒活性を有する抗体を誘出するために、異なる構造と電荷のＴＳＡ’ｓ及び他の免疫原が用いられている（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ；Ｔｈｏｒｎ；米国特許第４，７９２，４４６号；第４，９６３，３５５号；第５，１５６，９６５号；第５，４０１，６４１号；第５，３１８，８９７号（これらは本明細書に援用される）を参照のこと）。所望の基質の構造をより完全に模倣して選択性を高めるために延長した構造を有するＴＳＡ’ｓを製造することもできる。さらに、自殺基質阻害剤（機能的触媒ドメインに共有結合する基質）を用いて免疫感作をおこなうことができる。本発明に種々な抗原を用いることができる。希望する選択度に依存して、所望の基質へのより正確な及び／又は広範囲な類似性を有する抗原を用いることができる。
場合によっては、基質の実質的に全てをごく軽度な変更（alteration）で用いることができる、又は他の場合には基質自体を用いることができる。本発明の好ましい実施態様では、抗原又は抗原の成分として、酵素阻害剤及び／又は自殺基質が用いられる。本発明の特に好ましい実施態様では、酵素阻害剤及び／又は自殺基質が基質若しくはその類似体中に基質上の触媒作用の所望の部位において組み込まれる。
この数年間に、トランスジェニック／ノックアウト生殖系列変更の進歩は変化した性質を有する動物の産生を可能にしている。種々な異なるグループが他の種においてヒト抗体を産生させるように抗体遺伝子の生殖系列を変えることに成功している。当業者に公知であるように、新しい遺伝子及び／若しくは配列を動物の生殖系列に導入することができる、並びに／又は内因性遺伝子及び／若しくは配列を不活化、破壊及び／若しくは欠失させることができる。本発明では、このような生殖系列変更方法を用いて、機能的酵素配列を挿入して、キメラタンパク質の酵素部分が免疫学的な発達と選択とを受けて、所望の酵素活性を有する抗体を形成するように、キメラ抗体酵素分子を作成する。本発明の好ましい実施態様では、得られる触媒抗体の可能な免疫原性を制限するために、抗体配列と酵素配列の両方がヒトの配列である。１実施態様では、酵母人工染色体（yeast artificial chromosones）の使用を利用することができる。
抗体は２つのＨ鎖と２つのＬ鎖とから成る一般に知られた“Ｙ形状”構造に共有結合する幾つかの免疫グロブリンドメインから構成される。各Ｈ鎖と各Ｌ鎖は１つの可変免疫グロブリンドメインを含み、残りの免疫グロブリンドメインは不変ドメインである。構造において僅かに異なる、可変ドメインと不変ドメインの両方は逆平行βバレル第３構造を有する（図１参照）。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（相補性決定領域１、２及び３）と呼ばれる、可変ドメイン中のβ鎖を連結するループは抗体の間で広範囲に異なり、抗体特異性を与えることが見い出される。抗体多様化は種々な手段によって得られる。例えば、多様化は（１）多重な異なる生殖系列遺伝子、（２）組合せ多様性、（３）（ａ）不正確なＤＮＡ再構成と（ｂ）Ｎ領域多様化とを包含する接合多様性、（４）Ｈ鎖タンパク質とＬ鎖タンパク質との組合せの変化、及び（５）体細胞突然変異によって得られる（Ａｂｂａｓ等，“細胞及び分子の免疫学、第２版”Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．（１９９４）；Ｐａｕｌ，“基本的免疫学、第３版”Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、これは本明細書に援用される）。生殖系列中に酵素又は機能的触媒単位を適当に挿入することによって、このような多様化機構が抗体酵素タンパク質の酵素部分に与えられる。例えば、抗体のＶ，Ｄ及びＪ領域は既知のヒト酵素からの配列によって置換することができる。抗体遺伝子座のイントロン形態（intronic configuration）を維持して、広範囲な多様化を与える。例えば、反復配列（ナノマー及びヘプタマー）並びにイントロンスペース（intronic spacing）が維持される（図１参照）。
本発明はまた、酵素配列の配置及びセグメント化にある。例えば、広範囲な特異的基質結合に役割を果たすことができるような、酵素活性部位及び／又はその残基中に若しくは周囲に空間的に配置される挿入酵素配列のドメインは、最高の多様化を可能にするような領域（例えば、ＣＤＲ領域）に挿入される。例えば、キモトリプシンも免疫グロブリンドメインと同様な逆平行βバレルに折り畳まれる（図２と３を参照のこと）。活性部位領域及び基質特異性領域は、免疫グロブリン可変部のＣＤＲ領域と同様にβバレルのβ鎖を架橋するタンパク質配列に配置される。
本発明はまた、キメラ抗体／酵素構造の可変なアレイ（varying array）にある。１実施態様では、酵素配列が１個又は複数個の可変ドメインに置換する。さらに複数個の異なる酵素配列を生殖系列に、複数個のＶ、Ｄ及びＪ可変部と同様な形式で組み込んで、広範囲に変化した生殖系列を作成して、多様化をさらに高めることができる。他の実施態様では、挿入された可変部イントロンスペース及びシグナル配列を含む酵素配列を生殖系列に挿入して、酵素ドメインをアミノ末端融合として組み込むことができる。他の実施態様では、このようなアミノ末端酵素融合は可変部を不変免疫グロブリン部によって置換されることによって多様化を酵素領域のみに限定した抗体を得ることができる。本発明の他の実施態様では、酵素配列が免疫グロブリン可変部多様化を受けるように、但し、免疫グロブリンドメインに共有結合しないように、酵素機能をコードする配列を生殖系列抗体座に挿入する。当業者によって、非常に多様な、このような異なる構造を本発明に用いて、利用することができる。
本発明はまた、本発明の生殖系列が変化した動物を用いて触媒抗体を産生させる方法と配列にある。例えば、多様な異なる種類のＴＳＡ、阻害剤及び／又は自殺基質による免疫感作（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ；Ｔｈｏｒｎ；米国特許第４，７９２，４４６号；第４，９６３，３５５号；第５，１５６，９６５号；第５，４０１，６４１号（これらは本明細書に援用される）を参照のこと）を連続形式で実施して、増強したアフィニティを有する抗体を誘出することができる。他の実施態様では、本発明の動物の免疫感作後に、得られた酵素抗体配列を次に別の動物の生殖系列配列にトランスジェニック的に（transgenically）組み込む。例えば、この方法は触媒抗体の段階的繰り返し進化（stepwise iterative evolution）に用いることができる。このようにして、進化の進行は生殖系列レベルで続けられることができる。
免疫系は結合アフィニティ及び／又は結合動力学（binding kinetics）に基づいて抗体を選択する。反応物を結合して、生成物の形成を触媒し、この生成物を放出して、酵素の機能的活性部位への他の反応物のアクセスを可能にするためには、高い代謝回転速度を有する酵素が必要である。高い代謝回転速度の酵素は生成物の放出を必要とするが、抗体は高い結合アフィニティに関して選択される。本発明の他の実施態様では、トランスジェニック的に挿入された酵素機能単位又は触媒機能単位を比較的小さいセットの突然変異によって選択的に変化させて、触媒活性を実質的に低下させる（例えば、セリンプロテアーゼの触媒３つ組残基の突然変異）。このようにして、問題の基質を抗原として用いることができ、所望の基質に対する選択性を得ることができる。結合／選択性を選択した後に、触媒代謝回転を高めるために、小セットの突然変異を復帰させる（reverted）（例えば、特定の突然変異、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、選択等によって）。得られた触媒抗体を酵素阻害剤、自殺基質及び／又はＴＳＡ’ｓを用いてさらに選択することができる。
本発明は本発明の生殖系列が変化した動物の反復免疫感作（iterative immunization）にあり、多重抗原による同時免疫感作にもある。反復免疫感作は同じ抗原又は異なる抗原を用いて、免疫応答の進行を調節することができる。多重抗原を同時に供給して、免疫応答に必要に応じてバイアスをかけることができる。当業者は抗体産生を最適化するために多くの方法を用いることができる。例えば、免疫応答を高めるためにアジュバントを用いることができる。
本発明の酵素活性を有する抗体を技術上公知の方法によって修飾することができる。例えば、触媒抗体の合理的な設計修飾（design modification）のために三次元構造情報を用いることができる。他の実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発とスクリーニング及び／又は選択を用いて、本発明の酵素抗体をさらに開発することができる。
本発明の方法を用いて所望の酵素活性を選択するために、或る一定レベルの多様性を予め生成することが有利でありうる。多重の免疫グロブリン遺伝子要素、即ち、Ｖ、Ｄ及び／又はＪ領域の代わりに組み込むために幾つかの異なる突然変異済み（mutated）遺伝子フラグメントを生成することによる、多様性を高めた酵素遺伝子フラグメントを生成するための突然変異誘発方法の例を以下に挙げる：免疫グロブリン遺伝子座において、既存の多様性を用いて、多様性発生方法と適合させる。したがって、抗体多様性の生成に用いた方法と同様な方法で多様性選択機構を強化するために、問題の酵素フラグメントの多重コピーを導入することが有利であると考えられる。
多様性の生成のために、種々な突然変異誘発方法が技術上公知である。１方法では、問題の触媒エンジン配列を含有する“ドープされた（doped）”配列を用いて、但し、低レベルで、典型的には０．１〜１０％で他の３塩基によって“ドープされた”オリゴヌクレオチドの合成に用いられた塩基によって、合成遺伝子構築をおこなう。この合成では、触媒部位は突然変異を受けない、又は他の配列に比べて低レベルのみの突然変異を受ける。この方法はオリジナル配列に基づいて０．１〜１０％倍のみで全ての塩基において突然変異した配列のファミリーを生成する。これらの合成オリゴヌクレオチドを次に種々な標準方法を用いてアッセンブリーさせて、最終遺伝子を得る。
他の方法では、問題の遺伝子を上述したように合成オリゴヌクレオチドを用いて、但し、今や、可能なコドンに関して全体的にランダム化された特定部位（specific site）を組み込む配列の非常に画定された部分によって構築することもできる。これはオリゴヌクレオチドの合成に用いられる混合塩基の使用によって又は遺伝子合成のためのオリゴヌクレオチドの合成中に用いられる予め製造されたコドンの使用によって達成されることができる。次に、これらの突然変異済み遺伝子フラグメントを上述したようにアッセンブリーすることが考えられる。
さらに他の方法では、突然変異済み塩基を含む遺伝子フラグメントを生成するために限定する塩基又は非天然（unnatural）塩基によってＰＣＲの使用に基づいて、問題の遺伝子を構築することもできると考えられる。次に、これらの突然変異済み遺伝子フラグメントを上述したようにアッセンブリーすることが考えられる。
さらに他の方法では、塩基を修飾するための化学的方法、即ち、ジメチルスルフェート、ビスルフィット（bisulphite）、ギ酸、ヒドラジン等の使用に基づいて、問題の遺伝子を構築することもできると考えられる。次に、これらの突然変異済み遺伝子フラグメントを上述したようにアッセンブリーすることが考えられる。
これらの種類の遺伝子構築の結果は混合遺伝子のプールであり、これらの遺伝子を次に技術上公知の種々な方法を用いて免疫グロブリン座にクローン化することができる（実施例参照）。例えば、遺伝子を、免疫グロブリンＶ領域座から単離されたクローン非コーディング配列のプールによって、同時ライゲートする（co-ligated）ことができる。或いは、Ｖ領域遺伝子ファミリーに類似した、点在（interspersed）酵素遺伝子配列部分の系列を生成するという目的に基づいて、他の“より硬質の（stuffer）”配列を用いることができる。さらに、遺伝子フラグメントをＶ、Ｄ又はＪ領域遺伝子配列の代わりに特異的に挿入することができる。これらの修飾された及び／又は再構成された疑似座（psudeo loci）をコスミドベクターにクローン化して、クローンを酵素遺伝子配列部分のサイズと数に関してスクリーニングする。最適の数とサイズのフラグメントを有するクローンに次に免疫グロブリン座、ＹＡＣベクターの微小座への組換えをおこなう（実施例参照）。この組換えは選択された免疫グロブリン遺伝子座の５’及び３’フラグメント（選択された挿入部位の）を介して得られると考えられる。
ダイマー酵素活性部位を以下で考察する。免疫グロブリンとＴ細胞とのレセプター特異性も一部は、免疫グロブリン座の２種類の分離した可変部遺伝子、即ち、Ｌ鎖及びＨ鎖可変部から得られる組合せ多様性による。多様性の生成のための免疫グロブリンとＴ細胞とのレセプター機構の使用は、活性酵素を共に形成する２つの配列（又はサブユニット）から成る酵素に特有に適する。これらの２つのサブユニットはダイマーと同じ遺伝子から、フラグメント化タンパク質と同じ遺伝子から又は２つの異なる遺伝子からであることができる。ホモダイマーの界面に活性部位を形成する酵素の例は、オルニチンデカルボキシラーゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、デチオビオチンシンテターゼ及びグルコースオキシダーゼである（Ａｌｅｘｅｅｖ  Ｄ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９４，２：１０６１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ  Ａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３：１３６６２；Ｆｒｉｍｐｏｎｇ  Ｋ等，１９９４，２６９：１２１７；Ｄｙｄａ  Ｆ等，１９９３，３２：６１６５；Ｈｅｃｈｔ  ＨＪ等，１９９３，２２９：１５３）。２つのサブユニットから活性部位を形成するこれらの酵素は、ホモダイマー中に２つの活性部位を形成する、又はダイマー中のタンパク質の１つが活性部位中に単独の突然変異を有する場合には、単独の活性部位を形成する。
本発明では、酵素遺伝子フラグメントをＨ鎖座とＬ鎖座の両方に組込み、これらの修飾遺伝子座を含有するＥＳ細胞株からマウスを生成する。次に、トランスジェニックマウスの交雑によって、Ｈ鎖とＬ鎖の修飾座を組み合わせることができる。したがって、修飾された両方の座を有するマウスは可能な組合せ多様性によって可能な多様化のレベルを拡大することができると考えられる。
触媒抗体を得るために非常に多様な種が使用可能であることを、当業者は理解するであろう。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等並びに非哺乳動物種を用いることができる。さらに、非常に多様な酵素の機能と酵素ファミリー並びに特異的酵素が本発明に使用可能であることを、当業者は理解するであろう（本明細書に援用される、米国特許第４，７９２，４４６号、第４，９６３，３５５号、第５，１５６，９６５号、第５，４０１，６４１号、第５，２２９，２７２号、第５，１９４，５８５号、第５，２３６，８３６号）。
本発明の方法を説明する下記実施例は、下記方法と材料を用いる。
トランスジェニックマウスはＨｏｇａｎ等，“マウス胚の取り扱い：実験マニュアル”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（これは本明細書に援用され）に従ってもたらされる。
胚幹細胞は発表された方法に従って取り扱われる（“奇形癌と胚幹細胞：実際的アプローチ”，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８７；Ｚｊｉｌｓｔｒａ等，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）；及びＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：７９９〜８０３（１９８９）、これらの各々は本明細書に援用される）。
ＤＮＡクローニング方法はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（これは本明細書に援用される）に従っておこなわれる。
ハイブリドーマ細胞と抗体とは、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＨａｒｌｏｗとＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編集，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（これは本明細書に援用される）に従って取り扱われる。
実施例Ｉ
免疫グロブリン組換え機構及び体細胞突然変異機構を用いる活性酵素の再構成及び選択を可能にする組換えによる、マウス生殖系列のＨ鎖領域中への、酵素リゾチームの５’又はアミノ末端部分の組込み。
最初に、ＶＨ８１Ｘ（Ｄ領域に最も隣接するマウス同等ＶＨ，Ｎａｔｕｒｅ，３１１，７２７〜７５３，１９８４）Ｈ鎖可変部をファージライブラリーから、合成的に製造されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離して、マウス胎児肝臓ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来ゲノムλライブラリーファージをスクリーニングする。次に、このＶ領域遺伝子フラグメントを、マウスホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるヘルペス単純チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するプラスミドベクターにサブクローン化して（ＷＯ９４／０２６０２）、ベクターｐＶＨ８１Ｘを得る。プラスミドｐＶＨ８１Ｘを用いて、ＶＨ８１Ｘコーディング配列の代わりに、但し、完全なプレペプチドと組換えシグナルによって、リゾチーム遺伝子の５’部分のサブクローニングを可能にする。この実施例では、リゾチームの５’部分はアミノ酸Ｌｙｓ１からＧｌｙ７１に及ぶ（本明細書に援用される、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ＥＣ３．２．１．１７、Ｊｕｎｇ等、“Ｅｎｃｏｄｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ”、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ｓ．７７（１０）、５７５９−５７６３、１９８０）。この酵素の種々な部分が所望の組換え経路に基づいてこの構築体に挿入することができることは理解されるであろう。
ＰＣＲを用いて構築体を作成し、同じ配列オーバーラップを有する３フラグメントを得て、キメラゲノム遺伝子の逐次構築を可能にする。
これらの３フラグメントは、１）非コード領域を含むＶＨ８１Ｘ遺伝子の５’部分；２）ＰＣＲ後のフラグメントの５’及び３’末端にＶＨ領域配列を有するリゾチーム遺伝子の５’部分；及び３）ＶＨ遺伝子の３’末端である。この構築は、ＰＣＲ１）からの５’プライマー及びＰＣＲ２）からの３’プライマーによって１）及び２）をＰＣＲに組み合わせて、１）及び２）の配列を含有するフラグメントを得ることからなる。フラグメント１）及び２）を組み合わせるＰＣＲ反応生成物をＰＣＲ３）の生成物に加え、ＰＣＲ１）からの５’プライマーをＰＣＲ３）からの３’プライマーと組合せ、再びＰＣＲを受けさせる、これはフラグメント１）２）及び３）を単一フラグメントに組み込んだ最終ＰＣＲフラグメントを生じると考えられる。１）２）及び３）を組み合わせた、ＶＨ８１Ｘ  Ｖ領域遺伝子のゲノム配列内にリゾチームの５’部分を含有する、この最終フラグメントを次にｐＶＨ８１Ｘにクローン化して、天然配列を置換して、マウス生殖系列への組換えのためのベクターｐＶＨＬＹＳ５を得る。フラグメント３）の３’側のこの新しいゲノム配列内にｎｅｏ遺伝子を挿入して、ｐＶＨＬＹＳ５ｎｅｏを得た後に、このプラスミドｐＶＨＬＹＳ５は組換えのために準備されたことになる（図５ａ参照）。
この組換えベクターは、少なくとも１ｋｂのネイティブゲノム配列が、リゾチーム配列の５’部分を含む修飾ＶＨ８１Ｘ遺伝子要素に隣接するように構築される。
ベクターｐＶＨＬＹＳ５ｎｅｏを標準方法を用いて線状化して、胚幹細胞株のエレクトロポレーションに用いることができる。次に、このトランスフェクションからの細胞をｎｅｏ遺伝子に関して選択するためにはＧ４１８を含有し、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失（loss）を選択するためにはｇａｎｃｙｌｏｖｉｒ（Ｓｙｎｔｅｘ）を含有する培地上で選択する。この二重選択プロトコールは相同組換えイベントの回収（recovery）を改良して、ＶＨ８１Ｘ遺伝子の置換を生じる。得られたコロニーを次にｇａｎｃｙｌｏｖｉｒの不存在下で拡大させて（expanded）、組換えベクターの構築に用いられたリゾチームの５’遺伝子フラグメントにハイブリダイズする新しい大きさの遺伝子フラグメントを作成する特定の挿入に関して、サザンブロット分析によって試験する。
３００細胞株のスクリーニングから、所望のフラグメントを含む細胞株を拡大させて、さらに分析する。
リゾチーム遺伝子の５’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５を第２ラウンドのエレクトロポレーションに備えて拡大させて、Ｈ鎖組換え単位中にリゾチームの両部分を含有する最終細胞株を得る。
実施例ＩＩ
免疫グロブリン組換え機構及び体細胞突然変異機構を用いる活性酵素の再構成及び選択を可能にする組換えによる、マウス生殖系列のＨ鎖領域中への、酵素リゾチームの３’又はカルボキシ末端部分の組込み。
最初に、ＪＨ  Ｈ鎖Ｊ領域をファージライブラリーから、合成的に製造されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離して、マウス胎児肝臓ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来ゲノムλライブラリーファージをスクリーニングする。次に、このＪＨ領域遺伝子フラグメントを、マウスホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるヘルペス単純チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するプラスミドベクターにサブクローン化して（ＷＯ９４／０２６０２）、ベクターｐＪＨを得る。プラスミドｐＪＨを用いて、４個のＪＨコーディング配列の代わりに、但し、完全な両方の組換えシグナルによって、リゾチーム遺伝子の３’部分のサブクローニングを可能にする。この実施例では、リゾチームの３’部分はアミノ酸Ｌｅｕ７５からＬｅｕ１２９に及ぶ。この酵素の種々な部分が所望の組換え経路に基づいてこの構築体に挿入することができることは理解されるであろう。
ＰＣＲを用いて構築体を作成し、同じ配列オーバーラップを有する３フラグメントを得て、キメラゲノム遺伝子の逐次構築を可能にする。
これらの３フラグメントは、１）ＪＨ遺伝子クラスターの５’部分（最大５’組換えシグナルを包含する非コーディング領域）；２）フラグメントの５’及び３’末端にＪＨ領域配列を今や含むリゾチーム遺伝子の３’部分；及び３）最大３’組換えシグナルを含有するＪＨ遺伝子クラスターの３’末端である。この構築は、ＰＣＲ１）からの５’プライマー及びＰＣＲ２）からの３’プライマーによって１）及び２）をＰＣＲに組み合わせて、１）及び２）の配列を含有するフラグメントを得ることからなる。フラグメント１）及び２）を組み合わせるＰＣＲ反応の生成物をＰＣＲ３）の生成物に加え、ＰＣＲ１）からの５’プライマーをＰＣＲ３）からの３’プライマーと組合せて、再びＰＣＲを受けさせる、これはフラグメント１）２）及び３）を単一フラグメントに組み込んだ最終ＰＣＲフラグメントを生じると考えられる。１）２）及び３）を組み合わせた、ＪＨ領域遺伝子のゲノム配列内にリゾチームの３’部分を含有する、この最終フラグメントを次に、ｐＪＨにクローン化して、天然配列を置換して、マウス生殖系列への組換えためのベクターｐＪＨＬＹＳ３を得る。フラグメント３）の３’側のこの新しいゲノム配列内にヒグロマイシン遺伝子を挿入して、ｐＪＨＬＹＳ３ｈｙｇを得た後に、このプラスミドｐＪＨＬＹＳ３は組換えのために準備されたことになる（図５ｂ参照）。
この組換えベクターは、少なくとも１ｋｂのネイティブゲノム配列が、リゾチーム配列の３’部分を含む修飾ＪＨ遺伝子要素に隣接するように構築される。
ベクターｐＪＨＬＹＳ３ｈｙｇを標準方法を用いて線状化して、リゾチーム遺伝子の５’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５のエレクトロポレーションに用いることができる。次に、このトランスフェクションからの細胞をｈｙｇ遺伝子に関して選択するためにはヒグロマイシンを含有し、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失を選択するためにはｇａｎｃｙｌｏｖｉｒ（Ｓｙｎｔｅｘ）を含有する培地上で選択する。この二重選択プロトコールは相同組換えイベントの回収を改良して、ＪＨ遺伝子クラスターの置換を生じる。得られたコロニーを次にｇａｎｃｙｌｏｖｉｒの不存在下で拡大させて、組換えベクターの構築に用いられたリゾチームの３’遺伝子フラグメントにハイブリダイズする新しい大きさの遺伝子フラグメントを作成する特定の挿入に関して、サザンブロット分析によって試験する。
３００細胞株のスクリーニングから、所望のフラグメントを含む細胞株を拡大させて、さらに分析する。
５’及び３’遺伝子フラグメントの組合せから３アミノ酸（Ｓｅｒ７２、Ｌｙｓ７３及びＡｓｎ７４）を欠損させて、細胞株ＬＹＳ５３を構築する、これは組換え経路におけるＤ領域の組込みを可能にすべきである。これはこの５’及び３’遺伝子フラグメント組合せのためにリゾチーム構造に突然変異を起こさせるためのホットスポットを形成する。
リゾチーム遺伝子の５’及び３’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５３を使用に備えて拡大させる。この細胞はキメラマウスの発生と繁殖とを介して新しいマウスの基礎を形成することができる。或いは、この細胞株はネイティブマウス配列によって隣接された５’及び３’リゾチーム遺伝子を含有する遺伝子フラグメントの単離のために用いることができる。これらの遺伝子フラグメントは、単細胞マウス胚の核中に直接入れると、突然変異した免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスを生じると考えられる。
実施例ＩＩＩ
免疫グロブリン組換え機構及び体細胞突然変異機構を用いる活性酵素の再構成及び選択を可能にする組換えによる、マウス生殖系列のκＬ鎖領域中への、酵素リゾチームの５’又はアミノ末端部分の組込み。
最初に、ＶＫ  Ｌ鎖可変部をファージライブラリーから、合成的に製造されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離して、マウス胎児肝臓ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来ゲノムλライブラリーファージをスクリーニングする。次に、このＶ領域遺伝子フラグメントを、マウスホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるヘルペス単純チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するプラスミドベクターにサブクローン化して（ＷＯ９４／０２６０２）、ベクターｐＶＫを得る。プラスミドｐＶＫを用いて、ＶＫコーディング配列の代わりに、但し、完全なプレペプチドと組換えシグナルによって、リゾチーム遺伝子の５’部分のサブクローニングを可能にする。この実施例では、リゾチームの５’部分はアミノ酸ＬｙｓｌからＡｓｎ７４に及ぶ。この酵素の種々な部分が所望の組換え経路に基づいてこの構築体に挿入することができることは理解されるであろう。
ＰＣＲを用いて構築体を作成し、同じ配列オーバーラップを有する３フラグメントを得て、キメラゲノム遺伝子の逐次構築を可能にする。
これらの３フラグメントは、１）非コーディング領域を包含するＶＬ遺伝子の５’部分；２）フラグメントの５’及び３’末端にＶＬ領域配列を今や含むリゾチーム遺伝子の５’部分；及び３）ＶＬ遺伝子の３’末端である。この構築は、ＰＣＲ１）からの５’プライマー及びＰＣＲ２）からの３’プライマーによって１）及び２）をＰＣＲに組み合わせて、１）及び２）の配列を含有するフラグメントを得ることからなる。フラグメント１）及び２）を組み合わせるＰＣＲ反応の生成物をＰＣＲ３）の生成物に加え、ＰＣＲ１）からの５’プライマーをＰＣＲ３）からの３’プライマーと組合せて、再びＰＣＲを受けさせる、これはフラグメント１）２）及び３）を単一フラグメントに組み込んだ最終ＰＣＲフラグメントを生じると考えられる。１）２）及び３）を組み合わせた、ＶＬＶ領域遺伝子のゲノム配列内にリゾチームの５’部分を含有する、この最終フラグメントを次に、ｐＶＬにクローン化して、天然配列を置換して、マウス生殖系列への組換えのためのベクターｐＶＫＬＹＳ５を得る。フラグメント３）の３’側のこの新しいゲノム配列内にｎｅｏ遺伝子を挿入して、ｐＶＫＬＹＳ５ｎｅｏを得た後に、このプラスミドｐＶＫＬＹＳ５は組換えのために準備されたことになる（図６ａ参照）。
この組換えベクターは、少なくとも１ｋｂのネイティブゲノム配列が、リゾチーム配列の５’部分を含む修飾ＶＬ遺伝子要素に隣接するように構築される。
ベクターｐＶＫＬＹＳ５ｎｅｏを標準方法を用いて線状化して、胚幹細胞株のエレクトロポレーションに用いることができる。次に、このトランスフェクションからの細胞を、ｎｅｏ遺伝子に関して選択するためにはＧ４１８を含有し、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失を選択するためにはｇａｎｃｙｌｏｖｉｒ（Ｓｙｎｔｅｘ）を含有する培地上で選択する。この二重選択プロトコールは相同組換えイベントの回収を改良して、ＶＬ遺伝子の置換を生じる。得られたコロニーを次にｇａｎｃｙｌｏｖｉｒの不存在下で拡大させて、組換えベクターの構築に用いられたリゾチームの５’遺伝子フラグメントにハイブリダイズする新しい大きさの遺伝子フラグメントを作成する特定の挿入に関して、サザンブロット分析によって試験する。
３００細胞株のスクリーニングから、所望のフラグメントを含む細胞株を拡大させて、さらに分析する。
リゾチーム遺伝子の５’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５Ｋを第２ラウンドのエレクトロポレーションに備えて拡大させて、Ｈ鎖組換え単位内にリゾチーム遺伝子の両部分を含有する最終細胞株を得る。
実施例ＩＶ
免疫グロブリン組換え機構及び体細胞突然変異機構を用いる活性酵素の再構成及び選択を可能にする組換えによる、マウス生殖系列のＬ鎖領域中への、酵素リゾチームの３’又はカルボキシ末端部分の組込み。
最初に、ＪＫ  Ｈ鎖Ｊ領域をファージライブラリーから、合成的に製造されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離して、マウス胎児肝臓ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来ゲノムλライブラリーファージをスクリーニングする。次に、このＪＫ領域遺伝子フラグメントを、マウスホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるヘルペス単純チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するプラスミドベクターにサブクローン化して（ＷＯ９４／０２６０２）、ベクターｐＪＫを得る。プラスミドｐＪＫを用いて、４個のＪＫコーディング配列の代わりに、但し、完全な両方の組換えシグナルによって、リゾチーム遺伝子の３’部分のサブクローニングを可能にする。この実施例では、リゾチームの３’部分はアミノ酸Ｌｅｕ７５からＬｅｕ１２９に及ぶ。この酵素の種々な部分が所望の組換え経路に基づいてこの構築体に挿入することができることは理解されるであろう。
ＰＣＲを用いて構築体を作成し、同じ配列オーバーラップを有する３フラグメントを得て、キメラゲノム遺伝子の逐次構築を可能にする。
これらの３フラグメントは、１）ＪＫ遺伝子クラスターの５’部分（最大５’組換えシグナルを包含する非コーディング領域）；２）フラグメントの５’及び３’末端にＪＫ領域配列を今や含むリゾチーム遺伝子の３’部分；及び３）最大３’組換えシグナルを含有するＪＫ遺伝子クラスターの３’末端である。この構築は、ＰＣＲ１）からの５’プライマー及びＰＣＲ２）からの３’プライマーによって１）及び２）をＰＣＲに組み合わせて、１）及び２）の配列を含有するフラグメントを得ることからなる。フラグメント１）及び２）を組み合わせるＰＣＲ反応の生成物をＰＣＲ３）の生成物に加え、ＰＣＲ１）からの５’プライマーをＰＣＲ３）からの３’プライマーと組合せて、再びＰＣＲを受けさせる、これはフラグメント１）２）及び３）を単一フラグメントに組み込んだ最終ＰＣＲフラグメントを生じると考えられる。１）２）及び３）を組み合わせた、ＪＨ領域遺伝子のゲノム配列内にリゾチームの３’部分を含有する、この最終フラグメントを次に、ｐＪＫにクローン化して、天然配列を置換して、マウス生殖系列への組換えのためのベクターｐＪＫＬＹＳ３を得る。フラグメント３）の３’側のこの新しいゲノム配列内にヒグロマイシン遺伝子を挿入して、ｐＪＫＬＹＳ３ｈｙｇを得た後に、このプラスミドｐＪＫＬＹＳ３は組換えのために準備されたことになる（図６ｂ参照）。
この組換えベクターは、少なくとも１ｋｂのネイティブゲノム配列が、リゾチーム配列の３’部分を含む修飾ＪＫ遺伝子要素に隣接するように構築される。
ベクターｐＪＫＬＹＳ３ｈｙｇを標準方法を用いて線状化して、リゾチーム遺伝子の５’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５のエレクトロポレーションに用いる。次に、このトランスフェクションからの細胞を、ｈｙｇ遺伝子に関して選択するためにはヒグロマイシンを含有し、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失を選択するためにはｇａｎｃｙｌｏｖｉｒ（Ｓｙｎｔｅｘ）を含有する培地上で選択する。この二重選択プロトコールは相同組換えイベントの回収を改良して、ＪＨ遺伝子クラスターの置換を生じる。得られたコロニーを次にｇａｎｃｙｌｏｖｉｒの不存在下で拡大させて、組換えベクターの構築に用いられたリゾチームの３’遺伝子フラグメントにハイブリダイズする新しい大きさの遺伝子フラグメントを作成する特定の挿入に関して、サザンブロット分析によって試験する。
３００細胞株のスクリーニングから、所望のフラグメントを含む細胞株を拡大させて、さらに分析する。
リゾチーム遺伝子の５’及び３’部分を挿入された細胞株、ＬＹＳ５３Ｋを使用に備えて拡大させる。この細胞はキメラマウスの発生と繁殖とを介して新しいマウスの基礎を形成することができる。或いは、この細胞株はネイティブマウス配列によって隣接された５’及び３’リゾチーム遺伝子を含有する遺伝子フラグメントの単離のために用いることができる。これらの遺伝子フラグメントは、単細胞マウス胚の核中に直接入れると、突然変異した免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスを生じると考えられる。
実施例Ｖ
生殖系列キメラの作成。
トランスフェクトされたＥＳ細胞株ＬＹＳ５３及びＬＹＳ５３Ｋを標準方法に従って培養し、トリプシン処理し、注入媒質（ＤＭＥＭ１５％ウシ胎児血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、抗体及び２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させる。生後３．５日間のＣ５７ＢＬ／６Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の胚盤胞を生後４〜５週間過排卵した雌から標準方法に従って得る。
約１０〜１５細胞を各胚盤胞の胞胚腔に注入する。これらのＥＳ−細胞を含有する胚盤胞を次に手術によってＣ５７ＢＬ／６Ｌ  Ｘ  ＤＢＡ／２又はＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｘ  ＣＡＢ  Ｆ１偽妊娠雌の１つの子宮ホーン（uterine horn）に移す。
子に対するＥＳ細胞の寄与を毛皮の色（coat color）の検査によって判定する。ＥＳ細胞が動物の形成に関与しているキメラ子（chimeric offspring）はアゴーチ色（agouti）とクリーム色の毛を含む毛皮を有する。
選択されたキメラマウスの生殖系列寄与は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを掛け合わせ、予想されるＦ１子をアゴーチ色に関して計数することによって判定する。アゴーチマウスの約５０％が突然変異したＨ鎖又はκ鎖遺伝子座を遺伝によって受け継ぐと考えられる。生殖系列伝達（germline transmission）をさらにＦ１子孫の尾から単離したＤＮＡのサザンブロット分析によって特徴づける。
これらのＦ１マウスを次に交雑させて、突然変異したＨ鎖又はκ鎖遺伝子座に関してホモ接合体マウスを単離する。これらのマウスは今や、変化した基質特異性に関して組換えられたリゾチーム活性を単離するが、活性触媒部位残基Ｇｌｕ３５〜Ａｓｐ５２をまだ保有するマウスコロニーの基礎を形成すると考えられる。
実施例ＶＩ
酵素組換え系を含有するトランスジェニックマウスを生成するための他の方法
ＥＳ細胞株ＬＹＳ５３から単離された酵素修飾Ｈ鎖遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの生成。
ＬＹＳ５３細胞株を培養し、修飾Ｈ鎖微小座を、リゾチーム５’、Ｄ領域ゲノム配列、６ＪＨ遺伝子の代わりにリゾチーム３’部分を今や含有するＪＨ領域、ｍｕＨ鎖配列を今や含む修飾ＶＨ２９１遺伝子を含有するフラグメントとして単離する。この遺伝子フラグメントをＹＡＣライブラリー中へのクローニング及びリゾチーム遺伝子のプローブを用いたスクリーニングによって単離する。修飾ＶＨ２９１の５’側に殆ど余分なＶＨ遺伝子を有さない（ＪＨ領域に最も５’近接するＶＨ遺伝子）ＹＡＣクローンを増殖させ、ＤＮＡをＥＳ細胞株をトランスフェクトするために用いる。トランスフェクタント（transfectant）を修飾遺伝子中に存在するｎｅｏ遺伝子に関してＧ４１８を用いて選択する。得られた耐性（resistant）ＥＳ細胞株を次に所望の遺伝子挿入に関して特徴づける。次に、完全な修飾Ｈ鎖座を有するクローンを培養し、実施例Ｖに述べたようなキメラマウスの生成に用いる。得られたマウスは完全なネイティブ抗体系を修飾Ｈ鎖微小座と共に含有すると考えられる。
これらの第１世代マウスを次に、不完全な免疫グロブリンＨ鎖座に関してヘテロ接合体であるマウス（標準方法ＷＯ９４／０２６０２に従って生成）と交雑させる。これは（ｉ）不完全な免疫グロブリンＨ鎖に関してヘテロ接合体と、（ii）修飾Ｈ鎖微小座との組合せを含有する子孫を生じる。二重の修飾を有する、これらの子孫は次に交雑を受けて、不活性なＨ鎖座に関してホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｈ鎖微小座を含有するホモ接合体の生成を生じる（図７参照）。
上記繁殖ルートとは異なるルートでは、これらの第１世代マウスを次に、不完全な免疫グロブリンＨ鎖座と免疫グロブリンκＬ鎖座とに関してヘテロ接合体であるマウス（標準方法ＷＯ９４／０２６０２に従って生成）と交雑させる。これは（ｉ）不完全な免疫グロブリンＨ鎖とκＬ鎖とに関してヘテロ接合体と、（ii）修飾Ｈ鎖微小座との組合せを含有する子孫を生じる。二重の修飾を有する、これらの子孫は次に交雑を受けて、不活性なＨ鎖とＬ鎖座に関してホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｈ鎖微小座を含有するホモ接合体の生成を生じる（図８参照）。
二重及び三重に修飾された抗体遺伝子を含むこれらのマウスは、リゾチーム遺伝子フラグメントを含有する新しいＨ鎖微小座の組換えと体細胞突然変異とを駆動するために、免疫感作に基づいてリゾチームに関する新しい触媒活性の選択の準備が今やなされている。
実施例ＶＩＩ
酵素組換え系を含有するトランスジェニックマウスを生成するための別の方法
ＥＳ細胞株ＬＹＳ５３Ｋから単離された酵素修飾Ｈ鎖遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの生成。
ＬＹＳ５３細胞株を培養し、修飾Ｌ鎖微小座を、リゾチーム５’、ＪＫ遺伝子の代わりにリゾチーム３’部分を今や含有するＪＫ領域、κＬ鎖配列を今や有する、修飾ＶＫ遺伝子を含有するフラグメントとして単離する。この遺伝子フラグメントをＹＡＣライブラリー中へのクローニング及びリゾチーム遺伝子のプローブを用いたスクリーニングによって単離する。修飾ＶＫの５’側に殆ど余分なＶＫ遺伝子を有さない（ＪＫ領域に最も５’近接するＶＫ遺伝子）ＹＡＣクローンを増殖させ、ＤＮＡをＥＳ細胞株をトランスフェクトするために用いる。トランスフェクタントを修飾遺伝子中に存在するｎｅｏ遺伝子に関してＧ４１８を用いて選択する。得られた耐性ＥＳ細胞株を次に所望の遺伝子挿入に関して特徴づける。次に、完全な修飾Ｈ鎖座を有するクローンを培養し、実施例Ｖに述べたようなキメラマウスの生成に用いる。得られたマウスは完全なネイティブ抗体系を修飾κ鎖微小座と共に含有すると考えられる。
これらの第１世代マウスを次に、不完全な免疫グロブリンＬ鎖座に関してヘテロ接合体であるマウス（標準方法ＷＯ９４／０２６０２に従って生成）と交雑させる。これは（ｉ）不完全な免疫グロブリンＬ鎖に関してヘテロ接合体と、（ii）修飾Ｌ鎖κ微小座との組合せを含有する子孫を生じる。二重の修飾を有する、これらの子孫は次に交雑を受けて、不活性なＬ鎖座に関してホモ接合体であるが、リゾチーム修飾Ｌ鎖κ微小座を含有するホモ接合体の生成を生じる（図９参照）。
二重修飾を有するこれらのマウスは、リゾチーム遺伝子フラグメントを含有する新しいＨ鎖微小座の組換えと体細胞突然変異とを駆動するために、免疫感作に基づいてリゾチームに関する新しい触媒活性の選択の準備が今やなされている。
実施例ＶＩＩＩ
新しいリボヌクレアーゼ活性を生じるキメラマウスの生成のために微小座を発生する酵母中への組換えによって、マウス免疫グロブリン遺伝子座のＨ鎖領域中への酵素リボヌクレアーゼＡの導入。
リボヌクレアーゼＡ５’フラグメント、アミノ酸１〜６８（リボヌクレアーゼＡＥＣ３．１．２７．５、Ｂｏｒｋａｋｏｔｉ等，“１．４５Å解像でのリボヌクレアーゼ−Ａの精製構造”，Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．１４，４６７，１９８４（これは本明細書に援用される）を参照）。
リボヌクレアーゼＡ遺伝子を５０〜７０塩基長さの合成オリゴヌクレオチドから構築する。選択された制限部位を包含する全遺伝子は８オリゴヌクレオチドにコードされる。遺伝子をアッセンブリーし、ライゲートした後に、５’及び３’オリゴヌクレオチドによるＰＣＲによって、ライゲートされた遺伝子フラグメントを増幅する。次に、遺伝子をプラスミドベクターｐ５Ｒにクローン化する。ＰＣＲを用いて、（ｉ）プレペプチドと８００塩基５’とを含有する最も近接したＨ鎖可変部の５’部分と、（ii）組換えシグナルと８００塩基３’とを含有する最も近接したＨ鎖可変部の３’部分とに相当する２フラグメントを、ＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕＨ鎖遺伝子フラグメントを含有する実施例９に述べるＹＡＣクローンを用いて生成する。Ｒｎａｓｅ遺伝子フラグメントの５’部分の５’末端上の選択された制限部位に５’ＰＣＲフラグメントをクローン化する。３’ＰＣＲフラグメントを、Ｒｎａｓｅ遺伝子フラグメントの５’部分の３’末端上の選択された制限部位にクローン化する。このベクターｐ５ＲＲＥＣは免疫グロブリン遺伝子と隣接したＲｎａｓｅ遺伝子の５’部分を含有する遺伝子フラグメントのソースとして用いられる。次に、この遺伝子フラグメントを、オリジナルＹＡＣベクター中に存在しない酵母選択性マーカーＨＩＳ３、セントロメア（ＣＥＮ）及び単独テロメア（ＴＥＬ）を包含する１／２ＹＡＣベクター中にクローン化して、ｐ５ＲＲＥＣＹを得る。
リボヌクレアーゼＡ３’フラグメント、アミノ酸７２〜１２４（Ｂｏｒｋａｋｏｔｉ上記引用文献参照）。
リボヌクレアーゼＡ遺伝子を５０〜７０塩基長さの合成オリゴヌクレオチドから構築する。選択された制限部位を包含する全遺伝子は８オリゴヌクレオチドにコードされる。遺伝子をアッセンブリーし、ライゲートした後に、５’及び３’オリゴヌクレオチドによるＰＣＲによって、ライゲートされた遺伝子フラグメントを増幅する。次に、遺伝子をプラスミドベクターｐ３Ｒにクローン化する。次に、ＰＣＲを用いて、（ｉ）組換えシグナルと８００塩基５’とを含有する最も近接した（most）５’ＪＨ領域の５’部分と、（ii）組換えシグナルと８００塩基３’とを含有する最も近接した３’ＪＨ領域の３’部分とに相当する２フラグメントを、ＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕＨ鎖遺伝子フラグメントを含有する実施例９に述べるＹＡＣクローンを用いて生成する。Ｒｎａｓｅ遺伝子フラグメントの５’部分の５’末端上の選択された制限部位に５’ＰＣＲフラグメントをクローン化する。３’ＰＣＲフラグメントを、Ｒｎａｓｅ遺伝子フラグメントの５’部分の３’末端上の選択された制限部位にクローン化する。このベクターｐ３ＲＲＥＣは免疫グロブリンゲノム配列と隣接したＲｎａｓｅ遺伝子の３’部分を含有する遺伝子フラグメントのソースとして用いられる。
ｐ３ＲＲＥＣからの問題の酵素の３’部分を含有する修飾ＪＨ領域サブクローンも、オリジナルＹＡＣベクター中に存在しない酵母選択性マーカーＬＥＵ２、及び単独ＴＥＬを包含する１／２ＹＡＣベクター中にサブクローン化して、ｐ３ＲＲＥＣＹを得る。
これらのベクターの構築後に、修飾ＶＨ遺伝子（ｐ５ＲＲＥＣＹ）を含む１／２ＹＡＣベクターを線状化して、ＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕ  Ｈ鎖の所望のマウスＨ鎖配列を有する酵母菌株を形質転換するために用いる。ヒスチジン−原栄養株（prototrophy）の選択は、相同組換えを既に受けた酵母コロニーを生じる。問題の酵素の３’部分を含有する酵素修飾ＪＨ領域を含有する１／２ＹＡＣベクター（ｐ３ＲＲＥＣＹ）を次に線状化して、前工程で得られた酵母菌株の形質転換に用いる。ロイシン−原栄養株の選択は全酵素／免疫グロブリン座を含有する酵母菌株を生じる。好ましくは、両方の選択工程は一緒におこなうことができる。このＹＡＣを単離して、ＥＳ細胞中に微量注入して、細胞をＧ４１８を用いてｎｅｏ選択する。次に、得られた細胞株ＲＮＡ３５ＹＡＣを用いて、実施例Ｖに上述したように、キメラマウスを得る。得られたキメラマウスを次に繁殖させて、ネイティブ抗体を産生しないで、酵素抗体キメラ分子を産生するマウスを得る。実施例６と７は内因性のＨ鎖とＬ鎖、免疫グロブリン発現を除去するための繁殖プロトコールを説明する。
実施例ＩＸ
この実施例は、酵素／Ｈ鎖免疫グロブリン移植遺伝子（transgene）のネズミ接合体（murine zygote）中へのクローニングと微量注入の他の方法を説明する。
マウス肝臓から核を単離し、低温溶融（low melt）アガロース中に包埋し、ＥＤＴＡとプロテイナーゼＫとによって溶解させて、高分子量ＤＮＡを放出させる。この高分子量ＤＮＡに次に、大きなフラグメントを生じるように切断する、即ち、ｎｏｔ  １等の制限酵素による制限酵素消化を受けさせる。
この高分子量フラグメント化ＤＮＡに次にパルス化電界ゲル電気泳動を受けさせ、これらのフラグメントをマウスＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕ  Ｈ鎖の組合せに関して分析した。これらのフラグメントをプールして、ｎｅｏ耐性マーカーを含有するＹＡＣベクターにクローン化する。
ＹＡＣクローンを分析して、ＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕ  Ｈ鎖の所望のマウスＨ鎖配列を有するクローンをさらなるクローニング系列に用いる。
選択したＹＡＣクローンからのＶＨ遺伝子をプラスミドベクターにサブクローン化して、再クローニングを受けさせて、実施例１に述べたような問題の酵素部分によってＶＨ遺伝子を置換させて、ベクターｐＶＨ５Ｅを得る。ＪＨ領域もプラスミドベクターにサブクローン化して、実施例２に述べたように３’酵素部分を挿入して、ベクターｐＪＨ３Ｅを得る。
次に、ベクターｐＶＨ５Ｅを、オリジナルＹＡＣベクター中に存在しない酵母選択性マーカーＨＩＳ３、セントロメア（ＣＥＮ）及び単独テロメア（ＴＥＬ）を包含する１／２ＹＡＣベクター中に、問題の酵素の５’部分を含有する修飾ＶＨ遺伝子と共にサブクローン化する。ｐＪＨ３Ｅからの問題の酵素の３’部分を含有する修飾ＪＨ領域サブクーロンも、オリジナルＹＡＣベクター中に存在しない酵母選択性マーカーＬＥＵ２と単独ＴＥＬとを包含する１／２ＹＡＣベクターにサブクローン化する。修飾ＶＨ遺伝子を有する１／２ＹＡＣベクターを線状化して、ＶＨ、Ｄ、ＪＨ及びＭｕ  Ｈ鎖の所望のマウスＨ鎖配列を有する酵母菌株を形質転換するために用いる。ヒスチジン−原栄養株の選択は、相同組換えを既に受けた酵母コロニーを生じる。問題の酵素の３’部分を含有する酵素修飾ＪＨ領域を含有する１／２ＹＡＣベクターを次に線状化して、前工程で得られた酵母菌株の形質転換に用いる。ロイシン−原栄養株の選択は全酵素／免疫グロブリン座を含有する酵母菌株を生じる。好ましくは、両方の選択工程は一緒におこなうことができる。このＹＡＣを単離して、ＥＳ細胞中に微量注入して、細胞をＧ４１８を用いてｎｅｏ選択する。次に、得られた細胞株ＬＹＳ３５ＹＡＣを用いて、実施例Ｖに上述したように、キメラマウスを得る。得られたキメラマウスを次に繁殖させて、ネイティブ抗体を産生しないで、酵素抗体キメラ分子を産生するマウスを得る。実施例６と７は内因性のＨ鎖とＬ鎖、免疫グロブリン発現を除去するための繁殖プロトコールを説明する。
実施例Ｘ
実施例５、６、７、８及び９で得られたトランスジェニックマウスを用いた酵素多様性の生成。新規な活性を生じるための免疫感作の特定の例を下記の実施例１１、１２及び１３に説明する。
酵素／免疫グロブリンＤＮＡを組み込んだマウスの免疫感作はアジュバント中の抗原の注入によっておこなう。これらの抗原は遷移状態類似体又は基質又は生成物又は単一免疫原中の組合せでありうる。これらの種々な免疫原は単独で、又は免疫感作プロトコールによって刺激された酵素多様性の発現を強化することを目的として逐次組み合わせて用いることができる。最初の免疫感作から１４日間後にマウスに追加免疫感作する（boosted）。典型的に、この後に３４日目と５０日目にも免疫感作する。マウスの反応を免疫感作した動物に採血をおこなって、問題の基質に対する酵素反応の特異的活性を試験して追跡する。マウスの血液に免疫感作に用いる特定のトランスジェニックマウスに依存して組換え酵素（recombined enzyme）のＣＯＯＨ末端のＭｕ  Ｈ鎖配列又はκＬ鎖配列に基づいて精製工程を受けさせる。典型的に、この精製はビーズ又は他の固相上で抗マウス免疫グロブリン特異的抗体を用いて、迅速かつ効果的な精製をおこなうことができる。
最高に望ましい酵素活性を有するマウスを殺し、所望の酵素活性を分泌するハイブリドーマの発生のために脾臓を摘出する。
融合パートナーとして黒色腫細胞を用いて、標準方法に従ってハイブリドーマを発生させる。融合の１日前に、１０％ウシ胎児血清を含む新鮮な媒質中に５ｘ１０5細胞／ｍｌの濃度で細胞を分配する。融合の朝に、２０％ウシ胎児血清と２ＸＯＰＩ（３ｍｇ／ｍｌのオキサロアセテート、０．１ｍｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム及び０．４ＩＵ／ｍｌのインスリン）溶液とを補充した等量の培地で細胞を希釈する。
マウスを殺した後に、脾臓を無菌条件下で（aseptically）摘出して、培養培地を含む皿に入れる。脾臓が微小片に裂かれ、殆どの細胞が取り出されるまで、細胞を細断する。
細胞を新鮮な無菌培地中で洗浄し、凝集塊を沈殿させる。血清を含まない培地中での遠心分離によって脾臓細胞をさらに２回洗浄する。第２回洗浄中に、黒色腫細胞も別の試験管中で洗浄する。最終洗浄後に、２種類の細胞ペレットを一緒にし、一緒に１回遠心分離する。５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の溶液を細胞ペレットに徐々に加え、細胞を全体で２分間にわたって再懸濁させる。１０ｍｌの予熱した培地を細胞溶液に加え、ゆっくりと３分間にわたって混合する。細胞を遠心分離して、上清を取り出す。２０％ウシ胎児血清と、１ＸＯＰＩ溶液と、ＩＸ  ＡＨ溶液（５８μＭアザセリン、０．１ｍＭヒポキサンチン）とを補充した１０ｍｌの培地中に再懸濁させる。融合細胞を９６孔プレート中に等分し、３７℃において又は１週間培養する。上清を無菌条件下で各孔から採取して、プールに入れる。これらのプールを基質に対する酵素活性に関して試験する。陽性のプールを個々の孔に関してさらに試験する。陽性の孔が同定されたならば、細胞を９６孔プレートから、２４孔プレート中の２０％ウシ胎児血清と、１ＸＯＰＩと、ＩＸ  ＡＨとを補充した０．５ｍｌ培地に細胞を移す。培養物が集密的になったならば、細胞を５ｍｌ中に拡大し、次に１０ｍｌ中に拡大させる。この段階で、細胞をサブクローン化して、単一の酵素／抗体産生細胞が培養物中に存在するようにする。これらの培養物は新規な酵素活性の生成の基礎又は、技術上公知の方法を用いて、酵素活性の他の発現及び生成系の開発のための遺伝的情報のソースを形成することができる。
実施例ＸＩ
増強したリゾチーム活性と増強した配列多様性の生成。
この実施例では、リゾチーム／抗体融合に関するトランスジェニックマウスをＫＬＨに結合した酵素に対する天然基質“ＮＡＧＮＡＭＮＡＧＮＡＭＮＡＧＮＡＭ”によって刺激する。ＫＬＨに結合した天然阻害剤  ＮＡＧ−ラクトンも免疫原として用いる。これはリゾチーム遺伝子組換えの刺激と活性リゾチーム回収とを知るための試験系の基礎を形成した。
トランスジェニックマウスを実施例１０におけるように上述した免疫原によって免疫感作する。次に、活性ハイブリドーマに対してリゾチーム遺伝子のＰＣＲ増幅をおこなった後に、標準方法に従って配列決定する（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）。この刺激されたマウスからのリゾチーム遺伝子は有意なレベルの配列可変性（sequence variability）を示すことが判明し、このことはこの系が一定の方向をもった（directed）刺激によって酵素多様性を生じることができることを実証する。
実施例ＸＩＩ
リボヌクレアーゼ免疫グロブリンを産生するトランスジェニックマウスにおける多様性の生成。
この実施例では、リボヌクレアーゼ／免疫グロブリン  トランスジェニックマウスを天然基質ＲＮＡと、リボース環中のシスジオールの過ヨウ素酸酸化後のＫＬＨのアミノ基によるシフト塩基の形成とホウ水素化ナトリウムによる還元後に、ＫＬＨに結合した遷移基質ウリジン−バナデートの両方によって刺激する。上述した一般的プロトコールに従って、キメラマウスを免疫感作する。
ビーズ上での抗抗体試薬（anti antibody reagent）を用いた抗体の選択的単離後のキメラリボヌクレアーゼ抗体活性のレベルの上昇に関して、マウスをスクリーニングする。このことは血清中に見い出されるリボヌクレアーゼの内因性レベルのために重要であると判明している。
これらの免疫感作から単離されたハイブリドーマを酵素活性とリボヌクレアーゼ配列との両方による関して調べる。リボヌクレアーゼ／抗体キメラ分子のクローンの配列及び特異的活性には、有意差が見い出される。
実施例ＸＩＩＩ
遷移状態免疫感作に基づく新規なリゾチーム活性の生成。
この実施例では、酵素多様性の生成を刺激するために用いる免疫原は既述されているアミジン遷移状態類似体に基づくものである（本明細書に援用されるＷＯ９３／０２７０３）。この遷移状態類似体の他の代替え物としては、例えばＮＡＧ−ラクトン、１−アミノガラクトシド及びガラクタールが知られる。アミジンハプテンはグリコシド結合の加水分解の遷移状態を模倣し、リゾチームレパートリーの発生を刺激するための免疫原の良好なコア構造を表す。特定のアミジンはリゾチーム／抗体産生マウスからのガラクトシダーゼ活性の生成と選択とを可能にするために基質ガラクトースに適合するように用意される。これらの免疫原は典型的に、Ｒ基が多くの種々な選択である系列として生成される。この場合には、我々はタンパク質キャリヤーに結合したリボースとデオキシリボースの使用に重点をおく。このアミジン免疫原はキャリヤータンパク質に、典型的にはキーホールリンピット（keyhole limpet）ヘモシアニンに結合して、最良の結果を得る。免疫感作スケジュールは上記実施例１０の一般的プロトコールに説明するようにおこなわれる。免疫感作した動物からの血清を免疫感作中に化学発光性ガラクトシダーゼ基質（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて試験する。最大活性を示す動物を上述したようにハイブリドーマ系列と融合させるために用いる。
上記方法の種々な組合せを用いて、特許請求する本発明を実施することができることを、当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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