(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シス−９，10−オクタデセノアミド、アナンドアミド、ミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドを加水分解することができる単離された脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）であって、
該FAAHが、（ｉ）配列番号36に示されるアミノ酸残基配列、（ii）残基３から581まで配列番号40に示されるアミノ酸残基配列及び（iii）残基12から590まで配列番号43に示されるアミノ酸残基配列からなる群より選ばれるアミノ酸残基配列からなる
ことを特徴とするFAAH。
【請求項２】
配列番号36に示されるアミノ酸残基配列からなる、請求項１に記載のFAAH。
【請求項３】
残基３から581まで配列番号40に示されるアミノ酸残基配列からなる、請求項１に記載のFAAH。
【請求項４】
残基12から590まで配列番号43に示されるアミノ酸残基配列からなる、請求項１に記載のFAAH。
【請求項５】
脂肪酸一級アミドの加水分解を触媒作用する方法であって、該脂肪酸一級アミドと請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたFAAHとを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記脂肪酸一級アミドが、不飽和を有するアルキル鎖を含み、該不飽和がシス配置を有するアルキル鎖中にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪酸一級アミドが、シス−９，10−オクタデセノアミド、シス−８，９−オクタデセノアミド、シス−11，12−オクタデセノアミド、シス−13，14−ドコセノアミド、及び式：NH2C（O）（CH2）(6≦n≦11)CH=CH（CH2）(8≧n≧5)CH3を有する脂肪酸一級アミドからなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アナンドアミド、ミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド又はステアリン酸アミドを加水分解するための、請求項１に記載のFAAHの使用。
【請求項９】
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）の候補インヒビターの抑制活性の確認方法であって、下記の工程：
工程Ａ：請求項１に記載のFAAH及び脂肪酸一級アミド基質を反応条件下で組合わせることにより混合物“Ａ”を生成する工程、
工程Ｂ：該工程Ａの混合物“Ａ”を候補インヒビターと組合わせることにより混合物“Ｂ”を生成する工程、次いで
工程Ｃ：混合物“Ａ”中の該脂肪酸一級アミド基質から加水分解生成物への変換を定量する工程、
工程Ｄ：混合物“Ｂ”中の該脂肪酸一級アミド基質から加水分解生成物への変換を定量する工程、次いで
工程Ｅ：該工程Ｃ及びＤの定量化を比較することにより候補インヒビターの抑制活性を確認するする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸一級アミド基質が、シス−９，10−オクタデセノアミド、アナンドアミド、ミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドからなる群より選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脂肪酸アミドヒドロラーゼタンパク質をコードする核酸分子であって、該核酸分子が配列番号35、配列番号39及び配列番号42からなる群より選ばれるヌクレオチド配列からなることを特徴とする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１に記載のFAAHを製造する方法であって、
該FAAHをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターを発現させる工程、及び、
発現したFAAHを単離する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記FAAHが、アフィニティークロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び分配クロマトグラフィーからなる群より選ばれるクロマトグラフィー方法による精製により単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、FAAHを吸着するためのFAAHのトリフルオロケトンインヒビターで誘導体化された固相吸着剤を使用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記FAAHが以下のような精製：
工程Ａ：DEAEクロマトグラフィーカラムを使用して、FAAHの粗起源を交換クロマトグラフィーにより精製して第一溶離生成物を生成する工程、次いで
工程Ｂ：該工程Ａの第一溶離生成物をHgアフィニティークロマトグラフィーカラムによる溶離により更に精製して第二溶離生成物を生成する工程、次いで
工程Ｃ：該工程Ｂの第二溶離生成物をヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムによる溶離により更に精製して第三溶離生成物を生成する工程、次いで
工程Ｄ：該工程Ｃの溶離生成物を、FAAHのトリフルオロケトンインヒビターで誘導体化されたアフィニティークロマトグラフィーカラムによる溶離により更に精製してFAAHの精製形態を生成する工程
により単離される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の詳細な説明
技術分野
本発明は催眠性脂肪酸一級アミドとそれらの相当する脂肪酸の間の加水分解的変換を触媒作用し、脂肪酸アミドヒドラーゼ（FAAH）と称される酵素、このような変換の酵素触媒作用方法、及びこのような変換の酵素触媒作用の抑制方法に関する。更に特別には、本発明は単離された形態または組換え形態のFAAHタンパク質並びにその使用及び抑制に関する。
政府の権利の記述
本発明はNational Institutes of Health Shared Instrumentation補助金No.1S10 RR07273-01のもとに政府の支持によりなされた。政府は本発明に或る種の権利を有する。
背景
睡眠は、生体がそれ自体休息し、その生理力が回復される自然の周期的挙動状態である。それは環境に対する反応性の損失を特徴とする。睡眠中に、生体及び脳の両方の或る生理プロセスは、それらが警戒を怠らない目覚め中に機能するのとは異なって機能する。正常な睡眠は少なくとも二つの全く異なる挙動状態：同調睡眠（その間、脳波は高振幅の遅い波からなる）と、脱同調された（desynchronized）睡眠（DS）又は迅速な眼球運動を特徴とする活性化された睡眠（REM睡眠）（脳波パターンが高周波数及び低振幅を特徴とする）からなる。更に、同調された睡眠は遅く、かつ規則的な呼吸、比較的一定の心拍数及び血圧、並びにデルタ波の支配を特徴とする。同調された睡眠は、通常、四つの段階からなり、続いて活性化された睡眠の期間がある。夫々のサイクルは80〜120分間続く。対照的に、脱同調された睡眠は不規則な心拍数及び呼吸、不随意の筋肉の反射及び運動の期間、並びに覚醒の高い閾値を更に特徴とする。脱同調された睡眠の期間は５〜20分間続き、正常な夜の睡眠中に約90分間の間隔で起こる。
睡眠障害は睡眠遮断及び睡眠発作、即ち、ナルコレプシーを含む。睡眠の開始を促進もしくは抑制し、又は睡眠状態もしくは目覚め状態を維持するための薬理学的方法は知られていなかった。
脳髄液は、四つの脳室並びに脳及び脊髄の周囲のクモ膜下の間隙中を循環する無色透明の液体である。脳髄液は第三及び第四の側脳室中で脈絡叢により分泌された血液の限外濾過液として生じる。又、脳髄液は時折髄液と称される。四つの脳室及びクモ膜下の間隙を通過した後、脳髄液はクモ膜下の柔毛により静脈系に殆ど再吸収される。脳髄液はそれにより潤された組織からの異化代謝産物、排泄物、及び老廃物の除去のための媒体として利用できる。現在まで、脳髄液に由来する因子は睡眠遮断と相関関係があると報告されていなかった。必要とされるものは、睡眠遮断と相関関係がある物体により生じた生化学的因子を同定するための脳髄液の分析方法である。
プロスタグランジンの独創的な発見以来、重要な生理プロセスにおける脂肪酸及びそれらの誘導体の役割が次第に認識されてきている（例えば、B.Samuelsson,Les Prix Nobel 1982,153-174頁）。
シス−９，10−オクタデセノアミドは睡眠遮断されたネコの脳髄液から単離され、ラットに注射された時に睡眠誘発性を示すことが示されていた。シス−９，10−オクタデセノアミドの他のその他の脂肪酸一級アミドがネコ、ラット、及びヒトの脳髄液の天然成分として同定され、これらの化合物が脳脂質の特有のファミリーを含むことを示した。一緒になって、これらの結果は、脂肪酸一級アミドが被験者の睡眠誘発に使用し得る生物学的シグナリング分子の新しいクラスに相当することを教示する。好ましい脂肪酸一級アミドは不飽和を有するアルキル鎖を含み、下記の式により表される。
NH2C（O）（CH2）（6≧n≦11）CH=CH（CH2）（8≧n≦5）CH3。好ましい催眠性脂肪酸一級アミドはそれらのアルキル鎖中にシス配置で不飽和を有する。シス−９，10−オクタデセノアミドの他に、その他の催眠活性脂肪酸一級アミドとして、シス−８，９−オクタデセノアミド、シス−11，12−オクタデセノアミド、及びシス−13，14−ドコセノアミドが挙げられる。
Deutschら（Biochem.Pharmacol.,46:791（1993））は神経芽細胞腫、グリオーマ細胞及びラット脳組織の粗ホモジネートから採取された膜細胞下のフラクションからのアラキドニルエタノールアミド（アナンドアミド）の加水分解及び合成の両方を触媒作用するアミダーゼ活性を同定した。その研究は、ラットの心臓及び骨格筋からではなく、脳、肝臓、腎臓及び肺からの組織のホモジネートからアラキドニルエタノールアミド（アナンドアミド）からアラキドン酸へのとり込み及び酵素分解（及びその逆）を検出した。
このアミダーゼ活性を示す活性膜フラクションは、所望の細胞系を均質化し、続いて粗ホモジネートを密度遠心分離にかけることにより、又はラット脳の粗ホモジネートを採取し、それらをアナンドアミドとともに直接インキュベートすることにより調製された。
アラキドニルエタノールアミド（アナンドアミド）のとり込み及び分解が細胞培地中で[3H]−アナンドアミド（NEN、NET-1073、210Ci/ミリモル）のインキュベーションにより分析された。水相及び有機相の液体シンチレーションカウンティングにより、アラキドン酸及びアナンドアミドが有機相に分布されるこがわかった。こうして、細胞培地の有機抽出物が続いて薄層クロマトグラフィーを使用して視覚化され、表面オートラジオグラフエンハンサー（EN3HANCE、Dupont）で噴霧され、-80℃でＸ線フィルム（Kodak X-OMAT AR）に露出された。
セリンプロテアーゼインヒビターであるフェニルメチルスルホニルフルオリドは1.5mMの濃度でアミダーゼ活性を完全に抑制した。試験されたその他のインヒビターはその活性に対し殆ど効果を有せず、又は全く効果を有せず、それらはアプロチニン、ベンゾアミジン、ロイペプチン、キモスタチン及びペプスタチンを含んでいた。
第二の原稿中で、Deutschら（J.Biol Chem.,1994,269,22937）はアナンドアミド加水分解の特定のインヒビターの幾つかの型の合成及びアナンドアミド分解をin vitroで抑制するそれらの能力を報告している。化合物の四つのクラスが合成され、脂肪アシルエタノールアミド、α−ケトエタノールアミド、α−ケトエチルエステル及びトリフルオロメチルケトンを含む。これらの化合物の最も有効なクラスはトリフルオロメチルケトン及びα−ケトエチルエステルであった。最も効力のないインヒビターはアナンドアミドのα−ケトアミド及び飽和類縁体であった。
一例として、アナンドアミドが神経芽腫細胞とともにインキュベートされる場合、それはアラキドネートに迅速に加水分解されるが、インヒビターアラキドニルトリフルオロメチルケトンの存在下では、アナンドアミドレベルの５倍の増加がある。その研究は、トリフルオロメチルケトン中に見られるような極性カルボニルが求核性残基とアナンドアミドのカルボニル基の反応中に生成された四面体中間体を模擬する安定化された水和物を生成し得ることを推論している。Deutschは、求核性残基が加水分解酵素中のセリンヒドロキシルの活性部位であるかもしれないと示唆している。
この酵素は、その酵素がペプチド結合以外の炭素窒素結合に対し作用するアミダーゼ（EC#3.5）として分類される。アミダーゼ活性はセリンプロテアーゼインヒビターであるPMSFにより抑制され、トリフルオロメチルケトンインヒビター（及びその他）の作用はその酵素の加水分解活性に直接影響する。更に、Deutschは、アナンドアミドが活性部位セリンヒドロキシル基を伴うメカニズムにより開裂されると示唆している。
必要とされることは、これらの化合物の催眠活性を媒介するための、脳脊髄中に見られる催眠性化合物の分解を触媒作用する脳組織中の酵素の同定である。必要とされることは、脳髄液中に見られる型の催眠性化合物を分解する酵素の活性を抑制するためのインヒビターの同定である。
発明の要約
催眠性脂肪酸一級アミドを分解し、脂肪酸アミドヒドロラーゼ、またはFAAHと称される酵素が本明細書に開示される。FAAHは催眠性脂肪酸一級アミドを含む脂肪酸一級アミドの活性を媒介する酵素の一種である。
本明細書に開示されるように、FAAHは下記のスキーム１に示されるようにその他の基質の中でオレイン酸へのシス−９，10−オクタデセノアミドの変換を触媒作用するための酵素活性を特徴とし、それ故、当初にはシス−９，10−オクタデセノアミダーゼとして同定された。しかしながら、FAAHは種々の脂肪酸一級アミドを加水分解する活性を有することが今示され、それ故、シス−９，10−オクタデセノアミダーゼと当初称されたアミダーゼはFAAHと更に適切に称される。
0004102445.tif 000002
本発明の一つの局面はFAAHの精製形態に関する。FAAHはクロマトグラフィー方法を含む種々の方法により精製される。好ましいクロマトグラフィー方法として、アフィニティークロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び分配クロマトグラフィーが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、固相吸着剤は特別なタンパク質を結合する基を含む。何となれば、それらはタンパク質が自然アフィニティーを有するリガンドに似ているからである。好ましい様式において、固相吸着剤はその酵素を結合する一種以上のFAAHインヒビターを含む。抗体アフィニティークロマトグラフィーにおいて、FAAHに対する結合特異性を有する抗体を有する固相免疫吸着剤が使用される。電気クロマトグラフィー又は電気泳動において、FAAHはその分子量又は等電点に応じてその他の分子から分離される。ゲル透過、モレキュラーシーブ、及び排除クロマトグラフィーとしても知られているゲル濾過において、固相がゲル溶媒の静止相及び排除された溶媒の移動相を生じる。FAAHはその分子サイズに応じて分離される。何となれば、それが静止相と移動相の間で分配するからである。ゲル粒子はFAAHを越える排除サイズを有するように選択される。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、固相イオン交換樹脂がイオン力と非イオン力の間のその分配に応じてFAAHをその他の分子から分離するのに使用される。分配クロマトグラフィーにおいて、静止相及び移動相を有する不混和性液体が二つの不混和相の間のその分配に応じてFAAHを分離するのに使用される。好ましいクロマトグラフィー方法として、DEAEクロマトグラフィー、FAAHのインヒビター、例えば、トリフルオロケトンで誘導体化されたHg基を付着した固相によるアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
好ましい様式において、FAAHの粗起源が四つの工程で精製される。第一工程において、FAAHの粗起源がDEAEクロマトグラフィーカラムを使用する交換クロマトグラフィーにより精製されて第一溶離生成物を生成する。第二工程において、第一工程からの溶離生成物がアフィニティークロマトグラフィーで分配することにより更に精製されて第二溶離生成物を生成する。第三工程において、第二工程からの溶離生成物がヘパリンアフィニティークロマトグラフィーで分配することにより更に精製されて第三溶離生成物を生成する。第四工程において、第三工程からの溶離生成物がFAAHのトリフルオロケトンインヒビターで誘導体化された静止相で分配することにより更に精製される。第四工程からの溶離物がFAAHの精製形態を生成する。
FAAHは本明細書に記載されるようにラット、マウス又はヒトを含む種々の哺乳類種のいずれからも単離し得る。
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）は
0004102445.tif 000003
からなる群から選ばれたアミノ酸配列の包含を特徴とする。
本発明の別の局面は脂肪酸一級アミドの加水分解の触媒作用方法に関する。この加水分解方法において、脂肪酸一級アミドがFAAHの触媒量の精製形態と合わされ、又は接触される。好ましい様式において、脂肪酸一級アミドは、不飽和を有するアルキル鎖を含み、又は更に特別には下記の式により表される型のものである。
NH2C（O）（CH2）（6≧n≦11）CH=CH（CH2）（8≧n≦5）CH3
更に特別には、アルキル鎖の不飽和はシス配置を有してもよく、又はシス−９，10−オクタデセノアミド、シス−８，９−オクタデセノアミド、シス−11，12−オクタデセノアミド、又はシス−13，14−ドコセノアミドと同一であってもよい。
本発明の別の局面はFAAHによるシス−９，10−オクタデセノアミドの如き脂肪酸一級アミドの酵素触媒加水分解の抑制方法に関する。この方法において、FAAHがFAAHのインヒビターと合わされ、又は接触される。好ましいインヒビターとして、フェニルメチルスルホニルフルオリド、HgCl2、及び下記の構造を有するトリフルオロケトンが挙げられる。
0004102445.tif 000004
本発明の別の局面はFAAHの候補インヒビターの抑制活性の確認方法に関する。こうして、FAAHが候補FAAHインヒビターと混合されてスクリーニング方法で抑制能を評価する。
候補FAAHインヒビターの抑制活性を測定するのに好ましい方法において、意図される方法は五つの工程を含む。第一工程において、混合物“Ａ”がFAAH及びシス−９，10−オクタデセノアミド基質を反応条件下で合わせることにより生成される。第二工程において、混合物“Ｂ”が混合物“Ａ”を候補インヒビターと合わせることにより生成される。第三工程において、混合物“Ａ”中のシス−９，10−オクタデセノアミド基質から加水分解生成物への変換が定量される。第四工程において、混合物“Ｂ”中のシス−９，10−オクタデセノアミド基質から加水分解生成物への変換が定量される。第五工程において、候補インヒビターの抑制活性が工程３及び工程４の定量を比較することにより確かめられる。
本発明の別の局面は下記構造により表されるFAAHのトリフルオロケトンインヒビターに関する。
0004102445.tif 000005
本発明の別の局面はFAAHの一部又は全部をコードする一つ以上のヌクレオチド配列に関する。ヒト、マウス又はラットFAAHをコードする完全ヌクレオチド配列が夫々配列番号42、39又は35に示される。
ラットFAAHの部分ヌクレオチド配列は以下のように表される。
0004102445.tif 000006
【図面の簡単な説明】
図１は天然物質、シス−９，10−オクタデセノアミド（1）、関連類縁体（2-6）の構造を示す。化合物６は天然産Ｃ22脂肪酸アミドの好ましい構造である。
図２は節B.4に記載されたようなラットFAAHの決定された部分アミノ酸配列を示す。
図３は1）肝臓膜の蔗糖勾配、続いて2）100mMの炭酸ナトリウム洗浄及び3）トリトンをベースとする緩衝液中の可溶化を使用してラット肝臓からの原形質膜タンパク質フラクションの単離を伴う部分精製戦略を示す。次いで単離された肝臓原形質膜が四つの連続のクロマトグラフィー工程：1）、イオン交換DEAEカラム、2）水銀抑制カラム、3）洗剤交換ヘパリンカラム、続いて4）トリフルオロケトンインヒビターを含むアフィニティーカラムにより精製される。精製タンパク質は粗タンパク質フラクションとの精製タンパク質バンド強さの目視比較により粗膜タンパク質フラクションからアミダーゼ活性の20〜30倍の強化を有するこが測定された。推定の精製収率は粗肝臓原形質膜タンパク質から10〜15％である。
図４はジスルフィド誘導体化固体担体（ピリジルジスルフィドビーズ）に結合されているトリフルオロケトンインヒビターを使用するアフィニティーカラム精製戦略（工程４、図３）を示す。
図５はトリフルオロケトンインヒビターの合成及びピリジルジスルフィドビーズを使用するジスルフィド誘導体化固体担体へのインヒビターのその後の結合に関する合成プロトコルを示す。
図６はオレイン酸への放射能標識されたシス−９，10−オクタデセノアミドの加水分解及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）によるその抑制に関するラット脳膜フラクションのFAAH活性を示す薄層クロマトグラフィープレート（SiO2、55％酢酸エチル／ヘキサン）のオートラジオグラムを示す。レーン番号、内容：レーン１、シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質；レーン２、ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン３、ラット脳膜フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン４、ラット脳膜フラクション＋１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン５、ラット脳膜フラクション＋5mMのEDTAを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン６、ラット膵臓ミクロソームを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン７、プロテイナーゼＫ（200mg）を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン８、オレイン酸標準物質。
図７はオレイン酸への放射能標識されたシス−９，10−オクタデセノアミドの加水分解及び塩化第二水銀（HgCl2）によるその抑制に関するラット脳膜フラクションのFAAH活性を示す薄層クロマトグラフィープレート（SiO2、55％酢酸エチル／ヘキサン）のオートラジオグラムを示す。アミド加水分解活性の抑制に必要とされる最適濃度は50mM〜５mMのHgCl2にある。TLCプレートの種々のレーンは以下のように同定される。レーン１、シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質；レーン２、ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン３、ラット脳膜フラクション及び500mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン４、ラット脳膜フラクション及び50mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン５、ラット脳膜フラクション及び5mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン６、オレイン酸標準物質。典型的なHgCl2抑制研究はHgCl2の100mMのHgCl2原液（１mLのトリス緩衝液（50mM）、pH7.5中27mg）を使用する。
図８はクローニング操作から得られたｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。リボソームマーカーがレーン１の隣に矢印により示され、５kbバンド及び２kbバンドを示す。レーン６の隣の矢印は、オレイン酸アミダーゼ酵素に代表的である３kbバンドを指摘する。レーン１はラット脳からの全ＲＮＡであり、レーン２はラット肺からの全ＲＮＡであり、レーン３はラット腎臓からの全ＲＮＡであり、レーン４はラット心臓からの全ＲＮＡであり、レーン５はラット肝臓からの全ＲＮＡであり、レーン６はラット肝臓からのｍＲＮＡであり（レーン６に入れられたｍＲＮＡは約500ngである）、レーン１〜５に入れられた合計の夫々のＲＮＡは約15μgであった。
図９は脂肪酸アミドヒドロラーゼ又はFAAHと又称されるラットオレアミドヒドロラーゼのコードされた演繹アミノ酸残基配列（配列番号36）を示す。コードされたラットFAAHはrFAAHと適切に称される。太字はPSORTにより予測されるような推定トランスメンブランスパンニングドメインを示す。７つの不連続の下線を施された領域は酵素のトリプシン消化産物のHPLC精製により得られた７種の別々のペプチド（その表示は連続している）を示す。二重下線を施されたセグメントは推定SH3-ドメイン結合配列である。
図10-1〜10-5は節Ｄに記載されたラットFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮＡ配列を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメチオニン（M）で始まって示される。終止コドンが又ボックスされて示される。ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号35及び37に夫々リストされ、そのアミノ酸配列が配列番号35にそのヌクレオチド配列でリストされ、配列番号36にそれ自体リストされる。
図11は節D1に更に記載されるような幾つかのその他の代表的なアミダーゼとともにラットFAAHのアミダーゼ標示配列領域（アミノ酸残基215から246までの配列番号36）の配列を示す。ファミリー員の間で完全に保存される標示配列の残基が太字で示され、夫々の員の標示配列の相対アミノ酸位置が配列情報の前後の番号により示される。上部から下部に、配列は下記の夫々の配列番号36（残基215から246まで）、47、48、49、50、51、52及び53を有する。
図12A及び12Bは節Ｄに更に記載されるようなラットFAAH cDNAの内部800bpフラグメントで探査されたサザンブロット及びノーザンブロットの夫々の結果を示す。
図13-1〜13-4は節D2に記載されるようなマウスFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮＡ配列を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメチオニン（M）で始まって示される。終止コドンが又ボックスされて示される。ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号39及び41に夫々リストされ、そのアミノ酸配列が配列番号39にそのヌクレオチド配列でリストされ、配列番号40にそれ自体リストされる。
図14-1〜14-5は節D3に記載されるようなヒトFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮＡ配列を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメチオニン（M）で始まって示される。終止コドンが又ボックスされて示される。
ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号42及び44に夫々リストされ、そのアミノ酸配列が配列番号42にそのヌクレオチド配列でリストされ、配列番号43にそれ自体リストされる。
図15Aは節Ｆに更に記載されるようなオレイン酸への標識オレアミドの変換を示す薄層クロマトグラフィーにより行われるような節Ｅに記載されるようにして生じられるCOS-7細胞中の組換えラットFAAHの発現を示す。
図15Bは節Ｆに更に記載されるような図15Aに記載されたようにして又行われたトリフルオロメチルケトンによる組換えラットFAAHの抑制を示す。
図15Cは四つの左のレーン（1-4）に示されるような図９に示されたようなペプチド２に対し産生され、又四つの右のレーン（5-8）に示されるようなペプチドと競合された抗体による組換えラットFAAHのウェスタンブロッティングの結果を示す。トランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物のサンプルがレーン４及び８に示され、FAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物がレーン３及び７に示され、アフィニティー精製されたラットFAAHがレーン２及び６に示され、FAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物及びアフィニティー精製されたFAAHの混合物がレーン１及び５で実験される。タンパク質が競合ペプチド抗原の不在下（レーン1-4）又は存在下（レーン5-8）で抗体で探査された。対照ではなくFAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物は過剰のペプチド抗原と一緒の抗体のプレインキュベーションにより有効に競合された免疫反応性60K-65Kタンパク質を含んでいたが、一方、トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物及びトランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物の両方で観察された痕跡量の交差反応性タンパク質はペプチドにより競合されなかった。
図16は薄層クロマトグラフィーを用いて図15Aに、又節Ｆに更に記載されたようにオレアミドをオレイン酸に加水分解するヒト組換え発現FAAHの能力を示す。
図17は対照のトランスフェクトされなかった細胞（レーン２）ではなくレーン３に示されるようなラットFAAHトランスフェクトCOS-7細胞中のアラキドン酸への標識アナンドアミドの変換を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す。アナンドアミド及びアラキドン酸のTLC標準物質が夫々レーン１及び４に示される。
発明の詳細な説明
Ａ．睡眠の誘発に関するプロトコル
合成シス−９，10−オクタデセノアミドが、異なる投与量：１mg（ｎ＝２）、２mg（ｎ＝２）、５mg（ｎ＝７）、10mg（ｎ＝10）、20mg（ｎ＝２）、及び50mg（ｎ＝２）における自然挙動に関するその効果を試験するために、ラットに注射（ip）された（ｎ＝試験したラットの数）。ラットは、光がサイクルで消され、それらのホームケージ中で観察された２時間後に反転暗期間（12:12）中に注射された。低投与量（１mg及び２mg）では、自然挙動に関する明らかな効果が見られなかった。しかしながら、５mgの閾値以上では、正常な睡眠の特徴の閉じられた眼、鎮静された挙動と関連する長く持続する運動休止の誘導からなる著しい効果があった。又、正常な睡眠について、ラットは配向反射で聴覚刺激に対し依然として応答し、刺激の源に関する注意を持続した。加えて、運動挙動が損なわれた。投与後の挙動鎮静に関する潜伏期は約４分であり、通常、被験者は１時間（５mg）、２時間（10mg）、又は2.5時間（20mg及び50mg）後に再度活性であった。
本発明者らはシス−９，10−オクタデセノアミドをビヒクル及び図１にリストされた合成類縁体と比較してその睡眠誘発ポテンシャルの構造特異性を推定した。ビヒクル（食塩水溶液中５％のエタノール）又はオレイン酸（5）のいずれもが明らかな挙動効果を示さなかった。トランス−９，10−オクタデセノアミドはそのシス相対物と同様の薬理効果を示したが、その睡眠誘発性について比較的短い期間により測定されたように極めて小さい効力であった（ラット当たり10mgでは、生物効果はトランス異性体について１時間持続し、シス異性体について２時間持続した）。オレフィンがアルキル鎖に沿っていずれかの方向（その８，９位（3）又は11，12位（4）の方に）に移動され、又はアルキル鎖長が22個の炭素（6）に延長された時、薬理効果の程度及び期間の両方のかなりの減少が観察され、又ラットの運動性が依然として低下したが、それらの眼は開いたままであり、またそれらの警戒がほんのわずかに影響されたことが明らかであった。最後に、シス−９，10−オクタデセノアミダドで注射されたラットに関するポリソムノグラフの（polysomnographic）研究は、ビヒクル対照と比較した時、徐波睡眠（SWS）の合計時間の増大並びにSWSの個々の期間の平均期間の増大を示す。更に特別には、雄のSDラット（手術の時点で300g）にハロタン麻酔（２〜３％）のもとに睡眠記録用の電極の標準の組を移植した。これは被験者心電図（EEG）を記録するための海馬の上の頭頂骨中に置かれた二つのスクリュー電極と筋電活性（EMG）により体位トーンを記録するための首筋系に挿入された二つのワイヤ電極を含んでいた。ラットが食物及び水への随時の接近により個々に収容された。明暗サイクルが調節された（12:12、10p.m.に点灯）。手術の１週間後に、ラットが少なくとも３日間にわたって記録条件について順応された。順応期間の完結後に、ラットはビヒクル（５％のエタノール／食塩水溶液）、シス−９,10−オクタデセノアミド（10mg）、又はオレイン酸（10mg）のいずれか２ミリリットル（ip）を受けた。ラットがip注射後の４時間（12:00p.m.-4:00p.m.）にわたって連続的に記録された。ラットがワンウェイ・ウィンドーにより挙動の自然変化について観察された。睡眠記録が目視でスコアを付けられ、四つの段階が測定された：目覚め、徐波睡眠１（SWS1）、徐波睡眠２（SWS2）、及び迅速眼球運動（REM）睡眠。
徐波睡眠（SWS）に関するこれらの増大は目覚めを犠牲にしていた。REM睡眠の分布は変化されないものと考えられる。一緒になって、これらのデータは、シス−９，10−オクタデセノアミドが徐波睡眠変調に重要な役割を果たし得ることを示唆する。
細胞人工物の受動構造要素としての脂質分子の従来の考えは、これらの薬剤が細胞シグナルを伝達し、細胞挙動を変更する際に果たす積極的な役割の絶えず増大している知見、例えば、Liscovitchら，Cell 77:329（1994）に対し迅速に屈しつつある。ここで研究された脂肪酸アミドの魅力的な特徴は、それらが、多くの多様性がアルカン鎖の長さ並びにその一つ以上のオレフィンの位置、立体化学、及び数を単に変化することにより生じ得る単純な分子のファミリーに属することである。重要なことに、それらのカルボキシ末端にアミド修飾を有するその他の神経活性シグナリング分子が、カルボキサミド末端ペプチドからアラキドニルエタノールアミドに至るまで報告されていた。カルボキサミド末端ペプチドを使用する神経活性シグナリング分子がEipperら，Annu.Rev.Neurosci.15:57（1992）により開示されている。アラキドニルエタノールアミドを使用する神経活性シグナリング分子がDevaneら，Science 258:1946（1992）により開示されている。シス−９，10−オクタデセノアミドは、コアー化学構造の簡単な変化が特異な生理結果を有する生物学的エフェクターの新しいクラスの一員であることがここに開示されている。
Ｂ．FAAH活性を有する細胞膜内タンパク質フラクションの単離及びアッセイ
１．脂質アミダーゼ活性の観察
脂質アミダーゼ活性が脳、肝臓、肺、腎臓及び脾臓組織中で観察されたが、心臓組織中では観察されなかった。その活性は１mMのPMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）及び50mMのHgClにより抑制され、これはその反応のスルフヒドリル基依存性に関する試験である。フラクションは100mMの炭酸ナトリウム（pH11.5）により可溶化されないので、サンプルは膜タンパク質であることが明らかであり、これは核、ミクロソーム、及び原形質膜の細胞下のフラクション中で同定されたが、シトゾル中では同定されなかった。
精製シス−９，10−オクタデセノアミドによるシス−９，10−オクタデセノアミドからオレイン酸への酵素触媒加水分解及びPMSFによるこの酵素の抑制が、図６に示された薄層クロマトグラフィープレート（SiO2、55％酢酸エチル／ヘキサン）のオートラジオグラムで開示される。夫々の場合、酵素反応は別々の反応容器中で行われ、生成物がTLCプレートにスポットされる。夫々のレーンに相当する反応容器に関する種々の反応条件は、以下のように同定される。
レーン１：シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質、
レーン２：ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン３：ラット脳膜フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン４：ラット脳膜フラクション＋１mMのPMSFを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン５：ラット膵臓フラクション＋５mMのEDTAを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン６：ラット膵臓ミクロソームを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン７：プロテイナーゼＫ（200mg）を含むシス−９，10−オクタデセノアミド、及び
レーン８：オレイン酸標準物質。
HgCl2によるオレイン酸へのシス−９，10−オクタデセノアミド加水分解の抑制研究が図７に示される。アミド加水分解活性の抑制に必要とされる最適濃度は50mM〜５mMのHgCl2にある。精製シス−９，10−オクタデセノアミドによるシス−９，10−オクタデセノアミドからオレイン酸への酵素触媒加水分解及びHgCl2によるこの酵素の抑制は、一連の反応容器中で行われ、薄層クロマトグラフィープレート（SiO2、55％酢酸エチル／ヘキサン）にスポットされる。典型的なHgCl2抑制研究はHgCl2の100mMのHgCl2原液（１mLのトリス緩衝液（50mM）、pH7.5中27mg）を使用する。夫々のレーンに相当する反応容器に関する種々の反応条件は、以下のように同定される。
レーン１：シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質、
レーン２：ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン３：ラット脳膜フラクション及び500mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン４：ラット脳膜フラクション及び50mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン５：ラット脳膜フラクション及び５mMのHgCl2を含むシス−９，10−オクタデセノアミド、
レーン６：オレイン酸標準物質。
0004102445.tif 000007
推定のエフェクター分子であるシス−９，10−オクタデセノアミドを分解することができる特異な酵素活性が同定され、本明細書に開示される。ラット脳膜フラクションによるオレイン酸への14Ｃ−シス−９，10−オクタデセノアミドの迅速な変換がTLCにより観察された。酵素活性は５mMのEDTAにより影響されなかったが、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）により完全に抑制された。ほんの痕跡のアミド加水分解活性がラット脳可溶性フラクションで観察されたが、ラット膵臓ミクロソーム及びプロテイナーゼＫはオレイン酸へのシス−９，10−オクタデセノアミドを加水分解する有意な能力を示さなかった。
２．脂肪酸一級アミドの合成
例示の脂肪酸一級アミドを合成するのに好ましいプロトコルが提供される。合成プロトコルは出発物質の鎖長、生成物収率、及び種々のシス生成物及びトランス生成物の分離に関してのみ異なる。それ故、シス−９，10−オクタデセノアミド及び幾つかのその他の脂肪酸一級アミドの合成に関する合成プロトコルの例示の記載が示され、脂肪酸一級アミドの全クラスに関する合成プロトコルを説明するのに利用できる。
３．FAAH活性を有するラット細胞膜内タンパク質フラクションの単離
本明細書に記載されるプロトコルは組織約５〜10gに関するものである。一つ以上のラット肝臓が回収され、計量され、次いで氷の上で１mMのNaHCO3中に入れられる。次に、肝臓が切断され、１mMのNaHCO3ですすがれ（2X）、ワックスのシートの上でレーザーブレードで細断される。次いでそれが１mMの重炭酸ナトリウム25mlに入れられ、ティシュマイザー中で２分間にわたってセッティング６で均質にされる。続いて、１mMの重炭酸ナトリウムによる100mlへの希釈が行われ、続いてチーズクロスの４層で濾過され、次いで８層で濾過される。次いで濾液が100mlにされ、四つのJA-20管に分けられ、１mMの重炭酸ナトリウムで仕上げられる。管がJA-20ローター中で４℃で12分間にわたって6,000rpm（4500xg）で回転される。パスツールピペットを使用して、脂肪層が吸引され、上澄み層がデカントされ、溜められる。
次に、ペレットがシリンジ及びニードルで残りの上澄み層中で再度懸濁される。次いで再懸濁液のフラクション20mLが15mlのドウンスホモジナーザーで16回ドウンスされる（dounced）。次いでフラクションが単一JA-20管に合わされ、１mMのNaHCO3で所定の容積にされる。次に管がJA-20ローター中で４℃で15分間にわたって6,000rpm（4500xg）で再度回転され、続いて上澄みが注いで除かれ、溜められる。ペレットが前記のように再度懸濁され、ドウンスされ、次いで１mMの重炭酸ナトリウムで10mlの容積にされる。次に、67％の蔗糖溶液20mLが30mLの最終容積まで添加され、その混合物が二つの管に分けられる。30％蔗糖更に25mLが夫々の管の上部に添加され、超遠心分離機中で4℃で1時間45分にわたって27K rpmで回転される。フラクションが蔗糖勾配から回収され、蔗糖勾配からの中央バンド（原形質膜バンド）がキャップ付きのプラスチック管に入れられ、１mMの重炭酸ナトリウムで満たされる。続いて管が４℃で35分間にわたって17,000rpmで回転される。
上澄みが廃棄され、ペレットが100mMの炭酸ナトリウム中で再度懸濁される（ドウンシングによる）。続いて、この溶液が氷の上に１時間保たれ、次いで１時間にわたって100,000gで回転される。脂質アミダーゼ活性がこのフラクション中に存在しないので、上澄み（可溶化された周辺膜タンパク質）が廃棄され、ペレットが10％グリセロール、１％トリトン、0.1％ホスファチジルコリン、20mMのヘペス緩衝液中で再度懸濁され（ドウンシングによる）、次いで４℃で２時間にわたって攪拌される。最後に、その溶液が１時間にわたって100,000gで回転され、こうして得られた上澄みが以下のようにして更に精製される。
４．４工程カラムクロマトグラフィー方法による精製
工程１DEAEカラム／イオン交換（図３）。上記の可溶化上澄みバッチが更に精製される。上澄みバッチが１時間にわたって４℃でDEAE-セファデックス（ジエチルアミノエチル−セファデックス、シグマ・ケミカル社から市販される）と混合される。DEAE樹脂に結合されるフラクションは脂質アミダーゼ活性を示す（フロースルー中にはない）。可溶化ラット肝臓原形質膜（BI：10％グリセロール、１％トリトンX-100、１mMのEDTA、20mMのヘペス、pH7.2中）がDEAE高速流カラム（ファーマシア）に通され、５カラム容積のBI、0.2％トリトンで洗浄される。次いでアミダーゼ活性が１カラム容積の夫々50mM、100mM、及び200mMのNaCl BI、0.2％トリトンで溶離される。
工程２Hgカラム（図３）。DEAE交換からの上記溶離物が１時間にわたって４℃でｐ−クロロ水銀安息香酸樹脂（バイオラド・ケミカル社から市販される）と混合される。上記水銀樹脂に結合されるフラクションは脂質アミダーゼ活性を示し（フロースルー中にはない）、５カラム容積のBI、0.2％トリトン、５カラム容積のBI、0.2％トリトン及び150mMのNaClで洗浄され、1.5カラム容積のBI、0.2％トリトン、150 NaCl及び25mMのｐ−メルカプトエタノールで溶離される。
工程３ヘパリンカラム（図３）。Hg溶離されたアミダーゼ活性がヘパリンカラム（バイオラド）に通され、10カラム容積のBI、0.7％CHAPS及び150mMのNaClで洗浄された（洗剤交換）。溶離が１カラム容積の夫々BI、0.7％CHAPS及び300mM、400mM、500mM、650mM、及び750mMのNaClで行われ、アミダーゼ活性が最後の二つのフラクション中に溶離された。
工程４アフィニティーカラム（図３及び４）。ヘパリン溶離されたアミダーゼ活性が0.2％の最終濃度についてトリトンX-100と混合され、次いで活性化ピリジルジスルフィドビーズ（ビーズへのインヒビターの付着が以下に記載される）に結合されたCF3-インヒビターに通され、20カラム容積のBI、0.2％トリトンX-100で洗浄された。溶離は、0.2％トリトン及び20mMのDTTを含む３カラム容積のBIに通し、カラムを４℃で30時間放置することにより行われた。次いでカラムを0.2％トリトン及び20mMのDTTを含む1.5カラム容積のBIで洗浄してサイズ60kDの単一タンパク質を溶離した。
溶離された60kdタンパク質がトリプシンで消化され、ペプチドが以下に記載されるように配列決定された。
次いでその活性の純度がこの操作後にアッセイプロトコルに従って分析される。
５．脂肪酸アミドヒドロラーゼ活性に関するアッセイ
以下の薄層クロマトグラフィー（TLC）プロトコルがシス−９，10−オクタデセノアミド加水分解活性（又、脂肪酸アミドヒドロラーゼ活性と称される）を分析するのに使用される。オレアミドが最初に14Cで標識される。これを行うために、０℃のCH2Cl2（200μL、0.005-0.05M）中の14C-オレイン酸（1-10μM、モラベク・バイオケミカルズ、5-50μCi/μM）が過剰の塩化オキサリルで処理され、その反応混合物が６時間にわたって25℃に温められた。次いで反応混合物が窒素ガスの一定の流れのもとに濃縮され、残っている残渣が０℃に冷却され、過剰の飽和水酸化アンモニウム水溶液で処理された。５分後に、反応混合物がEtAc（1.5mL）と10％のHCl（1.0mL）の間に分配された。次いで有機層が水（1.0mL）で洗浄され、窒素ガスの一定の流れのもとに濃縮されて、TLCにより判定して定量的収率で14C-オレアミドを得た（ヘキサン中60％のEtOAc;オレアミドＲf-0.2;オレイン酸Ｒf-0.8）。
エタノール中14C-オレアミド約１μCi（比活性5-50μCi/μM）が126mMのトリス-HCl、pH9.0 70μLとともに37℃で１〜２時間インキュベートされた（エタノールの最終濃度は2.0％であった）。次いでその反応混合物が酢酸エチル（1.0mL）と0.07MのHCl（0.6mL）の間で分配された。酢酸エチル層が窒素ガスの一定の流れのもとに濃縮され、残っている残渣がエタノール15μL中で再度懸濁された。次いでこのエタノール原液約３μLがTLC分析に使用された（ヘキサン中60％のEtOAc;オレアミドＲf-0.2;オレイン酸Ｒf-0.8）。溶媒への露出後に、TLCプレートが空気乾燥され、EN3HANCEスプレー（デュポンNEN）で製造業者のガイドラインに従って処理され、１〜２時間にわたって-78℃でフィルムに露出された。
精製タンパク質は、粗タンパク質フラクションとの精製タンパク質バンド強さの目視比較により粗膜タンパク質からアミダーゼ活性の20-30倍の強化を有すると測定された。推定精製収率は10−15％である（図３）。
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Ｃ．合成プロトコル
１．シス−９，10−オクタデセノアミド（１：図１）
０℃のCH2Cl2（8.9mL、0.4M）中のオレイン酸（1.0g、3.55ミリモル、1.0当量）の溶液を塩化オキサリル（5.32mL、CH2Cl2中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル（EtOAc）（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて１を白色の固体として得た（0.810g、理論値0.996g、81.3％）。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ6.06（bs,1H,NH2C（O））,5.58（bs,1H,NH2C（O））,5.32（m,2H,CH=CH）,2.16（t,2H,J=7.5Hz,CH2C（O）NH2）,2.02（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.61（m,2H,CH2CH2C（O）NH2）,1.29（bs,14H,アルキルプロトン）,0.87（t,3H,CH3）;FABHRMS（NBA/NaI m/e 282.2804（C18H35NO+H+は282.2797を要する）.
シス異性体とトランス異性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3から5.2までのオレフィン性プロトン及びδ2.0から1.8までのアリル性プロトンである。これらの領域は天然化合物をシス−９，10−オクタデセノアミドと同定する。
２．トランス−９，10−オクタデセノアミド（２：図１）
０℃のCH2Cl2（8.9mL、0.4M）中のエライジン酸（1.0g、3.55ミリモル、1.0当量）の溶液を塩化オキサリル（5.32mL、CH2Cl2中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル（EtOAc）（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて２を白色の固体として得た。シス異性体とトランス異性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3から5.2までのオレフィン性プロトン及びδ2.0から1.8までのアリル性プロトンである。これらの領域は化合物をトランス−９，10−オクタデセノアミドと同定する。
３．シス−８，９−オクタデセノアミド（３：図１）
０℃のCH2Cl2（1.5mL、0.31M）中の以下のように合成した11の溶液（0.130g、0.461ミリモル、1.0当量）を塩化オキサリル（0.69mL、CH2Cl2中2.0Mの溶液、1.38ミリモル、3.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル（EtOAc）（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて３を白色の固体として得た（0.105g、理論値0.130、80.8％）。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ5.70-5.34（m,4H,H2NC（O）及びCH=CH）,2.21（t,2H,J=7.5Hz,CH2C（O）NH2）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.63（m,2H,CH2CH2C（O）NH2）,1.47-1.23（m,20H,アルキルプロトン）,0.87（t,3H,RCH3）;FABHRMS（NBA/CSI m/e 414.1762（C18H35NO+Cs+は414.1773を要する）.
４．シス−11，12−オクタデセノアミド（４：図１）
０℃のCH2Cl2（8.9mL、0.4M）中のΔ11,12オクタデセン酸（1.0g、3.55ミリモル、1.0当量）の溶液を塩化オキサリル（5.32mL、CH2Cl2中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル（EtOAc）（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて４を白色の固体として得た。
５．オレイン酸（５：図１）
オレイン酸をアルドリッチ・ケミカル社から入手した（CAS #112-80-1）。
６．エルカミド（６：図１）
エルカミドをアルドリッチ・ケミカル社から入手した（CAS #28,057-7）。
７．メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート（７：スキーム３）
-20℃のテトラヒドロフラン（THF）（32.0mL、0.25M）中のスベリン酸モノメチルエステル（1.5g、7.97ミリモル、1.0当量）の溶液をBF3・THF（THF中1Mの溶液、7.97mL、7.97ミリモル、1.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を一夜攪拌し、続いて室温に到達させた。次いでその反応混合物を酢酸エチル（100mL）で希釈し、メタノール（10mL）及び10％HCl（10mL）で反応停止した。NaHCO3（1X 20mL）、水（2X 10mL）、及び食塩水（1X 10mL）で抽出して、メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート（７）を白色の粗固体として得た。
８．メチル−８−ブロモ−オクタノエート（８：スキーム３）
０℃のCH2Cl2（15mL、0.48M）中の粗メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート（７、1.24g、7.13ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr4（3.07g、9.27ミリモル、1.3当量）及びPPh3（2.61g、9.98ミリモル、1.4当量）で連続して処理し、その反応混合物を10時間にわたって４℃で攪拌する。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（8X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。Et2O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、ヘキサン）にかけて、８を無色透明の油（1.25g、理論量1.69g、74.0％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ3.64（s,3H,C（O）OCH3）,3.38（t,2H,J=6.8Hz,CH2Br）,2.29（t,2H,J=7.4Hz CH2C（O）OCH3）,1.83（p,2H,CH2CH2Br）,1.63（m,2H,CH2CH2C（O）OCH3）1.47-1.28（m,6H,アルキルプロトン）.
９．メチル−８−トリフェニルホスホラニル−オクタノエート−ブロミド（９：スキーム３）
CH3CN（4.0mL、1.31M）中の８（1.25g、5.23ミリモル、1.0当量）の溶液をトリフェニルホスフィン（1.52g、5.75ミリモル、1.1当量）で処理し、10時間にわたって還流下で攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン（0.685g、2.61ミリモル、0.5当量）を反応混合物に添加し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（5X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣をCH2Cl2の最小容積中で可溶化し、減圧で濃縮して９を無色のフォーム（2.20g、理論量2.61g、84.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.82-7.51（m,15H,ArH）,3.70-3.46（m,5H,CH3OC（O）R及びCH2PPh3）,2.13（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,1.62-1.43（m,6H,アルキルプロトン）,1.30-1.02（m,4H,アルキルプロトン）;FABHRMS（NBA）m/e 419.2154（C27H32BrO2P-Br-は419.2140を要する）.
10．メチル−シス−８，９−オクタデセノエート（10：スキーム３）
25℃のTHF（7.0mL、0.2M）中の９（0.71g、1.42ミリモル、1.0当量）の溶液をKHMDS（3.0mL、THF中0.5Mの溶液、1.5ミリモル、1.06当量）で処理し、その反応混合物を還流下で１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、デシルアルデヒド（0.321mL、1.71ミリモル、1.2当量）で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH4Cl水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、０〜２％EtOAC-ヘキサン勾配溶離）にかけて10を無色の油（0.290g、理論量0.422g、68.7％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ5.34（m,2H,CH=CH）,3.65（s,3H,CH3OC（O））,2.29（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.61（m,2H,CH2CH2C（O）OCH3）,1.29（bs,20H,アルキルプロトン）,0.86（t,3H,RCH3）.
11．シス−８，９−オクタデセン酸（11：スキーム３）
０℃のTHF-MeOH-H2O（3-1-1比、4.1mL、0.2M）中の10（0.245g、0.825ミリモル、1.0当量）の溶液をLiOH・H2O（0.104g、2.48ミリモル、3.0当量）で処理した。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液（100mL）で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて11を無色の油（0.156g、理論量0.233g、67.0％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ5.34（m,2H,CH=CH）,2.34（t,2H,J=7.4Hz,CH2COOH）,2.01（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.61（m,2H,CH2CH2COOH）,1.47-1.23（m,20H,アルキルプロトン）,0.87（t,3H,RCH3）.
12．18−ヘミスクシネート−シス−９，10−オクタデセノアミド（12：スキーム４）
CH2Cl2−CHCl3（3-1、1.60mL、0.1M）中の18（0.047g、0.160M、1.0当量）の溶液をEt3N（0.045mL、0.320ミリモル、2.0当量）、無水コハク酸（0.033g、0.320ミリモル、2.0当量）及びDMAP（0.002g、0.016ミリモル、0.1当量）で連続的に処理し、その反応混合物を25℃で10時間攪拌した。次いでその反応混合物をCH2Cl2（50mL）とH2O（50mL）の間に分配し、有機層を10％HCl水溶液（50mL）及び飽和NaCl水溶液（50mL）で連続して洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、3cm x 15cm、０〜10％MeOH-EtOAc）にかけて12を白色の固体（0.051g、理論量0.063、80.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ6.95（bs,1H,H2NC（O））,5.72（bs,1H,H2NC（O））,5.34（m,2H,CH=CH）,4.08（t,3H,J=6.6Hz,CH2OC（O）R）,2.61（m,4H,ROC（O）CH2CH2COOH）,2.21（t,2H,J=7.5Hz,CH2C（O）NH2）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.70-1.52（m,4H,CH2CH2C（O）NH2及びCH2CH2OH）,1.29（bs,18H,アルキルプロトン）;FABHRMS（NBA）m/e 398.2893（C22H39NO5+H+は398.2906を要する）.
13．メチル−９−ブロモ−ノナノエート（13：スキーム４）
０℃のCH2Cl2（30mL、0.2M）中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート（1.1g、5.85ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr4（2.5g、7.54ミリモル、1.3当量）及びPPh3（2.15g、8.19ミリモル、1.4当量）で連続して処理し、その反応混合物を10時間にわたって４℃で攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（8X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。Et2O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、ヘキサン）にかけて、13を無色透明の油（1.02g、理論量1.47g、69.5％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）d 3.64（s,3H,C（O）OCH3）,3.38（t,2H,J=6.8Hz,CH2Br）,2.29（t,2H,J=7.4Hz CH2C（O）OCH3）,1.83（p,2H,CH2CH2Br）,1.63（m,2H,CH2CH2C（O）OCH3）1.47-1.28（m,8H,アルキルプロトン）.
14．メチル−９−トリフェニルホスホラニル−ノナノエート−ブロミド（14：スキーム４）
CH3CN（3.5mL、1.16M）中の13（1.02g、4.06ミリモル、1.0当量）の溶液をトリフェニルホスフィン（1.17g、4.47ミリモル、1.1当量）で処理し、10時間にわたって還流下で攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン（0.532g、2.03ミリモル、0.5当量）を反応混合物に添加し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（5X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣をCH2Cl2の最小容積中で可溶化し、減圧で濃縮して14を無色のフォーム（1.90g、理論量2.08g、91.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.82-7.51（m,15H,ArH）,3.70-3.46（m,5H,CH3OC（O）R及びCH2PPh3）,2.13（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,1.62-1.02（m,12H,アルキルプロトン）;FABHRMS（NBA）m/e 433.2312（C28H34BrO2P-Br-は433.2296を要する）.
15．メチル−18−t−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノエート（15：スキーム４）
25℃のTHF（6.5mL、0.3M）中の14（1.0g、1.95ミリモル、1.0当量）の溶液をKHMDS（3.9mL、THF中0.5Mの溶液、1.95ミリモル、1.0当量）で処理し、その反応混合物を還流下で１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、３（0.93g、2.35ミリモル、1.2当量）で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH4Cl水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、０〜２％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて15を無色の油（0.82g、理論量1.07g、76.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.67（m,4H,ArH）,7.41（m,6H,ArH）,5.34（m,2H,CH=CH）,3.65（m,5H,CH3OC（O）及びCH2OTBDPS）,2.29（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.55（m,4H,CH2CH2C（O）OCH3及びCH2CH2OTBDPS）,1.29（bs,18H,アルキルプロトン）,1.04（s,9H,（CH3）3C）.
16．18−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセン酸（16：スキーム４）
０℃のTHF-MeOH-H2O（3-1-1比、7.3mL、0.2M）中の５（0.81g、1.47ミリモル、1.0当量）の溶液をLiOH・H2O（0.188g、4.48ミリモル、3.0当量）で処理した。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液（100mL）で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて16を無色の油（0.700g、理論量0.790g、88.7％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.67（m,4H,ArH）,7.41（m,6H,ArH）,5.34（m,2H,CH=CH）,3.65（t,3H,J=6.5Hz,CH2OTBDPS）,2.34（t,2H,J=7.4Hz,CH2COOH）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.65-1.50（m,4H,CH2CH2COOH及びCH2CH2OTBDPS）,1.47-1.23（m,18H,アルキルプロトン）,1.05（s,9H,（CH3）3C）;FABHRMS（NBA/CsI）m/e 669.2772（C34H52O3Si+Cs+は669.2740を要する）.
17．18−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノアミド（17：スキーム４）
０℃のCH2Cl2（4.3mL、0.3M）中の16（0.685g、1.28ミリモル、1.0当量）の溶液を塩化オキサリル（1.92mL、CH2Cl2中2Mの溶液、3.84ミリモル、3.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。その反応混合物をEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて17を無色の油（0.520g、理論量0.684g、76.0％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.67（m,4H,ArH）,7.41（m,6H,ArH）,5.70-5.34（m,4H,H2NC（O）及びCH=CH）,3.65（t,3H,J=6.5Hz,CH2OTBDPS）,2.21（t,2H,J=7.5Hz,CH2C（O）NH2）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.65-1.50（m,4H,CH2CH2C（O）NH2及びCH2CH2OTBDPS）,1.47-1.23（m,18H,アルキルプロトン）,1.05（s,9H,（CH3）3C）;FABHRMS（NBA/CsI m/e 668.2929（C34H53O2NSi+Cs+は668.2900を要する）.
18．18−ヒドロキシ−シス−９，10−オクタデセノアミド（18：スキーム４）
THF（1.1mL、0.31M）中の17（0.185g、0.345ミリモル、1.0当量）の溶液をテトラブチルアンモニウムフルオリド（0.69mL、THF中1.0Mの溶液、0.69ミリモル、2.0当量）で処理し、その反応混合物を25℃で２時間攪拌した。次いでその反応混合物をEtOAc（50mL）とH2O（50mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、3cm x 15cm、０〜５％MeOH-EtOAc勾配溶離）にかけて18を白色の固体（0.097g、理論量0.103g、94.6％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ5.65-5.34（m,4H,H2NC（O）及びCH=CH）,3.62（t,3H,J=6.5Hz,CH2OH）,2.21（t,2H,J=7.5Hz,CH2C（O）NH2）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.65-1.50（m,4H,CH2CH2C（O）NH2及びCH2CH2OH）,1.29（bs,18H,アルキルプロトン）;FABHRMS（NBA）298.2732（C18H35NO2+H+は298.2746を要する）.
19．化合物100（図５）の合成
メチル−９−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナノエート（化合物100:図５の中間体）。CH2Cl2（15mL、0.3M）中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート（0.838g、4.46ミリモル、1.0当量：アルドリッチ）の溶液をEt3N（0.75mL、5.38ミリモル、1.2当量）、ｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（1.28mL、4.93ミリモル、1.1当量）、及びDMAP（0.180g、1.48ミリモル、0.33当量）で連続して処理し、その反応混合物を25℃で12時間攪拌した。飽和NH4Cl水溶液を反応混合物に添加し、その混合物をCH2Cl2（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、０〜５％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて、その中間体を無色透明の油（1.22g、理論量1.831、64.1％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.66（m,4H,ArH）,7.38（m,6H,ArH）,3.67-3.62（m,5H,C（O）OCH3及びCH2OTBDPS）,2.30（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,1.58（m,4H,CH2CH2OTBDPS及びCH2CH2C（O）OCH3）,1.28（bs,8H,アルキルプロトン）,1.05（s,9H,C（CH3）3）
20．メチル−９−ブロモ−ノナノエート（化合物100の中間体：図５）
０℃のCH2Cl2（30mL、0.2M）中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート（1.1g、5.85ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr4（2.5g、7.54ミリモル、1.3当量）及びPPh3（2.15g、8.19ミリモル、1.4当量）で連続して処理し、その反応混合物を10時間にわたって４℃で攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（8X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。Et2O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、ヘキサン）にかけて、その中間体を無色透明の油（1.02g、理論量1.47g、69.5％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）d 3.64（s,3H,C（O）OCH3）,3.38（t,2H,J=6.8Hz,CH2Br）,2.29（t,2H,J=7.4Hz CH2C（O）OCH3）,1.83（p,2H,CH2CH2Br）,1.63（m,2H,CH2CH2C（O）OCH3）1.47-1.28（m,8H,アルキルプロトン）.
21．９−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナナール（化合物100の中間体：図５）
-78℃のトルエン（9.80mL、3.0M）中の１（1.25g、2.93ミリモル、1.0当量）の溶液をDIBAL-H（4.40mL、ヘキサン中1.0Mの溶液、4.40ミリモル、1.5当量）で滴下して処理した。その反応混合物を-78℃で30分間攪拌した。次いでその反応混合物をMeOH（2mL）で滴下して処理し、EtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、０〜５％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて３を無色の油（1.1g、94.9％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ9.76（t,1H,J=1.8Hz,HC（O）R）,7.67（m,4H,ArH）,7.40（m,6H,ArH）,3.65（t,2H,J=6.4Hz,CH2OTBDPS）,2.41（dのt,2H J=1.8及び7.3Hz,CH2C（O）H）,1.58（m,4H,CH2CH2OTBDPS及びCH2CH2C（O）H）,1.29（bs,8H,アルキルプロトン）,1.05（s,9H,（CH3）3C）;FABHRMS（NBA/CsI）m/e 529.1560（C25H36O2Si+Cs+は529.1539を要する）.
22．メチル−９−トリフェニルホスホラニル−ノナノエートブロミド（化合物100の中間体：図５）
CH3CN（3.5mL、1.16M）中の９−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナナール（1.02g、4.06ミリモル、1.0当量）の溶液をトリフェニルホスフィン（1.17g、4.47ミリモル、1.1当量）で処理し、10時間にわたって還流下で攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン（0.532g、2.03ミリモル、0.5当量）を反応混合物に添加し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（5X 10mL洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣をCH2Cl2の最小容積中で可溶化し、減圧で濃縮してその中間体を無色のフォーム（1.90g、理論量2.08g、91.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.82-7.51（m,15H,ArH）,3.70-3.46（m,5H,CH3OC（O）R及びCH2PPh3）,2.13（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,1.62-1.02（m,12H,アルキルプロトン）;FABHRMS（NBA）m/e 433.2312（C28H34BrO2P-Br-は433.2296を要する）.
23．メチル−18−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノエート（化合物100の中間体：図５）
25℃のTHF（6.5mL、0.3M）中の（1.0g、1.95ミリモル、1.0当量）の溶液をKHMDS（3.9mL、THF中0.5Mの溶液、1.95ミリモル、1.0当量）で処理し、その反応混合物を還流下で１時間攪拌する。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、３（0.93g、2.35ミリモル、1.2当量）で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH4Cl水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、０〜２％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて、その中間体を無色の油（0.82g、理論量1.07g、76.3％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.67（m,4H,ArH）,7.41（m,6H,ArH）,5.34（m,2H,CH=CH）,3.65（m,5H,CH3OC（O）及びCH2OTBDPS）,2.29（t,2H,J=7.4Hz,CH2C（O）OCH3）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.55（m,4H,CH2CH2C（O）OCH3及びCH2CH2OTBDPS）,1.29（bs,18H,アルキルプロトン）,1.04（s,9H,（CH3）3C）.
24．18−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセン酸（化合物100：図５）
０℃のTHF-MeOH-H2O（3-1-1比、7.3mL、0.2M）中のメチル−18−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノエート（0.81g、1.47ミリモル、1.0当量）の溶液をLiOH・H2O（0.188g、4.48ミリモル、3.0当量）で処理した。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液（1001mL）で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、5cm x 15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて100を無色の油（0.700g、理論量0.790g、88.7％）として得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）δ7.67（m,4H,ArH）,7.41（m,6H,ArH）,5.34（m,2H,CH=CH）,3.65（t,3H,J=6.5Hz,CH2OTBDPS）,2.34（t,2H,J=7.4Hz,CH2COOH）,2.00（m,4H,CH2CH=CHCH2）,1.65-1.50（m,4H,CH2CH2COOH及びCH2CH2OTBDPS）,1.47-1.23（m,18H,アルキルプロトン）,1.05（s,9H,（CH3）3C）;FABHRMS（NBA/CsI）m/e 669.2772（C34H52O3Si+Cs+は669.2740を要する）.
25．化合物101（図５）の合成
工程１．０℃のCH2Cl2（0.3M）中の100（1.0当量）の溶液を塩化オキサリル（4.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物をEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。
工程２．０℃のエーテル（0.3M）中の上記工程１中間体化合物（1.0当量）の溶液をピリジン（8.0当量）、続いてトリフルオロ無水酢酸（6.0当量、アルドリッチ）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で３時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH4OH水溶液（2.0mL）で処理した。次いでその反応混合物をEtOAc（100mL）とH2O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。
工程３．THF（0.31M）中の上記工程２中間体化合物（1.0当量）の溶液をテトラブチルアンモニウムフルオリド（THF中1.0Mの溶液、3.0当量）で処理し、その反応混合物を25℃で３時間攪拌した。次いでその反応混合物をEtOAc（50mL）とH2O（50mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na2SO4）、減圧で濃縮した。生成物を通常のクロマトグラフィー条件により精製し、化合物101を３工程について66％の全収率で得た。
26．化合物102（図５）の合成
工程１．THF（0.1M）中の101（1.0当量）の溶液を０℃で30分間にわたってトリフェニルホスフィン（2.0当量）、続いてジエチルアゾジカルボキシレート溶液（1.0THF溶液、DEAD、2.0当量、アルドリッチ）で処理した。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（5x 10mLの洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣を最小容積のCH2Cl2に可溶化し、減圧で濃縮した。
工程２．THF（0.10M）中の上記工程１化合物（1.0当量）の溶液を０℃で30分間にわたってチオール酢酸（2.0当量、アルドリッチ）で処理した。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et2O（5x 10mLの洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣を最小容積のCH2Cl2に可溶化し、減圧で濃縮した。生成物を通常のクロマトグラフィー条件により精製し、化合物102を２工程について71％の全収率で得た。
27．化合物103（図４及び５）の合成
工程１．０℃のMeOH/水（2:1混合物、全濃度0.20M）中の102（1.0当量）の溶液をNaOH（3.0当量）で処理し、10分間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）と水（100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液（100mL）で連続して洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。
工程２．０℃の1NのHCl水溶液中の上記工程１化合物（1.0当量）の溶液を、その反応混合物が7.0のpHに達するまで攪拌し、次いでその混合物をEtOAc（100mL）と水（100mL）の間に分配した。有機層を飽和NaCl水溶液（100mL）で連続して洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。
工程３．25℃の１mMのNaHCO3水溶液中の上記工程２化合物（1.0当量）の溶液をピリジルジスルフィドビーズ（1.1当量、アルドリッチ）で処理し、２時間攪拌した。続いてビーズを過剰の飽和NaHCO3（3X）、水（3X）及び食塩水（1X）で洗浄した。通常に濾過して活性化ビーズ（化合物103）を得、次いで活性化ピリジルジスルフィドビーズに結合されたこのCF3-インヒビターを使用してこれを上記の酵素のアフィニティークロマトグラフィー用のカラムに詰めた。
Ｄ．シス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡのクローニング
１．ラット肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡ
ラット肝臓ｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡライブラリーからのシス−９，10−オクタデセノアミダーゼのｃＤＮＡクローンを得るために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、トリプシン消化から得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼポリペプチドフラグメントのアミノ酸残基配列に基いて設計した。簡単に言えば、上記のようにして精製したシス−９，10−オクタデセノアミダーゼをトリプシン消化にかけて、ウォーチェスター・ファウンデーション、ウォーチェスター、PAにより行われたようにして中間ポリペプチドフラグメントを生成した。得られたポリペプチドフラグメントをHPLCにより精製し、飛行時間によるマトリックス補助レーザー脱着イオン化（MALDI TOF、パーセプティブ・バイオシステムズ・リニアー・インストルメンツ）により測定して特有のペプチド質量を示す７種のHPLCフラクションを微量配列決定に選んだ。完全ラットシス−９，10−オクタデセノアミダーゼアミノ酸残基配列中で７つの不連続の一本下線を施された領域により示された図９中に示されたような12アミノ酸残基から25アミノ酸残基までの範囲の長さを有する７種のポリペプチドフラグメントを微量配列決定した。夫々のペフチドはそのＣ末端に必要とされるリシン残基又はアルギニン残基を有し、トリプチン消化が予想された選択性で進行することを示した。
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、フォワードプライマー及びバックワードプライマーとして機能するプライマーの5’末端に特異な制限部位をとり込むように設計した。また、フォワードプライマーを上流のセンスプライマー又は5’プライマーと称する。また、バックワードプライマーを下流のアンチセンスプライマー又は3’プライマーと称する。制限部位をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物にとり込んで、上記の配列決定ベクターの多重クローニング部位への挿入を可能にした。
最初の２種の不連続の一本下線を施されたアミノ酸残基配列により示されるように図９に示されたような配列決定されたペプチド１及び２の部分に相当する合成された5’縮重オリゴヌクレオチド及び3’縮重オリゴヌクレオチドを夫々設計した。縮重ヌクレオチドがIUPACコードＮ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ及びＲ＝Ａ又はＧにより示される。ペプチド１に相当する5’縮重プライマーのヌクレオチド配列はEcoRI制限部位をとり込み、アミノ酸配列GGEGA（配列番号４）に翻訳する5’CGGAATTCGGNGGNGARGGNGC3’（配列番号３）であった。ペプチド２に相当する3’縮重プライマーのヌクレオチド配列はBamHI制限部位をとり込み、アミノ酸配列DNYTMP（配列番号34）に翻訳する5’CGGGATCCGGCATNGTRTARTTRTC3’（配列番号33）であった。
シス−９，10−オクタデセノアミダーゼをコードするｃＤＮＡの領域を増幅するために、ラット肝臓ｍＲＮＡを、上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマーの選択された対によるPCR中の鋳型としての使用のためにｃＤＮＡに逆転写した。PCRを当業者に公知の条件下で行い、合計40サイクルの夫々のサイクルは温度94℃で30秒、60℃で45秒及び72℃で60秒を有していた。
クローン化されたPCRフラグメントの中で、３種を配列決定に選択した。３種のPCRフラグメントは350塩基対（bp）、400bp及び750bpであった。これらのシス−９，10−オクタデセノアミダーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントの配列決定は、750bpフラグメントが350bpフラグメント及び400bpフラグメントの両方の配列を含むことを示した。
次いでPCRにより得られた350bp ｃＤＮＡフラグメントを内部標識し、電気泳動されたラット肝臓ｍＲＮＡに関するノーザン分析用のプローブとして使用した。そのプローブは長さ約2.5〜3.0キロベース(kb）のフラグメントにハイブリッドを形成し、これは60kDaタンパク質をコードするシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｍＲＮＡの予想サイズである。
完全シス−９，10−オクタデセノアミダーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、350bpプローブをその後に32Pで内部標識して使用してクロンテク（パロ・アルト、CA）から得られたラット肝臓ｍＲＮＡからλgt11ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングについて、増幅された350bpフラグメントを最初に同様に消化されたｐブルースクリプトII SK（-）（ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA）への方向性クローニングのためにEcoRI及びBamHIで消化した。得られた配列は、350bpフラグメントが縮重オリゴヌクレオチドプライマーが設計されたペプチド１及び２をコードすることを示し、所望のクローンのPCR及び増幅の精度を確認した。本発明のシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡのクローニング方法は当業者に公知の技術であり、例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”,Ausebelら編集,Wiley ＆ Sons,Inc.,New York（1989）に記載されており、これらの開示が参考として本明細書に含まれる。
４種の陽性クローンを4.5 X 105プラークのスクリーニングから同定した。長さ2.7kbの２種のクローン及び長さ2.0kbの１種のクローンを得た。2.7kbクローンの一種（p60と称される）の部分配列は、そのクローンがシス−９，10−オクタデセノアミダーゼ特異性配列を含むことを示す。
先に得られたp60と称するラット肝臓ｃＤＮＡクローンは1996年６月12日以前にATCCに寄託され、ATCC受理番号97605を指定された。この寄託を特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際認可に関するブタペスト条約の条項及びその規則（ブタペスト条約）のもとに行った。これは夫々の寄託の日から30年にわたって生存プラスミドの管理を保証する。プラスミドは関連米国特許の発行後又は米国特許出願又はその他の外国特許出願の公衆への公開後（これらのいずれか最初）に公衆へのプラスミドの子孫の永久かつ無制限の利用可能性を保証し、かつ35U.S.C.§122及び米国特許庁の規則（886 OG 638を特に参考にして37 CFR§1.14を含む）に従って米国特許庁により定められた者への子孫の利用可能性を保証するブタペスト条約の条項のもとにATCCにより利用可能にされるであろう。特許出願の譲受人は、プラスミド寄託物が適当な条件で培養された時に死滅し、又は損失もしくは破壊された場合に、それが通知後速やかに同プラスミドの生存標本により置換されることに同意した。寄託物の利用可能性は、特許法に従って政府の権威のもとに付与された権利に反して本発明を実施するライセンスと見なされるべきではない。
上記780ヌクレオチドを含むp60 ｃＤＮＡクローンの上部ストランドの部分ヌクレオチド配列を演繹アミノ酸残基配列とともに配列番号１にリストする。コードされたアミノ酸残基配列を配列番号２に別々にリストする。配列表中夫々のトリプレットコドンによりコードされたアミノ酸残基を示すために、終止コドン、TAAを位置781〜783に付加して、配列表を作成するのに使用したパテンチンプログラム中のコード配列（CDS）機能を可能にした。換言すれば、終止コドンを配列番号１に示されたヌクレオチド配列に人工的に挿入してアミノ酸配列へのｃＤＮＡコード配列の翻訳を促進する。
完全ｃＤＮＡクローン中のシス−９，10−オクタデセノアミダーゼヌクレオチド位置の実際の位置は以下に記載されるように完全ｃＤＮＡ配列から明らかである。
次いで２種の最大の陽性ｃＤＮＡクローンをｐブルースクリプトII SK（+）にクローン化し、配列決定した。１種のクローンは付加的な200bpのイントロン配列とともにオレアミドアミダーゼの完全コーディング配列を含む部分プロセシングされた転写産物をコードした。別のクローンは完全にプロセシングされたオレアミドアミダーゼ転写産物をコードしたが、ｒＲＮＡをコードする300bpフラグメントがクローンの5’末端に融合された。内部オーバーラッピングHindIII制限部位による２種のクローンの融合はFAAHと略記される脂肪酸アミドヒドロラーゼと又称される完全長ラットシス−９，10−オクタデセノアミダーゼを生じた。クローンをベックマンオリゴ1000Mシンセサイザーで合成された配列決定プライマーで配列決定した。
得られた完全長ラットｃＤＮＡ FAAHクローン（又、rFAAH ｃＤＮＡと称される）は2473bpを含み、これは図10-1〜10-5に示されるように63.3kDaのタンパク質配列をコードする単一1.73kb読み取り枠を含んでいた。二本鎖ラットFAAH ｃＤＮＡ配列は受理番号U72497でゲンバンクにより入手し得る。コードされたラットFAAHタンパク質は又rFAAHタンパク質と称される。クローンは読み取り枠の開始の最初のATG指示に5’の50bpの配列を含んでいた。又、クローンは読み取り枠の末端を示す最初の終止コドンとpolyAテールの間の3’未翻訳領域の685bpを含んでいた。
図10-1〜10-5中、コードされたアミノ酸残基はトリプレットコドンの第二ヌクレオチドの直接下に位置される。例えば、ATGがメチオニン（M）をコードする開始部位では、Ａヌクレオチドがヌクレオチド位置50で開始し、Ｇヌクレオチドは52である。コードされたＭはヌクレオチド位置51でＴヌクレオチドの下に位置される。図に示されるように、こうして、示されたトリプレットコドンは示されたとおりではない。又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号35及び37に夫々リストされる。コードされたアミノ酸配列は配列番号35に上部ストランドで示され、配列番号36に再度それ自体で示される。
最初のATGの上流のヌクレオチド配列の50塩基はイン−フレーム（in-frame）終止コドンを有していなかったが、証拠の以下の幾つかのラインが完全なオレアミドヒドロラーゼタンパク質配列をコードする2.47kb ｃＤＮＡを支持した。1）ｃＤＮＡのサイズがノーザンブロット（以下に説明される図12B）により推定してｍＲＮＡ転写産物の予想サイズと密接にマッチした。2）最初のATGの周囲の配列が真核翻訳開始部位に必要とされるコンセンサス配列を有し、特に、Ａが-3位置に存在し、Gが+4位置に存在し、かつ3）オレアミドヒドロラーゼｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされた時に、COS-7細胞はSDS-PAGEでアフィニティー単離されたオレアミドヒドロラーゼとともに同時移動する機能性タンパク質産物を翻訳した（図12B、レーン１そして以下に説明される）。
オレアミドアミダーゼタンパク質配列（FAAH）によるデータベース検索はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Kleeら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:1728-1732,1984）、シュードモナス・サバスタノイ（Yamadaら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82:6522-6526,1985）、アスペルギルス・ニジュランス（Corrickら,Gene,53:63-71,1987）、サッカロミセス・セレビジエ（Changら,Nuc.Acids Res.,18:7180,1990）、ケノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）（Wilsonら,Nature,368:32-38,1994）、及びガルス・ドメスチクス（Ettingerら,Arch.Biochem.Biophys.,316:14-19,1995）と同程度に分岐した生物からの幾つかのアミダーゼ酵素配列に対し強い相同性を同定した。これらのアミダーゼは、員の全てが図11に示される様な共通の標示配列を共有する最近特定された酵素ファミリー（Mayauxら,J.Bacteriol.,172:6764-6773,1990）を集約的に構成する。ラット脂肪酸アミドヒドロラーゼ（オレアミドヒドロラーゼ又はFAAH）の位置215で始まり、246を介して延びるコードされたアミノ酸はアミダーゼのファミリーに見られる残基を含む。本発明のシス−９，10−オクタデセノアミダーゼラットタンパク質中の配列はアミノ酸位置215〜246で配列番号36に示されるGGSSGGEGALIGSGGSPLGLGTDIGGSIRFPSを有する。幾つかのその他の代表的なアミダーゼと一緒のラットFAAHのアミダーゼ標示配列領域にわたる配列は、標示配列がアミダーゼファミリー員間で完全に保存されることを明らかにする。これらのアミノ酸は図中太字で示され、夫々のアミダーゼ中の標示配列の相対的アミノ酸位置が配列情報の前後の番号により示される。配列の夫々について指定された配列番号が図面の簡単な説明中の図についての注にリストされる。
本発明者らが知る限りでは、FAAHと又称されるオレアミドアミダーゼは分子的に特性決定されたこの酵素ファミリーの最初の哺乳類員である。
ラットFAAH配列の疎水親水性（hydropathicity）プロット及びトランスメンブランドメイン研究（TMpredプログラム及びPSORTプログラム）を行い、夫々の研究がアミノ酸13-29（図９中の太字）からの強い推定トランスメンブランドメインを示した。ラットFAAHの推定トランスメンブランドメインを包囲し、含む50アミノ酸領域はその他のアミダーゼファミリー員のタンパク質配列と相同性を共有せず、ラットアミダーゼの特異な修飾の一つが膜へのその組込みであるかもしれないことを示した。重要なことに、FAAH配列の付加的な分析はコンセンサスクラスII SH3ドメイン結合配列、PPLPXR（配列番号38）Fengら,Science,266:1241-1246,1994）に対し位置310から315までの正確なマッチを含むポリプロリンセグメント、アミノ酸307-315（図９中に二重下線を施された）を明らかにし、その他のタンパク質がFAAHと相互作用してその活性（Pawson,Nature,373:573-580,1995）及び／又は細胞下の局在化（Rotinら,EMBO J.,13:4440-4450,1994）を調節し得ることを示唆した。
サザンブロット分析及びノーザンブロット分析をラットFAAHｃＤＮＡの内部800bpフラグメントを用いて行ってFAAHのゲノムコピー数及び組織分布を夫々評価した。
サザンブロットについて、ラットゲノムＤＮＡ10μgを12時間にわたって示された制限酵素（夫々100単位）で消化し、次いで0.8％のアガロースゲルで実験した。ラットゲノムＤＮＡを最初に以下のようにしてラット肝臓から単離した。ラット肝臓約500mgを２mlの100mMのトリス（pH8.0）、0.2％のSDS、200mMのNaCl、及び0.2mg/mlのプロテイナーゼＫ中で55℃で一夜振とうした。次いで混合物を15,000rpmで15分間回転させ、上澄みを除去し、等容積のイソプロパノールで処理した。沈殿したゲノムＤＮＡを除去し、部分乾燥させ、55℃で４時間加熱することにより水中で再度懸濁させた。ＤＮＡ10μgを12時間にわたって示された制限酵素（夫々100単位）で消化し、次いで0.8％のアガロースゲルで実験した。次いでＤＮＡをサザンブロット分析に使用するためのジーンスクリーンプラスハイブリダイゼーション転移膜（デュポンNEN）に毛管圧力下で移した。ブロットを製造業者（クロンテク）のガイドラインに従って取扱い、下記の後ハイブリダイゼーション洗浄にかけた。１％のSDS及び0.2X SSC（30mMのNaCl、3.0mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）の溶液中で25℃で１回の20分の洗浄、続いて0.1％のSDS及び0.2X SSCの溶液中で65℃で２回の20分の洗浄及び65℃で１時間の１回の付加的な後ハイブリダイゼーション洗浄（0.1％のSDS、0.1X SSC、pH7.0）。次いでブロットを12時間にわたって-78℃でＸ線フィルムに露出した。
サザンブロット研究は、ラットゲノムの幾つかの異なる制限消化産物を使用して、FAAHプローブが主として単一ＤＮＡフラグメントにハイブリッド形成することを示した（図12A）。予想されたように、２種のハイブリッド形成バンドをHindIII消化ＤＮＡ中に観察した。何とならば、FAAHプローブは内部HindIII部位を含んでいたからである。これらの結果はFAAH遺伝子が単一コピー遺伝子であることと最も合致する。
ノーザン分析について、65℃で１時間の0.1％のSDS及び0.1X SSC（15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）の溶液による付加的な後ハイブリダイゼーション洗浄を行って非特異的ハイブリダイゼーションの除去を確実にした以外は、クロンテクから得られたブロットを製造業者のガイドラインに従って取り扱った。得られるブロットを-78℃で６時間Ｘ線フィルムに露出した。
FAAHプローブによるノーザンブロット分析は肝臓及び脳中に最も多量にあり、少量が脾臓、肺、腎臓、及び睾丸中に存在するサイズ約2.5kbの単一の主要なｍＲＮＡ転写産物を同定した（図12B）。この転写産物は心臓又は骨格筋中で検出できず、これらの２種の組織中でアナンドアミドヒドロラーゼ活性を同定しない先に報告された生化学研究（Deutschら,Biochem.Pharmacol.,46:791-796,1993）と一致した。又、ノーザンブロットは同様に2.5kbの転写産物を発現する組織中にのみ存在する二三の大きい転写産物へのFAAHｃＤＮＡプローブの低レベルのハイブリダイゼーションを含んでいた。これらの転写産物は2.5kbのｍＲＮＡのプロセシングされなかった形態又はオルタナチブスプライシングされた形態であるかもしれない。加えて、ラット脳中のラットFAAH転写産物の領域分布をノーザン分析により調べて、最高レベルの海馬及び視床とともに、嗅球、皮質、小脳及び脳下垂体を含む脳のその他の領域中で検出し得る低レベルの転写産物を明らかにした。又、ラット脳切片の予備in situハイブリダイゼーション分析が海馬及び視床下部の両方中でラットFAAHに関する高い発現レベルを同定した。最後に、マウス胚発育の種々の段階におけるマウスFAAH発現レベルのノーザン分析を行い、そこでマウスFAAHを11日目〜15日目に最初に観察し、レベルが15日目から17日目まで著しく増加し続けた。
２．マウス肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡ
全ラットｃＤＮＡ（図10-1〜10-5）を標識プローブとして使用した以外は、ラットｃＤＮＡを得ることについて上記されたのと同じ条件を使用して、ラットシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡのマウス同族体をマウス肝臓5’ストレッチ＋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク）のスクリーニングから得た。
得られたマウス二本鎖1959bp ｃＤＮＡ同族体及びコードされたアミノ酸残基が図13-1〜13-4に示され、ATG開始部位がボックスされたメチオニン（M）残基で示されたヌクレオチド位置７で始まる。終止コドン、TGAがヌクレオチド位置1744〜1746、続いて3’未翻訳領域で図13-4に示されるように同様にボックスにされる。又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが夫々配列番号39及び41としてリストされる。コードされたアミノ酸配列が配列番号39に上部ストランドで示され、配列番号40にそれ自体で再度示される。
３．ヒト肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡ
先に調製した全ラットｃＤＮＡを標識プローブとして使用し、それ程ストリンジェントではないハイブリダイゼーション（製造業者の推奨ハイブリダイゼーション緩衝液中50％のホルムアミドに代えて25％）を使用した以外は、シス−９，10−オクタデセノアミダーゼのヒト同族体のｃＤＮＡクローンをヒト肝臓5’ストレッチ＋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク）のスクリーニングによりラットについて上記されたようにして同様に得た。又、洗浄条件は65℃で0.1％のSDSを含む1X SSCに代えて50℃で0.1％のSDSを含む2X SSCを含んでいた。
得られたヒト二本鎖2045bp ｃＤＮＡ同族体及びコードされたアミノ酸残基が図14-1〜14-5に示され、ATG開始部位がボックスされたメチオニン（M）残基で示されたヌクレオチド位置36で始まる。終止コドン、TGAがヌクレオチド位置1773〜1775、続いて3’未翻訳領域で図14-4に示されるように同様にボックスにされる。又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが夫々配列番号42及び44としてリストされる。コードされたアミノ酸配列が配列番号42に上部ストランドで示され、配列番号43にそれ自体で再度示される。
Ｅ．発現された組換え脂肪酸アミドヒドロラーゼシス−９，10−オクタデセノアミダーゼの調製
本発明に使用するための組換えFAAHタンパク質を調製するために、先に得られたラット、マウス及びヒトのｃＤＮＡをCOS-7細胞中の一時的発現研究のための真核生物発現ベクターpcDNA3に別々にクローン化した。
ラット、マウス及びヒトのFAAH組換えタンパク質を調製するために、相当するFAAHｃＤＮＡをブルースクリプトIIベクターから切除し、真核生物発現ベクターpcDNA3（インビトロゲン、サンジエゴ、CA）に別々につないだ。COS-7細胞の100mmの皿を完全培地（L-グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びウシ胎児血清を含むDMEM）中で37℃で70％の集密まで増殖させた。次いでCOS-7細胞を無血清培地で洗浄し、トランスフェクション溶液５mlで処理した（FAAH-pcDNA3ベクター5-6μgを無血清培地１ml中で30分間にわたってトランスフェクタミン（ギブコ-BRL）とともにプレインキュベートし、次いで無血清培地で５mlの最終容積まで希釈した）。COS-7細胞を37℃で５時間インキュベートし、その時点で完全培地10mlを細胞に添加し、インキュベーションを37℃で12時間続けた。次いでトランスフェクション溶液をCOS-7細胞から吸引して除き、細胞を更に24時間にわたって完全培地の新しいバッチ中でインキュベートした。COS-7細胞を細胞スクラッペーで回収し、低速でペレットにし、１mMのNaHCO3で２回洗浄し、１mMのNaHCO3200μl中で再度懸濁させた。再度懸濁させたCOS-7細胞を12回ドウンス均質化し、得られた細胞抽出液20μlを使用してオレアミドヒドロラーゼ活性について分析し（アッセイは節B6に先に詳述される）、結果が節Ｆに以下に記載される。トランスフェクションに使用したpcDNA3ベクターが逆配向でFAAHｃＤＮＡを含む以外は、対照COS-7細胞を同様に調製した。
次いでラット、ヒト及びマウスに関する得られた発現された組換えFAAHタンパク質がその後に以下に記載されるようにして特異性及び酵素活性を評価するのに使用される。
Ｆ．脂肪酸アミドヒドロラーゼ特異性及び発現された組換え脂肪酸アミドヒドロラーゼの活性
上記のように、トランスフェクトされたCOS-7細胞を溶解して本発明の組換え発現ラット、マウス及びヒトFAAHタンパク質の夫々について細胞抽出物を生成した。
トランスフェクトされなかったCOS-7細胞は無視できる量のオレアミドヒドロラーゼ活性を含んでいたが、ラットFAAHｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS-7細胞は高レベルのオレアミドヒドロラーゼ活性を発現した（図15A）。アッセイを節Ｂに記載されたようにして行い、そこでTLCによりオレイン酸へのオレアミドの変換を評価した。図15Aに示されるように、トランスフェクトされなかったCOS-7細胞（レーン１）又は対照のトランスフェクトされた細胞（レーン２、逆配向でオレアミドヒドロラーゼｃＤＮＡを含むpcDNA3でトランスフェクトされた）中ではなく、レーン３に示された発現ベクターpcDNA3中でラットオレアミドヒドロラーゼｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞は、標識オレアミドをオレイン酸に変換するのに有効であった。図16に示されたようなヒトオレアミドヒドロラーゼで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞で同様の結果が得られ、そこでオレイン酸への変換がレーン１中の対照COS-7細胞と比較してレーン２中でのみ見られる。
この酵素活性は、ラット肝臓原形質膜オレアミドヒドロラーゼ活性と同様に、レーン１中の未処理抽出物と比較して50μMのトリフルオロメチルケトンの存在下でラットオレアミドヒドロラーゼでトランスフェクトされたCOS-7細胞で図のレーン２に示されるように図15Bに証明されるようにトリフルオロメチルケトンにより抑制された。
発現された組換えタンパク質の特異性を確かめるために、単独又は競合ペプチドの存在下の抗FAAHポリクローナル抗体によるウェスタンブロット分析を行った。ほぼ等しいタンパク質量を含むラットFAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞及びトランスフェクトされなかったCOS-7細胞からの細胞抽出物のサンプルを２％のSDS及び５％のβ−メルカプトエタノールを含むローディング緩衝液中で65℃に10分間加熱した。次いで先に示されたサンプルを8-16％のポリアクリルアミドゲル勾配トリス−グリシンゲルで実験し、ウェスタンブロッティングのためにニトロセルロースに移した。ニトロセルロースブロットをTBS-トゥイーン中５％のブロットで４℃で一夜ブロックし、次いで２時間にわたって25℃で内部FAAHペプチド配列に対し生成された先に記載されたペプチド２（TBS-トゥイーン中15μg/ml）に対し産生されたポリクローナル抗体とともにインキュベートした。次いでブロットをTBS-トゥイーン（0.1％）中で洗浄し、25℃で30分間にわたって二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、TBS-トゥイーン中で再度洗浄し、安定なペルオキシド溶液及びルミノール／エンハンサー溶液（ピアス）で発色させた。ブロットへの抗体の添加の前に30分間にわたってポリクローナル抗体とともに先に記載されたペプチド２に相当する1000倍モル過剰のペプチド抗原をプレインキュベートすることによりペプチド競合実験を行った。
FAAHの内部ペプチド２配列に対し産生されたポリクローナル抗体によるラットｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物のウェスタンブロッティングは、SDS-PAGEでアフィニティー単離されたFAAHと同時移動する60-65kDa免疫反応性バンドを示した（図15C）。トランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物はこのサイズの検出可能な免疫反応性タンパク質バンドを含んでいなかった。更に、60-65kDaのタンパク質の免疫反応性が過剰のペプチド抗原と一緒の抗体のプレインキュベーションにより有効に競合されて除かれ（図15C）、一方、トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物及びトランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物の両方中で観察された痕跡量の交差反応性タンパク質がこのペプチドにより競合されなかった。
先の研究は、オレアミドを加水分解する酵素活性がアナンドアミド（アラキドニルエタノールアミド）をアラキドン酸に変換する同じ活性であるかもしれないと示唆した。それ故、ラットFAAHｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS-7細胞をアナンドアミドヒドロラーゼ活性について分析した。標識アナンドアミドに関する本発明の発現された組換え脂肪酸アミドヒドロラーゼの酵素活性を評価するために、以下の酵素アッセイを行った。14C-アナンドアミドを以下のようにして合成した。14Cアラキドン酸（モラベク・バイオケミカルズ）12.5μCi（50μCi/μMの比活性）をCH2Cl2100μlに溶解し、０℃に冷却し、過剰の塩化オキサリルで処理した。その反応混合物を25℃で６時間攪拌し、その時間後に溶媒を蒸発させた。残っている残渣を０℃に冷却し、大過剰のエタノールアミンで処理し、25℃で15分間攪拌した。次いでその反応混合物を酢酸エチルと2MのHClの間に分配し、有機層を水洗し、次いで蒸発、乾燥させた。得られる14C-アナンドアミドを未標識アナンドアミドでエタノール中５μCi/μMの最終比活性に希釈した。14C-アナンドアミド約１μCi及びドウンス均質化されたCOS-7細胞抽出物20μlをオレアミドヒドロラーゼアッセイについて先に詳述されたような夫々のアナンドアミドヒドロラーゼアッセイに使用した。簡単に言えば、FAAH加水分解アッセイを100μMの基質、ラットトランスフェクトされたCOS-7細胞タンパク質を用いて37℃で３回の反復実験で５分間行った（ステアリン酸アミドの場合を除く、この場合、低溶解性のためにオレアミドとの比較を20μMの基質で行った）。生成物を前記のようにしてTLCで分離し、シンチレーション液体にこすって取り、放射能をシンチレーションカウンティングにより定量した。等しい量のトランスフェクトされなかったCOS-7細胞タンパク質抽出物の存在下の基質加水分解が全ての場合にバックグラウンド対照として利用でき、FAAH加水分解速度から引かれて以下に示されるようなデータを得た。
アナンドアミドアッセイの結果は、トランスフェクトされなかったCOS-7細胞が無視できる量のアナンドアミドヒドロラーゼ活性を含むが、トランスフェクトされたCOS-7細胞が高レベルのアナンドアミドヒドロラーゼ活性を生じることを示した（図17）。こうして、FAAHはオレアミド及びアナンドアミドの両方を加水分解する能力を有し、アミダーゼがシグナリング分子の脂肪酸アミドファミリーに一般の分解酵素として作用し得ることを示す。FAAHの基質乱婚は種々のアミン含有神経伝達物質を酸化するのに利用できるモノアミンオキシダーゼ酵素を連想させる。
本発明の組換え発現タンパク質の酵素加水分解活性の基質特異性スペクトルを更に評価するために、その他の14C-標識脂肪酸アミドを節B6に記載されたようにして、又上記アナンドアミドを除いて14C-オレアミドについて上記されたようにして合成した。
結果は、組換え発現ラットFAAHがほぼ等しい速度でオレアミド及びアナンドアミドの加水分解を触媒作用するが、FAAHが脂肪酸アミド間で識別することを示した。何とならば、FAAHは以下の表１に示されるようにオレアミド又はアナンドアミドで見られる速度と較べてかなり低下された速度でミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドを含むその他の代表的な脂肪酸アミドを加水分解するからである。表に示される場合、アナンドアミド及びオレアミド加分水分解速度はFAAHの活性の100％であると考えられ、それに対してその他の脂肪酸アミド加水分解速度が比較される。
0004102445.tif 000010
比較アッセイを先に使用したラット酵素に対しマウス及びヒト組換え同族体を用いて行う。
こうして、先に示されたように、ラットFAAH酵素は基質優先性を有しないことはないが、それは幾つかのアミド基質に対する活性を示した。FAAHが基質選択性を示した程度はオレアミド及びステアリン酸アミドの酵素加水分解の間でほぼ20倍の速度の差により最良に例示され、その２種の化合物はΔ９位置で単一の不飽和度のみを異にする。このパターンが又インヒビタートリフルオロメチルケトンによるアッセイで確認され、これはステアリン酸アミドの相当するトリフルオロメチルケトン類縁体よりも20倍強いFAAHのインヒビターであった。こうして、FAAHはステアリン酸アミドのアルキル直鎖よりもオレアミドの曲がったアルキル鎖をかなり好む。
又、本発明のFAAH分子の可溶性形態を生成するための欠失変異体を調製した。推定トランスメンブランドメインが欠失された構築物をつくって、１ではなくコードされたタンパク質のアミノ酸残基30で開始するトランケートFAAHを生じた。この構築物を調製するために、FAAHのアミノ末端30アミノ酸をコードする最初の140bpを欠いているラットFAAHｃＤＮＡの5’末端のPCR増幅のために下記のプライマーを設計した。5’プライマー及び3’プライマーはアミノ酸30-35をコードし、KpnI部位及び人工終止コドンを含む夫々のヌクレオチド配列5’GCGGTACCATGCGATGGACCGGGCGC3’（配列番号45）及び5’GGTCTGGCCAAAGAGAGG3’（配列番号46）（その逆補体はアミノ酸199-204をコードする）を有していた。
次いで増幅されたトランスメンブラン欠失ラットFAAHｃＤＮＡフラグメントを適当な制限酵素（KpnI及びHindIII）で消化し、最初のｃＤＮＡ5’末端を置換する同様に消化されたFAAH-pブルースクリプトベクターにクローン化した。欠失構築物を配列決定により確認し、次いで切除し、本明細書に記載された発現研究のためにpcDNA3に転移した。
発現のために、トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物を以下のようにして可溶性フラクション及び膜フラクションに分離した。抽出物を25℃で５分間にわたって2500rpmで回転させ、上澄みをエアーフュージ管に移し、可溶性上澄みを調製するために超遠心分離機（４℃で40分間にわたって30psi）中で回転させた。ペレットは膜結合フラクションを含み、次いでこれを上澄みの容積に等しい容積の１mMのNaHCO3中で再度懸濁させた。
トランスメンブラン欠失発現組換えFAAHは上記のCOS-7細胞発現アッセイで機能性であった。ラットｃＤＮＡのマウス及びヒトトランスメンブラントランケーション同族体を同様に調製し、本発明を実施するのに使用する。
シグナリング分子の脂肪酸アミドファミリーの種々の員について生物活性を実証する増大する数の研究を考慮すると、本明細書に記載されたようなラット、マウス及びヒトの間に相同性を有する脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）ファミリーの発見は脂肪酸アミドを不活化する代謝プロセスの調節、メカニズム、及び薬理学を理解するのに専念する進行中の研究に有益な発明を提供する。加えて、クローン化されたFAAH遺伝子は強力なFAAHインヒビターと協力して脂肪酸アミドファミリーにより影響される生理学的経路を解明するとともにこれらの生物学的プロセスの薬理学的介入に関する系統的なアプローチを開発する可能性を与える。
配列表
（2）配列番号１に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：783塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..783
（xi）配列：配列番号１
0004102445.tif 000011
0004102445.tif 000012
0004102445.tif 000013
（2）配列番号２に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：260アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２
0004102445.tif 000014
0004102445.tif 000015
（2）配列番号３に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号３
0004102445.tif 000016
（2）配列番号４に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：５アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号４
0004102445.tif 000017
（2）配列番号５に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：31アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号５
0004102445.tif 000018
（2）配列番号６に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号６
0004102445.tif 000019
（2）配列番号７に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号７
0004102445.tif 000020
（2）配列番号８に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号８
0004102445.tif 000021
（2）配列番号９に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号９
0004102445.tif 000022
（2）配列番号10に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号10
0004102445.tif 000023
（2）配列番号11に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号11
0004102445.tif 000024
（2）配列番号12に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号12
0004102445.tif 000025
（2）配列番号13に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号13
0004102445.tif 000026
（2）配列番号14に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号14
0004102445.tif 000027
（2）配列番号15に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号15
0004102445.tif 000028
（2）配列番号16に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号16
0004102445.tif 000029
（2）配列番号17に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号17
0004102445.tif 000030
（2）配列番号18に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号18
0004102445.tif 000031
（2）配列番号19に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号19
0004102445.tif 000032
（2）配列番号20に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号20
0004102445.tif 000033
（2）配列番号21に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号21
0004102445.tif 000034
（2）配列番号22に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号22
0004102445.tif 000035
（2）配列番号23に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号23
0004102445.tif 000036
（2）配列番号24に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号24
0004102445.tif 000037
（2）配列番号25に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号25
0004102445.tif 000038
（2）配列番号26に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号26
0004102445.tif 000039
（2）配列番号27に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号27
0004102445.tif 000040
（2）配列番号28に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号28
0004102445.tif 000041
（2）配列番号29に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号29
0004102445.tif 000042
（2）配列番号30に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号30
0004102445.tif 000043
（2）配列番号31に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：15アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号31
0004102445.tif 000044
（2）配列番号32に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：14アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号32
0004102445.tif 000045
（2）配列番号33に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号33
0004102445.tif 000046
（2）配列番号34に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：６アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号34
0004102445.tif 000047
（2）配列番号35に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：2472塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：50..1789
（xi）配列：配列番号35
0004102445.tif 000048
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（2）配列番号36に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：579アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号36
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（2）配列番号37に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：2472塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号37
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（2）配列番号38に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：６アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号38
0004102445.tif 000061
（2）配列番号39に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：1959塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..1746
（xi）配列：配列番号39
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（2）配列番号40に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：581アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号40
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0004102445.tif 000071
（2）配列番号41に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：1959塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号41
0004102445.tif 000072
0004102445.tif 000073
（2）配列番号42に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：2045塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：3..1775
（xi）配列：配列番号42
0004102445.tif 000074
0004102445.tif 000075
0004102445.tif 000076
0004102445.tif 000077
0004102445.tif 000078
0004102445.tif 000079
（2）配列番号43に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：590アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号43
0004102445.tif 000080
0004102445.tif 000081
0004102445.tif 000082
0004102445.tif 000083
0004102445.tif 000084
（2）配列番号44に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：2045塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号44
0004102445.tif 000085
0004102445.tif 000086
（2）配列番号45に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：26塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号45
0004102445.tif 000087
（2）配列番号46に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号46
0004102445.tif 000088
（2）配列番号47に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号47
0004102445.tif 000089
（2）配列番号48に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号48
0004102445.tif 000090
（2）配列番号49に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号49
0004102445.tif 000091
（2）配列番号50に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号50
0004102445.tif 000092
（2）配列番号51に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号51
0004102445.tif 000093
（2）配列番号52に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号52
0004102445.tif 000094
（2）配列番号53に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：32アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（v）配列の型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号53
0004102445.tif 000095
（2）配列番号54に関する情報
（i）配列の記載の特徴：
（A）配列の長さ：819塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号54
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【図１】
0004102445.tif 000097
【図２】
0004102445.tif 000098
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0004102445.tif 000102
【図７】
0004102445.tif 000103
【図８】
0004102445.tif 000104
【図９】
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【図１０−１】
0004102445.tif 000106
【図１０−２】
0004102445.tif 000107
【図１０−３】
0004102445.tif 000108
【図１０−４】
0004102445.tif 000109
【図１０−５】
0004102445.tif 000110
【図１１】
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【図１２Ａ】
0004102445.tif 000112
【図１２Ｂ】
0004102445.tif 000113
【図１３−１】
0004102445.tif 000114
【図１３−２】
0004102445.tif 000115
【図１３−３】
0004102445.tif 000116
【図１３−４】
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【図１４−１】
0004102445.tif 000118
【図１４−２】
0004102445.tif 000119
【図１４−３】
0004102445.tif 000120
【図１４−４】
0004102445.tif 000121
【図１４−５】
0004102445.tif 000122
【図１５Ａ】
0004102445.tif 000123
【図１５Ｂ】
0004102445.tif 000124
【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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