(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖産生能を有するサッカロマイセス属に属する酵母を、栄養培地に培養してサイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖を産生せしめた培養物とし、この培養物から、サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖を採取することを特徴とするサイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖の製造方法。
【請求項２】
サッカロマイセス属に属する酵母が、サッカロマイセス  セレビシアエであることを特徴とする請求項１記載の環状四糖の製造方法。
【請求項３】
培養物が、酵母または酵母含有物である請求項１または２記載の環状四糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端の何れか一方が非還元性末端で他方が還元性末端であって、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・イクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ＝ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、低分子、低粘度で、甘味及び反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変し悪臭を発生し、得られる製品の品質を劣化し易いとの欠点を有することが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランス  アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ  ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシル結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かした各種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、及び特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、このトレハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デキストリンは工業的規模で生産され、それらの特性を生かした各種用途に利用されているものの、斯かる非還元性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。
【０００３】
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合とで交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（以下、本明細書では本糖質を「環状四糖」と略称することもある。）が生成することが示されている。斯かる環状構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用を有するとともに、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく各種用途に利用、加工できることが期待される。
【０００４】
しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。
【０００５】
斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際特許公開番号ＷＯ０１／９０３３８  Ａ１明細書で開示したように、土壌からの分離菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するα−イソマルトシル転移酵素産生微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株およびＡ１９株が、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を産生することを見出し、豊富で安価に供給される澱粉を原料とする澱粉部分分解物に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、高収率で環状四糖を生成できることを見出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、両酵素を併用した環状四糖又はこれを含む糖質及びその製造方法、併せて、これら方法により得られる環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、環状四糖の製造方法として、更なる新規な方法の提供が望まれる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環状四糖の新規製造方法を提供することを課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、環状四糖を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、先に見いだしたバチルス属、アルスロバクター属などの細菌とは全く異なるサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が、菌体中に環状四糖を著量生成することを発見した。
【０００８】
本発明者等は、酵母を培養し、この培養物から環状四糖を採取することによる環状四糖の新規製造方法を確立し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の酵母は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖産生能を有するサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であればよく、その由来は問わない。例えば、サッカロマイセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が有利に用いられ、例えば、ＩＦＯ０３０４、ＡＴＣＣ９７６３などや、更には、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母などからの酵母であってもよい。
【００１０】
本発明の酵母の培養に用いる培地は、酵母が生育でき、環状四糖を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、酵母が生育に利用できる物であればよく、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、Ｌ−ソルビトール、糖蜜など糖質、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物や、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
【００１１】
培養は、通常、温度４乃至４０℃、好ましくは１０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは２乃至９から選ばれる条件で行われる。培養時間は酵母が増殖し環状四糖を産生しうる時間であればよく、好ましくは１０時間乃至５００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はなく、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００１２】
このようにして酵母を培養した後、この培養物から環状四糖を回収する。環状四糖は、主に酵母菌体中に認められ、菌体そのものを環状四糖含有物として採取することも、培養物全体を環状四糖含有物として用いることもできる。菌体を回収するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。また、公知の方法によって、環状四糖を菌体から抽出、さらに、精製して、利用することもできる。抽出する方法としては、水抽出、熱水抽出、アルコールなど溶媒抽出、細胞壁分解酵素など酵素処理、超音波やフレンチプレスなどの破砕処理、ガラスビーズやアルミナなどを用いた磨砕処理などが採用される。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状四糖を利用せず夾雑物質を資化又は分解する微生物、例えば、乳酸菌、酢酸菌、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などによる残存している還元性糖質の分解除去などの方法を１種または２種以上を組み合わせた精製方法が有利に採用できる。
【００１３】
このようにして得られた環状四糖またはこれの含量を向上させた水溶液は、通常、環状四糖を、固形物当り、１ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）以上、望ましくは１０％以上含有する水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００１４】
更には、本発明における環状四糖の結晶を製造するには、通常、前記の精製方法を用いた、望ましくは環状四糖を、固形物当り約４０％以上含有する水溶液が用いられる。結晶の形態として、５乃至６含水結晶を製造する場合には、通常、この水溶液を環状四糖の過飽和水溶液、例えば、濃度約４０％乃至９０％水溶液とし、これを助晶缶にとり、約０．１乃至２０％の種結晶共存下で、過飽和を保つ温度、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、結晶を含有するマスキットを製造する。１含水結晶や無水結晶を晶出させる場合には、一般的には、更に高濃度、高温度での過飽和条件が採用される。マスキットから結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。また、１含水結晶や無水結晶は５乃至６含水結晶を脱水又は乾燥させて製造することもできる。このようにして製造される本発明の環状四糖結晶又はこれの高含有粉末は、上品で温和な低甘味を有する非還元性乃至低還元性の白色粉末で、耐酸性、耐熱性に優れた安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも少なく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、吸湿性も低く、粉末状物の付着、固結を防止できる。
【００１５】
また、環状四糖自体は、包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化が防止されることから、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れており、保香剤、安定剤などとして好適である。この際、必要ならば、他の環状糖質、例えば、環状デキストリン類、分岐環状デキストリン類、環状デキストラン類、環状フラクタン類などを併用して、安定化を強化することも有利に実施できる。
【００１６】
更に、環状四糖自体は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。換言すれば、環状四糖を摂取すれば、糖質としての重量、容量があるので、満腹感が得られるものの実質的に消化されず、低カロリー食品素材、ダイエット食品素材として好適である。また、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００１７】
更に、環状四糖自体は、耐酸性、耐アルカリ性、耐熱性に優れた無毒、無害の天然甘味料である。
【００１８】
また環状四糖自体は、安定な甘味料であることにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、安定性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性、蛋白質変性防止性、脂質劣化防止性などの性質を具備している。
【００１９】
従って、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物は、甘味料、難醗酵性食品素材、難消化性食品素材、低う蝕性食品素材、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、固結防止剤、保香剤、澱粉老化防止剤、蛋白質変性防止剤、脂質劣化防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、そのままで、又は必要に応じて、公知材料と適宜併用して、各種組成物、例えば、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などに有利に利用できる。公知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、薬効成分などが適宜利用できる。
【００２０】
本発明の環状四糖又はこれを含む含有物は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース（α，α）、蜂蜜、メープルシュガー、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と併用して使用することも、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロースなどの高甘味度甘味料などと併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして利用することも好適である。
【００２１】
また、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００２２】
また、本発明の環状四糖又はこれを含む含有物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、風味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２３】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、粉末みりん、粉末アルコール、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のたれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料へ甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、醸造酒、果実酒、ウィスキー、清酒、ビール、発泡酒、リキュール、カクテル、スピリッツ類、焼酎などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、アミノ酸含有飲料、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、風味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
【００２４】
また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上又はカロリーを低減させるなどの目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００２５】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、化粧品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、クマザサエキス、モモの葉エキス、ビワの葉エキス、ユズの皮エキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、化粧品、医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００２６】
以上述べたような各種組成物に環状四糖又はこれを含む含有物を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、環状四糖の種々の特性、とりわけ包接作用、呈味改良、風味改良などを発揮させるためには、環状四糖として、固形物当たり０．１％未満では不充分で、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
【００２７】
以下、本発明の実施例を述べる。
【００２８】
【実施例１】
＜酵母からの環状四糖の調製＞
グルコース１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『粉末酵母エキス−Ｓ』、日本製薬株式会社製）０．３ｗ／ｖ％、麦芽抽出物（商品名『Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、  Ｂａｃｔｏ』、ディフコ社製）０．３ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、酵母サッカロマイセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ９７６３を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで７２時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００２９】
スクロース３０ｗ／ｖ％、アスパラギン１水和物０．３ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム七水和物０．３ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地をｐＨ５．５に調整した後、３ｌ容三角フラスコに１．６ｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、種培養液２００ｍｌを接種し、温度２７℃で２５日間静置培養した。この培養液に、予めオートクレーブ（１２０℃、２０分間）した濃度６６．７％のスクロース水溶液６００ｇを加えて、さらに温度２７℃で１４日間静置培養を続けた。得られた培養液約１８ｌを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）して、湿菌体重量として酵母菌体約８４ｇを回収した。
【００３０】
得られた酵母湿菌体（約８４ｇ）に８０ｖ／ｖ％エタノール水溶液６７２ｍｌを加え懸濁し、温度８５℃で還流抽出を３０分間行った後、珪藻土濾過して濾過液を回収した。得られた濾液をエバポレーターで減圧濃縮してエタノールを留去し、さらに水約６００ｍｌを加えた後、エタノール臭が無くなるまで約３００ｍｌに減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶物を除去した後、再度減圧濃縮して濃縮抽出液約５０ｍｌを得た。
【００３１】
得られた濃縮抽出液（約５０ｍｌ）に濃度１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌを加え、温度約１００℃で１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ分解した後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、エバポレーターで減圧濃縮して、固形分濃度約１１ｗ／ｖ％の濃縮液約３ｍｌを得た。この濃縮液を分取用高速液体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱ  Ｒ−３５５−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液には水を用いてカラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させ、溶出時間約３２分乃至３９分の溶出液約２１０ｍｌを回収し、エバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥して固形分として約２４０ｍｇの糖質粉末を得た。
【００３２】
得られた糖質粉末について、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＬＰＣ）で純度を分析したところ、溶出時間約１１．１分に溶出ピークを示す糖質の本糖質粉末中の純度は約９８．２％であり、高純度の糖質標品であることがわかった。また、対照として国際特許公開番号ＷＯ０１／９０３３８  Ａ１明細書の実験２３に記載の方法で調製した環状四糖を用いて同様にＨＰＬＣを行ったところ、同一の溶出時間の約１１．１分に溶出ピークを示すことも判明した。尚、ＨＰＬＣは、カラムにＯＤＳ  ＡＱ−３０３カラム（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）を、溶離液に水を用いてカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００３３】
得られた糖質標品について、高速原子衝撃法による質量分析（通称ＦＡＢ−ＭＳ）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であり、環状四糖の質量数と同じであることが判明した。
【００３４】
また、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、得られた糖質の構成糖はＤ−グルコースであり、環状四糖の構成糖と同じであることも判明した。
【００３５】
さらに、得られた糖質標品を用いて核磁気共鳴法（以下、ＮＭＲと略称する）を行ったところ、図１に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図２に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを環状四糖標品のものと異同を比較したところ、実質的に同一であることが判明した。
【００３６】
以上のことから、酵母菌体から抽出・精製した糖質がサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖であることが判明した。
【００３７】
【実施例２】
＜酵母含有物からの環状四糖の調製＞
市販の酒粕（兵庫県加東郡滝野町、山田酒造食品（株）製造）１ｋｇに８０ｖ／ｖ％エタノール水溶液約６ｌを加え懸濁し、温度８５℃で還流抽出を３０分間行った後、珪藻土濾過して濾過液を回収した。得られた濾液をエバポレーターで減圧濃縮してエタノールを留去し、さらに水約３ｌを加えた後、エタノール臭が無くなるまで減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶物を除去した後、再度減圧濃縮して、固形分を約５８ｇ含む抽出液約１０００ｍｌを得た。
【００３８】
得られた抽出液をｐＨ５．０、温度５０℃に調整し、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ』天野製薬製造）を固形分１ｇ当たり１０，０００単位を加え、温度５０℃で２４時間保持した後、温度約１００℃で１０分間加熱し、水冷し、珪藻土濾過して不溶物を除去した。得られた濾過液に水酸化ナトリウム２３ｇを加え溶解させた後、温度約１００℃で１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ分解した後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、エバポレーターで減圧濃縮して、固形分として約２ｇを含む糖液約１３．９ｍｌを得た。
【００３９】
得られた糖液を２回に分けて分取用高速液体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱ  Ｒ−３５５−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液に水を用いてカラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させ、示差屈折計ＥＲＣ−７５３０（エルマ社製造）でモニターして溶出時間約３４分乃至３６分の溶出液約１８０ｍｌ（約９０ｍｌ×２回）を回収し、エバポレーターで減圧濃縮して、真空乾燥して約２２７ｍｇの糖粉末を得た。得られた糖粉末について、実施例１で用いたのと同様のＨＰＬＣで分析したところ、糖組成として環状四糖の純度が約９７．５％であることが判明した。
【００４０】
得られた糖粉末を蓋付き遠心管（１．５ｍｌ容）に移し、それに水０．２５ｍｌを加え、加熱して完全に溶解させた後、密栓して室温で２４時間放置したところ、結晶が析出した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、２分間）して、結晶と蜜を分離し、結晶を回収し、温度６０℃で常圧乾燥して約１２０ｍｇの結晶粉末を得た。得られた結晶粉末について、実施例１に記載のＨＰＬＣで分析したところ、糖組成として環状四糖の純度が約９９％以上で極めて高純度であることが判明した。さらに、粉末Ｘ線回折法で分析したところ、得られた粉末Ｘ線回折スペクトルが環状四糖５乃至６含水結晶のものと一致することがわかり、得られた結晶粉末が環状四糖５乃至６含水結晶であることが判明した。
【００４１】
【発明の効果】
以上、説明したように、本発明によれば、酵母の培養菌体よりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を製造することが可能となる。
【００４２】
従って、本発明の確立は、これまで酵素法のみが知られていたサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造方法に加え、サッカロマイセス属に属する酵母を用いた培養物からの新規な製造方法を提供し、その製造法の幅を広げ、必要に応じて製造方法を使い分けることを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  酵母サッカロマイセス  セレビシアエＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図２】  酵母サッカロマイセス  セレビシアエＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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