(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中に存在する粒子をテストする装置であって、
チャンバと、
該チャンバ内の離間された一連の電極と、
異なる周波数の電気的入力を各電極へ印加して電極に隣接する各領域において異なる周波数の異なる誘電泳動電界を生成する手段と、
前記各領域における粒子の存在を検出する手段とを含む装置において、
前記一連の電極は、その先端部が線形の導体ストリップの形態であって、櫛状のアレイにおける一連の長形のフィンガとして構成され、
前記一連の電極の先端部は、一連の並列電極（４２）を提供し、共通接地電極（１３）付近に延長し、
その結果、前記電気的入力が異なる誘電泳動電界を同時に確立することを特徴とする装置。
【請求項２】
煎記電極アレイが放射パターンに配置されることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記パターンが円形または部分円形であることを特徴とする請求項２記載の装置。
【請求項４】
前記電極が、それらの遠端部が共通電極が配置される中心領域を指すように、ディスク形状の周囲に配置されることを特徴とする請求項２記載の装置。
【請求項５】
前記電極が、周囲の共通電極を指すように外方へ放射することを特徴とする請求項２記載の装置。
【請求項６】
前記検出手段が、前記領域を介して前記粒子に衝突するように放射線を指向させるよう配置された少なくとも１つの電磁放射発生源と、前記領域における粒子の存在を表わす前記各領域に対する信号を生じる少なくとも１つの検知手段とを含む請求項１ないし５のいずれか一つに記載の装置。
【請求項７】
前記検出手段が、前記領域における電気的特性における変動を測定する検知手段を含む請求項１ないし５のいずれか一つに記載の装置。
【請求項８】
前記検知手段が、例えば電流および（または）電圧の前記測定のため前記電極に直列に接続される請求項１ないし５のいずれか一つに記載の装置。
【請求項９】
前記検出手段が、単位時間当たりの粒子の変位の速度または量子を表わす時間に依存するデータを取得する手段を含む請求項１ないし８のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１０】
装置の動作中に、粒子を搬送する流体のパラメータを逓増的に変化させる手段が設けられる請求項１ないし９のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１１】
前記電極が側方に離間された長形の要素のバンクとして配置される請求項１ないし１１のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１２】
前記流体中の粒子を誘電泳動電界に露呈する間、前記チャンバ内の流休のパラメータを変化させることにより、前記変化に対する粒子の応動をテストする手段を備える請求項１ないし１１のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１３】
前記チャンバの離間された区域に配置された複数の前記一連の離間された電極と、異なるパラメータを持つ流体を各区域へ供給し、前記各区域における粒子の存在を検出する手段とを備える請求項１ないし１２のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１４】
前記電気的入力印加手段を制御し、そして／または前記検出手段からの信号を処理するコンピュータ手段を備える請求項１ないし１３のいずれか一つに記載の装置。
【請求項１５】
チャンバと、
該チャンバ内の離間された一連の電極と、
異なる周波数の電気的入力を各電極へ印加して電極に隣接する各領域において異なる周波数の異なる誘電泳動電界を生成する手段と、
前記各領域における粒子の存在を検出する手段とを含み、
異なる周波数の複数の異なる誘電泳動電界に露呈される、異なる領域における空間内の搬送流体中の粒子の位置を見出すステップと、検出される粒子を特徴付けあるいは識別するために各領域における粒子の存在を検出するステップとを含む粒子テスト方法において、
前記一連の電極は、その先端部が線形の導体ストリップの形態であって、櫛状のアレイにおける一連の長形のフィンガとして構成され、
前記一連の電極の先端部は、一連の並列電極（４２）を提供し、共通接地電極（１３）付近に延長し、
その結果、前記電気的入力が異なる誘電泳動電界を同時に確立することを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記粒子が、前記空間内を循回される流体中に含まれる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記粒子の存在が、各領域における電磁エネルギの伝達を測定することにより検出される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記誘電泳動電界が一連の離間された電極を用いて生成され、電気的測定手段が該電極に接続されて各電極に隣接する該電界における粒子の存在を決定する請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子を搬送する流体のパラメータが、取得される応答の変化についてテストするため変化させられる請求項１５ないし１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
前記パラメータが、存在する任意の粒子を検出する期間にわたり変化させられる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記空間が、前記流体パラメータが区域間で異なり、かつ各区域における流体中の粒子が各区域における粒子の検出のため複数の異なる誘電泳動電界に露呈される複数の区域を含む請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、誘電泳動(dielectrophoresis)を用いて流体中に存在する粒子をテストまたは調査する、例えば、誘電泳動特性を決定しあるいは流体中の特定の種類の粒子の存在および(または)相対濃度を識別する装置および方法に関する。
誘電泳動(ＤＥＰ)は、不均一な電界内の分極効果によって生じる粒子の並進運動である。電気泳動とは異なり、ＤＥＰが生じるためには粒子における全電荷は不要である。その代わり、この現象は、粒子に誘起された電気双極子モーメントの大きさと時間的応答に依存し、かつ粒子に作用する電界勾配の結果として生じる力に依存する。半径aの球状粒子における誘電泳動力Ｆdepの大きさは、下式により与えられる。即ち、
0004105767.tif 000002
但し、εmは懸濁する媒体の絶対誘電率、▽Ｅは電界における勾配を示し、
0004105767.tif 000003
はそれぞれ粒子とその周囲の媒体の複素誘電率である。複素誘電率は、
0004105767.tif 000004
により与えられ、ここでεは絶対誘電率、σは導電率、ωは電界の角周波数、および
0004105767.tif 000005
である。項Ｒeは、式(１)の２乗括弧内の式の実数部分が取られることを示す。
水性電解液中に懸濁された粒子の場合は、懸濁媒体の誘電率と導電率とは、通常は周波数範囲100Ｈzないし100ＭＨzにわたって略々一定であるが、粒子自体では、これらのパラメータは著しく変動し得る。従って、項
0004105767.tif 000006
は、正または負であり得、このため、拡張された周波数範囲にわたり、粒子が正のＤＥＰ(高い電界強さの領域への運動)と負のＤＥＰ(低い電界強さの領域への運動)の両方を呈し得る。
粒子の誘電泳動の周波数応答における相違は、誘電泳動によって粒子を選択的に分離させるために用いることができる。かかる原理に基き働く粒子分離器の一例は国際特許出願第ＷＯ−Ａ１−9422583号に記載され、同出願では２つの粒子タイプを含む流体が電極に流れて、２つの粒子タイプが結果として生じる異なる力を受けて流体の流れが１つの粒子タイプを選好的に除去することができるように制御される不均一な電界を生じる。このように、かかる分離器は、誘電泳動的に異なる粒子または細胞を分離することができるが、有効に使用するためには、２つの異なる粒子タイプの誘電泳動的な挙動は既知でなければならない。
かかる目的のために、特定の粒子タイプの誘電泳動特性を決定するのにピン・プレート(pin−plate)電極が用いられたが、手順は手間と時間を要するものである。
Ｇascoyne等は、「Ｍeas.Ｓci.Ｔechnol.３(1992)」の439ないし445ページで、自動イメージ分析によって200ないし300個の粒子、特に哺乳動物の細胞のＤＥＰ挙動を決定している。しかし、ピン・プレート電極の使用においては、細胞のＤＥＰ応答は一時に１つの周波数で測定できるに過ぎない。ＤＥＰにおいて関心となる周波数範囲は比較的大きく(典型的に、100Ｈzないし10ＭＨz以上）、10個当たり数データ点が必要とされるので、充分に広いスペクトルに対して得られるように多くの単一周波数実験が必要である。従って、かかる方法を用いると、細胞または粒子の観察または操作を容易にするために、大きな周波数範囲にわたり誘電泳動スペクトルを得ることは厄介であり時間を要する。
従って、流体中の粒子の特性を決定し、そして／または存在する１つ以上の粒子タイプを識別する優れた方法の必要が生じる。
本発明によれば、１つのチャンバと、チャンバ内の一連の隔てられた電極と、電極に隣接する各領域に異なる誘電泳動電界を生じるため異なる周波数の電気的入力を各電極へ印加する手段と、各領域における粒子の存在を検出する手段とを備える、流体中に存在する粒子をテストする装置が提供される。
粒子の誘電泳動的応答に影響を及ぼすことができる、チャンバ内の他のパラメータを変化させる手段も設けられることが望ましい。このようなパラメータは、チャンバ内の物質の導電率および(または)誘電率、および(または)この物質のpＨ値を含み得る。電極に対する電気的入力の電圧を調整する手段も設けられることが望ましい。
更に、あるいは代替的に、粒子の運動を強化するために他の力を用いることもできる。これらは、動水、超音波、電気泳動あるいは光の作用力を含むこともできる。
当該装置は、例えば、流体中の特定の粒子タイプの分離および(または)識別に適するパラメータを決定し、あるいは存在する２つの特定の種類の粒子間を弁別し、あるいは幾つかの粒子タイプの混合物を分析するために動作される。
粒子が検出されるべき領域は、装置の幾何学的形態と、装置が動作させられる条件とに依存する。本発明の実施の一形態においては、電極は共通電位即ち接地電位における別の電極(単数または複数)に指向され、主たる関心部分は一連の電極および共通電極の先端部間の間隔にある。更に、あるいは代替的に、一連の電極の隣接電極間の領域が調べられる。
前記領域の各々における粒子の存在を検出する手段は、電極間隔に存在する粒子に衝突するようにチャンバを介して送られる電磁放射線の発生源と、前記粒子により吸収されない送られた放射線を検出する検出手段とを含む。一連の電極に隣接する各関心領域ごとに各放射線発生源があり、あるいはビーム偏向手段が１つの発生源に対する放射線を領域をうまく通るように指向させてもよい。
電磁放射線の発生源はレーザでよく、検出装置は電荷結合デバイスでよい。あるいはまた、送られる放射線を監視するためビデオ・カメラを設けることができ、レーザ以外の光源を用いることができる。このように得られるイメージを解釈するため、自動化されたイメージ分析手段を用いることができる。
粒子の存在を検出する他の手段は、前記電極の各々と直アレイに接続されて電極間隔内の電界特性の変動および(または)インピーダンスの変動を検出するように配置される電流および(または)電圧検出回路を含むこともできる。電極に隣接する粒子の存在を示す情報を用いることができる。電極間のかかる検出回路を切換えるため、自動電子スイッチ手段を設けることもできる。この切換えは順次に行われる。
これら検出技術のいずれも、時間的な誘電泳動応答、即ち粒子が異なる誘電泳動電界領域へあるいはかかる領域から移動する速度についての情報を得る手段を更に用いることもできる。粒子の移動速度がこれに働く作用力と直接的に関連するから、またこれらの作用力は電界特性とも関連するので、かかる時間的情報(例えば、粒子の到達速度)は、他の測定値を確証するのに役立ち、あるいは粒子を識別しあるいは粒子を特徴付けるため独立的に用いることもできる。
一連の電極は、先端部がアレイ(array)と対向して配置された線形の導体ストリップの形態で共通電極に指向された櫛状アレイの一連の長い形状のフィンガとして構成することもできる。修正された形態においては、電極アレイは、例えば円形状あるいは部分的に円形状の放射状パターンで配置される。１つのこのような配置において、電極は、その遠端部が共通電極が置かれる中心領域に向くように、円板状の支持部の周囲に配置される。円形電極アレイの場合は、共通電極は中心に配置される。別の事例においては、電極は、周囲の共通電極に向くように外方に放射形態となり、チャンバは任意の適当な形状でよく、電極アレイを収容する寸法でよい。
電極は、半導体産業において導電性トラックを塗布するために用いられる従来技術によって、ガラスまたはシリコンの如き非導電性基板の表面に塗布されてもよい。あるいはまた、例えばスクリーン印刷によって、導電性電極を多孔質膜(porous membrane)に塗布することもできる。多孔質膜の使用は、比較的大きな粒子の除去あるいは捕捉のためなどの他の機能を持ち得る。多孔質膜は、粒子を電極に向けあるいは電極から移動させるためにも用いられ、あるいはチャンバ内の導電率または誘電率、あるいはpＨ勾配あるいは他の勾配の確立を助けるようにも用いられる。
粒子をチャンバを介してフラッシングし、そして／またはチャンバを洗浄し、そして／またはチャンバの内容物の全導電率および(または)pＨを変更するために付加的な流体を供給するため、別個の流体供給手段をチャンバに接続することもできる。
本発明の別の特質によれば、粒子が複数の異なる誘電泳動電界を受ける異なる領域における空間内のキャリア流体(carrier fluid)中に粒子を配置し、検出される粒子を特徴付けあるいは識別するために各領域における粒子の存在を検出することを含む、粒子をテストする方法が提供される。
当該方法は、細胞の如き有生および無生の生物学的粒子ならびに無機的物質の粒子を含む、全ての粒子タイプにおいて用いられる。
本発明の方法および装置については、もっぱら事例として、添付図面に関して更に詳細に記述される。
図１は、本発明による装置の一形態の概略図、
図２は、図１の装置において用いられる多電極アレイの拡大された平面図、
図３は、図１の信号発生器を更に詳細に示すブロック図、
図４a、図４bおよび図４cは、異なる条件下における図１の装置の使用において収集された細胞数を示すグラフ、および
図５および図６は、本発明による装置の２つの変更された形態の概略図である。図１は、誘電泳動を用いて生物学的細胞をテストしあるいは特徴付けるための装置10を示している。チャンバ14内部に収容された多電極アレイ12は、図２に更に詳細に示される櫛状の一連の離間された電極からなり、電極の先端部は共通接地電極13の近くに延長する。チャンバの入口16には、合成プラスチックまたはゴムのチューブ20の一端部が接続される。注射器24が、栓22を介してチューブ20の他端部に接続される。注射器は、最初は調べられる細胞が懸濁されるキャリア液を保持している。チャンバ14の出口18に接続された第２のチューブ26を介して、流体をチャンバからフラスコ28へ注入することができる。電極アレイ12の個々の電極は、マイクロコンピュータ32の制御下で動作される信号発生器30に接続される。マイクロコンピュータ32の制御下にあるレーザ34は、ビームをチャンバ14を通るように指向させるよう配置されている。電荷結合デバイス(ＣＣＤ)または同様な感光デバイスの如きレーザ・ビームの波長に感応する検出器36が、レーザ34に対してチャンバの反対側に配置される。マイクロコンピュータ32はまた、検出器36により得られる信号を記憶して処理するようにプログラムされる。ポンプ38は、任意に、流体をチューブ40を介してチャンバへ供給することができる。
動作において、細胞懸濁液(cell suspension)が注射器24からチューブ20を経て、あるいはポンプ38からチューブ40を経てチャンバ14内へ導入される。マイクロコンピュータ32の制御下で、一連の異なる誘電泳動電界が特に個々の電極の先端部と共通接地電極13との間に確立されるように、信号発生器30が多電極アレイ12内の電極を同時に異なる周波数で励起する。かかる電界において個々の細胞が受ける吸引力または排斥力が、細胞を選好的に異なる誘電泳動領域に向けて押出しあるいはこの領域から排除することができる。液体は、誘電泳動電界が確立され細胞が電界から受ける作用力に従って分散される間は静止状態にあり、あるいは閉路された循回流を確立することができ、その結果粒子は任意の特定領域における作用力の勾配により捕捉されなければ、異なる電界の作用力を受け続けることになる。
信号発生器は、チャンバ14内に、例えば100Ｈzないし10ＭＨzの異なる周波数のスペクトル界を提供する。チャンバの異なる領域に異なる周波数の誘電泳動電界を確立することによって、異なる領域において電界による排斥力および(または)吸引力を受けるため特定の種類の細胞の細胞が特定の電極の先端部付近に集まる傾向を観察することが可能である。マイクロコンピュータ32の制御下で、レーザ34が異なる電界の領域を逐次照射する。ＣＣＤ36へ送られる放射線は、ＣＣＤ36が特定の電極付近に集まった細胞量に従って異なる放射線の強さを検出するように、各領域における細胞の量に応じてより強くあるいはより弱く観察される。無論、レーザ・アレイおよび関連する検出器を用いることにより、異なる電界の領域から同時に測定結果を得ることが可能である。
得られた放射線強さのディジタル信号が、多電極アレイの領域のそれぞれにおける吸収量を表わし、信号発生器30からのかかる吸収領域における電界の周波数についての情報と共に、マイクロコンピュータ32に格納される。マイクロコンピュータには、誘電泳動電界における粒子の挙動に影響を及ぼし、従って粒子を識別し、そして／または特徴付けるため用いることができる他のパラメータについてのデータもまた格納される。例えば、関連するであろう導電率およびpＨの如き、チャンバ内のキャリア流体における諸条件である。このデータは、初期の測定値から人手により入力することができ、あるいは動作中に監視することもできる。集まった情報は、例えば、マイクロコンピュータ32内部に格納された索引テーブルと比較されて、細胞の同定についての情報を得る。
自動イメージ分析、あるいは光学的な密度測定の実施を含む他の従来のカウント法も使用できる。イメージ強調アルゴリズム(image enhancement algorithm)を用いて、コンピュータ化されたイメージを取得し、格納し、分析することが可能であることが理解されよう。
一連のテストから、細胞の迅速な識別を可能にするように異なる細胞および(または)混合物のスペクトルのデータベースを確立しあるいは拡張することができる。
電極アレイ12の一形態が、図２に更に詳細に示されている。これは、フォトリトグラフを用いて作られ、それぞれ幅が21μmで同じ距離だけ隔てられた一連の並列電極42を提供する20個の金メッキされた導体12a、12b、12c、、、12tを含む。電極のテーパ状の先端部が共通接地電極13付近に延長し、それらの他端部では拡開したトラック44が、電極から外部の電気接続が行われる広い領域パッド(図示せず)まで続いている。
図３は、信号発生器30と電極アレイに対するその結線とを更に詳細に示している。この信号発生器は、それぞれ10ＭＨzと１ＭＨzの周波数で動作する水晶発振器52、54を含んでいる。発振器の一次周波数出力から、74連の10進カウンタＴＴＬデバイス74ＬＳ90からなる10進カウンタと２進カウンタを用いて低い周波数が得られる。２つのみが示される３つのカウンタ56の第１のグループが、10除算デバ酵母して働くようにカスケード接続される。周波数発振器52、54とカウンタ56とが、２除算カウンタとして動作して入力周波数に対して0.5、0.25および0.125の比で一連の周波数出力を与える、４つのみが図示される５つのカウンタ58の更に他のグループにそれぞれ接続されている。このように、発振器は10ＭＨz、５ＭＨz、2.5ＭＨz、1.25ＭＨzおよび１ＭＨz、500ＫＨz、250ＫＨz、125ＫＨz、100ＫＨz、50ＫＨz、25ＫＨz、12.5ＫＨz、10ＫＨz、５ＫＨz、2.5ＫＨz、1.25ＫＨzおよび１ＫＨz、および500Ｈz、250Ｈzおよび125Ｈzの周波数を得る。電圧制御増幅器60を介して、カウンタからの０〜５Ｖの方形波信号が±５Ｖの方形波信号へ変換され、これが電極アレイ12の電極へ与えられる。
このように、等しい電圧で異なる周波数の信号を多電極アレイにおける各電極に印加することによって、粒子の懸濁の完全な誘電泳動スペクトルを一回の実験で得ることができる。ピーク−ピークで０〜24Ｖの範囲内の電圧をコンピュータ制御により決められるように生じることができるが、実験においては、典型的にピーク−ピークで２ないし５Ｖ間の電圧が用いられた。
本発明により実施される実験テストに関する図１ないし図３の装置の使用の特定例は下記の通りである。
チャンバ14は、矩形状であり50μＬの体積を有する。電極アレイ12は、１つの壁面に形成され、水密シールとしてエポキシ樹脂を用いて対向する壁面間に配置され封止された200μｍのポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)スペーサを用いることにより、チャンバの内部空間が電極上に形成される。予め定めた導電率を有する細胞の水性懸濁液が、(Ｇilson Ｍinipuls ３システムを用いて)１mmの内孔のポリ塩化ビニール(ＰＶＣ)およびシリコーンの配管16、18を介してチャンバへかつチャンバから圧送された。
使用された粒子は、酵母細胞Ｓaccharomyces cerevisiae株ＲＸIIであった。この酵母は、５ｇ／Ｌの酵母エキス(Ｏxoid)、５ｇ／Ｌのバクテリア・ペプトン(Ｏxoid)および50ｇ／Ｌのスクロース(sucrose)からなるpＨ５の媒体中で30℃において一晩成長され、収穫されて脱イオン水中で４回洗浄された。懸濁液はまた、90℃で20分間熱処理により得て、脱イオン水中で４回洗浄された非生存酵母細胞も含んでいた。使用された最終懸濁液の635nmにおける光学密度は、７〜９×106細胞／ml程度の濃度に対応する、１cmの経路長さキュベット(cuvette)で0.3ないし0.4程度であった。
多電極アレイ12は、ビデオ・カメラとＣＣＤ36を持つモニターとに結合された顕微鏡(図示せず)下で監視された。細胞懸濁液をチャンバ内へ導入した後、流体の流れが止められ電極12が励起された。細胞は、電極付近へ直接移動すること、また電極アレイのある領域から他の領域へ移動することもが観察された。10秒以下程度を要した平衡状態が確立された後、多電極アレイ12上、および電極12の先端部と共通接地電極13間の領域における細胞の分布が、ビデオ記録された。次に、電極間の領域と電極先端部付近の領域とにおいて、ＣＣＤ36により捕捉されるイメージから細胞のカウントがなされた。
約0.6mＳ／mの導電率の懸濁媒体中で、生存酵母細胞が約10ＫＨz以下の周波数で励起された電極から出て、50ＫＨz以上で動作する電極へ吸引された。しかし、非生存酵母細胞は、１ＭＨz以上の周波数で動作する電極から排斥され、500ＫＨz以下の周波数で励起された電極付近に集められた。結果として得る分布は、図４aのグラフに示され、正のＤＥＰの下で電極付近に直接移動する細胞、ならびに負のＤＥＰの領域から正のＤＥＰへ移動する細胞の組合わせ効果に対応している。
図４bおよび図４cは、少量の濃縮ＮaＣl溶液の添加によりその導電率を変更させるように処理された懸濁流体における細胞分布を示している。懸濁媒体の結果として得た導電率は、細胞定数1.58cm-1のプラチナ−黒色電極を用いてＨＰ4192Ａインピーダンス・アナライザで測定された。
図４bは、約６mＳ／mの導電率の媒体中の生存酵母細胞のみを用いたテスト結果を示している。細胞の収集スペクトルは、約0.1ＭＨzないし１ＭＨzの強いピーク値を呈し、１ＫＨzでゼロに下がる。更に他の同様なテストから、図４cは、約0.45mＳ／mの導電率の媒体中の非生存酵母細胞の収集スペクトルを示し、また、ある程度の実験的なばらつきは存在するも、より低い周波数における細胞濃度を示し、１ＭＨzで略々ゼロになる。
異なる粒子タイプに対して、特徴的な周波数特性を確立することができる。混合物中に存在する粒子の種類に対する適切な周波数におけるかかるデータおよび粒子カウントから、流体媒体における既知の粒子の混合物の相対濃度を確立することが可能である。
先に述べたテストにおける前記細胞の変位後の時間内に、他のそれほど顕著でない細胞の移動が観察された。これらの移動は、共通電極から流れより低い周波数で励起された電極を横切り、最後に約５ＫＨzないし500ＫＨzの範囲内の周波数で励起される電極に沈静する細ような細胞の形態をとる。この現象は、おそらくは低い周波数の電気泳動作用によるものである。しかし、非生存細胞はまた、共通電極からＭＨzの周波数で励起される電極へ流れるのが時折観察され、従って他のＤＥＰを駆動した作用力がまた反応し得る。時間がたつと、このような更なる細胞移動が、正のＤＥＰ作用の過剰な推定を導くので、ＤＥＰ収集スペクトルを歪めた。この問題は、細胞懸濁を撹拌させるように電極アレイ上にゆるやかに圧送することによって克服された。誘起された流体力学的な力が各周波数領域における更なる細胞分布を助け、吸引されなかった細胞を除去し、ＤＥＰ作用に干渉することなく細胞の対流状の流れを減じた。流量が大きくなり過ぎると、比較的小さなＤＥＰ作用力によってのみ拘束された細胞が電極から取除かれ、これによりこれら電極における細胞数の低減した評価値を生じた。
例示的な実験は、一定の媒体導電率と誘電率で測定されたＤＥＰ応答の測定結果を示している。種々の導電率および誘電率、および(または)pＨ値において更なるＤＥＰスペクトルを一連の細胞または混合物において得ることができるように、電極アレイにおける導電率および(または)誘電率の勾配を生じるすることは、本発明の範囲内にある。図５は、粒子を含む流体が２つの容器62、64間に分けられ、導電率が容器62において増加した、図１における装置の修正例を示している。ポンプ66が液体をチャンバへ駆動する時、チャンバ62からの液体が既にチャンバ64内にある液体へ引張られてこれと混合するに伴い、チャンバ内の液体の導電率が徐々に増加する。同様に、キャリア流体におけるpＨ勾配も、より低い周波数では、細胞の表面電荷の変化と関連する効果を呈し得る。このようなイメージもまた、例えば微生物の臨床的識別における用途において、生物粒子の特徴付けおよび識別のために用いることができる。
先に述べた手法の別の開発において、増加した数のかかる多電極アレイ12を例えば導電率勾配、または誘電率勾配、またはpＨ勾配に設定することによって、かかるパラメータの関数としての誘電泳動周波数スペクトルもまた１つの実験において得ることができる。
図６は、このような形態の装置を略図的に示している。長形のチャンバ70は、長手方向に隔てて設置された一連の電極アレイ72a、72b、72c、72dを有する。これら電極アレイは、全く略図的に示されるが、図２に関して既に述べた電極アレイの形態をとってもよい。チャンバ70の両端部における入口ポート74、出口ポート76がそれぞれ、テストされる粒子の懸濁液のため設けられている。入口ポートと出口ポートは共に、チャンバの幅方向に比較的均一な速度の流れを生じるように配置されること、例えば、チャンバ幅を横切って離間された一連のポートを含むことが望ましい。チャンバ70の長手方向に沿う各電極アレイ72の区域には、入口ポート78と出口ポート80のグループが、電極アレイ上に他の流体の十字流を通すように設けられる。各電極アレイごとに、異なる導電率を持つ流体が十字流を生じるように、例えば導電率が連続する各電極アレイ72a、72b、72c、72dに対して徐々に大きくなるように用いられる。
動作において、調査中の物質がポート74を経てチャンバ内へ導入され、電極アレイが励起される。次いで、流体の流れが十字流ポート(cross−flow port)78、80を経て電極アレイ上へ向けられ、連続する各電極アレイ72a、72b、72c、72dが手前の電極アレイより大きな導電率の媒体へ露呈される。次に、粒子カウントが各電極アレイにおいて先に述べた任意の形態をとり得る手段(図示せず)により行われる。媒体の導電率が増すに従い、粒子が誘電泳動力によってそれほど強く吸引されなければ、粒子カウントは連続する各電極アレイにおいて減じ、異なる電極アレイから一連のスペクトラム値(spectrum of value)を得ることができる。要求されるデータが粒子カウントについて収集されると、十字流が終了され、ポート78、80を介するフラッシング流によって残骸(debris)が生じる。
これ以上の例示がなくとも、周囲の流動媒体の誘電率またはpＨ値の如き種々の他のパラメータにより誘電泳動の挙動をテストするために、先に述べた方法を用いることができることが理解されよう。適切である場合、導電率または他の可変パラメータがチャンバを流れる主な流体流の方向において減じる同様な実験を行うことができる。電極アレイを反応性の化学薬品で被覆することによって、更なる融通性および応用性を達成し得る。
本発明の使用により、適切な電極アレイおよびテスト・パラメータを用いて、広範囲の粒子および非生物学的細胞を調べることができる。例えば、一連の電極と共通電極との間の間隔の大きさの程度は、ビールス、プリオン(prions)、蛋白質、分子あるいはＤＮＡの如き異なる生物的粒子種、あるいは被覆されたラテックス・ビーズ(latex bead)の如き化学的に活性化された粒子を用いてテストするように変更することも可能である。
本発明の使用分野は、液化食品、尿または血漿の如き生物学的流体、あるいは化学的製造プロセス中にサンプルされた液体の検査に必要とされる如き水性媒体または他の流体中に懸濁される主成分とされる単一の粒子タイプ(動物性あるいは非動物性)の誘電泳動の特性化を含む。記載した方法は、流体から主要な粒子タイプの誘電泳動分離において用いられる流体の最も適切な導電率値および電圧周波数範囲、例えば、正または負の誘電泳動を用いて分離を得るのに必要な導電率および周波数の値を確認するための迅速手段を提供する。
当該手順は、分離された粒子を更に特徴付け、あるいは元のサンプルに存在した他の粒子タイプを分離するのに必要な実験条件を確認するために、誘電泳動分離段階を経て既に処理されたサンプルに対して反復することも可能である。
応用の別の領域は、比較的均質な粒子集団を持つはずの流体サンプルの誘電泳動の特徴付けにあろう。その事例は、ビールまたはワインの発酵における酵母細胞、あるいはヨーグルトまたはチーズの発酵における出発コロニー(starter colonies)として用いられる乳酸バクテリア、あるいは化学的生産プロセスにおいて形成される結晶の監視を含む。これらの場合において、粒子タイプの存在、生存率および均質度を検査するための迅速手段が提供される。例えば、死滅および生存酵母、あるいはヨーグルトにおける出発細菌(典型的には、連鎖球菌および乳酸桿菌)の相対組成が、導電率の関数ならびに有害不純物(例えば、ヨーグルトにおける酵母あるいはビールにおける乳酸バクテリア)の存在の表示として生じる誘電泳動スペクトルによって与えられる。化学的プロセス中にサンプルされる結晶子の均質性(粒度および化学的組成)もまた、監視することができる。
本発明はまた、幾つかの粒子タイプを含む流体の誘電泳動分析のために用いることができる。その事例は、グラム陽性およびグラム陰性のバクテリアの相対組成が、例えば優勢な伝染性細菌の存在を識別するため、ある範囲の導電率およびpＨ値にわたる誘電泳動スペクトルを得ることによって確認が可能である尿の如き生物学的流体を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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