(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の被検体の電気化学的分析に用いるための装置であって、
非伝導性基体と、
該基体上に置かれ、２つの部分からなり、それらの間の非伝導性空隙を規定する伝導性層と、
該空隙の一方の側の、前記伝導性層上にコートされた被検体に特異的な試薬と、
前記空隙の他方の側の、前記伝導性層上の標準電極と、
前記２つの部分からなる伝導性層上に置かれた非伝導性スペーサー層と、
前記試薬、前記標準電極及び前記スペーサー層を覆うように置かれた、界面活性剤又はカオトロピック剤でコートされたモノフィラメントメッシュと、
該メッシュ層に付着するが同一の広がりを有さないことにより前記メッシュの１つの縁にサンプル適用領域を供する第２の非伝導性層と、
を含む装置。
【請求項２】
前記被検体がグルコースであり、前記試薬がグルコースデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記メッシュが界面活性剤で処理されることを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記メッシュが、細胞溶解剤で更にコートされていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記伝導性層が、グラファイト粒子、炭素粒子及びポリマーバインダーを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記グラファイト粒子が１〜20μｍの平均粒径及び１〜50ｍ2／ｇの表面積を有し、前記炭素粒子が、５〜70nmの平均粒径及び150ｍ2／ｇ未満の表面積を有することを特徴とする請求項５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、少量のサンプルを受け入れることができる電極装置に、並びに小さなサンプル容量中に存在するテスト種の検出及び定量のためのテスト方法におけるそれらの使用に関する。
発明の背景
少量のサンプル材料を受け入れることができ、光学的又は電気的過程のいずれかで、サンプル中に存在する被検体が応答するのを許容する多くの装置が開示されている。特に、毛管作用により充填することができるサンプルチャンバーの使用及び構造が特許及び科学文献の両方に記載されている。例えば、EP-A-0170375及びUS-A-5141868を参照のこと。
このような周知の装置は、毛管作用によるサンプルの導入を許容するために十分に小さい寸法である空洞内に収容され、関心の被検体に特異的な試薬系でコートされた非伝導性基質が析出した電極を含み得る。そのサンプルは電極のすぐ近くに保持され、その電極はサンプルの特定の電気特性の測定を容易にするように電極が形づくられている。
このような装置は多数の欠点を有し、特に、極めて厳しく規定された制限内で空洞の寸法を調節する必要がある。これらの製造許容度を超えると、サンプルが毛管作用により空洞に入らないであろう。
更に、粘性のサンプル流体、例えば血液をその空洞に導入する場合、そのチャンバーは、比較的ゆっくりとサンプルで満たされ、これにより分析を完了するのにかかる時間を遅らせるであろう。サンプル粘度及びこれによるサンプル表面張力特性の変化は充填時間を変化させ；これは全分析時間を害するばかりでなく、より重要なのは、分析結果を不正確にすることである。なぜなら、サンプルを被検体特異的試薬に露出するのにかかる時間が変化するからである。
WO-A-9730344は、サンプルを基準電極に導くのに適合したポリエステルメッシュを含む電極装置を開示する。この装置は、試薬が、サンプルの取扱いのバリエーションに関連した問題を避けるため、及びグルコーステストのため、サンプルのヘマトクリットと独立するため、疎水性及び親水性表面領域の両方を有する充填剤を含むことを必要とする。
発明の記載
本発明によれば、少い流体サンプル容量中に存在する被検体のレベルを電気化学的に測定することができる装置は、被検体特異的試薬でコートされ非伝導性基体上に置かれた伝導層と、厚膜印刷により該非伝導性基体上に置かれたスペーサー層と、界面活性剤及び／又はカオトロピック試薬でコートされたモノフィラメントメッシュ材料であって該メッシュが前記スペーサー層上に重層されているものと、該メッシュ層に付着した第２の非伝導性基体と、を含む。これにより、その装置は、多層構造であり、印刷されたスペーサー層により分離され、サンプルの導入のため一端が開口した空洞又は領域を形成する２つの表面を含む。この空洞又は領域は、第２の基体を超えて広がり、サンプル適用領域を形成するメッシュ材料で満たされる。
本発明による装置は、
（ａ）第１の非伝導性基体上に、ポリマーバインダー中の炭素及びグラファイトの伝導性層を置き；
（ｂ）該第１の伝導性層に隣接するが連続していない標準／対極電極として機能するための銀／塩化銀からなる第２の伝導層を置き；
（ｃ）該第１の伝導性層の表面を、サンプル材料中の１又は複数の被検体と特異的に反応する試薬又は試薬の混合物でコートし；
（ｄ）前記第１及び第２の伝導性層の各々の一部を露出したままにするように、前記第１の非伝導性基体の上及び前記第１の伝導性層の上に厚膜印刷によりスペーサー層を形成し；
（ｅ）該スペーサー層の上にコートされたメッシュ材料を配置してそれを該スペーサー層に永久的に固定化し；
（ｆ）メッシュの拡張領域を露出したままにするように、前記メッシュ材料の上に第２の非伝導性基体を配置してそれを永久的に固定化し；
（ｇ）前記メッシュをサンプルで湿らせることにより、装置の検出領域を満たし又は注ぎ込むように、前記拡張領域にサンプルを適用し；そして
（ｈ）前記第１の伝導性層上での前記試薬との反応により、サンプル中の被検体を定量すること
により生産され、使用され得る。
本電極装置は、少量のサンプル（典型的には２μｌ未満）をメッシュ拡張部に適用するのを許容する。この後、装置の検出領域がサンプルで満たされ、それは測定電極と近密に接触する。空洞は、その空洞の端で、露出したメッシュの上に一滴のサンプル液をおくことにより又は空洞の端をサンプルに接触させることにより満たすことができる。
発明の記載
添付の図面は詳述目的のためだけに供する。
図１Ａは本発明を具体化する検出装置の概略側面図である。
図１Ｂは、図１Ａに示す実施形態の一部の平面図である。
より詳しくは、本図面は、非伝導性シート１、及びその上に置かれた２部２ａ，２ｂの伝導性電極を示す。２ａの部分は標準／対極電極３を有し、そして２ｂの部分は試薬層５を有する。２ａ，２ｂの部分はスペーサー層４も有する（これ及び以下に記載する他の部品は図１Ｂに示さない。この図は、単に電気的配置を示すためだけに供する）。メッシュ材料６は電極３、スペーサー４及び試薬層５上に重層される。テープ７はメッシュ材料６の上に供される。
装置の検出領域８は、伝導層の各々の部分の間及びこれにより試薬と標準電極との間に規定される。メッシュ材料はテープ７と同一の広がりを有さず、それによりサンプル適用領域９を規定する。使用において、領域９に適用されるサンプルは、それが領域３，５及び８に流れるように、メッシュ６により保持される。サンプル中の被検体の存在は、現在、電気化学的に測定することができる。
発明の記載
メッシュ材料は、（第１の基体上の）スペーサー層と第２の基体との間に挿入され、その表面上にコートされた湿潤剤により表面張力及び／又はサンプルの粘度を減少させるように機能する。メッシュの拡張部分へのサンプルの適用は、メッシュコーティング材料をサンプル中に溶かし、サンプル表面張力を減少させ、そしてサンプルを装置の空洞に流す。サンプルは、メッシュ上にコートされた湿潤試薬の欠如下では装置の空洞に入らないであろう。あるいは、完全な細胞の存在により特定の被検体の測定が悪影響を受ける、血液のような複合サンプルにおいては、例えば電極表面に毒を塗ることにより、メッシュを接触した細胞を溶解する剤でコートすることができ；これは、完全な細胞の干渉を除去しながら、同時にサンプル粘度を減少させる更なる利点を有する。
本システムは、一つの電極として、微小電極として、又は微小電極アレイとして供することができる。電極は、同じ基体上に置かれた標準／対極電極と合わせて用いることができる。
非伝導性基体材料は、例えばポリエステル、ポリカーボネート、ポリビニルクロライド、高密度ポリプロピレン又は低密度ポリプロピレンのシートであり得る。好ましい実施形態において、ポリエステルシート材料は処理前のポリエステル材料に寸法の安定性を与えるために、伝導性層の適用前に熱安定化される。
伝導層は、好ましくはグラファイト、炭素及びポリマーバインダーを含む。例えば、グラファイト成分は２０μｍまで、例えば１〜20μｍの平均粒径、50ｍ2／ｇまで、例えば１〜50ｍ2／ｇの典型的な表面領域を有する。それは本質的に伝導性であり；それは、天然のソースから得られ、又は合成して生産することができる。炭素成分は、好ましくは１μｍ未満、例えば５〜70nmの平均粒径、及び150ｍ2／ｇ未満の典型的な表面領域を有する。グラファイト成分と同様に、それも、本質的に伝導性である。
ポリマーバインダーは、熱硬化性又は熱可塑性のいずれであってもよい。それは、多様なポリマーファミリー、例えばビニルクロライド、ビニルアセテート、ビニルアルコール（及びビニルクロライド・アセテート及びアルコールのコポリマー）、炭化水素類、エチル及びメチルセルロース、エポキシ類、ポリエステル、アルキド樹脂、並びにポリマーを架橋させることができるカルボキシル、ヒドロキシル、アミン、チオール、エステル、エポニシ及びアミド基のような官能性反応基を含むポリマーのいずれかから得ることができる。
伝導性電極材料は、慣用的な印刷法、例えば厚膜印刷（スクリーン印刷とも呼ばれる）、リトグラフィー、凸版印刷、蒸着、スプレーコーティング、インクジェント印刷、レーザージェット印刷、ローラーコーティング又は真空蒸着によって非伝導性基体上に置くことができる。伝導性電極材料の配置の後、ポリマーバインダーは、いくつかの慣用的な工程、例えば強制空気乾燥、高温での強制空気乾燥、赤外照射、紫外照射、イオンビーム照射又はガンマ照射によって安定化し、又は硬化させることができる。これらの工程は、全て、ポリマーバインダーの個々の分子の架橋の程度を変えることができる。紫外照射の使用は、ポリマー架橋反応を始めるために、伝導性電極材料に感光性試薬を含めることを必要とする。
第１の伝導性層の上に位置した試薬は、サンプル中の被検体の濃度を測定するために必要な固体状態の全ての成分を含むことを特徴とする。このような成分には、酵素、酵素補因子、補酵素、共通基質、抗体又は他の被検体結合パートナー、DNA又はRNA、酸化還元パートナー、緩衝剤、イオン透過担体及び塩がある。
試薬は、マトリックス、バインダー及び他の成分のための安定剤も含み得る。例えば、適切なマトリックスには、グラファイト、炭素、シリカ、ガラス、ラテックス又はポリビニルクロライドの粒子がある。適切なバインダーには、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリジン、タンパク質、セルロース及びセルロースアセテートがある。適切な安定剤には、アルコール、エステル、タンパク質、タンパク質加水分解物及び単純な及び複雑な炭化水素がある。
試薬は、各々が特定の成分を含んだいくつかの個々に適用される層を含み得る。その組成は、流体サンプルに接触した時、少くとも部分的に溶解するような組成である。
試薬は、慣用的な析出工程、例えば厚膜印刷（スクリーン印刷とも呼ばれる）、リトグラフィー、凸版印刷、蒸着、スプレーコーティング、インクジェット印刷、レーザージェット印刷、ローラーコーティング又は真空蒸着により、第１の伝導性層上に置くことができる。これらの配置工程の組合せは、多層を作製するのに用いることができる。試薬の配置の後（又は各々の個々の層の配置の後）、その層は、いくつかの慣用的な方法、例えば上述の方法により、ポリマーバインダーの個々の分子の架橋を行うために、安定化させる又は硬化させることができる。
スペーサー層は、慣用的な厚膜析出法により第１の非伝導性基体上に析出させることができ、そしてポリマーバインダーの個々の分子を架橋するために、いくつかの慣用的な工程、例えば上述のものによって安定化させる又は硬化させることができる。スペーサー層の厚さは、いくつかのパラメータ、例えば印刷条件（圧力、速度、スクリーン張力及びエマルションの厚さ）及びインク特性、例えば固体成分及び粘度によって調製することができる。
メッシュ層は、好ましくは、合成、モノフィラメント、編んだ材料である。それは、ポリエステル又はナイロンから作ることができる。メッシュは、界面活性材料、デタージェント又は湿潤もしくは溶解剤でコートされる。例えば、フッ素界面活性剤、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、サポニン及びコール酸ナトリウムがある。
本発明の電極は、いくつかの要求される特徴を有する。例えば、本装置は、極めて少量、典型的には２μｌ未満のサンプル、例えば完全な血液、血漿、血清、間質液、汗又は唾液を要求する。サンプルがサンプル空洞を満たした時、サンプルの極めて薄い膜が析出した試薬の表面を横切って広がり、試薬との接触を最大にし、そして試薬をサンプル中に迅速に溶解させる。これにより、定常状態に迅速に達することができる。
本装置の好ましい実施形態において、空洞は装置の縁の端に位置する。この装置は、テストストリップの縁をサンプルに接触させることにより、サンプルで直ちに満たされ得る。別の好ましい実施形態において、空洞は装置の縁から０〜２mmに位置し、これによりサンプルを収集するために、（皮膚の穿刺した領域のような）表面に沿ってこすられ得るテストストリップの領域を露出し得る。
本発明の電極は、電極において電子の除去又は付加により直接、酸化又は還元され得る被検体／種；電極において電子の除去又は付加により直接、酸化又は還元され得る生成物に、酵素又は一連の酵素により迅速に変換され得る被検体／種；後に電子の付加／除去により直接、酸化又は還元され得る酵素補因子の同時の酸化又は還元を伴って、酵素により生成物に変換され得る被検体／種；酵素が電極から直接、電子を通過させ又は受容することができるように、電極表面に近密に接触する酵素により生成物に変換され得る被検体／種の分析のために用いることができる。その新規装置は、特にグルコースセンサーとして用いるのに適する。この場合、試薬は、好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼであり；これは、サンプルのヘマトクリットと実質的に独立したグルコースの読み取りを供することができる。
以下の例は本発明を詳述する。
実施例
伝導性インク材料を、スクリーン印刷法により、非伝導性ポリエステルシート材料（１２５μｍ厚）に印刷する。その伝導性インク材料は、グラファイト粒子（平均粒径１μｍ、表面積15ｍ2／ｇ）、伝導性炭素粒子（平均粒径40nm、表面積100ｍ2／ｇ）、及び有機溶媒中のビニルクロライド／アセテートコポリマーバインダーの混合物からなる。伝導性インクの析出後、強制空気オーブン内で溶媒を除去する一方、温度を上昇させて二官能性アミンによりポリマーバインダーの化学的架橋を開始する。
銀／塩化銀、スクリーン印刷標準／対極電極をポリエステル支持体上の伝導性炭素層に隣接して配置する。次に、スペーサー層を、伝導性炭素電極の一部を残し、標準／対極電極の全てを露出するように、スクリーン印刷する。
グルコースの測定に特有の多層試薬混合物を調製する。それは、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ナイルブルー、メドラ（Medola）ブルー又は酵素補因子NADHのためのいずれかの他の適切なメディエーターを含み、それを、ピペッティングにより水溶液から露出した伝導性炭素／グラファイト層上に析出させ、そして伝導性炭素／グラファイト層上にコートされたメディエーターの膜を残すように乾燥させる。グラファイト、NAD+、緩衝塩、界面活性剤、安定剤及びレオロジー改質剤の混合物からなる第２の層を厚膜印刷により析出させる。次にこれを乾燥させる。グルコースデヒドロゲナーゼ（NAD依存性）の水溶液、緩衝塩及び安定剤からなる第３の層をピペッティングにより配置する。次にそれも乾燥させる。
界面活性剤でコートしたモノフィラメントメッシュ材料はスペーサー層の上におき、第２のスペーサー層の厚膜析出により固定する。一側面を感圧接着剤でコートした75μｍ厚ポリエステルテープ材料を含む第２の非伝導層を、メッシュの拡張領域を露出したままにするようにモノフィラメントメッシュの上におく。その露出した領域はサンプル適用ゾーンとして機能する。
適切な電位差を伝導性炭素と塩化銀標準電極との間に適用した時、本電極装置は、クロノアンペロメトリーのような標準的な電気化学的技術を用いて、血液のサンプル中のグルコースの測定のために用いることができる。グルコースは、NAD+依存性グルコースデヒドロゲナーゼの作用により、NAD+のNADHへの変換を同時に伴ってグルコノラクトンに変換され、そしてNADHはメディエーター化合物によりNAD+に再び酸化される。次に、メディエーター化合物は電極表面において順々に酸化されて、その生成される電流は、サンプル中のグルコースの濃度に比例する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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