(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の毒性を決定する方法であって、該方法が、
（ｉ）非ヒトテスト生物に該化合物を投与する工程；
（ｉｉ）該非ヒトテスト生物の１つ以上の組織のそれぞれからmRNA分子の群を抽出する工程；
（ｉｉｉ）該１つ以上の組織に由来するｍＲＮＡ分子の群のそれぞれからcＤＮＡ分子の別々の群を形成し、該cＤＮＡ分子の別々の群におけるｃＤＮＡ分子のそれぞれにオリゴヌクレオチドタグを付着させることで、タグ−ｃＤＮＡ結合体の別々の群を形成する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドタグが同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択され、該セットにおける別個のオリゴヌクレオチドタグの数が、該ｍＲＮＡ分子の群におけるｍＲＮＡ分子の数と比較して少なくとも１０倍である、工程；
（ｉｖ）多量の混合物からそれに比べて小容量のサンプルを採取することで、タグ−ｃＤＮＡ結合体の別々の群のそれぞれを別々にサンプリングする工程であって、タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプリングした群内のそれぞれのｃＤＮＡ分子は、それにとって特有のオリゴヌクレオチドタグを有している、工程；
（ｖ）該オリゴヌクレオチドタグをそのそれぞれの相補物と特異的にハイブリダイズすることによって、タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプリングした集団のそれぞれのｃＤＮＡ分子をソーティングする工程であって、該それぞれの相補物が、別個の微粒子に付着されている、工程；
（ｖｉ）該１つ以上の組織のそれぞれについて発現された遺伝子の頻度分布を形成するために、タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプリングした群のそれぞれにおける該ソーティングされたcDNA分子のそれぞれの一部のヌクレオチド配列を決定する工程；および
（ｖｉｉ）該１つ以上の組織のそれぞれにおける発現された遺伝子の該頻度分布を、該化合物の毒性と相互関連させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
化合物での処理後に非ヒトテスト動物の選択された組織で区別して発現される遺伝子を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）該化合物を非ヒトテスト動物に投与する工程；
（ｉｉ）該非ヒトテスト動物の該選択された組織からmRNA分子の群を抽出する工程；
（ｉｉｉ）該mRNA分子の群からcDNA分子の群を形成し、各cDNA分子にオリゴヌクレオチドタグを付着させることで、タグ−ｃＤＮＡ結合体の群を形成する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドタグが、同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択され、該セットにおける別個のオリゴヌクレオチドタグの数が、該ｍＲＮＡ分子の群におけるｍＲＮＡ分子の数と比較して少なくとも１０倍である、工程；
（ｉｖ）多量の混合物からそれに比べて小容量のサンプルを採取することで、タグ−cDNA結合体の群をサンプリングする工程であって、ここで、タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプリングした群内のそれぞれのcDNA分子が、それにとって特有のオリゴヌクレオチドタグを有している、工程；
（ｖ）該オリゴヌクレオチドタグをそのそれぞれの相補物と特異的にハイブリダイズすることによって、該タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプリングした群をソーティングする工程であって、該それぞれの相補物が、別個の微粒子に付着されている、工程；
（ｖｉ）発現された遺伝子の頻度分布を形成するために、該ソーティングされたcDNA分子のそれぞれの一部のヌクレオチド配列を決定する工程；および
（ｖｉｉ）該非ヒトテスト動物の該選択された組織の発現された遺伝子の該頻度分布を、非ヒトコントロール動物の選択された組織の発現された遺伝子の頻度分布と比較することによって、該化合物を投与することに応じて発現される遺伝子を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドタグおよび該オリゴヌクレオチドタグの相補物が一本鎖である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドタグが多数のサブユニットからなり、各サブユニットが、３〜９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなり、そして各サブユニットが、同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記cDNA分子を前記微粒子上でソーティングする前記工程が、ロードされた微粒子およびロードされていない微粒子を生じ、ここで、該ロードされた微粒子は、ｃＤＮＡ分子が付着している微粒子で構成される、方法。
【請求項６】
前記ロードされていない微粒子から前記ロードされた微粒子を分離する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記ロードされた微粒子の数が少なくとも10,000で蓄積されるまで、サンプリング、ソーティング、および分離の前記工程を繰り返す工程をさらに包含する、方法。
【請求項８】
前記ロードされた微粒子の数が、少なくとも100,000である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ロードされた微粒子の数が、少なくとも500,000である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法であって、前記群の0.1％くらいの95％信頼限界で0.1％〜５％の範囲内の頻度で該群に存在するcDNA分子の相対的豊富さを見積もるために十分である、前記ロードされた微粒子の数が蓄積されるまで、サンプリング、ソーティング、および分離の前記工程を繰り返す工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
前記非ヒトテスト生物または非ヒトテスト動物が、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、およびサルからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択された組織が、肝臓、腎臓、脳、心臓血管、甲状腺、脾臓、副腎、大腸、小腸、膵臓、膀胱、胃、卵巣、精巣、および腸間膜リンパ腺からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ヒトテスト生物が哺乳動物組織培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物組織培養物が肝細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に、化学化合物の毒性を評価および／または決定するためのインビトロおよびインビボシステムにおける表現型変化を検出およびモニターする方法に関し、そしてより特定には、本発明は、薬物候補の毒性を決定するためのインビトロおよびインビボシステムにおける遺伝子発現パターンの変化を検出およびモニターする方法に関する。
背景
新化合物の毒性を迅速かつ便利に評価する能力は、非常に重要である。何千もの新化合物が毎年合成され、そして多くが、新しい市販の産物および加工の開発によって、しばしばその短期および長期の健康への影響の知見がほとんどなしに、環境中へ導入される。新薬物の開発では、候補化合物の安全性および有効性を評価する費用は天文学的になっている：製薬産業は、新しい薬学化合物をマーケットにもたらすために平均約300,000,000ドルを費やす、例えば、13:226-228（1995）。これらの費用の大部分は、開発過程のより後の段階における候補化合物の失敗によるものである。すなわち、候補薬物の評価は、例えば、比較的安価な結合アッセイまたはインビトロスクリーニングアッセイによって、薬物候補としての化合物の同定から進行するので、薬物動態学的研究に、毒性研究に、モデル系における有効性研究に、前臨床試験などに関連するテストおよび分析の費用は、途方もなく増加する。結果として、１度将来有望になった候補化合物が、さらに開発することが商業的に実行不可能になる副作用または交差反応性を有すると決定されるために、数千万ドルの費用がかかり得る。製薬開発の大きなチャレンジは、薬物テストのより後の段階で失敗するような化合物を、できるだけ早くさらなる考慮から除去することである。
薬物開発プログラムは、この対象について明らかに構築される；しかし、急速に増加する費用は、できるだけ早く間違った先導を同定するために、初期の段階でさらに緊縮しかつより高価でないスクリーニングを開発する必要性を生じている。毒性評価は、このような改良が、薬物開発のためと、一般的に新化合物の環境、健康、および安全性の効果を評価するためとの両方について行われる領域である。
代表的には、化合物の毒性は、制御された条件下で１種以上のテスト動物に化合物を投与することによって、および広範囲のパラメータにおける効果をモニターすることによって、決定される。パラメータには、血液化学、体重増加または減少、種々の行動パターン、筋緊張、体温、呼吸数、致死率などのようなことが挙げられ、これらはテスト動物の健康状態の尺度を集合的に提供する。正常範囲型のこのようなパラメータの逸脱の程度は、化合物の毒性の尺度を提供する。このようなテストは、化合物の急性、長期（prolonged）、または慢性（chronic）毒性を評価するために設計され得る。一般的に、急性テストは、テスト化学薬品の一回での投与を包含する。テスト動物の観察期間は、２、３時間のような短期であり得るが、通常は少なくとも24時間であり、そしてある場合には１週間以上の長期であり得る。一般的に、長期のテストは、テスト化学薬品の複数回での投与を包含する。テスト化学薬品は、毎日１回以上、食餌に組み込まれる場合は不規則に、妊娠中のような特定の時に、またはある場合には規則的であるが隔週で投与され得る。また、長期のテストでは、実験は、通常、ラットまたはマウスでは90日間未満、あるいはイヌでは１年間行われる。急性および長期のタイプのテストとは逆に、慢性毒性テストは、テスト化学薬品が、テスト動物の寿命の実質的な部分の間投与されるテストである。マウスまたはラットの場合には、これは、２〜３年の期間である。イヌの場合は、５〜７年間である。
このようなアッセイのために大群のテスト動物を、特に慢性毒性アッセイではより大きな動物を樹立しそして維持することで、重要な費用が損なわれる。さらに、種特異的効果のため、このような毒性テストを省略することは、化合物がヒトで使用される場合に毒性効果がないことを保証しない。しかし、このようなテストは、新化合物の安全性を判断するための情報の標準化されたセットを提供し、そして関連化合物の予備評価についてのデータベースを提供する。毒性決定を改良するための重要な領域は、高価かつ退屈な動物アッセイの結果の予測になる新しい注目すべきことの同定である。
他の医学分野では、バイオテクノロジーにおいて、特にDNA配列決定においての近年の進歩を、健常および病気の生物における区別して発現された遺伝子の同定および研究へ適用することに、非常に興味があった。例えば、Adamsら，Science, 252: 1651-1656（1991）；Matsubaraら，Gene, 135: 265-274（1993）；Rosenbergら，国際特許出願PCT/US95/01863。このような適用の対象には、病気の過程の知見を増加させること、病気の過程で重要な役割を果たす遺伝子を同定すること、ならびに発現された遺伝子またはその産物を利用する診断および治療アプローチを提供することが挙げられる。このようなアプローチは魅力的であるが、発現された遺伝子の徹底的なまたはさらにサンプリングされた配列決定に基づくアプローチは、必要とされる多くの努力がさらに付きまとう：30,000〜35,000の異なる遺伝子が任意の所定の段階の代表的な哺乳動物組織で発現されると推定される。例えば、Ausubelら編、Current Protocols, 5.8.1-5.8.4（John Wiley & Sons, New York, 1992）。ある数の遺伝子産物のより小さな試料の配列を決定することは、工業的規模の供給源を必要とする主要な企画である。したがって、発現された遺伝子のしっかりした配列決定のルーチンの適用は、まだ現在の市販の技法を越えない。
テスト動物の健康状態についてのより広いかつ正確な情報を提供する、候補薬物のような化合物の毒性を評価するための新しいアッセイの利用可能性が、非常に所望される。このような追加のアッセイは、好ましくは現在のテスト手順よりも、高価でなく、より迅速で、そしてより便利であり、そして同時に、新化合物の安全性に関する早い判断を行うために十分な情報を提供する。
発明の要旨
本発明の目的は、インビトロまたはインビボテストシステムにおける、遺伝子発現パターンまたはプロフィールの検査に基づく毒性評価への新しいアプローチを提供することである。
本発明の他の目的は、化学薬品、特に薬物候補の毒物学的特性に関する基本決定へのデータベースを提供することである。
本発明のさらなる目的は、テスト動物の選択された組織における遺伝子発現パターンを分析する方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、テスト化合物への曝露に応じて区別して発現される遺伝子を同定するためのシステムを提供することである。
本発明の目的は、遺伝子発現とテスト動物における短期および長期毒性とを相互関連させる迅速かつ信頼できる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、発現が有害な毒性の予測となる遺伝子を同定することである。
本発明は、テスト化合物に曝露された生物の１つ以上の選択された組織で発現された遺伝子のしっかりした並行したサイン配列決定（massively parallel signature sequecing）の方法を提供することによって、これらおよび他の目的を達成する。本発明の重要な特徴は、多数の異なるポリヌクレオチドの部分の配列を並行に決定することによって、選択された組織についての遺伝子発現プロフィールの形成を可能にする新規DNAソーティングおよび配列決定法の適用である。このようなプロフィールは、毒性を予測する発現パターンを同定するために、単一または複数の時点でのコントロール生物の組織からのプロフィールと比較され得る。
本発明のソーティング方法論は、オリゴヌクレオチドの最小で交差反応するセットのメンバーであるオリゴヌクレオチドタグを使用する。このようなセットのオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドによる同じセットの他のメンバー毎の配列とは異なる。したがって、このようなセットの各メンバーは、２つより少ないミスマッチを有する任意の他のメンバーの相補物との二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。本発明のオリゴヌクレオチドタグの相補物は、本明細書では「タグ相補物」といい、これは天然のヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。好ましくは、タグ相補物は、固相支持体に付着される。対応するタグ相補物とともに使用される場合、このようなオリゴヌクレオチドタグは、cDNAのようなポリヌクレオチドをソーティングするためのハイブリダイゼーションの特異性を増強する手段を提供する。
それぞれソーティングされるポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するように付着されたオリゴヌクレオチドタグを有する。以下により十分に説明されるように、この条件は、ポリヌクレオチドの群より実質的に大きいタグのレパートリーを用いることによって、およびタグ付けされたポリヌクレオチドの完全なアンサンブルからのタグ付けされたポリヌクレオチドの十分に小さい試料を採用することによって、達成される。このようなサンプリング後、支持体およびポリヌクレオチドの群が、オリゴヌクレオチドタグのそれぞれの相補物との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される場合、同一のポリヌクレオチドが、特定のビーズまたは領域上でソーティングする。次いで、ポリヌクレオチドのソーティングされた群は、以下のより詳細に記載するように、「単一塩基（single-base）」または「塩基毎（base-by-base）」配列決定方法論によって、固相支持体上で配列決定され得る。
１つの局面では、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（a）テスト生物に化合物を投与する工程；（b）テスト生物の１つ以上の組織のそれぞれからmRNA分子の群を抽出する工程；（c）別々の群の各cDNA分子が付着されたオリゴヌクレオチドタグを有するように、１つ以上の組織から抽出されたmRNA分子の各群からcDNA分子の別々の群を形成する工程であって、オリゴヌクレオチドタグが同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択される、工程；（d）別々の群内の実質的にすべての異なるcDNA分子が付着された異なるオリゴヌクレオチドタグを有するように、cDNA分子の各群を別々にサンプリングする工程；（e）オリゴヌクレオチドタグをそれぞれの相補物と特異的にハイブリダイズすることによってそれぞれ別々の群のcDNA分子をソーティングする工程であって、それぞれの相補物が、１つ以上の固相支持体上の空間的に異なる領域において実質的に同一の相補物の均一な群として付着される、工程；（f）１つ以上の組織のそれぞれについて発現された遺伝子の頻度分布を形成するために、それぞれ別々の群のソーティングされたcDNA分子のそれぞれの一部のヌクレオチド配列を決定する工程；および（g）１つ以上の組織のそれぞれにおいて発現された遺伝子の頻度分布を化合物の毒性と相互関係させる工程。
本発明の重要な局面は、発現が化合物の毒性の予測になる遺伝子の同定である。一旦このような遺伝子が同定されると、これらは、遺伝子発現のための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のような従来のアッセイで用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、オリゴヌクレオチドの最小交差ハイブリダイズセットを生成するためのアルゴリズムのフローチャート表示である。
図２は、本発明によるポリヌクレオチド配列決定を行うための装置を図示する。
定義
オリゴヌクレオチドタグに関して本明細書で使用される場合、「相補物」または「タグ相補物」とは、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして、完全に一致した二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施態様では、オリゴヌクレオチドタグは、二本鎖または一本鎖のいずれかに選択され得る。したがって、三重鎖が形成される場合、用語「相補物」とは、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補物または二本佐織後ヌクレオチドタグの一本鎖相補物のいずれかを包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」には、ワトソン・クリックタイプの塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対形成などのようなモノマー対モノマー相互作用の調節パターンによって、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー形態、ペプチド核酸（PNA）などを含む、天然または改変されたモノマーまたは結合の直線オリゴマーが含まれる。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されて、少数のモノマー単位、例えば、３〜４から数十のモノマー単位までのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ATGCCTG」のような文字の配列で表される場合はいつでも、ヌクレオチドが左から右へ5’→3’の順であり、そして他に記載がなければ、「A」がデオキシアデノシンを示し、「C」がデオキシシチジンを示し、「G」がデオキシグアノシンを示し、そして「T」がチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然ヌクレオチドを含む；しかし、これらはまた、非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。天然または非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられる場合、例えば、酵素によるプロセシングが要求される場合、通常、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされることが当業者には明らかである。
二重鎖に関して「完全に一致した」とは、各鎖におけるあらゆるヌクレオチドが他の鎖におけるヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対形成を受けるように、二重鎖を作り上げるポリ-またはオリゴヌクレオチド鎖が互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得る、デオキシイノシン、2-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドのような、ヌクレオシドアナログの対形成を包含する。三重鎖に関して、この用語は、三重鎖が、完全に一致した二重鎖と、あらゆるヌクレオチドが、完全に一致した二重鎖の塩基対とフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合を受ける第３の鎖とからなることを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「ミスマッチ」とは、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレットが、ワトソン・クリックおよび／またはフーグスティーンおよび／または逆フーグスティーン結合を受けないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」には、例えば、KornbergおよびBaker, DNA Replication，第2版（Freeman, San Francisco, 1992）に記載のように、2’-デオキシおよび2’-ヒドロキシル形態を含む、天然のヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドに関して「アナログ」には、特異的ハイブリダイゼーションし得ることのみを除いては、例えば、Scheit, Nucleotide Analog（John Wiley, New York, 1980）；UhlmanおよびPeyman, Chemical Reviews, 90: 543-584（1990）などに記載される、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドが挙げられる。このようなアナログには、結合特性を増強し、複雑性を減少させ、特異性を増加させるなどために設計された合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、「配列決定」または「ヌクレオチド配列を決定すること」には、ポリヌクレオチドの部分ならびに全配列情報を決定することが挙げられる。すなわち、この用語には、標的ポリヌクレオチドにおける、配列比較、フィンガープリンティング、および標的ポリヌクレオチドならびにヌクレオシド、通常、各ヌクレオシドの発現同定および順序付けについての情報の類似レベルが含まれる。この用語はまた、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプのうちの１、２、または３つの同定、順序づけ、および位置の決定を含む。例えば、いくつかの実施態様では、決定は、ヌクレオチドの単一タイプの順序づけおよび位置を同定することによって行われ得、例えば、標的ポリヌクレオチド「CATCGC...」内のシトシンは、そのため、その配列は、「C-（Cでない）-（Cでない）-C-（Cでない）-C...」については二進法コード、例えば、「100101...」として表されるなどである。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの群に関して用語「複雑性」とは、群に存在する分子の異なる種の数を意味する。
本明細書で使用される場合、等しく使用される用語「遺伝子発現プロフィール」および「遺伝子発現パターン」とは、タグ-cDNA結合体の群からサンプリングされたcDNA分子の一部の配列の頻度分布を意味する。一般的に、配列の一部は、その一部が生じたcDNAを独特に同定するために十分に長い。好ましくは、決定される配列の総数は、少なくとも1000であり；より好ましくは、遺伝子発現プロフィールで決定される配列の総数は、少なくとも10,000である。
本明細書で使用される場合、「テスト生物」とは、テスト化合物への曝露への測定可能な応答を提供する任意のインビトロまたはインビボシステムを意味する。代表的には、テスト生物は、哺乳動物細胞培養物、特に、肝細胞、腎臓細胞、コロニー形成細胞などの特定の組織の哺乳動物細胞培養物であるか、あるいは、テスト生物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、サルなどのような動物全体であり得る。
発明の詳細な説明
本発明は、化合物に曝露されたテスト生物の選択された組織における遺伝子発現プロフィールの変化を分析することによって、化合物の毒性を決定する方法を提供する。本発明はまた、急に発現されそして長期または慢性毒性と相互関係のある個々の遺伝子または遺伝子の群からなる毒性マーカーを同定する方法を提供し、あるいは、化合物が望ましくない反応性を有することを示唆する。遺伝子発現プロフィールは、テストされる化合物に曝露されたテスト生物の組織から抽出されたmRNAから、cDNA分子構築の一部を配列決定することによって生成される。本明細書で使用される場合、用語「組織」は、細胞培養物のようなインビトロテスト系に関して、単に培養物からの試料を意味すること以外は、通常の医学または生物学的意味で用いられる。テスト生物に由来する遺伝子発現プロフィールは、コントロール生物に由来する遺伝子発現プロフィールと比較されて、テストされる化合物への曝露のため、テスト生物で区別して発現される遺伝子を決定する。両方の場合とも、遺伝子発現プロフィールの配列情報は、cDNAのしっかりした並行のサイン配列決定によって得られ、これは上記の方法の工程（c）から（f）で行われる。
毒性評価
インビトロおよびインビボ系において毒性テストを設計および実行するための手順は周知であり、そしてLoomisらLoomis’s Esstentials of Toxicology，第4版（Academic Press, New York, 1996）；Echobichon, The Basics of Toxicity Testing（CRC Press, Boca Raton, 1992）；Frazier編，In Vitro Toxicity Testing（Marcel Dekker, New York, 1992）などのように、この主題について多くのテキストに記載される。
毒性テストでは、テスト生物の２群が通常用いられる：一方の群はコントロールとして用い、そして他方の群には単回用量（急性毒性テストについて）で、または数用量の投与計画（長期または慢性毒性テストについて）で、テスト化合物を投与する。ほとんどの場合には、本発明の方法で要求されるような組織の抽出は、テスト動物を屠殺することを必要とするので、コントロール群および化合物投与群の両方とも、実験の期間中に遺伝子発現の動力学を観察することが所望されるならば、組織をサンプリングするための動物の除去を可能にするために十分に大きくなければならない。
毒性研究を組み立てることにおいて、テストされる化合物、投与経路、用量範囲などについて適切なテスト生物を選択するための、広範な指針が文献に提供される。水または生理学的生理食塩水（水中に0.9％NaCl）は、これらの溶媒が種々の経路による投与を可能にするので、テスト化合物についての選択すべき溶質である。これが溶解性限界のため不可能である場合、プロピレングリコールが普通に使用される、コーン油または有機溶媒でさえものような植物油の使用に頼る必要がある。可能な場合はいつでも、乳化剤の懸濁液の使用は、経口投与以外は避けるべきである。投与経路に関わりなく、所定の用量を投与するために必要な容量は、使用される動物のサイズによって限定される。動物の群内および群間で均一の各用量容量を保つことが所望される。ラットまたはマウスが使用される場合、経口経路によって投与される容量は、0.005ml/グラム動物を越えるべきではない。水溶液または生理学的生理食塩溶液が、非経口注射に使用される場合でさえ、耐えられる容量は限定されるが、このような溶液は、通常無害であると考えられる。マウスにおける蒸留水の静脈内LD50は、約0.044ml/グラムであり、そして等張生理食塩水のLD50は、0.068ml/グラムマウスである。
化合物が吸入によって投与されるべきである場合、テスト雰囲気を生成するための特別の技法が必要である。用量推定は、非常に複雑になる。この方法は、通常、化合物を含む液体のエアロゾル化または噴霧化を包含する。テストされる薬剤がかなりの蒸気圧を有する液体であるならば、制御された温度条件下で空気を溶液に通すことによって投与され得る。これらの条件下で、用量は、単位時間当たりの吸入される空気の容量、溶液の温度、および含まれる薬剤の蒸気圧から推定される。気体はリザーバーから計量される。溶液の粒子が投与されるべき場合、粒子サイズが約２μm未満でなければ、粒子は、肺の末端肺胞嚢に達しない。種々の装置およびチャンバーが、吸入によって投与される場合、刺激剤または他の毒性端点の効果を検出するための研究を行うために利用可能である。薬剤を動物に投与する好ましい方法は、挿管法または食餌中に薬剤を組み込むことのいずれかによって、経口経路によるものである。
好ましくは、毒性評価を設計するにおいて、代謝、吸収、排出、組織貯蔵などの点でできる限りヒトに類似してテスト化合物を取り扱う、２つ以上の種が用いられるべきである。好ましくは、種々の濃度での複数回の用量または投与計画は、毒性効果に関して用量−応答関係を確立するために用いられるべきである。そして好ましくは、テスト動物への投与経路は、ヒトへの化合物の投与経路と同じ、またはできる限り類似であるべきである。テスト動物への投与の１つの経路により得られる効果は、ヒトへの別の投与経路による効果に経験的に適用可能ではない。例えば、ヒト用の食品添加物は、テスト動物の食餌中での物質の混合によってテストされるべきである。
急性毒性テストは、一回でテスト生物へ化合物を投与する工程からなる。このようなテストの目的は、化合物の投与の結果の症候学を決定することおよび化合物の致死率の程度を決定することである。最初の手順は、単一種において化合物の一連の範囲発見用量を行うことである。これは、投与経路の選択、選択された経路による投与に適切な形態での化合物の調製、および適切な種の選択を必要とする。好ましくは、最初の急性毒性研究は、その低費用、その利用可能性、およびこれらの種における豊富な毒物学的参照データの利用可能性のため、ラットまたはマウスのいずれかで行われる。長期毒性テストは、３〜４カ月の期間にわたって、繰り返して、通常は毎日ベースで、テスト生物に化合物を投与する工程からなる。このようなテストの設計を束縛する２つの実際の因子に遭遇する：第１に、選択された経路が有害な効果を誘導することなく繰り返された投与に適切でなければならないので、投与の利用可能な経路は限定される。そして第２に、血液、尿、およびおそらく他の試料は、テスト動物に顕著な有害性を誘導することなく、繰り返して採取されるべきである。好ましくは、本発明の方法では、遺伝子発現プロフィールは、以下の表に挙げられるような伝統的な毒物学的パラメータの測定とともに得られる：
0004105764.tif 000002
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物
オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドの最小交差ハイブリダイズセットのメンバーである。このようなセットのオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも２つのヌクレオチドが、同じセットのあらゆる他のメンバーの配列とは異なる。したがって、このようなセットの各メンバーは、２つ未満のミスマッチとの任意の他のメンバーの相補物と、二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。本明細書で「タグ相補物」と呼ばれる、オリゴヌクレオチドタグの相補物は、天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。好ましくは、タグ相補物は、固相支持体に結合する。このようなオリゴヌクレオチドタグは、対応するタグ相補物とともに使用される場合、分子、特にポリヌクレオチドをソーティング、トラッキング、または標識するためにハイブリダイゼーションの特異性を増強する手段を提供する。
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物の最小交差ハイブリダイズセットは、所望のセットのサイズおよび交差ハイブリダイゼーションが最小であることが求められる程度（または他の方法で述べると、特異性が増強されることが求められる程度）に依存して、組み合わせて、または個々に、のいずれかで合成され得る。例えば、最小交差ハイブリダイズセットは、少なくとも４ヌクレオチドが互いに異なる個々に合成された10マー配列のセットからなり得、このようなセットは、332の最大サイズを有する（３種のヌクレオチドから構成されそして付録Icに開示されるようなコンピュータプログラムを使用して計数される場合）。あるいは、オリゴヌクレオチドタグの最小交差ハイブリダイズセットはまた、それ自体が最小交差ハイブリダイズセットから選択されるサブユニットから組み合わせて組み立てられ得る。例えば、少なくとも３ヌクレオチドによって他方とは異なる最小交差ハイブリダイズ12マーのセットは、３ヌクレオチドが互いに異なる最小交差ハイブリダイズ４マーのセットから選択された３つのサブユニットを組み立てることによって合成され得る。このような実施態様は、９3、すなわち729、12マーの最大のサイズのセットを提供する。数字９は、付録Iaのコンピュータプログラムに挙げられるオリゴヌクレオチドの数であり、これは、10マーでのように、ヌクレオチドの４つの異なるタイプのうちの３つのみが使用されると仮定する。付録Ia〜cのコンピュータプログラムが、所定の入力（例えば、長さ、組成、メンバー間のヌクレオチドの数の差）について最大のセットを提供するので、セットは、「最大」として記載される。さらに最小交差ハイブリダイズセットは、このような計算されたセットのサブセットから形成され得る。
オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり得、そして二重鎖形成による一本鎖タグ相補物への特異的ハイブリダイゼーションのために、または三重鎖形成による二本鎖タグ相補物への特異的ハイブリダイゼーションのために設計され得る。オリゴヌクレオチドタグはまた、二本鎖であり得、そして三重鎖形成による一本鎖タグ相補物への特異的ハイブリダイゼーションのために設計され得る。
組み合わせて合成される場合、オリゴヌクレオチドタグは、好ましくは、多数のサブユニットからなり、各サブユニットは、３〜９ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなり、ここで各サブユニットは同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択される。このような実施態様では、利用可能なオリゴヌクレオチドタグの数は、タグ当たりのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。一般的に、数は、すべての可能な配列の数よりも非常に少なく、タグの長さは、ｎヌクレオチド長のタグについては４nである。
固相支持体に結合されたオリゴヌクレオチドタグの相補物は、タグを含むポリヌクレオチドそれぞれの混合物からポリヌクレオチドをソーティングするために使用される。オリゴヌクレオチドタグの相補物は、同一配列の群が特異的領域で生成されるような微細ビーズまたは単一支持体上の合成位置の整列における特異的位置のような、固相支持体の表面上で合成される。すなわち、ビーズの場合または各領域の場合、整列の場合には、各支持体の表面は、特定の配列を有する相補物の１つのみのタイプによって誘導体化される。このようなビーズまたは領域の群は、異なる配列との相補物のレパートリーを含む。オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物に関して本明細書で使用される場合、用語「レパートリー」とは、特定の実施態様でタグを作り上げるオリゴヌクレオチドの最小交差ハイブリダイズセットのセットまたはタグ相補物の対応するセットを意味する。
ソーティングされるポリヌクレオチドはそれぞれ、異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するように、付着されるオリゴヌクレオチドタグを有する。以下により十分に説明されるように、この条件は、ポリヌクレオチドの群より実質的に大きいタグのレパートリーを用いることによって、およびタグ付けされたポリヌクレオチドの完全アンサンブルからタグ付けされたポリヌクレオチドの十分に小さい試料を採取することによって達成される。このようなサンプリングの後、支持体およびポリヌクレオチドの群が、それぞれの相補物とオリゴヌクレオチドタグの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される場合、同一のポリヌクレオチドは、特定のビーズまたは領域上でソーティングされる。
最小交差ハイブリダイズセットのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ソースコードが付録IaおよびIbに挙げられるプログラムによって例示されるような、単純なコンピュータプログラムによって便宜上列挙される。付録Iaのプログラムminhxは、３種のヌクレオチドから構成される４マーサブユニットを有するすべての最小交差ハイブリダイズセットを計算する。付録IbのプログラムtagNは、最小交差ハイブリダイズセットのより長いオリゴヌクレオチドを列挙する。類似のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムは、本発明の任意の実施態様について最小交差ハイブリダイズセットのオリゴヌクレオチドを挙げるために容易に書かれる。以下の表Ｉは、指示された長さについての最小交差ハイブリダイズオリゴヌクレオチドのセットのサイズおよびヌクレオチドの差異の数についての指針を提供する。上記のコンピュータプログラムを使用して数を生成した。
0004105764.tif 000003
本発明のいくつかの実施態様について、タグの非常に大きなレパートリーが必要とされない場合、最小交差ハイブリダイズセットのオリゴヌクレオチドタグは、別々に合成され得る。数百から数千、または数万ものオリゴヌクレオチドを含むセットは、種々の並行合成アプローチによって直接合成され得、例えば、以下に開示される：Frankら，米国特許第4,689,405号；Frankら，Nucleic Acids Research, 11:4365-4377（1983）；Matsonら，Anal. Biochem., 224: 110-116（1995）；Fodorら，国際特許出願PCT/US93/04145；Peaseら，Proc. Natl. Acad. Sci., 91:5022-5026（1994）；Southernら，J. Biotechnology, 35: 217-227（1994）；Brennan，国際出願PCT/US94/05896；Lashkariら，Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7912-7915（1995）など。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドタグは、３と６との間のヌクレオチド長のサブユニットから組み合わせで合成され、そして同じ最小交差ハイブリダイズセットから選択される。この範囲におけるオリゴヌクレオチオについて、このようなセットのメンバーは、図１のアルゴリズムに基づいてコンピュータープログラムによって列挙され得る。
図１のアルゴリズムは、最初に、最小交差ハイブリダイズセットのサブユニットの特徴、すなわち、長さ、メンバー間の塩基の差異の数、および組成を定義することによって行われ、例えば、これらは、２、３、および４種の塩基からなる。表Ｍn、ｎ＝１は、所定の長さおよび組成のすべての可能な配列からなる（100）が生成される。最初のサブユニットＳ1が選択され、そして表の最後に対するｉ＝ｎ＋１についての連続するサブユニットＳiと（120）を比較する。連続するサブユニットが、最小交差ハイブリダイズセットのメンバーであるミスマッチの必要とされる数を有する場合はいつでも、新しい表Ｍn+1（125）において、工程120を通過する前に予め選択されたサブユニットも含むことが省かれる。例えば、比較の最初のセットでは、Ｍ2はＳ1を含み；比較の第２のセットでは、Ｍ3はＳ1およびＳ2を含み；比較の第３のセットでは、Ｍ4はＳ1、Ｓ2、およびＳ3を含むなどである。同様に、表Ｍjにおける比較は、ＳjとＭjにおけるすべての連続するサブユニットとの間である。サブユニットが工程130による連続通過で排除されるので、各連続する表Ｍn+1がその前のものよりも小さいことに留意すること。表Ｍnのあらゆるサブユニットが（140）と比較された後、古い表は新しい表Ｍn+1に置換され、そして比較の次のラウンドが始まる。選択されたサブユニットＳiと比較するために連続するサブユニットを含まない表Ｍnが達成される場合、すなわち、Ｍn＝Ｍn+1の場合、プロセスは（160）を停止する。
好ましくは、最小交差ハイブリダイズセットは、セット中のあらゆる他のサブユニットとして二重鎖安定性へのほとんど等しい貢献を行うサブユニットを含む。このように、あらゆるサブユニットとその相補物との間の完全に一致した二重鎖の安定性は、ほぼ等しい。このようなセットを選択するための指針は、最適PCRプライマーを選択することおよび二重鎖安定性を計算することについての公開された技法によって提供される：例えば、Rychlikら，Nucleic Acids Research, 17: 8543-8551（1989）および18: 6409-6412（1990）；Breslauerら，Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 3746-3750（1986）；Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26: 227-259（1991）など。より短いタグ、例えば、約30ヌクレオチド以下については、RychlikおよびWetmurに記載されるアルゴリズムが好ましく、そしてより長いタグ、例えば、約30〜35ヌクレオチド以上については、Suggsら，683-693頁，Brown編，ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. 23巻（Academic Press, New York, 1981）に開示されるアルゴリズムが、便利に用いられ得る。明らかに、本発明の範囲内の最小交差ハイブリダイズサブユニットのセットを設計するために、多くのアプローチが当業者に利用可能である。例えば、末端ヌクレオチドの異なる塩基スタッキングエネルギーの影響を最小にするために、サブユニットが組み立てられる場合、同じ末端ヌクレオチドを有するサブユニットが提供され得る。このように、サブユニットが連結される場合、すべての連結する末端ヌクレオチドの塩基スタッキングエネルギーの合計は同じであり、それによってタグの融点の変動性を減少または排除する。
以下のイタリックで示す、末端ヌクレオチドの「語」はまた、完全な一致がそれと任意の他のタグ相補物上の類似の末端「語」との間でいつも形成されるように、タグの各末端に付加され得る。このような増大されたタグは以下の形態を有する：
0004105764.tif 000004
ここで、プライムされたＷ’は相補物を示す。タグの末端が完全にマッチした二重鎖をいつも形成するので、すべてのミスマッチした語は、内部ミスマッチであり、それによって他に末端でミスマッチした語を有するタグ-相補物二重鎖の安定性を減少させる。内部ミスマッチを有する二重鎖が、末端での同じミスマッチを有する二重鎖よりも著しく安定でないことは周知である。
最小交差ハイブリダイズセットの好ましい実施態様は、サブユニットが４つの天然ヌクレオチドのうちの３つから作り上げられるセットである。以下により十分に論議されるように、オリゴヌクレオチドタグにおけるヌクレオチドの１つのタイプの不在は、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の使用によって、標的ポリヌクレオチドが固相支持体上にロードされることを可能にする。以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群より選択される４つのヌクレオチドを含むサブユニットそれぞれの代表的な最小交差ハイブリダイズセットである：
0004105764.tif 000005
このセットでは、各メンバーは、あらゆる他のメンバーの相補物との３つのミスマッチした塩基を有する二重鎖を形成する。
さらなる代表的な最小交差ハイブリダイズセットを、以下に表IIIに挙げる。明らかに、追加のセットは、ヌクレオチドの異なる群を置換することによって、または公知の最小交差ハイブリダイズセットのサブセットを使用することによって、生成され得る。
0004105764.tif 000006
本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびその相補物は、ホスホラミダイト化学反応のような標準的化学反応を使用して、自動化DNA合成機、例えば、Applied Biosystems, Inc.（Foster City, California）モデル392または394 DNA/RNA Synthesizerで都合良く合成され、例えば、以下の参考文献に開示される:BeaucageおよびIyer, Tetrahedron, 48: 2223-2311（1992）；Molkoら，米国特許第4,980,460号；Kosterら，米国特許第4,725,677号；Caruthersら，米国特許第4,415,732；同第4,458,066号；および同第4,973,679号など。得られるオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイゼーションし得ることを除いては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミダイトなどのような非天然骨格基を生じる代替の化学反応も、用いられ得る。いくつかの実施態様では、タグは、酵素によってプロセシングまたはマニピュレーションを可能にする天然に存在するヌクレオチドを含み得るが、対応するタグ相補物は、ソーティング中により安定な二本鎖の形成を促進する、ペプチド核酸、または類似化合物のような非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。
微粒子が支持体として使用される場合、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物のレパートリーは、「分割および混合」技術によるサブユニット関連合成によって生成され得、例えば、Shortleら，国際特許出願PCT/US93/03418またはLyttleら，Biotechniques, 19: 274-280（1995）に開示される。簡単にいえば、合成の基本単位は、オリゴヌクレオチドタグのサブユニットである。好ましくは、ホスホラミダイト化学反応が使用され、そして3’ホスホラミダイトリゴヌクレオチドは、最小交差ハイブリダイズセットにおける各サブユニットについて調製され、例えば、上記に列挙された第１のセットについては、８つの４マー3’-ホスホラミダイトがある。合成は、Shortleらに開示されるようにか、またはヌクレオシドモノマーを使用して異なるオリゴヌクレオチドライブラリーを生成するために用いられる技法を用いて直接的な類推において進められ、例えば、Teleniusら，Genomics, 13: 718-725（1992）；Welshら，Nucleic Acids Research, 19: 5275-5279（1991）；Grothuesら，Nucleic Acids Research, 21: 1321-1322（1993）；Hartley，欧州特許出願90304496.4；Lamら，Nature, 354: 82-84（1991）；Zuckermanら，Int. J. Pept. Protein Research, 40: 498-507（1992）などに開示される。一般的に、これらの技法は、単に、カップリング工程中に増大するオリゴヌクレオチドへの活性化されたモノマーの混合物の適用を要求する。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物は、タグの構築で使用される異なる種類の語の数より大きいかまたは等しい、多くの合成チャンバーを有するDNA合成機で合成される。すなわち、好ましくは、各タイプの語に対応する合成チャンバーがある。この実施態様では、語が５ヌクレオチドからなる場合のように、各合成チャンバーで５つのモノマーカップリングがあるように、語は、ヌクレオチド毎に付加される。語が完全に合成された後、合成支持体は、チャンバーから取り出され、混合され、そして語付加の次のサイクルのためのチャンバーに再分配される。この後の実施態様は、例えば、ホスホラミダイト化学で、モノマー付加の高いカップリング収率を利用する。
タグの二本鎖形態は、相補鎖を別々に合成すること、次いで二本鎖形成を可能にする条件下で混合することによって行われ得る。あるいは、二本鎖タグは、プライマー結合部位として役立つ既知のオリゴヌクレオチド配列に連結された一本鎖レパートリーを最初に合成することによって形成され得る。次いで、第２鎖は、一本鎖レパートリーをプライマーと合わせること、およびポリメラーゼで伸長することによって合成される。この後者のアプローチは、Oliphantら，Gene, 44: 177-183（1986）に記載される。次いで、このような二本鎖タグは、本発明に従って、標的ポリヌクレオチドのソーティングおよびマニピュレーションのための標的ポリヌクレオチドとともに、クローニングベクターに挿入され得る。
PNAまたはオリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホラミダイトのような、増強された結合の特徴を有するヌクレオチドから作成されるタグ相補物が用いられる場合、ソーティングは、タグを一本鎖にするためにDNAポリメラーゼの3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を用いる「ストリッピング」反応の代わりとして、天然ヌクレオチドおよびそのPNAまたはホスホラミダイト相補物を含む、タグ間のD-ループの形成によって行われ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドタグは、12〜60ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、18〜40ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、25〜40ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲である。好ましい、そしてより好ましい数の立場から、これらの範囲は以下のように表され得る：
0004105764.tif 000007
より好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり、そして特異的ハイブリダイゼーションは、タグ相補物とのワトソン・クリック対形成によって生じる。
好ましくは、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、少なくとも100メンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも1000メンバーを含み；そして最も好ましくは、このようなタグのレパートリーは、少なくとも10,000メンバーを含む。
三重鎖タグ
特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖形成によって生じる実施態様では、タグ配列のコードが二本鎖形成タグについてと同じ原理に従い；しかし、サブユニット配列の選択におけるさらなる制約がある。一般的に、Hoogsteenタイプの結合による第３の鎖は結合は、二本鎖標的におけるホモピリミジン-ホモプリントラックとともに最も安定である。通常、塩基トリプレットは、T-A*TまたはC-G*Cモチーフ（ここで、「-」はワトソン・クリック対形成を示し、そして「*」はHoogsteenタイプの結合を示す）中で形成し；しかし、他のモチーフもまた可能である。例えば、Hoogsteen塩基対形成は、条件および鎖の組成に依存して、第３の鎖（Hoogsteen鎖）と第３の鎖が結合する二本鎖のプリンリッチ鎖との間の平行および逆平行の配向を可能にする。特定の実施態様で所望される三重鎖の安定性を最大にするか、またはさもなくば調節するために、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシドタイプ（例えば、リボースまたはデオキシリボースヌクレオシドが用いられるかどうか）、塩基改変（例えば、メチル化シトシンなど）を選択するために、文献に広範な指針がある。例えば、Robertsら，Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 9397-9401（1991）；Robertsら，Science, 258: 1463-1466（1992）；Robertsら，Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 4320-4325（1996）；Distefanoら，Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 1179-1183（1993）；Mergnyら，Biochemistry, 30: 9791-9798（1991）；Chengら，J. Am. Chem. Soc., 114: 4465-4474（1992）；BealおよびDervan, Nucleic Acids Research, 20: 2773-2776（1992）；BealおよびDervan, J. Am. Chem. Soc., 114: 4976-4982（1992）；Giovannangeliら，Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8631-8635（1992）；MoserおよびDervan, Science, 238: 645-650（1987）；McShanら，J. Biol. Chem., 267: 5712-5721（1992）；Yoonら，Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 3840-3844（1992）；Blumeら，Nucleic Acids Research, 20: 1777-1784（1992）；ThuongおよびHelene, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 666-690（1993）；Escudeら，Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 4365-4369（1996）など）。一本鎖または二本鎖タグをその一本鎖または二本鎖相補物にアニールするための条件は周知である（例えば、Jiら，Anal. Chem. 65: 1323-1328（1993）；Cantorら，米国特許第5,482,836号など。三重鎖タグの使用は、その相補物にアニールするためのタグを曝露するために、ポリメラーゼとの「ストリッピング」反応を必要としない利点がある。
好ましくは、三重鎖ハイブリダイゼーションを用いる本発明のオリゴヌクレオチドタグは二本鎖DNAであり、そして対応するタグ相補物は一本鎖である。より好ましくは、タグとその相補物との間に形成される三重鎖のpH安定性の範囲を広げるために、タグ相補物中のシトシンの代わりに、5-メチルシトシンが使用される。三重鎖を形成するために好ましい条件は、上記の参考文献に十分に開示される。簡単にいえば、ハイブリダイゼーションは、5.5以下（または、5-メチルシトシンが使用される場合は6.5）のpHでの濃い塩溶液（例えば、1.0M NaCl、1.0M酢酸カリウムなど）で行う。ハイブリダイゼーション温度は、タグの長さおよび組成に依存し；しかし、より長い18〜20マータグについては、室温でのハイブリダイゼーションが適切である。洗浄は、室温にて、濃くない塩溶液、例えば、10mM酢酸ナトリウム、100mM MgCl2、pH5.8で行われ得る。タグは、pH9.0での同様の塩溶液中でのインキュベーションによってこれらのタグ相補物から溶出され得る。
三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドタグの最小交差ハイブリダイズセットは、添付物Icのコンピュータプログラムまたは類似のプログラムによって生成され得る。二本鎖８マー語の代表的セットは、大文字で以下に列挙され、対応する相補物は小文字で列挙される。このような語のそれぞれは、３つの塩基対によってセット中の他の語のそれぞれとは異なる。
0004105764.tif 000008
0004105764.tif 000009
好ましくは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、少なくとも10メンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパートリーは少なくとも100メンバーを含む。好ましくは、語は、組み合わせて合成された二本鎖オリゴヌクレオチドタグについては４と８との間のヌクレオチドの長さであり、そしてオリゴヌクレオチドタグは、12と60との間の塩基対の長さである。より好ましくは、このようなタグは、18と40との間の塩基対の長さである。
固相支持体
本発明での使用のための固相支持体は、微粒子、ビーズ、および膜、スライド、プレート、マイクロマシン化（micromachined）チップなどを含む、広範な種々の形態を有し得る。同様に、本発明の固相支持体は、ガラス、プラスチック、シリコン、アルカンチオエート誘導体化金、セルロース、低架橋および高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む、広範な種々の組成物を含み得る。好ましくは、それぞれが同じタグ（および他ではない）の相補配列の均一なコーティングもしくは群を有するように、別々の粒子の群のいずれかが用いられるか、または、同じタグ（および他ではない）への相補配列の均一のコーティングもしくは群をそれぞれ含む空間的に異なる領域を有する、単一または少数の支持体が用いられる。後の実施態様では、領域の面積は、特定の適用に従って変化し得る；通常、領域は、数μm2、例えば、３〜５から数百μm2、例えば、100〜500までの面積の範囲である。好ましくは、このような領域は、隣接領域での事象（例えば、蛍光発光）によって生じるシグナルが、用いられている検出システムによって解析され得るように、空間的に分離される。いくつかの適用では、例えば、同時配列分析について、またはタグ化分子を別々に近位に持ってくることについて、１つより多くのタグ相補物の均一なコーティングを有する領域を有することが所望され得る。
例えば、Lundら，Nucleic Acids Research, 16:10861-10880（1988）；Albretsenら，Anal. Biochem., 189: 40-50（1990）；Wolfら，Nucleic Acids Research, 15: 2911-2926（1987）；またはGhoshら，Nucleic Acids Research, 15: 5353-5372（1987）に開示されるように、タグ相補物は、固相支持体とともに使用され得、タグ相補物がそこで合成されるか、あるいは別に合成され、そして使用のために付着され得る。好ましくは、タグ相補物は、同じ固相支持体上で合成されてともに使用され、これは種々の形態を含み得、そして種々の連結部分を含み得る。タグ相補物の均一の群が合成される領域のこのような支持体は、微粒子または整列、あるいはマトリクスを含み得る。広範な種々の微粒子支持体が本発明で使用され得、これは、制御された孔ガラス（CPG）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどから生成される微粒子を含み、以下の例示的参考文献に開示される：Meth. Enzymol., A項，11-147頁，44巻（Academic Press, New York, 1976）；米国特許第4,678,814号；同第4,413,070号；および同第4,046,720号；およびPon, 19章，Agrawal編，Methods in Molecular Biology, 20巻，（Humana Press, Totowa, NJ, 1993）。微粒子支持体は、市販のヌクレオシド誘導体化CPGおよびポリスチレンビーズ（例えば、Applied Biosystems, Foster City, CAから入手可能）；誘導体化磁性ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン（例えば、TentaGelTM、Rapp Polymere、Tubingen Germany）などをさらに含む。物質、多孔性、サイズ、形状などのような支持体の特徴、ならびに用いられる連結部分のタイプの選択は、タグが使用される条件下に依存する。例えば、酵素での連続的プロセシングを含む適用では、酵素の立体障害を最小化し、そして基質への接近を容易にする支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持体の選択において考慮されるべき他の重要な因子には、サイズの均一性、合成支持体としての有効性、既知の表面積の程度、および光学特性が挙げられ、例えば、以下のより十分な説明として、表面上で多数のビーズを扱う場合、傷のない平滑なビーズは機械的利点を提供する。
微粒子表面上でタグを付着および／または合成するための例示的な連結部分は、Ponら，Biotechniques, 6:768-775（1988）；Webb，米国特許第4,659,774号；Baranyら，国際特許出願PCT/US91/06103；Brownら，J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893；Damhaら，Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821（1990）；Beattieら，Clinical Chemistry, 39: 719-722（1993）；MaskosおよびSouthern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684（1992）などに開示される。
上記のように、タグ相補物はまた、タグ相補物で均一にコーティングされた領域の配列を形成するために、単一（または少数）の固相支持体上で合成され得る。すなわち、このような配列中の各領域内で、同じタグ相補物が合成される。このような配列を合成するための技術は、McGallら，国際特許出願PCT/US93/03767；Peaseら，Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5022-5026（1994）；SouthernおよびMaskos，国際特許出願PCT/GB89/01114；MaskosおよびSouthern（前出）；Southernら，Genomics, 13: 1008-1017（1992）；およびMaskosおよびSouthern, Nucleic Acids Research, 21: 4663-4669（1993）に開示される。
好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補物で均一にコーティングされた微粒子またはビーズで行われる。微粒子支持体およびその表面にオリゴヌクレオチドを共有結合または非共有結合する方法は、以下の参考文献によって例示されるように、周知である：BeaucageおよびIyer（前出）；Gait編，Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach（IRL Press, Oxford, 1984）；および前出の参考文献。一般的に、微粒子のサイズおよび形状は重要ではない；しかし、少数、例えば、１〜２から数百、例えば、200〜1000μm直径のサイズ範囲の微粒子が好ましい。なぜなら、これらは、最少の試薬および試料使用でのオリゴヌクレオチドタグの大きなレパートリーの構築およびマニピュレーションを容易にするからである。
いくつかの好ましい適用では、市販の制御された孔ガラス（CPG）またはポリスチレン支持体は、本発明において固相支持体として用いられる。このような支持体は、塩基に不安定なリンカーおよび付着される最初のヌクレオチドとともに利用可能になる。例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）。好ましくは、500〜1000オングストロームの孔サイズを有する微粒子が用いられる。
他の好ましい適用では、非孔性微粒子が、それらの光学特性について用いられ、これは顕微鏡スライドのような平らな支持体上で多数の微粒子を追跡する場合、有利に使用され得る。特に好ましい非孔性微粒子は、Bangs laboratories（Carmel, IN）から入手可能なグリシダルメタクリレート（GMA）ビーズである。このような微粒子は、種々のサイズで有用であり、そしてタグまたはタグ相補物を合成するための種々の連結基で誘導体化される。好ましくは、タグ化された微粒子の大量の平行するマニピュレーションのために、５μm直径GMAビーズが用いられる。
固相支持体上でソーティングするためにタグをポリヌクレオチドに付着させる工程
本発明の重要な局面は、例えば、cDNAライブラリーからの、ポリヌクレオチドの群のソーティング、および各微粒子または領域が１種のみの付着されるポリヌクレオチドを実質的に有するように固相支持体上の別々の領域へのポリヌクレオチドの付着である。この目的は、実質的にすべての異なるポリヌクレオチドが付着された異なるタグを有することを保証することによって達成される。次に、この条件は、分析のためにタグ-ポリヌクレオチド結合体の完全な集合の試料を採取することによって達成される。（２つの異なる位置で操作または２度分析されている同じポリヌクレオチドを得るのみなので、同一のポリヌクレオチドが異なるタグを有することは、許容可能である。）このようなサンプリングは、タグがポリヌクレオチドに付着された後、明白に--例えば、より大きな混合物から小容量を採取することによって--行われ得るか、ポリヌクレオチドおよびタグをプロセシングするために使用される技術の二次的効果として本質的に行われ得るか、またはサンプリングは、明白かつプロセシング工程の固有の部分としての両方で行われ得るかのいずれかである。
好ましくは、実質的にすべての異なるcDNAが異なるタグを有するcDNAライブラリーを構築することにおいて、その複雑性、または異なるタグの数が、細胞または組織試料から抽出されるmRNAの総数を大きく越えるタグレパートリーが用いられる。好ましくは、タグレパートリーの複雑性は、ポリヌクレオチド集団の少なくとも10倍であり；そしてより好ましくは、タグレパートリーの複雑性は、ポリヌクレオチド集団の少なくとも100倍である。以下で、例示的９語タグの完全レパートリーを含むプライマー混合物を使用するcDNAライブラリー構築物についてのプロトコルが開示される。タグ含有プライマーのこのような混合物は、８9または1.34×108の複雑性を有する。Winslowら，Nucleic Acids Research, 19: 3251-3253（1991）に示されるように、ライブラリー構築のためのmRNAは、10〜100の少数の哺乳動物細胞から抽出され得る。単一哺乳動物細胞は、標準的技術によって約3.4×104の異なる種類のmRNA分子の約５×105コピーを含むので、約100細胞からのmRNA、すなわち（理論的には）約５×107mRNA分子を単離し得る。この数をプライマー混合物の複雑性と比較することは、いずれの追加工程もなしに、そしてさらに、mRNAが完全な効率で（１％以下の効率がより正確である）cDNAに変換されることを仮定せずに、cDNAライブラリー構築プロトコルが、異なるタグの総数のわずか37％しか含まない集団を生じることを示す。すなわち、いずれの明らかなサンプリング工程が全く無しで、このプロトコルは、タグレパートリーの37％、またはそれ以下を含む資料を本質的に生成する。これらの条件下で二本鎖を得ることの確率は、約５％であり、これは好ましい範囲内である。10細胞からのmRNAでは、サンプリングされたタグレパートリーの画分が、3.7％のみまで減少され、さらに、すべてのプロセシング工程が100％の効率で行うと想定される。実際、cDNAライブラリーを構築するためのプロセシング工程の効率は、非常に低く、「だいたいの目安」は、良好なライブラリーが106の哺乳動物細胞から抽出されたmRNAからの約108のcDNAクローンを含むべきであることである。
上記のプロトコルにおけるmRNAのより大量の使用、または一般にポリヌクレオチドのより大量の使用（ここで、このような分子の数はタグレパートリーの複雑性を上回る）、タグ-ポリヌクレオチド結合体混合物は、タグのあらゆる可能な対形成およびmRNAまたはポリヌクレオチドのタイプを潜在的に含む。このような場合には、明白なサンプリングは、タグ-ポリヌクレオチド結合体の開始混合物の連続希釈後に試料容量を除去することによって行われ得る。必要とされる希釈の量は、開始物質の量およびプロセシング工程の効率に依存し、これらは容易に推定される。
mRNAが106細胞（約0.5μgのポリ（A）+RNAに対応する）から抽出されたならば、そしてプライマーが約10〜100倍濃度の過剰で存在するならば--代表的プロトコル、例えば、Sambrbookら，Molecular Cloning，2版，8.61頁［１mg/mLでの10μL 1.8kb mRNAは約1.68×10-11モルに等しく、そして１mg/mLでの10μL 18マープライマーは約1.68×10-9モルに等しい］において要求されるように、cDNAライブラリーにおけるタグ-ポリヌクレオチド結合体の総数は、単に、mRNAの開始数に等しいかそれ以下、あるいはタグ-ポリヌクレオチド結合体を含む約５×1011ベクターである--これはまたcDNA構築における各工程--第１の鎖の合成、第２の鎖の合成、ベクターへのライゲーション--が完全な効率で生じることを想定する（これは非常に保守的な推定である）。実際の数は著しく、より少ない。
ｎ個のタグ-ポリヌクレオチド結合体の試料が、反応混合物からランダムに取られるならば--試料容量を採取することによって行われ得るように、同じタグを有する結合体を採取する確率は、Poisson分布、P（r）=e-λ（λ）r/rによって記載され、ここでｒは同じタグを有する結合体の数であり、そしてλ＝npであり、ここで、ｐは選択される所定のタグの確率である。ｎ＝106およびｐ＝1/（1.34×108）ならば、λ＝0.00746およびP（2）=2.76×10-5である。したがって、1,000,000分子の試料は、好ましい範囲内の二連のウェルの予測された数を生じる。このような試料は、以下のように容易に得られる：５×1011mRNAがインサートとしてタグ-cDNA結合体を有する５×1011ベクターに完全に変換され、そして５×1011ベクターが100μlの容量を有する反応溶液中にあると仮定する。４つの10倍連続希釈は、元の溶液からの10μlを、90μlの適切な緩衝液（例えば、TE）を含む容器に移すことによって行われ得る。このプロセスは、１μl当たり５×105ベクター分子を含む100μl溶液を得るために、３つの追加の希釈について繰り返され得る。この溶液からの２μlアリコートは、インサートとしてタグ-cDNA結合体を含む106ベクターを得る。次いで、この試料は、コンピテント宿主細胞の、直接的な（straight forward）形質転換、次いで培養することによって増幅される。
もちろん、上記のように、上記のプロセス中の工程は完全な効率では進行しない。特に、タグ-ポリヌクレオチド結合体の試料を増幅するために、ベクターが用いられる場合、宿主を形質転換する工程は非常に非効率的である。通常、わずか１％のベクターが、宿主によって採用されそして複製される。したがって、増幅のこのような方法について、さらに少ない希釈が、106結合体の試料を得るために必要とされる。
オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、タグ配列を含むプライマーなどを使用して、直接酵素的ライゲーション、例えば、PCRによる増幅を含む、多くの方法で、ポリヌクレオチドの集団に結合され得る。最初のライゲート工程は、単一のタグが、一般的に多くの異なるポリヌクレオチドに付着されるように、タグ-ポリヌクレオチド結合体の非常に大きな集団を生じる。しかし、上記のように、結合体の十分に小さい試料を採取することによって、「ダブル」（すなわち、２つの異なるポリヌクレオチド上の同じタグ）を得ることの確率は、無視され得る。一般的に、試料が大きくなるほど、ダブルを得る確率が大きくなる。したがって、設計の交換（trade-off）は、タグ-ポリヌクレオチド結合体の大きな試料を選択すること--これは、例えば、ショットガン配列決定操作における標的ポリヌクレオチドの適切な適用範囲または速く変化するmRNAプールの適切な表示を確実にする--と、最少数のダブルが存在することを確実にする小さい試料を選択することとの間に存在する。ほとんどの実施態様では、ダブルの存在は、ノイズのさらあなる供給源を付与するのみであるか、または、配列決定の場合は、多数の蛍光シグナルを与える微粒子が簡単に無視出来るので、スキャンニングおよびシグナルプロセシングにおける小さな複雑性を付与するのみである。
本明細書で使用される場合、タグを分子（特にポリヌクレオチド）に付着させることに関して、用語「実質的にすべて」とは、本質的にダブルを含まないタグ-分子結合体の集団を得るために用いられるサンプリング手順の統計学的性質を反映することを意味する。タグ-分子結合体の実際の割合に関して実質的にすべての意味は、どのようにタグが用いられるかに依存する。好ましくは、核酸配列決定については、実質的にすべてとは、少なくとも80パーセントのポリヌクレオチドが、付着された独特のタグを有することを意味する。より好ましくは、少なくとも90パーセントのポリヌクレオチドが、付着された独特のタグを有することを意味する。さらにより好ましくは、少なくとも95パーセントのポリヌクレオチドが、付着された独特のタグを有することを意味する。そして、最も好ましくは、少なくとも99パーセントのポリヌクレオチドが、付着された独特のタグを有することを意味する。
好ましくは、ポリヌクレオチドの集団がメッセンジャーRNA（mRNA）からなる場合、オリゴヌクレオチドタグは、好ましくはタグ配列の相補体を含む１セットのプライマーでmRNAを逆転写することによって付着され得る。このようなプライマーの例示的なセットは、以下の配列（配列番号１）を有し得る：
0004105764.tif 000010
ここで、「「W,W,W,C］9」は、各４つのヌクレオチドの９つのサブユニットのオリゴヌクレオチドタグの配列を表し、そして「「W,W,W,C］」は、上に挙げたサブユニット配列を表す（すなわち「W」はTまたはAを表す）。下線を引いた配列は、１つが使用される場合、ビオチンを介して固相支持体への付着からポリヌクレオチドを放出するために使用され得る、任意の制限エンドヌクレアーゼ部位を同定する。上記のプライマーについて、微粒子へ付着された相補体は以下の形態を有する：
0004105764.tif 000011
逆転写後、mRNAは（例えば、RNase H消化によって）除去され、そしてcDNAの第２鎖は、例えば、以下の形態（配列番号２）のプライマーを使用して合成される：
0004105764.tif 000012
ここで、Nは、A、T、G、またはCのいずれか１つであり；Rは、プリン含有ヌクレオチドであり、そしてYは、ピリミジン含有ヌクレオチドである。この特定のプライマーは、得られる二本鎖DNA（Sal I部位によって、ベクター（例えば、Bam HIおよびXho I部位を有する）中にクローニングすることを容易にする）中に、Bst Y1制限部位を生じる。Bst Y1およびSal I消化の後、例示的な結合体は以下の形態を有する：
0004105764.tif 000013
次いで、ポリヌクレオチド-タグ結合体は、標準的な分子生物学的技法を使用して処置され得る。例えば、上記の結合体--これは、実際には混合物である--は、市販のクローニングベクター（例えば、Stratagene Cloning System（La Jolla, CA））に挿入され得；宿主（例えば、市販の宿主細菌）にトランスフェクトされ；次いでこれは結合体の数を増加させるために培養される。次いで、クローニングベクターは、標準的な技法（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning, 第2版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989））を使用して単離され得る。あるいは、結合体集団がPCRによって増加され得るように、適切なアダプターおよびプライマーが用いられ得る。
好ましくは、配列決定のリガーゼに基づいた方法が用いられる場合、Bst Y1およびSal I消化したフラグメントは、以下の単一コピー制限部位（配列番号３）を有するBam HI-/Xho I消化したベクター中にクローニングされる：
0004105764.tif 000014
これは、以下でより十分に議論される配列決定プロセスの開始を可能にするFok I部位を付加する。
タグは、標準的なクローニング方法により、現存するライブラリーのcDNAに結合され得る。cDNAは、それらの現存するベクターから切除され、単離され、次いでタグのレパートリーを含むベクターに連結される。好ましくは、タグ含有ベクターは、切除されたcDNAが所定の配向で連結され得るように、２つの制限酵素で切断することによって線状化される。線状化されたタグ含有ベクターの濃度は、ライゲーションがタグの本来のサンプリングを提供するように、cDNAインサートの濃度を実質的に超えている。
増幅後に一本鎖タグを曝露するための一般的な方法は、T4 DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性で標的ポリヌクレオチド含有結合体を消化する工程または酵素のようなものを包含する。単一のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在において使用した場合、単一のデオキシヌクレオシド三リン酸の相補体がテンプレート鎖に達するまで、このようなポリメラーゼは、二本鎖フラグメントの非テンプレート鎖に存在する3’凹（recessed）末端からヌクレオチドを切断する。このようなヌクレオチドが達成される場合、ポリメラーゼの伸長活性が、切除活性がヌクレオチドを除去するよりも高い割合でヌクレオチドを付加するので、5’→3’消化は効率的に終わる。結果として、固相支持体上へのローディングのために、３つのヌクレオチドで構築される一本鎖タグは、容易に調製される。
この技法はまた、標的ポリヌクレオチドの内部Fok I部位を優先的にメチル化するために使用され得るが、メチル化されていないポリヌクレオチドの末端で単一のFok I部位を残す。第１に、末端Fok I部位は、デオキシシチジン三リン酸とともにポリメラーゼを使用して一本鎖にされる。次いで、フラグメントの二本鎖部分をメチル化し、その後一本鎖末端を、４つのすべてのヌクレオシド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼで満たし、それによってFok I部位を再生する。明らかに、この手順は、Fok I以外のエンドヌクレアーゼに対して一般化され得る。
オリゴヌクレオチドタグが（例えば、上記のように、これらを一本鎖にすることによって）特異的ハイブリダイゼーションのために調製された後、ポリヌクレオチドは、タグとその相補体との間の完全に一致した二重鎖の形成を好都合にする条件下でタグの相補配列を含む微粒子と混合される。文献中に、これらの条件を生じるための広範な指針がある。このような指針を提供する例示的な参考文献には、Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227-259（1991）；Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989）などが挙げられる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、完全に一致した配列のみが安定な二重鎖を形成するような、十分なストリンジェントである。このような条件下で、それらのタグを介して特異的にハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、微粒子に付着された相補配列に連結され得る。最終的に、微粒子は洗浄されて、連結されていないおよび／またはミスマッチしたタグを有するポリヌクレオチドが除去される。
合成支持体として便利に用いられるCPG微粒子が使用される場合、微粒子表面上のタグ相補体の密度は、代表的には、いくつかの配列決定操作に必要な相補体よりも大きい。すなわち、種々の酵素での付着されたポリヌクレオチドの連続処理を必要とする配列決定アプローチにおいて、密に間隔をとったポリヌクレオチドは、比較的かさばった酵素のポリヌクレオチドへの接近を阻害する傾向があり得る。このような場合には、ポリヌクレオチドは、好ましくは、タグ相補体が、ポリヌクレオチドよりも著しく過剰（例えば、10:1〜100:1、またはそれ以上）で存在するように、微粒子と混合される。これは、微粒子表面上のポリヌクレオチドの密度が、酵素の接近を阻害するほど高くないことを確実にする。好ましくは、微粒子表面上の平均ポリヌクレオチド間間隔は、30〜100nmくらいである。標準的なCPG支持体およびBallotiniビーズ（固体ガラス支持体の型）についての比を選択する指針は、MaskosおよびSouthern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684（1992）に見られる。好ましくは、配列決定適用について、20〜50μmの範囲の直径の標準的なCPGビーズは、約105ポリヌクレオチドでロードされ、そして５〜10μmの範囲の直径のGMAビーズは、数万ポリヌクレオチド、例えば、４×104〜６×104でロードされる。
好ましい実施態様では、タグ相補体は、微粒子上で組み合わせて合成され；したがって、合成の最後に、試料がタグ付けされたポリヌクレオチドをロードするために採取される微粒子の複合混合物を得る。微粒子の試料のサイズは、いくつかの因子に依存し、これには、タグ相補体のレパートリーのサイズ、ロードされた微粒子を観察するために使用される装置の性質--例えば、その能力、同じタグ相補体を有する微粒子の複数のコピーに対する抵抗性（すなわち、「ビーズダブル」などが含まれる。以下の表は、微粒子試料サイズ、微粒子直径、および種々の直径の微粒子のパックされた集合体（array）のおおよその物理的大きさに関する指針を提供する。
0004105764.tif 000015
微粒子の試料が、所定のタグ相補体を含む確率または複数コピー中に存在する確率は、以下の表に示すように、Poisson分布によって記載される。
0004105764.tif 000016
高度に特異的な選別およびパンニング
選別の動力学は、オリゴヌクレオチドタグのタグ相補体へのハイブリダイゼーションの速度に依存し、これは次にハイブリダイゼーション反応におけるタグの複雑性に依存する。したがって、交換（trade off）は、選別速度とタグ複雑性との間に存在し、そのため選別速度の増加は、ハイブリダイゼーション反応に関連するタグの複雑性を減少させる費用で達成され得る。以下に説明するように、この交換（trade off）の効果は、「パンニング」によって回復され得る。
ハイブリダイゼーションの特異性は、十分に小さい試料を採取することによって増加され得、その結果、試料中の高い割合のタグは独特であり、そして試料中の実質的にすべてのタグの最も近い隣接物は少なくとも２語で異なる。この後者の条件は、用いられているレパートリーの約0.1パーセント以下のサイズである多数のタグ-ポリヌクレオチド結合体を含む試料を採取することによって達せられ得る。例えば、タグが表IIから選択される８語で構築されるならば、８8（すなわち約1.67×107のレパートリー）タグ、およびタグ相補体が生成される。上記のようなタグ-cDNA結合体のライブラリーでは、0.1パーセント試料は、約16,700の異なるタグが存在することを意味する。微粒子のレパートリー等価物（すなわちこの実施例では、1.67×107微粒子）上にこれが直接ロードされた場合、試料になった微粒子の低密度なサブセットがロードされる。ロードされた微粒子の密度は--例えば、より効果的な配列決定のために--試料にされたタグ-cDNA結合体がロードされなかった微粒子からロードされた微粒子を分離するために使用される「パンニング」工程を行うことによって、増加され得る。したがって、上記の例において、たとえ「0.1パーセント」試料が16,700cDNAのみを含むとしても、サンプリングおよびパンニング工程は、所望のように多くのロードされた微粒子が蓄積されるまで繰り返され得る。
パンニング工程は、タグ-cDNA結合体の試料を提供することによって行われ得、このそれぞれは、オリゴヌクレオチドタグの反対の末端、または遠位に、捕獲部分を含む。好ましくは、捕獲部分は、タグ-cDNA結合体から放出され得るタイプのものであり、そのため、タグ-cDNA結合体は、一塩基配列決定方法で配列決定され得る。このような部分は、ビオチン、ジゴキシゲニン、または類似のリガンド、三重鎖結合領域などを含み得る。好ましくは、このような捕獲部分は、ビオチン成分を含む。ビオチンは、多くの標準的技法によってタグ-cDNA結合体に付着され得る。PCRプライマー結合部位を含む適切なアダプターが、タグ-cDNA結合体に付着される場合、ビオチンは、サンプリング後の増幅においてビオチン化したプライマーを使用することによって付着され得る。あるいは、タグ-cDNA結合体が、クローニングベクターのインサートである場合、ビオチンは、適切な制限酵素での消化次いで単離によって、タグ-cDNA結合体を切り出すこと、ならびにビオチン化ウリジン三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼでタグの遠位の突出する鎖を満した後に、付着され得る。
タグ-cDNA結合体が捕獲された後、還元によって切断される（例えば、Hermanら，Anal. Biochem., 156: 48-55（1986））、または光化学的に切断される（例えば、Olejnikら，Nucleic Acids Research, 24: 361-366（1996））、またはPCRプライマーに制限部位を導入することによって酵素的に切断される化学結合によって、多くの方法でビオチン部分から放出され得る。後者の実施態様は、上記のタグ-ポリヌクレオチド結合体のライブラリーを考慮することによって例示され得る：
0004105764.tif 000017
以下のアダプターは、PCRによる増幅を可能にするこれらのフラグメントの末端に連結され得る：
0004105764.tif 000018
ここで、「ACTAGT」は、Spe I認識部位（これは一塩基配列決定に準備した付着切断を残す）であり、そしてXおよびZは、それぞれのプライマーのアニーリングおよび解離温度がほぼ同じであるように選択されたヌクレオチドである。アダプターの連結、およびビオチン化プライマーを使用するPCRによる増幅の後、結合体のタグは、T4 DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって一本鎖にされ、そして結合体は、付着されたタグ相補体とともに、微粒子の試料（例えば、レパートリー等価物）と組み合わされる。（タグのミス付着を最少にするために）ストリンジェント条件下でのアニーリング後、結合体は、好ましくは、タグ相補体に連結され、そしてロードされた微粒子は、アビジン化磁性ビーズ、または類似の捕獲技法での捕獲によって、ロードされていない微粒子から分離される。
例に戻ると、このプロセスは、種々のタグを有する約10,500（＝16,700×0.63）のロードされた微粒子の蓄積を生じ、これはSpe Iでの切断によって磁性ビーズから放出され得る。微粒子およびタグ-cDNA結合体の新しい試料でこのプロセスを40〜50回繰り返すことによって、４〜５×105cDNAは、放出された微粒子をプールすることによって蓄積され得る。次いで、プールされた微粒子は、＋一塩基配列決定技法によって同時に配列決定され得る。
サンプリングおよびパンニング工程を繰り返す回数を決定すること--またはより一般的には、分析するcDNAの数を決定することは、その目的に依存する。目的が、例えば、集団の５％以上を構成する比較的普通の配列の豊富さの変化をモニターするならば、比較的小さい試料、すなわち、全体の群サイズの小画分が、相対的な豊富さの統計学的に有意な見積もりを可能にし得る。他方では、例えば、集団の0.1％以下を構成するまれな配列の豊富さをモニターしようとするならば、大きな試料が必要とされる。一般的に、試料サイズと、試料に基づく相対的豊富さの見積もりの信頼性との間には、直接的関係がある。信頼できる統計学的見積もりを作成するために適切な試料サイズを決定することについて、文献に広範な指針があり、例えば、Kollerら，Nucleic Acids Research, 23: 185-191（1994）；Good, Biometrika, 40: 16-264（1953）；Bungeら，J. Am. Stat. Assoc., 88: 364-373（1993）などである。好ましくは、3.0〜3.5×104の異なる配列の105〜108の独立したクローンを含む一連のcDNAライブラリーの分析に基づく遺伝子発現の変化をモニターするために、少なくとも104配列の試料が、各ライブラリーの分析のために蓄積される。より好ましくは、少なくとも105配列の試料が、各ライブラリーの分析のために蓄積され；そして最も好ましくは、少なくとも５×105配列の試料が、各ライブラリーの分析のために蓄積される。あるいは、サンプリングされた配列の数は、好ましくは、集団サイズの0.1％くらいの95％信頼限界で0.1％〜５％の範囲内の頻度で存在する配列の相対的豊富さを見積もるために十分である。
単一塩基DNA配列決定
本発明は、例えば、Hultmanら，Nucleic Acids Research, 17: 4937-4946（1989）に開示されるような、DNA配列決定の従来の方法で用いられ得る。しかし、並行、または同時の複数のポリヌクレオチドの配列決定については、近いサイズのDNAフラグメントの電気泳動分離も、ペプチド配列決定におけるような別個の分析手順による切断されたヌクレオチオの分析も必要としない、DNA配列決定方法論が好ましい。好ましくは、この方法論は、処理および検出の連続サイクルによって、配列において、通常は１度に１つずつ、ヌクレオチドの段階的同定を可能にする。このような方法論は、本明細書では、「単一塩基」配列決定方法という。単一塩基アプローチは、以下の参考文献に開示される：Cheeseman，米国特許5,302,509；Tsienら，国際出願WO 91/06678；Rosenthalら，国際出願WO 93/21340；Canardら，Gene, 148:1-6（1994）；およびMetzkerら，Nucleic Acids Research, 22:4259-4267（1994）。
本発明での使用に適切でありそしてDNAフラグメントの電気泳動分離を必要としないDNA配列決定の「単一塩基」方法は、国際出願PCT/US95/03678に記載される。簡単にいえば、この方法は、以下の工程を含む：（a）連結された複合体を形成するために突出鎖を有するポリヌクレオチドの末端にプローブを連結する工程であって、このプローブがポリヌクレオチドの鎖に相補的な突出鎖を有し、そしてこのプローブがヌクレアーゼ認識部位を有する、工程；（b）連結された複合体から連結されていないプローブを除去する工程；（c）連結されたプローブの同一性によってポリヌクレオチドの突出鎖における１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；（d）ヌクレアーゼで連結した複合体を切断する工程；および（e）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその一部が決定されるまで、工程（a）から（d）を繰り返す工程。
シグナル蛍光染料のような、単一のシグナル生成部分は、並行配列決定操作において、固定された微粒子のような、種々の空間的にアドレス可能な（addressable）固相支持体に付着されたいくつかの異なる標的ポリヌクレオチドを配列決定する場合に、用いられる。これは、種々の微粒子における多数の標的ポリヌクレオチドに連続的に適用されるプローブの４つのセットを提供することによって達成され得る。このようなプローブの代表的セットを以下に示す：
0004105764.tif 000019
ここで、リストされたプローブのそれぞれは、そのため上部鎖の3’末端ヌクレオチドの正体は固定され、そして突出鎖の他の位置は、ヌクレオチドのあらゆる３マー順列（permutation）または複雑性が減少したアナログによって満たされるような、４3＝64オリゴヌクレオチドの混合物を表す。リストしたプローブはまた、「T*」として示す末端チミジンに付着したシグナル生成部分を有する一本鎖ポリTテイルとともに示される。標識されていないプローブにおける「d」は、連結ブロック部分、または標識されていないプローブが連結されることを抑制する3’-ヒドロキシルが不在を示す。好ましくは、このような3’-末端ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。この実施態様では、セット１のプローブは、最初に多数の標的ポリヌクレオチドに適用され、そして標識されたプローブの3’末端アデノシンに相補的なチミジンを有する標的ポリヌクレオチドが連結されるように、リガーゼで処理される。標識されていないプローブは、不適切なライゲーションを最少にするために同時に適用される。「A」で終わるプローブと共に連結された複合体を形成する標的ポリヌクレオチドの位置は、プローブにおいて行われる標識によって生成されるシグナルによって同定される。洗浄および切断後、セット２のプローブが適用される。この場合、「C」で終わるプローブと共に連結された複合体を形成する標的ポリヌクレオチドは、位置によって同定される。同様に、セット３および４のプローブが適用され、そしてポジティブシグナルの位置が同定される。プローブの４つのセットを連続的に適用するこのプロセスは、所望の数のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドで同定されるまで、続ける。明らかに、当業者は、例えば、種々の長さの突出鎖、標識されていないプローブのライゲーションをブロックするための種々の部分、プローブを標識するための種々の手段を有するなどの、多くの変更を有し得るプローブの類似のセットを構築し得る。
ポリヌクレオチドの集団を配列決定するための装置
本発明の目的は、タグおよびその相補物の特異的ハイブリダイゼーションによって、微粒子の表面上に、同一の分子、特にポリヌクレオチドをソーティングすることである。一旦このようなソーティングが行われると、そこで行われる分子または操作の存在は、微粒子が別々にまたは「バッチ」で検出されるかどうか、繰り返しの測定が所望であるかどうかなどの、タグ付けされた分子の性質に依存して多くの方法で検出され得る。代表的には、ソーティングされた分子は、例えば、薬物の開発において、結合のためのリガンドに曝露されるか、または、例えば、ポリヌクレオチド配列決定において、化学的または酵素的プロセスを受ける。これらの使用の両方において、多数の微粒子におけるこのような事象またはプロセスに対応するシグナルを同時に観察することが、しばしば所望される。ソーティングされた分子を有する微粒子（本明細書では、「ロードされた」微粒子という）は、例えば、Lamら（前出）によって証明されるように、このような大規模並行操作に適合できる。
好ましくは、光生成シグナル、例えば、化学発光、蛍光などは、事象またはプロセスを検出するために用いられるいずれの場合でも、ロードされた微粒子は、国際特許出願PCT/US91/09217、PCT/NL90/00081、およびPCT/US95/01886に記載のように、スキャンニングシステムでの実験について、平坦な基板、例えば、ガラススライド上に広げられる。スキャンニングシステムは、基板を再生可能にスキャンすることおよび座標系によって所定の領域における各微粒子の位置を規定することが可能であるべきである。ポリヌクレオチド配列決定適用では、微粒子の位置の同定が、連続的スキャン工程で繰り返し可能であることが重要である。
このようなスキャンニングシステムは、市販の成分（例えば、１つ以上の光電子増倍管、または代替的にCCDアレイ、および例えば、蛍光シグナルを励起、収集、およびソーティングするために適切なレンズ系（optics）を含む検出システムとともに使用されるデジタルコンピュータによって制御されるx-y変換テーブル）から構築され得る。いくつかの実施態様では、共焦点レンズ系システムが所望され得る。４色配列決定での使用に適切な代表的なスキャンニングシステムは、図５で図示する。基板300（例えば、固定された微粒子を有する顕微鏡スライド）は、x-y変換テーブル302上に配置し、これは適切にプログラムされたディジタルコンピュータ304に接続されそして制御され、このコンピュータは、種々の市販のパーソナルコンピュータ、例えば、486ベースマシンまたはApple Computer（Cupertino, CA）から入手可能なPowerPC model 7100または8100のいずれかであり得る。テーブル変換およびデータ収集機能のためのコンピュータソフトウエアは、National Instrumentsから入手可能な、Lab Windowsのような市販の実験室ソフトウエアによって提供され得る。
基板300およびテーブル302は、１つ以上の対物レンズ308を有する顕微鏡306に操作上結合され、このレンズは、基板300に固定された微粒子に光を収集しそして送達し得る。光源312からの励起光線310（好ましくはレーザーである）は、光線スプリッター314（例えば、二色性ミラー）に向けられ、これは、顕微鏡306および対物レンズ308を通って光線を向け直し、次に基板300上に光線を焦点に集める。レンズ308は、微粒子から放射された蛍光316を収集し、そして光線スプリッター314を通してそれをシグナル分配レンズ系318に向け、次に、いくつかの蛍光特性（例えば、強度、寿命など）を電気シグナルに変換するために適切な１つ以上の光電素子に蛍光を向ける。シグナル分配レンズ系318は、当該技術分野で標準的な種々の構成物、例えば、帯域透過フィルター、光ファイバー（fiber optics）、回転ミラー、固定位置ミラーおよびレンズ、回折格子などを含み得る。図２に示すように、シグナル分配レンズ系318は、蛍光316を４つの別々の光電子増倍管330、332、334、および336に向け、次いで、その出力は、プリアンプおよびフォトンカウンター350、352、354、および356に向けられる。フォトンカウンターの出力は、コンピュータ304によって収集され、ここでこれは保存され、分析され、そしてビデオ360に表示される。あるいは、シグナル分配レンズ系318は、蛍光シグナル318をCCDアレイに向ける回折格子であり得る。
スキャンニングにおける位置的局在化（positional localization）の安定性および再現性は、近くに配置された微粒子を分離するための解像をだいたいにおいて決定する。好ましくは、スキャンニングシステムは、近くに配置された（例えば、パーティクル直径以下で離れている）微粒子を解像し得るべきである。したがって、ほとんどの適用では、例えば、CPG微粒子を使用すると、スキャンニングシステムは、少なくとも、10〜100μmほどの対象を解像する能力を有するべきである。さらにより高い解像度がいくつかの実施態様で所望され得るが、増加した解像度では基板を完全にスキャンするために必要とされる時間が増加し；したがって、いくつかの実施態様では、速度と解像度との間で妥協が行われるべきであり得る。スキャンニング時間の増加は、微粒子が、（例えば、最初の完全スキャンから）位置することが知られている位置をスキャンするのみのシステムによって達成され得る。好ましくは、微粒子サイズおよびスキャンニングシステム解像度は、cm2当たり約10,000〜100,000微粒子の間の密度で平面上に無作為に配置された蛍光標識した微粒子の解像を可能にするように選択される。
配列決定適用では、ロードされた微粒子は、種々の方法で基板の表面に固定され得る。固定は、微粒子が、試薬曝露および洗浄の連続的サイクルを著しい損失なしに受けることを可能にするに十分な強さであるべきである。基板がガラスである場合、その表面は、市販の試薬（例えば、Pierce Chemical）を使用して、アルキルアミノリンカーで誘導体化され得、次に、従来の化学を使用して再度アビジンに架橋され得て、アビジン化表面を形成する。ビオチン部分は、多くの方法で、ロードされた微粒子に導入され得る。例えば、タグをポリヌクレオチドに付着するために使用されるクローニングベクターの画分（例えば、10〜15％）が、タグの反対のポリヌクレオチドの末端でポリヌクレオチドインサートに直に隣接する独特の制限部位（消化の際に付着末端を提供する）を含むように操作される。この部位は、微粒子上へのローディングのためにポリヌクレオチドおよびタグで切り出される。ローディングの後、約10〜15％のロードされたポリヌクレオチドは、微粒子表面から遠位の独特の制限部位を有する。結合した制限エンドヌクレアーゼでの消化後、ビオチン部分を含む適切な二本鎖アダプターは、付着末端に連結される。次いで、得られる微粒子は、ビオチン-アビジン連結によって固定されるアビジン化ガラス表面上に広げられる。
あるいはおよび好ましくは、ライゲーションによる配列決定が用いられる場合、最初のライゲーション工程で、プローブの混合物はロードされた微粒子に適用される：プローブのある画分は、配列決定法に必要とされるような、IIs型制限認識部位を含み、そしてプローブのある画分は、このような認識部位を有さないが、代わりにその非連結末端にビオチン部分を含む。好ましくは、混合物は、ビオチン化したプローブの約10〜15パーセントを含む。
さらに他の代わりでは、DNAロードした微粒子がガラス基板に適用される場合、DNAは、数時間（例えば、24時間）インキュベーションでガラス表面に非特異的に吸着し得、微粒子を著しく損失することなく試薬および洗浄液への繰り返しの曝露を可能にするに十分に強い結合を生成する。好ましくは、このようなガラス基板は、フローセルであり、これはガラススライドにエッチングされたチャンネルを含み得る。好ましくは、このようなチャンネルは、液体がこれを通ってポンプで吸い出され得るように閉鎖され、そして微粒子の単層が規定の観察領域内に捕らえられるように微粒子の直径に十分に近い深さを有する。
cDNAライブラリーにおける新規ポリヌクレオチドの同定
cDNAライブラリーにおける新規ポリヌクレオチドは、上記のように、微粒子に付着したcDNA分子のライブラリーを構築することによって同定され得る。ライブラリーの大画分、または全ライブラリーでさえが、次いで、並行して部分的に配列決定され得る。mRNAの単離、およびおそらく、Soaresら，Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9228-9232（1994）などの参考文献に教示されるような集団の正規化の後、以下のプライマーが、従来のプロトコルを使用して、逆転写酵素での第１鎖合成のためにポリAテイルにハイブリダイズされ得る（配列番号１）：
0004105764.tif 000020
ここで、［W,W,W,C］9は、上記のようなタグを表し、「ACCAGCTGATC」は、二本鎖形態で制限部位を形成する任意配列であり、そして「プライマー部位」は、PCRによって目的のポリヌクレオチドを増幅するために後にプライマー結合部位として使用されるライブラリーのすべてのメンバーに普通の配列である。
従来の技法による逆転写および第２鎖の合成の後、二本鎖フラグメントは、上記のようにクローニングベクターに挿入されそして増幅される。次いで、増幅されたライブラリーはサンプリングされ、そして試料は増幅される。増幅された試料からのクローニングベクターは単離され、そしてタグ付けされたcDNAフラグメントが切り出され、そして精製される。上記のようにポリメラーゼでタグを一本鎖にした後、フラグメントはメチル化され、そして本発明に従って微粒子上にソーティングされる。好ましくは、上記のように、クローニングベクターは、タグ付けされたcDNAがFok Iのようなエンドヌクレアーゼで切り出され得るように構築され、ソーティングおよび微粒子への連結の後、好ましい単一塩基方法によってすぐに配列決定することを可能にする。
次いで、十分な数のヌクレオチドが、ライブラリーが由来する生物のゲノム中の独特の表現について各cDNAにおいて同定されるまで、段階的配列決定方法は、本発明に従って、ライブラリー全体またはライブラリーの１つ以上の大きな画分で同時に行われる。例えば、ライブラリーが哺乳動物mRNAに由来するならば、無作為に選択した配列14〜15ヌクレオチド長は、代表的な哺乳動物ゲノムの2000〜3000メガ塩基のうちの独特な表示を有すると予測される。もちろん、はるかに少ないヌクレオチドの同定は、細菌、または他の下等動物に由来するライブラリー独特の表示に十分である。好ましくは、少なくとも20〜30ヌクレオチドが、独特の表示を確実にし、そして以下に記載のように適切なプライマーの構築を可能にするために同定される。次いで、表にした配列は、独特のcDNAを同定するために公知の配列と比較され得る。
次いで、独特のcDNAは、従来の技法、例えば、プライム部位および配列が決定されたcDNAの部分に向けられるプライマーとともに生成されるPCRアンプリコンからプローブを構築することによって、単離される。次いで、プローブは、従来のスクリーニングプロトコルを使用して、ライブラリー中のcDNAを同定するために使用され得る。
新しいcDNAを同定するための上記の方法はまた、単離された測定において、または動力学的変化集団に関してのいずれかで、mRNA集団をフィンガープリントするために使用され得る。部分配列情報は、上記の方法で記載されるように微粒子を分離するために付着された大きな試料、例えば、10,000〜100,000以上のcDNAから、同時に得られる。
実施例１
タグライブラリーの構築
代表的タグライブラリーを、以下の式によって規定されるヌクレオチドA、G、およびTの化学合成された９語タグを形成するために以下のように構築する：
0004105764.tif 000021
ここで、「［4（A,G,T）9］」は、タグ混合物を示し、ここで各タグはA、G、およびTの９つの４マー語からなり；そして「p」は5’リン酸を示す。この混合物を、以下の右および左プライマー結合領域（配列番号４および配列番号５）に連結する：
0004105764.tif 000022
右および左プライマー結合領域を、上記のタグ混合物に連結し、その後、連結された構造の一本鎖部分を、DNAポリメラーゼで満たし、次いで以下に示される右および左プライマーと混合し、そして増幅してタグライブラリーを得る（配列番号６）。
0004105764.tif 000023
左プライマー結合領域の下線を引いた部分は、Rsr II認識部位を示す。右プライマー結合領域の最も左の下線を引いた領域は、Bsp 120I、Apa I、およびEco O 109Iについての認識部位、ならびにHga Iについての切断部位を示す。右プライマー結合領域の最も右の下線を引いた領域は、Hga Iについての認識部位を示す。必要に応じて、右または左プライマーを、増幅および／または切断後の精製を容易にするために、（例えば、Clontech Laboratories, Palo Alto, CAから入手可能な、従来の試薬を使用して）付着されたビオチンとともに合成し得る。
0004105764.tif 000024
プラスミドを、Ppu MIおよびPme Iで切断し（インサートが配向されるようにRsr II適合可能な末端および平滑末端を得るために）、次いで、DAMメチラーゼでメチル化する。タグ含有構築物を、Rsr IIで切断し、次いで開いたプラスミドに連結し、その後、結合体を、Mbo IおよびBam HIで切断して連結およびプラスミドの閉鎖を可能にする。次いで、プラスミドを増幅し、そして単離し、そして本発明に従って使用する。
実施例３
種々の生体異物薬剤に曝露されたラットの肝臓組織における遺伝子発現プロフィールの変化
この実施例では、生体異物化合物への曝露の結果として誘導される遺伝子を検出するための本発明の方法の能力をテストするために、ラット肝臓組織の遺伝子発現プロフィールを、シトクロムP-450イソ酵素の発現を誘導することが公知であるいくつかの化合物の以下の投与で検査する。本発明の方法から得られる結果を、逆転写酵素PCR測定およびシトクロムP-450イソ酵素の免疫化学的測定から得られる結果と比較する。後者のアッセイについてのプロトコルおよび材料は、Morrisら，Biochemical Pharmacology, 52: 781-792（1996）に記載される。
６〜８週齢および200〜300g体重の雄Sprague-Dawleyラットを使用し、そして食餌および水を動物に任意に与える。テスト化合物は、フェノバルビタール（PB）、メチラポン（MET）、デキサメタゾン（DEX）、クロフィブレート（CLO）、トウモロコシ油（CO）、およびβ-ナフトフラボン（BNF）であり、そしてSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手可能である。特定のP-450酵素に対する抗体は、以下の供給源から入手可能である：ウサギ抗ラットCYP3A1はHuman Biologics, Inc.（Phoenix, AZ）から；ヤギ抗ラットCYP4A1はDaiichi Pure Chemicals Co.（Tokyo, Japan）から；モノクローナルマウス抗ラットCYP1A1、モノクローナルマウス抗ラットCYP2C11、ヤギ抗ラットCYP2E1、およびモノクローナルマウス抗ラットCYP2B1はOxford Biochemical Research, Inc.（Oxford, MI）からである。二次抗体（ヤギ抗ウサギIgG、ウサギ抗ヤギIgG、およびヤギ抗マウスIgG）は、Jackson ImmunoResearch Laboratories（West Grove, PA）から入手可能である。
Wangら，Arch. Biochem. Biophys. 290: 355-361（1991）によって記載されるものと同様の投与方法に従って、動物に、PB（100mg/kg）、BNF（100mg/kg）、MET（100mg/kg）、DEX（100mg/kg）、またはCLO（250mg/kg）のいずれかを、４日間連続して腹腔内注射によって投与する。H2OおよびCOで処理した動物をコントロールとして使用する。最後の注射（４日目）後２時間で動物を屠殺し、そして肝臓を取り出す。肝臓を直ちに凍結し、そして−70℃で保存する。
総RNAを、Xieら，Biotechniques, 11: 326-327（1991）に記載される方法の改変を使用して、凍結した肝臓組織から調製する。約100〜200mgの肝臓組織を、Xieらに記載のRNA抽出緩衝液中でホモジナイズして、総RNAを単離する。得られるRNAを、ジエチルピロカーボネート処理した水中で再構成し、260nmで分光光度法によって定量し、そして100μg/mlの濃度に調整する。総RNAを、見かけ上の分解を全く伴わずに−70℃にて１年までジエチルピロカーボネート処理した水中で保存する。RT-PCRおよび配列決定を、これらの調製物からの試料で行う。
配列決定については、約0.5μgのポリ（A）+RNAに対応するRNAの試料を使用して、以下の例外を含む「Attaching Tags to Polynucleotides for Sorting onto Solid Phase Supports」という題の項に記載のプロトコルに従って、タグ-cDNA結合体のライブラリーを構築する：タグレパートリーは、表IIからの６つの４ヌクレオチド語から構築される。したがって、レパートリーの複雑性は、８6または約2.6×105である。構築された各タグ-cDNA結合体ライブラリーについては、約10,000クローンの10試料を、増幅およびソーティングのために採取する。増幅される試料のそれぞれを、タグ相補物を含む約10610μm直径のGMAビーズの固定された単層に、別々に適用する。すなわち、各単層におけるGMAビーズ群中のタグ相補物の「試料」は、約４倍の総サイズのレパートリーであり、したがって、サンプリングされたタグ-cDNA結合体のそれぞれが単層上でそのタグ相補物を見いだす高い確率があることを確実にする。増幅された試料のオリゴヌクレオチドタグが上記のように一本鎖になった後、試料のタグ-cDNA結合体を、オリゴヌクレオチドタグと完全に一致する二重鎖を形成するタグ相補物との間のみの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、単層に別々に適用する。増幅される試料の濃度およびハイブリダイゼーション時間を選択して、完全な一致が生じる各ビーズ上での約５×104〜２×105タグ-cDNA結合体の装填を可能にする。連結の後、付着したcDNAの９〜12ヌクレオチド部分を、Brenner，国際特許出願PCT/US95/03678に記載される単一塩基配列決定技法によって、並行して決定する。遺伝子発現プロフィールについての頻度分布を、10試料のそれぞれから得られる配列情報から構築する。
シトクロムP-450遺伝子および構成的に発現されるシクロフィリン遺伝子に対応する選択されたmRNAのRT-PCRを、Morrisら（前出）に記載のように行う。簡単にいえば、１×逆転写酵素緩衝液（Gibco BRL）、10nMジチオトレイトール、0.5nM dNTP、2.5μMオリゴd（T）15プライマー、40ユニットRNasin（Promega, Madison, WI）、200ユニットRNase H-逆転写酵素（Gibco BRL）、および400ngの総RNA（ジエチルピロカーボネート処理した水中）を含む20μl反応混合物を、調製する。反応物を、37℃にて１時間インキュベートし、次いで95℃にて５分間で酵素を不活性化する。得られるcDNAを、使用するまで−20℃で保存する。cDNAのPCR増幅については、10×ポリメラーゼ反応緩衝液、2mM MgCl2、１ユニットTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）、20ng cDNA、およびMorrisら（前出）に記載の配列の5’および3’特異的PCRプライマーの200nM濃度を含む10μL反応混合物を、調製する。PCRを、Perkin-Elmer 9600サーマルサイクラーで、それぞれ94℃で30秒間、56℃で１分間、および72℃で１分間の融解、アニーリング、および伸長条件を使用する23サイクルで行う。増幅したcDNA産物を、５％未変性ゲルを使用するPAGEによって分離する。バンドは、エチジウムブロミドで染色することによって検出する。
肝臓タンパク質のウエスタンブロットを、SDS-PAGEによる分離後に標準的プロトコルを使用して行う。簡単にいえば、タンパク質を、還元条件下で10％SDS-PAGEゲル上で分離し、そしてHarrisら，Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 1407-1410（1991）に記載の方法の改変を使用して、P-450イソ酵素の検出のために免疫ブロットする。タンパク質を、50μg/レーンでロードし、そして２℃にて約４時間定電流（250V）下で分離する。タンパク質を、120mMグリシンおよび20％（v/v）メタノールを含む15mM Tris緩衝液中で、ニトロセルロースメンブラン（Bio-Rad, Hercules, CA）に移す。ニトロセルロースメンブランを2.5％BSAでブロックし、そして一次モノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびに二次アルカリホスファターゼ結合した抗IgGを使用して、P-450イソ酵素について免疫ブロットする。免疫ブロットを、Bio-Radアルカリホスファターゼ基質キットで顕色する。
P-450イソ酵素誘導の測定の３つのタイプは、実質的な一致を示した。
付録Ia
最小で交差ハイブリダイズするセットを産生するための例示的なコンピュータープログラム
（一本鎖タグ/一本鎖タグ相補物）
0004105764.tif 000025
0004105764.tif 000026
0004105764.tif 000027
付録Ib
最小で交差ハイブリダイズするセットを産生するための例示的なコンピュータープログラム
（一本鎖タグ/一本鎖タグ相補物）
0004105764.tif 000028
0004105764.tif 000029
0004105764.tif 000030
付録Ic
最小で交差ハイブリダイズするセットを産生するための例示的なコンピュータープログラム
（二本鎖タグ/一本鎖タグ相補物）
0004105764.tif 000031
0004105764.tif 000032
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：デイビット  ダブリュ．マーチン，ジュニア．
（ii）発明の名称：毒性決定における遺伝子発現プロフィールの測定
（iii）配列数：７
（iv）連絡住所：
（A）名称：ステファン  シー．マセビクツ，リンクス
セラピューティクス，インコーポレイテッド
（B）番地：ベイ  センター  プレイス  3832
（C）市：ハイワード
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：94545
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：3.5インチフロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM 互換用
（C）OS：ウインドウズ  3.1
（D）ソフトウェア：マイクロソフト  ワード  5.1
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：PCT/US96/09513
（B）出願日：1996年6月6日
（vii）先願データ：
（A）出願番号：PCT/US95/12791
（B）出願日：1995年10月12日
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ステファン  シー．マセビクツ
（B）登録番号：30,285
（C）照会／記録番号：813wo
（ix）電話回線情報：
（A）電話：（510）670-9365
（B）テレファックス：（510）670-9302
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：11ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0004105764.tif 000033
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：11ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004105764.tif 000034
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：38ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
0004105764.tif 000035
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：20ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
0004105764.tif 000036
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：20ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0004105764.tif 000037
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：20ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0004105764.tif 000038
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：62ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
0004105764.tif 000039
【図１】
0004105764.tif 000040
【図２】
0004105764.tif 000041