(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させることを特徴とする、下記式（１）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
【化１】
Galβ1−4（GlcNAcβ1−6Galβ1−4)ｎGlcNAc  …（１）
（式中、Galはガラクトース残基を表し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を表す。ｎ＝１〜４）
【請求項２】
Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させた後、更にβ−D−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
【化２】
（GlcNAcβ1−6Galβ1−4）ｎGlcNAc  …（２）
（式中、Galはガラクトース残基を表し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を表す。ｎ＝１〜４）
【請求項３】
ｐＨ８〜１０の条件下で前記キチナーゼを作用させる、請求項１又は２に記載のβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記キチナーゼが、Bacillus属由来のキチナーゼである、請求項１〜３のいずれか一つに記載のβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖タンパクやグリコサミノグリカン、糖脂質等の複合糖鎖中に存在し、癌転移や癌化に関係している可能性のあるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミン鎖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパクやグリコサミノグリカン、糖脂質等の複合糖鎖は、細胞の癌化、分化、増殖、免疫等に深く関与していることが知られている。
【０００３】
例えば、ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンが交互に結合したポリＮ−アセチルラクトサミンは複合糖鎖中に広く存在し、癌転移等に関わりをもつガレクチンとの強い相互作用をもつことが報告されている。通常、ポリＮ−アセチルラクトサミンは、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ−１，３結合により繰り返し結合した構造を有する糖鎖を指す。
【０００４】
ところが、近年、ヒトミルクムチン型糖鎖から、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ−１，６結合により繰り返し結合した下記式（１）で表されるβ−１，６結合型ポリＮ−アセチルラクトサミン鎖が発見された（J. Biol. Chem.,264,872 (1989)）。
【０００５】
【化３】
Galβ1−4（GlcNAcβ1−6Galβ1−4)nGlcNAc  …（１）
（式中、Galはガラクトース残基を表し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を表す。ｎ＝１〜４）
さらに、マウス奇形腫細胞のポリラクトサミノグリカンからもβ−１，６結合型ポリＮ−アセチルラクトサミン鎖のフラグメントが単離されており（Glycoconjugate J.,6,129 (1989)）、β−１，６結合型ポリＮ−アセチルラクトサミン鎖の機能的役割が注目されている。
【０００６】
上記のようなβ−１，６結合型ポリＮ−アセチルラクトサミン鎖（本発明においてはβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖という）は、マウス奇形腫細胞のポリラクトサミノグリカンを部分的に酸分解し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等により分離、精製して調製されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のように天然物から抽出、精製する場合、原料に量的な制限があること、及び精製において多段階のカラム操作が必要であることなどから、工業的な規模で実施することは困難であった。また、目的物も微量しか得ることができないという問題もあった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、β−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を簡単かつ安価に大量に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の第１は、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させることを特徴とする、下記式（１）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法である。
【００１０】
【化４】
Galβ1−4（GlcNAcβ1−6Galβ1−4)nGlcNAc  …（１）
（式中、Galはガラクトース残基を表し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を表す。ｎ＝１〜４）
上記第１の発明によれば、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させることにより、上記オキサゾリン誘導体の水解物であるＮ−アセチルラクトサミンへの転移反応が繰り返し起こり、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ−１，６結合により繰り返し結合した上記式（１）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を簡単かつ安価に大量に得ることができる。
【００１１】
また、本発明の第２は、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させた後、更にβ−D−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とする、下記式（２）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法である。
【００１２】
【化５】
（GlcNAcβ1−6Galβ1−4)nGlcNAc  …（２）
（式中、Galはガラクトース残基を表し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を表す。ｎ＝１〜４）
上記第２の発明によれば、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させることにより、上記式（１）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得、これにβ−D−ガラクトシダーゼを作用させて非還元末端のガラクトース残基を切断することにより、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する上記式（２）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を簡単かつ安価に大量に得ることができる。
【００１３】
上記の各β−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法においては、ｐＨ８〜１０の条件下で前記キチナーゼを作用させることが好ましい。この態様によれば、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体の転移反応をより効率よく行うことができる。
【００１４】
また、前記キチナーゼが、Bacillus属由来のキチナーゼであることが好ましい。この態様によれば、より安価にβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を製造することができる。
【００１５】
上記のようなβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、何らかの生物学的役割を担っていることが推測されており、例えば新規生理活性物質として、癌の治療薬、予防薬等の医薬品、診断薬、化粧品、食品等の研究開発に有効に用いることができる。また、カラム充填剤や試薬等としての利用も期待できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の合成方法の基本は、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させて、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体の水解物であるＮ−アセチルラクトサミンへβ−１，６結合で転移させるものである。
【００１７】
本発明において、反応基質であるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体（以下、単にオキサゾリン誘導体という）とは、下記式に示す構造を有する化合物をいう。
【００１８】
【化６】
0004105874.tif 000002
【００１９】
上記オキサゾリン誘導体は、例えばＮ−アセチルラクトサミンに塩化アセチルを作用させてアノマー位の塩素化及び水酸基の保護を行い、塩化テトラエチルアンモニウムと炭酸水素ナトリウムによりオキサゾリン環を形成し、最後にナトリウムメトキシドによる脱アセチル化を行なうことにより得ることができる（K. Sasaki, S. Ahlfors, T. Frejd, J. Kihlberg, G. Magnusson, J. Org. Chem., 53, 5629 (1988)、S. Nishimura, H. Kuzuhara, Y. Takiguchi, K. Shimahara, Carbohydr. Res., 194, 223 (1989)）。
【００２０】
キチナーゼとしては、Henrissatらによる糖質加水分解酵素の分類（Henrissat, B., Biochem. J., 280, 309 (1991)、Henrissat, B., A. Bairoch., Biochem. J., 293, 781 (1993)）において、ファミリー１８に属するキチナーゼが用いられ、特に、Bacillus属由来のキチナーゼが好ましく用いられる。
【００２１】
キチナーゼは、Bacillus属の菌体（例えばBacillus circulans（ＩＦＯ１３６２７）等）の培養液から、例えば硫安沈殿により粗酵素を調製し、必要に応じて更にキチンカラム等を用いて精製することにより調製できる（T. Watanabe, K. Suzuki, W. Oyanagi, K. Ohnishi, H. Tanaka, J. Biol. Chem., 265, 15659 (1990)）。なお、キチナーゼは、精製されたものを用いてもよく、粗酵素を用いてもよい。また、市販のキチナーゼを用いてもよく、例えば商品名「キチナーゼ」（Bacillus sp．由来、和光純薬工業社製）等を用いることができる。
【００２２】
本発明においては、安価に入手できることから、Bacillus sp．由来のキチナーゼが特に好ましく用いられる。
【００２３】
キチナーゼは、従来キチンを加水分解する酵素として知られているが、分解の反応機構としてオキサゾリニウムイオン中間体を経由する機構が知られている（Substrate Assisted Catalysis）。上記オキサゾリン誘導体は、このオキサゾリニウムイオン中間体に類似した構造をもつ遷移状態アナログであるため、糖転移の活性化エネルギーが非常に高く、キチナーゼの転移反応基質として非常に優れているものと考えられる。
【００２４】
本発明において、式（１）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（以下、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（１）という）は、例えば以下のようにして調製することができる。
【００２５】
すなわち、上記オキサゾリン誘導体を、アルカリ性（好ましくはｐＨ７〜１１、より好ましくはｐＨ８〜１０）に調整した緩衝液に溶解し、これにキチナーゼを添加して２０〜４０℃で反応を行なう。上記のようなｐＨ範囲で酵素反応を行なうことにより、効率よく転移反応が進行すると共に、一旦生成したオリゴ糖がキチナーゼによって再び分解されることを防ぐことができる。
【００２６】
反応中は、反応液を経時的にサンプリングして高速液体クロマトグラフィーでオキサゾリン誘導体のピークの消失を確認した後、酵素を失活させ、高速液体クロマトグラフィー等により目的物を単離する。
【００２７】
キチナーゼの添加量は、転移反応が充分に進行する量であれば特に制限はないが、例えば上記オキサゾリン誘導体を０．１ｍｏｌ／Ｌ含む反応系においては、キチナーゼの添加量は５０〜５００ｍＵ／ｍＬが好ましく、７０〜１５０ｍＵ／ｍＬがより好ましい。なお、本発明において、キチナーゼ１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ６．８、３７℃の条件下で酵素をＮ−アセチルキトサンに作用させた際に、１分間にＮ−アセチルキトサンから１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元糖を生成する酵素量を意味する。
【００２８】
また、高速液体クロマトグラフィーの条件は、例えば「TSK-gel Amide-80」（商品名、トーソー社製）、「Asahipak NH2P-50 4E」（商品名、昭和電工社製）等のカラムを用い、溶媒としてアセトニトリル／水混合溶媒（アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝８０／２０〜６０／４０）等を用いて行なうことができる。
【００２９】
また、上記のようにして得られたＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（１）に、緩衝液（好ましくはｐＨ５〜７、より好ましくはｐＨ６〜６．５）中でβ−D−ガラクトシダーゼを作用させて、非還元末端のガラクトース残基を切断することにより、式（２）で表されるβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（以下、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（２）という）を得ることができる。
【００３０】
本発明において、β−D−ガラクトシダーゼの添加量は、反応が充分に進行する量であれば特に制限はないが、例えば、基質を５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ含む反応系においては、β−D−ガラクトシダーゼの添加量は５〜２５０ｍＵ／ｍＬが好ましく、２５〜１２５ｍＵ／ｍＬがより好ましい。なお、β−D−ガラクトシダーゼ１Ｕ（ユニット）とは、酵素をパラニトロフェニル−β−D−ガラクトシドにｐＨ６．０、３７℃で作用させた際に、１分間にパラニトロフェニル−β−D−ガラクトシドから１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離する酵素量を意味する。
【００３１】
β−D−ガラクトシダーゼとしては、特に制限はないが、例えばストレプトコッカス ニューモニア（Streptococcus pneumoniae、ＡＴＣＣ６３０５）、Bacillus circulans（ＩＦＯ１３６２７）等由来のものを使用することができる。
【００３２】
β−D−ガラクトシダーゼは、これらの菌体の培養液から、例えば硫安沈殿（Green, A. A. et al. : Methods in Enzymology, vol. 1, p76, 1955）や、ゲル濾過クロマトグラフィー（Miyazaki et al. : Agric Bio Chem, 52, 625-631, 1988）により調製することができる。また、市販のβ−D−ガラクトシダーゼを用いてもよく、例えば商品名「乳糖分解酵素製剤Biolacta FN5」（Bacillus circulans由来、大和化成社製）等が挙げられる。なお、β−D−ガラクトシダーゼは、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を除いておくことが好ましい。
【００３３】
本発明においては、ストレプトコッカス ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）由来のβ−D−ガラクトシダーゼが特に好ましく用いられる。
【００３４】
上記の各酵素反応を行なう際に用いられる緩衝液としては、キチナーゼを用いた酵素反応の場合は、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。また、β−D−ガラクトシダーゼを用いた酵素反応の場合は、例えばSodium cacodylate緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
製造例
Ｎ−アセチルラクトサミン４．０ｇに塩化アセチル２０ｍＬを加え、撹拌しながら室温で４日間反応を行なった。なお、反応中は、ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応を追跡した。
【００３６】
この反応液をエバポレートによって濃縮し、過剰量の塩化メチレンで希釈後、ｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液し、得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した。
【００３７】
得られた濾液をエバポレートにより濃縮し、更に減圧乾燥して溶媒を完全に除去して、塩化Ｎ−アセチル−3,6,2',3',4',6'−ヘキサ−O−アセチル−α−ラクトサミニル（以下、化合物（Ｉ）という）６．８０ｇを得た。
【００３８】
上記化合物（Ｉ）３．０１ｇをアセトニトリル２５ｍＬに溶解し、この溶液に、塩化カルシウムによって一時間半乾燥させた塩化テトラエチルアンモニウム１．０ｇと炭酸水素ナトリウム１．０ｇを加え、５５℃で１時間４０分間還流させた。
【００３９】
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）にて反応終了を確認し、ガラスフィルターＧ４（商品名、柴田科学社製）で固形物を除去し、得られた濾液を減圧下で濃縮した後、過剰量の塩化メチレンで希釈し、水相のｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液した。
【００４０】
得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した後、エバポレートによって濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Gel：商品名「Silica Gel 60」、Merck社製、particle size:0.04−0.063mm、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により精製して、固体状の2−メチル｛3,6ジ−O−アセチル−4−O−（2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル）1,2−ジデオキシ−α−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、化合物（ＩＩ）という）１．４０ｇを得た。
【００４１】
アルゴン雰囲気下、上記化合物（ＩＩ）１．４０ｇを無水メタノール２７０ｍＬに溶解させ、０．０１Ｍの濃度になるようにナトリウムメトキシドのメタノール溶液を添加し、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応終了を確認した後、反応溶液が中性になるまでイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+)（商品名、オルガノ社製）を加えた後、濾過してイオン交換樹脂を除去した。
【００４２】
得られた濾液をエバポレートによって濃縮し、更に減圧乾燥して、2−メチル｛4−O−（β−D−ガラクトピラノシル）1,2−ジデオキシ−α−D−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、オキサゾリン誘導体（Ｉ）という）０．８０ｇを得た。なお、オキサゾリン誘導体（Ｉ）は、ＮＭＲにより構造を確認した。
【００４３】
実施例１
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）４１.３ｍｇをエッペンドルフチューブに取り、２００ｍＵのキチナーゼＡ１（Bcillus cirulans WL-12由来）を溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１．１ｍＬを添加し、４０℃で反応を行なった。
【００４４】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、反応開始から２時間後にオキサゾリン誘導体（Ｉ）の消失及び重合体の生成を確認した後、１００℃で１０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（１）で行なった。
【００４５】
・条件（１）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液をフィルター処理後、以下の条件（２）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物を含む画分をそれぞれ回収した。
【００４６】
・条件（２）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６５／３５
温度：４０℃
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した各画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（１）（ｎ＝１〜３）を得た。乾燥質量による収率は、ｎ＝１は２０．５％、ｎ＝２は２６．４％、ｎ＝３は８．６％であった。なお、各糖鎖の構造は13ＣＮＭＲ、DEPT及びMALDI TOF MASSにより確認した。
【００４７】
実施例２
実施例１で得られたＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（１）（ｎ＝１）８．７ｍｇをファルコンチューブに入れ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２．０ｍＬを添加し、市販のβ−D−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、商品名「β１，４−ガラクトシダーゼ」、CALBIOCHEM社製）２６ｍＵを加えて、３７℃で反応を行なった。
【００４８】
反応開始から４２時間後に、高速液体クロマトグラフィーにて反応終了を確認し、８０℃で２５分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（３）で行なった。
【００４９】
・条件（３）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝７５／２５
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液をフィルター処理後、以下の条件（４）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物を含む画分を回収した。
【００５０】
・条件（４）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：４０℃
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（２）（ｎ＝１）を５．７ｍｇ得た。乾燥質量による収率は８４％であった。なお、糖鎖の構造は、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより確認した。
【００５１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させることにより、上記オキサゾリン誘導体の水解物であるＮ−アセチルラクトサミンへの転移反応が進行して、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ−１，６結合により繰り返し結合したβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を簡単かつ安価に大量に得ることができる。そして、さらにβ−D−ガラクトシダーゼを作用させて、非還元末端のガラクトース残基を切断することにより、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を簡単かつ安価に大量に得ることができる。
【００５２】
上記のようなβ−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、例えば新規生理活性物質として、癌の治療薬、予防薬等の医薬品、診断薬、化粧品、食品等の研究開発に有効に用いることができる。また、カラム充填剤や試薬等としての利用も期待できる。