(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）カッソウ綱から得られる粗製フカンを５〜100mg/ml濃度で含有する反応混合物のV1量に、金属触媒の存在下、５〜30％濃度の過酸化水素溶液のV2量を、連続的にかつ0.5〜10時間のあいだ撹拌下に１分当たりV1/1000〜V1/10の割合で添加し、反応混合物を水酸化ナトリウムを連続的に加えて６〜８のpHかつ40〜70℃の温度に保持し、
ｂ）この解重合により得られる多糖類を回収すること
を特徴とする、フリーラジカル解重合により硫酸化多糖類を得る方法。
【請求項２】
粗製フカンが、反応混合物に10〜50mg/mlの濃度で存在することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
５〜20％の濃度かつV1/50〜V1/500の割合で過酸化水素溶液を用いることを特徴とする請求項１および２いずれかに記載の方法。
【請求項４】
金属触媒が、反応混合物に0.01〜0.1Mの濃度で存在することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィーがDEAE-セファロースCL6Bカラムで行われる際に、フリーラジカル解重合の前か後のどちらかに行うことができ、その終わりに、0.8Mより大きいNaCl濃度に相当するイオン強度で溶出される画分を回収するイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のフリーラジカル解重合の方法により得ることができることを特徴とする10,000g/モルより低いかそれに等しい分子量の多糖類画分。
【発明の詳細な説明】
本発明は、カッソウ綱（Phaeophyceae）から抽出されるフカンの解重合による低分子量の硫酸化多糖類を得ることに関する。
フカンは、カッソウの苗条の細胞壁に存在する硫酸化多糖類である。酸抽出により苗条から抽出される粗製フカンは、主にα-1,2-L-フコース-4-サルフェートのポリマーである平均分子量の高い分子（100,000〜800,000g／モル）の不均質な群を形成する。しかしながら、フカンは、他の成分（特に、ウロン酸鎖）とD-キシロースのような中性の糖、およびD-ガラクトースならびにD-マンノースをかなりの割合で含む。
フカンは、新規の治療上の活性源としての使用を特に興味あるものにする様々な特性を有する。すなわち、フカンは抗凝固活性、抗血栓活性［T.NISHINOとT.NAGUMO、Carbohydr.Res.229,p.355-362,（1992）;EP出願第0403377号;S.COLLIECら、Thromb.Res.64,pp.143-154（1991）;S.SOEDAら、Thromb.Res.72,pp.247-256（1993）］、抗ウィルス活性［M.BABAら、J.AIDS,3,pp.493-492,（1990）］、抗血管形成活性［R.HAHNENBERGERとA.M.JACKOBSON、Glycoconjugate J.,8,350-353（1991）］及び抗相補活性［C.BLONDINら、Molecular Immunology,31,pp.247-253,（1994）］を有することが明らかに示されている。さらに、フカンは細胞付着のモジュレーター［C.G.GLABEら、J.Cell Sci.,61,pp.475-490,（1983）］、成長因子の放出モジュレーター［D.A.BELFORTら、J.Cell.Physiol.157,pp.184-189,（1993）］、腫瘍細胞の増殖モジュレーター［M.ELLOUALIら、Anticancer Research,13,pp.2011-2020,（1993）;D.R.C00MBEら、Int.J.Cancer,39,pp.82-90,（1987）］および異種間の精子／卵細胞の相互作用のブロック［M.C.MAHONYら、Contraception,48,pp.277-289,（1993）;M.C.MAHONYら、Contraception,44,pp.657-665,（1991）］として作用できることが認められている。
それらの可能性のある興味にもかかわらず、またそれらの特性の幾つか（例えば、それらの抗凝固活性）は長いあいだ知られていたが、粗製フカンは治療に用いられていない。なぜなら、それらの高分子量と不均質性のため溶解性を悪くし、活性製剤の特徴づけとそれらを再現可能に得ることを非常に困難にするからである。
上記研究のあいだ、本発明者らのチームは、粗製フカンを酸加水分解によって制御した分解をし（EP出願第0403377号）、次いでゲルろ過分画し、それにより20,000g/モルより低いかまたはそれに等しい分子量の多糖類画分を得ることができる方法を完成した。これらの画分は、抗凝固活性および抗相補活性のような粗製フカンの特性を保持する。
しかしながら、酸加水分解とその後の分画では、低分子量画分を中程度な収率（原料の粗製フカンの10％以下）で得ることができるのみである。さらに、酸加水分解で得られる画分の特徴づけは、重量ならびに化学組成において多糖類が非常に不均質であることを示している。
さらに、フリーラジカルの解重合反応を用いて、ヘパリンまたはデルマタン硫酸塩を原料として低分子量かつ一定組成の多糖類画分を得られることが示されている［VOLPIら、J.Chromatogr.B.Biomed.Appl.622,pp.13-20,（1993）;Anal.Bi-ochem.200,pp.100-107,（1992）］。反応は、金属イオン（Cu2+またはFe3+）と過酸化水素の反応から生じるフリーラジカルの生成により進行する［G.VAV DEDEMとJ.I.NIELSEN、Pharmeuropa,3,202-218,（1990）］。これらのフリーラジカルは、非常に反応性に富み、中性pHで、酸加水分解よりも効果的に多糖類を分解することができる。
本発明者らは、酢酸銅の存在下、過酸化水素の作用によるフカンの高分子量画分（HMWF）のフリーラジカル解重合を試みた。VOLPIらに記載される方法にしたがった最初の試験により、20,000g/モルより低く、かつ一定組成の分子量画分を得ることができた。
しかし、10,000g/モルより低い分子量画分を得るためには、立体排除によりフリーラジカル解重合の生成物を分画することが必要で、結果として50％に近い生成物の損失を伴なった。
本発明者らは、ここでフリーラジカル解重合の新規の方法を完成し、立体排除による相補分画に進める必要なしに、粗製フカンを原料とする単一工程で、良好な収率で10,000g/モルより低分子量の均質画分を得ることを可能にした。
本発明の対象は、
ａ）カッソウ綱から得られる粗製フカンを５〜100mg/ml濃度で含有する反応混合物のV1量に、金属触媒の存在下、５〜30％濃度の過酸化水素溶液のV2量を、連続的にかつ0.5〜10時間のあいだ撹拌下に１分当たりV1/1000〜V1/10の割合で添加し、反応混合物を水酸化ナトリウムを連続的に加えて６〜８のpHかつ40〜70℃の温度に保持し、
ｂ）この解重合により得られる多糖類を回収すること
を特徴とする、フリーラジカル解重合により硫酸化多糖類を得る方法である。
本発明の好ましい具体例によれば、カッソウ綱から得られる粗製フカンは、反応混合物に10〜50mg/mlの濃度で存在する。
本発明の別の好ましい具体例によれば、５〜20％、好ましくは９〜10％オーダーの濃度かつV1/50〜V1/500の割合で過酸化水素溶液が用いられる。
本発明の実施に用いることができる金属触媒は、例えばオポクリン  エス．ピーエー．のラボラトリオ  ファーマコバイオロジコ（OPOCRIN S.pA.LABORATORIO FARMACOBIOLOGICO）名のヨーロッパ特許第221977号に記載されている触媒である。
本発明の好ましい具体例によれば、金属触媒は、反応混合物に0.01〜0.1M、好ましくは0.01〜0.05Mの濃度で存在する。
本発明のフリーラジカル解重合の方法は、10,000g/モルより低いかそれに等しい分子量の均質な多糖類画分を、立体排除クロマグトラフィーによる予備分画なしに単一工程で、かつ良好な収率で得ることができる。
本発明の明細書で「均質画分」は、高速立体排除クロマトグラフィーで、画分に主な群を示す一つの主要なピークを有する画分を意味するものと解される。このピークから算出される多分散指数は、１〜２の値を示す。
さらに好ましくは、本発明の方法は、クロマトグラフィーがDEAE-セファロースCL6Bカラム（PHARMACIA）で行われる際に、フリーラジカル解重合の前か後のどちらかに行うことができ、その終わりに、0.8Mより大きく、好ましくは1Mより大きいNaCl濃度に相当するイオン強度で溶出される画分を回収するイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含む。
本発明の対象は、さらに上記のような本発明の方法で得ることができる多糖類画分である。
本発明は、本発明の方法を用いてカッソウから抽出されるフカンを原料とする硫酸化多糖類画分を得る実施例に言及する以下のさらなる記載からより良く理解されるであろう。
実施例１：
原料物質：
フカンの３つの製品を、原料物質として試験した。それらを以下の略号によりそれぞれ示した。
ＦＳ：フランスのSIGMAにより市販されているフカス・ベシクロサス（Fucus vesiculosus）のフコイダン（fucoidan）の製品、
ＥＡ：S.COLLIECらにより記載される方法［Phytochemistry,35,pp.697-700,（1994）］によるアスコフィルム・ノドサム（Ascophyllum nodosum）を原料として得られる酸抽出物、
Ｐ１：ヨーロッパ特許出願第403377号（13頁、実施例１、b）、A）に記載のようにＥＡの酸処理により得られる高分子量画分。
フリーラジカル解重合：
フカン600mgと酢酸銅一水和物80mg（0.02M）を、60℃に保持した反応器中で、二回蒸留した水20mlに溶解する。過酸化水素９％（v/v）溶液を１時間当たり12mlの割合で加え、2MのNaOHを連続的に加えてpHを7.5に保持する。反応は５時間後に停止する。酢酸でpHを５に調整し、次いで媒体から銅の共雑物を除去するため、キレート樹脂CHELEX 100（登録商標、BIORAD）を加える。0.1Mの水酸化ナトリウムで中和後に溶液を脱塩し、凍結乾燥する。
多糖類画分の特徴づけ：
-フカンの様々な画分の分子量は、LICROSPHER Si300カラム（登録商標、MERK-CLEVENOT）とHEMASEC BIO40カラム（登録商標、ALLTECH）を用いて0.15M NaCl、0.05M NaH2PO4、pH７の高速立体排除クロマトグラフィー（HPSEC）」で測定した。カラムは、以下の多糖類の基準で検定した：プルラン類853,000〜5800g/モル（POLYMER LABORATORIES,INTERCHIM）、デキストラン1500g/モルおよびメレジトース522g/モル（FLUKA）、シクロース342g/モルおよびグルコース180g/モル（SIGMA）。結果は、CHROMSTAR BRUKERソフトウェア（登録商標、MERKより市販）を用いて解析した。
-フコース含量は、システイン-H2SO4方法により測定した［Z.DISCHE,Method Biochem.Anal.2,pp.313-358,（1955）］。
-ウロン酸含量は、m-ヒドロキシビフェニル-H2SO4の改変した方法［T.M.C.C.FILISETTI-COZZIとN.C.CARPITTA、Anal.Biochem.197,pp.157-162,（1991）］と基準としてグルクロン酸を用いて行った。中性ヘキソースの干渉は、スルファメートカリウムを用い、m-ヒドロキシフェニルを除く全試薬からなる対照と処理して回避した。
-画分のサルフェート含量は、硫黄（５％）の元素分析と次の関係により測定した：
サルフェート基の割合（％）＝3.22 x S％
-窒素は、元素分析で測定した。確認された量はつねに非常に低く、タンパク質フラグメントまたはアミノ酸または窒素含有糖のいずれも存在している形跡は検出されなかった。その結果、測定の結果は純粋な窒素を示している（g/100g）。
-糖の組成は、気相クロマトグラフィーで測定した。
-フカンのサンプルそれぞれの抗凝固活性は、ＡＣＴ（セファリン活性時間）キット（ORGANON TEKNIKA）を用いてＡＣＴの測定により決定した。
対照の緩衝液100μlまたは代替物として様々な希釈度（０〜１μg/ml）のヘパリン溶液（H410、Institut Choay,SANOFI,170IU/mg）もしくはフカンの希釈液（０〜50μg/ml）を、血小板の少ない血漿（ＰＰＰ）100μlおよびＡＣＴ試薬100μlと混合する。全混合物を37℃で３分間インキュベートする。血餅の形成時間は、25mMのCaCl2溶液100μlの添加後に測定する。
結果：
３つの分解は、Ｐ１、ＥＡおよびＦＳを原料として上述の方法により同一条件下で行った。
幾つかの中止は解重合中に行い、HPSECで解析した。
時間中のクロマトグラフィーの態様を図１に示す。分子量66,000g/モルの画分は、30分で得られる（図1A）。しかし、この生成物は十分には均質ではない（19,000g/モルでスペクトルの肩）。60〜300分のあいだに多糖類は分子量9000g/モルの生成物に移動し、この時間は均質なクロマトグラフィーの態様を有する（図1H）。
結果を以下の表１に示す。Ｐ１、ＥＡおよびＦＳを原料として300分後に得た画分を、それぞれＤＲＰ１、ＤＲＥＡおよびＤＲＦＳと称する。
解重合から生じる画分のウロン酸量は減少するが、フコースの量は、ほとんど変化しない（表１）。他方、ＤＲＰ１とＤＲＦＳのサルフェートの量はかなり増加するが、ＤＲＥＡの場合は一定なままである。
0004074902.tif 000002
実施例２：
原料物質は、実施例１で用いた酸抽出物のように得られる酸抽出物ＥＡである。
フリーラジカル解重合：
粗製フカンＥＡ4.5gを、60℃に保持した反応器中の0.02Mの酢酸銅一水和物溶液150mlに溶解する。過酸化水素９％（v/v）溶液を、５時間のあいだ１分当たり1.5mlの割合で加える。pHは、2MのNaOHを連続的に添加して7.5に保持する。このpHを酢酸で５に調整し、次いで媒体から銅の共雑物を除去するためにキレート樹脂CHELEX 100を加える。0.1Mの水酸化ナトリウムで中和後に溶液を脱塩し、凍結乾燥する。
解重合反応の結果は、以下の表IIおよびIIIに要約する。解重合生成物をＥＡＤＲと称する。
0004074902.tif 000003
0004074902.tif 000004
ウロン酸、フコース、-SO3Naおよび窒素の含量は、g/100gで示している。Mcはg/モルで示している。抗凝固活性はIU/mgで示している。
イオン交換クロマトグラフィーによる分画：
1gのＥＡＤＲは、DEAEセファロースCL6Bのイオン交換カラムクロマトグラフィー（2.6 x 5 x 40cm）で分画した。
溶出は、1.6ml/分の割合で最初に水で、次いでNaClの線状勾配（0〜2M）で行った。溶出は、電導検出器（IBF）にしたがった。図２は溶出の態様を示す。
NaCl勾配の溶出で回収した部分に相当する２つの画分（ＥＡＤＲＥＩ１とＥＡＤＲＥＩ２）は、0.75〜1.5MのNaClに相当するイオン強度でそれぞれ回収した。
これらの画分の特徴を以下の表IVに示す。ウロン酸、フコース、-SO3Naおよび窒素の量は、g/100gで示している。Mcはg/モルで示している。抗凝固活性はIU/mgで示している。
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低イオン強度で回収した画分ＥＡＤＲＥＩ１は、高レベルのウロン酸と比較的低い抗凝固活性を有する。逆に、ＥＡＤＲＥＩ２はサルフェート基とフコースが多く、その凝固活性はかなり有為である。
実施例３：本発明の方法で得られる画分と酸加水分解で得られる同分子量画分の特性の比較
画分ＤＲＥＡとＱ３は、ともに粗製フカン製品ＥＡを原料として得た。
画分ＤＲＥＡは、実施例１に記載の条件下本発明のフリーラジカル解重合の方法で得た。
画分Ｑ３は、粗製フカンＥＡの酸加水分解（1N H2SO4、45℃、90分）で得た。
これらの画分の特徴を以下の表Ｖに示す。
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【図１】
0004074902.tif 000007
【図２】
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