(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Iのウロキナーゼ阻害剤：
【化１】
0004105540.tif 000005
式中、XはCHであり、置換基Yは4位に存在し、アミジノ基
【化２】
0004105540.tif 000006
であり、式中のR5はHであり、
R1はH、1〜8のC原子を有する分岐若しくは直鎖アルキルであり、
R2はHであり、
R3は(CH2)n-OH（n=1〜5）であり、及び
R4はスルホニル基-SO2-R、カルボニル基-CO-R、オキシカルボニル基-COO-R若しくはHであり、
ここにおいてRは1〜16のC原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アラルキル基である。
【請求項２】
アミノ酸Gly及びD-Serが前記4-アミジノベンジルアミド基に結合しており、R4がアリールスルホニル基又はアラルキルスルホニル基である、ことを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
腫瘍を制御するために経口的、皮下的、静脈注射的、又は経皮的に投与できる薬剤の調製のための、請求項１に記載の阻害剤の使用方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、錠剤、糖衣錠剤、カプセル、ペレット、座薬、溶液又は硬膏剤の形状の薬剤として使用される、ことを特徴とする請求項３に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は悪性腫瘍および転移の治療のための新規ウロキナーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
周囲組織への固形腫瘍の播種および転移は、腫瘍細胞の周囲での細胞外マトリックスの破壊および／または基底膜への浸潤が可能なために起こりうる。種々のマトリックスメタロプロテイナーゼおよびカテプシン以外では、特にプラスミノゲンアクチベータのウロキナーゼ(uPA)がこの過程において最も重要である(P. Mignatti and D.B. Rifkin, Physiol. Rev. 73, 161-195, 1993年)。従って、uPAはプラスミノゲンを活性化させ、その結果得られるプラスミンは細胞外マトリックス成分(特にフィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロテオグリカン) を破壊することができ、さらにメタロプロテアーゼとプロウロキナーゼも活性化させてuPAを得る(U. Reuning et al., Int. J. Oncol. 13, 893-906, 1998年)。プロウロキナーゼとuPAはどちらも、細胞表面にある特殊な受容体であるuPA受容体(uPAR)と結合する。これによってuPAが活性化され、その結果プラスミノゲンが活性化され、これは腫瘍細胞周囲で増加および集中する。腫瘍増殖および腫瘍播種におけるこの細胞関連プラスミノゲンアクチベータ系の重要性は、細胞生物学的研究および動物モデルの両方で示されている。従って、天然の阻害剤PAI-1およびPAI-2でuPAの酵素活性を阻害することによって 腫瘍細胞の浸潤能力が低下する(J.-F. Cajot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6939-6943, 1990年; M. Baker et al., Cancer Res. 50, 4876-4684, 1990年)。ニワトリ胚では、ヒトガン細胞により生じた肺転移形成は、uPAに対する抗体を加えることによってほぼ完全に阻害された(L. Ossowski et al., Cell 35, 611-619, 1983年)。
【０００３】
最近では、プラスミノゲンアクチベータ系に関与する因子(uPA、uPAR、PAI-1、およびPAI-2)の固形悪性腫瘍を有する患者の予後に対する臨床的関連性が集中的に研究されている。特に、種々の腫瘍組織中のuPAの含有率が予後因子となることが分かった。従って、腫瘍中のuPA濃度の高い患者はuPA濃度が低い患者よりも予後が劣る(M. Schmitt et al., Thromb. Haemost. 78, 285-296, 1997年; R.W. Stephens et al.. Breast Cancer Res. Treat. 52, 99-111, 1998年)。腫瘍組織中のuPARの濃度増加も予後不良と関連がある (H. Pedersen et al.. Cancer Res. 54, 4671-4675, 1994年; C. Duggan et al.. Int. J. Cancer 61, 597-600, 1995年)。
【０００４】
uPAR含有率の予後値および腫瘍組織中のuPA含有率に関する発見から、合成uPA阻害剤が腫瘍細胞の浸潤および播種を抑制可能であると考えることができる。しかしながら、これまで公知となっているuPA阻害剤の数は比較的少ない。その大部分は、種々のベンズアミジンおよびβ-ナフトアミジン誘導体と同様に特異性および効力がほんのわずかである(J. Stuzebecher and F. Markwardt, Pharmazie 33, 599-602, 1978年)。VassalliおよびBelin (FEBS Letters 214, 187-191, 1997年)がuPA阻害剤であるとして記載しているアミロリドはuPAの特異的な阻害剤であるが、その阻害作用は弱い(ki = 7 μM)。
【０００５】
4-置換ベンゾチオフェン-2-カルボキサミジンは、活性がより高いuPA阻害剤であることが分かっている(化合物623の場合でKi = 0.16 μM)。この種の阻害剤は、uPARと結合するuPAを不活性化する(M.J. Towle et al., Cancer Res. 53, 2553-2559, 1993年)。これらのベンゾチオフェン誘導体は非常に特異的であり、プラスミンおよび組織型プラスミノゲンアクチベータ(tPA)に対する阻害作用はわずかであるが、この種の化合物の合成は非常に複雑である。
【０００６】
4-アミノメチルフェニルグアニジン誘導体は同等の特異性を有するが、uPAに対する阻害作用(最も活性の高い化合物の場合でKi = 2.4 μM) は比較的低い(S. Speri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5113-5118, 2000年)。
これとは対照的に、Nα-トリイソプロピルフェニルスルホニル-3-アミジノフェニルアラニン誘導体はマイクロモル濃度のKi値(最も活性の高い化合物の場合で0.41 μM )を達成するが、非常に非特異的なuPA阻害剤であり、トリプシン、トロンビン、およびプラスミンに対して同等またはより強い阻害作用を示す(J. Sturzebecher et al., Bioorg. Med. Letters 9, 3147-3152, 1999年)。WO 99/05096号は、非常に有用なuPA阻害剤である改良されたβ-ナフトアミジンを開示している。この特許はIC50値がナノモル濃度範囲であると報告しているが、選択性や生物活性に関するデータは提供していない。
これまで基質の配列から誘導される少数のペプチドのみがuPA阻害剤であるとして記載されている。KettnerおよびShaw (Methods in Enzymology, 80, 826-842, 1981年)は、クロロメチルケトン類はuPAを不可逆的に阻害するがin-vivo用途には適していないと記載している。
【０００７】
欧州特許第18 32 71号は、ある程度uPAを阻害するリシン誘導体を開示しているが、これらは他の類似の酵素も阻害し、そのため非常に特異的、または制限された方法でのみ医療用途に使用することができる。uPA阻害剤であり、天然の阻害剤から誘導されるとWO 95/17885号で報告されている低分子量ポリペプチド(約50個のアミノ酸)についても同じことが言える。このペプチドの性質、およびその分子の大きさのため、in-vivo用途は非常に制限される。
【０００８】
しかしながら、WO 00/05245号は、C末端にアルギンを含有しP3にD-セリンを含有するペプチジルアルデヒドが効率的にuPA阻害するとごく最近報告している。しかし、このアルデヒドの機能は不安定であり選択性が低い。Serのヒドロキシルをアシル化すると、その腫瘍化合物iBuOCO-D-Ser-Ala-Arg-Hの皮下投与による相対的バイオアベイラビリティが87%であることが分かった(S. Y. Tamura et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 983-987, 2000年)。
さらに、uPAと関連する酵素であるトロンビンの阻害剤に関する研究でD-Phe-Pro-Arg型のトリペプチド誘導体を使用する場合、アグマチン、trans-4-アミノメチルシクロヘキシルアミン、または4-アミジノベンジルアミンをＣ末端に導入すると、阻害作用とバイオアベイラビリティの両方に関して顕著な進展が見られた。ピコモル濃度のKi値が得られ経口バイオアベイラビリティも向上した(T.J. Tucker et al., J. Med. Chem. 40, 1565-1569および3687-3693, 1997年)がuPA阻害剤は見つからなかった。例えば、4-アミジノベンジルアミド残基をＣ末端に有するメラガトランはトリプシン(Ki = 2.0 nM)およびトロンビン(Ki = 2.0 nM)を非常に非特異的に阻害するが、uPAの阻害ではKi = 6.3 μMであり、３桁分弱い値である(D. Gustafsson et al.. Blood Coagul. Fibrinolysis 7, 69-79, 1996年; WO 94/29336号)。
【０００９】
本発明の主要な目的は、高い活性および選択性でウロキナーゼを阻害し、できるだけ簡単な合成によって調製可能であり、治療用途にも好適である有効化合物を特定することである。
【００１０】
本発明は次の通りである。
［１］  一般式Iのウロキナーゼ阻害剤：
【化１】
0004105540.tif 000002
式中、XはCHであり、置換基Yは4位に存在し、アミジノ基
【化２】
0004105540.tif 000003
であり、式中のR5はHであり、
R1はH、1〜8のC原子を有する分岐若しくは直鎖アルキルであり、
R2はHであり、
R3は(CH2)n-OH（n=1〜5）であり、及び
R4はスルホニル基-SO2-R、カルボニル基-CO-R、オキシカルボニル基-COO-R若しくはHであり、
ここにおいてRは1〜16のC原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アラルキル基である。
［２］  アミノ酸Gly及びD-Serが前記4-アミジノベンジルアミド基に結合しており、R4がアリールスルホニル基又はアラルキルスルホニル基である、ことを特徴とする［１］に記載の阻害剤。
［３］  腫瘍を制御するために経口的、皮下的、静脈注射的、又は経皮的に投与できる薬剤の調製のための、［１］に記載の阻害剤の使用方法。
［４］  前記阻害剤が、錠剤、糖衣錠剤、カプセル、ペレット、座薬、溶液又は硬膏剤の形状の薬剤として使用される、ことを特徴とする［３］に記載の使用方法。
驚くべきことに、請求項１に記載の式Iによるアシル化アミジノベンジルアミン、特にX、R1、R2、およびR3によって天然および／または非天然のアミノ酸が得られる4-アミジノベンジルアミン化合物はウロキナーゼを非常に効率的かつ選択的に阻害することが分かった。これに関連して、アミジノ基が4位にあり、GlyおよびD-Serがアミノ酸として結合し、この化合物がアリールスルホニル基またはアラルキルスルホニル基で構成されるN末端保護基R4を有する場合、アミジノベンジルアミンは特に活性のウロキナーゼ阻害剤となる。
【００１１】
エステル、特にオキシカルボン酸とのエステルは、経腸摂取中に加水分解されるプロドラッグとして使用することができる。驚くべきことに、本発明による化合物のこれらのオキシカルボニル誘導体の一部も非常に強力なウロキナーゼ阻害剤であることも分かった。
ウロキナーゼ以外では、グリシン誘導体による他の酵素の阻害は明らかに弱く、このことは本発明によるこれらのアミジノベンジルアミン誘導体は非常に高活性で選択性の高いuPA阻害剤の新規グループであることを意味する。対照的に、R1としてHを全く有さない化合物(例えばアラニン誘導体)はウロキナーゼを選択的に阻害しないが、トリプシン、トロンビン、およびプラスミンの強力な阻害剤でもある。
通常、本発明の化合物は鉱酸の塩として存在し、好ましくは塩酸塩、または好適な有機酸の塩として存在する。
【００１２】
式Iの化合物は、以下のような公知の方法を使用した比較的簡単な方法で調製することができる。
出発化合物の4-シアノベンジルアミンはGabriel合成(G. Wagner and I. Wunderlich, Pharmazie 32, 76-77,. 1977年; B.C. Bookser and T.C. Bruice, J. Am. Chem. Soc. 113. 4208-4218, 1991年)によって4-シアノベンジルブロミドから調製される。Bocで保護されたアセチルオキサミジノベンジルアミン(acetyloxamidinobenzylamine)はこのようにして調製された4-シアノベンジルアミンから得られる。他のアミノ酸と保護基R4のカップリングは、標準的カップリング方法によって行われ、N末端保護基としてBocが使用される。第二のアミノ酸もN-アリールスルホニルまたはN-アラルキルスルホニルで保護されたアミノ酸として直接カップリングさせることができる。ペプチド類縁物質は、アセチルオキサミジノベンジルアミンから出発して順次合成される。対応するエステルを合成する場合は、対象化合物を対応する酸塩化物と反応させる。生成物の大部分はよく結晶化するため、容易に精製可能である。最終段階において、阻害剤は分取用逆相HPLCによって精製される。
【００１３】
本発明を、２つの実施例を使用して以下により詳細に説明する。
実施例１
ベンジルスルホニル-D-Ser(Bz)-Gly-4-アミジノベンジルアミド x HClの合成１．１  Boc-4-シアノベンジルアミド
20 g（0.151 mol）の4-シアノベンジルアミンを300 mlの水、150 mlのジオキサンと150 mlの1 N NaOHに溶解した。氷冷下で37.5 mlのジ-tert-ブチルジカーボネートを滴下し、混合物を0℃で1時間かく拌し室温でさらに24時間かく拌した。ジオキサンを真空除去し水性残渣を酢酸エチルで3回抽出した。一緒にまとめた抽出液を5％KHSO4溶液で3回洗浄した後に飽和NaCl溶液で3回洗浄し、Na2SO4で乾燥し真空濃縮した（白色結晶）。HPLC：アセトニトリル／水、44.1％アセトニトリルにて溶出；収率：30.48 g（0.131 mol）、87％。
【００１４】
１．２  Boc-4-アセチルオキサミジノベンジルアミド
Judkinsらの方法（Synthetic Comm. 26, 4351-4367, 1996）に従って、30.48 g（0.131 mol）のBoc-4-シアノベンジルアミドを、13.65 g（0.197 mol）のヒドロキシルアミン x HClと34 ml（0.197 mol）のDIEAとともに、300 mlの無水エタノールに溶解した。その溶液を2時間還流した後室温で一晩かく拌した。続いてバッチを真空濃縮し、残渣を約200 mlの酢酸に溶解し、その溶液を18.67 ml（0.197 mol）の無水酢酸で処理した。1時間後、それを再濃縮し、酢酸エチルに溶解し0℃にて5％KHSO4溶液及び飽和NaCl溶液で各3回洗浄した。Na2SO4で乾燥し真空濃縮した後、白色粉末が沈殿した。HPLC：アセトニトリル／水、32.0％アセトニトリルにて溶出；収率：31.3 g（0.102 mol）、78％。
【００１５】
１．３  4-アセチルオキサミジノベンジルアミン x HCl
5 mmolのBoc-4-アセチルオキサミジノベンジルアミドを20 mlの1 N HCl氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で45分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（frit）上でろ過し、新しいエーテルで再洗浄し、真空乾燥させた。定量反応のため、生成物をさらなる精製をすることなく次の合成段階へ使用した。
【００１６】
１．４  Boc-Gly-4-アセチルオキサミジノベンジルアミド
Boc-Gly-OH（Orpegen社、ハイデルベルグ）の4-アセチルオキサミジノベンジルアミンへのカップリングはFrerotら（Tetrahedron 47, 259 ff., 1991）に従って実施した。このために、2.064 g（9.3 mmol）の4-アセチルオキサミジノベンジルアミン x HClと1.629 g（9.3 mmol）のBoc-Gly-OHを約25 mlのDMFに溶解した。次に4.84 g（9.3 mmol）のPyPOPと3.878 ml（27.9 mmol）のTEAを0℃にて加え、TEAを用いてpHを9に調整した。室温で1時間かく拌した後、混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各3回の酸性、塩基性及び中性洗浄に供し、乾燥及び濃縮をした。収率：3 g（8.2 mmol）88％。
【００１７】
１．５  Boc-Gly-4-アミジノベンジルアミド x AcOH
3 g（8.2 mmol）のBoc-Gly-4-アセチルオキサミジノベンジルアミドを200 mlの90％酢酸に溶解した。続いて300 mgの10％活性炭担持型パラジウムをアルゴン下にて加えた。アルゴンを水素雰囲気に置換した後、バッチに24時間勢いよくかく拌しながら水素添加した。触媒をろ過し、ろ液を真空濃縮した。収率：2.9 g（7.9 mmol）96％。
【００１８】
１．６  H-Gly-4-アミジノベンジルアミド x 2HCl
2.9 g（7.9 mmol）のBoc-Gly-4-アミジノベンジルアミドを100 mlの1 N HCl氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で45分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（frit）上でろ過し、生成物を新しいエーテルで再洗浄した。生成物を真空乾燥させた後、さらなる精製をすることなく項１．８での合成に使用した。
【００１９】
１．７  ベンジルスルホニル-D-Ser(Bz)-OH
229 mg（1.173 mmol）のH-D-Ser(Bz)-OHと408μl（2.345 mmol）のDIEAを50 mlの50％アセトニトリルに溶解した。続いて335 mg（1.76 mmol）のベンジルスルホニルクロライドを加え、混合物を室温で12時間かく拌した。混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各3回の酸性及び中性洗浄に供した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、真空濃縮した。収率： 289 mg（0.827 mmol）71％。
【００２０】
１．８  ベンジルスルホニル-D-Ser(Bz)-Gly-4-アミジノベンジルアミド x TFA  151 mg（0.433 mmol）のベンジルスルホニル-D-Ser(Bz)-OHと121 mg（0.433 mmol）のH-Gly-4-アミジノベンジルアミド x 2HClを少量の無水DMFに溶解した。225 mg（0.433 mmol）のPyBOPと230μl（1.32 mmol）のDIEAを氷冷下にて加えた。室温にて1時間かく拌した後、混合物を真空濃縮して生成物をHPLC（アセトニトリル／水、0.1％トリフルオロ酢酸、37.4％アセトニトリルにて溶出）によって精製した。収率： 232 mg（0.356 mmol）82％。
【００２１】
１．９  ベンジルスルホニル-D-Ser-Gly-4-アミジノベンジルアミドx HCl
HPLCで精製した50 mgベンジルスルホニル-D-Ser(Bz)-Gly-4-アセチルオキサミジノベンジルアミド・TFAを50 mlの90%酢酸に溶解し、50 mgの10% 活性炭担持型パラジウムを使用して室温で48時間加水分解する。この後、触媒をろ過し、ろ液を真空濃縮する。生成物をHPLCで精製し(アセトニトリル/H2O、0.1% TFAを含有、分析用HPLCで21.4% アセトニトリルにて溶出)、イオン交換体を使用してHCl形態に変化させる。
収率: 20 mg (0.041 mmol) 54%。
【００２２】
１．１０  ベンジルスルホニル-D-Ser(COO-イソブチル)-Gly-4-アミジノ-ベンジルアミドx HCl
30 mg (0.062 mmol)のベンジルスルホニル-D-Ser-Gly-4-アミジノベンジルアミドx HClを、3 mlのピリジンに1 mlのアセトニトリルを加えたものに室温で溶解する。氷冷しながら16.1 μl (0.124 mmol)のクロロギ酸イソブチルを加える。氷冷しながら混合物を30分間かく拌し、続いて室温で終夜かく拌する。溶媒を減圧留去し、生成物をHPLCで精製し(分析用HPLCで37.9% アセトニトリルにて溶出)で精製し、イオン交換体を使用してHCl形態に変化させる。
収率: 13 mg (0.022 mmol) = 36%。
【００２３】
実施例２
Y = アミジノを有する選択された化合物によるウロキナーゼの阻害
【表１】
0004105540.tif 000004
【００２４】
阻害作用の測定
阻害作用の測定のために、200μlのトリスバッファー（0.05 M、0.154 M NaCl、5％エタノール、pH 8.0；阻害剤を含む）、25 μlの基質（Bz-βAla-Gly-Arg-pNA水溶液）及び50μlのscウロキナーゼを25℃でインキュベートした。3分後、25μlの酢酸（50％）の添加によって反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（MR 5000、ダイナテック社）を用いて405 nmの吸光度を測定した。Ki値はDixonの方法（Biochem. J. 55, 170-171, 1953）に従ってコンピュータープログラムを用いて直線回帰により決定した。Ki値は少なくとも3回の測定の平均を用いた。
【００２５】
使用した略語
Ac    アセチル
Boc    tert-ブチルオキシカルボニル
Bz    ベンジル
DIEA    ジイソプロピルエチルアミン
DMF    N,N-ジメチルホルムアミド
PyBOP    ベンゾトリアゾール-1-イル-N-オキシトリス(ピロリジノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
TEA    トリエチルアミン
TFA    トリフルオロ酢酸
THF    テトラヒドロフラン
Cme    シクロヘキシルメチル
iBu    イソブチル。