(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に、酵素及び該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドをエレクトロポレーション法で導入する方法であって、該方法をカチオンリポソームの共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素が制限酵素であって、ポリヌクレオチドが制限酵素認識部位を有するものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素がトランスポゼースであって、ポリヌクレオチドがトランスポゾンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
酵素と、該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドとが、複合体を形成していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞が、原核生物の細胞であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞が、ラン藻類の細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酵素及び該酵素で認識されるポリヌクレオチドに、カチオンリポソームを混合させた溶液を、冷蔵又は冷凍保存して用いることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞といった、種々の細胞に、酵素とポリヌクレオチドを、効率よく導入し、発現するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞へ、ポリヌクレオチドを導入し、発現することは、遺伝子の機能解析に際し、必須となる技術である。そのため、種々の細胞に、効率よく、ポリヌクレオチドを導入し、発現することを目的として、様々な技術や試薬の改良が、試みられている。
【０００３】
細胞へポリヌクレオチドを導入する方法としては、例えばリポフェクション法、エレクトロポレーション法などが知られている。
【０００４】
リポフェクション法は、正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）を、負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にポリヌクレオチドを導入させる方法である。
【０００５】
エレクトロポレーション法は、短い時間高電圧をかけることによって、細胞膜又は細胞壁を一部破壊し、その間からポリヌクレオチドを導入する方法である。
【０００６】
これらの方法は主にポリヌクレオチドのみを導入する際に用いられてきた手法であり、プラスミド等の導入などには有効であるが、幾つかの問題点もあった。
【０００７】
例えば、リポフェクション法では、適用対象が細胞壁を持たない細胞に限定されていた。一方、エレクトロポレーション法は、細菌類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など、ほとんどの細胞に対して充分な導入効率を示すが、導入されたポリヌクレオチドの安定性については不十分なことがあった。
【０００８】
細胞に導入されたポリヌクレオチドを、一過的に発現するだけでなく、安定的に発現させるためには、ポリヌクレオチドをゲノムに取り込ませることが必要である。ポリヌクレオチドをゲノムへ取り込む工程を効率的に行うための手法として、ポリヌクレオチドと共に制限酵素やトランスポゼースなどの酵素を、主にエレクトロポレーション法によって細胞内に導入する方法が試みられている。この方法によれば、ポリヌクレオチドのみを細胞に導入する方法に比べて、ゲノムへの取り込みが効率よく行われ、安定的な発現が行われることが期待される。
【０００９】
しかし、この場合でも、細胞内への導入効率や発現効率が十分でなく、不安定である場合があった。
【００１０】
更に、酵素とポリヌクレオチドを混合し、複合体を作って後、数日保存してから用いると、導入効率が極端に低下してしまい、酵素とポリヌクレオチドの複合体を安定的に保存させて用いることが難しいという問題もあった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細菌、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など、種々の細胞に対して、効率よく、酵素とポリヌクレオチドを導入することができ、安定的に形質発現を行う方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記従来技術の問題を解消し、ポリヌクレオチドを効率的に細胞に導入する方法を鋭意研究した結果、酵素とポリヌクレオチドを細胞に導入する方法において、更に、カチオン界面活性剤を共存させることにより、酵素とポリヌクレオチドをより効率よく細胞に導入できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明によれば、ポリヌクレオチドの細胞導入を、より効率的に行うことができる。しかも、本発明は、細菌類やラン藻類など、従来カチオン界面活性剤のみを用いた方法では適用が難しかった細胞に対しても、適用することができる。更に、本発明は、カチオン界面活性剤の共存によって、ポリヌクレオチドと酵素との複合体が安定化されることを見出し、従来、効率が悪いとされていた、ポリヌクレオチドと酵素の混合液を保存して用いる技術の改良にも成功した。
【００１４】
即ち、本発明は、次の方法に関する。
【００１５】
１．細胞に、酵素及び該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドを導入する方法であって、該方法をカチオン界面活性剤の共存下に行うことを特徴とする方法。
【００１６】
２．酵素が制限酵素であって、ポリヌクレオチドが制限酵素認識部位を有するものであることを特徴とする、前記項１記載の方法。
【００１７】
３．酵素がトランスポゼースであって、ポリヌクレオチドがトランスポゾンであることを特徴とする、前記項１記載の方法。
【００１８】
４．酵素と、該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドとが、複合体を形成していることを特徴とする、前記項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１９】
５．細胞に、酵素及び該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドを導入する方法が、エレクトロポレーション法であることを特徴とする、前記項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００２０】
６．細胞が、ラン藻類の細胞であることを特徴とする、前記項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２１】
７．酵素及び該酵素で認識されるポリヌクレオチドに、カチオン界面活性剤を混合させた溶液を、冷蔵又は冷凍保存して、用いることを特徴とする、前記項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００２３】
本発明の遺伝子導入方法を適用できる細胞としては、細菌、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など、種々の細胞が挙げられる。
【００２４】
本発明は、特に、ラン藻細胞、細菌等の原核生物等に対して、効率的に、遺伝子を導入し得る点で、有用な方法である。
【００２５】
本発明においては、酵素と、該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドとを用いる。
【００２６】
酵素と、該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドの組合せとしては例えば、トランスポゾンとトランスポゼース、制限酵素と制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００２７】
以下、（１）トランスポゾンとトランスポゼースを用いる場合、（２）制限酵素と制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドを用いる場合について、具体的に説明する。
【００２８】
（１）トランスポゾンとトランスポゼースを用いる場合
ここで、トランスポゾンとは、あるオリゴヌクレオチドから他のオリゴヌクレオチドへ転移できる特別なＤＮＡ断片を意味する。トランスポゾンは、両端に、逆向きあるいは同じ向きの繰り返し構造を有している。トランスポゼースとは、トランスポゾンの転移に必要な酵素である。
【００２９】
トランスポゾンとしては、例えば、Tn5、Tn10、Tn3、Tn1721、Tn7、Mu、Ty1、Tc1、Himar1、PiggyBac、R2-element、Line-1等が挙げられる。
【００３０】
トランスポゼースとしては、Tn5、Tn10、Tn1721、Tc1、Himar1、PiggyBac等のそれぞれのトランスポゾンに特有なトランスポゼースが用いられる。
【００３１】
このトランスポゾンとトランスポゼースを用いたシステムにより、挿入できる遺伝子としては、例えば、カナマイシン（Kanamycin）耐性遺伝子やクロラムフェニコール（Chloramphenicol）耐性遺伝子などのマーカー遺伝子、構造遺伝子、調節遺伝子など、種々のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
（２）制限酵素と制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドを用いる場合ここで、用いるポリヌクレオチドとしては、標的となる遺伝子と、制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドであれば、特に限定されない。
【００３３】
制限酵素としては、例えば、  EcoRI、BamHI  等の生化学に一般に用いられている制限酵素を用いることができる。
【００３４】
この、制限酵素と制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドを用いたシステムにより、挿入できる遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子、構造遺伝子、調節遺伝子など、種々のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
次に、本発明で用いるカチオン界面活性剤について説明する。
【００３６】
本発明において、カチオン界面活性剤とは、不飽和度が低い炭素分子鎖を主体とする分子の片端に、カチオンとなる原子団を有する荷電した分子を意味する。カチオン荷電分子の例として、アミン塩、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩などが挙げられる。また、炭素分子鎖を主体とする分子の例として、カチオンリポソームの主体となっている脂肪酸の他に、ベンゼン環に官能基を導入したものや、窒素を含む炭素環化合物、例えば、(S)-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボン酸、(S)-2-メチル-5-ヒドロキシ-1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボン酸等が挙げられる。
【００３７】
具体的には、カチオン界面活性剤としてカチオンリポソーム等が用いられる。
【００３８】
細胞に、酵素と該酵素で認識されるポリヌクレオチドを導入する手法としては、効率的に導入し得るものであれば、特に限定されない。例として、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、カーボンウイスカー法、又はカルシウム法などの化学的手法等が挙げられる。
【００３９】
中でも、エレクトロポレーション法が、導入効率が高いという点において、好ましい。
【００４０】
本発明においては、上記、酵素と該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドとを、カチオン界面活性剤の共存下に、細胞に導入することによって、より高い効率で細胞導入を行うことができ、また、安定的に形質転換を行うことができる。
【００４１】
オリゴヌクレオチドであるプラスミドと酵素それぞれ単独でのカチオン界面活性剤との効果を見るために、例えば、エレクトロポレーション法で細胞に導入する場合、プラスミド単独で用いたものと、プラスミドとカチオン界面活性剤を共存させたものを比較した場合、後者はその形質転換株の取得率が１０%以下に減少する。即ち、オリゴヌクレオチド、酵素それぞれ単独では、カチオン界面活性剤との形質導入の効率向上の効果は期待できない。
【００４２】
また、酵素とカチオン界面活性剤だけを共存させた場合、形質導入そのものが起こらない。
【００４３】
本発明において、酵素と該酵素で認識される配列を有するポリヌクレオチドとカチオンリポソームを混合させた溶液は、冷蔵又は冷凍保存して、用いることもできる。
【００４４】
冷蔵の場合には、２週間、０〜４℃の範囲で保存可能である。また、冷凍の場合には、２ヶ月間、−２０〜−３０℃の範囲で、保存可能である。特に、凍結後の融解は氷の上で行うことが望ましい。また、凍結融解を繰り返すことは好ましくない。
【００４５】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
【実施例】
実施例１
（１）Tn5トランスポゼースをCRUZらの手法(Journal of Bacteriology、Vol．175、 No.21、 p．6932−6938、1993)により精製した。
（２） カナマイシン耐性のTn5トランスポゾンEZ::TNTM<KAN2>Transposon (EPICENTER TECHNOLOGIES社) 15μg/ml溶液 0.4μl(0.0075pmol)とTn5トランスポゼース0.4μl(0.1pmol相当)を静かにタッピングにて混合し、37℃にて10分間インキュベートした。
（３）インキュベートした混合物を0.4μlずつ分注し、片方はそのまま、もう片方にカチオンリポソーム DOTAP Liposomal Transfection Reagent(Roche社)0.4μlを室温にて混合した。
（４）大腸菌エレクトロコンピテントセルDH5α(TAKARA)を用いて、形質転換したところ、トランスポゾン１μgあたり、カチオンリポソームを混ぜた方では3.0×105株のカナマイシン耐性の形質転換株が得られた。
（５）この際に得られた形質転換株にはプラスミドは存在せず、これらの形質転換体がトランスポゼースによってゲノムに遺伝子が導入されたものであることがわかった。
【００４７】
比較例１
カチオンリポソームを用いない以外は、実施例１と同様の方法で行った。カナマイシン耐性の形質転換株は、2.0×103株得られた。
【００４８】
実施例２
（１）クロラムフェニコール耐性プラスミドpHSG397より、クロラムフェニコール耐性遺伝子部をPCR法により増幅するためのプライマーを設計し、末端にEcoRI制限酵素サイトを付加し、同プラスミドをテンプレートとして増幅した。
（２）PCR産物をDNA精製カラムS-400(アマシャムファルマシア社)により精製し、濃度を50μg/mlに調整した。
（３）制限酵素EcoRI 10unit/μl  1μlとPCR産物1μlをタッピングにて混合し、37℃にて10分間インキュベートした。
（４）インキュベートした混合物を0.4μlずつ分注し、カチオンリポソーム DOTAP Liposomal Transfection Reagent(Roche社)0.4μlを室温にて混合した。
（５）大腸菌エレクトロコンピテントセルDH5α(TAKARA)を用いて、トランスフォーメーションしたところ、プラスミド1μgあたり、カチオンリポソームを混ぜた方では5.0×102株のクロラムフェニコール耐性の形質転換株が得られた。
（６）この際に得られた形質転換株にはプラスミドは存在せず、これらの形質転換体が制限酵素によりゲノムに遺伝子が導入されたものであることがわかった。
【００４９】
比較例２
カチオンリポソームを用いない以外は、実施例２と同様の方法で行った。得られた形質転換株は、4.0×101株であった。
【００５０】
実施例３
実施例１において、カチオンリポソームを混合させた溶液を、２週間４℃にて冷蔵保存して用いる以外は、実施例１と同様の手法により、行った。得られた形質転換株は、2.8×105株であった。
【００５１】
比較例３
比較例１において、カチオンリポソームを混合させていない溶液を、２週間４℃にて冷蔵保存して用いる以外は、比較例１と同様の手法により、行った。得られた形質転換株は、8.0×101株であった。
【００５２】
【発明の効果】
上記実施例に示されるように、本発明によれば、カチオン界面活性剤を共存させることによって、ポリヌクレオチドと酵素の複合体を、より高い効率で、細胞に導入させ、安定的に形質転換を行うことができる。
【００５３】
また、本発明の方法は、細菌類、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など、種々の細胞に、適用することができる。
さらに、本発明における、酵素とポリヌクレオチドに、カチオン界面活性剤を混合させた溶液は、冷蔵又は冷凍保存しても、導入効率をそれ程低下させずに用いることができるという効果も奏する。