(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の蛋白質に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項６記載の上記抗体。
【請求項８】
ヒト型化抗体である、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１又は２記載のＤＮＡと1mM EDTA ナトリウム、0.5M リン酸水素ナトリウム（pH7.2）、７％SDS 水溶液中で６５℃でハイブリダイズさせ、1mM EDTA ナトリウム、４０mM リン酸水素ナトリウム（pH7.2）、１％SDS 水溶液中で６５℃で洗浄するストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９記載のポリヌクレオチドをプローブとして使用する前立腺癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む癌関連遺伝子、該ＤＮＡにコードされる組換え蛋白質、該蛋白質に結合する抗体、該抗体を含む抗癌剤、及び、該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、ヒトゲノムの塩基配列に関する情報が日々産出されている。
ヒトゲノム計画の最終目的は単にゲノム全塩基配列を決定することではなく、その構造情報、即ち、ＤＮＡの塩基配列情報からヒトのさまざまな生命現象を読み解くことにあろう。
ヒトゲノム配列中で蛋白質をコードしている領域はその極一部であり、現在は、ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルと呼ばれる情報科学の手法を用いて、そのコード領域の予測が行われている。しかしながら、それらの予測精度はまだ充分なものではない。
今回、本発明者は新規な遺伝子を見出すべく、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト成人海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、蛋白質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングすることに成功し、それらの塩基配列を決定して本発明を完成させた。
発明の開示
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう。又、本発明はこれらＤＮＡを含む遺伝子にも係る。
更に、本発明の第三の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、及び、本発明遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質に係る。
更に、本発明の第四の態様として、上記蛋白質に結合する各種抗体に係る。
更に、本発明の第五の態様として、抗体を含む各種抗癌剤に係る。
更に、本発明の第六の態様として、上記蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質又はその部分ペプチドに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質又はその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む前記方法、に係る。
更に、本発明の第七の態様として、本発明ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドに係る。
更に、本発明の第八の態様として、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法、に係る。
発明を実施する為の最良の形態
［本発明ＤＮＡ］
本発明ＤＮＡは、市販されている（クロンテック社）ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト成人海馬及びヒト胎児全脳のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。
即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．４，５３−５９（１９９７））に従って調製したヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト成人海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローンをランダムに単離する。
次に、ハイブリダイゼーションにより、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除き、その後インビトロでの転写翻訳を行い５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンについてその両末端の塩基配列を決定する。
更に、こうして得られた末端塩基配列をクエリーとして既知遺伝子のデータベースにて相同性検索を行い、その結果、新規であることが判明したクローンについて全塩基配列を決定する。
また、上記のスクリーニング法に加えて、ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列をヒトのゲノム配列に対応させ、それらが挟む領域に未知の長鎖遺伝子が確認された場合には、そのｃＤＮＡの全長解析をおこなう。
このようにして既知の遺伝子に依存した従来のクローニング方法では得られなかった未知の遺伝子も、システマチックにクローニングを行なうことができる
又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、本発明ＤＮＡを含むヒト由来遺伝子の全領域を調製することも可能である。
このようにして本発明ＤＮＡを有するクローン（ＫＩＡＡ１７４２）を得ることが出来る。該クローンに含まれる遺伝子にコードされる本発明蛋白質の機能等については、本明細書中に示されている。
本発明ＤＮＡのクローニングの別の手段としては、本発明ポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを作成し、適当なライブラリーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。また、ヒトの脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１又は配列番号：２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列を意味する。
従って、本発明の配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、該アミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性（機能）が性質的に同質であることを示す。
又、本発明ポリペプチドには、例えば、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドも含まれる。
上記の配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同質の生物学的活性を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
更に、本発明ＤＮＡは、配列番号：１又は配列番号：２に示される塩基配列において、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡを包含する。
かかる条件下で、配列番号：１又は配列番号：２に示される塩基配列において、配列番号：１又は配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、０．５Ｍリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ水溶液中でハイブリダイズさせ、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、４０ｍＭリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ水溶液中でメンブレンを洗浄する条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
クローン化された本発明ＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
［本発明ポリゴヌクレオチド］
本発明ＤＮＡ（遺伝子）は、以下の実施例で示されるように、癌細胞で高発現していることから、本発明遺伝子を検出することにより、かかる癌の検出を行うことが可能である。
従って、配列番号：１又は配列番号：２に示された塩基配列を含む本発明ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクオチドは、このような癌の検査にプローブとして使用することが出来る。
このようなポリヌクオチドの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上、更に好ましくは５００塩基以上、特に好ましくは１０００塩基以上である。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、０．５Ｍリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ水溶液中でハイブリダイズさせ、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、４０ｍＭリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ水溶液中でメンブレンを洗浄する条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡにハイブリダイズする程度の条件である。
［本発明蛋白質］
本発明蛋白質は、当業者に公知の任意の方法によって、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換させた形質転換体を培養し、本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することによって、容易に調製することが出来る。
上記発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、サッカロマイセス  ピキア  パストリス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｃｊｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
このようにして得られた、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物から本発明ポリペプチド又は蛋白質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
［本発明抗体］
本発明の抗体は、本発明蛋白質と結合する限り特に制限はなく、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの等を含む。尚、本発明抗体は、本発明蛋白質と特異的に結合することが好ましい。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明蛋白質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
本発明蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的の本発明蛋白質を公知の方法で精製する。
次に、この本発明蛋白質を感作抗原として用いる。あるいは、本発明蛋白質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドは本発明蛋白質のアミノ酸配列より当業者に公知の一般的な方法による化学合成により得ることができる。
ここで、本発明の蛋白質の部分ポリペプチドとしては、例えば、本発明蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部分ポリペプチドとしては、例えば、後述するような各機能ドメインを含むものが特に好ましい。又、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明抗体は、本発明蛋白質の検出、精製等に用いることが出来、又、以下の実施例で示されるように本発明遺伝子は癌細胞で高発現しているので、本発明抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、細胞増殖を抑制し得ることから、本発明抗体の認識する本発明蛋白質分子上のエピトープは特定のものに限定されず、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明抗体を作製するための抗原は、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明蛋白質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、本発明蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる本発明蛋白質を投与して本発明抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から本発明蛋白質に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、本発明抗体を産生するハイブリドーマから、本発明抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする本発明抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される本発明抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギのカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず本発明蛋白質に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＥａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した本発明抗体を使用することもできる。抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞障害性物質などを結合することも可能である。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は本発明蛋白質分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が本発明蛋白質を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、本発明蛋白質を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、本発明蛋白質をコーティングしたプレートに、本発明抗体を含む試料、例えば、本発明抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明抗体は細胞障害活性を有していてもよい。本発明における細胞障害活性とは、例えば補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
本発明抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、例えば、細胞障害活性の測定は以下の方法により行うことが可能である。
・エフェクター細胞の調整
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調整する。
・補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
・標的細胞の調整
本発明蛋白質発現細胞（前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、大腸癌細胞など）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調整する。
・ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
・ＣＤＣ活性の測定
９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
［本発明抗癌剤］
本発明の抗癌剤（癌治療剤）の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。また、本発明の治療剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。本発明の治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合には、溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。本発明の治療剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
［本発明蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法］
本発明の蛋白質は、これに結合する物質のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、これに結合する化合物を含むと予想される被験試料とを接触せしめ、本発明の蛋白質と被験試料との結合活性を検出し、本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。被験試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、また、膜画分として被験試料に接触させることができる。本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質（リガンド等）をスクリーニングする方法としては当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニング方法としては、例えば、免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ．，（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ，６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））、アフィニティクロマトグラフィーを利用した方法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−４６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｌｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−１７）などが当業者に公知である。
本発明のスクリーニング方法により単離され得る化合物は、本発明の蛋白質とリガンドとの結合を阻害するための物質となり得る為、抗癌剤への応用が考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法により単離された化合物と薬理学上許容される担体とを混ぜ合わせて抗癌剤を製造することも可能である。
［その他］
本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）としては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と好ましくは約９０以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子をプローブとして使用することにより、本発明ポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
更に、本発明ＤＮＡ又は遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明ＤＮＡ又は遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明の蛋白質等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。
本発明ＤＮＡ又は遺伝子を、該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
又、本発明のＤＮＡ若しくは遺伝子又はそれらの一部の塩基配列に基づき作成した合成ＤＮＡプライマーを使用し、ヒトの血液又は組織から抽出した染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を決定することにより、本発明のＤＮＡ又は遺伝子中にある個体によって異なる一塩基の変異、即ち、ｃＳＮＰｓを見出すことが出来る。これにより、個体の体質等が予測され、各自に適した医薬の開発等が可能となる。
又、クロスハイブリダイゼーションにより、マウス等のモデル生物における本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対するオルソログ（ホモログ、カウンターパート）遺伝子を単離し、例えば、これら遺伝子をノックアウトすることによってヒトの疾患モデル動物を作成し、ヒトの病因となる遺伝子を探索・同定することも可能である。
尚、本明細書および表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
実施例
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に記載されている方法に従った。
（１）ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト成人海馬及びヒト胎児全脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（インビトロジェン社）をプライマーとして、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト成人海馬及びヒト胎児全脳由来ｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（インビトロジェン社）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）にエレクトロポレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。
（２）スクリーニング（その１）
次いで、こうして構築したｃＤＮＡライブラリーからランダムにクローンをピックアップし、メンブランにスポッティングした。次に、これまでに本発明者等によって既に全長の解析が行われている約１，３００個のクローンの塩基配列に基づき作成したオリゴＤＮＡ（各２１塩基）の混合物の各３’末端をターミナルトランスフェラーゼでＤＩＧラベルし、これらをプルーブとして使用してドットハイブリダイゼーション（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７））により、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除いた。
次に、インビトロでの転写翻訳（プロメガ社  ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を行い、５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンを選択した。
次に、選択したクローンの末端塩基配列を決定し、得られた配列をクエリーとして相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ  ２．２．１（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），″Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ″，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて、ｎｒ（Ａｌｌ  ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｂｕｔ  ｎｏ  ＥＳＴ，ＳＴＳ，ＧＳＳ，ｏｒ  ｐｈａｓｅ  ０，１  ｏｒ  ２ＨＴＧＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））データベースに対して相同検索を行った。その結果、相同遺伝子が存在しなかったもの、即ち、新規遺伝子であるものについて全塩基配列を決定した。
スクリーニング（その２）
ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．１を用いて、ヒトのゲノム配列（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。
次に、それらが挟むゲノム領域から、Ｇｅｎｓｃａｎプログラム（Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．１９９７，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８，７８−９４、ゲノムから遺伝子を予測するコンピューターソフト）を用いて、コードされる遺伝子を抜き出した。これをクエリーとして、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．１．３を用いて、ｍｅｒｇｅｄｂ（かずさＤＮＡ研究所で決定したヒトのｃＤＮＡの配列とＧｅｎＢａｎｋのｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓデータベースからＥＳＴとゲノムを除いたものを重複なく混ぜ合わせた、かずさＤＮＡ研究所で独自に作成したＤＮＡ配列データベース）に対応させ、新規の長鎖（Ｇｅｎｓｃａｎ予想ｃｄｓが１２００ｂｐ以上）遺伝子が確認された場合には、５’および３’の末端配列決定をおこなったｃＤＮＡの全長解析をおこなった。
配列決定には、ＰＥアプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
このようにして新規ＤＮＡ又は遺伝子のスクリーニングを行なった。その結果、クローンｐｊ０１３０４を見出した。更に、上記の小原らの方法で作成した脳のｃＤＮＡライブリーから単離した約１０万個のクローンの５’及び３’の末端配列と約２０００個の全長クローン配列をアッセンブルし、同じ遺伝子由来のｃＤＮＡクローンのグループ化を行った。
その結果、最終的に、クローンｐｊ０１３０４を含むグループの中に、クローンｐｊ０１３０４の上流領域を含む、クローンｈｊ０５４４３を見い出した。
次に、クローンｈｊ０５４４３からクローンｐｊ０１３０４の上流領域を切り出し、ｐｊ０１３０４に繋ぎ合わせることにより、最終的に、配列表の配列番号：１又は配列番号：２に示された本発明の新規ＤＮＡ又は遺伝子を含むクローンｐｊ０１３０４ｓ１（ＫＩＡＡ１７４２）を得た。クローンｐｊ０１３０４ｓ１の１ｂｐから８２０ｂｐは、クローンｈｊ０５４４３に由来し、クローンｐｊ０１３０４ｓ１の８２１ｂｐから５０３５ｂｐはクローンｐｊ０１３０４に由来する。
（３）本発明遺伝子にコードされる蛋白質の発現
インビトロでの転写翻訳系（プロメガ社，ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｉｏｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を用いて、ｃＤＮＡクローンｐｊ０１３０４からの遺伝子産物を発現させた。
３５Ｓ標識メチオニンを取り込ませた産物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ゲルを乾燥させ、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）のシステムでオートラジオグラフィーをおこない、クローンｐｊ０１３０４の遺伝子産物を検出した。
その結果、１３５ｋＤａのサイズマーカーに対応する位置に、クローンｐｊ０１３０４の転写翻訳産物と思われるバンドを確認した。
Ｐｊ０１３０４がコードするタンパク質は、最初のメチオニンから数えると１１３７アミノ酸残基からなり、分子量は、約１２４ｋＤａと予想され、実験結果によく一致するものであった。
（４）本発明ＤＮＡの相同性検索
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、クローンのアミノ酸配列を既知配列ライブラリーｎｒに対して解析プログラムＢＬＡＳＴＰ  ２．２．１（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），″Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ″，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて検索したところ、以下の表１に示した遺伝子と相同性を示すことが明らかになった。表１には、該相同遺伝子に関する情報、即ち、その名称、データベースＩＤ、生物種、蛋白質長、及び記載文献が挙げられている。尚、表１中の各項目の意味は以下の通りである。
「相同領域  クローン」クローンの相同領域の起点及び終点
「相同領域  相同遺伝子」相同遺伝子の相同領域の起点及び終点
「Ｓｃｏｒｅ」この値が高ければ高いほど信頼度が高い
「Ｅ−ｖａｌｕｅ」この値が０に近ければ近いほど信頼度が高い
「相同性」相同領域のアミノ酸残基の一致の割合
「相同範囲率」相同遺伝子中の相同領域の割合
0004125595.tif 000002
（５）各種ドメインの検索
本発明ＤＮＡ（ＫＩＡＡ１７４２遺伝子）は１２４５個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする５０３５ｂｐからなる遺伝子である。ＨＭＭＥＲ２．１．１（Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ．Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：７５５−７６３，１９９８．）によるモチーフ検索の結果、アミノ酸１４５番−９５４番の領城にｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｄのシグナルに関与するＰａｔｃｈｅｄ  ｆａｍｉｌｙのモチーフが存在した。
又、Ｓｏｓｕｉ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（１９９８）Ｍａｙ；１４（４）：３７８−３７９．）による検索の結果、以下の表２に示されるように、１２個の膜貫通領域の存在が予測された。アミノ酸３９番目から３２８番目の領域（１番目と２番目の膜貫通領域の間）、５６０番目から８０２番目の領域（７番目と８番目の膜貫通領域の間）の２個所が大きなループを形成していることが予想される。この構造は図１にあるようなＰａｔｃｈｅｄ（Ｃｅｌｌ  ５９，７５１（１９８９）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒ（２００１）１７３，１−７）の構造と非常に類似している。
0004125595.tif 000003
表２の簡単な説明
Ｓｏｓｕｉで予測された１２個の膜貫通領域のアミノ酸配列と位置を示す。
Ｎｏ．は何番目の膜貫通領域であるかを示す。Ｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌは膜貫通領域のＮ末端のアミノ酸の番号を、Ｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌは膜貫通領域のＣ末端のアミノ酸の配列を示す。Ｌｅｎｇｔｈは膜貫通領域の長さを示す。
ＰａｔｃｈｅｄはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで見つかった１２回膜貫通蛋白質であり、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｄのシグナルを遮断するｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒとして働く。Ｐａｔｃｈｅｄは２つの大きな親水性の細胞外のループを持っており、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｄと直接あるいは間接に相互作用してシグナルを伝えるが、Ｈｅｄｇｅｈｏｇの結合により、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｄのシグナルの遮断が解除されることがｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａの原因ではないかと想定されている。ＰａｔｃｈｅｄはＢＭＰなどＴＧＦβやＷｎｔファミリーのメンバーの転写を調節していることが知られている。（ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９８）１７，３５０５−３５１１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒ（２００１）１７３，１−７）。Ｈｐｔｃ（ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｔｏｐｔｃ）は皮膚癌に関与していることが報告されている（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２００１）１５８，３８１−３８５，ＰＮＡＳ（１９９９）９６，５１１７−５１２２）。
同じＰａｔｃｈｅｄファミリーに属する本発明蛋白質についてはＰａｔｃｈｅｄファミリーのＤｉｓｐａｔｃｈｅｄとアミノ酸配列の同一性３１％であり、Ｐａｔｃｈｅｄと同じく１２回膜貫通型の膜蛋白質である。遺伝子の発現分布から本発明蛋白質は前立腺がんや卵巣がんにおいて発現の上昇が見られることから、Ｐａｔｃｈｅｄのような癌抑制遺伝子ではなく癌遺伝子として機能していることが類推される。２つの大きな細胞外ループが存在しており、Ｐａｔｃｈｅｄと同じようにこのループを介してＳｍｏｏｔｈｅｎｄまたは別の蛋白質と相互作用して癌化のシグナルを伝達していることが考えられる。あるいは、本発明蛋白質はＨｅｄｇｅｈｏｇとＰａｔｃｈｅｄの結合に対して競合的には働き、癌化のシグナルを伝達している可能性もある。
以上の知見から、本発明ＤＮＡの生物学的活性（機能）としては、癌に関連した遺伝子であり、本発明蛋白質へのリガンドの結合を阻害すること等により癌を抑制することが可能であるものと考えられる。
従って、本発明抗体は本発明蛋白質の検出等だけでなく、前立腺癌、及び卵巣癌などの癌の治療薬又は予防薬として用いることもできる。
（６）リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析
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物の量を各種組織のｃＤＮＡを用いて解析した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の解析には、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社＃４３１０８８４Ｅ）を使用した。ＰＣＲ反応の組成は、１．２５μｌ  ２０Ｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｉｘ（ＧＡＰＤＨ），ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社＃９９２０）６．２５μｌ，ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０４４３７）１２．５μｌを混合したＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに対してクロンテック社のＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ｃＤＮＡ５μｌを加えて２５μｌとして、ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（ＡＢＩ社＃Ｎ８０１−０５６０）上でＡＢＩ社ＡＢＩ
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秒−６０度１分を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ｃＤＮＡはクロンテック社のＨｕｍａｎ  ＭＴＣＴＭ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（Ｋ１４２０−１）、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣＴＭ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩ（Ｋ１４２１−１）、Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＭＴＣＴＭ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（Ｋ１４２２−１）を使用した。
本発明遺伝子の発現量については、プライマー１７４２−３５３８（５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＧＧＣＴ−３’）、プライマー１７４２−３６５８（５’−ＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧ−３’）を使って遺伝子増幅を行なった。１０μＭのプライマー１７４２−３５３８  ０．５μｌ、１０μＭのプライマー１７４２−３６５８  ０．５μｌ、６．５μｌのＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ、１２．５μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０９１５５）を混合し２０μｌとして、これに対してクロンテック社のＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  ｃＤＮＡ１μｌ及びＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（処理水）４μｌを加えて２５μｌとした。ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏ  Ａｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ
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を用いて５０度２分、９５度１０分、９５度２０秒−５９度３０秒−７２度３０秒を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量をスタンダードコントロールとしておいたＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ添付のｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＤＮＡを標準曲線を引き、それをもとにして相対値を算出した。本発明遺伝子がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされているベクターを４０ｐｇ／μｌに調製し、５倍ずつ希釈した溶液を用意してリファレンスとして使用した。本発明遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子の発量で割って得られた相対値で、各組織での発現量を比較した結果を以下の表３に示す。
表３において、左側は組織の名前を示し、右側の数値は各々の組織におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を使ってノーマライズしたＫＩＡＡ１７４２遺伝子の発現量を示している。前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ）の値を１として他の組織での発現量を相対値として示した。
この表３から判るように、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）において高値を示した。
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（７）染色体位置
更に、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  ＥＬＩＳＡを用いて、本発明遺伝子が小脳で発現されていることを確認した。又、本発明のクローンのＤＮＡ配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ  ２．２．１を用いてヒトゲノムをコードするクローンのライブラリー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。その結果、本発明遺伝子は第１５染色体に位置することが判明した。
（８）ｐｊ０１３０４ｓ１（ＫＩＡＡ１７４２）遺伝子ファミリーの取得
ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子のＤＮＡ配列をＢＬＳＴＮ２．２．１を用いて、ヒトゲノム配列（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対して相同検索を行ったところ、特定のゲノム断片（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＮＴ＿０１０１９４．６）にヒットした。
このゲノム断片から、Ｇｅｎｓｃａｎプログラム（Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．１９９７，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８，７８−９４、ゲノムから遺伝子を予測するコンピューターソフト）を用いて、ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子に高い相同性（ＤＮＡレベルで１００％、タンパク質レベルで１００％、ＧｅｎＷｏｒｋｓ（インテリジェネティクス社）でアラインメントを持つｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子を見い出した。その、塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２として示す。ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子は１４９２個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする４４７９ｂｐからなる遺伝子である。
更に、ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子及びｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子にコードされるアミノ酸のアライメントを以下の表４に示す。表４から明らかなように、ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子にコードされる第２４８〜１４９２番目のアミノ酸配列は、ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子にコードされる第１〜１２４５番目のアミノ酸配列と同一であり、ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子は、ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子の更に５’上流に第１〜２４７番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることが判る。従って、ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子とｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子は、同一のゲノムから、選択的スプライシングの結果得られたものであると考えられる。又、ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子も、ｐｊ０１３０４ｓ１遺伝子と同じドメインを有しているために、同様な機能を示すものと考えられる。従って、ｐｊ０１３０４ＧＳ遺伝子及びそれにコードされる蛋白質も、夫々、本発明ＤＮＡ及び本発明蛋白質に包含される。
尚、同業者であれば、ＲＴ−ＰＣＲなどをもちいて、この遺伝子を得ることは容易である。具体的には、上流プライマー５’−ＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号２の１ｂｐから２０ｂｐ）と下流プライマー５’−ＣＡＡＧＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＧ−３’（配列番号２の５８８ｂｐから６０７ｂｐ）を用いて、ヒトの成人の小脳のｍＲＮＡから、ランダム配列プライマーを用いて逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行う。得られたＤＮＡをｐｊ０１３０４ｓ１にＬｉｃ方等（Ｃｈｕａｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  ２５；２０（４１６５−４１６６）を用いてつなぐことにより、ｐｊ０１３０４ＧＳタンパク質をコードするクローンを得る。
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産業上の利用分野
以上の知見から、本発明ＤＮＡは癌に関連した遺伝子であり、本発明蛋白質へのリガンドの結合を阻害すること等により癌を抑制することが可能であると考えられる。
従って、本発明抗体は本発明蛋白質の検出等だけでなく、前立腺癌、卵巣癌などの癌の治療薬又は予防薬として用いることもできる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
本発明蛋白質（ｐｊ０１３０４ｓ１）及び（ｐｊ０１３０４ＧＳ）とＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＰａｔｃｈｅｄ蛋白質構造を模式的に示した。膜貫通領域、細胞外ドメインは、それぞれ塗りつぶし、薄い塗りつぶしで示されている。図１から、大きな細胞外ドメインが２つ存在することがわかる。
【図１】
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