(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、少なくとも１つの脂質種、及び少なくとも１つのポリカチオンを含み、ｐＨ６．０〜８．０で正味の正電荷を有する、非共有結合性の核酸／脂質／ポリカチオン複合体の製造方法であって、該複合体の製造をもたらす核酸対脂質種対ポリカチオンの比で、該核酸を、少なくとも１つの脂質種及び少なくとも１つのポリカチオンを含む溶液と混合することを含み、該ポリカチオンが、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、ポリリシン、臭化ヘキサジメトリン、ヒストン、カチオン性デンドリマー、スペルミン、スペルミジン、及びポリリシン又は核局在配列を含むペプチドからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
核酸に対する脂質の比が、核酸１μｇ当たり脂質０．１nmol〜２００nmolの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸に対する脂質の比が、核酸１μｇ当たり脂質１nmol〜２５nmolの範囲である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ポリカチオン：核酸の比が、核酸１μｇ当たりポリカチオン０．０１μｇ〜１００μｇの範囲である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
脂質種が、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
脂質種が、カチオン性脂質及び中性リン脂質を含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールである、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
中性リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
ポリカチオンが、３００〜２００，０００の分子量を有する、請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリカチオンが、３００〜２００，０００の分子量を有するポリ−Ｌ−リシンである、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該ポリカチオンが、３００〜２００，０００の分子量を有するポリ−Ｌ−リシンであり、該カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールであり、及び中性リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項６〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリカチオンが、ポリリシンを含むペプチドである、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ポリカチオンが、核局在配列を含むペプチドである、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
核局在配列が、ＳＶ４０ラージＴ抗原から誘導される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該複合体が、４００nm未満の平均直径を有する、請求項１〜１４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該方法がさらに、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過及び相分配からなる群より選択される方法によって該複合体を精製する工程を含む、請求項１〜１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸、少なくとも１つの脂質種、及び少なくとも１つのポリカチオンを含み、ｐＨ６．０〜８．０で正味の正電荷を有する、非共有結合性の核酸／脂質／ポリカチオン複合体であって、該複合体の製造をもたらす核酸対脂質対ポリカチオンの比で、少なくとも１つの脂質種及び少なくとも１つのポリカチオンの溶液を該核酸と混合することによって製造され、該ポリカチオンが、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、ポリリシン、臭化ヘキサジメトリン、ヒストン、カチオン性デンドリマー、スペルミン、スペルミジン、及びポリリシン又は核局在配列を含むペプチドからなる群より選択されることを特徴とする、該複合体。
【請求項１８】
核酸に対する脂質の比が、核酸１μｇ当たり脂質０．１nmol〜２００nmolの範囲である、請求項１７記載の複合体。
【請求項１９】
核酸に対する脂質の比が、核酸１μｇ当たり脂質１nmol〜２５nmolの範囲である、請求項１８記載の複合体。
【請求項２０】
ポリカチオン：核酸の比が、核酸１μｇ当たりポリカチオン０．０１μｇ〜１００μｇの範囲である、請求項１７〜１９いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２１】
脂質種が、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む、請求項１７〜２０いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２２】
脂質種が、カチオン性脂質及び中性リン脂質を含む、請求項１７〜２１いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２３】
ポリカチオンが、３００〜２００，０００の分子量を有する、請求項１７〜２２いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２４】
該ポリカチオンが、３００〜２００，０００の分子量を有するポリ−Ｌ−リシンであり、該カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールであり、中性リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項２２又は２３記載の複合体。
【請求項２５】
ポリカチオンが、ポリリシンを含むペプチドである、請求項１７〜２３いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２６】
ポリカチオンが、核局在配列を含むペプチドである、請求項１７〜２３いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２７】
核局在配列が、ＳＶ４０ラージＴ抗原から誘導される、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
該複合体が、４００nm未満の平均直径を有する、請求項１７〜２７いずれか１項に記載の複合体。
【請求項２９】
該複合体が、実質的に非複合の核酸、リポソーム及びポリカチオンを含まない、請求項１７記載の複合体。
【請求項３０】
請求項１７〜２９いずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
核酸を細胞に送達する方法であって、細胞を請求項１７〜２９いずれか１項に記載の複合体とインビトロで接触させることを特徴とする該方法。
【請求項３２】
請求項１７〜２９いずれか１項に記載の複合体及び細胞からなる組成物であって、該複合体を細胞にインビトロで接触させる組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、カチオン性脂質、及び核酸又はタンパク質のような他の巨大分子の運搬用担体としてのこれらの用途に関する。更に具体的には、本発明は、安定で、生物学的に活性で、集中させうる脂質含有薬剤送達複合体、及びこれらの製造方法に関する。
発明の背景
タンパク質又は核酸のような巨大分子を治療剤として使用する新しい形の治療法の開発により、このような巨大分子をこれらの適切な細胞標的に送達する新規で有効な手段を開発する必要が生じた。特異的なポリペプチド成長因子の使用、又は欠失若しくは欠損した遺伝子を置換若しくは補足する特異的な遺伝子の使用のいずれかに基づく治療は、このような新規送達システムが必要とされうる治療の例である。このような治療の臨床適用は、新規な送達システムの有効性だけでなく、これらの安全性、並びにこれらのシステムの基礎をなす技術の、治療用製剤の大規模な薬剤製造、貯蔵、及び販売への適用の容易さにも依存する。遺伝子治療は、種々の遺伝子疾患を治療するためのますます重要な方法になってきている。有効な治療、更には治癒さえをも提供する可能性により、有効な治療法のなかった疾患に対してこの技術を適用するための集中的な努力が進められてきた。この分野の最近の進歩は、遺伝子治療が、単一遺伝子疾患の治療だけでなく、癌のような他の更に複雑な疾患にも著しい影響を及ぼしうることを示している。しかし、効率的な遺伝子治療の達成における重要な障害は、細胞標的に治療用核酸を送達するための新規で有効な手段を設計する困難さであった。即ち、細胞及び組織への外来遺伝子の送達用の理想的な担体は、核酸送達において非常に効率が高く、使用するのに安全であり、大量に製造することが容易であり、そして薬剤として実際的な十分な安定性を有するべきである。
主にカチオン性リポソームにより代表される非ウイルス性担体は、以下の理由から遺伝子治療における用途が考えられている担体の１つの型である。第１に、リポソーム介在遺伝子治療に必要とされるプラスミドＤＮＡは、大規模に広く日常的に調製することができ、単純であり、そしてレトロウイルスのようなウイルスベクターの使用よりも危険が少ない。第２に、リポソーム介在遺伝子送達は、レトロウイルス介在遺伝子送達とは異なり、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれも送達することができる。即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを細胞に直接導入することができる。更には、カチオン性リポソームは、非毒性で、非免疫原性であり、このため、カテーテルを挿入した血管（Nabel, E.G.ら（1990）Science, 249: 1285-1288）、肺上皮細胞（Brigham, K.L.ら（1989）Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 195-200; Stribling, R.ら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 11277-11281）、及び他の全身への使用（Zhu, N.ら（1993）Science, 261: 209-211; Philip, R.ら（1993）Science, 261: 209-211）へのカチオン性リポソームの遺伝子のインビボ送達に成功したことで証拠付けられるように、インビボで反復使用することができる。
市販のカチオン性リポソーム試薬ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（Ｎ−１，−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド／ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含む、種々のカチオン性リポソーム製剤が当該分野で公知である（Felgner, P.L.ら（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 7413-7417）が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（（３βＮ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロール）／（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン））と命名されたカチオン性リポソーム製剤は、インビトロの検討（Gao, X.,及びHuang, L.（1991）Biochem. Biophys. Res. Commun., 179: 280-285）において、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥよりも相対的に非毒性で有効性が高いことが証明されている。更には、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥが、核酸送達システムとして安全かつ有効であることが証明された広範なインビボの検討（Plautz, G.E.ら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 4645-4649; Stewart, M.J.ら（1992）Hum. Gene Ther., 3: 267-275）により、本製剤は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び英国医学統制機関（Medicines Control Agency）（ＭＣＡ）により承認され、２つの別個の遺伝子治療臨床試験（Nabel, G.J.ら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11307-11311; Caplen, N.J.ら（1995）Nature Medicine, 1: 39-46）で使用されている。
しかし、細胞標的への核酸の送達用の担体としてのＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ及び他の現在存在しているカチオン性リポソームの使用は、多くの理由から大規模な治療適用には不便である。第１に、先行技術の混合法における核酸／リポソーム複合体を形成するために使用される核酸に対するリポソームの比は、直径が大きく、このため相対的に安定性が低い、複合体の形成をもたらす。即ち、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含む現在使用されているカチオン性リポソーム製剤はいずれも、核酸／リポソーム複合体の安定で即時使用可能な製剤として設計されていない。混合法のこの制限は、各使用の前にユーザーが複合体を調製することが必要であり、人員の特別な訓練を必要とする不便さを要求する。更に、各使用前の混合による複合体の調製は、レシピエントの過剰用量又は過少用量となりうることにより、これらの複合体を使用する治療の評価を妨げる用量変動の原因となりうる。第２に、各使用前に核酸／カチオン性リポソーム複合体を調製する先行技術の混合法は、大きくて活性の低い凝集物形成の機会を低下させるため、核酸／リポソーム複合体を調製する際に希核酸溶液（４μg/ml未満）及び希リポソーム分散液（５０μM未満）を使用することを必要とする。この制限により、最適条件に達していない条件（例えば、リポソームの量の減少（核酸運搬活性が低下する）、又はリポソームの量の増加（毒性が増強される））を使用することなく、小さい生物学的に活性な複合体を作成することは困難になっている。更には、この複合体を希薄な濃度で作成しなければならないという事実は、臨床応用にとって著しい欠点であり、特に複合体の腫瘍内注入の場合には、各部位に少量の複合体しか注入することができないため、著しい欠点である（Nabel, G.J.ら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11307-11311）。
したがって、本発明の目的は、安定で、生物学的に活性で、集中させうる脂質含有薬剤送達複合体、及びこのような複合体の製造方法を提供することである。
発明の要約
本発明は、正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有する脂質含有薬剤送達複合体の製造方法を提供する。本明細書及び請求の範囲を通して使用される「薬剤」は、モノマー又はオリゴマーのいずれかであり、そして脂質と又は脂質及びポリカチオンと複合体を形成して、レシピエントに治療効果を提供する目的で個体に投与される、任意の分子本体を意味する。そして、全体として正味の負電荷を有するか又は負電荷の領域を有する巨大分子は、本発明の送達複合体を形成可能である。本発明の複合体での使用に特に適切な巨大分子は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は負に荷電したタンパク質である。しかし、正電荷を有する巨大分子（例えば、大きなカチオン性タンパク質）もまた、このカチオン性巨大分子を、順に、アニオン性脂質又はポリマーと複合体形成させ、次にカチオン性脂質と複合体形成させることにより、本発明の複合体の形成が可能である。
本発明の複合体は、送達すべき薬剤を、形成される薬剤／脂質複合体が正味の正電荷を有する薬剤対脂質比でカチオン性リポソームと混合することにより形成される、薬剤／脂質複合体；及び薬剤を、形成される薬剤／脂質／ポリカチオン複合体が正味の正電荷を有する薬剤対脂質対ポリカチオン比でカチオン性リポソーム及びポリカチオンと混合することにより形成される、薬剤／脂質／ポリカチオン複合体を含む。薬剤／脂質複合体に適用される「正味の正電荷」とは、薬剤に対する脂質の正電荷過剰を意味する。薬剤／脂質／ポリカチオン複合体に適用される「正味の正電荷」とは、カチオン性脂質及びポリカチオンの正電荷が薬剤の負電荷を上回ることを意味する。しかし、本発明はまた、複合体の正味の電荷が、正、中性又は負であっても、これとは関係なく、正に荷電した表面を有する薬剤／脂質及び薬剤／脂質／ポリカチオン複合体をも包含することを理解されたい。複合体の正に荷電した表面は、ゼータ電位の測定（Martin, A., Swarick, J.,及びCammarata, A.,製剤科学における物理薬学的及び物理化学的原理（Physical Pharmacy & Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences），第３版，Lea及びFebiger，フィラデルフィア，1983年）のような当業者には既知の方法による電場における複合体の遊走により、又はセル表面への複合体の結合親和性により測定することができる。正に荷電したセル表面を示す複合体は、中性又は負に荷電した表面を有する複合体よりもセル表面に対して大きな結合親和性を有する。
したがって本発明は、送達すべき薬剤を、形成される複合体が正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有するような比で、カチオン性リポソーム、及び場合によりポリカチオンと混合することを含む、これらの薬剤／脂質及び薬剤／脂質／ポリカチオン複合体の製造方法に関する。
本発明の別の実施態様において、薬剤／脂質又は薬剤／脂質／ポリカチオン複合体の製造方法は、これらの製造後に過剰の遊離成分（薬剤、脂質、ポリカチオン）から該複合体を精製する工程を更に含んでもよい。
本発明の薬剤／脂質及び薬剤／脂質／ポリカチオン複合体は、一般に安定で、比較的高濃度で製造することができ、そして貯蔵中長期に生物学的活性を保持する。このような複合体は、細胞及び組織への核酸、タンパク質及び他の巨大分子の送達に有用である。
図面の説明
図１は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（３：２）リポソーム及びｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡ（２μg）からの表示された脂質対ＤＮＡ比での混合物として調製された核酸／リポソーム複合体の典型的な粒度分布（平均直径）を示す。
図２Ａ及び２Ｂは、ショ糖勾配画分中のリポソームマーカー3Ｈ−コレステリルヘキサデシルエーテル（○）及び32Ｐ−ＤＮＡマーカー（■）の分布を示す。図２Ａ及び２Ｂ両方のショ糖勾配における各画分の位置は、図２Ａの一番上に示されている。
図２Ａは、ショ糖密度勾配による遊離リポソーム（容量２ml中のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３）１０μmol）又は遊離ＤＮＡ（容量２ml中のｐＲＳＶＬＤＮＡ５０μg）の超遠心分離後の3Ｈ及び32Ｐマーカーの分布を示す。図２Ｂは、ショ糖密度勾配によるＤＮＡ−脂質複合体（容量２ml中のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３）リポソーム２０μmolとｐＲＳＶＬＤＮＡ０．４mgの混合により形成された）の超遠心分離後の3Ｈ及び32Ｐマーカーの分布を示す。
図３は、混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体（○）、混合物ＤＮＡ／リポソーム／ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）複合体（□）、ＤＮＡ／脂質複合体（●）及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（■）のＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション活性を示す。上記複合体を形成するために使用したＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームは、図３の一番下に示されるように種々のモル％のＤＣ−Ｃｈｏｌを含有した。ＤＮＡ／脂質（●）及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ（■）複合体は、トランスフェクション活性を測定する前にショ糖密度勾配により精製した。トランスフェクション活性は、ルシフェラーゼ活性の相対光度単位として縦軸に示す。
図４は、ショ糖密度勾配での精製後１３０日間４℃で貯蔵した、ＤＮＡ／脂質複合体（●）及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（■）のトランスフェクション活性と比較した、混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体（○）及び混合物ＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ複合体（□）のトランスフェクション活性を示す。上記複合体を形成するために使用したＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームは、図４の一番下に示されるように種々のモル％のＤＣ−Ｃｈｏｌを含有した。トランスフェクション活性は、ルシフェラーゼ活性の相対光度単位として縦軸に示す。
図５は、ＣＨＯ細胞を、混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体（○）；混合物ＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ複合体（□）；ＤＮＡ／脂質複合体（●；又はＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（■）により処理した３６時間後に、ＣＨＯ細胞から抽出可能なタンパク質の濃度を示す。ＤＮＡ／脂質及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体は、トランスフェクション活性を測定する前にショ糖密度勾配により精製した。上記複合体を形成するために使用したＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームは、図５の一番下に示されるように種々のモル％のＤＣ−Ｃｈｏｌを含有した。
図６は、卵巣腫瘍を有するマウスから調製した腫瘍抽出物のＣＡＴ測定の結果を示す。０日目に２×１０6個のヒト卵巣癌細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。１４日目に、混合物の形でＤＣ−Ｃｈｏｌリポソーム（３０nmol）と複合体形成したｐＵＣＣＭＶＣＡＴ  ＤＮＡ（大腸菌（E. coli）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する）３０μgを含有する１００μl溶液（レーン１及び２；二重測定用試料）、又は精製した複合体の形で同じ量のＤＮＡ（１μg/２５nmolの比でＤＮＡ：ＤＣ−Ｃｈｏｌリポソームから調製した、レーン３及び４；二重測定用試料）を直接腫瘍に注射した。トランスフェクションの４８時間後、マウスを屠殺してタンパク質１００μgを含有する腫瘍抽出物をＣＡＴ活性について測定した。レーン５は、標準的大腸菌ＣＡＴの陽性対照ＣＡＴ活性を示す。
図７Ａ〜７Ｃは、２９３細胞（図７Ａ）、Ｃ３細胞（図７Ｂ）及びＢＬ６細胞（図７Ｃ）における、混合物ＤＮＡ／脂質複合体、並びに精製したＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体及び未精製の同複合体のトランスフェクション活性を示す。トランスフェクション活性は、ルシフェラーゼ活性の相対光度単位として図７Ａ〜７Ｃの縦軸に示す。
発明の説明
本発明は、pH６．０〜８．０で正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有する脂質含有薬剤送達複合体に関する。これらの複合体は、カチオン性脂質、薬剤を含み、場合により更にポリカチオンを含む。本発明は更に、場合により過剰な個々の成分からこれらの製剤を精製する工程を含んでもよい、これらの複合体の製造方法に関する。本発明の薬剤／脂質複合体の製造に関して、好適な実施態様は精製工程を含む。精製工程が、薬剤／脂質／ポリカチオン複合体に適用される場合には、ショ糖の密度による精製遠心分離後の薬剤／脂質／ポリカチオン複合体を含有するピークが、薬剤／脂質複合体を含有するピークよりもブロードであって、このため遊離成分のピークと重複するため、精製後過剰の成分を含まない純粋状態の薬剤／脂質／ポリカチオン複合体の回収率は、精製後の薬剤／脂質複合体の回収率よりも低いことを理解されたい。
本発明の脂質含有薬剤送達複合体は、安定で、比較的高濃度に製造することができ、そして貯蔵中長期に薬剤成分の生物学的活性を保持する。これらの複合体の製造方法は、カチオン性リポソーム又はカチオン性リポソーム及びポリカチオンの形の過剰量の正電荷の使用により薬剤の負電荷を中和することにより、大きくて不安定な凝集物の形成が回避される、２つの反対に荷電したポリマー（例えば、負に荷電した核酸と正に荷電した脂質）間の結合モデルに基づく。本発明の複合体は、１０％ショ糖緩衝液中の４ケ月にわたる貯蔵において初期の直径と生物活性を保持することが観察されている。
本発明の脂質含有薬剤送達複合体に含まれる「薬剤」は、核酸、ポリアニオン性タンパク質、多糖類、及びカチオン性脂質と直接に複合体を形成することができる他の巨大分子であってよい。しかし、カチオン性薬剤（例えば、大きなカチオン性タンパク質）は、アニオン性脂質と直接複合体を形成することができるか、又は順に、最初にアニオン性脂質若しくはポリマーと、次にカチオン性脂質と複合体形成することができる。このプロセスの使用により、本発明の複合体による細胞への正に荷電した薬剤又は中性の薬剤の送達が可能になる。
正味の正電荷を有する薬剤／脂質及び薬剤／脂質／ポリカチオン複合体を製造するために、薬剤に対する脂質の正電荷過剰、又は薬剤に対する脂質及びポリカチオンの正電荷過剰は、薬剤に対する全脂質又は薬剤に対する脂質及びポリカチオンの、複合体中で約３０倍までの正電荷過剰であり、好適には約２〜１０倍の電荷過剰であり、最も好適には約２〜６倍の電荷過剰であってよい。表面に正電荷を有する複合体は、同様な好適な範囲の、薬剤に対する表面電荷の過剰を有してよい。核酸に対する脂質の正電荷過剰を有する核酸／脂質複合体を製造するために、pH６．０〜８．０で核酸に対する脂質の正電荷過剰を有する核酸／脂質複合体を製造するために核酸１μgと混合すべきカチオン性リポソーム脂質のモル量は、カチオン性リポソームの正電荷含量により、脂質約０．１nmol〜約２００nmolの範囲であり、好適には脂質５nmol〜約１００nmolである。当然薬剤がタンパク質であれば、負に荷電したタンパク質１μgと混合すべき脂質の量は、タンパク質が核酸よりも電荷密度が低いため、上述のＤＮＡ１μgと混合すべき脂質の量よりも少なくとも１０倍は小さくなるであろう。当業者であれば、カチオン性リポソームの正電荷含量により、薬剤に対する脂質の正電荷過剰を生成するために、異なるモル量の異なるカチオン性リポソームを当量の薬剤と混合する必要があることは容易に理解できるであろう。
正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有する薬剤／脂質／ポリカチオン複合体を製造するとき、ポリカチオンを含めると、薬剤と混合する必要のある脂質の量が、脂質からの正電荷が薬剤からの負電荷よりも少ないという程度まで低下する。この脂質の量の低下は、ポリカチオン含有製剤の毒性を低下させる。核酸／脂質／ポリカチオン複合体を処方するのに使用されるカチオン性リポソームのモル量は、カチオン性リポソームの正電荷含量により、核酸１μg当たり脂質約０．１nmol〜約２００nmolの範囲であり、更に好適には核酸１μg当たり脂質約１〜約２５nmolである。本発明の核酸／脂質及び核酸／脂質／ポリカチオン複合体を製造する際、これらの複合体を製造するために必要なリポソームのモル量は、リポソームと混合される核酸の濃度が増大するに伴い増加することは、一般に理解されよう。
当業者であれば、本発明の複合体を精製すると、精製工程が、過剰な遊離脂質及び／又は遊離ポリカチオンの除去をもたらすため、混合直前の、薬剤に対するカチオン性リポソーム又は薬剤に対するカチオン性リポソーム及びポリカチオンの正電荷過剰は、精製した複合体における、薬剤に対する脂質又は脂質及びポリカチオンの正電荷過剰よりも大きいことは、容易に理解できるであろう。
カチオン性脂質、薬剤及びポリカチオンに帰属される電荷が、pH６．０〜８．０でどのように測定されるかを説明するために、以下の例が提供される。送達すべき薬剤がＤＮＡであると仮定して、送達されるＤＮＡの負電荷は、混合すべきＤＮＡの量、又は複合体中のＤＮＡの量を３３０（１つのヌクレオチドが、１つの負電荷に等しい場合の単一のヌクレオチドの分子量）で割ることにより決定する。即ち、ＤＮＡ１μgの負電荷は、３．３nmolである。
ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３）リポソーム１０nmolについて、脂質の有効電荷は、全リポソーム脂質（１０nmol）に０．４（全リポソーム脂質の４０％がカチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌである）をかけて計算して、リポソーム中のＤＣ−Ｃｈｏｌ４nmolが得られる。pH６〜８でＤＣ−Ｃｈｏｌの１分子は、１つの正電荷を有するため、混合時、又は複合体中のリポソーム脂質の有効正電荷は４．０nmolである。当然当業者であれば、他のカチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌと比べてpH６〜８．０でカチオン性脂質１分子当たり更に少ないか又は多い正電荷の量を有することは理解できるであろう。
混合して複合体を形成すべきポリカチオンが、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）の臭化物塩であると仮定すると、混合時のＰＬＬの正電荷は、混合されるＰＬＬの量を２０７（１つのリシル残基が、１つの正電荷に等しい場合のリシル残基の分子量）で割ることにより得られる。即ち、ＰＬＬ１μgの正電荷は、約５．０nmolである。形成される複合体中のリシル残基が与える正電荷を計算するために、複合体中に存在するリシンの量を、存在すれば対イオンの重量を考慮した１つのリシル残基の分子量で割る。
本明細書の表１に与えられるデータ（実施例３を参照のこと）に上記計算を適用して、ＤＮＡとリポソームの混合時、及びＤＮＡとリポソームの混合により製造される複合体の精製後の、正電荷対負電荷比をどのように計算することができるかを説明する。実施例３の表１では、ＤＮＡ０．４mgをカチオン性ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム２０μmolと混合してＤＮＡ／脂質複合体を製造している。４：６のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ比を有するカチオン性リポソームについて、上記段落に与えられた見本の計算に基づいて、リポソーム脂質の正電荷含量は、８，０００nmolと計算され、そしてリポソームと混合されるＤＮＡ０．４mgの負電荷含量は、１，３２０nmolと計算される。したがって、混合時の正電荷対負電荷比は、６．０６（８，０００を１，３２０で割る）である。しかし、複合体の精製後、この精製された複合体の脂質対ＤＮＡ比は、表１に示されるように１２．７nmol脂質／μgＤＮＡであった（「４：６列」を参照のこと）。この１２．７の比は、１．５の正電荷対負電荷比に書き換えられ、そしてこのことは、精製により遊離リポソームの過剰な正電荷が除去されたことを示している。
また表１において、ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体がリポソーム（４：６のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ）４μmol及びＰＬＬ１mgをＤＮＡ０．４mgと混合することにより調製された場合に、混合時の正電荷対負電荷比は、以下のように計算することができる。上記段落に与えられた見本の計算に基づいて、リポソーム脂質４μmolは、正電荷１，６００nmolを与え、ＰＬＬ１mgは、正電荷５，０００nmolを与え、そしてＤＮＡ０．４mgは、負電荷１，３２０nmolを与える。即ち、リポソーム、ＰＬＬ及びＤＮＡ混合時の正電荷対負電荷比は、５である（（１，６００＋１，５００）／１，３２０）。当業者であれば、更に本複合体の正味の電荷は、各成分の放射性同位体標識の使用のような適切な分析法の使用、又は元素分析により、複合体中のＤＮＡ、脂質及び存在するときにはポリカチオンの量を測定することにより決定することができることを理解するであろう。一旦所定のｐＨでの複合体中の各成分（ＤＮＡ、脂質及び存在するときにはポリカチオン）の量が判れば、次に所定のｐＨでのこの複合体の概算の正味電荷を、既知であるか又は分析的に測定される成分のｐＫを考慮に入れて、計算することができる。
好適な実施態様において、薬剤は、核酸配列、好適には治療的有用性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列である。
本発明の１つの実施態様において、pH６〜８．０で正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有する核酸／脂質複合体の製造方法は、核酸を、形成される核酸／脂質複合体が核酸に対する脂質の正電荷過剰を有するような核酸対脂質比でカチオン性リポソームと組合せることを含む。
代替となる実施態様において、核酸及びカチオン性リポソームは、形成される核酸／脂質／ポリカチオン複合体が、pH６〜８で核酸に対する脂質及びポリカチオンの正電荷過剰を有するような核酸対脂質対ポリカチオン比で、ポリカチオンと混合することができる。
好適な実施態様において、核酸／脂質及び核酸／脂質／ポリカチオン複合体は、核酸を、リポソーム又はリポソーム＋ポリカチオンの溶液にゆっくり添加し、撹拌棒で混合（混合は２回行う）することにより製造する。あるいは、リポソーム又はリポソーム／ポリカチオン混合物を、第１の引き入れ口から単一のチャンバーに、核酸を第２の引き入れ口からこのチャンバーに添加するのと同時に添加することができる。次に成分は、共通のチャンバー内で同時に機械的手段により混合する。
薬剤又は薬剤及びポリカチオンと混合して本発明の複合体を形成するカチオン性リポソームは、カチオン性脂質単独か、又は中性リン脂質と組合せたカチオン性脂質を含有してよい。適切なカチオン性脂質種は、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−１，−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）若しくは他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ置換アンモニウム界面活性剤；１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）若しくは（４’−トリメチルアンモニア）ブタン酸コレステリル（ＣｈＯＴＢ）［トリメチルアンモニウム基が、ブタノイルスペーサーアームを介して二重鎖（ＤＯＴＢ）又はコレステリル基（ＣｈＯＴＢ）のいずれかに結合している］；ＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）若しくはＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）（ＤＯＲＩＥ）若しくはWO 93/03709に開示されるその類似体；１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミコハク酸エステル（ＣｈＯＳＣ）；ドクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）のようなリポポリアミン、又は米国特許第5,283,185号に開示されるカチオン性脂質、ヨウ化コレステリル−３β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウム、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボン酸ヨウ化物、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンアミン、ヨウ化コレステリル−３β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウム、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨウ化物、２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨウ化物、３βＮ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、及び３β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロールを含むが、これらに限定されない。
好適なカチオン性脂質の例は、ヨウ化コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボン酸ヨウ化物、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンアミン、ヨウ化コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨウ化物、２−（２−トリメチルアンモニオ）エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３β−オキシコハク酸ヨウ化物、３βＮ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン）−カルバモイル−コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、及び３βＮ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロールを含む。
本発明の複合体の特質はその貯蔵中の安定性（即ち、形成後長期に、小さい直径を維持し、生物学的活性を保持するこれらの能力）であるため、当業者には、好適なカチオン性脂質は、親油性基とアミノ基の間の結合が水溶液中で安定な脂質であることが理解されよう。カチオン性脂質に見い出されるこのような結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合及びカルバモイル結合を含むが、好適なカチオン性脂質は、カルバモイル結合を有する脂質である。カルバモイル結合を有する好適なカチオン性脂質の一例は、ＤＣ−Ｃｈｏｌである。当業者であれば、本発明の複合体を製造するために、２つ以上のカチオン性脂質種を含有するリポソームを使用できることは容易に理解できるであろう。例えば、２つのカチオン性脂質種のリシル−ホスファチジルエタノールアミン及びβ−アラニルコレステロールエステルを含むリポソームが開示されている（Brunette, E.ら（1992）Nucl. Acids Res., 20: 1151）。
更に、薬剤と、場合により更にポリカチオンと混合して本発明の複合体を形成するための使用に適したカチオン性リポソームを考える際に、本発明の方法は上記の脂質の使用のみに制限されるのでなく、カチオン性リポソームが生成する限り任意の脂質組成物を使用することができることを理解されたい。
即ち、カチオン性脂質に加えて、本発明の複合体を形成するために使用されるカチオン性リポソームは、カチオン性脂質に加えて他の脂質を含有してよい。これらの脂質は、リゾホスファチジルコリン（１−オレオイルリゾホスファチジルコリン）を一例とするリゾ脂質、コレステロール、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）若しくはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む中性リン脂質を含むが、これらに限定されない。本発明の脂質複合体はまた、形成される複合体の正味の電荷が正であるか、かつ／又は複合体の表面が、正に荷電される限り、カチオン性脂質と同様に負に荷電した脂質を含有してもよい。本発明の負に荷電した脂質は、生理学的ｐＨ又はこのｐＨ付近で、正味の負電荷を有する少なくとも１つの脂質種又はこれらの組合せを含む脂質である。適切な負に荷電した脂質種は、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸又は同様なリン脂質類似体を含む。
更に、本発明の複合体を形成するために使用されるカチオン性リポソームにおいて、脂質の割合は、コレステロールと組合せた、又はリゾ若しくは中性脂質の混合物と組合せた、大部分のカチオン性脂質を含むように変化させうることが企図される。選択したカチオン性脂質が、別の脂質と組合せられるとき、好適な脂質は、中性リン脂質であり、最も好適にはＤＯＰＥである。
本発明の脂質含有薬剤送達複合体の製造に使用されるリポソームの製造方法は、当業者には既知のものである。リポソーム調製の方法論の総説は、「リポソーム技術（Liposome Technology）」（CFC Press NY 1984）; Ortroの「リポソーム（Liposomes）」（Marcel Schher, 1987）； Methods Biochem Anol. 33: 337-462（1988）及び米国特許第5,283,185号に見い出されよう。このような方法は、凍結融解放出（freeze-thaw extrusion）及び音波処理を含む。単一層リポソーム（平均直径約２００nm未満）及び多重層リポソーム（平均直径約３００nm以上）は両方とも、本発明の複合体を製造するための出発成分として使用することができる。
本発明の薬剤／脂質複合体を製造するために使用されるカチオン性リポソームにおいて、カチオン性脂質は、全リポソーム脂質の約１０〜約１００モル％、好適には約２０〜約８０モル％、そして最も好適には約２０〜約６０モル％で、リポソーム中に存在する。リポソームに含まれるとき、中性脂質は、全リポソーム脂質の約０〜約９０モル％、好適には約２０〜約８０モル％、そして最も好適には４０〜８０モル％の濃度で存在してよい。リポソームに含まれるとき、負に荷電した脂質は、全リポソーム脂質の約０モル％〜約４９モル％、好適には約０モル％〜約４０モル％の範囲の濃度で存在してよい。好適な実施態様において、リポソームはカチオン性脂質と中性脂質を含有し、最も好適にはＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥを約２：８〜約６：４の比で含有する。更に、本発明の複合体は、特定の組織又は細胞型に複合体を方向づける標的因子（targeting factors）として機能する、修飾脂質、タンパク質、ポリカチオン又は受容体リガンドを含有してもよいことを理解されたい。標的因子の例は、アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸化合物並びに細胞表面分子に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。可能性ある標的は、肝臓、血球、内皮細胞及び腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない。
更に、本発明の複合体の正電荷は、複合体の脂質組成だけでなく、薬剤／脂質複合体が形成される溶液のｐＨにも影響を受けることを理解されたい。例えば、ｐＨの上昇（塩基性増大）は、カチオン性脂質のＤＣ−Ｃｈｏｌの第三級アミンの正電荷を徐々に中和する。好適な実施態様において、本発明の複合体は、この複合体が、正味の正電荷及び／又は正に荷電した表面を有するようなｐＨで、製造し、かつ貯蔵する。好適なｐＨ範囲は、pH６．０〜８．０であり、最も好適にはpH７．０〜７．８である。ポリカチオンを核酸及びカチオン性リポソームと混合するとき、このポリカチオンは、約３００〜約２００，０００の間の分子量を有する有機ポリカチオンから選択することができる。これらのポリカチオンはまた、pH７．０で好適には約３〜約１，０００の間の結合価を有する。ポリカチオンは、天然又は合成アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアミン、炭水化物及び任意の合成カチオン性ポリマーであってよい。ポリカチオンの例としては、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン及びポリリシン、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）、ヒストン、カチオン性デンドリマー（dendrimer）、スペルミン、スペルミジン、及び過剰な正電荷を有する核内局在シグナルであるＳＶ４０ラージＴ抗原から誘導した合成ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。好適なポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）である。本発明の核酸／脂質／ポリカチオン複合体を製造する際、核酸に対するポリカチオンの比は、リポソームの量が変動しても固定されたままである。しかし、当業者であれば、核酸に対するポリカチオンの比は、核酸及びポリカチオンと混合されるリポソームの電荷密度に影響されることを認識するであろう。例えば、リポソームの電荷密度が、リポソームの脂質組成の変化（例えば、リポソーム中のカチオン性脂質：中性脂質の比の低下）の結果として低下するならば、核酸及びリポソームと混合すべきポリカチオンの量は、リポソームが与える正電荷の低下を補償するために増加させてよい。しかし、ポリカチオンを使用するとき、カチオン性脂質が核酸と複合体を形成することができるように、飽和量未満のポリカチオン（即ち、核酸の全ての負電荷を飽和させない量）を使用することが好適である。即ち、本発明の好適な実施態様において、核酸に対する脂質の正電荷過剰は、ポリカチオンを脂質及び核酸と混合するときでも使用される。本発明において核酸１μg及び種々の量のカチオン性リポソームと混合することができるポリカチオンの量は、核酸１μg当たりポリカチオン約０．０１μg〜約１００μgの範囲であり、好適には核酸１μg当たりポリカチオン約０．１μg〜約１０μgである。
過剰の遊離ＤＮＡ、遊離リポソーム及び遊離ポリカチオンからの核酸／脂質及び核酸／脂質／ポリカチオン複合体の精製を必要とする場合、精製は、ショ糖密度勾配又は密度勾配を形成するのに適した他の媒体による遠心分離により達成することができる。しかし、クロマトグラフィー、濾過、相分配、沈殿又は吸収のような他の精製方法も使用することができることを理解されたい。好適な方法において、ショ糖密度勾配での遠心分離による精製が利用される。ショ糖勾配は、ショ糖約０％〜ショ糖約６０％、好適にはショ糖約５％〜ショ糖約３０％の範囲であってよい。ショ糖勾配が作成される緩衝液は、複合体を含有する画分の貯蔵に適した任意の水性緩衝液、そして好適には細胞及び組織への複合体の投与に適した緩衝液であってよい。好適な緩衝液は、pH７．０〜８．０のＨｅｐｅｓである。
本発明において、好適な核酸配列は、タンパク質発現を指令することができる配列であることを理解されたい。このような配列は、カチオン性リポソーム又はリポソーム及びポリカチオンと混合して本発明の脂質含有薬剤送達複合体を形成する前に、日常的な方法により当業者には既知のプラスミド発現ベクター中に挿入することができる。カチオン性リポソーム又はカチオン性リポソーム及びポリカチオンと共に混合される核酸の量は、約０．０１μg〜約１０mg、好適には約０．１μg〜約１．０mgの範囲であってよい。重要な核酸がプラスミド発現ベクターに含有される場合、上述の核酸の量は、重要な核酸を含有するプラスミドに関するものと理解されたい。
本発明の核酸／脂質及び核酸／脂質／ポリカチオン複合体の精製は、生じた複合体中に含有される核酸及び脂質を、複合体中に含有される脂質含量が約４０μmol/mlにまで達し、かつ核酸含量が約２mg/mlにまで達するほど、約５０倍〜約５００倍濃縮するのに役立つ。
本発明の方法により製造される複合体の直径は、約４００nm未満、好適には約２００nm未満、そして更に好適には１５０nm未満である。
本発明の方法により形成される複合体は、４℃で貯蔵されるとき、約１年まで安定である。本複合体は、ショ糖勾配からのコレクションで１０％ショ糖溶液中で貯蔵することができるか、又は、凍結乾燥して次いで使用の前に１０％ショ糖溶液に再構成することができる。好適な実施態様において、複合体は溶液で貯蔵する。本発明の複合体の安定性は、貯蔵中長期にわたり物理的安定性及び生物学的活性を測定するための特異的な測定法により測定する。複合体の物理的安定性は、例えば、電子顕微鏡、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む当業者には既知の方法により、又は実施例に記載されるようにコールター（Coulter）Ｎ４ＳＤ粒子径測定器を使用する準弾性（quasi-elastic）光散乱の手段により、複合体の直径を決定することにより測定する。複合体の物理的安定性は、貯蔵した複合体の直径が、複合体の精製時に測定した複合体の直径から、１００％を超えて増大しないとき、好適には５０％を超えない増大であるとき、そして最も好適には３０％を超えない増大であるとき、貯蔵期間にわたり「実質的に不変」である。
複合体の生物学的活性を測定するのに使用される測定法は、複合体に含有される薬剤が何かにより変化する。例えば、薬剤が遺伝子産物をコードする核酸であるならば、生物学的活性は、細胞のトランスフェクションのために当業者に利用されるトランスフェクション条件下で、ＤＮＡとカチオン性リポソームとの混合物によりインビトロで細胞を処理することにより測定することができる。複合体によりトランスフェクションすることができる細胞は、ＤＮＡ／リポソーム複合体混合物によりトランスフェクションすることができる細胞を含む。次に貯蔵した複合体の活性を、混合により調製された複合体のトランスフェクション活性と比較する。薬剤がタンパク質であるならば、活性は、そのタンパク質に適したバイオアッセイにより測定することができる。
更に、当業者であれば、本発明の複合体は、遺伝子治療におけるベクターとしてインビボで使用できることを理解するであろう。
本発明の複合体を使用する治療用製剤は、好適には、例えばリン酸緩衝化生理食塩水、等張性食塩水、又はＨ2Ｏ中（pH７．４〜７．６）若しくはＨｅｐｅｓ中（pH７〜８、更に好適にはpH７．４〜７．６）の１０％ショ糖のような低イオン強度緩衝液などの生理学的に融和性の緩衝液中の複合体を含む。本複合体は、エーロゾルとして、又は腫瘍内、静脈内、気管内、腹腔内、及び筋肉内投与用の液剤として投与することができる。
本明細書に引用した論文又は特許を引用により加える。以下の実施例は、本発明の種々の側面を説明するものであるが、本発明の範囲を何ら限定することを意図したものではない。
実施例
材料
ＤＯＰＥは、Avanti Polar Lipid Inc.（Alabaster, AL）から購入した。ラウス肉腫ウイルスの長末端反覆を制御されたルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドであるｐＲＳＶＬ（De Wet, J.R.ら，（1987）Mol. Cell. Biol., 7: 725-737）は、大腸菌中で増殖させ、標準のＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ超遠心法（Sambrook, J., Fritsch, E.F及びManiatris, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ner York（1989））を用いて精製した。すべての組織培養の培地は、Gibco BRL（Gaithersburg, MD）から得た。ヒトの胚腎臓２９３細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＢＬ６及びＢＨＫ（幼児ハムスター腎臓細胞）細胞は、Amerikan Type Culture Collection（Rockville, MD）からのものであった。マウス肺細胞（ＭＬＣ）は、Dr. S. Kenned（Oak Ridge国立研究所，TN）によるＢａｌｂ／ｃマウスの肺をもとに得られた第１次培養細胞である。２９３、ＢＬ６、ＢＨＫ及びＭＬＣ細胞はＤＭＥＭ培地で培養し、ＣＨＯ細胞はＦ１２培地で培養し、Ｃ３  HeLa細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地の中で培養した。すべての培地は、１０％ウシ胎仔血清（Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT）並びにペニシリン１００単位/ml及びストレプトマイシン１００μg/mlで補足した。ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（分子量３，０００及び分子量２５，６００）及び他の化学薬品は、Sigma（St. Louis, MI）からのものであった。
ＤＣ−Ｃｈｏｌは、Gao及びHuang（1991）の方法（Gao, X,及びHuang, L.（1991）Biochem, Biophys, Res. Commun., 179：280-285）に従い、精製段階を下記のように改良して合成した。反応後、ヘキサン１０mlを加えて、混合物を水１０mlで３回抽出した。有機相を集めて、４℃の真空中で乾燥した。結果として得られた固体を、最小限度の量の純エタノールに加熱して溶解させ、０℃のアセトニトリル中で再結晶した。ＤＣ−Ｃｈｏｌの純度は、ＴＬＣ法及び1Ｈ−ＮＭＲによる分析で、少なくとも＞９５％であり、約７０％の収率は、Gao, X,及びHuang, L.（1991）Biochem, Biophys, Res. Ccmmun., 179：280-285）のすでに報告された方法の収率よりも有意に改良されていた。
方法
複合体の調製と精製
全脂質濃度２０mMにおけるカチオン性リポソームは、各種の比率のＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＤＯＰＥから、公表された手順（Gao, X,及びHuang, L.（1991）Biochem, Biophys, Res. Commun., 179：280-285）による超音波処理法によって調製した。微量の3Ｈコレステリルヘキサデシルエーテル（Amersham, Arlington Heights, IL）を、定量化の目的で含有させた。これらのリボポソームの大きさは、Coulter Ｎ４ＳＤ粒度計（Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL）を用いる準弾性光散乱による測定により、１００〜１５０nmの間であった。他に表示されないかぎり、以下の実施例では、ＤＮＡ／脂質複合体は、典型的な実験室規模で、１５×７．５ポリスチレン培養管（Baxter, McGraw Pare, IL）で、２nMのＨｅｐｅｓ緩衝液１ml量に、実施例ごとに示した量の遊離ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームを加え、培養管の中にミクロマグネチックスターラーを置いて、溶液をよく撹拌することによって調製した。次いで、実施例ごとに示した量のｐＲＳＶＬ  ＤＮＡを、貯蔵溶液（０．２mMのＨｅｐｅｓ緩衝液、pH７．６）からリポソーム溶液に、３分間かけて滴下した。ニックトランスレーションキット（Promega, Madison, WI）及び32Ｐ  ｄＣＴＰ（Amersham, Arlington Heights, IL）を用いて32Ｐによってラベルした微量のｐＲＳＶＬを、定量化の目的で含有させた。
精製脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体を調製するために、実施例ごとに示された、０．２mg/mlを超える量のＤＮＡ溶液を、実施例ごとに示された量のリポソームとＰＬＬを含有するＰＬＬ／リポソーム混合物１mlに加えた。ＤＮＡ／脂質複合体を、５％、７．５％、１０％及び１５％（w/w）のショ糖各０．５mlからなるショ糖段階勾配の頂部に置き、ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体を、５％、１０％、１５％、２０％、２５％及び３０％（w/w）のショ糖からなるショ糖段階勾配の頂部に置いた。ＤＮＡ／脂質及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体を、次いで１００，０００Gの超遠心分離に４℃で３０分かけて、遊離の脂質及びＰＬＬから精製した。遠心分離の後に、画分２００μlを頂部から管の底部に取った。各画分からのアリコートを、シンチレーションカウンターを用いる3Ｈ及び32Ｐの両方の放射能について検定した。32Ｐのピーク値を含む画分を、集めてプールした。これらのプールされた画分を、次いで粒子径及びトランスフェクション活性について検定した。
In vitorトランスフェクション検定
上記の複合体の生物活性を、下記の実施例において、細胞のin vitroトランスフェクションによって検定した。要約すると、４８ウェルのプレート中で成長した細胞を、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ（Gibco BRL）０．５ml中に希釈したＤＮＡ／脂質複合体とともに、又はGao及びHuang（1991）（Gao, X,及びHuang, L.（1991）Biochem, Biophys, Res. Commun., 179：280-285）によって調製した混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体とともに培養した。ＰＬＬの存在下にＤＣ−Ｃｈｏｌリポソームを用いるｐＲＳＶＬ  ＤＮＡのトランスフェクションのために、まずリポソームをＰＬＬと混合し、次いでＤＮＡとで複合体にした。すべてのトランスフェクションを、３７℃で４時間かけて実施した。トランスフェクションの後、ウシ胎仔血清１０％を含有する適切な培地中で、細胞を更に３６時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega, Madison, WI）によって用意された１Ｘ溶菌緩衝液１００μlで溶菌した。溶菌体試料４μlを、再構成させたルシフェラーゼアッセイキットからの基質溶液１００μl及びAotoLumat LB953発光計（Berthold，ドイツ）を用いて、ルシフェラーゼ活性について検定した。各溶菌体からのタンパク質濃度を、製造者プロトコール（Pierce, Rockford, IL）によるクーマッシーブルー染色（Coomassie blue dye）法によって検定した。
実施例１
ＤＮＡ／脂質複合体の粒径がＤＮＡの脂質に対する比で測定される
この実験は、リポソームと混合するＤＮＡの比が変わるにつれて、混合物によって形成されるＤＮＡ−脂質複合体の大きさが変化することを示すために実施した。簡単にいえば、ｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡ（２μg）を、pH７．６で２mMＨｅｐｅｓ緩衝液中のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（３：２）リポソームの各種の量と混合して、最終体積５００μlとし、７分後に、複合体の大きさを、単一モデルモードで作動するCoulterＮ４ＳＤレーザー光散乱粒子径測定器によって測定した。
図１に示すように、ＤＮＡが過剰に存在した（リポソームのＤＮＡに対する比が７未満）ときは、大きな凝集物は形成されなかったが、脂質のＤＮＡに対する比が、電荷が中性になるような比（〜１０）で、複合体は最大に達した。それに加えて、リポソームのＤＮＡに対する比を１０nmol/μgに一定に保つときは、複合体の大きさは、ＤＮＡとリポソームの両方の濃度が増大するにつれて増加し、沈殿を形成しさえした。しかしながら、リポソームのＤＮＡに対する比が増大するとき、複合体の大きさは次第に減少して、リポソームのＤＮＡに対する比が脂質２５nmol／ＤＮＡμgを超えると、複合体の大きさは一定（２５０〜３００nm）になった。この結果は、ＤＮＡがおそらく過剰のリポソームによって被覆され、それゆえ複合体の間の凝集が起こらなかったための結果であろう。
図１に示されたデータに基づいて、リポソームのＤＮＡに対する比５０nmol/μgを用い、２００μg/mlのＤＮＡ溶液をリポソームの過剰量（１０μmol）にゆっくり添加することにより、脂質／ＤＮＡ複合体を調製した。形成された複合体の大きさは、約２５０nmであった。リポソームのＤＮＡへの比率を２５nmol/μgに変えたとき、複合体の大きさは、約３５０nmに増加した。２５nmol/μg又は５０nmol/μgの比率を用いて形成された複合体は、４℃で４週間保存している間に沈殿を形成しないので、物理的に安定のように見えた。
実施例２
ＤＮＡ／脂質複合体の精製
ＤＮＡをリポソームと、１μg／５０nmolの比率で混合したとき、過剰の遊離リポソーム状脂質が、ＤＮＡ／脂質複合体と共在することが認められた。過剰の遊離脂質は細胞にとって有毒なので、密度勾配超遠心分離法によって、遊離リポソーム状脂質がＤＮＡ／脂質複合体から分離できるかどうかを見るために、実験を実施した。簡単にいえば、遊離リポソーム（体積２ml中、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３）１０μmol）、遊離ＤＮＡ（体積２ml中、ｐＲＳＶＬ５０μg）並びにＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３）２０μmol及びｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡ（５０nmol/μg）０．４mgから形成されたＤＮＡ／脂質複合体を、それぞれ５％、７．５％、１０％及び１５％（w/w）のショ糖各０．５mlからなる勾配上で、４℃、１００，０００Gで３０分かけて遠心分離した。次いで、画分２００μlを頂部から管の底部まで集めて、ＤＮＡマーカー（32Ｐ，■）及び脂質マーカー（3Ｈ，○）の分布について検定した。図２Ａ及び２Ｂは、代表的な遊離リポソーム状脂質、遊離ＤＮＡ（図２Ａ）及びＤＮＡ／脂質複合体（図２Ｂ）の、ショ糖勾配上の分離を示す。図２Ｂに示された結果は、遠心分離後に、複合体が１０％ショ糖層に主要なバンドを形成することを示している。これに比べて、図２Ａは、遊離ＤＮＡ又は遊離リポソーム状脂質の放射能の大部分が、管の上部半分に分布して、ショ糖勾配には入っていなかったことを示している。それに加えて、図２Ｂ中の3Ｈのピークと32Ｐのピークが画分番号１６に共在してはいるが、有意量の3Ｈが画分１〜１０に分布し、それは過剰のリポソーム状脂質がＤＮＡ／脂質複合体から良好に分離されることを示している。
実施例３
精製脂質／ＤＮＡ及び脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体の物理的安定性
各種のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ組成（表１を参照）のリポソーム２０μmolを、ｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡと、ＤＮＡ１μg／脂質５０nmolの比率で混合して、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させた。各種のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ組成のリポソーム４μmolを、ＰＬＬ（ＭＷ＝３，０００）１mg及びｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡ０．４mgと混合して、脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体を形成させた。次いで、両方の複合体を、遊離脂質、遊離ＤＮＡ及び遊離ＰＬＬから、方法の項に記載したショ糖勾配遠心分離によって精製した。ピーク画分を集めてプールした。次いで、プールした試料を、集めた直後（０日）又は１０％ショ糖に４℃で１２０日間貯蔵した後に、直径について検定した。表１は、これらの検定の結果を示す。
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表１に示されたデータは、精製された脂質／ＤＮＡ及び脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体が、０日日における粒度が小さい（２００nm以下）こと、及びそれらの粒度が貯蔵により劇的には増加しないことを示している。更に、精製複合体中のＤＮＡのリポソームに対する比率は、用いられたリポソームの組成に依存して、脂質１０〜２３nmol／ＤＮＡμgの間であって、この比率は１２０日間の貯蔵の後も変わらなかった。リポソーム中のＤＣ−Ｃｈｏｌの濃度と、複合体中の脂質の量との相互関係も観察し、それは、ＤＣ−Ｃｈｏｌを増加させたリポソームが、ＤＣ−Ｃｈｏｌをより少なく増加させたリポソームよりも、より強いＤＮＡ結合又は電荷中和活性を示すことを示している。最も右手の欄は、続けてショ糖密度勾配による精製を行ったＤＮＡ／脂質及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体中の、32ＰでラベルされたＤＮＡの回収率を示す。結果は、ＰＬＬを含有しない複合体中のＤＮＡの回収率は、ＰＬＬを含有する複合体について観察されたよりも高いことを示している。
実施例４
各種の細胞における精製複合体の生物活性
ＤＮＡに対する高い脂質の比率を有する、リポソームとＤＮＡの混合物から形成されたＤＮＡ／脂質複合体は、時間を通してともに小さくて安定なので、これらの複合体のトランスフェクション活性を、混合物法によって調製されたＤＮＡ／リポソーム複合体の活性と比較するために、実験を行った。
１つの実験で、４８ウェルのプレートで培養されたＣＨＯ細胞を、種々の脂質組成の、ｐＲＳＶＬ１μgとＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmol単独との混合物（○）、又はＰＬＬ（ＭＷ＝３，０００）１μgを加えた混合物（□）で４時間処理し、あるいは該細胞を、ＤＮＡ１μgをＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム５０nmolと（ＤＮＡ／脂質複合体の場合）、又はＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmol及びＰＬＬ１μgと（ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体の場合）を混合して形成させ、続いて、方法の項に記載したように、ショ糖密度勾配によって遠心分離した、精製ＤＮＡ／脂質複合体（●）又は精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（■）で処理した。処理して３６時間後に、細胞を溶菌緩衝液１００μl中で溶菌し、溶菌体４μlを、ルシフェラーゼ基質溶液１００μlを用いて、ルシフェラーゼ活性について検定した。次いで、ルシフェラーゼ活性を２０秒の間カウントした。図３に示す結果は、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするのに最も好ましいリポソーム組成は、ＤＣ−Ｃｈｏｌが４０％及びＤＯＰＥが６０％であったことを示している。それに加えて、追加のポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ、ＭＷ＝３，０００）１μgの存在下では、トランスフェクション活性の２〜７倍の増大が、大部分のケースで見られた。特に興味深いことに、同量のＤＮＡを細胞に加えたときに、精製ＤＮＡ／脂質複合体の活性は、混合物ＤＮＡ／脂質複合体のそれと同様であった。しかしながら、精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体のトランスフェクション活性は、混合物法によって調製されたＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ複合体のそれよりも約３０〜５０％低かった。
ＣＨＯ細胞で得られた結果が細胞によって特異的でないことを決定するために、２種の他の細胞であるＢＨＫ及びマウス肺細胞（ＭＬＣ）における精製ＤＮＡ／脂質及びＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体のトランスフェクション活性を、混合物によって形成されたＤＮＡ／リポソーム複合体のそれと比較した。
要約すると、ＤＣ−Ｃｈｏｌリポソーム１０nmolと混合したｐＲＳＶＬ１μg（混合物複合体）、精製ＤＮＡ／脂質複合体を製造するために、ＤＮＡ／リポソーム比が１μg/５０nmolでリポソームと混合した同量のＤＮＡ、又はＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ比が１μg/１０nmol/２μgで調製された精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体で、集密性（confluency）６０％で４８ウェルのプレート内で成長させた細胞（ＢＨＫ又はＭＬＣ）をトランスフェクトした。次いで細胞をトランスフェクション後３６時間で採取し、トランスフェクトした細胞溶菌体のルシフェラーゼ活性を、方法の項に記載したようにして測定した。これらの実験の結果を、表２及び表３に示す。
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興味深いことに、ＢＨＫ細胞ラインについては、精製ＤＮＡ／脂質複合体のトランスフェクション活性は、混合物から形成されたＤＮＡ／リポソーム複合体のそれよりも有意に高い。トランスフェクトしにくいＭＬＣのような細胞については、ＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ混合物から作られた精製複合体は、混合物複合体及びＰＬＬなしに作られたＤＮＡ／脂質複合体よりも明らかに優れている。
脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体が、異なる比率の脂質と核酸を用い、またこれまでの実施例に用いたのと異なる分子量のＰＬＬを用いて、脂質／ＰＬＬ／ＤＮＡ複合体を作り得るかどうかを見るために、以下の実験を実施した。ｐＲＳＶＬプラスミドＤＮＡ２０μg、ポリ−Ｌ−リシン（ＭＷ２５，６００）１０μg、及び脂質とＤＮＡの表４に示す比率のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム（モル比４．５／５．５）から、脂質／ポリ−Ｌ−リシン／ＤＮＡ複合体を調製した。結果として得られた複合体を、次いで方法の項に記載したショ糖勾配超遠心分離によって精製した。ＤＮＡ０．５μgを含有する精製複合体のアリコートを、ＣＨＯ細胞のトランスフェクトに用い、次いでルシフェラーゼ活性を測定した。この実験の結果を、下記の表４に示す。
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結果は、増加した量のポリカチオンの存在で、かなりのトランスフェクション効果を有するＤＮＡ／脂質／ポリカチオン複合体を製造するのに、ＤＮＡに対するより低い比率の脂質を用いることができることを示している。
実施例５
貯蔵された複合体のトランスフェクション効果
４８ウェルのプレートで培養されたＣＨＯ細胞を、１０％ショ糖中に４℃で１３０日間貯蔵した、各種のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ組成の、ｐＲＳＶＬ１μgとＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmol単独との混合物（○）若しくはＰＬＬ（ＭＷ＝３，０００）１μgを加えた混合物（□）、又は精製されたＤＮＡ／脂質（●）若しくはＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ（■）複合体で、４時間処理した。精製複合体は、ｐＲＳＶＬ１μgと、各種のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームを単独に５０nmol（ＤＮＡ／脂質）、又はＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmolとＰＬＬ１μg（ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体）から形成させ、続いて、方法の項に記載されたように、ショ糖密度勾配によって遠心分離した。図４に示される結果は、貯蔵されたＤＮＡ／脂質又はＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体でトランスフェクトされた細胞から調製された細胞溶菌体のルシフェラーゼ活性が、混合物から調製された対応する複合体でトランスフェクトした細胞の細胞溶菌体で観察されたルシフェラーゼ活性に匹敵することを示している。
実施例６
混合物から調製されたＤＮＡ／リポソーム複合体の精製ＤＮＡ／脂質複合体に比較しての細胞毒性
異なる複合体の細胞毒性を、ＣＨＯ細胞について、下記のように調べた。ＣＨＯ細胞を、混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体（○）、混合物ＤＮＡ／リポソーム／ＰＬＬ複合体（□）、精製ＤＮＡ／脂質複合体（●）又は精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（■）で処理した。ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ１μgを、各種のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ組成のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmol単独と、又は更にＰＬＬ（ＭＷ＝３，０００）１μgとともに混合して、混合物複合体を形成させた。精製複合体は、ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ１μgを、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム５０nmol単独と（ＤＮＡ／脂質複合体）、又は更にＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム１０nmol及びＰＬＬ１μg（ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体）と、混合し、続いて方法の項に記載したように、ショ糖密度勾配によって遠心分離することにより形成させた。処理後３６時間で、細胞を溶菌し、タンパク質を抽出し、次いでクーマッシーブルー染色法によって定量した。
図５は、この実験の結果を示し、そこでは、実験の最後に回収された抽出可能なすべてのタンパク質を、示された処理の後に生存している細胞のタンパク質の指標として用いた。与えられたデータは、精製複合体が、細胞に対して、混合物ＤＮＡ／リポソーム複合体より僅かに毒性であるように見えるが、形態学的に、高いモル％のＤＣ−Ｃｈｏｌを含有する精製複合体で処理された細胞が、実験の終りで集密性が低いことを除いて、混合物複合体又は精製複合体のいずれを用いて処理された細胞においても、トランスフェクションは著しい細胞毒性効果を生じてはいない。
実施例７
精製ＤＮＡ／脂質複合体による腫瘍のin vivoトランスフェクション
３×１０6のヒト卵巣腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスに０日目に皮下注射した。１４日後に、混合物の形（レーン１及び２）、又は同じＤＮＡ量の精製ＤＮＡ／脂質複合体の形（ＤＮＡ１μg/脂質２５nmolの比率で、ＤＮＡとＤＣ−Ｃｈｏｌリポソームから調製された）の、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥが３：２）リポソーム（３０nmol）で複合体にしたｐＵＣＣＭＶＣＡＴ  ＤＮＡ（３０μg）を含有する溶液１００μlを、腫瘍に直接に注射した。動物を２日後に殺し、タンパク質１００μgを含有する腫瘍抽出物を、Ausubelら（1991）（Current Protocols in Molecular Biology（Wiley, Boston）, Vol. 1, pp. 9.6.2-9.6.5）に従い、３７℃でＣＡＴ活性について測定した。結果は、精製複合体は、最適でない条件で調製されたものでも、in vivoトランスフェクション活性を有することを示している。
実施例８
精製及び未精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体と混合物ＤＮＡ／脂質複合体のトランスフェクション活性の比較
３種のセルライン（２９３、ＢＬ６及びＣ３）における、精製及び非精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体及び混合物ＤＮＡ／脂質複合体のトランスフェクション活性を、下記のようにして測定した。
精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体は、ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ１μgを、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソーム（２：３mol/mol）及びＰＬＬ（ＭＷ＝２５，６００）１μgと混合して形成させ、続いて、方法の項に記載されたショ糖密度勾配による遠心分離を行った。
未精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体は、ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ１００μgを、ＰＬＬ（ＭＷ＝２５，６００）８０μg及びＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（２：３mol/mol）リポソーム（即ち、ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ比がＤＮＡ１μg／脂質１７nmol／ＰＬＬ０．８μg）と混合して、水で最終体積を５００μlとした。未精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体（即ち、ＤＮＡ４μg、ＰＬＬ３．２μg及び脂質６８．１nmol）を、次いで、セルラインをトランスフェクトするのに適した、血清を含まない媒体７８０μlに加えた。
ｐＲＳＶＬ  ＤＮＡ１μgをＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（３：２mol/mol）リポソーム１０nmolと混合して、混合物ＤＮＡ／脂質複合体を形成させた。
２４ウェルのプレート内で、集密性８０％に成長した２９３、Ｃ３及びＢＬ６細胞を、精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体、混合物ＤＮＡ／脂質複合体又は未精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体の形の、ＤＮＡ１μgで、３７℃で４時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を更に、１０％ウシ胎仔血清を含有する適切な媒体中で、３６〜４８時間培養した。次いで、方法の項に記載した方向で、ルシフェラーゼ活性を測定した。
図７Ａ（２９３細胞）に示された結果は、未精製ＤＮＡ／脂質／ＰＬＬ複合体が、試験した全ての３種のセルラインで、最高のトランスフェクション活性を示した。
本発明の多数の実施態様を記載したが、本発明の方法と装置を用いる他の実施態様を提供するために、基本的な構造を変更できることは明らかである。それゆえ、本発明の範囲が、これまでに実施例として提示された特定の実施態様によるよりも、ここに付される特許請求の範囲によって定義されていることが、理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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