(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアスコルビン酸を還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素（以下本酵素を「ＡＳＯＤ」という）を用いて定量する方法において、水性媒体中、ＡＳＯＤの存在下、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応と、生成した過酸化水素と下記一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000019
又は一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000020
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000021
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000022
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000023
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000024
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000025
又は、一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000026
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000027
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000028
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す｝で表される色源体とを、パーオキシダーゼの存在下に反応させて色素を生成する反応とを同一反応系で行わせ、生成する色素を定量することを特徴とするアスコルビン酸の定量方法。
【請求項２】
該水性媒体中に酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤が存在している請求の範囲１記載の定量方法。
【請求項３】
酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤で該試料中の酸化型アスコルビン酸を還元した後、還元剤の還元力を喪失できる化合物の存在下に反応が行われる請求の範囲１記載の定量方法。
【請求項４】
色素の定量が色素によって着色した反応液の吸光度を測定することによって行われる請求の範囲１、２または３記載の定量方法。
【請求項５】
還元剤がＳＨ基含有化合物、ホスフィン類、ジホスファン類、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、二価鉄塩および水素化ホウ素塩から選択された１種である請求の範囲２又は３記載の定量方法。
【請求項６】
還元剤がジチオスレイトールである請求の範囲２又は３記載の定量方法。
【請求項７】
還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＳＨ試薬である請求の範囲３記載の定量方法。
【請求項８】
ＳＨ試薬がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲７記載の定量方法。
【請求項９】
還元剤がジチオスレイトールであって、還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲３記載の定量方法。
【請求項１０】
色源体が１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）および４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）から選ばれる請求の範囲１乃至９のいずれかに記載の定量方法。
【請求項１１】
還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素、下記一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000029
又は一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000030
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000031
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000032
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000033
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000034
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000035
又は、一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000036
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000037
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000038
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す｝で表される色源体及びパーオキシダーゼを含有するアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１２】
更に、酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤を含有する請求の範囲１１記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１３】
更に、還元剤の還元力を喪失させることができる化合物を含有する請求の範囲１２記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１４】
還元剤がＳＨ基含有化合物、ホスフィン類、ジホスファン類、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、二価鉄塩および水素化ホウ素塩から選択された1種である請求の範囲１２又は１３記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１５】
還元剤がジチオスレイトールである請求の範囲１２又は１３記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１６】
還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＳＨ試薬である請求の範囲１３記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１７】
ＳＨ試薬がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲１６記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１８】
還元剤がジチオスレイトールであり、還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲１３記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項１９】
色源体が１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）および４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）から選ばれる請求の範囲１１乃至１８のいずれかに記載のアスコルビン酸定量用試薬。
【請求項２０】
還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素およびパーオキシダーゼを含有する試薬と、下記一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000039
又は一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000040
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000041
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000042
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000043
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000044
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000045
又は、一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000046
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000047
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000048
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す｝で表される色源体を含有する試薬とを含有するアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２１】
下記一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000049
又は一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000050
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000051
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000052
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000053
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000054
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000055
又は、一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000056
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000057
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000058
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す｝で表される色源体および還元剤を含有する試薬と、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素およびパーオキシダーゼを含有する試薬とを含有するアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２２】
下記一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000059
又は一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000060
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000061
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000062
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000063
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000064
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000065
又は、一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000066
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000067
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000068
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す｝で表される色源体および還元剤を含有する試薬と、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素、パーオキシダーゼよび還元剤の還元力を喪失させることができる化合物を含有する試薬とを含有するアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２３】
還元剤がＳＨ基含有化合物、ホスフィン類、ジホスファン類、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、二価鉄塩および水素化ホウ素塩から選択された1種である請求の範囲２１又は２２記載のアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２４】
還元剤がジチオスレイトールである請求の範囲２１又は２２記載のアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２５】
還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＳＨ試薬である請求の範囲２２記載のアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２６】
ＳＨ試薬がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲２５記載のアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２７】
還元剤がジチオスレイトールであり、還元剤の還元力を喪失させることができる化合物がＮ−エチルマレイミドである請求の範囲２２記載のアスコルビン酸定量用キット。
【請求項２８】
色源体が１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）および４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）から選ばれる請求の範囲２０乃至２７のいずれかに記載のアスコルビン酸定量用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アスコルビン酸の定量方法、定量用試薬ならびに定量用キットに関する。
背景技術
アスコルビン酸はビタミンＣとも呼ばれ、生体内で不足すると壊血病等を起こす重要なビタミンである。また、近年アスコルビン酸と老化との関係が注目されている。それ故にアスコルビン酸の定量は重要である。
従来アスコルビン酸を定量する方法として、化学的な測定方法であるヒドラジン法等、機器分析方法である高速液体クロマトグラフィー法等が知られているが、操作が煩雑で定量に多くの時間を要する等の問題がある。
近年、酸素の存在下還元型アスコルビン酸を酸化して酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素（以下本酵素を「ＡＳＯＤ」という）が発見された。試料中のアスコルビン酸は、この酵素反応によって消費される酸素量又は生成する過酸化水素量を測定することにより定量できることが知られている〔ＪＰ−Ａ−２０９７７０／９４、ＪＰ−Ａ−２３９７１／９６（ＥＰ−Ａ−６８２１１６）〕。
ＪＰ−Ａ−２０９７７０／９４は過酸化水素の具体的定量法として化学的な測定方法を開示しているが、パーオキシダーゼを用いる方法を開示していない。ＪＰ−Ａ−２３９７１／９６（ＥＰ−Ａ−６８２１１６）は過酸化水素の具体的測定方法として、パーオキシダーゼの存在下に過酸化水素とフェノール等の水素供与体又はトリンダー試薬及び４−アミノアンチピリン等のカップラー等からなる色源体とを反応させて色素を生成させ、生成色素によって着色した反応液の吸光度を測定する方法を開示している。この方法は過酸化水素の生成反応が終了し、還元型アスコルビン酸が酸化型アスコルビン酸に完全に変換された後、生成した過酸化水素の定量を行う方法である。
一般に、アスコルビン酸やジチオスレイトール等の還元性物質の存在下ではパーオキシダーゼを用いる色素の生成反応は起こりにくいことが知られている。それ故に試料中の還元型アスコルビン酸をＡＳＯＤで完全に酸化し過酸化水素の生成完了後に、色素生成反応を行わせる必要がある。この方法においては、酵素反応を利用するにもかかわらず、化学的に不安定な過酸化水素を一旦反応液中に蓄積する必要がある。
生体試料には尿酸、カタラーゼ、ビリルビン、ヘモグロビン等の還元性物質が存在し、生成する過酸化水素が還元性物質によって消費されるため、過酸化水素を蓄積する前記方法によって再現性のある正確なデータは得られず、操作が煩雑で測定に多くの時間を要する。
また、生体内には還元型アスコルビン酸と共に酸化型アスコルビン酸も存在しており、この還元型アスコルビン酸と酸化型アスコルビン酸を合わせた総アスコルビン酸の定量も臨床的に重要である。
酸化型アスコルビン酸はジチオスレイトール等の還元剤により還元型アスコルビン酸に変換した後、還元型アスコルビン酸をＡＳＯＤを用いて総アスコルビン酸を定量することができる。しかし、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼの存在下に色源体と反応させて生成色素を定量する方法では、色源体が共存する還元剤の影響を受けて色素が生成しにくくなる。この問題を解消するためには過酸化水素定量に先立って反応液中に残存する還元剤を反応液から消去する必要があるが、操作が複雑になる。
試料中の成分の分析において、該成分を基質とする酸化酵素を用いて過酸化水素を生成させ（以下過酸化水素生成反応という）、過酸化水素と色源体から色素を生成する反応（以下色素生成反応という）を同一反応系で行う方法がＪＰ−Ａ−２９２９７／８２（ＵＳＰ４３８４０４２）及びＪＰ−Ａ−２１８０６９／８５に開示されているが、還元型アスコルビン酸をＡＳＯＤで酸化し、生成した過酸化水素と色源体とを反応させて色素を生成させる反応を同一反応系で定量する方法についてはこれらの公報は何も開示していない。
前述のとおり色素生成反応においてアスコルビン酸等の還元性物質の存在下では色素が生成し難いので、過酸化水素生成反応と色素生成反応を同一反応系で行うことは不可能と考えられていた。ところが驚くべきことに、還元性物質の存在下であっても特定の条件下で影響を受けることなく定量できる色源体が存在することを見出し本発明を完成するに至った。
発明の開示
本発明の目的は、臨床検査のスクリーニングにも適用でき、且つ多数検体を同時に測定可能なより簡便なアスコルビン酸の定量方法、アスコルビン酸定量用試薬並びにアスコルビン酸定量用キットを提供することにある。
本発明によれば、試料中のアスコルビン酸を還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素（以下本酵素を「ＡＳＯＤ」という）を用いて定量する方法において、水性媒体中、ＡＳＯＤの存在下、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応と生成した過酸化水素と色源体とをパーオキシダーゼの存在下に反応させて色素を生成する反応とを同一反応系で行わせ、生成する色素を定量することによってアスコルビン酸を定量できる（以下定量方法Ａという）。
試料中に酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤を存在させて前記定量方法Ａを適用することによって、試料中の総アスコルビン酸を定量できる。またこの方法において、酵素反応によって生成した酸化型アスコルビン酸が再び還元剤で還元されて還元型アスコルビン酸に変換するので酸化と還元が繰り返される。従って、比較的低濃度の総アスコルビン酸を容易に定量できる（以下定量方法Ｂという）。
試料中の酸化型アスコルビン酸を還元剤で還元した後、残存する還元剤の還元力を喪失させた試料について、前記定量方法Ａを適用することによって、試料中の総アスコルビン酸を定量できる（以下定量方法Ｃという）。
本発明によれば、ＡＳＯＤ、色源体およびパーオキシダーゼの成分の組み合せからなるアスコルビン酸定量用試薬（以下定量試薬Ａという）が提供される。
定量試薬Ａに、酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤を加えた成分の組み合せからなるアスコルビン酸定量用試薬（以下定量試薬Ｂという）が提供される。
更に定量試薬Ｂに、還元剤の還元能力を喪失させることができる化合物を加えた成分の組み合せからなるアスコルビン酸定量用試薬（以下定量試薬Ｃという）が提供される。
本明細書において、上記定量試薬Ａ、ＢまたはＣは、それらを構成する成分の任意の２もしくはそれ以上の成分が組成物を構成していてもよい。
さらに本発明によれば、アスコルビン酸定量に便利なアスコルビン酸定量用キットが提供される。
本発明の定量用試薬はいわゆる一試薬系で用いることができるが、試薬の保存安定性、操作性、試薬の供給形態等により、多試薬からなるキットとすることができる。キットは各単一の成分および任意の２以上の成分の組み合せからなる組成物から選択して必要な成分を構成するキットを用意すればよい。組成物とすることが好ましくない組み合せ、例えば還元剤と還元力を喪失させることができる化合物の組み合せ等は避けるべきである。キットの例が次に示される。
定量試薬Ａについて、成分をＡＳＯＤおよびパーオキシダーゼからなる試薬と色源体からなる試薬とからなるキットとすることができる（以下キットＡという）。
定量試薬Ｂについて、色源体および還元剤からなる試薬とＡＳＯＤおよびパーオキシダーゼからなる試薬とからなるキットとすることができる（以下キットＢという）。
定量試薬Ｃの成分について、色源体および還元剤からなる試薬とＡＳＯＤ、パーオキシダーゼおよび還元剤の還元力を喪失させることができる化合物からなる試薬とからなるキットとすることができる（以下キットＣという）。
定量用試薬及びそれらのキットを構成する各試薬は、乾燥品でもよいが、試薬の調製を省くためにはあらかじめ水性媒体を添加した液状試薬とすることもできる。
上記いずれの定量試薬あるいはキット中の試薬にも必要に応じて緩衝剤、酵素の賦活剤、防腐剤、安定化剤及び界面活性剤等を適宜加えることができる。またこれらの成分を定量の際反応液中に存在させることができる。
次に本発明による還元型アスコルビン酸の具体的定量方法について述べる。
定量方法Ａにおいては還元型アスコルビン酸を含有する試料、ＡＳＯＤ、色源体及びパーオキシダーゼを水性媒体例えば緩衝液中に加え、混合物を２０〜５０℃で、１〜１５分間反応させる。生成した色素によって着色した反応液の吸光度の変化を測定し、あらかじめ既知濃度の還元型アスコルビン酸含有液を用いて作成した検量線からアスコルビン酸量を求めることができる。
ＡＳＯＤは酸素を基質とするが、通常水性媒体に酸素が存在するので、酸素の供給は特に必要としない。しかし反応に先立って、還元型アスコルビン酸、色源体、ＡＳＯＤ及びパーオキシダーゼ等を含む反応液を振とう又は攪拌することが好ましい。
定量方法Ｂにおいて、アスコルビン酸を含有する試料に酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤が加えられる。ついで、反応混合物について定量方法Ａを実行することにより試料中の還元型および酸化型アスコルビン酸の総量を定量することができる。
より簡便に、この方法を実施するにはアスコルビン酸を含有する試料に定量試薬ＢまたはキットＢを加え、混合物を水性媒体中２０〜５０℃で、３〜３０分間反応させる。生成した色素によって着色した反応液の吸光度の変化を測定し、あらかじめ作成した検量線からアスコルビン酸量をより簡便に求めることができる。
定量方法Ｂにおいては、反応中、酸化型アスコルビン酸が還元剤で還元型アスコルビン酸に還元され、ついで酵素反応によって酸化型アスコルビン酸に変換される。従って酸化反応と還元反応が繰り返され、より高感度にアスコルビン酸を定量することができる。この方法によって、アスコルビン酸の含有量が低い試料の総アスコルビン酸を定量することができる。
定量方法Ｃはアスコルビン酸を含有する試料に酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤を加え、２０〜５０℃で、１〜１５分間反応させて酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元する。ついで還元剤の還元力を喪失させることができる化合物を加え、２０〜５０℃で、１〜１５分間反応させて残存する還元剤の還元力を喪失させた後、定量方法Ａを実行することにより試料中の還元型および酸化型アスコルビン酸の総量を定量するするができる。
この定量方法を実行する際に、還元剤の還元能力を消失させる反応は、定量方法Ａの方法による還元型アスコルビン酸の定量反応と同一反応系で行うことができる。即ち、キットＣの色源体および還元剤からなる試薬をアスコルビン酸含有試料に加えて酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元し、ついでキットＣの他の試薬を加えて酵素反応を行わせ、反応液の吸光度の変化を測定することによって総アスコルビン酸を定量することができる。
呈色反応により生じる色素の定量は、例えば市販の分光光度計を用い、４００〜７５０ｎｍの波長、好ましくは用いる色源体の極大吸収波長にて試薬ブランクを対照として吸光度の変化、通常吸光度の増加を測定することによって行われる。既知濃度を含有する還元型アスコルビン酸溶液を用いて、上述と同様に反応させ、吸光度の変化を測定し、検量線を作成する。未知量の還元型アスコルビン酸又は還元型アスコルビン酸と酸化型アスコルビン酸の総量はこの検量線を用いて定量することができる。
反応液中の各成分は次に示される濃度で用いられる。
色源体は反応液中の還元型アスコルビン酸濃度と等モル濃度以上、好ましくは１〜１０，０００倍濃度、より好ましくは１０〜１，０００倍濃度となるように調製される。通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭの濃度で用いられる。
アスコルビン酸酸化酵素（ＡＳＯＤ）およびパーオキシダーゼは、それぞれ０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いられる。
還元剤は、酸化型アスコルビン酸濃度と等モル濃度以上、好ましくは１〜１，０００倍、より好ましくは１０〜１００倍濃度で用いられ、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で用いられる。
緩衝剤は、１〜２０００ｍＭ、好ましくは５〜１０００ｍＭの濃度で用いられる。緩衝液のｐＨは、酵素及び各試薬の安定性及び反応条件等により決定されるが、ｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜９である。
還元剤の還元能力を喪失できる化合物は、酸化型アスコルビン酸を還元するのに用いた還元剤の濃度の１〜１０倍、好ましくは２〜５倍の濃度で用いられる。
これら定量用試薬及びそれらのキットを構成する各試薬中の各成分の含量又は濃度は、各成分の構成及び使用方法により変化させることができ、各成分が反応液を調製するために水性媒体に添加された時点又はそれ自身が反応液として調製された時点で前述した好ましい濃度となるように調整される。
試料中の酸化型アスコルビン酸量は、還元型および酸化型アスコルビン酸総量から還元型アスコルビン酸量を差し引くことにより求めることができる。
本発明において用いられる色源体としては、過酸化水素の定量反応において還元性物質の影響を受けにくい色源体であれば、いずれも用いうるが、好ましい化合物として下記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される化合物が例示できる。
一般式（Ｉ）
0004073963.tif 000002
一般式（ＩＩ）
0004073963.tif 000003
｛一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｙは水素原子又は一般式（ＩＩＩ）
0004073963.tif 000004
（式中、Ｚは酸素又はイオウを示し、Ｘは水素、アルキル、アルケニル、アリール、モノ置換アミノ又は非置換アミノを示す。）を示し、Ｒ1はヒドロキシ、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、一般式（ＩＶ）
0004073963.tif 000005
、一般式（Ｖ）
0004073963.tif 000006
、一般式（ＶＩ）
0004073963.tif 000007
、一般式（ＶＩＩ）
0004073963.tif 000008
又は一般式（ＶＩＩＩ）
0004073963.tif 000009
［一般式（ＩＶ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ａ1はアルキレンを示し、Ａ2は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルケニル、脂環式アルキル、モノもしくはジ置換アミノ又は非置換アミノを示し、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5及びＢ6は同一もしくは異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アロイル、アリール、ハロゲン、ニトロ、スルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ又はヒドロキシ置換アルキルを示す。］で表わされる基を示すか、Ｒ3とＲ4又はＲ5とＲ6は一体となってアルケニレンを形成してもよく、Ｊは酸素、イオウ、一般式（ＩＸ）
0004073963.tif 000010
又は一般式（ＸＩ）
0004073963.tif 000011
［一般式（ＩＸ）及び（ＸＩ）中、Ｒ7及びＲ8は同一もしくは異なって、水素、アルキル又はアルケニルを示す。］で表わされる基を示す。｝
上記各基の定義においてアルキル及びアルコキシ、ヒドロキシ置換アルキルにおけるアルキル部分は、直鎖又は分枝状の炭素数１〜６のアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、イソアミル、ヘキシル等を含む。ヒドロキシ置換アルキルのヒドロキシ置換数は１〜２を示す。
アルカノイルは、炭素数１〜６のアルカノイル、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル等を含む。
脂環式アルキルは、炭素数３〜８の脂環式アルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等を含む。アルケニルは、直鎖又は分枝状の炭素数２〜６のアルケニル、例えばビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等を含む。アリール及びアロイルにおけるアリール部分の例はフェニル、ナフチル等を含む。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を示す。
アルキレンは炭素数１〜６のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、メチルメチレン、プロピレン、メチルエチレン、エチルメチレン、ブチレン、１−メチルプロピレン、２−メチルプロピレン、エチルエチレン、プロピルメチレン、ペンチレン、メチルブチレン、エチルブチレン、プロピルメチレン、ブチルメチレン、ヘキシレン等を含む。
アルケニレンは、炭素数３〜４のアルケニレン、例えば−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−等を含む。
Ｒ1、Ｒ2、Ａ2及びＢ1〜Ｂ6の定義中のモノもしくはジ置換アミノの置換基の例は、置換もしくは非置換アルキル、アリール、脂環式アルキル、アルカノイル、アロイル、アルケニル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アルコキシスルホニル、カルバモイル等を含む。
アルキル、アルカノイル、アルコキシ、アリール、アロイル、脂環式アルキル及びアルケニルは前記と同義である。アルコキシカルボニル及びアルコキシスルホニルのアルキル部分は前述のアルキルと同義である。
置換アルキルは、同一又は異なった、１〜３の置換基を有し、該置換基の例は、ヒドロキシ、スルホ、アリール、アルカノイル、アロイル等を含む。
アリール、アルカノイル、アロイルは前記と同義である。
Ｘの定義中のモノ置換アミノの置換基の例は、脂環式アルキル、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール等を含む。脂環式アルキル、アルキル、アリールは前記と同義である。
置換アルキルは、同一又は異なった、１〜２の置換基を有し、該置換基の例は、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノフェニル、アルコキシカルボニルアミノアルキルフェニル等を含む。該置換基におけるアルコキシのアルキル部分は前記と同義であり、アルコキシカルボニルアミノアルキルフェニルのアルキル部分は前述したアルキレンと同義である。
置換アリールは、同一又は異なった、１〜２の置換基を有し、該置換基の例は、ハロゲン、アミノ、スルホ、アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノアルキル等を含む。アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノアルキル及びハロゲンは前記と同義である。
一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で表される化合物の具体例は、例えばＪＰ−Ａ−２９２９７／８２（ＵＳＰ４３８４０４２）、ＪＰ−Ａ−２１８０６９／８５及びＪＰ−Ａ−１２８７９９／８９、ＪＰ−Ａ−１４５３５２／８１（ＵＳＰ４８５１３５３）、ＪＰ−Ａ−１８２３６１／８４（ＵＳＰ４９１６０５８）に記載されている化合物を含む。
一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で表される化合物の中で特に好ましい化合物は、一般式（Ｉ）に含まれる化合物、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＣＣＡＰと略記する。）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＭＣＤＰと略記する。）等、一般式（ＩＩ）に含まれる化合物、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（以下、ＤＡ−６４と略記する。）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（以下、ＢＣＭＡと略記する。）等を含む。これらの色源体は例えばＪＰ−Ａ−５７−２９２９７（ＵＳＰ４３８４０４２）に記載の方法によって合成することができる。
ＡＳＯＤは、例えばユウペニシリウム（Eupenicillium）属（ＪＰ−Ａ−２３９７１／９６号公報）、トリコデルマ（Trichoderma）属又はモルティエレラ（Mortierella）属（ＪＰ−Ａ−２０９７７０／９４号公報）、プロウロタス（Pleurotus）属［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２７１，３１０５（１９９６）］等の微生物由来のアスコルビン酸酸化酵素、植物由来あるいは遺伝子組換え菌由来のものなどを使用することができる。また市販品［例えば、天野製薬（株）製］を入手できる。
パーオキシダーゼは、微生物、動物、植物から抽出して用いることができるが、市販品を利用できる。
酸化型アスコルビン酸を還元型アスコルビン酸に還元できる還元剤は、ＳＨ基含有化合物、ホスフィン類、ジホスファン類、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、二価鉄塩、水素化ホウ素塩等を含む。
ＳＨ基含有化合物は、例えばＮ−アセチルシステイン、還元型システイン、還元型グルタチオン等のアミノ酸又はペプチド類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のアルコール類、チオグリコール酸等のカルボン酸類、チオグルコース等の糖類、臭化−２−アミノエチルイソチオウロニウム等のチオウロニウム塩類を含む。
ホスフィン類は、置換もしくは非置換のホスフィンを含む。非置換ホスフィンはＰＨ3（ホスフィン）を意味する。
置換ホスフィンは、同一または異なった、１〜３の置換基を有し、該置換基の例は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換芳香族複素環基、置換もしくは非置換アミノ、置換もしくは非置換カルバモイル、置換もしくは非置換アルコキシ、置換もしくは非置換アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、置換もしくは非置換スルホ等を含む。
置換数１のものを第一ホスフィン類、置換数２のものを第二ホスフィン類、置換数３のものを第三ホスフィン類という。
ジホスファン類の例は、置換もしくは非置換のジホスファンを含む。非置換ジホスファンはＰ2Ｈ4（ジホスファン）を意味する。
置換ジホスファンは同一又は異なった、１〜４の置換基を有し、該置換基の例は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換芳香族複素環基、置換もしくは非置換アミノ、置換もしくは非置換カルバモイル、置換もしくは非置換アルコキシ、置換もしくは非置換アルカノイル、置換もしくは非置換アロイル、置換もしくは非置換スルホ等を含む。
ホスフィン類及びジホスファン類の置換基としての、置換もしくは非置換アルキル及び置換もしくは非置換アルコキシ並びに置換もしくは非置換アルカノイルのアルキル部分及び置換もしくは非置換アリール及び置換もしくは非置換アロイルのアリール部分は、前述のアルキル及びアリールと同意義である。
ホスフィン類及びジホスファン類の置換基としての、置換もしくは非置換芳香族複素環基の芳香族複素環基の例は、ピリジル、ピリミジニル、ナフチリジニル、フリル、チエニル、ピラゾリニル、イミダゾリル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル等を含む。
置換アルキルは、同一または異なった、１〜３の置換基を有し、該置換基の例は、アリール、芳香族複素環基、アルコキシ、アルカノイル、アロイル、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ホスホ、シアノ、ハロゲン等を含む。アリール、芳香族複素環基、アルコキシ、アルカノイル、アロイル及びハロゲンはそれぞれ前記と同意義を表す。
置換アリールは、同一または異なった、１〜５の置換基を有し、該置換基の例は、アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アロイル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、シアノ、アミノ、スルホ、ホスホ、ハロゲン等を含む。アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アロイル、アルコキシカルボニル及びハロゲンはそれぞれ前記と同意義である。置換芳香族複素環基は、同一または異なった、置換数１〜３の置換基を有し、該置換基は、前述の置換アリールと同一の置換基を含む。
置換アミノまたは置換カルバモイルは、同一または異なった、１〜２の置換基を有し、該置換基の例は、前述したと同様の置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール及び置換もしくは非置換の芳香族複素環基、アルカノイル、アロイル、アルコキシカルボニル等を含む。
置換アルコキシは、同一または異なった、１〜２の置換基を有し、該置換基の例は、アミノ、ヒドロキシ、スルホ、ホスホ、シアノ、前述のハロゲン等を含む。
置換スルホの置換基の例は、前述したと同様の置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基等を含む。
第一ホスフィン類の例は、メチルホスフィン、エチルホスフィン、プロピルホスフィン、イソブチルホスフィン、フェニルホスフィン、２−ナフチルホスフィン、２−ベンゾフラニルホスフィン、２−ホスフィノエチルアミン、４−（ホスフィノメチル）イミダゾール、１，２，４−ブタントリイルトリス（ホスフィン）、（フェニルスルホニル）ホスフィン、カルバモイルホスフィン等を含む。
第二ホスフィン類の例は、ジメチルホスフィン、ジエチルホスフィン、ジイソプロピルホスフィン、ジイソアミルホスフィン、ジフェニルホスフィン、３，３’−ホスフィンジイルジプロピオン酸、４−（ホスフィノメチル）イミダゾール、４，４’−ホスフィンジイルジ安息香酸等を含む。
第三ホスフィン類の例は、トリメチルホスフィン、トリエチルホスフィン、トリ−ｎ−ブチルホスフィン、トリ−ｎ−ヘキシルホスフィン、トリフェニルホスフィン、メチルジフェニルホスフィン、ジメチルフェニルホスフィン、ホスフィントリイルトリジメチルアミン、ホスフィントリイルトリジエチルアミン、トリス（２−メチルフェニル）ホスフィン、トリス（３−メチルフェニル）ホスフィン、トリス（４−メチルフェニル）ホスフィン、トリス（４−メトキシフェニル）ホスフィン、ホスフィントリイルトリ酢酸、３，３’，３”−ホスフィントリイルトリプロピオン酸、４，４’，４”−ホスフィントリイルトリ安息香酸、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、２，２’，２”−ホスフィントリイルトリエチルシアニド、エチル（フェニル）プロピルホスフィン、アセチルジエチルホスフィン等を含む。
亜硫酸塩、亜二チオン酸塩の塩はリチウム、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩等を含む。
二価鉄塩は、ハロゲン化鉄、硫酸鉄、硝酸鉄等を含む。ハロゲンは、前記と同意義である。
これら還元剤のなかで、ＳＨ基含有化合物が好ましい。
還元剤の還元能力を喪失させることができる化合物として、ＳＨ試薬、酸化物等が用いられるが、用いる還元剤の種類により選択される。還元剤としてＳＨ基含有化合物を用いる場合は、例えば酸化剤、メルカプト形成剤、アルキル化剤等のＳＨ試薬が好ましく用いられ、アルキル化剤が特に好ましい。
酸化剤の例は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、２，２’−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、酸化型グルタチオン等を含み、メルカプト形成剤の例は、ｐ−メルクリ安息香酸、ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸等を含み、アルキル化剤の例は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド等を含む。酸化物の例はヨウ素酸カリウム等ヨウ素酸塩等を含む。
緩衝剤の例は、乳酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、グリシン塩、３，３−ジメチルグルタル酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、ホウ酸塩、バルビツール塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、イミダゾール−酢酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、炭酸塩、グッド緩衝剤等を含む。
酵素の賦活剤の例は、デヒドロ酢酸を含む。防腐剤の例は、アジ化ナトリウム、硫酸ストレプトマイシンを含む。安定化剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）等の金属キレート剤を含み、その他酵素の安定化剤の例は可溶性デンプン等の多糖類及びその誘導体、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子化合物を含む。界面活性剤の例は、トリトンＸ−１００等を含む。
水性媒体としては、緩衝液、生理食塩水、蒸留水等水を含有する液体を例示できるが緩衝液が好ましい。
上記に示した化合物又は酵素は、例えば東京化成（株）、（株）同仁化学研究所、大東化学（株）、和光純薬工業（株）、盛進（株）、ナカライ（株）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社等の試薬カタログに掲載されており、市販品が入手できる。
以下に試験例を述べる。
試験例１（反応液の発色における還元型アスコルビン酸の影響）
トリンダー型試薬として、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（以下、ＨＳＤＡと略記する。）と４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する。）及びＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（以下、ＥＭＳＥと略記する。）と４−ＡＡ並びにロイコ型色源体として、ＣＣＡＰ及びＢＣＭＡを試験に用いた。
第１表に示す濃度の還元型アスコルビン酸、６．２５Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ及び０．０８６ｍＭの上記各色源体を含む１０．０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、ＰＩＰＥＳと略記する）緩衝液（ｐＨ６．０）を３７℃５分間加温した後、それぞれに過酸化水素が２５μＭとなるように添加して反応を開始した。反応が平衡に達した後、各色源体の最大吸収波長における反応液の吸光度を測定した。反応前後の吸光度の変化を第１表に示す。
0004073963.tif 000012
第１表に示す様に、トリンダー試薬であるＥＭＳＥと４−ＡＡ及びＨＳＤＡと４−ＡＡ並びにロイコ型色源体であるＣＣＡＰ及びＢＣＭＡのいずれを用いた呈色反応も還元型アスコルビン酸の存在により阻害される。
試験例２（反応液の発色におけるジチオスレイトールの影響）
試験例１の還元型アスコルビン酸に代えて、ジチオスレイトールを用いる他は試験例１と同様な試験を行った。
反応前後の吸光度の変化を第２表に示す。
0004073963.tif 000013
第２表に示される様に、トリンダー試薬であるＥＭＳＥと４−ＡＡ及びＨＳＤＡと４−ＡＡ並びにロイコ型色源体であるＣＣＡＰ及びＢＣＭＡのいずれを用いた呈色反応もジチオスレイトールの存在により阻害される。
試験例３
６．２５Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ及び０．０８６ｍＭの第３表に示される各色源体を含む１０．０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を３７℃５分間予備加温した後、過酸化水素が１５μＭとなるように添加して反応を開始した（反応系１）。
一方、２．７６Ｕ／ｍｌＡＳＯＤ（アスコルビン酸酸化酵素，天野製薬製、タイプＩＩＩ）、６．２５Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ及び０．０８６ｍＭの各色源体を含む１０．０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を３７℃５分間加温した後、還元型アスコルビン酸が１５μＭとなるように添加して反応を開始した（反応系２）。
それぞれの反応系で、反応開始時及び反応が平衡に達した後、反応液の吸光度を各色源体の最大吸収波長で測定した。それぞれの反応系の反応前後の吸光度の変化を第３表に示す。
0004073963.tif 000014
第３表に示される様に、ＥＭＳＥと４−ＡＡ及びＨＳＤＡと４−ＡＡを色源体とした場合は、ＡＳＯＤによる酵素反応で生じる過酸化水素と該色源体との反応による反応液の着色をほとんど検出することができない。一方、ロイコ型色源体ＣＣＡＰ及びＢＣＭＡを用いた場合は、酵素反応で生じる過酸化水素と該色源体との反応による色素の生成が良好に認められ、本反応系により還元型アスコルビン酸の定量が可能なことが示される。
試験例４
２．７６Ｕ／ｍｌのＡＳＯＤ（アスコルビン酸酸化酵素、天野製薬製、タイプＩＩＩ）、６．２５Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ及び０．０８６ｍＭ  ＣＣＡＰを含む１０．０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を３７℃５分間加温した後、還元型アスコルビン酸が７．５μＭとなるように添加して反応を開始した（ＤＴＴ無添加区）。
一方、２．７５Ｕ／ｍｌＡＳＯＤ、６．２５Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ、０．０８６ｍＭ  ＣＣＡＰ及び２．１６ｍｇ／ｄｌジチオスレイトールを含む１０．０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を３７℃５分間加温した後、アスコルビン酸が７．５μＭとなるように添加して反応を開始した（ＤＴＴ添加区）。
それぞれの反応系で、反応開始時及び反応が平衡に達した後、反応液の吸光度を６６０ｎｍで測定した。それぞれの反応系の反応前後の吸光度の変化を第４表に示す。
0004073963.tif 000015
第４表に示される様にジチオスレイトールの添加により本反応の発色の度合いが大きく高められるので、本方法により還元型アスコルビン酸の高感度の測定の可能性が示される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、試薬液Ａ−１を用いて測定した場合の還元型アスコルビン酸濃度と吸光度の関係を示す検量線である。
第２図は、試薬液Ａ−２を用いて測定した場合の還元型アスコルビン酸濃度と吸光度の関係を示す検量線である。
第３図は試薬液Ｂ−１を用いて測定した場合の還元型アスコルビン酸濃度と吸光度の関係を示す検量線である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の態様を実施例によって説明する。
実施例において下記試薬液を調製して用いた。
＊還元型アスコルビン酸定量用試薬液
試薬液Ａ−１
ＣＣＡＰ                                ０．０８９  ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ９７．４      ｍＭ
パーオキシダーゼ                        ６．５      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                                ３．１      Ｕ／ｍｌ
試薬液Ａ−２
ＢＣＭＡ                                ０．１２５  ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ９７．４      ｍＭ
パーオキシダーゼ                        ６．５      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                                ３．１      Ｕ／ｍｌ
試薬液Ａ−３
ＭＣＤＰ                                ０．１１５  ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ９７．４      ｍＭ
パーオキシダーゼ                        ６．５      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                                ３．１      Ｕ／ｍｌ
＊総アスコルビン酸の定量用試薬液
試薬液Ｂ−１
ＣＣＡＰ                                ０．０８９  ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ９７．４      ｍＭ
パーオキシダーゼ                        ６．５      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                                ３．１      Ｕ／ｍｌ
ジチオスレイトール                      ２．１６    ｍＭ
試薬液Ｂ−２                            ０．１２５  ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ９７．４      ｍＭ
パーオキシダーゼ                        ６．５      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                                ３．１      Ｕ／ｍｌ
ジチオスレイトール                      ２．１６    ｍＭ
＊還元型アスコルビン酸定量用試薬液のキット
キットＡ−４
試薬液Ａ−４ａ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）      ９．５        ｍＭ
ＣＣＡＰ                                ０．１１５    ｍＭ
試薬液Ａ−４ｂ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ８６．７      ｍＭ
パーオキシダーゼ                      ２５．０      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                              １２．０      Ｕ／ｍｌ
＊総アスコルビン酸の定量用試薬のキット
キットＣ−１
試薬液Ｃ−１ａ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）      ９．５        ｍＭ
ジチオスレイトール                      ０．５８      ｍＭ
ＣＣＡＰ                                ０．１１５    ｍＭ
試薬液Ｃ−１ｂ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）    ８６．７      ｍＭ
Ｎ−エチルマレイミド                    ４．２７    ｍＭ
パーオキシダーゼ                      ２５．０      Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ                              １２．０      Ｕ／ｍｌ
実施例１
標準液として種々の濃度の還元型アスコルビン酸を含む１０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を作成した。
試薬液Ａ−１の２．９ｍｌを３７℃５分間加温した後アスコルビン酸標準液０．１ｍｌを添加し３７℃５分間反応させた。反応終了後、反応液の吸光度の増加を６６０ｎｍで測定した。
第１図に還元型アスコルビン酸と吸光度の値の関係を示す。横軸に添加した還元型アスコルビン酸溶液の濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、縦軸に６６０ｎｍにおける吸光度値を示した。本図より被検液の還元型アスコルビン酸含有量と吸光度の比例関係を利用して被検液中の還元型アスコルビン酸量を良好に測定できることが明らかである。還元型アスコルビン酸は０．２ｍｇ／ｄｌ程度まで十分に測定可能である。
実施例２
試薬液Ａ−１の代わりに試薬液Ａ−２を用いる他は実施例１と同様に反応を行わせ、反応液の吸光度の増加を７５５ｎｍで測定した。結果を第２図に示す。
本図より被検液の還元型アスコルビン酸含有量と吸光度の比例関係を利用して被検液中の還元型アスコルビン酸量を良好に測定できることが明らかである。還元型アスコルビン酸は０．２ｍｇ／ｄｌ程度まで十分に測定可能である。
実施例３
実施例１に準じて新鮮な血清試料１〜３中の還元型アスコルビン酸濃度を試薬液Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３を用いて測定した。反応液の吸光度は用いた色源体の極大吸収波長で測定された。
また、比較対象として該血清試料をアスコルビン酸用定量キット（ベーリンガーマンハイム社製、Ｆ−キット  Ｌ−アスコルビン酸  製品番号４０９６７７）を用いて定量した。結果を第５表に示す。
0004073963.tif 000016
第５表に示される様に、本発明定量方法の結果はＦ−キットとほぼ同様の値を得た。血清試料３についてはＦ−キットを用いると吸光度が低く測定ができなかったが、本発明の定量方法では測定が可能であった。
実施例４
キットＡ−４およびキットＣ−１を用いて還元型アスコルビン酸と酸化型アスコルビン酸の総量を定量した。
還元型アスコルビン酸と酸化型アスコルビン酸を第６表に示す様に総量が２．５ｍｇ／ｄｌとなるように１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し試料液を調製した。
試薬液Ａ−４ａ及び試薬液Ｃ−１ａの２．２ｍｌにそれぞれ試料液５０μｌを添加し、３７℃５分間加温した後それぞれ試薬液Ａ−４ｂ及び試薬液Ｃ−１ｂの０．７５ｍｌを添加して３７℃５分間反応させた。反応後、反応液の吸光度の増加を６６０ｎｍで測定した。結果を第６表に示す。
0004073963.tif 000017
第６表に示すように、キットＡ−４を用いる方法によって、還元型アスコルビン酸量に比例した吸光度が得られ、キットＣ−１を用いる方法によって、還元型アスコルビン酸及び酸化型アスコルビン酸の総量に対応する吸光度が測定された。
実施例５
実施例３の血清試料１及び該血清試料１を室温下に６時間放置した試料の各５０μｌについてキットＣ−１を用いて実施例４の方法で定量した。このとき同様にＦ−キットを用いて同じ試料についてそれぞれ測定した。結果を第７表に示す。
0004073963.tif 000018
保存血液については、還元型アスコルビン酸を定量するＦ−キットによっては吸光度を測定ができなかったことから還元型アスコルビン酸は酸化型アスコルビン酸に酸化されていることがわかる。
長時間の放置により還元型アスコルビン酸が酸化され酸化型アスコルビン酸に変化している試料の場合においても放置前の還元型アスコルビン酸及び酸化型アスコルビン酸総量と同様な値が得られた。なお、保存血液試料中の還元型アスコルビン酸及び酸化型アスコルビン酸総量が新鮮な場合に比べ低いのは保存により酸化型アスコルビン酸が２、３−ジケトグロン酸へ不可逆的に分解したことによるものと考えられる。また実施例３に比べ本法によって得られる新鮮血液の値が高いのは血液にあらかじめ含まれていた酸化型アスコルビン酸を合わせて測定しているためである。
実施例６
標準液として種々の濃度の還元型アスコルビン酸を含む１０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を作成した。
試薬液Ｂ−１の２．９ｍｌを３７℃５分間加温した後、還元型アスコルビン酸標準液０．１ｍｌを添加し３７℃２０分間反応させた。反応終了後、反応液の吸光度の増加を６６０ｎｍで測定した。
第３図に還元型アスコルビン酸濃度と吸光度の値の関係を示す。横軸に添加した還元型アスコルビン酸濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、縦軸に６６０ｎｍにおける吸光度値を示す。本図より還元型アスコルビン酸の高感度試薬液Ｂ−１を用いて被検液の還元型含有量と吸光度の比例関係を利用して被検液中の微量な還元型アスコルビン酸を良好に定量できることが明らかである。還元型アスコルビン酸は０．０５ｍｇ／ｄｌ程度まで十分に測定可能である。
産業上の利用分野
本発明によれば、診断薬の分野において有用なアスコルビン酸の定量方法、定量用試薬、定量用キットを提供することができる。
【図１】
0004073963.tif 000069
【図２】
0004073963.tif 000070
【図３】
0004073963.tif 000071