(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸単離物。
【請求項２】
コード・ヌクレオチド配列が配列番号１のコード・ヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号２に示す品種シロイヌナズナのＧＡＩアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、追加および／または置換によって異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物であって、植物中での前記核酸の発現が該植物の成長の阻害をもたらし、該阻害がジベレリン（ＧＡ）によって拮抗される核酸単離物。
【請求項４】
植物中での前記核酸の過剰発現が該植物に矮性表現型を付与し、その矮性表現型がＧＡ処理によって変更可能である、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号２の位置２７〜４３の１７個のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第３項または第４項による核酸。
【請求項６】
配列番号２の位置２７〜４３の１７個のアミノ酸配列中の残基と対応する位置で少なくとも１０個の残基が類似性を有する１７個のアミノ酸残基の近接配列を前記ポリペプチドが含む、請求項３または４記載の核酸。
【請求項７】
配列番号２の品種シロイヌナズナのＧＡＩアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、追加および／または置換によって異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物であって、植物中での前記核酸の発現が該植物にＧＡＩ非発現突然変異体表現型を補足し、このような表現型がパクロブトラゾールの矮性効果に耐性である核酸単離物。
【請求項８】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項３〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項９】
配列番号２の位置２７〜４３の１７個のアミノ酸配列あるいは配列番号２の位置２７〜４３の１７個のアミノ酸配列中の残基と対応する位置で少なくとも１０個の残基が類似性を有する１７個の近接アミノ酸配列の欠失を除いて請求項７記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物。
【請求項１０】
配列番号２の品種シロイヌナズナのＧＡＩアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と１または数個のアミノ酸の挿入、欠失、追加および／または置換によって異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物であって、植物中での前記核酸の発現が該植物にジベレリン非応答性の表現型を付与する核酸単離物。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号２の位置２７〜４３の１７個のアミノ酸が欠失した配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
コード・ヌクレオチド配列が、配列番号１のコード・ヌクレオチド配列であるが配列番号２の位置２７〜４３のアミノ酸をコードするヌクレオチドが欠失した配列を含む、請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
前記コード・ヌクレオチド配列からの発現の調節配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の核酸。
【請求項１７】
前記調節配列が誘導可能なプロモーターを含む、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
植物細胞の形質転換に適し、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の異種性核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
微生物である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
植物細胞である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２２】
異種の前記核酸をそのゲノム内に有する請求項２１記載の植物細胞。
【請求項２３】
半数体ゲノムにつき１つを超える前記ヌクレオチド配列を有する請求項２２記載の植物細胞。
【請求項２４】
植物、植物の一部または植物胎芽、あるいは植物の抽出物に含まれる、請求項２１〜２３のいずれかに記載の植物細胞。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれかに記載の植物細胞を産生する方法であって、前記核酸を形質転換によって細胞へ取り込む段階を含む方法。
【請求項２６】
核酸が安定してそこに組込まれるようにその核酸を細胞ゲノム核酸と組換える段階を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
１個以上の形質転換細胞からの植物の再生を含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１〜２３のいずれかに記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２９】
請求項２８記載の植物の有性または無性で繁殖させた子孫、またはクローン、あるいは前記の植物、子孫またはクローンの任意の一部または胎芽である植物。
【請求項３０】
請求項２９記載の植物の一部または胎芽、あるいは抽出物。
【請求項３１】
植物を作出する方法であって、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸を植物細胞に組み込む段階と、前記植物細胞から植物を再生する段階を含む方法。
【請求項３２】
前記植物細胞から再生した植物の子孫を有性または無性で繁殖させるか成長させる段階を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
植物の特徴に影響を及ぼす方法であって、植物の細胞内で請求項１または請求項２に記載の異種性核酸を発現することを含む方法。
【請求項３４】
植物の特徴に影響を及ぼす方法であって、植物の細胞内で請求項３〜６のいずれかに記載の異種性核酸を発現することを含む方法。
【請求項３５】
植物の特徴に影響を及ぼす方法であって、植物の細胞内で請求項７または８記載の異種性核酸を発現することを含む方法。
【請求項３６】
植物の特徴に影響を及ぼす方法であって、植物の細胞内で請求項９〜１３のいずれかに記載の異種性核酸を発現することを含む方法。
【請求項３７】
請求項１または請求項２に記載の核酸のトランスジェニック植物の作出での使用。
【請求項３８】
請求項３〜６のいずれかに記載の核酸のトランスジェニック植物の作出での使用。
【請求項３９】
請求項７または８記載の核酸のトランスジェニック植物の作出での使用。
【請求項４０】
請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸のトランスジェニック植物の作出での使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は植物の成長および／または開発と、それらに関与する遺伝子のクローニングおよび発現に関する。さらに具体的には、本発明は、シロイヌナズナおよび他品種由来相同体であるＧＡＩ遺伝子のクローニングおよび発現に関し、植物での該遺伝子の使用に関する。
開花を含む、植物の成長・開発に影響を及ぼす遺伝機構について理解すると、標的植物の特徴を変更する手段が得られる。成長および／または開発特徴の操作が有利となり得る植物種には全作物が含まれ、重要な例としては、比較的暖かい気候区では恐らく最も農業経済学的に重要な穀物である稲およびトウモロコシなどがあり、より温和な気候では小麦、大麦、エンバクおよびライ麦などがある。種子生成物のための重要な作物は、油種子ナタネおよびカノーラ、サトウダイコン、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆およびモロコシなどである。根を収穫される多くの作物は、言うまでもなく種子から毎年成長するため、いかなる種類の種子の産生も、開花、授粉、種子形成という植物の能力に大いに依存する。園芸では、開花を含む成長・発育のタイミングに対する管理が重要である。開花を調節し得る園芸植物としては、レタス、キクヂシャ、キャベツとブロッコリとカリフラワーを含むアブラナ属の野菜、カーネーション、ゼラニウムなどがある。一方では矮性植物、他方では特大の、より丈の高い植物が有利かもしれず、かつ／または様々な園芸の情況および農業の情況で望ましいかもしれない。
イロイヌナズナ（アラビドプシス）はモデル生物として植物遺伝学者に人気がある。小さく、特性が十分決定されたゲノムを有し、形質転換、再生が比較的容易であり、かつ迅速な成長サイクルを有するため、アラビドプシスは成長・開発およびその調節を研究する理想的なモデル植物である。
多くの植物の成長・開発プロセスは、ジベレリン（ＧＡ）1として知られている、４環式ジテルペノイド成長因子ファミリーの特定要素によって調節される。アラビドプシスがｇａｉ変異すると矮性表現型が得られ、ＧＡ応答性の劇的低下がもたらされる2-9。本明細書では、我々はＤｓトランスポゾン突然変異誘導を介したｇａｉの分子クローニングを報告する。
Ｄｓ挿入対立遺伝子によって付与される表現型によると、ｇａｉが機能獲得性の変異となることと、野生型対立遺伝子（ＧＡＩ）がなくても済むことが保証される5,6。ＧＡＩは、５３２個のアミノ酸残基（そのうち１７個のアミノ酸ドメインがｇａｉ突然変異体ポリペプチドに欠失）の新規ポリペプチド（ＧＡＩ）をコードする。この結果は、活性がＧＡによって拮抗される植物成長リプレッサーの役割をするＧＡＩと一致している。我々は特定の理論に縛られるつもりはないが、ｇａｉにはＧＡシグナルと相互作用するドメインが欠けているため、ｇａｉは構造的に成長を抑制する可能性がある。従って、このモデルによれば、ＧＡは抑制解除によって植物の成長を調節する。
ｇａｉは優性で機能獲得性の変異であり、暗緑色の矮性表現型を付与し、ＧＡ受容あるいは後のシグナル形質導入を妨害する2-9。類似した表現型を付与する優性変異は、トウモロコシ10-12および小麦13を含む他の植物種で知られている。後者は、高産生の半矮性小麦品種「緑の革命」14の基礎であるため、特に重要である。この品種の産生量増大は、穂当たり穀物産生の増大と優れたわらの強度による。より短くより強いわらは、倒伏（雨／風により小麦が倒れること）による損失を大いに低減する。我々は、ＧＡシグナルの形質導入についての理解にｇａｉが重要であるため、また、小麦と、既に小麦で見られている進歩に匹敵する進歩が予想される油種子ナタネや稲などの他の穀物の開発にＧＡ無感受性を使用できる可能性があるため、アラビドプシス由来のｇａｉのクローン化に着手した。
本発明の第一の態様によると、ＧＡＩ機能のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。「ＧＡＩ機能」の語は、シロイヌナズナのＧＡＩ遺伝子などの植物の表現型に影響を及ぼす能力を示す。「ＧＡＩ機能」は、阻害、抑圧、抑制あるいは低減がＧＡにより拮抗される植物成長の阻害、抑圧、抑制あるいは低減として植物中で表現型で観察し得る、。ＧＡＩの発現は、ＧＡによって拮抗される植物に矮性表現型を付与する傾向がある。ＧＡＩ機能を備えたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列由来の植物中での過剰発現は、植物にＧＡ処理によって変更可能な矮性表現型を付与するために使用し得る。
また、本発明の一態様によると、発現にあたってｇａｉ突然変異体表現型を付与する能力のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。ｇａｉ突然変異体植物は野生型と比較して矮化され、矮化はＧＡ非感受性である。
ジベレリンまたはＧＡとは第１図に示した生物活性を有する基本的炭素環構造のあるジテルペノイド分子を意味し、即ち生物活性のあるジベレリンのことをいう。
生物活性は、細胞伸長の刺激、葉の老化、穀物アリューロンα−アミラーゼ反応の誘導などの１つ以上によって定義し得る。当技術分野において利用可能な多くの標準アッセイ法があり、そのうちのいずれか１つ、またはそれ以上のアッセイ法の肯定的結果によって被検ジベレリンに生物活性があることが示される28,29,30。
当技術分野で利用可能なアッセイ法としては、レタス胚軸分析、キュウリ胚軸分析、オート麦第一葉分析などがあり、それらはすべて、使用したジベレリンの、それぞれの組織の伸長を引き起こす能力に基づいて生物活性を測定する。好ましい分析は、被検成分をジベレリン欠乏植物に適用するものである。このような好ましい分析としては、成長測定のための矮性ＧＡ欠失アラビドプシス処理、節間伸長を測定する矮性エンドウ分析、葉鞘の伸長を測定する短銀坊主矮性稲分析、これも葉鞘伸長を測定するｄ５−トウモロコシ分析などがある。伸長生物検定は、それぞれの器官での一般細胞伸長の影響を測定し、特定の細胞型に限定されない。
さらに利用可能な分析としてはギシギシ（Ｒｕｍｅｘ）葉老化分析、穀物アリューロンα−アミラーゼ分析などがある。穀物中の胚乳を囲むアリューロン細胞は発芽にあたってα−アミラーゼを分泌し、α−アミラーゼによりデンプンが消化されて砂糖が生じ、次いで成長中の植物によって使用される。酵素産生はＧＡによって調節される。生物活性のあるＧＡを与えた単離アリューロン細胞はα−アミラーゼを分泌し、次いで、例えばデンプンの分解測定などにより、α−アミラーゼの活性を分析し得る。
高い生物活性（ＧＡ1、ＧＡ2、ＧＡ4およびＧＡ7によって表される）にとって重要な構造的特徴は、Ｂ環のＣ−６上のカルボキシルを含むグループ；Ｃ−１９およびＣ−１０ラクトン；Ｃ−３でのβ−ヒドロキシル化である。
Ｃ−２でのβ−ヒドロキシル化は不活性（ＧＡ8、ＧＡ29、ＧＡ34およびＧＡ51によって表される）を引き起こす。ｇａｉ突然変異体は、ＧＡ処理（例えばＧＡ1、ＧＡ3あるいはＧＡ4による処理）に反応しない。
ＧＡ処理は、例えば恐らく毎週、あるいはより頻繁にＧＡ3またはＧＡ4の１０-4Ｍ水溶液の噴霧するなど、水溶液の噴霧によることが好ましいが、噴霧ではなく植物上に小滴を置くことによってもよい。ＧＡは、水よりも有機溶媒の方に溶けやすいで、エタノールまたはアセトンなどの有機溶媒に溶かして適用し得るが、これらの溶媒には植物を損傷する傾向があるため好ましくない。有機溶媒を使用する場合、適当な処方には２４ηｌの０．６、４．０あるいは３００ｍＭ  ＧＡ3あるいは８０％エタノールに溶解したＧＡ4を含める。植物、例えばアラビドプシスは、寒天で凝固した補助ＧＡを含む組織培養培地（ＧＭ）などの、ＧＡを含む培地上で育成される。
本発明による核酸は、シロイヌナズナの野生型ＧＡＩ遺伝子の配列を持っていてよく、あるいは提供した配列の突然変異体、誘導体、変異体あるいは対立遺伝子であってよい。好ましい突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子は、野生型の遺伝子によってコードされる蛋白質の機能的な特徴、特に阻害をＧＡによって拮抗する植物成長阻害能力、あるいは植物のＧＡ処理に反応する他の１つ以上の特徴を一植物に付与する能力などを保持する蛋白質をコードするものである。他の好ましい突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子はｇａｉ突然変異体表現型、換言すれば成長低下がＧＡ非感受性の、即ちＧＡ処理で克服されない植物成長低下を付与する蛋白質をコードする。突然変異体、変異体あるいは誘導体を産生するための配列変更は、核酸中の１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換の１つ以上によって行なってよく、こうするとコードされるポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失または置換される。当然ながら、コードされるアミノ酸配列に違いを生じない核酸の変更が含まれる。
ＧＡＩ遺伝子のための好ましいヌクレオチド配列は、第４図に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、特に第３図に示されるコード配列（配列番号１）をコードするものである。好ましいｇａｉ突然変異体は、第４図中の下線部（配列番号２の位置２７〜４３）のアミノ酸配列１７個の一部あるいは全部が欠失している。
また、本発明は提供する配列のうちのいずれか１つを備えた核酸を含む核酸構築物またはベクター、好ましくは核酸配列がコードするポリペプチドを発現し得る構築物またはベクターを提供する。構築物またはベクターは、植物細胞の形質転換に好適である。本発明はさらに、このような構築物またはベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を含む。従って、本発明による核酸を含む植物細胞などの宿主細胞が提供される。この細胞内で、核酸を染色体内に組み込んでもよい。半数ゲノムにつき１つを越える異種ヌクレオチド配列があってよい。後で論じるように、これによると、例えば内因性レベルと比較して高い遺伝子生成物の発現が可能になる。
特にゲノムへの組換えのために細胞へ核酸を導入するためにベクターを使用する場合、本発明による核酸を含む構築物またはベクターにプロモーター配列または他の調節配列を含める必要はない。しかしながら一態様では、本発明は、発現を調節するための調節配列と連結した、ＧＡＩまたはｇａｉのコード配列（シロイヌナズナ以外のもの由来の相同体などを含む）を含む核酸構築物であって、調節配列がコード配列と自然に融合したもの以外であり、あるいは好ましくは別の遺伝子に由来したものである核酸構築物を提供する。
本発明による核酸分子およびベクターは、それらが存在する自然環境からほぼ純粋か均質な形で単離されるか、対象品種の核酸または遺伝子、あるいは成長および／または開発に影響を及ぼし得るポリペプチドをコードする配列以外の起源が存在しないかほぼ存在しない場合は単離物として存在してもよく、これには、例えばシロイヌナズナの、ＧＡＩをコードする配列以外の核酸中の開花配列などが含まれる。「核酸単離物」の語は、全合成または半合成の核酸を含む。
核酸は当然、適していれば二本鎖でも一本鎖でもよく、ｃＤＮＡでもＲＮＡでもゲノムＤＮＡでもよく、全合成または半合成でもよい。当然ながら、本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、示した配列への参照はＵをＴに置換したＲＮＡ等価物への参照として解釈するべきである。
また、本発明は、開示した核酸配列のあらゆる発現生成物と、これをコードする核酸を適当な宿主細胞中、適当な条件下で発現することによって発現生成物を作成する方法をも含む。当業者なら、組換え遺伝子の発現および発現生成物の回収のためのベクター構築とプロトコル設計を申し分なく行なうことができる。適当なベクターは、適当な調節配列を含むものを選ぶか構築することができ、これには適当なプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列などが含まれる。さらに詳細には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他著「Molecular Cloning:a Laboratory Manual」：第２版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press参照のこと。形質転換法は使用する宿主に依存するが、よく知られている。核酸の操作のための多くの公知の技術、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘導、塩基配列決定、細胞の中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、蛋白質の分析などは、Ausubel他編「Protocols in Molecular Biology」第２版，John Wiley & Sons（1992）に詳細に記載されている。以前、植物に使用され広く成功した具体的な方法およびベクターは、Bevan（Nucl.Acids Res.（1984）12,8711-8721）とGuerineauおよびMullineaux（「植物変異体および発現ベクター」：Croy RRD編「Plant Molecular Biology Labfax」BIOS Scientific Publishers（オックスフォード）121-148頁（1993）に収載）によって記載されている。本明細書で言及したＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文、Ａｕｓｕｂｅｌ等の論文その他のすべての書類の開示は、参照により本明細書の一部とする。
第４図に示すアラビドプシスのＧＡＩアミノ酸配列はＮ末端付近の連続する５個のヒスチジンを含むため、ＧＡＩまたはｇａｉの本質的な精製はＱＩＡＧＥＮ社（米国）およびＤＩＡＧＥＮ社（ドイツ）から市販のＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して達成し得る。Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ等の論文31およびＥＰ−Ａ−０２５３３０３およびＥＰ−Ａ−０２８２０４２参照のこと。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂は蛋白質のＮ末端またはＣ末端付近に連続ヒスチジンを備えた蛋白への高い親和性を有するため、植物、植物の一部または抽出物由来の、あるいは酵母や細菌などの組換え生物、例えば蛋白質を発現する大腸菌など由来の、ＧＡＩあるいはｇａｉ蛋白の精製に使用し得る。
精製されたＧＡＩ蛋白、例えば、それをコードする核酸由来の発現によって組換え産生されたものは、当技術分野で標準の技術を使用して抗体を作成するために使用し得る。抗体の抗原結合断片を含む抗体およびポリペプチドは、後でさらに論じる他品種由来の相同体を識別するのに使用し得る。
抗体を産生する方法としては、蛋白質あるいはそれの断片で哺乳動物、例えばヒト、マウス、ネズミ、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジあるいはサルなどを免疫するなどがある。抗体は、当技術分野で知られている様々な技術のうち任意のものを使用して免疫した動物から得られ、好ましくは対象の抗原への抗体結合を使用してスクリーンされる。例えば、ウェスタンブロット技術あるいは免疫沈降を使用し得る（Ａｒｍｉｔａｇｅ等、ネイチャー３５７：８０〜８２、１９９２年）。抗体は多クローンでも単クローンでもよい。
哺乳動物を免疫する代替法または補充法として、適当な結合特異性を備えた抗体は、例えば表面に機能免疫グロブリン結合ドメインを表示するラムダ・バクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから得られる；例えばＷＯ９２／０１０４７を参照のこと。
ＧＡＩまたはｇａｉ、ポリペプチドに対して作成した抗体は、相同ポリペプチドの識別および／または単離、次いで遺伝子のコードに使用し得る。従って本発明は、ＧＡＩ機能あるいはｇａｉ突然変異体表現型を付与する能力を備えたポリペプチドを識別または単離する方法であって、アラビドプシスのＧＡＩまたはｇａｉポリペプチドを結合し得る抗体、あるいは好ましくは第４図に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体（例えば抗体全体またはその断片）の抗原結合ドメインを含むポリペプチドで候補ポリペプチドをスクリーンする段階を含む方法を提供する。
スクリーニングのための候補ポリペプチドは、例えば対象植物由来の核酸を使用して創製した発現ライブラリー生成物、あるいは天然の源由来の精製操作の産物であってもよい。
抗体を結合することが分かったポリペプチドは、単離した後、アミノ酸配列決定に供する。ポリペプチドの全体または部分（例えば、ポリペプチドの断片配列を決定する）のいずれかの配列決定に適したいかなる技術も使用し得る。後でさらに論じるように、アミノ酸配列情報は、例えば候補核酸へのハイブリダイゼーションでプローブまたはプライマーとして使用するように１つ以上のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重プール）を設計することにより、ポリペプチドをコードする核酸を得るに際して使用し得る。
本発明のさらなる態様は、第３図に示される配列由来のヌクレオチド配列を使用する、シロイヌナズナ以外の植物品種からＧＡＩ相同体を識別、クローニングする方法を提供する。これらに由来する配列自体が他の配列を識別、クローニングするのに使用される。本明細書に提供されるヌクレオチド配列情報、あるいはその任意の一部は、発現生成物のＧＡＩ機能をテストし得る相同配列を見つけるためのデータベース検索に使用し得る。別法として、核酸ライブラリーは当業者にはよく知られている技術および相同配列を使用してスクリーンすることができ、それによって識別、次いで試験し得る。
例えば、本発明はまた、ＧＡＩまたはｇａｉの相同遺伝子を識別かつ／または単離する方法であって、ＧＡＩ機能を備えたポリペプチド、断片、突然変異体、誘導体あるいはその対立遺伝子などをコードする核酸によって候補（即ち「標的」）核酸を探査する段階を含む方法を提供する。候補核酸（例えばｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなど）は、このような相同体をコードする核酸を含み得る、あるいは含むと疑われる、すべての細胞または生物から得られる。
本発明のこの態様の好ましい実施態様では、候補核酸の探査に使用する核酸が第４図で示されるアミノ酸配列、コード配列に相補的な配列、あるいはこれらのうちいずれかの断片をコードし、第３図に示されるヌクレオチド配列をを含むことが最も好ましい。
別法として、考察したように、第４図に示すアミノ酸配列を一つなどのＧＡＩまたはｇａｉポリペプチドと結合する能力のある抗体の抗原結合ドメインによって結合され得ることが確認されたポリペプチドの配列を決定することによって得られるアミノ酸配列情報を使用してプローブを設計し得る。
探査に好ましい条件は、少ない回数のハイブリダイゼーションで陽性が確認される単純なパターンとなり、さらに調べ得るように十分に緊縮なものとする。少数の陽性クローンだけが残るまで、ハイブリダイゼーションの緊縮性を徐々に増大させる方法は、当技術分野ではよく知られている。
探査の別法として、なお核酸ハイブリダイゼーションを使用するが、ＧＡＩ遺伝子由来のＤＮＡ配列を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドを、常法を用いた、ＰＣＲあるいは核酸増幅を含む他の方法に使用し得る。例えばＩｎｎｉｓ編「PCR protocols;A Guide to Methods and Applications」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９０年）参照のこと。
プローブまたはＰＣＲプライマーの設計に使用するのに適した好ましいアミノ酸配列は、ＧＡＩ遺伝子間に（完全に、実質的に、あるいは部分的に）保存された配列である。
アミノ酸配列情報に基づくと、遺伝暗号の縮重を考慮に入れてオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを設計することができ、また、適当ならば、生物のコドン使用法が候補核酸から導かれる。
また、本発明は、第３図に示した配列（配列番号１）由来のヌクレオチド配列を使用して得られたＧＡＩ相同体をコードする核酸にも及ぶ。
さらに、シロイヌナズナのＧＡＩによってコードされるポリペプチドの相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸分子が本発明の範囲内に含まれる。相同体はシロイヌナズナ以外の品種由来でもよい。
相同性は、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列のレベルであってよい。好ましくは、核酸またはアミノ酸配列は、第３図のヌクレオチド配列（配列番号１）によってコードされる配列と相同性を有し、少なくとも約５０％、６０％、７０％または８０％の相同性を有することが好ましく、少なくとも９０％または９５％の相同性を有することが最も好ましい。このようなポリペプチドをコードする核酸は、植物での発現にあたって特定の表現型を付与する能力をシロイヌナズナＧＡＩ遺伝子と共有することが好ましく、この表現型は阻害がＧＡによって拮抗される場合に植物成長を阻害する能力などのＧＡ反応性の（即ち、ＧＡで処理すると植物の特徴に変更がある）表現型であることが好ましい。気づいたこととしては、植物中でのＧＡＩ発現は、植物の他の１つ以上の特徴に影響する可能性がある。シロイヌナズナＧＡＩ遺伝子と共有し得る好ましい特性は、シロイヌナズナなどの植物中のＧＡＩ無発現突然変異体の表現型を補足する能力であり、このような表現型は、パクロブトラゾールの矮化効果に対して耐性である。
本発明によるポリペプチドの好ましい実施態様（本発明による核酸実施態様によってコードされるもの）の中には、第４図に下線で示した１７個のアミノ酸配列、あるいは第４図に下線で示した１７個のアミノ酸中のそれぞれの（位置に関して）対応する残基と類似性または同一性を備えた少なくとも約１０個の残基のあるアミノ酸残基の近接配列を含むものがあり、このような残基を１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個含むことがより好ましい。
よく理解されているように、アミノ酸レベルの相同性は一般に、アミノ酸の類似性または同一性によって表わされる。類似性としては、「保存変異」、即ちイソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの１個の疎水残基の別の残基による置換、あるいはリジンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、アスパラギンをグルタミンで置換するなど、１個の極性残基の別の残基による置換などを考慮に入れる。類似性は、当技術分野で標準使用されている、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（J.Mol.Biol.215:403-10（1990））のＴＢＬＡＳＴＮプログラムによって定義され、決定されている通りであってよい。相同性は、第４図のＧＡＩ配列の完全長にわたってもよく、あるいはより好ましくは、第４図に下線で示した１７個のアミノ酸に匹敵する１７個のアミノ酸の近接配列にわたってもよく、あるいは第４図のアミノ酸配列に匹敵する、好ましくは下線で示した１７個のアミノ酸を含む、さらに長い配列、例えば約２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、あるいはそれ以上の個数のアミノ酸であってもよい。
核酸レベルでは、相同性は完全長にわたるか、あるいはより好ましくは、第３図の配列内にあり、第４図に下線で示した１７個のアミノ酸配列をコードする５１個のヌクレオチドコード配列、あるいはより長い配列、例えば約６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１５０個、あるいはそれ以上の個数のヌクレオチド、好ましくは、第４図の下線で示した１７個のアミノ酸配列をコードする第３図の５１個のヌクレオチドを含む配列に匹敵することによる。
また、ｇａｉ突然変異体への相同体も本発明によって提供される。これらは、野生型が第４図に下線で示した１７個のアミノ酸、あるいは第４図に下線で示した１７個のアミノ酸配列中の対応する残基との類似点あるいは同一性を持つ、少なくとも約１０個（好ましくは、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個または１７個）を備えた１７個のアミノ酸の近接配列を含む突然変異体であってもよいが、ｇａｉ突然変異体はそうではない。このような突然変異体ポリペプチドをコードする核酸は、植物中での発現にあたって植物のＧＡ処理に非感受性または非応答性の表現型を付与してもよく、それは克服されない、即ち植物のＧＡ処理にあたって野生型の表現型への復帰変異はない（尤も、ＧＡの提供または枯渇にあたって植物中に何らかの反応があるかも知れない）突然変異体表現型である。
本発明のさらなる一態様は、第４図に示される品種シロイヌナズナのＧＡＩアミノ酸配列の突然変異体、対立遺伝子、誘導体または変異配列であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物を提供するか、あるいは別の品種の相同体あるいはその突然変異体、対立遺伝子、誘導体あるいは変異体であり、ここで、前記の突然変異体、対立遺伝子、誘導体、変異体あるいは相同体は、ＧＡＩ無発現突然変異体表現型を有する植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を産生することによって得られる１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、付加および／または置換の仕方が第４図に示したアミノ酸配列と異なり、その表現型が、被検核酸でのパクロブトラゾールの矮化効果に対して耐性であり、トランスジェニック植物内での被検核酸による発現を引き起こすか可能にし、トランスジェニック植物をスクリーンしてＧＡＩ無発現突然変異体表現型の補足性を示すものを求めて、ＧＡＩ無発現突然変異体を補足し得る被検核酸を識別し、ＧＡＩ無発現突然変異体を補足し得ることを確認した核酸から第４図に下線で示した１７個のアミノ酸配列、あるいは少なくとも１０個の残基が第４図に下線で示した１７個のアミノ酸配列中の対応する位置にそれぞれのアミノ酸との類似性または同一性を有する１７個、より好ましくは１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個または１７個の近接アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失させる。
ＧＡＩとｇａｉの遺伝子相同体は、小麦、稲およびトウモロコシなどの経済的に重要な単子葉の作物から同定される。単子葉の植物および双子葉植物の植物中の同じ蛋白質をコードする遺伝子はヌクレオチド・レベルでは比較的小さな相同性を示すが、アミノ酸配列は保存される。
我々は最近、公開配列データベースの中に、無作為配列決定プログラムで得られ、ＧＡＩとの相同性を有するいくつかのＥＳＴ配列を同定した。表２に詳細を示したが、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｏ．Ｓａｔｉｖａ（稲）およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｅｓ（ナタネ）を含む様々な品種に相同配列が見いだされたことが示されている。配列決定、発現パターンに関する研究およびその発現を変更する効果の検討によって、他の植物中で類似機能を遂行するＧＡＩ遺伝子相同体を得ることができる。当然ながら、これらの配列の新規の用途、突然変異体、誘導体および対立遺伝子は、シロイヌナズナ遺伝子について上で論じたのと同様に本発明の様々な態様の範囲内に含まれる。
本発明の核酸を含む細胞は、本発明のさらなる態様、特に植物細胞あるいは細菌の細胞を意味する。
この細胞には、細胞またはその原種の中への核酸の導入により、例えば、当業者に利用可能な任意の適当な技術を使用する形質転換によって酵素をコードする核酸を含んでもよい。
また、本発明によれば、ゲノムへ組み込んだ開示した核酸を有する植物細胞が提供される。本発明はまた、このような植物細胞を含む植物を提供する。
さらに、発明によれば、発現調節用の調節配列に対し操作的な調節を行ないながらそのゲノムへ組み込んだ本発明により提供されるヌクレオチド配列を有する植物細胞が提供される。本発明のさらなる態様は、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞に導入する段階と、ベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えを引き起こすか、可能にしてゲノムへヌクレオチドの配列を導入する段階とを含むこのような植物細胞を作成する方法を提供する。
本発明による植物は、１つ以上の土地で実際に生育しないものであってもよい。植物変種、特に植物育種家の権利によって登録可能な植物変種は除外し得る。単に植物が植物またはその原種の細胞へ導入された導入遺伝子をそのゲノム内に安定して含むからといって、その植物を「植物変種」と考える必要がないことに注意する。
植物に加えて、本発明は、このような植物、種子、自家受粉または雑種の後代および子孫の任意のクローン、および挿し穂、種子など、これらのうちのいずれかの任意の一部を提供する。本発明は、有性であれ無性であれ、生殖または繁殖に使用し得る、すべての部分である挿し穂、種子等を含む任意の植物胎芽を提供する。また、有性または無性で繁殖させた子、このような植物の子、クローンまたは子孫、あるいは前記の植物、子、クローンまたは子孫の任意の一部または胎芽である植物が本発明に含まれる。
本発明はさらに、植物の細胞内の非相同のＧＡＩあるいはｇａｉ遺伝子配列（あるいは考察したように突然変異体、対立遺伝子、誘導体またはその相同体）の発現を含む植物の特徴に影響を及ぼす方法を提供する。「非相同」の語は、遺伝子工学を使用することによって、言い換えると形質転換を含むヒトの介在によって、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が植物あるいはその原種の前記細胞に導入されたことを示す。遺伝子はゲノム外のベクター上にあるか、あるいはゲノムへ好ましくは安定して組み込まれる。非相同の遺伝子を内因性の等価な遺伝子、即ち成長および／または開発の調節中での機能と同一または類似の機能を遂行するものと置換してもよく、あるいは、挿入配列を内因性の遺伝子に付加してもよい。非相同の遺伝子の導入の利点は、遺伝子発現に影響を及ぼすことを可能とするために、遺伝子の発現、従って好みによって植物の成長および／または開発を選択されたプロモーターの調節下に置く能力である。さらに、野生型の遺伝子の突然変異体および誘導体を内因性の遺伝子の代わりに使用し得る。挿入遺伝子は、宿主細胞にとり外来あるいは外因性の遺伝子、例えば別の植物品種の遺伝子であってもよい。
本発明を使用して変更し得る主な特徴は成長である。
成長抑制因子としてのＧＡＩ遺伝子のモデルによれば、遺伝子の低発現は、少なくともＧＡＩ機能（例えば補完する内因性相同体を有するアラビドプシスではなく）を付与するただ１つの内因性遺伝子がある植物で成長を促進するために使用し得る。これは、アンチセンスあるいはセンス調節の使用などがあってよい。より丈の高い植物は、対象植物中のＧＡＩあるいは適当な相同遺伝子を破壊することによって作成し得る。雑草は矮性のままとして作物は高く成長させるＧＡ生合成抑制因子の使用を可能にするために、例えばパクロブトラゾールなどのＧＡ生合成を阻害する化合物に耐性の植物を作成し得る。
ＧＡＩ遺伝子を過剰発現させると、ＧＡＩ抑制モデルによって予測されるようにＧＡ処理によって変更可能な、矮性植物が得られる可能性がある。
ｇａｉ突然変異体遺伝子は表現型上で支配的であるので、それをＧＡ非感受性の矮性植物を作成するために使用し得る。これは例えば、あらゆる形質転換が可能な作物、木あるいは果樹品種に適用し得る。それはＲｈｔ小麦などのようなより高い収獲量／倒伏低減を提供し得る。稲では、これが、Ｂａｋａｎｅ病（それは日本と他のどこかで問題である）に強いＧＡ非感受性の稲を提供し得る。矮性観賞植物は園芸および切花市場で価値を持ち得る。配列操作は、多様な矮化、ＧＡ非感受性表現型の厳密度に備え、各作物の必要性または操作者の希望に対する厳密度に合わせることが可能になる。ｇａｉ−突然変異体配列の過剰発現は最も有用となる可能性がある。
変更し得る第２の特徴は植物開発、例えば開花である。いくつかの植物では、ある環境条件でＧＡのシグナルが開花の誘導に必要になる。例えば、短日条件で育てられたＧＡ欠失突然変異体アラビドプシス植物は、ＧＡ処理しない限り開花しない。長日条件で育てられた場合、通常これらの植物は開花する。アラビドプシスｇａｉ突然変異体植物は、短日条件で開花の遅れを示す。高度突然変異体は全く開花しないかもしれない。従って、例えばＧＡＩまたはｇａｉ遺伝子の発現、あるいは過剰発現によって、開花誘導のために施されるＧＡ処理まで成長力を保つ植物を作出し得る。抽だいの抑制が望ましい場合、これは園芸の場で、あるいはほうれん草、レタスその他の作物に対して、有用となり得る。
本発明による核酸は、ＧＡＩまたはｇａｉのコード配列をユーザーの調節下に置くために、外部から誘導可能な遺伝子プロモーターの調節下に置き得る。
プロモーターに適用される「誘導可能な」の語は、当業者にはよく理解される。本質的には、誘導可能なプロモーターの調節下での発現は、加えた刺激に応じ、「スイッチ  オン」に切り換わるか増大する。刺激の性質はプロモーターよって異なる。いくつかの誘導可能なプロモーターは、適当な刺激がない状態では発現（または無発現）をほとんど、あるいは検出不能なレベルでしか発現を引き起こさない（または無発現である）。他の誘導可能なプロモーターは、刺激がない状態で検出可能な構成性発現を引き起こす。レベルが刺激がない状態での発現がどうであれ、いかなる誘導可能プロモーター由来の発現も正しい刺激がある状態で増大する。好ましい状況は、表現型の特性変更に有効な量で適当な刺激を与えると発現レベルが増大する場合である。従って、刺激がない状態で基底レベルの発現を引き起こすが、そのレベルが低すぎて所望の表現型を引き起こせない（実際０かもしれない）、誘導可能な（即ち「切り換え可能な」）プロモーターを使用し得る。刺激を与えると、発現が所望の表現型を引き起こすレベルに増大する（即ちオンに切り換わる）。
適当なプロモーターといては、事実上すべての植物組織中で高レベルで発現するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）遺伝子プロモーター（Ｂｅｎｆｅｙ等、１９９０ａおよび１９９０ｂ）；外因性毒性緩和剤の適用に応じて活性化されるトウモロコシ・グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼイソ型ＩＩ（ＧＳＴ−ＩＩ−２７）遺伝子プロモーター（ＷＯ９３／０１２９４（ＩＣＩ社））；植物身体中のよく局限されたいくつかの位置、例えば内生師部、花原基、根および筍の中の分岐点などと同様に成長力のある頂端分裂組織中でも発現するカリフラワーｍｅｒｉ５プロモーター（Ｍｅｄｆｏｒｄ、１９９２年；Ｍｅｄｆｏｒｄ等、１９９１年。）；花開発のきわめて初期に発現する、シロイヌナズナ  ＬＥＡＦＹプロモーター（Ｗｅｉｇｅｌ等、１９９２年）などがある。
ＧＳＴ−ＩＩ−２７遺伝子プロモーターは、植物の開発に適用し得るある化合物によって引き起こされることが明らかにされた。このプロモーターは単子葉植物および双子葉植物の両方で機能する。従って、それは種々の遺伝変更植物の遺伝子発現を調節するために使用することができ、このような植物としては、カノーラ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、綿などの畑作物；小麦、大麦、稲、トウモロコシ、モロコシなどの穀物；トマト、マンゴー、桃、りんご、西洋ナシ、イチゴ、バナナおよびメロンなどの果物；ニンジン、レタス、キャベツおよび玉ねぎなどの野菜などがある。ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターもまた、根、葉、軸および生殖組織を含む種々の組織での使用に適する。
従って、さらなる態様において本発明は、シロイヌナズナのＧＡＩ遺伝子、別の植物品種またはあらゆる突然変異体由来の相同体、誘導体またはその対立遺伝子など、本発明によって提供されるヌクレオチド配列と作用状態で結合した誘導可能なプロモーターを含む遺伝子構築物を提供する。これにより、遺伝子の発現の調節が可能となる。発明はさらに、前記の遺伝子構築物で形質転換された植物と、植物細胞中へのこのような構築物を導入する段階および／または適当な刺激物質、即ち有効な外因性誘導物質の適用により植物細胞内での構築物の発現を誘導する段階を含む方法とを提供する。プロモーターはＧＳＴ−ＩＩ−２７遺伝子プロモーターあるいは他の誘導可能な植物プロモーターであってもよい。
選択した構築物遺伝子を細胞へ導入する場合、当業者にはよく知られているある考察を考慮に入れなければならない。挿入する核酸は、転写を制御する有効な調節要素を含む構築物内に組み立てるべきである。細胞へ構築物を輸送する利用可能な方法がなければならない。一度構築物が細胞膜内に入れば、内因性の染色体物質の中への組み込みは起きるか起きないかのいずれかである。最後に、植物に関する限り、標的細胞型は細胞が植物全体へ再生し得るようなものでなければならない。
カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン、グリホセートなどの抗生物質に対する耐性などの選択可能な表現型を付与する、キメラ遺伝子から成る選択可能な遺伝標識を使用し得る。
本発明の一態様は、トランスジェニック植物産生での本発明による核酸の使用である。
さらなる一態様は、植物細胞へ核酸を導入する段階と、細胞ゲノムへの核酸の取込みを引き起こすか、可能にする段階とを含む方法を提供する。
植物形質転換のあらゆる適当な方法を本発明による核酸を含む植物細胞を生成させるために使用し得る。形質転換に続いて、形質転換された植物細胞および組織から植物を再生し得る。
形質転換が成功した細胞および／または植物、即ち、構築物をゲノムに組み入れたものは、植物細胞へ核酸の導入した後に、自由選択で、例えば抗生物質耐性（上記参照）などの１つ以上のマーカー遺伝子を使用して植物への再生した後に、選択し得る。
この配列を含むＤＮＡ部分で形質転換した植物は、植物の遺伝子操作で既に知られている、標準の技術によって作出し得る。ＤＮＡは、その自然な遺伝子トランスファー能力を活用するアグロバクテリウムが保持する弱毒化Ｔｉプラスミドベクター（ＥＰ−Ａ−２７０３５５、ＥＰ−Ａ−０１１６７１８、ＮＡＲ  １２（２２）８７１１−８７２１５  １９８４）、粒子ボンバードまたは微量噴出性ボンバード（米国５１００７９２、ＥＰ−Ａ−４４４８８２，ＥＰ−Ａ−４３４６１６）マイクロインジェクション（ＷＯ９２／０９６９６、およびＷＯ９４／００５８３、ＥＰ３３１０８３、ＥＰ１７５９６６、Ｇｒｅｅｎ他著（１９８７）「Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、およびエレクトロポレーション（ＥＰ２９０３９５、ＷＯ８７０６６１４  Ｇｅｌｖｉｎ  Ｄｅｂｅｙｓｅｒ−別添参照）、他の形態直接ＤＮＡ取込み（ＤＥ  ４００５１５２およびＷＯ９０１２０９６、米国特許第４６８４６１１号）、リポソーム介在ＤＮＡ取込み（例えばＦｒｅｅｍａｎ等、）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２ｇ：１３５３（１９８４）、あるいはボルテックス法（例えばＫｉｎｄｌｅ、ＰＮＡＳ米国８７：１２２８（１９９０ｄ））などの任意の適当な技術を使用して、植物細胞を形質転換し得る。植物細胞の形質転換のための物理的な方法がＯａｒｄの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．９：１−１１．１９９１年）中で吟味されている。
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物の種を形質転換するために当業者によって広く使用されている。最近、ほとんどすべての経済的に適当な単子葉植物植物で安定した結実能力のあるトランスジェニック植物の日常産生に向けてかなりの進歩があった（Ｔｏｒｉｙａｍａ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６、１０７２−１０７４；Ｚｈａｎｇ等（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７，３７９−３８４；Ｚｈａｎｇ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ７６，８３５−８４０；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等（１９８９）ネイチャー３３８，２７４−２７６；Ｄａｔｔａ等（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，７３６−７４０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，９５７−９６２；Ｐｅｎｇ等（１９９１）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，フィリピン，マニラ，５６３−５７４；Ｃａｏ等（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１１，５８５−５９１；Ｌｉ等（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１２，２５０−２５５；Ｒａｔｈｏｒｅ等（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，８７１−８８４；Ｆｒｏｍｍ等（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，８３３−８３９；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ等（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，６０３−６１８；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ等（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，１４９５−１５０５；Ｗａｌｔｅｒｓ等（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，１８９−２００；Ｋｏｚｉｅ１等（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，１９４−２００；Ｖａｓｉｌ，Ｉ．Ｋ．（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，９２５−９３７；Ｗｅｅｋｓ等（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０２，１０７７−１０８４；Ｓｏｍｅｒｓ等（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，１５８９−１５９４；Ｗ０９２／１４８２８）。特に、アグロバクテリウム介在形質転換は現在、単子葉植物中の高度に効率的な形質転換方法としても浮上しつつある（Ｈｉｅｉ等（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ６，２７１−２８２）。
結実能力のあるトランスジェニック植物の作製が米穀、トウモロコシ、小麦、オート麦、および大麦で達成された（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５，１５８−１６２；Ｖａｓｉｌ等（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０、６６７−６７４；Ｖａｉｎ等、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ１３（４）：６５３−６７１；Ｖａｓｉｌ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，７０２で論評された）。
微量噴出性ボンバード、エレクトロポレーションおよび直接ＤＮＡ取込みは、アグロバクテリウムが非能率的かあるいは効果がない場合に好ましい。別法として、例えばアグロバクテリウムを上塗りを施した微小粒子によるボンバード（ＥＰ−Ａ−４８６２３４）、アグロバクテリウムとの共培養後に損傷を生じさせる微量噴出性ボンバード（ＥＰ−Ａ−４８６２３３）などの異なる技術の組合せを形質転換法の効率増強に使用し得る。
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ形質転換はＭｏｌｏｎｅｙ等の論文（（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）８：２３８−２４２）に記載されている。
形質転換後、植物は、例えば、当技術分野で標準の単一細胞、カルス組織またはリーフディスク（ｌｅａｆ  ｄｉｓｃ）から再生し得る。ほとんどいかなる植物も、植物の細胞、組織および器官から完全に再生し得る。利用可能な技術がＶａｓｉｌ他著「植物の細胞培養および体細胞遺伝学」（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ），第Ｉ巻，第ＩＩ巻および第ＩＩＩ巻、「実験室法およびその応用（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４年、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ著，「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年などの中で論評されている。
形質転換技術の特定の選択は、植物品種の形質転換の効率、並びに選択した特定の方法論で本発明を実行する人の経験および好みによって決定されよう。植物細胞へ核酸を導入する形質転換系の特定の選択は本発明にとって本質的でなく、本発明を制限するものでもなく、また植物再生技術の選択もそうではないことは当業者には明白であろう。
本発明では、センスの向きでのヌクレオチド配列の導入によって過剰発現を達成し得る。従って本発明は、植物の特徴に影響を及ぼす方法を提供し、該方法は、本発明による核酸の発現を植物細胞内にある同核酸から引き起こすか可能にする段階を含む。
遺伝子生成物ポリペプチドの低発現はアンチセンス技術またはあるいは「センス調節」を使用して達成し得る。遺伝子発現をダウンレギュレートするアンチセンス遺伝子あるいは部分遺伝子配列の使用は現在、十分に確立されている。ＤＮＡの「アンチセンス」鎖の転写によって、標的遺伝子の「センス」鎖から転写された通常のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡが生成するようにＤＮＡをプロモーターの調節下に置く。二本鎖ＤＮＡについては、コード配列またはその断片をプロモーターの調節下に「逆向き」で置くことによってこれが達成される。すると、相補的なアンチセンスＲＮＡ配列はｍＲＮＡと結合して二重鎖を形成し、標的遺伝子から蛋白質への内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると思われる。これが実際の作用機構かどうかについては、まだ不明である。しかしながら、技術が役に立つことは既成の事実である。例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等，１９８７年；スミス等，（１９８８），ネイチャー  ３３４，７２４−７２６；Ｚｈａｎｇ等，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，１５７５−１５８８、Ｅｎｇｌｉｓｈ等，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８，１７９−１８８参照のこと。また、アンチセンス技術は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５年），Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０５、１２５−１４９、およびＦｌａｖｅｌｌ，（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１，３４９０−３４９６の中で論評されている。
逆向きのコード配列に対応する完全な配列は使用する必要がない。例えば、十分な長さの断片を使用すればよい。当業者にとり、コード配列の様々な部分から様々な大きさの断片をスクリーンしてアンチセンス阻害のレベルを最適化することは機械的な作業である。開始メチオニンＡＴＧコドンを含めることは有利であろうし、また開始コドンの上流に１つ以上のヌクレオチドを含めることは恐らく有利であろう。一層の可能性は遺伝子の調節配列、例えば耐性が望まれる１つ以上の病原体中の１つ以上の遺伝子に特有の配列などを標的とすることである。適切な断片は少なくとも約１４〜２３個のヌクレオチド、例えば約１５、１６または１７個、またはそれより多く、あるいは少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、あるいはより多くを持っていてもよい。このようなセンスの向きの断片はコサプレッションに使用し得る（下記参照）。
配列全体の相補性は好ましいであろうが本質的ではない。目標遺伝子由来のアンチセンス構築物で１つ以上のヌクレオチドが異なってもよい。特に植物細胞中に現存する条件下では、ハイブリダイズするべきそれぞれのアンチセンスＲＮＡ分子およびセンスＲＮＡ分子に対する十分な相同性があることが好ましいであろう。
従って、本発明はまた、植物の特徴に影響を及ぼす方法を提供し、該方法は、本発明による核酸の発現を植物細胞内にある同核酸から引き起こすか可能にする段階を含む。
目標遺伝子の追加のコピーが目標遺伝子と同じセンスの向きに挿入されると、過剰発現が起きる場合は個体を含み、目標遺伝子由来の蛋白質の低発現が生じる場合はいくつかを含む、一連の表現型が産生される。挿入遺伝子が内因性の遺伝子の一部のみである場合、遺伝子組み換え集団中の低発現個体数が増加する。センス調節、特にダウンレギュレーションが起きる機構は十分には理解されていない。しかしながら、この技術は、さらに科学文献および特許文献中にも十分に報告されており、遺伝子調節に日常的に使用されている。例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ等，（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２９１−２９９）；Ｎａｐｏｌｉ，（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２７９−２８９；Ｚｈａｎｇ等，（１９９２）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，１５７５−１５８８およびＵＳ−Ａ−５２３１０２０を参照のこと。
従って、本発明はまた、植物の特徴に影響を及ぼす方法を提供し、該方法は、本発明による核酸の発現を植物細胞内にある同核酸から引き起こすか可能にする段階を含む。これは成長に影響を及ぼすために使用し得る。
さて、本発明の態様および実施態様を、添付の図を参照して、実施例により説明する。さらなる態様および実施態様は当業者には明白であろう。本文中で言及した全ての書類を参照により本明細書の一部とする。
本明細書には以下の図を含む：
第１図  ジベレリンの基本炭素環構造。
第２図  ｇａｉ−ｔ６系統は転移遺伝子を遮断する転移Ｄｓを含む。
第２ａ図  示した植物（左から右）は、ＧＡＩ、ｇａｉおよびｇａｉ−ｔ６と同型接合である。ＧＡＩとｇａｉ−ｔ６植物とは識別不能である。
第２ｂ図  Ｄｓプローブを使用するＤＮＡゲル−ブロットハイブリダイゼーション。ＧＡＩレーン中のＤＮＡはＤｓ欠損である。ｇａｉレーンは、ｇａｉおよびＤｓ（１８．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片）を含むＴＤＮＡ  Ａ２６４5と同型接合の植物由来のＤＮＡを含む。ｇａｉ−ｔ６レーンは、Ａ２６４および転移Ｄｓ（１５．５ｋｂの断片）と同型接合の植物由来のＤＮＡを含む。
第２ｃ図  放射標識ＧＡＩ  ｃＤＮＡプローブを使用するＤＮＡゲル−ブロットハイブリダイゼーション。ｃＤＮＡは、ｇａｉ−ｔ６で６．４および２．８ｋｂの断片によって置換されたＧＡＩおよびｇａｉ由来のＤＮＡ中の５．１ｋｂのＢｃｌＩ断片とハイブリダイズする。ＢｃｌＩはＤｓ内で一度切断するので、Ｄｓ挿入の前後には両方ともｃＤＮＡをコードする遺伝子（ＧＡＩ）がある。１．７ｋｂのさらに微かなハイブリダイゼーションは、より長い露光で見られたいくつかのうちの１つであり、ＧＡＩと関連した配列を識別する。
第３図  ＧＡＩ機能を備えたポリペプチドをコードする、ＧＡＩ遺伝子のヌクレオチド配列。
第４図  ＧＡＩ蛋白およびｇａｉ蛋白の一次構造。ＧＡＩのゲノムＤＮＡ配列から予測されたアミノ酸配列を示す。ｇａｉ中に欠失した１７個のアミノ酸セグメントを太字体と二重下線で示す。
第５図  ＧＡによる植物成長調節の抑制解除モデル。
第６図  ｇａｉ誘導対立遺伝子のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。
第６ａ図  ｇａｉ−ｄ１のヌクレオチド配列（配列番号３）。
第６ｂ図  ｇａｉ−ｄ１のアミノ酸配列（配列番号４）。
第６ｃ図  ｇａｉ−ｄ２のヌクレオチド配列（配列番号５）。
第６ｄ図  ｇａｉ−ｄ２のアミノ酸配列（配列番号６）。
第６ｅ図  ｇａｉ−ｄ５のヌクレオチド配列（配列番号７）。
第６ｆ図  ｇａｉ−ｄ５のアミノ酸配列（配列番号８）。
第６ｇ図  ｇａｉ−ｄ７のヌクレオチド配列（配列番号９）。
第６ｈ図  ｇａｉ−ｄ７のアミノ酸配列（配列番号１０）。
実施例１
ＧＡＩとｇａｉの遺伝子のクローニングおよびキャラクタリゼーション
ｇａｉによると、アラビドプシスの染色体１2（Ｄｓ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ5,15を保持するＴ−ＤＮＡ挿入由来のおよそ１１ｃＭ）に対してマッピングされる5,15。遺伝子分析によると、機能喪失対立遺伝子が、野生型の対立遺伝子（ＧＡＩ）によって付与された表現型と識別不能な丈の高い表現型を付与することが示唆された5,6。我々は、結合部位に優先的に転移するＤｓの傾向を利用して、挿入突然変異誘発を介したＧＡＩのクローン化を試みた16,17。
Ａｃトランスポゼースを発現する導入遺伝子（ΔＮａｅＩ−ｓＡｃ（ＧＵＳ）−ｌ）を含むＡ２６４およびｇａｉと同型接合の植物系統を構築した。我々がｇａｉ−ｔ６と称する推定上のＤｓ挿入対立遺伝子と同型接合の植物を以下のようにこの材料から単離した5。この材料を、数世代にわたる自家受粉によって増やした。この増量の間、茎枝がｇａｉ同型接合体に期待されるより延びた植物を検索した。より綿密な試験のため、このような枝の自家受粉から得られた種子を植えた。このような１本の枝の後代によると、およそ１／４の頻度で植物が単離され、ＧＡＩによって付与された表現型と識別不能な丈の高い表現型が表示された（第２ａ図）。これらの植物は、我々がｇａｉ−ｔ６と称する新しいｇａｉ対立遺伝子と同型接合体であった。
ＤＮＡゲル−ブロット実験によると、ＧＡＩを含むことが知られている染色体の領域（およそ２００ｋｂ）内に挿入された転移Ｄｓ（図２ｂ）をｇａｉ−ｔ６が含むことが明らかにされた（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの調製およびゲル−ブロットハイブリダイゼーションは文献記載のようにして行なった5。ＥｃｏＲＩ消化物は、Ｄｓプローブ（３．４ｋｂの放射標識ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ  Ａｃサブ断片）でハイブリダイズした。ｇａｉ−ｔ６は遺伝的単離を介して（△ＮａｅＩ−ｓＡｃ（ＧＵＳ）−１）欠損とした。
さらなる実験によって、転移Ｄｓが遺伝子（ＧＡＩ）の転写された領域を遮断し、アラビドプシスゲノムがＧＡＩ（第２ｃ図）とのかなりの配列相同性を持つ少なくともさらに１つの遺伝子を含むことが明らかにされた。以前に記載されたようにして、ｇａｉ−ｔ６の中の転移Ｄｓ３’末端に隣接するゲノムＤＮＡを含む放射標識ＩＰＣＲ断片を単離した24。このプローブは、まだｇａｉ−ｔ６系統の中にあるＡ２６４中のＤｓの配列（Ｔ−ＤＮＡ３’由来）で潜在的に汚染されたので、このプローブの使用では相当な注意を払うことが必要であった。
しかしながら、このプローブが任意のＴ−ＤＮＡ挿入欠失植物由来のＤＮＡとハイブリダイズしたという事実から、それがｇａｉ−ｔ６中の転移Ｄｓを挿入したゲノムＤＮＡの領域のクローン化の目的に役立つことが示された。このプローブは、地図に基づいたクローニングによってＧＡＩを含むらしいことが以前に確認されたゲノムＤＮＡコスミドクローンとハイブリダイズすることが示された。これらのクローンのうち１つは、着生植物の一部（アラビドプシス）から単離されたｍＲＮＡで作られたｃＤＮＡライブラリー由来のクローンをハイブリダイゼーションによって同定するために使用された。これらのｃＤＮＡは、ＧＡＩ、ｇａｉおよびｇａｉ−ｔ６由来のゲノムＤＮＡにそれらをハイブリダイゼーションすることによって分類した。
これらのクローンのうちのいくつかは、ＧＡＩ（ｇａｉ−ｔ６へのＤｓ挿入に起因する断片サイズの変更によって定義）を含む断片を弱くハイブリダイズしたが、他の関連配列はより強くハイブリダイズした。これらのｃＤＮＡは、ＧＡＩと配列が関連した遺伝子から転写されたｍＲＮＡに由来すると思われるがＧＡＩ自体由来ではなく、今後の調査用に取っておいた。１つのｃＤＮＡ、即ちｐＰＣ１は、ＧＡＩに強くハイブリダイズし、ＧＡＩと関連した配列を含む断片にそれ程強くなくハイブリダイズした。このｃＤＮＡの部分ＤＮＡ配列は、ｇａｉ−ｔ６の中のＤ挿入の前後にあるゲノムＤＮＡのおよそ１５０ｂｐと同一であった。
復帰分析から、Ｄｓをｇａｉ−ｔ６から欠失することが支配的な矮性表現型の回復に関係していることを示された。
２個のＧＡＩオーバーラップｃＤＮＡのＤＮＡ配列により、５３２アミノ酸残基の蛋白質（ＧＡＩ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかにされた。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片は、ＧＡＩおよびｇａｉゲノムＤＮＡから増幅した。オーバーラップｃＤＮＡのｐＰＣ１およびｐＰＣ２のＤＮＡ配列由来のオリゴヌクレオチド・プライマーは、ＰＣＲを介してＧＡＩおよびｇａｉゲノムＤＮＡ由来の１．７ｋｂの断片増幅に使用した。
使用したプライマーの配列は次のとおりであった：
プライマーＮ６：５’ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＴＧＧ３’（配列番号１１）；
プライマーＡＴ１：５’ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  Ｇ３’（配列番号１２）。
プライマーＡＴ１の配列は、ゲノムクローンおよびｃ−ＤＮＡクローンの配列由来の一塩基が異なる。配列の最終訂正版が利用可能となる前に、このプライマーは配列プロジェクトのきわめて初期に合成された。
重複増幅由来の断片のＤＮＡ配列を決定し、それによりＰＣＲにより持ち込まれる誤りを回避した。
ＧＡＩゲノム配列は、オーバーラップｃＤＮＡのものとほとんど同一であった。生態型間の違いによる可能性のある、予測されたＧＡＩのアミノ酸配列を変更しないヌクレオチド置換が３個あった。これらのゲノム断片の配列によると、ＯＲＦがイントロンによって遮断されないことが明らかにされた（第３図）。
ｇａｉ−ｔ６中のＤｓ挿入は、Ｇｌｕ182とＡｓｎ183のコドン間に位置する（第４図）。予測されたＧＡＩの第２の構造は顕著な特徴をほとんど示さない。ＧＡＩはアミノ末端と近接した意義の不明なポリヒスチジン領域と、Ａｓｎ183で糖鎖形成部位の可能性のある部位を囲む弱疎水性ドメインとを備えたほとんど親水性の蛋白質である。コンピューター分析から、この疎水性の領域が膜貫通ドメインである可能性が比較的低いことが示される。
ＤＮＡと蛋白質の配列データベースの探索からは、ＧＡＩ中に明白な機能上の意義を持つドメインが明らかにならなかった。ｇａｉは、ＧＡＩ  ＯＲＦ中由来の５１ｂｐの欠失を含む。この枠内欠失の結果、予測されたＧＡＩ蛋白質のアミノ末端に近接して位置する１７個のアミノ酸残基セグメントがｇａｉに欠けている（第４図）。
Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ等45は、本発明の優先日後に、１つの細胞層が欠けた根をもたらすアラビドプシスのＳＣＲ（ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ）遺伝子の配列を報告した。開示されたＳＣＲ配列は、本発明のアラビドプシス  ＧＡＩ配列といくらか相同性を持っているが、論じた１７個のアミノ酸モチーフを欠いている。
以前の出版物にｇａｉ誘導対立遺伝子にガンマ放射突然変異誘発後の単離について記載されている5。これらの対立遺伝子は、同型接合の場合、ＧＡＩによって付与されるものと識別不能な丈の高い表現型を付与する5。誘導対立遺伝子（ｇａｉ−ｄ１、ｇａｉ−ｄ２、ｇａｉ−ｄ５およびｇａｉ−ｄ７）のいくつか由来の増幅断片の配列決定により、各々がｇａｉの５１ｂｐ欠失特性を含むことが示された。これらの対立遺伝子のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列を第６図に示す。それらにはまた、非機能性の遺伝子生成物（表１）を付与し得る、追加の突然変異が含まれる。ｇａｉ突然変異体表現型の損失がこれらの突然変異の各々と相関があるという事実から、復帰データ（上記参照）と相まって、ＧＡＩがクローン化されたことが確認される。さらに、これらの結果は、ｇａｉ−ｄ対立遺伝子が無発現対立遺伝子になるという予測と一致している5,6。
挿入突然変異誘発は機能獲得性突然変異なので、この誘発を介してｇａｉのクローニングが可能であった。このような突然変異は、通常の遺伝子生成物の異所性発現または増大した発現、あるいは突然変異体遺伝子生成物の機能変更を含む種々の理由のため、支配的な効果がを持ち得る。ここで我々は、ｇａｉ突然変異が変更された生成物と関連していることを示す。ＧＡＩ由来の１７個のアミノ酸残基ドメインの欠失は遺伝的に支配的な方法で矮性を引き起こす突然変異蛋白質（ｇａｉ）をもたらす。
これは、ＧＡＩが成長抑制因子であり、ＧＡがＧＡＩ作用への拮抗により成長を抑制解除することを強く示唆する。突然変異体ｇａｉ蛋白質に欠けたドメインは、ＧＡのシグナルあるいはＧＡそれ自身との相互作用の原因かもしれない。その場合、ＧＡがそれに拮抗できないため、ｇａｉは本質的に成長を抑制するであろう。ＧＡ介在性植物成長調節の抑制解除モデルはさらに第５図で補足説明するが、この提案が本発明の範囲を制限するものではないことに注意するべきである。ＧＡＩとｇａｉの実際の作用機構についての知識、つまり、それらがどう働くかは、野生型および突然変異版のＧＡＩ遺伝子のクローニングに基づいている本発明の実施の先行必要条件ではない。
アラビドプシスのＳＰＩＮＤＬＹ（ＳＰＹ）座位での突然変異は、以前に他の植物品種で記載された、細長い突然変異体に特徴的な表現型である、ＧＡ生合成抑制因子に対する耐性の増大と成長調節のためのＧＡへの依存低減18とを付与する19-23。最近の実験によると、ＳＰＹおよび他の座位での突然変異がｇａｉによって付与された矮性表現型を部分的に抑え得ることが明らかになった6,9。再び本発明の範囲を制限せずに、我々はＳＰＹが、これらの他の座位によってコードされる蛋白質と共に、ＧＡＩが出所である成長抑制シグナルの下流形質導入に関与することを提案する（第５図）。
第５図に示すモデルによると、ＧＡは成長抑制蛋白質であるＧＡＩの活性と拮抗するので、ＧＡ（またはＧＡシグナル伝達成分）は植物の成長を抑制する。成長抑制シグナルは、ＳＰＹ6,18、ＧＡＲ２6、ＧＡＳ２（Ｊ．Ｐ．およびＮ．Ｐ．Ｈ．，未発表）および他の蛋白質を介して伝達される。内因性のＧＡのレベルがＧＡＩ抑制因子の活性とほぼ拮抗するのに十分なほど高いので、通常の植物（ＧＡＩ）は丈が高く成長する。ＧＡ欠損植物は同程度のＧＡＩ抑制と拮抗するのに不十分なＧＡを含み、従って矮性になった25-27。突然変異体ｇａｉ蛋白質がＧＡによって拮抗されず、支配的な方法で成長を抑制するため、ｇａｉ突然変異体植物は矮性となる2。ｓｐｙ、ｇａｒ２およびｇａｓ２の突然変異体はｇａｉ表現型を部分的に抑え、ＧＡ生合成抑制因子に対する耐性を付与する6,18。これらの３つの突然変異体を対に組み合せると、単独のｓｐｙ、ｇａｒ２およびｇａｓ２のいずれによって付与されるよりいっそう極度のｇａｉ抑制およびＧＡ生合成阻害に対する耐性が付与される。従って、これらの遺伝子はＧＡＩ由来の成長抑制シグナル伝達の原因となる下流成分をコードするようにさせることが提案されている。ｇａｉ突然変異がトウモロコシ10-12と小麦13の中のＧＡ非感受性突然変異の機能相同体とすることもできる。従ってこのモデルは、ＧＡによる植物成長調節の一般的な説明を与えるために使用し得る。
トウモロコシ中のＧＡ非感受性の矮性突然変異体に関する独立の研究11,12と、エンドウと大麦のＧＡ非依存性の細長い突然変異体に関する独立の研究19-23とは以前、ＧＡシグナル形質導入への抑制因子機能の関与を示唆した。本明細書に記載の加工品から示唆されることは、アラビドプシスＧＡＩが多分このような抑制因子だということである。これが含む重要な意味は、その場合、ＧＡが活性化を介してではなく抑制解除によって植物成長を調節するということである。
実施例２
小麦、稲およびＢｒａｓｓｉｃａ種由来のＧＡＩ相同体のクローニング
これらの品種由来のＤＮＡを含むｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリーを低緊縮性探査することによってＤＮＡ含まれる潜在的ＧＡＩ相同体を小麦、稲およびアブラナ属から単離する。次いで、ハイブリダイズするクローンを標準の技術を使用して精製する。
別法として、ＧＡＩ配列と統計的に有意な相同性を示すｃＤＮＡおよび他の配列を検索するＥＳＴデータベースのスクリーニングによって潜在的なＧＡＩ相同体を識別する。次いで、適切な配送センターに要請することによってクローンが得られる。表２に、無作為配列決定プログラムで得られたＥＳＴ配列を含む公共の配列データベースを検索した結果の詳細を示すが、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｏ．Ｓａｔｉｖａ（稲）およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ナタネ）を含む様々な品種に相同配列が見つかったことが示されている。
小麦とトウモロコシの場合には、これらの相同配列が以前に特性決定されたＲｈｔおよびＤ８遺伝子座に相当するかどうかを知ることが重要である。これは次のように決定される。
稲、小麦あるいはトウモロコシ由来のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを小麦の遺伝子地図上にマッピングし、それによってＤＮＡの地図上の位置が小麦中のＲｈｔ座位の地図上の位置に相当するかどうかを判定する。さらに、トウモロコシの場合には、Ｄ８の潜在的トランスポゾン挿入対立遺伝子が存在し、これらは、我々がアラビドプシス由来のｇａｉのクローニングを証明したのと同じ方法でＤ８のクローニングを証明するために使用される。これらの様々なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンを配列決定し、その発現パターンを研究し、その発現の変更結果を検討することによって、植物成長の調節でＧＡＩと類似の機能を発揮する遺伝子が得られる。
これらの配列の突然変異体、誘導体、形質転換および対立遺伝子を適当に作製、同定する。
実施例３
大腸菌中でのＧＡＩ蛋白およびｇａｉ蛋白の発現
ＧＡＩとｇａｉの遺伝子を含む、ゲノムＤＮＡクローン（遺伝子中のイントロンはない）由来のＰＣＲを使用して、完全なＧＡＩまたはｇａｉのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を増幅した。ＡＴＧ翻訳開始コドンをＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ・部位に変換したプライマーを使用して増幅を行なった。この断片は反対側の末端（停止コドンの向こう）にＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ・部位を持っている。生成物をクローン化し、それらのＤＮＡ配列を決定して、ＰＣＲの間に誤りが持ち込まれていなかったことを確認した。正確な断片をＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ消化ＰＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販のＱｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキット）にクローン化し、大腸菌中でＧＡＩ蛋白およびｇａｉ蛋白を発現する可能性をもつ構築物が得られた。このベクターでの発現はＩＰＴＧ誘導可能なプロモーターによって調節され、得られた合成蛋白質は、細胞抽出物からこの蛋白質を精製するために使用し得るＮ末端ポリヒスチジン・タグを保持する。
ＩＰＴＧによって誘導したところ、大腸菌中のＧＡＩ蛋白およびｇａｉ蛋白の高度の発現が得られた。
実施例４
発現構築物および植物の形質転換
（ａ）内因性のプロモーターを使用した通常の発現レベル
適切なゲノムクローンからサブクローンを作ることによって、ＧＡＩおよびｇａｉの遺伝子を５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片（コード配列の前後に約４．５ｋｂの非コード配列を含む）として単離した。これらの断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローン化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片として再度単離し、アグロバクテリウム−ツメファシエンスＣ５８Ｃ１に動員するためにバイナリー・ベクターへ連結し、このときＴ−ＤＮＡをＶａｌｖｅｋｅｎｓ等32によって記載されたアラビドプシスおよびタバコ植物に導入したか、あるいはより新しい真空浸潤法33によって、Ｍｏｌｏｎｅｙ等の論文34に記載されている高効率アグロバクテリウム形質転換技術を使用してＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓに導入した。
（ｂ）外因性プロモーターを使用した過剰発現
単独の３５Ｓプロモーターを含むｐＪＩＴ６０の変更形の、二重の３５Ｓプロモーター35およびｐＪＩＴ６２を含むｐＪＩＴ６Ｑベクター由来のＤＮＡを使用して構築物を作製した。これらのベクター由来のプロモーターをおよそ１００ｂｐの５’非コード配列と、次いでＡＴＧおよび全ＧＡＩまたはｇａｉのオープンリーディングフレーム、次いで翻訳停止コドンと、次いでおよそ２０ｂｐの３’非コード配列、次いでポリアデニル化シグナルと融合したが、これらはすべてＳｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片上で行なった。
以前に記載したように、この断片を、アグロバクテリウム−ツメファシエンスを使用するか、あるいは裸のＤＮＡとしてのいずれかによりトランスジェニック植物中に導入するためにバイナリー・ベクターと連結した。
実施例４
ＧＡＩ配列およびｇａｉの配列の変更
ｇａｉ欠失を囲むＧＡＩオープンリーディングフレームの短いセグメントを、本明細書に提供した配列情報に基づいて設計した適当なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ中で使用することによってＧＡＩとｇａｉから増幅する。次いで、増幅したセグメントを一つ（ｏｎｒ）以上の形態の突然変異誘発に供し（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文参照）、一連のオーバーラップ欠失突然変異体を得るか、必要に応じ、この領域の個々のヌクレオチドを置換する。
次いで、突然変異増幅セグメントを、エンドヌクレアーゼ消化および後の連結反応を介して、ＧＡＩ中の等価なセグメントで置換する。次いで、この新しい形質転換体を、通常のレベルで、あるいは上に記載した過剰発現を介してトランスジェニック植物中で発現する。
モデル（例えばアラビドプシスおよびタバコ）および作物（例えば小麦、稲およびトウモロコシ）品種中の植物成長調節に対する構築物の影響を評価するため、構築物を研究する。異なった構築物は様々の程度の矮性を付与し、それぞれ特定の作物品種の変更および改良に、あるいは特定の環境で成長する作物に特に適合させてもよい。
実施例５
ＧＡＩ無発現対立遺伝子はパクロブトラゾール耐性の増大を付与する：
パクロブトラゾールはカウレン酸化酵素反応で特異的にＧＡの生合成を阻害するトリアゾール誘導体であり36,37、従って、内因性ＧＡレベルを低減し、その反応に暴露した植物に矮性表現型を付与する。エンドウおよび大麦の細長い突然変異体は、アラビドプシス構成ＧＡ応答性突然変異体ｓｐｙ43,44と同様に、パクロブトラゾールの矮化影響への耐性がある38-42。従ってこれらの突然変異体では、茎の伸長は通常の植物に特徴的なＧＡ介在性の調節から少なくとも部分的に切り離される。興味深いことに、ｇａｉ−ｔ６突然変異体はまた、パクロブトラゾール耐性をも表わす。パクロブトラゾールを含む培地上で培養した場合、ｇａｉ−ｔ６突然変異体はＧＡＩ調節植物より長い抽だい花茎を表わす。この結果は、ＧＡＩ機能喪失によって茎の伸長がＧＡ依存性の低減を引き起こすことを示唆する。別の見方をすると、ＧＡＩ無発現突然変異体は、ある程度の成長を達成するために正常植物ほど内因性ＧＡを要求しないように思われる。ＧＡ依存性がｇａｉ−ｔ６から完全にはなくならないのは、恐らくＧＡＩと配列が関連する遺伝子生成物（上記参照）が完全ではないにせよ、ほぼ、ＧＡＩ機能喪失を補償し得るためであろう。これらの観察は、野生型の遺伝子生成物、即ちＧＡＩがＧＡシグナルの形質導入成分であることを実証するので重要である。
0004068145.tif 000002
１１／１／９６に検索したデータベース
0004068145.tif 000003
0004068145.tif 000004
参考文献
1.  Hooley,Plant Mol.Biol.26,1529-1555(1994).
2.  Koornneef他、Physiol.Plant.65,33-39(1985).
3.  Talon他、Planta 182,501-505(1990).
4.  Wilson他、Plant Physiol.100,403-408(1992).
5.  Peng他、Plant Cell 5,351-360(1993).
6.  Wilson他、Plant Physiol.108,495-502(1995).
7.  Putterill他、Cell 80,847-857(1995).
8.  Xu他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6640-6644(1995).
9.  Carol他、Planta 197,414-417(1995).
10. Fujioka他、proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,9031-9035(1988).
11. Harberd他、Genetics 121,827-838(1989).
12. Winkler他、Planta 193,341-348(1994).
13. Gale他、Heredity 35,55-65(1975).
14. Gale他、Dwarfing genes in wheat.In:Progress in Plant Breeding,G.E.Russell,編(London:Butterworths)pp 1-35(1985).
15. Balcells他、Trends Biotechnol.9,31-37(1991).
16. Bancroft他、Genetics 134,1221-1229(1993).
17. Jones他、Science 266,789-793(1994).
18. Jacobsen他、Plant Cell 5,887-896(1993).
19. Brian他、Symp.Soc.Exp.Biol.11,166-182(1957).
20. Potts他、Physiol.Plant.63,357-364(1985).
21. Lanahan他、Planta 175,107-114(1988).
22. Candler他、Planta 175,115-120(1988).
23. Croker他、Plant Physiol.94,194-200(1990).
24. Long他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10370-10374(1993).
25. Koornneef他、Theor.Appl.Genet.58,257-263(1980).
26. Talon他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,7983-7987(1990).
27. Sun他、Plant Cell 6,1509-1518(1994).
28. Hoad他、Phytochemistry 20,703-713(1981).
29. Serebryakov他、Phytochemistry 23,1847-1854(1984).
30. Smith他、Phytochemistry 33,17-20(1993).
31. Janknecht他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,8972-8976(1991).
32. Valvekens他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5536-5540(1988).
33. Bechtold他、Comptes Rendus de L'Academie des Sciences Serie III-Sciences de la Vie-Life Sciences 316,1194-1199(1993).
34. Moloney他、(1989)Plant Cell Reports 8:238-242.
35. Guerineau及びMullineaux,in“Plant Molecular Biology Laboratory Fax”,編RRD Croy,Chapter 4,pp 121-147,Black stone Scientific.
36. Hedden P,Graebe J E(1985)J.Plant Growth Regul 4:111-122.
37. Davis T D,Curry E A(1991)Crit Rev Plant Sci 10:151-188.
38. Brian P W(1957)Symp Soc Exp Biol 11:166-182.
39. Potts W C,Reid J B,Murfet I C(1985)Physiol Plant 63:357-364.
40. Lanahan M B,Ho T-H D(1988)Planta 175:107-114.
41. Chandler P M(1988)Planta 175:115-120.
42. Croker S J,Hedden P,Lenton J R,Stoddart J L(1990)Plant Physiol 94:194-200.
43. Jacobsen S E,Olszewski N E(1993)Plant Cell 5:887-896.
44. Jacobsen S E,Binkowski K A,Olszewski N E(1996)ProcNatl Acad Sci,USA 93:9292-9296.
45. Laurenzio他、(1996)Cell 86:423-433.
配列表
配列の数
12
配列番号：1
配列の長さ：1964
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000005
配列番号：2
配列の長さ：532
配列の型：アミノ酸
配列
0004068145.tif 000006
0004068145.tif 000007
0004068145.tif 000008
配列番号：3
配列の長さ：1643
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000009
配列番号：4
配列の長さ：221
配列の型：アミノ酸
配列
0004068145.tif 000010
配列番号：5
配列の長さ：1642
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000011
配列番号：6
配列の長さ：259
配列の型：アミノ酸
配列
0004068145.tif 000012
配列番号：7
配列の長さ：1636
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000013
配列番号：8
配列の長さ：282
配列の型：アミノ酸
配列
0004068145.tif 000014
0004068145.tif 000015
配列番号：9
配列の長さ：1642
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000016
配列番号：10
配列の長さ：166
配列の型：アミノ酸
配列
0004068145.tif 000017
配列番号：11
配列の長さ：15
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000018
配列番号：12
配列の長さ：16
配列の型：核酸
配列
0004068145.tif 000019
【図１】
0004068145.tif 000020
【図２ａ】
0004068145.tif 000021
【図２ｂ】
0004068145.tif 000022
【図２ｃ】
0004068145.tif 000023
【図３】
0004068145.tif 000024
【図４】
0004068145.tif 000025
【図５】
0004068145.tif 000026
【図６（ａ）】
0004068145.tif 000027
【図６（ｂ）】
0004068145.tif 000028
【図６（ｃ）】
0004068145.tif 000029
【図６（ｄ）】
0004068145.tif 000030
【図６（ｅ）】
0004068145.tif 000031
【図６（ｆ）】
0004068145.tif 000032
【図６（ｇ）】
0004068145.tif 000033
【図６（ｈ）】
0004068145.tif 000034