(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のブドウの種の抽出物、ブドウの皮の抽出物、消化酵素、コケモモ抽出物、イチョウ抽出物、およびケルセチンを含む、血小板凝集を阻害するための食物サプリメントであって、該ブドウの種の抽出物およびブドウの皮の抽出物はそれぞれ１種以上のフラボノイドを含む、上記食物サプリメント。
【請求項２】
消化酵素が、菌類プロテアーゼである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項３】
消化酵素が、酸安定性プロテアーゼである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項４】
消化酵素が、ブロメラインである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項５】
消化酵素が、パパインである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項６】
消化酵素が、ペプシンである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項７】
消化酵素が、中性安定性プロテアーゼである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項８】
消化酵素が、アルカリ安定性プロテアーゼである、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項９】
12 %w/wのブドウの種の抽出物、20 %w/wのブドウの皮抽出物、10 %w/wのコケモモ抽出物、10 %w/wのイチョウ抽出物、24 %w/wのケルセチンおよび24 %w/wの消化酵素ブレンドを含む、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項１０】
3.30 %w/wのブドウの種の抽出物、67.77 %w/wのブドウの皮抽出物、7.32 %w/wのコケモモ抽出物、9.71 %w/wのイチョウ抽出物、7.32 %w/wのケルセチンおよび4.58 %w/wの消化酵素ブレンドを含む、請求項１記載の食物サプリメント。
【請求項１１】
有効量のブドウの種の抽出物、ブドウの皮の抽出物、消化酵素、コケモモ抽出物、イチョウ抽出物、およびケルセチンを含む、哺乳動物の血小板活性に関連した症状を治療するための医薬組成物であって、該ブドウの種の抽出物およびブドウの皮の抽出物はそれぞれ１種以上のフラボノイドを含む、上記医薬組成物。
【請求項１２】
消化酵素が、菌類プロテアーゼである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
消化酵素が、酸安定性プロテアーゼである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
消化酵素が、ブロメラインである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
消化酵素が、パパインである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１６】
消化酵素が、ペプシンである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１７】
消化酵素が、中性安定性プロテアーゼである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１８】
消化酵素が、アルカリ安定性プロテアーゼである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１９】
12 %w/wのブドウの種の抽出物、20 %w/wのブドウの皮抽出物、10 %w/wのコケモモ抽出物、10 %w/wのイチョウ抽出物、24 %w/wのケルセチンおよび24 %w/wの消化酵素ブレンドを含む、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項２０】
3.30 %w/wのブドウの種の抽出物、67.77 %w/wのブドウの皮抽出物、7.32 %w/wのコケモモ抽出物、9.71 %w/wのイチョウ抽出物、7.32 %w/wのケルセチンおよび4.58 %w/wの消化酵素ブレンドを含む、請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、天然成分を含む食物サプリメントに関する。
【０００２】
（背景技術）
冠動脈疾患、心筋梗塞、発作、その他の血管閉塞症は健康上の大きな懸念事項である。これらの疾患に共通する特徴は、アテローム性動脈硬化隆起または冠動脈の狭窄である。血小板は、アテローム性動脈硬化隆起を促進する増殖因子、走化性物質、その他の因子を放出することによって、アテローム性動脈硬化隆起の発達および進行に関与する。さらに、冠動脈障害部位またはその近傍での血小板凝集は、アテローム性動脈硬化症の発症ならびに急性血小板血栓形成の原因となる。
【０００３】
低密度リポタンパク質（LDL）コレステロールもまたアテローム性動脈硬化症に関係している。血液中を循環する非アテローム発生性LDLコレステロールは、アポタンパク質の修飾をもたらすポリ不飽和脂質の酸化により、アテローム発生性LDLコレステロールに変換されることが提案されている。
【０００４】
医師は、アテローム性動脈硬化状態を治療するために、アスピリン等の様々な薬剤を使用する。しかし、アスピリンには、胃腸の刺激をはじめとするマイナスの副作用がないわけではない。また、血管形成術等の介入も、狭窄した動脈を拡張し、これによって血流を増加させるのに利用可能である。しかし、介入法は、動脈内膜および中膜の損傷を引き起こし、血栓形成面を露出させる。従って、血管形成術後の再狭窄や突然冠動脈死の発生が、冠動脈疾患と認められた、あるいはそのように疑われる患者にとって大きな心配事となる。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症の重大な結果と、医療処置にかかる費用を考えると、これらの症状の発生および再発を防止するのに有効な薬理学的かつ栄養学的介入が必要である。
【０００６】
疫学研究では、果物や野菜からの食物フラボノイド類の摂取と、冠動脈疾患による死亡との間の逆相関関係に注目している。この相関関係は、果物や野菜中に存在するフラボノイド類の抗酸化および血小板抑制特性から生じると考えられる。
【０００７】
ブドウの種やブドウの皮の抽出物中に存在するものを含む特定のフラボノイド類は、アスピリンに認められる有益な健康上の効果を伴い、しかも、アスピリンが有するマイナスの副作用がない。しかし、フラボノイドの生物学的利用能または活性は、多くのフラボノイド源で低い。従って、フラボノイド類の特定の食物源が有効であるためには、大量の投与を必要とする。その結果、多くのフラボノイド源が１日ごとに有効であるためには、非実用的であるか、費用がかかり過ぎるか、あるいはその両方であった。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、食物サプリメントの形態で特定のフラボノイド類と酵素を組合せることによって、哺乳動物における血小板活性およびLDLコレステロール酸化を効果的に低下させるのに必要なサプリメントの投与量が減少するという知見に基づくものである。さらに、本発明は、フラボノイド類と酵素の組合せを投与して、血小板活性およびLDLコレステロール酸化を低下させることによって、血小板活性およびLDLコレステロール酸化に関連した症状を治療する方法に関する。
【０００９】
一態様では、本発明は、少なくとも１種のフラボノイド源と、酵素とを含む食物サプリメントであって、約30mg/Kg以下の投与量で、哺乳動物における血小板活性およびLDLコレステロール酸化を抑制するのに有効である食物サプリメントを特徴とする。本発明に従う食物サプリメントの一例として、PROVEX CVTMがある。なお、本明細書中で用いられるサプリメントの投与量または用量とは、１種以上のフラボノイド源と酵素の合計重量を意味することに留意されたい。さらに、充填剤、滑沢剤、担体等のようなその他の成分を追加成分として含んでもよい。
【００１０】
上記食物サプリメントの１種以上のフラボノイド源は、ブドウの種の抽出物、ブドウの皮の抽出物、イチョウの抽出物、コケモモの抽出物、またはケルセチンから得られるものでよい。上記酵素としては、真菌プロテアーゼ、酸安定性プロテアーゼ、中性安定性プロテアーゼ、アルカリ安定性プロテアーゼ、またはブロメライン(bromelain)を挙げることができる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、少なくとも１種のフラボノイド源を含む食物サプリメントであって、約30mg/Kg以下の投与量で、哺乳動物における血小板活性およびLDLコレステロール酸化を抑制するのに有効である食物サプリメントを特徴とする。好ましくは、この態様に従う食物サプリメントはさらに酵素を含み、これによって、上記のような抑制を達成するのに必要な投与量が実質的に減少する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、約30mg/Kg以下の投与量で、哺乳動物における血小板活性およびLDLコレステロール酸化を低下させるのに有効であるフラボノイド源と酵素を含む食物サプリメントを投与することによって、哺乳動物における血小板活性もしくはLDLコレステロール酸化、またはその両方を抑制する方法を特徴とする。また、この方法は、血小板活性およびLDLコレステロール酸化を低下させるのに有効なフラボノイド源と酵素を含む食物サプリメントを投与することによって、血小板活性およびLDLコレステロール酸化に関連した症状を治療するために使用することができる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、血小板活性およびLDLコレステロール酸化を低下させるのに有効な食物サプリメントを包装材料に収納してなる製品であって、該包装材料に、該食物サプリメントが約30mg/Kg以下の投与量で哺乳動物における血小板活性もしくはLDLコレステロール酸化、またはその両方を低下させるのに有効であることを示すラベルが付されている製品を特徴とする。この製品の別の実施形態では、上記包装材料に、該食物サプリメントが血小板活性およびLDLコレステロール酸化に関連した症状を治療するのに有効であることを示すラベルを貼ってもよい。
【００１４】
別に定義しない限り、本明細書中で使用した技術および科学用語ならびに略語はすべて、本発明が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味である。ここに記載したものと類似もしくは同等の方法および材料を実際に、あるいは本発明の試験に使用することもできるが、適切な方法および材料は以下に記載する。ここに述べた出版物、特許出願、特許、ならびにその他の参照文献はすべて、参照により本明細書にそのまま組み入れる。係争の場合には、本明細書を、定義を含めて、調整するものとする。本発明のその他の特徴および利点は、以下に示す詳細な説明、ならびに請求項から明らかになるであろう。
【００１５】
（詳細な説明）
本発明は、食物サプリメント(dietary supplement)の形状における、ある種のフラボノイドと酵素との組合せが、哺乳動物において血小板活性およびLDLコレステロールの酸化を有効に減らすのに必要とされる食物サプリメントの用量を減らすという発見に関する。本発明はさらに、フラボノイド、抽出物および酵素の組合せを投与して、血小板活性およびLDLコレステロールの酸化を減らすことによる、血小板活性およびLDLコレステロールの酸化に関連する状態を治療する方法に関する。
【００１６】
冠状動脈疾患、脳血管性の疾患および末梢血管閉塞は、動脈が狭くなることにより特徴づけられる。動脈の狭まりがさらに血栓による閉塞の危険にさらされるなら、血流がさらに減少され、心筋の梗塞または発作が生じ得る。これらの状態は、血小板活性およびLDLコレステロールの酸化に関連する。これらのタイプの血管閉塞のための現今の治療、例えば血管形成術は、結果的に動脈への内膜および内側の損傷をもたらし、これは、患者において再狭窄、急性血栓症、心筋梗塞および突然の冠状動脈死をもたらし得る。さらに、血小板により媒介される血栓形成はまた、血管形成術またはアテレクトミーの後の不安定なアンギナ、心筋梗塞および再狭窄において役割を演じる。本発明は、食物サプリメントならびに、血小板活性およびLDLコレステロールの酸化を妨げる食物サプリメントを投与することによる、新しい血栓および再発の血栓の発生を防ぐ方法を提供する。
【００１７】
（血小板活性を評価する方法）
1.  フォルツのモデル(Folts Model)
フォルツの(Folts)冠状動脈血栓症モデル（「フォルツのモデル」）を使用して、種々の動物モデルにおいて血小板凝集および血栓症を研究する。Folts, J.D., Circulation (Supplement 4), 83:3-14 (1991); Folts, J.D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9:31-43 (1995); Foltsら、Circulation, 54:365-370 (1976)。フォルツのモデルは、動脈硬化症の故に狭められた冠状動脈を有する患者に生じる問題を模倣する。
【００１８】
フォルツのモデルを使用するために、完全に麻酔した動物の胸を開き、心臓を露出する。ここで記載した実験はイヌに関するものであったが、フォルツのモデルに従う他の動物としては、ブタ、ウサギ、サルおよび他の同様の動物を含む。さらに、フォルツのモデルは、ヒトにおいて不安定なアンギナおよび他の血小板により媒介される血栓発生の臨床の症候群のためのモデルである。Samamaら、Thromb. Haemost., 68:500-05 (1992); Raederら、Am. Heart J., 104:249-253 (1983); Sherry, S., Cardiovasc. Rev. Rep., 5:1208-19 (1984); Ikedaら、J. Am. Coll. Cardiol., 21:1008-1017 (1993)。
【００１９】
図１に示されているように、回旋した冠状動脈が切り開かれ、冠状動脈流消息子(probe)が動脈上に置かれている。冠状動脈流消息子は、動脈を妨げることなしに、動脈を通る血流を連続的に測定する。次に、動脈はクランプで締められて、冠状動脈に対して内膜および内側の損傷を作り出す。プラスチックの締めつける円筒が、動脈の損傷の地点で冠状動脈の外側の回りに置かれて、冠状動脈の内径を減らす。円筒によって生じた狭窄または直径減少の範囲は、血管形成バルーンまたは他の適当な方法を用いて変えられる。
【００２０】
冠状動脈流消息子は、凝塊が定期的に発生したとき、冠状動脈血流における変化を測定する。動脈が狭窄されると、冠状動脈の狭められ損傷を受けた部分に、血小板が定期的に凝集する。血小板の凝集は、大きさが増し、徐々に冠状動脈血流を切断する血栓（凝血塊）を生成する。動脈が閉塞されてくると、血小板凝集の後ろで圧力が上がり、凝塊を無理に狭窄を通過させ、これは、狭くなった動脈中での冠状動脈血流の突然の修復を引き起こす。血流を減らすのに十分な損傷を受けた動脈中の血小板凝集は、急性血小板血栓形成(APTF)と称される。
【００２１】
ヒトの動脈硬化の動脈における血栓の動脈閉塞は、動脈の内膜内層のすぐ下のトロンボゲン表面の露出で始まると考えられる。さらに、現今の情報は、種々の異なる刺激が血小板を補充して、露出されたトロンボゲン表面に付着し凝集することを示唆する。しかし、本発明の範囲は、病因の特定の理論によって限定されることはないと理解すべきである。
【００２２】
繰り返される血小板により媒介される血栓形成、次いで塞栓形成および、観察される付随した血流における変化は、周期的流量減少(cyclical flow reduction)(CFR)もしくは周期的流量変化(cyclical flow variation)(CFV)と称される。本明細書は、CFRという語を使用する。CFRはまた、大腿動脈もしくは冠状動脈の疾患を持つヒトにおいて、損傷され、狭められた動脈に観察された。Foltsら、Tex. Heart Int. J., 9:19-27 (1982); Eichornら、J. Am. Coll. Cardiol., 17:43-52 (1991)。図２が示すように、CFRが検出され、冠状動脈血流を測定することによって監視される。図２は、冠状血流について観察されたCFRの実例であるが、フォルツの方法は一般的動脈流（例えば大腿動脈流）に適用可能であることを理解すべきである。さらに、フォルツのモデルおよびこのモデルの変形を使用するのに必要とされる技術は、Folts, J.D., Circulation (Supplement 4), 83:3-14 (1991); Folts, J.D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9:31-43 (1995)およびその中の参考文献に記載されている。
【００２３】
単位時間当たりのCFRの頻度もしくは数は、in vivoの血小板活性の直接の尺度である。Folts, J.D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9:31-43 (1995)。狭窄した動脈におけるCFRの頻度および範囲を測定することによって、フォルツのモデルを、血小板活性を変える剤を評価するのに使用することができる。Folts, J.D., J. Cardiovasc. Drugs Ther., 9:31-43 (1995)。そのように、フォルツのモデルは、血小板抑制剤、抑制剤活性の範囲、抑制剤の有効投与量、抑制のの持続時間および血小板作用薬を打ち消す抑制剤の能力を明らかにする。
【００２４】
アスピリンは、フォルツのモデルの実例を提供する。フォルツのモデルは、アスピリンが、実験条件下で血小板活性を抑制し、CFRを除去することを証明した。Foltsら、Clin. Res., 22:595 (1974)（抄録）； Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83:3-14 (1991); Folts, J.D., J. Cardiovasc. Drugs Ther., 9:31-43 (1995)。アスピリンは、5 mg/kgの用量で血小板活性を抑制することが知られている。フォルツのモデルで使用された条件下で、血小板活性がアスピリンで抑制されたとき、血小板活性は、血液中のエピネフリン（アドレナリン）またはノルエピネフリンの濃度を増加することによって更新され得る。アドレナリンのこの増加は、ストレスを受けたとき、おびえたとき、心配したとき、または運動するとき、多くの人々において自然に生じる。Folts, J.D. & Rowe, G.G., Thromb. Res., 50:507-516 (1988)。さらに、動脈の狭窄を増加させることはまた、アスピリンで破壊されたCFRの再発生を引き起こす。Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83:3-14 (1991)。そのように、フォルツのモデルは、血小板活性の抑制を評価するために有効な道具を提供する。
【００２５】
2.  血小板凝集能測定試験
ヒトもしくは動物において血小板活性を測定するための第２の方法は、全血血小板凝集能試験である。ここで記載し使用した全血血小板凝集能測定の評価を行うための装置および方法は、Chronolog Inc., 2 West Park Rd., Haverton, PA 19083から入手可能である。試験を行うために、血液試料を標準的方法によって抜き取り、次にこれをプラスチック管に入れる。１対の電極を血液試料中に入れて、血液試料の電気抵抗を測定する。血液の電気抵抗は普通、血液中に見出される多くのイオンや電解質の故に低い。そこで公知の血小板凝集刺激物、例えばアデノシン２リン酸(ADP)もしくはコラーゲンを、血液試料に加えて、血小板を活性化する。活性化された血小板は、血小板凝集能測定試験で使用される電極に付着する。図５（右側）に示されているように、血液試料の電気抵抗は普通、血小板が電極上に凝集するにつれて、S字形で増加する。対象が、血小板活性を抑制する物質を投与されると、血小板刺激物添加後の抵抗の増加はより小さい。
【００２６】
アスピリンは、血液の血小板凝集能測定試験の使用の実例を提供する。ヒトから採取された血液試料は、血小板活性のベースラインの量を有する。ADPの添加は、血液試料の抵抗を増加させる。図５、右側、「ADP」曲線参照。アスピリンの325mg錠剤を与えられて２時間後に、第２の血液試料を抜き取る。ADP添加後の血小板活性化は、血小板の活性を、初期の血液試料について観察された量まで増加させない。図５、右側、「ADP+ASA」曲線参照。観察された血液の抵抗の減少は、アスピリンにより引き起こされたex vivoでの血小板活性のパーセンテージ減少として表される。アスピリンを摂取した人のエピネフリン量が、血液試料を抜き取られる前に上げられると、アスピリンについて観察された抑制効果が減少される。図５、右側、「ADP+ASA+EPI」曲線参照。Folts, J.D., J. Cardiovascular Drugs & Therapy, 9:31-43 (1995)；Ingerman-Wojenski & Silver, Thromb. Haemost., 51:154-156 (1984)。
【００２７】
アスピリンはまた、血小板活性を刺激するのにコラーゲンが使用されるときに同様に応答する。血液の血小板凝集能測定試験において血小板活性を刺激するのにコラーゲンが使用されると、アスピリンは血小板活性を約30〜40％だけ減らす。したがって、血液の血小板凝集能測定法はまた、薬剤またはフラボノイドにより生じる血小板抑制効果の別の尺度として使用することができる。
【００２８】
3.  LDLコレステロール酸化の評価
LDLコレステロール酸化またはそれからの保護を、幾つかの方法によって測定することができる。Kleinveld ら、Clin. Chem., 38(10): 2066-2072 (1992)は、本明細書で記載され、使用されたLDL酸化実験についての方法を記載する。この方法を行うための好ましい方法は、標準的技術を用いて対象から集めた全血試料からLDLコレステロールを抽出することを含む。抽出されたLDLコレステロールは、対照と実験試料とに分けられる。LDL酸化は、銅イオン溶液を各LDLコレステロール試料に添加することによって触媒される。銅イオンは、LDLコレステロール酸化を触媒し、増進することが知られている。
【００２９】
対照のLDLコレステロール試料は、抽出されたLDLコレステロールおよび銅イオンを含む。対照試料は、血液を抜き取られた対象の食事およびそれから調製されたLDLコレステロールにおける酸化防止剤のベースライン尺度を提供する。試験のLDLコレステロール試料は、さらなる化合物、例えば酸化防止剤として作用することができる食物サプリメントの存在中または不在中で、銅イオンと合わせられる。
【００３０】
さらに、対象は、血液試料を集める前に、標準技術により酸化防止剤を投与されることができ、これは、in vivoでの酸化防止剤特性の測定を容易にする。in vivoのLDLコレステロール酸化防止剤特性を測定するために、試験をされるべき酸化防止剤供給源を投与する前および後に全血試料を得る。
【００３１】
銅イオンは、LDLコレステロール酸化において、234 nmで光を吸収する共役ジエンの生成を促進する。したがって、LDLコレステロール酸化は、図６に示されたように時間の関数として234 nmでの吸収の増加を追跡することによって監視される。酸化防止剤は、LDLコレステロールにおけるジエン生成の開始を延期する。その結果、酸化防止剤を含むLDLコレステロール試料は、LDLコレステロール酸化が観察される前に経過した時間（遅延時間）を計算することによって比べることができる。図７参照。遅延時間は、ここで記載したLDLコレステロール酸化実験条件下で、酸化的損傷からのLDLコレステロールの保護の最良の指標である。より長い遅延時間は、よりよい酸化防止剤特性を示す。
【００３２】
（血小板活性の抑制およびLDLコレステロール酸化の減少）
多くの複雑な要素が、動脈硬化、冠状動脈疾患および関連する状態に導く。これらの要素の中で、血小板と動脈壁との相互作用が、動脈硬化のプロセスを増進し得ることが知られている。さらに、増加された血小板活性は、動脈硬化の進展と血栓発生の一時および永久の発生との両方に密接に関連する。したがって、日々において血小板活性を減らす要素が、動脈硬化、冠状動脈疾患および関連する状態の進展もしくは発生を阻止すべきである。Flotsら、J. Myocard. Ischemia, 6(8):33-40 (1994)。
【００３３】
疫学研究は、酸化防止剤フラボノイドまたはビタミンEの高い食物の消費と、減少された冠状動脈心疾患との逆相関関係を示す。Hertogら、Lancet, 342(8878):1007-11 (1993); Waterhouseら、Hypernutritious Foods, Agscience, Inc., Auburndale, Fl., 219-238 (1997)。フラボノイドを含むことが知られている食物源としては、赤ワイン、ビール、グレープジュース、果物および野菜を含む。ブドウの種、ブドウの皮、イチョウ (ginkgo biloba)、コケモモおよび他の同様の果物、野菜ならびにハーブがまた、フラボノイドおよび酸化防止剤供給源である。
【００３４】
しかしながら、フラボノイドおよび酸化防止剤に関連する利益を有効に得るために克服されなければならないハードルがある。１つのハードルは、フラボノイドの食物供給源における活性成分の生物学的利用能である。生物学的利用能または活性が低いと、人は、血小板抑制剤または酸化防止剤に関連する利益を受けるために、大量の血小板抑制剤または酸化防止剤食物サプリメントを消費しなければならない。その結果、低い生物学的利用能は、食物サプリメントを多くの消費者にとって実際的でないもの、コストがかかりすぎるものまたはその両方にし得る。
【００３５】
さらに、個々のフラボノイドに関連する血小板抑制および酸化防止剤特性の効果は、特定のフラボノイド間で変化し、例えばブドウからのフラボノイドは、ヒトのボランティアおよび動物において、柑橘類の果物ジュースで見出されるフラボノイドよりよい血小板抑制剤である。Flotsら、J. Am. Coll. Cardiology, 29(2) (Supplement A): 303A (1997); Folts, J.D., J. Am. Coll. Cardiology, 29(2) (Supplement A):226A (1997); Flotsら、J. Am. Coll. Cardiology, 29(2) (Supplement A): 180A (1997)。
【００３６】
血流内の環境条件は変動しないものではない。有効であるためには、食物サプリメントは、血小板活性レベルを上げる傾向がある種々の程度のストレス、興奮および運動を含む種々の状態の下で有効でなければならない。
【００３７】
最後に、フラボノイドの多くの食物供給源はまた、望まない成分、例えばワインおよびビール中のアルコールならびに、グレープジュース中の砂糖およびカロリーを含む。また、種々のフラボノイドおよび薬剤に関係する毒性がある。例えば、アスピリンは、胃腸の刺激、エピネフリンの存在中での効果の損失および著しい狭窄状況下でのCFR阻害不能を含む、よく証明された副作用を有する。
【００３８】
したがって、実際的かつコストの面で有効なやり方で種々の条件下で、血小板活性およびLDLコレステロール酸化を抑制する食物サプリメントを作ることが有用であるという仮説が立てられた。さらに、有用な食物サプリメントの鍵となる特徴は、食物サプリメントの活性成分の吸収を高めるための成分を含むことによって、食物サプリメントの生物学的利用能を増加させることである。本発明者は、そのような食物サプリメントを発見した。そして、その食物サプリメントを本明細書に記載し、特許請求する。
【００３９】
第１の実施態様においては、本発明は、哺乳動物において約30 mg/kg以下の用量で、血液の血小板活性およびLDLコレステロール酸化を抑制するために有効である、少なくとも１のフラボノイド供給源および酵素を含む食物サプリメントを提供する。この食物サプリメントはさらに、フラボノイド供給源、例えばブドウの種抽出物、ブドウの皮抽出物、イチョウ抽出物、クエルセチン、コケモモ抽出物または任意の他の特定のフラボノイドを含むことができる。「フラボノイド供給源」は、任意の供給源から誘導されることができ、公知の供給源からの合成または精製したフラボノイドを含むことができる。フラボノイド供給源はまた、例えば、単独でまたは、フラボノイドが、多くのフラボノイドを含む複合混合物例えば植物抽出物から分離された組合せとして、非常に活性であると測定された１もしくはそれ以上のフラボノイドであることができる。
【００４０】
作用の特定の理論に縛られることはないが、目下開示された食物サプリメントの成分は、生物学的利用能または薬理学的相互作用を増加させて血液の血小板活性を抑制しLDLコレステロール酸化を抑制することによって、共同作用的にふるまうと考えられる。本発明の関連した態様において、この食物サプリメントは、上昇された血小板作用薬（例えばエピネフリン）濃度の存在中で、血小板活性を減らし、LDLコレステロール酸化を抑制するのに有効なままである。
【００４１】
食物サプリメント処方の例としては、１またはそれ以上の以下の成分を含むことができる：果物抽出物、野菜抽出物、消化酵素、、ハーブ、フラボノイド、酸化防止剤および他の同様の材料。
【００４２】
有用な消化酵素の実例としては、ペプシン、パパイン、菌類プロテアーゼ、酸安定性プロテアーゼ、中性安定性プロテアーゼ、アルカリ安定性プロテアーゼおよびブロメラインを含む。
【００４３】
有用なフラボノイドの実例としては、カテキン、プロシアニジン、プロアントシアニジン、クエルセチン、ルチンおよびフラボノイドのグリコシド形を含む。  本発明の食物サプリメントは、経口的に、静脈内に、皮下に、舌下に、胃内に、フィトゾーム(phytosome)として、または任意の容認できる搬送法によって搬送され得る。さらに食物サプリメントは、任意の適当な担体と併用して搬送を促進することができる。フォルツのモデルを用いてここで試験した食物サプリメントは、静脈内にまたは胃内に投与された。胃の内層を経由する吸収は普通、２〜４時間かかる。そのように、胃内に投与された食物サプリメントは、食物サプリメントを投与後約２〜４時間まで、CFRに影響を及ぼすことができない。
【００４４】
市販の食物サプリメントは一般に、経口で与えられるように処方されている。食物サプリメントのための投与の有用な形状としては、丸薬、ペースト、粉末、液体および他の普通の経口処方を含む。食物サプリメントの製造は、ここで記載した種々の形状の食物サプリメントのために普通の製造技術を用いて行うことができる。ここで記載した食物サプリメントはさらに、食物サプリメントのカプセルへの受渡しを容易にするために、ステアリン酸マグネシウムを滑剤として含むことができる。ステアリン酸マグネシウムは、一般に１〜４ mg/カプセル、好ましくは１〜２mg/カプセルの濃度で使用される。
【００４５】
フォルツのモデルは、血小板活性を減少させる食物サプリメント処方を明らかにするために使用することができる。イヌ冠状動脈を、ここで記載したようにCFRを示すように調製する。次にイヌに、測定した用量の食物サプリメントを、是認された方法の１つによって投与する。観察されたCFRに食物サプリメント用量が有する効果を監視する。フォルツのモデルを用いることによって、有効な用量、半減期および吸収の範囲を測定することができる。イヌから採取した血液試料は、血流内の食物サプリメント濃度および血小板活性量に関する情報を提供する。
【００４６】
さらなる実験を用いて、有用な食物サプリメントの特性を評価することができる。例えば、食物サプリメントを投与後に狭窄の激烈さを増加させて、CFRが再発生するかどうかを決定することができる。さらに、食物サプリメント投与前または後に種々の時点で投与された血小板作用薬は、血小板活性化条件下でCFRを除去することができる食物サプリメントを同定する。有用な作用薬としては、エピネフリンおよびノルエピネフリンを含む。エピネフリンの、この目的のために有用な用量は、0.2μg/kg/分で15分間静脈内に投与したエピネフリンを含む。
【００４７】
ヒトのボランティアまたは冠状動脈疾患を有する患者にまた、ここで記載され、特許請求された食物サプリメントおよびその変形物を投与して、ここに記載された血小板凝集能測定およびLDLコレステロール酸化実験を用いて食物サプリメントの効力を評価することができる。
【００４８】
有用な食物サプリメント処方は、１またはそれ以上の以下のものを含むことができる：ブドウの種の抽出物、ブドウの皮抽出物、イチョウ抽出物、コケモモ抽出物、クエルセチンおよび酵素ブレンド。食物サプリメントは、以下の方法で、重量にて処方され得る：12%w/wのブドウの種の抽出物、20%w/wのブドウの皮抽出物、10%w/wのイチョウ抽出物、10%w/wのコケモモ抽出物、24%w/wのクエルセチンおよび24%w/wの酵素ブレンド。
【００４９】
そのように、本発明に従いフラボノイドおよび酵素を含む有用な食物サプリメントは、PROVEXCVTMである。PROVEXCVTMは、Melaleuca, Inc., Idaho Falls, Idahoから入手可能である。
PROVEXCVTMは、380ミリグラムカプセル当たり、以下の成分を含む：
【００５０】
0004047538.tif 000002
【００５１】
サプリメントは、また、本発明にしたがって、酵素ブレンドを除く上記成分の全てを含むように調製することもできる。
ＰＲＯＶＥＸＣＶTMの３８０ｍｇカプセルのそれぞれにおいて用いた酵素ブレンドは、以下の酵素を含む。
0004047538.tif 000003
【００５２】
真菌プロテアーゼ２００５３及び２００５４は、酸性、中性及びアルカリ性プロテアーゼ酵素の酵素混合物である。ＨＵＴ活性は、変性ヘモグロビンの加水分解に基づくＦＣＣ  ＨＵＴアッセイで測定される酵素の活性である。１ＨＵＴ単位は、その２７５ｎｍにおける吸光度が０．００６Ｎ−ＨＣｌ中のチロシン１．１０ｍｇ／ｍｌの溶液に等しいヒドロシレート（hydrosylate）を１分で産生する酵素の量として定義される。ＳＡＰＵ活性は、ハマースタン（Hammarstan）カゼイン基質の加水分解に基づくＦＣＣ  ＳＡＰＵアッセイで測定される。１ＳＡＰＵ単位は、ｐＨ３、３７℃において、１分間に１マイクロモルのチロシンを解離する酵素の量として定義される。ＰＵ活性は、カゼインの加水分解に基づくＦＣＣ  ＰＵアッセイで測定される酵素の活性である。１ＰＵ単位は、ｐＨ６．０、４０℃において、１時間に１μｇのチロシンを解離する酵素の量として定義される。上記に示す酵素に関するより詳しい情報は、酵素に関する技術報告書を通して、ミズーリ州フォルシスのナショナル・エンザイム・カンパニー、（４１７）−５４６−４７９６から入手することができる。
【００５３】
ＰＲＯＶＥＸＣＶTM中に含まれる成分は、以下の源から得ることができる。用いた実際の源は、供給者にアンダーラインを引くことによって示している。
成分／抽出物 入手元
ブドウ種子抽出物      インデナ：イタリア、ミラノ
ポリフェノリクス：ＮＹ、カナンダイガ
インターヘルス：ＣＡ、コンコード
トリ−Ｋインダストリーズ：ＮＪ、ファナーソン
イチョウ二裂葉抽出物  インデナ：イタリア、ミラノ
ウェインスタイン・ニュートリショナル：ＣＡ、アーバイン
オプティピュア：ＣＡ、ロサンゼルス
ボタニカルズ・インターナショナル：ＣＡ、ロングビーチ、
コケモモ抽出物        インデナ：イタリア、ミラノ
オプティピュア：ＣＡ、ロサンゼルス
ケムコ・インダストリーズ：ＣＡ、ロサンゼルス
ブドウ果皮抽出物      フリーマン・インダストリーズ：ＮＹ、タッカホー
ウェインスタイン・ニュートリショナル：ＣＡ、アーバイン
ブルーシア・イクストラクツ：カリフォルニア
ケルセチン            ウェインスタイン・ニュートリショナル：ＣＡ、アーバイン
ボタニカルズ・インターナショナル：ＣＡ、ロングビー                        チ
酵素ブレンド          ナショナル・エンザイム・Ｃｏ：ＭＯ、フォルシス
マックウッド：ＷＩ、チエンスビル
ボタニカルズ・インターナショナル：ＣＡ、ロングビー                      チ、
シトラス抽出物        ボタニカルズ・インターナショナル：ＣＡ、ロングビー チ、
【００５４】
ＰｒｏＶＥＸ  ＰｌｕｓTMは、１２５ｍｇのカプセルあたり以下の成分を含む。
0004047538.tif 000004
【００５５】
酵素ブレンドを除くＰＲＯＶＥＸＣＶTMの成分の全てを含むサプリメントを用いたフォルツモデルでの実験によって、かかるサプリメントが、約２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量でＣＦＲを排出するのに有効であることが示された。食物フラボノイドを酵素と組み合わせることによって、フォルツモデルにおいて観察されるＣＦＲを排出するのに必要な用量を更に減少させることができることが分かった。等量部の二つの真菌プロテアーゼ、酸安定性プロテアーゼ及びブロメラインを含む酵素ブレンドを、酵素ブレンドを除くＰＲＯＶＥＸＣＶTMの成分の全てを含むサプリメントに加えることによって、ここで用いた動物モデルにおいてＣＦＲを排出するのに必要な用量が、約２０ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇに減少した。
【００５６】
ＰＲＯＶＥＸＣＶTMの有効性は、ＰＲＯＶＥＸＣＶTMが、ここで用いた動物モデルにおいて、ＣＦＲを排出するのに必要な用量を、ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTMについて必要な約３０ｍｇ／ｋｇから、ＰＲＯＶＥＸＣＶTMについて必要な約１０ｍｇ／ｋｇへと減少させたということであった。その結果として、ここで説明した食物サプリメントの有用な用量は約３０ｍｇ／ｋｇ以下である。好ましくは、有効な用量は約２０ｍｇ／ｋｇ以下である。より好ましくは、有効な用量は約１０ｍｇ／ｋｇ以下である。
【００５７】
このように、その抗酸化及び血小板抑制特性を有するＰＲＯＶＥＸＣＶTMを摂取することにより、冠状動脈疾病、急性閉塞血栓症、心筋梗塞による死亡、並びに血小板活性及びＬＤＬコレステロール酸化に関連する他の症状の進行に対して保護することができる。
【００５８】
本発明の他の態様は、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMと称される食物サプリメントを包含する。ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM及びＰＲＯＶＥＸＣＶTMと同様に、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMは、血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化を抑制するための食物サプリメントとして用いることができる。ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMは、１，６３８ｍｇあたり以下の成分を含む。
0004047538.tif 000005
【００５９】
ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMを含むここで説明する食物サプリメントに関する成分は、任意の供給者から得ることができる。例えば、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMに関する成分の全てを得るために上記に列記した供給者を用いることができる。更に、成分は、発酵プロセスにかけられていない源から得ることができる。例えば、未発酵ブドウ種子抽出物及び未発酵ブドウ果皮抽出物は、ここで記載した食物サプリメントのための成分として用いることができる。かかる未発酵成分は、ポリフェノリクス（ＮＹ、カナンダイガ）のような任意の供給者から得ることができる。
【００６０】
簡潔に記載すると、発酵プロセスは、ワインの製造において用いられる。成分が、ワイン製造に従事する供給者から得られる場合には、その成分は発酵成分であろう。例えば、発酵ブドウ種子抽出物又は発酵ブドウ果皮抽出物のような発酵成分は、発酵に供されたブドウのような源から単離される任意の成分であってよい。これに対して、未発酵成分は、発酵に供されていない源から単離される任意の成分であってよい。かかる未発酵成分は、発酵成分よりもより有効なフラボノイド源であり得る。例えば、未発酵ブドウ種子抽出物又は未発酵ブドウ果皮抽出物は、発酵ブドウ種子抽出物又は発酵ブドウ果皮抽出物よりも有効に、血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化を抑制することができる。
【００６１】
得られる組成物が血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化を抑制することができるのであれば、ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM、ＰＲＯＶＥＸＣＶTM及びＰＲＯＶＥＸＣＶ２TM中のそれぞれの成分の割合を変化させることができることに注意されたい。例えば、イチョウ二裂葉抽出物の割合を１０％を超える値に増加させることができる。
【００６２】
他の態様においては、本発明は、血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化又はその両方を減少させるのに有効な少なくとも一つのフラボノイド源、及び酵素を含む食物サプリメントを投与することにより、哺乳動物における血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化を抑制する方法を提供する。
【００６３】
他の態様においては、本発明は、哺乳動物における血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化に関連する症状を治療する方法が提供される。この方法は、約３０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化を減少させるのに有効な少なくとも一つのフラボノイド源及び酵素を含む食物サプリメントを投与するステップを含む。
【００６４】
上記記載の方法を実施するには、哺乳動物に、１回分の本明細書中に記載したような食物サプリメントを許容し得る投与法によって与える。投与は、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、或いは状況に応じてその何分の一かごとに行うことができる。食物サプリメントを投与した後、哺乳動物を、血小板活性及びＬＤＬコレステロール酸化に関して評価することができる。次に、血小板活性及びＬＤＬコレステロール酸化のレベルを、食物サプリメントを投与する前のこれらのレベルと比較することができる。
【００６５】
本発明の他の態様においては、血小板活性及びＬＤＬコレステロール酸化を減少させるのに有効な食物サプリメントを含む製造品が提供される。製造品は、食物サプリメントが約３０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で哺乳動物における血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化又はその両方を減少させるのに有用であることを示すラベルが付された包装材料内に包含される。製造品の他の態様においては、包装材料に、食物サプリメントが血小板活性又はＬＤＬコレステロール酸化に関連する症状を治療するのに有用でであることを示すラベルを付すこともできる。
任意の包装及び印刷法を用いて製造品を調製することができる。
【００６６】
本発明は、以下の具体的な態様を参照することにより更に理解されるであろう。以下の態様は、単なる例示であり、特許請求の範囲において記載されている本発明の真の範囲を制限するものではない。
【００６７】
（実施例）
実施例１：食物サプリメントによる血小板抑制の評価
Ｆｏｌｔｓ，Ｊ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４），８３：３−１４（１９９１）において開示されているフォルツモデルの方法を用いる評価のために、冠状動脈狭窄症及び中脈損傷を有する１０頭の麻酔されたイヌを準備した。血圧及び冠状動脈血流を、実験の間中連続的にモニタリングした。図２に示されるように、急性血小板血栓の形成によって、図２に示されるＣＦＲと同様のＣＦＲが、ＰＲＯＶＥＸＣＶTMを投与する前の１０頭のイヌにおいて３０分間隔で８±３回起こった。ストリップチャート記録を示す全ての図は、１２スクエアあたり１０分の同等のスケールで示されている。次に、１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMを、それぞれのイヌに胃チューブによって投与した。図３に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMを胃に投与することによって、１０頭のイヌの９頭において１７４±２４分に観察されたＣＦＲが排除された。１０番目のイヌにおいて観察されたＣＦＲは、１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMの投与３時間後に、３０分の間隔で２ＣＦＲに減少した。ＰＲＯＶＥＸＣＶTM中の食物フラボノイドによって生起した心拍数又は動脈血圧における変化はなかった。
【００６８】
フォルツモデルにおいて評価すると、アスピリンによって抑制される血小板活性は、０．２μｇ／ｋｇ／分のエピネフリンを静脈投与することによって再活性化され得る。Ｆｏｌｔｓ，Ｊ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４），８３：３−１４（１９９１）参照。１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMを投与することによってＣＦＲが排除された８頭のイヌに、０．２μｇ／ｋｇ／分のエピネフリンを１５分間静脈投与した。図４の右側は、１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMの胃投与によって排除されたＣＦＲが、８頭の全てのイヌにエピネフリンを０．２μｇ／ｋｇ／分で静脈投与しても再現しなかったことを示す。
【００６９】
本明細書中に記載した全血凝血測定法を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏの血小板活性を１０頭の全てのイヌに関して測定した。１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTM投与の前後においてそれぞれのイヌから血液試料を採取し試験した。血小板凝血がコラーゲンによって刺激された場合に、ｅｘ  ｖｉｖｏ全血血小板凝血は、１０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶTMを投与された１０頭のイヌの全てにおいて４０％±９％減少した。図５に示されるように、アスピリンと異なり、エピネフリンに応答して観察される血小板凝血の増加は、ＰＲＯＶＥＸＣＶTMによっては観察されなかった。
【００７０】
実施例２：食物サプリメントのＬＤＬコレステロール酸化の評価
上記に記載のように、ＬＤＬコレステロール酸化は、通常、ＬＤＬコレステロールを酸化条件にさらしながら、２３４ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ234nm）を時間の関数として観察することによって測定される。ＰＲＯＶＥＸＣＶTM及び他の物質の抗酸化有効性を測定した。
【００７１】
ＬＤＬコレステロールをボランティアのヒトの血液試料から調製した。次に、単離したＬＤＬコレステロールを、バッファー、ビタミンＥ、ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM（図６の「Ｏｒｉｇ」）又はＰＲＯＶＥＸＣＶTM（図６の「Ｃｕｒｒ」）と混合した。ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM及びＰＲＯＶＥＸＣＶTMの実験溶液を、０．５及び１．０ｍｇ／Ｌの最終濃度で調製した。Ｐｒｏｖｅｘ  ＰｌｕｓTM及びＰＲＯＶＥＸＣＶTMに関して選択した濃度は、許容される血液吸収モデルに基づいた食物サプリメントの予想される血液レベルの見積り値であった。それぞれの試料に、測定された量の銅イオンを加えた。用いたビタミンＥの量は、４００ＩＵのビタミンＥを投与したヒトの血液中に予測される量に匹敵するものであった。
【００７２】
混合した後、それぞれの溶液のＡｂｓ234nmを時間の関数としてモニタリングした。図６に示されるように、ＬＤＬコレステロールを０．５ｍｇ／Ｌ又は１．０ｍｇ／ＬのＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM又はＰＲＯＶＥＸＣＶTMと共にインキュベーションすることによって、５．３ＩＵでの周知の抗酸化ビタミンＥに関して観察されるよりもより長い間、ＬＤＬコレステロールが酸化から保護された。
図７に示されるように、ＬＤＬコレステロールは、銅イオンの添加から４５分までの間、認識され得る酸化は示さなかった。上記記載の濃度のビタミンＥにより、ＬＤＬコレステロールは約９５分間酸化から保護された。１．０ｍｇ／ＬのＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTMにより、ＬＤＬコレステロールは１００分を超える時間酸化から保護された。最後に、１．０ｍｇ／ＬのＰＲＯＶＥＸＣＶTMにより、ＬＤＬコレステロールは、これらの実験条件下で１５０分を超える時間酸化から保護された。このように、ＰｒｏＶｅｘ  ＰｌｕｓTM及びＰＲＯＶＥＸＣＶTMは、ビタミンＥよりも優れた抗酸化剤である。
【００７３】
実施例３：ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの評価
イヌにおいて、血小板活性に対するＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの効果を、フォルツモデルを用いｉｎ  ｖｉｖｏで及び全血血小板凝血試験を用いｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。簡潔に記載すると、いずれかの性の１０頭の雑種成犬に麻酔をかけ、第５肋間領域において胸部を切開した。左心の弓状湾曲冠状動脈を切開し、電磁流動プローブを動脈の周りに配置して、動脈血流を測定した。流動プローブの反対側において、動脈を特別の外科用クランプで３回圧迫して、脈管内膜及び中脈の損傷を生起させた。適当な内径のプラスチックシリンダを動脈の周りに配置して、動脈直径の７０％減少を生起させた。
【００７４】
ＣＦＲの発現の間、血液試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏ全血血小板凝血試験のために採取した。２０分の間ＣＦＲが連続して形成したことをモニターした後、１５ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMを胃チューブによって投与した。ＣＦＲを３時間モニタリングした。ＣＦＲが消滅したら、第２の血液試料を採取して、ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝血試験を繰り返した。次に、エピネフリン（０．２μｇ／ｋｇ／分）を２０分間注入して、ＣＦＲが復活するかどうかを観察した。
【００７５】
冠状動脈狭窄症及び脈管内膜損傷を有する１０頭のイヌは、３０分あたり７±３回の頻度で、急性血小板血栓形成によるＣＦＲを有していた。１５ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMを胃チューブにより投与した後は、ＣＦＲは１６４±２９分の間消滅した。エピネフリンの静脈注入（０．２μｇ／ｋｇ／分で２０分間）によっては、どのイヌにおいてもＣＦＲは復活しなかった。ここでも、５〜１０ｍｇ／ｋｇのアスピリンによってＣＦＲが消滅した後にエピネフリンを注入すると、実験したイヌの５０〜６０％においてＣＦＲが復活した。したがって、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMは、アスピリンよりもより強力に血小板活性を抑制することが明らかである。
【００７６】
ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの投与の前後において採取した全血試料における血小板活性を、全血血小板凝血試験を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TM投与の後、ＡＤＰ（２０μｌ／ｍｌ）によって誘発された血小板凝血が４２±１０％（ｐ＜０．０３）減少した。更に、エピネフリン及びＡＤＰの組み合わせによって生起した血小板凝血が、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TM投与の後３２±１１％（ｐ＜０．０５）減少した。
【００７７】
ヒトにおいて、血小板活性に対するＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの効果も、全血血小板凝血試験を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。具体的には、年齢２２〜５０歳の１２人の健康な被験者のヒト（男性８人、女性４人）を集めた。彼らは、実験の１週間前から実験の間中にわたって、茶、アルコール飲料、ブドウ製品、フラボノイド及びビタミンサプリメント、並びにアスピリン製品を含むすべての医薬の摂取を控えた。ベジタリアンは実験から排除した。
【００７８】
それぞれの被験者について、実験の１日目において、絶食状態で午前８時から昼の１２時の間に、ｅｘ  ｖｉｖｏ全血血小板凝血試験のために、静脈血１８ｍｌを採取した。次に、それぞれの被験者に、彼らの体重によって５〜７カプセル（約２０ｍｇ／ｋｇ／日）のＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMを７〜１４日間服用するように指示した。７〜１４日の後、それぞれの被験者を絶食状態で、但しその日のＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの投与は行なった状態で実験室に戻し、第２の血液試料の採取を行なった。この試料は、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの最後の投与の２〜４時間後に採取した。
【００７９】
簡潔に記載すると、１８ｍｌの全血を、抗凝血剤として３．８％のクエン酸ナトリウム２ｍｌを含むシリンジ中に採取した。血液を、保存剤を含まない等量の食塩水で速やかに希釈した。希釈血液１ｍｌを、シリコン被覆撹拌棒を有するキュベット中に配置し、３７℃で５分間加温した。電極をキュベット内に配置して、血小板凝血に比例するインピーダンスの変化を測定した。ベースラインの血小板活性が記録されたら、高用量（１２．５μｇ）のコラーゲンを、予め加温した血液に加え、凝血測定器中に配置して最大の血小板凝血応答を得た。血小板凝血によって生起するインピーダンスの変化は７分間継続測定した。最大限以下の用量のコラーゲン（０．５μｇ／ｍｌ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（０．５ナノモル／ｍｌ）、及びＡＤＰ（２０マイクロモル／ｍｌ）を、血小板拮抗剤として用いた。更に、エピネフリン（０．５μｇ／ｍｌ）で１分間予めインキュベートした血液１ｍｌ中の血小板凝血の拮抗剤として、ＡＤＰ（２０マイクロモル／ｍｌ）も用いた。凝血応答を、対照試料において二回測定して、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの毎日投与の７〜１４日後の応答と比較した。
【００８０】
ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの毎日投与の７〜１４日後に採取された試料において、コラーゲン（０．５μｇ／ｍｌ）、ＡＤＰ（２０マイクロモル／ｍｌ）、及びホルボールエステル、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ：０．５ナノモル／ｍｌ）に対する血小板凝血応答が、それぞれ、５１．６±４１．１％（ｐ＜０．００５）、３９．８±４１．５％（ｐ＜０．００５）、及び１７．９±１０．０％（ｐ＜０．００２）減少したことが示された。更に、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの毎日投与の７〜１４日後に採取された試料において、エピネフリン（０．５μｇ／ｍｌ）及びＡＤＰ（２０マイクロモル／ｍｌ）の組み合わせに応答した血小板凝血が、１４．９±８．５％（ｐ＜０．０５）減少したことが示された。これらの結果によって、ＰＭＡ誘発血小板凝血がＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの毎日投与の７〜１４日後に減少したので、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMによる血小板活性の抑制のメカニズムが、血小板タンパク質キナーゼＣの抑制によるものである可能性があることが示唆される。
【００８１】
血小板活性に対するＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの効果を評価したのに加えて、ＬＤＬコレステロール酸化に対するＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの効果を研究した。簡潔に記載すると、ＬＤＬは、健康な絶食状態の被験者から、ＶＬＤＬ／キロミクロンを除くための１．００６ｇ／ｍｌの密度での回転、及びより濃厚なＨＤＬ及び血清タンパクからＬＤＬを回収するための１．０６３ｇ／ｍｌ（ＫＢｒ）の密度での回転による連続超遠心を用いて単離した。それぞれの回転時間は、１００，０００ｒｐｍ（＞４，０００，０００×ｇ）に設定したベックマン・オプティマを用いて３時間であった。ＬＤＬを、バッファーを幾つか交換して、ＥＤＴＡを含むホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して４８時間透析した。次に、透析した材料を、電気泳動（アガロースゲル）によってチェックして、他のリポ蛋白フラクション又は血清タンパクが存在しないことを確認した。単離されたＬＤＬのタンパク濃度を測定して、希釈のためにＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いて０．５ｇ／Ｌに調節した。次に、ＬＤＬ溶液を、スクリューキャップ封を有する小型のガラス容器中に０．７ｍｌのアリコートとして入れた。バイアル及びＬＤＬ溶液を窒素でフラッシングして、残留酸素を除去して、安定性を確保し、使用する直前まで−８０℃に保存した。
【００８２】
上記に記載のようにしてＬＤＬ酸化を行なった。簡潔に記載すると、酸化性実験の直前に１００μｌの解凍したＬＤＬを９００μｌのＰＢＳと混合することによって、ＬＤＬをＥＤＴＡ非含有ＰＢＳで希釈した。新しく調製したＣｕＣｌ2（最終濃度５マイクロモル／Ｌ）１０μｌをＬＤＬ溶液に加えて、酸化を開始した。３分毎に吸光度の読み取りを行なって、共役ジエンの形成速度を、２３４ｎｍにおいて３０℃で５時間、分光光度測定によってモニタリングした。分光光度計は、単一の実験において分析した６個の試料の最大を与えるための６配置自動試料ホルダーを具備している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において直接混合を用いてＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMの能力を評価する際には、対照としてＬＤＬ単独をＰＢＳ及びＣｕＣｌ2と共に用いる。
【００８３】
ＬＤＬ酸化の時間経過は、三つの連続した相を示す。即ち、共役ジエンの形成が殆ど起こらない遅延相；ジエン形成が速やかに増加する増大相；そして最後に分解相である。ＣｕＣｌ2を加えた時点と増大の開始時との間の期間として定義される遅延相は、酸化ストレスに対するＬＤＬの感受性を反映するものとして考えられる。
【００８４】
ＬＤＬコレステロールの試料における共役ジエンの形成速度を図８に示す。天然のＬＤＬコレステロールを、ビタミンＥ（５．３ｍｇ／Ｌ）又はＰＲＯＶＥＸＣＶ２TM（１．０ｍｇ／Ｌ）でインキュベートされたＬＤＬコレステロールの等量の試料と比較した。酸化が開始する前の遅延時間は、ビタミンＥによって遅延し、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMによって極めて大きく遅延した。この結果によって、ＰＲＯＶＥＸＣＶ２TMは、銅イオンによって向上された酸化にさらした場合に、ビタミンＥよりも強力な抗酸化剤であることが示される。
【００８５】
他の態様、有利性及び修正は、特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  アテローム性動脈硬化症による狭窄冠動脈を持つ患者に起こる問題を模倣する目的で、狭窄動脈を発生させて、周期的な血栓症が発生する際に観測される冠動脈血流の変化を測定するための動物モデルを示す概略図である。
【図２】  反復血小板媒介血栓形成とその後の塞栓形成（この塞栓形成によって、フォルツモデル(Folts model)によって発生した狭窄動脈で測定される血流に認められる周期的血流減少（CFR）が起こる）を示すストリップチャート記録である。
【図３】  本発明の好ましい食物サプリメントであるPROVEX CVTMのin vivo血小板抑制特性によるPROVEX CVTM摂取後のCFRの排除を示すストリップチャート記録である。
【図４】  PROVEX CVTMの投与から2.5時間後にエピネフリン（アドレナリン）を投与した際、PROVEX CVTMの投与によって排除されたCFRが再発しないことを示すストリップチャート記録である。
【図５】  ex vivo血小板活性を測定するために本明細書中で使用した全血凝集測定法を説明する概略図である。
【図６】  ビタミンＥ、ProVex PlusTMまたはPROVEX CVTMの存在下で234nmでモニターされたLDLコレステロール酸化の時間経過を示すグラフである。
【図７】  PROVEX CVTMによってもたらされるLDLコレステロール酸化防止レベルを示すグラフである。
【図８】  LDLコレステロール酸化の比率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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