(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
広葉樹化学パルプをキシラナーゼ処理して得られたキシロオリゴ糖−リグニン複合体を含有する処理液を酸加水分解処理し、該酸加水分解処理液を、強酸性イオン交換樹脂処理−弱塩基性イオン交換樹脂処理−活性炭処理の順に吸着処理して精製されているキリロオリゴ糖組成物であって、キシロオリゴ糖鎖が２〜１０糖鎖で、平均重合度が４以上であり、かつ、重合度が３以下のキシロオリゴ糖含有率が４０％以下であるキシロオリゴ糖組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシロオリゴ糖含有組成物に関する。更に詳しくは、キシロースの２量体から１０量体を主な成分とするキシロオリゴ糖組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシロオリゴ糖は腸内細菌の選択的な増殖促進効果を通して、おなかの調子を良好に保つ機能を有する特定保健用食品として認定された乳酸菌飲料、チョコレートなどに利用される有用な糖類である。また、ヒトの食品用途だけではなく家畜の飼料としての用途もある。さらに、医薬、サニタリー製品の分野でも乳化剤、皮膚の保湿成分としての用途がある。
【０００３】
一般に、特定保健食品用に用いられるオリゴ糖類はその殆どが整腸作用、即ち腸内悪玉菌である大腸菌や腸内腐敗発酵菌であるクロストリジウム属の菌の数を減らし、相対的に腸内善玉菌といわれるビフィズス菌を増加させる作用を持っている。小麦フスマはキシランを主鎖とするヘミセルロースからなる多糖である。小麦フスマは難分解性の植物繊維であり、従来、整腸作用を持つ食品添加物として使用されてきている。
【０００４】
小麦フスマは、それを摂取した後に現れる排便時の爽快感により漠然とした整腸作用の効果が認識されてきたが、その本来の効果は、小麦フスマが腸内において腸内細菌により分解されて生成されるキシロオリゴ糖に由来するとされている。小麦フスマ由来のキシロオリゴ糖は、腸内善玉菌のビフィズス菌の選択的増殖を促す一方で、腸内悪玉菌である大腸菌の数を相対的に低下させると言われている。大腸菌や腸内腐敗発酵菌は腸内で増殖しながら発ガン性物質を生産することが知られていることから、大腸菌や腸内腐敗発酵菌の数を腸内で減らすことは長期にわたる健康を考えた場合に重要である。
【０００５】
以上のような理由から、整腸作用を有する糖類の研究が鋭意開発されてきているが十分な性能を有したオリゴ糖類の開発には至っていない。その理由の一つは、試験管内（in vitro）でのオリゴ糖類の整腸作用の効果が実際の生体内（in vivo ）での効果に結びつく例が少ないことに起因する。このin vitroとin vivo での効果の差は被試験物質であるオリゴ糖類が腸内に至る過程で胃酸やその他の消化液により変性することに原因があるとされている。
【０００６】
特に胃酸による酸加水分解によるオリゴ糖の重合度の低下が大きな問題である。オリゴ糖は酸加水分解により徐々に低分子化し最終的には大腸菌やクロストリジウム属に属する腐敗性嫌気性菌でも資化することが可能な単糖にまで分解されることが知られている。
しかし、キシロオリゴ糖はオリゴ糖の中でも胃酸に対する抵抗性が他のオリゴ糖に比べて高く、低分子化されることなく腸内に届けられるため、実際に生体内での整腸効果が確認されるオリゴ糖の代表格となっている。
【０００７】
胃酸やその他の消化液での分解を考慮すれば、キシロオリゴ糖を摂取することにより得られる選択的増殖促進効果はキシロオリゴ糖の鎖長が長いほど優れていると言われている。特に３量体以上１０量体程度までのキシロオリゴ糖が選択的増殖性に有効である。１０量体以上の鎖長を持つキシロオリゴ糖でも腸内乳酸菌がキシラナーゼを生産し、分解資化を行うので問題はないと言われている。
【０００８】
現在上市されているキシロオリゴ糖は、小麦フスマやコーンコブといった草本類を原料として作られているが、これらの草本植物中のキシラン主鎖にはグルクロン酸など他の糖が側鎖に分枝している。側鎖が多いキシランからはキシロースのみを構成糖とするオリゴ糖は重合度が比較的小さいものしか生成することができない。それは側鎖を除く作業過程により主鎖であるキシラン鎖も徐々に低分子化していくからである。現状では上市されているキシロオリゴ糖を構成するオリゴ糖は２量体や３量体を主成分とするものがほとんどであり、より重合度の大きなキシロオリゴ糖の開発が望まれている。
【０００９】
天然物に由来するヘミセルロース材料中のキシランを酵素的に分解処理する場合、使用する酵素であるキシラナーゼの違いにより分解生成物に大きな違いが現れる。一般に真菌類であるカビやキノコに由来するキシラナーゼでは酵素であるキシラナーゼの基質特異性が比較的にルーズであり、また糖化力がバクテリア由来のキシラナーゼに比べ非常に高いという特徴がある。このため酵素として真菌類に由来する酵素液を用いてキシロオリゴ糖組成物を生成させた場合、基質であるキシランを一気に分解してしまい、キシロオリゴ糖組成物中のキシロビオースの存在比が７０％以上であるようなキシロオリゴ糖組成物を作ってしまう。
【００１０】
現在上市されているキシロオリゴ糖は、真菌類に由来するキシラナーゼを用いて作製されており、オリゴ糖を構成する構成糖の種類は主に２量体と３量体となっている。一方、バクテリアが生産するようなキシラナーゼを用いてキシロオリゴ糖を生成させた場合、酵素の基質特異性が真菌類のキシラナーゼと大きく異なるため、生成するキシロオリゴマーの組成比が２量体であるキシロビオースから５量体までのきれいな分布でキシロオリゴ糖を生成する（特開平１−２５２２８０号公報）。
【００１１】
本発明者らは、今回、使用する酵素がバチルス属に由来する中性好熱キシラナーゼで、なおかつ原材料が広葉樹化学パルプであるようなリグノセルロース材料を用いた場合、キシロースの２量体から１０量体にわたるキシロオリゴ糖の分布を有するキシロオリゴ糖組成物を得ることができること、このキシロオリゴ糖組成物中では分子量が大きな５量体から１０量体が比較的多く含まれ、さらにはこのキシロオリゴ糖の組成物中でのキシロビオースの存在比はキシロオリゴ糖組成物中の全糖量の約１０％以下であることを見いだした。
キシロビオースが酸加水分解した場合、大腸菌等腸内有害菌が容易に資化し得るキシロースに変換されることを考えると、一般的にキシロオリゴ糖は酸加水分解に対する抵抗力が強いとはいえ、キシロビオースの存在比が低いことは機能性を保持する上で重要である。
【００１２】
このように、化学パルプ由来のリグノセルロースを材料として製造されたキシロオリゴ糖組成物はコーンコブや綿実殻を原料として製造されたキシロオリゴ糖よりも平均重合度が高いという特徴がある。リグノセルロースを材料とした場合、使用する酵素を調整することで平均重合度が２から平均重合度が１０までの任意の比率で新規なキシロオリゴ糖を作ることが可能である。
【００１３】
更に注目すべき点としては、平均重合度が高い新規なキシロオリゴ糖組成物は腸内乳酸菌に対して選択的な増殖性を示すと同時に、食中毒の原因となるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus  IFO 12711 , Vibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266といった人に対して有害である細菌に対しても静菌力を発揮する点である。２量体、３量体を主な構成糖とするキシロオリゴ糖組成物では人に対して有害であると思われるこれらの細菌類に対しての静菌作用がほとんどない。しかし鎖長の長いオリゴ糖鎖が静菌力を発揮することは全く新しい知見であり、そのことを見いだすことで、本発明を完成するに至った。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、現状では上市されているキシロオリゴ糖を構成するオリゴ糖は２量体や３量体を主成分とするものがほとんどであり、より重合度の大きなキシロオリゴ糖の開発が望まれている。
それ故、本発明は胃酸やその他の消化液での分解を受けることなく腸内に届けられるため、生体内での整腸効果が高い、分子量の大きな５量体〜１０量体を多く含有するキリロオリゴ糖組成物を提供することを目的とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明は、基本的には、キシロオリゴ糖鎖で１０糖鎖までを主な含有成分とするキシロオリゴ糖組成物に関するものであり、次の各発明を基礎として構成される発明である。
【００１６】
(1) キシロースの２〜１０量体の混合物であり、３量体以下のキシロオリゴ糖含有率が４０％以下で、かつ平均重合度が４以上、好ましくは５以上であるキシロオリゴ糖組成物。
(2) 上記キシロオリゴ糖組成物が、キシラン及び／又はヘミセルロースを酵素的又は物理化学的に処理することによって得られたものであることを特徴とする(1) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(3) 前記キシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料をヘミセルラーゼを用いて処理する工程を経て得られたものであることを特徴とする(1) 項又は(2) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物。
【００１７】
(4) 前記キシロオリゴ糖組成物は、前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液をさらに酸加水分解処理する工程を経て得られたものであることを特徴とする(3) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(5) 前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液は、キシロースの２〜１０量体の混合物とキシロオリゴ糖とリグニン様物質の複合体との混合物を含有する糖溶液であることを特徴とする(4) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(6) 前記酸加水分解処理する工程は、前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液を濃縮する工程を経て得られる糖溶液を酸加水分解処理する工程であることを特徴とする(4) 項又は(5) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物。
【００１８】
(7) 酵素処理工程においてキシラン及び／又はヘミセルロースをヘミセルラーゼを用いて処理し、得られる糖溶液を加水分解処理工程において酸加水分解処理し、次いで精製・分離工程において該加水分解処理工程から得られる処理液からキシロオリゴ糖成分を分離・回収することを特徴とする、重合度が３以下のキシロオリゴ糖含有率が４０％以下でありかつ平均重合度が４以上、好ましくは５以上であるキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１９】
(8) 前記加水分解処理工程は、前記酵素処理工程から得られる糖溶液を濃縮した糖溶液について行われる工程であることを特徴とする、(7) 項記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(9) 前記酵素処理工程は、キシラン及び／又はヘミセルロースを含むリグノセルロース材料をヘミセルラーゼによって処理する工程であることを特徴とする、(7) 項又は(8) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２０】
(10)前記酵素処理工程は、酵素としてキシラナーゼを使用した酵素処理工程であることを特徴とする、(7) 項〜(9) 項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(11)前記酵素処理工程は、ｐＨ３〜１０、好ましくは５〜９の範囲に調整した糖溶液を、１０℃〜９０℃、好ましくは３０℃〜６０℃の温度で酵素処理する工程であることを特徴とする、(7) 項〜(10)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(12)前記加水分解処理工程は、ｐＨを約３．５以下、又はそれ以下の値に調整した糖溶液を、１０５℃〜１５０℃、好ましくは１１０℃〜１２１℃の温度で、１５分以上、好ましくは３０分〜６０分間加熱して酸加水分解処理を行う工程であることを特徴とする、(7) 項〜(11)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２１】
(13)前記精製・分離工程は、前記酸加水分解処理工程から得られる糖溶液を、陽イオン交換樹脂カラム−陰イオン交換樹脂カラム−活性炭カラムの順序で通して精製する工程を含むことを特徴とする、(7) 項〜(12)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の新規キシロオリゴ糖組成物は、そのオリゴ糖組成物中の比較的重合度の大きなキシロオリゴ糖の含有率が高いという特徴を持つ。本発明の新規なキシロオリゴ糖組成物の平均重合度を測定した場合、平均重合度は４以上、好ましくは５以上である。もちろん使用する酵素や酸処理の条件を変更することで平均重合度がさらに高い値のキシロオリゴ糖組成物を自由に設計製造することが可能なことは言うまでもない。これに対して、現在上市されているキシロオリゴ糖の平均重合度を測定したとき、その値は平均重合度３以下となり、オリゴ糖中の構成糖が２量体、３量体から主としてなるものである。
【００２３】
本発明の新規キシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料をヘミセルラーゼ処理した後に、希酸により酸加水分解することによって重合度の大きなキシロオリゴ糖を含む液体として得ることができる。
リグノセルロースとしてのパルプをヘミセルラーゼ処理する際のパルプ濃度は１〜３０重量％、好ましくは２〜１５重量％の範囲で行われるが、広葉樹クラフトパルプ以外のリグノセルロースを製造原料に用いる場合はこの限りではない。たとえば、リグノセルロースに由来するキシランについて、処理時のパルプ濃度を例示すると、小麦フスマ由来キシランでは０．５〜５％、好ましくは２％前後、コーンコブ由来キシランでは１〜１０％、好ましくは５％前後、綿実殼由来キシランでは１〜１０％、好ましくは５％前後、粉砕コーンパイプでは０．２〜５％、好ましくは１％前後、カラスムギ由来キシランでは０．２〜５％、好ましくは１％前後などである。
【００２４】
本発明のキシロオリゴ糖組成物を得ることができる原料リグノセルロース物質としては針葉樹や広葉樹のような木材が好ましく用いられるが、ケナフ、麻、バガス、イネ等の非木本性の植物であってもよく、特に限定されるものではない。本発明に使用されるパルプは、化学パルプ、機械パルプ、脱墨パルプ等何でもよいが、広葉樹化学パルプが好ましい。化学パルプを得るための蒸解法としては、クラフト蒸解、ポリサルファイド蒸解、ソーダ蒸解、アルカリサルファイト蒸解等の公知の蒸解法を用いることができるが、パルプ品質、エネルギー効率等を考慮するとクラフト蒸解法が好適に用いられる。
【００２５】
リグノセルロース材料として広葉樹クラフトパルプを用いる場合、まずアルカリ酸素漂白工程で漂白したパルプをヘミセルラーゼで処理することが望ましいが、蒸解後のパルプや、機械パルプをそのままヘミセルラーゼ処理原料として用いても良い。
クラフト蒸解で得られたパルプ表面には蒸解工程でパルプ繊維内より溶出されたヘミセルロースが再吸着されていることは周知である。この再吸着したヘミセルロースはその９０％以上がＤ−キシロースがβ１→４結合することによって構成されたキシランである。
【００２６】
広葉樹クラフトパルプではヘミセルロース中の側鎖であるアラビノースやグルクロン酸はそのほとんどが分解除去されている。また側鎖の中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸は側鎖として残存するがアルカリ条件下でヘキセンウロン酸へと変換される。このヘキセンウロン酸は酸性条件下で加熱すると容易に分解除去されるのでキシロオリゴ糖の製造にはあまり問題ない。よって化学パルプ表面の再吸着キシランは、通常の植物中の細胞壁内に存在するキシランと違ってパルプの蒸解工程において抽出された際に、その主鎖であるキシランに結合している側鎖の大部分は分解除去されていることになる。そのため再吸着キシランは通常の細胞壁中のキシランと比べて側鎖の保有率が非常に低い。
【００２７】
再吸着分を含めたキシラン含量は広葉樹クラフトパルプ絶乾重量の約２０％を占める。ヘミセルラーゼ処理においては、酵素が広葉樹クラフトパルプに作用し、再吸着分を含むキシラン全般に作用してこれを低分子化する。例えばバチルス・エスピ−Ｓ−２１１３株のキシラナーゼ（特開平８−２２４０８１号公報参照）を利用する場合、処理反応液中に生じるキシロース及びキシロオリゴ糖の構成糖の割合は、３〜５量体が最も多く、単量体が少ない組成比のオリゴ糖を生成する。
【００２８】
本発明者らは、すでに、広葉樹クラフトパルプのヘミセルラーゼ処理工程より得られる排水中にキシロオリゴ糖とリグニン様物質が結合したキシロオリゴ糖複合体が存在することを見いだしている。更にはキシロオリゴ糖複合体は比較的重合度の大きなオリゴ糖にリグニン様の物質が結合していることを見いだしている。このキシロオリゴ糖複合体は希酸処理により容易にキシロオリゴ糖とリグニン様物質を分離除去し得るので重合度の大きなキシロオリゴ糖を大量安価に製造できる。
【００２９】
現在のところ、大規模な酵素処理工程で利用されている酵素はそのほとんどがヘミセルラーゼであるが、市販のヘミセルラーゼのいずれも本発明のキシロオリゴ糖の製造方法における酵素処理工程に用いることができる。例えば商品名カルタザイム（クラリアント社製）、商品名エコパルプ（ローム・エンザイム社製）、商品名スミチーム（新日本化学工業社製）、パルプザイム（ノボノルディクス社製）などの市販の酵素製剤や、トリコデルマ属、テルモミセス属、オウレオバシヂウム属、ストレプトミセス属、アスペルギルス属、クロストリジウム属、バチルス属、テルモトガ属、テルモアスクス属、カルドセラム属、テルモモノスポラ属などの微生物により生産されるキシラナーゼを使用することができる。
【００３０】
酵素処理温度は、１０〜９０℃、好ましくは３０〜６０℃の範囲であるが、酵素の至適温度に近い処理温度がより好ましい。一般的な酵素の場合、処理温度が１０℃未満では反応が不十分となる上、そのような温度を得ること自体に多大のコストを要するので適さない。一方、温度が９０℃を超えて高くなると、処理系を密閉化しないと熱ロスが大きくなる上、一般的な酵素の場合、酵素自体が変性し、不活性になるので適さない。処理時の溶液ｐＨは３〜１０、好ましくは５〜９の範囲であるが、酵素の至適ｐＨに近いｐＨがより好ましい。
広葉樹クラフトパルプをアルカリ酸素漂白して得られるパルプを酵素処理して糖液を得る場合、パルプのｐＨがアルカリ側に傾いているため、酵素の至適ｐＨがアルカリ側に近い酵素の方がｐＨを調整する際のコストも低く優位性がある。もしｐＨの調整が必要な場合は、任意の酸性溶液又はアルカリ性溶液を添加して調整し、酵素処理を行えばよいことは言うまでもない。
【００３１】
酵素処理により得られた糖液中にはキシロオリゴ糖（２〜１０量体）とキシロオリゴ糖複合体が含まれる。酵素処理液中の糖濃度は、バチルス・エスピー２１１３株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所  寄託菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを対パルプ絶乾重当たり１ユニット（１ユニットは１分間に１マイクロモルのキシロースを遊離させる酵素力）で使用し、１０％濃度のパルプスラリー中に添加して処理した場合、約３０００μｇ／ｍｌ（キシロース換算）である。
【００３２】
この糖溶液は、後段の製造工程を考慮に入れた場合、荷電ＮＦ膜やその他の限外ろ過膜、逆浸透膜などの膜分離技術を用いて濃縮したり、エバポレーション等の濃縮作業により糖濃度を上昇させる作業を行うことも可能である。実際に糖液のボリュームを減らすことは大量の糖液を後段の精製工程で処理する際のハンドリングを容易にする。加えて言うならば、膜濃縮における作業より得られた透過液は糖濃度が酵素処理液より低く、リグニン等着色性の有機物含量が少ない特徴を持つ。このため、膜濃縮工程より得られる透過液はパルプ製造工程における工業用水として再利用できる。
【００３３】
糖溶液もしくは濃縮処理工程後の糖溶液については、希酸による酸加水分解処理を行ってキシロオリゴ糖複合体をキシロオリゴ糖とリグニン様物質とに分離する。糖液のｐＨの調整方法としては、糖液に対して鉱酸もしくは有機酸を適宜添加して糖液のｐＨを３．５付近に調整することが一般的であるが、アンバーライト２００Ｃ（商品名、ローム・アンド・ハース社製）といったカチオン交換樹脂で糖液を処理してイオン交換によりｐＨを下げることも可能である。
次いでｐＨ調整の終わった糖溶液を１０５℃〜１５０℃、好ましくは１１０℃〜１２１℃の範囲で加熱し、酸加水分解の処理を行う。処理時間は１５分以上であるが好ましくは３０分から６０分である。加熱処理時間を９０分以上に設定するとオリゴ糖の単糖への分解が進み好ましくはない。糖液のｐＨが３．５付近である場合、キシロオリゴ糖複合体とリグニン様物質、キシロオリゴ糖と側鎖の一種であるヘキセンウロン酸は分離除去可能であるが、キシロオリゴ糖自身はほとんど分解することはない。
【００３４】
この処理でキシロオリゴ糖複合体からはリグニン様の有機物が分解除去され、キシロオリゴ糖へと変換される。ｐＨ３．５、１２１℃、６０分の処理条件の時のキシロオリゴ糖複合体からキシロオリゴ糖への変換効率は約９５％である。このとき単糖の一部は加水分解が進みフルフラール様物質となり更に縮合して沈殿する。キシロオリゴ糖複合体から切り離されたリグニン様物質も同様に酸性下で縮合し不溶化して沈殿する。この不溶化した沈殿物は濾紙や珪藻土によるろ過はもちろんのことＵＦ膜やＭＦ膜そしてセラミックフィルター等による分離除去が可能である。
【００３５】
上記のようにしてキシロオリゴ糖複合体から得られたキシロオリゴ糖組成物は、比較的鎖長が長い重合度が５〜８程度のキシロオリゴ糖を高い割合で含んでいる新規なキシロオリゴ糖組成物である。重合度が比較的高いキシロオリゴ糖が得られる理由としては、酵素処理により得られた糖液中のキシロオリゴ糖複合体は５量体から１０量体程度の鎖長のキシロオリゴ糖にリグニン様物質が結合しているためヘミセルラーゼによる必要以上の消化を免れていることに起因している。そのような状態から希酸による酸加水分解でリグニン様物質と分離すると、比較的長い鎖長のキシロオリゴ糖が得られる。
【００３６】
酸加水分解して得られた糖液中には、キシロオリゴ糖の他にキシロース、グルコースといった単糖類やリグニン、フラン化合物、フルフラールといった有機物も含有する。これらの有機物の混合物からキシロオリゴ糖のみを分離、精製する工程としては、イオン交換、分子ふるい、エタノール分画、膜処理などの従来のいかなる精製方法を組み合わせて用いても良い。例えば、陽イオン交換樹脂→陰イオン交換樹脂→活性炭といった順序でカラムを用いる精製方法では出発原料である酸処理糖液を１００％とした場合、精製キシロオリゴ糖の回収率は約７０％である。
【００３７】
精製されたキシロオリゴ糖を含む糖溶液をイオンクロマトグラフィー（ダイオネクス社）を用いて分析したところ２量体ないし１０量体のキシロオリゴ糖を含む糖液であることが判明した。このときの有機分重量を分析したところ絶乾重量中の全糖量は９９％以上であった。また、秤量されたるつぼを用いての灰分の測定では精製糖液中の灰分は事実上認められなかった。
【００３８】
本発明で得られた新規なキシロオリゴ糖組成物を含む糖液は食中毒の原因となるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus （ IFO 12711） , Vibrio(Listonella) anguillarum（ IFO 13266）といった人に対して有害である細菌に対して静菌力を発揮することが判明している。これらの細菌が増殖する培地に新規キシロオリゴ糖組成物を添加することで細菌類の増殖速度を低下させることができる。一方、新規なキシロオリゴ糖自身は人に対して全く無害である。
【００３９】
前述したように、本発明の新規なキシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料を出発原料とし、それをヘミセルラーゼ処理した反応ろ液から分離、精製して得られる重合度の大きなキシロオリゴ糖含有組成物である。この新規なシキロオリゴ糖組成物はヒトに対して有害であるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus  IFO 12711 , Vibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266といった細菌に対して静菌力を発揮する。また、この重合度の大きなキシロオリゴ糖組成物は、酵素や爆砕などの物理化学的手法を用いることで従来からあるキシロース、キシロースの２量体を主成分とするキシロオリゴ糖などに容易に変換することもできる。
【００４０】
【実施例】
以下に、実施例、比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、もちろん本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下に示す％は特に断らない限りすべて重量によるものであり、対パルプの添加率はパルプの絶乾重量に対する容量の比率である。なお、各測定法は以下のとおりである。
【００４１】
(1) 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法；学会出版センター）にて定量した。
(2) 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法；学会出版センター）にて定量した。
(3) 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(4) 新規キシロオリゴ糖の定量方法：
オリゴ糖の定量方法はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製）を用い、分析用カラムも同様にダイオネクス社のＣａｒｂｏ  ＰａｃｋＰＡ−１０を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｎＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝４：６となるような直線勾配を組み分離した。
【００４２】
（検量線の作製）
検量線の作成用には、標品としてキシロース（Ｘ）、キシロビオース（Ｘ２）、キシロトリオース（Ｘ３）、キシロテトラオース（Ｘ４）を用いた。これらオリゴ糖類は前述の分析メソッドでは単位重量あたり（今回は１μｇ当たり）のピーク面積がキシロースから順にキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースの順に小さくなる。以下標品が存在しない場合のキシロオリゴ糖の定量のために既存の単位重量当たりの面積をもとに検量線を作成したところ、
Ｙ＝４Ｅ＋０７Ｘ-0.6709 
という式を得た。この場合Ｙは１μｇ当たりのオリゴ糖のピーク面積を示し、Ｘはオリゴ糖の重合度である（図１参照）。
この式をもとにオリゴ糖の標品が存在しないキシロペンタオース（Ｘ５）、キシロヘキサオース（Ｘ６）、以下キシロオリゴ糖として１１量体（Ｘ１１）までの１μｇ当たりの面積を計算上求めて表１に示した。
【００４３】
【表１】
0004078778.tif 000002
【００４４】
以下、キシロオリゴ糖の濃度の定量にはこの計算シートを用いて計算した。キシロオリゴ糖を中性糖としてフェノール硫酸法で定量した時に３４ｍｇ／ｍｌであったサンプルをこの計算シートで計算すると３６．５ｍｇ／ｍｌであった。この計算シートはサンプル中の任意の重合度のオリゴ糖濃度を計算することが可能であり、非常に便利である。
【００４５】
(5) 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはバーチウッドキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法；学会出版センター）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００４６】
(6) イオンクロマトグラフによる分析：
キシロオリゴ糖の分析にはイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社）を用いた。分析には糖類の分析に適したカラムとしてＣａｒｂｏ  Ｐａｃｋ  ＰＡ−１０（ダイオネクス社）を用いた。
【００４７】
実施例１
（酵素処理工程）
国内産広葉樹チップ７０％、ユーカリ材３０％からなる混合広葉樹チップを原料として、クラフト蒸解によりカッパー価２０．１、パルプ粘度４１ｃｐｓの工場製の未晒パルプを得た。次いで、酸素脱リグニンを行い、カッパー価９．６、パルプ粘度２５．１ｃｐｓの酸素脱リグニンパルプを得た。
このパルプを１００メッシュのろ布にてろ別、洗浄後、パルプ濃度を１０％に調整し、希硫酸を加えてｐＨ８に調整し、ついでバチルス・エスピーＳ−２１１３株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所  寄託菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを対パルプ１ユニット／ｇとなるように添加し、６０℃で１２０分処理した。処理後、１００メッシュのろ布でろ過してパルプ残渣などを分離し、全糖濃度３７００ｍｇ／ｌを含む１０５０リッター（全糖量として３９００ｇ）の処理液を得た。続いてＮＦ膜（日東電工製：ＮＴＲ−７４５０、膜質：スルホン化ポリエーテルスルホン系、食塩阻止率５０％）を用いて容量比で４０倍に濃縮した。この濃縮液は全糖量で２７００ｇを有しており、全糖回収率は７０％であった。
【００４８】
（酸加水分解処理工程）
酵素処理工程で得られた濃縮糖液１，０００ｍｌに対して硫酸を添加してｐＨを３．５に調製した後、この濃縮糖液を１２１℃にて１時間反応させた。反応生成物をイオンクロマト用カラム（ダイオネクス社：ＰＡ−１０）を用いたイオンクロマトグラフィーで分析した結果、高濃度のキシロオリゴ糖（２量体〜１０量体）を含むことが判明した（図２参照）。
【００４９】
（キシロオリゴ糖の精製・分離工程）
酸加水分解処理工程で調製したキシロオリゴ糖の糖溶液（１１７ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ、全糖量として１．２ｇを強酸性イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハース社製：アンバーライト２００Ｃ）を充填したカラム（内径３６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に負荷した。カラムを通過したキシロオリゴ糖を回収した後に、弱塩基性イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハース社製：ＩＲＡ６７）を充填した同様のカラムに負荷した。カラムを通過し得られたキシロオリゴ糖は、濃縮後、８０ｍｇの活性炭（和光純薬製：品番０３７−０２１１５）をキシロオリゴ糖溶液に添加して６０℃にて１時間攪拌し、脱色を行った。攪拌後は０．２２μｍのメンブレンフィルターで活性炭をろ過し、精製したキシロオリゴ糖溶液を得た。精製したキシロオリゴ糖溶液には２８０ｎｍ及び２５０ｎｍの波長の吸収は認められず、酸処理後のキシロオリゴ糖溶液に含まれる紫外吸収物質は除去されていた。灰分の残存率も出発原料である酸処理後のキシロオリゴ糖溶液に対して０．１％以下であった。また、キシロオリゴ糖の回収率は７０．２％であった。
【００５０】
こうして得られた新規キシロオリゴ糖組成物溶液は、前述したイオンクロマトグラフを用いた分析を行うと、糖の重合度が２から１０程度までの分布を示した。更に、その平均重合度を測定するとキシロビオース、キシロトリオース（以上、和光純薬工業社の精製品）、キシロテトラオース（メガザイム社の精製品）は、各々２．２、３．４、４．４であった。また、得られたキシロオリゴ糖の単量体キシロース、二量体、以下１１量体までの含有率を前記した定量方法と検量線を用いて計算した。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
参考例１
実施例１の酵素処理工程と同様の手法で得られた全糖濃度で１５０ｍｇ／ｍｌの新規キシロオリゴ糖組成物を、硫酸を用いてｐＨを１．５に調整した。この糖溶液を温度１２１℃にて６０分処理して酸加水分解を行った。冷却後、イオンクロマトグラフィーにて構成糖を分析したところ、全てがキシロースとして検出され、高重合度キシロオリゴ糖からキシロースへの変換が確認された。
【００５３】
参考例２
実施例１の酵素処理工程と同様の手法で得られた全糖濃度で１５０ｍｇ／ｍｌの新規キシロオリゴ糖組成物に対して、真菌類（Trichoderma.sp）由来のキシラナーゼ（新日本化学工業社製）を酵素力価として１０ユニット添加してｐＨを４．５に調整した後に、温度５０℃にて６時間酵素による消化を行った。反応終了後にイオンクロマトグラフにて構成糖の分析を試みた。その結果構成糖はそのほとんどが２量体であるキシロビオースに変換されていた。
【００５４】
実施例２
実施例１の手法により精製された新規なキシロオリゴ糖組成物（平均重合度＝５．４）を用いて静菌性を調べる以下の実験を行った。
使用菌株としてビブリオ属の細菌はVibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266を用いた。Vibrioの場合は、炭素源として各種の糖を０．５％含む培地３．５ｍｌを生菌懸濁液（１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１００μｌ植菌して３７℃にて振とう培養を行い、６６０ｎｍの吸光度を測定することで菌体数の増加を調べた。
なお、上記の試験で用いた資化性検討用の培地は、一般のビブリオ培地を用い、グルコースの代わりにキシロオリゴ糖を加えたものである。
【００５５】
この結果から平均重合度が高い新規なキシロオリゴ糖は、ビブリオ培地中でのVibrio parahaemolyticus  IFO 12711の増殖を押さえることが判明した。
（図３参照）
ビブリオ培地中には炭素源としてもともとグルコースを含むにもかかわらず、新規なキシロオリゴ糖を添加することが菌体の増加を抑制することにつながった。このことから、新規なキシロオリゴ糖組成物は静菌作用を有することが明らかになった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、ビブリオ属に静菌効果がある高平均重合度のキシロオリゴ糖組成物が安価、かつ大量に供給される。この新規キシロオリゴ糖組成物は酸加水分解、酵素消化などの処理により容易にキシロビオース、キシロースに変換できる。またキシロオリゴ糖自体はもともと乳酸菌の選択的増殖性があり機能性食品の材料にも使用されていることからもわかるように、人体への安全性が高い材料であることから、本発明のキシロオリゴ糖組成物も、整腸作用、コレステロール低下作用等が期待される機能性食品用材料としての適用が十分に可能な組成物である。さらに、家畜用や栽培漁業用の餌等への添加剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴ糖定量用の検量線を示す図。
【図２】キシロオリゴ糖組成物中の２量体〜１０量体の分布を示す図。
【図３】キシロオリゴ糖組成物の静菌性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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