(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてVEGFおよびFｌｋ−１媒介性血管増殖に起因する疾患状態を治療するための組成物であって、
（ａ）機能性Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有するが細胞内キナーゼドメインを欠失しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが宿主細胞内での該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節エレメントに機能しうる状態で連結された発現ベクター、並びに
（ｂ）製薬上許容しうる担体、
を含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸残基番号１から８０６をコードする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
疾患が癌腫である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は、脈管形成（angiogenesis）および血管形成（vasculogenesis）の変調（modulation）のための、Ｆｌｋ−１受容体のリガンドの使用に関する。本発明は、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ受容体の発現が内皮細胞と結びついているという立証、およびＦｌｋ−１の高親和性リガンドとしての血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の同定、に部分的に基づく。これらの結果は、血管形成および脈管形成過程の信号系におけるＦｌｋ−１の主要な役割を示す。Ｆｌｋ−１を発現する宿主細胞を遺伝子工学的に作製すること、および発現されたＦｌｋ−１をアゴニストまたはアンタゴニスト活性によってＦｌｋ−１変調に関与する薬物ならびにＶＥＧＦ類似体を評価およびスクリーニングするために使用すること、が記述される。
本発明はまた、ＶＥＧＦアゴニストおよびアンタゴニストを含むＦｌｋ−１リガンドを、血管形成および脈管形成を変調することによりガンを含む障害を治療するのに使用することに関する。
２．発明の背景
受容体チロシンキナーゼ類は、多様な生物学的活性を有するポリペプチド増殖因子の膜貫通受容体の大ファミリーを構成する。それらの固有なチロシンキナーゼ機能は、リガンド結合によって活性化され、受容体および多数の細胞基質のリン酸化と、それに続く種々の細胞応答をもたらす（Ullrich A.およびSchlessinger，J．，1990，Cell 61:2-3-212）。
胎児肝キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）と称される受容体チロシンキナーゼのｃＤＮＡは、造血幹細胞および前駆細胞を富化したマウス細胞集団からクローン化された。この受容体は、造血幹細胞の更新に関与することが示唆された（Matthewsら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9026-9030）。Ｆｌｋ−１クローンの配列分析は、受容体キナーゼのｃ−Ｋｉｔサブファミリー、特にＦｌｔ遺伝子産物とのかなりの相同性を示した。これらの受容体はすべて共通に、イムノグロブリン様の構造を含む細胞外ドメインを持つ。
血管の形成および広がり、つまり血管形成および脈管形成は、種々の生理学的過程（例えば、胚発生、傷の治癒、臓器再生）および雌の生殖過程（例えば、排卵期の黄体における小胞発生、妊娠後の胎盤成長）等において、それぞれ重要な役割を果たす。制御されない脈管形成は、その増殖を血管新生に依存する固形癌の増殖におけるように、病理学的となりうる。
脈管形成は、血管内皮細胞の増殖、移行および浸透を含み、ポリペプチド増殖因子によって制御されているようである。In vitro内皮細胞増殖促進活性を有する数個のポリペプチドが同定されている。これらの例には、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、および胎盤増殖因子が含まれる。ＦＧＦファミリーの異なるメンバーに対する４つの別個の受容体が性状決定されたが、これらはいずれもin vivoで血管中に発現されるとは報告されていない。
ＦＧＦは多数の異なる細胞型に対するマイトジェンであると思われるが、ＶＥＧＦは内皮細胞特異的マイトジェンであることが最近報告された（Ferrara，N．およびHenzel，W.J．，1989，Biochem．Biophys．Res．Comm．161:851-858）。最近、ｆｍｓに似たチロシン受容体ｆｌｔがＶＥＧＦに親和性を有することが示された（DeVries，C．ら、1992，Science 255:989-991）。
３．発明の概要
本発明は、血管形成および脈管形成の変調のための、Ｆｌｋ−１受容体のリガンドの使用に関する。本発明は、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ受容体が内皮細胞の表面に発現されるという発見、およびＦｌｋ−１の高親和性リガンドとしての血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の同定、に部分的に基づく。血管形成および脈管形成過程の内皮細胞増殖および移行の役割は、これらの過程におけるＦｌｋ−１の重要な役割を示す。本発明はマウスを例にとって記述されているが、その原理はヒトを含む他の種に適用できる。
Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ相互作用を阻止するために設計された医薬は、腫瘍増殖の阻止に有用でありうる。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦアゴニストは、傷の治癒を促進するために使用できる。本発明は、Ｆｌｋ−１タンパク質を産生するために設計された発現系および／またはＦｌｋ−１受容体を発現する細胞系に関する。可溶性組換えＦｌｋ−１タンパク質の発現は、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ相互作用を阻止する分子についてペプチドライブラリーをスクリーニングするのに使用できる。その表面にＦｌｋ−１を発現する遺伝子工学的に作製した細胞系は、ＶＥＧＦアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングし、同定するのに使用できる。
従って、本発明は、以下の態様：
１．末端切断型組換えＦｌｋ−１を生産する方法であって、（ａ）ＶＥＧＦ結合の細胞効果を阻害する機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型のＦｌｋ−１をコードしているヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、末端切断型Ｆｌｋ−１を発現する宿主細胞を培養し、そして（ｂ）細胞培養物から末端切断型Ｆｌｋ−１遺伝子産物を回収する、ことを含む方法；
２．組換えＦｌｋ−１融合タンパク質を生産する方法であって、（ａ）機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有し、ＶＥＧＦ結合の細胞効果を阻害する、末端切断型Ｆｌｋ−１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、末端切断型Ｆｌｋ−１融合タンパク質を発現する宿主細胞を培養し、そして（ｂ）細胞培養物からＦｌｋ−１融合タンパク質を回収する、ことを含む方法；
３．ＶＥＧＦのアンタゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、（ａ）機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型Ｆｌｋ−１を発現する細胞系と試験化合物とをＶＥＧＦの存在下で接触させ、そして（ｂ）試験化合物が細胞系へのＶＥＧＦの結合および細胞効果を阻害するか否かを調べる、ことを含み、その際該アンタゴニストが細胞系へのＶＥＧＦの結合および細胞効果の両方を阻害する化合物として同定される、上記の方法；
４．ＶＥＧＦのアゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、（ａ）機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型Ｆｌｋ−１を発現する細胞系と試験化合物とをＶＥＧＦの存在下および不在下で接触させ、（ｂ）ＶＥＧＦの存在下で、試験化合物が細胞系へのＶＥＧＦの結合を阻害するか否かを調べ、そして（ｃ）ＶＥＧＦの不在下で、試験化合物が細胞系へのＶＥＧＦの細胞効果を模倣するか否かを調べる、ことを含み、その際該アゴニストが細胞系へのＶＥＧＦの結合を阻害するが該細胞効果を模倣する試験化合物として同定される、上記の方法；
５．前記の細胞系が遺伝子工学的に操作された細胞系である、上記３または４に記載の方法；
６．前記の細胞系が内因的にＦｌｋ−１を発現するものである、上記３または４に記載の方法；
７．ＶＥＧＦのアンタゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、（ａ）機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型Ｆｌｋ−１タンパク質とランダムペプチドライブラリーとを接触させて、Ｆｌｋ−１が該ライブラリーに含まれる１以上のペプチド種を認識して結合するようにし、（ｂ）Ｆｌｋ−１／ペプチドの組合せを単離し、（ｃ）工程（ｂ）で単離したペプチドの配列を決定し、そして（ｄ）該ペプチドがＶＥＧＦの結合および細胞効果を阻害するか否かを調べる、ことを含み、その際該アンタゴニストがＶＥＧＦの結合および細胞効果の両方を阻害するペプチドとして同定される、上記の方法；
８．ＶＥＧＦのアゴニストをスクリーニングして同定する方法であって、（ａ）機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型Ｆｌｋ−１タンパク質とランダムペプチドライブラリーとを接触させて、Ｆｌｋ−１が該ライブラリーに含まれる１以上のペプチド種を認識して結合するようにし、（ｂ）Ｆｌｋ−１／ペプチドの組合せを単離し、（ｃ）工程（ｂ）で単離したペプチドの配列を決定し、そして（ｄ）ＶＥＧＦの不在下で、該ペプチドがＶＥＧＦの細胞効果を模倣するか否かを調べる、ことを含み、その際該アゴニストがＶＥＧＦの結合を阻害するが該細胞効果を模倣するペプチドとして同定される、上記の方法；
９．Ｆｌｋ−１タンパク質が遺伝子工学的に操作されたものである、上記７または８に記載の方法。
１０．哺乳動物におけるチロシンキナーゼＦｌｋ−１受容体の内因的酵素活性を変調するための組成物であって、該酵素活性を変調させる有効量のＦｌｋ−１受容体タンパク質に対するリガンドを含む組成物；
１１．Ｆｌｋ−１受容体に対するリガンドがＶＥＧＦである、上記１０に記載の組成物；
１２．Ｆｌｋ−１受容体に対するリガンドがＶＥＧＦアゴニストである、上記１１に記載の組成物；
１３．Ｆｌｋ−１受容体に対するリガンドがＶＥＧＦのアンタゴニストである、上記１０に記載の組成物；
１４．Ｆｌｋ−１のエピトープと免疫特異的に結合するモノクローナル抗体である、上記１３に記載のアンタゴニスト；
１５．可溶性のＦｌｋ−１受容体である、上記１４に記載のアンタゴニスト；
１６．前記の受容体タンパク質の酵素活性が増大する、上記１０に記載の組成物；
１７．前記の受容体タンパク質の酵素活性が低下する、上記１０に記載の組成物；
１８．前記のリガンドが内皮細胞の増殖を刺激する、上記１６に記載の組成物；
１９．前記のリガンドが内皮細胞の増殖を阻害する、上記１７に記載の組成物；
２０．前記のリガンドが脈管形成を阻害する、上記１７に記載の組成物；
２１．ＶＥＧＦ結合の細胞効果を阻害する機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有する末端切断型のＦｌｋ−１をコードしているヌクレオチド配列を含む組換えベクター；
２２．Ｆｌｋ−１のアミノ酸１から８０６をコードしているヌクレオチド配列を含む、上記２１に記載の組換えベクター；
２３．前記のベクターがレトロウイルスベクター、アデノ随伴性ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、上記２１に記載の組換えベクター；
２４．Ｆｌｋ−１のアミノ酸１から８０６をコードしているヌクレオチド配列を含む、上記２３に記載の組換えベクター；
２５．上記２１の組換えＤＮＡベクターを含みかつ末端切断型のＦＬＫ−１を発現する、遺伝子工学的に操作された細胞系；
２６．上記２３または２４の組換えベクターを含みかつ末端切断型のＦｌｋ−１を発現する伝染性ウイルス粒子を産生する、遺伝子工学的に操作された細胞系；
２７．機能的Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメインを有し、ＶＥＧＦ結合の細胞効果を阻害するドミナント−陰性活性を有する、単離された組換え末端切断型Ｆｌｋ−１受容体タンパク質；
２８．哺乳動物におけるＶＥＧＦの細胞効果を変調するための組成物であって、ＶＥＧＦ結合の細胞効果を阻害する、有効量の末端切断型Ｆｌｋ−１受容体タンパク質を含む組成物；
２９．下記の（ａ）、（ｂ）：
（ａ）機能性Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメイン、および欠失または変異された細胞質ドメインを有するポリペプチドを、コードされた該ポリペプチドが信号伝達不能であり内因的野生型Ｆｌｋ−１をＶＥＧＦに対して無応答性とするようにコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが宿主細胞内での該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節エレメントに機能しうる状態で連結された発現ベクター、
（ｂ）製薬上許容しうる担体、
を含んでなる医薬組成物；
３０．前記発現ベクターが、レトロウイルスベクター、およびアデノ−随伴ウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、上記２９に記載の医薬組成物；
３１．前記発現ベクターが、ウイルス粒子中にパッケージングされている、上記３０に記載の医薬組成物；
３２．前記発現ベクターが、二量体化しうるが信号伝達不能であるＦｌｋ−１ポリペプチドをコードする、上記３０または３１に記載の医薬組成物；
３３．前記発現ベクターが、１以上の細胞質ドメインが欠失されたＦｌｋ−１ポリペプチドをコードする、上記３０または３１に記載の医薬組成物；
３４．前記Ｆｌｋ−１ポリペプチドがヒト受容体である、上記３０または３１に記載の医薬組成物；
３５．前記Ｆｌｋ−１ポリペプチドがマウス受容体である、上記３０または３１に記載の医薬組成物；
３６．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸残基番号１から８０６をコードする、上記３５に記載の医薬組成物；
３７．上記２９の医薬組成物を含んでなる、哺乳動物においてＶＥＧＦおよび／またはＦｌｋ−１媒介性血管増殖に関連する疾患状態を治療するための組成物；
３８．上記３６に記載の医薬組成物を含んでなる、腫瘍を有する被験者を治療するための組成物；
３９．前記疾患状態が、リューマチ性関節炎、網膜炎および癌腫からなる群より選択される、上記３７記載の組成物；
４０．Ｆｌｋ−１の酵素活性を阻害する化合物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物であって、該化合物が、機能性Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメイン、および欠失または変異された細胞質ドメインを有するポリペプチドを、コードされた該ポリペプチドが信号伝達不能であるようにコードするポリヌクレオチドである組成物；
４１．前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞内での該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節エレメントに機能しうる状態で連結された、上記４０に記載の組成物；
４２．上記２９、３０または３１のいずれかに記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
４３．Ｆｌｋ−１の酵素活性を阻害する化合物を含んでなる、内皮細胞中のＦｌｋ−１の信号伝達を阻害するための組成物であって、該化合物が、機能性Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメイン、および欠失または変異された細胞質ドメインを有するポリペプチドを、コードされた該ポリペプチドが信号伝達不能であるようにコードするポリヌクレオチドである組成物；
４４．前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞内での該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節エレメントに機能しうる状態で連結された、上記４３に記載の組成物；
４５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸残基番号１から８０６をコードする、上記４３に記載の医薬組成物；
４６．上記２９、３０または３１のいずれかに記載の医薬組成物を含んでなる、内皮細胞においてＦｌｋ−１の信号伝達を阻害するための組成物；
４７．Ｆｌｋ−１の酵素活性を阻害する化合物を含んでなる、脈管形成および／または血管形成を阻害するための組成物であって、該化合物が、機能性Ｆｌｋ−１細胞外および膜貫通ドメイン、および欠失または変異された細胞質ドメインを有するポリペプチドを、コードされた該ポリペプチドが信号伝達不能であるようにコードするポリヌクレオチドである組成物；
４８．前記Ｆｌｋ−１ポリペプチドがヒト受容体である、上記４０、４３または４７のいずれかに記載の組成物；
４９．前記Ｆｌｋ−１ポリペプチドがマウス受容体である、上記４０、４３または４７のいずれかに記載の組成物；
５０．前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞内での該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節エレメントに機能しうる状態で連結された、上記４９に記載の組成物；
５１．上記３２に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５２．上記３３に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５３．上記３４に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増植を阻害するための組成物；
５４．上記３５に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５５．上記３６に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５６．上記３２に記載の医薬組成物を含んでなる、被験者においてＦｌｋ−１の信号伝達を阻害するための組成物；
５７．上記３３に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５８．上記３４に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
５９．上記３５に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
６０．上記３６に記載の医薬組成物を含んでなる、ＶＥＧＦ−誘導性の内皮細胞の増殖を阻害するための組成物；
６１．ＶＥＧＦのＦｌｋ−１への結合により影響を受ける信号伝達応答を阻害する薬物を含んでなる、阻害の必要な被験者において脈管形成および／または血管形成を阻害するための組成物；
６２．ＶＥＧＦ依存性増殖アッセイにおいてＶＥＧＦのＦｌｋ−１への結合により影響を受ける信号伝達応答を阻害する薬物を含んでなる、阻害の必要な被検者において脈管形成および／または血管形成を阻害するための組成物；
６３．Ｆｌｋ−１の信号伝達応答時のＶＥＧＦの結合による影響を阻害する薬物を含んでなる、哺乳動物においてＶＥＧＦおよび／またはＦｌｋ−１媒介性の血管の増殖に関連した疾患を治療するための組成物；
６４．前記疾患が癌腫である、上記６３に記載の組成物；
６５．前記疾患がリューマチ性関節炎である、上記６３に記載の組成物；
６６．前記疾患が網膜炎である、上記６３に記載の組成物；
６７．前記Ｆｌｋ−１がヒト受容体である、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
６８．前記Ｆｌｋ−１がマウス受容体である、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
６９．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の酵素活性を阻害する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７０．前記薬物が、機能性Ｆｌｋ−１受容体の数を減少させる、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７１．前記薬物が、機能性Ｆｌｋ−１の二量体化を阻害する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７２．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の細胞内ドメインに結合する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７３．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の触媒性ドメインに結合する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７４．前記薬物が、医薬組成物中に存在する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
７５．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の酵素活性を阻害する、上記６７に記載の組成物；
７６．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の細胞内ドメインに結合する、上記６７に記載の組成物；
７７．前記薬物が、Ｆｌｋ−１の触媒性ドメインに結合する、上記６７に記載の組成物；
７８．前記薬物が、医薬組成物中に存在する、上記６７に記載の組成物；
７９．前記薬物が、遺伝子工学的に操作された細胞において、Ｆｌｋ−１により伝達された信号に対するＶＥＧＦの影響を阻害する、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
８０．前記薬物が、遺伝子工学的に操作された細胞において、Ｆｌｋ−１により伝達された信号に対するＶＥＧＦの影響を阻害する、上記６７に記載の組成物；
８１．前記薬物がペプチド化合物である、上記６１、６２、６３、６４、６５、または６６のいずれかに記載の組成物；
８２．前記薬物がペプチド化合物である、上記６７に記載の組成物；
に関する。
【図面の簡単な説明】
図１．Ｆｌｋ−１アミノ酸配列と関連ＲＴＫとの比較。Ｆｌｋ−１と、ヒトＫＤＲおよびラットＴＫｒ−Ｃとのアミノ酸配列比較。３つの受容体すべてについて公知である配列の一部を比較し、Ｆｌｋ−１配列との相違のみを示してある。
図２．Ｆｌｋ−１遺伝子発現のノーザンブロット分析。（Ａ）９．５〜１８．５日齢のマウス胚におけるＦｌｋ−１  ＲＮＡの発現。全マウス胚由来の全ＲＮＡの試料（１０μｇ）を各レーンで分析した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの位置がマークされている。（Ｂ）出生後４日齢の脳由来の毛細管断片と比較した、出生後４日齢および成体の脳におけるＦｌｋ−１  ｍＲＮＡの発現。１μｇのポリ（Ａ+）ＲＮＡを各レーンに負荷した。Ｆｌｋ−１ｃＤＮＡの５’末端２６１９ｂｐをプローブとして使用した。ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡプローブを用いた対照ハイブリダイゼーションを下のパネルに示してある。
図３．胚組織におけるＦｌｋ−１遺伝子の大量発現。１４．５日齢のマウス胚におけるＦｌｋ−１発現のin situハイブリダイゼーション分析。（Ａ）35Ｓで標識したアンチセンスプローブ（５’末端２６１９ｂｐ）を用いてハイブリダイズさせた全胚の、２つに矢状切開した断面の明視野照明。（Ｂ）同一断面の暗視野照明。（Ｃ）隣接する断面の、センスプローブによるハイブリダイゼーション。略語：Ａｏ、大動脈；Ａｔ、心房；Ｌ、肺；Ｌｉ、肝臓；Ｍａ、下顎骨；Ｍｎ、髄膜；Ｍｓ、中脳；Ｔ、終脳；Ｖ、心室；Ｖｔ、椎骨。
図４．胚器官におけるＦｌｋ−１ＲＮＡの発現は、特定の細胞に限定される。より高倍率で見た、１４．５日齢マウス胚におけるＦｌｋ−１  ＲＮＡの発現。（Ａ）心臓領域を35Ｓで標識したアンチセンスプローブで精査した。（Ｂ）センスプローブを用いてハイブリダイズさせた隣接切片。（Ｃ）細胞レベルで示された大動脈壁の一部。内皮細胞層を矢印で示してある。（Ｄ）Ｆｌｋ−１アンチセンスプローブで精査した肺。（Ｅ）センスプローブを用いてハイブリダイズさせた隣接切片の対照ハイブリダイゼーション。略語：Ａｔ、心房；Ｂ、気管支；Ｅｄ、内皮細胞層；Ｅｎ、心内膜；Ｌ、肺；Ｌｉ、肝臓；Ｌｕ、大動脈の内腔；Ｍｌ、筋肉；Ｍｙ、心筋層。
図５．発生しつつあるマウス脳におけるＦｌｋ−１遺伝子の発現。異なる発生段階の脳におけるＦｌｋ−１遺伝子の発現のin situハイブリダイゼーション分析。すべての切片は、Ｆｌｋ−１アンチセンスプローブを用いて精査した。（Ａ）１１．５日齢マウス胚終脳の矢状切開した断面。髄膜から神経外胚葉に突き出している、Ｆｌｋ−１を発現している単一の血管が、矢印で示されている。（Ｂ）１４．５日齢脳の矢状切断面、および（Ｃ）出生後４日齢の脳の矢状切断面。中脳の領域が示されている。Ｆｌｋ−１を発現している分枝毛細管および血管が、矢印で示されている。（Ｄ）成体脳の矢状切断面。中脳の領域が示されている。Ｆｌｋ−１を発現している細胞が、矢印で示されている。略語：Ｍ、髄膜；Ｖ、脳室。
図６．成体脳の脈絡膜叢におけるＦｌｋ−１の発現。（Ａ）Ｆｌｋ−１アンチセンスプローブを用いてハイブリダイズさせた成体マウス脳の脈絡膜叢の暗視野照明。（Ｂ）より高倍率で示された脈絡膜叢。矢印は、盛んなＦｌｋ−１発現を示す単細胞を指し示す。略語：ＣＰ、脈絡膜叢；Ｅ、上衣；Ｅｐ、上皮細胞；Ｖ、脳室。
図７．Ｆｌｋ−１は腎臓の糸球体で発現される。（Ａ）Ｆｌｋ−１アンチセンスプローブを用いてハイブリダイズさせた、出生後４日齢腎臓の矢状切断面。ハイブリダイゼーションシグナルは、矢印によって示されるように、糸球体に集まっている。（Ｂ）センスプローブを用いた隣接する切片の対照ハイブリダイゼーション。（Ｃ）Ｆｌｋ−１を用いて精査した成体腎臓の矢状切断面。矢印は糸球体を示す。（Ｄ）より高倍率で見た成体腎臓の糸球体。（Ａ）および（Ｄ）の矢印は、糸球体近接領域に房状に並んだ、Ｆｌｋ−１を発現している細胞を示す。
図８．初期胚および胚体外組織におけるＦｌｋ−１発現のin situハイブリダイゼーション分析。（Ａ）Ｆｌｋ−１を用いて精査した、母体脱落膜中の８．５日齢マウス胚の矢状切断面。（Ｂ）より高倍率で見た脱落膜。矢印は、盛んにＦｌｋ−１を発現している母体血管内皮を示す。（Ｃ）高倍率で見た９．５日齢マウス胚の卵黄嚢および栄養外胚葉。（Ｄ）高倍率で見た血島。略語：Ａ、尿膜；Ｂｉ、血島；Ｂｖ、母体血管；Ｄ、脱落膜；Ｅｎ、卵黄嚢の内胚葉層；Ｍ、間葉；Ｍｓ、卵黄嚢の中胚葉層；ＮＦ、神経ひだ；Ｔ、栄養膜；Ｙ、卵黄嚢。
図９．Ｆｌｋ−１はＶＥＧＦの受容体である。（Ａ）ＣＯＳ細胞への125Ｉ−ＶＥＧＦの架橋。一時的にＦｌｋ−１受容体を発現しているＣＯＳ細胞および対照細胞を、125Ｉ−ＶＥＧＦとともに４℃で一晩インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、次にＰＢＳ中で０．５ｍＭの架橋剤ＤＳＳに１時間４℃で暴露した。細胞を溶解し、Ｆｌｋ−１受容体を免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、次にオートラジオグラフィーにかけた。分子量マーカーはキロダルトンで示されている。（Ｂ）Ｆｌｋ−１を発現するＣＯＳ細胞への125Ｉ−ＶＥＧＦの特異的結合。一時的にＦｌｋ−１を発現しているＣＯＳ細胞をプレートから除去し、結合培地（ＤＭＥＭ、２５Ｍｍ Hepes、０．１５％ゼラチン）に再懸濁した。結合は、１５℃で９０分間、２ｘ１０5個の細胞、１５，０００ｃｐｍの125Ｉ−ＶＥＧＦ、および指示された濃度の非標識化リガンドを含む全容量０．５ｍｌの溶液中で実施した。細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを用いて２回洗浄し、ガンマカウンターで計測した。
図１０．Ｆｌｋ−１のＶＥＧＦ誘導自己リン酸化。一時的にＦｋｋ−１受容体を発現しているＣＯＳ細胞および対照細胞を２４時間、０．５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で飢餓状態におき、次にＶＥＧＦで１０分間刺激した。細胞を可溶化し、Ｆｌｋ−１受容体をそのＣ末端に対するポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して、ニトロセルロースに移した。ブロットを、抗ホスホチロシン抗体（５Ｂ２）を用いて精査した。タンパク質バンドを、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ結合二次抗体およびＢＣＬ（登録商標）(Amersham)検出アッセイを用いて、可視化した。
図１１．マウスＦｌｋ−１のヌクレオチド配列。
図１２．レトロウイルスベクター構築体のプラスミドマップ。ｐＬＸＳＮ  Ｆｌｋ−１  ＴＭ  Ｃｌ．１およびｐＬＸＳＮ  Ｆｌｋ−１  ＴＭ  ｃｌ．３は、Ｆｌｋ−１のアミノ酸１から８０６まで含有する。ｐＮＴＫ−ｃｆｍｓ−ＴＭは、ｃ−ｆｍｓのＮ末端アミノ酸５４１個を含有する。
図１３．Ｆｌｋ−１のトランスドミナント−陰性阻止（transdominant-negative inhibition）によるＣ６ダリア芽腫増殖の阻止。Ｃ６細胞を単独で、またはウイルス産生細胞とともに移植した。細胞数は各パネルに示すとおりである。２つの異なるウイルス産生細胞系を使用した：Ｆｌｋ−１  ＴＭ（トランスドミナント−陰性）変異体を発現する細胞系と、対照としてトランスドミナント−陰性ｃ−ｆｍｓ変異体（ｃ−ｆｍｓ  ＴＭ）を発現する細胞系であった。最初の腫瘍が出現した時から開始して、腫瘍容量を２〜３日置きに測定し、増殖曲線を得た。１群４匹のマウスを用いた。
図１４．Ｆｌｋ−１のトランスドミナント−陰性阻止によるＣ６グリア芽腫腫瘍増殖の阻止。Ｃ６細胞を単独で、またはウイルス産生細胞とともに移植した。細胞数は各パネルに示すとおりである。２つの異なるウイルス産生細胞系を使用した：Ｆｌｋ−１  ＴＭ（トランスドミナント−陰性）変異体を発現する細胞系と、対照としてトランスドミナント−陰性ｃ−ｆｍｓ変異体（ｃｆｍｓ  ＴＭ）を発現する細胞系であった。最初の腫瘍が出現した時から開始して、腫瘍容量を２〜３日置きに測定し、増殖曲線を得た。１群４匹のマウスを用いた。
５．発明の詳細な説明
本発明は、脈管形成および／または血管形成を変調するための、Ｆｌｋ−１受容体のリガンドの使用に関する。本発明はまた、受容体の活性化、調節および脱共役に関与しているかもしれない薬物ならびにＶＥＧＦ類似体を評価およびスクリーニングするために、Ｆｌｋ−１を発現させることを包含する。このようなＦｌｋ−１の調節物質は、治療に使用できる。例えば、ＶＥＧＦのアゴニストは、傷の治癒の過程等に使用できる。対照的に、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、増殖を血管新生に依存する腫瘍の治療に使用できる。
本発明は、その一部において、Ｆｌｋ−１が内皮細胞特異的ＲＴＫであることを示すin situハイブリダイゼーションおよびノーザンブロット分析の結果に基づいている。さらに、架橋実験は、Ｆｌｋ−１が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の高親和性受容体であることを示し、Ｆｌｋ−１が血管芽細胞の発生および分化、ならびにそれに続く血管形成および脈管形成の過程における内皮細胞増殖に、極めて重要な役割を果たすことを示した。
本発明はまた、トランスドミナント−陰性変異体形態のＦｌｋ−１分子の発現が、内因性天然型Ｆｌｋ−１の生物学的活性を阻害することが可能である、という発見に基づいている。腫瘍細胞ならびに先端切断型のＦｌｋ−１受容体をコードする組換えレトロウイルスを産生する細胞を混合し、マウスに注射しする実験がここに記述される。血管形成および注射された腫瘍細胞の阻止が、先端切断型のＦｌｋ−１受容体を発現するマウスにおいて観察された。トランスドミナント陰性形態のＦｌｋ−１分子の発現は、血管の異常増殖に起因する病気、例えば、慢性関節リューマチ、網膜症および固形癌の増殖、等の治療に有用でありうる。
後述の実施例で説明されるように、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が、移植後の胚および内皮細胞に特異的に発現される新規受容体チロシンキナーゼを単離するのに使用された。このようなクローンの１つは、造血細胞と選択された胎児肝キナーゼ−１（Ｆｌｋ−１）を富化した細胞集団より単離された、以前に同定されたｃＤＮＡクローンとほぼ同じ配列相同性を有するＲＴＫをコードすることが判明した（Matthewsら、1991,Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:9026-9030）（図１１参照）。
議論を明確にするため、本発明は以下の分節においてマウスＦｌｋ−１を例として記述される。しかし、この原理はヒトを含む他の種のＦｌｋ−１をクローン化し、発現するのに類似的に適用しうる。
５．１．Ｆｌｋ−１コード配列
マウスＦｌｋ−１遺伝子のヌクレオチドコード配列および推定されるアミノ酸配列を図１１（配列番号１）に示す。これらは最近Matthewsら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:9026-9030に記載されたものである。本発明によれば、ヒトを含む哺乳動物におけるＦｌｋ−１タンパク質またはその機能的等価物のヌクレオチド配列は、Ｆｌｋ−１の発現を引き出す組換え分子を作製するのに使用できる；以後、この受容体を、どの種から誘導されたものかに関係なく、「Ｆｌｋ−１」と称する。
ここに記述される特定の態様において、マウスＦｌｋ−１遺伝子は、受容体チロシンキナーゼのキナーゼドメイン内において高度に保存された配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を実施することにより単離された（Hanksら、1988）。鋳型として、８．５日齢マウス胚より調製されたλｇｔ１０  ｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡを使用した。並行的アプローチにおいて、同様なプライマーを、出生後４〜８日齢のマウス脳から単離された毛細管内皮細胞由来のＲＴＫ  ｃＤＮＡ配列を増幅するのに使用した。この時期は、脳内皮細胞増殖が最大となるときである。両方のアプローチとも、最近記述された胎児肝ＲＴＫ、すなわちＦｌｋ−１（Matthewsら、1991）をコードするｃＤＮＡ配列をもたらした。アミノ酸の相同性に基づき、この受容体は細胞外ドメインにイムノグロブリンに似た反復配列を含む（図１参照）ＲＴＫのタイプIIIサブクラスのメンバーである（UllrichおよびSchlessinger）。
本発明はまた、Ｆｌｋ−１活性が存在する他の種（ヒトを含む）より単離したＦｌｋ−１遺伝子に関する。Ｆｌｋ−１ファミリーのメンバーは、本明細書では、ＶＥＧＦまたはそのペプチドの断片と結合する受容体として定義される。このような受容体は、ＤＮＡ配列の実質的範囲におけるアミノ酸レベルで約８０％の相同性を示しうる。バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを、低減したストリンジェンシーのもとで、マウスＦｌｋ−１クローンの放射標識化断片を用いてスクリーニングすることができる。
または、マウスＦｌｋ−１配列を、ＰＣＲプローブとして使用可能な、またはバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用可能な、縮重または完全縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計するのに使用できる。ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に基づく方法は、ヒトＦｌｋ−１をクローン化するのに使用できる。マウスＦｌｋ−１と受容体チロシンキナーゼとの間で保存されてきたモチーフに対応する、縮重オリゴヌクレオチドの２つのプールは、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして役立つように設計することができる。反応のための鋳型は、ヒトＦｌｋ−１を発現することが知られている細胞系または組織より調製したｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡである。ＰＣＲ産物は、増幅させた配列がＦｌｋ−１配列を表すことを確実にするため、サブクローン化し、配列決定することができる。ＰＣＲ断片は、増幅させた断片を放射活性的に標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、全長Ｆｌｋ−１ｃＤＮＡクローンを単離するのに使用できる。または、上記の標識化断片は、ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使用できる。使用できるクローン化方法の検討には、例えば、Maniatisら、1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y.；およびAusubelら、1989，Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.）を参照されたい。
ヒトＦｌｋ−１  ｃＤＮＡの単離は、ＣＯＳ細胞に移入された時にプラスミドの多数コピー発現を可能とするＳＶ４０複製起点配列を含有する哺乳動物の発現ベクター（例えば，ｐｃＤＮＡ１等）に、ｃＤＮＡライブラリーを構築することによっても達成できる。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の表面におけるＦｌｋ−１の発現は、種々の方法によって検出できる。これらの方法には、標識化リガンド、例えば、放射標識、蛍光標識または酵素によって標識化されたＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのアゴニストの使用が含まれる。ヒトＦｌｋ−１を発現する細胞は、トランスフェクトされた細胞を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）による選別にかけることにより富化できる。
本発明によれば、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｋ−１のペプチド断片、Ｆｌｋ−１融合タンパク質またはそれらの機能的等価物をコードするＦｌｋ−１ヌクレオチド配列を、Ｆｌｋ−１タンパク質またはその機能的等価物の発現を適切な宿主細胞において引き出す組換えＤＮＡ分子の作製に使用することができる。または、Ｆｌｋ−１配列の部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析、等に使用することができる。
固有の遺伝暗号の縮重により、実質的に同一な、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施においてＦｌｋ−１タンパク質のクローン化および発現に使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、ストリンジェント条件下でマウスＦｌｋ−１配列とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列が含まれる。
本発明にしたがって使用することができる変更されたＤＮＡ配列は、同一の、または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列に帰着する、様々なヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物それ自体が、表に現れない、したがって機能的に等価なＦｌｋ−１を産生する変化に帰着する、アミノ酸の欠失、付加または置換をＦｌｋ−１配列内に含有することもありうる。このようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似に基づいてなされる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシンおよびアルギニンが含まれ、類似した親水性値をもつ非荷電の複数の極性ヘッド基(polar head group)を有するアミノ酸には以下のものが含まれる：すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンである。本明細書中で用いる「機能的に等価なＦｌｋ−１」とは、ＶＥＧＦまたはその断片に結合するが、必ずしもその対応物である天然のＦｌｋ−１と同一の結合親和性を有するわけではない受容体、をいう。
本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングと発現を修正する変更を含むがそれらだけに限定されない種々の目的に合わせて、Ｆｌｋ−１コード配列を変更するために、遺伝子工学的に操作することができる。例えば、当分野の技術で周知の技法（例えば、部位特異的突然変異誘導法）を使用して突然変異を導入することにより、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターン、リン酸化等を変える、等が可能である。例えば、酵母等の発現系において、宿主細胞は遺伝子産物を過度にグリコシル化することがある。そのような発現系を使用するときは、Ｆｌｋ−１コード配列を変更して任意のＮ−結合グリコシル化部位を除去することが好ましいかもしれない。
本発明の別な態様においては、Ｆｌｋ−１配列または修飾されたＦｌｋ−１配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、ペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販されている抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラＦｌｋ−１タンパク質をコードすることが役立ちうる。融合タンパク質は、Ｆｌｋ−１を異種部分から切り離せるように、Ｆｌｋ−１配列と異種タンパク質配列との間に位置する開裂部位を含有するように遺伝子操作することも可能である。
本発明のまた別な態様においては、当分野の技術で周知の化学的方法を用いて、Ｆｌｋ−１のコード配列を全部または部分的に合成することが可能であろう。例えば、Caruthersら、1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233; CreaおよびHorn，180，Nuc．Acids Res．9(10):2331; MatteucciおよびCaruthers，1980，Tetrahedron Letters 21:719; ならびにChowおよびKempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817参照。または、Ｆｌｋ−１アミノ酸配列を全部または部分的に合成する方法を用いて、タンパク質自体を製造することも可能であろう。例えば、ペプチドは固相法により合成し、樹脂から切り離し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co．，N.Y．，pp．50-60参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えば、Edman degradation procedure; Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co．，N.Y．，pp．34-49参照）。
５．２．Ｆｌｋ−１受容体の発現およびＦｌｋ−１を発現する細胞系の作製
生物学的に活性なＦｌｋ−１を発現するため、Ｆｌｋ−１または上記第５．１節に記述したその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターすなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な諸要素を含むベクターに挿入される。Ｆｌｋ−１遺伝子産物、ならびに組換えＦｌｋ−１発現ベクターによってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は、種々の目的に使用できる。これらの目的には、以下のものが含まれるがそれらだけに限定されない。すなわち、この受容体に結合する、ＶＥＧＦの結合を競合的に阻害しＦｌｋ−１の活性を「中和する」ものを含む抗体類（つまりモノクローナルおよびポリクローナル抗体）の作製、およびＦｌｋ−１受容体によって作用するＶＥＧＦ類似体または薬物のスクリーニングおよび選択、等である。
５．２．１．発現系
Ｆｌｋ−１コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築には、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y．;およびAusubelら、1989，Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.を参照されたい。
種々の宿主−発現ベクター系がＦｌｋ−１コード配列を発現するのに使用できる。これらには、Ｆｌｋ−１コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌等の微生物；Ｆｌｋ−１コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；Ｆｌｋ−１コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染させた、またはＦｌｋ−１コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；ＤＭ染色体中に安定に増幅された（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）または不安定に増幅されたＦｌｋ−１  ＤＮＡの多数コピーを含有するように遺伝子操作された細胞系を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系（例えば、マウス細胞系）が含まれるが、これらだけに限定されない。
これらの系の発現要素は、その強度と特異性において異なる。使用する宿主／ベクター系により、構成的および誘導性プロモーターを含む多数の適切な転写および翻訳要素の任意のものを発現ベクターに使用できる。例えば、細菌系でクローン化を行うときは、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等の誘導性プロモーターが使用できる；昆虫細胞系でクローン化を行うときは、バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモーター等が使用できる；植物細胞系でクローン化を行うときは、植物細胞ゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルスから誘導したプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用できる；哺乳動物細胞系でクローン化を行うときは、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用できる；Ｆｌｋ−１  ＤＮＡの多数コピーを含有する細胞系を作製するときは、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶに基づくベクターを適切な選択マーカーとともに使用できる。
細菌系においては、発現されるＦｌｋ−１の意図された用途によって、多数の発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の作製またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために大量のＦｌｋ−１を産生しなければならないときは、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を引き出すベクターが望ましいだろう。このようなベクターには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983，EMBO J．2:1791）（ここでＦｌｋ−１コード配列は、ハイブリッドAS-lac Zタンパク質が産生されるようにlac Zコード領域の読み枠に合わせてベクターに連結することができる）；pINベクター（InouyeおよびInouye，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-3109; Van HeekeおよびSchuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509）；等である。pGEXベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を有する融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解した細胞から容易に精製できる。このpGEXベクターは、興味のあるクローン化されたポリペプチドをＧＳＴ部分から解放できるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位を含むように設計されている。酵母においては、構成的または誘導性プロモーターを含有する多くのベクターが使用できる。プロモーターの検討には、Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，1988，Ausubelら（編）、Green Publish．Assoc. & Wiley Interscience，Ch.13; Grantら、1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，WuおよびGrossman（編），1987，Acad．Press，N.Y．，Vol.153，pp．516-544; Glover，1986，DNA Cloning，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，BergerおよびKimmel（編）、Acad．Press，N.Y．，Vol.152，pp．673-684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Scahharomyces，1982，Strathernら（編）、Cold Spring Harbor Press，Vols．IおよびIIを参照されたい。
植物発現ベクターを使用する場合には、Ｆｌｋ−１コード配列の発現は、多数のプロモーターのうち任意のものによって推進させることができる。例えば、ＣａＭＶの35S RNAおよび19S RNAプロモーター（Brissonら、1984，Nature 310:511-514）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら、1987，EMBO J．6:307-311）等のウイルスプロモーターが使用できる。または、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら、1984，EMBO J．3:1671-1680; Broglieら、1984，Science 224:838-843)等の植物プロモーター；または、大豆hsp17.5-Eもしくはhsp17.3-B（Gurleyら、1986，Mol．Cell．Biol．6:559-565）等の熱ショックプロモーターが使用できる。これらの構築体は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換(direct DNA transformation)、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、等を用いて植物細胞に導入することができる。これらの技法の検討には、例えば、WeissbachおよびWeissback，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp．421-463；ならびに、GriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed．，Blackie，London Ch．7-9を参照されたい。
Ｆｌｋ−１を発現するのに使用できる別の発現系は、昆虫系である。このような系の１つにおいては、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）が外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。Ｆｌｋ−１コード配列は、このウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。Ｆｌｋ−１コード配列の挿入がうまくゆくと、ポリヘドリン遺伝子の不活性化と外被をもたない（non-occluded)組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク様のコートを欠くウイルス）の産生をもたらすであろう。次に、これらの組換えウイルスを、そこで挿入遺伝子を発現させるスポドプテラ・フルジペルダ細胞を感染させるのに使用する（例えば、Smithら、1983，J．Viol．46:584; Smith，米国特許第4,215,051参照）。
哺乳動物細胞においては、ウイルスに基づく多数の発現系が使用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、Ｆｌｋ−１コード配列をアデノウイルスの転写/翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節リーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入は、感染した宿主中で生育可能であり、かつＦｌｋ−１を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう〔LogantおよびShenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA），81:3655-3659〕。または、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することもできる。［例えば、Mackettら、1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415-7419; Mackettら、1984，J．Virol．49:857-864; Panicaliら、1982，Proc．Natl．Acad．Sci．79:4927-4931参照。］
挿入されたＦｌｋ−１コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要とされることがある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む完全なＦｌｋ−１遺伝子を適切な発現ベクターに挿入する場合は、付加的翻訳調節シグナルはなんら必要とされない。しかし、Ｆｌｋ−１コード配列の一部のみを挿入する場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを供給しなければならない。さらに、その開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするために、Ｆｌｋ−１コード配列の読み枠と合致していなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の多様な起源のものでありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等を包含することにより増強されうる（Bittnerら、1987，Methods in Enzymol．153:516-544参照）。
さらに、挿入配列の発現を変調する、または所望の特異的方法で遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための、特徴的で特異的な作用機構をもつ。適切な細胞系または宿主系は、発現された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、または遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞が使用できる。このような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等が含まれるが、これらだけに限定されない。
組換えタンパク質の長期間にわたる高収率産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、Ｆｌｋ−１を安定的に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製することが可能である。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）および選択マーカーによって制御されるＦｌｋ−１  ＤＮＡによって宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作した細胞を１〜２日間、富化した培地中で増殖させてもよい。そして次に選択培地に替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み入れ、フォーカス（細胞増殖巣）を形成するまで増殖することを可能とする。次にこのフォーカスをクローン化し、細胞系へと発展させることができる。この方法は、Ｆｌｋ−１を細胞表面に発現し、ＶＥＧＦが仲介するシグナル伝達に応答する細胞系を遺伝子工学的に作製するのに有利に使用することができる。このように遺伝子工学的に作製された細胞系は、ＶＥＧＦ類似体をスクリーニングするのに特に有用である。
多数の選択系を使用することができる。これらの選択系には以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら、1977，Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskaおよびSzybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、1989，Cell 22:817）を、それぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞に採用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Wiglerら、1980，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567; 0'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527）；マイコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（MulliganおよびBerg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci.U.S.A．78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Colberre-Gerapinら、1981，J．Mol．Biol．150:1）；ハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Santerreら、1984，Gene 30:147）の選択の基礎として使用できる。最近、さらなる選択遺伝子が記述された。それらは、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用可能とするｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用可能とするｈｉｓＤ（HartmanおよびMulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:8047）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）への耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）［McConlogue L．，1987，In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor laboratory（編）］である。
5.2.2.  Ｆｌｋ−１を発現するトランスフェクタントおよびトランスフォーマントの同定
コード配列を含み、生物学的活性をもつ遺伝子産物を発現する細胞は、少なくとも４種の一般的アプローチによって同定することができる；（a）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（b）「マーカー」遺伝子機能の存否；（c）宿主細胞中におけるＦｌｋ−１メッセンジャーＲＮＡ転写物の発現の測定による、転写レベルの評価；（d）イムノアッセイまたは生物学的活性の測定を介した遺伝子産物の検出。
第一のアプローチでは、発現ベクター中に挿入したＦｌｋ−１のコード配列の存在は、Ｆｌｋ−１のコード配列またはその一部、またはその誘導体と相同のヌクレオチド配列を含むプローブを用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。
第二のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は、特定の「マーカー」遺伝子機能（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレキセートに対する抵抗性、トランスフォーメーション表現型、バキュロウイルスにおける閉塞（occlusion）体の形成など）の存在または不在に基づいて同定および選別することができる。たとえば、もしＦｌｋ−１コード配列がベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入されたとすると、Ｆｌｋ−１コード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができるだろう。これとはちがって、Ｆｌｋ−１のコード配列の発現を制御するために用いられる、同一または異なるプロモーターの制御下にあるように、マーカー遺伝子をＦｌｋ−１配列とタンデムに配置させることができる。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、Ｆｌｋ−１のコード配列の存在を示す。
第三番目のアプローチでは、Ｆｌｋ−１のコード領域に対する転写活性は、ハイブリダイゼーション検定によって評価することができる。たとえば、ＲＮＡは、Ｆｌｋ−１のコード配列またはその特定の部分に対する相同のプローブを用いて、ノーザンブロットによって単離および解析することができる。これとは別に、宿主細胞の全核酸を抽出し、同様のプローブを用いたハイブリダイゼーションで検定を行ってもよい。
第四のアプローチでは、Ｆｌｋ−１のタンパク産物の発現は、たとえばウェスタンブロット、放射性免疫沈澱、酵素−連結イムノアッセイおよび同様の手段など、免疫学的な手法によって評価できる。しかし、発現系の成功をはかる究極の試験は、生物学的に活性のあるＦｌｋ−１遺伝子産物の検出を含むものである。これだけに限るものではないが、ＶＥＧＦ結合試験；および、試験用基質として遺伝子工学的操作を施した細胞系を用いたＶＥＧＦ生物検定などを含む、数多くの検定を受容体活性の検出のために用いることができる。
5.3.  Ｆｌｋ−１受容体および遺伝子工学的に操作した細胞系の使用
脈管形成（angiogenesis）、即ち、新しい毛細血管の生育は、傷の治癒、組織および器官の再成、妊娠後の胎盤の形成および胚発生などにまたがる、数多くの生理学的なプロセスに必要とされる。血管の異常な増殖は、リューマチ性関節炎、網膜症、乾癬などさまざまな疾患の重要な構成要素となっている。毛細血管形成はまた、血管形成に依存した癌腫（solid fumor）の増殖および転移活性における重要な要素である。したがって、脈管形成阻害剤は、血管の異常な生育に由来または付随する疾患の治療および癌腫の成長および拡がりを含む悪性腫瘍の治療に有効に用いることができる。
本発明の一態様において、Ｆｌｋ−１受容体および／またはＦｌｋ−１受容体を発現する細胞系は、抗体、ペプチド、またはＦｌｋ−１受容体によって媒介される脈管形成または血管形成のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する他のリガンドのスクリーニングに用いることができる。たとえば、ＶＥＧＦの活性を中和することのできる抗Ｆｌｋ−１抗体は、Ｆｌｋ−１機能を阻害するために用いることができる。さらに、ＶＥＧＦの活性を模倣する抗Ｆｌｋ−１抗体は、傷の治癒に用いるために選ぶことができるであろう。あるいは、組換え技術によって発現させた可溶性のＦｌｋ−１タンパクまたはＦｌｋ−１タンパクを発現する細胞系によるペプチドライブラリーのスクリーニングは、Ｆｌｋ−１の生物学的活性の阻害によって機能する治療作用のある分子の同定に有用であろう。
本発明のある態様において、全Ｆｌｋ−１コード領域またはそのリガンド結合領域を発現する、遺伝子工学的に操作した細胞は、ＶＥＧＦのアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングおよび同定に用いることができる。合成化合物、天然物、および生物学的活性をもつ可能性のある他の原材料はさまざまな方法でスクリーニングを行うことができる。試験化合物がＶＥＧＦのＦｌｋ−１への結合を阻害する能力は、6.1.9節で述べたような標準の受容体結合技術を用いて測定することができる。Ｆｌｋ−１を発現する細胞に対する、ＶＥＧＦの結合のシグナル伝達応答への効果を妨害または模倣する能力を測定することが可能である。たとえば、Ｆｌｋ−１キナーゼ活性、セカンドメッセンジャー産生の調節または細胞の代謝の変化などを追跡することができる。これらの検定はこれらの目的のためにつくられた従来の技術を用いて実施することができる。
5.3.1.  Ｆｌｋ−１タンパクまたは遺伝子工学的に操作した細胞系を用いたペプチドライブラリーのスクリーニング
固相支持体に付着させた、アミノ酸のあらゆる可能な組合せにより成るランダムペプチドライブラリーを、特定のリガンドの結合部位またはキナーゼ領域など、受容体の他の機能領域と結合することのできるペプチドの同定に用いることができる（Lam，K.S．et al．，1991，Nature 354: 82-84）。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、特定の受容体との相互作用を介して受容体の生物活性を阻害するように作用する、薬理作用をもつ物質の発見において、治療上の価値をもちうるであろう。
Ｆｌｋ−１に結合する能力のある分子の同定は、ペプチドライブラリーを可溶の組換えＦｌｋ−１タンパクによってスクリーニングすることによって遂行しうる。Ｆｌｋ−１の発現および精製法は5.2.1節に述べられており、問題とする機能領域に応じて全長の組換えＦｌｋ−１またはＦｌｋ−１の断片の発現のために用いることができる。たとえば、Ｆｌｋ−１のキナーゼ領域および細胞外のリガンド結合領域を別々に発現させ、ペプチドライブラリーのスクリーニングに用いることができる。
Ｆｌｋ−１と相互作用を行い複合体を形成するペプチド／固相支持体を同定し単離するためには、Ｆｌｋ−１分子を標識するか「タグ」をつけることが必要である。Ｆｌｋ−１タンパクはアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、または蛍光性イソチアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）またはローダミンなどの蛍光性標識などの、他の試薬と結合させることができる。Ｆｌｋ−１に対するいかなる特定の標識の結合も、当業界によく知られた技術を用いて実施することができる。一方、Ｆｌｋ−１発現ベクターは市販の抗体に対するエピトープを含むキメラＦｌｋ−１タンパクを発現させるように操作することもできる。エピトープ特異的抗体は、酵素、蛍光色素、または着色あるいは磁性のビーズなどによる標識を含む、当業界でよく知られた方法を用いて「タグ」をつけることができる。
「タグ」をつけたＦｌｋ−１結合体をランダムペプチドライブラリーと共に22℃で30分間から１時間インキュベートし、Ｆｌｋ−１とライブラリー中のペプチド種との複合体形成を行わせる。ライブラリーを次いで洗い、結合しなかったＦｌｋ−１タンパクを除去する。Ｆｌｋ−１がアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合している場合には、全ライブラリーを、たとえば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルフォスフェート（ＢＣＩＰ）または３，３’，４，４”−ジアミノベンチジン（ＤＡＳ）など、それぞれアルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼに対する基質を含んだペトリ皿に注げばよい。数分間インキュベートした後、ペプチド／固相−Ｆｌｋ−１複合体の色は変化し、ミクロマニピュレーターを装備した分析用顕微鏡（dissecting microscope）を用い、容易に同定でき、物理的に単離することができる。蛍光「タグ」がつけられたＦｌｋ−１分子を用いた場合には、複合体は蛍光活性化ソーティング（fluorescent activated sorting）によって単離できるであろう。異種のエピトープを発現するキメラＦｌｋ−１タンパクを用いた場合には、ペプチド／Ｆｌｋ−１複合体は標識されたエピトープ特異的抗体を用いて検出することができる。一たび単離されれば、固相支持体に付着したペプチドの同定は、ペプチドのアミノ酸配列決定によって行うことができる。
可溶性のＦｌｋ−１分子の使用に加え、他の態様において、無傷の細胞を用いて細胞表面受容体と結合するタンパクを検出することも可能である。無傷の細胞の使用は、多くのサブユニットより成る、または不安定な、または機能的であるためには細胞膜の脂質領域を必要とする受容体などを使用する場合に望ましい。Ｆｌｋ−１を発現する細胞系統の作成の方法は、5.2.1および5.2.2節に述べた。この技術に用いる細胞は、生細胞または固定細胞のいずれでもよい。細胞はランダムペプチドライブラリーとインキュベートされ、ライブラリー中の特定のペプチドと結合して、標的細胞および適当な固相支持体／ペプチドとの間に「ロセット」を形成する。ロセットは次いで遠心分離によって分離、または分析用顕微鏡を用いて物理的にとりだすことができる。
膜結合の受容体または機能的であるために細胞膜の脂質領域を必要とする受容体のための全細胞検定の別法として、受容体分子を標識または「タグ」をつけることのできるリポゾーム中へと再構成することができる。
5.3.2.  抗体の産生とスクリーニング
組換え技術を用いて作成したＦｌｋ−１受容体のエピトープに対する抗体の産生のためには、当業界で知られたさまざまな方法を用いることができよう。そのような抗体には、以下に限るものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、FabフラグメントおよびFab発現ベクターによってつくられたフラグメントなどが含まれる。中和抗体、即ち、受容体のＶＥＧＦ結合部位と競する抗体は、診断と治療にとりわけ好ましい。
Ｆｌｋ−１に結合するモノクローナル抗体は、放射性の標識を行い、これにより注射後の体内での存在部位や分布を追跡が可能となる。放射性の「タグ」をつけた抗体は、リューマチ性関節炎、黄斑変性、および腫瘍の形成および転移などを含む多くの疾患に伴う、de novoの血管形成の造影のための、非侵入性の診断用材料として用いることができる。
細胞毒性物質に体内の特定部位を標的とさせるイムノトキシンの説計も可能である。例えば、高親和性の特異的モノクローナル抗体を、たとえばジフテリアトキシン、アブリンまたはリシンなどのバクテリアまたは植物トキシンと共有結合で結合させることができる。抗体／ハイブリッド分子の一般的な調製法は、抗体の一級アミノ基を攻撃し、ついでジスルフィド交換によってトキシンを抗体に結合させる、チオール架橋剤の使用を含むものである。ハイブリッド抗体はＦｌｋ−１を発現する内皮細胞の特異的な除去のために用いることができる。
抗体の産生を増強するためには宿主の種によってこれに限るものではないが、ウサギ、マウス、ラット等を含むさまざまな動物をＦｌｋ−１タンパクの注射による免疫化を行うことができる。免疫応答を増強させるために、これに限るものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンプレットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille  calmette-Guerin）および  コリネバクテリウム・パービュム(Corynebacterium marvum)などの有用な可能性のあるヒトのアジュバントなどを含むアジュバントを用いることができる。
Ｆｌｋ−１に対するモノクローナル抗体は、培養中に継続的な細胞系統によって生産される抗体分子を供給する諸技術のいずれを用いて調製してもよい。これらには以下に限るものではないが、KohlerとMilstein（Natute，1975，256: 495-497）によってはじめに記述されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al．，1983，Immunology Today，4; 72; Cote et al．，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．，80: 2026-2030）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al．，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc．，pp．77-96）などが含まれる。このほかに、適当な抗原特異性をもつマウスの抗体分子の遺伝子と適当な生物活性をもつヒト抗体の遺伝子とのスプライシングによる「キメラ抗体」の生産のために発展した技術（Morrison et al．，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．，81; 6851-6855; Neuberger et al．，1984，Nature，312: 604-608; Takeda et al．，1983，Nature，314: 452-454）を用いることができる。あるいは、単鎖抗体の生産のために発表された技術（米国特許4,946,773）をＦｌｋ−１特異的な単鎖抗体を生産するために適用することもできる。
Ｆｌｋ−１の特異的結合部位を含む抗体断片は、既知の技術によってつくり出すことができる。たとえば、そのような断片は以下に限るものではないが抗体分子のペプシン消化によって作りだすことのできるＦ（ab'）2断片、およびＦ（ab'）断片のジスルフィド架橋の還元によって生成させることのできるFab断片などを含む。これとは別に、Ｆｌｋ−１に対する望ましい特異性をもったモノクローナルFab断片の速やかで容易な検出を可能にする、Fab発現ライブラリーを構築してもよい(Huse et al．，1989，Science，246: 1275-1281)。
5.4.  Ｆｌｋ−１コード配列の利用
Ｆｌｋ−１コード配列は、Ｆｌｋ−１発現の検出のための診断目的に用いることができる。本発明の範囲に含まれるのは、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子を含むオリゴリボヌクレオチド配列、およびＦｌｋ−１の翻訳を阻害する機能をもつリボザイムなどである。さらに、ドミナント−陰性の効果をもつ、変異体のＦｌｋ−１を、内在的に発現した野性型のＦｌｋ−１の活性を阻害するために、標的細胞集団中で発現させることができる。
5.4.1.  診断薬および治療薬におけるＦｌｋ−１コード配列の利用
Ｆｌｋ−1 ＤＮＡはＦｌｋ−１の異常な発現に由来する疾患の診断への数多くの用途をもちうる。たとえば、Ｆｌｋ−1 ＤＮＡ配列はＦｌｋ−１の発現の異常を診断するためのバイオプシーまたはオートプシーのハイブリダイゼーション検定、たとえばin situのハイブリダイゼーション試験を含むサザンまたはノーザン分析に用いることができる。
Ｆｌｋ−1 ｃＤＮＡはＦｌｋ−1 ｍＲＮＡの発現を検出するためのプローブとして用いることができる。ここで記述された特定の実施例では、異なる発生段階にあるマウスの胚におけるＦｌｋ−1 ｍＲＮＡの発現を分析した。ノーザンブロット分析は、9.5から18.5日にかけて主成分の5.5kb ｍＲＮＡの多量の発現があり、妊娠の末期へ向けて明らかな減少をみせる（図２Ａ）ことを示している。生後４−８日にかけて脳の毛細血管のＦｌｋ−１ ｍＲＮＡは脳全体のＲＮＡに比較してきわめて多量にみつかり（図２Ｂ）、内皮細胞の増殖におけるＦｌｋ−１の役割が示唆される。
胚発生の過程および血管形成の初期におけるＦｌｋ−１の発現についてより詳細な知識を得るために、6.1.4節に述べたようなin situハイブリダイゼーション実験を行った。in situハイブリダイゼーションは、胚発生におけるin vivoのＦｌｋ−１の発現が主として内皮細胞およびその前駆体に限局していることを示した（図３および図４）。Ｆｌｋ−１は内皮細胞の増殖によって特徴づけられる生理的な過程で内皮細胞中で発現し、胎児の脳の中でみられる発現の時間的および空間的なパターンはBar（1980）が記載した神経の血管系の発生と正確に対応する。前神経叢（preneural plexus）に発する血管芽（vascular sprouts）は放射状に神経外胚葉へと成長し、そこで枝分れし、これら側芽（branch）は高レベルのｍＲＮＡを発現することがわかった（図５）。生後の初期段階では内皮細胞の増殖は依然として顕著でありＦｌｋ−１は発現している一方、成体では血管形成の完了後、内皮細胞の増殖の減退とＦｌｋ−１の発現の低下には平行関係にある。
さらに本発明の範囲内には、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチド配列およびＦｌｋ−1 ｍＲＮＡの翻訳を妨げる機能をもつリボザイムがある。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、タンパクの翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接に遮断する。アンチセンスＤＮＡについて言えば、翻訳開始部位、たとえばＦｌｋ−１ヌクレオチド配列の−10から＋10の間の領域から得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムはＲＮＡの特異的な切断を触媒することのできる酵素作用のあるＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構には相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーションとこれにエンドヌクレアーゼ作用による切断が続くプロセスか含まれる。本発明の範囲に含まれるのは、Ｆｌｋ−1 ＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ作用による切断を特異的にかつ効率よく触媒する、遺伝子操作したハンマーヘッドモチーフ（hammerhead motif）リボザイム分子である。
可能な標的ＲＮＡ中の特異的なリボザイムの切断部位は、標的分子をＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について走査することによってはじめ同定された。一たび同定されれば切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、15から20のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、このオリゴヌクレオチドを不適当なものとするかもしれない２次構造などの予見できる構造について評価することができる。標的候補の妥当性は、リボヌクレアーゼ保護試験を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの可能性をテストすることによって評価することもできる。
本発明のアンチセンスＲＮＡとＤＮＡ分子およびリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成について当業者間に知られているいかなる方法を用いて調製してもよい。これらは、たとえば固相フォスフォラミダイト化学合成などの当業界によく知られた化学合成のオリゴデオキシリボヌクレオチドに対する技術を含む。あるいはＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivoの転写によって生成させることもできる。このようなＤＮＡは、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをとり入れたさまざまな種類のベクター中にとり込むことができる。あるいは、用いるプロモーターによって、アンチセンスＲＮＡを構成的あるいは誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物を、細胞系に安定に導入することができる。
細胞内での安定性または半減期を増大させる手段として、ＤＮＡ分子に対しさまざまな改変を行うことができる。考えられる改変としては、以下に限るものではないが、分子の5'および／または3'末端をはさむリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド配列を付加するか、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のフォスフォジエステラーゼ連結の代わりにフォスフォチオエートまたは２'ｏ−メチルを用いることが含まれる。
5.4.2.  遺伝子治療におけるドミナント−陰性変異株の利用
リガンドによってひき起こされる受容体の二量体化は、リガンドの結合とキナーゼ活性の刺激とを共役させる働きをもつ、アロステリックな調節シグナルを提供するものと考えられている。欠陥のある受容体は、機能のないヘテロ二量体を形成することによって、正常な受容体の活性化と応答を抑制する、ドミナント−陰性変異として働らくことができる。したがって、欠陥受容体を組換えウイルスベクターに人工的にとりこませ、不適切にＦｌｋ−１を発現する患者の遺伝子治療に用いることができる。
本発明のある態様に於いては、ドミナント−陰性効果をもつ変異型のＦｌｋ−１分子は、選択された細胞内での発現によって同定することができる。野性型のＦｌｋ−１タンパクと二量体を形成する能力は保持するが、シグナル伝達の機能をもたないＦｌｋ−１の欠失またはミスセンス変異は、内在性の野性型Ｆｌｋ−１の生物活性を阻害させるために用いることができる。たとえば、Ｆｌｋ−１の細胞内キナーゼ領域を欠失させ、野性受容体との二量体化の形成は依然として行いうるが、シグナルの伝達はできないよう一部を欠いたＦｌｋ−１分子をつくることができる。
血管の異常な増殖は、リューマチ性関節炎、網膜炎および乾癬などのさまざまな病変の重要な要素である。制御を欠いた脈管形成は、また癌腫の成長や転移における重要な要素となっている。野性型の内在性Ｆｌｋ−１の活性を阻害するために用いることができる、ドミナント−陰性型のＦｌｋ−１を発現するような組換えウイルスを人工的に構築することができるであろう。これらウイルスはＦｌｋ−１の異常な発現または機能に由来する疾患の処置に、治療的に用いることができる。
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルス等に由来する発現ベクターは、標的細胞集団へ組換えＦｌｋ−１を導入するために用いることができる。組換え技術に十分な経験のある者にはよく知られた方法を、Ｆｌｋ−１のコード配列を含む組換えウイルスベクターの構築に用いることができる。たとえばManiatis et al．，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.およびAusubel et al．，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y．など参照。別の方法として、組換えＦｌｋ−１分子は標的細胞に到達させるために、リポゾーム中に組み入れることができる。
本発明の特定の態様において、Ｆｌｋ−１受容体の欠失変異を人工的に組換えレトロウイルスベクターに組込ませた。pLXSN F1k-1 TM cl.1およびpLXSN F1k-1 TM cl.3と名付けられた二つのクローン単離物は、561カルボキシル末端アミノ酸を欠く末端切断したＦｌｋ−１受容体を含んでいる。ウイルス産生細胞系統を得るために、ＰＡ37細胞を組換えベクターでトランスフェクトし、次いでウイルスを含む条件培地（conditioned media）を用いてＧＰＥ細胞を感染させた。
シグナル伝達欠損変異の発現が内在性のＦｌｋ−１受容体活性を阻害するかどうかをテストするために、Ｃ６ラット神経膠芽腫（腫瘍細胞）および組換えレトロウイルスを産生するマウス細胞を混合し、これをヌードマウスに皮下注射した。通常、腫瘍細胞のヌードマウスへの注射により、腫瘍細胞の増殖および生じた腫瘍部の血管形成が生じる。Ｆｌｋ−１は血管の形成に不可欠であると考えられているので、末端切断した受容体の発現によるＦｌｋ−１の活性の阻害は、発達しつつある腫瘍の血管形成を阻害し、その結果、腫瘍の生長を阻害する働らきをもつかもしれない。図13および14に示されているように、末端切断したＦｌｋ−１受容体を発現する、ウイルス産生細胞を共に注射することによって、腫瘍細胞のみの注射をうけた対照にくらべ、腫瘍の成長が著しく阻害された。
5.5.  Ｆｌｋ−１受容体またはリガンドの使用
Ｆｌｋ−１およびＶＥＧＦの間の受容体／リガンドの相互作用は、血管形成および脈管形成期間のシグナル伝達系に大きな役割を果たすと考えられている。異常な血管の増殖は数多くの疾患の重要な構成要素である。
Ｆｌｋ−1 ＲＮＡの発現が脳の発達および内皮細胞の増殖と関係があることは、Ｆｌｋ−１が血管形成の過程におけるシグナルの伝達にかかわる受容体であるらしいことを示唆している。ＶＥＧＦは内皮細胞にのみ働く分裂促進成長因子であることが示されている（Ferrata，N．and Henzel，W.J．，1989，Biochem．Biophys．Res．Comm．161: 851-858）。ＶＥＧＦはＦｌｋ−１のリガンドであるかどうかを決定するために、6.1.9および6.1.10にそれぞれ述べられているように、架橋実験およびリガンド結合実験を行った。結果はＦｌｋ−１が高い親和性をもつ、ＶＥＧＦの真正の受容体であることを示した（図９）。
本発明の一態様において、脈管形成および／または血管形成を変調するために、Ｆｌｋ−１のリガンド、Ｆｌｋ−１受容体自体、またはＶＥＧＦ結合部位を含むＦｌｋ−１の断片などをin vivoで投与することができるであろう。たとえば、Ｆｌｋ−１受容体またはＶＥＧＦ結合部位を含む断片の投与は、ＶＥＧＦと拮抗的に結合し、in vivoにおける内在性のＦｌｋ−１受容体との相互作用を阻害し、脈管形成および／または血管形成を阻害することができるだろう。あるいはまた、抗Ｆｌｋ−１抗体またはその断片を含む、Ｆｌｋ−１のリガンドを脈管形成および／または血管形成を調節するために用いることができる。ＶＥＧＦ活性のアゴニストは傷の治癒を促進するために用いられるが、一方、ＶＥＧＦ活性のアンタゴニストは腫瘍の成長を阻害するために用いることができる。
特定の治療条件に依存するが、これら薬剤を全身的にまたは局所的に処方し、投与することが考えられる。処方および投与の技術は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co．，Easton，PA，latest editionに見出すことができる。適切な経路としては、経口、経直腸、経粘膜（transmucosal）、腸内投与；またはいくつか例をあげるだけでも、筋肉内、皮下、髄内注射、および鞘内、直接の脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内注射などを含む非経口的な投与が含まれる。注射のためには、本発明の薬剤は水溶液で、好ましくはハンクス氏液、リンゲル氏液または生理食塩水のような生理的に適合性のある緩衝液で調剤することができる。経粘膜投与のためには通過の障壁にとって適当な浸透剤を処方の中に用いられる。そのような浸透剤は当業界では一般に知られている。
6.  実施例  ＶＥＧＦに対する高親和性受容体Ｆｌｋ−１のクローニングと発現パターン
以下の小節でＦｌｋ−1 ｃＤＮＡクローンのクローニングおよびその性質について述べる。ノーザンブロットおよびin situハイブリダイゼーション解析は、Ｆｌｋ−１が内皮細胞で発現していることを示す。架橋実験およびリガンド結合実験はさらに、Ｆｌｋ−１がＶＥＧＦに対する高親和性をもった受容体であることを示す。
6.1.  材料および方法
6.1.1.  Ｆｌｋ−１のｃＤＮＡクローニング
（受胎後）8.5日のマウス胚のλgt10 ｃＤＮＡライブラリー（Fahrner et al．，1987，EMBO．J．6: 1497-1508）から抽出したＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（RCR; Saiki R.K．et al．，1985，Science 230: 1350-1354）の鋳型として用いた。これとは別のアプローチとして、生後４−８日のマウスの脳から単離された毛細血管の内皮細胞のｃＤＮＡを増幅に用いた
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縮重プライマーはすべてのＲＴＫに共通のキナーゼ領域内の、高いアミノ酸の相同性に基づいて設計された（Wilks，A.F．，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86: 1603-1607）。
Ｆｌｋ−１の全長ｃＤＮＡクローンは別の（受胎後）8.5日のマウス胚から、OkayamaとBerg（1983）の方法に従って調製したｃＤＮＡライブラリー、および11.5日のマウス胚λgt11ライブラリー（Clonetech）から、32P-ラベルの（Feinberg，A.P．and Vogelstein，B．1983 Anal．Biochem．132: 6-13）210-塩基対のＰＣＲ断片を用いて単離した。
6.1.2.  マウス胚
Balb/cマウスを一夜交配させ、膣栓の検出の朝を妊娠1/2と定義した。ノーザンブロット解析のために、冷凍した胚を５Mグアニジニウムチオシアネート中でホモジネートし、ＲＮＡは報告されている方法（Ullrich，A．et al．，1985，Nature 313: 756-761）によって単離した。in situハイブリダイゼーションのためには、胚をTissue-Tek（Miles）に包埋し、液体窒素表面で冷凍し、使用するまで−70℃で保存した。
6.1.3.  プローブの調製
受容体ｃＤＮＡの5'側に位置する2619塩基対を、EcoRI／BamHI断片としてpGem 32ベクター（Promega）にサブクローンした。ノーザンブロットハイブリダイゼーションのためのプローブはランダムヘキサヌクレオチドプライミング（Boehringer; Feinberg，A.P．and Vogelstein，B．，1983 Anal．Biochem．132: 6-13）法を用い、α−32ＰｄＡＴＰ（Amersham）によってｃＤＮＡ断片を標識化することによって調製した。
in situハイブリダイゼーションのためには、
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およびRisau（Development，1991，111: 1143-54）の記した方法によって、一本鎖アンチセンスＤＮＡプローブを調製した。プラスミドはｃＤＮＡの3'末端で直線化し、センス転写産物はＳＰ6 ＲＮＡポリメラーゼ（Boehringer）を用いて合成した。ＤＮＡはＤＮＡase（ＲＮＡaseフリーの製品、Boehringer Mannheim）を用いて分解した。この転写産物を用い、α−35ＳｄＡＴＰによるランダム−プライムミングｃＤＮＡ合成をＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いた、逆転写によって行った。in situハイブリダイゼーションに適当な、平均約100塩基対の小さなｃＤＮＡ断片を得るために、大過剰のプライマーを用いた。これに続いてＲＮＡ転写物を100mM NaOH中、70℃で20分間部分的に加水分解し、プローブを同量のHClで中和後セファデックスＧ50カラムで精製した。エタノール沈澱後、プローブは最終比活性５×105cpmに溶かした。対照ハイブリダイゼーションのためのセンスプローブは、同じ方法によって調製した。
6.1.4.  ＲＮＡ抽出およびノーザン分析
全細胞質ＲＮＡをChromczynskiとSacchi（1987）の酸性フェノール法に従って分離した。ポリ（A+）ＲＮＡアリコートは、1.2%アガロースホルムアルデヒドゲル（Sambrook，J．et al．，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed．Cold Spring Harbor Laboratory press）で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に転写し（Schleicher & Schell）、ハイブリダイゼーションは50％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム）、５×Denhardt溶液（0.1％フィコール400,0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ＢＳＡ）および0.5％ＳＤＳ中、１−３×106cpm/mlの32Ｐ−ランダムプライミングＤＮＡプローブの存在下で42℃で一夜行い、ついで52℃で0.2×ＳＳＣ、0.5％ＳＤＳにより高いストリンジェシーを提供する洗浄（high stringency washes）を行った。フィルターは４〜８日間露出させた。
6.1.5   in situハイブリダイゼーション
サブクローニング固定後及びハイブリダイゼーションは基本的にHogan et al．（1986）の方法に従って行った。10μm厚の切片は−18℃でLeitzのクリオスタットを用いて得た。ハイブリダイゼーション前の処理には、塩基性タンパクを除くための0.2M HClによるインキュベーションは行わなかった。切片を50％ホルムアミド300mM NaCl，10mM  Tris-HCl，10mM NaPO4（pH6.8），5mM ＥＤＴＡ，0.02％フィコール400，0.01％ポリビニルピロリドン，0.02％ＢＳＡ，10m／ml酵母ＲＮＡ，10％デキストランサルフェートを含む緩衝液中で35Ｓ−ｃＤＮＡプローブ（５×104cpm／μl）と52℃でインキュベートし、次いで10mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM NaPO4（pH6.8）,5mM ＥＤＴＡ，10mM ＤＴＴで洗浄した。オートラジオグラフィーのためには、切片をKodak NTB2フィルム乳剤でコートした後、８日間露出した。現像後、切片をトルイジンブルーまたはMay-Grimwaldによって対比染色を行った。
6.1.6.  抗血清の調製
Ｆｌｋ−１のＣ末端アミノ酸128を含む3'側プライマー化EcoRV/HindII断片を融合タンパク発現ベクターｐＧＥＸ３Ｘ（Smith，D.B．and Johnson，K.S．，1990 Gene，67:31-40; Pharmacia）にサブクローンした。融合タンパクは述べられた方法によって精製し、ウサギの免疫に用いた。二度目の追加免疫後、ウサギより採血し抗血清を免疫沈澱のために用いた。
6.1.7.  ＣＯＳ−１細胞におけるＦｌｋ−１の一時的発現
ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは基本的にChen and Okayama（1987 Mol．Cell．Biol．7: 2745-2752）およびGorman et al．（1989 Virology 171: 377-385）で述べられた方法によって行った。簡単に言えば、細胞を10cmのペトリ皿あたり1.0×106の濃度に播き、10％ウシ胎児血清（Gibco）を含むＤＭＥＭ中で一夜インキュベートした。サイトメガロウイルスプロモーター駆動の発現ベクターにクローンした受容体ｃＤＮＡ 20μgを0.5mlの0.25M CaCl2、0.5mlの２×ＢＢＳ（280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，50mM BES，pH6.96）と混ぜ、室温で30分間インキュベートした。このリン酸カルシウム／ＤＮＡ溶液を次いで細胞に加え、ゆっくり混ぜ合わせた後３％CO2下37℃で18時間インキュベートした。リガンド結合実験のためには、細胞はプレートより除き、以下に記すように処理した。
ＶＥＧＦ条件化（conditioned）培地を得るためには細胞を15cmのペトリ皿でトランスフェクトした。培地を48時間後集め、ＶＥＧＦをヘパリンHigh Trapカラム（Pharmacia）を用いたアフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製し、限外濾過（Ferrara，N．and Henzel，W.J．1989 Biochem．Biophys．Res．Comm．16: 851-858）で濃縮した。ＶＥＧＦの濃度はウシ大動脈内皮細胞によるリガンド競合試験によって決定した。
自己リン酸化試験のためには、細胞を６ウェルのプレートに播き（１ウェルあたり２×105細胞）、さきに述べたようにトランスフェクトし、0.5％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で24時間飢餓させた。次いで細胞を無処理または500pMのＶＥＧＦで37℃10分間処理し、その後Kris et al．（1985）によって述べられた方法により溶解した。受容体のＣ末端に対してウサギを免疫して得た抗血清を用いてＦｌｋ−１の免疫沈澱を行った。免疫沈澱物は7.5％ＳＤＳポリアククリルアミドゲルにより分離し、ニトロセルロースに転写し、これをホスホチロシン（５Ｅ２；Fendly，B.M．et al．，1990 Cancer Research 50: 1556-1558）に対するマウスモノクローナルとともにインキュベートした。タンパクのバンドは西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたヤギ抗マウス抗体およびＥＣＬTM（Amersham）検出システムを用いて視覚化した。
6.1.8.  ＶＥＧＦの放射性ヨウ素化
組換えヒトＶＥＧＦ（５μg；H．Wiech博士より恵贈を受けた）を110μlのりん酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）に溶かし、HunterとGreen wood（1962）の方法に基づいてヨ素化を行った。反応生成物を標識したタンパクから0.7％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したセファデックスＧ50カラムムを用いて分離し、集めた各分画の一部を分取し、これを20％トリクロル酢酸による沈澱の前後にカウントを行った。ヨウ素化生成物の純度はゲル電気泳動に基づいて90％以上であると推定され、比放射能は77000cpm／ngであった。ヨウ素化ＶＥＧＦの生物活性はClauss M．et al．（1990．J.Exp．Mod．172: 1535-1545）によって述べられた組織ファクター誘導試験を用い、天然のＶＥＧＦの生物活性と比較することによって確認した。
6.1.9.  ＶＥＧＦのＦｌｋ−１への架橋化
Ｆｌｋ−１を一時的に発現するＣＯＳ−１細胞とトランスフェクションを行わなかった細胞を200pMの125Ｉ−ＶＥＧＦと４℃で一夜インキュベートした後、これをＰＢＳで二度洗い、ＰＢＳ中に溶かした0.5mMジスクシニイミジルスベレート（ＤＳＳ）で処理した。細胞を溶解し、Ｆｌｋ−１を免疫沈澱し、７％ポリアクリルアミド電気泳動で分離後オートラジオグラフィーを行った。
6.1.10.  ＶＥＧＦ結合
リガンド結合実験を先に記載したようにして実施し（R.Schumacherら．，1991，J.Biol．Chem．266: 19288-19295）、トランスフェクション後48時間の間15cmの培養皿中のＤＭＥＭ内でＣＯＳ−１細胞を増殖させた。細胞は次にＰＢＳで注意深く洗い、ＰＢＳ中で25mMのＥＤＴＡ５mlとともに10分間インキュベートした。細胞を次にプレートから脱離させ、結合緩衝液（DMEM，25mM HEPES，pH7.5,0.15％ゼラチン）で一度洗い、そして細胞数を測定するために５mlの結合緩衝液中に再懸濁させた。この細胞懸濁物を全量500μlにて、10pMの125Ｉ−ＶＥＧＥとともに、非標識化リガンド（これはＶＥＧＦを過度的に発現するＣＯＳ−１細胞の順化培地から部分的に精製されたものである（164個のアミノ酸型；Breierら．，1992））の濃度を増大させながら（０から７×10-9）、15℃で90分間インキュベートした。インキュベート後に、細胞を冷時ＰＢＳ 0.1％ＰＢＳで洗った。遊離のリガンドを遠心分離及び結合緩衝液への再懸濁の繰り返しにより除去した。最後に細胞に結合した125Ｉ放射活性をガンマ計測器（Riastar）で測定した。得られたデータはムンソン（Munson，P.J．）及びロッドバード（Rodbard，D．）の方法（1980 Anal．Biochem．107: 220-235）で分析した。
6.1.11.  Ｆｌｋ−１のトランスドミナント−陰性の突然変異体をコード化するレトロウイルスベクター
Ｆｌｋ−１受容体（pLX Flk-1 cl.1及びcl.3，図12）のアミノ酸１から806に対するコドン領域を含む組み換えレトロウイルスベクターを構築した。末端を切断したｃ−ｆｍｓ受容体突然変異体を含む組換えウイルスを対照として使用した。ウイルス産生細胞を得るために、マウスＧＰＥ細胞を組換えレトロウイルスＤＮＡでトランスフェクトされた両栄養性ウイルス含有ＰＡ317細胞の順化培地で感染させた。Ｃ６膠芽腫腫瘍細胞を単独で又はウイルス産生細胞と共にヌードマウスに移植した。２組の実験について注入された細胞数を以下に示す。腫瘍が最初に現われた時点から開始して、腫瘍容積を２〜３日毎に測定して、増殖カーブを得た。
実験No．１
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実験No．２
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6.2.  結論
6.2.1.  Ｆｌｋ−１の分離
マウスの成長の過程で発現されたＲＴＫｓを同定するために、ＲＴＫｓのキナーゼ領域内に高度に保存されている配列に基づいてデザインされた２個の変成オリゴヌクレオチドプライマープールを使用するＰＣＲアッセイを実施した（Hanks，S.K.ら，1988，Science 241: 42-52）。8.5日齢のマウス胚（Fahrner，K.ら，1987，EMBO．J．，6: 1497-1508）（マウスの成長において多くの分化の過程が始まる段階である）のλgt10 ｃＤＮＡライブラリーから抽出されたＤＮＡがＰＣＲアッセイにおいて鋳型として使用された。並行実験において、血管形成を制御するＲＴＫｓを同定する意図で、生後４〜８日のマウスの脳（この時期に脳の内皮細胞の増殖が最大となる）から分離した毛細管内皮細胞から得られたＲＴＫ  ｃＤＮＡ配列を増殖させるために類似のプライマーを使用した（Robertson，P.L.ら．，1985，Devel．Brain Res．23: 219-223）。いずれのアプローチも最近記述された胎児の肝臓ＲＴＫ，Ｆｌｋ−１をコード化するｃＤＮＡ配列（図11，配列番号：）を得た（Matthews，W.ら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88: 9026-9030）。アミノ酸の相同性に基づけば、この受容体はＲＴＫｓのIII型サブクラスのメンバーであり（Ullrich，A.及びSchlessinger，J．1990，Cell 61: 203-212）、免疫グロブリン−様繰り返し構造体を５個のみ含有するそのサブファミリーの他のＲＴＫｓと対比して、その細胞外領域に７個の免疫グロブリン−様繰り返し体（repeats）を含有する、ヒトのｆｌｔに密接に関係している（Matthews,W．ら，1991，Proc．Natl，Acad．Sci．U.S.A.88: 9026-9030）。Ｆｌｋ−１とＫＤＲ（Terman，B.I.ら．，1991，Oncogene 6:1677-1683）及びＴＫｒ−Ｃ（Sarzani，R.ら．，1992，Biochem.Biophys.Res．Comm．186: 706-714）との配列とを比較すると、これらはそれぞれＦｌｋ−１のヒト及びラット相同体であることが示唆された（図１）。
6.2.2.  胎児の発達の間のＦｌｋ−１  ｍＲＮＡの発現
Ｆｌｋ−１の生物学的機能の解決に向けての第一段階として、種々の発達段階におけるマウスの胎児においてＦｌｋ−１  ｍＲＮＡの発現を分析した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション実験によれば、9.5日から18.5日の間においてメジャー(major)5.5KbｍＲＮＡの豊富な発現が示され、妊娠の終わりに向けて明らかに減少している（図２Ａ）。出産後４〜８日で、脳の毛細管のＦｌｋ−１  ｍＲＮＡが脳の全ｍＲＮＡに比較して極めて豊富であることが見い出された（図２Ｂ）。
異なる胎児段階の間のＦｌｋ−１の発現に関してより詳細な情報を得るために、in situハイブリダイゼーション実験を実施した。Ｆｌｋ−１細胞外領域を含む2619ヌクレオチド長のＤＮＡプローブである一本鎖アンチセンスをプローブとして使用した。なぜならば、これが最も特異的なハイブリダイゼーションシグナルを生成するからである。14.5日齢の胚の矢状切開した断面が例として図３に示されている。高レベルのハイブリダイゼーションが心室、肺、及び髄膜で検出された；脳、肝臓、及び下顎のような他の組織はより少ないＦｌｋ−１  ｍＲＮＡ発現細胞を含有するように見えた。Ｆｌｋ−１発現の薄いストランド（thin strands）は、脊椎の体節間領域並びに心房及び大動脈の内部表面でも観察された。高倍率では、Ｆｌｋ−１の発現は毛細管及び血管に限定されていたようにみえた。例えば、心臓をより詳細に試験すると、心室毛細管及び心房の内皮内層（endothelial lining）でのみ陽性のシグナルが示された（図４Ａ）。肺では気管支周囲の毛細管で検出されたが、気管支の上皮には存在しなかった（図４Ｄ）。大動脈では内皮細胞で強いハイブリダイゼーションが示されたが、筋肉層では見られなかった（図４Ｃ）。
6.2.3.  器官の血管形成の間のＦｌｋ−１発現
11.5日齢のマウスの胚の終脳の神経外胚葉は著しく駆血性（avascular）である；最初の血管の発芽は神経周囲脈管叢から始まって器官への放射状の侵入を開始する（Bar，J.,1980，Adv．Anat．Embryol．Cell．Biol．59: 1-62; Risau，W.及びLemmon,V．1988，Dev．Biol．125: 441-450）。この段階で、Ｆｌｋ−１の発現は図５Ａに示されるように、神経周囲脈管叢及び侵入する血管の発芽において高い。これらのin situハイブリダイゼーション分析は、血管形成性発芽の増殖している内皮細胞がＦｌｋ−１  ｍＲＮＡを発現することを示した。14.5日において、神経外胚葉がすでに高度に脈管化しているときは、多数の放射状血管及び神経内叢の分枝化している血管は多量のＦｌｋ−１  ｍＲＮＡを含有していた（図５Ｂ）。出産後４日において、発芽及び内皮細胞増殖が最大時点にあるとき、内皮細胞においてＦｌｋ−1 ｍＲＮＡの強力な発現が観察された（図５Ｃ）。逆に、血管形成が終了した大人の脳においては、Ｆｌｋ−１発現は極めて低く（図５Ｄ）、そして主に脈絡膜叢（choroid plexus）に限定されているように見えた（図６）。脈絡膜叢において、内部血管層にある細胞はＦｌｋ−1 ｍＲＮＡを発現したが、上皮細胞は発現しなかった（図６Ａ及びＢ）。
胎児性の腎臓は、血管形成プロセスにより脈管化される（Ekblom，P.ら．，1982，Cell Diff．11: 35-39）。糸球体及び管周の毛管は、上皮の形態形成と同時期に成長する。出産後４日齢の腎臓において、他の毛管に加えて、Ｆｌｋ−１の顕著な発現が推定糸球体毛管で観察された（図７Ａ）。この発現は大人の腎臓でも存続し（図７Ｃ及びＤ）、そして、出産後間もない腎臓と比較してより糸球体に限定されるように思われる。
6.2.4.  内皮細胞始原体におけるＦｌｋ−１発現
血管発達の初期の段階におけるＦｌｋ−１の関与の可能性を研究するために、血島形成の間における異なる段階で胚の分析を実施した。8.5日齢のマウスの胎児の脱落膜（deciduum）の矢状切断面において、Ｆｌｋ−１発現は脱落膜、卵黄嚢及び栄養外胚葉にある母体の血管において検出された。また、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡは、アラントイン中及び胚の内側において見い出され、主に間充織がみられる部分に存在していた（図８Ａ）。母体の脱落膜を高倍率でみると、高レベルのＦｌｋ−１  ｍＲＮＡ発現が、内皮細胞から構成される、血管の内部の層で見られた（図８Ｂ）。卵黄嚢において、ハイブリダイゼーションシグナルは中胚葉の層に限定されており、ここで血管芽細胞が分化する（図８Ｃ）。図８Ｄは高倍率でみた血島を示しており、末梢血管芽細胞が高レベルのＦｌｋ−１  ｍＲＮＡを発現していた。
6.2.5.  Ｆｌｋ−１はＶＥＧＦに対する高親和性の受容体である
in situハイブリダイゼーションの詳細な試験結果及びブライアー（Breier，G．）らによって最近報告されたＶＥＧＦについての結果（1992，Development114: 521-532）との比較は、発現形態における驚くべき類似性を示した。さらに、糸球体の内皮におけるＦｌｋ−１発現及び周囲の上皮細胞におけるＶＥＧＦ（Breier，G.ら．，1992，Development114: 521-532）は、これらの細胞の型の間でのパラ分泌の関係の可能性を提起し、したがってＶＥＧＦ及びＦｌｋ−１のそれぞれに対するリガンド−受容体の関係を示唆した。この仮説を試験するため、標準の長さ（full length）のＦｌｋ−１  ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ（これはヒトのサイトメガロウイルスの転写調節要素を有している）にクローン化させた（Gorman，C.M.ら．，1989，Virology171: 377-385）。次いで、受容体の過度的な発現のために、Ｆｌｋ−１発現）プラスミドをＣＯＳ−１線維芽細胞にトランスフェクトした。
ＶＥＧＦのＦｌｋ−１  ＲＴＫへの特異的結合が、架橋及び競合結合実験により示された。精製された125Ｉ−ラベル化ＶＥＧＦを、ｐＣＭＶ−Ｆｌｋ−１発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞とともにインキュベートした。ＤＳＳによる架橋及びその後の免疫沈降、ＰＡＧＥ、及びオートラジオグラフィー分析は、トランスフェクトされていないＣＯＳ−１細胞による対照実験では検出されなかった約220KDの帯を示しており、ＶＥＧＦ／Ｆｌｋ−１受容体複合体を表しているように思われる（図５９Ａ）。加えて、ＶＥＧＦは、ＣＯＳ−１細胞を発現するＦｌｋ−１に結合する  125Ｉ−ＶＥＧＦと競合したのに対し（図９Ｂ）、トランスフェクトされていないＣＯＳ−１細胞は125Ｉ−ＶＥＧＦを結合しなかった。ＰＤＧＦ−ＢＢは125Ｉ−ＶＥＧＦの結合と競合しなかったので、トランスフェクトされた細胞上の受容体とＶＥＧＦの相互作用は特異的であった。結合データの分析は、約10-10MのKdを示しており、これはＦｌｋ−１がＶＥＧＦの高親和性受容体であることを示唆している。この発現は、Ｆｌｋ−１及びＶＥＧＦのin situハイブリダイゼーション結果とともに、Ｆｌｋ−１はＶＥＧＦに対する生理的に適切な受容体であることを強力に示唆している。
Ｆｌｋ−１受容体に結合するＶＥＧＦの生物学的適切性を確認するために、自己リン酸化（autophosphorylation）アッセイを実施した。過度的にＦｌｋ−１を発現したＣＯＳ−１細胞を0.5％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で24時間飢餓状態におき、0.5mM ＶＥＧＦで刺激し、そして溶解させた。この受容体をＦｌｋ−１特異的ポリクローナル抗体ＣＴ128で免疫沈降させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ホスホチロシン抗体５Ｅ２を使用するその後のイムノブロッティングで分析した（Fendly，B.M.ら．，1990，Cancer Research 50: 1550-1558）。図10に示されるように、Ｆｌｋ−１発現細胞のＶＥＧＦ刺激は180KD Ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を有意に誘導した。
6.2.6.  Ｆｌｋ−１のトランスドミナント−陰性の阻止による腫瘍の増殖の阻止
Ｆｌｋ−１受容体は、脈管形成及び血管形成において主要な役割を果たすものと信じられている。それゆえ、Ｆｌｋ−１活性の阻止は進行する腫瘍の脈管形成を抑制可能であり、そしてその成長を阻止しうる。この仮説を試験するために、腫瘍細胞（Ｃ６ラット膠芽腫）及び末端を切断したＦｌｋ−１受容体をコード化する組換えレトロウイルスを産生するマウス細胞を混合し、ヌードマウスの皮下に移植した。移植されたＣ６膠芽腫細胞は、マウスの内皮細胞の表面上で発現されるＦｌｋ−受容体に結合し、これを活性化するＶＥＧＦを分泌する。脈管形成の抑制体が不在の場合には、内皮細胞が増殖し、腫瘍細胞に向かって移動するであろう。代わりに、注入時に、腫瘍細胞がドミナント−陰性のＦｌｋ−１をコード化する組換えレトロウイルスを産生する細胞とともに注入されるならば、移植された腫瘍細胞に向けて成長する内皮細胞はドミナント−陰性のＦｌｋ−１変異体発現をもたらし、かつ内因性のＦｌｋ−１シグナル化を阻止しうる組換えレトロウイルスで感染されるであろう。内皮細胞増殖及び移動の抑制は、移植された腫瘍細胞が脈管形成することができず、これにより腫瘍の成長を抑制するであろう。図12及び13に示されるように、末端を切断したＦｌｋ−１を産生する細胞が移植されたマウスにおいて腫瘍成長が有意に阻止されるということは、末端を切断したＦｌｋ−１受容体の発現は内因性の野性型（wide-type）Ｆｌｋ−１の活性を阻止するためにドミナント−陰性の態様で作用しうることを示している。
本発明は、本発明の一つの局面を示すものとして意図される実施態様により範囲が限定されるものではなく、機能的に均等であるいずれのクローン、ＤＮＡ又はアミノ酸配列も本発明の範囲内にある。事実、本明細書に記載されたものに加えて本発明の種々の変形は、前記した記述及び付属の図面から当業者には明らかになるであろう。かかる変形は添付の請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
さらに、ヌクレオチドに関するすべての塩基対のサイズはおおよそのものであり、記載の目的で使用されることも理解されるであろう。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：5470
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：286..4386
配列
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配列番号：２
配列の長さ：1367
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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