(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と共存したとき、中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質。
【請求項２】
ラット由来である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と共存したとき、中性アミノ酸を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ラット由来である請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】
臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求項５記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかの項に記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項９】
発現プラスミドである請求項８記載のプラスミド。
【請求項１０】
請求項８記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を共存させた請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を用いて、該請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の有する中性アミノ酸を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。
【請求項１２】
配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を共存させた請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を用いて、該請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の有する中性アミノ酸を輸送する能力を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は中性アミノ酸及びその類似物質の輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は、栄養としてアミノ酸を常時取り込むことを必要するが、この機能は細胞膜に存在する膜タンパク質であるアミノ酸トランスポーターによって担われている。特に、細胞内で生合成できない必須アミノ酸の供給は、細胞外からの取り込みのみに依存する。必須アミノ酸輸送機構のうちでも、中性アミノ酸輸送系Ｌは、多くの必須アミノ酸の細胞への供給を担当することから細胞栄養において最も重要な輸送機構のひとつである。また、中性アミノ酸輸送系Ｌは、基質選択性が広いことから、中性アミノ酸類似物質もしくは中性アミノ酸類似の構造を有する薬物を輸送することでも知られていた。
【０００３】
中性アミノ酸輸送系Ｌは、もともとは、腫瘍細胞株で始めて記載され、その後、培養細胞、膜小胞標本、摘出臓器標本もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ標本を用いて検討されてきた（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第７０巻、４３頁、１９９０年）。中性アミノ酸輸送系Ｌは、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターであり、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンなどを輸送するが、細胞や組織により、基質選択性に多少の差異があることが知られていた。
【０００４】
しかし、従来の方法では、中性アミノ酸及びその類似物質の輸送の詳細や、細胞の生存もしくは増殖への中性アミノ酸輸送系Ｌの役割を解析することは困難であり、中性アミノ酸輸送系Ｌの機能を担う中性アミノ酸トランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。
【０００５】
中性アミノ酸トランスポーターとしては、ナトリウム依存的なトランスポーターとして、ＡＳＣＴ１およびＡＳＣＴ２がクローニングされている（Ｋａｎａｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、第９巻、５６５項、１９９７年）。  しかし、これらは、アラニン、セリン、システイン、スレオニン、グルタミンを主な基質とするものであり、中性アミノ酸輸送系Ｌとは基質選択性が異なっている。また、グリシントランスポーターとプロリントランスポーターがクローニングされているが、中性アミノ酸輸送系Ｌとは基質選択性が異なる。（Ａｍａｒａ  ａｎｄ  Ｋｕｈａｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第１６巻、７３項、１９９３年）。
【０００６】
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質であるｒＢＡＴ及び４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞で発現させると中性アミノ酸とともに塩基性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている（Ｐａｌａｃｉｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、１２３項、１９９４年）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、中性アミノ酸輸送系Ｌの機能を担う中性アミノ酸トランスポーターの遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドである中性アミノ酸トランスポーターを提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられていた４Ｆ２ｈｃの遺伝子とラットＣ６グリオーマ細胞株から抽出したポリ（Ａ）+ＲＮＡの共発現による発現クローニングを行い、中性アミノ酸を輸送する能力を有する新規タンパク質の遺伝子をクローニングした。さらに、この遺伝子の産物をアフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させて、この遺伝子の産物が機能を発揮するためには４Ｆ２ｈｃが必須であること、及び発現する機能は中性アミノ酸輸送系Ｌに相当する中性アミノ酸輸送であることを確認することに成功し、本発明を完成するにいたった。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質。
【００１０】
また、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質あるいは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と共存したとき、中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
さらに、本発明は前記本発明の遺伝子を含むプラスミド、及び、当該プラスミドで形質転換された宿主細胞（形質転換体）に関する。また、本発明は中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用、又は、当該遺伝子の発現を変調させるために使用する配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関する。
【００１２】
さらに、本発明は前記本発明のタンパク質に対する抗体に関する。
また、本発明は前記本発明のタンパク質を用いて、当該タンパク質の有する中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用の検出剤及びその検出方法、並びに、その能力を変調させることにより正常細胞又は腫瘍細胞の増殖制御剤及びその制御方法に関する。本発明の増殖制御は、前記本発明のタンパク質を発現させる、又は、発現を抑制し得るものを用いて行われる。
【００１３】
本発明の中性アミノ酸を輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわち中性アミノ酸トランスポーター  ＬＡＴ１（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １）は、アミノ酸輸送活性化因子４Ｆ２ｈｃと共存することにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンなどの中性アミノ酸、及びＬ−ドーパを輸送する（取り込む）能力を有する。ＬＡＴ１は、さらに抗腫瘍薬であるメルファラン、甲状線ホルモン（トリヨードチロニン及びチロキシン）を受け入れ、中性アミノ酸類似の構造を持つ化合物を広く輸送する広い基質選択性を有すると考えられる。
【００１４】
また、本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１は、生体内においては胎盤、脳、脾臓、大腸、精巣に主に発現している。さらに、ラットＣ６グリオーマ細胞株、形質転換したラット肝細胞株、肝細胞癌細胞株、及び、ヒト胃印環細胞癌細胞株、肺小細胞癌細胞株、黒色腫細胞株、神経芽細胞腫細胞株に発現が認められ、さらに多くの培養細胞株や腫瘍細胞株に発現していると考えられる。
【００１５】
また、本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１を抑制薬によって抑制することにより、ＬＡＴ１を発現する培養細胞の増殖速度が低下することから、ＬＡＴ１が細胞増殖に必要な必須アミノ酸を細胞に供給するために必要不可欠であると考えられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
後記の配列表の配列番号２は、ラットＣ６グリオーマ細胞株由来の中性アミノ酸トランスポーター（ラットＬＡＴ１）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約３．５ｋｂｐ）、及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（５１２アミノ酸）を表わす。
【００１７】
前記の配列番号２に示される塩基配列もしくはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、これらの配列は、新規なものであると考えられる。
【００１８】
本発明のタンパク質としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、中性アミノ酸輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約１０２個、好ましくは１〜約５１個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００１９】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が中性アミノ酸を輸送する能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２０】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２１】
本発明の中性アミノ酸トランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２２】
遺伝子のスクリーニング及び単離は、発現クローニング法（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）などにより好適に実施できる。
例えば、ラットＣ６グリオーマ細胞を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）+ＲＮＡ）を調製する。これを、分画し各画分について、４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡとともに、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入する。
【００２３】
４Ｆ２ｈｃの遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されている［Ｂｒｏｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第３１２巻、８６３項、１９９５年］ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易に４Ｆ２ｈｃの遺伝子を得ることが可能である。得られた４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡから、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等を用いて、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（キャプ化されたもの）を合成できる。
【００２４】
ｍＲＮＡと４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡを導入した卵母細胞について、例えば、ロイシンなどを基質として、細胞内への基質の輸送（取り込み）を測定し、高い取り込み活性を示したｍＲＮＡ画分を選択することにより、ＬＡＴ１のｍＲＮＡを濃縮できる。この濃縮されたｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。ライブラリーのｃＤＮＡから、約５００クローンを一グループとして、ｃＲＮＡ（キャップ化されたもの）を調製し、各々のグループについて、４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡとともに卵母細胞に導入し、基質の取り込み活性を指標として、陽性グループを選択する。陽性グループが見い出せたら、それをさらにサブグループに分け、同様の操作を繰り返すことにより、ＬＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
【００２５】
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、ＬＡＴ１のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡが、中性アミノ酸トランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、すなわち、ｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が中性アミノ酸トランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＬＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調製したｃＲＮＡを４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡとともに卵母細胞内に導入して発現させ、中性アミノ酸を細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、前記と同様、適当な中性アミノ酸を基質とする通常の取り込み試験（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１貢、１９９２年）により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
【００２６】
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＬＡＴ１の特性、例えば、ＬＡＴ１がアミノ酸の交換輸送を行っているという特性や、ＬＡＴ１の基質特異性などを調べることができる。
【００２７】
得られたＬＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
【００２８】
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号１に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
【００２９】
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊）に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００３０】
本発明の中性アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）は、例えば、中性アミノ酸トランスポーターをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、中性アミノ酸トランスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
【００３１】
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、中性アミノ酸トランスポーターをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、又はヒトＨｅＬａ細胞などの細胞株などが挙げられる。
【００３２】
中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６項（１９８４年））等によって実施できる。
【００３３】
本発明の中性アミノ酸トランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、中性アミノ酸トランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の中性アミノ酸トランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００３４】
本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１およびその遺伝子は、ＬＡＴ１により輸送される薬物（例えば、Ｌ−ドーパ等）の、細胞膜通過や、ＬＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば血液組織関門、胎盤もしくは精巣など）での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、ＬＡＴ１を発現する細胞膜や、ＬＡＴ１が存在すると予想される部位（例えば血液組織関門、胎盤もしくは精巣など）を効率良く透過する薬物の開発に使用できる。
【００３５】
本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１を抑制することにより、ＬＡＴ１を高レベルに発現する細胞の増殖を抑制することができる。ＬＡＴ１の抑制の目的には、その抑制薬を使用するか、もしくはアンチセンスオリゴＤＮＡを使用することができる。
【００３６】
また、本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１を用いて、腫瘍細胞などのＬＡＴ１を高レベルに発現する細胞の増殖を抑制する目的で使用する、ＬＡＴ１の機能抑制薬をスクリーニングする方法に利用でき、医薬の開発に寄与することができる。
【００３７】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００３８】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００３９】
【実施例】
実施例１（ラット中性アミノ酸トランスポーターのクローニング）
（１）ラット４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡの単離とｃＲＮＡの調製
ｃＤＮＡライブラリーはラット肝から精製したポリ（Ａ）+ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ギブコ社製）を使用して作成し、ファージベクターλＺｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。ＰＣＲ法にて、ラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子（Ｂｒｏｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第３１２巻、８６３項、１９９５年）の第１３５−５８０番目の塩基に相当するセグメントを増幅し、これを32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いて、ラット肝ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５ｘＳＳＣ、３ｘデンハード液（Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ液）０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、０．０１％Ａｂｔｉｆｏｒｍ  Ｂ（商品名、シグマ社）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌサーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。ｃＤＮＡを組み込んだλＺｉｐＬｏｘファージのｃＤＮＡ部分を、プラスミドｐＺＬ１に組み込み、さらにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）へサブクローン化した。
【００４０】
得られたクローンすなわち、ラット４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマー、塩基配列決定用キット（商品名：Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒ．２．０、アマシャム社製）を用いてダイデオキシ法により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これにより、クローニングしたｃＤＮＡがラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のものであることが確認できた。得られた４Ｆ２ｈｃの塩基配列を後記配列表の配列番号２に示した。
【００４１】
上記より得られたラット４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて。ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）調製した。
【００４２】
（２）ラット中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１のクローニング
【００４３】
金井らの方法（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１貢、１９９２年）に準じて、発現クローニング法により、以下のようにして行った。
【００４４】
ゲル電気泳動によりラットＣ６グリオーマ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡ４００μｇを分画した。
【００４５】
分画により得られた各画分を、上記（１）で得られたラット４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡと共に卵母細胞に注入し、２日間培養した。
【００４６】
ＲＮＡを注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１貢、１９９２年）に準じて、以下のように行った。基質として14Ｃ−ロイシン（５０μＭ）を含む塩化コリン取り込み用溶液（ｕｐｔａｋｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中にて３０分卵母細胞を培養して、細胞内に取り込まれた放射能のカウントで基質の取り込み率を測定した。なお、この系において、ラットＣ６グリオーマ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とラット４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞は、それぞれを単独で注入した卵母細胞に比し、相乗的な取り込み亢進が見られることを確認した（図１）。
【００４７】
分画により得られた各ＲＮＡ画分のうち、ＲＮＡを注入した卵母細胞が、最も高いロイシンの取り込み率を示した画分を選択した。この画分のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（２．８〜４．０ｋｂ）について、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用キット（商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ギブコ社製）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。これらＤＮＡはプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（ギブコ社製）の制限酵素Ｓａｌ１及びＮｏｔ１認識部位に組み込み、得られた組み換えプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ株のコンピテントセル（商品名：Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍａｘ  ＤＨ１０Ｂ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ、ギブコ社製）に導入した。得られた形質転換体をニトロセルロース膜上で培養し、１プレート当たり約５００個のコロニーが得られた。これらコロニーから、プラスミドＤＮＡを調製し、これらを制限酵素ＮｏｔＩで切断した。得られたＤＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、キャップ化されたｃＲＮＡを合成した。
【００４８】
得られたｃＲＮＡ（約４５ｎｇ）を、上記（１）で得られたラット４Ｆ２ｈｃのｃＲＮＡ（５ｎｇ）と共に卵母細胞へ注入した。これら卵母細胞について、前記と同様にして、ロイシン取り込み実験を行うことにより陽性クローンのスクリーニングを行った。スクリーニングに際しては、複数のクローンから抽出したＤＮＡをプールしたグループについて調べ、あるグループでロイシン取り込みが確認された場合、さらにそれを複数のグループに分割し、さらにスクリーニングを行った。
【００４９】
得られたクローン、すなわち、ラット中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１のｃＤＮＡを含むクローンについて、基配列決定のための合成プライマー、塩基配列決定用キット（商品名：Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒ．２．０、アマシャム社製）を用いてダイデオキシ法により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００５０】
これにより、ラット中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１遺伝子の塩基配列が得られた。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるＬＡＴ１のアミノ酸配列を決定した。翻訳領域は第６４−１５９９塩基である。
【００５１】
これらの配列を、後記配列表の配列番号１（アミノ酸配列）及び２（塩基配列）に示した。
【００５２】
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（疎水性プロット）により、ＬＡＴ１のアミノ酸配列を解析した結果、図２に示したように、１２個の膜貫通領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）が予想された。また、第２の親水性ループにチロシンリン酸化部位、第４と第８の親水性ループにプロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化部位と考えられる部位が２つあった。
【００５３】
（３）ラットの種々の組織及びラット培養細胞株におけるＬＡＴ１遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ラットＬＡＴ１遺伝子の第２０２−１５３４番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ラットの種々の組織及びラット由来の培養腫瘍細胞株から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、32Ｐ−ｄＣＴＰ  でラベルしたＬＡＴ１ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
【００５４】
ノーザンブロッティングの結果（図３）、Ｃ６グリオーマ細胞、胎盤、脳、脾臓、大腸、精巣において３．８ｋｂ付近に、胎盤ではそれに加えて２．６ｋｂ付近にバンドが検出され、発現が認められた。また、正常肝では発現は極めて弱いが、形質転換したラット肝細胞株、肝細胞癌細胞株においても３．８ｋｂ付近に強いバンドが検出され、発現が認められた（図４）。
【００５５】
さらに長時間感光で、その他の組織においても、３．８ｋｂ付近にかすかなバンドが検出された。
【００５６】
（４）ヒト腫瘍細胞株おけるＬＡＴ１遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ラットＬＡＴ１遺伝子の第２０２−１５３４番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒト由来の培養腫瘍細胞株から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを３７℃で、32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたラットＬＡＴ１ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、３７℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
【００５７】
ノーザンブロッティングの結果（図５）、胃印環細胞癌細胞株、肺小細胞癌細胞株、黒色腫細胞株に４．０ｋｂの強いバンド、神経芽細胞腫細胞株に４．０ｋｂの弱いバンドが検出され、発現が認められた。
【００５８】
実施例２（中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１の特徴づけ）
（１）ＬＡＴ１の輸送活性における４Ｆ２ｈｃの役割
ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを単独で卵母細胞に発現させた場合と、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡと４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に卵母細胞に発現させた場合のロイシン取り込み活性を比較した。
【００５９】
ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡ２５ｎｇ、ラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡ２５ｎｇ、もしくはラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡ１２．５ｎｇ／ラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡ１２．５ｎｇを、卵母細胞に注入することによって発現させ、２日間あるいは５日間培養した。
【００６０】
ロイシンの取り込み実験は、前記実施例１（２）記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡ、ラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡ、もしくはラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、14Ｃ−ロイシン（５０μＭ）を含む取り込み用溶液中にて３０分培養して、細胞内への放射能の取り込みを測定した。
【００６１】
その結果（図６）、ロイシンの取り込みは、ＬＡＴ１のみを発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞と同レベルであったが、ＬＡＴ１と４Ｆ２ｈｃを共に発現させた卵母細胞ではおおきなロイシンの取り込みを示しており、ＬＡＴ１が機能を発揮するためには、４Ｆ２ｈｃが必要であると考えられた。
【００６２】
（２）ＬＡＴ１の輸送活性の塩依存性
ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡと４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に卵母細胞によるロイシン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。
【００６３】
ロイシンの取り込み実験は、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞を用い、前記実施例１（２）記載方法に準じて実施した。但し、取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、塩化コリン取り込み用溶液にかえて、ナトリウム取り込み用溶液（１００ｍＭ塩化コリンを１００ｍＭ塩化ナトリウムに変えたもの）を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、ナトリウム取り込み用溶液にかえて、グルコン酸取り込み用溶液（１００ｍＭ塩化ナトリウムを１００ｍＭグルコン酸ナトリウムに変えたもの）を用いた。
【００６４】
その結果（図７）、細胞外のコリンをナトリウムに変えても、細胞外の塩素イオンをグルコン酸イオンに変えても、ロイシン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＬＡＴ１はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存性に働くトランスポーターであることが示された。
【００６５】
（３）ＬＡＴ１のミカエリス−メンテン動力学試験
中性アミノ酸トランスポーターのミカエリス−メンテン動力学試験を行った。基質ロイシンの濃度の違いによるロイシン取り込み率の変化を調べることにより、中性アミノ酸トランスポーターのミカエリス−メンテン動力学試験を行った。
【００６６】
ロイシンの取り込み実験は、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞を用い、前記実施例１（２）記載方法に準じて実施した。その結果（図８）、Ｋｍ値は約２４μＭであった。
【００６７】
（４）ＬＡＴ１の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
【００６８】
ロイシンの取り込み実験は、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞を用い、前記実施例１（２）記載方法に準じて実施した。但し、コリン取り込み用溶液を用い、２ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、14Ｃ−ロイシン（２０μＭ）の取り込みを測定した。
【００６９】
その結果（図９）、各種の中性アミノ酸で、ｃｉｓ−阻害効果が観察された。特に、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、バリンはＬＡＴ１を介した14Ｃ−ロイシンの取り込みを強く阻害した。また、標準アミノ酸以外の物質でも、Ｌ−ＤＯＰＡ（パーキンソン病治療薬）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）（抗腫瘍薬）、トリヨードサイロニン（甲状腺ホルモン）、サイロキシン（甲状腺ホルモン）などの薬物や生理活性物質もＬＡＴ１を介した14Ｃ−ロイシンの取り込みを阻害した。さらに中性アミノ酸取り込み阻害薬として知られていた２−アミノ−２−ノルボルナン−カルボン酸（２−ａｍｉｎｏ−２−ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＣＨ）もＬＡＴ１を介した14Ｃ−ロイシンの取り込みを阻害した。酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸は、ＬＡＴ１を介した14Ｃ−ロイシンの取り込みに影響を与えなかった。
【００７０】
（５）ＬＡＴ１の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、ＬＡＴ１による取り込みを調べた。
【００７１】
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、ラットＬＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを共に注入した卵母細胞を用い、前記実施例１（２）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、14Ｃ−ロイシンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
【００７２】
その結果、ロイシン（14Ｃ化合物）、イソロシン（14Ｃ化合物）、フェニルアラニン（14Ｃ化合物）、メチオニン（14Ｃ化合物）、チロシン（14Ｃ化合物）、ヒスチジン（14Ｃ化合物）、トリプトファン（14Ｃ化合物）、バリン（14Ｃ化合物）を基質とした場合に、卵母細胞への取り込みが認められた。
【００７３】
実施例２  中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１の抑制による細胞増殖の制御
（１）ＬＡＴ１抑制の細胞増殖抑制効果
ＬＡＴ１抑制薬によるＬＡＴ１抑制の細胞増殖に対する抑制効果を調べた。
【００７４】
ＬＡＴ１を高発現するラット肝細胞株をＷｉｌｌｉａｍ’ｓ培地で培養し、ＬＡＴ１を介する取り込みを阻害するＤ−ロイシンもしくはＢＣＨを２０ｍＭ培地に添加し、４８時間培養て、細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社製）を用いて検討した。細胞数は、４５０ｎｍにおける吸収（Ｏ．Ｄ．４５０）として測定した。
【００７５】
その結果（図１０）、Ｄ−ロイシンもしくはＢＣＨを添加した群は、Ｄ−ロイシンもしくはＢＣＨを添加しない対照群に比較して、細胞数に低下が認められ、ＬＡＴ１抑制による中性アミノ酸取り込み阻害により、細胞増殖が抑制されたと考えられた。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１およびその遺伝子は、薬物の細胞膜通過や血液組織関門通過のインビトロでの解析など、薬物動態や毒物動態の分子レベルでの解明や、細胞膜や血液組織関門を効率良く透過する薬物の開発に有用と考えられる。また、ＬＡＴ１は、腫瘍細胞に高レベルに発現し、その抑制により細胞増殖が抑えられることから、親和性の高い抑制薬の開発により、それを腫瘍増殖を抑制する薬物として使用し得ると考えられる。さらに、ＬＡＴ１が腫瘍細胞に高レベルに発現することから、ＬＡＴ１により高親和性に輸送される抗腫瘍薬として、腫瘍細胞により選択性の高い抗腫瘍薬を開発し得ると考えられる。
【００７７】
【配列表】
0004157192.tif 000002
0004157192.tif 000003
0004157192.tif 000004
0004157192.tif 000005
0004157192.tif 000006
0004157192.tif 000007
0004157192.tif 000008
0004157192.tif 000009
0004157192.tif 000010
0004157192.tif 000011
0004157192.tif 000012
0004157192.tif 000013
0004157192.tif 000014
0004157192.tif 000015
0004157192.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットＣ６グリオーマ由来ｍＲＮＡ及び／又はラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験の結果を示す図。
【図２】ラット中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１の疎水性プロットを示す図。
【図３】ラットの各臓器組織におけるＬＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した写真。
【図４】ラットの各培養細胞株におけるＬＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現とラット肝臓におけるＬＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより比較した結果を示した写真。
【図５】ヒトの各培養細胞株におけるＬＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した写真。
【図６】ラットＬＡＴ１遺伝子のｃＲＮＡ及び／又はラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験をｃＲＮＡ注入後２日又は５日で行った結果を示す図。
【図７】ラットＬＡＴ１遺伝子のｃＲＮＡ及びラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示す図。
【図８】ラットＬＡＴ１遺伝子のｃＲＮＡ及びラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において基質ロイシンの濃度の影響を調べた結果を示す図。
【図９】ラットＬＡＴ１遺伝子のｃＲＮＡ及びラット４Ｆ２ｈｃ遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種アミノ酸もしくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す図。
【図１０】培養ラット肝細胞株において、培地へのＤ−ロイシン又はＢＣＨ添加の細胞増殖への影響を調べた結果を示す図。
【図１】
0004157192.tif 000017
【図２】
0004157192.tif 000018
【図３】
0004157192.tif 000019
【図４】
0004157192.tif 000020
【図５】
0004157192.tif 000021
【図６】
0004157192.tif 000022
【図７】
0004157192.tif 000023
【図８】
0004157192.tif 000024
【図９】
0004157192.tif 000025
【図１０】
0004157192.tif 000026