(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0004125904.tif 000024
［式中、Ｒ１は−ＣＨＯまたは−ＣＨ２Ｒ４（Ｒ４はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ２およびＲ３は一方が水素原子、他方が水素原子、ヒドロキシ、または保護されたヒドロキシ；またはＲ２とＲ３が一緒になってオキソ］で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有するＧＭ−ＣＳＦ様医薬組成物。
【請求項２】
一般式（Ｉ）：
【化２】
0004125904.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）：
【化３】
0004125904.tif 000026
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
【請求項４】
一般式（Ｉ）：
【化４】
0004125904.tif 000027
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項５】
腫瘍が造血器腫瘍である請求項４記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）：
【化５】
0004125904.tif 000028
（式中、Ｒ１は−ＣＨＯまたは−ＣＨ２Ｒ４（Ｒ４はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ２およびＲ３はともに水素原子）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
【請求項７】
式：
【化６】
0004125904.tif 000029
で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
【請求項８】
請求項６または７に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項９】
ＧＭ−ＣＳＦ様活性を有する請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の化合物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【請求項１１】
請求項６または７に記載の化合物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
【請求項１２】
請求項６または７に記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤
【請求項１３】
腫瘍が造血器腫瘍である請求項１２記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を有する医薬組成物および新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＧＭ−ＣＳＦはコロニー刺激因子の一種であり、顆粒球、マクロファージの前駆細胞に作用し、それらの増殖と分化を促進する。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ様作用を有する化合物は、骨髄細胞等に働きかけ、好中球の増殖および分化を促進する作用を有し、好中球減少症等に使用しうる。ＧＭ−ＣＳＦ製剤としては、ムラミルジペプチド誘導体であるロムルチド（特開昭５８−１７２３９９）が知られている。
好中球の分化増殖を示す刺激因子としては、他にＧ−ＣＳＦがあり、リコンビナントＧ−ＣＳＦタンパク製剤として、フィルグラスチム（特表昭６１−５００６３６）、レノグラスチム（特開昭６４−８５０９８）、ミリモスチム（特開昭５７−５８６２９）等が市販されている。また、Ｇ−ＣＳＦ様作用を示す低分子化合物としては、ＳＢ−２４７４６４（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８），２８１（５３７４），２５７−２５９））等が知られている。
ビニグロール（Ｖｉｎｉｇｒｏｌ）およびビニグロール誘導体が抗血小板凝集作用および血圧降下作用を有することが特開昭６３−２１５６５０に記載されている。また、ビニグロールが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）拮抗作用を有することが特表平５−５０４１３０に、ヒト免疫不全ウイルス感染症の治療剤として有用であることが特開平７−２０６６６８に記載されている。さらに、ビニグロールを含むサイトカインの生産を抑制する抗炎症性薬剤および免疫抑制剤を含有する薬剤が自己免疫疾患に有効であることが特表平１１−５１５０２０に、ビニグロールを含むＴＮＦ拮抗剤および選択的ＣＯＸ−ＩＩ阻害剤を含有する薬剤が炎症性疾患に有用であることがＷＯ０１／００２２９に記載されている。しかし、これらの文献においてＧＭ−ＣＳＦに関する記載はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を有する医薬組成物および新規化合物を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、不完全菌類に属する、ブロキサミア  クレメア  ＲＦ−１９４５株の醗酵液から単離された化合物およびそれらの誘導体が、ＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用をを有することを見出した。すなわち、Ｉ）一般式（Ｉ）：
【化７】
0004125904.tif 000002
［式中、Ｒ1は−ＣＨＯまたは−ＣＨ2Ｒ4（Ｒ4はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ2およびＲ3は一方が水素原子、他方が水素原子、ヒドロキシ、または保護されたヒドロキシ；またはＲ2とＲ3が一緒になってオキソ］で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有するＧＭ−ＣＳＦ様医薬組成物、に関する。
【０００５】
さらには、以下のＩＩ）〜ＸＩＶ）に関する。
ＩＩ）一般式（Ｉ）：
【化８】
0004125904.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【０００６】
ＩＩＩ）一般式（Ｉ）：
【化９】
0004125904.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
【０００７】
ＩＶ）一般式（Ｉ）：
【化１０】
0004125904.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【０００８】
Ｖ）腫瘍が造血器腫瘍であるＩＶ）記載の抗腫瘍剤。
ＶＩ）一般式（Ｉ）：
【化１１】
0004125904.tif 000006
（式中、Ｒ1は−ＣＨＯまたは−ＣＨ2Ｒ4（Ｒ4はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ2およびＲ3はともに水素原子）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
【０００９】
ＶＩＩ）式：
【化１２】
0004125904.tif 000007
で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
ＶＩＩＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
ＩＸ）ＧＭ−ＣＳＦ様活性を有するＶＩＩＩ）記載の医薬組成物。
Ｘ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
ＸＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
ＸＩＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
ＸＩＩＩ）腫瘍が造血器腫瘍であるＸＩＩ）記載の抗腫瘍剤。
ＸＩＶ）ブロキサミア(Bloxamia)属に属する微生物を培養し、得られた培養物から産生された化合物を分離、精製する工程を包含する請求項ＶＩ）またはＶＩＩ）のいずれかに記載の化合物の製造方法。
【００１０】
本明細書中、「保護されたヒドロキシ」とは、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons)等に記載された、通常用いられるヒドロキシの保護基で保護されたヒドロキシを意味する。例えば、ｔ−ブチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、トリチル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メタンスルホニル、アセチル、ピバロイル、ベンゾイル、テトラヒドロピラニル等で保護されたヒドロキシが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明化合物（Ｉ）の製造方法を説明する。製造法としては、微生物の発酵生産物から分離採取する方法（抽出法）、およびそれらを出発原料として化学合成（合成法）する方法が挙げられる。
抽出法においては、本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物を通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養し、通常の発酵生産物を分離採取する方法により化合物（Ｉ）を単離する。
本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物としては、ブロキサミア(Bloxamia)属に属する微生物、例えばブロキサミア  クレメア(cremea)  ＲＦ−１９４５株が例示される。ブロキサミア  クレメア  ＲＦ−１９４５は以下のような形態学的性状を有していた。
【００１２】
コーンミール寒天平板培地上での生育はやや遅く、コロニーは無色、コロニーの裏面も無色で、色素を産生せず、気中菌糸は認められなかった。
寒天中に埋没した栄養菌糸は無色で表面は平滑、幅は1.0μｍ〜2.0μｍで多細胞からなり、分枝する。分生子柄は培地上の菌糸組織からなる無色のストロマから直立、集合し、濃茶色から黒色で不定形のスポロドキアを形成する。個々の分生子柄は長さ30.0μｍ〜40.0 μｍ、幅2.0μｍ〜2.5μｍの円筒形で多細胞、基部は薄茶色で上方に向かって濃度を増し先端は濃茶色、表面は滑沢である。
分生子形成細胞は分生子柄と一体化し、分生子形成様式は単出芽型である。
内生の分生子は単細胞で、長さ2.5μｍ〜4.0μｍ、幅2.0μｍの短円柱形を呈し、無色で、表面は平滑、スポロドキア上で集合しクリーム状の粘塊となる。
ポテト・デキストロース寒天平板培地上での生育はやや遅く、コロニーは無色、コロニーの裏面も無色で、色素の産生は認められず、植菌寒天片周辺で若干の気中菌糸を形成した。スポロドキアの形成は認められなかった。10.5〜32.0℃の範囲で生育し、生育至適温度は19.0〜29.0℃であった。
テレオモルフはいずれの培地上でも観察されなかった。
以上の所見から、本菌株はブロキサミア属(Bloxamia)に属する不完全菌であると推察し、文献（Pirozynski, K.A., and G. Morgan-Jones. 1968. Notes on Microfungi. III. Trans. Brit. Mycol. Soc. 51:185-206 7904, Nag Raj & Kendrick. 1975. A Monograph of Chalara and Allied Genera. Wilfred Laurier Univ. Press, Waterloo, Canada, B. J. Coppins & D. W. Minter., 1980. A new Hyphomycete from Northumberland. Notes R. B. G. Edinb. 38(2): 363-635, Arambarri, A., M. Cabello, and C. Cazau. 1992. A new hyphomycete from Santiago River. V. Bloxamia cremea. Mycotaxon 43:327-330）に記載されているブロキサミア属の既知種と比較した。その結果、上記の形態学的特徴から、本菌株をブロキサミア  クレメア(Bloxamia cremea)と同定した。
【００１３】
尚、本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号「Ｐ−１８７５５」として平成１４年（２００２年）３月８日に寄託されている。
【００１４】
本発明化合物（Ｉ）の生産用培地としては、炭素源、窒素源および無機塩を適当に含有するものであれば合成培地または天然培地のいずれでも好適に用いることができる。必要に応じて、ビタミン類またはその他栄養物質を適宜加えてもよい。
【００１５】
炭素源としては例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、シュークロース、デンプン等の糖類、グリセロール、マンニトール等のアルコール類、グリシン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類、大豆油、オリーブ油等の油脂類等の一般的な炭素源より微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。
窒素源としては、大豆粉、コーンスチープリカー、ビーフエキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸混合物、魚粉等の有機含窒素化合物またはアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素化合物等が挙げられ、微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。無機塩としては、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩を必要に応じて添加すればよい。
また、消泡剤、例えば植物油、ポリプロピレングリコール等は必要に応じて添加することができる。
【００１６】
培養温度は微生物が発育し、本発明化合物（Ｉ）を生産する範囲で適宜変更できるが、好ましくは１０℃〜３２℃であり、さらに好ましくは２０℃〜２５℃である。初発ｐＨは６〜８付近が好ましく、培養時間は通常数日〜数週間程度であるが、本発明化合物（Ｉ）の生産量が採取可能な量に達した時、好ましくは最高に達したときに培養を終了すればよい。培養法は固層培養、通気攪拌培養等の通常用いられる方法であればいずれも好適に用い得る。
【００１７】
培養物から発酵生産物を分離採取する方法には、濾過、遠心分離、各種イオン交換樹脂やその他の活性吸着やクロマトグラフィー、各種有機溶媒による抽出等を適当に組み合わせた通常の発酵生産物分離精製法を用いることができる。例えば、培養物を、酢酸エチル、ｎ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン等の有機溶媒で抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーを組み合わせて分離精製すればよい。
【００１８】
一般式（Ｉ）で表される化合物の合成法としては、上記の方法で得られた抽出物を出発原料にして行うことができる。例えば、下記に示す化合物（Ａ）：
【化１３】
0004125904.tif 000008
を出発原料にして、アセチルオキシ基の脱保護反応、脱保護反応によりえられヒドロキシ基を有する化合物の保護や酸化反応を行うことにより種々の化合物を合成することができる。
【００１９】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物は、特開昭６３−２１５６５０に記載された下記に示す化合物（Ｂ）：
【化１４】
0004125904.tif 000009
（ＦＲ−９００４７８（ビニグロール））を出発原料として、特開昭６３−２１５６５０等に記載の方法に従って、ヒドロキシ基の保護や酸化反応を行うことによっても合成することができる。特開昭６３−２１５６５０には、式：
【化１５】
0004125904.tif 000010
（式中、Phはフェニル、TBDMSはｔ−ブチルジメチルシリル、およびAcはアセチル）で表される化合物が具体的に記載されている。
また、J. Org. Chem., 1993, 58, 2349、Synlett., 1996, 625、Synlett., 1996, 1057および219、J. Org. Chem., 1997, 62, 5062等に記載されている方法に従って化合物（Ｂ）を合成することもできる。
【００２０】
ヒドロキシ基の保護および脱保護を行う場合は、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons)等に記載の方法に従って行うことができる。
１級および２級のヒドロキシ基を有する化合物は、導入するヒドロキシ基の保護基の種類や反応条件等によって、一方のヒドロキシ基のみが保護される場合および両方のヒドロキシ基が保護される場合がある。両方のヒドロキシ基が保護された場合は一方のみを脱保護することもできる。それぞれのヒドロキシ基を異なる保護基で保護することもできる。
【００２１】
ヒドロキシ基をアセチルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をピリジン等の塩基の存在下、無水酢酸、塩化アセチル等で処理すること等により行うことができる。アセチル基の脱保護は、保護されたヒドロキシ基を有する化合物を、メタノール等の溶媒中で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基で処理することにより行うことができる。ピバロイル、ベンゾイル等で保護・脱保護する場合も同様に行うことができる。
ヒドロキシ基をシリルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をイミダゾール、トリエチルアミン等の塩基の存在下、また必要に応じてジメチルアミノピリジンの存在下、ハロゲン化シリルと処理するか、２，６−ルチジン等の塩基の存在下、シリルトリフラートで処理すること等により行うことができる。シリル基の脱保護は、保護されたヒドロキシ基を有する化合物を、テトラヒドロフラン−酢酸−水で処理するか、適当な溶媒中、ｎ−テトラブチルアンモニウムフルオリドで処理すること等により行うことができる。
ヒドロキシ基をベンジルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をアルコキシド等の塩基の存在下、ハロゲン化ベンジルと処理すること等により行うことができる。ベンジル基の脱保護は水素添加等により行うことができる。ｐ−メトキシベンジル等で保護・脱保護する場合も同様に行うことができる。
酸化反応を行う場合は、ジョーンズ酸化、コリンズ酸化、ＰＣＣ酸化、スワン酸化等、通常用いられる酸化反応を行うことができる。
【００２２】
「本発明化合物」という場合には、製薬上許容される塩、またはその水和物も包含される。例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウム等）、アンモニウム、有機塩基およびアミノ酸との塩、または無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等）、および有機酸（酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）との塩が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
【００２３】
また、本発明化合物は特定の異性体に限定するものではなく、全ての可能な異性体やラセミ体を含むものである。
本発明化合物は後述する実験例の記載の通り、優れたＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を示す。好中球減少症、例えば、癌における化学療法による好中球減少症、癌における放射線療法による好中球減少症、骨髄異形成症候群による好中球減少症、再生不良性貧血による好中球減少症、骨髄移植による好中球減少症、腎移植による好中球減少症、免疫抑制療法による好中球減少症等の治療または予防剤として使用しうる。抗腫瘍剤としては、特に、造血器腫瘍、例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、小児白血病、慢性骨髄増殖性疾患（真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症）、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄腫類縁疾患、血球貪食症候群等の治療または予防剤として使用しうる。
本発明化合物を、上記の疾患の治療を目的としてヒトに投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本化合物の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。
投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に経口で投与する場合、通常０．１〜１００mg／kg／日であり、好ましくは１〜２０mg／kg／日である。
【００２４】
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
１）培養法
玄米25g、乾燥オカラ(自家製)3g、グルコース0.5g、イーストエキストラクト（ディフコ社製）0.1g、水道水50mlの組成からなる培地を含む500ml容広口三角フラスコを、121℃、30分間オ−トクレ−ブ滅菌した。ブロキサミア  クレメア  RF-19445株の寒天平板培養菌を無菌水(4ml)に懸濁した液4mlをこの培地に接種し、23℃、14日間静置培養を行う。
２）抽出法
培養が終了したフラスコに、１本当たり70mlのエタノールを加え、3日間室温抽出し、エタノール抽出液を得た。エタノール抽出液を蒸留水(1L)で希釈後、固相抽出担体(GL-Pak PLS-2,0.5g)にロードし水洗後(10ml)、吸着物をジメチルスルホキシド(4ml)で溶出した。
３）化合物（１）および化合物（２）の分離法
ジメチルスルホキシド溶出液1mlを高速液体クロマトグラフィー［カラム：Symmetry C18,7μm,19ｘ150mm (ウォーターズ社製)．溶出液：A液0.1%ギ酸／水、B液0.1%ギ酸／アセトニトリル(60%A/40%B〜5%A/95%B)のリニアグラジエント(18分)．流速：30ml／分．検出：紫外部210,254nm］に付し、保持時間11.2分付近に検出される化合物（１）と15.2分付近に検出される化合物（２）のピークを分取した。分離操作を4回繰り返し、各ピークを合した後、減圧下濃縮乾燥した。化合物（１）1.2mgと化合物（２）11.8mgの無色ガム状物を得た。
４）化合物（３）から化合物（１）の合成法
化合物（３）22mgにピリジン22μl、無水酢酸15μlを加えコルベン中室温で4時間攪拌した。反応液は減圧下溶媒留去し、オイル状物24mg得た。反応物は高速液体クロマトグラフィー［カラム：Symmetry C18,7μm,7.8ｘ150mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分)．流速：6ml／分．検出：紫外部210,254nm］に付し、保持時間3.2分付近のピーク(化合物（３，ビニグロール）)7.3mg、保持時間5.5分付近の目的ピーク(化合物（１）)12.9mg、ジアセチル体1.4mgを単離した。上記の天然から単離した化合物（１）と合成品のLC-MS、1H-NMRを測定し比較同定した。
【００２６】
化合物（１）および化合物（２）の物理的および化学的性質を以下に示す。
化合物（１）
【化１６】
0004125904.tif 000011
形状：無色ガム状物
[α]D24：−81.6±1.6°(c 0.75,CHCl3)
IR(CHCl3)cm-1 ：3604, 3550, 2959, 1733, 1464, 1375, 1147, 1105, 1024, 1004
ESI-MS(m/z)：387(M+Na)+, 751(2M+Na) +, 409(M+HCOO)-, 773(2M+HCOO)-
1H-NMR(CDCl3,δ)： 0.90(d, J=6.7Hz, 3H), 0.97(d, J=6.9Hz, 3H), 0.98(d,J=6.7Hz,3H), 0.98(d, J=6.7Hz, 3H), 1.11(m, 1H), 1.15(m, 1H), 1.21(m, 1H), 1.25(m, 1H), 1.34(m, 1H), 1.35(m, 1H), 1.55(m, 1H), 1.60(m, 1H), 1.64(m, 1H), 1.72(s, 1H), 1.73(m, 1H), 1.78(dt, J=12.6, 4.7Hz), 1.97(m, 1H), 2.08(s, 3H), 2.13(m, 1H), 2.27(d, J=5.6Hz, 1H), 2.32(d, J=3.8Hz, 1H), 2.83(d, J=8.3, 1H), 4.05(d, J=8.3Hz, 1H), 4.67(d, J=12.2Hz, 1H), 4.85(d, J=12.2Hz, 1H), 5.90(d, J=5.6Hz, 1H)
13C-NMR(CDCl3, δ)： 15.23(q), 20.50(q), 20.98(q), 21.48(q), 24.82(q), 27.23(t), 28.56(t), 28.78(t), 29.61(t), 33.04(d), 34.56(d), 35.88(d), 40.50(d), 44.26(d), 45.53(d), 51.31(d), 66.60(t), 70.27(d), 75.74(s), 130.28(d), 133.63(s), 171.06(s)
溶解性：メタノール、アセトン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水に難溶。
HPLC：[カラム：Symmetry C18,5μm, 3.9ｘ50mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分), 流速：1ml／分．検出：紫外部210,254nm] 保持時間：4.52分
【００２７】
化合物（２）
【化１７】
0004125904.tif 000012
形状：無色ガム状物
[α]D24：−42.3±1.1° (c 0.757,CHCl3)
IR(CHCl3)cm-1 ：3597, 2958, 1729, 1463, 1376, 1139, 1097, 1024, 984, 962ESI-MS(m/z)：371(M+Na)+, 719(2M+Na)+, 393(M+HCOO)-, 741(2M+HCOO)-
1H-NMR(CDCl3,δ)： 0.93(d, J=6.8Hz, 3H), 0.95(d, J=6.7Hz, 3H), 0.97(d, J=6.7Hz, 3H), 1.01(d, J=7.0Hz, 3H), 1.09(m, 1H), 1.32(m, 1H), 1.34(m, 1H), 1.34(m, 2H), 1.48(m, 1H), 1.53(m, 1H), 1.55(m, 1H), 1.63(m, 1H), 1.74(m, 1H), 1.85(m, 1H), 1.87(m, 1H), 2.06(s, 3H), 2.08(m, 1H), 2.12(m, 1H), 2.25(m, 1H), 2.26(m, 1H), 2.59(m, 1H), 4.43(d, J=12.0Hz, 1H), 4.55(d, J=12.0Hz, 1H), 5.77(d, J=5.8Hz, 1H)
13C-NMR(CDCl3,δ)： 15.98(q), 20.30(q), 20.94(q), 21.35(q), 25.76(q), 28.08(t), 28.18(t), 29.36(t), 29.50(t), 30.21(t), 33.58(d), 34.87(d), 35.96(d), 39.84(d), 40.00(d), 45.57(d), 46.04(d), 68.59(t), 75.01(s), 127.61(d), 132.59(s), 170.94(s)
溶解性：メタノール、アセトン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水に難溶。
HPLC：[カラム：Symmetry C18,5μm, 3.9ｘ50mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分), 流速：1ml／分．検出：紫外部210,254nm] 保持時間：6.55分
【００２８】
化合物（３，ビニグロール）の構造式を以下に示す。
【化１８】
0004125904.tif 000013
【００２９】
試験例１−１  ヒトGM-CSF依存性細胞株（TF-1細胞）に対する増殖誘導効果
96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり5x103個のヒトGM-CSF依存性細胞TF-1細胞を0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、及び2-メルカプトエタノ−ル5x10-5Mを添加）に浮遊させ、その各ウェルに化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）をそれぞれ種々の濃度で加えた。各ウェルの最終容量は0.2mlとした。各被験化合物はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記RPMI1640培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように調製した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、72時間培養し、ハ−ベストする6時間前に3H-チミジン(18.5KBq/ウェル)を添加し、細胞をパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。各検体についてtriplicateで行った。結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】
0004125904.tif 000014
表１に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）は、ヒトGM-CSF依存性細胞株の増殖を誘導することから、GM-CSF様活性を有する。
【００３１】
試験例１−２  ヒトGM-CSF依存性細胞株（F36P細胞）に対する増殖誘導効果
試験例１−１の反応において、TF-1細胞の代わりにヒトGM-CSF依存性細胞株であるF36-P細胞を用いて化合物（１）の増殖誘導効果を検討した。方法は以下に記すＭＴＴ方法で行った。即ち、96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり1x104個のF36P細胞を0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、及び2-メルカプトエタノ−ル5x10-5Mを添加）に浮遊させ、その各ウェルに化合物（１）を種々の濃度で加えた。各ウェルの最終容量を0.2mlとした。被験化合物は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記RPMI1640培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、3日間培養し、培養終了後、6mg/mlのMTT[3-(4,5-ジメチルチアゾ−ル-2イル)-2,5-ジフエニルテトラゾリウムブロマイド](シグマ製)溶液を25μl各ウェルに加え、37℃にて4時間同一条件下で培養した。培養終了後、生成したホルマザンを、各ウェル50μlずつ20%ドデシルナトリウムスルホン酸(SDS)を加えた0.02N-塩酸溶液を加え、37℃、24時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成、溶解したホルマザンを570nmのフィルタ−を装着したイムノリ−ダ−(InterMed)で570nmにおける吸光強度(OD)を測定した(ザ ジャ−ナル オブ イムノロジカル メソッド，65巻，55〜63頁，1983年参照)。結果を表２に示した。
【００３２】
【表２】
0004125904.tif 000015
表２に示すように、化合物（１）は、ヒトGM-CSF依存性細胞株の増殖を誘導することから、GM-CSF様活性を有する。
【００３３】
試験例２  ヒト骨髄由来単核球細胞に対する効果(コロニーアッセイ)
ヒト骨髄細胞由来単核球細胞(BioWhittaker Inc., USA)1x105個をMegaCult-C Serum Free Medium without Cytokine培地(StemCell Technologies Inc., Canada)に添加し、更に化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）を表３に記した濃度になるようにそれぞれ加え、最終0.75mlとして2ウェルチャンバースライドの各ウェルに入れた。それらを湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、8日間培養し、顕微鏡観察により形成されたコロニー（構成細胞数10個以上）を顆粒球、顆粒球／マクロファージ、マクロファージのコロニーとして計数し、それぞれduplicateで行った。結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
0004125904.tif 000016
表３に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）を添加したウェルでは、無添加のコントロール(Medium)に比し明らかなコロニー数の増加が観察できた。特に顆粒球コロニーの増加を認めた。
【００３５】
試験例４  ヒト骨髄由来単核球細胞に対する効果(増殖能)
試験例２と同様の細胞を、96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり1.3x105個となるように、0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを添加）に浮遊させた。その各ウェルにリコンビナントヒトGM-CSF(rhGM-CSF)、化合物（１）、および化合物（２）をそれぞれ種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を0.2mlとした。各被験物質はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記培地にて希釈し最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、4日間培養し、ハ−ベストする18時間前に3H-チミジン(18.5KBq/ウェル)でパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。実験はtriplicateで行った。結果を表４に示した。
【００３６】
【表４】
0004125904.tif 000017
表４に示すように、化合物（１）および化合物（２）はコロニー形成能だけでなく骨髄細胞の増殖を促した。
【００３７】
試験例４  マウス骨髄細胞の増殖に対する効果
Balb/Cマウス（8週令、雄性、日本クレア）の大腿骨より骨髄細胞を採取し、ナイロンメッシュを通過させた。得られた細胞を96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに4x105個となるように0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを添加）に浮遊させた。その各ウェルにリコンビナントヒトGM-CSF(rhGM-CSF)、化合物（１）、および化合物（２）を種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を0.2mlとした。各被験物質はそれぞれジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。細胞を添加した96ウェルマクロタイタ−プレ−トを湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、5日間培養し、ハ−ベストする18時間前に3H-チミジン(18.5KBq/ウェル)でパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。結果を表５に示した。
【００３８】
【表５】
0004125904.tif 000018
表５に示すように、化合物（１）および化合物（２）はマウス骨髄細胞の増殖を有意に誘導した。
【００３９】
試験例５  抗細胞増殖効果
96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに各細胞を表６で示した細胞数となるように0.1mlのスケ−ルで加え、0〜10,000ng/mlとなるように化合物（１）を0.1ml添加した。3日間培養した後、6mg/mlのMTT[3-(4,5-ジメチルチアゾ−ル-2イル)-2,5-ジフエニルテトラゾリウムブロマイド](シグマ製)溶液を25μlずつ各ウェルに加え、37℃にて4時間同一条件下でインキュベートした。生成したホルマザンを、各ウェルあたり50μlの20%ドデシルナトリウムスルホン酸(SDS)−0.02N-塩酸溶液を加え、37℃、24時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成したホルマザンを570nmのフィルタ−を装着したイムノリ−ダ−(InterMed)で測定した(ザ ジャ−ナル オブ イムノロジカル メソッド，65巻，55〜63頁，1983年参照)。化合物（１）の濃度と吸光強度との相関より50%の細胞増殖阻止濃度(IC50値)を算出した。結果を表６に示した。
【００４０】
【表６】
0004125904.tif 000019
表６に示すように、化合物（１）は正常羊膜細胞FLには作用が弱く、腫瘍細胞に対して効果を有する。
【００４１】
上記試験例１〜５に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子様活性、免疫賦活作用、及び腫瘍細胞増殖抑制作用の生物学的活性を有する。
【００４２】
製剤例
製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。
0004125904.tif 000020
式（Ｉ）で表わされる化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをV型混合機にて混合する。混合末にＨＰＣ−Ｌ（低粘度ヒドロキシプロピルセルロース）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒  孔径０．５〜１ｍｍ）したのち、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（１２／６０メッシュ）で櫛過し顆粒剤を得る。
製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
0004125904.tif 000021
式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチは１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをV型混合機にて混合する。１０倍散１００ｍｇを５号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【００４３】
製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
0004125904.tif 000022
式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらを混合し、混合末にＨＰＣ−Ｌ溶液を添加して練合、造粒、乾燥する。得られた乾燥顆粒を整粒後、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例４
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
0004125904.tif 000023
式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖、微結晶セルロース、ＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロース  ナトリウム塩）を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウム混合し、製錠用混合末を得る。本混合末を直打し、１５０ｍｇの錠剤を得る。
【発明の効果】
本発明化合物は、ＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を有し、好中球減少症の治療または予防剤、免疫賦活剤、抗腫瘍剤（抗造血器腫瘍剤）等として有効に機能し得ることを見出した。