(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有するポリペプチドであって、一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含み、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、
0004125373.tif 000007
から選択されるところの、ポリペプチド。
【請求項２】
さらに、ポリペプチドのカルボキシル末端およびアミノ末端にてシステイン残基を有し、そのシステイン残基によるジスルフィド結合の形成を介して環状ポリペプチドを形成することのできる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
さらに、ポリペプチドのカルボキシル末端およびアミノ末端からなる群より選択される少なくとも一つの位置にて付加的なアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、その付加的なアミノ酸残基がシステイン、リシン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、トリプトファン、セリン、スレオニンおよびアスパラギン酸からなる群より選択されるところの、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
その付加的なアミノ酸残基が誘導化されているか、または誘導化可能であるところの、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
末端アミノ酸残基がＳ−（２−ピリジル）ジチオで誘導化されたシステインであるところの、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有するマルチマーポリペプチドであって、一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含むポリペプチド成分を少なくとも２つ含み、ここでそのポリペプチド成分が
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、リシン誘導体、トリス（アミノエチル）アミンおよび１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸からなる群より選択されるコア構造体に共有結合されており、
0004125373.tif 000008
から選択される、マルチマーポリペプチド。
【請求項７】
コア構造体が多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を含むところの、請求項６記載のマルチマーポリペプチド。
【請求項８】
マルチマーポリペプチドが少なくとも２つの、多くて８つのポリペプチド成分を含むところの、請求項６記載のマルチマーポリペプチド。
【請求項９】
ＭＡＰペプチドが（Ｌｙｓ）4（Ｌｙｓ）2Ａｌａ−ＯＨを含むところの、請求項６記載のマルチマーポリペプチド。
【請求項１０】
宿主たんぱく質と、挿入体として、補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有するポリペプチドとを含むキメラポリペプチドであって、補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３から由来の部分配列だけを有するポリペプチドが一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含み、補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３から由来の部分配列だけを有するポリペプチドが
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、
0004125373.tif 000009
から選択され、
その補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３から由来の部分配列だけを有するポリペプチドが宿主たんぱく質中に挿入されている、キメラポリペプチド。
【請求項１１】
宿主たんぱく質が補体受容体１の少なくとも一つの短コンセンサス繰り返し配列を含有するところの、請求項１０記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
宿主たんぱく質が血漿たんぱく質であるところの、請求項１０記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有し、一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含み、かつ
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、
0004125373.tif 000010
から選択される、ポリペプチドの製法であって、ペプチド単位を固相合成にて縮合させてポリペプチドを形成し、そのポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
【請求項１４】
補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有し、一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含み、かつ
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、
0004125373.tif 000011
から選択される、ポリペプチドの製法であって、組換え宿主細胞において該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させ、該ポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
【請求項１５】
補体受容体１の短コンセンサス繰り返し配列３（short consensus repeat 3（SCR-3））から由来の部分配列だけを有し、一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ
の６ないし２３アミノ酸部分を含み、かつ
（ａ）配列番号：１のアミノ酸６−１１、および
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸１１−２０
からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有し、
0004125373.tif 000012
から選択される、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
発現ベクター中にあるところの、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
形質転換またはトランスフェクションにより、発現ベクター中にあり、その発現ベクターが宿主細胞中にあるところの、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
本発明はポリペプチドおよびその診断における使用および補体活性が関与する障害および種々の炎症および免疫障害の治療法に関する。
正常な血清中約１０％のグロブリンを構成し、補体系は免疫系の外来抗原に対する応答において重要な多くの異なるたんぱく質から成る。補体系はその主成分が開裂し、生成物が単独でまたは他のたんぱく質と合わせて追加的補体たんぱく質を活性化し、その結果タンパク分解カスケードがもたらされる場合に活性化される。補体介の活性化は血管浸透性の増加、食細胞の走化性、炎症性細胞の活性化、外来粒子のオプソニン作用、細胞の直接的抑制および組織損傷などの種々の応答につながる。補体系の活性化は抗原−抗体複合体（古典的経路）または、例えば病原菌細胞壁に存在するリポ多糖類により（別の経路）誘発される。
補体活性化（ＣＡ）は広範囲の急性炎症プロセス、特に虚血および再灌流傷害に関連するプロセスにおいて起こることが知られている［ロッセン（Ｒｏｓｓｅｎ）ら、１９８５、サーキュレイション・リサーチ（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．）、５７、１１９；モーガン、ビー・ピー（Ｍｏｒｇａｎ  Ｂ．Ｐ．）、１９９０  補体活性化の生物学的効果  コンプリメント、クリニカル・アスペクツ・アンド・リレバンス・トウ・ディジーズ（’Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ’Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）］。
古典的な補体カスケードの成分の少なくとも一部はＡＤ脳における老年斑と密接に関連して免疫組織化学的方法により検出できることが一般に知られている[エイケレンブーム（Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９４、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５９、５６１−５６８］。Ｃ１、Ｃ３およびＣ４の関与についての良好な証拠はあるが、Ｃ５−Ｃ９膜−攻撃複合体（ＭＡＣ）の存在についての証拠はまだ明らかでない［ビールイス（Ｖｅｅｒｈｕｉｓ）ら、１９９５、Ｖｉｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４２６、６０３−６１０］。ＣＮＳの細胞は、補体成分を合成することが立証されていて［総説については、バーヌン（Ｂａｒｎｕｍ）、１９９５  クリティカル・レビューズ・オブ・オーラル・バイオロジカル・メジシン（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ）、６、１３２−１４６］、Ｃ３の産生はｂＡ４ペプチドとのインキュベーションに応答して向上する［ハガ（Ｈａｇａ）ら、１９９３  ブレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．）、６０１、８８−９４］。このような補体は脳において局所的にそれ自身誘発できるが、必ずしも血漿部分からのみ由来するわけではない。
特に興味深いのは、ｂＡ４ペプチドが補体カスケード（Ｃｌｑ）の第一成分と直接結合し、全古典的補体系ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＭＡＣを包含）を抗体独立機構により開始することが判明していることである［ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、１９９２、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８９、１００１６−１００２０；ジアン（Ｊｉａｎｈ）ら、１９９４、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５２、５０５０−５０５９］。この相互作用は、βＡ４の６ないし１６領域およびＣ１ｑＡ鎖のコラーゲン様尾領域の１４ないし２６領域が関与するようである。後者の部位をＣ１ｑの球状ヘッド領域状に位置するＩｇＧ−免疫複合体結合部位から分離する。繊維状ｂＡ４がモノマーペプチドよりもＣ１ｑに対して高い親和性で結合して、病気の進行において補体の活性化について合理的な基礎をもたらしうることの証拠がある［ジャン（Ｊｉａｎｇ）ら、１９９４、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５２、５０５０−５０５９；シンダー（Ｓｙｎｄｅｒ）ら、エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．）、１２８、１３６−１４２］。
Ｉ型補体受容体（ＣＲ１）は赤血球、単核細胞／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、一部のＴ細胞、脾臓小胞樹状細胞、および糸球足細胞の膜上に存在することが判明している。ＣＲ１は補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂとも称する。ＣＲ１の１アロタイプの構造および一次配列は公知である［クリックシュタイン（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ）ら、１９８７、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６５：１０９５−１１１２、クリックシュタイン（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６８：１６９９−１７１７；ホーケイド（Ｈｏｕｒｃａｄｅ）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６８：１２５５−１２７０、ＷＯ  ８９／０９２２０、ＷＯ  ９１／０５０４７］。これは３０個の短コンセンサス繰り返し配列（ＳＣＲ）からなり、その各々は約６０ないし７０個のアミノ酸を含有する。各ＳＣＲにおいて平均６５個のアミノ酸のうち約２９個が保存されている。各ＳＣＲはジスルフィド結合において第３および第１ならびに第４および第２の半分のシスチンとのジスルフィド結合により三次元三重ループ構造を形成するとされている。ＣＲ１はさらに各７個のＳＣＲの４個の長相同性繰り返し配列（ＬＨＲ）として配列している。リーダー配列に続いて、ＣＲ１分子はＮ末端ＬＨＲ−Ａ、続く２個の繰り返し配列、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−Ｃ、ならびにＣ末端ＬＨＲ−Ｄとそれに続く２個の別のＳＣＲ、２５残基のトランスメンブラン領域および４３残基の細胞質尾部からなる。
予想されるＮ−末端グルタミン残基を有する成熟ＣＲ１分子（本明細書において以後残基１で示す）に基づいて、ＬＨＲ−Ａの初めの４個のＳＣＲ領域を本明細書において各々、２〜５８、６３〜１２０、１２５〜１９１および１９７〜２５２の成熟ＣＲ１からなると定義する。
ホーケイド（Ｈｏｕｒｃａｄｅ）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６８：１２５５−１２７０は、ＣＲ１の分泌形態を産生すると予想されるヒトＣＲ１転写単位中に交互のポリアデニル化部位を観察した。この截形配列によりコードされるｍＲＮＡはＣＲ１の初めの８．５ＳＣＲを含み、Ｃ４ｂ結合領域を含むと考えられる約８０ｋＤａの蛋白質をコードする。この截形配列に対応するｃＤＮＡをＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、発現した場合、これは予想されるＣ４ｂ結合活性を示すが、Ｃ３ｂと結合しない［クリヒ（Ｋｒｙｃｈ）ら、１９８９、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．３：Ａ３６８；クリヒ（Ｋｒｙｃｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）１９９１、８８、４３５３−７］。クリヒ（Ｋｙｒｃｈ）らは、さらに、いくつかのヒト細胞系において予想されるものと類似したｍＲＮＡを観察し、このようなＣ４ｂ結合活性を有するＣＲ１の截形可溶性形態はヒトにおいて合成できると仮定している。
加えて、マクライデス（Ｍａｋｒｉｄｅｓ）ら、［１９９２、ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６７（３４）２４７５４−６１）は、ＣＨＯ細胞中膜結合蛋白質としてＬＨＲ−ＡのＳＣＲ１＋２および１＋２＋３＋４を発現した。
数個のＣＲ１の可溶性フラグメントも、ＤＮＡが発現されるトランスメンブラン領域を除去することにより組み換えＤＮＡ法により産生されている（ＷＯ  ８９／０９９２０、ＷＯ９１／０５０４７）。可溶性ＣＲ１フラグメントは機能的に活性で、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合し、それらが含む領域によってファクターＩコファクター活性を示す。このような構造物は、好中球酸化破裂、補体媒介溶血現象、およびＣ３ａおよびＣ５ａ産生などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体関連機能を阻害する。特定の可溶性構造物、ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃも逆受動アルチュス反応においてｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示し［ＷＯ８９／０９２２０号、ＷＯ９１／０５０４７号；イェ（Ｙｅｈ）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４６：２５０］、虚血後心筋炎症および壊死を阻害し［ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７；ワイズマン（Ｗｅｉｓｍａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９０、２４９：１４６−１５１１；デュープ、アール（Ｄｕｐｅ，Ｒ．）ら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ＆  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（１９９１）６５（６）６９５］、移植後の生存率をのばす［プルイット（Ｐｒｕｉｔｔ）およびボリンガー（Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ）、１９９１、ジャーナル・オブ・サージェリー・リサーチ（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．）５０：３５０；プルイット（Ｐｒｕｉｔｔ）ら、１９９１トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）］。さらに、ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃをｐ−アニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）と共に配合するとｓＣＲ１単独と類似した抗溶血活性が得られ、補体阻害剤ｓＣＲ１と血栓溶解物質とを組み合わせるのが可能であることがわかる（ＷＯ９１／０５０４７）。
抗体媒介脱髄実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＡＤＥＡＥ）のモデルにおいて、６日にわたるｓＣＲ１を用いたＣＡの全身性抑制は、臨床指数の向上およびブロックされたＣＮＳ炎症をもたらした［ピドルスデン（Ｐｉｄｄｌｅｓｄｅｎ）ら、１９９４、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５２、５４７７］。ＡＤＥＡＥは多発性硬化症（ＭＳ）における急性再発のモデルとみなされ、これらの驚くべき結果は、この薬剤は高分子量（２４５キロダルトン）にかかわらず、ＭＳ療法におけるｓＣＲ１について適用可能であることを示唆するものである。
外傷性脳傷害のラットモデルにおいて、補体抑制物質ｓＣＲ１（ＢＲＬ５５７３０）は外傷性傷害後のミエロペルオキシダーゼ活性（好中球蓄積のインジケーター）を軽減することが判明している［カツォロブスカ（Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋａ）ら、１９９５、ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロー・アンド・メタボリズム（Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、１５、８６０−８６４］。このことは、補体活性化は局所的炎症応答に関与することを示唆する。
抗溶血活性を含む機能的補体阻害を有するＣＲ１の一部に対応する可溶性ポリペプチドは、ＷＯ９４／００５７１に記載され、ＣＲ１の構造的および機能的に完全なＳＣＲ領域である長相同性重複配列Ａ（ＬＨＲ−Ａ）のＳＣＲ１、２、３および４から選択された順番に配列した１ないし４の短コンセンサス繰り返し配列（ＳＣＲ）を含み、最低ＳＣＲ３を含むことが記載されている。
本発明によると、６ないし２３アミノ酸長の一般式（Ｉ）：
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ    （１）
の配列の一部を含み、配列ａ）および／またはｂ）：
ａ）ＧＧＲＫＶＦ
ｂ）ＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹ
を含むポリペプチドが得られる。
本発明のペプチドは、アミノ酸Ｃ１５４ないしＧ１８６の間のヒトＣＲ１のＳＣＲ３の領域由来である。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における、残基の添加、欠失または同類置換による変化（アレリック変異を含む）では、ポリペプチドの生物活性が保持されるが、このような変化も本発明に含まれる。同類置換は、アミノ酸側鎖の荷電、疎水性／親水性およびサイズ特性を保持すること、例えばアルギニンをヒスチジンまたはリシンで置換することを意味する。
ポリペプチドは、ジスルフィド結合により環状分子架橋を形成できる分子を提供できるようにＣおよびＮ末端でシステイン残基を有するように修飾される。ペプチドはさらに特定のアミノ酸で、システインなどの化学的に反応性のアミノ酸を除去するかまたはこのようなアミノ酸をセリンなどの同類置換により置換するように変更される。
ポリペプチドは、所望によりさらに他のペプチドまたは化学物質との化学的結合についての経路を提供するために誘導化されていてもよいかまたは誘導化可能なＮまたはＣ末端で化学的に反応性のアミノ酸、例えばシステイン、リシンまたはグルタミン酸を有していてもよい。好ましくは、末端アミノ酸はシステインであり、誘導体はＳ−（２−ピリジル）ジチオである。
マルチマー化されたポリペプチドを形成することにより、活性の向上が達成される。本発明によると、コアペプチドまたは多機能分子であるコア構造体と結合した２以上、例えば２ないし８の本発明のポリペプチドを含むマルチマーポリペプチドが提供される。コアペプチドは好ましくは、（ｌｙｓ）4（ｌｙｓ）2ｌｙｓ  ａｌａ（ここに、最初のリシンはアルファおよびイプシロンアミノ基の両方と結合したさらに２個のリシンを有し、二番目の２つのリシンはそれぞれさらに２つのリシンを有し、８個の非置換アミノ基を有する分枝ポリマーをもたらす）で例示される「ＭＡＰ」ペプチドなどのリシン誘導体である［ポスネット、ディー・エヌ（Ｐｏｓｎｅｔｔ，Ｄ．Ｎ．）およびタム、ジェイ・ピー（Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．）、メソッズ・イン・エンザモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９８９、１７８、７３９−７４６］。コア構造体の他の例は、トリス（アミノエチル）アミンおよび１，２，４，５ベンゼンテトラカルボン酸を包含する。各ポリペプチドはコア構造体と結合する。好ましくは、システイン末端ペプチドはチオール反応性コア構造体と結合する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドが宿主たんぱく質の全体構造または重複経路に必須でない配列中に挿入されているかまたはこれと置換しているキメラポリペプチドを提供する。
別の態様において、宿主たんぱく質は補体調節たんぱく質科のＳＣＲ−含有たんぱく質などの１またはそれ以上のＳＣＲ繰り返し配列、例えばファクターＨ、Ｃ４結合たんぱく質、崩壊促進因子、膜補助因子タンパクまたは補体受容体２などを含む。このような挿入または付加は、宿主たんぱく質の抗補体活性の付加および／または増進の手段として用いられる。好ましくは、このような置換または挿入はＳＣＲ−型モジュールのループ領域中に行われる（第二構造予想アルゴリズム、三次構造の相同性モデリングまたは他の保存配列背景における可変長挿入を同定する配列から予想）。
別の態様において、宿主たんぱく質は血漿たんぱく質であり、挿入または置換は宿主たんぱく質に抗補体活性を付与するために用いられ、またｉｎ  ｖｉｖｏでの挿入されたポリペプチドの安定性または薬物動態学的挙動を変更するために用いられる。このような置換または挿入の適当な例は、イムノグロブリンＦｃ領域の表面ループ、Ｆａｂ領域の非相補性決定領域（ＣＤＲ）、環のターン領域または成長因子領域または「フィンガー」領域のベータ−ターン領域、例えばフィブロネクチンに見られるようなものを包含する。
「本発明のポリペプチド」なる用語は、以後一般式（Ｉ）の配列から由来する本発明のポリペプチドならびにマルチマー化ポリペプチドおよびキメラポリペプチドを意味する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドの調製法であって、組換え宿主細胞において前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現し、生成物を回収し、その後所望によりポリペプチドをコア構造体に化学的に結合させることからなる方法を提供する。
特に、該方法は以下の工程からなる：
ｉ）宿主細胞中で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターを調製し；
ｉｉ）前記ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｉｉｉ）前記形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーが前記ポリペプチドを産生できるような発現を可能にする条件下で培養し；および
ｉｖ）前記ポリペプチドを回収する。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーも本発明の一部をなす。
本発明の方法は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラ・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．）第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）およびＤＮＡクローニング第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻［ディー・エム・グローバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）］に記載されているような通常の組み換え技術により行うことができる。
本発明はさらに適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチド単位の縮合によるＤＮＡポリマーの調製方法を提供する。
調製は化学的、酵素的、または２つの方法の組み合わせにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで適宜行われる。このように、ＤＮＡポリマーは適当なＤＮＡフラグメントを、ディー・エム．ロバーツ（Ｄ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８５、２４、５０９０−５０９８に記載されているような通常の方法により酵素的ライゲーションすることにより調製される。
ＤＮＡフラグメントは、必要なヌクレオチド配列を含有するＤＮＡを適当な制限酵素で化学合成法、酵素重合法、またはこれらの方法の組み合わせにより消化することにより得られる。
制限酵素での消化は、適当な緩衝液中、２０ないし７０℃の温度で、一般に５０μｌ未満の容積で、０．１ないし１０μｇのＤＮＡを用いて行われる。
ＤＮＡの酵素重合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウフラグメント）などのＤＮＡポリメラーゼを用いて、必要に応じてヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む適当な緩衝液中で、１０℃ないし３７℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で行われる。
ＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを用いて、適当な緩衝液中、４℃ないし３７℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で行われる。
ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学合成は、通常のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミジト化学により、「ケミカル・アンド・エンザイマティック・シンセシス・オブ・ジーン・フラグメンツ−ア・ラボラトリー・マニュアル」（’Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ’  ［エイチ・ジー・ゲイセン（Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ）およびエイ・ラング（Ａ．Ｌａｎｇ）編、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  （１９８２）］または他の科学出版物、例えば、エム・ジェイ・ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）、エイチ・ダブリュー・ディー・マテス（Ｈ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓ）、エム・シン（Ｍ．Ｓｉｎｇｈ）、ビー・エス・スプロート（Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏａｔ）およびアール・シー・ティットマス（Ｒ．Ｃ．Ｔｉｔｍａｓ）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８２、１０、６２４３；ビー・エス・スプロート（Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏａｔ）およびダブリュー・バンワース（Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８３、２４、５７７１；エム・ディー・マテウチ（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびエム・エイチ・カルサーズ（Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８０、２１、７１９；エム・ディー・マテウチ（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびエム・エイチ・カルサーズ（Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８１、１０３、３１８５；エス・ピー・アダムズ（Ｓ．Ｐ．Ａｄａｍｓ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８３、１０５、６６１；エヌ・ディー・シンハ（Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ）、ジェイ・バーナト（Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ）、ジェイ・マクマナス（Ｊ.ＭｃＭａｎｎｕｓ）およびエイチ・ケスター（Ｈ.Ｋｏｅｓｔｅｒ）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８４、１２、４５３９；およびエイチ・ダブリュー・ディー・マテス（Ｈ．Ｗ．Ｄ．Ｍａｔｔｈｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８４、３、８０１に記載されているような固相技術を用いて行われる。好ましくは、自動ＤＮＡ合成器[例えば、アプライド・バイオシステムズ３８１Ａシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８１Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）]を用いる。
ＤＮＡポリマーは好ましくは２以上のＤＮＡ分子であって、一緒になってポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものをライゲーションすることにより調製される。
ＤＮＡ分子は必要なコーディング配列を担うベクターの適当な制限酵素での消化により得られる。
ＤＮＡ分子の正確な構造およびこれを得る方法は望ましい生成物の構造に依存する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の構築の適当な方法のデザインは当業者が常時行っていることである。
特に、特定の宿主細胞のコドン使用を考慮しなければならない。コドンをハイレベルのイー・コリにおける発現についてデベルクス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、（１９８４）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、１２、３８７に示されている方法を用いて最適化する。
組み換え宿主細胞中でポリペプチドをコードするＤＮＡポリマーの発現は、宿主細胞中ＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターにより行うことができる。該発現ベクターは新規であり、本発明に含まれる。
複製可能な発現ベクターは本発明にしたがって、宿主細胞と適合するベクターを開裂させて完全レプリコンを有する直線状ＤＮＡセグメントを得、前記直線状セグメントを、ライゲーション条件下で、前記直線状セグメントと共にポリペプチドをコードする１以上のＤＮＡ分子と結合することにより調製される。
直線状セグメントおよび１以上のＤＮＡ分子のライゲーションは、所望により同時にまたは順次行う。
このように、ＤＮＡポリマーを所望により前もって形成するかまたはベクターの構築中に形成する。ベクターの選択は、一部、大腸菌のような原核、またはマウスＣ１２７、マウス骨髄腫、チャイニーズハムスター卵巣細胞、カビ、例えば糸状菌または単細胞「酵母」またはショウジョウバエなどの昆虫細胞である宿主細胞により決定する。宿主細胞はトランスジェニック動物であってもよい。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミッドおよび例えばバクロウイルスまたはワクシニア由来の組み換えウイルスを包含する。
ＤＮＡポリマーは例えばマウスＣ１２７細胞中のウシ乳頭腫ウイルスベクター等のフラグメントまたはチャイニーズハムスター卵巣細胞中の増幅されたベクターを発現する安定な形質転換哺乳類細胞系の単離用にデザインされたベクター中に組み立てられる［ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｖｏｌ．  ＩＩ、ディー・エム・グロバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５；カウフマン、アール・ジェイ（Ｋａｕｆｍａｎｎ，  Ｒ．Ｊ．）ら、モレキュラ・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）５、１７５０−１７５９、１９８５；パブラキス、ジー・エヌ（Ｐａｖｌａｋｉｓ  Ｇ．Ｎ．）およびヘイマー、ディー・エイチ（Ｈａｍｅｒ，  Ｄ．Ｈ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＵＳＡ））８０、３９７−４０１、１９８３；ゲッデル、ディー・ブイ（Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．Ｖ．）ら、ヨーロッパ特許出願番号００９３６１９（１９８３）］。
複製可能な発現ベクターの調製は、通常どおり適当なＤＮＡの制限用、重合用およびライゲーション用酵素を用いて、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前出）により記載された方法により行われる。重合およびライゲーションは、ＤＮＡポリマーの調製に関して既に記載したようにして行う。制限酵素での消化は適当な緩衝液中、２０ないし７０℃の温度で、一般に５０μｌ以下の容積で、０．１ないし１０μｇのＤＮＡを用いて行う。
組み換え宿主細胞は、本発明にしたがって、宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターを用いて形質転換条件下で調製する。適当な形質転換条件は通常のものであり、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前出）または「ＤＮＡクローニング」（”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”）第ＩＩ巻、ディー・エム・グロバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，１９８５に記載されているものである。
形質転換条件の選択は、宿主細胞により決定される。従って、イー・コリなどの細菌宿主をＣａＣｌ２の溶液［コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９７３、６９、２１１０］またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ2、酢酸カリウムおよびグリセロールを含む溶液で処理し、次に３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパンスルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理するかまたは例えばバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）（エレクトロポレーターの製造業者）により記載されているようにエレクトロポーレーションにより処理する。培養物中の哺乳動物細胞をベクターＤＮＡの細胞上へのカルシウム共沈またはカチオン性リポソームを用いることにより形質転換する。
本発明は、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも及ぶ。
形質転換された宿主細胞のＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での培養は、通常、例えば前記サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、および「ディー・エヌ・エイ・クローニング」（”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”）（前出）に記載されているように行う。このように、好ましくは細胞に栄養分を供給し、４５℃より低い温度で培養する。
蛋白質生成物を宿主細胞について通常の方法により回収する。このように、宿主細胞がイー・コリなどの細菌であり、蛋白質が細胞内に発現される場合、これは物理的、化学的または酵素的に溶解し、タンパク質生成物は得られたリゼートから単離される。宿主細胞が哺乳類である場合、生成物は通常栄養培地から単離される。
宿主細胞がイー・コリなどの細菌である場合、培養から得られる生成物は機能活性を最適とするためにフォールディングを必要とする。これは蛋白質が封入体として発現される場合に最も起こりやすい。重要と考えられる単離およびフォールディング法は多くある。特に、汚染蛋白質との凝集物の形成を最少にし、ポリペプチドのミスフォールディングを最少にするためにポリペプチドをフォールディング前に部分的に精製するのが好ましい。このように、特異的に封入体を単離し、続いてフォールディング前にさらに精製することによる汚染イー・コリ蛋白質の除去は該方法の重要な態様である。
フォールディング法は、ポリペプチドの中間体折畳み状態の凝集を最少にするように行われる。したがって、とりわけ、塩の種類および濃度、温度、蛋白質濃度、酸化還元緩衝液濃度およびフォールディング期間を慎重に考慮する必要がある。特定のポリペプチドに関する厳密な条件は一般に予想できず、実験により決定しなければならない。
封入体からの蛋白質のフォールディングに利用できる方法は数多くあり、これらは当業者には周知である。該方法では一般に、例えば５０ｍＭ２−メルカプトエタノールで高濃度の変性剤、例えば８Ｍ尿素または６Ｍグアニジン塩酸塩の存在下に封入体中の全てのジスルフィド結合を切断する。次の段階は、これらの試薬を除去して、蛋白質のフォールディングを行うことである。ジスルフィド結合の形成には、酸化的環境が必要であり、これは種々の方法、例えば、空気、または適当な酸化還元系、例えば還元および酸化グルタチオンの混合物を取り入れることにより得られる。
好ましくは、封入体は、メルカプトエタノールの存在下に８Ｍ尿素を用いて可溶化し、１回目の汚染蛋白質の除去の後、冷緩衝液を添加することにより、蛋白質をフォールドする。好ましい緩衝液は、１ｍＭ還元グルタチオンおよび０．５ｍＭ酸化グルタチオンを含有する２０ｍＭエタノールアミンである。フォールディングは、１ないし５℃の範囲の温度で、１ないし４日の期間行うのが好ましい。
沈殿または凝集が観察される場合、凝集蛋白質は種々の方法、例えば、遠心分離または硫酸アンモニウムなどの沈殿剤での処理などにより除去できる。これらの方法のいずれかを採用した場合、モノマーポリペプチドが主な可溶性生成物である。
細菌細胞が蛋白質を分泌する場合、フォールディングは通常必要でない。
別法として、ポリペプチドは通常の固相ペプチド合成、例えば自動化ペプチド合成器およびあらかじめ結合したＣ末端アミノ酸を有するパラ−アルコキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）に関してＦｍｏｃ（９−フルオロニルメトキシカルボニル）化学を用いて合成される。
従って、さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの調製法であって、適当なペプチド単位を縮合し、その後所望によりポリペプチドをコア構造体に化学的に結合させることからなる方法を提供する。
本発明のマルチマーポリペプチドを好ましくはコアペプチドまたは多機能分子と化学的架橋基により結合させ、これはＥＰ０１０９６５３およびＥＰ０１５２７３６に記載されているものを包含する。架橋基は一般に、式：
−Ａ−Ｒ−Ｂ−                  （ＩＩ）
（式中、ＡおよびＢは、各々、同一または異なって、−ＣＯ−、−Ｃ（＝ＮＨ2+）−、マレイミド、−Ｓ−または結合を表し、Ｒは結合または１またはそれ以上の−（ＣＨ2）−またはメタ−またはパラ−ニ置換フェニル単位を含む結合基を意味する）
である。
ポリペプチドおよびコアペプチドまたは多機能分子が両方ともシステインを包含する場合、化学的架橋基は−Ｓ−Ｓ-の形態をとる。架橋は、通常のジスルフィド交換反応により、ポリペプチド上のチオールを活性化し、活性化チオールをコア構造体上の遊離チオールと反応させることにより生成する。別法として、遊離チオールはポリペプチド上にあり、活性化基はコア構造体上にある。このような活性化は、Ｓ−Ｓ結合の開裂により安定なチオレートアニオンを生じ、さらにチオールと反応して安定なジスルフィド結合をもたらすことができる中間体混合ジスルフィドを形成する２，２’ジチオピリジンおよび５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ）を包含するジスルフィドを利用する。
Ｒは、水と相互作用して、結合の水溶性を維持する基を包含し、適当な基は、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＭｅ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＳＯ2−、−ＣＯ2−、−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）m−および−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ここに、ｍは２またはそれ以上の整数である）を包含する。
Ｒの例は、−（ＣＨ2）r−、−（ＣＨ2）p−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）q−および−（ＣＨ2）p−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ2）q−（ここに、ｒは最低２、好ましくは最低４の整数であり、ｐおよびｑは独立して最低２の整数である）を包含する。
式（ＩＩ）の架橋基は、式（ＩＩＩ）：
Ｘ−Ｒ1−Ｙ−              （ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1は１またはそれ以上の−（ＣＨ2）−単位を含有する結合基であり、ＸおよびＹは表面アミノ酸基、好ましくはリシンまたはシステイン基、あるいはＮ−末端アミノ基、またはたんぱく質結合基と反応できる官能基である）
の結合剤から由来する。
好ましい試薬は、ＸおよびＹが異なる場合ヘテロ二機能剤として知られるものである。試薬分子の各末端を順次別の反応で結合させる各分子と反応させる。式（ＩＩＩ）のヘテロ二機能薬剤の例は、以下のものを包含する：
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステル
４−（Ｎ−マレイミド）カプロン酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステル
３−（２−ピリジル）メチルプロピオンイミデート塩酸塩。
各々の場合において、Ｙは元のチオールであるかまたはたんぱく質結合基として導入されたものであるポリペプチド上のチオール基との反応能を有する。
たんぱく質結合基は、１またはそれ以上のアミノ酸側鎖について特異的な試薬を用いてポリペプチドを修飾することにより機能的に誘導され、他の分子上の開裂可能な部分と反応できる基を含有する。たんぱく質結合基の一例はチオール基である。開裂可能な部分の例は、ジスルフィド結合である。別法として、開裂可能な部分はα、βジヒドロキシ官能基を含む。
一例として、ポリペプチドまたはコア構造体の２−イミノチオラン、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステル（続いて還元）またはＮ−アセチルホモシステインチオラクトンとの反応による遊離チオール官能基の導入はたんぱく質結合基のチオール反応性Ｂ構造体とのカップリングを可能にする。別法として、たんぱく質結合基は、Ｘにおいて遊離チオールと反応できるチオール反応性基、例えば６−マレイミドヘキシル基または２−ピリジル−ジチオ基を含有しうる。好ましくは、たんぱく質結合基は、たんぱく質修飾剤、例えばたんぱく質中のリシンε−アミノ基と反応する２−イミノチオラン由来のものである。
Ｘがたんぱく質のアミノ酸側鎖と直接反応できる基を表す場合、これは好ましくはＮ−オキシスクシンイミジル基である。Ｘがたんぱく質結合基と反応できる場合、これは好ましくはピリジルチオ基である。
前記プロセスにおいて、ポリペプチドをたんぱく質結合基へ導入する修飾は、好ましくは用いる試薬に応じて３．０と９．０の間のｐＨで水性緩衝媒体中で行う。好ましい試薬である２−イミノチオランでは、ｐＨは好ましくは６．５ないし８．５である。ポリペプチドの濃度は高い（＞１０ｍｇ／ｍｌ）のが好ましく、修飾試薬は試薬の反応性に応じて、中程度（１．１ないし５倍）のモル過剰で用いる。反応の温度および期間は好ましくは０ないし４０℃、１０分ないし７日の範囲である。ポリペプチドの修飾の程度は、導入される結合基に関する分析により決定する。
このような分析は、標準的たんぱく質化学技術、例えば５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）での滴定である。好ましくは、ポリペプチド１モル当たり平均して０．５ないし３．０モルのたんぱく質結合基を導入する。修飾されたポリペプチドを過剰の修飾試薬から標準的技術、例えば透析、限外濾過、ゲル濾過および溶媒または塩沈降により分離する。中間体物質を凍結溶液中または凍結乾燥して保存する。
たんぱく質結合基をこのようにして導入する場合、架橋基（ＩＩ）は結合剤（ＩＩＩ）およびたんぱく質結合基の反応から形成される。
ポリペプチドおよび結合させるコア構造体は、典型的には過剰の試薬を、通常、中性または適度のアルカリ性緩衝液中のポリペプチドに加えることにより、結合剤またはたんぱく質結合基を導入する試薬と別々に反応させ、反応後、低分子量物質をゲル濾過または透析により除去する。正確なｐＨ、温度、緩衝液および反応時間の条件は、用いる試薬および修飾されるポリペプチドの性質に依存する。ポリペプチド結合反応は、好ましくは、修飾されたポリペプチドおよびコア構造体を、中性緩衝液中でコア構造体中の反応性官能基の数に対して適当な１モル過剰のポリペプチドで混合することにより行う。他の反応条件、例えば時間および温度は、望ましい程度の結合が得られるように選択する。チオール交換反応が含まれる場合、反応は好ましくは窒素雰囲気下で行う。好ましくは、カップリングがモニターできるようにＵＶ−活性な生成物を（例えば、２−ピリジルジチオ誘導体からのピリジン２−チオンの放出から）産生する。
結合反応後、マルチマーポリペプチドは多くのクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーなどにより単離できる。これらの方法は低圧または高性能のいずれかである。
マルチマーポリペプチドは低圧または高性能ゲル濾過、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点分画電気泳動または質量分析などを含む多くの技術により特徴決定できる。
本発明のポリペプチドは、以下に列挙する多くの補体媒介性または補体関連病（これに限定されない）および障害の治療または診断において有用である。
補体が関与する病気および障害
神経障害
多発性硬化症
卒中
ギラン・バレー症候群
外傷性脳損傷
パーキンソン病
アレルギー性脳炎
アルツハイマー病
不適当または望ましくない補体活性化の障害
血液透析合併症
超急性同種移植片拒絶反応
異種組織移植拒絶反応
角膜移植片拒絶反応
ＩＬ−２療法中のインターロイキン−２誘発毒性
発作性夜間ヘモグロビン尿症
炎症性障害
自己免疫疾患の炎症
クローン病
成人呼吸窮迫症候群
火傷および凍傷を含む熱傷
ぶどう膜炎
乾癬
喘息
急性膵炎
川崎病などの血管炎症性疾患
虚血後再潅流症状
心筋梗塞
バルーン血管形成
アテローム性動脈硬化症（コレステロール誘発性）および再狭窄
高血圧
心肺バイパスまたは腎血液透析におけるポストポンプ症候群
腎虚血
腸管虚血
免疫合併症および自己免疫疾患
慢性関節リウマチ
全身紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）
ＳＬＥ腎炎
増殖性腎炎
糸球体腎炎
溶血性貧血
重症筋無力症
感染症または敗血症
多器官不全
敗血症性ショック
生殖障害
抗体または補体媒介性不妊症
傷の治癒および瘢痕形成の予防
本発明はまた、治療上有効量の前記本発明のポリペプチドと医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はさらに活性治療物質として使用する本発明のポリペプチド、および炎症または不適当な補体活性化に関連した病気または障害の治療における使用を提供する。
本発明はさらにこのような治療を必要とする患者に治療上有効量の本発明のポリペプチドを投与することからなる炎症または不適切な補体活性化と関連した病気または障害の治療法も提供する。
前記方法において、患者はヒトまたはヒト以外の哺乳動物、好ましくはヒトである。
病気または障害の治療に関するポリペプチドの有効量は、０．０１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
投与用に、ポリペプチドは適当な医薬または治療組成物中に処方される。このような組成物は、典型的には治療上活性量の該ポリペプチドおよび食塩水、緩衝食塩水、デキストロースまたは水などの医薬上許容される賦形剤または担体を含有する。組成物はさらに特定に安定化剤、例えばマンノースおよびマンニトールを含む糖類、注射組成物用局所麻酔剤、例えばリドカインを含んでもよい。
さらに、本発明のポリペプチドの、炎症または不適切な補体活性化に関連した病気または障害の治療用医薬の製造における使用が提供される。
本発明はさらに、血栓症の治療、特にこのような治療を必要とする患者における急性心筋梗塞の治療法も提供する。この方法は、この治療を必要とする患者に、有効量の本発明のポリペプチドおよび有効量の血栓融解剤を投与することからなる。このような方法および使用は、ＷＯ９１／０５０４７に記載されているようにして行われる。
本発明はさらにこのような治療を必要とする患者における成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療法であって、有効量の本発明のポリペプチドを患者に投与することからなる方法を提供する。
本発明は、また、有効量の本発明のポリペプチドを投与することからなる、移植を受けたこのような治療を必要とする患者における超急性同種移植片または超急性異種移植片拒絶反応を遅らせる方法を提供する。このような投与は、患者に対してなされるか、または埋込前に移植組織に適用することによりなされる。
本発明は、さらに、局所的または非経口、例えば静脈内経路により、有効量の本発明のポリペプチドを投与することによる、このような治療を必要とする患者における傷の治療法を提供する。
本発明はさらに、このような治療を必要とする患者に有効量の本発明のポリペプチドを投与することによるアルツハイマー病の治療法を提供する。
本発明はさらに、このような治療を必要とする患者に有効量の本発明のポリペプチドを投与することによる虚血性卒中に関連するようなＣＮＳ炎症性疾患の治療法も提供する。
方法
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
ノベックスプレカストゲル４−２０％をブリティッシュ・バイオテクノロジーから購入し、製造業者の注意にしたがってＸｃｅｌｌ  ＩＩ電気泳動セルで用いる。
ペプチド合成
ペプチドをアプライド・バイオシステム４３０Ａペプチド合成器およびＣ−末端アミノ酸をあらかじめ結合させたパラ−アルコキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂上Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）化学を用いて固相技術により合成した。鎖の延長の前に残存する遊離ヒドロキシ基をブロックするために樹脂をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（０．０４ミリモル）の存在下で樹脂を無水安息香酸（２ミリモル）で処理した。各シングルカップリングサイクルは以下の工程からなる：工程１．樹脂をＮＭＰで洗浄し（１回）；工程２．Ｆｍｏｃ保護基除去をピペリジンのＮＭＰ中溶液（出発濃度２０％ｖ／ｖ）を用いて樹脂を２回連続的に処理（３分および１５分）して行い；工程３．樹脂をＮＭＰで洗浄し（５回）；工程４．樹脂をＮＭＰおよびＤＭＦ中あらかじめ活性化させたアミノ酸（１ミリモル）の溶液を用いてカップリングし（６０分）；工程５．樹脂をＮＭＰで洗浄した（７回）。ダブルカップリングサイクルの場合、工程４および工程５を２回行った。Ｆｍｏｃアミノ酸（１ミリモル）を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２ミリモル）の存在下、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１ミリモル）で６ないし１２分間予備活性化した。鎖拡張後、Ｆｍｏｃ基を除去した。用いた側鎖保護は、アルギニンについては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、アスパラギン、グルタミンおよびシステインについてはトリチル、リシンおよびトリプトファンについてはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、セリン、トレオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸についてはｔｅｒｔ−ブチルであった。すべての残基は特記しないかぎりダブルカップリングした。
樹脂からの開裂
氷冷したペプチジル樹脂を、氷冷した開裂混合物ＡまたはＢ（１０ｍｌ）で処理し、２時間室温で攪拌した。混合物を濾過し、濾液を真空中で蒸発させて溶液を低容積にした（３ないし５ｍｌ）。これを真空中で乾燥トルエンを用いて共沸し（２回）、残存する油状物を乾燥ジエチルエーテルで磨砕して（３×５０ｍｌ）、白色沈殿を得た。これを集め、真空乾燥して、凍結乾燥の前に希水性酢酸から微量のジエチルエーテルを除去した。用いた開裂混合物は、Ａ：ＴＦＡ／水／チオアニソール／１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）／フェノール（８８．９：４．４：４．４：２．２：６．７  ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）；Ｂ：ＴＦＡ／水／ＥＤＴ（７５：５：２０  ｖ／ｖ／ｖ）であった。
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ギルソングラジエントシステムを用いて２２０ｎｍで検出して分離を行った。特記しないかぎり、分析的ＨＰＬＣをスフェリソルブＣ−１８カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ  ｉｄ）で１ｍｌ／分で溶出して行い、分取ＨＰＬＣはスフェリソルブＣ−８カラム（２５ｃｍ×１０ｍｍ  ｉｄ）で４ｍｌ／分で溶出して行った。用いた勾配は以下の通りであった：Ａ：１０％Ｂで５分間定組成溶出、続いて４５分間５０％Ｂまで直線的勾配；Ｂ：５分間１０％Ｂで定組成溶出、続いて８０％Ｂまで４５分間直線的勾配；Ｃ：１０％Ｂで５分間定組成溶出、続いて５０％Ｂまで５０分間直線的勾配；Ｄ：１０％Ｂで１分間定組成溶出、続いて８０％Ｂまで３０分間直線的勾配；Ｅ：１５％Ｂで５分間定組成溶出、続いて３０％Ｂまで６０分間直線的勾配；Ｆ；３０％Ｂで１分間定組成溶出、続いて４０％Ｂまで３０分間直線的勾配；Ｇ；１０％Ｂで５分間定組成溶出、続いて４０％Ｂまで６０分間直線的勾配；Ｈ；１％Ｂで５分間定組成溶出、続いて３５％Ｂまで６０分間直線的勾配；Ｉ：５％Ｂで５分間定組成溶出、続いて３０％Ｂまで６０分間直線的勾配；Ｊ：２０％Ｂで１分間定組成溶出、続いて３０％Ｂまで３０分間直線的勾配。
実施例
ペプチド残基のナンバリングはヒトＣＤ３５（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター、ＣＲ１）に対応する［クリックシュタイン（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ）ら、１９８７、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６５：１０９５−１１１２；クリックシュタイン（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６８：１６９９−１７１７；ホーケイド（Ｈｏｕｒｃａｄｅ）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１６８：１２５５−１２７０］。このナンバリングによると、ＬＨＲ−ＡのＳＣＲ３はＲ１２２−Ｋ１９６である：
0004125373.tif 000002
ペプチド配列は慣例通りＮ末端残基を左側にして表す。
実施例１：Ｃ１５４−Ｃ１７４（Ｅ１ａ直線状ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ｅ１ｂ環状ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））
ＣＮＰＧＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣ      （Ｅ１）
Ｅ１はＳＣＲ３の第二および第三システインに対応する成熟ヒトＣＲ１のＣ１５４−Ｃ１７４残基に及ぶ配列を有する。これらの２個のシステインは通常野生型ＣＲ１中でジスルフィドを形成しない。
１ａ  Ｅ１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−樹脂（０．２０ｇ；０．１０ミリモル）からの段階的結合によりＮ−末端Ｆｍｏｃ基が除去された２１−残基ペプチジル樹脂（０．５７ｇ）を得た。ペプチジル樹脂（０．２８ｇ）を、混合物Ａを用いて開裂して、凍結乾燥後、粗固体（０．１４ｇ）を得た。粗生成物を１Ｍ水性酢酸を溶離剤として用いてセファデクスＧ２５（カラム８３ｃｍ×２．５ｃｍ；２２０ｎｍで検出）上ゲル濾過により精製した。ペプチドは単一ピークとして溶出し、これを６フラクションに分けた（合計重量０．０８２ｇ；４９％）：Ａ（１１ｍｇ）、Ｂ（２２ｍｇ）、Ｃ（１７ｍｇ）、Ｄ（２４ｍｇ）、Ｅ（４ｍｇ）、Ｆ（４ｍｇ）。
１ｂ  Ｅ１の特性決定
勾配Ｆを用いたＨＰＬＣ分析は、各フラクション中以下に示す様な割合で保持時間１７．８分（ピーク１）、１８．６分（ピーク２）および１９．８分（ピーク３）の３つのピークの存在を示した。
0004125373.tif 000003
ピーク１および３は、それぞれジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）での処理によるペプチドの還元および酸化形態であることが判明した。ピーク２はＤＴＴにもＤＭＳＯにも影響されない未知の汚染物質であった。フラクションＢの水性溶液（ｐＨ７．５）を過剰のＤＴＴで処理し；勾配Ｆを用いた６時間後のＨＰＬＣは、ピーク１の増加、一方ピーク３の減少を示した。フラクションＢをＤＭＳＯの水性溶液（２０％ｖ／ｖ）で処理し；勾配Ｆを用いた１１時間後のＨＰＬＣは、ピーク１の消失とピーク３の増加を示した。フラクションＥの水性溶液（ｐＨ７．５）を過剰のＤＴＴで処理し；勾配Ｆを用いた５．８時間後のＨＰＬＣはピーク３の消失とピーク１の増加を示した。フラクションＥをＤＭＳＯの水性溶液（２０％ｖ／ｖ）で処理し；勾配Ｆを用いた１２時間後のＨＰＬＣはピーク１の消失とピーク３の増加を示した。
エレクトロスプレー質量分析はピーク１および３がそれぞれペプチドの直線状（Ｅ１ａ）および環状（Ｅ１ｂ）形態である証拠を示した。
フラクションＡはｍ／ｚ１１０５．８（相対強度５３％、分子量２２０９．６に対応、環状形態２２０９．０について計算）、ｍ／ｚ  １１０６．３（６６％、２２１０．６）、およびｍ／ｚ  １１０６．８（５３％、２２１１．６、直線形態２２１０．０について計算）で、［Ｍ＋２Ｈ］2+に対応するイオンをもたらした。
フラクションＣは、ｍ／ｚ１１０５．８（４１％、２２０９．６）、ｍ／ｚ  １１０６．４（６６％、２２１０．８）、ｍ／ｚ  １１０６．９（１００％、２２１１．８）、ｍ／ｚ  １１０７．３（９８％、２２１２．６）、およびｍ／ｚ  １１０７．８（７５％、２２１３．６）で、［Ｍ＋２Ｈ］2+に対応するイオンをもたらした。
フラクションＦはｍ／ｚ１１０６．８（９８％、分子量２２１０．６）、ｍ／ｚ１１０７．３（９９％、２２１２．６）、およびｍ／ｚ  １１０７．７（８３％、２２１３．４）で、［Ｍ＋２Ｈ］2+に対応するイオンをもたらした。
アミノ酸分析：フラクションＡ：Ａｓｘ１．０（理論値１）、Ｇｌｕ２．４（２）、Ｓｅｒ２．３（２）、Ｇｌｙ４．２（４）、Ａｒｇ１．３（１）、Ｐｒｏ２．２（２）、Ｔｒｙ０．９（１）、Ｖａｌ１．５（２）、Ｃｙｓ１．１（２）、Ｉｌｅ１．１（１）、Ｌｅｕ１．３（１）、Ｐｈｅ０．１（１）、Ｌｙｓ１．７（１）  フラクションＣ：Ａｓｘ１．１、Ｇｌｕ２．５、Ｓｅｒ２．１、Ｇｌｙ４．０、Ａｒｇ１．２、Ｐｒｏ２．１、Ｔｒｙ１．０、Ｖａｌ１．６、Ｃｙｓ１．１、Ｉｌｅ１．１、Ｌｅｕ１．３、Ｐｈｅ０．１、Ｌｙｓ１．８  フラクションＦ：Ａｓｘ１．１、Ｇｌｕ２．４、Ｓｅｒ２．３、Ｇｌｙ４．１、Ａｒｇ１．２、Ｐｒｏ２．４、Ｔｒｙ１．１、Ｖａｌ１．４、Ｃｙｓ０．９、Ｉｌｅ１．３、Ｌｅｕ１．１、Ｐｈｅ０．１、Ｌｙｓ１．６（注：Ｃｙｓは部分的に分解、Ｖａｌ−Ｐｈｅ結合は酸加水分解で部分的に加水分解）。
実施例２：Ｓ１５８−Ｃ１７４（Ｅ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＳＧＧＲＫＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣ  （Ｅ２）
このペプチドは成熟ヒトＣＲ１  Ｓ１５８ないしＣ１７４の配列に及ぶ。
２ａ  Ｅ２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−樹脂（０．４９ｇ；０．２５ミリモル）からの段階的結合によりＮ−末端Ｆｍｏｃ基が除去された１７−残基ペプチジル樹脂（１．０３ｇ）を得た。残基Ｓｅｒ1、Ｇｌｙ2,11、Ｐｈｅ7、Ｇｌｕ8,12、Ｐｒｏ13はシングルカップリングしている。ペプチジル樹脂（０．５１ｇ）を、混合物Ａを用いて開裂して、凍結乾燥後、粗固体（０．２２ｇ）を得た。勾配Ａ、ＢおよびＣを用いた分取ＨＰＬＣによる０．０７２ｇの精製は精製固体（０．０４８ｇ；６６％）をもたらした。
２ｂ  Ｅ２の特性決定
分析的ＨＰＬＣによると生成物は＞９５％の純度であり、勾配Ｄを用いて保持時間は１８．６であった。その同一性はｍ／ｚ１８４２でのＦＡＢ質量分析において［Ｍ＋Ｈ］+イオンの観察およびアミノ酸分析Ｇｌｘ１．９７（理論値２）、Ｓｅｒ１．８６（２）、Ｇｌｙ２．８５（３）、Ａｒｇ１．１３（１）、Ｐｒｏ１．０８（１）、Ｔｙｒ０．９４（１）、Ｖａｌ１．８２（２）、Ｉｌｅ０．９９（１）、Ｌｅｕ１．１２（１）、Ｐｈｅ１．１１（１）、Ｌｙｓ１．１４（１）（Ｃｙｓは酸加水分解での消失のために計算せず）により確認した。
実施例３：多抗原ペプチド（ＭＡＰ）−Ｅ２複合体（Ｅ３）
Ｓ１５８−Ｃ１７４（Ｅ２）の活性を増強するために、Ｅ２のリシンコア残基との架橋により複数の結合部位を形成した。
３ａ  ＭＡＰペプチドの誘導化
（ｉ）Ｎ−（２−ピリジル）ジチオプロピオニルＭＡＰ
ＭＡＰペプチド（構造（Ｌｙｓ）4（Ｌｙｓ）2Ａｌａ−ＯＨ）をペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｘｔｅｒ，ＵＫ）から購入した。ペプチド（９．８ｍｇ、１０マイクロモル）を、３−（２−ピリジル）ジチオプロピオン酸Ｎ−オキシスクシンイミドエステル（ファーマシア、２５ｍｇ、８０マイクロモル、ＭＡＰペプチド中遊離アミノ基に対して１モル当量）をあらかじめ溶解しておいた乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１００マイクロモル）およびＡＣＳ級ピリジン（２００マイクロモル）の混合物中に溶解させた。透明溶液を静かに一夜（１５時間）室温（〜２２℃）で攪拌し、次に−８０℃で保存した。
（ｉｉ）Ｅ２との複合
ペプチドＥ２（前記のとおり、７．４ｍｇ、４マイクロモル）を乾燥ＤＭＳＯ（１８０マイクロリットル）および乾燥ＡＣＳ級ピリジン（９０マイクロリットル）の混合物中に溶解させ、前記ＰＤＰ−ＭＡＰ（溶液１５マイクロリットル、〜０．５マイクロモル、〜４マイクロモルＰＤＰ−等価物）を添加した。混合物を乾燥窒素雰囲気下で６時間常温で攪拌し、若干黄色が見られた。これを次に４℃の２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ７．４で最終体積１．５ｍｌに希釈した。若干白濁した溶液を４℃で炭酸水素アンモニウム緩衝液で平衡化し、溶出したセファデクスＧ−２５の１×１０ｃｍカラムに適用した。２．５と５．５ｍｌ、５．５と７．５ｍｌ、７．５と９．０ｍｌ間で溶出したフラクションを集め、凍結乾燥した。これらのうち最初のものだけが白色粉末の測定可能な固体を含有していた（約１４ｍｇ）。
３ｂ  Ｍａｐ−Ｅ２複合体の特性決定
セファデクスＧ−２５カラム上の複合体の溶出位置は、〜１００００の有効分子量を示唆した。これはＭＡＰとジスルフィド結合した最小４つのＥ２単位に対応する（理論的Ｍｒ９９１０）。最大置換は８単位／ＭＡＰである（理論的Ｍｒ１７７５０）。
実施例４：Ｃ−（Ｇ１５９−Ｆ１６４）−Ｃ（Ｅ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＣＧＧＲＫＶＦＣ（Ｅ４）
この配列は、成熟ヒトＣＲ１のＧ１５９−Ｆ１６４残基に及ぶ。環化を可能にするために、システインをペプチドのＮおよびＣ−末端にあらかじめ添加しておく。
４ａ  Ｅ４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−樹脂（０．４９ｇ；０．２５ミリモル）からの段階的結合によりＮ−末端Ｆｍｏｃ基が除去された８−残基ペプチジル樹脂（０．７４ｇ）を得る。残基Ｇｌｙ2,3はシングルカップリングしていた。ペプチジル樹脂（０．６８ｇ）を、混合物Ａを用いて開裂して、凍結乾燥後、粗固体（０．２２ｇ）を得た。勾配Ｇ、ＨおよびＩを用いた分取ＨＰＬＣにより、精製固体を得た（０．０１７ｇ；８．６％）。
４ｂ  Ｅ４の特質決定
分析ＨＰＬＣによると生成物は＞９０％の純度であり、勾配Ｊを用いて保持時間は１４．６であった。生成物はＤＴＴおよびＤＭＳＯでの処理により酸化された形態であることが判明した。生成物の水性溶液（ｐＨ７．５）を過剰のＤＴＴで処理し；勾配Ｊを用いた２．３時間後のＨＰＬＣから、ＲＴ１４．６分でのピークが減少し、ＲＴ１５．０に新しいピークが出現したことがわかる。生成物をＤＭＳＯの水性溶液（２０％ｖ／ｖ）で処理；１．３時間後勾配Ｊを用いたＨＰＬＣは変化なし。その環状ペプチドとしての同一性はｍ／ｚ８６８でのＦＡＢ質量分析において［Ｍ＋Ｈ］+イオンの観察により確認した。
実施例５：Ｆ１６４−Ｇ１８６（Ｃ１７４Ｓ）（Ｅ５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＳＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧ  （Ｅ５）
このペプチドは成熟ヒトＣＲ１のＦ１６４−Ｇ１８６残基に及ぶ。Ｃ１７４はセリンで置換されている。
５ａ  Ｅ５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂（０．１４ｇ；０．１０ミリモル）からの段階的結合によりＮ−末端Ｆｍｏｃ基が除去された２３−残基ペプチジル樹脂（０．５１ｇ）を得た。残基Ｐｈｅ1、Ｇｌｕ2、Ｇｌｙ5、Ｐｒｏ7、Ｔｒｙ10、Ｓｅｒ13,22、Ａｓｎ14およびＡｓｐ15,16はシングルカップリングしていた。ペプチジル樹脂（０．２４ｇ）を、混合物Ｂを用いて開裂して、凍結乾燥後、粗固体（０．１４ｇ）を得た。勾配Ｅを用いたスフェリソルブＣ−１８カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ  ｉｄ）上分画ＨＰＬＣによる精製により、精製固体を得た（０．００３９ｇ；３．３％）。
５ｂ  Ｅ５の特性決定
分析ＨＰＬＣによると生成物は＞９０％の純度であり、勾配Ｆを用いて保持時間は１２．２であった。その同一性はｍ／ｚ２５０１でのＦＡＢ質量分析において［Ｍ＋Ｈ］+イオンの観察およびアミノ酸分析：Ａｓｘ２．９１（理論値３）、Ｇｌｘ３．０１（３）、Ｓｅｒ３．９９（４）、Ｇｌｙ２．８８（３）、Ｔｈｒ１．０７（１）、Ｐｒｏ１．０５（１）、Ｔｙｒ０．８７（１）、Ｖａｌ２．４７（２）、Ｉｌｅ１．７５（２）、Ｌｅｕ０．９７（１）、Ｐｈｅ１．０９（１）（Ｔｒｐは酸加水分解の消滅のために計算せず）により確認した。
生物学的活性
ヒツジ赤血球の溶血により測定した抗補体活性
補体阻害物質の機能活性をウサギ抗体（Ｄｉａｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍｉａｍｉ，  ＵＳＡより入手）で感作したヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を測定することにより評価した。０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中で１／１２５に希釈したヒト血清が補体供給源であり、基本的にデイシー（Ｄａｃｉｅ）およびルイス（Ｌｅｗｉｓ）（１９７５）により記載されたようにボランティアのプールから調製した。簡単に説明すると、血液を３７℃に５分間暖め、血餅を除去し、残存する血清を遠心分離により清澄化した。血清フラクションを少量のアリコートに分割し、−１９６℃で貯蔵した。アリコートを必要に応じて解凍し、使用直前にＨｅｐｅｓ緩衝液中で希釈した。要すれば、窒素ガスまたはヘリウムガスを緩衝液に約３０分間吹き込み、その後、緩衝液を含む瓶に栓をした。
感作ヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を、以下のようにして、基本的にはワイズマン（Ｗｅｉｓｍａｎ）ら（１９９０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９  １４６−１５１により記載されたようにして、ｖ底マイクロタイタープレートフォーマットを用いた標準的溶血検定を用いて測定した。
Ｈｅｐｅｓ緩衝液中希釈した５０ｕｌのある範囲の濃度の阻害物質を５０ｕｌの１／１２５とともに培養した。１００ｕｌの予め暖めた感作ヒツジ赤血球を添加し、サンプルを最終反応容積を２００ｕｌ中３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを３００ｇ、４℃で１５分間スピンさせた後、平底マイクロタイタープレートに上清１５０ｕｌを移し、４１０ｎｍでの吸収を測定する。これは各試験溶液中の溶解量を反映する。最大溶解を、血清を赤血球と共に阻害物質の非存在下（Ｅ＋Ｓ）に培養することにより測定し、それから基底溶解度（赤血球を緩衝液（Ｅ）と共に培養することにより測定する）を引く。阻害物質による基底溶解を、阻害物質を赤血球と共に培養（Ｅ＋Ｉ）し、ついで試験サンプル（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）からそれを差し引くことにより評価した。ＩＨ５０が溶解の５０％阻害を与えるのに必要な阻害物質の濃度を表わすように阻害率を全細胞溶解の分数として表わした。
最大溶解：  Ａｍａｘ＝（Ｅ＋Ｓ）−（Ｅ）
阻害物質の存在下での溶解：  Ａｏ＝（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）−（Ｅ＋Ｉ）
0004125373.tif 000004
結果
Ｅ１  各フラクションからのペプチドを、酸素を除去し、環状ペプチドに対する酸化の量を制限するためにＮ2雰囲気下にしておいた０．１Ｍ  ＨｅｐｅｓｐＨ７．４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中に再懸濁した。ペプチドを、抗補体（抗溶血）活性に関して直接分析し、結果を以下の第１表に示す。
0004125373.tif 000005
データから、このペプチドは効果の増加が直線状ペプチド（Ｅ１ａ）の割合と正比例する場合、抗溶血活性を示すことがわかる。環状ペプチド（Ｅ１ｂ）の形成において、ジスルフィドが天然のＳＣＲにおいて通常対になっていない２残基間に形成され、これはペプチドを好ましくない構造にする。
Ｅ２  ペプチドを前記のようにＮ2下に保持した緩衝液を用いて分析した。３回の別個の分析を行い、結果は平均〜６７０ｕＭのＩＨ５０であった。
Ｅ３  ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、複合ペプチドのＭｒは〜８０００Ｄａと推定された。ＭＡＰペプチド単独のＩＨ５０は約２０００ｕＭで、未複合Ｅ２については約６００ｕＭであった。複合Ｅ３は部位をマルチマー化することにより活性が４６倍向上している約１３ｕＭのＩＨ５０を示した。
Ｅ４  ペプチドを、酸素を除去し、環状ペプチドに対する酸化量を制限するためにあらかじめＮ2下にしておいた０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中に再懸濁した。ペプチドは約３００ｕＭのＩＨ５０を有することが判明した。
Ｅ５  ペプチドを０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中に再懸濁した。ペプチドの活性は約８０ｕＭと測定された。
配列表
0004125373.tif 000006