(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリオン構造蛋白が組換えアデノウイルスを生産する天然アデノウイルスにおけるビリオン構造蛋白から変化せず、かつ、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス由来(ＨＩＶ−１)の抗原をコードする、tplenvまたはtplgagとtplHrevの組合せより選択される遺伝子を含有し、組換えアデノウイルスが、４型アデノウイルス（Ａｄ４）、５型アデノウイルス（Ａｄ５）、および７型アデノウイルス（Ａｄ７）から成る群から選択される１種類以上のアデノウイルスである、生の組換えアデノウイルスからなる、鼻腔内投与用の組成物。
【請求項２】
初期領域３における遺伝子がアデノウイルスにおいて欠失している、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組換えアデノウイルスが、Ａｄ７−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖ、Ａｄ７−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖ、Ａｄ４−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖ、Ａｄ４−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖ、Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖおよびＡｄ５−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖ からなる群から選択される１種類以上のアデノウイルスである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物にて用いるための、ＸがＡｄ４、Ａｄ５またはＡｄ７であり、ＹがｅｎｖまたはｇａｇであるＸ−ｔｐｌＹ−ｔｐｌＨｒｅｖである組換えアデノウイルス。
【請求項５】
Ａｄ４−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
Ａｄ７−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
Ａｄ４−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
Ａｄ５−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
Ａｄ７−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖである請求項４記載の組換えアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、温血哺乳類のための組換えアデノウイルスワクチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
生物医学的研究の主な目標は、免疫化を介してウイルス性疾患に対する保護を提供することである。ある研究は、死菌ワクチンを使用することであった。しかしながら、充分な抗原塊を保持するためには死菌ワクチンに対して多量の物質を必要とする。さらに、死菌はしばしばその調製の間に望ましくない生成物で汚染される。自体ワクチンである適当に操作されたアデノウイルスを使用する異種生菌ワクチンは優れた免疫原であると思われる[チャノック・アール(Ｃhanock Ｒ.)、ＪＡＭＡ、１９５、１５１(１９６７)]。本発明は、ベクターとしてアデノウイルスを使用するワクチンに関する。
【０００３】
現在市販されているアデノワクチンは、腸溶性投与形態の生の感染性アデノウイルスからなる。ワクチン接種されるべき患者への投与によって、該ウイルスは上気道系(ここで疾患を引き起こす感染が生じると思われる)を通過し、腸内に放出される。腸内では、該ウイルスは腸壁で増殖するが、ここでは、アデノウイルス性疾患を引き起こすことはできず、それにもかかわらず、アデノウイルス抗体の形成を誘発し、その結果としてアデノウイルス性疾患に対する免疫を与える。本発明では、生の感染性アデノウイルスは、他の疾患誘発性微生物によって生産された抗原をコードする遺伝子を含有するように操作された。放出によって、該ウイルスは増殖し、アデノウイルス性抗原および病原抗原を共に別々に発現し、これによって、アデノウイルスおよび他の疾患誘発性微生物の両方に対する抗体の形成を誘発するかまたは細胞性免疫を誘発する。「死」ウイルスと対比して、「生のウイルス」なる語は、同一子孫を生産することができるウイルスそれ自体、またはさらなる遺伝物質と一緒になっているウイルスを意味する。「感染性の」なる語は、ウイルスゲノムを細胞中に送達する能力を有することを意味する。
【０００４】
欧州特許出願公開第８０,８０６号(１９８３)においてロイ(Ｒoy)は、免疫を与える第２の微生物の抗原を発現する異種遺伝子を含有する微生物の投与による微生物性疾患に対する免疫の生産方法を提案した。彼は、好ましい経口調製物は腸溶性であると述べている。ダベルコ(Ｄubelcco)は、アデノウイルスの表面蛋白がその構造中に動物への投与に対する所望の生物学的応答を生じる異種蛋白の断片を含有するように修飾されている組換えアデノウイルスワクチンを提案した。[ＰＣＴ国際公開ＷＯ ８３／０２３９３(１９８３)]。デイビス(Ｄavis)は、組換えアデノウイルスから誘導された経口ワクチンを開示している[英国特許ＧＢ２１６６３４９ Ｂ]。
【０００５】
１型ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ−１)は、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)および関連疾患と病因学的に関連していた。[バレー−シノウジィ,エフ(Ｂarre−Ｓinoussi,Ｆ.)、サイエンス(Ｓcience)２２０：８６８(１９８３)；ガロ,アール(Ｇallo,Ｒ.)、サイエンス(Ｓcience)２２４：５００（１９８４)；ポポビック,エム（Ｐopovic,Ｍ.)、サイエンス(Ｓcience)２２４：４９７(１９８４)；サーンガドハラン,エム(Ｓarngadharan,Ｍ.)、サイエンス(Ｓcience)２２４：５０６(１９８４)]。ＡＩＤＳは、現在、世界的に流行しており、これに対するワクチンや治療法はない。ワクチン開発についての試みのほとんどは、防御免疫を与え得る抗原としてのエンベロープ(ｅｎｖ)糖蛋白に集中していた。精製したｇｐ１２０に対して調製された抗血清は、in virtoでＨＩＶ−１を中和することができる[クロウル,アール(Ｃrowl,Ｒ.)、セル(Ｃell)４１：９７９(１９８５)；プットニィ,エス(Ｐutney,Ｓ.)、サイエンス(Ｓcience)２３４：１３９２(１９８６)；ホ,ディ(Ｈo,Ｄ.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)６１：２０２４(１９８７)；ナラ,ピー(Ｎara,Ｐ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８４：３７９７(１９８７)]。ＨＩＶ−１エンベロープ抗原は、エシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)[クロウル,アール(Ｃrowl,Ｒ.)、セル(Ｃell)４１：９７９(１９８５)；チャン,ティ(Ｃhang,Ｔ.)、バイオ／テクノロジー(Ｂio／Ｔechnology)、３：９０５(１９８５)；ドーソン,ジー(Ｄawson,Ｇ.)、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス(Ｊ.Ｉnfect.Ｄis.)、１５７：１４９(１９８８)]および哺乳類[チャクラバルチ,エス(Ｃhakrabarti,Ｓ.)、ネイチャー(Ｎature)、３２０：５３５(１９８６)；デウォー,アール(Ｄewar,Ｒ.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)、６３：１２９(１９８９)；リコッシュ,ディ(Ｒekosh,Ｄ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８５：３３４(１９８８)；ウィーリー,エム(Ｗhealy,Ｍ.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)６２：４１８５(１９８８)]、酵母[バー,ピー(Ｂarr,Ｐ.)、バクシーン(Ｖacinne)、５：９０(１９８７)］および昆虫細胞[フ,エス(Ｈu,Ｓ.)、ネイチャー(Ｎature)３２８：７２１(１９７８)；ラッシェ,ジェイ(Ｒusche,Ｊ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８４：６２９４(１９８７)]を含む種々の発現系において生産された。
【０００６】
無傷のＨＩＶ−１ｅｎｖ糖蛋白[フ,エス(Ｈu,Ｓ.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)６１：３６１７(１９８７)]または精製した組換えｇｐ１２０ｅｎｖ糖蛋白[バーマン,ピー(Ｂerman,Ｐ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、８５：５２００(１９８８)]を発現する生の組換えワクシニアウイルスを、ワクチン候補としてチンパンジーにおいて評価した。これらのワクチンによる活性免疫化は良好な細胞性免疫応答およびｅｎｖ抗原に対する細胞毒性Ｔ−細胞活性を誘発した[ザーリング,ジェイ(Ｚarling,Ｊ.)、ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ.Ｉmmunol.)１３９：９８８(１９８７)]。すべての実験動物は、ＥＬＩＳＡ法およびウェスタンブロッティング法によってアッセイされるように血清変換(seroconvert)された。しかしながら、免疫化チンパンジーは、ＨＩＶ−１に対する中和抗体の力価を全く発現しないかまたは非常に低い力価を発現した。生ウイルスによる攻撃誘発は、これらのワクチンに対してチンパンジーを保護しなかった。型特異性ＨＩＶ−１中和抗体は、ｇｐ１２０のＣ−末端半分内で可変性ドメイン(Ｖ３)に対して感染の初期のチンパンジーにおいて見いだされた[ゴウズミット,ジェイ(Ｇoudsmit,Ｊ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８５：４４７８(１９８８)]。昆虫細胞中で作製された組換えｇｐ１２０は、ヤギにおける体液性免疫応答を誘発することも示された[ルッシェ,ジェイ(Ｒusche,Ｊ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８４：６２９４(１９８７)]。ザガリー(Ｚagury)[ネイチャー(Ｎature)３３２：７２８(１９８８)]は、ｇｐ１６０を発現するワクチンウイルス組換え体を使用してヒトにおける既往の体液性および細胞性免疫応答の両方を示した。[チャクラバルチ,エス(Ｃhakrabarti,Ｓ.)、ネイチャー(Ｎature)３２０：５３５(１９８６)；ハーン,ビー(Ｈahn,Ｂ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８２：４８１３(１９８５)]。感染Ｔ４細胞に対する基特異性細胞性免疫および細胞性細胞毒性が共に見られた。これらの結果は、ヒトにおいて、組換えｅｎｖベースのワクチンを使用してＨＩＶ−１に対する免疫状態が得られることを示す。最近、デスロジャーズ(Ｄesrosiers)は、不活化全サル免疫不全ウイルス(ＳＩＶ)によるワクチン接種が生ＳＩＶによる攻撃誘発に対してマカクを保護できることを示した。[プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８６：６３５３(１９８９)]。これらのデータは、ヒトＡＩＤＳウイルス、ＨＩＶ−１感染に対するワクチン保護が可能であるという希望を与える。
【０００７】
チャンダ(Ｃhanda)は、ヘルパー独立性７型アデノウイルス組換え体を使用するｒｅｖ遺伝子の存在下におけるＨＩＶ−１のエンベロープ糖蛋白の高レベルの発現を開示している。[バイロロジー(Ｖirology)１７５：５３５(１９９０)]。バーノン(Ｖernon)は、組換えアデノウイルスベクター系中に組み込まれたＨＩＶ−ｇａｇ含有粒子の超微構造的特性付けを開示している[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirology)７２：１２４３(１９９１)]。バーノン(Ｖernon)は、また、ＨＩＶ−１組換えアデノウイルスＡｄ７−ｒｅｖ−ｇａｇおよびＡｄ４−ｒｅｖ−ｇａｇの調製を開示している。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ビリオン構造蛋白が組換えアデノウイルスを生産する天然アデノウイルスにおけるビリオン構造蛋白から変化せず、かつ、抗体に対応するかまたは細胞性免疫を誘発する抗原をコードする遺伝子を含有する生の組換えアデノウイルスを温血哺乳類に鼻腔内投与、筋肉内投与または皮下投与することからなる、温血哺乳類における感染性微生物に対する抗体または細胞性免疫の生産方法を提供するものである。
【０００９】
好ましい具体例では、本発明は、ビリオン構造蛋白が組換えアデノウイルスを生産する天然アデノウイルスにおけるビリオン構造蛋白から変化せず、かつ、各々、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、ＲＳウイルス(respiratory syncytial virus)、ロタウイルスまたはパラインフルエンザウイルスをコードする遺伝子を含有する生の組換えアデノウイルスを温血哺乳類に鼻腔内投与、筋肉内投与または皮下投与することからなる、温血哺乳類におけるヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ−１)、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルスまたはパラインフルエンザウイルスに対する抗体の生産方法を提供するものである。
【００１０】
本発明は、ビリオン構造蛋白が組換えアデノウイルスを生産する天然アデノウイルスにおけるビリオン構造蛋白から変化せず、かつ抗体に対応するかまたは細胞性免疫を誘発する抗原をコードする遺伝子を含有する生の組換えアデノウイルスからなり、鼻腔内投与形態、筋肉内投与形態または皮下投与形態に製剤化された、温血哺乳類における感染性微生物に対する抗体または細胞性免疫の生産用組成物を提供するものでもある。
【００１１】
本明細書は特に４型、５型または７型のアデノウイルスに関するものであるが、本発明ではいずれの型の生の感染性アデノウイルスも使用することができる。さらに、本発明は詳細には初期領域３(Ｅ３)欠失を有するアデノウイルスに関するが、弱毒化されており、温度感受性損傷またはＥ１欠失を有するアデノウイルスをベクターとして使用してもよい。同様に、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルスまたはパラインフルエンザウイルスに対する抗体を生産するワクチンについて特に言及されてきたが、本発明は、温血動物が抗体または細胞性免疫を生産し、かつ、約３０００までの塩基対からなる遺伝子によってコードされる抗原を含有するいずれの病原菌にも対する経口ワクチンを提供するものである。かくして、例えば、インフルエンザ、Ａ型肝炎、コレラ、イー・コリ(Ｅ.coli)、百日咳、ジフテリア、破傷風、細菌性赤痢、淋病、マイコプラズマ肺炎などの疾患に対する免疫化も本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
好ましい具体例では、当該治療方法は、ＨＩＶ−１罹病性哺乳類に予防学的に、および該哺乳類においてＨＩＶの検出後の免疫療法として、組換えアデノウイルスを投与することを含む。以下の組換えアデノウイルスを含む療法を使用して抗ＨＩＶ応答を生産する。
【００１３】
【表１】
0004093597.tif 000002
【００１４】
前記「表１」に関して、Ａｄ４、Ａｄ５およびＡｄ７は、各々、Ｅ３領域が欠失した４型、５型、および７型ヒトアデノウイルスを表す。ｅｎｖは、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白(ｇｐ１６０)遺伝子を表す。ｇａｇは、ＨＩＶｇａｇ／ｐｒｏ遺伝子を表す。ｒｅｖは、ＨＩＶ調節遺伝子を表す。Ｈｒｅｖは、しばしばヒト遺伝子中で使用されたコドンを使用してアミノ酸配列を変化させずにヌクレオチド配列を変化させたｒｅｖ遺伝子の変形バージョンを表す。ｔｐｌは、組換え遺伝子の前にある第１および第２リーダー間に介在配列を有する上流のアデノウイルス３分節系リーダー配列を表す。
【００１５】
以下に詳述するとおり、ナイーブチンパンジーへのＡｄ−ＨＩＶ組換えウイルスの鼻腔内投与によって、ＨＩＶ組換え抗原に向けられた体液性免疫応答および細胞性免疫応答を初回免疫および追加免疫した。チンパンジーに投与した組換えアデノウイルスは、ＨＩＶのｅｎｖおよびｇａｇ蛋白に対する抗体を生産することを示した。ＨＩＶに対して特異的なＩｇＧ抗体は、組換えアデノウイルスの投与後の鼻分泌物、唾液分泌物および膣分泌物中で観察され、ＨＩＶに対して特異的なＩｇＡ抗体は、鼻分泌物および唾液分泌物中で観察された。第１組目の組換えウイルス(Ａｄ７)は、最も長い時間放出され、最良の抗Ａｄ抗体応答を誘発すると思われる。この結果は、鼻腔内経路によるＡｄ−ＨＩＶワクチンの投与が経口経路による腸溶性組換えウイルスの投与よりも優れていることも示した。
【００１６】
ＨＩＶ抗原に向けられた最適な免疫応答は、強い抗ＨＩＶ結合抗体を惹起するために異型組換えＡｄ−ＨＩＶによる一次感染一ブースター免疫化を必要とした。該Ａｄ−ＨＩＶウイルスの鼻腔内投与はチンパンジーを有効に初回免疫して、次なるＨＩＶ−１サブユニット蛋白ブースター免疫化の後でＨＩＶ−１に対する高力価の中和抗体と応答した。
【００１７】
【実施例】
代表的な組換えアデノウイルスの調製
以下の実施例は、本発明の代表的な組換えアデノウイルスの構築を示す。当該組換えウイルスは、Ａ５４９細胞上で増殖させ、次いで、Ａ５４９細胞上で力価測定した。
【００１８】
実施例１
Ａｄ７−ｇａｇ−１
ＨＩＶエンベロープ蛋白に関する遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの構築は開示されており[チャンダ,ピー(Ｃhanda,Ｐ.)、バイロロジー(Ｖirology)１７５：５３５(１９９０)]；同様の方法を使用してｇａｇおよびｐｒｏを取り込んだ[バーノン,エス(Ｖernon,Ｓ.)、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirology)７２：１２４３(１９９１)]。すなわち、ウイルスのｒｅｖ応答素子(ｒｒｅ；ｂｐ７１７８〜７６９８)の挿入のために、ＨＩＶ−１菌株ＬＡＶ[ワイン−ホブソン,エス(Ｗain−Ｈobson,Ｓ.)、セル(Ｃell)４０：９(１９８５)]の全ｇａｇおよびｐｒｏコード化領域(ｂｐ３３５〜２１６５)を含むＤＮＡ断片をｇａｇ遺伝子のＡＵＧコドンの前の固有のＳａ／Ｉ部位およびｂｐ２１６５のＸｂａＩ部位とともに構築した。チャンダ(Ｃhanda）[バイロロジー(Ｖirology)、１７５：５３５(１９９０)]に開示されている７型アデノウイルス(Ａｄ７)、主要後期プロモーター(ＭＬＰ)、第１および第２リーダー間に介在配列を有する３分節系リーダー(ＴＰＬ)ならびにヘキソンポリアデノシンリン酸化部位(ｐｏｌｙ Ａ)を含む発現カセットのＳaＩ部位に３つのＨＩＶ−１配列を含む２.３７ｋｂのＳaＩ断片を挿入した。このカセットを、欠失した[７９.５〜８８.４マップ単位(ｍ.ｕ.)]Ｅ３領域においてＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子[ファインバーグ,エム(Ｆeinberg,Ｍ.)、セル(Ｃell)４６：８０７(１９８６)；ソドロスキー,ジェイ(Ｓodroski,Ｊ.)、ネイチャー(Ｎature)３２１：４１２(１９８６)]を含有するＡｄ７ゲノム[スーセンバッハ(Ｓussenbach)、ジ・アデノバイラシズ(Ｔhe Ａdenoviruses)、ギンスバーク(Ｇinsberg)編、プレナム・プレス(ＰlenumＰress)、第３４〜１２４頁(１９８４)]の右端から１５９ｂｐに挿入した。
【００１９】
実施例２
Ａｄ４−ｇａｇ−１
実施例１におけるＡｄ７−ｇａｇ−１組換えアデノウイルスの構築方法に従って、類似のＡｄ４配列を含む同様の発現カセットおよび３つのＨＩＶコード化領域を、７６〜８６ｍ.ｕ.間のＥ３欠失においてＨＩＶ−１ ｒｅｖを含むＡｄ４ゲノムの右端から部位１３９ｂｐに挿入した。
【００２０】
実施例３
Ａｄ５−ｅｎｖ
Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖはＨＩＶ−１(ＬＡＶ菌株)ｇｐ１６０の全暗号配列およびｒｅｖ遺伝子の修飾バージョン、いわゆるＨｒｅｖを含む。このｅｎｖおよびｒｅｖの両遺伝子の前にＡｄ５の３分節系リーダー(Ａｄ５−ｔｐｌ)の合成複写を行った。Ａｄ５−ｔｐｌを化学的に合成し、ｐＴＺベクター中でクローン化した。次いで、Ａｄ５−ｔｐｌの後ろにｇｐ１６０ ＤＮＡ配列を挿入してＡｄ５−ｔｐｌｅｎｖ／ＰＴＺ１８Ｒクローンを生じさせた。Ｈｒｅｖ(〜３６０ｂｐ)もまた化学的に合成した。ここで、コドン使用法の助けを借りて、アミノ酸配列を変化させずにヌクレオチド配列を変化させた。これは、いくつかの同一配列がｅｎｖおよびｒｅｖ間に存在する場合の同種組換えを回避するために行った。Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ構築のような類似の方法において、ｐＴＺ１８Ｒベクターにおいてｔｐｌの後ろにＨｒｅｖ遺伝子を挿入してプラスミド、Ａｄ５−ｔｐｌＨｒｅｖを生じさせた。Ａｄ５−ｔｐｌＨｒｅｖを含有する全配列を切除し、次いで、Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖの後ろに挿入してプラスミド、Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖを生じさせた。次いで、７８.８ｍｕでＡｄ５マリエッタ(Ｍarietta)菌株の欠失Ｅ３領域(７８.８−８５.７ｍｕ欠失)においてこのプラスミドを挿入した。このプラスミドをＢｇｌI酵素で直線化し、次いで、野生型の純粋なＡｄ５ウイルスから誘導した０−８７ｍｕ ＳｎａＢ１断片と混合した。Ａ５４９細胞をＤＮＡ混合物でトランスフェクトした後、組換えウイルスプラークを選び、プラークを３回精製し、ハート(Ｈirt)の方法[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂio.)、２６：３６５(１９６７)]によって感染細胞から抽出したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ部位分析によってそれらのゲノム構造を確認した。
【００２１】
実施例４
Ａｄ５−ｇａｇ
Ａｄ５−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖは全ｇａｇおよびｐｒｏ領域ならびに修飾ｒｅｖ遺伝子、Ｈｒｅｖを含有する。ｇａｇおよびＨｒｅｖ遺伝子の前にＡｄ５合成３文節系リーダーの一複写物を置いた。ｇａｇ遺伝子のＡＵＧコドンの前で固有のＳａｌI部位およびウイルスｒｅｖ応答素子(ｒｒｅ；ｂｐ７１７８−７６９８)の挿入のためのｂｐ２１６５のｘｂａ部位と一緒に全ｇａｇおよびｐｒｏ領域を含有するＤＮＡ断片(ＨＩＶ−１のＬＡＶ菌株のｂｐ３３５〜２１６５)を構築した。Ａｄ５−ｔｐｌｅｎｖ−ｔｐｌＨｒｅｖについて記載したと同様の方法で、２つの別々のプラスミド、Ａｄ５−ｔｐｌｇａｇおよびＡｄ５−ｔｐｌＨｒｅｖを構築した。次いで、Ａｄ５−ｔｐｌｇａｇの後ろにＡｄ５−ｔｐｌＨｒｅｖ断片を挿入してプラスミドＡｄ５−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖを生じさせた。次いで、Ｅ３欠失(７８.８−８５.７ｍｕ Ｅ３欠失)を有するＡｄ５マリエッタ菌株の遺伝子位置７８.８の固有のＸｂａI部位で断片Ａｄ５−ｔｐｌｇａｇ−ｔｐｌＨｒｅｖを挿入した。次いで、Ａｄ５配列を含有する最終プラスミドを直線化し、次いで、トランスフェクションのために０−８７ｍｕ ＳｎａＢ１ウイルス断片と混合する。組換えプラークを選択し、プラークを３回精製し、感染細胞から抽出したＤＮＡのハート分析によって検査した。
【００２２】
実施例５
腸溶性カプセル
Ａ５４９細胞中で組換えアデノウイルスを増殖し、３回冷凍−解凍した後に収穫した。清澄化された感染細胞溶解物を凍結乾燥し、除湿条件下で１ミリリットルの注射器プランジャを使用して＃２ゼラチンカプセル中に６０〜１００mgを充填した。該カプセルをアセトン／１００％エタノール(１：１)中１０％フタル酸酢酸セルロースで、浸漬の間に風乾しつつ、６回手動で浸漬することによってコーティングした。これらの条件下でフタル酸酢酸セルロース６９〜７７mgのコーティングを形成した。ファンケル・ディスインテグレーション・テスター装置(ＶanＫel Ｄisintegration Ｔestor apparatus)を使用して３７℃で１時間、試料カプセルを、疑似胃液(０.３２％ペプシン、０.２％ＮaＣl pＨ１.２)に対する耐性について試験した。当該カプセルを穴または亀裂について検査し、疑似腸液(１.０％パンクレアチン、０.０５Ｍ第一リン酸カリウム pＨ７.５)１０ミリリットルを含有する１５ミリリットルのチューブに移し、３７℃で旋回させた。試験した全てのカプセルは、撹拌しつつ３７℃で１時間、疑似胃液に対して耐性であり、疑似腸液中では１５分以内に溶解し始めた。プラークアッセイおよびハート分析によって確認されたウイルスＤＮＡ安定性によって、集密性Ａ５４９細胞単層上でウイルスの量を滴定した。
【００２３】
処置療法
３つの処置法の下、チンパンジーにおいてＨＩＶに対する組換えアデノウイルスの免疫原性を評価した。第１の処置法は、０、７および２６週目に腸溶性カプル(実施例５)を介して経口的に組換えアデノウイルスを、次いで、アジュバントとしてミョウバンを使用するｅｎｖ＋ｇａｇサブユニット蛋白ブースターを投与することからなっていた。第２の処置法は、処置法１を受けたチンパンジーを、さらに、４６および５８週目に、鼻腔内投与された組換えアデノウイルスのさらなるブースターで、処置することからなる。第３の処置法は、０、２４および５２週目にナイーブチンパンジーに鼻腔内で組換えアデノウイルスを、次いで、７２週目にｅｎｖサブユニットブースターを投与することからなる。
【００２４】
下記「表２」に処置法１および２を概略記載する。
【００２５】
【表２】
0004093597.tif 000003
【００２６】
下記「表３」に処置法３を概略記載する。
【００２７】
【表３】
0004093597.tif 000004
【００２８】
免疫原性の測定：処置法１
チンパンジー接種法
処置法１を使用して、４型および７型ヒトアデノウイルスに対する中和抗体の存在についてネガティブにスクリーニングされた３匹のチンパンジー(オス２匹およびメス１匹)を評価した。３日連続麻酔下、胃管を使用して組換えアデノウイルスを含有する腸溶性カプセルを投与した。２匹のチンパンジー(１および２)にｅｎｖおよびｇａｇ組換えウイルスの両方を投与し、一方、第３のチンパンジー(３)にはｅｎｖ組換えウイルスだけを投与した。
【００２９】
ｅｎｖまたはｇａｇ遺伝子生産物を含有するアデノウイルス誘導サブユニット調製物を感染Ａ５４９細胞培養物から精製した[バーノン,エス(Ｖernon,Ｓ.)、ジャー ナル・オブ・ジェネティック・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirology)、７２：１２４３(１９９１)およびナトゥク,アール(Ｎatuk,Ｒ.)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、８９：７７７７(１９９２)を参照]。組換え抗原をミョウバンアジュバントと一緒に製剤化し、ｅｎｖ粒子２００μg／用量およびｇａｇ粒子５００μg／用量を筋肉内投与した。
【００３０】
実験の間、さまざまな時点で全血、血清、および便試料を収集した。全血を処理して、(ＨＩＶ−ｅｎｖ、ＨＩＶ−ｇａｇまたはｌａｃ遺伝子生産物を発現する組換えワクチニアウイルスを使用して)ＦＡＣＳ、ＨＩＶ ＣＴＬのために、および精製したＨＩＶ組換えｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｐ２４についてのリンパ増殖性アッセイのために白血球個体群を得た。血清および便標本は使用まで−７０℃で貯蔵した。
【００３１】
便標本における組換えアデノウイルスの検出
チンパンジーの便標本を解凍し、１０％(Ｖ／Ｖ)懸濁液を抗生物質含有ＤＭＥＭにした。清澄化した便の懸濁液を使用して６０mmの組織培養皿中で集密性Ａ５４９細胞単層に感染させた。１時間の吸着期間の後、未結合物質を洗い落とし、単層を０.５％寒天オーバーレイ培地で覆った。プラークを７−１０日間増殖させ、プラークをニュートラルレッド染色によって可視化し、計数し、細胞単層を侵害しないように注意して寒天オーバーレイを徐々に除去した。細胞シートをニトロセルロースフィルター膜(ミリポア・タイプＨＡ(Ｍillipore Ｔype ＨＡ)、０.４５μm)に移し、２０Ｘ ＳＳＣ中で予備洗浄し、細胞層上に置き、細胞単層と２〜４分間接触させた。フィルターを剥がし、風乾し、真空オーブン中、８０℃で２時間焼いた。ニトロセルロースフィルターを室温で３Ｘ ＳＳｃ／０.１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、標準的な方法に従って予備ハイブリダイスおよびハイブリダイスした[ポンセット,ディ(Ｐoncet,Ｄ.)、ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッズ(Ｊ.Ｖirol.Ｍethods)、２６：２７(１９８９)]。ハイブリダイゼーション緩衝液(１×１０6ＣＰＭ)に32Ｐ標識オリゴ−プローブを添加し、４２℃で一晩インキュベートした。Ａｄ４繊維、Ａｄ５繊維、Ａｄ７繊維、ＨＩＶ−ｅｎｖまたはＨＩＶ−ｇａｇ特異的配列を検出することができるＤＮＡプローブを調製した。[ワイン−ホブソン(Ｗain−Ｈobson)、セル(Ｃell)、４０：９(１９８５)]。フィルターを洗浄し、オートラジオグフィーに付して、ハイブリダイゼーションシグナルを計数した。
【００３２】
アデノウイルス中和試験法
熱不活性化された(５６℃で３０分間)イヌの血清の連続２倍希釈液(１：４で開始)を９６ウエル微量滴定プレートにおいて作製し(０.０５ミリリットル／ウエル)、３７℃で１時間、３０−１００ ＴＣＩＤ50ウイルスを含有する０.０５ミリリットル培地と混合した。各ウエルに２×１０4 Ａ５４９細胞を含有する培地０.０５ミリリットルを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ2で７〜１０日間インキュベートした。全ての試料を２重に作製した。試験血清における最終点を決定するために各アッセイにおいてウイルスおよび非感染細胞対照を含んだ。力価は、５０％細胞変性効果が観察された最も低い希釈の逆数として表した。
【００３３】
ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングによる抗ＨＩＶ抗体の検出
抗ＨＩＶ抗体の検出：ＨＩＶ−１抗原に対するチンパンジー抗体応答を、製造者(ドイツ国ウィルミントンのデュポン(ＤuＰont))による指示に従って、市販のＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットキットによって種々の希釈液を試験することによって測定した。
【００３４】
結果
ウイルス接種の前後に各チンパンジーから便を収集し、−７０℃で貯蔵した。各試料から１０％懸濁液を調製し、これを使用して集密性Ａ５４９細胞単層に感染させた。７〜１０日後、ウイルスプラークをニュートラルレッド染色によって同定し、細胞単層をニトロセルロース膜に移した。代表的な試料を種々の標識オリゴ−プローブと一緒にハイブリダイズしてＡｄ４、Ａｄ５、Ａｄ７、ＨＩＶ−ｒｅｖまたはＨＩＶ−ｇａｇ遺伝子に対して特異的な配列を検出した。特異的な組換えＡｄ−ＨＩＶウイルスの同定は、このプラークハイブリダイゼーション法によって測定され得る。組換えウイルスは、接種後７日間を越える期間、便中に全く放出されなかった。ピーク力価は、常に、１〜３日目試料に関連しており、おそらく非吸着ウイルス接種物を表すのであろう。Ａｄ−ＨＢｓＡｇ組換え体を使用する前記チンパンジー研究によって、Ａｄ−ＨＢｓＡｇ組換え体が接種後３０〜４０日間検出されることが判明した。腸用カプセル投与形態について、これらの組換えウイルスはin vivoであまり複製しなかったと思われる。
【００３５】
使用したアデノウイルスベクターの血清型へのセロコンバージョンを中和試験法によって決定した。チンパンジーの各々において使用した３つの血清型全てについて非常に低いものから適度なものまで抗アデノウイルス血清力価を測定した。
【００３６】
ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング法によって組換えＨＩＶ遺伝子生産物へのセロコンバージョンを測定した。Ａｄ５−ｅｎｖ組換え体による第２ブースター接種前にはいずれのチンパンジーにおいてもＥＬＩＳＡ応答は検出されなかった。Ａｄ５−ｅｎｖ接種の２週間後、該動物３匹のうち２匹において抗ｅｎｖ応答が測定された。ｇａｇおよび／またはｅｎｖ調製物の筋肉内注射は、該動物３匹のうち１匹においてわずかな追加免疫化効果を有した。ウェスタンブロット分析法は、ＥＬＩＳＡよりも非常に感度が高いと思われ、ｅｎｖおよび／またはｇａｇ遺伝子生産物が免疫原性であると認識されている同定のさらなる長所を有していた。初回免疫Ａｄ７組換え体およびＡｄ４組換えウイルスを含有する第１ブースターの後に、低い血清抗体力価が測定された。Ａｄ５−ｅｎｖ組換え体による第２ブースター免疫化の後に、ｅｎｖ遺伝子生産物に対する血清力価の有意な増加が観察された。サブユニット調製物の注射の後に、ｇａｇ遺伝子生産物を投与した動物２匹において有意な増加が観察された。比較的良好なＨＩＶ抗原に対するウェスタンブロット力価を除いて、動物３匹のうち１匹だけが、血清中和抗体と応答した。チンパンジー２におけるこの応答は非常に低かった(力価１０〜２０)。
【００３７】
これらの結果を下記「表４」に概略記載した。
【表４】
0004093597.tif 000005
【００３８】
チンパンジーから得られた末梢血液単核細胞固体群において細胞性免疫を測定した。ＨＩＶ−ｅｎｖ遺伝子生産物、ＨＩＶ−ｇａｇ遺伝子生産物またはｌａｃ遺伝子生産物(非特異的細胞毒性に関する対照)を発現するワクチニアウイルス組換え体に感染した同系標的細胞の溶解を測定することによって、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性を測定した。この方法で微量のＨＩＶ特異性ＣＴＬ様活性を測定した。
【００３９】
精製した組換えｅｎｖ(ｇｐ１６０、ｇｐ１２０)またはｇａｇ(ｐ２４)調製物が幼若化を刺激することができるか否かを決定するために、リンパ増殖性アッセイを行った。初回接種物の後に増殖性は測定されず、該動物３匹のうち１匹だけがＡｄ４組換えウイルスを有する第１ブーストの投与後にリンパ増殖性応答を示す。動物３匹全ては、第２ブースター(Ａｄ５−ｅｎｖ)および第３ブースト(サブユニット調製物)後に増殖性応答で応じた。
【００４０】
免疫原性の測定：処置法２
チンパンジー接種およびデータ収集
予め腸溶性カプセル中のＡｄ−ＨＩＶ組換えウイルスを接種し、アデノウイルス誘導ｇａｇおよび／またはｅｎｖサブユニットでブーストしたチンパンジー３匹(オス２匹およびメス１匹)(処置法１)を、Ａｄ７−ＨＩＶウイルス(４６週目)で、および１２週後(５８週目)にＡｄ４−ＨＩＶウイルスで鼻腔内感染させた。麻酔下、チンパンジーの鼻孔中に、リン酸塩食塩緩衝液を滴下して希釈した組織培養培地中の組換えアデノウイルスを投与した。チンパンジー２匹(番号１および２)にｅｎｖおよびｇａｇ組換えウイルスの両方を投与し、一方、第３のチンパンジー(番号３)にｅｎｖ組換えウイルスだけを投与した。
【００４１】
全血、血清、および便の試料を実験の間の様々な時点で収集し、処置法１の記載と同様に処理した。処置法１に記載の方法に従って、便試料または鼻の綿棒におけるアデノウイルス検出、アデノウイルス中和試験法、および抗ＨＩＶ抗体の検出を行った。
【００４２】
結果
１×１０8pfu／チンパンジーの一用量でＡｄ７組換え体を有する第１鼻腔内ブースターを投与した。ウイルス投与時にチンパンジー３、１および２は、前記経口投与から、各々、＜４、８および６４の血清抗Ａｄ７中和力価を有した。プラークハイブリダイゼーション法によって、放出された組換えウイルスの存在について鼻の綿棒および便の試料を試験した。動物のうち２匹では、接種後７日間まで、鼻の綿棒中で組換えＡｄ７−ｅｎｖが検出された。組換えＡｄ７−ｅｎｖおよびＡｄ７−ｇａｇは、接種後５〜１２日間、便の試料中に存在することが判明した。Ａｄ７に対する血清力価および鼻の綿棒および便の試料中の組換えウイルスの検出能の間に関係があった。限界抗ＨＩＶ抗体応答を表示する２匹の動物は鼻腔内ブーストによって非常に強化された。より少量で第３の動物をブーストした。今、３匹の動物においてＨＩＶで指向された低い力価の中和抗体を検出することができた。抗ｇａｇおよび／またはｅｎｖ結合抗体を含有する鼻の綿棒試料中で分泌抗体を検出した。Ａｄ７組換えウイルスの鼻腔内投与の結果、これらの動物において呼吸疾患の徴候または症候は観察されなかった。
【００４３】
３カ月後、これらのチンパンジーを１×１０8pfu／チンパンジー／ウイルスの一回用量のＡｄ４組換え体で免疫化した。これらの動物は、鼻腔内攻撃時誘発時に前記経口免疫化により１２８〜２５６の間の血清抗Ａｄ４中和力価を有した。感染の３日後、動物のうちの２匹(２および３)は、少し咳がでた。第３の動物(番号１)は、細菌性肺炎から５日目に死んだ(ストレプトコッカス・ニューモニエ(Ｓtreptococcus pneumoniae)が単離された)。他の２匹の動物からは、聴診法によって耳障りな音が得られ、両方のチンパンジーからエス・ニューモニエ(Ｓ.pneumonia)が単離された。抗生物質治療を開始し、両方のチンパンジーを再生した。
【００４４】
この条件の既往実験の後、いくつかの観察を行った。鼻腔内投与時、チンパンジー番号１は、すでに、発熱および異常完全血球算定を経験していた。不均衡数の多形核細胞が存在し、５％レベルの杆状球(未成熟多形核細胞)が一緒に存在しており、この情報により、ウイルス接種前に有意な細菌感染を生じていたことが判明した。肺、肝臓、脾臓および血清から採取した剖検試料を全て、罹病性Ａ５４９細胞単層上で３つのブラインドパッセージを使用して組織培養によって感染アデノウイルスの存在についての陰性を試験した。プラークハイブリダイゼーション法によって同様の発見が得られた。肺および肝臓パラフィン包埋試料は、アデノウイルス抗原に関する市販の免疫蛍光キットを使用してアデノウイルス抗原の存在についての陰性を試験した。Ｈ＆Ｅ染色した肺切片中で封入体が観察された。これらの封入体がアデノウイルスによって生じたか否かについて専門家による不一致があった。数週間後、同一の霊長類センターで別のチンパンジーが同様の運命を経験し、死んだ。組換えアデノウイルスの投与は小さい役割を持ったに過ぎないと思われたが、いずれの場合も、チンパンジー番号１の死を引き起こす際に、チンパンジーへのアデノウイルス組換え体のさらなる鼻腔内投与の前後に予防学的に抗生物質を投与することが賢明であると考えられた。
【００４５】
下記「表５」は、処置法１および処置法２におけるＡｄ７−組換え体を使用して得られた結果を示す。
【００４６】
【表５】
0004093597.tif 000006
【００４７】
免疫原性の測定：処置法３
チンパンジー接種およびデータ収集
４型、５型および７型ヒトアデノウイルスに対する中和抗体の存在についてネガティブにスクリーニングされた３匹のチンパンジー(オス２匹およびメス１匹)を処置法３を使用して評価した。２匹のチンパンジー(番号４および５)にｅｎｖおよびｇａｇ組換えウイルスを投与し、一方、第３のチンパンジー(番号６)にｅｎｖ組換えウイルスだけを投与した。該チンパンジーに予防的に抗生物質を投与し、呼吸疾患は観察されなかった。
【００４８】
実験の間の様々な時点で全血、血清、および便の試料を収集し、処置法１の記載と同様に処理した。処置法１に記載の方法に従って、便の試料および鼻の綿棒中のアデノウイルスの検出、アデノウイルス中和アッセイ、および抗ＨＩＶ抗体の検出を行った。
【００４９】
結果
Ａｄ７組換え体による第１免疫化
感染後２２〜３４日間、便中に組換えウイルスが放出された。感染後２週間目に採取した鼻分泌物中には組換えウイルスは検出されなかった。中和アッセイによって使用したアデノウイルスベクターの血清型へのセロコンバージョンを測定した。チンパンジーの各々において使用されたＡｄ７血清型について、３匹のチンパンジー全てにおいて優れた抗アデノウイルス血清力価を測定した。ウェスタンブロッティングによって組換えＨＩＶ遺伝子生産物へのセロコンバージョンを測定した。Ａｄ７−組換え抗ｅｎｖおよび抗ｇａｇによる初回免疫化の４週間後に３匹のチンパンジーのうち２匹において応答が測定された。感染後２０週間まで、３匹の動物の全てがＨＩＶ抗原に対する測定可能な抗体を有していた。初回免疫化後の最初の４週間以内では、分泌抗体は鼻の綿棒中には見られなかった。３匹のチンパンジー全てが検出可能な抗ＨＩＶ中和抗体応答を増大させなかった。
【００５０】
Ａｄ４−組換え体による第１ブースター免疫化
感染後１４〜２８日間、便中に組換えＡｄ４ウイルスが放出された。鼻の綿棒の実験によって、組換えＡｄ４ウイルスが感染後少なくとも７日間３匹のチンパンジーの全てにおいて検出されることが判明した。有意な抗Ａｄ４応答は鼻腔内投与の後にＡｄ４血清型に対して増大した。程度は、Ａｄ７組換えウイルスに対して測定されたものよりもわずかに低かった。ｇａｇおよび／またはｅｎｖ抗原に対する優れたブースター応答は、３匹の動物の全てにおいて測定された。低い力価の(１：２)抗ｇａｇおよび／または抗ｅｎｖ応答は、チンパンジー４および５からの鼻の綿棒中で測定された。いずれの動物においても、抗ＨＩＶ中和抗体はまだ測定されなかった。
【００５１】
Ａｄ５組換え体による第２ブースター免疫化
感染後８日間、便中に組換えＡｄ５ウイルスが放出された。感染後０、１または２週間目に、鼻の綿棒中に組換えウイルスを検出することができなかった。３匹の動物の全てから採取した鼻の綿棒中で分泌型ＩｇＧおよびＩｇＡを測定することができた。３匹の動物の全てから採取した唾液中で、および１匹のメスのチンパンジーから採取した膣の綿棒から分泌型抗体が検出された。３匹の動物の全てにおいて抗ＨＩＶ型特異性中和抗体が検出された。
【００５２】
下記「表６」は処置法３を使用して得られた結果を示す。
【００５３】
【表６】
0004093597.tif 000007
【００５４】
下記「表７」において、Ａｄ５−ＨＩＶ組換え体による鼻腔内ブースター免疫化の後にチンパンジー分泌物中で検出された抗ＨＩＶ応答を概略記載した。
【００５５】
【表７】
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