(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式［Ｉ］
【化１】
0004196423.tif 000012
（式中、Ｒは、蛋白質、ペプチドあるいはアルギニンの残基を示す。またＲ1はアルキルグリオキサール由来の炭素数１〜６のアルキル基を示す。）
で表されるアルキルグリオキサール付加体。
【請求項２】
Ｒ1がメチル基である、下記一般式［II］
【化２】
0004196423.tif 000013
（式中、Ｒは前記に同じ）
で表される請求項１記載のアルキルグリオキサール付加体。
【請求項３】
下記の式［III］
【化３】
0004196423.tif 000014
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）
で表されるアルギニンのメチルグリオキサール付加体である請求項１または２記載のアルキルグリオキサール付加体。
【請求項４】
蛋白質、ペプチドあるいはＮ−アセチル化したアルギニンを原料として、アルキルグリオキサールと反応してなる請求項１ないし３項のいずれか１項に記載のグリオキサール付加体の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチル化したアルギニンを原料として、メチルグリオキサールと水溶液中で反応させ、その際のアルギニン残基／メチルグリオキサールのモル比は、１／５〜１００／１で反応させてなる請求項４記載のグリオキサール付加体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアルキルグリオキサール付加体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
これまでメチルグリオキサール（ＭＧと略す。）と蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸との反応は、既に知られている。特に、アミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）あるいはシステイン（Ｃｙｓ）とＭＧの反応がかなり詳細に論じられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６９，ｐ３２２９９−３２３３０５（１９９４年）、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．Ｖ１４（５）ｐ３５９−３７２（１９９５年））。
【０００３】
例えば、アミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ）とＭＧの反応では、蛋白質やペプチドのアルギニン残基あるいはアミノ酸のアルギニンとＭＧと反応して次の一般式式［IV］
【化４】
0004196423.tif 000002
（式中、Ｒ2、Ｒ3は、蛋白質残基、ペプチド残基あるいはＲ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基であり、Ｒ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基のときＮ−アセチルアルギニンを示す。）
で表されるアルグピリミジン構造を有する化合物を生成することが知られている。
【０００４】
また、リジン（Ｌｙｓ）とＭＧの反応では、蛋白質やペプチドのリジン残基あるいはアミノ酸のリジンとＭＧと反応して次の一般式［Ｖ］
【化５】
0004196423.tif 000003
（式中、Ｒ2、Ｒ3は蛋白質残基、ペプチド残基あるいはＲ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基であり、Ｒ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基のときＮ−アセチルリジンを示す。）
で表されるリジン残基２モルとＭＧ１モルとの化合物を生成することが知られている。
【０００５】
またさらに、システイン（Ｃｙｓ）とＭＧの反応では、蛋白質やペプチドのシステイン残基あるいはアミノ酸のシステインとＭＧと反応して次の一般式［VI］
【化６】
0004196423.tif 000004
（式中、Ｒ2、Ｒ3は蛋白質残基、ペプチド残基あるいはＲ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基であり、Ｒ2＝ＯＨ基、Ｒ3＝Ａｃ基のときＮ−アセチルシステインを示す。）
で表されるシステイン残基１モルとＭＧ１モルとの化合物を生成することが知られている。
以上のようなメチルグリオキサールとアミノ酸との反応の型は知られているが、アルギニン１分子にメチルグリオキサール２分子が反応した化合物は知られていない。
【０００６】
ＭＧと蛋白質の反応により生じる化合物は生体内でも一部知られており、これらの構造体を明確にすることは、臨床学上、あるいは分析方法上非常に有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、アルギニン残基とアルキルグリオキサールの２分子が結合した構造の新規化合物を提供することにある。
本発明の第２の目的は、前記のアルギニン残基とアルキルグリオキサールの２分子が結合した構造の新規化合物の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミノ基をアセチル化したアルギニンにメチルグリオキサールを反応させるとグリオキサール付加体の新規化合物ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は次の（１）〜（５）である。
（１）下記の一般式［Ｉ］
【化７】
0004196423.tif 000005
（式中、Ｒは、蛋白質、ペプチドあるいはアルギニンの残基を示す。またＲ1はアルキルグリオキサール由来の炭素数１〜６のアルキル基を示す。）
で表されるアルキルグリオキサール付加体。
【０００９】
（２）Ｒ1がメチル基である、下記一般式［II］
【化８】
0004196423.tif 000006
（式中、Ｒは前記に同じ）
で表される前記のアルキルグリオキサール付加体。
【００１０】
（３）下記の式［III］
【化９】
0004196423.tif 000007
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）
で表されるアルギニンのメチルグリオキサール付加体である前記のアルキルグリオキサール付加体。
【００１１】
（４）蛋白質、ペプチドあるいはＮ−アセチル化したアルギニンを原料として、アルキルグリオキサールと反応させてなる前記のグリオキサール付加体の製造方法。
（５）Ｎ−アセチル化したアルギニンを原料として、メチルグリオキサールと水溶液中で反応させ、その際のアルギニン残基／メチルグリオキサールのモル比は１／５〜１００／１である前記グリオキサール付加体の製造方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明では、蛋白質、ペプチドあるいはアルギニンを次の式［VII］
【化１０】
0004196423.tif 000008
で示す。
ここで、Ｒは、アミノ酸の構成単位としてアルギニンを含む蛋白質、ペプチドあるいはアルギニン自体の残基を示し、例えばＲが次式［VIII］のとき、アセチル化アルギニンを示す。
【化１１】
0004196423.tif 000009
ただしこの場合Ａｃはアセチル基を示す。
【００１３】
また、一般式［Ｉ］で表されるアルキルグリオキサール付加体において、Ｒ1はアルキルグリオキサール由来のアルキル基であり、アルキルグリオキサールは、次式［IX］で表される。
【化１２】
0004196423.tif 000010
ここで、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基を示す。アルキルグリオキサールとして、具体的には、メチルグリオキサール、エチルグリオキサール、プロピルグリオキサール、ブチルグリオキサール、ペンチルグリオキサール、ヘキシルグリオキサール等が挙げられる。
【００１４】
前記の一般式［Ｉ］で表されるアルキルグリオキサール付加体は、例えば前記の一般式［VII］で表される蛋白質、ペプチドあるいはアルギニンと、一般式［IX］で表されるアルキルグリオキサールの原料を水溶液でかき混ぜることにより反応させることができる。
一般式［VII］で表されるアルギニンの当量と一般式［IX］で表されるアルキルグリオキサールとのモル比は、アルギニンの当量／アルキルグリオキサールのモル比で、１／５〜１００／１であり、好ましくは、１／３〜 ５０／１である。より好ましくは、アルギニンの等量／アルキルグリオキサールのモル比で、１／２〜１０／１である。一般式［VII］で表されるアルギニンの当量と一般式［IX］で表されるアルキルグリオキサールとのモル比が１／５より小さいとアルキルグリオキサール付加体の収率が少なくなり、１００／１より大きいとアルキルグリオキサール付加体の収率は多くなるものの精製が困難となるので好ましくない。
【００１５】
反応のときに用いる溶媒としては、水、あるいはメタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒を用いることができる。またこれらの溶媒と水との混合溶媒も好ましく挙げられる。より好ましくは水である。
用いる溶媒は、ｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。緩衝剤としては、リン酸塩、炭酸塩等が挙げられる。好ましくは、リン酸塩が挙げられる。緩衝剤を含有する場合のｐＨは、反応が進行するｐＨであればよく、特に限定されないが、好ましくはｐＨ６〜１１、より好ましくはｐＨ７〜９が挙げられる。また緩衝液の濃度は１ｍＭ〜０．５Ｍであり、好ましくは１０〜２００ｍＭである。
反応時間は、１時間〜２０日、好ましくは、１〜１０日が挙げられる。
また反応温度は、５〜６０℃、好ましくは、３０〜４０℃である。
触媒は特に必要としない。
【００１６】
精製方法としては、反応液を凍結乾燥後、分取型高速液体クロマトグラフィーにより分取して精製する方法、溶剤抽出、凍結乾燥、晶析−再結晶等の方法により精製することができる。また、カラムクロマトグラフィによる分離精製を行ってもかまわない。好ましくは、凍結乾燥後、分取型高速液体クロマトグラフィーにより分取して精製する方法が挙げられる。
【００１７】
反応方法および精製方法としては、具体的には、例えば所定量の原料のアルギニンをｐＨ緩衝剤の水溶液に溶かし、これに所定量のメチルグリオキサールを加えて所定温度で所定時間かき混ぜた後、凍結乾燥で固形分とし、ついでこれに溶媒を加えて化合物を抽出し、次にその溶媒を留去してから水に溶解し高速液体クロマトグラフィーにより分取して精製した目的物を得ることができる。
なお、適宜保護基として用いたＮ−アセチル基は、加水分解で取り除いてもよい。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の化合物は、アルギニン残基に２分子のアルキルグリオキサールが付加した新規化合物である。この化合物は、生体内で生じるメチルグリオキサールと蛋白質のアルギニン残基との反応物類似体として、臨床学上、あるいは分析上有用である。また、本発明のアルギニン残基に２分子のアルキルグリオキサールが付加した新規化合物の製造方法は、原料の水溶液をかき混ぜておくだけで粗生成物が得られ、抽出精製、分取精製することにより簡便に精製したアルキルグリオキサール付加体を得ることができる方法である。
【００１９】
【実施例】
本発明を実施例に基づいて説明する。
実施例１−１
Ｎ−アセチルアルギニン（シグマ社製）０．２１５ｇ（１０ｍｍｏｌ）とメチルグリオキサール（シグマ社製）０．０７２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに溶解し、この反応液を３７℃で７日間反応した。その後、反応液を凍結乾燥した後、２５ｍｌのエタノールで３回抽出した。得られた抽出液をエバポレーターで濃縮した後、高速液体クロマトグラフィーで次の条件により分取して目的物の溶液を得た。これを凍結乾燥して目的物１１．５ｍｇを得た（収率４％）。
＜高速液体クロマトグラフィーの条件＞
高速液体クロマトグラフィーの機種；日本分光社製ガリバーＰＶ９８０
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＡ−ＨＧ−５（径８ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
溶剤；５０ｍＭ酢酸水溶液
流量；２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長；２１５ｎｍのＵＶ波長
【００２０】
実施例１−２
前記の得られたメチルグリオキサール付加体は、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＦＡＳ−ＭＡＳＳ、元素分析を行った。結果を次に示した。
1Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を次に示した。
（1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ）、Ｄ2Ｏ／ＴＭＳ）；
１．４９−１．５２；Ｃ(g)Ｈ3，ｓ、
１．５３−１．５７；Ｃ(f)Ｈ3  ｓ、
１．５９−１．６３；Ｃ(d)Ｈ2  ｍ、
１．６５−１．８８；Ｃ(c)Ｈ2  ｍ、
１．９８          ；Ｃ(a)Ｈ3  ｓ、
３．１７−３．２３；Ｃ(e)Ｈ2  ｔ、
３．６６−３．９３；Ｃ(h)Ｈ  ｓ、
４．１８−４．２４；Ｃ(b)Ｈ  ｍ。
【００２１】
13Ｃ−ＮＭＲ分析の結果を次に示した。
13Ｃ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ）、Ｄ2Ｏ／ＴＭＳ）；
２２．６（Ｃ（ａ），Ｃ（ｆ）），２４．７（Ｃ（ｄ）），２５．２（Ｃ（ｇ）），２９．０（Ｃ（ｃ）），４１．１（Ｃ（ｅ）），５４．４（Ｃ（ｂ）），５８．４（Ｃ（ｈ）），７２．５（Ｃ（ｎ）），７５．４（Ｃ（ｌ）），８０．２（Ｃ（ｍ）），１５１．６（Ｃ（ｋ）），１７４．８（Ｃ（ｉ）），１７７．９（Ｃ（ｊ））。
【００２２】
ＦＡＳ−ＭＡＳＳの分析結果を次に示した。
ＦＡＳ−ＭＡＳＳ（Ｍ／Ｚ）；
３６１（Ｍ+＋１）
【００２３】
元素分析の結果；
（Ｃ14 Ｈ24 Ｎ4 Ｏ6として）
理論値Ｃ＝４６．６５；Ｈ＝６．７２；Ｎ＝１５．５５
計算値Ｃ＝４６．６４；Ｈ＝６．６８；Ｎ＝１５．５３
【００２４】
以上の結果から、実施例１−１で得られた化合物は次式の構造であると確認した。
【化１３】
0004196423.tif 000011
【００２５】
以上の結果からアルギニンのメチルグリオキサール２モル付加体が確認された。また本発明の製造方法で前記の化合物が合成できることがわかった。