(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドであって、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２、LLKYRAREPVおよびLLLKYRAREPVからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるものではない、前記ペプチド。
【請求項２】
単離されたペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：８３および配列番号：８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項３】
単離されたペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項４】
単離されたペプチドが、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号；３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項５】
単離されたペプチドがエンドソーム標的化シグナルを含む、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項６】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項５に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項７】
単離されたペプチドが加水分解されない、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項８】
単離されたペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合を含むペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
【請求項９】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよび単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含む免疫応答を誘導するための組成物であって、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI−結合ペプチドも、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３クラス  ＨＬＡII−結合ペプチドも、配列番号：２、LLKYRAREPVおよびLLLKYRAREPVからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるものではない、前記組成物。
【請求項１０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドがポリトープポリペプチドとして結合する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドがエンドソーム標的化シグナルを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
エンドソーム標的化シグナルがヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のペプチド、請求項３に記載のペプチド、請求項５に記載のペプチドからなる群より選択されるペプチドをコードしている単離された核酸であって、配列番号：１からならない単離された核酸。
【請求項１６】
核酸が配列番号：４３、配列番号：４４および配列番号：８７からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
作動可能にプロモーターと連結した請求項１５に記載の単離された核酸を含んでいる発現ベクター。
【請求項１８】
核酸が配列番号：４３、配列番号：４４および配列番号：８７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子をコードしている核酸をさらに含んでいる、請求項１７または１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の発現ベクター、請求項１８に記載の発現ベクター、および請求項１９に記載の発現ベクターからなる群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１７に記載の発現ベクター、請求項１８に記載の発現ベクターの群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞であって、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現している宿主細胞。
【請求項２２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに対して特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球でＴリンパ球の集団を選択的に豊富にする方法であって、
Ｔリンパ球の単離された集団を、ＣＤ４＋Ｔリンパ球でＴリンパ球の単離された集団を選択的に豊富にするのに充分な量でＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を提示している試薬と接触させることを含み、ＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２３】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドがヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現を測定するための方法であって、
対象より単離された生物学的試料を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的である薬剤と接触させること、
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患の決定として、薬剤とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド間の相互作用を測定することを含み、そこでＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが配列番号：２からならず、前記疾患が癌である、前記方法。
【請求項２７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現を測定するための方法であって、
対象より単離された生物学的試料を、複合体に特異的である薬剤と接触させること、
ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の決定として、薬剤とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド間の相互作用を測定すること
を含み、そこでＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記疾患が癌である、前記方法。
【請求項３０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための医薬であって、
疾患を改善するのに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含み、
ここでＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが配列番号：２、LLKYRAREPVおよびLLLKYRAREPVからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるものではなく、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項３３】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドがエンドソーム標的化シグナルを含む、請求項３２に記載の医薬。
【請求項３４】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の医薬。
【請求項３６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の医薬。
【請求項３７】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための医薬であって、
疾患を改善するのに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含み、
ここでＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが、LLKYRAREPVおよびLLLKYRAREPVからなる群より選択されるアミノ酸配列からなるものではなく、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項３８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドがポリトープポリペプチドとして結合する、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドがエンドソーム標的化シグナルを含む、請求項３７に記載の医薬。
【請求項４０】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項３９に記載の医薬。
【請求項４１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３７に記載の医薬。
【請求項４２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３７に記載の医薬。
【請求項４３】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための医薬であって、
疾患を改善するのに充分な量の、対象内で選択的にＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの複合体の存在を豊富にする薬剤を含み、
ここでＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項４４】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４６】
薬剤がＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含む、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項４６に記載の医薬。
【請求項４８】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項４７に記載の医薬。
【請求項４９】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための医薬であって、
疾患を改善するのに充分な量の自己ＣＤ４＋Ｔリンパ球を含み、ここでＣＤ４＋Ｔリンパ球がＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの複合体に特異的であり、
ＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記疾患が癌である、前記医薬。
【請求項５０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４９に記載の医薬。
【請求項５１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４９に記載の医薬。
【請求項５２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの変異体を同定するための方法であって、
配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスII分子およびＨＬＡクラスII分子によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによって刺激されるＴ細胞を選択すること、
変異体ペプチドを調製するために、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの第一アミノ酸残基を変異させること、および
ＨＬＡクラスII分子に対する変異体ペプチドの結合およびＴ細胞の刺激を測定することを含み、前記調製された変異体ペプチドがＨＬＡクラスII分子に結合し、ＨＬＡクラスII分子によって提示されたときにＴ細胞を刺激するか否かによって、ＨＬＡクラスII分子に結合し、かつ、ＨＬＡクラスII分子によって提示されたときにＴ細胞を刺激する変異体ペプチドを同定する、前記方法。
【請求項５３】
同定された変異体によるＴ細胞の刺激の効力の決定として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、同定された変異体によるＴ細胞の刺激を比較する工程をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項３に記載のポリペプチドに選択的に結合する単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプチドが、抗体、または、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片およびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに選択的であるＣＤＲ３領域を含む断片からなる群より選択される抗体断片である、前記単離されたポリペプチド。
【請求項５５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５４に記載の抗体。
【請求項５６】
ＨＬＡクラスII分子およびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに選択的に結合する単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球であって、
ここでＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項５７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５６に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項５８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５６に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項５９】
ＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの複合体を含む単離された抗原提示細胞であって、
ここでＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離された抗原提示細胞。
【請求項６０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５９に記載の単離された抗原提示細胞。
【請求項６１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５９に記載の単離された抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は腫瘍関連遺伝子の産物ＭＡＧＥ−Ａ３のフラグメントであって、 ＨＬＡクラスII分子によりＴリンパ球に対して結合および提示されるフラグメントに関する。このペプチド、かかるペプチドをコードする核酸分子、ならびに関連する抗体およびＣＤ４＋リンパ球は、特に診断および治療の面において重要である。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳類の免疫系が外来性または異質の物質を認識し、かつ反応する過程は複雑である。この系の重要な一面はＴ細胞の応答であり、一部はＣＤ４またはＣＤ８細胞表面タンパク質のいずれかについて陽性である成熟したＴリンパ球を含む。Ｔ細胞は、他の細胞上のヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）または主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれるペプチドおよび分子から成る細胞表面複合体を介して他の細胞を認識し相互作用することができる。当該ペプチドはさらに長い分子に由来するが、それらはＨＬＡ／ＭＨＣ分子の提示も行なう細胞によってプロセスされる。Male ら、Advanced Immunology（J. P. Lipincott Company, 1987）、特に第６〜１０章参照のこと。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は制限されており、ＨＬＡ分子とペプチドとの特異的な複合体には特異的なＴ細胞が必要である。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえその相手の複合体が存在してもＴ細胞の応答はない。同様に、もし特異的な複合体がなければ、Ｔ細胞が存在しても反応はない。上記のメカニズムは外来タンパク質に対する免疫系の応答に、自己免疫の病理学に、また細胞異常に対する応答に関わっている。
【０００３】
外来抗原に対するＴ細胞の応答は、細胞溶解性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の双方を含む。ＣＤ８＋細胞傷害性または細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活性化された時、ＨＬＡクラスI分子によって提示される適当な抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞はサイトカインを分泌するＴ細胞であって、表面上のＨＬＡクラスII分子により適当な抗原を提示するマクロファージおよび抗原産生B細胞を刺激する。
【０００４】
Ｔ細胞が異質な物質を認識する機構もまた癌と関係づけられてきた。自己由来のメラノーマに対して指示された細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の数多くのクローンが記述されてきた。いくつかの例では、このようなクローンによって認識される抗原が特徴づけされてきた。Plaen ら、Immunogenetics 40 : 360 - 369（1994）には、腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリー、「ＭＡＧＥ」が述べられている（１９９２年１１月２６日刊行のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４も参照のこと）。これらの遺伝子の発現産物はプロセスされてペプチドとなり、次いでそれは細胞表面上に発現される。このことは、特異的なＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を導くことが可能である。これらの遺伝子は「腫瘍拒絶抗原先駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードしているといわれ、それらに由来するペプチドは「腫瘍拒絶抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。この遺伝子ファミリーについてのさらなる情報は、Traversariら、Immunogenetics 35 : 145（1992）；van der Bruggenら、Science 254 : 1643 ( 1991 )を参照のこと。また米国特許第５,３４２,７７４号も参照のこと。
【０００５】
米国特許第５,４０５,９４０号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるＭＡＧＥノナペプチドが教示されている。特定のＨＬＡ分子についての特定のペプチドという既知の特異性があるとすれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分子に結合し、他とは結合しないことが期待されるだろう。異なる個体は異なるＨＬＡ表現型をもっているため、このことは重要である。その結果として、ある特定のＨＬＡ分子の相手となるべき特定のペプチドの同定に診断上および治療上の効果があるとしても、それは当該特定のＨＬＡ表現型をもつ個体にしか関係がない。細胞の異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限定されず、また標的とされた治療法は治療中の異常細胞の表現型についてのいくつかの知識を必要とするため、この領域においてはさらなる研究の必要性がある。
【０００６】
米国特許第５,５９１,４３０号においては、単離された付加的なＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるものとして教示されている。したがって、所与のＴＲＡＰは複数のＴＲＡを生じることができる。
上述の参考文献は、ＨＬＡクラスI分子によって提示される腫瘍拒絶抗原の単離および／または特徴づけを記載する。このようなＴＲＡは、ＴＲＡをコードする腫瘍関連遺伝子（たとえばＭＡＧＥ遺伝子）を発現する腫瘍細胞を認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および増殖を誘導することができる。
【０００７】
抗腫瘍免疫性におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）の重要性は動物モデルにおいて説明されており、その中ではこれらの細胞は協力的なエフェクター機能を務めるばかりでなく、免疫記憶の維持においても重要である（Topalianによる総説、Curr. Opin. Immunol. 6 : 741 -745, 1994）。さらに、いくつかの研究は、腫瘍に特異的な免疫性の乏しさがＴヘルパー細胞の不適切な活性化によるものであるという主張を支持している。
【０００８】
最近、チロシナーゼ遺伝子が、ＨＬＡクラスII分子によりＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するべく提示されることが証明された（Topalianら、1994；Yeeら、J. Immunol. 157 : 4079 - 4086, 1996；Topalianら、 J. Exp. Med. 183 : 1965 - 1971, 1996）。
多くの癌関連抗原と同様に、チロシナーゼは限られたパーセントの腫瘍および限られた型の腫瘍に発現される。さらに、二つの同定されたＭＨＣクラスII結合性チロシナーゼペプチドはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１制限ペプチドであり、この特定のＨＬＡ分子を発現する細胞によってのみ認識される。
したがって、対象の腫瘍がチロシナーゼを発現しないため、または対象が適当なＨＬＡ分子を発現しないために、チロシナーゼペプチドによるヘルパーＴ細胞の刺激を含む治療から何ら利益を得ない多くの対象が存在する。したがって、ＭＨＣクラスII分子によって提示されかつＣＤ４＋リンパ球によって認識されるエピトープを含む、さらなる腫瘍関連抗原を同定する必要がある。
【０００９】
（発明の概要）
ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子が、ＨＬＡクラスII結合ペプチドである、さらなる腫瘍拒絶抗原をコードしていることが今や見出された。これらのペプチドは、ＨＬＡクラスII分子を有する抗原提示細胞により提示された場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化および増殖を効果的に誘導する。
【００１０】
本発明はＨＬＡクラスII分子に結合する単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドおよび、かかるペプチドの機能的変異体であって、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド配列に対する一つまたはそれより多いアミノ酸の付加、置換、または欠失を含んでいる変異体を提供する。本発明はまた、かかるペプチドをコードしている単離された核酸分子、それらの核酸分子を含んでいる発現ベクター、それらの核酸分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞、およびそれらのペプチドおよびペプチドとＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体に対する抗体も提供する。ペプチドとＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体を認識するＴリンパ球も提供される。前述の分子を付加的に含んでいるキットおよびワクチン組成物が提供される。前述のものは、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる症状の診断または治療に使用されることが可能である。ＭＡＧＥファミリーのポリペプチドおよび核酸のメンバーが、有意な配列の一致および機能上の相同関係を共有すること（たとえば腫瘍抗原および先駆体）が知られているため、本発明はまたＭＡＧＥ−Ａ３以外のＭＡＧＥファミリーのメンバーに由来するＨＬＡ結合ペプチドも含む。したがって、本明細書に含まれているＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、かかるペプチドを含んでいる組成物、およびかかるペプチドを同定および使用する方法についての開示は、ＭＡＧＥ腫瘍関連抗原ファミリーの他のメンバーに対しても適用されるものと理解される。
【００１１】
本発明の一つの局面によれば、配列番号：２のアミノ酸のフラグメントを含んでおり、ＨＬＡクラスII分子か、またはそれらの一つまたはそれより多いアミノ酸の付加、置換、または欠失を含んでいる機能上の変異体と結合する単離されたＭＡＧＥ−Ａ３クラスII結合ペプチドが提供される。一つの態様においては、単離された当該ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含む。ある態様においては、単離された当該ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：８３および配列番号：８４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい態様においては、単離された当該ペプチドは前述のアミノ酸配列の一つから成る。さらに好ましくは、単離された当該ペプチドは配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、および配列番号：８６より選択されるアミノ酸配列から成る単離されたペプチドである。ある態様においては、単離された当該ペプチドはエンドソーム標的化シグナル(endosomal targeting signal)、好ましくはヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。本発明の他の態様においては、単離された当該ＨＬＡクラスII結合タンパク質は加水分解不能である。好ましい加水分解不能のペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−(シアノメチレン）アミノペプチド結合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ） ］−ヒドロキシエチレンペプチド結合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ２Ｓ］−ペプチド結合を含んでいるペプチド、から成る群より選ばれる。
【００１２】
本発明のもう一つの局面によれば、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが提供される。ある態様においては、 当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI結合ペプチドと当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとは、ポリトープポリペプチドとして結合されている。他の態様においては、当該組成物中の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該組成物中の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６から成る群より選ばれるアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、および配列番号：８６から成る群より選ばれるアミノ酸配列から成る。上記の組成物のある態様においては、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナルを含む。好ましくは当該エンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１３】
本発明のもう一つの局面によれば、前述のＨＬＡクラスII結合タンパク質のいずれかをコードしている単離された核酸が提供される。好ましくは、当該核酸は配列番号：４３、配列番号：４４、または配列番号：８７を含む。
本発明のさらに別の局面によれば、発現ベクターが提供される。当該発現ベクターは、作動可能に(operably)プロモーターに連結された前述の単離された核酸のいずれかを含む。好ましい態様においては、当該核酸は配列番号：４３、配列番号：４４、または配列番号：８７を含む。他の態様においては、当該発現ベクターは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子をコードする核酸をさらに含む。
本発明のさらにもう一つの局面によれば、前述の発現ベクターのいずれかを用いてトランスフェクトまたは形質転換される宿主細胞が提供される。 またＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現し、さらに前述の発現ベクターのいずれかを用いてトランスフェクトまたは形質転換される宿主細胞も提供される。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球を用いてＴリンパ球の集団を選択的に豊富にする方法が提供される。この方法は、ある単離されたＴリンパ球集団を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を提示する薬剤と、当該単離されたＴリンパ球集団をＣＤ４＋Ｔリンパ球について選択的に豊富にするに充分な量において接触させることを含む。ある態様においては、当該薬剤はＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合フラグメントと接触した抗原提示細胞である。好ましい態様においては、当該ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であって、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。前述の方法ほある態様においては、当該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合ペプチドは、エンドソーム標的化シグナルを含む。好ましくは当該エンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１５】
本発明のさらなる局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患の診断法が提供される。この方法は、対象からの生物学的試料を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的な薬剤と接触させることと、当該薬剤と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの間の相互作用を、疾患の決定として測定することを含む。いくつかの態様においては、当該生物学的試料はたとえば腫瘍細胞の溶解物をロードされた樹状細胞である。ある態様においては、当該ペプチドは配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６、のアミノ酸配列またはそれらの機能的変異体を含む。好ましい態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１６】
本発明のもう一つの局面によれば、ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の診断法が提供される。この方法は、対象から単離された生物学的試料を、当該複合体と結合する薬剤と接触させること；および当該複合体と当該薬剤の間の結合を、当該疾患の決定として測定することを含む。いくつかの態様においては、当該ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、またＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはその機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の治療法が、本発明のもう一つの局面において提供される。この方法は、この疾患を改善させるに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを対象に投与することを含む。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列か、それらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１８】
本発明のさらにもう一つの局面においては、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の治療法が提供される。この方法は当該対象に、この疾患を改善させるに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI結合タンパク質とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質とを投与することを含む。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質は、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６、のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質は、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質は、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。前述の方法のいくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI結合ペプチドと、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質とは、ポリトープポリペプチドとして結合される。さらに別の態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質はエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１９】
本発明のもう一つの局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の治療法が提供される。この方法は、当該疾患を改善させるに充分な、ＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体の存在を、当該対象において選択的に豊富にする薬剤を、対象に投与することを含む。好ましくは、 当該ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様においては、当該薬剤はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナルを含む。好ましいエンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００２０】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を治療するためのさらなる方法が、本発明のもう一つの局面において提供される。この方法は、対象に、当該疾患を改善させるに充分な量の自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球であって、当該ＣＤ４＋Ｔリンパ球がＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体に特異的であるＴリンパを投与することを含む。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。ある態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体の同定法は、本発明のもう一つの局面により提供される。この方法によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスII結合分子、および当該ＨＬＡクラスII結合分子により提示されるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによって刺激されるＴ細胞が選択される。当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの第一アミノ酸が、変異体ペプチドを調製するべく突然変異される。次いで、当該変異体ペプチドのＨＬＡクラスII結合分子に対する結合と、Ｔ細胞の刺激とが測定されるが、この場合当該変異体ペプチドの当該ＨＬＡクラスII結合分子に対する結合と、当該ＨＬＡクラスII結合分子によって提示される当該変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激とは、当該変異体が機能的変異体であることを示す。好ましい態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。ある態様においては、この方法はさらに、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、当該機能的変異体によるＴ細胞の刺激とを、当該機能的変異体によるＴ細胞の刺激の有効性を決定するものとして比較する工程を含む。
【００２２】
本発明のもう一つの局面によれば、単離されたポリペプチドが提供される。単離されたこのペプチドは、単離された当該ペプチドがＨＬＡクラスII分子ではない場合、選択的にＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合する。ある態様においては、単離された当該ペプチドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。他の態様においては、単離された当該ペプチドは、 ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに選択的な、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはＣＤＲ３領域を含んでいるフラグメントから成る群より選ばれる抗体フラグメントである。
【００２３】
本発明のさらにもう一つの局面によれば、単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球が提供される。単離された当該ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＨＬＡクラスII分子と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体に対し、選択的に結合する。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましいＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含むペプチドと結合する。
【００２４】
本発明のなおもう一つの局面によれば、単離された抗原提示細胞が提供される。当該抗原提示細胞は、ＨＬＡクラスII分子と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体を含む。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。ある態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明はまた前述の、または本明細書全体を通して述べられた１または２以上の薬物を含んでいる製剤を提供する。かかる製剤は、薬学的に許容され得る希釈剤の担体を含むことができる。
薬物、特に癌の治療のための薬物の調製における、前記の組成物、ペプチドおよび核酸の使用もまた提供される。
本発明のこれらの、また他の目的は、本発明についての詳細な説明を参照してさらに述べられるだろう。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明はＨＬＡクラスII分子により提示される単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドであって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖および活性化を刺激するペプチドを提供する。かかるペプチドは本明細書において、「ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質」、「ＨＬＡクラスII結合ペプチド」、および「ＭＨＣクラスII結合タンパク質」と呼ばれる。したがって、本発明の一つの局面は、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。
【００２７】
以下の例は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドであるペプチドの単離を示している。これらの代表的なペプチドは、配列番号：１の核酸のプロセスされた翻訳産物である。そのように、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドがそこから提示用の最終的な形状にプロセスされる翻訳産物は、それらが当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを包含する限り、いかなる長さまたは配列であってもよいことが当業者には理解されるであろう。以下の例において証明されるように、１０アミノ酸程の小ささでも、またＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（配列番号：２）のような大きさでも、ペプチドまたはタンパク質は適切にプロセスされ、ＨＬＡクラスII分子によって提示され、かつＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激することにおいて有効である。配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のペプチドといったＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合タンパク質は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多いアミノ酸が一端または両端に付加されてよい。このようなペプチドの抗原性部分は、生理的な条件下ではＨＬＡクラスII分子による提示用に切断される。この技術においては、ＨＬＡクラスIIペプチドの長さが約１０アミノ酸と約３０アミノ酸の間で可変であることも知られている（Engelhard, Ann. Rev. Immunol. 12 : 181 - 201, 1994）。当該ＨＬＡクラスII結合ペプチドのほとんどは、１２〜１９アミノ酸長の範囲に入る。ペプチドがコア配列を共有しているが、アミノおよび／カルボキシ末端においては異なるアミノ酸を有するＨＬＡクラスII結合ペプチドの入れ子のセット（nested sets）が同定されている（たとえば、Chiczら、J. Exp. Med. 178 : 27 - 47, 1993参照のこと）。このように、付加的なＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３ファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドが、本明細書に開示された手順に従って当業者によって同定されることが可能であろう。
【００２８】
例において記述された手順は、ＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドを同定するべく使用されることが可能である。したがって、たとえば正常な血液ドナーの樹状細胞などの抗原提示細胞を、当該細胞をＭＡＧＥポリペプチドと接触させることにより、あるいは注目のＭＡＧＥタンパク質の発現を指示する核酸分子を細胞内に導入することにより、組換えＭＡＧＥタンパク質（またはそのフラグメント）を用いてロードすることができる。当該抗原提示細胞は次いで、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを認識する特異的なＣＤ４リンパ球のインビトロの活性化および増殖を誘導するべく用いられることが可能である。次いで当該ペプチドの配列は、例において記述されているように、たとえばＣＤ４リンパ球の活性化および増殖を刺激するべく用いられたＭＡＧＥタンパク質のペプチドフラグメントを用いて細胞を刺激することにより決定されることが可能である。別法として、ＭＡＧＥタンパク質由来のペプチドを用いて抗原提示細胞をロードすることもできる。たとえば、結合性ＨＬＡクラスII分子についてのアミノ酸のコンセンサス配列に基づき、ＨＬＡクラスII結合ペプチドの候補者であるＭＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチド配列を予測することが可能である。この点については、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０１３７３を参照のこと。かくして選ばれたペプチドは、特異的なＣＤ４リンパ球の誘導およびペプチドの同定のための本明細書に述べられた検定において使用されることが可能である。ＨＬＡクラスII結合ペプチドの選択および検査のための付加的な方法は、この技術において周知である。
【００２９】
前文に記したように、本発明はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を含む。本明細書に用いられているように、ＨＬＡクラスII結合ペプチドの「機能的変異体」または「変異体」は、あるＨＬＡクラスII結合ペプチドの一次アミノ酸配列の一つまたはそれより多い修飾を含み、かつ本明細書に開示されたＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞受容体結合特性を保持しているペプチドである。
【００３０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの変異体を生じる修飾は、たとえば、１）発現系におけるペプチドの安定性、またはＨＬＡ−ペプチド結合などのタンパク質−タンパク質結合の安定性といった、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの特性を強化するため；２）抗原性エピトープの付加、または検出可能な成分の付加といった、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに対する新規な活性または特性を提供するため；または３）同一または同様のＴ細胞刺激特性を生じる異なるアミノ酸配列を提供するため作製されることが可能である。ＭＡＧＥ−Ａ３（ならびにＭＡＧＥファミリー）ＨＬＡクラスII結合ペプチドの修飾は、当該ペプチドをコードしている核酸に対して行なわれることが可能であり、欠失、点突然変異、アミノ酸置換、およびアミノ酸付加を含むことができる。別法として、切断、リンカー分子の付加、ビオチンなどの検出可能な成分の付加、脂肪酸の付加、１アミノ酸の他への置換、その他によるなどの修飾が、当該ポリペプチドに対して直接に行なわれることが可能である。変異体はまたランダムペプチドか、または一つまたはそれより多い部分における置換を含むＭＡＧＥペプチドの置換に基づく、ペプチドのライブラリーから選ばれることが可能である。たとえば、ペプチドライブラリーはＨＬＡクラスII分子に結合したＭＡＧＥペプチドの複合体（たとえばＭＡＧＥタンパク質を付加された樹状細胞）を用いた競合性の検定に使用されることができる。ＨＬＡクラスII分子に対するＭＡＧＥペプチドの結合について競合するペプチドは、配列決定されることが可能であり、ＭＡＧＥペプチドの機能的変異体を決定するべく、他の検定（たとえば、ＣＤ４リンパ球の増殖）に使用される。
【００３１】
修飾はまた、本明細書に述べられた不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質などの、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでいる融合タンパク質を含む。したがって本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、ヒト不変鎖（Iｉ）などのエンドソーム標的化部分とを含んでいる融合タンパク質を含む。以下に開示されるように、ヒト不変鎖のエンドソーム標的化部分のＭＡＧＥ−Ａ３に対する融合の結果、ＨＬＡクラスIIペプチド提示経路に対するＭＡＧＥ−Ａ３の効果的な標的化を生じた。ヒト不変鎖または他の標的化ポリペプチドの「エンドソーム標的化部分」は、第２のポリペプチドに対して融合または結合された時、当該第２のポリペプチドのエンドソームの局在性を亢進する分子部分である。したがって、エンドソーム標的化部分は、全配列かまたはヒト不変鎖Iｉなどの標的化ポリペプチドのごく小さな部分を含むことが可能である。当業者は、標的化分子のエンドソーム標的化部分を容易に決定することができる。
【００３２】
驚いたことに、ＬＡＭＰ−１タンパク質の融合は、ＨＬＡクラスII結合ペプチド提示経路へのＭＡＧＥ−Ａ３の標的化を有意に亢進しなかった。したがって、本発明はＭＡＧＥ−Ａ３およびヒト不変鎖Iｉの融合タンパク質はＨＬＡクラスII結合ペプチド提示経路に対して効果的に標的化されるが、ＬＡＭＰ−１はそうではないという意外な発見を含む。さらなるエンドソーム標的化シグナルが当業者により同定され、ＭＡＧＥ−Ａ３またはそのＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合部分に融合され、さらにＨＬＡクラスIIペプチド提示経路に対する標的化について、日常の実験法のみを用いて検査されることが可能である。
【００３３】
ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列は、天然または非天然由来であってよく、すなわち、それらは天然のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチド分子を含むか、または提示された際に当該アミノ酸配列がヘルパーＴ細胞を刺激する能力を保持し、かつＨＬＡＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡＤＰＢ１分子などのＨＬＡクラスII分子に結合する特性を保持している限り、修飾された配列を含んでよい。たとえば、このような状況にあるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、無関係なアミノ酸配列、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６に示されるアミノ酸配列の合成ペプチド、標識されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している癌対象から単離されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現する培養細胞から単離されたペプチド、非ペプチド分子に結合されたペプチド（たとえばある薬剤のデリバリーシステムにおいて）、および配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含んでいる他の分子、を含んでいる融合タンパク質であってよい。
【００３４】
好ましくは、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは非加水分解性である。かかるペプチドを提供するため、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは一つまたはそれより多いＤ−アミノ酸を含んでいるペプチド、または一つまたはそれより多い非加水分解性ペプチド結合アミノ酸を含んでいるペプチドなどの、非加水分解性ペプチドのライブラリーから選択されてよい。別法として、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の誘導に最適なペプチドを選択し、次いでプロテアーゼによる加水分解の可能性を減じるために必要とされるように、当該ペプチドを修飾することもできる。たとえば、タンパク質分解に対する感受性を測定するべくペプチドが標識され、さらに細胞抽出物または精製されたプロテアーゼと共にインキュベートされ、次いでどのペプチド結合がタンパク質分解に対して感受性であるのかを、たとえばペプチドおよびタンパク質分解によるフラグメントの配列決定により決定するべく単離されてもよい。別法として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列を、一団のプロテアーゼの既知の切断特異性と比較することにより、可能性のある感受性ペプチド結合が同定されることも可能である。このような分析結果に基づき、タンパク質分解に対して感受性である個々のペプチド結合が、インビトロのペプチド合成により非加水分解性ペプチド結合に置き換えられることが可能である。
【００３５】
この技術においては、多くの非加水分解性ペプチド結合が、かかる結合を含んでいるペプチドの合成法と共に周知である。非加水分解性結合は、−psi［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−psi［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合、−psi［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−psi［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−psi［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合、および−psi［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合を含む。
非ペプチドであるペプチド類似体、たとえば安定化された構造または減じられた生物分解を提供するものもまた考えられる。ペプチド模倣性類似体(mimetic analogs)は、選ばれたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを主成分とし、非ペプチド成分による一つまたはそれより多い残基の置換により調製されることができる。好ましくは、当該非ペプチド成分は当該ペプチドがその天然の構造を保持することか、または好ましい、たとえば生物活性のある確証（confirmation）を安定化させることを可能にする。かかるペプチドは、構造および／または活性についての置換の影響を査定するための、分子または細胞を基盤とする結合分析において検査されることが可能である。ペプチドからの非ペプチド模倣性類似体の調製法は、Nachmanら、Regul. Pept. 57 : 359 - 370（1995）に記述されている。本明細書において使用されたようなペプチドは前述のすべてを含む。
【００３６】
変異体が、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６の一つのアミノ酸についての変化を含む場合、保存性のアミノ酸の置換を有するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体、すなわちもとのアミノ酸の電荷、疎水性、構造、その他といった特性を保持する置換が、典型的には好ましいであろう。アミノ酸の保存性の置換の実例は、以下のグループ内でのアミノ酸の間で行なわれる置換を含む：（ａ）Ｍ、I、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００３７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を同定するための他の方法は、Strominger ＆ Wucherpfenningの刊行されたＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２）に提供されている。これらの方法は、可能性のあるエピトープがそれについて比較されてよいアミノ酸配列モチーフの開発に依存している。各々のモチーフはある有限のアミノ酸配列のセットを記述しており、各々の（相対的な）位置は（ａ）一つの残基に限定されるか、（ｂ）限定された残基のセットの中で変化するようにされるか、または（ｃ）すべての可能な残基の中で変化するようにされてよい。たとえば、一つのモチーフは第１の位置の残基がバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはフェニルアラニンの残基のうちのどの一つであってもよく；第２の位置の残基はヒスチジンでなけらばならず；第３の位置の残基はどのアミノ酸残基でもよく；第４の位置の残基はバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの残っ基のどの一つであってもよく；さらに第５の位置の残基はリジンでなけらばならないことを明示している。
【００３８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体についての配列モチーフは、本明細書において開示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの、主要組織適合性複合体ＨＬＡ−ＤＲタンパク質および／またはＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）接触点の結合ドメインまたは結合ポケットの分析により開発されることが可能性である。
ＨＬＡクラスII結合ポケットの形成に関わる残基についての詳細な構造分析を提供することにより、いかなるＨＬＡクラスIIタンパク質に対してもＭＡＧＥペプチドを結合するための配列モチーフを予測することが可能となる。
【００３９】
このような配列モチーフを研究、評価、または設計の基準として用いることにより、特定のＨＬＡ分子に対して結合すること、およびＴ細胞の応答を誘導するべくＴ細胞受容体と相互作用することについての正当な可能性をもつペプチド（たとえばＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、特に本明細書において開示されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド、およびそれらの機能的変異体）の種類を同定することが可能となる。このようなペプチドは、本明細書に記述されたように合成され、活性について検査されることが可能である。純粋な配列の相同性（抗原性としては同様であるが全く配列の異なる多くのペプチドを除外する）、または制限されない「保存性」の置換のある配列の相同性（高度に保存された決定的な部位が異なる多くのペプチドを認める）に反してこれらのモチーフを用いることは、それによって当業者がペプチドを、疾患の治療における可能性のある適用について評価することができる方法を表している。
【００４０】
Strominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願および、そのすべてが参考文献として取込まれており、それに引用された参考文献は、ＨＬＡクラスIIと、ＨＬＡクラスIIペプチドの残基と接触するＴＣＲ結合ポケットについて記述している。ＨＬＡクラスIIおよび／またはＴＣＲ結合ポケットににおいて結合しやすい残基を一定に保持することにより、あるいはわずかに指定された置換のみを許すことにより、ＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞受容体に対する結合性を保持しているＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を調製することができる。
【００４１】
このように、付加的なＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスIIペプチド、特にＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、およびそれらの機能的変異体を同定するための方法が提供される。一般に、どのようなＭＡＧＥタンパク質も上記の分析を受けることが可能であり、ペプチド配列は本明細書に記述されたように選択され、かつ検査される。たとえばＭＡＧＥ−Ａ３については、当該方法は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスII結合分子、およびＨＬＡクラスII結合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによって刺激されるＴ細胞を選択することを含む。好ましい態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、当該ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸配列から成る。当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの一つの第一アミノ酸残基が、変異体ペプチドを調製するべく突然変異される。当該アミノ酸残基は、上記のStrominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願に述べられたＨＬＡとＴ細胞受容体の接触点についての原理に従って突然変異されることが可能である。変異体ペプチドの合成、突然変異した核酸分子を用いた変異体ペプチドの組換えによる産生、その他といった変異体ペプチドを調製するためのどのような方法も用いられることが可能である。
【００４２】
次いで当該変異体ペプチドの、ＨＬＡクラスII結合分子に対する結合とＴ細胞の刺激とが、標準的な方法に従って測定される。たとえば、以下において例証されるように、当該変異体ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと結合して当該変異体と抗原提示細胞との複合体を形成する当該ＨＬＡクラスII分子を含む、抗原提示細胞と接触することができる。次いでこの複合体は、当該ＨＬＡクラスII結合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを認識するＴ細胞と接触することが可能である。Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる症状を有する患者から取得されることが可能である。当該Ｔ細胞による変異体ペプチドの認識は、ＴＮＦまたはIＦＮγ産生といったＴ細胞刺激の指標を測定することにより決定されることが可能である。他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドの同定および特徴づけのため、同様の方法が行なわれることが可能である。
【００４３】
ＨＬＡクラスII結合分子に対する変異体ペプチドの結合と、当該ＨＬＡクラスII結合分子によって提示された当該変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激とは、当該変異体ペプチドが機能的変異体であることを示唆している。この方法はまた、機能的変異体によるＴ細胞の刺激の有効性の測定として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、当該機能的変異体によるＴ細胞の刺激とを比較することの工程を含むことができる。機能的変異体をＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと比較することにより、Ｔ細胞刺激特性の亢進されたペプチドの調製が可能となる。
前記のどの方法によって調製されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの変異体でも、もし必要であれば、アミノ酸配列を決定するべく、したがってかかる変異体をコードしている核酸配列を演繹するべく、配列決定されることが可能である。
【００４４】
また本発明の一部はＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその変異体をコードしている核酸配列および、ストリンジェントな条件下に上記のヌクレオチド配列から成る核酸分子とハイブリッド形成する他の核酸配列である。本明細書において用いられたような「ストリンジェントな条件」という用語は、この技術において知られたパラメーターである。核酸のハイブリッド形成のパラメーターは、かかる方法を集めた参考文献、たとえばMolecular Cloning：A Laboratory Manual, J. Sambrook ら編、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989、またはCurrent Protokols in Molecular Biology, F. M. Ausubeiら編、ジョン・ウィリー＆サンズ（John Wiley & Sons ）社、ニューヨーク、に見出されるであろう。さらに具体的には、本明細書において用いられたようなストリンジェントな条件は、６５℃においての、ハイブリッド形成緩衝液（３．５xＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン（pyrolidone）、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）におけるハイブリッド形成を指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；またＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリッド形成後、ＤＮＡが移された膜は、２xＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳにて６５℃までの温度において洗浄される。
【００４５】
同程度の緊縮(stringency)を生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬、その他がある。熟練した技術者はかかる条件に通じていると思われるため、それらはここに記されていない。しかしながら熟練した技術者は、本発明のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸の相同物または対立遺伝子の明確な同定を可能にする方式で、条件を操作することが可能であることが理解されよう。また熟練した技術者は、かかる分子の発現のための細胞およびライブラリーのスクリーニングについての方法論にも通じており、それらの分子は次いで慣例的に単離され、続いて関連する核酸分子が単離され配列決定される。
【００４６】
一般的に相同物および対立遺伝子は、典型的には少なくとも５０％のアミノ酸の同一性、および／または少なくとも４０％のヌクレオチドの同一性を（配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６などの）ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列に対して、またはかかるペプチドをコードしている核酸に対して各々共有するであろう。いくつかの実例においては、相同物および対立遺伝子は、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を共有するであろうし、さらに別の実例では、少なくとも９５％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸の同一性を共有するであろう。上記の核酸の相補体もまた本発明に含まれる。
【００４７】
ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸についてのスクリーニングでは、サザンブロットまたはノーザンブロットなどの核酸のハイブリッド形成は、上記の条件を３２Pプローブと共に用いて行なってよい。ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしているＤＮＡが最終的に移された膜の洗浄後、放射性シグナルを検出するべく、X線フィルムに対し当該膜を設置することができる。
【００４８】
本発明はまた、当該ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと同一のアミノ酸配列をコードする代替コドンを含む核酸配列の使用を含む。たとえば、本明細書に開示されているように、ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（配列番号：３）はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドである。ロイシン残基（配列番号：３のアミノ酸番号６、１０、１１、および１２）はコドンＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡ、およびＵＵＧによりコードされることが可能である。６個のコドンの各々はロイシン残基をコードする目的については同等である。したがって、ロイシンをコードしているヌクレオチドトリプレットのいずれもが、ロイシン残基を取込むため、インビトロまたはインビボのタンパク質合成装置を指示するべく用いられてよいことが当業者には明らかであろう。同様に、配列番号：３のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含む他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列のトリプレットは：ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ、およびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＡＡおよびＡＡＧ（リジンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、およびＧＵＵ（バリンコドン）；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＣＡＣおよびＣＡＵ（ヒスチジンコドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）、およびＵＡＣおよびＵＡＵ（チロシンコドン）を含む。他のアミノ酸残基も同様に複数のヌクレオチド配列によってコードされてよい。したがって本発明は、遺伝子コードの縮重のため、コドンの配列において天然のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸とは異なる縮重された核酸を含む。
【００４９】
また本発明が、当該配列の発現ベクターにおける、ならびに原核性（たとえば大腸菌）または真核性（たとえば樹状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母の発現系、および昆虫細胞における組換えバキュロウイルスの発現）である、宿主細胞または細胞系をトランスフェクトするための使用を含むことも理解されよう。発現ベクターは、関係する配列、すなわち前述のものが、プロモーターに対し作動可能に連結されていることを必要とする。ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２分子がＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを提示することが判っているため、当該発現ベクターもまたＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子をコードしている核酸配列を含んでもよい。（他のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドのためには、ＨＬＡ−ＤＰＢ１などの異なるＨＬＡ分子、特にＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１が使用されることが可能である）。ベクターが、コードしている配列の双方を含む状況においては、それはいずれの一つも正常には発現しない細胞をトランスフェクトすべく用いられることが可能である。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている配列は、たとえば宿主細胞がすでにＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現している場合には、単独で用いられてよい。もちろん、当該二つのコードしている配列を含むベクターが、所望であればＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現しない宿主細胞において用いられてよく、またＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸が、 ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現する抗原提示細胞において使用されることが可能であることから、使用可能な宿主細胞については何ら制限はない。
【００５０】
本明細書に用いられているように、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子」は、
【外１】
0004102027.tif 000002
のサブタイプを含む。ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子はまたBodmerらのTissue Antigens 49: 297, 1996に見られるサブタイプを含む。
【００５１】
本明細書に用いられているように、「ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子」は、
【外２】
0004102027.tif 000003
のサブタイプ、および当業者には周知の他のサブタイプを含む。 好ましくは、 ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４分子、特にＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１分子である。
【００５２】
本明細書に用いられているように、「ベクター」は、異なる遺伝的環境の間の移送のため、または宿主細胞における発現のために、制限または連結によって所望の配列が挿入されてよい多数の核酸のどれでもよい。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用できる。ベクターはプラスミド、ファージミド、およびウイルスゲノムを含むがこれに制限されない。クローニングベクターは、自律的に、あるいはゲノムへの組込みの後に、宿主細胞において複製することができるものであり、それはさらに一つまたはそれより多いエンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴づけられ、その場所で当該ベクターは測定可能な様式で切断されてよく、そこに所望のＤＮＡ配列が連結されてよく、新規な組換えベクターが宿主におけるその複製能を保持するようにする。プラスミドの場合には、宿主細菌内のプラスミドのコピー数が増えるにつれて所望の配列の複製が何度も起きてよく、あるいは細胞分裂によって宿主が再生される前に宿主あたり１回だけでもよい。ファージの場合には、複製は溶菌相の間は積極的に、あるいは溶原相の間は受動的に起きてよい。発現ベクターは、その中に所望のＤＮＡ配列が制限および連結により挿入され、それが調節配列に対して作動可能に連結されて、ＲＮＡ転写物として発現されようにするものである。ベクターはさらに、当該ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされたか、またはされない細胞を同定することにおける使用に適した一つまたはそれより多いマーカー配列を含んでもよい。マーカーは、たとえば抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のどちらかを亢進または低下させるタンパク質をコードしている遺伝子、その活性がこの技術における標準的な分析法によって検出可能な酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的に影響する遺伝子を含む。好ましいベクターは自律的な複製と、それに対してベクターが作動可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現が可能なベクターである。
【００５３】
好ましくは、当該発現ベクターはＭＡＧＥファミリーポリペプチド、たとえばＭＡＧＥ−Ａ３、またはそれに由来するＨＬＡクラスII結合ペプチドを、当該タンパク質が発現される細胞のエンドソームに対して標的化する配列を含む。ＨＬＡクラスII分子は、当該ＨＬＡクラスII分子に対する他の分子の結合を妨げる不変鎖（Iｉ）を含む。この不変鎖はエンドソームにおいて切断され、それによりＨＬＡクラスII分子によるペプチドの結合が許される。したがって、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびその先駆体（たとえばＭＡＧＥ−Ａ３）はエンドソームに対して標的化され、それによりＨＬＡクラスII分子に結合するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが増大する。エンドソームに向けて分子を指向させるための標的化シグナルはこの技術において周知であり、これらのシグナルは発現ベクターに都合よく取込まれ、エンドソーム標的化シグナルを含む融合タンパク質が産生されるようにする。Sandersonら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 92 ; 7217 - 7221, 1995）、Wuら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 92 ; 11671 - 11675, 1995）、およびThomsonら（J. Virol. 72 : 2246 - 2252, 1998）は、エンドソーム標的化シグナル（不変鎖（Iｉ）およびリソゾーム結合性膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）と、エンドソームおよび／またはリソゾーム性の細胞区画へ抗原を指向させることにおけるそれらの使用について述べている。例に示したように、不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質が好ましい。
【００５４】
不変鎖などのエンドソーム標的化シグナルもまた、特異的にＭＡＧＥ−Ａ３を標的化することができる結合体を調製するべく、非ペプチド結合により（すなわち非融合タンパク質）、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはペプチドに結合されることが可能である。共有結合の具体例は、二価性架橋分子が用いられているものを含む。この架橋分子は結合されるべき分子の性質に依存して、ホモの二価性（homobifunctional）か、またはヘテロの二価性（heterobifunctional）であってよい。ホモの二価性架橋剤は二つの同等の反応基を有する。へテロの二価性架橋剤は、連続的な結合反応を可能にする二つの異なる反応基を有するものとして定義される。市販の種々の架橋剤は、以下の一つまたはそれより多い基と反応性である；第一級アミン、第二級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、および炭水化物。当業者は、結合されるべき分子の化学的特性と、結合または複数の結合についての好ましい性質とに基づき、エンドソーム標的化成分とＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドまたはタンパク質との連結のために好ましい分子を、過度の実験をすることなく確認することができるであろう。
【００５５】
本明細書に用いられたように、コーディング配列および調節配列は、当該コーディング配列の発現または転写が、当該調節配列の影響または支配下にあるように位置される様式において共有結合されている場合、「作動可能に」結合されているといわれる。もし当該コーディング配列が機能タンパク質に翻訳されることが望まれる場合には、二つのＤＮＡ配列は、もし５´調節配列におけるプロモーターの誘導の結果当該コーディング配列の転写を生じ、またもし当該二つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とならず、（２）当該コーディング配列の転写を指示するための当該プロモーターの能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されているといわれる。したがってプロモーター領域は、もし当該プロモーター領域が、結果として得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列の転写を果たすことができれば、作動可能にコーディング配列に結合されていることになる。
【００５６】
遺伝子発現に必要な調節配列の詳細な性質は、種または細胞型の間で異なってよいが、一般的には、必要なこととして、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、その他といった各々転写および翻訳の開始に関与する５´非転写、および５´非翻訳配列を含むであろう。特に、かかる５´非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまたエンハンサー配列か、または所望の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５´リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適当なベクターの選択および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。
発現に必要な要素のすべてを含んでいる発現ベクターが市販されており、当業者らには周知である。 たとえば、 Sambrookらの、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1989参照のこと。細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）を当該細胞に導入することにより遺伝子操作される。その異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にするための転写エレメントの作動可能な支配下に置かれる。本明細書に述べたように、かかる発現構築物はまた、任意にエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変鎖またはその標的化フラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ発現についての好ましいシステムは、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン（Invitrogen）、カールズバード、カリフォルニア州より市販）などの、Ｇ４１８抵抗性を与える遺伝子（安定にトランスフェクトされた細胞系の選択を容易にする）などの選択可能なマーカーと、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む。さらに、霊長類またはイヌの細胞系における発現に適したものはｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン）であり、これは多コピー染色体外エレメントとしてのプラスミドの維持を容易にするＥＢ−ウイルス（ＥＢＶ）の複製起点を含む。もう一つの発現ベクターはポリペプチド伸長因子１αのプロモーターを含んでいるｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドであって、それはインビトロの転写を効果的に刺激する。当該プラスミドはMishizuma & Nagata（Nuc. Acids Res. 18 : 5322, 1990）によって記述され、トランスフェクション実験におけるその使用は、たとえばDemoulin（Mol. Cell. Biol. 16 : 4710 - 4716, 1996）によって開示されている。さらにもう一つの好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetにより記述されたアデノウイルスであり、それはＥ１およびＥ３タンパク質が欠失している（J. Clin. Invest. 90 : 626 - 630, 1992）。Ａｄｅｎｏ．Ｐ１Ａ組換え体のようなアデノウイルスの使用は、WarnierらによりＰ１Ａに対する免疫化のためのマウスへの皮内注射において開示されている（Int. J. Cancer, 67 : 303 - 310, 1996）。
本発明はまた、技術者に所望の発現ベクターまたは複数のベクターの調製を可能にするいわゆる発現キットも含む。かかる発現キットは、先に議論した物質の少なくとも二つについての、少なくとも別々の部分を含む。所望の、他の成分が加えられてもよい。
【００５８】
本明細書に記述された本発明には多くの用途があり、それらのいくつかは本明細書に述べられている。以下の用途はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドについて述べられたものであるが、他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドの使用に対しても同様に適用することができる。第１に、本発明は技術者が、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患を診断することができるようにする。これらの方法は、生物学的試料におけるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドか、またはＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体の発現を測定することを含む。ペプチドか、またはペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体の発現は、抗体などの、当該ペプチドまたは複合体に対する結合相手を用いた検定により測定されることが可能である。
【００５９】
本発明はまた、技術者がＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を治療できるようにする。治療は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を対象の中で強化させる薬剤を投与すること、およびかかる複合体に特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球を投与することを含む。上記の治療において有用な薬剤は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、それらの機能的変異体、かかるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを含むエンドソーム標的化融合タンパク質、かかるタンパク質およびペプチドを発現する核酸（当該核酸を含んでいるウイルスを含めて）、かかるペプチドとＨＬＡクラスII結合ペプチド（たとえばＨＬＡＤＲＢ１／１３０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１）との複合体，ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII結合分子との複合体を運んでいる抗原提示細胞、その他を含む。本発明はまた、技術者があるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球のための一つのＴリンパ球集団を選択的に豊富にすることができるようにする。
【００６０】
また、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの単離は、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸の単離を可能にする。核酸は、インビトロか、または原核性または真核性の宿主細胞において、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを産生するべく用いられることが可能である。熟練した開業医には周知の種々の方法が、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを取得するべく利用されることが可能である。たとえば、ある発現ベクターが当該ペプチドの産生を引起こすべく細胞内に導入されてよい。もう一つの方法においては、ｍＲＮＡ転写物は、そのコードされたペプチドの産生を引起こすべく細胞内にマイクロインジェクションされるかまたは他の方法で注入されてよい。網状赤血球溶解産物系などの無細胞抽出物におけるｍＲＮＡの翻訳はもまたペプチドを産生するべく用いられてよい。また本発明のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含んでいるペプチドは、インビトロにおいて合成されてよい。当業者らはまた、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを取得するため、既知のペプチド単離法に容易に従うことができる。これらは免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫親和性クロマトグラフィーを含むが、これに制限されない。
【００６１】
これらの単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、かかるペプチドを含むタンパク質、または当該ペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子といったＨＬＡクラスII分子との複合体は、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の治療に有用なワクチンを製造するべく、アジュバントなどの物質と結合されてよい。さらに、ワクチンは樹状細胞、B細胞、非増殖性のトランスフェクタントなどの、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド／ＨＬＡ複合体を表面上に提示する細胞から調製することができる。細胞がワクチンとして用いられる場合にはすべて、それらの細胞はＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するために必要な成分の一つまたは双方をコードしている配列を用いてトランスフェクトされることが可能であるか、またはトランスフェクションの必要なくしてすでに双方の分子を発現している細胞である。たとえば、自己由来の抗原提示細胞が対象から単離され、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスII分子との結合においてＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを提示する細胞を取得するべく処理することが可能である。これらの細菌は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答の双方を刺激し得る。かかる抗原提示細胞は、Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質をコードしている組換えウイルスを用いて樹状細胞を感染させることにより取得することができる。樹状細胞はまたＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスIIエピトープを用いてロードされることが可能である。
【００６２】
ワクチンはまたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその先駆体をコードしている裸のＤＮＡまたはＲＮＡ含んでおり、それらはインビトロにおいて製造されてよく、注射、粒子衝撃、鼻からの吸入、および他の方法により投与される。「裸の核酸」型のワクチンは、当該裸の核酸によってコードされるペプチドに特異的なＣＴＬの発生を誘導する免疫学的応答を引起こすことが証明されている（Science 259 : 1745 - 1748, 1993）。またワクチンは、ウイルス、リポソーム、または薬剤のデリバリーに有用なポリマー粒子を含む他の粒子にパッケージされた核酸を含む。
【００６３】
本明細書に述べられた処理のいずれかによって発生または亢進された免疫応答は、この技術において知られた種々の方法によって監視されることが可能である。たとえば、所与の抗原に特異的なＴ細胞の存在は、抗原性ペプチドを提示する可溶性の蛍光性ＭＨＣ分子４量体を用いたＴ細胞受容体の直接的な標識により検出されることが可能である（Altmanら、Science 274 : 94 - 96, 1996；Dunbarら、Curr. Biol. 8 : 413 - 416, 1998）。要すれば、可溶性のＭＨＣクラスI分子が、βミクログロブリンおよびクラスI分子と結合するペプチド抗原の存在下に、インビトロにおいて折りたたまれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製され、ビオチンを用いて標識される。４量体は、ビオチニル化されたペプチド−ＭＨＣ複合体を、標識されたアビジン（たとえばフィコエリトリン）と共に４：１のモル比において混合することにより形成される。次いで４量体を、末梢血またはリンパ節などのＣＴＬの供給源と接触させる。当該４量体は、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスI複合体を認識するＣＴＬと結合する。当該４量体に結合された細胞は、反応性のＣＴＬを単離するべく、蛍光活性化セルソーティングにより分類されることができる。単離されたＣＴＬは次いで本明細書に記述された用途のためにインビトロにおいて拡大されることが可能である。４量体としてのＭＨＣクラスII分子の用途は、最近Crawfordら（Immunity 8 ; 675 - 682, 1998）により証明された。可溶性のＭＨＣクラスII分子の多量体が、共有結合により結合されたペプチドと複合体形成された。クラスII４量体は、適当な特異性と親和性とを以って特異的なＴ細胞に結合することが示されている。したがって４量体は、ワクチン接種に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の双方を監視するべく使用されることが可能である。
【００６４】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡ分子との複合体もまた、この技術に周知の標準的な技術を用いて抗体を産生するべく用いられてよい。抗体産生についての一般原理を記述している参考となる標準的な研究は、Catty, D., Antibodies. A Practical approach, 第１巻、IRL 出版、ワシントン（1998）；Klein, J., Immunology: The Science of Cell-Non-Cell Discrimination, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（1982）；Kennett, R.,ら、Monoclonal Antibodies, Hybridoma. A New Dimension In Biological Analysis, プレナム（Plenum）出版、ニューヨーク（1980）；Campbell, A., Laboratory Techniques and Biochenistry and Molecular Biology、第１３巻のMonoclonal Antibody Technology, （Burdon, R.ら編）、エルセヴィア（Elsevier）アムステルダム（1984）；およびEisen, H. N., Microbiology,第３版、Davis, B. D. ら編（ハーパー＆ロウ（Harper & Rowe）、フィファデルフィア（1980）を含む。
【００６５】
本発明の抗体はしたがって、タンパク質、タンパク質のフラグメント、当該タンパク質またはそのフラグメントを発現している細胞、および適当なＨＬＡクラスII分子、その他を、ポリクローナル抗体を誘導するべく動物に投与することを含む。モノクローナル抗体の製造は、この技術において周知の技術に従う。本明細書に詳述したように、かかる抗体はたとえば、タンパク質を発現している組織を同定するため、またはタンパク質を精製するために用いられてよい。抗体もまた、イメージングのための特異的な標識薬剤に対し、またはメトトレキセート、放射性ヨウ素標識化合物、リシンなどの毒素、他の細胞増殖抑制性または細胞溶解性薬剤などを含むがこれに制限されない抗腫瘍薬剤に対し、結合されてよい。本発明により調製された抗体もまた、好ましくは本明細書に記したペプチド／ＨＬＡ複合体に特異的である。
【００６６】
本明細書において「疾患」または「症状」が用いられる場合、それはＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドが発現されているいかなる病的状態も指す。かかる疾患は、メラノーマ、頭部、頚部、肺、または食道の扁平上皮癌、結腸直腸癌、骨肉腫、神経芽腫、頭部または頚部の非偏平上皮癌、卵巣腫瘍、リンパ球性白血病、膀胱癌、前立腺癌、その他などの癌を含む。
【００６７】
この開示に基づくいくつかの治療用アプローチは、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチド提示細胞に対しての、対象の免疫系による応答の誘導を前提としている。かかるアプローチの一つは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体に特異的な自己由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、論争中の表現型をもつ異常細胞のある対象に投与することである。かかるＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロにおいて発生させることは、技術者の技術の範囲内にある。一般的に、対象から採取された血液細胞などの検体は、当該複合体を提示しており、かつＣＤ４＋Ｔリンパ球を増殖させるべく刺激することができる細胞と接触せられる。ターゲット細胞は、ＣＯＳ細胞か、または樹状細胞またはB細胞などのＨＬＡクラスII分子を運んでいる抗原提示細胞といった、トランスファクタントであることが可能である。このような標的細胞は、その表面上の所望の複合体を提示しており、興味のＣＤ４＋Ｔリンパ球と結びつけられると、その増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細胞と同様に、広く市販されている。ＣＤ４＋Ｔリンパ球の特異的な産生については、下文に記述されている。次いで、クローンにより拡大された自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球が対象へ投与される。 ＣＤ４＋Ｔリンパ球は次いで当該対象の免疫応答を刺激し、それにより所望の治療上のゴールが達成される。
【００６８】
ＣＴＬの増殖は、Ｔ細胞の培養物におけるトリプトファンの濃度を、インドールアミン２,３-ジオキシゲナーゼ（IＤＯ）などの、トリプトファンを異化する酵素を阻害することによるか、または当該培養物にトリプトファンを添加することにより増加させることにより、亢進されることが可能である（たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２９３１０を参照のこと）。Ｔ細胞の増殖は、増殖の速度を増すことおよび／または培養物中のＴ細胞の分裂数を増すことによって亢進される。
【００６９】
上記の治療は、対象の異常細胞の少なくともいくらかが、関連するＨＬＡ／ペプチド複合体を提示するものと仮定している。このことは、この技術が特定のＨＬＡ分子を発現している細胞を同定する方法について、ならびに関係する配列、この場合にはＭＡＧＥ−Ａ３配列、のＤＮＡを発現している細胞をいかにして同定するかについて熟知しているため、非常に容易に測定できる。
【００７０】
上記の治療は、本発明に従って取得できる唯一の治療形態ではない。 またＣＤ４＋Ｔリンパ球も、多くのアプローチを用いてインビボにおいて刺激されることが可能である。一つのアプローチは、当該複合体を発現している非増殖性の細胞の使用である。このアプローチに用いられる細胞は、樹状細胞などの当該複合体を正常に発現しているものか、あるいは当該複合体の提示に必要な遺伝子の一つまたは双方を用いてトランスフェクトされた細胞であってよい。Chenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110 - 114, 1991）は、このアプローチを例示し、ＨＰＶ−Ｅ７ペプチドを発現しているトランスフェクタント細胞の治療用プログラムにおける使用について示している。種々の細胞型が用いられてよい。同様に、興味の遺伝子の一つまたは双方を運んでいるベクターが使用されてよい。ウイルス性または細菌性のベクターが特に好ましい。たとえば、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸は、ある組織または細胞型において当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現を指示するプロモーターおよびエンハンサー配列に、作動可能に連結されてよい。当該核酸は発現ベクターに取込まれてよい。発現ベクターは、未修飾の染色体外核酸、プラスミド、または、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしているような外来性の核酸の挿入を可能にするべく構築または修飾されたウイルスゲノムであってよい。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸はまた、レトロウイルスゲノムにも挿入されてよく、それにより当該核酸の、標的組織または細胞型のゲノムへの組込みが容易となる。このような系においては、注目の遺伝子は、たとえばワクシニアウイルス、ポックスウイルス全般、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、または細菌ＢＣＧなどの微生物によって運ばれ、この物質は宿主細胞に事実上「感染する」。結果として得られた細胞は興味の複合体を提示し、自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球により認識され、次にそれらは増殖する。
【００７１】
同様な効果は、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスII結合ペプチドを、ＨＬＡクラスII提示細胞への取込みをインビボにおいて促進するためのアジュバントと結合させることにより、成遂げられることが可能である。もしＨＬＡクラスII結合性の部分より大きい場合には、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは必要であればＨＬＡ分子に対するペプチドのパートナーを生じるべくプロセスされると共に、ＴＲＡはさらなるプロセシングを必要とせずに提示されるようにすることができる。一般的に対象は、有効量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの皮内注射を受けることができる。この技術において標準的な免疫化のプロトコールに従って、初回量にブースター投与量が続くことが可能である。
ＨＬＡクラスII提示細胞へのＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドの取込みを促進するための好ましい方法は、当該クラスII結合ペプチドを含むＭＡＧＥ−Ａ３ポリペプチドに融合されたエンドソーム標的化シグナルを含むポリペプチドを、当該提示細胞に発現させることによる。特に好ましいのはヒト不変鎖Iｉを含むＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質である。
【００７２】
上記のいかなる組成物またはプロトコールもまた、細胞溶解性Ｔリンパ球の応答の誘導のため、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスI結合ペプチドを含むことができる。たとえば、以下において論証されるように、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は細胞内においてプロセスされ、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスIIの双方の応答を生じることができる。かかるペプチドのいくつかは、米国特許第５,５８５,４６１号および５,５９１,４３０号と、刊行されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５７，ならびにGauglerら（J. Exp. Med. 179 : 921 - 930, 1994）、van der Bruggenら（Eur. J. Immunol. 24 : 3038 - 3043, 1994）、およびHermanら（Immunogenetics 43 : 377 - 383, 1996）によって述べられている。ＨＬＡクラスIIおよびクラスII分子と結合しているＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド（またはかかるペプチドをコードしている核酸）を投与することで、Ｔヘルパー細胞およびＴキラー細胞の双方を誘導することにより、改善された免疫応答が提供されてよい。
【００７３】
さらに、非ＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連ペプチドもまた、ＨＬＡクラスIおよび／またはクラスIIによる免疫応答を亢進するべく投与されることが可能である。癌細胞が一つ以上の腫瘍関連遺伝子を発現することができることはよく確立されている。ある特定の対象が、付加的な腫瘍関連抗原を発現しているかどうか、したがってかかる遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスIおよび／またはＨＬＡクラスII結合ペプチドを上記のＭＡＧＥ−Ａ３組成物およびワクチンの中に含むかどうかを決定することは、当業者には日常の実験の範囲内にある。
【００７４】
特に好ましいのは、「ポリトープ」として知られる一連のエピトープをコードしている核酸である。エピトープは連続的に、あるいは重なりあう様式で、天然のフランキング配列を伴って、または伴わずに配列されることが可能であり（たとえば、Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 5854 - 5849, 1995；Gilbertら、Nature Biotechnol. 15 : 1280 - 1284, 1997参照）、所望であれば無関係なリンカー配列により分離されることが可能である。ポリトープは生成された個々のエピトープにプロセスされ、それらは免疫系によって、免疫応答の発生のために認識される。
【００７５】
したがって、たとえばＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、他の腫瘍拒絶抗原からのペプチドと（たとえば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドの調製による）、またＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスI結合ペプチド（これらのいくつかは以下にリストされている）と共に、「ポリトープ」を形成するべく結合される。免疫応答を誘導または亢進するべく投与されることが可能な代表的な腫瘍関連ペプチドは、腫瘍関連遺伝子に由来し、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ１３、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリコゲンホスホリラーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、およびＣＴ−７を含むタンパク質をコードしていた。たとえば、腫瘍に特徴的な抗原性ペプチドは以下の表１にリストされたものを含む。
【００７６】
【表１】
0004102027.tif 000004
【表２】
0004102027.tif 000005
【００７７】
他のＨＬＡクラスIおよびクラスII結合ペプチドの実例は、当業者に周知であろうし（たとえば、Coulie、Stem Cells 13 : 393 - 403, 1995参照）、また本明細書に開示されたものと同様の方法で本発明に使用されることが可能である。当業者は、一つまたはそれより多いＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと、一つまたはそれより多い上記の腫瘍拒絶抗原ペプチドを含んでいるポリペプチドか、またはかかるポリペプチドをコードしている核酸を、分子生物学の標準的な方法に従って調製することができる。
【００７８】
このように、ポリトープは二つまたはそれより多い潜在的な免疫原性または、免疫応答刺激性ペプチドのグループであり、それらは種々の配置でつなぎあわされることが可能である（たとえば連鎖状、重複）。ポリトープ（または当該ポリトープをコードしている核酸）は、免疫応答の刺激、亢進、および／または誘発における当該ポリトープの有効性を検査するべく、たとえば動物に対し、標準的な免疫化のプロトコールによって投与されることが可能である。
【００７９】
ペプチドは直接か、またはフランキング配列の使用により、ポリトープを形成するべく結合されることが可能であり、またポリトープのワクチンとしての使用はこの技術において周知である（Thomsonら、Proc. Acad. Natl. Acad. Sci. USA 92（13）: 5845 - 5849, 1995；Gilbertら、Nature Biotechnol. 15（12 ) : 1280 - 1284, 1997：Thomsonら、J. Immunol. 157 (2 ) : 822 - 826, 1996；Tamら、J. Exp. Med. 171（1）:299 - 306, 1990参照のこと ）。たとえば、TamはＭＨＣクラスIおよびクラスII結合エピトープの双方から成るポリトープが、マウスモデルにおいて抗体および防御免疫を成功裏に生じたことを示した。Tamはまた、エピトープの「紐(strings)」がプロセスされて個々のエピトープを生じ、それらがＭＨＣ分子により提示され、さらにＣＴＬにより認識されることを証明した。このように、様々な数および組合わせのエピトープを含むポリトープの調製が可能であり、ＣＴＬによる認識について、また免疫応答の亢進における有効性について検査されることが可能である。
【００８０】
腫瘍が、あるセットの腫瘍抗原を発現しており、そのうちのあるサブセットのみがどのような所与の患者の腫瘍にも発現されてよいことは周知である。ポリトープは、特定の患者において発現された腫瘍拒絶抗原のサブセットを表している、エピトープの異なる組み合わせに対応するべく調製されることができる。またエピトープは、ある腫瘍型によって発現されることが知られている腫瘍拒絶抗原のより広い範囲を反映するべく調製されることが可能である。ポリトープは、かかる治療を必要としている患者に対し、ポリペプチド構造物として、あるいはこの技術において周知の核酸デリバリーシステムを用いることにより、導入されることが可能である（Allsoppら、Eur. J. Immunol. 26（8）: 1951 - 1959, 1996参照）。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様粒子、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、細菌、その他は、かかるデリバリーにおいて使用されることが可能である。ポリトープのデリバリーシステムは、当該デリバリーシステムの有効性を測定するべく、マウスモデルにおいて検査することができる。またこのシステムは、ヒトの臨床試験においても検査されることが可能である。
【００８１】
免疫化のプロトコールの一部として、癌ワクチンの核酸またはペプチド成分と共に、免疫応答を強化する物質が投与されてよい。かかる免疫応答強化化合物は、アジュバントかまたはサイトカインのいずれかに分類されてよい。ジュバントは、抗原の保有体を提供すること（細胞外に、またはマクロファージ内に）、マクロファージを活性化すること、および特定のリンパ球のセットを刺激することにより、免疫学的応答を亢進させてよい。多くの種類のアジュバントがこの技術において周知であり；具体的な実例は、ＭＰＬ（スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham））、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）Ｒｅ５９５リポ多糖の精製および酸加水分解後に取得された同種のもの、ＱＳ２１（スミスクライン・ビーチャム）、シャボンノキ（Quillja saponiria）抽出物から精製された純粋なＱＡ−２１、ＤＱＳ２１（スミスクライン・ビーチャム）、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９に述べられている、ビタミンＥ、およびスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生体分解性油剤から調製された種々の油中水型乳剤を含む。サイトカインもまた、リンパ球刺激特性の結果としてワクチン接種プロトコールにおいて有用である。かかる目的のために有用な多くのサイトカインは、当業者には、ワクチンの防護効果を亢進することが示されているインターロイキン−１２（IＬ−１２）（Science268 : 1432 - 1434, 1995）、ＧＭ−ＣＦＳ、およびIＬ−１８を含めて周知であろう。
【００８２】
ワクチン接種プロトコールにおいて用いられることが可能な多数のさらなる免疫応答強化化合物がある。これらは、タンパク質または核酸のどちらかの形状で提供される補助的刺激分子を含む。かかる補助的刺激分子はＢ７−１およびＢ７−２（各々ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子を含んでおり、それらは樹状細胞（ＤＣ）上に発現され、またＴ細胞上に発現されたＣＤ２８分子と相互作用する。この相互作用は、抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激された（シグナル１）Ｔ細胞に対し、補助刺激（シグナル２）を提供し、Ｔ細胞の増殖、およびエフェクター機能を亢進する。Ｂ７もまたＴ細胞上のＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と反応し、ＣＴＬＡ４およびＢ７リガンドに関係している研究は、Ｂ７-ＣＴＬＡ４相互作用が抗腫瘍免疫およびＣＴＬの増殖を亢進することができることを示している（Zhengら、Proc Nat’l Acad. Sci. USA 95 : 6284 - 6289, 1998）。
【００８３】
Ｂ７は典型的には腫瘍細胞上に発現されず、したがってそれらはＴ細胞のための効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。B７発現の誘導は、腫瘍細胞がより効果的にＣＴＬの増殖およびエフェクター機能を刺激することができるようにする。Ｂ７／IＬ−６／IＬ−１２補助刺激の組合せは、Ｔ細胞におけるIＦＮ−γおよびＴｈ１サイトカインプロフィールを、Ｔ細胞活性のさらなる亢進に導くことが示されている（Gajewskiら、J. Immunol. 154 : 5637 - 5648, 1995）。
B７を用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、Wangら、（J. Immunother. 19 : 1 - 8, 1996）により、養子移入免疫療法のためのインビトロでのＣＴＬの拡大に関連して議論されてきた。B７分子のための他のデリバリーメカニズムは、核酸（裸のＤＮＡ）、免疫化（Kimら、Nature Biotechnol. 15 : 7 : 641 - 646, 1997）、およびアデノおよびポックスなどの組換えウイルス（Wendtnerら、Gene Ther. 4: 726 - 735, 1997）を含むであろう。これらのシステムはすべて、Ｂ７と、本明細書において議論された抗原または抗原フラグメント（ポリトープを含む）、あるいはサイトカインといった他の選択分子との同時発現のための発現カセットの構築および使用に従う。このようなデリバリーシステムは、インビトロにおける適当な分子の誘導のため、およびインビボにおけるワクチン接種状況のために使用されることが可能である。インビトロおよびインビボにおいてＴ細胞を直接刺激するべく抗ＣＤ２８抗体を用いることについても考慮することができた。同様に、外来性抗原に対してＴ細胞の応答を誘導する誘導可能な補助的刺激分子、IＣＯＳ分子が、たとえば抗IＣＯＳ抗体の使用により調節できた（Hutloffら、Nature 397 : 263 - 266, 1999）。
【００８４】
リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）はＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞上に発現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用はＴ細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８補助的刺激相互作用を補足することはできるが、代替えすることはできない（Parraら、J. Immunol., 158 : 637 - 642, 1997；Fentonら、J. Immunother. , 21 : 95 - 108, 1998）。
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は白血球上に発現され、ＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞上に発現されたIＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用はＴ細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８補助的刺激相互作用を補足することはできるが、代替えすることはできない（Fentonら、1998）。したがってＬＦＡ−１は、Ｂ７について前文に議論された種々の方法における、ワクチン接種プロトコールにおいて提供されることが可能な補助的刺激分子のさらなる実例である。
【００８５】
完全なＣＴＬの活性化およびエフェクター機能は、Ｔｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）分子と、ＤＣによって発現されるＣＤ４０分子との間の相互作用を通したＴｈ細胞の助けを必要とする（Ridgeら、Nature 393 : 474, 1998；Bennettら、Nature 393 : 478, 1998；Schoenbergerら、Nature 393 : 480, 1998）。この補助的刺激シグナルの機構は、Ｂ７と、ＤＣ（ＡＰＣ）によって産生される、関連するIＬ−６／IＬ−１２とのアップレギュレーションを含むだろう。従って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）およびシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）の相互作用を補足する。
【００８６】
ＤＣ細胞を直接刺激するべく抗ＣＤ−４０抗体を使用することは、正常には炎症性の環境の外側で遭遇するか、または専門でないＡＰＣ（腫瘍細胞）によって提示される腫瘍関連抗原に対する応答を亢進するものと期待される。たとえばＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用によるか、またはＤＣを、ＣｐＧを含んでいるオリゴデオキシヌクレオチドかまたは細胞外マトリックスからの刺激性の糖成分と接触させることによる、樹状細胞の成熟を誘導するための他の方法は、この技術において周知である。このような状況においては、Ｔｈの助けおよびＢ７補助的刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パルスされたＤＣを主体とする治療という状況において、あるいはＴｈエピトープが既知の腫瘍関連抗原先駆体の中では定義されていない状況において有用であろう。
【００８７】
投与に際しては、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容され得る製剤において投与される。かかる製剤は、薬学的に許容され得る濃度の塩、緩衝薬、保存料、適合性のキャリア、アジュバントおよびサイトカインなどの補足的な免疫強化薬剤、および任意に他の治療用薬剤を慣例的に含んでよい。
【００８８】
本発明は有効な量において投与される。有効量は、ある薬学的製剤が、単独で、あるいは付加的な用量と共に、所望の応答を刺激する量である。癌の治療の場合には、所望の応答は癌の進行を阻止することである。このことは、この疾患の進行を一時的に遅くすることを含んでよいが、さらに好ましくは当該疾患の進行を永久に止めることを含む。免疫応答を誘導する場合には、所望の応答は、用いられたＭＡＧＥ−Ａ３免疫原に特異的な抗体またはＴリンパ球の増加である。このような所望の応答は、慣例的な方法により監視されるか、または本明細書に議論した本発明の診断法に従って監視されることが可能である。
【００８９】
本発明の治療用組成物を用いて免疫応答を刺激することが所望される場合には、血清中の抗体力価を増加させる結果となる液性抗体の応答、細胞傷害性リンパ球のクローン拡大、または他の所望の免疫学的応答に対する刺激を含んでよい。免疫原の用量は、投与の様式に応じて、１ナノグラム／キログラムから１００ミリグラム／キログラムまでの範囲が効果的であると信じられている。好ましい範囲は、キログラムあたり５００ナノグラムと５００マイクログラムの間であると信じられている。絶対量は、投与のために選択された物質、単回での投与かまたは複数の用量か、および年齢、身体の状況、大きさ、体重、および病期を含む個々の対象のパラメーターを含めた種々の因子に依存するであろう。これらの因子は当業者には周知であり、慣例的な実験法を超えることなく扱われることが可能である。
【００９０】
（例）
本発明者らは遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ３によってコードされ、ＨＬＡクラスII分子に関連してＴ細胞に対して提示された抗原性ペプチドを同定した。この戦略には正常血液ドナーの樹状細胞に組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を与えること、およびこれらの抗原提示細胞をインビトロで特定のＣＤ４リンパ球の活性化および増殖を誘導するために使用することが含まれる。プロトコールを以下（Ａ、Ｂ、Ｃ）および図１に記述する。
Ａ．ヒト血液の処理
末梢血を標準のバフィーコート調製品としてローカル血液バンク(the local blood bank)（非癌対象、たとえばヘモクロマトーシス対象ではない）より得た。末梢血単球（ＰＢＭＣ）をリンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏｍｅｄ  ｐｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）での遠心にて単離された。血小板によるＰＢＭＣの混入を最小化するために、調製品をまず２０分間／１０００ｒｐｍで室温にて遠心した。ほとんどの血小板を含んでいる上部２０−２５ｍｌを取り除いた後、チューブを室温にて２０分間／１５００ｒｐｍにて遠心した。ＰＢＭＣを２−アミノエチルイソチオウロニウム（Ｓｉｇｍａ）処理ヒツジ赤血球にてロゼット形成することによってＴ細胞を枯渇させた。リンパ球枯渇ＰＢＭＣを、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１．５ｍＭ）および１％自己血清を含むＲＰＭI  １６４０培地（完全培地）中２×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内で３７℃にて２時間接着させたままにした。接着しなかった細胞を捨て、接着細胞を完全培地中IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。培養に、培地５ｍｌを取り除き、IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地を加えなおすことによって第２日および第４日に栄養を与えた。第５日に非接着細胞集団を豊富な樹状細胞の供給源として使用した。
ロゼット形成したＴ細胞をＮＨ４Ｃｌ（１６０ｍＭ）で処理し、ヒツジ赤血球を溶解し、洗浄した。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を、磁気マイクロビーズと共役した抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者によって推奨されたようにＭＡＣＳ磁石を通して分類することによるネガティブ選別によりロゼット形成したＴ細胞より単離された。
【００９１】
Ｂ．細胞株、サイトカイン
ＥＢＶ−形質転換Ｂ（ＥＢＶ−Ｂ）細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．２４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ  Ｌ−アルギニン、1１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むイスコブ（Iｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地（IＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。ヒト組換え体IＬ−１２はバイオゲン（Ｂｉｏｇｅｎ：Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって寄贈されたか、またはチロン（Ｃｈｉｒｏｎ：Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）より購入した。ヒト組換え体IＬ−４、IＬ−６およびIＬ−１２は我々の実験室で得た。ヒト組換え体IＬ−７はゲンザム（Ｇｅｎｚｙｍｅ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）より購入した。ヒト組換え体ＧＭ−ＣＳＦはサンド（Ｓａｎｄｏｚ：Ｓａｎｄｏｚ  Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により寄贈されたか、またはシェリングプロウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ：Ｂｒｉｎｎｙ，Iｒｅｌａｎｄ）より購入した。ヒト組換え体ＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）より購入した。
【００９２】
Ｃ．タンパク質または細胞溶解物の供給および混合リンパ球−樹状細胞培養
組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（ＨｉｓタグのついたＭＡＧＥ−Ａ３）およびＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でスミスクラインコーポレーションファーマシューティカルカンパニー（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）より生産され、標準のクロマトグラフィー手順によって精製した。ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−ＨｉｓはそのＮ−末端残基の位置にヘモフィラスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質の脂質形態の３分の１、およびそのＣ−末端残基の位置にポリヒスチジンマーカーを含む。
【００９３】
自己樹状細胞（５×１０５）を、組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、１％自己血清、IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭI培地中で１８−２０時間３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベートした。Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をパルスした樹状細胞を洗浄し、IＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、１０％ヒト血清、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１．５ｍＭ）を含む２００μｌのイスコブ培地中の１０５  ＣＤ４＋Ｔリンパ球へ丸底マイクロウェル毎に１０４加えた。ＣＤ４＋リンパ球を、Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質で新たにパルスした自己樹状細胞で週毎に刺激し、IＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含む完全イスコブ培地中で増殖させた。メラノーマ対象７００２に対する樹状細胞の短期補充のために、１０４の代わりに６×１０３の樹状細胞を使用し、刺激を１０日目、２０日目および３０日目に行った。
【００９４】
樹状細胞をＭＡＧＥ−Ａ３を発現している２９３−ＥＢＮＡ細胞の溶解物の提示のために使用した。発現ベクターｐＣＥＰ−４内にクローン化したＭＡＧＥ−Ａ３配列をリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭIＮＥ（登録商標）：ＧIＢＣＯ／ＢＲＬ）によって２９３−ＥＢＮＡ細胞株内に一過性にトランスフェクトした。簡単に記すと、平底マイクロウェルあたり５×１０４の２９３−ＥＢＮＡ細胞にＯｐｔｉＭＥＭ培地（ＧIＢＣＯ／ＢＲＬ）中、６、１８、５３または１６０ｎｇのプラスミドｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３および１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭIＮＥ（登録商標）をトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞を３サイクルの急速凍結−融解によって５０μｌの完全ＲＰＭI培地中で溶解した。次いでＨＬＡ−ＤＲ１３分子を発現している単球由来樹状細胞を、トランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の溶解物上に加え（１．５×１０４細胞／ウェル）、２４時間３７℃にて保持した。次いで樹状細胞をＣＤ４＋クローンを加える前に洗浄した。上清を２０時間後回収し、IＦＮ−γ分泌について査定した。
【００９５】
例１：ＣＤ４  Ｔ細胞株およびＭＡＧＥ−Ａ３に特異的なクローンの入手
増殖しているＣＤ４＋  Ｔ細胞を含むマイクロ培養液を培養の開始後約３５日間、Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激したときにＴＮＦおよび／またはIＦＮ−γを産生するその能力に関して査定した。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（５００，０００／ｍｌ）を２０μｇ／ｍｌのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質、またはネガティブ対照としてオバルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ：Ｓｉｇｍａ）の存在下、３７℃にて１８−２０時間インキュベートした。本明細書で言及したＥＢＶ−Ｂ細胞はエプスタイン‐バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス）で不死化させたＢ細胞である。ＥＶＢ−Ｂ細胞は本技術分野で標準の手順に従って調製した。タンパク質パルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞を洗浄し、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％ヒト血清およびIＬ−１２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む１５０μｌの完全イスコブ培地中、２，５００  ＣＤ４＋  Ｔリンパ球へ丸底マイクロウェルあたり５，０００加えた。１８−２０時間後、上清を回収し、すでに記述されたような（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１９：２０３−２１０，１９８９；Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Iｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５−１５２，１９９２）ＭＴＴ比色定量アッセイにて、すでに記述されたように（Ｅｓｐｅｖｉｋ  ａｎｄ  Ｎｉｓｓｅｎ−Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９５：９９−１０５，１９８６）ＴＮＦ−感受性ＷＥＨI  １６４クローン１３細胞における上清の細胞傷害性効果を試験することでＴＮＦ含量について査定した。IＦＮ−γ産生を、メドジェニックスダイアゴノスティックス−バイオソース（Ｍｅｄｇｅｎｉｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ：Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの試薬により我々の実験室で開発した（以下を参照のこと）ＥＬIＳＡアッセイを使用して測定した。ｍＡｂｓ  Ｗ６／３２（抗ＨＬＡクラスI）または２Ｂ６（抗ＨＬＡ−ＤＲ）による阻害を実験中腹水の１／２０希釈の添加によって行った。ＭＡＧＥ−Ａ３によってパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞への応答におけるサイトカイン分泌は、オバルブミンでパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞へのＴ細胞のバックグラウンド応答より少なくとも２倍である場合、およびｍｌあたり５００ｐｇのIＦＮ−γまたは５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを超える場合、有意であると見なした。
【００９６】
特異的にＴＮＦを産生しているＣＤ４＋  Ｔ細胞株（図２）、すなわちＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を認識するものを、刺激細胞として外因性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞株および供給細胞として同種ＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ）を使用して、限界希釈にてクローン化した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンをIＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、IＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍｌ精製ＰＨＡ（ムレックスダイアゴノスティックス（Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＧＢ）を含む完全イスコブ培地内で増殖させた。このクローンを一週間に一回新鮮な培養培地で補充し、１−２週間の間隔で供給細胞（２４ウェルプレートあたり１．５×１０６同種ＰＢＬ＋５×１０５  ＬＧ２−ＥＢＶ形質転換細胞）を接種させた。いくつかの例において、クローンを２４ウェルプレートあたり２×１０５刺激細胞＋１０６  ＬＧ２  ＥＢＶ−Ｂ形質転換細胞を使用し、Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で再形質導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞株を使用し再刺激した。
【００９７】
次いで確立したＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンを、上述したように外因性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３またはＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞での刺激におけるＴＮＦおよび／またはIＮＦ−γ分泌について試験した。簡単に記すと、アッセイは細胞上清とのインキュベーションの前にIＮＦ−γ抗体をプラスチックマイクロタイタープレートのウェル上にコートし、産生されたIＦＮ−γの量を決定する標準ＥＬIＳＡであった。IＦＮ−γ  ＥＬIＳＡアッセイは産生されたIＦＮ−γの測定に使用できた。いくつかのＭＡＧＥ−３特異的クローンをＢ６株から得た（図３）。
【００９８】
ＭＡＧＥ−Ａ３エピトープはＨＬＡ−ＤＲ分子（図３）によってＣＤ４クローンに提示される。ＭＡＧＥ−Ａ３−パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を、１／２０希釈にて使用した保存剤を含まないモノクローナル抗体の連続的な存在下で、ＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ４＋クローンとともに８％ＣＯ２下３７℃にて２４時間共培養した。モノクローナル抗体２Ｂ６（抗ＨＬＡ−ＤＲ）は認識をなくし、一方認識はモノクローナル抗体Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）の存在下で変化しない。
例２：ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡ−ＤＲ制限ペプチドの同定
これらのＣＤ４＋クローンによって認識されるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを同定するために、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質配列の部分に相当する１６アミノ酸ペプチドを合成し、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞上に加え、認識について試験した（図４および５）。ペプチドを一過性のＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを使用して合成し、質量分光計を使用して特性化した。すべてのペプチドは、解析的ＨＰＬＣによって示したように＞８０％純粋であった。凍結乾燥した合成ペプチドをＤＭＳＯ（メルク、Ｍｅｒｃｋ）中に溶解し、最終濃度５００μＭ、５０μＭまたは５μｇ／ｍｌで使用した。ＥＢＶ−Ｂ細胞（丸底マイクロウェルあたり５，０００）を異なるペプチド、インキュベーション工程の間ペプチドの濃度を表している示した濃度の存在下で、８％  ＣＯ２、３７℃にて２時間インキュベートした。ついでＣＤ４＋クローンをウェルあたり２，５００細胞加えた。アッセイ培地はＬ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％  ヒト血清およびIＬ−１２（２５Ｕ／ｍｌ）を含むイスコブ培地であった。１８−２０時間後、上清を回収し、ＴＮＦ−αおよび／またはIＦＮ−γ分泌について査定した。IＦＮ−γ産生をＭｅｄｇｅｎｉｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの試薬を用いて実験室で展開したＥＬIＳＡ試験（２０−４０００ｐｇ／ｍｌ）を使用して測定した。
【００９９】
１つの実験の組において、ペプチドを５００μＭの非生理学的濃度にて調べた。ペプチドの非生理学的濃度はＴ細胞クローンの非特異的活性を引き起こす可能性がある。実際に、５００μＭで使用したときに、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１５９−１７４（図４−ペプチド３５５；配列番号：６）はクローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）および４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）の活性化を誘導するが、このペプチドは５０μＭで使用したときにはこれらのクローンの活性化に効果的ではなかった（図５）。一方ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６−図４−ペプチド３２３；配列番号：３）およびＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０−−図４−ペプチド３２４；配列番号：４）はより生理学的な濃度、または好ましくはより低い濃度で使用したときにクローンＢ６／３４およびＢ６／３７によるＴＮＦ−αおよびIＦＮ−γ産生を特異的に刺激した。これらの２つのペプチドはまたＢ６クローンの増殖を誘導できた（図６）。
【０１００】
図３−６で示したように、クローンＦ３／４０およびＦ３／３７はＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを認識せず、ＭＡＧＥ−Ａ３を提示している細胞を認識した。したがって、これらの２つのクローンはＭＡＧＥ−Ａ３よりも細胞成分を認識していると信じられている。
例３：ＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ４＋クローンＢ６／３７によって使用されるＨＬＡ制限部位の決定
Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に対する応答でのこれらのＣＤ４＋クローンによるサイトカイン分泌はＨＬＡ−ＤＲに制限される。クローンＢ６／３７によって使用されたＨＬＡ−制限部位をさらに定義するために、さらなるＥＢＶ−Ｂ細胞株を上述したようにペプチド提示のために使用した（図７）。ＡＵＭＡ−ＥＢＶ（ＬＢ１６２２−ＥＢＶ）のＨＬＡ血清型、ＬＢ  １５５５−ＥＢＶ、ＧＥＲＬ−ＥＢＶ（ＭＺ２−ＥＢＶ）は、すべての３つの細胞型によって共有されるクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に限定されたことを明らかにした。さらにＡＤＥＴ−ＥＢＶ（ＬＢ１１１８−ＥＢＶ）はＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０ペプチドを効果的に発現していることが明らかになり、これらの細胞のＨＬＡ血清型がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１であることが明らかになった。上述したようないくつかの他のＥＢＶ−Ｂ細胞株の、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６およびＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０でパルスしたときのクローンＢ６／３７を刺激するその能力に対するスクリーニングを行い、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２両方がこれらのペプチドを提示できることを確認した（表II）。
【０１０１】
【表３】
0004102027.tif 000006
【０１０２】
上述したような他のＥＢＶ−Ｂ細胞株の、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６および／またはＭＡＧＥ−３１１５−１３０でパルスしたときにクローンＢ６／３４および／またはＢ６／３７を刺激する能力に対するスクリーニングを行い、他のＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３提示分子を定義した。
【０１０３】
例４：Ｂ６／３７クローンを刺激することができる最小ペプチドの決定
ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドと違い、クラスII−制限ペプチドは長さにおいて相当変化し、アミノ末端およびカルボキシ末端両方において伸張を許容することができる。ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６およびＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０両方がクローンＢ６／３４およびＢ６／３７を特異的に刺激する一方、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１０７−１２２およびＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４はこれらのクローンを活性化できないことが明らかにされた。したがって、ＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１２６ペプチド（ＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ；配列番号９）がＢ６／３４およびＢ６／３７クローンの活性化に必要な最小１２アミノ酸モチーフでありうる。予想したように、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１２６はクローンＢ６／３７によるIＦＮ−γの有意な産生を誘導した（図８）。１つの残基またはそれ以上の欠失を持つ短くしたペプチドをまた調製した。短くしたペプチドのいくつか、たとえばＭＡＧＥ−Ａ３１１６−１２６（配列番号：１０）およびＭＡＧＥ−Ａ３１１７−１２６（配列番号：１１）はまた、IＦＮ−γの量を減少させたが、クローンＢ６／３７（図８）によるIＦＮ−γ産生を誘導した。ＭＡＧＥ−Ａ３１１８−１２６（配列番号：１２）はIＦＮ−γの有意な量の産生を誘導しなかった。
【０１０４】
例５：樹状細胞による外因性ＭＡＧＥ−Ａ３の提示
クローン３７をＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を多量に加えた自己樹状細胞で得た。２，３のＭＡＧＥ−Ａ３＋細胞によって放出された多数のＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を捕獲する樹状細胞の、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激する能力を決定するために、ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞を（図９Ａ）で図示したようにＭＡＧＥ−Ａ３の希釈系列濃度と共に２４時間インキュベートした。クローン３７の刺激を、細胞を洗浄すること、丸底マイクロウェル中に細胞を分配すること、および２５００のクローン３７細胞を加えることによって試験した。IＦＮ−γ分泌を２０時間の共培養後、ＥＬIＳＡによって測定した。実験を三重に行った。IＦＮ−γの半最大産生が、１００μｌの容量中の１０４樹状細胞を３０ｎｇのＭＡＧＥ−Ａ３といっしょにプリインキュベートしたときに得られ、多量のＭＡＧＥ−Ａ３がおよそ２×１０４  ＭＺ２−ＭＥＬ．４３腫瘍細胞で存在する。この結果は、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているとても少数の腫瘍細胞のエンドサイトーシス残骸がクローン３７を刺激することができることを示唆する。
【０１０５】
もう一つのアッセイをＭＡＧＥ−Ａ３＋細胞の残骸を処理する樹状細胞の能力を試験するために行った。ＭＡＧＥ−Ａ３を一過性に２９３−ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトし、後に融解した。ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞をまず２４時間溶解物と共にインキュベートし、次いでクローン３７を刺激するのに使用した。３つの個別の実験において、クローン３７を、IＦＮ−γ放出による判定として、ｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３でトランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の融解物でインキュベートした樹状細胞によって刺激した（図９Ｂ）。２９３−ＥＢＮＡ細胞（ウェルあたり５×１０５細胞）をｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭIＮ（登録商標）と混合した異なる用量のｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３でトランスフェクトし、トランスフェクトした２４時間後に溶解した。ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞を２９３−ＥＢＮＡ溶解物と共に２４時間培養した（樹状細胞あたり５細胞と等しい）。次いで樹状細胞を洗浄し、丸底マイクロウェル中に分配し、２５００細胞のクローン３７を加えた。IＦＮ−γ分泌を共培養の２０時間後にＥＬIＳＡによって測定した。実験を３重で行った。
【０１０６】
例６：ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質の調製および使用
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を、短くした不変鎖（Iｉ）を持つか、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）を持つ融合タンパク質としてＥＢＶ  Ｂ細胞株ＭＺ２  ＥＢＶ（ＨＬＡ  Ａ１ＤＲ１３）内に発現させ、ＨＬＡクラスII分子内でのＭＡＧＥ−Ａ３誘導ペプチドの提示を標的にした（図１４の略図を参照のこと）。Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３の形質導入は  ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピトープと反応するＣＤ４  Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７による認識によって測定したようにＨＬＡクラスIIでのペプチド提示を産生する。さらに、ＥＢＶ  Ｂ細胞でのIｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３の発現は結果としてＨＬＡクラスIでのペプチド提示となり、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１特異的ＣＴＬのクローンＬＢ７０５  ４３４／１の活性化によって測定した。反対にＭＡＧＥ−Ａ３−ＬＡＭＰ−１融合タンパク質の発現は、ＨＬＡ分子でのＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの発現をただわずかに増加した。したがってIｉとＭＡＧＥ−Ａ３の連結はＨＬＡクラスIおよびクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプチドの発見を誘導するためのワクチンとして使用できる。
【０１０７】
プラスミドおよび融合構築物のクローニング
ＭＡＧＥ−Ａ３：ＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡおよびポリペプチドはそれぞれ配列番号１および配列番号２として列記する。
ヒト不変鎖：ｃＤＮＡをコードしているヒト不変鎖を含むIｉｐＳＶ５１Ｌと名付けたプラスミドはＪ．ピータース（Ｊ．Ｐｉｅｔｅｒｓ）博士（Ｂａｓｅｌ  Iｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Iｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０６：８３１−８４６，１９９３）より親切にも提供された。
ＬＡＭＰ１：プラスミドｐＣＭＶ−ｓｉｇＥ７−ＬＡＭＰ１はＴ．ウー（Ｔ．Ｗｕ）博士（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１６７１−１１６７５，１９９５）によって親切にも提供された。
ｐＭＦＧ：プラスミドｐＭＦＧはＯ．ダノス（Ｏ．Ｄａｎｏｓ）博士（Ｓｏｍａｔｉｘ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）より親切にも提供された。
【０１０８】
ｐＭＦＧ−ＭＡＧＥ−Ａ３の構築
ＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡを、コードしている配列の５’および３’末端での好ましい制限酵素認識部位の導入の後にｐＭＦＧへ挿入した。ＮｃｏI部位を５’末端に、ＢｇｌII部位を３’末端に、プライマー：ＮｃｏI−センス：
【外３】
0004102027.tif 000007
（配列番号：１４）およびＢｇｌII−アンチセンス：
【外４】
0004102027.tif 000008
（配列番号：１５）［ＮｃｏIおよびＢｇｌIIに対する認識部位はイタリック体である］を用いたＰＣＲによって導入した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、標準の方法に従って配列決定した。ＮｃｏI−ＢｇｌII増幅産物を酵素ＮｃｏIおよびＢａｍＨIによって開裂したｐＭＦＧ内にクローン化した。
【０１０９】
ｐＭＦＧ−Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３の構築
ヒト不変鎖ポリペプチド（ｈｕ−Iｉ；残基１−８０）のアミノ末端（すなわち細胞質末端および膜貫通領域）をコードしているｃＤＮＡ、を鋳型としてIｉｐＳＶ５１Ｌを使用したＰＣＲによって増幅した。以下のプライマーを使用した。ｈｕ−Iｉセンス：
【外５】
0004102027.tif 000009
（配列番号：１６）およびｈｕ−Iｉアンチセンス：
【外６】
0004102027.tif 000010
（配列番号：１７）［ＮｃｏIおよびＢａｍＨIに対する認識部位はイタリック体である］。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、標準の方法に従って配列決定した。ＮｃｏI−ＢａｍＨI増幅産物を、結果としてｐＭＦＧ−Iｉとなるよう酵素ＮｃｏIおよびＢａｍＨIで開裂したｐＭＦＧ内にクローン化した。
【０１１０】
短くしたIｉ−ｃＤＮＡの３’末端におけるＢａｍＨI部位とインフレームに、ＡＴＧコドンと置き換えた、ＢｇｌII認識部位を、プライマー：ＢｇｌII−センス：
【外７】
0004102027.tif 000011
（配列番号：１８）およびＢｇｌII−アンチセンス（配列番号：１５）［ＢｇｌIIに対する認識部位はイタリック体である］を用いたＰＣＲによってＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡの５’末端に導入した。ＰＣＲ産物（ＢｇｌII．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＢｇｌII）をｐＣＲ２．１内にクローン化し、標準の方法に従って配列決定した。
組換え体プラスミドｐＭＦＧ−IｉをＢａｍＨIで再開裂し、ＢｇｌII．ＭＡＧＥ−３．ＢｇｌII増幅産物を互換性末端とでライゲーションした。インフレームで、そして正しい方向でＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡを含む組換え体プラスミドを制限断片解析によって同定した。
【０１１１】
ｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．MAＧＥ−Ａ３．ＬＡＭＰ−１の構築
ＬＡＭＰ−１タンパク質のシグナルペプチドおよびＬＡＭＰ−１の膜貫通領域および細胞質内末端をコードしているｃＤＮＡｓを、鋳型としてｐＣＭＶ−ｓｉｇＥ７−ＬＡＭＰ１を使用したＰＣＲによって増幅した。ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチドに対するプライマーの組は以下である。Ｓｉｇセンス：
【外８】
0004102027.tif 000012
（配列番号：１９）およびＳｉｇアンチセンス：
【外９】
0004102027.tif 000013
（配列番号：２０）［ＮｃｏIおよびＢａｍＨに対する認識部位はイタリック体である］。このｃＤＮＡの３’末端でのＢａｍＨI部位は、ＢｇｌII．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＢｇｌII 断片の５’末端のＢｇｌII部位とインフレームである。この増幅産物をｐＭＦＧ内にクローン化し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇを調製した。
【０１１２】
ＬＡＭＰ１膜貫通ドメインおよび細胞質内末端に対するプライマーの組は以下である。ＬＡＭＰ−１センス：
【外１０】
0004102027.tif 000014
（配列番号：２１）およびＬＡＭＰ−１アンチセンス：
【外１１】
0004102027.tif 000015
（配列番号：２２）［ＢａｍＨIおよびＢｇｌIIに対する認識部位はイタリック体である］。この増幅産物を標準の方法に従って配列決定し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇ内にクローン化し、結果としてシグナルペプチドと膜貫通配列の境目に特徴的なＢａｍＨI部位をもつプラスミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＬＡＭＰ−１を得た。プラスミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＬＡＭＰ−１を合成するために、ＢｇｌII．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＢｇｌII断片より単離されたＢｇｌII−ＢａｍＨI断片をｃＤＮＡをＢａｍＨIで開裂したｐＭＦＧ−Ｓｉｇ。ＬＡＭＰ−１内にクローン化した。このクローニング工程により、アミノ酸２４０−３１４をコードしているＭＡＧＥ−Ａ３の３’末端を削除した。
【０１１３】
細胞株、培地および試薬
ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞株（ノラン（Ｎｏｌａｎ）博士、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡより親切にも提供された）はＲＳＶプロモーターおよびｐＰＧＫハイグロ選択可能マーカーをもつＭｏｌｏｎｅｙ  ＧａｇＰｏｌ−IＲＥＳ−Ｌｙｔ２構造での２９３Ｔ細胞の安定トランスフェクションによって生成された高タイター両栄養性レトロウイルス産生細胞株である。ここでこれらの細胞を、ＣＭＶプロモーターによって駆動するモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）両栄養性エンベロープ遺伝子で安定にトランスフェクトし、ジフテリア毒素抵抗性遺伝子（ｐＨＥＤ−７）で共選択した。このプロデューサー細胞株はヘルパーウイルスを必要としない。
ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞を培養し、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中、１７５ｃｍ２フラスコ内に継代した。
【０１１４】
ＭＺ２−ＥＢＶ  Ｂ細胞株をＥＢＶを感染させることでメラノーマ対象ＭＺ２（ＨＬＡ  Ａ１  Ａ２９  ＤＲ０１０１  ＤＲ１３０２）のＢ細胞より作製した。同様にＬＧ２−ＥＢＶ  Ｂ細胞株を非癌対象ＬＧ２（ＨＬＡ  Ａ２４  Ａ３２  ＤＲ７  ＤＲ１４）から作製した。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は対象ＭＺ２からのメラノーマ細胞株である。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株およびＭＺ２−ＭＥＬ．４３を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、０．２４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ  Ｌ−アルギニンおよび１．５ｍＭ  グルタミン（ＡＡＧ）を含むイスコブ改変ダルベッコ（IＤ）培地中で培養した。
【０１１５】
細胞傷害性Ｔ細胞クローンＬＢ  ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１はＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１エピトープを相手とし、非癌対象ＬＢ７０５（ＨＬＡ  Ａ１  Ａ２）からのＣＤ８＋  Ｔ細胞の初代培養で作製し、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドでパルスした自己ＰＢＬ（末梢血リンパ球）を照射した。ＣＤ４  Ｔ細胞クローンＬＢ  １５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７はＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピトープを認識し、対象ＬＢ  １５５５  ＤＥＳＡ（ＨＬＡ  ＤＲ３  ＤＲ１３０２）のＴ細胞の初代培養および精製ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質と共にプレインキュベートした自己単球由来樹状細胞によって同定した。このＴ細胞クローンを、曝露供給細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ、貯留ヒトＰＢＬ）および特異的刺激細胞（ＣＴＬ  ４３４／１に対するＭＺ２−ＭＥＬ−４３、またはＣＤ４  Ｔ細胞クローン４３６／Ｂ６．３７に対するＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質とともにプレインキュベートしたＤＥＳＡ−ＥＢＶ）の存在下、１０％熱不活性化ヒト血清（ＨＳ）、ＡＡＧおよび５０Ｕ／ｍｌ組換え体ヒトIＬ−２（ｒｈ  IＬ−２）を含むIＤ中で培養した。
【０１１６】
高タイターＭＡＧＥ３コード組換え体レトロウイルスの生成
ＭＡＧＥ−Ａ３コードレトロウイルスベクタープラスミド、ＭＦＧ−ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＦＧ−Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−ＬＡＭＰおよび（増幅緑色蛍光タンパク質レポーターをコードしている）ＭＦＧ−ＥＧＦＰをトランスフェクションによってＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細胞内に導入した。ＭＦＧレトロウイルスベクターはモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルスより由来し、薬剤耐性マーカーを欠いており、挿入されたｃＤＮＡ以外他の潜在的な抗原性タンパク質を発現していない（Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６７３３−６７３７，１９９５）。トランスフェクションの手順は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファンデルＥｂ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５４：５３６−５３９）のリン酸カルシウム媒介トランスフェクションプロトコールの改良である。
【０１１７】
トランスフェクションの２４時間前、１０．８×１０６ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））内で１４ｍｌ細胞増殖培地中にプレートした。細胞を加えた後、このフラスコを穏やかに前後に揺すり、フラスコの底あちこちに均等に分配した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの時、細胞が７０−８０％のコンフレントに達していなければならないが、培地を取り除き、２５ｍＭクロロキニン（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む新鮮な１４ｍｌのＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞増殖培地で置換した。トランスフェクションカクテルを、４０μｇレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを水に加え、１５７５μｌの最終容量まで希釈することで５０ｍｌチューブ内に調製した。このＤＮＡ溶液に２２５μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を加えた。次いで１８００μｌの２×ＨｅＢＳ（滅菌水中に５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  デキストラン、２８０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を溶解し、０．２μフィルターで濾過し、−２０℃で保存した）を、自動ピペットで１５秒間勢いよくバブリングすることでＤＮＡ／ＣａＣｌ２溶液に滴下して加えた。ＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨｅＢＳ混合液をすぐに加えて細胞上に滴下し、フラスコを緩やかに攪拌し、ＤＮＡ／ＣａＰＯ４粒子を均一混合させた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて７から９時間インキュベートし、クロロキニン含有培地を新鮮なＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞増殖培地に交換した。レトロウイルス上清の回収のおよそ２４時間前に、ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ培地を取り除き、ゆっくりと２．５％ＦＣＳのみを含む９ｍｌのＥＢＶ細胞増殖培地（イスコブ）で置換した。レトロウイルス上清を、培地を細胞から取り除き、０．４５μフィルターを通して濾過して細胞残骸を取り除くことでトランスフェクション４８時間後に回収した。回収および濾過後、ウイルス含有培地を氷上におき、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ内で望ましい容量に分液し、−８０℃で保存した。ＭＦＧ−ＥＧＦＰトランスフェクトＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析によってトランスフェクション効率に関してアッセイした。
【０１１８】
ＥＢＶ細胞株のレトロウイルス導入
ＥＢＶ形質転換細胞を、細胞を感染カクテル中で再懸濁させ、遠心することで感染させた。標的細胞を６０ｍｍ組織培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））内で４ｍｌの感染カクテル中１．０×１０６細胞の濃度で再懸濁させた。プレートをIＥＣ遠心器、ローター型２２８内で２時間、３２℃、１２００ｒｃｆで遠心した。それぞれの導入すべきプレートに対して、４ｍｌの感染カクテルを、ＥＢＶ細胞増殖培地中でウイルス上清１：２に希釈し、最終濃度６μｇ／ｍｌまで硫酸プロタミンを加えることで調製した。さらに２時間の加湿インキュベーター内で３７℃でのインキュベーション後に遠心をし、細胞を４ｍｌの標的細胞増殖培地へ移した。この導入サイクルを細胞をプレーティングした直後に行い、２４および４８時間の時点で繰り返した。感染ＥＢＶ細胞をＥＧＦＰレポーター遺伝子発現に関してＦＡＣＳ解析にて第３回の感染サイクル後２４−４８時間アッセイした。
【０１１９】
インターフェロン−γ産生アッセイ
ＬＢ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１の５０００のＴ細胞またはクローンＬＢ１５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７の３０００のＴ細胞を洗浄し、５０００のＭＺ２−ＥＢＶのレトロウイルス導入ＥＢＶ  Ｂ細胞またはＬＧ２−ＥＢＶ  Ｂ細胞の存在下、丸底９６ウェルプレート内で１０％ＨＳ、ＡＡＧおよび５０Ｕ／ｍｌ  ｒｈ  IＬ−２を含む１００μｌのIＤ培地中で一晩培養した。すべての培養を三重で行った。５０μｌの培養上清をＥＬIＳＡ（IＦＮ−γ  ＥＬIＳＡ，バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ））によってIＦＮ−γの存在に関してアッセイした。簡単に記すと、抗ヒトIＦＮ−γ  ＡｂをプレコートしたＥＬIＳＡプレートを洗浄し、５０μｌの培養上清および５０μｌのビオチン化抗ヒトIＦＮ−γ  Ａｂ（IＤ、１０％ＨＳ、ＡＡＧ中１：１２５０）とともに２時間、室温（ＲＴ）にてインキュベートした。３回の洗浄の後、プレートをウェルあたり５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡ中１：３０００）を加えて３０分間ＲＴにてインキュベートし、ＴＭＢ基質で検出し、Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。最適濃度は４５０ｎｍで読んだ。４０００ｐｇ／ｍｌのIＦＮ−γを含む試料および１：２希釈液を標準として使用した。
【０１２０】
細胞傷害性アッセイ
１×１０６ＥＢＶ  Ｂ細胞を２５μＣｉ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４で３７℃にて６０−９０分間標識した。細胞を洗浄し、１×１０４／ｍｌで再懸濁させた。対照アッセイにおいて、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドを細胞懸濁液に１μＭの濃度で加えた。ＬＢ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１  Ｔ細胞を、Ｖ型９６ウェルプレート中で、対標的細胞比３０から１および１０倍希釈の効果器にて、３７℃でウェルあたり１０００の標識化標的細胞ととも培養した。４時間後、クロミウム放出（ＥＲ）を１００μｌ上清のアリコートで測定した。培地のみまたは１％Ｔｒｉｔｏｎ中でインキュベートした標的細胞をそれぞれ最小（ＳＲ）および最大（ＭＲ）５１Ｃｒ放出としてとった。試料中のパーセンテージ実験的５１Ｃｒ放出を（ＥＲ−ＳＲ／ＭＲ−ＳＲ）×１００％として計算した。
【０１２１】
Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７による導入ＥＢＶ  Ｂ細胞株の認識
ＭＺ２  ＥＢＶにＭＦＧ  Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＺ２  ＥＢＶ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＭＦＧ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰ（ＭＺ２  ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰ）、ＭＦＧ  ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＺ２  ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−Ａ３）またはＭＦＧ  ＥＧＦＰ（ＭＺ２  ＥＢＶ−ＥＦＧＰ）を導入した。導入細胞を、ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３エピトープと反応するＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７の存在下で一晩培養した。Ｔ細胞クローンは、ＥＬIＳＡによって測定した培養上清中のIＦＮ−γの放出によって決定したように（図１０）、ＭＺ２−ＥＢＶ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３を認識した。反対に、Ｍ２  ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰのみはIＦＮ−γの弱い産生を誘導した。対照トランスフェクションであるＭＺ２  ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＺ２  ＥＢＶ−ＥＧＦＰおよびＬＧ２  ＥＢＶ（示していない）はＣＤ４  Ｔ細胞にて認識されなかった。これらの結果は、Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質がＨＬＡクラスIIによる発現に関して処理され、一方ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質のみはＨＬＡクラスII抗原提示経路に到達しないことを示している。
【０１２２】
ＬＢ  ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１による導入ＥＢＶ  Ｂ細胞株の認識
ＭＺ２  ＥＢＶ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＺ２  ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰ両方とも一晩の共培養後にＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１特異的ＣＴＬクローンＬＢ  ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１によって同程度認識された（図１１）。培養上清中のIＦＮ−γ放出をＥＬIＳＡによって測定した。ＭＺ２  ＥＢＶ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３はＣＴＬクローンによる高IＦＮ−γ産生を顕在化させ、このことはIｉに融合したＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の発現がまだＨＬＡクラスI経路での処理を導くことができることを示唆している。
ＭＡＧＥ−Ａ３、Iｉ  ＭＡＧＥ−３Ａ、ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰまたはＧＦＰをレトロウイルス的に導入したＭＺ２−ＥＢＶのＬＢ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１による溶解物を、標的細胞に対するさまざまな効果器比（Ｅ／Ｔ）での４時間５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。平行して、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドをＴ細胞活性化の陽性対照として加えた。ＭＺ２  ＥＢＶ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＺ２  ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３  ＬＡＭＰ両方を、ＭＺ２  ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−Ａ３と同様にＬＢ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１にて溶解した。溶解のパーセンテージはＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドの存在下での標的細胞溶解物と同等であった（図１２）。
【０１２３】
ＭＺ２−ＭＥＬ．４３によるＨＬＡクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプチドの提示
ＨＬＡクラスII分子でのＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの提示に対するIｉの寄与をさらに確かめるために、メラノーマ細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ．４３にＭＦＧ  Iｉ  ＭＡＧＡ−Ａ３（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３）またはＭＦＧ  ＥＧＦＰ（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−ＥＧＦＰ）を導入した。ＭＦＧ  ＥＧＦＰを導入した１ヶ月後、９０％のＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞が高レベルのＥＧＦＰを発現した（示していない）。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は内因的にＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を発現するが、しかしＨＬＡクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプチドは発現しない。しかしながら、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３へのＭＦＧ−Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３の導入後、一晩の共培養の後にＣＤ４  Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５  ＣＤ４  ４３６／Ｂ６．３７によって認識された（図１３Ａ）。培養上清中のIＦＮ−γ放出をＥＬIＳＡによって測定した。これは、内因的に発現したＭＡＧＥ−Ａ３と対照的に、Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３がＨＬＡクラスIIでの発現に対して処理されうることを示唆する。親および導入ＭＺ２−ＭＥＬ．４３両方がＣＴＬクローンＬＢ７０５  ＣＴＬ  ４３４／１を活性化した（図１３Ｂ）。
【０１２４】
例７：２つの他のＣＤ４＋クローンは第二のＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを認識した
このプロトコールの効力を確かめるために、上述の条件を使用して樹状細胞にＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を供給し、ヘモクロマトーシス対象ＬＢ１１５８からの、またはメラノーマ対象７００２からの自己ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を刺激した。４回の再刺激後、それぞれのＭＡＧＥ−Ａ３をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激したマイクロ培養液のアリコートによるIＦＮ−γの特異的産生を、対象ＬＢ１１５８に対しては３５日目に、対象７００２に対しては３７日目に試験した。それぞれの個人に対して、１つの陽性マイクロ培養を、刺激細胞として自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用してクローン化し、ＬＢ１１５８に対してＭＦＧ  Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３を再導入するか、または対象７００２に対してタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３を供給した。ＬＢ１１５８  ＣＤ４＋クローン２２および７００２  ＣＤ４＋クローン２を得た。両方のクローンはＭＡＧＥ−Ａ３を与えた、またはＭＦＧ  Iｉ  ＭＡＧＥ−Ａ３を導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞での刺激によってIＦＮ−γを分泌し、このことはこのクローンがＭＡＧＥ−Ａ３に特異的であり、タンパク質のバッチでの混在物に対して結合したのではないことを証明している。クローン２２について、IＦＮ−γ放出はＨＬＡ−ＤＲ分子を認識するｍＡｂ  ２Ｂ６によって阻害された。とりわけ、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を２０μｇ／ｍｌの組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の存在下、２０時間インキュベートした。クローン２２（２５００細胞）を一晩、５０００個のＭＡＧＥ−Ａ３をロードしたＥＢＶ−Ｂ細胞とともに、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｗ６／３２）またはＨＬＡ−ＤＲ（２Ｂ６）を認識するモノクローナル抗体の存在下または非存在下で、丸底マイクロウェル中で一晩インキュベートした。IＦＮ−γ分泌をＥＬIＳＡによって２０時間後に測定した（図１５Ａ）。
【０１２５】
ＭＡＧＥ−Ａ３の部分に相当するペプチド（たとえば、ＭＡＧＥ１０７−１２２、ＭＡＧＥ１１１−１２６、ＭＡＧＥ１１５−１３０、ＭＡＧＥ１１９−１３４）をクローン２および２２による認識について試験した。ＨＬＡ−ＤＲ１３  ＥＢＶ−Ｂ細胞を２時間、異なる濃度のこれらのペプチドでパルスした。クローン２および３７（２５００細胞）を丸底マイクロウェル中で２０時間、５０００のペプチドでパルスした細胞とともにインキュベートし、IＦＮ−γ産生についてアッセイした。ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（ＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ；配列番号：２３）は陽性を記録した。このペプチドは１０ｎｇ／ｍｌの濃度にてクローン２によるIＦＮ−γの分泌を刺激し、一方でクローン３７は同様の条件下でこのペプチドにより刺激されなかった（図１５Ｂ）。クローン２２はまた、同様の実験においてペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（配列番号：２３）によって刺激された。
ドナーＬＢ１１５８はＤＲＢ１＊０１０１、ＤＢＲ１＊１３０１およびＤＢＲ３＊０２０２対立遺伝子を発現し、一方対象７００２はＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊１３０２およびＤＲＢ３＊０３０１を発現している。多くのさらなるＥＢＶ−Ｂ細胞を試験し、ＤＲ１３を提示しているこれらのみがクローン２および２２に対してペプチドを発現できたことを明らかにした（表III）。自己のまたは同種のＥＢＶ−Ｂ細胞を２時間、１μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４ペプチドでパルスし、次いで洗浄した。クローン２または２２を５０００のペプチドパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞と共に２０時間、丸底マイクロウェル中でインキュベートし、クローンのＥＶＢ−Ｂ細胞への反応性をIＦＮ−γ分泌としてＥＬIＳＡにて測定した。実験は三重に行った。
【０１２６】
【表４】
0004102027.tif 000016
【０１２７】
例８：最小ＭＡＧＥ−Ａ３抗原性ペプチドの定義
ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドと違い、溝内でそれらの末端によって固定されないことから、クラスII−制限ペプチドは通常長さがさまざまであり、アミノ末端およびカルボキシ末端両方における伸張を許容する。したがって、抗原性ペプチドの長さを正確に定義することは難しい。したがって、多くのＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを異なる濃度で試験した（表IVおよびV）。表IVに示すように、自己ＬＢ１５５５  ＥＢＶ−Ｂ細胞を異なるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと共に２時間インキュベートした。次いでクローン３７の２５００細胞を５０００ペプチドパルス細胞と共に丸底マイクロウェル内で２０時間共培養した。共培養上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡアッセイにて測定した。実験は三重に行った。表Vに示したように、ＨＬＡ−ＤＲ１３  ＥＢＶ−Ｂ細胞を異なるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと共に２時間インキュベートした。次いでクローン２および２２（２５００細胞）を５０００ペプチドパルス細胞と共に丸底マイクロウェル内で２０時間共培養した。共培養上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡアッセイにて測定した。実験は三重に２回行った。これらの実験より、クローン３７によってよく認識された短いペプチドはＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１４−１２７；配列番号：２８）であり、一方クローン２および２２によってよく認識された短いペプチドはＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３１；配列番号：３４）およびＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（ＭＡＧＥ−Ａ３１２１−１３４；配列番号：３８）であったと結論づけた。
【０１２８】
ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドに関する限り、ＨＬＡ−クラスII−制限ペプチドは９から１０アミノ酸のＨＬＡ結合コア内でのアンカー残基が好ましい。ＨＬＡ−ＤＲＢａ＊１３０１およびＢ１＊１３０２に結合しているほとんどのペプチドは、結合コア内のＰ１部位でのI、ＬまたはＶ、Ｐ４部位でのＬ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＷまたはＹ、Ｐ６部位でのＲまたはＫ、Ｐ９または１０部位でのＹ、Ｆ、Ａ、ＳまたはＴによって特徴づけられる（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＨＣ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｅｆｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Iｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９７）。先の結果は、（クローン３７によって認識された）第一の抗原性ペプチドに対して、１０アミノ酸ペプチドＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１６−１２５；配列番号４１）は、それぞれＰ１およびＰ９／１０アンカーとして保存されているＨＬＡ−ＤＲ１３、Ｌ１１６およびＹ１２５残基に対する結合コアであることを示唆している（表IV）。あるいは、クローン３７認識に対して、１０アミノ酸ペプチドＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１７−１２６；配列番号１１）がそれぞれＰ１およびＰ９アンカーとして保存されているＶ１１７およびＡ１２６を持つ、ＨＬＡ−ＤＲ１３に対する結合コアであり得る。（クローン２および２２によって認識された）第二の抗原性ペプチドに対して、結果は、１０アミノ酸ペプチドＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴ（ＭＡＧＥ−Ａ３１２２−１３１；配列番号：４２）が、それぞれＰ１、Ｐ６およびＰ１０アンカーとして保存されている残基Ｌ１２２、Ｒ１２７およびＴ１３１を持つＨＬＡ−ＤＲ１３に対する結合コアであることを示唆している（表V）。したがって結合クローン３７、２または２２について本明細書で記述したペプチドはヌクレオチド配列、クローン３７に対してはＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＣＣ（配列番号：１３）またはＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＡ（配列番号：４３）、クローン２または２２に対してはＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡ（配列番号：４４）を含む核酸によってコードされる。
【０１２９】
【表５】
0004102027.tif 000017
【０１３０】
【表６】
0004102027.tif 000018
【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
例９：クローン２および２２による他のＭＡＧＥタンパク質の認識
ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（ＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ；配列番号：２３）はＭＡＧＥ−Ａ１（アミノ酸１１２−１２７）、ＭＡＧＥ−Ａ２（アミノ酸１１９−１３４）およびＭＡＧＥ−Ａ６（アミノ酸１１９−１３４）に同一に存在する。クローン３７ではなく、クローン２および２２を、上述したアッセイに従ってＭＡＧＥ−Ａ１組換え体タンパク質をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞によって刺激した。クローン３７によって認識されたペプチドはまた他のＭＡＧＥタンパク質によってもコードされている。配列番号：２８はＭＡＧＥ−Ａ１２に存在し、配列番号：１１および４１はＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ６にも存在する。したがって、２つのＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピトープは他のＭＡＧＥ産物での臨床試験に有用である。
【０１３３】
相同性ペプチド配列が、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｃ１を含む他の癌抗原で発見されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンがこれらのさらなる癌関連抗原を認識するかどうかを決定するために、組換え体タンパク質またはこれらのタンパク質の相同性領域に相関している合成ペプチドを、上述したアッセイに従ってクローン２、２２または３７による認識について試験するために抗原提示細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞など）をロードするのに使用する。クローン２、２２または３７によって認識される相同性ペプチドは本明細書で記述したＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの機能的な変異体として見なすことができる。
【０１３４】
例１０：ＨＬＡ−ＤＰ分子によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの同定
I．細胞株、サイトカイン
上述した物と同様
II．組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生
Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生
組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を上述のように産生した。大腸菌内（バッチ９７Ａ２１／１ａ）で産生した組換え体タンパク質を本明細書では以後、タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）とした。
【０１３５】
Ｂ．Ｓｆ９昆虫細胞でのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生
他の組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をバキュロウイルス発現系（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてスポドプテラ  フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）内で、我々の研究所で作製した。ＭＡＧＥ−Ａ３のコード配列をバキュロウイルス導入ベクター（ｐＡｃＧＰ６７−Ａ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の、バキュロウイルスの一種であるオートグラファ  カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核酸多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のｇｐ６７表面タンパク質のシグナル配列の下流内にクローン化した。精製をより簡単にするために、ヒスチジン末端をコードしている配列をＭＡＧＥ−Ａ３配列のＣ−末端に加えた。この構造はＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の昆虫細胞による分泌を可能にし、本明細書以下でＭＡＧＥ−Ａ３（昆虫）とした。組換え体プラスミドのＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞内への致死遺伝子的に変異したＡｃＮＰＶのＤＮＡと共トランスフェクトした。共トランスフェクションにより、プラスミドおよびウイルスの相同性領域間の組換えが可能になり、ベクターからの外来遺伝子をＡｃＮＰＶ  ＤＮＡへ送達する。Ｓｆ９昆虫細胞培養液の上清に含まれるタンパク質の精製には濾過、陽イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー、ＮｉＣｌ２で飽和したＨｉｇｈＴｒａｐキレーティングカラム上のクロマトグラフィー、固定化抗ＭＡＧＥ−モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ５７ｂ、ギウリオ  シパグノリー（Ｇｉｕｌｉｏ  Ｓｐａｇｎｏｌｉ）博士、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ，Ｋａｎｔｏｎｓｓｐｉｔａｌ．ＣＨ−４０３１  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄよりいただいた）でのアフィニティクロマトグラフィー、濃縮および透析が含まれる。
【０１３６】
III．レトロウイルスの構築
組換え体レトロウイルス、ｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）−ｔＮＧＦＲを構築した。神経増殖因子に対する低アフィニティーレセプターの細胞外および膜貫通領域をコードしているｔＮＧＦＲ遺伝子断片を、親切にもＣ．トラバーサリー（Ｃ．Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）博士より提供されたプラスミドｐＵＣ１９−ｔＮＧＦＲより増幅した。ＰＣＲを以下のプライマーを使用して行った。センス：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧ−３’（配列番号：８８）、アンチセンス：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：８９）。
このＰＣＲにより開始コドン部位にＢｓｐＨ１部位および終止コドンの下流にＢｇｌ２部位が導入される。３’末端付近のＢａｍＨ１部位は削除された。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、配列決定した。ｔＮＧＦＲ遺伝子断片をＢｓｐＨ１−Ｎｏｔ１（ｐＣＲ２．１ポリリンカーより）断片としてこのベクターより単離された。
【０１３７】
脳心筋炎ウイルス由来のIＲＥＳ配列をｐＧＥＭ−ＥＭＣ２（Ｊ．−Ｃ．レナルド（Ｊ．−Ｃ．Ｒｅｎａｕｌｄ）博士、Ｃａｔｈｏｌｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｖａｉｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍより親切にもいただいた）よりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へ送達した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−IＲＥＳからのＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１断片をさらなる構築に使用した。
両方のＤＮＡ断片を一緒にｐＣＲ２．１  ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１内へライゲーションした。この３つの断片ライゲーションにより、結果としてｐＣＲ２．１−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲと命名したプラスミドができる。
IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲ配列を含むｐＣＲ２．１−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲからのＢａｍＨ１−Ｂｇｌ２断片をＢａｍＨ１によって開裂したｐＭＦＧ−Iｉ８０（ｐＭＦＧ−Iｉ８０は例６で記述したｐＭＦＧ−Iｉの別名である）内にライゲーションした。このことにより、Iｉ８０遺伝子断片の３’末端部に特徴的なＢａｍＨ１部位を持つｐＭＦＧ−Iｉ８０−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲができる。
Iｉ８０の３’境界にあるＢａｍＨ１部位とインフレームで、５’Ｂｇｌ２部位を持つ全長ＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡを含むＢｇｌ２−Ｂｇｌ２断片をｐＣＲ２．１  ＭＡＧＥ−Ａ３（Ｂｇｌ２）より単離し、ＢａｍＨ１で開裂したｐＭＦＧ−Iｉ８０−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲ内へ挿入した。得られたプラスミドｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−３−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲはIｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質と膜挿入ｔＮＧＦＲ両方の刺激性発現を可能にする。
高タイターＭＡＧＥ３コード組換え体レトロウイルスストックを、上述のようにトランスフェクションによってプラスミドｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲをＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細胞内へ導入することで作製した。レトロウイルスストックを回収し、上述したような導入に使用した。
【０１３８】
IV．ヒト血液の処理
血液を、若干の改良をして上述のように処理した。自己血清の調製のためにＬｙｍｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈｒａｍ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上での遠心の後、上清の上部分（血清希釈１／３）を回収し、５００ｇにて１０分間遠心し血小板を取り除いた。この上清を５６℃にて３０分間インキュベートし、−２０℃にて保存した。
【０１３９】
V．混合リンパ球／樹状細胞培養
樹状細胞（５００マイクロリットルあたり５×１０５）を３７℃、５％ＣＯ２にて、１０マイクログラムのＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（昆虫）の存在下で、０．２４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ  Ｌ−アルギニン、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭI１６４０培地内で１８−２０時間インキュベートした。細胞を洗浄し、IＬ−６（１，０００Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、丸底マイクロウェルあたり１０４個、ＡＡＧ（本明細書で以下、完全IＭＤＭ培地と表記する）および１％  自己血清を含むIＭＤＭ培地２００マイクロリットル中の１０５個の自己ＣＤ４＋  リンパ球へ加えた（図１６）。ＣＤ４＋リンパ球をタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（昆虫）をあらたにロードした自己樹状細胞で第７日、１４日、２１日および３０日で再刺激し（上記を参照のこと）、１０％ヒト血清、IＬ−１２（１０Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含む完全イスコル培地内で増殖させた。増殖しているＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでいるマイクロ培養液を、タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激した場合のそのIＦＮ−γ産生の能力について３６日目に査定した。他のタンパク質を使用することの理由は、樹状刺激細胞をロードするのに使用したタンパク質のバッチ内に含まれた交雑物に対して反応するＣＤ４＋Ｔ細胞を考慮に入れることをさけるためである。タンパク質パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を洗浄し、１０％ヒト血清およびIＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む完全IＭＤＭ培地１００μｌ中で〜４，０００のＣＤ４＋  Ｔリンパ球と一緒に、丸底マイクロウェルあたり〜１０，０００細胞に希釈した。２０時間後、上清を回収し、そのIＦＮ−γ含量を、Ｍｅｄｇｅｎｉｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの試薬を使用したＥＬIＳＡによって測定した。タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）での刺激後、高レベルのIＦＮ−γを産生したマイクロ培養Ｃ３を限界希釈法にてクローン化した（図１７）。
【０１４０】
VI．ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンはＭＡＧＥ−Ａ３抗原に反応する
タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）（２０マイクログラム／ｍｌ）をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を最初の２回の刺激に関して刺激細胞として使用した（マイクロウェルあたり６×１０３から１０×１０３細胞）。精製ＰＨＡ（０．２μｇ／ｍｌ、ＨＡ  １６、ＭＵＲＥＡＸ  ＤIＡＧＮＯＳＴIＣＳ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を次の刺激に使用した。同種ＬＧ２−ＥＢＶ−Ｂ細胞（マイクロウェルあたり５×１０３から１０×１０４細胞）を添加細胞として加えた。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を週に１回再刺激し、１０％ヒト血清、IＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍｌ精製ＰＨＡ（ＨＡ  １６、ＭＵＲＥＸ  ＤIＡＧＮＯＳＴIＣＳ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＵＫ）またはタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）をロードしたＥＢＶ−Ｂ細胞を含む完全IＭＤＭ培地内で増殖させた。時折、IＬ−４（５Ｕ／ｍｌ）、１−メチル−ＤＬ−トリプトファン（１００μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＭＲＡ（マイコプラズマ除去剤、５００ｎｇ／ｍｌ、IＣＮ）もまた加えた。
【０１４１】
ヘモクロマトーシス対象ＬＢ１９８１からのＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＢ−１９８１−ＥＢＶ）を２０μｇ／ｍｌのオバルブミン（ＯＶＡ）またはＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（バクテリア）と共に２０時間インキュベートした。１００００細胞を、マイクロ培養液Ｃ３（〜４，０００効果細胞のアリコートを加えたマイクロウェル中に分配した。いくつかのクローンをマイクロ培養液Ｃ３より、とりわけＣＤ４＋クローンＬＢ１９８１−ＣＤ４  ５２７／Ｃ３．２２（本明細書で以下、クローンＣ３．２２と記す）およびＬＢ１９８１−ＣＤ４  ５２７／Ｃ３．４３（本明細書で以下、クローンＣ３．４３と記す）を得た。クローンＣ３．２２およびＣ３．４３（〜３，０００細胞）を２０μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ３とともにインキュベートしたＬＢ−１９８１−ＥＢＶ（〜１６，０００細胞）、または融合タンパク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３についてコードしているレトロウイルスを導入したＬＢ−１９８１−ＥＢＶ（〜２０，０００細胞）で刺激した。上清中でのIＦＮ−γ産生をＥＬIＳＡによって一晩培養後に見積もった。これらは両方ともタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）をロードした、または短くした不変鎖（Iｉ）−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質をコードしているレトロウイルスを導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を認識した（図１７）。これらの（もっとも可能性のある２つの）クローンは外因性にIｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している細胞を認識し、したがって、これらはＭＡＧＥ−Ａ３由来の抗原に対して反応し、タンパク質のバッチ内の夾雑物には反応しない。
【０１４２】
VII．ＣＤ４クローンＣ３．２２はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１上のＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８６）を認識する
抗原性ペプチドを、ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度にて試験したことと、試験を１００μｌ中で行ったことを除いて、上述のように同定した。ペプチドＬＧＤＰＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮ（配列番号：８２）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８３）、ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰ（配列番号：８４）およびＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰＧＳＤＰ（配列番号：８５）を試験した。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を１時間、１μｇ／ｍｌのそれぞれのペプチドと共にインキュベートした。ついでクローンＣ３．４３（３，０００細胞）を２０時間、２０，０００ペプチドパルス細胞と共に共培養した。上清中のIＦＮ−γ産生をＥＬIＳＡによって測定した。２つのペプチド、すなわちＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４３−２５８；配列番号：８３）およびＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰ（アミノ酸２４７−２６２；配列番号：８４）がＣ３．４３と陽性を示した（図１８Ａ）。その配列が２つの陽性１６アミノ酸ペプチドに含まれるような１２アミノ酸ペプチドの他の組を試験した。クローンＣ３．２２（４，０００細胞）を２０時間１０，０００ペプチドパルス細胞と共培養した。ペプチドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４７−２５８；配列番号：８６）はクローンＣ３．２２によって認識された。明らかな認識がおよそ１０ｍＭではやくも得られた（図１８Ｂ）。
【０１４３】
ペプチドＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４３−２５８；配列番号８３）をロードした細胞のクローンＣ３．２２による認識は、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体によって消滅した。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００細胞）を１時間１μｇ／ｍｌのペプチドＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８３）と共にインキュベートし、洗浄した。次いでこのペプチドパルス細胞を、モノクローナル抗体２Ｂ６（抗ＨＬＡ−ＤＲ；１／２０）、Ｂ７．２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ；１／１００）またはＳＰＶＬ３（抗ＨＬＡ−ＤＱ；１／１００）（Ａ．ムルダー（Ａ．Ｍｕｌｄｅｒ）博士，Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ，Ｌｅｉｄｅｎより提供された）の連続的な存在下（または非存在下）でクローンＣ３．２２（３，０００細胞）と共に２４時間、８％ＣＯ２下３７℃にてインキュベートした。上清中のIＦＮ−γ産生をＥＬIＳＡによって測定した。モノクローナル抗体Ｂ７．２１はこの認識を消滅させ、一方この認識はモノクローナル抗体２Ｂ６、またはＳＰＶＬ３の存在下で変化はなく（図１９）、提示分子がＨＬＡ−ＤＰ分子であったことを指し示している。
【０１４４】
対象ＬＢ１９８１はＤＰＢ１＊０４０１に分類された。ＤＰＢ１＊０４０１が提示ＨＬＡ−ＤＰ分子であったことを確かめるために、さらなるＥＢＶ−Ｂ細胞株を試験した。自己ＬＢ１９８１−ＥＢＶまたは同種−ＥＢＶ−Ｂ細胞を１時間、１μｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベートし、洗浄した。次いでＣＤ４クローン（３，０００細胞）を２０，０００ペプチドパルスＥＢＶ−Ｂ細胞と共に２０時間インキュベートした。上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡによって測定した。ＤＰＢ１＊０４０１を発現しているこれらのＥＢＶ−Ｂ細胞株はクローンＣ３．２２に対してＭＡＧＥ−Ａ３２４３−２５８を提示できた（表VII）。ＤＰＮ１＊０４０１はおよそ６４％のカフカス人で発現している。
【０１４５】
【表８】
0004102027.tif 000020
【０１４６】
VIII．腫瘍細胞株の直接認識
以上で、ＭＡＧＥタンパク質の細胞質または核局在にしたがって、ＨＬＡ−ＤＲ１３上で認識されたＭＡＧＥ−Ａ３抗原は腫瘍細胞の表面で発現され得ないと結論づけられた。もしこれがＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３抗原の場合でもあったかどうかを決定するために、IＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で４８時間前処理したまたはしない、ＭＡＧＥ−Ａ３（刺激細胞；２０，０００）を発現しているＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１腫瘍細胞を３，０００のクローンＣ３．２２またはＣ．３．４３のＴ細胞と共に２０時間共培養した。上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡによって測定した。図２０に示すように、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３エピトープはＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているいくつかのＤＰＢ１＊０４０４腫瘍細胞株の表面にて認識される（図２０）。
【０１４７】
クローンＣ３．２２をまたその溶解活性について試験した。標的細胞を１時間５１Ｃｒ−標識し、さまざまな効果器対標的比でＣＤ４クローンＣ３．２２と共にインキュベートした。クロミウム放出を４時間後測定した。ＭＥＬはメラノーマを意味する。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞にまた融合タンパク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３をコードしているレトロウイルスを導入した。クローンＣ３．２２は融合タンパク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３をコードしているレトロウイルスを導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞およびＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているＨＬＡ−ＤＰ４メラノーマ細胞株（ＬＢ１６２２−ＭＥＬ）両方を溶解した（図２１）。
本発明の他の観点は当業者に対して明らかになるであろうので、ここで繰り返す必要ない。本明細書で引用したそれぞれの参考文献はそのすべてを参考文献として組み入れる。
使用した語句および表現は記述の語句として使用し、限定の語と使用したのではなく、示され、記述された特徴の同等物またはその部分を除外したこのような語および表現の使用を意図するものではなく、さまざまな改変が本発明の範囲内で可能であることが認識されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＭＡＧＥ−Ａ３に特異的なＣＤ４Ｔ細胞系を取得するために用いられたプロトコールの概略説明図である。
【図２】  ＣＤ４Ｔ細胞系Ｂ６およびＦ３が、プロセスされた組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を有する自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞を認識したことを示しているグラフである。
【図３】  ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンによる、外来性のＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を用いてパルスされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞の認識が、抗ＨＬＡ ＤＲモノクローナル抗体により阻害されることを示しているグラフである。
【図４】  ＣＤ４＋クローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）、４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）、Ｆ３／３７、およびＦ３／４０による認識についての、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドのスクリーニングを詳しく述べているグラフ。
【図５】  ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１１〜１２６、配列番号：３）または、ＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０、配列番号：４）を用いてパルスされたＣＤ４＋クローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）、４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）ＥＢＶ−Ｂ細胞によるＴＮＦおよびIＦＮ−γ産生の刺激を描いているグラフである。
【図６】  ＭＡＧＥ−Ａ３１１１〜１２６またはＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０を用いてパルスされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞が、クローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）、４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）の増殖を誘導したことを示すグラフである。
【図７】  ＣＤ４＋クローン４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）のペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０に対する応答がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に制限されることを証明するグラフである。
【図８】  ＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０に由来する切断されたペプチドを用いてパルスされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞に対する、クローン４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７の反応性を示すグラフである。
【図９Ａ】  樹状細胞によりプロセスされた外来性のＭＡＧＥ−Ａ３の、クローン３７に対する提示を描いている。
【図９Ｂ】  樹状細胞によりプロセスされた外来性のＭＡＧＥ−Ａ３の、クローン３７に対する提示を描いている。
【図１０】  ＣＤ４ Ｔ細胞クローン４３６／Ｂ６．３７による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの認識を示す（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３）。
【図１１】  ＣＴＬクローン４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１２】  ＣＴＬ４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの溶解を示す。
【図１３Ａ】  ＣＤ４ Ｔ細胞クローン４３６／Ｂ６．３７（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３）による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１３Ｂ】  ＣＴＬクローン４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１４】  不変鎖（Iｉ）とＬＡＭＰ−１ ＭＡＧＥ−Ａ３の融合タンパク質のレトロウイルス性構築物の概略図である。
【図１５Ａ】  クローン２および２２がＨＬＡ−ＤＲとの関連においてＭＡＧＥ−Ａ３由来のペプチドを認識したことを示す。
【図１５Ｂ】  クローン２および２２がＨＬＡ−ＤＲとの関連においてＭＡＧＥ−Ａ３由来のペプチドを認識したことを示す。
【図１６】  ＭＡＧＥ−Ａ３（昆虫）およびＭＡＧＥ−Ａ３（細菌）タンパク質を用いて抗ＭＡＧＥ−Ａ３ＣＤ４＋細胞クローンを取得するために用いられた方法の大要を示す。
【図１７】  タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３と共にインキュベートされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるIＦＮ−γの産生を描いている。
【図１８Ａ】  ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＣＤ４クローン４３および２２によって認識されたことを証明している。（Ａ）二つの重複するＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドによるクローンＣ３．４３の刺激。
【図１８Ｂ】  ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＣＤ４クローン４３および２２によって認識されたことを証明している。（Ｂ）クローンＣ３．２２（ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ；配列番号：８６）により認識される最も短いペプチドの滴定。
【図１９】  ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＨＬＡ−ＤＰ分子によりクローンＣ３．２２へ提示されることを示す。
【図２０】  ＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１腫瘍細胞が、ＣＤ４クローンＣ３．２２およびＣ３．４３により認識されることを証明する。
【図２１】  ＣＤ４クローンＣ３．２２の溶解活性を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0004102027.tif 000049
【図１０】
0004102027.tif 000050
【図１１】
0004102027.tif 000051
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
0004102027.tif 000054
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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