(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１において１番目のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンと、セレンテラジンまたはセレンテラジンのアナログから構成される、変異型イクオリン１モルに対し、リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬５モル以下を、ｐＨ７.０〜７.５かつ０〜５℃において反応させ、１分子のイクオリンに２〜３分子のリガンドが、アミノ末端のアミノ基、配列番号１の２番目、１７番目、５６番目、５９番目、８７番目のリジン残基のイプシロン位のアミノ基に結合した変異型イクオリンを採取することよりなる標識物質の製造方法。
【請求項２】
リガンドがビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、抗原、レセプター、酵素、基質、核酸、多糖類である請求項１記載の標識物質の製造方法。
【請求項３】
配列番号１において１番目のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンを構成成分とする変異型イクオリン１モルに対し、リガンドとしてのビオチンを結合させたアミノ基修飾試薬としてスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートを３〜４モル反応させる請求項１記載の標識物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イムノアッセイ等の標識物質として有用な、カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリンまたは変異体イクオリン分子にリガンドを導入した新規な標識物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリン（aequorin）は、蛋白質部分であるアポイクオリン（アポ蛋白質、apoaequorin）と発光基質に相当するセレンテラジン（coelenterazine）と分子状酸素（Ｏ2）が複合体を形成した状態で存在している。イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（極大波長４６５nm）の瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド（coelenteramide）、二酸化炭素を生成する。発光反応後、アポイクオリンは、ＥＤＴＡ等のキレート剤によりＣａ2+を除去し、還元剤で処理した後、セレンテラジンおよび酸素の存在下に低温においてインキュベーションすることによってイクオリンに再生することができる。これを模式的に図１で示す。
【０００３】
また、イクオリンは、アポ蛋白質部分（アポイクオリン）をコードする遺伝子の解析により、１８９個のアミノ酸からなる単純蛋白質であり、カルシウム結合蛋白質のカルモジュリンと相同性があり、カルシウム結合のためヘリックス−ループ−へリックス構造であるＥＦハンドモチーフが３カ所あることが報告されている（Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 3154-3158）。また、Ｘ線結晶解析により、Ｃ末端付近の１８４番目のチロシン残基がセレンテラジンのペルオキシドの安定化に関与していることが示唆されている（Head et al., Nature (2000) 405: 372-376）。
【０００４】
イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた市販の検出装置においての検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。このため、イクオリンは、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムの動的変化のイメ−ジプローブとして用いられている。イクオリンの発光がカルシウムイオンとの特異的結合による発光であるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にＳ／Ｎ比（signal/noise ratio）のよいシグナルを得ることができるという利点を有する。
【０００５】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、全て生体由来の成分で構成されているため、有害な化学物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は研究用試薬、診断薬等のマーカーまたはレポーターへの応用が期待されている。
【０００６】
本発明者等は、イクオリン遺伝子の単離（特開昭６１−１３５５８６号公報）、生産（特開昭６２−１７１６９５号公報）、変異型イクオリン遺伝子の生産（特開昭６３−２９１５９３号公報、特開昭６３−２９１５８６号公報）、アポイクオリン、セレンテラジンと酸素より、発光活生を持つイクオリンへの変換（特開昭６４−０４７３７９号公報）、組換えイクオリンの発現系および精製法の改良（特開平１−１３２３９７号公報）等を行ってきた。この結果、安価なイクオリンの安定供給が可能となり、市販されるに至っている。さらに、ラジオアイソトープに代わる非放射性の発光量の標準物質として高純度組換えイクオリンを使用した（特開平２００１−２７０８９９）。
【０００７】
イクオリンをマーカーとして利用するには、検出すべき物質とマーカーを関連付けることが必要となる。つまり、イクオリンをマーカーとして用いる場合には、イクオリンを検出すべき物質に直接的に結合させるか、または、何らかの物質を介して間接的に検出すべき物質に結合させる必要がある。本明細書においては、検出すべき物質とイクオリン（マーカー）を関連付ける物質であって、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質を「リガンド」と称する。リガンドとしては、後で詳細に説明するように、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体等があげられる。
【０００８】
イクオリンをリガンドと結合させる際に、イクオリンは比較的不安定であるため、その発光活性が失活する可能性がある。また、より正確な分析・診断結果を得るためには、リガンドとイクオリンが特定の割合で結合しており、反応性にばらつきの無い、品質の一定な製品が要求される。品質が一定であることによって、時期や場所が同じでない測定結果を比較することが容易となる。
【０００９】
イムノアッセイ等の一般的な診断・検出系において、汎用される方法の一つがビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）法である。現在までにビオチン化されたイクオリンについて、Zatta等（Zatta et al., Anal. Biochem. (1991) 194:185-191）およびStults等（Stults et al., Biochemistry (1992) 31:1433-1442）の報告がある。Zatta等は、アポイクオリンをビオチン化してから、セレンテラジンと共に再生し発光活性のあるイクオリンとしている。しかし、アポイクオリンをビオチン化してからイクオリンに再生する場合には、ビオチン化アポイクオリンからのビオチン化イクオリンへの再生効率は３０％程度である。また、アポイクオリンのどの部位がビオチン化されるかは不明である。Stultsは、アポイクオリンもしくはイクオリンをビオチン化したと記載しているが、イクオリンのビオチン化の条件等は一切明らかにしていない。Stultsのアポイクオリンのビオチン化の反応条件は、Ｎ−スクシンイミドエステルの反応性が最も良いと言われるpH８.６の弱アルカリ、モル比５−６０倍、室温で３０分で終了している。この条件では、１８９個のアミノ酸より構成されるアポイクオリンの不特定なアミノ基（−ＮＨ2）がビオチン化される。これらの条件で、修飾される可能性のあるアミノ酸残基は、アミノ末端のアミノ基１箇所と１５箇所のリジン残基であるが、どのアミノ酸残基部位にビオチン化されるか決定されておらず、また特定の部位のアミノ基の特異的修飾法もまた確立されていない。すなわち、均一な品質のビオチン化イクオリンの製造およびその提供は未だ達成されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アミノ末端のアミノ基および１５個のリジン残基のアミノ基のうち、特定のアミノ基にのみリガンドが結合し、且つ発光活性がリガンドとの結合により損なわれないことを特徴とするイクオリンからなる標識物質、および当該標識物質を安定的に且つ高効率で製造する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１に記載のアポイクオリン、配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型アポイクオリンの、アミノ末端のアミノ基、配列番号１の２番目、１７番目、５６番目、５９番目、８７番目のリジン残基のイプシロン位のアミノ基のいずれかのみにリガンドが結合しているアポイクオリンまたは変異型アポイクオリンを構成成分とするイクオリンまたは変異型イクオリンよりなる標識物質である。
【００１２】
天然型アポイクオリンのアミノ酸配列は、本発明者等が解明し、特開昭６１−１３５５８６号公報、Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 3154-3158およびCharbonneau et al., Biochemistry (1985), 24: 6762-6771に記載されている。その天然型アポイクオリンは１８９個のアミノ酸を有し、そのアミノ酸配列は配列表１に示されている。
【００１３】
本発明者等は、そのアポイクオリンを大腸菌により高効率で発現させるベクターpiP-HEを用いて生産した（特開平１−１３２３９７号公報およびInouye et al., J. Biochem.(1989) 105: 473-477）。その際発現ベクターの制限酵素由来のＮ−末のリンカー部分がVal-からAla-Asn-Ser-に置き換わり、１９１個のアミノ酸を有する組換えアポイクオリンが生産されることが判明している（Inouye et al., Protein Expression and Purification (1991) 2: 122-126）。この組換えアポイクオリンは、カルシウム結合活性、発光活性において配列表１の天然型アポイクオリンと同等である。
【００１４】
天然のアポイクオリンには、配列表１に示されるものの外、数種の変異体が存在する（特許2655981、2894687、Biochemistry (1987)26: 1326-1332）。また、アポイクオリンの分子内に存在する３個のシステインを人為的にセリンに変換したアポイクオリン（特開昭63-291593、特開昭63-291586）のほか、いくつかの変異体が知られている（Tsuji et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986)83:8107-8111, Kurose at al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989)86:80-84, Ohmiya et al. FEBS Lett. (1992)301:197-201, Ohmiya et al. FEBS Lett.(1993)320:267-270, Lewis et al. Bioconjugate Chem. (2000)11,65-70, Lewis et al. Bioconjugate Chem. (2000)11,140-145）。
【００１５】
本発明では、配列表１に記載のアミノ酸配列を有するもののほか、これらの公知のまたは未知の変異体を使用することができる。したがって、本発明で使用されるアポイクオリンは、配列表１記載のアミノ酸配列を有するアポイクオリンおよび配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型アポイクオリンである。特に好ましい変異型アポイクオリンの例として、配列番号１において１番目のValがAla-Asn-Serで置換されたものが挙げられる。
【００１６】
本発明に言う、リガンドとは 、検出すべき物質に直接的に結合する物質、または、検出すべき物質に間接的に結合する物質である。例えば、イムノアッセイで抗原部位や抗原量を検出する場合、１次抗体をイクオリンと結合させておけば、イクオリンが結合した１次抗体は、検出すべき抗原に結合するので、イクオリンの発光を測定することにより抗原の部位や量が検出できる。この場合は１次抗原がリガンドとなる。
【００１７】
感度を高めるために、２次抗体を使う方法も周知である。１次抗体に対し、ビオチンを結合させた２次抗体を用い、イクオリンを結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる方法である。この際は、アビジンおよびストレプトアビジンがリガンドとなる。この場合に、１分子のアビジンおよびストレプトアビジンが、４分子のビオチンと結合する性質を利用することが出来る。すなわち、イクオリンをビオチンと結合させ次いでそのビオチンを介してアビジンまたはストレプトアビジンに結合させるものである。この場合は、ビオチンがリガンドとなる。
【００１８】
リセプターを検出する場合においては、リセプターに結合するシグナルペプチド（インシュリンのようなホルモン、サイトカイン、ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド等）がリガンドとなる。シグナルペプチドを検出する場合には受容体を構成するタンパクがリガンドとなる。薬物の受容体を検出する場合には薬物がリガンドとなり、薬物を検出する場合は薬物受容体がリガンドとなる。
【００１９】
酵素を検出する場合にはその基質がリガンドとなり、酵素の基質を検出する場合には酵素がリガンドとなる。核酸に対して特異的に結合する他の核酸を検出する場合には、相補的な核酸がリガンドとなる。多糖類に対して特異的に結合する他の物質を検出する場合には、多糖類がリガンドとなる。血液凝固因子と特異的に結合しうるレクチンや転写因子等のＤＮＡ結合性蛋白質等もリガンドとなり得る。
【００２０】
したがって、本発明に言うリガンドは、検出対象に直接的または間接的に結合可能な物質と定義することもでき、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、基質、抗体、抗原、核酸、多糖類、レセプター、またはこれらに結合能を有する化合物である。好ましくは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、核酸等である。この場合、本発明の標識物質が特異的リガンドから発生するシグナルの増感物質として作用するため、より好感度の特異的リガンド結合−標識物質が得られる。
【００２１】
イクオリンまたは変異体イクオリンを構成する発光基質としては、セレンテラジンが用いられるが、セレンテラジンのアナログも同様に用いることができる（Methods in Enzymology (2000) 326: 165-174）。セレンテラジンのアナログを用いることにより、発光活性を有する半合成イクオリンを製造することが可能である。半合成イクオリンは、天然イクオリンに比べて、カルシウムに対するレスポンスの異なるもの、Ｓ／Ｎ比が改善された性質をもつものが報告されており（Shimomura et al., Biochem. J. (1993)296:549-551）、本発明でも同様の効果が期待できる。
【００２２】
本発明のイクオリンまたは変異型イクオリンにおいては、アポイクオリンまたは変異型アポイクオリンの、アミノ末端のアミノ基、配列番号１の２番目、１７番目、５６番目、５９番目、８７番目のリジン残基のイプシロン位のアミノ基のいずれかのみリガンドが結合している。その割合は、１分子のイクオリンまたは変異型イクオリンに対し、少なくとも１分子以上のリガンド、好ましくは２〜３分子のリガンドが結合している。ただし、ここでいう反応割合はイクオリン１分子に結合するリガンド分子の平均値であり、リガンドと結合していない少量のイクオリンの存在を妨げるものではない。このようにアポイクオリンの特定位置にリガンドが結合しており、その他の位置には結合しないことによって、安定した測定結果を得ることができる。
【００２３】
さらに本発明は、イクオリンまたは変異型イクオリンと、リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬を反応させることを特長とする標識物質の製造方法に関する。リガンドを結合させたイクオリンまたは変異体イクオリンを製造するには、アポイクオリンにリガンドを結合させた後で、セレンテラジン、酸素とインキュベーションすることによりイクオリンを再生させることも出来るが、既に複合体となっているイクオリンにリガンドを直接結合させることによって、生産の効率を良くし、適切な製品の品質管理ができる。
【００２４】
適当な反応割合は、イクオリンまたは変異型イクオリン１モルに対し、リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬５モル以下である。アミノ基修飾試薬の量は導入すべきリガンドの量によって調節することができるが、好ましくは３〜４モルである。
【００２５】
イクオリンのリジン残基への特異的修飾は、リジン残基のイプシロン位のアミノ基が解離しにくい中性付近のｐＨ条件で反応を行うことにより、特定のリジン残基を修飾することができる。反応時のｐＨはｐＨ７.０〜７.５とすることが望ましい。反応温度は、選択性をますため低温例えば０〜５℃、特に好ましくは約４℃とすることが好ましい。反応温度が高いと反応部位の選択性が低くなり、かつイクオリンの発光活性が低下する。
【００２６】
リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬を反応させるに際しては、イクリン分子内で−Ｓ−Ｓ−を形成するのを防ぐためメルカプトエタノール、ジチオスレイトールのような還元剤を抗酸化作用を目的として、その存在下で行うこともできる。
【００２７】
特異的リガンドとの結合手段は、リガンドの物理化学的特性等により異なるが、イクオリンの分子サイズおよびリガンドとの立体障害を考慮して、直接的にまたはリンカーもしくはスペーサーを介して結合させる。そのためには、リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬を、イクオリンのアミノ基と反応させる。
【００２８】
リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬として、市販されているNHS-LC-Biotinを用いた場合について、ビオチン化の原理を図２に模式的に示した。図中における、６−アミノヘキサン酸の部分がスペーサーに相当する。
【００２９】
本発明において、使用されるリガンドを結合させたアミノ基修飾試薬は、NHS-LC-Biotinやビオチン４−ニトロフェニルエステルのようにそれ自体が市販されているものもあるが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、４−ニトロフェノール等にリガンドもしくはリガンドとスペーサーを結合させて作ることができる。リガンドを結合させたアミノ基修飾試薬として特に好ましいのは、スクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（NHS-LC-Biotin）である。
【００３０】
本発明において用いるリンカーもしくはスペーサーは、アミノ基と特異的に反応しうるものであれば特に限定されないが、２０オングストローム以上の長さを有するものが好ましい。リンカーもしくはスペーサーとして使用しうる種々のアミノ基修飾試薬は市販されており、これらを適宜利用することができる。
【００３１】
別の態様において、本発明は、上記において説明した標識物質を用いる分析方法および分析用キットに関する。測定／検出対象は、リガンドと特異的に結合する物質、もしくは、リガンドと結合する物質が特異的に結合する物質である。後者の測定対象の例は、リガンドと結合する物質が２次抗体である場合の、１次抗体が認識する抗原である。測定対象にリガンドを介して結合したイクオリンの発光特性から診断等の分野において迅速且つ正確な診断・検出系を確立することができる。
【００３２】
本発明を完成するに当たって、修飾されたリジン残基の部位を迅速に決定する方法を確立した。具体的には、リジン特異的ペプチダーゼ消化と質量分析法を組み合わせた、ペプチドマッピング−質量分析法である。ペプチドマッピング−質量分析法の原理（図３）を模式的に示した。まず、反応物のリジン残基のＣ末端を特異的に切断するリジン特異的ペプチダーゼ消化を行う。この時、リジン残基のイプシロン位のアミノ基が修飾を受けている場合は、修飾リジン残基はリジン特異的ペプチダーゼで切断されない。消化処理した試料は、精製する事なく、Voyager DE Pro mass spectrometer（PerSeptive Biosystem社）を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（Matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry／MALDI-TOF-MS）にて、質量分析を行う。同一消化条件で、未ビオチン化サンプルも処理を行い、コントロールとして用いる。すなわち、質量分析の結果、ビオチン化する事によって分子量（３４０.４６）が増加し、且つ切断されないため新規に生じたペプチドフラグメントを未処理サンプルのピークと比較して確認し、予測されるペプチドフラグメントの質量値と比較することにより、容易にビオチン化されたリジン残基を特定できる。
またこの分析法は、グルタミン酸のＣ−末端を特異的に切断する市販の消化酵素を用いて、同様に行うことができる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
組換えイクオリンを例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１  組換えイクオリンの調製法。
組換えイクオリンは、以下に示すように、特開平１−１３２３９７号公報に記載される大腸菌にて組換えアポイクオリン遺伝子を発現させ、セレンテラジンと結合させて組換えイクオリンへと再生した後、特開２００１−２７０８９９号公報に記載されるように精製して取得した。得られる組換えアポイクオリンのＮ−末端は、Ala-Asn-Ser-より始まる１９１個のアミノ酸より構成されている（配列表１のＮ−末端のVal-がAla-Asn-Ser-で置換されたもの）。
【００３５】
１）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現
大腸菌において組換えアポイクオリンを発現させるために、アポイクオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換した。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピシリン（５０μg／ml）を含有する５０mlのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２リットルに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現した組換えアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００３６】
２）菌体からの組換えイクオリンの精製
集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上澄み液を集めた。得られた上澄み液にセレンテラジン（和光純薬社製）を産生された組換えアポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０nmでの吸光度が０.０５以下になるまで２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着した組換えアポイクオリンと組換えイクオリン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出させた。
【００３７】
組換えイクオリンと組換えアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調整した。次いで、不溶性画分を遠心分離によって除去し、その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の組換えイクオリン画分を収集した。
一方、組換えアポイクオリンは、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６でのみ溶出された。
【００３８】
組換えイクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からの組換えイクオリンの回収率は約８０％で、８０mgの高純度組換えイクオリンを得た。
【００３９】
３）培養液からの組換えイクオリンの精製
培養液からの高純度組換えアポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤（ＤＴＴ：ジチオスレイトール）を含む上述の緩衝液に溶解させ、１.２倍モル濃度になるように少量のメタノールに溶かし込んだセレンテラジンを加え、イクオリンの再生を開始する。５時間以上、４℃で放置することにより、９０％以上イクオリンに再生する。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にＱ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製組換えイクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。高純度組換えイクオリン４５mgを得た。
【００４０】
実施例２  精製組換えイクオリン溶液から硫酸アンモニウムの除去法
Ｎ−スクシンイミドエステル試薬は、アミノ基と特異的に反応するため、精製組換えイクオリン溶液からのアミノ化合物である硫酸アンモニウムの除去が必須である。精製組換えイクオリン７mgを含む０.５mlを、分子量分画１００００の膜を持つセントリコン１０（アミコン社製）に加え、０.１mM EDTAを含む６６mMリン酸緩衝液（pH７.２）１.５mlを加え、液高速遠心機（日立社製：CR２０B２型）にて４０００×ｇ、６０分間以上遠心を行い、２００μLまで濃縮する。さらに０.１mM EDTAを含む６６mMリン酸緩衝液（pH７.２）１.５mlを加え、再度２００μＬまで濃縮する。この操作を最低３回以上くり返し、硫酸アンモニウムの存在の影響がないまでに除去した組換えイクオリン溶液を得た。
【００４１】
実施例３  Ｎ−スクシイミドビオチンエステルによる組換えイクオリンの特異的ビオチン化
組換えイクオリンのリジン残基を考慮したモル数の５分の１以下のＮ−スクシイミドビオチンエステルを０.１mM EDTAを含む６６mMリン酸緩衝液中において、反応温度０〜４℃にて２時間以上インキュベートすることにより、リジン残基を特異的にビオチン化した。
具体的には次のように実施した。１.５mlのポリプロピレン製チューブに、４５０μlの０.１mM EDTAを含む６６mMリン酸緩衝液（pH７.２）に、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）溶液に溶解した１０mM のＮ−スクシンイミドビオチンエステル（EZ-Link NHS-LC-Biotin，Pierce社：スペーサーの長さ：２２.４オングストローム）１０μl（１００nmol）を加え、次いで組換えイクオリン５０μl（３２.５nmolイクオリン：アミノ残基に換算して５２０nmol）を添加して、修飾反応を開始させ、暗所で４℃にて１２時間反応を行った。修飾反応の経過は、２時間ごとに反応液を１μl取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、抗ビオチンウサギ抗体−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法で、ビオチン化を確認した。その結果、０分から２時間で急速にビオチン化が起き、６時間以上において顕著なビオチン化の増加は検出されなかった。
上記と同様に、２０オングストローム以上のスペーサーを持つスクシイミド型のアミノ基修飾試薬を用いれば、ビオチン以外のリガンド、例えば抗体、抗原、低分子有機化合物等を直接結合させることが可能である。
【００４２】
上述のようにして得られたビオチン化された組換えイクオリンと未反応の組換えイクオリンの発光活性を比較したところ、ビオチン化により活性の低下はほとんど観察されず、ビオチン化組換えイクオリンは９８％の発光活性を保持していた。また、上記反応系で、反応温度を２０℃に上げた場合、発光活性は反応時間２時間で５０％以下に低下した。反応後、未反応試薬の除去、ビオチン化組換えイクオリンの単離および緩衝液交換は、４℃でのセントリコン１０（アミコン社製）を用いた遠心型濾過法の単一工程で行った。この工程は、使用目的の反応系に応じて、緩衝液を交換できる利点がある。発光活性の低下を防ぐため、蛋白質濃度を１００ng／mL以上で、−８０℃以下の温度で保存する。この場合だと６ヶ月以上、著しい活性低下は観察されない。
【００４３】
実施例４  ビオチン化組換えイクオリンに結合するビオチン数の決定
実施例３においてビオチン化された組換えイクオリンについて、蛋白質１分子当たりのビオチンの結合個数を確認した。具体的には、Voyager DE Pro mass spectrometer（PerSeptive Biosystem社）を用いたMALDI-TOF-MS法により分子量を測定することにより実施した。この方法は未反応組換えイクオリンとビオチン化組換えイクオリンの分離が可能であり、且つビオチンの結合個数が決定できる。
【００４４】
ビオチン化された組換えイクオリンをMALDI-TOF-MSにかけた場合、セレンテラジン−酸素部分は分解するため、測定される組換えイクオリンの分子量は組換えアポイクオリンのそれと同じとなる。その計算平均分子量は、２１６３２.２０、であり１ケ所、２ケ所、３ケ所、４ケ所、５ケ所、ビオチン化されたイクオリンの計算平均分子量はそれぞれ、２１９７２.６６、２２３１３.１２、２２６５３.５８、２２９９４.０４、２３３３４.５０である。
【００４５】
分子量スタンダードとして、アンジオテンシンＩ (m／z 1296.69)、インスリン（m／z 5734.59）、アポミオグロビン（m／z 16952.60）、アポイクオリン（m／z  21362.20）を用いた。使用するマトリックスとして、アルファーシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（アルドリッチ社製）とシナピン酸（アルドリッチ社製）より０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液にて５０％（Ｖ／Ｖ）アルファーシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸および３０％（Ｖ／Ｖ）シナピン酸を含むマトリックス溶液を調製した。マトリックス液１.５μlと測定サンプル０.５μlを混合し、次いで風乾した後に混合液を分子量測定に供した。その結果、スペクトルを図４に示した。主要ピークの測定値は、２１６３５.１３、２１９７２.７９、２２３１５.２９、２２６５８.３１、２２９９４.３３であった。未ビオチン化組換えイクオリンとの質量差は、３３７.６６、６８０.１６、１０２３.１８、１３５９.２０であり、それぞれビオチン化による分子量３４０.４６に相当する質量の増加が検出された。すなわち、検出された主要なピークは未反応の組換えイクオリン、１ケ所、２ケ所、３ケ所、４ケ所、ビオチン化された組換えイクオリンである。また、マイナーなピークは、５ケ所ビオチン化された組換えイクオリンと各々のビオチン化された組換えイクオリンとマトリックスであるシナピン酸とのコンプレックスに相当する分子量ピークも検出された。
【００４６】
検出された主要なピークの強度から計算すると、未反応の組換えイクオリン、１ケ所、２ケ所、３ケ所、４ケ所、ビオチン化された組換えイクオリンの存在比は、０.０５：０.１９２；０.３５２：０.２５０：０.１５３であった。すなわち、９５％以上の割合で組換えイクオリンにビオチン化が起きていることが明らかとなった。されに、この値から、組換えイクオリン１分子あたり、２.２６のビオチン化が起きていることが明らかとなった。
ビオチンの結合比率の明確なビオチン化イクオリンを安定的に且つ高効率で製造しうる方法が達成された。
【００４７】
実施例５  リジン特異的エンドペプチダーゼによる消化法
実施例３で調製したビオチン化組換えイクオリンおよびコントロールとして実施例２で調製した未ビオチン化組換えイクオリンを用い、分解酵素としてアミノ分析グレードのAchromobacter lyticus M497-1由来のリジン特異的エンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を使用し、消化した。
具体的には、ビオチン化組換えイクオリン（１６μg）または未ビオチン化組換えイクオリン(７０μg)を含む溶液１０μlを、２５μlの８Ｍ尿素（和光純薬社製）を含む０．４Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８.０：和光純薬社製）溶液に溶解する。さらに、２μlの５０mMジチオスレイトール（和光純薬社製）と２μlの５０ｍＭＥＤＴＡを組換えイクオリン溶液に加える。混合溶液を５０℃で１５分間加熱し、氷上で急冷する。この変性蛋白溶液に、１６μlの蒸留水を加え、１μlのリジン特異的エンドペプチダーゼ（０.１μg）を加え、３５℃で５時間保温し、消化を行った。
【００４８】
実施例６  ぺプチドマッピング−質量分析およびその解析法
実施例５でリジン特異的エンドペプチダーゼ消化処理したビオチン化組換えイクオリンおよび未ビオチン化組換えイクオリン溶液のうち０.５μlを実施例４に示したMALDI-TOF-MS法の同一条件で測定した。その質量スペクトルチャートを図５にそれぞれ示した。解析は以下の手順で行った。
１）先ず、未ビオチン化組換えイクオリンについて、リジン特異的エンドペプチダーゼ処理で生成する予想ペプチドフラグメントの分子量を計算で求める。その値より、質量スペクトルチャート中のピークについて、未ビオチン化組換えイクオリン配列のどこに相当するか決定する。
２）次いで、ビオチン化組換えイクオリンについて、リジン特異的エンドペプチダーゼ処理で切断されない、すなわちリジン残基がビオチン化され且つ分子量３４０.４６が増加する予想ペプチドフラグメントの分子量を計算で求める。
３）未ビオチン化組換えイクオリン消化物とビオチン化イクオリン消化物の質量スペクトルチャートの比較を行い、ビオチン化処理によって新規に現われたピークを探す。新規に現われたピーク値から、２）で計算した分子量と一致するものを探し出し、ビオチン化されたリジン残基を特定する。
【００４９】
組換えイクオリンをリジン特異的エンドペプチダーゼ処理した場合に予想されるペプチドフラグメントの配列、計算分子量値および実際にビオチン化された組換えイクオリンから生成したペプチドフラグメントを表１にまとめた。その結果、質量ピーク７５８.７０、２０６１.５０、２２８２.９０、２５０３.０９、２５８２.８７、３７３７.２６がビオチン化された組換えイクオリンに特有なピークであることが明らかとなった。７５８.７０はＮ末端のアミノ基由来、２０６１.５０は６１番目のリジン残基、２２８２.９０、８９番目のリジン残基、２５０３.０９は５８番目のリジン残基、２５８２.８７は４番目のリジン残基、３７３７.２６は１９番目のリジン残基がビオチン化されていることが明らかとなった。すなわち、配列番号１に示す天然型イクオリンのアミノ酸配列中、末端アミノ基、末端アミノ基から２番目、１７番目、５６番目、５９番目、８７番目の特定する５つのリジン残基のみが、特異的に修飾を受けたことが明らかとなった。このことより、ぺプチドマッピング−質量分析法は一般的なリジン残基の修飾を正確に特定させることができることを示している。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例７  ビオチン化組換えイクオリンの検定
１）発光パターンの比較
未ビオチン化組換えイクオリンとビオチン化組換えイクオリンについて、そのカルシウムによる発光パターンを比較した。同量（１ng）のビオチン化組換えイクオリン、未ビオチン化組換えイクオリンについて、１００μlの５０mMの塩化カルシウム溶液の添加により、発光量および瞬間発光のパターンをルミノメーター（ＴＤ−４０００型、ラボサイエンス社製）で測定した。ビオチン化組換えイクオリンについて、初期発光最大値（Imax）の半分までに減衰に要する時間は２秒および発光量は天然型イクオリンと比較しても変化はなく、数個のリジン残基へのビオチン化修飾により比活性の低下、カルシウムに対するレスポンスの違いは無いことが明らかとなった。
【００５２】
２）ビオチン化組換えイクオリンの定量性
ビオチン化組換えイクオリンの検出限界と蛋白質濃度に対する直線性についての検討を行った。ビオチン化組換えイクオリン濃度を１００フェムトグラムから１００ナノグラムに希釈し、５０mMの塩化カルシウム溶液（１００μl）添加し、その発光強度（初期発光最大値：Imax）をルミノメーター（アトー社製、モデルAB２２００型）で測定した。３回の測定値の平均値をから直線性が確認された。ビオチン化組換えイクオリンの検出限界は１ピコグラム以下であり、この検出限界は、未ビオチン化組換えイクオリンと同等であった。すなわち、ビオチン化によって発光活性が低下しないことが確認された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリンのアミノ末端アミノ基、およびリジン残基のアミノ基のうち、特定のアミノ基にのみリガンドを導入した発光活性を有する標識物質およびその製造方法が提供される。イクオリンに結合するリガンドの結合数、結合位置を特定化することによって、均質な標識物質となる。このため、測定場所、測定時間が相違する測定値の比較が容易となる。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】イクオリンの構成および発光機構を模式的に示す。
【図２】イクオリンのビオチン化の原理を模式的に示す。
【図３】ペプチドマッピング−質量分析分析法の原理を模式的に示す。
【図４】未ビオチン化イクオリン（Ａ）およびビオチン化イクオリン（Ｂ）のペプチダーゼ処理前の質量分析スペクトルチャートである。
【図５】未ビオチン化イクオリン（Ａ）およびビオチン化イクオリン（Ｂ）のペプチダーゼ処理後の質量分析スペクトルチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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