(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性β−ラクタマーゼの活性部位の共有結合インヒビターで固定支持体上に組換え線状ファージが固定され、組換え線状ファージまたはそのゲノムの全部または一部が回収され、かつ線状ファージのゲノムの全部または一部が単離されることを特徴とし、共有結合インヒビターが、アームで固体支持体に連結されるペナムスルフォンである、その表面に活性β−ラクタマーゼを含有する組換え線状ファージを選択するための方法。
【請求項２】
固体支持体への固定に先立って、固体支持体に固定できるリガンドにアームによって連結された、ペナムスルフォンで組換え線状ファージが標識付けされている、請求項１記載の選択法。
【請求項３】
固体支持体が、その上にアビジン、ストレプトアビジンおよび／または抗体を固定したクロマトグラフィーのカラムから成る、請求項１または２に記載の選択法。
【請求項４】
β−ラクタマーゼが１以上の変異を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の選択法。
【請求項５】
線状ファージがその固体支持体からの脱離によって回収される請求項１〜４のいずれか１項に記載の選択法。
【請求項６】
固体支持体からの脱離が、（ａ）共有結合インヒビターを固体支持体に連結するアームの切断；（ｂ）溶出用の溶液、好ましくは酸性ｐＨの溶液で固体支持体からリガンドを脱離すること；（ｃ）共有結合インヒビターとβ−ラクタマーゼとの間の結合の切断；（ｄ）β−ラクタマーゼと線状ファージとの間のペプチド結合の切断、から成る群から選ばれる、請求項５記載の選択法。
【請求項７】
（ｃ）の切断が、プロテアーゼ、臭化シアンまたはヒドロキシルアミンによって行われる、請求項６記載の選択法。
【請求項８】
アームが、切断できる官能基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の選択法。
【請求項９】
切断できる官能基がジスルフィド官能基を含む請求項８記載の選択法。
【請求項１０】
アームが、エステル結合によって固体支持体に連結されているか、隣接ジオールを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の選択法。
【発明の詳細な説明】
発明の課題
本発明は、表面に、酵素活性を有する少なくとも一個の分子を含む組換え微生物（recombinant microorganisms）を選択する方法に関する。
本発明はまた、この方法を実施するための手段およびそれを得る方法にも関する。
先行技術および本発明の基礎を成す技術的背景
新規な性質（触媒活性、新規に向上した安定性、変化した特異性、変化したｐＨプロファイルなど）の発見は、生化学的過程の改良に関連して非常に興味がある。
蛋白質の構造−活性の関係の理解において非常に重要な進歩が達成されたけれども（アトキンスら、構造生物学における新意見（１９９１）、１、６１１〜６２３頁）、その性質を所望の方向に変えるために蛋白質に導入すべき変成の種類の予測は依然として困難なままである。
そのためその遺伝子が変異している現存の酵素が出発物質として使用される。この変異は無作為に行われ、変異酵素の莫大な個体数を造る。これらのうち、その幾つかが所望の新規な性質を有することが望まれる（カニンガムら、蛋白質工学（１９８７）、１、３１９〜３２５頁およびレートバーラら、蛋白質工学（１９８８）、２、２６３〜２６８頁）。
成功の機会を増やすためには、極めて多数の変異体を試験し、可能な最多数の個体数のなかで、適切な性質を持った酵素を選択できるようにする技術を手に入れることが必要である。
新規な酵素的性質を持つ蛋白質は、モノクローナル抗体法の助けを借りても製造できる。この場合、適切な性質を持つ抗体−酵素（アプザイムとも言う）の選択には、やはり有効なスクリーニングの方法が必要である。
よく使用される変異酵素の検出法は、酵素活性の高感度試験の進歩に基づく。つぎに、所望の酵素を生産するものについてペトリ皿上にコロニー形成された変異体の個体数について直接検索が行われる。しかし、この方法は労力を要し、試験すべきクローンの数が限られてしまう（ポラックら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、５９６１〜５９６２頁（１９８９）およびヒューズら、サイエンス、２４６、１２７５〜１２８１頁（１９８９））。
所望の触媒活性が相当する遺伝子を表現する微生物の存続または開発に有用であるとき、有利な別法が生まれる。この場合、所望の酵素を生産する株を選択するためには、変異体の個体群を培養するための培地に淘汰圧をかけるだけで充分である（エルメスら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、およびエブニンら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８７、６６５９〜６６６３頁（１９９０））。
この方法は酵素活性をもつすべての分子に適用できないという欠点がある。
「線状」ファージおよびファージミドの表面に或る種の外来のペプチド配列、特に蛋白質を露出できることは公知である（スミス、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）、２２８、１３１５〜１３１７頁、パームレーおよびスミス、Ｇｅｎｅ（１９８５）、７６、３０５〜３１８、ド・ラ・クルツら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（’１９８８）：、２６３、４３１８〜４３２２頁、バスら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９０）、８、３０９〜３１４頁、クワーラら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）、８７、６３７８〜６３８２頁、デブリンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）、２４９、４０４〜４０６、マッカファティーら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）、３４８、５５２〜５５４頁、スコットおよびスミス、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）、２４９、３８６〜３９０、クラックソンら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）、３５２、６２４〜６２８、ロウマンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０、１０８３２〜１０８３８頁、Ｊ．マッカファティーＲＡ、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｎｇ（１９９１）９５５〜９６１、カングら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、４３６３〜４３６６頁；バーバスら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻７９７８〜７９８２頁；ロバートら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、２４２９〜２４３３頁）。
しかし、その表面に正確に活性なポリペプチド配列を露出するファージのインビトロの選択は全く解決されていない。
種々のアフィニティークロマトグラフィー法が記載されている。開発されたアフィニティー支持体のなかで、幾つかは固定したストレプトアビジンまたはアビジンを使用しており、後者は単量体の形が有利である（ＥＰ−Ａ−０，４２３，９３８）。こうして、この蛋白質を担持するアガロースの助けによって、ストレプトアビジンに親和性を持つペプチド配列を有するファージが選択された（デブリンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）、２４９、４０４〜４０６）。
しかし、これらの方法には、アフィニティークロマトグラフィーの間に、これらのファージの選択が、活性なまたは不活性な分子を無差別に結合するペプチドレセプターまたは特定の抗体と複合体を形成する能力に基づいて行われるという欠点がある。
特定の微生物を探す目的で、種々の他の標識法が開発された。例えば、或る種の微生物はこれらのホストに特異なバクテリオファージの助けで検出され標識された（ＷＯ−Ａ−８，８０４，３２６）。既知のホスト特異性をもつ粒子の導入およびフェノタイプを変える遺伝子の包含が、バクテリアの標識に使用できる（ＷＯ−Ａ−９，００４，０４１）。
プラスミドによってエンコードされる生物発光による検出に伴う或る種の毒性物質への敏感性も、特定の微生物の検出に使用された。
しかし、これらのどの方法でも触媒活性のあるペプチドを担持する微生物の選択は出来ない。
さらに、或る種の酵素の基体として使用される共有結合インヒビターは、酵素の活性部位に共有結合で結合することによってすべての酵素反応を抑止する能力があることでも知られている。
二三の共有結合インヒビターは、酵素の触媒機構を使って酵素の活性部位に不可逆的に結合して酵素の再使用を不可能にするので、「自殺」インヒビターとも呼ばれる（アトルら、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ、１９巻、２１４〜２８２頁、シグマン・ボイヤー編、第３版（１９９０））。
先ず基体をビオチンと結合させ、得られた生成物を水不溶性の支持体に結合したアビジンの存在下に置くことによって基体を固定することが可能であることも公知である（ＪＰ−Ａ−３，０８０，０９８）。この固定された基体は或る種の酵素活性の測定を容易にするが、触媒活性のあるペプチドを担持する微生物を選択するためのクロマトグラフィーの支持体としては使えない。
発明の目的
本発明の目的は、酵素活性を持つ少なくとも一つの分子を表面に含む組換え微生物の選択のための先行技術の欠点を持たない方法を開発することである。
本発明の目的は、特にその複合体形成活性に基づくのではなく、分子の触媒活性に基づいて行われる、酵素活性を持つ分子を表面に露出する組換え微生物の検出および選択を可能にする方法を開発することである。
発明の特徴
本発明は、組換え微生物、好ましくは線状ファージまたはλファージまたはファージミドのようなウイルスを、アームによって固体支持体に連結された酵素活性を持つ分子の活性部位の共有結合インヒビターによって個体支持体に固定し、つぎにその組換え微生物またはそれらのゲノムの全部または一部を単離することを特徴とする、酵素活性を持つ少なくとも一つの分子を表面に含む組換え微生物の選択のための方法に関する。
「組換え微生物」という用語は、「遺伝的ディスプレー・パッケージ」（ＧＤＰ）の英語の定義、すなわち遺伝的物質を包含し、この遺伝的物質によってエンコードされるペプチド配列を含む高分子構造、を満たす高分子構造を意味すると理解される。
この定義は特に酵母、バクテリア、ウイルス、線状ファージまたはファージミドのようなファージを包含する。
「固体支持体」という用語は、その上に微生物が一時的に固定できる固体構造を意味するものと理解される。
そのような支持体は、先行技術で公知の方法によって当業者が造ることができる。
この支持体は、その上にアビジンまたはストレプトアビジンのような複合体形成性の蛋白質が固定されたクロマトグラフィー用支持体、常磁性粒子、ポイスチレン支持体または他の支持体から成る。
好ましくは、酵素活性をもつ分子は、酵素、アプザイム、触媒活性ペプチドまたはそれらの混合物から成る群から選ばれる。
本発明の好ましい実施態様によれば、固体支持体上への固定の前に、その固体支持体に固定できるリガンドにアームで連結された共有結合インヒビター（コバレント阻害剤）で組換え微生物を標識する。
本発明の別の好ましい実施態様によれば、微生物の破壊または固体支持体からの微生物の脱離によって微生物またはそれらのゲノムの全部または一部を回収する。
この脱離は、種々の方法、例えば溶離液、好ましくは酸性のｐＨを持つ溶液で固体支持体からリガンドを脱離するか、固体支持体に共有結合インヒビターを連結しているアームを切断するか、共有結合インヒビターと酵素活性をもつ分子との間の結合を切断するか、または酵素活性をもつ分子と微生物との間のペプチド結合を切断することによって行うことができる。
酵素活性をもつ分子との間のペプチド結合の切断は、好ましくはファクター１０Ａやコラゲナーゼのような特定のプロテアーゼによって行うことができる。メチオニンまたはヒドロキシルアミンを含むペプチド結合を、ペプチドのアスパラギン−グリシンを含むペプチド結合に対する〔ｓｉｃ〕と同様に切断する臭化シアンも使用された。
そのような切断は本発明による方法の選択性を有利に向上させることを可能にする。
事実、本発明の方法の共有結合インヒビターは酵素活性をもつ分子の活性部位以外の部位でも微生物と結合できる。
酵素活性をもつ分子と微生物との間に存在する特定のペプチド結合を切断することによって、活性な酵素分子をその表面に含む微生物だけが溶離中に回収される。
さらに、この選択の方法は細胞性または体液性の免疫応答を誘発することがでる一つ以上の特定のペプチドを、その微生物の生または組換え蛋白質の上で、それらの表面で露出する微生物の検出および選択に応用できる。
事実、そのような抗体−抗原認識だけでは、細胞性または体液性の免疫応答を最も誘導することのできるペプチドを選択することはできなかった（ウェツェル（１９９１）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第４巻、３７１〜３７４頁）。
その結果、そのペプチドと微生物の生の分子との間に存在するペプチド結合の水準において、本発明によって行われる切断は、細胞性または体液性の反応を最も誘発するペプチドを特定の方式で選択することをも可能にする。
さらに、微生物のゲノムの全部または一部は、微生物を破壊するか、そのゲノムの全部または一部を回収することによっても回収できる。このゲノムは、つぎに単離され、（例えばＰＣＲによって）増幅され、クローンされる。
本発明はまた、固体支持体上に固定できるリガンドにアームによって連結された酵素活性をもつ分子の活性部位の共有結合性の、好ましくは不可逆性のインヒビターから成るマーカーにも関する。
このリガンドは、ビオチンまたはイミノビオチンであるのが好ましい。
このアームは、切断できる化学官能基、好ましくはジスルフィド官能基を含むのが有利である。
本発明によるマーカーの好ましい実施態様によれば、共有結合インヒビターは酵素活性をもつ分子によって行われる酵素反応の特定の遷移状態のアナログ（同族体）である。
本発明の別の態様は、酵素活性をもつ分子の活性部位の共有結合インヒビターが固体支持体上に固定できるリガンドにアームによって連結されることを特徴とする、本発明によってマーカーを調製する方法に関する。
本発明はまた、酵素活性をもつ分子の活性部位の共有結合インヒビターが、アームによって固体支持体に連結されていることを特徴とする固体支持体にも関する。
固体支持体に連結された共有結合インヒビターは、本発明によるマーカーから成るのが有利である。
本発明の好ましい実施態様によれば、アームはエステル結合によって固体支持体に連結されるか、隣接のジオールを含む。
本発明の最後の態様は、酵素活性をもつ分子の活性部位の共有結合インヒビターが固体支持体にアームによって連結されることを特徴とする本発明による固体支持体の調製法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＢＲ３３２のβ−ラクタマーゼをエンコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
図２は、成熟β−ラクタマーゼをエンコードする遺伝子をファージｆｄＤＯＧ１に挿入する方法の段階を図示する。
図３は、β−ラクタマーゼをエンコードする遺伝子に相補的なプライマーのヌクレオチド配列を示す。
図４ないし９は、本発明によるマーカーの合成の方法を図示する。
図１０は、本発明によるマーカーでの微生物の固体支持体上への固定ならびにその微生物の回収を可能にする切断部位を図示する。
発明の好ましい実施態様の説明
図１０は、表面に酵素活性をもつ分子（２）を含む組換え微生物（１）で、アビジンまたはストレプトアビジンのような複合体形成性の蛋白質（４）を含む固体支持体（３）上に、酵素活性をもつ分子（２）の活性部位の共有結合インヒビター（５）、アーム（６）及びリガンド（７）からなるマーカーによって固定されたものを図示する。このリガンド（７）は固体支持体（３）に複合体形成性の蛋白質（４）によって固定できるものである。
この微生物またはそのゲノムの全部または一部は、下記の方法で回収できる。
―溶離液、例えば４のオーダーのｐＨの溶液（Ａ）で固体支持体からリガンド（７）を脱離させる。
―マーカー（Ｂ）のアーム（６）を切断する。
―インヒビター（５）と酵素活性をもつ分子（２）との間の結合（Ｃ）を切断する。
―微生物（１）と酵素活性をもつ分子（２）との間のペプチド結合（Ｄ）を切断する。
−微生物（１）を破壊し、そのゲノム（Ｅ）の全部または一部を回収する。
この方法は、下記の実施例において、添付図面を参照しながらさらに詳細に説明することとする。
実施例Ｉ：  活性β−ラクタマーゼを担持するファージ（ｆｄ−ｂｌａ）の構築および選択
表面に酵素活性をもつ分子を有するウイルスは、「線状の」ファージから構築される。
Ｍ１３またはｆｄのような線状のファージは、遊離の形において、五つの蛋白質から成る極めて長い円筒の形の蛋白質エンベロープ内に封入された６．５ｋｂの一本鎖環状ＤＮＡを含む細菌ウイルスである（ベックおよびジンク、Ｇｅｎｅ（１９８１）、１６、３５〜５８頁、グラントら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）、２５６、５３９〜５４６頁、ロペッツおよびウエブスター、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）、１２７、１７７〜１９３頁）。
これらのうち、遺伝子IIIの生成物（ｐIII）は、３ないし５個のコピーの量で存在する複合蛋白質であり、ビリオンの端の一つを閉環しており、三つの部分から成っている。すなわち、細菌（バクテリア）のペリプラズムに蛋白質を輸出するのに使用され、排泄中に切断されるシグナルペプチド；大腸菌標的細胞のＦ−線毛を認識する感染に必要な球状部分；そのあと粒子中にｐIIIの足場を確保するウイルス形態形成期中のトランスメンブラン部分である（Ｊ．アームストロングら、ＦＥＢＳレター（１９８１）、１３５、１６７〜１７２頁、Ｃ．Ｗ．グレイら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）、１４６、６２１〜６２７頁、Ｇ．グラゼッツ−ウトケら、ＢＢＡ（１９８９）９８５、２３９〜２４７頁）。
ファージｆｄの生理学における蛋白質ｐIIIの役割と機能についての研究のあと、スミスおよびクリスマン（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８４）、１３２、４４５〜４５５頁）は、組換えＤＮＡ法によって、蛋白質ｐIII配列の内部に（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８、１３１５〜１３１７頁）または成熟蛋白質のシグナルペプチドと配列の間に（Ｇｅｎｅ（１９８８）、７３、３０５〜３１８頁）、外来のペプチド配列を導入することが可能なことを示した。この挿入は、ファージの生存率を抑制せず、導入された配列は利用可能である。
ファージ酵素ｆｄ−ｔｅｔ−β−ラクタマーゼ（ｆｄ−ｂｌａ）は、変異β−ラクタマーゼをエンコードする配列が導入されたファージｆｄＤＯＧ１（クラックソンら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８頁（１９９１））から構築される。
このファージは、ファージｆｄ−ｔｅｔから誘導され（ベックら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、５、４４９５〜４５０３頁（１９７８））、この場合ポリリンカーは蛋白質III（ｐIII）のシグナルペプチドをエンコードする配列と成熟ｐIIIをエンコードする配列との間に挿入され、これによってβ−ラクタマーゼはｐIIIと融合蛋白質を形成する。ファージｆｄ−ｔｅｔは、それ自体トランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入によってファージｆｄ（ザッヘルラ、遺伝子Ｇｅｎｅ、９、１２７〜１４０頁（１９８０）））から造られる。
ファージｆｄＤＯＧ１は、シグナルペプチドと球状部分の間の蛋白質ｐIIIをエンコードする領域内に変異によって構成された二つの制限部位（ＮｏｔｌおよびＡｐａＬ１）から成る。
ファージｆｄＤＯＧ１はまた、ファージの複製の元の領域に挿入され、ファージのプラスミドとしての増殖を許すテトラサイクリン遺伝子から成る。
β−ラクタマーゼをエンコードするヌクレオチド配列の単離
大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子（その配列はストクリッフ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７５、３７３７〜３７４１頁（１９８７）および図１に示されている）は、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｓ／Ｋ＋▲Ｒ▼から単離された。
ｆｄＤＯＧ１へのクローニングがＡｐａｌ１部位を使用し、β−ラクタマーゼの配列がそのような部位を含むとすると、後者は先ず部位指向の変異誘発によって除去されねばならない。この変異は蛋白質の配列を維持する。
ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｓ／Ｋ＋▲Ｒ▼（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ▲Ｒ▼から、Ｏｚｙｍｅ▲Ｒ▼より販売）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ▲Ｒ▼の市販するキットの助けによってエックシュタインの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１４、９６７９〜９６９８頁（１９８６））に従って変異される。
インビトロでの変異誘発の後、変異されたファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｓ／Ｋ＋▲Ｒ▼（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍ）の二重鎖は、大腸菌の株ＴＧ１を形質転換するのに使用される（ギプソン、エプシュタイン−バールウイルスゲノムに関する研究、博士論文、イングランド、ケンブリッジ大学（１９８４））。
形質転換された細胞は、ＬＢ−Ａｍｐ媒地に移植される（サムブルックら、分子クローニング、実験マニュアル、第二版、コールド・スプリング・ハーバー研究所（１９８９）補遺Ａ）。
コロニーは回収されＬＢ−Ａｍｐ媒地で培養される。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍの一本鎖形は培地へのヘルパーファージＲ４０８の添加によって生産される（ラッセルら、４５、３３３〜３３８頁（１９８６））。
ストランドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍは、つぎに選ばれたクローン内で変異が事実導入されていることを確認するために、Ｓｅｒ６８をエンコードする位置に中心を置くプライマー５’−ＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡの助けによってサンガーの方法（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７４、５４６３〜５４６７（１９７１））に従って配列される。
ファージｆｄＤＯＧ１中へのβ−ラクタマーゼのクローニング
成熟したβ−ラクタマーゼをエンコードする遺伝子の配列は、ｐIIIのシグナルペプチドをエンコードする配列と成熟したｐIIIをエンコードするそれとの間のファージｆｄＤＯＧ１に挿入される。クローニング部位ＡｐａＬ１およびＮｏｔ１は、図２に示す体系によって使用される。この効果のために、ＰＣＲによる適切な制限部位の導入によってβ−ラクタマーゼ遺伝子がファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍから回収される。
図３に示す使用プライマーは、下記の性質を持つ。
５’内のプライマーは、（Ｐｒｏ２をエンコードする）第二のコドンから出発する成熟したβ−ラクタマーゼ遺伝子の１８個の塩基にわたって相補性のある３０量体である。５’延長鎖（１２個の塩基）はＡｐａＬ１部位を導入し、変異を起こしてＧｌｎ１によるＨｉｓ１の置換が起こる。この変異は、アビジンまたはストレプトアビジン（デブリンら、サイエンスＳｃｉｅｎｃｅ、２４９、４０４〜４０６頁（１９９０））への親和性を発揮することのできる末端アミノ配列Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎを持つβ−ラクタマーゼを担持するファージがそのあとそれらの選別に使用されるために導入される。
３’内のプライマーは、β−ラクタマーゼ遺伝子の末端からの２１個の塩基にわたって相補性の４７量体である。鎖伸長は、ストップコドンをグリシンをエンコードするコドンに替え、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子と蛋白質ｐIIIをエンコードする遺伝子との間に４個のコドンを導入し、またクローニングのためのＮｏｔ１制限部位を導入スル。これらの４個の追加のアミノ酸は、因子Ｘａのための２個の蛋白質の間に強力な切断部位を形成する。事実、蛋白質ｐIIIはファージの感染のための能力を与える（ゴールドスミスら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｔｒｙ、１６、２６８６〜２６９４頁（１９７７））。β−ラクタマーゼのような嵩高い蛋白質の存在は感染の能力に影響を与えるが、因子Ｘａによる培養は後者の復活を可能にする。さらに、この部位は微生物を回収するための追加の切断点を構成する。
ファージｆｄＤＯＧ１は、ＡｐａＬ１およびＮｏｔ１によって１８時間消化され、アガロースゲル上で精製される。さらに、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍの配列は、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ▲Ｒ▼の存在で、３４回のＰＣＲサイクル（９５℃で１分、６０℃で１分および７２℃で２．５分）を使って、上記のプライマーで増幅される（サイキら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、４８７頁（１９８８））。ゲル精製のあと、生成物はＡｐａＬ１およびＮｏｔ１によって１８時間消化され、再精製される。つぎに、消化されたｆｄＤＯＧ１．５μｇとβ−ラクタマーゼ２５０ｎｇとを４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ▲Ｒ▼）の入った６０μｌの液と混合し一夜１６℃に保持した。精製されたライゲーション混合物は大腸菌の株ＴＧ１を形質転換するのに使用する。
細胞はＬＢ−ｔｅｔおよびＬＢ−Ａｍｐ培地（サムブルックら）上に移植され、ここでファージの存在が抗生物質に対する抵抗性を与えることが観察される。つぎに、ファージｆｄ−ｂｌａを調製するために、コロニーは２×ＹＴ−Ｔｅｔ培地または２×ＹＴ−Ａｍｐ培地で培養される。
蛋白質ｐIIIの操作によるファージ−酵素の構成の代わりに、ファージｆｄの円筒状の胴体を構成する５．２ｋｄの小さい蛋白質であり、２７００個のコピーで通常存在する蛋白質ｐVIII（１）で融合蛋白質を構成することも可能である（ニューマンら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７７）、１１６、５９３〜６０６頁）。ＤＮＡ分子の大きさが変更されたときは、蛋白質ｐVIIIのコピーの数はそのＤＮＡの分子を包含させるために調節することができる。
この変法は融合蛋白質のコピーの数を調節することを可能にするためにファージミドで達成される（カングら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻、４３６３〜４３６６頁）。
活性β−ラクタマーゼを担持するファージ（ｆｄ−ｂｌａ）の特徴付け
こうして構成されたファージは、下記の方法で特徴付けられる。ファージによる感染が細胞にアンピシリン耐性を与えるという事実が先ず示される。つぎに、β−ラクタムであるニトロセフィンを加水分解する能力をファージ自体が発揮するということが直接示される。β−ラクタマーゼを通す皮膜上で濾過したあとに限外濾過の濾液中には酵素活性は存在しないという事実が、酵素がファージに結合していることを既に示している。最後に、ファージ蛋白質はゲル電気泳動およびウエスタン・ブロッティングによって分析され、蛋白質ｐVIIIがβ−ラクタマーゼとの融合蛋白質の形で存在することが示される。このことは、構成が事実正しく、ウイルスの形態発生の間に、ファージからのβ−ラクタマーゼの脱離を来すような蛋白質分解性の切断がないことを確証するものである。
このファージによる大腸菌ＴＧ１の細胞の感染およびＬＢ−Ａｍｐ培地への移植によって、アンピシリン耐性のコロニーが得られる。β−ラクタマーゼ活性は、ニトロセフィン試験によってペトリ皿内で直接検出される（プリュックタンら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２、３９５１〜３９５７頁（１９８７））。同様に、細胞の遠心分離のあとに培養培地から単離され、４％ＰＥＧ、０．５ＭＮａＣｌ（最終）で沈澱し、ｐＨ７．５の１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液に１０12導入単位（ｔｕ）／ｍｌのオーダーの濃度で再懸濁したファージは、ニトロセフィンを加水分解する。
ファージによって担持される酵素の相対活性は、溶解状態のβ−ラクタマーゼＲＴＥＭのそれ（ベーリンガー）に等しい。活性の測定は、市販のβ−ラクタマーゼＲＴＥＭを通過させる１００，０００のカットオフ分子量のセントリ／ポール皮膜上でのファージの限外濾過のあとでも実施された。限外濾過の濾液中に５％未満のβ−ラクタマーゼ活性が検出され、これは酵素がファージに結合したままであることを示す。
ウイルス、ｆｄ−ｔｅｔおよびｆｄ−ｂｌａ、が調製され濃縮される（１０12ｔｕ／ｍｌ）。各溶液の２０μｌが１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷され、分析される（Ｂｉｏｒａｄ▲Ｒ▼製ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ▲Ｒ▼II）。ウエスターン・ブロッティングによって、蛋白質はニトロセルロース（Ｂｉｏｒａｄ▲Ｒ▼製ｍｉｎｉｔｒａｎｓｂｌｏｔ▲Ｒ▼）上に移植され、その検出は抗蛋白質IIIウサギ抗体によって行われ、つぎにＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）に結合したウサギ抗体に対するヤギ抗体によって行われた。ＨＲＰの発色団基体がｆｄ−ｔｅｔおよびｆｄ−ｂｌａについてそれぞれ、７０ｋｄおよび１０５ｋｄの見掛けの分子量のバンドを示す。この検出は、抗−β−ラクタマーゼ抗体でも行われた。融合蛋白質について期待される位置にｆｄ−ｂｌａについてだけバンドが認められた。
実施例II：  不活性β−ラクタマーゼ（ｆｄ−ｂｌａ-）を担持するファージの構成および特徴付け
本発明による選択法の効率を試験するために、不活性β−ラクタマーゼ（ｆｄ−ｂｌａ-）を担持するファージを構成し特徴付ける。
ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｍは、必須セリン６８をエンコードするコドンが酵素を不活性化するためにアラニンに変異される変異誘発にかけられる。
変異された遺伝子は、活性ラクタマーゼに使用したのと同じ方法（制限部位の導入を伴うＰＣＲ増幅（図２参照））で回収される。不活性β−ラクタマーゼ（ｆｄ−ｂｌａ-）を担持するファージは、制限フラグメントの分析、Ｂｌａ遺伝子の完全配列付け、酵素活性の検出および蛋白質の分析によって特徴付けられる。
Ｓ６８Ａ変異は、ＡｐａＬ１部位の変異と同じ方法で導入される。形質転換された細胞は、アンピシリンを含まないＸ−Ｇａｌ培地（ホルビッツら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、７、５７４頁（１９６４））上の移植する。青いコロニーを２×ＹＴ培地で培養し、ヘルパーファージＲ４０８の添加によって一本鎖の形を造る。変異はＧ９０−Ｙ９５をエンコードする領域に対し相補性のプライマー５’−ＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣの助けによってサンガー法で配列付けする。
活性β−ラクタマーゼについて行ったようなＰＣＲ、クローニング、形質転換およびｔｅｔ培地への移植による遺伝子の増幅の後、コロニーは回収され２×ＹＴ−ｔｅｔ培地で培養される。ファージの二重鎖ＤＮＡを単離し、制限ヌゥレアーゼＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で消化する。消化生成物はアガロース上で分離する。形質転換体は期待された通り、４．７ｋｂｐと５．５ｋｂｐの二つの断片を示す。変異されたＢｌａ遺伝子の完全な配列付けは、それぞれ成熟蛋白質ｐIIIのＥ５−Ａ９およびβ−ラクタマーゼのＧ９０−Ｙ６５、Ｈ１５６−Ｌ１６０、Ｌ２２３−Ｗ２２７をエンコードする領域に位置するプライマー５’−ＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ、５’−Ａ〔ｌａｃｕｎａ〕ＧＣＧＡＧＴＴＡＣ〔ｌａｃｕｎａ〕Ｇ、５’−ＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧおよび５’−ＴＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣで行われる。こうして、ＰＣＲ増幅が活性部位の不活性化を目的とした以外の変異を導入しなかったことが立証される。
つぎに、ファージｆｄ−ｂｌａ-の培養物の上澄液に上記のニトロセフィン試験を行うことによってβ−ラクタマーゼ活性の存在が検出される。予期された通り、活性は検出されない。
最後に、変性ゲル電気泳動、ウエスターン・ブロッティングおよび免疫学的検出によってファージコート蛋白質の分析がファージｆｄ−ｂｌａについてと同様に行われる。融合蛋白質ｐIII−β−ラクタマーゼは正確に同定される。
実施例III：  自殺インヒビターとリガンドとの間の小型のアームで与えられる活性β−ラクラマーゼ・マーカーの合成
そのＤＮＡが活性β−ラクラマーゼを含み、コート蛋白質ｐIIIに連結した対応の酵素を担持するファージが、本発明によるマーカーとの反応で選択される。このマーカーは、一端にβ−ラクラマーゼの共有結合のインヒビターを、もう一方の端に、容易に固体の支持体上に固定できるリガンド、この場合ビオチンを含む二官能分子から成る。
自殺インヒビターモジュールは、リガンドまたは支持体にアームによって連結できるように官能基を付けたペナムスルフォン（フィッシャーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）、２０、２７２６〜２７３１、メゼスら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．（１９８２）、１４３、２６５〜２６７、クラークら、（１９８３）、７４８、３８９〜３９７、ドミトリエンコら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）、１３、３４〜４６を参照）から成る。
溶液のｐＨを低下させることによってストレプトアビジンに対するその親和生をかなり減少できるので、イミノビオチンも有利に使用できる。これで、固定後のファージの支持体からの遊離のもう一つの可能性が与えられる。
これらの二つの存在は充分な長さのアームで連結されて、マーカーの担持するリガンドと固定された蛋白質の相互作用を可能にする。
二官能性の分子の合成の体系は、図４ないし図６に示される。この合成の工程の大部分は、化学文献に記載され、または従来の方法を含んでいる。分子は赤外線スペクトル分析および1Ｈ−ＮＭＲで特徴付けられる。
ｐ−ニトロベンジルオキシルボニル−２−アミノエタンスルホン酸ナトリウム（３）は、０℃で１ＮのＮａＯＨの１当量〔ｓｉｃ〕に溶解したタウリン（２）に、二当量のｐ−ニトロベンジルクロロフォルメートを添加し、ＮａＯＨの添加で媒体を連続的にＮａＯＨの添加でショッテン−バウマンの条件下に中和することによって調製される。酢酸エチルでｐ−ニトロベンジルアルコールを抽出した後、生成物を冷凍乾燥する。収率は６６％であった。
スルホネート（３）は、フジタの方法（合成、４２３〜４２４（１９８２））によってオキシ塩化燐でスルホニルクロリド（４）に変えられた。乾燥エーテルによって得られた油を洗浄することによって、生成物は９７％の収率で白色粉末の形で得られた。
平行して、アセト酢酸エチルで一時的に保護した後、塩化メトキシメチルの助けでマンハスらの方法（合成、５４９〜５５２（１９８３））で６−アミノペニシラン酸（５）をそのメトキシメチルエステル（６）に変えた。
この酸クロリド（４）を、トリエチルアミンの存在でジクロロメタン中で６−アミノペニシラン酸エステル（５）に結合させた。シリカカラム（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン８０：２０）で精製した生成物（７）は、５０％の収率で得られた。
この精製物はジョンソンらの方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２８、１９２７〜２８（１９６３））で酸化してスルホン（８）に変えた。得られた生成物はエーテルで洗浄して白色の固体〔ｓｉｃ〕を得、これはシリカ上で精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は７５％であった。
従来法によるパラジューム／炭素上での水素添加によるアミン官能基の脱保護によって、生成物（９）が得られ、これは直接スルホサクシニミジル２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオネート（１０）（Ｐｉｅｒｃｅ▲Ｒ▼により市販）と結合させて、マーカープレカーサー（１１）を得、これをシリカ上で精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は２５５であった。
（１１）のペナム環の３位のカルボキシル官能基の保護は、キムらの方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３２、３０９９〜３１００（１９９１））によってジクロロメタン中で臭化マグネシウムの助けで除去した。溶媒の蒸発のあと回収された粗製物（１２）は、酵素を阻害し活性酵素を担持するファージを標識するのに直接使用された。
実施例IV：  活性β−ラクタマーゼを担持するファージ（ｆｄ−ｂｌａ）の固定
酵素の活性部位を不可逆的に結合し、酵素の再使用を不可能にする共有結合マーカーの使用は、この酵素の選択法の短所を構成するものではない。事実、この方法では活性分子をエンコードする遺伝子配列を選択し回収することだけが望まれる。
二官能性マーカーによる活性β−ラクタマーゼを担持するファージの阻害の最適条件がまず決定される。この目的のため、インヒビターの添加後の時間の関数として、ニトロセフィン試験によってファージのβ−ラクタマーゼ活性の消失速度が測定される。つぎに、ファージをマーカーの存在下で培養する。
つぎに、反応生成物をアガロース−結合ストレプトアビジンカラムに通し、その後、マーカーのジスルフィド官能基を切断してファージを溶出させる。これは大腸菌の培養物を再感染させるのに使用される。この培養物から、活性β−ラクタマーゼをエンコードする遺伝子は容易に回収できる。
このｆｄ−ｂｌａファージで感染されたバクテリアの培養物は、１ｍｌ当たり１５μｇのテトラサイクリンを含む２×ＹＴ培地で調製され、攪拌下３７℃で１６時間培養される。培養物を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離したあと、上澄液を回収する。２．５ＭのＮａＣｌで１／５容の２０％ポリエチレングリコール溶液を添加してファージを沈澱させる。１時間４℃で培養し遠心分離した後、ファージをｐＨ５．０で５０ｍＭの酢酸塩緩衝液に再懸濁させる。
１ｍｇ／２５μｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解したマーカー（１２）を、ファージ（約１０11ｔｕ／ｍｌ）および１％のＢＳＡを含む溶液に最終濃度０．２５ｍＭで添加した。阻害は３０分間続ける。
さらに、アガロース−ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ▲Ｒ▼）の２５０μｌの懸濁液を、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ）を含むＰＢＳ緩衝液２０ｍｌで洗浄した。ファージ１．２５×１０9を含むこの溶液０．３ｍｌを、カラムに負荷し、６ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡと６ｍｌのＰＢＳで洗浄した。つぎに、ファージをＰＢＳ緩衝液中５００ｍＭジチオスレイトール溶液１ｍｌで溶出した。回収したファージの一分別量を、緩衝液の交換の後、３７℃で指数増殖期にある大腸菌ＴＧ１の１０ｍｌとともに培養した。ファージの回収は、種々の希釈液をＬＢ−ｔｅｔ培地上に移植しコロニーを数えることによって示した。１４．４ｐｐｍに相当する活性β−ラクタマーゼを担持する１．８×１０4個のファージは、この方法で回収した。
実施例Ｖ：  不活性β−ラクタマーゼを担持するファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）の固定
ｐＨ５の酢酸塩緩衝液０．３ｍｌに含まれる１．０５×１０9個のファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を本発明によるマーカー（１２）の存在で置き、反応生成物をアガロース−結合ストレプトアビジンカラムに通し、実施例IVに記載したのと同じ方法で溶出させた。１．９ｐｐｍに相当する不活性β−ラクタマーゼを担持するファージ２．０×１０3個がこの場合には回収された。
実施例IVとＶを比較すると、活性ファージは不活性ファージの８倍保持されることがわかる。
実施例VI：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：ジチオスレイトールによる溶出
活性ファージ因子の増量を直接決定するために、同じ種類の実験を活性ファージと不活性ファージの混合物で行った。
１％ＢＳＡの存在でｐＨ５の酢酸塩緩衝液０．３ｍｌ中に６．４×１０9個の活性ファージと１．４×１０10個の不活性ファージを含む混合物を、０．２５ｍＭの最終濃度においてマーカー（１２）の存在下に置いた。過剰のマーカーをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ▲Ｒ▼のＵｌｔｒａｆｒｅｅ３０，０００のユニットでの限外濾過で除去した。溶液はストレプトアビジン−アガロース上に負荷させた。カラムを５ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄した後、ファージを５００ｍＭのジチオスレイトールで溶出した。溶出したファージの一分別量を、種々の希釈度でＬＢ−ｔｅｔ皿の上に移植し、コロニーを数えた。この方法で合計１．３×１０6個のファージが回収された。活性β−ラクタマーゼを担持するファージの数は、上記のニトロセフィン試験でコロニーの活性β−ラクタマーゼ活性を直接測定することによって決定した。この数はＬＢ−Ａｍｐ皿上に溶出液の一分別量を移植することによっても確認された。溶出した活性ファージの数は、１．１×１０6であった。従って得られた増量倍数は５．５であった。
実施例VII  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：因子Ｘａによる溶出
増量倍数を直接決定するために、同じ種類の実験を活性ファージと不活性ファージの混合物で行った。この場合、溶出はβ−ラクタマーゼと蛋白質IIIとの間のペプチド結合を切断する因子Ｘａで行った。
１％ＢＳＡを含む酢酸塩緩衝液１．５ｍｌ中に２．８×１０10個の活性ファージと２．２×１０10個の不活性ファージを含む混合物を、０．７５ｍＭの最終濃度においてマーカー（１２）の存在下に置き、ストレプトアビジン−アガロース上を通した。カラムをＰＢＳ８０ｍｌ、０．０２％ＮａＮ3を含むｐＨ７の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液２ｍｌ、およびｐＨ７のＴｒｉｓ緩衝液２ｍｌで洗浄した後、因子Ｘａ（ベーリンガー）１０μｇを含む溶液１ｍｌを懸濁液に加えて、静かに攪拌しながら室温で一夜放置した。遠心分離した後、上澄液を種々の希釈度でＬＢ−ｔｅｔ皿上で分析した。コロニーを数えた。合計６×１０5個のファージがこの方法で回収された。溶出した活性ファージの数は、５．７×１０5であった。従って得られた増量倍数は１５であった。
実施例VIII：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：マーカーの前固定
活性ファージと不活性ファージの混合物で別の実験を行ったが、ストレプトアビジン−アガロースカラム上にマーカーを予め固定した。
２５０μｌのストレプトアビジン−アガロース懸濁液を、１％ＢＳＡの存在でｐＨ５の酢酸塩緩衝液中で１時間培養した。ＢＳＡを含まない酢酸塩緩衝液２．５ｍｌで洗浄した後、マーカー（１２）の５０ｍＭのＤＭＳＯ溶液２μｌを添加した。１分放置、５回の洗浄および各回１ｍｌの酢酸塩緩衝液による遠心分離の後、９．６×１０10個の活性ファージと５×１０10個の不活性ファージを含む１％ＢＳＡ入りの酢酸塩緩衝液中のファージ０．８ｍｌを静かに攪拌しながら４℃で一夜で懸濁液に添加した。２０ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ２０ｍｌおよび５０ｍｌの０．１％ツイーン２０ＰＢＳ溶液で洗浄した後、ファージを因子Ｘａで溶出し、実施例VIと同じように数えた。１．１５×１０5個の活性ファージおよび１．８５×１０5個の不活性ファージがこの方法で回収された。従って得られた増量倍数は３．２であった。
実施例IX：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：アシル−酵素結合の加水分解による溶出
β−ラクタマーゼと自殺インヒビターとの間の結合、すなわちアシル−酵素結合を切断することによってファージを回収する可能性を確かめるために、活性ファージと不活性ファージの混合物で、実施例VIIIのそれと類似した実験を行った。
２．８×１０10個の活性ファージと１．０５×１０10個の不活性ファージを含む混合物を、マーカーを固定したカラム上に負荷〔ｓｉｃ〕させた。実施例VIIIと同様の強力な洗浄の後、懸濁液を室温に一夜放置し、遠心分離からの上澄液を分析した。１．４×１０5個の活性ファージおよび２．５×１０5個の不活性ファージがこの方法で回収された。従って得られた増量倍数は２．１であった。
上記の各実施例において、固定できるリガンドとインヒビターとの間のアームの寸法は小さいので、固定されたファージのパーセンテージは低い。この欠点を避けるために、サイズの大きいアームを持つ別のマーカーが調製された。
実施例Ｘ：  自殺インヒビターとリガンドとの間のサイズの大きいアームによって与えられた活性β−ラクタマーゼのマーカーの合成
重炭酸塩で飽和された水中の２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１４）への１当量のクロロ蟻酸ベンジル（１３）の付加によって、カルボベンゾイルオキシ−２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１５）（図７）を調製した。生成物を有機相で抽出し、シリカカラムで精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は５８％であった。
ウィトモアおよびランダウの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６８、１７９７〜１７９８頁（１９４６））により、塩化２−クロロエタン−スルホニル（１６）からビニル−スルホン酸エチル（１７）を調製した。それを０．６ｍｍＨｇで８８℃において横型蒸留で精製して、無色の油を得た（収率４５％）。乾燥アセトニトリル中の（１７）に１当量の保護されたアミノアルコール（１５）を加え、これに微粉砕した重炭酸カリウムを添加した。８０℃で３日間加熱し、濾過および溶媒の蒸発の後、生成物（１８）をシリカ上で精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は６０％であった。ティプソン等の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１２、１３３〜１３７（１９４７））により、スルホン官能基を脱保護して、２４時間の反応の後、ヘキサンでの洗浄の後に白色粉末の形の（１９）を得た（収率８６％）。この生成物はフジタの方法（合成、４２３〜４２３（１９８２））によって酸塩化物（２０）に変えた。
トリエチルアミンの存在においてジクロロメタン中で、酸塩化物（２０）（図７）を〔ｓｉｃ〕６−アミノペニシラン酸（６）のエステルと１時間で直接結合させた。生成物（２１）をシリカ上で精製し（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）、３４％の収率で得た。それをジョンソンらの方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２８、１９２７〜２８（１９６３））で酸化してスルホン（２２）とし、得られた生成物をエーテルで洗浄して、白色の固体を得、これをシリカ上で精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は７２％であった。
従来法によるエタノール中パラジューム／炭素上での水素添加によるアミン官能基の脱保護で、生成物（２３）（図８）が得られ、これはマーカー前駆体（２４）を得るためにスルホサクシニミジル・２−（ビオチンアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネート（１０）（Ｐｉｅｒｃｅ▲Ｒ▼が市販）と直接結合させ、前駆体はシリカ上でクロマトグラフィーにより精製した（溶出剤：酢酸エチル−ジクロロメタン５０：５０）。収率は１３％であった。
（２４）のペナム環の３位のカルボキシル官能基の保護は、キムらの方法（テトラヘドロン・レター、３２、３０９９〜３１００（１９９１））によってジクロロメタン中で臭化マグネシウムの助けで除去した。
実施例ＸＩ：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：インヒビターによる標識付け、因子Ｘａによる溶出
ビオチンリガンドと自殺インヒビターモジュールとを連結するアームの寸法の影響を調べるために、活性ファージと不活性ファージとの混合物のインヒビター（２４）による標識付けで、増量の実験を行った。
１％ＢＳＡ入りの酢酸塩緩衝液１．５ｍｌ中の１．２×１０10個の活性ファージと３．３×１０10個の不活性ファージを含む混合物を０．７５ｍＭの最終濃度のマーカーの存在下に置き、スレプトアビジンの上を通した。カラムの洗浄、実施例VIIに述べた溶出および分析の後、６．８×１０6個の活性ファージおよび１．９×１０5個の不活性ファージが得られた。従って得られた増量倍数は９８であった。
実施例ＸII：  自殺インヒビターとリガンドとの間に寸法の大きいアームを与える第二の活性β−ラクタマーゼマーカーの合成
リガンドと自殺インヒビターとの間に寸法の大きいアームを与えるマーカーを合成するための一般的な方法を得るために、活性化されたエステル官能基を有するために多数のインヒビターと結合できる、それ自体寸法の大きいアームを含んでいる前駆体を調製した。それをβ−ラクタマーゼの自殺インヒビターに結合させた。
前記のように、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドとビオチン−Ｎ−ε−アミノカプロン酸の活性化エステル（２６）を調製した（ウィルチェックおよびバイエル、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚ．（１９９０）、１８４、１２３〜１６０）。これをＤＭＦに溶解し、３当量のシスタミン（２６）〔ｓｉｃ〕のＤＭＦ溶液に添加した（図９）。
エーテル（溶液の体積の１０倍容）による沈澱で単離した粗生成物を塩化リチウムで平衡化したセファローズＳ（ファーマシア▲Ｒ▼）カラムで、２５％エタノールを溶出剤として使って、精製した。付加生成物（２８）は、５０ｍＭのＬｉＣｌで溶出した。溶液を冷凍乾燥した。収率は７９％であった。
アセトニトリルに溶解したグルタール酸無水物（２９）３当量を、１０％エタノールをふくむ緩衝水性媒体（ＫＨＣＯ3−Ｋ2ＣＯ3、５０／５０、１０ｍＭ、ｐＨ９．６）に０．０１Ｍのオーダーで溶かした精製済みの生成物（ＬｉＣｌを含む）に少しずつ加えた。得られた酸（３０）をｐＨ２まで１ＮのＨＣｌで酸性にして沈澱させた。生成物を濾過し乾燥した。収率は４３％であった。
この酸（３０）はＤＭＦ中ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の助けでＮ−ヒドロキシサクシニミド（３１）と結合させることによって、標準条件下で活性化されたエステルに変えた。７２時間の後、反応媒体は乾燥エーテルで沈澱させた。沈澱をデシケーターで乾燥し（収率：８７％）、この生成物（３２）はそのまま乾燥エタノール中での６−アミノペニシラン酸（６）の脱保護されたエステルとの連結反応に使用された。
実施例ＸIII：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：常磁性粒子上への固定
ストレプトアビジンが常磁性の粒子の上で行われた以外は、実験VIに類似した実験を行った。洗浄は新しい緩衝液中への再懸濁で行った。固定したファージの溶出は、５０ｍＭのジチオスレイトールで行った。増量倍数は実施例VIと同様にして求めた。
実施例ＸIV：  活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ）および不活性ファージ（ｆｄ−ｂｌａ-）を含む混合物の活性ファージの増量：ポリスチレン管内での「パンニング」による固定
ポリスチレン管の表面で「パンニング」によってストレプトアビジンを固定し、つぎに従来ＥＬＩＳＡ試験に使う方法を行う以外は、実験VIIに類似した実験を行う。洗浄は洗浄は新しい緩衝液中への再懸濁で行う。固定したファージの溶出は、因子Ｘａで行う。増量倍数は実施例VIIと同様にして求める。
実施例ＸIIIおよびＸIVにおいて、洗浄がクロマトグラフィー法を使った実施例におけるよりも迅速に行え、ファージがゲル中よりも捕捉しにくいとすると、増量実験のこれらの変法は高い増量倍数の観察にはより適したものである。
実施例ＸＶ：  アプザイムを担持するファージの〔原文のまま〕選択
この場合、共有結合インヒビターはアプザイムまたは特定の遷移状態の同族体によって触媒されるべき反応の自殺インヒビター特性から成るであろう。
これらのファージの検出および選択は、つぎにその表面に活性酵素を露出するファージの検出および選択と同じ方法で行われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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