(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下図：
0004046349.tif 000010
のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、腫瘍細胞増殖の阻害活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。
【請求項７】
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを請求項６に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。
【請求項８】
ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造する方法であって、細胞を請求項５に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、腫瘍細胞増殖の阻害活性、を有するポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストであって、該アンタゴニストは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、該ポリペプチドの発現を阻害することができるアンチセンス分子であるアンタゴニスト。
【請求項１２】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤であって、有効成分として請求項９に記載のポリペプチドを含む薬剤。
【請求項１３】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤であって、請求項９に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として含み、該ポリペプチドをインビボにおいて発現させる薬剤。
【請求項１４】
請求項９に記載のポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法であって、
スクリーニングすべき化合物の存在下または不存在下、ヒト静脈内皮細胞、コンカナバリン−Ａ、請求項９に記載のポリペプチド、［3Ｈ］チミジンを混合し；
内皮細胞による［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定し；および
該化合物が［3Ｈ］チミジンの取り込みを高めたか、またはブロックしたかどうかを測定する；
ことを含んでなる方法。
【請求項１５】
下図：
0004046349.tif 000011
の塩基配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドであって、腫瘍細胞増殖の阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
異種のポリヌクレオチドに融合している請求項１〜２、及び１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
異種のポリヌクレオチドが異種のポリペプチドをコードする請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
該異種のポリペプチドが請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに融合している請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に結合している請求項５又は１９に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１または１５に記載の該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを請求項２１に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。
【請求項２３】
宿主細胞が原核細胞、真核細胞、脊椎動物細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＨＯ細胞、又はＥ．Ｃｏｌｉ細胞である請求項６又は２１に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
ポリペプチドが標識され、又はポリエチレングリコールに融合している請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドが異種のポリペプチドに融合している請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドがＮ−末端メチオニンを欠いている請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドがＮ−末端メチオニンを有する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
抗体が請求項９に記載のポリペプチドに特異的に結合する請求項１０に記載の抗体。
【請求項２９】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、ヒト化抗体、又はＦａｂ断片である請求項１０又は２８に記載の抗体。
【請求項３０】
請求項１〜４及び１５〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、及び担体を含む、患者における腫瘍細胞増殖を阻害するための組成物。
【請求項３１】
請求項９、２４〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、及び担体を含む患者における腫瘍細胞増殖を阻害するための組成物。
【請求項３２】
患者における腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬の製造における請求項１〜４及び１５〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用の方法。
【請求項３３】
患者における腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬の製造における請求項９及び２４〜２７のいずれかに記載のポリペプチドの使用の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、腫瘍壊死因子ファミリーの新たなメンバーとして同定され、以下で「ＴＮＦ−γ」と呼ぶ。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンフォトキシン）は、サイトカインと総称される、インターフェロン、インターロイキンおよび増殖因子が含まれる、ポリペプチドメディエーターの広範にわたるクラスの関係するメンバーである（Ｂeutler,Ｂ.およびＣerami,Ａ.、Ａnnu.Ｒev.Ｉmmunol.、７：６２５−６５５（１９８９））。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、元来、その抗腫瘍活性の結果として発見されたが、今や、免疫調節および炎症において重要な役割を担う多面的サイトカインとして認められている。現在まで、ＴＮＦ関連サイトカインファミリーの８つの既知のメンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンフォトキシン−α）、ＬＴ−β、並びにＦas、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−１ＢＢ受容体に対するリガンドがある。これらのタンパク質は、ＴＮＦ−βを除き、膜アンカーとして使用されることの多い、保存されたＣ末端配列、および可変性のＮ末端配列を有する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは両方とも、それらがＴＮＦ受容体に結合する場合、ホモトリマーとして機能する。
ＴＮＦは、単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含め、多くの細胞の種類により、また主として活性化マクロファージにより産生される。ＴＮＦ−αは、腫瘍の急速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶、寄生生物に対する耐性、抗ウイルス応答を引き起こすこと、敗血症性ショック、増殖調節、血管内皮効果および代謝効果において役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含め、様々な因子を分泌するよう、内皮細胞を誘発して、細胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１といったような、様々な細胞接着分子を上方調節する。ＴＮＦ−αおよびＦasリガンドはまた、プログラムされた細胞死を誘起することも示されている。
ＴＮＦまたはＬＴにより媒介される様々な細胞応答の誘起における第一段階は、それらが特異的な細胞表面受容体に結合することである。約５５ＫＤa（ＴＮＦ−Ｒ１）および７５ＫＤa（ＴＮＦ−Ｒ２）の２つの異なったＴＮＦ受容体が同定されており（Ｈohman,Ｈ.Ｐ.ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９））、また両方の受容体型に対応するヒトおよびマウスcＤＮＡが単離されて特徴付けられている（Ｌoetscher,Ｈ.ら、Ｃell、６１：３５１（１９９０））。両方のＴＮＦ−Ｒとも、細胞外、膜貫通および細胞内領域を含め、典型的な細胞表面受容体構造を共有する。
本発明のポリペプチドは、構造上の、アミノ酸配列の相同性、および機能上の類似性に基づいて、ＴＮＦファミリーの新規メンバーとして同定されており、例えば、ＴＮＦ−γは、炎症前タンパク質である。
本発明の一態様により、ＴＮＦ−γである新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。
本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトＴＮＦ−γをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、アナログ、並びに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメントおよび誘導体を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質の回収を促進する条件下、ヒトＴＮＦ−γの核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、アゴニストおよびアンタゴニストに関してスクリーニングするために、また治療目的に、例えば、創傷治癒に、腫瘍増殖を阻害するために、寄生生物、細菌およびウイルスに対する耐性を与えるために、炎症活性を誘起するために、内皮細胞およびある造血細胞の増殖を誘起するために、再狭窄を治療するために、またある自己免疫疾患を予防するために利用する方法を提供する。
本発明のまたさらなる態様により、ヒトＴＮＦ−γ配列へ特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブもまた提供する。
本発明の別の態様により、ＴＮＦ−γによく似ており、またＴＮＦ−γ受容体に結合して、ＴＮＦ−γ型の応答を誘発する、ＴＮＦ−γアゴニストを提供する。
本発明のまた別の態様により、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片拒絶、骨吸収および悪液質を予防するために使用することができる、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。
本発明のさらに別の態様により、ＴＮＦ−γポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸配列の発現不足および過剰発現に関係のある疾患を検出するための診断アッセイを提供する。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。
以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
第１図は、本発明のポリペプチドのcＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を説明する。最初の２５個のアミノ酸（下線部）は、推定されるリーダー配列である。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。
第２図は、ＴＮＦ−γとＴＮＦファミリーの他のメンバーとの間のアミノ酸配列のアラインメント（alignment）を説明する。ＴＮＦ−γは、陰影をつけた範囲によって示されるように、ＴＮＦファミリーの保存されたアミノ酸残基を含む。
第３Ａ図は、ＴＮＦ−γが発現されるヒト組織を示す、ＲＮＡブロット分析である。示した組織から得られたＲＮＡを、標識化ＴＮＦ−γ cＤＮＡでプローブした。ＴＮＦ−γ mＲＮＡは、第３Ａ図が異なったバンドを示すことから、主として腎臓に存在する。他のレーンは、強いハイブリダイゼーションを示すようであるが、実際には、非特異的なスミア（smear）がある。
第３Ｂ図は、ＴＮＦ−γが、主として、レーン９であるＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞）において発現されることを示す、ＲＮＡブロット分析である。レーン６およびレーン８は、非特異的なスミアである。示した細胞系から得られたＲＮＡを、標識化ＴＮＦ−γ cＤＮＡでプローブした。レーン１は、ＣＡＭＡ１（乳癌）であり；レーン２は、ＡＮ３ＣＡ（子宮癌）であり；レーン３は、ＳＫ．ＵＴ．１（子宮癌）であり；レーン４は、ＭＧ６３（骨芽細胞腫）であり；レーン５は、ＨＯＳ（骨芽細胞腫）であり；レーン６は、ＭＣＦ７（乳癌）であり；レーン７は、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）であり；レーン８は、ＣＡＯＶ−３（卵巣癌）であり；レーン９は、ＨＵＶＥＣであり；レーン１０は、ＡＯＳＭＩＣ（平滑筋）であり；レーン１１は、包皮線維芽細胞である。
第４図は、細菌発現および精製により産生されたＴＮＦ−γを電気泳動した後のゲルの写真である。
第５図は、ＴＮＦ−γのバキュロウイルス発現後のゲルの写真である。
第６Ａ図は、未処理のＷＥＨＩ １６４細胞（左上）、並びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γにさらした後のＷＥＨＩ １６４細胞の写真である。伸長された、丸くない形態学を有する細胞が溶菌している。加えたＴＮＦは、約０．５μg／mlであった。ＴＮＦを加えてから７２時間後に写真を撮った。
第６Ｂ図は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと比較して、ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力を説明する。
第７図は、組換えＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βがＷＥＨＩ １６４細胞死を誘起する能力を説明する。
第８図は、組換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γがＬ９２９細胞において形態学的変化を誘起する能力を説明する。その形態学的変化は、黒く丸い細胞により示される。細胞を、Ｅ.Ｃoliが産生する組換えＴＮＦを用いて、約０．５μg／mlの割合で処理した。ＴＮＦを加えてから７２時間後に写真を撮った。その形態学的変化は、細胞が殺されていることを示す。
第９図は、静脈内皮細胞に対する、ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの効果のグラフ説明である。静脈内皮細胞を市販のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βおよびＥ.Ｃoliが産生するＴＮＦ−γで処理した後の細胞増殖を、ＭＴＳアッセイを利用して定量した。
第１０図は、ＨＬ６０細胞がばらばらに広がっていることを示す対照と共に、ＨＬ６０細胞の写真である；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−γは、細胞接着を誘起して、細胞と細胞が、右下で一緒に接着している細胞によって説明されるように接触する。
第１１図は、ＴＮＦ−γが、２つの既知の可溶性ＴＮＦ受容体、すなわちsＴＮＦ ＲＩ（p５５）およびsＴＮＦ ＲII（p７５）へ有意に結合しないことを説明する。
本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年１０月２６日にＡＴＣＣ寄託番号第７５９２７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト腎臓および臍静脈内皮細胞から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト臍静脈内皮細胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。それは、構造上、ＴＮＦファミリーに関係がある。それは、１７４個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち、最初の約２５個のアミノ酸残基は推定されるリーダー配列であることから、成熟タンパク質は１４９個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、ウサギＴＮＦ−αに対し、１１１個のアミノ酸範囲にわたり、３８％の同一性および５８％の類似性をもって、最も高い程度の相同性をＣ末端で示す。ＴＮＦファミリーのメンバー全てに保存された配列はまた、ＴＮＦ−γにおいても保存されている（第２図参照）。肉太の文字は、保存されたアミノ酸残基を示す。ＴＮＦ−γ mＲＮＡは、第３Ｂ図のＲＮＡブロット分析で示されるように、ヒト臍静脈内皮細胞において特異的に発現される。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード（アンチ−センス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。
第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、これに限定されるものではないが、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（また場合により、付加的コード配列）、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。
従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。
先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。
本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ（tag）であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。
本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。
本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。
第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基（好ましくは、同型アミノ酸残基）で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。
「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＴＮＦ−γ遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。
発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。
上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。
適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（Ｑiagen）、pＢＳ、pＤ１０、ファージスクリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene）；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（Ｐharmacia）。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ（Ｓtratagene）、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（Ｐharmacia）。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期（immediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。（Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９８６））。
宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９）により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相（phase）で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクターpＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン）およびＧＥＭ１（Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。
適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。
ＴＮＦ−γポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって）組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
本発明のＴＮＦ−γポリペプチドは、腫瘍細胞増殖または新形成を阻害するために使用することができる。該ＴＮＦ−γポリペプチドは、膜ブレビン（blebbin）（ゼイオシス（zeiosis））、細胞質の圧縮、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴付けられる、アポプトシスによる腫瘍破壊の原因となり得る（第７図）。表１に示されるように、ＴＮＦ−γは、異常な細胞増殖および調節を有する、試験した細胞系、例えば、線維肉腫および癌細胞系に対して、強い細胞毒活性を有する。このことはまた、第６Ａ図、第６Ｂ図および第８図でも説明されており、ここでは、ＴＮＦ−γが、細胞毒活性によってＬ９２９およびＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力を有することが示されている。ＷＥＨＩ １６４細胞は、マウス線維肉腫細胞である。ＴＮＦ−γを投与する好ましい方法は、腫瘍内への直接注射による。
ＴＮＦ−γの細胞接着活性は、創傷治癒に利用することができる。表１および第９図に示されるように、ＴＮＦ−γは強い内皮細胞増殖効果を有し、このことは、ＴＮＦ−γが創傷治癒において役割を担うことの指標である。ＴＮＦ−γの細胞接着効果はまた、創傷治癒においての役割も担い得る。
ＴＮＦ−γはまた、増殖促進活性を必要とする疾患、例えば、再狭窄を治療するのに使用することもできる。上述のように、ＴＮＦ−γは、内皮細胞増殖に対して強い増殖効果を有することが示されている。従って、ＴＮＦ−γはまた、造血および内皮細胞の発達を調節するのに使用することもできる。
該ＴＮＦ−γポリペプチドは、そのＴ細胞の活性化を刺激する能力により、免疫応答の重要なメディエーターである。従って、このポリペプチドは、様々な寄生生物、細菌およびウイルス感染に対する免疫応答を刺激するのに使用することができる。ＴＮＦ−γは、ウイルス感染細胞を溶菌することから、ＨＩＶ感染細胞を停止するのに使用することができる。
該ＴＮＦ−γポリペプチドはまた、Ｔ細胞増殖応答を高めることにより、Ｉ型糖尿病のような自己免疫疾患を治療するのに使用することもできる。
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本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のための、研究試薬および物質として使用することができる。
本発明は、ＴＮＦ−γに対する受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガンドパニング（panning）およびＦＡＣＳソーティングにより同定することができる（Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun.、１（２）、第５章（１９９１））。好ましくは、発現クローニングを利用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡをＴＮＦ−γに応答する細胞から調製して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプールに分けて、ＣＯＳ細胞またはＴＮＦ−γに応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標識化ＴＮＦ−γにさらす。ＴＮＦ−γは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を利用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定される受容体をコードする単一クローンを得る。
受容体を同定するための他の方法として、標識化ＴＮＦ−γを細胞膜と光親和性により結合させるか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することができる。橋かけ（cross-linked）物質をＰＡＧＥにより分けて、Ｘ線フィルムにさらす。ＴＮＦ−γ−受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであろう。
ＴＮＦ−γは、２つの可溶性ＴＮＦ受容体、sＴＮＦ−ＲＩ（p５５）およびsＴＮＦ−ＲII（p７５）へ有意に結合しない。従って、ＴＮＦ−γは、既知のＴＮＦタンパク質活性を含み、また既知のＴＮＦタンパク質の活性以外の活性を有し得る（第１１図参照）。
本発明はまた、化合物をスクリーニングして、ＴＮＦ−γによく似ている化合物（アゴニスト）を同定する、またはＴＮＦ−γの効果を防ぐ方法にも関する。そのような方法の一例は、ＴＮＦ−γがコミトゲン（comitogen）Ｃon Ａ.の存在下にヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激する能力を利用する。内皮細胞を得て、２μg／mlのＣon−Ａ（Ｃalbiochem、Ｌa Ｊolla、ＣＡ）の存在下、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈyclone Ｌabs、Ｌogan、ＵＴ）、１％Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシン、０．１％ゲンタマイシン（Ｇibco Ｌife Ｔechnologies、Ｇrand Ｉ sland、ＮＹ）を補ったＲＰＭ１ １６４０の入った、９６ウェルの平底培養プレート（Ｃostar、Ｃambridge、ＭＡ）で培養する。Ｃon−Ａ、およびスクリーニングすべき化合物を、最終体積が０．２mlとなるまで加える。３７℃で６０時間後、培養物を、１μＣiの［3Ｈ］チミジン（５Ｃi／mmol；１Ｃi＝３７ＢＧq；ＮＥＮ）で１２−１８時間パルスして、ガラス繊維フィルター（ＰhＤ；Ｃambridge Ｔechnology、Ｗatertown、ＭＡ）上に収集する。３回行った培養の平均の［3Ｈ］チミジンの取込み（cpm）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂeckman Ｉnstruments、Ｉrvine、ＣＡ）を使用して測定する。有意な［3Ｈ］チミジンの取込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
あるいはまた、ＴＮＦ−γと受容体との相互作用に続いて起こる、既知の第二メッセンジャーシステムの応答は、該化合物の存在下または不存在下に測定して比較されるであろう。そのような第二メッセンジャーシステムには、これらに限定されるものではないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解が含まれる。
アンタゴニストに関してアッセイするには、上記アッセイを行うが、このアッセイでは、ＴＮＦ−γを、スクリーニングすべき化合物と一緒に加え、また該化合物がＴＮＦ−γの存在下に［3Ｈ］チミジンの取込みを阻害する能力は、該化合物がＴＮＦ−γに対するアンタゴニストであることを示す。あるいはまた、ＴＮＦ−γアンタゴニストは、競合阻害アッセイに適当な条件下、ＴＮＦ−γおよび可能性のあるアンタゴニストを、膜に結合したＴＮＦ−γ受容体と、または組換え受容体と合わせることにより検出することができる。ＴＮＦ−γは、例えば、放射能より標識化することができることから、該受容体に結合したＴＮＦ−γ分子の数により、可能性のあるアンタゴニストの有効性を測定することができる。
あるいはまた、該化合物の存在下、ＴＮＦ−γ受容体を発現する哺乳動物の細胞または膜調製物を、標識化ＴＮＦ−γと共にインキュベートする。次いで、該化合物がこの相互作用を高める、またはブロックする能力を測定することができるであろう。
ＴＮＦ−γに特異的な抗体は、ＴＮＦ−γに結合して、ＴＮＦ−γがその受容体に結合できないようにすることにより、アンタゴニストとして使用することができる。この試薬において、モノクローナル抗体が特に有効である。該ＴＮＦ−γ受容体に特異的な抗体は、しかし、その受容体との相互作用に対するＴＮＦ−γの効果にアゴナイズ（agonize）傾向がある、異なった細胞応答を媒介し得る。
可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニストにはまた、ＴＮＦ−γ受容体に結合して、該受容体をその天然リガンドから有効にブロックするために第二メッセンジャー応答を全く誘発しない、ＴＮＦ−γの変異体も含まれる。具体的に設計されたオリゴヌクレオチドおよび小さな分子もまた、ＴＮＦ−γ受容体に結合して、ＴＮＦ−γ受容体をＴＮＦ−γからブロックすることができる。小さな分子の例には、これらに限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。
別の可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニストは、ＴＮＦ−γに結合して、ＴＮＦ−γが膜に結合したＴＮＦ−γ受容体と相互作用できないようにする、可溶性型のＴＮＦ−γ受容体である。この方法では、該受容体が、ＴＮＦ−γにより刺激されない。
別の可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニストは、アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し（三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照）、そのことによって、転写およびＴＮＦ−γの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＴＮＦ−γポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＴＮＦ−γの産生を阻害することができる。
ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γにより抑制されるリポタンパク質リパーゼの全身性欠損から起こる脂質清澄化欠損症である、悪液質を治療するのに使用することもできる。ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γが病原的役割を担うらしい、大脳マラリアを治療するのにも使用される。該アンタゴニストはまた、滑液細胞において、ＩＬ−１のような炎症性サイトカインの産生を誘起するＴＮＦ−γを阻害することにより、慢性関節リウマチを治療するのに使用することもできる。関節炎を治療する場合、ＴＮＦ−γを関節内に注射するのが好ましい。
該ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、移植片の存在下、ＴＮＦ−γによる免疫系の刺激を防ぐことにより、移植片拒絶を防ぐのに使用することもできる。
該ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γが骨吸収を誘起し得ることから、骨粗鬆症を治療するのに使用することもできる。
ＴＮＦ−γに対するアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γが炎症応答の高まりを媒介することから、抗炎症剤として使用することもできる。
該アンタゴニストはまた、敗血症性ショックとも呼ばれる内毒素性ショックを治療するのに使用することもできる。この重篤な病態は、細菌または他の種類の感染に対する応答の誇張から起こる。この応答は、ショックおよび組織損傷の原因となるＴＮＦ−γレベルの上昇をもたらす。
該アンタゴニストは、以下に記載するような薬学上許容され得る担体と共に、組成物中で使用することができる。
完全な長さのＴＮＦ−γ遺伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対する高い配列類似性、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この種類のプローブは、例えば、２０〜２０００塩基であり得る。好ましくは、しかし、該プローブは、３０〜５０塩基対を有する。該プローブはまた、完全な長さの転写物、並びにゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれる、完全なＴＮＦ−γ遺伝子を含むクローンに対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使用することもできる。スクリーニングの例としては、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することによって、ＴＮＦ−γ遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定する。
本発明のＴＮＦ−γポリペプチド並びにアゴニストおよびアンタゴニストは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該化合物、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明の医薬組成物は、他の治療化合物と共に使用することができる。
該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg（体重）の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg（体重）を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg（体重）である。
該ＴＮＦ−γポリペプチド、並びにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもできる。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知であって、本明細書中の教示から明らかである。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用により、細胞を操作することができる。
同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。例えば、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。
本発明はまた、疾患、または変異したＴＮＦ−γの存在に関係のある疾患に対する感受率を検出するための診断アッセイの一部としての、ＴＮＦ−γ遺伝子の使用にも関する。そのような疾患、例えば、腫瘍および癌といったような異常な細胞増殖は、ＴＮＦ−γの発現不足と関係がある。
ヒトＴＮＦ−γ遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ（Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６））を利用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。例としては、ＴＮＦ−γをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＴＮＦ−γ変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＴＮＦ−γ ＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＴＮＦ−γアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない複式物（duplexes）と区別することができる。
ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される（例えば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５）を参照）。
特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる（例えば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。
さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ分析により検出することもできる。
本発明はまた、正常な対照の組織試料と比較しての該タンパク質の過剰発現により、疾患、または疾患に対する感受率、例えば、腫瘍および大脳マラリアの存在を検出することができることから、様々な組織におけるＴＮＦ−γタンパク質レベルの変化を検出するための診断アッセイにも関する。宿主から得られた試料中のＴＮＦ−γタンパク質レベルを検出するために利用されるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology、１（２）、第６章、（１９９１））は、まず最初に、ＴＮＦ−γ抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含んでなる。さらに、リポーター抗体を、そのモノクローナル抗体に対して調製する。そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、また本実施例では、ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような、検出可能な試薬を結合させる。試料を直ちに宿主から取り除いて、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例えば、ポリスチレン皿の上でインキュベートする。次いで、ＢＳＡのような、非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノクローナル抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合した全てのＴＮＦ−γタンパク質に結合する。結合しなかったモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、ＴＮＦ−γに結合した全てのモノクローナル抗体への結合が起こる。次いで、結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加えて、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比較する場合、患者の試料の一定体積中に存在するＴＮＦ−γタンパク質の量の測定値である。
競合アッセイを利用することができ、ここでは、ＴＮＦ−γに特異的な抗体を固形保持体に結合させて、標識化ＴＮＦ−γおよび宿主から得られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出される標識の量を、試料中のＴＮＦ−γの量に関連づけることができる。
「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、ＴＮＦ−γを固形保持体上に通過させて、固形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗体をＴＮＦ−γに結合させる。標識化され、また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保持体上に通過させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することができる。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。
簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。配列の３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン（span）しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド（flow−sorted）染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。
cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２，０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ（ＥＳＴ）が得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２，０００bpが良好であり、４，０００はより良好であって、４，０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。
ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる）に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝（coinheritance））によって確認する。
次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。
現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。（これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する）。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋozborら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において）が含まれる。
単鎖抗体の産生に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。
本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。
以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。
「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。
切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。
「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう（Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁）。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０．５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。
実施例 １
ＴＮＦ−γの細菌発現および精製
最初に、ＴＮＦ−γをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９２７号を、ＴＮＦ−γタンパク質の５'配列、およびＴＮＦ−γ遺伝子の３'側ベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。ＴＮＦ−γに対応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に付加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
0004046349.tif 000003
を有し、ＢamＨＩ制限酵素部位、続いて、プロセッシングされたタンパク質コドンの推定される末端アミノ酸から始まる、ＴＮＦ−γコード配列の最初の２４ヌクレオチドを含む。３'配列：
0004046349.tif 000004
は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、続いて、ＴＮＦ−γの２２ヌクレオチド、およびＴＮＦ−γ ＤＮＡ挿入物の３'に位置するpＱＥ−９ベクター配列に対する相補的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−９（Ｑiagen）上の制限酵素部位に対応する。次いで、pＱＥ−９をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した。増幅された配列をpＱＥ−９にライゲートして、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載されている手順により、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.株をトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性（Ｋanr）も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp（１００ug／ml）とＫan（２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、０．４〜０．６の光学密度６００（Ｏ.Ｄ.600）まで増殖した。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＴＮＦ−γを精製した（Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４））。ニッケル−キレートカラムでの２回目の操作により、ＴＮＦ−γをさらに精製した。６モルのグアニジンＨＣl（pＨ５．０）中、ＴＮＦ−γ（純度９０％）をカラムから溶出し、また再生を目的として、ＰＢＳ緩衝液中で透析した。その発現産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、またその結果は、第４図（ここで、Ｍは、分子量マーカーであり；レーン１は、誘導された細胞ライゼートであり；レーン２は、誘導されない細胞ライゼートであり；レーン３は、２回のニッケル−キレートカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク質であり；レーン４は、１回のカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク質である）に見ることができる。
実施例 ２
バキュロウイルス発現システムを用いてのＴＮＦ−γのクローニングおよび発現
完全な長さのＴＮＦ−γタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９２７号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅した。
その５'プライマーは、配列：
0004046349.tif 000005
を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位（肉太の活字）、続いて、２４ヌクレオチドのＴＮＦ−γ遺伝子を含む（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く）。
その３'プライマーは、配列：
0004046349.tif 000006
を有し、また制限エンドヌクレアーゼＸbaＩの切断部位、およびＴＮＦ−γ遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な２２ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット（「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した後、１％アガロースゲル上で次に再度精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。
ベクターpＡ２（pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる）を、バキュロウイルス発現システムを用いてのＴＮＦ−γタンパク質の発現に使用した（レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照）。この発現ベクターは、オートグラファ（Ａutographa）カリフォルニアポリヘドロシスウイルス（ＡcＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸbaＩの認識部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした（cotransfected）野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＲＧ１、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＡ２の代わりに使用することができるであろう（Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９）。
プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、市販のキット（「Ｇeneclean」ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.）を使用して、ＤＮＡを１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせた。次いで、Ｅ.coli ＸＬ１ブルー細胞をトランスフォームした。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
リポフェクション法を利用して、プラスミドpＢac ＴＮＦ−γ ５μgを市販の線形化バキュロウイルス（「ＢaculoＧoldTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ）１．０μgと共に同時トランスフェクトした（Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７））。
ＢaculoＧoldTMウイルスＤＮＡ １μgおよびプラスミドpＢac ＴＮＦ−γ ５μgを、無血清グレイス（Ｇrace's）培地（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg、ＭＤ）５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン（Ｌipofectin）１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴加した。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。
４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith（上記）により記載されたようにして、プラークアッセイを行った。変法として、「Ｂlue Ｇal」（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg）を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見い出すことができる）。
連続希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用した。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存した。
Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＴＮＦ−γを感染させた。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００II培地（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg）に替えた。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの35Ｓ システイン５μＣi（Ａmersham）を加えた。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化した。第５図は、ゲルを説明する（ここで、レーン１およびレーン３は、ＴＮＦ−γおよび対照の培地であり；レーン２および４は、ＴＮＦ−γおよび対照の細胞ライゼートである）。
実施例 ３
ＣＯＳ細胞における組換えＴＮＦ−γの発現
プラスミド、ＴＮＦ−γ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（Ｉnvitrogen）から得られる。完全なＴＮＦ−γ前駆体およびその３'末端に枠内で融合したＨＡタグ（tag）をコードするＤＮＡフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化したことから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、およびＲ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７）。ＨＡタグを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。
プラスミド構築方法を以下に記載する：
ＴＮＦ−γをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９２７号を、２つのプライマーを用いてクローン化した、もとのＥＳＴでのＰＣＲにより構築した：
５'プライマー（バキュラ（bacula）の実施例に関するものと同じ）は、ＢamＨＩ部位、続いて、開始コドンから始まる２４ヌクレオチドのＴＮＦ−γコード配列を含む；
３'配列
0004046349.tif 000007
は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およびＴＮＦ−γコード配列の最後の１８ヌクレオチド（終止コドンは含まれていない）を含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＢamＨＩ部位、ＴＮＦ−γコード配列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＢamＨＩおよびＸbaＩ制限酵素で消化して、ライゲートさせた。そのライゲーション混合物をＥ.coli株ＳＵＲＥ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems、１１０９９ Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌa Ｊolla、ＣＡ ９２０３７から入手可能である）にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により試験した。組換えＴＮＦ−γの発現には、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８９））。ＴＮＦ−γ ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。（Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８８））。トランスフェクションから２日後、細胞を35Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０mＭ ＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０mＭトリス、pＨ７．５））で溶菌した。（Ｗilson，Ｉ.ら、同上３７：７６７（１９８４））。細胞溶菌液および培養培地は両方とも、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降した。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
実施例 ４
ヒト組織におけるＴＮＦ−γの発現パターン
ＲＮＡブロット分析を行って、ヒト組織におけるＴＮＦ−γの発現レベルを調べた。全体の細胞ＲＮＡ試料をＲＮＡzolTM Ｂシステム（Ｂiotecx Ｌaboratories,Ｉnc．６０２３ Ｓouth Ｌoop Ｅast、Ｈouston、ＴＸ ７７０３３）で単離した。指定された各々のヒト組織から単離された総ＲＮＡ約２μg（第３Ａ図のＲＮＡブロットに関して）を１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで分離して、ナイロンフィルター上にブロットした（Ｓambrook、Ｆritsch、およびＭaniatis、Ｍolecular Ｃloning、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress、（１９８９））。Ｓtratagene Ｐrime−Ｉtキットにより、標識化反応をＴＮＦ−γ cＤＮＡ５０ngで行っって、32Ｐ−標識化ＴＮＦ−γ cＤＮＡを産生した。標識化ＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラム（５ Ｐrime−３ Ｐrime,Ｉnc．５６０３ Ａrapahoe Ｒoad、Ｂoulder、ＣＯ ８０３０３）で精製した。次いで、０．５Ｍ ＮaＰＯ4（pＨ７．４）および７％ＳＤＳ中、フィルターを、１，０００，０００cpm／mlの、完全な長さの放射能標識化ＴＮＦ−γ遺伝子と、６５℃で一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、室温で２回および６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターを増感紙に−７０℃で一晩さらした。ＴＮＦ−γのメッセージＲＮＡは、腎臓に豊富である（第３Ａ図）。
示した組織から得られたポリＡ ＲＮＡ１０μgを使用することだけを変えて、同じ反応を第３Ｂ図に示す結果に関して行った。ＴＮＦ−γのメッセージＲＮＡは、ＨＵＶＥＣ細胞において主に発現する（第３Ｂ図）。
実施例 ５
組換えＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４およびＬ９２９細胞増殖を阻害し、ＨＬ−６０細胞における細胞接着を誘起して、内皮細胞増殖を促進する能力
ＰＢＳ中でのトリプシン処理により、接着性標的細胞を集密的（confluent）培養から調製し、非接着性標的細胞を静置培養から収集して、培養液で１回洗浄した。標的細胞を、１０％ＦＣＳを含む培養液中に３×１０5細胞／mlの割合で懸濁させた。０．１mlのアリコートを、細胞（ＷＥＨＩ １６４およびＬ９２９）の連続的に希釈した試験試料０．１mlを含む９６ウェルの平底マイクロタイタープレートへと分配した。７０時間インキュベーションし続けた。ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γを０．５μg／mlの濃度で加えた。ＭＴＳおよびメト硫酸フェナジン（ＰＭＳ）溶液２０μlを各々のウェルに加えることにより行われるＭＴＳアッセイを利用して、細胞毒性および増殖活性を定量した。３時間インキュベーションした後、４９２nmでのＯＤをＥＬＩＳＡプレート読み取り装置により測定した。ＯＤ492は、ウェル中の生存可能な細胞の数に比例する。細胞毒性のパーセントを以下のように計算した：
細胞毒性（％）＝（１００−測定したＯＤ／対照のＯＤ）×１００。
７２時間後に写真をとった。第６Ａ図および第８図で示すように、ＴＮＦ−γは、殺された黒く丸い細胞として現れるという、形態学的変化を誘起した。
第６Ｂ図のグラフでは、アッセイを上記のように行ったが、ＴＮＦの量を次第に増加させて加えた。その結果は、ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞のインヒビターであることを示す。
ＴＮＦ−γの接着能力を試験するために、ＨＬ−６０細胞を使用し、細胞接着および細胞と細胞の接触を顕微鏡で観察することにより測定して、２人の別々の研究者により個人的に記録した。第１０図は、細胞接着を誘起するＴＮＦ−γの能力を説明する。
ＴＮＦ−γが内皮細胞増殖を促進する能力を試験するためのアッセイでは、増殖指数（ＰＩ）を以下のように計算した：
ＰＩ＝測定したＯＤ／対照のＯＤ。
第８図は、ＴＮＦ−γが内皮細胞増殖のプロモーターであることを説明する。
実施例 ６
ＴＮＦ−γのアポプトシス能力の測定
第一インキュベーション段階では、抗ヒストン抗体をマイクロタイタープレートモジュールの壁に吸着固定させる。その後、壁の上の非特異的な結合部位をインキュベーション緩衝液（例えば、ブロッキング溶液）で処理することにより飽和する。第二インキュベーション段階の間に、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＴＮＦ−γで処理したＷＥＨＩ １６４細胞試料中に含まれるヌクレオソームが、それらのヒストン成分によって、固定化された抗ヒストン抗体に結合する。第三インキュベーション段階では、抗−ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をヌクレオソームのＤＮＡ部分と反応させる。結合しなかったペルオキシダーゼ複合体を洗浄工程により全て取り除いた後、ＡＢＴＳ（２,２'−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリン スルホネート］）を基質として用い、免疫複合体中に保有されるペルオキシダーゼの量を吸光光度法により測定する。抗ヒストン抗体は、試料から得られたヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４と反応する。抗−ＤＮＡ ＰＯＤ抗体を一本鎖および二本鎖ＤＮＡに結合させる。従って、ＥＬＩＳ Ａは、モノ−およびオリゴヌクレオソームの検出を可能とし、またアポプトシス的な（apoptotic）細胞死を測定するのに適用することができる。細胞死のレベルは、吸光度Ａ４０５nm／Ａ４９０として示される、細胞質ヒストンが結合したＤＮＡフラグメントの量により測定される（Ｂoehringer mannheimカタログ、０９９０ Ｃ ９３ ２ １５４１１７０を参照）（第７図を参照）。
実施例 ７
ＴＮＦ−γを用いての受容体結合アッセイ
６−Ｈisタグを用いて、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−γをＮi−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー精製し、１μg／ウェルをニッケルキレートで覆われた９６ウェルのプレート（Ｘenopore Ｃorp.）に加えて、２時間インキュベートした。３回洗浄した後、ヒト可溶性ＴＮＦ受容体、sＴＮＦ ＲＩまたはsＴＮＦ ＲII  １００ngを各々のウェルに加えて、２時間インキュベートした。そのプレートを３回洗浄して、sＴＮＦ ＲＩまたはsＴＮＦ ＲII（２００μl）に対する、アルカリ性ホスファターゼで標識化したポリクローナル抗体を加えた。基質溶液２００μlを各々のウェルに加えて、そのプレートを２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ読み取り装置（試験波長４５０nm、補正波長５９０nm）を用いて、ＯＤを測定した。第１１図に示す結果は、ＴＮＦ−γがsＴＮＦ受容体に有意に結合しないことを説明する。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。
配  列  表
（１）一般的情報：
（i）特許出願人：ユー等
（ii）発明の名称：ヒト腫瘍壊死因子−γ
（iii）配列の数：２
（iv）連絡先：
（Ａ）住所：カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラン，
セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン
（Ｂ）通り：ベッカー・ファーム・ロード６番
（Ｃ）市：ローズランド
（Ｄ）州：ニュージャージー
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：０７０６８
（v）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：３．５インチ ディスケット
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト５．１
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：同日
（Ｃ）分類：
（vii）先行技術データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：＿
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：フェルラロ，グレゴリー・ディ
（Ｂ）登録番号：３６，１３４
（Ｃ）参照／整理番号：３２５８００−２５６
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：２０１−９９４−１７００
（Ｂ）ファックス番号：２０１−９９４−１７４４
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴
（Ａ）長さ：２４４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：cＤＮＡ
（xi）配列の記述：配列番号１：
0004046349.tif 000008
（２）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記述：配列番号２：
0004046349.tif 000009
【図１】
0004046349.tif 000012
0004046349.tif 000013
【図２Ａ】
0004046349.tif 000014
【図２Ｂ】
0004046349.tif 000015
【図２Ｃ】
0004046349.tif 000016
【図３Ａ】
0004046349.tif 000017
【図３Ｂ】
0004046349.tif 000018
【図４】
0004046349.tif 000019
【図５】
0004046349.tif 000020
【図６Ａ】
0004046349.tif 000021
【図６Ｂａ】
0004046349.tif 000022
【図６Ｂｂ】
0004046349.tif 000023
【図６Ｂｃ】
0004046349.tif 000024
【図７】
0004046349.tif 000025
【図８】
0004046349.tif 000026
【図９Ａ】
0004046349.tif 000027
【図９Ｂ】
0004046349.tif 000028
【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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