(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
GGF/p185erbB2リガンド遺伝子によってコードされるポリペプチドであって、
p185erbB2レセプターと相互作用し、かつ配列認識番号１７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、グリア細胞の細胞分裂誘発を誘発する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４】
前記単離核酸分子が、配列認識番号２１の塩基配列を含む請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
プロモーターに作動連結された請求項３に記載の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項３に記載の単離核酸分子でトランスフォーム、またはトランスフェクトされた細胞ライン。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを生体外で産生する方法であって、
請求項６に記載の細胞ラインを提供する工程、前記細胞ラインを前記核酸分子の発現を許容する条件下で培養する工程、そして前記ポリペプチドを単離する工程、を有する方法。
【請求項８】
サンプル中における請求項１に記載のポリペプチドに対するレセプターの存在を同定する方法であって、
前記サンプルを前記ポリペプチドに接触させる工程、及びそれの間の結合を測定する工程を有し、前記結合が前記レセプターの存在の指標である、方法。
【請求項９】
許容可能な希釈剤、担体または賦形剤、および／または単位製剤での、医薬または獣医薬用に調製された請求項１に記載のポリペプチドを有する医薬または獣医薬用製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、１９本出願は、１９９２年１０月２３日出願の出願番号第０７／９６５，１７３号と、１９９２年９月３日出願の出願番号第０７／９４０，３８９号と、１９９２年６月３０日出願の出願番号第０７／９０７，１３８号と、１９９２年４月３日出願の出願番号第０７／８６３，７０３号との一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
本発明は、脊椎類に見られ、シュワン細胞を含むグリア細胞の細胞分裂誘発成長因子であるポリペプチドに関する。本発明は、更に、そのような因子を生成可能な方法と、そのような因子の治療的利用とにも関する。
【０００３】
脊椎類のグリア細胞は、中枢及び末梢神経システムの特殊化した結合組織を構成している。重要なグリア細胞としてシュワン細胞があるが、これは、ニューロンの為の代謝支持体を提供するとともに、特定の末梢神経の神経軸索の周囲に髄鞘（ミエリン鞘）を提供することによって、個別の神経繊維を形成する。シュワン細胞は、ニューロンを支持し、近接する神経軸索の周囲において近接同心の膜層を形成し、その成長につれて前記軸索の周囲において捻れながら形成されることによってミエリン鞘効果を提供するものである。これらのミエリン鞘は、多くの神経線維の弱い部分であり、これらシュワン細胞の損傷、発育及び成長の不全が、数多くの末梢神経システムの疾患と障害を特徴付ける大幅な脱髄や神経退化に関連している可能性がある。神経システムの発達において、その細胞がその分裂と成長を制御するのに様々な因子を必要とすることが明らかになった。そして、近年、このような種々の因子が同定され、これらの内のいくつかはシュワン細胞の分裂と発達に影響することが判っている。
【０００４】
従って、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎｔｅｒａｌｉａ，ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，４（１９８４）７５−８３は、ウシの脳と下垂体組織とからの抽出物質に存在するタンパク質成長因子について記載しており、これはグリア細胞成長因子（ＧＧＦ）と命名された。この因子は、ウシ胎仔血清を１０％含有するバックグラウンド培地において、培養ラットのシュワン細胞を刺激してこれを分裂させた。又、この因子は分子量が３１，０００ダルトンであり、容易にダイマー化することも記載されている。Ｉｎ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１４７（１９８７），２１７−２２５において、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）は、ＧＧＦの、シュワン細胞に基づく分析について記載している。
【０００５】
ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，上記、は、更に、ＧＧＦの外見上の均質状態への精製方法についても記載している。要約すると、ここに記載された一つの大規模精製方法は、凍結乾燥したウシの前頭葉の抽出と、それによって得られた物質をＣＭセルロースからのＮａＣｌグラジエント溶出を使用したクロマトグラフィーに関するものである。次に、ゲル濾過を、先ずウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）カラムで、次に、ホスホセルロースカラムで、そして最後に、小規模ＳＤＳゲル電気泳動法で行う。あるいは、前記ＣＭセルロース物質を、ホスホセルロースカラムに直接に適用し、該カラムからのフラクションをプールして、調製天然ゲル電気泳動によって精製し、その後、最終的なＳＤＳゲル電気泳動にかける。
【０００６】
ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他は、以前に報告されたゲル濾過実験（ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）８３７４−８３７７）において、成長因子活性の大きなピークが、分子量５６，０００ダルトンで移動（ｍｉｇｒａｔｅ）することが観察され、これに対して、上述の手法の最初のものにおいては、分子量３１，０００においておもに活性が観察された、と述べている。ＧＧＦダイマーは、この実験において、主として、ＣＭセルロースからのグラジエント溶出の生成物として除去されることが報告されている。
【０００７】
ベンヴェニスト（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ）他（ＰＮＡＳ，８２（１８８５），３９３０−３９３４）は、Ｔリンパ球由来のグリア細胞発育誘発因子について記載している。この因子は、還元状態において、ＳＤＳゲルの見かけ上の分子量の変化を示す。
【０００８】
キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）他（Ｎａｔｕｒｅ，３４８（１９９０），２５７−２６０）は、自ら神経線維腫由来成長因子（ＳＤＧＦ）と呼称する座骨神経鞘腫瘍から得られる因子について記載している。これらの著者は、反対に部分的に精製された下垂体フラクション含有のＧＧＦが活性な状態においては、ＳＤＧＦは、トリチウム標識化ＴｄＲのシュワン細胞への結合を刺激しないと述べている。ＳＤＧＦの見かけ上の分子量は３１，０００ないし３５，０００である。
【０００９】
デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）とストローバント（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ）（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０（１９９０），１３５３〜１３６０）とは、多数の候補細胞分裂誘発物質について記載している。ラットのシュワン細胞を使用し、選択された候補物質が、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）が１０％存在して、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存在する場合と、存在しない場合とにおいて、シュワン細胞へのＤＮＡ合成を刺激する能力をテストした。テストした因子の一つは、ＧＧＦ−カルボキシメチルセルロースフラクション（ＧＧＦ−ＣＭ）であり、これはＦＣＳが存在する場合、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存在及び不在の両方の場合において細胞分裂誘発作用を有していた。この研究に依り、フォルスコリンの存在下において、特に血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が、シュワン細胞に対する潜在的細胞分裂誘発物質であることが判った。ＰＤＧＦは、以前には、シュワン細胞に影響しないと考えられていたものである。
【００１０】
ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：１２０５及びウェン（Ｗｅｎ）他，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：５５９は、レセプター（ｐ１８５erbB2）に結合するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列がいくつかのヒトの腫瘍に関連していることを示している。
【００１１】
前記ｐ１８５erbB2タンパク質は、チロシンキナーゼ活性を備えた１８５キロダルトン膜長のタンパク質である。そしてこのタンパク質は、ｅｒｂＢ２プロト−がん遺伝子によってコード化される（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）及びユルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３（１９８８））。前記ｒｂＢ２遺伝子は、ＨＥＲ−２（ヒト細胞）、あるいはｅｎｅｕ（ラット細胞）とも呼称されるが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）のレセプターに密接に関連している。最近の証拠に依れば、ｐ１８５erbB2と作用する（そしてそのキナーゼを活性化する）タンパク質は、ｐ１８５erbB2を有する細胞の増殖を誘発することが示されている（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２）；ドバシ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８５８２（１９９１）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２２８７（１９９２））。更に、ｐ１８５erbB2結合タンパク質をコード化する前記遺伝子が、それぞれ長さが異なり、かつ、いくつかの共通のペプチド配列とユニークなペプチド配列とを含む一連のタンパク質を生成する多くの、大きさとスプライシングとが異なったＲＮＡ転写体を生成することが明らかである。これは、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）から得られるスプライシングが異なったＲＮＡ転写体によって証明されている（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２））。更に、これは（ここに記載されているように）ｐ１８５erbB2レセプターのためのリガンドとして作用する広範囲のタンパク質によっても証明されている（下記参照）。
【００１２】
発明の要旨
一般に、本発明は、グリア細胞（特に、シュワン細胞と中枢神経システムのグリア）の分裂を刺激する方法と、更に、そのようなグリア細胞の分裂誘発活性を示す新規なタンパク質とに関する。更に、これらのタンパク質とこれらタンパク質と、関連タンパク質とに結合する抗体をコード化するＤＮＡも提供される。
【００１３】
本発明の新規なタンパク質は、公知のポリペプチドをコード化する配列の別のスプライス生成物を含む。一般に、これらの公知タンパク質は、前記ＧＧＦ／ｐ１８５erbB2族タンパク質のメンバーである。
【００１４】
より詳しくは、本発明は、所定の式のポリペプチドと、これらのポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列とを提供する。即ち、これらポリペプチドは、以下の式を有する。
【００１５】
ＷＹＢＡＺＣＸ
ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列から成り（配列認識番号１３６〜１３９、１４１〜１４７、１６０、１６１）、Ｗは、ポリペプチドセグメントＦを有するかあるいは有さず、Ｙは、ポリペプチドセグメントＥを有するかあるいは有さず、Ｚは、ポリペプチドセグメントＧを有するかあるいは有さず、そして、ここにＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬを含み、
以下のいずれかの条件を満たす、
ａ）Ｆ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ｚ、Ｃ又はＸの少なくとも一つは、ウシ由来である、
ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであるか、又は、
ｃ）ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬを含む。
【００１６】
更に、本発明は、コード化セグメント5’ＦＢＡ3’と、図３１に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１３６、１３８、１３９）を有する対応のポリペプチドセグメントを備えたＤＮＡ配列も含む。
【００１７】
前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント5’ＦＢＡ3’と、図３１に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１４０）を有する対応のポリペプチドセグメントを含む。
【００１８】
前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント5’ＦＥＢＡ3’と、図３１に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１３６〜１３９）を有する対応のポリペプチドセグメントを含む。
【００１９】
前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント5’ＦＥＢＡ3’と、図３１に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１３６〜１３８、１４０）を有する対応のポリペプチドセグメントを含む。そして、前記ＤＮＡ配列は、ＣＧＦ２ＨＢＳ５  ｃＤＮＡクローンのポリペプチドコード化セグメントを含む（ＡＴＣＣ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．７５２９８，ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ１９９２年９月２日）。
【００２０】
本発明は、更に、式ＦＢＡ，ＦＥＢＡ，ＦＢＡ’，ＦＥＢＡ’のペプチドと、これらペプチドをコード化するＤＮＡ配列とを含み、前記ポリペプチドセグメントは、図３１において、それぞれ、配列認識番号（１３６，１３８及び１３９）、（１３６〜１３９）と（１３６、１３８及び１４０）、及び（１３６〜１３８及び１４０）とで示されるアミノ酸配列に対応する。精製ＧＧＦ−ＩＩポリペプチド（配列認識番号１７０）である前記ポリペプチドも本発明の一部に含まれる。
【００２１】
更に、本発明の一態様は、中枢神経システムのグリア、特に乏突起膠細胞、小グリア細胞及び星状膠細胞、の治療に有用なペプチドと、これらのペプチドをコード化するＤＮＡと、更にこれらのペプチドの投与方法を含む。
【００２２】
本発明は、更に、前記定義のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を含むベクターを含む。又、前述のアミノ酸配列をコード化する単離ＤＮＡを含有するホスト細胞も含まれる。本発明は、更に、前記ｐ１８５erbB2レセプターを結合し、生体内及び／又は生体外でグリア細胞分裂を刺激する化合物を含む。
【００２３】
また、前述の新規なペプチドに対する抗体も本発明の一部として含まれる。更に、ここに記載のすべてのペプチドに対する抗体は、ここに記載のポリペプチドの精製に利用可能である。又、これらのポリペプチド対する抗体は、グリア細胞の細胞分裂治療用インヒビターとしても利用可能である。
【００２４】
本発明は、更に、グリア細胞の細胞分裂を刺激する方法も提供し、該方法は、グリア細胞を以下の式で定義されるポリペプチドに接触させる工程を有する、即ち、
ＷＹＢＡＺＣＸ
ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列から成り（配列認識番号１３６〜１３９，１４１〜１４７，１６０，１６１）、Ｗは、ポリペプチドセグメントＦを有するかあるいは有さず、Ｙは、ポリペプチドセグメントＥを有するかあるいは有さず、Ｚは、ポリペプチドセグメントＧを有するかあるいは有さず、そして、ここにＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬを含む。
【００２５】
本発明は、更に、グリア細胞分裂誘発因子を合成する方法に関し、この方法は、上記定義の変成ホスト細胞を、本発明のＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において培養することから構成される。
【００２６】
本発明のペプチドは、薬用又は獣医用としての薬用調合物質又は獣医療調合物質の製造に利用可能である。オプションとして、前記調合物質は、許容可能な希釈液、キャリア又は賦形薬との併用で、及び／又は単位投与薬の形態として使用可能である。
【００２７】
グリア細胞を生体内又は生体外においてグリア細胞分裂誘発物質としての上述のポリペプチドと接触させることによってグリア細胞の細胞分裂を刺激する方法も本発明の一態様を構成するものである。有効量の前述のポリペプチドを投与することによって脊椎類（好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒト）においてグリア細胞細胞分裂効果を作り出す方法も本発明の一部である。
【００２８】
前述のポリペプチドを使用して様々な疾病及び障害を治療する方法も本発明の一部である。例えば、前述のポリペプチドによって、神経疾病又は障害の治療又は予防方法を行うことができる。更に、前記ポリペプチドに対して敏感であるか又は反応する種類の細胞における神経系の病態生理学的症状を予防又は治療する方法も、本発明の一部を構成する。
【００２９】
更に、本発明は、末梢神経の損傷、中枢神経系における神経損傷、神経性障害、末梢又は中枢神経系における脱髄、シュワン細胞の損傷又は消失、乏突起膠細胞、小グリア細胞、星状膠細胞に関連する病状の治療方法にも関する。例えば、知覚神経繊維又は運動神経繊維の神経障害や、神経変成性障害の治療が含まれる。これらのいずれの場合においても、その治療方法は、有効量の前記ポリペプチドを投与する工程から成る。
【００３０】
本発明は、更に、有効量の前記ポリペプチドを投与することによって、神経の再生及び／又は修復する方法にも関する。そのような薬品は、前記ポリペプチドを薬剤的に有効なキャリアと共に投与することによって得られる。
【００３１】
本発明は、薬品の製造における前記ポリペプチドの使用にも関する。
【００３２】
本発明は、更に、前記定義のポリペプチドの以下に記載するような使用を含む。
・選択的に治療又は診断目的に利用可能な抗体を生成するために哺乳動物を免疫化するのに利用すること。
・前記ポリペプチドのレセプター結合特性に対応するレセプター結合特性を有する分子を同定したり定量化したりする競合アッセイに利用すること、及び／または、
・前記ポリペプチドに特異的に結合可能なレセプターとともにこのポリペプチドにサンプルを接触させて、該ポリペプチドに対する結合の競合阻害を検出する目的に利用すること、
・例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセスに使用して対応のレセプターを分離するのに利用すること。
【００３３】
本発明は、更に、グリア細胞腫瘍の予防又は治療方法にも関する。この方法は、前記ペプチドによって定義される因子の結合を抑止する物質の有効量を投与することから成る。
【００３４】
更に、本発明は、以下に記載するものをグリア細胞に適用することによってグリア細胞細胞分裂誘発活性を刺激する方法にも関する、即ち、
・ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞ラインから分離された３０ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系からグリア細胞に分離された３５ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・ＳＫＢＲ−３ヒト胸細胞系から分離された７５ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系から分離された４４ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・活性化マウス腹膜マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞から分離された４５ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・ＡＴＬ−２ヒトＴ−細胞ラインからグリア細胞に分離された７ないし１４ｋＤのポリペプチド因子、又は
・ウシ腎臓細胞から分離された２５ｋＤのポリペプチド因子、又は、
・脳から分離された４２ｋＤのポリペプチド因子（ＡＲＩＡ）。
【００３５】
本発明は、更に、生体内及び生体外でのグリア細胞の細胞分裂誘発の刺激用の、それぞれ図３８ないし４３において配列認識番号１５４〜１５９によって示されＥＧＦＬ１、ＥＧＦＬ２、ＥＧＦＬ３、ＥＧＦＬ４、ＥＧＦＬ５、ＥＧＦＬ６ポリペプチドの利用方法にも関する。
【００３６】
本発明には、更に、グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する図４５のその配列を示すＧＣＦ−ＩＩポリペプチドの投与も含まれる。
【００３７】
本発明の他の一態様は、上記のペプチドを、シュワン細胞を刺激して科学的用途又は治療用途に採取可能な成長因子を生成させる使用にも関する。
【００３８】
更に、ここに記載のペプチドは、再髄鞘形成が必要な、例えばＭＳ等の疾患の治療のための、中枢グリア細胞の増殖及び再髄鞘形成誘発に利用することも可能である。
【００３９】
本発明の更に別の態様において、ここに記載の新規なポリペプチドは、アセチルコリンレセプターの合成を刺激するのに利用できる。
【００４０】
上述のように、本発明は、公知の因子とは異なった、ウシやヒトを含むほ乳類源から得られる新規なグリア成長因子を提供するものである。これらの因子は、ウシ胎仔血漿（ＦＣＰ）をバックグラウンドとして、シュワン細胞に対して細胞分裂誘発活性を有する。本発明は、更に、これらの因子の調合方法と、これら及びその他の因子の活性を定義する改良方法も提供するものである。これら因子の治療への適用も本発明の重要な一態様である。
【００４１】
従って、本発明の重要な特徴は以下の通りである。
（ａ）ウシ胎仔血漿の存在下においてグリア細胞分裂誘発活性、特に、シュワン細胞分裂誘発活性を有し、分子量が約３０ｋＤないし約３６ｋＤの範囲で、そのアミノ酸配列内に、以下に記載のペプチド配列の一つ又は複数を有する基礎（ベーシック）ポリペプチド因子、
0004127567.tif 000002
及び、
（ｂ）ウシ胎仔血漿の存在下において、グリア細胞の細胞分裂誘発、特に、シュワン細胞の分裂誘発を刺激する基礎ポリペプチド因子であって、分子量が約５５ｋＤないし約６３ｋＤの範囲であり、そのアミノ酸配列内において以下のペプチド配列のうちの一つ又は複数のものを含む、
0004127567.tif 000003
【００４２】
分子量が小さなポリペプチド因子と、分子量が大きなポリペプチド因子とから得られる上記の新規なペプチド配列も、それ自身本発明の権利の一部を構成するものである。これらの配列は、本発明のポリペプチド因子について、広範囲の様々な種からこのような因子（又は対応の遺伝子配列）を調査し、分離し、あるいは合成し、又は、このような因子を遺伝子組替え技術によって合成するためのプローブ源として有用であり、更には、対応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、であってそれ自身が有用な研究手段であり、また治療物質としての可能性も有する抗体の、従来技術による合成にも有用である。本発明は、更に、本発明の新規なペプチド配列のための前記の方法によって得られる、遺伝子配列又はそのフラグメントをコード化する分離グリア細胞細胞分裂誘発活性にも関する。
【００４３】
本発明における高度に精製された因子から得られる短いペプチドの使用により、更に別の配列も特定することが可能になった（下記の例参照）。
【００４４】
従って、本発明は、更に、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有し、以下に記載するＤＮＡ配列によってコード化されるアミノ酸配列を備えたポリペプチド因子も含む。即ち、
（ａ）図２８Ａ、２８Ｂ又は２８Ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列識別番号１３３〜１３５で示されるＤＮＡ配列、
（ｂ）図２２において、配列識別番号８９によって示されるＤＮＡ配列、
（ｃ）図２８Ａにおいて配列識別番号１３３によって示される配列のヌクレオチド２８１〜５５７によって表されるＤＮＡ配列、
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）によって、いずれかのＤＮＡとハイブリダイゼーション可能なＤＮＡ配列。
【００４５】
本発明は、更に、上述の配列に対して６０％以上、好ましくは８０％以上の相同同一性を有する配列を含む。
【００４６】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件に限定されるものではないが、以下の実験記録は、便宜的に従われるガイダンスを提供するものである。
【００４７】
ＤＮＡプローブは、ショワルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）及びゾマー（Ｓｏｍｍｅｒ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７：９０−９４，１９８９）に従い、ニックトランスレーションあるいはＰＣＲ反応によって、高比活性（約１０8ないし１０9 32Ｐｄｍｐ／μｇに標識化して、Ｇ−１５０セファーデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムでの脱塩によって精製できる。プローブは、変性し（沸騰水中で１０分間、その後、冷水に漬ける）、次に、１０6ｄｐｍ32Ｐ／ｍｌにて１０％の硫酸デキストランを含有する８０％のバッファＢ（ポリビニルピロリジン２ｇ、Ｆｉｃｏｌｌ−４００  ２ｇ，ウシ血清アルブミン２ｇ，ＩＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ（ｐｈ７．５）５０ｍｌ，ＮａＣｌ  ５８ｇ，ピロ燐酸塩ナトリウム１ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム１０ｇ、Ｈ2Ｏ  ９５０ｍｌ）のハイブリダイゼーション溶液に加え、６０℃で一晩（約１６時間）培養することができる。次に、前記フィルターを、６０℃にて、先ず、バッファＢ中で１５分間、次に、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２０分間洗浄を３回、ＩＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２０分間の洗浄を１回行うことによって洗浄することができる。
【００４８】
その他の態様において、本発明は、以下記載のものを提供する、
（ａ）ウシ下垂体物質から得られた場合には、還元状態であるか否かに関わらず、下記の分子量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、約３０ｋＤないし約３６ｋＤの分子量が観察される基礎ポリペプチド因子：
リゾチーム（鶏卵白）１４，４００
大豆トリプシンインヒビター２１，５００
カルボニックアンヒドラーゼ（ウシ）３１，０００
卵白アルブミン（鶏卵白）４５，０００
ウシ血清アルブミン６６，２００
フォスフォリラーゼＢ（ラビット筋肉）９７，４００
そして、当該因子は、ウシ胎仔血漿の存在下において、ラットシュワン細胞の分裂を含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合、４℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後においてその活性の少なくとも５０％を保持する。そして、
（ｂ）ウシ下垂体物質から得られた場合に、非還元状態において、下記の分子量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、約５５ｋＤないし約６３ｋＤの分子量が観察される基礎ポリペプチド因子：
リゾチーム（鶏卵白）１４，４００
大豆トリプシンインヒビター２１，５００
カルボニックアンヒドラーゼ（ウシ）３１，０００
卵白アルブミン（鶏卵白）４５，０００
ウシ血清アルブミン６６，２００
フォスフォリラーゼＢ（ラビット筋肉）９７，４００
【００４９】
そして、当該因子のヒトの等価物質は、ここに記載のＤＮＡクローンＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化され、また該因子は、ウシ胎仔血漿の存在下において、ラットシュワン細胞の分裂を含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合、４℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後においてその活性の少なくとも５０％を保持する。
【００５０】
尚、便宜上、本発明の低い分子量の因子と高い分子量の因子とを、それぞれ、”ＧＧＦ−Ｉ”、”ＧＧＦ−ＩＩ”と称する。前記ＧＧＦ−ＩＩという表示は、ＧＧＦ−ＩＩタンパク質由来のペプチド配列データで分離されたすべてのクローン（即ち、ＧＧＦ２ＨＢＳ５，ＧＧＦ２ＢＰＰ３）に使用される。
【００５１】
尚、前述の分子量範囲は、正確なものではなく、特定のポリペプチド因子のソースによって僅かに変化するものである。たとえば、別のソースからの物質において約１０％の変化は不可能であろう。
【００５２】
本発明の別の重要な特徴は、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列であって、以下のＤＮＡ配列である、
（ａ）図２８Ａ，２８Ｂ又は２８Ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列識別番号１３３〜１３５で示されるＤＮＡ配列、
（ｂ）図２２において、配列識別番号８９によって示されるＤＮＡ配列、
（ｃ）図２８Ａにおいて配列識別番号１３３によって示される配列のヌクレオチド２８１〜５５７によって表されるＤＮＡ配列、
（ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）により、他のＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列。
【００５３】
本発明の別の態様は、グリア細胞因子とｐ１８５erbB2リガンドタンパク質とが前記同じ遺伝子によってコード化されるという事実を利用するものである。この遺伝子から様々なメッセンジャＲＮＡスプライシング変異体が由来し、これらの生成物質の多くが、ｐ１８５erbB2結合及び活性を示す。前記（ＧＧＦ−ＩＩ）遺伝子生成物のいくつかを使用して、シュワン細胞細胞分裂誘発活性が示された。本発明は、前記ＧＧＦ／ｐ１８５erbB2リガンド遺伝子のすべて公知の生成物（前記参考文献に記載されている）のシュワン細胞細胞分裂誘発物質としの利用を提供するものである。
【００５４】
本発明は、更に、その他のこれまで自然には分離されていないグリア成長因子遺伝子のスプライシング変異体にも関する。図３０は、ポリメラーゼ連鎖反応実験（逆転写ＲＮＡにおける）とｃＤＮＡクローン（ここに記載）の分析、更に、ｐ１８５erbB2リガンドをコード化する配列として公開されているもの（ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他，Ｃｅｌｌ ６９：２０５（１９９２）及びウェン（Ｗｅｎｎ）他，Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２））からのスプライシングの公知のパターンを示している。これらのパターンは、ここに記載のその他のパターンとともに、存在する可能なスプライシング変異体を表すものである。従って、本発明の別の態様は、この遺伝子から由来の新規なタンパク質因子をコード化するヌクレオチド配列に関する。本発明は、更に、これらの因子の合成方法にも関する。これらの新規な因子の治療への適用も本発明の更に別の態様を構成するものである。
【００５５】
従って、本発明の他の重要な特徴は以下の通りである、
（ａ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有する一連のヒト及びウシポリペプチド因子。これらのポリペプチド配列は、図３１，３２，３３及び３４において、それぞれ配列識別番号１３６〜１３７として示されている。
（ｂ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有する一連のポリペプチド因子であって、以下の記載概要に基づいて精製され、特徴付けられるもの、即ち、ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｓｃｌｅｎｃｅ  ２４９：１５５２（１９９０）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２２８７（１９９２）；ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２）；ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他，６９：２０５（１９９２）；ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅｓ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３５４３（１９９１）；ドバシ（Ｄｏｂａｓｈｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８５８２（１９９１）；デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：１５３６（１９９１）；ビューモント（Ｂｅａｕｍｏｎｔ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０）；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０）、アスディン（Ｕｓｄｉｎ）およびフィッシュバック（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３−５０７（１９８６）；フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５５：３９７−４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７６６４−７６６８（１９９１）；及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５（１９９３）。
（ｃ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有するポリペプチド因子（ＧＧＦＢＰＰ５）。そのアミノ酸配列は、図３２において配列認識番号１４８によって示され、図３２において配列認識番号１４８によって示されるウシＤＮＡ配列によってコード化される。
【００５６】
上述の新規なヒトペプチド配列は、図３１、３２、３３、３４において、それぞれ配列認識番号１３６〜１５０として示され、これらは、天然ソース（適当な繊維組織から得られるｃＤＮＡライブラリー）からの完全長の相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）として分離可能であり、あるいは、当業者によって、個々のエクソン（例えば、分離エクソンとして得られる）とのＤＮＡ構造物として組立可能である。
【００５７】
ｐ１８５erbB2レセプターに特異的に結合する他の化合物、特に、ペプチドも、本発明においては、グリア細胞細胞分裂誘発物質として利用可能である。候補化合物は、ｐ１８５erbB2結合によりルーチン的にスクリーニングすることが出来、もしも結合する場合には、ここに記載の方法を使用してグリア細胞細胞分裂誘発活性のスクリーニングを行うことができる。
【００５８】
本発明は、活性が大幅に減少したものでない、上記ポリペプチド因子のすべての変成物質及び等価物質も含む。例えば、その活性に大きな悪影響を与えることなくアミノ酸内容又は配列を変化させた改変物質が含まれる。例として、天然タンパク質のＥＰ−Ａ１０９７４８に於ける突然変異が開示され、ここでは、生物学的反応には必要の無い該天然の配列中のシステインを中性アミノ酸に置換することによって、不要な二硫化物結合の可能性を避けている。従ってここに含まれる効果及び使用方法の記載は、このような改変物質及び同等物質の効果及び使用方法をも含むものであると理解される。
【００５９】
本発明の新規な配列は、組替え技術の利点を新たに開くものである。従って、本発明は、以下の態様を含む。
（ａ）前記構築物による形質転換後の選択されたホスト細胞のベクター（前記配列の発現を許容すべく制御配列に対して位置決めされている）内の作動読み取り枠に於ける前述のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物（好ましくは、前記制御配列は、例えばＴｒｐ等の調節可能プロモーターを有している）。尚、プロモーターと調節配列（あるとすれば）の選択は当業者に於ける選択事項である。
（ｂ）前記ＤＮＡ配列が前記ホスト細胞において発現できるように上記（ａ）に定義された構築物を組み込むことによって変成されたホスト細胞−ホストの選択は重要でなく、選択される細胞は、原核生物あるいは真核生物のいずれであってもよく、公知の方法によって遺伝子的に変形して前記構築物を組み込むことが可能である。そして
（ｃ）ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において、変成されたホスト細胞を培養することからなる上記因子の合成方法。前記条件は、ＤＮＡ組替え技術の当業者によって実施態様に応じて容易に決定することが可能である。本発明は、この手段によって合成されたグリア細胞細胞分裂誘発物質を含む。
【００６０】
該技術において記載されているいずれの因子も、本発明の新規なポリペプチド因子が有する組合せの特性を有していない。
【００６１】
前述したように、本発明の因子を特徴付けるシュワン細胞分析は、バックグランドとしてウシ胎仔血漿を使用する。その他すべての点においては、この分析は、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐｒａと同じであってよいが、但し、１０％のＦＣＳを１０％のＦＣＰで置き換える。この分析技術の違いは重要である。というのは、ウシ胎仔血漿において血清由来の因子が不在であることによって（血清に対抗するように）、その他のいくつかの因子からの疑似効果を除去することにより、シュワン細胞に於ける活性を厳密に定義することが可能になるからである。
【００６２】
本発明は、更に、上述のポリペプチドを調製する方法を含み、該方法は、タンパク質を得るために脊椎類の脳物質を抽出し、この抽出物をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣによってクロマトグラフィ精製し、次に、これらのフラクションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることよりなる。約３０ｋＤの分子量が観察されたフラクション及び／又は約５５ｋＤないし６３ｋＤの分子量が観察されたフラクションを採取する。いずれの場合においても、このフラクションを、下記の分子量標準を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。
【００６３】
リゾチーム（鶏卵白）１４，４００
大豆トリプシンインヒビター２１，５００
カルボニックアンヒドラーゼ（ウシ）３１，０００
卵アルブミン（鶏卵白）４５，０００
ウシ血清アルブミン６６，２００
フォスフォリラーゼＢ（ラビット筋肉）９７，４００
【００６４】
分子量の小さなフラクションの場合には、前記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを、非還元条件下、あるいは還元条件下のいずれかでランさせ、分子量の大きなフラクションの場合には、該ゲルを非還元条件下でランさせる。次に、これらのフラクションの、ウシ胎仔血漿のバックグラウンド下でラットシュワン細胞の分裂を刺激する活性についてテストする。
【００６５】
好ましくは、上記方法は、例えば、ウシ下垂体物質からのカルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィによって得られた関連フラクションを分離することによって始める。又、好ましくは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、及び／または逆相ＨＰＬＣを使用する。この方法の各段階において、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）ｉｎ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐｒａに一般的手段として記載されている分析、但し、１０％ＦＣＰを１０％ＦＣＳに代えた分析、により、放射性ヨウ化デオキシウリジンを標準として組み入れシュワン細胞を使用することによって活性を測定することができる。
【００６６】
従って、本発明は、更に、分析対象の物質によって刺激された（もしあれば）グリア細胞におけるＤＮＡ合成を評価することに対して、バックグランドとしてウシ胎仔血漿を使用するグリア細胞細胞分裂誘発活性の分析方法を含む。
【００６７】
本発明の更に別の態様は、オプションとして、許容可能な希釈液、キャリア又は補形薬との併用で、及び／又は単位投与として使用される、薬用又は獣医用として調合された前述のすべての因子からなる薬用又は獣医療用調合物質に関する。本発明の因子の使用においては、適当な調合又は組成を提供するべく従来の薬学的又は獣医学的慣用手段を利用することが出来る。
【００６８】
従って、本発明は、例えば、静脈内、皮下内、筋肉内、眼窩内、眼用、心室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹膜内、鼻腔内、煙霧、乱刺の各投与そして又、経口、口内、直腸、又は膣への投与等の非経口投与法に適用可能である。
【００６９】
本発明の調合物は、更に、本発明のＤＮＡを発現するホスト細胞の患者への移植、あるいはこれら調合物を放出する外科移植によって投与することも可能である。
【００７０】
非経口調合物の形態は、溶液や懸濁液であってよく、又、経口投与調合物の形態は、錠剤、カプセル等であり、鼻腔内投与調合物の形態は、粉末、鼻腔点滴薬、エアロゾル等とすることができる。
【００７１】
公知の調合方法は、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。非経口投与用調合物は、補形薬として、例えば、滅菌した水または塩水、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物性オイル、水素化ナフタレン、生物学的適合性、生物分解性ラクチドポリマ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー等を使用して本発明の因子の放出を調節することが可能である。他のこれら因子の非経口投与システムとして可能なものとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能注入システムやリポソーム等がある。吸引用の調合物は、補形薬として、例えば、ラクトースを含有することが可能であり、又は、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩やデオキシコール酸塩等を含有する水溶液にしたり、鼻腔点滴液投与用としては油性溶液としたり、あるいは、ゲル状にしたりすることができる。非経口投与用調合物としては、更に、口内投与用にはグリココール酸塩、直腸投与にはメトキシサリチル酸塩、または膣投与用にはクエン酸等がある。
【００７２】
本発明の因子は、単独の活性薬剤として使用したり、あるいは他の活性成分、例えば、神経疾患における神経生存を容易にする他の成長因子や、ペプチダーゼ又はプロテアーゼインヒビター等と組み合わせて使用することができる。
【００７３】
本発明の調合物における本発明の因子の濃度は、投与される量な投与経路等の多くの要因に応じて変化する。
【００７４】
一般に、本発明の因子は、非経口投与用としては水性生理バッファ溶液中に約０．１ないし１０％ｗ／ｖ化合物を入れて提供することができる。一般的な投与量は、体重当り、一日につき、約１ｍｇ／ｋｇないし約１ｇ／ｋｇの範囲である。好ましい投与量範囲は、体重当り、一日につき、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇである。この好ましい投与量は、治療対象の病理状態の種類と程度、患者の全体的健康状態、調合物の形態及び投与経路によって異なったものになる。
【００７５】
前述のように、シュワン細胞（末梢神経系のグリア細胞）は、本発明の因子が存在することによって刺激され分裂する。末梢神経のシュワン細胞は、ニューロンの支持と、個々の神経線維の周りの髄鞘（ミエリン鞘）の形成に関連している。この鞘は、筋肉への電気パルスと知覚レセプターからの電気パルスの適当な伝達にとって重要である。
【００７６】
一次的又は二次的にシュワン細胞と神経線維が損傷を受ける数多くの種類の末梢神経障害が存在する。又、知覚神経と運動神経の双方の神経障害も数多くのものがある（アダムズ（Ａｄａｍｓ）およびヴィクター（Ｖｉｃｔｏｒ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。これらの神経障害のなかで最も重要なものは、恐らく、糖尿病、多発性硬化症、Ｌａｎｄｒｙ−Ｇｕｉｌｌｉａｎ−Ｂａｒｒ症候群、腫瘍によって発生する神経障害、及び毒物によって生じる神経障害（これらの内のいくつかは腫瘍の治療に利用される）である。
【００７７】
しかしながら、本発明は、神経システムの損傷が、例えば、感染又は怪我等いかなる原因によって生じた場合においても使用できる治療方法と予防方法とを提供するものである。従って、脱髄又はシュワン細胞の損失が存在する神経システムの障害又疾患の治療において本発明の因子を使用することに加えて、これらのグリア細胞成長因子は、末梢神経に対する損傷によって生じた神経系の障害の治療においても有効である。末梢神経に対する損傷の後、シュワン細胞の成長又は再形成によって再生プロセスが誘発され、その後、神経線維がその目標に向かって再成長する。シュワン細胞の分裂を加速することによって、損傷後の再生プロセスを促進することができる。
【００７８】
中枢神経系（脳及び脊髄）の損傷又は神経退化疾患の治療にも類似の方法を使用することができる。
【００７９】
更に、様々なグリア細胞の腫瘍があるが、それらの内で最も一般的なものは、恐らく、神経線維腫であり、これはグリア細胞の過剰成長によって生じる斑状小腫瘍である。又、いくつかのシュワン細胞腫瘍においてＧＧＦに非常に類似した活性物質が見られることも知られており、従って、それらのレセプターに対する本発明のインヒビター活性によってグリア腫瘍を治療することが出来、これは前述ように、因子のレセプターへの結合を阻害するのに有効量の物質を投与することからなる。
【００８０】
一般に、本発明は、因子−感受性又は因子−反応性細胞が関連する神経系の病態生理学的症状の予防又は治療に本発明のポリペプチド因子を使用することを含む。
【００８１】
本発明のポリペプチド因子は、更に、標準的技術に従って、モノクローナル抗体等の抗体を作る免疫源としても利用可能である。このような抗体も本発明の範囲に含まれる。又、これらの抗体を、治療や診断の目的の為に利用することも可能である。従って、恐らく因子が異常なレベルであることに関連する状態を、このような抗体を利用して追求することができる。標準的方法により単離されたサンプルの分析を利用し、生体外技術が使用できる。又、腫瘍画像化技術を利用して抗体を、例えば、放射性アイソトープで標識化し、体外から画像化できる画像化方法も、使用可能である。
【００８２】
本発明は、更に、前記因子を生体内（in vivo）又は生体外（in vitro）でグリア細胞細胞分裂誘発物質として使用することと、そのような用途としての因子とを含む。従って一つの具体的実施例は、有効量の本発明の因子を投与することによって、脊椎類においてグリア細胞細胞分裂誘発効果を生成する方法に関する。そのような方法の好適な実施例は、神経システム疾患又は障害の治療方法又は予防方法である。
【００８３】
本発明の更に別の態様は、本発明の因子を、薬品の製造、好ましくは、神経疾患又は障害、あるいは神経再生又は修復のための薬品の製造に使用することである。
【００８４】
更に、本発明は、本発明の因子の、前記ポリペプチドに対応のレセプター結合特性を有する分子を同定、あるいは定量する競合アッセイへの利用も含む。これらのポリペプチドは、ラジアイソトープによって標識化してもよい。競合アッセイは、関連するレセプターの拮抗薬と作用薬の両方を同定することができる。
【００８５】
別の態様において、本発明は、それぞれの対応レセプターを分離するために、例えばアフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセスにおける本発明の因子の使用を提供する。このような特定のタンパク質に対応するレセプターの分離のためのプロセスは、当該技術において公知であり、本発明の因子においても数多くの技術が適用可能である。例えば、ＩＬ−６とＩＦＮとに関して、ノヴィック，ディ（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．）他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１９９０）５１０：３３１−７が挙げられる。ゴナドトロピン放出ホルモンに関しては文献は以下のものである：ハザム，イー（Ｈａｚｕｍ，Ｅ．），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１９９０）５１０：２３３−８。またＧ−ＣＳＦに関しては、フクナガ，アール（Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１３３８６−９０がある。ＩＬ−２に関しては、スマート，ジェイ，イー（Ｓｍａｒｔ，Ｊ．Ｅ．）他，（１９９０）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４：１５８Ｓ−１６３Ｓがあり、ヒトＩＦＮ−ガンマに関しては、ステファノス，エス（Ｓｔｅｆａｎｏｓ，Ｓ．）他，（１９８９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．，９：７１９−３０がある。
【００８６】
図面の簡単な説明
先ず、図面について説明する。
図面
図１ないし８は、例１に関し、これらについて簡単に説明する。
図１は、カルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィからの生成物のプロフィール、
図２は、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣからの生成物のプロフィール、
図３は、モノ Ｓ ＦＰＬＣからの生成物のプロフィール、
図４は、ゲル濾過処理ＦＰＬＣの生成物のプロフィール、
図５及び６は、逆相ＨＰＬＣからの二つの部分的に精製されたポリペプチド生成物のプロフィールを示す、
図７及び８は、ウシ胎仔血清又はウシ胎仔血漿のバックグランドを使用した逆相ＨＰＬＣからのＧＣＦ−ＩＩ及びＧＣＦ−ＩＩの投与量−反応曲線を示す、
図９ないし１２は、ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０、２２〜２９、３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列を示し（後記の例２参照）、図１０及び１２は、特に、新規な配列を示す、
図１０において、パネルＡは、縮重オリゴヌクレオチドプローブと縮重ＰＣＲプライマーとを構成するのに使用するＧＣＦ−Ｉペプチドの配列がリストされている（配列認識番号２０，１，２２〜２９及び１７）。パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、合成ペプチドの構成にも使用された。パネルＢは、縮重プローブと縮重ＰＣＲプライマーの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリストである（配列認識番号１７及び５２）、
図１２において、パネルＡは、縮重オリゴヌクレオチドプローブと縮重ＰＣＲプライマーとを構成するのに使用するＧＣＦ−ＩＩペプチドの配列がリストされている（配列認識番号４５〜５２）。パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、合成ペプチドの構成に使用された。パネルＢは、縮重プローブと縮重ＰＣＲプライマーの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリストである（配列認識番号５３）、
図１３ないし２０は、後記の例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示し、
図２１ないし２８（ａ，ｂ及びｃ）は、後記の例４に関し、これらについて以下簡単に説明する、
図２１は、図１０のパネルＡ及び図１２のパネルＡに示された新規なペプチド配列から構成された縮重オリゴヌクレオチド（配列認識番号５４−８８）のリストである、
図２２（配列認識番号８９）は、縮重オリゴヌクレオチドプローブ６０９，６５０（それぞれ図２１，配列認識番号６９及び７２参照）の結合サイトを含有する組替えウシゲノムファーゼＧＣＦ２ＢＧ１からの推定ゲノムファーゼＧＧＦ２ＢＧ１のストレッチを示す。同図は、ＤＮＡ配列のコード化ストランドと第３読み取り枠の推定されたアミノ酸配列である。因子２（太字）からのペプチド１２の配列は、６６アミノ酸転写読み取り枠（ヌクレオチド７５２７２）の一部である、
図２３は、後部下垂体からのＲＮＡに存在するウシＧＧＦ−ＩＩコード下配列のセグメントを分離する実験に使用された縮重ＰＣＲプライマー（パネルＡ，配列認識番号９０〜１０８）とユニークなＰＣＲプライマー（パネルＢ，配列認識番号１０９〜１１９）である、
図２４は、図７のパネルＡ，Ｂのプライマーのリストを使用したＰＣＲ増幅実験において得られた９つの別々の隣接したウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ構造体と配列、及び後部下垂体からのＲＮＡを示す。同図の最上ラインは、特徴付けられたｃＤＮＡ構造体に寄与するコード化配列の略図である、
図２５は、ＧＧＦ２ＢＧ１のウシ組替えファーゼの物理的地図である。前記ウシフラグメントは、長さが約２０ｋｂであり、ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の二つのエクソン（太字）を有している。酵素Ｘｂａｌ，ＳｐｅＩ，Ｎｄｅｌ，ＥｃｏＲＩ，Ｋｐｎｌ，ＳｓｔＩの制限サイトがこの物理的地図上に示されている。斜線部分は、配列のためにサブクローンされたフラグメントに対応する、
図２６は、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の三つの別の遺伝子生成物の構造の略図である。エクソンはその発見の順番にＡないしＥとしてリストされている。別のスプライシングパターン１，２及び３は、三つのオーバーラップする推定タンパク質構造体（ＧＧＦ２ＢＰＰ１，２，３）を生成し、これらはそれぞれ別の図２８Ａ，Ｂ，Ｃ（下記）に示されている、
図２７（配列認識番号１２０〜１３２）は、図２８Ａ，２８Ｂ，２８Ｃ（下記）に示された推定タンパク質配列において同定されたＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩと、図１０及び１２にリストされた新規なペプチド配列との比較である。同図は、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つが、これらの推定タンパク質配列に見られることを示している。ＧＧＦ−Ｉ配列に類似の二つのペプチド配列も見られる、
図２８Ａ（配列認識番号１３３）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ．１から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２０６アミノ酸のタンパク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
図２８Ｂ（配列認識番号１３４）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ．２から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２８１アミノ酸のタンパク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
図２８Ｃ（配列認識番号１３５）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ．３から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２５７アミノ酸のタンパク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
図２９は、下記の例６に関し、サザンブロット上の様々なほ乳類ＤＮＡに対する推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子配列のクロスハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムである。前記フィルターは、同図にリストされた種からのＥｃｏＲＩ−消化ＤＮＡ（各レーンにつき５μｇ）を含有する。前記プローブは、図２５の物理的地図によって予測されるウシＤＮＡの４キロベースのフラグメントを含んで、各ＤＮＡサンプルにおける単一の強力なバンドを検出する。より力の小さいバンドも観察され、これらは関連ＤＮＡ配列を示す。他のほ乳類ＤＮＡサンプルからの強いハイブリダイゼーションバンドは、これらの種のＧＧＦ−ＩＩ相同体を示すものと考えられる。
図３０は、さまざまなスプライシング変異体を示す図である。コード化セグメントは、Ｆ，Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’，Ｄ，Ｄ’，Ｈ，Ｋ及びＬによって示されている。精製タンパク質からのペプチド配列の位置は、”０”によって示されている。
図３１（配列認識番号１３６〜１４７，１６０，１６１）はＧＧＦのコード化セグメントのＤＮＡ配列と予想ペプチド配列のリストである。ライン１は、ウシＧＧＦの予想アミノ酸配列のリストであり、ライン２は、ウシＧＧＦのヌクレオチド配列のリストであり、ライン３は、ヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列のリストであり（ヌクレオチドベースのマッチングは縦線にて示してある）、ライン４は、前記予想ウシ配列とは異なる場合におけるヒトＧＧＦ／ｈｅｒｅｇｕｌｉｎの予想アミノ酸配列のリストである。コード化セグメントＥ、Ａ’及びＫは、ウシ配列のみを表す。コード化セグメントＤ’は、ヒト（ヘレグリン）配列のみを表す。
図３２（配列認識番号１４８）は、ＢＰＰ５の予想ＧＧＦ２アミノ酸配列とヌクレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
図３３（配列認識番号１４９）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ２の予想アミノ酸配列とヌクレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
図３４（配列認識番号１５０）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ４の予想アミノ酸配列とヌクレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
図３５（配列認識番号１５１〜１５２）は、二つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧＦ２ｐｐ４とＧＧＦ２ｐｐ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）との整合を示す。星印は、保存されたシステインを示す。
図３６は、ＧＧＦの増加に対する、約２００ｋＤ（抗燐酸化ポリクローナル抗体とともに現像したウエスタンブロット上における２００ｋＤバンドの強度）のタンパク質のＧＧＦ活性のレベル（シュワン細胞細胞分裂誘発分析）と、チロシン燐酸化を示す。
図３７は、図３１の配列からのスプライシング変異体のリスト、
図３８は、ＥＧＦＬ１（配列認識番号１５４）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図３９は、ＥＧＦＬ２（配列認識番号１５５）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図４０は、ＥＧＦＬ３（配列認識番号１５６）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図４１は、ＥＧＦＬ４（配列認識番号１５７）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図４２は、ＥＧＦＬ５（配列認識番号１５８）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図４３は、ＥＧＦＬ６（配列認識番号１５９）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、
図４４は、クローンのスケールコード化セグメントマップである。Ｔ３は、前記クローンからｍＲＮＡを生成するのに使用するバクテリオファージプロモーターを示す。Ｒ＝隣接のＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。５’ＵＴは、５’非翻訳領域を示す。Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｃ，Ｃ／Ｄ’及びＤは、コード化セグメントを示す。０＝翻訳開始サイト。Λ＝ウシＥセグメントに対して相同の領域の５’限界（例６参照）、そして、３’ＵＴは３’非翻訳領域を示す。
図４５は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５の予想アミノ酸配列（中間部：配列認識番号１７０）と、核酸配列（上部：配列認識番号２１）とを示す。下部（中間）配列は、ＧＧＦ−ＩＩ調製物（図１１及び１２参照）からのペプチド配列を示す。
図４６は、組替えヒト及びウシグリア成長因子のシュワン細胞細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
図４７は、ＣＨＯ細胞のならし培地の大きさの異なる部分標本（ａｌｉｑｕｏｔｓ）の投与から生じたシュワン細胞増殖活性物質の投与量−反応曲線である。
図４８は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含有するバキュロウィルスによって感染したＳＦ９昆虫細胞によって細胞外培地中に分泌されたシュワン細胞細胞分裂誘発活性物質の投与量−反応曲線、
図４９は、ＧＧＦペプチド抗体を使用した組替えＣＨＯ細胞のならし培地のウェスタンブロット、
図５０Ａは、陽イオン交換カラムから溶出した組替え（ＣＯＳ細胞が生成）ヒトＧＧＦ−ＩＩ（ｒｈＧＧＦ−ＩＩ）ピークのシュワン細胞増殖活性のグラフであり、
図５０Ｂは、ｒｈＧＧＦＩＩの特定のペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体を使用した組替えＧＧＦＩＩピークに対する免疫ブロットである、
図５１Ａは、フラクションごとの陽イオン交換カラムでのｒｈＧＧＦ−ＩＩ（ＣＨＯ細胞が生成）の精製を示すグラフ、
図５１Ｂは、図５１Ａに示されたフラクションとｒｈＧＧＦ−ＩＩ特異抗体を使用したウエスタンブロットの写真である、
図５２は、組替えグリア成長因子で処理したシュワン細胞におけるチロシン燐酸化を示すゲルの写真、
図５３は、ＧＧＦＨＢＳ５，ＧＧＦＨＦＢ１及びＧＧＦＢＰＰ５ポリペプチド（配列認識番号１７０，１７１，１７２）の配列、
図５４は、前記ＣＨＯ細胞−発現ベクターｐｃＤＨＦＲｐｏｌｙＡのマップである。
【００８７】
詳細な説明
本発明は、新規なグリア成長因子の分離と精製、及び、これら因子をコード化するＤＮＡ配列のクローニングとに関する。本発明の他の組成物は、一連のグリア成長因子を潜在的にコード化できるいくつかの遺伝子スプライシング変異体、特に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５、特にウシＧＧＦ−ＩＩのヒト等価物をコード化する変異体である。ＧＧＦ’ｓ及びｐ１８５erbB2結合タンパク質をコード化する遺伝子が、長さが異なりいくつかの共通のペプチド配列といくつかのユニークなペプチド配列とを有する一連のタンパク質を生み出すＲＮＡ転写体であって、様々な大きさとスプライス状態の異なったＲＮＡ転写体を生成することは明らかである。これは、ウシ後方下垂体ＲＮＡ（ここに開示される）、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２））や鶏の脳のＲＮＡ（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ  ７２：１−２０（１９９３））から回収可能なスプライシングの異なる諸配列によって証拠付けられている。又、シュワン細胞に対する細胞分裂誘発物質（ここに開示）として、また、前記ｐ１８５erbB2レセプター（下記参照）のためのリガンドの両方として作用する広範囲のタンパク質によっても証拠付けられている。
【００８８】
前記ＧＧＦとｐ１８５erbB2をコード化する遺伝子が相同であるという事実の更なる証拠は、ヌクレオチド配列の比較から得られる。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（１９９２），（１２０５〜１２１０）ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，は、前記レセプタータンパク質ｐ１８５erbB2に特異的に反応し、いくつかのヒトの悪性腫瘍に関連する４５−キロダルトンのヒトタンパク質（ヘレグリン−α）の精製について記載している。ヘレグリン−αをコード化するいくつかの相補性ＤＮＡクローンが分離された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ ６９：２０５（１９９２））及びウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２））は、「ｎｅｕ分化因子」（ＮＤＦ）と称するタンパク質をコード化するラット細胞から分離された相補性ＤＮＡについて記載している。前記ＮＤＦｃＤＮＡのトランスレーション生成物は、ｐ１８５erbB2結合活性を有する。アスディン（Ｕｓｄｉｎ）及びフィッシュバック，ジェイ（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｊ．）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３−５０７（１９８６）；フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５５：３９７−４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７６６４−７６６８（１９９１）；及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５（１９９３）は、レセプタータンパク質ｐ１８５erbB2と作用する４２Ｋｄのグリコプロテインの精製されたこと、また、いくつかの相補性ｃＤＮＡが分離されたこと（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他Ｃｅｌｌ ７２：８０１：８１５（１９９３））を示している。その他のグループとしては、ルプ（Ｌｕｐｕ）他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２２８７；ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）とペレス（Ｐｅｌｅｓ）（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３５４３；ルプ（Ｌｕｐｕ）他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５５２；ドバシ（Ｄｏｂａｓｈｉ）他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：１５３６；そしてフアング（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８−１１５１２等が含まれる。
【００８９】
他の実施例
本発明は、図３１のコード化セグメント（配列認識番号１３６〜１４７，１６０及び１６１）にほぼ相同のすべてのタンパク質と、自然発生ＧＧＦポリペプチドとを含む。更に、対立遺伝子変異体、自然突然変異体、誘発突然変異体、自然発生の核酸に対する高ストリンジェント条件又は低ストリンジェント条件下においてハイブリダイズしたＤＮＡによってコード化されたタンパク質（高ストリンジェント条件及び低ストリンジェント条件の定義に関しては、ここに参照文献として添付するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，６．３．１−６．３．６を参照）、そして、抗血清によってＧＧＦポリペプチドに特異的に結合したポリペプチド又はタンパク質も含まれる。又、この用語は、図３１からの配列を有するＧＧＦポリペプチドを含むキメラポリペプチドも含む。
【００９０】
以下の例は、本発明を限定するものではなく、本発明を有用に例示する目的で提供されるものであり、有効な調製技術に関するガイダンスを提供するものである。
【００９１】
下記の例３から理解されるように、本発明の因子は、ある範囲のタイプの細胞に細胞分裂誘発活性を示す。線維芽細胞に関する活性は、傷修復能力があることを示し、本発明は、この利用方法も含むものである。上述の調合物及び／又は薬品、及びその製造方法に関連の本発明の一般的記載は、適当な製造物とその使用方法を含むものであると理解されるべきである。これは、線維芽成長因子（ＦＧＦｓ）に対する類似の活性に関する報告に鑑みて、本発明に対し合理的に期待されるものである。例えば、Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，「ペプチド成長因子とそのレセプターＩ」３９６頁（Ｂａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂｏｈｌｅｎ）の「傷の治癒と繊維組織の修復におけるＦＧＦｓ」というタイトルを付けられた章を参照。
【００９２】
例１
ウシ下垂体からのＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩとの精製
Ｉ．因子−ＣＭフラクションの調製
４，０００の冷凍全ウシ下垂体（約１２ｋｇ）を一晩解凍し、先ず水で簡単に洗浄し、次に、Ｗａｒｉｎｇ  Ｂｌｅｎｄｅｒによって各々同量の０．１５Ｍ硫酸アンモニウムでバッチ処理によりホモジナイズした。このホモジナイズ化物を１．０ＭのＨＣｌでｐＨ４．５に調節し、４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけた。上澄液中のすべての脂肪分を、グラスウールを通過させることによって除去した。前記上澄液のｐＨを１．０ＭのＮａＯＨを使用して６．５に調整した後、固体の硫酸アンモニウムを添加して３６％の飽和溶液となるようにした。数時間の攪拌後、その縣濁液を４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけ、沈澱物を取り除いた。グラスウールでのフィルター処理後、更に前記上澄液に固体硫酸アンモニウムを追加し、７５％の飽和溶液となるようにし、数時間の攪拌後、これを再び４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけた。そのペレットを、約２リットルのｐＨ６．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム中にて再縣濁し、３ラ４０Ｌの同じバッファで透析した。透析物の導電性が２０．０μジーメンス以下であることを確認した後、毎分２ｍｌの流量で、カルボキシルセルロース（ＣＭ−５２，Ｗｈａｔｍａｎ）でパックしたバイオプロセスカラム（１２０ラ１１３ｍｍ，Ｐｈａｒａｃｉａ）に負荷した。このカラムを、先ず、２倍量のｐＨ６．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウムで、次に、２倍量の５０ｍＭＮａＣｌで、そして最後に２倍量の０．２Ｍ ＮａＣｌで、同じバッファ中にて洗浄した。最終工程中において、１０ｍＬ（５分間）のフラクションが収集された。フラクション７３〜１１８までをプールし、１０倍量のｐＨ６．．０の１０ｍＭ燐酸ナトリウムで２度、透析し、１００，０００ｇで６０分間の遠心分離によって浄化した。
【００９３】
ＩＩ．ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ
ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣは、グリア成長因子の分離において従来使用された技術ではないが、本発明において特に有効であることが判った。
【００９４】
前記ＣＭ−セルロースクロマトグラフィによって得られた物質を、０．０２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）によって濾過し、室温にて、ガードカラム（１５×２５ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ）を備えた高性能ハイドロキシアパタイトカラム（５０×５０ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ）に負荷し、ｐＨ６．０の１０ｍＭの燐酸カリウムで平衡させた。室温での抽出を、下記のプログラムされたリニアグラジエントを使用して毎分２ｍｌの流量で行った。
【００９５】
0004127567.tif 000004
【００９６】
６．０ｍＬ（３分間）フラクションを、前記グラジエント溶出中に採取した。フラクション３９〜４５をプールし、１０分量の５０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ６．０で透析した。
【００９７】
ＩＩＩ．モノ Ｓ ＦＰＬＣ
モノ Ｓ ＦＰＬＣにより、後のゲル濾過のためにより高濃度の物質を作ることが可能となった。
【００９８】
前記ハイドロキシアパタイトカラムからのプールされた物質のすべての粒状成分を、調製ＨＲ１０／１０モノ  Ｓ  陽イオン交換カラム（１００×１０ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける前に、１０，０００ｇでの浄化スピンによって、６０分間で除去し、次に、これを室温下で、毎分１．０ｍｌの流量でｐＨ６．０の５０ｍＭ燐酸ナトリウムに再平衡させた。これらの条件下において、結合したタンパク質を、下記のプログラムされた一次グラジエントを使用して溶出した。
【００９９】
0004127567.tif 000005
【０１００】
１．０ｍＬ（１分間）フラクションを、このグラジエントプログラム中に採取した。フラクション９９〜１１５までをプールした。
【０１０１】
ＩＶ．ゲル濾過ＦＰＬＣ
この工程は、最終精製処理の前に、本発明の二つの因子の分離より始め、濃縮フラクションを作った。
【０１０２】
この実験の目的のため、調製スペローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２ ＦＰＬＣ カラム（５１０×２０ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、その製造会社の指示に従って充填した。このカラムを標準化するために、製造会社の指示に従って、理論段数測定を行い、９，７００理論段数という値を得た。
【０１０３】
モノ Ｓ 溶出物質のプールを、室温において、２．５Ｍｌの部分標本ごとに、予めＣ１８逆相カラム（Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させた５０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．７５ＮａＣｌ ｐＨ６．０中で毎分１．０ｍＬの流量でこのカラムに適用した。各サンプルが該カラムに適用された後、３５分後から１ｍＬ（０．５分間）のフラクションが採取された。各実行（ラン）からフラクション２７ないし４１（ＧＧＦ−ＩＩ）及び４２〜５７（ＧＧＦ−Ｉ）
までがプールされた。
【０１０４】
Ｖ．逆相ＨＰＬＣ
上記スペローズの１２回のランから得られたＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩとを、それぞれ、三つの等しい部分標本に分割した。各部分を、ガードカートリッジ（ＲＰ−８，１５×３．２ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって保護され、４０℃に平衡させた、Ｃ８逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００ ７μ  Ｃ８  ２２０×４．６ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、毎分０．５ｍＬの流量で通過させた。これらの条件下において、下記のプログラムによるリニアグラジエントを使用してタンパク質を溶出した。
【０１０５】
0004127567.tif 000006
【０１０６】
２００μＬ（０．４分間）のフラクションを前記プログラムグラジエントの開始後からの１５．２分間でシリコン化チューブ（Ｍｕｌｔｉｌｕｂｅチューブ、Ｂｉｏｑｕｏｔｅ）内に採取した。
【０１０７】
ＶＩ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
この工程においては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｗａｔｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄのタンパク質分子量標準、低レンジ、カタログＮｏ．１６１−０３０４を使用した。実際に使用されたタンパク質とその分子量標準は、前述の通りであった。
【０１０８】
前記逆相プログラムのランから得たフラクション４７〜５３（ＧＧＦ−Ｉ）とフラクション６１〜６７（ＧＧＦ−ＩＩ）を、個別にプールした。このプールした物質の７μｌを、０．０１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，４％ＳＤＳ，２０％グリセロール、及びＧＧＦ−Ｉに対しては１０％のβ−メルカプトエタノールの等量混合液中で、５分間沸騰させ、４％の濃縮用ゲルを有する１１％ポリアクリルアミドＬａｅｍｍｌｉゲル中に充填し、５０Ｖの定電圧を１６時間かけた。このゲルを、次に、固定し、銀染色キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して染色した。これらの条件下において、前記因子は、分子量マーカーを基準として、相対分子量が３０，０００ないし３６，０００ダルトン（ＧＧＦ−Ｉ）と５５，０００ないし６３，０００ダルトン（ＧＧＦ−ＩＩ）の、幾分拡散したバンドとして観察される。前記ゲル染色から、前記逆相プログラム実行からプールされた物質において前記ＧＧＦ−Ｉ（５ＧＧＦ−ＩＩと同等のレベルで、他のタンパク質が存在することが明らかである。
【０１０９】
ＶＩＩ．トリフルオロ酢酸中における安定性
トリフルオロ酢酸存在下における、本発明の因子の安定性に関して得られたデータは以下の通りである。
【０１１０】
ＧＧＦ−Ｉ：０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記逆相ＨＰＬＣから得た物質を、カラムランの完了後１２時間以内と、その４０℃での１０週間の培養後とにおいて分析した。培養後、ＧＧＦ−Ｉは、カラム流出後、直接にとって分析した物質の活性の少なくとも５０％を保持していた。
ＧＧＦ−ＩＩ：０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記逆相ＨＰＬＣから得て、−２０℃て保存しておいて物質を、解凍後と、４０℃で４日間の培養後とにおいて分析した。培養後、ＧＧＦ−ＩＩは、解凍直後の物質の活性の少なくとも５０％を保持していた。
【０１１１】
尚、上記研究において使用されたトリフルオロ酢酸濃度は、逆相クロマトグラフィにおいて最も一般的に使用されるものである。
【０１１２】
ＶＩＩＩ．活性分析条件
特に明記の無い限り、すべての作業は３７℃で行った。そして図１ないし６に示されるように、各工程での活性は、下記の変更以外には、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐｒａ）の技術を使用して測定された。従って、シュワン細胞の調製において、５μＭのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＦＣＳ及びＧＧＦ以外に添加した。分析に使用した細胞は、継代数が１０以内の無線維芽細胞シュワン細胞であり、これらの細胞は、トリプシンとともにフラスコから除去され、１ミクロ・ウェル当り３．３千細胞の割合で平底９６−ウェル・プレートにプレート化した。
【０１１３】
［125Ｉ］ＩＵｄＲを、テスト溶液の添加後の最後の２４時間後に添加した。バックグラウンド（非刺激）の各分析に対する関与は、１００ｃｐｍ以下であり、最大の組込みは、シュワン細胞のバッチと継代数とに応じて、２０ないし２００倍（ｆｏｌｄ）であった。
【０１１４】
上述の逆相ＨＰＬＣから得られるＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩフラクションの場合、各因子に対する一本の曲線について、全く同じ前述の方法を使用して、二本の投与量−反応曲線が得られた。そして、この分析実験において上記方法は、各因子についての他の曲線を得るために、ウシ胎仔血漿をウシ胎仔血清に代えた点のみ変更された。その結果は、図７及び８に示されている。
【０１１５】
例２
精製ＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列
高度に精製したウシ下垂体ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩを使用してアミノ酸配列分析研究を行った。これらの配列の記載には従来式の単一文字コードを使用した。ペプチドは、還元されそしてカルボキシメチル化されたサンプルについて、リシルエンドペプチダーゼとプロテアーゼＶ８による消化物として得られた。特に前記ＧＧＦ−ＩＩのリシルエンドペプチダーゼの消化は、１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（前記マーカーに対するＭＷ）の５５〜−６５ＲＤ領域において行った。
【０１１６】
ＧＧＦ−Ｉに関して全部で２１のペプチド配列（図９、配列認識番号１〜２０，１６９参照）が得られ、その内の１２のペプチド（図１０、配列認識番号１，２２〜２９，１７，１９及び３２）は現在のタンパク質データベースには存在しないものであり、従って、新規な配列である。ＧＧＦ−ＩＩに関して全部で１２のペプチド配列（図１１）配列認識番号３３〜４４参照）が得られ、その内の１０のペプチド（図１２、配列認識番号４５〜５３）は現在のタンパク質データベースには存在しないものであり、従って、新規な配列である（例外は、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ ０６であり、これは多くのタンパク質においても同じ配列を示しているが、これらはその残基の数が小さいことから恐らく重要ではない）。これらの新規な配列が、ＧＧＦ−ＩとＩＩの真のアミノ酸配列の部分に対応するものである可能性は極めて高い。
【０１１７】
特に注目されるのはＧＧＦ−Ｉ ０７とＧＧＦ−ＩＩ １２とであって、これらは明らかに互いに密接に関連している。その類似性は、これらのペプチドの配列がほぼ確実に指定されたＧＧＦ類のそれであることと、汚染タンパク質由来である可能性が非常に低いこととを示すものである。
【０１１８】
更に、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ ０２において、配列Ｘ Ｓ Ｓは、Ｘによって示す位置におけるアスパラギンのＮ−結合の炭水化物部分（ｍｏｉｅｔｙ）の存在と一致している。
【０１１９】
一般に、図９及び１１において、Ｘは、サイクル中に同じ大きさの信号が一つ以上存在したか、あるいは、全く信号が無かったことによって一つの位置も確実に呼び出すことができなかったシーケンスサイクルを表す未知の残基を示している。星印は、最後に呼び出したアミノ酸が、そのペプチドに存在する最後のアミノ酸に対応するペプチドを示す。その他のタンパク質において、最後に呼び出したアミノ酸の後の信号強度では、そのペプチドの末端まで呼び出しを継続するのには不十分であった。右側のカラムは、ＮＢＲＦとＥＭＢＬ配列データベースを分析するためにＧＣＧパッケージＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡプログラムを使用して行ったコンピュータデータベースサーチの結果を示している。このカラムのタンパク質の名称は、その配列の一部の一致を示し、呼び出されたペプチドアミノ酸配列は最大２つのミスマッチを許容するものであった。疑問符（？）は、許容された３つのミスマッチを示している。使用された略記は以下の通りである。
【０１２０】
ＨＭＧ−１ 高移動性グループタンパク質−１
ＨＭＧ−２ 高移動性グループタンパク質−２
ＬＨ−アルファ 黄体形成ホルモンアルファサブユニット
ＬＨ−ベータ 黄体形成ホルモンベータサブユニット
【０１２１】
例３
精製ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩの細胞分裂誘発活性
ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩとの両方を含有する高度に精製したサンプルの細胞分裂誘発活性の研究を、定量方法により行った。この方法は、単一のミクロ培養による、ＤＮＡ合成、細胞組織形態、細胞数、細胞アンチゲンの発現の評価を可能にするものである。この技術は、以前にミュール（Ｍｕｉｒ）他，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８５，３７７−３８２，１９９０によって報告された方法を変更したものである。主な変更点は、１）非被覆ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートの使用、２）一ウェル当りの細胞数、３）１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）に代えての５％の胎児ウシ血漿（ＦＢＰ）の使用、そして４）培養に同時に添加された細胞分裂誘発物質と臭化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下における培養時間、である。更に、細胞の損失を避けるために、前記細胞の単層は、固定前において洗浄しなかった。そして、モノクローナル・マウス抗−ＢｒｄＵ抗体とペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体とを、分析の感度を高めるために、２倍にした。ラットの座骨神経シュワン細胞ように最適化した分析も、前記細胞培養条件に対して適当な変更を施した後に、いくつかの細胞系に使用した。
【０１２２】
Ｉ．細胞分裂誘発テスト
第１日目に、精製したシュワン細胞を、５％ＥＢＰ／ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（５，０００細胞／ウェル）中で、非被覆の９６ウェルのプレートにプレート化した。第２日目に、ＧＧＦ又はその他のテスト因子を、１０μｍの最終濃度のＢｒｄＵとともに、前記培養物に添加した。４８時間後（第４日目）、ＢｒｄＵ組み込みを、前記培地を吸引することによって終わらせ、室温で２０分間、７０％エタノールを２００μｌ／ウェル添加し、細胞を固定した。次に、これらの細胞を、水及び３７℃で１０分間、１００μｌの２Ｎ ＨＣｌでの培養によって変質させたＤＮＡで洗浄した。吸引後、残りの酸を、前記ウェルを０．１Ｍホウ酸塩バッファｐＨ９．０で満たすことによって中和し、細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に、細胞を、５０μｌのブロッキングバッファ（０．１％のトリトンＸ１００と２％の正常ヤギ血清とを含有するＰＢＳ）で３７℃にて１５分間処理した。吸引後、モノクローナル・マウス抗−ＢｒｄＵ抗体（ダコ・コーポレイション（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ．），カリフォルニア州，サンタ・バーバラ）（５０μｌ／ウェル，ブロッキングバッファ中で１．４μｇ／ｍｌに希釈）を添加し、３７℃で２時間培養した。非結合抗体を、０．１％トリトンＸ−１００を含有のＰＢＳ中において３回洗浄して除去し、ペルオキシダーゼ−結合ヤギ・抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ・コーポレイション（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ．），カリフォルニア州，サンタ・バーバラ）（５０μｌ／ウェル，ブロッキングバッファ中で２μｇ／ｍｌに希釈）を添加し、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳ／トリトンでの３回の洗浄と、ＰＢＳ中での最終すすぎ後、ウェルは、０．０５％の溶解性クロモゲンＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と、０．０２％のＨ2Ｏ2とを含有する１００μｌ／ウェルの５０ｍＭのｐＨ５．０燐酸／クエン酸塩バッファを受けた。室温で５〜２０分後、各ウェルから８０μｌを、２Ｎ硫酸を４０μｌ／ウェル含有するクリーンなプレートにピペットで移すことによって、前記反応をに終結させた。４９０ｎｍにおける吸光はプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）を使用して記録した。前記細胞単層を含有する分析プレートを、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を加えてＢｒＤＵ−ＤＮＡについて免疫細胞化学的に染色し、０．０２％のＨ2Ｏ2とを添加することによって不溶性生成物とした。１０〜２０分後、前記染色反応を、水で洗浄することによって終結させ、倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用してＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核を観察計数した。場合により、ネガティブ核を０．００１％のトルイジンブルーで対比染色し、上述と同じように計数した。
【０１２３】
ＩＩ．細胞分裂誘発分析に使用した細胞系
Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３線維芽細胞：Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓからの細胞を、１０％ＣＯ2の空気中で、加湿雰囲気下、３７℃で、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中に保持した。細胞を、２日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて５，０００細胞／ウェルの濃度でプレート化し、細胞が融合性を得て、静止状態になるまで１週間培養した。血清を含有する培地を除去し、細胞単層を、無血清培地で２回洗浄した。細胞分裂誘発物質を含有する１００μｌの無血清培地と、１０μＭのＢｒｄＵとを各ウェルに添加し、４８時間培養した。ＧＧＦと血清又はＰＤＧＦ（ホジティブコントロールとして）に対する投与量反応を行った。
【０１２４】
ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）２１  Ｃ１３線維芽細胞：動物細胞培養ヨーロッパ保存機関（ＥＣＡＣＣ）からの細胞を、５％ＣＯ2空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したグラスゴー変法イーグル培地（ＧＭＥＭ）中で保持した。細胞を、２ないし３日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて、２，０００細胞／ウェルの濃度で、２４時間プレート化した。血清を含有する培地を除去し、無血清培地で２回洗浄した後、１００μｌの、０．１％のＦＣＳを含有するＧＭＥＭあるいはＧＭＥＭのみで、置換した。ホジティブコントロールとしてＧＧＦとＦＣＳ又はｂＦＧＦとを、１０μＭのＢｒｄＵとともに、添加し、４８時間培養した。次に、細胞培養のシュワン細胞を、前述の方法で処理した。
【０１２５】
Ｃ６ラットグリオマ細胞系：継代３９から得た細胞を、１０％ＣＯ2空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５％のＦＣＳ、ウマ血清（ＨＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ中で保持した。細胞を、３日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて２，０００細胞／ウェルの濃度でプレート化し、２４時間培養した。次に、培地を、無血清培地中にて洗浄した後、ＤＭＥＭと０．１％のＦＣＳを含有するＦ１２の１：１の混合物にて置換した。次に、ＧＧＦ，ＦＣＳ及びαＦＧＦに対する投与量反応を行い、細胞を、他のタイプの細胞に関して前述した方法でＥＬＩＳＡを通じて処理した。
【０１２６】
ＰＣ１２（Ｒａｔ  Ａｄｒｅｎａｌ  Ｐｈｅｏ−ｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ細胞）：ＥＣＡＣＣからの細胞を、５％ＣＯ2空気中、加湿雰囲気下で、３７℃でコラーゲン被覆フラスコ内にて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞を、３日毎に培地の８０％を置換することによって、供給した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて３，０００細胞／ウェルの濃度でコラーゲン被覆プレート（５０μｌ／ウェルコラーゲン、ヴィトロゲン・コラーゲン・コーポレイション（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、１：５０に希釈、３７℃で３０分間）にプレート化し、２４時間培養した。次に、前記培地を、新たなＲＰＭＩのみか、あるいは、１ｍＭのインシュリンを含有したもの、あるいは、１％のＦＣＳによって置換した。ポジィティブコントロールとしてのＦＣＳ／ＨＳ（１：２）及びＧＧＦとに対する投与量反応を前述のように行った。４８時間後、細胞を固定して、ＥＬＩＳＡを前述したように行った。
【０１２７】
ＩＩＩ．細胞分裂誘発分析の結果：
この例におけるすべての実験は、セファロース１２クロマトグラフィー精製工程（例１のセクションＤ参照）からの、ＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦｓ）との混合物を含有する高度に精製したサンプルを使用して行った。
【０１２８】
先ず、ＢｒｄＵ組み込み分析によって得られた結果を、Ｊ．Ｐ．Ｂｒｏｃｋｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４７：２１７，１９８７）に記載の、分裂細胞のＤＮＡへの［１２５］Ｉ−ＵｄＲ組み込みに基づくシュワン細胞の古典的な細胞分裂誘発分析と比較した。
【０１２９】
図１３は、同じ細胞培養条件（５，０００細胞／ウェル５％ＦＢＰ／ＤＭＥＭ中、ＧＧＦｓ又の存在下で４８時間培養）で行われた二つの分析によって得られた結果を比較して示したものである。同図に明らかに示されているように、これらの結果は比較可能であるが、ＢｒｄＵ組み込み分析の方が、グラフにおいて曲線が左側、即ち、ＧＧＦＳの低い濃度の方へシフトしていることに示されるように、僅かに感度が高い。
【０１３０】
「細胞分裂誘発テスト方法」と題された章に記載されているように、免疫反応性ＢｒｄＵ−ＤＮＡを、前記ＯＰＤペルオキシダーゼ反応の溶解生成物強度を読み取ることによって定量化した後、細胞単層を含有する元の分析プレートを、第２の反応をさせて、非溶解性ＤＡＢ生成物を得ることができ、これはＢｒｄＵポジティブ細胞核を染色する。前記マイクロ培養を、次に倒立顕微鏡で調べ、細胞の形態と、ＢｒｄＵ−ポジティブ及びネガティブ細胞核の数を観察することができる。
【０１３１】
図１４ａ及び図１４ｂにおいて、４９０ｎｍでの吸収の読み取りによって評価されたＢｒｄＵ−ＤＮＡの免疫活性が、同じ培養内における、ＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核の数と、ウェル当りのＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核の百分率と比較されている。標準偏差は、１０％以内であった。二つの評価方法は、ＧＧＦｓの最大投与量における値の間の非常に良好な相関関係と不一致とが、ＢｒｄＵ−ポジティブとして検出された細胞におけるＤＮＡ合成の程度の違いによって説明可能であることを示している。
【０１３２】
従って、ＢｒｄＵ組み込み分析は、前記（１２５）Ｉ−ＵｄＲ組み込み分析との比較した場合、シュワン細胞に対するポリペプチドの生物学的活性についての別の有用な情報を提供するものである。例えば、図１５に報告されるデータは、ＧＧＦｓがシュワン細胞に作用して、ＤＮＡ合成を誘発することができるが、より少ない投与量においては、４８時間後においてマイクロ培養中に存在するネガティブ細胞の数を増やすことを示している。
【０１３３】
次に、前記分析を、起源の異なるいくつかの細胞系に使用した。図１６において、ＧＧＦｓに対する、シュワン細胞とＳｗｉｓｓ線維芽細胞との細胞分裂誘発反応が比較されており、３Ｔ３線維芽細胞においては弱い反応しか得られなかったにもかかわらず、これらの培養中においていくつかのはっきりとしたＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核が検出された。コントロール培養を、ＦＣＳ又はヒト組替えＰＤＧＦの複数の投与量の存在下において平行に実行したところ、これら細胞が適当な刺激に対して反応可能であることが判った（図示せず）。
【０１３４】
線維芽細胞のＧＧＦｓに対する反応性を、更に、ＢＨＫ  ２１  Ｃ１３細胞系を使用して調べた。これらの腎臓から得た線維芽細胞は、接触阻止反応を示さず、あるいは、融合性状態の場合に静止状態には到らない。従って、細胞の生存力を損なわない範囲で、バックグラウンドの増殖が非常に低くなるように実験条件を調節した。ＧＧＦｓは、図１７及び１８に示すように、ＢＨＫ  ２１  Ｃ１３細胞において非常に顕著な細胞分裂誘発活性を有する。図１７は、０．１％のＦＣＳの存在下においてＧＧＦＳによって刺激されたＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞による、ＢｒｄＵのＤＮＡへの組み込みを示している。ＦＣＳに対する良好な応答は、細胞培養条件が限定的でなかったことを示している。図１８において、ＧＧＦｓの細胞分裂誘発効果が、１ウェル当りに計測されたＢｒｄＵ−ポジティブ及びＢｒｄＵ−ネガティブ細胞の数として表されている。データは、全く同一条件で実行された２つの実験を示すものであり、少なくとも一つのウェル毎に３つのフィールドが数えられた。シュワン細胞の観察において、低投与量における増殖性効果に加えて、ＧＧＦｓは、非反応性細胞の生存数も増加させる。ＢｒｄＵ−ポジティブ細胞の率は、前記培養に添加されたＧＧＦｓの増加量に比例する。高投与量のＧＧＦｓの存在下における４８時間後の細胞の総数は、少なくとも２倍に増加し、これはＧＧＦｓがＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞におけるＤＮＡ合成と増殖とを誘発することを確証するものである。同じ条件下において、２％のＦＣＳの存在下において４８時間維持した細胞は、約６倍の増加を示した（図示せず）。
【０１３５】
Ｃ６グリオマ細胞は、グリア細胞の特性の研究のための有用なモデルを提供した。発現した表現型は、細胞継代に依存し、細胞は、初期段階においては星状膠細胞表現型に類似し、後期段階（継代数７０以降）においては乏突起膠細胞表現型に類似するようである。これらの実験において使用されたＣ６細胞は、継代数３９から継代数５２からのものであった。Ｃ６細胞はきわめて増殖性の高い個体群であるので、ＢｒｄＵ組み込みのバックグランドを非常に低くするように実験条件を最適化した。ＦＣＳに対する投与量反応に示されるように、細胞分裂誘発反応に大きく影響することなく細胞の生存力を維持するのに、０．１％の血清の存在が必要であった（図１９）。
【０１３６】
図２０において、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞成長因子）とＧＧＦｓとに対する細胞分裂誘発反応が、ＦＣＳ（８％）の存在下において得られた最大のＢｒｄＵ組み込みの百分率として表されている。値は、全く同一の条件で実行された二つの実験の平均値である。ＧＧＦの効果は、ａＦＧＦの純粋調合物の効果と等価である。Ｃ６細胞の独特の成長因子としてａＦＧＦが既に記載されており（Ｌｉｍ  Ｒ  ｅｔ ａｌ．，１：７４１−７４６，１９９０）、その理由で、これはポジティブコントロールとして使用された。ＢｒｄＵポジティブ及びネガティブ細胞を直接に数えることは、マイクロ培養の細胞濃度が高かったために不可能であった。これまでに報告された細胞系とは対照的に、ＰＣ１２細胞は、このＰＣ１２が血清に対して反応可能な培養条件下（細胞の維持において通常に使用されるＦＣＳとＨＳとの混合物）において処理された場合ＧＧＦ２に対してはっきりとした反応を示さない。しかしながら、各ウェル毎のプレート化された細胞の数は、ＰＣ１２細胞の挙動に影響するようである。従って、更に実験が必要である。
【０１３７】
例４．ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩペプチドを含有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の分離とクローン化
ＧＧＦ−ＩＩヌクレオチド配列の分離とクローン化とを、ペプチド配列情報とライブラリースクリーニングとを使用した結果を外観し、そして以下に記載の方法によって実際に行った。尚、図４及び５のペプチドは、下記の技術に従ってＧＧＦ−Ｉ配列を分離及びクローン化する出発点として利用することができることは評価されるであろう。即ち、図２１（配列認識番号５４〜８８）は、この目的のために利用可能な縮重オリゴヌクレオチドプローブを示し、図２３（配列認識番号９０〜１１９）は、利用可能なＰＣＲプライマーをリストアップしている。ＤＮＡ配列とポリペプチド配列とは、ＧＧＦ−ＩＩと同様にこの手段によって入手されるべきであり、更に、このようなＤＮＡ配列を組み込んだＤＮＡ構築体と発現ベクター、このような構築体／ベクターを組み込むことによって遺伝子的に変成されたホスト細胞、また、このようなホスト細胞を培養することによって得られるタンパク質も同じである。本発明は、更に、これらの物質をも含む。
【０１３８】
Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーの構成と分析
前記アミノ酸配列（精製ＧＧＦタンパク質からのペプチド由来のもの）をヌクレオチド配列に逆転写（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ）することによって縮重ＤＮＡオリゴマープローブを構成した。オリゴマーは、前記ＤＮＡ配列のコード化ストランド又は非コード化ストランドを表した。オリゴマー構成にセリン、アルギニン又はロイシンが含まれていた場合には、曖昧さをなくすために二つの別の合成物を作った。例えば、セリンは、５３７及び５３８又は６０９及び６１０のＴＣＮ又はＡＧＹのいずれかによってコード化された。アルギニン又はロイシン（例えば、５４４，５４５）について類似のコドン分割を行った。ＤＮＡオリゴマーを、０．２マイクロモルスケールでのβ−シアノエチル化学反応を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０４−カラムＤＮＡシンセサイザーで合成した。オリゴマーを、前記カラム（５００オングストロームＣｐＧ樹脂）から切り離し、濃い水酸化アンモニウム中において５５〜６０℃で６〜２４時間保護解除（ｄｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）した。これら保護解除オリゴマーを真空下で乾燥させ（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）、７Ｍの尿素を含有する、１５％アクリルアミド（２０モノ：１ビス）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファのゲル中での電気泳動によって精製した。ＵＶシャドウイング（ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）によって、前記ゲル中に全長オリゴマーが検出され、次に、前記バンドを摘出し、ＤＮＡオリゴマーを４〜１６時間のシェイキングによって、１．５ｍｌ  ｓ  Ｈ2Ｏに溶出した。この溶出液を乾燥し、０．１ｍｌ  Ｈ2Ｏ中に再溶解し、光吸収測定を２６０ｎｍで行った。
【０１３９】
濃度は次の式に基づいて測定した。
（Ａ  ２６０×単位／ｍｌ）（６０．６／長さ＝ｘ  μＭ）
【０１４０】
すべてのオリゴマーを、Ｈ2Ｏの添加によって、５０μＭの濃度に調節した。
【０１４１】
上記構成の縮重プローブが、図２１、配列認識番号５４〜８８に示されている。
【０１４２】
下記の変更を加えたうえでプローブに対して使用したものと実質的に同じ手順によってＰＣＲプライマーを作った。１３のヌクレオチド含有制限サイトのリンカーが、ベクターへのクローン化用の前記縮重オリゴマーの５’末端に含まれていた。ＤＮＡ合成を、１，０００オングストロームＣｐＧ樹脂を使用した１マイクロモルスケールで行い、すべての４つのヌクレオチドが縮重プローブに正常に取り込まれた位置においてはイノシンを使用した。ＰＣＲプライマーの精製には、前記ゲル電気泳動精製後にエタノール沈澱することを含んでいた。
【０１４３】
ＩＩ．ライブラリー構築及びスクリーニング
ウシゲノムＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ（カタログ番号：９４５７０１）から購入した。このライブラリーは、ベクターラムダダッシュＩＩにクローン化された、２×１０6の１５〜２０ｋｂ Ｓａｕ３Ａｌ部分ウシＤＮＡ２フラグメントを含有していた。ウシの全脳ＣＤＮＡライブラリーを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＬ１０１３９）から購入した。全脳と、ウシ下垂体と、ウシ後部下垂体とから、調製したｍＲＮＡから相補性ＤＮＡライブラリーを構成した（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓｔｒａｇｅｎｅ）。Ｖｉｔｒｏｇｅｎは２つのｃＤＮＡライブラリーからなる：一つのライブラリーは、ベクターラムダｇ１０であり、他方はベクターｐｃＤＮＡＩである（プラシミドライブラリー）。前記Ｓｔｒａｔａｇｅｎライブラリーは、ベクターラムダユニザップ（ｕｎｉｚａｐ）よりなる。全体として、前記ｃＤＮＡライブラリーは、１，４００万の一次組替えファージを含有していた。
【０１４４】
前記ウシゲノムライブラリーを、各プレートにつき、１５０，０００ないし２００，０００のファージプレークで、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ホスト株ＬＥ３９２で２３ｘ２３ｃｍのプレート（Ｎｕｎｃ）にプレート化した。各プレートは、約一つのウシゲノム等価物を表した。３７℃での一晩の培養後、前記プレートを冷却して、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他（１：６０−８１）の手法に従って、複製フィルターを作った。４つのプレークリフトを、各プレートから非荷電ナイロン膜に作った（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ又はＭＳＩ  Ｎｉｔｒｏｐｕｒｅ）。前記ＤＮＡを、紫外線下で５分間のクロスリンキングによって、又は、８０℃の真空下において２時間のベーキングで、前記膜上に固定した。ＤＮＡプローブを、製造会社の指示に従って、ガンマ32Ｐ  ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；６５００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して標識化した。簡単に説明すると、５０ｐｍｏｌｓの縮重ＤＮＡオリゴマーを、３７℃で３０分間、６００μＣｉ  ガンマ32Ｐ−ＡＴＰと５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下において培養した。反応を終結させ、ゲル電気泳動負荷バッファを添加し、次に、放射能標識化プローブを、電気泳動によって精製した。
【０１４５】
32Ｐ標識化プローブを、ゲルスライスから摘出し、水に溶出した。別の方法として、ＤＮＡプローブを、ショウォルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）及びソマー（Ｓｏｍｍｅｒ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｅｍ１７７：９０〜９４（１９８９）の実験記録に従って、α−32Ｐ−ｄＡＴＰ又はα−32Ｐ ｄＣＴＰを組み込むことにより、ＰＣＲ増幅で標識化した。ＰＣＲ反応において標識化したプローブを、セファーデックスＧ−１５０カラムでの脱塩によって精製した。
【０１４６】
プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを、ＧＭＣバッファ（０．５２Ｍ  ＮａＰｉ，７％  ＳＤＳ，１％  ＢＳＡ，１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１Ｎ  ＮａＣｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ）中で行った。洗浄は、オリゴウォシュ（１６０ｍｌ  １ＭＮａ2ＨＰＯ4，２００ｍｌ  ２０％  ＳＤＳ，８．０ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ，１００ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ，３６３２ｍｌ  Ｈ2Ｏ）。通常は、１０のウシゲノム等価物の複写コピーを表す２０のフィルター（それぞれ４００平方センチ）を、１００ｐｍｏｌｓの縮重オリゴヌクレオチドプローブ（１２８−５１２倍の縮重）とともに２００ｍｌのハイブリダイゼーション溶液中において培養した。ハイブリダイゼーションは、前記縮重プローブに対し算出された最低融解温度以下の５℃で、一晩、進行させるようにした。尚、最低融解温度の計算においては、ＡＴペアに対して２℃、ＧＣペアに対して４℃と仮定した。
【０１４７】
フィルターを、そのハイブリダイゼーション温度において、オリゴウォシュを繰り返し交換して、４ないし５時間にわたり洗浄し、最後に、ＤＮＡプローブの長さに依存した温度において３０分間、３．２Ｍテトラメチルアンモニウムクロライド、１％ＳＤＳで２度洗浄した。２０ｍｅｒｓの場合、最終洗浄温度は６０℃であった。フィルターを取り付け、次に、強化スクリーン（デュポン社、Ｃｒｏｎｅｘ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ）を使用してＸ線フィルム（コダック社ＸＡＲ５）に露光した。通常は、−８０℃において３ないし５日間の露光で、これらのライブラリースクリーン中の複製信号を検出するのに十分であった。その結果の分析後、フィルターを取り外して、再プローブすることができた。フィルターの取り外しは、１０ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８を含有する１％ＳＤＳの溶液中で、フルパワー状態のマイクロウェーブオーブンで１５分間のサイクルを２回行って培養することによって行われた。フィルターは、最低３ないし４回のサイクルを通じて取られ、様々なプローブで再プローブした。
【０１４８】
ＩＩＩ．組替えファージの分離、成長及びＤＮＡ調製
これらの手法は、組替えＤＮＡ（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他２：６０−２：８１）に記載の標準実験記録に基づいて行われた。
【０１４９】
ＩＶ．ＤＮＡ消化とサザンブロットとを使用した分離クローンの分析
組替えファージＤＮＡサンプル（２マイクログラム）を、制限エンドヌクレアーゼ製造会社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって推奨された条件に従って消化した。３７℃に於ける４時間の培養後、反応生成物を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムと３倍量のエタノールとの存在下において沈澱させた。沈澱ＤＮＡを、遠心分離によって採取し、７５％のエタノールですすぎ、乾燥させた。すべての再懸濁サンプルを、アガロースゲル（通常、ＴＡＥバッファにおいて１％０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート、０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ）にかけた。ゲルのランは、１センチメートル当り１ボルトで４ないし２０時間行った。マーカーには、ラムダＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ＤＮＡフラグメント及び／又はφＸ１７４ＨａｅＩＩＩ  ＤＮＡフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が含まれていた。前記ゲルを、０．５マイクログラム／ｍｌの臭化エチディウムによって染色し、撮影した。サザンブロッティングのために、ＤＮＡを、先ず０．１２５Ｎ  ＨＣｌでの処理によって、前記ゲル中にて脱プリンし、０．５Ｎ  ＮａＯＨで変成し、そして２０×ＳＳＣ（３Ｍ  塩化ナトリウム、０．０３Ｍ  クエン酸塩ナトリウム）で非荷電ナイロン膜に移した。ブロッティングを、６時間から２４時間かけて行い、次に、フィルターを、０．５Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１５Ｍ塩化ナトリウム中で中和し、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ホウ酸  ＥＤＴＡ中で簡単にすすいだ。
【０１５０】
架橋するために、前記フィルターを、先ず、透明プラスチックラップに包み、次に、ＤＮＡ側を紫外線に５分間露光した。ハイブリダイゼーションと洗浄を、ライブラリースクリーニングに関して説明したように行った（この実施例の第２節参照）。類似の遺伝子が他の種に存在するか否かを調べるためのハイブリダイゼーション分析において、僅かな変更を行った。前記ＤＮＡフィルターは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ７７５３−１）から購入したもので、各レーン当り様々な種に関しての５マイクログラムのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有している。前記プローブを、前記セクション２に記載の方法で、ＰＣＲ増幅反応によって標識化し、ハイブリダイゼーションを、硫酸デキストランを１０％を含有する８０％バッファＢ（２ｇのポリビニルピロロリジン、２ｇのＦｉｃｏＩＩ−４００、２ｇのウシ血清アルブミン、５０ｍｌ  １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５８ｇ  ＮａＣｌ，１ｇピロ燐酸ナトリウム、１０ｇのドデシル硫酸ナトリウム、９５０ｍｌの水）中で行った。前記プローブを、１０分間の沸騰で変成させ、次に、氷水中にて急冷させた。このプローブを、ミリリットル当り１０6ｄｐｍ32Ｐで前記ハイブリダイゼーションバッファに添加し、６０℃で一晩培養した。前記フィルターを６０℃にて、先ずバッファＢ中で、次に２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、その後、１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄した。ストリンジェンシーを高くするために、実験、最終洗浄は、０．１ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳで、温度を６５℃に上げて行った。
【０１５１】
前記ゲノムクローンの制限マップを作り、どのサブフラグメントが前記ＧＧＦプローブ（サブクローニングの候補）にハイブリダイゼーションしたかを示すためにサザンブロットを使用した。
【０１５２】
Ｖ．ＤＮＡ相同体のセグメントのハイブリダイゼーションプローブへのサブクローニング
ＤＮＡ消化物（例えば、５マイクログラム）を、１％のアガロースゲルに投入し、次に、適当なフラグメントを染色後、ゲルから摘出した。前記ＤＮＡを、ガラスビーズへの吸着によって精製し、その後、製造会社（Ｂｉｏ  １０１）によって記載された実験記録を使用して溶出した。回収したＤＮＡフラグメント（００〜２００ｎｇ）を、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、例えば、ｐＵＣ１８の派生物であるｐＴ３Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ）等のリニア化された脱燐酸化ベクター中に結合した。このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ．βラクタマーゼ遺伝子を有しているので、形質転換物質を、アンピシリンを含むプレート上で選別することが可能である。前記ベクターは、更に、ホスト細胞へβ−グラクトシダーゼ相補性を与えるので、非−組替え（ブルー）を、イソプロピルチオガラクトシドとブルオーグ（Ｂｌｕｏｇ）他（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）とを使用して検出することができる。前記結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物の一部を、使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２  ＸＬ１ブル競合細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２００２３６）を形質転換し、次に、これらの形質転換物質をアンピシリン１ｍｌ当り５０マイクログラムを含有するＬＢプレート上にて選別した。ホワイトコロニーを選別し、プラスミドミニプレップをＤＮＡ消化及びＤＮＡ配列分析のために調製した。選別したクローンを、それらの挿入ＤＮＡが前記ＧＧＦプローブとハイブリダイズしたか否かを確認するために再テストした。
【０１５３】
ＶＩ．ＤＮＡ配列決定
２重ストランドプラスミドＤＮＡテンプレートを、標準実験記録に従って、５ｍｌの培養から調製した。製造業者の実験記録に従い、シーケナーゼ２．０とジデオキシヌクレオチド配列キット（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）とを使用したジデオキシチエーン終結法によって、配列決定を行った（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他ＰＮＡＳ；ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７）の変形）。あるいは、配列決定を、サイクルシークエンシングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ｍｏｄｅｌ  ４８００）中において行い、５’−末端標識化プライマーを使用した製造業者の指示に従って行った。配列プライマーは、前記配列決定キットで供給されたものか、あるいは、前記クローンから決められた配列によって合成されたものであった。配列決定用反応物を、６％ポリアクリルアミドの０．４ｍｍ厚さ配列決定用ゲル上に負荷（ｌｏａｄ）し、溶解した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光した。通常、標準配列決定キットが使用された時は35Ｓが組み込まれ、32Ｐ末端標識化プライマーをサイクルシークエンシング配列決定反応に使用した。配列は、ゲルの底部から頂部の方向（５’より３’の方向に向かって）にＤＮＡ配列エディタに読み込まれ、データを、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ，ウィスコンシン大学）によって供給されているプログラムを使用して解析した。
【０１５４】
ＶＩＩ．ＲＮＡの調製とＰＣＲの増幅
ゲノムＤＮＡ中に検出され、ＧＧＦペプチドをコード化する配列を含む転写読み取り枠を、下垂体ＲＮＡのＰＣＲ増幅によって拡張した。ＲＮＡは、グアニジン中性−ＣｓＣｌ手法（チャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）他Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４（１９７９））に従って冷凍ウシ繊維組織（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）から調製した。ポリアデニール化ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースカラムクロマトグラフィによって選別した（Ａｖｉｖ  ａｎｄ  Ｌｅｄｅｒ  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）６９：１４０８（１９７２））。
【０１５５】
特定のＤＮＡ目標配列を、全ＲＮＡ、もしくは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰＣＲ／ＲＮＡキットＮｏ．Ｎ８−８−００１７を使用してｃＤＮＡから変換しておいたポリアデニール化ＲＮＡサンプルから始めて増幅した。第１ストランド逆転写反応は、１μｇのテンプレートＲＮＡ及び、制限酵素認識サイトリンカーを結合したオリゴｄＴのプライマーカー、又は、制限サイトを結合したクローン化配列から決められた特定のアンチセンスプライマーのいずれかを使用した。第２ストランドを作るために、前記プライマーは、３’ＲＡＣＥ反応（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）他ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：８９９８（１９８８））において使用されるプラスストランド特徴配列か、あるいは、第２目標サイトが、予め、ｄＡＴＰを備えた第１ストランド反応生成物の後の終端トランスフェラーゼによって添加された場合（例えば、５’のレース反応、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）他ｉｂｉｄ）には制限サイトを取り付けたオリゴｄＴプライマーのいずれかであった。あるいは、固定されたＰＣＲ反応物と同様に、前記第２ストランドプライマーは分解物であって、従って特定のペプチド配列を示すものであった。
【０１５６】
増幅プロフィールは、次の一般的手法に従った。
１）９５℃で５分間の浸漬ファイル；２）９５℃、１分間の熱サイクルファイル、１分間で４５℃、５０℃又は５５℃のアニーリング温度にまで下げ、このアニーリング温度を１分間維持：１分間以上で７２℃にまで温度を上げる；７２℃で伸長するか、あるいは、１分１０秒で自動伸長、３）７２℃での５分間の伸長サイクル、及び４）４℃で不定時間の浸漬ファイル。熱サイクルファイル（＃２）は、通常、３０サイクルだけ実行した。各１００μｌの増幅反応の１６μｌサンプルを３時間、１センチメータ当り４ボルトの条件で、ＴＡＥバッファ中において２％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１％アガロースゲルでの電気泳動実行によって分析した。これらゲルを染色し、次に、前記プライマーの内部の標識化ＤＮＡプローブでプローブした非荷電ナイロン膜にブロットした。
【０１５７】
このブロッティング実験において、特定のセットのＤＮＡ増幅生成物を同定することができた。そして、その位置を、精製と再増幅のためのガイドとして使用した。適当な場合、選別されたサンプルの残りの部分を、調製ゲルに負荷し、次に、電気泳動を行い、前記ゲルから０．５ｍｍ厚さの４ないし５のスライス（特定生成物の予想位置をブラケット化する）を取り出した。前記アガロースを粉砕し、次に、４０℃で２〜１６時間、０．５ｍｌの電気泳動バッファ中に浸漬した。粉砕したアガロースを２分間遠心分離し、水相を新しい試験管に移した。
【０１５８】
最初の反応と同じセットのプライマーと反応プロフィールとを使用し、５μｌ（生成物の約１％）の溶出物質に対して再増幅を行った。再増幅反応が完了したとき、サンプルを、クロロフォルムで抽出し、新しい試験管に移した。リンカー中に存在する制限サイトで切り離すために、濃縮制限酵素バッファと酵素とを、反応物に添加した。消化ＰＣＲ生成物を、ゲル電気泳動によって精製し、次に、前述のサブクローン化の章に記載のようにベクターにサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、前述のように行った。
【０１５９】
ＶＩＩＩ．ＤＮＡ配列分析
フラグメントアセンブリプログラムを使用してＤＮＡ配列をアセンブルし、アミノ酸配列を、ＧＣＧプログラムＧｅｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｅ，Ｍａｐ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｅによって推定した。これらの推定タンパク質配列を、質問配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用して、ワード・サーチ（Ｗｏｒｄ  Ｓｅａｒｃｈ）を使用してタンパク質配列データベースを検索した。分析は、ＶＭＳ５．１で作動するＶＡＸステーション３１００ワークステーションにて行った。前記データベース検索は、ＧＣＧバージョン７．０を使用したＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  Ｎｏ．２１にて行った。
【０１６０】
ＩＸ．ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩをコード化する遺伝子のクローン化と配列決定の結果
前述のように、ウシＧＧＦ−ＩＩをコード化するＤＮＡ配列を同定するために、分解オリゴヌクレオチドプローブを、ＧＧＦ−ＩＩペプチド配列から構成した。リシルエンドペプチダーゼによって消化された、精製ＧＧＦ−ＩＩ調合物のペプチドであるＧＧＦ−ＩＩ１２（配列認識番号４４）（図１１及び１２参照）は、精製ＧＧＦ−Ｉ調製物から調製されたトリプシンペプチドであるＧＧＦ−Ｉ ０７（配列認識番号３９）と強いアミノ酸配列相同性を示した。従って、１０個の縮重オリゴヌクレオチドプローブを作るためにＧＧＦ−11１２を使用した（図２１の配列認識番号６９，７０，７１，７９としてそれぞれ示されているオリゴ６０９，６１０，６４９〜６５６参照）。フィルターの複製セットを、ＧＧＦ−ＩＩ １２の二つのオーバーラップする部分をコード化する２セットのプローブ（セット１＝６０９，セット２＝６４９〜５６５６）でプローブした。ハイブリダイゼーション信号が観察されたが、両方のプローブセットにハイブリダイズしたクローンは一つだけであった。このクローン（ＧＧＦ２ＢＧ１として指定）を精製した。
【０１６１】
前記ファージクローンＧＧＦ２ＢＧ１からのＤＮＡのサザンブロッティング分析によって、両方のプローブセットが前記ウシＤＮＡ配列とハイブリダイズしたことが確認されるとともに、更に、両方のプローブが、該クローン中において、同じセットのＤＮＡフラグメントと反応していることが判った。これらの実験に基づき、元のクローンの４ｋｂ  Ｅｃｏ  ＲＩサブ−フラグメントが同定され、サブクローン化され、部分的に配列決定された。図２２は、前記ヌクレオチド配列認識番号８９とプローブ６０９及び６５０のハイブリダイゼーションサイトを含む初期ＤＮＡ配列解読の推定アミノ酸配列を示し、更に、このウシゲノムＤＮＡの部分がペプチド１２（ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭ）をコード化したことを立証している。
【０１６２】
更に配列分析をしたところ、前記ＧＧＦ−ＩＩ  １２が、ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子とｃＤＮＡとを表すオーバーラップ配列の分離の開始点になった６６アミノ酸転写読み取り枠（下記参照）に位置することが判った。
【０１６３】
いくつかのＰＣＲ手法を使用して、推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の、更に別のコード化配列を得た。全部のＲＮＡ及びオリゴｄＴ−選択（ポリＡ含有）ＲＮＡサンプルを、ウシの全下垂体、前方下垂体、後方下垂体、及び視床下部から調製した。図２３、配列認識番号１０９〜１１９に示すリストからのプライマーを使用して、片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ反応によって、３’と５’との両方の方向においてｃＤＮＡ末端を増幅し、固定ＰＣＲ反応を、別のＧＧＦ−ＩＩペプチドを表す縮重オリゴヌクレオチドプライマーにて行った。図２４は、これらの実験において得られた隣接するＤＮＡ構造体と、配列とをまとめて示している。３’レース（ＲＡＣＥ）反応から、三つの交互にスプライスされたｃＤＮＡ配列が生成され、これらをクローン化し配列決定した。５’レース反応によって、少なくとも５２のアミノ酸のコード化配列を含む別のエクソンが発見された。この推定アミノ酸配列の分析によって、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−６と、ＧＧＦ−Ｉ−１８に類似した配列とが明らかになった（下記参照）。固定化ＰＣＲ反応によって、３００ｂｐの別のｃＤＮＡセグメント中に含有されるペプチドＧＧＦ−ＩＩ−１，２，３及び１０の（ｃＤＮＡ）コード化配列が同定された。このセグメントの５’境界（即ち、図３１のセグメントＥ）は、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−１をコード化するとともに、前記ＰＣＲ反応において使用されたオリゴヌクレオチドによって規定されている（例６のヒトクローンに関して記載されているように別の５’配列データが存在する）。従って、このクローンは、既存の全部で９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つをコード化するヌクレオチド配列を有する。
【０１６４】
前記クローン化遺伝子は、先ず、前記コード化配列を、それらが見出された状態（図２５参照）において位置決めすることを可能にするＧＣＦ２ＢＧ１の物理的地図を構成することによって特徴付けられる。上述のコード化配列からのＤＮＡプローブを使用して、このファージクローンにおいて前記エクソンを含有する更に別のＤＮＡフラグメントを同定するとともに、両方の方向においてオーバラップするクローンを同定した。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子は、少なくとも５つのコード化セグメントに分割される。コード化セグメントは、ユニバーサルな遺伝子コードを使用してポリペプチド配列に翻訳可能な、個々の長さのＤＮＡ配列であると定義される。図３１に示し、本出願において言及されるこれらコード化セグメントは以下の通りである。１）ＧＧＦ遺伝子内に存在する特定のエクソン（例えば、コード化セグメントａ）、あるいは、２）各セットが図示の遺伝子生成物と同様に特定のポリペプチドセグメントに翻訳可能な場合において、ｍＲＮＡｓの特定のサブーグループ中に現れる２つ又はそれ以上のエクソンのセットから派生するもの。クレームにおいて言及されているポリペプチドセグメントは、前記相同ＤＮＡコード化セグメントの翻訳生成物である。これまで、コード化セグメントＡ及びＢのみが、エクソンとして定義され、配列決定されマップ化された。図２６は、同定された隣接コード化配列をまとめて示している。エクソンは、その発見の順序（アルファベット順）でリストされている。そのイントロン／エクソン境界から、エクソンＢを、コード化セグメントＥとコード化セグメントＡとを接続するｃＤＮＡｓに含めることが出来ることが明らかである。即ち、エクソンＢは、その読み取り枠を損なうことなく、スプライスすることは出来ない。従って、我々は、三つのスプライシングパターンが、推定ウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ配列１，２及び３を生成することが出来ると示唆する。それぞれ、ＧＧＦ２ＢＰＰ１．ＣＤＳ、ＧＧＦ２ＢＰＰ２．ＣＤＳ及びＧＧＦ２ＢＰＰ３．ＣＤＳとされるこれらのコード化配列は、図２８Ａ（配列認識番号１３３）、２８Ｂ（配列認識番号１３４）及び２８Ｃ（配列認識番号１３５）にそれぞれ示されている。これら三つのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列も、図２８Ａ（配列認識番号１３３）、２８Ｂ（配列認識番号１３４）及び２８Ｃ（配列認識番号１３５）にそれぞれ示されている。
【０１６５】
これら三つの推定構造体は、アミノ酸長さが２０６，２８１，２５７であるタンパク質をコード化する。推定されたタンパク質配列の最初の１８３残基は３つの遺伝子生成物において同一である。位置１８４において、前記クローンは大幅に異なっている。ＧＧＦ２ＢＰＰ１におけるグリシンＧＧＴ用に対するコドンは、又、ＧＧＦ２ＢＰＰ２とＧＧＦ２ＢＰＰ３に対するスプライスドナーとしても作用し、これらは、それぞれ交互に、エクソンＣ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’及びＤ又はＣ，Ｃ／Ｄ及びＤに加わるものであり、図３３において、配列認識番号１４９として示されている。ＧＧＦＩＩＢＰＰ１は、前記コード化セグメントＡスプライス接合部を越えて次の介在配列（イントロン）への読み取りによって生成される裁頭遺伝子生成物である。これは、図３１におけるコード化セグメントＡ’を示す（配列認識番号１４０）。前記転写体は、標準型ＡＡＴＡＡＡポリアデニール化配列の隣で終端し、我々は、この裁頭遺伝子生成物が、真性成熟転写体を表すものであると提案する。他の二つのより長い遺伝子生成物は、同じ３’非翻訳配列とポリアデニリン化配列を共有する。
【０１６６】
これらの三つの分子は、すべて、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つを有し（図１２参照）、もう一つのペプチドがＧＧＦ−Ｉ−１８に対してきわめて高い相同性を有している（図２７参照）。この発見は、この組替え分子が、ウシＧＧＦ−ＩＩの少なくとも一部分をコード化している可能性がきわめて高いことを示している。更に、三つのペプチドの計算上の等電点は、ＧＧＦ−ＩとＩＩの物理的特性と一致している。ＧＧＦ−ＩＩの分子の大きさはおよそ６０ｋＤであるので、これら三つのｃＤＮＡの最も長いものが、予想数のアミノ酸の１／２近くをコード化しているはずである。
【０１６７】
Ｂ及びＡエクソンを含むプローブを、ＰＣＲ増幅によって標識化し、ウシ後部下垂体から分離されたＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。一つのクローン（ＧＧＦ２ＢＰＰ５）は、図３０に示すパターンを示し、コード化セグメントＡとＣとの間にもう一つのＤＮＡコード化セグメント（Ｇ）を有していた。核酸配列の全体が図３２に示されている（配列認識番号１４８）。最長転写読み取り枠からの予想翻訳生成物は、２４１のアミノ酸である。第２のｃＤＮＡの一部（ＧＧＦ２ＢＰＰ４）も、上述のプローブを使用してウシ後部下垂体ライブラリーから分離された。このクローンは、図３０に示すパターンを示した。このクローンは、５’の部分において不完全であるが、コード化セグメントＧ及びＤを欠いているという意味においてこれはスプライシング変異体である。ＢＰＰ４も、領域Ｃ／Ｄ以降において領域Ｈ，Ｋ及びＬを備えた新規な３’末端を示す。ＢＰＰ４の配列は、図３４に示されている（配列認識番号１５０）。
【０１６８】
例５
様々な種に於けるＧＧＦ配列
データベース検索によっては、予想ＧＧＦ翻訳生成物と公知のタンパク質配列との間になんら有義な類似性は見つからなかった。これは、ＧＧＦ−ＩＩが、タンパク質の新規なファミリ又はスーパーファミリの最初のメンバであることを示唆している。これまでに我々が示した、他のほ乳類ＤＮＡとの高ストリンジェンシーのクロスハイブリダイゼーション研究（ＤＮＡブロッティング実験）においては、はっきりと、このウシ組替え分子からのＤＮＡプローブによって、テストされた様々なサンプルにおいて特定の配列が容易に検出される。相同性の高い配列は、ヒトゲノムＤＮＡにも検出された。そのオートラジオグラムを図２９に示す。ラットとヒトのＤＮＡを含むレーンの信号は、ＧＧＦ遺伝子のラット及びヒト同等物を表し、この遺伝子によってコード化された複数のｃＤＮＡの配列が、最近、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２））とウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ  ６９：５５９（１９９２））とによって報告されている。
【０１６９】
例６
ヒト配列コード化ヒトＧＧＦ２の分離
ウシＧＧＦＩＩコード化セグメントＥをからの配列を含む複数のヒトクローンを、脳幹から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって分離した（Ｓｔｒａｔａｇｎｅｎｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃９３５２０６）。このストラテジーを、大半のＧＧＦ２ペプチド（ＧＧＦ２に特有）と、前記ウシＥセグメントを含むクローンからの予想ペプチド配列との間の強い関連性に基づき、追求した。このライブラリーは、次にリストするオリゴヌクレオチドプローブ９１４−９１９を使用した前述の例４、第１１章で記載したものと同様にスクリーニングした。
【０１７０】
0004127567.tif 000007
【０１７１】
これらのプローブで検出されたクローンを、ハイブリダイゼーションによって更に分析した。セグメントＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を標識化することによって生成された、コード化セグメントＡからのプローブ（図２１参照）は、一次ライブラリーをスクリーニングするのにも利用した。Ａ及びＥ由来のプローブとハイブリダイズした複数のクローンを選別し、一つの特定のクローン、ＧＧＦ２ＨＢＳ５、を選別して更に分析した。このクローンは、コード化セグメントのパターン（図３１に示すＥＢＡＣＣ／Ｄ’Ｄ）によって表されている。このクローン中のＥセグメントは、図３７に示されるＥの裁頭化ウシ・バージョンのヒト等価物である。ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、前述のすべての「推定」ＧＧＦ−ＩＩ候補の内で最も可能性の高い候補である。コード化配列セグメントＥの長さは、７８６のヌクレオチドと２６４の非翻訳配列のベースとである。ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化されるタンパク質の予想サイズは、約４２３アミノ酸であり（約４５キロダルトン、図４５、配列認識番号１７０参照）、これはデグリコシル化状態のＧＧＦ−ＩＩ（例１６参照）のサイズに類似している。更に、図２７にリストしたＧＧＦ−ＩＩペプチドのうちの７つは、領域Ｅから予想されるタンパク質配列内に属する同等配列を有している。ペプチドＩＩ−６とＩＩ−１２は例外であって、それぞれコード化セグメントＢ及びコード化セグメントＡに属する。ＧＦ２ＨＢＳ５タンパク質をコード化するＲＮＡを、ＧＧＦ２ＨＢＳ５挿入部を有するベクター（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．］図４４参照）にあるバクテリオファージＴ７プロモーターによってドライブされた生体外転写システム中において生成した。このＲＮＡは、無細胞（ラビット網状赤血球）翻訳システムに翻訳され、そのタンパク質生成物のサイズは４５ｋｄであった。
【０１７２】
更に、前記無細胞生成物を、シュワン細胞細胞分裂誘発分析において分離し、生物学的活性を確認した。調整培地によって処理されたシュワン細胞は、125Ｉ−ウリジンの組み込みによって測定した増殖度の増加と、１８５キロダイン領域のタンパク質のチロシンの燐酸化との両方を示した。従って、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化された生成物のサイズと、図１２に示したウシペプチドに対する相同性の高いヒトペプチドをコード化するＤＮＡ配列の存在とは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５が、ウシＧＧＦ２のヒト等価物をコード化することを裏付けるものである。このクローンと形質変換した細胞から作られた調整培地が、シュワン細胞細胞分裂誘発活性を顕在化させるという事実から、ＧＧＦＩＩＨＢＳ５遺伝子生成物（前記ＢＰＰ５遺伝子生成物とは違って）が分泌されるということが確かめられた。更に、ＧＧＦＩＩＢＰＰ５遺伝子生成物は、ｐ１８５erbB2等のレセプターチロシンキナーゼや、あるいは、密接に関連したレセプター（図１４参照）を介してシュワン細胞増殖反応を仲介すると考えられる。
【０１７３】
例７
ほ乳類及び昆虫細胞におけるヒト組替えＧＧＦ２の発現
ヒトＧＧＦ２をコード化する前記ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡ（例６において記載され、ここでＨＢＳ５と称される）を、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にクローン化し（タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）他Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デクストラン法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＮＹ（１９８９））によって、１００ｍｍディシュにおいて移入させた。細胞溶解物又は一過的発現ＣＯＳ細胞からの調整培地を、移入の３又は４日後に収穫した。溶解物を調製するために、細胞単層を、ＰＢＳによって洗浄し、１５０μｌの０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での三回の冷凍／解凍サイクルによって溶解したディシュから掻き取った。細胞堆積物をペレットで取り、上澄を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌ）を収集し、次に、濃縮し、製造業者（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ビヴァリー）によって記載されたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ−１０とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを使用して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４とバッファ交換した。前述したように（例３参照）、ラットの神経シュワン細胞のＤＮＡ合成先駆体の組み込みを分析した。調整培地又は細胞溶解物サンプルを、例３において記載した方法で、シュワン細胞増殖分析においてテストした。その細胞分裂誘発活性データは、図４６に示されている。ＧＧＦ２をコード化する、ｃＤＮＡ、ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、タンパク質生成物の分泌を前記培地に振り向けた。全活性の極く一部分が、細胞分解物を使用した分析によって、細胞内に検出可能であった。ＧＧＦ２ＨＦＢ１とＧＧＦＢＰＰ５  ｃＤＮＡでは、生成物の分泌を細胞外培地に振り向けることが出来なかった。これらのクローンからのＧＧＦ活性物質は、細胞分解物においてのみ検出可能であった（図４６）。
【０１７４】
組替えＧＧＦ２も、ＣＨＯ細胞に発現された。ＧＧＦ２をコード化するＧＧＦ２ＨＢＳ５  ｃＤＮＡを、ベクターｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡのＥｃｏＲＩサイトにクローン化し（図５４）、燐酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３））によってＤＨＦＲネガティブＣＨＯ細胞に移入した。クローンを、９６−ウェルプレート中のヌクレオチド及び無ヌクレオチドα培地（Ｇｉｂｃｏ）内で選別した。３週間後、個々のクローンの調整培地を、例３で記載したシュワン細胞増殖分析によって、ＧＧＦ発現のためにスクリーニングした。前記培地へかなり高いレベルのＧＧＦ活性物質を分泌した安定したクローンが同定された。ＣＨＯ細胞調整培地の異なった分量の部分標本から得られたシュワン細胞増殖活性データを使用して、図４７に示す投与量反応曲線を得た（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３））。この物質を、ＧＧＦ２特定ペプチドに対して生成したポリクローナル抗血清によってプローブしたウェスタンブロッティングにて分析した。約６９〜９０ｋｄ（下垂体及び高分子量グリコフォームから抽出されたＧＧＦ２の予想サイズ）の広い範囲のバンドが特異的に標識化されている（図４９，レーン１２）。
【０１７５】
組替えＧＧＦ２は、バキュロウィルス発現を使用して昆虫細胞にも発現した。Ｓｆ昆虫細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含有するバキュロウィルスに、３〜５の多重度（１０6細胞／ｍｌ）で感染させ、そしてＳｆ９００−ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。シュワン細胞細胞分裂誘発活性物質を、前記細胞外に培地中に分泌させた（図４８）。異なった分量の昆虫細胞調整培地を、フォルスコリン不存在の状態で、シュワン細胞増殖分析でテストし、そのデータを使用して図４８に示す投与量反応曲線を得た。
【０１７６】
この物質は、更に、前述のＧＧＦ ＩＩ特異性抗体でプローブしたウェスタンブロッティング（図４７）でも分析した。４５ｋｄのバンド、デグリコシル化ＧＧＦ−ＩＩ（例１６）のサイズが示されている。
【０１７７】
この例で使用された方法は、次の通りである。
【０１７８】
組替えヒト及びウシ・グリア成長因子のシュワン細胞細胞分裂誘発活性を以下のように測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反応を、短命ほ乳類発現実験から得た粗組替えＧＧＦ生成物を使用して、５・lのフォルスコリンの存在下において測定した。［125Ｉ］−ウリジンの組み込みを、前述の方法に記載の移入した、あるいは疑似移入したＣＯＳ細胞から得た物質に対して１８〜２４時間さらした後に行った。４セットのデータの平均及び標準偏差が図示されている。部分的に精製された天然ウシ下垂体ＧＧＦ（カルボキシルメチルセルロースフラクション：グッドアール（Ｇｏｏｄｅａｒｌ）他、提出）に対する細胞分裂誘発反応が、１００パーセントの活性の標準として図示（ＧＧＦ）されている。
【０１７９】
ｃＤＮＡ（図５３）を、ｐｃＤＬ−ＳＲ痰Q９６にクローン化し（タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．８：４６６〜４７２（１９８８））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９））によって１００ｍｍディシュ中で移入した。細胞溶解物又は調整培地を転写の３又は４日後に収穫した。溶解物を調製するために、細胞単層をＰＢＳによって洗浄し、ディシュから掻き取り、１５０μｌの０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での３回の冷凍／解凍サイクルによって溶解した。細胞堆積物をペレットとし、上澄を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌｓ）を採取し、次に、濃縮し、製造業者（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ビヴァリー）によって記載されたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ−１０とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを使用して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４とバッファ交換した。前述したように（デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）およびストローバント（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：１３５３−１３６０（１９９０）；ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１６５：１０５〜１１８（１９７９））、ラットの座骨神経シュワン細胞はＤＮＡ合成先駆体の組み込みについて分析した。
【０１８０】
組替えＣＨＯ細胞調整培地のウェスタンブロッティングは、以下のように行った。一つのＣＨＯクローンを、７ｍｌのＭＣＤＢ３０２無タンパク質培地中で３日間、培養した。２ｍｌの調整培地を濃縮し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４に対してバッファ交換し、凍結乾燥させた。そのペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ中で再懸濁し、還元性ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ＧＧＦペプチド抗体でのウェスタンブロッティングによって分析した。ＣＨＯコントロールを、非移入ＣＨＯ−ＤＧ４４ホストからの調整培地を使用して行い、ＣＨＯ ＨＢＳ５レベルを、組替えクローンからの調整培地を使用して分析した。
【０１８１】
例８
ウシＧＧＦに関連する他のヒト配列の分離
例５及び６の結果は、ヒトのソースからのＧＧＦ関連配列が、ウシＧＧＦ配列由来のＤＮＡプローブを使用することによっても容易に分離可能であることを示している。これに代えて、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５（１９９２））によって記載された方法も利用可能である。この例において、前記ｐ１８５erbB2レセプターに結合し、これを活性化する（そしてＧＧＦに関係する）ヒトタンパク質（ヘレグリン瘁jが、腫瘍細胞系から精製され、派生したペプチド配列を使用して、ｃＤＮＡコード化ヘレグリンをクローン化するのに使用されたオリゴヌクレオチドプローブを生成する。ｐ１８５erbB2レセプター活性の生化学的分析は、シュワン細胞の増幅とは異なる。これは、下垂体ｃＤＮＡからＧＧＦ配列をクローン化するために例１〜４において使用した方法に類似している。ヘレグリンタンパク質と相補性ＤＮＡとは、次の手法に従って腫瘍細胞系から分離した。
【０１８２】
ヘレグリンは、Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａマイクロキャリアビーズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）上で成長したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ２６）によって調整した培地から精製した。前記培地（１０リットル）は、膜（１０−ｋＤカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるフィルター処理によって〜２５倍に濃縮し、遠心分離処理と、フィルター（０．２２ｕｍ）を通す濾過処理とによって清浄化した。濾過物を、ヘパリンセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、そのタンパク質を、燐酸−緩衝食塩水中にて０．３、０．６及び０．９ＭのＮａＣｌステップで溶出した。種々のクロマトグラフィック・フラクション中の活性を、ＭＣＦ−７乳ガン細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ２２）中におけるｐ１８５erbB2のチロシン燐酸化の増加を定量化することによって測定した。ＭＣＦ−７細胞を、血清（１０％）を含有した（ウェル当り１０5の細胞）、Ｆ１２（５０％）のダルベッコの最小必須培地（５０％）中にて２４−ウェルＣｏｓｔａｒプレートにプレート化し、少なくとも２４時間付着させた。分析の前に、細胞を、少なくとも１時間、血清を含まない培地中に移した。カラムフラクション（１０ないし１００μｌ）を、３７℃で３０分間、培養した。次に上澄を吸引して、ＳＰＤ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（１００μｌ）を添加することによって反応を終わらせた。サンプルを１００℃で５分間加熱し、一部分（１０ないし１５μｌ）を、ｔｒｉｓ−グリシンゲル（４ないし２０％）（Ｎｏｖｅｘ）にかけた。電気泳動後、タンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上にエレクトロブロッティングし、次に、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有する（０．０５％）ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）中にてウシ血清アルブミン（５％）でブロックした。ブロットを、ホスホチロシン（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するモノクローナル抗体（１：１０００希釈）で、室温で最低１時間、プローブした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、室温で最低３０分間、アルカリフォスファターゼと結合したマウスの免疫グロブリンＧに対する抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）（１：７５００に希釈）でプローブした。反応性バンドは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−１−フォスフェートとニトロ−ブルーテトラゾリウムによって可視化した。免疫ブロットを、Ｓｃａｎ  Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（ヒューレットパーカード）濃度計によって走査した。非刺激ＭＣＦ−７細胞の信号強度は、２０ないし３０ユニットであった。完全に刺激したｐ１８５erbB2は、１８０ないし２００ユニットであった。活性のほとんどを有する０．６Ｍ  ＮａＣｌプールを、エタノール（３０％）を含有する１７ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中で平衡されたポリアスパルテン酸（ＰｏｌｙＬＣ）カラムに適用した。前記平衡バッファ中で、０．３から０．６Ｍ  ＮａＣｌまでのリニアグラジエント使用して、結合タンパク質を溶出した。活性のピーク（０．４５Ｍ  ＮａＣｌに於ける）を、ＴＦＡ（０．１％）とアセトニトリル（１５％）とを含有するバッファで平衡させたＣ４逆相カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｃｋ  ＲＰ−４）にて更にフラクション化した。このカラムから、２��から４０％のアセトニトリル・グラジエント範囲にて、６０分間にわたり、タンパク質が溶出した。フラクション（１ｍｌ）を採取し、その活性を分析し、ｔｒｉｓ−グリシンゲル（４〜２０％，Ｎｏｖｅｘ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＰＬＣ−精製したＨＲＧ−αを、ＳＤＳ（０．１％）、１０ｍＭジチオトレイトール、０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８．０）中で、リシンＣにて、３７℃で２０時間に渡って消化させ、その結果得られたフラメントを、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ  Ｃ４カラム（４０００Å，０．２ｂｙ１０ｃｍ）上で溶解させた。このカラムを、０．１％のＴＦＡ中で平衡させ、次いで０．１％ＴＦＡ中で１−プロパノール使用グラジエントで溶出した（ダブリュ・ジェイ・ヘンゼル（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ），ジェイ・ティ・スタルツ（Ｊ．Ｔ．Ｓｔｕｌｔｓ），シー・スー（Ｃ．Ｈｓｕ），ディ・ダブリュ・アシュワド（Ｄ．Ｗ．Ａｓｗａｄ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５９０５（１９８９））。クロマトログラフ・ランのピークを真空下において乾燥し、配列決定した。これらのペプチドの一つ（〜２４％１−プロパノールで溶出）の配列は、［Ａ］ＡＥＫＥＫＴＦ［Ｃ］ＶＮＧＧＥＸＦＭＶＫＤＬＸＮＰ（配列認識番号１６２）であった。括弧内の残基は、不確定であり、Ｘは、アミノ酸の同定が不可能であったサイクルを示している。最初の収量は、８．５ｐｍｏｌであり、その配列はいずれの公知のタンパク質にも対応していなかった。残基１，９，１５及び２２は、後に、ｃＤＮＡ配列中においてシステインとして同定された。これまで過負荷され（ｏｖｅｒ−ｌｏａｄｅｄ）、そしてＰＶＤＦにブロットされたゲルから得られた〜４５ｋＤバンドの直接的配列決定は、初期収量が極めて低い（０．２ｐｍｏｌ）、低量（ｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅ）の配列、ＸＥＸＫＥ［Ｇ］［Ｒ］ＧＫ［Ｇ］Ｋ［Ｇ］ＫＫＫＥＸＧＸＧ［Ｋ］（配列認識番号１６３）を示した。これは、ヘレグリン−α（図３１）のアミノ酸残基２ないし２２に対応し、セリン２がｐｒｏＨＲＧ−αのＮＨ2末端であることを示唆している。ＮＨ2末端はブロックされているが、時として小量の自然にブロックされたタンパク質は、翻訳後に変成されないこともあることが観察された。前記ＮＨ2末端指定は、臭化シアンとの消化後のタンパク質のマススペクトル分析によって確かめられた。前記分離タンパク質のＣＯＯＨ−末端は、はっきりとは同定されていなかったが、タンパク質分解消化物の混合配列決定によって、成熟した配列は、残基２４１を越えて拡張しないようである。アミノ酸残基の略称は以下の通りである。Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；そしてＹ，Ｔｙｒ。
【０１８３】
ｃＤＮＡクローンの源として、オリゴ（ｄＴ）−開始λｇｔ１０（ティ・ヴィ・ハイン（Ｔ．Ｖ．Ｈｕｙｎｎ），アール・エイ・ヤング（Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ），アール・ダブリュ・デイヴィス（Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ），λｇｔ１０及びλｇｔ１１ＤＮＡクローン化技術：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（ＩＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８４））ｃＤＮＡライブラリーを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの、ｍＲＮＡ精製（ジェイ・エム・クルウィン（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｒｗｉｎ），エイ・イー・プルズビラ（Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｂｙｌａ），アール・ジェイ・マクドーランド（Ｒ．Ｊ．ＭａｃＤｏｌａｎｄ），ダブリュ・ジェイ・ラッター（Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８，５２９４（１９７９）によって構成した（ユー・ガブラー（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ）およびビー・ジェイ・ホフマン（Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ  ２５，２６３（１９８３））。１３−アミノ酸配列ＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥ（配列識別番号１６４）（１３）をコード化する下記の８重の縮重アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドを、ヒトコドン周波数最適値（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｐｔｉｍａ）（アール・ラテ（Ｒ．Ｌａｔｈｅ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３，１（１９８５））のベースに構成し、化学的に合成した。即ち、５’−ＣＴＣＧＣＣ（Ｇ  ＯＲ  Ｔ）ＣＣ（Ａ  ＯＲ  Ｇ）ＴＴＡＣ（Ａ  ＯＲ  Ｇ）ＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣ−３’（配列識別番号１６５）。プローブ構成の目的のため、システインを前記アミノ酸配列中の未知の残基に指定した。このプローブを燐酸化により標識化し、低−ストリンジェンシー条件下におけるｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイズした。前記ｐｒｏＨＲＧ−α  タンパク質を、このライブラリー中において同定した。ＨＲＢ−Ｂ１  ｃＤＮＡは、ｐｒｏＨＲＧ−αの５’と３’との両方の末端からの配列とともに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡから作られた第２オリゴ（ｄＴ）−開始  λｇｔ１０ライブラリーのプローブ化によって同定された。クローン１３（図２Ａ）は、プライム化（５’−ＣＣＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣ−３’プライマー（配列識別番号１６６）；ｐｒｏＨＲＧ−α  アンチセンスヌクレオチド３３ないし５６）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  λｇｔ１０ライブラリーを５’ＨＲＧ−α  配列によってスクリーニングすることによって得られた生成物であった。前記プローブとしてのクローン１３の５’末端に対応する配列を使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡからの第３のオリゴ（ｄＴ）−開始  λｇｔ１０ライブラリー中におけるｐｒｏＨＲＧβ２とｐｒｏＨＲＧβ３とを同定した。４つのＨＲＧのそれぞれをコード化する二つのｃＤＮＡクローンを配列決定した（エフ・サンガー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ），エス・ミルケン（Ｓ．Ｍｉｌｋｅｎ），エイ・アール・カルソン（Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５４６３  １９７７））。別のｃＤＮＡ指定クローン８４は、アミノ酸数４２０を通じてｐｒｏＨＲＧβ２と同一のアミノ酸配列を有している。位置４２１の終止コドンの後には、異なっ��３’−非翻訳配列が続く。
【０１８４】
例９
別のスプライシング変異体の分離
例６の方法によって、スプライシング変異の結果として４つの密接に関連した配列（ヘレグリンα，β１，β２，β３）が作り出された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ  ６９，２０５（１９９２））及びウェン（Ｗｅｎｎ）他（Ｃｅｌｌ  ６９，５５９（１９９２））は、ｐ１８５erbBに結合するタンパク質に関する例１〜４及び６に記載の方法に類似の精製方法とクローン化方法を使用して別のスプライシング変異体を分離した（ラットから）。ｃＤＮＡクローンは次にようにして得られた（形質転換ラット線維芽細胞系からのｐ１８５erbB2結合タンパク質の精製と配列決定による）。
【０１８５】
ｐ１８５erbB結合タンパク質は、以下のようにして調整培地から精製された。５００のローラボトル（全部で１２０リットル）の３回の収穫からのプールされた調整培地を、０．２μ  フィルターによる濾過によって浄化し、２０ｋｄ分子径カットオフの膜によるＰｅｌｉｃｏｎ限外濾過システムによって３１倍に濃縮した。すべての精製工程は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｆａｓｔタンパク質液体クロマトログラフィーシステムを使用して行われた。前記濃縮物を、直接、ヘパリン−セファローズ（１５０ｍｌ，燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって予め平衡化しておいたもの）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍの波長において全く吸収が検出されなくなるまで、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有のＰＢＳで洗浄した。結合タンパク質を、次に、ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）の連続グラジエント（０．２Ｍから１．０Ｍ）で溶出し、５ｍｌのフラクションを採取した。サンプル（前記採取フラクションの０．０１ｍｌ）を使用して、キナーゼ刺激活性の定量分析を行った。三つのカラム・ラン（全容量＝３６０ｍｌ）からの活性フラクションを、プールし、ＹＭ１０限外濾過膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ダンヴァース）を使用して２５ｍｌに濃縮し、１．７Ｍの濃度となるように硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離処理（１０，０００ｘｇ，１５分間）による浄化後、プールされた物質をフェニール・スペローズカラム（ＨＲ１０／１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に負荷した。前記カラムを、０．１ＭのＮａ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）中で（ＮＨ4）2ＳＯ4の４５ｍｌグラジエント（１．７Ｍから無塩状態まで）で展開し、２ｍｌのフラクションを採取してそのキナーゼ刺激を分析（一サンプルにつき０．００２ｍｌ）した（例６に記載のように）。活性の主なピークをプールし、５０ｍＭの燐酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．３）に対して透析した。一つのモノ−Ｓ陽イオン交換カラム（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、５０ｍＭの燐酸ナトリウムで予め平衡させた。活性物質（タンパク質の０．８８４ｍｇ；３５ｍｌ）の負荷後、前記カラムを、開始バッファで洗浄し、次に、ＮａＣｌのグラジエントで１ｍｌ／分の速度で展開した。キナーゼ刺激活性は、０．４５〜０．５５Ｍ塩で回復され、それぞれ２ｍｌずつの４つのフラクションに渡っていた。
【０１８６】
これらをプールし、Ｃｕ+2キレート化カラムに直接負荷した（１．６ｍｌ，ＨＲ２／５キレート化スペローズ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。大半のタンパク質は樹脂に吸着されたが、これらは徐々に塩化アンモニウムの３０ｍｌのリニアグラジエント（０〜１Ｍ）によって溶出した。前記活性物質は、０．０５ないし０．２Ｍ ＮＨ4Ｃｌの範囲の一つのタンパク質ピークで溶出した。様々な精製工程から得られたサンプルを、ゲル電気泳動によって分離し、ＩＣＮ（カリフォルニア州，コスタ・メサ）のキットを使用した銀染色後、それらのタンパク質内容を、Ｂｉｏ−Ｒｅｄ（カリフォルニア州，リッチモンド）のキットを使用したコマーシブルー染色結合分析によって調べた。
【０１８７】
前記ｐ４４タンパク質（１０μｇ）を、０．１Ｍアンモニウム重炭酸塩バッファ（ｐＨ７．８）２００μｌ中で再構築した。Ｌ−１−トシル−アミド２−フェニールエチルクロロメチルケトン処理トリプシン（Ｓｅｒｖａ）による消化を、１：１０の酵素対基質比で、３７℃で１８時間かけて行った。その結果得られたペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４マイクロカラム（２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ１５ｃｍ，３００Å）と、ダイオードアレイ検出器とワークステーションとを備えたＨＰ１０９０液体クロマトグラフィシステムとを使用し、２１５ｎｍでモニタしつつ、逆相ＨＰＬＣで分離した。前記カラムを、０．１％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）で平衡させ、０％から５５％の移動相Ｂ（０．１％のトリフルオロ酢酸中に９０％のアセトニトリル）のリニアグラジエントで７０分間にわたり溶出を行った。その流量は０．２ｍｌ／分で、カラム温度は、２５℃に制御された。前記ＨＰＬＣシステムから手作業によって採取されたペプチドのピークの１／３部分は、Ｅｄｍａｎ分解によるＮ−末端配列分析によって特徴付けられた。２７．７分後（Ｔ２７．７）に溶出されたフラクションは、混合アミノ酸配列を有し、還元後、つぎのようにして更に、再クロマトグラフされた。前記ペプチドフラクションの７０％の部分を真空中で乾燥し、１００μｌの０．２Ｍ重炭酸塩アンモニウムバッファ（ｐＨ７．８）中で再構築した。前記溶液にＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加し、これを次に３７℃で３０分間培養した。次に還元したペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃカラム（２．１ｍｍ  ｉ．ｄ×１５ｃｍ）を使用して逆相ＨＰＬＣによって分離した。溶出条件と流量は、前述したものと同じであった。前記ペプチドのアミノ酸配列の分析を、オンライン・フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析器を備えたモデル４７７タンパク質シーケンサ（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），カリフォルニア州，フォスター・シティ）と、モデル９００データ分析システム（フンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）他（１９８６）Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．ｅ．Ｓｈｉｖｅｌｙ，ｅｄ．（ニュージャージー州，クリフトン：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ｐ．２２３−２４７）とによって行った。前記タンパク質を、ポリブレンとＮａＣｌとでプレサイクルしたトリフルオロ酢酸−処理グラスファイバーディスクに負荷した。ＰＴＨ−アミノ酸分析を、デュアルシュリンジポンプと逆相（Ｃ−１８）小口径カラムを使用したマイクロ液体クロマトグラフィシステム（モデル１２０）で行った（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），２．１ｍｍ  ｘ２５０ｍｍ）。
【０１８８】
ＲＮＡを、標準手順（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））によってラット１−ＥＪ細胞から分離し、ポリ（Ａ）+をｒＲＮＡ分離キット（クロンテック・ラボ・インコーポレイテッド，カリフォルニア州，パロ・アルト）を使用して選別した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（ビー・アール・エル・ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），メリーランド州，ベテスダ）で合成した。カラム−細分化−二重ストランドｃＤＮＡをＳａｌ１及びＮｏｔ１−消化ｐＪＴ−２プラスミドベクター、ｐＣＤ−Ｘベクターの派生物に結合し（オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルク（Ｂｅｒｇ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））、電気泳動によってＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した（ダウアー（Ｄｏｗｅｒ）他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７（１９８８））。約５ｘ１０5の一次形質転換物が、Ｎ−末端のＮＤＦ（残基５〜２４）とＴ４０．４トリプシンペプチド（残基７−１２）のタンパク質配列から由来の二つのオリゴヌクレオチドプローブによってスクリーニングされた。これらのそれぞれの配列は以下の通りである（Ｎはすべての４ｎｔ示す）：
0004127567.tif 000008
（１：配列認識番号１６７；  ２：配列認識番号１６８）
【０１８９】
前記合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼにより、［γ−32Ｐ］ＡＴＰによって末端標識化し、これらを使用してニトロセルロースフィルターの複製セットをスクリーニングした。そのハイブリダイゼーション溶液は、６ｘＳＳＣ，５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）と、０．１％のピロ燐酸ナトリウム、２×デンハルト溶液、５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡと、２０％のフォルムアミドを含有（プローブ１について）又はフォルムアミド０％（プローブ２について）を含んでいた。フィルターを、５０℃で０．５×ＳＳＣ，０．２％ＡＳＡ，２ｍＭ  ＥＤＴＡによって（プローブ１について）、又は３７℃で２ｘＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ，２ｍＭ  ＥＤＴＡによって（プローブ２について）、洗浄した。これらフィルターのオートラジオグラフィは、両方のプローブとハイブリダイズした１０のクローンを示した。これらのクローンを、前述のような再プレート化とプローブハイブリダイゼーションによって精製した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサとＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑ  ＤｙｅＤｏｘｙ（登録商標）ターミネータサイクル配列決定キットとを、該製造業者の指示に従って使用して、前記ｃＤＮＡクローンの配列決定をした。いくつかの場合においては、配列は、［35Ｓ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＵ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｓのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）キットを使用することによって得られた。ｃＤＮＡクローン４４の両方のストランドは、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによって配列決定された。ほぼ５’３５０ｎｔの配列が、７つの独立したｃＤＮＡクローンにおいて決定された。その結果得られたクローンは、図３０示すパターンを示した（ＮＤＦ）。
【０１９０】
例１０
他の可能なスプライシング変異体の検出戦略
ウシのｃＤＮＡクローンとＰＣＲ生成物の推定アミノ酸配列、及び公表されているヒト（図３１）とラット配列との整合性は、高いレベルの類似性を示して、これはこれらの配列が三つの種の中の相同遺伝子由来のものであることを示している。ｃＤＮＡ／ＰＣＲ生成物レベルにおいて検出可能なメッセンジャＲＮＡ転写体の数が変化するのは、恐らく、広範囲な組織−特異スプライシングに依るものと思われる。得られた、そして図３０に示すパターンは、その他のスプライシング変異体が存在することを示唆している。可能なスプライシング変異体のリストが図３７に示されている。これらの変異体の多くは、様々な組織から由来のｃＤＮＡライブラリーのコード化セグメント特異なプローブ化と、特定のコード化セグメントに特異的なプライマー対を使用したＰＣＲ実験とによって得ることが出来る。あるいはこれに代えて、これら変異体は、当業者の公知の切断及びスプライス技術により、特異なｃＤＮＡクローン、ＰＣＲ生成物又はゲノムＤＮＡ領域から組み立てることも可能である。例えば、共通のコード化セグメント（例えば、Ａ）中の稀な制限酵素切断サイトを使用して、ＧＧＦ２ＢＰＰ５のＦＢＡアミノ末端を、ＧＧＦ２ＢＰＰ１、ＧＧＦＢＰＰ２、ＧＧＦＰＰ３、又はＧＧＦＰＰ４のカルボキシ末端配列に接続することができる。コード化セグメントＥ及び／又はＧの存在又は不在が、目的とし、又既述の用途のために有利である場合には、これらのコード化セグメントを、発現構築体に含ませることができる。これらの変異体配列は、組替えシステム中に発現させることができ、その組替え生成物を分析して、そのシュワン細胞細胞分裂誘発活性のレベルと、そのｐ１８５erbB2レセプターに結合しこれを活性化する能力とを測定することができる。
【０１９１】
例１１
ＧＧＦの機能要素の同定
ＧＧＦ配列のファミリの推定構造は、その最長の形状（ＧＧＦ２ＢＰＰ４によって表される）が、細胞外部分が上皮細胞成長因子に類似するドメインを含む場合に、経膜タンパク質をコード化することを示しているＣａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｉ  ｐｐ．６９−１３３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ  １９９１参照）。コード化セグメントＣ及びＣ／Ｄ又はＣ／Ｄ’ペプチド配列におけるシスチン残基の位置は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ペプチド配列に於ける相同残基に対して保存されている（図３５、配列識別番号１５１−１５３参照）。これは、前記細胞外ドメインが、レセプター認識及び生物学的活性サイトとして機能することを示唆している。変異体形状の内のいくつかは、Ｈ，Ｋ及びＬコード化セグメントを欠如しており、従って、分泌、拡散可能生物学的活性タンパク質として発現可能である。ＥＧＦ状ドメイン（ＥＧＦＬ）を含むポリペプチドをコード化するＧＧＦ ＤＮＡ配列は、グリア細胞細胞分裂誘発活性を刺激するための十分な生物学的活性を有している可能性がある。
【０１９２】
このタンパク質の膜結合バージョンは、胚形成中又は、神経再生中（ニューロンの表面が増殖シュワン細胞の表面に密接に関連している場合）にニューロンの表面に発現された場合、シュワン細胞の増殖を誘発する可能性がある。
【０１９３】
分泌（非膜結合）ＧＧＦは、シュワン細胞とその分泌位置からいくらか離れた位置において作用することが可能な分類上拡散可能な因子として作用する可能性がある。他の形態も、細胞の損傷や細胞の破壊を通じた源から細胞内から放出される可能性がある。分泌ＧＧＦの一例は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化されるタンパク質であり（例６参照）、これは細胞の外部に向けられることが判った唯一のＧＧＦである（例７）。分泌は、恐らく、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化される組替えＧＧＦ−ＩＩ中に含まれるＮ−末端ドメインであって、領域Ｅにおいてのみ見られるＮ−末端疎水性配列によって仲介される。
【０１９４】
他のＧＧＦは、分泌されるものではないように思える（例６参照）。これらのＧＧＦは、組織の損傷の結果として放出される損傷反応形態であるのかもしれない。
【０１９５】
ＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化される）の予想タンパク質構造の他の領域と、領域Ｂ及びＡを含む他のタンパク質とは、ヒト基底膜ヘパラン硫酸プロテオグリカン核タンパク質（ｒｅｆ．）に対する類似性を示す。これらのＧＧＦにおけるＣ２免疫グロブリンフォールドの第２システインの隣に位置するペプチドＡＤＳＧＥＹは、基底薄膜タンパク質に見られる２２のＣ−２反復の内の９つに発生する。この証拠は、これらのタンパク質が、ニューロンやグリア等に関連するマトリックスタンパク質に関連していることを強く示唆するものであり、その目標サイトとしてのグリア成長因子の隔離の方法を示唆している可能性がある。
【０１９６】
例１２
組替え細胞からのＧＧＦの精製
その生物学的活性を分析するべく完全長ＧＦＦあるいはＧＧＦの部分を得るために、タンパク質を、クローン化ＤＮＡを使用して過剰生産することができる。いくつかの方法が使用可能である。前述の配列を有する組替えＥ．ｃｏｌｉ細胞を構築することができる。ｐＮＨ８ａやｐＨＨ１６ａ（ストラトジェン・インコーポレイテッド（Ｓｔｒａｔａｇｎｅ，Ｉｎｃ．））等の発現システムをその製造業者の指示に従ってこの目的のために使用することができる。あるいはこの代わりに、これらの配列を、ほ乳類発現ベクターに挿入して、過剰生産細胞系を構築することができる。例えば、この目的のために、ＧＧＦをコード化するＤＮＡ、クローンＧＧＦ２ＢＰＰ５を、ＣＯＳ細胞と、チャイニーズハムスタの卵巣細胞との両方に発現させた（例７参照）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，３５２１〜３５２７（１９８１））。このＧＧＧＦ  ＤＮＡを有するベクターを、公知の手法を使用してホスト細胞に移入することができる。
【０１９７】
一過的発現を調べるか、もしくは、Ｇ４１８耐性クローンを、メトトレキセートの存在下おいて成育させることにより、ｄｈｆｒ遺伝子（ｐＭＳＸＮＤベクター上に含まれる）を増幅し、その過程において、隣接のＧＧＦタンパク質コード化配列を共増幅する細胞を選別することができる。全く血清やタンパク質を含まない培地（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびハム（Ｈａｍ），Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １３，５３７〜５４７（１９７７））中に、ＣＨＯ細胞維持することができるので、所望のタンパク質は、その培地から精製することが可能である。例９において作られた抗血清を使用したウェスタン分析を使用して、前記過剰生産細胞の調整培地中における所望のタンパク質の存在を検出することができる。
【０１９８】
所望のタンパク質（ｒＧＧＦ−ＩＩ）を、次のようにして、ＣＯＳ細胞を一過的に発現させることによって調整した培地から精製した。ｒＧＧＦ−ＩＩを、調整培地から収穫し、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用して部分精製した。前記カラムを、３３．３ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０で平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分の流量で負荷した。シュワン細胞増殖活性と免疫反応性（ポリクローナル抗血清を上述のようにＧＧＦＩＩペプチドに対して使用した）とを有するピークを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０で溶出した（それぞれ、図５０Ａ及び５０Ｂ）。
【０１９９】
ｒＧＧＦ−ＩＩも、安定したチャイニーズハムスタの卵巣細胞系を使用して発現される。収穫された調整培地からのｒＧＧＦ−ＩＩを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用して部分精製した。前記カラムを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４によって平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分で負荷した。シュワン細胞増幅活性と免疫反応性（ＧＧＦ−ＩＩポリクローナル抗血清を使用）とを有するピークを、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０で抽出した。増殖性と免疫反応性の両方を備えた別のピークが、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０で観察された。
【０２００】
ｒＧＧＦ−ＩＩは、高分解能工程として疎水性反応クロマトグラフィ（陽イオン交換／リザーブフェーズクロマトグラフィ（必要な場合には第２高分解能工程として）、陰イオン交換クロマトログラフィのようなウィルス不活性化工程及びＤＮＡ除去工程、を使用することによって更に精製することができる。
【０２０１】
使用した手法の詳細な記述は以下の通りである。
【０２０２】
前記陽イオン交換カラムから抽出した組替えＧＧＦ−ＩＩピークのシュワン細胞増幅活性は、以下のようにして測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反応を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０によって抽出したピークを使用して５Ｍフォルスコリンの存在下において測定した。前記ピークは、２０  １，１０  １（１：１０）１０  １及び（１：１００）１０  １で添加した。125Ｉ−ウリジンの組み込みを測定し、１８〜２４時間の露光後に（ＣＰＭ）として表現した。
【０２０３】
ＧＧＦ−ＩＩのペプチドに対して発育させたポリクローナル抗体を使用した免疫ブロットを、次のようにして行った。１０μｌの異なったフラクションを、４−１２％のグラジエントゲルでランさせた。これらのゲルを、ニトロセルロース紙に移し、このニトロセルロースブロットを５％のＢＳＡでブロックし、ＧＧＦ−ＩＩ−特異抗体（１：２５０希釈）でプローブした。125Ｉタンパク質Ａ（１：５００希釈、特異的活性＝９．０／Ｃｉ／ｇ）を、二次抗体として使用した。前記免疫ブロットを、コダック社Ｘ線フィルムに６時間露光した。１Ｍ  ＮａＣｌで溶出したピークフラクションは、６５〜９０Ｋｄにおいて、ＧＧＦ−ＩＩと高分子量グリコフォームの予想サイズ範囲である，広い免疫反応性バンドを示した。
【０２０４】
陽イオン交換カラムでのＧＧＦ−ＩＩ精製は以下のように行った。ｒＧＧＦＩＩを発現するＣＨＯ細胞調整培地を、１０ｍｌ／分で前記陽イオン交換カラムに負荷した。このカラムを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化した。溶出は、それぞれ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０と５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０とで行った。すべてのフラクションを、ここに記載のシュワン細胞増殖分析（ＣＰＭ）を使用して分析した。タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、ＢＳＡを標準として使用したＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０２０５】
１０μｌの各フラクションを使用したウェスタンブロットを行った。図５１Ａ及び５１Ｂに示すように、免疫反応性とシュワン細胞活性とは相互移動する。
【０２０６】
前述のシュワン細胞細胞分裂誘発分析を使用して、完全長クローン又はその全ての物学的活性部分からの発現生成物の分析を行った。完全長クローンＧＧＦ２ＢＰＰ５が、ＣＯＳ細胞に一過的に発現された。移入されたＣＯＳ細胞の細胞内抽出物は、例１に記載したシュワン細胞増殖分析により分析した時に生物学的活性を示す。更に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５を発現する完全長に近いものが、ＣＨＯと昆虫（例７）細胞とに一過的に発現された。この場合、細胞抽出物と調整培地との両方が、例１に記載したシュワン細胞増殖分析において生物学的活性を示す。当業者によって、ＧＧＦ（ヘレグリンを含む）からのスプライシング変異体相補性ＤＮＡのファミリのすべてのメンバを、このようにして発現させ、シュワン細胞増殖分析において分析することができる。
【０２０７】
あるいは、組替え物質を、ＣＯＳ−７細胞においてスプライシング変異体Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）を発現させたウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ  ６９，５５９（１９９２））に従って、他の変異体から分離することができる。ｐＪＴ−２真核生物プラスミドベクターに挿入したｃＤＮＡクローンは、ＳＶ４０初期プロモーターのコントロール下にあり、ＳＶ４０終結及びポリアデニール化信号に３’で挟まれている。ＣＯＳ−７細胞は、以下のようにして、電気ポレーションによって、ｐＪＴ−２プラスミドＤＮＡで移入された。即ち、６ｘ１０6の細胞を（０．８ｍｌのＤＭＥＭと１０％のＦＥＢＳにおいて）、０．４ｃｍのキュベットに移し、１０μＬのＴＥ溶液中（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）にて２０μｇのプラスミドＤＮＡと混合した。エレクトロポレーションは、パルスコントローラユニットを２００オームに設定したＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｕｌｓｅｒ装置を使用して、室温で、１６００Ｖ、２４μＦで行った。次に、細胞を、２０ｍｌのＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ中に希釈し、Ｔ７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に移した。３７℃における１４時間の培養後、培地を、ＤＭＥＭ，１％ＦＢＳと置換し、培養を更に４８時間継続した。細胞から収穫した組替えタンパク質を含む調整培地は、このタンパク質のレセプターを発現する細胞系において生物学的活性を示した。この細胞系（ヒト乳ガン細胞ラインＡＵ５６５）を、組替え物質で処理した。処理された細胞は、ｅｒｂＢ２レセプターの活性化に特徴的な形態変化を示した。このタイプの調整培地も、シュワン細胞増殖分析においてテストすることが出来る。
【０２０８】
例１３
ｐ１８５レセプターに結合する他のタンパク質の精製と分析
Ｉ．ｇｐ３０とｐ７０との精製
ここに参考文献として添付するルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，１５５２（１９９２））及びリップマン（Ｌｉｐｐｍａｎ）およびルプ（Ｌｕｐｕ）（特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０））は、以下のようにして、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１の調整培地からタンパク質を精製した。
【０２０９】
調製培地採取を、周知の方法を使用して行った。培地を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過フィルターセル（ＹＭ５膜）（Ａｍｉｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中にて１００倍に濃縮した。浄化し濃縮した後、培地を、−２０℃で保存し、一方、連続採取を以後数日の間に行った。濃縮培地を、４℃で２日間に渡り、１００容量の０．１Ｍの酢酸に対して、Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ３チュービング（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ），カリフォルニア州，ロス・アンジェルス）を使用して透析した。透析中に沈澱した物質を、４℃で３０分間、４０００ｒｐｍでの遠心分離処理によって除去し、プロテアーゼインヒビターを添加した。次に、浄化したサンプルを凍結乾燥した。
【０２１０】
凍結乾燥した調整培地を、全タンパク質が約２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるように、１Ｍの酢酸中に、溶解させた。不溶性物質は、１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離処理によって除去した。次に、このサンプルをセファーデックスＧ−１００カラム（ＸＫ１６，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に負荷し、平衡化し、更に、これに、４℃で１Ｍの酢酸を３０ｍｌ／時間の流量で上方に流すことによる溶出を行った。４ｍｌの１００倍濃縮培地から、１００ｎｇのタンパク質が処理された。３ｍｌの溶出物を含むフラクションを、凍結乾燥させ、分析用に３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させ、更なる精製のための原料として利用した。
【０２１１】
セファデックスＧ−１００精製物を、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）でランした。第１の工程には、急勾配のアセトニトリルグラジエントを使用した。急勾配アセトニトリルグラジエントと他のすべてのＨＰＣＬ工程とは、Ｃ３−逆相カラムを、水中（ＨＰＬＣ−グレード）０で０．０５％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）によって平衡化した後に、室温で行った。これらのサンプルを負荷し、フラクションは、１ｍｌ／分の流量で３０分間に渡って、リニアグラジエント（０．０５％のＴＦＡ中で０〜４５％のアセトニトリル）で溶出した。２８０ｎｍで吸収が観察された。１ｍｌのフラクションを採取し、ＥＧＦレセプター競合活性の分析の前に凍結乾燥させた。
【０２１２】
第２のＨＰＬＣ工程には、緩勾配アセトニトリルグラジエントを使用した。前のＨＰＬＣ工程からの活性フラクションのプールを、同じカラムに関して再びクロマトグラフィ分析した。０．０５％のＴＦＡ中で５分間の０−１８％アセトニトリルグラジエント後に、０．０５％のＴＦＡ中で３０分間のリニアな１８〜４５％アセトニトリルグラジエントにて、溶出を行った。流量は１．０ｍｌ／分で、１ｍｌのフラクションが採取された。ヒトＴＧＦ瘁｜状因子が、３０〜３２％のアセトニトリル濃度で、ＲＲＡによる検出可能な一つのピークとして溶出した。
【０２１３】
ルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，２２８７（１９９２））は、ｐ１８５erbB2レセプターに結合する別のタンパク質を精製した。この特定のタンパク質、ｐ７５、は、１０％の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）を補足した改良イーグル培地（ＩＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ）中で繁殖させたＳＫＢｒ−３（ヒト乳ガン細胞系）の成長に使用される調整培地から精製されたものである。タンパク質ｐ７５は、ｐ１８５erbB2アフィニティーカラムを使用した濃縮（１００倍）調整培地から精製された。ｐ１８５erbB2の９４キロダルトン細胞外ドメイン（ｐ７５に結合）を、組替え発現によって生成し、ポリアクリルアミドヒドラジド−セファローズアフィニテイークロマトグラフィマトリックスに結合させた。結合後、前記マトリックスを、氷冷した１．０Ｍ ＨＣｌ中で十分に洗浄し、そのビーズを０．５Ｍ ＮａＮＯ2で活性化させた。温度は２０分間、０℃に維持し、その後に、濾過と、氷冷した０．１Ｍ ＨＣｌでの洗浄を行った。５００ｍｌの濃縮調整培地を、重力によって前記ビーズに流した。カラムを洗浄し、１．０Ｍのクエン酸で、４．０から２．０のｐＨ値で（ｅｒｂＢ２とｐ７５を分離させるため）ステップ的に溶出させた。すべてのフラクションを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＰＤ１０カラム上で脱塩させた。精製によって、３．０−３．５溶出ｐＨで７５ｋＤａの均−なポリペプチドが得られた（銀染色によるＳＤＳ／ＰＡＧＥでの分析によって確認）。
【０２１４】
ＩＩ．ｇＰ３０のＰ１８５erbB2Ｂ２への結合
精製ｇｐ３０タンパク質を、それがｐ１８５erbB2に結合したか否かを調べる分析においてテストした。ｐ１８５erbB2に対するモノクローナル抗体を備えた競合アッセイ。ｇｐ３０タンパク質は、ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ｐ１８５erbB2レセプターを発現するヒト乳ガン細胞系）中でＰ１８５erbB2に結合する抗体を置換した。ｇｐ３０のシュワン細胞増殖活性は、更に、シュワン細胞培養物を、例１〜３に記載の分析手法を使用して、精製ｐｇ３０によって処理することによっても示すことができる。
【０２１５】
ＩＩＩ．ｐ７５のｐ１８５erbB2への結合
ＳＫＢｒ−３調整培地から得た７５ｋＤａのポリペプチド（ｐ７５）が実際に、ＳＫＢｒ−３細胞中のｅｒｂＢ２ガン・タンパク質のためのリガンドであるのか否かを分析するために、ｇｐ３０のための前述の競合アッセイを使用した。ｐ７５が結合活性を示すことが判ったが、これに対して、他のクロマトグラフィフラクションからの物質はそのような活性を示さなかった（データは図示せず）。通過物質は、いくらかの結合活性を示した。これは、抜け出たｅｒｂＢ２  ＥＣＤの存在によるものであろう。
【０２１６】
ＩＶ．他のｐ１８５erbB2リガンド
ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ  ６９，２０５（１９９２））は、更に、ラット細胞（ＮＤＦ，その方法については例８参照）からのｐ１８５erbB2刺激リガンドをも精製した。ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１２０５（１９９２））は、ｐ１８５erbB2に結合し、これを刺激する、ヒト細胞からのヘレグリンαを精製した（例６参照）。ここに参考として添付する、タラコフスキー（Ｔａｒａｋｏｖｓｋｙ）他Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：２１８（１９９１）は、活性化マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチドの、ｐ１８５erbB2相同体である、Ｎｅｕレセプターへの結合を示した。
【０２１７】
ＶＩ．ＮＤＦの分離
ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅｓ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，３５４３（１９９１））は、ｐ１８５erbB2レセプターを刺激するであろう３５キロダルトンのグリコタンパク質を同定した。このタンパク質は、次の手法に従って調整された培地中において同定された。ラットＩ−ＥＪ細胞を、１７５−ｃｍ2フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で集合成長させた。単層を、ＰＢＳで洗浄し、無血清培地中にて１０〜１６時間放置した。前記培地を廃棄し、新たな無血清培地によって置換し、３日間の培養後に採取した。調整培地を、低速遠心分離によって浄化し、ＹＭ２膜（分子量２０００でカットオフ）を備えたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セル中で１００倍に濃縮した。調整培地におけるｎｅｕ刺激活性の生化学的分析は、前記リガンドが、熱に対しては安定しているが還元に対しては敏感な３５−ｋＤグリコタンパク質であることを示している。該因子は、高い塩濃度か、酸性アルコールのいずれかによって沈澱させることができる。選択的沈澱、ヘパリン−アガロースクロマトグラフィ、及び希釈酸中でのゲル濾過によって前記分子を部分精製することにより活性リガンドが得られ、これはがん原遺伝子のレセプターを刺激することが出来るが、構造的に活性ながん遺伝子ｎｅｕタンパク質に対しては無効果であった。しかしながら、この精製されたフラクションは、ＥＧＦのための関連レセプターをも刺激する能力を保持しており、これはこれらの二つのレセプターが、双方向メカニズムを介して機能的に結合していることを示唆するものである。あるいは、前記推定リガンドは、同時に二つのレセプターと反応する。該因子の、提示された生化学的特徴を利用して、これらの可能性が探求される完全に精製された因子を達成することができる。
【０２１８】
他の出版物において、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１５３６（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，８５８２（１９９１）およびグリーン（Ｇｒｅｅｎ）他，ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０））は、ヒトＴ−細胞（ＡＴＬ−２）系の調整培地からのタンパク質の精製について記載している。
【０２１９】
ＡＴＬ−２細胞系は、ＩＬ−２独立ＨＴＬＶ−１（＋）Ｔ細胞系である。無マイコプラズムＡＴＬ−２細胞を、５％のＣＯ2を含む加湿雰囲気中において３７℃で、培養培地として１０％のＦＣＢを含有するＲＰＭＩ  １６４０（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０）培地中に保持した。
【０２２０】
タンパク質物質の精製のために、ＡＴＬ−２細胞を、１ｘＰＢＳで２回洗浄し、７２時間、無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地／２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で３ｘ１０5ｍｌで培養し、その後、前記細胞をペレット化した。このように生成した培養上澄を、「調整培地」（Ｃ．Ｍ．）と称する。
【０２２１】
Ｃ．Ｍ．を１０００ｄカットオフのＹＭ−２Ｄｉａｆｌｏ膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ボストン）を使用して、１リットルから１０ｍｌへと濃縮した。いくつかの分析用に、１０００ＭＷ以上の成分を含有する濃縮Ｃ．Ｍ．を、ＲＰＭＩ培地によって、もとの容量に再希釈した。ポリアクリルアミドグラジエントゲル（インテグレイテッド・セパレーション・システムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），メリーランド州，ハイド・パーク又はフォアキャスト・システム・バイ・アマーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  Ａｍｅｒｓｃｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を使用してゲル電気泳動にかけ、その後、前記１リットルの調合物からのこの２つのカラム精製物資の幾らかを銀染色したところ、少なくとも４ないし５のバンドが現れ、これらの内、１０ｋＤと２０ｋＤとのバンドがこの物質に特有のものであった。通過した、１０００ＮＷ以下のＣ．Ｍ．含有成分は希釈せずに使用した。
【０２２２】
濃縮調整培地を、．４５μ  ユニフロフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）でフィルター殺菌し、次に、予め１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．１で平衡化させておいたＤＥＡＥ−ＳＷ陰イオン交換カラム（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．），マサチューセッツ州，ミルフォード）への適用によって更に精製した。一ランのＨＰＬＣ当り１リットルの元のＡＴＬ−２調整培地を表す濃縮Ｃ．Ｍ．タンパク質を、前記カラムに吸着させ、次に、４ｍｌ／分の流量で、０ｍＭから４０ｍＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出した。フラクションを、１０％の適当なＤＥＡＥフラクション（１カラム精製物）又は１％の適当なＣ１８フラクション（２カラム精製物）に対する生体外免疫複合体キナーゼ分析を使用して、分析した。この生体外免疫複合体キナーゼ分析を使用して投与量−依存的にｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させた活性物質は、２２０ないし２４０ｍＭのＮａＣｌの近辺での４ないし５のフラクション（３６−４０）に渡って一つの主要ピークとして溶出した。ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥ精製後、前記活性フラクション中のタンパク質を、濃縮、プールして、更に濃縮し、その後、Ｃ１８（百万マトリクス）逆相クロマトグラフィ分析した（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．），マサチューセッツ州，ミルフォード）（Ｃ１８＋１工程または２カラム精製物と称する）。溶出は、０．１％のＴＦＡに対する２−プロパノールのリニアグラジエントで行った。すべてのフラクションを、ＲＰＭＩ１６４０培地に対して透析して２−プロパノールを除去し、下記のように、前記生体外免疫複合体キナーゼ分析と、適当なフラクションの１％濃縮物を使用して分析した。ｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させる活性物質は、二つのピークで抽出された。一つはフラクション１１〜１３において溶出し、第２番目の僅かに低い活性の活性物質ピークは、フラクション２０〜２３において溶出した。これらの二つのピークは、それぞれ、約５ないし７％のイソプロパノールと約１１ないし１４％のイソプロパノールとに対応している。Ｃ１８＃１発生フラクション１１〜１３を、特徴付け研究に使用した。第２クロマトグラフィ工程から得られた活性フラクションをプールし、タンパク質物質サンプルに指定した。
【０２２３】
２０リットルの調合も同じ精製戦略を使用した。前記ＤＥＡＥ活性フラクション３５〜４１をプールし、前述のようにしてｃ１８クロマトログラフィ分析にかけた。Ｃ１８＃１フラクション１１〜１３と２１〜２４との両方が、投与量−依存活性を有していた。フラクション１１〜１３のプールを、更にＣ１８クロマトグラフィ分析工程にかけた（Ｃ１８＃２又は３カラム精製物と称する）。ここでも再び、フラクション１１〜１３と２１〜２４とが活性を有していた。例８で記載の生体外免疫複合体キナーゼ分析において測定されたフラクション２３の投与量反応は、フラクション２３を容量で０．００５％、フラクション２３を容量で０．０５％添加することによって得られる。これは達成された最も高い純度である。
【０２２４】
分子量の範囲を、ゲル濾過クロマトグラフィ分析と限外濾過膜分析とに基づいて測定した。ほぼ同じ量のチロシンキナーゼ活性を、保持し、１０，０００分子量カットオフフィルターにより通過した。ほとんどすべての活性物質が、３０，０００分子量カットオフフィルターを通過した。活性物質クロマトグラフフラクションの分子量範囲を、投与量−依存ｎｅｕ−活性化活性物質を含むフラクションを、同じ実行条件を使用して発生された一組のタンパク質分子量標準（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ州，セント・ルイス）の溶出プロフィールと比較することによって決定した。活性物質の低分子量の領域が、７，０００と１４，０００ダルトンの間に見つかった。活性物質の第２の範囲は、約１４，０００から約２４，０００ダルトンの間であった。
【０２２５】
ポリアクリルアミドグラジエントゲル（インテグレイテッド・セパレーション・システムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，メリーランド州，ハイド・パーク又はフォアキャスト・システム・バイ・アマーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  Ａｍｅｒｓｃｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を使用した電気泳動後、３−カラム精製物質（ｃ１８＃２）の銀染色を、市販の銀染色キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，ＮＹ）を使用して行った。２０リットルの調合物のｃ１８＃２精製から得られたフラクション２１，２２，２３及び２４を、マーカーとともにランさせた。フラクション２２と２３とが、１８５erbB2（ｎｅｕ）キナーゼ分析（下記参照）において最も強力な投与量反応を示した。選択された分子量フラクションがｐ１８５erbB2と作用するという事実が、免疫複合体キナーゼ分析によって示された。
【０２２６】
ここに参考文献として添付するフアング（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８〜１１５１２）は、ウシの腎臓から別のｎｅｕ／ｅｒｂ  Ｂ２リガンド成長因子を分離した。２５ｋＤのポリペプチド因子が、カラム分別の手法によって分離され、次いで、ＤＥＡＥ／セルロース（ＤＥ５２）、Ｓｕｌｆａｄｅｘ（硫酸エステル化されたセファーデックスＧ−５０）、ヘパリン−セファロース４Ｂ、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）で連続カラムクロマトグラフィー分析された。前記因子、ＮＥＦ−ＧＦ、は、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２遺伝子生成物のチロシン−特異性自己燐酸化を刺激する。
【０２２７】
ＶＩＩ．ｐ１８５erbB2Ｂ２に結合するリガンドに対する免疫複合体分析ＮＤＦ
この分析は、ＡＴＬ−２調整培地（Ｃ．Ｍ．）又はタンパク質物質を変量させながらＰＮ−ＮＲ６細胞溶解物の予備培養によって推進した、免疫沈降したｐ１８５の自己燐酸化活性物質における相違を示すものであって、これをここでｎｅｕ−活性化活性物質と称する。
【０２２８】
免疫複合体キナーゼ分析において使用した細胞系は、ここにその全部を参考文献として添付する、コカイ（Ｋｏｋａｉ）他，Ｃｅｌｌ  ５５，２８７〜２９２（Ｊｕｌｙ ２８，１９８９）と、これもその全部を参考文献として添付する、マーク・アイ・グリーン（Ｍａｒｋ Ｉ．Ｇｒｅｅｎ）の名のもとに「抗−レセプター抗体によってがん細胞を治療する方法」という名称で１９８９年７月２７に出願された米国出願第３８６，８２０号とに記載の方法によって、入手、調合、培養したものである。
【０２２９】
細胞ラインは、すべて、５％のＣＯ2を有する加湿雰囲気中において、培養培地として５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中に維持した。
【０２３０】
１５０ｍｍディシュ中の細胞の濃縮培養物を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍｌの冷凍−解凍バッファ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，１０％グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％アプロチニン）中に掻き入れ、遠心分離（６００×６，１０分間）した。細胞ペレットを、１ｍｌの溶出（Ｌｙｓｉｓ）バッファ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３％Ｂｒｉｊ３５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１％アプロチニン，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２０μｌＭ  Ｎａ3ＶＯ4，１０％グリセロール）中で再懸濁させ、４℃で３０分間回転させた。
【０２３１】
すべての化学物質は、特に明記の無い限り、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．），ミズーリ州，セント・ルイスからのものであった。非溶解物質を、４０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除去した。次に使用するクリアな上澄を、細胞溶出物と指定する。
【０２３２】
前記細胞溶出物を、５０μｌの５０％（容量／容量）ｓプロテインＡ−セファローズ（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．），ミズーリ州，セント・ルイス）と、１５分間培養し、２分間の遠心分離で、溶出物を予備浄化した。この予備浄化細胞溶出物の５０μｌ部分を、調整培地、タンパク質物質、又は特定の他の因子とともに、溶出バッファと１ｍｌの最終容量で、氷上で１５分間培養した。次に、サンプルを、ｐ１８５ｎｅｕ及びｐ１８５ｃ−ｎｅｕを認識する５μｇの７．１６．４モノクローナル抗体又は他の適当な抗体と共に、氷上で２０分間培養し、その後４℃で回転させながら、５０μｌの５０％（容量／容量）タンパク質Ａ−セファロースで培養した。免疫複合体を、遠心分離によって収集し、５００μｌの洗浄バッファ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ．７．５、０．１％，Ｂｒｉｊ３５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％アプロンチニン、３０μｍ  Ｎａ3ＶＯ4）で４回洗浄し、更に、反応バッファ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＭｎＣｌ2、及び０．１％Ｂｒｉｊ３５、３０μｍ  Ｎａ3ＶＯ4）で２回洗浄した。ペレットを、５０μｌの反応バッファ中で再懸濁させ、（ガンマ−32Ｐ）−ＡＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を添加して０．２μｍの最終濃度を得た。これらのサンプルを、２７℃で２０分間、又は純粋サンプルとともに４℃で２５分間培養した。２ｍＭ  ＡＴＰと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含有する３ｘＳＤＳサンプルバッファを添加することによって反応を終結させ、次に、これらを１００℃で５分間培養した。これらのサンプルを、次に、１０％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。ゲルを染色、乾燥し、強化スクリーンを備えたＫｏｄａｋ  ＸＡＲまたはＸＲＰフィルムに露光した。
【０２３３】
ＶＩＩＩ．活性を有するアセチルコリンレセプター（ＡＲＩＡ）の精製
ＡＲＩＡ、即ち、アセチルコリンレセプターの合成を刺激する４２ｋＤのタンパク質が、Ｇｅｒａｌｄ  Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他  Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５（１９９３））の実験室にて分離された。ＡＲＩＡは、ｐ１８５erbB2に類似の１８５Ｋｄａ筋肉経膜タンパク質のチロシン燐酸化を誘発し、培養胚筋管内のアセチルコリンレセプター合成を刺激する。ＡＲＩＡをコード化するｃＤＮＡクローンの配列分析は、ＡＲＩＡが、タンパク質のＧＧＦ／ｅｒｂＢ２リガンドグループのメンバであることを示しており、これは、グリア細胞細胞分裂誘発を刺激や、ここに記載の例えばＧＧＦ２の適用に潜在的に有効である可能性を有している。
【０２３４】
例１４
シュワン細胞中のＧＧＦによって仲介されたタンパク質チロシン燐酸化
増殖を誘発するための十分なレベルのグリア成長因子での処理の後、ラットシュワン細胞は、タンパク質チロシンの燐酸化の刺激を示す（図３６）。様々な量の部分精製ＧＧＦを、例３に概述した手法に従ってラットシュワン細胞の一次培養に適用した。シュワン細胞を、ポリＤ−リジン被覆した２４のウェルプレート内の、１ｍＬのＧＧＦ−ＣＭにつき（１ウェル当り０．５ｍＬ）ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清／５μＭフォルスコリン／０．５μｇ中で発育させた。集合状態において、前記細胞に、ウェル当り０．５ｍＬでＤＭＥＭ／１０％のウシ胎仔血清を供給し、培養器内に一晩放置して鎮静化させた。次の日、前記細胞に、０．２ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を供給し、培養器内で１時間放置した。次に、テストサンプルを、必要に応じて、様々な濃度と長さで、前記培地に直接添加した。次に、細胞を、沸騰している溶解バッファ（燐酸ナトリウム、５ｍＭ，ｐＨ６．８；ＳＤＳ，２％，β−メルカプトエタノール、５％；ジチオトレイトール、０．１Ｍ；グリセロール、１０％；ブロモフェノールブルー，０．４％；バナジウム酸ナトリウム，１０ｍＭ）中で溶解し、沸騰水浴中で１０分間培養し、次に、直接に分析するか、あるいは、−７０℃で冷凍した。サンプルは、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのランによって分析し、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）他（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４３５０−４３５４に記載の標準手法を使用してニトロセルロース上にエレクトロブロッティングした。ブロットされたニトロセルロースを、Ｋａｍｐｓ  ａｎｄ  Ｓｅｌｔｏｎ（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：３０５−３１５に記載されている標準方法を使用して、抗ホスホチロシン抗体でプローブした。プローブされたブロットを、一晩オートラジオグラフィに露光し、標準実験室手法を使用して現像した。濃度測定を、ウルトラスキャンＸＬ強化レーザ濃度計（ＬＫＢ）を使用して行った。分子量指定は、予備染色高分子量標準（Ｓｉｇｍａ）に対して行われた。タンパク質燐酸化とシュワン細胞増殖の投与量反応は非常に類似している（図３６）。燐酸化バンドの分子量は、ｐ１８５erbB2の分子量に非常に近い。シュワン細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５クローンによってＣＯＳ細胞翻訳物から調整した培地によって処理した場合にも類似の結果が得られた。これらの結果は、予想されていた、ＧＧＦｓとの相互作用および１８５erbB2の活性化とよく相関している。
【０２３５】
この実験を組替えＧＧＦ−ＩＩで繰り返した。ＧＧＦ−ＩＩクローンで安定的に形質転換したＣＨＯ細胞系（ＧＧＦ２ＨＢＳ５）からの調整培地は、上述の分析を使用して、タンパク質チロシン燐酸化を刺激する。疑似移入されたＣＨＯ細胞系ではこの活性を刺激することは出来なかった（図５２）。
【０２３６】
例１５
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系からのタンパク質因子によるシュワン細胞増殖の分析
シュワン細胞の増殖は、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の調整培地によって媒介される。分析の第１日目、１０4個の一次ラットシュワン細胞を、９６ウェル・ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート中に、ウェル当り５％のウシ胎仔血漿を補足した１００μｌのダルベッコ変法イーグル培地内にプレート化した。分析の第２日目、１０μｌの調整培地（例６に記載のように培養された、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１からのもの）を、前記ミクロタイタープレートの各ウェルに添加した。第６日目、各プレート当りのシュワン細胞の数を、酸ホスファターゼ分析（コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）他Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１３６（１９８６）の手法に従って）によって測定した。前記プレートを、１００μｌの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と１００μｌｎｏ反応バッファ（０．１ｍ酢酸ナトリウム，（ｐＨ５．５））と０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で洗浄し、各ウェル毎に、１０ｍＭの燐酸ｐ−ニトロフェニルを添加した。プレートを３７℃で２時間培養し、１０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって反応を終結させた。各サンプルの光濃度を、分光光度計で４１０ｎｍで読み取った。コントロール細胞系（ＨＳ−２９４Ｔ，ｅｒｂＢ−２リガンドの非プロデューサ）からの調整培地によって処理したシュワン細胞において細胞数の３８％の刺激が観察された。この結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ライン（ｐ１８５erbB2結合活性を刺激する）によって分泌されたタンパク質が、シュワン細胞の増殖を刺激することを示すものである。
【０２３７】
例１６
ＧＧＦのＮ−グリコシル化
ＧＧＦ−ＩＩ候補クローンＧＧＦ２ＢＰＰ１，２及び３のｃＤＮＡ配列から予測されるタンパク質配列は、多数のコンセンサスＮ−グリコシル化モチーフを有している。ＧＧＦＩＩ０２ペプチド配列におけるギャップは、これらのモチーフの一つにおけるアスパラギン残基に一致し、これは、このサイトにおいて恐らく炭水化物が結合していることを示している。
【０２３８】
ＧＧＦのＮ−グリコシル化を、タンパク質中において炭水化物とアスパラギン残基との間の共有結合を切断する酵素であるＮ−グリカナーゼとの培養後においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度の変化を観察することによって調べた。
【０２３９】
ＧＧＦ−ＩＩのＮ−グリカナーゼ処理によって、ＭＷ４０〜４２ｋＤａの主要なバンドと、４５〜４８ｋＤａの副バンドとが得られた。非還元条件下における活性物質溶出実験は、約４５〜５０ｋＤａにおける一つの活性脱グリコシル化種を示した。
【０２４０】
ＧＧＦ−Ｉの活性物質溶出実験も、Ｎ−グリカナーゼによって処理された場合に、ＭＷ２６〜２８ｋＤａの活性種を生ずることにより、電気泳動的移動度の増加を示している。銀染色によって、移動度のシフトがあることが確認されたが、使用されたサンプルのバックグラウンドの染色によってＮ−脱グリコシル化バンドを指定することが出来なかった。
【０２４１】
寄託
Ｔ７プロモーターのコントロール下におけるプラスミドｐブルースクリプト５ｋ中の核酸コード化ＧＧＦ−ＩＩ（ｃＤＮＡ，ＧＧＦ２ＨＢＳ５）タンパク質（例６）を、アメリカ培養細胞系統保存機関，メリーランド州ロックスビルに寄託し、ＡＴＴＣ番号７５２９８を与えられた。本出願人は、もしもこのプラスミドが、本件が特許となった時にこの特許の権利期間が終結するまでに生存不能となった場合には、これを取り替える義務と、更に、そのような特許が発行されたことをＡＴＴＣに通知し、その発行時にこの寄託物を公衆に利用可能とする義務があることを認識するものである。それ以前においては、該寄託物は、３７ＣＦＲ １．１４及び３５ ＵＳＣ １１２の規定に従って特許庁長官に利用可能とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】例１に関し、カルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィからの生成物のプロフィール。
【図２】例１に関し、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣからの生成物のプロフィール。
【図３】例１に関し、モノ Ｓ ＦＰＬＣからの生成物のプロフィール。
【図４】例１に関し、ゲル濾過処理ＦＰＬＣの生成物のプロフィール、
【図５】例１に関し、逆相ＨＰＬＣからの二つの部分的に精製されたポリペプチド生成物のプロフィール。
【図６】例１に関し、逆相ＨＰＬＣからの二つの部分的に精製されたポリペプチド生成物のプロフィール。
【図７】例１に関し、ウシ胎仔血清又はウシ胎仔血漿のバックグランドを使用した逆相ＨＰＬＣからのＧＣＦ−ＩＩ及びＧＣＦ−ＩＩの投与量−反応曲線。
【図８】例１に関し、ウシ胎仔血清又はウシ胎仔血漿のバックグランドを使用した逆相ＨＰＬＣからのＧＣＦ−ＩＩ及びＧＣＦ−ＩＩの投与量−反応曲線。
【図９】ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０、２２〜２９、３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列のリスト（例２参照）。
【図１０】ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０、２２〜２９、３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列（後記の例２参照）を示し、特に新規な配列を示し、パネルＡは、縮重オリゴヌクレオチドプローブと縮重ＰＣＲプライマーとを構成するのに使用するＧＣＦ−Ｉペプチドの配列がリストされ（配列認識番号２０，１，２２〜２９及び１７）、パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、合成ペプチドの構成にも使用され、パネルＢは、縮重プローブと縮重ＰＣＲプライマーの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリスト（配列認識番号１７及び５２）。
【図１１】ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０、２２〜２９、３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列（例２参照）を示し、特に新規な配列のリスト。
【図１２】ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０、２２〜２９、３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列（後記の例２参照）を示し、特に新規な配列を示し、パネルＡは、縮重オリゴヌクレオチドプローブと縮重ＰＣＲプライマーとを構成するのに使用するＧＣＦ−ＩＩペプチドの配列がリストされ（配列認識番号４５〜５２）、パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、合成ペプチドの構成に使用され、パネルＢは、縮重プローブと縮重ＰＣＲプライマーの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリスト（配列認識番号５３）。
【図１３】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１４】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１５】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１６】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１７】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１８】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図１９】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図２０】例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図２１】例４に関し、図１０のパネルＡ及び図１２のパネルＡに示された新規なペプチド配列から構成された縮重オリゴヌクレオチドのリスト（配列認識番号５４〜８８）。
【図２２】例４に関し、縮重オリゴヌクレオチドプローブ６０９，６５０（それぞれ図２１，配列認識番号６９及び７２参照）の結合サイトを含有する組替えウシゲノムファーゼＧＣＦ２ＢＧ１からの推定ゲノムファーゼＧＧＦ２ＢＧ１のストレッチを示すリストであって、同図は、ＤＮＡ配列のコード化ストランドと第３読み取り枠の推定されたアミノ酸配列であり、因子２（太字）からのペプチド１２の配列は、６６アミノ酸転写読み取り枠（ヌクレオチド７５２７２）の一部である。
【図２３】例４に関し、後部下垂体からのＲＮＡに存在するウシＧＧＦ−ＩＩコード下配列のセグメントを分離する実験に使用された縮重ＰＣＲプライマー（パネルＡ，配列認識番号９０〜１０８）とユニークなＰＣＲプライマー（パネルＢ，配列認識番号１０９〜１１９）のリスト。
【図２４】例４に関し、図７のパネルＡ，Ｂのプライマーのリストを使用したＰＣＲ増幅実験において得られた９つの別々の隣接したウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ構造体と配列、及び後部下垂体からのＲＮＡを示し、同図の最上ラインは、特徴付けられたｃＤＮＡ構造体に寄与するコード化配列の略図。
【図２５】例４に関し、ＧＧＦ２ＢＧ１のウシ組替えファーゼの物理的地図であり、前記ウシフラグメントは、長さが約２０ｋｂであり、ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の二つのエクソン（太字）を有している。酵素Ｘｂａｌ，ＳｐｅＩ，Ｎｄｅｌ，ＥｃｏＲＩ，Ｋｐｎｌ，ＳｓｔＩの制限サイトがこの物理的地図上に示され、斜線部分は、配列のためにサブクローンされたフラグメントに対応する。
【図２６】例４に関し、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の三つの別の遺伝子生成物の構造の略図であり、エクソンはその発見の順番にＡないしＥとしてリストされている。別のスプライシングパターン１，２及び３は、三つのオーバーラップする推定タンパク質構造体（ＧＧＦ２ＢＰＰ１，２，３）を生成し、これらはそれぞれ別の図２８Ａ，Ｂ，Ｃ（下記）に示されている。
【図２７】配列認識番号１２０〜１３２を示し、図２８Ａ，２８Ｂ，２８Ｃ（下記）に示された推定タンパク質配列において同定されたＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩと、図１０及び１２にリストされた新規なペプチド配列との比較を示すリストであり、同図は、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つが、これらの推定タンパク質配列に見られることを示しており、ＧＧＦ−Ｉ配列に類似の二つのペプチド配列も見られる。
【図２８Ａ】、配列認識番号１３３を示し、図２６のスプライシングパターンＮｏ．１から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリスト（配列認識番号１３３）であり、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２０６アミノ酸のタンパク質をコード化し、太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
【図２８Ｂ】配列認識番号１３４を示し、図２６のスプライシングパターンＮｏ．２から得られるコード化ストランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストであり、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２８１アミノ酸のタンパク質をコード化し、太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
【図２８Ｃ】配列認識番号１３５を示し、図２６のスプライシングパターンＮｏ．３から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストであり、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２５７アミノ酸のタンパク質をコード化し、太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。
【図２９】例６に関し、サザンブロット上の様々なほ乳類ＤＮＡに対する推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子配列のクロスハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムであり、前記フィルターは、同図にリストされた種からのＥｃｏＲＩ−消化ＤＮＡ（各レーンにつき５μｇ）を含有する。前記プローブは、図２５の物理的地図によって予測されるウシＤＮＡの４キロベースのフラグメントを含んで、各ＤＮＡサンプルにおける単一の強力なバンドを検出し、より力の小さいバンドも観察され、これらは関連ＤＮＡ配列を示す。他のほ乳類ＤＮＡサンプルからの強いハイブリダイゼーションバンドは、これらの種のＧＧＦ−ＩＩ相同体を示すものと考えられる。
【図３０】さまざまなスプライシング変異体を示す図であり、コード化セグメントは、Ｆ，Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’，Ｄ，Ｄ’，Ｈ，Ｋ及びＬによって示され、精製タンパク質からのペプチド配列の位置は、”０”によって示されている。
【図３１】配列認識番号１３６〜１４７、１６０、１６１を示し、ＧＧＦのコード化セグメントのＤＮＡ配列と予想ペプチド配列のリストであり、ライン１は、ウシＧＧＦの予想アミノ酸配列のリストであり、ライン２は、ウシＧＧＦのヌクレオチド配列のリストであり、ライン３は、ヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列のリストであり（ヌクレオチドベースのマッチングは縦線にて示してある）、ライン４は、前記予想ウシ配列とは異なる場合におけるヒトＧＧＦ／ｈｅｒｅｇｕｌｉｎの予想アミノ酸配列のリストであり、コード化セグメントＥ、Ａ’及びＫは、ウシ配列のみを表し、コード化セグメントＤ’は、ヒト（ヘレグリン）配列のみを表す。
【図３２】配列認識番号１４８を示し、ＢＰＰ５の予想ＧＧＦ２アミノ酸配列とヌクレオチド配列のリストであり、上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
【図３３】配列認識番号１４９を示し、ＧＧＦ２ＢＰＰ２の予想アミノ酸配列とヌクレオチド配列のリストであり、上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
【図３４】配列認識番号１５０を示し、ＧＧＦ２ＢＰＰ４の予想アミノ酸配列とヌクレオチド配列のリストであり、上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、予想アミノ酸配列である。
【図３５】配列認識番号１５１〜１５２を示し、二つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧＦ２ｐｐ４とＧＧＦ２ｐｐ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）との整合を示す配列のリストであり、星印は、保存されたシステインを示す。
【図３６】ＧＧＦの増加に対する、約２００ｋＤ（抗燐酸化ポリクローナル抗体とともに現像したウエスタンブロット上における２００ｋＤバンドの強度）のタンパク質のＧＧＦ活性のレベル（シュワン細胞細胞分裂誘発分析）と、チロシン燐酸化を示すグラフ。
【図３７】図３１の配列からのスプライシング変異体の配列のリスト。
【図３８】ＥＧＦＬ１（配列認識番号１５４）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図３９】ＥＧＦＬ２（配列認識番号１５５）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図４０】ＥＧＦＬ３（配列認識番号１５６）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図４１】ＥＧＦＬ４（配列認識番号１５７）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図４２】ＥＧＦＬ５（配列認識番号１５８）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図４３】ＥＧＦＬ６（配列認識番号１５９）の、予想アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す配列のリスト。
【図４４】クローンのスケールコード化セグメントマップであり、Ｔ３は、前記クローンからｍＲＮＡを生成するのに使用するバクテリオファージプロモーターを示し、Ｒ＝隣接のＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを、５’ＵＴは、５’非翻訳領域を示し、Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｃ，Ｃ／Ｄ’及びＤは、コード化セグメントを示し、０＝翻訳開始サイト。ヒ＝ウシＥセグメントに対して相同の領域の５’限界（例６参照）、そして、３’ＵＴは３’非翻訳領域を示す。
【図４５】ＧＧＦ２ＨＢＳ５の予想アミノ酸配列（中間部：配列認識番号１７０）と、核酸配列（上部：配列認識番号２１）とを示す。下部（中間）配列は、ＧＧＦ−ＩＩ調製物（図１１及び１２参照）からのペプチド配列を示す配列のリスト。
【図４６】組替えヒト及びウシグリア成長因子のシュワン細胞細胞分裂誘発活性を示すグラフ。
【図４７】ＣＨＯ細胞のならし培地の大きさの異なる部分標本（ａｌｉｑｕｏｔｓ）の投与から生じたシュワン細胞増殖活性物質の投与量−反応曲線。
【図４８】ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含有するバキュロウィルスによって感染したＳＦ９昆虫細胞によって細胞外培地中に分泌されたシュワン細胞細胞分裂誘発活性物質の投与量−反応曲線、
【図４９】ＧＧＦペプチド抗体を使用した組替えＣＨＯ細胞のならし培地のウェスタンブロットを示す図。
【図５０Ａ】陽イオン交換カラムから溶出した組替え（ＣＯＳ細胞が生成）ヒトＧＧＦ−ＩＩ（ｒｈＧＧＦ−ＩＩ）ピークのシュワン細胞増殖活性のグラフ。
【図５０Ｂ】ｒｈＧＧＦＩＩの特定のペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体を使用した組替えＧＧＦＩＩピークに対する免疫ブロット
【図５１Ａ】フラクションごとの陽イオン交換カラムでのｒｈＧＧＦ−ＩＩ（ＣＨＯ細胞が生成）の精製を示すグラフ。
【図５１Ｂ】図５１Ａに示されたフラクションとｒｈＧＧＦ−ＩＩ特異抗体を使用したウエスタンブロットの写真。
【図５２】組替えグリア成長因子で処理したシュワン細胞におけるチロシン燐酸化を示すゲルの写真。
【図５３】ＧＧＦＨＢＳ５，ＧＧＦＨＦＢ１及びＧＧＦＢＰＰ５ポリペプチド（配列認識番号１７０，１７１，１７２）の配列のリスト。
【図５４】前記ＣＨＯ細胞−発現ベクターｐｃＤＨＦＲｐｏｌｙＡのマップ。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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