(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ペプチド抗原とは逆向き鏡像体に改変されて少なくとも５つの連続したD-アミノ酸を含有し、ここでこれらのアミノ酸の残基が反転した方向性を有し、少なくとも８つのアミノ酸を含有し、該天然ペプチド抗原を認識する抗体の産生を誘導し得る、天然抗原の合成ペプチド抗原類似物。
【請求項２】
天然ペプチド抗原の完全に逆向き鏡像体に改変された、請求項１に記載の天然抗原の合成ペプチド抗原類似物。
【請求項３】
前記逆向き鏡像体配列に隣接するアミノ酸残基が、該アミノ酸残基と同一の側鎖によりα置換された一対のジアミノメタンおよびマロネートにより置換されている、請求項１または２に記載の抗原類似物。
【請求項４】
免疫適格宿主の免疫処置に用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成ペプチド抗原類似物。
【請求項５】
前記天然抗原が、自然界に産生するポリペプチドまたはその抗原性断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原類似物。
【請求項６】
前記抗原類似物が、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）スポロゾイトのスポロゾイト外被タンパク質の主要抗原エピトープ、ジフテリア毒素抗原、ロバストキシン、肝炎ウィルス抗原、またはＨＩＶ抗原のいずれか１つの類似物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原類似物。
【請求項７】
対応する天然抗原を用いて得られる免疫応答よりも長時間持続する免疫応答を誘発し得る、請求項１に記載の抗原類似物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原類似物を、医薬学的に許容し得る担体、稀釈剤、賦形剤および／または補助物質と共に含有する、ワクチン。
【請求項９】
宿主に投与するに適切な担体分子と結合させられた請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原類似物を含有する、ワクチン。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗原類似物を含有するワクチンであって、その際、該抗原類似物が抗体を産生する能力および／または抗体と結合する能力を有する最小の抗原性断片の類似物であり、かつ該抗原類似物のＣ末端およびＮ末端が改変されて保護されていることを特徴とする、ワクチン。
【請求項１１】
経口投与される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原類似物を、陽性および陰性の対照基準物と共に含む、診断用キット。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の天然ペプチド抗原の逆向き鏡像体類似物を合成することを包含する、天然ペプチド抗原の抗原類似物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、部分的または全体的に逆向き（retro）、鏡像体（inverso）または逆向き鏡像体（retro-inverso）に改変された、天然ペプチド抗原の合成ペプチド抗原類似物に関する。この合成ペプチド抗原類似物は、免疫原として免疫適格宿主に投与されたときに、元の天然ペプチド抗原を認識する抗体の産生を齎す。また、本発明は、これらの類似物の使用、これらの抗原類似物を含有するワクチンおよびその調製方法、並びにこれらの抗原類似物を用いて生成される抗体にも関する。
背景技術
ポリペプチドの立体化学は、アミノ酸残基と結合残基のα炭素原子との間のペプチド結合により規定されるポリペプチド骨格について、アミノ酸残基の側鎖の位相化学的配置により表され得る。さらに、ポリペプチド骨格は相異なる末端を有するので方向性も有している。
自然界において産するアミノ酸の大半はＬ-アミノ酸である。自然界において産するポリペプチドはＬ-アミノ酸を多数含んでいる。
Ｄ-アミノ酸はＬ-アミノ酸の鏡像異性体であり、本明細書において鏡像体ペプチドと称されるペプチド、即ち天然ペプチドに対応するがＬ-アミノ酸よりはむしろＤ-アミノ酸からなるペプチドを形成する。
逆向きのペプチドはＬ−アミノ酸からなるが、そのアミノ酸残基は天然ペプチド配列の逆向きに付けられている。
自然界において産するポリペプチドを逆向き鏡像体にする改変は、対応するＬ-アミノ酸とは立体化学的に逆の位置にα炭素を有するアミノ酸、即ちＤ-またはＤ-アロ-アミノ酸を天然ペプチド配列とは逆の順序で合成付加することを包含する。従って、逆向き鏡像体は反転した末端およびペプチド結合の反転した方向性を有しているが、天然ペプチド配列におけると同様の側鎖のトポロジーは殆ど維持している。
部分的に逆向き鏡像体であるペプチド類似物とは、その配列の一部分だけが反転され、かつ光学異性体性のアミノ酸残基に置き換えられたポリペプチドである。そのような類似物の逆向き鏡像部分は反転したアミノ末端およびカルボキシル末端を有しているので、逆向き鏡像部分の側面に位置するアミノ酸残基は、側鎖類似物であるα置換された一対のジアミノメタン類およびマロネート類により、それぞれ置き換えられる。
逆向き鏡像体ペプチド類似物の合成方法（Bonelli et al., 1984; Verdini and Viscomi, 1985）および、部分的に逆向き鏡像体であるペプチド類似物を固相合成する幾つかの方法（Pessi et al., 1987）が既に知られている。
基質に対する酵素の立体特異性の故に、ペプチド基質におけるＬ-アミノ酸のＤ-アミノ酸による置き換えは、例外は知られているものの一般的には、タンパク質分解酵素の認識および/または活性を失わせる。
ペプチドホルモン類は、逆向き鏡像体の研究対象として特別に興味深いものとされているが、それは恐らく、それらの類似物が治療用薬剤としての使用可能性を有しているためである。多数のペプチドホルモン類の部分的な逆向き鏡像体類似物および少数の完全な逆向き鏡像体類似物が調製および試験されている（例えば、Goodman and Chorev, 1981参照）。
ホルモンの完全な、または広い部分に亙る逆向き鏡像体類似物は、一般的に生物学的活性を欠くことが知られている。生物学的活性の欠如は、広範な改変、反転した鎖末端の存在または配列中のプロリンの存在に起因して起こり得る複合的な構造変化によるものと考えられている。一方、ある種の部分的な逆向き鏡像体類似物、即ち、選択された残基だけが改変されたペプチドは、生物学的活性を保持または増強することが示されている。また、逆向き鏡像体は、酵素阻害剤の理論的設計の分野にも適用されている。
生物学的に活性なペプチドの逆向き鏡像体が天然ペプチドの活性の保持または増強において限られた成功しか収めていないのは、恐らくは種々の理由によるものである。ペプチドおよびその逆向き鏡像異性体は、構造的に非常に類似していてもトポロジー的には同一でないと考えられており、結晶構造および溶液のコンフォメーションの研究はこの考えを支持している。ペプチドホルモンまたは神経伝達物質の生物学的活性は、本質的にはそれら自身と受容体との動的相互作用、並びにペプチド受容体間複合体の変換（transduction）過程に依存する。現在、そのような相互作用は複数のコンフォメーションおよびトポロジーに拘わる特質を包含する複雑な過程であることが明らかとなっている。これらのことから、逆向き鏡像異性体がそれらの特質の全てを擬態する（mimic）ことが不可能である可能性があることは、驚くにあたらない。
合成ペプチドワクチンの開発は、過去２０年間に亙って非常に活気のある研究分野である（Arnon, 1991; Steward and Howard, 1987）。
不運なことに抗原抗体結合の化学についてはあまり判明しておらず、抗原抗体結合のＸ線結晶構造解析のうち、現在までに解読されたのは非常にわずかなものだけである。その結果、本発明がなされるまでは、逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体ペプチドに対して抗体が誘発され得ること、並びにそのような抗体が該ペプチドの配列を誘導する元となった天然ペプチド抗原を認識し得ることを予測することは不可能であった。レーナーとその共同研究者は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ペプチドを、天然型、逆向き、鏡像体および逆向き鏡像体の形態で合成したことを報告している（Lerner, 1984）。彼らは、それらのペプチドに対して生じさせられた抗体は交叉反応せず、かつ天然型ペプチドに対する抗体だけが天然ペプチド抗原と結合すると主張している。
種々の粘膜における分泌型イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体の産生を伴う経口免疫処置が、特に胃腸感染において長年用いられている。経口的に投与されたポリペプチド抗原に対する全身的な免疫応答の誘導を成功させるには、少なくとも幾つかの抗原が血管系内に取り込まれることが必要である。現在、粘膜に存在する吸収細胞内へのペプチドの非特異的輸送後に細胞内部で起こるタンパク質消化の最終段階を含む、腸管によるペプチド輸送が主要な過程であることが分かっている。また、少量の未消化（intact）ペプチドおよびタンパク質が通常の環境下において消化管から血管系に入れられるということの、反駁できない証拠もある。非能率的な腸管吸収および“天然”ポリペプチド抗原のタンパク質分解系による分解のため、通常、経口免疫処置に必要な抗原の量は、全身的な免疫の非経口的誘導に必要な量を遥かに越えている。さらに、抗原のそのような大量の経口投与はしばしばイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の産生を減少させる、ＩｇＡ/抑制Ｔ細胞性全身耐性の同時誘導を導く。従って、タンパク質分解系による攻撃に耐えることができる、非耐性誘導性で効率的な経口ワクチンが必要とされている。
発明の開示
定義
本明細書および請求の範囲を通じて、“逆向きに改変されたペプチド”という術語は、Ｌ-アミノ酸から作られ、そのアミノ酸残基が逆向きに改変された元の天然ペプチドとは反対向きに付けられているペプチドを意味する。
本明細書および請求の範囲を通じて、“鏡像体に改変されたペプチド”という術語は、Ｄ-アミノ酸から作られ、そのアミノ酸残基が鏡像体に改変された元の天然ペプチドと同じ向きに付けられているペプチドを意味する。
本明細書および請求の範囲を通じて、“逆向き鏡像体に改変されたペプチド”という術語は、Ｄ-アミノ酸から作られ、そのアミノ酸残基が逆向き鏡像体に改変された元の天然ペプチドとは反対向きに付けられているペプチドを意味する。
本明細書および請求の範囲を通じて、“天然”という術語は、部分的または完全に逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体である類似物を調製する元となる配列として使用されるＬ-アミノ酸のどのような配列をも意味する。
本明細書および請求の範囲を通じて用いられる“ペプチド”という術語は、いかなる長さのペプチドをも包含するものとして理解されるべきである。
本明細書および請求の範囲を通じて、“抗原性断片”という術語は、それ自身が免疫原性であるかまたは抗体と結合し得る抗原の一部分を意味する。
本明細書および請求の範囲を通じて用いられる“抗原”という術語は、文脈に応じた免疫原を包含するものとして理解されるべきである。
本明細書および請求の範囲を通じて、“抗原類似物”という術語は、部分的または完全に逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体に改変される元の天然ペプチド抗原の免疫学的活性を擬態し得るペプチド分子を意味する。
部分的に改変されたペプチドとは、天然ペプチドの一部分が改変された類似物を意味する。改変された部分は、抗体を産生する能力および／または抗体と結合し得る能力を有する最小の抗原性断片を少なくとも１つ含んでいなければならない。そのような断片は長さを変え得るが、その変動範囲は、“部分的に改変された類似物”が最低２つの連続する残基が改変された類似物を含み得る範囲内である。典型的には、少なくとも５つまたは６つの連続した残基が改変される。
対合または溶解性の増加等の目的で、抗原ペプチドにその他のアミノ酸を添加することができるが、その添加アミノ酸は、通常、Ｌ型異性体には制限されない。システインは、そのＡｃｍ誘導体として含まれてペプチドの重合化または結晶化を防止したり、アミノブチル酸で置き換えられたりすることができる。
本発明は、免疫原として免疫適格宿主に投与されたときに、天然ペプチドを認識する抗体の産生を誘導する、天然ペプチド類似物の部分的または完全な逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体に改変された抗原類似物に関する。驚くべきことに、本発明による抗原類似物は免疫学的活性を有していることが示されたので、本発明による類似物はワクチンの調製に使用し得るものと思われる。ペプチド抗原類似物へのＤ-アミノ酸の組込みは、投与後の分解に対する該類似物の安定性を増加させる。さらに、Ｄ-アミノ酸の組込みは、類似物の経口投与の可能性を秘めている。逆向き、鏡像体および逆向き鏡像体抗原類似物に対する抗体が誘発され得ること、さらにはその類似物の配列が誘導された元の天然ペプチド抗原を該抗体が認識し得ることが示されていれば、抗原抗体結合の相互作用は種類が異なれば全く異なるというものではないことから、逆向き、鏡像体および逆向き鏡像体抗原類似物は、大体において、成功すると見なされることができる。
本発明の第１の主題によれば、天然抗原とは部分的または完全に逆向きに改変された、天然ペプチド抗原の合成ペプチド抗原類似物が提供される。
本発明の第２の主題によれば、天然抗原の部分的または完全な鏡像体に改変された、天然ペプチド抗原の合成ペプチド抗原類似物が提供される。
本発明の第３の主題によれば、天然抗原の部分的または完全な逆向き鏡像体に改変された、天然ペプチド抗原の合成ペプチド抗原類似物が提供される。本発明の類似物は、免疫適格宿主に免疫原として投与されたときに天然ペプチド抗原を認識し得る抗体の産生を誘導する。逆向き鏡像体類似物においては、特別の場合にはさらなる改変が必要とされ得ることが認められている。選択されたペプチド抗原が抗体結合抗原性構造の平均的サイズよりも小さい場合には、抗体の認識および抗体との結合において、Ｃ−およびＮ−末端基はペプチド骨格内部の残基と同じくらい重要である。そのようなペプチド抗原の完全な逆向き鏡像体改変物は、それを抗原類似物として無効とするに充分な程、その両末端が天然ペプチド抗原と異なっているようである。そのようなペプチドにおいては、そのペプチドの複数のコピーからなるポリマーを生成させるか、あるいはそのペプチド末端を、例えば該末端に結合した付加的な残基で保護するか、または、側鎖類似物が置換された一対のジアミノメタン類およびマロネート類によって該末端を化学的に置換することにより改変することが望ましい。これらのペプチドを環化する等の他の技術も有効であろう。
典型的には、産生された抗体は天然ペプチド抗原の有害な生物学的活性を中和することができるが、該抗体がそのような中和をなし得るかどうかに拘わらず、本発明の類似物に対して産生された、天然ペプチド抗原に結合し得る抗体は、例えば診断等の用途に用いられることを理解しなければならない。本発明の抗原類似物が天然抗原を認識する抗体の産生を導くのであれば、天然抗原に対するワクチンの接種が望ましい状況において、この類似物はワクチン成分の候補となる。試験動物集団のある種の個体においては、主要組織適合因子複合体（ＭＨＣ）による制限のために、免疫処置への応答に失敗することが認められる。しかし、その集団内の応答した動物は、非常によく応答する。この応答の欠如はよくある免疫学的現象であり、逆向き鏡像体抗原類似物の効力にバラツキがあることを示すものと考えるべきではない。
本発明は、本発明の抗原類似物を用いて免疫適格宿主を免疫処置することをも包含する。
本発明の第４の主題によれば、少なくとも１種類の本発明の抗原類似物を、医薬学的または獣医学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤および/または補助物質と共に含有するワクチンが提供される。
本発明のワクチンは、適切な担体と結合した抗原類似物、または抗原類似物と連続したポリペプチドを形成するタンパク質様担体とから合成した抗原類似物を含有することができる。
適当な希釈剤、担体、賦形剤および/または補助物質の選択は、当該分野において標準的な技術を用いて行われることができる。
本発明による、Ｄ-アミノ酸を含むそれらの合成ペプチド抗原類似物は、対応する天然抗原により得られるよりも長期間維持される免疫応答を誘発し得ることが好ましい。
典型的には、類似物の元となる天然抗原は、宿主において免疫応答を誘発し得るものであれば、自然界において産するポリペプチドまたはその抗原性断片のうちのどのようなものであっても良い。本発明に言う天然抗原は、ポリオ、Ｂ型肝炎、家畜の口蹄疫、破傷風、百日咳、エイズ（ＨＩＶ）、コレラ、マラリア、インフルエンザ、狂犬病またはジフテリアを引き起こすもの等の病原体のポリペプチド；またはロバストキシン（robustoxin）、病原性大腸菌（Escherichia coli）系統の非耐熱性毒素およびシゲラダイセンテリア（Shigella dysenteriae）由来の志賀毒素等の毒素のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を有する、あらゆる長さのペプチドまたはポリペプチドを包含する。対象となるその他の抗原は、アミロイドβタンパク質（アルツハイマー症候群）ならびにヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよびヒト性腺刺激ホルモン放出ホルモン（避妊ワクチン）を包含する。
本発明の類似物としては、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトのスポロゾイト外被タンパク質の主要抗原エピトープであるマラリア抗原、ジフテリア毒素抗原、ＨＩＶ-１抗原、ＨＢＶ抗原またはロバストキシンの類似物が好ましい。さらには、これらの分子の逆向き鏡像体の形態である類似物がより好ましい。
本発明のワクチンは、そのような治療を必要とする宿主に、注射により投与することができる。また、Ｄ-アミノ酸を含む類似物を組み込んだワクチンは経口的に投与されることもできる。ワクチンが注射により投与されるときには、抗原類似物は適当な担体分子と結合させられ、そして例えば筋肉内注射等の従来法により注入されることができる。
また、本発明は、宿主に対して本発明による抗原類似物またはワクチンを有効量投与することを包含する、そのような治療を必要とする宿主にワクチンを接種する方法をも提供する。
本発明のさらなる主題において、本発明の抗原類似物による宿主の免疫処置により産生される抗体が提供される。これらの抗体は病気の診断、治療および/または予防に用いる薬剤、ならびにドラッグデリバリーとして有用である。
また、本発明は、天然ペプチド抗原に対する抗体について試料を分析する方法であって、本発明による該抗原の抗原類似物を用いることを特徴とする分析方法を提供する。
上記に加え、本発明は、天然ペプチド抗原の存在についての試料分析方法であって、上記抗原を認識する本発明の抗体を用いることを特徴とする分析方法を提供する。
さらに、本発明は、少なくとも１種類の本発明による抗原類似物または抗体を、陽性および陰性の対照基準物（control standards）と共に含む診断用キットを提供する。このキットを用いて特定の天然抗原に対する抗体を検出する場合には、その天然抗原の抗原類似物が含まれたキットが使用される。陽性基準物は、抗原類似物に対して産生された本発明の抗体であってもよい。陰性基準物は、どのような非交叉反応性抗体であってもよい。本発明の診断用キットが天然抗原の検出に使用される場合には、そのキットは天然抗原の類似物に対する抗体を含む。天然抗原の類似物は陽性基準物として使用される。抗体に認識されないペプチドは陰性基準物として使用される。
また、本発明は、天然ペプチド抗原の部分的または完全に逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体類似物を合成することを包含する、天然ペプチド抗原の抗原類似物の調製方法も提供する。対合または溶解性の増加等の目的で抗原ペプチドにその他のアミノ酸を添加することができるが、添加アミノ酸は、通常、Ｌ型異性体には制限されない。システインは、そのＡｃｍ誘導体として含まれてペプチドの重合化または結晶化を防止するか、またはアミノブチル酸で置き換えられたりすることができる。
本発明は、さらに、天然ペプチド抗原の逆向き、鏡像体または逆向き鏡像体類似物を提供すること、および有効量の該抗原類似物と医薬学的または獣医学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤および/または補助物質とを調合することを包含する、天然ペプチド抗原に対するワクチンの調製方法を提供する。このワクチン調製方法は、付加的に、抗原類似物を適切な担体分子と結合させることを包含していてもよい。
略号
Ａｂ          抗体
ＢＯＰ        （ベンゾトリアゾリルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート（カストロ氏試薬）
ＤＭＦ        ジメチルホルムアミド
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着検定法（エリザ）
Ｆｍｏｃ      ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＰＬＣ      高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ｉｇ          イムノグロブリン
ｉｎ          鏡像体
Ｉ．ｐ．      腹腔内
ＫＬＨ        キーホールリンペットヘモシアニン
Ｍｏｄ        モデル
ｎｏ          正常（天然）
ＰＢＳ        リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ ホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）
Ｐｆｐ        ペンタフルオロフェニル
ＰＶＣ        ポリビニルクロライド
ｒｅ          逆向き
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
アミノ酸：
Ｌ-アミノ酸は、ローマ字で、大文字の後に小文字を使用して示される。例えば、ＡｌａはＬ-アラニンを示す。
Ｄ-アミノ酸は、ローマ字で、全て小文字を使用して示される。例えば、ａｌａはＤ-アラニンを示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に従いアミノ酸配列になし得る改変を示す図である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はアミノ酸側鎖を表し、Ｘａａはいずれかのアミノ酸残基を表している。
図２は、異なる不動化ペプチド−ＢＳＡに対する、抗逆向き鏡像体ペプチドモデル（mod）−ＫＬＨ血清のエリザの結果を示しており、図中、□はnoMod、＋はriMod、◇はreMod、△はinMod、ｘは対照１、そして▽は対照２をそれぞれ示している。
図３は、ペプチド−ＢＳＡに対する、抗マラリア（Mal）−ペプチド血清（経口免疫処置）のエリザの結果を示しており、図中の血清/不動化抗原を示す記号は、それぞれ以下のことを示している：▽はriMal/riMal、＋はriMal/noMal、□はnoMal/noMal、◇はnoMal/riMal、そしてｘは非免疫血清/noMalをそれぞれ示している。
図４は、不動化ペプチド−ＢＳＡに対する抗ジフテリア（Dip）ペプチド−ＫＬＨ血清のエリザの結果を示しており、図中の血清/不動化抗原を示す記号はそれぞれ以下のことを示している：▽はriMal/riMal、＋はriMal/noMal、□はnoMal/noMal、◇はniMal/riMal、そしてｘは非免疫血清/niMalをそれぞれ示している。
図５は、不動化ジフテリア毒素に対する抗ジフテリア（Dip）ペプチド−ＫＬＨ血清のエリザの結果を示しており、図中、＋は抗riDip、□は抗noDip、◇は非免疫血清をそれぞれ示している。
図６は、不動化ジフテリア毒素に対する経口的に誘導された抗ジフテリア（Dip）ペプチド血清のエリザの結果を示しており、図中、□は抗noDip（免疫２週間後）、＋は抗riDip（免疫２週間後）、◇は抗riDip（免疫８週間後）をそれぞれ示している。
図７は、不動化ペプチドに対する抗HIVgp41（735-753）血清のエリザの結果を示しており、図中の記号は、血清/不動化抗原を意味している。
図８は、HIVgp41モノクローナル抗体とｇｐ４１ペプチドとのエリザの結果を示している。
図９は、実施例１４にて行われたエリザの結果を図示したものであり、図中、□はriHBVプレートコーティングを、そして■はnoHBVプレートコーティングをそれぞれ示している。
図１０は、実施例１５にて行われたエリザの結果を図示したものであり、図中、Ｓ１はｎｏ-ペプチドでコーティングされたウェルを、そしてＳ２はｒｉ-ペプチドでコーティングされたウエルをそれぞれ示している。
図１１は、実施例１６にて行われたエリザの結果を図示したものであり、図中、太線はriHBVペプチドに対する抗血清、普通線はnoHBVに対する抗血清、丸およびダイアモンドの記号はnoHBVペプチドでコーティングされたウエル、四角および三角の記号はriHBVペプチドでコーティングされたウエルをそれぞれ示している。
図１２は、実施例１７にて行われたエリザの結果を図示したものであり、図中、太線はriHBVペプチドに対する抗血清、普通線はnoHBVに対する抗血清、丸およびダイアモンドの記号はnoHBVペプチドでコーティングされたウエル、四角および三角の記号はriHBVペプチドでコーティングされたウエルをそれぞれ示している。
本発明の最良の実施態様
本発明の抗原類似物は、ペプチドを含むＬ-およびＤ-アミノ酸の調製のための標準的な技術、特に実施例１で述べられる技術により調製される。
本発明のワクチンは、経口ワクチンまたは注射可能なワクチンの調合に適した標準的な担体、希釈剤、賦形剤および/または補助物質を用いる、ワクチン調合のための標準的な技術により調合される。ワクチンに組み込まれるべき抗原類似物の有効量は標準的な方法に従い決定されることができる。
ワクチン接種に使用されるレジメは、対象となる動物またはヒトのワクチン接種のための標準的なレジメである。これらのレジメは、宿主の免疫処置が望ましいか、あるいはその宿主が他の宿主において使用するための抗体の産生に使用される場合に用いられることができる。本発明の診断用キットは、そのようなキットの試薬および対照の調製のための標準的な方法により調製される。
一般的に、診断用キットは放射免疫検定（ＲＩＡ）または免疫蛍光法またはエリザの方式であり、エリザ方式のものが、後記実施例４にて実施されている。
本発明による類似物またはそれらに対して産生された抗体が天然抗原またはそれに対する抗体の検出に使用される場合には、適当な試薬が、試験される試料に対する免疫検定方式で、適当な対照と共に使用される。
本発明は、さらに、本発明を説明するためだけの、本発明に何らの制限をも与えない後記実施例により説明される。
後記実施例は、驚くべきことに、本発明による抗原類似物が、その元の天然の配列がペプチドの形態であるときのみならず元々のタンパク質配列中に含まれている場合であっても元の天然の配列を認識し得る抗体を誘発し得ることを示している。３種類の抗原配列が選ばれ、該配列が有する、その親である天然配列を認識しかつ相互作用し得る抗体の産生能力が試験された（実施例５、６および７）。１種類の抗原配列（実施例５）は生物学的関連性の無いモデルであったが、他の２種類の抗原配列（実施例６および７）は、それぞれマラリアおよびジフテリアに対するワクチンとしての潜在的有用性が既に明示されていた合成ペプチド抗原を代表している。“天然”および逆向き鏡像体に対する抗体において観察された交叉反応性は、抗体は、それらの骨格には拘わらず主としてそのアミノ酸側鎖の配置により抗原を認識することを強く示している。３つの研究全てにおいて、研究された、逆向き鏡像体ペプチド抗原に対するポリクローナル抗体調製物は、改変元の親配列および改変された逆向き鏡像体抗原と同程度に結合した。
本発明のキャリアタンパク質と結合させられた逆向き鏡像体抗原を用いる慣用の免疫処置、および遊離の逆向き鏡像体抗原を用いる経口免疫処置が実施可能であることが示された。上記免疫処置において使用された抗原の有する、逆向き鏡像体抗原に対する交叉反応性血清抗体を誘導する能力は、そのような抗原がワクチンとして有用であることを示している。明示された如く、これらの抗原は、注射による免疫処置のみならず経口投与による免疫処置においても、キャリアタンパク質を用いることなく適用することができる。恐らくこれは、少なくとも１種類のＴ細胞エピトープが存在するためである。この所見は、逆向き鏡像対抗原に対する免疫応答が比較的長期間存続するという知見と共に、実験的合成ペプチドワクチンに内在する２つの主要な問題を克服するためにはこれらの類似物が有用であることを示している。
実施例１
ペプチドの合成
ペプチドは、側鎖を保護したFmocアミノ酸を用い、ポリハイプ（polyhipe）支持体上で行う固相法（Carpino & Han, 1972）、または支持体としてポリアミドを用いた固相法（Arshady et a l., 1981）により、本質的にはエベーレらの報告（Eberle et al., 1986）に従って合成した。購入または合成して得られた純粋なアミノ酸誘導体だけを使用した。ｐ-アルコキシベンジルアルコール基カップリング剤で誘導されたポリアミド合成樹脂を、０．２モル当量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよびＮ-メチルモルフォリンの存在下に、あらかじめ準備された適当なＣ末端のFmoc-アミノ酸対称無水物と定量的にエステル化した。Fmoc-Rinkリンカー（Rink, 1987）で誘導されたポリハイプは、最初のアミノ酸とのエステル化を必要としなかった。鎖の伸長は、Fmoc-アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（Atherton et al., 1988）またはカストロ氏試薬/１-ヒドロキシベンゾトリアゾールカップリング（Hudson, 1988）を用いて実施した。それぞれの合成の進行は、特異的カラーテスト（specific colour test；Hancock & Battersby, 1976）および/または酸加水分解されたペプチジル樹脂試料のアミノ酸分析を用いてモニターした。
ペプチドを樹脂から分割し、そして脱除剤の適当な混合物を含むＴＦＡの助けを借りて側鎖を脱保護した（Tam, 1988）。濾過して減圧下に蒸留した後、ペプチドをジエチルエーテルで粉末化して遠心により収集し、次いで、重炭酸アンモニウムの水性溶液から凍結乾燥させた。
次に、全てのペプチドを、まず脱塩した後に、水性溶媒中の適当なゲル濾過媒体上でカロムクロマトグラフィーにより精製した。その後、水−アセトニトリル（０．０５〜０．１％ＴＦＡ含有）勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製して均質化した。さらに、合成ペプチドの純度を、気相酸加水分解/アミノ酸分析（Bidlingmeyer et al., 1987）、および必要であれば自動気相塩基配列決定（Hunkapiller & Hood, 1983）により検定した。
実施例２
ペプチド−キャリアタンパク質複合体
合成ペプチドを、そのシステインチオール基を通じてキャリアタンパク質とカップリングした。その方法を下記に示すが、これはリュウらの方法（Liu et al., 1979）の変法である。
ＫＬＨ（４０ｍｇ）またはＢＳＡ（１００ｍｇ）を、ｐＨ６．０の５０ｍＭ リン酸緩衝液３ｍＬ中に溶解させた。ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド エステル（ＭＢＳ；２５mg/mLのＮ，Ｎ-ジメチルホルムアミド溶液の新鮮な貯蔵溶液０．２ｍＬ）を穏やかに添加し、混合液を室温下に３０分間撹拌した。そして、直ちに０．８ｍｍ濾過膜を通過させて濾過し、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００カラム（１１×１７０ｍｍ）に供した。これは、ｐＨ６の緩衝液を用いて０．２５ｍＬ/分の速さで行った。タンパク質−ＭＢを含有する画分を回収してプールした後、予め準備しておいたペプチド溶液（濃度１０μmol、ｐＨ７．５のリン酸緩衝溶液）に添加した。この混合液のｐＨは０．１Ｍ ＮａＯＨにて７．５に調節した。次いで、これを窒素でフラッシし、磁力撹拌機を用いて２．５時間撹拌した。希釈重炭酸アンモニウムに対する徹底的な透析（Mr 12,000〜15,000切捨て）の後、凍結乾燥によりタンパク質キャリアタンパク質複合体を単離した。全ての水性溶液は、使用に先立って脱気した。
実施例３
免疫処置
免疫処置には、若いスイスアルビノマウス（swiss albino mice）を用いた。ペプチド−ＫＬＨ複合体の腹腔内注射を、補助物質を使用せずに行った。経口免疫処置は、適当な抗原溶液に浸漬させた餌ペレットを、絶食させておいたマウスに給餌することにより実施した。
実施例４
エリザの手順
ＰＶＣマイクロタイタープレートのウエルを、ｐＨ９．２の希釈炭酸/重炭酸緩衝液に溶解した適当な抗原で、４℃で一晩かけてコーティングした（０．２５〜１０μｇ/ウエル）。液を吸引した後、４％のＢＳＡまたはボイルカゼイン、および０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ溶液と共に２時間インキュベートすることにより、ブロックさせた。次いで、ウェルを０．１％のツイーン２０を含有するＰＢＳ溶液で数回洗浄した後、ブロック溶液で順次希釈した抗血清を添加した。４時間インキュベートした後、再度プレートを洗浄した。（ブロック溶液で）適切に希釈され、親和性により純化された抗マウスＩｇＧ−ホースラディシュペルオキシダーゼと１時間インキュベートして結合ＩｇＧを検出した。これを洗浄し、ｐＨ５、暗黒の条件下に０．５mg/mL ｏ-フェニレンジアミン、０．０１％過酸化物と共に放置して顕色させた。４Ｍ硫酸を添加して顕色を停止させた。直ちに、波長４９２ｎｍにてプレートの吸光度を測定した。
コーティング工程を除く全てのインキュベーション工程は、室温下にプレートを撹拌しながら行った。
実施例５
生物学的関連の無い合成抗原配列に対して生じさせられた抗体の活性および抗体産生の分析
下記ドデカペプチドモデルを、システインチオール保護基を用いて合成してトリチルチオエーテルとし、チオフェノールの５％ＴＦＡ溶液で９０分間処理してペプチジル樹脂を分割させた。タンパク質複合体は免疫処置を行うために調製した。
正常（天然）ペプチド（Ｌ-アミノ酸、方向：Ｎ→Ｃ）
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逆向き鏡像体ペプチド（Ｄ-アミノ酸、方向：Ｃ→Ｎ）
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逆向きペプチド（Ｌ-アミノ酸、方向：Ｃ→Ｎ）
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鏡像体ペプチド（Ｄ-アミノ酸、方向：Ｎ→Ｃ）
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腹腔内免疫処置
抗原の種類ごとに４匹のマウスからなる群を、ＫＬＨペプチドを０．２ｍｇ/投与量含む０．１ｍＬのＰＢＳを腹腔内に投与して免疫した。その４日後、９日後および１６日後にブースターを投与した。（各群から採取した）プール血清における抗ペプチド抗体を、不動化ＢＳＳＡ−ペプチド複合体を用いたエリザにて測定した。
Ｄ-アミノ酸を含有するものも含めて、４種類の抗原全てが抗原性であることが分かった。ほぼ等量の、それぞれのペプチド抗原の不動化ＢＳＡ複合体に対する検定において、抗血清は非常に良く似た抗体レベルを示した。さらに、それぞれの抗血清中の抗体は、他の３種類のペプチド抗原とも結合した。そのような検定の内で、抗逆向き鏡像体ペプチド−ＫＬＨ血清の４種類のペプチド全てに対する結合が測定された検定結果を図２に示す。noMod抗体とriMod抗体との交叉反応のみならず、イソステリズムでない抗原に対する抗体の交叉反応も観察されたということは、非常に驚くべきことである。このことは、研究対象であった抗体は、配列方向およびα炭素原子の絶対的な立体配置には拘わり無く、抗原内のアミノ酸側鎖の配置を認識していることを示しているのかもしれない。さらに、逆向き鏡像体ペプチドホルモン類似物において既に観察されていたように、ペプチド配列内のプロリン残基の存在は、Ｄ-アミノ酸を含むペプチドがうまく天然配列に擬態することを妨げなかった。
キャリアタンパク質付着部位-Gly-Cys-Gly-、即ち全ての抗原に共通する部分に特異的な抗体を供給するために、共通付着部位以外は関連する配列を全く有しない１４残基ペプチドのＫＬＨ複合体に対する抗血清も検定した（図２の対照１）。図に見られるとおり、この部位に対する抗体が、観察された交叉反応性に有意に関与しているとの結果はでなかった（対照２は抗riMod-KLH 血清とＢＳＡとの結合のみを示している）。
経口免疫処置
遊離の、即ち結合していない天然および逆向き鏡像体ペプチドモデルによる経口免疫処置を次のとおり行った。ペプチドを０．３ｍｇ/投与量含む５０ｍＬのＰＢＳをマウス群に投与した。投与スケジュールは、上記腹腔内免疫処置において概略を述べたスケジュールに従った。得られた血清のエリザの結果を表１に要約して示す。比較のために、同様の免疫処置を注射で行った結果も示す。
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逆向き鏡像体ペプチドの場合には、経口免疫処置は検出可能な血清ＩｇＧ応答だけを与えた。抗逆向き鏡像体血清中の抗体が天然ペプチドと完全に交叉反応することが、再度示された。明らかに、天然ペプチドとは対照的に、ＩｇＧ応答を起こさせるに充分な量の逆向き鏡像体ペプチドが循環系に入り得た。また、逆向き鏡像体ペプチドは緩慢に分解されるだけであることも、抗ペプチドＩｇＧが実験動物の血流中に何週間も存在し続けたという事実によって示されている。
実施例６
ａ）  熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）スポロゾイトの外被タンパク質の主要抗原タンパク質に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）スポロゾイトの外被タンパク質の主要抗原タンパク質に基づいて、下記の４種類のペプチドを合成した。
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合成のために、システイン誘導体を保護してトリチルチオエーテルとした。配列内のアスパラギンは、側鎖保護することなく、カップリングさせてペンタフルオロフェニルエステルとした。Fmoc-Asn-Pro-ペプチジル樹脂の脱保護は３分間と短くした。次いで、ＤＭＦにより１５秒間づつ３回洗浄した後、直ちにFmoc-Ala-OH/BOP-HOBtを用いてアセチル化することにより、ジケトピペラジン形成によるペプチドの損出（約５０％）を最少化した。アスパラギンを合成樹脂とカップリングさせて、Fmoc-Asn（Mh）-OH対称無水物誘導体とした。
分割/脱保護は、noMalCys-ペプチジル樹脂およびriMalCys-ペプチジル樹脂に対してはチオフェノールの５％ＴＦＡ溶液、そしてnoMal-樹脂およびriMal-樹脂に対しては５％水性ＴＦＡ溶液を用いて行った。分割後、チオアニソールの５％ＴＦＡ溶液で室温下に２時間、粗riMalペプチドをさらに処理してジメトキシベンズヒドリル保護基を完全に除去した。
１回投与量を１００μgとしたnoMalCys-KLH複合体およびriMalCys-KLH複合体を１週間間隔で合計４週間に亙って腹腔内に投与することにより、マウス群を免疫処置した。血液は５週間後に採取し、エリザによりその血清力価を決定した（表２）。
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これにより、天然抗原が逆向き鏡像体抗原よりも抗原性が強いことが判明した。既述の実施例と同様、抗血清は完全に交叉反応性であった。noMalペプチドおよびriMalペプチドを１週間間隔で合計４週間投与して、マウスを経口的に免疫処置した。５週間後に血液を採取してエリザにより検定した。力価測定の結果を図３に示す。逆向き鏡像体ペプチドだけが抗ペプチド抗体の有意な力価を誘導した。これらの抗体は正常ペプチドと完全に交叉反応性を示した。同様に、抗ペプチド−ＫＬＨ血清も完全に交叉反応性であった。
ｂ）  no/riMalペプチドとマラリア患者由来の抗血清との試験
高いレベルのスポロゾイト外被タンパク質の反復配列に対する抗体はスポロゾイトの発生を抑制し得ることが既に知られている（Mazier et al., 1986）。さらに、そのような反復配列を含む組換えワクチン、および破傷風毒素とカップリングした３反復のＮＡＮＰ配列からなるペプチドワクチンは、臨床的試行においていくらかの成果を見せている（Herrington et al., 1987 & 1990）。noMalペプチドおよびriMalペプチドに対して動物内で生じさせられた抗血清が交叉反応性であることが示された後では、マラリア患者の体内で抗スポロゾイト抗体が両方のペプチドを認識することを示すことが重要であった。
タイのマラリア患者由来の血清試料を得た。これらの血清は熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のスポロゾイトタンパク質の主要抗原エピトープに対する抗体を含有することが知られていた（Wirtz et al., 1989）。僅かな例外を除いて、すべての患者は臨床的にマラリアであるとの診断を受けており、最近罹患していた。
本発明者らは、これらの血清の抗体が、組換えスポロゾイト外被構築物、合成ポリマーおよびnoMal（上記３種類のものはすべてＮＡＮＰ反復を含有している）、並びにriMalと結合し得るかどうかを試験した。その結果を表３に要約して示す。表に見られるとおり、ほとんどの血清において試験結果には良い相関があり、ＮＡＮＰ反復を多数含有する抗体との結合がより強かった。全ての場合において、抗血清と、正常型および逆向き鏡像対型であり３反復のＮＡＮＰを有するペプチドとの有意の交叉反応が観察された。
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実施例７
ジフテリア毒素のアミノ酸配列に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
ジフテリア毒素分子のアミノ末端近傍のジサルファイド架橋により形成された１４アミノ酸残基のループ配列に基づき、下記の２種類のペプチドを合成した。
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使用した側鎖保護基は次のとおりである：システインにはトリチル基、リシンにはｔ−ブトキシカルボニル基、セリンにはｔ−ブチル基そしてアルギニンには４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル基である。両方のペプチドの調製において、アスパラギンは遊離側鎖アミドとしてペンタフルオロフェニルエステルの形態でカップリングさせた（Gausepohl et al., 1989）。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で７５分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。ＫＬＨと結合させた正常および逆向き鏡像体のペプチドを１００μｇの投与量で腹腔内に投与してマウス（抗原当たり４匹）を免疫処置し、その日を第０日として、第４日、第９日および第１６日にブースターを与えた。血液は第２１日に採取してプールした。投与ペプチドに対するＩｇＧ抗体を、不動化したＢＳＡ−ペプチド複合体を用いたエリザにより測定した。その結果を図４に要約して示す。正常および逆向き鏡像体のペプチドとＫＬＨとの複合体は共に同程度の力価の抗体を産生させたが、これにより、抗原中に天然型ではないアミノ酸が存在しても免疫抗原性は保持されることが再度示された。さらに、この結果は、双方の抗血清は双方の抗原を等しく良く認識することを示している。
これらの抗血清をさらに試験して、その抗原配列がジフテリア毒素内に存在していても認識する能力を有しているかどうかを調べた。不動化ジフテリア毒素（１μｇ/ウエル）を用いたエリザをこの目的のために採用した。図５に示した結果は、双方の抗血清中のＩｇＧ抗体がジフテリア毒素と結合することを明示している。抗逆向き鏡像体ペプチド−ＫＬＨ血清は非常に高い抗毒素力価（正常抗血清の力価の約１０倍超）を示した。
遊離天然ジフテリアペプチドと逆向き鏡像体ジフテリアペプチドを用いた経口免疫処置においてさらに驚くべき結果が記録された。この処置において、マウスには約１ｍｇのペプチドを１回投与した。その１週間後および２週間後、少なくともどちらか一方のペプチドで免疫処置された動物から採取した血清は、ジフテリア毒素と結合し得る抗体を含有していた。両方の場合において、抗毒素力価は非常に高かった。一方、免疫処置の８週間後には逆向き鏡像体ペプチドを投与された動物だけが抗毒素抗体を含有していることが分かった（図６）。さらに、測定された力価は非常に高く、対応するＫＬＨ複合体をブースターとして投与して腹腔内免疫処置することにより得られる力価に匹敵し得るものであった。
実施例８
ＨＩＶ−１ペプチド
組換えウイルスタンパク質または合成ペプチドからなるエイズ（ＡＩＤＳ）ワクチンは多数提案されており、そして試験されつつある（Spalding, 1992）。種々のエピトープ、とりわけウイルス外被の糖タンパク質であるｇｐ１２０とｇｐ４１に由来するエピトープがウイルス中和抗体を誘導する能力と関連があると考えられている。本発明者らは、研究のために、ｇｐ４１の７３５〜７５３の配列（Chanh et al., 1986）および５８３〜５９９の配列（Klasse et al., 1988）を選び、下記のペプチドを調製した。
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合成は通常の方法にて行ったが、トリアルコキシジフェニル−アミド結合を有する合成樹脂（Rink, 1987）を使用した。ＢＳＡおよびＫＬＨとの複合体は、マリアーニらの方法（Mariani et al., 1987）に従い、グルタルアルデヒド重合により調製した。フロインド完全アジュバント液中のHIVgp41（735-753）ペプチド−ＫＬＨ複合体を１００μｇの１回投与量で投与してマウス群を免疫処置し、フロインド不完全アジュバント液を用いた注射により、２週間間隔で２回ブースターを与えた。最後のブースターを与えた２週間後に血液を採取し、血清を調製した。
HIV-1gp41タンパク質に対する抗体を産生する、マウスの単一クローン性ハイブリドーマ細胞を、組換えｇｐ４１を用いた免疫処置により取得した。最良の応答をした実験動物の脾臓細胞を単離し、ポリエチレングリコール−４，０００を用いてＮＳ-１ミエローマ細胞と融合させた。得られた細胞を培養プレートに載せ、限界希釈クローニングに供した。
両方のHIVgp41（735-753）ペプチドに対する多クローン性抗血清をエリザにより分析した。その結果を図７に示す。ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中のnoHIVgp41（735-753）-BSAおよびriHIVgp41（735-753）-BSAにより、５μｇ/ウエルの濃度で１時間かけて、エリザ用プレートをコーティングした。１時間後、これらのプレートをボイルカゼイン溶液を用いてブロックした。次に、ペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫処置されたマウス由来の血清を順次倍希釈した希釈血清と共に、１時間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヒツジの抗マウスＩｇＧ抗体を検出に用いた。得られた結果は、非特異的結合に関して補正した（無関連ペプチド−ＢＳＡ複合体を用いて測定した）。５つの測定点（抗原群当たり５個体のマウスに対応している）をプロットした。測定点の標識（例えば、no/no）は、コーティング抗体/抗血清を表している。明らかに、抗体と２形態のペプチドとの交叉反応範囲は広い。個々の抗体が異なる形態のペプチドを認識し得ることを明示するために、ｇｐ４１に対するモノクローナル抗体を用いたエリザによる検定を実施した。HIVgp41（583-599）ペプチドを用いた結果を図８に示す。HIVgp41に対する抗体を産生する細胞系のライブラリーを、マイクロタイタープレート上に不動化したHIVgp41（583-599）-BSAを用いたエリザにより、予備スクリーニングした。２４のクローンをさらに試験した。１００μＬの細胞懸濁液を、１００μｇ/ウエルの３種類のペプチド−ＢＳＡ複合体それぞれと共にインキュベートした。プレートを洗浄し、そして抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体により検出された抗体と結合させた。ｏ−フェニレンジアミン/パーオキサイドにより顕色させた後、未補正の色信号を対象細胞系に対してプロットした。モノクローナル抗体が、ある形態のペプチドを認識した場合には常に、その抗体は他の２つの形態のペプチドとも結合した。実際、交叉反応範囲の拡張が完全に認められた。HIVgp41（735-753）ペプチドを認識する、ｇｐ４１に対する細胞系も何種類か同定され、交叉反応が再度見いだされた。
実施例９
逆向き鏡像体ロバストキシン（riRtx）
潜在的に致死性のロバストキシンは、雄のクモ（funnel-web spider：Atraxrobustus）の毒物から発見された（Nicholson et al., 1991）。この毒素の合成類似物から調製されたワクチンが天然毒素によるチャレンジからマウスおよびサルを防御し得ることは既に示されている（Mylecharane et al., 1991）。逆向き鏡像体ペプチドのワクチンとしての有用性を明示するために、下記の配列を有する、ロバストキシンの逆向き鏡像体類似物を調製した。
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ペプチドを純化し、気相配列解析によりその構造を検証した。ワクチンの調製は、０．２ｍｇのペプチドおよび０．８ｍｇのＫＬＨを含有するリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬとグルタルアルデヒドの２５％水溶液１０μＬとを室温で一晩かけて重合させることにより行った。反応の停止は、リジンの２％溶液を１００μＬ添加することにより行った。
マウス群の免疫処置は、このワクチン、または正常なCys（Acm）-で保護された合成ロバストキシンを用いた以外は同様の手順で調製したワクチンにより、下記スケジュールに従って行った。２週間間隔で５０μｇづつペプチド−ＫＬＨを注射したが、最初の２回は皮下注射、そしてその後の３回のブースターは腹腔内注射であった。次に、これらの動物、並びに非免疫対照群は最後のブースター投与の１４週間後に、最少致死量（致死量の測定はチャレンジの直前に行った）のクモ毒（funnel-web spider venom）の血管内注射によるチャレンジを２回受けた。非免疫動物は１０分間以内に犠牲となったが、天然ワクチンにより免疫されていた動物は生き残った。riRtx-KLHで免疫されていた個体群においては、２４時間後に１匹死亡したが、残りの７匹はこのチャレンジを生き延びた。
実施例１０
Ｃ型肝炎ウイルスの外被ペプチド
Ｃ型肝炎ウイルスの外被の配列（３０６−３３０）に基いて、下記の２種類のペプチドを合成した。
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noCEnvの合成は、Fmoc-Alaで予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ（PepsynKA）上で行い、riCEnvの合成はポリハイプリンク（Polyhipe Rink）樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。システイン、ヒスチジンおよびアスパラギンにはトリチル基、セリン、スレオニンおよびアスパラギン酸にはｔ−ブチル基そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチル クロマン−６−スルフォニル基である。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。ペプチドは、実施例２の記載と同様にしてＢＳＡと結合させた。
両方のペプチドを、実施例１１に記載の方法を用いたエリザにて中国のＨＣＶ陽性患者に由来する血清に対して試験した。noCEnvは供試陽性血清の１５/３０（５０％）を検出したが、riCEnvも同様の結果を示した。
実施例１１
Ｃ型肝炎のキャプシドペプチド
Ｃ型肝炎ウイルスのキャプシド配列（３９−７４）に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
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noCCapの合成は、Fmoc-Arg（Mtr）で予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ上で行い、riCCapの合成はポリハイプリンク樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。システインおよびグルタミンにはトリチル基、セリン、スレオニンおよびグルタミン酸にはｔ−ブチル基、リジンにはｔ−ブトキシカルボニル基そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル基である。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２−エタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。ペプチドは、実施例２の記載と同様にしてＢＳＡと結合させた。
ＰＶＣ製マイクロタイタープレートを、ｐＨ９．６の希釈した炭酸/重炭酸緩衝液似溶解させた適当な抗原にてコーティング（０．０５〜１μｇ/ウエル）し、４℃で一晩インキュベートした。液を吸引した後、２０％コウシ血清を含有する炭酸/重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）と３７℃で１時間インキュベートしてブロックを行った。次いで、ツイーン２０の０．２％ＰＢＳ溶液にてウエルを４回洗浄した後、０．５％のＢＳＡ、１０％のコウシ血清および０．２％のトリトン（Triton）×１００（抗体結合緩衝液）を含有するＰＢＳにて順次倍希釈した抗血清を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、再度プレートを洗浄した。抗体結合緩衝液で適切に希釈した、親和性により純化した抗ヒトＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼと、３７℃で３０分間インキュベートして結合ＩｇＧを検出した。洗浄した後、プレートを、３，３’５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、０．０１％ペルオキシドと、ｐＨ５で暗黒下に放置して顕色させた。２Ｍ硫酸の添加により顕色を停止させ、波長４５０ｎｍ/６３０ｎｍにてプレートの吸光度を測定した。
ＢＳＡに結合したペプチドnoCCapおよびriCCapでエリザ用プレートをコーティングし、中国人のＣ型肝炎患者に由来する血清に対する試験を行った。その結果を下記の表に要約して示す。それぞれの場合において、正常型および逆向き鏡像体型のキャプシドペプチドの間で交叉反応が観察され、番号１の血清においては、逆向き鏡像体ペプチドが正常ペプチドよりも高い力価を与えた。
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実施例１２
ＨＩＶ診断用ペプチド
ヒト免疫不全ウイルスの外被タンパク質由来のペプチド
ヒト免疫不全ウイルスの外被タンパク質の残基５７９−６１１に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
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noHIVgp41（579-611）の合成は、Fmoc-Cys（trt）で予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ上で行い、riHIVgp41（579-611）の合成はポリハイプリンク樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。末端のシステイン、グルタミンおよびアスパラギンにはトリチル基、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびチロシンにはｔ−ブチル基、リジンにはｔ−ブトキシカルボニル基そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル基である。noHIVgp41（579-611）ではアミノブチル酸（Ａｂａ）、そしてriHIVgp41（579-611）ではメルカプト基の保護基であるアセトアミドメチル（Ａｃｍ）を有するシステインで、配列中のシステインを置き換えた。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応せる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。システインのアセトアミドメチル（Ａｃｍ）保護基はこの操作では除去されなかった。ペプチドは、実施例２の記載と同様にしてＢＳＡと結合させた。
実施例１３
ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ４１に由来するペプチド
ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ４１タンパク質の配列７３５−７５２に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
0004116072.tif 000018
両方のペプチドの合成はポリハイプリンク樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびチロシンにはｔ−ブチル基、そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチル クロマン−６−スルフォニル基である。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。２-イミノチオラン．ＨＣＬ（トラウト試薬：Traut’s Reagent）と反応させることにより、これらのペプチドのＮ末端にメルカプト基を導入した（Jue et al., 1978）。ペプチドは、実施例２の記載と同様にしてＢＳＡと結合させた。
ＰＶＣ製マイクロタイタープレートを、ｐＨ９．６の炭酸/重炭酸緩衝液希釈液に溶解させた適当な抗原にてコーティング（０．０５〜１μｇ/ウエル）し、４℃で一晩インキュベートした。液を吸引した後、２０％コウシ血清を含有する炭酸/重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）と３７℃で１時間インキュベートしてブロックを行った。次いで、ツイーン２０の０．２％ＰＢＳ溶液にてウエルを４回洗浄した後、０．５％のＢＳＡ、１０％のコウシ血清および０．２％のトリトン（Triton）×１００（抗体結合緩衝液）を含有するＰＢＳにて順次倍希釈した抗血清を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、再度プレートを洗浄した。抗体結合緩衝液で適切に希釈した、親和性により純化した抗ヒトＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼと、３７℃で３０分間インキュベートして結合ＩｇＧを検出した。洗浄した後、プレートを、３，３’５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および０．０１％ペルオキシドと、ｐＨ５で暗黒下に放置して顕色させた。２Ｍ硫酸の添加により顕色を停止させ、波長４５０ｎｍ/６３０ｎｍにてプレートの吸光度を測定した。
実施例１２で調製したＢＳＡ結合ペプチド、即ちnoHIVgp41（579-611）とriHIVgp41（579-611）、並びに本実施例で調製したＢＳＡ結合ペプチド、即ちnoHIVgp41（735-753）とriHIVgp41（735-753）を用いてエリザ用プレートをコーティングし、ＨＩＶ陽性血清の患者由来の血清に対する試験を中国で行った。その結果を下記の表に要約して示す。それぞれの場合において、正常な形態のｇｐ４１ペプチドと逆向き鏡像体の形態をとるｇｐ４１ペプチドとの間で交叉反応が観察された。
0004116072.tif 000019
実施例１４
Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質の残基１２６−１３７に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質の残基１２６−１３７に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
0004116072.tif 000020
noHBv-S（126-137）の合成は、Fmoc-Ser（tBu）で予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ上で行い、そしてriHBV-S（126-137）の合成は、Fmoc-Cys（trt）で予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ上で行った。ＨＢＶ配列にはリジンは含まれていないが、溶解性を高めるために含ませた。使用した側鎖保護基は次のとおりである。システイン、グルタミンおよびアスパラギンにはトリチル基、セリン、スレオニンおよびチロシンにはｔ−ブチル基、そしてリジンにはｔ−ブトキシカルボニル基である。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を、１０ｍｌのＴＦＡ、０．２５ｍｌの１，２ーエタンジチオール、０．５ｍｌのチオアニソール、０．５ｍｌの水および０．７５ｇのフェノールと室温下に９０分間反応させることにより行った。
noHBV-S（126-137）をＫＬＨと結合させ、そして双方のペプチドをそれぞれ独立にＢＳＡと結合させた。
ＫＬＨ複合体をフロインド完全アジュバント中に乳化させ、これを用いて下記スケジュールに従って白色スイスマウス（White Swiss mice）を免疫処置した。
0004116072.tif 000021
最後の注射後、５日間いに亙ってマウス（各群４匹）に逆向きペプチドを経口的に給餌し、そして得られた血清を、ＢＳＡと結合した適当な抗原で１μｇ/ウエルの濃度にコーティングしたマイクロタイタープレートを使用したエリザに供した。
0004116072.tif 000022
これらの結果を、図９にグラフの形で表した。
実施例１５
Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質の残基１２６−１３７に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質の残基１２６−１３７に基づいて、下記のペプチドを合成した。
0004116072.tif 000023
前記表面タンパク質から潜在的Ｔ細胞エピトープである残基２０−３３を選択した：
0004116072.tif 000024
これらのペプチドの合成は、アセトアミドメチル基により保護されたシステインとカップリングしたＭＡＰ（多抗原性ペプシド）樹脂の核それぞれにリジンを介して８つのペプチド枝を有するＭＡＰ樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。グルタミンおよびアスパラギンにはトリチル基、セリン、スレオニン、アスパラギン酸およびチロシンにはｔ−ブチル基、そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチル クロマン−６−スルフォニル基である。noHBV-S（126-137）の分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を、１０ｍｌのＴＦＡ、０．２５ｍｌの１，２ーエタンジチオール、０．５ｍｌのチオアニソール、０．５ｍｌの水および０．７５ｇのフェノールと室温下に９０分間反応させることにより行った。潜在的Ｔ細胞エピトープの分割および脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２−エタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。
等モル量の２つのＭＡＰ産物、即ちnoHBV-S（126-137）と潜在的Ｔ細胞エピトープの二量体化は、酢酸溶液中のイオジンにより酸化させてジスルフィドとすることにより行ったが、この操作は、タムとルーの方法（Tam and Lu 1989）により実施した。
0004116072.tif 000025
上記構築物をフロインド完全アジュバント中に乳化（１：１）させ、これを用いて下記スケジュールに従って白色スイスマウス（White Swiss mice）を免疫処置した。
0004116072.tif 000026
最後の注射後、５日間いに亙ってマウス（各群４匹）に逆向きペプチドを経口的に給餌し、そして得られた血清を、共にＢＳＡと結合した、noHBV-S（126-137）またはriHBV-S（126-137）のいづれか一方で１μg/ウエルの濃度にコーティングしたマイクロタイタープレートを使用したエリザに供した。
0004116072.tif 000027
これらの結果を、図１０にグラフの形で表した。
実施例１６
Ｂ型肝炎ウイルスのＰｒｅＳタンパク質の残基１２７−１４０に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
Ｂ型肝炎ウイルスのＰｒｅＳタンパク質の残基１２７−１４０に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
0004116072.tif 000028
noHBV-PreS（127-140）の合成は、Fmoc-Cys（trt）で予めエステル化した、ポリアミド樹脂であるペプシンカ上で行い、riHBV-PreS（127-140）の合成はポリハイプリンク樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。システイン、ヒスチジンおよびグルタミンにはトリチル基、スレオニン、アスパラギン酸およびチロシンにはｔ−ブチル基そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチル クロマン−６−スルフォニル基である。分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニソールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。両方のペプチドをそれぞれ独立してＫＬＨまたはＢＳＡのどちらか一方に結合させた。
ＫＬＨ複合体をフロインド完全アジュバント中に乳化（１：１）させ、これを用いて下記スケジュールに従って白色スイスマウス（White Swiss mice）を免疫処置した。
0004116072.tif 000029
最後の注射後、５日間いに亙ってマウス（各群４匹）に逆向きペプチドを経口的に給餌し、そして得られた血清を、ＢＳＡと結合した適当なペプチドで１μg/ウエルの濃度にコーティングしたマイクロタイタープレートを使用したエリザに供した。
0004116072.tif 000030
これらの結果を、図１１にグラフの形で表した。
実施例１７
Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳタンパク質の残基１２７−１４０に対応するペプチド配列に対して生じさせられた抗体の抗体産生および活性の分析
Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳタンパク質の残基１２７−１４０に基づいて、下記の２種類のペプチドを合成した。
0004116072.tif 000031
前記ｐｒｅＳタンパク質から潜在的Ｔ細胞エピトープである残基５２−６４を選択した：
0004116072.tif 000032
これらのペプチドの合成は、アセトアミドメチル基により保護されたシステインとカップリングしたＭＡＰ（多抗原性ペプチド）樹脂の核それぞれにリジンを介して８つのペプチド枝を有するＭＡＰ樹脂上で行った。使用した側鎖保護基は次のとおりである。ヒスチジン、グルタミンおよびアスパラギンにはトリチル基、スレオニン、アスパラギン酸およびチロシンにはｔ−ブチル基、リジンにはｔ−ブトキシカルボニル基そしてアルギニンには２，２，５，７，８−ペンタメチル クロマン−６−スルフォニル基である。noHBV-PreS（127-440）およびriHBV-PreS（127-140）の分割および側鎖の脱保護は、ペプチジル樹脂を０．２５Ｍ １，２ーエタンジチオールを含む１Ｍ トリメチルシリルブロミド−チオアニゾールのＴＦＡ溶液と０℃で９０分間反応させる（Yajima et al., 1988）ことにより行った。潜在的Ｔ細胞エピトープの分割および脱保護は、ペプチジル樹脂を、１，２ーエタンジチオール（５容量％）および水（５容量％）を含むＴＦＡと室温下に９０分間反応させることにより行った。
等モル量の２つのＭＡＰ産物、即ちnoHBV-PreS（127-140）と潜在的Ｔ細胞エピトープの二量体化は、酢酸溶液中のイオジンにより酸化させてジスルフィドとすることにより行ったが、この操作は、タムとリューの方法（Tam and Lu 1989）により実施した。同様にして、他の２つのＭＡＰ産物、即ちriHBV-PreS（127-140）およびnoHBV-PreS（52-64）を二量体化した。
0004116072.tif 000033
上記複数の構築物をフロインド完全アジュバント中に乳化（１：１）させ、これを用いて下記スケジュールに従って白色スイスマウス（White Swiss mice）を免疫処置した。
0004116072.tif 000034
最後の注射後、５日間に亙ってマウス（各群４匹）に逆向きペプチドを経口的に給餌し、そして得られた血清を、共にＢＳＡと結合した、noHBV-PreS（127-140）またはriHBV-PreS（127-140）のいづれか一方で１μg/ウエルの濃度にコーティングしたマイクロタイタープレートを使用したエリザに供した。
0004116072.tif 000035
これらの結果を、図１２にグラフの形で表した。
産業上の利用
本発明による抗原類似物は、宿主内における免疫原性応答の誘発に潜在的に適用範囲を有している。これらの抗原類似物は、疾病の治療および/または予防、薬剤送達、並びに病状の改善に使用されることができる。特に、これらの抗原類似物は、ヒトを含む動物のための、病原体等から身を守るためのワクチンに使用されることができる。
さらに、本発明の合成抗原類似物は、診断用ツールとして、天然抗原に対する抗体の存在を検出するための検定、あるいは抗原抗体認識、特異性、抗原性および免疫原性応答の調査等の研究において使用される能力を有している。
本発明の抗原類似物に対して生じさせられる抗体は、診断の目的で、各種試料、抗体により中和される疾患の治療および/または予防、あるいはドラッグデリバリー等、天然抗原の検出が望ましい場面において使用されることができる。
0004116072.tif 000036
0004116072.tif 000037
0004116072.tif 000038
0004116072.tif 000039
0004116072.tif 000040
配列表
（１）  一般的情報
（ｉ）出願人：ディーキン，リサーチ  リミテッド
コミス，アルフィオ
フィッシャー，ピーター
タイラー，マーガレット  Ｉ
（ii）発明の名称：ワクチン
（iii）配列の数：１６
（iv）連絡先：
（Ａ）宛先：グリフィス  ハック  アンド  カンパニー
（Ｂ）番地：ウォーカー通り  １６８  ８階
（Ｃ）都市：ノースシドニー
（Ｄ）州：ニューサウスウエールズ
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）郵便番号：２０６０
（ｖ）コンピューター形式：
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換
（Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ/ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：パテントイン  リリース番号１．０
バージョン１．２５
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）名前：カーツ，アン  Ｄ
（Ｂ）登録番号：Ｎ/Ａ
（Ｃ）参照／整理番号：２１１９２１：ＡＤＫ/ＭＴ
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：６１  ２  ９５７  ５９４４
（Ｂ）テレファックス：６１  ２  ９５７  ６２８８
（Ｃ）テレックス：２６５４７
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１：
0004116072.tif 000041
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号２：
0004116072.tif 000042
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Plasmodium falciparum
（Ｂ）分化の程度：スポロゾイト
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：modified-site
（Ｂ）存在位置：１．．２
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“残基１はペプチドのＮ末端に加えた余分なシステイン残基である。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号３：
0004116072.tif 000043
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Plasmodium falciparum
（Ｂ）分化の程度：スポロゾイト
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号４：
0004116072.tif 000044
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Corynebacterium diphteriae
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号５：
0004116072.tif 000045
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：modified-site
（Ｂ）存在位置：１８．．１９
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドのＣ末端アミノ酸はアミド化されている。ペプチド全体は、ＨＩＶ１のｇｐ４１タンパク質のアミノ酸７３５−７５３に基づいている。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号６：
0004116072.tif 000046
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：modified-site
（Ｂ）存在位置：１６．．１７
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドのＣ末端アミノ酸はアミド化されている。ペプチド全体は、ＨＩＶ１のｇｐ４１タンパク質のアミノ酸５８３−５９９に基づいている。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号７：
0004116072.tif 000047
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｃ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：region
（Ｂ）存在位置：１．．２５
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、ＨＣＶ由来の外被タンパク質のアミノ酸３０６−３３０に対応する。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号８：
0004116072.tif 000048
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：３７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｃ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：region
（Ｂ）存在位置：１．．３７
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、ＨＣＶ由来のキャプシドタンパク質のアミノ酸３９−７４に対応する。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号９：
0004116072.tif 000049
（２）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：３４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：modified-site
（Ｂ）存在位置：２０．．２６
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“残基２０および２６のＸａａはアミノブチル酸を表す。ペプチド全体はＨＩＶ１の外被タンパク質の残基５７９−６１１に基づいている。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１０：
0004116072.tif 000050
（２）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：modified-site
（Ｂ）存在位置：１．．２
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、残基Cys LysによりそのＮ末端で改変してある。残基３−１４はＨＢＶ表面タンパク質のアミノ酸１２６−１３７である。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１１：
0004116072.tif 000051
（２）配列番号：１２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：region
（Ｂ）存在位置：１．．１２
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“ペプチドは、ＨＢＶ表面タンパク質の残基１２６−１３７に対応する。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１２：
0004116072.tif 000052
（２）配列番号：１３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：region
（Ｂ）存在位置：１．．１４
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“ペプチドはＨＢＶの表面タンパク質のアミノ酸２０−３３に対応している。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１３：
0004116072.tif 000053
（２）配列番号：１４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：region
（Ｂ）存在位置：１．．１５
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、そのＣ末端におけるＣｙｓ残基の添加により改変された、ＨＢＶのＰＲＥ Ｓタンパク質のアミノ酸１２７−１４０に対応している。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１４：
0004116072.tif 000054
（２）配列番号：１５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：rejion
（Ｂ）存在位置：１．．１４
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、ＨＢＶのＰＲＥ Ｓタンパク質の残基１２７−１４０に対応している。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１５：
0004116072.tif 000055
（２）配列番号：１６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：Ｂ型肝炎ウイルス
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：rejion
（Ｂ）存在位置：１．．１３
（Ｄ）他の情報：／Ａにて標識
／注“このペプチドは、ＨＢＶのＰＲＥ Ｓタンパク質のアミノ酸５２−６４に対応している。”
（X）印刷物情報：
（Ｈ）書類番号：ＡＵ ＰＬ４３７４
（Ｉ）出願日：１９９２年８月２７日
（xi）配列：配列番号１６：
0004116072.tif 000056
【図１】
0004116072.tif 000057
【図２】
0004116072.tif 000058
【図３】
0004116072.tif 000059
【図４】
0004116072.tif 000060
【図５】
0004116072.tif 000061
【図６】
0004116072.tif 000062
【図７】
0004116072.tif 000063
【図８】
0004116072.tif 000064
【図９】
0004116072.tif 000065
【図１０】
0004116072.tif 000066
【図１１】
0004116072.tif 000067
【図１２】
0004116072.tif 000068