(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主において、インフルエンザ菌の型特定不能菌株の感染に起因する疾病に対する防御を付与するためのワクチンとして使用するための、免疫原性組成物であって、
少なくとも、型特定不能のインフルエンザ菌株１２に由来する１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質と、
そのプロテアーゼ活性が天然Ｈｉｎ４７タンパク質の値の約１０％未満までに低下している、ヒスチジン−９１のアラニンによる置換の変異を有するインフルエンザ菌Ｈｉｎ４７タンパク質の類縁体である、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質とを含み、
該Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質の、前記１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質に対する含有比率は、
３μｇ〜１０μｇの１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質当たり、３μｇ〜１μｇのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質の範囲である
ことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質の、前記１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質に対する含有比率は、１０μｇの１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質当たり、３μｇ〜１μｇのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質の範囲である
ことを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記１２５ｋＤａの成熟型ＨＭＷ１タンパク質は、組換え製造されている、成熟型ＨＭＷ１タンパク質である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
さらにアジュバントを含む
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
別の病原体に起因する感染症に対する防御を付与するための、少なくとも１つの付加的な抗原成分をさらに含む
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ワクチンは、中耳炎を含む、インフルエンザ菌の型特定不能菌株による感染に起因する疾病に対する防御を付与するために使用される
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ワクチン学の分野、具体的には、中耳炎を含む、インフルエンザ菌に起因する疾病に対する防御に有用な、組換えインフルエンザ菌タンパク質を含んでなる多成分ワクチンに関する。
【０００２】
（発明の背景）
インフルエンザ菌は、髄膜炎、喉頭蓋炎、敗血症および中耳炎など、いくつかの重篤なヒトの疾病の原因である。インフルエンザ菌には、その莢膜多糖によって同定されている、ａ〜ｆと称される６種類の血清型がある。ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）は、１９８０年代にいくつかのＨｉｂ接合ワクチンの導入がなされるまで、細菌性髄膜炎の主要な原因であった（ｒｅｆ．１．  本出願全体に渡って、本発明の属する技術分野の現状をより完全に説明するため、様々な参考文献を括弧内に引用する。各引用に関する完全な文献情報は、請求の範囲の直前、明細書の末尾に備えられている。これらの参考文献の開示も、参照により本開示に組み込まれる。）。ジフテリア・トキソイド（ｒｅｆ．２）、破傷風トキソイド（ｒｅｆ．３および米国特許４，４９６，５３８）、あるいは、髄膜炎菌外膜タンパク質（ｒｅｆ．４）と接合された、ｂ型インフルエンザ菌の莢膜多糖に基づくワクチンは、ｂ型インフルエンザ菌誘発髄膜炎の抑制に有効とされてきた。他の血清型インフルエンザ菌は、Ｈｉｂ疾患の頻度が下降するに伴って（ｒｅｆ．５、６）、それらの菌株に起因する疾病の比率に増加が見られるものの、侵襲性疾患に関連する頻度は低い。無莢膜のまたは型特定不能のインフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）もまた、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎を含む、広範なヒトの疾病の原因となる。ＮＴＨｉ誘発疾患の比率は、Ｈｉｂワクチンの導入によっも、影響を受けなかった（ｒｅｆ．７）。
【０００３】
中耳炎は、１回から３回の耳感染症を経験した２歳未満の子供全体の６０〜７０％に達している（ｒｅｆ．８）、幼児期に最もよくみられる病気である。慢性中耳炎は、子供において、聴力、発話および認知障害の原因に帰される。インフルエンザ菌感染は、急性中耳炎の症例の約３０％、慢性中耳炎の約６０％の原因となっている。米国内だけでも、中耳炎の治療には、抗生物質ならびに、扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および鼓膜穿孔管の挿入などの外科的処置に、年当たり１０億〜２０億ドルを要している。年間に、言語療法および特殊教育授業などの付随する治療に対し、追加的な３００億ドルが費やされていると推定される。さらに、中耳炎の病原菌は、抗生物質治療に対して耐性になりつつある。したがって、中耳炎に対する有効な予防ワクチンが望まれている。
【０００４】
ＮＴＨｉによる自然感染では、抗体反応を刺激する表面に露出した外膜タンパク質が、殺菌および／または防御抗体に対する、可能性の高い重要な標的であり、また、したがって、可能性の高いワクチン候補である。ＢａｒｅｎｋａｍｐおよびＢｏｄｏｒは、ＮＴＨｉによる中耳炎に罹患している子供の回復期血清は、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質に対する抗体を含むことを明らかにした（ｒｅｆ．９）。ＮＴＨｉ菌株の約７０〜７５％は、ＨＭＷタンパク質を発現しており、また、これらの菌株の大部分は、ｈｍｗ１ＡＢＣおよびｈｍｗ２ＡＢＣと名づけられた２つの遺伝子群を含んている（ｒｅｆ．１０、１１）。ＨＭＷＡタンパク質は、ヒト上皮細胞への接着を仲介する接着因子であることが明らかとなった（ｒｅｆ．１２）。天然型のＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質の混合物による免疫は、中耳炎のチンチラ水疱内攻撃モデルにおいて、部分的防御をもたらした（ｒｅｆ．１３）。
【０００５】
米国特許第５，６０３，９３８号（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ）は、セントルイス大学とワシントン大学に譲渡されており、また、参照によりその開示をここに組み込むが、型特定不能のヘモフィルス属菌株１２由来のＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質をコードする遺伝子のクローニング、発現および配列決定を記載している。このＨＭＷタンパク質は、型特定不能のヘモフィルス属菌株で見出される、分子量が約１００〜１２５ｋＤａの型特定不能のヘモフィルス属に由来する、１群のタンパク質である。ＨＭＷタンパク質は、ヘモフィルス属の莢膜保有菌株では、存在していない。
【０００６】
インフルエンザ菌からの天然型ＨＭＷタンパク質の産生は極めて少なく、また、防御的な組換えＨＭＷ（ｒＨＭＷ）タンパク質の作製方法が、本出願と同じ譲受人に譲渡されている、１９９８年１０月７日出願、同時係属中の米国特許出願第０９／１６７，５６８号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に組み込む。チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルが、特に接着因子のワクチンとしての有効性を立証するために開発され（ｒｅｆ．１４）、かつ、前述の同時係属中の米国特許出願第０９／１６７，５６８号中に記載されるように、ｒＨＭＷタンパク質はこのモデルにおいて防御性を示す。ｒＨＭＷ１ＡおよびｒＨＭＷ２Ａタンパク質は、互いに等価な防御を与えることが示され、以後のワクチン研究にはｒＨＭＷ１Ａタンパク質が選択された。本出願においては、他のＮＴＨｉ菌株由来の対応する組換えＨＭＷ１Ａタンパク質、ならびにＮＴＨｉ菌株由来の対応するｒＨＭＷ２Ａタンパク質も、ｒＨＭＷとして使用することもできるものの、ｒＨＭＷは、ＮＴＨｉ菌株１２由来の組換えＨＭＷ１Ａタンパク質を指す。対応する、天然に存在するタンパク質を使用することもできる。
【０００７】
高温などの環境ストレスの下において、生物体は、ストレス応答あるいはヒート・ショックタンパク質（ｈｓｐｓ）を過剰産生する。細菌性のｈｓｐｓは、Ｂ細胞とＴ細胞を共に刺激する、重要な免疫原であることが証明された（ｒｅｆ．１６）。細菌性のＨｔｒＡあるいはＤｅｇＰヒート・ショックタンパク質は、ストレス条件下で発現され、かつ、インフルエンザ菌のＨｔｒＡタンパク質は、中耳炎の水疱内攻撃モデルにおいて部分的に防御抗原であることが示されている（ｒｅｆ．１７）。ＨｔｒＡタンパク質は、セリンプロテアーゼであり、そのタンパク質分解活性は、それ自体を不安定にする。加えて、多成分ワクチンの成分とした際、野生型ＨｔｒＡタンパク質は、混合された抗原を失活させる。インフルエンザ菌ｈｔｒＡ遺伝子（ｈｉｎ４７と呼ばれる）の部位特異的変異導入、ならびにその変異体の特性は、本出願と同じ譲受人に譲渡されている、米国特許第５，５０６，１３９号（Ｌｏｏｓｍｏｒｅ等）にすべて記載されており、また、参照によりその開示を本明細書に組み込む。非タンパク質分解性のＨｔｒＡ類似体；Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７は、ｂ型インフルエンザ菌により引き起こされる菌血症、ならびに型特定不能のインフルエンザ菌に起因する中耳炎に対する防御抗原となることが判明している（ｒｅｆ．１７）。Ｈｉｎ４７の他のいかなる非タンパク質分解性類縁体を使用してもよいが、ここでは、かかる類縁体は利用される。ＨｔｒＡは、インフルエンザ菌のすべての莢膜保有菌株を含め、被験菌株全てにおいて見いだされる。
【０００８】
中耳炎を含むインフルエンザ菌疾病に対する、予防ワクチンの主な目標は、免疫原として接着因子を含有することによって、鼻咽頭コロニー形成の確立を予防することにあるものの、ＨＭＷタンパク質は、莢膜保有インフルエンザ菌ならびに約２５％のＮＴＨｉ菌株中には、存在しない。したがって、少なくとも１個の接着因子分子、および全てのインフルエンザ菌株中に見いだされる、付加的な防御抗原を含んでなる混合ワクチンは、疾病に対するより優れた保護および広範な疾病防御の範囲をもたらすであろう。
【０００９】
選択された相対量の選択された抗原を含んでいる、インフルエンザ菌成分を含んでなる有効な混合ワクチンを提供することが望まれている。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病を防御するための、多成分ワクチンの提供を目指している。
【００１１】
本発明の一形態によれば、宿主において、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病に対する防御を付与するための、その抗原の少なくとも１つが接着因子である、インフルエンザ菌の少なくとも２つの異なる抗原を含んでなる免疫原性組成物が提供される。
【００１２】
接着因子である抗原は、ヘモフィルス属の型特定不能の菌株の高分子量タンパク質（ＨＭＷ）、特には、組換えによって製造することもできる、その型特定不能菌株のＨＭＷ１またはＨＭＷ２タンパク質であってもよい。
【００１３】
接着因子ではない、インフルエンザ菌の抗原は、インフルエンザ菌の非タンパク質分解性ヒート・ショックタンパク質であってよい。インフルエンザ菌の非タンパク質分解性ヒート・ショックタンパク質は、そのプロテアーゼ活性が、天然のＨｉｎ４７タンパク質の値の約１０％未満に低下している、インフルエンザ菌のＨｉｎ４７タンパク質の類縁体でもよい。
【００１４】
本発明のかかる形態での好ましい態様によれば、宿主において、中耳炎を含む、インフルエンザ菌に起因する疾病に対する防御を付与するための免疫原性組成物であって、
そのプロテアーゼ活性が、天然のＨｉｎ４７タンパク質の値の約１０％未満に低下している、インフルエンザ菌のＨｉｎ４７タンパク質の類縁体、および
型特定不能のインフルエンザ菌株の高分子量（ＨＭＷ）タンパク質を含むものが提供される。
【００１５】
かかる組成物中では、個々の免疫原性に関しては、成分間で互の抵触は存在しないものの、宿主における、Ｈｉｎ４７タンパク質類縁体に対する免疫応答を増強する量でＨＭＷタンパク質が存在していてもよい。
【００１６】
Ｈｉｎ４７タンパク質の類縁体は、プロテアーゼ活性に寄与する、天然Ｈｉｎ４７タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が、除去されるか、または、異なるアミノ酸により置換されており、また、天然のＨｉｎ４７タンパク質と実質的に同等の免疫原性を有するものであることができる。
【００１７】
この少なくとも１つのアミノ酸は、天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸９１、１２１、および１９５〜２０７からなる群より選択することができる。用いることができる、具体的な変異体に、セリン−１９７のアラニンによる置換、ヒスチジン−９１のアラニン、リジンまたはアルギニンによる置換、ならびに、Ａｓｐ−１２１のアラニンによる置換が含まれる。
【００１８】
インフルエンザ菌の型特定不能の菌株のＨＭＷタンパク質は、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２タンパク質でよく、また、組換えによって製造されていてもよい。該ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質は、型特定不能のインフルエンザ菌の各菌株に由来しており、かつ下記の表Ｉに示すそれぞれの分子量を有している。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
本発明の免疫原性組成物は、さらにアジュバントを具える、処方とすることもできる。本発明に利用される、かかるアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、その誘導体および成分、ＩＳＣＯＭ  マトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミル−ジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡおよびリポタンパク質、ならびに、例えば、本出願と同じ譲受人に譲渡されており、その開示を参照により本明細書に組み込む１９９４年６月１０日出願のＵＳＡＮ０８／２５８，２２８に記載されているように（ＷＯ  ９５／３４３２３）、細菌性毒素、その要素およびその誘導体を含む、その他のアジュバントが含まれる（なお、これらに限られるものではない）。特定の環境下においては、Ｔｈ１応答を誘発するアジュバントが望ましい。アジュバントの有利な組合せは、本出願と同じ譲受人に譲渡されている、同時係属している、１９９４年６月１６日出願の米国特許出願第０８／２６１，１９４号と１９９５年６月７日出願の第０８／４８３，８５６号に記載されており（１９９５年１１月２１日発行のＷＯ  ９５／３４３０８）、また、その開示を参照により本明細書に組み込む。好ましくは、アジュバントは、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム（まとめて、アルムとして知られている）を含むことができる。
【００２１】
免疫原性組成物の成分は、所望の免疫応答をもたらすのに適当な量で存在することができる。成分は、宿主へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与用ワクチンとして、処方することができる。ワクチン組成物は、Ｈｉｎ４７タンパク質を約２５〜約１００μｇ、および、ＨＭＷタンパク質を約２５〜約１００μｇ含有することができる。
【００２２】
免疫原性組成物は、その付加的な抗原成分が別の病原体に起因する疾病に対する防御を付与する、多価ワクチンを提供するため、その他の抗原成分を備えた処方とすることができる。かかる付加的な抗原は、最終的にできるワクチンの成分個々の免疫原性が、組成物の他の個々の成分によって、損なわれることのないもので、且つそのような量で存在しなければならない。かかる付加的な抗原は、成分ワクチンを製造するために、規定されている量の精製抗原であることが好ましい。
【００２３】
このような付加的な抗原は、ジフテリア・トキソイド、破傷風トキソイド、ならびに、繊維状赤血球凝集素、ペルタクチンおよび／または凝集原を含む百日咳抗原などの、多価防御ワクチンに伝統的に見いだされる抗原であってよい。
【００２４】
得られる多価ワクチンは、また、１型、２型および／または３型ポリオウイルスであってもよい、不活化ポリオウイルスなどの、非毒性ポリオウイルスを含有してもよい。多成分ワクチンは、さらに、破傷風またはジフテリア・トキソイドと、インフルエンザ菌の莢膜多糖、好ましくはＰＲＰ−Ｔとの複合体を含むことができる。
【００２５】
本発明は、ここに提供される免疫有効量の免疫原性組成物を宿主に投与することを含んでなる、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病に対して宿主を免疫化する方法にまで及んでいる。
【００２６】
本発明は、さらに、ワクチンとして使用するされる、本発明の免疫原性組成物にまで及んでいる。加えて、本発明は、その少なくとも１つが接着因子である、インフルエンザ菌の少なくとも２つの異なる抗原の、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病に対する防御を付与するためのワクチンの製造における使用も含んでいる。
【００２７】
本発明の利点には、莢膜保有のおよび無莢膜のインフルエンザ菌疾病に対して、安全かつ有効な防護の付与ができる多成分ワクチンが含まれる。
【００２８】
本発明は、図面を参照して、以下の説明によって、より理解することができる。
【００２９】
（発明の一般的説明）
鼻咽頭のコロニー形成は、インフルエンザ菌を含む、多くの細菌またはウイルス病原体における疾病発生の第一段階であり、接着因子分子を含有するワクチンは、疾病進行におけるこの第一段階に対して、防御をするはずである。型特定不能のインフルエンザ菌の約７５％において見いだされる、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質は、ワクチン組成物として投与された際、コロニー形成に対して防御的である接着因子であることが判明した。該ＨＭＷタンパク質は、莢膜保有のインフルエンザ菌株あるいは約２５％の型特定不能のインフルエンザ菌株には存在しておらず、従って、全菌株に対する防御性を有するワクチンとしては、それらのみでは、十分ではない。
【００３０】
ＨｔｒＡタンパク質あるいはＨｉｎ４７は、莢膜保有および型特定不能のインフルエンザ菌株の全てに見いだされる。Ｈｉｎ４７は、ｂ型インフルエンザ菌に起因する菌血症および型特定不能のインフルエンザ菌に起因する中耳炎に対して防御性であるものの、それ自体はコロニー形成を妨げない。Ｈｉｎ４７は、タンパク質分解性であり、また、それ自体では、タンパク質製剤中で用いることはできない。ＨＭＷおよび非タンパク質分解性のＨｉｎ４７抗原を含んでなる混合ワクチンは、中耳炎を含む、顕著なインフルエンザ菌疾病に対する防御するために、製剤化することができる。本発明は、このような混合ワクチンを提供する。
【００３１】
米国特許第５，５０６，１３９号（Ｌｏｏｓｍｏｒｅ他）は、そのプロテアーゼ活性が天然のＨｉｎ４７タンパク質の値の約１０％未満に低下しており、かつ好ましくも、天然のＨｉｎ４７タンパク質と実質的に同等な免疫原性を有する、インフルエンザ菌Ｈｉｎ４７タンパク質の類縁体の調製を記載している。この特許は、また、Ｈｉｎ４７類縁体をコードする核酸分子の分離、精製ならびに同定も記載している。天然のＨｉｎ４７タンパク質は、免疫学的にはインフルエンザ菌の型特定不能株およびｂ型分離株中において保持されている。天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列ならびにコードしているｈｉｎ４７遺伝子のヌクレオチド配列は、１９９４年１月６日発行のＷＯ９４／００１４９に記載されており、参照により本明細書に組み込む。
【００３２】
米国特許第５，５０６，１３９号のＨｉｎ４７類縁体は、そこに具体的に述べられているように、天然Ｈｉｎ４７タンパク質のプロテアーゼ活性に寄与する少なくとも１つのアミノ酸を欠失させるか、異なるアミノ酸で置換することにより、あるいは、天然Ｈｉｎ４７タンパク質中に少なくとも１つのアミノ酸を挿入することによって調製される。該少なくとも１つの欠失または置換されるアミノ酸は、Ｈｉｎ４７の１９５から２０１のアミノ酸から選択することができ、具体的にはセリン−１９７であって、これを欠失させても、アラニンにより置換してもよい。加えて、少なくとも１つの欠失または置換されるアミノ酸は、Ｈｉｓ−９１でもよく、欠失させても、アラニン、リジンまたはアルギニンにより置換してもよい。さらに、少なくとも１つの欠失または置換されるアミノ酸は、Ａｓｐ−１２１でもよく、欠失させても、アラニンにより置換してもよい。
【００３３】
本出願と同じ譲受人に譲渡されており、その開示を参照により本明細書に組み込む、米国特許第５，８６９，３０２号中には、非タンパク質分解性Ｈｉｎ４７類縁体を与えるための、天然Ｈｉｎ４７タンパク質の異なるアミノ酸に施された多重変異が記載されている。
【００３４】
本発明では、前述の特許および出願に記載されているような、プロテアーゼ活性の低下した他のＨｉｎ４７変異体を利用することもできるものの、ヒスチジン９１のアラニンへの変異（本明細書では、しばしば「Ｈ９１Ａ」と称する）を、変異体Ｈｉｎ４７タンパク質の例として用いる。
【００３５】
組換えによるＨＭＷタンパク質（ｒＨＭＷ）の調製は、前述の同時係属中の米国特許出願第０９／１６７，５６８号に記載されている。
【００３６】
多成分ワクチンの組成は重要である。ワクチン成分は、互いに相容れるものであらねばならず、また、それらは、抗原性の妨害を避け、可能な何らかの相乗効果も最適化するため、適当な比率で混合しなければならない。他の既存ワクチンと共に投与する場合には、該ワクチンによってもたらされる他の疾病に対する防御を妨害してはならない。
【００３７】
ここでなされている具体的な実験においては、２つの動物種において、２成分Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷワクチンについて様々な抗原比率が比較されている。抗原性の干渉は、低用量のｒＨＭＷと混合した際、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の量を増加した場合に観察されたが、この影響は、より高用量のｒＨＭＷでは消失した。低用量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する一次抗体応答に対し、ｒＨＭＷの量を増加させると、相乗効果が観察され、また、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７は、ｒＨＭＷが低用量で存在しない場合には、ｒＨＭＷに対する一次応答を改善させた。これらの知見は、単一の抗原（Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７）は、他の抗原（ｒＨＭＷ）に対して、存在するｒＨＭＷの用量に依存して、抑制ならびに増強効果を共に有するという点で驚くべきことである。また、それ自体は、より弱い免疫原であるので、そのｒＨＭＷが、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する活発な抗体応答を促進することも驚くべきことであった。
【００３８】
図１を参照して、マウスにおける、２成分Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷワクチンのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する免疫応答を説明する。最終採血においてすべてのワクチンの組合せについて高い抗体価が達成されているが、低用量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７での一次応答には、ｒＨＭＷの有無によりサンプル間に差があるようである。図２を参照すると、０．３μｇ用量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に添加するｒＨＭＷの量を増加させた場合、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する一次免疫応答において観察された、相乗効果の統計分析が例示されている。
【００３９】
図３を参照して、マウスにおける、２成分Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷワクチンのｒＨＭＷ抗原に対する免疫応答を説明する。最低用量のｒＨＭＷを含有するものを除き、すべてのワクチンの組合せにおいて、最終採血では、高い抗体価に達している。０．３μｇ用量のｒＨＭＷに、増加した量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７を組み合わせると、抗ＨＭＷ抗体応答に劇的な低下が生じている。最高用量のｒＨＭＷに、増加した量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７を組み合わせる際には、明らかに、その一次抗体応答に差がある。図４を参照すると、増加した量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７を混合した際の、１０μｇ用量のｒＨＭＷに対する一次免疫応答における、相乗効果の統計分析が例示されている。
【００４０】
図５を参照して、モルモットにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７成分に対する免疫応答を説明する。いずれのワクチンに対しても、抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７応答に統計学的差はなかった。図６を参照して、モルモットにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンのｒＨＭＷ成分に対する免疫応答を説明する。いずれのワクチンに対しても抗ＨＭＷ応答に統計学的差はなかった。
【００４１】
図７を参照して、中耳炎の水疱内攻撃モデルにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンによってもたらされる防御を、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７成分のみによってもたらされる防御と比較して、説明する。両ワクチンとも、部分的に防御性である。図８を参照して、鼻咽頭コロニー形成モデルにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンによってもたらされる防御を、ｒＨＭＷ成分のみによってもたらされる防御と比較して、説明する。両ワクチンともに、極めて防御性である。
【００４２】
図９を参照して、０および１４日目における、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷワクチンの安定性プロフィルを説明する。２つの抗原は、後者の時点でも、アルム上に依然として吸着されており、劣化を受けていない。
【００４３】
図１０Ａと１０Ｂを参照して、単独で、またはＰｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）（ジフテリア・トキソイド＋破傷風トキソイド＋１型ポリオ＋２型ポリオ＋３型ポリオ＋ＰＲＰ−Ｔ＋百日咳トキソイドからなる無細胞百日咳ワクチン＋繊維状赤血球凝集素＋６９ｋＤａ／ペルタクチン＋ふさ状凝集原）と同時投与された際の、２成分インフルエンザ菌ワクチンのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７およびｒＨＭＷ抗原に対する、モルモットにおける免疫応答を説明する。単独で、または２成分インフルエンザ菌ワクチンと同時投与された際の、Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）に対する免疫応答も説明する。同時投与した多成分ワクチンの有意な相乗あるいは抑制効果はなかった。
【００４４】
Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）製剤は、本出願と同じ譲受人に譲渡されている、１９９６年７月２日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／６７２，５３０号に記載されており（ＷＯ９８／００１６７）、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００４５】
（生物寄託）
ここにおいて記載され、参照されている、ヘモフィルス属の型特定不能菌株の高分子量タンパク質をコードする核酸を含む特定のベクターは、本出願の出願に先立って、ブダペスト条約に従い、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９、米国に所在するAmerica Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に寄託がなさている。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能とし、課されるすべての制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の許可により、受けることとする。加えて、該受託機関による生存可能なサンプルの分配ができない場合には、寄託物の交換を行うこととする。かかる寄託された態様は、本発明の例示として、なされたものであり、本明細書に記載および請求する記載され、また特許請求されている本発明は、該寄託された生物材料によってその技術的範囲を限定されるものではない。本出願中に記載されたものと、等価または同様の抗原をコードする核酸を含む、いずれの等価あるいは類似のベクターも本発明の技術的範囲内である。
【００４６】
（寄託物の概要）
プラスミド              ＡＴＣＣ        寄託日
ＢＫ−７６−１−１      ２０３２６１    １９９８年９月２５日
（実施例）
上記の開示は、本発明を一般的に記述している。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に例示の目的で記載されており、従って、本発明の技術的範囲を限定することを意図していない。適宜な、また、場合に応じた、形態の変更および等価体の置換は、考えに入れられている。ここでは具体的な条件を用いてきたが、かかる条件は記述上の便宜を目的とするもので、限定を目的とするものではない。
【００４７】
利用された分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学および培養技術の手法は、本開示ならびにこれらの実施例中に事細かには記述されてはいないが、科学文献に詳細に報告されてもおり、また、十分に当業者の能力の範囲内のものである。
（実施例１）
本実施例は、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７ワクチン成分の調製について記載している。
【００４８】
Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７変異体は、米国特許第５，５０６，１３９号中の記載と同様に調製した。簡単に言うと、Ｈｉｎ４７タンパク質中の９１位のヒスチジン残基をアラニンに変える、オリゴヌクレオチド  ５’  ＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＴ  ３’（配列番号１）を合成した（ｒｅｆ．１７）。
【００４９】
プラスミドＪＢ−１２７６−１−２は、ＥｃｏＲＩ断片上にＴ７／ｈｉｎ４７遺伝子を含んでいるｐＵＣベースのプラスミドであり、そして、ＡｍｅｒｓｈａｍのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットによって、部位特異的変異導入用のＭ１３ｍｐ１８中にｈｉｎ４７遺伝子をクローニングするため、利用した。プラスミドＪＢ−１２７６−１−２の調製は、ＵＳＰ５，５０６，１３９に記載されている。Ｈｉｓ９１コドンのＡｌａ９１への変異は、部分的な配列決定によって確認した。Ｈ９１Ａ変異体ｈｉｎ４７遺伝子を、ｐＴ７−７中にサブクローニングし、プラスミドＤＳ−１２７７−１９を生成した（図１１）。
【００５０】
Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７発現プラスミド（ＤＳ−１２７７−１９）は、アンピシリン選択を利用する。Ｔ７／Ｈ９１Ａ  ｈｉｎ４７遺伝子をｐＢＲ３２８中にクローニングして、テトラサイクリン選択をも使用できるようにした。従って、ベクターＤＳ−１３１２−１２は、ｐＢＲ３２８ベースのプラスミドであり、ＥｃｏＲＩとＣｌａＩ部位の間にＴ７／Ｈ９１Ａ  ｈｉｎ４７遺伝子配列を含み、機能性のアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を有し、ｐＢＲ３２８とｐＥＶｖｒｆｌの双方に見いだされるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉ配列の繰り返しを含む。
【００５１】
カナマイシン選択を利用するＤＳ−１３１２−１２をベースとする新たなプラスミドを構築した。構築スキームを図１１に示す。ＤＳ−１３１２−１２のプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２つのフラグメントを生成した。大きい方の５．９ｋｂフラグメントは、プロモーターを欠くｔｅｔＲ遺伝子、ａｍｐＲ遺伝子およびＴ７／Ｈ９１Ａ  ｈｉｎ４７遺伝子を含み、また、それ自体中で再連結して、ベクターＤＳ−２１４０−３を生成した。プラスミドＤＳ−２１４０−３をＰｓｔ  Ｉで消化し、そして、プラスミドｐＵＣ−４Ｋ（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のｋａｎＲ遺伝子を、このＰｓｔ  Ｉ部位に挿入して、ｋａｎＲ（カナマイシン耐性）であるが、アンピシリンとテトラサイクリンの双方に感受性を示す、プラスミドＤＳ−２１５０−１を生成した。
【００５２】
ＤＳ−２１５０−１由来のプラスミドＤＮＡは、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇｌｅｙの手法（ｒｅｆ．１８）に基づき、また、フェノールならびにクロロホルムを用いた抽出を含む、プロトコルを用いて、５０ｍＬ培養から調製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に、以下のようにエレクトロコンピテントした。簡単に言うと、１０ｍＬの一夜培養物を、ＹＴ培地５００ｍＬに接種し、Ａ620＝０．５４０に達するまで、振盪しながら３７℃で細胞を生長させた。培養物を３０分間氷冷し、５Ｋｒｐｍ、１５分間の遠心し、そして、細胞ペレットを氷冷滅菌水５００ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を前と同様に遠心分離し、細胞ペレットを氷冷滅菌水２５０ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を再度遠心し、細胞を１０％グリセロール１０ｍＬに再懸濁した。このグリセロール懸濁液を遠心し、そして、細胞を１０％グリセロール１．５ｍＬに再懸濁し、４０μＬのサンプルに分液し、−７０℃で保存した。
【００５３】
エレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の一つの分液を氷上で解凍し、ＤＳ−２１５０−１ＤＮＡ約９ｎｇを加えた。サンプルを氷上で３分間インキュベートし、次いで、−２０℃のＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ電極キュベットに移し、電気パルスにかけた。ＳＯＣ培地９００μｌを加え、混合物を培養管に移し、そこで、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＹＴ寒天上へのプレートに先立ち、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、単一コロニーを発現検討に使用した。
【００５４】
個々のコロニーは、Ａ600 nm約０．３までＮＺＣＹＭ培地中で生長させ、そして、乳糖を１％まで加えて発現を誘導した。細胞を４時間生長させ、次いで集菌し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。クローンＤＳ−２１７１−１−１が、高レベルのＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７を発現する代表的クローンとして選択された。
【００５５】
ＤＳ−２１７１−１−１が入っている大腸菌は、各ＥＣＧＭ（グルコース８ｇ／Ｌを含む、ｐＨ６．５）２５０ｍＬを入れた２×２Ｌフラスコ中で生長させ、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら暗所で、約９時間インキュベートした。培養液（２×２５０ｍＬ）を１０Ｌの培養槽に接種し、培養物を３７℃で生長させた。約１０時間のインキュベーション後、誘導のために１％乳糖（最終濃度）を加え、続いてさらに４時間インキュベートした。
【００５６】
培養液を滅菌したトランスファ・ボトルに採取し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ／ＨＣＩ緩衝液５０ｍＭに対するクロスフローろ過によって、濃縮ならびにダイアフィルトレーションを行った。濃縮物中の細胞を高圧ホモジナイザー（１５，０００ｐｓｉで２通過）で破菌し、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質を遊離させた。細胞細片は、１５，０００ｒｐｍ、１．５時間の遠心分離により除去した。上清は、遠心分離によってさらに浄化し、０．２２μｍのデッド・エンド  フィルタを通してろ過した。生成物は、さらなる処理まで−７０℃で凍結保存した。
【００５７】
純化したサンプルに、最終濃度１００ｍＭまで、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えた。次いで、１００ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｓで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィカラム（ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）上でサンプルを精製した。Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質が流出画分中に得られた。
【００５８】
ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した１型セラミック・ヒドロキシアパタイト（ＣＨＴＰ−１）カラム上に水層を載せた。次いで、ｐＨ８．０の１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄し、１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７を溶出した。
【００５９】
Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の精製タンパク質を、１０ｋＤａ分子量カットオフ・メンブランを用い、続いて約１０倍量のｐＨ７．５リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によるダイアフィルトレーションにより濃縮した。
【００６０】
ＰＢＳ中のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の精製タンパク質を、Ｑ６００  ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  メンブラン吸着膜に通した。溶液の通過後、１．０Ｍ  ＫＣｌ／１．０Ｍ  ＮａＯＨを用い、続いて１Ｍ  ＫＣｌで洗浄し、次いでＰＢＳで平衡化することによりメンブランを再生した。このプロセスを２回繰り返した。濃縮とダイアフィルトレーションを受けたＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質を、０．２２μｍのメンブラン・フィルタを通して滅菌ろ過した。滅菌Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７タンパク質は、リン酸アルミニウムによりアジュバントとした。吸着された精製濃縮物を希釈し、１００μｇ／ｍＬの吸着済みバルクを製造した。
【００６１】
（実施例２）
本実施例は、ｒＨＭＷワクチン成分の調製について記載している。
【００６２】
ＨＭＷタンパク質の製造および精製は、１９９８年１０月７日出願の同時係属中の米国特許出願第０９／１６７，５６８号に記載されている。
【００６３】
簡単に言うと、プラスミドｐＨＭＷ１−１５（ｒｅｆ．１０）は、Ｔ７プロモーター配列内にＸｂａ  Ｉ部位を、型特定不能のヘモフィルス属菌株１２の成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質のコード配列内に単一のＢａｍＨ  Ｉ部位を含む。ｐＨＭＷ１−１５の１．８ｋｂのＸｂａ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉフラグメントを除去し、オリゴヌクレオチドから生成する約１１４ｂｐのＸｂａ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉフラグメントによって置換された。すなわち、得られる１１．３ｋｂプラスミド、ＤＳ−１０４６−１−１は、成熟型１２５ｋＤａのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするｈｍｗ１ＡＢＣオペロンと一体に結合されたＴ７プロモーターを含む（図１１）。
【００６４】
プラスミドＤＳ−１０４６−１−１は、Ｔ７  ｈｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含み、成熟ＨＭＷ１Ａ遺伝子のコード領域の外部に単一のＢｇｌ  ＩＩ部位を有する。プラスミドＤＳ−２２２４−１−４は、ＢａｍＨ  Ｉフラグメント上に位置する大腸菌ｃｅｒ遺伝子を含む。このフラグメントを単離し、プラスミドＤＳ−１０４６−１−１のＢｇｌ  ＩＩ部位に連結して、プラスミドＢＫ−３５−４を作製した（図１１）。カナマイシン耐性カセットを、Ｓａｌ  Ｉ制限酵素によってｐＵＣ  ４Ｋから切り取り、Ｓａｌ  Ｉで切断されたＢＫ−３５−４プラスミド中に連結して、プラスミドＢＫ−７６−１−１を作製した。
【００６５】
プラスミドは、ＢｉｏＲａｄ装置を用い電気穿孔法によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に導入した。吸光度がＡ578＝０．３となるまで、ＮＺＣＹＭ培地中３７℃で菌株を成長させ、次いで、１．０％まで乳糖を添加することにより４時間発現誘導した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解＋添加緩衝液で０．２ＯＤ／μｌに調整し、同量のタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。
【００６６】
組換えＨＭＷタンパク質は、大腸菌中で封入体として発現し、同じ手順で精製した（図１２）。５００ｍｌ培養液からの大腸菌細胞ペレットを、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｌに再懸濁し、超音波処理によって破砕した。抽出物を、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、得られる上清は捨てた。０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｌ中でペレットをさらに抽出し、次いで、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清は捨てた。１％オクチルグリコシドを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｌ中でペレットをさらに抽出し、次いで、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清は捨てた。
【００６７】
上記の抽出後に得られるペレットは、封入体を含む。６Ｍグアニジンおよび５ｍＭ  ＤＴＴを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ６ｍｌ中でペレットを可溶化した。ｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １２ｍｌをこの溶液に加え、混合物を２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、最終濃度７％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００で沈澱させた。２０，０００ｇで３０分間の遠心分離により得られるペレットを除去し、そして、５０％飽和の（ＮＨ4）2ＳＯ4により上清を析出させた。（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加後、溶液を相分離するとタンパク質は上層に移行し、次いで２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。６ＭグアニジンＨＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２ｍｌに得られたペレットを溶かし、透明溶液を、２ＭグアニジンＨＣｌを含むｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラム上で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分を分析し、精製ｒＨＭＷ１を含むものをプールし、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析し、次いで、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。これらの条件下では、該タンパク質は溶けたままであり、−２０℃での保存のため、最終濃度２０％で、グリセロールをｒＨＭＷ１調製物に加えた。
【００６８】
ｒＨＭＷワクチン成分の濃度を、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中で４００μｇｍｌ-1に調整し、リン酸アルミニウムでアジュバント化して、最終濃度３ｍｇｍｌ-1とした。原液を、ＰＢＳ中の３ｍｇｍｌ-1のリン酸アルミニウムで希釈することにより、様々な用量を調製した。
【００６９】
（実施例３）
本実施例は、２成分ワクチンとして、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７とｒＨＭＷの組合せについて記載している。
【００７０】
下記の表ＩＩに示すように、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７とｒＨＭＷの組合せからなるワクチンを調製した。
【００７１】
【表３】
0004105393.tif 000003
【００７２】
ワクチン成分は０日目に混合し、４℃で一夜混ぜ、１日目に分液した。混合ワクチンは、免疫化期間を通し４℃で保存した。
【００７３】
（実施例４）
本実施例は、動物における、多成分ワクチンの免疫原性の分析について記載している。
【００７４】
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｑｕｅｂｅｃ）からなる群を、実施例３に記載のマウスワクチンの１つで、１、２９および４３日目に皮下（ｓ．ｃ．）で免疫化した。血液サンプルは、０、１４、２８、４２および５６日目に採取した。
【００７５】
５匹のＨａｒｔｌｅｙ  異系交配モルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｑｕｅｂｅｃ）からなる群を、実施例３に記載のモルモットワクチンの１つで、１、２９および４３日目に筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫化した。血液サンプルは、０、１４、２８、４２および５６日目に採取した。
【００７６】
抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７および抗ｒＨＭＷ  ＩｇＧ抗体価は、抗原特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。マイクロタイターウエル（ＮｕｎｃＭＡＸＩＳＯＲＢ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｍｍａｒｋ）をタンパク質溶液（Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の場合、０．４μｇｍｌ-1、またはｒＨＭＷの場合、０．４μｇｍｌ-1）でコーティングした。用いる二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）と接合した、ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）または抗モルモットＩｇＧ（Ｆｃ特異的）のアフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）2フラグメントとした。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2、ＡＤＩ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて反応を起こさせ、Ｆｌｏｗ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣマイクロプレートリーダー（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）において、４５０ｎｍ（対照波長として５４０ｎｍを用いる）で吸光度を測定した。抗血清の反応価は、予め採血しておいた血清サンプルで得られた吸光度に対して、２倍の吸光度の増加を確実に示す希釈度の逆数と定義する。
【００７７】
免疫原性検討の結果を図１から６に示す。図１に示すように、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ０．３、１．０または３．０μｇで免疫化されたマウスから得られる最終採血血清はすべて、存在するｒＨＭＷの量（０から１０μｇ）とは関係なく、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する高い抗体価を有していた。しかしながら、抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  一次応答には統計学的に有意差がある。図２に示すように、増加した量のｒＨＭＷの存在下では、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する一次応答は増強されている。これらの知見は驚くべきことで、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する一次免疫応答に対してｒＨＭＷが相乗効果を示すことを示唆している。
【００７８】
図３に示すように、ｒＨＭＷ  １、３または１０μｇで免疫化されたマウスから得られる最終採血血清はすべて、存在するＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の量（０から３μｇ）とは関係なく、ｒＨＭＷに対する高い抗体価を有していた。しかしながら、最低用量のｒＨＭＷ（０．３μｇ）では、添加されている、増加した量のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７によって、ｒＨＭＷに対する免疫応答の統計学的に有意な阻害がある。この知見は驚くべきことで、低用量のｒＨＭＷに対しては、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７が免疫サプレッサーとして作用することを暗示している。これに対して、最高用量のｒＨＭＷ（１０μｇ）では、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の添加は、ｒＨＭＷに対する免疫応答を明確に増強する（図４）。マウスにおけるこれらの知見は、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７とｒＨＭＷの２成分の相対量が、両抗原に対する良好な免疫応答を得るために重要であることを示している。
【００７９】
ここに示されるデータからは、ｒＨＭＷ  約３から約１０μｇ、最も好ましくは約１０μｇは、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  約１から約３μｇとすると、増強効果を示すと思われる。
【００８０】
図５は、モルモットで得られた抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７抗体価を示す。ｒＨＭＷの添加は、抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７抗体価に影響しなかった。同様に、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の添加は、モルモットにおける抗ｒＨＭＷ抗体価に影響しなかった（図６）。
【００８１】
（実施例５）
本実施例は、疾病の動物モデルにおける、多成分ワクチンの防御能力について記載している。
【００８２】
前述の米国特許第５，５０６，１３９号に記載されるように、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７は、中耳炎のチンチラモデルで部分的に防御性がある。このモデルでは、１から２歳のチンチラ（Ｍｏｕｌｔｏｎ  Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ  Ｒａｎｃｈ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を、アルムに吸着させたＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ３０μｇで０、１４および２８日目に筋肉内で免疫化し、鼓室上胞を経由して中耳空間に注入した、５０から３５０ｃｆｕの生きた微生物で４４日目にチャレンジする（ｒｅｆ．１１）。鼓膜聴力検査により動物をモニターし、チャレンジ後４日間中耳液を集め、ＢＨＩ培地２００μｌと混ぜ、希釈液をチョコレート寒天プレート上にプレートし、３７℃で２４時間インキュベートする。回復期動物またはアルムのみで模擬免疫化した動物を対照として用いる。多成分ワクチンの検討では、実施例３に記載のようにＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ５０μｇをｒＨＭＷ  ５０μｇと混ぜ、記載したようにチンチラを免疫化した。防御性検討の結果を図７に示すが、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷの組合せによる水疱内攻撃モデルにおいても、やはり部分的防御性のあることを示している。
【００８３】
若いチンチラでは、型特定不能のインフルエンザ菌による鼻咽頭コロニー形成が中耳炎につながることが明らかにされている（ｒｅｆ．１４）。前述の米国特許出願第０９／１６７，５６８号に記載されるように、チンチラ鼻咽頭コロニー形成チャレンジモデルにおいて、ｒＨＭＷは部分的に防御性がある。このモデルでは、アルムに吸着させたｒＨＭＷ  ２５、５０または１００μｇで０、１４および２８日目に筋肉内で動物を免疫化し、鼻腔内に送り込んだ生きた細菌１０8ｃｆｕ（鼻孔あたり５０μｌ）で４４日目にチャレンジする。
【００８４】
洗浄液として滅菌食塩水１ｍｌを用い、チャレンジ後４日間鼻咽頭洗浄を行う。洗浄液２５μｌをｍストレプトマイシン存在下でチョコレート寒天上にプレートし、プレートを３７℃で２４時間インキュベートする（なお、ストレプトマイシンによって殺される自然細菌叢の存在下で、回収細菌の定量を容易にするために、連続継代培養によってストレプトマイシン耐性のチャレンジ菌株を作成した）。回復期動物またはアルムのみで模擬免疫化した動物を対照として用いる。多成分ワクチンの検討には、実施例３に記載のようにｒＨＭＷ  ５０μｇをＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ５０μｇと混ぜ、記載したようにチンチラを免疫化した。防御性検討の結果を図８に示すが、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷの組合せによる鼻咽頭コロニー形成チャレンジモデルにおいても、やはり優れた防御性のあることを示している。
【００８５】
（実施例６）
本実施例は、２成分ワクチンの安定性の分析を記載している。
【００８６】
吸着されたＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７（１ｍｌ当たりタンパク質４００μｇ＋リン酸アルミニウム３ｍｇ）およびｒＨＭＷ（１ｍｌ当たりタンパク質４００μｇ＋リン酸アルミニウム３ｍｇ）を実施例３に記載のように１：１で混ぜ、最終濃度を１ｍｌ当たり各タンパク質１００μｇ＋リン酸アルミニウム３ｍｇとした。個々に吸着されたＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７およびｒＨＭＷタンパク質も、タンパク質１００μｇ＋リン酸アルミニウム３ｍｇ／ｍｌの最終濃度に調整した。サンプルを４℃で保存し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために０日目および２週間毎に０．５ｍｌの分液を採取する。この分液を、１０，０００ｒｐｍで１０分間微量遠心し、アルムペレットから上清を分離した。ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶かし、上清をまずアセトンで沈澱させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶かした。上清とペレットの等量を、タンパク質が１００％吸着されているか吸着されていないと仮定して分析した。安定性検討の結果を図９に示すが、２週間後でもタンパク質の分解はなく、アルム上になお完全に吸着していることを示している。
【００８７】
（実施例７）
本実施例は、２成分インフルエンザ菌ワクチンのＰｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）との同時投与に対する免疫応答について記載している。
【００８８】
５匹のＨａｒｔｌｅｙモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｑｕｅｂｅｃ）からなる群を、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ２成分ワクチン、Ｐｅｎｔａｃｅｌワクチン（ＰＴ＋ＦＨＡ＋６９ｋＤａ＋Ａｇｇｓを重量で２０：２０：５：３μｇ；ジフテリア・トキソイド１５Ｌｆ；破傷風トキソイド５Ｌｆ；１、２および３型不活化ポリオウイルスをそれぞれ４０、８および３２Ｄ−抗原単位含むＩＰＶ；破傷風トキソイド２０μｇと接合したＢ型インフルエンザ菌多糖のＰＲＰ−Ｔ複合体１０μｇを含有するＣｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄの市販ワクチン）、またはＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ２成分ワクチン＋Ｐｅｎｔａｃｅｌの１つで、１および２１日目に筋肉内で免疫化した。２成分ワクチンは、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７およびｒＨＭＷをそれぞれ５０μｇを含んでいた。２成分＋Ｐｅｎｔａｃｅｌワクチンを投与される動物は、それぞれ両脇腹に注射した。血液サンプルは、注射に先立つ１日目と、次いで２８日目に採取した。
【００８９】
抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７および抗ｒＨＭＷ  ＩｇＧ抗体価は、実施例４に記載のようにＥＬＩＳＡで測定した。抗Ｐｅｎｔａｃｅｌ成分ＩｇＧ抗体価は、本質的に実施例４に記載されているような、ＥＬＩＳＡによって測定した。マイクロタイタープレートは、ＰＴ、ＦＨＡ、６９ｋＤａ、Ａｇｇｓ、およびＰＲＰの場合は、５μｇｍｌ-1の抗原；ジフテリア・トキソイドの場合は、２．５Ｌｆｍｌ-1の１／２０希釈液；破傷風トキソイドの場合には、１．３Ｌｆｍｌ-1；１型ポリオの場合には、２５．６ＥＵｍｌ-1の１／５０希釈液；ならびに２型ポリオの場合には、１５．１ＥＵｍｌ-1の１／５０希釈液で、それぞれコーティングした。３型ポリオについては、信号雑音比は、確認できなかった。用いる二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）と接合した、ロバの抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦ（ａｂ）’2フラグメントとした。陰性対照は、予め採血しておいた血清、または、ＲＳＶ由来の関連のない抗原に対する抗血清とした。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【００９０】
（開示の概要）
本開示を要約すると、本発明は、広い範囲の有効性を示す、インフルエンザ菌の２つの異なる抗原を含み、その抗原の１つが接着因子である多成分ワクチンを提供する。本発明の技術的範囲内で、形態の変更も可能である。
（参照文献）
【００９１】
【表４】
0004105393.tif 000004
【００９２】
【表５】
0004105393.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】  パネルＡからＥまであって、マウスにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンに対する抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７免疫応答を示す図である。パネルＡ、ｒＨＭＷ無添加；パネルＢ、ｒＨＭＷ  ０．３μｇ添加；パネルＣ、ｒＨＭＷ  １．０μｇ添加；パネルＤ、ｒＨＭＷ  ３．０μｇ添加；パネルＥ、ｒＨＭＷ  １０μｇ添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
【図２】  低用量（０．３μｇ）のＨ９１Ａ  Ｈｉｎ４７に対する一次免疫応答における、ｒＨＭＷの添加による相乗効果を示す棒グラフである。
【図３】  パネルＡからＤまであって、マウスにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンに対する抗ｒＨＭＷ免疫応答を示す図である。パネルＡ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７無添加；パネルＢ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ０．３μｇ添加；パネルＣ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  １．０μｇ添加；パネルＤ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ３．０μｇ添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
【図４】  高用量（１０μｇ）のｒＨＭＷに対する、マウスの一次免疫応答における、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７の添加による相乗効果を示す棒グラフである。
【図５】  パネルＡからＤまであって、モルモットにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンに対する抗Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７免疫応答を示す図である。パネルＡ、ｒＨＭＷ無添加；パネルＢ、ｒＨＭＷ  ２５μｇ添加；パネルＣ、ｒＨＭＷ  ５０μｇ添加；パネルＤ、ｒＨＭＷ  １００μｇ添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
【図６】  パネルＡからＤまであって、モルモットにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンに対する抗ｒＨＭＷ免疫応答を示す図である。パネルＡ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７無添加；パネルＢ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ２５μｇ添加；パネルＣ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  ５０μｇ添加；パネルＤ、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７  １００μｇ添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
【図７】  中耳炎のチンチラモデルにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンの防御を示す図である。
【図８】  鼻咽頭コロニー形成のチンチラモデルにおける、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンの防御を示す図である。
【図９】  パネルＡおよびＢがあって、個々の成分と比較して、Ｈ９１Ａ  Ｈｉｎ４７＋ｒＨＭＷ混合ワクチンの０日目（パネルＡ）および１４日目（パネルＢ）の安定性プロフィルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図１０】  図１０Ａは、Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）の存在下、および非存在下における、Ｈ９１ＡおよびｒＨＭＷに対する免疫応答の棒グラフである。
図１０Ｂは、パネルＡおよびＢがあって、Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）を単独に、または２成分Ｈ９１Ａ＋ｒＨＭＷインフルエンザ菌ワクチンと共に投与した際の、Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）中の百日咳トキソイド（ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン（６９ｋＤａ）、ふさ状凝集素（パネルＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリア・トキソイド（ＤＴ）、１型ポリオ、２型ポリオおよびＰＲＰ−Ｔ（パネルＢ）に対する免疫応答の棒グラフを含む図である。
【図１１】  Ｔ７プロモーターの制御下にある変異体Ｈ９１Ａ  ｈｉｎ４７遺伝子を含む、プラスミドＤＳ−２１５０−１を調製するための構築スキームを示す図である。
【図１２】  Ｔ７プロモーターの制御下にあるｈｍｗ／ＡＢＣ遺伝子を含む、プラスミドＢＫ−７６−１−１を調製するための構築スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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