(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖又はその塩。
【化１】
0004073787.tif 000031
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
【請求項２】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ：
（Ｉ）作用：ヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してα−Ｄ−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる；
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約６．５〜８．０付近である；
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約３０℃〜４０℃である；および
（ＩＶ）分子量：本酵素の分子量は、ゲルろ過法で測定した場合、約５０〜６０万である、
（Ｖ）フコフィラス  フコイダノリティカス  ＳＩ−１２３４株から得ることができる。
【請求項３】
請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ生産能を有するフコフィラス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌を培養する工程およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含することを特徴とする請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼをヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナン含有画分に作用させる工程を包含することを特徴とする下記一般式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）で表される硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖又はその塩の製造方法。
【化２】
0004073787.tif 000032
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
【化３】
0004073787.tif 000033
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
【請求項５】
褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させる工程およびフコイダン画分を採取する工程を包含することを特徴とするフコイダン画分の製造方法。
【請求項６】
請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを含むことを特徴とする糖質工学用試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フコグルクロノマンナンを分解する酵素、該酵素の製造方法、並びに糖鎖工学用試薬として有用な分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖及びそれらの製造方法に関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。これらの硫酸化多糖はフコイダンあるいはフコイジンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海藻により異なる。例えば、ヒバマタ目海藻、ガゴメ、マコンブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれから抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ。また、一般に一種の海藻から硫酸化多糖画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。
これまでに構造が決定された硫酸化多糖の分子種としては、硫酸化フカン、硫酸化フコグルクロノマンナン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化グルクロノフカン等が挙げられる。硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性、硫酸化フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性が報告されている等、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つことが多い。そのため、硫酸化多糖を医薬品として開発する試みがなされている。
硫酸化多糖を医薬品として開発する際、その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利である。しかし褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によって異なるため、硫酸化多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する酵素が必要となる。
ヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖混合物は抗凝血作用、クラミジアの子宮表皮細胞への定着阻害作用、アレルギー反応抑制作用、移植臓器の拒絶抑制作用などを持つことが報告されている。これらの活性と構造の関係を解明するためヒバマタ目海藻由来フコイダンの構造が研究されているが、物理化学的な分析によりその平均的な構造が提唱されているに過ぎない。
また、ヒバマタ目海藻から硫酸化多糖混合物画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。一般に、目的とする生物活性を担う分子種以外の硫酸化多糖は不必要であり、時には不必要な分子種が副作用を誘発させるだけの場合もある。
また、構造的に再現性よくヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖のオリゴ糖を調製できれば生物活性と構造の関係を解明する際非常に有用である。例えば、国際公開第９６／３４００４号パンフレットに記載の褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に含まれる硫酸化フコグルクロノマンナンを分解してオリゴ糖を生成させる酵素が知られている。この酵素はコンブ目褐藻類の硫酸化フコグルクロノマンナンによく作用して硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を生成させるが、ヒバマタ目褐藻類の硫酸化フコグルクロノマンナンにはほとんど作用しない。
以上のことから、ヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に含まれる分子種のそれぞれを特異的に分解する酵素、より均一な分子種からなるフコイダン画分、酵素的に製造した構造が均一なオリゴ糖、及びそれらの製造方法が求められていた。
発明の目的
本発明の目的は、糖鎖工学的に有用なヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンを効率よく分解する酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フコグルクロノマンナンに該酵素を作用させて得られるオリゴ糖及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した画分及びその製造方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、フコフィラス属に属する細菌の１菌株、フコフィラス  フコイダノリィティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４株が、新規な硫酸化フコグルクロノマンナン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを分解除去してフコイダン画分の純度を上げられることも見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から構造の均一な新規な硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の発明は、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖又はその塩に関する。
0004073787.tif 000002
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
0004073787.tif 000003
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
本発明の第２の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼに関する：
（Ｉ）作用：ヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してα−Ｄ−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる；
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約６．５〜８．０である；および
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約３０℃〜４０℃である。
本発明の第２の発明の酵素は、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ生産能を有するフコフィラス属細菌を培養する工程およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含する方法によって得ることができる。
本発明の第１の発明の糖化合物又はその塩は、本発明の第２の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼをヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分に作用させる工程を包含することを特徴とする糖化合物の製造方法によって調製することができる。
本発明の第３の発明は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に本発明の第２の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて低分子化した硫酸化フコグルクロノマンナンを除去する工程を包含する方法によって得られることを特徴とするフコイダン画分に関する。
本発明の第３の発明のフコイダン画分は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に本発明の第２の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させる工程およびフコイダン画分を採取する工程を包含することを特徴とするフコイダン画分の製造方法によって調製する事ができる。
本発明の第４の発明は、本発明の第２の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを含むことを特徴とする糖質工学用試薬に関する。
本発明の第５の発明は、下記一般式（Ｘ）で表される硫酸化フコグルクロノマンナンからなる多糖類に関する。
0004073787.tif 000004
（式中、Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒ２は、Ｈ又はＳＯ３Ｈ又は下記一般式（ＸＩ）である。ｎは１以上の整数である。）
0004073787.tif 000005
（式中、Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
本発明の第６の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナン又はその塩に関する：
（１）構成糖：フコース、マンノース及びグルクロン酸を含有し、
（２）請求項２記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼにより低分子化され、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物より選択される１種類以上の化合物が生成する：
0004073787.tif 000006
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
0004073787.tif 000007
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本明細書において、硫酸化フコグルクロノマンナンとは褐藻類に含まれる硫酸化多糖で、その構成糖がフコース、マンノース及びグルクロン酸からなるもののことをいう。また、硫酸化フコグルクロノマンナンに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させると、前記一般式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）で表される化学構造の物質が得られる。当該硫酸化フコグルクロノマンナンの由来は特に限定されるものではないが、例えば、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍなどのヒバマタ目（Ｆｕｃａｌｅｓ）の褐藻類由来の硫酸化フコグルクロノマンナンが好適に使用できる。本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナン画分とは硫酸化フコグルクロノマンナンを含有する画分をいう。
本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼとは、褐藻類由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してマンノースとグルクロン酸の間のα−Ｄ−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる酵素のことをいう。
本明細書において糖化合物とは、硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖のことであり、硫酸化フコグルクロノマンナンに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がマンノースであるものが含まれる。
本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナンを製造する際にはまず、褐藻類に含まれる水溶性成分を抽出する。その際硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化を防ぐためには、抽出の際のｐＨは４〜９、温度は１００℃以下が好ましい。また、上記抽出液中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過で効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。
このようにして褐藻類の硫酸化多糖混合物画分が得られる。該画分を硫酸化フコグルクロノマンナン画分として例えば本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの基質として使用できる。硫酸化フコグルクロノマンナン画分を陰イオン交換カラムで分離すればより純度の高い硫酸化フコグルクロノマンナンを得られる。上記の硫酸化多糖混合物画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸化フコグルクロノマンナンもともに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを精製する際の活性測定用基質、及び本発明の分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖製造時の原料として使用できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの製造に使用される細菌としては、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコフィラス  フコイダノリティカス  （Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）  ＳＩ−１２３４株が挙げられる。
なお、上記のフコフィラス  フコイダノリティカス  ＳＩ−１２３４株はナマコの腸内より本発明者らが新たに探索して得た細菌で、その菌学的性質は次のとおりである。
ａ．  形態的性質
（１）本菌は直径１．２〜１．６μｍの球菌である。
（２）胞子の有無    なし
（３）グラム染色性    陰性
ｂ．  生理的性質
（１）生育温度    ２５℃で生育する。
（２）酸素に対する態度    好気性
（３）カタラーゼ    陽性
（４）オキシダーゼ    陰性
（５）塩類要求性
０％食塩培地での生育    陰性
１％食塩培地での生育    陰性
海水培地での生育        陽性
（６）キノン系    メナキノン７
（７）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量    ５２％
（８）ＯＦ−テスト    酸を生成しない
（９）集落の色調    特徴的な集落色素を生成せず
（１０）運動性    陰性
（１１）滑走性    陰性
（１２）鞭毛    なし
本菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネィティブ  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第９巻（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性桿菌及び球菌）に分類される。しかし本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、ＧＣ含量が５２％という点でグループ４に属する菌と大いに異なる。
そこで、本菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の塩基配列を決定（配列表の配列番号１）し、既知の細菌と相同性を比較したところ１６Ｓ  ｒＤＮＡの全域（約１５００塩基）にわたって相同性の高い既知菌株は存在しなかった。１６Ｓ  ｒＤＮＡの全配列の相同性が９０％以下の場合、両細菌の属が同じであることはない。そこで、本発明者らは、本菌株は既知の属に属さない新属の細菌であると断定し、本菌株をフコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４と命名した。従って、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列より、フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４と同属と判断される細菌から得られた硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼも本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼに含まれる。
なお、上記菌株は  Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＩ−１２３４と表示され、ブタペスト条約のもと、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１１年８月１８日より（移管日：平成１３年３月７日）、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４９５として寄託されている。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フコグルクロノマンナン、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓやＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ等の海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水中で極めて生育し易い。
また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離で菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを得ることができる。
上記のフコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により精製酵素標品を得られる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製し、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素を含まない純化された本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを得られる。
また、上述の培養上清中にも本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼが大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段で精製できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの理化学的性質は以下の通りである。
（Ｉ）作用：硫酸化フコグルクロノマンナンに作用して、α−Ｄ−マンノシル結合を脱離的に切断し不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる。
（ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約６．５〜８．０付近にある（図１）。
すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
（ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約３０℃〜４０℃付近にある（図２）。
すなわち、図２は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（ＩＶ）分子量：本酵素の分子量は、ゲルろ過法で測定した場合、約５０〜６０万である。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは、硫酸化フコグルクロノマンナン分解活性を測定して確認でき、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトで精製後の酵素溶液でも確認できる。
フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４株は硫酸化フコグルクロノマンナンを資化する微生物であり、硫酸化フコグルクロノマンナンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する。
本明細書において褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分とは、褐藻類から抽出したフコースを含有する硫酸化多糖混合物（褐藻類由来フコイダン）を含む画分のことをいう。
本発明によれば、上記硫酸化多糖混合物画分に含まれる硫酸化フコグルクロノマンナンを酵素で分解後除去することによって分子種の少ないフコイダン画分を得ることができる。
上記分子種の少ないフコイダン画分を得るには、褐藻類から抽出した硫酸化多糖混合物画分に硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて、低分子化した硫酸化フコグルクロノマンナンすなわち硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を例えば限外ろ過、ゲルろ過、陰イオン交換カラム処理等で除去すればよい。必要に応じて脱塩、凍結乾燥等の処理をしてもよい。
例えばヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖混合物画分には硫酸化フカンの他に硫酸化フコグルクロノマンナン等数種の硫酸化多糖が含まれているが、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼで硫酸化フコグルクロノマンナンを分解除去し、分子種の少ないフコイダン画分を調製できる。分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンの分解で生成した硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として有用である。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分を調製する際、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の当該硫酸化多糖混合物画分の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、分解に用いる本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの量等を考慮して選定すればよい。該硫酸化多糖混合物画分の溶解液は、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。分子種の少ないフコイダン画分は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、限外ろ過等で精製してもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、硫酸基及び／又はカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム、カリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム、亜鉛等の塩とすることができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物に作用させて調製できる。硫酸化フコグルクロノマンナン含有物としては、例えば硫酸化フコグルクロノマンナンの部分精製品、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製する際、硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物の溶解は常法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの量等を考慮して選定すればよい。硫酸化フコグルクロノマンナンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。反応に使用する本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムで分画して、更に均一な分子量の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。これらの方法で、後述のごとく、ＮＭＲ分析で構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を得られる。例えばこの硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。本発明を特に限定するものではないが、好適には、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）においてＲは少なくとも１つのＳＯ３Ｈである。
0004073787.tif 000008
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
0004073787.tif 000009
（Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、硫酸基及びカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム、カリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム、亜鉛等の塩とすることができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは硫酸化フコグルクロノマンナンを低分子化するため硫酸化フコグルクロノマンナンの構造解析に使用できる。また、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、後述のごとく該オリゴ糖のＰＡ化物を調製すれば、フコフラノシダーゼや５−硫酸化フコフラノシダーゼの基質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンは、グルクロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖のマンノースからフコースの側鎖が伸びている構造を持つ多糖である。この多糖は、２価の陽イオンによる架橋などにより重合している事も多いが、それらを切断した場合の分子量は、特に限定はされないが、５０００〜２００万の範囲、さらに好ましくは、１万〜１００万の範囲である。特に限定はされないが例えば、下記一般式（Ｘ）で表されるものが例示される。下記一般式（Ｘ）において、ｎは、１以上の整数であり、好ましくは、５〜２０００の範囲、さらに好ましくは１０〜１０００の範囲である。
0004073787.tif 000010
（式中、Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒ２は、Ｈ又はＳＯ３Ｈ又は下記一般式（ＸＩ）である。ｎは１以上の整数である。）
0004073787.tif 000011
（式中、Ｒは、Ｈ又はＳＯ３Ｈである。）
実施例
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１  Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分の調製
乾燥したＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ藻体を粉砕し、その１ｋｇを１０リットルの８０％エタノールに懸濁し、２５℃で３時間攪拌後ろ過、洗浄し残渣を得た。その残渣を３０リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に懸濁し、９５℃で２時間処理後、３０℃に冷却し、１００ｇの活性炭、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）、及び３．７５リットルのエタノールを添加し２４時間攪拌後、遠心分離して上清を得た。その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、１００ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒を置換した。この溶液を５℃まで冷却し、０．５Ｎ塩酸でｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離で除去し、上清を得た。その上清のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムで８．０とし、上記の限外ろ過機で２リットルに濃縮後、２０ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒を置換し、遠心分離で不溶物を除去後、凍結乾燥して８０ｇのＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例２  Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖混合物画分の調製
市販のＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｈｏｄｏｓｕｍ粉末１ｋｇから、参考例１と同様の方法で１００ｇのＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例３  ガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分の調製
市販の乾燥ガゴメコンブをカッターミル（増幸産業製）で破砕してチップとし、１ｋｇのチップから、参考例１と同様の方法で３８ｇのガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例４  Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
７ｇの参考例１記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分を７００ｍｌの１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化させた５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。試料を流した後、１０リットルの同緩衝液で洗浄し、１００〜１６００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取（５００ｍｌ）した。各画分に含まれる総糖量をフェノール硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度２００−７００ｍＭの画分を、限外ろ過（排除分子量１０万）で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、１．３ｇのＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例５  Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
７ｇの参考例２記載のＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化多糖混合物画分から、参考例４と同様の方法で１．１ｇのＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例６  ガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
７ｇの参考例３記載のガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分を７００ｍｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化させた５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけた。試料を流した後、１０リットルの同緩衝液で洗浄し、１５０〜１９５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取（５００ｍｌ）した。溶出画分に含まれる総糖量をフェノール硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度３５０−４９０ｍＭの画分を限外ろ過（排除分子量１０万）で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、１．３２ｇのガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例７  硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性測定方法
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは硫酸化フコグルクロノマンナンに作用すると、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させるため、２３２ｎｍの吸光度が増加する。これを利用して下記の方法で硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの活性を測定した。また、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼはＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ及びＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用するが、ガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナンにも作用するので活性の測定には調製がより容易なガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナンを基質に用いた。
すなわち、５０μｌの２．５％の参考例６記載のガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分溶液と、５０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、１０μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと１０μｌの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼとを混合し、３７℃で３時間反応させた後、反応液１０５μｌを２ｍｌの冷水で希釈しその２３２ｎｍの吸光度を測定した。対照として、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたもの及び硫酸化フコグルクロノマンナン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。
１単位の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの不飽和グルクロン酸基を生成する酵素量とした。該酵素の活性は下記式により求めた。
Δ２３２×２．１０５／５．５／１８０／０．０１＝Ｕ／ｍｌ
Δ２３２：２３２ｎｍにおける吸光度の増加量
２．１０５：吸光度を測定した試料の液量（ｍｌ）
５．５：不飽和グルクロン酸基のｍＭ分子吸光係数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
また、タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行ない、その際１ｍｇ／ｍｌの蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。
実施例１  硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの調製
フコフィラス  フコイダノリィティカス  ＳＩ−１２３４を参考例１に記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分０．２％とペプトン１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）（ｐＨ８．０）からなる培地６００ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２４℃で７２時間培養して種培養液とした。参考例１に記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分０．２％、ペプトン１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットルのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間処理した培地に、上記の種培養液を接種し、毎分１２５回転の回転速度で、２４℃で４８時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
この菌体を６００ｍｌの４００ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を得た。
なお、上記の培養上清と粗酵素溶液に含まれる、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性を測定した結果、培養液上清には培地１ｍｌあたり１ｍＵ、菌体抽出液には培地１ｍｌあたり２ｍＵの活性が検出された。
実施例２  硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析（１）
（１）調製
参考例１記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分に実施例１記載の粗酵素溶液を作用させ本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、５ｇのＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分を５００ｍｌの３００ｍＭ塩化ナトリウム及び５０ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、５０ｍｌの実施例１記載の粗酵素溶液を加え、２５℃で４日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置にかけ、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分１とした。
（２）精製
実施例２−（１）で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分１を脱塩装置（マイクロアシライザーＧ３、旭化成工業製）で脱塩し、１０ｍＭとなるようにイミダゾールを、１０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、２リットルの同じ緩衝液で洗浄後、１０〜１２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取した。各フラクションの２３２ｎｍの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、洗浄の後半及び３６０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する部分に、２３２ｎｍの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例するピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖１−（１）及び１−（２）画分とした。
オリゴ糖１−（１）画分に水を加えて、導電率を５ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）と同じにし、５ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した３０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、６０ｍｌの同じ緩衝液で洗浄した。素通り画分を集め、エバポレーターで２．８ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（２×３２ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして１．６ｍｇの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）を得た。
オリゴ糖１−（２）画分に水を加えて、導電率を２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）と同じにし、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、４０ｍｌの同じ緩衝液で洗浄した。次に、２００−５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、２４０−３２０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分を集め、エバポレーターで１．０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（２×３２ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩後乾固した。こうして６．４ｍｇの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（２）を得た。
（３）構造解析
実施例２−（２）で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）及び１−（２）を２−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）及び１−（２）の還元性末端糖はともにマンノースであった。また、中性糖組成は、ともにフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）で質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）でＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）及び１−（２）の物性を示す。
（ａ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に、マススペクトルを図４にそれぞれ示した。図３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図４において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；４８４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８３．３［Ｍ−Ｈ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表１に示す。
0004073787.tif 000012
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＩＩ）の通りである。
0004073787.tif 000013
（ｂ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（２）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５に、マススペクトルを図６にそれぞれ示した。図５において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図６において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；７２４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ７２３．１［Ｍ−Ｈ＋］−、７６６．７［Ｍ＋２Ｎａ＋−３Ｈ＋］−、７９０．５［Ｍ＋３Ｎａ＋−４Ｈ＋］−、３６０．９［Ｍ−２Ｈ＋］２−、３７２．０［Ｍ＋Ｎａ＋−３Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表２に示す。
0004073787.tif 000014
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＶ）の通りである。
0004073787.tif 000015
実施例３  硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析（２）
（１）調製
参考例４記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分に実施例１記載の粗酵素溶液を作用させ本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、０．６１ｇのＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を６０ｍｌの４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、３００ｍＭ塩化ナトリウムと５ｍＭ  ＥＤＴＡと５ｍＭアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した実施例１記載の粗酵素溶液を６ｍｌ加え、２５℃で７日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を限外ろ過（排除分子量１万）し、分子量１万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分２とした。
（２）精製
実施例３−（１）で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分２を４０ｍｌに濃縮し、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−１０００（４×８７ｃｍ）にかけ、溶出液を１０ｍｌずつ分画した。第７０−１００画分を集め、脱塩装置（マイクロアシライザーＧ３、旭化成工業製）で脱塩後、１０ｍＭとなるようにイミダゾールを添加し、１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した８０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、１６０ｍｌの同じ緩衝液で洗浄後、０−８００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取した。各フラクションの２３２ｎｍの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、２３２ｎｍの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例する明瞭なピークが５個検出されたのでそれぞれのピーク部分を集め、溶出塩濃度の低い順にオリゴ糖２−（１）〜（５）画分とした。
オリゴ糖２−（１）〜（５）画分をそれぞれエバポレーターで４ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（２×３２ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして３．５ｍｇ、３．９ｍｇ、１．９ｍｇ、１．７ｍｇ、０．９ｍｇの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（１）〜（５）を得た。
（３）構造解析
実施例３−（２）で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（１）〜（５）を、２−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（１）〜（５）の還元性末端糖は総てマンノースであった。また、中性糖組成は、総てフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）で質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）でＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（１）〜（５）の物性を示す。
（ａ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（１）の物性
上記分析の結果、本物質は本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）と同じ物質であることが判明した。
（ｂ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（２）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に、マススペクトルを図８にそれぞれ示した。図７において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図８において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；５６４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６３．０［Ｍ−Ｈ＋］−、５８５．０［Ｍ＋Ｎａ＋−２Ｈ＋］−  ２８１．０［Ｍ−２Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表３に示す。
0004073787.tif 000016
0004073787.tif 000017
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。
0004073787.tif 000018
（ｃ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に、マススペクトルを図１０にそれぞれ示した。図９において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１０において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；６４４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３２１．３［Ｍ−２Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表４に示す。
0004073787.tif 000019
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＶＩ）の通りである。
0004073787.tif 000020
（ｄ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（４）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１１に、マススペクトルを図１２にそれぞれ示した。図１１において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１２において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；８７０
ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５６．１［Ｍ＋２Ｎａ−４Ｈ＋］２−、４４５．０［Ｍ＋Ｎａ＋−３Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表５〜６に示す。
0004073787.tif 000021
0004073787.tif 000022
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＶＩＩ）の通りである。
0004073787.tif 000023
（ｅ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（５）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１３に、マススペクトルを図１４にそれぞれ示した。図１３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１４において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；９５０
ＭＳ  ｍ／ｚ  １０３７．０［Ｍ＋４Ｎａ−５Ｈ＋］−、５０６．９［Ｍ＋３Ｎａ−５Ｈ＋］２−、４９５．８［Ｍ＋２Ｎａ＋−４Ｈ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を表７〜８に示す。
0004073787.tif 000024
0004073787.tif 000025
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＶＩＩＩ）の通りである。
0004073787.tif 000026
実施例４  組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）調製
参考例４記載の硫酸化フコグルクロノマンナン画分に、国際公開第ＷＯ９９／１１７９７号パンフレット記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの遺伝子を大腸菌に組み込んで生産させた組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、０．４ｇのＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を４０ｍｌの４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、５ｍｌの組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ溶液（６６Ｕ相当）を加え、２５℃で２５時間反応させた。反応液を１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−１０００のカラム（４×８７ｃｍ）にかけ、１画分あたり９．５ｍｌで分取した。溶出画分のうち第８３−１２０画分を集め、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分３とした。
（２）精製
実施例４−（１）で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分３を脱塩装置（マイクロアシライザーＧ３、旭化成工業製）で脱塩し、１０ｍＭとなるようにイミダゾールを添加し、１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、４０ｍｌの同じ緩衝液で洗浄後、０〜８００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させた。各フラクションの２３２ｎｍの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、２００ｍＭ及び３００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出される部分に、２３２ｎｍの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例するピークが検出されたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖３−（１）及び３−（２）画分とした。
オリゴ糖３−（１）画分をエバポレーターにより１ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（１．２×３０ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして０．７ｍｇの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（１）を得た。
オリゴ糖３−（２）画分をエバポレーターにより１．０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラム（１．２×３０ｃｍ）にかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩後乾固した。こうして１．６ｍｇの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（２）を得た。
（３）構造解析
実施例４−（２）で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（１）及び３−（２）について、２−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（１）及び３−（２）の還元性末端糖はともにマンノースであった。また、中性糖組成は、ともにフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定し、質量分析装置（ＡＰＩ−ＩＩＩ、パーキンエルマー・サイエクス社製）で質量を分析した。また、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）でＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（１）及び３−（２）の物性を示す。
（ａ）本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖３−（１）の物性
上記分析の結果、本物質は、既に報告されているオリゴ糖と同じ構造であることが判明した。
その構造を下記式（ＩＸ）に示す。
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（ｂ）  本発明の硫酸化グルクロノマンナンオリゴ糖３−（２）の物性
上記分析の結果、本物質は本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（３）と同じ物質であることが判明した。
実施例３と実施例４を比較すると、実施例４では、使用した硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは２００倍以上であるが、基質重量に対するオリゴ糖の生成効率が１／５未満である。また、実施例３では６種類のオリゴ糖が得られているが、実施例４では２種類のオリゴ糖が得られたのみである。すなわち、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼはＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ  由来硫酸化フコグルクロノマンナンを効率良く分解するが、実施例４で使用したリコンビナント硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの場合はＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化フコグルクロノマンナンをあまり分解することができない。
実施例５  本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの分子量の測定
実施例１記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの粗酵素溶液を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、及び５ｍＭアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラム（４．４×１００ｃｍ）でゲルろ過し、溶出液を１３．５ｍｌずつ分取した。参考例７記載と同様の方法で、各フラクションの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの活性を測定した。こうして、決定された本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの分子量は約５０〜６０万であった。
実施例６  分子種の少ないフコイダン画分の製造
参考例１記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分を用いて分子種の少ないフコイダン画分を調製するため、５００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍｌの４Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍｌの実施例１記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液、５ｇの参考例１記載のＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖画分を混合後、２５℃で５日間反応させた。分解された硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を透析で除去し、硫酸化多糖画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した本発明の分子種の少ないフコイダン画分を調製した。
実施例７  硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの作用部位の構造
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼにより、生成されるオリゴ糖の還元性末端糖は総てマンノースで、非還元性末端には不飽和グルクロン酸があり、反応の進行とともに２３２ｎｍの吸光度が増加することから、本酵素は、国際公開第９６／３４００４号パンフレット記載のように、硫酸化フコグルクロノマンナンのマンノースとグルクロン酸の間のマンノシル結合を脱離的に切断する酵素であると推定された。
推定通りの酵素であれば、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来フコイダンにはグルクロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖のマンノースからフコースの側鎖が伸びている構造を持つ多糖（硫酸化フコグルクロノマンナン）が存在することになる。褐藻類由来硫酸化他等混合物からマンノースとグルクロン酸からなる多糖（グルクロノマンナン）を得る方法として、シュウ酸処理が知られている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１２５，２８３−２９０（１９８４））。そこでＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓにも推定通り硫酸化フコグルクロノマンナンが含まれているかどうかを確かめるため、本方法を参考にして、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来フコイダンを処理し、その構造を分析した。
すなわち、参考例１の方法で製造したＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来硫酸化多糖混合物画分１ｇを１００ｍｌの水に溶解後、４．５ｇのシュウ酸を加え、６Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを１．０とし、１００℃で５時間処理し、６Ｍ水酸化ナトリウムで、ｐＨを８とし、遠心分離した。得られた上清にエタノールを８５％となるように添加し、２時間放置後、遠心分離で沈殿を得た。沈殿を３０００ｍｌの１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインにかけ、同緩衝液で洗浄後、３０ｍＭ〜５００ｍＭの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させた。溶出画分を１０ｍｌずつ分画し、それぞれの中性糖含量及びウロン酸含量をフェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度１２０〜２５０ｍＭに中性糖とウロン酸を含む主成分が溶出されたので、この画分を集め、電気透析機で脱塩後凍結乾燥し、重水置換後ＮＭＲ分析を行った。この結果、本物質はＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１２５，２８３−２９０（１９８４）に記載のグルクロノマンナンと同じ構造であることが確認できた。
すなわち、本発明のオリゴ糖に含まれている不飽和グルクロン酸は、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの作用により硫酸化フコグルクロノマンナンのグルクロン酸から生成されることがわかった。
また、同時に、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来フコイダンにはフコフラノースを含む新規な硫酸化フコグルクロノマンナンが含まれることが分かった。
産業上の利用の可能性
本発明により硫酸化フコグルクロノマンナンの構造解析や硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の再現性よい製造に用いることができる新規の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ及び該酵素の製造方法が提供される。また、該酵素を使用することにより製造できる、糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖や分子種の少ないフコイダン画分及びそれらの製造方法が提供される。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼのｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図２：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの温度（℃）と相対活性（％）の関係を表すグラフである。
図３：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図４：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図５：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図６：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図７：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図８：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図９：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１０：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１１：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１２：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
図１３：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（５）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図１４：本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖２−（５）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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