(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）〜（３）に示す理化学的性質を有する、アルコール脱水素酵素。
（1）    ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する。
（2）    ３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。
（3）    分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合約52,000であり、ゲル濾過で測定した場合約220,000である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用且つ新規なアルコール脱水素酵素酵素およびその作用による光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する方法に関する。これらの光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩は種々の医農薬品等の原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
酵素不斉還元による光学活性３−キヌクリジノールは特開平10-243795、特開平11-196890および特開2000-245495に微生物菌体を利用した方法が提案されている。しかし、これらの方法で使用されている触媒は、特開平10-243795では、ナカザワエア（Nakazawaea）属、カンジダ（Candida）属、プロテウス（Proteus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属およびロドスポリジウム（Rhodosporidium）属の菌体のみであり、特開平11-196890ではロドトルウラ（Rhodotorula）属、カンジダ（Candida）属、スポリジオボルウス（Sporidiobolus）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、スシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属およびノカルデイア（Nocardia）属の菌体のみであり、また、特開2000-245495ではアルアリゲネス（Alcaligenes）属、コルネバクテリウム（Corynebacterium）属、 アースロバクター（Arthrobacter）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、 ロドトルウラ（Rhodotorula）属、オウレオバシジウム（Aureobasidium）属およびヤロウィア（Yarrowia）属の菌体のみを用いている。これらの菌体での反応はそれ由来の不純物、あるいは他の酵素による副反応等により、生成物の単離が煩雑になることがしばしばある。
【０００３】
一方、光学活性３−キヌクリジノールの製法として精製あるいは粗精製の酵素レベルでの本反応は知られていない。
本発明により提供されるような新規酵素およびそれらを利用してのＲ−３−キヌクリジノールあるいはその塩の有用な合成方法が望まれていた。
【０００４】
その他、光学活性３-キヌクリジノールの製法としては、これまでに、例えば、光学活性酒石酸等を分割剤とする優先晶析法により光学活性３−キヌクリジノール誘導体に導く方法（ Acta. Pharm. Suec., 16, 281-3 (1979) ）等が報告されている。微生物等の触媒を利用する方法としては、３−キヌクリジノールの低級脂肪酸エステルを酵素により不斉加水分解して光学活性３−キヌクリジノールに分割する方法（米国特許5,215,918、特開平10-136995、特開平10-210997および Life Sic. 21, 1293-1302 (1977)）が知られている。しかし、これらの方法は、ラセミ体を出発原料とし、光学分割して目的の光学異性体を得る手法であり、目的としない対掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にある。
【０００５】
一方、ルイス酸付加物をロジウム錯化合物を触媒として不斉還元により、３-キヌクリジノンから、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法（特開平９−１９４４８０）が報告されているが、この方法は光学純度が低く、工業的に有利な製造方法とは言い難い。
従って、本発明のより提供されるような新規酵素による有用な合成方法が望まれていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、新たなアルコール脱水素酵素を提供するとともに、医農薬合成中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を、その酵素による不斉還元反応により、工業的に有利な製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の微生物が３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用し、そのＲ体へ立体選択的に還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールあるいはその塩を生成する能力を有することに着目し、さらにその酵素を精製し、その酵素化学的性質について鋭意検討を行った結果、高い立体選択性でＲ体を優先的に還元する性状を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の（１）および（２）に示す性状を有するアルコール脱水素酵素である。
（1）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する。
（2）３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。
【０００９】
さらに、本発明は、該酵素、該酵素を産生する微生物または、形質転換微生物もしくはそれらの処理物を３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用させすることを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールまたはその塩の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明であるアルコール脱水素酵素はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有する。補酵素としては他にも、一般には数種類が知られているが、ＮＡＤＨ以外のもであってもＲ−３−キヌクリジノールを生成能が発揮できれば特に制限はないが、ＮＡＤＨ依存性であることが望ましい。
【００１１】
本酵素は３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。この範囲内に至適ｐＨがあれば特に限定はないが、好ましくは至適ｐＨが7.5〜8.0であることが望ましい。
【００１２】
さらに、本酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合が約52,000。ゲル濾過（高速液体クロマトグラフィー）で測定した場合、約220,000であることが好ましい。
【００１３】
本発明におけるアルコール脱水素酵素の供給源としては特に制限されるものではないが、微生物等の生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、Microbacterium属等に属する微生物が挙げられる。好ましくは、Microbacterium estevoaromaticum IFO 3751、Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM 9171、Microbacterium luteolum JCM 9174が挙げられる。特に好ましくはMicrobacterium luteolum JCM 9174が挙げられる。
【００１４】
なお、IFO番号およびJCM番号が付された菌株は公知で、それぞれ財団法人発酵研究所および理化学研究所微生物系統保存施設から容易に入手することができる。
【００１５】
本酵素の単離精製方法は、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepharose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200 pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー等を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００１６】
本発明において、３−キヌクリジノンおよび３−キヌクリジノールの塩とは、その窒素原子を、有機酸あるいは鉱酸等の塩を形成させたものを意図する。具体的には鉱酸塩として塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が例示できる。有機酸塩としては酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン酸、シュウ酸等の脂肪族有機酸塩、安息香酸等の芳香族有機酸塩等が例示される。
本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物等も含まれる。また、本発明において、形質転換微生物とは本発明の酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現した組換え微生物をいう。その宿主としては、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ピキア（Pichia）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属などが挙げられる。さらに、形質転換微生物処理物とは、アセトン乾燥微生物菌体、凍結乾燥微生物菌体、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処理したものあるいはそれらの固定化物などをいう。
【００１７】
本発明において、不斉還元反応によるＲ−３−キヌクリジノールあるいはその塩の生産は、以下の方法で行うことができる。必要に応じて補酵素（NADH、NADPH、NAD+、NADP+）あるいは／およびグルコース、シュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー源の存在下、水または緩衝液等の反応溶媒中で３−キヌクリジノンあるいはその塩に酵素、形質転換微生物、または該菌体処理物を接触させることにより行うことができる。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応基質（３−キヌクリジノンあるいはその塩）あるいは／および前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継続させることもある。
【００１８】
また、還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ+の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ+還元能（解糖系など）を用いて行うことができる場合がある。
これらＮＡＤ+還元能は、反応系にグルコースやエタノールを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。
【００１９】
反応液の基質濃度は、０．０１〜５０重量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．０５〜３０重量％の濃度で実施するのが好ましい。
反応液中の酵素等の触媒の濃度は、その形状およびその活性により適宜決定され、特に制限はない。
反応液のpHは用いる酵素の至適pH等を考慮し、総合的に決定され、特に制限はないが、好ましくはpH５〜１０である。本酵素の至適ｐＨ7.0から9.0の範囲で実施することがさらに好ましい。また、反応が進行するに従いpHが変化してくるが、この場合は適当な中和剤を添加して最適pHに調整することが望ましい。
反応温度は０〜６０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。
【００２０】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、３−キヌクリジノンあるいはその塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２１】
また、これらの有機溶媒あるいは界面活性剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上することも多い。反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
尚、以上のような基質濃度、補酵素濃度、酵素濃度、pH、温度、溶媒、反応時間およびその他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮して目的とする光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００２２】
反応終了混合液からの目的物の単離は除菌後、濃縮、抽出、カラム分離、結晶化等通常の公知の方法によって行うことができる。
例えば、ｐＨをアルカリ性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類； ブタノール、イソブタノール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般的な溶媒により抽出分離することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２４】
＜実施例１＞  Microbacterium luteolum JCM 9174の培養
ペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム0.3％、スクロース1.0％（ｐＨ7.0）を含む培地により、30℃で前培養を行い、続いて本培養は同前培養培地に消泡剤0.1％添加した組成の培養液3リットルを使用し、30℃24時間実施した。
【００２５】
＜実施例２＞  本酵素の精製を以下に示す。なお全工程を4℃にて行った。
１）粗酵素液の調製
前記培養方法により６リットルの培養液から菌体湿重量33.8gを得た。170mlの1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1ｍＭMgCl2、プロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ ＦＲＥＥ(Roche社製；1 tablet/50ml)を含む20ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ7.0で懸濁し、菌体破砕を超音波破砕装置(201M ultrasonic oscillator，久保田製作所)を用いて180Ｗ、0℃で8分間行った。破砕液を9000g、20分4℃で遠心を行い、上清を粗酵素液として回収した。以後特に述べない限りでは、緩衝液は1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1ｍＭMgCl2を含む20ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を使用した。(以降、緩衝液Ａ)
【００２６】
２）硫安分画
粗酵素液について硫安分画を行い、0〜55％飽和画分の沈殿を回収した。得られら沈殿を緩衝液Ａに溶解し、さらに同緩衝液にて透析した。
【００２７】
３）Blue-Sepharose カラムクロマトグラフィー
緩衝液Ａで平衡化した Blue-Sepharose(φ2.5mm×24mm)に酵素液を供し、同緩衝液にて非吸着成分を洗い流したところ、酵素活性は未吸着画分に溶出された。
【００２８】
４）DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラフィー
緩衝液Ａで平衡化したDEAT-Toyopearl 650Ｍ（東ソー、φ20mm×210mm）に、酵素液を吸着させた後、同緩衝液にてカラムを洗浄した後、NaClの0〜0.8Ｍ濃度勾配にて、カラムに結合した酵素を溶出した。溶出パターンを図１に示す。
【００２９】
５）Hiload Superdex 200 pg FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜(旭化成ペンシル型モジュール；分画分子量 6000)により濃縮後50ｍＭ NaClを含む緩衝液Ａ（ｐＨ7.5）で平衡化したHiload Superdex 200 pg(Phamacia Biotech、φ16mm×600mm)に吸着させた。酵素液は流速2ml/minにて溶出を行い、4ml/fractionにて分取した。溶出パターンを図２に示す。
【００３０】
６）HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を5ｍＭ緩衝液Ａ（ｐＨ7.7）で限外ろ過膜にて濃縮および透析を行い、同緩衝液にて平衡化した HAP-C-BEADS hydroxypatite(Sangi社製)クロマトグラフィー(Sangi、φ16mm×100mm)に吸着させた。同緩衝液を流速2ml/minで洗浄後、0〜1Ｍの緩衝液Ａ(pH7.7)の直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。溶出パターンを図３に示す。
【００３１】
７）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィー
限外ろ過法によって濃縮透析した酵素液を10ｍＭ緩衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M(PerSeptive Biosystems MA、USA、φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図４に示す。
【００３２】
８）BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜（アミコン centriprep；分画分子量 6000）により濃縮透析し、緩衝液Ａ(pH7.0)にて平衡化したBioAssistQ (東ソー、φ4.6mm×50mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、1ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図５に示す。
【００３３】
９）（２回目） Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィー
活性画分を限外ろ過膜によりにより濃縮透析し、10mM緩衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M (φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配により、たんぱく質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め精製酵素とした。溶出パターンを図６に示す。
各精製の結果を表１に示す。
【００３４】
＜表１＞
0004125543.tif 000002
各精製時におけるタンパク質濃度は280nmにおける吸収又はProtein Assay Kit(Bio Rad)を用い算出した。なお、３−キヌクリジノン還元酵素の活性測定は必要に応じて以下の２法により適宜実施した。
【００３５】
（活性測定方法A）ガスクロマトグラフィーを用いた活性測定
50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌクリジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、酵素液を250μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。25℃、6時間の反応の後、6Ｎの水酸化ナトリウム30μｌにより、ｐＨを12.0にして反応を停止し、1-ブタノールにより生成物を抽出した後、硫酸ナトリウムで脱水し測定サンプルを調整した。キラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）により、生成したＲ-3-キヌクリジノールを定量した。なお、1分間あたりに1ｎｍｏｌの3-キヌクリジノンｍＭを生成する酵素活性量を1unitと定義した。
【００３６】
（活性測定方法B）分光光学法を用いた活性測定
50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、0.3ｍＭ ＮＡＤＨ、酵素液20μｌを加えブランク反応を確認した後、基質である20ｍＭ 3-キヌクリジノンを添加して全量1.5ｍｌとした。ＮＡＤＨの340ｎｍのおける吸収の減少を測定し25℃で1分間あたりに1ｎｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換する酵素活性量を1unitと定義した。酵素の総活性（Ｕ）は下記の計算式を用いて算出した。
【００３７】
0004125543.tif 000003
＊6220：ＮＡＤＨの340ｎｍにおける分子吸光係数
【００３８】
＜実施例３＞  アルコール脱水素酵素の安定化剤の検討
本酵素の粗酵素を用い、図７に示す各種添加剤を1ｍＭになるように加え（一部濃度が異なる）、4℃中における0、12、24、48、60、216時間後の粗酵素の安定性を調べた。酵素活性測定はA法により実施した。ＦＡＤ、ＦＭＮ、Pyridoxal-5’-phosphateの３添加剤については0.1ｍＭになるよう加えた。その結果を図７に示す。
【００３９】
＜実施例４＞  アルコール脱水素酵素のミカエリス定数（Km）の測定
酵素量を一定にとし、ＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノン濃度を各々変化させて、それぞれにおける生成ＮＡＤ＋の量を測定した。得られたデータについてLineweaver-Burkの両逆数プロットを行うことでＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノンに対するKm値を算出した（図８および９を参照）。３−キヌクリジノンおよびＮＡＤＨに対するKm値はそれぞれ7.5mMおよび9.0μMであった。
【００４０】
＜実施例５＞  アルコール脱水素酵素の至適ｐＨの検討
本酵素活性の至適pHの測定はは各100mMの酢酸ナトリウムpH5.0〜6.0リン酸カリウムpH6.0〜7.5、Tris-HCl pH7.5〜9.0、グリシン-KOH pH 9.0〜10.0の各緩衝液を使用した。なお活性測定は活性測定方法Aよって行った。結果を図10に示す。本酵素の３−キヌクリジノンに対する至適ｐHは7.5〜8.0付近であることが示された。
【００４１】
＜実施例６＞  アルコール脱水素酵素の分子量およびポリアクリルアミドゲル電気泳動
本酵素の分子量は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用い、以下の条件で検討した。カラムにTSK-GEL G3000SW×X（東ソー株式会社）、溶離液に0.1M NaClを含む0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)を使用し、流速1.0ml/min、で行った。溶出液を分別回収し、各画分における本酵素の活性化のアッセイ結果によりR-3-キヌクリジノールの溶出時間を求め、分子量マーカー(MW-Marker；オリエンタル酵母工業株式会社)の溶出時間と比較し分子量を求めた。図11および12を参照。
native 電気泳動は5〜20％濃度勾配の電気泳動既製ゲルPAGEL(ATOO CORPORATION)のを使用した。またSDS-PAGEは12.5％(w/v)ポリアクリルアミドゲルを使用した。タンパク質の検出はクマジーブリリアントブルーR-250を用いて行った。native-PAGEおよびSDS-PAGEの結果をそれぞれ図13（A）および（B）に示す。
これらの結果から、本酵素の分子量は約220,000であることが示された。また、SDS-PAGEの結果より、サブユニット分子量52,000の４量体と推定された。
【００４２】
＜実施例７＞  アルコール脱水素酵素の金属塩の影響
表２に示す各種金属化合物を反応液へ１ｍＭになるよう添加し、活性測定方法Aに従い、その影響を検討した。ごくわずかであるがＭｇイオンにより活性化をうけた一方、ＺｎＳＯ4では強い阻害が見られた。
【００４３】
＜表２＞
0004125543.tif 000004
【００４４】
＜実施例８＞  アルコール脱水素酵素の基質特異性
表３に示す各種基質化合物を活性測定法Ｂに従い反応液を調整し、その相対活性を検討した。
【００４５】
＜表３＞
0004125543.tif 000005
【００４６】
＜実施例９＞  アルコール脱水素酵素のN末端アミノ酸配列の解析
精製酵素を定法に従い、N末端アミノ酸配列を決定した。具体的には、SDS-PAGEにて分離した精製酵素を電気的にポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜にブロットした。PVDF膜に吸着した酵素蛋白質のＮ末配列をエドマン分解法により、アプライドバイオシステム社製のProcise491シ-ケンサを使用して決定した。その結果、以下に示す配列が確認された。
【００４７】
N末端アミノ酸配列：ＰＥＡＳＡＮＩＧＶＶＧＬＡＭＧＳＮＬＡ
【００４８】
＜実施例10＞  アルコール脱水素酵素によるＲ−３−キヌクリジノールの合成
50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌクリジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、精製酵素液を250μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。この反応液を25℃で反応させた。経時的にＲ−３−キヌクリジノールの生成量および光学純度を定量した。定量はキラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）により実施した。生成量の経時変化を図14に示す。尚、光学純度はＲ体100％eeであった。
【００４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】  DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図２】  Hiload Superdex 200 pg FPLC カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図３】  HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図４】  Pros HQ/M FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図５】  BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図６】  （２回め）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図７】  アルコール脱水素酵素の安定化剤の検討結果を示す図である。
【図８】  アルコール脱水素酵素の３−キヌクリジノンに対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
【図９】  アルコール脱水素酵素のＮＡＤＨに対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
【図１０】  アルコール脱水素酵素の至適ｐＨの検討結果を示す図である。
【図１１】  アルコール脱水素酵素の高速液体クロマトグラフィー溶出パターンを示す図である。
【図１２】  高速液体クロマトグラフィーによる標準蛋白質の検量線およびアルコール脱水素酵素の分子量測定結果を示す図である。
【図１３】  （A）は精製アルコール脱水素酵素のnative-PAGEにおけるパターンを示す図である。（B）は精製アルコール脱水素酵素のSDS-PAGEにおけるパターンを示す図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製アルコール脱水素酵素を示す。
【図１４】  アルコール脱水素酵素を用いたＲ−３−キヌクリジノールの生成量の経時変化結果を示す図である。
【００５０】
【配列表】
0004125543.tif 000006
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、医農薬合成中間体として重要なＲ−３−キヌクリジノールの製造能を有する有用なアルコール脱水素酵素が提供されるとともに、それらを利用してに効率的な生産が可能となる。
【図１】
0004125543.tif 000007
【図２】
0004125543.tif 000008
【図３】
0004125543.tif 000009
【図４】
0004125543.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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