(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビンを含有する検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずるビリルビンの変化を光学的に測定することにより前記検体中の抱合ビリルビン量を測定する方法において、ヒドロキノン、メチルヒドロキノン、メトキシヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、クロロヒドロキノン、ブロモヒドロキノン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，５−ジヒドロキシ−４’−メチルジフェニル、および１，２，４−トリヒドロキシベンゼンから成る群から選択される少なくとも１種を共存させることを特徴とする検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【請求項２】
ヒドロキノン、メチルヒドロキノン、メトキシヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、クロロヒドロキノン、ブロモヒドロキノン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，５−ジヒドロキシ−４’−メチルジフェニル、および１，２，４−トリヒドロキシベンゼンから成る群から選択される少なくとも１種の濃度が０．００１〜１０ｍＭの範囲である請求項１記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【請求項３】
ｐＨ４．５〜７．０の範囲で反応させる請求項１または２記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビリルビンのうち抱合ビリルビンを酵素的に測定する抱合ビリルビンの分別測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンは、胆汁中に最も多く存在する色素で、主として老廃赤血球により生成する血色素からつくられ、血清中では主にグルクロン酸と結合した抱合ビリルビンと、アルブミンと結合した非抱合型ビリルビンおよびδ−ビリルビンとして存在する。抱合ビリルビンと、非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンとを合わせたものを総ビリルビンと呼んでいる。
抱合ビリルビン、非抱合ビリルビンの血清中での存在量から、肝機能障害の分別診断および肝機能障害の程度を知ることが可能であるため、これらビリルビンの分別定量は臨床診断において重要な位置を占めている。特に抱合ビリルビンは、肝機能障害、胆汁うっ滞、さらにそれらの疾患の予後の指標になるものと考えられている。
【０００３】
従来、このようなビリルビンの測定法としては、ジアゾ試薬による比色法（例えば、非特許文献１参照)などの化学的測定法が主に用いられてきた。
しかしながら、これらの化学的測定法では、抱合ビリルビンのうちジグルクロナイド体は速やかに反応するが、モノグルクロナイド体は反応が遅いため、反応時間を正確に規定しないと抱合ビリルビンの正確な測定ができないという問題があった。
【０００４】
一方、血清中のビリルビンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析法がラウルらにより報告された（例えば、非特許文献２参照)。
この報告によると、血清中のビリルビンは主にα〜δの４分画に分けられ、δ位分画のビリルビン、すなわちδ−ビリルビンは、アルブミンと共有結合したビリルビンであることが明らかにされた。
その後、多数のグループにより、ＨＰＬＣによるビリルビンの定量法が提案された（例えば、非特許文献３、４、５参照)。
しかしながら、このＨＰＬＣ法では、一度に大量の検体を測定できないこと、およびランニングコストが高いことなど多くの問題があった。
【０００５】
さらに、酵素を用いた抱合ビリルビンの定量法としては、ミロセシウム属（Myrothecium）由来のビリルビンオキシダーゼを用いる測定法（例えば、特許文献１参照）やビリルビンオキシダーゼをｐＨ３．５〜４．５の範囲で作用させて測定を行う方法（例えば、特許文献２参照）などが報告されており、従来のジアゾ法に比べて、いずれも簡便性に優れたものであった。
【０００６】
しかしながら、本発明者の追試によれば、前記酵素による定量法のうち、前者では非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンの反応が認められ、正確性に欠けるという問題があり、後者ではδ−ビリルビンの反応が認められ正確性に欠けること、および長い反応時間が必要であるため測定の自動化が困難であるという問題があった。
【０００７】
このため、本発明者は、ビリルビンオキシダーゼに反応促進剤としてアニリン類、ペンタシアノ鉄錯塩およびコバルト（ＩＩ）錯体を配合し、測定のｐＨを２．５〜４．０とすることにより、抱合ビリルビンを選択的かつ迅速に測定できる酵素法による抱合ビリルビン比色定量法および試薬を既に提案している（例えば、特許文献３参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開昭５９−１７９９９号公報
【特許文献２】
特開昭５９−１２５８９９号公報
【特許文献３】
特開平３−１７５９９８号公報
【０００９】
【非特許文献１】
金井泉.「臨床検査法提要」昭和53年、金原出版、p.XII-24
【非特許文献２】
John J.Lauff、et.al.「J.Chromatogr」1981年、226巻、p.391-402
【非特許文献３】
Ohnishi S、et.al.「 Biochem.J」1980年、190巻、p.527-532
【非特許文献４】
Nakamura H、et.al.「分析化学」1987年、36巻、p.352-355
【非特許文献５】
Adachi Y、et.al.「Clin.Chem.」1988年、34巻、p.385-388
【００１０】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、上記酵素を利用した測定法では、ジアゾ試薬を用いる場合と同様に、ビリルビンの分別性が充分でないため、抱合ビリルビンに対し反応が完全ではないか、または、抱合ビリルビンだけでなく、非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンの一部にも反応してしまうという問題があった。
また、抱合ビリルビンの分別性を向上させるために低ｐＨ域（ｐＨ２．５〜４．０）で反応を行う必要があり、分析装置に対して好ましいものではなかった。
【００１１】
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、ビリルビンを含有する検体中の非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンに反応することなく、抱合ビリルビンのみを精度良く測定できる抱合ビリルビンの分別測定法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を共存させることによって、ｐＨ４．５〜７．０という穏やかな条件においても、抱合ビリルビンのみを精度良く測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記のような構成からなるものである。
（１）ビリルビンを含有する検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずるビリルビンの変化を光学的に測定することにより前記検体中の抱合ビリルビン量を測定する方法において、ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を共存させることを特徴とする検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【００１４】
（２）ヒドロキノン類がヒドロキノン、メチルヒドロキノン、メトキシヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、クロロヒドロキノン、ブロモヒドロキノン、３’，８’−ジヒドロキシベンゾノルボルナン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，５−ジヒドロキシ−４’−メチルジフェニル、および１，２，４−トリヒドロキシベンゼンから成る群から選択される少なくとも１種である（１）記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【００１５】
（３）６−ヒドロキシ−クロマン類が６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸および／またはトコフェロールである（１）記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【００１６】
（４）ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種の濃度が０．００１〜１０ｍＭの範囲である（１）〜（３）記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【００１７】
（５）ｐＨ４．５〜７．０の範囲で反応させる（１）〜（４）記載の検体中の抱合ビリルビンの分別測定法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
酵素法によるビリルビンの測定において、抱合ビリルビンのみを測定しようとする場合、検体のｐＨを変化させて測定することが知られている（Akira Kosaka,Clin.Biochem.,20,451-458;1987)。つまり、非抱合ビリルビンやδ−ビリルビンは、抱合ビリルビンに比べ酵素反応性が低く、低いｐＨ領域では酵素反応を受けにくくなるため、例えばｐＨ３．５付近で反応させると、抱合ビリルビンが優先的に反応するようになる。ｐＨを更に低くすると、非抱合ビリルビンやδ−ビリルビンは殆ど反応を受けなくなるが、その一方でビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨは、５〜７であり、酵素活性が著しく低下してしまうため、反応に長時間を要したり、充分に抱合ビリルビンが酸化されなくなる。また、ｐＨ８〜１０でも同様の特性があり、満足のいく測定結果を出せなくなる。
【００１９】
本発明は、抱合ビリルビンの分別剤としてヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を用いることにより、上記の問題点を解決したものである。
この分別剤は、抱合ビリルビンが最もビリルビンオキシダーゼの酵素活性が高いｐＨ領域で反応でき、更に非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンの反応を選択的に阻害するという効果を有している。
【００２０】
本発明で抱合ビリルビンの分別剤として使用するヒドロキノン類としては、公知のものの中から適宜選択することができる。その具体例としては、ヒドロキノン、メチルヒドロキノン、メトキシヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、クロロヒドロキノン、ブロモヒドロキノン、３’，８’−ジヒドロキシベンゾノルボルナン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，５−ジヒドロキシ−４’−メチルジフェニル、および１，２，４−トリヒドロキシベンゼンから成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２１】
また、６−ヒドロキシ−クロマン類も公知のものの中から適宜選択すれば良いが、特に６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、および／またはトコフェロールが好ましい。
【００２２】
これら抱合ビリルビンの分別剤の濃度は０．００１〜１０ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．５ｍＭの範囲である。
分別剤の濃度が０．００１ｍＭ未満となると、非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンの反応を選択的に阻害できないため、抱合ビリルビンのみを精度良く測定することができなくなり、逆に、１０ｍＭを超えると、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性が阻害される。
【００２３】
ビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨは、５．０〜７．０、好ましくは５．０〜６．５であるため、測定中は反応液のｐＨを一定に維持することが必要である。このため、一般に酵素反応により抱合ビリルビンを測定する場合は、緩衝液を用いる。
本発明で用いることのできる緩衝液としては、ｐＨを上記範囲に維持できるものであれば、特に制限されず、公知の緩衝液の中から適宜選択することができるが、特にグッド緩衝液やリン酸緩衝液などが好ましい。
本発明においては、ｐＨ４．５〜７．０という穏やかな条件下で反応を行えるため、分析装置に対しても好ましいと言える。
【００２４】
本発明において、抱合ビリルビンの測定を行う検体としては、一般にビリルビンを含有する水性検体であり、例えば、血清、血漿、胆汁などが挙げられる。これらの検体は、必要に応じて希釈されたり、前処理されていても良い。
また、本発明で用いられるビリルビンオキシダーゼとしては、一般にビリルビンオキシダーゼとして用いられている酵素であればいずれでも良いが、入手し易さや取り扱い易さを考慮すると、ミロセシウム属由来のものが好ましい。このビリルビンオキシダーゼの反応中の濃度は、０．０１〜１０単位／ｍＬ、好ましくは０．１〜２単位／ｍＬである。
【００２５】
本発明は、ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を含む緩衝液（第１試薬）と、ビリルビンオキシダーゼ溶液（第２試薬）とからなる２試薬系の抱合ビリルビン測定用試薬を提供することができる。
ヒドロキノン類および６−ヒドロキシ−クロマン類としては、上述したものの中から適宜選択すれば良い。
【００２６】
本発明による抱合ビリルビンの測定は、上記ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を含む緩衝液（第１試薬）を加え、予備加温後、ビリルビンオキシダーゼ溶液（第２試薬）を加えて反応させ、その結果生ずる抱合ビリルビンの減少を光学的に測定することにより行われる。
【００２７】
また、ヒスチジンやアルギニンを添加することによりヒドロキノン類などの分別剤としての効果を更に増強させることができる。本発明においては、特に必要とされないが、必要に応じて安息香酸などの反応促進剤、界面活性剤、アルブミンなどの蛋白質などを適宜添加することができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、ヒドロキノン類、６−ヒドロキシ−クロマン類、および５−ヒドロキシベンゾ−２，３−ジヒドロフラン類から成る群から選択される少なくとも１種を共存させることによって、ビリルビンを含有する検体中の非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンに反応することなく、抱合ビリルビンのみを精度良く測定できる抱合ビリルビンの分別測定法を提供することができる。
従って本発明によれば、検体中の抱合ビリルビンを高い精度で測定できるので、肝機能や造血機能系疾患を精度良く診断することができる。
【００２９】
また、本発明は、ｐＨ４．５〜７．０という穏やかな条件下においても、抱合ビリルビンのみを精度良く測定できるので、分析装置に対しても好ましいと言える。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  非抱合ビリルビン反応の抑制効果
５０μＭの各種ヒドロキノン類、０．０５％のトリトンＸ−３０５、および１００ｍＭのサリチル酸ナトリウムを含有する２００ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（第１試薬：ｐＨ５．５０）０．２４ｍＬに、非抱合ビリルビン（干渉チェック ＢＩＬ−Ｆを１５ｍｇ／ｄＬに希釈したもの：国際試薬社製）０．００８ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加熱後、ビリルビンオキシダーゼ２．０Ｕ／ｍＬを含む１０ｍＭのＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ：ｐＨ９．０）緩衝液（第２試薬）０．０６ｍＬを加えて、３７℃で日立７１７０形自動分析装置を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度の経時的変化を測定した。
また、ヒドロキノン類を含まない他は、上記と全く同様な方法で測定を行い、コントロールとして上記測定値と比較した。その結果、図１に示すように、本発明の抱合ビリルビンの分別測定法によれば、第２試薬添加後のある一定時間経過まで非抱合ビリルビンは殆ど酸化されないことが判る。非抱合ビリルビンの酸化を防止できる時間は、ヒドロキノンの種類や添加濃度によりコントロールできる。
尚、１，２，４−トリヒドロキシベンゼンでは、吸光度の上昇が見られるが、この場合でも非抱合ビリルビンの反応は抑制されていることが判る。
【００３２】
実施例２  抱合ビリルビン反応に対する影響
実施例１における非抱合ビリルビン試料の代わりにジタウロビリルビン試料（干渉チェック ＢＩＬ−Ｃを１０ｍｇ／ｄＬに希釈したもの：国際試薬社製の抱合ビリルビン）を用いた他は、実施例１と全く同様にして吸光度の経時的変化を測定した。その結果、図２に示すように、抱合ビリルビンの酸化反応は、非常に速やかであり、ヒドロキノン類の影響は殆どないことが判る。
実施例１および実施例２の結果から、ヒドロキノン類は、非抱合ビリルビンの酸化反応のみを特異的に阻害するため、抱合ビリルビンのみを分別測定できることが判る。
【００３３】
実施例３  試薬における各種ビリルビンの反応性
実施例１におけるヒドロキノン類としてヒドロキノンを用いた第１試薬０．４５ｍＬと血清検体０．０１５ｍＬとを３７℃で５分間予備加熱後、実施例１で用いた第２試薬０．１１２ｍＬを加えて、更に３７℃で５分間予備加熱し、３ｇ／ｄＬのフッ化ナトリウム水溶液０．０３ｍＬおよび１０ｇ／ｄＬのアスコルビン酸水溶液０．０１ｍＬを加えて、その反応液０．１ｍＬをＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣは、溶離液-1中にフッ化ナトリウムが０．０５ｇ／ｄＬおよびアスコルビン酸が０．２ｇ／ｄＬとなる様に添加したこと、カラムとしてLicrospher 100RP-18（メルク社製）を使用したこと、および装置として東ソー8020分析装置を用いた他は、上記したラウルらの方法に準じて行った。
尚、第１試薬と血清検体とを３７℃で５分間予備加熱後、フッ化ナトリウム水溶液およびアスコルビン酸水溶液を添加し、次いで第２試薬を加え、ビリルビンオキシダーゼ反応を抑制した時の溶液中の各種ビリルビンを対照とした。
その結果、図３に示すように、本発明の試薬によるビリルビンオキシダーゼ反応により、ジグルクロナイドビリルビンおよびモノグルクロナイドビリルビンに相当するピークが消失し、非抱合ビリルビンおよびδ−ビリルビンに相当するピークは、それぞれ１００％、９６％残存していることが判る。
このことから、本発明による試薬により抱合ビリルビンのみを分別測定できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】非抱合ビリルビン反応の抑制効果を示すグラフである。
【図２】抱合ビリルビン反応に対する影響を示すグラフである。
【図３】試薬反応前後の各種ビリルビンに対する反応性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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