(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪のダメージを評価する方法であって、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ダメージが毛髪のパーマ処理、ブリーチ処理、酸化染毛剤処理、コーミング、熱処理、紫外線に対する暴露、プールでの次亜塩素酸に対する暴露のいずれか又はそれらの複数の組合せに起因する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識が、前記酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドラジノ基含有蛍光物質がフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びダンシルヒドラジンから成る群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記評価が蛍光顕微鏡下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ヒドラジノ基含有蛍光物質がダンシルヒドラジンであり、前記蛍光の検出が目視で行われる、請求項３記載の方法。
【請求項７】
毛髪のダメージを評価する方法に利用するためのキットであって、酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含んで成ることを特徴とするキット。
【請求項８】
前記蛍光物質がヒドラジノ基含有蛍光物質である、請求項７記載のキット
【請求項９】
前記ヒドラジノ基含有蛍光物質がフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びダンシルヒドラジンから成る群から選ばれる、請求項７又は８記載のキット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで毛髪のダメージ度の評価を行う方法、及びその方法を実施するために利用されるキットを提供する。
【背景技術】  毛髪はパーマ処理、ブリーチや酸化染毛剤処理、コーミング、ドライヤー等による熱処理、紫外線に対する暴露、プールでの次亜塩素酸に対する暴露など、様々な外的要因によってダメージを受ける。毛髪は一度ダメージを受けると修復することはない。加えて、ダメージが経時的に進行してしまう場合もある。従って、毛髪の健康状態を保つには日頃のケアによりダメージを与えにくくすることも当然ながら、そのダメージ度を認識しておき、ダメージの進行を抑制することも極めて重要である。毛髪のダメージ度を評価する方法として、視感評価、物性評価などの方法が知られており、例えば走査型電子顕微鏡による毛髪の表面分析法（Ｓｗｉｆｔ  Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９７２）Ｖｏｌ．２３，ｐ．６９５）、毛髪の機械的強度を測定する引張試験法（Ｄｏｎａｌｄ  Ｅ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９６８）Ｖｏｌ．１９，ｐ．３９５）、毛髪の内部構造変化を測定する方法（Ｈｕｍｐｈｒｅｓ  Ｗ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９７２）Ｖｏｌ．２３，ｐ．３５９）、毛髪を蛍光物質で標識し、蛍光顕微鏡でダメージを測定する方法（Ｔａｔｅ  Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（１９９３）Ｖｏｌ．４４，ｐ．３４７）などがあるが、いずれも特別な装置を要したり、操作がめんどうであるといった欠点を有する。
特開平８−１７８９２０号公報や特開平８−２７１５１５号公報は、例えばパーマ処理などによるケラチンに多数含まれるＳ−Ｓ結合の切断の結果生ずるＳＨ基を毛髪ダメージの指標とし、当該ＳＨ基を選択的に標識する蛍光物質、例えばＮ−（９−アクリジニル）マレイミドやＮ−（７−ジメチル−アミノ−４−メチルクマリニル）マレイミドで毛髮を蛍光染色して、毛髪のダメージ度を測定する方法を開示する。これらの方法によれば、ダメージの検出は蛍光顕微鏡などを要せずにして目視で行われ、測定の簡便化が図れる。一般に、パーマ処理は還元処理により毛髪ケラチン内のＳ−Ｓ結合を一旦切断してＳＨ基を生じせしめ、後に酸化処理によりそのＳＨ基をＳ−Ｓ結合に戻すといった工程から成る。また、ブリーチ処理は酸化処理だけからなる。しかし、パーマ処理、ブリーチ処理ともに酸化反応が過度に進行すると、ＳＨ基やＳ−Ｓ結合がシステイン酸（ＳＯ３Ｈ）に変化し、これが毛髪ダメージの一因であることが知られている。システイン酸は、ＳＨ基を選択的に標識する蛍光物質とは反応しないので、ＳＨ基を毛髪ダメージの指標とするこれらの方法により得られる結果は、毛髪の実際のダメージ度を的確に反映していない場合があると考えられる。
【発明の開示】
本発明は、簡便で、しかも毛髪の実際のダメージをより正確に反映した、毛髪ダメージ度を評価する方法の提供を課題とする。
本発明は、毛髪のダメージを評価する方法を提供する。この方法は、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする。かかるダメージは毛髪のパーマ処理、ブリーチや酸化染毛剤処理、コーミング、ヘアドライヤー等の熱処理、紫外線に対する暴露、プールでの次亜塩素酸に対する暴露のいずれか又はそれらの複数の組合せに起因し得る。
好適な態様において、酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する。好ましくは、かかるヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びダンシルヒドラジンから成る群から選ばれる。
好適な態様において、上記評価は蛍光顕微鏡下で行われ得る。しかしながら、ヒドラジノ基含有蛍光物質がダンシルヒドラジンの場合、前記蛍光の検出は目視で行うことができる。
別の観点において、本発明は毛髪のダメージを評価する方法に利用するためのキットを提供する。このキットは、酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含んで成ることを特徴とする。
好ましくは、蛍光物質はヒドラジノ基含有蛍光物質であり、より好ましくはヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びダンシルヒドラジンから成る群から選ばれる。
本発明により、簡便で、しかも毛髪の実際のダメージを的確に反映する結果を示す、毛髪ダメージ評価方法が提供される。この評価方法により、パーマ処理、ブリーチや酸化染毛剤処理、コーミング、ヘアドライヤー等による熱処理、紫外線暴露、プールの次亜塩素酸薬剤に対する暴露などに起因するダメージが評価できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる毛髪酸化タンパク質の検出結果を示す。
図２は、紫外線処理、次亜塩素酸ナトリウム処理による毛髪酸化タンパク質の亢進を示す蛍光顕微鏡写真図を示す。
図３は、図２の結果を平均輝度に数値化した図である。
図４は、平均輝度による、パーマ処理、ブリーチ処理による毛髪酸化タンパク質の亢進を示す。
図５は、蛍光物質としてダンシルヒドラジンを用いた場合の、平均輝度による、パーマ処理、ブリーチ処理による毛髪酸化タンパク質の亢進を示す。
図６は、医療用紫外線蛍光ランプによる毛髪ダメージの定量実験の結果を示す。
図７は、人工太陽照明灯による毛髪ダメージの写真図（ａ）及びその定量実験の結果（ｂ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで毛髪のダメージ度の評価を行う方法、及びその方法を実施するために利用されるキットを提供する。
毛髪（又は毛幹）はその表面を覆う毛小皮、その内部にあって毛髪の大部分を占める毛皮質及び中心部の毛髄質から構成される。特に毛小皮は毛髪の根元から先端に向かって鱗状に重なって毛髪の表面を覆い、内部を保護し、毛小皮に損傷がなく、健常な状態であれば、毛髪は艶やかに見える。毛髪はタンパク質８０〜９０％、脂質１〜８％、微量元素０．６〜１．０％、そして水１２〜１３％から概ね構成される。毛髪中のタンパク質には様々なものが存在するが、主だったタンパク質はケラチンである。ケラチンを含む毛髪タンパク質はパーマ剤、ブリーチ剤、酸化染毛剤等に含まれる化学系酸化剤、紫外光、大気汚染物質、プールに使われる次亜塩素系薬剤、コーミングによる摩擦、ヘアドライヤー等による熱などの様々な因子に対する暴露に伴い、酸化を受けた結果カルボニル基が導入される。このような酸化には、タンパク質におけるＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏといったアミノ酸残基のＮＨ２基が直接酸化されてカルボニル基となる場合と、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで起こる場合とが考えられる。
本発明において利用できる酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基
−ＮＨＮＨ２
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、ダンシルヒドラジン、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
（１）毛髪を採取する；
（２）これに適当な緩衝液（例えば１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
（３）反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））にて十分に洗浄した後、酸化タンパク質を例えば蛍光顕微鏡で検出する；
（４）任意的に、顕微鏡写真撮影する。
紫外線を照射することにより目視できる蛍光を発光する蛍光物質、例えばダンシルヒドラジンをヒドラジノ基含有蛍光物質として使用する場合、蛍光標識された酸化タンパク質は蛍光顕微鏡を使うことなく、目視だけで検出することもできる。紫外線を照射することにより目視できる蛍光を発光するその他の蛍光物質としては、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）ヒドラジン（ＦＭＯＣ−ヒドラジン）等が挙げられる。
紫外線を照射することにより目視できる蛍光を発光する蛍光物質、例えばダンシルヒドラジンをヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
（１）毛髪を採取する；
（２）これに適当な緩衝液（例えば１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
（３）反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））にて十分に洗浄した後、これに例えばブラックライトなどを使用して紫外線を照射する；
（４）蛍光を発する酸化タンパク質を目視観察する；
（５）任意的に、写真撮影する。
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、ビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの組合せを用いることもできる。ビオチンヒドラジドもヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。この場合、まず酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを結合させ、しかる後に蛍光標識アビジンをビオチンーアビジン結合を介してビオチンヒドラジドに結合させ、その結果酸化タンパク質は蛍光標識される。ビオチンヒドラジドは当業界においてよく知られ、例えばピアース社から製造販売されているものを使用することができる。また、蛍光アビジンは、例えばフルオレセインアビジンなどが使用できる。
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
（１）毛髪を採取する；
（２）これに適当な緩衝液（例えば１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
（３）反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））にて十分に洗浄した後、蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
（４）酸化タンパク質を例えば蛍光顕微鏡で検出する；
（５）任意的に、顕微鏡写真撮影する。
本発明に係るキットは、上述の蛍光物質の他に、上述の各種評価方法の実施に必要な試薬、例えば各種緩衝剤も一緒に含んでよい。
本発明者は、以降の実施例においても示すように、毛髪内の酸化タンパク質の量は毛髪のダメージ度にある程度相関することを見出した。例えば、パーマ処理に使用される酸化剤は一般に過酸化水素系のものと臭素酸ナトリウム系の２種類に分類され、その中で過酸化水素系の方が酸化力が強く、毛髪に及ぼすダメージが大きいことがよく知られている。そして、酸化タンパク質を指標とし、過酸化水素系及び臭素酸ナトリウム系パーマ処理による毛髪のダメージ度を比較したところ、過酸化水素系パーマ処理した毛髪の方が臭素酸ナトリウム系パーマ処理毛髪と比べ強いダメージを受けていることを見出した。また、毛髪のブリーチ処理は、パーマ処理とは異なり毛髪を酸化処理するだけの工程から成るものであり、反応が過度に進行するとＳＨ基やＳ−Ｓ結合がシステイン酸（ＳＯ３Ｈ）に変化するため、従来のＳＨ基を指標とした方法では、ダメージを正確に評価することができなかった。しかし、酸化タンパク質を指標とし、ブリーチ処理及びパーマ処理による毛髪のダメージ度を比較したところ、ブリーチ処理した毛髪の方がパーマ処理毛髪と比べ比較的強いダメージを受けることを見出した。これらの結果から、毛髪のダメージ度の上昇に伴い、毛髪中の酸化タンパク質の量も増大することが明らかとなった。よって、酸化タンパク質を指標とする毛髪ダメージ評価方法は、毛髪の実際のダメージをより的確に反映した結果を示すことがわかる。
上記の酸化タンパク質の検出方法及びキットを使用することで、酸化タンパク質を指標とした簡便な毛髪のダメージ測定が可能となる。本発明の方法はタンパク質の抽出操作、電気泳動操作、ウェスタンブロッティング操作などを必要とせず、蛍光顕微鏡さえあれば実施可能となる。また、蛍光物質としてダンシルヒドラジンなどを使用すれば、紫外線を照射するだけで蛍光染色された酸化タンパク質を目視評価することも可能である。従って、上記の酸化タンパク質の検出方法及びキットは、毛質の評価にとって有力な情報を簡単な操作及び設備で実施できるものとし、例えば化粧品販売の店頭等でも簡単に実施することが可能である。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】［実施例１］
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる毛髪酸化タンパク質の検出
９人の被験者（毛髪化学的処理経験なし）の毛髪の根元側と先端側（根元から約２０センチの箇所）を５センチの長さで１本ずつ採取し、下記の組成を有する洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。それを乾燥させた後に、アロンアルファでスライドガラスに固定した。それを２０μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジドの１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）に１時間、室温で反応させた。反応終了後はＰＢＳにて充分に洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、画像を１サンプルにつき４枚ずつ取り込んだ。数値化に際しては、画像から毛髪と背景を分離し、毛髪の平均輝度を求めた。
処方１（洗浄剤）
原料名                                    配合量（質量％）
アルスコープＮＭ（（株）東邦化学）          ６．８０
ヤシ油脂肪酸アミドプロピル
ベタイン液（３０％）                        １．２０
クエン酸                                    ０．０６
安息香酸ナトリウム                          ０．０９
ＥＤＴＡ・３Ｎａ                            ０．０１
イオン交換水                              ９１．８４        
合計                                    １００．００
図１にその結果を示す。図１から明らかなとおり、根元側では個人差が観察されなかった。それに対して、先端側ではかなりの個人差が観察された。髪の手入れの仕方の個人差等を反映しているものと考えられる。
［実施例２］
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる毛髪酸化タンパク質の検出
一人の被験者（毛髪化学的処理経験なし）の毛髪の先端側を５センチの長さで３本採取し、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。１本目に対しては、紫外線（ＵＶＡ）を２００Ｊ／ｃｍ２照射し、２本目に対しては０．２ｍＭ次亜塩素酸ナトリウム中に３７℃で１６時間インキュベートし、最後の３本目に対しては何の処理も行わなかった。紫外線処理、次亜塩素酸ナトリウム処理を行った毛髪は、最後に、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。それらを乾燥させた後に、アロンアルファでスライドガラスに固定した。それを２０μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジドの１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）に室温で１時間反応させた。反応終了後はＰＢＳにて充分に洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、画像を１サンプルにつき１２枚ずつ取り込んだ。数値化に際しては、画像から毛髪と背景を分離し、毛髪の平均輝度を求めた。
図２は上記のとおりに蛍光処理した毛髪の蛍光顕微鏡写真図であり、図３は各毛髪の平均輝度を示す。図２及び３に示すとおり、紫外線処理、次亜塩素酸ナトリウム処理、どちらの処理においても毛髪の酸化タンパクの亢進が観察された。
［実施例３］
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる毛髪酸化タンパク質の検出
一人の被験者（毛髪化学的処理経験なし）の毛髪の先端側を５センチの長さで４本採取し、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。１本目に対しては、ブリーチ処理、２本目に対してはパーマ処理（臭素酸ナトリウム系）、３本目に対してはパーマ処理（過酸化水素系）、最後の４本目に対しては何の処理も行わなかった。ブリーチ処理は、以下に示す処方２のＡ剤、Ｂ剤、Ｃ剤を４：６：１の割合で混合し、毛髪をその中に室温で３０分浸した。この作業を４回繰り返した。パーマ処理（臭素酸ナトリウム系）は、以下に示す処方３の１液に３０℃で１０分間浸して、３０秒水洗いし、２液（臭素酸ナトリウム系）に３０℃で１０分間浸した。パーマ処理（過酸化水素系）は、処方３の１液に３０℃で１０分間浸して、３０秒水洗いし、３液（過酸化水素系）に３０℃で５分間浸した。ブリーチ処理、パーマ処理を行った毛髪は、最後に、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。それらを乾燥させた後に、アロンアルファでスライドガラスに固定した。それを２０μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジドの１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）に室温で１時間反応させた。反応終了後はＰＢＳにて充分に洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、画像を１サンプルにつき８枚ずつ取り込んだ。数値化に際しては、画像から毛髪と背景を分離し、毛髪の平均輝度を求めた。
処方２（ブリーチダメージ用のブリーチ剤処方）
Ａ剤    原料名                              配合量（質量％）
アンモニア水（２８％）                  ３．６０
イオン交換水                          ９６．４０      
合計                                １００．００
Ｂ剤    原料名                              配合量（質量％）
過酸化水素（３０％）                  ２０．００
リン酸（一級）                          ０．２０
リン酸水素二ナトリウム（無水）          ０．２０
スズ酸ナトリウム                        ０．０２
メチルパラベン                          ０．０５
イオン交換水                          ７９．５３      
合計                                １００．００
Ｃ剤    原料名                              配合量（質量％）
過硫酸カリウム                        ７４．２２
メタケイ酸ナトリウム                  １７．６２
硫酸アンモニウム                        １．９１
ピロリン酸ナトリウム                    ６．２５      
合計                                １００．００
処方３（パーマダメージ用のパーマ剤処方）
１剤    原料名                              配合量（質量％）
チオグリコール酸アンモニウム
液（５０％）                          １２．９０
モノエタノールアミン                    ０．９０
炭酸アンモニウム（一級）                ２．８０
尿素                                    １．００
ＥＤＴＡ・３Ｎａ                        ０．１０
ラウリルジメチルアミノ酢酸
ベタイン（４０％）                      ０．３０
イオン交換水                          ８２．００      
合計                                １００．００
２剤（臭素酸ナトリウム系）
原料名                              配合量（質量％）
臭素酸ナトリウム液（２０％）          ４０．００
リン酸水素カリウム                      ０．３０
リン酸水素二ナトリウム（１２水）        ０．２０
イオン交換水                          ５９．３０      
合計                                １００．００
３剤（過酸化水素系）
原料名                              配合量（質量％）
過酸化水素水（３１％）                  ６．４５
リン酸（１％）                          ２．００
リン酸水素二ナトリウム（１２水）        ０．０３
イオン交換水                          ９１．５２      
合計                                １００．００
図４に各毛髪の平均輝度の結果を示す。パーマ処理、ブリーチ処理、ともに毛髪酸化タンパクの亢進が観察された。また、興味深いことに、過酸化水素系のパーマ処理の方が、臭素酸ナトリウム系のパーマ処理よりも酸化タンパクが多く観察された。これは、パーマ処理の方法が異なると毛髪が受ける酸化の度合いが異なることを反映しているものと考えられる。
［実施例４］
ダンシルヒドラジンによる毛髪酸化タンパク質の検出
一人の被験者（毛髪化学的処理経験なし）の毛髪の先端側を５センチの長さで４本採取し、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。１本目に対しては、ブリーチ処理、２本目に対してはパーマ処理（臭素酸ナトリウム系）、３本目に対してはパーマ処理（過酸化水素系）、最後の４本目に対しては何の処理も行わなかった。ブリーチ処理は、処方２のＡ剤、Ｂ剤、Ｃ剤を４：６：１の割合で混合し、毛髪をその中に室温で３０分浸した。この作業を４回繰り返した。パーマ処理（臭素酸ナトリウ厶系）は、処方３の１液に３０℃で１０分間浸して、３０秒水洗いし、２液（臭素酸ナトリウム系）に３０℃で１０分間浸した。パーマ処理（過酸化水素系）は、処方３の１液に３０℃で１０分間浸して、３０秒水洗いし、３液（過酸化水素系）に３０℃で５分間浸した。ブリーチ処理、パーマ処理を行った毛髪は、最後に、洗浄剤（処方１）に室温で１０分間浸して洗浄し、その後１時間水に浸してすすぎを行った。それらを乾燥させた後に、アロンアルファでスライドガラスに固定した。それを５０μＭのダンシルヒドラジンの１００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）に室温で１時間反応させた。反応終了後はＰＢＳにて充分に洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、画像を１サンプルにつき４枚ずつ取り込んだ。数値化に際しては、画像から毛髪と背景を分離し、毛髪の平均輝度を求めた。
図５に各毛髪の平均輝度の結果を示す。パーマ処理、ブリーチ処理、ともに毛髪酸化タンパクの亢進が観察された。また、興味深いことに、過酸化水素系のパーマ処理の方が、臭素酸ナトリウム系のパーマ処理よりも酸化タンパクが多く観察された。これは、パーマ処理の方法が異なると毛髪が受ける酸化の度合いが異なることを反映しているものと考えられる。
［実施例５］
本方法を用いて、健常黒髪及びブリーチ毛の紫外線による毛髪ダメージの定量を行った。
（１）実験１
紫外線照射条件は、医療用紫外線蛍光ランプ（ＵＶ−Ｂ）［ＦＬ２０Ｓ・Ｅ−３０／ＤＭＲ］３本を対象から１５ｃｍの高さに設定した。（０．６４１ｍＷ／ｃｍ２）
サンプルは４水準
▲１▼健常黒髪
▲２▼ブリーチ毛１（健常黒髪にブリーチ処理１５分行ったもの）
▲３▼ブリーチ毛２（健常黒髪にブリーチ処理３０分行ったもの）
▲４▼ブリーチ毛３（健常黒髪にブリーチ処理３０分×２回行ったもの）
上記４水準の毛髪を洗髪乾燥後、未照射と照射の２つに分け、照射サンプルのほうは、紫外線照射を７０時間行った。照射後のサンプルは未照射のサンプルとあわせて洗浄し、本方法で毛髪の損傷評価を行った。得られた平均輝度を用いて以下の式を用いてヘアサンダメージを数値化した。
式：ヘアサンダメージ
＝照射毛髪平均蛍光輝度−未照射毛髪平均蛍光輝度
その結果を図６に示す。
結果：メラニンの少なくなったブリーチ毛２及び３で、大きなヘアサンダメージが確認された。ブリーチの処理時間に依存して毛髪内部のメラニン量が減少する事から、ブリーチ毛ではメラニンの現象により、紫外線に対する防御力の低下が考えられる。
また、本試験法が毛髪の損傷評価に適していることがわかる。
今後の実験は影響力が大きいブリーチ毛３にて実験を行った。
（２）実験２
ブリーチ処理３０分×２回の毛髪を対象に実験を行った。
紫外線照射条件は、人工太陽照明灯ＳＯＬＡＸ  ５００ＷのＸＣ−５００Ｂ形（セリック株式会社）製の照明１つを対象から４０ｃｍの高さに設定した。
（ＵＶ強度：５４Ｗ／ｍ２，ＵＶ照射量：２１０ＫＪ／ｍ２：ＵＶセンサー［東レテクノ（株）製］で測定）
照射水準は６水準（３，６，１２，２４，４８，７２時間）
ブリーチ毛を洗髪乾燥後、未照射と照射の２つに分け、照射サンプルのほうは、上記６水準にて人工太陽照射を行った。照射後のサンプルは未照射のサンプルとあわせて洗浄し、本方法で毛髪の損傷評価を行った。得られた平均輝度を用いて以下の式を用いてヘアサンダメージを数値化した。
式：ヘアサンダメージ
＝照射毛髪平均蛍光輝度−未照射毛髪平均蛍光輝度
その結果を図７に示す。
結果：人工太陽照明の照射時間に依存してヘアサンダメージが増加する事が確認された。よって、本試験法が紫外線による毛髪の損傷を評価するのに適している事がわかる。
以下は、実験の効率を考え、人工太陽照明１２時間照射で、抗酸化剤の効果を確認した。
（３）実験３
ブリーチ処理３０分×２回の毛髪を対象に実験を行った。
紫外線照射条件は、人工太陽照明灯ＳＯＬＡＸ  ５００ＷのＸＣ−５００Ｂ形（セリック株式会社）製の照明１つを対象から４０ｃｍの高さに設定し、１２時間照射を行った。
（ＵＶ強度：５４Ｗ／ｍ２，ＵＶ照射量：２１０ＫＪ／ｍ２：ＵＶセンサー［東レテクノ（株）製］で測定）
試験水準：８水準
▲１▼未塗布（イオン交換水）
▲２▼紅茶エキス（０．１％：香栄興行社製）
▲３▼ラベンダー抽出液（０．１％：香栄興行社製）
▲４▼ブドウ種子エキス（０．１％：キッコーマン製）
▲５▼トコフェロール（０．００１％）
▲６▼酢酸トコフェロール（０．００１％）
▲７▼チオタウリン（０．００１％）
▲８▼グリセリン（０．１％）
ブリーチ毛を洗髪乾燥後、未照射サンプル群と照射サンプルの２つに分けた。照射サンプルのほうは、上記８水準の試料に毛髪サンプルを１５分間浸漬し、引き上げ乾燥させた。乾燥後のサンプルに上記条件で人工太陽照明照射を行った。照射後のサンプルは未照射のサンプルとあわせて洗浄し、本方法で毛髪の損傷評価を行った。得られた平均輝度を、以下の式１と２を用いてヘアサンダメージ抑制効果を算出した。
0004116035.tif 000002
0004116035.tif 000003
便宜上、ヘアサンダメージ防御効果の評価基準は以下のように設定した。
Ａ：８０％以上
Ｂ：５０〜８０％未満
Ｃ：２０〜５０％未満
Ｄ：２０％未満
以下に調査した薬剤の効果を示す。
紅茶エキス：Ｂ，ラベンダー抽出液：Ｂ，ブドウ種子エキス：Ａ，トコフェロール：Ａ，酢酸トコフェロール：Ａ，チオタウリン：Ａ，グリセリン：Ｄ
結果：本方法は抗酸化剤のスクリーニング系にも適している事が判明した。
【図１】
0004116035.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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