(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
D,L-アミノ酸に、Crotalus adamanteus由来のL-アミノ酸酸化酵素を作用させて該D,L-アミノ酸中のL-アミノ酸をオキソ酸に分解し、残存するD−アミノ酸を分離することを特徴とするD−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
D,L−アミノ酸がL−アミノ酸よりラセミ化反応により製造されるものであることを特徴とする請求項１に記載のD−アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬・農薬中間体或いは抗生物質の修飾剤として有用なＤ−アミノ酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−アミノ酸は非天然型の光学活性アミノ酸であり、製造が困難な化合物として知られている。これまでに、Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸との物理的性質の違いを利用した析晶法によって、D,L−アミノ酸から製造されていた。しかし、両者は共にアミノ酸であるため物理的性質の差は小さく、Ｄ−アミノ酸の分離精製には極めて厳密な条件の設定が必要である。
【０００３】
また、アシル−D,L−アミノ酸にＬ−アミノ酸アシラーゼを作用させ、アシル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に分解し、アシル−Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を分離後、アシル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する方法、５−置換ヒダントインに酵素を作用させる方法（特開昭55−104890、特開昭55−114292など）、アシル−D,L−アミノ酸にＤ−アミノ酸アシラーゼを作用させ、アシル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に分解し、アシル−Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸を分離する方法（特公昭53−36035）等が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アミノ酸とアミノ酸の誘導体の物理的性質の差も必ずしも十分ではないため、上述したようなアミノ酸とアミノ酸の誘導体の物理的性質の違いを利用するこれらの方法においてもＤ−アミノ酸の分離精製は極めて厳密な条件設定が必要である。
【０００５】
更にまた、他の方法においても原料基質が高価であることや、工程が煩雑であること等や、生成物の収率、光学純度が低い等の問題点があり、更に低コストのＤ−アミノ酸を製造法が求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、D,L−アミノ酸のうち目的化合物でないＬ−アミノ酸の物理的性質を目的化合物であるＤ−アミノ酸の物理的性質と大きく異なる化合物に変換し、Ｄ−アミノ酸の分離精製を簡便化する方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは温和な条件下でL−アミノ酸を物理化学的性質の大きく異なり、かつ水溶性の向上した化合物に変換するための方法を鋭意研究を行った結果、D,L−アミノ酸を基質として用い、L−アミノ酸酸化酵素を用いてL−アミノ酸をオキソ酸に分解することにより、未分解のD−アミノ酸のみを容易に析出させることが可能となることを見い出し、D−アミノ酸を簡便に単離精製して製造する方法を確立した。
【０００８】
即ち、本発明は対応するオキソ酸に変換する反応を触媒するL−アミノ酸酸化酵素を、D,L−アミノ酸に作用させた後、残存するD−アミノ酸を分離することを特徴とするD−アミノ酸の製造法である。
【０００９】
以下本発明について詳しく述べるが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００１０】
本発明の基質として使用できるD,L−アミノ酸としては、例えば、D,L−グルタミン酸、D,L−バリン、D,L−アスパラギン酸、D,L−メチオニン、D,L−ロイシン、D,L−イソロイシン、D,L−ヒスチジン、D,L−アルギニン、D,L−フェニルアラニン、D,L−チロシン、D,L−トリプトファン、D,L−アラニン、D,L−セリンなどが挙げられる。これらのD,L−アミノ酸はＬ−アミノ酸を適当な手段を用いてラセミ化した後に用いることもできる。ラセミ化方法としては、例えば加熱する方法、ラセマーゼを使用する方法などが挙げられる。
【００１１】
本発明に使用できる酵素は、L−アミノ酸を他の化合物に変化させ、当該化合物と残存するD−アミノ酸の物理化学的性質などの違いによりこれらを分離できるものである。L−アミノ酸酸化酵素（EC 1.4.3.2）、L−グルタミン酸酸化酵素（EC 1.4.3.11）、L−リジン酸化酵素（EC 1.4.3.14）などが挙げられる。これらの酵素はその基質特異性を加味し、基質として使用されるD,L−アミノ酸に対応して選択することができる。
【００１２】
更に具体的には、既に報告されているCrotalus adamanteus［J. Biol. Chem., 235, 2013-2018(1960)］、Neurospora属［J. Biol. Chem., 50, 258-2268(1951)］、Proteus属（特公昭45-16789）、Colletotrichum属（特公昭62-43671）、Streptomyces属（特公昭59-26267）、Cryptococcus属（特公平５-61909、特公平６-46939）、Trichoderma属（特開平8-509367）のＬ−アミノ酸酸化酵素、Streptomyces属（特公昭59-26267、特公昭61-26357、特公平４-28353）のＬ−グルタミン酸酸化酵素、Trichoderema属［J. Biol. Chem., 255, 976-981(1980)］のＬ−リジン酸化酵素等が使用できる。より好ましくはCrotalus adamanteus由来のＬ−アミノ酸酸化酵素が使用できる。
【００１３】
本発明の反応の条件は、使用する酵素により異なるが、通常pH7〜10、温度25〜55℃の範囲で実施される。pHは、反応中のpH変動を、酸、アルカリを添加しながらコントロールしてもよいが、通常トリス−塩酸等の緩衝液を使用してもよい。反応後、目的とするＤ−アミノ酸は、反応液を濃縮したりＬ−アミノ酸から生成したオキソ酸とＤ−アミノ酸の各種溶媒に対する溶解性の差を利用するなどの方法により、反応液から容易に分離精製することができる。分離手段としてはろ過、或いは遠心分離などの方法が利用できる。
【００１４】
試験例１    ＨＰＬＣによるＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の分析
Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸分析は、0.1Ｍのロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、グルタミン酸、フェニルアラニンの各Ｄ，Ｌ−アミノ酸を50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、この溶液を精製水で100倍希釈後、SUMICHIRAL AO-5000を用いて下記の条件にてＨＰＬＣを行い、その溶出パターン、溶出時間及びピーク面積より分析した。
【００１５】
Solvent - A : 2 mM CuSO4 / ５% Isopropylalcohol
Solvent - B : 2 mM CuSO4 / 10% Isopropylalcohol
Flow rate   : 0.5 mL / min
Absorbance  : 254 nm
【００１６】
その結果、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、グルタミン酸は、Solvent - A でＤ体とＬ体の分離が可能であった。（図１から図５を参照）また、フェニルアラニンは Solvent - B で 分離可能であった。（図６を参照）
【００１７】
試験例２    Ｌ−アミノ酸酸化酵素によるＬ−アミノ酸の分解
25mMの各種アミノ酸（D,L−アミノ酸：D,L−ロイシン、D,L−イソロイシン、D,L−メチオニン、D,L−バリン、およびD,L−フェニルアラニン）を各々50mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）１mlに溶解し、基質溶液とした。
【００１８】
この基質溶液にＬ−アミノ酸酸化酵素（Crotalus adamanteus由来；Sigma Type I、0.55u/mg）２mgを添加し、30℃，17時間反応した後、１Ｍ−塩酸を60μl添加して反応を停止し、沈殿物は遠心分離にて除去した。反応液に未反応で残存するアミノ酸の光学体の種類及びその量は、得られた上澄液を精製水にて100倍希釈後HPLCにて求めた。
【００１９】
その結果、D,L−ロイシン、D,L−イソロイシン、D,L−メチオニン、D,L− バリン、およびD,L−フェニルアラニンのＬ体アミノ酸のみが、Ｌ−アミノ酸酸化酵素と反応しほぼ完全に分解され、反応終了液中にはＤ−アミノ酸のみが未反応アミノ酸として残存することが明かとなった。（図７から図１１を参照）
【００２０】
試験例３    Ｌ−アミノ酸酸化酵素によるＬ−グルタミン酸の分解
25mM D,L−グルタミン酸を用いて、反応液のpHを７に調整し、Ｌ−グルタミン酸酸化酵素を用いて試験例２と同様に反応を行った。その結果、試験例２と同様にＬ−グルタミン酸のみが分解され、Ｄ−グルタミン酸のみが反応液中に未反応化合物として残存することが明かとなった。（図１２を参照）
【００２１】
以上の試験例１〜３により、各種D,L−アミノ酸のL体アミノ酸にアミノ酸酸化酵素を作用させることにより、L−アミノ酸のみを分解し、D−アミノ酸を反応液中に未反応化合物として残存させることが可能であることが明かとなった。また、反応開始時のアミノ酸濃度を溶解不可能な濃度まで高めても反応はスムーズに進行し、反応終了液にD−アミノ酸のみを未反応アミノ酸として残存させることも可能であった。
【００２２】
なお、本明細書中「％」はいずれも「重量／容量（ｇ／ｄｌ）」を意味するものとする。
【００２３】
【実施例】
実施例１
0.1Ｍ D,L−ロイシンを50mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）50mlに溶解後、そのpHを7.5に調整し、基質溶液とした。この基質溶液にＬ−アミノ酸酸化酵素（Crotalus adamanteus由来；Sigma Type I、0.55u／mg）100mgを添加し、30℃で24時間反応した。
【００２４】
その後、0.1Ｍに相当する各種D,L−アミノ酸と100mgのＬ−アミノ酸酸化酵素（いずれも粉末状）を24時間反応ごとに添加しながら４日間反応した。
【００２５】
その結果、共存するＬ−ロイシンはいずれも24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−ロイシンは完全に消失し、Ｄ−ロイシンのみが未反応アミノ酸として残存した。（図１３を参照）
【００２６】
また、Ｄ−ロイシンの残存量は98.7％であり、Ｄ−ロイシンは殆ど分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−ロイシンのうち、約50mMに相当する量が既に結晶状に析出しており、反応液をさらに濃縮することによりＬ−ロイシンを全く含有しないＤ−ロイシンを析出させることができた。さらに、析出したＤ−ロイシンを濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約95％で精製されたＤ−ロイシンを得ることができた。
【００２７】
実施例２
D,L−イソロイシンを基質として用いて実施例１と同一の条件でＤ−イソロイシンの調製を検討した。その結果、0.1M L−イソロイシンも24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−イソロイシンは完全に消失し、Ｄ−イソロイシンのみが未反応アミノ酸として残存した。（図１３を参照）
【００２８】
また、Ｄ−イソロイシンの残存量は100％であり、Ｄ−イソロイシンは全く分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−イソロイシンのうち、約20mMに相当する量が既に結晶状に析出しており、反応液をさらに濃縮することによりＬ−イソロイシンを全く含有しないＤ−イソロイシンを析出させることができた。さらに、析出したＤ−イソロイシンを濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約96％で精製されたＤ−イソロイシンを得ることができた。
【００２９】
実施例３
D,L−メチオニンを基質として用いて実施例１と同一の条件でＤ−メチオニンの調製を検討した。その結果、0.1M L−メチオニンも24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−メチオニンは完全に消失し、Ｄ−メチオニンのみが未反応アミノ酸として残存した。（図１３を参照）
【００３０】
また、Ｄ−メチオニンの残存量は92.4%であり、Ｄ−メチオニンは全く分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−メチオニンのうち、結晶状に析出している量は約４mMであったが、反応液を濃縮することによりＬ−メチオニンを全く含有しないＤ−メチオニンを析出させることができた。さらに、析出したＤ−メチオニンを濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約86％で精製されたＤ−イソロイシンを得ることができた。
【００３１】
実施例４
D,L−バリンを基質として用いて実施例１と同一の条件でＤ−バリンの調製を検討した。その結果、0.1M Ｌ−バリンも24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−バリンは完全に消失し、Ｄ−バリンのみが未反応アミノ酸として残存した。（図１３を参照）
【００３２】
また、Ｄ−バリンの残存量は100％であり、Ｄ−バリンは全く分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−バリンのうち、結晶状に析出している量は約３mMであったが、反応液を濃縮することによりＬ−バリンを全く含有しないＤ−バリンを析出させることができた。さらに、析出したＤ−バリンを濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約96％で精製されたＤ−バリンを得ることができた。
【００３３】
実施例５
D,L−フェニルアラニンを基質として用いて実施例１と同一の条件でＤ−フェニルアラニンの調製を検討した。その結果、0.1M Ｌ−フェニルアラニンも24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−フェニルアラニンはほぼ消失し、Ｄ−フェニルアラニンが未反応アミノ酸として残存した。（図１３を参照）
【００３４】
また、Ｄ−フェニルアラニンの残存量は100％であり、Ｄ−フェニルアラニンは全く分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−フェニルアラニンのうち、約48mMに相当する量が既に結晶状に析出しており、反応液をさらに濃縮することによりＬ−フェニルアラニンを全く含有しないＤ−フェニルアラニンを析出させることができた。さらに、析出したＤ−フェニルアラニンを濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約95％で精製されたＤ−フェニルアラニンを得ることができた。
【００３５】
実施例６
Ｌ−フェニルアラニン 1.0gを２Ｎ−水酸化ナトリウム 50mlに溶解し、封管中150℃で５時間加熱した。放冷後、この溶液を２Ｎ−塩酸で中和し、析出した結晶をろ過、水洗し、乾燥した。得られた結晶は、ラセミ化されたD,L−フェニルアラニンで、その比率は、Ｄ：Ｌ＝46：54 であった。ここで得られたD,L−フェニルアラニン 920mgを用いて、実施例５と同一の条件でＤ−フェニルアラニンの調製を行った。その結果、415mgの精製されたＤ−フェニルアラニンを得た。（Ｌ−フェニルアラニンからの収率42％）
【００３６】
実施例７
D,L−グルタミン酸を基質として用いて実施例１と同一の条件でＤ−グルタミン酸の調製を検討した。その結果、0.1M Ｌ−グルタミン酸も24時間以内にＬ−アミノ酸酸化酵素（100mg）によってほぼ完全に分解され、４日間反応した反応液においてもＬ−グルタミン酸は完全に消失し、Ｄ−グルタミン酸のみが未反応アミノ酸として残存した。
【００３７】
また、Ｄ−グルタミン酸の残存量は100％であり、Ｄ−グルタミン酸は全く分解されなかった。また、反応液に残存するＤ−グルタミン酸のうち、約48mMに相当する量が既に結晶状に析出しており、反応液をさらに濃縮することによりＬ−グルタミン酸を全く含有しないＤ−グルタミン酸を析出させることができた。さらに、析出したＤ−グルタミン酸を濾過にて集め、常法により精製した。その結果、回収率約92％で精製されたＤ−グルタミン酸を得ることができた。
【００３８】
実施例８
安価なＬ−グルタミン酸 ３gを200℃に４時間減圧下に加熱することにより、D,L−ピログルタミン酸 2.25gが得られた。これを、２Ｎ−塩酸で５時間加水分解を行うことにより、完全にラセミ化されたD,L−グルタミン酸 2.5gを得た。
【００３９】
ここで得られたD,L−グルタミン酸 2.25gを用いて実施例７と同一の条件でＤ−グルタミン酸の調製を行った。その結果、1.03gの精製されたＤ−グルタミン酸を得た。（Ｌ−グルタミン酸からの収率34％）
【００４０】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明にかかるＬ−アミノ酸酸化酵素を利用するＤ−アミノ酸の製造法は、物性の異なる化合物への変換により反応液からの分離精製が可能となり、効率よく、目的とするD-アミノ酸を得ることができるため、実用的な製造法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１のD,L−ロイシンのＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図２】試験例１のD,L−イソロイシンのＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図３】試験例１のD,L−メチオニンのＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図４】試験例１のD,L−バリンのＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図５】試験例１のD,L−グルタミン酸のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図６】試験例１のD,L−フェニルアラニンのＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図７】試験例２のD,L−ロイシンを用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図８】試験例２のD,L−イソロイシンを用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図９】試験例２のD,L−メチオニンを用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図１０】試験例２のD,L−バリンを用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図１１】試験例２のD,L−フェニルアラニンを用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図１２】試験例３のD,L−グルタミン酸を用いた場合のＨＰＬＣの溶出パターンを示す図である。
【図１３】実施例１〜実施例５の結果を示す図である。
【符号の説明】
図中で−●−はＬ−アミノ酸の残存量を示し、−○−はＤ−アミノ酸の残存量を示す。
【図１】
0004125809.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004125809.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0004125809.tif 000011
【図１１】
0004125809.tif 000012
【図１２】
0004125809.tif 000013
【図１３】
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