(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量８,５００〜９,５００を有する中分子ヘパリンと、一般式：
ＮＨ２ＣＨ(Ｒ１)ＣＯＯＲ２
［式中、Ｒ１は、
・Ｈ；
・アミノ酸のα−アミノ基のＮおよびα位のＣと共にピロリジン環を形成するか；または、
・ＯＨで置換されていてもよいフェニル、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グアニジノ、インドリルおよび１Ｈ−イミダゾリルからなる群から選ばれる基で置換されていてもよい低級アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルである］
で示されるアミノ酸誘導体がカルボキシル基にアミド結合してなる中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
【請求項２】
アミノ酸が天然のアミノ酸である、請求項１記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
【請求項３】
アミノ酸が必須アミノ酸である、請求項２記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
【請求項４】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする抗凝血活性医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする腎メサンギウム細胞増殖抑制活性医薬組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする癌転移抑制活性医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする補体活性化抑制活性医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする肺水腫抑制活性医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする腎疾患治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とするラジカルスカベンジャー活性医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とするアレルギー性疾患予防および治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、中分子ヘパリンのアミノ酸誘導体に関する。より具体的には、中分子ヘパリニル−アミノ酸または−アミノ酸低級アルキルエステルに関する。また、本発明は、中分子ヘパリンのアミノ酸誘導体を有効成分とする医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ヘパリンは、肝、小腸、肺、皮膚などに存在する複雑な構造をもつヘテロ多糖であり、分子量4,000〜20,000の酸性ムコ多糖である。すなわち、糖鎖はＤ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸を含んでおり、グルコサミンのアミノ基は部分的に硫酸エステルになっている。強い血液抗凝固活性を有しており、汎発性血管内血液凝固症候群(ＤＩＣ)の治療、種々の血栓塞栓症(静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、術中・術後の血栓塞栓症など)の治療および予防のほか、血液透析・人工心肺などの体外循環装置使用時や血管カテーテル挿入時または輸血および血液検査の際などにおける血液凝固の防止に用いられている。
【０００３】
しかし、ヘパリンは抗Ｘa活性に基づく強力な血液抗凝固作用を有することから、血液凝固時間の延長に伴う出血傾向の憎悪という重篤な副作用がある。また、脂質分解作用による高中性脂肪血症や遊離脂肪酸増加、低ＨＤＬ血症、あるいは長期連用による血小板減少症の発症も知られている。
【０００４】
一方、血液体外循環時の灌流血液の凝固防止やＤＩＣの治療には、メシル酸ガベキサートやメシル酸ナファモスタットなどの蛋白分解酵素阻害剤も用いられているが、これらの薬剤は、代謝産物であるグアニジン化合物によって消化器障害が発現する。さらに、分子量が539ダルトンと小さく、ダイアライザーから透析除去されるため、回路内凝血、特にダイアライザー後の静脈側ドリップチャンバー内で凝血が発生する。
【０００５】
近年、ヘパリンの解重合により得られる分子量約5,000ダルトン以下の低分子量分画である低分子ヘパリン(ダルテパリンナトリウム)に、血液凝固第Ｘ因子に対する阻害活性及び活性化部分トロンボプラスチン時間に対する延長作用の比率の増大が確認され、出血傾向が比較的少ない血液抗凝固剤として使用されつつある。しかしながら、この低分子ヘパリン製剤によっても前記の副作用を完全に改善するには至っておらず、また、高用量での使用においてヘパリンよりも高い頻度で骨多孔症が発生することが認められている。
【０００６】
また、ヘパリンとグリシンとの化合物であるヘパリニルグリシンが、出血傾向の少ない血液抗凝固剤であることが報告されているが、このものは血液抗凝固活性も低下してしまうという問題点があるため、実用化されるには至っていない。
【０００７】
以上のように、上記のヘパリンをはじめとする血液抗凝固剤は、出血傾向の増大という重篤な副作用などが発現するおそれがあるものの、特に、血液透析・人工心肺などの体外循環装置使用時の血液凝固防止には欠かせない薬剤であり、また、代替すべき適当な他の薬物もないことから、ある程度の危険性を承知の上で、使用せざるを得ないのが現状であった。
【０００８】
一方、ヘパリンは前述の血液抗凝固活性の他に、リポ蛋白リパーゼ活性化作用、抗血小板凝集作用、血圧低下作用、抗補体作用、癌転移抑制作用および肥満細胞からの脱顆粒阻害作用などの多くの生理活性を有することが知られている。しかしながら、血液抗凝固活性に伴う出血傾向があまりに強いため、血液抗凝固目的以外に用いることはできなかった。
【０００９】
本発明者らは、出血傾向などの副作用の少ない血液抗凝固剤について検討した結果、ヘパリンを解重合して平均分子量８,５００〜９,５００の中分子ヘパリンの画分を採取し、さらにこの中分子ヘパリンをアミノ酸誘導体化した化合物がこの目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、本来ヘパリンが有している各種の生理活性を損なうことなく、出血傾向を軽減することができるため、従来、重篤な副作用ゆえに適用できなかった種々の疾病に対しても有効に使用することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様は平均分子量８,５００〜９,５００を有する中分子ヘパリンである。
【００１１】
本発明の第２は上記の中分子ヘパリンから誘導される中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体であり、より具体的には、中分子ヘパリニルアミノ酸または中分子ヘパリニルアミノ酸低級アルキルエステルである。
【００１２】
さらに、具体的には、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体が、
一般式：ＮＨ2ＣＨ(Ｒ1)ＣＯＯＲ2
［式中、Ｒ1は、Ｈ；アミノ酸のα−アミノ基のＮおよびα位のＣと共にピロリジン環を形成するか；または、ＯＨで置換されていてもよいフェニル、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、グアニジノ（ＮＨ2Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ−）、インドリルおよび１Ｈ−イミダゾリルからなる群から選ばれる基で置換されていてもよい低級アルキルであり、Ｒ2は、Ｈまたは低級アルキルである］で示される化合物である。
【００１３】
本発明のアミノ酸は、好ましくは天然のアミノ酸であるか、より好ましくは必須アミノ酸である。
【００１４】
本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体には抗凝血活性および腎メサンギウム細胞増殖抑制活性、癌転移抑制活性、補体活性化抑制活性、肺水腫抑制活性、腎疾患抑制活性、ラジカルスカベンジャー活性および肥満細胞からの脱顆粒阻害作用を示すことが確認されているところから、本発明の第３の態様は、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を含むこれらの活性を有する医薬組成物である。
【００１５】
本発明で用いる中分子ヘパリンは、解重合ヘパリンの平均分子量８,５００〜９,５００の画分をいう。最小分子量が４,５００、最大分子量１２,５００であり、分子量５,０００〜１０,０００が中分子ヘパリン中７０％以上のものをいう。
【００１６】
また、本発明で用いるアミノ酸は、合成物、天然物を問わずアミノ基とカルボキシル基を有する化合物であれば特に制限はないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンなどのα−アミノ酸またはその誘導体類が好適に用いられる。これらのアミノ酸はＤ体、Ｌ体またはＤＬ体のいずれでもよい。
本発明の低級アルキルとは飽和の直鎖または分枝状の、炭素原子１〜６個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個を含む炭化水素残基をいう。例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどが包含される。
本発明の化合物には一般に生体内において遊離形と実質的に同様の生理活性または薬理活性を発揮するもの、例えば、本発明の化合物の誘導体および医薬的に許容される塩、付加塩、水和物などは本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【００１７】
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の製造
（１）中分子ヘパリンの調製
通常のヘパリンを酵素分解法、亜硝酸分解法、過酸化水素分解法などの常法により解重合した後に、例えば、限外濾過などの分画手段を用いて分画したもので、平均分子量が８,５００〜９,５００の画分からなる。
【００１８】
例えば、ヘパリンを水に溶解し、陽イオン交換樹脂を加えてｐＨ３.３０〜３.４０とした後、濾過する。濾液に過酸化水素水を加え、加圧加熱して解重合する。加熱終了後、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて、限外濾過を繰り返して分子量分画を行う。エタノールによる再結晶を行い、中分子ヘパリンを得る。
【００１９】
（２）中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の調製
前述の中分子ヘパリンを、例えば、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を用いてカルボキシル基をエステル化した後、上記アミノ酸のエステル体を加えて中分子ヘパリニルアミノ酸エステルとし、さらにアルカリ条件下で加水分解して中分子ヘパリニルアミノ酸を得る。
例えば、中分子ヘパリンを水に溶解し、ｐＨ４.７５に調整後、対応するアミノ酸エステル塩酸塩（中分子ヘパリンに対するモル比、１：１００）を加える。
【００２０】
さらに、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（中分子ヘパリンに対するモル比、１：５０）の水溶液を徐々に加え、約４時間攪拌反応させた後、水および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液をアンモニウム塩の沈澱物が生じなくなるまで加える。
次いでこの沈澱物を分離後、沈澱物にヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を加える。攪拌後、濾過し、沈澱物をエタノールで再結晶して、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸エステルを得る。
【００２１】
この中分子ヘパリニルアミノ酸エステルに水酸化ナトリウム水溶液を加え、窒素気流下、０〜５℃にて長時間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ５に調整後、濾過し、濾液にエタノールを加えて、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸を得る。
【００２２】
こうして得られる中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、通常の方法により製剤化し、注射剤や経口剤として投与することができる。
例えば以下のような投与法によって投与されるが、その投与量あるいは投与速度は、通常本剤投与後、全血凝固時間または全血活性化部分トロンボプラスチン時間を測定しつつ、年齢、症例、適応領域あるいは目的によって決定される。
【００２３】
例えば、静脈内点滴投与法では、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の５,０００〜５０,０００ヘパリン単位に相当する量を５％ブドウ糖注射液、生理食塩液またはリンゲル液１,０００ｍｌで希釈し、１分間に２０〜３０滴前後の速度で静脈内に点滴投与する。
また、静脈内間歇注射法では、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の５,０００〜５０,０００ヘパリン単位に相当する量を４〜８時間毎に静脈内に注射する。皮下注射・筋肉内注射法では、１回５,０００〜１０,０００ヘパリン単位に相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を４時間毎に皮下注射または筋肉内注射する。
【００２４】
体外循環時（血液透析・人工心肺）における使用において、人工腎では各患者の適正使用量は透析前のヘパリン感受性試験の結果に基づいて算出されるが、全身ヘパリン化法の場合、通常透析開始に先だって、１,０００〜３,０００ヘパリン単位に相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を投与し、透析開始後は、１時間あたり５００〜１,５００ヘパリン単位に相当する量を持続的に、または１時間毎に５００〜１,５００ヘパリン単位に相当する量を間歇的に追加する。局所ヘパリン化法の場合は、１時間あたり１,５００〜２,５００ヘパリン単位に相当する量を持続注入する。また、人工心肺灌流時では、術式・方法によって異なるが、１５０〜３００ヘパリン単位/kgに相当する量を投与し、更に体外循環時間の延長に応じて適宜追加投与する。
【００２５】
経口投与の場合は、５００〜２,０００ヘパリン単位/ｇに相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を１日１〜数回服用する。
外用剤の場合は、１００〜５００ヘパリン単位/ｇに相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の軟膏として用いられ、適量を１日１〜数回塗擦またはガーゼなどに延ばして貼付する。
【００２６】
座剤の場合は、１,０００〜４,０００ヘパリン単位/ｇに相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を１日１〜２回肛門または膣に適用する。
【００２７】
薬理実験
I. in vitroにおけるＡＰＴＴ測定
本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体における出血傾向の低減効果を調べるために、各化合物の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する影響を測定した。ヒト正常血漿(Ｃoagulation Ｃontrol Ｐlasma(Ｎormal)Ｌevel １：Ｐacific Ｈemostasis製)９容量に、種々の濃度に調製したヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体水溶液１容量を加えて被験血漿とする。別にＰＢＳ（−）１容量をとり、被験血漿と同様に操作し、対照血漿とする。
被験血漿および対照血漿につき、活性化部分トロンボプラスチン試薬（ＡＰＴＴテストワコー：和光純薬工業製）および塩化カルシウム溶液を添加後、血漿凝固時間自動測定器(Amelung-coagulometer)を用いて、各血漿のＡＰＴＴを測定した。結果を表１に示す。ヒト正常血漿におけるＡＰＴＴ延長作用は、いずれの化合物においてもヘパリンに比べて軽度であり、出血傾向が低下していることが明らかになった。
【００２８】
II．in vitro における抗Ｘa活性測定
本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の血液抗凝固活性を調べるために、各化合物の抗Ｘａ活性を測定し、ヘパリン、低分子ヘパリンおよび低分子ヘパリニルアミノ酸誘導体と比較した。なお、低分子ヘパリンはヘパリンを常法により解重合したもの、また、低分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、この低分子ヘパリンを原料とし、前述の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の調製法に準じて製した。
ヒト正常血漿(Ｃoagulation Ｃontrol Ｐlasma(Ｎormal)Ｌevel １：ＰacificＨemostasis製)２容量に、種々の濃度に調製したヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体水溶液２容量を加え、さらに緩衝液(50mMの2−アミノ−2−ヒドロキシル−1,3−プロパンジオール、pH8.4)を６容量加えて被験血漿とする。
【００２９】
被験血漿につき、Ｘa因子、基質液および反応停止液を添加後、405nmにおける吸光度から残存するＸa因子を測定した。結果を表１に示す。
ＡＰＴＴおよび抗Ｘa活性の結果から、血液抗凝固能の指標となる抗Ｘa/ＡＰＴＴ活性比を求めた。結果を表１に示す。ヘパリンを解重合して中分子画分を選別し、さらにアミノ酸誘導体とすることにより、血液抗凝固活性を維持しつつ、重篤な出血傾向を軽減できることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
0004047945.tif 000002
【００３１】
副作用の指標であるＡＰＴＴについては、本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、いずれも、血液凝固時間を１００秒に延長した濃度は、ヘパリンの６〜１７倍であり、ヘパリンと比較して明らかな副作用の低減が認められた。また、低分子ヘパリン（１３.５７）との比較においても同等若しくはそれ以上の副作用の低減が確認された。
従来、低分子ヘパリンの血液抗凝固作用の指標として、抗Ｘa／ＡＰＴＴ活性比が用いられ、この比が高いほど出血傾向が弱く、かつ血液抗凝固能が強いとされている（長沼信治ら、医学ジャーナル、第２７巻、５５頁、１９９１年）。通常のヘパリンを１としたときの抗Ｘa／ＡＰＴＴ活性比は、中分子ヘパリニルプロリンが２.１４と高活性を示した他、低分子ヘパリニルアミノ酸に比べて同等若しくはそれ以上の活性を示した。
【００３２】
III．中分子ヘパリニルアミノ酸の腎メサンギウム細胞増殖抑制効果
近年、ヘパリンの薬理作用の一つとして、腎メサンギウム細胞の増殖抑制効果が報告されていることから（Ｃastellot,Ｊ.Ｊ.et al.,アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａm.Ｊ.Ｐathol.）,第１２０巻、４２７頁、１９８５年）、ヘパリンの有するこの腎メサンギウム細胞増殖抑制効果について、中分子ヘパリニルアミノ酸のうち、中分子ヘパリニルフェニルアラニンを被験薬物とし、ヘパリンを対照として検討した。
【００３３】
（１）糸球体および腎メサンギウム細胞の培養
糸球体は種類の異なる篩を連続的に用いる方法（sieving method）により単離した。
体重約１５０ｇのＷistar系雄性ラット（日本チャールス・リバー）をエーテルで麻酔し、背部を剃毛した後、頸動脈を切断し、放血した。放血終了後、ラットをクリーンベンチ内に入れ、背部側から腎臓を摘出し、ＰＢＳ（−）（カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液）を満たしたシャーレに保存した。腎臓の被膜を剥離し、腎皮質を細切した。この細片を金属篩（篩サイズ３５５μｍ、１２５μm、７５μmの順）上に置き、スパーテルで押し潰しながら篩を通過させ、篩サイズ７５μmの篩上に残った糸球体を回収しＰＢＳ（−）に懸濁した。この懸濁液を１０００rpmで５分間遠心分離し、上澄を除去し、得られた糸球体を０.２％トリプシン液で３７℃、２０分間、さらに０.１％コラゲナーゼ液で３７℃、４０分間インキュベーションした。その後、糸球体を洗浄し、２０％牛胎児血清（Ｂiowhittaker製）および０.６６Ｕ／mlのインスリンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培養液（日水製薬製）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。
培養７日目に培養液を交換し、それ以降は２〜３回／週の頻度で培養液を交換した。培養２１日目に糸球体周囲に増殖した腎メサンギウム細胞を培養フラスコからトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離し、継代した。本実施例では、第３〜１０継代細胞を用いた。
【００３４】
（２）腎メサンギウム細胞増殖に対する中分子ヘパリニルフェニルアラニンの効果
腎メサンギウム細胞を２０％牛胎児血清添加培養液に加え、２４−ウェルのマイクロプレート（コーニング製）を用い、細胞数５〜８×１０3cell／wellの条件で２４時間培養した。さらに、０.４％牛胎児血清添加培養液に置換して３日間培養した後、１０％牛胎児血清添加培養液に置換し、被験薬物または対照薬物を添加した。４日後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離し、Ｃoulter Ｃounter（日科機製）を用いて細胞数を測定した。なお、各薬物の添加量は全容量の１／１０容量とした。
下式に示す制御率により腎メサンギウム細胞増殖に対する抑制効果を評価した。
【数１】
0004047945.tif 000003
【００３５】
実験の結果、対照のヘパリンは１〜１００μg／mlの用量において、腎メサンギウム細胞増殖を用量依存的に４０.５〜８３.５％抑制した。一方、中分子ヘパリニルフェニルアラニン１００μg／mlの抑制率は、９５.０％であり、腎メサンギウム細胞増殖抑制効果が認められた。
【００３６】
IV．中分子ヘパリニルアミノ酸の癌転移抑制効果
ヘパリンのグリシン誘導体であるヘパリニルグリシンに癌転移抑制効果作用が報告されていることから（Ｖillanueva,Ｇ.Ｂ.et al.,アナルズ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａnn.Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓci.）、第５５６巻、４９６頁、１９８９年）、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の癌転移抑制作用について、ヘパリンを対照とし、in vitroケモインベーションアッセイ法およびマウスの実験的腫瘍肺転移系を用いて検討した。
【００３７】
（１）癌細胞
Ｆidlerの方法（Ｆidler,Ｉ.Ｊ.,ネイチャー（Ｎature）,第２４２巻、１４８頁、１９７３年）に準じて作成した肺高転移性のＢ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ７またはＦ１０）を使用した。５％牛胎児血清含有Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培養液中、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した細胞を実験に供した。
【００３８】
（２）実験動物
生後７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣrj系マウス（日本チャールス・リバー）を使用した。
【００３９】
（３）癌転移抑制効果の検討
操作
▲１▼ケモインベーション誘発因子の調製
Ｓub−confluentな状態にある３Ｔ３細胞を無血清Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培地中で３７℃炭酸ガスインキュベーター内で２４時間培養後の培養上清を無血清Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培地で２倍希釈したものをケモインベーション誘発因子とした。
【００４０】
▲２▼in vitroケモインベーション法
２４穴プレートウェル内に上記で調製したケモインベーション誘発因子７００μlを入れ、チャンバー内には０.１％ＢＳＡ含有Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培地中に懸濁されたＢ１６−Ｆ７細胞５×１０4個（２００μl）を添加した。中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体をチャンバー内に５００μg／mlとなるように加え、２４穴プレートに蓋をした後、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間静置した。その後チャンバーを取り出し、チャンバー中のメンブレン下面に浸潤したＢ１６−Ｆ７細胞をギムザ染色後、メンブレンを切り出し、スライドグラス上に封入した。封入終了後、Ｂ１６−Ｆ７細胞を顕微鏡下（×２００）で、Ｍiller ocular discを用いて、０.２０２５mm2あたりの浸潤細胞数をカウントした。
【００４１】
結果
結果を表２に示す。表から明らかなように、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸は、メチオニンおよびフェニルアラニン誘導体以外すべて浸潤癌細胞数を減少させた。特に中分子ヘパリン、アスパラギン酸誘導体、セリン誘導体およびアルギニン誘導体については、ヘパリンを上回る浸潤癌細胞数抑制効果が確認された。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
（４）中分子ヘパリニルアスパラギン酸および中分子ヘパリニルセリンの癌転移抑制効果の検討
中分子ヘパリニルアスパラギン酸および中分子ヘパリニルセリンにつき、さらに検討を加えた。
Ｂ１６−Ｆ１０癌細胞（１×１０5個／マウス）を対照薬物（１０、３０、１００μg／マウス）または被験薬物（１００、３００、１０００μg／マウス）と同時にマウス尾静脈内に投与し、２０日後に肺を摘出して、癌細胞生着による肺結節数を測定した。同量の癌細胞と同容量の溶媒のみを投与する対照群および無処置正常群を設定し、比較した。一群の例数は６ないし７匹とした。また、同容量の対照薬物または被験薬物をマウス尾静脈内に投与し、その１時間後にネンブタール麻酔下腹部大動脈より採血（３.８％クエン酸ナトリウム溶液：血液＝１：９）し、遠心分離後、血漿サンプルを得た。この血漿サンプルに試薬を加え、アメルング−コアグロメーターＫＣ１０Ａ（アメルング製）を用いてＡＰＴＴを測定した。なお、対照として同容量（０.１ml）のＰＢＳ（−）（溶媒）を投与した群を設けた。一群の例数は３または５匹とした。
【００４４】
肺メラノーマ結節数の測定結果並びに当該投与量におけるＡＰＴＴ値を表３に示す。中分子ヘパリニルアスパラギン酸および中分子ヘパリニルセリンは、統計学的に有意（ｐ＜０.０１）な結節形成抑制効果を示した。ＡＰＴＴ値より判断して、ヘパリンでは出血助長の副作用のために癌転移抑制薬としての応用は不可能であるのに対し、中分子ヘパリニルアミノ酸は出血傾向が軽減されていることから、癌転移抑制薬としての臨床応用が期待できる。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
Ｖ．中分子ヘパリニルアミノ酸の補体活性化抑制効果
中分子ヘパリニルアミノ酸の抗補体作用について、classical pathwayの活性化に基づく感作ヒツジ赤血球の溶血反応を指標とし、メシル酸ナファモスタットを陽性対照として検討した。なお、被験薬物はin vitro試験ではゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）に、in vivo試験では生理食塩液に溶解して使用した。
【００４７】
生後６週齢の雄性Ｈartley系モルモット（日本チャールス・リバー）を購入し、１２時間の明暗サイクル（明期：７時〜１９時）、温度２３±２℃、湿度５０±５％の条件下で１週間の予備飼育後、実験に供した。実験当日までの予備飼育の期間は、自由に摂食・摂水させた。
【００４８】
（２）補体活性化抑制効果の検討
▲１▼in vitroにおけるモルモット補体classical pathway活性化による感作ヒツジ赤血球の溶血反応に対する作用
【００４９】
操作
５×１０8cells／mlの濃度になるように感作ヒツジ赤血球（デンカ生検）をＧＶＢに浮遊させる。この液２００μlにＧＶＢで溶解、希釈した補体（乾燥補体、デンカ生検）を加え、さらにＧＶＢを加えて全量１.５mlとした。３７℃の恒温槽中で１時間反応させた後に、３０００rpmで１０分間遠心分離し、上清のヘモグロビン量の測定波長５４２nmにおける吸光値を測定した（ＵＶＩＤＥＣ−７７Σ）。
同時に物理的溶血として補体の代わりにＧＶＢを加えたもの、及び１００％溶血として補体及びＧＶＢの代わりに純水を加えた検体の吸光値を測定した。
各被験薬物の作用検討は、補体の活性化による溶血率が約５０％となる条件下で行った。また、被験薬物の添加量は、全容量の１／１００容とした。
【００５０】
結果
ヘパリンは２〜５０μg／mlの用量において９.６〜８３.４％の溶血抑制作用を示し、そのＩＣ５０値は２０.１μg／mlであった。中分子ヘパリンも同様に、１０〜４００μg／mlの用量において、１０〜９７.８％の溶血抑制作用を示したが、そのＩＣ５０値は６６.８μg／mlとヘパリンの約３.３倍であり、作用の低下が認められた。
しかしながら、中分子ヘパリンにフェニルアラニンを導入した場合、ＩＣ５０値は中分子ヘパリンの０.０９倍の６.１μg／mlとなり、また、チロシンを導入した場合には、ＩＣ５０値は中分子ヘパリンの０.３２倍の２１.４μg／mlとなり、中分子ヘパリンに比べて溶血抑制作用は増強した（表４）。
【００５１】
▲２▼in vivoにおけるモルモット補体classical pathway活性化による感作ヒツジ赤血球の溶血反応に対する作用
操作
１０10cells／mlの感作ヒツジ赤血球浮遊液１mlをモルモット背中足静脈より静脈内投与し、その３分後に外頸静脈より０.５mlの血液を採取した。直ちに、その血液に０.０１％のＥＤＴＡ−Ｓalineを４.５ml加え、２０００rpmで１０分間遠心分離し、上清のヘモグロビン量の測定波長５４２nmにおける吸光値を測定した。被験薬物は感作ヒツジ赤血球投与の１分前に背中足静脈より静脈内投与した。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
結果
陽性対照であるメシル酸ナファモスタットは、０.１〜１.０mg／kgの静脈内投与によって８.５〜７６.６％の抑制作用を示した。中分子ヘパリニルフェニルアラニンも３〜３０mg／kgの静脈内投与によって２３.８〜９１.１％の溶血抑制作用を示した。中分子ヘパリニルアミノ酸は低分子ヘパリニルアミノ酸と比較すると明らかにより強力な溶血抑制効果および補体活性化抑制作用を示した。
【００５４】
VI．中分子ヘパリニルアミノ酸の肺水腫抑制効果
中分子ヘパリニルアミノ酸のサソリ毒誘発肺水腫抑制効果について検討した。
（１）実験動物
生後６週齢の雄性Ｗistar系ラット（日本チャールス・リバー）を購入し、１２時間の明暗サイクル（明期：７時〜１９時）、温度２３±２℃、湿度５０±５％および換気オールフレッシュ１５回／時間の条件下で１週間の予備飼育後、実験に供した。
【００５５】
（２）肺水腫抑制効果の検討
操作
Ｌineu,Ｆ.Ｍ.およびＩone,Ｍ.Ｄ.Ｍ.の方法（トキシコン(Ｔoxicon)、第３１巻、１２０７頁、１９９３年）に準じて操作した。すなわち、ラットにヘパリン、中分子ヘパリンまたは中分子ヘパリニルアミノ酸あるいは同容量のＳalineを静脈内に投与し、３０分後にサソリ毒（Ｔityus serrulatus venom,シグマ製）を静脈内に投与した。１時間後にラットを致死せしめ、瀉血後、肺を摘出し、湿重量を測定した。肺の湿重量よりＬＢＩ（Ｌung／Ｂody  Ｉndex：Ｌung  weight（g）×１００／Ｂody  weight（g））および炎光光度計（ＭＦ−３０３型、日本分光工業製）により肺組織中Ｎa+／Ｋ+比を求め、各被験化合物の肺水腫抑制効果を算定した。
一群の例数は４〜１４匹とし、群間の有意性は、Ｂartlett法にて分散の均一性を確認した後、Ｄuncan法により検定した。
【００５６】
結果
ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸のサソリ毒誘発肺水腫に対する抑制効果を表５に示した。
その結果、ヘパリンにはサソリ毒誘発肺水腫抑制効果は認められなかったが、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸はいずれも対照群に比べてＬＢＩを減少させ、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、チロシン誘導体では有意な肺水腫抑制効果が確認された。また、フェニルアラニン、ヒスチジン、アルギニンおよびチロシン誘導体では、Ｎa+／Ｋ+比の値においても改善効果が認められた。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
VII．中分子ヘパリニルアミノ酸の腎疾患治療効果
微小変化型ネフローゼ症候群に近似した病態を生ずることが知られているピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）腎疾患モデルを用い、被験薬物に中分子ヘパリニルフェニルアラニンを選択し、中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の腎疾患治療効果について検討した。
【００５９】
（１）実験動物
生後６週齢の雄性Ｃｒｊ：ＣＤ系ラット（日本チャールス・リバー）を使用した。
【００６０】
（２）腎疾患抑制効果の検討
ラットをエーテルで麻酔し、先端にシリコンチューブ（内径０.７mm、外径１.３mm、イマムラ製）を付けたアルザ浸透圧ポンプ（モデル２００２、アルザ製）を頸部皮下に埋め込んだ。シリコンチューブは右頸静脈内に挿入固定した。ラットが覚醒した後、１００mg/kgのＰＡＮを腹腔内に単回投与して腎疾患を惹起した。腎疾患惹起後１、４、７、１０および１４日目にラットを代謝ケージ内に収容して採尿し、尿量および尿中蛋白濃度（マイクロＴＰ−テストワコー、和光純薬工業製）を測定し、尿中蛋白排泄量／日を算出した。
中分子ヘパリニルフェニルアラニンの投与量は０.３、１および３mg/kg/dayとし、投与期間は２週間とした。各群の動物数は６例とした。結果を表６に示す。その結果、中分子ヘパリニルフェニルアラニン、３mg/kg/day投与群において、４日目以降に有意な尿中蛋白排泄抑制効果が認められた。これは文献によるヘパリンの尿中蛋白排泄抑制効果を大幅に凌駕するものであった。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
VIII．中分子ヘパリニルアミノ酸のラジカルスカベンジャー効果
ヘパリンは、ラジカルスカベンジャーとしての作用を有することが報告されている（Hiebert,L.M.、Liu,Ji-min、アテロスクレローシス（Atherosclerosis）、第８３巻、４７頁、１９９０年）そこで、キサンチン（Ｘ）およびキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）を用い、これらの化合物から発生したフリーラジカルによる培養細胞の傷害に対するラジカルスカベンジャーとしての中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の傷害抑制効果を検討した。
【００６３】
（１）培養細胞
培養細胞にはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣ：大日本製薬製）を使用し、２０％ウシ胎児血清、ウシ脳抽出液、Epidermal Growth Factor（ＥＧＦ）、ハイドロコーチゾン、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンを含むヘパリンフリーの血管内皮細胞培養用添加因子セット（ＥＧＭ−ＭＶ添加因子セット：三光純薬製）を含有するＭ−１９９培地（大日本製薬製）を用いて培養した。
【００６４】
（２）ＨＵＶ−ＥＣがフリーラジカルによって受ける傷害に対する中分子ヘパリニルフェニルアラニン、中分子ヘパリニルチロシンおよび中分子ヘパリニルロイシンの効果
フラスコ内でサブコンフルエントな状態のＨＵＶ−ＥＣを０.２５％トリプシン：０.２５％ＥＤＴＡ＝１：１の混合溶液で処理後、回収し、６穴プレートに１.５×１０5cells/wellの細胞密度で分注した後、１％ウシ胎児血清のみを含有するＭ−１９９培地を用いて２４時間培養した。その後にＸ（０.０１μM/ｍｌ）およびＸＯ（０.２Ｕ/ｍｌ）（ともに和光純薬工業製）を培地中に２４時間作用させることによりフリーラジカルを発生させた。Ｘ及びＸＯ作用２４時間後にプレート中のＨＵＶ−ＥＣを再び前記のトリプシン：ＥＤＴＡ＝１：１混合溶液で処理した後、回収した。回収された細胞浮遊液に同量の０.２％トリパンブルー溶液を加え、この混液中の細胞質・核全体が青染された細胞（死細胞）と非染色細胞（生細胞）を区別し、血球計算盤を用いてそれぞれの細胞数を計測し、セルバイアビリティー（生細胞数／全細胞数）を求めた。なお、ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体はＰＢＳ（−）に溶解した後、５０μg/ｍｌの用量でＸおよびＸＯを作用させると同時に培地中に添加した。また、ＸおよびＸＯを作用させない正常群並びにヘパリンあるいは中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の溶媒のみを添加した対照群も設けた。
【００６５】
実験の結果を表７に示す。ＸとＸＯによる傷害により、対照群においては著しいセルバイアビリティーの低下がみられたが、中分子ヘパリニルフェニルアラニン、中分子ヘパリニルチロシンあるいは中分子ヘパリニルロイシンを添加することにより、統計学的に有意にセルバイアビリティーの低下を抑制することができた。また、この抑制効果はヘパリンを上回るものであった。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
XI．中分子ヘパリニルアミノ酸のアレルギー抑制効果
近年、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、慢性蕁麻疹などのアレルギー性疾患が増加する傾向にあるが、これらの疾患は肥満細胞からの脱顆粒を主たる発症原因のひとつとする。
一方、ヘパリンには肥満細胞からの脱顆粒を阻害する作用のあることが知られている。（T.Ahmed et.al.、アメリカン・レビュー・オブ・レスピレイトリー・ディシーズ（Am. Rev. Respir. Dis.）、第１４５巻、５６６頁、１９９２年）。そこで、本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体のアレルギー抑制効果について、ラット４８時間の同種受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応に対する作用を指標とし、検討した。
【００６８】
（１）実験動物
生後８週齢の雄性Wistar系ラット（日本チャールス・リバー）および５週齢の雌性Wistar系ラット（日本チャールス・リバー）を１２時間の明暗サイクル（明期：７時〜１９時）、室温２３±２℃、湿度５０±５％および換気オールフレッシュ１５回／時間の条件下で１週間の予備飼育をした後、実験に供した。
【００６９】
（２）中分子ヘパリニルフェニルアラニンのラット４８時間同種ＰＣＡ反応に対する作用
操作
Stotlandらの方法（カナディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Can. J. Physiol. Pharmacol.）、第５２巻、１１１９頁、１９７４年）に準拠して抗ovalbumin（ＯＶＡ）ラット血清を調製した。すなわち、雌性ラットの脾臓を摘出して４日後に、ＯＶＡ（生化学工業製）２.０mg／mlを含む生理食塩液と２％水酸化アルミニウムゲル（和光純薬工業製）の等量混合液１.０mlを四肢の皮下に４分割して投与し、さらに百日咳死菌体（和光純薬工業製）２×１０10cell／１.０mlを腹腔内に投与することにより感作しておく。投与５日後にＯＶＡ２.０mg／mlを含む生理食塩液と２％水酸化アルミニウムゲルの等量混合液をさらに１.０ml投与し、追加感作した。最終感作から２週間後に麻酔下にて腹部大動脈より採血し、血液を遠心分離し、抗ＯＶＡラット血清を採取した。このもののラット４８時間ＰＣＡ抗体価は１２８であった。
【００７０】
このようにして得られた抗ＯＶＡラット血清を生理食塩液で抗体価が１６となるように希釈し、その１００μl／siteを雄性ラットの剃毛した背部皮内の６箇所に投与して受動感作させた。感作４８時間後に体重１kgあたり０.３、３.０および３０.０mgの中分子ヘパリニルフェニルアラニンを１０ml／kgの液量となるように尾静脈内に投与した。対照には同容量の生理食塩液を用いた。投与５分後に１mgのＯＶＡを含有するエバンスブルー生理食塩液溶液１mlを尾静脈内に投与した。このＯＶＡはＰＣＡ反応を誘発し、その強度はエバンスブルー（色素）が感作部位の周囲の組織へ拡散する程度に比例する。ＯＶＡ含有エバンスブルー生理食塩液溶液を投与して３０分後に断頭放血致死させ、Katayamaらの方法（マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Microbiol.Immunol.）、第２２巻、８９頁、１９７８年）により、ラット背部皮膚の感作部位の組織内色素漏出量（μg／site）ならびに色素漏出部位面積（mm2）を測定した。
なお、一群の例数は４〜５匹とした。また、群間の有意性は、Bartlett法にて分散の均一性を確認した後、Spjotvoll ＆ Stoline法（補正チューキー法）を用いて検定することにより確認した。
【００７１】
結果
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体のラット４８時間ＰＣＡ反応に対する抑制効果を表８に示す。
【表８】
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【００７２】
中分子ヘパリニルフェニルアラニン投与群において、組織内色素漏出量ならびに色素漏出部位面積を用量依存的に抑制する傾向が認められ、特に３０.０mg／kg投与群においては組織内色素漏出量を生理食塩液（対照）投与群と比べて約３０％と有意（Ｐ＜０.０１）に減少させ、アレルギー反応の抑制効果が顕著であった。
アレルギー性疾患に用いる薬剤には、症状の改善もさることながら、発症を未然に防止する効果を併せ持つことが要求される。本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、上記の結果より、アレルギー性疾患の予防剤や治療剤として用い得る。
【００７３】
実施例
実施例１
中分子ヘパリンの調製
ヘパリン(サイエンティフィック・プロテイン・ラボラトリーズ製)３ｇを水に溶かして５２.５ｍｌとしたものに、陽イオン交換樹脂(Dowex HCR-W2 20-50mesh)を加えてｐＨ３.３０〜３.４０とした後、濾過する。
濾液に３０％過酸化水素水(三菱瓦斯化学製)３.５ｍｌを加え、オートクレーブ中、１２３℃、１.４ｋｇｆ/ｃｍ2、１０分間の条件で加圧加熱して解重合する。
加熱終了後、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ６.８とし、限外濾過（ウルトラフリーＣＬ:ミリポア製、ウルトラセント-１０:東ソー製、モルカットII:ミリポア製、モルカットＬ:ミリポア製）を繰り返して分子量分画を行った。エタノールによる再結晶で、白色粉末の中分子ヘパリン(２.１ｇ、収率７０.１０％)を得た。
【００７４】
実施例２
中分子ヘパリニルアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシン）の調製
中分子ヘパリン０.６４ｇに水を加えて１５ｍｌとし、ｐＨ４.７５に調整後、対応するアミノ酸エステル塩酸塩（中分子ヘパリン１Ｍに対して、１００Ｍ）を加える（Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−アルギニンメチルエステル二塩酸塩：シグマ製、Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−グリシンメチルエステル塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−ヒスチジンメチルエステル二塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−ロイシンメチルエステル塩酸塩：東京化成製、Ｌ−メチオニンメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩：アルドリッチ製、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩：東京化成製、Ｌ−セリンメチルエステル塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−チロシンメチルエステル塩酸塩：和光純薬工業製）。
【００７５】
さらに、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(半井テスク製)０.９８ｇの水溶液５ｍｌを徐々に加え、４時間攪拌した後、少量の水および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(半井テスク製)の５％水溶液をアンモニウム塩の沈澱物が生じなくなるまで加える。
次いでこの沈澱物を遠心分離により完全に分離後、沈澱物にヨウ化ナトリウム(半井テスク製)の５％エタノール溶液５０ｍｌを加える。１時間攪拌後、濾過し、沈澱物をエタノールで再結晶して、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸エステルを得る。
この中分子ヘパリニルアミノ酸エステルに０.１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ｍｌを加え、窒素気流下、０〜５℃で２日間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ５に調整後、濾過し、濾液にエタノールを加えて、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸を得た。各収率を表９に示す。
【００７６】
【表９】
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【００７７】
中分子ヘパリニルアミノ酸の機器分析
（１）ＨＰＬＣ分析による分子量の測定
ヘパリン、中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体を０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液で５ｍｇ／ｍｌに調整し、試料溶液とする。
一方、ポリエチレングリコール（分子量１０,０００：アルドリッチ製、分子量８,５００および平均分子量３,０００：東京化成製、平均分子量１,４５０：関東化学製）を標準物質とし、試料溶液と同様に調整し、標準溶液とする。
試料溶液および標準溶液につき、以下の測定機器および操作条件でＨＰＬＣ分析を行い、検量線法により、ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸の分子量を測定した。結果を表１０に示す。
使用機器  送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ（島津製作所製）
示差屈折計：ＲＩ−８０２０（東ソー製）
オ―トサンプラ―：ＫＭＴ−６０Ａ−１１（協和精密製）
デ―タ処理装置：Ｃ−Ｒ３Ａ（島津製作所製）
カラム：ＴＳＫ−Ｇel  Ｇ3000ＰＷＸＬ(7.8mm×30cm:東ソー製）を２本連結して使用
操作条件  流速：１.０ｍｌ／分
圧力：４３ｋｇ／ｃｍ2
感度：ＲＩ  ５１２×１０-6  ＲＩＶＦＳ
カラム温度：４０℃
検出感度：８〜１０
注入量：２００μｌ
【００７８】
【表１０】
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【００７９】
（２）赤外吸収スペクトルの測定
中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体をそれぞれ約３ｍｇ秤量し、約１００ｍｇの臭化カリウムと混ぜ合わせ、ハンディープレスでペレットを作成した。このものにつき、臭化カリウム錠剤法により、以下の測定機器および操作条件で赤外吸収スペクトルを測定した。結果を表１１に示す。
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【００８０】
【表１１】
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【００８１】
（３）アミノ酸分析
中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体約１００μｇを試料用試験管に秤量し、この試験管を反応バイアル瓶に入れ減圧乾燥した。次に反応バイアル瓶の底に加水分解用６Ｎ塩酸（１％フェノール含有）１００μｌを入れ、減圧下、反応バイアル瓶内の空気を窒素で置換した後、１０５℃で２４時間加熱し、加水分解した。冷却後、試料用試験管を取り出し、０．０２Ｎ塩酸１００μｌを加えてよく混合し、フィルターで濾過し、濾液を試料溶液とした。試料溶液と加水分解前の原料を用いて、以下の測定機器および操作条件でアミノ酸の含有量を測定した。その結果すべての中分子ヘパリニルアミノ酸において、中分子ヘパリンに対するカルボン酸の約９０％以上の比率でアミノ酸に置換していた。
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【００８２】
（４）1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定
中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した（ＸＬ−３００：バリアン製、３００ＭＨｚ、７５.４ＭＨｚ）。結果を図１〜図１２に示す。
【００８３】
（５）元素分析
ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体につき、ＣＨＮ  ＣＯＲＤＥＲ（柳本製）を用い、燃焼法により測定した。結果を表１２に示す。
【表１２】
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【００８４】
（６）ウロン酸の定量
カルバゾール硫酸法(Bitter-Muirの改良法：アナリティカル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、第４巻、３３０頁、１９６２年）により、ウロン酸含量を測定した。
ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体の水溶液０.５ｍｌを試験管にとり、氷水で冷却しながら３.０ｍｌの硫酸溶液（四ホウ酸ナトリウム１０水和物(キシダ化学製)０.９５ｇを濃硫酸１００ｍｌに溶かしたもの)を滴下し、０.１ｍｌの０.１２５％カルバゾール溶液（カルバゾール（和光純薬工業製）１２.５ｍｇを１０ｍｌのエタノールに溶かしたもの）を加え、十分混合した後、ガラス球で栓をし、沸騰水浴中で２０分間加熱する。室温に冷却後、５３０ｎｍにおける吸光度を測定した(UVIDEC-77Σ：日本分光工業製）。
【００８５】
（７）硫酸基の定量
T.T.Terho et al.の方法（アナリティカル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、第４１巻、４７１頁、１９７１年）に準じ、ロジゾン酸法により硫酸基を測定した。すなわち、ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリンの各アミノ酸誘導体約０.２ｍｇを含む１Ｎ塩酸溶液０.５ｍｌをガラス栓付試験管にとり、密栓する。沸騰水浴中で１時間加熱して加水分解した後、減圧乾固して塩酸を除去し、このものを１.０ｍｌの水に溶かした。
この溶液０.５ｍｌをガラス栓付遠心管にとり、エタノール２.０ｍｌを加える。さらに１.０ｍｌの塩化バリウム溶液（２.０Ｍ酢酸１０ｍｌ、５ｍＭ塩化バリウム２ｍｌ、２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム８ｍｌを混合し、エタノールを加えて１００ｍｌとしたもの）、および１.５ｍｌのロジゾン酸ナトリウム溶液（ロジゾン酸ナトリウム（和光純薬工業製）５ｍｇを水２０ｍｌに溶かし、１００ｍｇのＬ−アスコルビン酸を加えて溶かし、さらにエタノールを加えて１００ｍｌとしたもの）を加えてよく攪拌する。室温暗所に１０分間放置した後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した(UVIDEC-77Σ：日本分光工業製)。結果を表１３に示す。
【００８６】
【表１３】
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【００８７】
実施例３  注射剤
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２５０μg〜２.５ｍｇをとり、生理食塩液１０ｍｌを加えて溶かした後、アンプルに充填、密封および滅菌して注射剤とする。
【００８８】
実施例４  錠剤
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２.５〜１０ｍｇをとり、賦形剤として乳糖３００ｍｇを加えて均等に混和したものを、直接圧縮成形して錠剤とする。
【００８９】
実施例５
カプセル剤
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２.５〜１０ｍｇをとり、賦形剤として乳糖３００ｍｇを加えて均等に混和したものをカプセルに充填してカプセル剤とする。
【００９０】
実施例６
坐剤
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体５.０〜２０ｍｇをとり、基剤としてマクロゴール２ｇを加えて均等に混和し、一定の形状に成形して、坐剤とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  中分子ヘパリンの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】  中分子ヘパリンの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】  中分子ヘパリニルフェニルアラニンの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】  中分子ヘパリニルフェニルアラニンの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】  中分子ヘパリニルアルギニンの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】  中分子ヘパリニルアルギニンの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】  中分子ヘパリニルセリンの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】  中分子ヘパリニルセリンの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】  中分子ヘパリニルプロリンの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０】  中分子ヘパリニルプロリンの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１１】  中分子ヘパリニルアスパラギン酸の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】  中分子ヘパリニルアスパラギン酸の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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