(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）前記試料の第１アリコート中の抱合および未抱合ビリルビン濃度を測定し；
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、前記酸化試薬および触媒試薬を添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、酸化後の前記第２アリコートに残存する抱合および未抱合ビリルビンを測定し；次いで
（ｄ）以下の式：
ｂss＝−Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）／（希釈率・Ｋp・Ｐ・ｔ）
［式中、ｂssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり；
Ｂoは、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は工程（ａ）で測定されたものであり；
Ｂtは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン酸化後に残存する、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前記工程（ｃ）で測定されたものであり；
希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔは酸化反応に対する所定の反応時間であり；
Ｐは標準化触媒試薬の濃度であり；そして
Ｋpは、アルブミン、あるいはビリルビンに結合できる他の分子の不存在下での前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する１次速度定数である。］
の計算から、ｂssで示される定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度を測定する。
【請求項２】
以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）前記試料の第１アリコート中の未抱合ビリルビン（Ｂo）の濃度を測定し；
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、前記酸化試薬および触媒試薬を添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第２アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度（Ｂt）を測定し；
（ｄ）前記工程（ｂ）のものと同容量の前記試料の第３アリコートを、添加触媒試薬の不存在下、工程（ｂ）と同一時間で酸化試薬および緩衝液と混合し、次いで前記第３アリコート中の未酸化未抱合ビリルビンの濃度を測定し、それにより添加された緩衝液の量は工程（ｂ）で添加された触媒試薬の量と等容量で、かつ添加された酸化試薬の容量および濃度は工程（ｂ）で用いられたものと等しくし；次いで
（ｅ）以下の式：
ｂss＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（（Ｂo−Ｂb＋Ｂt）／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ・ｔ）
［式中、ｂssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり；
Ｂoは、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は工程（ａ）で測定されたものであり；
Ｂtは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン酸化後に残存する、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前記工程（ｃ）で測定されたものであり；
Ｂbは標準化触媒試薬の不存在下におけるバックグラウンド酸化であり；
希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔは酸化反応に対する所定の反応時間であり；
Ｐは標準化触媒試薬の濃度であり；そして
Ｋpは、前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する１次速度定数である。］
の計算からｂssで示される定常状態未抱合非アルブミン結合ビリルビン濃度を測定する。
【請求項３】
以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）前記試料の第１アリコート中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し；
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の第１標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一時速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、前記酸化試薬および触媒試薬を添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第２アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し；
（ｄ）第３アリコートにおいて第２の量の同一触媒試薬を用いて工程（ｂ）および（ｃ）を反復し、前記触媒試薬の第２の量は触媒試薬の第１の量とは異なるものであり；
（ｅ）前記工程（ｂ）のものと同容量の前記試料の第４アリコートを、添加触媒試薬の不存在下、工程（ｂ）と同一時間で酸化試薬および緩衝液と混合し、次いで前記第４アリコート中の未酸化未抱合ビリルビンの濃度を測定し、それにより添加された緩衝液の量は工程（ｂ）で添加された触媒試薬の量と等容量で、かつ添加された酸化試薬の容量および濃度は工程（ｂ）で用いられたものと等しくし；次いで
（ｆ）以下の方程式：
ｂss1＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（（Ｂo−Ｂb＋Ｂt1／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ1・ｔ1）
ｂss2＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（（Ｂo−Ｂb＋Ｂt2／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ2・ｔ2）
を用いて、２つの触媒試薬濃度における定常状態未抱合未結合濃度を決定し、次いで、方程式：
0004068156.tif 000017
からｋ-1、Ｂoおよびｋ1・ａを決定し、次いで、方程式：
0004068156.tif 000018
から平衡未結合未抱合ビリルビンｂeqを決定する。
［式中、ｂss1は触媒試薬の第１濃度における第１定常状態未抱合未結合アルブミン濃度であり；
ｂss2は触媒試薬の第２濃度における第２定常状態未抱合未結合アルブミン濃度であり；
Ｐ1は第１触媒試薬濃度であり；
Ｐ2は第２触媒試薬濃度であり；
Ｂoは前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は前記工程（ａ）で測定され；
Ｂbは標準化触媒試薬不存在下でのバックグラウンド酸化であり；
Ｂt1およびＢt2は、各々、触媒試薬存在下での酸化試薬による所定時間のビリルビン酸化後の前記工程（ｃ）および工程（ｄ）からの未抱合ビリルビン濃度であり；
希釈率は酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔ1およびｔ2は、独立して、酸化反応の所定の反応時間であって、ｔ1およびｔ2は同一であっても異なっていてもよく；
Ｋpは前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化についての一次速度定数であり；
ｋ-1はアルブミンからのビリルビンの解離速度定数であり；
ｋ1はアルブミンとビリルビンの会合速度定数であり；
ａは未結合アルブミンの濃度であり；そして
ｂeqは未結合未抱合ビリルビンの平衡濃度である。］
【請求項４】
以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）前記試料の第１アリコート中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し；
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の第１標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、前記酸化試薬および触媒試薬を添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第２アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し；
（ｄ）第３アリコートにおいて第２の量の同一触媒試薬を用いて工程（ｂ）および（ｃ）を反復し、前記触媒試薬の第２の量は触媒試薬の第１の量とは異なるものであり；
（ｅ）以下の方程式：
ｂss1＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt1／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ1・ｔ1）
ｂss2＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt2／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ2・ｔ2）
を用い、２つの触媒試薬濃度における定常状態未抱合未結合アルブミン濃度を決定し、次いで、方程式：
0004068156.tif 000019
からｋ-1、Ｂoおよびｋ1・ａを決定し、次いで、方程式：
0004068156.tif 000020
から平衡未結合未抱合ビリルビンｂeqを決定する。
［式中、ｂss1は触媒試薬の第１濃度における第１定常状態未抱合未結合アルブミン濃度であり；
ｂss2は触媒試薬の第２濃度における第２定常状態未抱合未結合アルブミン濃度であり；
Ｐ1は第１触媒試薬濃度であり；
Ｐ2は第２触媒試薬濃度であり；
Ｂoは前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は前記工程（ａ）で測定され；
Ｂbは標準化触媒試薬不存在下でのバックグラウンド酸化であり；
Ｂt1およびＢt2は、各々、触媒試薬存在下での酸化試薬による所定時間のビリルビン酸化後の前記工程（ｃ）および工程（ｄ）からの未抱合ビリルビン濃度であり；
希釈率は酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔ1およびｔ2は、独立して、酸化反応の所定の反応時間であって、ｔ1およびｔ2は同一であっても異なっていてもよく；
Ｋpは前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化についての一次速度定数であり；
ｋ-1はアルブミンからのビリルビンの解離速度定数であり；
ｋ1はアルブミンとビリルビンの会合速度定数であり；
ａは未結合アルブミンの濃度であり；そして
ｂeqは未結合未抱合ビリルビンの平衡濃度である。］
【請求項５】
以下の工程を含む、全ビリルビン濃度が既知の新生児から得られた試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）前記試料のアリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、前記酸化試薬および触媒試薬を添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｂ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、酸化後の前記アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し；
（ｃ）以下の式：
ｂss＝−Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）／（希釈率・Ｋp・Ｐ・ｔ）
［式中、ｂssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり；
Ｂoは、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり；
Ｂtは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン酸化後に残存する、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前記工程（ｂ）で測定されたものであり；
希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔは酸化反応に対する所定の反応時間であり；
Ｐは標準化触媒試薬の濃度であり；そして
Ｋpは、アルブミン、あるいはビリルビンに結合できる他の分子の不存在下での前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する１次速度定数である。］
の計算から、ｂssで示される定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度を測定する。
【請求項６】
前記触媒試薬がペルオキシダーゼであって、かつ、前記酸化試薬がペルオキシドである請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度が以下のようにして測定される請求項１〜４のいずれか１に記載の方法：
（ａ）第１容器中で、前記試料中の抱合ビリルビンの全量との着色複合体を形成するのに十分な時間、前記試料のアリコートと有効量のジアゾ試薬を混合し、その濃度を測定し；
（ｂ）前記第１容器に反応促進に有効量のアクセレレータを添加し、未抱合ビリルビンと反応して第２の着色複合体を形成するのに十分な時間、前記アクセレレータを（ａ）の生成物と混合し、次いで抱合および未抱合ビリルビンの濃度を決定する。
【請求項９】
以下の工程を含む、血清試料中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法：
（ａ）第１容器中で、前記試料中の抱合ビリルビンの全量との着色複合体を形成するのに十分な時間、前記血清試料のアリコートと有効量のジアゾ試薬を混合し、その濃度を測定し；
（ｂ）前記第１容器に反応促進に有効量のアクセレレータを添加し、未抱合ビリルビンと反応して第２の着色複合体を形成するのに十分な時間、前記アクセレレータを（ａ）の生成物と混合し、次いでＢoで示す未抱合ビリルビンの濃度を決定し；
（ｃ）第２の容器に第２アリコート試料、ペルオキシド、および、ベルオキシドによるビリルビンのペルオキシダーゼ触媒酸化に対する所定の一次速度定数を有する触媒的に有効量の標準化ペルオキシダーゼ溶液を添加し、これを未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で所定の時間混合し、前記酸化された未抱合ビリルビンは全ビリルビン濃度の５０％未満であって、ペルオキシドおよびペルオキシダーゼを添加した後の前記第２アリコート試料の容積は添加前の容積の３倍未満であり；
（ｄ）前記試料中の未抱合ビリルビンの全量と着色複合体を形成するのに十分な時間、工程（ｃ）の生成物にジアゾ試薬を添加し、その濃度を測定し；
（ｅ）反応促進に有効量のアクセレレータを第２容器に添加し、残存する未抱合ビリルビンと反応するのに十分な時間、工程（ｄ）の生成物と混合し、次いで、Ｂtで示す酸化未抱合ビリルビンの量をそれから測定し；
（ｆ）第３の容器において、添加ペルオキシダーゼ不存在下で、工程（ｃ）で添加されたペルオキシダーゼの量と等容量のさらなる緩衝液溶液、および前記血清試料のアリコート試料とペルオキシドを混合し、前記血清試料およびペルオキシドの容量は工程（ｃ）で用いたものと同一であり、工程（ｃ）の混合と同一時間、前記溶液を混合し；
（ｇ）工程（ｄ）および（ｅ）で用いたと同一量のジアゾ試薬および同一量のアクセレレータを前記第３の容器に各々添加し、それから、前記試料中に存在するＢbで示す未酸化未抱合ビリルビンの量を測定し；次いで、
（ｈ）定常状態未抱合非アルブミン結合ビリルビン濃度を決定する。
【請求項１０】
前記ジアゾ試薬が酸存在下での芳香族アミンと亜硝酸塩との反応によって形成されるものである請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記芳香族アミンがスルファニル酸である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクセレレータがメタノールである請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料中の未抱合ビリルビンの濃度が以下のようにして測定される請求項５に記載の方法：
未酸化未抱合ビリルビンと反応して着色複合体を形成させるのに十分な時間、有効量のアクセレレータおよびジアゾ試薬を前記試料に添加し、それにより前記試料中の未抱合ビリルビンの濃度を測定する。
【請求項１４】
前記ジアゾ試薬が酸存在下での芳香族アミンと亜硝酸塩との反応によって形成されるものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
芳香族アミンがスルファニル酸である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アクセレレータがメタノールである請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ペルオキシダーゼの濃度が１〜１５０μｇ／ｍＬの範囲である請求項６または７に記載の方法。
【請求項１８】
前記アリコート中に存在する試料の容量が１０μＬ以上であって１００μＬ未満である請求項１〜５および９のいずれか１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が哺乳動物からの血清または血漿である請求項１〜５および９のいずれか１に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に、試料中の未抱合（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）で未結合（ｕｎｂｏｕｎｄ）のビリルビンの測定に関する。また、本発明は、高ビリルビン血症の診断および治療に使用することもできる。
発明の背景
ビリルビンは、細網内皮細胞による赤血球の分解により形成されたヘムの代謝産物である胆汁色素である。またそれは、チトクロムのような、蛋白質を含有する他のヘムの分解によっても形成され得る。ビリルビンの最も典型的な生物学的形態は、ビリルビンＩＸａである。
ビリルビンＩＸａは、通常、いくつかの形態の血流の血漿中を循環する。１つの形態は「未抱合」または「間接的」ビリルビンと命名されている。未抱合ビリルビンは血清アルブミンに複合体化することがあり、それ自体「結合」未抱合ビリルビンと命名され、あるいはそれは非アルブミン結合または遊離形態で存在することがあり、「未結合」非抱合ビリルビンと命名される。結合および未結合の両未抱合ビリルビンは、通常、肝臓に運ばれて、そこで肝臓細胞によって吸収され、極性抱合形態に変換される。この変換は、典型的には、酵素である肝臓グルクロニルトランスフェラーゼによって触媒される、グルクロン酸分子の未抱合ビリルビンへの移動を含む。この変換されたビリルビンは、当該分野では、「抱合」または「直接」ビリルビンと呼ばれている。抱合したビリルビンのうちの一部は、漏れて血流へ戻ることがある。未抱合形態はよりタイトにアルブミンに結合するようであるが、その未抱合ビリルビンと同様に、血流中の抱合ビリルビンもアルブミンに結合できる。こうして、血液中のビリルビンは、４つの形態：（１）結合した抱合ビリルビン、（２）未結合抱合ビリルビン、（３）結合した未抱合ビリルビン、および（４）未結合未抱合ビリルビン、で存在する。要約すると、（１）および（２）は共に「直接」ビリルビンとして知られ、他方、（３）および（４）は共に「間接的」ビリルビンと命名される。これらの４つの画分は、一般に、血清または血漿ビリルビン集団を構成する。第５の成分、アルブミンに共有結合したビリルビンであるデルタビリルビンも記述されているが、これは全ビリルビンの中の非常に小さな画分であり、この議論には重要でない。
未抱合であるが抱合していないビリルビンは、多くの生命維持に必要な（ｖｉｔａｌ）細胞機能を毒し得るものであり、種々の実験的および臨床的証拠は、未結合未抱合ビリルビンが潜在的な神経毒であることを示唆する。具体的には、未結合未抱合ビリルビンは、アルブミン結合によって制限されないので、脈管空間から神経系へ、そこでは神経組織と複合体化して不可逆的な損傷を引き起こし得るが、その移動する能力のために、神経毒として作用し得る。典型的には、未結合未抱合ビリルビンは血液中の全ビリルビンの画分の０．０５％未満であり、従って、測定をするのが困難である。血清ビリルビンの上昇レベルをもたらす疾患状態は、「抱合」または「未抱合」の、あるいはその両形態のビリルビンレベルを同時に上昇させることがある。しかしながら、上昇した未抱合で未結合の形態のみが、神経学的ビリルビン毒性に対して患者に素因を与える。
高レベルの未抱合ビリルビン（すなわち、高ビリルビン血漿）に罹った新生児は、誕生後に黄疸となり、進展する核黄疸に罹りやすいが、これは、神経系の組織、特に発生する脳の基底核における未抱合ビリルビンの蓄積である。ビリルビン脳障害とも呼ばれるこの疾患は、アテトーシス様大脳麻痺、眼麻痺、難聴、精神遅滞、および微妙な運動制御と認識機能の欠陥をもたらしうる。溶血に罹った新生児および未熟児として生まれた幼児は、ビリルビン脳障害に対し、最も高い危険群を構成する；しかしながら、その黄疸に対する明瞭な病理学的な病因を持たない黄疸期新生児でも、核黄疸は報告されている。
ほとんどの新生児は、人生の最初の数日で、一過性の未抱合高ビリルビン血漿を発症する。早期の出生後退院やヘルスケア提供者によるビリルビン毒性への低い関心の双方に起因している、妊娠終結時および妊娠終結時間近の新生児におけるビリルビン脳障害（核黄疸）に、新たな再起がみられている。
米国において１年間当たりほぼ１−２％（４０，０００〜８０，０００）の新生児が、高ビリルビン血漿のために病院に再び入り、約５％（２０００〜４０００人の新生児）は、交換輸血による治療を考慮するほどの高い全ビリルビン濃度を有するであろう。
これらの高ビリルビン血漿乳児に対する治療決定に際して、医師は、黄疸が交換輸血を要するほど重症か否かを決定しなければならない。交換輸血および黄疸には、死亡を含め、患者に対する大きな危険が伴うので、これらの決定の基礎となるデータは非常に重要である。未結合で未抱合のビリルビンを容易に測定することはできないので、新生児に対して交換輸血を行うことの決定は、通常、全抱合および未抱合血液ビリルビンレベルに基づいている。事実、この目的のためのルーチンの臨床的実験室的方法というものは存在しない。さらに、進展する核黄疸の危険を予測するのに、血液中の全ビリルビンの濃度は、感度も特異性も乏しい。例えば、溶血を持つ妊娠終結時新生児に対する交換輸血レベルとして使用する場合、１５ｍｇ／ｄＬのＴＢＣ（全結合ビリルビン濃度）は約８３％の感度および約７８％の特異性を有する。もしこの基準をさらに考慮することなく医学的決定で使用するならば、交換輸血を要する乳児の約１７％がこれを受けないで、神経学的損傷を蒙ることのなるであろう。さらに、交換輸血を要しないものの２２％が、危険を伴いながら、にもかかわらずこれを受けることになるであろう。従って、交換輸血治療は、その治療を必要としている新生児がそれを受けない一方で、それを要しない新生児に対して無駄に行われることがある。
未結合未抱合ビリルビン（血液ビリルビンの神経毒画分）の測定は、黄疸乳児が交換輸血を必要とする場合の決定に良好な方法であろう。
患者の未結合未抱合ビリルビンのレベルに有意に相関すると考えられる物質のレベルを測定することにより交換輸血による治療の必要性を決定するのに、２種類の医学的診断テストが行われてきた。これらのテストは、以下の式：
0004068156.tif 000002
［式中、ｂｕは未結合未抱合のビリルビンであり、ｂｃは未結合抱合ビリルビンであり、ａは血清未結合アルブミンであり、Ａ：ｂｕ、ｂｃは未抱合および抱合ビリルビンと複合体化したアルブミンである。］
に基づいている。簡単に言えば、第１の方法は未結合アルブミン（ａ）を測定し、第２の方法（ペルオキシダーゼ）は未結合未抱合および未結合抱合（すなわち、ｂｕ＋ｂｃ）の全量を測定する。より詳しくは、第１のタイプは、アルブミンのビリルビンによる「飽和」を予測するために、ビリルビンによって占められていないアルブミン結合部位の循環レベル（すなわち、未結合アルブミン）を測定することに基づくものである。アルブミンは未結合未抱合ビリルビンと結合するので、未結合アルブミンのレベルに関する知見は、患者における未結合未抱合ビリルビンの量と間接的に相関するであろうということが提案されてきた。このアプローチは、アルブミンがビリルビンに対する１つの主要な結合部位を有すること、および、いずれかのさらなるビリルビン結合部位は重要ではないことを仮定している。これらのテストは、アルブミンがビリルビンで「飽和」するときの全ビリルビン濃度を決定することを試みるものである。もしこのテストにより、循環している未結合アルブミンの量は、血液中のビリルビン量に結合するのに余りにも少ないと判断されれば、交換輸血が推奨されるであろう。直接的には測定されないが、未結合ビリルビンはビリルビンで飽和したアルブミンの程度に比例すると推定される。再度、アルブミンがビリルビンで飽和しているとみなされる場合、交換輸血が推奨される。
しかしながら、かかるテストは、信頼できない終点をもち、患者における未結合未抱合ビリルビンの「真実の」レベルを正確には反映しない。何故ならば、単一のアルブミン分子は１を超えるビリルビン分子と結合し、ビリルビン分子はアルブミンにおいてアロステリックな変化を引き起こして「飽和」の概念を不明確にし、終点を信頼できないものにするからである。
２番目の種類のテストは相関的なテストではない。すなわち、それらは血液中にある種々の未結合ビリルビン種の現実のレベルを測定しようとするものである。この２番目の種類のテスト方法は、相関的方法を用いてテストするのに好ましい。というのも、試料中のビリルビン種を直接的に特定するテストは、一般的には、より小さい誤差限界を示すからである。しかしながら、現在、かかるテストは血液中のビリルビンの神経毒画分よりもむしろ、ビリルビンの未結合種（ｂｃおよびｂｕ）の全量を測定する。これまでに記載されている全てのビリルビン結合テストは、未結合ビリルビンの抱合および未抱合画分を区別しない。
米国の臨床研究所では、未結合未抱合ビリルビン濃度を日常的に測定することはしていない。現在、臨床研究所で使用されている１つの非相関的な分析試験は、血清／血漿中の全ビリルビン濃度（ＴＢＣ）を測定し、ビリルビンの４つの全ての種（すなわち、（１）結合抱合ビリルビン、（２）未結合抱合ビリルビン、（３）結合未抱合ビリルビン、および（４）未結合未抱合ビリルビン）の合計を測定するものである。例えば、４４０から４７０ｎｍの間のビリルビンの光吸収特性を用いてＴＢＣを測定することができる。抱合および未抱合ビリルビンの吸収スペクトルの差異は余りにも僅かで両者を区別することができないため、ビリルビン固有の吸収を用い、全ビリルビン濃度のみが測定可能である。
臨床用途の２番目の非相関的テストは、全ビリルビン濃度と抱合している全ビリルビン分率の双方を測定する。例えば、１つのテストは、ビリルビンを、５００ｎｍを超える波長の光を吸収する青−紫に着色したジアゾ誘導体に変換することによって、血清／血漿の全および抱合（直接的）ビリルビン濃度を測定する。このテストでは、血清または血漿はジアゾ試薬（スルファニル酸のような有機酸を酸性ｐＨ下で亜硝酸塩と化合させることにより得られる）と化合する。抱合ビリルビンは、未抱合ビリルビンよりもかなり速くジアゾ誘導体を形成するので、試料中の抱合ビリルビン濃度を表す直接的ビリルビン濃度は、初期ジアゾ誘導体による５６５ｎｍの光の吸収から計算される。次いで、メタノールまたはカフェインおよび安息香酸ナトリウムのような促進剤を添加するが、これは未抱合ビリルビンとジアゾ試薬との反応を加速する。全ビリルビンは、全てのジアゾ誘導体の５６５ｎｍの最終吸収から計算される。全ビリルビンおよび抱合ビリルビンの間の差異は、未抱合（間接的）ビリルビンの濃度である。しかしながら、この組み合わせたデータでさえ、２つのタイプの未抱合ビリルビン、すなわち、アルブミンに結合し無害なものとアルブミンに結合せずに神経毒の可能性のあるものとの区別をしないため、依然として、血清血漿試料の未抱合未結合ビリルビンについての十分な情報を臨床医に与えるものではない。それにも拘わらず、ビリルビン脳障害の発症に対する黄疸新生児の危険を最良に評価するのは、未結合未抱合ビリルビン、すなわちＴＢＣのわずかな画分である。アルブミンに結合しない未抱合ビリルビンの濃度に関する知見（および、従って潜在的な神経毒）は、有用な情報である。
従って、未抱合結合ビリルビンを示すような診断テストが好ましいであろう。というのは、それは血液中の全ビリルビンの神経毒画分を特異的かつ正確に測定することができるからである。未結合未抱合ビリルビンの濃度は、ビリルビンとアルブミンとの結合に対する大部分の作用の影響により全ビリルビンの濃度の任意の直線的増加に応じて指数関数的に増加するため、その濃度に関する知見は有益であろう。従って、この種のビリルビンは、潜在的に命を救うものではあるが危険を伴う交換輸血治療の実施に対する臨床的決定に大きく関与するために、未結合未抱合ビリルビン濃度のあらゆる変化の正確な測定が望まれる。
非アルブミン結合ビリルビンの非相関的測定に関する現在の速度論的方法は、ビリルビンの全ての種の、ペルオキシドによる、ホースラディッシュペルオキシダーゼ触媒酸化を使用する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＆  Ｗｅｎｎｂｅｒｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９７４，２０（７），７８３−７８９）（以下、「Ｊ＆Ｗ方法」と呼ぶ）。この方法では、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、抱合および非抱合ビリルビン双方のペルオキシドによる酸化を触媒して、４６０ｎｍにおいて無色の生成物を形成する。アルブミン結合ビリルビンは酸化から保護され、未結合ビリルビンのみが酸化される。未結合ビリルビンのみがペルオキシドと反応するので、抱合および未抱合ビリルビン種双方の酸化の反応速度は試料内の未結合ビリルビンの濃度に比例する。アルブミンフリー溶液（すなわち、全てのアルブミンが未結合である）中のペルオキシドによる未抱合ビリルビンのペルオキシダーゼ触媒酸化の一次速度定数（Ｋp）を測定した後、未結合ビリルビンの濃度を試料の酸化速度から決定する。しかしながら、従前に使用されてきたペルオキシダーゼテストは、いくつかの制限を有している。必要な試料希釈（約４０倍）は、他のリガンドと同様ビリルビンの結合を変化させることが示されている（例えば、Ａｈｌｆｏｒｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２７，６９２−６９６参照）。加えて、直接的（抱合）ビリルビンは非神経毒性ではあるが、もし存在すれば、ペルオキシドによって酸化されて、試料中に存在する毒性未結合ビリルビン濃度量の過剰評価を引き起こす。さらに、テスト中におけるアルブミンとの複合体からのビリルビンの律速解離は酸化中の未結合ビリルビン濃度の定常状態レベルをかなり低下させて、試料中の未結合未抱合ビリルビンの重大な過小評価を引き起こす場合がある。従って、この方法によって測定された未結合ビリルビンは、未結合未抱合ビリルビン、すなわち神経毒画分（ｂｕ）に関する適切な情報を提供するものではない。
従って、未結合未抱合ビリルビン（ｂｕ）の濃度を測定する方法は、非常に有用である。本発明者は、かかる方法を開発した。
発明の概要
本発明は、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法であり、この方法は：
（ａ）試料の第１アリコート中の抱合した「直接的」および未抱合「間接的」ビリルビンの濃度を測定し、
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標準化された触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビンの量が全ビリルビン濃度の約５０％未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記第２アリコート試料の希釈は容量で約３：１未満であり、
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、酸化後に前記第２アリコートに残存する抱合および未抱合ビリルビンを測定し、次いで
（ｄ）以下の式：
ｂss＝−Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）／（希釈率・Ｋp・Ｐ・ｔ）
方程式１
［式中、ｂssはビリルビンの定常状態未抱合未結合濃度であり；
Ｂoは、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は工程（ａ）で測定されたものであり；
Ｂtは、標準化された触媒試薬の存在下で所定時間中に酸化試薬によりビリルビンが酸化された後に残存する、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は工程（ｃ）で測定されたものであり；
希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり；
ｔは酸化反応に対する所定の反応時間であり；
Ｐは触媒試薬の濃度であり；
Ｋpは、アルブミン、あるいはビリルビンに結合できる他の分子の不存在下での前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する１次速度定数である。］
の計算から、ｂssで示される定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度を測定することを含んでいる。
本発明の別の態様は、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法であって、未結合ビリルビンのバックグラウンド酸化に対する修正が望まれる場合に；
（ａ）試料中の抱合した「直接的」および未抱合の「間接的」ビリルビンＢoの濃度を測定し、
（ｂ）前記試料の第２アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約５０％未満となるように充分に短い所定時間でビリルビンを酸化するのに有効な条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記第２アリコート試料の希釈は容量で約３：１未満であり、
（ｃ）前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第２アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度（Ｂt）を測定し、
（ｄ）工程（ｂ）のものと同容量の前記試料の第３アリコートを、添加触媒試薬の不存在下、工程（ｂ）と同一時間で酸化試薬および緩衝液と混合し、次いで前記第３アリコート（Ｂb）中の未酸化未抱合ビリルビンの濃度を測定し、それにより添加された緩衝液の量は工程（ｂ）で添加された触媒試薬の量と容量で等しく、かつ添加された酸化試薬の容量および濃度は工程（ｂ）で用いられたものと等しくし、次いで
（ｅ）以下の式：
ｂss＝−［Ｂo・Ｌｏｇ（（Ｂo−Ｂb＋Ｂt）／Ｂo）］／（希釈率・Ｋp・Ｐ・ｔ）
方程式２
［式中、ｂss、Ｂo、Ｂt、希釈率、Ｋp、Ｐおよびｔは前記のように定義され、Ｂbは添加触媒試薬の不存在下におけるあらゆる酸化後の前記試料中の未抱合ビリルビンであり、その値は工程（ｄ）で測定される。］
の計算からｂssで示される定常状態未抱合非アルブミン結合ビリルビン濃度を測定すること、を含む。
図面の簡単な記載
図１は、２０人の新生児から得られた測定（ｂｓｓ）未結合未抱合ビリルビン濃度と平衡未結合未抱合ビリルビン濃度（ＵＵＢＣｓ）の比を、触媒試薬であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の濃度の関数として表したグラフを示す。傾きの下降は、増大するＨＲＰ濃度に伴いその比が減少することを示している。
図２は、本発明の方法に従い１：１．８の試料希釈で測定した未抱合未結合ビリルビン濃度（ＵＵＢＣ）の関数として、新生児におけるアルブミンに対する結合ビリルビンの比をブロットした、結合等温線である。前記曲線は、非直線回帰を用いて２部位平衡結合モデルに適合させた。
図３は、１：４０試料希釈で未結合ビリルビン濃度（ＵＢＣ）についてのＷ＆Ｊ方法により得られた値と、１：１試料希釈で本発明によって測定された値（ＵＵＢＣ）との相関を示したグラフである。Ｊ＆Ｗ方法によって測定されたＵＢＣは、抱合および未抱合の未結合ビリルビン画分を共に含有するが、本発明の方法では未結合未抱合ビリルビン画分のみが測定される。下方の線は傾きが１（ｕｎｉｔｙ）である。上方の線は回帰曲線である。
図４は、ホモ抱合Ｇｕｎｎ子供ラットにおける全ビリルビン濃度と脳幹聴覚惹起ポテンシャル波Ｉ−ＩＩインターバルの変化との間に有意な相関がないことを示したグラフである。（ｒ2＝０．０４５）
図５は、ホモ抱合Ｇｕｎｎ子供ラットにおける未抱合未結合ビリルビン濃度および脳幹聴覚惹起ポテンシャル波Ｉ−ＩＩインターバルの変化の正の相関をグラフで示す。（ｒ2＝０．３１）
発明の詳細な記載
本発明は、試料中の未抱合未結合ビリルビン濃度の測定方法に関する。
本明細書で用いられる「試料」なる用語は、哺乳動物から収集された流体をいい、通常ビリルビンおよびアルブミンを含んでいる。この流体は、ビリルビン含有血清あるいは血漿、脳脊髄液、羊膜液、リンパ液等を含むが、それらに限定されるものではない。好ましい流体試料は血清または血漿である。分析（アッセイ）すべき生物学的流体はイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、有蹄類および特にヒトから得られる。最も好ましい流体は、ヒトからの血清または血漿である。
本明細書で用いる「抱合された」という用語は、肝臓で変換された後のビリルビンＩＸａの生物学的形態をいい、それに限定されるものではないが水溶性ビリルビンジグルクロニドのような極性抱合体に変換される。
本明細書で用いる「未抱合」という用語は、アイソ形態ビリルビンＩＸａとして示されるビリルビンの脂質可溶性形態をいう。
本明細書で用いる「結合した」という用語は、アルブミンと複合体化した抱合または未抱合のビリルビンの形態をいう。
本明細書で用いる「未結合」なる用語は、アルブミンと複合体化していないまたはそれに結合していない、抱合または未抱合のビリルビンの形態をいう。
ビリルビン酸化剤は、未結合ビリルビンを酸化できるが結合ビリルビンを酸化できない酸化試薬である。例えば、ペルオキシド、フェリシアニド、特にフェリシアニド塩が挙げられ、第ＩＡ族金属塩（例えば、フェリシアン化カリウム）を含む金属塩などがある。酸化剤は、有機のものでも無機のものでもよい。好ましい酸化剤は、式
ＲＯＯＲ1：
［式中、ＲおよびＲ1は好ましくは水素、または炭素数１〜６の有機ヒドロカルビル部である］
のペルオキシドである。Ｒ1は水素であるのが好ましい。好ましいペルオキシドは商業的に入手可能なものであり、過酸化水素、ｔ−ブチルペルオキシド、エチルヒドロペルオキシド等などである。しかしながら、当業者であれば他の許容されるペルオキシドも利用できることを認識するであろう。
「ヒドロカルビル」とは、炭素および水素のみを含有し、かつ１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を含む有機基を意味する。それらは、分岐鎖であっても直鎖であってもよい。好ましいヒドロカルビル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどのようなアルキル基である。
本明細書で用いる「ビリルビン触媒試薬」という語は、未結合であるが結合していないビリルビンの酸化を促進する構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）をいう。好ましい具体例において、かかるビリルビン触媒試薬はペルオキシダーゼである。しかしながら、酸素や、酸素によるビリルビンの酸化を触媒するビリルビンオキシダーゼのような、未結合ビリルビンの酸化を促進するが結合ビリルビンの酸化は促進しないいずれの触媒試薬も使用することができる。
「ペルオキシダーゼ」という用語は、ペルオキシドが電子アクセプターである、反応を触媒する酵素をいう。ペルオキシダーゼは、当業者に知られた技術によって、動物および大部分は植物源から単離されている。ペルオキシダーゼはまた、商業的に入手可能である。これらのペルオキシダーゼの全てが本発明で意図されている。好ましいペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。
本明細書で用いる「緩衝液」という用語は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６、５、４６７においてＧｏｏｄｅによって記載された任意の溶液をいう。好ましい緩衝液としては、ほぼ生理学的ｐＨ、例えばｐＨ７．４で、特に濃度０．０３〜０．７５Ｍにおける、より好ましくは約０．０５５ＭにおけるＳｏｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液のような、リン酸緩衝液が挙げられる。
ジアゾ試薬とは、ビリルビンと反応し、そのジアゾ誘導体を形成する任意の基を意味する。ジアゾとは、化合物が基Ｎ＝Ｎを含むことを意味する。事実上、いずれのジアゾ化芳香族アミンであっても、本明細書で教示する条件に適合する限り、本発明の方法の比色技術においてアゾ試薬として使用することができる。好ましくは、ジアゾ試薬、例えば、本発明で利用されるジアゾ化芳香族アミンは、例えば、塩酸のような強酸を含むスルファニル酸と亜硝酸ナトリウムとの反応により、その場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）形成される。芳香族アミンのジアゾ誘導体を形成する方法は当業者によく知られている。例えば、引用によりその内容が包含される、Ｈｅｎｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版，ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ，ＮＹ，ＮＹ（１９７４）１０３７〜１０７９頁参照。また、例えば、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｈ．Ｊ．Ｃｏｎｎ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＡ（１９６９），第ＶＩ版も参照。一般に、反応は、亜硝酸ナトリウムと塩酸や硫酸のような無機酸との反応からｉｎ ｓｉｔｕで調製される亜硝酸と、ヒドロカルビル、例えばアルキルおよび特に芳香族アミンと、の反応を含む。
芳香族とは、炭素環原子の数が４ｎ＋２であり、ｎが少なくとも１である芳香族化合物を意味する。ｎは１〜１０であるのが好ましく、より好ましくはｎは１〜５であり、最も好ましくはｎは１〜３である。芳香族環はアミンで置換され、さらに、用いる酸化試薬、触媒試薬およびビリルビンの酸化生成物に対して不活性な置換基により置換されていてもよいし、無置換であってもよい。これらのさらなる置換基は、ハロ、オキソ、カルボキシ、炭素数１〜６のカルバルコキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、スルホン酸基等を含む。しかしながら、用いられる芳香族アミンは、好ましくは第一級アミンである。このテストで使用される芳香族アミンは、商業的に入手できるものであって、公知であり、および／または、公知の方法によって実験室で合成される。例えば、スルファニル酸、Ｏ−ジアニシジン、ｐ−クロロアニリン、１，５−ジクロロアニリン、２，４−ジクロロアニリン、２−メトキシ−４−ニトロアニリン、１−アミノアントラキノン、ｐ−ニトロアニリン、４−クロロメチルアニリン、４−クロロアニリン等が挙げられる。当業者であれば、ｉｎ ｓｉｔｕでジアゾ試薬を形成できて本発明の比色部分で使用され得る他の芳香族アミンを認識することができよう。
ジアゾ試薬を調製する好ましい方法において、芳香族アミンを、濃塩酸、濃硫酸、濃リン酸等のような強酸と混合し、次いでこれを水、好ましくは蒸留水、より好ましくは脱イオン水で希釈する。水を添加した後、芳香族化合物の濃度は、約０．０５Ｍ〜約１モル、より好ましくは約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍの範囲であるのが好ましい。加えて、酸の濃度は、好ましくは約０．０５Ｍ〜約１モル、より好ましくは０．０５Ｍ〜約０．５Ｍの範囲である。ジアゾ試薬を形成するには、芳香族アミンを含有する溶液を、亜硝酸塩を含む溶液、例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸リチウムのような第ＩＡ族金属塩の溶液、と反応させる。亜硝酸溶液のモル濃度は、約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、より好ましくは約０．０５Ｍ〜約０．５モルの範囲である。
ジアゾ試薬の形成において、ほぼ等量（モル）の酸性硝酸塩溶液を、等量（モル）の芳香族アミン溶液と反応させるが、モル比は約４：１〜約１：４の範囲であってもよい。ジアゾ試薬の濃度は、約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、より好ましくは約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの範囲である。ジアゾ試薬はかなり反応性であるので、使用に先立って新たに調製されるのが好ましい。あるいは、１つの容器中で上記の量の酸、芳香族アミンおよび亜硝酸塩を混合して、所望の濃度のジアゾ試薬を調製することもできる。
本発明は、試料中の未結合の未抱合ビリルビンの濃度を正確に測定できる点で有用である。さらに、本技術は、ほとんど希釈していないような少量サイズの試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する。上記のように、酸化反応を行うために試料を大量に希釈すると、歪みを促進して、未結合ビリルビンの測定を不正確なものにしてしまう。本発明は、このような大希釈の必要性を軽減する。加えて、本発明は、臨床実験室に容易に適合させうる比色酵素反応および速度論的酵素反応を用いる。本発明は、費用がかからず、高価で精巧な装置の購入を必要とすることはない。
上記のように、本発明の特徴は、試料中に存在する全ビリルビンの潜在的な神経毒成分、すなわち、未結合未抱合ビリルビンの濃度を直接的に測定する方法に向けられている。この方法は、大試料容量または大希釈、高価な器具やトレーニング、および長期の加工遅延によって課される様々な制約を克服する。この方法は、安価で、速く、正確であり、直接的および間接的ビリルビン濃度を測定できる標準的な臨床研究所の器具を用いて行うことができる。
本方法にはいくつかの利点がある：（１）単一方法において比色的および速度論的（すなわち酵素的）技術を組合せ、その結果、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する直接的な一体化方法を可能とする；（２）小試料容量（例えば、１００μｌ以下）であり、その結果、新生児で実験室的テストを行う場合に限定因子となる、より大きな試料容量を回避する；（３）少量試料希釈（例えば、１：３以下）であり、その結果、大希釈（すなわち、約１：４０の範囲）を用いる試料中における、弱く結合する薬物または内因性ビリルビン結合競争体のビリルビン−アルブミンバインディング（結合）もしくはマスキング効果のいずれの内因的変化も回避する。約１：４０の範囲の試料希釈は、もし試料中に弱いビリルビン結合競争体が存在すると、ビリルビン−アルブミン結合を特に変化させ得る。大試料希釈によるマスキング効果は、最終的に、未結合未抱合ビリルビン、すなわちビリルビンの毒性画分の濃度の過小評価につながる；（４）本方法は、アルブミン分子上の占められていないビリルビン結合部位を測定することによって、アルブミンのビリルビンでの「飽和」を測定する代わりに未結合未抱合ビリルビンを直接的に測定する。本方法は、アルブミンが単一のビリルビン分子に結合することを仮定せずアルブミンがいくつかのビリルビン分子に結合できることを考慮に入れているので、ビリルビンの種類の濃度を測定する本方法では、測定において非特異的終点に至ることはない；（５）本発明は、試料中のビリルビンの全濃度を占めるビリルビン画分の各種を測定し、その結果、正確な標準化参照値の確立を可能とし、あるいはビリルビン疾患状態の臨床治療において有用な参照値を確立する方法をもたらす；（６）本発明は、添加触媒試薬の不存在下での試料中のビリルビンの内因性酸化に対し修正するコントロール反応条件を含み得る；（７）本発明は、アルブミンからのビリルビンの潜在的律速解離を解除し、またはこれを修正する反応条件を使用する。というのは、もしそのアルブミンとの複合体からのビリルビンの解離の速度がビリルビンの酸化において律速段階であれば、未結合ビリルビン濃度は有意に過小評価されうるからである；（８）本発明は、抱合および未抱合未結合ビリルビンの両者を測定するのとは反対に、両種は酸化されうるが未抱合未結合のもののみが潜在的に毒性なのであるから、試料中の抱合ビリルビンの酸化によりもたらされる測定のあらゆる誤差を修正する。従って、抱合および未抱合ビリルビン両者の酸化の測定の合体された効果を、本技術によって排除することができる；（９）本発明は、未結合未抱合ビリルビン濃度の過剰評価につながり得る、抱合ビリルビンからの干渉によって引き起こされる誤差を排除する；（１０）高価な器具も、時間を消費するデータプロセッシングも必要ではない；（１１）本発明の方法を実施するにあたり、技術者は、経時的にビリルビンの光吸収の変化をモニターするための献身的な技術者のサポートや計器装備を必要とする代わりに、容易に訓練され、教育される。
加えて、本方法に必要な試薬からなるキットは、安定で安価な試薬から作ることができる。本方法を用いた後、ビリルビンのレベルについての参照値を確立して、臨床的な治療決定における助けとして使用できる。
本発明の分析（アッセイ）方法は、いくつかの異なるビリルビン分析値を提供し得る。例えば、この方法は、未抱合ビリルビンの存在および／または濃度、抱合ビリルビンの存在および／または濃度、未抱合未結合ビリルビンの存在および／または濃度、結合ビリルビンの存在および／または濃度、または、アルブミンに結合したまたは未結合の抱合または未抱合ビリルビンの４つの可能な組合せの各々の存在および／または濃度を測定する。また、この方法は、未抱合および抱合ビリルビンの量の合計と等しい全ビリルビンの存在および／または濃度を測定することができる。本発明の方法は、抱合および未抱合ビリルビンを測定するための両比色技術の特定の要素と、未結合ビリルビンを測定するための速度論技術とをユニークに組み合わせたものである。
本発明の工程の１つは、比色方法であり、もう１つの工程は、比色／速度論的方法の組合せ工程である。特定の順序で後記するが、本発明はあまり限定的ではなく、これらの工程を任意の順序で行うこともできる。例えば、比色工程は後記する比色／速度論的工程の前に、あるいは後で行うことができる。
本発明の分析を行うにおいて、試料は当該分野で公知の標準的技術を用いて患者から採取できる。上記で定義したように、試料はヒト血清または血漿であるのが好ましい。新たに調製された血清または血漿を利用するのが好ましく、好ましくは分析を行うその日に調製する。加えて、血漿または血清は光から保護され、および／または、使用中以外は暗所に保存するのが好ましい。これを義務づけるつもりはないが、これらの注意は、もし光に過剰に暴露されれば、試料中のビリルビン成分の自動的な光酸化による値の減少を防止すると考えられる。
分析を行うにおいて、各工程で必要なのは少量の試料に過ぎない。１００μｌ未満の試料を用いるのが好ましく、より好ましくは８０μｌ未満、最も好ましくは７５μｌ未満の試料が全部で利用される。事実、１０〜１５μｌと少ない試料を、分析の各工程で利用することができる。
Ｂoの測定
上記の方程式１を見ると、測定に必要な変数の１つは試料中の未抱合ビリルビンの濃度である。この間接的ビリルビンは、後記するように、試料中の全ビリルビンおよび試料中の抱合ビリルビンの測定から決定される。
当該分野のビリルビンを分析するまたは定量的に測定する多数の標準的方法は、比色方法に基づくものであり、これはビリルビン色素自体の固有の吸収を測定するか、ある種の試薬の存在下でビリルビンを混合して着色した反応生成物を形成させ、これをスペクトル分析に付すことによる。一般的には、抱合および未抱合ビリルビンの吸収スペクトルの差は余りにもわずかで区別することができないため、ビリルビン色素自体の吸収の測定からは、存在するビリルビンの全量のみが測定できる。従って、ビリルビンに対する多くの比色分析は、通常、着色アゾビリルビン反応生成物を形成するために、ジアゾ化スルファニル酸または他のジアゾ化試薬を使用する。例えば、引用により包含される、Ｍａｌｌｏｙ−Ｅｖｅｌｙｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９（１９３７）；Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒｏｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，２９７，８１（１９３８）、および、ＷａｌｔｅｒｓおよびＧｅｒａｒｄｅ，Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１５，２３１（１９７０）参照。
ジアゾ方法では、抱合および未抱合ビリルビンの濃度が共に測定される。ジアゾ方法の根底となる基礎は、未抱合ビリルビンに比べて抱合ビリルビンのジアゾ試薬との速い反応性、および約５６５ｎｍにおける着色ジアゾ誘導体による光の吸収を前提とするものである。
過剰量（モル）のジアゾ試薬を試料のアリコートに添加する。十分量のジアゾ試薬を、試料中のビリルビンと反応するのに有効な条件下で添加する。添加されるジアゾ試薬の量は、試料の各容量に対するジアゾ試薬の約２０容量〜約１０容量の範囲であることが好ましい。この工程において、上記のようにジアゾ試薬は、抱合ビリルビンと選択的に反応するが未抱合ビリルビンとは全く反応しない。反応は、抱合ビリルビンと反応するジアゾ試薬に効果的な条件下で、十分な時間をかけて行う。溶液は、ジアゾ試薬が抱合ビリルビンをジアゾ化するにつれ着色するようになる。ジアゾ試薬が試料中の抱合ビリルビンと反応してジアゾ化誘導体を形成させるのに充分な時間後、好ましくは約１分以内に、存在する抱合ビリルビンの量をスペクトル分析によって測定する。
本発明のスペクトル分析方法としては、放射線検出の適当な方法であるような、比色検出等の吸収測光法、または蛍光検出等の発光測光法を用いるなど、当該分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。ビリルビンまたはそのジアゾ誘導体の吸収または発光バンドの放射線検出は、種々のよく知られた吸収または発光検出デバイスおよび技術、ここでは一般にスペクトルアナライザーと呼ぶが、を用いて行うことができる。「スペクトルアナライザー」とは、これに限定されるものではないが分光光度計のような、試料の吸収を測定する任意の方法または装置を意味する。これらのスペクトルバンドの検出は、例えば、同一または異なる時間間隔で測定して、既知量の抱合および未抱合ビリルビンまたはそのジアゾ誘導体を含有する一連の対照から得られたスペクトルデータに基づくキャリブレーション曲線に、得られたスペクトルデータを容易に相関させることができるように試料を加工した後、所定の時点で行うことができる。加えて、分析試料（例えば、ヘモグロビン）に存在し得る潜在的な干渉成分からのスペクトル干渉を回避するために、ここで言及する記録された吸収極大のいずれかを、「オフ−ピーク」検出することができる。この「オフ−ピーク」という語は、一般に、ここで言及する極大値から約２０ｎｍまでの波長でスペクトル検出を行うことができることを意味する。従って、本明細書で用いるように、吸収極大「においてまたはその近くの」波長を検出することは、ピーク波長±２０ｎｍ、ピーク強度５０％以上の強度、を表す。
存在する抱合ビリルビンの量は、比色技術によって検出されるのが好ましい。比色技術とは、化学反応の結果として着色反応生成物が形成され、その生成物はスペクトル分析、例えば分光光度計によって測定されるユニークな吸収または発光特徴を有することを意味する。
本システムにおいて、抱合または未抱合ビリルビンに由来するか否かに拘わらず、ジアゾ化ビリルビンは着色溶液を形成する。存在するジアゾ化ビリルビンの量は、好ましくは、約５６５ｎｍの波長において、そのジアゾ化誘導体の吸収から測定される。しかし、この吸収は、既知量のビリルビンから得られた標準曲線を用いるような、当該分野で知られた技術によって、抱合ビリルビンの容量（例えば、ｍグラム／ｄＬまたはモル／Ｌ）当たりの量に変換することができる。
本分析において、この最初の吸収の読みは、試料中に存在する抱合（直接的）ビリルビンの量を与える。存在するビリルビンの全量を測定するために、アクセレレータ（促進剤）を添加する。この促進剤は、未抱合ビリルビンとジアゾ試薬の反応を加速する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，（１９７４）においてＨｅｒｒｙらによって議論されているように、時には「エフェクター」あるいは「プロモーター」として知られているが、種々のアクセレレータが、ビリルビン分析におけるそれらの使用に関して当該分野で知られており、メタノール、カフェイン、安息香酸ナトリウム、界面活性剤、胆汁塩、アラビアガム、サリチル酸塩等のような試薬が挙げられる。利用するアクセレレータは、実質的に純粋であることが好ましい。また、それらは、試料に添加される前に水、特に蒸留水および／または脱イオン水に溶解させ、またはそれと混合するのが好ましい。十分なアクセレレータを添加して、ジアゾ化合物が残存する未ジアゾ化未抱合ビリルビンと反応させる。先の工程で添加したジアゾ化試薬の量に対して等モル量のアクセレレータを、ジアゾ化抱合ビリルビンを含有する試料に添加するのが好ましい。
この時点で、アクセレレータの添加に続き、試料はジアゾ化ビリルビンおよび未抱合ジアゾ化ビリルビンを含有する。本明細書で規定されるように、スペクトル分析を利用することによって、試料に存在するビリルビンの全量を測定することができる。好ましくは、その吸収は比色法によって測定され、吸収値は約５６５ｎｍで読まれ、存在する全ビリルビンの量は、既知量のビリルビンからの、すなわちジアゾ化ビリルビンの既知量に吸収を相関させた標準曲線を用いるような、当該分野で知られた技術によって測定される。次いで、未抱合（間接的）ビリルビンを、全ビリルビンの値と抱合（直接的）ビリルビンの値の差異として計算する。
上記範囲内にｐＨを維持するのを助けるには、これらのビリルビン測定を緩衝液の存在下で行うことができる。本発明の方法の実施には、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，４６７（１９９６）でＧｏｏｄによって報告されているような種々の緩衝液を用いることができる。しかしながら、当業者であれば、特定の条件に応じて、上記の範囲を超えるまたは下回る値にｐＨおよび温度を変化させることができる。但し、望まない副反応またはいずれかのビリルビン組成物の有意な分解を引き起こすようなｐＨまたは温度は使用しないものとする。
許容される方法で機能する他の試薬を本明細書で記載するものの代わりに置き換えることができるのは、当業者によって認識されよう。例えば、もしそれらが所望のｐＨ範囲を供するならば、他の緩衝液を使用することができる。
Ｂｔの測定
方程式１または２に戻るが、本発明のこの工程は、本明細書で定義したように、Ｂtの濃度を測定することによって機能する。上記のように、Ｂoはジアゾ方法によって試料の第１アリコートで測定され、他方、Ｂt、すなわち試料の第２アリコート中の一部のビリルビンの酸化後に残存する未抱合ビリルビンは、上記酸化に続くジアゾ方法によって検出される。
抱合および未抱合ビリルビンは共に、触媒試薬（例えば、ペルオキシダーゼ）の存在下で、酸化試薬（例えば、ペルオキシド）によって、またはヘキサシアノ鉄（III）酸塩のような他の酸化試薬によって酸化され、ジアゾ陰性反応生成物、すなわち、ジアゾ化されておらず、ジアゾ試薬と反応させた場合にジアゾ化誘導体を形成せず天然ビリルビンが光を吸収するスペクトル領域で光を吸収しないような反応生成物、として同定される生成物を生じる。一方、ビリルビンのアルブミン結合は、未結合ビリルビンのみが酸化できるように、ビリルビンの酸化を妨げる。上記したように、未結合ビリルビンの酸化速度は試料中の未結合ビリルビンの全量に比例するので、酸化後に残存する未抱合ビリルビンの測定は、酸化速度の尺度、およびそれにより元々試料中にある未抱合未結合ビリルビンの濃度（ｂss；方程式１参照）を提供することができる。酸化された生成物、酸化試薬および触媒試薬はジアゾ試薬と反応しないので、酸化反応後に残存する未酸化ビリルビンの量は、上記方法の比色技術箇所を通じて測定することができる。以下に述べるように、酸化反応は所定のインキュベーション時間中継続させ、次いでそれを停止させる。所定時間の酸化後に試料に残存する未酸化未抱合ビリルビン（Ｂt）の量を測定するには、比色法を用いる。この方法の素晴らしいところは、比色技術で用いる試薬がビリルビン触媒試薬、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼも変性して、それにより酵素反応を停止させることである。例えば、ジアゾ反応は、典型的には、ｐＨ１およびｐＨ２のおよその間の範囲で行って、誘導体の吸収を増強する。かかる範囲のｐＨにおいて、酸化工程で利用される、ホースラディッシュペルオキシダーゼのようなビリルビンの未結合種の酸化反応を触媒するペルオキシダーゼを変性させる。上記のように、ビリルビン酸化生成物、ペルオキシド、ペルオキシダーゼは、ジアゾ試薬と反応しない。従って、もし試料中のビリルビンが、ジアゾ試薬が添加された後の所定の時間酸化されれば、酸化反応は停止され、全および抱合ビリルビンの残存濃度を測定することができる。もし全および抱合ビリルビンの濃度が、試料中のビリルビン酸化の開始前と開始から所定時間後に測定されていれば、それらの測定を引き続き使用して、後記するように、方程式１または２を用いて、未結合未抱合ビリルビンの濃度を計算することができる。
このようにして、酸性ジアゾ試薬または他の比色試薬の添加は、酸化反応が直ちに停止されて未結合未抱合ビリルビン濃度の計算ができるように、直ちに酵素を変性させる。
上記のＢt測定の記載において、試料が臨界的ｐＨ範囲にあることが重要である。好ましくは、酸化反応中に触媒試薬が有効であるような所定のｐＨ内に試料のｐＨが保たれるように、緩衝剤が用いられる。好ましくは、試料のｐＨは約７．２〜約７．６の範囲、特に約７．４に維持される。この範囲でｐＨを維持するために当業者が通常使用するいずれの緩衝液を用いてもよいが、リン酸緩衝液、特に二水素リン酸緩衝液を利用するのが好ましい。緩衝液の充分量を添加して、このｐＨ範囲に試料溶液を維持する。ビリルビン触媒試薬、例えば、ペルオキシダーゼ、およびビリルビン酸化試薬、例えばペルオキシドは、更に緩衝液を添加する必要がないように、この緩衝液中で調製される。酸化を促進するために試料に添加される試薬は、試料希釈が最小化されるように、緩衝液中に存在させることができる。本発明の方法では、４アリコートまでの試料が要求され得る。しかしながら、後記するように、本発明の具体例は、用いられる近似と状況に応じては、試料の１、２または３アリコートを要する。
試料のアリコート中の未抱合ビリルビンの濃度Ｂoは、上記の比色（例えば、ジアゾ）によって、あらゆる酸化が起こる前に測定される。この測定は試料の第１アリコートを利用する。
酸化試薬および触媒試薬を、試料の第２アリコートに添加する。酸化試薬は、好ましくは緩衝液と混合し、やはり好ましくは緩衝液と混合された触媒試薬の存在下で試料中に存在するビリルビンを酸化するのに十分な量で、アリコート試料に添加される。もしｐＨを適当な値にするのに必要であれば、さらなる緩衝液を添加することができる。存在するビリルビンの量は、上記の比色分析により、酸化のための特定の時間後に測定される。好ましくは、酸化試薬溶液は、その最小容量が試料に添加されるように十分に濃縮する。例えば、おおよそ、約０．１容量〜約１容量の酸化試薬、例えばペルオキシド、を試料１容量当たりに添加し、より好ましくは約０．５容量の酸化試薬、例えばペルオキシド、をそれに添加する。しかしながら、アリコート試料の全希釈率は約３：１（ｖ／ｖ）未満であり、より好ましくは約１．８：１（ｖ／ｖ）未満である。さらに、試料への添加後、酸化試薬の最終濃度は、触媒を酸化試薬で飽和させるのを維持するのに十分であることが好ましい。これは、使用する酸化試薬に応じて変化する。例えば、過酸化水素濃度は、好ましくは、１００〜２００μモル／Ｌの間であり、他方、エチルヒドロペルオキシド濃度は、好ましくは５００〜２０００μモル／Ｌの間である。試料に添加すべき酸化試薬ならびに触媒試薬の濃度は、過度の実験が不要な範囲内の当業者の決定事項である。
試料に添加される触媒試薬の量は、酸化のための所定時間の間に試料中に存在するビリルビンの５０％までの酸化を引き起こすのに十分なものとする。用いる触媒試薬は、当該分野で知られた技術によって標準化されているものである。標準化された触媒試薬の好ましい濃度は、使用する触媒のタイプに依存し、当業者によって容易に決定され得る。タイプＩホースラディッシュペルオキシダーゼでは、使用される量は約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約１０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬの範囲である。続いて、上記第２アリコート中の未抱合ビリルビンの一部（約５０％未満）を酸化するのに有効な反応条件下で、特定の時間、酸化反応を行う。
速度論的（動的）技術の反応速度は温度依存性であるため、また、触媒試薬はある特定の温度範囲内のみで安定であるため、本発明の方法の速度論的部分（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を行う温度は重要である。しかし、標準化の温度と同一温度で試料分析が全て行われる限り、ビリルビン触媒試薬（例えば、ＨＲＰ）と速度論の標準化は、種々の温度で行うことができる。標準化ならびに酸化反応は、触媒試薬が安定な温度範囲で行われる。ペルオキシダーゼに関しては、これらの反応は約１９℃〜約４０℃の範囲の温度で行われる。ホースラディッシュペルオキシダーゼに関しては、好ましい温度は約２１℃である（この温度でＫpは、μｇ／ｍｌ  ＨＲＰ当たり１分につき約８の範囲にある）。ホースラディッシュペルオキシドに関しては、より好ましい温度は約３７℃である（この温度では、Ｋpはμｇ／ｍＬ  ＨＲＰ当たり１分につき約１８の範囲にある）。事実、もしペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）が触媒試薬であれば、好ましい温度は約３７℃である。
酸化反応を所定時間行った後（この時間は、酸化されたビリルビンの量が上記第２アリコートにおける全ビリルビン濃度の約５０％未満となるように十分に短いが）、反応を、例えばジアゾ試薬の添加によって、停止する。上記の比色技術を利用し、触媒反応停止後に残存する未抱合未酸化ビリルビンの量を上記のように測定する（Ｂt）。好ましい実施例において、試料１容量当たり２０容量のジアゾ試薬を添加する。ジアゾ試薬はまず、未酸化抱合ビリルビンの全てを反応させて〜５６５ｎｍでその吸光度が読めるような充分な時間、ここで標準曲線と比較することによってその吸光度から試料中の残存する抱合ビリルビンの濃度が計算されるのであるが、未酸化抱合ビリルビンと反応させる。次いで、アクセレレータを、上記した手法に従い、未酸化未抱合ビリルビンとジアゾ試薬との反応を行うのに十分な量で添加する。好ましくは、試料１容量当たり約２０容量のアクセレレータを添加する。残存する未酸化ビリルビンが上記のようなジアゾ試薬と反応するのに十分な時間、反応を進行させる。〜５６５ｎｍにおける吸光度を読み、それを用いて、標準曲線から第２の試料アリコート中の全ビリルビンを計算する。したがって、試料中の未酸化未抱合ビリルビンの量（Ｂt）は、試料中の全未酸化ビリルビンと試料の未酸化抱合ビリルビンの差である。
Ｂbの測定
試料は、ペルオキシドのような添加された酸化試薬によるビリルビンの酸化を促進する他の触媒または他の物質を元々含有しているので、対照を利用することにより、特定の反応時間の間に添加触媒によって触媒されずに酸化を受けたビリルビンの量を相殺する。こうして、第２アリコートに添加された触媒試薬の量に等しい容量の緩衝液を、今度は、第２アリコートに対して上記で特定した時間、触媒試薬の不存在下で、同一量の試料と酸化試薬（例えばペルオキシド）を含有する第３アリコート試料に添加する。次いで、比色試薬、例えばジアゾ試薬を上記のように添加し、試料中の未抱合未酸化ビリルビンの量（Ｂb）を、上記の比色技術を用いて測定する。
本発明の好ましい実施例を、以下に述べる。好ましい比色試薬は、各々以下の濃度のスルファニル酸、硝酸ナトリウムおよびメタノールである。
ａ．スルファニル酸：濃塩酸１５ｍＬ中１０ｇを、脱イオン水で１Ｌまで希釈
ｂ．硝酸ナトリウム：脱イオン水１００ｍＬ中０．５ｇ
ｃ．９０％無水メタノール／脱イオン水（ｖ／ｖ）
ｄ．ジアゾ試薬：スルファニル酸１．０ｍＬ当たり亜硝酸塩０．０５ｍＬ
Ｂo測定方法の一例を、以下に記載する。
１．ジアゾ試薬を試料に添加し（試料１容量当たり２０容量）、１分後に吸光度を５６５ｎｍで読む。この吸光度を用いて、ビリルビンの既知量から作成した標準曲線から直接的ビリルビンを計算する（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌは約２０ｍｇ／ｄＬの間接的ビリルビン標準を製造する）。次いで、試料１容量当たり２０容量の９０％メタノールを添加し、吸光度を５６５ｎｍで読んで、全ビリルビンを決定する。
２．試料中の未抱合（間接的）ビリルビン濃度は、全ビリルビン濃度から直接的ビリルビン濃度を差し引いたものである。
定常状態の未結合未抱合ビリルビン濃度（ｂss）を決定するために用いられる速度論／比色方法を、以下に例示する。
１．試料の間接的ビリルビン（Ｂo）は、上記したジアゾ方法によって決定される（一般的には、試料の２５μＬアリコート）。
２．６７．５μｇ／ｍＬ標準化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１０μＬおよびエチルヒドロペルオキシド（最終濃度１．０ミリモル／Ｌ）１０μＬを、試料の第２アリコート２５μＬに、ＨＲＰ最終濃度が１５μｇ／ｍＬとなるまで添加する。
３．ペルオキシドの添加に先立ち、試料を３７℃まで加温する。
４．５分後、ジアゾ試薬を添加し、酸化後に残存する間接的ビリルビン（Ｂt）を上記のように測定する。
５．これらの工程から、試料中の未結合未抱合ビリルビンの値（ｂss）を方程式１を用いて計算する。
Ｂb（ビリルビンの非ペルオキシダーゼ触媒酸化後に残存する未抱合ビリルビン濃度）を測定するための方法は、以下に例示される：
６．ＨＲＰの代わりに１０μＬのＳｏｒｅｎｓｅｎ緩衝液と共に、試料の第３アリコートを前記工程１〜４と同様に処理する。
７．工程１〜４および６から、試料中の未結合未抱合ビリルビンの値（ｂss）を方程式２を用いて計算する。
触媒試薬の標準化
試料中の未抱合未結合ビリルビンの値を計算するにあたり、通常はペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）であるが、触媒試薬が標準化される必要がある。これは、Ｋp、すなわち、触媒試薬の存在下での酸化試薬（通常はペルオキシド）によるビリルビンの酸化についての一次速度定数、を決定することによってなされる。このＫpは、未結合未抱合ビリルビンの公知濃度を利用して、当該分野で知られた標準的技術によって測定される。しかしながら、前記Ｋpは、触媒試薬、例えばペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と前記触媒を飽和させるのに充分な量の酸化試薬とを、アルブミンの不存在下で、既知量の未抱合ビリルビンと共に溶液に添加した後、ビリルビン溶液における吸収の減少を時間を追って測定することによっても決定が可能であろう。もしＢが時点ｔにおける未抱合未酸化ビリルビン濃度であれば、Ｐは触媒試薬、例えばペルオキシダーゼの濃度であり、ＢoおよびＢtは、各々、初期未抱合ビリルビン濃度および時点ｔにおける未抱合ビリルビン濃度であり、酸化試薬、例えばペルオキシドの濃度は律速ではなく、ビリルビンのペルオキシダーゼ触媒ペルオキシド酸化に対するＫmよりも充分に低いビリルビン濃度におけるものであり（ＨＲＰについては、この値は３７℃でほぼ７０μモルである）、
ｄＢ／ｄｔ＝−Ｋp・Ｐ・Ｂ    方程式３
である。
限界ｔ＝０とｔ＝ｔの間の積分方程式３（ここで、ｔは上記の所定の時間である）は、以下のようなる。
0004068156.tif 000003
したがって、方程式４に従うと、もし既知濃度のペルオキシダーゼが既知量の未結合未抱合ビリルビンと共に過剰量のペルオキシドと反応するならば、Ｋpの値は決定される。
さらに、ホースラディッシュペルオキシダーゼを凍結乾燥する場合、−５〜−１０℃で乾燥保存すれば少なくとも６カ月間安定であると判断された。さらに、凍結乾燥したＨＲＰを水で１００μｇ／ｍＬの濃度になるよう戻すと、Ｋpは４週間まで未変化のままであることが見出された。
分析により、未結合未抱合ビリルビンの値は方程式１および２から計算される。
本発明者は、例えばペルオキシダーゼ方法のような酸化反応の測定に関する本技術の主要な進歩の１つは、アリコート試料に酸化試薬および触媒試薬を添加することにより得られる最小希釈であることを見いだした。より具体的には、本方法によれば、従来法ほど試料を希釈することがない。従来法では、試料はかなり希釈されなければならない（通常は約１：４０）。本発明の方法では、試料は約３：１（ｖ／ｖ）未満、より好ましくは約１．８：１（ｖ／ｖ）以下の希釈まで、酸化試薬および触媒試薬の添加によって希釈される。
アルブミン分子を固有に変化させることにより、あるいはビリルビン−アルブミン結合を改変する薬物または内因性分子の効果をすっかり弱めることによって、希釈はビリルビン−アルブミン結合を改変させることが示されている。
本発明におけるもう１つの進歩は、未結合未抱合ビリルビン画分を測定する本方法の能力である。ＨＲＰは、抱合または直接的ビリルビンの試料中のペルオキシドによる酸化を触媒できることが判明している。
もしかなりの量の抱合ビリルビンが試料中に存在すれば、酸化中の経時的ビリルビン濃度の変化（ｄＢ／ｄｔ）は抱合および未抱合ビリルビン双方からのかなりの寄与を受けるであろうから、未抱合未結合ビリルビンの濃度は過剰評価されるであろう。抱合および未抱合ビリルビン濃度が上昇している患者は、依然としてビリルビン脳障害に対して危険であるが、もし吸光度の変化を用いて酸化を追跡するならば、ビリルビン濃度の変化の何パーセントが神経毒性の未結合未抱合ビリルビン画分の酸化によるものであるかを測定する方法はない。従って、未結合ビリルビンを測定するための天然ビリルビン吸光度の変化を使用するＪ＆Ｗ方法だけでは、高濃度の未抱合（間接的）ビリルビンの存在下で未結合未抱合ビリルビン濃度を測定することができない。
ビリルビン酸化に対し先行技術で推奨されるペルオキシダーゼの濃度は、これらのペルオキシダーゼ濃度ではアルブミンからのビリルビンの解離はしばしば反応の律速となるため、かなり過小評価された未結合ビリルビン濃度を生じる。ここの記載に従って本分析を行うことによって、先行技術に伴うこれらの問題は克服される。
第１の近似として、試料中の未結合未抱合ビリルビンの測定のためにＢbを測定される必要はない。通常、Ｂb−Ｂo値はＢt値に対して最小であり、従って、未結合未抱合ビリルビン濃度の第１次近似を得るためには、上記プロセスはＢb値を測定することなく行われる。このようにして、方程式１を用いてｂssを解くことができる。要約すると、この実施態様においては、試料の２つのアリコートのみが要求され、１つはＢoを測定するためのものであり、他はＢtを測定するためのものである。
しかし、もし試料において、所定時間（例えば、５分以内）で酸化されたビリルビンの量が全ビリルビン濃度の約５０％より大きい場合は、Ｂbを測定すべきである。
上記のように、第３アリコートで使用したものとは異なる（例えば、低い量）触媒試薬を含有する試料の第４アリコートは、特にもしアルブミンからのビリルビンの解離速度が律速であれば（すなわち、ビリルビンがアルブミンから解離して酸化されたビリルビンを補う速度が実質的にもっと速くない、例えばビリルビンの酸化速度よりも３０倍以上速い）有用である。これは、方程式：
0004068156.tif 000004
によって示され、ここで、Ａ：Ｂはビリルビン−アルブミン複合体であり、未結合ビリルビンである。Ｒ1はビリルビンがアルブミンから解離される速度であり、Ｒ2はビリルビンが酸化される速度である。Ｒ1が＞＞Ｒ2でなければ、ビリルビンのアルブミンからの解離は律速である。Ｒ1がＲ2よりもかなり大きいわけではない場合、方程式１からの定常状態未結合ビリルビン（ｂss）は実際の平衡未結合ビリルビン濃度よりもかなり低いであろう。ビリルビンのアルブミンからの速度がわかっているので、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、Ｒ1がＲ2よりもかなり大きいか否か（例えば、実施例４参照）について、所定の時間内に酸化されたビリルビンの量から決定することができるであろう。
Ｒ1がＲ2よりもかなり大きくはない場合、試料のさらなるアリコートが必要である。
一方、もし、より高いペルオキシダーゼ濃度における定常状態未結合未抱合ビリルビン濃度測定値が、より低いペルオキシダーゼ濃度で見いだされる定常状態未結合未抱合ビリルビンと等しいかそれより大きければ、定常状態未結合ビリルビン濃度は平衡未結合ビリルビン濃度の正確な概算値であって、２つの値は対の試料として単純に平均できる。しかしながら、もし、上記のように、より高いペルオキジターゼ濃度における定常状態未結合ビリルビン濃度がより低いペルオキジターゼ濃度で測定されるものよりも低いならば、ビリルビンのアルブミンからの解離の速度は律速であって、未結合未抱合ビリルビンの平衡濃度ｂ（eq）は、後述するように、定常状態未結合ビリルビン濃度から計算されるはずである。種々のペルオキジターゼ濃度における定常状態未結合未抱合ビリルビン濃度（ｂss）の測定を用いて、以下の方程式（ここで、ｋ-1およびｋ1は、各々、ビリルビン：アルブミン複合体についての解離および会合速度定数であり、「ａ」（これは、酸化の間は一定である）は非占有ビリルビン結合部位の平均濃度である）：
0004068156.tif 000005
［ここで、ｂssは定常状態未結合未抱合ビリルビン濃度であり、ｋ1、Ｂo、ａ、ＫpおよびＰは上記定義の通りである］
に代入することによって平衡未結合未抱合ビリルビンを計算する。
しかしながら、ｂssはバックグラウンド酸化があるか否かに応じて上記方程式１または方程式２から計算され、テストする触媒試薬の異なる濃度の各々に対して値が計算される。２つの異なるが既知である標準化されたペルオキジターゼ濃度、すなわちＰ1、Ｐ2を用いて測定される、未抱合未結合ビリルビンの定常状態濃度であるこれらの値ｂss1およびｂss2を以下の方程式：
0004068156.tif 000006
（ｋ1・ａは、ｋ-1を得るために方程式６に逆代入されうる）
を仮定して方程式６に代入することができる。未結合ビリルビンの平衡濃度は、ｋ-1、ｋ1・ａおよびＢoを用いて計算される。
ｂeq＝（ｋ-1・Ｂo）／ｋ1・ａ      方程式７
２より多い触媒試薬（例えば、ペルオキジターゼ）濃度を本方法で使用するに際し、触媒試薬濃度の増大と共に定常状態未結合未抱合ビリルビン濃度が減少する場合、方程式６の直線変換、非直線回帰またはメジアン方法のような他の方法を用いて平衡未結合未抱合ビリルビン濃度を計算することができる。
本発明のもう１つの態様では、３アリコートの試料が必要である。この実施態様においては、Ｂbは測定されない。というのはＢo−Ｂb値はＢtに対して最小だからである。しかしながら、もし試料において、酸化の間のビリルビンのアルブミンからの解離が律速であれば、上記した触媒試薬の第２の濃度を用い、第２の酸化工程を行う必要があろう。この具体例においては、試料の１つのアリコートがＢoを測定するのに必要であり、他方、他の２つの試料を用い異なる濃度の触媒試薬を利用して２つのｂss値を決定する。使用するペルオキシダーゼの各濃度に対し、ｂssは方程式１を用いて計算する。
ｂss＝Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）÷（希釈率・Ｋｐ・ｐ・ｔ）
このようにして、もしｂss1およびｂss2が非アルブミン結合ビリルビンの定常状態であれば、以下の方程式が適用される：
ｂss1＝（ｋ-1・Ｂo）÷［（ｋ1・ａ）＋（Ｋp・Ｐ1）］
ｂss2＝（ｋ1・Ｂo）÷［（ｋ1・ａ）＋（Ｋp・Ｐ2）］
ｂss1およびｂss2を本方法から決定し、かつｋ-1およびｋ1・ａをこれらの２つの方程式を解いて決定した後、ｂeqは本発明に従って方程式７によって決定される。
本発明の別の実施態様では、試料のただ１つのアリコートが要求される。これは、新生児におけるように、試料中の直接的（抱合）ビリルビン濃度が小さく、試料中に存在する未抱合ビリルビンの量に比して無視できる場合、および全ビリルビンＢoが、例えばもし上記分析によって測定され、知られているような場合に適用できる。これらの状況下で、工程は以下のように行われる。
酸化されたビリルビンの量が全ビリルビン濃度の約５０％未満となるように充分短い所定時間、未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件下、試料のアリコートをビリルビン酸化試薬および標準化触媒試薬と混合する。このとき、上記酸化および触媒試薬の添加による前記アリコート試料の希釈率は、容量で約３：１未満である。酸化反応は所定時間で停止させ、未抱合ビリルビンの濃度を測定する。好ましい具体例では、ジアゾ試薬と酸とアクセレレータを添加する。本具体例においては、抱合ビリルビンの濃度は小さいと仮定されているので、２つの工程でジアゾ試薬およびアクセレレータを添加する必要がないことに注意すべきである。この具体例において、それらはほとんど同時に添加することができる。吸光度は〜５６５ｎｍで読まれ、それを用いて試料中に存在するビリルビンの量を計算する。試料はほとんど抱合ビリルビンを含有しないので、標準曲線から得られる値は試料中の未抱合未酸化ビリルビン（Ｂt）である。
従って、本具体例において、
ｂss＝−Ｂo・Ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）÷（希釈率・Ｋp・ｐ・ｔ）
「ＵＵＢＣ」および「Ｂｕ」という語は同義語であり、交換可能に使用される。
以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例１
ペルオキシダーゼおよびジアゾテストを組み合わせることによる未結合未抱合ビリルビンの測定方法（ペルオキシダーゼ−ジアゾテスト）
利用できる試料容量に応じて、分析すべき試料を各々１０μＬという少量の少なくとも２つのアリコートに分けた。第１のアリコートを用いて、ジアゾ方法によって初期未抱合ビリルビン濃度（Ｂo）を測定した。第２アリコートを用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によって触媒されるエチルヒドロペルオキシド酸化のｔ分後に残存する間接的ビリルビン濃度（Ｂt）を測定した。第３アリコートを用いて、あらゆる非−ＨＲＰ触媒酸化に対し照査するためにペルオキシダーゼ不存在下におけるペルオキシドによるビリルビン酸化のｔ分後に残存する未抱合ビリルビン（Ｂb）を測定した。これは、ほとんどの試料で最小である。ビリルビン−アルブミン複合体の律速解離に対する補正に必要な場合、１以上のさらなるＨＲＰ濃度でさらなるアリコートにおいてＢtを測定することができる。
ＨＲＰ（または触媒なしの対照における緩衝液）を添加して、一般的には１〜１５０μｇ／ｍｌの間の最終濃度とした。
前記アリコートを水浴中で３７℃まで加温し、過酸化水素に対し２００μモル／Ｌ、またはエチルヒドロペルオキシドに対し６００〜１０００μモル／Ｌの最終濃度までペルオキシドを添加して、反応を開始させた。試料容量と共に選択されたペルオキシドおよびＨＲＰの容量は、未抱合未結合ビリルビン濃度が測定される希釈率を決定する。試料希釈率＜１：３（試料容量：反応容量）を用いた。
酸化のｔ分後（アリコート１につき０分および他のアリコートにつき１〜５分）、ＨＲＰを変性させる試薬であるとともにジアゾテスト用の初期試薬でもあるスルファニル酸を添加することによって、反応を停止させた。残存する間接的ビリルビン濃度（Ｂb）または（Ｂt）は、ジアゾテストによって測定される。ジアゾテストは、全ビリルビン濃度ＴＢＣおよび未抱合ビリルビン濃度を共に測定するので、各々、未抱合ビリルビン濃度または全ビリルビン濃度のいずれかを用い、上記で概説したようにこの結果を用いて未抱合未結合ビリルビンおよび全未結合ビリルビンを共に計算することができる。
実施例２
抱合したビリルビンのＵＵＢＣに対する効果
ＵＵＢＣ測定に対する抱合（直接的）ビリルビンの効果を、高ビリルビン血症を有する２人の新生児および２人の成人からの血漿で調べた。
１人は高抱合ビリルビン濃度を持つ者（試料Ａ）および１人はそれを持たない者（試料Ｂ）の２人の新生児において、本方法を用いて、全未結合ビリルビン（ＴＵＢＣ）および未結合未抱合未結合（ＵＵＢＣ）測定分析を行った。試料Ａは体重が７５０ｇの乳児からのものであり、乳児は月齢１カ月で胆汁うっ滞に罹っていた。アルブミン濃度は２．４ｇ／ｄＬであった。酸化は１分間行い、ホースラディッシュペルオキシダーゼのＫpは１７．６ｍＬ−分-1μｇ-1であった。試料Ｂは、血液輸血の後に未抱合高ビリルビン血漿を発症した、体重が１６４０ｇの月齢１カ月の未成熟児からのものである。アルブミンは３．０ｇ／ｄＬであり、Ｋpは１７．７ｍＬ／分・μｇであって、希釈率は１：２．２である。
このＴＵＢＣおよびＵＵＢＣは、本発明に従って測定したものである。試料Ａの結果を表１に示す。ビリルビン濃度の単位をｍｇ／ｄＬからｕモル／Ｌに変換するのに、分母中のファクター０．０５８５が用いられている。
0004068156.tif 000007
計算によるＵＵＢＣは０．００６モル／Ｌであり、他方、計算したＴＵＢＣは０．０１５μモル／Ｌにおいて２５０％高かった。
あまり直接的ビリルビンが存在しない新生児からのＵＵＢＣも、比較のために表１に示す（試料Ｂ）。この新生児においては、ＴＵＢＣはＵＵＢＣよりも約８％高いだけである。
上昇した直接的反応ビリルビンを有する成人血清を用いて、以下のように同様の実験を行った：
高い直接的ビリルビン濃度を持つ２人の成人血清におけるＵＵＢＣおよびＴＵＢＣを、本発明の方法に従って測定した。アルブミン濃度は試料Ａにおいて３．０ｇ／ｄＬであり、試料Ｂにおいて２．２ｇ／ｄＬであった。ペルオキシダーゼ濃度は１．８５μｇ／ｍＬ、Ｋpはペルオキシダーゼ１μｇ当たり１８．５ｍＬ／分、希釈率は１：２．４、反応時間は５分であった。ＴＵＢＣは全ビリルビン濃度（未抱合＋抱合ビリルビン濃度）を用いて計算し、ＵＵＢＣは毒性未抱合ビリルビン濃度のみを用いて計算した。
結果を表２に示す。
0004068156.tif 000008
未結合抱合および未結合未抱合ビリルビン濃度を共に含むＴＵＢＣは、Ａでは０．２０８μモル／Ｌであり、Ｂでは０．２８５μモル／Ｌであり、患者はビリルビン毒性に対して等しく危険にあることを示唆するであろう。しかしながら、２つの試料間のＵＵＢＳは実質的に異なっている（Ａでは０．０２４μモル／Ｌであり、Ｂでは０．１９２μモル／Ｌである）。このＵＵＢＣは、患者Ｂがビリルビン毒性に対してかなり高い危険性を有することを示す。
実施例３
毒性である未結合ビリルビンのレベル
本発明の方法を用い、新生児における９個の未結合ビリルビン測定を行った。全ビリルビンレベルはそれらのに全てにおいて類似していた。新生児の一人は、異常聞き取りスクリーンにより証明されているビリルビン脳障害の病気を持っていた。全てのテストはうまく行われた。未結合ビリルビンは、病気の新生児において実質的に一層高かった。
0004068156.tif 000009
上記表から分かるように、健康な乳児の平均未結合は０．０６３μモル／Ｌ±０．０３７であり、他方、病気乳児のそれは４倍高かった。
この実験は、試料中の未結合未抱合ビリルビン濃度において高い値はビリルビン毒性とよく相関し、低い値はビリルビン毒性の証拠がないこととよく相関することを示す。テスト試料でテストを行う場合、結果を、同程度の全ビリルビン濃度を持つがビリルビン毒性の証拠を有しない患者からのテストの値と比較するのが好ましい。もしテスト試料からの値が有意に高ければ、例えば、正常値の約２倍または約２標準偏差を超えていれば、試料が得られた患者はビリルビン毒性を発症するかなりの危険性を有していると結論される。
実施例４
対照がペルオキシダーゼ−ジアゾテストで必要な場合の測定条件
未結合ビリルビンを測定するためのペルオキシダーゼスキームの正確性は、ビリルビンおよびアルブミンの、基礎をなす動的平衡の最小摂動に依る（全てのビリルビンは未抱合であると仮定する）。ここで、Ａ：Ｂはビリルビン−アルブミン複合体の濃度であり、ｂeqは平衡未結合ビリルビン濃度であって、ａは平衡未結合アルブミン濃度である。
Ａ：Ｂ→ａ＋ｂeq
ＨＲＰおよびペルオキシドを系に添加すると、未結合ビリルビンは酸化され、以下のスキームに従って、系は平衡から定常状態にシフトする。
0004068156.tif 000010
ここで、ｂssはここでは未結合ビリルビンの定常状態であり、ｂoxは反応の酸化生成物を表す。速度１は速度２に対して非常に速いのが好ましい。もし第一次解離速度定数ｋ-1（複合体の解離速度はｋ-1・Ａ：Ｂである）によって支配されるＡ：Ｂ複合体の解離がＫp・ＨＲＰ・ｂssの速度と比べて非常に速ければ（例えば、前記複合体は酸化速度よりも約２０倍速く解離する）、ｂssはｂeqとほとんど等しいに近いであろう（例えば、もしＡ：Ｂ解離が酸化の速度よりも９５％速ければｂeqの約９５％である）。
ｋ-1についての最低値が約０．４／分があることが確立された。従って、経時的な酸化されたビリルビン量と対照をそのようにする必要性との間の関係を確立することができる。これは、一般的方程式：
ｌｏｇ（Ｂt／Ｂo）＝−ｋ-1・時間
を用いてなされる。ｋ-1に対し０．４／分を仮定して複合体が解離に必要とするであろう最長時間についての表は、以下のように作成することができる。
0004068156.tif 000011
上記データを用いて酸化速度は解離速度の５％以上ではないことを確立し、対照が必要か否かに拘わらず、どれだけ多くの現実のビリルビン濃度が所定時間にわたって減少しうるかを決定することができる。
例えば、もし２０％を超えるビリルビンが、６７０秒（１１．２分）経過前に酸化されれば、酸化の速度は解離の速度の２０倍遅いのではないようである。もう１つの例として、もし５％を超えるビリルビンが１５４秒（２．６分）内に酸化されれば、再度、ビリルビンのアルブミンからの解離はかなり律速で、ｂeqを、試料中の真実の（平衡）未結合ビリルビン濃度をかなり下回り得る定常状態値ｂssまで減少させるようである。上記方法の誤差を考慮すると、それは平衡未結合ビリルビンの９５％より大きいであろう。これは、反応に対して選択された時間間隔の間に酸化されたビリルビンの量を記録することによって決定することができる。もし酸化された量が割り当てられたものを超えるならば（上記表参照）、対照（すなわち、さらなるペルオキシダーゼ濃度における未結合ビリルビンの決定およびビリルビンの非ペルオキシダーゼ触媒酸化が起こっているか否かの判断）が必要である。
実施例５
ＵＵＢＳに対するアルブミン複合体からのビリルビンの律速解離の効果
ＨＲＰ濃度は、２０人の黄疸新生児からの血漿試料において、約１〜１２５μｇ／ｍｌの間で変化した。平衡ＵＵＢＣに対する定常状態の比を、図１においてＨＲＰ濃度の関数としてプロットする。この比は、ＨＲＰ濃度が増大するにつれてかなり減少し、これは、ＨＲＰ濃度が増大するにつれてＵＵＢＣ過小評価が増えることを示す。非常に低いＨＲＰ濃度においてさえ、いくつかの試料ではＵＵＢＣのかなりの過小評価が依然としてあり、これは、試料の分析には少なくとも２つのＨＲＰ濃度を使用する必要があることを示す。さらに、非−ＨＲＰ触媒酸化のバックグラウンドはしばしば全酸化速度のかなりの部分となって分析の精度を低下させるため、約５μｇ／ｍｌ未満のＨＲＰ濃度は現実的でなかった。このため、酸化時間中の未抱合ビリルビン濃度の変化から、さらなるホースラディッシュペルオキシダーゼ濃度での未結合ビリルビン濃度の測定が必要か否かを決定することができる。
実施例６
高レベルの抱合ビリルビンを有する試料における未結合未抱合ビリルビンの測定
本発明は、全未結合ビリルビンを測定するにすぎない方法とは対照的に、試料中の高レベルの抱合ビリルビンを検出し修正する利点を有する。抱合ビリルビンの酸化の混同した効果は、毒性未結合ビリルビン画分の過剰評価に導き得る。本発明の方法はまた、毒性未結合ビリルビン画分の過小評価に導き得るアルブミンからのビリルビンのあらゆる律速解離を修正する。これらの特徴は、試料中の抱合と未抱合の未結合ビリルビンを区別できないことからの誤差を示す以下の実施例で説明される。本実施例では、ビリルビンのアルブミンからの解離の値は律速であり、２つの異なるペルオキシダーゼ濃度において測定を行った。
溶液：
緩衝液：０．０５５Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４
標準：
１．Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌビリルビン対照（未抱合ビリルビンのみ）：全ビリルビン１９．９ｍｇ／ｄＬ、抱合ビリルビン０ｍｇ／ｄＬ
試料：
２．全ビリルビン約１５ｍｇ／ｄＬおよび抱合ビリルビン約４ｍｇ／ｄＬを含むＣｈｅｍＴｒａｋ３対照血清
ペルオキシダーゼ：
３．標準化したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）：０．０５５Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中８０μｇ／ｍｌおよび１６０μｇ／ｍｌ。３７℃においてμｇ／ｍｌ当たり１分につきＫp＝２０．９。
４．エチルヒドロペルオキシド（ＥｔＯＯＨ）、０．０５５Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎリン酸緩衝液中１０ｍＭ
ジアゾ：
５．１５ｍｌの濃塩酸を含有する水１リットル中のスルファニル酸１０ｇ／Ｌ
６．水１００ｍｌ中、亜硝酸ナトリウム０．５ｇ
７．メタノール／水  ９０％ｖ／ｖ
反応速度論：
１．試料０．０５ｍｌ
２．緩衝液またはＨＲＰ０．０５ｍｌ（各々、８０および１６０μｇ／ｍｌストックにつき最終ＨＲＰ＝３６．４および７２．８μｇ／ｍｌ）
３．緩衝液またはＥｔＯＯＨ  ０．０１ｍｌ
反応容器中の試料にＨＲＰを添加し、３７℃まで加温した。ＥｔＯＯＨを添加し、１．０ｍｌのスルファニル酸を添加することによって、１分後に反応を停止させた。試料溶液をキュベットに移し、前記キュベットをＨＰ８４５２分光光度計を用い５６６ｎｍでブランクを採った。亜硝酸塩（０．０５０ｍｌ）を添加し、１分後に吸光度を測定した（５６６ｎｍ）。この吸光度値を用いて、試料中の抱合ビリルビンの濃度を計算した。メタノール（１．０ｍｌ）を引き続き添加し、混合した後、２分後に吸光度を再度測定した（５６６ｎｍ）。この第２の吸光度値を用いて、試料中の全ビリルビンの濃度を決定した。試料中の未抱合ビリルビンの濃度は、抱合ビリルビン濃度についての値から全ビリルビン濃度についての値を差し引くことによって決定した。
Ｓｉｇｍａ標準を用いて、５６６ｎｍにおけるジアゾ誘導体に対する吸光係数を測定した（反応容器１）。反応に対しては同様に処理したが、ビリルビン酸化試薬またはビリルビン酸化触媒試薬（例えば、ＥｔＯＯＨまたはＨＲＰ）は添加しなかった。ＣｈｅｎＴｒａｋ試料中の全ての、抱合および未抱合ビリルビンについての濃度を、酸化の前後で測定した。ペルオキシダーゼの不存在下では、この試料中にペルオキシドによるビリルビンの酸化は生じなかった。プレ・酸化ビリルビン濃度をＳｉｇｍａ標準（反応チューブ２）と同様に測定した。チューブ３および４において、２つの異なるＨＲＰ濃度で、酸化を１分間進行させた。
0004068156.tif 000012
１：００分後（容器の３および４）、スルファニル酸０．１ｍｇ＋亜硝酸塩０．０５ｍｌ、続いてメタノール１．０ｍｌを、上記のように添加した。
0004068156.tif 000013
全ビリルビン濃度のみを考慮する未結合ビリルビンの計算（ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇによる；１９７４）：
ＨＲＰ＝３６．４μｇ／ｍｌに対し；初期全ビリルビン（Ｂo）＝１５．１ｍｇ／ｄＬ。（ビリルビンのＭＷ＝５８５グラム／モル）。ビリルビンをａ μモル／Ｌに変換するには、そのｍｇ／ｄＬ濃度を０．０５８５で割る。
全ビリルビン（Ｂt）＝１２．７ｍｇ／ｄＬ（チューブ３における合計）定常状態未結合ビリルビン（ｂss）の正味の変化
式：
0004068156.tif 000014
定常状態全未結合（抱合＋未抱合）ビリルビン＝０．０２７μＭであり、これは全ビリルビン濃度１５．１ｍｇ／ｄＬ（２５８μＭ）の約０．０１％である。
ＨＲＰ＝７２．８については、定常状態未結合ビリルビンは先に概説したように計算した。ここで：
Ｂoは１５．１ｍｇ／ｄＬであって、
Ｂtは１１．６ｍｇ／ｄＬである。
定常状態未結合ビリルビンは０．０２０μＭとしてある。
より高いＨＲＰにおける定常状態未結合は、より低いＨＲＰにおけるものよりも小さいので、ビリルビンのアルブミンからの解離は、酸化の間は律速でなければならない。
上記のようにして方程式を解くと、０．０４２μモル／Ｌの平衡未結合ビリルビンを与える。このようにして、アルブミンからのビリルビンの律速議論に対する修正をすることなく、未結合ビリルビンはほぼ３６％だけ過小評価される。この問題に対する修正の必要性は、２以上のＨＲＰ濃度においてテストを行う場合にのみ明らかになるであろう。未抱合ビリルビンと同様に抱合ビリルビンの酸化についても修正はなされないので、これを例として用いて、さらなる潜在的誤差が起こる。もし抱合ビリルビンを各合計ビリルビンから差し引いてビリルビンの未抱合（毒性形態）（結果の表の最後の欄）を得るとすると、未抱合未結合ビリルビンは、未抱合ビリルビン値を用いて、概説したように計算される：
ＨＲＰ＝３６．４μｇ／ｍｌについては、Ｂoは１０．９ｍｇ／ｄＬであり（全未抱合ビリルビン）およびＢtは１０．７ｍｇ／ｄＬである。定常状態未結合未抱合ビリルビンは０．００２μＭとしてある。
ＨＲＰ＝７２．７μｇ／ｍｌについては、Ｂoは１０．９ｍｇ／ｄＬであり（全未抱合ビリルビン）およびＢtは１０．５ｍｇ／ｄＬである。定常状態未結合未抱合ビリルビンは０．００２μＭとする。
未結合未抱合ビリルビンは各ＨＲＰで同一であるので、未抱合ビリルビンのアルブミンからの解離はこの反応では律速ではないことに注意されたい。さらに、抱合ビリルビンの干渉を考慮することなく、毒性ビリルビン画分はその現実の値よりも４０倍大きい値において、誤って同定されるであろうことにも注意されたい。抱合ビリルビンからの干渉に対して修正した後は、ビリルビンのアルブミンからの律速解離の徴候はない。本実施例において、未抱合未結合ビリルビンの測定で使用した希釈率は１：２．２である。抱合および未抱合ビリルビンを区別できない方法と比較して、未抱合未結合ビリルビンを測定する本技術の利点は明瞭である。加えて、もし１つのビリルビン酸化触媒濃度のみ（例えば、ただ１つのＨＲＰ濃度）を本例で用いると、試料中の未結合ビリルビンの濃度は非常に過小評価される。
実施例７
Ｇｕｎｎ子供ラットにおける未結合未抱合ビリルビン脳幹聴覚惹起ポテンシャルの測定
ビリルビン毒性は、とりわけ難聴を生じる。ビリルビンは脳幹聴覚惹起ポテンシャル（ＢＡＥＰ）、新生児における聞き取りを評価するのに使用されるテスト、を誘導することが示された。ＢＡＥＰは、新生児がビリルビン毒性に対し危険である場合の評価方法として提案されている。
最近、ＢＡＥＰの変化が、ヒト新生児における全ビリルビン濃度とよりも、（Ｗ＆Ｊテストで測定した）未結合ビリルビン濃度の測定と良好に相関することが示されている。
未抱合未結合濃度およびＢＡＥＰを、ホモ抱合（ｊｊ）Ｇｕｎｎ子供ラットにおいて、本発明の方法によって測定した。（新生児黄疸のモデルとして働く、先天的未抱合高ビリルビン血症を持つ動物）。Ｗ＆Ｊ方法はこの動物においてビリルビン−アルブミン結合を測定するのに使用されてきたが、試料希釈に要する血清濁度、ならびに可変吸光度特性は、テストの精度を制限する。本発明の方法による結果をＢＡＥＰＳ測定と比較した。
脳幹聴覚惹起ポテンシャル（ビリルビン毒性の感度インジケーター）を、１６．０日齢（ＳＤ  ０．５）で体重が２６．８ｇ（ＳＤ  ２．０）のＧｕｎｎ子供ラットで測定した。ＢＡＥＰは、ケタミンおよびアセプロマジン麻酔薬下で測定した。７５のｄＢＨＬ単耳クリックを右および左の耳に投与し、右および左耳からのＩ−ＩＩ波間間隔（ＢＡＥＰはＩＩ潜伏、ＢＡＥＰはＩ潜伏）を平均した。この間隔は、ビリルビン毒性の感度インジケーターである。
Ｉ−ＩＩ波間間隔の測定に続き、ビリルビン−アルブミン結合の分析のために心臓穿刺によって血液を採取した。
血清を分離し、分析まで−７０℃で凍結させた。
アルブミンは、標準としてラット・アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いるＢＣＰ方法によって測定した。１０μＬにおいては、アリコートを２ｍｌのＢＣＰと組み合わせた。ラット・アルブミンの吸光度および６０４ｎｍにおけるＢＣＰは、ヒト・アルブミンについてのそれの約５０％である。
全ビリルビン濃度（これらの動物は抱合ビリルビンを作らない）を、２５μＬの血清を用いるジアゾ方法によって測定した。Ｓｉｇｍａ未抱合ビリルビン対照を、標準として使用した。試料を添加した後であるが亜硝酸塩およびメタノールを添加する前にキュベットをゼロとするので、この方法は濁度に対して修正する。
次いで、２５μＬのラット血清を、ＨＲＰ２５μＬ、および、１：１６０希釈の１０−１２％エチルヒドロペルオキシド１０μＬと混合し、酸化を１〜３分間で進行させた。ＨＲＰを変性させるジアゾスルファニル酸試薬により反応を停止させた。ゼロにした分光光度計に試料を入れ、亜硝酸塩およびメタノールを添加した。２分後に、ジアゾ化試料の吸光度からＢtを計算した。ｂssは方程式１によって計算した。
０．３〜６７μｇ／ｍｌの間の３〜４の異なるＨＲＰ濃度での測定からｂssを決定して、ビリルビンのアルブミンからの律速解離を修正し、ｂss値を用いて、上記の平衡未結合ビリルビン（ｂeq）を計算した。
２つの方法からの結果を、ＢＡＥＰ変化と全ビリルビン濃度およびＵＵＢＳとの関数を比較する図４−５で示す。
図４は、全ビリルビンとの有意な相関はないことを示す（ｒ2＝０．０４５）。
図５は、未結合未抱合ビリルビンとの有意な相関を示す（ｒ2＝０．３１）。
実施例８
未結合ビリルビンの濃度測定に対する試料希釈の効果
上記のように、ビリルビンの直接的テストは間接的テストよりも好ましい。しかしながら、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度に対する直接的テストは、使用する試料希釈に対して敏感である。以下の実施例は、試料中の未結合未抱合ビリルビン濃度の直接的テストにおいて、試料の希釈率がどれ位大きければ（すなわち、約１：４０の範囲）試料中の未結合未抱合ビリルビンの真の値の過小評価につながり得るかを説明する。アルブミンからビリルビンを置換する薬物スルフィソキサゾールは、恐らくは新生児の血液および組織中の未結合未抱合ビリルビンの濃度の増大の結果として、新生児に投与されるとビリルビン毒性の発症をもたらすことが報告されている（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＷＡら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １８：６１４，１９５６）。この事実を利用して、出願人は、イン・ビトロの直接的テストにおいて試料希釈率を変えることが未結合未抱合ビリルビンの濃度の測定に影響するであろうかを決定しようと試みた。既知濃度の試薬を用いることができ、テストにおける未結合ビリルビンの量を操作できることから、このイン・ビトロテストを採用した。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎによって報告されているように、アルブミンに結合しているビリルビンを除去して試料中の未結合未抱合ビリルビンのレベルを増加させるする手段として、スルフィソキサゾールを採用した。未結合未抱合ビリルビンの濃度のこれらの増加は、大きな試料希釈率（すなわち、約１：４０の範囲の希釈）を要する直接的方法を用いるよりも小さな試料希釈率（すなわち、約１：２の範囲の希釈率）を用いる本発明の方法を用いることにより、より正確に測定されるであろうことが仮定された。
２つの試料希釈濃度を用いた（１：１．８および１：４１．８）。ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇの未結合ビリルビン分析方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０：７８３、１９７４）に必要であると報告された希釈率の範囲にあることから、より高い試料希釈率（１：４１．８）を選択した。より低い試料希釈率は、本発明で使用する直接的分析方法を表す。
脱脂肪アルブミン中の未抱合ビリルビンの溶液（全ビリルビン２０ｍｇ／ｄＬ、全アルブミン３．０ｇ／ｄＬ）を、スルフィソキサゾール１５ｍｇ／ｄＬの存在下および非存在下で分析した。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎによって報告されているスルフィゾソサゾールの血中レベル（すなわち、１５ｍｇ／ｄＬ）を模倣して、スルフィソキサゾールのこの濃度を採用した。
ｐＨ７．４の０．０５５Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎの緩衝液中ビリルビン約２０ｍｇ／ｄＬを含有する３．０ｇ／ｄＬ脱脂肪アルブミン溶液の０．９７５ｍｌに、スルフィソキサゾール（６ｍｇ／ｄＬの０．０２５ｍｌ）または緩衝液（０．０２５ｍｌ）を添加した。最終スルフィソキサゾール濃度は１５ｍｇ／ｄＬであった。上記したペルオキシダーゼ技術を用い、ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇの方法と比較して本発明方法を採用して、１：１．８および１：４１．８の希釈率にて未結合未抱合濃度を測定した。０．１ｃｍ光路長キュベットを使用して、１：１．８希釈率において未結合ビリルビンの直接的スペクトル分析を行った。
方法：１：１．８希釈率の読み取りは以下のようにに行った：
１００μｌのビリルビン−脱脂肪アルブミン試料を、１６μｇ／ｍｌ標準化ＨＲＰ（Ｋp＝１９．６ｍｌ／分μｇ）４０μｌを含有する０．１ｃｍ光路長キュベットに添加した。ＨＲＰおよびＥｔＯＯＨを０．０５５Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎの緩衝液（ｐＨ７．４）に含有させた。最終ＨＲＰ濃度は３．５６μｇ／ｍｌであった。４６０ｎｍで測定した吸光度の降下を５分間より長くモニターした。未結合ビリルビンの濃度は、方程式１を用い、所定時間後に全ビリルビン濃度の一次変化から計算した。
ＨＲＰ濃度がほぼ２倍になったとき、アルブミンからのビリルビンの律速解離により干渉は見いだされなかった。
比色方法：各１０μｌのＨＲＰおよびＥｔＯＯＨ（上記した濃度およびモル濃度）を、スルフィソキサゾールを含むまたは含まないビリルビン−脱脂肪アルブミン溶液試料２５μｌに添加した。５分後、ジアゾ試薬（スルファニル酸＋亜硝酸塩）０．５ｍｌを添加して反応を停止させた（この人工的な系には存在しないため、抱合ビリルビン濃度は測定しなかった）。続いて、９０％メタノール０．５ｍｌを添加して、色形成を加速した。ＨＲＰの代わりに１０μｌの緩衝液を含有する類似の試料を用いて、時刻ゼロ（ｔ＝０）にて全ビリルビン濃度を測定した。未結合ビリルビン濃度は方程式（１）を用いて計算した。
試料０．０２５ｍｌを緩衝液１．０ｍｌに添加し、上記の各１０μｌのＥｔＯＯＨとＨＲＰを用いて反応を開始させることによって、１：４１．８の希釈を行った。ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ方法は、１ｃｍ光路長を用いて上記のように行った。比色手法は、１．０ｍｌのジアゾ−Ａで５分後に反応を停止させ、次いで、９０％メタノール１．０ｍｌを添加することによって行われた。結果を表３に示す。
0004068156.tif 000015
各値は、３回の反復実験の平均および標準偏差である。
表３に示すように、最小希釈率（すなわち、１：１．８）を使用した分析は、スルフィソキサゾールによって放出される未結合未抱合ビリルビンの濃度をより正確に反映する。より高い試料希釈率（すなわち、１：４０）を使用する分析は、未結合ビリルビンに対するスルフィソキサゾールの効果を反映しない。スルフィソキサゾールの適用後に放出された未結合未抱合ビリルビンの量は、ほぼ２倍に増加した。全ビリルビンの毒性画分は、未結合未抱合ビリルビン種からなる部分に表れるているので、かかる知見は非常に重要である。従って、未結合未抱合ビリルビンの濃度の増加を検出する感度の向上した方法は、非常に有用で有利であろう。ビリルビンに対するアルブミンの結合部位が飽和するにつれ、全ビリルビン濃度のさらなる小さな増加には神経毒性である未結合未抱合ビリルビンの濃度の不均衡な大きな変化が伴い得ることから、未結合未抱合ビリルビンの濃度の最も小さい変化に対する感度の向上は有益である。そこで、全ビリルビンの濃度の小さな増加でさえ、ビリルビン脳障害を発症する実質的な危険に新生児をさらし得る。従って、全ビリルビンの小さな変化によって、あるいは、ビリルビン−アルブミン結合と干渉できる分子によって生じた未結合ビリルビンの上昇レベルを検出できない分析よりも、未結合未抱合ビリルビンの量の小さな増加に対してさえ感度のよい分析のほうが好ましい。
実施例９
ＵＵＢＣ測定に対する本発明の方法とＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇの方法との比較
本発明によって、２０人の新生児の血漿ＵＵＢＣを測定し、得られた値をＷ＆Ｊ方法によりＵＢＣ値を測定する場合と比較した。Ｗ＆Ｊ方法では、４つのＨＲＰ濃度を１：４３．７の試料希釈率で使用し、本発明では、１：１．８試料希釈率および２〜４のペルオキシダーゼ濃度を使用した。結果を図３に示す。本発明から得られた値はＵＵＢＣをより正確に測定してした。
実施例１０
本発明により測定した新生児の血漿におけるＵＵＢＣ
赤血球増加症を持つ妊娠終結時新生児で行った部分的交換輸血からの血漿をビリルビンで滴定し、未抱合未結合ビリルビンを本発明の方法によって測定して、最小に希釈した血漿中のビリルビン−アルブミン結合等温線を評価した。結果を図２に示す。非直線回帰を用いて平衡結合定数を決定したところ、部位間の相互作用のある２部位モデルが結合等温線に最良に適合した。１：１ビリルビン／アルブミン種についての平衡解離定数は０．０５９μモル／Ｌであり、一方、２：１ビリルビン／アルブミン種についてのそれは０．０３０３μモル／Ｌであった。この結果は、固定された部位モデルに曲線を適合させようとする試みにより１つの負の定数が得られたことから、ビリルビンに対するアルブミン結合部位が正の協同性を示すことを示唆する。
この分析は、遊離アルブミン上に単一の結合部位は存在しないこと、および遊離アルブミンを測定する他の結合方法は正確ではないであろうことを示す。
実施例１１
酸化中の「ａ」（占められていないビリルビン結合部位）の濃度の変化
従来の研究は、Ｗ＆Ｊ方法に対する速度曲線は一次反応速度に従うことを示し、これは結合ビリルビンに対して利用できるアルブミン部位の濃度が反応の間で一定であることを示す。未占有ビリルビン結合部位の濃度は、反応中、基本的に一定である。このことは、ＵＵＢＣを計算するのに使用される式をバリデートするのに重要であるので、さらに検討された。
２７８μモル／Ｌビリルビン、６０，８３９カウント／分、５０μｇ／ｍＬペルオキシダーゼ、および１０００モル／Ｌのエチルヒドロペルオキシドを含有するビリルビン−14Ｃ／脱脂肪アルブミン溶液（モル比０．４２）を８分間反応させた。種々の時点（０〜８分）で、１００μｌの反応混合物を取り出し、１００ミリモル／Ｌ  Ｎａ2Ｓ  １０μｌに添加して反応を停止させた。０．０５５ＭのＳｏｍｅｎｓｅｎの緩衝液で１．０ｍｌまで希釈した後、４６０ｎｍでの吸光度からビリルビン濃度を計算し、次いで、製造業者の指示に従って、全希釈反応混合物をセファデックス  Ｇ２５  ０．５×５ｃｍ（直径×長さ）カラム上に置いた。次いで、アルブミン画分を緩衝液で溶出させた。残存するビリルビンおよび溶出物の放射能を各時間間隔で測定して、反応のあいだ酸化生成物がアルブミンに結合したままであって、従って、アルブミンと共にセファデックス カラムを通過するか否かを判断した。
非占有ビリルビン−アルブミン結合部位の濃度が反応の間に変化するか否かを判断するための実験から得られた結果を、表４に示す。
0004068156.tif 000016
予備的実験により、約５％の放射能がカラムを通過することによって試料から取り出されたことが示された。全ビリルビン濃度は、８分間の反応によってその元の値の約４６％まで降下し、放射能の８６％がアルブミンと共に残り、これは酸化生成物が依然としてアルブミンに結合したままであることを示す。
この実験は、約半分のビリルビンが酸化された場合に、上記の計算において遊離アルブミンは一定と考えるのが適当であることを示す。
最も現実的で好ましい実施態様であると考えられるものにおいて本発明を示し、ここに記載した。しかしながら、本発明のスコープの範囲内においてこれらの実施態様から外れることができ、当業者であればこの開示を読んで部分的な変更等を加えるであうことが認められる。本記載を通じ、好ましい実施態様および示した実施例は、本発明についての限定ではなく、例示と考えられるべきである。従って、本発明は特定の例示的実施態様によって制限されるべきものではなく、添付の請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
【図１】
0004068156.tif 000021
【図２】
0004068156.tif 000022
【図３】
0004068156.tif 000023
【図４】
0004068156.tif 000024
【図５】
0004068156.tif 000025