(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるか、またはポリメラーゼ活性が保持される範囲で１個または複数個のアミノ酸の欠失または置換を有する配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなる、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスの酵素的に活性な、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性が除去されているものである、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ポリメラーゼが、アミノ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失されているかまたはアミノ酸が変更されて、前記エキソヌクレアーゼ活性が除去されている、請求項２記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが、７０６位においてフェニルアラニンがチロシンに置き換えられたものである、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ポリメラーゼが、アミノ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、７０６位においてフェニルアラニンがチロシンに置き換えられたものである、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
前記ポリメラーゼが、１個またはそれ以上のアミノ酸が変更されてエキソヌクレアーゼ活性が除去されており、７０６位においてフェニルアラニンがチロシンに置き換えられたものである、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかに記載の精製されたＤＮＡポリメラーゼを緩衝液中に含む、安定な酵素的組成物。
【請求項８】
請求項１−６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする精製された核酸。
【請求項９】
請求項１−６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含有するベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
鎖置換増幅において用いるための、請求項１−６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性制限酵素。
【請求項１１】
配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるか、またはポリメラーゼ活性が保持される範囲で１個または複数個のアミノ酸の欠失または置換を有する配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなる、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスの酵素的に活性な、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鎖置換により核酸フラグメントを生成し増幅する方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性が除去されたものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１−６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性制限酵素を含む、ＤＮＡの鎖置換増幅のためのキット。
【請求項１４】
ＤＮＡをシークエンシングし、このことにより、ＤＮＡテンプレートのヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定することができる方法であって、請求項４、５、または６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼを少なくとも１つの鎖停止剤の存在下で用いて、前記ＤＮＡテンプレートから鎖停止されたフラグメントを生成し、そして前記フラグメントのサイズから前記ＤＮＡテンプレートの少なくとも一部の配列を決定する、の各工程を含む方法。
【請求項１５】
請求項４、５、または６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼおよびピロホスファターゼを含む、ＤＮＡシークエンシング用のキット。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドプライマー、請求項１−６のいずれかに記載のポリメラーゼ、および１種類から４種類のデオキシリボヌクレオシドリン酸を提供することによりｃＤＮＡを製造する方法。
【請求項１７】
リバーストランスクリプターゼとして有用な、請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
リバーストランスクリプターゼとして有用な、請求項２記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼおよび単一の反応容器中でポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適したポリメラーゼを用いる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性が除去されたものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適した前記ポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適したポリメラーゼを含む、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応用のキット。
【請求項２３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性が除去されたものである、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適した前記ポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適したポリメラーゼを含む、ＲＴ／ＰＣＲにおいて用いるための溶液。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性が除去されたものである。請求項２５記載の溶液。
【請求項２７】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適した前記ポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項２５記載の溶液。
【請求項２８】
請求項１−６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性制限酵素を含む、ＤＮＡの鎖置換増幅のための溶液。
【請求項２９】
請求項４、５、または６のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼおよびピロホスファターゼを含む、ＤＮＡのシークエンシングのための溶液。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、好熱性嫌気性菌であるテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）から得ることができる新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびこの酵素のある種の欠失体（ｄｅｌｅｔａｎｔｓ）および変異体、および野生型および変異体ポリメラーゼをコードする遺伝子およびベクター、ならびに鎖置換活性、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシークエンシングにおける、およびリバーストランスクリプターゼとしてのそれらの使用に関する。
以下は関連する技術の説明であり、これらのいずれも本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復および複製に関与する酵素のファミリーである。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよびそのクレノー・フラグメント）およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、および最近では熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが単離されている（例えばＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（米国特許４，８８９，８１８）およびＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから）。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、現存する核酸配列を元々存在する量と比較して大量に増幅するために用いることが示唆されている（米国特許４，６８３，１９５）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）は核酸配列を増幅する２つの方法である。
ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドプライマーが標的ＤＮＡ分子の反対側の鎖上の特定の配列にハイブリダイズし、続いてＤＮＡポリメラーゼによりこれらのプライマーが伸長されてＤＮＡの２つの新たな鎖が生成し、これはそれ自体後続のラウンドのハイブリダイゼーションおよび伸長のためのテンプレートとして働くことができる。ＰＣＲ反応においては、１つのサイクルの生成物が次のサイクルのテンプレートとして働いて、サイクルのそれぞれの繰り返しにおいて反応系中に存在する特定の配列の量が倍増して指数関数的増幅プロセスをもたらす。
ＰＣＲは、温度サイクリングのプロセスにより増幅反応を進行させる。この温度サイクリングは、反応の１つのサイクルで形成されたＤＮＡの鎖を分離して、次のサイクルを開始させるのに必要なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能とするのに必要である。ＤＮＡ鎖の分離は、通常は９０−１００℃の範囲の温度でＤＮＡを溶融させることにより行い、次いでより低い温度に冷却してオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、続いて反応プロセスによって伸長またはライゲーションを行う。このサイクリングプロセスは、プロセスおよび必要な増幅の程度によって、２０−５０回繰り返すことができる。
温度サイクリングは、通常は、一般に熱サイクラーと称される特化された装置を使用することにより行われる。これは、広範な機械的、電気的または液圧的手段により作動することができるが、増幅反応を実施する小さい容器または多数のそのような容器を加熱および冷却するという一般的な目的にかなう。
増幅反応を所望の効率および特異性で進行させるためには、厳密に規定され再現可能な温度および時間の範囲の温度サイクリングプロセスを実施することが必要である。温度サイクリング装置が必要な条件を達成することに失敗すると、増幅反応は部分的にまたは完全に失敗する。サイクリングの時間および温度についてのこれらの厳しい要件は、多数の反応の取扱が必要な場合に重大な制限を課す可能性がある。数百またはそれ以上の反応を実施することが望まれる場合、一般的な熱サイクラーを同時に使用することは装置に必要な資本投資の点で非常に高価となるであろうし、いずれにせよ、個々の熱サイクラーの間の変動が生じやすい。大スケール使用の別の解決法は、ファン補助付きオーブンまたは多数の水浴に基づいて構成されている。しかし、そのような解決法は使用が不可避的に煩わしく、いずれにせよ蒸発を回避するためにユーザーが通常の厳しさの工程をとることを必要とし、これは多数のサイクルに適用することは非常に困難となる。
逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）においては、ＤＮＡプライマーを標的ＲＮＡ分子の鎖にハイブリダイズさせ、続いてこのプライマーをリバーストランスクリプターゼで伸長させて、ＤＮＡの新たな鎖を生成させ、これがＰＣＲのテンプレートとして働くことができる。ＤＮＡテンプレートの調製は、好ましくは高温で実施してＲＮＡ二次構造により引き起こされるリバーストランスクリプターゼ反応の早期停止を回避する。高温、例えば５０℃以上で作用する有効なリバーストランスクリプターゼは不足している。
ＳＤＡは、等温増幅プロセス、すなわち、すべての反応が同じ温度で起こり、ＤＮＡ鎖を溶融させるために高温を必要としない点においてＰＣＲと異なる。これは、ある種のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡテンプレート鎖に沿って伸長するときに既にテンプレートにハイブリダイズしている任意のＤＮＡ分子を置き換える能力を利用する反応スキームを適用することにより可能となる。ＳＤＡにおいては、この鎖置換を用いて反応プロセスの間に生成した二本鎖ＤＮＡを分離し、このことにより標的ＤＮＡ配列の連続増幅を持続させる（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．Ｃ．、Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  ＳｈａｎｋＤ．Ｄ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６）。したがって、３７℃から６０℃の温度で実施される等温プロセスは、蒸発を防ぐために厳しく用心することを必要とせず、単純な温度制御装置、例えば標準的な実験室インキュベータで実施しうるため、原理的にはＳＤＡは多数の試料について用いるのにＰＣＲより適している。
ＤＮＡポリメラーゼ、例えばシークエナーゼ、クレノー、Ｔａｑ等はまた、ＤＮＡシークエンシングにおいて広く用いられている。例えば米国特許５，１７３，４１１を参照。
発明の概要
本発明は、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。この酵素は、ＳＤＡ等の鎖置換ＤＮＡ合成を必要とする方法、ＤＮＡシークエンシング、および／または逆転写に有用である。熱安定性およびＤＮＡを複製させる能力を維持した、天然のテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのポリメラーゼと実質的に同じ効力を有する種々の変異体（欠失および置換）も本発明の範囲に含まれる。
第１の観点においては、本発明は、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、図２Ａ−Ｄ（配列番号２）に示される少なくとも４０個の連続するアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸ホモロジー、好ましくは少なくとも９０％のホモロジーを有する精製されたＤＮＡポリメラーゼまたはそのフラグメントを提供する。図２Ａ−Ｄは、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノムＤＮＡ（図１Ａ−Ｅ）（配列番号１）の、天然のポリメラーゼをコードする可能性のあるヌクレオチド１０５６−３６７４にわたるオープンリーディングフレームの翻訳を表す。
本明細書において用いる場合、アミノ酸ホモロジーとの用語は、親酵素のアミノ酸との同一性またはそれに対する保存アミノ酸の変更を意味する。
本発明の精製された酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約９０，０００ダルトンの分子量を有する。これは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成の至適温度はアッセイ条件下で７５℃付近である。ＤＮＡ合成のための至適マグネシウムイオンおよびマンガンイオン濃度は、それぞれ１ｍＭおよび０．５ｍＭである。
熱安定性ポリメラーゼとの用語は、熱に対して安定（かつ熱耐性）であり、高温、例えば７０℃でのＳＤＡおよび／またはシークエンシングにおいて用いるのに適した酵素を意味する。本明細書では、熱安定性酵素は増幅反応において有効であるための１つの基準を満たさなければならない。すなわち、酵素は増幅を行うのに必要な時間高温にしたときに不可逆的に変性（不活性化）してはならない。本明細書の目的においては、不可逆的変性とは、永久的かつ完全な酵素的活性の喪失を表す。好ましくは、酵素は約７０℃において不可逆的に変性しないが、より高い温度においては変性してもよい。本明細書における熱安定性酵素は、好ましくは、それが機能する至適温度を約４０℃より高い温度に有し、これはプライマーのテンプレートへのハイブリダイゼーションが促進される温度より低い。ただし、ハイブリダイゼーションは、（１）塩の濃度および組成、および（２）プライマーの組成および長さに依存して、より高い温度（例えば４５−７０℃）で生じうる。酵素の至適温度が高ければ高いほど、プライマー指示性伸長プロセスの特異性および／または選択性が高くなる。しかし、４０℃以下、例えば３７℃で活性な酵素もまた、熱安定性であるかぎり本発明の範囲内である。好ましくは、至適温度は約５０から８０℃、より好ましくは５０−７０℃の範囲である。
本明細書において用いる場合、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼまたはそのフラグメントとの用語は、配列番号１によりコードされる酵素と実質的に同じ効率でＤＮＡを複製する能力を有するＤＮＡポリメラーゼまたはそのフラグメント（以下で定義する）を意味する。実質的に同じ効率とは、配列番号１によりコードされる酵素がデオキシヌクレオチドを取り込む効率の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％を意味する。
本発明はまた、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを緩衝液中に含む安定な酵素組成物を包含する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは精製された形態である。精製されたとは、ＤＮＡポリメラーゼが通常これに付随する大部分の宿主細胞蛋白質から単離されることを意味し、好ましくは、ポリメラーゼが調製物の蛋白質の少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、例えば少なくとも５０％（ｗ／ｗ）であり、さらにより好ましくはこれが均一な調製物、例えば均一溶液として提供されることを意味する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で単一のポリペプチドである。
中性ｐＨ（５−９）付近の緩衝液、例えば５−１００ｍＭ  ＴｒｉＳ−ＨＣｌ、リン酸またはＭＥＳが、本発明において用いるのに適している。
本発明はまた、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を提供する。図１Ａ−Ｅは、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を包含する、クローン化されたゲノム配列のヌクレオチド１−５３００を表す（配列番号１）。図７Ａ−Ｃは、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの全長天然ポリメラーゼのＤＮＡ配列（配列番号２３）を表す。
ポリメラーゼの全アミノ酸配列が酵素的活性に必要なわけではないことが見いだされている。すなわち、例えば酵素のエキソヌクレアーゼドメインを欠失させて、酵素活性を保持し、かつこの酵素をｃＤＮＡの作成に有用とするリバーストランスクリプターゼ活性を有する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定したときに約６４，０００ダルトンの分子量の酵素が得られている。このエキソヌクレアーゼフリー酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントの類似体である。すなわち、本発明はまた、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのＤＮＡポリメラーゼ活性を保持するが、１個またはそれ以上のアミノ酸が、好ましくはアミノ末端から欠失されており、依然として図２Ａ−Ｄ（配列番号２）に示される少なくとも４０個の連続するアミノ酸配列に少なくとも８０％のアミノ酸ホモロジーを有するポリメラーゼのフラグメントを提供する。
別の観点においては、本発明はテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのＤＮＡポリメラーゼに対応し、アミノ末端のアミノ酸配列の３分の１までが欠失されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。特に、Ｎ−末端が欠失されて５７８アミノ酸（図４Ａ−Ｃを参照）（配列番号４）および６０８アミノ酸（図３を参照）（配列番号３）を与えるテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのフラグメントが酵素活性を保持していることが見いだされた。
ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が除去されているか、または減少していることが好ましい。これは、酵素のこの活性の原因であるアミノ酸領域を欠失させることにより、例えば、アミノ末端において３分の１までのアミノ酸配列を欠失させることにより、または適当なアミノ酸変更により、行うことができる。
エキソヌクレアーゼ活性を除去するためのＮ−末端欠失およびアミノ酸変更に加えて、酵素は、熱安定性または酵素活性に有意な影響を与えないように天然酵素と比較して保存アミノ酸が変更されていてもよい。このような変更には、同様に荷電したアミノ酸を互いに置換すること、または小さい側鎖を有するアミノ酸を他の小さい側鎖と置換すること、例えばａｌａでｖａｌを置換することが含まれる。そのような変更によりポリメラーゼ活性にほとんどまたは全く影響がみられない重要でない領域に、より大きな変更を導入してもよい。
ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｔｚ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６３：７７７−８２２，１９９４）は、触媒中心、プライマーの３’末端のための結合部位、およびｄＮＴＰ結合部位等のＤＮＡポリメラーゼの種々の機能を検討している。特に、ここでは、三者複合体中のｄＮＴＰの結合に影響する変異が述べられている。欧州特許出願０６５５５０６Ａは、極性の、ヒドロキシル含有アミノ酸残基がｄＮＴＰ基質の結合部位の近くに存在することが、ポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドを効率的に取り込むことが可能であるために重要であることを開示する。本出願人は、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスから得ることができるＤＮＡポリメラーゼ中のｄＮＴＰ基質のためのｄＮＴＰ結合部位を、結合部位の近くの位置に極性の、ヒドロキシ含有アミノ酸残基を含有させることにより改変すると、ポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドを取り込む効率が増加することを発見した。好ましくは、極性の、ヒドロキシ含有アミノ酸はチロシンである。また、天然の酵素の７０６位に対応する位置においてフェニルアラニンをチロシンで置き換えると、酵素をシークエンシングに用いる場合にジデオキシヌクレオチドの取り込みが改良されることが見いだされている。特に、エキソヌクレアーゼ活性が例えば点突然変異または欠失により欠失されており、かつ天然の酵素の７０６位に対応する位置のフェニルアラニンが、酵素がジデオキシヌクレオチドを取り込む効率を野生型酵素の少なくとも２０倍に増加させるアミノ酸、例えばチロシンで置き換えられている、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのポリメラーゼが、シークエンシングにおいて用いるのに特に好ましい酵素である。好ましくは、この改変された酵素は、５４０−５８２アミノ酸、例えば５６０−５８２アミノ酸、好ましくは５７８アミノ酸を有する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、当業者に知られる標準的な技術を用いて構築することができる。例として、フェニルアラニンからチロシンへの変異を有するポリメラーゼを製造するためには、ＰｈｅからＴｙｒアミノ酸への所望の変更を取り込むように変異原ＰＣＲプライマーを設計することができる（１つのプライマー中でのＦＹ変異）。エキソヌクレアーゼ機能の削除は、ＰＣＲによりアミノ末端を除去することにより、または部位指向性突然変異の標準的技術により点突然変異を生成させることにより行う。
本発明のＤＮＡポリメラーゼの改良された発現は、サイレントコドン変更（すなわちコードされるアミノ酸が変更されない）を導入することにより達成することができる。そのような変更は、変異原性ＰＣＲプライマーを用いることにより導入することができる。サイレントコドン変更、例えば以下のものは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて蛋白質生成を増加させる：
コドンＧＡＧでＧＡＡを置換；
コドンＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧまたはＣＧＡでＣＧＴまたはＣＧＣを置換；
コドンＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＴＴＧまたはＴＴＡでＣＴＧを置換；
コドンＡＴＡでＡＴＴまたはＡＴＣを置換；
コドンＧＧＧまたはＧＧＡでＧＧＴまたはＧＧＣを置換。
アミノ末端の３分の１までのアミノ酸配列が欠失されている、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスポリメラーゼからのＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、およびフェニルアラニンからチロシンへの改変を組み込んだそのようなポリメラーゼもまた、本発明により提供される。
さらに別の観点においては、本発明は本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性をコードする遺伝子、例えば、天然のテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスに対応するアミノ酸配列、または３分の１までのＮ−末端アミノ酸を欠失しており、７０６位のフェニルアラニンがチロシンにより置換されていてもよい点においてこれと異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含有するベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＡにおいて、好ましくは熱安定性制限酵素と組み合わせて適切に用いられる。したがって、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼと熱安定性制限酵素、例えばバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＢｓｏＢＩとを組み合わせて含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のＤＮＡポリメラーゼを熱安定性制限酵素と組み合わせて含む、ＳＤＡ用のキットまたは溶液を特徴とする。
本発明のポリメラーゼはまた、鎖置換増幅（ＳＤＡ）メカニズムを介して核酸フラグメントを生成し増幅する方法において有用である。この方法は、一般に、ａ）第１のプライマーを標的核酸配列の５’側に特異的にハイブリダイズさせ、第１のプライマーは標的結合領域の５’側に制限酵素認識配列を含み；
ｂ）３種類のｄＮＴＰおよび１種類のｄＮＴＰαＳの存在下で、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼ活性が除去されているＤＮＡポリメラーゼを用いてハイブリダイズした物質の３’末端を伸長させ；
ｃ）好ましくは、制限酵素でヘミホスホロチオエート認識部位にニックを入れ；
ｄ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いてニックにおいて３’末端を伸長させて、標的鎖の下流の相補体を置き換え；そして
ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す、
の各工程を含む。
このＳＤＡ方法は、１つのプライマーを上述のように用いるとき、直線的増幅速度で進行する。しかし、二本鎖ＤＮＡフラグメントの各鎖にハイブリダイズする２つのプライマーを用いると、この方法は指数関数的に進行する（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．Ｃ．、Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｎｋ，Ｄ．Ｄ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９６）。
本発明はまた、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法を提供する。この方法は、ＤＮＡ分子を用意し、ＤＮＡ分子にハイブリダイズしうるプライマー分子とアニーリングさせ、そしてアニーリングした分子を、少なくとも１種類の、好ましくは４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはフェニルアラニンからチロシンへの変異を含むＤＮＡポリメラーゼを含む容器中でインキュベートすることを含む。また、特定のヌクレオチド塩基でＤＮＡ合成を停止させる少なくとも１つのＤＮＡ合成停止剤が提供される。この方法はさらに、インキュベーション反応のＤＮＡ生成物をサイズにしたがって分離することを含み、このことによりＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定することができる。
好ましい態様においては、シークエンシングは４０から７５℃の間の温度で実施する。
別の好ましい態様においては、ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼ１ｍｇあたり１０００、２５０、１００、５０、１０または２ユニットより低いエキソヌクレアーゼ活性を有し（標準的方法により測定、以下を参照）、４、６または１０塩基しか有しないプライマーを用いることが可能である。インキュベート工程の開始時における４つすべてのデオキシヌクレオシド三リン酸の濃度は、停止剤、例えばｄｄＮＴＰにより停止されるまでＤＮＡ合成が持続することを可能にするのに十分である。
好ましくは、対応するｄｄＮＴＰに対して２、５、１０または１００倍以上過剰のｄＮＴＰが提供される。
関連する観点においては、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびシークエンシングに必要な試薬、例えば、ｄＩＴＰ、デアザｄＧＴＰ、ｄｄＮＴＰ等の鎖停止剤、および任意にピロホスファターゼを含む、ＤＮＡシークエンシングのためのキットまたは溶液を特徴とする。
フェニルアラニンからチロシンへの変異を含む本発明のＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはピロホスファターゼと組み合わせて、シークエンシングにおいて好適に用いられる。したがって、本発明は、フェニルアラニンからチロシンへの変異を含む本発明のＤＮＡポリメラーゼを、ピロホスファターゼ、好ましくはテルモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）からの熱安定性ピロホスファターゼと組み合わせて含む組成物を提供する。
別の関連する観点においては、本発明は、１種類またはそれ以上の（好ましくは２、３または４種類の）デオキシリボヌクレオシド三リン酸、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および第１の鎖停止剤を用いて、本質的に上述したようにＤＮＡの鎖をシークエンシングする方法を特徴とする。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを伸長させて、伸長されたプライマーの長さにおいて異なる第１のＤＮＡ生成物の第１の群を形成することを引き起こし、それぞれの第１のＤＮＡ生成物はその伸長された末端に鎖停止剤を有し、それぞれの第１のＤＮＡ生成物の分子の数は、２０塩基以下の長さで異なる実質的にすべてのＤＮＡ生成物についてほぼ同じである。この方法はまた、第２の鎖停止剤を第１の鎖停止剤と異なる濃度でハイブリダイズした混合物中に提供することを特徴とする。ここで、ＤＮＡポリメラーゼは伸長されたプライマーの長さにおいて異なる第２のＤＮＡ生成物の第２の群の生成を引き起こし、それぞれの第２のＤＮＡ生成物はその伸長された末端に第２の鎖停止剤を有する。それぞれの第２のＤＮＡ生成物の分子の数は、互いに１−２０塩基の長さで異なる実質的にすべての第２のＤＮＡ生成物についてほぼ同じであり、前記第２のＤＮＡ生成物の長さと２０塩基以下の長さの差を有するすべての第１のＤＮＡ生成物の分子の数とは明確に異なる。
好ましい態様においては、３種類または４種類のそのような鎖停止剤を用いて異なる生成物を生成させ、シークエンシング反応はマグネシウムイオン、またはマンガンもしくは鉄イオンとともに提供され（例えば、０．０５−１００ｍＭ、好ましくは１−１０ｍＭの濃度）、そしてＤＮＡ生成物はゲルの４つまたはそれ以下のレーンで分子量にしたがって分離することができる。
別の関連する態様においては、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマー、シークエンシングされるべき核酸、１種類から４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および量の異なる少なくとも２つの鎖停止剤を、オリゴヌクレオチドプライマーが伸長してシークエンシングすべき核酸に相補的な核酸フラグメントを形成するのに好ましい条件下で組み合わせることにより、核酸をシークエンシングする方法を特徴とする。この方法はさらに、核酸フラグメントをサイズにより分離し、核酸配列を決定することを含む。作用物質（ａｇｅｎｔ）は、プライマー伸長生成物中の標識の強度により互いに区別される。
さらに別の観点においては、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡの試料、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および１から４種類のデオキシリボヌクレオシドリン酸を、相補的ＤＮＡの製造に好適な条件下で組み合わせることにより、相補的ＤＮＡを製造する方法を提供する。
リバーストランスクリプターゼとして作用する本発明のＤＮＡポリメラーゼはＲＮａｓｅＨ活性をかなり欠失しているかまたは好ましくはこれを有さず、したがって、ＲＴ／ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションプローブの生成およびＲＮＡシークエンシングにおいて有用である。さらに別の観点においては、本発明は、１ｍｇあたり１０００ユニットより高いリバーストランスクリプターゼ活性を有する精製された熱安定性リバーストランスクリプターゼを提供する。好ましくは、リバーストランスクリプターゼはＲＮａｓｅＨ活性を欠失しており、リバーストランスクリプターゼはテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのものであり、リバーストランスクリプターゼはエキソヌクレアーゼ機能を除去するＮ−末端欠失またはアミノ酸変更を有する。別の観点においては、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲに適したＤＮＡポリメラーゼを同じ反応容器中で用いる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）のための方法を特徴とする。好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼはテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのものであり、ポリメラーゼは１個またはそれ以上のアミノ酸がアミノ末端から欠失しているかまたはアミノ酸が変更されてエキソヌクレアーゼ活性が除去されており、ＰＣＲに適したＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。別の観点においては、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲに適したＤＮＡポリメラーゼを含む、ＲＴ／ＰＣＲのためのキットまたは溶液を特徴とする。好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼはテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのものであり、ポリメラーゼは１個またはそれ以上のアミノ酸がアミノ末端から欠失しているかまたはアミノ酸が変更されてエキソヌクレアーゼ機能が除去されており、ＰＣＲに適したＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。
本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
好ましい態様の説明
まず図面を簡単に説明する。
図面
図１Ａ−Ｅは、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの全長ＤＮＡポリメラーゼに隣接しおよびコードするゲノムＤＮＡの５３００ｂｐのＤＮＡ配列（配列番号１）である。
図２Ａ−Ｄは、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの全長ポリメラーゼをコードしうる連続オープンリーディングフレーム（配列番号２）である。翻訳は、図１Ａ−Ｅ中のゲノムＤＮＡのヌクレオチド１０５６−３６７４にわたるオープンリーディングフレームのものであり、これは天然のポリメラーゼをコードする可能性がある。
図３は、ヌクレオチド７９６−２６１６、アミノ酸２６６−８７２およびアミノ末端における開始メチオニンの連続オープンリーディングフレームであり、６０８アミノ酸（配列番号３）を含む酵素のエキソ変異体である。
図４Ａ−Ｃは、５７８アミノ酸を含む、エキソ変異体ポリメラーゼのＦ４１２Ｙ変異の連続オープンリーディングフレーム（配列番号４）である。アミノ酸４１２において、フェニルアラニンがチロシンで置換されている。
図５は、クローン化ポリメラーゼの概略図である。文字Ａ−Ｄは、実施例２の表に示される種々の構築物の開始部位を表す。
図６は、エキソ変異体酵素および逆転写活性を有する他の酵素の相対的ＲＴ活性を比較したグラフ描写である。ｘ軸はポリメラーゼ（ＭＭＬＶ、ＡＭＶ、Ｔｔｈ、ＵＳＢ）を表す。ｙ軸はリバーストランスクリプターゼ活性をｃｐｍで表す。
図７Ａ−Ｃは、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの全長の天然のポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号２３）である。
実施例
以下の実施例は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを例証するためのものである。
実施例１：精製および特性決定の間に用いられる一般方法
ＤＮＡポリメラーゼ活性のアッセイ
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、活性化サケ精子ＤＮＡをテンプレートとして用いて、酸沈殿可能物質への放射性標識デオキシヌクレオチドの取り込み量を測定することによりアッセイした（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．（１９６６）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｐｐ．２６３−２７６，Ｇ．Ｌ．Ｃａｎｔｏｎｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ（ｅｄ．），Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  ｎｕｃｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｃｈ，Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。１ユニットのＤＮＡポリメラーゼは、７０℃で３０分間に１０ｎｍｏｌのデオキシヌクレオチド三リン酸の酸沈殿可能物質への取り込みを触媒する酵素の量である。アッセイは、ＤＮＡポリメラーゼを含む２−１０μｌの蛋白質溶液を５０μｌのアッセイミックス（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．５（室温で）、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍｌ活性化サケ精子ＤＮＡ、１μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α−33Ｐ］ｄＡＴＰ）とともに７０℃で１０分間インキュベートすることからなる。反応は、それぞれ１ｍｌの担体（５０μｇ／ｍｌ魚精子ＤＮＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）および沈殿剤（２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、２％（ｗ／ｖ）ピロホスフェートナトリウム）を含む管にアッセイの内容物を加えることにより停止する。氷上で少なくとも５分間インキュベートした後、溶液をガラス繊維フィルター（例えばＧＦ／Ｂ，Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過し、数ミリリットルの氷冷洗浄溶液（１Ｎ塩酸、１００ｍＭピロホスフェートナトリウム）で洗浄し、水性液体シンチレーションカクテル（例えばＢｉｏｓａｆｅ  ＩＩ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）とともに計数バイアルに入れ、液体シンチレーションカウンターで計数する。試験溶液のＤＮＡポリメラーゼ活性は、アッセイミックスの測定された比活性から計算する。アッセイ反応あたり０．０１−０．２ユニットの直線範囲内にあると測定された活性値のみを有意であると認めた。
蛋白質濃度の測定
溶液の蛋白質濃度は、試験溶液の波長２０５ｎｍにおける吸光度（Ａ205）を決定することにより分光光度計により測定した（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．（１９９４）ｐｐ．４６−４８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ポリペプチドの吸光計数はＥ２０５（１ｍｇ／ｍｌ）＝３１とした。
エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ
エキソヌクレアーゼ活性は、記載されるように（Ｋｏｎｇ、Ｈ．，Ｋｕｃｅｒａ、Ｒ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊａｃｋ、Ｗ．Ｅ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６８，１９６５−１９７５）、ＣｐＧメチラーゼの作用により3Ｈで標識されたＨｉｎｄＩＩＩ消化ファージλＤＮＡ、またはトリチル化ＴＴＰの取り込みにより3Ｈで標識されたｐＢＲ３２２から生成された５００ｂｐのＰＣＲ生成物を基質として用いて測定した。エキソヌクレアーゼアッセイは、ポリメラーゼアッセイと同じ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．５（室温）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で、同じ温度（７０℃）で実施した。
エキソヌクレアーゼの指向性のアッセイ
付随するエキソヌクレアーゼ活性の指向性は、記載されるように（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．上掲）、５’および３’末端で異なるように標識したＤＮＡ基質からの放射活性の時間依存的放出をモニターすることにより決定した。
鎖置換活性のアッセイ
ＳＤＡ（鎖置換増幅）反応における有用性についてポリメラーゼを評価するために伸長アッセイが開発されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。この伸長反応は、ポリメラーゼが下流の鎖を置き換える能力およびこれがニック部位から伸長を開始する能力を試験する。この置換およびニックにおける開始は、互いにすぐに隣接するそれらの５’末端で標識された２つのプライマーをアニーリングさせることにより行う。ポリメラーゼが鎖置換活性を有し、ニックにおいて開始することができれば、両方のプライマーは伸長され、２つの伸長生成物を観察することができる。ポリメラーゼがニックにおいて開始することができなれば（すなわち、ギャップにおいて開始することを好む）、またはこれが置換活性を有さなければ、下流プライマーのみが伸長され、１つの生成物のみが検出される。
プラスミドｐＢＲ３２２を標的として用いて、プラスミド上で互いにすぐ隣接してアニーリングする２つのプライマーｐＢＲ１およびｐＢＲ２を合成した。プライマーｐＢＲ１は上流プライマーであり、ｐＢＲ３２２中の塩基３６６１−３６９０（ＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡ）（配列番号５）に対応する。プライマーｐＢＲ２は、下流にアニーリングし、ｐＢＲ３２２の３６９１−３７２０（ＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣ）（配列番号６）に対応する。これらの３０ｍｅｒオリゴを変性ポリアクリルアミドゲルから電気溶出により精製した。１０μＭプライマー、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７０μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよび１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、３７℃で３０分間のキナーゼ反応によりプライマーを標識した。最終濃度０．２μＭ（それぞれ）のこれらの２つの標識プライマーを２００ｎｇのＰｓｔＩ／ＨｉｎｃＩＩ消化ｐＢＲ３２２と合わせた。これらを、２５ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７．４、２．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２−１ｍＭ  ｄＮＴＰｓを含む緩衝液中で９８℃で３分間変性させ、反応温度（５０−７０℃）まで２分間冷却した。１ユニットのポリメラーゼを加え、反応を１０分間続けた。等量の９５％ホルムアミド、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー染料を加えることにより反応を停止した。２５μｌを６％変性ゲル上で電気泳動し、ゲルはオートラジオグラフフィルムに露光した。
実施例２：天然酵素の精製
粗精製
テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカス細胞の増殖
テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスＪＷ１０２株の凍結乾燥培養物は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）から購入した。用いた増殖培地は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳＭ株カタログ、１９９３年版の培地＃６１）であり、これは１リットルあたり次のものからなる：１０ｇトリプトン、１０ｇショ糖、２ｇイーストエクストラクト、０．２ｇＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇＮａ2ＳＯ3、０．０８ｇＮａ2Ｓ2Ｏ3・５Ｈ2０および１ｍｇレサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）。培養物は７０℃で嫌気性条件下で増殖させた。増殖後、培地をほぼ室温まで冷却し、培養物を連続フロー遠心分離により回収した。細胞ペーストは、以後の手順の前に−８０℃で保存した。
抽出物の調製
冷凍細胞ペースト（５グラム）を１００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）と合わせた。ペーストを完全に再懸濁するまで室温で撹拌した。得られた細胞懸濁液を氷浴中でインキュベートすることにより０℃に冷却し、約５分間超音波処理を行って細胞を破壊した。細胞破片を４℃、７０，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離により除去した。上清透明溶解物を画分１と名付けた。
液体クロマトグラフィー精製
画分１を緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ−５２、Ｗｈａｔｍａｎ）の低圧液体クロマトグラフィーカラム（ベッド容量７０ｍｌ、２６ｍｍφ）に負荷した。カラム容量の数倍の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中１０ｍＭ−１０００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配で流速０．９ｍｌ／ｍｉｎでＤＮＡポリメラーゼを溶出した。このおよびこの後のすべてのクロマトグラフィー工程は、周囲温度（約２５℃）において実施した。活性のピークは約３２ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。活性な画分をプールし、画分２と名付けた。
画分２を緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロース（ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（ベッド容量２２ｍｌ、１６ｍｍφ）に直接負荷した。カラム容量の数倍の緩衝液Ａでカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の１０ｍＭ−７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎでＤＮＡポリメラーゼ活性を溶出した。活性のピークは約４００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。活性な画分をプールし、画分３と名付けた。
画分３を緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）で平衡化したヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＧｅｌ  ＨＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のカラム（ベッド容量２ｍｌ、１６ｍｍφ）に直接負荷した。カラム容量の数倍の緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の５０ｍＭ−７００ｍＭリン酸カリウムの直線勾配で流速０．４ｍｌ／ｍｉｎでＤＮＡポリメラーゼを溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ含有画分をプールし、限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０、Ａｍｉｃｏｎ）により容量１００ｍｌに濃縮し、これに１００ｍｌの１００％グリセロールを加えて最終生成物を得た。この最終調製物は、約１０００ユニットのＤＮＡポリメラーゼを含むことが決定され、これはクマシー染色変性ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において純度約８０％であると判定された。
最適化された精製
抽出物の調製
凍結細胞ペースト（４５グラム）を２５０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。リゾチウムを最終濃度２００ｍｇ／ｍｌで加え、溶液を室温で６０分間撹拌した。ＤＮａｓｅＩを最終濃度１０ｍｇ／ｍｌで加え、１０分間インキュベーションを続けた。不溶性物質を７０，０００ｘｇ、４０分間の超遠心分離により除去した。デカントした上清を画分Ｉと名付けた。
ポリエチレンイミン沈殿
この溶解物について最小の共沈殿蛋白質含量ですべてのポリメラーゼ活性を沈殿させる最終ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）濃度を決定するために、ＰＥＩ沈殿のパイロット実験を行った。ＰＥＩを１０％（ｖ／ｖ）保存溶液から画分Ｉに加えて０．４％の最終濃度とした。この溶液を４℃で２０分間撹拌した。ＰＥＩ沈殿物を８，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離により回収した。ポリメラーゼ活性は、１５０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール）中の３００ｍＭ  ＮａＣｌでペレットから抽出した。この溶液を１７，０００ｘｇで再び遠心分離した。硫酸アンモニウムを上清に加えて８０％飽和とし、溶液を４℃で１時間撹拌して蛋白質を残りのＰＥＩから沈殿させた。硫酸アンモニウム画分を４８，０００ｘｇ、３０分間遠心分離し、ペレットを４００ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８中に再懸濁した。これを画分ＩＩと名付けた。
液体クロマトグラフィー精製
ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（ベッド容量１５０ｍｌ）を緩衝液Ａ中の１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。画分ＩＩを１５０ｍｌ／ｈで負荷し、ベッド容量の２倍の緩衝液Ａで洗浄した。次に緩衝液Ａ中の１５０ｍＭ−７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配でポリメラーゼ活性を溶出させ、約４００ｍＭ  ＮａＣｌにポリメラーゼのピークを得た。ピーク画分をプールし、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％グリセロール）中の１００ｍＭ  ＮａＣｌで５倍に希釈した。このプールを画分ＩＩＩと名付けた。
ｓｓＤＮＡアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（ベッド容量４ｍｌ）を緩衝液Ｂ中の１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。画分ＩＩＩの３分の１を流速１２ｍｌ／ｈｒで負荷した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液Ｂ中の１００ｍＭ−１０００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配でポリメラーゼ活性を溶出した。ポリメラーゼ活性のピークは、約３７５ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。ピーク画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、等量の１００％グリセロールを加えて保存した。
ズブチリシン切断によるエキソ酵素の調製
約８５０ユニットの精製した天然のテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスＤＮＡポリメラーゼＩを、３ラウンドの緩衝液中での希釈および限外濾過による濃縮により１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．５中に交換して、５５０μｌ中に約２５０ｍｇの蛋白質を含む溶液を得た。ズブチリシン（０．０６ｍｇ／ｍｌ溶液１０μｌ）をポリメラーゼに加え、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、反応液を緩衝液Ａで最終容量１０ｍｌに希釈し、１５．０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロース（ベッド容量４ｍｌ、１６ｍｍφ）のカラムに負荷した。カラム容量の数倍のこの緩衝液でカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の１５０ｍＭ−７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配でポリメラーゼ活性を溶出した。活性な画分をプールした。
実施例３：天然の酵素の特性決定
一般特性
天然の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約９０，０００Ｄａのポリペプチド（ホスホリラーゼＢのすぐ下）として移動する。酵素は鎖置換活性を有する。これは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をポリメラーゼ活性の約１／８０のレベル（ユニット：ユニット）で有する。アッセイ条件下で、ＤＮＡ合成の至適温度は７５℃付近である。ＤＮＡ合成の至適Ｍｇ2+濃度は１ｍＭである。ＤＮＡ合成の至適Ｍｎ2+濃度は０．５ｍＭである。
熱望定性のアッセイ
酵素の熱安定性を評価するために、天然のテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスＤＮＡポリメラーゼの試料を、いくつかの緩衝液中で高温でインキュベートした。緩衝液はすべて、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０および１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡからなるものであり、以下の添加物を含んでいた：
ＢＳＡ緩衝液：添加物なし
ＧＬＹ緩衝液：グリセロールを４０％（ｖ／ｖ）となるように加える
ＭＭＯ緩衝液：Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（ＭＭＯ）を３Ｍとなるように加える
ＴＭＡＮＯ緩衝液：トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）を４Ｍとなるように加える
天然の酵素（０．０２ユニット／μｌ）をこれらの緩衝液中で種々の温度でインキュベートした。５、１０および１５分において、５μｌのアリコートを取り出し、氷上の新しい管中に入れた。すべての試料を得た後、加熱したアリコートを通常の方法によりアッセイした。結果は所定の時点に所定の温度において保持されている画分活性で表す。
酵素はＢＳＡ緩衝液中で最も不安定であり、８０℃で約５分後に最初に測定したポリメラーゼ活性の半分を保持していた。ＧＬＹ緩衝液中においては、酵素は、８５℃で約５分後に最初の活性の半分を保持していた。ＭＭＯおよびＴＭＡＮＯ緩衝液中においては、最初に測定した活性の半分を除去するためには８５−９０℃で５分間のインキュベーションが必要であった。これらのいずれの緩衝液中でも７５℃で１５分間のインキュベーションにより最初のＤＮＡポリメラーゼ活性の２０％以下しか失われなかった。
実施例４：ズブチリシン切断酵素の特性決定
一般特性
切断した酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６４ｋＤａと５５ｋＤａで移動するポリペプチドからなるダブレットとして移動する。これは検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有していない。酵素は鎖置換活性を有する。酵素は天然の酵素と同様の熱安定性を有する。
実施例５：クローン化６４ｋＤａ酵素の調製
ゲノムＤＮＡの調製
テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスの凍結細胞ペースト（約３５０ｍｇ）を７００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、ｌ％  ２−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ））中に再懸濁し、６５℃で１時間インキュベートした。この溶液を２５：２４：１のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで３回、クロロホルムで２回抽出し、２容量の１００％エタノールで沈殿させた。ペレットを真空中で軽く乾燥させ、７００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。ゲノムＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍ（１Ａ260＝５０μｇ／ｍｌ）の吸光度を測定することにより分光光度計により、および臭化エチジウム染色アガロースゲル上のバンドのＵＶ蛍光を標準的濃度マーカーと比較することにより決定した。
ＤＮＡポリメラーゼＩ特異的プローブの調製
ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーのポリメラーゼの保存領域に対して設計された縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応の基質として用いた（Ｕｅｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｎｏ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．，Ａｓａｄａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｋａｔｏ，Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３，４０１−４１０）。標準的ＴａｑＰＣＲ反応（２０μｌ）は、約１ｎｇのゲノムＤＮＡおよび１ｍＭの各プライマー：ＥＰＯＬＦ（ＧＡＣＣＣ（ＡＴＣ）ＡＡＣ（ＣＴ）Ｔ（ＣＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＡＡ（ＣＴ）ＡＴ（ＡＴＣ）ＣＣ）（配列番号７）およびＥＰＯＬＲ（（ＧＴ）Ａ（ＣＧ）（ＣＧ）Ａ（ＧＴ）（ＣＴ）ＴＣ（ＡＧ）ＴＣＧＴＧ（ＧＡＴＣ）ＡＣ（ＣＴ）ＴＧ）（配列番号８）を含んでいた。１ラウンドのＰＣＲの後、生成物をアガロースゲル上で分離した。予測される６００ｂｐ領域の周囲の生成物をゲルから切り出し、破砕し、ＴＥ中に浸漬し、同じ条件を用いる第２ラウンドのＰＣＲの基質として用いた。得られた約６００ｂｐの生成物は、ＥＰＯＬＦおよびＥＰＯＬＲプライマーを用いて直接シークエーンシングした（シークエナーゼＰＣＲ生成物シークエンシングキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ＢＬＡＳＴ分析により判断して、１つのオープンリーディングフレームが既知の配列のＤＮＡポリメラーゼＩの標的領域と相同であることが見いだされた。
サブゲノムライブラリの調製およびスクリーニング
このＰＣＲ生成物を、放射活性または非放射活性ハイブリダイゼーションキット（Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ、ＵＳＢ）を用いて標識し、種々の制限酵素で消化したゲノムＤＮＡのアガロースゲルのブロットを探索するのに用いた。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、約１．７ｋｂのユニークハイブリダイズフラグメントを生成した。約１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。プローブにハイブリダイズした個々のコロニーを精製しシークエンシングした。同様に、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで２重に消化して、約１．９ｋｂのユニークハイブリダイズフラグメントを生成し、ＥｃｏＲＩで消化して約３ｋｂのユニークハイブリダイズフラグメントを生成した。これらのクローンの配列を合わせて、ＢＬＡＳＴ分析により判断して既知の配列のＤＮＡポリメラーゼＩのＣ末端部分に対して高いホモロジーを有する一貫したオープンリーディングフレームを形成した。１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含むクローンをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化して、１．４ｋｂのフラグメントを生成し、これをゲル精製し、ニックトランスレーションにより32Ｐで標識し、これを用いてＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化したテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスのゲノムＤＮＡのブロットを探索した。このことにより、遺伝子の残りのＮ−末端部分を含む３ｋｂのユニークハイブリダイズフラグメントが同定された。ヌクレオチド配列は図１Ａ−Ｅ（配列番号１）に示され、天然のポリメラーゼをコードする可能性のある連続オープンリーディングフレームは図２Ａ−Ｄ（配列番号２）に示される。
発現ベクターの調製
ゲノムＤＮＡからいくつかのＰＣＲ生成物を作成し、これにより５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを含まないポリメラーゼコーディング配列の一部をクローニングした（図５を参照）。文字Ａ−Ｄは、以下の表にその概要が示される種々の構築物の開始部位を表す。これらのトランケートしたポリメラーゼコーディング配列を、発現ベクターｐＲＥ２（Ｒｅｄｄｙ，Ｐ．，Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ，Ａ．ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｋ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，１０４７３−１０４８８）のλＰLプロモータの制御下においた。これらのベクターはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ−１  λ＋（λｃＩ＋）株内で増殖させた。
ＰＣＲにおいてＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより導入される誤りを最小限にするために、改変ロングＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応液は以下のものを含んでいた：２０ｍＭトリシン（ｐＨ８．８）、８５ｍＭ  ＫＯＡｃ、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、０．５ｍＭの各プライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＯＡｃ（ホットスタートとして添加）、１００μｌの反応につき２．５ユニットのホットタブ（Ｈｏｔ  Ｔｕｂ）（またはｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１００μｌの反応につき０．０２５Ｕのディープベント（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）ＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）ポリメラーゼ、１００μｌの反応につき２０−１００ｎｇのテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスゲノムＤＮＡ。サイクリングパラメータは次のものから構成された：９４℃で３０秒間、次に６８℃で１０分４０秒間ｘ８サイクル；９４℃で３０秒間、次に６８℃で１２分００秒間ｘ８サイクル；９４℃で３０秒間、次に６８℃で１３分２０秒間ｘ８サイクル；９４℃で３０秒間、次に６８℃で１４分４０秒間ｘ８サイクル。
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を用いて生成された。
得られたＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＲＥ２中にクローニングした。
サイレント変化（以下の表を参照）とは、５’プライマーが天然の配列と同類であるがＥ．ｃｏｌｉによってより頻繁に使われるいくつかのコドンをコードすることを示す。この方法により、４種類の異なるポリペプチドをコードする６個の異なるクローンを構築した。
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クローン化６４ｋＤａ酵素の発現
プラスミドｐＲＥＤ６４０４を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＺ−１株（ｃＩ８５７溶原性）を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬＢ培地（１リットルあたり：１０ｇトリプトン、５ｇイーストエクストラクト、１０ｇＮａＣｌ）中で培養した。培養物を３０−３２℃でＯＤ600が１．５になるまで増殖させ、このとき、培養温度を４０−４２℃に上昇させた。この温度で２時間培養を続け、その後連続フロー遠心分離により培養物を回収した。細胞ペーストは、以後の手順の前に−８０℃で保存した。
実施例６：クローン化全長酵素の調製
全長酵素は、ゲノムＤＮＡのクローンからＰＣＲによりクローニングした（配列番号１）（図１Ａ−Ｅ）。Ａ５’プライマーＤＤＦ−ＦＯＲ（ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣ）（配列番号２４）を合成した。このプライマーはＮｄｅＩ部位をコードし、開始メチオニンの後にアラニンコドンを挿入し、２つのコドンをＥ．ｃｏｌｉによって好まれる同義のコドンに変更する（ＡＴＡ→ＡＴＣ、アミノ酸位置６におけるＩｌｅ；およびＧＧＡ→ＧＧＴ、アミノ酸位置９におけるＧｌｙ）。このプライマーをゲノムＤＮＡの組み立てられたクローンからのベクタープライマーとともに用いてＰＣＲ生成物を生成し、次にこれをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に消化したｐＲＥＤ６４０４中にサブクローニングして、ｐＬＳ−３を形成した。全長酵素のＤＮＡは図７Ａ−Ｃ（配列番号２３）に示される。
実施例７：クローン化６４ｋＤａ酵素の精製
抽出物の調製
凍結細胞ペースト（３７０グラム）を１８００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）と合わせた。ペーストを室温で再懸濁が完了するまで撹拌した。フレンチプレスセルを用いて細胞を溶解させた。細胞破片を７０，０００ｘｇ、２０分間、４℃で遠心分離により除去した。
液体クロマトグラフィー精製
透明にした溶解物を塩濃度３００ｍＭでＤＥＡＥセルロースのカラムに通した。回収されたフロースルーを７０℃に１０分間加熱し、遠心分離により再び透明にし、ヘパリンセファロースのカラム上に負荷した。ＤＮＡポリメラーゼは、前述のように塩勾配でこのカラムから溶出され、ほとんどの場合純粋であることが認められた。そうでない場合には、ヒドロキシアパタイト上でのカラムクロマトグラフィーを実施した。
実施例８：クローン化６４ｋＤａ酵素の特性決定
一般特性
クローン化酵素はｐＲＥＤ６４０４の精製された遺伝子生成物を表す。クローン化酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６４，０００Ｄａのポリペプチド（ウシ血清アルブミン、ＭＷ６７，０００のすぐ下）として移動する。クローン化酵素の比活性は２８，０００ユニット／ｍｇである。これは検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有しない。ＤＮＡ合成の至適温度はアッセイ条件下で７２℃付近である。ＤＮＡ合成の至適Ｍｇ2+濃度は２ｍＭである。ＤＮＡ合成の至適Ｍｎ2+濃度は０．７ｍＭである。
リバーストランスクリプターゼ活性
クローン化された酵素は、ポリ（ｒＡ）：オリゴ（ｄＴ12-18）および［3Ｈ］ＴＴＰを含む４２℃でのアッセイにおいて、リバーストランスクリプターゼとして機能した。この酵素はＭｎ2+を加えても加えなくても、Ｍｇ2+の存在下でＲＴ活性を有する。
ＳＰＡフォーマットを用いる多様な酵素のリバーストランスクリプターゼ活性の測定
Ａｍｅｒｓｈａｍリバーストランスクリプターゼシンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ）キット（ＮＫ９０２０）、およびＭＭＬＶ（Ｅ７０４５６）およびＡＭＶ（Ｅ７００４１）酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから供給された。上述のようにして調製したクローン化６４ｋＤ酵素はＵＳＢ酵素と名付けられた。Ｔｔｈ（Ｎ８０８−００９８）酵素はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手した。
ＭＭＬＶおよびＡＭＶ酵素は、マグネシウムの存在下で、それぞれ３７℃および４２℃において試験した。ＴｔｈおよびＵＳＢ酵素はいずれも、６０℃において補因子としてのマンガンの存在下で試験した。用いたアッセイ緩衝液はＳＰＡキット中で供給されるものと同じであるが、ただし、緩衝液ミックス中で適当な補因子を置き換えた。本質的に、アッセイは、ＳＰＡキット中で提供されるプロトコルを用いて、サルステッド管中で総反応容量１００μｌで以下のように２重に構成した。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８
８０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2もしくは４ｍＭ  ＭｎＣｌ2
１０ｍＭ  ＤＴＴ
０．０５％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０
からなる緩衝液中のの０．７７μＭ［3Ｈ］ＴＴＰを８０μｌ；
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2中の０．２μＭプライマー／テンプレート（ポリｒ（Ａ）にアニーリングしたビオチニル化（ｄＴ16）オリゴヌクレオチド）を１０μｌ；
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８、１０ｍＭ  ＤＴＴ中で希釈した１０μｌの１ユニット（製造者により定義される）の酵素を各管に加えて反応を開始させ、指示された温度で３０分間インキュベートし、その後１０μｌの０．５６Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８を加えて反応を停止させた。次に１０μｌの供給されたストレプトアビジンＳＰＡビーズを各管に加え、さらに室温で１０分間インキュベートした後、ＬＫＢ１２０５シンチレーションカウンターで計数した。
酵素を含まない適当な対照も実施した。得られたデータは図６に示される。この実験は、この実験で用いたプライマーの溶融温度を考慮していない。理論的には、この実験においては６０℃ではわずかのプライマーのみがテンプレートにアニーリングしたままである。実際には、このことにより、ＵＳＢおよびＴｔｈ酵素について観察された活性が過小評価されるであろう。
鎖置換増幅における６４ｋＤａポリメラーゼの使用
上述のエキソヌクレアーゼ欠陥クローン化酵素を鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６）において用いた。増幅すべき標的ＤＮＡはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９８９９］からの挿入エレメントＩＳ６１１０の１．２ｋｂクローンである。標的ＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中にクローン化した。反応混合物（最終濃度：２５ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７．４、０．１μｇ／ｍｌのＢＳＡ、それぞれ０．０５μＭのプライマーＢ１（ＣＧＡＴＣＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡ）（配列番号１６）およびＢ２（ＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＡ）（配列番号１７）、それぞれ０．５μＭのプライマーＳ１．１（ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＴＡＧＧＣＧ  ＡＣＴＣＧＡＣＣ）（配列番号１８）およびＳ２．２（ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＴ  ＴＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＴ）（配列番号１９）、１．４ｍＭ  ｄＣＴＰαＳ、それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、および１０7コピーの標的プラスミド）を１００℃に３分間加熱して標的を変性させ、次に５５℃に置いた。５５℃で約５分間の後、酵素ミックス（最終濃度：３５ユニットの６４ｋＤポリメラーゼ、１６０ユニットのＢｓｏＢＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および６．９ｍＭ  ＭｇＣｌ2（総反応容量５０μｌ）を加え、１０分間インキュベーションを続けた。等容量の停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよびそれぞれ０．０５％のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールＦＦ）を加え、この５μｌを１０％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。臭化エチジウムで染色することによりＤＮＡを可視化した。６４ｋＤａポリメラーゼは、予測された１０５ヌクレオチド全長の生成物（メジャー生成物）および予測された８６ヌクレオチドのニックを有する生成物（マイナー生成物）を生成した。
６４ｋＤａポリメラーゼのＲＴ−ＰＣＲにおける使用
６４ｋＤポリメラーゼをＡｍＰｌｉＴａｑとともにＲＴ−ＰＣＲにおいてリバーストランスクリプターゼとして用いた。ウサギグロビンｍＲＮＡをテンプレートとして用いて、以下のプロトコルにより１０6コピーが検出可能であった。反応容量１００μｌ中に、以下の成分を組み合わせた：１ＸＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００Ｕのヒト胎盤ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１０6コピーのウサギグロビンｍＲＮＡ（ＢＲＬ）、３０ｐｍｏｌのグロビン−ダウンプライマー（ＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴ）（配列番号２５）、１５ｐｍｏｌのグロビン−アッププライマー（ＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＣＣ）（配列番号２６）、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼおよび５Ｕの６４ｋＤポリメラーゼ。反応液を６５℃で３０分間、続いて９５℃で５分間、３５サイクルの［９５℃で１分間、６５℃で１分間、７０℃で２分間］、続いて７２℃で５分間インキュベートした。生成物を２％の臭化エチジウム染色アガロースゲル上で分離し、予測された４６３ｂｐの生成物が認められた。
以下のプロトコルを用いて、ラット肝臓からの総ＲＮＡを用いて、アルブミン遺伝子からのＲＴ−ＰＣＲ生成物を２５０ｎｇのテンプレートから検出した。反応容量１００μｌ中に以下の成分を組み合わせた：１ＸＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００Ｕのヒト胎盤ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、２５０ｎｇのラット肝臓ＲＮＡ、３０ｐｍｏｌのアルブミン−ダウンプライマー（ＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＣＣＴＣ）（配列番号２７）、１５ｐｍｏｌのアルブミン−アッププライマー（ＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡ）（配列番号２８）、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼおよび４０Ｕの６４ｋＤポリメラーゼ。反応液を６５℃で３０分間、続いて９５℃で５分間、３５サイクルの［９５℃で１分間、６５℃で１分間、７０℃で２分間］、続いて７２℃で５分間インキュベートした。生成物を２％の臭化エチジウム染色アガロースゲルで分離し、予測された３８６ｂｐの生成物が認められた。
実施例９：テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからのＦＹＤＮＡポリメラーゼの構築
出発物質
ＦＹポリメラーゼを生成するために用いたＤＮＡ構築物は以下のとおりである。ｐＲＥＤ６７０６は、６０８アミノ酸のポリペプチドをコードする発現ベクターである。工学的に作成された開始メチオニンの後の、コードされる残りの６０７アミノ酸は、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスから得ることができるＤＮＡポリメラーゼＩのＣ末端部分を表す。
ｐＲＥＤ６４０４は、５７８アミノ酸のポリペプチドをコードする発現ベクターである。工学的に作成された開始メチオニンの後の、コードされる残りの５７７アミノ酸は、テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスから得ることができるＤＮＡポリメラーゼＩのＣ末端部分を表す。
ｐＰＲＥＦ２は、ｐＲＥＤ６４０４と同じポリペプチドをコードするが、Ｅ．ｃｏｌｉではほとんど用いられないコドンを排除するために、コドン７、１０および１１においてテルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカス配列の３つのサイレント変異を有する。
これらのすべての構築物は、λＰLプロモーターおよびλｃＩＩリボソーム結合部位を利用する発現ベクターｐＲＥ２（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，１０４７３−８８）に由来する。
Ｆ４１２Ｙの構築
テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスＤＮＡポリメラーゼを配列（ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＧ）（配列番号２０）について検索して、モチーフＢまたはＯ−ヘリックス領域の位置を求めた。予測されるｐＲＥＤ６７０６遺伝子産物のアミノ酸残基４３３−４６６に配列（ＲＲＡＡＫＡＶＮＦＧＩＩＹＧ）（配列番号２１）が見いだされた。変異原性オリゴヌクレオチド、ＤＤＦＹ（ＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＴＧ  ＣＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧＧＣ）（配列番号２２）は、ヌクレオチド１３２５における変更（ＡＡＡ−ＡＴＡ）を除き、ｐＲＥＤ６７０６のコーディング配列のヌクレオチド１３１５−１３７１にアンチパラレルであるように設計した。この変更は発現したポリメラーゼにおけるフェニルアラニンからチロシンへの変更に対応する。このオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチド１３６１におけるユニークＸｈｏｌ制限部位と重なっている。
オリゴヌクレオチドＤＤＦＹを、ｐＲＥＤ６７０６のコーディング配列のヌクレオチド９４−１３３に相補的でありＮｄｅＩ制限部位を含むＤＤ６４ｐｒｅｆ（配列番号１３）とともに用いて、ＰＣＲ増幅およびｐＲＥＤ６７０６の同時突然変異誘発を行った。得られたＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、同様に処理したｐＲＥＤ６４０４の大きいフラグメントとライゲートさせた。ライゲートさせた構築物を用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１  λ＋（λｃＩ＋）株をトランスフォームした。適当な制限酵素消化パターンを与えるクローンをシークエンシングして変異を確認した。試験したすべてのクローンにおいて所望の変異に加えて偽変異が見いだされ、このため、Ｆ４１２Ｙ変異（ｐＲＥＤ６４０４の番号付け）のみを含むＡｆｌＩＩＩ／ＫｐｎＩ制限プラグメントをｐＲＥＤ６４０４中にサブクローニングしてｐＬＳ−１を得た。
実施例１０：Ｆ４１２ＹＤＮＡポリメラーゼの精製
プラスミドｐＬＳ−１をＥ・ｃｏｌｉ  ＭＺ−１株（λｃ１８５７、溶原菌）にトランスフォームした。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中の１リットルの培養物を３０℃でＯＤ600＝１．１まで増殖させた。温度を４２℃に上昇させ、２時間培養を続けた。細胞を遠心分離により回収し（４ｇ湿重量）、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に再懸濁した。再懸濁液を３０秒間、４回超音波処理し、溶解物を遠心分離により透明にした。透明にした溶解物を３００ｍＭのＮａＣｌとし、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセルロースのカラム（ベッド容量６５ｍｌ）を通した。フロースルー画分（４５ｍｌ）を回収し、７０℃に１５分間加熱し、遠心分離により透明にした。透明にした上清を、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで希釈して、総量１２０ｍｌとした。この溶液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロースのカラム（ベッド容量７０ｍｌ）に負荷した。カラムをこの同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液Ａ中の１５０ｍＭ−７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配によりカラムから活性を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度が９０％より高いと判定された活性画分をプールし、限外濾過により濃縮し、５０ｍＭリン酸、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに対して透析した。配列は図４Ａ−Ｃ（配列番号４）に与えられる。
他の態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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