(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のヌクレオチド配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３のヌクレオチド配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
ヒト由来である請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列を有するＴＧＦ−βＩＩ型受容体、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸残基の欠失、挿入、付加若しくは置換の少なくとも１つから生じるアミノ酸配列を有し、ＴＧＦ−βと結合するＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
【請求項４】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸１から１６６までを含む可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、又はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のアミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸残基の欠失、挿入、付加若しくは置換の少なくとも１つから生じるアミノ酸配列を有し、ＴＧＦ−βと結合する可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするアミノ酸配列である、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
【請求項５】
請求項３記載のＴＧＦ−βＩＩ型受容体、又は請求項４記載の可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を特異的に認識する抗体。
【請求項６】
それがモノクローナル抗体である請求項５記載の抗体。
【請求項７】
可溶性ＴＧＦ−β受容体とＴＧＦ−βとの結合に適した条件下で、請求項４記載の可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を細胞と結合させることからなる、これにより細胞表面におけるＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−βの結合レベルが減少する、細胞表面上に存在するＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合レベルを阻害する方法。
【請求項８】
適切な発現系において、ヒトを除く哺乳動物における可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の発現及び可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体とのＴＧＦ−βの結合に適した条件下で、請求項４記載の可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡを該哺乳動物の細胞に導入する工程を含む、ヒトを除く哺乳動物におけるＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合レベルを阻害する方法。
【請求項９】
ａ）
１）請求項３記載のＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する哺乳類の細胞、
２）標識化ＴＧＦ−β、及び
３）評価される化合物、
を合せ、
ｂ）ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するのに充分な条件下で（ａ）の生産物を維持し、
ｃ）評価される化合物の存在下でのＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
ｄ）（ｃ）でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性が評価される化合物の非存在下においてより、評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害すると評価される、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法。
【請求項１０】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞が細胞系である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞がＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞である請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡおよび哺乳類由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡの単離、配列決定、およびキャラクタライゼーションに関する。本発明はさらに、上記コードされたＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体、ならびにそれぞれの可溶性型、上記受容体をコードする遺伝子と受容体そのものの用途、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体特異的抗体およびＴＧＦ−βＩＩ型受容体特異性抗体に関する。とりわけ、本発明は、ラットおよびヒト由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡおよびヒト由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ、ならびにそれぞれの類似体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）は、多くの異なる細胞型において増殖、分化、形態形成をはじめとする様々な応答を誘導する構造的に近縁のサイトカイン類のファミリーに属する物質である［例えば、非特許文献１および非特許文献２参照］。脊椎動物では、ＴＧＦ−β１ないしＴＧＦ−β５と呼ばれる少なくとも５種類の型のＴＧＦ−βが同定されており、これらはいずれも高度（６０％〜８０％）のアミノ酸配列相同性を共有している。ＴＧＦ−β１は当初、正常ラット腎臓細胞の足場非依存性増殖を誘導する能力を有することが特徴であるとされたが、ほとんどの細胞型に及ぼすその作用は抗分裂促進的である［例えば、非特許文献３および非特許文献４参照] 。ＴＧＦ−β１は、正常なものと形質転換されたものの両者の上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ系細胞、および造血細胞をはじめとする多くの型の細胞に対して強力な増殖阻害性を示す。また、ＴＧＦ−βは、細胞外マトリックスおよび細胞とマトリックスの接着プロセスの形成の調節において中心的な役目を果たす。
【０００３】
ＴＧＦ−βは細胞の表現型と生理に対して広範な作用を及ぼすにもかかわらず、ＴＧＦ−βファミリーに属する物質にこれらの様々な応答を引き起こさせる生化学的機構についてはほとんど知られていない。放射標識ＴＧＦ−β１とともに細胞をインキュベートし、結合ＴＧＦ−β１を細胞表面分子に架橋させ、標識化複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することによって、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型と呼ばれる３つの異なる高親和性細胞表面ＴＧＦ−β結合性タンパク質が同定されている［例えば、非特許文献５および非特許文献６参照］。結合定数は、Ｉ型およびＩＩ型受容体では約５〜５０ｐＭ、ＩＩＩ型受容体では３０〜３００ｐＭである［例えば、非特許文献７参照］。
【０００４】
それぞれ５３キロダルトンと７０〜１００キロダルトンの推定分子量を有するＩ型およびＩＩ型受容体は、多くの受容体と同じく、Ｎ−グリコシル化された貫膜タンパク質である。これらの受容体はそれぞれ、リガンドのＴＧＦ−βファミリーのそれぞれのものに対して異なる親和性を有する［例えば、非特許文献７参照］。一方、ＩＩＩ型受容体はすべてのＴＧＦ−βイソタイプに対して同等の親和性を示す。ＩＩＩ型受容体は、多くの細胞系において最も豊富な、ＴＧＦ−βのための細胞表面受容体であり（細胞１個あたり２００，０００個以上）、膜内在性プロテオグリカンである。ＩＩＩ型受容体はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）グループによって高度に修飾されており、ゲル電気泳動を行なうと２８０ないし３３０キロダルトンのタンパク質として不均一に泳動される。ヘパリチナーゼとコンドロイチナーゼ（Chondrontinase) で脱グリコシル化すると、該タンパク質コアは１００〜１１０キロダルトンのタンパク質として泳動される。ＧＡＧ合成を欠損する細胞変異体中で産生される非グリコシル化型該受容体は、天然型受容体のそれらと同等の親和性をもってリガンド結合する能力を有するので、ＴＧＦ−β結合部位はこのタンパク質コア内に存在する［例えば、非特許文献８参照］。ＩＩＩ型受容体の一つの変異型が、膜アンカーを明らかに欠いている可溶性分子として、いくつかの型の細胞によって分泌される。この可溶性分子は血清中および細胞外マトリックス中に少量見られる。
【０００５】
ＩＩＩ型受容体はベータグリカンとも呼ばれ、Ｉ型およびＩＩ型受容体のものとは異なる生物学的機能を有する。ＴＧＦ−β応答性の欠損を対象として選択した変異体ミンク肺上皮細胞（Ｍｖ１Ｌｕ）のなかには、もはやＩ型受容体を発現しないものがあり、同様に選択したものでも、Ｉ型とＩＩ型の両受容体の発現を欠損しているものもある。しかし、これらの変異体はいずれもＩＩＩ型受容体を発現し続ける［例えば、非特許文献７および非特許文献９参照］。これは、Ｉ型およびＩＩ型受容体はシグナル導入性分子であり、一方、ＩＩＩ型受容体は、真性の(bona fide) シグナル導入性受容体に提示される前のリガンド濃縮におけるものなど何か他の機能を担っているかもしれないとする説を導いた。一方、ＩＩＩ型受容体の分泌型は生物活性ＴＧＦ−βの貯蔵系またはクリアランス系として作用するのかもしれない。
【０００６】
これらのＴＧＦ−β受容体型のそれぞれについてのこれ以上の情報があれば、それらの役目についての理解が深まり、所望すればそれらの機能を変化させることができるようになる。
【０００７】
【非特許文献１】Roberts, A.B. and M.B. Sporn, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Springer-Verlag, Heidelberg, pp. 421-472 (1990)
【非特許文献２】Massague, J., Annu. Rev. Cell. Biol.  6:597-641 (1990)
【非特許文献３】Altschul, S.F. et  al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)
【非特許文献４】Andres, J.L. et  al., J. Cell. Biol.  109:3137-3145 (1989)
【非特許文献５】Massague, J. and B. Like, J. Biol. Chem.  260:2636-2645 (1985)
【非特許文献６】Cheifetz, S. et  al., J. Biol. Chem.  261:9972-9978 (1986)
【非特許文献７】Boyd, F.T. and J. Massague, J. Biol. Chem.  264:2272-2278 (1989)
【非特許文献８】Cheifetz, S. and J. Massague, J. Biol. Chem.  264:12025-12028 (1989)
【非特許文献９】Laiho, M. et al., J. Biol. Chem.  265:18518-18524 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の１つは、たとえば公知のハイブリダイゼーションに基づく方法やポリメラーゼ連鎖反応を用いて、その他の起源由来の同等のＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型およびＩＩ型遺伝子を同定するための、ＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡを提供することにある。また、細胞増殖や生長、細胞接着および細胞表現型に及ぼす作用などのＴＧＦ−βの作用を変えるための（たとえばＴＧＦ−βに対する細胞の受容性を変えたり、受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害することによって）ＩＩＩ型受容体遺伝子、ＩＩ型受容体遺伝子またはそれらのそれぞれのコード化物を提供することにある。たとえば、ＴＧＦ−β作用を変えようとする者に投与することができる、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型遺伝子、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型遺伝子、または受容体全体をコードしてはいない切断遺伝子（たとえば可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型結合部位）を提供することにある。あるいは、ＴＧＦ−βの作用を変えるために、人に投与することができる、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、それらの可溶性型（すなわち膜アンカーを欠損する型）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型受容体の活性結合部位を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は、
[１]  図１のヌクレオチド配列若しくはＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするのに充分な図１のヌクレオチド配列の一部分、又はＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするのに充分な図１のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードする単離されたＤＮＡ；
[２]  哺乳類由来である[１]の単離されたＤＮＡ；
[３]  ネズミ若しくはヒト由来である[２]の単離されたＤＮＡ；
[４]  図２のヌクレオチド配列若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするのに充分な図２のヌクレオチド配列の一部分、又はＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするのに充分な図２のヌクレオチド配列のすべて若しくは一部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する脊椎動物由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードする単離されたＤＮＡ；
[５]  ネズミ若しくはヒト由来である[４]の単離されたＤＮＡ；
[６]  図１のアミノ酸配列若しくはＴＧＦ−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体；
[７]  図３のアミノ酸配列若しくはＴＧＦ−βと結合するアミノ酸配列を有する単離されたＴＧＦ−βＩＩ型受容体；
[８]  図１、図３及びＴＧＦ−βと結合するアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する、組み換えで生産された哺乳類のＴＧＦ−βＩＩＩ受容体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体；
[９]  アミノ酸配列が図１のアミノ酸１から７８５までを含み、若しくは可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするアミノ酸配列であり、ＴＧＦ−βに結合する可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体；
[１０]  アミノ酸配列が図３のアミノ酸１から１６６までを含み、若しくは可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするアミノ酸配列であり、ＴＧＦ−βに結合する可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体；
[１１]  哺乳類のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、哺乳類の可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、又は哺乳類の可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を特異的に認識する抗体；
[１２]  それがモノクローナル抗体である[１１]の抗体；
[１３]  可溶性ＴＧＦ−β受容体とＴＧＦ−βとの結合に適した条件下で、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体を細胞と結合させることからなる、これによりＴＧＦ−βを発現する細胞表面におけるＴＧＦ−βのＴＧＦ−β受容体への結合が減少する、ＴＧＦ−βを発現する細胞表面上に存在するＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害する方法；
[１４]  ＴＧＦ−βの結合が阻害される[１３]の方法；
[１５]  ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の発現及び、適切な発現系においてＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡから発現されたＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体とのＴＧＦ−βの結合に適した条件下で、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現するのに適した発現系において、細胞をＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡと結合することからなる、ＴＧＦ−βを発現する細胞表面上に存在するＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害する方法；
[１６]  ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性、若しくはその両方を改変するのに充分な量において、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に結合したＴＧＦ−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたＴＧＦ−β受容体を哺乳類に投与することからなる、哺乳類においてＴＧＦ−βの効果を制御する方法；
[１７]  治療に用いられる、 [６]〜[１０]いずれか記載のＴＧＦ−β受容体；
[１８]  治療に用いられる、[１１]又は[１２]のいずれか記載の抗体；
[１９]  細胞表面上のＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性を改変（例えば、阻害）する薬剤を製造するための、[６]〜[１０]いずれか記載のＴＧＦ−β受容体の使用；
[２０]  哺乳類においてＴＧＦ−βの影響を制御する際に用いられる薬剤の製造のための、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に結合したＴＧＦ−β若しくはそれらの組み合わせからなる群から選ばれたＴＧＦ−β受容体の使用；
[２１]  ａ）
１）ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する哺乳類の細胞、
２）標識化ＴＧＦ−β、及び
３）評価される化合物、
を結合し、
ｂ）ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に結合するのに充分な条件下で（ａ）の生産物を維持し、
ｃ）評価される化合物の存在下でＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
ｄ）（ｃ）でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性が、評価される化合物の非存在下においてより評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害することになる、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法；
[２２]  ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である[２１]の方法；
[２３]  ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する細胞がＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞である[２２]の方法；
[２４]  ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡがそれらに組み込まれた若しくはＴＧＦ−β受容体ＲＮＡを顕微注入された細胞である[２３]の方法；
[２５]  ａ）
１）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する哺乳類の細胞、
２）標識化ＴＧＦ−β、及び
３）評価される化合物、
を結合し、
ｂ）ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するのに充分な条件下で（ａ）の生産物を維持し、
ｃ）評価される化合物の存在下でのＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合性の程度を測定し、並びに
ｄ）（ｃ）でなされた測定と評価される化合物の非存在下で起きたＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合性の程度を比較する、
工程からなる、ここで、もしＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性が評価される化合物の非存在下においてより、評価される化合物の存在下においての方が小さいなら、評価される化合物はＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害すると評価される、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合を妨害する化合物の能力の評価方法；
[２６]  ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である[２５]の方法；
[２７]  ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞がＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞である[２６]の方法；
[２８]  ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベクター中のＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡがそれらに組み込まれた若しくはＴＧＦ−β受容体ＲＮＡを顕微注入された細胞である[２７]の方法；ならびに
[２９]  ａ）結合性が評価される個体から得られたサンプル中の細胞によるＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合の程度を測定し、それによりテスト結合値を取得し、及び
ｂ）（ａ）の結果と、対照結合値となる、ＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への異常な結合が既に知られた細胞である対照細胞の細胞表面において起こる結合の程度とを比較する、
ことからなる、ここで、対照結合値と同程度のテスト結合値はＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への異常な結合を示す、細胞表面上のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体又はＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するＴＧＦ−βの異常結合の検出方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡは、たとえば公知のハイブリダイゼーションに基づく方法やポリメラーゼ連鎖反応を用いて、その他の起源由来の同等のＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型およびＩＩ型遺伝子を同定するために使うことができる。ＩＩＩ型受容体遺伝子、ＩＩ型受容体遺伝子またはそれらのそれぞれのコード化物は、細胞増殖や生長、細胞接着および細胞表現型に及ぼす作用などのＴＧＦ−βの作用を変えるために使うことができる（たとえばＴＧＦ−βに対する細胞の受容性を変えたり、受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害することにより）。たとえば、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型遺伝子、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型遺伝子、または受容体全体をコードしてはいない切断遺伝子（たとえば可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型結合部位）は、ＴＧＦ−β作用を変えようとする者に投与することができる。あるいは、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、それらの可溶性型（すなわち膜アンカーを欠損する型）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型受容体の活性結合部位は、ＴＧＦ−βの作用を変えるために、人に投与することができる。
【００１１】
ＴＧＦ−βは体内で多くの役目があるので、本明細書で説明するＴＧＦ−β受容体が入手可能であれば、イン・ビボおよびイン・ビトロの方法を利用してさらにＴＧＦ−β機能を評価すること、およびその作用を変える（強化または抑制する）ことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、哺乳類由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡおよび哺乳類由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡの単離、配列決定、およびキャラクタライゼーションに関する。本発明はさらに、上記コードされたＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体、ならびにそれぞれの可溶性型、上記受容体をコードする遺伝子と受容体そのものの用途、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体特異的抗体およびＴＧＦ−βＩＩ型受容体特異性抗体に関する。とりわけ、本発明は、ラットおよびヒト由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡおよびヒト由来のＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ、ならびにそれぞれの類似体に関する。
【００１３】
本発明のＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡは、たとえば公知のハイブリダイゼーションに基づく方法やポリメラーゼ連鎖反応を用いて、その他の起源由来の同等のＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型およびＩＩ型遺伝子を同定するために使うことができる。ＩＩＩ型受容体遺伝子、ＩＩ型受容体遺伝子またはそれらのそれぞれのコード化物は、細胞増殖や生長、細胞接着および細胞表現型に及ぼす作用などのＴＧＦ−βの作用を変えるために使うことができる（たとえばＴＧＦ−βに対する細胞の受容性を変えたり、受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害することにより）。たとえば、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型遺伝子、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型遺伝子、または受容体全体をコードしてはいない切断遺伝子（たとえば可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型結合部位）は、ＴＧＦ−β作用を変えようとする者に投与することができる。あるいは、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、それらの可溶性型（すなわち膜アンカーを欠損する型）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型またはＩＩ型受容体の活性結合部位は、ＴＧＦ−βの作用を変えるために、人に投与することができる。
【００１４】
ＴＧＦ−βは体内で多くの役目があるので、本明細書で説明するＴＧＦ−β受容体が入手可能であれば、イン・ビボおよびイン・ビトロの方法を利用してさらにＴＧＦ−β機能を評価すること、およびその作用を変える（強化または抑制する）ことができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードする脊椎動物とくに哺乳類由来のＤＮＡおよびＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードする哺乳類由来ＤＮＡの単離および配列決定、上記コード化物の発現、および上記発現物のキャラクタライゼーションに基づくものである。上述のように、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型をコードする全長ｃＤＮＡがラット血管平滑筋細胞系から構築したｃＤＮＡライブラリーから単離されており、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードする全長ｃＤＮＡがヒトｃＤＮＡライブラリーから単離されている。ＩＩＩ型遺伝子のヒトの類似体もクローン化されている。プラスミドｐＢＳＫ中のヒトＴＧＦ−βＩＩＩ型ｃＤＮＡの寄託がブダペスト条約の規定に従い寄託番号７５１２７でAmerican Type Culture Collection（１０／２１／９１）でなされている。上記寄託物の入手可能性に関するすべての制限は、本願に基づく米国特許が認められると同時に最終的に消失するものとする。
【００１６】
ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の単離とキャラクタライゼーション
本明細書に説明するとおり、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体ｃＤＮＡの単離のために２つの異なる手法を用いた。一つのアプローチでは、ＩＩＩ型受容体タンパク質に対するモノクローナル抗体を作成して受容体の精製に使い、次いで受容体をミクロシークエンシングに付した（実施例１参照）。精製受容体の部分タンパク質分解で生じた数個のペプチドのミクロシークエンシングで４つのオリゴペプチド配列が得られ、これらを用いて縮重オリゴヌクレオチドを構築した。縮重オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するクローン化法においてプライマーとして使用するか、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいてプローブとして使用した。この方式は生産的でないことが判明したが、オリゴヌクレオチド配列は第２の方式によって単離した受容体クローンの同一性を確認する際に有用であった。
【００１７】
ＴＧＦ−β受容体をコードするクローンの単離のための第２のアプローチでは、ＣＯＳ細胞において発現クローン化方式を用いた。すなわち、受容体陽性細胞の直接可視化を用いて受容体ｃＤＮＡを単離した（実施例２参照）。このアプローチでは、３つのＴＧＦ−β受容体（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）すべてを発現するラット血管平滑筋細胞系Ａ−１０細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）転写プロモーターとＳＶ４０複製起点を保持するベクター中の、該ライブラリーｃＤＮＡ成分を移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）したＣＯＳ細胞をスクリーニングして、正常レベルよりかなり高いレベルのＴＧＦ−β受容体を発現する細胞を同定した。上記高レベルのＴＧＦ−β結合性タンパク質を発現する１つの移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を同定し、その由来先である発現構築物のオリジナルプールをサブプールに分割し、２ラウンド目のスクリーニングに付した。さらに２ラウンドの姉妹選抜を行ったところ、２．９ｋｂの挿入断片を有する１個のｃＤＮＡクローン（Ｒ３−ＯＦ）が単離されたが、このものは導入先の細胞の約１０％において高レベルのＴＧＦ−β結合性タンパク質を誘導した。２００倍過剰量の非標識競合体ＴＧＦ−β１の添加が移入細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）に対する１２５Ｉ−ＴＧＦ−βの結合を強力に低下させるということを示すことによって、ＴＧＦ−β結合の特異性を確認した。
【００１８】
Ｒ３−ＯＦのｃＤＮＡは８１７個のアミノ酸残基より成るオープンリーディングフレームをコードしたが、終止コドンは含んでいなかった。Ｒ３−ＯＦをプローブとして使用して、ラット２０８Ｆライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離した。得られたクローンＲ３−ＯＦＦは長さが６ｋｂあり、クローンＲ３−ＯＦと共直線的な８５３個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする。Ｒ３−ＯＦＦのヌクレオチド配列を翻訳アミノ酸配列とともに図１に示す。
【００１９】
実施例３に述べたようにして、Ｒ３−ＯＦＦによってコードされる受容体のキャラクタライゼーションを行った。その結果、モック移入ＣＯＳ細胞（ｍｏｃ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ＣＯＳ  ｃｅｌｌｓ）の表面上に３つの異なるＴＧＦ−β結合性タンパク質が見られたが、これは他者が報告している結果と一致する［マッサーグら(Massague, J. et  al. ）, Ann. NY Acad. Sci.  593:59-72 (1990)］。これらには、比較的分子量の小さいＩ型とＩＩ型の２つの受容体（６５ｋＤと８５ｋＤ）および２８０〜３３０ｋｄの拡散バンドとして泳動される比較的分子量の大きいＩＩＩ型プロテオグリカンが含まれていた。該プロテオグリカンの酵素的除去により、約１００ｋｄのコアタンパク質が得られた。２００倍過剰量の非標識ＴＧＦ−β１によって競合されたという点で、３つの受容体型いずれに対する結合も特異的である。
【００２０】
単離ｃＤＮＡを移入したところ、ＩＩＩ型受容体の発現が２倍増加した。クローンＲ３−ＯＦＦを移入したＣＯＳ細胞から得た細胞溶解物を脱グリコシル化酵素で処理したところ、不均一な２８０〜３３０ｋｄのバンドは親のＡ１０細胞中に見られるＩＩＩ型タンパク質コアとともに泳動されるタンパク質コアに変換された。重要なことに、該組換えタンパク質コアは内生ＣＯＳ細胞ＩＩＩ型タンパク質コアと異なって泳動された。
【００２１】
ＩＩＩ型ｃＤＮＡを発現する安定移入細胞を使って、これらの観察結果を確認、拡張した。Ｌ６ラット骨格筋筋芽細胞は検出可能なＩＩＩ型ｍＲＮＡや内生表面ＩＩＩ型受容体を発現しない［マッサーグら(Massague et  al.), 1986；セガリニら(Segarini et  al.), 1989］。これらの細胞に、ベクターｐｃＤＮＡ−ｎｅｏにおける単離ｃＤＮＡを移入した。ＣＭＶプロモーターに対して前後両方向でこのクローンを安定的に発現する細胞クローンを単離し、リガンド結合測定法によって分析した。
【００２２】
全長クローンＲ３−ＯＦＦまたは部分クローンＲ３−ＯＦのいずれかを前方に導入したところ、ＩＩＩ型受容体が発現した。逆方向にｃＤＮＡクローンを移入したＬ６細胞はこのタンパク質を発現しなかった。重要なことに、Ｒ３−ＯＦクローンで形質転換した細胞におけるＩＩＩ型受容体のタンパク質コアの見かけサイズは、Ｒ３−ＯＦＦで形質転換した細胞のものより小さいのであるが、これは核酸配列から予想されるタンパク質コアサイズの違いと一致する。
【００２３】
驚くべきことに、ＩＩ型受容体への放射標識リガンドの結合はＩＩＩ型ｃＤＮＡを発現する細胞中で２．５倍増大した。Ｉ型受容体への結合は変化しなかった。ＩＩ型受容体へのリガンド結合のこの見かけ上特異的なアップレギュレーションは、これまで分析した１５個の安定移入Ｌ６細胞系のいずれにおいても明白であった。さらに、この効果は、全長クローンによって同等に仲介されているように思われる。すなわち、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の細胞質ドメインを欠いている切断クローン（Ｒ３−ＯＦ）が発現された。
【００２４】
ＩＩＩ型受容体ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット分析法とＲＮＡブロット分析法によって判定した。ノーザンゲル分析によって、ＩＩＩ型受容体ｍＲＮＡが数種類のラット組織において単一の６ｋｂのｍＲＮＡ分子として発現されることが示された。数種類の異なる組織培養細胞系のＲＮＡドットブロット分析も行った。マウス由来の細胞（ＭＥＬおよびＹＨ１６）は、ブタ、ラット、およびヒト由来のものより小さい（約５．５ｋｂ）ＩＩＩ型ｍＲＮＡ分子を発現するようである。これらの細胞のいずれにおいても、網膜芽細胞腫細胞系（Ｙ７９、Ｗｅｒｉ−１、Ｗｅｒｉ−２４、およびＷｅｒｉ−２７）が顕著な例外として認められる以外は、ＩＩＩ型ｍＲＮＡの発現または欠損は、検出可能な細胞表面ＩＩＩ型受容体の発現または欠損と一致している。これらの細胞は検出可能なＩＩＩ型受容体表面発現を欠いており、既報を確認するものである［キムチら(Kimchi, A. et  al.), Science   240:196-198 (1988)］。容易に検出できるレベルでＩＩＩ型受容体タンパク質を本当に発現するその他の細胞のレベルと同等のレベルでこれらの細胞中でＩＩＩ型受容体ｍＲＮＡが発現されることは興味深い。正常網膜芽細胞（ＡＤ１２）においてかなりあるＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型発現は、おそらく転写後機構によってこれらの網膜芽細胞腫細胞中でダウンレギュレーションされているようである。
【００２５】
ヌクレオチド配列全長リーディングフレームを全長ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦのフランキング配列とともに決定したものを図１に示す。該リーディングフレームは８５３個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするが、これは完全脱グリコシル化ＴＧＦ−β１ＩＩＩ型受容体で見られる１００ｋＤのサイズと一致する。該受容体がＴＧＦ−βＩＩＩ型であることは、単離されたＩＩＩ型受容体のミクロシークエンシングによって決定したペプチド配列を含む推定転写産物の断片を探索することによって確認された（実施例１参照）。図１に示したように、誘導タンパク質の２つの断片（下線およびイタリック、残基３７８−３８８および４２７−４３４）は精製ＩＩＩ型受容体の直接生化学的分析によって決定された２つのペプチド（ＩとＩＩＩ）のアミノ酸配列と厳密に一致する。
【００２６】
さらに分析を行ったところ、ＴＧＦ−βＩＩＩ型結合性タンパク質はサイトカイン受容体としては珍しい構造を有することが示された。ヒドロパシー分析で、該タンパク質はＮ末端シグナル配列とそれに続く長い親水性Ｎ末端領域を含むことが示される。強い疎水性を示すＣ末端側２７残基領域（図１の下線部分、残基７８６−８１２）は単一の推定貫膜ドメインにあたる。このことは、Ｎ末端細胞外ドメインである受容体のほぼ全体がそのＣ末端付近の細胞膜に固定されていることを示唆している。４１残基から成る比較的小さなＣ末端テイルは細胞質ドメインにあたる。
【００２７】
関連配列の分析は、ＴＧＦ−βＩＩＩ型タンパク質の機能の手掛かりをほとんど提供しない。今までに記載されたその他の遺伝子のうちの１つだけ、すなわち内皮細胞によって大量に発現されるエンドグリンと呼ばれる糖タンパク質だけが関連アミノ酸配列を含んでいる。ＩＩＩ型受容体とエンドグリンの配列の間の最も相同な領域（７４％）は主に推定貫膜ドメインと細胞質ドメインに存在する。ＩＩＩ型受容体の全体構造同様に、エンドグリンは、おそらく細胞外にある大型の親水性Ｎ末端ドメインとそれに続く推定貫膜ドメインと４７個のアミノ酸残基から成る短い細胞質テイルを含む糖タンパク質である。エンドグリンは、エクトドメイン上の「ＲＧＤ」配列とその他の接着分子の相互作用によって細胞どうしの認識に関与しているかもしれないことが示唆されているが、エンドグリンの生物学的役目はいまのところ不明である。ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体と異なり、エンドグリンはＧＡＧグループを保持しない。
【００２８】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の単離
ＣＯＳ細胞中での発現クローン化を用い、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体をコードするｃＤＮＡも単離した。高ストリンジェンシー（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）でのハイブリダイゼーションによりヒトＨｅｐＧ２細胞ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡ（クローン３ＦＦと命名）を単離した（実施例６参照）。分析により、対応するｍＲＮＡ分子は異なる細胞系や組織において発現される５ｋｂのｍＲＮＡ分子であることが示された。配列分析で、該ｃＤＮＡは５７２個のアミノ酸残基より成るコアタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有することが示された。全長ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡクローン３ＦＦのヌクレオチド配列を図２に示し、アミノ酸配列を図３に示す。
【００２９】
該５７２個のアミノ酸残基より成るタンパク質は、単一の推定貫膜ドメインと数個のコンセンサスグリコシル化部位と１つの推定細胞内セリン／スレオニンキナーゼドメインを有する。コードされたタンパク質コアの予想サイズは約６０ｋｄであるが、これはＩ型ＴＧＦ−β受容体としては大きすぎる。そのかわり、ヨウ素標識ＴＧＦ−βと一時的にクローン３ＦＦを移入したＣＯＳ細胞を用いた架橋実験で、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体のサイズに対応する約７０〜８０ｋｄのタンパク質の過剰発現が示される。したがって、クローン３ＦＦはＴＧＦ−βと特異的に結合するタンパク質をコードし、７０〜８０ｋｄの発現タンパク質サイズを有するが、いずれもＩＩ型ＴＧＦ−β受容体の特徴である。
【００３０】
クローン化ＴＧＦ−β受容体と関連産物の用途
本明細書で説明する研究の結果、３つの高親和性細胞表面ＴＧＦ−β受容体のうちの２つをコードするＤＮＡがはじめて単離され、その配列と発現パターンが決定され、コードされたタンパク質のキャラクタライゼーションが行なわれた。通常は該受容体を発現しない細胞においてＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現させ、次いでリガンド結合測定を行ったところ、クローン化されたＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ（すなわち全長クローンＲ３−ＯＦＦまたは部分クローンＲ３−ＯＦ）が該受容体をコードすることが確認された。また、本明細書で説明する研究から、ＩＩＩ型ＤＮＡを発現する細胞においてはＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合が２．５倍増大するという驚くべき知見が得られた。
【００３１】
説明する研究の結果、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の役目およびそれとＴＧＦ−βＩＩ型受容体の相互作用に関する新たな洞察が得られた。たとえば、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の役目は不明であるが、近接のシグナル導入受容体へ最終的に移動させるＴＧＦ−βを引きつけ濃縮するという最も一般的でない機能を果たすとされている。ほとんどのサイトカインは単一の細胞表面受容体に結合するが、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはそれより大きいか小さい親和性をもって３つの異なる細胞表面タンパク質に結合する。このことは、なぜこれら３種の受容体がほとんどの細胞型によって発現されるのか、およびそれらが異なる機能を果たすかどうかという疑問を呼び起こしている。これまでに得られた証拠は、ＩＩＩ型受容体はＩ型およびＩＩ型の機能と全く異なる機能を果たすかもしれないことを示唆している。したがって、ＩＩＩ型はＧＡＧによってかなり修飾されているが、Ｉ型とＩＩ型はほとんどの成長因子受容体の特徴であるＮ結合（そしておそらくＯ結合）側鎖を主に保持すると思われる。また、ＴＧＦ−β誘導増殖阻害に抵抗する能力を対象として選抜した変異細胞は、ＩＩＩ型受容体を発現し続けながらＩ型またはＩＩ型受容体の欠損を示す。これらのデータを総合的にみて、Ｉ型およびＩＩ型受容体は真性の（bona  fide）シグナル導入受容体にあたり、ここで説明するＩＩＩ型受容体は細胞中で別の異なる役目を果たすと提唱する者もいる。
【００３２】
ＩＩＩ型受容体が、近隣のシグナル導入受容体（ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）へ最終的に移動させるＴＧＦ−βを引きつけ濃縮するという最も一般的でない機能を果たしているという可能性は依然としてある。このような機能はタンパク性受容体としてはこれまで報告されていないが、硫酸ヘパリンは、ＦＧＦとその受容体との会合に先立ち、この成長因子と結合することで塩基性ＦＧＦを活性化することが示されている［ヤヨンら（Yayon, A. et  al. ）, Cell  64:841-848 (1991) ］。さらに付け加えるとすれば、ＩＩＩ型受容体は大量の硫酸ヘパリン側鎖も含有しているので、塩基性ＦＧＦをその受容体に結合させ提示するかもしれない。
【００３３】
ＩＩＩ型受容体の役目と一致する証拠が、本明細書で説明するＬ６ラット筋芽細胞の研究から得られる。上記のように、ＩＩＩ型受容体を過剰発現するＬ６細胞においては、ＩＩ型受容体への放射標識ＴＧＦ−βの結合が、親細胞で見られるものと比べて数倍増大している。これらの疑問に答えるためにはＴＧＦ−βＩＩＩ型の機能とＩＩ型およびＩ型受容体との相互作用をさらに評価する必要があるが、これは本明細書で説明する材料と方法を使って実施することができる。
【００３４】
同定しようとする受容体をコードするＤＮＡの全体または一部をプローブとして用い、本明細書で説明する方法を用いれば、ＩＩＩ型とＩＩ型のいずれの型のＴＧＦ−β受容体も他の種において同定することができる。たとえば、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ配列（図１に示す）の全体または一部、またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡ配列（図２に示す）の全体または一部は、他の動物における同等の配列を同定するために使うことができる。他の種における同等の配列を同定するために、必要に応じて使用するストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件を変更することができる。推定ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型またはＩＩ型をコードする配列がひとたび同定されれば、全長クローンＲ３−ＯＦＦのｃＤＮＡ挿入断片および部分クローンＲ３−ＯＦのｃＤＮＡ挿入断片がＩＩＩ型受容体をコードすることを確認するために、該配列がそれぞれの受容体型をコードするかどうか、本明細書で説明するものなど公知の方法を用いて決定することができる。たとえば、このやり方で単離したＤＮＡは、本明細書で説明するようにして、受容体ｍＲＮＡや表面受容体を発現しない適当な宿主細胞（たとえばＬ６ラット骨格筋筋芽細胞）中で発現させ、リガンド結合（ＴＧＦ−β結合）測定法によって分析することができる。
【００３５】
本明細書に説明する研究の結果、クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型またはクローン化ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対して特異的な抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）も公知の方法を用いて製造することができる。該抗体および該抗体を産生する宿主細胞（たとえばハイブリドーマ細胞）も本発明の対象である。クローン化ＴＧＦ−β受容体に対して特異的な抗体は、ＴＧＦ−β受容体をコードすると考えられる単離ＤＮＡを発現する宿主細胞を同定するために使用することができる。また、抗体は、ＴＧＦ−β活性をブロックするか阻害するために使用することができる。たとえば、クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に対して特異的な抗体は、受容体へのＴＧＦ−βの結合をブロックするために使うことができる。それらは、一部の線維症（たとえば皮膚、腎臓、肺の）における場合のようにＴＧＦ−β結合の低下が望まれる者に投与するすることができる。
【００３６】
本発明の方法は、線維症などＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体および／またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの異常結合を伴う疾患の診断に使うことができる。細胞表面におけるＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの異常結合を測定して測定結合値を得ることができ、これを適当な対照結合値と比較する。対照結合値は、受容体へのＴＧＦ−βの異常結合を有することが知られている対照細胞、または正常細胞（たとえばＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−β結合が生理的な範囲内にあることを示す証拠）である対照細胞を用いて得ることができる。対照値は、適当な受容体（すなわちＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体）へのＴＧＦ−βの結合程度を求めることによって得ることができ、このような値は測定結合値を求めるときに得てもよいし、あらかじめ求めておくこともできる（すなわちあらかじめ求めた基準値）。異常細胞から得られた対照結合値に近い測定結合値は、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合が異常であることを示している。正常細胞から得られた対照結合値に近い測定結合値は、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合が正常であることを示している。
【００３７】
ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡとＲＮＡおよびＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするＤＮＡとＲＮＡが現在入手可能である。本明細書中で使用する場合、それぞれのＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、発現されるとＴＧＦ−β受容体の機能的特徴を有するＴＧＦ−β受容体の産生をもたらすあらゆるオリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を包含する。すなわち、本発明は、適当な宿主細胞中で発現されると、天然細胞表面上におけるＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体のそれと同様のＴＧＦ−β親和性を有する（たとえばすべてのＴＧＦ−βイソタイプに対して同等の親和性を示す）ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を産生するＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。同様に、本発明は、適当な宿主細胞中で発現されると、天然細胞表面上におけるＴＧＦ−βＩＩ型受容体のそれと同様のＴＧＦ−β親和性を有する（たとえば天然ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のそれと同様のＴＧＦ−βファミリーリガンドのそれぞれのメンバーに対して異なる親和性を示す）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を産生するＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。該ＤＮＡまたはＲＮＡは適当な宿主細胞中で製造することができ、または合成的に（たとえばＰＣＲなどの増幅技術により）あるいは化学的に製造することができる。
【００３８】
本発明はまた、全長Ｒ３−ＯＦＦのヌクレオチド配列によってコードされる単離ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、部分クローンＲ３−ＯＦのヌクレオチド配列によってコードされる単離ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、全長クローン３ＦＦのヌクレオチド配列によってコードされる単離ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、および実質的に同じ親和性をもってＴＧＦ−βイソタイプと結合するＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体を包含する。該単離ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体は、本明細書で説明するようにして組替え技術によって製造することができ、それらが天然にまたは化学合成的に存在するソースから単離することもできる。本明細書中で使用する場合、クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびクローン化ＴＧＦ−βＩＩ型受容体という用語は、本明細書で説明したようにして同定されたそれぞれの受容体、およびそれぞれの受容体と実質的に同じＴＧＦ−βイソタイプ親和性を示すＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体（たとえばその他の種由来のもの）を包含する。
【００３９】
すでに述べたように、クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体が発現される細胞は、ＩＩＩ型受容体が天然に存在する細胞と実質的に同じようにしてＴＧＦ−βと結合する。ＴＧＦ−βと受容体の両者の部位特異的突然変異誘発に基づき、リガンドとクローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の相互作用をさらに分析して結合に重要な残基を同定することができる。たとえば、図１の配列を有するＤＮＡは、修飾クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードする修飾ＤＮＡ配列を製造する目的で、少なくとも１個のヌクレオチドを付加、欠失、または置換させることによって、変化させることができる。修飾受容体の機能的特徴（たとえばＴＧＦ−β結合能力や結合と結合によって通常生じる影響との関係）は、本明細書で説明する方法を用いて判定することができる。クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の修飾は、たとえば、膜結合性でなく、天然受容体と実質的に同じ親和性をもってＴＧＦ−βイソタイプと結合する能力を保持する、本明細書中で可溶性ＴＧＦ−β受容体と呼ぶ型のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を製造するために実施することができる。このようなＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体は、公知の遺伝子工学技術または合成技術を用いて製造することができる。それは、天然ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体中に存在する貫膜領域を全く含むことができないか、その領域の一部分（すなわち可溶性を阻害しない程度に十分に小さい）だけしか含むことができない。たとえば、それは図１のアミノ酸１ないし７８５から成るＴＧＦ−βＩＩＩ型配列またはＴＧＦ−β結合能力を保持するのに十分な該配列の一部（たとえばアミノ酸２４〜７８５、このものは最初の２３個のアミノ酸中に存在するシグナルペプチド切断部位を含まない）を含み得る。可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（たとえば貫膜ドメインと細胞質ドメインを含まないもの）も製造することができる。たとえば、それは、図３を含むアミノ酸１ないし１６６、またはＴＧＦ−βＩＩ型受容体のそれと実質的に同じＴＧＦ−β結合能力を保持するのに十分なその一部を含むことができる。
【００４０】
ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体は治療目的に使うことができる。上記のように、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、細胞増殖の調節、細胞分化の調節、および細胞代謝の制御をはじめとする様々な細胞活性に関与している。ＴＧＦ−βは細胞機能に不可欠であるかもしれず、ほとんどの細胞はＴＧＦ−βを合成し、ＴＧＦ−β細胞表面受容体を有する。細胞型と環境によってＴＧＦ−βの作用は異なり、増殖が刺激されたり阻害されたりし、分化が誘導されたり中断されたりし、細胞機能が刺激されたり抑制されたりする。ＴＧＦ−βは胚段階から成熟後の段階まで存在するので、生涯を通じてこれらの重要なプロセスに影響を及ぼしうる。特定のＴＧＦ−β（たとえばＴＧＦ−β１）は種間および細胞間で顕著な類似性がある。たとえば、特定のＴＧＦ−βのアミノ酸配列およびソースにかかわらずそれをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は種間で実質的に同じである。このことは、ＴＧＦ−βが必須プロセスにおいて重要な役目を果たしていることをさらに示唆している。
【００４１】
具体的には、ＴＧＦ−βは抗炎症および免疫抑制能力を有していて、骨形成において重要な役目を果たし（骨芽細胞活性を増大させることによる）、培養中の癌細胞増殖を阻害し、前立腺の腺細胞の増殖を抑えることが示されている。その結果、ある種の免疫系応答を変化させるうえで（およびおそらくは免疫関与疾患を緩和するうえで）、全身性骨疾患（たとえば骨粗鬆症）および骨成長を強化させたい状態（たとえば骨折部の修復）を治療するうえで、および癌細胞の増殖と転移を抑えるうえで、可能と思われる治療用途がある。また、ＴＧＦ−βは、ある種の細胞型が分裂を起こすか起こさないかを決定する際、ひとつの役目を果たしているようである。この点で、ＴＧＦ−βは組織修復において重要な役目を果たしているのかもしれない。一部の疾患や状態は、ＴＧＦ−βの産生の低下や慢性的な産生過剰を伴っているようである。（たとえば、動物実験の成績で、ＴＧＦ−βの過剰産生と肺、腎臓、肝臓またはウイルス関与免疫発現における線維症を特徴とする疾患の間に相関があることが示唆されている。）
【００４２】
明らかに、ＴＧＦ−βは身体プロセスおよび関連する創傷治癒、癌、免疫療法、骨療法における多くの可能と思われる臨床的すなわち治療的用途において重要な役目を有している。ＴＧＦ−β受容体遺伝子、コード物、およびそれらをイン・ビトロおよびイン・ビボで用いる方法が利用可能となれば、体内のＴＧＦ−βの活性と作用をさらに制御または調節することができる。たとえば、本発明のＩＩ型またはＩＩＩ型受容体遺伝子によってコードされるＴＧＦ−βＩＩ型またはＩＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βの作用を変えるために（たとえば、体内のＴＧＦ−βの作用を強化したり、その作用を（完全にまたは部分的に）阻害または低下させるために）適宜使うことができる。ＴＧＦ−βが可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体などのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に結合している者に投与することも可能である。本発明は、ＴＧＦ−β作用剤とＴＧＦ−β拮抗剤の両方を提供する。これらの目的のためには、ＴＧＦ−βＩＩ型またはＩＩＩ型受容体全体をコードするＤＮＡ遺伝子、コードされたＩＩ型またはＩＩＩ型受容体、またはどちらか一方の受容体の可溶性型を使うことができる。あるいは、これらの配列に基づいて設計されたかそれらに対して特異的な抗体またはその他のリガンドをこの目的に使うことができる。
【００４３】
ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体のアミノ酸配列がわかれば、それらの構造の理解を深めるとともに、受容体のＴＧＦ−βとの結合を阻害する化合物を設計することができる。それは、既存化合物の同定およびＩＩＩ型および／またはＩＩ型受容体拮抗剤である新規化合物の設計を可能にする。
【００４４】
本発明のＩＩＩ型および／またはＩＩ型受容体を発現する細胞は、受容体へのＴＧＦ結合を阻害（完全にまたは部分的にブロックする）能力を対象として化合物をスクリーニングするために使うことができる。たとえば、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現しないが（たとえばＬ６ラット骨格筋筋芽細胞）適当なベクターに保持させたＩＩＩ型ｃＤＮＡを挿入することによってそうなるように修飾させた細胞は、この目的に使うことができる。たとえば、判定しようとする化合物を標識化ＴＧＦ−βとともにＩＩＩ型発現細胞を含む組織培養シャーレに加える。対照として、同濃度の標識化ＴＧＦ−βを同種細胞を含む組織培養シャーレに加える。受容体へのＴＧＦ−βの結合が起きるのに十分な時間が経過した後、公知の方法（たとえばガンマカウンターによる）を用いて細胞への標識化ＴＧＦ−βの結合を判定し、判定しようとする化合物の存在下と非存在下でのその発生程度を測定する。２つの値を比較すると、試験化合物が受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックしたかどうかがわかる（すなわち、化合物の非存在下での場合より存在下の場合の方が結合が少ないということは、試験化合物がＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合をブロックしたことの証拠である）。
【００４５】
あるいは、ＴＧＦ−β受容体を発現する細胞系または顕微注入されたＴＧＦ−β受容体ＲＮＡを発現する細胞は、受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックする能力について、化合物を判定するために使うことができる。本態様においては、判定しようとする化合物をＴＧＦ−βとともに顕微注入されたＴＧＦ−β受容体ＲＮＡ発現細胞系の細胞を含む組織培養シャーレに加える。対照として、ＴＧＦ−βのみを顕微注入されたエンドセリン受容体ＲＮＡを発現する同種の細胞に加える。受容体へのＴＧＦ−βの結合が起きるのに十分な時間が経過した後、判定しようとする化合物の存在下と非存在下での結合程度を測定する。２つの値を比較すると、該化合物が受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックしたかどうかがわかる。ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−β様物質を同定したり、ＴＧＦ−βを精製したり、それぞれの受容体への結合の原因となっているＴＧＦ−β領域を同定したりするために使うことができる。たとえばＩＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βの場合と同様に受容体と結合する物質を同定するために親和性に基づく方法において使うことができる。
【００４６】
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。
【実施例】
【００４７】
実施例１〜５で使用した材料および方法を以下に説明する。
【００４８】
材料
以下は本明細書で説明する研究で使用した材料の説明である。
組替えヒトＴＧＦ−β１は、ジェネンテック社(Genentech）のリック・デリンク(Rik Derynck）から提供された。ＣＯＳ−Ｍ６細胞は、マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital）のブライアン・シード（Brian Seed）およびブリストル−マイヤーズ−スクイブ社（Bristol-Myers-Squibb）のアレジャンドロ・アルーフォ（Alejandro Aruffo）から提供された。ヘパリチナーゼは、ＭＩＴのテツヒト・コジマ（Tetsuhito Kojima）およびロバート・ローゼンバーグ（Robert Rosenberg）から提供された。ＬＬＣ−ＰＫ1 細胞は、マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital）のデニス・アウシエロ(Dennis Ausiello）の贈与物であった。ＹＨ−１６細胞は、マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital）のエドワード・イー（Edward Yeh）の贈与物であった。３−４細胞は、ホワイトヘッド生化学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research）のユージン・カジ(Eugene Kaji）の贈与物であった。注記ある場合を除き、その他の細胞系はいずれもＡＴＣＣより購入し、販売者の指定どおりに培養した。
【００４９】
発現クローニング
ｃＤＮＡライブラリーの構築とプラスミドプールの作成
プロテイナーゼ−Ｋ／ＳＤＳ法によりＡ１０細胞から１０μｇのポリアデニル化ｍＲＮＡを調製した［ゴンダら（Gonda et  al.), Molec. Cell. Biol.  2:617-624 (1982)］。二重ら旋ｃＤＮＡを合成し、既報［シードとアルーフォ（Seed, B. and A. Aruffo）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3365-3369 (1987) ］に従い非パリンドロームＢｓｔＸ１アダプターに結合させた。アダプターを結合させた（ａｃａｐｔｏｒｅｄ）ｃＤＮＡを５ないし２０％酢酸カリウム勾配上でサイズ分画し、１ｋｂより大きい挿入断片をプラスミドベクターｐｃＤＮＡ−１につなぎ、大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３中でエレクトロポレーションしたところ、力価＞１０7個組替え体を有する一次ライブラリーが得られた。ｃＤＮＡの一部を、７．５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンと１２．５ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含有するルリア−ブロス寒天を入れた１５ｃｍペトリ皿上で培養した約１ｘ１０4個組替え細菌コロニーのプールとして平板培養した。１０ｍｌのルリア−ブロス中で細胞を平板からかきとり、プールした細菌のグリセリン液を−７０℃で保存した。残りの細菌は、アルカリ溶菌ミニ−プレップ法［サムブルックら(Sambrook, J. et  al.), Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2d Ed. (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]を用いてプラスミドＤＮＡを精製するために使った。
【００５０】
ＣＯＳ細胞移入と結合測定
シードとアルーフォ（Seed, B. and A. Aruffo）によって記載されているＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3365-3369 (1987）］によりプラスミドプール（それぞれ約１ｘ１０4 個のクローンを含む）をＣＯＳ−Ｍ６（ＣＯＳ−７細胞のサブクローン）に移入した。移入後４８時間目に、細胞を５０ｐＭの 125Ｉ−ＴＧＦ−β１（１００ないし２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに４℃で４時間インキュベートし、実質的に既報［ゲアリングら（Gearing, D.P. et  al.), EMBO J. 8:3667-3676 (1989)］と同様にしてＮＴ−Ｂ２写真乳剤［コダック社（Kodak)］を用いて移入細胞のオートラジオグラフィー分析を行なった。スライドガラス現像後、細胞を風乾し、マウンティング剤とともにカバーガラスでマウントした。暗視野照明用分解トランスイルミネーターを使用して、オリンパスＯＭ−Ｔ１倒立位相差顕微鏡下でスライドガラスを分析した。
【００５１】
陽性プールの小分け
スクリーニングした８６個のプールのうち１個のプール（＃１３）が陽性と判定され、このプールに対応する細菌グリセリン液を滴定し、１０００個のクローンの２５個のプールを作成し、これらのプール由来のミニプレッププラスミドを上記のようにしてＣＯＳ細胞に移入した。１０００個のうち数個の陽性プールが同定され、１個を１００個のコロニーの２５枚プレートとして再び平板培養した。この陽性プレートの複製を作成し、集菌した。陽性プールが同定されたら、個々のコロニーを対応するマスタープレートから取り上げ、３ｍｌの液体培地中で１夜培養した。１００個のコロニーに相当する２次元格子を作成し、単一のクローンＲ３−ＯＦを単離した。
【００５２】
Ｒ３−ＯＦＦのクローニング
ラムダＺＡＰＩＩ［ストラタジーン社（Stratagene）］に保持させた２０８Ｆラット繊維芽細胞ライブラリーをクローンＲ３−ＯＦ挿入断片によって、高ストリンジェンシーでスクリーニングし、約６ｋｂの挿入断片を有する数個のクローンを単離したが、そのうちの１つをＲ３−ＯＦＦと呼ぶ。
【００５３】
ＤＮＡ配列決定と配列分析
シークエナーゼ(Sequenase）試薬［ユナイテッドステーツバイオケミカルズ社（United States Biochemicals）］を用いるジデオキシチェーンターミネーター法により二重ら旋ＤＮＡの配列を決定した。ＢＬＡＳＴ［アルトシュールら（Altschcul, S.F. et  al.), J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)］を用いて配列をデータベースと比較した。
【００５４】
ＴＧＦ−βのヨウ素標識
既報のクロラミン−Ｔ法［チャイフェッツとアンドレ（Cheifetz, S. and J.L. Andres），J. Biol. Chem.  263:16984-16991 (1988)］を用いてＴＧＦ−β１をヨウ素標識した。
【００５５】
化学的架橋
１０ｃｍペトリ皿上で培養した移入ＣＯＳ細胞または３．５ｃｍペトリ皿上で培養したサブコンフルーエントな（subconfluent）Ｌ６およびＡ−１０細胞を 125Ｉ−ＴＧＦ−β１とともに結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．５％ＢＳＡで緩衝したフレブス・リンゲル液）中でインキュベートし、ＢＳＡ不含氷冷結合緩衝液で４回洗い、６０ｎｇ／ｍｌジスクシニミジルスベラートを含有するＢＳＡ不含結合緩衝液とともに４℃、回転速度一定下で１５分インキュベートした。結合緩衝液に７％ショ糖を加えることによって架橋を停止させた。細胞をかきとり、集め、遠心分離によりペレット化し、次いで溶菌緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％トリトン−Ｘ１００、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアンチパイン、１００μｇ／ｍｌ塩酸ベンズアミジン、１００μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター、５０μｇ／ｍｌアプロトニン、および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）に再懸濁した。可溶化物を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、−７０℃でＸ−ＡＲフィルム「コダック社(Kodak）］に密着させてオートラジオグラフィー分析に付した。
【００５６】
酵素消化
既報［チャイフェッツとアンドレ（Cheifetz, S. and J.L. Andres）, J. Biol. Chem.  263:16984-16991(1988) ，セガリニとセイェジン（Segarini, P.R. and S.M. Seyedin), J. Biol. Chem.  263:8366-8370(1988) ］に従い、コンドロイチナーゼとヘパリチナーゼによる可溶化ＴＧＦ−β受容体の消化を行なった。
【００５７】
安定細胞系の作成
Ｌ６筋芽細胞を１０ｃｍペトリ皿に１０分の１づつ分割し、翌日、リン酸カルシウム法［チェンとオカヤマ(Chen, C. and H. Okayama）, Molec. Cell. Biol.  7:2745-2752 (1987)］により、ベクターｐｃＤＮＡ−ｎｅｏ［インビトロゲン社（InVitrogen）］に保持させたクローンＲ３−ＯＦとＲ３−ＯＦＦを前後両方向に移入した。細胞は、肉眼で個々のコロニーが見える様になるまで数週間、Ｇ４１８［ゲネチシン（Geneticin)，ギブコ社（GIBCO)］の存在下の選抜に付した。これらのクローンを単離、増幅した。
【００５８】
ＲＮＡブロット分析
塩化リチウム／尿素法［アウフレーとラウゲオン（Auffrey, C. and F. Raugeon）, Eur. J. Biochemistry  107:303-313 (1980)］によりラット組織ポリアデニル化ｍＲＮＡを調製した後、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィー［アビブとレデル（Aviv and Leder）, 1972］を行なった。複数の細胞系からポリアデニル化ｍＲＮＡをプロテイナーゼＫ／ＳＤＳ法［ゴンダら（Gonda, T.J. et  al.), Molec. Cell. Biol.  2:617-624 (1982)］により調製した。ｍＲＮＡの試料を１％アガロース−２．２Ｍホルムアルデヒドゲル上の電気泳動によって分析し、ナイロン膜［バイオトリンス（Biotrns)，ＩＣＮ社］上にブロットし、ランダムプライミングにより32Ｐで標識したクローンＲｅ−ＯＦの２．９ｋｂ挿入断片をプローブとしてインキュベートした［サムブロックら(Sambrook, J. et  al.), Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2d Ed. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］。５０％ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中４２℃で１夜ハイブリダイゼーションを行ない、−７０℃でＸ−ＡＲフィルムに密着させる前に、ブロットを５５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗った。
【００５９】
実施例１．  抗ＩＩＩ型受容体タンパク質抗体の製造と精製ＩＩＩ型受容体の部分タンパク質分解によって生じたペプチドのミクロシークエンシング
まず、細胞性プロテオグリカンをヒト胎盤から精製し、次いで、ヘパリチナーゼとコンドロイチナーゼによる酵素的脱グリコシル化に付した。１００〜１３０キロダルトンの分子量範囲のタンパク質コアを調製用ゲル電気泳動によりさらに精製した。これらのものはＩＩＩ型受容体を含んでいるはずであった。この部分精製物をマウスの抗原として用いた。免疫化マウスから得られた８５０個のハイブリドーマ系のスクリーニング後、３系が１００〜１２０ｋＤの脱グリコシル化ポリペプチドを特異的に認識し免疫沈降させる抗体を産生することがわかった。このものは、全細胞を 125Ｉ−ＴＧＦ−βとともにインキュベートした後で共有架橋を行なうことによって放射標識することができた。そのサイズはＩＩＩ型受容体について既報のタンパク質コアサイズと一致している［マッサーグら（Massague, J.）, Annu. Rev. Cell. Biol. 6:597-641 (1990)］。
【００６０】
モノクローナル抗体９４を用いてアフィニティークロマトグラフィーによりラット肝臓からＩＩＩ型受容体を精製した。精製受容体を部分タンパク質分解に付し、生じたペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分析した。数個のペプチドをミクロシークエンシングに付したところ、以下のオリゴペプチド配列が得られた。
【００６１】
ペプチドＩ：ＩＬＬＤＰＤＨＰＰＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）
ペプチドＩＩ：ＱＡＰＦＰＩＮＦＭＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）
ペプチドＩＩＩ：ＱＰＩＶＰＳＶＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）
ペプチドＩＶ：ＦＹＶＥＱＧＹＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）
【００６２】
これらのペプチド配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使うクローニング法におけるプライマーとして、またはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおけるプローブとして機能する縮重オリゴヌクレオチドを構築した。この方式は生産的ではなかったが、オリゴペプチド配列は、第２の代替法（実施例２参照）によって単離された受容体クローンの確認において有用であることがわかった。
【００６３】
実施例２．  ＩＩＩ型受容体ｃＤＮＡの発現クローニング
ＣＯＳ細胞における発現クローンニング方法として、移入を受けたＣＯＳ細胞中で個々のｃＤＮＡが顕著な増幅を示すことを利用する手順をＴＧＦ−β受容体クローンを単離する代替法として用いた。上記増幅は、ｃＤＮＡベクター中でＳＶ４０複製起点と相互作用するＣＯＳ細胞によって発現されたＳＶ４０大型Ｔ抗原が介在する［ゲアリングら（Gearing, D. et  al.), EMBO J. 8:3667-3676 (1989)；リンら（Lin, H.Y. et  al.), Proc. Natl. Acad. Sci.  88:3185-3189 (1991a)；リンら（Lin, H.Y. et  al.), Science, in press (1991)；マシューズとバーレ（Mathews, L.S. and Vale, W.W.）, Cell  65:973-982 (1991) ］。
【００６４】
この方式は、３つの高親和性ＴＧＦ−β受容体のいずれも発現するラット血管平滑筋細胞系であるＡ−１０細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築することより成るものであった。生じたｃＤＮＡは、ＣＭＶ転写プロモーターとＳＶ４０複製起点を保持するベクターｐｃＤＮＡ−１に挿入した。次いで、生じたライブラリーをそれぞれ１０，０００個の独立の組替え体のプールに分割し、ガラスフラスケット上で培養した１．５ｘ１０6 個のＣＯＳ−７細胞に各プール由来のＤＮＡをＤＥＡＥ−デキストラン移入法［アルーフォとシード（Aruffo, A. and Seed, B.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:8573-8577(1987); ゲアリングら（Gearing, D.P. et  al. ）, EMBO J. 8:3667-3676 (1989)；マシューズとバーレ（Mathews, L.S. and Vale, W.W.),  Cell  65:973-982 (1991) ］によって移入した。移入された細胞は４８〜６０時間培養し、次いで放射標識ＴＧＦ−β１に４時間曝露した。この処理の後で、これらの細胞をのせたスライドガラスをよく洗い、固定した。これらのスライドガラスを液体写真乳剤に漬け、暗視野顕微鏡で調べた。この方法によってこれまでクローン化された受容体遺伝子はいずれも、ＣＯＳ細胞中での発現は検出不可能または低濃度レベルであるが、非移入ＣＯＳ細胞がすでに相当量のＩＩＩ型ＴＧＦ−β受容体を発現しているという事実に当惑した。１細胞あたり約２ｘ１０5個の受容体分子と推定される上記発現が、容認できないほど高レベルのバックグランド結合をもたらしたのかもしれない。しかし、上記検出法は放射標識リガンドの個々の細胞上での結合を可視化するものであるので、本質的により高レベルのベクターコード化受容体を発現する偶発的細胞を同定することが可能であると期待された。この期待は初期実験において正しいことが判明した。
【００６５】
このやり方による１００万個近いｃＤＮＡクローンのスクリーニングの後、２０個の陽性移入体を含むスライドガラスが同定された。１つの上記移入体の由来本であるオリジナルの発現構築物プールを、それぞれ１０００個のクローンより成る２５個のサブプールに分割し、これらを２ラウンド目のスクリーニングに付した。さらに２ラウンドの姉妹選抜を行なったところ、その移入先であるＣＯＳ細胞のうちの約１０％において高レベルのＴＧＦ−β−結合性タンパク質を誘導した２．９ｋｂの挿入断片を有するｃＤＮＡクローン（Ｒ３−ＯＦ）が生じた。
【００６６】
この結合の特異性は、２００倍過剰量の未標識ＴＧＦ−β競合体の添加が移入細胞への 125Ｉ−ＴＧＦ−βの結合を強力に低下させることを示すことによって確認した。１０％という移入効率と高いバックグランドの内生受容体結合を考慮に入れ、各スライドガラスのこのｃＤＮＡクローンを移入した細胞への 125Ｉ−ＴＧＦ−β結合の合計のレベル（図１Ｃ）は、モック移入体で見られるレベル（データは示さない）より２倍高いだけであると計算した。それにもかかわらず、このわずかなリガンド結合の増大はこのバックグランドレベルの受容体を発現する多数の細胞のなかから数少ない移入体を同定するのに十分であった。
【００６７】
Ｒ３−ＯＦのｃＤＮＡは、そのうちの３’側１８個がベクター配列によってコードされた８３６個のアミノ酸残基から成るオープンリーディングフレームをコードしたが、このことは、クローンＲ３−ＯＦはアラニン８１８特定コドンの位置で未成熟終止してしまう不完全なｃＤＮＡ挿入断片であることをはっきりと示している（図４）。Ｒ３−ＯＦをプローブとして用いてラット２０８Ｆラムダファージライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離した。このクローンをＲ３−ＯＦＦと名付けたが、長さは６ｋｂで、８５３個のアミノ酸から成るタンパク質をコードした。その配列はクローンＲ３−ＯＦのそれと共直線的であった。
【００６８】
実施例３．  全長クローンＲ３−ＯＦＦ産物のキャラクタライゼーション
３つのＴＧＦ−β受容体のうちのどれを特定するかを決めるために、全長クローンＲ３−ＯＦＦ産物のキャラクタライゼーションを行なった。そうするために、ＣＯＳ移入体を放射標識ＴＧＦ−βとともにインキュベートし、化学架橋剤を加え、標識化受容体をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００６９】
このやり方で細胞表面ＴＧＦ−β受容体を標識したところ、既報［マッサーグら(Massague, J. et  al.), Ann. NY Acad. Sci.  593:59-72 (1990)］のとおりＣＯＳ細胞の表面に、３つの異なる型が検出された。これらには、分子量のより小さいＩ型およびＩＩ型の２つの受容体（６５ｋＤと８５ｋＤ）および２８０〜３３０ｋｄの拡散バンドとして泳動される分子量のより大きいＩＩＩ型プロテオグリカンが含まれていた。該プロテオグリカンをコンドロイチナーゼとヘパリチナーゼで酵素処理したところ、約１００ｋｄのコアタンパク質が得られた。２００倍過剰量の未標識ＴＧＦ−β１によって競合されたという点で、３つの受容体型すべてに対する結合が特異的であった。
【００７０】
Ｒ３−ＯＦＦのｃＤＮＡの移入は、ＩＩＩ型受容体の発現の２倍増大をもたらした。クローンＲ３−ＯＦＦを移入したＣＯＳ細胞から得た細胞溶解物を脱グリコシル化酵素で処理したところ、不均一な２８０〜３３０ｋｄのバンドは未移入Ａ１０細胞で見られるＩＩＩ型タンパク質コアとともに泳動されるタンパク質コアに変換された。重要なことに、該組替えタンパク質コアは内生ＣＯＳ細胞ＩＩＩ型タンパク質コアと異なって泳動された。
【００７１】
これらの観察は、Ｒ３−ＯＦＦｃＤＮＡを発現する安定移入細胞を用いた実験で確認され拡張された。Ｌ６ラット骨格筋筋芽細胞は、検出可能なＩＩＩ型ｍＲＮＡや内生ＩＩＩ型受容体を発現しないのが普通である（放射標識リガンド結合測定による）。上記細胞にベクターｐｃＤＮＡ−ｎｅｏに保持させた単離ｃＤＮＡを移入した。ＣＭＶプロモーターに対して前後両方向でこのクローンを安定的に発現する細胞クローンを単離し、リガンド結合測定法によって分析した。
【００７２】
全長クローンＲ３−ＯＦＦまたは部分クローンＲ３−ＯＦを前方に導入したところ、ＩＩＩ型受容体の新規発現をもたらした。逆方向にｃＤＮＡを移入したＬ６細胞はこのタンパク質を発現しなかった。Ｒ３−ＯＦクローンを移入した細胞中のＩＩＩ型受容体のタンパク質コアの見かけサイズは、Ｒ３−ＯＦＦ移入細胞によって発現されるものより小さいが、これはそれぞれの核酸配列（図１）から予想されるタンパク質コアのサイズの違いと一致する。
【００７３】
予想外にも、ＩＩ型受容体に架橋される放射標識リガンドの量はＩＩＩ型ｃＤＮＡを発現する細胞中で２．５倍増大するのに対し、Ｉ型受容体に架橋される量は変化しなかった。この見かけ上特異的なＩＩ型受容体へのリガンド結合のアップレギュレーションは、これまで分析した１５個の安定移入Ｌ６細胞系のいずれの場合も検出可能であった。この効果は、全長クローンＲ３−ＯＦＦだけでなく細胞質領域を欠く切断クローンＲ３−ＯＦも関与しているようである。
【００７４】
実施例４．  ＩＩＩ型受容体の発現
ノーザンブロット分析によって、ＩＩＩ型受容体ｍＲＮＡは数種類のラット組織中で単一の６ｋｂのｍＲＮＡ分子として発現されることが示された。肝臓中のｍＲＮＡ発現レベルはその他の組織中より低かったが、この結果は放射性ヨウ素標識ＴＧＦ−β１を用いて行なわれた様々な組織の、より以前の研究から予想されたことである。この情報に基づけば、約６ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を有するクローンＲ３−ＯＦＦは全長ラットＩＩＩ型ｃＤＮＡクローンに該当すると思われる。
【００７５】
マウス由来の細胞（ＭＥＬおよびＹＨ１６）は、ブタ、ラット、およびヒト由来のものより小さい（約５．５ｋｂ）ＩＩＩ型ｍＲＮＡ分子を発現するようである。網膜芽細胞腫細胞系（Ｙ７９、Ｗｅｒｉ−１、Ｗｅｒｉ−２４、およびＷｅｒｉ−２７）が顕著な例外として認められる以外は、これらの細胞のいずれにおいてもＩＩＩ型ｍＲＮＡの発現または欠損は検出可能細胞表面ＩＩＩ型受容体の発現または欠損と一致している。これらの細胞は、検出可能なＩＩＩ型受容体表面発現を欠いていることがすでに示されており、この結果はわれわれ自信の未発表研究によって確認されている。容易に検出できるレベルでＩＩＩ型受容体タンパク質を本当に発現するその他の細胞のレベルと同等のレベルでこれらの細胞中でＩＩＩ型受容体ｍＲＮＡが発現されることは興味深い。現時点では、正常網膜芽細胞（ＡＤ１２）においてかなりあるＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型発現は、おそらく転写後機構によってこれらの網膜芽細胞腫細胞中でダウンレギュレーションされていると結論づけることができるだけである。
【００７６】
実施例５．  全長ＩＩＩ型ｃＤＮＡの配列分析
実施例４で説明する全長ｃＤＮＡクローン（Ｒ３−ＯＦＦ）を配列分析に付した。全長リーディングフレームをフランキング配列とともに図１に示す。このリーディングフレームは８５３個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするが、これは完全脱グリコシル化ＴＧＦ−β１ＩＩＩ型受容体で見られる１００ｋＤのサイズと一致する。
【００７７】
誘導タンパク質配列の２つの断片（下線およびイタリック、残基３７８−３８８および４２７−４３４）は、精製受容体タンパク質の直接生化学的分析によってすでに決定されているものと厳密に一致する。このことから、この単離ｃＤＮＡクローンがラットＩＩＩ型受容体をコードすることも確認された。
【００７８】
このＴＧＦ−β結合性タンパク質はサイトカイン受容体としては珍しい構造を有する。ヒドロパシー分析で、Ｎ末端シグナル配列とそれに続く長い親水性Ｎ末端領域が示される［カイトとドゥーリトル(Kyte, J. and R.F. Doolittle）, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)］。強い疎水性を示すＣ末端側２７残基から成る領域（下線部分、残基７８６−８１２）は単一の推定貫膜ドメインにあたる。このことは、受容体のほぼ全体が、Ｃ末端付近の細胞膜に固定されたＮ末端細胞外ドメインから成ることを示唆するものである。４１残基から成る比較的小さなＣ末端テイルは推定細胞質ドメインにあたる。
【００７９】
クローンＲ３−ＯＦも分析し、同一のオープンリーディングフレームを有するが最後のコード化残基がアラニン８１８であるＲ３−ＯＦＦの切断体であることがわかった（図１）。
【００８０】
Ｒ３−ＯＦＦには、６個のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位と１５個のシステインが存在する（図１に示す）。セリン５３５の位置に少なくとも１個のコンセンサスグリコサミノグリカン付加部位が存在し［ベルンフィールドとホッパー（Bernfield, M. and K.C. Hooper), Ann. N.Y. Acad. Sci. in press (1991)］、ＧＡＧ共役部位となりうる多くのＳｅｒ−Ｇｌｙ残基も存在する。コンセンサスタンパク質キナーゼＣ部位も残基８１７に存在する。
【００８１】
今までに記載された唯一のその他の遺伝子、すなわち内皮細胞によって大量に発現されるエンドグリンと呼ばれる糖タンパク質［ゴウゴスとレタルテ（Gougos and Letarte）, 1990］だけが関連アミノ酸配列を含んでいる。総じて、６４５個のアミノ酸残基から成るエンドグリンの全長にわたりＩＩＩ型受容体と約３０％の相同性がある。ＩＩＩ型受容体とエンドグリンの配列の間で最も相同性が高い領域（７４％相同）は主に推定貫膜ドメインと細胞質ドメインに存在する。ＩＩＩ型受容体の全体構造同様に、エンドグリンは、おそらく細胞外にある大型の親水性Ｎ末端ドメインとそれに続く推定貫膜ドメインと４７個のアミノ酸残基から成る短い細胞質テイルを含有する糖タンパク質である。エンドグリンはエクトドメイン上の「ＲＧＤ」配列とその他の接着分子の相互作用によって細胞どうしの認識に関与しているかもしれないことが示唆されているが、エンドグリンの生物学的役目は不明である。ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体と異なり、エンドグリンはＧＡＧグループを保持しない。
【００８２】
均等物
当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識しまた確認し得るであろう。そのような均等物は下記のクレームの範疇に含まれるものである。 
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１−Ａ】図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β１受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦ（完全挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と翻訳アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）であり、該クローンのフランキング配列を有するオープンリーディングフレームを示してある。貫膜領域は１重下線で示す。本文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受容体由来ペプチド配列はイタリック表記で下線を付けてある。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、細胞外システインは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位は＄で示す。クローンＲ３−ＯＦ（２．９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化アミノ酸は＠で示す。コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋＋＋で示す。その他の潜在的グリコサミノグリカン付着部位は＋で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２ないし−４４）は波線で示す。フォンヘイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（von Heijne, G.）, Nucl. Acid. Res.  14:4683-4690 (1986) ］によって予想されるシグナルペプチド切断部位は矢印で示す。
【図１−Ｂ】図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β１受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦ（完全挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と翻訳アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）であり、該クローンのフランキング配列を有するオープンリーディングフレームを示してある。貫膜領域は１重下線で示す。本文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受容体由来ペプチド配列はイタリック表記で下線を付けてある。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、細胞外システインは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位は＄で示す。クローンＲ３−ＯＦ（２．９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化アミノ酸は＠で示す。コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋＋＋で示す。その他の潜在的グリコサミノグリカン付着部位は＋で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２ないし−４４）は波線で示す。フォンヘイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（von Heijne, G.）, Nucl. Acid. Res.  14:4683-4690 (1986) ］によって予想されるシグナルペプチド切断部位は矢印で示す。
【図１−Ｃ】図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β１受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦ（完全挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と翻訳アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）であり、該クローンのフランキング配列を有するオープンリーディングフレームを示してある。貫膜領域は１重下線で示す。本文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受容体由来ペプチド配列はイタリック表記で下線を付けてある。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、細胞外システインは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位は＄で示す。クローンＲ３−ＯＦ（２．９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化アミノ酸は＠で示す。コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋＋＋で示す。その他の潜在的グリコサミノグリカン付着部位は＋で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２ないし−４４）は波線で示す。フォンヘイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（von Heijne, G.）, Nucl. Acid. Res.  14:4683-4690 (1986) ］によって予想されるシグナルペプチド切断部位は矢印で示す。
【図１−Ｄ】図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β１受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦ（完全挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と翻訳アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）であり、該クローンのフランキング配列を有するオープンリーディングフレームを示してある。貫膜領域は１重下線で示す。本文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受容体由来ペプチド配列はイタリック表記で下線を付けてある。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、細胞外システインは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位は＄で示す。クローンＲ３−ＯＦ（２．９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化アミノ酸は＠で示す。コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋＋＋で示す。その他の潜在的グリコサミノグリカン付着部位は＋で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２ないし−４４）は波線で示す。フォンヘイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（von Heijne, G.）, Nucl. Acid. Res.  14:4683-4690 (1986) ］によって予想されるシグナルペプチド切断部位は矢印で示す。
【図１−Ｅ】図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−β１受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦＦ（完全挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と翻訳アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）であり、該クローンのフランキング配列を有するオープンリーディングフレームを示してある。貫膜領域は１重下線で示す。本文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受容体由来ペプチド配列はイタリック表記で下線を付けてある。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、細胞外システインは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位は＄で示す。クローンＲ３−ＯＦ（２．９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化アミノ酸は＠で示す。コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋＋＋で示す。その他の潜在的グリコサミノグリカン付着部位は＋で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２ないし−４４）は波線で示す。フォンヘイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（von Heijne, G.）, Nucl. Acid. Res.  14:4683-4690 (1986) ］によって予想されるシグナルペプチド切断部位は矢印で示す。
【図２】図２は、ヒトＨｅｐＧ２細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した全長ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡクローン３ＦＦ（完全挿入断片サイズ５ｋｂ）のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）である。該ｃＤＮＡは５７２個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する。
【図３】図３は、全長ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）である。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図１−Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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