(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのジメチルアミンとホルムアルデヒドへの分解を触媒する、熱安定性が高く、ドデシル硫酸ナトリウムにも安定で、キモトリプシンで消化されない、２８０ｎｍでの吸収が無く、コマシー色素で染色されない、ゲル濾過で分子量４０万であり、性状から単純タンパク質ではなく、複合タンパク質と推定され、反応にＦｅ２＋およびシステインを必要とする、スケトウダラ筋肉より可溶化抽出したトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明は、新規トリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（以下、「ＴＭＡＯ」と略することもある。）は海産魚介類筋肉中の主要な非タンパク質態窒素であり、タラ科の魚類、軟骨魚類、および軟体動物組織に多く含まれている。産業的に重要な魚種であるスケトウダラ筋肉中には６０−１００ｍＭの多量のＴＭＡＯが存在しており、魚の貯蔵中に生成したホルムアルデヒドは魚肉タンパク質を変性させるために、タラ類の冷凍変性を促進させる要因と考えられている。
【０００３】
しかし、これまでのところ、次の２点については十分な研究が行われておらず、未解決である。
（１）ＴＭＡＯはトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素（ＴＭＡＯａｌｄｏｌａｓｅ，ＥＣ４．１．２．３２、以下、「ＴＭＡＯａｓｅ」と略することもある。）によってジメチルアミンとホルムアルデヒドに分解されると考えられている。この酵素は幽門垂や腎臓由来のものについてはその性状が多少検討されているが、単離、精製されたものはない。筋肉の酵素についてはｒｅｄ  ｈａｋｅで、Ｐａｒｋｉｎ  ＆  Ｈｕｌｔｉｎが研究した例があるのみである。彼らは酵素活性は筋肉のミクロゾーム画分に含まれることを明らかにしたが、それ以上の精製と酵素の性状については調べていない。
（２）ホルムアルデヒドが筋肉タンパク質を変性させることは容易に推測できるが、変性の機構とその度合いについては検討されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単離したＴＭＡＯａｓｅの提供を目的としている。本発明は、単離したＴＭＡＯａｓｅを用いて水産物の変性防止に機能するそのインヒビターの探索のために役立てることを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
酵素活性が筋原繊維に結合して存在することから、筋原繊維画分を酵素として使用し、酵素反応の特徴を検討していたが、スケトウダラ筋肉から酵素の可溶化と精製方法を検討した結果、本発明者らは酵素を可溶化することができた。酵素の性状について若干の検討をおこない、可溶化した酵素が筋原繊維レベルの酵素とは活性化剤に対する影響、温度安定性などの点で性状が異なっていることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００６】
本研究により、魚肉中からトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素を可溶化抽出することに初めて成功し、酵素の調製方法を確立することができた。
本酵素は熱安定性が高く、ドデシル硫酸ナトリウムにも安定でキモトリプシンで消化されない。２８０ｎｍでの吸収が無く、コマシー色素で染色されない。分子量４０万であるが、性状から単純タンパク質ではなく、複合タンパク質と推定されるが、詳細については今後のさらに検討することが必要である。  反応にはＦｅ２＋およびシステインを必要とした。
【０００７】
本発明は、基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのジメチルアミンとホルムアルデヒドへの分解を触媒するトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素を要旨としている。
水産物筋肉由来のものであり、したがって本発明は、基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのジメチルアミンとホルムアルデヒドへの分解を触媒する水産物筋肉由来のトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素を要旨としている。
魚肉より可溶化抽出したものであり、したがって本発明は、基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのジメチルアミンとホルムアルデヒドへの分解を触媒する魚肉より可溶化抽出したトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素を要旨としている。
【０００８】
本発明のトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素熱は、安定性が高く、ドデシル硫酸ナトリウムにも安定でキモトリプシンで消化されない、２８０ｎｍでの吸収が無く、コマシー色素で染色されない、分子量４０万であるが、性状から単純タンパク質ではなく、複合タンパク質と推定され、反応にＦｅ２＋およびシステインを必要とするものであり、したがって本発明は、基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのジメチルアミンとホルムアルデヒドへの分解を触媒する魚肉より可溶化抽出した、安定性が高く、ドデシル硫酸ナトリウムにも安定でキモトリプシンで消化されない、２８０ｎｍでの吸収が無く、コマシー色素で染色されない、分子量４０万であるが、性状から単純タンパク質ではなく、複合タンパク質と推定され、反応にＦｅ２＋およびシステインを必要とするトリメチルアミン−Ｎ−オキシド分解酵素を要旨としている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
実験方法
（試料）
函館近海で漁獲されたスケトウダラを使用した。一部は−４０℃で凍結貯蔵した肉を用いた。
【００１０】
（酵素反応と活性の測定）
筋肉および筋原繊維画分の酵素活性は肉糊状の反応組織で測定した。
すなわち、２０ｍＭ  ＴＡＭＯ，０．２ｍＭ  ＦｅＣｌ２，２ｍＭアスコルビン酸，２ｍＭシステイン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）および１．５ｇの酵素（タンパク質濃度として３０−５０ｍｇ／ｇ反応液）からなり、全量３ｇである。
これを２５℃の恒温水槽中にいれて反応を開始した。反応停止は１ｍｌの１０％ＴＣＡを入れた遠心管中に酵素反応物を移して行った。４ｍｌの水で容器を洗浄して、これも遠心管に入れた。撹拌して生成したジメチルアミンを抽出し、遠心分離して上清のジメチルアミンを比色定量した。
可溶化した酵素の活性は終濃度２０ｍＭ  ＴＡＭＯ，０．２ｍＭ  ＦｅＣｌ２，２ｍＭシステイン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）の反応混液を用いて測定した。なお、生成するホルムアルデヒドを定量して活性を測定する場合は緩衝液には２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。
【００１１】
（反応生成物の定量）
ジメチルアミンの定量は銅−ジメチルカルバメート法で行った。ホルムアルデヒドの定量は４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾールとホルムアルデヒドをアルカリ溶液中で縮合させ、過ヨウ素酸で酸化させて生成する色素を５５０ｎｍで比色して行った。
【００１２】
実験結果および考察
（酵素活性の抽出と精製）
スケトウダラ筋肉から常法で筋原繊維を調製した。活性は全て筋原繊維画分に回収され、可溶化画分（水溶性画分）には全く回収されなかった。そこで、筋原繊維画分からの酵素の抽出、可溶化を検討した。
【００１３】
１）筋原繊維の高塩濃度溶液による可溶化：筋原繊維はアクトミオシンとして可溶化されるが、酵素活性は全てアクトミオシンに移行するだけで、アクトミオシンから分離できなかった。
【００１４】
２）筋原繊維のアセトン粉末を調製したところ、活性は粉末中に残存することがわかった。そこでこの粉末から活性の可溶化を試みた（図１、アセトン粉末中の全活性を１００％としてある。）。
（ａ）低塩濃度溶液によるアクチンの抽出を試みたところ、活性は抽出されずに抽出残渣に残存した。
（ｂ）高濃度のＮａＣｌ（０．５Ｍ＜）では活性の約５０％が抽出されることがわかった。
（ｃ）トリトンｘ−１００あるいはＢｒｉｊｉを添加して抽出を試みたが（ｂ）の方法以上の抽出率は得られず、界面活性剤の効果は特に認められなかった。
（ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液ではアセトン粉末は完全に可溶化され、しかも活性が増大することが示された。ドデシル硫酸ナトリウム抽出は共存タンパク質をも完全に溶解するので、精製の効果がないことと、ドデシル硫酸ナトリウムの除去が問題となることから精製法としてはこれ以上検討しなかった。しかし、ドデシル硫酸ナトリウム溶液中で酵素活性が失活しないことが見いだされた。
以上の結果から、アセトン粉末からアクチンを低塩濃度の緩衝液で抽出し、その残渣から０．５または１ＭＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）で活性の抽出をおこなうことにした。
【００１５】
（ｅ）前記（ｂ）の抽出液の主要タンパク質はトロポミオシンであるので、トロポミオシンの除去を硫安分画、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００）およびＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーによって試みた。しかし、いずれの方法によっても活性はトロポミオシン画分に共存したままで分離できなかった。
なお、Ｓｅｐｈａｄｅｘからは活性はほとんど回収されなかった。これは酵素がＳｅｐｈａｄｅｘゲルに吸着されるのが原因のように思われる。
【００１６】
（ｆ）前記（ｂ）の抽出液中のトロポミオシンを等電点沈殿で除去することを試みた。すなわち、氷冷下で前記（ｂ）の抽出液に１ＮＨＣｌを添加して、ｐＨを４．５に調整した。遠心分離によりトロポミオシンを沈殿として除去したところ、活性は上清画分に回収され、可溶化することに成功した。１ＮＮａＯＨで上清を中和したのち、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）に透析した。透析によってＮａＣｌ濃度を下げることによって、酵素活性はいくぶん上昇した。本酵素は一旦可溶化されると、水溶性になることが明らかとなった。
以上の結果に基づいて本酵素の抽出方法をまとめ、そのフローチャートを図２に示した。また酵素精製（ＭｅｔｈｏｄＩ）の概略を表１に示した。
【００１７】
この結果によると、筋原繊維画分からアセトン粉末を調製し、それから抽出、酸処理することによって、酵素は可溶化された。その活性の回収率は約６０％、比活性の上昇は約２０倍であった。ここで、活性の回収量がアセトン粉末からの抽出量よりも高くなったのは酸処理とその後の透析によって活性の上昇が起きるためであるが、その原因については良くわからない。
【００１８】
３）酵素抽出の改良法（ＭｅｔｈｏｄＩＩ）
前項で述べたように、トロポミオシンの等電点沈殿によって、酵素が可溶化された事実から、筋原繊維画分を直接高塩濃度下で等電点沈殿しても酵素が可溶化される可能性が考えられた。
そこで、この可能性を検討し、結果を表１（ＭｅｔｈｏｄＩＩ）に示した（図２）。筋原繊維から直接酸処理抽出を行うと、酵素の抽出率が約８０％と高く、比活性は９０倍程度にも上昇した。したがって、この方法の方がアセトン粉末から抽出するよりも酵素の回収量が格段に高いことが明らかになった。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２１】
実施例
酵素の精製
可溶化された酵素をイオン交換クロマトグラフィーで精製することを試みた。酵素抽出液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ  ７．０）に透析した後に、ＣＭ−およびＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーに供したところ、酵素活性はＣＭ−セルロースカラムには吸着されなかったが、ＤＥＡＥ−セルロースには吸着されたので、ＮａＣｌの濃度勾配により活性を抽出した。
図３〔筋原繊維画分を酸処理して可溶化抽出された活性画分をＤＥ５２カラム（径２ｃｍ×１８ｃｍ）に供し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）中でＮａＣｌの濃度勾配で溶出した結果を示した図面である。〕に結果を示した。
酵素活性はＮａＣｌ濃度がおよそ０．３５Ｍの画分に抽出された。この活性画分を集めて、ゲルろ過に供した。上述したようにＳｅｐｈａｄｅｘカラムからは酵素活性が回収されないので、ここではＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００のカラムを使用することにした。
結果を図４〔図３で得られた活性画分を濃縮してＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００カラム（２．６ｃｍ×４５ｃｍ）に供し、０．１ＭＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）で溶出し、５ｍｌを分取した。その結果を示した図面である。〕に示した。
活性は画分２２に回収された。この活性ピークを酵素標品として使用することとした。なお、興味深いことに、溶出画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸収値で測定したところ、活性画分は吸収を示さないことがわかった。そこで図４はタンパク質量を２３０ｎｍの吸収値として示してある。
【００２２】
酵素の性状
１）酵素反応の活性化剤
筋肉ホモジネート（筋原繊維）中の本酵素は活性発現にアスコルビン酸、Ｆｅ２＋およびシステインを必要とした。この点について、可溶化した酵素を調べ、結果を表２に示した。
この結果によると、可溶化酵素の反応系ではアスコルビン酸が全く不必要であることが示されている。しかし、Ｆｅ２＋およびシステインは必要である。この相違の原因は現時点ではわからない。この結果から、可溶化、精製酵素を用いた反応系では活性化剤としてＦｅ２＋とシステインのみを使用した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
２）酵素反応の生成物
本酵素反応の生成物は等モルのジメチルアミンとホルムアルデヒドである。しかし、筋肉ホモジネート（筋原繊維）中での反応では生成したホルムアルデヒドの一部は筋肉タンパク質に結合してしまうので、化学量論的な量は定量できない。可溶化、生成した酵素で基質トリメチルアミン−Ｎ−オキシドからのジメチルアミンとホルムアルデヒドの生成量を調べたところ、反応時間が２時間以内であると、両者の生成量は等モルであることが確認された。反応時間がこれよりも長くなるとジメチルアミンの定量値が少し低くなった。
【００２５】
３）酵素の安定性
（ａ）加熱安定性
酵素溶液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ７．０）を温度に変えて一定時間（３０分間）加熱した後、残存活性を測定した（図５、ＴＭＡＯａｓｅの熱安定性。各温度で３０分間過熱後、残存活性を測定した。）。この結果は非常に特異的であった。４０℃付近の加熱では一旦活性が低下したが、それよりも高温の加熱ではむしろ活性は高くなることが示された。１００℃で１分間の加熱でも失活しなかった（加熱前の活性と同性（●）をここに再掲載したが、この場合は５０℃以上で失活しており、今回の結果とは異なった。多量に混在する筋原繊維タンパク質の熱変性凝集によって活性が隠蔽され、見かけ上失活したものと推測される。
（ｂ）氷蔵および凍結貯蔵中の安定性
酵素溶液と氷蔵および−２０℃で貯蔵した〔図６、氷蔵と凍結貯蔵中の酵素の安定性。抽出可溶化した酵素溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０）を貯蔵した。（ａ）、氷蔵；（ｂ）−２０℃での凍結貯蔵。〕。氷蔵１５日まで、凍結貯蔵２カ月間での範囲では活性の低下はほとんどなかった。
【００２６】
４）酵素の分子量
Ｓｈｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００によるゲルろ過によって分子量を推定した。結果を図７に示した。標準タンパク質の分子量との比較によれば、分子量はおよそ４０万と見積もられた。
ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥによって分子量を求めるために、３％のアクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥをおこない、常法によりコマジー染色した。しかし、タンパク質バンドの検出はできなかった。上述したように、酵素はドデシル硫酸ナトリウムに対して安定であることを認めたので、ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ後の未染色ゲルを５ｍｍ幅で切り出し、緩衝液で抽出した後、酵素活性をホルムアルデヒドの生成量から測定した。
結果を図８〔抽出可溶化された酵素のドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ。ゲルろ過で精製した酵素を３％ポリアクリルアミドゲルでドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥに供した後、コマジー染色を行ったが、染色バンドは検出されなかった。そこで、ゲルの上端（一極）から、５ｍｍずつの小片を切り出し、２０ｍＭイミダソールーＨＣｌ（ｐＨ７．０）で抽出し、ＴＭＡＯａｓｅ活性をホルムアルデヒト（ＦＡ）生成量で測定した。〕に示した。
この結果によると活性はゲルの最上端部５ｍｍ内にあることが明らかとなった。しかもコマジーでは染色されなかった。もし、分子量が４０万であるなら、上端から３番目のゲル片に活性が検出されるはずであるから、ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥではそれよりも分子量が大きいことを示しているが、通常のタンパク質と異なって、例えば、塩基性アミノ酸含量が高いヒストン様のタンパク質や、電荷に無関係な糖などを多量に含むタンパク質の様にドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥでの移動度が異常に小さいタンパク質の可能性がある。
【００２７】
５）キモトリプシン消化
ＴＭＡＯａｓｅタンパク質とキモトリプシンとを７０：１（Ｗ／Ｗ）に混合して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中で３０℃で６０分間まで消化した。消化中のＴＭＡＯａｓｅの活性変化を調べた（図９、抽出可溶化された酵素のキモトリプシン消化
キモトリプシン消化した後、残存するＴＭＡＯａｓｅの活性を測定した。）。
この結果によると消化中の活性の低下は起きないことがわかった。むしろ、活性は次第に増大することが認められた。また、キモトリプシン消化を６０分間おこなった後、ゲルろ過に供したが、活性の溶出位置は変化していなかった。これらの結果から、本酵素はキモトリプシン消化に抵抗性があることがわかった。この結果および２８０ｎｍの吸収が無いことから、本酵素は芳香族のアミノ酸を含まない可能性が高い。キモトリプシン消化で活性が増大する原因は不明である。
【００２８】
本酵素は熱に対して安定であるだけでなく、凍結やドデシル硫酸ナトリウムに対しても安定であること、コマシーで染色されないこと（したがってＢｒａｄｆｏｒｄの方法ではタンパク質は定量できなかった）ゲルろ過で分子量が４０万と大きいが、ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥではさらに大きい可能性が示された。さらに、キモトリプシンで消化されないことから、単純タンパク質では無いと推定される。界面活性剤で抽出されないことから、本酵素はリポタンパク質よりは糖タンパク質の可能性が考えられる。
【００２９】
【発明の効果】
単離したＴＭＡＯａｓｅを提供することができる。単離したＴＭＡＯａｓｅを用いて水産物の変性防止に機能するそのインヒビターの探索のために役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アセトン粉末中の全活性を１００％とし、スケトウダラ筋原繊維のアセトン粉末からのＴＭＡＯａｓｅ活性の抽出結果を示した図面である。
【図２】ＴＭＡＯａｓｅの抽出可溶化と精製の概略を示した図面である。
【図３】ＴＭＡＯａｓｅのＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーによる精製を示した図面である。
【図４】ＴＭＡＯａｓｅのゲルろ過による精製を示した図面である。
【図５】酵素溶液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ７．０）を温度を変えて各温度で一定時間（３０分間）加熱後、残存活性を測定した結果を示した図面である。
【図６】  （ａ）抽出可溶化した酵素溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０）を氷蔵で貯蔵し、酵素の安定性を測定し、その結果を示した図面である。（ｂ）抽出可溶化した酵素溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０）を−２０℃で凍結貯蔵し、酵素の安定性を測定し、その結果を示した図面である。
【図７】ゲルろ過によってＴＭＡＯａｓｅの分子量を測定した結果を示した図面である。
【図８】ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ後の未染色ゲルを５ｍｍ幅で切り出し、緩衝液で抽出した後、酵素活性をホルムアルデヒドの生成量から測定し、その結果を示した図面である。
【図９】消化中のＴＭＡＯａｓｅの活性変化を測定し、その結果を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004068719.tif 000010
【図８】
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【図９】
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