(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウムを含む試料とルモガリオンを含むキレート試薬との反応混合液のｐＨを７〜９の範囲とし、該反応混合液に含まれるアルミニウムキレートを蛍光検出器で検出するアルミニウム測定方法。
【請求項２】
アルミニウムを含む試料とルモガリオンを含むキレート試薬との反応混合液のｐＨを７〜９の範囲とし、液体クロマトグラフィーにより該反応混合液からアルミニウムキレートを分離し、該アルミニウムキレートを蛍光検出器で検出するアルミニウム測定方法。
【請求項３】
前記液体クロマトグラフィーは、移動相の有機溶媒の濃度が５％以下であることを特徴とする請求項２に記載のアルミニウム測定方法。
【請求項４】
前記反応混合液中に、２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸(EPPS)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(CHES)、３−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)のいずれかの緩衝液調製用試薬を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のアルミニウム測定方法。
【請求項５】
前記反応混合液が、試料を１０倍以上に希釈したものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のアルミニウム測定方法。
【請求項６】
前記試料が、薬剤であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のアルミニウム測定方法。
【請求項７】
前記薬剤がビタミンＢ２を含むことを特徴とする請求項６に記載のアルミニウム測定方法。
【請求項８】
前記薬剤が脂肪乳剤を含むことを特徴とする請求項６に記載のアルミニウム測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のアルミニウム含量をクロマトグラフィーを用いて測定するアルミニウム測定方法、およびその測定方法に用いるキレート試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品中のアルミニウムの測定は、これまで主にフレームレス原子吸光法や、ICP-AES(inductively coupled plasma-auger electron spectroscopy)、ICP-MS(inductively coupled plasma-mass spectroscopy)で測定されてきた。米国では１０年以上前から、注射剤中のアルミニウムの測定が試みられているが、その多くはフレームレス原子吸光法によるものである。薬剤、特に注射剤については、米国および日本で、アルミニウム含量の規制が行われることになるため、薬剤中のアルミニウム含量の測定は重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
フレームレス原子吸光法やICP-AES、ICP-MS法は、本来、純粋な試料に対しては高感度（ppbからpptレベル）なアルミニウムの測定が可能である。しかしながら、注射剤のような複雑なマトリックス中の微量アルミニウムの測定は難しく、前処理操作が必要となり、また、感度や再現性は著しく低下する。（S.Nomoto et al., Biomed. Res. Trace Elements, Vol.8, 245(1997))
【０００４】
また、フレームレス原子吸光法や、ICP-AES、ICP-MS法は、換気装置やガスの配管等が必要であるため、小規模な品質管理施設において設置・運用することは非常に難しい。さらに、フレームレス原子吸光法や、ICP-AES、ICP-MS法は、ガス、原子化炉、プラズマ等を用いるため、品質管理部門で大変重要である夜間の無人運転ができない。（日本分析化学会第５０年会要旨集１３３頁「蛍光HPLC法を用いる注射剤中のアルミニウムの測定」）
【０００５】
また、アルミニウムの測定方法として、フレームレス原子吸光法や、ICP-AES、ICP-MS法以外に、HPLC(high performance liquid chromatography)法が知られており、血清や尿などの生体成分中のアルミニウム含量の測定方法や海水中のアルミニウム含量の測定方法が報告されている。HPLCによるアルミニウムの測定方法は、アルミニウムをキレート試薬と反応させてアルミニウムキレートとし、そのアルミニウムキレートを分離検出する方法である。キレート試薬としては、DHAB(2,2'-dihydroxyazobenzene)(E.Kaneko et al., Analytical Chemistry 63(1991) 2219-2222)、ルモガリオン(Y.Suzuki et al., Analyst 114(1989) 839-842, J.Wu et al., Journal of Chromatography B 663(1995) 247-253)、および８−キノリノール(M.Sato et al., Journal of Chromatography A 789(1997) 361-367)が報告されている。
【０００６】
しかし、これまでに報告されているルモガリオンをキレート試薬として用いる方法は、アルミニウムキレートの合成反応を、そのアルミニウムキレートの蛍光感度が高いｐＨ４〜５の弱酸性液中で行っている（西川ら、分析化学、 Vol.16, 692-697(1967)）。そのため、十分な時間（２０分程度）をかけて反応を行うか、キレート化反応の速度を速くするために７０℃程度に加熱する必要があることから、品質管理用の測定方法としては、操作が煩雑すぎるという問題がある。また、これまでに報告されているDHABをキレート試薬として用いる方法は、以下のような問題点がある。すなわち、キレート化反応は７０度程度に加熱し、且つ２０分程度の反応時間が必要であること、吸光法なので感度と選択性が低いこと、アルミニウムのピークの近傍に鉄のピークが存在するので多量の鉄が存在する場合にはアルミニウムの測定が妨害されること、デフェロキサミン（ＤＦＯ）等の妨害物質の影響を回避できないこと等の問題がある。そのため、現在、クロマトグラフィー法によるアルミニウム検出用としてキット化されて発売されているものは、８−キノリノールをキレート試薬として用いるもの（（株）同仁化学研究所：熊本）だけであり、ルモガリオンおよびDHABをキレート試薬とするアルミニウム検出キットは発売されていない。なお、上記８−キノリノールをキレート試薬とするアルミニウム検出キットには、キレート試薬、キレート形成液（緩衝液）、溶離液が含まれている。
【０００７】
また、８−キノリノールをキレート試薬とするアルミニウム検出キットを用いて、注射剤等の薬剤中のアルミニウムの測定が試みられているが、測定が困難な注射剤もある。たとえば、ビタミンＢ2製剤中のアルミニウム含量を測定しようとすると、ビタミンＢ2の蛍光波長とアルミニウムキレートの蛍光波長とがほぼ同じであるために信号の分離ができず、測定ができない。また、脂肪乳剤中のアルミニウム含量を測定する場合にも、アルミニウムキレート由来の信号をマトリックス由来の信号から分離することができず、測定ができない。
【０００８】
さらに、マトリックスに由来する信号を軽減し、かつ、外部から混入するアルミニウムの影響を少なくするには、測定試料の希釈や反応混合液の希釈をすることが必要となるが、８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウムの測定方法では、蛍光感度が不十分なために希釈が困難であった。
【０００９】
また、８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウムの測定方法では、溶離液（移動相）が１５％以上の高濃度の有機溶媒を含むことから、測定終了後の廃液が危険物であるので、廃液処理費用が高額となるという問題もある。
【００１０】
本発明は以上の事情を背景として為されたもので、その目的とするところは、迅速且つ高感度に試料中のアルミニウム含量を測定することができるアルミニウム測定方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための第１発明は、アルミニウムを含む試料とルモガリオンを含むキレート試薬との反応混合液のｐＨを７〜９の範囲とし、その反応混合液に含まれるアルミニウムキレートを蛍光検出器で検出するアルミニウム測定方法である。
【００１２】
また、上記目的を達成するための第２発明は、アルミニウムを含む試料とルモガリオンを含むキレート試薬との反応混合液のｐＨを７〜９の範囲とし、液体クロマトグラフィーによりその反応混合液からアルミニウムキレートを分離し、そのアルミニウムキレートを蛍光検出器で検出するアルミニウム測定方法である。
【００１３】
また、上記目的を達成するための第３発明は、第２発明において、前記液体クロマトグラフィーは、移動相の有機溶媒の濃度が５％以下であることを特徴とするものである。
【００１４】
また、上記目的を達成するための第４発明は、第１〜３発明のいずれかの発明において、前記反応混合液中に、２−モルホリノエタンスルホン酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid、以下、MESという）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)、以下、PIPESという）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（2-〔4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl〕 ethanesulfonic acid、以下、HEPESという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid、以下、TESという）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（3-〔4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl〕 propanesulfonic aicid、以下、EPPSという）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid、以下、CHESという)、３−モルホリノプロパンスルホン酸（3-Morpholinopropsnesulfonic acid、以下、MOPSという）のいずれかの緩衝液調製用試薬を含むことを特徴とするものである。
【００１５】
また、上記目的を達成するための第５発明は、第１〜４発明のいずれかの発明において、前記反応混合液が、試料を１０倍以上に希釈したものであることを特徴とするものである。
【００１６】
また、上記目的を達成するための第６発明は、第１〜５発明のいずれかの発明において、前記試料が薬剤であることを特徴とするものである。
【００１７】
また、上記目的を達成するための第７発明は、第６発明において、薬剤がビタミンＢ2を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
また、上記目的を達成するための第８発明は、第６発明において、薬剤が脂肪乳剤を含むことを特徴とするものである。
【００１９】
【発明の効果】
第１発明によれば、ルモガリオンを含むキレート試薬を用い、ルモガリオンとアルミニウムとのキレートを蛍光検出器で検出することから、高感度に試料中のアルミニウム含量を測定することができる。また、キレート形成反応をｐＨを７〜９の範囲とした液中で行うことから、室温（２５℃）でも十分に反応速度が速くなるので、２分程度の反応時間にてキレート形成反応が完了する。そのため、品質管理などのルーチン測定方法として利用することが可能である。
【００２０】
上記第１発明のアルミニウム測定方法は、バッチ式の測定あるいはフローインジェクション法を用いて、反応混合液を分離せずにアルミニウムキレートを蛍光検出器で検出することも可能であるが、測定試料によっては、ルモガリオンとアルミニウムとのキレート以外に蛍光検出器で検出される成分を含むことがある。これについて、第２発明によれば、アルミニウムを含む試料とルモガリオンを含むキレート試薬との反応混合液のｐＨを７〜９の範囲とし、液体クロマトグラフィーにより該反応混合液からルモガリオンとアルミニウムとのキレートを液体クロマトグラフィーにより分離した後に、そのキレートを蛍光検出器で検出するので、試料中のアルミニウム含量をより正確に測定することができる。
【００２１】
また、第２発明のアルミニウム測定方法の液体クロマトグラフィーは、第３発明のように、移動相の有機溶媒の濃度が５％以下の溶媒を移動相として用いた逆送液体クロマトグラフィーとすることができる。このようにすれば、有機溶媒の排出量が軽減できるので、廃液処理のコストが低減でき、環境へ与える影響も少なくなる。
【００２２】
また、前記反応混合液はキレート化反応を一定のｐＨで行わせるために緩衝液が加えられることが多く、この緩衝剤には一般的に製造工程に起因するアルミニウムの汚染が認められるが、第４発明のように、緩衝液調製試薬としてMES、PIPES、HEPES、TES、EPPS、CHES、MOPSのいずれかを用いると、ブランク値が低下するので、より高感度にアルミニウム含量を測定することができる。
【００２３】
また、第１発明のアルミニウム測定方法は検出感度が高感度であることから、第５発明のように、試料を１０倍以上に希釈してもアルミニウムキレートを検出することができる。そのように試料を１０倍以上に希釈すれば、マトリックスの影響を軽減させることができるので、さらに高感度にアルミニウム含量を測定することができる。
【００２４】
また、第１発明は、薬剤中のアルミニウム含量を測定することもできる（第６発明）。ルモガリオンとアルミニウムとが反応して生成するアルミニウムキレートは蛍光波長が５７４nmであり、この波長はビタミンＢ2の蛍光波長と異なることから、アルミニウムキレートの信号とビタミンＢ2の信号とが完全に分離できる。従って、第１発明は、ビタミンＢ2と励起波長および蛍光波長がほぼ同じである８−キノリノールをキレート試薬として用いるアルミニウム測定方法では困難であったビタミンＢ2を含む薬剤中のアルミニウム含量の測定にも適用することができる（第７発明）。また、上記アルミニウムキレートの蛍光波長は、脂肪乳剤のマトリックス成分の蛍光波長とも異なるので、第１発明は、脂肪乳剤を含む薬剤中のアルミニウム含量の測定にも適用することができる（第８発明）。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明を実施するために用いる高速液体クロマトグラフ装置（以下、HPLCという）１０の一般的な構成を説明するブロック図である。
【００２６】
図１において、溶媒槽１２に予め蓄えられた移動相溶媒（溶離液）は、ポンプ１４により、所定の速度、たとえば１．０mL/min程度で、カラム１６に導入される。
【００２７】
移動相溶媒は、緩衝液、或いは緩衝液と有機溶媒との混合液など、ルモガリオン−アルミニウムキレートの保持、溶出に適した溶媒であればよい。たとえば、後述する試薬３、すなわち、２−プロパノール  25 W/V%、0.1 mol/L  酢酸緩衝液(pH4.6)を用いることができるが、２−プロパノールの濃度は25W/V%に限定されず、それ以下であっても、それ以上であってもよい。また、２−プロパノールに代えて他の有機溶媒が用いられてもよいし、それら有機溶媒が全く加えられなくてもよい。また、緩衝液のｐＨや緩衝液調製試薬も、ルモガリオン−アルミニウムキレートの保持、溶出に適したものであれば、種々の変更が可能である。
【００２８】
注入部１８では、図示しない注射器により、試料とキレート試薬とを反応させて調製された反応混合液が、カラム１６に注入される。なお、この反応混合液の調製は機械により自動的に行われるようになっていてもよい。カラム１６は、たとえばステンレス管であり、たとえば内径4.6mm×長さ150mmとされている。注入部１８から注入された反応混合液は、カラム１６により分離されて、蛍光検出器２０へ導入される。蛍光検出器２０で検出された結果は記録装置２２に記録される。
【００２９】
試料は特に限定されず、例えば、薬剤医薬品の原料、薬剤、植物組織、動物組織、健康食品の原料、健康食品、飲料水の原料、飲料水、化粧品の原料、化粧品、お茶、酒類、水道水、環境水、海水、湖水、河川水、工業廃水、工業用水、研究用試薬、工業原料、抗体、各抗原によりなるワクチン、血清、尿、血漿、血液、人や動物の体液（精液、汗、涙、腹水、羊水など）などを用いることができる。また、薬剤には、循環器系の薬（たとえば、強心薬、抗狭心症薬、抗不整脈薬、利尿薬、降圧薬、血管拡張薬、昇圧薬など）、消化器系の薬（たとえば、健胃・消化薬、消化性潰瘍薬、下剤、止痢・整腸薬、利胆薬など）、呼吸器系の薬（呼吸促進薬、気管支拡張薬、去痰薬、鎮痰薬など）、血液系の薬（造血剤、止血剤、抗血栓剤など）、神経科系の薬（睡眠・鎮静薬、鎮痛薬、抗てんかん薬、抗脳循環障害薬、パーキンソン病治療薬、筋弛緩薬、制吐・抗めまい薬など）、精神科系の薬（抗精神剤、抗不安薬、抗うつ薬、自律神経作用薬など）、内分泌・代謝系の薬（インスリン製剤、経口血糖降圧剤、食後過血糖改善薬などの糖尿病薬、高脂血症薬、痛風・高尿酸血症薬、骨・カルシウム代謝薬、甲状腺モルモン剤、女性ホルモン剤、男性ホルモン剤、その他ホルモン剤など）、炎症・アレルギー用薬・免疫抑制薬（副腎皮質ステロイド薬、非ステロイド性抗炎症薬、消炎酵素薬、抗リウマチ薬、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、免疫抑制薬など）、抗癌剤（アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、生体応答調節物質(BRM)など）、病原微生物用の薬（抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫・原虫薬など）、漢方薬、注射剤、輸液、透析液、抗生物質、血液製剤などが含まれる。輸液には、糖質輸液剤、アミノ酸製剤、デキストラン輸液剤、脂肪乳剤、蛋白アミノ酸配合剤、電解質輸液剤、高カロリー輸液剤、補正用電解質製剤、ヘパリン製等が含まれ、透析液には、腹膜透析液、人工腎臓透析液等が含まれ、、造血剤には、注射用鉄剤、、ビタミンＢ2製剤、ビタミンＢ12製剤、葉酸、ビタミンＢ6、エリスロポエチン製剤、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）製剤等が含まれ、抗生物質には、ペニシリン系、セフェム系、モノバクタム系、カルバペネム系、アミノグリコシド系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ピリドンカルボン酸系、ペプチド系の各製剤が含まれ、抗ウイルス剤には、抗ヘルペス薬、抗サイトメガロウイルス薬、抗ＨＩＶ薬、抗インフルエンザ薬等が含まれ、血液製剤には各分画製剤が含まれる。
【００３０】
なお、試料の形態は、液体であることが好ましいが、液体でない場合には、可溶化処理又は抽出処理などにより液体試料とする。
【００３１】
【実施例１】
検量線の作成
[試薬および試料の調製]
試薬は以下のようにして調製した。
キレート試薬（試薬１）の調製
ルモガリオン（分析用キレート試薬）[（株）同仁化学研究所]、塩酸（超高純度）[関東化学（株）]、および超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、ルモガリオン  1m mol/L、塩酸  1mol/Lの溶液を調製した。ここで、超高純度試薬とは、アルミニウムや他の微量元素に関してppt以下のレベルが保証された試薬である。また、塩酸を添加するのは、キレート試薬と試料の混合液を酸性にすることによって、測定試料中に含まれるアルミニウムを一旦イオン化するためである。従って、塩酸に代えて硝酸等の他の酸を用いることもでき、測定試料に前もって酸を加える場合には、中性のキレート試薬を用いることもできる。また、キレート試薬中には有機溶媒を添加しても良い。
緩衝液（試薬２）の調製
MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)（分析用試薬）[（株）同仁化学研究所]、水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、0.5 mol/L MES緩衝液(pH7.0)を調製した。
溶離液（試薬３）の調製
２−プロパノール（HPLCグレード）[関東化学（株）]、酢酸ナトリウム（特級試薬）[和光純薬工業（株）]、塩酸（超高純度）[関東化学（株）]、および超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、２−プロパノール  25 W/V%、0.1 mol/L  酢酸緩衝液(pH4.6)を調製した。
検量線作成用試料の調製
原子吸光用のアルミニウム標準液（分析用）を超高純度硝酸（超高純度）[関東化学（株）]と超純水（超高純度）[関東化学（株）]から調製した0.1mol/Lの硝酸溶液で体積比１：９の比率で希釈して、０，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０μg/Lのアルミニウム濃度になるように調製した。
[アルミニウム濃度の測定]
キレート試薬（試薬１）50μを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに検量線作成用試料300μLを添加して速やかに攪拌、混合する。次に緩衝液（試薬２）600μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合する。試薬２を添加することにより反応混合液が中性となるので、アルミニウムイオンとルモガリオンとが迅速に反応して、迅速にアルミニウムキレートが形成される。そして、５分間、室温（２５℃）に静置した後、この反応混合液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。この方法で、各検量線作成用試料を２回ずつ測定した。また、アルミニウム濃度が０，５，１０μg/Lの各試料については、再現性確認のため、５回ずつ測定した。
[HPLCの測定条件]
流速  1.0 mL/min
カラム  Develosil LAL 4.6mm i.d.×150mm（野村化学株式会社）
カラム温度  ４０℃
波長  Ex.（励起波長）=505 nm, Em.（検出波長）=574nm
[測定結果]
図２に示すように、少なくとも０−５０μg/Lの間で定量性が確認された。また、図３に示すように、再現性も良好であった。なお、図３において、ＣＶ値(=coefficient of variation) とは、標準偏差σを平均値で割ることにより算出される値である。
【００３２】
【実施例２】
輸液中のアルミニウム含量の測定
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。また、測定試料には、高カロリー輸液用維持液ユニカリックＮ（ブドウ糖17.5%、アミノ酸3.0%、Ｌ−乳酸ナトリウム0.4%）[テルモ（株）]）、キシリトール含有総合アミノ酸注射液テルアミノ１２Ｘ（キシリトール５％  [テルモ（株）]）を、それぞれそのまま用いた。なお、「ユニカリック」「テルアミノ」はテルモ（株）の登録商標である。
また、キャリブレーター（内標準試料）として、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031, JAC0032)をそのまま用いた。これらは、ICP-AES, ICP-MS, GF-AAS(graphite furnace-atomic absorption spectrometry)および蛍光法にてアルミニウムの濃度の認証値を付けた標準物質であり、JAC0031はアルミニウムを13.4±0.7μg/L含み、JAC0032はアルミニウムを61±2μg/L含むものとして認証されている。
[アルミニウム濃度の測定]
（１）本発明によるアルミニウム濃度の測定
キレート試薬（試薬１）50μLを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに測定試料300μLを添加して速やかに攪拌、混合した。次に緩衝液（試薬２）600μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合した。５分間、室温（２５℃）に静置した後、この反応混合液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。この方法で各測定試料を連続３回測定した。
(２)８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウム濃度の測定
参照値を得るために、８−キノリノールをキレート試薬とする前記アルミニウム測定キット（（株）同仁化学研究所：熊本）を推奨方法に従って用いた。すなわち、８−キノリノールと塩酸とを含むキレート試薬液50μLを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに測定試料150μLを添加して速やかに攪拌、混合する。次にｐＨ７．５に調製された緩衝液400μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合する。１０分間、室温（２５℃）に静置した後、この反応混合液を200μL採取して、HPLC１０の注入部１８に注入して測定した。なお、溶離液は、界面活性剤を含むｐＨ７．０の溶液であるる。
[HPLCの測定条件]
（１）本発明によるアルミニウム濃度の測定
流速  1.0 mL/min
カラム  Develosil LAL 4.6mm i.d.×150mm（野村化学株式会社）
カラム温度  ４０℃
波長  Ex.=505 nm, Em.=574nm
(２)８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウム濃度の測定
流速  1.0 mL/min
カラム  アルミニウム分析専用カラム 4.6mm i.d.×50mm（（株）シノテスト）
カラム温度  ２５℃
波長  Ex.=370 nm, Em.=504nm
[測定結果]
図４に示すように、本発明の方法によって測定した高カロリー輸液用維持液、キシリトール含有総合アミノ酸注射液に関してアルミニウムキレートのピークの近傍には妨害ピークは認められなかった。また、表１に示すように、測定値は、８−キノリノールをキレート試薬として用いて測定した参照値と一致した。
0004102062.tif 000002
【００３３】
【実施例３】
８キノリノールをキレート試薬として用いた測定方法と本発明との感度比較
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。また、測定試料には、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031)をそのまま用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
本発明によるアルミニウム濃度の測定は、実施例２と同様の方法で測定した。８−キノリノールをキレート試薬として用いた測定も、実施例２と同様の方法で測定した。
[測定結果]
表２の差に示すように、本発明では、８−キノリノールを用いた測定の約５倍の感度が得られた。また、注入液中に含まれる測定試料量は、表３に示すように、８−キノリノールを用いた測定の方が約８倍多い。このことから、本発明は８−キノリノールを用いた測定の約４０倍の感度があると推定できる。４０倍の感度があることにより、８−キノリノールを用いた測定における希釈倍率よりも３０倍以上の希釈が可能となるので、外部から混入するアルミニウムの影響を少なくすることが可能である。
0004102062.tif 000003
0004102062.tif 000004
【００３４】
【実施例４】
反応速度と反応pHの関係
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，３を用いた。また、測定試料には、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031)をそのまま用いた。
キレート化反応に用いる緩衝液は、pH4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0の各緩衝液を以下の方法で調製した。
pH4.0の緩衝液、pH5.0の緩衝液
酢酸ナトリウム（特級試薬）[和光純薬工業（株）]、水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、0.5 mol/L酢酸  pH4.0の緩衝液、および0.5 mol/L酢酸  pH5.0の緩衝液を調製した。
pH6.0の緩衝液、pH6.5の緩衝液、pH7.0の緩衝液
MES（分析用試薬）[（株）同仁化学研究所]、水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、0.5 mol/L MES pH6.0の緩衝液、0.5 mol/L MES pH6.5の緩衝液、および0.5 mol/L MES pH7.0の緩衝液を調製した。
pH8.0の緩衝液
BES(Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)）（分析用試薬）[（株）同仁化学研究所]、水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、0.5 mol/L BES pH8.0の緩衝液を調製した。
pH9.0の緩衝液
CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid)（分析用試薬）[（株）同仁化学研究所]、水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、0.5 mol/L CHES pH9.0の緩衝液を調製した。[アルミニウム濃度の測定]
キレート試薬（試薬１）50μを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに測定試料300μLを添加して速やかに攪拌、混合した。次に上記pH4.0〜9.0のいずれかの緩衝液600μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合した。５分間、室温（２５℃）に静置した後、この反応混合液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。なお、HPLCの測定条件は実施例２と同じである。また、ブランク値を測定するために、キレート試薬（試薬１）50μを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに上記pH4.0〜9.0のいずれかの緩衝液600μLを加えて速やかに攪拌、混合し、５分間、室温（２５℃）に静置した後、この混合液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。
[測定結果]
図５に示すように、pH4.0の緩衝液を用いた場合には、アルミニウムキレートの信号は全く検出できなかった。pH5.0の緩衝液を用いた場合には、アルミニウムキレートの信号は検出できるが、信号強度が弱いことからキレート化反応は終了していないと考えられる。pH6.0以上のpHの緩衝液では、ブランク値と測定試料を用いた場合の信号強度の差が測定試料中のアルミニウム濃度であると考えると、測定試料中のアルミニウム由来の信号強度はほぼ同じであるといえる。
【００３５】
【実施例５】
ビタミンＢ2を含有する製剤について、８−キノリノールをキレート試薬として用いる方法と本発明の方法との比較
[試薬の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。
[測定試料の調製]
ビタミンＢ2を300mg/L含有するK.C.L.注射液（１号）（塩化カリウム１５W/V%[丸石製薬（株）]）をそのまま用いた。
キャリブレーターとしては、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031, JAC0032)をそのまま用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
本発明によるアルミニウム濃度の測定は、実施例２と同様の方法で行った。また、参照値を得るために、８−キノリノールをキレート試薬として用いる前記アルミニウム測定キットを推奨方法に従って用いた。なお、いずれの測定ともHPLCの測定条件は実施例２と同様である。
[測定結果]
図６(a)に示すように、本発明では、マトリックス由来のピークとアルミニウムキレート由来のピークが完全に分離できており、アルミニウム濃度の測定が可能である。これに対して、図６(b)に示すように、８−キノリノールをキレート試薬として用いた方法では、マトリックス由来のピークとアルミニウムキレート由来のピークとが分離されていないので、アルミニウム濃度の測定が困難である。
【００３６】
【実施例６】
脂肪乳剤について、８−キノリノールをキレート試薬として用いる方法と本発明の方法との比較
[試薬の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。
[測定試料の調製]
脂肪乳剤であるイントラファット（ダイズ油１０％）[日本製薬（株）]をそのまま用いた。なお、イントラファットは日本製薬（株）の登録商標である。
キャリブレーターとしては、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031, JAC0032)をそのまま用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
本発明によるアルミニウム濃度の測定は、実施例２と同様の方法で行った。また、参照値を得るために、８−キノリノールをキレート試薬とする前記アルミニウム測定キットを推奨方法に従って用いた。なお、いずれの測定ともHPLCの測定条件は実施例２と同様である。
[測定結果]
図７(a)に示すように、本発明では、マトリックス由来のピークがほとんど検出されないので、高感度にアルミニウム濃度を測定することが可能である。なお、このように、他の成分がほとんど検出されない場合には分離が不要なので、バッチ式の測定あるいはフローインジェクション法でもアルミニウム濃度を測定することができる。
一方、図７(b)に示すように、８−キノリノールをキレート試薬として用いた方法では、マトリックス由来のピークとアルミニウムキレート由来のピークとが分離されていないので、アルミニウム濃度の測定が困難である。
【００３７】
【実施例７】
希釈法によるビタミン剤のアルミニウム濃度の測定
[試薬の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。
[測定試料の調製]
ネオM.V.I-9（5mL中にリン酸リボフラビンナトリウム（ビタミンＢ2）をリボフラビンとして3.6mg含んでいる）[エスエス製薬（株）]をそのまま用いた。
キャリブレーターとしては、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031, JAC0032)をそのまま用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
（１）本発明によるアルミニウム濃度の測定
キレート試薬（試薬１）50μLを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに測定試料300μLを添加して速やかに攪拌、混合した。次に緩衝液（試薬２）600μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合した。この段階で測定試料は約３倍に希釈されているが、本実施例では、さらに、２分間、室温（２５℃）に静置した後、上記反応混合液に超純水を加えて9.5mLとすることにより、測定試料を約３０倍に希釈し、希釈後の液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。この方法で連続１０回測定した。また、比較のために、超純水にて希釈する前の反応混合液すなわち測定試料を約３倍に希釈した反応混合液も同様にして測定した。
（２）８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウム濃度の測定は、キット化されて発売されている８−キノリノールを用いた方法（（株）同仁化学研究所：熊本）の推奨方法に従って反応混合液を調製した。この段階で測定試料は４倍に希釈されているが、本実施例では、さらにその反応混合液を超純水で１０倍に希釈することにより測定試料を４０倍に希釈し、超純水で希釈する前の混合液（すなわち測定試料が４倍に希釈されたもの）および超純水で希釈した後の混合液（すなわち測定試料が４０倍に希釈されたもの）をそれぞれ200μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。
[HPLCの測定条件]
本発明によるアルミニウム濃度の測定および８−キノリノールをキレート試薬として用いたアルミニウム濃度の測定とも、実施例２と同じ測定条件である。
[測定結果]
本発明では、測定試料の希釈倍率が約３倍の混合液は、図８(a)に示すように、アルミニウムキレートの信号がマトリックス由来の信号と一部重なっているため、図８(a)のピーク面積から算出されるアルミニウム濃度は信頼性がそれほど高くない。しかし、本発明は、図８(b)に示すように、測定試料を約３０倍に希釈してもアルミニウムキレートのピークの検出が十分に可能であることから、測定試料を約３０倍に希釈しても測定試料中にppbレベルで含まれるアルミニウムの濃度を測定することができる。（従って、１０倍程度のより低い希釈倍率でも当然にアルミニウム濃度の測定が可能である。）しかも、約３０倍に希釈することにより、アルミニウムキレートの信号が他の信号から十分に分離されるので、正確にアルミニウム濃度の測定をすることができる。なお、図８(b)の信号強度から求めたアルミニウム濃度は2.1ppbであった。
一方、図８(c)は、８−キノリノールをキレート試薬として用いる方法であって、測定試料が４０倍に希釈されている混合液のクロマトグラムであるが、アルミニウムキレートのピークはマトッリクス由来のピークに隠れてしまい全く観測できない。前述の実施例５から、アルミニウムキレートは５分前後に存在するはずであるので、アルミニウムキレートのピークを観測するには、さらに希釈してマトリックス成分の量を減少させる必要がある。しかし、実施例３（感度比較の実施例）で示したように、８−キノリノールをキレート試薬として用いる方法は、本発明よりも感度が悪いので、これ以上の希釈は困難である。従って、８−キノリノールをキレート試薬として用いる方法では、ネオM.V.I-9中のアルミニウム濃度を測定することはできない。
【００３８】
【実施例８】
反応時間の比較
キレート化反応に必要な時間を確認するための実験を以下のようにして行った。
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、緩衝液、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，２，３を用いた。また、測定試料には、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031)をそのまま用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
キレート試薬（試薬１）50μLを1.5mLサンプルバイアルに取り、そこに測定試料300μLを添加して速やかに攪拌、混合した。次に緩衝液（試薬２）600μLを加えて再度、速やかに攪拌、混合した。２分間または２４０分間、室温（２５℃）に静置した後、この反応混合液を20μL採取してHPLC１０の注入部１８に注入して測定した。
[HPLCの測定条件]
流速  1.0 mL/min
カラム  Develosil LAL 4.6mm i.d.×150mm（野村化学株式会社）
カラム温度  ４０℃
波長  Ex.（励起波長）=505 nm, Em.（検出波長）=574nm
[測定結果]
表４に測定結果を示す。表４に示すように、保持時間、ピーク面積値、ピーク高さとも、ほぼ同様の結果が得られたことから、２分間でキレート化反応は完了しているといえる。従って、本発明では、キレート化反応の反応時間が２分以上であればよい。
0004102062.tif 000005
【００３９】
【実施例９】
緩衝液（試薬２）の種類の検討
緩衝液（試薬２）の種類を検討するために、以下の実験を行った。
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、溶離液は、実施例１と同じ試薬１，３を用いた。測定試料には、測定試料には、（社）日本分析化学会が発売している河川水標準物質(JAC0031)をそのまま用いた。
緩衝液には、以下の各緩衝液調製用試薬、および水酸化ナトリウム（超高純度）[関東化学（株）]、超純水（超高純度）[関東化学（株）]を用いて、各緩衝液調製用試薬の濃度が0.5 mol/LのpH7.0の緩衝液をそれぞれ調製した。
緩衝液調製用試薬
MES、MOPS、BES、PIPES、HEPES、TES、HEPPSO（２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）〕プロパンスルホン酸 (2-Hydroxy-3-〔4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl〕propanesulfonic acid, monohydrate)）、EPPS、MOPSO（２−ヒドロキシ３−モルホリノプロパンスルホン酸(2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid)）、Bis-Tris（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)）、ACES（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid)）、ADA（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ２酢酸(N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid)）、CHES、リン酸カリウム
なお、緩衝液調製用試薬は、リン酸カリウムは和光純薬工業（株）製、それ以外は、（株）同仁化学研究所製である。
[アルミニウム濃度の測定およびHPLCの測定条件]
アルミニウム濃度の測定は、測定試料を加えていないこと以外は、実施例１と同じである。従って、この測定によって得られる測定値はブランク値を意味する。また、HPLCの測定条件も実施例１と同じである。
[測定結果]
測定結果を表５に示す。表５に示すように、MES、MOPS、PIPES、HEPES、TES、EPPS、CHESを緩衝液調製用試薬として用いた場合には、測定値すなわちブランク値が小さい値となるので、これらの緩衝液を用いると信頼性のあるアルミニウム濃度の測定ができる。
0004102062.tif 000006
【００４０】
【実施例１０】
有機溶媒の濃度が５％以下の移動相溶媒を用いたHPLCへの適用
[試薬および試料の調製]
キレート試薬、緩衝液は、実施例１と同じ試薬１、２を用いた。溶離液（移動相溶媒）は、２−プロパノールが含まれていない以外は試薬３と同じものを調製した。すなわち、0.1 mol/L  酢酸緩衝液(pH4.6)を調製した。
測定試料には、グルコース（和光純薬工業（株））を超純水で30 w/v%に希釈調製したものを用いた。
[アルミニウム濃度の測定]
実施例１と同じ方法で測定した。
[HPLCの測定条件]
流速  0.5 mL/min
カラム  Develosil NPS 4.0mm i.d.×10mm（野村化学株式会社）
カラム温度  ４０℃
波長  Ex.（励起波長）=505 nm, Em.（検出波長）=574nm
[測定結果]
図９のクロマトグラムに示すように、ルモガリオン−アルミニウムキレートのピークが検出されている。このピーク強度と、ブランク測定時のピーク強度および図２の検量線を用いて算出したアルミニウム濃度は、0.8ppbであった。
このように、移動相溶媒中に有機溶媒が全く含まれていなくても、ルモガリオン−アルミニウムキレートは検出できることが分かった。従って、有機溶媒の濃度が５％以下の移動相溶媒を用いてもアルミニウム濃度の測定が可能であるといえる。
【００４１】
以上、本発明の実施例を説明したが、本発明は他の態様においても適用される。
【００４２】
たとえば、前述の実施例では、注入試料量を20μLとし、その注入試料量に適合するような大きさのカラム（内径4.6mm×長さ150mm）を用いていたが、本発明は高感度であるため、注入試料量が2μL程度であっても試料中のアルミニウム濃度の測定が可能である。なお、注入試料量が2μLの場合には、たとえば、内径0.5〜2.0mmのカラムを用い、流速を0.1mL/minに設定して測定する。
【００４３】
また、前述の実施例では、多くの実施例において、測定試料300μLにキレート試薬（試薬１）50μLおよび緩衝液（試薬２）600μLを加えて950μLの反応混液（混合調整後の試料）としていたが、測定試料、試薬１、試薬２の量をそれぞれ等倍して反応混液の体積を大きく（例えば10mLまたは前述の実施例の反応混液の10倍以上）すると、容器や外部からのアルミニウムの汚染の影響を受けにくくなるので、より正確に測定試料中のアルミニウム濃度が測定できる。
【００４４】
以上、本発明を実施例に基づいて説明したが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではなく、本発明は当業者の知識に基づいて種々の変更、改良を加えた態様で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施するために用いる高速液体クロマトグラフ装置の一般的な構成を説明するブロック図である。
【図２】実施例１で作成された検量線を示す図である。
【図３】実施例１の測定の再現性を示す図である。
【図４】本発明のアルミニウム測定方法により得られたクロマトグラムであって、(a)は高カロリー輸液用維持液のクロマトグラム、(b)はキシリトール含有総合アミノ酸注射液のクロマトグラムである。
【図５】異なるpHの緩衝液中でキレート化反応をさせた場合のアルミニウムキレートの蛍光強度を示す図である。
【図６】ビタミンＢ2製剤のクロマトグラムであって、(a)は本発明のアルミニウム測定方法、(b)は８−キノリノールをキレート試薬として用いた方法によってそれぞれ得られたクロマトグラムである。
【図７】脂肪乳剤のクロマトグラムであって、(a)は本発明のアルミニウム測定方法、(b)は８−キノリノールをキレート試薬として用いた方法によってそれぞれ得られたクロマトグラムである。
【図８】ビタミン製剤のクロマトグラムであって、(a)は本発明のアルミニウム測定方法（希釈なし）、(b)は本発明のアルミニウム測定方法（１０倍希釈）、(c)は８−キノリノールをキレート試薬として用いた方法（１０倍希釈）によってそれぞれ得られたクロマトグラムである。
【図９】本発明のアルミニウム測定方法であって、有機溶媒を含まない移動相溶媒を用いた場合の３０％ブドウ糖液のクロマトグラムである。
【図１】
0004102062.tif 000007
【図２】
0004102062.tif 000008
【図３】
0004102062.tif 000009
【図４】
0004102062.tif 000010
【図５】
0004102062.tif 000011
【図６】
0004102062.tif 000012
【図７】
0004102062.tif 000013
【図８】
0004102062.tif 000014
【図９】
0004102062.tif 000015