(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【請求項３】
配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【請求項４】
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【請求項５】
下記の何れかのタンパク質。
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から２０個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【請求項６】
細胞質雄性不稔個体が、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものであることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする配列番号２２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする配列番号２３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１０】
細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする配列番号２４に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１１】
細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号２９のアミノ酸配列をコードする配列番号２５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１２】
下記の何れかのＤＮＡ。
（１）細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列において１から２０個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【請求項１３】
下記の何れかのＤＮＡ。
（１）細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列において１から２０個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【請求項１４】
下記の何れかのＤＮＡ。
（１）細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する、配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列において１から２０個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【請求項１５】
細胞質雄性不稔個体が、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである、請求項７〜１４の何れか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項７〜１５の何れかに記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１７】
請求項７〜１５の何れかに記載のＤＮＡ又は請求項１６に記載のベクターを有する形質転換体。
【請求項１８】
形質転換植物である、請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項７〜１５の何れかに記載のＤＮＡを、細胞質雄性不稔形質を有する宿主植物のゲノムへ遺伝子工学的手法によって導入することを特徴とする、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復する方法。
【請求項２０】
細胞質雄性不稔遺伝子を有し、かつ、誘導型プロモーターと連結させた、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する請求項７〜１５の何れかに記載のＤＮＡからなるキメラＤＮＡ構築物を、細胞質雄性不稔系統の植物体の細胞に導入することにより、雄性不稔回復遺伝子の発現を制御することが可能となった形質転換体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の形質転換体を利用することによる細胞質雄性不稔系統の維持方法。
【請求項２２】
配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜５０９１番目の塩基配列、又は配列番号１５に記載の塩基配列の１番目〜８１１番目の塩基配列を有する、プロモーターＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞質雄性不稔から可稔への回復に関与する遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、一代雑種（以下、Ｆ1と略す）品種開発のために利用される細胞質雄性不稔形質（以下、ｃｍｓと略すことがある）の回復に関与する遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター及び形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
禾穀類、野菜などの農作物では、１）雑種強勢による優れた農業形質、２）収穫物の均一性、３）次世代で遺伝形質が分離するため品種育成者の利益が保護される、などの特徴のもと、Ｆ1品種の開発が盛んであり、多くの主要作物で実用化されている。
【０００３】
Ｆ1品種の種子を生産するための方法の一つとしては、細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）系統とその雄性不稔を回復する（以下、Ｒｆと略すことがある）系統からなるｃｍｓ／Ｒｆ採種システムがあり、例えばイネ、ソルガム、トウモロコシ等の禾穀類や例えばひまわりなどの油量作物で開発されているが、これらはいずれも、交配あるいは細胞融合の手法を用いて開発されたものである。
【０００４】
一方、アブラナ科では、自家不和合性を用いたＦ1採種システムが広く利用されているが、ナタネに関しては、安定な自家不和合性のないため、ｃｍｓ系統とＲｆ系統を利用したＦ1採種システムが求められている。
【０００５】
これに対して、近年、コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔（コセナｃｍｓ）やオグラダイコン由来の細胞質雄性不稔（オグラｃｍｓ）をナタネで利用する研究がなされている。両ｃｍｓ遺伝子に関しては細胞質小器官であるミトコンドリアのゲノムにコードされており、塩基配列についても知られているが、ダイコンは、分子生物学的な研究が進んでおらず、遺伝子単離に必要なマーカーもほとんど知られていない状態であるため、核からの遺伝子の単離が困難であり、Ｒｆに関しては、ダイコンの稔性回復系統から交配あるいは細胞融合の手法を使いナタネに導入されているのみである。
【０００６】
さらに、Ｒｆ遺伝子に関しては、植物の各ｃｍｓ系統により、１つ又は複数の回復遺伝子が存在する。ダイコンにおいては、Ｒｆ１遺伝子及びＲｆ２遺伝子が同時に存在することが稔性回復に必要であり、加えて、Ｒｆ１遺伝子が、ダイコンのｃｍｓ原因タンパク質として知られている、ミトコンドリア内のＯＲＦ１２５タンパク質（M. Iwabuchi et al. Plant Mol. Biol. 39:183-188, 1999）の蓄積量を大幅に減少させることが知られている。（育種学雑誌  ４７（別１）Ｐ１８６，１９９７、育種学雑誌４８（別１）Ｐ１９７、１９９８）。
【０００７】
またナタネにおいては、遺伝解析実験により、交配または細胞融合によって導入されたダイコンのＲｆ１遺伝子が、ｃｍｓ原因タンパク質として知られているＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質(M. Grelon et al. Mol. Gen. Genet. 243:540-547)の蓄積量を減少させること、これらＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量の減少と稔性が回復する現象は完全に一致していることが知られている（N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000）。つまり、ナタネ雄性不稔系統で稔性が回復するには、ＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量の減少が必須であり、そのために、Ｒｆ１遺伝子は重要な遺伝子である。
しかしながら、一方でＲｆ遺伝子の塩基配列については、トウモロコシのｃｍｓの一つであるＴ―サイトプラズムに対する回復遺伝子の一つであるＲｆ２遺伝子のみについては同定、単離されているが、他の植物でＲｆ遺伝子の塩基配列については、全く知られていない。
【０００８】
【発明が解決するための課題】
交配あるいは細胞融合によりオグラダイコン由来のＲｆ１遺伝子を導入したナタネ回復系統とその系統を父親として作出されたＦ1品種は、グルコシノレート（以下ＧＳＬと略す）含量が、規制値より高くなることがわかり、実用上問題となっている。これは、ＧＳＬの生合成に関与するダイコン由来の遺伝子がＲｆ１遺伝子の近傍に存在し、遺伝的に強連鎖しているため、ナタネの回復系統（Ｒｆ系統）のＧＳＬの含量が上昇するものと考えられている。ＧＳＬはナタネの搾油かすに含まれ、それを飼料として動物に与えたとき、甲状腺肥大をもたらすことが知られているため、ナタネ種子のＧＳＬ含量は、育種段階において、北米では18μmole/g ヨーロッパでは20μmole/g以下にすることが求められている。
【０００９】
さらに、近年では、除草剤耐性等の機能を遺伝子組換えにより付加した植物の開発も活発であり、これらの植物を効率的に創出するためには、交配あるいは細胞融合により得られたナタネ回復系の存在のみでは不十分であり、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子の単離が望まれていた。
【００１０】
即ち、本発明は、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子を単離してその構造を同定することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、単離したＲｆ遺伝子を利用してナタネ回復系統を確立する手段を提供することを解決すべき課題とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ダイコン及びナタネからＲｆ１遺伝子をクローニングすることに成功し、本課題を解決するに至った。
すなわち、本発明によれば、Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、該ＰＰＲモチーフ群は３つ以上のブロックに分割されており、該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側のブロックは４つのＰＰＲモチーフを有することを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が提供される。
【００１２】
上記タンパク質の好ましい態様によれば、
ＰＰＲモチーフの数が１４〜１６個であるタンパク質；
ＰＰＲモチーフ群が３つのブロックに分割されており、アミノ末端（N末端）側から順に各ブロックが５個、７個及び４個のＰＰＲモチーフを有するタンパク質；
アミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がセリン、スレオニン又はシステイン以外であるタンパク質；
アミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンのいずれかであるタンパク質；並びに
さらに、アミノ末端にミトコンドリアに移行するためのシグナルペプチド配列を有するか又はカルボキシ末端に−LysAspGluLeu−からなる配列を有するタンパク質；
が提供される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲルシフトを起こさせることを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；並びに、
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質：
が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのタンパク質が提供される。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのタンパク質が提供される。
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
本発明において好ましくは、細胞質雄性不稔個体は、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、
配列番号２２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
配列番号２３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
配列番号２４に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；並びに、
配列番号２５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ：
が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
本発明において好ましくは、細胞質雄性不稔個体は、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子又はそのホモログを有するものである。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを含有するベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡ又は本発明のベクターを有する形質転換体が提供される。形質転換体は、好ましくは形質転換植物である。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを用いることを特徴とする、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、細胞質雄性不稔遺伝子を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞に、さらに本発明のＤＮＡの一部又は全部を誘導型プロモーターと共に導入することにより、雄性不稔回復遺伝子の発現を制御することが可能となった形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した形質転換体を利用することによる細胞質雄性不稔系統の維持方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡから任意に設定した１５〜５０merのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、上記した本発明のＤＮＡの全部又は１部からなる少なくとも１５mer以上のプローブを使用し、目的の生物試料中に、該プライマーにより増幅される塩基配列の量、又は、プローブにより検出される塩基配列の量が、１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認することで、細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜５０９１番目の塩基配列、又は配列番号１５に記載の塩基配列の１番目〜８１１番目の塩基配列を有する、プロモーターＤＮＡが提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質の態様
本発明のタンパク質は下記（ｉ）から（ｖ）のいずれかのタンパク質に関する。
（ｉ）  Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、該ＰＰＲモチーフ群は３つ以上のブロックに分割されており、該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側のブロックは４つのＰＰＲモチーフを有することを特徴とする細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；
（ｉｉ）  細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と接触させた後に該転写産物にゲルシフトを起こさせることを特徴とするタンパク質；
（ｉｉｉ）  配列番号２６〜２９の何れかに記載のアミノ酸配列を有する細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
（ｉｖ）  下記の何れかのタンパク質。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質；並びに、
（ｖ）下記の何れかのタンパク質。
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質。
【００２１】
本明細書において、PPRモチーフとは「Pentatricopeptide Repeat」モチーフのことを称す。このPPRモチーフは、アラビドピシスのゲノムプロジェクトの進行によって見出された新しいタンパク質のモチーフ構造である。その基本モチーフは35個の縮重した（degenarate）したアミノ酸配列が、そのタンパク質の一次構造上でタンデムに繰り返されたものである。PPRモチーフは、コンセンサスアミノ酸配列として、アミノ末端（Ｎ末端）-「VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV」-カルボキシ末端（Ｃ末端）に代表される配列を有する。このモチーフは、Small and Peeters（文献  Trends Biochem Sci 2000, 25 46-47）によって提唱されたもので、アラビドピシスのゲノム中には、このモチーフを取りうる遺伝子が、この文献が出版された当時で200ほどGenBank (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) などの遺伝子バンクに報告されている。現在、ある任意のタンパク質が、このモチーフ構造を持ち得るか否か判断は、英国のサンガー研究所内にあるProtein families database of alignments and HMNs (以下Pfamと略、 http//:www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)にあるプログラムで容易に判断することができる。
【００２２】
現在までのところでPPRモチーフを有するタンパク質の機能が明らかになっている例としては、１）ミトコンドリアに移行するタンパク質である酵母のPET309やアカパンカビのCYA-5が、ミトコンドリア遺伝子であるcox1 mRNAと相互作用をしてcox1の発現を転写後のプロセシングもしくは翻訳のレベルで制御している例（Manthey and McEwen EMBO J 1995 14 4031-4043, Coffin et.al. Curr Genet 1997 32 273-280）や２）葉緑体に移行するPPRモチーフタンパク質であるトウモロコシのCRP1が、葉緑体遺伝子であるpetAおよびpetD遺伝子の翻訳に必須であり、加えてpetDmRNAのプロセシングのステップにも必須である例（Fisk et.at. EMBO J 1999 18 2621-2630）等が挙げられ、従って、ＰＰＲモチーフを有するタンパク質は、何らかの形で翻訳制御に関わっている可能性が高いと推察される。
【００２３】
今回、本発明者らがコセナダイコン細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する遺伝子を単離したところ、それによりコードされているタンパク質は、Pentatricopeptide Repeat（以下PPRと略）モチーフを１４個以上持ち、加えて該ＰＰＲモチーフ群が３つ以上のブロックに分割されており、さらに該各ブロックはそれぞれ少なくとも２つ以上のＰＰＲモチーフを有し、かつ、最もカルボキシ末端（Ｃ末端）側に存在するブロックは４つのＰＰＲモチーフを有するものであることを見出した。
【００２４】
上述の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質として好ましくは、ＰＰＲモチーフの数が１４〜１６個のものであり、より好ましくはＰＰＲモチーフ群が３つのブロックに分割されており、アミノ末端（N末端）側から順に各ブロックが５個、７個及び４個のＰＰＲモチーフを有するものである。
具体的には、
（１）PPRクラスター＃１：N末端から1番目のPPRモチーフから5番目のPPRモチーフが連続した１７５残基からなるPPRクラスター、
（２）PPRクラスター＃２：N末端から６番目のPPRモチーフから12番目のPPRモチーフが連続した２４５残基からなるPPRクラスター、
（３）PPRクラスター＃３：N末端から13番目のPPRモチーフから16番目のPPRモチーフが連続した１４０残基、
からなるものである。
【００２５】
更に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がセリン、スレオニン又はシステイン以外であるものであり、更に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンのいずれかであるものであり、特に好ましくはアミノ末端（N末端）側から２番目のPPRモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギンであるものである。
【００２６】
通常、稔性回復遺伝子は、核ゲノムに存在し、細胞質雄性不稔遺伝子はミトコンドリアに存在する事が知られているため、上記細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質は、さらに、アミノ末端にミトコンドリアに移行するためのシグナルペプチド配列を有するか又はカルボキシ末端に「LysAspGluLeu」からなる配列を有することが好ましい。
【００２７】
該ミトコンドリアに移行するためのＮ末端のシグナルペプチドとしては、O. Emanuelsson ら(J. Mol. Biol. 300,1005-1016(2000)のアルゴリズムを基にした予測プログラム「TargetP」(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)又は予測プログラム「Psort」( HYPERLINK http://psort.nibb.ac.jp) http://psort.nibb.ac.jp/)から確認されるものが挙げられ、また、該シグナルペプチドの具体例としては、シロイヌナズナAtOXA1遺伝子のシグナルペプチド(W. Sakamoto et al:Plant Cell Physiol, 41:1157-1163)（MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProArgGluSerAspHisGluArgAsp）といった配列が挙げられる。このうち、好ましくは配列番号３に記載のアミノ酸配列における１〜７９のアミノ酸配列が挙げられ、特に好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列における１〜３４のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質は、細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合することにより、その細胞質雄性不稔遺伝子の翻訳阻害を起こさせ、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させるものである。
【００２９】
細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物としては、コセナ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質であるＯＲＦ１２５又はオグラ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質であるＯＲＦ１３８のそれぞれの遺伝子の転写産物(mRNA)が挙げられ、好ましくは該遺伝子の５’−ＵＴＲ（Bonhomme et al; Mol Gen Genet, 235:340-348(1992)領域が挙げられる。
細胞質雄性不稔遺伝子の転写産物と結合するか否かを確認する方法としては、in vitroで人工的に転写させたorf125又はorf１３８のmRNAに本発明のタンパク質を加え、電気泳動させる方法、いわゆるゲルシフト法が挙げられ、具体的操作方法としては、ゲルシフト法として、通常行われているような条件で行えばよい。
【００３０】
また、ＯＲＦ１２５又はＯＲＦ１３８の遺伝子と、例えばβ-ガラクトシダーゼやルシフェラーゼのような検出可能なレポーター遺伝子との融合遺伝子を大腸菌などに発現させたものに、さらに本願タンパク質を加えることで発現が抑制されるか否かを確認する方法も挙げられる。
具体的には、配列番号２の塩基配列で示される稔性回復遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込んだものと、orf125の5'-UTR領域と25アミノ酸のコーディング部分をLacZ遺伝子に融合したベクターを大腸菌に組み込みんだものを作成し、誘導発現させると、稔性回復遺伝子を組み込んだ発現ベクターを同居させた場合にのみ、LacZ遺伝子の発現が抑制されて、X-Galの存在下で青い大腸菌コロニーが白くなる。このように本願タンパク質をコードする遺伝子を利用し、上記のような確認を行うことによっても、細胞質雄性不稔遺伝子の翻訳阻害を起こさせることにより、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させる機能を有することが確認できる。
【００３１】
本発明の細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質の中で最も好ましいものとしては、コンセンサス配列である配列番号２６〜２９に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。コンセンサス配列としては配列番号２６に記載のアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは配列番号２７又は２８に記載のアミノ酸配列が挙げられ、特に好ましくは配列番号２９に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
また、上記したタンパク質の好ましい具体例としては、
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の８０〜６８７番目のアミノ酸配列、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列の８２〜６９０番目のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が挙げられる。
また、該配列にミトコンドリアへの移行配列を有するものとしては、
（１）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（２）配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質が挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質は、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与することができるタンパク質である。より具体的には、本発明のタンパク質をコードするDNAが導入されている形質転換植物（Ｒｆ系統）を細胞質雄性不稔系統（ｃｍｓ系統）の個体と交配させた場合に、稔性の回復されたＦ1種子を得ることができる。上記ｃｍｓ系統の個体として好ましくは、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子が導入された個体が挙げられる。本発明のタンパク質は、上述のようなゲルシフト法を利用してスクリーニングをし、単離したり、下記で説明する本発明のＤＮＡを利用し、単離又は合成することができる。本発明のタンパク質の取得方法については後記する。
【００３３】
（２）本発明のＤＮＡの態様
本発明のＤＮＡは、下記の（ｉ）から（ｉｖ）の何れかのＤＮＡに関する。
（ｉ）  上記した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｉ）配列番号２２〜配列番号２５の何れかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｉｉｉ）  下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
（ｉｖ）  下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜８５５３番目の塩基配列又は配列番号１５に記載の塩基配列の８１２番目〜３００２番目の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
（ｖ）  下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は
（２）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；又は
（３）配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ。
【００３４】
本明細書では、本発明のＤＮＡを、本発明の遺伝子と称する場合もある。
配列番号１で示される塩基配列は、８５５３個の塩基から成るゲノムＤＮＡ塩基配列であり、配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１より得られたコード配列である。配列番号３は、配列番号２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列である。
配列番号１５で示される塩基配列は３３０６個の塩基から成るゲノムＤＮＡ塩基配列であり、配列番号１６で示される塩基配列は、配列番号１５より得られたコード配列である。配列番号１７は、配列番号１６で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列である。
【００３５】
本明細書において「１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列のことを言う。
本明細書において、「１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列のことを言う。
【００３６】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後"モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上である。なお。ここで言う一定以上の相同性を有するＤＮＡとしては、上記した相同性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【００３９】
本発明のＤＮＡは、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与することができるＤＮＡである。より具体的には、本発明のＤＮＡを導入した形質転換植物（Ｒｆ系統）を細胞質雄性不稔系統（ｃｍｓ系統）の個体と交配させることにより、稔性の回復されたＦ1種子を得ることができる。上記ｃｍｓ系統の個体として好ましくは、コセナダイコン及び／又はオグラダイコンの細胞質雄性不稔遺伝子が導入された個体が挙げられる。
【００４０】
（３）本発明のＤＮＡの取得方法
本発明のＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中に開示した配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、並びに配列番号３に記載したアミノ酸配列または配列番号３に記載したアミノ酸配列の情報に基づいて得られたPPRモチーフやミトコンドリア移行配列を組み合わせて得られるアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者に公知の一般的育種手法及び一般的遺伝子工学的手法を利用することにより、本発明のＤＮＡを単離又は合成することができる。
【００４１】
具体的には、本発明の遺伝子が発現される適当な植物起源、具体的にはダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたその他の植物、より具体的にはコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等のＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたブラシカ属の植物から得ることができ、例えば、Ｒｆ遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーを単離し、このＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離の関係を示したゲノムの地図を作製し、ゲノムの地図を出発点としてＲｆ領域のポジショナルクローニング法（クロモゾームウオーキングとも言う）によって、本発明の遺伝子を単離、取得できる。
【００４２】
この手法はゲノムＤＮＡ上に適当なＤＮＡマーカーを見いだし、Ｒｆ遺伝子とＤＮＡマーカーの遺伝距離を測ることでゲノムの地図を作製することから始める。ＤＮＡマーカーは父親由来のゲノムと母親由来のゲノムとを識別する必要があり、一般的には数１００ｂｐの長さからなる。またＤＮＡマーカーは遺伝子と同一染色体上に座乗している必要があり、遺伝子との距離が近いために遺伝様式がほぼ同様となるようなもの、つまり遺伝的に強く連鎖しているマーカーほど望ましい。
【００４３】
ＤＮＡマーカー単離法には、以前よりＲＦＬＰ法が使われていたが、近年はＰＣＲを用いた簡便な方法であるＲＡＰＤ法やＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法（Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21, 4407-4414）が利用されている。特に、ＡＦＬＰ法は遺伝的に強く連鎖するマーカーを得る手段として有効である。マーカーとの遺伝距離を測る材料として、通常、Ｒｆ１遺伝子を持たない劣性ホモ個体とＲｆ１遺伝子をホモに有する優性ホモ個体を交配したＦ1世代を自家受粉して得られるＦ２集団やＦ1世代とこの親である目的の遺伝子を持たない劣性ホモ個体を交配して得られるＢＣ１集団を用いることができる。
【００４４】
上記劣性ホモ個体としては、細胞質雄性不稔系統のダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物、より具体的には細胞質雄性不稔系統のコセナダイコンやオグラダイコン、又は、コセナダイコン由来の細胞質雄性不稔（コセナｃｍｓ）やオグラダイコン由来の細胞質雄性不稔（オグラｃｍｓ）が移入されたブラシカ属植物、より具体的にはｃｍｓナタネを使用することができる。
【００４５】
上記優性ホモ個体としては、Ｒｆ系統であるダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物、より具体的には細胞質雄性不稔回復系統のコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン、又は、これらのダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシカ属の植物、より具体的にはＲｆナタネを使用することができる。
【００４６】
これらの両親を交配して得られたＦ1世代を自家受粉して得られるＦ２集団や、Ｆ1世代と劣性ホモ個体を交配して得られるＢＣ１集団は、通常は１００個体以上、より好ましくは１０００個体以上解析することが望ましく、個体数が増すほどゲノムの地図の精度が上がり、ＤＮＡマーカーから目的の遺伝子までの物理的距離が短くなる。Ｒｆ遺伝子の場合も同様に、より物理的距離が短いＤＮＡマーカーを得ることが可能になる。
【００４７】
ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離を測る材料としては、例えば、ｃｍｓ系統コセナダイコン(Raphanus sativus cv. Kosena)とＲｆ系統である園紅ダイコン(Raphanus sativus cv. Yuanhong)とをN. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000に記載の方法に準じ、交配したダイコンＦ1世代を自家受粉して得られる数千個のＦ２集団を用いることができる。これらを解析することにより、Ｒｆ遺伝子を挟むような形で、両側にそれぞれ0.2cM程度の遺伝距離で離れた位置に連鎖するＤＮＡマーカーを単離することができ、これにより図１に示すようなマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離を示したゲノムの地図を作成することができる。
【００４８】
ゲノムの地図作成に続いては、その位置に対応するゲノムＤＮＡをクローン化し、目的の遺伝子を挟むＤＮＡマーカー間を繋ぐことが必要になる。通常はＤＮＡマーカーと目的遺伝子との物理距離が離れているため、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋げることによって、ＤＮＡマーカーから目的遺伝子領域をカバーすることになる。このＤＮＡマーカー間を、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンで繋ぐ行程がコンティグの作製である。Ｒｆ遺伝子の場合も同様に、よりＲｆ遺伝子に近い位置に存在するＤＮＡマーカー間を、Ｒｆ遺伝子領域をカバーするように、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋ぐことによってコンティグを作製することができる。
【００４９】
ゲノムＤＮＡ断片をもつクローンの集合体はゲノミックライブラリーを作製することで得られる。通常は、クローニングできるゲノムＤＮＡの長さによって、いくつかの種類のベクターが使用され、例えば、約２０ｋｂまでの断片をクローニングできるラムダファージベクター、比較的長い断片（〜４０ｋｂ）がクローニングできるコスミドベクター、より長い１００ｋｂ以上の断片をクローニングできるＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）ベクター等を利用したライブラリーが挙げられる。
【００５０】
いずれのライブラリーも、クローニングされた断片の平均長にライブラリーの集団数を乗じた値が、ライブラリーに供与されたゲノムの全長（ゲノムサイズ）に対して４から５倍程度の値に成ることが重要である。ダイコンのゲノムサイズは約５００Ｍｂｐと考えられているので、ラムダファージベクターで平均長２０ｋｂの場合、集団数は１．０×１０5個から１．２５×１０5個となり、コスミドライブラリーで平均長が４０ｋｂの場合は、集団数は５．０×１０4個から６．２５×１０4個となる。ナタネのゲノムサイズは約１０００Ｍｂｐと考えられているので、ラムダファージベクターで平均長２０ｋｂの場合、集団数は２．０×１０5個から２．５×１０5個となり、コスミドライブラリーで平均長が４０ｋｂの場合は、集団数は１．０×１０5個から１．２５×１０5個となる。
【００５１】
ライブラリーに供与するゲノムＤＮＡは、目的の遺伝子を含む生物からゲノムＤＮＡを常法により抽出すればよい。Ｒｆ遺伝子の場合、Ｒｆ系統であるダイコンの品種、近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物、より具体的には細胞質雄性不稔回復系統のコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン、又は、これらのダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが交配や細胞融合の手法により移入されたブラシカ属の植物、より具体的にはＲｆナタネが利用できる。一般的には、Ｆ２集団やＢＣ１集団を作製した時に利用した親と同じＲｆ系統の植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製することが最も望ましいと考えられる。ゲノムＤＮＡはＣＴＡＢ法（Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321）のような常法に従い、調製することができる。
【００５２】
コンティグの作製は最初に、Ｒｆ遺伝子の両側に位置するＤＮＡマーカーを保持するクローンを単離する。ゲノミックライブラリーから、常法により、ラムダファージライブラリーの場合は、プラークハイブリダイエーション法を用いて、コスミドライブラリーとＢＡＣライブラリーの場合はコロニーハイブリダイゼーション法を用いて単離する。次にその単離したクローンの末端領域を指標にして、そのクローンに隣接するクローンを単離する事によってコンティグを作製する。作成後、コンティグの塩基配列を、常法により決定する。
【００５３】
近年のゲノムプロジェクトの進展から、ゲノムＤＮＡの塩基配列から機能する遺伝子を推定する技術が発達してきた。「Genscan」に代表される遺伝子発見プログラムは、かなりの確度で遺伝子を推定することができる。また「BLAST」に代表されるホモロジー検索プログラムは、他の遺伝子やタンパク質の類似性を推定することができる。この様な解析ソフトウエアーを利用して、目的の遺伝子を推定し、単離することが行われている。Ｒｆ遺伝子の場合も、同様にコンティグのゲノムＤＮＡ配列を同様の解析ソフトウエアーを利用して、単離、同定することが可能である。また解析すると、ゲノムＤＮＡ塩基配列上のプロモーター部分、イントロンを含んだ構造遺伝子部分、ターミネーター部分が明示される。また同時に、イントロンを含んだ構造遺伝子に対して、イントロンが除かれたタンパク質に翻訳される形の遺伝子とその遺伝子に対するアミノ酸配列が明示される。この様にしてコンティグ上のＲｆ遺伝子をかなりの確度で推定することが可能である。
【００５４】
また、上記解析ソフトを利用し推定された遺伝子配列を元にして、生体内で目的のゲノムが実際にはどのような形で発現しているかどうかを確認するために、mRNAを精製し、これに対する相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)を単離することで証明できる。また、どこから転写が開始しているかについては簡便法としては5'-RACE法と呼ばれるＰＣＲを応用した方法やより確実にはプライマーイクステンション法やS1マッピング法をもちいて解析することで証明することが可能である。
以上の方法は、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.等に記載されている。
【００５５】
上述の手法で推定される塩基配列を元にして、単離された本発明の遺伝子としては、具体的には、配列番号２、配列番号１６、又は配列番号１８で示されるＤＮＡが挙げられ、これにより、該ＤＮＡ配列をもとに、一般的な遺伝子工学的手法によって、他の植物起源等からｃＤＮＡを容易に単離することも可能となった。
【００５６】
具体的には、本発明の遺伝子が発現される適当な植物起源、具体的にはダイコンの品種や近縁種を含むＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物から細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたその他の植物、より具体的にはコセナダイコン、オグラダイコン、園紅ダイコン又はこれらのダイコンの品種や近縁種等のＲａｐｈａｎｕｓ属の植物又は交配や細胞融合の手法によりこれらの植物の細胞質雄性不稔回復遺伝子を含んだゲノムＤＮＡが移入されたブラシカ属の植物から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なＤＮＡ断片をプローブとして、又は本発明の遺伝子の翻訳産物に対する抗体を用いて所望のクローンを選抜することにより、本発明の遺伝子に相当するｃＤＮＡを単離することができる。
【００５７】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞が例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００５８】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、すでに取得された本発明の遺伝子やその断片も良好に使用できる。また、本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００５９】
前記プローブとして用いられるセンスプライマーとアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個〜５０の連続した塩基、好ましくは２０〜３０個の連続した塩基を有するものが挙げられる。あるいは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることもできる。
【００６０】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ/ＲＮＡ増幅法や５’−ＲＡＣＥ法等に代表されるＲＡＣＥ法等、遺伝子の単離に通常用いられる手法を組み合わせて行えばよい。
【００６１】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適時設定でき、これは常法に従って合成できる。なお、増幅させたＤＮＡ/ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などで行うことができる。
【００６２】
また、上記で得られる本発明の遺伝子あるいは各種ＤＮＡ断片は、常法に従って、その塩基配列を決定することができる。
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の存在と発現の有無を特徴的に検出することができる。
【００６３】
前述した通り、本発明の遺伝子としては、例えば配列番号３、配列番号１７、又は配列番号１９に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該遺伝子の相同物も包含される。
ここで遺伝子の相同物とは、本発明遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴、および上記したようなその生物学的機能の類似性により一つの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、該遺伝子の対立遺伝子も当然含まれる。
【００６４】
例えば、本発明の遺伝子は、配列番号１もしくは配列番号２で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号３で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能である。同様に、配列番号１５もしくは配列番号１６で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号１７で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能であり、配列番号１８で示される特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、配列番号１９で示した各アミノ酸残基に対する任意のコドンを組み合わせて選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる。
【００６５】
また、前記の通り、本発明の遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又はそれらの一部に示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも包含する。このようなＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又はそれらの一部に示される塩基配列を有するＤＮＡと一定以上の相同性を有するＤＮＡである。
【００６６】
上記した一定以上の相同性を有するＤＮＡとは、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８で示される塩基配列又はそれらの一部あるいは配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列又はその一部をコードする塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、さらにもっとも好ましくは少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
【００６７】
より具体的には、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１８に示される塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを例示することができる。
【００６８】
また、本発明のＤＮＡのうち、特に、
配列番号１又は配列番号１５に記載の塩基配列又はその一部において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；
配列番号２、配列番号１６又は配列番号１８に記載の塩基配列又はその一部において１から複数個の塩基が欠失、付加及び／または置換されている塩基配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するＤＮＡ；及び
配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列又はその一部において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加及び／または置換されているアミノ酸配列を有し、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与するタンパク質をコードするＤＮＡ：
については、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列番号１、２、１５、１６、又は１８に記載の塩基配列またはそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異遺伝子を取得することができる。
【００６９】
変異遺伝子を得るための方法として、例えばランダム突然変異体、標的のある突然変異体、合成遺伝子を用いた方法など（新遺伝子工学ハンドブック、実験医学  別冊、羊土社、1996参照）等の公知の方法を用いることができる。
具体的には、配列番号１又は２の塩基配列又はそれらの一部の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００７０】
（４）本発明のＤＮＡを含有するベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に応じて選ぶことができる。
クローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できるものが好ましく、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescrlpt II SK(+)〔Nuclelc Acids Research, 17, 9494(1989)〕、Lambda ZAP II(ストラタジーン社製)、λgt10、λgt11〔ＤＮＡ Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49(1985)〕、λTriplEx(クローンテック社製)、λExCell(ファルマシア社製)、pT7T318U(ファルマシア社製)、pcD2〔Mo1. Cen. Bio1., 3, 280 (1983)〕、pMW218(和光純薬社製)、pUC118(宝酒造社製)、pEG400〔J.Bac., 172, 2392 (1990)〕、pQE-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。
【００７１】
発現ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、好ましくは宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明の遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００７２】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescrlptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400〔J. Bacterio1., 172, 2392(1990)〕、pQE-30(QIAGEN社製)等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００７３】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００７４】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcＤＮＡI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcＤＮＡI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００７５】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕、pLAN411やpLAN421（Plant Cell Reports 10(1991) 286-290）を例示することができる。また、特に10kb以上の長いＤＮＡ 断片を植物に導入するときは、長鎖ＤＮＡを安定的に保持・導入できるように改良されたベクターの使用が望ましい。例えば、pBIBAC2(Gene 200(1997)107-116)、pYLTAC7（PNAS 96(1999)6535-6540）やpBIGRZ2（バイオサイエンスとインダストリー55(1997)37-39）があげられる。
植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕等が挙げられる。なお、植物の形質転換についての詳細は別途後述する。
【００７６】
（５）本発明のＤＮＡを有する形質転換体
本発明のＤＮＡを有する形質転換体は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospiri11um属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属等に属する微生物をあげることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００７７】
酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。
酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００７８】
動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等を挙げることができる。
動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
植物細胞を用いた形質転換体については後述する。
【００７９】
（６）本発明のタンパク質の取得方法
本発明のタンパク質の取得方法は特に限定されない。本明細書中に開示した配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載したアミノ酸配列又は配列番号３、配列番号１７又は配列番号１９に記載したアミノ酸配列の情報に基づいて得られるPPRモチーフやミトコンドリア移行配列を、組み合わせて得られるアミノ酸配列の情報に基づいて、当業者に一般的遺伝子工学的手法を利用することにより、本発明のタンパク質を単離、発現、又は合成することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを単離または合成して、細胞に導入することにより発現させることができる。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物より該タンパク質を採取することにより取得することができる。
【００８０】
本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８２】
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＭＳ培地、Ｒ２Ｐ培地等、その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、１５〜３５℃等の条件下で１〜２１日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８３】
形質転換体の培養物から、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することに関与する本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００８４】
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００８５】
本発明のタンパク質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該タンパク質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００８６】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製〉、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００８７】
（７）本発明のＤＮＡを有する植物の形質転換体
配列番号１及び配列番号１５に記載された塩基配列は、植物ゲノム本来の塩基配列を抜き出した形の塩基配列である。この塩基配列は、遺伝子の発現に必要なプロモーターとターミネーターを作動可能な形で含んでいる。導入するベクターは、直接導入法の場合は一般的なクローニングベクター、たとえばコスミドpWE15（STRATAGENE社製）などに当該遺伝子をクローニングすることができる。アグロバクテリウムを利用する場合は、一般的な植物形質転換用ベクター、たとえばpBI121（Clontec社製）などにクローニングすることができる。
【００８８】
また、この配列（ゲノム配列）から一部のイントロンを抜き出した塩基配列のＤＮＡや、ほとんどすべてのイントロンを抜き出した塩基配列のＤＮＡ、配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入してもよい。
【００８９】
ここで、配列番号１に記載の塩基配列の３７５４番目〜５０９１番目の塩基配列、又は配列番号１５に記載の塩基配列の１番目〜８１１番目の塩基配列を有するＤＮＡは、葯でｍＲＮＡを転写する能力を有するプロモーターであり、雄性不稔性を回復させるのに好ましく用いられる。
さらに、プロモーターとターミネーター部分を既知の植物細胞中で機能するプロモーターやターミネーターと置換してもよい。
尚、上記した配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入する場合には、このＤＮＡの他にプロモーターとターミネーターが必要である。通常よく使用される一般的な発現ベクターとしては、pBI121(clonetec社製)が挙げられるが、このベクターはプロモーターにカリフラワーモザイクウイルスの３５Sプロモーター、ターミネーターにA. tumefacienceのTiプラスミドに存在するノパリン合成酵素のターミネーターが使用されている。また発現に必要なプロモーターとしては、上記カリフラワーモザイクウイルスの３５Sプロモーターに限らずに、植物に広く存在するｒｂｃSプロモーター等を用いてもよく、より好ましくは花粉の生育期に発現する種類のプロモーター例えばTA29プロモーターが、さらに好ましくは当該遺伝子の上流に配位された本来のプロモーターが用いられる。ターミネーターについても、上記ノパリン合成酵素のターミネーターに限らず、カリフラワーモザイクウイルスの３５Sターミネーター等を用いることができ、より好ましくは当該遺伝子の下流に配位された本来のターミネーターが用いられる。加えて、上記した配列番号２又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１６又はその２３８〜２０６４番目の塩基で示されるＤＮＡ、配列番号１８又はその２４４〜２０７３番目の塩基で示されるＤＮＡ、あるいは配列番号３又はその８０〜６８７残基に該当する部分、配列番号１７又はその８０〜６８７残基に該当する部分、又は配列番号１９又はその８２〜６９０残基に該当する部分で示されるタンパク質をコードするＤＮＡを用いて、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復させる目的に使用する場合、この配列に加え、ミトコンドリアへの移行配列が必要となる。
該ミトコンドリアへの移行配列としては、上記配列番号２の１〜２３７番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号３の１〜７９番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、上記配列番号１６の１〜２３７番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号１７の１〜７９番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは上記配列番号１８の１〜２４３番目の塩基で示されるＤＮＡ又は配列番号１９の１〜８１番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、その他上述の公知の移行配列等が利用できる。
【００９０】
本発明者らは以下の実施例において、配列番号１に示された、ゲノムに存在する本来のプロモーターからターミネーターまでに含まれるイントロンを含んだＲｆ遺伝子のＤＮＡを、本来の形で植物に導入するために、植物形質転換用ベクターを作製した。コンティグの一部をなすクローンから配列番号１に示された塩基配列を制限酵素によって切り出した後、適当なクローニングベクターにサブクローンした後、植物形質転換用ベクターpKM424,pBIGRZ2にサブクローニングした断片を導入し、当該断片を植物に導入可能なベクターを得た。このベクターを植物形質転換用アグロバクテリウムに導入した。このベクターを保持したアグロバクテリウムを植物に感染させることによって当該ＤＮＡ 断片が植物ゲノム中に組み込まれる。
【００９１】
本発明の遺伝子が適用される植物は、例えばナタネ、ヒマワリ、ダイズ、パーム椰子等の油量作物、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ等の禾穀類、例えば、タバコ、ペチュニア等の花卉類、例えばトマト、ブロッコリー、キャベツ、白菜、人参等の各種の野菜類などが例示される。
このうち、ナタネ、キャベツ、白菜、ブロッコリー等のブラシカ属の植物やトマトなどが好ましく、特に好ましくは、ナタネ、キャベツ、白菜、ブロッコリーが挙げられ、最も好ましくは、ナタネである。
【００９２】
本明細書において、形質転換植物源としては、種子、芽生え、苗、カルス、培養細胞、植物体などが挙げられ、例えば、ナタネの場合には芽生えまたはプロトプラスト；ダイズの場合には芽生え、カルスまたは培養細胞；ヒマワリの場合には芽生え；パーム椰子の場合にはカルスまたは培養細胞；イネの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；トウモロコシには、芽生え、苗、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；コムギの場合には、芽生え、カルスまたは培養細胞；キャベツ、ブロッコリーの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；ニンジンの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト等と言ったように、当業者が通常行うように、対象植物によって適宜好ましい部位を選択して行えばよい。
【００９３】
植物への形質転換法は常法に従って行うことができ、例えば、ベクターを一度アグロバクテリウムに導入した後に、アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることで、ベクターを植物に導入する方法や、エレクトロポーレイション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などを用いてベクターを細胞へ直接導入する方法等を挙げることができる。
【００９４】
例えば、ナタネの場合に好ましい遺伝子導入法としては、下記に記載された方法が挙げられる。
スクロース等の糖類を炭素源として含んだ MS培地で無菌発芽させたナタネ品種の下胚軸を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、及びスクロースを含むMS培地上で前培養する。YEB培地で増殖させたアグロバクテリウムを遠心により集菌し、スクロースを含んだMS培地に再懸濁を行う。この懸濁液に、先のナタネ下胚軸を加え振とうさせた後、取り出した下胚軸を元の前培養培地に戻し３日間共存培養した後、ゼアチン、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモン、カルベニシリン、及びカナマイシンを含む選択培地に移して選抜を行う。 これにより、得られた緑色の再生芽を、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモンを任意に含んだ伸長培地、引き続いてナフタレン酢酸、ベンジルアミノプリン等の植物ホルモンを任意に含んだ発根培地で培養することで再生個体を得ることができ、この個体をｃｍｓ系統の個体と交配することにより、稔性が回復されたＦ１雑種を得ることができる。
【００９５】
このように植物に本発明のＤＮＡを導入することにより、細胞質雄性不稔個体の不稔性を可稔に回復することが可能になる。
尚、上記再生個体は、ｃｍｓ系統のナタネと交配し、その子孫の稔性を調査することで、発現の確認ができるが、ｃｍｓ細胞質を持つナタネを材料として形質転換を行った場合には、上記のように根を形成した形質転換体（再生個体）を通常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、花粉稔性を調査でき、時間的にも操作的にも簡便で好ましい。
【００９６】
また、上記形質転換において、用いる細胞としてｃｍｓ細胞質を有するナタネの細胞又は組織、好ましくは胚軸、子葉、葉、花粉、培養細胞、カルス、プロトプラストを利用して上述のように形質転換を行った場合には、上記の方法で得られる植物体（再生個体）を通常の肥料を含む土壌に移し開花させることで、花粉稔性が回復された植物個体を得ることができる。
すなわち、ｃｍｓ細胞を用い、該ｃｍｓ細胞に上述の遺伝子導入法で本発明のＤＮＡを導入し、該ＤＮＡが核に組み込まれている細胞をカナマイシン等の抗生物質耐性あるいは除草剤耐性選抜マーカーを指標にして選抜した後、前述のような伸長培地及び発根培地で培養することにより該ＤＮＡが核に組み込まれた植物体を得ることができる。この植物体は、雄性不稔形質が回復され可稔となる。
【００９７】
細胞質雄性不稔回復に関与する遺伝子を検出する方法としては、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡから任意に設定した15〜50merのオリゴヌクレオチドプライマー、又は、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡの全部又は１部からなる少なくとも１５mer以上のプローブを使用し、目的の生物試料中に、該プライマーにより増幅される塩基配列の量、又は、プローブにより検出される塩基配列の量が、１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認することにより行うことができる。
【００９８】
具体的な確認手法としては、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法などがあげられ、このうち、ＰＣＲ法が好ましい。これらの手法は、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００９９】
１ゲノム中に１遺伝子以上あることを確認するためには、ＰＣＲ法では簡易法として同じコピー数のＤＮＡを鋳型にして、同程度の増幅が認められることが必要であり、より正確には定量ＰＣＲ法を用いて、内部標準として１ゲノム中に１遺伝子存在することがわかっている既知の遺伝子を増幅させる任意のプライマーを用い、同量の生物試料中に、この既知の遺伝子の増幅量と該プライマーにより増幅される塩基配列の量を比較することで確認できる。サザンハイブリダイゼーション法では、当該ＤＮＡが１ゲノム中に１遺伝子あることがわかっている稔性回復系統植物個体のＤＮＡと目的の植物試料のＤＮＡを等量ずつ比較して、検出されるＤＮＡの量が同じ又はそれ以上であることを確認する。
【０１００】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、たとえば配列番号１もしくは配列番号２に記載のＤＮＡ配列と同一の、または相補性を有する15〜50merのオリゴヌクレオチドがあげられる。
サザンハイブリダイゼーション法に用いるプローブは、配列番号１もしくは配列番号２に記載のＤＮＡ配列と同一の２本鎖ＤＮＡの全域もしくは少なくとも１５mer以上のその一部分、または１本鎖ＤＮＡまたはその相補鎖の全域もしくは少なくとも１５mer以上のその一部分があげられる。また、先に述べたようにプローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上である。なお。ここで言う一定以上の相同性を有するＤＮＡとしては、上記した相同性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【０１０１】
以上に述べた遺伝子を検出する方法は、形質転換体において当該ＤＮＡが組み込まれているかどうかを確認することだけでなく、交配によりＲｆ遺伝子の導入を試みた個体においても、Ｒｆ遺伝子の有無を確認する手段として用いることができる。この方法を用いれば、細胞質雄性不稔個体にＲｆ遺伝子を導入した場合、開花する前にＲｆ遺伝子の有無を確認することが可能である。また、通常の細胞質を持つ個体にＲｆ遺伝子を導入した場合は、開花時の花粉を細胞質雄性不稔個体に交配して得られた次世代の個体の稔性を確認しなければならないが、この方法を用いることでこれ以前にＲｆ遺伝子の有無を確認できる。このような利用方法は、一般的にマーカーＤＮＡの利用またはマーカー ＤＮＡ育種と呼ばれている。Ｒｆ遺伝子の場合は、Ｒｆ遺伝子のマーカーＤＮＡ（Ｒｆマーカー）としての利用が考えられる。Ｒｆマーカーは、先に述べたように、当該ＤＮＡを導入した組み換え個体や非組み換え体である交配によりＲｆ 遺伝子を導入した植物を母本として用い、実用品種を育種していく上で、重要である。
【０１０２】
尚、導入ＤＮＡがＲｆ遺伝子として機能するかどうかを確認するには、上述のように形質転換体の稔性回復を確認することによっても可能であるが、その他にも、下記に示すような方法でも行うことができる。
先に述べたように、Ｒｆ遺伝子は、ｃｍｓ原因タンパク質であるＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質のミトコンドリア内の蓄積量を減少させることにより、植物体の稔性を回復させる。従って形質転換個体のミトコンドリアにおいて、ＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質蓄積量の減少を確認することにより、導入遺伝子がＲｆ遺伝子であることが確認できる。
【０１０３】
ミトコンドリアにおけるＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質蓄積量の減少を確認する方法としては、本明細書に記述した条件に従ってウエスタンブロッティング法によりＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質を検出した時に、内部標準として用いるミトコンドリアゲノム由来のタンパク質に対する抗体、例えば、N. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955, 2000に記載されている、抗Ｆ1-F0ATPase（以下ATPAと省略）のシグナル量が、細胞質雄性不稔個体と、稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該ＤＮＡを導入した形質転換個体とで等量であって、かつ、細胞質雄性不稔個体のＯＲＦ１２５またはＯＲＦ１３８タンパク質の蓄積量と比べて、稔性回復個体または細胞質雄性不稔個体に該ＤＮＡを導入した形質転換個体での蓄積量が５０％より多く減少、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上減少していることを確認する方法である。
【０１０４】
実際には、ＯＲＦ１２５を有する細胞質雄性不稔ダイコンのつぼみでは、稔性回復遺伝子Ｒｆが導入されると、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量は激減し、ほとんど検出されない。またナタネでは、細胞質ＯＲＦ１２５を有する細胞質雄性不稔ナタネに、交配により稔性回復遺伝子が導入された稔性回復ナタネのつぼみでは、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が80%以上減少していることが観察されている。また、実施例においても、細胞質雄性不稔個体に当該ＤＮＡ を導入した形質転換ナタネのつぼみでは、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が80%以上減少していることが観察されている。
尚、上述の方法における、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８タンパク質に対する抗体は、下記のような一般的な手法を用いることにより得ることができる。すなわち、抗原としてこれらのタンパク質を動物に免疫することで抗血清が得られ、さらにproteinAを結合したアフィニティーカラムを用いることでイムノグロブリンＧ抗体を精製することが出来る。用いる抗原としては、発現している細胞質雄性不稔植物やこの培養細胞から、定法によりタンパク質を精製する事で得られる。また、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８遺伝子を発現ベクターに繋いで、大腸菌や酵母において発現させ、同様に精製することで得られる。さらには、ＯＲＦ１２５やＯＲＦ１３８の全長もしくは一部分を化学合成したペプチドも抗原としてもちいる事ができる。ATPAに対する抗体も同様の手法で得ることができる。
【０１０５】
さらに、ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞に、さらに誘導型プロモーターと共に本発明の遺伝子の一部又は全部を導入することで、本発明のＤＮＡの発現を特異的にしかも一時的に制御することで、ハイブリッド種子生産に必要な雄性不稔性維持系統（維持系統）を必要としない新しいハイブリッド種子生産システムを作ることができる。
【０１０６】
すなわち、通常、ｃｍｓ系統のナタネは不稔であるため、ｃｍｓ系統を増殖、維持するためには、別途、ｃｍｓ及びＲｆが関与していない維持系統というものが必要であり、従来、ハイブリッド種子の生産のためにはＲｆ系統、ｃｍｓ系統、維持系統という３つの系統の植物を必要としたが、本発明により、Ｒｆ遺伝子が単離・同定されたため、ハイブリッド生産の際に、化学物質によるプロモーターの誘導を行い、回復遺伝子の発現を制御する方法を用いることにより、維持系統が無くとも増殖、維持が可能となるｃｍｓ系統が構築できる。
【０１０７】
具体的には、外部から誘導するプロモーター、例えば、薬剤感受性のあるプロモーターを有するベクターに、本発明の遺伝子の一部または全長をアンチセンスあるいはセンスの向きで組み込み、該ベクターを用いて、ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞を形質転換する。
ｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞としては、上述の方法に従い、ｃｍｓ細胞質を有する細胞を本発明のＤＮＡで形質転換したものだけでなく、ｃｍｓ系統とＲｆ系等を交配して得られたものでもよい。
上述の誘導可能なプロモーターとしては、例えば、特開平６−４６６９７号公報で知られており、ベクターの作成及び形質転換の方法としては上述と同様の手法が挙げられる。
【０１０８】
上記方法により得られるｃｍｓ細胞質を有し、かつ、本発明のＤＮＡを有する細胞であって、さらに誘導型プロモーターと共に本発明のＤＮＡの一部又は全部が組み込まれた形質転換体は、通常、プロモーターが誘導されていないため、元々存在するＲｆ遺伝子により植物は可稔性を示し、該系統の維持も自家受粉により行うことができるが、ハイブリッド生産の際には、この植物にプロモーターを誘導させる能力を有する化学物質を作用させ、プロモーターが誘導されることによりＲｆ遺伝子の発現が阻害される。これにより、その植物は雄性不稔となるため、ハイブリッド種子生産時にｃｍｓ系統として使用することができる。
従って、この方法を用いることで、ｃｍｓ系統であっても増殖、維持が自家受粉で行えることになるので、従来はハイブリッド種子の生産のために３つの系統が必要であったものが、維持系統は必要なくなり、生産コストを大幅に減少させることが可能になる。
以下、実施例について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【０１０９】
【実施例】
実施例１：細胞質雄性不稔回復遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーの単離とゲノム地図の作製
稔性回復遺伝子（Ｒｆ遺伝子）を単離するために、まず、Ｒｆ遺伝子の近傍に位置するＤＮＡマーカーを単離し、このＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝距離の関係を示したゲノムの地図を作製する必要がある。それの出発点としてＲｆ領域のポジショナルクローニングを行った。
【０１１０】
ＤＮＡマーカー単離法には、ＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法(Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.21 4407-4414)に準じた、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社のＡＦＬＰ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ  ＡＦＬＰ Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｋｉｔに従ってＡＦＬＰを行った。マーカーとの遺伝距離を測定する材料として、ｃｍｓ系統コセナダイコン(Raphanus sativus cv. Kosena)の１個体（（ＫＣ２/ＫＡ１）-1）とＲｆ系統である園紅ダイコン(Raphanus sativus cv. Yuanhong)の１個体（Ｙｕａｎ１０−３）とをN. Koizuka, et al. Theor Appl Genet, 100:949-955 2000に記載の方法に準じ、交配したダイコンＦ1世代８個体を自家受粉して得られた約２１００個体のＦ２集団を用いた。その結果、Ｒｆ遺伝子を挟むような形で、両側にそれぞれ0.2〜0.3cMの遺伝距離で離れた位置に連鎖するマーカーを５つ単離した。各ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子の遺伝的距離を示したゲノムの地図を図１に示す。
【０１１１】
実施例２：ゲノム地図を基にしたコンティグの作製とＲｆ遺伝子の解析
ゲノム地図作成に続いてはその位置に対応するゲノムＤＮＡをクローン化し、Ｒｆ遺伝子を挟むＤＮＡ マーカー間を繋ぐ事が必要になる。ここで、ＤＮＡマーカーとＲｆ遺伝子との距離が離れているため、ゲノムＤＮＡ断片を持つクローンを複数個繋げる事によって、ＤＮＡマーカー間をカバーするＲｆ遺伝子領域のコンティグを作製した。
【０１１２】
ゲノムＤＮＡ断片をもつクローンの集合体をゲノミックライブラリーといい、我々は２種類のライブラリーを作製した。ＤＮＡ供与体として、Ｆ2集団を作製した時に利用した回復系統の親と同じ園紅ダイコンより、常法に従い、CTAB法（Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321）によりゲノムＤＮＡを調製した。ライブラリーは、ラムダベクターとしてλDASHIIベクター（STRATAGENE社製）を用いて、平均長20kb、集団数1.5×105個のラムダファージライブラリーを作製した。また、コスミドベクターとしてpWEB::TNCベクター(EPICENTRE TECHNOLOGIES社製)を用いて、平均長40kb、集団数5.5×104個のコスミドライブラリーを作製した。
【０１１３】
コンティグの作製は最初に、Ｒｆ遺伝子の両側に位置するＤＮＡマーカーを指標に、上記で作製したラムダファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーション法を用いて、ラムダクローンを単離した。またコスミドライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法を用いてコスミドクローンを単離し、図１に示すような両端のＤＮＡマーカー間をカーバーするコンティグを完成した。コンティグの一部を成すコスミドクローンNIT7/2とTO3-2は常法により、塩基配列を決定した。
【０１１４】
続いて、上記コンティグの一部を成すコスミドクローンNIT7/2とTO3-2の塩基配列を、「Genscan」（三菱スペースソフトウエア社製）を用いて、ダイコンとゲノムＤＮＡ 配列が似通っており、最近全ゲノム配列が決定されたシロイヌナズナに対するパラメーターを加味して解析した。その結果、Ｒｆ遺伝子を発現すると思われるプロモーター部分とイントロンを含んだ構造遺伝子部分とターミネーター部分を発見した。さらに、イントロンが除かれたタンパク質に翻訳される形の遺伝子とその遺伝子に対するアミノ酸配列を得た。
【０１１５】
実施例３：ゲノミックＤＮＡ領域のサブクローニング
「Genscan」で推定されたプロモーターからターミネーターを十分に含む、配列番号１に記載された1〜8553の塩基配列からなるＤＮＡのHpaI-SwaI断片(8546bp)を、フラグメント回収用アガロース(FMC社製)を用いたゲル電気泳動によりベクターと分離した。ＤＮＡ断片を含むゲルをゲル分解酵素(Epicentre Technologies社製)により消化してＤＮＡを回収した。さらに、得られた断片を制限酵素BamHIにより切断したクローニング断片を得た。これらＤＮＡ断片を、pGEM-T easyベクター(Promega社製)にサブクローニングして、cds6BT/pGEM-T easyを得た。以下、詳細に記述する。
【０１１６】
100μlの1×K制限酵素緩衝液(20mM Tris-HCl(pH8.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM KCl)中に、1μgの NIT7/2コスミドＤＮＡと10 unitの制限酵素HpaI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。
【０１１７】
加温後、10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と250μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心する。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心する。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させる。回収したＤＮＡ沈殿に、滅菌水89μlを加えて溶かす。
【０１１８】
溶かしたＤＮＡ溶液に、10μlの10×H制限酵素緩衝液(500mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl)、1μlの10unit/μl制限酵素SwaI（宝酒造社製）を加え、25℃にて1時間加温した。11μlの10×loading緩衝液(1% SDS, 50% Glycetrol, 0.05% Bromophenol Blue)を加えた。
【０１１９】
1.2gの低融点アガロースSeaPlaqueGTG agarose（FMC社製）と、150ml の1×TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 緩衝液を混和後、100℃に加熱してアガロースを溶かし、45℃まで攪拌しながら冷却した。14×15cｍのゲルトレイに30mm幅×1mm厚のコームを設置し、冷却したゲルを流し込み固めた。ゲルコームにloading Dyeを加えたＤＮＡを流し込み、1×TAE、30V/30cmの電圧で18時間電気泳動した。
【０１２０】
電気泳動したゲルを、0.5μg/ml エチジウムブロミド／1×TAE溶液に移し、30分染色した。ゲルを365nmの長波紫外線を放射したトランスイルミネーターの上に乗せ、目的の8546bpの断片を、滅菌したメスを用いて切り出した。さらにゲルを約1mm角の断片になるように刻み、あらかじめ秤量した2mlのマイクロチューブに移し、ゲルの重さを秤量した。
【０１２１】
ゲルの重さ50mgに対して1μl の50×GELase Buffer(2M Bis-Tris(pH6.0), 2M NaCl）を加えた。ゲルの入ったチューブを68℃に加温したドライヒートブロックに入れ、時々チューブを上下にしながら攪拌し、10分間加温して、ゲルを完全に溶かした。このチューブを45℃のドライヒートブロックに移し、時々チューブを上下にしながら攪拌し、5分間加温した。このチューブに、ゲルの重さ200mgに対して1unitのGELase (Epicentre Technologies社製)を加えて45℃のドライヒートブロックで、時々チューブを上下にしながら攪拌し、30分間加温した。
【０１２２】
ゲル容積に対して、1/3容量の10M 酢酸アンモニウム(pH7.0)を加え攪拌し、15000rpm, 5分間遠心した。上清を新しい2mlのマイクロチューブに移し、上に対して2容量のエタノールを加えた。チューブを攪拌後、15000rpm、4℃で２０分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に20μl のTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、DNA断片を回収した。
【０１２３】
回収した20μlのＤＮＡ溶液に、10μlの10×K制限酵素緩衝液(200mM Tris-HCl (pH8.5), 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1000mM KCl)、68μl のｄH20、2μl の10 unit/μlの制限酵素BamHI（宝酒造社製）を加え、30℃にて1時間加温した。加温後、10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と250μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心する。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心する。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させる。回収したＤＮＡ沈殿に、滅菌水20μlを加えて溶かす。55μlの滅菌水、10μlの10x ＰＣＲ 緩衝液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl) 、6μlの25mM MgCl2、8μlの2.5mM dNTP mix、1μlの5 unit/μl のrTaq ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、72℃で30分間加温して、3'末端にdATPを付加した。
【０１２４】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。20μｌのTE緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）を加え、フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡ を回収した。
【０１２５】
上述の方法で得られた5μlの精製されたDNAに、1μlの50ng/μl pGEM-T easyベクター（Promega社製）、6μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)のI溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
【０１２６】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡ を回収した。
【０１２７】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡと混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。100μg/mlのAmpiciline(和光純薬社製)、20μg/mlのX-Gal(宝酒造社製)、1mMのIPTG(宝酒造社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１２８】
寒天培地上に現れた白いコロニーを、100μg/mlのAmpiciIlinを加えた2ml のLB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡに目的の断片がクローニングされていることを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で切断して確認して、cds6BT/pGEM-T easyを得た。
【０１２９】
上述の方法で得たcds6BT/pGEM-T easyを保持したそれぞれの大腸菌DH10Bを、100μg/mlのAmpiciIlinを加えた100mlのLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社製）を用いて精製した。
【０１３０】
実施例４−１：植物形質転換用ベクターの作製(1)
cds6BT/pGEM-Teasyを制限酵素EcoRIで切断後、フラグメント回収用アガロースを用いたゲル電気泳動によりベクターと分離し、回収されたＤＮＡ断片を植物形質転換用ベクターpKM424 （pKM424にCaMV35Sプロモーター：GUS gene：NOSターミネーターの断片を加えたベクターがpLAN421（Plant Cell Reports 10(1991) 286-290ベクター）のEcoRI部位にクローニングして、植物形質転換用ベクターcds6BT/pKM424とした。以下に詳細を示す。
【０１３１】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl)中に、1μg のcds6BT/pGEM-T easy ＤＮＡと10 unitの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。
以下、上記のHpaI-SwaI断片を取り出した同様の方法で、cds6BT/pGEM-T easyからcds6BTを含むEcoRI断片を分離回収した。
【０１３２】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl)中に、1μgの植物形質転換用ベクターpKM424と10 unitの制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。加温後、100μl の1M Tris-HCl(pH8.0)と、1 unitのBacterial Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)を加えて混和後、50℃で1時間加温して脱リン酸化した。
【０１３３】
200μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で飽和したフェノール・クロロホルムを加え、激しく攪拌した。15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチューブに移す。同様の操作をもう一度繰り返し、タンパク質を取り除いた。20μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と500μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に100μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、10ng/μlの濃度とした。
【０１３４】
10μlの精製されたEcoRI断片、1μlの脱リン酸化されたpKM424ベクター、11μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)I溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
【０１３５】
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。
3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡ を回収した。
【０１３６】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡ と混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。50μg/mlのSpectinomycin(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１３７】
寒天培地上に現れたコロニーを、50μg/mlのSpectinomycinを加えた2mlの LB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡにBamHI部位からHpaI部位がクローニングされていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認し、cds6BT/pKM424とした。
cds6BT/pKM424を保持した大腸菌DH10Bを、50μg/mlのSpectinomycinを加えた250ml のLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１３８】
実施例４−２：植物形質転換用ベクターの作製(２)
配列番号１に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローンCHI（図２参照、クローニング断片長約17kb）をマルチプルクローニング部位に存在する制限酵素NotI（宝酒造社製）で切断後、フラグメント回収用アガロースを用いたゲル電気泳動によりベクターと分離し、回収されたＤＮＡ断片を植物形質転換用ベクターpBIGRZ2（バイオサイエンスとインダストリー55(1997)37-39）のNotI部位にクローニングして、植物形質転換用ベクターCHI/pBIGRZ2とした。以下に詳細を示す。
【０１３９】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100)中に、1μg のラムダクローンCHI ＤＮＡと10 unitの制限酵素NotI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。以下、上記のHpaI-SwaI断片を取り出した同様の方法で、ラムダクローンCHIのNotI断片を分離回収した。
【０１４０】
100μlの1×H制限酵素緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, 100mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% TritonX-100)中に、1μgの植物形質転換用ベクターpBIGRZ2と10 unitの制限酵素NotI（宝酒造社製）を加え、37℃にて1時間加温した。加温後、100μl の1M Tris-HCl(pH8.0)と、1 unitのBacterial Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)を加えて混和後、50℃で1時間加温して脱リン酸化した。
【０１４１】
200μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)で飽和したフェノール・クロロホルムを加え、激しく攪拌した。15000rpm、 5分間遠心後、上清を新しいチューブに移す。同様の操作をもう一度繰り返し、タンパク質を取り除いた。20μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.6)と500μlのエタノールを加えて攪拌後、-80℃にて5分間冷却して、15000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を除き、さらに1mlの70%エタノールを静かに加え、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を除き、遠心真空乾燥機を用いて、沈殿を5分間乾燥させた。沈殿に100μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)を加え、完全に溶かし、10ng/μlの濃度とした。
【０１４２】
10μlの精製されたNotI断片、1μlの脱リン酸化されたpBIGRZ2ベクター、11μl のＤＮＡ Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)I溶液を混和後、16℃で30分間インキュベートした。
限外ろ過フィルターユニット:Microcon-50（ミリポア社製）に、上記反応液を100μlの滅菌水とともに移し、5000rpm、4℃で20分間遠心した。トラップの水を捨て、再度100μlの滅菌水を加えて、5000rpm、4℃で20分間遠心した。フィルターユニットを取り外し、向きを逆さにして新しいマイクロチューブに装着した。3000rpm、4℃、5分間遠心して、フィルターユニットのＤＮＡ を回収した。
【０１４３】
回収したＤＮＡをチューブごと氷上に立て冷却した。30μlのエレクトロポレーション用大腸菌DH10B（Gibco BRL社製）をチューブに入れ、軽く混ぜた。予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)に、ＤＮＡ と混和した大腸菌を移した。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.25kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに37℃に温めた500μlのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。大腸菌を10mlの培養チューブに移し、37℃で1時間振とう培養した。25μg/mlのKanamycin（和光純薬社製）を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5%Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養した大腸菌を拡げ、18時間以上37℃で培養した。
【０１４４】
寒天培地上に現れたコロニーを、25μg/mlのKanamycinを加えた2mlの LB培地にて、37℃で18時間以上培養した。培養した大腸菌から、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡに目的の断片がクローニングされていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認し、CHI/pBIGRZ2とした。
CHI/pBIGRZ2を保持した大腸菌DH10Bを、25μg/mlのKanamycinを加えた250ml のLB 培地にて、37℃で18時間培養した。アルカリSDS法により、Qiagen Midiキット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１４５】
実施例５：アグロバクテリウムへの植物形質転換用ベクターの導入
アグロバクテリウムのコンピテントセルを調製し、実施例４−１及び４−２で得られたcds6BT/pKM424ベクター及びCHI/pBIGRZ2ベクターのそれぞれを、調製した植物形質転換用アグロバクテリウムEHA101に導入した。以下、詳細に示す。
【０１４６】
アグロバクテリウムEHA101のエレクトロポレーション用コンピテントセルを以下の方法で作製した。アグロバクテリウムEHA101を、50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）を加えたLB寒天培地上でストリークして、28℃で24時間以上培養し、シングルコロニーを得た。50μg/ml Kanamycin, 25μg/ml Chloramphenicolを加えたLB培地20mlを50ml遠心管に入れ、直径1mm程度のコロニーを植菌し、28℃で40時間振とう培養した。40時間後、遠心管の蓋を一度開閉して、さらに4時間同様に培養した。培養液を1500×g, 4℃で遠心して集菌した。上清を捨てたチューブに40mlの氷冷した滅菌10%グリセロールを入れ、菌体を再懸濁し、1500×g, 4℃で遠心して集菌した。この操作を2回繰り返した。得られた菌体に氷冷した500μｌの滅菌10%グリセロールを加え、再懸濁した。滅菌したマイクロチューブに100μｌずつ菌体を分注し、液体窒素で凍結後、-80℃フリーザーに保存した。
【０１４７】
アグロバクテリウムEHA101のエレクトロポレーション用コンピテントセルを氷水上で溶かした。予め冷やした1.5mlチューブに40μｌのエレクトロコンピテントセルを入れ、それぞれ100ngのcds6BT/pKM424 又は、CHI/pBIGRZ2のプラスミドＤＮＡを加えて軽く混和した。
【０１４８】
予め氷上で冷やしたエレクトロポレーション用（電極間隔1mm）キュベット(USA Scientific Plastics社製)にＤＮＡ と混和したアグロバクテリウムを移す。Electro Cell Manipulator 600(BTX社製)を用いて、1.44kv、129Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを行い、その後直ちに30℃に温めた500μｌのSOC培地(Gibco BRL社製)をキュベットに加えた。アグロバクテリウムを10mlの培養チューブに移し、30℃で1時間振とう培養する。
cds6BT/pKM424ベクターを導入したアグロバクテリウムは50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）, 50μg/ml Spectinomycin(Sigma社製), 2.5μg/ml Tetracycline(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(１% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1%NaCl, 1.5% Bacto-Agar)に、培養したアグロバクテリウムを拡げ、24時間以上28℃で培養した。
CHI/pBIGRZ2ベクターを導入したアグロバクテリウムは50μg/ml Kanamycin（和光純薬社製）, 25μg/ml Chloramphenicol（和光純薬社製）, 30μg/ml Hygromycin(Sigma社製)を加えたLB寒天培地に、培養したアグロバクテリウムを拡げ、24時間以上28℃で培養した。
【０１４９】
寒天培地上に現れたコロニーを、それぞれのベクターごとに適合した上記の抗生物質を加えた2ml のLB培地にて、30℃で24時間以上培養した。培養したアグロバクテリウムから、定法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、cds6BT/pKM424ベクターもしくはCHI/pBIGRZ2ベクターがアグロバクテリウムに導入されていることを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で切断して確認した。確認されたクローンは、24時間培養した培養液に滅菌80%グリセロールを等量加えて混和後、-80℃に保存し、ナタネの形質転換に用いた。
【０１５０】
実施例６：ナタネ形質転換体の作製
ナタネへの形質転換は以下のように行った。ダイコン由来のcms原因遺伝子orf125をもつCMSナタネ（SW18）の種子を１０％の次亜塩素酸溶液で滅菌処理し、ホルモンを含まないMS培地(T.  Murashige and F.  Skoog  Physiol. Plant. 15: 485, 1962) で発芽させた。発芽後７日-１４日の幼植物から胚軸部分だけを切り取り３−５ｍｍの長さに切り分け、ＭＳ培地（シグマ社  Ｍ５５１９）＋しょ糖３％＋２．４−Ｄ  1mg/l、アガロース（シグマ社、typeI）０．４％で２３度、１２〜１６時間前培養した。このとき、保護培養のためにタバコ由来の細胞系統ＢＹ−２と共存培養を行った。
【０１５１】
一方CHI/pBIGRZ2を含むアグロバクテリウムを28℃で８〜４８時間培養し、OD600=1.0程度まで増殖させた。アグロバクテリウムの菌体は液体のMSホルモンフリー培地に懸濁した。切り分けた胚軸とこのアグロバクテリウム溶液を混ぜ合わせ、約20分共存培養した。共存培養後、アグロバクテリウムをろ紙で除去した胚軸は例えばMS基本培地＋B5ビタミン（シグマ社、Ｍ０４０４）＋スクロース３％＋２，４-Ｄ  1mg/lの培地で2日間培養し、感染させた。感染後、MS基本培地＋B5ビタミン＋スクロース３％＋２，４-Ｄ  1mg/lに抗生物質カルベニシリン（ファイザー社、ゼオペンまたはGIBCO-BRL社 Carbenicillin disodium salts）を500mg/lの濃度で添加した除菌培地に胚軸を移植し、アグロバクテリウムを除去した。
【０１５２】
上述の除菌培地で５日から1週間経過した後、胚軸はMS基本培地＋B5ビタミン＋スクロース１％＋ベンジルアミノプリン3mg/l＋カーベニシリン500mg/lに加え、硝酸銀5mg/l、また選抜用としてカナマイシン5-30mg/l（ナカライテスク社、カナマイシン硫酸塩）を添加した培地で14日-21日培養した。このとき緑色のカルスが出現する場合があるので、それらは速やかに次のステップの培地に植え替えた。
【０１５３】
次のステップの培地としては例えばMS培地(シグマ社、Ｍ５５１９)＋スクロース１％＋ベンジルアミノプリン3mg/l＋ゼアチン1mg/l＋カーベニシリン500mg/l＋カナマイシン5〜30mg/lを含む選抜培地がある。切り口からカルス形成した胚軸をこの培地に移植し23℃で3週間培養し、その後緑のカルスが出現するまで3週間後ごとに3〜5回移植を繰り返した。
【０１５４】
緑のカルスは、見つけ次第胚軸から切り取り同じ組成の培地に移した。その後、緑色の部分だけを切り取って植えついで行くと１〜３０％の確率で不定芽が形成された。不定芽はその後B5基本培地(シグマ社、Ｇ５８９３)＋スクロース３％＋ベンジルアミノプリン1mg/lに移して育成したあとMS培地（シグマ社  Ｍ５５１９）＋スクロース３％＋ナフタレン酸0．1mg/l＋ベンジルアミノプリン0．01mg/lを含む培地で発根させた。
【０１５５】
実施例７：形質転換体の解析（導入ＤＮＡの検出）
実施例６により得られた、つぼみを形成した形質転換体の１個体から葉を１枚取りキアゲン社のＤＮＡ単離キット（DNeasy plant mini）を用いてＤＮＡを単離した。
ＰＣＲ法を用いて、導入ＤＮＡ断片の３カ所(a,b,c部位)について、検出した（結果を図３に示す）。a部位は配列番号１の塩基配列3186bpから3753bpまでの568bpであり、フォワードプライマーとして「5'-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3'」（配列番号４）、リバースプライマーとして「5'-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3'」（配列番号５）を使用した。b部位は配列番号１の塩基配列4869bpから5112bpまでの244bpであり、フォワードプライマーとして「5'-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3'」（配列番号６）、リバースプライマーとして「5'-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3'」（配列番号７）を使用した。c部位は配列番号１の塩基配列7766bpから8250bpまでの485bpであり、フォワードプライマーとして「5'-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3'」（配列番号８）、リバースプライマーとして「5'-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3'」（配列番号９）を使用した。
【０１５６】
1μlの形質転換体ＤＮＡ溶液（50ng/μl）に、12.1μlの滅菌水、2μlの10xＰＣＲ 緩衝液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl) 、1.2μlの25mM MgCl2、1.6μlの2.5mM dNTP mix、1μlの各部位の10μMフォワードプライマー溶液、1μlの各部位の10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のrTaq ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、94℃40秒、55℃３０秒、72℃1分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII（Biometra社製）を使用した。反応終了後、4% Nusive3:1 Agarose(FMC社製)/1×TBE(89mM Tris-borate, 89mM boric acid, 2mM EDTA) 緩衝液のゲル電気泳動により、増幅産物を確認した（図３を参照）。
【０１５７】
その結果、a部位はこの形質転換ナタネには導入されていないことがわかった。残りの２カ所（b,c部位）は、ポジティブコントロールと同じ大きさの増幅産物が得られ、形質転換ナタネに当該ＤＮＡが組み込まれていることが確認された。
【０１５８】
実施例８：形質転換体の解析（cms原因タンパク質ＯＲＦ１２５蓄積量の減少の確認）
実施例７と同じ個体のつぼみを１つ取り、ＣＭＳタンパクであるＯＲＦ１２５の蓄積量の減少をウエスタンブロッティング法によって解析した。結果を図４に示す。
【０１５９】
（１）形質転換個体からのタンパク質抽出
タンパク質の抽出法、ウエスタンブロティング法に関して、N. Koizukaら(Theor Appl Genet(2000)100:949-955)の方法に準じて行った。
具体的には、得られた形質転換ナタネのつぼみ（長さ1mm）1つと、100μlの氷冷したタンパク質抽出緩衝液（50mM Tris-HCl(pH7.5), 2%(W/V)SDS）を氷冷した乳鉢に入れ、乳棒で磨り潰した。この液を、マイクロ遠心チューブに移し、15000rpm,15分間, 4℃で遠心した。遠心後、上澄み液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、100℃で5分間加熱した。再度15000rpm,15分間, 4℃で遠心し、上澄み液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、SDS可溶性タンパク質溶液とした。ブラッドフォード法によるタンパク質定量キット（Bio-rad社製）を用いてSDS可溶性タンパク質溶液の濃度を測定した。これと平行して、細胞質雄性不稔系統のナタネと稔性回復系統のナタネのつぼみからも同様にSDS可溶性タンパク質溶液を抽出、濃度測定を行った。
【０１６０】
（２）SDS-PAGE法によるタンパク質の分離とPVDF膜への転写：ウエスタンブロティング
7x10cm角の10%のSDSポリアクリルアミドゲルを用いて、1レーンあたり15μgのSDS可溶性タンパク質を乗せて電気泳動にて分離した。加えて、ＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量の比較のため、細胞質雄性不稔系統のナタネの希釈系列も同様に乗せて分離した。電気泳動条件は10mAで1時間、15mAで1時間行った。電気泳動後、セミドライブロティング装置（日本泳動社製）を用いて、PVDF膜（ミリポア社製）にポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、100mA, １時間の条件で転写した。
【０１６１】
（３）抗体を用いたタンパク質の検出：ウエスタンブロティング
タンパク質を転写したPVDF 膜を、上下2枚に分割し、10mlのブロッキング溶液（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20, 5%スキムミルク）に移し、１時間振とうして、ブロッキングした。上のPVDF膜でミトコンドリアタンパク質量のコントロールとしてATPAを、下のPVDF膜で細胞質雄性不稔関連タンパク質であるＯＲＦ１２５をそれぞれ検出した。10mlの１次抗体反応液（10mlのブロッキング溶液に、ATPA検出用として100μlのATPAモノクローナル抗体を加え、ＯＲＦ１２５検出用として2μlのＯＲＦ１２５に対するウサギ抗血清を加えた(M. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)）に、PVDF膜を移し１８時間振とうした。100mlのTTBS（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20）にPVDF 膜を移し、10分間振とうした。この操作を3回繰り返し過剰の一次抗体液を洗い流した。10mlの２次抗体反応液（10mlのブロッキング溶液に、ATPA検出用として10μlのパーオキシダーゼを付加したヤギ抗マウスIgG（Amersham社製）、ＯＲＦ１２５検出用として10μlのアルカリフォスファターゼを付加したヤギ抗ウサギIgG（Bio-rad社製）を加えた (M. Iwabuchi  et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)））に、PVDF膜を移しそれぞれ1時間振とうした。100mlのTTBS（20mM Tris-HCl(pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween20）にPVDF 膜を移し、10分間振とうした。この操作を3回繰り返し過剰の2次抗体液を洗い流した。ATPA検出用として、パーオキシダーゼに対する化学発光システム「ECL+」(Amersham社製)を用い、5秒間露光検出した。ＯＲＦ１２５検出用として、アルカリフォスファターゼの発色基質であるBCIP/NBT（MOSS Inc.社製）を用い、5分間発色検出した。
【０１６２】
その結果、２系統の細胞質雄性不稔ナタネのつぼみ、稔性回復ナタネ、細胞質雄性不稔系統に当該ＤＮＡ が挿入された形質転換体ナタネのつぼみでは、コントロールであるATPAの蓄積量はほとんど変化しないが、ＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量は形質転換体ナタネで優位に減少していることが示された。この減少の度合いは、細胞質雄性不稔系統に交配によって稔性回復遺伝子が導入された稔性回復系統と同等である(図４、及びM. Iwabuchi et al. Plant Molecular Biology (1999)39:183-188)。また、ＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量の減少の度合いを希釈系列と比較すると、稔性回復ナタネで1/8〜1/16、形質転換ナタネで1/8程度であることが解った。以上、先に述べたようにナタネでは稔性が回復する事とＯＲＦ１２５タンパク質の蓄積量が減少する事とは、強く連鎖し、同意の関係にあることから、当該ＤＮＡ配列は、ミトコンドリア内のＯＲＦ１２５タンパク質蓄積量を減少させる働きがあり、稔性回復遺伝子を保持したゲノムＤＮＡ 配列であることが証明された。
さらに開花体から葯を取り出し、顕微鏡観察したところ、正常な花粉が形成されていることが確認できた（図５）。
【０１６３】
実施例９：ｃＤＮＡの単離
ｃDNA の単離は、ＲＮＡ供与体として、遺伝子地図を作製したときに用いたＦ2集団よりRf1遺伝子をホモに持つ花粉稔性のあるＦ2個体を選び、つぼみからmRNAを精製した後、cDNAを合成後、5'-RACEまたは3'-RACE法を用いて行った。
（ｍRNAの精製）
Rf1遺伝子をホモに持つ花粉稔性のあるＦ2個体のつぼみから、常法であるグアニジウムチオシアネート法により、RNeasyキット（Qiagen社）を用いて、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
【０１６４】
（5'-RACEと3'-RACEによるｃDNA の単離）
精製したmRNA・１μgを用いて、5'-RACEと3'-RACE法による「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キットを用いてｃDNA を単離した。遺伝子特異的プライマーとして5'-RACEには5'-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3'（配列番号１０）を使用し、3'-RACEには、
5'-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3'（配列番号１１）を使用した。得られたクローンの塩基配列を確定後、cDNA配列を得た（配列番号２）。
【０１６５】
実施例１０：cDNAのアミノ酸配列への変換と解析
（１）ｃDNA のアミノ酸配列への変換は、通常のジェネティックコードを用いて、遺伝子解析ソフト「Genetyx-SV」（ソフトウエア開発（株））を用いて行い、配列番号３に記載のアミノ酸配列を得た。PPRモチーフの解析は、Protein families database of alignments and HMNs (以下Pfamと略 http//:www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml )にあるプログラムで行った。解析の結果、配列番号１に示した稔性回復遺伝子の翻訳産物は16個のPPRモチーフを持つタンパク質である事を見出した。またPPRモチーフは、3つのPPRクラスターとなっていた。その3つとは、
▲１▼  PPRクラスター＃１：N末端から1番目のPPRモチーフから5番目のPPRモチーフが連続した１７５残基からなるPPRクラスター、
▲２▼  PPRクラスター＃２：N末端から６番目のPPRモチーフから12番目のPPRモチーフが連続した２４５残基からなるPPRクラスター、並びに
▲３▼  PPRクラスター＃３：N末端から13番目のPPRモチーフから16番目のPPRモチーフが連続した１４０残基からなるPPRクラスター、
であった。
【０１６６】
実施例１１：本発明のタンパク質の解析
コセナ細胞質雄性不稔を引き起こす原因タンパク質ＯＲＦ１２５の遺伝子の転写産物(mRNA)に結合することで大腸菌において翻訳阻害を起こすかどうかの実験を行った。
配列番号２に示した稔性回復遺伝子を大腸菌発現ベクターpQE-80L（Qiagen社）のBamHI-SphI部位に導入し、6個のヒスチジン残基が（6XHis）N末端に付加する発現ベクターを構築した(pQEB1/cds6)。また、pSTV29（宝酒造）ベクターを鋳型として、BamHI部位を導入するプライマー：CGGGATCCGCTCACAATT（配列番号１２）と、M13プライマー  RV（宝酒造（株））を用いてＤＮＡを増幅した。ＤＮＡの増幅は、Takara LA PCR Kit（宝酒造（株））を用いた。増幅したＤＮＡを、制限酵素BamHI、EcoRI（宝酒造（株））で切断後、Suprec-02（宝酒造（株））を用いて精製した。orf125遺伝子の5'-UTR領域とorf125の25アミノ酸の両端にBamHIとEcoRI部位を有するＤＮＡ断片を合成するために、２本のプライマーを用いて、藤本の方法（植物のPCR実験プロトコール：合成ＤＮＡの実際PP84-87（秀潤社））に従って、PCRを行った。プライマーは、
0004102099.tif 000002
の２本を用いた。増幅したＤＮＡを、制限酵素BamHI、EcoRI（宝酒造（株））で切断後、Suprec-02（宝酒造（株））を用いて精製した。精製したＤＮＡはTaKaRa Ligation kit（宝酒造（株））を用いて結合させ、大腸菌DH10B(Gibco BRL社製)に形質転換した。50μg/mlのクロラムフェニコール(Sigma社製)を加えたLB寒天培地(1%Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto-Yeast Extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto-Agar, 0.1mMIPTG, 20ug/ml X-Gal)にて、18時間以上37℃で培養した。薄く青いコロニーから、定法によりプラスミドを抽出し塩基配列を確認した。この様にして、EcoRI部位からlacZ遺伝子の転写開始点の間にorf125遺伝子の5'-UTR領域とorf125の25アミノ酸を含む174bp（図６に記載の塩基配列のうち、７〜１８０番目）を導入したベクターを構築した(pSTV125-5'#LA6)。また同時に該１７４bpに相当する部分に数箇所に変異を起こさせた断片（図６に記載の塩基配列の７〜１８３番目）を持つベクターが得られた(pSTV125-5'#LA12)。
【０１６７】
該ベクターpSTV125-5'#LA6及び#LA12をそれぞれ、大腸菌DH10B（GibcoBRL社）に導入し、LB培地に50μg/mlのクロラムフェニコール（和光純薬社）、200μMのIPTG(和光純薬社)、40μg/mlのX-Gal（宝酒造社）を加えた寒天培地で、37℃一晩静地培養し、コロニーを生育させたところ、薄く青色になった。すなわち、いずれのベクターを導入した大腸菌においても導入されたLacZ遺伝子が発現したことが認められた。
【０１６８】
さらに、上述のpSTV125-5'ベクターとpQEB1/cds6ベクターとを共に上記と同様の大腸菌に導入するために、上記培地に50μg/mlのアンピシリンを加えた培地を用いて培養したところ、pSTV125-5'#LA6と共存させた場合は、コロニーが白くなったが、導入断片部位に変異を有するpSTV125-5'#LA12と共存させた場合は、コロニーが薄く青くなり、青さの程度は#LA12単独の場合と変わり無かった。尚、導入したこれらのベクターが大腸菌から欠落していないかについては、それぞれのコロニーを培養後、常法によりベクターを抽出することで確認した。
【０１６９】
以上の結果より、pQEB1/cds6ベクターにより大腸菌内で発現したタンパク質は、pSTV125-5'#LA6のmRNAと結合した結果、LacZ遺伝子の発現が抑えられ白いコロニーになったと考えられる。また、pSTV125-5'#LA12と共存させた場合には、導入断片部位に変異を有することによりpQEB1/cds6由来のタンパク質がmRNAに結合することが出来ず、その結果LacZ遺伝子が発現し青色になったと考えられる。
【０１７０】
このことから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質はorf125のmRNA、より具体的には、少なくともorf125-5'UTR領域とORF125の25アミノ酸残基のコード領域の転写産物に関与して、ORF125タンパク質の発現を抑えているものと推察される。
【０１７１】
すなわち、本発明の遺伝子の翻訳産物は、ミトコンドリアに移送された後に、該ミトコンドリア内で、雄性不稔遺伝子と結合し、翻訳を阻害することで、細胞質雄性不稔の原因タンパク質の蓄積量を減少させることにより、細胞質雄性不稔性を可稔に回復していることが推察される。
【０１７２】
実施例１２：コセナナタネ稔性回復遺伝子の単離
コセナダイコンの稔性回復遺伝子を細胞融合により導入して得られたナタネの系統（以下コセナナタネ）から、PCR法を用いて稔性回復遺伝子のゲノム配列を得た。コセナナタネの葉0.1gからキアゲン社のDNA単離キット（DNeasy plant mini）を用いてＤＮＡを抽出した。DNA増幅のために、配列番号１の塩基配列1027bpから1059bpbpまでの配列である5'-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3'（配列番号３０）を、フォワードプライマーとして設定し、配列番号１の塩基配列7675bpから7651bpbpまでの配列である5'-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3'（配列番号３１）を、リバースプライマーとして設定した。
【０１７３】
10μlのコセナナタネＤＮＡ溶液（50ng/μl）に、49μlの滅菌水、10μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、10μlの25mM MgCl2、16μlの2.5mM dNTP mix、2μlの10μMフォワードプライマー溶液、2μlの10μMリバースプライマー溶液、1μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq （宝酒造社製）を加えて混和後、98℃20秒、68℃15分のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。反応終了後、限外ろ過フィルターMicrocon-PCR（ミリポア社製）を用いて約６ｋｂの増幅産物を精製した。精製された増幅産物を鋳型として、配列番号１における４２８０〜７５８５番目に相当する部分について、定法により塩基配列3306bpを決定した（配列番号１５）。得られたコセナナタネのゲノム塩基配列と園紅ダイコンの配列を比較したところ、3306bpのうち7bpのみDNA塩基置換がみつかり、高い相同性を有することが解った。
【０１７４】
またコセナナタネの稔性回復遺伝子の3'部分cDNA配列を、RT-PCR法により取得し、イントロンが園紅ダイコンと同じ形でスプライスされている事を確認した。コセナナタネのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社  細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎  P161〜166）により、全RNA を抽出した。１μg の全RNAより、SUPERSCRIPT II RNaseH- Reverse Transcriptase (Invitrogen社製)を用いてｃDNA を合成した。稔性回復遺伝子3'部分特異的フォワードプライマーとして5'-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC-3'（配列番号３２）を使用し、稔性回復遺伝子3'部分特異的リバースプライマーとして、5'-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3'（配列番号３３）を使用した。1μlのコセナナタネcDNA溶液に、14.9μlの滅菌水、2.5μlの10x PCR緩衝液(宝酒造社製) 、1.5μlの25mM MgCl2、2μlの2.5mM dNTP mix、1.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、1.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のTaKaRa Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、94℃40秒、60℃３０秒、72℃2分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）,  1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンについて定法により塩基配列を確定し、コセナナタネのcDNAは、園紅ダイコンと同様に、イントロンがスプライスされていることが確認できた。すなわち、先のゲノム配列の比較により見つかった7bpの塩基置換は配列番号１の5444bp-5814bpに存在し、スプライシングに影響を与えていないことが判明した。
【０１７５】
以上のことからコセナナタネの稔性回復遺伝子は、園紅ダイコンと同様な形でmRNAを発現していることが解った。翻訳領域のみをコードするcDNA配列を配列番号１６に記す。さらに、このcDNA配列からアミノ酸配列を得た（配列番号１７）。
【０１７６】
実施例１３：ダイコン野生種Raphanus raphanistrum (以下R.. raphanistrum)稔性回復遺伝子部分配列の単離
R.. raphanistrumの稔性回復遺伝子の部分配列をcDNAから単離した。
（mRNAの精製）
R.. raphanistrumのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社  細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎  P161〜166）により、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
（ｃDNAの部分配列単離）
精製した１μg のmRNAより、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いてｃDNA を合成した。
稔性回復遺伝子特異的フォワードプライマーとして
5'-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3'（配列番号３４）を使用し、
稔性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、
5'-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3'（配列番号３５）を使用した。
【０１７７】
1μlのR.. raphanistrum cDNA溶液に、14.4μlの滅菌水、2.5μlの10x Pyrobest PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの2.5mM dNTP mix、2.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、2.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、55℃３０秒、72℃1分30秒のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。増幅したDNA溶液に 0.1μlの5 unit/μl TaKaRa Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、72℃10分加温処理し、DNAの3'末端にアデニンヌクレオチドを付加した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）,  1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを定法により塩基配列を確定後、cDNA部分配列を得た（配列番号２０）。さらにcDNA配列から、アミノ酸配列を得た（配列番号２１）。
【０１７８】
実施例１４：オグラナタネ稔性回復遺伝子の単離
オグラダイコンの稔性回復遺伝子を交配により導入して得られたナタネの系統（以下オグラナタネ）から、5'-RACE法と3'-RACE法を用いて稔性回復遺伝子のcDNA配列を単離した。
（ｍRNAの精製）
オグラナタネのつぼみから、常法であるAGPC（Acid Guanidium-Phenol-Chloroform）法（秀潤社  細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎  P161〜166）により、全RNA を抽出した。全RNA からPolyA+RNAを、Origo(dT)セルロースカラムを用いた「mRNA Purification kit」（Amersham Pharmacia社）を用いて精製しmRNAとした。
（ｃDNAの部分配列単離）
精製した１μg のmRNAより、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いてｃDNA を合成した。稔性回復遺伝子特異的フォワードプライマーとして5'-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3'（配列番号３６）を使用し、稔性回復遺伝子特異的リバースプライマーとして、5'-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3'（配列番号３７）を使用した。
【０１７９】
1μlのオグラナタネcDNA溶液に、14.4μlの滅菌水、2.5μlの10x Pyrobest PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの2.5mM dNTP mix、2.5μlの10μMフォワードプライマー溶液、2.5μlの10μMリバースプライマー溶液、0.1μlの5 unit/μl のPyrobest ＤＮＡ polymerase（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、55℃３０秒、72℃1分30秒のサイクルを30回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。増幅したDNA溶液に 0.1μlの5 unit/μl のTaKaRa Taqを加えて混和後、72℃10分加温処理し、DNAの3'末端にアデニンヌクレオチドを付加した。3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）,  1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンを定法により塩基配列を確定後、4種類のcDNA部分配列を得た。得られた４種類の配列情報を基にして、４つに共通な部分に5'-RACEと3'-RACE用のプライマーを設定し、それぞれcDNA単離を行った。
【０１８０】
（5'-RACEと3'-RACEによるｃDNA の単離）
上記と同様にcDNA を合成し、「Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE」キット(Clontech社製)を用いて5'-RACEと3'-RACE法を行いｃDNA を単離した。遺伝子特異的プライマーとして5'-RACEには
5'-CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3'（配列番号３７）と5'-GTCCGGAGAGCAGCCCTTGGTAG-3'（配列番号３８）を使用し、3'-RACEには、5'-TCATCGTATAATTCTTCAGCCTC-3'（配列番号３９）を使用した。
【０１８１】
5'RACEでは、２回PCRを行いDNAを得た。2μlの250倍希釈したオグラナタネcDNA溶液に、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl2、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号9907Fのプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、72℃3分のサイクルを５回、98℃5秒、70℃3分3のサイクルを５回、98℃5秒、68℃3分のサイクルを25回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。得られたDNA溶液を100倍希釈し、そのうちの2μlに、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl2、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号5'ogu-1のプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、72℃3分のサイクルを５回、98℃5秒、70℃3分3のサイクルを５回、98℃5秒、68℃3分のサイクルを25回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。サーマルサイクラーは、UNOII （Biometra社製）を使用した。
【０１８２】
3'RACEでは、2μlの50倍希釈したオグラナタネcDNA溶液に、8.6μlの滅菌水、2μlの10x LA PCR緩衝液(宝酒造社製) 、2μlの25mM MgCl2、3.2μlの2.5mM dNTP mix、1μlの10μM配列番号3'ogu-1のプライマー溶液、1μlの10μMアダプタープライマー溶液（Marathon RACE system 5'RACE 3'RACE キット、Clontech社製）、0.2μlの5 unit/μl のTaKaRa LA Taq（宝酒造社製）を加えて混和後、98℃5秒、63℃30秒、72℃2分のサイクルを35回繰り返す事によりＤＮＡを増幅した。
【０１８３】
3μlの増幅産物に、pGEM-Teasy ベクター（プロメガ社製）1μlと5μlの2xligation 緩衝液（プロメガ社製）、1μlのT4 DNA ligase（プロメガ社製）を加え、室温で1時間放置して、ベクターに結合させた。このベクターを大腸菌DH5α(Gibco BRL社製)に形質転換してクローンを得た。得られたクローンの塩基配列を確定後、上記4種類のcDNA部分配列に対応する5'-RACE配列と3'-RACE配列を得て、各々の配列を結合して全長ｃDNA 配列を得た。この内園紅ダイコンのｃDNA 配列と最も相同性の高い配列をコセナナタネの稔性回復遺伝子とした（配列番号１８）。さらにcDNA配列から、アミノ酸配列を得た（配列番号１９）。
【０１８４】
実施例１５：稔性回復遺伝子の解析
上記の方法で得られた各々の稔性回復遺伝子について、cDNA 配列及びアミノ酸配列の相同性については遺伝子解析ソフト「Mac Vector6.5」（Oxford MolecularLtd.）を用い、モチーフ解析については、英国のサンガー研究所内にあるProtein families database of alignments and HMNsを用いて、解析を行った。
【０１８５】
本発明の園紅ダイコン、コセナナタネ及びオグラナタネ由来のＲｆ遺伝子は、いずれもＰＰＲモチーフを１６個有し、このＰＰＲモチーフ群はアミノ末端側から５個、７個及び４個の３つのブロックに分割されている上、アミノ末端側から２番目のＰＰＲモチーフに存在する４番目のアミノ酸がアスパラギンであった。また、ラファナス・ラファニストラム由来の部分断片についても、上述の配列に対し相当する部分（配列番号２６の９４〜２６４番目）に当てはめて解析したところ、アミノ末端の１番目から６番目のPPRモチーフに相当する部分を有しており、PPRモチーフ群とアミノ末端側から２番目のＰＰＲモチーフに存在する４番目のアミノ酸についても上記の特徴を有していた。
【０１８６】
さらに園紅ダイコン、コセナナタネ、オグラナタネから得られた3種の稔性回復遺伝子とR.. raphanistrum稔性回復遺伝子部分配列についての解析の結果得られた本発明のタンパク質(配列番号２６）及びそれをコードする遺伝子(配列番号２２)の中でも、園紅ダイコンとコセナナタネは相同性が非常に高く、アミノ酸配列では９９．６％（3箇所のアミノ酸で違いが見られただけであった）、塩基配列では99.7％と高い値を示すことから、特に好ましくは配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びそれをコードする遺伝子(配列番号２５)が挙げられる。
【０１８７】
その一方で、オグラナタネと園紅ダイコン、そしてオグラナタネとコセナナタネを比較するといずれも高い相同性が認められたが、それぞれの相同性がアミノ酸配列ではオグラナタネと園紅ダイコンを比較すると92.0％、オグラナタネとコセナナタネでは91.6%であり、塩基配列ではいずれも95％程度と、園紅ダイコンとコセナナタネ間の値よりは低い値を示した。
【０１８８】
【発明の効果】
本発明により、Ｒｆ遺伝子、特には、ダイコン由来のＲｆ１遺伝子が単離され、その構造が同定された。さらに、本発明によれば、単離したＲｆ遺伝子を利用してナタネ回復系統を確立する手段を提供することが可能になった。
【０１８９】
【配列表】
0004102099.tif 000003
0004102099.tif 000004
0004102099.tif 000005
0004102099.tif 000006
0004102099.tif 000007
0004102099.tif 000008
【０１９１】
0004102099.tif 000009
0004102099.tif 000010
0004102099.tif 000011
0004102099.tif 000012
0004102099.tif 000013
【０１９２】
0004102099.tif 000014
0004102099.tif 000015
0004102099.tif 000016
0004102099.tif 000017
【０１９３】
0004102099.tif 000018
【０１９４】
0004102099.tif 000019
【０１９５】
0004102099.tif 000020
【０１９６】
0004102099.tif 000021
【０１９７】
0004102099.tif 000022
【０１９８】
0004102099.tif 000023
【０１９９】
0004102099.tif 000024
【０２００】
0004102099.tif 000025
【０２０１】
0004102099.tif 000026
【０２０２】
0004102099.tif 000027
【０２０３】
0004102099.tif 000028
【０２０４】
0004102099.tif 000029
0004102099.tif 000030
0004102099.tif 000031
【０２０５】
0004102099.tif 000032
0004102099.tif 000033
0004102099.tif 000034
0004102099.tif 000035
0004102099.tif 000036
【０２０６】
0004102099.tif 000037
0004102099.tif 000038
0004102099.tif 000039
0004102099.tif 000040
【０２０７】
0004102099.tif 000041
0004102099.tif 000042
0004102099.tif 000043
0004102099.tif 000044
0004102099.tif 000045
690
【０２０８】
0004102099.tif 000046
0004102099.tif 000047
0004102099.tif 000048
0004102099.tif 000049
【０２０９】
0004102099.tif 000050
0004102099.tif 000051
【０２１０】
0004102099.tif 000052
【０２１１】
0004102099.tif 000053
0004102099.tif 000054
【０２１２】
0004102099.tif 000055
0004102099.tif 000056
【０２１３】
0004102099.tif 000057
0004102099.tif 000058
【０２１４】
0004102099.tif 000059
0004102099.tif 000060
【０２１５】
0004102099.tif 000061
0004102099.tif 000062
0004102099.tif 000063
0004102099.tif 000064
0004102099.tif 000065
0004102099.tif 000066
0004102099.tif 000067
0004102099.tif 000068
0004102099.tif 000069
0004102099.tif 000070
0004102099.tif 000071
【０２１６】
0004102099.tif 000072
0004102099.tif 000073
0004102099.tif 000074
0004102099.tif 000075
0004102099.tif 000076
0004102099.tif 000077
0004102099.tif 000078
0004102099.tif 000079
0004102099.tif 000080
0004102099.tif 000081
【０２１７】
0004102099.tif 000082
0004102099.tif 000083
0004102099.tif 000084
0004102099.tif 000085
0004102099.tif 000086
0004102099.tif 000087
【０２１８】
0004102099.tif 000088
0004102099.tif 000089
0004102099.tif 000090
0004102099.tif 000091
【０２１９】
0004102099.tif 000092
【０２２０】
0004102099.tif 000093
【０２２１】
0004102099.tif 000094
【０２２２】
0004102099.tif 000095
【０２２３】
0004102099.tif 000096
【０２２４】
0004102099.tif 000097
【０２２５】
0004102099.tif 000098
【０２２６】
0004102099.tif 000099
【０２２７】
0004102099.tif 000100
【０２２８】
0004102099.tif 000101
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｒｆマーカー遺伝地図を示す。
【図２】図２は、配列番号１に記載の塩基配列を十分に保持するラムダクローンCHIの構造の模式図を示す。
【図３】図３は、形質転換体中の導入ＤＮＡをＰＣＲ法を用いて検出した結果を示す。
【図４】図４は、形質転換体中におけるＣＭＳタンパクであるＯＲＦ１２５の蓄積量の減少をウエスタンブロッティング法により解析した結果を示す。
【図５】図５は、形質転換ナタネの開花体から葯を取り出し、顕微鏡観察した結果を示す。
【図６】図６は、pSTV125-5'#LA6とpSTV125-5'#LA12の塩基配列を示す。
【図１】
0004102099.tif 000102
【図２】
0004102099.tif 000103
【図３】
0004102099.tif 000104
【図４】
0004102099.tif 000105
【図５】
0004102099.tif 000106
【図６】
0004102099.tif 000107