(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌（Bacillus natto）の細胞壁を卵白リゾチームで溶解した後、ブロメライン又はセラチオペプチダーゼで処理するＩｇＥ抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項２】
卵白リゾチームによる細胞壁の溶解を等張圧の媒体中で行い、生じたプロトプラストを分離除去し、媒体中の可溶化画分をブロメライン又はセラチオペプチダーゼで処理する請求項１記載のＩｇＥ抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法により得られたＩｇＥ抗体産生抑制物質。
【請求項４】
請求項３記載のＩｇＥ抗体産生抑制物質を含有する食品または飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な免疫調節活性を有する菌体分解物およびその製造方法並びにそれを用いた食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アレルギーはその発症の免疫学的機序によって１型から４型に分類されている。このうち、１型アレルギーは別名即時型アレルギー、アトピーとも呼ばれ、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーなどの発症機序の主な原因となっており、抗原に対するＩｇＥタイプの免疫グロブリンがその原因である。これに対し、２型、３型アレルギーはＩｇＧおよびＩｇＭタイプの免疫グロブリンによる。
【０００３】
通常、アレルギー体質といわれるのは、１型アレルギーを発症しやすい体質を称するが、通常アレルギー体質の患者においては、血液中のＩｇＥ抗体の濃度が高く、様々な抗原に対して容易にＩｇＥ抗体を産生することが知られている。産生されたＩｇＥ抗体は皮膚や目、鼻、気管、消化管などの粘膜組織に多い肥満細胞表面にあるＩｇＥ抗体の受容体に結合する。１型アレルギーの発症は、この抗体に抗原が結合すると肥満細胞からヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンなどの生理活性物質（メデイエーター）が放出され、アレルギー反応が惹起される。また、肥満細胞のみならず、抗原特異的なリンパ球と抗原との反応に伴い、これらの細胞から産生される各種サイトカインを介して、好酸球などが活性化され炎症反応が進行する。
【０００４】
１型アレルギーの予防治療には、現在これらのメデイエーターの拮抗する薬剤（抗ヒスタミン剤、抗セロトニン剤、抗ロイコトリエン剤）や、肥満細胞からこれらのメデイエーターの放出を阻止する薬剤、免疫担当細胞の活性化を抑制してサイトカインの産生を抑制したり、サイトカインによる活性化を抑える副腎ホルモンステロイド剤などが医薬品として用いられている。
【０００５】
１型アレルギーの原因抗体は、先に述べたようにＩｇＥ抗体であるので、ＩｇＥ抗体の産生を抑制する薬剤は１型アレルギーの原因療法として有効と考えられる。抗体の産生を抑制する薬剤として従来から知られている薬品としては制癌作用を有する薬剤などが知られているが、これらの薬物は毒性が強いために、アレルギー疾患の治療には使用されていない。先に述べた、２型、３型アレルギーはＩｇＧおよびＩｇＭタイプの免疫グロブリンによるとされているが、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体はＩｇＡ抗体とともに、ウイルスや病原性細菌に対する防御作用に重要な抗体であり、生体の正常な免疫機能の維持のためには、これらの抗体にはむしろ増強させるような薬剤ないし食品が開発されることが望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＩｇＧ抗体などの抗体産生に影響しないか、乃至は増強するのに対し、ＩｇＥ抗体の産生を抑制し、アトピー、アレルギー体質を改善できる食品添加物ないしは健康食品を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究の結果、Bacillus属細菌及び／又は乳酸菌の酵素等による分解物を含む食品を摂取することにより、ＩｇＧ抗体などの抗体産生に影響しないか、乃至は増強するのに対し、ＩｇＥ抗体の産生を抑制することができることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
動物において免疫抗体を効率よく産生させるために、抗原と混合して非経口的に投与されるものを称して、免疫アジュバントと呼んでいる。結核菌死菌体には免疫アジュバント作用があることが古くから知られている。その免疫アジュバント作用の有効成分を追求した結果、最小構成単位は細胞壁のペプチドグリカン構成成分であるムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）であった。また、ＭＤＰは結核菌のみならず、病原性、非病原性、グラム染色の陽性陰性菌を問わず、全ての細菌にあることが知られている。実際検討された殆どの細菌で、ＭＤＰを含む細胞壁分画は免疫アジュバント作用を示した。また、化学合成したＭＤＰは経口的に投与しても免疫増強作用を示した（小谷尚三、生化学、第48巻第12号第1081─1107頁、1976) 。
【０００９】
以上の背景から、免疫増強作用を目的として、様々な研究がなされ、細胞壁を含む分画について、腫瘍に対する抵抗性（Bogdanov IG et al.,Antitumor glycopeptides from Lactobacillus bulgaricus cell wall FEBS LETT. 1975 57(3):251-261) や、細菌感染に対する抵抗に関係するマクロファージや細胞免疫の活性化や、細菌ウイルス感染に対する抵抗性に重要な役割をになうＩｇＧ抗体の増強作用（Namba Y et al.,Effect of oral administration of Isozyme or digested cell wall on immunostimulation in guinea pigs.,Infect Immun 31:580-583 1981)が知られている。また、活性と構造との関係では、細胞壁、その酵素消化物について研究がなされた（小谷尚三、生化学、第48巻第12号第1081─1107頁、1976) 。
しかし、これまでの研究はＭＤＰを含有する分画がアトピーなどの１型アレルギーの原因抗体の産生にどのような影響を有するかについては知られていなかった。
【００１０】
本発明者らは、納豆菌と乳酸菌について、菌体とその酵素消化物を作成し、経口的に摂取させた場合のＩｇＥ抗体産生について調べ、両細菌ともに、そのＭＤＰを含む酵素分解物を投与することにより、ＩｇＥ抗体の産生を抑制することができること、菌体それ自体では上記活性は弱いが細胞壁溶解酵素により酵素分解することにより、ＩｇＥ抗体産生の抑制活性が増強されることを見出した。
【００１１】
細菌細胞壁のムコペプチド層は、Ｎ−アセチルグルコサミンとムラミン酸がβ−１，４結合で長鎖に結合したポリマーとムラミン酸のカルボキシル残基からペプチド結合でＬ−アラニンまたはＬ−グリシン、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−リジンまたはメメゾジアミノピメリン酸、Ｄ−アラニンなどの順にアミノ酸が結合する。最後のＤ−アラニンは隣の糖鎖のムラミン酸のカルボキシル残基から同様に派生するペプチド鎖のＤ−グルタミンまたはＬ−リジンまたはメメゾジアミノピメリン酸にペプチド結合する。糖鎖間にまたがって結合するアミノ酸の数は、菌により異なるが、全て６乃至７残基のアミノ酸である。平行に並ぶ糖鎖と糖鎖を縦の糸とすると、これらと糖鎖を結ぶペプチド結合は横の糸の関係で、両者により網の構造をなし、ペプチドグリカンとも命名されている。ペプチドグリカンは細胞質を含む形となり、細胞が浸透圧の変化にも物理的に対応できる強固な壁を形成する。
【００１２】
細菌細胞壁溶解酵素は、ペプチドグリカンを加水分解する酵素で酵素の作用機序から大別して糖鎖を切断するグリコシダーゼ型酵素（例えば卵白リゾチームなど）、ペプチド結合に作用するエンドペプチダーゼ（例えばAchromobacter プロテアーゼＩ）、糖鎖のムラミン酸とアミノ酸の結合を分解するアミダーゼの３者に大別される。
【００１３】
本発明はBacillus属細菌及び／又は乳酸菌の細胞壁を溶解してえられた免疫調節活性を有する菌体分解物（以下、免疫調節活性分解物という）およびその製造方法、並びにそれを含有する食品または飲料である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
Bacillus属細菌および乳酸菌は入手容易な細菌であり、なかでも納豆菌（Bacillus natto) は食品としてその安全性が認められており、また好気性菌であるため、培養が容易で菌体の生産効率もよく、経済的にも安価であるという利点がある。Bacillus属細菌としては、納豆菌のほか、Bacillus  subtilis、Bacillusmegateriumを挙げることができる。また、乳酸菌としては、Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbruckii, Biphidobacterium longum,および Leuconostoc mesenteroidesを挙げることができる。
【００１５】
Bacillus属細菌および乳酸菌の培養は任意の培地を用いて公知の方法で培養すればよい。菌体は培養物そのもの、遠心分離生菌体、凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体などいずれも使用できる。
【００１６】
菌体より本発明の免疫調節活性分解物の製造は、菌体細胞の細胞壁の溶解によるが細胞壁の溶解法としては、細胞壁溶解酵素による方法、溶原ファージの誘発による方法および菌自体の有する自己融解酵素による方法を挙げることができる。
【００１７】
これらのうち、効率のよい細胞壁溶解酵素による方法は細胞壁溶解酵素グルコシダーゼ型酵素及び／又はエンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素を作用させる方法である。本発明においては両者の酵素の単独よりも両酵素の併用が優れた活性を有する分解物を生ずることができ、好ましい。また、両者のうちではグルコシダーゼ型酵素を用いる分解が効率的であり、グルコシダーゼ型酵素としては卵白リゾチーム、細菌リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミデイスＳＧを挙げることができるが、安全性の点から食品添加物として用いられている卵白リゾチームが好ましい。
【００１８】
エンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素としてはブロメライン、セラチオペプチターゼ、プロナーゼ（Streptomyces griseus f1-エンドペプチダーゼ）、ナガーゼ（Subtilisin BPN) 、セアプローゼＳ(Armillaria mellea（ナラタケ）プロテアーゼ）、トリプシン、Achromobacter プロテアーゼI(リシルエンドペプチダーゼ）、Grifola frondosa（マイタケ）メタロエンドペプチダーゼを挙げることができるが、基質特異性が広く、食品の加工に用いられているブロメラインが最も好ましい。
【００１９】
これらの酵素による処理はそれぞれの酵素の至適ｐＨ付近で行う。グリコシダーゼ型酵素及びエンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素処理は通常の中性付近ｐＨ５〜８で、酵素の添加量は乾燥菌体１ｇ当たり０．０１〜１０ｍｇ、温度は室温から３０〜７０℃でよい。酵素処理物には、粘度を下げる必要に応じて、核酸分解酵素ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅを１０〜５００μｇ／ｍｌ加えてもよい。
【００２０】
溶原ファージの誘発による菌体の融解はBacillus属細菌を４５℃で５分処理の後、４２℃で培養することにより行う。また、自己融解による方法は菌体を精製水に懸濁し、５０℃付近に１〜３日間保温することにより行う。
【００２１】
具体的な免疫調節活性分解物の製造方法としては、例えば納豆菌を適当な培地中で培養した後、遠心分離して集菌し、例えば生理食塩液などの等張圧の媒体中で菌体懸濁液に卵白リゾチーム等のグリコシダーゼ型酵素、またはブロメライン等のエンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素を添加して細胞壁を溶かし、菌体の細胞膜とこれに囲まれた細胞質をプロトプラストの状態として残し、これを遠心分離または分子篩などの手段で分離除去した後、上澄み液に、他方の酵素、すなわちエンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素、またはグリコシダーゼ型酵素を作用させる方法を挙げることができるが、グリコシダーゼ型酵素でまず細胞壁を溶解してプロトプラストを分離除去後、エンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素処理を行う方が効率が高く、好ましい。プロトプラストを分離除去することにより該媒体可溶化画分に効率よく活性分解物を精製することができる。生じる免疫調節活性分解物の濃縮はエタノール、アセトン分別によることもできる。
【００２２】
また、別な製造方法しては、例えば納豆菌を培養後、分離集菌し、精製水中に懸濁してグリコシダーゼ型酵素を加えて攪拌して細胞壁を溶かし、その後エンドペプチダーゼ型蛋白分解酵素を加えてさらに攪拌する方法によってもよい。
【００２３】
本発明の免疫調節活性分解物の標準的な摂取量は乾燥死菌体に換算して一日０．２〜２ｇ相当量で、好ましくは１ｇ程度である。
【００２４】
本発明の免疫調節活性分解物は粉末、倍散、錠剤、カプセル、お菓子、パン、麺類、ドリンク剤などの形態で食品または飲料とすることができる。これらの食品は公知の方法によって製造すればよい。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。実施例中、％、部はともに重量基準である。
【００２６】
実施例１
ソイビーンカゼインダイジェスト（ＳＣＤ）培地１０ｍｌを含むＬ字管に納豆菌（ＢＮ−２株）を接種し３７℃で７時間振盪培養した。この培養液の各１ｍｌをＳＣＤ培地１００ｍｌを含む坂口フラスコ４本に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。菌体を遠心して集菌し、約５ｇの湿菌体を得た。生理食塩液で１回遠心洗浄の後、菌体に精製水２０ｍｌを加えて懸濁し、攪拌しながら卵白リゾチーム５ｍｇを加え、３７℃で１時間攪拌の後、セラチオペプチターゼ１０ｍｇを加え、さらに３７℃で１時間攪拌し、分解物とした。分解物を８０℃で３０分間加熱の後、凍結乾燥し、乾燥物１ｇを得た。
【００２７】
実施例２
ソイビーンカゼインダイジェスト（ＳＣＤ）培地１００ｍｌを含む坂口フラスコに納豆菌（ＢＮ−２株）を接種し３７℃で１８時間振盪培養した。この培養液の各１ｍｌをＳＣＤ培地１００ｍｌを含む坂口フラスコ４０本に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。菌体を遠心して集菌し、約５０ｇの湿菌体を得た。生理食塩液で１回遠心洗浄の後、菌体に生理食塩液２００ｍｌを加えて懸濁し、攪拌しながら卵白リゾチーム５０ｍｇを加え、３７℃で１時間攪拌の後、１３０００回転／３０分遠心して沈殿するプロトプラストを除き、上澄みを分取した。上澄みにセラチオペプチターゼ５０ｍｇを加え、さらに３７℃で１時間攪拌し、分解物とした。分解物を８０℃で３０分間加熱の後、透析して食塩を除いた後、凍結乾燥し、乾燥物１．２ｇを得た。
【００２８】
実施例３
セラチオペプチターゼ５０ｍｇの代わりにブロメライン５０ｍｇを用いるほかは実施例２と同様に処理して乾燥物１．０ｇを得た。
【００２９】
実施例４
納豆菌（三浦株）の凍結乾燥菌体１ｋｇを２０リットルの生理食塩液に懸濁し、３０℃で攪拌しつつ、卵白リゾチーム５ｇを含む生理食塩液１００ｍｌを加えて３０℃で１時間攪拌の後、ブロメライン１０ｇを含む生理食塩液２００ｍｌを加え、さらに３０℃で１時間攪拌し、分解物とした。分解物を噴霧乾燥し、乾燥物１ｋｇを得た。
【００３０】
実施例５
納豆菌（三浦株）の凍結乾燥菌体１ｋｇを２０リットルの精製水に懸濁し、５０℃に２４時間静置し自己融解させた。自己融解物を噴霧乾燥し、乾燥物１ｋｇを得た。
【００３１】
実施例６
Bacillus subtilis 溶原ファージの誘導による溶菌を以下のようにして実施した。
ソイビーンカゼインダイジェスト（ＳＣＤ）培地１００ｍｌを含む坂口フラスコにBacillus subtilis marburg 株を接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。この培養物の各１ｍｌをＳＣＤ培地１００ｍｌを含む坂口フラスコ４０本に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。菌体を遠心して集菌し、約５０ｇの湿菌体を得た。菌体を４５℃の２リットルの新鮮培地に懸濁した。通気しつつ、５分間培養の後、氷冷した培地を加えて培養温度を４２℃にし、６０分培養を続けた。菌液の濃度は６１０ｎｍの吸光度で測定した。通気培養開始時ＯＤ610nm ＝２８であったが、４２℃、６０分後にはＯＤ610nm ＝６．５となり、溶菌が確認された。
【００３２】
実施例７
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス１群６匹に納豆菌加熱死体、実施例３と４で得られた乾燥物、のそれぞれを加えた混餌飼料を作成した。混餌飼料で２週間飼育の後、卵白アルブミン１０μｇ、水酸化アルミニウム１ｍｇを含む０．１ｍｌで免疫した。免疫の１４日後に眼底静脈叢より採血し血清を分離した。６匹の血清をプールし、プール血清のＩｇＥ抗体をラットにおける受け身皮膚反応により測定した。すなわち、１５〜２０週齢の雄性ＳＤ系ラットの背部の毛を刈り、ネンブタール麻酔下に、皮内に注射用生理食塩液で希釈した血清の０．１ｍｌを各希釈血清とも２匹の動物に投与した。皮内投与の２４時間後に、ネンブタール麻酔下に、エヴァンスブルー色素１０ｍｇと卵白アルブミン１ｍｇを含む生理食塩液１ｍｌを静脈内投与し、静脈内投与の３０分後に皮内投与部位に見られた青色漏出色素の長径と短径を計り、その平均径が５ｍｍ以上を陽性と判定した。抗体価は血清の希釈倍数で示し、２匹の抗体価の高い値をその血清の抗体価とした。結果を表１に示した。なお、表中効果の判定は血清希釈２倍希釈倍数で２管以上の差を有意とし、１管の差につき＋と判定した。
【００３３】
【表１】
0004074006.tif 000002
【００３４】
抗原刺激の前処理でＩｇＥ抗体産生を抑制したことは、菌体およびその分解物の摂取により生体の反応性乃至体質に影響していることを示した。また菌体自体より実施例４の分解物摂取群で強い抑制が認められたことは、酵素分解により活性が強まったこと、さらに、ＩｇＥ抗体産生抑制作用が実施例３の分解物摂取群で最も高かったことはその活性分解物は主として細胞壁の構成成分であることを示した。
【００３５】
実施例８
免疫調節活性分解物摂取のＩｇＧ抗体産生に及ぼす作用を卵白アルブミンで免疫したマウス血清中の抗卵白アルブミンＩｇＧ抗体産生により調べた。すなわち、平底９６穴マイクロプレート（Coster,Cambridge,MA,USA)に、０．０５ＭのｐＨ９．５の炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した卵白アルブミン０．１ｍｇ／ｍｌの５０μｌを入れ、４℃に一晩置いた。洗浄液（０．９％ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、牛血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝生理食塩水（日水製薬、ＰＢＳ）２００を加え、３７℃、１時間おいてブロッキングし、洗浄後、牛血清アルブミン１０ｍｇ／ｍｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、食塩３％を含むＰＢＳ（溶液Ａ）にて希釈した実施例７のマウス血清を加え、３７℃に１時間置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（生化学工業製）の溶液Ａによる１００００倍希釈液５０μｌを加え、３７℃に１時間置いた後、洗浄し、基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン４０ｍｇ、３０％過酸化水素２０μｌ／クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液１００ｍｌ）１００μｌを加え、室温に置き、４９２ｎｍの吸光度で測定した。
【００３６】
抗体量は、卵白アルブミンをフロインドの完全アジュバントとともに免疫したマウス血清より、卵白アルブミン結合セファロース４Ｂアフィニテイーカラムを用いて精製したＩｇＧ抗体を用いて作成した検量線より求めた。実施例７で用いたプール血清中の抗卵白アルブミンＩｇＧ抗体（抗ＥＡＩｇＧ）の測定結果を表２に示した。
【００３７】
【表２】
0004074006.tif 000003
【００３８】
この結果は納豆菌の菌体乃至酵素分解物の摂取により、ＩｇＧ抗体産生の増強（対照群の２倍以上）乃至増強傾向を示している。
【００３９】
実施例９
ＩｇＥ抗体産生抑制性分解物の安全性
４週齢のＳＤ系雄ラット一群５匹に実施例４で得られた酵素分解物の２ｇ／ｋｇ体重当てを強制経口投与し、単回投与における安全性を調べた。また、４週齢のＳＤ系雄ラット一群１０匹に５％含有する飼料で４週間に亘って飼育し、飼料のみを与えた群を対照群として投与群と比較した。その結果、単回投与では何らの急性症状も認められず、表３に示した如く、反復投与試験においても、体重増加、一般状態ともに対照群との間に差は認められなかった。
【００４０】
【表３】
0004074006.tif 000004
【００４１】
実施例１０
実施例４で得られた納豆菌の卵白リゾチームおよびブロメラインを用いた酵素分解物９０ｍｇ、デンプン３０ｍｇ、アビセル（セルロース）１８０ｍｇの割合で用いて１錠３００ｍｇの食品を常法により製造した。
【００４２】
実施例１１
実施例４で得られた納豆菌の卵白リゾチーム及びブロメラインを用いた分解物２部、ココアバター１０部、グラニュー糖７部、牛乳７部、乳化剤０．０５部に精製水を加え、全量を１００部とし、常法によりココア飲料を製造した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によるとＩｇＧ抗体の産生を増強し、ＩｇＥ抗体の産生を選択的に抑制する免疫調節活性分解物を容易に製造することができ、そのような作用を有する食品を提供することができる。