(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップの、測定時に光を入射させる側と反対側の表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成る物質測定用センサー。
【請求項２】
前記核酸は、前記リプレッサータンパク質と結合するオペレーター配列又は該配列において１又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であって前記リプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸である請求項１記載のセンサー。
【請求項３】
前記核酸は、カンファーヒドロキシラーゼオペロンのオペレーター配列又は該配列において１又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する核酸である請求項２記載のセンサー。
【請求項４】
前記核酸は、配列表の配列番号１で示される塩基配列又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸である請求項３記載のセンサー。
【請求項５】
前記核酸は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を有する核酸である請求項４記載のセンサー。
【請求項６】
前記測定すべき物質は、臭気物質である請求項１ないし５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項７】
前記臭気物質は、カンファー、２−メチルイソボルネオール、イソボルネオール又はジェオスミンである請求項６記載のセンサー。
【請求項８】
前記リプレッサータンパク質は、天然のリプレッサータンパク質にのアミノ末端に複数のヒスチジンの繰返しから成るタグが付されたものである請求項１ないし７のいずれか１項に記載のセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臭気物質等の各種物質の測定用センサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
カビ臭物質等の臭気を検出するための臭気センサーとして、遺伝子工学的手法により作製された微生物センサーが知られている(特開平８−２４２８５７号公報)。この微生物センサーは、カンファーヒドロキシラーゼオペロン（ｃａｍオペロン）中のオペレーター／プロモーター領域と、該領域の下流に挿入され、該領域の制御を受ける遺伝子であって、その発現を検出することができるレポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子群を含む組換えベクターにより形質転換された微生物から成る。なお、ｃａｍオペロンは、カンファー(樟脳)を唯一の炭素源として生育可能なシュードモナスキプチダのＣＡＭプラスミド由来のオペロンであり、カンファー分解の初発段階に働くものである。被検試料中にカンファーなどの臭気物質が存在すると、該臭気物質が上記オペレーター／プロモーター領域に作用してその下流のレポーター遺伝子が発現されるので、臭気物質を検出することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記公知の微生物センサーは、認識物質に対する特異性が高く、微生物である材料を際限なく増やすことができるため材料費が安価である等の利点を有する。しかしながら、微生物センサーは、センサー自体が微生物であることから取り扱いが不便であり、また、培養時間を要するために測定時間がかかるという問題がある。また、検出感度がより一層向上すればより好ましいことは言うまでもない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、微生物に比較して取り扱いが簡便で、培養が不要で測定に要する時間が短く、かつ、従来の微生物センサーよりも高感度で臭気物質等の物質を測定することができる物質測定用センサーを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップ表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成るセンサーを用いることにより、簡便に、短時間で、高感度に物質を測定することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップの、測定時に光を入射させる側と反対側の表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸を結合させて成る物質測定用センサーを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、センサーチップ（ガラス基板上に、金等の金属を蒸着したもの)の下面に接触している溶液等の媒質の屈折率が変化すると、該金属薄膜の上面にプリズムを通して種々の角度で入射する光の反射光のうち、強度の低下した反射光の角度が変化することを利用して、媒質の屈折率の変化を測定する方法である(笠井献一、蛋白質  核酸  酵素、Vol.37 No.15(1992), pp.2977-2984)。特定の角度で反射する反射光の強度が低下するのは、ガラスと金属薄膜との界面で発生するエバネッセント波と、金属薄膜表面に生じる表面プラズモンと呼ばれる表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使われ、反射光として戻る分が減るために起きる。化学反応に関与する反応物質の一方をセンサーチップの下面に結合しておくと、該反応物質がもう一方の反応物質と反応することによりセンサーチップ下面に接触する媒質の屈折率が変化するので、強度が低下した反射光の角度(この角度は「共鳴角」と呼ばれる)が化学反応の進行に応じて時々刻々と変化する。従って、共鳴角の変化をリアルタイムに測定することにより、化学反応の進行をリアルタイムに観察することができる。このため、ＳＰＲは化学反応速度論の研究に用いられ、また、生化学分野では抗原抗体反応の解析等に用いられている。
【０００８】
本発明のセンサーは、上記ＳＰＲ装置を利用したものである。ＳＰＲ装置自体は市販されているので、市販品を利用することができる。本発明のセンサーでは、ＳＰＲ装置のセンサーチップの下側(すなわち、測定時に光が入射する側の反対側)表面上に、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合する核酸が結合されている。結合される核酸としては、測定すべき物質と結合するリプレッサータンパク質と結合するものであればいかなる核酸も用いることができる。このような核酸の好ましい例として、当該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子を包含するオペロン中のオペレーター配列を挙げることができる。例えば、カンファーリプレッサータンパク質と結合する、ｃａｍオペロン中のオペレーターを挙げることができる。ｃａｍオペロン中のオペレーターの塩基配列は公知であり、Aramaki, H., et al., (1993) J. Bacteriol., 175, 7828-7833, 及びFujita, M. et al., (1993) J. Bacteriol, 175, 6953-6958に記載されている。ｃａｍオペロン中のオペレーターには、ｃａｍオペロン中のｃａｍＲ遺伝子によりコードされるリプレッサータンパク質が結合する。さらに、環境中の微生物のオペロンの代謝するものであれば、自然に存在する有機物の他に、人間が人工的に作り出して環境に放出したものなど、また、ベンゼン、キシレン、トルエン、ナフタレン、フェノールなどの有害な有機物、メチル水銀など有機重金属などと結合するリプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含む微生物オペロンはすでに知られているので、これらのオペロン中のオペレーター配列も用いることができる。なお、オペレーター配列において１又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であって当該リプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸も用いることができる。特に、リプレッサータンパク質が結合するためには、完全なオペレーター配列が必要なわけではなく、その一部分だけ存在すればよいので、このようなオペレーターの部分配列も好ましく用いることができる。例えば、ｃａｍオペロンの好ましいオペレーター部分配列の例として、配列表の配列番号１に示す塩基配列を挙げることができる。なお、言うまでもなく、配列番号１に示される配列において１又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換され、挿入され若しくは付加された配列であってカンファーリプレッサータンパク質と結合する配列を有する核酸も好ましく用いることができる。
【０００９】
核酸をＳＰＲ装置のセンサーチップ表面に結合することは、ジスルフィド化合物を用いるＳＡ膜法(Taizo UDA et al.,(1995) DENKI KAGAKU, 63, NO.12, 1160-1166)、チオール膜法、Ｌ−Ｂ膜法(安田隆一ほか(1997)電子情報通信学会論文誌C-II Vol. J80-C-II No.1 pp.1-7)等のそれ自体公知の方法により行なうことができる。これらのうち、ＳＡ膜法は、核酸の固定化が容易であり、センサーチップの再利用が可能であるので好ましい。これらの方法により、核酸の一端をセンサーチップ表面に結合させることができ、核酸の該端部以外の部分は何物とも接触していないので、センサーチップ表面に固定化された核酸は、リプレッサータンパク質と自由に結合することができる。なお、ＳＡ膜法により、配列番号１に示される配列を有するＤＮＡを、ガラス基板に金蒸着したセンサーチップに結合させる方法の具体例が下記実施例に詳述されている。センサーチップ表面に結合させる核酸の量は、特に限定されず、試料中の物質が測定できる量であればいずれの量であってもよいが、通常１ｍｍ2当たり500〜2000 pmol程度である。
【００１０】
測定にあたっては、測定すべき物質を含むかもしれない試料に上記リプレッサータンパク質を加えたものを、上記センサーチップの下側表面と接触させると共に、センサーチップの上面に種々の角度の光を一点に向けて入射させ(すなわち、光は全体として楔形になる)、その反射光の強度を測定することにより上記した共鳴角をリアルタイムに測定する。もし、試料中に測定すべき物質が含まれていると、該物質がリプレッサータンパク質と結合するので、リプレッサータンパク質はセンサーチップに固定化された上記核酸とは結合できず、従って、共鳴角は測定の前後でほとんど変化しない。一方、試料中に測定すべき物質が含まれていない場合には、リプレッサータンパク質が上記核酸と結合するので、共鳴角が大きく増加する。そして、共鳴角の増加の程度は、含まれる物質の量に依存するから、共鳴角の増加を測定することにより、試料中の物質の検出のみならず定量が可能になる。従って、本明細書において、「測定」とは、検出と定量の両者を包含する。なお、センサーチップに光を入射させる操作や反射光を測定する操作は、市販のＳＰＲ装置の取り扱い説明書に従って容易に行なうことができる。リプレッサータンパク質としてcamRタンパク質を用い、臭気物質であるカンファーを測定する場合の上記の測定原理を図1に模式的に示す。
【００１１】
なお、試料に加えるリプレッサータンパク質の終濃度は、特に限定されず、測定しようとする物質の存在量の予想範囲に照らして適宜選択することができるが、通常、１〜1000 mM程度が好ましく、さらに好ましくは5〜200 mM 程度である。また、リプレッサータンパク質自体は、これをコードする遺伝子を公知の方法によりクローニングすることができるので、遺伝子工学的手法により大量に調製することができる(下記実施例参照)。
【００１２】
なお、リプレッサータンパク質は、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものであればよく、必ずしも天然のリプレッサータンパク質と同一である必要はない。すなわち、天然のリプレッサータンパク質のアミノ酸配列の中の１若しくは複数のアミノ酸が置換し、欠失し、又は１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたものであって、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。従って、天然のリプレッサータンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質であって、測定すべき物質及び上記核酸と結合することができるものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。
【００１３】
このような修飾リプレッサータンパク質として、例えば、下記実施例では、CamRのアミノ末端に６残基のヒスチジンのタグを付加したものが用いられているが、このようなものも本発明で言う「リプレッサータンパク質」に包含される。リプレッサータンパク質のアミノ末端に複数のヒスチジン残基を付加することにより、Ni-NTA(Ni-ニトリロ三酢酸(Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA))カラムによって分離精製する方法によって容易に高純度のタンパク質を大量に分離精製することができる。本方法は、リプレッサータンパク質を先ず他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、次いで、融合部をFactor Xa等により切断してリプレッサータンパク質を精製する場合に、イオン交換カラムを用いて精製する方法と較べ、融合される他のタンパク質や、切れ残った融合タンパク質の混入もないため純度が高く、回収率が高くなる。また、アミノ末端にヒスチジンが付加された融合タンパク質はFactor Xaによる消化が著しく高まり、少ない酵素量（以前の1/5量）で切れ残りがほとんどなくなる。このため、リプレッサータンパク質のアミノ末端に複数のヒスチジン残基を付加してNi-NTAカラムによる精製を行うことにより、高価なFactor Xa の使用量が少なくて済むためコストを低くすることができるという利点も得られる。なお、この場合、付加するヒスチジン残基の数としては４〜８個程度が好ましい。
【００１４】
なお、核酸としてｃａｍオペロンのオペレーター又はその部分配列を用い、リプレッサータンパク質としてｃａｍＲタンパク質を用いる場合には、測定をカルシウムイオンの存在下で行なうと、オペレーター又はその部分配列とｃａｍＲとの結合がスムースに進むので好ましい。この場合、カルシウムイオンの濃度は、特に限定されないが、１〜１０ｍＭ程度が好ましい。
【００１５】
本発明のセンサーを用いて測定される物質は、センサーチップに結合される核酸の種類及びリプレッサータンパク質の種類により異なるが、例えば、センサーチップに結合される核酸として、ｃａｍオペロンのオペレーター配列又はその部分配列を用い、リプレッサータンパク質としてカンファーリプレッサータンパク質を用いる場合には、カンファー、２−メチル−イソボルネオール及びイソボルネオール等のカビ臭物質を挙げることができる。また、上記のように、環境中の微生物のオペロンの代謝するものであれば、自然に存在する有機物の他に、人間が人工的に作り出して環境に放出したものなど、また、ベンゼン、キシレン、トルエン、ナフタレン、フェノールなどの有害な有機物、メチル水銀など有機重金属などの測定に適用することもできる。被検試料としては、その中に含まれる物質を測定したいいずれの試料であってもよく、例えば水道水のような飲料水や、海洋や河川、池などの水等を試料として、その中に含まれる臭気物質等の物質を測定することができる。
【００１６】
なお、CamRタンパク質に反応する臭気物質はカンファーを含め、モノテルペンと言う化合物に属する。モノテルペンは大多数の植物や果物の香り物質としてや、いくつかの種の昆虫のフェロモンとしても知られている。CamRタンパク質はカンファーのみならず類似の構造をした、多数の二環性のモノテルペンに反応する（特開平8-242857号公報）。また、数種のCamRの変異型に反応するモノテルペンの種類は変異型によって異なる。変異型の中には選択性があり、カンファーのみしか反応しないもの（特開平10−52276号公報）、二環性のモノテルペンのみならず、一環性や開環性のモノテルペンに反応するものなどがある（特開平10−28591号公報）。これらの変異型のCamRタンパク質を野生型同様に本方法に用いることによって、カンファーの分析の他に植物 ( 食品を含む ) の香りを分析するためにセンサーとしても応用可能である。
【００１７】
CamRタンパク質の野生型はカンファーの構造と良く似た、上水道におけるかび臭物質である2-メチルイソボルネオールにも反応する。また、変異型のあるものはセスキテルペンに属するもう一つの上水道のかび臭物質ジェオスミンに反応する（特開平10−28591号公報）。そのため、本発明のセンサーはかび臭物質を分析するための水質試験に用いることもできると考えられる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例においては、断りのない限り、Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratry Pressに記載された方法に従った。
【００１９】
実施例１
（Ａ）(1)  CamRの大量生産用プラスミドの構築
CamRの大量生産用プラスミドの構築は、マルトース結合タンパク質と試料の融合タンパク質として発現させ、アミロースレジンカラムを用いてアフィニティー精製するための、大腸菌発現ベクターpMal-c2 (New England Biolabs,INC.)を用いた。ただし、MalE-CamR融合タンパク質からCamRの精製は次の二つの方法のいずれかによって行った。一つはイオン交換カラムクロマトによる方法(実施例１)であり、もう一方はCamRのアミノ末端に６残基のヒスチジンのタグを付加し(PCRによって導入）、このHis-tagged CamRをNi-ニトリロ三酢酸(Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)) カラムクロマト によって精製する方法(実施例２)を取った。
【００２０】
表面プラズモン共鳴反応は反応させる分子の分子量が大きければ、大きいほど共鳴角度が大きくなり、感度が高くなる。また、CamRはDNAに結合する時2量体で結合する（Aramaki, H.前掲）。
【００２１】
これらSPRの原理やCamRの性質を考慮に入れ、マルトース結合遺伝子に連結するcamR遺伝子はそれぞれ１つ（1xcamR)、連結したものに加えて、２つ(2xcamR)または３つ(3xcamR)タンデムに連結して、分子量を大きくしてSPR反応を高めるように構築した。camR遺伝子の間には4つのアミノ酸（グリシン）残基をPCRによって導入した。
【００２２】
１）1xcamRの構築（図2）
PCRに用いるためのcamR-Ntプライマー  5'-ATGGACATCAAGCAGAGCTTG-3'はT4 ポリヌクレオチドキナーゼ処理して5'-OH基をリン酸化した。PCRはpLC87(特開平８−２４２８５７号公報、FERM P-14818)を鋳型にして、リン酸化したcamR-Ntプライマーとr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて行った。増幅した断片はEco RIで切断した上で、アガロースゲル電気泳動し、1037 bpの断片を分離回収した。この断片をpMal-C2のXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをp1xcamRとして、1xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【００２３】
２）2xcamRの構築（図3〜5）
pLC87を鋳型にしてcamR-NtプライマーとHind IIIサイトを導入したHin-r2プライマー5'-CCAAGCTTGGCTTTTTGCAGGGCCAAGTCTTGTGTGTACCCT-3'を用いて増幅した。増幅した断片はHind IIIで消化した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して513bpの断片を分離および回収した。(これをA断片とする）。
【００２４】
pLC87をEco RIで切断した後にアガロースゲル電気泳動し、分離回収して得た1383 bpの断片を、pBluescript II SK-(STRATAGENE)のEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドpSK+LC87はEco RIとSph Iで消化した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、626 bpの断片を分離して回収した。ゲルから回収して得た断片は次の5回の連続PCRによって5'側にHind IIIサイトと4つのアミノ酸（グリシン）残基の導入のための最初の鋳型に用いた。１回目のPCRはHin 21プライマー 5'-GGTGGAGGTGGAATGGACATCAAGCAGAGCTTGCTGCACGCA-3'とRVプライマー 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'を用いて10 サイクル増幅した。2回目のPCRはHin 22プライマー 5'-ATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAATGGACATCAAGCAGAGC-3'とRVプライマーを用いて、1回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 cycles 行った。3回目のPCRはHin 23プライマー 5'-GCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGAGGTGGAATGGAC-3'とRVプライマーを用いて、2回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 サイクル行った。4回目のPCRはHin 24プライマー 5'-ATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAGGAGGAGGGTGGA-3'とRVプライマーを用いて、3回目のPCR反応液1μlを鋳型にして10 サイクル行った。5回目のPCRはHin 25プライマー 5'-CCAAGCTTGACATTACCTTGGTCGCGCTCTTCAATATCGAG-3'とRVプライマーを用いて、4回目のPCR反応液1μlを鋳型にして25サイクル行った。増幅した断片はHind IIIとBgl IIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、183bpの断片を  分離および回収した。（これをB-1断片とした）
【００２５】
pSK+LC87はBgl IIとEco RIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、905 bpの断片を分離および回収した。（これをB-2断片とした）
【００２６】
B-1断片とB-2断片は連結してpBluscript II KS-のEco RIとHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドpKS+Hin25はEco RIとHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動して、1088 bpの断片を分離および回収した。（これをC断片とした）
【００２７】
pMal-C2はHind IIIで切断した後にKlenow DNA polymeraseを用いて平滑化させた。これを自己ライゲイションして、Hind IIIサイトを破壊したプラスミドは大腸菌に導入した。この形質転換体からプラスミドを調製しpMal-C2 / Hind IIIbを得た。
【００２８】
A断片とC断片は連結して、pMal-C2 / Hind IIIbのXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをp2xcamRとして、2xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【００２９】
３）3xcamRの構築（図6〜7）
pKS+Hin25を鋳型にしてHinr2プライマー とRVプライマーを用いてPCRを行った。増幅した断片はHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、565 bpの断片を分離および回収した。回収した断片をpBluscript II KS-のHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpKS+Hin25-Hinr2はHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、565 bpの断片を分離および回収した。（これをD断片とした）
【００３０】
D断片はp2xcamRのHind IIIサイトに挿入した。得られたプラスミドの順方向のものをp3xcamRとして3xCamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【００３１】
4）PCR
PCRは断わりのない限り次の条件で行った。PCR反応は94 ℃で 2 分を1 サイクル、94 ℃で30秒、60 ℃で 30 秒、70 ℃で1 分を25 サイクルで行った。各（アデノシン、チミン、グアノシン、シトシン）デオキシヌクレオチド三リン酸は終濃度が200 μMになるように添加した。プライマーはそれぞれ20 pmol 用いた。MgCl2は終濃度が1 mMになるように添加した。DNA ポリメラーゼはKOD DNA ポリメラーゼ（TOYOBO CO.,LTD)を 1単位用いた。各鋳型のプラスミドDNA は1 ngを用いた。
【００３２】
(2)  CamRの大量生産用プラスミドを保有する大腸菌からのCamRの精製
1)  マルトース結合タンパク質（MalE)とCamRタンパク質の融合タンパク質の精製
それぞれのCamR大量生産用プラスミドは大腸菌XL1-blueに導入した。得られた組換え体はそれぞれ、XL1-blue+1xCamR、XL1-blue＋2xCamR、XL1-blue+3xCamRと名付け、以下の実験に用いた。
【００３３】
- 85℃でグリセロール溶液に保存した各々の形質転換体は100μg / mlのアンピシリン(Amp)入りの1xLB寒天培地に画線し、37 ℃で一晩静置培養した。単一のコロニーは20 mlのAmp入りの1xLB液体培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。翌日10 mlの培養液をAmp入りの１Lのグルコースリッチ1 x LB培地に植え継ぎ30℃でOD600 nmが0.5になるまで110 rpmで振とう培養した。終濃度が0.3 mMになるようにIPTGを添加し、さらに2時間培養した。培養液を500 ml 容のチューブに移し4℃、5,000 rpm、5 分遠心して集菌した。培地を捨て、菌体は50 ml容のチューブに移し,次の操作まで-85 ℃で保存した。菌体は1 mlのカラムバッファー (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-メルカプトエタノール)にパスツールピペットを用いて懸濁した。その後、菌体は10 ml 容の超音波破砕機用プラスチック製チューブに移した。20 秒間超音波破砕を行い、１分冷却した。この操作を10 回行った。その細胞破壊液は1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、4 ℃、15,000 rpm、20 分遠心した。上清（粗抽出物）は新しいマイクロチューブに移した。15 mlのアミロースレジン(New England biolabs, Inc)を2.5 x 10 cmの column に注いだ。カラムを400 ml のカラムバッファーで洗った。粗抽出物（2.5 μg/μl)を約１ml／minの流速でロードした。600 mlのカラムバッファーで洗った。60 mlの10 mMのマルトース入りのカラムバッファーで融合タンパク質を溶出させた。3 mlずつフラクションを回収した。タンパクを含むフラクションをプールした。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、適量をfactor Xaの消化に用いた。
【００３４】
2)  MalEとCamR融合タンパク質からのCamRタンパク質の精製
イオン交換カラムクロマト法による精製法
1 mg/mlのタンパク質溶液 1mlは1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、４μgのFactor Xaを加え16 ℃で一晩インキュベートして、消化した。消化した10 mgのタンパク質はUltracent-10を用いてTNbuffer ( 20 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 8.0)に交換した。 6 mlのTSKgel DEAE-トヨパール650Medium（東ソー（株））を50 ml容のチューブに加えた。これに20 mlのTNbufferを加え混合した。室温で１時間静置し、分離させた。上清を捨て繰り返えした。1x10 cm カラムは5 mlのbed volumeを与え、DEAEレジンを注いだ。15 mlのTNbufferでカラムを洗った。factor Xaで消化し、バッファーで交換したタンパク質をカラムに加えた。30 mlの同じバッファーでカラムを洗った。カラムは最初のバッファー濃度が25 mM NaClから最後のバッファー濃度が500 mM NaCl (それぞれ25 mlで20 mM Tris-HCl, pH 8.0を含む）のグラジエントをかけた。1 mlずつフラクションを回収した。回収したタンパク質はUltracent-10を用いてカラムバッファーに交換するとともに濃縮した。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、その後0.5 ml容マイクロチューブに分注し、SPR実験に使用するまで - 85℃保存した。
【００３５】
(3)  SPRを用いたカンファーの測定法
1)  SPR装置
表面プラズモン共鳴方式を採用した生体分子の相互作用を測定する装置はいくつかの機械のメーカーから製造販売されている。本実施例では日本レーザー電子株式会社のNL-SPR670-E（1チャンネルバッチ式）を用いた。以下SPR装置と略す。このSPR装置は光源として感度が高い半導体レーザー光を使用している。また、リガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法、チオール膜法、L-B膜法などを選択することが可能である。リガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法を用いた場合は固定化が容易であり、センサーチップである金蒸着ガラス基板の再利用が可能であるために、ランニングコストがかからない。金蒸着ガラス基盤はメーカーより入手可能である。このことから本実施例ではリガンドの固定化にジスルフィド化合物によるSA膜法を採用した。なお、本実施例はDNAの固定化が可能であれば他のSPRの装置にも適用可能である。
【００３６】
2)  ジスルフィド化合物を用いるSA膜の作製
ジスルフィド化合物を用いるSA膜の作製法は日本レーザー電子株式会社の方法に従い、下記のように行った。
【００３７】
(i)アセトンを直径10 ml のガラス製のプレートに加えた。これにセンサーチップである金蒸着ガラス基盤を浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。(ii)10 mMの4,4-Ditho butyric acid（ＤＢＡ）エタノール溶液を終濃度が10μMになるように、さらにエタノールで1000倍希釈した。希釈した溶液を別のガラス製のプレートに加えた。これにアセトンで洗浄したセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌した。その後、室温で30 分静置した。この反応によってジスルフィド化合物の金表面への結合がなされる。(iii)エタノールを別のガラス製のプレートに加えた。これに(ii)のセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。エタノールを捨て、繰り返した。(iv) 25 mgの水溶液カルボジイミドと15 mgのN-ヒドロキシスクシンイミドを10 mlの90 %の1,4-ジオキサンに溶解した溶液を作製し、別のガラス製のプレートに加えた。これに(iii)のセンサーチップをエタノールで洗浄したものを浸し、穏やかに撹拌した。その後、室温で15 分静置した。この反応によってセンサーチップはアミノ基をもったリガンドが結合できるように、活性化される。(v)超純水を別のガラス製のプレートに加える。これに上記のように活性化したセンサーチップを浸し、穏やかに撹拌し、洗浄した。(vi)超純水で洗浄したセンサーチップはSPR装置に取り付けるまで、ペーパータオルの上に置き乾かした。
【００３８】
3)  センサーチップに固定化するオペレーターDNAの調製
(i)  オペレーターDNA配列
CamRリプレッサータンパク質の結合するオペレーターDNA配列部位はAramaki H., et al.,(上掲)によって明らかにされている。本実施例ではこの部位の内の27塩基をオペレーター配列として用いた。 センス 鎖は5'-GCTCAGTATATCGCAGATATAGGGCCT-3'で ありアンチセンス 鎖は5'-AGGCCCTATATCTGCGATATACTGAGC-3'である。これら2つのオリゴヌクレオチドDNAは合成時に5'末端にアミノ基を導入し、活性化したセンサーチップに化学的に結合できるようにした。また合成したオリゴヌクレオチドDNAの精製はHPLCで行った。オリゴヌクレオチドDNAの合成は本条件で日本ジェノシスバイオテクノロージー株式会社で依託製造されたものを用いた。
【００３９】
(ii)DNAのアニーリング
それぞれ5μlずつの50 pmolのセンス鎖およびアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドDNAはTE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)に溶解した。これを0.5 ml容マイクロチューブに加えて混合し、95 ℃で10 分加温し変成させた。その後室温で20 分静置し、アニーリングさせた。なお、アニーリング後のＤＮＡは、後述する方法によりＳＡ膜に結合させた。
【００４０】
4)  精製したCamRタンパク質とセンサーチップに固定化したDNAの結合
0.5 ml 容のマイクロチューブにそれぞれ、9 μlの各種の濃度に精製したCamR-MalE 融合タンパク質(1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE)またはCamR 精製タンパク質(2xCamR)と1μlの10 x CamR 結合バッファー(200 mM HEPES (pH8.0), 10 mM MEDTA,100 mM 2-メルカプトエタノール, 50 mM CaCl2)および2 μlのカラムバッファーを加えた。この溶液を室温で10 分以上、SPR装置にかけるまで放置した。溶液をDNAを固定化したセンサーチップに加えた。
【００４１】
5)  精製したCamRタンパク質とカンファーの結合反応
100 mg / ml にエタノールに溶解して調製したカンファーエタノール溶液は、CamRタンパク質を溶解したカラムバッファーで100 fg/mlまで段階希釈した。0.5 ml 容のマイクロチューブに9 μlの各種の濃度に精製したCamRタンパク質(2xCamR)を加えた。次に1μlの10 x CamR 結合バッファーと2 μlの結合バッファーで希釈した各々の濃度のカンファー（1 μg/ml 〜100 fg/mlまで）を加え、混合し、室温で10 分以上、SPR装置にかけるまで放置した。コントロールとして、等量のCamRタンパク質(2xCamR)とカラムバッファーのみを添加した試料を用いた。これをDNAを固定化したセンサーチップに加えた。
【００４２】
6) SPR装置の操作手順
(i)SPR装置は使用する1 時間前に、電源を入れ安定化させた。(ii)活性化させたセンサーチップは装置のプリズムの中央に顕微鏡用の屈折液（Cargille社製, 屈折率1.518）を一滴、滴下した上に静かに置き、止め金で動かないように固定した。(iii)20μlのTEを加えた。共鳴角が安定するまで約 1 分静置した。(iv)10μlのTE をマイクロピペットで吸って捨て、10 μl（ 100 pmol ) のアニーリングさせたDNA溶液を加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 3分静置した。(v)DNA溶液 10μl をマイクロピペットで吸って捨て、20 μlのカラムバッファーを加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 3 分静置した。(vi)カラムバッファーをマイクロピペットで20μl 吸って捨て、カラムバッファーに溶解した5μlの10 mg/ml のBSA(超純水に溶解したウシ血清アルブミン)溶液を加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 5 分静置した。ここでBSAはチップ表面状のDNAの結合していない空サイトをブロックして、CamRタンパク質の非特異的結合を防ぐために添加した。(vii)BSA溶液をマイクロピペットで 5 μl 吸って捨てた。10μl のグリシン-HCl (pH 1.0)溶液を添加し、約30 秒静置し、すばやくマイクロピペットで10 μl 吸って 捨て、カラムバッファーで共鳴角が安定するまで10 μlずつピペッティングして、バッファー交換を行った。グリシン-HCl (pH 1.0)溶液はフリーのBSAを除くために加えた。共鳴角は一定のラインまで低下し、安定するまで静置した。(viii)次に、マイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、10μの1 x CamR 結合バッファーを加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 1 分静置した。この時の共鳴角はCamRタンパク質を加える前の値として記録した。(ix) 4）または5)で調製したCamRタンパク質試料を10μl 加えた。共鳴角が上昇し、その後、一定の共鳴角になるまで約 1分静置した。この時の共鳴角はCamRタンパク質を加えた後の値として記録した。(x)マイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、10μlのグリシン-HCl (pH 1.0)溶液を添加し、約 30 秒静置した。すばやくマイクロピペットで 10 μl 吸って 捨て、共鳴角が安定するまで10 μlずつピペッティングして、バッファー交換を行った。その後、溶液はマイクロピペットで吸って捨てた。グリシン-HCl (pH 1.0)溶液はDNAに結合したCamRタンパク質を解離させて、センサーチップを再生するために加えた。
【００４３】
(xi) グリシン- HCl ( pH 1.0 )溶液によって再生したセンサーチップを用いて、別の試料で(viii)、(ix)、(x)を繰り返し行った。(xii)各々の濃度のカンファーとCamRタンパク質の結合反応試料を加えてから、安定するまでの一定時間のSPR反応のデータを一つのグラフに合わせ、カンファーの定量性を調べた。
【００４４】
7)  センサーチップの再利用
SPRに使用したセンサーチップは次の手順に従った超音波洗浄によって、表面に結合したDNA、タンパク質およびカンファー等を洗浄して除き、再利用した。(i)  200 ml 容ビーカーに100 mlのアセトンを加え、これに使用したセンサーチップを入れ超音波洗浄機のバスにビーカーの上に重しを乗せて置き、20 分洗浄した。(ii)洗浄後、センサーチップをペーパータオルの上に置き、乾かし次のSPR実験に使用した。
【００４５】
（Ｂ）結果
構築したプラスミドのマルトース結合タンパク質とCamRタンパク質をコードする遺伝子領域を含む塩基配列を図8〜14に示す。
【００４６】
CamRタンパク質は上記した精製法によって、単一の分子まで精製することができた。
【００４７】
図15はアニーリングさせたDNAを100 pmol 用いてセンサーチップに固定化させ、それぞれ10 mMのアミロースレジンカラムを用いて精製したCamR-MalE 融合タンパク質(1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, 3xCamR-MalE)または融合タンパク質をfactor Xa で消化後、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した10 mMのCamRタンパク質(2xCamR)を用いてSPR実験を行った場合の共鳴角の時間的変化を示す。同じ試料を用いて3回繰り返し実験を行っている。一枚のセンサーチップを用いた連続実験の結果を示す。なお、図15中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表1に示す通りである。
【００４８】
【表１】
0004047482.tif 000002
【００４９】
図16は図15で示された結果の内、それぞれ 1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3xCamR-MalE融合タンパク質のDNAに対する結合実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示したものである。
【００５０】
図17は図15で示された結果の内、それぞれ 1 x CamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【００５１】
図18はアニーリングさせたDNAを100 pmol 用いてセンサーチップに固定化させ、それぞれ 5 mMのアミロースレジンカラムを用いて精製した2 x CamR-MalE 融合タンパク質または融合タンパク質をfactor Xa で消化後、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製した5 mMの2 x CamRタンパク質を用いてSPR実験を行った場合の共鳴角の時間的変化を示す。同じ試料を用いて3回繰り返し実験を行っている。一枚のセンサーチップを用いた連続実験である。なお、図18中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表２に示す通りである。
【００５２】
【表２】
0004047482.tif 000003
【００５３】
図19は図18で示された結果の内、 2 x CamR-MalE 融合タンパク質, および2 x CamRのDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【００５４】
図20は濃度の違う5 mMおよび10 mMの2 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示したものである。
【００５５】
図21は図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性調べた実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示したものである。
【００５６】
図22は図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性を調べた実験で、ある時間の共鳴角の3 回の結果を平均化して示したものである。
【００５７】
センサーに用いるCamRタンパク質は構築した大量発現用プラスミドを保有する組換え体（XL1-blue+1xCamR、XL1-blue＋2xCamR、XL1-blue+3xCamR）を培養して、マルトース結合タンパク質の融合タンパク質として大量発現させる系によって、容易に精製することができた。CamRタンパク質は本精製法によって際限なく得ることが可能である。また精製したCamRタンパク質は- 20 ℃または- 85 ℃で長期間保存可能であり、4 ℃でも２週間以上安定である。
【００５８】
図18に示されるように、SPRによるカンファーの測定はリアルタイムにデータを得ることができ、これに要した時間はDNAの固定から検出まで、一つのサンプルを20分未満で終了することができた。センサーチップはglycine-HCl (pH 1.0)溶液を用いて再生することができ、一枚のチップで10 回以上繰り返し使用することができた。また、センサーチップは超音波洗浄することによって再利用することができた。
【００５９】
同じサンプルを繰り返し行った場合、ほぼ同じ共鳴角が得られ、再現性が得られた（図15および18）。カンファーを加えないCamRタンパク質のみのコントロールの共鳴角はカンファーを添加したもの (1 ng/ml および10μg/ml )より大きな値を示した（図21および図22）。この結果より、本実施例の原理で予測したように、カンファーに結合したCamRはカンファーの濃度依存的にDNAの結合が阻害されることが示された。
【００６０】
図19よりSPRを用いて調べたCamRタンパク質のDNAの結合性は、CamRタンパク質がMalEタンパク質との融合タンパク質の状態より分離されたCamRタンパク質のみを用いた方が強いことが知られた。これはCamRタンパク質のMalEタンパク質との融合タンパク質の状態ではMalEタンパク質によって、DNAに結合するためのコンフォメーションを取ることが阻害されるためであると考えられる。このことからSPRに供するCamRタンパク質はfactor Xaで切断した後に、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製したものを用いた方が、臭気物質の検出感度の向上が見込まれた。
【００６１】
図20より5 mMと10 mMの2xCamR-MalE 融合タンパク質の共鳴角を比較すると、5 mMのものより10 mMのものの方が共鳴角が高く、CamRタンパク質の濃度が高いほど共鳴角が高くなる傾向が見られた。これはSPRを用いた分子間の相互作用を分析する反応において結合する物質濃度が高いほどレスポンスが大きくなる事実と一致する。
【００６２】
図21および図22より臭気物質カンファーは10 pg/ml〜100 ngの間の濃度を定量検出することができた。検出限界は100 fg/ml〜10 pg/mlの間であるが、正確な値は得られていない。この感度のレベルはヒトが鼻で感じることができるよりも10〜100倍高く、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた場合と同等またはそれ以上である。
【００６３】
本実施例に用いている材料のDNAおよびCamRタンパク質は物質であり、取り扱いや実験場所に制限を受けない。感度はcamオペロンを微生物の発光遺伝子オペロンを用いた系の場合が1 ng / mlの検出限度（開発者らの以前のデータ）であったものが、本研究のSPR方法の場合が10 pg / mlである。従って、検出感度は本研究のSPRを用いた方法の方が、発光遺伝子を用いた方法より100 倍高い。測定時間は発光遺伝子を用いた場合20 時間要したものが、本研究のSPRを用いた方法は20分未満であり、大幅に測定時間を短縮することができる。
【００６４】
実施例２
（Ａ）(1)  CamRの大量生産用プラスミドの構築
１)  His-tagged CamRの構築（図２３）
PCRに用いるためのHtnt-2プライマー5'-ATGCATCACCATCACCATCACATGGACATCAAG-3'はT4 ポリヌクレオチドキナーゼ処理してリン酸化した。1回目のPCRはpLC87を鋳型にして、Htnt-1プライマー5'-ATCACCATCACATGGACATCAAGCAGAGCTTGCTG-3'とr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて10サイクル行った。2回目のPCRは1回目のPCR反応液1μlを鋳型にして、リン酸化したHtnt-2プライマーとr7プライマー5'-GAGGAACACCAGATGTCGTT-3'を用いて25サイクル行った。増幅した断片はEco RIで切断した上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、1058 bpの断片を分離回収した。この断片をpMal-c2のXmn IとEco RIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpHis-tagged camRとして、His-tagged CamRの大量発現用プラスミドとして用いた。
【００６５】
(2)  CamRの大量生産用プラスミドを保有する大腸菌からのCamRの精製
１）  マルトース結合タンパク質（MalE)とCamRタンパク質の融合タンパク質の精製
CamR大量生産用プラスミドは大腸菌XL1-blueに導入した。得られた組換え体はDH5α+His-tagged CamRと名付け、以下、実施例１と同様にしてFactor XaによりMalEとCamRとに切断した。
【００６６】
２)  Ni-NTAカラムクロマト法による精製法
1 mg/ml のタンパク質溶液 1 ml は1.5 ml 容のマイクロチューブに移し、４μgのFactor Xa (New England biolabs, Inc)を加え16 ℃で一晩インキュベートして、消化した。消化した10 mgのタンパク質はCentriplus 10 (Amicon,Inc.)を用いて溶解バッファー (50 mM NaH2PO4 pH8.0, 300 mM NaCl, 10 mMイミダゾール) に交換した。5 mlのNi-NTA Superflow レジン (QIAGEN)を1x10 cm のカラムに注いだ。カラムを40 mlの溶解バッファーで平衡化させた。溶解バッファーに交換したタンパク質を0.5 ml／minの流速でカラムに加えた。カラムを40 mlの溶解バッファーで洗った。カラムを40 mlの洗浄バッファー (50 mM NaH2PO4, pH8.0, 300 mM NaCl, 20 mMイミダゾール) で洗った。カラムに40 mlの溶出バッファー (50 mM NaH2PO4, pH8.0, 300 mM NaCl, 250 mMイミダゾール)を加えHis-tagged CamRを溶出させた。1 mlずつフラクションを回収した。回収したタンパク質はCentriplus 10 (Amicon,Inc.)を用いてカラムバッファー ( 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl,  1 mM EDTA, 10 mM β-メルカプトエタノール)に交換するとともに濃縮した。タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量し、その後0.5 ml容マイクロチューブに分注し、SPR実験に使用するまで - 85℃保存した。
【００６７】
(3)  カンファーによるCamRの解離実験
実施例１と同様にして、DNAの固定→buffer交換→BSAによるブロッキング→グリシンHCl (pH1.0)によるフリーのBSAの洗い→CamR結合バッファーによる平衡化の一連の操作を行った。その後、10μlの10 mM CamR溶液を加えた。安定したところでエタノールに溶解した20 mMカンファー溶液をカラムバッファーで希釈した1pg/ml〜100ng/mlまでの濃度のカンファーを2μl 加えた。コントロールとして2 μlのカラムバッファーを添加した試料を用いた。この実験は２回行った。
【００６８】
(4)  CamR二量体形成のモニタリング実験
実施例１と同様にして、DNAの固定→buffer交換→BSAによるブロッキング→グリシンHCl (pH1.0)によるフリーのBSAの洗い→CamR結合バッファーによる平衡化の一連の操作を行った。その後、10μlの10 mM CamR溶液を加え、20 分以上静置した。
【００６９】
(5)  かび臭物質2-MIBの定量
カンファーと同様に上水におけるかび臭物質 2-メチルイソボルネオール(2-MIB)の定量性や検出限界を求める実験を行った。2-MIBはエタノールに溶解して20 mg/mlの濃度の保存液を調製した。この保存液は蒸留水で希釈し1 pg/ml〜10μg/mlの濃度に調製した。実験にはこの2-MIBの希釈液と10 mM His-tagged CamRの混合液10 μlを用いた。
【００７０】
（Ｂ） 実験結果
１)    構築したプラスミドのマルトース結合タンパク質とCamRタンパク質をコードする遺伝子領域を含む塩基配列を図２４，２５に示す。
【００７１】
２）MalE-CamR融合タンパク質からのCamRの精製は、CamRのアミノ末端に6 残基のヒスチジンを付加して発現したタンパク質をNi-NTAカラムによって分離精製する方法によって容易に高純度のタンパク質を大量に分離精製することができた。本方法はイオン交換カラムを用いて精製する方法と較べ、MalEやFactor Xaによって切れ残った融合タンパク質の混入もないため純度が高く、回収率も高かった。また、アミノ末端にヒスチジンが付加された融合タンパク質はFactor Xaによる消化が著しく高まり、少ない酵素量（以前の1/5量）で切れ残りがほとんどなくなった。このため、本方法によるCamRの生産および精製法は高価なFactor Xa の使用量が少なくて済むためコストを低くすることができることも有益である。
【００７２】
３） カンファーによるDNAからCamRの解離度を調べる実験は図２６に示す共鳴角の減少量の値を用いた。この結果、1 pg/ml 〜 100 ng/mlの濃度のカンファーを添加した場合の共鳴角の減少度はbufferのみのコントロールの減少度と同程度かこれより低く、著しく大きくなることはなかった。このため、カンファー添加によるDNAからCamRの解離現象を検出することはできなかった。従って、臭気物質によってDNAからCamRが解離する現象をもとに臭気物質量を測定する方法は適用できないことが示された（図２７、２８）。なお、図２７中の各矢印で示される数字における操作の内容は下記表３に示す通りである。
【００７３】
【表３】
0004047482.tif 000004
【００７４】
４）CamRタンパク質のDNAの結合性は予めCamRタンパク質とカンファーまたは2-MIBを結合させた混合試料をDNAに結合させたところ、カンファーまたは2-MIBの添加量に応じた結合が示された（図３１）。また、この場合の共鳴角の変化量はカンファーまたは2-MIBの濃度の違いを十分に捕らえることができた。従って、かび臭物質の検出にはCamRタンパク質のかび臭物質によるDNAへの結合阻害度から求める方法が適している。本方法によってSPRを応用したかび臭バイオセンサーの基本原理が完成した。
【００７５】
５）実施例１又は実施例２で作製した、MalE-1xCamR融合タンパク質、His tagged CamR、MalE-2xCamR融合タンパク質、2xCamRタンパク質、MalE-3xCamR融合タンパク質のDNAの結合性はHis-tagged CamRが圧倒的に高いDNA結合を示した（図２９）。ただし、コントロールはCamRを加えないバッファーのみの試料であり、また濃度は2xCamRタンパク質が5 mMであり、他は10 mMの濃度のタンパク質である。また、値は３回の平均値である。この結果はMalEまたはタンデムに繋がった際のCamRの構造がDNA結合を阻害しているためであると考えられ、そのため以後の実験にはNi-NTAカラムによって精製した単独のCamRタンパク質を用いた。
【００７６】
６）CamRタンパク質のDNA結合状態の時間変化をSPRでモニターした所、約10 分までは一つの右上がりのDNA結合曲線が検出されたが、その後にもう一つの右上がりの曲線が検出された（図３０）。Aramakiら（上掲)は、CamRがDNAに結合する際、二量体で結合すると報告している。この考察から推測すると、最初の反応は1つ目のCamRがDNAに結合した反応であり、次の反応は、2つ目のCamRが1つ目のCamRとDNAに結合した反応であるかも知れない。すなわち、CamRのDNAの結合はCamRが二量体となってからDNAに結合するのではなく、一つのCamRが結合した後に、DNAの上でもう一つのCamRが結合すると考えられる。本研究の臭気物質の測定には一つ目の反応を用いている。しかしながら、今後、2つ目の反応を用いて臭気物質を測定すれば、トータルの反応は大きくなり、感度の向上に役立つかも知れない。
【００７７】
７）上水におけるかび臭物質2-メチルイソボルネオール(2-MIB)を本センサーによって測定したところ、1 ng／L〜10 mg／Lまで定量的に検出することができた（図３１）。このレベルはヒトの鼻の約数十倍であり、ガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)法と同程度である。
【００７８】
【発明の効果】
以上のように、本発明により、微生物に比較して取り扱いが簡便で、培養が不要で測定に要する時間が短く、かつ、従来の微生物センサーよりも高感度で臭気物質等の物質を測定することができる物質測定用センサーが提供された。
【００７９】
【配列表】
0004047482.tif 000005
0004047482.tif 000006
【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のセンサーを用いた測定方法の原理を説明するための模式図である。
【図２】本発明の実施例で作製した、ｃａｍＲタンパク質の単量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるp1xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図３】本発明の実施例で作製した、ｃａｍＲタンパク質の二量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるp2xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図４】図３の続きを示す図である。
【図５】図４の続きを示す図である。
【図６】本発明の実施例で作製した、ｃａｍＲタンパク質の三量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質発現するベクターであるp3xcamRを構築する方法を説明するための図である。
【図７】図６の続きを示す図である。
【図８】  p1xcamRベクター中の、ｃａｍＲタンパク質の単量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図９】図８の続きを示す図である。
【図１０】  p2xcamRベクター中の、ｃａｍＲタンパク質の二量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図１１】図１０の続きを示す図である。
【図１２】  p3xcamRベクター中の、ｃａｍＲタンパク質の三量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図１３】図１２の続きを示す図である。
【図１４】図１３の続きを示す図である。
【図１５】実施例１で行なった、ＳＰＲ実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図１６】図15で示された結果の内、それぞれ同濃度の1xCamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3xCamR-MalE融合タンパク質のDNAに対する結合実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示した図である。
【図１７】図15で示された結果の内、それぞれ 1 x CamR-MalE, 2 x CamR-MalE, および3 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。コントロールはタンパク質の溶解に用いたバッファーのみを添加したものである。
【図１８】本発明の実施例において、各種濃度のカンファーを測定したＳＰＲ実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図１９】図18で示された結果の内、2 x CamR-MalE 融合タンパク質, および2 x CamRのDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。
【図２０】本発明の実施例において、濃度の違う5 mMおよび10 mMの2 x CamR-MalE 融合タンパク質のDNAに対する結合実験で、ある時間の共鳴角の3回の結果を平均化して示した図である。
【図２１】図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性調べた実験の結果の典型的な例を抜き出し、一定時間のレスポンスカーブを一枚のグラフに重ね合わせて示した図である。
【図２２】図18で示された結果の内、精製した2 x CamRタンパク質を用いて100 fg/ml, 1 ng/ml, 10 μg/mlの濃度のカンファーを用いてカンファーの定量性を調べた実験で、ある時間の共鳴角の３回の結果を平均化して示した図である。
【図２３】本発明の実施例で作製した、ヒスチジンが６個連続して成るタグを含むｃａｍＲタンパク質の単量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターであるpHis-tagged CamRを構築する方法を説明するための図である。
【図２４】  pHis-tagged CamRベクター中の、ｃａｍＲタンパク質の単量体とＭａｌＥタンパク質との融合タンパク質をコードする領域及びその近傍の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
【図２５】図２４の続きを示す図である。
【図２６】実施例２において、試料液にカンファーを加える前後の共鳴角の変化を示す図である。
【図２７】実施例２で行なったＳＰＲ実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図２８】実施例２で行なったＳＰＲ実験における、添加したカンファー濃度と共鳴角との関係を示す図である。
【図２９】本発明の実施例で作製した、各種リプレッサータンパク質とcamオペロンＤＮＡとの結合性を示す図である。
【図３０】実施例２において行った、CamR二量体形成のモニタリング実験における時間と共鳴角との関係を示す図である。
【図３１】実施例２において行った、２−メチルイソボルネオールの測定実験により得られた、２−メチルイソボルネオールの濃度と共鳴角との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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