(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量がおよそ６３０００であることを特徴とする、酵母由来のアルコールアセチルトランスフェラーゼであって、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とするアルコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴とするアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列、または配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が付加、挿入、欠失、削除または置換されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖であって、アルコール類とアセチルＣｏＡを縮合させて酢酸エステルを産生する活性を有し、かつ温度３０℃で安定であり、不飽和脂肪酸によって阻害を受けないアルコールアセチルトランスフェラーゼを生産し得るＤＮＡ鎖。
【請求項３】
外来遺伝子の導入によって該外来遺伝子の形質を導入してなる酵母において、該外来遺伝子が請求項１に記載のアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子または請求項２に記載のＤＮＡ鎖であることを特徴とする、形質転換されてアルコールアセチルトランスフェラーゼ産生能の富化された酵母。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵母由来の新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ(以下、アルコールアセチルトランスフェラーゼをＡＡＴaseとし、本発明による新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼを新ＡＡＴaseという)、新ＡＡＴaseの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、およびこのＤＮＡ鎖により形質転換されてエステル生産能が増加している酵母に関するものである。本発明は、既知のＡＡＴaseに比べ、より安定した新ＡＡＴaseが増強された形質転換体により、エステル香味の強化された酒類製造を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＡＴaseは、アルコール類とアセチルＣoＡを縮合させて酢酸エステルを産生する、酵母によるエステル類産生の重要な酵素である。酵母のＡＡＴaseによって産生された酢酸イソアミルを代表とするエステル類は、清酒、ビール等の酒類において、その品質の評価を左右する事は周知の事実である。
【０００３】
ＡＡＴaseの完全な精製は峰時らによって報告されている(Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．,５７(１２),p２０９４,１９９３)。峰時らが完全精製したＡＡＴaseは、精製の最初のカラムクロマトグラフィーで溶出される大小２つのＡＡＴaseのピークのうちで、ＡＡＴaseＩと命名したメインピークについて精製したものである。もう一つのＡＡＴaseＩＩとしたサブピークについては、ＡＡＴaseＩより熱安定性に優れ、至適温度も高いＡＡＴaseであると報告されているが(日本醸造協会誌,８７(５),p３３４,１９９２)、ＡＡＴaseＩに比較してはるかに少量しか存在しないため、ＡＡＴaseＩと同様な方法ではＡＡＴaseＩＩの完全な精製は不可能であり、酵素学的性質の詳細な解明、遺伝子の取得はできなかったのである。このように、酵母には複数種のＡＡＴaseが存在するという報告は他にもあるが(Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．２１０,p１０１５,１９９２)、本発明者らの知る限りでは、酵母由来で、性質の異なる他のＡＡＴaseについての詳細な報告はない。従って、既知のＡＡＴaseとは、峰時らが完全精製したＡＡＴaseについての知見を指すものである。ＡＡＴase遺伝子に関しても、峰時らが完全精製したＡＡＴaseの遺伝子の取得と解析について報告されているが(Ａppl．Ｅnviron．Ｍicrobiol．,６０(８),p２７８６,１９９４)、それ以外のＡＡＴaseを産生するＤＮＡ鎖に関しての報告はない。
【０００４】
酵母のＡＡＴase活性を増強し、エステル香味の強化された酒類を製造する方法として、峰時らが精製したＡＡＴaseにより取得した遺伝子を利用することが知られている(特開平０６−６２８４９号公報)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、熱安定性について、峰時らが完全精製したＡＡＴaseは、４℃まで比較的安定であるがそれ以上の温度では極めて不安定であり、さらには、リノール酸等の不飽和脂肪酸によって著しく酵素活性が阻害を受ける等の問題点があった(Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．,４５(１０),p２１８３,１９８１、Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．,５４(６),p１４８５,１９９０等)。従来なされてきた酒類の製造において、原料の選定や処理、発酵管理は、これらの問題点を結果として回避する事につながっている点も多いのである。清酒の製造を例に挙げるならば、特に吟醸酒と呼ばれるエステル香味の強化された清酒製造において、原料となる玄米をその重量比で４０％あるいはそれ以上を糠として除去することは、玄米中に含まれる油脂成分等を除去することにつながり、結果としてリノール酸等の不飽和脂肪酸によるＡＡＴaseの活性阻害を低減することになる。そのうえ、その発酵温度も通常行われる清酒製造に比べ、より低温でしかも発酵期間は長期に及ぶことは、ＡＡＴaseの熱による失活を抑え、より長くその活性を維持することにつながっているのである。これらの工程管理は原料処理から生成酒の取得に至るまで、熟練者の経験および勘に頼るところが多い。従って、既知のＡＡＴaseに比べ、より安定性の高いＡＡＴase産生能のある酵母を用いることができれば、熟練を要する製造工程が簡便となり、その製造期間も短縮してエステル香味の強化された清酒の製造を可能にするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、上記問題点を解決すべく、酵母に存在している他のＡＡＴaseについて種々検討した結果、熱安定性のある、しかもリノール酸等の不飽和脂肪酸によって酵素活性阻害を受けない、酵母由来の新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼを完全精製し、その遺伝子の単離および構造決定することに成功し、更に、この新ＡＡＴase産生能を強化した形質転換酵母を得ることを知り、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１は、温度３０℃で安定であり、不飽和脂肪酸によって阻害を受けない、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量がおよそ６３０００であることを特徴とする、酵母由来の新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼである。
【０００８】
第２は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼである。
第３は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなることを特徴とする新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０００９】
第４は、配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列、または少なくともその一部と実質的に相同な塩基配列を有し、新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを生産し得るＤＮＡ鎖である。
【００１０】
第５は、前記本発明の第３および第４の新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子またはＤＮＡ鎖を含む外来遺伝子の導入によって形質転換されて新ＡＡＴase産生能の富化された酵母である。
【００１１】
なお、本発明では、「遺伝子」、「ＤＮＡ鎖」、および「ＤＮＡ配列」を実質的に同義のものとして使用している。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明による新ＡＡＴaseは酵母由来のものであって、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、いくつかのアミノ酸の付加、挿入、欠失、削除または置換によってそのペプチドの生理活性が変化しないことがあることは遺伝子工学あるいは蛋白質工学の明らかにするところである。従って、本発明で示したアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列と全く同一である場合にのみに限られず、ＡＡＴase活性が保存されている限り、上記のようないくつかのアミノ酸の改変を包含するものである。
【００１３】
本発明の新ＡＡＴaseは、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓaccharomyces  cerevisiae)から得られたものである。本発明でいうサッカロマイセス・セレビシエとは、Ｔhe  yeast,a  Ｔaxonomic  study  ３rd．Ｅdition(ed．by  Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋreger−van  Ｒij．Ｅlsevier  Ｓcience  Ｐublishers  Ｂ．Ｖ．,Ａmsterdam,p３７９,１９８４)に記載されているところのサッカロマイセス・セレビシエおよびそのシノニムないし変異株である。
【００１４】
本発明の新ＡＡＴaseの性質のうち、既知のＡＡＴaseと異なる代表的なものをいくつかあげるならば、至適温度、熱安定性、不飽和脂肪酸による阻害および分子量である。既知のＡＡＴaseの至適温度は２５℃であるが、新ＡＡＴaseの至適温度は４０℃と高い。既知のＡＡＴaseは４℃を超える温度では失活しやすく、本発明者らが検討したところによると、３０℃、３０分でその活性は３０％程度に低下するが、新ＡＡＴaseは同条件で、９０％以上の酵素活性を維持している。また、既知のＡＡＴaseは、リノール酸のような不飽和脂肪酸によって大きく酵素活性が阻害されるが、新ＡＡＴaseはリノール酸を２mＭ添加した場合でも９０％以上の活性を維持している。既知のＡＡＴaseは、２mＭのリノール酸の添加によって４.３％にまで酵素活性が低下してしまう。新ＡＡＴaseの分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、約６３０００であり、峰時らが完全精製したＡＡＴase(分子量約６００００)やＡＡＴaseＩＩに相当するＡＡＴase(分子量約５６０００(日本醸造協会誌,８７(５),p３３４,１９９２))の分子量と異なっている。従って、いくつかの重要な酵素学的性質や分子量の違いなどから本発明によるＡＡＴaseは、新規なＡＡＴaseである。塩基配列から推定される分子量は、約６２０００である。
【００１５】
本発明による新ＡＡＴaseの酵素学的な性質をあげれば、下記の通りである。
(１)  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量  約６３０００
(２)  至適および安定pＨ
至適pＨ:７.５
安定pＨ:６.５−９.５
(３)  至適および安定温度
至適温度:４０℃
安定温度:３０℃以下で安定
(４)  阻害剤などの影響
パラクロロ水銀安息香酸、ジチオビス安息香酸により強い阻害を受ける。
(５)  各種脂肪酸の活性におよぼす影響
飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸により強い阻害を受けない。
(６)  イソアミルアルコールおよびアセチルＣoＡに対するＫm値
イソアミルアルコール:８４.６mＭ
アセチルＣoＡ:８２.３μＭ
【００１６】
この新ＡＡＴaseは、サッカロマイセス・セレビシエである清酒酵母協会７号の培養菌体内容物からの可溶化粗酵素の調製ならびに各種クロマトグラフィーからなる精製方法によって得ることができる。これらの単位工程からなる新ＡＡＴaseの取得の実際は、後記の実施例に示したとおりであって、当業者にとって可能である。
【００１７】
本発明の新ＡＡＴase遺伝子の取得方法の一つは、本発明の提供する新ＡＡＴaseを産生する能力を有するＤＮＡ鎖の一部をプローブとして使用し、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手段を行うことであり、これらの手段はいずれも当該分野に関わる当業者に周知であって、容易に実施できるものである。
【００１８】
また、新ＡＡＴaseを産生する能力を有するＤＮＡ鎖を取得するための遺伝子源として有用なものは、酵母に限られず、細菌、植物等が考えられ、特に望ましい遺伝子源は、酒類あるいは発酵食品の製造に使用されている酵母類である。
【００１９】
このＤＮＡ鎖は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にちょうど対応するものであってもよく、また、その上流側または下流側および双方にＤＮＡ配列が結合した構造のものであってもよい。後者の具体例は、適当なベクターに組み込まれたプラスミドの形状のものである。
【００２０】
配列表の配列番号２のアミノ酸に対応するものとして、配列表の配列番号１に特定のＤＮＡ配列が示されているが、これは清酒酵母協会７号から取得した新ＡＡＴase遺伝子について分析を行い、得たものであって、本発明によるＤＮＡ配列の好ましい具体例である。
【００２１】
本発明による、新ＡＡＴaseを産生する能力を有するＤＮＡ鎖ないしＤＮＡ配列とは、新ＡＡＴaseの特徴を示すＡＡＴase活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖ないしＤＮＡ配列のことであり、前記したようにポリペプチドの変動に対応して変動するわけであるが、いわゆる遺伝暗号に関する知見にしたがってその最も広い意味に解するものとする。したがって、縮重(または縮退)によって所与のアミノ酸をコードする核酸のトリプレットは複数種ありえる。また、本発明で対象とするＤＮＡ鎖は、天然物由来のものでも、全合成あるいは半合成のものでもよい。
【００２２】
形質転換体の作製のための方法は、遺伝子工学の分野において慣用されているものであり、たとえばプロトプラスト法(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．,７５,p１９２９,１９７８)、あるいは金属処理法(Ｊ．Ｂacteriol．,１１３,p７２７,１９８３)によって行われる。この際用いられるベクターとしては、酵母用として知られているものであれば如何なるものでもよく、たとえば、ＹＥp系、ＹＣp系、ＹＩp系等は文献上公知であるばかりでなく、容易に作成することができる。
【００２３】
一方、本発明のＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母内で発現させるため、あるいは発現を増加もしくは減少させるためには、転写および翻訳を制御するプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５'上流域に、ターミネーターを３'下流域にそれぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとしては、新ＡＡＴase遺伝子自身に由来するものの他、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Ｊ．Ｂio．Ｃhem．,２５７,p３０１８,１９８２)、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子(ＮucleicＡcid  Ｒes．,１０,p７７９１,１９８２)、グリセロールアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．,２５４,p９８３９,１９７９)等、既に知られているあらゆる遺伝子由来のもの、もしくは人工的にそれを改良したものの使用が可能である。
【００２４】
本発明において、形質転換すべき酵母、すなわち宿主となる酵母は分類学上酵母の範疇に入る任意のものでよいが、本発明の目的からすれば、サッカロマイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母、具体的には清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、ウイスキー酵母が望ましい。たとえば、清酒酵母:ＩＦＯ ２３４７、ビール酵母:ＡＴＣＣ２６２９２、ワイン酵母;ＩＦＯ ２２６０、ウイスキー酵母:ＩＦＯ ２１１２等を例示することができる。宿主として好ましい他の一群は、パン酵母である。具体的にはＡＴＣＣ３２１２０を例示することができる。
【００２５】
上記のようにして得た新ＡＡＴase産生能の富化された形質転換酵母は、それぞれの用途に利用することができる。宿主酵母が酒類製造用酵母である場合は、本発明により新ＡＡＴase産生能が富化されているため、安定したＡＡＴaseの活性によりエステル香味の富化ないし強化された酒類を製造することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１  新ＡＡＴaseの製造
本発明の酵素は、サッカロマイセス属に属し、前記特性を有する酵素を生産する酵母を培養し、その培養物から得ることができる。好ましい製造法の一例を示せば次の通りである。
【００２７】
１−(１)  粗酵素液の調製
ＡＡＴase活性は、峰時らの方法(Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．,５７(１２),p２０９４,１９９３)に従い測定した。
清酒酵母協会７号をＹＰＤ培地(１％  酵母エキス、２％  ペプトン、２％  グルコース)５００mlに植菌し、１５℃で３日間培養した。その培養液を３０リットルのＹＰＤ培地を入れた４０リットル容ポリ容器に５００ml接種し、２５℃で１２時間嫌気的に攪拌培養した。次に、遠心(３０００回転／分、１０分)により菌体を回収し、その菌体重量の１０倍容の緩衝液(２５mＭ  トリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、１.５Ｍ  ソルビトール)に懸濁させ、菌体重量の１０００分の１量のザイモリエース１００Ｔ(生化学工業(株)より入手)を加えた。これを３０℃で１時間振盪し、生じたプロトプラストを２０００回転／分、５分間の遠心によって回収した。回収したプロトプラストを４００mlの菌体破砕用緩衝液(２５mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.５Ｍ  ソルビトール)に懸濁させ、ポリトロンＰＴ１０型(ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製)の菌体破砕装置を用いて細胞を破砕した。破砕後、４５００回転／分、１０分間遠心し、さらにその上清を１４０００回転／分、２０分間の遠心により破砕残渣を取り除き上清に５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、氷中に１時間保持した後、１００００回転／分、２０分間の遠心により沈澱を得た。得られた沈澱を洗浄液(２５mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、５０％飽和硫酸アンモニウム、１mＭ  ジチオスレイトール)に懸濁し、洗浄した後、１００００回転／分、２０分間の遠心により沈澱を回収した。この沈澱を緩衝液(２５mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、１mＭ  ジチオスレイトール)に溶解し、粗酵素液を得た。
【００２８】
１−(２)  ミクロソーム画分の調製
１−(１)で得られた粗酵素液を、１０００００×Ｇで２時間遠心し、生じた沈澱(ミクロソーム画分)を４０mlの緩衝液(２５mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、１mＭジチオスレイトール)に懸濁させた。直ちに使用しない場合は、これを−２０℃で保存した。
【００２９】
１−(３)  可溶化酵素の調製
１−(２)で得られたミクロソーム画分を三角フラスコに移し、１００分の１容のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを加え、４℃で泡立たないように注意して６０分間マグネチックスターラーを用いて攪拌した。その後、１０００００×Ｇで２時間遠心し、上清を緩衝液Ａ(２５mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、０.５％イソアミルアルコール、１mＭ  ジチオスレイトール、２０％  グリセロール)に対して１晩透析した。
【００３０】
１−(４)  酵素の精製
酵素の精製は、１−(１)および１−(２)の操作を５０回繰り返して取得・保存したミクロソーム画分に対して１−(３)の操作を行い、得られた可溶化酵素液を用いて行った。まず、可溶化酵素液を２回に分けてポリバッファーエクスチェンジャー９４(ファルマシア社より入手)を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した(吸着:緩衝液Ａ、溶出:緩衝液Ａ  ０.０−０.６Ｍ  塩化ナトリウム濃度勾配)。溶出した活性画分のうち図１に示した矢印の画分を集め、再度ポリバッファーエクスチェンジャー９４により精製を行った。溶出した活性画分は、さらに下記に示す▲１▼から▲６▼までの各種のカラムクロマトグラフィーにより順次精製した。すなわち、
▲１▼イオン交換カラムクロマトグラフィーＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ(ＴＯＳＯＨ社より入手)
吸着:緩衝液Ａ、溶出:緩衝液Ａ  ０.０−０.３Ｍ  塩化ナトリウム濃度勾配
▲２▼ゲル濾過カラムクロマトグラフィートヨパールＨＷ５５(ＴＯＳＯＨ社より入手)
緩衝液Ｂ(１０mＭ  リン酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、０.５％  イソアミルアルコール、１mＭ  ジチオスレイトール、０.１Ｍ  塩化ナトリウム、２０％  グリセロール)
▲３▼ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー(和光純薬社より入手)
吸着:緩衝液Ｂ、溶出:緩衝液Ｂ  １０−８０mＭ  リン酸緩衝液(pＨ７.５)濃度勾配
▲４▼オクチルセファロースカラムクロマトグラフィーＣＬ４Ｂ(ファルマシア社より入手)
吸着:５０mＭ  イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.５％  イソアミルアルコール、１mＭ  ジチオスレイトール、０.１Ｍ  塩化ナトリウム、２０％  グリセロール  溶出:イミダゾール塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、０.５％  イソアミルアルコール、１mＭ  ジチオスレイトール、０.１Ｍ  塩化ナトリウム、２０％  グリセロール
▲５▼▲３▼と同様に再度ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
▲６▼１−ヘキサノールアフィニティーカラムクロマトグラフィー
６−アミノ−１−ヘキサノール(和光純薬社より入手)を、担体にＣＮＢr活性化セファロース４Ｂ(ファルマシア社より入手)を用いてファルマシア社のマニュアルにしたがって、１−ヘキサノールセファロース４Ｂを作製した。
吸着:５mＭ  リン酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、２０％  グリセロール、１mＭ  ジチオスレイトール  溶出:５mＭ  リン酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、２０％  グリセロール、１mＭ  ジチオスレイトール、０.０−０.２Ｍ  塩化ナトリウム濃度勾配により精製した。
この段階で得られた活性画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、銀染色を行ったところ、ＡＡＴase活性のない小さな分子量のバンドが認められたため、セントリカットＵ−５０(クラボウ社より入手)を用いて添付のマニュアルに従い、限外濾過することにより、小分子量のものを除き、図２に示したように、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、銀染色で単一バンドとなる精製標品を得た。
【００３１】
実施例２  新ＡＡＴaseの特徴
２−(１)  至適および安定pＨ
酵素の安定性に及ぼすpＨの影響を調べるために、pＨの幅を３〜１１(pＨ３〜６:５０mＭ  クエン酸−リン酸緩衝液、pＨ６〜８:５０mＭ  リン酸緩衝液、pＨ８〜９:５０mＭ  トリス−リン酸緩衝液、pＨ９〜１１:５０mＭ  グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液)の範囲で４℃、２２時間放置したのち、０.２Ｍ  リン酸二ナトリウムでpＨ７.５に調製し、峰時らの方法により酵素活性を測定した。
また、酵素活性に及ぼすpＨの影響を調べるために、pＨの幅を３〜１１(pＨ３〜６:５０mＭ  クエン酸−リン酸緩衝液、pＨ６〜８:５０mＭ  リン酸緩衝液、pＨ８〜９:５０mＭ  トリス−リン酸緩衝液、pＨ９〜１１:５０mＭ  グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液)の範囲で変化させて、峰時らの方法により酵素活性を測定した。pＨ安定性については、pＨ６.５〜９.５の範囲で安定であった。また、至適pＨは７.５であった。
【００３２】
２−(２)  至適および安定温度
酵素活性に及ぼす温度の影響を調べるために、峰時らの方法により各温度で酵素活性を測定した。また、酵素の安定性に及ぼす温度の影響を調べるために、各温度で酵素液を３０分間保持した後、峰時らの方法により酵素活性を測定した。
結果を図３に示す。温度安定性については、３０℃までは安定であり、４０℃でも６０％の活性を維持していた。また、至適温度は、４０℃であった。
【００３３】
２−(３)  阻害剤の影響
各種阻害剤の酵素活性に及ぼす影響を調べるために、各種阻害剤を表１に示した濃度で酵素反応液中に加えた後、峰時らの方法により酵素活性を測定した。結果を表１に示す。パラクロロ水銀安息香酸、ジチオビス(２−ニトロ)安息香酸により強い阻害を受けたことから、本酵素はＳＨ酵素であると考えられる。
【００３４】
【表１】
0004093598.tif 000002
【００３５】
２−(４)  脂肪酸の影響
各種脂肪酸の酵素活性に及ぼす影響を調べるために、表２に示した各種脂肪酸を、酵素反応液中に２mＭの濃度になるように加えて、峰時らの方法により酵素活性を測定した。結果を表２に示す。峰時らが精製したＡＡＴaseはリノレン酸の添加によって無添加の３２％に、リノール酸では４.３％にまで活性が低下するが(Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．,５７,(１２),p２０９４,１９９３)、本酵素はいずれの脂肪酸によっても阻害を受けないことがわかる。
【００３６】
【表２】
0004093598.tif 000003
【００３７】
実施例３  部分アミノ酸配列の決定
部分アミノ酸配列の決定は岩松のポリビニリデンジフロリド膜(以下、ＰＶＤＦ膜と略記)を利用した方法(生化学,６３,p１３９,１９９１)に従って行った。１−(４)で取得した精製酵素を１０mＭ  ギ酸３リットルで１時間透析した後に、凍結乾燥した。これを泳動用緩衝液(１０％  グリセロール、２.５％  ＳＤＳ、２％  ２−メルカプトエタノール、６２mＭ  トリス塩酸緩衝液(pＨ６.８))に懸濁させて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、エレクトロブロッティングにより当該酵素をゲルより１０cm×７cmのＰＶＤＦ膜「ＰroＢlot」(アプライド・バイオシステムズ社より入手)へ転写した。エレクトロブロッティング装置はＫＳ−８４６０型(マリソル社製)を用いて、島津製作所編の「プロテインシーケンサの試料前処理方法について(１)」に従って、エレクトロブロッティングを１６０mＡで１時間行った。転写後、当該酵素の転写された部分の膜を切りとり、約３００μlの還元用緩衝液(６Ｍ  グアニジン塩酸−０.５Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ８.５)、０.３％  ＥＤＴＡ、２％  アセトニトリル)に浸し、１mgのジチオスレイトールを加えて、アルゴン下で６０℃、約１時間の還元を行った。これに、２.４mgモノヨード酢酸０.５Ｎ  水酸化ナトリウム液１０μlに溶かしたものを加えて、遮光下で２０分間攪拌した。つぎに、ＰＶＤＦ膜を取り出し、２％  アセトニトリル水溶液で十分洗浄した後、０.１％  ＳＤＳ溶液中で５分間攪拌した。次に、ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄後、０.５％  ポリビニルピロリドン４０−１００mＭ  酢酸に浸し、３０分間静置した。この後、ＰＶＤＦ膜を水で十分洗浄し、約１mm四方に切断した。これを消化用緩衝液(８％  アセトニトリル、９０mＭ  トリス塩酸緩衝液(pＨ９.０)に浸し、Ａchromobacter  ＰroteaseＩ(和光純薬社より入手)を１pmol加え、室温で１５時間消化した。その消化物をＣ１８カラム(和光純薬より入手、Ｗakosil−ＩＩ５Ｃ１８ＡＲ、２.０×１５０mm)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー(日立社製、モデルＬ６２００)により分離して、数種のペプチド断片を得た。さらに、Ａchromobacter  ＰroteaseＩ消化後のＰＶＤＦ膜を、１０％  アセトニトリル水溶液で洗浄後、これを消化用緩衝液(８％  アセトニトリル、１００mＭ  重炭酸アンモニウム緩衝液(pＨ７.８))に浸し、Ｅndoproteinase  Ａsp−Ｎ(ベーリンガーマンハイム社より入手)を１pmol加え、４０℃で１５時間消化した。この消化物からも、上記と同様の逆相高速液体クロマトグラフィーにより、数種のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としては、Ａ溶媒(０.０５％  トリフルオロ酢酸)、Ｂ溶媒(０.０２％  トリフルオロ酢酸を含む２−プロパノール／アセトニトリル(７:３))を用い、Ｂ溶媒に関し、２〜５０％  ２−プロパノール／アセトニトリル(７:３)直線濃度勾配で０.２５ml／minの流速で４０分間溶出させた。両プロテアーゼ消化物から得られたペプチド断片について、アミノ酸配列決定試験を、島津製作所社の気相プロテインシークエンサーＰＳＱ−２型をマニュアルに従って用い、自動エドマン分解法により行った。結果を表３に示す。
決定されたアミノ酸配列と、峰時らが精製したＡＡＴaseをもとに取得したＡＡＴase遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列(Ａppl．Ｅnviron．Ｍicrobiol．,６０(８),p２７８６,１９９４)と比較した結果、同一の配列は見い出されず、新規なＡＡＴaseである。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
実施例４  新ＡＡＴaseを産生するＤＮＡ鎖の清酒酵母協会７号よりのクローニング
４−(１)  清酒酵母協会７号の染色体ＤＮＡの調製
清酒酵母協会７号をＹＰＤ培地１０００mlにＯ．Ｄ．６００＝１０まで培養し、集菌後オートクレーブ処理した水で洗浄した。これを菌体１gあたり２mlのＳＣＥ液(１Ｍ  ソルビトール、０.１２５Ｍ  ＥＤＴＡ、０.１Ｍ  クエン酸３ナトリウム(pＨ７)、０.７５％  ２−メルカプトエタノール、０.０１％  ザイモリエース１００Ｔ(生化学工業(株)より入手))に懸濁させた後、３７℃で約２時間緩やかに振盪し、酵母を完全にプロトプラスト化させた。これに、菌体あたり３.５mlの溶菌液(０.５Ｍ  トリス塩酸緩衝液(pＨ９)、０.２Ｍ  ＥＤＴＡ、３％  ＳＤＳ)を加えて緩やかに攪拌した。これを、６５℃で１５分間保温し、完全に溶菌させた。溶菌後、室温まで冷却し、あらかじめ日立超遠心チューブ４０ＰＡに作製しておいた２３.５mlの１０％−４０％シュークロース密度勾配液(０.８Ｍ  塩化ナトリウム、０.０２Ｍ  トリス塩酸緩衝液(pＨ８)、０.０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１０％−４０％  シュークロース)に１０mlずつ静かにのせた。これを、日立超遠心機ＳＣＰ８５Ｈを用いて、４℃で２６０００回転／分、３時間遠心した。遠心後、駒込ピペットを用いてチューブ底になるべく近いところから液を約５mlずつ回収した。回収したサンプルを１０００mlのＴＥ液(１０mＭ  トリス塩酸緩衝液(pＨ８)、１mＭ  ＥＤＴＡ)で一晩透析し、染色体ＤＮＡを得た。
【００４０】
４−(２)  ゲノムライブラリーの作製
次に、こうして得られた染色体ＤＮＡをＦrischauらの方法(Ｍethods  in  Ｅnzymology,１５２,p１８３,Ａcademic  press,１９８７)に準じて、制限酵素Ｓau３ＡＩ(宝酒造社より入手)で部分消化し、再び１０％−４０％  シュークロース密度勾配液にのせ、２０℃で２５０００回転／分、２２時間遠心を行った。遠心後、注射針で超遠心チューブの底に穴をあけ、０.５mlずつサンプリングチューブに分取した。分取したそれぞれの一部をアガロースゲル電気泳動し、分取した液中に含まれる染色体ＤＮＡの分子量を確認した後、１５〜２０kbの染色体ＤＮＡを集めて、エタノール沈澱によって回収した。この染色体ＤＮＡ１μgとλＥＭＢＬ３  ＢamＨＩベクターキット(ストラタジーン社より入手)のλＥＭＢＬ３ベクターＤＮＡ１μgとを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ(宝酒造社より入手)１ユニットで１６℃で一晩ライゲーションした。これをＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＧＯＬＤ(ストラタジーン社より入手)を用いて、付属のマニュアルに従ってパッケージングを行い、λＥＭＢＬ３  ＢamＨＩベクターキットに付属の大腸菌Ｐ２３９２に感染させ、約２００００個のプラークを得た。得られたプラークをナイロンメンブレンフィルターＨybond−Ｎ(アマシャム社より入手)に、アマシャム社のプロトコールに従いブロッティングした。
【００４１】
４−(３)  プローブの合成と標識
実施例３で得られた部分アミノ酸配列のうち、ＡＰ−３およびＡＰ−７の配列をもとに、ＤＮＡシンセサイザー(アプライド・バイオシステムズ社製、モデル３９１)を用いて、下記のような合成プローブ(Ａ:アデニン、Ｃ:シトシン、Ｇ:グアニン、Ｔ:チミン)を作製した。
【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
合成試薬(ＦＯＤホスホアミダイト等)は全て同社のものを用い、付属のオペレーターズマニュアルに従って使用した。得られた合成ＤＮＡを、２７％  アンモニア水２mlで５５℃、１時間処理し、これをＯＰＣカートリッジ(アプライド・バイオシステムズ社より入手)で精製した。この２種の合成ＤＮＡ１μgをそれぞれＥＣＬ３'オリゴラベリング・ディテクションシステム(アマシャム社より入手)により付属のプロトコールに従い標識し、プラークハイブリダイゼーションのプローブとした。
【００４５】
４−(４)  プラークハイブリダイゼーションによる新ＡＡＴase遺伝子の単離ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出方法は、ＥＣＬ３'オリゴラベリング・ディテクションシステム付属のプロトコールに従って行った。
まず、第一スクリーニングとして、４−(２)で作製したゲノムライブラリーのファージＤＮＡをトランスファーしたメンブレン２５枚を、４−(３)で合成・標識したプローブ１を用い、３２℃、一晩のハイブリダイゼーションとシグナルの検出を行った後、同メンブレンからプローブを除去し、引き続きプローブ２を用いて同様の操作を行い、プローブ１およびプローブ２で共通に陽性のシグナルを示すプラーク２５個を第二スクリーニングに用いた。なお、メンブレンからのプローブの除去は、検出終了後のメンブレンを０.４Ｍ  水酸化ナトリウム溶液を用い４５℃で３０分間緩やかに振盪した後、中和溶液(０.２Ｍ  トリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ＳＤＳ、０.１×ＳＳＣ(１５mＭ  塩化ナトリウム、１.５mＭ  クエン酸ナトリウム))にメンブレンを移し、４５℃で３０分間穏やかに振盪することで除去した。
第二スクリーニングは、プローブ１およびプローブ２で共通のシグナルを示した２５個のプラークをもとの寒天培地より、滅菌チップで寒天ごと打ち抜き、それぞれ１００μlのＳＭ液(０.１Ｍ  塩化ナトリウム、１０mＭ  硫酸マグネシウム、０.０１％  ゼラチン、５０mＭ  トリス塩酸緩衝液(pＨ７.５))に懸濁させた。この溶液をＳＭ液を用いて、出現するプラーク数がプレート１枚当たり５０個程度となるように適宜それぞれ希釈し、大腸菌Ｐ２３９２に感染させた。出現した２５クローンのプラークは、ライブラリー作製と同様にそれぞれナイロンメンブレンにブロッティングした。プローブ１を用い、３５℃、一晩のハイブリダイゼーションを行い、１２個の陽性クローンを取得した。
次に、単離した陽性クローンのファージＤＮＡを常法(Ｍolecular  Ｃloning,p７７,Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor,ＵＳＡ,１９８２)に従って調製した。取得したファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動により比較した結果、１２個の陽性クローン中７クローンが酵母染色体上の同じ部位をクローニングしたものであった。
【００４６】
４−(５)  新ＡＡＴase遺伝子の解析
７クローン中に含まれる共通のＤＮＡ断片について、プローブ１およびプローブ２を用いたサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、５.９kbのＨindＩＩＩ断片上に新ＡＡＴase遺伝子が含まれることがわかったので、この断片をアガロースゲル電気泳動後、遠心濾過チューブウルトラフリーＣ３ＨＶ(ミリポア社より入手)により精製し、pＵＣ１８に挿入した。得られた組み換えプラスミドを用いて、Ｂst  ＤＮＡシークエンシングキット(バイオラッド社より入手)により塩基配列の決定を行った。当該ＤＮＡ鎖の完全長を含む５.９kbのＨindＩＩＩ断片の制限酵素地図を図４に示す。新ＡＡＴaseをコードする部分の塩基配列を配列表の配列番号１に、該ＤＮＡから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。新ＡＡＴase遺伝子は１６０５塩基のコーディング領域をもち、５３５個のアミノ酸をコードしていた。
【００４７】
４−(６)  他の酵母における新ＡＡＴase遺伝子の存在
いくつかの酵母から染色体ＤＮＡを抽出し、新ＡＡＴase遺伝子をプローブとしたゲノムサザン解析により、その存在を検討した。酵母からの染色体ＤＮＡの抽出は、Ｄavis,Ｒ．Ｗらの方法(Ｍethod  in  Ｅnzymology,６５,p４０４,１９８０)に従った。抽出した染色体ＤＮＡ６μgを制限酵素ＰstＩ(宝酒造社より入手)で消化した後、常法(Ｍolecular  Ｃloning,p３８２,Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌaboratory,ＵＳＡ,１９８２)に従ってサザントランスファーした。プローブは図４に示した１.５kbのＰstＩ断片(矢印の範囲)を用い、ＥＣＬランダムプライムオリゴラベリング・ディテクションシステム(アマシャム社より入手)により標識し、ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は付属のプロトコールに従った、なお、ハイブリダイゼーションとメンブレンの洗浄は５０℃で行った。結果を図５に示す。実験室株を含めた全ての株(ビール酵母ＡＪＬ２１５５はＳaccharomyces uvarumであり、他は全てＳaccharomyces cerevisiaeに分類される)において、清酒酵母協会７号の１.５kbのシグナルと同一のシグナルが認められ、これらの酵母には新ＡＡＴaseと同一の遺伝子が存在している。また、ハイブリダイゼーションを通常(６０℃程度)より緩い条件で行ったにもかかわらず、他のシグナルが全く無いことより、これらの酵母に存在している既知のＡＡＴase遺伝子(Ａppl．Ｅnviron．Ｍicrobiol．,６０(８),p２７８６,１９９４)ともハイブリダイズせず、新ＡＡＴase遺伝子と相同性のあるＤＮＡ断片は他に存在しないことを示している。また、既知のＡＡＴase遺伝子をプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行っても、新ＡＡＴase遺伝子に相当するシグナルは全く観察されないことからも、本発明によるＡＡＴase遺伝子は新規な遺伝子である。
【００４８】
実施例５  新ＡＡＴase遺伝子を含むベクターの作製およびこのベクターにより形質転換された酵母のＡＡＴase活性
４−(５)で得られた新ＡＡＴase遺伝子を挿入したpＵＣ１８から、当該ＤＮＡ鎖の完全長を含む５.４kbのＢamＨＩ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片を、酵母２μmＤＮＡの複製起点とＬＥＵ２遺伝子をマーカーに持つ酵母用ベクターＹＥp１３(Ｇene,８,p１２１,１９７９)を制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造社より入手)で切断したものと連結して発現ベクターＹＡＴ２４を作製した(図６)。酢酸リチウム法(Ｊ．Ｂacteriol．,１５３,p１６３,１９８３)を用い、ＹＡＴ２４をサッカロマイセス・セレビシエＴＤ４(a,his,leu,ura,trp)に形質転換し、形質転換体ＴＤ４−ＡＴ２−４株を得た。なお、該株は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５９０として寄託されている。形質転換体ＴＤ４−ＡＴ２−４株および対照株のＡＡＴase活性の測定は、次のようにして行った。すなわち、ロイシンを除いたアミノ酸混合液を添加したＳＤ液体培地(０.６７％  イーストナイトロジェンベース(除アミノ酸、ディフコ社より入手)、２％グルコース)５mlで３０℃、約１６時間振盪培養したものを、５０mlの同培地に１ml添加し、３０℃、２４時間静置培養した。培養液を３０００回転／分、１０分間遠心して菌体を回収し、可溶化液(２５mＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液(pＨ７.５)、０.１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、０.５％  イソアミルアルコール、０.１Ｍ  塩化ナトリウム、１mＭ  ジチオスレイトール、２０％  グリセロール)５mlで一度洗浄後、０.４mlの可溶化液に懸濁した。これに０.８gのガラスビーズ(ＭＫ−２ＧＸ(直径０.２５−０.５mm)、シンマルエンタープライゼス社より入手)を加えて、３０秒間、３回激しく攪拌することにより細胞を破砕した。これに可溶化液を０.８ml加えて軽く攪拌後、パスツールピペットを用いて液部を回収し、１５０００回転／分、５分間遠心して取得した上清を、ＡＡＴase活性測定の試料とした。なお、対照株としては、サッカロマイセス・セレビシエＴＤ４にベクターのＹＥp１３を形質転換した株を用いた。活性の測定は峰時らの方法に従って行い、新ＡＡＴase遺伝子の組み換え体から得た試料について、不飽和脂肪酸であるリノール酸１mＭを添加して活性を測定したもの、および、試料を３０℃で１時間放置した後のＡＡＴase活性も測定した。また、蛋白質の定量は、バイオラッドプロテインアッセイキット(バイオラッド社より入手)を用い、付属のマニュアルに従って行った。結果を表４に示す。組み換え体のＡＡＴase活性は、対照株に比べ２.８倍高くなり、不飽和脂肪酸の阻害も少なく、さらには、３０℃で１時間放置しても８０％以上の活性を保持していることが認められた。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
実施例６  形質転換酵母ＴＤ４−ＡＴ２−４株による発酵試験
実施例５で取得した、新ＡＡＴase遺伝子により形質転換されたサッカロマイセス・セレビシエＴＤ４−ＡＴ２−４株を用いて発酵試験を行い、酢酸エステル生成量について検討した。ＴＤ４−ＡＴ２−４株をロイシンを除いたアミノ酸混合液を添加したＳＤ液体培地(０.６７％、イーストナイトロジエンベース(除アミノ酸、ディフコ社より入手)、２％  グルコース)５mlで３０℃、約１６時間振盪培養した培養液を、ＹＭ改変培地(０.３％  酵母エキス、０.５％  ペプトン、０.３％  麦芽エキス、１５％  グルコース、０.５％  りん酸二水素カリウム、０.２％  硫酸マグネシウム、pＨ６.０)に２％添加して、３０℃、４８時間発酵させた。培養液を遠心処理(８０００回転／分、１０分)し、その上澄み液の香気成分を分析した。結果を表５に示す。本発明の酵母を用いた場合、ベクターのみの対照株と比較して酢酸エチルでは１.４倍、酢酸イソアミルでは４.８倍も生成量が増大し、発酵試験においても酢酸エステル生成量が増加することがわかる。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
【発明の効果】
本発明による新ＡＡＴase遺伝子を用いることによって、酢酸イソアミル等の酢酸エステル産生能の増強した、しかも、より安定したＡＡＴase活性を持つ株を育種することができる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
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【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明による新ＡＡＴaseのポリバッファーエクスチェンジャー９４による活性画分の溶出パターンを示す図面である。
【図２】  本発明による新ＡＡＴaseのフアィニティーカラム溶出活性画分の、セントリカットによる限外濾過前および濾過後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、銀染色の写真である。
【図３】  本発明による新ＡＡＴaseの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図面である。
【図４】  本発明による新ＡＡＴase遺伝子の制限酵素地図である。
【図５】  本発明による新ＡＡＴase遺伝子を用いたゲノムサザン解析の電気泳動の写真である。
【図６】  本発明による新ＡＡＴase遺伝子の酵母用発現ベクターＹＡＴ２４の構築工程を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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