(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグーチシグナリングタンパク質の精製された生物学的に活性なペプチドであって、該ペプチドは、以下：
（ａ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、および、２８からなる群より選択される配列からなる、ペプチド；ならびに
（ｂ）１または数個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失によって該（ａ）のペプチドから誘導されたペプチドであって、該ペプチドは、少なくとも１つのメラニンの産生を阻害するその能力のために、脱色活性を有する、ペプチド
からなる群より選択される、ペプチド。
【請求項２】
前記アグーチシグナリングタンパク質は、細胞へのその移入を促進するペプチドにカップリングされる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号３の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号４の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号５の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号６の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号７の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号８の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号９の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号１０の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号１５の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号１６の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号１７の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号１８の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
配列番号１９の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号２０の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
配列番号２５の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列番号２６の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
配列番号２７の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号２８の配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかのペプチドに特異的に結合する、精製されたポリクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれかのペプチドに特異的に結合する、精製されたモノクローナル抗体。
【請求項２４】
被験体においてメラニン合成に関与するメラニン形成酵素をダウンレギュレートするための組成物であって、一定量の請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドを含む、組成物。
【請求項２５】
被験体においてメラニン合成を減少させるための組成物であって、一定量の請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドを含む、組成物。
【請求項２６】
被験体においてメラニン合成を変化させるための組成物であって、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドをコードする核酸に相補的な核酸の一定量を含む、組成物。
【請求項２７】
被験体における色素過剰状態を処置するための組成物であって、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドを含む、組成物。
【請求項２８】
被験体におけるメラニン合成に関与するメラニン形成酵素をダウンレギュレートするのに使用するための、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチド。
【請求項２９】
被験体におけるメラニン合成を減少させるのに使用するための、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチド。
【請求項３０】
被験体においてメラニン合成を変化させるのに使用するための、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチドをコードする核酸に対して相補的な、核酸。
【請求項３１】
被験体において色素過剰状態を処置するのに使用するための、請求項１に記載の生物学的に活性なペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
哺乳動物メラノサイトは、２つの型のメラニン（ユーメラニン（黒色および／または茶色）およびフェオメラニン（赤色および／または黄色））を産生し得る（Prota, 1992; Ito, 1993a）。小胞（すなわち、毛球）メラノサイトにおけるメラニンのこれらの２つの型間の切り替えは、ユーメラニン形成からフェオメラニン形成への一時のシフトを誘発し、これはマウスの体毛の色の野生型アグーチ色素のパターン（すなわち、Silvers（1979）およびHirobe（1991）によって概説される、各毛幹上の黒いバックグラウンドに対する黄色の縞のバンド）を担う。この生理学的切り替えは、agouti遺伝子座によって制御され、これは最近クローン化されている（Bultmanら、1992; Millerら、1993）。agouti遺伝子座コードタンパク質は、非メラノサイト小胞細胞（Silvers, 1958）によって分泌されると考えられ、そしてメラノサイト刺激ホルモン（αMSH）レセプターのアンタゴニスト（これはメラノサイトによって特異的に発現される（Luら、1994））として機能する。agouti遺伝子座における劣性黒色変異（非アグーチ;a）は、ユーメラニン黒色毛の構成的な産生を生じるagouti RNAのほぼ完全な喪失を生じる。それに対して、優性致死黄色変異（Ay/a）は、体のほとんど全ての組織中の、および体毛成長サイクルの全ての段階を通してagouti RNAの遍在性異所性産生を誘発し、完全に黄色のフェオメラニンの体毛の産生を促進する誘発する（ItoおよびFujita, 1985; Duhlら、1994a,b）。
何十年間も、メラニンの生合成を調節するメラノソームタンパク質（特に、ユーメラニン形成のために必要とされるもの）は、研究され、そして特徴づけされてきた（HearingおよびTsukamoto（1991）ならびにHearingおよびKing（1993）によって概説されている）。albino遺伝子座でコードされるチロシン（EC 1.14.18.1）は、メラニン形成の両方の型についての必須の酵素タンパク質である。チロシナーゼは、以下の３つの触媒活性を有する三機能性（trifunctional）酵素である：チロシンから3,4-ジヒドロキシフェニル-アラニン（DOPA）へ、DOPAのドーパキノンへの酸化、および5,6-ジヒドロキシインドール（DHI）のインドール-5,6-キノンへの酸化（KornerおよびPawelek, 1982; Hearing, 1987; Tripathiら、1992）。他のチロシン関連タンパク質（TRP）は、チロシナーゼに対して遠位の工程で、ユーメラニン形成を触媒的に調節することが示されてきた。brown遺伝子座でコードされるTRP1は、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸（DHICA）オキシダーゼとして機能する（Jimenez-Cervantesら、1994; Kobayashiら、1994b）一方、slaty遺伝子座でコードされるTRP2は、DOPAクロムタウトメラーゼ（tautomerase）（EC 5.3.2.3）として機能する（Barberら、1984; Arocaら、1990; Tsukamotoら、1992; Jacksonら、1992）。silver遺伝子座コードタンパク質は、メラノソーム中でのメラニン形成において触媒的に機能することが提唱されていた。そして、チロシナーゼ関連タンパク質とのいくらか限られた相同性を有するが（Kwonら、1991）、最近、それらはメラノソームマトリックスタンパク質であり、そして公知のメラニン形成（melanogenic）活性を有さないことが示されている（Zhouら、1994; Kobayashiら、1994a）。pink-eyed dilution遺伝子座の産物はまた、メラニン形成の調節において活発に関与するメラノソームタンパク質である（Tamateら、1989; Chiuら、1993; Rosemblatら、1994）。
フェオメラニン形成の間、チロシナーゼの活性および発現は、ユーメラニン形成の間に見出された活性および発現より低いと報告されてきた（Barberら、1985; Burchillら、1986,1989; Lamoreuxら、1986; MovagharおよびHunt, 1987; Tamateら、1989; Granholmら、1990; Kappenmanら、1992）。チロシナーゼに加えて、チオールは、フェオメラニン形成に必要なシステイニルドーパを産生するためにチロシナーゼによって酵素的に作製されたドーパキノンを捕獲するのに必須である（図１）。特徴づけされていない一連の反応におけるシステイニルドーパーの引き続く環化および重合は、フェオメラニンとして公知の高分子量複合体の産生をもたらす（Prota, 1992; HearingおよびKing, 1993; Ito, 1993a）。ユーメラニン形成とフェオメラニン形成との間の切り替えは、チロシナーゼのレベルで、主に酵素的に調節されると提唱されてきた（Ito, 1993a）。しかし、フェオメラニン形成の間の他のメラニン形成遺伝子産物の潜在的な役割は、不明確なままである。なぜなら、このようなタンパク質のフェオメラニン形成の間の発現および機能についての研究はほとんど存在していなかったからである。現在までのところ、フェオメラニン形成マウス（ThodyおよびBurchill, 1992）およびヒトメラノーマ細胞（Del-Marmolら、1993）においてTRP1 mRNA発現が存在しないことが報告されてきたように、黄色マウスにおけるDOPAクロムタウトメラーゼ活性が存在しないことのみが報告されてきた（Barberら、1985）。
本発明は、フェオメラニン形成の間のチロシナーゼ、TRP1、TRP2、および銀タンパク質の発現および触媒機能の転写レベルおよび翻訳レベルを決定する。フェオメラニン形成段階の間の野生型アグーチマウスの毛球中のそれらのタンパク質の発現およびメラニン形成活性もまた、本発明において決定される。本発明は、TRP1、TRP2、および銀タンパク質がユーメラニン形成において特異的に機能し、そしてユーメラノソームの産生において重要な役割を果たし得ることを示す。メラニン形成の間のこれらのタンパク質の発現のダウンレギュレーションは、アグーチシグナリングタンパク質を用いて本発明において示される。
発明の要旨
本発明は、脱色活性を有するアグーチシグナリングタンパク質の生物学的に活性なペプチドである。
本発明は、メラニン合成に関与する１つ以上のメラニン形成酵素をダウンレギュレートする方法である。
本発明はまた、メラニン合成を阻害する方法におけるアグーチシグナリングタンパク質およびその生物学的に活性なペプチドの使用である。
本発明のさらなる局面は、有効量のアグーチシグナリングタンパク質またはそのペプチドを使用する色素過剰状態および疾患の処置である。
本発明の別の局面は、アグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアからなる薬学的組成物である。
本発明はまた、アグーチシグナリングタンパク質の生物学的に活性なペプチドおよびメラニン合成を阻害するのに有用な他の化合物をスクリーニングする方法である。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、ならびに多くの付随の利点は、以下の添付する図面とともに考慮した場合、以下の詳細な説明を読む際により理解される：
図１は、ユーメラニンおよびフェオメラニンの生合成経路を示す。
図２は、新生致死黄色マウスおよび黒色マウスの毛球メラノサイトによって発現したメラニン形成タンパク質の分析を示す。材料および方法に詳述されるように、10日目の新生致死黄色マウスまたは黒色マウスの毛球（またはメラン-a細胞）の抽出物由来のタンパク質の20μgのサンプルを、SDS/ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、それをメンブレンに移し、そしてウェスタンイムノブロッティングによってメラニン形成タンパク質を分析した。材料および方法に詳述されるように、器官培養物中の皮膚細胞（またはメラン-a細胞）を、[35S]メチオニンで４時間標識し、可溶化し、そして記載した抗体によって免疫沈降し、SDS-PAGEによって分離し、乾燥し、そして蛍光間接撮影した。
図３は、新生の致死黄色マウス、黒色マウス、およびアグーチマウスの毛球メラノサイトに存在するRNAのノーザンブロット分析を示す。材料および方法に詳述されるように、10日目の新生の致死黄色マウス、黒色マウス、およびアグーチマウスの毛球由来のmRNAを、単離しそして電気泳動し（２μg/レーン）、ナイロンメンブレンに移し、そしてチロシナーゼ、TRP1、TRP2、および銀タンパク質またはGAPDH（グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）に対する32P標識プローブを用いて繰り返しハイブリダイズした。sは、Svedbergユニット。
図４は、致死黄色マウスおよび黒色マウスの毛球の再生におけるメラニン形成タンパク質の発現を示す。発育相成長体毛を、２月齢の兄弟の致死黄色マウスおよび黒色マウスの背中の休止期の体毛を引き抜くことにより誘導した。各マウスの７つの１cm×１cm角を、屠殺前の０（屠殺直前）、２、４、６、８、10、および12日にランダムに引き抜いた。背中の皮膚のサンプルを、３匹のマウスの各遺伝子型から回収し、可溶化し、そして図２に詳述のようにウェスタンイムノブロッティングによって分析した；30μgのタンパク質を、各レーンにおいて分離した。
図５は、新生のアグーチ（A/A）マウスの背中の皮膚におけるメラニン形成タンパク質の発現を示す。背中の皮膚を、３、５、７、９、および11日目の新生のアグーチマウスから回収し、可溶化し、そして図２に詳述のようにウェスタンイムノブロッティングによって分析した；各背中の皮膚の抽出物の30μgのタンパク質（10μgのメラン-a細胞抽出物）を各レーンにおいて分離した。
図６Aおよび６Bは、アグーチ（A/a）マウスおよび黒色（a/a）マウスの背中の皮膚のメラニン形成タンパク質の発現を示す。材料および方法に詳述のように、５日目および11日目の兄弟の新生アグーチマウスおよび黒色マウスの背中の皮膚中のメラニン形成タンパク質の発現を、ウェスタンイムノブロッティング、および代謝標識、および免疫沈降を用いて試験した。（図６A）図２に詳述のように、アグーチマウスおよび黒色マウスの背中の皮膚の抽出物中のタンパク質を、可溶化し、そしてウェスタンイムノブロッティングによって分析した；各背中の皮膚の抽出物の40μgのタンパク質（10μgのメラン-a細胞抽出物）を各レーンにおいて分離した。（図６B）材料および方法に詳述のように、器官培養物中の皮膚組織を、[35S]メチオニンを用いて６時間標識し、可溶化し、そして免疫沈降によって分析した。
図7Aおよび7Bは、種々の濃度のアグーチタンパク質の存在下で培養したメラン-a細胞（図7A）、および10nMのアグーチタンパク質の存在下で１、２、または４日間培養したメラン-a細胞（図7B）に由来するのチロシナーゼおよびGAPDHのRNAレベルのノーザンブロット分析を示す。
図8Aおよび図8Bは、10nMのアグーチタンパク質の存在下（図8B）、またはアグーチタンパク質の非存在下（図8A）で５日間増殖させたメラン-a細胞の超微細構造を示す（倍率×8000）。
図９は、種々の濃度のアグーチタンパク質の存在下またはアグーチタンパク質の非存在下で１日間培養したメラン-a細胞由来のチロシナーゼ、TRP1、TRP2、MSH-R、およびGAPDHのRNAレベルのノーザンブロット分析を示す。
図10は、10nM MSHの存在下または非存在下、10nMアグーチタンパク質の存在下または非存在下、またはMSHおよびアグーチタンパク質の両方の存在下で５日間培養したメラン-a細胞由来のチロシナーゼ、TRP1、TRP2、MSH-R、およびGAPDHのRNAレベルのノーザンブロット分析を示す。
図11は、10nM MSHの存在下または非存在下、10nMアグーチタンパク質の存在下または非存在下、またはMSHおよびアグーチタンパク質の両方の存在下で５日間培養したメラン-a細胞由来のチロシナーゼ、TRP1、およびTRP2タンパク質の免疫沈降の代謝標識の結果を示す。
図12は、10nM MSHの存在下または非存在下、10nMアグーチタンパク質の存在下または非存在下、またはMSHおよびアグーチタンパク質の両方の存在下で５日間培養したメラン-a細胞由来のチロシナーゼ、TRP1、およびTRP2タンパク質のウェスタンブロットを示す。
図13は、10nM MSHの存在下または非存在下、10nMアグーチタンパク質の存在下または非存在下、またはMSHおよびアグーチタンパク質の両方の存在下で５日間培養したメラン-a細胞由来のチロシナーゼ、TRP1、TRP2、MSH-R、およびGAPDHのRNAレベルのノーザンブロット分析を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物におけるメラニン形成の生理学的な外因性インヒビターである。本発明のメラニン形成のインヒビターは、メラニンの産生を阻害するタンパク質およびそのペプチドである。本発明の好ましいメラニン形成のインヒビターは、アグーチシグナリングタンパク質およびそれらの生物学的に活性なペプチドである。従って、本発明は、被験体における色素過剰の症状を処置する方法であり、これには被験体にアグーチシグナリングタンパク質またはそれらの生物学的に活性なペプチドを投与する工程を包含する。アグーチシグナリングタンパク質およびそれらのペプチドは、種々の色素過剰の症状および疾患の予防または処置における化粧用の目的および臨床的適用に有用である。このような症状または疾患として、光加齢斑黒皮症（melasma photoaging spot）、日光性角化症、および創傷治癒部位で生じる炎症後の色素過剰症が挙げられるがこれらに限定されない。
ポリペプチドおよびペプチドは、αアミノ基と隣接した残基のカルボキシル基との間のペプチド結合によって一方から他方へ結合した一連の直鎖状アミノ酸残基を意味するために本明細書中で交換可能に使用される用語である。ポリペプチドおよびペプチドは、合成ペプチドまたは合成ポリペプチド、組換えペプチドまたは組換えポリペプチド、あるいは天然に存在する全長タンパク質の酵素的切断に由来するペプチドまたはポリペプチドであり得る。
合成ペプチドは、天然に存在するタンパク質およびそれらのフラグメントを含まないペプチド結合によってお互いに結合したアミノ酸残基の化学的に産生された鎖をいう。
本明細書中で使用されるように、句「アグーチシグナリングペプチド」は、アミノ酸残基配列を有するポリペプチドまたはペプチドをいい、それはマウスアグーチシグナリングタンパク質またはヒトホモログの一部に対応し、そして好ましくは同一であるアミノ酸残基配列を含む。成熟マウスアグーチシグナリングタンパク質のアミノ酸残基配列は、Millerら、Gene ＆ Development 7:454-467, 1993に開示され、そして配列番号１に列挙されている。アグーチシグナリングタンパク質に対する成熟ヒトホモログのアミノ酸配列は、Wilson,B.D.ら、Human Mol. Genetics, 4（2）: 223-230, 1995に開示され、そして配列番号２に列挙される。本発明のペプチドは、メラニンの産生を阻害するための能力を有する。
0004105763.tif 000002
本発明のアグーチシグナリングペプチドは、塩基性領域もしくはその一部、システインリッチ領域もしくはその一部、または塩基性領域とシステインリッチ領域との組合せに由来する。
本発明のアグーチシグナリングペプチドは、合成の容易さおよび阻害を指向する能力の理由のために、好ましくは、約131アミノ酸残基長以下である。従って、アグーチシグナリングペプチドは、約109アミノ酸残基長以下、なおさらに好ましくはわずか約50残基長未満、そして最も好ましくはわずか20未満のアミノ酸残基長であることがより好ましい。１つの実施態様において、本発明のアグーチシグナリングペプチドは、約５〜約10アミノ酸残基を有し、そしてメラニン産生を阻害する能力を有する。
本発明は、以下の特徴を有するアグーチシグナリングタンパク質の精製された生物学的に活性なペプチドである：（a）ペプチドが少なくとも１つのメラニンの産生を阻害するその能力のために脱色活性を有する；（b）ペプチドが以下からなる群から選択される少なくとも１つの領域を有する：（i）全長アグーチシグナリングタンパク質またはその一部に由来する少なくとも１つの塩基性領域；および（ii）全長アグーチシグナリングタンパク質またはその一部に由来するシステインリッチ領域；（c）ペプチドが少なくとも約５アミノ酸残基の最小長を有するが、以下からなる群から選択される最大長を有する：（i）約131アミノ酸残基以下；（ii）約109アミノ酸残基以下；（iii）約50アミノ酸残基以下；（iv）約20アミノ酸残基以下；および（v）約10アミノ酸残基以下；そして、ここで、このアグーチシグナリングタンパク質は、細胞内へのその輸送を促進する分子に必要に応じて結合される。特定の実施態様において、これらの特徴および約131アミノ酸残基以下の最大長を有するアグーチシグナリングタンパク質が提供される。さらなる特定の実施態様において、アグーチシグナリングタンパク質は、約109アミノ酸残基以下の最大長を有する。
１つの実施態様において、本発明のアグーチシグナリングペプチドは、約109アミノ酸残基以下の長さを有し、そして以下の式によって示されるアミノ酸残基配列またはその生物学的に活性な部分を含む：
0004105763.tif 000003
別の実施態様において、本発明のアグーチシグナリングペプチドは、約109アミノ酸残基以下の長さを有し、そして以下の式によって示されるアミノ酸残基配列またはその生物学的に活性な部分を含む：
0004105763.tif 000004
別の実施態様において、本発明のアグーチペプチドは、約109アミノ酸残基以下の長さ、好ましくは約50アミノ酸未満の長さを有し、そして以下の式によって示されるアミノ酸配列またはその一部を含む：
0004105763.tif 000005
別の実施態様において、本発明のアグーチペプチドは、約109アミノ酸以下の長さ、好ましくは約50アミノ酸未満の長さを有し、そして以下の式によって示されるアミノ酸配列またはその一部を含む：
0004105763.tif 000006
１つの実施態様において、好ましいアグーチシグナリングペプチドは、配列番号３または配列番号４によって示される少なくとも１つのアミノ酸残基配列またはその一部を含み、そして配列番号５または配列番号６によって示される少なくとも１つのアミノ酸残基配列またはその一部、あるいはその組合せを含む。
本発明の他の例示的なペプチドは：
0004105763.tif 000007
反復配列、および少なくとも１つのメラニン産生を阻害する能力を有する１つ以上のそれらの配列の組合せからなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有するペプチドを含むが、これに限定されない。
天然に折りたたまれたアグーチシグナリングタンパク質の３次元構造により、アグーチシグナリングタンパク質の複数の領域が、メラニン産生の阻害に関係し得る。従って、別の実施態様において、本発明は、メラニンの同時阻害を提供するために組合せて混合された、上記の１つ以上の異なるアグーチシグナリングペプチドを含むアグーチシグナリングペプチド組成物を意図する。同様に、正常に介在するアミノ酸配列以外によって結合された２つ以上のアグーチシグナリングペプチドを含むモザイクポリペプチドもまた意図される。
本発明のペプチドは、必要な配列を含み、そして本明細書中に記載されるような少なくとも１つのメラニンの産生を阻害し得る限り、配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基配列と同一である必要はない。
ポリペプチドが少なくとも１つのメラニンの産生を阻害し得る限り、本発明のポリペプチドは、本明細書中に示されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチド（そのアミノ酸残基配列は本明細書中に示される）の任意のアナログ、フラグメント、または化学的誘導体を含む。従って、本発明のポリペプチは、種々の変化、置換、挿入、および欠失に供され得、このような変化は、その使用において特定の利点を提供する。
用語「アナログ」は、本明細書中に詳細に示される配列に実質的に同一なアミノ酸残基配列を有する任意のペプチドを含む。これは、１つ以上の残基が、機能的に類似の残基と保存的に置換され、そして本明細書中に記載されるようなメラニンの産生を阻害する能力を示す。保存的置換の例には、ある非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニン）の別の残基への置換、特定の極性（親水性）残基の別の残基への置換（例えば、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間）、特定の塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）の別の残基への置換、または特定の酸性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の別の残基への置換が挙げられる。
句「保存的置換」はまた、このようなペプチドが必要な阻害活性を示す場合は、非誘導残基のかわりに化学的に誘導された残基の使用を包含する。
「化学的誘導体」は、官能側基（functional side group）の反応によって化学的に誘導された１つ以上の残基を有する本発明のペプチドをいう。このような誘導分子として、例えば、遊離アミノ基が誘導されてアミンヒドロクロリド、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチイルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は、誘導されて塩、メチルエステル、およびエチルエステル、または他の型のエステルまたはヒドラジンを形成し得る。遊離のヒドロキシル基は、誘導されてO-アセチルまたはO-アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾールの窒素は、誘導されてN-イム-ベンジルヒスチジンを形成し得る。20種類の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドがまた化学的誘導体として含まれる。例えば：プロリンの換わりに4-ヒドロキシプロリンが用いられ得る；リジンの換わりに5-ヒドロキシルリジンが用いられ得る；ヒスチジンの換わりに3-メチルヒスチジンが用いられ得る；セリンの換わりにホモセリンが用いられ得る；そしてリジンの換わりにオルニチンが用いられ得る。本発明のペプチドはまた、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加および／または欠失、または配列が本明細書中で示されるペプチドの配列に関連する残基を有する任意のペプチドを含む。
用語「フラグメント」は、そのアミノ酸残基配列が本明細書中に示されているポリペプチドのアミノ酸残基配列より短いアミノ酸残基配列を有する本発明の任意のペプチドをいう。
本発明のペプチドがアグーチシグナリングタンパク質の配列に同一でない配列を有する場合、それは、代表的には、１つ以上の保存的置換または非保存的置換が行われてきたからである（通常約30％以下、好ましくは約20％以下、そしてより好ましくは約10％以下のアミノ酸残基が置換される）。さらなる残基はまた、「リンカー」を提供する目的のためにいずれかの末端で添加され得、それにより本発明のペプチドは、簡便にキャリアを添加され得る。
キャリア分子は、本発明のペプチドに対する安定性を提供するために使用され得、そして/または特定の部位もしくは特定の標的細胞に対してペプチドを標識するために使用され得る。例えば、キャリアは、メラノサイトに対してアグーチペプチドを標的化するメラノサイトレセプターまたはメラノサイト特異的リガンドであり得る。別の実施態様において、キャリアは、標的細胞に対するペプチドの送達を促進し得る補助的ペプチドである。このようなペプチドの例は、Oncorの事業部であるAppligeneにより市販されているPenetratinである。このペプチドは特許化されており、そして16アミノ酸を有する。ペプチド、糖、脂質などを含む他のキャリア分子は、標的細胞への送達を促進するためにアグーチシグナリングタンパク質またはそのペプチドに結合され、安定性が改善されるか、または他の有用な機能が提供され得る。
１つの実施態様において、アグーチシグナリングペプチドのより安定な誘導体は、Hadley,M.E.ら、Endocrine Res. 11（3-4）157-170,1985に記載のプロトコルによって合成される。
アミノ酸残基のリンカーは、アグーチペプチドをキャリア分子に結合させるために使用され得、そして通常は少なくとも１つの残基であり、そして40以上の残基、より多くの場合１〜10残基であり得る。結合のために用いられる代表的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。さらに、本発明のペプチドは、他に特定されない限り、末端-NH2アシル化（例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシル化（例えば、アンモニア、メチルアミン、など）によって改変された配列によってアグーチシグナリングタンパク質の天然の配列と異なり得る。
本発明の任意のペプチドは、薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。本発明のペプチドとともに塩を形成し得る適切な酸として、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸など）が挙げられる。
本発明のペプチドとともに塩を形成し得る適切な塩基として、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）；および有機塩基（例えば、モノ、ジ、ならびにトリ-アルキルおよびアリルアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど））ならびに必要に応じて置換されたエタノールアミン（エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）が挙げられる。
本発明のアグーチシグナリングペプチドは、ポリペプチドにおける当業者に公知の任意の技術（組換えDNA技術を含む）によって合成され得る。組換えタンパク質の構築、発現、および精製の方法は、Current Protocols in Molecular Biology, 第1-3巻、Ausbel,F.M.ら編、John Wiley＆Son, Inc., 1995に詳述されている。短いペプチドを産生するために、合成化学技術（例えば、固相Merrifield型合成）は、純度、所望でない部位産物からの解放、産生の容易さの理由のために好ましい。利用可能な多くの技術の優れた要約は、固相ペプチド合成についてはJ.M.StewardおよびJ.D.Young,「固相ペプチド合成」、W.H.Freeman Co., San Francisco, 1969; M.Bodanszkyら、「ペプチド合成」、John Wiley＆Sons,第２版,1976、およびJ.Meienhofer, 「ホルモン性タンパク質およびペプチド」、第２巻、46頁、Academic Press（New York）,1983、ならびに伝統的な溶液合成についてはE.SchroderおよびK.Kubke,「ペプチド」第１巻、Academic Press（New York）,1965（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）に見出され得る。このような合成に使用可能な適切な保護基は、上記試験およびJ.F.W. McOmie,「有機化学における保護基」、Plenum Press, New York, 1973（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する精製された抗体である。特に、ペプチドは、配列CGLGENSPLLSGQQV（配列番号29）を有するカルボキシ末端ペプチドに特異的に結合するポリクロール抗体であり得る。さらなる実施態様においては、配列番号29を有するペプチドに特異的に結合する精製されたモノクローナル抗体である。本発明の別の新規のペプチドに対する精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が意図される。
本発明は、少なくとも１つのメラニン形成酵素、好ましくは１つより多いメラニン形成酵素を阻害する方法である。クローン化された皮膚色素遺伝子がこのようにはるかに高いレベルの配列類似性を示し、そしてマウスとヒトとの間で同一の機能を有するので、マウスにおける実験の結果は、ヒトにおいて予想される結果に明らかに対応する。阻害され得るかまたはダウンレギュレートされ得るメラニン形成酵素として、チロシナーゼ、TRP1およびそのヒトホモログ、TRP2およびそのヒトホモログなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の１つの実施態様において、メラニン形成酵素を阻害またはダウンレギュレートする方法により、チロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の阻害が生じる。従って、被検体においてメラニン合成に関するメラニン形成酵素をダウンレギュレートする方法（メラニン形成酵素をダウンレギュレートするために被検体に一定量のアグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に活性なペプチドを投与する工程を包含する）が提供される。本発明の別の実施態様において、本方法により、少なくとも１つのメラニンの合成の阻害が生じる。本発明によって阻害され得るこのようなメラニンとして、ユーメラニンおよびフェオメラニンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施態様において、この方法は、少なくとも１つのユーメラニンの産生の阻害を生じる。
この方法は、アグーチシグナリングタンパク質または１つ以上のそれらの生物学的に活性なペプチドを、少なくとも１つのメラニン（例えば、ユーメラニンおよびフェオメラニン）の産生または合成を阻害または減少させるための有効量の哺乳動物への投与である。
本方法は、色素過剰の症状または疾患の処置において特に有用である。このような症状または疾患として、光加齢斑黒皮症、日光性角化症、および創傷治癒部位で生じる炎症後の色素過剰症が挙げられるがこれらに限定されない。
アグーチシグナリングタンパク質およびその生物学的に機能的なペプチドは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における色素過剰部位でのメラニン産生を阻害する方法において有用である。このような部位で投与されたアグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に機能的なペプチドは、その部位でのメラニンの形成を妨げるかまたは阻害する。従って、本発明は、被験体におけるメラニン合成を減少させる方法である。この方法は、このような減少が必要な被験体に、メラニン合成を減少させるために、一定量のアグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に活性なペプチドを投与する工程を包含する。
処置方法において、アグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に機能的なペプチドの投与は、予防的用途または治療的用途のいずれかのために供給され得る。予防的に提供される場合、アグーチシグナリングタンパク質またはその生物学的に機能的なペプチドは、ある部位での全てのメラニンの色素過剰産生の進行において提供される。本発明のタンパク質またはペプチドの予防的投与は、その部位で任意のメラニン過剰産生を妨げるかまたは阻害するように作用する。治療的に提供される場合、タンパク質またはペプチドは、その部位でのメラニン産生の開始の時点で（または開始後に）提供される。従って、タンパク質またはペプチドは、その部位での予想されるメラニン形成の前に、またはメラニン形成がその部位で開始された後のいずれかで提供され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「単位用量」は、哺乳動物について単位投与量として適切な物理的に異なる単位をいう。各ユニットは、所望の阻害効果を産生するように計算されたアグーチシグナリングタンパク質、そのペプチドおよび誘導体の予め決定された量を含む。
代表的には、接種物は、許容可能な（受容可能な）希釈物（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化食塩水）または他の生理学的に許容可能な希釈物などにおける溶液として調製され、水溶性の薬学的組成物を形成する。さらに、タンパク質、それらのペプチドまたは誘導体は、固体形態および凍結乾燥形態で処方され得、そして使用前に再溶解されるかまたは懸濁される。
この組成物は、必要に応じて他の治療物を含む。特に興味のあるものは、損傷を受けた皮膚の予防または処置において有用な治療物である。例えば、組成物はまた、エストロゲンまたはその誘導体、トレチノインまたはビタミンＡ誘導体、UV-Aおよび／またはUV-B光ブロック剤、抗生物質、座瘡処置剤などを含み得る。例えば、この組成物は、クリームとして処方された有効濃度のトレチオニンと組み合わせた有効濃度のアグーチシグナリングペプチドを含み得る。トレチノイン濃度は、約0.025％〜約0.1％トレチノインであり得る。
アグーチシグナリングタンパク質またはアグーチシグナリングペプチドはまた、化粧品の組成物として調製され得る。
投与の経路は、メラノサイトに指向されるように、皮下（S.C.）、皮内（I.D.）、局所などであり得る。処置方法の１つの実施態様において、タンパク質、それらのペプチドまたは誘導体は局所的に投与される。本発明のペプチドは、皮膚を介するそれらの浸透を促進するキャリア基の添加によって改変され得る。このような基として親油基などが挙げられるが、これらに限定されない。親油基の例は、長鎖炭化水素基を付加された脂肪酸または脂肪族アルコールである。局所的に適用された薬学的に活性な薬剤の表皮の浸透、真皮の浸透、および経皮の浸透を促進するための他の処方物は、米国特許第5,326,566号、同第5,409,917号、および同第5,260,292号に開示されている。あるいは、本発明のペプチドは、局所的な投与を用いてそれらの侵入を促進するためにリポソームに処方され得る。当業者に一般に公知のように、局所的な投与のために、タンパク質、それらのペプチドまたは誘導体を、軟膏、膏薬、ゲル、真皮用のパッチ、またはクリーム中で処方する。
哺乳動物（好ましくは、ヒト）にアグーチシグナリングタンパク質またはペプチドを供給することにおいて、タンパク質、それらのペプチドまたはその誘導体の投与の用量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的症状、以前の医学的症状、投与の経路、処方、および色素過剰の進行の状態のような因子に依存して変化する。
一般に、少なくとも約ピコモル濃度、好ましくは少なくとも約ナノモル濃度のアグーチシグナリングタンパク質またはペプチドの用量をレシピエントに供給することが望ましいが、より低いかまたはより高い用量が投与され得る。長い半減期を有する安定な誘導体の場合、より低い用量（例えば、ピコモル範囲であるが、これに限定されない）が有効であり得る。この用量は、ある部位でのメラニン形成を阻害するために有効な組織レベルのアグーチシグナリングタンパク質またはそれらのペプチドを提供する。用量は、少なくとも一度投与される。数時間、数日、または数週間にわたる複数回の投与が好まれ得る。タンパク質またはペプチドを、少なくとも一度／週すること、およびより頻繁な投与がまた好まれ得る。その後の用量は、示したように投与され得る。
１つの実施態様において、アグーチシグナリングタンパク質またはそれらのペプチドは、手および顔の罹患した皮膚に適用されるローションの形態で局所的に毎日提供される。
本明細書中に記載の方法は、メラニン形成の阻害に有用なアグーチシグナリングタンパク質のアナログ、誘導体、およびフラグメントのスクリーニングにおいて有用である。この方法において、一定量のアグーチタンパク質またはペプチドは、初代培養の最初のメラノサイトまたはメラノサイト細胞株に添加される。種々の時間間隔で、サンプルを取り出し、そしてメラノサイト酵素の量を測定する。従って、本発明は、メラニン合成のインヒビターをスクリーニングする方法であり、以下を含む：ａ）メラノサイト培養物を一定量のメラニン合成の推定のインヒビターと接触させる工程；b）工程ａ）由来のメラノサイト培養物中に存在するメラノサイト酵素の量を測定する工程；ｃ）工程ｂ）で測定されたメラノサイト酵素の量を、接触させていないメラノサイト培養物中のメラノサイト酵素の量を比較する工程；およびｄ）少なくとも１つのメラノサイト酵素の減少とメラニン合成のインヒビターとの相関関係を明らかにする工程。コントロールの比較した少なくとも１つのメラノサイト酵素の減少は、阻害的アグーチタンパク質またはペプチドの指標である。
アグーチシグナリングタンパク質の過剰発現を生じる遺伝的条件が存在する。１つの例は、マウスにおける致死黄色変異である。他の症状または疾患（例えば、光加齢斑黒皮症、日光性角化症、および創傷治癒部位で生じる炎症後の色素過剰症）は、メラニンの過剰発現に関連する。従って、本発明の別の局面は、哺乳動物における内因性アグーチシグナリングタンパク質の発現の調節である。内因性アグーチシグナリングタンパク質の発現は、抗アグーチシグナリングタンパク質抗体、FAbフラグメントなどの物質によって、またはアグーチタンパク質に結合し、従ってその機能を防止する化学物質によってタンパク質レベルで阻害され得る。
転写または翻訳レベルでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してアグーチシグナリングタンパク質の発現を防げ得る。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のタンパク質をコードする核酸配列に基づいて処方され、これは当業者に公知の方法によって作製され得る。従って、本発明は被験体においてメラニン合成を変化させる方法であり、これは、アグーチシグナリングタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする一定量の核酸を被験体に投与する工程を包含する。それによりアグーチをコードする核酸が転写も翻訳もされず、そしてメラニン合成が変化する。この処置により、促進されたユーメラニン形成を生じる。これは、白斑（vitiligo）、白斑（leucoderma）、白皮症のいくつかの形態、および体毛の灰色化の処置において有利であり得る。
この技術は、アンチセンスRNA治療であり得る。一般的なプロトコルは、ヒトにおける疾患を引き起こす遺伝子を同定することである。アグーチシグナリングタンパク質コード遺伝子は、このような遺伝子である。次に、遺伝子が逆方向で、そして強力な誘導性の外因性プロモーターを有してクローン化される（Bultmanら、1992およびMillerら、1993）。次いで、この構築物は、この遺伝子を発現する細胞に組み込まれ、プロモーターが、誘導性化合物および産生された「アンチセンス」RNAによって活性化される。このRNAは、疾患状態において産生される「センス」RNA（例えば、mRNA）に結合し得る。センスRNAをブロックすることにより、翻訳が妨げられ、そして疾患の誘発における産物の効果が停止される。
標的細胞中のアンチセンス分子を得るために、キャリア分子は、アンチセンス分子に共有結合する。このキャリア部分は、アグーチシグナリングタンパク質発現細胞に不可欠な／必要とされる生化学的化合物の形態を取る。この細胞は、不意をつかれてキャリア分子（従って、完全なアンチセンス分子）を受容する。結合速度論はこの点から引き継ぐ。アンチセンスDNAの場合、さらにより少数の抗ASP分子は、転写（おそらく翻訳）の妨げに必要とされるはずであり、そして最終的にはメラニン産生に影響を与えるはずである。
本明細書中に記載されるの実施例および実施態様は、例示的目的のためのみであり、そしてそれらに照らして種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲内に含まれることが理解される。
参照される全ての参考文献および特許は、本明細書中で参考として援用される。
実施例１
材料および方法
動物
C3H/HeJアグーチマウス（A/A:B/B:C/C）およびC57BL/6J（C3H/HeJ F12マウス（A/a:B/B:C/C）をCharles River（Kingston, NY）より購入した。C57BL/6J非アグーチ黒色マウス（a/a:B/B:C/C）およびC57BL/6J致死黄色マウス（A/a:B/B:C/C）をJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から得た。致死黄色マウスを、ヘテロ接合性致死黄色（A/a）雄性マウスと黒色（a/a）雌性マウスとを交配することによって維持した。同胞種非アグーチ（a/a）マウスおよびヘテロ接合性（a/a）マウスおよび雌性C57BL/6J（C3H/HeJ F1（A/a）マウス。全てのマウスをNCI/HIHの動物施設に収容した。
使用した抗体
本研究に使用した抗体は、研究された４つのメラニン形成タンパク質の独特なカルボキシル配列に対応する合成ペプチドに対して、ウサギにおいて産生された；それらの特異性については、適切な参考文献において、きわめて詳細に記載されている。それらは、αPEP1（TRP1を認識する；Jimenezら、1991）、αPEP7（チロシナーゼを認識する；Jimenezら、1991）、αPEP8（TRP2を認識する；Tsukamotoら、1992）、およびαPEP13（銀タンパク質（silver protein）を認識する；Kobayashiら、1994a）と呼ばれる。
サンプルの調製
麻酔したマウスを、頸椎脱臼によって屠殺し、そしてそれらの背部の皮膚を60％エタノールで清潔にし、そして解剖した。脂肪組織を除去した後直ちに、背部皮膚を、Potter-Elvehjemガラスホモジナイザーを用いて、５容量（v/v）のNP40/SDS緩衝液（１％Nonidet P-40、0.01％SDS、0.1M Tris HCl（pH7.2）、１μg/mlアプロチニン、および100μMフェニルメチルスルホニルフルオライド）中で、氷上でホモジナイズするか、または使用時までそれらを凍結しそして-70℃で保存した。1,000g、10分間、４℃で遠心分離した後、上清を続いて10,000g、30分間、４℃で遠心分離した。上清を0.45μmポアフィルターユニット（Millex, Millipore Co., Bedford, MA）を通して濾過し、そして、以下に詳述するように、可溶性の皮膚抽出物を、メラニン形成アッセイおよびウエスタンイムノブロッティング分析のために使用した。記載のいくつかの場合において、剃刀の刃を用いて、背部の皮膚から毛球を回収した。
器官の培養
この技術は、先に記載（Imokawaら、1988）のように行った。簡単に説明すると、背部の皮膚を６または10日齢のマウスから摘出し、清潔にして脂肪組織を除去し、そして毛球を露出させ、次いで剃刀の刃を用いて細片（約１mm×２mm）に切断した。細片を、400i.u./mlペニシリンおよび400μg/mlストレプトマイシンを含むハンクス溶液（Hanks’balanced salt solution）中で20分間滅菌し、次いで、器官培養ディッシュ（Falcon 3037, Lincoln Park, NJ）中のステンレス鋼グッリト上のレンズペーパー（lens paper）のシート上に置いた。37℃で、液体／大気（５％Co2）界面で皮膚組織を培養するために、10％ウシ胎児血清、100i.u./mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地の750μlのサンプルを、ディッシュの内部プレートに添加した。
細胞および培養の条件
遺伝的に規定されたC56Blマウス（a/a B/B C/C）から培養される、メラン-aメラノサイト細胞株は、Dr. Dorothy Bennett, London, United Kingdomから好意的に贈与されたものである。最初に報告されている（Bennettら、1987）ように、細胞を増殖させた。
代謝標識および免疫沈降
先に報告されている（Jimenezら、1989、1991；Tsukamotoら、1992；Arocaら、1993；Kobayashiら、1994a）ように、これらの技術を実施した。簡単に説明すると、器官培養における背部皮膚のフラグメントを、透析したウシ胎児血清を含むメチオニンを含まない培地中で、１時間プレインキュベートし、そしてメチオニンを含まない培地において[35Ｓ]メチオニン（0.4〜1.0mCi/ml）（Dupont-NEN, Boston, MA）で４〜６時間標識した。それらを、過剰の非標識メチオニンを含み、Ca2+、Mg2+を含まない氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS-）で３回洗浄し、そして剃刀の刃を用いて放射性標識した皮膚片から毛球を回収した；上記に詳述したように、これらをホモジナイズし、そして４℃、NP40/SDS緩衝液中で１晩溶解した。次いで、溶解物を30分間、10,000gで遠心分離し、次いで上清を、正常ウサギ血清およびGrammaBind G Sepharose（Pharmacia/LKB, Piscataway, NJ）で予めクリアにした。予めクリアにした抽出物の107TCA沈殿可能cmpを含むサンプルを、図の説明に記載の５μlの抗体とともに、１時間、４℃でインキュベートし、次いでGammaBind G Sepharoseで30分間、４℃で30μlで複合体化した。免疫複合体をNP40/SDS緩衝液で５回洗浄し、次いで95℃で５分間SDSサンプル緩衝液中に溶出し、そしてSDSゲル電気泳動（Laemmli、1970）、続いてフルオログラフィーにより分析した。
ウエスタンイムノブロッティング分析
先に報告されている（Jimenezら、1991；Arocaら、1993；Kobayashiら、1994a）ように、この技術もまた実施した。簡単に説明すると、NP40/SDSで可溶化したメラン-a細胞または背部皮膚由来のタンパク質を7.5％SDSゲル上で分離し、次いでポリビニリデンジフルオライドメンブレン（Immunobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA）に移し、そして図の説明に記載のような１次抗体（１/1000希釈）とともにインキュベートした。製造者の指示に従い、Enhanced CehmiLumine scence（Amersham Corp., Arlington Height, IL）を用いて続く抗体結合の可視化を行った。
メラニン形成アッセイ
下記のようなメラニン形成触媒活性についてのアッセイを、pH6.8、37℃で、60分間行った。（１）[3Ｈ]チロシンアッセイ（HearingおよびEkel、1976；Hearing、1987）を用いて、チロシンヒドロキシラーゼ活性を測定した。この方法は、チロシンからDOPAへの水酸化の間に産生されるトリチウムを含む水を特異的に測定する。（２）先に詳述された（Arocaら、1993）ように、[3-14Ｃ]DOPAの酸不溶性メラニンへの取り込みを用いて、DOPAオキシダーゼ活性を測定した。（３）DOPAクロムタウトメラーゼ活性を、HPLCによって、DOPAクロム基質の消失および（DHIよりむしろ）DHICAの産生として測定した；データは、既知の標準と比較することによって、pmol生成物に変換する。HPLCアッセイは以前に詳述された（Palumboら、1987；Tsukamotoら、1992）。（４）DHIオキシダーゼ活性およびDHICAオキシダーゼ活性を、HPLCによって、自発的自動酸化についてのコントロールと比較して、反応混合物からのこれらの基質の消失として測定した；データは、既知の標準（Arocaら、1993）と比較することによって、pmolに変換する。（５）また、先に詳述された（HearingおよびEkel、1976；Hearing、1987）ように、[14Ｃ]チロシンの酸不溶性メラニンへの取り込みを用いて、メラニン産生を測定した；生成したpmolメラニンを、放射能産物から算出する。
これらのアッセイにおいて標準および反応基質として用いたチロシンおよびDOPAは、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した；[L-3,5-3Ｈ]チロシン、[3-14Ｃ]DOPAおよび[U-14Ｃ]チロシンは、New England Nuclear（Boston, MA）から入手した；DOPAクロムは、KornerおよびPawelek（1980）によって最初に記載された酸化銀方法を用いて調製した。DHIおよびDHICAは、Giuseppe Prota博士（University of Naples, Naples）およびShosuke Ito博士（Fujita Health University, Nagoya）から好意的に贈与され、そしてRegis Chemical Co.（Morton Grove, IL）から購入した。
RNAの単離およびノーザンブロッティング
これらの技術は、先に記載（Arocaら、1993）のように実施した。簡単に説明すると、総RNA単離キットおよびmRNA精製キット（Promega, Madison, WI）を用いて単離した2.0μgのmRNAを電気泳動し、次いでSure-Blotナイロンメンブレン（Oncor, Gaithersburg, MD）にブロットし、32Ｐ標識プローブでハイブリダイズし、必要であれば、脱ハイブリダイズしそして他のプローブで再ハイブリダイズした。TYRS-J（チロシナーゼに特異的なプローブ）は、H. Yamamoto博士およびT. Takeuchi, Sendai博士、Japanから好意的に贈与され、そして、Yamamotoら、Japan J. Genentics 62巻：271-274, 1987に記載されている。pMT4（TRP1に特異的）は、S. Shibahara博士、Sendai, Japanから提供され、そして、Shibahara, S.ら、Nucleic Acid Res. 14巻：2413-2427, 1986に記載されている。TRP2a（TRP2に特異的）は、I. Jackson博士、Edinburgh, Scotlandから提供され、そして、Jackson, Iら、EMBO 11巻：527-535, 1992に記載されている。gp100（銀に特異的）は、Dr. Y. Kawakami, Bethesda, MDから提供され、そして、Kawakamiら、PNAS 91巻、6458-6462, 1994に記載されている。
種々の方法
標準としてウシ血清アルブミンを用いるBCAアッセイキット（Pierce Chem Co., Rockford, IL）で、タンパク質濃度を決定した。ウエスタンブロットおよびオートラジオグラフの定量は、ImageQuant imagerおよびソフトウエアを用いて実施した。
実施例２
新生児致死黄色および黒色マウスの毛球におけるメラニン形成タンパク質の発現
フェオメラニン形成の間のメラニン形成タンパク質の発現を、10日齢の新生児致死黄色および黒色マウスの背部毛球を比較することによって研究した；これらは同腹子由来の同胞の子孫（sbling offspring）であった。10日齢の新生児致死黄色マウスは、毛球内に顕著にフェオメラニンを産生するが、より若齢の黄色致死マウスはより小量のユーメラニンを作製し、そして褐色系色素がそれらの毛球において時折観察され得る。
３つの異なるチロシナーゼ活性（すなわち、チロシンヒドロキシラーゼ、DOPAオキシダーゼ、およびDHIオキシダーゼ）ならびに致死黄色マウス由来の毛球の抽出物においてメラニンを産生する能力は、黒色の同胞マウス由来の毛球の抽出物において見い出されるレベルの約20〜25％であった（表１）。しかし、フェオメラニン形成性毛球のこれらの抽出物における、DOPAクロムタウトメラーゼ活性（すなわち、TRP2）およびDHICAオキシダーゼ活性（すなわち、TRP1）は、バックグランドのレベルであった。メラン-aメラノサイトの純粋な集団において測定されるこれらの触媒機能の比較的高い比活性を、比較のために示す。
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ウエスタンイムノブロッティング分析により、チロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の発現のパターンは、メラニン形成アッセイの結果と一致した（図２）。新生児黒色マウス由来の毛球の抽出物は、４つの全てのメラノソームタンパク質（チロシナーゼ、TRP1、TRP2、および銀タンパク質）を有し、これらは、ポジティブコントロールとして使用したメラン-aマウスメラノサイト株について見い出されたのと同じ分子質量を有した。しかし、新生児致死黄色マウス由来の毛球では顕著に少ない量のチロシナーゼが検出され、そしてTRP1、TRP2、および銀タンパク質はそれらのフェオメラニンの毛球内において検出され得なかった。器官培養において増殖させた背部毛球の[35Ｓ]メチオニンでの代謝標識、続く免疫沈降分析は、致死黄色および黒色メラノサイトによるメラニン形成タンパク質の合成について同様のパターンを示した（データを示さず）。黒色マウス由来の毛球において、チロシナーゼ、TRP1およびTRP2、ならびに銀タンパク質は、検出可能であり、そしてサイズにおいて、メラン-a細胞で見い出されるものに匹敵した。しかし、致死黄色マウス由来の毛球において、チロシナーゼ合成の顕著な減少が検出され、そしてTRP1、TRP2、または銀タンパク質の顕著な発現は認められなかった。
ノーザンブロット分析により、致死黄色マウスのフェオメラニン形成毛球は、チロシナーゼmRNAのみを産生するが、TRP1、TRP2、または銀タンパク質に対するmRNAはほとんど産生しないかまたは全く産生しないことが確認されたが、本発明者らは、黒色またはアグーチマウスから得られるユーメラニン形成毛球におけるそれらの全てのメラニン形成タンパク質に対するmRNAの有意なレベルを、容易に検出し得る（図３）。
以上より、酵素活性、翻訳レベルおよび転写レベルでのこれらの結果は、チロシナーゼの機能が新生児致死黄色マウスの毛球において減少する一方、TRP1、TRP2、および銀タンパク質は全く発現されないことを明らかに示す。従って、TRP1、TRP2、および銀タンパク質の機能は、フェオメラニン形成には必須ではあり得ない。
実施例３
致死黄色および黒色成体マウスの毛球の再生におけるメラニン形成タンパク質の発現
メラニン形成タンパク質の同様のパターンが成体マウスの毛球の再生において発現されたかどうかを調べるために、毛の成長期の成長を、２ヶ月齢の致死黄色および黒色同胞マウスの背部休止期の毛を引き抜くことによって誘導した。毛を抜いた10日後に、両タイプのマウスにおいて背部の毛の再生が観察され得、そして両遺伝子タイプの毛の成長は、同一の速度で生じた。再生している背部皮膚の細片を生検し、ホモジナイズし、NP40/SDS緩衝液中で可溶化し、次いでウエスタンイムノブロッティングおよびメラニン形成酵素アッセイにより分析した。チロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の発現は、ウエスタンイムノブロッティングによって、毛を抜いて６日後に早くも黒色マウスの毛球の再生において検出され得た（図４）。それらのタンパク質のそれぞれのレベルは、毛を抜いた後８日および10日目にさらに増加し、12日目に一定に保持された。しかし、TRP1およびTRP2の発現は、毛を抜いた後12日目までのいずれの時点においても、同胞の致死黄色マウスのフェオメラニン毛球の再生において検出され得なかったが、これと同じ期間の間、（黒色コントロールと比較して）チロシナーゼの発現の減少が認められた。銀タンパク質は、これらの皮膚抽出物のいずれにおいてもウエスタンブロッティングによって検出されなかった（示さず）。それらの同じ抽出物におけるチロシンヒドロキシラーゼおよびDOPAクロムタウトメラーゼ活性についてのアッセイは、ウエスタンイムノブロッティング分析と一致する結果を示した（表２）。
組織の粗抽出物におけるDHICA産生のレベルは、時折顕著にバックグランドを上回った；この高バックグランド（本実験において約５〜６pmol）は、おそらく、これらの粗サンプル中の２価金属カチオンの存在により、これは上記のように活性型酵素の非存在下でこのタウトメラーゼ反応を触媒し得る。
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実施例４
フェオメラニン形成からユーメラニンへの生理学的切り替えの間のメラニン形成タンパク質の発現パターン
C3Hアグーチマウスは、典型的なアグーチの毛パターン（すなわち、各毛幹上の黒色のバックグランドの２つ領域における黄色の縞（a yellow strips））を有する。このパターンは、ユーメラニンから形成されるメラニンのタイプからフェオメラニンへ一時的に切り替えることによって生じ、次いで毛の成長の間に再度ユーメラニンに戻る。フェオメラニン期前、中、後のアグーチ毛球におけるメラニン形成タンパク質の発現を調べて、致死黄色マウスの毛球の再生において上記で観察されたように、TRP1、TRP2、および銀タンパク質発現のダウンレギュレーションが生理学的に生じたかどうかについて決定するために調査した。ウエスタンイムノブロッティング（図５およびそれらのブロットの定量）によって、新生児アグーチマウスの濾胞メラノサイトにおける（正確にはフェオメラニンが顕著に産生される時点での）TRP1の発現の減少（７日目に最大）が示された。これは、ユーメラニン形成期（９および11日目）と比較され得、ここでTRP1のレベルが増加する；それらの組織に存在するチロシナーゼの量が、この同じ時間枠を通して比較的一定であったことか示され得る。発現のこれらのパターンと一致する結果は、メラニン形成アッセイにおいて得られ（表２、上）、ここで、チロシナーゼ活性のレベルは、５日齢および11日齢の新生児アグーチ皮膚の抽出物において同等であったが、５日目のTRP1の触媒活性（DHICAオキシダーゼ）は、11日目の検出可能であったものより顕著に低かった（わずか約50％）に過ぎなかった。ウエスタンブロットによって検出されるTRP2のバンドの有意な減少は認められなかった（図５）が、その触媒活性機能（DOPAクロムタウトメラーゼ）は、11日目に比較して５日目では約50％減少した。
同胞の５日齢および11日齢新生児ヘテロ接合型アグーチ（A/a）およびホモ接合型非アグーチ（a/a）黒色マウスの毛球におけるこれらのメラニン形成タンパク質の発現についても調べた。上記と同様の結果が、ウエスタンイムノブロッティング分析（図6A）およびメラニン形成アッセイ（表２、下）によって得られた；すなわち、チロシナーゼおよびTRP2の発現は、５日目および11日目の遺伝子型の両方において比較的一定であったが、一方、TRP1の発現は、アグーチ毛球のフェオメラニン形成期（５日目）の間に約50％減少した。図５および6Aに示す実験において、銀タンパク質は、これらの抽出物において低濃度であったために、ウエスタンブロッティングによっては検出されなかった。それゆえ、５日齢アグーチおよび黒同胞マウスから得られる皮膚の器官培養の代謝標識および免疫沈降を用いる銀パターンの発現（図6B）について調べた。それらの実験は、TRP1について見い出されるのと同様に、黒色マウス由来の毛球と比較して、５日齢のアグーチマウスの毛球において合成される銀タンパク質の顕著な減少が認められたことを示した。
実施例５
アグーチタンパク質は、マウスメラノサイトにおけるチロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質の発現および活性を抑制する。
ユーメラニン形成とフェオメラニン形成との間の切り替えを特徴づけるために、αMSHおよび／またはアグーチに曝した培養メラノサイトの応答を決定した。
メラン-aメラノサイト細胞株を、実施例１に記載のように使用した。このクローン株は、C57B1非アグーチ黒色マウス由来であった。増殖培地は、200nMのTPAを含む最少必須培地であった。B16F10メラノーマ細胞をまた使用し、アグーチタンパク質の影響をメラン-aと比較した。これらの細胞を、ダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。
組換えアグーチタンパク質を、当該分野に公知の方法によって、Gregory Barsh博士の研究室のMichael Ollmann博士によるバキュロウイルス系から精製した。直径15cmのディッシュあたり２×106細胞を、播種した。培地を毎日交換し、そして新鮮なアグーチタンパク質および／またはαMSHを、通常10nMで毎日添加した。転写調節を試験するために、実施例１に記載の方法によって、全RNAを単離し、そしてノーザンブロッティングを行った。MSH-Rに対するA26プローブは、R. Cone博士によって提供された。そしてこれは、Mountjoyら、Science 257:1248-1251,1992に記載される。翻訳のレベルで、実施例１に記載のように、免疫沈降と組み合わせて代謝標識を使用した。ウエスタンブロッティングおよび酵素アッセイを使用して、機能を試験した。
第１に、アグーチタンパク質がチロシナーゼ発現に対して何らかの影響を有するかどうかを、ノーザンブロッティングによって決定した。メラン-a細胞を、図7Aに示すようにアグーチタンパク質の４濃度で処理した。24時間後、細胞を回収し、全RNAを単離し、そしてチロシナーゼについてのプローブとハイブリダイズさせ、そしてホスホイメージャーによって検出した。各バンドの活性をホスホイメージャーによって測定し、そしてコントロール％をGAPDHを標準として使用して補正した。インキュベーション時間はわずか24時間であったが、10nMおよび１nMのアグーチタンパク質で、チロシナーゼの発現において有意な用量依存的な減少が存在した。インビボで、アグーチRNAが現れた後の24時間以内にフェオメラニンが合成されることが留意されるべきである。より長いインキュベーション時間をまた試験した。10nMのアグーチタンパク質を、１、２、または４日間添加した。２日または４日間のインキュベーションの後、チロシナーゼの発現の減少は、ずっとより劇的であり、２日目までに完全な阻害を生じた（図７Ｂ）。
10nMのアグーチタンパク質とのメラン-a細胞の５日間のインキュベーションの後、ペレットの色は黒から明褐色に変化した。超微細構造の研究によって、アグーチタンパク質への曝露後、メラノソームの量は減少し、そしてフェオメラノソーム様構造が見出された（図８Ｂ）。
TRP1、TRP2、およびMSHレセプターの発現に対するアグーチタンパク質の影響を試験した。異なる濃度のアグーチタンパク質への曝露の24時間後、TRP1およびTRP2のRNAのレベルは減少したが、チロシナーゼRNAと同じ程度ではなかった。そしてMSHレセプターについてのRNAレベルへの有意な影響はなかった（図９）。
アグーチタンパク質とMSHとの間の相互作用を直接試験するために、そしてアグーチタンパク質がレセプターレベルにおける変化を介したMSHシグナリングに影響し得るかどうかを決定するために、メラン-a細胞を、10nMアグーチ、10nM MSH、または両方に５日間曝し、次いでRNAレベルを、チロシナーゼ、TRP1、TRP2、およびMSHレセプター自身について測定した。MSH単独では、チロシナーゼにおいてはほぼ２倍の増加、TRP2においては50％の増加を生じ、そしてTRP1またはMSHレセプターにおいては有意な増加を生じなかった。アグーチ単独では、チロシナーゼ、TRP1、およびTRP2についてのRNAのレベルにおいて、ほぼ５倍の減少を生じたが、MSHレセプターRNAのレベルに対しては、やはり有意な影響を与えなかった（図10）。これらの濃度で、アグーチおよびMSHの両方の同時添加によって、MSH単独とは区別がつかない応答が生じた。これらの結果から、外因性のMSHの非存在下で生理学的変化を引き起こすアグーチタンパク質の能力が確認され、そしてこのことはアグーチとMSHとの相互作用はMSHレセプター自身のレベルの変化によって媒介されるのではないことを示唆する。
しかし、ノーザンハイブリダイゼーションによって測定されたRNAの定常状態レベルは、タンパク質レベルまたはタンパク質機能の調節によって起こり得る遺伝子産物の発現における変化を示さなかった。翻訳レベルでの影響を試験するために、メラン-a細胞を同一条件下で５日間培養し、次いで細胞を35Sメチオニンと共に４時間インキュベートした。次いで、免疫沈降分析を行った。チロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の免疫沈降分析において、ノーザンブロッティングと一致した結果が、観察された（図１１）。
酵素機能を試験するために、酵素アッセイを、同一条件下で５日間培養した細胞の抽出物で行った。チロシンヒドロキシラーゼ、DOPAオキシダーゼ、DOPAクロムタウトメラー、およびメラニン形成アッセイの結果もまた、ノーザンブロッティング実験と一致した。これらの活性は、MSH単独に曝した後に増加した。しかし、これらはアグーチタンパク質単独へ曝露した後にバックグラウンドレベルに減少し、そしてアグーチタンパク質およびMSH両方の同時添加により、MSH単独とは区別がつかない応答を生じた。
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メラニン形成酵素レベルをまた、ウエスタンブロッティングを使用して同一の条件下で試験し、そして結果はまた、ノーザンブロッティングと再度一致した（図１２）。これらの結果は、培養物中のアグーチタンパク質またはMSHによる色素細胞酵素の活性の調節が、翻訳効率または翻訳後のプロセッシングよりむしろ主にメッセンジャーRNAのレベルで起こることを示唆する。
メラン-a細胞について観察されたアグーチタンパク質およびMSHの影響を、B16F10マウスメラノーマ細胞を使用して確認した。同様の影響が観察された（図１３）。しかし、アグーチタンパク質がチロシナーゼRNAを基準線よりも下に減少させなかったこと、そしてMSHレセプター発現がこれらのアグーチで処理した細胞において上昇することに留意されたい。
メラン-a細胞に添加したアグーチタンパク質は、インビトロでチロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の発現を抑制し、そして産生されるべきフェオメラノソームを生じた。このアッセイ系は、色素タイプを切り替えるために必要とされる分子事象および生化学的事象の決定を補助するに有用である。
実施例６
ヒト皮膚等価モデル
ヒト皮膚等価モデルにおけるヒトメラノサイトの挙動は、これらのインビボでの挙動を密接に模倣する。従って、このモデルを使用して得られた結果は、ヒトにおける効力を合理的に予測する。皮膚等価モデルは、Archambault, M.ら、J. Invest. Dermatol. 104（5）:859-867,1995に記載されている。
簡潔に述べると、ヒト新生児線維芽細胞を、10％ウシ血清（Hyclone Labs, Logan, UT）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）中で包皮真皮の外植片から培養し、そして継代第６回目で使用する。
ヒトメラノサイトを、分離した新生児包皮表皮から培養する。継代第２回目のメラノサイトを、真皮等価物上でプレーティングするかまたは組織培養ディッシュ（Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ）中の組織培養物中にプレーティングする。
ヒトケラチノサイト培養物を、新生児包皮から確立する。プレコンフルエントな継代第２回目のケラチノサイト培養物をトリプシン処理し、そして真皮等価物に播種する。
アグーチシグナリングタンパク質またはそのペプチドを培養物に添加し、そして細胞を１〜５日間インキュベートする。ヒトメラノサイトに対する阻害効果を、前述の実施例１および５に記載のように、ノーザンブロット分析、ウエスタンブロット分析、およびチロシナーゼ、TRP1、およびTRP2の酵素アッセイによって決定する。
実施例７
細胞培養物におけるアグーチシグナルタンパク質による、マウスメラノサイトにおけるメラノソームタンパク質の発現および活性の調節
細胞および細胞培養条件
メラン-aメラノサイト株（Bennettら、1987）（C57B1非アグーチ黒色マウス（a/a B/B C/C）由来）は、Dorothy Bennett博士（London, United Kingdom）から好意的に譲渡された。このクローン株を、Bennettら（1987）に記載のように、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、25mM重炭酸ナトリウム、５％ウシ胎児血清、200nMホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート、および100μM 2-メルカプトエタノール（pH6.9）を含むダルベッコの最少必須培地中で培養した。細胞を、通常は直径15cmのディッシュあたり1.5×106細胞の密度で播種した。24時間の実験については、ASPおよび／またはMSHを、細胞が最初に播種されたときに添加した。５日間の実験については、ASPを直ちに添加し、そしてMSHを開始の翌日に添加した（MSHを用いて４日間の処理を、最適な刺激のために慣例的に使用した（Arocaら、1993））。使用したASPおよびMSHの濃度は、図および表の凡例に詳細に記載されるように、0.01〜10nMの範囲であった。ASPまたはMSHを用いないコントロールのために、同量の保存緩衝液（20mM PIPES、pH6.8、50mM NaCl）を添加した。細胞を、５％CO2の加湿インキュベーター内で37℃で慣例的に培養し、そして全培地を毎日交換した。細胞を、標準的な様式でトリプシン/EDTAを用いた短時間の処理によって回収し、そして以下に詳細に記載するように、継代培養のために使用するか、またはRNA、タンパク質、または酵素分析のためにプロセッシングした。
アグーチシグナルタンパク質
組換えマウスASPを、Ollmannら（準備中）に記載されるように、バキュロウイルス発現系を使用して作製し、そして精製した。本明細書中で記載の実験のほとんどで使用した調製物は、銀染色ゲルの分析によって測定すると90％以上純粋であり、そして2.2×10-10ＭのＫiでMC1-Rの活性を阻害した。37℃で、ASPは水中または組織培養培地中で48時間以上活性を保持する。図２に記載の実験をまた、99％以上純粋なASP調製物を用いて繰り返して、実質的に同一の結果を生じた。
電子顕微鏡
細胞を回収し、14,000ｇで、４℃で５分間遠心分離し、そして0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）中の２％グルタルアルデヒド-２％パラホルムアルデヒド中で23℃で２時間、固定した；次いで、固定液を除去し、そしてサンプルを２％スクロースを含むリン酸緩衝化生理食塩水中で４℃で保存した。続いてサンプルを、通常の様式で、電子顕微鏡のために、等級付けした（graded）アルコールで処理し、そしてエポキシ樹脂に包埋した。以前に記載されたように（Protaら、1995）、薄い切片をウラニルアセテートおよびクエン酸鉛で染色し、Zeiss EM10電子顕微鏡で観察し、そして写真を撮影した。
RNA単離およびノーザンブロッティング
全RNAを、RNeasy全RNA単離キット（QIAGEN, Catsworth, CA）を製造業者の説明書に従って使用して、細胞から抽出した。標準的な様式で、20μgの全RNAを変性し、1.0％アガロースゲルで電気泳動し、そして23℃で一晩、SureBlotナイロンハイブリダイゼーションメンブレン（Oncor, Gaithersburg, MD）に移した。フィルターをHybrisol I溶液（Oncor, 50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、１％SDS、およびブロッキング試薬）と45℃で３時間、プレハイブリダイズさせ、次いで32P標識したプローブとハイブリダイズさせた。2.0kbのTYRS-JのEcoRIフラグメント、1.7kbのpMT4のHindIIIフラグメント、1.75kbのTRP2aのEcoRIフラグメント、および2.1kbのA26のBamHI-SalIフラグメントを使用して、チロシナーゼ、TRP1、TRP2、およびMC1-R mRNAをそれぞれ検出した。TYRS-Jは、Hiroaki Yamamoto博士およびTakuji Takeuchi博士、Sendai, Japan（Yamamotoら、1987）から得た；pMT4は、Shigeki Shibahara博士、Sendai, Japan（Shibaharaら、1986）から得た；TRP2は、Ian Jackson博士、EdinburghScotland（Jacksonら、1992）から得た；A26は、Roger Cone博士、Oregon（Mountjoyら、1992）から得た。グリセルアルデヒド-3-ホスホ-デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に特異的な市販のcDNAプローブを使用して、ブロット上のRNAローディングを標準化した。cDNAプローブを、ランダムプライマー伸長を使用して標識し、そして100℃で10分間加熱し、次いで、ハイブリダイゼーション溶液への添加の前に氷上で10分間冷却した。Hybrisol I（３×107cpm/10ml）中の放射標識したプローブとのハイブリダイゼーションを、穏やかに振盪しながら、45℃で一晩行った。インキュベーション後、ブロットを、２×SSC/10％ SDSで23℃で10分間、次いで、0.2×SSC/0.5％ SDSで10分間、最後に0.1×SSC/0.1％ SDSで10分間洗浄した。次いで、ブロットを、23℃で１時間、ホスホイメージャーカセットにおいて曝露し、そしてバンドの濃さをImageQuantソフトウェアを使用してスキャンした。各プローブのコントロール％を、GAPDH標準との比較を使用して最初のローディングについて補正した。各スキャンの後、残りのプローブを、10mMTris（pH7.0）中の0.1×SSC/0.1％SDS中で100℃で15分間インキュベートすることによって除去した。これを、必要に応じて、残りのプローブが検出できなくなるまで繰り返した。
代謝標識および免疫沈降
これらの技術を、以前に報告されているように（Jimenezら、1989;1991;Tsukamotoら、1992; Arocaら、1993）行った。簡単に述べると、直径10cmのディッシュ中で増殖しているサブコンフルエントな細胞を、予め温めておいたメチオニンを含まない培地中で、37℃で１時間予備インキュベートし、次いで、0.4mCi/フラスコの[35S]メチオニンで６時間放射標識した。次いで、細胞を回収し、そしてNP-40/SDS緩衝液（１％ Nonidet P-40、0.01％SDS、0.1M Tris-HCl（pH7.2）、100μMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/mlアプロチニン）で、４℃で１時間、可溶化した。次いで、細胞溶解物を、４℃で15分、14,000gで遠心分離し、そして上清を正常ウサギ血清およびGammaBind G Sepharose（Pharmacia/LKB, Piscataway, NJ）で、４℃で一晩、前処理して、バックグラウンドを減少させた。次いで、５×106cpmの各々の前もって吸着した上清を、10μlの適切な抗体と共にインキュベートした。使用した抗体は、研究されている３つのメラニン形成タンパク質の独特のカルボキシル配列に対応する合成ペプチドに対してウサギで産生された；これらは、αPEP1（TRP1を認識する（Jimenezら、1991））、αPEP7（チロシナーゼを認識する（Jimenezら、1991））、およびαPEP8（TRP2を認識する（Tsukamotoら、1992））と称されている。37℃で１時間インキュベートした後、50μlのGammaBind G Sepharoseを各チューブに添加し、次いで混合しながら23℃で20分間、さらにインキュベートした。GammaBind G Sepharose-抗原-抗体免疫複合体を、23℃のNP40/SDS緩衝液で４回洗浄し、次いで100℃で３分間加熱することによって、SDSサンプル緩衝液中で変性させた。次いで、特異的に結合したタンパク質を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
ウエスタンイムノブロッティング分析
組織培養物中の細胞を回収し、そしてNP-40/SDS緩衝液で、４℃で１時間可溶化し、次いで４℃で15分間、14,000gで遠心分離し、そして上清を回収した。NP-40/SDSで可溶化した細胞由来のタンパク質を7.5％SDSゲル上で分離し、次いでポリビニリデンジフルオリドメンブレン（Immobilon-P, Milipore Corp., Bedford, MA）に電気泳動的に移した。TBS/Tween（Tris緩衝化生理食塩水中0.1％のTween20）中の３％ウシ血清アルブミン中で、23℃で一晩ブロッキングした後、ブロットを１次抗体と共にインキュベートした（TBS/Tween中に1/1000での希釈）。TBS/Tweenで４回洗浄して非特異的結合を減少させた後、Enhanced ChemiLuminescence（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を製造業者の説明書に従って使用して、その後の結合した特異的な抗体の可視化を行った。
メラニン形成酵素アッセイ
メラニン形成アッセイを、NP-40/SDSで可溶化した抽出物（上記のように得た）で、pH6.8で、37℃で60分間、慣例的に行った。チロシナーゼ活性を決定するために、チロシンヒドロキシラーゼアッセイを使用した；このアッセイは、L-[3,5-3H]チロシンの3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）への水酸化の間に生成されるトリチウムを含む水を測定する（HearingおよびEkel, 1976; Hearing, 1987）。DOPAオキシダーゼ活性のために、[3-14C]DOPA由来の酸に不溶性のメラニン産物の生成を測定した（Arocaら、1993）。DOPAクロムタウトメラー活性を決定するために、DOPAクロム基質の消失、および自然発生的に由来する産物5,6-ジヒドロキシインドール（DHI）ではなく5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸（DHICA）の産生を、HPLCによって測定した（Palumboら、1987; Tsukamotoら、1992）。メラニン生成を決定するために、[U-14C]チロシンアッセイ（HearingおよびEkel、1976; Hearing, 1987）を使用した。全ての放射活性を有する前駆体を、DuPont-New England Nuclearから得た。DOPAクロムを、酸化銀法（KornerおよびPawelek, 1980）を使用して調製し、そして標準として使用したDHIおよびDHICAを、Pierce Chemical Co.（Rockfold, IL）およびShosuke Ito教授（Nagoya, Japan）から得た。アッセイのPmol産物を、測定した放射活性から、または標準曲線との比較によって、算出した。
cAMPアッセイ
これらのアッセイを、以前に詳細に記載されたように（Barkerら、1995; Medranoら、1995）行った。簡単に述べると、細胞を、３×105細胞/ウェルで24ウェルプレートにプレーティングし、そして培地を１回交換して、48時間増殖させた。次いで、培地を各ウェルから除去し、そして細胞を、αMSH、ASP、および／またはコレラ毒素の存在下で40分間インキュベートし、その後１ＮのHClで反応を停止させた。次いで、各サンプルを、トリエチルアミンおよび無水酢酸を添加することによってアセチル化し、そしてcAMPの量を、以前に詳細に記載されたように（Liggettら、1989）、ラジオイムノアッセイによって測定した。
化学的分析
ユーメラニンおよびフェオメラニン含量の化学的分解および分析を、以前に記載されたように（ItoおよびFujita, 1985）行いそして定量した。
ユーメラニンまたはフェオメラニンの生成の間でメラノサイトを転換する分子機構および生化学的機構は、２つの細胞内シグナル分子、α-メラノサイト刺激ホルモンおよびアグーチシグナリングタンパク質の相反する作用を含む。この研究において、精製組換えアグーチシグナリングタンパク質で処理した培養物における、ユーメラニン形成メラノサイトによるメラノソームのタンパク質発現に対するアグーチシグナリングタンパク質の生理学的影響が特徴づけられた。黒色メラン-aマウスメラノサイトをインビトロでアグーチシグナリングタンパク質に曝露した後、細胞の着色は顕著に阻害され、そしてユーメラノソームの生成が顕著に減少した。さらに、生成されたメラノソームは構造がフェオメラノソーム様になり、そして化学的分析によって、ユーメラニン形成が顕著に減少した一方で、フェオメラニンの合成は増加したことが示された。アグーチシグナリングタンパク質単独で処理したメラノサイトはまた、いくつかのメラノソームのタンパク質（メラニン形成酵素チロシナーゼおよびチロシン関連タンパク質１および２を含む）のmRNAおよびタンパク質の含量における時間依存的および用量依存的減少を示した。逆に、α-メラノサイト刺激ホルモン単独に曝露したメラノサイトは、チロシナーゼmRNAおよびタンパク質増加を示した。ほぼ等モル濃度でのアグーチシグナリングタンパク質およびα-メラノサイト刺激ホルモンの同時添加により、α-メラノサイト刺激ホルモン単独によって誘発された応答と類似した応答を生じた。これらのデータは、メラノサイトに対するアグーチシグナリングタンパク質の影響が、そのレセプターへのα-メラノサイト刺激ホルモンの結合の阻害のみによっては媒介されないという仮説と一致し、そしてその存在がフェオメラニン形成に必要とされる新規な因子を同定するための細胞培養モデルを提供する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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