(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンを用いるリウマチ因子の測定方法において、リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子を含有する試薬を使用することを特徴とするリウマチ因子の測定方法。
【請求項２】
リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子が、リウマチ因子としての性質を失った因子である請求項１記載のリウマチ因子の測定方法。
【請求項３】
リウマチ因子としての性質を失った因子が、加熱変性されたリウマチ因子である請求項２記載のリウマチ因子の測定方法。
【請求項４】
ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンを用いるリウマチ因子の測定試薬において、リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子を含有することを特徴とするリウマチ因子の測定試薬。
【請求項５】
リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子が、リウマチ因子としての性質を失った因子である請求項４記載のリウマチ因子の測定試薬。
【請求項６】
リウマチ因子としての性質を失った因子が、加熱変性されたリウマチ因子である請求項５記載のリウマチ因子の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンを用いるリウマチ因子の測定方法および測定試薬において、リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子を使用することを特徴とするリウマチ因子の測定方法および測定試薬に関するものであり、臨床検査の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
リウマチ因子(以下、ＲＦとも言う)は、主として慢性関節リウマチ(以下、ＲＡとも言う)患者の血清中に見い出される免疫グロブリン(以下、Ｉgとも言う)であり、自己、同種または異種のＩgＧのＦc部分と反応する抗体である。ＲＦには、ＩgＭクラスのものだけでなく、ＩgＧ、ＩgＡ、ＩgＤおよびＩgＥクラスのものも存在することが明らかにされている。ＲＦの存在は、直ちにＲＡを意味するものではないが、ＲＡ患者の血清中に最も高頻度に認められ、ＲＡの診断ならびに病態の解明に重要な役割を果たしてきた[入江昭一郎ら、臨床検査Ｍook １２:１８１〜１８８、１９８２]。
【０００３】
ＲＡの診断方法としては、主にＩgＭ型のＲＦを検出するラテックス凝集反応(ＲＡテスト)、受身血球凝集反応(ＲＡＨＡテスト)、ラテックス比濁法、免疫比濁法、あるいはＩgＧ型のＲＦを検出する酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)などがある。しかし最近では、より確実な診断と治療のために、定量的な測定方法の開発に関心が移行しつつある。
【０００４】
定量可能な測定方法として、上述したラテックス比濁法および免疫比濁法が挙げられ、臨床検査の分野でよく利用されている。しかし、これらの方法は低値域での定量性に問題があり、信頼性の点で百パーセント満足できる状態ではない。即ち、従来の試薬を用いたときには、低値域での測定感度が低く、全測定範囲内で検量線が直線を示さず、多点検量測定と一点検量測定との間で検体の測定値に乖離が見られた。ラテックス比濁法あるいは免疫比濁法においては、この低値域での感度不足問題を解決して、多点検量測定でも一点検量測定でも同じ測定値を導き出す定量性に優れた試薬の開発が望まれていた。
【０００５】
また、酵素免疫測定法においても同様の問題があり、この問題を解決するためにリウマチ患者由来のＩgＧを用いた報告がある(特開平７−２０９３００)。この文献には、リウマチ患者の血清からＩgＧを精製し、このＩgＧを固相化し、この固相化ＩgＧを用いて検体中のリウマチ因子を高感度に検出できることが記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、免疫比濁法によるリウマチ因子測定法において、低値域での感度不足の問題を解決し、より優れた定量性と特異性を持つ測定方法および測定試薬を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
免疫比濁法(ＴＩＡ法)によるリウマチ因子の測定において、検体中のリウマチ因子と反応させる物質としては、ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンを熱変性させたものが一般に用いられている。本発明者らは、免疫比濁法によるリウマチ因子の測定においてリウマチ因子を高感度に検出できる物質を検索したところ、通常の抗原となるヒトまたは動物由来のγ−グロブリンに、リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子(以下、ＩgＭ−ＲＦとも言う)を適量添加し、この混合物を加熱変性して抗原を調製し、この抗原を使用することにより、低値域での検体の反応性が改善され、全測定領域にわたって高感度でリウマチ因子を定量することができるリウマチ因子の測定方法および測定試薬が提供できることを見い出した。
【０００８】
即ち、本発明は、ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンを用いるリウマチ因子の測定方法および測定試薬において、リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ型リウマチ因子を使用することを特徴とするリウマチ因子の測定方法および測定試薬を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の大きな特徴は、リウマチ因子陽性の血清または血漿から精製したＩgＭ−ＲＦを使用することである。リウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ−ＲＦは、加熱変性することによりＲＦとしての性質を失い、ＲＦと反応する抗原としての働きを持つようになる。一方、リウマチ因子陰性の血清または血漿から精製したＩgＭをγ−グロブリンに同様に添加して加熱変性しても低値域での感度上昇は見られなかった。
【００１０】
本発明におけるリウマチ因子陽性の血清または血漿とは、ＩgＭ−ＲＦの存在が、直接および間接を問わず、ある種の疾患を診断する根拠となっている患者からのものを指す。そのような疾患としては、慢性関節リウマチ(ＲＡ)の他にも各種膠原病、肝疾患や感染症等がある。また、最近ではバイオ技術の進歩により、リウマチ因子陽性の患者の体液や免疫細胞をもとにしたモノクローナルＲＦの製造も可能になっている。本発明のＩgＭ−ＲＦにはこれらモノクローナルＲＦも含まれる。
【００１１】
ＩgＭ−ＲＦと混合して用いられるγ−グロブリンは、ヒトまたは動物由来のγ−グロブリンであれば、特に限定されない。
【００１２】
本発明は、免疫比濁法(ＴＩＡ法)やラテックス比濁法等の免疫測定法に適用できる。これらの中でも、特にＴＩＡ法において本発明の効果がより有効に発揮される。
【００１３】
通常、ＴＩＡ法では次の２種類の試薬を用いて検体中のリウマチ因子を測定する。即ち、第Ｉ試薬は凝集促進剤を含む試薬であり、第II試薬はγ−グロブリンとリウマチ因子陽性の血清または血漿由来の精製ＩgＭを含む試薬である。測定方法がＴＩＡ法である場合、ＲＦの検出をより容易にするために凝集促進剤を添加するのが普通である。
【００１４】
凝集促進剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、あるいは界面活性剤が挙げられる。
【００１５】
液状試薬を使用する場合、その安定性が問題となることが多い。本発明において用いる第II試薬においても、γ−グロブリンにＩgＭ−ＲＦを添加した場合に沈澱が出やすくなる。これを抑制するために、試薬中にある種のアミノ酸を添加するのが有効であることがわかった。このようなアミノ酸としては、６−アミノ−n−カプロン酸(ε−ＡＣＡ)、グルタミン酸ナトリウム等が好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
また、γ−グロブリンの長期安定化を図るためには、試薬のpＨを適切に調整するのが有効であることがわかった。即ち、沈殿の抑制にはpＨを酸性側にするのが好ましく、pＨ５.０〜６.０が至適であることがわかった。
【００１７】
本発明のＲＦ測定方法は、ＲＦ測定のための試薬中に、γ−グロブリンに加えてリウマチ因子陽性の血清または血漿由来のＩgＭ−ＲＦを添加することに特徴があり、その他の測定条件は通常のＴＩＡ法による条件であってよい。即ち、検体を本発明の測定試薬と通常の条件下で反応させ、反応したＲＦ量を通常の方法で検出することによって本方法を実施してよい。検体としては、ヒト血清あるいは血漿等を挙げることができる。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１  γ−グロブリンとＩgＭ−ＲＦの加熱変性
γ−グロブリン粉末５.５gを、５０mmol／Ｌグリシン塩酸緩衝液(０.１mol／Ｌ ＮaＣl、１g／Ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎa、pＨ７.６)１００mＬに溶解し、０.２２μmミリポアフィルターで濾過した。この濾液の一部に精製ＩgＭ−ＲＦを２０、４０、６０、８０および１００ ＩＵ／mＬになるようにそれぞれ添加して混合し、ＩgＭ−ＲＦ添加濾液とした。
その後、γ−グロブリンのみの濾液とＩgＭ−ＲＦ添加濾液を、それぞれ６１℃で１０分間加熱変性した。その後、各濾液を２０mmol／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液(０.４２８mol／Ｌ ＮaＣl、０.２１４mol／Ｌ ε−ＡＣＡ、０.１mol／Ｌ グルタミン酸ナトリウム、０.７g／Ｌ トリトンＸ−４０５を含有、pＨ５.６)でそれぞれ１５倍希釈し、０.２２μmミリポアフィルターで濾過し、これらを第II試薬として以下の測定に用いた。
【００２０】
実施例２  ＩgＭ−ＲＦの添加効果
凝集促進剤として４.５g／Ｌポリエチレングリコール−６０００を添加した２０mmol／Ｌトリス塩酸緩衝液(８０g／Ｌポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、０.３mol／Ｌ ＮaＣlを含有、pＨ８.４)を調製し、これを第Ｉ試薬とした。
検体としてＲＦ標準液を用い、これを段階希釈した。この希釈検体１２μＬに第Ｉ試薬２４０μＬを添加して３７℃で５分間反応させた。その後、第II試薬(γ−グロブリン液またはＩgＭ−ＲＦ添加液)６０μＬを添加して３７℃で５分間反応させた。
３４０nmと７００nmの２波長差を測定し、標準液の値と各吸光度から検量線を作成した。測定は、自動分析装置ＴＢＡ−８０ＦＲを用いて２ポイントエンド法で行い、その結果を図１および図２に示した。
図１および図２において、黒四角で示す曲線はγ−グロブリン液を第II試薬とした測定系であり、それ以外の曲線はＩgＭ−ＲＦ添加液を第II試薬とした測定系である。これらの図に示されるように、ＩgＭ−ＲＦ添加液を使用した系ではいずれも低値域の感度が上昇しており、定量性に優れている。ＩgＭ−ＲＦ添加量としては４０〜８０ ＩＵ／mＬが適量であった。
【００２１】
実施例３  一点検量測定と多点検量測定の相関性
実施例２と同様の試薬と操作法を用いて、一点検量測定(０および１１０ ＩＵ／mＬ)および多点検量測定(０、１１、２２、４４、６６および１１０ ＩＵ／mＬ)で患者血清４７例のＲＦ値を測定し、比較した。これらの結果を図３および図４に示した。
図３はγ−グロブリン液を第II試薬とした測定系の相関図であり、図４はＩgＭ−ＲＦ(７０ ＩＵ／mＬ)添加液を第II試薬とした測定系の相関図である。これら２つの図を比較した結果、γ−グロブリンのみの測定系では一点検量測定と多点検量測定の乖離が著しいのに対し、ＩgＭ−ＲＦを添加した測定系では測定値の乖離が殆ど見られないことがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明に従い、ＲＦ測定用試薬としてγ−グロブリンに加えてＲＦ陽性の血清または血漿由来のＩgＭ−ＲＦを含む試薬を使用することにより、低値域での検体の反応性が改善され、全測定領域にわたって高感度でＲＦを定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  γ−グロブリン液ならびにＩgＭ−ＲＦ添加液(１０、２０、４０および８０ ＩＵ／mＬ)を第II試薬として用いてＲＦ標準液を定量することによって得た検量線のグラフである(全測定領域)。縦軸は吸光度(×１００００)を表し、横軸はＲＦ値(ＩＵ／mＬ)を表す。
【図２】  γ−グロブリン液ならびにＩgＭ−ＲＦ添加液(１０、２０、４０および８０ ＩＵ／mＬ)を第II試薬として用いてＲＦ標準液を定量することによって得た検量線のグラフである(低ＲＦ領域)。縦軸は吸光度(×１００００)を表し、横軸はＲＦ値(ＩＵ／mＬ)を表す。
【図３】  γ−グロブリン液を第II試薬とした測定系の相関図である。縦軸は一点検量測定による患者血清の値(ＩＵ／mＬ)を表し、横軸は多点検量測定による患者血清の値(ＩＵ／mＬ)を表す。
【図４】  ＩgＭ−ＲＦ添加液を第II試薬とした測定系の相関図である。縦軸は一点検量測定による患者血清の値(ＩＵ／mＬ)を表し、横軸は多点検量測定による患者血清の値(ＩＵ／mＬ)を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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