(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）体重減少、ｂ）摂食量低下、及びｃ）食欲不振を包含する悪性腫瘍に伴う症状、又は状態の少なくとも一つの予防又は改善剤であって、ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチド（PTHrP）に対するヒト型化抗体を有効成分として含み、
前記ヒト型化抗体は
そのＬ鎖Ｖ領域が配列番号48〜55で表されるいずれか一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、及び
そのＨ鎖Ｖ領域が配列番号56で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでなる、前記予防又は改善剤。
【請求項２】
前記ヒト型化抗体は、そのＬ鎖Ｃ領域がＣλ領域を含み、及び／又はそのＨ鎖Ｃ領域がＣγ１領域を含む、請求項１に記載の予防又は改善剤。
【請求項３】
悪性腫瘍は、膵臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、及び悪性リンパ腫からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項1又は２に記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（humanized）抗体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ鎖又はＨ鎖を構成するＶ領域を含むポリペプチドに関する。
【０００２】
本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及びＶ領域を含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡに関する。本発明はさらに、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。
【０００３】
本発明はさらに、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体を有効成分として含む医薬組成物並びに高カルシウム血症抑制剤及び低リン血症改善剤に関する。
【０００４】
【従来の技術】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は、全悪性腫瘍患者の５〜20％にみられる重篤な合併症状であり、放置すれば確実に死に至るため悪性腫瘍の末期的症状であると考えられている。高カルシウム血症のコントロールは患者の治療予後とQOL（Quality of Life）に大きく影響することから、臨床的に重要な役割を持つ。
【０００５】
悪性腫瘍患者における高カルシウム血症は、一般に、腫瘍産生性の体液性骨吸収因子によるHHM（Humoral hypercalcemia of malignancy）と、骨に転移又は浸潤した腫瘍の局所的な作用によるLOH（Local Osteolytic hypercalcemia）とに大別される。HHMでは骨吸収又は骨破壊の亢進によりカルシウムの流出が増加し、腎のカルシウム排泄能の低下とあいまって高カルシウム血症を生ずると考えられている（和田誠基及び永田直一，内科69, 644-648 ）。
【０００６】
高カルシウム血症は、血清カルシウム値が12mg/dlを超えるとその症状が現れると考えられ、その症状として、初期に食思不振、悪心、嘔吐が悪性腫瘍患者において非特異的に認められる。高カルシウム血症が悪化すると、腎遠位尿細管の障害で水分の濃縮力が低下するために多尿となり、また、悪心、嘔吐により水分が十分に摂取されないため脱水を伴う。
【０００７】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症のうちHHMを起こす液性因子として、PTH（副甲状腺ホルモン；Parathyroid Hormone）様の物質である副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Parathyroid Hormone related Peptide、以下「PTHrP」という）がMoseley, J. M.らにより見いだされた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)、84,5048-5052）。
【０００８】
その後、PTHrPをコードする遺伝子が単離され（Suva, L. J. et al., Science(1987) 237, 893）その解析から、ヒトPTHrPは遺伝子の選択的スプライシングに基づく139、141及び173個のアミノ酸からなる三種が存在すること、並びに血中では全構造を有するPTHrP（1-139）の限定分解に基づく様々なフラグメントが存在することが明らかになった（Baba, H. Clinical Calcium (1995) 5, 229-223）。PTHrPは、N末端側第1位から第13位のアミノ酸13個のうち8個がPTHと同一である他、第14位から第34位アミノ酸部位においてもPTHと類似の立体構造を呈するものと推定され、少なくともN末端側においてはPTHと共通のPTH/PTHrP 受容体に結合する（Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026、Abou-Samra, A-B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 2732-2736）。
【０００９】
PTHrPは様々な腫瘍組織から産生されることが報告されているが、腫瘍のみならず、皮膚、中枢神経、子宮、胎盤、授乳中の乳腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、肝、腎、膀胱をはじめとする、胎児から成人に至るまでの種々の正常な組織により産生されることが明らかになった（Burtis, W. J. Clin. Chem. (1992) 38, 2171-2183、Stewart, A. F. & Broadus, A. E. J. Clin. Endocrinol. (1991) 71, 1410-1414）。また、PTHrPは、胎児期から新生児期にかけて母体より高く保たれるカルシウム代謝調節に重要な役割を演じていると考えられている。
【００１０】
PTH/PTHrP 受容体は主に骨と腎に存在し（滋野長平、Clinical Calcium (1995) 5, 355-359）、PTHrPが受容体に結合することにより複数の細胞内シグナル伝達系が活性化されることが知られている。その一つは、アデニルシクラーゼであり、もう一つはフォスフォリパーゼCである。アデニルシクラアーゼの活性化により、細胞内cAMP濃度が上昇しプロテインキナーゼAが活性化される。また、フォスフォリパーゼCはフォスファチヂルイノシトール4, 5-ビスフォスフォネートを分解してイノシトール1, 4, 5-トリフォスフォネートとジアシルグリセロールを生じさせる。これらのシグナル伝達系にはG蛋白質が関与する（Coleman, D. T. et al., Biochemical mechanisms of parathyroid hormone action. In: "The parathyroids" (Bilezikian, J. P. et al.),Raven press, New York, (1994)page 239 ）。
【００１１】
PTHrPは、これらのシグナル伝達系を介して、HHMに観察される高カルシウム血症、低リン血症、腎リン再吸収能の低下、腎性cAMP排泄の増加などを引き起こす。
このように、PTHrPは悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症に密接に関連していることが明らかになっている。悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療には補液を行う他、カルシトニン、ステロイド剤、インドメタシン、無機リン酸塩、ビスフォスフォネート等が使用される。しかしながら、これらの薬剤は連続使用により効果が低減すること、強い副作用が発現すること、又は薬効発現が遅いことなどから、より治療効果が高く副作用の少ない薬剤の使用が期待されている。
【００１２】
一方、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症治療の新しい試みとして、Kukreja, S. C.らは、ヒト肺ガン細胞又はヒト喉頭ガン細胞を移植して高カルシウム血症を生じた無胸腺マウスにPTHrPに対する中和抗血清を投与すると、血中カルシウム濃度及び尿cAMPレベルが減少したことを報告している（J. Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802）。佐藤幹二らは、PTHrP産生ヒト腫瘍を移植したヌードマウスにPTHrP（1-34）に対する抗体を投与すると、高カルシウム血症を低減させ、マウスの生存時間を大幅に延長させたことを報告している（J. bone & Mine. Res.(1993) 8, 849-860）。また、特開平4-228089号には、ヒトPTHrP（1-34）に対するマウス／ヒトキメラ抗体が開示されている。
【００１３】
マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）を有し、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス抗体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（HAMA）は、血清病又は他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウスモノクローナル抗体をヒトに頻回投与することはできない。
【００１４】
これらの問題を解決するため、非ヒト由来の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫原性を低減させる方法が開発された。その一つが、抗体の可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。
【００１５】
得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全な形で含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来するアミノ酸配列の比率が実質的に滅少しており、それ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体はもとのマウスモノクローナル抗体と同等に抗原に結合し、かつ免疫原性が低いが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（LoBuglio,A.F.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,4220-4224,1989）。
【００１６】
マウス抗体の免疫原性を低減させるための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させることが期待される。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（complementarity determining region；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」（reshaped）ヒト可変領域を作製する。ただし、必要によっては、再構成ヒト可変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。
【００１７】
次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分は、ＣＤＲ及び極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。このため、マウスＣＤＲを担持するヒト型化抗体は、もはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１８】
ヒト型化抗体については、さらに、Riechmann,L.et al.,Nature,332,323-327,1988; Verhoeye,M.et al, Science,239,1534-1536,1988; Kettleborough, C.A.et al.,Protein Engng.,4,773-783,1991; Maeda,H.et al.,Human Antibodies and Hybridoma,2,124-134,1991; Gorman,S.D.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88,4181-4185,1991; Tempest,P.R.et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co,M.S.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88,2869-2873, 1991; Carter,P.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,4285-4289,1992; Co, M. S. et al.,J.Immunol.,148,1149-1154,1992; 及びSato, K.et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993を参照のこと。
【００１９】
前記のごとく、ヒト型化抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、PTHrPに対するヒト型化抗体は知られておらず、前記文献にはその示唆もなされていない。また、ヒト型化抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在せず、特定の抗原に対して十分な結合活性、中和活性を示すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Sato,K. et al., Cancer Res.,53,851-856,1993を参照のこと）。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相捕性決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（humanized ）抗体、該抗体のＬ鎖及びＨ鎖、並びに該抗体のＬ鎖又はＨ鎖を構成するＶ領域を含むポリペプチドを提供することを目的とする。
【００２１】
本発明はさらに、上記の抗体、特にそのＶ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及びＶ領域を含むポリペプチドを含むＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡを提供することを目的とする。本発明はさらに、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主を提供することを目的とする。本発明はさらに、PTHrPに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の製造方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、中和活性が高いPTHrPに対する抗体を提供することを目的とする。本発明はさらに、PTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物並びに高カルシウム血症抑制剤、低リン血症改善剤及びアルカローシス改善剤を提供することを目的とする。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体のヒトにおける免疫原性が低減されている抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域、及びPTHrPに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むキメラＬ鎖である。Ｌ鎖Ｖ領域としては、配列番号45で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、Ｌ鎖Ｃ領域としてはＣλ領域のものが挙げられる。
【００２３】
さらに、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域、及びPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含むキメラＨ鎖である。Ｈ鎖Ｖ領域としては、配列番号46で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、Ｃ領域としてはＣγ１領域のものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記キメラＬ鎖及びキメラＨ鎖を含む、PTHrPに対するキメラモノクローナル抗体である。
【００２４】
さらに、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域１〜４、及びPTHrPに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域１〜３を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。相補性決定領域１〜３としては、それぞれ配列番号59〜61で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれヒト抗体HSU03868のフレームワーク領域１〜３由来のもの、かつ、フレームワーク領域４としてはヒト抗体S25755のフレームワーク４由来のものが挙げられる。あるいは、フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれヒト抗体HSU03868のフレームワーク領域１〜３と実質的に同一のもの、かつ、フレームワーク領域４としてはヒト抗体S25755のフレームワーク領域４と実質的に同一のものが挙げられる。
【００２５】
ここで、「実質的に同一」とは、ヒト型化抗体において使用されるヒト抗体のフレームワーク領域において、ヒト型化抗体がマウスモノクローナル抗体と同等の活性を有するように、マウスモノクローナル抗体の相補性決定領域を形成するために必要なアミノ酸の欠失、置換、付加等を生じてもよいことを意味する。
【００２６】
さらに、本発明は、フレームワーク領域中のKabatの規定(Kabat,E.A.et al.,US Dept. Health and Human Services,US Government Printing Offices,1991)による第36番目のアミノ酸がチロシンであり、かつ、同第49番目のアミノ酸がアスパラギン酸である、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。
【００２７】
さらに、本発明は、配列番号48〜51で表されるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。
さらに、本発明は、フレームワーク領域中のKabat の規定による第45番目のアミノ酸がリジンであり、かつ、同第87番目のアミノ酸がイソロイシンである、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。
さらに、本発明は、配列番号52〜55で表されるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。
【００２８】
さらに、本発明は、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域１〜４、及びヒトPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の相補性決定領域１〜３を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。相補性決定領域１〜３としては、それぞれ配列番号62〜64で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、フレームワーク領域１〜４としては、ヒトサブグループIII (Human Subgroup III(HSG III)、Kabat,E.A.et al.,US Dept.Health and Human Services, US Government Printing Offices,1991)に属するヒト抗体のフレームワーク領域１〜４由来のもの、より詳しくはそれぞれヒト抗体S31679のフレームワーク領域１〜４由来のものが挙げられ、あるいはヒト抗体S31679のフレームワーク領域１〜４と実質的に同一のものが挙げられる。
【００２９】
さらに、本発明は、配列番号56で表されるアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドである。
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域を含むポリペプチドを含む、ヒトPTHrP に対するヒト型化抗体のＬ鎖である。ここで、Ｃ領域としてはＣλ領域、フレームワーク領域１〜３としてはそれぞれヒト抗体HSU03868のフレームワーク領域１〜３と実質的に同一のもの、フレームワーク領域４としてはヒト抗体S25755のフレームワーク領域４と実質的に同一のもの、そして相補性決定領域１〜３のアミノ酸配列としてはそれぞれ配列番号59〜61で表されるものが挙げられる。
【００３０】
さらに、本発明は、前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域を含むポリペプチド及びＨ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドを含む、ヒトPTHrP に対するヒト型化抗体のＨ鎖である。Ｃ領域としてはＣγ１領域、フレームワーク領域１〜４としてはHSGIIIに属するヒト抗体由来のフレームワーク領域１〜４由来のもの、そして相補性決定領域１〜３としてはそれぞれ配列番号62〜64で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００３１】
さらに、本発明は、抗原性が弱く、中和活性が高い抗PTHrP 抗体に関する。該PTHrP 抗体はヒトの疾患の治療に供することが可能な、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、プライマタイズド抗体などを含む。また、該抗体は低い解離定数を有するものである。さらに、本発明の抗体は解離定数が小さいため中和活性が高く、ヒトの疾患の治療に供することができる。
【００３２】
本発明の抗体は、1.86×10-7[M] 以下の解離定数、1.22×10-1[1/Sec]以下の解離速度定数、そして6.55×104[1/M.Sec] 以上の結合速度定数を有するものである。また、これらの定数は、ＲＩ標識されたリガンドを用いたスキャッチャード解析や表面プラズモン共鳴センサー等により測定することができる。
【００３３】
さらに、本発明は、ヒトPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ又はＨ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡである。Ｌ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域としては、それぞれ配列番号45、46で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては例えば配列番号65で表されるものが挙げられ、Ｈ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては配列番号57で表されるものが挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明は、前記キメラＬ鎖又はキメラＨ鎖をコードするＤＮＡである。該Ｌ鎖をコードするＤＮＡとしては例えば配列番号65で表される塩基配列を含むものが挙げられ、該Ｈ鎖をコードするＤＮＡとしては配列番号57で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００３５】
さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域コードする塩基配列を含むＤＮＡ又はＨ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡである。Ｌ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては配列番号66〜74で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられ、Ｈ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡとしては配列番号58で表されるものが挙げられる。
【００３６】
さらに、本発明は、配列番号47〜55で表されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡである。該ＤＮＡとしては、配列番号66〜74で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、配列番号56で表されるアミノ酸配列をコードする、ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域のＤＮＡである。該ＤＮＡとしては配列番号58で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００３７】
さらに、本発明は、前記いずれかのＤＮＡを含む組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヒト副甲状腺関連ペプチドに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体を採取することを特徴とするヒト副甲状腺関連ペプチドに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体の製造方法である。
【００３８】
さらに、本発明は、前記抗体を有効成分として含む医薬組成物並びに高カルシウム血症抑制剤及び低リン血症改善剤である。該カルシウム血症は悪性腫瘍に起因するものであり、また、悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症患者においてはしばしば低リン血症が認められる。従って、本発明の抗体は、上記悪性腫瘍に対する治療又は高カルシウム血症若しくは低リン血状症状の軽減をするために使用することができる。なお、悪性腫瘍としては、例えば膵臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも一つが挙げられるが、これらの癌に限定されるものではなく、高カルシウム血症をもたらす悪性腫瘍はすべて本発明の高カルシウム血症抑制剤の適用の対象とすることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
【発明の実施の形態】
１．ヒトPTHrP に対するマウスモノクローナル抗体の作製
PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからPTHrP活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
【００４０】
(1) 抗原の調製
動物の免疫に用いるPTHrPとしては、組換えＤＮＡ法又は化学合成により調製したPTHrPのアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチド、又は高カルシウム血症を惹起する癌細胞の培養上清液由来のPTHrPなどが挙げられる。例えば、公知のPTHrP（Kemp,B.E. et al., Science(1987)238,1568-1570） の第１〜34番目のアミノ酸からなるペプチド（PTHrP(1-34)）を抗原として用いることができる。なお、ヒトPTHrP(1-34)は、配列番号75で表されるアミノ酸配列を有するものである。
【００４１】
得られたPTHrPをキャリアータンパク質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【００４２】
(2) 免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜21日間間隔で免疫する。
【００４３】
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、100 μg用いられる。
【００４４】
(3) 抗体価の測定
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、又は抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。
抗体検出の方法としては、公知技術、例えばEIA(エンザイムイムノアッセイ)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ)等が挙げられる。
【００４５】
(4) 細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８-アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
【００４６】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、P3 (P3x63Ag8.653) (J.Immunol.(1979)123:1548-1550) 、P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7)、NS-1(Kohler,G.and Milstein, C., Eur.J.Immunol.(1976)6:511-519)、MPC-11 (Margulies,D.H.et al., Cell (1976) 8:405-415)、SP2/0 (Shulman,M. et al., Nature(1978)276:269-270)、FO(de St.Groth, S.F.et al., J.Immunol. Methods (1980) 35:1-21)、S194 (Trowbridge, I.S., J.Exp.Med. (1978)148:313-323) 、R210 (Galfre,G. et al., Nature (1979) 277:131-133)等が好適に使用される。
【００４７】
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をPBS 、DMEM、RPMI1640等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
【００４８】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。
細胞融合は、MEM 、DMEM、RPME-1640 培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：10で融合促進剤の存在下、30〜37℃で１〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,000〜6,000 のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４９】
(5) ハイブリドーマの選択及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。
すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。
その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。
【００５０】
(6) モノクローナル抗体の採取
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10〜20％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃，５％CO2濃度）で２〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５１】
腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水又は血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製する。
【００５２】
２．キメラ抗体の構築
（１）ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする塩基配列を含むDNAのクローニング
(i) mRNAの調製
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡのクローニングを行うため、回収されたハイブリドーマから公知の方法、例えばグアニジン−超遠心法（Chirgwin,J.M. ら、Biochemistry (1979), 18, 5294-5299） 、ＡＧＰＣ法（Chomczynski,P ら、Analytical Biochemistry (1987), 162, 156-159）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Purification Kit (Pharmacia 社製)に添付されたOligo(dT)-セルローススパンカラム等によりｍＲＮＡを調製する。また、Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 社製) を用いることにより、全ＲＮＡの抽出操作を経ずに、ｍＲＮＡの調製を行うこともできる。
【００５３】
(ii)ｃＤＮＡの調製及び増幅
上記(i) で得たｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域におけるｃＤＮＡをそれぞれ合成する。ｃＤＮＡの合成は、Oligo-dTプライマー又はＬ鎖Ｃ領域若しくはＨ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする適当なプライマー（例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＭＨＣ２プライマー）を用いることが出来る。
ｃＤＮＡ合成反応は、前記ｍＲＮＡとプライマーとを混合し、逆転写酵素の存在下で例えば５２℃で３０分の反応を行う。
【００５４】
ｃＤＮＡの増幅は、Ｌ鎖及びＨ鎖ともに5’-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH社)を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Frohman,M. A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988、Belyavsky,A.ら, Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932,1989）に基づくＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来る。すなわち、上記で合成したｃＤＮＡの５’末端にAmpli FINDER Anchor（配列番号４２）を連結し、Ｌ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ（以下、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡを「Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡ」又は「Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ」と略記することもある（Ｈ鎖Ｖ領域、Ｃ領域等についても同様））についてＰＣＲを行う。
【００５５】
Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、例えばＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）及びマウス抗体のＬ鎖λ鎖定常領域（Ｃλ領域）の保存配列から設計したプライマー（例えば配列番号４で表される塩基配列を有するＭＬＣプライマー）を用いることが出来る。また、Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、例えばＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）及びＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（S.T.Jones ら, Biotechnology, 9, 88, 1991）を用いることが出来る。
【００５６】
(iii) ＤＮＡの精製及び塩基配列の決定
ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した後、ＤＮＡの回収及び精製を行い、ベクターＤＮＡに連結する。
ＤＮＡの精製は、市販のキット（例えばGENECLEAN II; BIO101）を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばpUC19 、Bluescript等）を用いることができる。
【００５７】
前記ＤＮＡと上記ベクターＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌JM109 等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを調製する（J.Sambrook, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（J.Sambrook, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。本発明では、自動塩基配列決定装置（DNA Sequencer 373A; ABI 社）を用いることができる。
【００５８】
(iv)相補性決定領域
Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、抗原結合部位を形成し、その全般の構造は互いに類似性を有している。すなわち、それぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）部分が、３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。ＦＲのアミノ酸配列は比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.ら、「Sequence of Proteinsof Immunological Interest」 US Dept. Health and Human Services, 1983）。
【００５９】
前記４個のＦＲの多くの部分は、β−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲは、ある場合にはβ−シート構造の一部を形成することもある。従って、３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そしてＦＲは対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
【００６０】
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 US Dept. Health and Human Services, 1983）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見い出すことが出来る。
【００６１】
（２）キメラ抗体の発現ベクターの作製
マウスモノクローナル抗体のマウスＬ鎖（以下、抗体のＬ鎖又はＨ鎖を表す場合は、マウスについては「マウスＬ鎖」、ヒト抗体のＨ鎖については「ヒトＨ鎖」のように略記することもある。）及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒトＰＴＨｒＰ抗体が得られる。
【００６２】
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んでなる。あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域の配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを含んでなる。
【００６３】
ヒト抗体Ｃ領域を含むポリペプチドは、任意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域のものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについてはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４、及びＬ鎖のものについてはＣλ又はＣκを各々挙げることができる。
【００６４】
キメラ抗体の製造のためには、まず、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。
【００６５】
あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列並びにマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリーダー配列並びにマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００６６】
(i) キメラ抗体Ｈ鎖の構築
キメラ抗体のＨ鎖発現ベクターは、マウスのＨ鎖Ｖ領域をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡ（以下、「Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ」ともいう）を、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードする塩基配列を含むゲノムＤＮＡ（以下、「Ｈ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡ」ともいう）又は当該領域をコードするｃＤＮＡ（以下、「Ｈ鎖Ｃ領域のｃＤＮＡ」ともいう）を含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｈ鎖Ｃ領域としては、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４領域が挙げられる。
【００６７】
(i-a) Ｈ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターの構築
Ｈ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを有する発現ベクターとしては、Ｃγ１領域をコードするものについては、例えばＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（ＷＯ９２／１９７５９参照）又はＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）が挙げられる。
【００６８】
ここで、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをこれらの発現ベクターに挿入するにあたり、ＰＣＲ法により該ｃＤＮＡに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするため該ｃＤＮＡの開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、該ｃＤＮＡの３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そしてゲノムＤＮＡの一次転写産物が正しくスプライスされｍＲＮＡとなるためのスプライスドナー部位を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を発現ベクターに導入することができる。
【００６９】
こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、上記発現ベクターに挿入して、Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１領域）をコードするゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。
【００７０】
(i-b) Ｈ鎖をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターの構築
Ｈ鎖Ｃ領域（例えばＣγ１領域）をコードするｃＤＮＡを有する発現ベクターは、以下のようにして構築することができる。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡ（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のゲノムＤＮＡびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターＲＶｌ−ＰＭ１ａ（ＷＯ９２／１９７５９参照）とを導入したＣＨＯ細胞からｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域コードするｃＤＮＡ及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１）をコードするｃＤＮＡをクローニングし、該ｃＤＮＡを適当な制限酵素処理を行った動物細胞発現用ベクターに連結することにより、目的とする発現ベクターが構築される。
【００７１】
ここで、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡと直接連結するにあたり、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む断片に、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするために該ｃＤＮＡの開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、該ｃＤＮＡの３’−末端にＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のＤＮＡと直接連結するための適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡに導入する。
【００７２】
こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理して、上記Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡと連結して、ｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することにより、キメラＨ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築することが出来る。
【００７３】
(ii)キメラ抗体Ｌ鎖の構築
キメラ抗体のＬ鎖発現ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとを連結し、適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｌ鎖Ｃ領域としては、例えばκ鎖又はλ鎖が挙げられる。
【００７４】
(ii-a) キメラＬ鎖λ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築するにあたり、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を該発現ベクターに導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡに導入する。
【００７５】
ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡは、全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法により構築することが出来る。ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域は、アイソタイプの違いにより少なくとも４種類の存在が知られ、いずれのアイソタイプも発現ベクターの構築に用いることが可能である。例えば、クローニングしたマウスモノクローナル抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性の検索から、ヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域断片のアイソタイプとしてＭｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−（accession No. X57819） (P.Dariavachら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)のものを選択して発現ベクターの構築に用いることが出来る。公知のヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域、例えばＭｃｇ＋ Ｋｅ＋ Ｏｚ− のｃＤＮＡを構築するために、例えば配列番号１１から１４に示す４本の下記プライマーに分ける。プライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号１１）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号１３）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号１２）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号１４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に２０から２３ｂｐの相補的配列を有する様に設計する。
【００７６】
ＭＢＣ１ＨＧＰＳ（配列番号１５）及びＭＢＣ１ＨＧＰＲ（配列番号１６）は外部プライマーと呼ばれ、ＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ４とそれぞれ相同な配列を有しており、それぞれ適当な制限酵素の認識配列をそれぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本のプライマーをアセンブリさせ、完全長のｃＤＮＡ合成し、さらに外部プライマーを加えｃＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法によるアセンブリとは、ＭＢＣ１ＨＧＰ１とＭＢＣ１ＨＧＰ２、又はＭＢＣ１ＨＧＰ３とＭＢＣ１ＨＧＰ４とがその相補的配列によりアニーリングし、ＭＢＣ１ＨＧＰ１−ＭＢＣ１ＨＧＰ２断片とＭＢＣ１ＨＧＰ３−ＭＢＣ１ＨＧＰ４断片が合成され、さらに、各断片の相補的配列によりアニーリングして、完全長のヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡが合成されることを指す。
【００７７】
このようにして構築したヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡと、上記のようにして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡとを、適当な制限酵素部位間で連結し、さらにｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することにより、キメラ抗体のＬ鎖λ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築することが出来る。
【００７８】
(ii-b)キメラＬ鎖κ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築するにあたり、ＰＣＲ法により、該ｃＤＮＡに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該ｃＤＮＡの５’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を該ｃＤＮＡに導入する。
【００７９】
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと連結させるためのヒトＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡを含むＨＥＦ-PM1k-gk（ＷＯ９２／１９７５９参照）から構築することが出来る。
ＰＣＲ法により、Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５’−末端及び３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を導入し、上記のようにして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡとＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、ｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することにより、キメラ抗体のＬ鎖κ鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築することが出来る。
【００８０】
３．ヒト型化抗体の作製
（１）ヒト抗体との相同性検索
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト型化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域を、プロテイン・データ・バンクを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。また、同時にＫａｂａｔらにより、抗体のＦＲの長さ、アミノ酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグループ（ＨＳＧ：Human subgroup）(Kabat, E.A. ら、US Dep.Health and Human Services, US Government Printing Offices,1991) との比較を行う。
【００８１】
ヒトＨ鎖Ｖ領域の場合は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜IIIに分類することが出来、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域は、ＨＳＧIIIのコンセンサス配列と82.7％のホモロジーを有する。一方、ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜VIに分類することが出来、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｌ鎖λ鎖Ｖ領域は、いずれのサブグループに属するヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域のコンセンサス配列とも高いホモロジーを有さない。
【００８２】
従って、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体をヒト型化する際には、ヒトＨ鎖Ｖ領域としてＨＳＧIIIに属し、最も相同性の高いヒトＨ鎖Ｖ領域、又はカノニカルストラクチャー（Chothia C, et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917,1987）の一致するＦＲの構造を有するヒトＨ鎖Ｖ領域をヒト型化抗体の構築に使用することが望ましい。また、ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域のサブグループには相同性の高いコンセンサス配列がないことより、プロテイン・データ・バンクに登録されている最も高い相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｖ領域をヒト型化抗体の構築に使用することが望ましい。
【００８３】
（２）ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの設計
ヒト型化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの設計における第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することである。
本発明においては、マウス抗体Ｖ領域のＦＲと８０％以上ホモロジーを有するヒト抗体Ｖ領域のＦＲを、ヒト型化抗体に用いることができる。ここで、Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとしては、サブグループIIIに属するもの、例えばS31679(NBRF-PDB、Cuisinier A.M.ら、Eur.J.Immunol. 23,110-118,1993) 由来のＦＲを実質的に同一なＦＲの断片として挙げることができる。また、Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲとしては、例えばヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（GEN-BANK、Deftos Mら、Scand. J. Immunol. 39, 95-103, 1994）由来のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３と、ヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ４とを実質的に同一なＦＲの断片として挙げることができる。
なお、ヒト抗体Ｓ３１６７９は、ヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされた抗体であり、ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８は新規ヒトＬ鎖λ鎖Ｖ領域の遺伝子としてクローニングされた抗体である。
【００８４】
（３）ヒト型化抗体Ｖ領域を含むポリペプチドの作製
本発明のヒト型化抗体は、該抗体のＣ領域、及びＶ領域のフレームワーク（ＦＲ）領域がヒト由来のものであり、Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス由来のものである（図１）。本発明のヒト型化抗体のＶ領域を含むポリペプチドは、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が入手可能ならば、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングと呼ばれる手法により作製することができる。「ＣＤＲ−グラフティング」とは、マウス由来のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を作製し、これを鋳型となるヒト抗体のＣＤＲと入れ換える手法をいう。
【００８５】
また、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が入手できない場合は、データベースに登録されている塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒト型化抗体Ｖ領域のＤＮＡを作製することができる。さらに、アミノ酸配列のみデータベースに登録されている場合は、そのアミノ酸配列を基に、Kabat, E. A.らの報告（US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991）している抗体のコドン使用頻度に基づいて、全塩基配列を類推することができる。この塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法によりヒト型化抗体Ｖ領域のＤＮＡを作製し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、目的のポリペプチドを作製することができる。
以下に、鋳型となるヒト抗体のＤＮＡ断片が入手できる場合の、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングの一般的な概要を示す。
【００８６】
(i) ＣＤＲ−グラフティング
図２に示すように、Ｖ領域をコードするＤＮＡがＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４をコードするＤＮＡの順で連結されているものとする。
【００８７】
まず、それぞれのＣＤＲに対応するマウス由来のＤＮＡ断片を合成する。ＣＤＲ１〜３は、先にクローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域の塩基配列を基に合成されたＤＮＡである。グラフティングプライマーＢは、センス方向のマウスＣＤＲ１とヒト抗体のＦＲ２にハイブリダイズする配列を有し、グラフティングプライマーＥは、アンチセンス方向のＣＤＲ１とヒト抗体のＦＲ１にハイブリダイズする配列を有するように合成する（グラフティングプライマーＣとＦ、グラフティングプライマーＤとＧについても同様）（図２(1) ）。また、ＦＲ１の上流の領域及びＦＲ４の下流の領域にハイブリダイズすることができる適当なプライマー（外部プライマーという；図２(1) のＡ及びＨ）も合成する。なお、グラフティングプライマーの分離、抽出は、公知の手法により行うことができる（Sambrook,et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【００８８】
次に、グラフティングプライマーＥと外部プライマーＡ、グラフティングプライマーＢとＦ、グラフティングプライマーＣとＧ、グラフティングプライマーＤと外部プライマーＨとを用いて第一ＰＣＲを行う。その結果、それぞれ断片Ａ−Ｅ、断片Ｂ−Ｆ、断片Ｃ−Ｇ及び断片Ｄ−Ｈが得られる（図２(2) ）。
【００８９】
前記の通り、グラフティングプライマーＢの上流とグラフティングプライマーＥの下流の一部の領域とが重複するように設計されているので（グラフティングプライマーＣとＦ、ＤとＧについても同様）、これらの断片は、適当な温度条件で反応させることにより、それぞれの相補的配列にアニーリングし、ＰＣＲを行うことによりＡからＨまでの長さを有するＤＮＡにアセンブリーすることが可能である。そして、Ｖ領域をコードする１本のＤＮＡ断片が得られたところで外部プライマーＡとＨを加え、第二ＰＣＲを行うことにより、ＦＲ１〜４はヒト由来のものであるがＣＤＲ１〜３はマウス由来のものとなったヒト型抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを得る。そして、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、目的のポリペプチドを得ることができる（図２(3) ）。
【００９０】
(ii)ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び発現ベクターの構築
本発明では、ヒト型化抗体の鋳型となるヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを天然から入手することができないため、当該ＤＮＡはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法により構築することが出来る。
【００９１】
マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域は、ヒトサブグループIIIに属するＳ３１６７９と高い相同性を有する。このヒト抗体を鋳型としてヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを構築するために、例えば配列番号２３から２６に示す４本のプライマーに分けて使用する。プライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する様に設計する。
【００９２】
外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）、ＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ４とそれぞれ相同な配列を有しており、それぞれ適当な制限酵素の認識配列をそれぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本のプライマーをアセンブリさせ完全長のｃＤＮＡ合成し、さらに外部プライマーを加えＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法によるアセンブリとは、ＭＢＣ１ＨＧＰ１とＭＢＣ１ＨＧＰ２、又はＭＢＣ１ＨＧＰ３とＭＢＣ１ＨＧＰ４とがその相補的配列によりアニーリングし、ＭＢＣ１ＨＧＰ１−ＭＢＣ１ＨＧＰ３断片とＭＢＣ１ＨＧＰ２−ＭＢＣ１ＨＧＰ４断片が合成され、さらに、各断片の相補的配列によりアニーリングして、完全長のヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡが合成されることを指す。
【００９３】
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＨ鎖Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を挙げることができる。
前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、例えばヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１領域のＤＮＡと連結することができる。キメラ抗体Ｈ鎖の構築で述べたように、適当な制限酵素にて処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
【００９４】
(iii) ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び発現ベクターの構築
本発明では、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの場合と同様、鋳型となるヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡを天然から入手することができないため、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの全塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲ法により構築することが出来る。
【００９５】
マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域と最も相同性を有するヒト抗体ＨＳＵ０３８６８を鋳型としてヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを構築するために、例えば配列番号２９から３２に示す４本のプライマーに分けて使用する。プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する様に設計する。
【００９６】
外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）、ＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ４とそれぞれ相同な配列を有しており、それぞれ適当な制限酵素の認識配列をそれぞれ含んでいる。ＰＣＲ法を用いて、４本のプライマーをアセンブリさせ完全長のＤＮＡ合成し、さらに外部プライマーを加えＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ法によるアセンブリとは、ＭＢＣ１ＬＧＰ１とＭＢＣ１ＬＧＰ３、又はＭＢＣ１ＬＧＰ２とＭＢＣ１ＬＧＰ４とがその相補的配列によりアニーリングし、ＭＢＣ１ＬＧＰ１−ＭＢＣ１ＬＧＰ３断片とＭＢＣ１ＬＧＰ２−ＭＢＣ１ＬＧＰ４断片が合成され、さらに、各断片の相補的配列によりアニーリングして、完全長のヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが合成されることを指す。
【００９７】
ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＬ鎖ＣλやＣκを挙げることができる。
前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のものと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
【００９８】
前記のようにして、ヒト型化抗体のＶ領域を含むポリペプチドが作製されても、該ポリペプチドが抗体としての活性（抗原に対する結合活性、中和活性等）を有するか否かは必ずしも明らかではない。特にＬ鎖の場合は、マウス抗ヒトＰＴＨｒＰモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域が、非常に希なＶλｘ遺伝子由来であるため、ヒト型化Ｈ鎖との組み合わせによりＣＯＳ−７のごとき動物細胞で発現させ、活性の有無を検討する必要がある。
【００９９】
ヒト型化抗体Ｖ領域のどのＦＲが、ヒト型化抗体の結合活性及び中和活性に寄与するのかを明らかにする方法として、ハイブリッドＶ領域を構築し（Ohtomo,T. et al. Molecular Immunology, 32,407-416,1995）、確認するのが有効である。本発明のヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域において、どのアミノ酸を変異させれば活性を有するものが得られるかを調べるため、ヒト型化抗体のＦＲ領域の断片をマウス由来のＦＲ領域の断片と組換えたものをコードするＤＮＡを構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行う。
【０１００】
図３に示すように、ＦＲ１及びＦＲ２はヒト抗体由来であるがＦＲ３及びＦＲ４をマウス抗体由来に組み換えたＶ領域を含むポリペプチドを有する抗体（このような組み換えた断片を有する抗体を「ハイブリッド抗体」という）、ＦＲ１のみをヒトのものに組み換えたハイブリッド抗体、ＦＲ２のみをヒトのものに組み換えたハイブリッド抗体を作製する。そして、これらのハイブリッド抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、ヒト型化抗体を一過性に発現させ、抗体の活性の有無を調べる。
【０１０１】
本発明者は、この方法を用いてＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドの抗原結合活性及び中和活性について検討した結果、ＦＲ２及びＦＲ３に、置換すべきアミノ酸が存在することが判明した。
本発明者は、ＦＲ２及びＦＲ３領域に活性に寄与するアミノ酸が存在することが判明し、Kabat, E.A. ら（US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices,1991）により決定された抗体のアミノ酸番号の第36、45及び49番目のアミノ酸（ＦＲ２領域に存在する）、並びに第87番目のアミノ酸（ＦＲ３領域に存在する）が活性に寄与するアミノ酸であることを明らかにした。
【０１０２】
そこで、本発明では、これらのアミノ酸を変異（例えば置換）させたＶ領域を含むポリペプチドを作製する。
まず、前記ＣＤＲ−グラフティングにより、アミノ酸の変異を導入させるための基本となるアミノ酸配列を有するＶ領域を含むポリペプチドを調製する。この基本となるポリペプチドは、配列番号47で表されるアミノ酸配列を含むものであり、「バージョンａ」とする（表１のａ）。
【０１０３】
次に、このバージョンａを基準として、ＦＲのいくつかのアミノ酸を変異させた種々の変異型断片を作製する。
変異の導入は、目的の変異を導入しようとするアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドプライマー（変異原プライマー）を設計し、該プライマーを用いたＰＣＲにより行うことができる。
このようにして、ＦＲ２及びＦＲ３の特定のアミノ酸を変異させたＶ領域を含むポリペプチド（バージョンｂ〜ｔ）が作製される（表１のｂ〜ｔ）。
【０１０４】
【表１】
0004078164.tif 000002
【０１０５】
前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域各バージョンをコードするＤＮＡは、任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のＤＮＡと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトＬ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域各バージョンをコードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを含む発現ベクターを作製する。
【０１０６】
また、前記のようにして構築したヒト型化抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするヒト型化抗体を生産させることができる。
【０１０７】
４．キメラ抗体及びヒト型抗体の製造
キメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するためには、前記のようなそれぞれ２種類の発現ベクターを作製する。すなわち、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製する。
【０１０８】
次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。
【０１０９】
また、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ、並びにＬ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一ベクターに連結し、適当な宿主細胞を形質転換し、抗体を産生させることができる。すなわち、キメラ抗体の発現には、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリーダー配列並びにマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。ヒト型化抗体の発現には、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）に導入する。そして、これらのベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体を生産させる。
【０１１０】
以上のようにして目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体又はヒト型化抗体は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。
なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体又はヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡアガロースカラムを用いて行うことができる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体又はヒト型化抗体を分離・精製することができる。
【０１１１】
ヒトＰＴＨｒＰに対する本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するために、任意の発現系を使用することができる。例えば、真核細胞を用いる場合は動物細胞（例えば樹立された哺乳類細胞系）、真糸状菌細胞又は酵母細胞などが挙げられ、原核細胞を用いる場合は細菌細胞（例えば大腸菌細胞等）などを使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【０１１２】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（human cytomegalovirus immediate early; HCMV）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（ＷＯ９２−１９７５９）が含まれる。
【０１１３】
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Mulliganらの方法（Nature 277,108,1979）、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Mizushima, S. らの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990）に従えば容易に実施することができる。
【０１１４】
複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３' ）II又はＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【０１１５】
５．キメラ抗体及びヒト型抗体の抗原結合活性及び中和活性の評価
(1) 抗体の濃度測定
得られた精製抗体の濃度の測定は、ELISAにより行うことができる。
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（例えばMaxisorp, NUNC）の各穴を、例えば１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体100 μl で固相化する。200 μl の希釈バッファー（例えば50mM Tris-HCl 、１mM MgCl2、0.1M NaCl 、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.2 ）でブロッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッド抗体若しくはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞若しくはＣＨＯ細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、ハイブリッド抗体若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加え、次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体100 μl を加え、１mg/ml の基質溶液（Sigma 104、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に405nm での吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad ）で測定する。濃度測定のスタンダードとして、Hu IgG1λ Purified (The Binding Site)を用いることができる。
【０１１６】
(2) 抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を１μg/mlの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（1-34） 100 μl で固相化する。200 μl の希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッド抗体若しくはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞若しくはＣＨＯ細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、ハイブリッド抗体若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加え、次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体100 μl を加え、１mg/ml の基質溶液（Sigma 104 、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に405nm での吸光度をマイクロプレートリーダー（BioRad）で測定する。
【０１１７】
(3) 中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性の測定は、例えばラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５細胞（Sato,K.et al.,Acta Endocrinology 116,113-120,1987）を用て行うことができる。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を、４ｍＭのヒドロコルチゾンで刺激し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを誘導する。１ｍＭのイソブチル-1-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）でｃＡＭＰの分解酵素を阻害し、中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体又はヒト型化抗体をＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合液を各穴に添加する。ＰＴＨｒＰの刺激により、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５細胞が産生するｃＡＭＰの量を測定することにより、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト型抗体の中和能を評価することができる。
【０１１８】
(4) PTHrP と抗PTHrP 抗体との相互作用における速度論的解析
本発明では、PTHrP と抗PTHrP 抗体との相互作用における速度論を、様々な手法を用いて解析することができる。具体的には、スキャッチャード解析やBIACORE と呼ばれる表面プラズモン共鳴センサー（ファルマシアバイオテク社により開発・実用化された）により解離定数、解離速度定数、結合速度定数を測定することが可能であるが、本発明では、その一例として、BIACORE と呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより解析する場合を説明する。
【０１１９】
BIACOREの基本構造は、光源とプリズム、ディテクターとマイクロ流路から成っている。実際には、カセット式のセンサーチップ上にリガンドを固定化し、そこにアナライトをインジェクションする。両者に親和性があれば、その結合量が光学的に検出される。
【０１２０】
その検出原理は表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。すなわち、ガラスと金属薄膜との界面に全反射するように入射した光のうち、ある角度の入射光は表面プラズモンの励起に使われ減衰してしまう。その角度が金属薄膜（センサー）に接している溶媒の濃度変化に依存して変動する。BIACORE はこの変動を検出するというものである。
【０１２１】
BIACOREではこの変化を共鳴シグナル（SPR signal）と呼び、0.1度の変化を1000RU（resonance units ）としている。1000RUは表面積1mm2の薄金センサー上に約１ngの蛋白質が結合した場合の変化量であり、蛋白質であれば50RU（50pg）程度の変化を十分検出することができる。
検出されたシグナルは、BIACOREに付属しているコンピューターがセンサーグラムと呼ばれる結合曲線に変換し、リアルタイムにコンピューターディスプレイ上に描き出される（夏目徹  他、（1995）実験医学、13，p563-569．）（Karlsson，R. et al.,（1991）J.Immunol.Methods 145,p229-240.）。
【０１２２】
上記BIACORE によって本発明の抗PTHrP 抗体のカイネティクスパラメーター、すなわち解離定数（ＫＤ）、解離速度定数（Ｋdiss）および結合速度定数（Ｋass）を測定することができる。
本発明の抗PTHrP 抗体は、解離定数（ＫＤ値）が小さい値であるほど中和活性を有する点で好ましい。本発明の抗PTHrP 抗体において、ＫＤ値は1.86×10-7以下であることが好ましく、1.86×10-8以下であることがより好ましく、3.58×10-10 以下のものが最も好ましい。
【０１２３】
また、ＫＤ値は解離速度定数（Ｋdiss）および結合速度定数（Ｋass）の２つのパラメーターから決定される（ＫＤ＝Ｋdiss／Ｋass ）。したがって、Ｋdissの値が小さく、Ｋass の値が大きければＫＤ値が小さくなることは明らかである。
具体的には、本発明の抗PTHrP 抗体の場合、Ｋdissの値が1.22×10-1 [1/Sec]以下であればよい。好ましくは、Ｋdissの値が1.22×10-2以下であり、より好ましくは3.16×10-4以下であり、最も好ましくは2.32×10-4 [1/Sec]以下である。
【０１２４】
一方、Ｋass の値は6.55×104 [1/M.Sec]以上であればよい。好ましくはＫassの値は6.55×105 以上であり、より好ましくは0.883 ×106 以上であり、最も好ましくは1.03×106 [1/M.Sec]以上である。
さらに、Ｋdissの値が1.22×10-1 [1/Sec]以下であり、かつ、Ｋass の値が6.55×104 [1/M.Sec]以上の抗PTHrP 抗体も好ましい。
【０１２５】
さらに具体的には、本発明の抗PTHrP 抗体は、ＫＤ値がＫＤ値は1.02×10-11〜1.86×10-7[M] の範囲であり、1.02×10-10〜1.86×10-8[M] のものが好ましく、1.34×10-10〜3.58×10-10[M]のものがより好ましく、2.25×10-10〜3.58×10-10[M] のものが最も好ましい。
また、Ｋdiss値は7.38×10-6〜1.22×10-1[1/Sec]の範囲であり、7.38×10-5〜1.22×10-2[1/Sec]のものが好ましく、1.66×10-4〜3.16×10-4[1/Sec]のものがより好ましく、1.66×10-4〜2.32×10-4[1/Sec]のものが最も好ましい。
【０１２６】
そしてＫass 値は、6.55×104〜1.24×107[1/M.Sec] の範囲であり、6.55×105〜1.24×106[1/M.Sec] のものが好ましく、7.23×105〜1.03×106 [1/M.Sec]のものがより好ましく、0.883 ×106〜1.03×106[1/M.Sec] のものが最も好ましい。
これらのＫＤ値、Ｋdiss値およびＫass 値はスキャッチャード解析、あるいはBIACORE などの表面プラズモン共鳴センサー等により得ることができるが、BIACORE を用いて得ることが好ましい。
【０１２７】
６．抗PTHrP 抗体又はヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び高カルシウム血症抑制剤
PTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体の治療効果を確認するには、PTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体を、高カルシウム血症を呈した動物に投与し、高カルシウム血症の指標を測定することによりその治療効果を確認することができる。また、高カルシウム血症を呈した動物及び高カルシウム血症患者においては、しばしば低リン血症が認められるが、本発明の抗体は、この低リン血症を改善するために用いることもできる。
【０１２８】
本発明で使用される抗体は、前記解離定数、解離速度定数及び結合速度定数を有する抗PTHrP 抗体（ヒト抗体、キメラ抗体、プライマタイズド抗体を含む）、あるいはPTHrPに対するヒト型化された抗体である。この抗体は、PTHrPに結合することにより、PTHrPの活性を中和する抗体であり、特に、好ましくはヒト型化された#23-57-137-1抗体が挙げられる。ヒト型化#23-57-137-1抗体の作製方法は、実施例１〜３に記載されている。
【０１２９】
本発明で使用される抗体は、塩析法、HPLC等を用いたゲル濾過法、プロテインAカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を組み合わせて高純度に精製することができる。このように精製された抗体は、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA、ELISA）、あるいは蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis）等の通常の免疫学的手段により、高精度にPTHrPを認識することを確認できる。
【０１３０】
高カルシウム血症を呈する動物には、PTHrPを産生する腫瘍細胞を免疫機能が低下又は欠失した実験動物に移植することにより作製したモデル動物を使用することができる。移植される腫瘍細胞としては、ヒト由来の腫瘍細胞が好ましく、例えば、ヒト膵臓癌PAN-7が挙げられる。また、腫瘍細胞を移植される免疫機能が低下又は欠失した動物としてはヌードマウス、SCIDマウスが挙げられる。
高カルシウム血症の抑制の評価は、血中カルシウム濃度、体重減少、あるいは運動量の低下を経時観察し、その改善の程度を評価することによって行われる。
【０１３１】
本発明のPTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び高カルシウム血症抑制剤は、非経口的に全身又は局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり5〜10000 mg/body、好ましくは50〜1000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。
【０１３２】
本発明のPTHrPに対する抗体又はヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び高カルシウム血症抑制剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
なお、本発明の抗体は、種々の癌（悪性腫瘍）によって誘発される高カルシウム血症に広く使用することができる。これらの癌種は特に限定されるものではなく、単一の癌のみならず複数の癌が併発したものも含まれる。癌種としては、例えば膵臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌又は悪性リンパ腫などが挙げられる。
【０１３４】
【実施例】
以下、参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
〔参考例１〕
抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃23-57-154 および＃23-57-137-1の作製は、佐藤幹二らによって行われた（Sato, K.et al., J.Bone Miner.Res.8,849-860,1993）。
【０１３５】
免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３４）（Peninsula 製）とキャリアータンパクであるサイログロブリンをカルボジイミド（Dojinn）を用いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μｇ/ml となるように調製した後、フロイントアジュバント（Difco）と１:１で混合し、エマルジョン作製後、16匹の雌性BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり100 μｇを11回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
【０１３６】
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清と125I標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリアータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）を動物あたり50μｇを最終免疫した。
【０１３７】
最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3x63Ag8U.1 を、50％ポリエチレングリコール4000を用いる常法にしたがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×104／ウェルの細胞数で85枚の96穴プレートに蒔き込んだ。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。
【０１３８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡＴ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩＡ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択することにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハイブリドーマを回収し、15％ＦＣＳを含むRPMI-1640 培地にＯＰＩ-supplement(Sigma)を添加した培地に懸濁し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施した。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン＃23-57-154 および＃23-57-137-1 を得た。
【０１３９】
なお、ハイブリドーマクローン＃23-57-137-1 は、mouse-mouse hybridoma ＃23-57-137-1 として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１４０】
〔実施例１〕ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体＃23-57-137-1 の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングした。
(1) ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ＃23-57-137-1 からのｍＲＮＡをQuick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech社) を用いて調製した。ハイブリドーマ＃23-57-137-1 の細胞を抽出バッファーで完全にホモジナイズし、キット添付の処方に従い、オリゴ(dT)-セルローススパンカラム(Oligo(dT)-Cellulose Spun Column) にてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出バッファーに溶解した。
【０１４１】
(2) マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製および増幅
(i) ＃23-57-137-1 抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングは、5'-RACE 法（Frohman,M.A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.17, 2919-2932, 1989） により行った。5'-RACE 法には5'-Ampli FINDER RACE kit(CLONETECH社) を用い、操作はキット添付の処方にしたがって行った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー10pmole を加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
【０１４２】
６Ｎ NaOH でＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応することにより、合成したｃＤＮＡの５’末端にAmpli FINDER Anchor(配列番号42) を連結した。これを鋳型としてＰＣＲにより増幅するためのプライマーとしてAnchorプライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（S.T.Jones,et al.,Biotechnology,9,88,1991） を使用した。
【０１４３】
ＰＣＲ溶液は、その50μｌ中に10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、1.5 mM MgCl2、2.5 ユニットのTaKaRa Taq（宝酒造）、10pmole のAnchorプライマー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びAmpli FINDER Anchor を連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはThermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer)を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１４４】
(ii)＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングは、5'-RACE 法（Frohman,M.A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ; Belyavsky,A. et al., Nucleic Acids Res.17, 2919-2932, 1989）により行った。5'-RACE 法には５'-Ampli Finder RACE Kit(Clonetech)を用い、操作は添付の処方に従った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、oligo-dTプライマーを用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてoligo-dTプライマーを加え、逆転写酵素と52℃、30分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。６N NaOHでＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。合成したｃＤＮＡの５’末端に前記Ampli FINDER Anchor をＴ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応させることにより連結した。
【０１４５】
マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からＰＣＲプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、394 DNA/RNA シンセサイザー(ABI社)を用いて合成した。ＰＣＲ溶液は、その100 μｌ中に10 mM Tris-HCl（pH８．３）、50mM KCl、0.25mM ｄＮＴＰｓ（dATP, dGTP，dCTP，dTTP）、1.5Mm MgCl2 、2.5 ユニットの AmpliTaq（PERKIN ELMER）、50pmole のAnchorプライマー（配列番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびAmpli FINDER Anchor を連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはThermal Cycler Model 480J （Perkin Elmer）を用い、94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで３５回行った。
【０１４６】
(3) ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域として約550bp 長、Ｌ鎖Ｖ領域として約550bp 長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＸｍａＩ（New England Biolabs）により37℃で１時間消化し、次いで制限酵素EcoRI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
こうして、５’−末端にEcoRI 認識配列を有し、３’−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを得た。
【０１４７】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡおよびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むEcoRI-XmaIＤＮＡ断片と、EcoRI 及びXmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターとを、ＤＮＡライゲーションキットver.2 （宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で１時間反応させ連結した。次に10μｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）100 μｌに加え、この細胞を氷上で15分間、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。次いで300 μｌのＳＯＣ培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を加えて37℃にて30分間インキュベートした後、100 μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.1mM のIPTG、20μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地または２ｘＹＴ寒天培地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１４８】
この形質転換体を100 μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×ＹＴ培地２ｍｌで37℃にて一夜培養し、菌体画分からプラスミド抽出機PI-100Σ（クラボウ）又はQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
【０１４９】
(4) マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの塩基配列決定
前記プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット(Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer)) を用い、ＤＮＡシークエンサー373A (ABI 社Perkin-Elmer)により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4 （宝酒造）（配列番号５）及びM13 Primer RV （宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０１５０】
こうして得られたハイブリドーマ＃23-57-137-1 に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するプラスミドをMBC1H04 、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するプラスミドをMBC1L24 と命名した。プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 に含まれるマウス＃23-57-137-1 抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号57、65に示す。Ｈ鎖Ｖ領域を含むポリペプチド及びＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドは、いずれも、それぞれ配列番号57、65で表される塩基配列の第58番目（グルタミンをコードする）から開始されている。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域含むポリペプチドについては配列番号46、Ｌ鎖Ｖ領域含むポリペプチドについては配列番号45に示す。
【０１５１】
なお、前記プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 を有する大腸菌は、Escherichia coli JM109（MBC1H04 ）およびEscherichia coli JM109（MBC1L24 ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Escherichia coli JM109 (MBC1H04)についてはFERM BP-5628、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)についてはFERM BP-5627としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０１５２】
(5) ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体＃23-57-137-1 のＣＤＲの決定
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983） 。
【０１５３】
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をKabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表２に示すごとく決定した。
なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号59〜61に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号62〜64に示した。
【０１５４】
【表２】
0004078164.tif 000003
【０１５５】
〔実施例２〕キメラ抗体の構築
(1) キメラ抗体Ｈ鎖の構築
(i) Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡを含む発現ベクターに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つKozak コンセンサス配列（Kozak, M. et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950,1987）及び制限酵素Hind IIIの認識配列を有するように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素BamHIの認識配列を有するように設計した。ＰＣＲは、TaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして0.07μｇのプラスミドMBC1H04 、プライマーとしてMBC1-aおよびMBC1-S1 をそれぞれ50pmole 、2.5UのTaKaRa Ex Taq 、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層し、94℃にて１分間、55℃にて１分間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％NuSieve GTGアガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１５６】
437bp 長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素BamHI、Hind III（宝酒造）により37℃１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
【０１５７】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むHind III-BamHIＤＮＡ断片をHind IIIおよびBamHIで消化することにより調製したpUC19ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するためプライマーM13 Primer M4 およびM13 Primer RV をプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット(Perkin-Elmer)を用い、ＤＮＡシークエンサー373A (Perkin-Elmer) により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃23-57-137-1 に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有し、５’−側にHind III認識配列及びKozak 配列、３’−側にBamHI認識配列を持つプラスミドをMBC1H/pUC19 と命名した。
【０１５８】
(ii)ｃＤＮＡタイプのマウス−ヒトキメラＨ鎖を作製するためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲ法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域を修飾するための後方プライマーMBC1HVS2（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且つKozak コンセンサス配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.,196,947-950,1987）並びにHind IIIおよびEcoRI 認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域を修飾するための前方プライマーMBC1HVR2（配列番号10）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５’−側の配列をコードしＡpaＩおよびSmaI認識配列を有するように設計した。
【０１５９】
ＰＣＲはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして0.6 μｇのプラスミドMBC1H/pUC19 、プライマーとしてMBC1HVS2およびMBC1HVR2をそれぞれ50pmole 、TaKaRa Ex Taq を2.5U、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で、添付の緩衝液を使用して、50μｌの鉱油を上層して94℃１分間、55℃１分間、72℃１分間の温度サイクルで30回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を１％Sea Kem GTG アガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。456bp 長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿させた後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。
【０１６０】
得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素EcoRI およびSmaI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むEcoRI-SmaIＤＮＡ断片を、EcoRI およびSmaIで消化することにより調製したpUC19 ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライマーM13 Primer M4 及びM13 Primer RVをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット(Perkin-Elmer)を用い、ＤＮＡシークエンサー373A(Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃23-57-137-1 に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有し、５’−側にEcoRI およびHind III認識配列及びKozak 配列、３’−側にＡpaＩおよびSmaI認識配列を持つプラスミドをMBC1Hv/pUC19と命名した。
【０１６１】
(iii) キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡは、以下のようにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムＤＮＡ（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）をコードする発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM-1-f（WO92/19759参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡおよびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードする発現ベクターRV1-PM1a（WO92/19759参照）とを導入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、pUC19 のHind IIIとBamHI部位にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをpRVh-PM1f-ｃＤＮＡと命名した。
【０１６２】
DHFR-△E-RVh-PM-1-f上のＳＶ４０プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるHind III部位、およびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域との間にあるEcoRI 部位を欠失した発現ベクターを作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡの発現ベクターの構築のために使用した。
【０１６３】
pRVh-PM1f-ｃＤＮＡをBamHIで消化した後、Klenowフラグメントで平滑化し、さらにHind IIIで消化し、Hind III-BamHI平滑化断片を調製した。このHind III-BamHI平滑化断片を、上記のHind III部位およびEcoRI 部位が欠失したDHFR-△E-RVh-PM1-f をHind IIIおよびSmaIで消化することにより調製した発現ベクターに連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃＤＮＡを構築した。
【０１６４】
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターRVh-PM1f−ｃＤＮＡをApaIおよびBamHIで消化した後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ApaIおよびBamHIで消化することにより調製したMBC1Hv/pUC19に導入した。こうして作製したプラスミドをMBC1HcDNA ／pUC19 と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含み、５'-末端にEcoRI およびHind III認識配列、３'-末端にBamHI認識配列を持つ。
【０１６５】
プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現ベクターｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。なお、発現ベクターｐＣＯＳ１は、HEF-PMh-gγ1（WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１６６】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体Ｈ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、EcoRI およびBamHIで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMBC1HcDNA/pCHO1 と命名した。なお、発現ベクターｐＣＨＯ１は、DHFR-△E-rvH-PM1-f （WO92/19759参照）から、EcoRI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。
【０１６７】
(2) ヒトＬ鎖定常領域の構築
(i) クローニングベクターの作製
ヒトＬ鎖定常領域を含むpUC19 ベクターを構築するために、Hind III部位欠失pUC19 ベクターを作製した。pUC19 ベクター２μｇを20mM Tris-HCl（pH8.5 ）、10mM MgCl2、１mM DTT、100 mM KCl、８Ｕの Hind III （宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
【０１６８】
回収したＤＮＡを50mM Tris-HCl （pH7.5）、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP、６ＵのKlenowフラグメント（GIBCO BRL）を含有する50μｌの反応混合液中で室温にて20分間反応させ、末端を平滑化させた。反応混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ベクターＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
【０１６９】
回収したベクターＤＮＡを50mM Tris-HCl （pH7.6）、10mM MgCl2 、１mM ATP、１mM DTT、５％(v/v) ポリエチレングリコール-8000、0.5 ＵのT4 DNAリガーゼ（GIBCO BRL）を含有する反応混合液10μｌ中で16℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌを大腸菌JM109 コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μｌに加え、氷上で30分間静置した後、42℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地500μｌを加えて、37℃で１時間インキュベーションした後、X-gal とIPTGを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（50μｇ/ml アンピシリン含有）（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にまき、３７℃で一夜培養して形質転換体を得た。
【０１７０】
形質転換体を、50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地20mlで37℃一夜培養し、菌体画分からPlasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付の処方に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドをHind IIIで消化し、HindIII部位が欠失していることを確認したプラスミドをpUC19 ΔHind IIIと命名した。
【０１７１】
(ii)ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードするＤＮＡの構築
ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ＋、Ｍｃｇ−  Ｋｅ＋  Ｏｚ−  の少なくとも４種類のアイソタイプが知られている（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987）。＃23-57-137-1 マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−（accession No. X57819）（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987）のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示し、＃23-57-137-1 マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で64.4％、塩基配列で73.4％であった。
【０１７２】
そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの構築を、ＰＣＲ法を用いて行った。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA シンセサイザー(ABI社)を用いて行った。HLAMB1（配列番号11）およびHLAMB3（配列番号13）はセンスＤＮＡ配列を有し、HLAMB2（配列番号１２）およびHLAMB4（配列番号１４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に20から23bpの相補的配列を有する。
【０１７３】
外部プライマーHLAMBS（配列番号15）、HLAMBR（配列番号16）はHLAMB1、HLAMB4とそれぞれ相同な配列を有しており、またHLAMBSはEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、HLAMBRはEcoRI 認識配列をそれぞれ含んでいる。第一ＰＣＲでHLAMB1-HLAMB2 とHLAMB3-HLAMB4 の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
【０１７４】
ＰＣＲはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を使い、添付の処方に従って行った。第一ＰＣＲでは、５pmole のHLAMB1および 0.5pmole のHLAMB2と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液、あるいは0.5pmoleのHLAMB3および５pmole のHLAMB4と５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。第二ＰＣＲは、反応液を50μｌずつ混合し、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。第三ＰＣＲは、反応液に外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを各50pmole ずつ添加し、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１７５】
第三ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲル（NuSieve GTG Agarose, FMC）で電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用い、添付の処方に従ってゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片を50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、 100mM NaCl 、８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１７６】
プラスミドpUC19 ΔHind III 0.8μｇを同様にEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。消化したプラスミドpUC19 ΔHind IIIを50 mM Tris-HCl（pH9.0）、１mM MgCl2、アルカリホスファターゼ(E.coli C75,宝酒造)を含有する反応混合液50μｌ中で37℃、30分間反応させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１７７】
上記のＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind III１μｌと先のＰＣＲ産物４μｌとを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌JM109 コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid
Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１７８】
上記プラスミドについて、クローニングされたＤＮＡの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定には373A DNAシークエンサー(ABI社) を用い、プライマーにはM13 プライマー M4 およびM13 プライマーRV（宝酒造）を用いた。その結果、クローニングされたＤＮＡの内部に12bpの欠失があることが判明した。このＤＮＡを含むプラスミドをＣλΔ／pUC19 と命名した。そこで、その部分を補うためのプライマーHCLMS （配列番号17）、 HCLMR（配列番号18）を新たに合成し、ＰＣＲで再度正しいＤＮＡの構築を行った。
【０１７９】
第一ＰＣＲで欠失ＤＮＡを含むプラスミドＣλΔ／pUC19 を鋳型とし、プライマーHLAMBSとHCLMR 、HCLMS とHLAMB4で反応を行った。ＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSおよびHLAMB4を添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
【０１８０】
第一ＰＣＲでは、鋳型としてＣλΔ／pUC19 0.1μｇ、プライマーHLAMBSおよびHCLMR 各50pmole 、あるいはHCLMS およびHLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。
【０１８１】
ＰＣＲ産物HLAMBS-HCLMR(236bp) 、HCLMS-HLAMB4(147bp) をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。第二ＰＣＲでは精製ＤＮＡ断片各40ng、１ＵのTaKaRa Ex Taq（宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液を用い、25μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルを５回行った。
【０１８２】
第三ＰＣＲでは、第二ＰＣＲ反応液２μｌ、外部プライマーHLAMBS、HLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲは、94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。第三ＰＣＲ産物である357bp のＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８３】
得られたＤＮＡ断片0.1μｇをEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミド pUC19ΔHind IIIにサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドについて塩基配列をM13 プライマー M4 、M13 プライマーRV（宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー（ABI社）にて決定した。欠失のない正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／pUC19 とした。
【０１８４】
(iii) ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードするＤＮＡの構築
プラスミドHEF-PM1k-gk （WO92/19759）からＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。394 DNA/RNA シンセサイザー(ABI社)を用いて合成した前方プライマーHKAPS （配列番号19）はEcoRI 、Hind III、BlnI認識配列を、後方プライマーHKAPA （配列番号20）はEcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１８５】
鋳型となるプラスミドHEF-PM1k-gk 0.1 μｇ、プライマーHKAPS 、HKAPA 各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層した。94℃にて１分間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の反応を30サイクル行った。360bp のＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。
【０１８６】
得られたＤＮＡ断片をEcoRI で消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19ΔHind IIIにクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドの塩基配列をM13 プライマー M4 、M13 プライマー RV （宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社)にて決定した。正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣκ／pUC19 とした。
【０１８７】
(3) キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
キメラ＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 のヒト抗体定常領域の直前にあるHind III、BlnI部位に、＃23-57-137-1 Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを連結することによって、それぞれキメラ＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびＬ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするＤＮＡを含むpUC19 ベクターを作製した。EcoRI 消化によってキメラ抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡを切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。
【０１８８】
すなわち、プラスミドMBC1L24 から＃23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA シンセサイザー（ABI社）を用いて行った。後方プライマーMBCCHL1（配列番号２１）はHind III認識配列とKozak 配列（Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.196,947-950,1987）を、前方プライマーMBCCHL3 （配列番号２２）はBglII 、EcoRI 認識配列を有するように設計した。
【０１８９】
ＰＣＲは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.2mM ｄＮＴＰ、0.1 μｇのMBC1L24 、プライマーとしてMBCCHL1 およびMBCCHL3 を各50pmole、１μｌの AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する100μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイクルで30回行った。
【０１９０】
444bp のＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEAN II kit(BIO101)を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。ＰＣＲ産物１μｌをそれぞれ10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、１mM DTT、50mM NaCl、８ＵのHind III（宝酒造）および８ＵのEcoRI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl（pH7.4）、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解した。
【０１９１】
プラスミドpUC19 １μｇを同様にHind IIIおよびEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスファターゼ(E.coli C75 ，宝酒造)でＢＡＰ処理した。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１９２】
ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 １μｌと先のＰＣＲ産物４μｌをDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。これを、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換体を、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで37℃で一夜培養した。菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラスミドをCHL/pUC19 とした。
【０１９３】
プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 各１μｇをそれぞれ20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl、８Ｕの Hind III（宝酒造）および２ＵのBlnI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、37℃で30分間ＢＡＰ処理を行った。反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１９４】
＃23-57-137-1 Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むプラスミドCHL/pUC19 から８μｇを同様にHind IIIおよびBlnIで消化した。得られた409bp のＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl（pH7.4）、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１９５】
このＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ４μｌを、ＢＡＰ処理したプラスミドＣλ／pUC19 またはＣκ／pUC19 各１μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドMBC1L(λ)/pUC19 、MBC1L(κ)/pUC19 とした。
プラスミドMBC1L(λ)/pUC19 およびMBC1L(κ)/pUC19 をそれぞれEcoRI で消化し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、743bp のＤＮＡ断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１９６】
発現ベクターとしてプラスミドHEF-PM1k-gk 2.7 μｇをEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。回収したＤＮＡ断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロースゲルで電気泳動し、6561bpのＤＮＡ断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。
【０１９７】
ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドMBC1L(λ) またはMBC1L(κ) EcoRI 断片各３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50μｇ/ml アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
【０１９８】
精製したプラスミドを、20mM Tris-HCl (pH8.5) 、10mM MgCl2、１mM DTT、100mM KCl 、８ＵのHind III（宝酒造）および２ＵのPvuI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば5104/2195bp 、逆方向に挿入されていれば4378/2926bp の消化断片が生じることより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれMBC1L(λ)/neo 、MBC1L(κ)/neo とした。
【０１９９】
(4) ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとの組み合わせでGene Pulser 装置（Bio Rad ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞0.8mlに、各プラスミドＤＮＡ10μｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Low IgG ウシ胎児血清（GIBCO）を含有するＤＭＥＭ培地（GIBCO）に懸濁し、10ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。72時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ELISA の試料に供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、AffiGel Protein A MAPSIIキット（BioRad）を用いてキット添付の処方に従って行った。
【０２００】
(5) ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのELISA プレートを次のようにして調製した。ELISA 用96穴プレート（Maxisorp, NUNC）の各穴を、固相化バッファー（0.1M NaHCO３、0.02％ NaN３）で１μg/mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（TAGO）100μlで固相化し、200μl の希釈バッファー（50mM Tris-HCl、１mM MgCl2、0.1M NaCl、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.2）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（TAGO）100μl を加えた。１時間室温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で洗浄の後、１mg/ml の基質溶液（Sigma104、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA ）を加え、次に405nm での吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Hu IgG1λ Purified (The Binding Site)を用いた。
【０２０１】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用96穴プレートの各穴を、固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（1-34）（ペプチド研究所）100μｌで固相化した。200μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（TAGO）100 μｌを加えた。室温にてインキュベートし、PBS-Tween20 で洗浄の後、１mg/ml の基質溶液（Sigma104、ｐ−ニトロフェニルリン酸、SIGMA）を加え、次に405nm での吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad）で測定した。
【０２０２】
その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ（1-34） に対する結合能を有しており、クローニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示された（図４）。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ（1-34） に対する結合能は変化しないことから、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて構築した。
【０２０３】
(6) ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとの組み合わせで、Gene Pulser 装置（Bio Rad ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収してエレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞0.8ml に、各プラスミドＤＮＡ10μｇを加え、1,500Ｖ，25μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を10％ウシ胎児血清（GIBCO）を添加したＭＥＭ−α培地（GIBCO ）に懸濁し、３枚の96穴プレート（Falcon）を用いてＣＯ2インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、10％ウシ胎児血清（GIBCO）および500mg/mlのGENETICIN （G418Sulfate、GIBCO ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（GIBCO）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
【０２０４】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のUltra Law IgG ウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2 μｍのフィルター（Millipore ）により細胞破片を除去した。
ＣＨＯ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（PerSeptive Biosystems ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００（Millipore ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０２０５】
〔実施例３〕ヒト型化抗体の構築
(1) ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
(i) ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体S31679(NBRF-PDB、Cuisinier A.M.ら、Eur.J.Immunol.,23,110-118,1993)由来のＦＲを有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。
【０２０６】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、ゲルからの抽出はcrush andsoak法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にて行った。
【０２０７】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、crush and soak法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解した。ＰＣＲは、TaKaRa Ex Taq（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およびＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ並びに２．５ＵのTaKaRa Ex Taqを含む条件で、添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を４％Nu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２０８】
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０２０９】
（ii） ヒト型化Ｈ鎖ｃＤＮＡのためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡをＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードする配列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Kozak,M,ら、J.Mol.Biol.196,947-950,1987）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを修飾するための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２は、Ｊ領域の３’―側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つＣ領域の５’−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
【０２１０】
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、鋳型ＤＮＡとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘ  Ｔａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２１１】
４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物を、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有し、５’−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側にＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
【０２１２】
（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、Ｈ鎖Ｃ領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を回収し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするＤＮＡを含み、５'-末端にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３'-末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
【０２１３】
ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。
【０２１４】
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と命名した。
【０２１５】
（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築
(i) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み換えたＬ鎖をコードするＤＮＡを構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリッド抗体を作製した。
【０２１６】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とする）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行った。ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
【０２１７】
ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
【０２１８】
精製したプラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2及び１ｍＭＤＴＴ並びにＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）８Ｕ又はＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１-ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
【０２１９】
ヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１-ｃ２のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用いた。
【０２２０】
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＨｉｎｄＩＩＩ１６Ｕ，ＡｆｌＩＩ４Ｕを含有する反応混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ２'）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８ｂｐ（ｈａ１'，ｈｄ１'）のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
【０２２１】
ｈａ１'、ｈｄ１'断片をそれぞれｃ２'断片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。ｈａ１'、ｈｄ１'断片を含むプラスミドを、それぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９とした。
【０２２２】
得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのＤＮＡ断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
【０２２３】
各ＤＮＡ断片４μｌを前述のＢＡＰ処理したＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
【０２２４】
精製した各プラスミドを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。これらを、それぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。
【０２２５】
(ii)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作製
ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することによって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作製した。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で、３７℃にて１時間消化した。次に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ６Ｕを含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０２２６】
反応液を１．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）の各ＤＮＡ断片を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液４０μｌに溶解した。
【０２２７】
ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製した各プラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ及びＡｐａＩ（宝酒造）８ＵまたはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
【０２２８】
各断片が正しく連結されていれば、ＡｐａＩで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ（ｍ１-ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６／４９８ｂｐ（ｈｍ１-ｍ２）の消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
ヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。
【０２２９】
（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（GEN-BANK、Deftos Mら,Scand.J.Immunol.,39,95-103,1994）由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ４を有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。
【０２３０】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジーを有する。
【０２３１】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、ゲルからの抽出はcrush and soak法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
【０２３２】
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、crush and soak法にてゲルから回収し、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ溶液に溶解した。
【０２３３】
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ並びに２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを含む条件で、添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２３４】
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３５）を設計し、合成した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２３５】
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０２３６】
Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４プライマー及びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたので、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮＡをプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン"ａ"の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号66に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号47に示す。
【０２３７】
バージョン"ｂ"をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｂ"では４３位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１により、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２３８】
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含む断片をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
【０２３９】
バージョン"ｃ"をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン"ｃ"では８４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。 塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
【０２４０】
バージョン"ｄ" 、"ｅ" 及び"ｆ" をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｂ" 、"ｃ" バージョンの９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ-Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。
【０２４１】
こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
【０２４２】
バージョン"ｇ" 及び"ｈ" をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ" 、"ｄ" バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４をプライマーとして用いて、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩでＩ消化し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＣＯＳ１およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
【０２４３】
バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｋ" 、"ｌ" 、"ｍ" 、"ｎ" および"ｏ" をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、"ｍ" および"ｏ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号67、68、69、70に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号48、49、50、51に示す。
【０２４４】
バージョン"ｐ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" および"ｔ" は、バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" または"ｏ" のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョン"ｈ" を、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"または"ｏ" とつなぎ換えることにより作製したものである。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定を行い、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" および"ｏ" の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ"ｐ" 、"ｑ" 、"ｓ" 、"ｒ" および"ｔ" とし、得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" および"ｔ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号71、72、73、74に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号52、53、54、55に示す。
【０２４５】
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９と命名した。
ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表３に示す。
【０２４６】
【表３】
0004078164.tif 000004
【０２４７】
表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋはリジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシンを示す。
【０２４８】
なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を有する大腸菌は、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）および Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【０２４９】
（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ハイブリッド抗体およびヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、またはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×107細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａＬｏｗＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
【０２５０】
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗体またはヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従って行った。
【０２５１】
（６）ＥＬＩＳＡ
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、０．０２％ ＮａＮ3 ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ ＮａＮ3 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。
【０２５２】
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ―７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０２５３】
（７） 活性確認
(i) ヒト型化Ｈ鎖の評価
ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であった（図５）。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバージョン”ａ”で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。
【０２５４】
(ii)ハイブリッド抗体の活性
(ii-a) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した（図６）。これらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２５５】
(ii-b) ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した（図７）。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
【０２５６】
(iii) ヒト型化抗体の活性
Ｌ鎖としてバージョン"ａ" から"ｔ" の各々一つを用いたヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。その結果、Ｌ鎖バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、" ｍ"、"ｏ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" 、"ｔ" を有するヒト型化抗体はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した（図８〜11）。
【０２５７】
（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／ｐＣＯＳ１、またはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１、あるいはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／ｐＣＯＳ１との組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、エレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ―α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含のＭＥＭ―α選択培地（ＧＩＢＣＯ）に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。
【０２５８】
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａＬｏｗＩｇＧウシ胎児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレオシド不含のＭＥＭ―α選択培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞破片を除去した。 ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
【０２５９】
〔実施例４〕中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ2 インキュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を９６穴プレートに１０4 細胞／１００μｌ／穴で蒔込み、１日間培養し、４ｍＭのヒドロコルチゾンと１０％牛胎児血清を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌのＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１ｍＭのイソブチル-1-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ'ｓＦ-１２を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。
【０２６０】
中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）との混合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は、上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の濃度は、１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）付属のＥＩＡバッファー１２０μｌを添加してｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バージョン”ｑ”がもっとも強い中和能を示した（図12〜14）。
【０２６１】
〔実施例５〕高カルシウム血症モデル動物での薬効試験(1)
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデル動物を用いて、ＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体およびＬ鎖バージョン”ｍ”、”ｒ”および”ｑ”を有するヒト型化抗体について高カルシウム血症に対する治療効果を検討した。
【０２６２】
高カルシウム血症モデル動物としてヒト膵臓癌ＰＡＮ−７（（財）実験動物中央研究所より購入）移植ヌードマウスを用いた。ヒト膵臓癌ＰＡＮ−７を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血症を発症する。高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、キメラ抗体およびヒト型化抗体が、ヒト膵臓癌ＰＡＮ−７によって引き起こされる高カルシウム血症を改善することを、体重および血中カルシウム濃度を指標にして評価した。
【０２６３】
ヒト膵臓癌ＰＡＮ−７の継代は、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本チャールズリバー）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで行った。薬効評価には、５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本チャールズリバー）を購入し、１週間の馴化の後、６週齢の動物を使用した。高カルシウム血症モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト膵臓癌ＰＡＮ−７を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、２ないし３週間して腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、高カルシウム血症モデル動物とした。
【０２６４】
高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹あたり１０μｇまたは３０μｇのＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体またはＬ鎖バージョンｍ、ｒを有するヒト型化抗体を尾静脈内に単回投与した。Ｌ鎖バージョン”ｑ”を有するヒト型化抗体は、マウス１匹あたり２０μｇまたは６０μｇを尾静脈内に単回投与した。キメラ抗体およびヒト型化抗体投与後、１日、４日、７日、１１日目に血中カルシウム濃度および体重を測定し、各抗体の薬効評価を行った。腫瘍体積は、腫瘍の長径（ａｍｍ）および短径（ｂｍｍ）を測定し、ギャランの計算式ａｂ2／２により腫瘍体積として算出した。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、６４３自動Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
【０２６５】
その結果、キメラ抗体およびＬ鎖バージョン”ｍ”、”ｒ”および”ｑ”を有するヒト型化抗体を投与することにより、体重および血中カルシウム濃度の速やかな改善および持続性が認められた。このことから、本発明のキメラ抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症治療薬としての有用性が示された（図15〜16）。
【０２６６】
〔実施例６〕高カルシウム血症モデル動物での薬効試験(2)
ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデル動物を用いて、ＰＴＨｒＰに対するキメラ抗体およびＬ鎖バージョン”ｑ”を有するヒト型化抗体について、高カルシウム血症に対する治療効果を検討した。
高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは30μgのPTHrP に対するキメラ抗体またはL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体を尾静脈内に単回投与した。キメラ抗体およびヒト型化抗体投与後、１日、３日、７日、10日目に血中カルシウム濃度および体重を測定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca++／pHアナライザー（CIBA-CORNING） を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
【０２６７】
その結果、ヒト膵臓癌PAN-7移植高カルシウム血症モデルにおいて、キメラ抗体およびL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体を投与することにより、体重および血中カルシウム濃度の速やかな改善および待続性が認められた。このことから、本発明のキメラ抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症治療薬としての有用性が示された（図17）。
【０２６８】
〔実施例７〕高カルシウム血症モデル動物での薬効試験(3)
ヒト腫瘍-ヌードマウス移植系の高カルシウム血症モデル動物（ヒト肺癌LC-6移植高カルシウム血症モデル）を用いて、PTHrP に対するキメラ抗体およびL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体について高カルシウム血症に対する治療効果を検討した。
高カルシウム血症モデル動物としてヒト肺癌LC-6（（財）実験動物中央研究所より購入）移植ヌードマウスを用いた。ヒト肺癌LC-6を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血症を発症する。
【０２６９】
高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、キメラ抗体およびヒト型化抗体が、ヒト肺癌LC-6によって引き起こされる高カルシウム血症を改善することを、体重および血中カルシウム濃度を指標にして評価した。
ヒト肺癌LC-6の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本チャールズリバー）を用いてin vivo で行った。薬効評価には、５週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本チャールズリバー）を購入し、１週間の馴化の後、６週齢の動物を使用した。
【０２７０】
高カルシウム血症モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト肺癌LC-6を摘出し、3mm 角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、２ないし３週間して腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、高カルシウム血症モデル動物とした。
【０２７１】
高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹あたり10μgまたは30μgのPTHrP に対するキメラ抗体またはL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体を尾静脈内に単回投与した。キメラ抗体およびヒト型化抗体投与後、１日、３日、６日、10日目に血中カルシウム濃度および体重を測定し、各抗体の薬効評価を行った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、643自動Ca++/pH アナライザー（CIBA-CORNING）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
【０２７２】
その結果、ヒト肺癌LC-6移植高カルシウム血症モデルにおいて、キメラ抗体およびL鎖バージョン”q”を有するヒト型化抗体を投与することにより、体重および血中カルシウム濃度の速やかな改善および持続性が認められた。このことから、本発明のキメラ抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症治療薬としての有用性が示された（図18）。
【０２７３】
〔実施例８〕BIACORE を用いたPTHrPと抗PTHrP抗体の相互作用における速度論的解析
BIACORE を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。抗原としてPTHrP(1-34+Cys) を用い、Ｃ末端部位特異的にセンサーチップ上に固定化し、種々の濃度に調製した精製抗体をアナライトとした。得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーター（結合速度定数kass及び解離速度定数kdiss）を算出した。速度論的解析に関して、文献「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system 」(Karlsson,R. et al.,(1991) J.Immunol.Methods 145,p229-240.) を参考にした。
【０２７４】
(1) センサーチツプヘのPTHrP（1-34＋C）の固定化
センサーチップ CM5(Pharmacia)へPTHrP（1-34＋C）を固定化する。
ランニングバッファーとしてHBS(10mM HEPES pH7.4，0.15M NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005％ Surfactant P20)を用い、流速は５μl/分とした。センサーチップCM5上のカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を100 μl の0.05M N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)/0.2M塩酸 N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC) のインジェクトおよび100 μl の80mM塩酸 2-(2-ピリジニルジチオ) エタンアミン(PDEA)/0.1M ホウ酸緩衝液 pH8.5のインジェクトにより活性化した。引き続き、10μl の5 μg/ml PTHrP（1-34＋C）/ 10mM酢酸ナトリウム緩衝液 pH5.0をインジェクトし、PTHrP(1-34＋C)のC末端のCys残基特異的に固定化した。さらに、100 μl の50mM (L)-システイン/1M NaCl/0.1M 蟻酸ナトリウム緩衝液 pH4.3をインジェクトすることにより、過剰の活性基をブロックした。さらに、10μl の0.1Mグリシン-塩酸緩衝液 pH2.5および10μl の10mM塩酸をインジェクトすることにより、非共有結合をしている物質を洗浄した。このときのPTHrP(1-34＋C)の固定量は、226.4 RU(resonance units) であった（図１９）。
【０２７５】
(2) 固定化PTHrP(1-34＋C)とマウス抗PTHrP精製抗体との相互作用
ランニングバッファーとしてHBSを用い、流速は20μl/分とした。抗体は、ハイブリドーマ細胞をBalb/cマウスに腹水化し、採取した腹水をプロテインA カラムを用いて精製した。精製した#23-57-137-1抗体をMBC、精製した3F5 抗体を3F5と表記した。これらの抗体を、HBSを用いて1.25、2.5 、5 、10、20μg/mlの濃度に調製した。
分析は、抗体溶液の40μl をインジェクトする2分間を結合相とし、その後HBSに切り換え、２分間の解離相とした。解離相終了後、10μl の10mM塩酸をインジェクトすることにより、センサーチツプを再生した。この結合・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液をインジェクトし、センサーグラムを得た。
【０２７６】
(3) 固定化PTHrP(1-34＋C)とヒト型化抗PTHrP 精製抗体との相互作用
ランニングバッファーとしてHBSを用い、流速は20μl/分とした。抗体は、CHO細胞に産生させ、プロテインA カラムを用いて精製した。精製したキメラ抗体をchMBC、精製したヒト型化抗体バージョンm をhMBCm、バージョンq をhMBCqと表記した。これらの抗体を、HBSを用いて1.25、2.5 、5 、10、20μg/mlの濃度に調製した。
分析は、抗体溶液の40μl をインジェクトする2分間を結合相とし、その後HBSに切り換え、2分間の解離相とした。解離相終了後、10μl の10mM HClをインジェクトすることにより、センサーチツプを再生した。この結合・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液をインジェクトし、センサーグラムを得た。
【０２７７】
(4) 相互作用の速度論的解析
目的のデータファイルを読み込み、目的の反応領域について重ね書きによる反応パターンの比較を行った（図２０〜２４）。さらに、カーブフィッティングによるカイネティクスパラメーター（結合速度定数kassおよび解離速度定数kdiss）の算定を行うBIACORE 専用の解析ソフトウエアである「BIAevaluation 2.1 」(Pharmacia) を用いて、相互作用の速度論的解析を行った（表４〜５）。
なお、図２０〜２４において、各曲線は、図の上方から下方に向かってそれぞれ1.25、2.5 、5 、10、20μg/mlの抗体濃度のものである。
【０２７８】
【表４】
0004078164.tif 000005
【０２７９】
【表５】
0004078164.tif 000006
【０２８０】
なお、結合速度定数を求める際には、解析モデルタイプ４を用いた（BIAevaluation 2.1 Software Handbook, A1〜A5）。
【０２８１】
〔実施例９〕悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルでのリン排泄抑制作用悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症（HHM）は腫瘍が産生するPTHrPがその原因物質であり、PTHrPは骨吸収および腎尿細管でのカルシウム再吸収を亢進し、高カルシウム血症を惹起することが知られている。一方、リンに関しては、PTHrPは腎尿細管において再吸収を抑制する結果、排泄促進作用を示し、臨床HHM患者においてしばしば低リン血症が認められる。そこで、ラット悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルを用いて、ヒト型化抗PTHrP抗体の腎におけるリン排泄に対する効果を検討した。
【０２８２】
モデル動物としてヒト肺癌株LC-6（（財）実験動物中央研究所より購入）を移植したヌードラットを用いた。ヒト肺癌株LC-6を皮下移植されたヌードラットは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血症症状を呈する。本モデルを用い、腎クリアランス法にてヒト型化抗PTHrP抗体の腎におけるリン排泄に対する効果をリン排泄率（後述）を指標に評価した。
ヒト肺癌株LC-6の継代は、BALB/c-nu/nuヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行った。薬効評価には、5週齢雄性F344/N Jcl-rnuヌードラット（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、6週齢の動物を使用した。
【０２８３】
悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの作製は、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト肺癌株LC-6腫瘍を摘出し、3mm角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、30日目前後に腫瘍体積が十分に大きくなった（3000mm3）のを確認した後、血中カルシウム濃度、体重を指標として悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデル動物とした。
腎クリアランス法によるリン排泄の検討は、以下のようにして行った。
【０２８４】
（1）腎クリアランス法
悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデル動物をペントバルビタール（ネンブタール、大日本製薬(株)）で麻酔し、37℃の保温マット上に背位固定し、採尿用に膀胱カニューレ（ポリエチレンチューブ、PE50、日本ベクトンディッキンソン）を挿入した。次に大腿静脈にインフュージョン用にカニューレ（ポリエチレンチューブ、PE10、日本ベクトンディッキンソン）を挿入し、インフュージョン溶液（組成： 0.7% イヌリン、 5% マンニトール、0.2%ペントバルビタール、0.9%塩化ナトリウム）をインフュージョンポンプ（テルフュージョンシリンジポンプ、STC-525、テルモ）にて流速2 ml/hrでインフュージョンした。50分間の平衡化の後、20分間間隔で5回（ピリオド-1からピリオド-5まで）の採尿を膀胱カニューレより行い、尿サンプルとした。また各採尿の中間点において，右頚静脈より血液サンプルをヘパリン処理した注射筒にて約0.25ml採取した。
【０２８５】
（2）抗体の投与
上記したクリアランス実験のピリオド-2の採尿開始時点で、ヒト型化抗PTHrP抗体を1mg/ml/kg 静脈内投与した。
（3）尿中および血中イヌリンおよびリン濃度測定
ピリオド-1からピリオド-5より得られた尿サンプルは尿量を測定後、イヌリンおよびリン濃度を測定した。また同様に得られた血液サンプルは冷却遠心分離後、血漿サンプルとしてイヌリンおよびリン濃度を測定した。イヌリン濃度はアンスロン-硫酸法（Roe,J.H.ら、J Biol Chem 178, 839-845, 1949）にて測定した。リン濃度は日立自動分析装置7170型にて無機リン測定用試薬、オートセラIP（第一化学薬品）を用いて、測定のマニュアル通りに測定した（フィスケ・サバロー法）。
【０２８６】
（4）イヌリンクリアランス、リンクリアランスおよびリン排泄率の算出
イヌリンクリアランス（inulin clearance、Cin）、リンクリアランス（phosphate clearance、Cp）およびリン排泄率（fractional excretion of phosphate、FEp）は以下の式により算出した。
【０２８７】
イヌリンクリアランス（inulin clearance、Cin）の算出
Cin = Uin V / Pin
Cinはイヌリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。Uinは尿中イヌリン濃度（mg/ml）を表す。Vは単位時間当たりの尿量（ml/kg/min）を表す。Pinは血中イヌリン濃度（mg/ml）を表す。
【０２８８】
リンクリアランス（phosphate clearance、Cp）の算出
Cp = Up V / Pp
Cpはリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。Up は尿中リン濃度（mg/ml）を表す。Vは単位時間当たりの尿量（ml/kg/min）を表す。Pp は血中リン濃度（mg/ml）を表す。
【０２８９】
リン排泄率（fractional excretion of phosphate、FEp）の算出
FEp = Cp / Cin
FEpはリン排泄率を表す。Cinはイヌリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。Cpはリンクリアランス（ml/kg/min）を表す。実験は4匹の動物を用いて行った。結果はその平均値±標準誤差で示す。
【０２９０】
リン排泄率および血中リン濃度の結果を図25および図26に示す。
図25はクリアランスの各ピリオド（１ピリオドは２０分間）と、腎からのリン排泄率（＝リンクリアランス／イヌリンクリアランス）との関係を示すグラフである。なお、ヒト型化抗PTHrP抗体、１mg/kg（i.v.）はピリオド-2のはじめに投与した。
【０２９１】
図26はクリアランスの各ピリオド（１ピリオドは２０分間）と、血漿中のリン濃度との関係を示すグラフである。ヒト型化抗PTHrP抗体、１mg/kg（i.v.）はピリオド-2のはじめに投与した。
以上の結果より、抗体投与前のリン排泄率(ピリオド-1)に対して、抗体投与後のリン排泄率（ピリオド-2からピリオド-5）は明らかな抑制を示した。すなわち、中和抗体を投与することで、リン排泄亢進（FEp>0.2）により低リン血症状態を呈する病態に対してリン再吸収を正常化レベル（リン再吸収率＝1-FEp＞0.8%）付近まで回復させ、その結果、血中リン濃度が正常化する傾向が示された。このように、PTHrPが原因で起こるリン排泄亢進や低リン血症などの治療薬として本抗体の有用性が示された。
【０２９２】
PTHrP は悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症の原因物質であるため、PTHrPによるリン排泄の増加や組織中高エネルギー有機リン酸濃度の低下が予想される。従って、低リン血症を伴う疾患、例えば低リン血性くる病、低リン血性ビタミンＤ抵抗性くる病などでは尿中へのリン排泄増加が主たる病因であり、本抗体にはこれら疾患の治療薬として有用である。
【０２９３】
〔実施例10〕悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症の臨床諸症状の改善
悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症は腫瘍が産生するＰＴＨｒＰがその原因物質であり、ＰＴＨｒＰは骨吸収および腎尿細管でのカルシウム再吸収を亢進し、高カルシウム血症を惹起することが知られている。また、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症では、Performance statusの悪化、意識障害、全身倦怠感、口渇感や悪心・嘔吐（食欲不振）などの臨床症状の悪化が認められる。これら臨床症状に対する抗ＰＴＨｒＰ抗体の効果をヒト腫瘍−ヌードマウス移植系およびヒト腫瘍−ヌードラット移植系の高カルシウム血症モデル動物を用いて検討した。
【０２９４】
高カルシウム血症モデル動物としてヒト肺癌ＬＣ−６（（財）実験動物中央研究所より購入）移植ヌードマウスおよびヌードラットを用いた。ヒト肺癌ＬＣ−６を移植されたヌードマウスおよびヌードラットは、腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、体温低下、体重減少や運動量の低下などの高カルシウム血症症状を発症する。
【０２９５】
悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症の一般臨床症状に対するマウス抗ＰＴＨｒＰ抗体の改善効果を、ヒト肺癌ＬＣ−６−ヌードマウス移植系を用いて写真で示した。また、運動量の改善、体温改善並びに摂食量低下の改善効果は、ヒト肺癌ＬＣ−６−ヌードラット移植系を用いて評価した。
【０２９６】
１．高カルシウム血症に伴う外観上の臨床症状の改善
ヒト肺癌ＬＣ−６の継代は、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本クレア）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで行った。薬効評価には、５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、６週齢の動物を使用した。
【０２９７】
高カルシウム血症モデル動物の作製および群分けは、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト肺癌ＬＣ−６を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、２７日目して腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、高カルシウム血症モデル動物とした。
【０２９８】
腫瘍体積は、腫瘍の長径（ａｍｍ）および短径（ｂｍｍ）を測定し、ギャランの計算式ａｂ2／２により腫瘍体積として算出した。
血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、６４３自動Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
【０２９９】
高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、以下のようにして行った。すなわち、上記で作製、群分けした高カルシウム血症モデル動物に、マウス１匹あたり１００μｇのＰＴＨｒＰに対するマウス抗体を、腫瘍移植後、２７、３０、３４、３７日目に尾静脈内に投与した。対照群には、リン酸緩衝生理食塩水を同様に尾静脈内に投与した。抗体投与群並びに対照群の中から典型的な１匹をそれぞれ選び、正常動物とともに、腫瘍移植４１日目に写真撮影を行った。
【０３００】
その結果、ヒト肺癌ＬＣ−６移植高カルシウム血症モデルにおいて、抗体投与動物（図27の中央及び図28の中央）は、対照動物（図27の右及び図28の右）と同程度の腫瘍塊を保持するにも関わらず正常動物（図27の左及び図28の左）と同等の外見を呈し、抗ＰＴＨｒＰ抗体投与により外見上の臨床症状の改善が認められた（図27及び28）。
【０３０１】
２．高カルシウム血症に伴う運動量低下の改善
ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代は、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（日本クレア）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで行った。薬効評価には、5週齢雄性Ｆ３４４／Ｎ Ｊｃｌ−ｒｎｕヌードラット（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、６週齢の動物を使用した。
【０３０２】
悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの作製は、以下のようにして行った。すなわち、継代しているヒト肺癌株ＬＣ−６を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に１匹あたり１個ずつ移植した。腫瘍塊移植後、３０日目前後に腫瘍体積が十分に大きくなったのを確認した後、血中カルシウム濃度、体重を指標として悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデル動物とした。
血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管で採血し、６４３自動Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
【０３０３】
（1）自発運動量測定法
自発運動量の測定は自発運動量測定装置アニメックス（ANIMEX activity meter type SE、FARAD Electronics、Sweden）を用いて、個体毎に個別飼育しているポリ製ケージ（給水、給餌下）を装置の所定の位置に置き行った。この装置はラットの運動量を計測するもので、一定時間当たりのカウントとして記録される。測定は午後７時から翌日午前８時までの１３時間行い、測定結果は１時間当たりのカウント数とした。
【０３０４】
（2）抗体の投与
上記したように高カルシウム血症を発症したラットを用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。また、対照には、生理食塩水を同様に尾静脈内に投与した。測定は抗体投与個体と対照個体を交互に測定した。測定日は抗体投与個体は抗体投与０（投与前日）、２、４、７、１４日目に、また対照個体は１、３、５、８、１５日目に行った。
その結果、対照個体の自発運動量は実験期間中変化がないかまたは減少傾向を示すのに対して、抗体投与個体は４日目以降自発運動量の増加が認められた（図29）。
【０３０５】
３．高カルシウム血症に伴う体温低下の改善
ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様に実施した。
（1）体温測定法
体温の測定はデジタル温度計を用い、個体はペントバルビタール（ネンブタール、大日本製薬（株））で麻酔し、温度センサープローブを直腸に挿入して行った。
【０３０６】
（2）抗体の投与
上記したように高カルシウム血症を発症したラットを用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を１ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。また、対照には、生理食塩水を同様に尾静脈内に投与した。さらに、正常ラット（無投与）の体温についても同時に測定した。体温測定は抗体投与個体、対照個体および正常ラットいずれも、投与０（投与当日）、１、２、３日目に行った。
【０３０７】
その結果、正常ラットの体温は実験期間中34.2〜34.4℃とほとんど変化なく推移した。悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症ラットでは、正常ラットに比べ、約2℃の体温の低下が認められた。このモデルにヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与すると、投与３日目で正常ラットの体温まで回復することが確認された。このように、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体は悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルでの体温低下に対して改善する作用を有することが示された（図30）。
【０３０８】
４．高カルシウム血症に伴う摂食量低下の改善
ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様に実施した。作製したモデルは血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、以下の実験に使用した。
（1）摂食量測定法
ラットは実験期間中、個別飼育用の代謝ケージに入れ、給水、給餌下で飼育した。摂食量は当日午前９時から翌日午前９時までの２４時間摂食量とし、給餌器の重量を測定し、予め測定した重量（風袋重量）との差をその個体の摂食量（ｇ）とした。
【０３０９】
（2）抗体の投与
上記したように高カルシウム血症を発症したラット（ＨＨＭラット）を用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。また、対照群には、生理食塩水を同様に静脈内に投与した。さらに、正常ラットについても生理食塩水を同様に尾静脈内に投与した。摂食量測定は、抗体投与群、対照群および正常ラット群のいずれも、投与０（投与前日から当日）、１（投与当日から翌日）、３（投与３日目から翌日）、５日目（投与５日目から翌日）に行った。
【０３１０】
その結果、投与前値の摂食量は高カルシウム血症ラット（個体５から９）では平均で８．１１ｇであり、正常ラットは平均１２．０６ｇであった。このように明らかに高カルシウム血症ラットでは摂食量の低下が認められた。このモデルにヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与すると、対照群ではあまり摂食量に変化がないのに比べ、抗体投与群では投与１日目以降正常ラットの摂食量まで回復することが確認された。このように、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体は悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルでの摂食量低下に対して改善する作用のあることが示された（表６）。
【０３１１】
【表６】
0004078164.tif 000007
【０３１２】
以上の結果より、本発明のキメラ抗体およびヒト型化抗体の悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の臨床諸症状の改善薬としての有用性が示された。
５．高カルシウム血症に伴う血液ｐＨの改善
ヒト肺癌株ＬＣ−６の継代および悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症モデルの作製は、上記２で示した方法と同様に実施した。作製したモデルは血中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、以下の実験に使用した。
（1）血液ｐＨ測定法
血液ｐＨは、ヘパリン処理した注射筒を用い、心臓採血法にて血液を採取し、６４３自動Ｃａ++／ｐＨアナライザー(CIBA-CORNING)を用いて血液ｐＨを測定した。
【０３１３】
（2）抗体の投与
上記したように高カルシウム血症を発症したラット（ＨＨＭラット）を用い、ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した(ｎ＝３)。また、対照群には、生理食塩水を同様に静脈内に投与した(ｎ＝２)。血液ｐＨ測定は、抗体投与群および対照群のいずれも、投与０（投与当日）、１、７日目に行った。結果は各群ともにその平均値で示した。
【０３１４】
その結果、高カルシウム血症ラットの抗体投与前の血液ｐＨは約7.49であり（正常ラットの血液ｐＨはｐＨ7.40±0.02）、本モデルは明らかに代謝性アルカローシスの病態を示していた。このモデルにヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与すると、対照群ではほとんど血液ｐＨの変化はないのに比べ、抗体投与群では投与7日目には正常ラットの血液ｐＨに近い値まで改善していることが確認された。悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症（ＨＨＭ）における臨床諸症状の一つに腎臓での重炭酸イオン（ＨＣＯ3-）の排泄阻害に基づく代謝性アルカローシスが報告されている。ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の投与は本モデルで血液ｐＨを正常化したことから、ＨＨＭで見られる代謝性アルカローシスを改善する作用を有することが示された(図31)。
以上の結果より、本発明のキメラ抗体及びヒト型化抗体は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の臨床諸症状を改善するための改善薬として有用であることが示された。
【０３１５】
【発明の効果】
本発明により、ＰＴＨｒＰに対する抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体が提供される。これらの抗体は、ヒトにおける抗原性が低いことから、高カルシウム血症、低リン血症等の治療薬として有用である。
【０３１６】
【配列表】
0004078164.tif 000008
【０３１７】
0004078164.tif 000009
【０３１８】
0004078164.tif 000010
【０３１９】
0004078164.tif 000011
【０３２０】
0004078164.tif 000012
【０３２１】
0004078164.tif 000013
【０３２２】
0004078164.tif 000014
【０３２３】
0004078164.tif 000015
【０３２４】
0004078164.tif 000016
【０３２５】
0004078164.tif 000017
【０３２６】
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【０３２７】
0004078164.tif 000019
【０３２８】
0004078164.tif 000020
【０３２９】
0004078164.tif 000021
【０３３０】
0004078164.tif 000022
【０３３１】
0004078164.tif 000023
【０３３２】
0004078164.tif 000024
【０３３３】
0004078164.tif 000025
【０３３４】
0004078164.tif 000026
【０３３５】
0004078164.tif 000027
【０３３６】
0004078164.tif 000028
【０３３７】
0004078164.tif 000029
【０３３８】
0004078164.tif 000030
【０３３９】
0004078164.tif 000031
【０３４０】
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【０３４１】
0004078164.tif 000033
【０３４２】
0004078164.tif 000034
【０３４３】
0004078164.tif 000035
【０３４４】
0004078164.tif 000036
【０３４５】
0004078164.tif 000037
【０３４６】
0004078164.tif 000038
【０３４７】
0004078164.tif 000039
【０３４８】
0004078164.tif 000040
【０３４９】
0004078164.tif 000041
【０３５０】
0004078164.tif 000042
【０３５１】
0004078164.tif 000043
【０３５２】
0004078164.tif 000044
【０３５３】
0004078164.tif 000045
【０３５４】
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【０３５５】
0004078164.tif 000047
【０３５６】
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【０３５７】
0004078164.tif 000049
【０３５８】
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【０３５９】
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【０３６０】
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【０３６１】
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【０３６２】
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【０３６３】
0004078164.tif 000055
【０３６４】
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【０３６５】
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【０３６６】
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【０３６７】
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【０３６８】
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【０３６９】
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【０３７０】
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【０３７１】
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【０３７２】
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【０３７３】
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【０３７４】
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【０３７５】
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【０３７６】
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【０３７７】
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【０３７８】
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【０３７９】
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【０３８０】
0004078164.tif 000074
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【０３８１】
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【０３８２】
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【０３８３】
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【０３８４】
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【０３８５】
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【０３８６】
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【０３８７】
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【０３８８】
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【０３８９】
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【０３９０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の抗体の模式図である
【図２】ＣＤＲ−グラフティングの概要を示す図である。
【図３】Ｖ領域のＦＲ及びＣＤＲの評価を示す図である。
【図４】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図５】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図６】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図７】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図８】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図９】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１０】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１１】抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【図１２】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１３】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１４】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。
【図１５】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明の抗体の効果を示す図である。
【図１６】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明の抗体の効果を示す図である。
【図１７】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明の抗体の効果を示す図である。
【図１８】高カルシウム血症モデル動物に対する本発明の抗体の効果を示す図である。
【図１９】センサーチップへのPTHrP の固定化のセンサーグラムを示す図である。
【図２０】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【図２１】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【図２２】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【図２３】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【図２４】本発明の抗体の速度論的解析結果を示す図である。
【図２５】本発明のヒト型化抗体についてリン排泄率に及ぼす影響を試験した結果を示す図である。
【図２６】本発明のヒト型化抗体について血漿中リン濃度濃度に及ぼす影響を試験した結果を示す図である。
【図２７】高カルシウム血症マウスに抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与した後の外見上の臨床諸症状を観察した結果を示す写真である(生物の形態)。
【図２８】高カルシウム血症マウスに抗ＰＴＨｒＰ抗体を投与した後の外見上の臨床諸症状を観察した結果を示す写真である(生物の形態)。
【図２９】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨｒＰ抗体投与後の自発運動量の経日変化を、対照群（生理食塩水投与）と比較した図である。
【図３０】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨｒＰ抗体投与後の体温の経日変化を、対照群（生理食塩水投与）と比較した図である。
【図３１】高カルシウム血症モデルを用いて、抗ＰＴＨｒＰ抗体投与後の血液ｐＨの経日変化を、対照群（生理食塩水投与）と比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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