(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの脂肪酸と共有結合して、高分子化および／または疎水化したε−ポリリジンを含有するワクチン用アジュバンド。
【請求項２】
脂肪酸がステアリン酸である、請求項１に記載のワクチン用アジュバンド。
【請求項３】
脂肪酸がリノール酸である、請求項１に記載のワクチン用アジュバンド。
【請求項４】
セルロースおよびカルボキシメチルセルロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの多糖と共有結合して、高分子化および／または疎水化したε−ポリリジンを含有するワクチン用アジュバンド。
【請求項５】
多糖がセルロースである、請求項４に記載のワクチン用アジュバンド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアジュバンドを含むワクチン。
【請求項７】
アジュバンドに用いるε−ポリリジンの遊離アミノ基と、カルボキシル基を活性エステル化したステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選ばれる脂肪酸をぺプチド結合させて、アジュバンドを高分子化および／または疎水化する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なワクチン用アジュバンドに関する。詳細には、抗原徐放剤、免疫賦活化剤としてε−ポリリジンを含むワクチン用アジュバンドおよびこれを用いたワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ワクチンには、生ワクチンと不活性化微生物またはその感染抗原を含む不活化ワクチンがある。不活化ワクチンの開発は生ワクチンよりも容易だが、ワクチン効果とその持続性に関して生ワクチンに劣ることが知られていた。そのため、種々のアジュバンドが開発されている。アジュバントは、抗原を不溶化することで組織の滞留時間を長くして抗原を徐々に遊離させる、抗原をマクロファージに貧食きれやすい状態にするおよび／または免疫細胞を非特異的に活性化するなどの効果を有する。
【０００３】
また、アジュバンドには、殺菌微生物またはその成分、例えばエンドトキシンなどなどのそれ自体が抗原性を有するもの、硫酸アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、動物油、植物油および鉱物油などの脂質、塩基性ポリマー並びに合成ポリマーのように非抗原性のものがある。例えば、予防接種に用いられるジフテリア・破傷風のトキソイドにはアルミニウム化合物のアジュバントが添加されており、このアジュバントの効果により、抗体の産生が数倍に増強される。また動物では、フロイントアジュバンド、特に完全フロイントアジュバンドとして、結核菌と界面活性剤と流動パラフィンの油中水エマルジョンに結核菌を添加したものが用いられている。
【０００４】
しかしながら、動物において慣用されるアルミニウム化合物や動植物油は、抗原の徐放性を有するが、免疫系を刺激する作用は弱い。鉱物油は、抗原の徐放性、免疫刺激性を有するが、その毒性が指摘されている。また、塩基性ポリマーなどは免疫刺激性に優れるが、価格が高い等の問題点を有する。特に、ヒトで使用しうるものは、水酸化アルミニウムのみであり、免疫系を刺激する作用が弱いために、抗体の産生が十分とは言えない。
【０００５】
このため、慢性疾患においてはワクチン接種により発症は予防できるが感染は阻止できないものが多い。この不顕性感染では、感染個体は病原体を保有し続け、場合により他の個体へ病原体を伝染させるキャリアとなる。また、不顕性感染でも個体の免疫力の低下により発症することがある。このため、抗原の徐放性、免疫刺激性に優れ、しかも低毒性であり且つ価格も安価で容易に入手しうるアジュバンドが求められている。
【０００６】
一方、ε−ポリリジンは放線菌に由来するものであり、その優れた抗菌作用と安全性のために食品保存料として広く利用されており、近年は食品以外への適用も増加している。また、ε−ポリリジンにはインターフェロン（ＩＦＮ）産生の増強効果等の免疫刺激作用があることは報告されている（中国農業試験場研究報告,１１,１−４５，１９９２）。またα−ポリ−Ｄ−リジンは、ＤＥＡＥ−デキストランよりも低毒性でしかもＩＦＮの産生を増強すると報告されており（American Society for Microbiology 19, 867-869, 1970）、ポリイノシン−ポリシチジル酸複合体とα−ポリ−Ｄ−リジンとの複合体を予め皮下注射したマウスはその後ヘルペスウイルスを注射しても致死率が著しく低かったとの報告がある（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140, 66-71, 1972）。このようにα−ポリリジンと塩基ポリマーとの複合体はＩＦＮの産生を増強するという報告あるが、ε−ポリリジンをワクチンのアジュバントとして使用することは知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、抗原の徐放性および免疫賦活化作用に優れ、且つ安全性が高くしかも容易に入手しうるアジュバンドを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ε−ポリリジンをワクチン用アジュバンドに含有させることにより、抗原の徐放性および免疫賦活化作用に優れ、且つ安全性が高いワクチン用アジュバンドが得られることを見出した。即ち、本発明は、ε−ポリリジンを含有することを特徴とするワクチン用アジュバンドに関する。ε−ポリリジンは、例えばα−ポリリジン等と比較してカチオン性が高いため、一般的に陰電荷である抗原をより強く吸着でき、このためＩＦＮ増強などの免疫賦活化作用に加えて、より長期にわたって抗原を担持できるという良好な抗原の徐放作用を有する。
【０００９】
本発明において、ε−ポリリジンは、その抗原保持能力（徐放性）および免疫賦活化作用のためにも少なくとも１０アミノ酸からなるものが好ましく、より好ましくは１５アミノ酸以上、さらに好ましくは２５アミノ酸以上からなるε−ポリリジンを用いる。
【００１０】
また、本発明のワクチン用アジュバンドにおいて、ε−ポリリジンの他に油脂、脂肪酸、多糖、合成樹脂、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１種を添加・配合することができる。ε−ポリリジンは極めて親水性が強く、また生体が通常は陰電荷であるのに対して生理条件下では陽電荷であるため、体内に投与された場合にはこの電気的な結合により投与箇所に滞留するが、しかしながら徐々に拡散してしまう。このため、アジュバンドの生体内滞留をコントロールするために前記添加物質を添加・配合して、アジュバンドの高分子化および／または疎水化することによりアジュバンドの抗原徐放性を向上させるとともにその拡散を抑制するのが好ましい。
【００１１】
同様な理由により、ε−ポリリジンを油脂、脂肪酸、多糖、合成樹脂、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１種と共有結合させることができる。例えば油脂、脂肪酸、ヒドロキシモノカルボン酸重合体、グリコール酸／ヒドロキシモノカルボン酸共重合体（特開平５−１１２４６８号公報）等はε−ポリリジンと共有結合させることによりその複合体に疎水性を付与し、且つ高分子化することによってアジュバンドの抗原徐放性を向上させるとともにその拡散を抑制することができる。ε−ポリリジンとこれら添加物質を共有結合させる場合、添加物質がε−ポリリジンのアミノ基またはカルボキシル基と共有結合しうる官能基（例えば、カルボキシル基、水酸基、アミノ基等）を有するのが好ましい。
【００１２】
ε−ポリリジンと共有結合させる方法として、カルボキシル基を有するものについて、例えばジメチルスルフオキシド中でカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてカルボキシル基を活性エステル化し、これにε−ポリリジンを添加することによりε−ポリリジン中の遊離アミノ基とぺプチド結合させる。アミノ基を有するものについては、ε−ポリリジン中の遊離カルボキシル基を同様に活性エステル化し、これらにアミノ基を有する物質を添加してその遊離アミノ基とペプチド結合させることができる。また、架橋物質がアミノ酸、ポリペプチドまたはタンパク質である場合には他の架橋試薬（例えば、ＤＭＡ[ジメチルアジピミデート]試薬またはＤＭＳ[ジメチルスベリミデート]試薬等）を用いて添加物質のアミノ基とε−ポリリジンのアミノ基を架橋することにより共有結合させることができる。
【００１３】
添加物質がカルボキシル基、アミノ基を有さず、水酸基を有する場合、例えばジメチルスルフォキシド中にε−ポリリジンおよび反応触媒として三フッ化ホウ素を添加し、ジグリシジルエーテルに代表される架橋試薬と添加物質を加えることにより、ε−ポリリジンのアミノ基と物質の水酸基との間に共有結合を生じさせることができる。
【００１４】
また、添加物質がシステイン残基有するペプチドまたはタンパク質の場合、システイン残基のＳＨ基とε−ポリリジンのアミノ基を架橋試薬（例えばＭＢＳ[ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル]試薬）を用いてペプチドまたはタンパク質とε−ポリリジンとを共有結合させることができる。
【００１５】
ε−ポリリジンと混合または共有結合させうる脂肪酸の例には、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、べへン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、クルパノドン酸、イソ吉草酸、ツべルクロステアリン酸、セレブロン酸、リシノール酸、ラクトバチル酸、シャウムーグラ酸、ヒドノカルビン酸およびミコマイシン等が含まれる。
【００１６】
また、多糖類の例には、セルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ヘミセルロース、グリコーゲン、デキストラン、プルラン、ニゲラン、プソイドニゲラン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カ一ドラン、イヌリン、レバン、マンナン、キシラン、アラビナン、ぺクチン、ぺクチン酸、キチン、キトサン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、アラビノガラクタン、寒天、カラギーナン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、へパリンおよびケラタン硫酸等が含まれる。
【００１７】
合成樹脂の例としてはカルボキシビニル、ポリビニルアルコール、ヒドロキシモノカルボン酸重合体、グリコール酸／ヒドロキシモノカルボン酸共重合体を挙げることができる。
用いうるアミノ酸の例としては、好ましくは必須アミノ酸またはそのＤ−アミノ酸を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００１８】
ポリペプチドまたはタンパク質は、等電点が８.０以上のものが好ましい。ε−ポリリジンは酸性〜中性付近では陽電荷であるため、このｐＨ領域では陰電荷のタンパク質またはペプチドはε−ポリリジンと電気的に結合して抗原吸着力を低下させる場合がある。ε−ポリリジンと混合または結合させうる等電点が８.０以上のタンパク質の例として、アビジン、アデニル酸キナーゼ、アリールスルファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、エステラーゼ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、ガラクトースオキシダーゼ、キモトリプシノーゲンＡ、キモトリプシンＡα、キモパパインＡ、キモパパインＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ＡＴ XI、ケラチナーゼ、コリシンＥ１、シトクロムＣ、スブチリシン、ＤＮＡポリメラーゼβ、トリプシン、ヌクレアーゼ、パパイン、ヒストン、ペニシリナーゼ、ポスト−γ−グロブリン、ミオグロビン、モネリン、ヒト乳ラクトフェリン、卵白リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ等を挙げることができる。また、同様な物性を有するオリゴペプチドも本発明において用いることができる。しかし、等電点が８.０以下のタンパク質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドであっても、中性付近でε−ポリリジンと結合しても抗原の荷電次第ではこれと置換される場合がある。このため、抗原と置換されうる等電点が８.０以下のタンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドも本発明において使用可能である。
【００１９】
本発明を下記の実施例によって説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１（リノール酸とε−ポリリジンとの複合体）
溶液ａ：リノール酸（和光純薬製）０.１ｇ（約０.３５ｍＭ）を１０ｍＬのジメチルスルフオキシド（和光純薬製）に溶解し、これにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬製）０.１ｇを添加した。混合物を４℃で３０分間攪拌した後、１,３−ジシクロへキシルカルボジイミドを０.１ｇ添加し、さらに４℃で１時間攪拌した。
溶液ｂ：これとは別に１０ｍＬのジメチルスルホキシドにε−ポリリジン水溶液（２５ｗ／ｗ％）（チッソ製）６ｍＬを添加し、激しく攪拌させて分散させた。
溶液ａを激しく攪拌している溶液ｂ中にゆっくり滴下した。全量滴下後、１０分間反応させ、得られたリノール酸とε−ポリリジン複合体をジメチルスルフォキシド中で不溶化させた。次いでこの溶液をろ紙（ＪＩＳ Ｎｏ.５Ｃ）でろ過し、不溶化した複合体をジメチルスルフォキシドで３回洗浄し、室温で自然乾燥した。得られた粉末をリノール酸とε−ポリリジンとの複合体として下記の免疫応答比較試験に供した。
【００２１】
実施例２（セルロースとε−ポリリジンとの複合体）
溶液ａ：結晶性セルロース粉末（重合度２００，旭化成製）０.２ｇをジメチルスルフオキシド中に懸濁し、次いで１４％三フッ化ホウ素メタノール溶液（シグマ−アルドリッチ製）０.１ｍＬを添加して混和した。これにジグリシジルエーテル（日本油脂製）０.１ｍＬを撹絆しながらゆっくり滴下した。
溶液ｂ：１０ｍＬのジメチルスルホキシドにε−ポリリジン水溶液（２５ｗ／ｗ％）（チッソ製）６ｍＬを添加し、激しく攪拌させて分散させた。
溶液ａを激しく攪拌している溶液ｂ中にゆっくり滴下した。全量滴下後、１０分間反応させ、得られたリノール酸とε−ポリリジン複合体をジメチルスルフォキシド中で不溶化させた。次いでこの溶液をろ紙（ＪＩＳ Ｎｏ.５Ｃ）でろ過し、不溶化した複合体をジメチルスルフォキシドで３回、精製水で３回洗浄し、室温で自然乾燥した。得られた粉末をセルロースとε−ポリリジンとの複合体として下記の免疫応答比較試験に供した。
【００２２】
実施例３（免疫応答比較試験）
ε−ポリリジン並びに実施例１および２で得られた各ε−ポリリジン複合体を含むワクチン用アジュバントを、抗体産生能について試験した。具体的には、ε−ポリリジンのみ（ＰＬ）、実施例１のリノール酸−ε−ポリリジン複合体（Ｌ−ＰＬ）、実施例２のセルロース−ε−ポリリジン複合体（Ｃ−ＰＬ）をワクチン用アジュバンドとして用いた場合について、マウスを用いて牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を抗原として、抗ＢＳＡ抗体の産生能を試験した。なお、アジュバントを用いずにＢＳＡのみを用いた場合を対照とした。
【００２３】
（１）抗原の調製および免疫
Ｌ−ＰＬまたはＣ−ＰＬを生理食塩水にそれぞれ０.１μｇ／ｍＬ、０.５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの５段階の濃度にて懸濁させた。また、ＰＬを生理食塩水に前記５段階の濃度にて溶解した。ＢＳＡ（和光純薬製）１ｍｇを生理食塩水１ｍＬに溶解し、これに各濃度のＬ−ＰＬもしくはＣ−ＰＬ懸濁液１ｍＬまたはＰＬ溶液１ｍＬを添加してよく混和し、各濃度につき３匹ずつのマウス（ＩＣＲクローズドコロニー４週齢雌）の皮下に０.１ｍＬ注射した。対照では、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ生理食塩水溶液１ｍＬに対１ｍＬの生理食塩水を添加してよく混和し、同様にマウス３匹に皮下注射した。
各試料の注射後、７日目、１４日目、２１日日、２８日目に各マウスの尾部静脈より採血し、これらを抗ＢＳＡ抗体の産生を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて調べた。
【００２４】
（２）ＥＬＩＳＡによる抗体産生能の測定
▲１▼ＢＳＡ固相化プレートの作製
ＢＳＡを０.０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）中に１μｇ／ｍＬの濃度にて溶解し、このＢＳＡ溶液１００μＬをポリスチレン製平底マイクロタイタープレート（ヌンク製）の各ウェルに添加し、４℃で２４時間静置した。プレートの各ウェルを精製水で４回洗浄後、リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７.４）中のスキムミルク溶液（１ｗ／ｖ％）３００μＬを各ウェルに添加し、４℃で２４時間静置した。次いで、プレートを精製水で４回洗浄した後、０.０５ｗ／ｖ％  Ｔｗｅｅｎ２０(R)（和光純薬製）および０.０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム（和光純薬製）を含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７.４）（以下Ａ液とする）で各ウェルを満たし、使用時まで密封して４℃に保存した。
【００２５】
▲２▼ＥＬＩＳＡ法
血液試料約５０μＬ／頭をマイクロチューブに移し、４℃で１８時間静置した。次いで３０００×Ｇにて５分間遠心分離し、得られた上清の血清画分をＥＬＩＳＡに供した。血清はＡ液で５０倍に希釈し、ＢＳＡ固相化プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、プレートをシールして３７℃で１時問静置した。プレートをＡ液で５回洗浄した後、２次抗体としてぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（和光純薬）をＡ液で２０００倍希釈したもの１００μＬを各ウェルに添加し、プレートをシールして３７℃で３０分静置した。次に、プレートをＡ液で５回洗浄した後、発色基質と０.０５５ｍＭ  ３,３′５,５′−テトラメチルべンチジンおよび０.００３％過酸化水素を含有する０.５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）１００μＬを各ウェルに添加して１５分静置した。各ウェルに１Ｍ硫酸５０μＬを添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（バイオラッド製モデル３５５０）を用いて４５０ｎｍの吸光度にて各ウェルの発色を測定した。
【００２６】
▲３▼結果
各血清試料についてＥＬＩＳＡの結果を下記の表１に示す。
【００２７】
【表１】
0004123756.tif 000002
【００２８】
対照では抗ＢＳＡ抗体はほとんど産生されなかったが、ＰＬ、Ｌ−ＰＬ、Ｃ−ＰＬを投与したマウスでは１回の注射で、即ち追加免役することなくで抗体産生が認められた。特にＣ−ＰＬおよびＬ一ＰＬでは抗体産生の顕著な上昇が観察された。これは、ε−ポリリジンがワクチン用アジュバンドとして非常に有用であることを示す。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、抗原の徐放性および免疫刺激性に優れたワクチン用アジュバンドおよびこれを用いたワクチンが提供される。本発明のワクチン用アジュバンドは、免疫賦活化作用に優れているため、これを用いたワクチンは顕著に優れた抗体産生能を有する。また、ε−ポリリジン自体が非常に安全性が高く、且つ容易に入手可能であるため、これを用いた本発明のワクチン用アジュバンドは、ヒトを含む哺乳類動物、鳥類等の免疫に非常に有用である。