(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体からなることを特徴とする、生体関連物質の修飾剤。
【化１】
0004123856.tif 000014
（式中、Ｚはエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリンおよびペンタエリスリトールからなる群より選ばれた化合物から水酸基を除いた残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基、Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示す。）
【請求項２】
ＧＰＣ純度が９０％以上およびマレイミド基導入率が９０％以上である請求項１記載の修飾剤。
【請求項３】
式（１）において、Ｚが３〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、３≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂである請求項１または請求項２記載の修飾剤。
【請求項４】
式（１）において、Ｘが炭素数３の２価の炭化水素基である請求項１〜３のいずれか一つの請求項に記載の修飾剤。
【請求項５】
式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体
【化２】
0004123856.tif 000015
（式中、Ｚは２〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基、Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示す。）と無水マレイン酸を反応させて式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸
【化３】
0004123856.tif 000016
（記号は前記と同じである。）を得た後、式（４）で示される化合物を式（４）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％の有機溶媒で溶解し、ついで式（４）で示される化合物に対し３００〜５０００容量／重量％の酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を用いて晶析を行った後にマレイミド化反応を行う、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の製造方法。
【化４】
0004123856.tif 000017
（記号は前記と同じである。）
【請求項６】
式（２）で示される末端水酸基含有ポリオキシアルキレン誘導体
【化５】
0004123856.tif 000018
（式中、Ｚは２〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基を示す。）をシアノ化し、水素化により末端をアミノ化した式（３）で示される末端アミノ基ポリオキシアルキレン誘導体
【化６】
0004123856.tif 000019
（Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示し、他の記号は前記と同じである。）と無水マレイン酸を反応させて式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸
【化７】
0004123856.tif 000020
（記号は前記と同じである。）を得た後、式（４）で示される化合物を式（４）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％の有機溶媒で溶解し、ついで式（４）で示される化合物に対し３００〜５０００容量／重量％の酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を用いて晶析を行った後にマレイミド化反応を行う、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の製造方法。
【化８】
0004123856.tif 000021
（記号は前記と同じである。）
【請求項７】
無水マレイン酸の含有量が０．５重量％以下である式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸を用いる請求項５または請求項６記載のポリオキシアルキレン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリオキシアルキレン誘導体およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、ポリペプチド、生理活性タンパク質、酵素などへの修飾やリポソーム、ポリマーミセルなどの薬物送達システム（以下ＤＤＳという）における修飾など、生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＤＳの重要な担体として末端変性ポリオキシアルキレン化合物が注目されている。特にポリペプチド、生理活性タンパク質、酵素などへのポリオキシアルキレン化合物による修飾やリポソーム、ポリマーミセルなどのポリオキシアルキレン化合物による修飾は抗原性(免疫反応性)の低減、薬剤の安定性増加、体内滞留時間の延長などの効果を得ることができる。末端変性ポリオキシアルキレン化合物としては、ペプチドやタンパク質の側鎖官能基、例えばリジン残基のアミノ基、アスパラギン酸、グルタミン酸残基のカルボキシル基、システイン残基のチオール基、またはリン脂質、ポリマーミセル原料のアミノ基やカルボキシル基などと反応するカルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、マレイミド基などの官能基が導入されている。
これらの中で、システイン残基の側鎖チオール基やリジン残基に導入されたチオール基などに対して、マレイミド基を有する末端変性ポリオキシアルキレン化合物による修飾はチオエーテル結合を形成することから他の修飾法による結合よりもより強固な結合となりうる。しかし、従来、マレイミド基を有するポリオキシアルキレン化合物による修飾にはポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールに６−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなどを反応させたものが使用されていた。これらはポリオキシアルキレン鎖とマレイミド基の間にエステル結合を介しているため、生体内で加水分解し易いといった問題点があった。
【０００３】
また、国際公開９２／１６２２１パンフレット、国際公開９８／３８８７パンフレット、特開２０００−１９１７００号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７（１５），８５４８−５３（２０００）およびＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ，３５１（１），８７−９３（２０００）に記載されているα−マレイミドエチルオキシ−ω−メトキシ（ポリオキシアルキレン）は、同様に保存安定性が低いといった問題点があった。
また、医薬用途で使用される末端変性ポリオキシアルキレン化合物については、医薬製剤として展開していくには目的の化合物より高分子量の不純物などが少なく、活性基の導入率が高いものでなければならず、これらの純度や活性基の導入率に関してより高いものが要求されている。
【０００４】
従来、末端にマレイミド基を有するポリオキシアルキレン誘導体は、ポリオキシアルキレン鎖とマレイミド基の間に炭素数２のアルキル基をもつポリオキシアルキレン誘導体の製造方法がＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２２（１６），２４２５−２９（１９９２）に記載されているが、中間体の精製方法について低引火点物質であるジエチルエーテルを多量に使用しており、工業生産を行うには適当な方法ではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高純度であり、保存安定性に優れた生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体および安全で高純度のポリオキシアルキレン誘導体を得る製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
本発明は、
（１）式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体からなることを特徴とする、生体関連物質の修飾剤、
【０００７】
【化９】
0004123856.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｚはエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ペンタエリスリトールからなる群より選ばれた化合物から水酸基を除いた残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基、Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示す。）
（２） ＧＰＣ純度が９０％以上およびマレイミド基導入率が９０％以上である前記のポリオキシアルキレン誘導体、
（３） 式（１）において、Ｚが３〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、３≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂである前記のポリオキシアルキレン誘導体、
（４）  式（１）において、Ｘが炭素数３の２価の炭化水素基である前記のポリオキシアルキレン誘導体、
（５） 式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体
【０００９】
【化１０】
0004123856.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｚは２〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基、Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示す。）
と無水マレイン酸を反応させて式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸
【００１１】
【化１１】
0004123856.tif 000004
【００１２】
（記号は前記と同じである。）
を得た後、式（４）で示される化合物を式（４）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％の有機溶媒で溶解し、ついで式（４）で示される化合物に対し３００〜５０００容量／重量％の酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を用いて晶析を行った後にマレイミド化反応を行う、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の製造方法、
【００１３】
【化１２】
0004123856.tif 000005
【００１４】
（記号は前記と同じである。）
（８）  式（２）で示される末端水酸基含有ポリオキシアルキレン誘導体
【００１５】
【化１３】
0004123856.tif 000006
【００１６】
（上記式において、Ｚは２〜８個の水酸基をもつ化合物の残基であり、ＡＯは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基、ｎは０〜２０００、ｍは０〜２０００、１≦ｎ＋ｍ、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂであり、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基を示す。）
をシアノ化し、水素化により末端をアミノ化した式（３）で示される末端アミノ基ポリオキシアルキレン誘導体
【００１７】
【化１４】
0004123856.tif 000007
【００１８】
（Ｘは炭素数３〜１０の２価の炭化水素基を示し、他の記号は前記と同じである。）
と無水マレイン酸を反応させて式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸
【００１９】
【化１５】
0004123856.tif 000008
【００２０】
（記号は前記と同じである。）
を得た後、式（４）で示される化合物を式（４）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％の有機溶媒で溶解し、ついで式（４）で示される化合物に対し３００〜５０００容量／重量％の酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を用いて晶析を行った後にマレイミド化反応を行う、生体関連物質の修飾に用いられる式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の製造方法、
【００２１】
【化１６】
0004123856.tif 000009
【００２２】
（記号は前記と同じである。）
（９）  無水マレイン酸の含有量が０．５重量％以下である式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸を用いる前記のポリオキシアルキレン誘導体の製造方法である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明のポリオキシアルキレン誘導体は、特に生体関連物質の修飾に有用な化合物である。
生体関連物質とは、生体内において生命活動を維持していくために必要な物質およびそれに関連した物質のことである。
例えば生理活性物質、構造タンパク質やリン脂質が挙げられ、アミノ酸を人工的に重合させたポリリジンやポリグルタミン酸などのポリアミノ酸も含まれる。
生理活性物質としてはグルタチオンなどのチオール基を有するペプチド、ヘモグロビン、インシュリンなどの生理活性タンパク質、リパーゼ、プロテアーゼなどの酵素、化学的手法や遺伝子組み替えにより得られるペプチド、タンパク質、酵素などである。構造タンパク質としては生体組織を形成するコラーゲンやケラチンなどが挙げられる。
【００２４】
式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体について以下に詳細に述べる。Ｚはエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ペンタエリスリトールであり、好ましくはエチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ヘキサグリセリン、ペンタエリスリトールであり、より好ましくはグリセリン、ジグリセリン、ヘキサグリセリン、ペンタエリスリトールである。ＡＯで示される炭素数２〜１８のオキシアルキレン基としては、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシスチレン基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、オキシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基などが挙げられ、好ましくは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、より好ましくはオキシエチレン基である。
【００２５】
ｎおよびｍは炭素数２〜１８のオキシアルキレン基の付加モル数を示しており、ｎおよびｍはそれぞれ０〜２０００、１≦ｎ＋ｍの範囲である。ｎおよびｍは好ましくはそれぞれ２０〜２，０００、より好ましくはそれぞれ４０〜１，０００の範囲である。また、２０≦ｎ＋ｍ≦１，２００の範囲が好ましく、より好ましくは４０≦ｎ＋ｍ≦４００の範囲である。
ａおよびｂはポリオキシアルキレン鎖の本数を示しており、２≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂの範囲である。好ましくは３≦ａ＋ｂ≦８、１≦ｂの範囲である。生体関連物質は修飾することにより免疫系への取り込みを抑制することができるが、２本以上のポリオキシアルキレン鎖を有するポリオキシアルキレン誘導体により生理活性物質を修飾することで、活性を低下させずに修飾効果を得ることができる。また、２つ以上のマレイミド基を有するポリオキシアルキレン誘導体により生理活性物質を修飾すると、さらに分子量を増加させることができ、より免疫系への取り込みを抑制することができる。
また、ｎ、ｍ、ａおよびｂはポリオキシアルキレン誘導体の全体分子量を表す指標であり、これらの関係式は１≦（ｎ×ａ＋ｍ×ｂ）≦１６，０００の範囲であり、２０≦（ｎ×ａ＋ｍ×ｂ）≦５，０００の範囲が好ましく、より好ましくは４０≦（ｎ×ａ＋ｍ×ｂ）≦１，２００の範囲である。これらの範囲から式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の全体分子量としては２５０〜７０万であり、好ましくは１０００〜２０万であり、より好ましくは２０００〜５万である。
【００２６】
Ｒで示される炭素数１〜３０の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、イソヘキサデシル基、オクタデシル基、イソオクタデシル基、オクタデセニル基、オクチルドデシル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基等の脂肪族炭化水素基、ベンジル基、クレジル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル基、オクチルフェニル基、ドデシルフェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニルフェニル基、ナフチル基、スチレン化フェニル基、４−メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基等の芳香族炭化水素基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、第三ブチル基、オクタデシル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基である。より好ましくはメチル基、第三ブチル基、ベンジル基である。
Ｘで示される炭素数３〜１０の２価の炭化水素基としては、例えばトリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ジメチルメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基などの直鎖および分岐炭化水素基、フェニルメチレン基などの芳香族炭化水素基が挙げられ、好ましくはトリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基であり、より好ましくはトリメチレン基、またはヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基である。
水酸基を有する化合物に対して、シアノ基を導入する方法としてアクリロニトリルを付加させるシアノエチル化が純度および収率の面で優れている。シアノエチル化された化合物から得られるものは炭素数３の２価の炭化水素基を有する化合物である。このことから、式（１）において、Ｘが炭素数３の２価の炭化水素基であるものがより好ましい。
一方、Ｘにおいて炭素数が６〜１０である２価の炭化水素基であるものについては、加水分解安定性がさらに優れたものになるため、生体関連物質を修飾して製剤を開発する際、同質性の優れた製剤を提供することが可能になることから、好ましい。
【００２７】
また、得られるポリオキシアルキレン誘導体の純度に関して、医薬製剤の原料として用いる場合には製剤の均質性や生体関連物質との反応性が要求されることからより高い純度が求められる。ポリオキシアルキレン誘導体においては、まず、製剤の均質性に関する問題からＧＰＣ純度が要求される。これは目的分子量の２倍量体、３倍量体などの含有量に関する純度である。
本発明で得られる生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体は、ＧＰＣ純度が好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上である。
【００２８】
ＧＰＣ純度は以下に記載の試験法において測定を行うことができる。
ＧＰＣ純度の測定法：
ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィ）にて測定を行う。カラムはＳＨＯＤＥＸ  ＫＦ８０４Ｌ（８ｍｍＩ．Ｄ×３０ｃｍ、昭和電工（株）製）を３本接続したものを使用し、溶離液はテトラヒドロフラン、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃、検出器に示差屈折計を用い、試料は０．１重量％濃度のテトラヒドロフラン溶液とし、注入量は１００μＬとする。得られたクロマトグラムにおいて、ピークが分離している場合はピーク間の極小値から垂直分割し、ピークが重なっている場合はピーク間の変曲点から垂直分割して、得られた各ピークの面積値からメインピークの面積百分率を算出する。
【００２９】
また、生体関連物質との十分な反応性を得るためには末端活性基であるマレイミド基の置換率が高いことが望まれる。末端活性基の置換率が不十分であると修飾された生体関連物質の生成率が低下し、血中滞留性が低下するなど製剤の性能低下につながる。本発明で得られる生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体は、ポリオキシアルキレン鎖末端官能基であるマレイミド基導入率が好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９２％以上である。
マレイミド基導入率は以下に記載の試験法において測定を行うことができる。マレイミド基導入率の測定法：
４００ＭＨｚ1Ｈ−ＮＭＲにて測定を行う（測定装置：ＥＣＰ４００、日本電子（株）製）。試料１５〜２０ｍｇを重クロロホルム０．５５ｍＬに溶解し、
1Ｈ−ＮＭＲを測定する。得られたＮＭＲチャートにおいて、マレイミド基由来のピーク（δ６．６９、ｓ）、中間原料（ポリオキシアルキレン末端マレアミド酸）由来ピーク（δ６．３５、ｄｄ）および反応中間体由来ピーク（δ７．２２および６．６２、ｄ）の積分値を求め、各積分値の総和に対するマレイミド基由来のピーク面積の百分率を計算し、ポリオキシアルキレン鎖末端官能基のマレイミド基導入率を算出する。
また、通常、生体関連物質との反応は緩衝液中で行われる。そのため、ポリオキシアルキレン誘導体については、緩衝液中での加水分解安定性の優れたものが要求されている。加水分解安定性が低い場合には、緩衝液中での反応において加水分解を起こし、生体関連物質の修飾率が低下し、その修飾効果が十分得られない、また、十分な修飾効果を得るためには大過剰量のポリオキシアルキレン誘導体が必要になってくる、といった問題がある。
本発明で得られる生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体は、ｐＨ７、２３℃での加水分解安定性試験において、マレイミド基導入率の半減期（５０％減衰時間）が４８時間以上であり、好ましくは５４時間以上であり、より好ましくは６０時間以上である。また、２５％減衰時間が２４時間以上、７０％減衰時間が６７時間以上であることが好ましく、より好ましくは２５％減衰時間が２７時間以上、７０％減衰時間が７５時間以上である。
【００３０】
加水分解安定性試験は以下に記載の試験法において測定を行うことができる。
加水分解安定性試験：
試料０．０２ｇを５０ｍＬスクリュー管に採取し、２０ｍＬのｐＨ７に調整した５０ｍＭリン酸緩衝液で溶解する。溶解後、２３℃で２４、４８、７２時間後にそれぞれ４ｍＬずつとり、１％リン酸水溶液を数滴加えた後、凍結乾燥を行う。これをクロロホルムに溶解し不溶物を濾別し、エバポレーターで濃縮して得られたものについて1Ｈ−ＮＭＲを測定してマレイミド基導入率を算出する。
得られた各時間におけるマレイミド基導入率の初期マレイミド基導入率に対する下記の変化率を算出する。
変化率＝[（各時間におけるマレイミド基導入率）／（初期のマレイミド基導入率）]×１００
変化率が７５％になった時間を２５％減衰時間、５０％になった時間を５０％減衰時間（半減期）、３０％になった時間を７０％減衰時間とする。
２５％減衰時間、５０％減衰時間（半減期）および７０％減衰時間は、２４、４８、７２時間後の変化率を測定し、横軸を時間、縦軸を変化率としたグラフを作成し、切片を１００として最小二乗法により得られた直線式を用いて、それぞれ７５％、５０％および３０％になる時間を算出することにより求められる。
【００３１】
本発明で得られる生体関連物質の修飾に用いられるポリオキシアルキレン誘導体は以下に示す製造工程によって得られる。
式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体から製造を行うことができる。好ましくは、純度の点で式（２）で示される末端水酸基含有ポリオキシアルキレン誘導体から製造することが良好である。
【００３２】
【化１７】
0004123856.tif 000010
【００３３】
工程［Ａ］は式（２）で示される末端水酸基含有ポリオキシアルキレン誘導体に対しアルカリ触媒存在下においてアクリロニトリル、ニトリル基を有する炭素数３〜１０である２価の炭化水素のハロゲン化物などを付加してシアノ化を行い、その後、水素添加を行う工程であり、ポリオキシアルキレン鎖と末端アミノ基との間に炭素数３〜１０の２価の炭化水素基をもつ式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体が得られる。ここで、ニトリル基を有する炭素数３〜１０である２価の炭化水素のハロゲン化物として、臭化物、塩化物、ヨウ化物が好ましく、より好ましくは塩化物、臭化物である。
式（２）で示される化合物をシアノ化する際には水や式（２）で示される化合物を溶解する有機溶媒を用いることが好ましく、式（２）で示される化合物を溶解する有機溶媒としてはクロロホルム、トルエン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドなどが好ましく、さらに好ましくはトルエン、アセトニトリルである。溶媒使用量は式（２）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％である。
アルカリ触媒は水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどの強アルカリ金属の水酸化物、ナトリウムメチラートなどの強アルカリアルコラートを用いる。触媒の使用量は式（２）で示される化合物に対し０．５〜２５重量％であり、好ましくは３〜１０重量％である。
アクリロニトリルなどのシアノ化剤の量は式（２）で示される化合物の水酸基１当量に対し１〜１００当量が好ましく、より好ましくは１０〜６０当量である。
反応温度は−２０℃〜１５０℃が好ましく、より好ましくは０℃〜１００℃である。
反応時間は１〜１０時間が好ましく、より好ましくは２〜６時間である。反応後、水洗や吸着処理により触媒を除去し、溶剤を除去してポリオキシアルキレンシアノ化物が得られる。
【００３４】
得られたポリオキシアルキレンシアノ化物は水素化に通常用いられる触媒を用いて水素化を行い、式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体とする。この工程において、ポリオキシアルキレンシアノ化物はこれを溶解する有機溶媒に溶解するのが好ましく、トルエンまたはエタノールが好ましく、より好ましくはトルエンである。溶媒使用量はポリオキシアルキレンシアノ化物に対し５０〜５００容量／重量％であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％である。
触媒としては、ニッケルまたはコバルトが好ましく、より好ましくはニッケルである。触媒量はポリオキシアルキレンシアノ化物に対し０．５〜２５重量％が好ましく、より好ましくは１〜１０重量％である。
ニッケル触媒を用いる場合は水素化反応時の副反応を防ぐためにアンモニアガスを添加することが好ましい。アンモニアガスの添加量はポリオキシアルキレンシアノ化物に対し５〜３０重量％であり、より好ましくは１０〜２０重量％である。
水素圧は１〜１０ＭＰａが好ましく、より好ましくは３〜６ＭＰａである。
反応温度は８０〜２００℃が好ましく、より好ましくは１００〜１５０℃である。
反応時間は０．５〜１０時間が好ましく、より好ましくは１〜５時間である。反応後、ろ過により触媒を除去し、溶剤を除去して式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体が得られる。
この工程において、得られたポリオキシアルキレンシアノ化物および式（３）で示される化合物は晶析、吸着処理などによる精製工程を行ってもよい。
【００３５】
工程［Ｂ］は工程［Ａ］で得られた式（３）で示される化合物と無水マレイン酸を反応させることにより、式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸を得る工程である。
式（３）で示される末端アミノ基含有ポリオキシアルキレン誘導体のアミン純度は９０％以上が好ましく、より好ましくは９５％以上である。アミン純度が低い場合、工程［Ｃ］における閉環反応が起こらないため、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体の末端官能基のマレイミド基導入率が低くなってしまう。
アミン純度は以下に記載の試験法において測定を行うことができる。
アミン純度の測定法：
液体クロマトグラフィにて測定を行う。カラムは東ソー  ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ×７．５ｃｍ、東ソ−（株）製）を使用し、溶離液は２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度４０℃、検出器に示差屈折計を用い、試料は０．５重量％濃度の２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）溶液とし、注入量は２０μＬとする。得られたクロマトグラムにおいて、ピークが分離している場合はピーク間の極小値から垂直分割し、ピークが重なっている場合はピーク間の変曲点から垂直分割して、得られた各ピークの面積値からメインピークの面積百分率を算出する。
式（３）で示される化合物はこれを溶解する有機溶媒に溶解するのが好ましく、クロロホルムまたはトルエンが好ましい。溶媒使用量は式（３）で示される化合物に対し５０〜５００容量／重量％であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％である。無水マレイン酸量は（３）で示される化合物のアミノ基１当量に対し１．０〜２０当量が好ましく、より好ましくは５〜１５当量である。反応温度は２０〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６０℃である。反応時間は０．５〜１０時間が好ましく、より好ましくは１〜５時間である。
得られた式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸はこれを溶解する有機溶剤に溶解し、酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を用いて晶析を行う。
式（４）で示される化合物を溶解する有機溶剤としてはクロロホルム、トルエン、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドが好ましく、より好ましくはクロロホルムまたはトルエンである。有機溶剤量は式（４)で示される化合物に対して５０〜５００容量／重量％の範囲であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％の範囲である。
【００３６】
酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物の溶剤量はポリオキシアルキレン末端マレアミド酸に対し３００〜５０００容量／重量％であり、好ましくは５００〜２０００容量／重量％である。酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合比は容量比で１：９〜９：１であり、好ましくは４：６〜６：４である。
晶析工程において、式（４）で示される化合物を溶解する有機溶剤で溶解する際の温度は０〜８０℃が好ましく、より好ましくは２０〜４０℃である。この溶液に対して酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物を加え、結晶を析出させる際の温度は２０〜３５℃が好ましい。
酢酸エチルとｎ−ヘキサンは別々に加えてもよい。晶析は２回以上繰り返し行っても良い。
また、得られた式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量は０．５重量％以下であり、好ましくは０．１重量％以下である。式（４）で示される化合物に含まれる無水マレイン酸の含有量が多いと目的の化合物より高分子量の不純物が生成し、ＧＰＣ純度が低下する問題が生じる。
【００３７】
無水マレイン酸の含有量は以下に記載の方法で測定することができる。
ポリオキシアルキレン末端マレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量の測定法：
試料１５〜２０ｍｇを重クロロホルム０．５５ｍＬに溶解し、４００ＭＨｚ1Ｈ−ＮＭＲ（測定装置：ＥＣＰ４００、日本電子（株）製）にて測定を行う。得られたＮＭＲチャートにおいて、基準となるピーク（例えばメトキシ基を基準とした場合、δ３．３８、ｓ、３Ｈ）に対して無水マレイン酸由来のピーク（δ７．０５、ｓ、２Ｈ）の積分値を求め、以下の式から無水マレイン酸の含有量を算出する。
無水マレイン酸含有量［重量％］＝（（積分値／２）×９８／ポリオキシアルキレン末端マレアミド酸の分子量）×１００
【００３８】
工程［Ｃ］は工程［Ｂ］で得られた式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸を閉環し、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体を得る工程である。
閉環反応は、式（４）で示されるポリオキシアルキレン末端マレアミド酸に対し５〜１０００重量％、好ましくは１００〜５００重量％の無水酢酸を加えて溶解し、１〜５０重量％、好ましくは５〜４０重量％の酢酸ナトリウムやトリエチルアミンなどの触媒を加え、６０〜１３０℃に加温することにより行われる。必要ならば、有機溶剤を用いてもよい。用いる有機溶媒としてはクロロホルム、アセトニトリル、トルエンが好ましく、式（４）の化合物に対し、５０〜５００容量／重量％の範囲であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％の範囲である。
反応後、触媒をろ過により除き、減圧下、６０〜１３０℃で濾液を濃縮する。濃縮物を有機溶剤に溶解した後、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合物を加えて結晶を析出させ、ろ過後、乾燥し、式（１）で示されるポリオキシアルキレン誘導体を得ることができる。
有機溶剤としてはクロロホルムまたはトルエンが好ましく、有機溶剤量は式（１）の化合物に対して５０〜５００容量／重量％の範囲であり、好ましくは７０〜３００容量／重量％の範囲である。
酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物の溶剤量は式（１）の化合物に対して３００〜５０００容量／重量％であり、好ましくは５００〜２０００容量／重量％である。酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合比は容量比で１：９〜９：１であり、好ましくは４：６〜６：４である。
酢酸エチルとｎ−ヘキサンは別々に加えてもよく、精製は繰り返し行っても良い。
【００３９】
本発明のポリオキシアルキレン誘導体を用いて生体関連物質を修飾する方法は、例えば、生体関連物質をリン酸緩衝液に溶解し、１０℃以下に冷却した後、ポリオキシアルキレン末端マレイミド誘導体を加え、１〜１０時間攪拌する。脱塩後、凍結乾燥してポリオキシアルキレン誘導体で修飾した生体関連物質が得られる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のポリオキシアルキレン誘導体は、高純度であり、マレイミド基部分が保存安定性に優れているため、生体関連物質の修飾を行っても安定性に優れている。また、本発明の製造方法で製造することにより、安全に高純度のものが容易に得られる。
本発明のポリオキシアルキレン誘導体を用いて修飾した生体関連物質は、安定性に優れており、有用である。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
実施例１
シアノ化反応：
メトキシポリオキシエチレン（分子量５０００、式（２）においてｎ＋ｍ＝１１２、ａ＝１、ｂ＝１である化合物、ＭＥＨ−５０Ｈ  日本油脂(株)製）６４０ｇを攪拌機、滴下装置、温度計および窒素バブリングラインのついた３Ｌ四つ口フラスコに仕込み、イオン交換水６４０ｇを加えて溶解し、１０℃以下まで冷却した。これに５０％水酸化カリウム４０ｇを加え、さらに５℃以下に冷却した後、５℃以下に保ったまま、アクリロニトリル３４０ｇを２時間かけて滴下し、さらに２時間攪拌した。反応終了後、８５％リン酸２４ｇを加えて中和した。この反応液８４２ｇにイオン交換水２８００ｇに塩化ナトリウム５００ｇを溶かした水溶液を加え、クロロホルム１０００ｍＬで抽出した。クロロホルム層を分層後、水層にクロロホルム５００ｍＬを加えて抽出した。このクロロホルム液を濾過した後、９０℃、０.３ｋＰａの減圧下で脱溶剤を行い、固化して粗メトキシポリオキシエチレンシアノエチル化物６４０ｇを得た。
粗メトキシポリオキシエチレンシアノエチル化物６００ｇを攪拌機および窒素シールラインのついた１０Ｌビーカーに仕込み、クロロホルム５００ｍＬに溶解した後、酢酸エチル４Ｌとヘキサン４Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム４００ｍＬに溶解して、さらに酢酸エチル４Ｌとヘキサン４Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してメトキシポリオキシエチレンシアノエチル化物５４０ｇを得た。
アミノ化反応：
メトキシポリオキシエチレンシアノエチル化物２００ｇ、トルエン４００ｇ、ニッケル触媒４ｇを攪拌機、温度計、窒素導入管、水素導入管およびアンモニア導入管のついた１Ｌオートクレーブに仕込み、反応容器内を窒素置換した。６０℃まで昇温して溶解した後、アンモニアガスを３０ｇ吹き込み、さらに水素ガスを４ＭＰａまで吹き込んだ。反応容器を１３０℃まで昇温して３時間攪拌しながら反応した。反応容器を８０℃まで冷却してから触媒を濾別し、９０℃、０.３ｋＰａの減圧下、１時間で脱溶剤を行い、固化してメトキシポリオキシエチレンプロピルアミン１７０ｇを得た。得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルアミンのアミン純度は９５．２％であった。
マレイミド化反応：
メトキシポリオキシエチレンプロピルアミン１６４ｇ、トルエン３２５ｍＬを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、５０℃に加温して溶解した。これに無水マレイン酸３２ｇを加え、４時間攪拌して反応した。反応液を４０℃まで冷却後、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得た結晶を再度トルエン３２５ｍＬに溶解し、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させ、濾過して結晶を得た。この結晶を乾燥してメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸１６７ｇを得た。得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量は０．００１１重量％であった。
得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸１６７ｇ、無水酢酸５００ｍＬ、酢酸ナトリウム６４ｇを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、９０℃まで加温した。９０℃で３時間攪拌して反応を行った後、５０℃まで冷却し酢酸ナトリウムを濾過し、９０℃、０.３ｋＰａの減圧下で濾液を濃縮した。クロロホルム３３０ｍＬに溶解して不溶物を濾過した後、酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム３３０ｍＬに溶解して、さらに酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してメトキシポリオキシエチレンプロピルマレイミド１６０ｇを得た。得られた結晶は薄桃色であった。
【００４２】
実施例２
シアノ化反応：
ポリオキシエチレン（分子量１００００、式（２）においてｍ＝１１３、ａ＝０、ｂ＝２である化合物、ＰＥＧ１１０００  日本油脂(株)製）１６００ｇを攪拌機、滴下装置、温度計および窒素バブリングラインのついた５Ｌ四つ口フラスコに仕込み、イオン交換水１６００ｇを加えて溶解し、１０℃以下まで冷却した。これに５０％水酸化カリウム１００ｇを加え、さらに５℃以下に冷却した後、５℃以下まで冷却した。５℃以下に保ったまま、アクリロニトリル８５０ｇを２時間かけて滴下し、さらに２時間攪拌した。反応終了後、８５％リン酸６０ｇを加えて中和した。クロロホルム２５００ｍＬおよび１２５０ｍＬ、イオン交換水７０００ｇ、塩化ナトリウム１２５０ｇを使用し、以下は実施例１と同様に操作を行い、粗ポリオキシエチレンジシアノエチル化物１６００ｇを得た。粗ポリオキシエチレンジシアノエチル化物１６００ｇを攪拌機および窒素シールラインのついた３０Ｌビーカーに仕込み、クロロホルム１．４Ｌに溶解した後、酢酸エチル１１.１Ｌとヘキサン１１.１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム１．４Ｌに溶解して、さらに酢酸エチル１１.１Ｌとヘキサン１１.１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してポリオキシエチレンジシアノエチル化物１４００ｇを得た。
アミノ化反応：
ポリオキシエチレンジシアノエチル化物２００ｇ、トルエン４００ｇ、ニッケル触媒９ｇを攪拌機、温度計、窒素導入管、水素導入管およびアンモニア導入管のついた１Ｌオートクレーブに仕込んだ。その後は実施例１と同様に操作を行い、ポリオキシエチレンジプロピルアミン１７０ｇを得た。得られたポリオキシエチレンジプロピルアミンのアミン純度は９３．７％であった。
マレイミド化反応：
ポリオキシエチレンジプロピルアミン１６４ｇ、トルエン３２５ｍＬを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、５０℃に加温して溶解した。これに無水マレイン酸３２ｇを加え、４時間攪拌して反応した。反応液を４０℃まで冷却後、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得た結晶を再度トルエン３２５ｍＬに溶解し、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させ、濾過して結晶を得た。この結晶を乾燥してポリオキシエチレンジプロピルマレアミド酸１６５ｇを得た。得られたポリオキシエチレンジプロピルマレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量は０．００１８重量％であった。
得られたポリオキシエチレンジプロピルマレアミド酸１６５ｇ、無水酢酸５００ｍＬ、酢酸ナトリウム６３ｇを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、９０℃まで加温した。９０℃で３時間攪拌して反応を行った後、５０℃まで冷却し酢酸ナトリウムを濾過し、９０℃、０.３ｋＰａの減圧下で濾液を濃縮した。クロロホルム３６０ｍＬに溶解して不溶物を濾過した後、酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム３６０ｍＬに溶解して、さらに酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してポリオキシエチレンジプロピルマレイミド１６０ｇを得た。得られた結晶は薄桃色であった。
【００４３】
実施例３
シアノ化反応：
テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールエーテル（分子量１００００、式（２）においてｍ＝５６、ａ＝０、ｂ＝４である化合物、ＤＧＥ−１００００日本油脂(株)製）１６００ｇを攪拌機、滴下装置、温度計および窒素バブリングラインのついた５Ｌ四つ口フラスコに仕込み、イオン交換水１６００ｇを加えて溶解し、１０℃以下まで冷却した。これに５０％水酸化カリウム１００ｇを加え、さらに５℃以下に冷却した。５℃以下に保ったまま、アクリロニトリル８５０ｇを２時間かけて滴下し、さらに２時間攪拌した。反応終了後、８５％リン酸６０ｇを加えて中和した。クロロホルム２５００ｍＬおよび１２５０ｍＬ、イオン交換水７０００ｇ、塩化ナトリウム１２５０ｇを使用し、以下は実施例１と同様に操作を行い、粗テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラシアノエチル化物１６００ｇを得た。粗テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラシアノエチル化物１６００ｇを攪拌機および窒素シールラインのついた３０Ｌビーカーに仕込み、クロロホルム１．４Ｌに溶解した後、酢酸エチル１１.１Ｌとヘキサン１１.１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム１．４Ｌに溶解して、さらに酢酸エチル１１.１Ｌとヘキサン１１.１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラシアノエチル化物１４００ｇを得た。
アミノ化反応：
テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラシアノエチル化物２００ｇ、トルエン４００ｇ、ニッケル触媒９ｇを攪拌機、温度計、窒素導入管、水素導入管およびアンモニア導入管のついた１Ｌオートクレーブに仕込み、後は実施例１と同様に操作を行い、テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルアミン１７０ｇを得た。得られたテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルアミンのアミン純度は９３．１％であった。
マレイミド化反応：
テトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルアミン１６４ｇ、トルエン３２５ｍＬを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、５０℃に加温して溶解した。これに無水マレイン酸６４ｇを加え、４時間攪拌して反応した。反応液を４０℃まで冷却後、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得た結晶を再度トルエン３２５ｍＬに溶解し、酢酸エチル８００ｍＬとヘキサン８００ｍＬの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させ、濾過して結晶を得た。この結晶を乾燥してテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルマレアミド酸１６７ｇを得た。得られたテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルマレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量は０．０２５重量％であった。
得られたテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルマレアミド酸１６７ｇ、無水酢酸５００ｍＬ、酢酸ナトリウム６３ｇを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、９０℃まで加温した。９０℃で３時間攪拌して反応を行った後、５０℃まで冷却し酢酸ナトリウムを濾過し、９０℃、０.３ｋＰａの減圧下で濾液を濃縮した。クロロホルム３６０ｍＬに溶解して不溶物を濾過した後、酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して結晶を得た後、さらにクロロホルム３６０ｍＬに溶解して、さらに酢酸エチル１Ｌとヘキサン１Ｌの混合液を注ぎ、３０分攪拌して結晶を析出させた。濾過して得られた結晶を乾燥してテトラ（ポリオキシエチレン）ジグリセロールテトラプロピルマレイミド１６２ｇを得た。得られた結晶は薄桃色であった。
【００４４】
比較例１
メトキシポリオキシエチレンプロピルアミン（分子量５０００）を原料として、先行文献（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２２（１６），２４２５−２９（１９９２））記載の方法により、メトキシポリオキシエチレンエチルマレイミドの合成を行った。
シアノ化、アミノ化においては、実施例１と同一原料、同一方法で行い、メトキシポリオキシエチレンプロピルアミンを得た。得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルアミンのアミン純度は９６．８％であった。
得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルアミン２．５ｇ、無水マレイン酸４６０ｍｇおよびジオキサン１０ｍＬを５０ｍＬフラスコに仕込み、８０℃で３０分攪拌して反応した。反応液を冷却後、エーテル５００ｍＬを注ぎ、一晩放置して結晶を析出させた。析出した結晶を濾過し、結晶をエーテルで洗浄した後、真空下で乾燥してメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸を得た。得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸に含まれる無水マレイン酸の含有量は０．０８６重量％であった。
得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルマレアミド酸に対し、無水酢酸２０ｍＬ、酢酸ナトリウム１．０ｇを５０ｍＬフラスコに仕込み、１００℃で４５分攪拌して反応を行った。冷却後、エバポレーションで溶剤を除き、５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、活性炭で吸着処理を行った。これを濾過し、エーテル５００ｍＬを注ぎ、一晩放置して結晶を析出させた。析出した結晶を濾過し、結晶をエーテルで洗浄した後、真空下で乾燥してメトキシポリオキシエチレンプロピルマレイミド２．２ｇを得た。得られた結晶は薄桃色であった。
【００４５】
比較例２
シアノ化、アミノ化においては、実施例１と同一原料、同一方法で行い、メトキシポリオキシエチレンプロピルアミンを得た。得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルアミンのアミン純度は９８．８％であった。
得られたメトキシポリオキシエチレンプロピルアミン１６４ｇ、トルエン３２５ｍＬを攪拌機、温度計、冷却管および窒素バブリングラインのついた１Ｌ四つ口フラスコに仕込み、５０℃に加温して溶解した。これに無水マレイン酸３２ｇを加え、４時間攪拌して反応した。反応終了後、サンプリングを行ったところ、無水マレイン酸の含有量は１５重量％であった。無水酢酸５００ｍＬ、酢酸ナトリウム６４ｇを仕込み、９０℃まで加温した。以下、実施例１と同様の操作を行い、メトキシポリオキシエチレンプロピルマレイミド１６４ｇを得た。得られた結晶は濃茶色であった。
比較例３
比較例３としてメトキシポリエチレングリコールマレイミド（分子量５０００、Ｆｌｕｋａ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６３１８７［Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ５，０００  ｍｌｅｉｍｉｄｅ］）を用いた。
【００４６】
実施例１〜３および比較例１〜３で得られたポリオキシアルキレン誘導体について、ＧＰＣ純度およびマレイミド基導入率について比較した。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0004123856.tif 000011
【００４８】
本発明の製造方法で得られたポリオキシアルキレン誘導体は、ＧＰＣ純度、マレイミド基導入率とも高純度であるのに対して、本発明の範囲外である比較例はＧＰＣ純度、マレイミド基導入率ともに本発明の要求を満足するものは得られなかった。
【００４９】
実施例１および比較例３で得られたポリオキシアルキレン誘導体について、加水分解安定性について比較した。結果を表２に示す。試験方法は次の通りである。
加水分解安定性試験
試料０．１ｇを５０ｍＬスクリュー管に採取し、１００ｍＬのｐＨ７に調整した５０ｍＭリン酸緩衝液で溶解する。溶解後、２３℃で２４時間、４８時間、７２時間後にそれぞれ４ｍＬとり、１％リン酸水溶液を数滴加えた後、凍結乾燥を行った。これをクロロホルムに溶解し不溶物を濾別し、エバポレーターで濃縮して得られたものについて1Ｈ−ＮＭＲを測定してマレイミド基導入率を算出した。初期マレイミド基導入率に対する変化率を表２に示す。
【００５０】
【表２】
0004123856.tif 000012
【００５１】
これらの測定結果から得られた５０％減衰時間（半減期）は実施例１が６７時間、比較例３が４６時間であり、２５％減衰時間については、それぞれ３３時間、２３時間、７０％減衰時間については、それぞれ９４時間、６４時間であった。
また、実施例１および比較例３のポリオキシアルキレン誘導体により修飾したリゾチームの安定性について比較した。結果を表３に示す。試験方法は次の通りである。
リゾチームのチオール化
ニワトリ卵白リゾチームをｐＨ７．４のリン酸緩衝液に溶解して０．５ｍＭとし、４℃に冷却しながらリゾチームに対し２．５倍モル量の２−イミノチオラン塩酸塩（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を加えて一晩攪拌し、リジン残基の側鎖アミノ基をチオール化した。これに２倍モル過剰の実施例１および比較例３で得られたポリオキシアルキレン末端マレイミド誘導体を加え、冷却しながら３時間反応させた。無機塩を除去後、凍結乾燥してポリオキシアルキレン誘導体により修飾したリゾチームを得た。
【００５２】
修飾リゾチームの安定性試験
修飾リゾチーム０．１ｇをｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液（４−ヒドロキシ安息香酸メチル０．１％）２０ｍＬに溶解し、４０℃で所定時間保持して修飾リゾチームの活性を測定した。
修飾リゾチームの活性測定法は以下の通りである。
マイクロコッカス・リソデイクチクス（ＭＬｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｓ）の乾燥菌体を適量とり、７５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）を加えて振り混ぜ、７５ｍＭリン酸ナトリウムを対照として波長６４０ｎｍの吸光度が１．００になるように調整し、基質溶液とした。また、リゾチーム量が５〜１５μｇ／ｇになるように精製水で調整し、試料溶液とした。
３７℃に保った基質溶液３．０ｍＬに対し試料溶液を０．１ｍＬ加え、攪拌した後、７５ｍＭリン酸ナトリウムを対照として波長６４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
【表３】
0004123856.tif 000013
【００５４】
上記の結果から、ポリオキシアルキレン鎖とマレイミド基の間に炭素数２のアルキル基をもつ比較例３のポリオキシアルキレン誘導体は、実施例と比較して化合物単体での安定性、酵素修飾を行った後の酵素の活性も著しく劣ることがわかる。