(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面結合した触媒性部分を発現し得る、組換えウイルス又は有機体（organisms）の採取方法であって、
前記触媒性部分を発現する組換えウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、所望の基質を有する支持体の表面と接触させることにより、前記触媒部分を、前記基質へ結合させて、前記基質の反応を触媒させ、次いで、前記表面結合した触媒性部分を発現する前記組換えウイルス又は有機体からなる第一の付属集団（subpopulation）を、前記基質から放出させる工程を含み、
（ａ）前記組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と、前記支持体表面の第一の地点で接触させ、前記放出された第一の付属集団が前記表面の第二の地点までの距離を移動するのに充分な時間経過後、前記第一の付属集団を前記第二の地点から単離する工程；
（ｂ）前記組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と接触させて結合させ、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第一の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに十分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して、前記第一の付属集団を収集する工程；及び
（ｃ）前記組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と、前記集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第一の付属集団が前記所望の基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第一の付属集団を採取する工程
からなる群から選択される工程を使用して、前記組換えウイルス又は有機体からなる第一の付属集団を単離する、方法。
【請求項２】
前記触媒性部分を発現する組換えウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と、前記支持体表面の第一の地点で接触させ、前記放出された第一の付属集団が前記表面の第二の地点までの距離を移動するのに充分な時間経過後、前記第一の付属集団を前記第二の地点から単離することによって、前記第一の付属集団を選択して単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記触媒性部分を発現する組換えウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と接触させて結合させ、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第一の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに十分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して、前記第一の付属集団を収集することによって、前記第一の付属集団を選択して単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記触媒性部分を発現する組換えウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、前記所望の基質と、前記集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第一の付属集団が前記所望の基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第一の付属集団を採取することによって、前記第一の付属集団を選択して単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中の、表面結合した触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体を、無触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体に対して増加させる方法であって、
前記触媒性部分を有するウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を含有する第一の試料を、所望の基質と、支持体表面の第一の地点で接触させることにより、前記触媒部分を前記基質に結合させて、前記基質の反応を触媒させ、次いで、前記表面結合した触媒性部分を有する前記組換えウイルス又は有機体からなる第一の付属集団を、前記基質から放出させ、
前記放出された第一の付属集団が前記表面の第二の地点までの距離を移動するのに充分な時間経過後、前記第一の付属集団を前記第二の地点から単離して、前記第一の試料から、前記触媒部分を有する付属集団を前記第一の試料より多く含む第二の試料を得る、方法。
【請求項６】
前記触媒部分を有する第一の付属集団の移動を、前記支持体表面に電場を印加することにより促進させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料中の、触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体を、無触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体に対して増加させる方法であって、
前記触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体を含む可能性のある組換えウイルス又は有機体の集団を含有する第一の試料を、支持体表面の所望の基質と接触させて結合させ、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第一の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに充分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して前記第一の付属集団を収集して、前記第一の試料から、前記触媒部分を有する付属集団を前記第一の試料より多く含む第二の試料を得る、方法。
【請求項８】
前記触媒性部分を発現する組換えウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、前記基質を有する支持体の表面と接触させた後、且つ前記表面を洗浄して、前記表面から前記触媒性部分を有する第一の付属集団を収集する前であって、結合活性を有する組換えウイルス又は有機体が基質に結合するために前記第一試料の前記接触から充分に後で、前記触媒性部分を有する第一の付属集団が触媒反応を完了するよりも短い時間の時点で、
前記支持体の表面を洗浄することにより、
前記基質に対して弱い親和性を有するか、又は親和性を有しない、組換えウイルス又は有機体を除去する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料中の、触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体を、無触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体に対して増加させる方法であって、
前記触媒性部分を有するウイルス又は有機体からなる第一の付属集団を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を含有する第一の試料を、支持体表面の所望の基質と、前記集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第一の付属集団が前記所望の基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第二の温度で放出される前記第一の付属集団を収集して、前記第一の試料から、前記触媒部分を有する付属集団を前記第一の試料より多く含む第二の試料を得る、方法。
【請求項１０】
前記触媒性部分が、触媒性抗体又はその触媒性を有する一部分である、請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
表面結合した触媒性部分を発現し得る組換えウイルス又は有機体を採取する方法であって、
触媒性部分を発現するウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、不動化した基質又はハプテンを含有するメジウムと接触させ、前記基質又はハプテンに結合する第一の付属集団を採取し、
前記第一の付属集団を、所望の基質を有する支持体表面と接触させることにより、前記触媒部分を前記基質へ結合させて、前記基質の反応を触媒させ、次いで、前記触媒性部分を有するウイルス又は有機体からなる第二の付属集団を、前記基質から放出させる工程を含み、
（ａ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と、前記表面の第一の地点で接触させ、前記放出された第二の付属集団が前記表面の第二の地点までの距離を移動するのに充分な時間経過後、前記第二の付属集団を前記第二の地点から単離する工程；
（ｂ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と接触させて結合させ、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第二の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに充分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して、前記第二の付属集団を収集する工程；及び
（ｃ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と、前記第一の付属集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第二の付属集団が前記基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第二の付属集団を採取する工程
からなる群から選択される工程を使用して、前記組換えウイルス又は有機体からなる第二の付属集団を単離する、方法。
【請求項１２】
表面結合した触媒性部分を発現することができる細胞ラインの産生方法であって、
触媒性部分を発現するウイルス又は有機体を含む可能性がある組換えウイルス又は有機体の集団を、不動化した基質又はハプテンを含有するメジウムと接触させ、前記基質又はハプテンに結合する第一の付属集団を採取し、
前記第一の付属集団を、所望の基質を有する支持体表面と接触させることにより、前記触媒部分を前記基質へ結合させて、前記基質の反応を触媒させ、次いで、前記触媒性部分を有するウイルス又は有機体からなる第二の付属集団を、前記基質から放出させる工程を含み、
（ａ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と、前記表面の第一の地点で接触させ、次いで、前記放出された第二の付属集団が前記表面の第二の地点までの距離を移動するのに充分な時間経過後、前記第二の付属集団を前記第二の地点から単離する工程；
（ｂ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と接触させて結合させ、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第二の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに十分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して、前記第二の付属集団を収集する工程；及び
（ｃ）前記第一の付属集団を、前記所望の基質と、前記集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第二の付属集団が前記基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第二の付属集団を採取する工程
からなる群から選択される工程を使用して、前記組換えウイルス又は有機体からなる第二の付属集団を単離し、
組換えウイルスにより感染させることができる宿主に、前記第二付属集団からなるウイルスを感染させる、方法。
【請求項１３】
前記不動化した基質又はハプテンを含有するメジウムが、不動化した基質又はハプテンを含有するアフィニティカラムを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の付属集団の採取が、前記組換えウイルス又は細胞の集団を、不動化したハプテンのアフィニティカラムに通し、
前記アフィニティカラムに結合する付属集団を溶出することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二の付属集団の単離が、
前記第一の付属集団を、前記所望の基質と接触させて結合せて、
前記支持体の表面を洗浄して、前記所望の基質に対する結合活性も触媒活性も有しない組換えウイルス又は有機体を除去し、
前記第二の付属集団が、前記所望の基質の反応を触媒し、前記表面から放出されるのに十分な時間が経過した後、前記表面を洗浄して、前記第二の付属集団を収集することを含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の付属集団の採取が、前記組換えウイルス又は細胞の集団を、不動化したハプテンのアフィニティカラムに通し、
前記アフィニティカラムに結合する付属集団を溶出することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の付属集団の単離が、
前記第一付属集団を、前記基質を有する支持体の表面と接触させた後、且つ前記表面を洗浄して、前記表面から前記触媒性部分を有する第二の付属集団を収集する前であって、結合活性を有する組換えウイルス又は有機体が該基質に結合するのに前記第一の付属集団の前記接触から充分に後で、前記触媒性部分を有する組換えウイルス又は有機体が触媒反応を完了するよりも短い時間の時点で、
前記支持体の表面を洗浄することにより、
前記基質に対して弱い親和性を有するか、又は親和性を有しない、第四の付属集団を除去する工程を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二の付属集団の単離が、
前記第一の付属集団を、前記所望の基質と、前記第一の付属集団と前記基質との結合は生じるが、前記触媒性部分による触媒作用は実質的に発揮されない第一の温度で接触させ、
次いで、前記第一の温度を、前記第二の付属集団が前記基質の反応を触媒し前記表面から放出される、前記第一の温度より高い第二の温度に上昇し、
前記第二の付属集団を採取することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質から放出された触媒部分を有するウイルス又は有機体からなる第二の付属集団の移動を、前記基質を有する支持体表面に電場を印加することによって促進させる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えウイルスが、ｆｄ又はＭ１３ファージであり、そして触媒性部分が、エステル加水分解を触媒することができる触媒性抗体又はその触媒性を有する一部分である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えウイルスが、ｆｄ又はＭ１３ファージであり、そして宿主がE.coliである、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞ラインが、E.coli細胞ラインである、請求項１２から２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は触媒性部分の選別方法、触媒性部分含有試料中の触媒性部分の濃度を増加させる方法、およびまたこのような方法による実質的に純粋もしくは濃縮された触媒性生成物に関するものである。本発明はまた、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するウイルスを含有する可能性がある組換えウイルス集団の選別または濃縮方法に関するものである。本発明はまた、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現し、触媒作用を発揮する組換えウイルスの検出に関するものである。本発明はさらにまた、感染の可能性がある宿主に、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えウイルスを感染させることによって、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えウイルスまたは細胞ラインを産生させる方法に関するものである。本発明はまた、上記方法により得られる触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する、実質的に純粋な組換えウイルスまたは細胞の集団に関するものである。
発明の背景
本明細書の記載の全体をとおして、公知刊行物はカッコ内の数字により示されている。これらの数字は、本明細書の最後の部分に記載の参考文献リストの数字に対応する；これらの参考文献の全部を引用してここに組み入れる。
ウイルスは細胞に感染し、この細胞の生合成器官を転換させて、ウイルス子孫を合成する。ある種のウイルスは宿主細胞に感染し、宿主ＤＮＡを分解し、細胞内でウイルスの子孫を生じる。これにより細胞は、この成熟ウイルス子孫の放出を伴い溶解する。他のウイルスは溶原性である。これらのウイルスは宿主細胞に感染し、そのウイルスＤＮＡが宿主染色体の領域に挿入される。そこで世代交代の間に、生成された細胞ライン（感染細胞の複製からの）は、このウイルスの遺伝子産物を発現する。元の感染細胞の子孫は、その染色体からウイルスＤＮＡを自発的に放出することができ、あるいはその染色体からのウイルスＤＮＡの自発的放出を誘発させることができ、これによりウイルス子孫がもたらされる溶解サイクルが生じる。この後者のタイプのウイルスの例には、ラムダファージがあり、これはある機会に、例えばある種の化学物質または紫外線などの照射にさらされると、感染直後に溶解サイクルを開始することができるが、その他の点に関しては、かなりの世代にわたりイー．コリ（E.coli）宿主ゲノムにプロウイルスまたはプロファージとして存在することができる。
抗体分野における近年の開発は、抗体またはその一部分のヌクレオチド配列のポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）により拡大されている（１）。この開発の拡大部分には、これらの配列のウイルスゲノム、特にファージまたはバクテリオファージへの挿入がある（２、３、４、１１）。これらの点に関して、参考文献として、１９９２年１月２３日付けで発行された、「特異結合対のメンバーの生成方法（Methods For Producing Members of Specific Binding Pairs）」と題するＰＣＴ特許公開ＷＯ９２０１０４７を挙げることができ、この特許を引用してここに組み入れる。同様に、ファージの表面上の触媒活性酵素の発現も達成されている（３２）。
一例として、クラクソン等（Clackson et al.）（２）は、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）に対して感作されているマウスから、Ｈ−鎖（Ｖh）およびカッパ（ＶK）Ｌ−鎖に係わる再整列配列のランダム組み合わせライブラリイを使用して、このｆｄファージの表面上に抗体フラグメントの種々のライブラリイを表示させたことを報告している。この組換えｆｄファージは、その集団をアフィニティカラム上に通すことによって選別されている。
同様に、マカファーティ等（MaCafferty et al.）（３）は、完全抗体Ｖドメインを、組換えｆｄバクテリオファージの表面上に表示できること、および抗体に結合する（例えば、１００万分の１）、これらの完全抗体Ｖドメインをアフィニティ  クロマトグラフィにより単離できることを報告している。そしてまた、マカファーティ等（３２）は、バクテリオファージの表面上における機能性アルカリ性ホスファターゼの発現およびアフィニティクロマトグラフィを報告している。
同様に、ヒューズ等（Huse et al.）の刊行物（４）は、バクテリオファージ  ラムダベクター系を使用して、Ｆａｂフラグメントの組み合わせライブラリイをE.coliで発現させることに関連している。この発現の選別は抗体に対する結合選択性によって行われている。
ハプテンまたは抗原に対する結合性または親和性により、触媒性抗体あるいはその触媒活性部分を発現する可能性がある組換えファージを選別する技術が伴う問題には、初めに多大数のファージ、例えば１０5以上の程度のファージが得られることにある。この大多数のファージ集団からハプテン結合に係わり選別を行うと、依然として大多数の、例えば６，０００−１０，０００ファージの程度のファージ付属集団（結合性のもの）が得られる。しかしながら、この結合性の第一付属集団の中にはまだ、それらの表面上で抗体を発現する（従って、ハプテンに結合する）ばかりでなく、また触媒性抗体である（すなわち、発現された抗体またはその一部が触媒性である）狭い群の第二のファージ付属集団が存在する。従って、第一付属集団（すなわち、抗原またはハプテン結合性の集団）のみを単離する技術は、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するものを単離する、組換えファージ集団の選別法としては不適である。すなわち、ハプテン結合性による選別は、後続の使用のために、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に感染させ、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージまたは細胞の一定の発生を生じさせるために、組換えファージ集団から触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するものを単離するには不充分である。広い観点において、触媒性抗体などの触媒の開発で直面する問題として、超過剰の無触媒性部分、例えば同一遷移状態の類縁体に対して誘発される超過剰の無触媒性部分の中から、所望の触媒活性を示す部分、例えば抗体、を選別するか、またはこのような部分に富んだ部分の選別を経済的に行うことができないという問題がある。
さらにまた、抗体フラグメントの触媒活性の従来の選別方法（過度の選別操作によるそれらの同定とは異なる）は、該当フラグメントを発現する有機体における遺伝的欠失を補償する能力に基づく生物学的選別に依存している（１６）。従来、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えウイルスまたはこのようなウイルスで感染された細胞を、これらのウイルスまたは細胞の触媒性に基づき選別する方法は存在していない。
酵素学分野の刊行物（５，６）では、メカニズム−ベース  インヒビター（アフィニティ標識または自殺基質）と称される反応体が報告されている。これらの反応体は正常基質と同様に酵素の活性部位に結合するが、正常基質に反して、反応メカニズムの化学的特徴を利用して、酵素との不可逆性付加物を形成する。このような反応体が、多くの酵素および酵素メカニズムで特別にデザインされている。一般に、正常基質で沈殿する、求核性酵素アミノ酸残基はむしろメカニズム−ベース  インヒビターと反応し、そして永久的に不活性化される。自殺基質であるハプテンは、抗体の誘発に使用されている（１４）。これらの自殺基質は、触媒活性を有する抗体の選別には使用されていない。
従って、従来、組換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団からの触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する一団を選別するために、または触媒性部分を発現する一団を濃縮するために、メカニズム−ベース  インヒビターが適用されたことはなかった。触媒性部分、例えばファージ、細胞、またはその他の自己複製性系、あるいは触媒性ペプチド、オリゴペプチド類、ポリペプチド類、または酵素により発現される触媒性部分を選別するためにメカニズム−ベース  インヒビターをいかなる方法でも利用したことはなかった。また、触媒性部分を含有する試料中の触媒性部分の濃度を増加させるために、メカニズム−ベース  インヒビターをいかなる方法でも利用したことはなかった。
酵素を使用する研究で、活性酵素は基質で覆われている二次元表面を「はうように」横切ることができるが（マイクロメーター距離規模で）、この基質に対して同一の結合親和性を有する不活性酵素は、それらの移動性が格別に制限されることが証明されている（７，８，９）。しかしながら、従来、組換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団からの触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する一団を選別するために、あるいは触媒性部分を発現する一団の濃度を増加させるために、所望の触媒反応の基質を含む二次元表面を利用したことはなかった。触媒性部分の選別に、あるいは触媒性部分を含有する試料中の触媒性部分の濃度の増加に、触媒加速移動を利用したことはなかった。
固相不動化抗原に結合する抗体の運動力学は研究されている（１０）。しかしながら、このような表面結合に基づいては、触媒性部分からの無触媒性部分の分離は行われていない。例えば、インキュベーション時間に関係なく、同一の親和性を有する基質に対して結合する無触媒性部分を発現させ、一方で初期にはこの基質に結合するが、触媒作用を一旦生じると解離する触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する該当ファージまたは感染細胞に基づいて、組換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団が選別または濃縮されたこともない。触媒性部分を含有する試料中の触媒性部分の選別に表面結合性が使用されたことはない。
さらにまた、結合および酵素による触媒作用に対する温度の影響は研究されているが（１２）、触媒性部分の選別に、または触媒性部分を含有する試料中の触媒性部分の濃度の増加に、または触媒性部分を発現する組換えファージまたは組換えファージ感染細胞の選別あるいは濃縮に、触媒性部分の基質結合性（非触媒は非結合性）に係わる、温度の関数としての不連続性が使用されたこともない。
クロマトグラフィ  カラムにおける分子の保持性を変更させる、種々の競合性可溶性リガンド、例えば固体支持体に共有結合した基に対して比較的弱い親和性を有するリガンド、の存在の下における「弱親和性クロマトグラフィ」（１７）およびその触媒メカニズムの原理は研究されているが、従来技術において、無触媒からの触媒の単離または選別に、あるいは触媒の濃縮に、競合による触媒結合性の変化が利用されたことはない。
触媒性部分の運動学的理論および本質的に、かつまた実質的に触媒作用を付随する熱力学的理論に基づいて触媒性部分を選別できることが望ましい、すなわち反応−ベース選別は望ましい方法である。また、反応に基づいて、試料中の触媒性部分の濃度を増加させることができ、そして触媒性性質を利用することによって、その濃度の増加を達成できること、すなわち触媒性部分の濃度増加を得ることができることは望ましいことである。さらにまた、触媒性部分を発現する組換えウイルスまたは組換えウイルス感染細胞集団の選別あるいは濃縮を触媒性に基づいて行うこと、すなわちこのような集団の反応−ベース選別または濃縮は望ましいことである。
前述したように、組換えファージ集団から抗体を発現するものを選別する（例えば親和性またはハプテン結合性による）ことができるばかりでなくまた、この集団から、触媒性抗体またはその部分、触媒性酵素、あるいはさらに一般的な触媒性部分を発現するものを選別することができることは望ましいことである。例えば、この集団の中の触媒性抗体またはその部分を発現するものは、引き続く集団（抗体またはその一部を発現しないもの、またはこれを発現するが、触媒性ではないものが実質的に夾雑していない集団）の産生に使用できることから、あるいはまた所望の反応（触媒性抗体またはその部分を発現しないものによる夾雜が最低であるか、または触媒性抗体またはその部分を発現しないものの濃度が減少されている反応）を触媒させるために使用できることから、触媒性に基づく選別は望ましい手段である。組換えファージまたは組換えファージ感染細胞の産物を使用しようとする研究のシナリオでは、この集団の中の抗体またはその部分を発現するが、触媒的に活性ではない形態のものは反応系において有害であることは確かなことである。これは、これらが、基質に対して、触媒性ファージまたは触媒性部分と競合できるからである。同様に、組換えファージ集団を使用して、これを細胞に感染させ、モノクローナル抗体を産生させる場合に、この集団の反応−ベース選別は、この集団を引き続くモノクローナル抗体を産生させるためのさらに狭い群の集団に減少させることを含む労力の節約に望ましい手段である。
従って、組換えファージまたは組換えファージ感染細胞集団の選別または濃縮を、触媒活性に係わり反応−ベースで行うことができることは望ましいことである。
発明の要旨
従って、本発明は、触媒活性を有する部分の反応−ベース選別からなる触媒性部分の選別およびまたこれらの部分の単離方法を提供するものである。本発明はまた、触媒活性を有する部分を反応−ベース選別に付し、これらの部分を単離することからなる、試料中の触媒性部分の濃度を増加させる方法を提供する。この選別は、メカニズム−ベース  インヒビター、触媒加速移動、表面結合、温度の関数としての結合の不連続性または競合による結合性の変更を使用する方法により行うことができる。
本発明はさらにまた、触媒性抗体またはその触媒性部分などを発現する、組換えウイルスまたは細胞、例えば組換えウイルス感染細胞の選別方法およびまたウイルスまたは細胞試料中のこのようなウイルスまたは細胞の濃度を増加させる方法を提供し、この方法は、下記の工程からなる：
触媒性部分を発現するウイルスまたは細胞を含有する可能性がある組換えウイルスまたは細胞の集団の触媒活性を反応−ベース選別に付し、次いで
この集団から、触媒作用を発揮できる付属集団を単離する。
同様に、本発明は、触媒性抗体またはその触媒性部分などの触媒性部分を発現することができる細胞ラインまたは組換えウイルスの産生方法を提供し、この方法は、下記の工程からなる：
触媒性部分を発現するウイルスを含有する可能性がある組換えウイルスの集団の触媒活性を反応−ベース選別に付し、
この集団から、触媒作用を発揮できる付属集団を単離し、次いで
この付属集団のウイルスを含有する組換えウイルスにより、感染させることのできる宿主を感染させる。
反応−ベース選別は、メカニズム−ベース  インヒビター、触媒加速移動、表面結合性、温度の関数としての結合の不連続性、あるいは競合による結合性の変更を使用することによって行うことができる。これらの態様はまた、反復を包含するものである。所望により、例えば反応−ベース選別は、単離工程の後に反復することができる；この反復は同一技術によって行うことができる（例えば、触媒加速移動の反復）、あるいは別種の技術によることもできる（例えば、一回目の表面結合、メカニズム−ベース  インヒビター、触媒加速移動、温度の関数としての結合の不連続性、あるいは競合による結合性の変更による反応ベース選別工程中における触媒加速移動を、引き続く反応−ベース選別工程中に使用する）。
本発明はさらにまた、触媒性部分（たとえば、触媒性抗体またはその触媒性部分）を発現する組換えウイルスまたは細胞の検出方法、あるいは試料中のこのようなウイルスまたは細胞の濃度の増加方法を提供し、この方法は、下記の工程からなる：
触媒性部分を発現するウイルスを含有する可能性がある組換えウイルスまたは細胞の集団を、選択されたハプテンに対する結合性に係わり選別し、
この集団から、この選択されたハプテンに結合できる第一付属集団を単離し、
この第一付属集団を、触媒活性に関して反応ベース選別に付し、次いで
この第一付属集団から、触媒作用を発揮することができる第二付属集団を単離する。
同様に、本発明はまた、触媒性部分を発現することができる組換えウイルスまたは細胞ラインを産生する方法を提供し、この方法は、下記の工程からなる：
触媒性部分を発現するウイルスを含有する可能性がある組換えウイルスの集団を、選択されたハプテンに対する結合性に係わり選別し、
この集団から、この選択されたハプテンに結合できる第一付属集団を単離し、
この第一付属集団を、触媒活性に関して反応ベース選別に付し、
この第一付属集団から、触媒作用を発揮することができる第二付属集団を単離し、次いで
組換えウイルスにより感染する可能性がある宿主に、この第二付属集団のウイルスを感染させる。
選択されたハプテンに対する結合性に係わる選別は、集団を不動化したハプテンのアフィニティカラム上に通すことからなることができる。この点に関して、第一付属集団の単離は、集団中のこのアフィニティカラムに結合する部分を溶出することからなることができる。
触媒活性に係わる選別は、メカニズム−ベース  インヒビターを使用して行うことができる；例えばこの選別は、第一付属集団をメカニズム−ベース  インヒビターと接触させ、反応混合物を生成させることからなることができる。そしてまた、この第二付属集団の単離は、この反応混合物をハプテンアフィニティカラム上に通し、不動化ハプテンに結合していないウイルスまたは細胞を採取することからなることができる。第一付属集団とメカニズム−ベース  インヒビターとの接触はまた、第一付属集団を粒子に結合させたインヒビターとの接触によって、例えばインヒビターが脱離性基により結合しているカラム上に、第一付属集団を通すことによって行うことができる。この場合の第二付属集団の単離は、インヒビター−ウイルス（または細胞）複合体をカラムから脱離させるか、またはインヒビター−ウイルス（または細胞）粒子状複合体を分離することからなることができる。
別法として、触媒活性に係わる選別は、触媒加速移動を採用して行うこともできる。例えば、この選別は、所望の触媒反応の基質を含有する表面と第一付属集団とを接触させ、ここでこの接触を当該表面の第一の地点で生じさせ、次いで第一付属集団中の触媒活性を有するものが当該表面の第二の地点まで離れて移動するのに充分の時間の後に、この第二の地点で、第一付属集団中の一団を検出することからなることができる。この別法において、第二付属集団の単離は、表面上のこの第二の地点から第一付属集団中の一団を採取することからなることができる。
もう一つの別法においては、触媒活性に係わる選別は、表面結合により行うことができる。例えば、この選別は、第一付属集団中の触媒活性を有していない一団は結合し、一方第一付属集団中の触媒活性を有する一団は結合し、次いで触媒作用を発揮する、所望の触媒反応の基質を含有する表面と第一付属集団とを接触させ、次いでこの第一付属集団中の触媒活性を有していない一団が当該表面と平衡に近付くには充分であるが、第一付属集団中の触媒活性を有する一団が当該基質を消費する時間よりも短い時間の後に、当該表面を洗浄して、第一付属集団中の触媒活性を有する一団をここから分離することからなることができ、そしてこの第二付属集団の単離はこの洗浄液を採取することからなることができる。このもう一つの別法において、触媒活性に係わる選択はまた、表面を洗浄して、第一付属集団中の触媒活性を有する一団を洗出する前であって、第一付属集団中の触媒活性を有する一団と第一付属集団中の触媒活性を有していない一団との両方が接触して、そこに結合するのに充分の時間であって、第一付属集団中の触媒活性を有する一団が当該基質を消費するか、またはその触媒作用を完了する時間よりも短い時間の後に、当該表面を洗浄して、この第一付属集団中の基質に対して弱い親和性を有するか、または親和性を有していない一団を分離することからなることもできる。
さらにもう一つの別法においては、反応−ベース選別は、温度の関数としての結合性のエンタルピー要素の変化によることができる。例えば、この選別は、第一付属集団を、第一の温度において基質と接触させ、次いでこの第一付属集団を、第一の温度よりも高い第二の温度において基質と接触させ、その後に見掛け上の結合に対する温度の作用が相違している第二付属集団を採取することからなる。この態様において、基質は、例えばカラムに不動化させることができ、この場合には、第一付属集団中の弱く結合している、または初めに溶出される一団と強固に結合している、または後で溶出される一団とをフラクションとしてそれぞれ採取し、これらのフラクションを再度、第二の温度で基質と接触させ、そのフラクションを再度、採取する。この第二の温度における基質との接触の後に採取されたフラクションを次いで、第一付属集団中のこの一団の相対濃度に係わり分析する：最低濃度（１種または２種以上）を有するフラクション（１つまたは２つ以上）は、第一付属集団中の触媒活性が最大の一団を含有している。これは、見掛け上の結合に対する温度の作用が相違していることに基づいている。この第一の温度は、結合は生じるが、触媒作用は発揮されないような低温であると好ましい。
さらにもう一つの別法では、触媒活性に係わる選別は、競合による結合性の変化によることができる。例えば、この選別は、移動性の無反応性基質類縁体の存在の下に、第一付属集団と不動化した無反応性基質類縁体とを接触させ、次いでここから当該不動化類縁体に結合する試料（１種または２種以上）を採取し、この試料（１種または２種以上）を、基質の存在の下に、当該不動化類縁体と接触させ、次いでここから第一付属集団中の大部分の一団とは見掛け上の結合性が相違している一団を採取することからなることができる。一例として、この不動化類縁体がアフィニティクロマトグラフィカラムに不動化されている無反応性基質類縁体である場合に、試料（１種または２種以上）を、基質の存在の下に、この不動化カラムと接触させると、主ピーク（１つまたは２つ以上）に比較して、後に、または直ぐに溶出されるフラクション（１つまたは２つ以上）が第一付属集団中の大部分の一団とは見掛け上の結合性が相違している一団である。
本発明の方法はまた、次工程に進行する前に、いづれかの一工程を反復して行う方法を包含する。一例として、初めの集団を選択されたハプテンとの結合に係わる選別に付し、次いでこの２回目の工程により結合した集団を単離し、反応−ベース選別工程で使用することができる。同様に、初めの「第一付属集団」を触媒活性に係わる反応−ベース選別に付し、次いで触媒作用を発揮できる第二付属集団をここから単離し、この第二付属集団を再度、反応−ベース選別に付し、この第二の「第二付属集団」を単離することができる。これらの工程の反復は、当該方法の生成物の触媒活性（発現）を増加または増強するために使用することができる。この二回目の反応−ベース選別は、一回目の反応−ベース選別と同一方法であってもよく、あるいは本発明の別の態様のいづれかによってもよい。さらに、本発明は、上記態様のさらに別の態様をも包含する。
従って、本発明はまた、前記の本発明の方法により生成される触媒性部分、例えば触媒性抗体またはその触媒性部分を発現できる組換えウイルスまたは細胞集団を提供する。これらの集団は、前記方法に従うかぎり実質的に純粋であり、触媒として作用しないウイルス、細胞またはその部分、あるいはハプテンに結合せず、かつまた触媒として作用しないものの、全部ではなくとも、大部分が除去されている。さらにまた、本発明は、前記本発明の方法により調製された触媒組成物を提供する。これらの触媒組成物には、前記ウイルスまたは細胞集団およびまたその他の触媒性部分が包含され、これらの組成物はまた、前記本発明の方法により無触媒性部分、あるいはハプテンに結合せず、無触媒性であるものの、全部ではなくとも、大部分が除去されているという点で、実質的に純粋である。本発明におけるウイルスは、Ｍ１３ファージまたはｆｄファージのようなバクテリアであることができ、従って宿主は、E.coliのようなバクテリアであることができる。
【図面の簡単な説明】
以下の詳細な説明において、添付図面が引用されており、これらの図面をここに組み入れる。これらの図面は本発明を必ずしも制限するものではなく、本発明を説明するものである。
図１および２は、縦軸に無反応性類縁体による第一の面積溶出プロフィール（ｖｏｌ．）および横軸に基質による第二の面積溶出プロフィール（ｖｏｌ．）を示す二次元分離プロフィールを示すものであり、小さい星印のピークは主ピークの溶出の前または後に溶出されたことを示し、従って引き続いて濃縮することができる、触媒含有フラクションを示している。
詳細な説明
抗体（またはその部分）の発現コードをウイルスゲノムに増幅、挿入することに係わる技術およびこれにより触媒性部分を発現できる一団を含有する可能性があるウイルス集団を得る技術は当業者にすでに認識されており（１，２，３，４，１１）、従ってこのような組換えウイルスがE.coliなどの宿主細胞の感染に使用できること、そして溶解サイクルが開始されるまで、この組換えウイルスが、触媒性部分を発現する細胞およびその子孫とともに宿主染色体中にプロウイルスまたはプロファージとして存在できることは当業者に認識されていることと見做される。また、触媒性部分を含有する試料を得る技術も当業者に認識されているものと見做される。従って、以下の説明は、触媒性部分、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現できるウイルスまたは細胞を含有する可能性がある、組換えウイルスの集団または細胞の集団から、あるいはその中の触媒性部分の存在を測定、選別、または濃縮しようとする試料から始めることにする。
本明細書で使用するものとして、「触媒性抗体（catalytic antibody）」および「触媒性部分（catalytic portion thereof）」は、その他の条件の全部（例えば、温度、反応体／基質濃度など）が同一であるものとして、対象の化学反応の速度を変更でき、かつまたこの化学反応により不可逆的に変性されず、従って当該反応で消費されない物質である。この物質はまた、触媒性抗体の１モルに対して、多モルの反応体／基質を変換する能力を示し、かつまたそのメカニズム上の観点から、反応体／基質に結合し、反応体／基質の生成物への変換を加速し、次いで生成物の放出を加速する作用をなし、およびまた平衡の位置を移動させることなく化学反応の速度を変更させる物質である。この定義は、理想的触媒の特徴であるが、実際には、最上の触媒でさえも、反応系の汚染により、または反応プロセス中の化学的または物理的劣化の結果として、阻害化もしくは脱活性化されることがある。当業者に周知の理由によって、真正の触媒動作は反応系の成分または反応環境の条件により明確ではないこともある。
さらにまた、本明細書で使用するものとして、「触媒性部分」の用語は、触媒作用を発揮する全ての部分を意味するものであり、この用語には、これらに制限されないものとして、「触媒性抗体」；「その触媒性部分」（触媒性抗体の）；触媒性ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、あるいは酵素またはその触媒性部分；自己複製性系により発現される触媒性部分：それらの遺伝子コードに触媒性分子またはその発現部分を含有し、自己複製性であるか、または必ずしも自己複製性ではなくてもよい、例えば触媒性分子が結合している、例えばそこに存在する蛋白質の結合作用により結合しているもの、例えば、裸のｍＲＮＡ、リボソームまたはポリソームなどが包含される。
本明細書で使用するものとして、「表面結合」の用語は、例えば表面に対する物理的吸引力による結合または化学的結合のどちらかで結合する部分に対して使用される。本明細書で使用するものとして、触媒性部分は好ましくは、触媒性部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡに対して直接に、あるいは触媒性部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを包含しているエンベロープに対して、表面結合しているものである。このようなエンベロープには、これらに制限されないものとして、細胞膜、ウイルスコート、または細胞壁が包含されうる。
触媒活性を表すには、ある種の作用上の定義が適当である。これらの表現方法には、以下の方法が包含される：
（１）Ｋcat、または「ターンオーバー数」；Ｋcat／Ｋuncat、「速度増加因子」（rate enhancement factor）およびＫm、「ミカエリス定数」。ターンオーバーは、生成物に変換できる反応体／基質のモル数／触媒性抗体１モル／単位時間を示す。例えば、分子が１分当たりで１０3の基質ターンオーバーを示し、そしてこの分子が室温およびその最適ｐＨにおいて、２４時間その触媒活性を維持する場合に、この触媒の各分子は総合して、１．４×１０6の変換を生じさせる触媒活性を示す。この総合変換数は、どんなに長い反応が行われても、１．０を決して越えることはない化学量論的反応における総合変換数とは区別されなければならない。速度増加因子は、その他の反応条件が同一であるとして、触媒の非存在下における反応速度に対する触媒の存在下における反応速度を表す、大きさのない数である。ミカエリス定数は、見掛け上の結合定数である。この定数は、反応速度が最大の２分の１である基質濃度に等しい：（Ｋcat／２において、［Ｓ］＝Ｋm）。
本発明に従う場合に、抗体は純粋な免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）、あるいは免疫グロブリンの抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆｖなどを包含することができる。触媒性抗体は、ある種の主要カテゴリーに包含される。第一のカテゴリーには、純理的にデザインされた触媒性抗体、すなわち標的抗原または基質に対する特異免疫感作により導入された抗原に対して誘発される抗体が包含される。このような触媒性抗体、それらの調製方法およびそれらの使用は、１９８９年１２月１９日付けで発行された米国特許４，８８８，２８１、１９８８年１２月２０日付けで発行された米国特許４，７９２，４４６および１９８７年６月１９日付けで出願された米国特許出願serial No.０６４，２３９および１９９１年１２月１０日付けで出願された米国特許出願serial No.８０５，５７６に記載されており、これらの記載を引用してここに組み入れる。触媒性抗体の第二のカテゴリーには、前記の第一のカテゴリーの触媒性抗体とは異なり、動物自身の細胞成分（自己抗原）に対する動物の免疫系によって産生される天然産生抗体が包含される。これらの「自己抗体」は、１９８９年４月２５日付けで出願された米国特許出願serial No.３４３，０８１に記載されており、これらの記載を引用してここに組み入れる。これらのタイプの触媒性抗体の両方、あるいはその触媒性フラグメントをコードするＤＮＡは、増幅させ、ウイルスゲノム中に挿入することができる（１、２、３、４参照）。第三のカテゴリーには、免疫感作を含まない方法によって発現される触媒性抗体が包含される。例えば、触媒性抗体は、予め誘発させた抗体をランダム化して、新しい特異性を有するが、免疫感作から誘発されたものではない抗体を発生させることによって得ることができる。
「化学反応」の用語は、少なくとも１種の反応体を少なくとも１種の生成物に変換させる反応を表す。このような化学反応には、例えばオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼなどの酵素により触媒されうる化学反応、およびまた例えば酸化、還元、付加、縮合、消去、置換、開裂および転移などの酵素が未知の化学反応が包含される。化学反応はまた、ペプチド結合の開裂であることもできる。本明細書で使用するものとして、ペプチド結合の用語は、２個の隣接するアミノ酸残基を連結するアミド結合を意味し、一般的に次式で表される：
0004125365.tif 000002
この式において、ペプチド結合はカッコ内に示されている。
アミノ酸は、そこにアミノ基、カルボキシル基、水素原子および「側鎖」と称される特別の基（上記式では、ＲaおよびＲbで表されている）が結合している炭素原子からなる。本明細書で使用するものとして、アミノ酸は、これに制限されないが、蛋白質の構築ブロックを構成している２０個の天然産出アミノ酸を包含する。隣接するアミノ酸のどちらかがプロリンである場合に、側鎖、ＲaおよびＲb、はそれぞれ、隣接する窒素原子に結合して、特徴ある５−員プロリン環を形成するものと当業者に理解される。
「基質」の用語は、化学反応における反応体と同義であり、これらに制限されないものとして、エステル、ペプチド、蛋白質、リン脂質、炭水化物（例えば、グリコーゲン、グルコースなど）および薬物（有害薬物および医薬、ならびに外部供給源からのプロドラッグを包含する）を包含する、多くの分子および生物分子のいづれかであることができる。この点に関しては、１９９１年８月５日付けで出願された審査中の出願serial No.０７／７４０，５０１および１９９１年１０月１０日付けで出願された同０７／７７３，０４２を挙げることができ、これらを引用してここに組み入れる。一例として、基質は１個または２個以上のエステル結合および１個または２個以上のペプチド結合を含有することができる。基質はまた、いづれかの蛋白質分子、例えば調節蛋白質または構造蛋白質であることができ、これらに制限されないものとして、ペプチドホルモン類（例えば、インシュリン、成長ホルモン、セクレチンなど）、ペプチド神経伝達物質、神経モジュレーター、神経ホルモン因子（例えばＶＩＰ、エンドフィリン類、エンケフィリン類、ブラディキニン類、物質Ｐなど）、腫瘍蛋白質（例えば、腫瘍遺伝子産物、癌胎児性抗原など）、これらに制限されないが、核蛋白質および膜蛋白質を含むバクテリア蛋白質およびウイルス蛋白質（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０、インフルエンザ糖蛋白質など）を包含する。基質はまた、抗原または自己抗原、すなわち動物の身体がそれ自身の遺伝子コードを用いて作り出す抗原であることができる。すなわち、自己抗原は、異種抗原（例えばバクテリア抗原、ウイルス抗原）とは相違するものである。本明細書で使用するものとして、「動物」の用語は、免疫系を有する全ての有機体を意味し、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。
Ｉ．メカニズム−ベース  インヒビター選別
Ａ．方法の概略
本発明のこの態様の一般的概略において、触媒性抗体またはその触媒性部分を潜在的に有するウイルスまたは細胞の集団、あるいは触媒性部分を含有する細胞が好適である：
１．不動化ハプテンのアフィニティカラム上を通過させたもの。結合しているものが、例えばｐＨの変化により、またはこのカラムに遊離ハプテンを通すことにより、溶出されるもの。
２．ａ．ハプテンアフィニティカラムに結合することが見出だされているウイルス、細胞または触媒性部分を、例えば適当にデザインされたメカニズム−ベース  インヒビターと混合し、次いで反応させて、混合物を生成させたもの。
２．ｂ．別様には、メカニズム−ベース  インヒビターをカラムなどの粒子に、例えば脱離性基により結合させることができるもの。ウイルス、細胞または触媒性部分を、このカラムに通し、結合したものは、カラムから溶出してさらに使用される（例えば、感染に）。これは、結合したものをカラムからのインヒビターの脱離により、またはカラムに酸性溶液などの適当な溶液を通すことにより、ウイルスまたは細胞の被膜を溶解させ、そこからＤＮＡを溶出し、その後に、このＤＮＡを使用して、宿主細胞を形質転換させるか、または組換え細胞またはウイルスを得、引き続き使用することによって行うことができる。
３．この態様の２．ａ．の別法では、適当な長さの経過時間の後に、ウイルス細胞または触媒性部分の混合物を、ハプテンアフィニティカラムにおいてクロマトグラフィまたは再クロマトグラフィに付す。この時間の間に流出した（ハプテンに結合しない）ウイルス、細胞または触媒性部分を採取する。これらのウイルスまたは細胞を使用して、E.coliなどの適当な宿主に感染させるか、または溶解サイクルを受けるようにし、そこから、例えば宿主感染または溶解から得られるウイルスをスケールアップし、触媒として使用するか、または触媒選別に使用する。この態様を以下にさらに詳細に説明する。
Ｂ．ハプテン  アフィニティクロマトグラフィ
好適態様において、メカニズム−ベース無活性化により触媒性選別を行う前に、抗体発現性のウイルスまたは細胞または触媒性部分を、例えばハプテンアフィニティクロマトグラフィにより、予備選別する。しかしながら、触媒性選別はまた、ハプテン結合による初めの予備選別を行うことなく実施することもできる。好適態様においては、ハプテンに結合するウイルス、ファージ、細胞または部分（＞６０００）を、メカニズム−ベース  インヒビターとの反応に付す。不動化したハプテンを使用する抗体保有ウイルスのアフィニティクロマトグラフィは、刊行物で成功裏に行われている（２，３，４）。最近の発明において、触媒選別の第一工程は好ましくは、ハプテンアフィニティクロマトグラフィのような結合を用いる。例えば、下記のエステル基質（ＩＩ）の加水分解が望まれる場合には、下記のハプテン（Ｉ）を使用すると好ましい：
0004125365.tif 000003
ハプテン（Ｉ）において、Ｒは、免疫感作中における、共有結合型蛋白質に対する、次いで固体マトリックス、例えばアフィニティクロマトグラフィカラムに対するリンカー（例えば、ＫＬＨまたはＢＳＡ）であり、そして基質（ＩＩ）において、Ｒ1は−Ｈまたは−ＮＯ2である。
同様に、下記のエステル類（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）の加水分解の場合に、下記のハプテン（ＩＡ）および（ＩＢ）が好ましく使用できる：
0004125365.tif 000004
0004125365.tif 000005
これらの構造式において、Ｍｅ＝メチル基であり、これらの化合物の製造および使用を開示する、１９９１年１０月１０日付の審査中の出願serial No.０７／７７３，０４２を引用してここに組み入れる。
このハプテンに結合するウイルス、細胞または部分は、ｐＨを変えることによって、または遊離ハプテンにより（この場合には、引き続いて透析して、結合したハプテンを分離する）溶離し、次いで引き続く工程に付す、すなわちメカニズム−ベース反応体（１種または２種以上）にさらす。
Ｃ．メカニズム−ベースインヒビターとの反応
この工程では、ハプテンに結合する単離付属集団を、適当なメカニズム−ベースインヒビター（アフィニティラベルまたは自殺基質）と接触させる。適当なメカニズム−ベース  インヒビターは、触媒的に活性の抗体またはその部分、例えばウイルス、ファージまたは細胞の外側表面に発現される触媒部分と不可逆性付加物を形成させる。一方、このようなインヒビターは、抗体またはその部分を発現するが、触媒性ではないウイルスまたは細胞とは不可逆性付加物を形成しない。ハプテンＩ、ＩＡ、またはＩＢによる免疫感作から生じるものと予想することができるエステル加水分解性抗体のメカニズム−ベース  インヒビターを以下に示す。その他のメカニズム−ベース  インヒビターは、エステル加水分解以外の反応に対して不活性であり、その他の反応を触媒できる、触媒性部分、例えば触媒性抗体の選別に使用することができることは周知である。メカニズム−ベース  インヒビターが存在する触媒反応には、シンテターゼ反応、ペプチダーゼ反応、酸化／還元反応、β−ラクタマーゼ反応、脱カルボキシル化反応、アミノトランスフェラーゼ反応、リアーゼ反応、ラセマーゼ反応およびヒドロキシラーゼ反応が包含される（５）。類似のインヒビターのデザインおよび使用は、これらのおよびまたその他の反応に関して、当業者により実施できることである。
一例として、前記のエステル分解反応の場合に、メカニズム−ベース  インヒビターは下記の構造を有する：
（ｉ）エステル基質（ＩＩ）の加水分解：
0004125365.tif 000006
0004125365.tif 000007
0004125365.tif 000008
これらの式において、Ｒ5はカラムに充填されているか、または液体（流動性）中に懸濁されていてもよい粒子に対する結合基であり、そしてｘはＢｒ、Ｉ、ＯＳＯ2ＣＨ3などの脱離性基である。インヒビターが流動性形態で使用される場合には、この結合基は存在する必要がないことは勿論のことである。
従って、ハプテン（Ｉ）により誘発された触媒性抗体、（または触媒性抗体またはその部分を産生するファージまたは細胞により誘発された触媒性抗体）を反応条件の下に、基質ＩＩと接触させた場合には、次の反応が生起する：
0004125365.tif 000009
すなわち、基質と触媒性部分、例えば触媒性抗体との間で錯体が生成され、その結果として、生成物（ｉ）および（ｉｉ）が得られ、触媒の再生が生じる。
しかしながら、インヒビター（ＩＩＩ）−（ＸＩ）の場合には、ハプテン（Ｉ）により誘発された触媒性抗体と反応条件の下に接触させると、その一部が触媒に結合したまま残り、これによりこの触媒が引き続き触媒として作用することを妨害する（再生の妨害）。従って、下記の表Ｉに示されているように、本発明によるその単離が可能になる。
0004125365.tif 000010
0004125365.tif 000011
（ｉｉ）エステル基質（ＩＩＡ）の加水分解
同様に、５−フルオロウリジンエステラーゼ反応の場合における、すなわち化合物（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）を反応条件の下に、相当する触媒（例えば、ハプテン（ＩＡ）または（ＩＢ）により誘発された触媒性抗体、あるいは触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するファージまたは細胞により誘発された触媒性抗体）と接触させることによって、化合物（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）を加水分解させて、５−フルオロウリジンを生成させる場合における、触媒のインヒビターを下記の表ＩＩに示す。このインヒビターの一部（反応性生成物）は、触媒に結合したまま残る。この表ＩＩにおいて、ｘおよびＲ5は前記定義のとおりである。
0004125365.tif 000012
0004125365.tif 000013
0004125365.tif 000014
0004125365.tif 000015
0004125365.tif 000016
上記エステル分解反応において、条件は一般に、次のとおりである：ｐＨ６．０−８．０、代表的には７．０、１０−１００ｍＭ、例えば３０−７０ｍＭ、代表的には５０ｍＭのヘペス（Hepes）、１００−３００ｍＭ、例えば１００−２００ｍＭ、代表的には１５０ｍＭのＮａＣｌ、温度２０−４０℃、通常３０℃および時間０．５−３時間。
Ｄ．アフィニティ分別によるウイルスまたは部分の分離
インキュベーションの後に、抗体またはその部分を担持しており、触媒性である、すなわちメカニズム−ベース  インヒビターと反応したウイルスまたは細胞はもはやハプテンとは結合しないのに対して、反応体と反応しなかった抗体担持ファージまたは細胞は、ハプテンに結合しつづける。従って、無触媒性ウイルスまたは細胞から、触媒性抗体またはその触媒性部分を表示するウイルスまたは細胞を分離するためには、第二ラウンドのハプテンアフィニティクロマトグラフィを徹底的に行うことができる。この処理は、前記のとおりに行われ、未反応のメカニズム−ベース  インヒビターからのウイルスまたは細胞の分離は不必要である。触媒性抗体ファージまたは細胞はこのカラムに結合しないが、無触媒性ファージはこのカラムに結合する。従って、結合しないでカラムを通過したウイルスまたは細胞は、触媒性抗体またはその部分を発現するファージである。これらのウイルスを使用して、適当な宿主に感染させる；例えば、ウイルスがＭ１３、ｆｄまたはラムダなどのファージである場合には、E.coliは適当な宿主である。感染の後に、ウイルスＤＮＡベクターにコードされている抗体をスケールアップし、引き続いて使用するか、または特徴確認する。特に、これらのファージによりE.coliを感染させることによって、このE.coliは触媒性抗体またはその部分を発現するファージ生産のための工場になることができ、あるいは触媒性抗体またはその部分の発現工場になることができる。感染したE.coliのウイルス産物または発現は、例えばエステル加水分解において、触媒として使用することができ、あるいは前記の選別により触媒として最も活性なウイルス（ファージ）および宿主（例えばE.coli）系の産生に使用することができる。同様に、細胞が触媒的に選別されており、その溶離物が採取されている場合には、この細胞は次いで、触媒性産生物の発現に使用することができる；あるいはまた細胞がウイルス感染により（この場合に、ウイルスはプロウイルスまたはプロファージである）触媒性産生物を発現する場合には、この細胞はまた、溶解サイクルを受けるように誘発させることができる。
別法では、このインヒビターを粒子に結合させる。広い観点において、カラムは、この粒子の例であり、これらの粒子を「充填」（不動化）する。インヒビターは好ましくは、開裂性基により粒子に結合させ、インヒビターとの反応は、例えばウイルス、細胞または触媒性部分をこのカラムに通すことによって、ウイルス、細胞または触媒性部分と接触させることにより行う。カラムを使用する場合に、無触媒は溶離され、触媒は結合する；そしてこれらの触媒は、インヒビター−触媒錯体をカラムから脱離させることによって、あるいはインヒビターからの別段の解離によって、分離される。例えば、ウイルス、ファージまたは細胞の場合に、このカラムに適当な液体、例えば酸を通し、次いでそこからＤＮＡを溶離して、後で使用する（形質転換、組換え）。
特に、特異的にデザインされたメカニズムベース  インヒビターを用いて選別された触媒性ファージ、ウイルス、細胞または部分は、インヒビターがカラムなどの固体マトリックスに不動化されている場合に、アフィニティクロマトグラフィを使用して無触媒から分離することができる。この態様において、触媒は、不動化したインヒビターとの反応の後に、回収することができることが望まれる。この目的を達成するためには、インヒビターを、カラムマトリックスから容易に脱離または解離させることができ、これにより触媒の回収が可能になる、１種または２種以上の分子（「開裂性基」または架橋）を介してカラムに結合させることができる。この開裂性基は、非共有結合または共有結合によりインヒビターをカラムマトリックスに結合させることができるものである。
実際には、適当な緩衝液中のファージ、ウイルス、細胞または部分の懸濁液を、そこに適当なインヒビターが開裂性基を介して不動化されているカラム上で溶離する。この実験方法を下記の経路で示す。この経路において、左側は共有結合型開裂性基の例であり、そして右側は非共有結合型解離性架橋基の例である。触媒は、インヒビターと反応することができ、インヒビター（左側および右側の両方ともに、中央の図）を介してカラム（支持体）に共有結合するが、インヒビターと反応できないものはカラムから洗出される（この経路図には示されていない）。このカラムを次いで、ほぼ５カラム容積の初期溶離液により洗浄する。
0004125365.tif 000017
この緩衝液は、触媒とインヒビターとの反応を最適にするように選択する。緩衝液による洗浄の後に、溶離条件を変更して、開裂性基の開裂（経路図の左側下方）または解離（経路図の右側下方）を生じさせ、インヒビターと反応したもの（触媒）を採取する。
非共有結合相互反応は、固体マトリックスへのインヒビターの有用な結合手段を提供する。インヒビターは、解離性非共有結合様相でカラムと相互反応することができるリガンドに対して共有結合する。このカラムは、インヒビターに結合しているリガンドに対して特異的に、緊密に相互反応する部分を提示するように変性されている、セファロース（Sepharose）６Ｂのような標準的固体マトリックスである。（一般的例では、酵素インヒビターはカラムに不動化されている。このインヒビターは、自殺基質の１種または２種以上の分子が提示されるように、その表面が共有結合型に変性されている、その相当する酵素に対して可逆的に、かつまた非共有結合様相で結合することができる）。変性カラムとリガンドとの相互反応は、溶離溶剤系の内容を変えることによって実験者がその親和性を故意に破壊するまで、高親和性の反応である（２１，２２）。このリガンドを溶離するための溶剤に対してなされる変更の種類は、非共有結合的に相互反応する一対の分子の選択に依存し、過度の実験を行うことなく当業者が決定できることである。溶離条件における変更の例には、リガンド競合、アロステリー修飾、基質溶離、インヒビター溶離、イオン強度の変化、有機溶剤または水性／有機性混合物への溶剤変更、温度変化、緩衝剤またはｐＨ変化、金属キレート溶離、カオトロピック試薬、または電気泳動脱着（２３）が包含される。固体支持体に対するインヒビターの非共有型の（しかし緊密な）結合に使用できる相互反応の特定の例を、以下の表ＩＩＩに挙げる。また、Pierce、Amicon、Sigma Chem.のカタログをまた参照でき、これらのカタログを引用してここに組み入れる（２４，２５，２６，２７）：
0004125365.tif 000018
インヒビターは、標準方法、例えば免疫学において、カルボジイミド  カプリングおよびハプテンのキーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンへのカプリングに使用されるその他のカプリングにより、右側欄に挙げられている分子に結合させることができる。
上記したように、非共有結合型錯体の解離に要する溶出条件は、選択された分子対に依存する。若干の特定の溶離剤の例を以下の表ＩＶに示す（また２１を参照することができる）。
0004125365.tif 000019
非共有結合の開裂性相互反応の代わりのものとして、開裂性基は、カラムとインヒビターとの両方に共有結合させることもできる。共有結合型開裂性基を脱離させることができる手段の一つは、これらを酵素基質にすることである。この基を接触開裂させる相当する酵素を、このカラムに通すことによって、この基を次いで開裂させる。多分、酵素による開裂の例の中で最も何にでも有効な手段は、プロテイナーゼ酵素を使用する手段である。インヒビターおよびカラムマトリックスは両方ともに、蛋白質基質にカプリングすることができ、″カラム−−プロテアーゼ基質−−インヒビター″結合をもたらす（ここで″−−″は、共有結合を表す）。この結合を相当するプロテアーゼにさらすと、プロテイナーゼ基質が加水分解され、カラムからインヒビターが放出され、結合している触媒の採取が可能になる。プロテイナーゼ基質のカラムへの結合およびまたインヒビターへの結合に係わるカプリング方法は、市販されている試薬を使用して、充分に確立されている（例えば、Pierce Chemical Co.カタログ参照）。
ペプチドに共有結合した開裂性基およびこれらの開裂に使用できる酵素の特定の例を下記の表Ｖに示す。挙げられているプロテイナーゼおよび基質はいずれも、精製形態で市販されている（例えば、Boehringer−Mannheimから）：
0004125365.tif 000020
その他の共有結合基は、温和な条件を用いて開裂させることができる。以下の表ＶＩに、チオール基またはアミノ基を有するインヒビターに結合することができ、かつまたチオールで処理することにより脱離させることができる、市場で入手できる若干の官能性化されたマトリックスを挙げる。この表ＶＩにはまた、必要な基質とマトリックスとの間の架橋基およびまたこれらの使用に係わる参考刊行物を挙げる。
0004125365.tif 000021
２つの方法に従うことができる。方法の１つでは、官能性化した自殺基質を、活性マトリックスまたはマトリックス／架橋基と反応させる。ウイルス、ファージ、細胞または部分の懸濁液を次いで、このカラムに通して溶出し、次いでインヒビターと反応させる。非共有結合したウイルス、ファージ、細胞または部分を洗出した後に、不動化されたファージ、ウイルス、細胞または部分を、メルカプトエタノールなどのチオールにより溶離することによって、カラムから脱離させることができる。
もう１つの方法では、官能性化したインヒビターを、ウイルス、ファージ、細胞または部分の懸濁液と反応させる。触媒性活性を有するファージ、ウイルス、細胞または部分は、インヒビターにより共有結合される。相応する時間の後に、このウイルス、ファージ、細胞または部分の懸濁液を活性マトリックスまたはマトリックス／架橋基のカラムに通し溶出させる。触媒性活性を有するファージ、ウイルス、細胞または部分のみが、インヒビターのチオール基またはアミノ基と活性マトリックスまたは架橋基との反応を経て保持される。これらのウイルス、ファージ、細胞または部分をチオールによる処理により脱離させることができる。
インヒビターのカラムへの結合に係わる前記方法と同様の方法がまた、移動性粒子に対するインヒビターの結合に、あるいはカラムまたは膜に対する非反応性基質類縁体または基質への結合に使用できることに留意されるべきであり、これらの方法を、本発明のもう１つの態様として以下で説明する。
別法として、インヒビターは充填されていない、または不動化されていない粒子、すなわちカラム中には存在していない粒子からなるか、あるいはこのような粒子に結合されていることもできる。この場合には、ウイルス、細胞または触媒性部分を、これらの粒子と接触させる。この場合にもまた、触媒は、これらの粒子に結合するが、無触媒性部分は結合しない。従って、無触媒から触媒を分離するには、接触の後に、これらの粒子を、例えば重力、濾過、遠心分離、電気泳動、または磁場により（粒子が磁気に応答する場合）、接触メジウムから分離する。粒子を単離した後に、これらの粒子は次いで、洗浄して、分離操作中に粒子に含まれることがある無触媒をいづれも除去すると好ましい。
これらの粒子は有利には、０．００１−２００μｍ、例えば０．０５−２００μｍまたは０．００１−１００μｍ、好ましくは０．１−１００μｍ、最も好ましくは０．５−１０μｍの径を有し、かつまたインヒビターに結合できる表面部分を有する、微粒子物質である。一例として、この微粒子物質は、デンプン、デキストラン類、セルロース類、蛋白質類、有機ポリマー類、スチレンコポリマー類、例えばスチレン／ブタジエンコポリマー、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレンコポリマー、ビニルアセチルアクリレートコポリマーまたは塩化ビニル／アクリレートコポリマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄酸化物、シリカ、シリカ混合物、および蛋白質様物質あるいはその混合物に交差結合させることもできる。本発明の粒子を用いる態様においては、広範囲の粒子を使用することができる。一般に、これらの粒子は１．０−５．０ｇ／ｍＬ、好ましくは１．１−２ｇ／ｍＬの比重を有する。最適比重の選択は、当業者の技術範囲にあり、重力駆動分離では、沈降速度を考慮する。
インヒビター組成物中の粒子の濃度はまた、広範囲の濃度を使用できる。一例として、この濃度は、１−１０，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは５−１０００μｇ／ｍＬの範囲にわたることができる。
本発明の実施方法で、濾過方式を使用する場合には、この濾過手段は好ましくは、平均直径として測定して、粒子の径の広くて０．０１−９０％、好ましくは粒子の径の広くて１０−９０％の孔寸法を有する。このフィルターの孔寸法は、無触媒は通過させるが、粒子に結合している触媒は通過しないような寸法であるべきである。
本発明のインヒビターに使用できる多くの磁性粒子が公開されている。一例として、米国特許第４，６２８，０３７号、同第４，６９５，３９３号、同第４，６９８，３０２号、同第４，５５４，０８８号、英国特許出願ＧＢ２，００５，０１９ＡおよびＥＰ０，１８０，３８４には、成功裏に使用できる種々の磁性粒子が記載されており、これらの記載を引用してここに組み入れる。これらの粒子は常磁性または強磁性であることができ、そしてまたインヒビター物質がカプリングして、本発明で使用できる磁性粒子が生成されるような、種々の物質により被覆されていてもよい。望ましくは、本発明で使用される磁性粒子は、少なくとも０．００１ｃｇｓ単位、望ましくは少なくとも０．０１ｃｇｓ単位の感受性を有する。これらの磁性粒子は、広範囲、すなわち水の比重よりも小さい、比重、例えば０．０１−５ｇ／ｍＬ、好ましくは０．５−２ｇ／ｍＬの比重を有することができる。これらの粒子寸法は０．００１−２００μｍ、例えば０．００１−１００μｍ、好ましくは０．０１−１０μｍの範囲にわたることができる。これらの粒子の濃度は、１−１０，０００μｇ／ｍＬの広範囲にわたることができ、好ましくは５−１０００μｇ／ｍＬである。
望ましくは、使用される磁性粒子は、例えばＥＰ０，１８０，３８４に記載されているように、低磁気応答性を有していて、磁場が取り除かれた後には、粒子が脱磁性化されるようにする。これらの磁性粒子の望ましい、比重、濃度および粒子寸法は、沈降時間が、少なくとも０．５ｍｍ／分であり、望ましくは、電気化学ルミネセンス粒子ベース分離方法（この方法は、本発明の粒子に有利に使用することができる）を包含する粒子ベース分離方法および粒子に関連して、上記速度以上であるように選択する。この点に関しては、１９９０年６月１８日付けで出願された審査中の特許出願ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．０７／５３９，３８９および１９９１年２月６日付けで出願された同Ｎｏ．０７／６５２，４２７を参照することができ、これらの特許出願を引用してここに組み入れる。
ＩＩ．触媒−加速移動による選別
Ａ．方法の一般概述
触媒性選別の前に、ウイルスまたはファージまたは細胞集団あるいは触媒性部分の試料を好ましくは、ハプテン  アフィニティ  クロマトグラフィにより選別する。ハプテンに結合するウイルス、細胞または部分（＞６０００）を好ましくは次いで、触媒性選別に付す。
この方法は、触媒反応の所望の基質により、共有結合によって、または非共有結合によって、被覆されている平坦な膜またはその他の２次元表面を包含する。最適表面基質濃度は、特定の基質および膜に応じて、当業者による不当な実験を用いなくても決定することができる。非常に鋭い器具のような適当な器具を使用して、触媒部分を潜在的に発現するビリオンまたは細胞、例えば触媒性抗体のペースト状混合物を、好ましくは表面を横切る非常に細い線として、この表面に適用する（表面上の第１の地点）。この線を可視化するために、少量の染料、例えばブロモフェノールブルーをこのペーストに加えることができる。適当な時間の後に（この時間は、代表的には、８時間−３日間であるが、別段には、特定の基質に依存し、すなわち触媒される反応およびその条件に依存し、そして当業者による不当な実験を用いなくても決定することができる）、この膜の表面を好ましくは、鋭い器具、例えばレーザー刃により、第１の地点（または線）から適当な距離をおいた、例えば第１の地点から  ０．０５−０．１５ｍｍ、代表的には０．１０ｍｍ離れている第２の地点でスクラップする。微小距離を目で見る助けとして、このスクラッピングは、低倍率の顕微鏡を用いて行うことができる。触媒性部分を有するウイルスまたは細胞、例えば触媒性抗体、あるいはさらに一般的には、触媒性部分は、触媒加速移動により移動されて、このスクラッピング部分に存在し、一方無触媒性抗体または無触媒性部分を有するウイルスまたは細胞はこのようには拡散されない。この方法は反復することができ、これにより触媒性部分を発現するウイルス、ファージまたは細胞、あるいはさらに一般的には、触媒性部分の集団または濃度を、後続の触媒としての使用、または次のファージ世代の産生における使用（例えば、E.coliなどの宿主の感染による）に関わりスケールアップする前に、豊かにすることができる。この方法はまた、電気泳動の使用により強化させることができる。すなわち、触媒性部分の、あるいは触媒性部分を有するウイルスまたは細胞の触媒性部分の移動もしくは拡散は、表面を横切る電位の傾きを印加することによって増強させることができる。
Ｂ．表面
表面は、多くの種々の材料、例えばアガロース、澱粉、ポリアクリルアミド、ナイロン、活性ナイロン、イモビロン（Immobilon）ＡＶ（Millipore,Corp.）、ガラスまたはニトロセルロースからなることができる。この態様の重要な特徴は、この表面が選択された基質を支持する（共有結合または非共有結合による）ことができるべきであること、ウイルスまたはファージまたは細胞、あるいは触媒性部分がこの表面に対して幾分弱い結合性を有していなければならないこと、およびまた適当な時間の間、例えば８時間から３日間の間（できれば人工的加湿環境中で）、浸蝕されることなく水分を保有することができなければならないことにある。この表面上の基質濃度は、各基質分子が大きい間隔（＞１０００オングストローム）で分離されているように、あまり小さいことはできない。この表面は好ましくは、基質の一面に広がる単層により被覆されており、ここに各基質分子が好ましくは、５００オングストロームより小さくない間隔、さらに好ましくは、１００オングストロームより小さくない間隔で、最も好ましくは、５０オングストロームより小さくない間隔で分離されている。この一面に広がる単層よりも大きい基質濃度も許容され、いくつかの場合に、単層が好ましい。当業者は、不当な実験を用いなくても重量測定、紫外線吸収またはその他の定量法に基づいて、この表面に適用すべき基質濃度を決定することができる。触媒加速移動に加えて、若干の他の特徴がファージの分離、例えばアフィニティ  クロマトグラフィ、を補助するために望まれる場合には、この表面は、そのキャパシティを提供するものであるべきである。例えば、ファージ移動を、基質表面を横切る電気泳動により加速しようとする場合には、この表面は、そこに適用される電位を保有することができなければならない。
Ｃ．触媒を発現するウイルス、細胞または部分の適用およびインキュベーション
ウイルスまたはファージまたは細胞あるいは触媒性部分は、含水ペーストまたは非常に濃厚な溶液として、好ましくは注射針を使用して、基質表面に適用する。ウイルス、ファージ、細胞あるいは触媒性部分が適用された場所を見ることができるために、適用前に、少量の染料、例えばブロモフェノール  ブルー、を試料中に添加することができる。これらのファージ、細胞あるいは触媒性部分は好ましくは次いで、適当な環境中で、例えば５０％より過剰の湿度または「湿った」環境中で、適当な温度で、例えば２０−４０℃、代表的には２５℃または３７℃で、条件に応じた時間（この時間は代表的には、８時間ないし３日間である）、表面上でインキュベートする。
Ｄ．触媒活性を発現するウイルス、細胞あるいは部分の選別
インキュベーションに引き続いて、この表面を好ましくは、低倍率の顕微鏡の下に置くか、または視覚を別段の方法で補助する。レーザー刃またはその他の鋭い器具を使用して、実質的な線である場合には、元の地点からこの線に沿って、この表面の一面またはもう一つの面あるいは両面で、スクラッピングを行い、そして元の地点が実質的に線として適用されていない場合には、元の地点から０．０５−０．１５ｍｍ、代表的には０．１０ｍｍ、半径を有する円に実質的に沿って、または円周に沿って、スクラッピングを行う。無触媒に比較して触媒はさらに移動性であるから、このスクラッピング中に触媒が濃縮されて存在する。この方法は、さらに反復して行うことによって、触媒性ファージまたは細胞集団の濃度をさらに増加することができる（すなわち、触媒として最も活性な集団を生成させることができる）。同様に、この方法は一般に、試料中の触媒性部分の濃度の増加に使用することができる。
或る場合には、基質に結合していないウイルス、ファージ、細胞または部分、例えば基質ではなく、ハプテンに結合しているウイルス、ファージ、細胞または部分の除去が必要であることもある。これはこのようなウイルス、ファージ、細胞または部分が基質表面上に容易に拡散するからである。これは、画線培養の直後に、迅速にかつまた軽く、表面を洗浄するか、または表面をハプテンによりブロッティングすることによって、達成することができる。この場合には、ハプテンに結合するが、基質に結合しないウイルス、ファージ、細胞または部分が、基質に結合するもの（触媒性または無触媒性のどちらか）よりも先に、初めに拡散する。従って、これらの基質非結合性ハプテン結合性で基質非結合性のウイルス、ファージ、細胞または部分を直ちに単離することができ、基質表面から分離することができる。無触媒拡散は重大な問題ではない。
同様に、或る場合には、膜表面を横切る電位を印加して、拡散を増強させ、すなわち電気泳動により拡散を増強させることが望ましいこともある。電気泳動増強移動に係わる代表的条件は、メジウム（表面に非結合性のもの、例えば基質が表面に引き付けられたときの表面上の水分）、拡散されるもの（ファージ、細胞、触媒性部分）などの因子を考慮して、材料上の電荷とメジウムの電導性の最低化との間の関係が最適にされるようにすることによって（これにより最大分離が促進される）、不当な実験を行うことなく、当業者により実験的に決定することができる。表面に適用された元の地点からのスクラッピング点（触媒採取点）の距離は、触媒による移動が電気泳動により増強される場合に合わせることができる。
ＩＩＩ．表面結合による触媒選別
Ａ．概論
この態様は、その中の若干が相違する抗体または部分を示す、極めて大多数のウイルス、細胞または部分の中から触媒活性に係わる選別（例えば、触媒対無触媒）を行う方法である。この方法は、触媒活性の検出に、例えば触媒性部分の発現の検出に、または試料中の触媒性部分の濃度の増加に、使用することができる。この選別は、基質に結合する抗体などの無触媒性部分が堅固に結合し、膜またはその他の二次元表面に、インキュベーション時間には無関係に、同一の親和性をもって不動化されるようになることを観察することに基づいている。他方、触媒性抗体またはその触媒性部分などの触媒性部分は先に基質に結合するが、触媒が一旦、生成されると、これらは表面にもはや結合しない。すなわち、無触媒が表面と平衡に達するのに充分な時間であって、表面上の基質と接触して、これを消費する時間よりも短い時間の後に、無触媒は表面に結合したままであり、他方触媒は、そこから洗出（採取）することができる。
この触媒選別態様は好ましくは、ハプテン結合部分、例えば抗体、を、ハプテンに対して弱い結合性を有するか、またはハプテンに対して無結合性である部分、例えば抗体、を選別する初期選別を包含する。この選別は好ましくは、アフィニティ  クロマトグラフィ（２，３，４）またはフィルター−分離法（３１）を包含する前記方法により行うことができる。同様に、この種の別の態様においては、ハプテン結合部分に係わる初期選別が行われた場合に、フィルター−分離法を使用することもできる。このウイルス、ファージ、細胞または部分のハプテン結合による選別に引き続いて、これらのウイルス、ファージ、細胞または部分を次いで、基質触媒性に係わり、すなわち反応−ベースまたは触媒性選別に係わり、分別を行う。
この態様における触媒選別は好ましくは、膜、例えばイモビロンＡＶ（Millipore Corp.,Bedford,MA）上に基質を共有結合させて不動化するなどにより不動化させることを包含する。膜表面に、ウイルス、ファージ、細胞または部分の溶液を添加する。別法として、感染させた宿主、例えばバクテリアコロニーなどの試料に基質−膜を押し付けて、付随ウイルスまたはファージ抗体を遊離させることにより、ウイルス、ファージ、細胞または部分を直接に転移させることもできる。実質的に直後に、この膜を好ましくは、適当な緩衝液により洗出し、基質に対する親和性が低いか、または親和性がないウイルス、ファージ、細胞または部分、例えば抗体を迅速に除去する。この洗出工程は、表面を洗浄するか、または緩衝洗浄液（この液は、選択されたｐＨ、例えば５．０−９．０、例えば７．０に緩衝されており、１００ｍＭより多いＮａＣｌを含有する）を流通させることによって行うことができる。その後で、この膜を好ましくは、緩衝液により再度洗浄する。堅く結合する無触媒性のファージ、ウイルス、細胞または部分、例えば抗体は、膜から溶出されないが、基質を充分に触媒し、非結合性になった、触媒性であるファージ、ウイルス、細胞または部分、例えば触媒性抗体またはその触媒性部分を有するウイルス、ファージまたは細胞（あるいは感染コロニーから遊離されたこのような抗体またはその部分）は、溶出される。この洗液は、濃縮することができ、触媒として使用するか、またはE.coliなどの宿主に再感染させることができる。触媒性抗体またはその触媒性部分を有するファージ、ウイルスまたは細胞の集団をさらに濃縮するには、上記方法を反復する。同様に、この方法は、試料中の触媒性部分の濃度の増加に使用することもできる。
この方法において、ウイルス、ファージ、細胞（またはそれからの抗体）または部分は、極めて制限された拡散により膜の局所的領域に残留し、触媒性ファージ、ウイルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）または触媒性部分が、それらの局所的基質供給物を枯渇させ、あまり遠くに離れずに、触媒作用を受けなかった基質に結合しつづけなければならない。さらにまた、拡散が触媒性ファージ、ウイルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）で生じた場合には、結合性の無触媒性ファージ、ウイルスあるいは細胞（またはそれからの抗体）と競合するか、または無触媒性部分と競合して、基質を触媒し、無触媒が基質供給物を消費し、膜からまた容易に洗出される。触媒性部分、例えば触媒性ファージ、ウイルスあるいは細胞部分、例えば抗体の移動を防止するためには、膜が過剰の湿分、例えば水分、をできるだけ含有していないように保持し、例えば加湿器内で湿った状態にのみ維持することが好ましい。また、このインキュベーション時間は、拡散が防止されるように最短にすることが最良であることもある。触媒を選択的に分離する、２回目の洗浄は適当な時点で、例えば０．５−１６時間、代表的には１時間、３時間、６時間および１２時間の間隔で行うことができる。
Ｂ．不動化基質
基質は好ましくは、アフィニティ  クロマトグラフィにおけるハプテンと同様の方法で変性させ、この基質が膜とカプリングできるリンカーを有するようにする。この基質リンカーは、本発明のメカニズム−ベース  インヒビション選別態様における粒子に、インヒビターを結合させるために、およびまたその逆の結合に使用されるものと同種である。その化学の詳細は、選択される特定の基質に依存しうるが、例えば、ハプテン結合性に係わる初期選別が行われる場合には、このハプテン調製に使用される化学にほとんど基づいていることができ、同一ではない場合でも、好ましくは非常に類似している。
Ｃ．膜
基質は、リンカーを介して膜、例えば触媒加速移動による選別に関して上記した表面物質、例えばイモビリオンＡＶ膜、にカプリングさせることができる。このカプリングは、公知方法によって、例えば膜供給業者（Millipore）の推薦などに従うことができ（１９９０Milliporeカタログ、１７７−１７８頁参照、この記載を引用してここに組み入れる）、触媒加速移動による選別でも、このリンカー法を使用することができる。いづれか特定の理論に拘束されることは必ずしも望むことではないが、この態様の成功は、当業者が代表的に考慮する、立体的制限およびその他の因子により、膜上の基質濃度（ミリモル／ｃｍ2）に関連することがある。この膜上の基質濃度は、触媒加速移動による選別態様の場合と同様であることができる。すなわち、この膜上の基質濃度は、不当な実験を行うことなく、いづれか特定の触媒性部分−基質系に係わる本明細書の記載から最適にすることができる。
他の固相表面を膜の代わりに使用できることは、当業者に理解されることである。例えば、非磁性の、または磁気応答性の粒子を触媒加速移動による選別態様の場合と同様に使用することができる。
Ｄ．ファージ、ウイルス、細胞または部分の適用
ファージ、ウイルス、細胞または部分は、抗体−抗原の確立されている結合運動学に従って、膜に結合する（１０）。これらの発見に従い、ファージ−、ウイルス−、細胞−または部分−含有溶液の基質−膜への結合は、２分（急速結合）ないし１０分（遅い結合）でありうる。これらの時間の後に、膜を好ましくは実質的に直ちに、そして好ましくは迅速に（１−１０秒、好ましくは１−５秒）、表面上の洗浄または流れを通すことにより、初期洗浄に付す。この洗浄は、基質に対して弱く結合しているファージ、ウイルス、細胞または部分のような部分（例えば、格別に高い見掛けの結合定数、Ｋｍ、抗体）または膜表面に非特異的に結合しているものを分離するために行われる。
Ｅ．インキュベーション
僅かに湿った膜を次いで、加湿容器内で、２０−４０℃、代表的には２５℃または３７℃において、特定の部分、例えば抗体、に応じて、適当な時間、例えば０．５−１６時間、代表的には１時間、３時間、６時間または１２時間、インキュベートすることができる。次いで第二の洗浄を、選択された緩衝液（通常、反応緩衝液と同一の緩衝液）中で、適当な時間、代表的には１−５秒間、行う。第二の洗浄をもう一度行って、触媒を分離することができるが、過剰の労力を節約するために、一度の洗浄が好ましい。この第二の洗浄（一度または二度以上）は、膜の表面上で、または膜に緩衝液を流動させることにより行うこともできる。
Ｆ．第二の洗浄液の使用
触媒性ファージ、ウイルス、細胞または部分を含有する第二の洗浄液（一度または二度以上）は濃縮することができ、触媒として使用するために、またはこのファージによるE.coliなどの適当な宿主に感染させるために、あるいは細胞による触媒の誘発に、例えば組換えウイルス感染細胞に溶解サイクルを受けさせるために、調製することができる。この本発明の膜技術態様は、第二の洗浄（一度または二度以上）とともに反復することができ、これにより第二の洗浄液（一度または二度以上の）に含まれていることがある無触媒性部分の量または無触媒性ファージ、ウイルスまたは細胞（あるいはそれからの抗体）の量を減少させ、かつまた触媒性部分の濃度を増加させることができる。触媒活性に富んだファージクローンを含有する宿主、例えばE.coliのコロニーは、増殖させて、充分な触媒、例えば触媒性抗体またはその触媒性フラグメントを分泌させることができ、これらの触媒は精製し、触媒活性に係わり分別するか、または直接に使用することができる。生成した触媒、例えば触媒性抗体、の精製を次いで、標準方法により行うことができる。
ＩＶ．温度などの反応条件の関数としての、または競合による結合性の変更による選別
Ａ．温度に関する一般的概説
結合および触媒作用に対する温度の作用は、特定の蛋白質触媒毎に相違している。すなわち、結合はするが、触媒作用は非常に弱い低温またはむしろ冷温のような第一の温度から、実質的な触媒作用が発揮される、一般にさらに高い温度にまで温度が上昇するにしたがって、当該触媒およびその基質の見掛け上の解離定数は、不連続的様相で変化する。この変化は、触媒の見掛け上の基質結合（無触媒は結合しない）における温度変化に伴う変化である。触媒性部分あるいは触媒性抗体またはその触媒性部分などの触媒性部分を発現することができるファージ、ウイルスまたは細胞を大きい一団の無触媒性部分、ファージ、ウイルスまたは細胞の集団から、分離、選別または濃縮することに係わる本発明の態様は、この変化に基づいている。
Ｂ．結合性および触媒作用に対する温度の効果
結合は、下記の物理的観測および現象に属している：
0004125365.tif 000022
この式において、Ｅは触媒、例えば酵素または抗体であり、Ｓは基質であり、ＥＳは触媒−基質複合体であり（この複合体が生成物Ｐに進行する）、Ｇはギブス（Gibbs）の遊離エネルギーであり、Ｒは普遍気体定数であり、そしてＴは温度（ケルビン単位）である。
すなわち、低温における酵素または無触媒性抗体などの結合性分子に係わるＴ-1対ｌｏｇＫSをプロットすると、（２．３０３Ｒ）／△Ｇの傾斜を有する直線が与えられる。
酵素または触媒性抗体のような触媒の場合には、この見掛け上の結合定数はＫｓではなく、Ｋｍであり、この簡単な反応は次式で示される：
0004125365.tif 000023
Ｋ-1／Ｋ+1（Ｋｓ）に対する温度の効果は前記で説明した。温度効果Ｋ+2は、エイリング（Eyring）の絶対反応速度理論を使用して決定される。この反応に対する温度の効果（Ｋ+2）は
0004125365.tif 000024
（式中、△Ｈ＊は活性化のエンタルピーである）
であり、従って、ｌｏｇＫ+2（ｌｏｇＶｍａｘ）対１／Ｔをプロットすると、−（△Ｈ＊＋ＲＴ／２．３０３）の傾斜が得られる。
従って、Ｋｍに対する温度効果は、Ｋ+2とＫ-1との相対サイズに依存する。極端な場合に、Ｋｍ＝Ｋ+2／Ｋ-1およびＫｍ＝Ｋｓである。しかしながら、大部分の場合には、Ｋｍは速度定数の若干の混合に等しい（Ｋｍ＝（Ｋ+2＋Ｋ-1）／Ｋ+1）。
上記概念と観測とを組み合わせると、１つのみの温度が含まれることから、抗体などの結合性部分は１／ＴとＫｓとの間に直線関係を有する。一方、触媒性部分（例えば酵素、触媒性抗体またはその触媒性部分）では、この見掛け上の結合定数（Ｋｍ）は、それぞれがそれ自体の温度係数を有する、２つ（または３つ以上）の温度依存現象、結合性および触媒作用に依存する。触媒作用は、前記等式に温度依存性因子である、エントロピーの要素を持ち込む。従って、触媒性部分の場合には、１／ＴとＫｓとの関係は直線状ではなく、触媒作用および結合温度係数における差異に依存して曲線になる。本発明のこの態様は、触媒性抗体またはその触媒性部分などの触媒性部分を発現することができるファージ、ウイルスまたは細胞などの触媒性部分の単離、選別、分別または濃度増加に係わる見掛上の結合性に対する温度の効果を活用するものである。
Ｃ．温度に基づく選別に係わる一般方法
一般に、この態様において、見掛上の基質結合性に対する温度の効果に基づく、ファージ、細胞または部分の分離方法が提供される。触媒は温度変化に対する応答が、無触媒性のものとは異なっている。低温において、類似のＫｓを有する、ウイルス、ファージ、または細胞抗体などの部分（触媒作用は実質的に存在しない）は、類似するそれらの温度依存性、Ｋｓ値を有する。この数値は、ほとんど大部分の部分に通用し、例えばウイルス、ファージ、または細胞は類似するＫｓ値を有する。実際上で：
１．ハプテンに結合するウイルスなどの部分は、先ず一般的に低温（例えば、−３０−０℃、代表的には−２０℃）で不動化基質のカラムで分離される；ゆるく結合する（大きいＫｓ値を有する）ファージが最初に溶出され、堅く結合する（小さいＫｓ値を有する）ファージは後で溶出される。
２．フラクションを採取する。
３．第二の一般にさらに高い温度（例えば、＋２０−４５℃、代表的には＋２５℃または＋３７℃）で、濃縮フラクションをそれぞれ、同一カラムで再溶出し、各溶出液からフラクションを再度、採取する。
４．最高濃度のウイルス、ファージ、細胞または部分を含有する溶出フラクション（１つまたは２つ以上）を、吸収により直接に、あるいはウエスターン法により間接的に、あるいはE.coliなどの宿主の感染後のファージの場合には、一定量の各フラクションを用いて、検出操作する。主フラクション（１つまたは２つ以上）以外のフラクション中に溶出されるウイルス、ファージ、細胞または部分は、主フラクション中に溶出されるウイルス、ファージ、細胞または部分（無触媒性）とは相違する温度係数を有する。これらは相違する親和性をもって、一団のウイルス、ファージ、細胞または部分（無触媒性）から溶出されるので、主フラクション（１つまたは２つ以上）以外の溶出フラクションは次いで、さらに濃厚にするか、または濃縮することができる。これは、主フラクション（１つまたは２つ以上）以外で溶出されるウイルス、ファージ、細胞または部分は、結合に係わる温度係数に加えて、触媒作用に係わる温度係数をまた有することによる。一般に、触媒性ウイルス、ファージ、細胞または部分の見掛上の結合定数に対する温度の効果は、一団の無触媒性ウイルス、ファージ、細胞または部分とは実質的に相違している。
５．濃縮された、希少ウイルスまたはファージを次いで使用して、E.coliなどの宿主に感染させ、そこから部分を単離する、例えば、得られた抗体を触媒として使用するか、または触媒活性に係わりさらに選別する。同様に、濃縮された細胞は、単離し、触媒性部分の発現に使用するか、またはウイルスまたはファージ世代を産生させるための溶解サイクルを受けるようにする。同様に、この方法によって単離された濃厚部分は、触媒として使用される。
本発明に関するこの態様に係わる上記説明は、対象の部分に応じて変えることができ、標準方法（重力または強制分離）によるカラムマトリックスに、電気泳動ゲル（電場分離）に、遠心分離管（ｇ力分離）、例えば粘性溶液中に懸濁された不動化基質を含有する遠心分離管に、あるいはその他の懸濁または不動化基質を通すウイルス、ファージ、細胞または部分の基本的分離手段に、不動化された基質を包含することができる。低温分離は好ましくは、冷凍、ドライアイス、または液状窒素あるいは液状ヘリウムにより温度を低温に維持して、水性媒質中で行う。この水性媒質は、適当濃度のＮａＣｌまたは他の塩を、あるいはグリセロールを一緒に包含させることによって、凍結を防止する。
そしてまた、この態様は、触媒性の触媒性部分、ウイルス、ファージまたは細胞の試料をさらに濃縮させるために、反復して行うこともできる。
Ｄ．無反応性基質類縁体との競合による選別の概説
この態様では、対象触媒反応における基質の類縁体を使用する。この類縁体において、目標結合は、触媒種による変更に対して抵抗性であるが、この類縁体はまた、基質分子の部分（この部分は触媒性であるか、または無触媒性である）に対する結合親和性と同様の結合親和性を示すのに充分な構造類似性を有する。Ｒ3ＣＯＯＲ4エステル基質のエステル分解反応に関する、この例には、このエステル構造に充分に似ている構造Ｒ3ＣＯＣＨ2Ｒ4があり、構造的に充分に似ているが、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2目標結合は、このエステル分解性触媒による変性に対して抵抗性である。多くのこのような無反応性基質類縁体がいづれか特定の反応に関して存在しており、使用のための適当な類縁体の選択は不当な実験を行うことなく、潜在的無反応性基質類縁体と基質それ自体との間の構造上の類似点、当該類縁体における目標結合の変更に対する抵抗性、包含される化学反応、当該類縁体に対する結合親和性、およびまた当業者の技術範囲内にあるその他の因子を考慮して、当業者により決定できることである。
従って、この態様により、触媒性ファージ、ウイルスまたは細胞あるいは触媒性部分の試料を、無反応性基質類縁体、好ましくはカラムに充填されている固相支持体にカプリングされている類縁体、と接触させることによって、これらの触媒性ファージ、ウイルスまたは細胞あるいは触媒性部分を分離または濃縮させる態様が提供される。この接触は好ましくは、このような類縁体の存在（移動性）の下に行う。ここから、接触フラクションを採取する。それぞれ、フラクションを不動化無反応性基質と、基質の存在の下に、再度接触させる。触媒性のファージ、ウイルスまたは細胞あるいは触媒性部分は、それらの無触媒性相対物とは異なる速度で基質から解離され、この類縁体がカラムに充填されている固相支持体にカプリングされている場合には、これらの触媒は、主フラクション以外に溶出される、すなわち触媒は、主フラクションの前または後に溶出される。
特に、反応方程式：
0004125365.tif 000025
（式中、“Ｓ”は基質であり、そして“Ｐ”は生成物である）
において、Ｋ2＞Ｋ-1のような充分の触媒活性を有する試料中のウイルス、ファージ、細胞あるいは部分（Ａｂ）は、それらの無触媒性相対物とは異なる速度でＡｂＳ複合体から解離する触媒として溶出する主ピークのファージ、ウイルス、細胞あるいは部分とは相違する保有時間を有する第二の溶離操作で溶出される。従って、この主ピーク以外のウイルス、ファージ、細胞あるいは部分の採取は、触媒活性を示すものを濃縮（濃度増加）または選別ことになる。特定の触媒メカニズムに応じて、この第二の溶出において、触媒は主ピークよりも遅くまたは早く溶離される（１５）。これは図１および２をまた参照できる。しかしながら、この説明から、当業者は不当な実験を行うことなく、例えば主ピーク以外の溶出液が主ピークの前に溶出されるか、後に溶出されるかを決定することによって、そしてまた主ピーク以外（前または後）に溶出されるものにより達成されるターンオーバー数を考慮することによって、およびまた当業者の技術範囲にあるその他の因子を考慮することによって、触媒が主フラクションよりも後で溶出されるか、あるいは前に溶出されるかを決定することができる。基質または無反応性基質（“Ｓ”）による触媒（Ｎｃ）の会合および解離は次式のとおりであるのみであるから、
0004125365.tif 000026
この基質（または無触媒性基質類縁体）による無触媒会合／解離は、Ｋｓで表される：
0004125365.tif 000027
上記式で表される触媒メカニズムでは（ミカエリスの複合体（ＡｂＳ）と生成生成物“Ｐ”との間に生じる、無触媒性の中間体を伴う）、抗体および基質の見掛上の会合／解離は、Ｋｍで表すことができる：
0004125365.tif 000028
これらの状況の下に、Ｋｓ値は常に、Ｋｍ値よりも小さくなければならない；すなわち、無触媒性ウイルス、ファージ、細胞あるいは部分結合基質は、さらに堅く結合するので、第二の溶出工程では触媒性ウイルス、ファージ、細胞あるいは部分よりも遅く溶出される（図１参照）。
他方、例えば下記：
0004125365.tif 000029
のメカニズムで示されるように（ここで、“Ｓ”は基質であり、“ＡｂＳ2”は中間体であり、そして“Ｐ”は生成物である）、反応中間体（例えば、共有結合型中間体）がミカエリスの複合体と生成物生成との間の反応座標に存在するメカニズムに、触媒性ウイルス、ファージ、細胞あるいは部分（Ａｂ）が従う場合には、基質の見掛上の会合／解離の説明は、この方程式で相違し、ＫｍはＫｓよりも小さい数値を有する：すなわち：
Ｋｍ＝［Ｋｓ］［Ｋ3／（Ｋ2＋Ｋ3）］
である。
従って、このメカニズムまたは中間体がＡｂＳ複合体の後に生成されるメカニズムの場合には、触媒性ウイルス、ファージ、細胞あるいは部分がさらに堅固に結合し、第二の溶出において、無触媒性のものよりも遅く溶出される（図１参照）。
しかしながら、ＡｂＳ→Ａｂ＋Ｐの反応が、ＫｓをＫｍよりも大きくするように、非常に急速である場合、またはＮｃＳ複合体のＫｓがＫｍよりも大きい場合には、図２に示されているように、触媒が、無触媒よりも早く溶出される。従って、相違する結合性を示す、例えば後でまたは先に溶出される、部分、細胞、ウイルスまたはファージの採取は、単に触媒を単離するというばかりでなく、また試料中の最上の触媒を単離することになる。
Ｅ．無反応性類縁体との競合による選別の要旨
無反応性類縁体は好ましくは、固相支持体とカプリングさせて、アフィニティマトリックスを調製することができ、このマトリックスを好ましくはクロマトグラフィカラムに充填する。触媒として作用する部分を潜在的に含有するウイルスファージ、細胞または部分（例えば抗体を誘発させる免疫応答の誘発およびその発現のために使用される遷移状態類縁体に結合する、触媒性抗体またはその触媒性部分を発現するファージ、ウイルスまたは細胞）の懸濁液をカラムに適用する。この適用は、この基質類縁体に対する親和性をもって、これらのウイルス、ファージ、細胞または部分が不動化リガンドに結合し、これらがリガンドに対する親和性を持たないものとは相対的に、カラムに保持されるような条件、例えば温度、緩衝剤組成、流動速度などの条件の下に行なう。順次時間間隔で、このカラムから溶出するウイルス、ファージ、細胞または部分を採取し、適当なフラクション中に集め、次いで濃縮させる。可溶性の無反応性基質類縁体を、この溶出に使用される緩衝液中でインキュベートすると、ウイルス、ファージ、細胞または部分を結合させるための固相リガンドとの競合によって、カラム様相で、試料中の結合物が先に溶出される。同様に、基質を、溶出用緩衝液中でインキュベートすると、類似のＫｍを有する基質に結合する無触媒の溶出に対して、無反応性基質類縁体と結合する場合と同一の効果が得られる。従って、無反応性基質類縁体カラムから無反応性基質類縁体とともに溶出されるフラクションを次いで、このカラムに再度通す。しかしながら、このカラムには、溶出の達成に使用された類縁体の濃度に等しい濃度またはこの類縁体の濃度よりも小さい濃度の基質を存在させると好ましい。
しかしながら、触媒性部分、ウイルス、ファージ、または細胞の場合には、この基質はカラムからのそれらの溶出を促進させる効果を多少有する。これは、基質が、当該触媒を不動化リガンドに再結合させる、結合部位から放出される触媒により生成物（１種または２種以上）に変換されることによるものである。この場合には、触媒は、無反応性基質類縁体を用いて溶出させるカラムからに比較して、基質を用いて溶出させる同一カラムから、後でまたは先に、溶出される。これは、図１および２に示されている２次元分離プロフィールの基礎を形成している。図１および２において、無反応性基質類縁体カラムからの無反応性基質類縁体による１次溶出が縦軸に示されており、そして無反応性基質類縁体カラムからの基質による２次溶出が横軸に示されている。星印のピークは、主フラクション以外の溶出フラクション（１つまたは２つ以上）を表す。図１および２に示されているように、触媒は主ピークの後の後端部分として（図１）、または主ピークの前の後端部分として（図２）、溶出できる、すなわち触媒は主ピーク（１つまたは２つ以上）よりも有意に遅れて、または先に溶出され、これらを次いで集め、触媒的に濃厚な集団を採取または濃縮できるように、これらの星印ピークは標準化させる。図１はＫｍ＞Ｋｓの場合（この場合には、触媒は無触媒よりも長く結合している）の様相を示しており、そして図２はＫｓ＞Ｋｍの場合（この場合には、触媒は無触媒に比較して早く溶出される）の様相を示している。
前述のエステル（ＩＩ）：
0004125365.tif 000030
の加水分解の関して、このエステルは一般に、次式（ＸＸＸＩ）で表さすことができる：
0004125365.tif 000031
この式において、Ｒ3は
0004125365.tif 000032
であり、そしてＲ4は
0004125365.tif 000033
である。この場合に、下記の化合物は、無反応性基質類縁体として作用する：
0004125365.tif 000034
0004125365.tif 000035
0004125365.tif 000036
上記したように、エステルに係わる無反応性基質類縁体は、基質エステルと同一または類似の置換基（例えばＲ3およびＲ4）を有する、ケトン、カーボネート、カルバメート、エーテル（例えば、メチレンエーテル）、可逆性エステル、チオエステル、イミノエステル、アミドおよび可逆性アミドである。この記載から、当業者が、不当な実験を行うことなく、他の基質に対応する無反応性類縁体を誘導できることは勿論のことである。さらにまた、ペプチド加水分解反応、酸化／還元反応、付加反応、脱離反応、縮合反応、異性体化反応、およびまた転移反応を包含する、エステラーゼ反応以外の反応に係わる無反応性類縁体を誘導することもできる。特に、本明細書に示されているように、無反応性類縁体は基質と構造上で類似している、例えば同一または類似の置換基を有するが、基質の反応部位の結合は、触媒による変更（反応）に対して抵抗するように変えられている。しかしながら、その目標結合は類似している。例えば、目標結合が、典型的エステル、可逆性エステル、チオエステル、またはイミノエステルなどのエステル、ケトン、カーボネート、カルバメート、典型的エーテルまたはメチレンエステルなどのエーテル、および典型的アミド、可逆性アミドなどのアミドおよびアミノから選択される結合である場合には、無反応性類縁体の反応部位におけるこの結合は、上記群から選択されるが、別種の結合であると好ましい。
この態様はまた、別の態様をさらに包含する。例えば、最適選別（最良の触媒の濃縮または単離）を達成するために、固相に対するリガンドのカプリング濃度、固相支持体の種類、緩衝剤組成、流動速度、および溶出剤の濃度を、不当な実験を行うことなく、上記記載から、特に上記方程式を考慮して、変えることができる。さらにまた、一定の上記方程式、およびまた触媒が、その触媒挙動により相違して結合し、従って相違して溶出されるように、結合に係わり競合が存在するという、この態様の説明から、この態様およびその説明が、不当な実験を行うことなく、当業者が固相リガンド（１種または２種以上）用の化合物および溶出剤組成を、上記無反応性類縁体および基質のみでなく、また遷移状態類縁体（１種または２種以上）について、およびまた対象部分への結合に係わり有意の親和性を有する無関係の化合物（１種または２種以上）についてさえも、選択することを可能にする。この競合による結合性の変更による選別方法は、触媒の単離および濃縮を可能にするばかりでなくまた、本明細書の開示によって、最良の触媒の選別を可能にすること、特にこの選別が触媒作用（Ｋｍ）に基づいており、かつまた触媒作用に直接に関連していること、は注目されることである。
本発明のこの態様のもう一つの別法では、無反応性類縁体を２次元支持体、例えば上記したような膜に結合させ、そして試料を、重力（カラムで利用される）以外の力により膜表面を横切って施用する。例えば、試料を、電場により無反応性類縁体膜を横切って適用することができる。すなわち、この場合には、触媒と無触媒との分離が電気泳動により誘発される。この場合には、触媒はまた、小割合のフラクション中にも見出だされる。この電気泳動誘発分離の条件は、前述の代表的因子を考慮して、不当な実験を行うことなく、試料が受ける分離に係わる変化と媒質（その上の含湿溶液などの膜表面上の非結合物質）の最低導電率との間が最適にされ、この変更により最高分離が促進されるように、実験的に決定することができる。
ウイルス、ファージ、細胞または部分の触媒性集団または試料（本明細書において、時には、「付属集団」または「第二集団」の用語で表されている）は、本発明の方法の１つにより得ることができ、当該世代またはその次の世代（例えば、宿主感染から、または溶解サイクルから）をまた、本発明のもう一つの方法により選別または濃縮することができることは勿論のことである。一例として、表面結合による触媒性選別からの第二の洗浄液（一回または二回以上の液）（付属集団または第二集団）は次いで、触媒加速移動による選別、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別、競合による結合性の変更による選別、またはメカニズム−ベース  インヒビター選別に付することができる。同様に、触媒加速移動による選別からのスクラッピング採取集団（付属集団または第二集団）は次いでさらに、表面結合による選別、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別、競合による結合性の変更による選別、またはメカニズム−ベース  インヒビター選別に付することができる。同様に、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別において、見掛け上の結合に対する温度の効果が相違している試料（一種または二種以上）（例えば、主フラクション以外で、溶出または結合するもの）はまた次いで、表面結合による選別、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別、競合による結合性の変更による選別、またはメカニズム−ベース  インヒビター選別に付することができる。そしてまた、基質の存在の下に、不動化無反応性基質類縁体と接触させた時に、相違する結合性を示す試料（一種または二種以上）（例えば、主フラクション以外で、溶出または結合するもの）はまた次いで、表面結合による選別、触媒加速移動による選別、温度の関数としての結合のエントロピー要素における変化による選別、またはメカニズム−ベース  インヒビター選別に付することができる。
本明細書で検討されている、インヒビター、基質および無反応性基質類縁体は、当該技術における教示（例えば、３３参照）に従い、不当な実験を行うことなく、当業者が合成することができるものである。
下記に、非制限的例を例示の目的で示す。これらの例は、本発明を制限しようとするものではなく、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多くの明らかな変更が可能である。いづれの場合にも、これらには、エステル加水分解反応以外の反応、例えばペプチド加水分解反応、酸化／還元反応、付加反応、脱離反応、縮合反応、異性体化反応、および転移反応が包含される。
例
例１
組換えファージ  ライブラリイの構築
ｆｄおよびＭ１３ファージの表面上での発現に係わるＶＨおよびＶＬ抗体ドメインのライブラリイの作成は、ＰＣＲ技術および相当してデザインされたコンセンサス  プライマーを使用して達成される（１，２，３，４，１１；また引用してここに組み入れる、１９９２年１月２３日発行のＰＣＴ公開ＷＯ９２０１０４７を参照できる）。このＰＣＲ用の出発材料はハプテン（Ｉ）により免疫感作されたマウスから得たひ臓ＲＮＡである。マウス抗体可変ドメインの増幅用の一組のＰＣＲコンセンサス  プライマーを以下の示す。これはまた従来技術で開示されており、このプライマー配列の部分整列を示すために（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＶＨドメインのコーディングとともに（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＥＱ  Ａが与えられている。
0004125365.tif 000037
ＶＨドメインおよびＶＬドメインの増幅に引き続いて、第二のＰＣＲ反応を使用して、これらのドメインを短鎖ペプチドにより一緒に連結させて、一本鎖Ｆｖを生成させる。リンキングペプチド、ＰＣＲプライマーおよび方法は、従来技術で開示されている（２）。さらにまた、第三のＰＣＲ反応を使用して、この一本鎖Ｆｖライブラリイの５′および３′末端で、相当する制限酵素部位を挿入し、ｆｄ表面表示用のｆｄＤＯＧ１（２）またはＭ１３表面表示用のｐＣｏｍｂ３（１１）などのファージ表示発現ベクター中にクローニングさせる。
別法として、可変ドメインライブラリイはまた、免疫感作されていないマウスまたはその他の動物、例えばヒトから得ることもできる。この場合の出発材料は、ひ臓から（マウスまたはその他の哺乳動物の場合）またはリンパ球（ヒトの場合）からのＲＮＡである。増幅およびクローニングは、ヒト  ライブラリイの場合を除いて、上記のとおりに行う。ヒト  ライブラリイの場合には、マウスの可変ドメインとヒトの可変ドメインとの間の相違を反映させるために、ＰＣＲコンセンサスプライマーの配列を修飾する。ヒトコンセンサスプライマーおよびヒト抗体ファージ表示ライブラリイの構築は、従来技術で開示されている（１８）。
さらにまた、ファージ表面におけるＦａｂ（ｓｃＦｖと対立するものとして）の発現（従って、このファージライブラリイはＦａｂライブラリイを包含する）は、上記のものとは相違する異なる一組の３′ＰＣＲプライマーを使用して、２本の鎖の間のジスルフィド結合の生成に含まれるシステイン残基を含有するＨ鎖不変部およびＬ鎖不変部の一部を増幅させることによって達成される；これは、従来技術で開示されているとおりにして行うことができる（４）。Ｆａｂライブラリイのファージ表面表示用のベクターには、ｆｄファージ用のｐＨｅｎＩ（１９）ならびにＭ１３用のｐＣｏｍｂ３（１１）およびｐＴａｃＣＰ（２０）が包含される。
これらの技術を使用して、基質ＩＩのエステル加水分解のためのハプテンＩにより誘発される触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージを、ｆｄファージおよびＭ１３ファージから生成させる。本明細書において、この組換えファージの初期集団を、それぞれｃａｔ１ｆｄおよびｃａｔ１Ｍ１３と記する。
例２
メカニズム−ベース  インヒビター選別
ｃａｔ１ｆｄ含有溶液を、結合ハプテン（Ｒを介して結合）として式Ｉで表される化合物を含有するアフィニティカラム［セファロース（Sepharose）］上に通す。このハプテンに結合したファージの第一の付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）を、このカラムに遊離ハプテンを引き続いて通し、次いでこの遊離ハプテン洗浄により溶出されたファージを透析することによって、結合したハプテンを除去することにより、採取する。この第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力を、その速度加速ファクターを測定することによって評価する（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス（Hepes）、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；この第一付属集団は低い触媒活性を示す。
この第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）の第一の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式ＩＩＩで表される化合物（Ｒ8結合基を有していない）と接触させる（ｐＨ７．０、５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）。この第一の部分を次いでハプテン  アフィニティカラム上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から生成するファージ（ｃａｔ１ｆｄ２）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ２は、第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
上記第一付属集団の第二の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式ＩＶで表される化合物（Ｒ8結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）と接触させる。この第二の部分を次いでハプテン  アフィニティカラム上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から生成するファージ（ｃａｔ１ｆｄ３）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ３は、第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例３
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例２の方法を使用して、上記第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）の第三から第十までの部分をそれぞれ、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式Ｖ−ＸＩで表される化合物（Ｒ8結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）と接触させる。これらの第三から第十までの部分をそれぞれ、次いでハプテン  アフィニティカラム（Ｒを介してハプテンＩに結合）上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から生成するファージ（ｃａｔ１ｆｄ４−ｃａｔ１ｆｄ１０）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；これらのｃａｔ１ｆｄ４−ｃａｔ１ｆｄ１０はそれぞれ、第一付属集団（ｃａｔ１ｆｄ１）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例４
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例２の方法と同様の方法を使用して、第一付属集団（ｃａｔ１Ｍ１３１）を、ハプテンアフィニティクロマトグラフィによりｃａｔ１Ｍ１３から単離する。速度加速を測定することによって、このｃａｔ１Ｍ１３１は、式ＩＩで表される化合物の加水分解を触媒するその能力に関して、低い触媒活性を示す。
このｃａｔ１Ｍ１３１の第一の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式ＩＩＩで表される化合物（Ｒ8結合基を有していない）と接触させる。この第一の部分を、次いでハプテン  アフィニティカラム上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から得られるファージ、ｃａｔ１Ｍ１３２を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３２は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
上記ｃａｔ１Ｍ１３１の第二の部分を、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式ＩＶで表される化合物（Ｒ8結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）と接触させる。この第二の部分を次いでハプテン  アフィニティカラム上に通し、この通過でカラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から得られたファージ（ｃａｔ１Ｍ１３３）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３３は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例５
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例４の方法を使用して、第一付属集団（ｃａｔ１Ｍ１３１）の第三から第十までの部分をそれぞれ、式ＩＩで表される化合物の加水分解反応条件の下に、式Ｖ−ＸＩで表される化合物（Ｒ8結合基を有しておらず、Ｘ＝Ｂｒである）とそれぞれ接触させる。これらの第三から第十までの部分をそれぞれ、次いでハプテン  アフィニティカラム（Ｒを介してハプテンＩに結合）上に通し、カラムに結合しないファージを採取し、次いでE.coliの感染に使用する。このE.coli感染から得られたファージ（ｃａｔ１Ｍ１３４−ｃａｔ１Ｍ１３１０）を、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；これらのｃａｔ１Ｍ１３４−ｃａｔ１Ｍ１３１０はそれぞれ、第一付属集団（ｃａｔ１Ｍ１３１）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例６
触媒−加速移動による選別
例２からの第一付属集団ｃａｔ１ｆｄ１の一部をブロモフェノールブルーと混合し、ファージペーストを調製する。式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）を、イモビリオンＡＶ膜上に支持させる（Ｒ1を介して）。この式ＩＩで表される化合物−イモビリオンＡＶ膜を横切るファージペーストの非常に細い線を画線培養する。この膜を含湿（５０−１００％相対湿度）環境の下に、２５℃で４８時間、インキュベートする。インキュベーションの後に、顕微鏡を用いて、レーザーによりスクラッピングを行い、元の線から０．１０ｍｍのファージを採取する。この採取したファージ、ｃａｔ１ｆｄ１１、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ１１は、ｃａｔ１ｆｄ１に比較して、大きい触媒性（ターンオーバー数）を示す。
例７
触媒−加速移動による選別
例６の方法を使用して、例６からの第一付属集団ｃａｔ１Ｍ１３１をブロモフェノールブルーと混合し、ファージペーストを調製し、式ＩＩで表される化合物−イモビリオンＡＶ膜を横切るファージペーストの非常に細い線を画線培養する。インキュベーション（５０−１００％相対湿度、２５℃、４８時間）の後に、顕微鏡を補助的に使用し、レーザーによりスクラッピングを行い、元の線から０．１０ｍｍのファージを採取する。この採取したファージ、ｃａｔ１Ｍ１３１１、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３１１は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例８
表面結合による選別
例２からの第一付属集団ｃａｔ１ｆｄ１の一部を溶液として、式ＩＩで表される化合物−イモビリオンＡＶ膜（例６）に添加し、２分後および１０分後に、この膜を緩衝液（溶液と同一）により、迅速に洗浄する（１−５秒）。この洗浄は、この基質に弱く結合しているか、または結合していないファージをいづれも除去するものであり、この洗浄液は廃棄する。この湿った膜を、１時間目、３時間目、６時間目および１２時間目に、１−２秒の迅速洗浄（溶液と同一の緩衝液）を行いながら、１２時間インキュベートする（２５℃、５０−１００％相対湿度）；これらの洗浄液を採取し、濃縮し、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１ｆｄ１２、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ１２は、ｃａｔ１ｆｄ１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例９
表面結合による選別
例４からの第一付属集団ｃａｔ１Ｍ１３１の部を溶液として、式ＩＩで表される化合物−イモビリオンＡＶ膜（例６）に添加し、２分後および１０分後に、この膜を緩衝液（溶液と同一）により、迅速に洗浄する（１−５秒）。これらの洗浄液は廃棄する。この湿った膜を、１時間目、３時間目、６時間目および１２時間目に、１−５秒の迅速洗浄（溶液と同一の緩衝液）を行いながら、１２時間インキュベートする（２５℃、５０−１００％相対湿度）；これらの洗浄液を採取し、濃縮し、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１Ｍ１３１２、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３１２は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１０
温度の関数としての結合のエンタルピー要素における変化による選別
例１に記載のｃａｔ１ｆｄを、式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2、Ｒ1を介して結合）のカラム（セファロース）上に、−２０℃で、結合は生じるが、触媒作用は生じないようにして、通し、次いでフラクションを採取する。３７℃で、これらのフラクションを、式ＩＩで表される化合物のカラムに再度通し、フラクションを再度、採取する。吸光度を使用して、最低濃度でｃａｔ１ｆｄを含有するフラクション（結合と温度とが非線状関係にある）を単離し、E.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１ｆｄ１３、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ１３は、ｃａｔ１ｆｄ１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１１
温度の関数としての結合のエンタルピー要素における変化による選別
例１に記載のｃａｔ１Ｍ１３を、式ＩＩで表される化合物（例１４に記載のものと同一）のカラム（セファロース）上に、−２０℃で、結合は生じうるが、触媒作用は生じないようにして、通し、次いでフラクションを採取する。３７℃で、これらのフラクションを、式ＩＩで表される化合物のカラムに再度通し、フラクションを再度、採取する。吸光度を使用して、最低濃度でｃａｔ１ｆｄを含有するフラクション（結合と温度とが非線状関係にある）を単離し、E.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１Ｍ１３１３、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３１３。
例１２
競合による結合の変化による選別
例１に記載のｃａｔ１ｆｄを、式ＸＸＩで表される化合物（Ｒ1を介して結合）のカラム（セファロース）上に通し、次いで式ＸＸＩで表される化合物を含有する緩衝液により溶出する。フラクションを採取し、次いで濃縮する。これらのフラクションを次いで、それぞれ同一カラムに通し、次いで基質［式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）］により溶出する。この２次元分離様相が標準化されて、図１に示されている。この図において、２回のカラム通過で溶離する一団のファージは１回のカラム通過とほとんど同一の保持時間で、主ピークとして溶出する。この一団よりも遅く溶出するファージを採取し、集め、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１ｆｄ１４、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１ｆｄ１４は、ｃａｔ１ｆｄ１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１３
競合による結合の変化による選別
例１２の方法を使用して、ｃａｔ１ｆｄの別の一部をそれぞれ、カラム上に通す。各カラムは、式ＸＸＩＩ−ＸＸＸおよび式ＸＸＸＩＩで表される化合物（Ｒ1を介して結合）を含有する。各部分をカラムに結合している各無反応性基質類縁体により溶出する。各溶出液からのフラクションを次いで、それぞれこれらのフラクションが溶出されたカラムと同一のカラムに通し、次いでこの時点で基質［式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）］により溶出する。この２次元分離様相が標準化されて、図１に示されている。各溶出液から遅くれて溶出するファージをそれぞれ単離し、集め、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から生成されたファージ、ｃａｔ１ｆｄ１５−ｃａｔ１ｆｄ２４、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ２ｆｄ１５−ｃａｔ１ｆｄ２４はそれぞれ、ｃａｔ１ｆｄ１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１４
競合による結合の変化による選別
例１に記載のｃａｔ１Ｍ１３を、式ＸＸＩで表される化合物（Ｒ1を介して結合）のカラム（セファロース）上に通し、次いで式ＸＸＩで表される化合物を含有する緩衝液により溶出する。フラクションを採取し、次いで濃縮する。これらのフラクションを次いで、それぞれ同一カラムに通し、次いで基質［式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）］により溶出する。この２次元分離様相が標準化されて、図１に示されている。この図において、２回のカラム通過で溶離する一団のファージは１回のカラム通過とほとんど同一の保持時間で、主ピークとして溶出する。この一団よりも遅く溶出するファージを単離し、集め、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から得られたファージ、ｃａｔ１Ｍ１３１４、を式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３１４は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１５
競合による結合の変化による選別
例２１の方法を使用して、ｃａｔ１Ｍ１３の別の一部をそれぞれ、カラム上に通す。各カラムは、式ＸＸＩＩ−ＸＸＸおよび式ＸＸＸＩＩで表される化合物（Ｒ1を介して結合）を含有する。各部分をカラムに結合している各無反応性基質類縁体により溶出する。各溶出液からのフラクションを次いで、それぞれこれらのフラクションが溶出されたカラムと同一のカラムに通し、次いでこの時点で基質［式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）］により溶出する。この２次元分離様相が標準化されて、図１に示されている。各溶出液から遅くれて溶出するファージをそれぞれ単離し、集め、次いでE.coli感染に使用する。E.coli感染から生成されたファージ、ｃａｔ１Ｍ１３１５−ｃａｔ１Ｍ１３２３、をそれぞれ式ＩＩで表される化合物（Ｒ1＝ＮＯ2）の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（速度加速）（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；このｃａｔ１Ｍ１３１５−ｃａｔ１Ｍ１３２３は、ｃａｔ１Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１６
ファージライブラリイの構築
１９９１年１０月１０日付け出願の米国出願serialNo.０７／７７３０４２に記載の方法を使用して、マウスをハプテンＩＡまたはＩＢにより免疫感作し、化合物ＩＩＡまたはＩＩＢを加水分解して、５−フルオロウリジンを生成させる反応を触媒する、触媒性抗体を誘発させる。
例１の方法を採用して、この免疫感作したマウスからのひ臓ＲＮＡ、増幅用のＰＣＲコンセンサスプライマー、短鎖ペプチドによりドメインを連結させて、一本鎖Ｆｖを生成させるためのＰＣＲ、この一本鎖Ｆｖライブラリイの５′および３′末端に制限酵素部位を挿入するためのＰＣＲ、およびｆｄ、ラムダおよびＭ１３の各ファージ表示ベクター中へのクローニングを採用して、ハプテンＩＡまたはＩＢにより誘発される、基質ＩＩＡまたはＩＩＢのエステル加水分解に係わる触媒性抗体またはその触媒性部分を発現する組換えファージを調製する。本明細書において、これらの組換えファージの初期集団を、それぞれｃａｔ２ｆｄ、ｃａ２λおよびｃａｔ２Ｍ１３と記する。
例１７
メカニズム−ベース  インヒビター選別：第一付属集団の生成
ｃａｔ２ｆｄ含有溶液を、結合ハプテンとして式ＩＡで表される化合物（ＮＨ2を介して結合）を含有するアフィニティカラム（セファロース）上に通す。このカラム上に遊離のハプテンを引き続いて通し、次いでこの遊離ハプテン洗浄により溶出されるファージを透析して、結合したハプテンを分離することによって、カラムのハプテンに結合するファージの第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄ１Ａ）を、採取する。この第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄ１Ａ）を、式ＩＩＡおよびＩＩＢで表される化合物の両方の加水分解を触媒するその能力に関して試験し、その速度加速ファクターを測定する（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；この第一付属集団は、若干の触媒活性を示す。ｃａｔ２ｆｄを含有するが、結合ハプテンが式ＩＢで表される化合物である、別の溶液を用いて、上記方法を反復する。この反復操作により得られた第一付属集団、ｃａｔ２ｆｄ１Ｂ、はまた、式ＩＩＡおよびＩＩＢで表される化合物の両方の加水分解において若干の触媒活性を示す。ｃａｔ２ｆｄ１Ａおよびｃａｔ２ｆｄ１Ｂを集め、第一付属集団、ｃａｔ２ｆｄ１とする。
同様の方法で、ｃａｔ２Ｍ１３からの第一付属集団、すなわちｃａｔ２Ｍ１３１、を調製する。ｃａｔ２Ｍ１３１ならびにこれらから生成された付属集団（ｃａｔ２Ｍ１３１Ａおよびｃａｔ２Ｍ１３１Ｂ）は、式ＩＩＡおよびＩＩＢで表される化合物の両方の加水分解において若干の触媒活性を示す。
例１８
メカニズム−ベース  インヒビター選別
上記第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄ１）の第一の一部を、上記のとおりに、セファロースカラムに共有結合させた式ＸＩＩで表される化合物と、式ＩＩＡおよびＩＩＢで表される化合物の加水分解反応条件（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）の下に、接触させる。溶出するものを採取し、廃棄する。このカラムに、温和な無機酸（ＨＣｌ）溶液（ｐＨ４−５）を通し、これにより溶出されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ形質転換に使用する。このE.coli形質転換から得られたファージ（ｃａｔ２ｆｄ２）を、式ＩＩＡおよびＩＩＢで表される化合物の両方の加水分解を触媒するその能力に関して試験する（ｐＨ７．０；５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０℃、０．５−３時間）；ｃａｔ２ｆｄ２は、第一付属集団（ｃａｔ２ｆｄ１）に比較して、大きい触媒活性（ターンオーバー数）を示す。
例１９
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例１８の方法に従い、第一付属集団ｃａｔ２Ｍ１３１の一部から、第二付属集団ｃａｔ２Ｍ１３２を生成させ、その触媒活性を試験する。ｃａｔ２Ｍ１３２はｃａｔ２Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性を示す。
例２０
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例１８の方法に従うが、式ＸＩＩＩ−ＸＸで表される化合物をカラムに結合させて、第二付属集団、ｃａｔ２ｆｄ３−ｃａｔ２ｆｄ１０をそれぞれ、第一付属集団ｃａｔ２ｆｄ１の一部から生成させ、触媒活性を試験する。ｃａｔ２ｆｄ３−ｃａｔ２ｆｄ１０はそれぞれ、ｃａｔ２ｆｄ１に比較して、大きい触媒活性を示す。
例２１
メカニズム−ベース  インヒビター選別
例２０の方法に従い、式ＸＩＩＩ−ＸＸで表される化合物をそれぞれ使用して、第一付属集団ｃａｔ２Ｍ１３１の一部から、第二付属集団ｃａｔ２１３３ーｃａｔ２Ｍ１３１０を生成させる；これらの第二付属集団の触媒活性を試験する。ｃａｔ２Ｍ１３３ーｃａｔ２Ｍ１３１０はそれぞれ、ｃａｔ２Ｍ１３１に比較して、大きい触媒活性を示す。
前記例は本発明の方法の驚くべき利点を証明している：触媒を無触媒から選別または濃縮することができ、かつまた良好な触媒を得ることができる。
参考刊行物
0004125365.tif 000038
0004125365.tif 000039
0004125365.tif 000040
本発明の好適態様を詳細に説明したが、添付請求の範囲により特定されている本発明は、前記の特定の詳細な説明に制限されるものではなく、かなりの明白な変更が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく可能であることは、理解されるべきである。
配列リスト
（１）一般情報
（ｉ）出願人：
0004125365.tif 000041
（ｉｉ）発明の名称：触媒性部分の発現に係わる反応−ベース選別および濃縮
（ｉｉｉ）配列の数：４
（ｉｖ）相当する住所：
（Ａ）住所：Curtis, Morris & Safford, P.C.
（Ｂ）ストリート：530 Fifth Avenue
（Ｃ）市：New York
（Ｄ）州：New York
（Ｅ）国：United States
（Ｆ）ZIP：10036
（ｖ）コンピューター読取り可能フォーム：
（Ａ）メディアムタイプ：フロッピイディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパーティブル
（Ｃ）オペレーティング  システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：
（ｖｉ）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人／エイジェント情報：
（Ａ）名前：Ｅｖａｎｓ  Ｂａｒｒｙ
（Ｂ）登録番号：２２８０２
（Ｃ）参照／内容摘要番号：３７００６８−３５８１
（ｉｘ）電信情報：
（Ａ）（電話）（２１２）８４０−３３３３
（Ｂ）ファックス：（２１２）８４０−０７１２
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に係わる情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）線型：一本鎖
（Ｄ）形態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0004125365.tif 000042
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に係わる情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）線型：一本鎖
（Ｄ）形態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0004125365.tif 000043
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に係わる情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）線型：一本鎖
（Ｄ）形態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0004125365.tif 000044
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に係わる情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）線型：一本鎖
（Ｄ）形態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0004125365.tif 000045
【図１】
0004125365.tif 000046
【図２】
0004125365.tif 000047