(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、
ａ）その中を体液試料が毛管作用により流れることができる試験マトリックスを提供する工程｛ここで、該試験マトリックスは、分析対象物に対して特異的である移動性結合パートナー（該結合パートナーは、検出可能な標識を有しており、また、分析対象物と反応して分析対象物／標識化結合パートナー複合体を形成することができる）を含有する第一領域と；固定化分析対象物、又は標識化結合パートナーが特異的であるエピトープとは別の分析対象物のエピトープに対して特異的である固定化結合パートナーを含有する、少なくとも一つの第二領域と；第二領域では結合しない該分析対象物／標識化特異的結合パートナー複合体を捕捉するための手段を含む、少なくとも一つの第三領域と；検出可能な信号（該信号の強度は、第二の分析対象物のレベルに相当し、その第二の分析対象物の濃度は、濃度が測定されるべき第一の分析対象物のそれに臨床的に関連する）を発生するための手段を含む第四領域を有する｝；
ｂ）第一及び第二の分析対象物を含有する疑いがある体液試料を適用することにより、該マトリックスを展開する工程｛これにより、標識化特異的結合パートナーをそれに接触させ、そのために、過剰な未反応標識化結合パートナーを更に反応させるために遊離な状態にして、液体試料中に存在する分析対象物が標識化特異的結合パートナーに結合して複合体を形成し、これにより、液体試料は、分析対象物／標識化結合パートナー複合体と未反応の標識化結合パートナーとを、該マトリックスに沿って、毛管作用により、第二領域（この領域において、未反応標識化結合パートナーが、液体試料中の第一の分析対象物の濃度と反比例の関係で、固定化分析対象物に結合するか、分析対象物／標識化結合パートナー複合体が、流体試料中の分析対象物の濃度と比例の関係で、固定化特異的結合パートナーに結合する）に運び、第二領域で結合しなかった標識化結合パートナーは、毛管作用により第三領域に運ばれ、そこで固定化手段により固定化される｝；
ｃ）展開したマトリックスの第二領域を、検出可能な標識からの信号を測定しうる検出器を有する装置により、第二領域中の標識化結合パートナーの濃度を測定するために読み取り、また、展開したマトリックスの第三領域を、同様の方法により、マトリックスの第三領域中の標識化結合パートナーからの信号を測定するために読み取る工程；
ｄ）第二領域で捕捉された標識化結合パートナーからの信号と第三領域で固定化された標識化結合パートナーからの信号とを比率化することにより、最終応答信号を決定する工程；
ｅ）流体試料中の第一の分析対象物の濃度を、工程ｄ）で決定した最終応答信号と、既知濃度の第一の分析対象物を含有する流体試料について同様の方法で決定した最終応答信号とを比較することにより決定する工程；及び
ｆ）マトリックスの第四領域における信号の強度を測定することにより流体試料中の第二の分析対象物の濃度を決定し、その後定量的濃度が求められている第一の分析対象物に対する第二の分析対象物の比を決定することにより、工程ｅ）で決定した第一の分析対象物の濃度を補正する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
体液が、尿、全血、血漿、血清、汗又は唾液である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
体液が全血であり、第一の分析対象物がＨＢＡ1Cであり、第二の分析対象物が全ヘモグロビンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
体液が血清であり、第一の分析対象物がトランスフェリンであり、第二の分析対象物がトランスフェリン−鉄結合能（transferrin-iron binding capacity）である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
体液が尿であり、第一の分析対象物が尿中物質であり、第二の分析対象物がその濃度が腎臓クリアランスの尺度である物質である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
第二の分析対象物がクレアチニン又はイヌリンである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
第一の分析対象物が、デオキシピリジノリン、ヒト血清アルブミン、アンフェタミン類、バルビツエート類、コカイン、前立腺特異性抗原、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンダーゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ろ胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、タム・ホースフォール蛋白質、リポ多糖、β2ミクログロブリン、アミラーゼ又はクラミジアリポ多糖（chlamydial LPS）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
体液が全血又は血清であり、第一の分析対象物が全前立腺特異性抗原であり、第二の分析対象物が遊離の前立腺特異性抗原である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
第一の分析対象物がアラニンアミノトランスフェラーゼであり、第二の分析対象物がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
マトリックスが試験片の形態であり、その中を液体試料が平面方向に流れる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
試験マトリックスの第二領域が三個の別個のバンドに分割されており、第三領域が単一バンドであり、最終応答信号が、式：
【数１】
0004183308.tif 000024
（式中、Ｔは全４バンドからの信号の合計であり、Ｐ1は第二領域の第一バンドである）を解くことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
試験マトリックスの第二及び第三領域が、複数の捕捉及び検出バンドにそれぞれ分割されており、最終応答信号が、式：
【数２】
0004183308.tif 000025
（式中、「捕捉バンド１」は第二領域の第一バンドからの信号であり、「検出バンド１」は第三領域の第一バンドからの信号である）を解くことにより決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
第二及び第三領域から受け取った反射率信号から最終応答信号を決定するための、また、第四領域から受け取った反射率信号から第二の分析対象物の濃度を決定するための、また、第一の分析対象物の補正濃度を決定するために、第一の分析対象物濃度に対する体液試料中の第二の分析対象物濃度の比を決定するための、適当なアルゴリズムで予めプログラム化されているソフトウエアを備えた反射率計の使用により試験片を読み取る、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
体液試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、ａ）体液試料をマルチ領域試験片に適用する工程｛ここで、該試験片は、分析対象物に対して特異的である移動性結合パートナー（該結合パートナーは、視覚的に検出可能な標識を有しており、また、分析対象物と反応して分析対象物／標識化結合パートナー複合体を形成することができる）を含有する第一領域と；固定化分析対象物、又は標識化結合パートナーが特異的であるエピトープとは別の分析対象物のエピトープに対して特異的である固定化結合パートナーを含有する、少なくとも一つの第二領域と；第二領域では結合しない該分析対象物／標識化特異的結合パートナー複合体を捕捉するための手段を含む、少なくとも一つの第三領域を含む｝；
ｂ）第二領域（一つ又は複数）で捕捉された標識化特異的結合パートナーの量を、可視標識が反射する光の波長で反射率を検出することができる反射率計により決定し、また、第三領域（一つ又は複数）で固定化された分析対象物／標識化特異的結合パートナー複合体の量を、同様の方法により決定する工程；
ｃ）反射率計により高められた精度で読み取られうる最終応答信号を提供するように選択された複数の第二及び第三領域とアルゴリズムを用いて、第二領域（一つ又は複数）で捕捉された標識化特異的結合パートナーからの反射率信号と第三領域（一つ又は複数）で固定化された標識化結合パートナーからの反射率信号とを比率化することにより、最終応答信号を決定する工程；
ｄ）該最終応答信号と、既知濃度の分析対象物を含有する体液試料に関して同様の方法で測定された最終応答信号とを比較することにより、分析対象物の濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
試験片の第二領域が三個のバンドに分割されており、第三領域が単一バンドであり、最終応答信号が、式：
【数３】
0004183308.tif 000026
（式中、Ｔは全４バンドからの信号の合計であり、Ｐ1は第二領域の第一バンドである）を解くことにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
試験片の第二及び第三領域が、複数の捕捉及び検出バンドにそれぞれ分割されており、最終応答信号が、式：
【数４】
0004183308.tif 000027
（式中、「捕捉バンド１」は第二領域の第一バンドからの信号であり、「検出バンド１」は第三領域の第一バンドからの信号である）を解くことにより決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
試験片が、視覚的に検出可能な信号（ここで、該信号の強度は、体液中の第二の分析対象物のレベルに相当し、その第二の分析対象物の濃度は、濃度が測定されるべき分析対象物のそれに臨床的に関連する）を発生するための手段を含む第四領域を有し、また、第二の分析対象物に対する、濃度が求められている分析対象物の比を決定することにより最終応答信号を補正する、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
体液が尿であり、分析対象物がデオキシピリジノリンである、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
体液が尿であり、第一の分析対象物が尿中物質であり、第二の分析対象物がその濃度が腎臓クリアランスの尺度である物質である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
第二の分析対象物がクレアチニンである、請求項５記載の方法。
【請求項２１】
第二及び第三領域から受け取った反射率信号から最終応答信号を決定するための適当なアルゴリズムで予めプログラム化されているソフトウエアを備えた反射率計の使用により試験片を読み取る、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
試験片が分光光度的に検出可能な信号（ここで、該信号の強度は、体液中の第二の分析対象物のレベルに相当し、その第二の分析対象物の濃度は、濃度が測定されるべき分析対象物のそれに臨床的に関連する）を発生するための手段を含む第四領域を有し、反射率計は、第四領域からの反射率に基づき分析対象物の濃度を決定するための、また、第一の分析対象物の補正濃度を決定するために、最終応答信号から決定された第一の分析対象物の濃度に対する第二の分析対象物のそれの比を決定するための、予めプログラム化されているソフトウエアを備えている、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
免疫クロマトグラフィー試験片フォーマットは、目視検出系を用いる定量及び半定量アッセイにとり益々一般的になっている。この種の免疫アッセイは、検出が求められている分析対象物を含有する疑いがある液体試料を、免疫クロマトグラフィー試験片の適用ゾーンに適用する工程を含む。この試験片はマトリックス材料からなり、その中を、試験流体及びその中に懸濁又は溶解した分析対象物が、毛管作用により、適用ゾーンから捕捉ゾーン（このゾーンにおいて、検出可能な信号又はその欠如が、分析対象物の存在を示す）へと流れることができる。一般的に、試験片は、検出が求められている分析対象物を、検出可能な標識を有するその特異的結合パートナーに免疫特異的に結合させるための手段を含む。米国特許第４，４４６，２３２号明細書に開示されたような一つの系において、試験片は、分析対象物に対する酵素標識・移動性結合パートナーを、試料適用ゾーンの下流にあるゾーンに含有する。分析対象物が試料中に存在する場合、分析対象物はその標識化結合パートナーと結合して複合体を形成し、この複合体は試験片に沿って検出ゾーン（ここで、この検出ゾーンは、その酵素標識の存在下で色応答を提供しうる、その酵素標識に対する基質を含有する）へ流れる。この試験片は、分析対象物が固定化されているゾーンを含むことができ、これにより、試料中の分析対象物の不在のため分析対象物と結合しない標識化結合パートナーが捕捉され、そのために検出ゾーンに達するのを抑制する。この技術については様々な変更が発表されており、それらのすべてはいくつかの競合的特異的結合系を含み、その系において、試料中の分析対象物の存在又は不在が、捕捉ゾーンにおける標識化結合パートナーの検出又は欠如により決定される。
【０００２】
遊離の標識化抗体を検出する上記免疫測定アッセイの代替手段は、サンドイッチフォーマットと称されるものであり、このフォーマットにおいて、捕捉ゾーンは、標識化抗体が特異的であるエピトープとは別の分析対象物のエピトープに対する固定化抗体を含有する。このフォーマットにおいて、固定化抗体と標識化抗体との間に分析対象物のサンドイッチが形成される。そのために、このフォーマットは、結合した標識化抗体種を検出する免疫測定アッセイである。
【０００３】
免疫クロマトグラフィーに関するすべての系が、分析対象物の検出に関する信号を提供するために、酵素標識化結合パートナー／酵素基質に依存しているわけではない。米国特許第４，８０６，３１１号明細書において、分析対象物と固定化結合パートナーとの特異的結合アッセイ測定（したがって、試薬ゾーンから捕捉ゾーンに移動する標識化試薬を受け取るための捕捉ゾーンと共に）のためのマルチゾーン試験具が開示されている。捕捉ゾーンは、標識化試薬に対する固定化物質を固定形態で含有する。標識化試薬は、検出可能な物理特性を有する化学基を有し、自身の物理特性を基礎として検出可能である。それにより、別の物質との化学反応を要しない。そのような群の例は、蛍光群の有色種、燐光分子、放射性同位体及び電気的活性部分である。
【０００４】
米国特許第４，７０３，０１７号明細書には、レセプターとして目視可能な粒子状標識の使用が記載されている。金ゾル粒子及び目視可能な染料を含有するリポソームのような様々な粒子状標識について言及されている。
【０００５】
国際公開第９６／３４２７１号パンフレットには、流体試料中の標的分析対象物とクレアチニンを測定するための試験具が開示されている。この試験具は、クレアチニン検出のためのアッセイ試験片と、標的分析対象物検出のための第二のアッセイ試験片とを有する。クレアチニン濃度は、比色法又は標識化クレアチニン結合パートナーの特異的捕捉により測定されうる。標的分析対象物の濃度は、試料のクレアチニン濃度に基づき補正される。この補正は、マニュアルか、適当にプログラム化された反射率アナライザーのいずれかによりなされうる。
【０００６】
欧州特許出願公開第０４６２３７６（Ａ2）号明細書には、免疫クロマトグラフィー手順が開示されている。この手順において、試験片の捕捉部位及び結合体回収部位における信号を検出し、結合体回収部位での信号に対する捕捉部位での信号強度により分析対象物濃度を決定する。これについては、米国特許第５，５６９，６０８号明細書もまた関連する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
免疫クロマトグラフィー試験片フォーマットは、様々な分析対象物（抗原、抗体のいずれであろうと）を測定するための目視可能な系を提供するが、いくつかの分析対象物に関してより正確な定量的結果が要求される場合に、せいぜい半定量的な結果しかもたらさないという限界がある。したがって、免疫クロマトグラフィー試験片フォーマットの使用により達成される分析結果を定量化するための手段を提供することが望ましく、これが本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体液試料中の分析対象物を測定する方法であって、
ａ）その中を液体試料が毛管作用により流れることができるマトリックスを含む試験片を提供する工程｛ここで、該試験片は、分析対象物に対して特異的である移動性結合パートナー（該結合パートナーは、検出可能な標識を有しており、また、分析対象物と反応して分析対象物／標識化結合パートナー複合体を形成することができる）を含有する第一領域と；固定化分析対象物、又は標識化結合パートナーが特異的であるエピトープとは別の分析対象物のエピトープに対して特異的である固定化結合パートナーを含有する、少なくとも一つの第二領域と；第二領域では結合しない該分析対象物／標識化特異的結合パートナー複合体を捕捉するための手段を含む、少なくとも一つの第三領域と；検出可能な信号（ここで、この信号の強度は、第二の分析対象物のレベルに相当し、その第二の分析対象物の濃度は、体液中のその濃度が測定されるべき分析対象物の濃度に、臨床的に関連する）を発生するための手段を含む第四領域を有する｝；
ｂ）第一及び第二の分析対象物を含有する疑いがある体液試料を適用することにより、該マトリックスを展開する工程｛これにより、標識化特異的結合パートナーをそれに接触させ、そのために、過剰な未反応標識化結合パートナーを更に反応させるために遊離な状態にしながら、液体試料中に存在する分析対象物が標識化特異的結合パートナーに結合して複合体を形成し、これにより、液体試料は、分析対象物／標識化パートナー複合体と未反応の標識化結合パートナーとを、マトリックスに沿って、毛管作用により、第二領域（この領域において、未反応標識化結合パートナーが、液体試料中の第一の分析対象物の濃度と反比例の関係で、固定化分析対象物に結合するか、分析対象物／標識化結合パートナー複合体が、流体試料中の分析対象物の濃度と比例の関係で、固定化特異的結合パートナーに結合する）に運び、第二領域で結合しなかった標識化特異的結合パートナーは、毛管作用により第三領域に運ばれ、そこで捕捉手段により捕捉される｝；
ｃ）展開したマトリックスの第二領域を、検出可能な標識からの信号を測定しうる検出器を有する装置により、第二領域中の標識化結合パートナーの濃度を測定するために読み取り、また、展開したマトリックスの第三領域を、同様の方法により、マトリックスの第三領域中の標識化結合パートナーからの信号を測定するために読み取る工程；
ｄ）第二領域で固定化された標識化結合パートナーからの信号と第三領域で捕捉された標識化結合パートナーからの信号とを比率化することにより、最終応答信号を決定する工程；
ｅ）流体試料中の第一の分析対象物の濃度を、工程ｄ）で決定した最終応答信号と、既知濃度の第一の分析対象物を含有する流体試料について同様の方法で決定した最終応答信号とを比較することにより決定する工程；及び
ｆ）マトリックスの第四領域における信号の強度を測定し、これを第二の分析対象物の濃度値に変換することにより流体試料中の第二の分析対象物の濃度を決定し、その後定量的濃度が求められている第一の分析対象物に対する第二の分析対象物の比を決定することにより、工程ｅ）で決定した第一の分析対象物の濃度を補正する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明は、最初に、その中を流体試料が毛管作用により流れることができる試験マトリックスを提供する工程により実施される。一般に、このマトリックスは、試験片の形態であり、その中を試験流体は平面方向に流れる。試験流体がその中を頂部から底部に又はその逆に鉛直的に流れる層状フォーマットの形態でマトリックスを組み立てうるが、以下では好ましい試験片フォーマットに絞る。
【００１０】
試験片は、試験流体及びその中に含まれる分析対象物が毛管作用によりその中を流れることができるすべてのマトリックス材料から製造しうる。また、非吸収性側方流動をサポートすることができる材料のものでありうる。このタイプの流れは、液体流として米国特許第４，９４３，５２２号明細書に記載されており、液体の溶解又は分散成分のすべてが、マトリックス材料が一種以上の成分を吸収しうる場合のように一種以上の成分を優先的に保持する場合とは対照的に、マトリックスの中を実質的に等速かつ相対的に弱められない（unimpaired）流れで運ばれる。そのようなマトリックス材料の例は、Porex Technologies製の高密度又は超高分子量ポリエチレンシート材料である。同じく、紙、ニトロセルロース及びナイロンのような吸収性材料がマトリックスとして使用するのに適しており、これからクロマトグラフィー試験片が製造されうる。
【００１１】
様々な免疫クロマトグラフィー試験片フォーマットが、本発明との関連で使用するのに適する。特に適したフォーマットは、米国特許第４，４４６，２３２号明細書に開示されているものであり、抗原の存在を測定するための試験具（この試験具は、固定化分析対象物と、測定が求められる分析対象物に対して特異的である酵素結合抗体とを備えた第一ゾーンを有するマトリックス材料の試験片を有する）がこの中に記載されている。標識化抗体は、試料を介して第一ゾーンに導入された分析対象物と反応した場合、第二ゾーンに流れることができる。しかし、標識化抗体は、試験流体中に分析対象物が不在の場合には、固定化分析対象物との相互作用により第一領域に結合するために、流れないであろう。分析対象物は一般には抗原であるが、分析対象物として抗体の存在を検出するためにフォーマットを設計しうる。このフォーマットの変形が、米国特許第４，８６８，１０８号明細書に開示されている。別の変形では、酵素基質は、第二の固定化抗体の領域に配置されている。これにより、酵素標識結合パートナーと分析対象物との間で形成された複合体を捕らえることができる。本発明を酵素とその基質の相互作用に限定させる必要はないので、検出可能な信号を提供するためにいかなる物理的に検出可能な信号発生物質を使用してもよいが、この種のフォーマットは本発明への適合に特に適している。このように、分析対象物に対する標識化結合パートナーが捕捉されるゾーンから試験片の下流に位置する別個の検出ゾーンにおいて、結合体を固定することにより、物理的に検出可能なその標識の特性がその濃度を決定するために測定されうる二個の領域が提供される。マトリックスの第二領域（時々、捕捉ゾーンという）における検出可能な標識からの信号と、第三領域（時々、検出ゾーンという）における標識の物理的に検出可能な特性からの信号を測定し{ここで、標識化結合パートナー（例えば、標識化結合パートナーが抗体である場合、抗マウスＩｇＧ）に対する固定化抗体が捕捉手段である}、これらの信号の比を決定することにより、分析対象物濃度に関する試験の精度を上げることができる。この技術によれば、標識化結合体沈着及び／又はマトリックス中の不均一流の不正確さを補正するので精度は上がる。特に、前述の標識化結合体沈着及び不均一流の不正確さは通常は小さいが有意の大きさであるので、それらは結合平衡を実質的に乱さない。したがって、二個の結合領域における信号の比は、いずれかの領域からの信号単独よりも、分析対象物濃度のより正確な測定手段である。この原理は、前述のサンドイッチフォーマットを用いる場合、等しい効力で当てはまる。
【００１２】
本発明で使用されるマトリックスの第二及び第三領域は、それぞれ２個又は３個のバンドに分割されていてもよく、好ましくは、第二領域は１〜３個の別個のバンドを有し、第三領域は１〜２個のバンドを有する。これらの領域を複数のバンドに分割することにより、検出された標識化結合パートナー数に対する反射率の非直線性のため、ダイナミックレンジ及び／又はアッセイの精度が上がる。検出された標識化結合パートナーのわずかな変化の測定は、反射率の低い値より高い値においてより確実なので、これら領域を別個のバンドに分割することは望ましい。望ましい捕捉及び／又は捕集バンドの数は、試験片が設計されている個々のアッセイに依存する。捕捉及び補正ゾーンを２個以上の別個のゾーンに分割することは、あるアッセイではダイナミックレンジを上昇させるが、他のアッセイでは上昇させないからである。あるゾーン中の１個を超える単一の捕捉又は検出バンドに着目するならば、ダイナミックレンジは、全体の信号を上昇させうるという事実を指す。このように、検出可能な標識が反射率計により検出可能である場合、反射率のかなりの非直線性及び使用した反射率計に関連した誤差が存する可能性がある。例えば、反射率が７０％と７５％との相違は相当少量の検出標識を示すのに対し、３０％と３５％の相違は高いパーセンテージの検出標識を示す。ある種の反射率計を使用する場合、反射率読み取りにおける誤差は一定のままか、反射率値が減少するにつれて増加する。このように、1個以上の付加的な捕捉又は検出バンドを使用することは、粒子濃度に対してより感度のある高い値に反射率読み取りを置く場合、有利である。広いダイナミックレンジが要求されないこれらアッセイにおいて、単純な読み取りと、単一の捕捉領域と単一の検出領域とを比率化することは、良好な定量的結果を与えうる。これは以下の実施例１によって例示される。この実施例においては、デオキシピリジノリンが第一の分析対象物であり、捕捉ゾーンは３個のバンド（Ｐ1、Ｐ2及びＰ3）に分割されており、検出ゾーンは１個のバンド（Ｐ4）であり、ＤＰＤアッセイのデコードアルゴリズムはＴ／Ｐn（ここで、Ｔは、４個すべてのバンドからの信号の合計である）である。これら試薬バンド反射率値を用いるアルゴリズムは、ＳＮ比を最大にし、これにより変動係数（ＣＶ）を下げることによりアッセイの定量性を高めるように構築される。選択されたある特定のアルゴリズムは、使用されるある特定の試験片における試薬バンドの数と、アッセイの感度及び／又は精度とに依存する。適切なアルゴリズムが選択される場合、アルゴリズム値と分析対象物濃度との関係を決定し、非直線回帰関数に当てはめる。そのような当てはめの目的は、選択されたアルゴリズム値を分析対象物濃度のそれに関連づける誤差を減少させることである。回帰関数は、決定されたアルゴリズム値を分析対象物濃度のそれに関連づけるために用いられる校正曲線を決定するために使用される。この関係が確立されたとき、反射率装置中で式として保存されうる校正曲線は、分析対象物濃度を計算するために用いられる。
【００１３】
捕捉及び検出ゾーンの反射率は互いに対して変化する（すなわち、捕捉ゾーンからの信号が大きくなるにつれ、検出ゾーンからの信号が小さくなる）ので、マルチ捕捉及び／又は検出バンドの使用は、反射率値のこの範囲を改めるように設計される。分析対象物濃度がバンドの反射率を変化させるメカニズムは、ある特定のアッセイの化学作用である。サンドイッチアッセイに関しては、分析対象物濃度の上昇につれ、捕捉バンド反射率は増加し、検出バンド反射率は減少する。競合的アッセイに関しては、流体試料中の分析対象物量が増加するにつれ、捕捉バンド反射率は減少し、検出バンド反射率は増大する。
【００１４】
付加的な捕捉及び／又は検出バンドの必要性は、付加的バンドにおける変化量が、他のどのバンドより、与えられた分析対象物領域において、かなり大きいか否かに依存する。標識（すなわち、金ゾル）濃度に依存して、付加的捕捉バンドは検出ゾーンにおける信号変化量も引き下げるであろう。ある種のアッセイにおいて、第二の捕捉バンドは単に第一の捕捉バンドを反映するが、信号変化量が引き下げられ、このような場合、その必要性が疑われる。しかしながら、低反射率のために検出ゾーンが非常に暗いアッセイにおいては、捕捉バンドの付加はこのゾーンにおける信号を引き下げうる。
【００１５】
概括すると、本発明の本質は、ある特定のアルゴリズムと、付加的な捕捉及び／又は検出バンドを選択し、反射率計によってより大きな精度で読み取ることができるように信号を変える工程を含む。
【００１６】
適当なアルゴリズムを開発することに関連した二つのステップがある。第一は、できる限り高いレベルにＳＮ比を上昇させることである。第二は、いかなる分析対象物濃度に対しても正確な値を得ることができるように、式に容易に当てはまるアルゴリズムを定めることである。このことを、３個のバンドを含む試験片（２個の捕捉バンド及び１個の検出バンド）に関連した以下の検討で示す。２個の捕捉バンドは、異なった捕捉試薬濃度を有しており、第一の捕捉バンドは、第二の捕捉バンドより１０倍低い捕捉試薬濃度を有する。捕捉及び捕集バンドの様々な組み合わせと濃度を、各アッセイのユニークな特性に依存して用いることができることをこのフォーマットは示す。２日間にわたり、３種類の異なったＣＬＩＮＩＴＥＫ（登録商標）５０反射率計を用いてデータを取った（各分析対象物レベルに関し、Ｎ＝１８を表す）。表１は、様々なバンド反射率変化量のＤＰＤレベルと、様々な反射率変化量の使用と、様々なアルゴリズムの使用との間の最小感度（ＦＯＭ）の相違を示す。ＦＯＭは、（Ａｖｇ１−Ａｖｇ２）／（ＳＤ１＋ＳＤ２）で計算される（式中、Ａｖｇ１及びＡｖｇ２は分析対象物レベル１と分析対象物レベル２に関する平均測定値であり、ＳＤ１及びＳＤ２は、分析対象物１と分析対象物２に関する平均値の標準偏差である）。
【００１７】
【表１】
0004183308.tif 000002
【００１８】
表１では、捕捉１は、捕捉１バンドに関するＩＲ補正反射率データであり、検出バンド１は、検出バンド２に関するＩＲ補正反射率データであり、捕捉１／検出１は、検出１で割った捕捉１のＫ／Ｓ変形データであり、アルゴリズム１は、式：
【００１９】
【数５】
0004183308.tif 000003
【００２０】
（式中、ＡＢＳは数の絶対値を示す）であり、式中、Ｃは、式：
【００２１】
【数６】
0004183308.tif 000004
であり、全／捕捉１は、式：
【００２２】
【数７】
0004183308.tif 000005
である。
【００２３】
この例示において、検出バンド性能は、ＤＰＤ濃度が上がるにつれて減少するのに対し、より大きい信号変化は、捕捉バンドに関して顕著である。いかなるアルゴリズムに関しても、アッセイに最も重要である領域においてＳＮ比が最大となるように反射率値を偏らせることが目標である。ＦＯＭ解析を用いることによりこれを達成することができ、アルゴリズム１は、低分析対象物濃度において２個の捕捉バンドがより大きい相違となるように偏るように構築される（ここで、この相違は、高分析対象物濃度において、全体にわたる補集バンドの偏りの中で最も大きい）。アルゴリズム１の別の目標は、多くの免疫アッセイで使用される共通の４個のパラメーター当てはめ値に当てはめることを可能にするように、この偏りを置くことである。
【００２４】
アルゴリズム開発における第二のステップは、容易に当てはめられうる、かつ値間に正確な分析対象物濃度を与える式を使用することである。ＦＯＭは２種の異なる分析対象物レベルを区別するための好適な方法であるが、曲線の形に関する如何なる情報も与えない。ある特定のアッセイの化学を模倣する分析法を使用することが、しばしば最も好適なアプローチである。免疫アッセイに関し、これはしばしば４個のパラメーター当てはめ式である。すべての当てはめ式及びアルゴリズムに関する試験は、様々な分析対象物濃度を有するランダム試料の使用並びに誤差（％ＣＶ）及び偏りの計算である。目標は、アッセイの予期される範囲を通して、最小の偏りを有する最も低い％ＣＶを探すことである。２種の分析法に関する尿中のＤＰＤ結果０〜２５０nM/mMの比較を、表２及び３に示す。この例示では、３個のバンドを有する免疫試験片を用いた。
【００２５】
【表２】
0004183308.tif 000006
【００２６】
【表３】
0004183308.tif 000007
【００２７】
表２及び３のデータから、この特定の分析に関し、最初のアルゴリズムは、すべてのＤＰＤ値において殆ど誤差を有しない（％ＣＶで測定）。この例は、正確なアルゴリズムを見出すための幾分経験的な方法を示す。選択したアルゴリズムは、与えられた試験片及びフォーマット並びに分析対象物に対する与えられた臨床範囲に関し、それと関連した最も低い誤差を有するものであろう。
【００２８】
標的分析対象物に関する値が得られた後、装置は、第二の分析対象物に関する、一以上の波長での試薬パッドの反射率値を用い、流体試料中のこの分析対象物の濃度を決定する。ＤＰＤが標的分析対象物でありクレアチニンが第二の分析対象物である場合、精度（又はＳＮ比の減少）は両分析対象物に関するアッセイに重要である。高レベルの精度がない場合、その結果の誤差は、ＤＰＤ／クレアチニン比における２倍弱の増加は「通常」と「骨粗しょう症状態」の間で生ずるので、殆ど医学的重要性をもたない試験を招くであろう。第二の分析対象物は、第一の分析対象物と臨床的に関連する体液中のこれら物質から選択される。第二の分析対象物の最も著名な例はクレアチニンであり、クレアチンが筋収縮のエネルギー源として使用されるクレアチンリン酸となる場合の最終代謝産物である。生産されるクレアチニンは、腎糸球体により濾過され、その後再吸収なしに尿中に排泄される。尿アッセイの感度を上げ、尿希釈という結果を招く高尿フローレートの問題を最小化するために、分析対象物／クレアチニン比が尿蛋白アッセイで使用され、尿濃度を標準化する。通常のクレアチニンアッセイには、高pH、通常は１１．５〜１２．５の範囲で行うアルカリ性Jaffe and Benedict-Behre法を含む。最近、シトレート、過酸化水素及び酸素フリーラジカルや擬ペルオキシドの存在下で色応答を供する酸化性染料の存在下で、尿試料を第二銅イオンと接触させるクレアチニンアッセイが開発された。この方法は、米国特許第５，３７４，５６１号明細書に詳細に記載されている。クレアチニンの定量はまた、国際公開第９６／３４２７１号パンフレットに記載されているように、免疫学的にも達成されうる。これら第二の分析対象物（その体液試料中の濃度は、臨床的に標的分析対象物の濃度に関連する）は、尿中のクレアチニンに限定されず、また、尿は、本発明の方法により検定されうる唯一の体液ではない。このように、例えば、試験される体液が全血であり、第一の（標的）分析対象物がＨｂＡ1Cであり、第二の分析対象物が全ヘモグロビンであってもよい。ＨｂＡ1Cの見掛け濃度を全血の全ヘモグロビン濃度に調節し、ＨｂＡ1Cアッセイにおける偏りを排除することができるからである。静脈投与されたイヌリンは、クレアチニンのように腎臓流の指標である。血清学基礎アッセイにおいて、第一の分析対象物は、全前立腺特異的抗原であり、第二の分析対象物が遊離型の前立腺特異的抗原であってもよい。それらの濃度が臨床的に関連する他の分析対象物の対は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）であり、これらは広くヒト組織に分布している。ＡＬＴ及びＡＳＴの両方は、通常、ヒト血漿、胆汁及び唾液中に存在する。ウイルス性肝炎及び他の形態の肝臓疾患の場合、黄疸のような疾患の臨床的なサインが現れる前でさえ、ＡＳＴ及びＡＬＴのレベルが上昇する。毒性又はウイルス性肝炎においては、ＡＬＴはＡＳＴと同等又はより高く、通常は１未満であるＡＬＴ／ＡＳＴ比は、１に近づくか超える。更に、心筋梗塞後はＡＳＴ濃度は上昇し、これによりこれら２種の酵素の比とそれらの活性が変化する。このように、臨床的に重要な結果を、血清中のこれ���２種の分析対象物の比を決定することにより得ることができる。
【００２９】
多くの臨床的に重要な標的分析対象物は尿中に存在し、本発明により測定されうる。これらにおいて、分析対象物は、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ヒト血清アルブミン、乱用薬物、例えばアンフェタミン類／バルビツエート類／コカイン、臨床的に重要な蛋白質マーカー、例えば前立腺特異的抗原、腎臓疾患蛋白質、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンダーゼ、妊娠又は受胎関連ホルモン、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン、ろ胞刺激ホルモン及び黄体形成ホルモン、尿路感染のマーカー、例えばタム・ホースフォール蛋白質又はリポ多糖、β2ミクログロブリン、アミラーゼ又はクラミジアリポ多糖である。感染を評価するためにＩｇＡ／ＩｇＧの比を決定することは、本発明により達成されうる。実測クレアチニン濃度に対してこれら見掛け濃度を比率化することにより腎臓流中の変動に関しこれら見掛け濃度を補正することは、測定の精度を上昇させる。
【００３０】
展開した試験片からの信号を検出する手段は、標識化結合パートナーに結合した検出可能な標識に依存するものの、標識の検出可能な物理特性がスペクトルの可視又は赤外領域での所定波長における光反射率である場合には、反射率計の使用が一般である。所望の実施態様において、例えば検出器の読み取りヘッドの下で横方向に移動させることができる試験片用の試料テーブルの使用により、試験片又は反射率計の検出要素を、互いに対して動かす手段を有する反射率計が提供される。この技術は、反射率計の検出手段に対して正確に配置されていない試験片領域における正確な定量を提供することを支援する。特に、検出器に対する試験片の位置は、マイクロプロセッサーの制御下に置くことができ、それにより、試験片の第二、第三又は第四領域並びにこれら領域内の個々のバンドが、個々に検出されうる。
【００３１】
【実施例】
本発明を実践する方法を、以下の実施例でより詳しく説明する。
実施例１
長さ４インチ（１０１．６mm）で幅０．２インチ（５．０mm）のポリスチレン指示体上で一緒にした６個の別個の領域を有する、クレアチニン及びデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）を測定するための試験片を図１に示す。図１を参照すると、領域１は、サイズが０．２×０．２インチであるクレアチニンパットである。クレアチニンの比色測定に適合させるために、クレアチニンパッドを以下のように準備した：３０mM硫酸銅、５０mMシトレート、７５０mMグリセロール−２−ホスフェート、０．２％ヘキサンスルホン酸、５０mMフィチン酸及び０．２％ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するｐH６．９４の溶液中に、０．２インチ深までワットマン（Whatman）３mmフィルター紙を含浸させることにより最初に処理した。乾燥後、３３mM３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、７３mMジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオシキド、６３mMトリイソプロパノールアミンホウ酸塩、０．５％plasonde及び０．０３２％エチルオレンジを含有する溶液中に、試験片を含浸させた。試験片をクレアチニンを含有する水性媒体と接触させる際に生じる色応答の強度は、クレアチニン濃度に比例する。領域２は緩衝剤パットであり、０．５〜１Mグリシンと１７５〜３５０mM尿素で、ワットマンＦ０７５−０７ガラス繊維を含浸させることにより調製した。得られたパッドのサイズは０．２×０．５インチ（１２．７mm）である。この緩衝剤パットは、尿試料のpHを所望の値に緩衝する目的に役立つ。例えば、尿のpHは４．５〜８の範囲にあり、緩衝剤パットは、抗原／抗体結合反応に有利なように、pH＞７に試料を維持するために使用されうる。クレアチニンパット１と緩衝剤パット２間には、クレアチニン試薬を緩衝剤パット試薬から隔離するために、０．１インチ（２．５mm）の間隔がある。領域３は金ゾル−ＤＰＤ抗体パットである（分析対象物に対して特異的である標識化結合パートナーを含有する第一領域）。領域４及び５は免疫クロマトグラフィー展開領域であり、ここに、捕捉及び検出試薬が、０．２×１．２５インチ（３１．７５mm）のサイズを有するニトロセルロースの一片上に沈着している。領域４は、３個の捕捉バンド（固定化分析対象物を含有する第二領域）を含み、カルボキシル末端ポリエチレングリコールに固定されたＤＰＤを有し、バンド当たり約０．０５９インチ（１．５mm）の幅を有し、また、バンド間の間隔は０．２インチ（中心から中心）である。第三の捕捉バンドの中心から０．２インチにおいて、抗ＩｇＧ捕集バンドからなる領域５があり（未反応の標識化結合パートナーを固定化するための第三領域）、バンド幅は約０．０５９インチ（１．５mm）である。捕集バンドの上０．２インチにおいて、吸収パット６があり、０．２インチ×０．５インチ（１２．７mm）のサイズである試験片のニトロセルロース領域から移動する液体を吸収するように機能する。
【００３２】
アッセイを実施するため、試験溶液、すなわち測定されるべきＤＰＤ分析対象物を含有する尿試料に試験片を３秒間浸すが、この際に、クレアチニンゾーン及び緩衝剤パットのみが試験溶液の表面より下になるような深さで浸し、試験溶液が捕捉領域の捕捉バンド、検出領域の第一のバンドを通って吸収パットへ毛管作用により試験片を上昇することを可能にする。３秒浸績の後、ＣＬＩＮＩＴＥＫ（登録商標）５０反射率分光計の読み取りテーブル上に試験片を配置し、計器のスタートボタンを押した。クレアチニンパット反射率を３分間記録し、免疫ＤＰＤ試験片（全４バンド）の反射率を測定し、３分間記録した。ＤＰＤアッセイに関する反射率信号をＩＲ及び緑色フィルターで測定した一方、クレアチニンアッセイに関する反射率を赤色及び緑色フィルターで測定した。計器は、式１〜５により導出されるデコード値における応答を供する。
【００３３】
【数８】
0004183308.tif 000008
【００３４】
式中、〔Ｒ〕greenは緑色フィルターで測定した反射率であり、〔Ｒ〕redは赤色フィルターで測定した反射率である。
【００３５】
ＤＰＤアッセイに関し、バンド応答信号を表４で示すように指定した。
【００３６】
【表４】
0004183308.tif 000009
【００３７】
緑色フィルターでの反射率を、ＩＲフィルターでの反射率に対して比率化し、高さや表面変動のような試験片間での変動からの誤差を減少させる。ＩＲ波長での反射率は、バンドの金ゾル強度に関わらず、ほぼ一定値を保つ。補正反射率〔Ｒｎ〕は、式２に従って計算される。
【００３８】
【数９】
0004183308.tif 000010
【００３９】
式中、ｎはバンド数１、２、３又は４であり、〔Ｒｎ〕greenは緑色フィルターでのバンドｎの反射率であり、〔Ｒｎ〕IRはＩＲフィルターでのバンドｎの反射率である。数６５は割り当てられた補正反射率値であるが、これはＩＲフィルターでの反射率％が約６５％であるからである。
【００４０】
ＩＲ補正反射率値である〔Ｒｎ〕は、その後式３に従ってＫ／Ｓに変換され、各バンドに関するバンド応答信号を供する。
【００４１】
【数１０】
0004183308.tif 000011
【００４２】
式中、バンド信号Ｐｎは、Ｋ／Ｓ変換反射率値〔Ｒｎ〕である。
【００４３】
各バンドの応答デコードは、最終的に式４に従って計算される。
【００４４】
【数１１】
0004183308.tif 000012
【００４５】
式中、Ｔはすべてのバンドに関するバンド信号の合計である（式５）。
【００４６】
【数１２】
0004183308.tif 000013
【００４７】
式中、Ｎは捕捉バンド及び捕集バンドの合計数、本実施例では４であり、Ｐｎはバンド信号ｎであり、ｎは１、２、３又は４である。
【００４８】
ＤＰＤ及びクレアチニンに関する標準曲線を、６レベルの分析対象物濃度を含む校正物質を用いて得た。標準曲線の例を、ＤＰＤアッセイに関しては図２に、クレアチニンアッセイに関しては図３に示した。尿試験試料に関するＤＰＤ及びクレアチニン濃度を、ＤＰＤ及びクレアチニン標準曲線からそれぞれ計算した。その後、nM/mMでのＤＰＤ／クレアチニン比を、以下の計算のように、尿試料Ａに関して計算した。
【００４９】
ＤＰＤ標準曲線から計算されたＤＰＤ濃度＝１２３nM
クレアチニン標準曲線から計算されたクレアチニン濃度＝１０．２mM
ＤＰＤ／クレアチニン比＝１２３nM／１０．２mM＝１２．１nM/mM
【００５０】
高い骨吸収状態を決定するための境界値（cutoff）は、ＤＰＤ／クレアチニン比７．４nm/mMである。７．４未満が正常であり、７．４を超える場合は高い骨吸収状態である。それゆえに、本例において、その結果は高い骨吸収状態を示している。第二の尿試料を同様の方法で分析し、以下の結果を得た：
ＤＰＤ濃度＝１２３nM
クレアチニン濃度＝２０．５mM
ＤＰＤ／クレアチニン比＝６．０nM／mM
【００５１】
ＤＰＤ濃度は同じであるが、クレアチニンに対するＤＰＤの比は、低い骨吸収状態を示している。
【００５２】
様々な量のＤＰＤとクレアチニンを含有する尿試料を用いて、上記手順で５回試験した。予想比、実測比、標準偏差、変動係数（％）及び＋／−偏りを表５に示す。表５から、３個のレベル（ＤＰＤ／クレアチニン＝４．５２、７．５４、１２．０７nM/mM）において、変動係数が１２％未満である精度が得られた。
【００５３】
【表５】
0004183308.tif 000014
【００５４】
金ゾル標識化抗体は、試験片の捕捉及び捕集ゾーンで視覚的に観察可能であるが、臨床的に意味のある結果は、反射率計の使用を通してのみ得ることができる。これは、試験片の全長にわたるマルチバンドの使用による場合である。加えて、バンド信号は、様々な波長（赤外、緑及び赤）において、これら波長における反射率を測定及び記録する能力をもつ装置を用いる反射率測定を要する。反射率測定値は、装置のソフトウエアを用いて、所定のアルゴリズムに基づき比率化される。更に、分析対象物濃度は、装置内に保存されている標準曲線を用いて決定され、ＤＰＤ／クレアチニン比は装置内にセットアップされたソフトウエアを用いて計算される。
【００５５】
前記実施例において、ＤＰＤアッセイに関する最終応答信号（デコード）は、アルゴリズムデコード＝〔Ｔ／Ｐｎ〕（式中、Ｔは４個すべてのバンドからの信号の合計であり、Ｐｎはバンド１のバンド信号である）を用いて決定された。このアルゴリズムの使用はアッセイの精度を高めるが、これは、バンド信号を比率化することが、装置間の変動による誤差のような系統的誤差を減じるためである。別のアルゴリズムは、最終応答信号を決定するために使用されうる。本例における応答信号は、式：
【００５６】
【数１３】
0004183308.tif 000015
【００５７】
（式中、すべてのバンド信号は、Ｋ／Ｓ変形反射率値であり、Ｔは捕捉バンド及び検出バンドの合計である）のように決定される。
【００５８】
バンド比率化を用いる利点は、表６及び７のデータにより示される。これら表から、捕捉ゾーンからの信号のみを用いて得ることができる精度より大きい精度で、試験片がＤＰＤ濃度を測定することができるということが確認できる。
【００５９】
【表６】
0004183308.tif 000016
【００６０】
【表７】
0004183308.tif 000017
【００６１】
あるいはまた、最終応答信号は、式：
【００６２】
【数１４】
0004183308.tif 000018
【００６３】
（式中、すべてのバンド信号はＫ／Ｓ変形反射率値である）のように計算されうる。更にはまた、試験片が複数の捕捉バンド及び検出バンドを含む場合、最終応答信号は、式：
【００６４】
【数１５】
0004183308.tif 000019
【００６５】
（式中、すべてのバンド信号はＫ／Ｓ変形反射率値である）のように計算されうる。あるいはまた、応答信号を計算する別の方法は、アルゴリズム：
【００６６】
【数１６】
0004183308.tif 000020
【００６７】
（式中、すべての信号は反射率値であり、Ｗcap及びＷdetは、捕捉バンドと検出バンドを別々に重みづけする重みづけ関数である）を用いる工程を含む。このように、非常に多くのアルゴリズムを、最終応答信号を決定するために用いうる。
【００６８】
試験片の第二（捕捉）領域に固定された標識化結合パートナーからの信号と、第三（検出）領域に固定された標識化結合パートナーからの信号とを比率化することによる応答信号の計算は、ＳＮ比を引き下げることによりアッセイの精度を上げることに関して重要である。この高められた精度は、ＤＰＤ／クレアチニン比のわずか２倍の増加が、正常と疾病を示す骨粗しょう症状態との間で生じるので、臨床的意義をもつ検査にとり重要である。
【００６９】
本発明において達成されうる、分析結果における更なる改良の証拠を、表８〜１０に示す。これらの表は、同じデータセットを用いて得られたが、３個の異なったアルゴリズム｛バンド比率化をしている〔Ｔ／Ｐ1〕、ＩＲ補正及びバンド比率化をしていない第一捕捉バンドの反射率（％）、及び、バンド比率化をしていないがＩＲ補正をしている第一捕捉バンドの反射率（％）｝を比較した。
【００７０】
【表８】
0004183308.tif 000021
【００７１】
【表９】
0004183308.tif 000022
【００７２】
【表１０】
0004183308.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る試験片である。
【図２】ＤＰＤアッセイに関する標準曲線である。
【図３】クレアチニンアッセイに関する標準曲線である。
【符号の説明】
１  クレアチニンパット
２  緩衝剤パット
３  金ゾル−ＤＰＤ抗体パット
４  捕捉バンド
５  抗ＩｇＧ捕集バンド
６  吸収パット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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