(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)哺乳類脳内でシナプス活性中に発現が増強され、(ii)PDZ様結合ドメインが存在し、かつ(iii)配列番号２に対して90％以上の同一性を有する配列であることを特徴とするポリペプチドであって、さらに、代謝型グルタミン酸受容体mGluR5またはmGluR1αに選択的に結合する能力を示す、哺乳類脳由来の単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号２の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の配列を有する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３によって定義されたポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが配列番号１の配列を有する、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
哺乳類中枢神経系中の代謝型グルタミン酸受容体へのシナプス活性化タンパク質の結合を妨害する化合物を選択する方法であって、
(i)請求項１または２に記載のポリペプチドであるシナプス活性化タンパク質、(ii)代謝型グルタミン酸受容体であるmGluR5またはmGluR1α、および(iii)該シナプス活性化タンパク質と該mGluR5またはmGluR1αとの結合を検出する手段、を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、
該シナプス活性化タンパク質と該mGluR5またはmGluR1αとの結合を測定し、そして、
測定した結合が該試験化合物の不在下で測定した結合よりも多いかまたは少ない場合に、該化合物を選択する、
ことを含む、上記方法。
【請求項８】
前記シナプス活性化タンパク質が細胞中で発現され、そして該細胞中のホスホイノシチダーゼＣ（PI-PLC）活性を測定することによって、該代謝型グルタミン酸受容体と前記シナプス活性化タンパク質との結合が測定される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、National Institutes of Mental Healthから承認番号K02MHO1152-O1A2、およびNIDAから承認番号RO1DA10309-01として米国政府の支援の下になされた。したがって、米国政府がこの発明に関する一定の権利を有している。
発明の分野
本発明はシナプスにおいて活性化される新ファミリーのタンパク質、ならびに特に代謝型（metabotropic）グルタミン酸受容体に特異的に結合してその機能を変更させるタンパク質に関する。
参考文献
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発明の背景
膜タンパク質の空間的局在化およびクラスター化はニューロンの発達およびシナプス形成性にとって極めて重要である。形質膜タンパク質と相互作用するタンパク質はこうした膜タンパク質の空間分布に影響するものと考えられる。これらの相互作用は、中枢神経系におけるシナプスの活性を制御する、神経伝達物質受容体などの膜タンパク質の機能を調節するために重要であるらしい。
本発明は、哺乳類中枢神経系で増量され、そしてシナプス機能に関与するタンパク質と相互作用する、新ファミリーのタンパク質の発見に関する。これらのタンパク質は、発作、視覚刺激、急性コカイン、外傷などのニューロン活性化によるこれらの誘導から証明されるように、シナプス機能に関与する。これらのタンパク質を「シナプス活性化タンパク質」と総称する。
「Homer」と称される新規な樹状タンパク質が本発明の代表例である。このタンパク質は１個のPDZ様結合ドメインを含有し、代謝型グルタミン酸受容体のC-末端に特異的に結合する。代謝型グルタミン酸受容体は、膜ホスホイノシチドの加水分解を触媒するホスホリパーゼＣを活性化することによって、細胞内カルシウムを放出する。しかし、Homerタンパク質はPDZ様ドメインを含有する以外には既知のPDZタンパク質には類似性がなく、最も近似するPDZタンパク質との配列同一性は10％未満である。その上、Homerタンパク質は即時型遺伝子として調節を受ける。この動的転写制御からは、Homerが新しい細胞機構を仲介して代謝型グルタミン酸のシグナル伝達を調節することが示唆される。
Homerタンパク質について概説した性質は新ファミリーのタンパク質、シナプス活性化タンパク質を特徴付けるもので、これが本発明の基礎を形成している。これらのタンパク質はシナプス機能に関与するので、以下にさらに記載するように、例えば、シナプス機能に影響し、したがって中枢活性である薬剤のスクリーニングアッセイなどの、特定の有用性を有する。
発明の概要
本発明は哺乳類中枢神経系中に存在する新ファミリーのタンパク質に関する。これらのタンパク質は（i）シナプス活性化に応答して哺乳類中枢神経組織中で発現が増強されること、および（ii）新規なPDZ様ドメインを有すること、によって特に特徴付けられる。
この新ファミリータンパク質は「Homer」と称されるラットタンパク質（配列番号２）によって代表される。このファミリーに属するその他のメンバーはこのラットタンパク質、またはセグメントを配列番号３および配列番号４として本明細書に示すこのファミリーのヒトおよびマウス・メンバーの配列に実質的に同一性（例えば、70％以上の配列同一性、好ましくは80％以上の配列同一性）の配列を有する。これら後者のペプチドの全長型も、本明細書に記載する全長配列の発見によって明らかにされるものである限り、本発明の一部を構成する。本発明はまた、本明細書に記載するような種相同体および／または配列番号２とこうした全長種相同体の間での内部的に矛盾しない変異に基づく組成物をも含む。
さらに特定すると、開示された配列間の、これらの保存アミノ酸の置換を含む、内部的に矛盾しない変異体を含む配列を有するタンパク質も本発明の一部を構成する。ファミリーのメンバーは低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション、縮重PCR、またはそれぞれ配列番号１または配列番号２に約70％以上、好ましい実施形態においては80％以上の同一性を有する核酸若しくはアミノ酸配列を検出するその他の方法によって、同定される。
本発明のタンパク質は中枢作用性薬剤のスクリーニングアッセイに特に有用である。これらのタンパク質はシナプス活性化をもたらすような多重刺激に応答して発生し得るような、シナプス活性化の誘導を測定するための診断アッセイの成分としても有用である。同様に、こうしたタンパク質からのペプチド断片、特にこれらのタンパク質とそれらのシナプスエフェクター結合相手との結合部位に由来するペプチド断片は、長期の異常シナプス活性化の結果のインヒビターとしての有用性を有する。
関連する１実施形態において、本発明は上記のポリペプチドであって、さらにSSSLおよびSSTLからなる群から選択されるC-末端ペプチド領域を有するシナプス膜タンパク質と選択的に結合する能力を示すポリペプチドを含む。
関連する１態様において、本発明は本明細書に記載する新規なタンパク質ファミリーのメンバーをコードするヌクレオチド配列をも含む。したがって、開示されたHomerタンパク質をコードする配列（配列番号１など）に実質的に同一なヌクレオチド配列も、これらの開示された配列自体と同様に本発明に含まれる。
上記のポリヌクレオチド配列を含有するベクターも本発明の一部を構成する。こうしたベクターは例えば請求されたタンパク質の組換え技術による製造のために有用である。
関連する１態様において、本発明は哺乳類中枢神経系におけるシナプス活性化タンパク質の細胞結合タンパク質への結合を妨害する化合物を選択する方法をも含む。この方法は、（i）配列番号２として示した配列を有するポリペプチドに実質的に配列同一性の１以上のポリペプチドに実質的に同一な単離されたシナプス活性化タンパク質、（ii）この単離されたシナプス活性化タンパク質が結合する単離された結合タンパク質、および（iii）このシナプス活性化タンパク質とこの結合タンパク質との結合を検出する手段、を含有する反応混合物に試験化合物を添加することを含む。結合タンパク質のシナプス活性化タンパク質への結合を試験化合物の存在下で測定し、そしてその試験化合物の不在下で測定した結合と比較する。この比較によってこれらの条件下での結合に実質的な差異が明らかになれば、その試験化合物を中枢作用性薬剤として使用するために選択する。
特定の１実施形態において、このアッセイ方法における結合タンパク質はSSSLおよびSSTLからなる群から選択される配列を含む代謝型グルタミン酸受容体ポリペプチドである。別の特定の１実施形態において、結合タンパク質はホスホイノシチダーゼＣに結合したmGluRである。さらに別の実施形態において、mGkuRは細胞中で発現され、そしてこの受容体と結合タンパク質との結合が細胞中のホスホイノシチダーゼＣ活性を測定することによって測定される。
本発明のこれらのおよびその他の目的および特徴は、添付する図面とともに本発明の以下の詳細な記載を読むことによってさらに完全に明らかになるであろう。
図の簡単な説明
図１は、ラット由来のシナプス活性化タンパク質のオープンリーディングフレームヌクレオチドコード配列（ORF）を示す（配列番号１）。
図２は、ラットの推定アミノ酸配列（Homer；配列番号２）を示し、ヒトのEST（配列番号３）およびマウス（配列番号４）シナプス活性化タンパク質から誘導されたアミノ酸配列と比較ている。
図３は、ラット脳（海馬、皮質）および他の示された器官からの全RNA（10μg）のノーザンブロットのコンピュータにより作製した画像を示し、海馬および皮質の6.5kb（近似的）mGluR結合タンパク質の発作による急速かつ一過性の誘導を示す。
図４は、矢印で示したように、発作刺激を与えたラットからの海馬中に、28kDaタンパク質（レーン「Homer」）および28/29kDa二重線としてHEK-293細胞で発現された全長結合タンパク質の免疫ブロット分析のコンピュータにより作製した画像を示す。
図５は、ベクターのみをトランスフェクトした細胞（レーン１）と比較してHEK-293細胞に発現されたmGluR5（140kDaバンド）（レーン２）、GSTアフィニティカラムからの溶出画分（レーン４）、およびGST-Homerアフィニティカラムからの溶出画分（レーン５）（これら両カラムには海馬抽出物（レーン３）を負荷した）の免疫ブロットのコンピュータにより作製した画像を示し、溶出Homerタンパク質がmGluR5と結合することが説明される。
図６は、海馬溶解物（レーン１）からの免疫前血清（レーン２）、抗Homerタンパク質抗血清（レーン３）、および前吸収した（preabsorbed）抗Homer血清（レーン４）による、mGluR5の免疫沈降の免疫ブロットのコンピュータにより作製した画像を示し、Homerタンパク質とmGluR5がin vivoで相互作用することが説明される。
図７Aおよび７Bは、抗Homer抗血清（７A）および抗mGluR5抗血清（７B）を使うラット頭頂皮質組織の免疫染色のコンピュータにより作製した画像を、拡大率100xで示す。
図７C〜７Fは、ペルオキシダーゼ法により検出した成熟ラットの皮質におけるHomerタンパク質の免疫反応性、対照（C）および発作4時間後（D）（ここに免疫染色は発作により誘導され、層II/IIIおよびVの錐体ニューロンに濃縮される）（拡大率100x）を示し、（E）では、免疫反応性は、核でなく、樹状突起軸（dendritic shaft）（矢印）沿いおよび細胞体（矢じり；拡大率600x）に存在し、遠位樹状突起は棘様プロフィルを有する（F、拡大率1000x）ことが説明される。
図８Aおよび８Bは、一次海馬培養物のニューロン中のAMPA型グルタミン酸受容体であるGluR1とHomerの二重免疫蛍光局在化を示し（拡大率600ｘ）（ここに、矢印は、GluR1ともに広範に共局在化するHomer染色の点状パターンを示す）、Homerタンパク質が興奮性シナプスを標的としていることが実証される。
図９（A〜E）は、代謝型グルタミン酸受容体mGluR1α（９A）、mGluR2（９B；配列番号６）、mGluR3（９C；配列番号７）、mGluR4（９D；配列番号８）、およびmGluR5（９E；配列番号９）のＣ末端の10アミノ酸を示す。
図10A〜10Dは、代謝型グルタミン酸受容体mGluR1（10A）、mGluR2（10B）、mGluR3（10C）、mGluR5および末端切断型mGluR5（10D）のHomerタンパク質によるHomerタンパク質へのin vitro結合の免疫ブロット分析のコンピュータにより作製した画像を示し、Homerタンパク質のmGluR1αおよびmGluR5への選択的結合が実証される。
図10E〜10Fは、HEK-293細胞中に発現されたmyc-タグ付きmGluR5のＣ末端（195aa）への結合についてGST-Homerの欠失構築物を検証するために使われたin vitro結合アッセイの免疫ブロット分析の結果（ここにレーンマーカーは発現されたHomerの部分を示す）を示し、ここで図10Eに示された免疫ブロットはmycに対して免疫ブロットされており、mGluR5が全長Homer（1〜186）および断片1〜131に結合し、断片109〜186と結合していないこと（ここに、図10Fに示した画像はHomer欠失構築物のクーマシー染色（Comassie stain）である）が実証される。
図11は、ラット前脳のHomer mRNAの出生後増加を示すノーザンブロット（10μg全RNA）のコンピュータにより作製した画像を示す。
図12（A〜F）は、通常の日周条件下で飼育した同じ齢の対照ラット（12D、12E）と比較して、暗所で犠牲にした（12B、12C）または犠牲前30分間、周囲の部屋の光に曝露した（12A、12F）暗所育成した仔ラットから採取して、Homerの３’非翻訳領域に特異的な放射性標識したアンチセンスRNAプローブとin situハイブリダイゼーションさせた冠状部（coronal sections）の、コンピュータにより作製した画像を示す。
図13は、犠牲前のラットの眼中へのテトロドトキシン（TTX）の単眼注入の影響を実証するin situハイブリダイゼーション実験のコンピュータにより作製した画像を示す。
図14は、長期間増強（LTP）に関係するHomer mRNAの誘導（ここに、矢印は、LTPを生成するシナプス刺激に続く海馬顆粒状細胞中のHomer RNAの誘導された発現を示す）を実証するin situハイブリダイゼーション実験のコンピュータにより作製した画像を示す。
図15は、犠牲前２時間に腹腔にコカイン（10mg/kg）の投与によるHomerの線状体中の誘導を実証するin situハイブリダイゼーション実験のコンピュータにより作製した画像を示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、典型的なポリヌクレオチドと水素結合する能力のある塩基を支持する主鎖を有するポリマー分子を意味し、ここで、ポリマー主鎖はポリマー分子と典型的なポリヌクレオチド（例えば、１本鎖DNA）との間に配列特異的な様式で水素結合を可能とする方式により塩基を提供する。このような塩基は、典型的には、イノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジンである。ポリマー分子は、２本鎖および１本鎖RNAおよびDNAを含み、その主鎖修飾は例えば、メチルホスホネート結合である。
用語「ベクター」は、新しい核酸を同化することができ、そしてこれらの新しい配列を適切な宿主に伝播することができるヌクレオチド配列を意味する。ベクターは、限定されるものではないが、組換えプラスミドおよびウイルスを含む。本発明の核酸を含んでなるベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルス）は、担体、例えばタンパク質に複合したプラスミド、脂質に基づく核酸形質導入系と複合したプラスミド、または他の非ウイルス担体系中に存在することができる。
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結した１本鎖のアミノ酸残基からなる化合物を意味する。用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義であるか、またはさらに２つ以上のポリペプチドの複合体を意味することができる。
本明細書中で使用する用語「実質的な相同性」または「実質的な同一性」、およびそれらの語形変化は、アミノ酸配列と他のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と他のポリヌクレオチド配列が、これらの配列を最も適合するように整列したときに、少なくとも70％もしくは好ましくは少なくとも80％一致することを意味する。ヌクレオチド配列の場合は、この用語は、問題のヌクレオチド配列は、配列番号１（Homerコード配列）で定義されたヌクレオチド配列から誘導されたハイブリダイゼーションプローブにより、中程度のストリンジェンシー条件下のスクリーニングアッセイで検出可能であることも意味する（Ausubel）。
用語「アラインメント（alignment）」は、共通の特性を共有する配列の領域を整列させるための２つ以上のアミノ酸または核酸配列の配置を意味する。配列間の相関度または相同性は、配列間にアラインメントされた要素に割り当てられた重み（weight）に基づいてコンピュータ的にまたは統計的に予測される。
２つのアミノ酸配列に関する百分率（％）同一性は、配列を最適に整列した時に２つの配列中で同一である残基の百分率を意味する。最適アラインメントは最高の百分率同一性スコアを与えるアラインメントとして定義される。このようなアラインメントは「GENEWORKS」プログラムを使って達成することができる。代わりに、１のktup、デフォルトパラメーターおよびデフォルトPAMを用いる局所アラインメントプログラムLALIGNを使って達成することができる。本発明の意味では、与えられた配列に対してタンパク質または核酸が80％の同一性を有すると言われれば、これはこの２つのタンパク質のうち長い方の配列の全配列を意味すると考えられる。従って、例えば、EST産物の長さに対しては全長配列配列番号２と同一であるがそのEST産物がその全長配列の長さの25％でしかない或るESTの推定翻訳産物は、配列番号２に80％以上の配列同一性を有すると定義される本発明で請求された配列の範囲内であるとは考えられない。
用語「PDZ様」結合ドメインは、アミノ酸GLGFの１つ以上の反復、および好ましくは、好ましくはGLGFから１〜10残基だけ離れたアルギニンのような先行塩基性アミノ酸を含有するポリペプチドの一部分を意味する。
本明細書中で使用する用語「代謝型グルタミン酸受容体」または「mGluR」は、アデニル酸シクラーゼ（AC）またはホスホイノシチダーゼｃ（PI-PLC）に機能的に結合しているグルタミン酸結合部位を意味する。少なくとも５つの代謝型グルタミン酸受容体が同定されている：mGluR1およびmGluR5はPLCに結合され；mGluR2およびmGluR4はAC活性を調節する。
本明細書中で使用する用語「代謝型グルタミン酸受容体結合タンパク質」は、１つ以上の代謝型グルタミン酸受容体に結合するポリペプチドを意味し、抗mGluR抗体による結合タンパク質およびmGluRの同時免疫沈降により、または無関係（non-relevant）な対照タンパク質と比較してin vitro結合により確証される。この相互作用に対する典型的な結合親和力（binding affinity）は少なくとも約10-6Mである。
用語「中枢神経系（CNS）」は、脳脊椎液（CNF）を含む脳および脊椎を意味する。
用語「スプライス変異体（splice variant）」は、翻訳前にmRNAの選択的スプライシングにより改変された配列を有する共通遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。
用語「発現配列タグ」またはESTは、cDNA配列から誘導される短い（典型的には200〜300）塩基対セグメントであり、その配列はユニークで、特異的プライマーを使いポリメラーゼ連鎖反応で選択的に増幅される能力により実証される。ESTは、通常、全長配列を表さない。
アミノ酸残基は、本明細書では標準一文字表記により表される：A、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；E、グルタミン酸；F、フェニルアラニン；G、グリシン；H、ヒスチジン；I、イソロイシン；K、リシン；L、ロイシン；M、メチオニン；N、アスパラギン；P、プロリン；Q、グルタミン；R、アルギニン；S、セリン；T、トレオニン；V、バリン；W、トリプトファン；X、ヒドロキシプロリン；Y、チロシン。
II．結合タンパク質の単離
本発明の発見は、脳の興奮性シナプス活性の活性化が、本明細書に「シナプス活性化タンパク質」と記載され、そして本明細書に「Homer」と記載されたラットタンパク質により例証された新規ファミリーのタンパク質の発現の増強をもたらすことである。そのスプライス変異体および多種由来のその同族体と一緒に、このタンパク質は、中枢神経系のある特定の生理学的エフェクター（例えば、受容体、イオンチャンネル、輸送タンパク質、酵素）に結合しその活性に影響を与える新しいファミリーのシナプス活性化タンパク質を定義する。
１．シナプス活性化タンパク質に対するヌクレオチドコード配列の単離
ａ．コード配列の同定
例として、本明細書でラットHomerタンパク質と称するラットタンパク質は、海馬および皮質における興奮性シナプス活性中の発現の急速な誘導に基づいて差次（differential）スクリーニングにより最初に同定された。さらなるシナプス活性化タンパク質をこの方法または以下第２節に記載した相同性スクリーニング法により同定することができる。
実施例１は、ラットのHomerタンパク質を同定するために使う差次スクリーニング法の詳細を提供する。簡単に言えば、ポリ（A）+RNAを、活性発作を有する動物の脳から抽出してcDNAを作るために使った。この刺激したcDNAを無刺激対照動物の脳からの過剰RNAとハイブリダイズさせた。その後、サブトラクト（subtracted）mRNAから作ったcDNAを使って、ライブラリーを構築し、その中からラットHomerタンパク質を同定した。本明細書に論じられたように、このタンパク質は、シナプス結合または活性化タンパク質の１つのファミリーを定義する特定の配列特性および結合特性を有する。
差次スクリーニング法において、対照より刺激されたラット海馬中で高いレベルを有するのが見られる、全部で16個の新規で独立したクローンを同定した。差次的なmRNA発現を標準ノーザン分析により確証した。ラットHomerタンパク質を、これらの差次的に発現されたクローンの１つの翻訳産物として作製した。ノーザン分析は、HomerRNAがほぼ6.5kBの長さであることを実証した。大きなcDNAを含有するよう特別に調製したファージライブラリー（λ Zap II）のスクリーニングにより、ラットHomerタンパク質のいくつかの全長cDNAを同定した。２つの独立クローンの両鎖を配列決定し、558ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）を同定した。このORFを、推定全長クローンから調製したin vitro mRNAのin vitro転写および翻訳により作製したタンパク質産物のサイズの分析により、およびこれを開始メチオニンを欠いたクローンからのmRNAで調製したタンパク質と比較して、確証した。さらにこのORFを、全長Homerの細菌融合タンパク質に対する、または、Homerタンパク質のＣ末端を表す合成ペプチドに対する、ウサギポリクローナル抗血清を調製して確証した。これらの抗血清を使って、最大電撃発作（MECS）後に急速に誘導される脳内の適切なサイズをもつタンパク質の存在を確証した。
ラット脳から単離されたHomerタンパク質のヌクレオチドコード配列を図１に配列番号１として示す。このコード配列は558ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）を有する（図１A；配列番号１）。上に記載のとおり、このDNAから誘導された6.5kbのmRNAは186アミノ酸タンパク質をコードする（図２A；配列番号２）。長い3’UTR（GENBANK受託番号#:U92079）は、前初期遺伝子（IEG）のmRNA不安定化に意味されるように多重AUUUA反復をコードする。このアミノ酸配列は、単一GLGF配列を含有する可溶性タンパク質および先行アルギニン（図2）、いわゆる「PDZ様ドメイン」を予測し、これはPSD-95のような様々な無関係のタンパク質の特性決定に基づき、ある特定の結合特性を有することが予測される。Homerタンパク質配列は、その他の点では新規であり、ESTのような短い配列からは予測不可能である。ラットHomerと報告されたPDZファミリーのメンバーとの間には10％以下のアミノ酸配列同一性しかない（Doyleら，1996）。
ヒト（Z17805）およびマウス（AA166092およびAA013888）からの発現配列タグ（EST）は、Homerタンパク質に対するORFコード配列の領域に84％および72％同一であることが同定された（図２；ヒト，配列番号３、およびマウス，配列番号４）。ESTの翻訳は、マウスおよびヒトESTのアミノ酸配列がそれらが重複する限定された領域でお互いに同一であるが、マウスESTはこの領域でラットHomerタンパク質から相異することを示し、これらのESTがさらなるファミリーメンバーの相同体であることを示唆する。ラットHomerの本発明の発見に基づくと、ヒトおよびマウスタンパク質配列は、本明細書に記載のとおり、ラット配列および／またはそれらの保存的置換を含むまで拡張することができる。このような拡張配列は、本明細書に定義されるシナプス活性化タンパク質ファミリーメンバーの定義の範囲に入るであろう。
さらなるシナプス活性化タンパク質ファミリーメンバーは、実施例１に記載されたのと同様の差次スクリーニングプロトコルを使い、本明細書に記載された配列に基づくプローブと結合して、当業周知の方法によって同定することができる。代わりに、またはさらに、このようなタンパク質は、（i）ラットHomerコード配列またはタンパク質に対して、ヌクレオチドまたはタンパク質配列レベルでの実質的な相同性、（ii）代謝型グルタミン酸受容体のような、CNSの効果器タンパク質に結合してその活性に影響を与える能力、（iii）特定の結合配列に対する結合特異性、ならびに（iv）HomerPDZ様ドメインの配列における存在により同定される。刺激したラット脳の差次的発現により意味されるように、上に記載のとおり、そしてさらに以下に記載のとおり、この遺伝子の発現は興奮性シナプス活性により刺激される。シナプス活性化タンパク質のこれらの属性は、以下の節で記載される。
ｂ．シナプス活性化タンパク質相同体の同定
ラットHomerコード配列およびポリペプチド配列の本明細書による開示から、Homerに実質的な相同性を有するHomerポリペプチドファミリーのさらなるメンバーの同定が、当業者に周知の複数の方法により、以下に論じられるとおり、実施することができる。
例えば、配列番号１から誘導されたヌクレオチドプローブを使い、そのファミリーメンバーを適切なライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。特に、Genbankに報告されたほぼ全長cDNA（受託番号＃：U92079）のnt558〜nt1127から誘導されたハイブリダイゼーションプローブは、市販DNA合成器（例えば、Applied Biosystems Model 381A）で、当業周知の標準技術（Ausubelら，1992）を使って合成することができる。特に適切なライブラリーは、ストラタジーン社（Stratagene（La Jolla，CA））およびインビトロゲン社（In Vitrogen（San Diego，CA））から市販されるヒト脳ライブラリーのようなCNSまたは脳ライブラリーである。プローブを、典型的には65℃でハイブリダイズさせ、55℃で洗浄する（中程度ストリンジェンシーのスクリーニング）。この方法により同定されたクローンは、当業周知の方法で、単離され、それらのコード配列を決定される。クローンは、それらの推定アミノ酸配列が、上に論じたとおり、最低（minimally）HomerPDZ様ドメインを含むかによってさらに選択する。
選択したクローンのさらなる特性決定は、単離されたコード領域をベクターに挿入して、実施例３に記載した１つ以上の系のような適切な発現系または他の当業周知の適切な系における発現について実施される。その後、翻訳産物を、実施例４に記載した方法等により単離し、そして、以下、第III.C節で論じられるような、CNS中の特定の標的タンパク質と結合する能力および配列SSTLもしくはSSSLのような特定のペプチド結合配列に対する結合特異性について試験される。
さらに、テンプレートとして、図２（A〜C）に示される配列番号２（ラットHomer）、配列番号３および配列番号４に提示されたタンパク質配列を使い、さらなるファミリーメンバーを、（i）ポリペプチド間およびポリペプチド中の配列変化、ならびに（ii）配列内アミノ酸の保存的置換、に基づいて同定できることが評価される。
このようにして、図２に示されるポリペプチドのＮ末端領域を見ると、最初の30アミノ酸が３つの配列中で不変であることが明らかである。しかし、位置31〜34は異なる。ラット配列はAVTVであるが、ヒトおよびマウスタンパク質は配列GHRFを共有する。この変化から、位置31〜34が可変配列：A/G V/H T/R V/Fを有するポリペプチドを構築することが可能である。可変性のさらなる領域は整列した配列を検査すると明らかである。ラットHomerタンパク質の或る特定の領域は、その機能の相互関係から重要であることが確認されている。例えば、それぞれ87〜90および81に位置するPDZ様ドメインGLGF配列および先行アルギニンは、シナプス結合タンパク質PSD95の周知の結合ポケットに基づいて、「結合ポケット」を形成することができる（Kornauら，1995）。置換に関する今までのガイドラインによれば、この領域は３つの例示シナプス活性化タンパク質中で不変であり、したがって、これらのタンパク質から推定されるどの配列にも保存されるべきである。
同定された可変位置でのさらなる置換は、保存的アミノ酸置換をすることにより行うことができる。すなわち、もし可変位置の複数の可能なアミノ酸が共通の置換クラスにあれば、そのクラス内のアミノ酸によるその位置の置換は、ポリペプチドのコンフォメーションおよび機能を保存することができる。この分析で使うことができる標準置換クラスは、共通側鎖特性および例えば標準Dayhoff頻度交換マトリックス（Dayhoff，1972）により決定された天然の相同性タンパク質における置換の最高頻度に基づく６クラスである。これらのクラスは、クラスＩ：Ｃ；クラスII：小さい脂肪族側鎖とOH基側鎖を表すＳ、Ｔ、Ｐ、Ｘ、Ａ、およびG；クラスIII：水素結合を形成する能力のある中性および負に帯電した側鎖を表すＮ、Ｑ、Ｄ、およびＣ；クラスIV：塩基性極性側鎖をあらわすＨ、Ｒ、およびＫ；クラスＶ：分岐脂肪族側鎖を表すＩ、Ｖ、およびＬ、およびMet；ならびにクラスVI：芳香族側鎖を表すＦ、Ｙ、およびＷである。さらに、各群は、クラスIVのオルニチン、ホモアルギニン、N-メチルリシン、ジメチルリシン、またはトリメチルリシン、および群VIのシクロヘキシルアラニンまたはハロゲン化チロシンのような関係アミノ酸類似体を含みうる。さらに、各クラスは、L-アミノ酸が置換には好ましいが、LおよびD立体異性体を含むことができる。
今までのガイドラインにより設計されるポリペプチド配列は、例えば、組換え体発現により作ることができる。選択されたORFは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）による融合体としてクローニングされ、細菌中で発現される。代わりに、ORFは、当業周知の方法により、哺乳類発現ベクターにクローニングし、哺乳類細胞中で発現させることができる。
ｃ．シナプス活性化タンパク質オリゴヌクレオチド／ベクターの調製
今までの分析を通して明らかになったタンパク質配列に基づいて、シナプス活性化タンパク質をコードするヌクレオチドは、当業周知の方法により設計することができる。以下に論じるように、このような設計はタンパク質発現に使われる細胞型の考察を含みうる。
本発明のヌクレオチド配列は、限定されるものでないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修飾する変更を含む、様々な理由でタンパク質コード配列を変える目的で遺伝子操作することができる。例えば、変更は、当業で周知の技術、例えば位置指定突然変異誘発を使って導入して、新しい制限切断部位を挿入すること、糖鎖形成パターンを変更すること、コドン選好性を変化させること、スプライス変異体を生成することなどができる。
本発明は、広範に上に記載した１つ以上の配列を含んでなる組換え構築物を含むこともできる。構築物は、本発明の配列を順方向にまたは逆方向に挿入したプラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含んでなる。この実施様態の好ましい様態では、構築物は、さらに例えば配列に機能しうる形で連結されたプロモーターを含む調節配列を含んでなる。多数の適切なベクターとプロモーターが当業では周知であり、市販されている。原核生物および真核生物宿主について使用される適切なクローニングと発現ベクターは、サンブルックら（Sambrook，et al.，1989）も記載している。
実施例２に詳細を記載したように、全長ラットHomerタンパク質の哺乳類発現構築物を、5’EcoRI断片（1.6kb）を哺乳類発現ベクターpRK5にクローニングすることにより調製した。このベクターを使って哺乳類真核細胞（ヒト胚性腎臓；HEV-293細胞）をトランスフェクトした。
代わりのベクターを様々な細胞型のトランスフェクションに使うことができる。例えば、GSTに融合したラットHomerポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現には、HomerORFを細菌ベクターpGEX中にクローニングした。酵母系の発現には、HomerORFをpPC86中にクローニングした。
２．シナプス活性化タンパク質の産生
ａ．シナプス活性化タンパク質の発現
シナプス活性化タンパク質は、タンパク質の発現に利用可能ないくつかの方法により、組換えで製造することができる。例として、実施例３は、無細胞の転写／翻訳系中でラットHomerタンパク質を発現させるために使った方法を提供する。
さらに大きな規模の生産には、Homerタンパク質およびシナプス活性化タンパク質ファミリーメンバー相同体の発現を、いくつかの細胞発現系で実施することができる。可能な宿主細胞は、限定されるものでないが、細菌、酵母、昆虫、および哺乳類細胞を含む。特定の系での発現を、発現が生じる特定の細胞型に対するコドンを仕立てることにより最適化することが評価される。したがって、本発明により含まれるポリヌクレオチドは、配列番号１に対する全配列同一性についてでなく、所与の発現系での最適な発現のために修飾された目的のタンパク質をコードするポリペプチドを含むものである。そのような設計は、当業で周知のコドン使用または選好表の助けをかりて行うことができる。図５に示されるように、mGluR5をHEK-293細胞（レーン２）にて発現させて、ベクター単独でトランスフェクトした細胞（レーン１）と比較した。ここに、mGluR5は、主バンドほぼ140kDaおよび二次バンド50kDaの推定切断断片として移動する。海馬抽出物（レーン３）では、上側（より高い分子量）バンドが二重線として現れる。これらの実験で、海馬抽出物は、GSTまたはGST-Homer融合タンパク質のいずれかを含有するAffigelゲルカラムを通過させ、SDS負荷バッファーで溶出した（レーン４および５）。抗GluR5抗体によるポジティブ免疫ブロットは、抽出物中でのラットHomerタンパク質のmGluR5受容体との結合を実証した。
ｂ．細胞抽出物からのラットHomerタンパク質の精製
Homerタンパク質とその類似体は、標準の調製法を使い、細胞抽出物から精製することができる。最終段階精製は、実施例４に記載したように、Homerタンパク質またはその断片に対する抗体を使う免疫アフィニティカラム精製を含むいくつかの数の標準法により実施することができる。
３．シナプス活性化タンパク質の組織局在化
本発明によって実施した実験において、シナプス活性化タンパク質の発現は中枢神経系に高度に濃縮されることが決定されている。例えば、図３に示したデータでは、ラットHomermRNAはほとんど専ら中枢神経組織中に見出された。
さらに、HomermRNAの発現は、発作が誘導する神経活性化により海馬で強くアップレギュレートされる。ピークmRNA発現は、海馬で発作１時間以内に起こる（図３）。Homerタンパク質は、海馬抽出物中に濃縮され、28/29kDaの見かけの分子量で二重線として移動し（図３）、発作により速やかに誘導される。
実施例６は、Homerタンパク質の発現レベルを測定するために使うことができる例示的方法を提供する。成熟ラット脳について、ラットHomerタンパク質タンパク質発現の解剖および細胞パターンを免疫組織化学的分析により検証した。IEGとしての調節と一致して、皮質のHomer免疫染色は、発作４時間後に著しく増加した（図４）。
III．シナプス活性化タンパク質の細胞結合の特性決定
本発明の重要な特徴によれば、シナプス活性化タンパク質ファミリーのメンバーは、特定の中枢神経系受容体または結合パートナーに結合し、そのタンパク質の機能を修飾する。例えば、以下に論じられるように、ラットHomerタンパク質は、中枢神経系に見出される代謝型グルタミン酸受容体（mGluR）の２つのサブタイプ、すなわちmGluR1αおよびmGluR5に結合する。
上記の第II節で論じられ確認された特定のシナプス活性化結合タンパク質に対する、さらなる中枢神経系結合パートナーは、以下の第Ａ節に記載した手法を使って確認することができる。第Ｂ節および第Ｃ節は、特定のシナプス活性化結合タンパク質とその細胞結合パートナーとの相互作用を特性決定するための方法を記載する。
１．中枢神経系のシナプス活性化タンパク質に対する細胞結合部位の確認
中枢神経組織のシナプス活性化タンパク質結合部位は、ツーハイブリッドタンパク質相互作用アッセイを使って確認することができる（Ausubelら，1992）。このアッセイ法は、生細胞の２つのタンパク質の間の相互作用を検出する簡単で高感度の手段を提供する。このようなアッセイは実施例５に記載され、これはラットHomerタンパク質に対するある特定の機能的結合パートナーを確認するために使われた。類似のアッセイが、マウスおよびヒトのタンパク質、ならびに本発明による他の相同性タンパク質の細胞結合部位を決定するために使われる。
ツーハイブリッドスクリーニング系は、もし２つの潜在的に相互作用するタンパク質が融合体またはキメラとして発現されると、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することができるという観察に基づく。第１融合タンパク質は、DNA結合ドメインに融合した１対の相互作用タンパク質の片方を含有し、そして第２融合タンパク質は、転写活性化ドメインに融合した１対の相互作用タンパク質の他方を含有する。二つの融合タンパク質は、同じ細胞中で独立して発現され、融合体の「相互作用タンパク質」部分の間の相互作用が転写活性化因子の機能を再構築し、それがレポーター遺伝子の転写の活性化により検出される。本発明における使用には、第１融合タンパク質はシナプス活性化結合タンパク質を含有する。第２融合タンパク質は、以下に記載のとおり、中枢神経系特異的タンパク質の発現ライブラリーの１つを含有する。
本発明の関係で使うことができる、ツーハイブリッドスクリーニングアッセイのいくつかの可能なコンフィギュレーションがある（Ausubelら，1992）。それらの１つである酵母GAL4ツーハイブリッド系では、酵母由来の転写活性化因子であるGAL4の機能の再構築に基づいて、GAL1-lacZレポーター遺伝子の活性化によりタンパク質−タンパク質相互作用が検出される。いくつかの他の転写活性化因子と同様に、GAL4は、２つの別のドメイン、すなわちDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。それぞれのドメインは、ドメインからなる融合タンパク質の一部分および第２の「餌（bait）」相互作用タンパク質として、独立して発現されることができる。その後、２つの融合タンパク質は、細胞内で一緒に独立して発現される。「餌」と「結合」タンパク質の間の相互作用により２つのGAL4ドメインが集められると、レポーター遺伝子の転写がGAL4の転写制御下で開始される。レポーター遺伝子は、典型的にはGAL4タンパク質結合部位（GAL上流活性化配列、USAG）を含有するプロモーターを有する。レポーター遺伝子のGAL1-lacZ、およびGAL1-HIS3レポーター遺伝子である。
アウスユーベルら（Ausubelら，1992）が詳細に記載した第２のツーハイブリッド系は、適切なオペレーターにしっかりと結合する本来の（native）大腸菌（E.coli）LexAリプレッサータンパク質を用いる。１対の相互作用タンパク質の１つ（「餌」タンパク質、例えばHomerタンパク質）をLexAへの融合体として発現させるために、プラスミドが使われる。LexA融合餌タンパク質を発現するプラスミドは、ｐSH18-34を含有する、EGY48のような酵母のレポーター株を形質変換するために使われる。
この株においては、LexAへの結合部位は、２つのレポーター遺伝子の上流に位置する。最初のレポーター系では、ロイシン（Leu）の生合成経路に必要とされる染色体LEU2遺伝子の上流活性化配列は、EGY48中でlexAオペレーターと置換され、細胞がLeu欠乏培地にプレーティングされた場合に、生存度による選択を可能とする。第２のレポーター系では、EGY48は、lexAオペレーター−lacZ融合遺伝子を含有するプラスミドpSH18-34を担持し、酵母がXga1を含有する培地上で増殖すると、色に基づいた識別を可能とする（Ausubelら，1992）。
LexAライブラリーは、誘導可能な酵母GAL1プロモーターを使って、ポータブル転写活性化モティーフ（「アクト（act）」）として機能する酸性ドメイン（「酸性斑点（acid blob）」）、および他の有用な部分への融合体としてのタンパク質を発現する。ライブラリーにコードされたタンパク質の発現は、形質転換体をガラクトース（Gal）含有培地上にプレーティングすることにより誘導され、そこで、特異的に餌タンパク質と相互作用しないライブラリータンパク質を含有する酵母細胞は、Leu欠乏培地では増殖できない。餌タンパク質と相互作用するライブラリータンパク質を含有する酵母細胞は、コロニーを２〜５日で形成し、細胞がXgaIを含有する培地にストリーキングされると、コロニーは青色に変わる。プラスミドは単離され、最初の餌タンパク質との相互作用の特異性を確証する一連の試験で特性決定される。特異的であることが見出されたものは、さらなる分析のための準備ができた（例えば、配列決定）。
本発明の支持により実施し、本明細書の実施例５に記載した実験では、酵母GAL4ツーハイブリッド系を使って、ラット脳cDNAライブラリー中のラットHomerタンパク質の結合パートナーを確認した（ChevrayおよびNathans，1992）。フランキングSmaI部位をもつ全長HomerORFのPCR産物を酵母発現ベクターpPC97中にサブクローニングした。ランダムプライムした（randomprimed）cDNAライブラリーを発作刺激した成熟ラット海馬から調製し、酵母発現ベクターpPC86中にクローニングした。ライブラリーは2×106個の独立したcDNAを含有した。全部で1.5×106個のクローンをスクリーニングした。相互作用タンパク質を、ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジンを欠くプレート上で選択し、再ストリーキングし、β-ガラクトシダーゼを使って確認した。
このアッセイで確認された相互作用cDNAの１つは、mGluR5のＣ末端195アミノ酸をコードする。mGluR5のこの領域は、サイトゾルで、ニューロンのホスホリパーゼＣ（PLC）介在シグナル伝達に関わるとされている。結合の確認とさらなる特性決定を以下の第Ｂ節に記載のとおり実施した。
２．細胞成分へのシナプス活性化タンパク質の結合
本発明の発見と一致して、シナプス活性化タンパク質は、上記の第Ａ節に記載した方法によって確認された細胞成分と結合する。細胞結合パートナー候補物質を決定した後、シナプス活性化タンパク質を、候補物質との結合について、以下に記載したin vitro結合アッセイの１つ以上で、さらに試験することができる。
例えば、細菌により発現されたGST−Homer融合タンパク質を、海馬の洗剤抽出物（detergent extract）中の本来の（native）mGluR5との結合を実施例７Aに詳述したin vitro結合アッセイで試験した。図５に示すように、mGluR5は、GST-Homer融合タンパク質と結合するが、GST単独とは結合しない。
in vitro結合を評価する他の方法は、同時免疫沈降アッセイにより提供され、その方法ではタンパク質の１つを指向する抗体を使って２つのタンパク質が溶液中で結合複合体を形成するかを評価する。図６は、実施例７Bに詳述した方法によって、海馬由来のHomerとmGluR5との同時免疫沈降を試験するアッセイ結果を示す。ここで、海馬の抽出物は、免疫前血清、抗Homer血清、またはGST-Homerで前処理した抗Homer血清のいずれかで免疫沈降された。示されたように、mGluR5は、Homer抗血清と同時免疫沈降するが、免疫前血清とはしなかった。さらに、同時沈降は、Homer抗原をもつ抗血清の前吸着（レーン４）によりブロックされ、ラットHomerタンパク質に対する抗血清の特異性を示した。
シナプス活性化タンパク質と候補結合パートナーとの間の天然相互作用に対するポテンシャルは、さらにin situでタンパク質のそれぞれを指向する抗体による脳組織の免疫染色断面により評価することができる。この分析の目標は、両方のタンパク質が細胞の同じ領域に発現されることを確立することである。例えば、図７Aおよび７Bは、成熟ラット頭頂皮質における、抗Homer抗血清によるラットHomerタンパク質の免疫染色（７A）および抗mGluR5抗体によるmGluR5の免疫染色（７B）を示す。これらの実験から、mGluR5およびHomer免疫染色は、共に層Ｖ錐体ニューロン（Layer V pyramidal neuron）の先端樹状突起（apical dendrites）に濃縮されることが観察される。これらのデータは、Homerタンパク質とmGluR5の間のin vivo相互作用に対して解剖的な支持を与える。
Homer免疫染色の解剖および経時パターンは、以下の第IV節に論じられるように、mRNA発現と正確に平行して起こる。皮質層II/IIIおよびＶの錐体ニューロンは、最も強力な免疫染色を示し、これは典型的に細胞体（soma）を満たし、樹状突起の周辺沿いに点状パターンで、先端樹状突起に向けて伸長した（図７Ｃ）。棘様の輪郭が遠位樹状突起にしばしば見られた（図７Ｄ）。Homer免疫反応性は、核には存在しなかった。Homer免疫染色の点状パターンは、海馬ニューロンの一次培養中に確証された（図８Ａ、Ｂ）。さらに、免疫染色で、Homerは広範にグルタミン酸受容体GluR1と共局在し、Homerは興奮性シナプスに濃縮されていることを示した。Homer発現の解剖パターンは、mGluR5免疫反応性の報告と密接に整合する。mGluR5免疫反応性は、Homerを発現する他の多くのニューロン集合体（populations）と同様に、皮質錐体ニューロンの樹状突起に濃縮され、そして興奮性シナプスに存在する。Homerタンパク質とmGluR5の錐体ニューロン樹状突起および興奮性シナプスにおける広範な共局在は、それらの物理的（physical）相互作用の著しい特異性と一緒に、これらのタンパク質が生理学的パートナーであるという考えを支持する。ラットHomerタンパク質は、また小脳のプルキンエ細胞（Purkinje cell）に高度に発現される。これらの細胞は、mGluR1αを強く発現し、これらニューロンの２つのタンパク質タイプの間の生理学的パートナーシップを示唆する。
ラットHomerタンパク質に関する上に記載した研究は、ファミリーに含まれることを実証する目的で、候補シナプス活性化タンパク質ファミリーメンバーに行うことができる実験のタイプの例示である。シナプス活性化タンパク質が結合する特定の結合パートナータンパク質を確認すると、このような結合が結合パートナータンパク質の生物学的機能を妨害するか増強するかを決定するための適切な機能アッセイが設定される。例えば、ラットHomerタンパク質の場合、mGluR1およびmGluR5は、ホスホリパーゼＣに結合してホスホイノシチダーゼＣ（PI-PLC）経由のホスホイノシチド加水分解を調節するが、mGluR2および4はアデニル酸シクラーゼをネガティブに調節することは周知である（Nakanishi，1994；Pin and Duvoisin，1995）。従って、さらにラットHomerタンパク質がこの機能活性を妨害するかまたは増強するかを決定する目的で、付加したラットHomerタンパク質の不在下と存在下におけるmGluR依存PI-PLC活性をモニターするアッセイを設定した。
３．結合相互作用のペプチド配列特異性
本発明のさらなる特徴によって、ラットHomerタンパク質により例示されたシナプス活性化タンパク質ファミリーメンバーは、特定ペプチド配列と結合することが見出されている。このような配列特異性は、PDZドメイン、またはシナプス活性化タンパク質に存在する他のドメインにより指揮されうる。
本発明の支持で実施された研究において、ラットHomerタンパク質と代謝型グルタミン酸受容体mGluR5およびmGluR1αとの間の相互作用の特異性を、in vitro結合アッセイを使って検証した。
代謝型グルタミン酸受容体は、ユニークに、最後の55アミノ酸にわたって67％同一であり、かつそれぞれ同じ配列；-RDYTQSSSSLおよび-RDYKQSSSTLで終結する長い細胞質Ｃ末端尾部を持つ（図９A〜９E）。結合相互作用を測定するために、mGluR5およびmGluR1αをHEK-293細胞中で発現させた。細胞抽出物をビーズに結合したGST-Homerと混合し、その後、SDS負荷バッファーで溶出した。両方ともに、一過的に全長mGluR1αおよびmGluR5を発現し、図10Aおよび10Dに示されたように、ラットHomer融合タンパク質と結合した。mGluR5のＣ末端４アミノ酸が欠失すると、mGluR5のHomerとの結合は70％以上減少した（図10D、レーン３および４）。他の代謝型グルタミン酸受容体のＣ末端配列の比較は、mGluR2およびmGluR3受容体は、同じＣ末端-TSSLを共有する（図８）が、この領域外ではmGluR1αおよびmGluR5と異なることを示す。mGluR2もmGluR4もHomerタンパク質と結合しない（図10B、10C）。Ｃ末端TSSLを持つことが知られている無関係なタンパク質（RSK1）も結合を試験したが、このタンパク質はHomerと結合しなかった。これらのデータに基づいて、最終４アミノ酸は、結合に重要であるが、十分でないと考えられる。
今までのデータは、Homerタンパク質は特異的にPI-PLCの結合した代謝性グルタミン酸受容体と相互作用すること、そして結合特異性は少なくとも部分的にこれらの受容体のＣ末端４アミノ酸により決定されることを示す。さらなるシナプス活性化タンパク質に対する特異的結合部位は、同じかまたは異なるアミノ酸配列を有することができ、以上論じられたのと同じ方法を使って実験的に決定することができる。
mGluR5との結合にあたえるHomerタンパク質の欠失変異の影響を、全長Homer-GST融合タンパク質とHEK-293細胞から発現されたmycタグ付きmGluR5 Ｃ末端195aa断片との結合を測定することにより検証した。同様に、Ｃ末端55アミノ酸を欠いた欠失構築物もmGluR5と結合させた。比較により、GLGF配列を含むHomerタンパク質のＮ末端108アミノ酸の欠失は、mGluR5との結合を無効にした。これらの観察は、mGluR5のＣ末端配列への結合におけるGLGF領域の役割を示す。
IV．発現のin vivo調節
本発明の発見は、ラットHomerタンパク質により例示されたファミリーに属するシナプス活性化タンパク質は、上に記載したように、発作活性および急性コカイン投与を含むニューロン活性により動力学的に調節され得ることである。さらに、本発明の支持で実施された実験は、ラットHomerタンパク質は、発育段階で調節され、生後第３〜第５週目にラット前脳にピーク発現をもつことを示す（図11）。ピークの発育段階の発現のこの期間に、Homerタンパク質mRNAは、暗所育成したラトの大脳皮質に最初の視覚経験の30分以内に著しく誘導される（図12A〜12F）。さらに、テトロドトキシンでの網膜活性の遮断による単眼剥奪は、対側視覚皮質におけるHomermRNAの急速な減少を起こす（図13）。これらの観察は、シナプス活性化タンパク質Homerの発育段階の発現は天然シナプス活性により皮質で調節されることを示す。シナプス活性化タンパク質ファミリーのさらなるメンバーがこれらの、または非常に類似した発現特性を共有しうることが予測される。
成熟体では、HomermRNAは、長期間増強を誘導するNMDA依存シナプス刺激により、覚醒した、行動するラットの海馬において急速に誘導される（図14）。最も顕著な誘導は、海馬顆粒細胞ニューロン内に起こり、発作による誘導と規模（magnitude）は同じである。Homerタンパク質は、コカインにより線状体にも急速に誘導され（図15）、ドーパミン受容体機構による調節を示唆する。これらの研究は、他の既知のPDZタンパク質と異なり、Homerタンパク質は、生理学的ニューロン活性の多重の形態により速やかに調節されることを示す。
ラットHomerタンパク質の多くの新規の特徴は、Homerとそのヒト類似体について、グルタミン酸作動性のシナプス柔軟性における重要な役割を示唆する。
Ｖ．有用性
本発明の一部を形成するポリヌクレオチドおよびポリペプチド組成物は、シナプス活性化タンパク質とその細胞結合部位の間の相互作用を増強または阻害する能力のある薬剤を確認するための、診断アッセイおよびスクリーニングアッセイの主要成分として有用である。このようなアッセイの特定の例、およびいかにそれらを使うことができるかは、以下の節で提供される。
１．スクリーニングアッセイ
本明細書に記載されたシナプス活性化タンパク質は、タンパク質HomerとmGluR5もしくはmGluR1αの結合を妨害またはモジュレートする化合物を確認するための、従って、PI結合mGluR活性についてのスクリーニングアッセイに使うことができる。本発明によって、このスクリーニングアッセイにより確認された化合物は、てんかん、異常脳発育、神経障害、心的外傷（trauma）およびある特定の化学品中毒を治療する薬剤として使うことができる。
タンパク質−タンパク質相互作用を測定するアッセイのフォーマットは当業で周知である。例えば、標準の方法によって、精製シナプス活性化タンパク質を、マイクロタイタープレートのような固相上に被覆し、続いて、開放プレート結合部位のブロッキングをすることができる。その後、試験化合物の不在下または存在下で、mGluRをプレートに加える。シナプス活性化タンパク質に結合したmGluRの検出は、mGluRの直接標識によりまたは続いて抗体のような標識したmGluR特異的結合試薬の添加により達成する。結合試薬は、例えば、125Iで放射標識するか、または蛍光染料、シグナル作製能力のある酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase））、金もしくはビオチンで、当業周知の方法（Howard，1993）により標識することができる。その後、結合の検出は、作製されたシグナルに適切な方法を使って実施される。試験化合物は、薬剤開発のために、それがタンパク質の間の結合を有意に変えるかで選択される。
したがって、本発明の部分を形成するポリヌクレオチドは、上記スクリーニングアッセイのために、シナプス活性化タンパク質の大規模生産に使うことができる。
２．診断アッセイ
シナプス活性化Homerタンパク質のラットまたはヒト形態とmGluR5との間の相互作用を使い、例えばシナプス活性化タンパク質の誘導を測定するための診断アッセイキットを作ることができる。シナプス活性化タンパク質の誘導は、中枢神経組織の発作活性のような脳活性化の物指を果たしうると評価される。ここに、シナプス活性化タンパク質レベルの測定は、発作活性および／またはそのような活性の結果であるニューロン障害のレベルの指標を果たしうる。このような測定は、急性コカイン中毒のレベルの指標も果たしうる（上記の第IV節参照）。
シナプス活性化タンパク質のレベルを測定するための診断キットは、ラジオイムノアッセイの形態をとることができ、その場合、サンプルタンパク質レベルは、標識対照タンパク質の特異的抗体からの変位により測定される。代わりに、タンパク質レベルは、ELISAサンドイッチ型アッセイで測定することができ、その場合、シナプス活性化タンパク質の特定のエピトープを指向するモノクローナル抗体を固相に付着させる。その後、試験サンプルを加え、続いて、シナプス活性化タンパク質の異なるエピトープを指向する検出可能なモノクローナル抗体を加える。検出可能なシグナルは、サンプル中に存在するシナプス活性化タンパク質の量に比例する。
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、いかなる意味でもこれを限定する意図はない。
実施例１
分別スクリーニングによるシナプス活性化タンパク質Homerのクローニング
ラットをシクロヘキシミドで前処置し、15分後から最大電気痙攣発作（MECS）を３時間にわたって合計12回繰り返し与えることによって、海馬中のIEBの超誘導（superinduction）を達成した。
MECSおよびシクロヘキシミド処置をしたラットの海馬から全RNAを単離した。オリゴdTカラムクロマトグラフィーによってポリ（A）+RNAを選別した。次にオリゴdT/XhoIプライマーを使用してこのRNAをcDNAに変換し、製造者のプロトコルにしたがって、λZapII（Stratagene,La Jolla,CA）中に方向性を持たせてクローン化した。このライブラリーのコンプレキシティは約2×106個の独立クローンであった。次にこの刺激を受けた親ライブラリーを使用して、発作後に海馬中に誘導された遺伝子が増量されたサブトラクト（subtract）ライブラリーを調製した。刺激されたライブラリーを50000pfu／皿の密度でプレーティングし（合計40枚の皿）、ファージDNAを調製した。XhoIを使用してこのDNAをcDNAインサートの3’末端の位置で直線化し、次にT3 RNAポリメラーゼの存在下でこれを鋳型として使用して、大量の「in vitro」cRNAを合成した。不完全転写物およびベクター配列を除去するため、オリゴdTカラムクロマトグラフィーによって、このcRNAからポリ（A）+cRNAを単離した。オリゴdT/XhoIプライマーおよびスーパースクリプト（superscript）逆転写酵素（Gibco BRL,Ground Island,NY）を使用して、このcRNAをcDNAに転換した。塩基の変性およびその後の「SEPHADEX G-50」（Pharmacia,Piscataway,NJ）上のカラムクロマトグラフィーによってRNA鋳型を除去し、正常成熟ラット脳から単離したポリ（A）+RNAに対してこのcDNAをサブトラクトした。サブトラクションのため、「PHOTOPROBE」（長アーム）ビオチン（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA）を使用して、脳「ドライバー（driver）」ポリ（A）+RNAをビオチン化した。サブトラクションの第１ラウンドのため、20倍過剰のビオチン化ドライバー脳RNA（200ug）を刺激されたcDNA（10ug）と68℃で48時間ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジン（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA）の添加およびその後のフェノール抽出によって、分別されないcDNA/bioRNAハイブリッドを除去し、一本鎖cDNAを水相中に回収した。このサブトラクションの第１ラウンドで出発cDNAの80％が除去され、残存する一本鎖cDNAを100倍過剰のビオチン化ドライバー肝臓RNA（200ug）と68℃でさらに48時間ハイブリダイズさせた。このサブトラクションの第２ラウンドで出発刺激cDNAのさらに16％が除去された。「SEPHADEX G-50」（Pharmacia,Piscataway,NJ）上のカラムクロマトグラフィーによって残存物質をサイズ分画して、分解された小さいcDNA類を除去した。「SEQUENASE」DNAポリメラーゼ（USB）およびSKプライマー（Stratagene,La Jolla,CA）を使用して、「刺激された」サブトラクト一本鎖cDNAを二本鎖に変換した。EcoRIおよびXhoIでの消化ならびにカラムクロマトグラフィーによるサイズ分画後、サブトラクトcDNAをλZapII中に方向性を持たせてクローン化した（サブトラクト／MECSおよびシクロヘキシミド／海馬）。このサブトラクトcDNAライブラリーのコンプレキシテイは約5×106個の独立クローンであった。次にこのファージライブラリーを約1000ファージ／15cm皿の密度でプレーティングし、複製物リフトを取得した。次にリフトを、未処置対照ラットまたはMECS／シクロヘキシミド刺激を受けたラットのいずれかからの海馬のポリA+RNAから調製した32P-dCTP放射性標識cDNAとハイブリダイズさせた。製造者の指示にしたがって「SUPERSCRIPT」を使用して、一本鎖cDNAを調製した。RNA鋳型の塩基変性後、ランダムプライミング法によってcDNAを��活性が4×109cpm/ugとなるまで放射性標識した。フィルターをサブトラクトcDNAプローブと65℃で２日間ハイブリダイズさせ、次に65℃で0.5X SSC／0.2％SDSで洗浄し、増感紙を有するＸ線フィルムに-80℃で露光した。
実施例２
Homerタンパク質オリゴヌクレオチドおよびベクターの調製
当分野で既知の方法（Ausubel）にしたがって、5’EcoRI断片（1.6kb）をpRK5（Genentech,South San Fransisco,CA）中にクローン化することによって、全長Homerの哺乳類発現構築物を調製した。
実施例３
Homerタンパク質の合成
ヒト胚性腎細胞（IDEK293）中でHomerタンパク質を発現させた。標準的リン酸カルシウム沈降法によって、Homer真核生物発現ベクター（sRK5 Homer）をHEK-293細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後24〜48時間目に細胞を収穫した。
１．無細胞翻訳
Homerタンパク質をいくつかの戦略を使用して発現させてみた。T3ポリメラーゼならびに製造者の指示（Promega Biotech,Madison,WI）にしたがったin vitro転写および翻訳方法を使用して、pBSKS-（Stratsgene,LaJolla,CA）中にクローン化したcDNAから、Homerを最初に発現させた。この技術を使用してHomerのサイズを評価し（HomerはSDS-PAGE上で見かけの分子量が28kDaとして移動する）、ORFによって予測したサイズを確認した。この方法を以下に記載するその他の使用のためのHomerの調製にも使用することができる。
２．細胞内発現
pTrkHis（InVitrogen,San Diego,CA）およびpGEX（Pharmacia,Piscataway,NJ）中にORFをクローン化することによって、細菌融合Homerタンパク質を調製した。融合タンパク質を細菌中で発現させて、製造者の指示にしたがって、適切なアフィニティカラムで精製した。
当分野で既知の標準的操作法にしたがって、ORFを含む2kB EcoRI制限断片をベクターpRK5（Genentech,South San Fransisco,CA）中にクローン化することによって、Homerを真核細胞（ヒト胚性腎細胞、American Type Culture Collection,Rockville,MD）中で発現させた。標準リン酸カルシウム沈降法によって、この真核発現ベクター（pRK4 Homer）をHEK-293中にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクト後24〜48時間目に収穫した。これらの細胞から単離したタンパク質を結合アッセイおよび天然タンパク質のサイズの確認のために使用した。
Homerを酵母中でも発現させた。ORFをpPC86（Chevray and Nathans,1992）中にクローン化し、Homerと相互作用するタンパク質のスクリーニングに使用した。このスクリーニングではHomerがタイプ5の代謝型グルタミン酸受容体と相互作用することが最初に判定された。
実施例４
Homerタンパク質のイムノアフィニティ精製
製造者の指示にしたがって、（Igイソ型に応じて）プロテインＡまたはＧビーズ（Pharmacia,Piscataway,NJから市販されている）にモノクローナル抗体を連結し、このビーズ複合体をイムノアフィニティカラムに集める。清澄化した全細胞溶解物をアガロースビーズに予備吸着させ、このイムノアフィニティカラムを通過させ、数倍容量の洗浄バッファーで洗浄し、その後事前に決定したバッファー条件を使用して、目的のタンパク質をカラムから溶離させる。普通、こうした溶離には高塩濃度が使用される。
あるいは、当技術分野で既知の方法（Garveyら、1977）にしたがって、「SEPHAROSE 4B-200」（Pharmacia,Piscataway,NJ）などのクロマトグラフィー固相試薬に抗体を直接付着させてもよい。
実施例５
ツーハイブリッドタンパク質結合アッセイ
フランキングSmaI部位を有する全長Homer ORFを酵母発現ベクターpPC97中にサブクローン化した。発作刺激を受けた成熟ラット海馬からランダムプライムcDNAライブラリーを調製し、酵母発現ベクターpPC86中にクローン化した。このライブラリーは6×106個の独立cDNAを含有しており、合計1.5×106個がスクリーニングされた。ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジンを欠失したプレート上のコロニー選別によって、相互作用するタンパク質を同定し、βガラクトシダーゼアッセイ（Ausubelら、1992）を使用して確認した。あるいは、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、市販のツーハイブリッド検出システム、例えば「HYBRID HUNTER」（InVitrogen,San Diego,CA）を使用することができる。
実施例６
発現レベルの測定
１．抗血清の調製
mGluR受容体のためのウサギポリクローナル抗血清を以下のC-末端ペプチドに対して作製した；C-末端21aaペプチドに対して既述のmGluR1、mGluR2/3（Chemicon International Inc.），mGluR4（Wyeth-Ayerst Research,Princeton,NJ）、およびmGluR5。GST融合体としての全長Homer ORFまたはC-末端18aaペプチドのいずれかを使用して、抗Homerウサギポリクローナル抗血清を作製した。両抗血清はHomerがHEK-293細胞中で発現された時の28kDaタンパク質および海馬中の発作誘導性28/29kDa二重体タンパク質を検出した。
２．イムノブロット分析
標準的方法にしたがってSDS-PAGEによってタンパク質混合物を分離した。当技術分野で既知の方法（Ausubelら、1992）にしたがって、電気泳動の後、ゲルを十分に洗浄し、次にタンパク質をニトロセルロースに移した。次にニトロセルロースを事前に決定した検出基準にしたがって希釈したポリクローナル抗mGluR5ウサギポリクローナル抗血清とともにインキュベートした。ブロットを洗浄し、次に放射性標識するかまたは酵素に結合した抗ウサギ抗血清とともにインキュベートした。乾燥したゲルをオートラジオグラフィーにかけた。
実施例７
シナプス活性化タンパク質、Homerタンパク質のmGluR5への結合
１．細菌抽出物中の細菌中で発現されたGST-Homer融合タンパク質の結合
21日令ラットの海馬をプロテアーゼ阻害剤を含むPBSおよび1％ Triton中で音波処理（3×10秒）し、15,000gで10分遠心分離し、そしてCL-4Bセファロースビーズ（Pharmacia,Piscataway,NJ）で予備清澄化することによって、海馬溶解物を調製した。Homer GST融合タンパク質をAffigelアガロースビーズに不可逆的に架橋結合させる（カラム床体積1mlについてHomerタンパク質1mg；Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA）ことによって、Homerアフィニティカラムを調製した。次に、ビーズ40mlを海馬１種からの溶解物とともに4℃で１時間インキュベートし、PBSで３回洗浄し、そして3xローディングバッファー中で煮沸することによって、結合したmGluR5を溶離させた。
２．ラットHomerタンパク質の代謝型グルタミン酸受容体への結合
代謝型グルタミン酸受容体へのHomerの結合の特異性を試験する実験のため、HEK-293細胞をmGluR1α，mGluR2，mGluR4またはmGluR5発現構築物で一時的にトランスフェクトし、細胞をかき取ってPBS＋1％Triton X100中に入れ、2×10秒間音波処理し、4℃で10分間15,000gで遠心分離し、予備清澄化した。10cmプレートの半分からの溶解物をタンパク質250ngに結合したビーズ50μlとともにインキュベートし、上記のように洗浄した。適切なポリクローナルmGluR抗体を使用したウェスタンブロット分析によってサンプルを分析した。PCRによってHomerの欠失構築物を調製し、pGEX（Pharmacia,Piscataway,NJ）中にGSTとの融合構築物としてクローン化した。
Ｃ．Homerタンパク質およびmGluR5の共免疫沈降
上記のようにして海馬溶解物を調製した。ウサギ抗Homer血清または免疫前血清を「AFFIGEL」アガロースビーズ（Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA）に不可逆的に結合させ、PBSで十分に洗浄した。ビーズ50μlを海馬１種からの溶解物とともに4℃で一晩インキュベートし、1％Tritonを含むPBSで2回、次にPBSで2回洗浄し、3xSDSローディングバッファー中に再懸濁し、そしてゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析によって分析した。対照試験においては、抗Homerを結合したビーズをHomer GST-融合タンパク質50μgとともに4℃で１時間予備インキュベートすることによって、mGluR5の共免疫沈降をブロックした。
実施例８
免疫組織化学
６週令ラットに麻酔をかけ、4％パラホルムアルデヒドで潅流した。全脳を取り出し、１時間固定液中に置き、その後30％ショ糖中に72時間入れた。スライドマイクロトーム（sliding microtome）を使用して35μmの切片を切り取り、0.1％ Tritonを含むPBS中の1％ドライミルクおよび5％正常ヤギ血清中で１時間、ブロックおよび透過性化（permeabilize）した。切片を一次抗体中で24時間インキュベートし、洗浄し、Vectastain Elite ABC Kit（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA）を使用して免疫ペルオキシダーゼ染色を実施した。一次抗体を省くか、または免疫原性ペプチドで予備吸着させたHomer若しくはmGluR5抗血清は完全に染色をブロックした。生後４日目の子ラットから一次海馬培養物を調製した。アミノ酸251-269に相当する合成ペプチドに対して生起させた抗体のCy3標識FAB断片を使用して、GluR1染色を実施した。細胞を4％パラホルムアルデヒド中で１時間固定し、0.1％Tritonで透過性化し、アフィニティ精製した抗Homer抗血清とともに4℃で一晩インキュベートした。FITCに連結したヤギ抗ウサギ抗体（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA）によってHomerを検出した。
実施例９
アッセイキット
Ａ．モノクローナル抗体の調製
ペントバルビタール注射によってBalb/cマウスに麻酔をかける。脾臓部分の毛を剃った後、その部分を70％エタノールで拭き、そして滅菌等張生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで覆う。左腹膜（midcapsular）線で長さ約1cmの皮膚切開を実施し、その後腹壁および腹膜の切開をする。鉗子を使用して、分離したHomerタンパク質を含有するゲルのニトロセルロースブロットから切り取ったニトロセルロースディスクを脾臓内にこのスリットを通して挿入し、ディスクが完全に脾臓組織内に埋没するまで尾部の方向の末端に向けて慎重に動かす。あるいは、標準的方法にしたがって、抽出したタンパク質の5マイクロリットル未満の容量を脾臓内または腹腔内に注射する。脾臓を観察して出血が過剰でないことを確認し、腹腔内に戻す。腹壁および皮膚を結節4-0絹縫合糸で別々に縫合する。8〜10日後、マウスから採血し、分離用SDS電気泳動（ウェスタンブロット）によって分画した分子量がマッチするタンパク質に対する抗体力価について血清を試験する。抗体力価が低ければ、この手順を繰り返す。
次に、標準プロトコルを使用して抗体産生性ハイブリドーマを作製する。例えば、Balb/cマウスを起源とするp3x63-Ag8.653ミエローマ細胞（非分泌ミエローマ、8-アザグアニン耐性、HPRT）を標準PEG4000（Merck,Philadelphia,PA）融合プロトコルにしたがって、ミエローマ：リンパ球比10:1で免疫脾細胞と融合させ、HATを含有する培地およびLPSでパルスしたJ774.1マウスマクロファージラインからの10％ならし培地中で、細胞をマイクロプレートに入れる。
分離用SDS-PAGEによって分離し、これから溶離させた、関連するポリペプチドを使用して、産生されたモノクローナル抗体の特異性をチェックする。通常、部分精製したタンパク質30〜80μg/mlを含有する溶離液をマイクロタイターウェルに入れ、例えば37℃で２時間、次に4℃で２時間インキュベートする。洗浄後、各ハイブリドーマウェルからの上清を添加して4℃で１時間インキュベートし、次にPBSで数回洗浄する。フルオレセイン標識したヤギ抗マウスイムノグロブリン「二次」抗体を添加し、その後洗浄し、そして蛍光測定によって結合をモニターする。
抗体（腹水）の大量生産のため、陽性ハイブリドーマクローンを増量させ、再クローン化し、Pristane処置したBalb/cマウス中に注射する。腹水液からの抗体を（Igイソ型によって）プロテインAまたはGカラム上で精製する。
Ｂ．固相イムノアッセイ
精製したラットHomerをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）などの標準コーティング用希釈バッファーで希釈し、マイクロタイタープレートなどの固相にコーティングし、つぎに標準的方法にしたがって、ウシ血清アルブミンまたはカゼインなどの無関係なタンパク質でプレートの開放された結合部位をブロックする。次に、このプレートに試験化合物の不在下または存在下でmGluRを添加する。mGluRの直接の標識、またはmGluRに特異的なモノクローナル若しくはポリクローナル抗体などの標識されたmGluR特異的結合試薬の追加によって、シナプス活性化タンパク質に結合したm GluRの検出が達成される。試験化合物がタンパク質間の結合を有意に変更させる場合は、薬剤の開発のために、これを選択する。
本発明を特定の方法および実施形態を参考にしながら記載してきたが、本発明から逸脱することなく、各種の修飾および変更が可能であることが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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