(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
3,6−フィターゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（ｉ）配列番号：１に記載の核酸配列と又は（ii）配列番号：１に記載の核酸配列に対して相補的な核酸配列とハイブリダイズすることが出来る核酸によりコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
（ｅ）上記（a）〜（ｃ）のいずれかの対立遺伝子型；
から成る群から選択されるポリペプチド。
【請求項２】
真菌から得られる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
サーモマイセス（Thermomyces）の株又はその異名もしくはテレオモルフから得られる請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）の株又はその異名もしくはテレオモルフから得られる請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）CBS 586.94又はその変異株から得られる請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
（ｉ）配列番号：１に記載の核酸配列もしくは（ii）その相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
サーモマイセス（Thermomyces）の株又はその異名もしくはテレオモルフから得られる請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）の株又はその異名もしくはテレオモルフから得られる請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）CBS 586.94又はその変異株から得られる請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
大腸菌NRRL B-21527内に含まれるプラスミドpMWR46内に含まれる核酸配列によりコードされる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項１４】
前記核酸配列がサーモマイセス（Themomyces）の株から得られるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項13に記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸配列がサーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）又はその異名もしくはテレオモルフから得られるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項14に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸配列がサーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanyuginosus）CBS 586.94又はその異変株から得られるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項15に記載の核酸。
【請求項１７】
配列番号：２に記載のアミノ酸と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項13〜15のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１８】
（ａ）配列番号：１に記載の核酸配列を有する核酸と又は（ｂ）その相補鎖と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる請求項13に記載の核酸。
【請求項１９】
前記核酸が、大腸菌NRRL B-21527内に含まれるプラスミドpMWR46内に含まれる、請求項13に記載の核酸。
【請求項２０】
前記核酸が、配列番号：１に記載の核酸配列を有する、請求項13〜16のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項２１】
適切な発現宿主内で前記ポリペプチドの発現を誘導することができる１又は複数の調節配列に作用可能に連結された請求項13〜20のいずれか１項に記載の核酸配列を含む核酸構成物。
【請求項２２】
請求項21に記載の核酸構成物、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクター。
【請求項２３】
選択マーカーを更に含む請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項21〜23のいずれか1項に記載の核酸構成物を含む組換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記核酸構成物がベクター内に含まれる、請求項24に記載の細胞。
【請求項２６】
前記核酸構成物が前記宿主細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項24に記載の細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が細菌又は真菌細胞である、請求項24〜26のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細菌細胞が、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、又はストレプトマイセス（Streptomyces）の細胞である、請求項27に記載の細胞。
【請求項２９】
前記真菌細胞が糸状菌又は酵母の細胞である、請求項27に記載の細胞。
【請求項３０】
前記糸状菌細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypoladium）、又はトリコデルマ（Trichoderma）の種の細胞であることを特徴とする請求項29に記載の細胞。
【請求項３１】
前記酵母細胞が、カンジダ（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）又はヤルロビア（Yarrowia）の種の細胞である、請求項29に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１に記載のポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）サーモマイセス（Thermomyces）の株を培養して前記ポリペプチドを含む上清を得；そして
（ｂ）該ポリペプチドを回収する；
ことを含んでなる方法。
【請求項３３】
請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）該ポリペプチドの発現に資する条件下で、該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構成物を含む宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
ことを含んでなる方法。
【請求項３４】
請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチド及び１又は複数の飼料又は食品添加物又は構成物を含む飼料又は食物組成物。
【請求項３５】
有効量の請求項34に記載の飼料組成物をヒト以外の動物に与えることを含む動物肥料中のフィチン酸レベルを減少させるための方法。
【請求項３６】
デンプンを液化するための方法であって、
（ａ）液化する前又はそれと同時に、請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドで前記デンプンを処理し；
（ｂ）該デンプンにα−アミラーゼを添加し；そして
（ｃ）該デンプンを液化するのに有効な時間及び温度でステップｂ）のデンプンを反応させる；
ことを含む方法。
【請求項３７】
フィチン酸から無機リン酸塩を遊離させるための、請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３８】
食物又は飼料調製物又は添加物の調製の間の請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３９】
食物又は飼料利用性を改善するための請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、フィターゼ活性を有する単離されたポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。本発明は、その核酸配列を含む核酸構成物、ベクター、及び宿主細胞、並びにそのポリペプチドを生産するための方法にも関する。本発明は、更に、そのポリペプチドを含む組成物及びその使用の方法に関する。
関連技術の記載
フィターゼ（ミオ−イノシトールヘキサキスホスフェートホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.8）は、フィテート（ミオ−イノシトールヘキサキスホスフェート）の、（１）ミオ−イノシトール、（２）そのモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、及びペンタ−ホスフェート並びに（３）無機リン酸塩への加水分解を触媒する。以後、略して、上述の化合物は時々、各々IP６，Ｉ，IP１，IP２，IP３，IP４，IP５及びＰと呼ぶ。これは、フィターゼの機能により、IP６が無機リン酸塩並びに１又は複数の構成物IP５，IP４，IP３，IP２，IP１及びＩに分解される。あるいは、位置ｐ，ｑ，ｒ，…に結合した全部でｎのリン酸基を有するmyo−イノシトールは（Ins（p，q，r，…）Pn）と呼ぶ。
２つの異なる型のフィターゼ：いわゆる３−フィターゼ（myo−イノシトールヘキサキスホスフェート３−ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.8）及びいわゆる６−フィターゼ（myo−イノシトールヘキサキスホスフェート６−ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.26）が知られている。３−フィターゼは最初に３倍のエステル結合を加水分解し、他方６−フィターゼは最初に６位のエステル結合を加水分解する。（１，２，４，５，６−IP５であるか１，２，３，４，５−IP５であるかにかかわらず）結果として生ずるIP５基質の残りのエステル結合は、実質的に異なる比率で加水分解される。また、全ておいて加水分解されるなら、構成物IP４，IP３，IP２及びIP１の加水分解の比率は可変性であるようである。
フィターゼを生産する微生物は、バクテリア、例えばバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）（Paver and Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108）及びジードモナス（Pseudomonas）（Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220）；イースト、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）（Navini and Marcakis, 1984. Lebensmittei Wissenschaft und Technologie 17: 24-26）；及びアスペルギルス（Aspergillus）属の真菌、例えばアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）（Yamadaら、1986, Agricultural Biological Chemistry 322: 1275-1282）を含む。
Piddingtonら（1993, Gene 133: 55-62）によるアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）変種アワモリ（awamori）及びvan Hartingsveldtら（1993, Gene 127: 87-94; EP 420 358）によるアスペルギルス・ニゲル（フィクウム（ficuum））からのフィターゼ遺伝子のクローニング及び発現が開示されている。
フィチン酸は、動物の飼料の主要な構成物である、穀物、マメ類、脂肪種子、例えば大豆内の一次的貯蔵形態である。しかしながら、単胃動物のための動物の飼料内のフィチン酸の存在は、フィチン酸のリン酸成分がミネラルをキレート化し、おそらくタンパク質がそれらを栄養的に利用できなくするので不要である。更に、フィチン酸のリンは単胃動物の胃腸管を通過して代謝されない、リンは全ての生物の成長のための本質的要素であるので、家畜の飼料には無機リン酸塩を補給しなければならない。これにより、当該技術は単胃動物の飼料におけるフィターゼの使用を開示する。
更に、フィチン酸は単胃動物によって代謝されないのでそれは肥料内に排出される。家畜生産の増加から生ずる生産された肥料の量は世界的に大きく増加している。肥料の処分は、特に水の中の、リン酸塩の蓄積のため、世界じゅうの様々の場所で環境問題を引きおこしている。これにより、肥料中のフィテートの量を減らすためのフィターゼの使用も当該技術は開示する。
商業的に大量に生産することができる改良された特性を有する新規フィターゼについて、当該技術において必要性がある。
本発明の目的は、新しいクラスのフィターゼ、即ち３，６−フィターゼ、即ちホスホエステルの両方の結合を攻撃するフィターゼを提供することである。
発明の概要
本発明は、
（ａ）３，６−フィターゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：２に記載されるアミノ酸配列と少くとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号：１に記載される核酸配列又は（ii）その相補鎖と、中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子形態；及び
（ｅ）（ｂ），（ｃ）、又は（ｄ）のフラグメント
からなる群から選択されるフィターゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
本発明は、前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列並びに該核酸配列を含む核酸構成物、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを生産するための方法にも関する。本発明は、複合飼料及びフィテートレベルを削減する方法に更に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）CBS 586.94ゲノムDNAの、フィターゼ遺伝子プローブとのサザンハイブリダイゼーション分析からのオートラジオグラムを示す。
図２は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼのゲノムDNA配列及び予想されるアミノ酸配列（各々配列番号：１及び配列番号：２）を示す。
図３は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94及びアスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135からのフィターゼについてアミノ酸配列のアラインメント（配列番号：３）を示す。
図４は、pDM181の制限地図を示す。
図５は、pMWR48の制限地図を示す。
図６は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94及びアスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135フィターゼの熱安定性の比較を示す。
図７は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94及びアスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135フィターゼのpH−活性プロフィールを示す。
図８は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94及びアスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135フィターゼの温度−活性プロフィールを示す。
図９は、アスペルギルス・ニゲル（フィクウム）フィターゼの産物プロフィールを示す、NMRスペクトルの積み重ねたプロット（24時間まで）を示す。
図10は、サーモマイセス・ラヌギノススフィターゼの産物プロフィールを示すNMRスペクトルの積み重ねたプロット（24時間まで）を示す。
図11は、アスペルギルス・ニゲル（フィクウム）フィターゼの産物プロフィールを示す4.5時間までのNMRスペクトルの積み重ねたプロットを示す。
図12は、サーモマイセス・ラヌギノススフィターゼの産物プロフィールを示す4.5時間までのNMRスペクトルの積み重ねたプロットを示す。
図13は、20分後の、アスペルギルス・ニゲル（フィクウム）フィターゼ及びサーモマイセス・ラヌギノススフィターゼの産物プロフィールを示すNMRスペクトルを示す。
発明の詳細な記載
フィターゼ活性を有するポリペプチド
第１の実施形態において、本発明は、３，６−フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。これにより、本発明のこの態様のポリペプチドは、フィチン酸の６−及び３−位について高い初期アフィニティーを示すフィターゼの新規クラスに属する。換言すれば、それは３−フィターゼでも６−フィターゼでもないが、いずれの周知のフィターゼについて今まで報告されているものよりも小さい位置特異性である。好ましくは、これらのポリペプチドは３位及び６位についてより大きい初期アフィニティーを有する。更に、これらのポリペプチドは、真菌株、より好ましは糸状菌株から得られる。最も好ましい実施形態において、そのポリペプチドはサーモマイセス、より好ましくはサーモマイセス・ラヌギノスス、そして最も好ましくはその株CBS 586.94から得られる。
第２の実施形態において、本発明は、そのポリペプチドのフィターゼ活性を質的に保持する、少くとも約60％、好ましくは少くとも約70％、より好ましくは少くとも約80％、更により好ましくは少くとも約90％、最も好ましくは少くとも95％、そして更に最も好ましくは少くとも約97％の、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列との同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（以後“相同ポリペプチド”）に関する。好ましい実施形態においてその相同ポリペプチドは、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列と５アミノ酸、好ましくは４アミノ酸、より好ましくは３アミノ酸、更により好ましくは２アミノ酸、そして最も好ましくは１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、同一性テーブル、10ギャップペナルティー、及び10のギャップ長ペナルティーでのClustal法（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151〜153）により決定される。
その相同性ポリペプチドのアミノ酸配列は、１もしくは複数のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失及び／又は異なるアミノ酸残基による１もしくは複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列と異なる。好ましくは、アミノ酸変換は、少しの性質の変換、即ちタンパク質のホールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存性アミノ酸置換；少量の欠失、典型的には１〜約30アミノ酸の欠失；少量のアミノ−もしくはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基の伸長；約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド；又は実効電荷もしくは他の機能、例えばポリヒスチジン域、抗原エピトープもしくは結合ドメインを変化させることにより精製を容易にする小さな伸長である。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群の中にある。比活性を一般的に変えないアミノ酸置換は当該技術で周知であり、例えばH.Neurath及びR.L.Hill（1979, In, The Proteins, Academic Press, New York）に記載される。最も一般的におこる変換は、Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu、及びAsp/Gly並びにこれらの逆である。
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列を有するフィターゼ活性を有する単離されたポリペプチド、並びにフィターゼ活性を保持するその対立遺伝子形態及びフラグメントに関する。好ましくは、フラグメントは、少くとも400アミノ酸残基、より好ましくは少くとも425アミノ酸残基、そして最も好ましくは少くとも475アミノ酸残基を含む。
第３の実施形態において、本発明は、配列番号：１に記載される核酸配列と高、中、又は低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと同じ条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされるフィターゼ活性を有する単離されたポリペプチド、又はその相補鎖（J.Sambrook, E.F.Fritsch、及びT.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）、並びにその対立遺伝子形態及びフラグメントに関する。ハイブリダイゼーションは、類似している核酸配列が、標準的サザンブロッティング手順の後、低〜高ストリンジェンシー条件（例えば５×SSPE、0.3％ SDS、200mg／mlのせん断して変性したサケ精子DNA、及び高、中及び低ストリンジェンシーについて各々50，35又は25％のホルムアミド中での42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下において、配列番号：１に示される核酸配列の一部をコードするポリペプチドに相当するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを示す。
配列番号：２に記載されるアミノ酸配列又はその部分的アミノ酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブをデザインするのに用いることができ、又は本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、例えば配列番号１に記載される核酸配列、又はそのサブ配列は、当該技術で公知である方法に従って異なる属又は種の株から、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定及びクローン化するのに用いることができる。特に、このようなプローブは、本明細書に記載される対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準的サザンブロッティング手順の後の、関心の属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために用いることができる。このようなプローブは、その全体の配列よりかなり短くてよいが、少くとも15、好ましくは少くとも25、そしてより好ましくは少くとも40ヌクレオチドの長さであるべきである。より長いプローブを用いることもできるDNA及びRNAの両方のプローブを用いることができる。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために、（例えば32Ｐ，3Ｈ，35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識される。
これにより、このような他の生物から調製されたゲノム、cDNA又は組合わせの化学的ライブラリーは、上述のプローブとハイブリダイズするDNA及びフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーニングすることができる。このような生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術により分離することができる。そのライブラリーからのDNAは分離したDNAは、ニトロセルロース又は他の適切な担体材料に移し、それ上に固定化することができる。配列番号：１と相同性のあるクローン又はDNAを同定するために、担体材料はサザン・ブロットに用いられる。ここで、サザン・ブロットにおいては、担体材料は、好ましくは50℃以下、より好ましくは55℃以下、更により好ましくは60℃以下、そして最も好ましくは65℃以下で２×SSC、0.2％ SDSを用いて各々30分、３回、最終的に洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出することができる。
好ましい実施形態において、本発明の単離したポリペプチドは、配列番号：１に記載される核酸配列又はその相補鎖、並びにその対立遺伝子形態及びフラグメントと、中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと、同じ条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされる。より好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号：１に記載される核酸配列又はその相補鎖、並びにその対立遺伝子形態及びフラグメントと、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと、同じ条件下でハイブリダイズすることができる。核酸配列によりコードされる。
本発明は、サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）CBS 586.94に対してネイティブであるポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドにも関する。この実施形態において、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性があるか又はそれに結合する抗体を生産するのに用いられる。サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94に対してネイティブであるポリペプチドと免疫学的同一性を有するポリペプチドは、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94に対してネイティブであるポリペプチドに対する抗体を含む抗血清が、特定の免疫化学的技術を用いて、沈殿物の全体的様式、同一の沈殿形態、及び／又は同一の電気泳動移動度のような同一の様式で、他のポリペプチドと反応することを意味する。免疫化学的同一性更なる説明は、
0004125375.tif 000002
に記載される。部分的免疫学的同一性は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94に対してネイティブであるポリペプチドに対する抗体を含む抗血清が、特定の免疫化学的技術を用いて、沈殿の部分的な様式、部分的に同一な沈殿形態、及び／又は部分的に同一な電気泳動移動度のような部分的に同一な様式で他のポリペプチドと反応することを意味する。部分的免疫学的同一性の更なる説明は、
0004125375.tif 000003
に記載される。免疫化学的特性は、公知のオクタロニー二重免疫拡散手順による免疫学的交差反応同一性テストにより決定される。特に、本発明のポリペプチドに対する抗血清は、
0004125375.tif 000004
（より詳しくはページ27−31）により記載される手順に従って、ウサギ（又は他のげっ歯動物）を免疫化することにより生ずる。
配列番号：１に記載される核酸配列又はその相補鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができる核酸配列並びにその対立遺伝子及びフラグメントによりコードされるポリペプチド、相同ポリペプチド並びに同一又は部分的に同一の免疫学的特性を有するポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得ることができる。好ましくは、それらはバクテリア源から得られる。他の好ましい実施形態において、これらのポリペプチドは真菌源から得られる。このようなポリペプチドのためのソースは公共の寄託機関で利用できるサーモマイセス属及びその種の株である。更に、これらのポリペプチドは、上述のプローブを用いて自然（例えば土壌、コンポスト、水等）から単離された微生物を含む他のソースから同定し、得ることができる。自然の環境から微生物を単離するための技術は当該技術で公知である。次に、核酸配列は、他の微生物、特に真菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus）種の株、特にアスペルギルス・アクレアトウス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ホエチドウス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の株、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）の株、特にトリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアトウム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）もしくはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の株又はフサリウム種（Fusarium sp.）、特にフサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロオクウエルレンス（Fusarium crookwellense）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・スルクレウム（Fusarium sulphureum）もしくはフサリウム・ベネアトウム（Fusarium venenatum）の株又はヒュミコラ種（Humicola sp.）の株、又はアウレオバシジウム（Aureobasidium sp.）、クリプトコッカス種（Cryptococcus sp.）、フィリバシジウム種（Filibasidium sp.）マグナポルテ種（Magnaporthe sp.）、マイセリホフトーラ種（Myceliophthora sp.）、ネオカルリマスチックス（Neocallimastix sp.）、パエシロマイセス種（Paecilomyces sp.）、プリオマイセス種（Piromyces sp.）、タラロマイセス種（Talaromyces sp.）、サーモアスクス種（Thermoascus sp.）、チエラビア種（Thielavia sp.）、もしくはスキゾフィルム種（Schizophyllum sp.）の種のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得ることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列をプローブで検出した後、その配列は、当業者に周知である技術を利用することにより単離し、又はクローン化することができる（Sambrookら、1989、前掲）。
本発明のポリペプチドは、好ましくはサーモマイセスの種、例えばこれらに限られないが、サーモマイセス・イバダネンシス（Thermomyces ibadanensis）、サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）、サーモマイセス・ステルラトウス（Thermomyces stellatus）、及びサーモマイセス・ベルルコスス（Thermomyces verrucosas）から得られる。これらの種の株は、いくつかの培養コレクション、例えばAmerican Type Culture Collection（ATCC）, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）, Centraalbureau Voor Schimmelcultures（CBS）、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center（NRRL）で公共的に直ちにアクセスできる。
より好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、サーモマイセス・ラヌギノススから、そして最も好ましくはサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94又はその変異株から得られ、例えば配列番号：２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、更に、S.C.Jong, J.M.Birmingham、及びG.Ma（ATCC Names of Industrial Fungi, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 1994）又はM.B.Ellis（Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute, Surrey, England, 1971）により記載されるようなサーモマイセスの異名である他の真菌から得ることができる。例えば、サーモマイセス・ラヌギノススの異名は、アクレモニエラ・サーモフィラ（Acremoniella thermophila）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lannginosa）、モノトスポラ・ラヌギノサ（Monotospora lanuginosa）、及びセペドニウム・ラヌギノスム（Sepedonium lanuginosum）を含む。本発明は、サーモマイセスのテレオモルフである真菌から得られるフィターゼも包含する。サーモマイセス属はdematiaceous hyphomycete真菌の群の陸生メンバーである。コロニーは、不規則に広がり、綿様で、又はビロード状で、そして灰色、緑がかった灰色、バフ色、暗く黒がかった茶色、又は黒である。菌条体は部分的に表面状で部分的に沈んでいる。分生子柄はミクロネマチック又は半マクロネマチックで、単一のネマチックで、非分枝又は不規則に枝分れした直線的又は曲がった無色又は茶色で、なめらかである。分生子形成細胞は単芽球で、一体化し、そして終端性又は分かれており、有限で、円柱状又は壼形態である。分生子は単生で、乾燥し、頂生植物状で、単純で、球形からサブ球形又は角ばってローブ状で、青白色から暗黒がかった茶色で、なめらか又はいぼ状でＯ−中隔を有する。フィアライド状態は知られていない。
本発明の目的のため、所定のソースに関連して本明細書で用いられる用語“から得られる”とは、ポリペプチドが、ソース、又はソースからの遺伝子が挿入されている細胞により生産されることを意味する。
本明細書で定義される場合、“単離された”ポリペプチドは、本質的に他の非フィターゼポリペプチドのないポリペプチド、例えばSDS-PAGEで測定して、少くとも約20％純粋、好ましくは少くとも約40％純粋、より好ましくは約60％純粋、更により好ましくは約80％純粋、最も好ましくは約90％純粋、そして更に最も好ましくは約95％純粋であるポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、高温で高い活性を有することを特徴とする。より詳しくは、これらのポリペプチドは65℃近くで最大フィターゼ活性を有し、そして75℃においてでさえ部分的な活性を有する。対照的に、アスペルギルス・ニゲルフィターゼは65℃において本質的に不活性である。
核酸の配列
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する。好ましい実施形態において、その核酸配列は、サーモマイセス、例えばサーモマイセス・ラヌギノススから得られるポリペプチドをコードし、より好ましい実施形態において、その核酸配列は、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94から得られ、例えば配列番号：１に記載される核酸配列である。より好ましい実施形態において、その核酸配列は、大腸菌NRRL B-21527に含まれるプラスミドpMWR46内に含まれる配列である。本発明は、遺伝子コードの縮重により配列番号：１と異なる配列番号：２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列も含む。本発明は、フィターゼ活性を保持する配列番号：２のフラグメントをコードする配列番号：１のサブ配列にも関する。好ましくは、サブ配列は、少くとも1200ヌクレオチド、より好ましくは少くとも1275ヌクレオチド、そして最も好ましくは少くとも1425ヌクレオチドを含む。
上述の通り、その核酸配列は、M.B.Ellis, 1971、前掲又はJongら、1994、前掲により定義されるようなサーモマイセスの異名又はテレオモルフである微生物から得ることができる。
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するのに用いられる技術は当該技術で周知であり、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せを含む。これらのゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ鎖反応（PCR）又は共有する構造物特徴でクローン化されたDNAフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることにより、行うことができる。例えばInnisら（1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York）を参照のこと。他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結化活性化転写（LAT）及び核酸配列ベースの増幅（NASBA）を用いることができる。核酸配列は、そのポリペプチドを生産するサーモマイセスの株、又は他のもしくは関連する生物からクローン化することができ、そしてこれにより、例えば、その核酸配列のポリペプチドコード化領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
本明細書に用いられる用語“単離された”核酸配列とは、他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列、例えばアガロースゲル電気泳動により測定して、少くとも約20％純粋、好ましは少くとも約40％純粋、より好ましくは約60％純粋、更により好ましくは約80％純粋、最も好ましくは約90％純粋、そして更に最も好ましくは約95％純粋である核酸配列をいう。例えば、単離された核酸配列は、再生産されるであろう異なる部位に、その天然の位置からの核酸配列を再配置するために遺伝子工学において用いられる標準的クローニング手順により得ることができる。そのクローニング手順は、そのポリペプチドをコードする核酸配列を含む要求される核酸フラグメントの切出し及び単離、ベクター分子内へのそのフラグメントの挿入、及び核酸配列の多重コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞内への組換へベクターの組込みを含み得る。その核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA、半合成、合成源、又はそれらの組合せのものであり得る。
本発明は、活性ポリペプチドをコードする、少くとも約60％、好ましくは少くとも約70％、より好ましくは少くとも約80％、更により好ましくは少くとも約90％、最も好ましくは少くとも約95％、そして更に最も好ましくは少くとも約97％の、配列番号：１に記載の核酸配列との同一性の程度を有する核酸配列にも関する。本発明の目的のため、２つの核酸配列の間の同一性の程度は、同一性テーブル、10のギャップペナルティー、及び10のギャップ長でClustal法（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153）により決定される。
そのポリペプチドをコードする核酸配列の改変は、そのポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドの合成のために必要であり得る。ポリペプチドに“実質的に類似”とは、ポリペプチドの非天然形態をいう。これらのポリペプチドは、そのネイティブ源から単離されたポリペプチドといくつかの工学的方法において異なり得る。例えば、部位特異的変異誘発を用いて、変異体が比活性、熱安定性、pH至適性等において異なるポリペプチドの変異体を合成することに関心がある。配列番号：１の一部をコードするポリペプチド、例えばそのサブ配列に基づいて、及び／又はその核酸配列によりコードされるポリペプチドの他のアミノ酸配列を生じさせないが、その酵素の生産を意図する宿主生物のコドン利用に相当する置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を生じさせ得るヌクレオチド置換の導入により、作製することができる。ヌクレオチド置換の一般的記載については、例えばFordら（1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107）を参照のこと。
これらの置換は、その分子の機能に重大な領域の外側で行うことができ、なお活性ポリペプチドを生じ得ることは当業者に明らかであろう。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に本質的であり、それゆえ好ましくは置換にかけられないアミノ酸残基は、当該技術で周知である手順、例えば部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発に従って同定することができる（例えばCunningham及びWells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照のこと）。後者の技術において、変異は、分子内の各々の正電荷の残基において導入され、結果として生じた変異分子は、分子の活性に重大であるアミノ酸残基を同定するためフィターゼ活性についてテストされる。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又はホトアフィニティーラベリングのような技術により決定される三次元構造の分析によっても決定することができる（例えば、de Vosら（1992, Science 255, 306-312）; Smithら（1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904）; Wlodaverら（1992, FEBS Letter 309, 59-64）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドは、他のポリペプチドがポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端において融合した、融合ポリペプチド又は開裂性融合ポリペプチドも含む。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、本発明の核酸配列（又はその一部）に融合させることによって生産される。融合ポリペプチドを生産するための技術は当該技術において周知であり、それらが枠内にあり、その融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード化配列を連結することを含む。
本発明は、配列番号：１に記載の核酸配列又はその相補鎖と中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと同じ条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされるフィターゼ活性を有する単離されたポリペプチドにも関する（Sambrookら、1989、前掲）。ハイブリダイゼーションは、類似している核酸配列が、標準条件下で配列番号：１に示される核酸配列の部分をコードするポリペプチドに相当するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを示す。
先に開示したように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列又はその部分的アミノ酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブをデザインするのに用いることができ、又は本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、例えば配列番号：１に記載の核酸配列、又はそのサブ配列も、いずれかの属又は種の相同遺伝子を単離するため、プローブとして用いることができる。
核酸構成物
本発明は、調節配列に適合する条件下で適切な宿主細胞内でコード化配列の発現を指示することができる１又は複数の調節配列に作用的に結合した本発明の核酸配列を含む核酸構成物にも関する。
“核酸構成物”とは、天然の遺伝子から単離され、又はさもなければ天然に存在しないであろう様式で組み合わされ、並置された核酸のセグメントを含むように改変されている一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。核酸構成物という用語は、その核酸構成物が本発明のコード化配列の発現のために要求される全ての調節配列を含む場合、発現カセットという用語と類義語である。本明細書に定義される用語“コード化配列”とは、上述の調節配列の制御下におかれた場合に、mRNAに転写され、本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コード化配列の境界は、一般に、５′末端におけ翻訳開始コドンATG及び３′末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード化配列は、これらに限られないが、DNA, cDNA、及び組換え核酸配列を含み得る。
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、そのポリペプチドの発現を供するための種々の方法において操作され得る。ベクターへの挿入の前のポリペプチドをコードする核酸配列の操作が、発現ベクターによっては要求され又は必要とされ得る。クローニング技術を利用する核酸配列を改変するための技術は当該技術において公知である。
用語“調節配列”とは、核酸配列のコード化配列の発現のために必要であり又はそのために有利である全ての構成物を含むように本明細書で定義される。各々の調節配列はそのポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。このような調節配列は、これらに限られないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを含む。最小限、調節配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。調節配列にはポリペプチドをコードする核酸配列のコード化領域と共に、調節配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーが供され得る。
調節配列は、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列である適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異され、トランケートされ、及びハイブリッドのプロモーターを含む選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そして宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
本発明の核酸構成物の転写を、特にバクテリア宿主細胞内で促進するための適切なプロモーターの例は、大腸菌lacオペロン、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）アガロース遺伝子（dagA）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）xylA及びxylB遺伝子、並びに原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroffら、1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75: 3727-3731）並びにtacプロモーター（DeBoerら、1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 21-25）から得られるプロモーターである。更なるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria”（Scientific American, 1980, 242: 74-94）及びSambrookら（1989、前掲）を参照のこと。
糸状菌宿主細胞内で本発明の核酸構成物の転写を促進するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリホスリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（引用により本明細書に組み込まれる米国特許第4,288,627号に記載）から得られるプロモーター、並びにそれらの変異され、トランケートされ、及びハイブリッドのプロモーターである。糸状菌宿主細胞に用いるための特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi（アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリホスリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びglaAプロモーターである。
イースト宿主において、役立つプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）、サッカロマイセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2／GAP）、及びサッカロマイセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。イースト宿主細胞のための他の役立つプロモーターはRomanosら（1992, Yeast 8: 423-488）に記載される。哺乳動物宿主細胞において、役立つプロモーターは、Simian Virus 40（SV40）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス及びウシパピローマウイルス（BPV）からのプロモーターのようなウイルスプロモーターを含む。
調節配列は、転写を終了させるために宿主細胞により認識される配列である適切な転写ターミネーター配列でもあり得る。そのターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用的に結合される。選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかのターミネーターを本発明に用いることができる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
イースト宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエシトクロムＣ（CYC1）、又はサッカロマイセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。イースト宿主細胞のための他の役立つターミネーターは、Romanosら（1992、前掲）に記載される。哺乳動物宿主細胞についてのターミネーター配列は、当該技術で公知である。
調節配列は、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域である適切なリーダー配列でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用的に結合される。選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかのリーダー配列を本発明に用いることができる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリホスホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
イースト宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシアエエノラーゼ（ENO-1）遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエα−因子及びサッカロマイセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2／GAP）から得られる。
調節配列は、核酸配列の３′末端に作用的に結合し、転写された時、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を加えるためのシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列でもあり得る。選択された宿主細胞内で機能するいずれかのポリアデニル化配列を本発明に用いることができる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼから得られる。
イースト宿主細胞のための役立つポリアデニル化配列は、Guo及びSherman（1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990）に記載される。哺乳動物宿主細胞についてのポリアデニル化配列は、当該技術で公知である。
調節配列は、細胞の分泌経路に、発現されたポリペプチドを導くことができるポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード化領域でもあり得る。核酸配列のコード化配列の５′端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード化領域のセグメントに翻訳読み枠内に天然に連結しているシグナルペプチドコード化領域を本来的に含み得る。あるいは、コード化配列の５′端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード化配列の部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード化領域を含み得る。コード化領域が通常に、シグナルペプチドコード化領域を含まない場合、外来シグナルペプチドコード化領域が必要とされ得る。あるいは、コード化配列に通常関連する天然のシグナルペプチドコード化領域に対してフィターゼの分泌を増強させるために、外来シグナルペプチドコード化領域は、天然のシグナルペプチドコード化領域を簡単に置換し得る。シグナルペプチドコード化領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、リゾムコール種からのリパーゼもしくはプロティナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バチルス種からのアミラーゼもしくはプロテアーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。しかしながら、選択された宿主細胞の分泌経路に、発現されたフィターゼを導くことができるいずれかのシグナルペプチドコード化領域を本発明に用いることができる。
バクテリア宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード化領域は、バチルスNCIB 11837からのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・ステアロサーモフィルスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスサブチリシン遺伝子、バチルス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ遺伝子、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ遺伝子（nprT, nprS, nprM）、及びバチルス・サブチリスPrsA遺伝子から得られるシグナルペプチドコード化領域である。更なるシグナルペプチドはSimonen及びPalva（1993, Microbiological Reviews 57: 109-137）に記載される。
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード化領域は、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、又はリゾムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子からのシグナルペプチドコード化領域である。
イースト宿主細胞のための役立つシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシアエα−因子及びサッカロマイセス・セレビシアエインベルターゼのための遺伝子から得られる。他の役立つシグナルペプチドコード化領域は、Romanosら（1992、前掲）に記載される。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード化領域でもあり得る。結果として生ずるポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド（又は特定の場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード化領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ遺伝子（nprT）、サッカロマイセス・セレビシアエα−因子遺伝子、又はマイセリオフドラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子（WO 95／33836）から得ることができる。
本発明の核酸構成物は、ポリペプチドの発現に有利である１又は複数の因子、例えばアクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかの因子を本発明に用いることができる。１又は複数のこれらの因子をコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずしも縦に並ぶ必要はない。
アクティベーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudlaら、1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai及びBuxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297）。アクティベーターをコードする核酸配列は、バチルス・ステアロサーモフィルスNprA（nprA）、サッカロマイセス・セレビシアエヘムアクティベータータンパク質１（hap1）、サッカロマイセス・セレビシアエガラクトース代謝タンパク質４（ga14）、及びアスペルギルス・ニジュランスアンモニア制御タンパク質（areA）をコードする遺伝子から得ることができる。更なる例について、Verdier（1990、前掲）及びMackenzieら（1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307）を参照のこと。
シャペロンは、ホールディング特性において他のポリペプチドを助けるタンパク質である（Hartlら., 1994, TIBS 19: 20-25 ; Bergeronら., 1994, TIBS 19: 124-128 ; Demolderら., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903 ; Gething及びSambrook, 1992, Nature 355: 33-45 ; Puig及びGilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771 ; Wang及びTsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157 ; Robinsonら., 1994, Bio／Technology 1: 381-384）。シャペロンをコードする核酸配列は、バチルス・サブチリスGroEタンパク質、アスペルギルス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロマイセス・セレビシアエBiP／GRP78、及びサッカロマイセス・セレビシアエHsp70をコードする遺伝子から得ることができる。更なる例について、Gething及びSambrook（1992、前掲）及びHartlら（1994、前掲）を参照のこと。
プロセッシングプロテアーゼは、成熟した生化学的に活性なポリペプチドを形成するようにプロペプチドを開裂するプロテアーゼである（Enderlin及びOgrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fullerら., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Juliusら., 1984, Cell 37: 1075-1089; Juliusら., 1983, Cell 32: 839-852）。プロセッシングプロテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロマイセス・セレビシアエジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエKex2、及びヤルロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）二塩基プロセッシングエンドプロテアーゼ（xpr6）から得ることができる。
宿主細胞の増殖に関するポリペプチドの発現の制御を許容する制御配列を加えることも要求され得る。制御システムの例は、制御化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応じて遺伝子の発現を行い又はそれを止めるものである。原核生物系における制御システムは、lac, tac、及びtrpオペレーターシステムを含むであろう。イーストにおいては、ADH2システム又はGAL1システムを用いることができる。糸状菌においてはTAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターを、制御配列として用いることができる。他の制御配列の例は、遺伝子増幅を許容するものである。真核生物系において、これらは、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は制御配列に作用的に結合されるであろう。
発現ベクター
本発明は、本発明の核酸配列、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。上述の種々の核酸及び調節配列を一緒に連結して、その部位においてポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を許容するための１又は複数の便利な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを生産することができる。あるいは、本発明の核酸配列は、その核酸配列又はその配列を含む核酸構成物を発現のための適切なベクターに挿入することにより、発現することができる。発現ベクターを作り出すことにおいて、コード化配列は、そのコード化配列が発現及びおそらく分泌のための適切な調節配列に作用的に結合されるようにベクター内に位置する。
組換え発現ベクターは、便利には組換えDNA手順にかけ、核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（例えばプラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性によるであろう。ベクターは、直鎖又は閉環プラスミドであり得る。ベクターは、自己複製ベクター、即ちその複製が染色体の複製と独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロソーム、又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入した時、ゲノム内に組み込まれ、組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム内に導入されるべき全てのDNAを一緒に含む、単一ベクターもしくはプラスミドもしくは２もしくはそれ超のベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンであり得る。
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の選択を容易にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、及び栄養要求体からの栄養摂取を供する遺伝子である。バクテリアの選択マーカーの例は、バチルス・サブチリスもしくはバチルス・ソケニホルミスからのdal遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を与えるマーカーである。頻繁に用いられる哺乳動物マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である。イースト宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1、及びURA3である。糸状菌宿主細胞に用いるための選択マーカーは、これらに限られないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、sC（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、trpC（アントラニレートシンターゼ）、及びグルホシネート耐性マーカー、並びに他の種からの等価物を含む群から選択することができる。アスペルギルス細胞に用いるのに好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子並びにストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子である。更に、例えば選択マーカーが別個のベクター上にあるWO 91／17243に記載されるように、同時形質転換によって選択を行うことができる。
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノム内へのベクターの安定な組込み又は細胞のゲノムと独立した細胞内でのベクターの複製を許容する要素を含む。
本発明のベクターは、宿主細胞内に導入した時に宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得る。組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は相同的もしくは非相同的組換えによるゲノム内へのベクターの安定な一体化のためのベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノム内への相同的組換えにより組込みを行うための更なる核酸配列を含み得る。その更なる核酸配列は、ベクターが、染色体内の正確な位置で宿主細胞ゲノム内に組み込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの可能性を増加させるために、組込み要素は、好ましくは、相同的組換えの可能性を増強するために対応する標的配列と高い相同性の十分な数の核酸、例えば100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対を含む。組込み要素は、宿主細胞のゲノム内の標的細胞と相同性のあるいずれかの配列であり得る。更に、組込み要素は、非コード化又はコード化核酸配列であり得る。他方、ベクターは非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム内に組み込むことができる。これらの核酸配列は宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性のあるいずれかの配列であり得、更に非コード化又はコード化配列であり得る。
自己複製のためにベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞内で自分で複製するのを可能にする複製の源を更に含み得る。複製のバクテリア源の例は、大腸菌内で複製を許容するpBR322, pUC19, PACYC177、及びpACYC184、並びにバチルス内で複製を許容するpUB110, pE194, pTA1060及びpAMβ1である。イースト宿主細胞内で用いるための複製の源の例は、複製の２ミクロン源、ARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組合せ、並びにARS4及びCEN6の組合せである。複製の源は、宿主細胞内でその機能発生を温度センシティブにする変異を有するものであり得る（例えばEhrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433）。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の１超の複製は、核酸配列の発現を増幅するために宿主細胞内に挿入することができる。核酸配列の安定な増幅は、その配列の少くとも１の更なる複製を、宿主細胞ゲノム内に当該技術で公知である方法を用いて組み込み、そして形質転換について選択することにより得ることができる。
本発明の組換え発現ベクターを作製するために上述の要素を連結するのに用いられる手順は当業者に公知である（例えばSambrookら、1989、前掲を参照のこと）。
宿主細胞
本発明は、ポリペプチドの組換え生産に有利に用いられる本発明の核酸配列を含む組換え宿主細胞にも関する。用語“宿主細胞”には、複製の間におこる変異により親細胞と同一でない親細胞のいずれの子孫も含む。
その細胞は、好ましくは、本発明の核酸配列を含むベクターで形質転換し、次に宿主染色体内へのベクターの組込みが行われる。“形質転換”とは、ベクターが染色体組込み体として又は自己複製性染色体外ベクターとして維持されるように、本発明の核酸配列を含むベクターを宿主細胞内に導入することを意味する。組込みは、一般に、核酸配列が細胞内により安定に維持されるようであるので有利であると考えられる。ベクターの宿主染色体への組込みは、上述の相同的又は非相同的組換えによりおこり得る。
宿主細胞の選択は、かなりの程度、ペプチドをコードする遺伝子及びそのソースに依存する。宿主細胞は、単細胞、例えば原核生物、又は非単細胞微生物、例えば真核生物であり得る。役立つ単細胞の細胞は、バクテリア細胞、例えばグラム陽性バクテリア、例えばこれらに限られないが、バチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアキュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウトウス（Bacillus lautus）、バチルス・レントウス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）；又はストレプトマイセス（Streptomyces）細胞、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）もしくはストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）、又はグラム陰性バクテリア、例えば大腸菌及びシュードモナス（Pseudomonas）種である。好ましい実施形態において、バクテリア宿主細胞は、バチルス・レントウス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス又はバチルス・サブチリス細胞である。バクテリア宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えばChang及びCohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115を参照のこと）により、コンピテント細胞（例えば、Young及びSpizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829、又はDubnau及びDavidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221を参照のこと）を用いることにより、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa及びDower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のことにより）、又はコンジュゲーション（例えばKoehler及びThorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと）により行うことができる。
宿主細胞は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞であり得る。役立つ哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎臓（BHK）細胞、COS細胞、又は例えばAmerican Type Culture Collectionから利用できるいずれかの数の他の不朽化細胞を含む。
好ましい実施形態において、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書に用いられる“真菌”には、（Hawksworthら（In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK）により定義される）アスコマイコタ（Ascomycota）、バシジオマイコタ（Basidiomycota）、キトリジオマイコタ（Chytridiomycota）、及びザイゴマイコタ（Zygomycota）門並びに（Hawksworthら、1995、前掲、ページ171に言及される）オオマイコタ（Oomycota）及び全ての栄養胞子性真菌（Hawksworthら、1995、前掲）を含む。アスコマイコタの代表的な群は、例えばニューロスポラ（Neurospora）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）（＝ペニシリウム（Penicillium））、エメリセラ（Emericella）（＝アスペルギルス（Aspergillus））、ユーロチウム（Eurotium）（＝アスペルギルス（Aspergillus））、及び以下に列記される真性イーストを含む。バシジオマイコタの例は、キノコ、サビ菌、黒穂病菌を含む。キトリジオマイコタの代表的群は、例えばアルロマイセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Blastocladiella）、コエロモマイセス（Coelomomyces）、及び水生真菌を含む。オオマイコタの代表的群は、例えばサプロレグニオマイセス（Saprolegniomycetous）水生真菌（ミズカビ）、例えばアキリア（Achlya）を含む。栄養胞子性真菌の例は、アスペルギルス、ペニシリウム（Penicillium）、カンジダ（Candida）、及びアルテルナリア（Alternaria）を含む。ザイゴマイコタの代表的群は、例えばリゾプス（Rhizopus）及びムコル（Mucor）を含む。
好ましい実施形態において、真菌宿主細胞はイースト細胞である。本明細書に用いる“イースト”には、子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子胞子酵母、及び真菌インパーフェクチ（Fungi Imperfecti）（Blastomycetes）に属する酵母を含む。子嚢胞子酵母はスペルモフトラセアエ（Spermophthoraceae）及びサッカロマイセタセアエ（Saccharomycetaceae）科に分けられる。後者は４つの亜科、スキゾサッカロマイコイデアエ（Schizosaccharomycoidae）（例えばスキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属）、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae）、リポマイコイデアエ（Lipomycoideae）、及びサッカロマイコイデアエ（Saccharomycoideae）（例えばピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）及びサッカロマイセス（Saccharomyces）属）に分けられる。担子胞子酵母、ロイコスポリシウム（Leucosporidim）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、スポリジオボルス（Sporidiobolus）、フィロバシジウム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ（Filobasidiella）属を含む。真菌インパーフェクチに属するイーストは２つの科、スポロボロマイセタセアエ（Sporobolomycetaceae）（例えばソロボロマイセス（Sorobolomyces）及びブルレラ（Bullera）及びクリプトコッカセアエ（Cryptococcaceae）（例えばカンジダ属）に分けられる。イーストの分類はその特徴において変化し得るので、本発明の目的のため、イーストは、Biology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9, 1980）に記載されるように定義される。イーストの生物学及びイースト遺伝子の操作は当該技術で公知である（例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., 及びStopani, A.O.M., editors, 2nd edition, 1987: The Yeasts, Rose, A.H., and Harrison, J.S., editors, 2nd edition, 1987;及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editors, 1981を参照のこと）。
より好ましい実施形態において、イースト宿主細胞はカンジダ、クルイベロマイセス、サッカロマイセス、スキゾサッカロマイセス、ピキア、又はヤルロビア（Yarrowia）の種の細胞である。
最も好ましい実施形態において、イースト宿主細胞は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergenisi）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）又はサッカロマイセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、イースト宿主細胞はクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactrs）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、イースト宿主細胞は、サルロピア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
好ましい実施形態において、真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”には、下位区分ユーマイコタ（Eumycota）及びオオマイコタ（Oomycota）（Hawksworthら、1995、前掲による定義）に分けられる。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合ポリサッカライドから構成される菌糸壁を特徴とする。生長は、菌糸の伸長により、炭素代謝は偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシアエのようなイーストによる生長は、単細胞葉状体の発芽により、炭素代謝は発酵による。より好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、これらに限られないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、及びトリコデルマ（Trichoderma）の種の細胞である。
更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はヒュミコラ細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はムコル細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はマイセリオフトラ細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はチエラビア細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞である。他の更により好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ細胞である。
最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ホエチドウス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウエルレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、又はフサリウム・ベネナトウム（Fusarium venenatum）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はマイセリオフトラ・サーモフィルム（Myceliophthora thermophilum）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）細胞である。他の最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、チェラビア・テルレストリス（Thielavia terrestris）である。他の最も好ましい実施形態において、トリコデルマ細胞は、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンジイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアトウム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及びそれ自体周知の方法における細胞壁の再生に関する方法により形質転換することができる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、EP 238023及びYeltonら（1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474）に記載される。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、Malardierら（1989, Gene 78: 147-156）又は同時係属の米国通し番号08／269,449に記載される。イーストは、Becker及びGuarente（In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York）; Itoら（1983, Journal of Bacteriology 153: 163）;及びHinnenら（1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920）により記載される手順を用いて形質転換することができる。哺乳動物細胞は、Graham及びVan der Eb（1978, Virology 52: 546）のリン酸カルシウム沈殿法を用いて直接的取込みにより形質転換することができる。
生産の方法
本発明は、（ａ）サーモマイセス株を培養してポリペプチドを含む上清を生産し；そして（ｂ）そのポリペプチドを回収することを含む本発明のポリペプチドを生産する方法にも関する。
本発明は、（ａ）ポリペプチドの発現に資する条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）そのポリペプチドを回収することを含む本発明のポリペプチドを生産するための方法にも関する。
両方の方法において、細胞は、当該技術で周知の方法を用いてポリペプチドの生産のために適した栄養培地内で培養される。例えば、細胞は、振とうフラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェド−バッチ、又は固状発酵を含む）により、研究室又は工業発酵槽内で培養することができ、適切な培地中でポリペプチドが発現され及び／又は単離されるのを許容する条件下で行うことができる。培養は、当該技術で周知である手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で行われる（例えばバクテリア及びイーストについての文献：Bennett, J.W. 及びLaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。適切な培養は市販の供給元から利用でき、又は公開された組成に従って調製することができる（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地内に分泌されるなら、ポリペプチドはその培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、それは細胞ライゼートから回収される。
ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的である当該技術で周知である方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消滅を含み得る。例えば、ポリペプチドの活性を決定するために酵素アッセイを用いることができる。フィターゼ活性を決定するための手順は当該技術で周知であり例えばフィチン酸から遊離された無機リン酸塩のアッセイを含む。
結果として生ずるポリペプチドは、当該技術で周知である方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限られないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、又は沈殿を含む慣用的な手順により栄養培地から回収することができる。次にその回収されたポリペプチドは、種々のクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により更に精製することができる。
本発明のポリペプチドは、当該技術で周知である種々の手順、例えばこれらに限られないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動（IEF）、溶解度の差（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出により精製することができる（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）。
ポリペプチド組成物
なお更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドが豊富化されたポリペプチド組成物に関する。本文脈において、用語“豊富”とは、ポリペプチド組成物のフィターゼ活性が、便利には本発明のポリペプチドの添加により、例えば1.1の濃縮率で増加されることを示すことを意図する。
ポリペプチド組成物は、主要酵素構成物として本発明のポリペプチドを含むもの、例えば単一構成物ポリペプチド組成物であり得る。あるいは、本組成物は、多重の酵素活性、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチノ分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はキシラナーゼを含み得る。更なる酵素は、アスペルギルス属、好ましくはアスペルギルス・アクレアトウス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニゲル、もしくはアスペルギルス・オリザエ、又はトリコデルマ、ヒュミコラ、好ましくはヒュミコラ・インソレンス、又はフサリウム、好ましくはフサリウム・セレアリス、フサリウム・クロックウエルレンセ、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・オキシスポルム、フサリウム・サンブシヌム、フサリウム・スルフレウム、もしくはフサリウム・ベネナトリウムに属する微生物により生産され得る。
ポリペプチド組成物は当該技術で周知の方法に従って調製することができ、液体又は乾燥組成物の形態であり得る。組成物内に含まれるポリペプチドは、当該技術で周知の方法に従って安定化することができる。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例を以下に示す。本発明のポリペプチド組成物の投与量及び組成物が用いられる他の条件は、当該技術で周知の方法に基づいて決定することができる。
使  用
本発明は、広くは、フィテート又はフィチン酸からの無機リン酸塩の遊離を触媒するための本発明のポリペプチドの使用にも関する。
より詳しくは、ポリペプチドは、そのフィターゼが消化性を改善し、成長を促進し、並びに食物及び飼料利用性又はその転化効率を改善するヒト食物もしくは動物食物組成物に、又はこれら調製物のための添加物として用いることができる。
“飼料組成物”及び“食物組成物”は、各々動物及びヒトにより、食べられ、取り入れられ、消化されることを意図し又はそれに適したいずれかの天然又は人工の食物、食事等又はこれら食物の構成物を意味する。
“食物又は飼料添加物”は、食物又は飼料に加えることを意図し、又はそれに適した本質的に純粋な化合物又は多重構成組成物である。それは、通常、１又は複数の化合物、例えばビタミン、ミネラル又は飼料増強酵素並びに適切な担体及び／又は賦形剤を含み、それは通常、動物の飼料に加えられるのに適した形態で供される。
本発明は、それゆえ本発明のポリペプチドを含む飼料及び食物組成物並びに添加物にも関する。
食物又は飼料内の本ポリペプチドの有効量は、約10〜20,000；好ましくは約10〜15,000、より好ましくは約10〜10,000、特に約100〜5,000、特に約100〜約2,000Ｕ／kg食物又は飼料である。
本発明は、有効量の本発明のポリペプチドを含む飼料を動物に与えることを含む動物肥料内のフィテート（フィチン酸塩）レベルを減少させるための方法にも関する。
また、食物又は飼料調製物又は添加物の調製の間の本発明のポリペプチドの使用は本発明の範囲内である。即ち、ポリペプチドは、その製造の間にのみフィターゼ活性を発揮し、最終食物又は飼料製品内で活性でない。この態様は、例えばベーキングに関連する。
本発明は、デンプンを液化するための方法におけるポリペプチドの使用であって、（ａ）液化する前又はそれと同時に請求項１のポリペプチドで処理し；（ｂ）そのデンプンにα−アミラーゼを加え；そして（ｃ）デンプンを液化するのに有効な時間及び温度において、ステップ（ｂ）のデンプンを反応させることを含む使用にも関する。
本発明は、この酵素を発現又は生産するように、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列で形質転換されているトランスジェニック植物並びに植物種子及び植物細胞のような植物の一部にも関する。本発明は、特に飼料及び食物又は添加物としてのこれら植物及び植物の一部の組成物及び使用にも関する。
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物、略してdicot又はmonocotであり得る。潜在的な食物又は飼料構成物であり、フィチン酸を含む植物に主に関心がある。飼料構成物の正常なフィチン酸レベルは0.1〜100ｇ／kg、又はより通常は0.5〜50ｇ／kg、最も通常は0.5〜20ｇ／kgである。単子葉植物の例は草、例えばmeadow grass（blue grass, Poa）、飼草、例えばフェスツカ（festuca）、ロリウム（lolium）、温帯性の草、例えばアグロスチス（Agrostis）及び穀類、例えばコムギ、オート、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ及びトウモロコシ（コーン）である。
双子葉植物の例は、マメ類、例えばルビナス、エンドウ、マメ及び大豆、並びにアブラナ科（Brassicaceae科）、例えばカリフラワー、脂肪種子ナタネ及び密接に関連したモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）である。
これらのトランスジェニック植物、枯物の一部及び植物細胞は、それら自体のフィチン酸を分解することができ、従って、これらの酵素をこれら植物を含む食物又は飼料に加えるための必要性が緩和される。好ましくは、植物及び植物の一部、例えば種子は粉砕又は製粉され、おそらく、酵素分解の速度を実際の使用に適合させる観点で、食物もしくは飼料に添加する前又は使用例えば取り込み前に浸漬される。
必要に応じて、植物生産ポリペプチドは、植物からも回収することができる。特定の場合、植物からの回収は、潜在的な後のペレット化過程において熱に安定な形成を安全にする観点において好ましい。
植物の一部の例は、幹、カルス、葉、根、果実、種子、塊茎等である。しかし、いずれの植物組織もこの定義に含まれる。
本発明は、これら植物の子孫、植物の一部及び植物細胞にも関する。
当業者は、問題の植物内への挿入のためのDNA発現構成物をいかに作製するか、特に組織特異的方法で酵素が排出されるか否かを知っているであろう。この評価に関連性があるのは植物の発現区画内のフィターゼの安定性（pH安定性、内在性プロテアーゼによる分解性等）である。必要に応じてプロモーター及びターミネーター配列、並びにシグナル又はトランジット配列のような適切な調節配列を選択することもできよう（Tagueら、1998, Plant Phys. 86: 506）。
植物、植物の一部及び植物細胞に、いずれかの周知の方法を用いてDNA構成物を形質転換することができる。これらの方法の例は、本発明のフィターゼをコードする遺伝子を含むように遺伝子的に処理されたアグロバクテリウム属のバクテリア種のようなウイルス又はバクテリアベクターによる形質転換である。更に、植物細胞又は植物組織内にフィターゼDNAを直接導入する方法、例えばマイクロインジェクション及びエレクトロポレーション（Gasserら、Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio／Techn. 8: 535; Shimamotoら、1989, Nature 338: 274）は当該技術で周知である。
形質転換の後、その形質転換体は、当業者に周知であるいずれかの方法を用いてスクリーニングされ、次にそれらは完全な植物に再生される。
これらの植物、植物の一部及び植物細胞並びにそれらの子孫は、それらの遺伝子の一部としてフィターゼコード化DNAを有する。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介遺伝子転移はトランスジェニック双子葉植物について選択する方法である（報告についてHooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15〜38を参照のこと）。宿主範囲の制限のため、Ａ．ツメファシエンスの助けで単子葉植物を形質転換することは一般に可能でない。ここで、他の方法を用いなければならない。トランスジェニック単子葉植物を作り出すための選択の方法は、胚のカルス又は発達中の胚の粒子ボンバードメント（形質転換DNAでコートされた微小金又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr.Opin Biotechnol. 5: 158〜162; Vasilら., 1992, Bio／Technology 10: 667-674）。
また、遊離DNAのこれらの植物へのデリバリーのための他のシステム、例えばウイルスベクター（Joshi & Joshi, 1991. FEBS Lett. 281: 1-8）、ポリエチレングリコール又はエレクトロポレーションでのプロトプラスト形質転換（報告について、Potyrkus, 1991, Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 42: 205-225を参照のこと）、DNAの葉肉プロトプラストへのマイクロインジェクション（Crosswayら、1986, Mol.Gen.Cenet. 202: 79-85）、及びDNAの、穀類植物の若い花の若木へのマイクロインジェクション（de la Penaら、1987, Nature 325: 274-276）が好ましい方法である。
一般に、本発明のフィターゼをコードするcDNA又は遺伝子は、標的植物内で活性な適切なプロモーター及び適切なターミネーター（転写の停止）からなる発現カセット（例えばPietrzakら、1986, Nucleic Acids Res. 14: 5857-5868）内に位置する。このカセット（もちろん、以下の通り適切な選択マーカーを含むもの）は粒子ボンバードメントにより電子葉植物の場合に植物自体に形質転換できるであろう。双子葉植物の場合、発現カセットはT-DNAボーダー及び適切な選択マーカーを供する適切なベクター内に最初におかれ、次にアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換される。双子葉植物は標準的プロトコル（例えばAkamaら、1992, Plant Cell Reports 12: 7-11）に従ってT-DNAにより隣接した発現カセット及び選択マーカーを有するアグロバクテリウムにより形質転換されよう。アグロバクテリウムの植物細胞へのT-DNAの転移は現在報告されている（Zupan & Zambryski, 1995, Plant Physiol. 107: 1041-1047）。アグロバクテリウムによる植物形質転換のためのベクターは市販されているか、又はこれらのベクターを作製する多くの研究室から得ることができる（例えばDeblaereら、1985, Nucleic Acids. Res. 13: 4777-4788；報告について、Kleeら、1987; Annu.Rev.Plant Physiol. 38: 467-486を参照のこと）。
利用できる植物プロモーター：操作下の過程により、器官−及び／又は細胞−特異的発現並びに適切な発達的及び環境的制御が必要とされ得る。例えば、トウモロコシ内乳等内ではフィターゼcDNAを発現させることが要求される。最も一般的に用いられるプロモーターは、構成的35S-CaMVプロモーター（Franckら、1980, Cell 21: 285-294）である。発現は完全な植物全体を通して多少等しいであろう。このプロモーターは除草剤及び病原体耐性植物を作り出すのに上手く用いられている（報告について、Stitt & Sonnewald, 1995, Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46: 341-368を参照のこと）。器官特異的プロモーターは、種子、ポテト塊茎、及び果実のような貯蔵シンク組織について（Edwards & Coruzzi, 1990, Annu.Rev.Genet. 24: 275-303）、及び分裂組織のような代謝シンク組織について（Itoら、1994, Plant.Mol.Biol. 24: 863-878）報告されている。
本発明は、食物又は飼料調製物又は添加物の調製の間の本発明のフィターゼの使用にも関する。即ちフィターゼは、その製造の間にのみそのフィターゼ活性を発揮し、最終食物又は飼料製品内では活性できない。この実施形態は、生地（ドー）作製及びベーキングに適用される。
本発明は、以下の実施例により更に記載されるが、これらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
実施例
実施例１：サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94ゲノムDNA抽出
サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94を、32℃及び250rpmで24時間、0.5％イースト抽出液−２％グルコース（YEG）培地25ml中で増殖させた。次にMiracloth（Calbiochem, La Jolla, CA）を通してのろ過により菌糸体を収集し、25mlの10mM Tris−１mM EDTA（TE）緩衝液で１回、洗った。その菌糸体から過剰な緩衝液を吸い取り、次にそれを液体窒素中で凍結した。その凍結した菌糸体を電気コーヒー粉砕機で細かい粉末に粉砕し、その粉末を、使い捨てプラスチック遠心管内の20mlのTE緩衝液及び５mlの20％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に加えた。その混合物を静かに数回、逆さにして確実に混合し、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１ｖ／ｖ／ｖ）で２回、抽出した。最終濃度0.3Ｍを供するように酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液）を加え、2.5容量の氷冷エタノールで核酸を沈殿させた。そのチューブを15,000×ｇで30分、遠心し、そのペレットを30分、空気乾燥させた後、0.5mlのTE緩衝液中に再懸濁した。DNaseを含まないリボヌクレアーゼＡを100μｇ／mlの濃度まで加え、その混合物を30分、37℃でインキュベートした。次にプロテインキナーゼＫ（200μｇ／ml）を加え、その混合物を37℃で更なる時間、インキュベートした。最後に、その混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１ｖ／ｖ／ｖ）で２回、抽出した後、酢酸ナトリウム及びエタノールでそのDNAを沈殿させた。そのDNAペレットを真空下で乾燥させ、TE緩衝液中に再度懸濁し、４℃に保存した。
実施例２：ゲノムDNAのハイブリダイゼーション分析
実施例１に記載されるように調製した全細胞DNAサンプルを、サザンハイブリダイゼーション（Maniatisら、1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York）により分析した。約５μｇのDNAサンプルをBamH Ｉ又はPstＩで消化し、１％アガロースゲル上で大きさにより分画した。そのゲルを短波長UV光下で写真にとり、0.5Ｍ NaOH−1.5Ｍ NaCl中に15分、次に１Ｍ Tris-HCl pH8−1.5Ｍ NaCl中に15分、浸漬した。そのゲル内のDNAを、Davisら（1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York）に従って、20×SSPE（３Ｍ塩化ナトリウム−0.2Ｍリン酸二塩基ナトリウム−0.02Ｍ EDTA二ナトリウム）中のキャピラリーブロッティングによりNYtranTMハイブリダイゼーション膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）上に移した。その膜を真空下で80℃で２時間、焼き、静かに撹拌しながら45℃で次のハイブリダイゼーション緩衝液：５×SSPE、25％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、0.3％ SDS、及び200μｇ／ml変性及びせん断サケ精巣DNA中に２時間、浸漬した。フィターゼ特異的プローブフラグメント（約1.6kb）をα〔32Ｐ〕dCTP（Amersham, Arlington Heights, IL）でのニックトランスレーションにより放射能標識し、緩衝液１ml当り約１×106cpmの活性でハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。その混合物を振とう水浴中45℃で一晩、その膜と共にインキュベートした。インキュベーションの後、その膜を45℃で0.1％ SDSを含む1.0×SSPEで１回、洗い、次に同じ温度で1.0×SSPE（SDSなし）で２回洗った。その膜を15分間、ペーパータオル上で乾燥させ、次にSaran-WrapTMで包み、補カスクリーン（Kodak, Rochester, NY）で−70℃で一晩、Ｘ線フィルムに露出した。
サザンブロッティングは、そのプローブが、図１に示すようにサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94からのフィターゼ遺伝子を同定及びクローン化するためにプローブとして用いることができることを示す。
実施例３：DNAライブラリー及びフィターゼクローンの同定
ゲノムDNAライブラリーを、組換えバクテリオファージ、及び個々のpzL1−フィターゼクローンの切出しのための大腸菌DH10Bzip（Life Technologies, Gaithersburg, MD）のプレーティング及び精製のための宿主としての大腸菌Y1090ZL細胞（Life Technologies, Gaithersburg, MD）と共にバクテリオファージクローニングベクターλZipLox（Lite Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて作製した。全細胞DNAをTsp509Iで部分的に消化し、１％アガロースゲル上でサイズ分画した。サイズ範囲３−７kbに移動するDNAフラグメントを切り出し、Prep-a-Gene試薬（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いてそのゲルから溶出したその溶出したDNAフラグメントをEcoR Ｉで開裂（脱リン酸化したλZipLoxベクターアーム（Life Technologies, Gaithersburg, MD）に連結し、そしてその連結混合物を市販のパッケージング抽出液（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてパッキングした。そのパッケージ化されたDNAライブラーをプレートし、大腸菌Y1090ZL細胞（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で増幅した。そのライブラリーからの約30,000のプラークを、実施例２に記載される放射能標識フィターゼプローブでのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。そのプローブに強くハイブリダイズする１つの陽性クローンを取り、大腸菌Y1090ZL細胞内で２回、精製した。次にフィターゼクローンをpZL1−フィターゼクローン（D’Alessioら、1992, Focus▲Ｒ▼ 14: 76）としてλZipLoxから切り出し、大腸菌DH5α（pMWR46）を作り出した。
実施例４：サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子のDNAスクリーニング
実施例３に記載されるpZL1−フィターゼクローン大腸菌DH5α（pMWR46）の制限地図作製を、標準的方法（Maniatisら、1982、前掲）を用いて行った。フィターゼクローンのDNA配列決定を、染料−ターミネーター化学でのプライマーウォーキング技術（Gieseckeら、1992, Journal of Virol.Methods 38: 47-60）を用いて、Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）で行った。lac−正及びlac−逆プライマーに加えて、製造元の説明に従って、Applied Biosystems Model 394 DNA／RNA Synthesizer（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）で特定のオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを合成した。
実施例５：サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子の特性
クローン化されたサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子（大腸菌DH5α−pMWR46）の部分のDNA配列決定は、アスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135フィターゼ遺伝子と相同性のあるオープンリーディングフレーム（配列番号：１）（図２）を証明した（図３）。
サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子内のイントロン及びエキソンの位置を、その予想されるアミノ酸配列の、対応するアスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135フィターゼ遺伝子産物の予想されるアミノ酸配列へのアライメントに基づいて割り当てた。この比較に基づいて、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子は、１つの小さなイントロン（56bp）により介在された２つのエキソン（47及び1377bp）から構成される。そのイントロンの大きさ及び組成は、他の真菌遺伝子のもの（Gurrら、1987, In Kinghorn, J.R.（ed.）, Gene Structure in Eukaryotic Microbes, pp 93-139, IRL Press, Oxford）と、全てがコンセンサススプライスドナー及びアクセプター配列並びに各々の介在配列の３′端近くのコンセンサスラリアット配列（PuCTPuAC）を含む点で一致する。
サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94遺伝子産物の予想されるアミノ酸配列を図２（配列番号：２）に示す。von Heijne（1984, Journal of Molecular Biology 173: 243-251）の規則に基づいて、サーモマイセス・ラヌギノスス遺伝子産物の最初の22アミノ酸は、発生しようとするポリペプチドを小胞体内に導く分泌シグナルペプチドを含むようである。成熟フィターゼは452アミノ酸から構成される酸性タンパク質（予想される導電点＝5.4）（MW＝51kDa）である。その予想されるアミノ酸配列は、他の周知の真菌フィターゼが共有する活性部位モチーフRHGXRXP（配列番号：２）を含む（Ullah及びDischinger, 1993, Biochem. Biophys.Res.Commun. 192: 754-759）。
成熟サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼの予想されるアミノ酸配列は、図３に示すように、アスペルギルス・ニゲル（フィクウム）NRRL 3135からのフィターゼと約47.5％同一性を有する（配列番号：３）。
実施例６：他の真菌からのゲノムDNAを用いるクロスハイブリダイゼーション研究
クローン化したサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子を、種々の真菌属からのゲノムDNAサンプルでのサザンハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして用いた。サザンブロットを、低ストリンジェンシー（25％ホルムアミド、５×SSPE、0.3％ SDS、42℃）及び中ストリンジェンシー（35％ホルムアミド、５×SSPE、0.3％ SDS、42℃）の条件下でプローブした。ゲノムDNAサンプルを実施例１に概説されるプロトコルを用いて、次の種：コリナスクス・サーモフィルス（ATCC 22066）、フサリウム・グラミネアルム（ATCC 20334）、ヒュミコラ・グリセア変性サーモイデア（ATCC 16453）、ニューロスポラ・クラッサ（FGSC 987）、ボトリティス・シネレア（ATCC 11542）、クルブラリア・ベルルクロサ（CBS 147.63）、リゾクトニア・ソラニ（IMI 358730）、トリコデルマ・ハルジアヌム（CBS 819.68）、アブシジア・スポロホラーバリアビリス（ATCC 36019）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（CBS 117.65）、及びペニシリウム・ジベルスム（CBS 320.48）から単離した。各々のDNAサンプル（約５μｇ）をBamH Ｉで消化した後、１％アガロースゲル上で電気泳動を行った。そのDNAをZeta-Probeナイロン膜（BioRad Laboratories, Hercules, CA）にブロットし、phy1遺伝子を含むニックトランスレートしたDNAプローブでプローブした。そのブロットを42℃で２×SSPE±0.1％ SDSで洗った。
サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94からのフィターゼ遺伝子をいくつかの他の真菌種中の有望なフィターゼ遺伝子配列とクロスハイブリダイズさせた（表１）。低ストリンジェンシーの条件下において、コリナスクス・サーモフィルス、フサリウム・グラミネアルム、ヒュミコラ・グリセア変性サーモイデア、ニューロスポラ・クラッサ、及びもちろんサーモマイセス・ラヌギノサからのDNAにおいて強いハイブリダイゼーションシグナルが現れた。ボトリティス・シネレア、クルブラリア・ベルルクロサ、リゾクトニア・ソラニ及びトリコデルマ・ハルジアヌムにおいてはもっと弱いシグナルが検出された。アブシジア・スポロホラーバリアビリス、マイセリオフトラ・サーモフィラ、又はペニシリウム・ジベルスムにおいてはハイブリダイゼーションは検出されなかった。中ストリンジェンシーを用いて、コリナスクス・サーモフィルス、フサリウム・グラミネアルム、及びサーモマイセス・ラヌギノサでのみ強いハイブリダイゼーションシグナルが見られた。ヒュミコラ・グリセア変性サーモイデア及びニューロスポラ・クラッサからのDNAで弱いハイブリダイゼーションが観察された。これらのデータは、サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子は、他の糸状菌からのフィターゼ遺伝子をクローン化するためにプローブとして用いることができることを示す。
0004125375.tif 000005
実施例７：フィターゼ発現ベクターpMWR48の作製
次の２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー：
0004125375.tif 000006
を、フサリウム宿主内でのサブクローニング及び発現のためのプラスミドpMWR46（大腸菌DH5α−pMWR46）からのサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子コード化配列をPCR増幅するためにデザインした。センスプライマーを最初の枠内ATGにデザインし、14bp下流に広げた。アンチセンスプライマーを翻訳停止コドンの14bp上流の領域にデザインし、終止コドンまで広げた。
その遺伝子フラグメントのpDM181（図４）で示される発現ベクターへのサブクローニングを容易にするために、SwaＩ及びPacＩ制限酵素部位を各々フィターゼ遺伝子の５′及び３′端に導入した、ベクターpDM181は、調節配列としてフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼプロモーター及びターミネーター（WO 96／00787）を含んでいる。そのプラスミドは、真菌の形質転換の選択マーカーとしてbar遺伝子も含んでいる（de Blockら、1987, EMBO Journal 6: 2513-2518）。
上述のプライマー各々100ピコモルを、52ngのpEJG13、１×Pwo緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、各々１mMのdATP, dTTP, dGTP及びdCTP、並びに2.5ユニットのPwoＩ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含むPCR反応に用いた。増幅条件は、94℃で２分、50℃で30秒、及び72℃で１分の１サイクル；各々94℃で15秒、50℃で30秒、及び72℃で１分の９サイクル；各々94℃で15秒、55℃で30秒、及び72℃で１分＋各々の追加サイクルについて20秒の15サイクル；94℃で15秒、55℃で30秒、及び72℃で７分の１サイクル；並びに４℃での浸漬サイクルである。この増幅された2866bp DNAフラグメントをゲル電気泳動により精製し、制限エンドヌクレアーゼSwaＩ及びPacＩで（製造元により特定される条件を用いて）切断した。その切断したフラグメントを、先にSwaＩ及びPacＩで切断されているpDM181（図４）にクローン化し、フィターゼ遺伝子の転写がフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼプロモーターの制限下である発現プラスミドpMWR48（図５）を作り出した。プラスミドpMWR48を大腸菌DH5α細胞に形質転換した。pMWR48プラスミドを含む大腸菌形質転換体を単離し、Sambrookら（1989、前掲）に記載される手順に従ってプラスミドDNAを調製した。
実施例８：フサリウムCC1-3の形質転換及び形質転換体の分析フサリウム株A315（ATCC 20334）の高度に枝分れした形態の変異体であるフサリウム株CC1-3（Wiebeら、1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebeら、1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebeら、1991, Mycological Research 96: 555-562）を、フォーゲルの（Vogel’s）塩（Vogel, 1964, Am.Nature 98: 435-446）、25mM NaNO3、及び1.5％グルコースを含む液体培地中で、28℃及び150rpmで４日間、増殖させた。４層のチーズクロス及び最後に１層のMiraclothを通すろ過により分生子を精製した。その分生子懸濁液を遠心により収集した。１％イースト抽出液、２％バクトトリプトン、及び２％グルコースから構成される50mlのYPG培地に約108の分生子を接種し、24℃及び150rpmで14時間、インキュベートした。結果として生じた菌糸を滅菌0.4μｍフィルター上にとり、滅菌蒸留水及び1.0Ｍ MgSO4で連続的に洗った。その菌糸を10mlのNOVOZYM 234TM溶液に再度懸濁し（1.0Ｍ MgSO4中２〜10mg／ml）、34℃で15〜30分、80rpmで撹拌しながら消化した。その結果生じたプロトプラスト懸濁液から、４層のチーズクロス及びMiraclothを通す連続的ろ過により未消化の菌糸材料を除去した。そのプロトプラスト溶液に１Ｍソルビトール20mlを組み合わせた。混合した後、そのプロトプラストを遠心によりペレット化し、20mlの１Ｍソルビトール中及び20mlのSTC（0.8Ｍソルビトール、0.05Ｍ Tris pH8.0、0.05Ｍ CaCl2）中での再懸濁及び遠心により連続的に洗った。その洗ったプロトプラストを４部のSTC及び１部のSPTC（0.8Ｍソルビトール、40％ PEG 4000、0.05Ｍ Tris pH8.0、0.05M CaCl2）中に、５×107／mlの濃度で再度懸濁した。100μｌのプロトプラストをポリプロピレンチューブ（17×100mm）中5μｇのpMWR48に加え、混合し、30分、インキュベートした。１mlのSPTCをプロトプラスト懸濁液中に静かに混合し、室温で20分、インキュベートを続けた。１×フォーゲル塩、25mM NaNO3、0.8Ｍスクロース及び１％低融解性アガロース（Sigma Chemical Company, St.Louis, MO）からなる12.5mlの（40℃に冷やした）溶解液をプロトプラストと混合し、次に空の100mmペトリ皿上にプレートした。10〜14日間、室温でインキュベーションを続けた。24時間の室温でのインキュベーションの後、12.5mlの同じ培地＋ml当り10mgのバスタ（basta）（Hoechst Schering, Rodovre, Denmark）をそのペトリ皿上に重層した。使用前に、バスタを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で２回、クロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で１回、抽出した。２週間後、17の形質転換体が出現した。各々の形質転換体の端からの菌糸体フラグメントを、フォーゲル塩／BASTA培地を含む24ウエルプレートの個々のウエルに移した。その培地は１ｌ当り25ｇのスクロース、25ｇのNoble寒天、20mlの50×フォーゲル塩（Vogel，1964、前掲）、25mM NaNO3、及び10ｇのバスタを含んでいる。そのプレートをプラスチックバッグ内に密閉して水分を維持し、室温で約１週間、インキュベートした。
実施例９：サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼ遺伝子の発現
実施例８に記載される17のフサリウムCC1-3形質転換体の各々からの菌糸体フラグメントを、１ｌ当り50ｇのマルトデキストリン、2.0ｇのMgSO4・7H2O、2.0ｇのKH2PO4、4.0ｇのクエン酸、8.0ｇのイースト抽出液、2.0ｇの尿素、及び0.5mlの微量金属溶液を含む20mlのM400Da培地に接種し、30℃及び150rpmで７日間、インキュベートした。その培地を５Ｎ NaOHでpH6.0に調節した。微量金属溶液は、リッター当り14.3ｇのZnSO4・7H2O、2.5ｇのCuSO4・5H2O、0.5ｇのNiCl2・6H2O、13.8ｇのFeSO4・7H2O、8.5ｇのMnSO4・H2O及び3.0ｇのクエン酸を含んでいる。対照として形質転換していない宿主でも行った。１mlの培養物上清を４，５、及び７日目に収集し、４℃で保存した。フィターゼ活性を以下の通り決定した。
サンプルを0.2Ｍクエン酸pH5.5緩衝液に希釈し、その希釈サンプル１mlを２つのテストチューブの各々に加えた。15％トリクロロ酢酸（TCA）２ミリリッターを１方のチューブに加え、他方のチューブは５分間、40℃でプレインキュベートした。次に0.2Ｍクエン酸pH5.5緩衝液中１％フィチン酸基質溶液１ミリリッターを両方のチューブに加えた。TCAを欠如するサンプルを30分、40℃でインイキュベートした。インキュベーション期間の終りに２mlのTCAを加え、そのサンプルを冷やした。次に100マイクロリッターの量の各々のサンプルを水で１mlに希釈し、50℃で５分、プレインキュベートした。６Ｎ硫酸：水：2.5％モリブデン酸アンモニウム：10％アスコルビン酸を１：２：１：１で含む試薬１ミリリッターを各々のサンプルに加え、そのサンプルを色の進展のため、更に15分、インキュベートした。結果として生じた色をMolecular Devices Thermomax Microplate Reader（Molecular Devices Sunnyvale, CA）で690nmで測定した。
最も高いフィターゼ活性を生産する一次形質転換体からの胞子を、リッター当り12.1ｇのNaNO3、50ｇのコハク酸、及び20mlの50×フォーゲル塩を含む培地20ml（pH6.0に調節）に菌糸体を接種し、２〜３日、振とうしながら30℃でインキュベートすることにより作り出した。150mlの胞子培養物を１×フォーゲル塩、25mM NaNO3、2.5％スクロース、２％ Noble寒天及び５mg／ml BASTAを含むマイクロマニュピュレータープレート上に広げ、マイクロマニピュレーターを用いて単一胞子をそのプレートの透明な領域に移すことにより単一胞子を単離した。室温での３日の成長の後、その発芽した胞子を５mg／ml BASTAを含む個々のフォーゲルプレートに移した。
pMWR48の17の一次形質転換体のうち14からの培養上清は、フィターゼ活性についてアッセイした時、陽性であった。形質転換体＃３及び＃５で示す２つの一次形質転換体を、フィターゼ活性に基づく単一胞子単離について選択した。９の単一胞子を得た。25mlのM400Da培地＋５mg／mlのBASTAを含む振とうフラスコに、各々の単一胞子単離物からの菌糸体チャンクを重複して接種し、30℃でインキュベートした。その培養培地の１mlアリコートを、接種後４，５、及び７日目に収集し、フィターゼ活性についてアッセイした。フィターゼアッセイの結果は、両方の一次形質転換体が活性を示すことを証明した。
実施例10：サーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼの生産
実施例９に記載される一次フサリウム形質転換体＃５を、リッター当り20ｇの大豆、20ｇのグルコース、10ｇのイースト抽出液、２ｇのMgSO4・7H2O、２ｇのKH2PO4、２ｇのクエン酸、３ｇのK2SO4、２ｇのCaCl2-2H2O、及び0.5mlの微量金属溶液から構成されるpH6.25の培地中に30℃で７日間、２つの２ｌ発酵槽中で培養し、リッター当り300ｇのグルコース、20ｇの（NH4）2HPO4及び１ｇのクエン酸から構成される培地を供した。発酵のために2.5％の接種物を用いた。その接種物を、リッター当り62.5ｇのNutriose、２ｇのMgSO4・7H2O、10ｇのKH2PO4、２ｇのK2SO4、２ｇのクエン酸、10ｇのイースト抽出液、２ｇの尿素、0.5ｇのCaCl2及び0.5mlの微量金属溶液pH6.0から構成される48〜72時間振とうフラスコ培養物であった。
全培養物ブイヨンを、ゴムバンドで４ｌビーカーの頂上に取り付けた二重層のMiraclothを用いてろ過した。そのろ液を回収し、次に−20℃で凍結した。
実施例11：組換えサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼの精製
実施例９に記載される凍結した無細胞ブイヨン（1700ml）を解凍し、10,000×ｇでの遠心により澄ませ、Amicon S1Y10フィルター（Amicon, Beverly, MA）を備えたAmicon中空ファイバーろ過ユニットで350mlの容量に濃縮した。そのサンプルをpH７に調節し、２mSの導電率まで希釈し、20mM Tris-Cl pH７緩衝液で予め平衡化した75mlベッド容量Pharmacia Q-Sepharose Big Beadsカラム（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）上に室温において充填した。そのカラムを、流れ出るＡ280がベースライン近くまで減少するまで、平衡緩衝液を用いて、分当り５mlの流速で溶出した。次にそのカラムを分当り５mlの流速で同じ緩衝液中０−0.6Ｍ NaClの600ml勾配で溶出した。フィターゼ酵素活性を、Molecular Devices Thermomax Microplate Readerを用いて、200μｌの反応容量で405nm及び30℃で0.2Ｍクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液中で10mMのp−ニトロフェニルホスフェートの加水分解速度を測定することにより決定した。その結合した酵素活性は、約0.2Ｍ NaClに相当する画分において溶出した。
その活性画分をプールし、Amicon PM-10膜（Amicon, Beverly, MA）での限外ろ過により25mlの容量に濃縮し、0.9mSの導電率に希釈し、そして20mM MOPS pH７緩衝液で予め平衡化したPharmacia Mono Q HR 10／16カラム（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）上に分当り４mlで充填した。そのカラムを80mlの平衡緩衝液、次に同じ緩衝液中０〜0.5ＭのNaClの400mlの勾配で溶出した。上述のp−ニトロフェニルホスフェートアッセイを用いて酵素活性を画分内に検出した。その活性画分も製造元の説明（Novex, San Diego, CA）に従ってNovox 10〜27％勾配SDS−ポリアクリルアミドゲルで分析し、電気泳動により実質的に精製されたと判断されたなら、その画分をプールした。
そのプールした画分を限外ろ過によりAmicon PM-10膜で濃縮し、20mM MES pH5.5緩衝液に交換した。そのサンプル導電率は1.1mSであった。このサンプルの３分の１を分当り１mlで、20mM MES pH5.5緩衝液で予め平衡化したPharmacia Mono SHR 5／5カラム（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）上に充填した。そのカラムを５mlの平衡緩衝液で、次に同緩衝液中０〜0.6M塩化ナトリウムの25ml直線勾配で溶出した。その活性画分を微量汚染物を含むものを除去するための電気泳動分析後にプールした。
その精製した組換えサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼは、約60,000ダルトンの分子量を有する単一構成物でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により均一であることが明らかになった。
実施例12：精製した組換えサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼの物理化学的特徴
全てのキャラクタリゼーションを、実施例11に記載される精製した組換えサーモマイセス・ラヌギノススCBS 586.94フィターゼで行った。Novo Nordisk A/S
0004125375.tif 000007
から得られたアスペギルス・ニゲル（フィクウム）の標準に注目して比較も行った。
等電点。サーモマイセス・フィターゼの等電点（pI）をアスペルギルス・ニゲルフィターゼと決定した。製造元の説明に従って、Novex pH３〜７ IEFゲル（Novex, San Diego, CA）で等電点電気泳動（IEF）を行った。Pharmacia（Pharmacia, Uppsala, Sweden）及びBioRad（BioRad Laboratories, Hercules, CA）の両方からのIEF標準を用いてゲルを較正した。
IEFは、サーモマイセスフィターゼは4.7〜5.2の範囲のpIで多重構成物を含んでおり、アスペルギルス・ニゲルフィターゼは4.8〜5.0のpIを有することが観察された。
アミノ末端配列分析。精製した組換えサーモマイセスフィターゼを、液相TFAデリバリー及びPTH−アミノ酸分離のためのオンラインHPLCと共に、製造元の説明に従って、Applied Biosystems Model 476A Sequencer（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）でアミノ末端タンパク質配列分析にかけた。サンプルをBiobreneTMコートしたTFAガラスファイバーフィルター（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）上にスポットし、直接配列決定した。
精製したフィターゼのアミノ末端配列分析は３つの構成物を示した。主な構成物（約60％）は、一次翻訳産物内の位置34のkey2開裂部位に相当するH2N-His-Pro-Asn-Val-Asp-Ile-Ala-Arg-His-Trp-Gly-Gln-Tyr-Ser-Pro-Phe-Phe-Ser-Leu-Ala（配列番号：２）である。少量の配列（約30％）H2N-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg-Val-Val-Pro-Leu-His-Gly（配列番号：２）及び（約10％）H2N-Ser-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Glu-Asp-Glu-Pro-Phe-Val-Arg-Val-Leu-Val-Asn-Asp-Arg（配列番号：２）は、一次翻訳産物中の位置428及び435におけるタンパク質のCOOH末端近くの内部開裂部位に相当する。
酵素速度研究。サーモマイセスフィターゼ及びアスペルギルス・ニゲルフィターゼで酵素速度研究を行った。その研究は、コーンフィチン酸（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）から遊離した無機リン酸塩のアッセイにより行った。0.5％ｗ／ｗフィチン酸中37℃及びpH5.5で30分、標準的酵素反応を行った。その反応を、等量の15％ｗ／ｗトリクロロ酢酸の添加により止めた。冷やした後、生じた混合物100μｌを1.0mlのガラス蒸留水に希釈した。そのサンプルを５分間、50℃でインキュベートした色試薬（1.0ml）を加え、50℃インキュベーションを15分、続けた。200μｌアリコートの吸光度をMolecular Devices Thermomax Microplate Readerで690nmにおいて測定した。色試薬は、６Ｎ硫酸：水：2.5％（ｗ／ｖ）ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物：10％アスコルベート（水性）を１：２：１：１の比で含み、１日ごとに新しく調製する。定量は、10mMリン酸一塩基ナトリウム標準で作られた標準線に基づく。１ユニット（Ｕ）は、37℃及びpH5.5で１分当りに遊離した無機リン酸塩のμmoleとして定義される。
定常状態速度測定を、基質滴定ににり行った。Ｋm測定の目的のため、フィテート濃度を2.16, 1.08, 0.541, 0.216, 0.108、及び0.0758mMとした。産物阻害を評価する目的のため、１mMリン酸一塩基ナトリウムの存在又は欠如下で1.08, 0.541, 0.216及び0.108mMの濃度を用いた。
定常状態の速度測定は、サーモマイセスフィターゼはフィテートに対して約110μｍの見掛けＫmを有し、アスペルギルス・ニゲルフィターゼは200μｍの見掛けＫmを有することを証明した。おそらくアスペルギルスフィターゼについての２mMを超える濃度での阻害の文献報告と一致する、2.16mMの基質濃度における過剰な基質阻害を少し示した（Ullah, 1988, Preparative Biochemistry 18: 443-458）。１mMホスフェートでの定常状態速度測定は、この産物での阻害のいずれの型の阻害かを示すのに失敗したホスフェートについてのＫiは我々の実験において検出できない３mMを超えなければならない。対照的に、Ullah（UHah, 1988、前掲）は、ホスフェートが1.9mMのＫiでアスペルギルフィターゼの競合阻害剤であることを報告している。
熱安定性測定。サーモマイセスフィターゼの熱安定性をアスペルギルス・ニゲルフィターゼと比較した。サーモマイセスフィターゼ及びアスペルギルス・ニゲルフィターゼのサンプルを0.2Ｍクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液中１ml当り100Ｕで溶かした。各々の酵素溶液のアリコート（100μｌ）を、次の温度：37, 45, 50, 55, 60, 65, 70及び75℃において水浴中で20分、インキュベートした。温度処理の後、そのサンプルを、活性アッセイを行うまで０℃で保存した。各々のサンプルを、0.01％ｗ／ｗ Tween 20を含む0.2Ｍクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液に１：８０で希釈し、上述の標準活性アッセイを行った。
酵素熱安定性プロフィールの比較（図６）は、２つの酵素間の安定性の差が小さいことを示唆する。しかしながら、いずれの酵素も高温インキュベーションにより十分に活性化されず、残存活性プロファイルは部分的な可逆的熱変性と一致する（Ullah and Mullaney, 1996, Biochem, Biophys.Res.Comm. 227: 311〜317）。
pH−活性測定。サーモマイセスフィターゼのpH−活性プロファイルをアスペルギルス・ニゲルフィターゼと比較した。pH２〜７の間の緩衝域とするために、３つの構成物の0.125Ｍグリシン−酢酸−クエン酸緩衝液を用いた。その緩衝液構成物を構成物当り42mMの最終濃度で組み合わせ、１％ｗ／ｗまで固体としてフィチン酸を加えた。この混合物を濃縮HClでpH７に調節し、10mlアリコートをとった。これを、その後毎0.5pH増加ごとに、pH２まで行った。
ml当り20Ｕの酵素保存流を、20mM MES緩衝液pH5.5中に調製した。所定のpHにおける緩衝液中の基質（850マイクロリッター）を100マイクロリッターの水及び50マイクロリッターの酵素保存液と組み合わせ、37℃で30分、インキュベートした。次にその酵素反応を１mlの15％ TCAで止め、標準的な方法で定量した。
サーモマイセス及びアスペルギルスフィターゼのpH−活性プロフィール比較は、pHプロファイル中の２つの酵素間の実質的な類似性を示した（図７）。しかしながら、サーモマイセスフィターゼは中性pHでも活性であるが、アスペルギルス酵素はそうでない。初期の文献報告（例えばSandbergら、1996, J.Nutr. 126: 476-480）は、アスペルギルスフィターゼが２つの至適pHを有することを示唆する。これらの報告は文献で公知であるアスペルギルス酸ホスファターゼを微量含む不純物のある材料に基づいている可能性がある（Zyla, 1993, World.J.Microbiol.Biotechnol. 9: 117-119）。
温度−活性測定。サーモマイセスフィターゼの温度−活性プロフィールをアスペルギルス・ニゲルフィターゼと比較した。ml当り12.5Ｕの酵素保存液を、0.2Ｍクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液中に調製した。１％フィチン酸基質250マイクロリッターを1.7mlエッペンドルフチューブに加え、次に0.2Ｍクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液240マイクロリッターを加えた。この溶液をボルテキシングして、指定温度で水浴に入れた。水浴中での20分の平衡化の後、そのエッペンドルフチューブをボルテキシングし、フィターゼ溶液10マイクロリッターを加えた。そのサンプルをボルテキシングし、更に30分、水浴中でインキュベートした。水浴中で30分放置した後、その反応を１mlの15％ TCAで止め、上述のアッセイ法により定量した。
温度の関数としての酵素活性の測定は、２つの酵素間に大きな差を示した（図８）。サーモマイセスフィターゼは65℃近くで最大酵素活性を示し、75℃でさえ部分的活性を有するが、アスペルギルス・ニゲルフィターゼは65℃で本質的に不活性である。
フィテート加水分解。サーモマイセス及びアスペルギルス・ニゲルフィターゼがフィチン酸を加水分解する能力の比較を行った。各々のフィターゼ（ml当り0.5Ｕの酵素活性）を、10時間、pH5.5及び37℃において、0.5％又は0.1％のいずれかのフィチン酸とインキュベートした。その結果は、アスペルギルス・ニゲル及びサーモマイセスフィターゼが、0.5％又は0.1％のフィチン酸濃度のいずれかで、10時間後に、同じ量（70％）の全ての理論的に利用できるリンを遊離したことを示した。
実施例13：1H NMR分光法によるフィチン酸のフィターゼ触媒加水分解の時間分解産物プロファイリング
サーモマイセスフィターゼにより及び市販のアスペルギルス・ニゲルフィターゼ（Phytase Novo▲Ｒ▼）により触媒されるフィチン酸の加水分解を、24時間の間の産物混合物をプロファイリングする1H NMRにより研究した（27mMフィテート、１FYT／ml、pH5.5、及び27℃）。
以下、Ins（p，q，r，…）Pnは、位置ｐ，ｑ，ｒ，…に結合した全部でｎのリン酸基を有するmyo−イノシトールをいう。
その技術は、フィチン酸への酵素による攻撃の開始点についての特定の情報、及び最終産物の同一性についての情報を提供する。他方、中間産物混合物の比較を反映するピークの展開パターンは、個々の酵素間の類似性及び差違の同定に適した質的基準、フィングープリントを供する。
NMRスペクトルを、５mm選択的逆プローブヘッドを備えたBruker DRX400装置で300°Ｋ（27℃）で記録した。４つのダミースキャンの後に６つのスキャンを、８Ｋのデータ点によりカバーした2003Hz（５ppm）の掃引幅を用いて蓄積した。残存HOD共鳴の減衰を、３秒プレ飽和期間により行った。スペクトルはHODシグナル（δ4.70）に引用した。
NMR分析のフィチン酸サンプルを以下のように調製した：フィチン酸（100mg、フィチン酸二カリウム塩、Sigma P-5681）を脱イオン水（4.0ml）に溶かし、NaOH水溶液（４Ｎ）を加えることによりpHを5.5に調節した。脱イオン水を加え（５ml）、各々20mgのフィチン酸に相当する１ml部をスクリューキャップバイアルに移し、その溶媒をエバポレートした（真空遠心）。その乾燥サンプルを酸化ジューテリウム（２ml、Merck 99.5％ D）に溶かし、乾燥するまで再びエバポレートした（使用するまで−18℃で保存）。
NMR分析のため、20mgのフィチン酸サンプルを酸化ジューテリウム（1.0ml、Merck 99.95％ D）に溶かした。その溶液をNMRチューブに移し、1H NMRスペクトルを、酵素添加直後（ｔ＝０）、次に５，10，15，20，25，30，45，60，75，90，105，120，135，150，165，180，195，210分（＝3.5時間）、4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，11.5，13.5，15.5，17.5，19.5，21.5、及び23.5時間後に記録した。NMRチューブ内のpHを測定した。酵素がその触媒活性を保存するなら、基質の一部（６mgのフィチン酸）をプローブに加えた場合、更なるスペクトルを48及び120時間（５日）後に得た。
公開されているNMRデータ（Scholz, P.; Bergmann, G., 及びMayr, G.W.: Methods in Inositide Research（Ed. Irvine, R.F.）, pp.65-82, Raven Press, Ltd., New York（1990））と組み合わせた、フィチン酸の部分的消化により得たイノシトールリン酸混合物の2D NMR分析により、Ins（1，2，3，4，5，6）P6（PA），Ins（1，2，4，5，6）P5，Ins（1，2，3，4，5）P5，Ins（1，2，5，6）P4，Ins（1，2，6）P3，Ins（1，2）P2、及びIns（2）Pに寄与する1H NMRシグナルを同定し、その反応の間のこれらの種の相対的定量化を行った。
反応時間の24時間をカバーするアスペルギルスフィターゼ及びサーモマイセスフィターゼについての生成物プロフィールの積み重ねたプロットを各々図９及び10に供する。
δ3.25（t）のシグナルはIns（1，2）P2におけるＨ−５を示し、δ3.18（t）のシグナルはIns（2）PにおけるＨ−５を示す。Ins（1，2）P2は、アスペルギルスフィターゼで反応時間の約４時間後、サーモマイセスフィターゼで反応時間の約２時間後に増加を開始する。Ins（2）Pは、アスペルギルスフィターゼで反応の約10時間後、サーモマイセスフィターゼで反応の約５時間後に観察された。反応の24時間後に、Ins（1，2）P2の量又はレベルに両方のフィターゼについて極めて低くなり、Ins（2）Pの量は24時間後に両方のフィターゼについて最大である。
従って、反応時間の24時間後に観察されたプロフィールは、両方のフィターゼがPAをIns（2）Pに分解することを証明する。十分に脱リン酸化された種のイノシトール（Ins）は全く観察されなかった。
両方の酵素について、24時間における反応混合物は、Ins（2）Pに加えて、小量のIns（1，2）P2を含んでいた。長い反応時間（数日）では、残存Ins（1，2）P2は消滅したが、十分に脱リン酸化された種であるイノシトール（Ins）は全く観察されなかった。その観察結果は、室温で５日間、それを保持した後、NMRチューブに添加されたフィチン酸の新しい部分を消化するそれらの能力により証明されるように、酵素は長期間、それらの触媒活性を保持するので、その酵素の不可逆的阻害／変性により説明されない。
図11及び12は、最初の4.5時間の間に展開するプロフィールをより詳細に示す。図13は、Ins（1，2，4，5，6）P5中のＨ−３（Ａで示す）はδ3.66（dd）のシグナルを示し、Ins（1，2，3，4，5）P5におけるＨ−６（Ｂ）はδ3.87（t）のシグナルを示し、そしてIns（1，2，5，6）P4におけるＨ−３（Ｃ）はδ3.56（dd）のシグナルを示すことを示す。化合物Ａは加水分解されている位置３のホスフェートに相当し、Ｂは位置６、Ｃは位置３及び４に相当する。
図11は、化合物Ａがアスペルギルスフィターゼを用いて主な一次産物（ｔ＝５分）であり、化合物Ｂは出現しないことを示す。化合物Ｃは20〜25分後に出現する。
他方、図12（サーモマイセスフィターゼ）は、化合物Ａ及び化合物Ｂが極めて初期に、即ち最初の15分以内に、おそらく化合物ＢよりＡの方が多く生産されることを示す。
δ4.82（dt，Ｈ−２），4.38（ｑ，Ｈ−４／Ｈ−６），4.13（ｑ，Ｈ−５）及び4.11（dt，Ｈ１／Ｈ３）のシグナルは基質であるフィチン酸に帰する。図11及び12は、これらのピークがアスペルギルスフィターゼよりサーモマイセスフィターゼでより迅速に（即ち１時間以内に）減少することを示す。
生物材料の寄託
以下の株は、ブダペスト条約に従って、Agricultural Research Service Patent Culture Conection（NRRL）（Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA）に寄託した。
株                        受託番号          寄託日
大腸菌DH5α（pMWR46）     NRRL B-21527      1996年２月23日
その株は、その培養物へのアクセスが、37 C.F.R.§1.14及び35 U.S.C.§122下でCommissioner of Patents and Trademarksにより決定されるものに、本特許出願の係属中に利用できるであろうことを確実にする条件下で寄託されている。その寄託物は各々の寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す。その寄託物は本願の対応出願又はその子出願が出願された国の外国の特許法により必要に応じて利用できる。しかしながら、寄託物の利用性は、政府により認可された特許権を逸脱して本発明を実施する許可を構成しないことが理解されるはずである。
本明細書に記載され、クレームされる本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態により範囲を限定されない。なぜならこれらの実施形態は本発明のいくつかの態様を詳説することを意図するからである。いずれかの等価な実施形態が本発明の範囲内であることを意図する。実際本明細書に示され、記載されるものに加えて種々の改良が先の記載から当業者に明らかになるであろう。これらの改良も添付の請求の範囲内にあることを意図する。
種々の引用文献が本明細書に言及されるが、その開示内容はそれら全体が引用により組み込まれる。
配  列  表
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：2200塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１
0004125375.tif 000008
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：475アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（ｖ）フラグメントの型：内部
（xi）配列の記載：配列番号：２
0004125375.tif 000009
0004125375.tif 000010
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：467アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３
0004125375.tif 000011
0004125375.tif 000012
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004125375.tif 000013
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５：
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0004125375.tif 000017
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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