(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメリカンタイプカルチャーコレクションにおいて加盟番号Ｎｏ．ＡＴＣＣ ５５８９３として寄託されているプラスミド。
【請求項２】
請求項１記載のプラスミドを含む、細菌のＤＮＡから精製されたプラスミドＤＮＡの無細胞調製物。
【請求項３】
請求項１記載のプラスミドを含む、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅファミリーの宿主細胞。
【請求項４】
以下の工程：
請求項１記載のプラスミドを用意し；
５’−ＧＣＧＣ−３’の認識部位を有するメチルトランスフェラーゼ酵素により上記プラスミドをメチル化して、メチル化プラスミドを形成し；
メチル化されたプラスミドを用いてＨ．ｓｏｍｎｕｓを形質転換することからなる、
Ｈ．ｓｏｍｎｕｓにＤＮＡを導入する方法。
【請求項５】
メチルトランスフェラーゼ酵素が部位５’−ＧｍＣＧＣ−３’を生じる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
メチルトランスフェラーゼ酵素がＨｈａＩメチルトランスフェラーゼである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
Ｈ．ｓｏｍｎｕｓゲノムのＤＮＡの特定の領域中において変異を生じさせる方法であって、
Ｈ．Ｓｏｍｎｕｓからゲノムの領域を単離して；
該領域に変異を導入して変異したＤＮＡ領域を形成し；
認識配列５’−ＧＣＧＣ−３’においてエンドヌクレアーゼによる分割を阻害するメチル化酵素を用いて変異ＤＮＡ領域をメチル化することにより、メチル化ＤＮＡを形成し；
該メチル化ＤＮＡをＨ．ｓｏｍｎｕｓ細胞に導入することにより形質転換体を形成するが、但し当該メチル化ＤＮＡは請求項１記載のプラスミドにより導入され；そして
Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ細胞の染色体ＤＮＡ上の上記領域に上記変異を有する形質転換体をスクリーニングすること
含む方法。
【請求項８】
メチル化の工程が、ＨｈａＩメチルトランスフェラーゼを含む細胞を通してＤＮＡを移行させることにより実施される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
メチル化工程がインビトロにおいて実施される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
メチル化酵素がＨｈａＩメチルトランスフェラーゼである、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
Pasteurella haemolytica、P.multocidaおよびHaemophilus somnusはパスツレラ科に属する。各々、家畜の牛の呼吸器疾患症候群に関与する。これらの微生物は、遺伝子操作が困難であることが判明しており、そのため弱毒生ワクチン構築の障害となってきた。
弱毒生菌菌株は、一般に死菌ワクチン（バクテリン）と比較して優れた保護を提供する。一般に、生ワクチンは、バクテリンよりも強い宿主中細胞媒介性の応答を誘発する。弱毒生微生物によって提供される優れた免疫は、ストレス蛋白質の、または宿主内のある毒素の、発現を誘発するその能力によって説明されよう。生きた微生物によって引き起こされる免疫反応をこれらの豊富な蛋白質に向けることが可能であり、それにより、よりよい保護が提供される。
パスツレラ科によって引き起こされる家畜の牛の呼吸器疾患症候群用の弱毒生ワクチンの技術に対する必要性がある。また、このようなワクチンの構築を促進する、技術およびツールに対する必要性もある。
発明の要約
本発明の目的は、複製条件制限プラスミドを提供することである。
本発明の別の目的は、ゲノミックＤＮＡから精製され、複製条件制限プラスミドの無細胞調製を提供することである。
本発明の別の目的は、複製条件制限プラスミドを包含するパスツレラ科宿主細胞を提供することである。
本発明の目的は、H.somnusへＤＮＡを導入する方法を提供することである。
本発明の目的は、H.somnusに突然変異を起こさせる方法を提供することである。
本発明の目的は、H.somnusの形質転換株を提供することである。
本発明の目的は、H.somnusの突然変異株を提供することである。
本発明の別の目的は、遺伝子操作されたH.somnusを提供することである。
本発明の目的は、パスツレラ科ゲノムへＤＮＡセグメントを導入する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、遺伝的に修飾されたパスツレラ科を提供することである。
上記および他の目的は、下記の１つ以上の態様によって提供される。一態様では、H.somnus、P.multocidaおよびP.haemolytica中の複製用の条件制限のプラスミドが提供される。
本発明の別の態様では、プラスミドＤＮＡの無細胞調製が提供される。プラスミドＤＮＡは、ゲノミックＤＮＡが無くなるように精製される。プラスミドは、H.somnus、P.multocidaおよびP.haemolytica中の複製には温度条件制限である。
本発明の別の態様では、パスツレラ科の宿主細胞が提供される。宿主細胞は、H.somnus、P.multocidaおよびP.haemolytica中で複製条件制限プラスミドを包含する。
本発明の一態様では、H.somnusにＤＮＡを導入する方法が提供される。この方法は、DNA分子を提供する段階と、メチル化されたＤＮＡを作成するために5'-GCGC-3'の認識部位がある、メチルトランスフェラーゼ酵素でDNA分子をメチル化する段階と、またメチル化されたＤＮＡでH.somnus細胞を形質転換する段階とを包含する。
本発明の別の態様では、H.somnusゲノミックＤＮＡの特定領域の突然変異をもたらす方法が提供される。この方法は、H.somnusからゲノムの領域を単離する段階と、突然変異させられたDNA領域を作成するためにその領域に突然変異を導入する段階と、メチル化されたＤＮＡを作成するために認識配列5'-GCGC-3'にエンドヌクレアーゼ切断を阻害するメチル化酵素で突然変異させられたDNA領域をメチル化する段階と、形質転換株を作成するためにH.somnus細胞にメチル化されたＤＮＡを導入する段階と、H.somnus細胞の染色体のDNA領域中に突然変異を持つ形質転換株をスクリーンする段階とを包含する。
本発明の別の態様では、単離されたHsoIエンドヌクレアーゼの調製物が提供される。
他の態様では、本発明のプロセスによって作成されるH.somnus突然変異体、および形質転換株が提供される。
本発明の別の態様では、パスツレラ科細胞における複製のための温度条件制限のＤＮＡセグメントおよびプラスミドを包含する組換え構築物をパスツレラ科の細胞に投与して形質転換株を作成する段階と、非許容温度に形質転換株をさらす段階と、ＤＮＡセグメントの存在用の形質転換株をスクリーンする段階と、プラスミドの欠如について形質転換株をスクリーンする段階とを包含するパスツレラ科ゲノムにＤＮＡセグメントを導入する方法が提供される。
また別の態様では、パスツレラ科細胞における複製のための温度条件制限のＤＮＡセグメントおよびプラスミドを含む組換え構築物をパスツレラ科の細胞に投与して形質転換株を作成する段階と、非許容温度に形質転換株をさらす段階と、形質転換株をＤＮＡセグメントの存在についてスクリーンする段階と、プラスミドの欠如について形質転換株をスクリーンする段階とを包含する方法によって作製される遺伝的に修飾されたパスツレラ科の細菌が提供される。
本発明の上記および他の態様は、経済的に重要であり、かつ従来難治性であったパスツレラ科の病原体の、望ましい突然変異体と形質転換株を構築する手段を当技術分野に提供する。
好ましい実施例の詳細な説明
パスツレラ科中に所定の突然変異を生じさせるには、試験管内または別の細菌中のいずれかに作成された、所定の突然変異を運搬するゲノムのセグメントを導入することが望ましい。典型的な場合では、ゲノムのセグメントはプラスミドに導入される。挿入ＤＮＡからゲノムへ所定の突然変異を「転移する」には、相同の組換えが要求される。単一の組換え事象により、プラスミド全体の組込みが行なわれ、１つの野生型と１つの突然変異体の遺伝子が得られる。遺伝子およびベクター配列の野生型複製物を削除するため、第２の組換え事象を設けることが望ましい。所望の２倍組換えの発生は、導入ＤＮＡを受容する、ほんの数分の１の細胞に起きる、まれな事象であるので、導入ＤＮＡを含む細胞の数を増加させると２倍組換え体細胞の回収率が上昇するであろう。パスツレラ科の中で自己複製し得るプラスミドを使用すると、導入ＤＮＡを有する細胞の数が増える。しかしながら、このようなプラスミドは、生態学的、医学的に不適当な薬物および毒素に抵抗性の決定要素を含むことが多いため、最終的にワクチンに使用され得る細胞中にプラスミドが存在することは、望ましくない。
発明者らは、所定の条件下で自己複製しないプラスミド、すなわち複製に条件制限プラスミドを作成することにより、この問題を解決した。したがって、許容温度で細胞を増殖させることにより、プラスミドによって細胞に導入された、所定の突然変異を運搬するゲノミックＤＮＡを、多くの直接形質転換細胞および子孫細胞の中の多くの複製物中に存在させ得る。この特徴によると、ＤＮＡセグメントを運搬する細胞の出発集団を増加させることによって得られる、所望の２倍組換え体の絶対数が増大する。さらに、非許容条件（例えば高温など）に切り換えることにより、エピゾームのプラスミドを除去し得る。効率よいプラスミドの自己複製を許さない高温にこのようなプラスミドをもつ細菌を置くと、プラスミドが急速に失われることは、本発明の発見である。
本発明のプラスミドの複製の条件制限は、任意の選択可能な表現型をベースとし得る。例えば、プラスミドは、薬物または毒素などの特定の作用物質が存在すると自己複製し得ない可能性がある。プラスミドは、ある種の代謝物質または塩類の有無によっては自己複製し得ない可能性がある。温度条件制限は、pD70の突然変異体について実証されたが、パスツレラ科の中で自己複製する他のプラスミドと同様に、他の条件制限も使用し得る。特に好ましいのは、pD70と同じ不和合群のプラスミドである。
本発明のプラスミドは当技術分野で認められた任意の技術によってゲノミックＤＮＡから精製し得る。無細胞調製物中のゲノミックＤＮＡからのプラスミドの典型的な分離方法は、電気泳動法、クロマトグラフィー、密度勾配沈降法、アルカリ溶解法等である。プラスミドは、形質転換、接合、リポソーム介在遺伝子転移、粒子射撃法などを含む、当技術分野で知られている任意の手段によって、パスツレラ科の細菌宿主細胞へ導入し得る。任意のパスツレラ科の宿主を使用し得る。
プラスミドの突然変異は、当技術分野で知られている任意の手段によって誘発し得る。これらは、試験管内または生体内で化学的突然変異誘発、突然変異誘発株による移行等を誘発する。さらに広範囲のスクリーニングを進んで行なう場合は、自発的突然変異さえも使用し得る。特に好ましいのは、非可逆性の欠失および挿入である。このような突然変異は、例えば制限酵素を使用して、試験管内で容易に生成される。条件制限変異は、ほぼミスセンス突然変異であるが、温度感受性サプレッサーｔＲＮＡが存在すると、ナンセンス突然変異も使用し得る。
本発明の温度条件制限プラスミドは、エレクトロポレーション、形質転換、トランスフェクション、形質導入を含む、当技術分野で知られている標準の方法によってパスツレラ科の細胞に適用し得るが、これらに限定されない。プラスミドＤＮＡを受容した細胞を検出するには、遺伝的または物理的な方法によってスクリーンし得る。続いて、プラスミドを欠失し、プラスミド上に対象ＤＮＡを保持運搬するものを調べるため、プラスミド受容細胞同士の間でスクリーンし得る。スクリーニングの方法は、表現型についてのスクリーニングやハイブリダイゼーションによる細胞中の特定ＤＮＡ配列の存在についのスクリーニングなどの、遺伝的または物理的な方法である。
H.somnusが、本明細書中でHsoIシステムと呼ぶ制限修飾システムを含むことも、また本発明の発見である。HsoI制限エンドヌクレアーゼは単離され、その切断配列は5'-GCGC-3'であることが決定された。また、H.somnus形質転換の障害が、HsoIメチルトランスフェラーゼ（M.HsoI）などのメチル化酵素でＤＮＡを処理することによって克服し得ることも、本発明者らによって発見された。このような酵素は、このような修飾された基質を5'-GCGC-3'配列を認識するエンドヌクレアーゼが消化するその能力を阻害するように、ＤＮＡ基質を修飾する。メチルトランスフェラーゼは5'-GmCGC-3'である部位を生じる、すなわち５’位のシトシンがメチル化される。このようなメチルトランスフェラーゼとしては、例えばHsoIメチルトランスフェラーゼ、HinPIメチルトランスフェラーゼ、およびHhaIメチルトランスフェラーゼなどがあり、ニューイングランド・バイオラブ社（New England Biolabs）（米国01915マサチューセッツ州ベヴァリー）から市販されている。このようなメチルトランスフェラーゼ酵素を含む細胞も使用し得る。これらは、同族の制限酵素を欠失するように、導入されたメチルトランスフェラーゼ酵素を備えた組換え細胞であることが好ましい。代わりに、それらは同族の制限酵素を欠失した、突然変異体または自然形質転換体でもよい。ある場合には、前者に後者ほど活性がない（遅い）か、それほど優勢でない場合、制限酵素とメチルトランスフェラーゼ酵素の両方を有する細胞を通してＤＮＡを移行させることが可能なこともある。
形質転換用のＤＮＡ基質のメチル化（細胞中へＤＮＡを導入する、エレクトロポレーションまたは他の手段）は、試験管内または生体内で達成し得る。試験管内メチル化のため、Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）などのメチル供与体がある状態で、ＤＮＡをメチルトランスフェラーゼの調製物と共にインキュベートした。生体内メチル化は、HsoI、HinPI、HhaIの各メチルトランスフェラーゼなどの適切なメチルトランスフェラーゼを含む細菌によってＤＮＡ基質を移行させることによって達成し得る。HsoIエンドヌクレアーゼが欠失したH.somnusの突然変異体または自然形質転換体も、その後のH.somnus中への導入用のＤＮＡを調製するために使用し得る。このような突然変異体は、とりわけ、本明細書に開示した部位特異的突然変異誘発のための方法によって作成し得る。
H.somnusの部位特異的突然変異誘発は、本発明によると、まず野生型のDNA領域をH.somnusから単離することにより達成し得る。突然変異は、当技術分野で知られている任意の方法により、単離野生型ＤＮＡ領域の中で引き起こされる。例えば、細菌中か試験管内のいずれかで、単離ＤＮＡを化学的に突然変異誘発し得る。代わりに、制限エンドヌクレアーゼを使用して、精密な欠失または挿入を試験管内で生じさせ得る。特定の適用に望ましいものとして、当技術分野で知られている他の方法を使用し得る。
H.somnusのＤＮＡを単離、突然変異誘発した後、上記のように、それをメチル化する。次いで、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションおよび接合を含む、当技術分野で知られている任意の技法によって、それをH.somnusへ導入し得るが、これらに限定されない。代わりに、突然変異誘発されたＤＮＡをメチル化し、HsoI制限エンドヌクレアーゼを発現するH.somnusへそれを導入するのではなく、突然変異誘発されたＤＮＡのメチル化を省略し、HsoI制限エンドヌクレアーゼまたはそのアイソシゾマーを効率的に発現しないH.somnus、H.haemolyticusまたはH.influenza細胞へ、突然変異誘発されたＤＮＡを導入し得る。このような細胞は、広範囲なスクリーニングによって自然から単離すること、HsoI制限エンドヌクレアーゼを発現する細胞の化学の突然変異誘発した後に単離すること、または本明細書に開示した部位特異的突然変異誘発方法によって作成することが可能である。本発明の一観点によると、突然変異誘発され、メチル化されたH.somnusのＤＮＡ領域は、P.haemolyticaのおよそ4.2kbのストレプトマイシン耐性決定プラスミド（pD70）を含むプラスミド上で、P.multocida細胞へ導入される。このプラスミドはまた、ブダペスト条約の条件の下で、1993年12月2日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国 20852 メリーランド州ロックヴィル・パークローンドライブ12301）に受け入れ番号ATCC  69499として寄託された。このプラスミドまたは他のpD70−非不和合プラスミドの誘導体も、同様に使用し得る。pD70の複製の起点は、ストレプトマイシン耐性決定要素の直ぐ下流にある1.2kbのSau3AIフラグメント上に単離し得る。遺伝子転換は、とりわけ、導入ＤＮＡ構築物（アンピシリン▲Ｒ▼やストレプトマイシン▲Ｒ▼など）上の遺伝マーカーについてスクリーンすることにより、対象遺伝子のプローブによるサザンハイブリダイゼーションによって、さらには形質転換細胞の子孫中のプラスミドの有無についてスクリーンすることによって、モニターし得る。
また、開示する形質転換および／または部位特異的突然変異誘発の方法によって作成される突然変異体と形質転換株も、本発明によって提供される。このような突然変異体は、ワクチンがパスツレラ科の感染に対する保護免疫を引き起こすのに適切であるパスツレラ科の弱毒生菌株を獣医技術分野に提供し得る。ワクチン生産については、細菌を弱毒化する突然変異が本質的に非可逆性の突然変異であることが望ましい。典型的な場合では、これらは欠失または挿入の突然変異であり、後者は転移因子によって引き起こされない。多数の弱毒化する突然変異を含む株も使用してよいが、野生型の有毒細菌への復帰の危険はほとんどないと言っていいほど小さい。適切な弱毒化する突然変異体としては、例えば栄養要求性の突然変異体などがある。変更された毒性因子を備えた突然変異体も使用してよい。
開示する部位特異的突然変異誘発方法によって作成し得る１つの突然変異株は、HsoI制限エンドヌクレアーゼ陰性の突然変異株である。このような株は、H.somnusでの遺伝子工学に役立つ。このような株は、依然としてHsoIメチルトランスフェラーゼがメチル化されたＤＮＡを産出する、メチル化されたHsoIメチルトランスフェラーゼではない、ＤＮＡの受容細胞とし得る。
とりわけ、ヘパリン−セファロースのカラム上のH.somnusの無細胞溶解物を移行させることにより、単離されたHsoIエンドヌクレアーゼ調製物を調製し得る。制限エンドヌクレアーゼを単離するための他の知られている技術も、適切なものとして使用し得る。典型的な場合では、無細胞溶解物と比較して、このような調製物の比活性は強化されるであろう。
本発明はこのように、当業者なら安定してH.somnusへＤＮＡを導入することを可能にする。ＤＮＡは、他の株または種由来のものでもよい。ＤＮＡは人工修飾しても、天然の状態でもよい。ゲノム中への組換えが要求される場合、フランキング相同体の２つの領域が好ましい。このような技術は一般に、他の細菌で知られているが、その制限システムのため、これまではH.somnusで不成功であった。
ワクチンは通常、緩衝液を用いた無菌の塩類溶液を使用して処方される。当技術分野で知られているように、蔗糖および／またはゼラチンを安定剤として使用してもよい。鼻腔内または気管内の経路によって本発明のパスツレラ・ワクチンを投与することが望ましいが、皮下、筋肉内または静脈内の注射を使用してもよい。適切な処方および技術は、Kuceraの米国特許第4,335,106号、Gilmourの米国特許第4,346,074号およびBergetの米国特許第4,957,739号によって教示される。典型的な場合では、１薬用量あたり107から1011CFUの間で投与されるが、105から103CFUも使用し得る。また、アジュバントを加えてもよい。
実施例
実施例１：プラスミドの構築および突然変異誘発。ストレプトマイシン耐性をコード化するPasteurella haemolytica血清型Ｉ中の4.2kbのプラスミド（pD70）は、記載されているように（Chang，Tatum）、以前から配列決定されている。プラスミドはHindIII消化によって直線化し、dNTPおよびクレノー断片処理によって平滑末端化した。上記のようにしてあらかじめBamHIで消化し、平滑末端化したカナマイシン・カセット（Genblock）を、pD70へ連結してpD70kanを生じさせた。このプラスミドは、コスミドPhaImtase上にPhaIメチルトランスフェラーゼを含む大腸菌DH10B中で増幅した。このプラスミドを、P.haemolytica NADC-D153株中に導入した。カナマイシン耐性の形質転換株から回収されたプラスミドＤＮＡ（l ug）を、以前に記載されているようにして、ヒドロキシルアミンで70℃で90分間突然変異誘発した。処理されたＤＮＡをTEに対して透析し、エタノール沈殿を行ない、TE（10mMトリス、1mM EDTA pH8.0）中で再懸濁液した。
実施例２：温度感受性プラスミドの回収。
Pasteurella haemolytica血清型１NADC D153株を37℃で、100mlのコロンビア・ブロス中で穏やかに振盪しながら後期対数増殖期まで増殖させた。5000×Ｇの遠心分離によって細菌をペレット化し、０℃で100mlの272mMの蔗糖中で洗浄した。等量の272mm蔗糖中でペレットを０℃で再懸濁液した。0.1cmのエレクトロポレーション・キュベット６個にコンピテント細胞（100μl）を入れ、処理された100ナノグラムのＤＮＡと混合した。細胞を18,000V/cm、800オームで電気穿孔し（Gene pulser,Bio-Rad）、11〜12ミリ秒の範囲の時定数が得られた。各エレクトロポレーション後、直ちに細胞を０℃で1.0mlコロンビア・ブロスに再懸濁液した。回収は30℃で２時間行なった。懸濁液は、50ug/mlのカナマイシンを含む、コロンビア寒天（Difco）プレート上に広げた（100μl/プレート）。プレートを30℃で28時間インキュベートした後、６時間42℃まで転移させた。典型的なコロニーより小さいコロニーを選定し、カナマイシン・プレート上に点在させた。30℃で終夜インキュベーションした後、選択された各コロニーからの増殖物を、カナマイシンが存在する状態と存在しない状態でコロンビア寒天プレート上に複写し、42℃で終夜インキュベートした。非選択的プレートからの増殖物をカナマイシン・プレートに移し、30℃で終夜インキュベートした。42℃での選択で増殖しなかったが、42℃で選択せずに継代した後に30℃で選択培地上でよく増殖したクローンは、カナマイシン発現について温度感受性であると推定された。42℃で選択せずに継代した後に、30℃で選択的プレート上で増殖の低下を示した、類似のクローンは、プラスミドの維持について温度感受性であると推定した。後者のクローンのうち４個を今後の研究のために選択した。
実施例３：温度感受性プラスミドの試験。プラスミドＤＮＡは、温度感受性プラスミドの複製開始点を含むと推定される４個のP.haemolyticaクローンからアルカリ溶解法によって回収した。ＤＮＡは、カーター＝ヘドルストンＡ：３型の牛の肺単離物である、P.multocida NADC TT94株中へ電気穿孔した。HhaIによって（前記同様）特異的にメチル化した後、このＤＮＡを牛の肺単離物であるH.somnus HS91株中に電気穿孔した。形質転換株は、10%CO2中の30℃で、５％牛血液＋50ug/mlカナマイシン補足コロンビア寒天プレート上で終夜増殖させた。複製されたブロス培養物に各微生物およびプラスミドの形質転換株を接種した。一方の培養物を40℃で終夜増殖させ、他方は30℃で増殖させた。プラスミドをアルカリ溶解法によって各ブロスから回収し、１％アガロース・ゲルに溶解した。選択的プレートおよび非選択的プレートは、継代後に、カナマイシンに対するパーセントCFU耐性の主観的評価のために取り除いた。
実施例４：複製条件付きプラスミドの特性。６×104  CFU/ugDNAの効率で突然変異誘発されたプラスミドにより、Pasteurella haemolyticaをカナマイシン耐性に形質転換した。形質転換株のうち、約１％（360）が42℃でのインキュベーション後に非定型的に小さなコロニーを形成することが分かった。30℃または42℃のいずれかでカナマイシンが存在するプレート上と存在しないプレート上でこれらのコロニーを継代させたところ、形質転換株の約90％がカナマイシン耐性発現について温度感受性であることが明らかになった（約10％が第１の継代で増殖せず、それ以上試験しなかった）。これらの微生物は30℃で選択的または非選択的プレート上でコロニーを形成したが、42℃では選択的プレート上で増殖しなかった。42℃の非選択的プレートから30℃の選択的プレートへ培養物を継代したところ、激しく増殖したが、これはプラスミドがなお存在していたことを示している。これらの培養物を代表するプラスミド調製物中で5.5kbのプラスミドが検知された。
360個のコロニーのうちの10個を42℃で選択せずに継代した後、30℃の選択培地上で増殖が低下したこと以外は、温度感受性カナマイシン遺伝子を含むコロニーに類似の継代で挙動した。42℃で選択せずに継代した後では、カナマイシンに体するパーセント耐性が異なるように思われ、これらのコロニーは非許容温度（42℃）で不安定度が異なる可能性を示している。非許容温度で選択せずに継代した後に、カナマイシン耐性のコロニーの低い収量に基づいて、４個を選択した。
温度感受性の４個のプラスミドは、P.multocida 株 NADC-TT94およびH.somnus 株 NADC-HS91（適切なメチル化の後の）へ容易に導入された。プラスミドは、P.haemolyticaにおけると同様に挙動した。増殖は40℃でインキュベートされた選択的プレート上では観察されず、４０℃での選択をせずに増殖したブロス培養ではプラスミドは検出されなかった。野生型のプラスミドで形質転換された培養物は、40℃での選択下でよく増殖し、その温度で、プラスミドＤＮＡが非選択ブロス培養から産生された。すべての培養物は、30℃の選択を行う場合も選択を行わない場合も増殖し、プラスミドを産生した。この結果によると、プラスミドの複製が３種類の株細菌の各々において温度条件付きであることが示唆される。
pBB192と呼ぶ、温度条件付きプラスミドのうちの１つは、1996年12月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（メリーランド州ロックヴィル、パークローンドライブ20852）にP.haemolytica NADC D153、受け入れ番号ATCC 55893として寄託された。
実施例５：Haemophilus somnus由来の制限エンドヌクレアーゼ、HsoIの単離および特性記述、並びにHhaIメチルトランスフェラーゼによる異種ＤＮＡの保護
エンドヌクレアーゼ活性を示すクロマトグラフィー画分は、680および760mMのNaCl（960〜1060  uS)によってヘパリン−セファロースカラムから溶出された。このカラムを単回通過させたところ、認識特異性と切断部位を両方とも識別するのに十分であった。濃縮HsoI調製物によるλＤＮＡの消化により、HhaI（Haemophilus  haemolyticaから単離された市販エンドヌクレアーゼ）によって作成された、それと同一の明瞭な制限フラグメントパターンが得られた。この切断部位（5'...G↓CGC...3'）は、HhaIのものとは異なり、HinPIによって生産されるものと同一の5'のオーバーハング（overhang)を作成することが分かった。
使用した方法
細菌、増殖および粗抽出物。Haemophilus  somnus  2336株（Lynette Corbeil（カリフォルニア州サンディエゴ）から供与）は、８枚のチョコレート寒天プレート（90℃で５％繊維素除去牛血液を補足したコロンビア血液寒天基礎培地：全量200ml，Difco，米国ミシガン州デトロイト）上で16時間増殖させた。細胞は、TB（10mMトリス、1mMEDTA、pH  8.0）中で収穫し、４℃で５分間16,000×gの遠心分離によってペレット化し、TEの中で１回洗浄した。洗浄したペレットを、12mlのクロマトグラフィー用緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、10mM２−メルカプトエタノール、pH 8.0、０℃）中で再懸濁液し、氷上に置いた。細菌細胞を15−ｓのバーストで２分間の超音波処理によって破砕した。破片および完全な細胞を10分間、16,000×gの遠心分離し、0.45μｍのポアサイズのメンブラン（Millex-HA社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）によって上清をろ過した。粗製抽出物の処理は、それ以上、chromatogaphyの前に行なわなかった。
蛋白質のクロマトグラフィー分離。クロマトグラフィー法は、すべて室温で実行した。メーカーによって推薦されたように、充填済みヘパリン−セファロースカラム（Econo-pacヘパリン・カラム（Bio-Rad、米国カリフォルニア州リッチモンド）を平衡化した。1.0ml/分間の流速を用い、勾配低圧自動クロマトグラフィー・システム（自動Econo-システム（Bio-Rad、米国カリフォルニア州リッチモンド）を分離に使用した。粗製抽出物5mlを注入し、0〜1.0MのNaCl緩衝液の線形勾配60mlを蛋白質を溶出するために使用した。活性分析に先立ち、画分（1ml）を氷上に保存した。新しいカラムで別の同一のクロマトグラフィー分離を行ない、活性のある画分を保存するために集め、プールした。
エンドヌクレアーゼ活性のアッセイ。
クロマトグラフィー画分の部分標本（5μl）を1μlのReact1（BRL（メリーランド州ゲーサーズバーグ））およびメチル化されていないバクテリオファージ・ラムダDNA  0.5μl（0.5  μg/μl（New England Biolabs、ベヴァリー、MES）と共に37℃で２時間インキュベートした。トリス硼酸塩EDTA緩衝液中の1％アガロース・ゲル上に追跡色素を添加して電気泳動した後、エチジウム臭化物染色およびUY照明によりバンドのパターンを視覚化した。ＤＮＡ切断活性に対応する画分は、−20℃で保存用に第２のクロマトグラフィー分離からプールし、分子量30,000カット限外ろ過フィルターで20倍濃縮し、150mM  NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM  EDTA、5mM  ２−メルカプトエタノール、1ml当たり0.25μgの牛血清アルブミン、および50:50（体積/体積）のグリセリン、pH8.0の最終濃度とした。この濃縮調製物をHsoIと呼ぶ。
HsoIのための認識と切断の部位の決定。pBluescript（Stratagene、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）およびラムダDNAにの消化によって認識配列を識別した。切断部位は、pBluescriptによるプライングされた合成反応消化によって識別した。pBluescriptのHsoI部位からの３'配列と相補的なオリゴヌクレオチド・プライマーを合成した。１本鎖DNAをテンプレートに使用した。標準のジデオキシＤＮＡ塩基配列決定反応を行ない、32P末端ラベルが付けられたプライマーの使用により、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片を備えたHsoI部位を通ってジデオキシ・ターミネーターを含んでいない一層の反応を拡張した。拡張反応は、フェノールクロロホルム抽出、次いでエタノール投入によって停止した。HsoIまたはHhaI（New England Biolabs）を追加の反応に加え、ＤＮＡを２分間消化させた。ゲル負荷緩衝液を加え、３分間で80℃まで加熱することにより反応を停止させた。
実施例６：メチル化されたＤＮＡによるH.somnusの形質転換
Haemophilus somnusまたは大腸菌から得られ、HhaIメチルトランスフェラーゼで試験管内メチル化されたＤＮＡは、HsoIおよびHhaIの両方による切断に対して抵抗性であった。基質DNAをフェノールクロロホルム−イソアミルアルコールによって抽出し、次いで、CsCl勾配遠心分離によって精製するときでさえ、あらかじめ試験管内でメチル化しても、メチル化しなくとも、消化後のＤＮＡの電気泳動の可動性に基づくと、試験管内メチル化による保護は、多くの場合部分的であることが分かった。
Haemophilus  somnusの中へのプラスミドＤＮＡの導入は、事前のプラスミドの試験管内メチル化によって約４桁増強された。pD70に基づいた各プラスミドはH.somnusを形質転換したが、サイズが増加するに従って、効率は低下した。プラスミドのサイズが増大するに従って、第２の制限修飾システムが効率の著しい低下に寄与している可能性がある。大腸菌中のmcrまたはmrrと類似したシステムの可能性については、調査しなかった。試験管内メチル化によって確認された部分的な保護ではなく、完全な保護によると、低下を説明することも可能であった。
耐アンピシリン性の形質転換株は回収されなかったが、このことは、pD80のアンピシリン耐性カセットがH.somnus中で発現しないか、複製の基原は機能しないことを示す。HindIII部位にpD80アンピシリン耐性カセットを含むpD70に基づくレプリコンにより、H.somnusを形質転換して、耐ストレプトマイシン性のコロニーを産生させた。アンピシリンを含む培地上で自己複製しなかったコロニーは、H.somnusでアンピシリン・カセットが機能しないことを示す。
複製のpD80基原については、それ以上試験を行なわなかった。Tn903由来のカナマイシン耐性カセットは、形質転換株の選択に優れていることが分かった。ストレプトマイシンは単に公平な選択を提供した。ストレプトマイシンおよびカナマイシンの両方に対して耐性のカセットを含む形質転換株は、ストレプトマイシンよりカナマイシン選択について比較的頑強であった。反対に、形質転換されていないコロニーは、ストレプトマイシン選択で一般に見られたが、カナマイシン選択では遭遇しなかった。
H.sornrus、649の第２の株（Lynette Corbeil博士から供与）は、pD70の誘導体によって形質転換されなかった。この株は、我々がpD70と非不和合性であると推定する小さなプラスミドを保護することが分かった。このプラスミドは、pD70のように、細菌の中へのＤＮＡの導入のための有用なベクターとして役立つ可能性がある。
Haemophilus  somnusによって保持される制限修飾システムは、この病原体を遺伝子操作するのに有用である。エンドヌクレアーゼに対する特異的メチル化によると、異種ＤＮＡの導入が可能である。異種遺伝子導入用ベクターとして役に立つ、両方とも複製の類似した基原に基づいた２つのレプリコンが発見された。
使用した方法
シャトルベクターの構築およびメチル化。pD70の誘導体、すなわちPasteurella  haemolytica血清型１の4.2kbのストレプトマイシン耐性プラスミドは、その細菌に関連した実験の間に、あらかじめ構築しておいた。簡潔に述べると、ストレプトマイシン耐性を含むpD70の2.2kbのPstIフラグメントを電気溶出し、1％アガロース・ゲルから削除し、Tn903（Genblock、Pharmacia）由来のカナマイシン・カセットとPstIで連結した。得られたプラスミドは、大腸菌中、およびP.haemolytica中でのカナマイシン耐性を保証した。プラスミドは、指示に従って、市販のHhaIメチルトランスフェラーゼでメチル化した。無傷のpD70、pD70kan（ユニークなHindIIIへ部位と平滑末端化連結したカナマイシン・カセットを備えたpD70）、およびpD80（アンピシリン耐性をコードする4.2kbのP.haemolyticaプラスミド）を含めて、複製のpD70基原に基づいた他のプラスミドについて試験した。Haemophilus  somnusの中でのメチル化ＤＮＡのエレクトロポレーション。10%CO2中で37℃でおよそ４時間、100mlのLevintholのブロスでHaemophilus  somnusNADC  Hs91 株（肺炎牛肺単離物）を後期対数増殖期まで増殖させた。増殖物はｍ15分間5000×Gの遠心分離によってペレット化し、０℃で100mlの272mM蔗糖中であらかじめ洗浄した。1:3パック細菌：272mM蔗糖となるように氷上でペレットを再懸濁した。コンピテント細菌（100ml）は、0.1cmのエレクトロポレーション・キュベット（Bio-Rad）中で、メチル化条件もしくは試験管内メチル化条件で、100ナノグラムのプラスミドＤＮＡと混合した。細胞は、ＤＮＡ（Gene pulser、Bio-Rad）を添加した後、18,000V/ｃｍ、800オーム、25  mFd、11〜15ミリ秒の範囲となる時定数で、迅速に電気穿孔した。Levinthalのブロス（1ml、０℃）を、直ちに電気穿孔した細胞に加え、懸濁液を25℃でおよそ10分間インキュベートした。次いで、細胞を10%CO、37℃で２時間回収した。チョコレート寒天プレート（5％脱線維素牛血液、50mg/mlのカナマイシン、100mg/mlのストレプトマイシンまたは20mg/mlのアンピシリンを含むコロンビア血液寒天基礎）上に10倍稀釈液をプレーティングした。コロニーは、10％CO2、37℃で36時間インキュベーションした後、計数した。迅速なアルカリ溶解方法を使用して、代表的なコロニーをプラスミド内容物のために検査した。
実施例７：P.multocidaのaroA削除突然変異体を作成する温度制限レプリコンの使用
遺伝子組換え突然変異体を作成する我々の実験室での以前の試みは、貧弱なエレクトロポレーション効率と、P.multocida（未発表の結果）中のColE1に基づいたレプリコンの複製によって妨げられた。￥また、遺伝子組換え生成物は通常、異種抗生物質耐性遺伝子を含み、それにより、そうでなければ望ましい突然変異体の使用が排除されるか、遅延されることがある。本明細書中で構築されたシャトル・プラスミドは、それらの問題を克服するために使用された。
P.haemolyticaプラスミドpD70の複製の基原は、Sau3A1フラグメント内のストレプトマイシンコード化領域から1.2kb下流にあることが分かった。Tn903由来のカナマイシン・カセットにより、このベクター（pBBI92）は、パスツレラ科のメンバーの自己複製することが判明したが、大腸菌中では、pD70基原に依存する配列のクローニングが要求され、それほどよく自己複製しないことが分かった。P.multocida中での使用に適さない一方で、P.haemolyticaまたはH.somnusの標的微生物（未発表の結果）中で使用するために、温度条件制限大腸菌中での構築を促進するために、BamHI部位（pBBI92C）に複製のColE1基原を含む、シャトルベクターの誘導体を構築した。プラスミドpBBI92Cは、大腸菌の中で効率的に自己増殖した。
カナマイシン上で、30℃で25ナノグラムの置換プラスミドによるエレクトロポレーションによってほぼ100個のP.multocida形質転換株を回収した。6個の代表的なコロニーから40℃でカナマイシン・プレートへのブロス培養物の経代により、各10μl接種原からの約20個のよく単離されたコロニーが得られたが、産生されたコロニーの数は、６個の培養物に変わった。コロニーのサイズは、各プレート上で著しく変わり、多くの小さなコロニーと、少数の大きなコロニーが産生された。これらのサイズの相対的な割合は６個の培養物で変化した。コロニー（aroAで探査）からのゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析から、小さなコロニーが単一のクロスオーバー事象の生成物であることが明らかにされた。大きなコロニーは、野生型の染色体のaroAと一致するフラグメントに加え、置換プラスミドとサイズの点で類似していない、aroAと同族の配列を含んでいた。
大きなコロニーもそれ以上検査しなかった。我々のデータの解釈は、組み込まれた置換プラスミドによって染色体が不安定化し、そのために複製の割合が本質的に低下し、従って小さなコロニーサイズが保証されるというものである。しかしながら、置換プラスミドは、非許容温度で非常に非能率的に単独で自己複製するため、コロニーはカナマイシン選択下で全く形成されない。この状況により、改善された複製用のプラスミドを再構成するか、生じているカナマイシン遺伝子を含む染色体プラスミド配列への組み換えに対して、強い選択的な圧力をかけ、その結果、いくつかの潜在的な、ありそうもない生成物が得られた。
カナマイシン選択のない単一クロスオーバー事象の生成物からの増殖物を移行させると、一移行あたり、＞99％のカナマイシン耐性の損失に帰着した。これらの結果は、単一のクロスオーバー生成物の本質的な不安定さを示す。このような移行からの500個の単離されたコロニー中、５個は所定培地としてカナマイシン選択下の両方で増殖できなかった。サザンブロット分析により、削除されたClaIと同族のＤＮＡ配列の損失が確認されたが、EcoRVフラグメント、プラスミド・ベクターとの相同は示されず、染色体のaroAのサイズの約300  bpの縮小が示された。PCR分析の結果によると、生成物サイズの300bp縮小が示された。PCR生成物の遺伝子配列決定により、5'ATTGATAT-GAACCAT-3'（下流のＤＮＡ配列の読み枠を修飾しない）EcoRV部位からわずかにClaI部位を越えて伸びる削除が確認された。
温度感受性シャトルベクターによると、遺伝子組換え中のクロスオーバー生成物の選択と、細菌の形質転換のオペレーションとが識別された。さらに、異種選択可能なマーカーのない生成物の生成が単純化された。単一のクロスオーバー生成物の不安定さは、SacBなどの遺伝子によって与えられた陰性選択を使用しない欠失突然変異体を生成する、プラスミドの染色体からの識別を促進するように思われた。P.haemolyticaとH.somnusでは、ベクターが温度条件制限で自己複製するので両者は他のパスツレラ科において等しく、同様に有用となりそうである。本明細書中で構築され、1996年12月２日にATCCに受け入れ番号ATCC55892として寄託されたP.multocida  aroA突然変異体は、現在の株が牛の起源であり、欠失がaroAに導入され、異種ＤＮＡ配列が生成物中にないので、Homchampaらによって記載されたものと異なる。この突然変異体は、弱毒生ワクチンとして使用し得る。
使用した方法
構築温度感受性シャトルベクター。シャトルベクターは、以前に記載されている温度感受性基原のpD70の複製に基づいて緊縮され、ストレプトマイシン耐性プラスミドは元々、P.haemolytica血清型１（Tatumら，Chang）から単離された。およそ1450bpのPCR生成物は、順方向プライマー5'-GCCTGTTTTTCCTGCTC-3'、および逆方向プライマー5'-CCTGCGGTGTAAGTGTTATT-3'を使用して、温度感受性pD70kan#192から作成した。ほぼ1.2  kbのフラグメントを生成させるために生成物を完成させるため、Sau3A1で消化した。Tn903（GenBlock Pharmacia）からのカナマイシン耐性カセットは、pBCSK（Stratagene）のEcoRI部位と連結されたEcoRIで消化し、PhaIでメチル化されたプラスミドＤＮＡ（Briggsら）を生成させるために、大腸菌30-9G株中へ電気穿孔した。およそ1.3kbのカナマイシン耐性カセットを、BamHIによってメチル化されたプラスミドから削除し、1.2kbのSau3A1となるまで終夜連結を行なった。P.haemolytica株NADC-D153へ連結混合物を電気穿孔し、カナマイシン耐性のコロニーからプラスミドを回収した。カナマイシン・カセットに加えてEcoRI部位からBamHI部位へのpBC  SKの複合クローニング部位の部分が転移され、その結果、30℃のP.haemolytica、P.multocidaおよびH.somnusの中で自己複製するが、大腸菌中では自己複製が非常に貧弱な、ユニークEcoRI部位および有効にユニークなBamHI部位とを備えた2.5kbのプラスミドが得られたことが分かった。このプラスミドをpBB192と命名した。P.multocida aroAのクローニングおよび削除。aroA遺伝子を含む1.2kbのPCR生成物は、順方向プライマー5'-TTACTCTCAATCCCATCAGCTATA-3'、および逆方向プライマー5'-CTATCTGTAGGCTACTTCGCGTC-3'を使用して作成した。この生成物は、PCR生成物インサート（TAベクター、Invitrogen）にフランキングする（前後にある）EcoRI部位を含むベクターへクローン化される。このインサートをEcoRIで削除し、puC9のEcoRI部位へ連結した。生成物はClaIとEcoRVで二重消化して、およそ300bpのフラグメントを除去した。DNAポリメラーゼＩおよびdNTPsのクレノー断片を使用して残存プラスミドの末端を平滑化した後、aroAの削除を行なうために、それら自身と連結した。ＤＮＡをPhaIでメチル化するため、削除されたプラスミドを大腸菌30-9G株の中で増幅し、次いでEcoRIで消化し、削除を確認するためにアガロース・ゲル上で電気泳動にかけた。pBB192PrnAaroAを作成するため、削除を含むPhaIでメチル化されたEcoRI  aroAフラグメントをpBBI92のEcoRI部位へ連結した。連結混合物をP.haemolytica  NADC-D153株へ電気穿孔し、プラスミドをカナマイシン耐性のコロニーから回収した。
P.multocidaの単一クロスオーバー生成物の産生。カーター＝ヘドルストンＡ：３型の牛の肺単離物である、Pasteurella  multocida  NADC-TT94株は、2,500Uヒアルロニダーゼを含む100mlのコロンビア・ブロス中で４時間増殖させた。増殖物を5000×Ｇで15分間遠心分離し、272mM蔗糖の中で０℃で２度洗浄し、1mlの1272mM蔗糖中で再懸濁液し、この細胞（100 pt）を0.1cmのキュベット中の25ナノグラムのpBB  192PmΔaroAで、8kv、800および25  uF、14.7ミリ秒の合成時定数で、電気穿孔した（Gene Pulser、Bio-Rad）。細胞は、30℃で２時間インキュベートし、1mlのコロンビア・ブロス中で0℃で直ちに再懸濁液した。回収した細胞を50ug/mlカナマイシンを含むコロンビア寒天プレート上に100μl／プレートで分散させた後、30℃で24時間インキュベートした。６個のコロニーを別々に、50ug/mlカナマイシンを含む、5mlのコロンビア・ブロス中で30℃で18時間インキュベートした。増殖物をカナマイシンを含むコロンビア寒天プレート上に広げ（10μl／プレート）、40℃で24時間インキュベートした。（削除突然変異体についてスクリーンするため）カナマイシン非存在条件でコロンビア・ブロス（25ml）に、あるいはサザンブロット分析によって単一のクロスオーバー生成物を確認するため）カナマイシン存在条件で、コロンビア・ブロス（5ml）に代表的なコロニーを移行させ、40℃で終夜インキュベートした。P.multocida削除突然変異体についてのスクリーニング。上記の非選択的ブロス培養物から、コロンビア寒天プレートを単離コロニーのために取り出し、終夜インキュベートした。単離された500個のコロニーを、100μl  コロンビア・ブロス／ウェルを含む、マイクロタイター・プレートへ移行させ、６時間インキュベートした。増殖物（１μl）をカナマイシンの入った100μl／ウェルのコロンビア・ブロスまたはVessmanらおよびWatkoらに基づいたトリプトファンに基づいた、化学的に規定された100  μl／ウェルのいずれかを含む、各２枚ずつのマイクロタイター・プレートへ移した。起原の非選択的マイクロタイター・プレート上だけで増殖したが、カナマイシンまたは所定の培地のいずれかの上では増殖しなかったウェルは、削除突然変異体であることが疑われた。これらは、順方向プライマー5'fTACCCACCTATCGCCATTC-3'、および逆方向プライマー5'-TCCGCCCCCACCTTA-3'を使用した、サザンブロット分析およびPCR分析に移行させた。削除突然変異体のうちの１個由来のPCR生成物を削除配列決定のためにクローン化した。