(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) 血液凝固第ＶＩＩ因子（以下、ＦＶＩＩと称することがある）を含有する溶液を陰イオン交換樹脂に展開し接触させ、（ｂ）ＦＶＩＩを活性化率が６０％未満を維持しつつ活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（以下、ＦＶＩＩaと称することがある）へ活性化し、（ｃ）０.５ｍＭ以上の濃度のＣａ2+を含有する溶出緩衝液を用いて溶出して、（ｄ）該溶出液を溶液状態で静置（熟成）し未活性体分子を完全に活性化させる工程を経てなる血液凝固第ＶＩＩ因子の活性化血液凝固第ＶＩＩ因子への活性化方法。
【請求項２】
上記陰イオン交換樹脂からの溶出時の溶出方法が段階的溶出法（ステップワイズ溶出法）である請求項１に記載のＦＶＩＩの活性化方法。
【請求項３】
請求項１もしくは請求項２のいずれかに記載のＦＶＩＩの活性化方法に基づく工程を含むことを特徴とする活性化血液凝固第ＶＩＩ因子の製造方法。
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、血漿蛋白質の分野に関する。より詳細には、活性化血液凝固第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩＩaと称することがある)の製造方法に関し、ＦＶＩＩを含有する血漿画分または遺伝子組換え技術に基づいて作出されたＦＶＩＩ産生細胞培養上清から、陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理及びそれに連続した液相中での活性化によって、夾雑蛋白質含量が低減されたＦＶＩＩaを、極めて簡便に生産し得るＦＶＩＩaの製造方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】
ＦＶＩＩはビタミンＫ依存性の血液凝固因子であり、外因系血液凝固の開始因子であることは広く知られている。他のビタミンＫ依存性凝固因子と同様にＮ末端から３５残基までのアミノ酸配列に１０個のγカルボキシグルタミン酸(以下、Ｇｌａと称することがある)からなるＧｌａ領域を有している(Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.８３,ｐ.２４１２−２４１６,１９８６)。ＦＶＩＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性化血液凝固第Ｘ因子(以下、ＦＸaと称することがある)、活性化血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸaと称することがある)またはトロンビン(以下、ＦＩＩaと称することがある)によって、152Ａｒｇ−153Ｉｌｅが加水分解され、一個のＳ−Ｓ結合で架橋されたＨ鎖とＬ鎖から構成される活性型ＦＶＩＩすなわちＦＶＩＩaに変換されることが知られている(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２５１,ｐ.４７９７−４８０２,１９７６)。また、最近、Ｓａｕｌｉｕｓ等は生理的なＦＶＩＩ活性化酵素が活性化血液凝固第Ｘ因子であると報告した(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.３５,ｐ.１９０４−１９１０,１９９６)。
【０００３】
血友病Ａ及び血友病Ｂ患者に対する補充療法として、血液凝固第ＶIII因子(以下、ＦＶIIIと称することがある)及び血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸと称することがある)製剤の投与が行なわれている。しかし、当該治療法に伴いＦＶIII及びＦＩＸに対する中和抗体(インヒビターと呼ばれることもある)の出現が問題視されている。このようなインヒビター患者の治療にＦＶＩＩaが有効であることは既に報告されており、現在、血漿由来ＦＶＩＩa及び遺伝子組換え技術を応用した遺伝子組換え型ＦＶＩＩaの開発が進められている(基礎と臨床,ｖｏｌ.３０,ｐ.３１５−３２５,１９９６;Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ,ｖｏｌ.１９,ｐ.３３５−３４３,１９８９)
【０００４】
酵素前駆体であるＦＶＩＩからＦＶＩＩaへの変換に関しては各種の試験が行なわれ、ＦＶＩＩ活性化酵素であるＦＸa、ＦＩＸa及びＦＩＩaが存在しない場合、ＦＶＩＩaの関与によるＦＶＩＩの自己活性化反応が生じること、即ち次式で示される反応"ＦＶＩＩ ＋ ＦＶＩＩa → ２ＦＶＩＩa"で進行することが明らかにされている(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.２８,ｐ.９３３１−９３３６,１９８９)。
ところで、ＦＶＩＩaの調製方法として、陰イオン交換樹脂を使用した活性化方法がある(Ｒｅｓ.Ｄｉｓｃｌ.,ｖｏｌ.２６９,ｐ.５６４−５６５,１９８６)。この方法は、反応の詳細は明らかにされていないが、ＦＶＩＩaを工業規模で生産するうえで極めて有効な方法である。しかしながら、陰イオン交換樹脂を使用したＦＶＩＩの活性化において問題となるのは、副産物としてＦＶＩＩのＬ鎖のＮ末端から３８残基のアミノ酸が欠失したＧｌａ領域欠失ＦＶＩＩa(以下、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaと称することがある)が生成することにある。ＦＶＩＩaの生体内での活性発現にはリン脂質及び組織因子との結合が必要であり、Ｇｌａ領域はそのためには必須である。従って、Ｇｌａ領域の存在しないＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaはリン脂質及び組織因子との結合が極めて弱く、生物学的活性を有さずその存在の生理的意義はないものと考えられている(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２６５,ｐ.１８９０−１８９４,１９９０；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ.,ｖｏｌ.６７,ｐ.６７９−６８５,１９９２)。
【０００５】
これまで、陰イオン交換樹脂上での活性化はゲルにＦＶＩＩを展開した後、完全活性化させ、グラジエント溶出することにより、溶出段階で副産物のＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaとＦＶＩＩaの等電点の差異を利用して分離する方法が報告されており、Ｔｈｉｍ等はＭｏｎｏＱを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによる活性化反応においては産生されたＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaは分離可能と述べている(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.２７,ｐ.７７８５−７７９３,１９８８)。しかしながら、実際上その完全分離は極めて難しく、分離を厳密に行なえば工程間収率は著しく低減する。さらに、これまでに陰イオン交換樹脂上でのＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生機構に関する報告はなく、その制御を陰イオン交換樹脂上で行なうことは極めて困難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は活性化反応における上記問題点に鑑み、陰イオン交換樹脂上での活性化反応における副産物であるＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生を抑制するべく鋭意研究を重ね種々の検討を行なった結果、本願発明を完成するに至った。
本願発明は、陰イオン交換樹脂上における活性化反応を６０％未満に抑制し、溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液を０.５ｍＭ以上のＣａ2+が存在する溶液中での液相中で熟成させ９５％以上活性化させる方法をその技術の骨子とする。本願発明を適用すれば、活性化工程におけるＦＶＩＩからＦＶＩＩaの変換において生ずるＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が抑制され、著しい工程間収率の上昇が可能となる。
【０００７】
以下、本願発明の詳細について説明する。
本願発明で用いられる出発物質は、▲１▼血漿または血漿を適当なクロマトグラフィー操作またはコーンのエタノール分離法もしくはその改良法を用いて調製されたＦＶＩＩ含有溶液または、▲２▼遺伝子組換え技術に基づいて作出されたＦＶＩＩ産生形質転換細胞より調製されるＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩ誘導体含有溶液が対象となるが、最適な出発原料としては、血漿を陰イオンクロマトグラフィーで粗精製したＧｌａ領域を有する蛋白溶液(ＰＰＳＢ画分)を抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化アフィニティーゲルに展開し溶出したほぼＦＶＩＩのみを含有する溶液である。ＦＶＩＩの精製は特に免疫吸着の原理に基づく方法に限定されるものではなく、ＦＶＩＩを純化可能な方法であればいずれでもよい。
【０００８】
前記ＦＶＩＩ画分を、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに供する。陰イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂であれば特に限定されるものではないが、好適にはＤＥＡＥセファロースファーストフロウ(ファルマシア社)及びＱセファロースファーストフロウ(ファルマシア社)等が使用され、ＦＶＩＩ画分を樹脂と接触させる。この工程では種々の条件を採用することができ、上記リガンドとの接触はバッチ法または連続カラム法で実施することができるが、最適な態様としては、前記の陰イオン交換樹脂をクロマトグラフィーのカラムに充填し、試料を通液後、吸着した所望のＦＶＩＩを溶出させる。陰イオン交換樹脂からの溶出は０.５ｍＭ以上のＣａ2+を含む緩衝液を用いて段階的溶出法(ステップワイズ溶出法)により、溶出液中のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液のＦＶＩＩaへの活性化率が６０％以下になるように溶出する。
溶出液中の活性化率を制御するためには、陰イオン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量と樹脂内での滞留時間を調整すればよい。すなわち、樹脂へのＦＶＩＩ展開量及び樹脂内での滞留時間の増加は活性化率を増大させ、樹脂へのＦＶＩＩ展開量及び樹脂内での滞留時間の減少は活性化率を低下せしめる。
【０００９】
溶出後の熟成時間は、▲１▼溶出時のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaの混合比率、▲２▼ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaの蛋白濃度によって決定される。溶出液中の蛋白濃度は陰イオン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量及びカラムサイズが決定されれば一定になる。好適には１.０〜３.０ｍｇ／ｍｌが望ましく、そのように陰イオン交換樹脂への展開量及びカラムサイズを決定する。また、溶出時の活性化率は陰イオン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量が決定されれば、上述のごとく樹脂内での滞留時間を制御すればよい。また、熟成開始時のＣａ2+濃度は０.５ｍＭ以上が要求され、それ以下の濃度ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が顕著になり、適正ではない。好適には１.０〜１０ｍＭの濃度範囲が使用される。熟成の終了は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaの混合溶液のＦＶＩＩaの活性化率が９５％を越えた時点で、希釈操作によって蛋白濃度を減じ活性化反応速度を遅延させるか、またはｐＨを低下させ酵素反応を一時停止せしめることによって行なう。得られたＦＶＩＩa溶液は透析操作によって所望の製薬学的調合剤に処方すればよい。
【００１０】
静脈内投与のための調合剤に対しては、組成物を、通常、生理学的に適合し得る物質例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み且つ生理学的条件に適合し得る緩衝されたｐＨを有する水溶液中に溶解する。また、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製剤の形態を採ることも考慮され得る。なお、静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明は何等これらに限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
実施例の記述に先立ち、本願発明において使用されたＦＶＩＩ活性及びＦＶＩＩa含量の測定方法について概説する。
１) ＦＶＩＩの生物学的活性
ＦＶＩＩは血液凝固の開始因子である組織因子と結合し血液凝固を開始する。ＦＶＩＩの定量方法は、検体をＦＶＩＩ欠乏血漿に添加後、一定時間インキュベーションした後、組織因子、リン脂質及びＣａ2+を含有したＰＴ試薬を添加しその凝固時間から算出する。
２) ＦＶＩＩa含量の測定
ＦＶＩＩa含量の測定にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する。ＦＶＩＩ(分子量５０ｋｄａ)は活性化すると１個のＳ−Ｓ結合で結合した２本鎖に分かれる。Ｈ鎖は分子量３０ｋｄａ、Ｌ鎖は分子量２０ｋｄａ。還元系のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは未活性体は分子量５０ｋｄａの位置に、Ｈ鎖は３０ｋｄａ、Ｌ鎖は２０ｋｄａの位置に確認される。検出されるバンドをデンシトメーターで読み取り、分子量５０ｋｄａのバンドを未活性化ＦＶＩＩ含量％、Ｈ鎖とＬ鎖の含量の和をＦＶＩＩa含量％とした。活性化率はＦＶＩＩa含量をＦＶＩＩ含量とＦＶＩＩa含量の和で除した値を百分率(％)で表した。
【００１２】
実施例１
新鮮凍結血漿１００リットルを冷融解し沈澱画分を遠心分離した上清を、陰イオン交換体(ＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−５０:ファルマシア社)カラムに通液し、２０ｍＭクエン酸／０.１ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ７.０)にて充分に洗浄し、２０ｍＭクエン酸／０.５ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ７.０)にてＧｌａドメインを有するＰＰＳＢ画分を溶出した。
溶出液１０リットルを５０ｍＭＴｒｉｓ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.０)で予め平衡化した抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化アフィニティーゲルに展開し、５０ｍＭＴｒｉｓ／２.５ＭＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.０)で洗浄後、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.０)でさらに洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液(ｐＨ７.４)で溶出してＦＶＩＩ画分を得た。該ＦＶＩＩ画分を予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で充填されているウイルス除去膜(ベンベルグマイクロポーラスメンブレン、旭化成)に展開し濾液を得た。得られた濾液のＦＶＩＩ純度は８５％であった。
【００１３】
上記０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液５０ｍｌを、予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で所定の各種カラム容量洗浄し、吸着したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaを失活させるために５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ３.５)で溶出した。溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、表１の結果を得た。本結果は洗浄カラム容量が７０カラム容量を越えるとＦＶＩＩaの活性化率が６６.４％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示している。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
実施例２
実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液５０ｍｌを、予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で１０倍カラム容量洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／２.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.０)を用い各種線速で溶出した。溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、表２の結果を得た。本結果は溶出線速が１００ｃｍ／ｈｒを下回るとＦＶＩＩaの活性化率が６２.８％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示している。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
実施例３
実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液７０ｍｌを、予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ３.３ｃｍのＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速２００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１.７５ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.０)を用い線速１５０ｃｍ／ｈｒで溶出した。溶出した濃度２.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液をさらに液相中で１０時間熟成させた。カラム溶出直後(熟成前)及び熟成後の成績を表３に示す。
結果は、実施例１、２とは陰イオン交換樹脂への展開量及びカラムサイズの異なる条件においても、溶出後の活性化率が６０％以下ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaが産生されず、且つ熟成後もその産生が極めて抑制されていることを示している。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
実施例４
実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製された０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを予め１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で各種カラム容量洗浄後、吸着したＦＶＩＩaを失活させるために５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ３.５)で溶出した。溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、表４の結果を得た。本結果は洗浄カラム容量が４０カラム容量を越えるとＦＶＩＩaの活性化率が６１.３％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示している。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
実施例５
実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを、予め１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で１０倍カラム容量洗浄し、１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ／４.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.５)を用い各種線速で溶出した。溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、表５の結果を得た。本結果は溶出線速が１０８ｃｍ／ｈｒ以下になるとＦＶＩＩaの活性化率が６２.７％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示している。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
実施例６
実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを、予め１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ／４.０ｍＭＣａＣｌ2緩衝液(ｐＨ８.５)で線速１８０ｃｍ／ｈｒで溶出した。溶出した濃度１.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液を液相中で２５時間熟成させた。カラム溶出直後(熟成前)及び熟成後の成績を表６に示す。
結果は、実施例３と同様に陰イオン交換樹脂としてＱ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)を使用しても、溶出後の活性化率が６０％以下ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaが産生されず、且つ溶出液熟成後もその産生が極めて抑制されていることを示している。
【００２４】
【表６】
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【００２５】
実施例７
実施例３と同様な操作で、ＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)を使用し部分活性化後、液相で熟成し完全活性化させたＣａ2+濃度２.０ｍＭを含む５.０ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＶＩＩa混合溶液を、Ｃａ2+濃度が０.１７ｍＭ、０.５０ｍＭ、０.７５ｍＭ、１.０ｍＭ、２.０ｍＭ、蛋白質濃度が０.４ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.１)で希釈し、９℃で８８時間インキュベートした。
インキュベート後の成績を表７に記載する。表７の成績はＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩa産生の至適Ｃａ2+濃度が０.５ｍＭ未満であることを示すと共に、ＦＶＩＩaのＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaへの分解反応が０.７５ｍＭ以上のＣａ2+濃度下で抑制されることをも示している。この結果は液相におけるＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩa産生反応のＣａ2+濃度の閾値を示すと共に、陰イオン交換樹脂からの溶出をＣａ2+を含む緩衝液で行なう場合、溶出時のＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生を抑制するためには溶出緩衝液のＣａ2+濃度は０.５ｍＭ以上必要であることを示している。
【００２６】
【表７】
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