(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドを含有し生物活性を有する水溶液をＣ1〜Ｃ5アルキル基で調整された支持体物質と接触させ、続いて当該タンパク質含有またはペプチド含有溶液を支持体物質から分離することよりなるタンパク質またはペプチドを含有し生物活性を有する水溶液からの芳香族化合物の除去方法。
【請求項２】
芳香族化合物がアクリジン、ヒペリシン、プソラレン、メチレンブルーおよびそれら化合物の誘導体からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
芳香族化合物がアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体である請求項１記載の方法。
【請求項４】
支持体物質がシリカゲルである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
シリカゲルがエチル基で疎水性に調整されている請求項４記載の方法。
【請求項６】
カラムクロマトグラフィーまたはバッチクロマトグラフィーにより実施する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
支持体物質を介してろ過するかまたは支持体物質の上を流すことにより実施される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶液が、タンパク質への芳香族化合物の結合を実質的に防止するかまたは既に結合した芳香族化合物を放出するような添加剤を含有している請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
添加剤が疎水性または両親媒性物質である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
添加剤が、ポリビニルアルコール類、ポリビニルピロリドン類、ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノラウレート、ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノパルミテート、ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノステアレート、ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノオレアート、エチルフェノールポリ（エチレン)nグリコールエーテル、ポリエチレングリコール類、デオキシコレート、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート、エトキシル化アルキルフェノール、部分的に脂肪酸でエステル化されたポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン脂肪アルコール誘導体、ドデシル−Ｎ−ベタイン、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−β−アラニン、Ｎ−ドデシルアミノエタンスルホン酸、テトラデシルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルピリミジニウムクロリド、エチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合物、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルベンジルアンモニウムクロリド、エトキシル化アミン、硫酸化エトキシル化アルキルフェノール、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、スルホエチルスルホン酸ナトリウム、Ｎ−メチル−Ｎ−オレイルエタノールスルホネートおよびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
添加剤がポリビニルアルコールもしくはポリビニルピロリドンまたはエトキシル化アルキルフェノールである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
添加剤が芳香族化合物と同時に溶液から除去される請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
溶液が血漿または血漿産生物である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は生成物含有溶液からの芳香族化合物の除去方法に関する。
アクリジンまたはアクリジン誘導体のような芳香族化合物は、長い間医薬に、例えば外傷の治療薬に使用されてきた。さらに、アクリジンおよびアクリジン誘導体がエンベロープ含有ウイルスおよびエンベロープ非含有ウイルス例えばポリオウイルスを不活化するのに使用され得ることは知られている。この点で、アクリジンおよびアクリジン誘導体がウイルス不活化に使用された後に、最終生成物中のそれらの濃度が長期治療の場合でも毒物学的に無害のままであるようにそれらを再び除去することが極めて重要であることがある。
【０００２】
溶液からアクリジン類を除去する簡単な方法は，それらを塩析することからなる。例えばリバノール（Rivanol(R)）は種々のタンパク質精製工程において塩析により生成物から分離された。しかし、この操作は血漿タンパク質への適用性に関して種々の不利点がある。すなわち第１にある種のタンパク質およびそれより生ずる生成物が共沈し、収量の損失が生ずる。第２にこのような操作でのアクリジンおよび／またはその誘導体の分離はそこでの１工程後において完全ではない。しかし、医薬調製工程の場合には、添加した剤をほんの数ｐｐｍのみが生成物中に未結合形態でまだ存在する程度に再び凅渇させることは可能であるはずである。このことは例えば長期治療の状況下で反復投与すべき物質を調製する場合には特に重要である。
【０００３】
血漿タンパク質の沈殿による血漿タンパク質生成物からの非変性、両親媒性物質の分離はＥＰ−Ａ−００５００６１に開示されている。しかし、前述のように高純度生成物を得るのに沈殿法は好都合でないことが多い。
Ｃ−６〜Ｃ−２４樹脂上での疎水性交換クロマトグラフィーを用いて生物学的物質から製造工程で生ずる液体可溶性化学薬品を除去する方法はヨーロッパ特許第０３００９４６に開示されている。
【０００４】
従って、本発明の目的は生成物の組成または同時に生ずる個々の成分の構造を有意に変化させずに生成物含有特にタンパク質含有の溶液から芳香族化合物を除去することができる方法を入手することにある。これにより、存在する溶液のいずれもの生物活性は大いに維持され得る。
さらに別の目的は、生成物に結合した芳香族化合物もまた溶液から除去され得るか、あるいはまた芳香族化合物の生成物への結合が防止されるかまたは少なくとも遅延されるようにして上記方法を設計することにある。
【０００５】
今や、本発明によれば支持体物質が芳香族化合物に対して高アフィニティーを有しそして生成物に対して低アフィニティーを有することを必須条件として、生成物含有溶液をその支持体物質に接触させることにより該溶液から芳香族化合物を除去し得ることが見いだされた。
【０００６】
アクリジン、ヒペリシン、プソラレン、メチレンブルーおよびこれら化合物の誘導体が生成物含有溶液から除去されるのが好ましい。アクリジンおよび／またはアクリジン誘導体が該溶液から除去されるのが特に好ましい。
アクリジン誘導体の例としてはエタクリジン、９−アミノアクリジン（＝Aminacrine)、３,６−アクリジンジアミン（Proflavine)、アクリソルシン、アクリザンクロリド（＝phenacridan chloride)、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド（Acricid)、アクリドン、９−アクリジンカルボン酸、アクラニル（１−〔（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリニジル）アミノ〕−３−（ジエチルアミン）−２−プロパノールジ塩酸塩)、３,７−ジアミノ−５−フェニルフェナジニウムクロリド（phenosafranin, safranin B extra)、フェノキサジン、フェノチアジンおよびアクリフラビン（３,６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロリド）およびまたそれらの塩例えば塩酸塩、硫酸塩および臭化水素酸塩を挙げることができる。好ましいアクリジン誘導体はプロフラビンおよびアクリフラビンである。
【０００７】
この新規方法において、タンパク質溶液またはペプチド溶液は生成物含有溶液として特に好ましい。水溶液も同様に好ましく用いられる。この溶液は例えば下記の出発物質を含有する：
血漿、血清、寒冷沈降物、フィブリノーゲン、トロンビン、プロトロンビン、因子Ｖ、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ、因子XII、因子XIII、アンチトロンビンIII、アルブミン、プレアルブミン、α−グロブリン類、β−グロブリン類、γ−グロブリン類、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、フィブロネクチン、α１−抗プラスミン、抗トリプシン、プラスミノーゲン、プラスミン、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＣ阻害剤、凍結乾燥血清、フラクションＩ、フラクションII、フラクションIII、フラクションIV、フラクションIV−１、フラクションIV−２、フラクションIV−３、フラクションIV−４、フラクションＶ、フラクションVI、レチノール結合タンパク質、トランスフェリン、キニノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、カリクレイン、トロンボモデュリン、ビトロネクチン、ＧＣグロブリン、マクログロブリン、白血球プロテイナーゼ阻害剤、生長因子、正常細胞および永久細胞からの細胞培養上澄み液、正常細胞および永久細胞からの抽出物、全血液、体液、細胞懸濁液、細胞培養上澄み液、ハイブリドーマの抽出物、動物および植物組織の抽出物、微生物の抽出物または上澄み液、トランスジェニック細胞または動物の分泌物、培養液、植物細胞の抽出物または懸濁液、臓器抽出物、ミルク、抗原製剤またはワクチン。
【０００８】
芳香族化合物に対して高アフィニティーを有しそして生成物に対して低アフィニティーを有する物質はいずれも支持体物質として使用できる。ここでのアフィニティーはこの場合、物質を保持しまたは結合させ得る支持体物質の能力を意味するものと解される。従って、高アフィニティーおよび低アフィニティーはそれぞれ、溶液が支持体物質に接触する場合に、支持体が芳香族化合物を大いにまたは好ましくは本質的に完全に保持または結合し得る能力および生成物を僅かにしかまたは好ましくは全く保持または結合しない能力を意味するものと解される。適当な支持体物質の例としてはゲルマトリックス、イオン交換マトリックス、極性型に調製された支持体および疎水的に調製された支持体を挙げることができる。
【０００９】
ゲルマトリックスはゲルクロマトグラフィーで知られている。それらの活性はそれらの孔構造または孔サイズに基づいている。特定のサイズ（分子質量）までの分子だけがそれらの孔の中に拡散することができる。より大きな分子はそれらの孔の中に浸透することができず（ゲルの排除限界）、溶媒により飛沫同伴される。
【００１０】
本発明により用いることのできるゲル支持体物質の例としては、ファーマシア（Pharmacia）社製の商標名Sephadex(R)（デキストランマトリックス）およびセファロース（アガロースマトリックス）、メルク社製の商標名Fractogel(R)（ビニルポリマーマトリックス）およびビオセプラ（Biosepra）社製の商標名Hyper D(R)から得られるゲルを挙げることができる。
【００１１】
しかし、かかるゲルの分離効率は一般的には非常に高いという訳ではない。すなわちそれらは例えばアクリジンおよびアクリジン誘導体のような比較的小さな分子を非常に強くは結合させない。例えば慣用のゲルを詰めたゲルろ過カラムを介してリバノール含有溶液をクロマトグラフィー処理すると、黄色リバノールがカラム全体にわたって不鮮明になっているのが観察された。
このため、本発明によれば、そのアフィニティーが、保持されるべき物質の分子質量のみならずこの物質の化学的性質にも左右されるような化学的に調製された支持体物質が好ましい。
【００１２】
本発明により除去され得る多くの物質はまたそれらの芳香性、疎水性の基本構造の外に極性性質も示す。すなわちそれらは生理学的ｐＨで荷電した側鎖基例えばアミノ基を依然として有することがある。例えばプロフラビンの場合には、２個のアミノ基がｐＨ７.０で９７％プロトン化され、その結果荷電している。このために、この新規方法にはイオン交換支持体が適している。
【００１３】
イオン交換クロマトグラフィーで知られた支持体物質はイオン交換支持体として使用するのに適当である。この場合、支持体物質は容易に分離可能な対イオンを有するイオン性基を担持している。例えば荷電したアクリジン誘導体のようなイオン性物質は、このような支持体物質と接触するとその対イオンでの“交換”により吸着される。
【００１４】
知られたイオン交換支持体物質は例えば前述の商標名セファロース、フラクトゲル、セファデックスおよびハイパーＤで同様に市販されており、これらのゲルは適当な荷電基を有している。例えばアクリジンおよびアクリジン誘導体のような多くの芳香族化合物の極性性質のために、これらの化合物はまた極性型に調製された支持体を用いて溶液から除去され得る。このための適当な支持体物質の例としてはシアノ、アミノまたはヒドロキシル基例えばシアノプロピル、アミノプロピル、ジオール、アミノエチルおよびジエチルアミノ基で調製されたものを挙げることができる。
【００１５】
極性型に調製された知られているゲル支持体物質はメルク社（Darmstadt）製の商標名LiChroprep CN(R)、LiChroprep NH2(R)およびLiChroprep Diol(R)で市販されている。これらの支持体物質はまた例えばビオセプラ社（Biosepra）製の商標名SDR Hyper D(R)ゲルのような混合ポリマーをも包含する。
【００１６】
疎水性型に調製された支持体物質例えば知られている逆相ゲル支持体は本発明によれば特に好ましい。ここでは、Ｃ1〜Ｃ24側鎖で疎水的に調製される支持体物質が特に好ましい。これらの側鎖は線状または分枝状のＣ1〜Ｃ24−アルキルもしくはＣ3〜Ｃ24−シクロアルキルの側鎖基または芳香族側鎖基例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはtert-ブチル、およびまた線状または分枝状のペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、オクタデシル、イコサニル、テトラコサニル、フェニルまたはシクロヘキシルであることができる。これらの基およびまた置換された基の組み合わせ例えばフェニルアラニンもまた可能である。
【００１７】
生成物の収量損失をできるだけ少なくするためには、短い側鎖を有する疎水的に調製された支持体物質が好ましい。なぜならばこれらの物質はタンパク質に対して低アフィニティーを有しているからである。この場合、短い側鎖基は１〜５個の炭素原子を有する基特にＣ1〜Ｃ5−アルキル基を意味するものと解される。特に好ましいのはエチル基で疎水的に調製されたシリカゲルである。
支持体物質の上記カテゴリーに入る商業的製品としての例にはLiChroprep RP-2（メルク社製、 Darmstadt)、シラン化されたシリカゲル60（メルク社製、Darmastadt）およびTMS-250（Cl−アルキル化され、 トリメチルシリル基でエンド−キャップされている；TosoHass社製）がある。
【００１８】
生成物と支持体物質との親水性相互作用を減少させるには、従って収量の損失を少くするには、支持体物質の荷電された基を例えばジメチルシリル基またはトリメチルシリル基で遮断するのが有利である。例えばODS-Prep（C18, エンド−キャップされている；TosoHaas社製）およびPrep C18（Waters社製）はこの支持体物質のグループに入る。
前記支持体物質および１官能性基の外に、非極性機能およびイオン交換機能を合一したコポリマー支持体物質もまた本発明に適している。
【００１９】
シリカゲルおよびシリカゲル誘導体は支持体物質用の基体として用いるのに好適である。しかし、例えばポリスチレンをベースとする重合樹脂例えばAmberchrom(R)CG-161、Amberchrom(R)CG-300およびAmberchrom(R)CG-1000（これらの商標名でTosoHaas社より市販されている）もまたそれらが使用され得る作用ｐＨ範囲に関して利点を与える。
【００２０】
本発明によればカラムクロマトグラフィーまたはバッチクロマトグラフィーを用いて溶液を支持体物質と接触させることができる。さらに、支持体物質を介して溶液をろ過することによりまたは支持体物質上に溶液を流すことにより溶液を支持体物質と接触させることが可能である。これに関しては、支持体物質を含有するかまたはそれで被覆された適当な装置例えば膜に溶液を通過させるかまたはその上に溶液を流す。例えば官能基特に疎水性基または荷電基が固定されている膜が適当である。芳香族化合物はml当たり該物質５０ｍｇまでを含有する溶液から除去するのが好ましい。次に、溶液を支持体物質と接触させた後の該溶液中の芳香族化合物の残留含量を光度測定法例えば蛍光測光法により測定することができる。この残留含量は１ｐｐｍより少ないのが好ましいが、０.１ｐｐｍより少ないのが特に好ましい。
【００２１】
溶液を支持体物質と接触させた後の該溶液中の芳香族化合物の残留含量はとりわけ、芳香族化合物の生成物特にタンパク質との結合による。本発明によれば、溶液を支持体物質と接触させる前に該溶液に添加剤を加えることによってさらにこの残留含量を低下させることができ、その際この添加剤は実質的に芳香族化合物のタンパク質と結合を防止するかまたは既に結合した芳香族化合物を放出する。
適当な添加剤は疎水性および両親媒性物質例えば洗剤であり、それは０.１〜５％、好ましくは０.２〜１.５％および非常に好ましくは０.３〜１.２％の濃度でその溶液に加えることができる。
【００２２】
アクリジンまたはアクリジン誘導体によるウイルス不活化の後に芳香族化合物を除去する場合には、添加剤の添加について２つの可能性が生ずる。アクリジンまたはアクリジン誘導体によるウイルス不活化中のアクリジンおよびアクリジン誘導体のタンパク質との結合は、疎水性または両親媒性物質の添加によりタンパク質の疎水性領域が遮断されることにより減少するか、または既に結合したアクリジンまたはアクリジン誘導体がウイルス不活化後に疎水性物質または洗剤により置換されるかのいずれかである。タンパク質の結合したアクリジンまたはアクリジン誘導体をウイルス不活化後に生成物から単に分離するやり方は、特定の両親媒性物質または洗剤の添加がウイルス不活化法を否定的に妨げる場合には特に興味深い。この場合には、アクリジンまたはアクリジン誘導体による実質的なウイルス不活化の後に、タンパク質の結合したアクリジンまたはアクリジン誘導体を放出する目的で添加剤を添加することだけが可能である。
【００２３】
添加剤は芳香族化合物と同時に溶液から除去するのが好ましい。アクリジンおよび／またはアクリジン誘導体および洗剤例えばTriton X-100の同時除去を逆相クロマトグラフィーを用いて、Ｃ1−〜Ｃ24−側鎖基が結合するシリカ支持体物質にこれらの物質を結合させることにより実施するような新規方法が特に好ましい。
【００２４】
適当な添加剤の例はポリビニルアルコール類（PVA)、ポリビニルピロリドン類、トウィーン２０（Tween(R)20)、トウィーン４０（Tween(R)40)、トウィーン６０（Tween(R)60)、トウィーン８０（Tween(R)80)、ノニデットＰ４０（Nonidet(R)P40)、ポリエチレングリコール類、デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、エトキシル化アルキルフェノール（例えばTriton(R)X-100)、部分的に脂肪酸でエステル化されたポリオキシエチレン（例えばMyrj 45)、ポリオキシエチレン脂肪アルコール誘導体（例えばBrij)、ドデシル−Ｎ−ベタイン、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−β−アラニン、Ｎ−ドデシルアミノエタンスルホン酸、テトラデシルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルピリミジニウムクロリド、エチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合物（Pluronic ブロックコポリマー）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルベンジルアンモニウムクロリド（Triton(R)K-60)、エトキシル化アミン（Ethomeen)、硫酸化エトキシル化アルキルフェノール（Triton(R)W-30）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Igepon A（スルホエチルスルホン酸ナトリウム）、Igepon T（Ｎ−メチル−Ｎ−オレイルエタノールスルホネート）およびNacconol(R)NR（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）である。
【００２５】
ここで用いる商標名の、既述されていない化学名は下記のとおりである。
Tween(R)20：ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノラウレート
Tween(R)40：ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノパルミテート
Tween(R)60：ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノステアレート
Tween(R)80：ポリ（オキシエチレン)nソルビタンモノオレアート
Nonidet(R)P40：エチルフェノールポリ（エチレン)nグリコールエーテル
CHAPS：３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート
Triton(R)X-100：オクチルフェノールポリ（エチレン)nグリコールエーテル
【００２６】
さらに別の態様において、この新規方法はアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体でウイルスを不活化する方法でもある。例えば、ウイルス不活化血漿の調製方法はアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体を血漿に加え、そのアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体を血漿とともにインキュベートし、次いでそのアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体を前述のようにして血漿から除去することからなる。この場合、アクリジンおよび／またはアクリジン誘導体はリットル当たり１０μｇ〜１０ｍｇの量で加えるのが好ましい。インキュベーションは１〜６時間行うことができ、全工程は好ましくは２℃〜５０℃特に好ましくは１０℃〜３７℃または１０℃〜２５℃で実施する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様では、ウイルス不活化工程でインキュベーション段階後に添加剤を加える。その際添加剤はアクリジンおよびアクリジン誘導体のタンパク質への結合を実質的に防止するかまたは既に結合したアクリジンおよびアクリジン誘導体を実質的に放出する。このためには洗剤例えばTriton X-100またはTriton X-114を１％まで、好ましくは０.２〜０.８％、非常に好ましくは０.４〜０.７％の濃度で加える。次いでこのアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体はその添加剤と一緒に１段階で、疎水性支持体物質特にＣ2−またはＣ18−支持体物質を含有するクロマトグラフィーカラム例えばLiChroprep-RP-2 カラムに通して分離除去するのが好ましい。
【００２８】
この態様においては、ウイルス不活化された溶液をTriton X-100で処理し、それを例えば撹拌下で５〜６０分間好ましくは５〜３０分間インキュベートし、次いでアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体およびTriton X-100をもクロマトグラフィーカラムで除去するのがさらに好ましい。
【００２９】
この新規方法には、生成物含有溶液特にタンパク質溶液から生成物組成の有意な付随変化または溶液の生物活性の変化を何らもたらさずに芳香族化合物を除去することができるという利点がある。 さらに、アクリジンおよび／またはアクリジン誘導体を使用するウイルス不活化法とこれらの物質を該溶液から除去する新規方法を組み合わせることから、ウイルス含有物質の初期クロマトグラフィーにおいてまたはアクリジンおよび／またはアクリジン誘導体によるかのいずれかで不活化されなかったウイルス（例えばエンベロープ非含有ウイルス例えばパルボウイルスまたはエンベロープ含有ウイルス例えばＢＶＤＶウイルス）が支持体物質により保持され、その結果生成物溶液から除去され、それにより製造工程中にウイルスの全凅渇に寄与するという利点が生じる。
【００３０】
さらに別の利点はＣ2−疎水的に調製された支持体物質の使用にある。その理由は、水溶液からの芳香族化合物の結合が迅速かつ効率的に進行し、実質的に疎水性の物質（例えば非ウイルス性由来のタンパク質）は結合せず、そのため起こり得る生成物損失が最小に保たれるからである。これにより例えば、非常に高いタンパク質収量および非常に高い活性に特徴を有するウイルス含有タンパク質溶液から芳香族化合物を迅速に除去することができる。
【００３１】
〔実施例〕
以下に本発明を実施例により明確にする。重量％で記載のアクリフラビンおよびプロフラビン濃度の値を除けば、濃度の値は容量％で示される。
【００３２】
実施例  １
LiChroprep RP-2 を使用することによる因子VIII含有溶液からの０.００１％アクリフラビンの除去
この実施例および以下の実施例では、重量％で記載のアクリフラビンおよびプロフラビン濃度の値を除けば、濃度の値は例えば実施例２および３におけるＰＶＡおよびTritonに関する値のように容量％で示される。
０.００１％アクリフラビンを因子VIIIおよびフォンビルブラント因子をＯＤ280-320２.５およびｐＨ６.９で含有する溶液２０mlと混合する。次いで混合物を、４mlのLiChroprep RP-2 を含有するカラムにポンプで通過させる。アクリフラビン０.２ｐｐｍのみが依然として実験の間中存在する。このアクリフラビンを４５０ｎｍで光度測定法で測定する。
【００３３】
実施例  ２
ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンの存在下における、LiChroprep RP-2 を使用することによる因子VIII含有溶液からの０.００１％アクリフラビンの除去
最終濃度０.００１％までのアクリフラビンおよび種々の濃度のポリビニルアルコールＰＶＡ（ヘキスト社製）またはポリビニルピロリドンＰＶＰ  Ｋ６０（ＢＡＳＦ社製）を因子VIIIおよびフォンビルブラント因子をＯＤ280-320２.５およびｐＨ６.９で含有する溶液２０mlと混合する。次いで混合物を４mlのLiChroprep RP-2 を含有するカラムにポンプで通過させる。次いでタンパク質溶液中のアクリフラビン含量を光度測定法で測定する。後記表１から分かるように、タンパク質へのアクリフラビンの非特異的結合は濃度に依存して、ＰＶＡおよびＰＶＰの両方により防止され得る。
【００３４】
【表１】
0004047407.tif 000002
【００３５】
実施例  ３
LiChroprep RP-2 を使用することによる、トリトンＸ−100添加後の因子VIII含有溶液からの０.００１％アクリフラビンの除去
最終濃度０.００１％までのアクリフラビンを因子VIIIおよびフォンビルブラント因子をＯＤ280-320２.５およびｐＨ６.９で含有する溶液２０mlと混合する。４時間のインキュベーション後にトリトンＸ−100を種々の濃度で混合物とさらに混合し、１０分間撹拌した後に混合物を４mlのLiChroprep RP-2 を含有するカラムにポンプで通過させる。次いでタンパク質溶液中のアクリフラビン含量を光度測定法で測定する。後記表２から分かるように、アクリフラビンはトリトンＸ−100により、濃度に依存して、タンパク質へのその非特異的結合から置換され得る。
【００３６】
【表２】
0004047407.tif 000003