(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有することを特徴とする拡張型心筋症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は拡張型心筋症の治療及び予防に有効な薬剤に関する。より詳細には肝実質細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor, ＨＧＦ)を有効成分として含有する拡張型心筋症治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
拡張型心筋症の主な病態は心筋収縮力の低下であり、その結果左室内腔の拡大をきたす。左室拍出血液量の減少、左室拡張期圧の上昇をきたしやすく、鬱血性心不全を引き起こしやすい状態にある。しかし、すべてが鬱血性心不全に陥るわけではなく、この意味では従来の鬱血性心筋症という名称よりは拡張型心筋症のほうが合理的である。発症は急性のことも、また潜行性のこともあるが、末期では難治性心不全を呈することが多い。
病理組織学的には、びまん性にあるいは局所的に心筋組織の変性、線維化、萎縮が認められる。残存心筋細胞が肥大している例も多い。原因としてアルコール多飲、ウイルス感染後遺症、微小血管のスパスム、免疫機序などが考えられているが不明である。一部は家族内発生があり、劣性遺伝が示唆される。心不全のほか重篤な不整脈、血栓塞栓症をきたし、予後はきわめて不良である。鑑別すべきものに、虚血性心疾患、心不全をきたす二次性心筋疾患、高血圧性心疾患などがある。しかし、拡張型心筋症の治療に際してはおのおのの因子を単独に抑制するだけでは不十分で同時に多因子を抑制する必要があり、今後はこのような方向で治療を考えていかなければならない現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
拡張型心筋症は米国では心不全患者の約４分の１を占め、心臓移植対象患者の約半数を占める難治性疾患である。近年、拡張型心筋症の病因と推定されるものがいくつか明らかとなってきた。１９９５年のWHO/ISFC委員会による拡張型心筋症の定義には、遺伝素因、ウイルス感染、アルコールなどが原因であることを示唆する記述がなされている。現在、拡張型心筋症はその病因、病態により分類される傾向にある。
ウイルス感染症や免疫異常などにより慢性炎症が持続することにより多くの転写因子が同時に活性化され、自己抗体の産生、MHCや接着分子の発現の亢進、サイトカインの産生、癌遺伝子の活性化などが持続することが考えられる。また遺伝素因により、変異した遺伝子の産物やMHCを介した免疫異常により、心筋細胞を持続的に障害していることも考えられる。これらの持続的な心筋細胞への障害から、拡張型心筋症類似病変へ進展すると考えられるが、この機序はなお不明である。しかし、拡張型心筋症の治療に際してはおのおのの因子を単独に抑制するだけでは不十分で同時に多因子を抑制することが必要であり、今後はこのような方向で治療を考えていかなければならない現状である。
【０００４】
拡張型心筋症の基本的な病態は左心不全による肺鬱血と心拍出量の制限であり、労作時呼吸困難や易疲労性のため日常生活が制限されていることが多い。右心不全合併例では抹消浮腫も認める。血行動態の改善による症状の軽減は、患者の信頼を得るためにも当面の重要な治療目標である。しかし本症の心筋不全は進行性で予後不良であるため、長期的には延命も重要な治療目標である。本症の原因治療は現状では不可能であるが、最近になり心筋不全の進展促進因子や抑制因子についての理解が深まり、進展を抑制し延命効果を示す薬剤も登場してきた。心筋不全促進因子としては交感神経およびレニンーアンジオテンシンーアルドステロン系の亢進が重要とされている。これらの因子の抑制により心不全の進展が抑制されるだけでなく、ある程度の心筋不全の回復も期待できる。当然、その場合には二次的に心不全症状も軽減する。心不全症状の軽減、心不全進展抑制のいずれの治療目標にも、薬物治療とともに適切な生活指導が欠かせない。また感染、貧血、甲状腺機能異常などは心不全の増悪因子となるため、予防、早期治療が必要である。糖尿病、アルコール過飲、長期に持続する頻脈なども拡張型心筋症に類似の心筋不全をもたらすことがあるが、これらの場合には、基礎疾患の是正により心筋不全は著しく改善するのが通常である。拡張型心筋症の合併症として特異的なものはないが、一般の心不全と同様、不整脈と心腔内壁在血栓による塞栓症があり、これらは直接死因としても重要である。
いずれにしても拡張型心筋症は、５年生存率で５０ー６０％であり、しかも、予後不良の疾患であり、その成因の解明、そして有効な治療法の開発が切に望まれている。
【０００５】
本発明者等は、かかる観点から、拡張型心筋症に対してＨＧＦが抑制、改善あるいは予防の作用を有することを見出し、ＨＧＦが拡張型心筋症の予防・治療に有用であることが判明した。
上記のＨＧＦは肝実質細胞をin vitroで増殖させる因子として見出されたタンパク質である（Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1986, FEBS Letter, 22, 311, 1987, Nature, 342, 440, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990）。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見されたＨＧＦは、本発明者らをはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治癒などの種々の活性を示していることが明らかとなり、研究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。
ＨＧＦは主に間葉系の細胞により産生されていることが解明されており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給される、所謂パラクリン機構が成立していることが明らかにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにおいてもＨＧＦの産生が高まることから、所謂エンドクリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えられる。
このようなＨＧＦの受容体に関して、最近の研究から、c-Met原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが確定的になった（Bottaro et al., Science 251, 802-804, 1991; Naldini et al., Oncogene 6, 501-504, 1991）。
上述のようにＨＧＦに関して多くの知見が得られているが、ＨＧＦが拡張型心筋症に対して、抑制、改善あるいは予防が可能であることは従来知られていない新知見である。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は新規な拡張型心筋症治療剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成分として含有することを特徴とする拡張型心筋症剤に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる（FEBS Letters, 224, 312, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照）。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる（例えば、Nature, 342, 440, 1989, 特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００８】
より具体的にはＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えばラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を抽出して摘出して粉砕し、S-セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸をコードする遺伝子を、ウシパピローマウイルスDNAなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウスC127細胞、サルCOS細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００９】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されたり、N末端及び/又はC末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００１０】
本発明の治療剤は上記のＨＧＦを有効成分とし、ＨＧＦは、後記試験例に示されるように、拡張型心筋症の自然発症モデルであるハムスターBio53.58による拡張型心筋症に対して抑制、改善あるいは予防の効果を有する。更に、ＨＧＦは障害を受けていない組織には作用を示さず、障害を受けている組織にのみ作用するので、副作用を惹起するおそれが少ないという特長を有する。従って、本発明の治療剤は、拡張型心筋症の治療・予防に有効である。
本発明の治療剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）における拡張型心筋症の治療・予防に適用される。
【００１１】
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、座剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002-0.2(w/v%)程度、好ましくは0.001-0.1(w/v%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。座剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１２】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合には凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
本発明の治療剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常、ＨＧＦとして0.05mg-500mg、好ましくは1mg-100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１３】
【発明の効果】
本発明において、有効成分であるＨＧＦは、拡張型心筋症に対して抑制、改善あるいは予防の作用を有する。従って、本発明の治療剤は、前述した拡張型心筋症の治療・予防に有効である。更に、ＨＧＦは、障害を受けている組織のみに作用するので、副作用の少ない薬剤を得ることができるという効果を奏する。
【００１４】
【実施例】
以下、試験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
試験例１
拡張型心筋症の自然発症モデルであるハムスターBio53.58での試験
拡張型心筋症の自然発症モデルであるハムスターBio53.58（３ヶ月令）を使用して、ＨＧＦを450μg/kg、１日１回、３０日間、皮下投与した。ＨＧＦ投与群は１０例、コントロールとしての生食投与群は８例を対象として試験を行った。その結果は以下のとおりである。
▲１▼心エコードップラーによる心室径(Cardiac Dimension)の測定により、ＨＧＦ投与群と生食投与群を比較した結果では、心拍数（ＨＲ）、左室容積［拡張末期径（ＥＤＤ）、収縮末期径（ＥＳＤ)］、壁厚［心室中隔 Ｔｈ（ＩＶＳ）、後壁Ｔｈ（ＰＷ）］に関しては影響はなかった(図１参照)。
▲２▼収縮機能(Systolic Function)については、左室駆出率(ＬＶＥＦ)、左室内径短縮率(ＦＳ)、壁肥厚率［心室中隔 Thickening(IVS)、後壁 Thickening(PW)］が有意に改善した（図２参照）。
▲３▼拡張機能(Diastolic Function)については、心房流入血流が高くなっている傾向があるが、拡張早期僧帽弁口血流流入速度(Early Diastolic Mitral Flow Velocity)、心房収縮期僧帽弁口血流流入速度(Peak Mitral Flow Velocity at Atrial Contraction)、Ａ／Ｅ、減衰時間(Deceleration time)に有意差はなかった（図３参照）。
▲４▼心筋重量、左室の重量には有意な変化はなかった。
▲５▼病理組織学(Histopathology)的検討では、ＨＧＦ投与により、膠原線維の減少［線維症(% Area Fibrosis in the Ventricles)の減少、つまりアニリン青に染まる線維組織面積の減少、ヒドロキシプロリン含量(Hydroxyproline Content)の減少）、筋細胞(Myocyte Diameter)が比較的大きく、空胞化、核の異形成の抑制が観察された（図４参照）。また、ＨＧＦ投与群では、カルシウムの沈着、炎症性細胞の浸潤も少なかった。
以上より、ＨＧＦは拡張型心筋症のモデルであるハムスターBio53.58の心筋症に有効であることが判明した。
【００１５】
実施例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００１６】
実施例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＧＦ投与群と生食投与群について、心拍数（ＨＲ）、左室容積［拡張末期径（ＥＤＤ）、収縮末期径（ＥＳＤ)］、壁厚［心室中隔 Ｔｈ（ＩＶＳ）、後壁 Ｔｈ（ＰＷ）］を比較した図である。
【図２】ＨＧＦ投与群と生食投与群について、左室駆出率(ＬＶＥＦ)、左室内径短縮率(ＦＳ)、壁肥厚率［心室中隔 Thickening(IVS)、後壁 Thickening(PW)］を比較した図である。
【図３】ＨＧＦ投与群と生食投与群について、拡張早期僧帽弁口血流流入速度、心房収縮期僧帽弁口血流流入速度、Ａ／Ｅ、減衰時間を比較した図である。
【図４】ＨＧＦ投与群と生食投与群について、％線維症面積、ヒドロキシプロリン含量、筋細胞径を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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