(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３、４、５又は６に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数を増幅することにより酢酸耐性が増強された微生物。
【請求項８】
微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する酢酸耐性遺伝子(Acetic acid resistance gene）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００５】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.），１７２巻，２０９６頁，１９９０年）。
【０００６】
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（J. Ferment. Bioeng.），７６巻，２７０頁，１９９３年）。
【０００７】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上程度が僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（特開平３−２１９８７８号公報）。
【０００８】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が特開平２−２３６４号公報に開示されている。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００９】
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【００１０】
【発明が解決するための課題】
本発明は、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な酢酸耐性遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを課題とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する酢酸耐性遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢の効率的な製造法を開発することが可能になると考えた。
【００１２】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
【００１３】
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸の存在下で特異的に発現しているタンパク質を検索し、そのタンパク質をコードする遺伝子を取得するといった、従来全く行われていなかった方法を開発した。
【００１４】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター属とグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることに成功した。
【００１５】
得られた酢酸耐性遺伝子は、大腸菌などで見出されており、ＡＴＰバインディングカセット（ATP binding cassette）を有するＡＢＣトランスポーターと称される一群のタンパク質に共通する特徴的な塩基配列を有しており、酢酸菌のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子（ＡＢＣトランスポーター遺伝子）であると推定された。
【００１６】
しかし、取得された酢酸菌の酢酸耐性遺伝子を、大腸菌などの他の微生物で見出されている既知のＡＢＣトランスポーター遺伝子と比較したところ、相同性がきわめて低くかったことから、ＡＴＰ結合部位を有する点では他のＡＢＣトランスポーター遺伝子と似ているものの該酢酸耐性遺伝子は酢酸菌に特異的な新規タンパク質をコードする新規遺伝子であるこが判った。
【００１７】
一方、取得された酢酸耐性遺伝子について、食酢製造に使用されているアセトバクター属の酢酸菌由来のものとグルコンアセトバクター属の酢酸菌由来のもので比較したところ、両者の相同性は約７０％であり、酢酸菌間での相同性は高かった。
【００１８】
さらに、取得された酢酸耐性遺伝子を用いた相同組換えによって該酢酸耐性遺伝子を破壊した酢酸菌は、酢酸に対する耐性が低下するが、類縁の各種有機酸に対する耐性はほとんど変化しなかったことから、該酢酸耐性遺伝子は酢酸に対する耐性に特異的に関与する遺伝子であることが明らかとなった。
【００１９】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換してコピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、その結果、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度が向上し、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上し、より高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の（１）〜（９）からなるものである。
【００２０】
（１）  以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【００２１】
（２）  以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【００２２】
（３）  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【００２３】
（４）  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質。
【００２４】
（５）  配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２５】
（６）  配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる酢酸耐性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
（７）  (３)、(４)、(５)又は(６)に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数を増幅することにより酢酸耐性が増強された微生物。
【００２７】
（８）  微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項（７）に記載の微生物。
【００２８】
（９）  （７）又は（８）に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【００２９】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、ＡＴＰバインディングカセット（ATP binding cassette）を持つなど、ＡＢＣトランスポーターのモチーフを有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列表配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含むものである。
【００３１】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号１の塩基番号３０１〜２０７３又は配列表配列番号３の３３１〜２１５４からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
配列番号1又は３に示す塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋにおいて相同遺伝子を検索したところ、大腸菌（Escherichia coli）のＡＢＣトランスポーター遺伝子の一つであるＵＵＰ遺伝子とアミノ酸配列レベルで３８．５％、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophillus influenzae）のＵＵＰ遺伝子ともアミノ酸配列レベルで３８．１％の相同性を示すことが分かったが、いずれも３０％台の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。また、上記のＵＵＰ遺伝子は機能が不明であり、当然ながら酢酸耐性と関係していることは全く知られていない。
【００３３】
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）として用い、酢酸菌、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes ＭＨ−２４:FERM BP-491)のゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オブ・ジェネテェックス（Trends Genet. ）５巻，１８５頁，１９８９年）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、前記酢酸菌のゲノムＤＮＡイブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の酢酸耐性又は該酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００３６】
このような酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００３７】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００３８】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３０１〜２０７３からなる塩基配列を有するＤＮＡや該塩基配列の一部を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＴＰバインディングカセットを有し、酢酸耐性又は該酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００３９】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００４０】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する細菌をさし、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属の細菌及びグルコンアセトバクター属の細菌、または酢酸耐性が低下したアセトバクター属の細菌及びグルコンアセトバクター属の細菌である。
【００４１】
アセトバクター属の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株  （特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
【００４２】
また、グルコンアセトバクター属の細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。
【００４３】
酢酸耐性の増強は、例えば酢酸耐性遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属の酢酸菌の中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属酢酸菌を形質転換することによって増強することができる。
【００４４】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
【００４５】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００４６】
マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）やｐＴＡ５００１(a)、ｐＴＡ５００１(b)（特開昭６０−９４８８号公報）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）５２巻，３１２５頁，１９８８年）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００４７】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）４９巻，p.２０９１，１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７４頁、１９９４年）等によって行うことができる。
【００４８】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００４９】
該遺伝子を破壊して酢酸耐性を低下させたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、例えば、該遺伝子の一部を破壊して不完全な形にした遺伝子を有するＤＮＡ断片を該微生物に導入し、該微生物の染色体上の該遺伝子との相同組換えにより、染色体ＤＮＡに不完全な形の遺伝子を組み込むことにより得ることができる。
【００５０】
具体的には、例えば、該遺伝子内部にカナマイシン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子を挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌を形質転換し、カナマイシン等の薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上に元々存在する該遺伝子配列との組換えを起こし、染色体上の該遺伝子が薬剤マーカー遺伝子を挿入した不完全な形の該遺伝子と入れ替わったものである。
【００５１】
（３）食酢製造法
上記のようにして、酢酸耐性遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であって、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
【００５２】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
【００５３】
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００５４】
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００５５】
【実施例】
（実施例１）アセトバクター・アセチの酢酸耐性遺伝子のクローニングと該遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）酢酸耐性遺伝子のクローニング
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）を１％の酢酸を含むＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）を用いて、３０℃で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）して菌体を得た。また、酢酸を含まないＹＰＧ培地でも、同様にして培養して、菌体を得た。
【００５６】
得られたこれらの菌体を、それぞれソニケーションにより破砕し、その菌体破砕液を遠心分離（１２，０００×g、１０分間）して得られた上澄液を、さらに超遠心分離（４００，０００×ｇ、１時間）を行なうことによって沈殿物（不溶性蛋白質）を得た。その後、この沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。
【００５７】
この懸濁した沈殿物を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４％ＳＤＳ、１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００４％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）に１：１の比率で懸濁し、沸騰水浴中で３分間加熱処理した。このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＣＢＢ染色し、１％の酢酸を含むＹＰＧ培地で生育したものと、酢酸を含まないＹＰＧ培地で生育したものとを比較しところ、分子量約７０ｋＤａのバンドが１％酢酸を含む培地で生育したもので発現が増幅しているのが確認された。
【００５８】
このように発現が増幅していたバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、アミノ末端のアミノ酸配列をプロテインシークエンサーにて決定した。決定したアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕであった。
【００５９】
上記のアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドを合成し、これをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株から定法により染色体ＤＮＡを抽出し制限酵素ＰｓｔＩで完全分解したものに対して、サザンハイブリダイゼーションを行なった。
【００６０】
その結果、約２．５ｋｂｐの位置にポジティブなバンドを確認した。このバンドをアガロースゲルより抽出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９の制限酵素ＰｓｔＩ切断部位にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、１００μg／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーをサザンハイブリダイゼーションで用いたと同じオリゴヌクレオチドをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブな形質転換体を単離した。
【００６１】
その後、プラスミドＤＮＡをポジティブな形質転換体より分離し、挿入断片の構造を制限酵素マッピングにより解析し、その結果、図１に示した約２．５ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を確認した。
【００６２】
（２）クローン化された遺伝子断片の塩基配列の決定
上記挿入断片の大部分について、塩基配列をサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。塩基配列の決定は、両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。その結果、配列番号1に記載した塩基配列が決定された。
【００６３】
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号３０１から塩基番号２０７３にかけて、配列番号２に記載したような５９１個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番号２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−であり、先に決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と完全に一致することが確認された。
【００６４】
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列のタンパク質には、ＡＴＰバインディングカッセットをアミノ酸番号３９〜４６と３１４〜３２１の２個所に持つなど、ＡＢＣトランスポーターのモチーフを有していることが確認された。
【００６５】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１菌株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００６６】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ及び酢酸―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻、１７１頁、１９８９年）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2，宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００６７】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.) ,５８巻、９７４頁、１９９４年）で形質転換し、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で４日間培養した。
【００６８】
生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、約３．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片がクローン化されており、該断片の構造を制限酵素マッピングにより解析し、その結果を図２に示した。また、クローン化されたＤＮＡ断片のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸を含むＹＰＧ培地で生育可能にする断片は、Ｓｐｈｌ−ＥｃｏＲＩ断片であった。
【００６９】
このようにして通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有培地でも増殖可能にする上記Ｓｐｈｌ−ＥｃｏＲＩ断片からなる酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００７０】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例１と同様に、酢酸耐性遺伝子を含有する断片の塩基配列をサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。その結果、配列番号３に記載した塩基配列が決定された。アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の場合と同様に、配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００７１】
配列番号３記載の塩基配列中には、塩基番号３３１から塩基番号２１５４にかけて、配列番号４に記載したような６０８個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番号４に記載のアミノ酸配列のタンパク質には、ＡＴＰバインディングカセットのモチーフをアミノ酸番号４１〜４８と３１９〜３２６の２個所に有していた。
【００７２】
（実施例３）相同組換で酢酸耐性遺伝子を破壊させた遺伝子破壊株の造成と該遺伝子破壊株の酢酸耐性の特異的な低下
（１）相同組換えによる遺伝子破壊株の造成
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の破壊を目的として、図１に示すＰｓｔＩ断片をベクターｐＵＣ１８のＰｓｔＩ切断部位へ組み込んだ組換えプラスミドｐＵＣＭ１８１を構築した後、このｐＵＣＭ１８１の酢酸耐性遺伝子（Acetic acid resistance gene）の中に存在するＥｃｏＲＶ切断部位に、プラスミドｐＨＳＤ２９８（ジーン（Gene），６１巻，６３頁，１９８７年）のカナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片を組み込んだ組換えプラスミドｐＵＣＭＫ１８１を構築した。
【００７３】
このようにして構築したｐＵＣＭＫ１８１を、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci.Biotech.Biochem.),５８巻、９７４頁、１９９４年）で形質転換し、形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹＰＧ寒天培地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．２％、寒天２％、ｐＨ６．５）で選択した。
【００７４】
選択培地で増殖したカナマイシン耐性株から定法に従って染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、酢酸耐性遺伝子を含むＰｓｔＩ断片とカナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、カナマイシン耐性株の酢酸耐性遺伝子内にカナマイシン耐性遺伝子断片（１．６７ｋｂｐ）が挿入され、酢酸耐性遺伝子が破壊された酢酸耐性遺伝子破壊株が確認された。
【００７５】
（２）酢酸耐性遺伝子破壊株の有機酸耐性
上記で得られたカナマイシン耐性株、すなわち酢酸耐性遺伝子破壊株について、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸の有機酸に対する感受性を調べた。酢酸耐性遺伝子破壊株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ培地で、またその元株であるアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株はカナマイシン無添加のＹＰＧ培地で、３０℃で２４時間培養して得た培養液を、１．５％の酢酸、０．０２％のギ酸、０．１％のプロピオン酸、または０．１％の酪酸を添加した各ＹＰＧ培地にそれぞれ１％ずつ植菌し、また有機酸無添加のＹＰＧ培地にもそれぞれ１％ずつ植菌した後、３０℃にて振盪培養して増殖状況を比較した。増殖は６６０ｎｍにおける吸光度で測定した。
【００７６】
結果を図３に示したが、酢酸以外の有機酸では、該遺伝子破壊株は元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株とほぼ同等の増殖を示したが、酢酸を添加した時のみ、該遺伝子破壊株において増殖誘導期の遅延や増殖の低下が認められ、該遺伝子は酢酸に特異的な耐性に関与することが確認できた。
【００７７】
（実施例４）アセトバクター・アセチ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株由来の酢酸耐性遺伝子を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＰｓｔＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＢＣ１を作製した。
【００７８】
このｐＡＢＣ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.) ,５８巻、９７４頁、１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００７９】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００８０】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００８１】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での増殖を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００８２】
その結果、図４に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも比較的短い誘導期の後に旺盛な増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では誘導期が非常に長く、また増殖も比較的弱いことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００８３】
（実施例５）アセトバクター・アセチ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例４で得られたプラスミドｐＡＢＣ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸醗酵能を比較した。
【００８４】
具体的には、５Ｌのミニジャー（エイブル社製；ＢＭＳ−０５） を用いて、酢酸４％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、３００ｒｐｍ、０．１５ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表１にまとめた。
【００８５】
【表１】
0004157314.tif 000002
【００８６】
表１の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度、増殖誘導期の何れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。
【００８７】
（実施例６）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
（１）セトバクター・アセチへの形質転換
グルコンアセトバクター・エンタニイの1菌株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株由来の酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅し、その結果得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、この断片を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＢＣ１１を作製した。
【００８８】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を用いて、KOD−Plus−（東洋紡績社製）を使用し、下記するPCR条件にてPCRを実施した。
(PCR条件）９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００８９】
このｐＡＢＣ１１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.），５８巻，９７４頁，１９９４年）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００９０】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００９１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００９２】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００９３】
その結果、図５に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも比較的短い誘導期の後に旺盛な増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では誘導期が非常に長く、また増殖も比較的弱いことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００９４】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【００９５】
【配列表】
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0004157314.tif 000004
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【００９６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰｓｔＩを用いてクローニングされたアセトバクター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びｐＡＢＣ１への挿入断片とｐＵＣＭＫ１８１への挿入断片の概略図。
【図２】ＥｃｏＲＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びＡＢＣ１１への挿入断片の概略図。
【図３】酢酸耐性遺伝子破壊株の各種有機酸含有培地での培養特性を示す図面。
【図４】アセトバクター・アセチ由来の酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地の培養経過を示す図面。
【図５】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地の培養経過を示す図面。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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