(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学的センサーであって、
（ａ）電極；
（ｂ）熱安定性ペルオキシダーゼおよび該電極と該ペルオキシダーゼとの間で電子を移動させるための非浸出性レドックス中心を含む、該電極上の過酸化水素検知層；および
（ｃ）過酸化水素の産生を分析物の存在下で触媒することができ、ケイ素原子および酸素原子を含むマトリックス内に固定化され、該電極上の該検知層の近傍に配置されて該検知層から電気的に絶縁されている第２の酵素を含み、
さらに、過酸化水素とアスコルビン酸との透過率の比、または過酸化水素とアセトアミノフェンとの透過率の比、または過酸化水素と尿酸との透過率の比が２よりも大きい膜を含み、
該膜が前記第２の酵素を覆って配置されている、電気化学的センサー。
【請求項２】
前記熱安定性ペルオキシダーゼはダイズペルオキシダーゼである、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記非浸出性レドックス中心は、静電的に、共有結合的に、または配位結合的にポリマーに結合している、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記非浸出性レドックス中心はオスミウムカチオンを含み、該オスミウムカチオンは配位結合的にポリマーに結合している、請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
前記ポリマーは架橋され、水性溶液と接触して膨張し、その重量または容量の増大が少なくとも１０％である、請求項３に記載のセンサー。
【請求項６】
前記固定化マトリックスにおけるケイ素対酸素の比が約１：２と約１：４との間である、請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
有機ポリマーが、前記マトリックスにおいて前記第２の酵素とともに固定化されており；
該有機ポリマーは水溶性であり；
該有機ポリマーは、ｐＨ７において、前記第２の酵素の正味電荷に対抗する正味電荷を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のセンサー。
【請求項８】
前記センサーは、分子状酸素の透過係数が、２５℃で、１０-8ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍｃｍ-2ｓ-1（ｃｍＨｇ-1）よりも大きいポリマーを含む層であって、分析される溶液と前記第２の酵素との間に存在するように配置された層をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のセンサー。
【請求項９】
前記センサーはポリシロキサンをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１０】
前記センサーは、前記検知層および前記電極を覆って配置された生体適合層をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１１】
前記の第２の酵素を覆って配置されている膜が、過酸化水素とアスコルビン酸との透過率の比、または過酸化水素とアセトアミノフェンとの透過率の比、または過酸化水素と尿酸との透過率の比が５よりも大きい膜である、請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１２】
前記第２の酵素は、該酵素の固有のタンパク質構造によって前記検知層から絶縁されている、請求項１〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１３】
前記第２の酵素は、過酸化水素透過性膜またはポリマーによって前記検知層から絶縁されている、請求項１〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１４】
前記第２の酵素は、ケイ素含有マトリックスによって前記検知層から絶縁され、該マトリックスは、約１：２と約１：４との間のケイ素：酸素の比で酸素原子に共有結合したケイ素を含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１５】
前記マトリックスは、該マトリックスにおいて非ケイ素ポリマーをさらに含み、
該非ケイ素ポリマーは水溶性であり；
該非ケイ素ポリマーは前記の第２の酵素に結合している、請求項１４に記載のセンサー。
【請求項１６】
請求項１〜１５に記載のセンサーの製造に用いる酵素組成物であって、
前記第２の酵素；
該酵素に結合し、ポリカチオンまたはポリアニオンであるポリマー；および
ケイ素原子および酸素原子を含むマトリックスであって、結合した酵素−ポリマーがその中に固定化されているマトリックスを含む、酵素組成物。
【請求項１７】
前記マトリックスは、共有結合したケイ素原子および酸素原子を含み、ケイ素原子対酸素原子の比が約１：２と約１：４との間である、請求項１６に記載の酵素組成物。
【請求項１８】
前記ポリマーは水溶性である、請求項１６または１７に記載の酵素組成物。
【請求項１９】
前記ポリマーはｐＨ４とｐＨ９との間の範囲のｐＨで多価電解質であり、前記酵素はｐＨ４とｐＨ９との間の範囲の特定のｐＨで多価電解質である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の酵素組成物。
【請求項２０】
前記酵素がｐＨ４とｐＨ９との間の特定のｐＨでポリカチオンであるとき、前記ポリマーはポリアニオンであるか、あるいは、前記酵素はｐＨ４とｐＨ９との間の特定のｐＨでポリアニオンであるとき、前記ポリマーはポリカチオンである、請求項１６〜１９のいずれかに記載の酵素組成物。
【請求項２１】
前記熱安定性ペルオキシダーゼはレドックスポリマーとともに前記の電極に固定化され、前記センサーは、酸素に対して選択的な透過性である分析物輸送制御層を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２２】
ケイ素原子および酸素原子を含む前記マトリックスはエラストマーシリコーンである、請求項１〜１５、および２１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２３】
前記過酸化水素検知層をコーティングする電気的絶縁層を含む、請求項１〜１５、２１、および２２のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２４】
（ａ）前記過酸化水素検知層を含む第１の層；
（ｂ）該第１の層の上に置かれ、酢酸セルロースのフィルムを含む第２の層；
（ｃ）前記第２の酵素を含み、該第２の層の上に置かれている第３の層；および
（ｄ）該第３の層の上に置かれ、酢酸セルロースのフィルムを含む第４の層
を含む、請求項１〜１５、および２１〜２３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２５】
前記第２の酵素は該熱安定性ペルオキシダーゼの近傍に固定化され、それから絶縁されている、請求項１〜１５、および２１〜２４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２６】
請求項１〜１５および２１〜２５のいずれかに記載のセンサーを用いて、過酸化水素を電気化学的に分析する方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）請求項１〜１５および２１〜２５のいずれかに記載のセンサーを提供する工程：
（ｂ）電極により過酸化水素の存在下で電気シグナルを生成する工程；および
（ｃ）該生成電気シグナルをサンプル中の過酸化水素の存在と相関させる工程。
【請求項２７】
請求項１〜１５および２１〜２５のいずれかに記載のセンサーを用いて、分析物の連続的な測定を行う方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）請求項１〜１５および２１〜２５のいずれかに記載のセンサーを体液または体組織の表面またはその中に置く工程；および
（ｂ）電極によって生成した電気シグナルを、該体液または体組織に存在する分析物の量と相関させる工程。
【請求項２８】
前記マトリックスは少なくとも部分的にアニオンである場合、前記ポリマーは少なくとも部分的にカチオンである、請求項１６〜２０のいずれかに記載の酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、熱に安定な分析物センサーに関する。より詳細には、本発明は、グルコースおよび乳酸などの生体分析物を測定するための電気化学的センサーに関する。本発明のセンサーは、電極上に配置された熱安定性ペルオキシダーゼ（ダイズペルオキシダーゼなど）を、レドックス化合物を含有するフィルム内に含む。本発明のセンサーは、過酸化水素産生酵素をさらに含む。本発明のセンサーは、例えば、血中のグルコースまたは乳酸の測定において、37℃で５日以上作動し、連続的または断続的に作動している期間中におけるその感度の喪失が10％未満である。
発明の背景
本出願は、1995年10月11日に出願された係属中の米国特許出願第08/540,789号（この出願はこれによりすべての目的のために参考として援用される）の一部継続出願である。
グルコースおよび乳酸などの生化学物質のアッセイは、医療、バイオテクノロジー、食品加工（乳製品およびワイン）において重要である。ヒト体液中のグルコース濃度をモニターすることは、糖尿病の管理において特に問題にされる。ヒト体液中の乳酸をモニターすることは、外傷、心筋梗塞、うっ血性心不全、肺水腫、敗血症および出血などの診断において特に問題にされる。７〜８mMを超える血中乳酸値は、致命的な結果に至ることを示す。枕元に置かれる乳酸分析器は、処置に対する患者の応答を確認することにおいて有用である。一方、事故および戦場においては、そのような分析器は負傷者の分類において有用である。グルコースアッセイは、臨床業務においては一般的であり、真性糖尿病の診断およびその管理において適用されている。連続的にまたは断続的に使用されているグルコースセンサーは、ヒトの体内に埋め込まれたセンサーを含めて、Ｉ型糖尿病の管理のために、例えば、差し迫った低血糖または実際の低血糖を警告してそれらを回避するために求められている。低血糖は致命的であり得る。糖尿病患者の血中グルコースレベルを正常値またはそれに近い値で維持するためには、グルコースの頻繁な測定または連続的な測定が必要である。今日、大部分のＩ型糖尿病患者は、その血中グルコースが正常レベルよりも高く維持され、致命的な低血糖の危険性が低くなるようにしている。このことは望ましいことではない。なぜなら、正常な血中グルコースレベルよりも高く維持することは、失明、腎不全、神経障害、および糖尿病の他の合併症の主要な原因になることが明らかにされているからである。従って、感度の実質的な喪失がなく、37℃で体液中のグルコースを測定するために、連続的にまたは断続的に長期間作動するグルコースセンサーを提供することは有用である。
本発明は、電気化学的センサーの連続的な使用を可能にする材料、構造物および方法、例えば、感度の低下が10％未満で、１週間を超えるグルコース測定、または100時間を超える乳酸測定を開示する。
発明の要約
新規な電気化学的センサーが提供され、そのいくつかは37℃で連続的にまたは断続的に作動し得る。100時間を超える作動において、感度の喪失が10％未満である体液中の生化学的物質の測定が、本明細書中に記載される。本発明のセンサーは、アスコルビン酸およびアセトアミノフェンを含む電気的に酸化され得る妨害物質の影響を比較的受けない。
本発明のセンサーは、少なくとも２つの酵素、すなわち、ダイズペルオキシダーゼなどの熱安定性ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ生成酵素を含む。好ましい実施態様において、熱安定性ペルオキシダーゼのレドックス中心は、熱安定性ペルオキシダーゼが固定化されているレドックスハイドロゲルを通じて作用電極から輸送される電子によって電気的に還元され、標準カロメル電極（SCE）に対して0.4Ｖの負側の電位であり、−0.15Ｖ（対SCE）の正側の電位であることが好ましい。最も好ましくは、熱安定性ペルオキシダーゼは、電位がほぼ０Ｖ（対SCE）の電極にコーティングされる。
好ましいレドックスハイドロゲルは、アッセイすべき体液と接触しているとき、少なくとも20重量％の水を含む。そのレドックス中心は、37℃でアッセイ体液によって浸出しない。非浸出性レドックス中心は、水を取り込んだときにハイドロゲルを形成するポリマーに結合している。ポリマーへの結合は、好ましくは、共有結合、静電結合／イオン結合、または配位結合による。
過酸化物生成酵素のレドックス中心は、好ましくは、電極、熱安定性ペルオキシダーゼのレドックス中心、およびレドックスハイドロゲルのレドックス中心から電気的に絶縁されている。電気的に絶縁されている過酸化物生成酵素は、生化学的分析物（例えば、グルコースまたは乳酸あるいは分析物の産物）と分子状酸素との反応を触媒する。その酸化反応において、酸素は過酸化水素（H2O2）に還元される。
過酸化水素生成酵素は、好ましくは、マトリックスに安定化されている。好ましい安定化マトリックスは高分子および無機質である。最も好ましいマトリックスはケイ素原子を含み、その少なくとも50％は隣接酸素原子と共有結合し、三次元の架橋網目構造になっている。そのようなマトリックスは、ゾル−ゲル重合プロセスを使用して作製することができる。安定化マトリックスは、必要に応じて、絶縁されている過酸化物生成酵素をさらに安定化する機能を有する第２のポリマーを含む。
過酸化物生成酵素は、好ましくは、測定すべき生化学的分析物よりも、酸素に対する透過性が少なくとも10倍、好ましくは少なくと100倍であるポリマーの背後に配置されるか、またはそのようなポリマー内に固定化される。
【図面の簡単な説明】
次に図面を参照する。この場合、参照番号および参照文字は、いくつかの図面を通して対応する構造を示し、実施例２〜実施例12は、実施例１に記載されるセンサーに関する。
図１は、負荷が60μgcm-2である検知層内の熱安定性ペルオキシダーゼの重量比に対する電流密度依存性を示すグラフである（16mMグルコース、1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図２は、GOx負荷に対する電気的還元の電流密度依存性を示すグラフである（16mMグルコース、1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図３は、検知層と固定化グルコースオキシダーゼフィルムとの間の酢酸セルロース層の厚さに対する校正曲線の依存性を示すグラフである。0.25％酢酸セルロース量：（Ａ）４μl、（Ｂ）８μl、および（Ｃ）２８μl（16mMグルコース、1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図４は、実施例４によるグルコースセンサーに関する電流密度の電位依存性を示すグラフである（５mMグルコース、1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図５は、実施例５に従って、溶存酸素濃度に対する電流密度依存性を示すグラフである（1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE）、（Ａ）５mMグルコース、（Ｂ）５mM乳酸）。
図６は、NaCl濃度に対する電流密度依存性を示すグラフである（1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE）、（Ａ）５mMグルコース、（Ｂ）５mM乳酸）。
図7Aおよび図7Bは、pHに対する電流密度依存性を示すグラフである。図7Aは５mMグルコースに関するデータを示す；図7Bは５mM乳酸に関するデータを示す（1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図８は、角速度に対する電流密度依存性を示すグラフである（37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE）、（Ａ）５mMグルコース、（Ｂ）５mM乳酸）。
図9Aおよび図9Bは、温度に対する電流密度依存性を示すグラフである。図9Aは５mMグルコースに関するデータを示す；図9Bは５mM乳酸に関するデータを示す（1000rpm、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図10Aおよび図10Ｂは、異なるオキシダーゼ負荷量での熱安定性ペルオキシダーゼに基づくグルコースセンサーおよび乳酸センサーの安定性を示すグラフである。固定化グルコースオキシダーゼ量：（ａ）1.3μg；（ｂ）13μg；（ｃ）26μg；（ｄ）52μg（図10A）；固定化乳酸オキシダーゼ量：（ａ）20μg；（ｂ）40μg；（ｃ）96μg；（ｄ）160μg（図10B）（1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図11は、実施例８の安定性研究における37℃での280時間作動の前後でのグルコース校正曲線を示すグラフである：（Ａ）安定性実験前の26μgのGOx；（Ｂ）安定性実験後の26μgのGOx；（Ｃ）安定性実験前の1.3μgのGOx；（Ｄ）安定性実験後の1.3μgのGOx（1000rpm、37℃、pH7.3、空気中、0.00Ｖ（SCE））。
図12は、37℃での280時間作動の前後でのグルコースセンサーのサイクリックボルタモグラムを示すグラフである；（Ａ）安定性実験後；（Ｂ）安定性実験前。
図13は、63℃における溶液での乳酸オキシダーゼ活性の時間依存性のグラフである。
図14Aおよび図14Bは、乳酸オキシダーゼでドープ処理したシリカゲル粉末の活性の63℃における時間依存性を示すグラフである；図14Aおよび図14B（a）：PVI−乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル、図14B（b）：乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル。
図15は、50℃の異なる環境における乳酸オキシダーゼ活性の時間依存性を示すグラフである。（Ａ）PVI−LOxドープ処理シリカゲル；（Ｂ）LOxドープ処理シリカゲル；（Ｃ）溶液中のPVI−LOx；（Ｄ）溶液中のLOx。
図16は、63℃の異なる環境におけるグルコースオキシダーゼ活性の時間依存性を示すグラフである。（Ａ）溶液中のグルコースオキシダーゼ；（Ｂ）グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末；挿入図は（Ａ）の短時間の挙動を示す。
図17は、PEI−乳酸オキシダーゼでドープ処理したシリカゲル粉末の活性の63℃における時間依存性を示すグラフである。挿入図は短時間の挙動を示す。
図18Aは、電極の線図である。
図18Bは、検知層を有する電極の線図である。
図19は、本発明のバイオセンサーの検知層の線図である。
図20は、本発明の熱安定性バイオセンサーの２層型検知層の線図である。
図21は、本発明の熱安定性バイオセンサーの３層型検知層の線図である。
発明の詳細な説明
図面を全般的に、特に図18（a）〜図18（b）を参照すると、本発明のセンサーは、典型的には、非腐食性の作用電極１を含む。この作用電極１は、分析物含有液と作用電極１との間の電解質接触を可能にする凹部４を有する絶縁体２によって実質的に覆われている。複数の層を有するフィルム３が凹部４の中に配置される。図19〜図21は、フィルム３の３通りの実施形態を示す。一般に、フィルム３は、検知層11、21および第２の酵素層13、24を含む。フィルム３はまた、必要に応じて、下記のような層の１つまたは複数を含有することができる：検知層11と第２の酵素層13との間の電気的絶縁層12；分析物の検知層11への流れを制御するための分析物輸送制御層14；および体液中でのセンサーの生体適合性に必要な生体適合層15、25など。
電極
本発明の電気化学的センサーは、アッセイすべき電解質溶液に接触するために少なくとも２つの電極を含む。このような電極の一方は、作用電極１である。これは、非腐食性金属または炭素から作製される。炭素の作用電極は、ガラス状またはグラファイト状であってもよく、固体またはペーストから作製することができる。金属状の作用電極は、パラジウムまたは金を含む白金属の金属、または二酸化ルテニウムなどの非腐食性の金属導電性酸化物から作製することができる。作用電極は、例えば、コーティングまたは印刷によって基材に塗布された線状導電性フィルムまたは薄い導電性フィルムであり得る。
金属または炭素の導電体は、典型的には、その表面のほんの一部が分析物含有溶液との電解質による接触状態にある。この部分は、電極の作用表面と呼ばれる。電極の残りの表面は、絶縁体２によって溶液から隔てられている。有用な絶縁体の例には、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリヘキサフルオロプロピレンおよび（ポリシロキサンとしても知られている）シリコーンなどのポリマーが含まれる。
作用電極に加えて、本発明のセンサーはまた、参照電極または複合参照対向電極（準参照電極または対向／参照電極とも呼ばれる）を含む。参照電極または対向／参照電極は、例えば、銀／塩化銀電極であり得る。センサーが対向／参照電極を有さない場合、作用電極と同じ材料から作製され得る別の対向電極を有する。
本発明のセンサーは、１つまたは複数の作用電極、および１つまたは複数の対向電極、参照電極および／または対向／参照電極を有する。本発明のセンサーの実施態様の１つは、２つ以上の作用電極を有する。このような作用電極は一体型に連結することができ、あるいは別々の状態のままであり得る。
インビボ使用に関して、本発明の作用電極は、典型的には、患者の体液（例えば、血液）と直接接触させるために患者の皮膚の皮下に埋め込まれる。多数の作用電極を使用する場合、それらは、一緒に埋め込むことができ、あるいは身体の異なる位置に埋め込むことができる。対向電極、参照電極および／または対向／参照電極は、また、作用電極の近くに、または患者身体の他の位置に埋め込むことができる。あるいは、対向電極、参照電極および／または対向／参照電極は、患者の皮膚に設置することができる。
検知層
絶縁されていない作用電極の一部は、検知層３によって覆われる。本発明のセンサーの代表的な検知層３には、水中で膨張してレドックスハイドロゲルを形成し得るレドックスポリマーが含まれる。検知層３には、また、典型的には、分析物または分析物生成化合物の反応を触媒し得る酵素が含まれる。酵素は、好ましくは、レドックスポリマー内に固定化される。本発明の実施態様の１つにおいて、センサーは、ダイズペルオキシダーゼなどの熱安定性ペルオキシダーゼであることが好ましいペルオキシダーゼを含有する。ペルオキシダーゼを含有するハイドロゲルは、H2O2流束を電気シグナルに変換する検知層を形成する。
レドックスポリマーは、共有結合、配位結合、または静電結合によってポリマーに結合しているレドックス中心を含有する；後者の結合は、ポリマーの荷電部位とその逆荷電のレドックス種との相互作用から生じることが好ましい。レドックスメディエーターは、封じ込めまたは静電結合によって固定化され得るが、好ましくは、共有結合的にまたは配位結合的にレドックスポリマーに結合する。
レドックス中心は、好ましくは非浸出性である。ポリマーに静電結合したレドックス種に関して、浸出しないためには、一般に、荷電したレドックス種が、分析物溶液のpHで、少なくとも２価の荷電、好ましくは３価以上の荷電を有する。例えば、レドックス種がカチオンである場合、少なくとも＋２の荷電を有することが好ましく、＋３以上の荷電が好ましい。レドックス種の荷電が大きいほど、浸出は遅くなる。同様に、レドックス種がアニオンで、ポリマーへの結合が静電的である場合には、−２の荷電を有するべきであり、−３以上が好ましい。レドックス中心の大部分（少なくとも90％）は、37℃で少なくとも14日間は電極に結合したままであることが好ましい。
レドックスポリマーは、水中および希釈水溶液中で膨張するように設計されている。水の取り込みは、乾燥ポリマー重量に対して、少なくとも10重量％、好ましくは20重量％である。レドックスポリマー層内の熱安定性ペルオキシダーゼは、37℃で、水または生理学的な緩衝溶液によって実質的に浸出しない。熱安定性ペルオキシダーゼを含有するレドックスポリマー層は、例えば、GreggおよびHeller（J.Phys.Chem.95:5970（1991）によって記載されているようにして、そして米国特許第5,262,033号および係属中の米国特許出願第08/540,789号（1995年10月11日出願）の記載のようにして都合良く作製することができる。
一般に、レドックスポリマーは、安定であり、かつ約−0.1Ｖ（対SCE）と約＋0.6Ｖ（対SCE）との間のレドックス電位を有するレドックス中心を含有する。好ましい範囲は、約−0.1Ｖ（対SCE）と約＋0.4Ｖ（対SCE）との間である。O2が電気的に還元されない電位で電極を保つことは望ましい；そうでない場合、H2O2が水に電気的に還元されることから生じるシグナルが観測され、これにより、溶存O2の電気的な還元により生じるバックグラウンドに関して補正を行わなければならない。さらに、尿酸、アスコルビン酸およびアセトアミノフェンなどの他の妨害物質の電気的酸化速度が大きくない電位で電極を保つことも望ましく、その結果、それらの電気的酸化に関する補正は必要でない。
検知層のポリマーに結合し得る有用なレドックス中心の例が、米国特許第5,264,104号；同第5,356,786号；同第5,262,035号；および同第5,320,725号に記載されている（これらは参考として本明細書中に援用される）。レドックスメディエーターは、典型的には、特にオスミウム、ルテニウム、鉄およびコバルトの金属錯体、あるいはキノン類およびキノイド構造を有する他の化合物などの有機レドックス化合物である。好ましいレドックス中心は、相互に電子を迅速に交換する。好ましいレドックス中心の一例として、窒素含有ヘテロ環（2,2'-ビピリジン、1,10-フェナントロリン、またはそれらの誘導体など）を有する１つまたは複数の配位子とのオスミウム遷移金属錯体が挙げられる。特に、2,2'-ビピリジン、1,10-フェナントロリンまたはそれらの誘導体を含有する２つの配位子（２つの配位子は必ずしも同一である必要はない）と錯体形成したオスミウムカチオンは、本発明のセンサーにおいて特に有用なレドックス中心を形成することが明らかにされている。オスミウムカチオンとの錯体形成に好ましい2,2'-ビピリジン誘導体は、4,4'-ジメチル-2,2'-ビピリジンならびにモノアルコキシ-2,2'-ビピリジン、ジアルコキシ-2,2'-ビピリジンおよびポリアルコキシ-2,2'-ビピリジン（4,4'-ジメトキシ-2,2'-ビピリジンなど）である。この場合、アルコキシ基の炭素対酸素比は、遷移金属錯体の水における溶解性を維持するのに十分である。
レドックスポリマーの有用な一群が、ポリ（４-ビニルピリジン）から誘導され、そのピリジン環の1/3〜1/15の間で、［Os（bpy）2Cl］+/2+（ここで、bpyは2,2'-ビピリジンである）または［Os（phen）2Cl］+/2+（ここで、phenは1,10-フェナントロリンである）との錯体形成反応により作製される。この場合、好ましくはポリマーのピリジン環のいくつかは、２-ブロモエチルアミンとの反応によって四量体化（quaternize）される。有用なポリマーは、また、（PVIと呼ばれる）ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）、ポリ（アクリルアミドコ-４-ビニルピリジン）、およびポリ（アクリルアミドコ-４-ビニルイミダゾール）から誘導される。
本発明のセンサーを製造するために、熱安定性ペルオキシダーゼを含有する過酸化水素検知層が、ペルオキシダーゼ、レドックスポリマーおよび架橋剤の各溶液を、清浄な電極表面に滴下混合することによって調製される。これらの溶液を乾燥し硬化させる。これらの溶液はまた、予備混合することができる。予備混合した溶液の液滴を電極に置くことができる。有用な架橋剤の例は、分子量が300〜600の間であり、好ましくは400〜600の間であるポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルである。別の有用な架橋剤は、ポリ（エチレングリコール）-α，ω-ジカルボン酸のビスＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
第２の酵素層
作用電極上の第２の酵素層13は、O2と基質との反応を触媒し、それによってH2O2が生成する。基質は、一般には、センサーによってアッセイされ得る分析物である。あるいは、基質は、アッセイすべき分析物の反応産物、例えば、分析物の加水分解産物である。層13において使用される第２の酵素はまた、本明細書中では、過酸化物生成酵素と呼ばれる。本発明のセンサーにおいて、過酸化物生成酵素のレドックス中心は、検知層のレドックスポリマーによる電子交換によって直接生じる還元または酸化から防止される。そのような酸化または還元は、本明細書中の下記に記載される方法によって防止される。
最初に、レドックスポリマーによる過酸化物生成（第２の）酵素の酸化／還元の防止は、第２の酵素に固有であり得る。例えば、第２の酵素は、１つまたは複数のその反応中心を覆って、十分に厚く、天然の電気的に絶縁性のタンパク質または糖タンパク質の層を含むことができる。この場合、さらなる手段は、レドックスポリマーによる第２の酵素の還元または酸化を防止するために必要でない。
無機ポリマーマトリックスでの固定化および安定性
その代わりとして、H2O2生成の（第２の）酵素は、非導電性の無機または有機のポリマーマトリックス内に固定化され、そのレドックス中心とレドックスポリマーとの間の電子交換が防止される。固定化マトリックスは、O2に対する透過性が高いことが好ましく、通常は分析物またはその前駆体に対するよりもO2に対して大きな透過性を有する。好ましい固定化マトリックスは、下記においてさらに十分に議論するように、第２の酵素が安定化され、固定化によって自身を熱安定性にするマトリックスである。
ゾル−ゲル重合プロセスは、適切なモノマーを室温またはその付近で重合させることによる無機ポリマーマトリックス（例えば、ガラス）の調製法を提供する。適切なモノマーには、アルコキシドならびに金属および半導電性元素のエステルが含まれ、好ましい金属および半導体には、Si、Al、TiおよびPbが含まれる。最も好ましいモノマーはケイ素を含み、ケイ素対酸素比は約１：２〜約１：４の間である。
酵素は、例えば、１個または複数のケイ素原子を含有し得るテトラメトキシシランまたは他のポリアルコキシシランの加水分解を含むゾル−ゲルプロセスによって作製されたシリカおよび他の無機ポリマーマトリックス内に固定化することができる。酵素は、得られるシラノールを酵素の存在下で縮合することによって封じ込められる。このプロセスは、ゾル−ゲル固定化と呼ばれている。
酵素を無機ポリマーマトリックス内に固定化して、固定化された第２の酵素とレドックスポリマーおよび／または電極との間の電気的な接触を防止することができる。さらに、酵素は、ゾル−ゲルから得られたシリカまたは他の無機ポリマーマトリックス内に酵素を結合することによって安定化される。グルコースオキシダーゼ（糖タンパク質）は、シリカゾル−ゲル内に封じ込めることによって、酵素の安定性は大きく増大する。そのような固定化によって、水中において98℃に10分間加熱したとき、活性は保持されている。
乳酸オキシダーゼ（これは糖タンパク質ではない）は、同様にしてゾル−ゲルプロセスによってシリカ内に固定化したとき、酵素は特に熱に対して安定ではなかった。しかし、ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）を同時に溶解している水性緩衝溶液に乳酸オキシダーゼを溶解し、乳酸オキシダーゼ−ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）の混合物をゾル−ゲルプロセスによってシリカ内に固定化すると、比類ないほど安定した固定化乳酸キシダーゼが得られる。この安定化された乳酸オキシダーゼは、水中で90℃に10分間加熱することができ、依然として酵素活性を保持し得る。
ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）は、pH７でポリカチオンであり、このpHで、乳酸オキシダーゼなどの、pH７でポリアニオンである酵素と結合する。従って、特定のポリマーを特定の酵素に添加することによって、酵素の安定性を大きく増大させることができる。乳酸オキシダーゼの場合、ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）の代わりに、多塩基性ポリマーでもあり、pH７で同様に多プロトン化されているポリエチレンイミンを添加することによって、酵素安定性は向上したが、好ましいポリマーであるポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）を添加したときほど大きくなかった。
酵素が特定のpHでポリカチオンまたはポリアニオンである場合、それぞれ、ゾル−ゲルから得られた無機ポリマーマトリックス内にポリマー状のポリアニオンまたはポリカチオンをともに固定化して、酵素を安定化させることができる。次いで、安定化された酵素は、酵素がゾル−ゲル内に単独で固定化された場合に可能となるよりも高い温度および／またはそれよりも長い期間にわたって作動することができる。
ゲル化後、過酸化物を生成する今や熱安定性の第２の酵素が固定化されているシリカは固い材料であり、微細粉末に粉砕することができる。次いで、この粉末を、本明細書中の下記においてさらに説明するO2透過性の高いポリマー内に分散させて、過酸化物を生成する本発明のセンサーの第２の酵素層13を形成させることができる。この過酸化物生成層13は、好ましくは、下記の望ましい特性を有する：熱安定性；検知層のレドックスポリマーと第２の酵素を含有するH2O2生成層のレドックス中心との間での電子移動がないこと、すなわち、第２の酵素のレドックス中心によってレドックスポリマーが酸化または還元されないこと；および高いO2透過性。
あるいは、検知層のレドックスポリマーと過酸化物生成の第２の酵素との間での電子輸送が、H2O2生成酵素の固有的な電気的絶縁性のために、または電気的絶縁マトリックス（上記の無機ポリマーマトリックスなど）内に酵素を固定化することによって避けられる場合、第２の酵素をペルオキシダーゼ含有検知層内に組み込むことは実用的である。この場合、検知層には、熱安定性ペルオキシダーゼ（第１の酵素）を電極に電気的に連結しているレドックスポリマーが含まれ、そしてレドックス中心がレドックスポリマーまたは電極に電気的に連結していない過酸化物生成酵素（第２の酵素）もまた含まれる。
あるいは、過酸化物生成層24は、過酸化物生成酵素が固有的に絶縁されているか、または電気的絶縁マトリックス内に固定化されている場合に限られるが、検知層21を覆って直接形成することができる（図20および図21を参照のこと）。H2O2生成酵素が固有的に絶縁されておらず、または絶縁マトリックス内に固定化されていない場合、H2O2透過性の電気的絶縁層12を、検知層11と過酸化物生成（第２の）酵素層13との間に設置して、所望の絶縁性を達成することができる。
過酸化物生成（第２の）酵素層は、下記の方法のいずれかによって生成される。第２の酵素が安定化されているシリカ含有粒子などの粒子は、シリコーンゴム溶液またはシリコーンゴム前駆体溶液などのポリマー中に分散させることができる。次いで、この混合物の液滴を作用電極に塗布する。あるいは、過酸化物生成層は、架橋剤を第２の酵素に添加し、第２の酵素およびその架橋剤を含有する液滴を作用電極に塗布することによって得られる。有用な架橋剤には、例えば、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（PEGDGE）が含まれる。グルコースオキシダーゼなどの糖タンパク質の架橋に関しては、酵素をNaIO4で酸化し、反応性アルデヒド基を生成させて表面アミン（酵素のリジンのアミンなど）と縮合する。グルコースオキシダーゼを含有する過酸化物生成層の製造に好ましい方法は、酵素がシリカのゾル−ゲル内に固定化されていない場合においては後者のNaIO4法である。同様に、シリカのゾル−ゲル内に固定化されていない乳酸オキシダーゼを含有する過酸化物生成層に関しては、ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）を含むその混合物のPEGDGEによる架橋が好ましい。第２の酵素はまた、グルタルアルデヒドを用いて、またはグルタルアルデヒドおよびアルブミンなどのタンパク質を用いて固定化することができる。
シリカのゾル−ゲルマトリックスによって安定化された酵素は、微細粉末に粉砕することができ、シリコーン内に、好ましくはエラストマーシリコーン、最も好ましくは水ベースのエラストマーシリコーン前駆体内に分散させることができる。次いで、この分散物を熱安定性ペルオキシダーゼ層に塗布して過酸化水素生成層を形成させる。シリコーンは、その酸素透過性のために、このような層における好ましいバインダーである。
電気的絶縁層
過酸化物生成（第２の）酵素の酸化／還元を防止するための別の手段は、検知層11と第２の酵素層13との間に、H2O2に対して透過性である電気的絶縁膜12を付加することである。この絶縁膜は、無機または有機とすることができ、好ましくは、酢酸セルロースなどの有機ポリマーである。第２の酵素は、ポリマー膜を覆う層13内に固定化することができる。
絶縁膜12は、好ましくは、小さなH2O2分子に対して透過性であるが、より大きく容易に酸化される潜在的な妨害種のアスコルビン酸、アセトアミノフェンまたは尿酸に対する透過性を有さない。層12のH2O2ならびにアスコルビン酸、アセトアミノフェンおよび尿酸の１つまたは複数に対する透過性の比は、好ましくは、２：１よりも大きい。有用で選択的なH2O2透過性のポリマーフィルムには、稠密な酢酸セルロース、硬化NafionTM、およびナイロンが含まれる。公知で標準的な方法を使用して、酢酸セルロースまたはナイロンの稠密で小さいポアサイズのフィルムが、シクロヘキサノンまたはテトラヒドロフランから成型される。NafionTMフィルムは、アルコールおよびアルコール−水のエマルションから作製され硬化される。
分析物輸送制御層
第２の酵素が固定化されない場合、あるいはセンサーの作動範囲を広げ、その結果、センサーが、分析物のより高い濃度まで、好ましくは直線的に応答することが望ましい場合、分析輸送制御層14が、分析されている溶液とセンサーの第２の酵素層13との間に置かれる。この分析物輸送制御層13は、第２の酵素を含有し、それによってその損失を避け、そして／または分析物または第２の酵素の基質が第２の酵素層に至る流束を制限するように機能を有する。
この第２の膜は、基質存在下での酵素触媒によるH2O2の生成における共反応物であるO2に対して透過性であることが不可欠である。この第２の膜を通過するO2の透過率と基質またはその前駆体の透過率との比は、水が同時に生成する第２の酵素によって触媒される反応（それによってO2が消費される反応）における基質の酸化または脱水素に関して十分に大きいこともまた不可欠である。飽和水溶液におけるO2濃度は、生物学的液（動物の体液を含む）におけるグルコースまたは乳酸などの分析物の通常濃度よりも十分に低いために、基質またはその前駆体に対するよりもO2に対する透過性がさらに大きい分析物輸送制御層14が好ましい。
一般に、分子状酸素の透過係数が25℃で10-8cm3（STP）cmcm-2s-1（cmHg）-1である膜またはポリマーが好ましい。（透過性単位の説明は、Polymer Handbook、第２版、J.PandrupおよびE.H.Immergut編、John Wiley & Sons、New York、1975、III−229〜231頁に記載されている。）分析物輸送制御層14において使用されるポリマーは、O2に対する透過性が高いポリマーであり、好ましくはO2および基質（または基質前駆体）の透過率の比が10：１よりも大きく、より好ましくは100：１よりも大きい。ポリ（ジメチルシロキサン）類を架橋することによって得られるシリコーン（例えば、シリコーンゴム）のO2透過性が特に高いことは広く知られている。従って、シリコーンは、この層に有用なポリマーである。別の有用な材料は酢酸セルロースである。
生体適合層
インビボ使用に関して、センサーは、好ましくは、第２の酵素によって触媒される反応において変換される基質に対して透過性である生体適合フィルム15でコーティングされる。このような生体適合フィルムはセンサーの溶液側に置かれる。
好ましい生体適合フィルム15は、ハイドロゲル、例えば、生組織または血液などの生理学的環境と平衡状態にあるときに20重量％よりも多い水を含有するポリマー組成物から作製される。一例として、ポリエチレンオキシドの架橋誘導体、例えば、ポリエチレンオキシドのテトラアクリル酸誘導体が挙げられる。ポリマー組成物は、非毒性であり、非免疫原性であり、非トロンボゲン形成性であり、そうでなければ動物の生組織と適合し得る。
分析物輸送制御層14または第２の酵素層13が生体適合性である場合、生体適合層15は必須ではない。例えば、多くの固体シリコーンは生体適合性であり、従って、生体適合層をさらに必要としない（図20を参照のこと。これとは対照的に、図21に示す本発明の実施態様は生体適合層25を含む）。
センサーの安定性
本発明のセンサーの重要な性能基準は、感度の喪失速度である。この速度は、分析物の濃度に依存する。なぜなら、感度の喪失は、通常、高い分析物濃度で最初に気付くからである。分析物濃度が高いほど、入ってくる分析物流束のH2O2への完全な変換には多くの活性な第２の酵素の存在が必要とされるため、システムは、第２の酵素層での不十分な基質変換に対して非常に敏感である。感度の喪失速度は、第２の酵素が特に熱安定性でない場合でも、分析物輸送制御層14の使用によって第２の酵素層13への分析物流束を制限し、それにより分析物濃度を制限することによって減少させることができる。
感度の喪失はまた、その一部が不活性になった場合でも、残存する第２の酵素によって分析物流束のすべてがH2O2流束に依然として変換される大量の酵素を第２の酵素層に組み入れることによって制限することができ、そして数日または数週間の期間回避することさえできる。無機ポリマーマトリックス内に封じ込められた酵素などの熱安定性の第２の酵素を使用して、第２の酵素層13が形成され、これまでにない良好な安定性および長い寿命のセンサーを組み立てることができる。このセンサーは、下記のいずれかによってさらに改善することができる：大過剰の熱安定性の第２の酵素（分析物流束をH2O2流束に変換するために必要とされるよりもさらに多い量）を組み入れること、あるいは分析物流束の制限、あるいは両技法の協調的な使用。
好ましいセンサーはまた、37℃以上の温度で長期間安定である。センサーは、好ましくは、この温度で100時間以上安定であり、センサーの出力低下は10％以下である。センサーおよびセンサー内の酵素は、好ましくは、30℃で安定であり、より好ましくは40℃で安定であり、最も好ましくは50℃または60℃またはそれ以上の温度で安定である。
他のセンサー
本発明の多くの原理は、本明細書中上記に記載されたペルオキシダーゼセンサー以外のセンサーにおいて使用することができる。特に、ゾル−ゲルプロセスを使用して形成される無機ポリマーマトリックスでの第２の酵素の固定化は、米国特許第5,593,852号（これは参考として本明細書中に援用される）に記載されている酵素センサーにおいて効果的に使用することができる。そのセンサーにおいて、図19〜図21に示される層構造と類似した層構造が使用されている。しかし、検知層において、分析物を検知する酵素には、ペルオキシダーゼが使用されていない。例えば、分析物がグルコースである場合、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼが検知層に存在する。また、分析物が乳酸である場合には、乳酸オキシダーゼが使用されている。
これらのセンサーは、多くの場合、妨害物質排除層として機能する第２の酵素層を有する。この層は、アスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェンなどの妨害物質の反応を触媒する１つまた複数の酵素を含有する。この層において使用される酵素には、ペルオキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼ（グルコースが分析物である場合）、またはグルコースオキシダーゼ（乳酸が分析物である場合）が含まれる。これらの酵素は、本明細書中上記の無機ポリマーマトリックス内に固定化することができ、第２の酵素層を形成するために使用することができる。さらに、これらの酵素は、無機ポリマーマトリックス内に単独で、あるいは本明細書中上記の多価電解質ポリマーと一緒に固定化することによって安定化させることができる。
実施例
本発明を、下記の実施例を参照することによってさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、むしろ、本発明の特定の実施態様のいくつかを例示することを目的とする。
実施例１
４層型センサーの調製
ダイズペルオキシダーゼ（SBP）をHarlan Bioproducts for Science（Indianapolis、IN）から入手した（High grade、130ピロガールユニット/mg、カタログ番号：SP04、ロット番号：SPLO515）。乳酸オキシダーゼ（LOx）をGenzyme（Boston、MA）から入手した（ロット番号；D50293、カタログ番号：70-1381-01、EC 1.1.2.3、Acerococcus viridans由来、37.0ユニット/mg粉末）。ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（PEGDGE）をPolysciences,Inc.（Warrington、PA）から入手した。30％過酸化水素溶液をAldrichから入手し、希釈溶液を毎日調製した。
電極
ガラス状炭素電極（直径：３mm）を、３規格のアルミナスラリー（５ミクロン、１ミクロン、0.3ミクロン）を使用して研磨および洗浄し、次の規格の間で超音波処理しリンスした。研磨および洗浄した各電極を、PBS中で目的の電位（SCEに対して−0.4Ｖ〜＋0.4Ｖ）を走査することによって調べ、その電気化学が特徴的でないことを確保した。４層型センサーを下記の通りに調製した：
過酸化水素検知層
レドックスポリマーのPVP-bpy-Os（または、POs-EA）を、GreggおよびHeller、1991、J.Phys.Chem．95:5970に記載されている方法によって、ポリ（４-ビニルピリジン）のピリジン窒素とOs（bpy）Cl+/+2との部分的な錯体形成反応を行い、次いで得られるポリマーと２-ブロモエチルアミンとの部分的な４量化（quaternize）を行うことによって合成した。オスミウム含有レドックス中心は、炭素表面とペルオキシダーゼのヘム中心との間での電気的な伝達を可能にする。ピリジニウム−Ｎ-エチルアミンの機能によって、水素化が増強され、架橋に必要な一級アミンが得られる。未修飾ピリジン対オスミウム錯化ピリジン対エチルアミン４量化ピリジンの比は、3.3：1.0：0.8であった。
第１層の過酸化水素検知層を、２μlのPVP-bpy-Os（５mg/ml）、２μlのダイズペルオキシダーゼ（５mg/ml）、および１μlの架橋剤PEGDGE（2.5mg/ml）の各液滴を炭素表面に置くことによって調製した。液滴を、シリンジの先端で、電極の表面で混合した。次いで、電極を16時間室温で乾燥させた。得られる暗紫色のフィルムは十分に拡がり均一であるようであった。乾燥した電極を、PBS中で、20分間、1000rpmで洗浄し、水でリンスして室温で乾燥させた。
過酸化水素輸送制限層
第２層を調製するために、0.5％酢酸セルロース（Sigma、約40％の酢酸含有率）を含むシクロヘキサノン（Aldrich）の４μlを、乾燥および洗浄した過酸化水素検知層の上に置いた。電極を２時間室温で乾燥させた。得られるフィルムは十分に拡がり均一であるようであった。
第２の酵素層（ゾル−ゲルシリカを含まない）
グルコースオキシダーゼ（GOx）酵素を固定化するために、２つの異なる固定化手順を使用した。GOxに関して、100μlの20mg/mlのGOx水溶液を調製した。グルコースオキシダーゼ（GOx）はSigmaから入手した（ED 1.1.3.4、Aspergillus niger X-Sタイプ由来、198mg/ml固体、75％タンパク質）。Vreeke et al.、1995、Anal.Chem．67:4247に記載されている手順に従って、12mg/mlのNaIO4水溶液の50μlを添加した後、酵素−過ヨウ素酸塩の溶液を室温で、暗所下、２時間インキュベーションした。４μlのインキュベーションした混合物を酢酸セルロースフィルムの上に置き、固定化GOx分析物検知層を形成し、これを一晩乾燥させた。
LOxに関して、20mg/mlのLOx水溶液の10μl、10mg/mlのPVI水溶液の20μl、および５mg/mlのPEGDGE水溶液の10μlからなる混合物を調製した。LOx混合物の４μlを酢酸セルロースフィルムの上に置き、固定化LOx分析物検知層を形成し、これを一晩乾燥させた。
分析物輸送制限層
第４のポリマー層である酢酸セルロースの分析物輸送制限層を、過酸化水素輸送制限層に関して上記に記載されるように、調製して分析物検知層に塗布した。0.5％酢酸セルロースを含むシクロヘキサノンの４μlを、固定化オキシダーゼ層（分析物検知層）の上に置き、２時間乾燥させた。
次いで、４層型電極をPBS中で25分間洗浄して水でリンスした。
実施例２
種々の量のダイズペルオキシダーゼ
４層型電極を実施例１の記載のようにして調製した。しかし、過酸化水素検知層の架橋したレドックスポリマーにおけるダイズペルオキシダーゼの酵素重量割合を変更するか、あるいはSBPの総負荷量を変更した。電流の測定を、Princeton Applied Research 273型定電位装置／定電流装置を使用して３電極型セルで行った。すべての測定は、pH依存性を調べる測定を除いて、0.1Ｍ NaClを含有する20mMリン酸緩衝液（pH7.3）を使用して行った。pHを変更する実験においては、HClまたはNaOHの２Ｍ溶液をリン酸緩衝溶液に添加した。
グルコース溶液および乳酸溶液は、リン酸緩衝液で２Ｍ貯蔵溶液を希釈することによって調製した。すべての実験を、別途指示がない限り、37℃の大気下、100mlのリン酸緩衝液中で行った。セルは、回転ガラス炭素作用電極、飽和カロメル参照電極（SCE）、およびVycorTMフリット（frit）によって、大部分の溶液から絶縁された白金対向電極を含んだ。安定性の測定は攪拌セル内で行った。回転ディスク実験を、MSRX速度調節器、X-Y-Y'プロッターおよびVWR 1165冷却定温循環器とともに、Pine RDE4定電位装置を使用して行った。回転電極実験を、別途記載がない限り、1000rpmで行った。
結果：
図１に示すように、所与量のレドックスポリマー（POsEA）に関して、電流密度は、SBPが40wt％〜60wt％の間で最大になった。50wt％の電極に関して、電流密度は、60μg/cm2の負荷でプラトーに達した。電流密度は60μg/cm2を超えるところでは負荷に依存しなかったが、その応答時間は、負荷の増大とともに増大した。このため、好ましい検知層は、60μg/cm2の総負荷で50wt％のSBPを含有した。
図２は、電極に固定化されたグルコースオキシダーゼの量に対する電流密度の依存性を示す。４mMグルコースでの電流密度は、375μg/cm2のGOx負荷でプラトーに達した。LOxを用いて作製した電極は類似した挙動を示し、電流密度は600μg/cm2の負荷でプラトーに達した。
実施例３
様々な厚さを有する第１の輸送制御層および第４の分析物輸送制限層
過酸化水素輸送制御層は、分析物検知層から過酸化水素検知層への過酸化水素輸送を制御するように機能する。この層はまた、過酸化水素検知層のPOsEAを固定化オキシダーゼ層からの電気的な絶縁、すなわち、オキシダーゼの「結線」によるセンサーの「短絡」の防止に役立つ。
分析物検知層の固定化オキシダーゼが過酸化水素検知層から十分に絶縁されていない場合、オキシダーゼのレドックス中心およびPOs-EAのオスミウム中心は電気的に結合している。この結果、電極は「短絡」する。VreekeおよびRocca、1996、Electroanalysis 8:55に記載されているように、高い基質濃度でのみ多く見られる「短絡」の徴候は、基質濃度が増加したときに触媒的な還元電流が抑制されることである。この実験において、「短絡」を、過酸化水素が「結線」ペルオキシダーゼ層で触媒的に電気的に還元されない＋0.5Ｖ（SCE）で電極を保ち、10mMの基質を注入することに診断した。酸化電流の流れは、電極が短絡していることを示した。
４μlの0.25％酢酸セルロースを塗布することによって得られた実施例１の電極において、POsEAによるオキシダーゼの「結線」による「短絡」は、より薄い酢酸セルロースフィルムを用いて調製した電極とは対照的に、効果的に防止された（データを示さず）。内部の酢酸セルロース層を用いずに作製した電極は、常に短絡を示した。従って、その効果は、多くの場合、非常に明確であった。例えば、このような絶縁層を用いずに作製した代表的なグルコース電極は、グルコースが１mMよりも高い濃度で電流抑制を示し、電流は、20mMの濃度におけるその最大値の50％未満に抑制された。このような結果は、この型のセンサーにおいては絶縁層が必要であることを示している。
様々な厚さの膜を、異なる酢酸セルロース濃度の溶液を使用し、様々な量のこの溶液を塗布することによって得た。最も薄い膜は、0.25重量％の酢酸セルロースを１μl塗布することによって作製した。最も厚い膜は、表面に0.5重量％の酢酸セルロース溶液を４μl塗布することによって作製した。
内部の酢酸セルロース層の存在は短絡を効果的に防止する一方で、電極の感度を約50％低下させた。感度の喪失は、オキシダーゼ触媒反応によって生成するH2O2が効率的にあまり捕集されないことによる。
分析物輸送制限層は、第４のポリマー層を形成する。実施例１に記載されているように、この層を酢酸セルロースから作製した。この層は、基質輸送を制御し、それによって、センサーの作動範囲を規定する。外側の酢酸セルロース層の厚さを増大させると、センサーの感度は低下したが、見かけのKmは増大した。図３は、様々な量の酢酸セルロースで過剰にコーティングされた電極の応答を示す：0.25％酢酸セルロース（Ａ）４μl；（Ｂ）８μl；（Ｃ）28μl。外側の酢酸セルロース層の厚さを0.25％酢酸セルロースの４μl（Ａ）から８μl（Ｂ）に増大させると、感度は50％低下したが、見かけのkmは１mMグルコースから２mMグルコースに増大した。0.25％が８μlの外側の酢酸セルロース層を有する電極の応答時間（t10/90）は２分未満であった。
実施例４
電極の電位依存性
実施例１の電極のレドックスポリマー（POs-EA）は、形式的には、＋278mV（対SCE）のレドックス電位を有する（GreggおよびHeller、1991、J.Phys.Chem．95:5970）。図４は、実施例１のグルコース電極に関して、印加電位に対する電流密度依存性を示す。0.20Ｖ〜＋0.35Ｖ（対SCE）の間において、電流密度は印加電位に依存しなかった。＋0.40Ｖの正側の印加電位では、還元電流はもはや観測されなかった。−0.20Ｖのより負側の印加電位では、酸素の還元効果が観測される。
実施例５
電極の酸素依存性
実際、還元型のオキシダーゼは、過酸化水素の再酸化および産生に酸素を必要とする。図５は、実施例１の電極に関して溶存酸素の分圧に対する電流密度依存性を示す。37℃での空気飽和水溶液の酸素濃度は約0.2mMである（Hodgmanを参照のこと：Handbook of Chemistry and Physics、第44版、The Chemical Rubber Publishing Co.、Cleveland、OH、1963、1706頁）。
グルコース電極に関して、非常に低い酸素濃度においてさえ、電流密度は、酸素飽和溶液における電流密度よりも約20％の低下にすぎなかった。酸素濃度が0.04mM以上の場合、すなわち、わずかに４容量％の酸素を含有する大気圧アルゴンで飽和させた溶液において、電流密度は酸素濃度に依存しなかった。
しかし、乳酸電極に関しては、低い酸素分圧において、酸素濃度に対する電流密度依存性は一層明確であった。この違いは、GOxおよびLOxの固定化法が異なることにより説明される。過ヨウ素酸ナトリウムで架橋したGOx層は、PEGDGEで架橋したPVI-LOx層の酸素透過性よりも低い酸素透過性を有する。高い（５mM）乳酸濃度において、電流密度は、酸素分圧に依存しなくなった。それは、酸素の容量％が空気中のその容量％（21％）に達したにすぎなかった。より低い乳酸濃度に関して、より低い酸素流束によって乳酸の過酸化水素およびピルビン酸への定量的な変換が十分に行われるので、電流は酸素分圧にあまり依存しないことが予想される。
実施例６
電極の塩およびpH依存性
図６は、実施例１のGOx電極（Ａ）およびLOx電極（Ｂ）の両方に関して、NaCl濃度に対する電流密度依存性を示す。電流密度は低い塩濃度で少し高くなっているが、電極は、事実上、１Ｍ NaClまでの塩濃度に対して影響を受けなかった。塩濃度を0.1Ｍから１Ｍまで増大させても、電流密度の低下は10％未満であった。
図7Aおよび図7Bは、実施例１のGOx電極（図7A）およびLOx電極（図7B）の両方のpHに対する電流密度依存性を示す。グルコース電極に関して、電流密度は、pH4.5〜pH6.5の間でほぼその最大値であった。そのプラトーは、pH5.5付近で最大活性を示す溶液中でのGOx活性のpH依存性と一致する。乳酸電極に関しては、電流密度は、pH4.0でその最大値に達した。それは、pH6.5で最大活性を示す溶液中でのLOx活性のpH依存性とは異なっていた。グルコース電極および乳酸電極はともに、pH3.0未満で不可逆的に失活した。
実施例７
回転速度および温度依存性
図８は、GOx（Ａ）およびLOx（Ｂ）の両方に関して、回転電極の角速度に対する電流密度依存性を示す。電流密度は、実際、回転速度に依存していなかった。例えば、グルコース電極の場合、回転速度を50rpmから1000rpmまで増大させても、電流密度の増大は５％未満であった。
図9Aおよび図9Bは、両電極の温度に対する電流密度依存性を示す。図9Aは５mMグルコースのデータを示し、図9Bは５mM乳酸のデータを示す。
実施例８
長期間の作動安定性
37℃での連続作動における実施例１のセンサーの電流密度の安定性は、オキシダーゼ負荷の優れた結果であった。図10Aに示すように、GOx負荷が多いほど、37℃での作動安定性は良好であった。1.3μgのGOxを負荷した電極（ａ）は、40時間の作動寿命を有していた。一方、52μgのGOxを負荷した電極（ｄ）は、100時間を超える間、その初期の電流密度の100％を維持し、200時間後においてその初期電流密度の10％が喪失したにすぎず、280時間後では25％未満の喪失であった。図11は、高負荷および低負荷の両方でのグルコース電極に関する長期間の作動安定性実験の前後における電流密度の応答を示す。1.3μgのGOxを負荷した電極は、37℃で100時間作動した後、すべてのグルコース濃度においてその電流密度の90％以上が失われた。一方、26μgのGOxを負荷した電極は、低濃度での電流密度の喪失は見られず、200時間作動した後、５mMを超えるグルコース濃度において25％の電流密度の喪失が見られたにすぎなかった。サイクリックボルタンメトリーによって、電極は、長期間の安定性実験（図12）を通して電気的に反応性のオスミウムを失っておらず、活性酵素の量がグルコース流束のすべてを酸化するのに十分である限り、作動安定性は維持されていることが明らかにされた。
同様に、図10（B）は、LOx負荷が多いほど、37℃での作動安定性が良好であることを示す。20μgのLOxを負荷した電極は、37℃で120時間連続的に作動した後、すべての乳酸濃度においてその電流密度の80％以上を失った。一方、160μgのLOxを負荷した電極は、低濃度での電流密度の喪失は見られず、160時間作動した後、５mMを超える乳酸濃度において10％の喪失が見られたにすぎなかった。サイクリックボルタンメトリーによって、電極は、長期間の安定性実験を通して電気的に反応性のオスミウムを失っておらず、活性酵素の量が乳酸流束のすべてを酸化するのに十分である限り、作動安定性は維持されていることが明らかにされた（データを示さず）。
実施例９
妨害物質に対する選択性
アスコルビン酸、尿酸およびアセトアミノフェンなどの妨害物質は、POsEAコーティングの炭素電極で酸化される。これらの妨害物質は、触媒的な過酸化水素の電気的還元電流を減少させる。それにも関わらず、電流の変化は、基質の存在下および非存在下の両方において0.5mMまでの尿酸または1.0mMまでのアセトアミノフェンを添加したときに、実施例１の電極では観測されなかった。アスコルビン酸は、無視できるほどゆっくりした速度で電気的に酸化されるだけであった。例えば、１mMグルコースにおいて、0.1mMアスコルビン酸の注入は、電流密度の１％未満の減少を引き起こした。64mMグルコースでは、0.1mMアスコルビン酸の注入により、電流密度の0.1％未満の減少が生じた。
実施例１０
乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の調製および活性試験
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の調製
0.15ｇのテトラメチルオルトケイ酸（TMOS、カタログ番号：34,143-6、Aldrich、Milwaukee、Wisconsin）を小バイアルに加えた。このバイアルを氷浴に置き、約600rpmで攪拌した。36mLの2.44mM HClを添加し、この溶液を10分間攪拌した。次いで、バイアルをさらに10分間真空下に置き、ゾルプロセスにおいて生成したメタノールを除去した。真空を解き、20mLの20mMリン酸緩衝液（pH7.4）を添加することによって溶液のpHをpH5.1に調節した。
別の小バイアルにおいて、６mgの乳酸オキシダーゼ（LOx、Aerococcus viridens由来、41ユニット/mg、カタログ番号：1381、Genzyme、Cambridge、Massachusetts）、180mLの10mM４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝溶液（pH7.5）、および20mLの20mg/ml水性ポリ（１-ビニルイミダゾール）を、Timothy J.Ohara、Ravi RajagopalanおよびAdam Heller（Anal.Chem．1994、66、2451-57）によって記載されているように混合した。この溶液を上記のTMOS含有溶液に加え、１分間攪拌した。攪拌した混合物を、ゲルが生成するまで真空下に置いた。真空を解き、ゲルを２mLの蒸留水で３回洗浄した。次いで、ゲルを２mLの蒸留水に、一晩、４℃で浸した。水をバイアルから除き、ゲルを室温で一晩乾燥させた。乾燥ゲルを集め、乳鉢および乳棒で粉砕して粉末にした。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の定性的活性試験
乳酸オキシダーゼでドープ処理したシリカゲルの室温での定性的な活性試験に関して、過酸化物試験片（Reflectoquant▲Ｒ▼ 16974過酸化物試験、Merck、Darmstadt、Germany）を使用した。１〜２mgの乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を試験片の活性領域に塗布した。20μlの１Ｍ乳酸（リン酸緩衝溶液（PH7.4）で調製）を、試験片のその同じ領域に塗布した。乳酸オキシダーゼ活性の存在は、試験片の活性領域での青色の発色によって示された。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の定量的活性試験
酸素の存在下、乳酸オキシダーゼは、乳酸のピルビン酸への酸化を触媒する。その過程において、過酸化水素が化学量論的に生成する。酵素的に生成した過酸化水素は、キノンイミン色素を生成させるペルオキシダーゼ連結アッセイシステムを使用して定量的に測定することができる。この色素は、分光光度的に564nmで測定することができる。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の活性試験に必要な溶液の調製
反応混合物Ｉを、下記の溶液を配合することによって調製した：
（ａ）6.0mLの0.2Ｍ3,3-ジメチルグルタル酸［HO2CCH2CH2C（CH3）2CO2H］−NaOH緩衝液、pH6.5；
（ｂ）3.0mLペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来、Sigma Chemical Inc、St.Louis、Missouri）、50ユニット/ml、水溶液；
（ｃ）3.0mLの15mM４-アミノアンチピリン水溶液；
（ｄ）3.0mLの0.5Ｍ基質；および
（ｅ）9.0mLの蒸留水。
0.5％N,N'-ジメチルアニリンの貯蔵溶液を、0.2ｇを100mLの水に混合することによって調製した。酵素希釈液の貯蔵溶液を、66mgのFADを４mLの10mM KH2PO4−NaOH緩衝溶液（pH7.0）に添加することによって調製した。乳酸オキシダーゼ溶液を、酵素希釈液で１mg/mlの濃度で調製した。酵素反応停止液の貯蔵溶液を、0.25ｇのドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩［C12H25C6H4SO3Na］を100mlの蒸留水に溶解することによって調製した。すべての化学品は、別途記載がない限り、Aldrich Chemical Company（Milwaukee、Wisconsin）から購入した。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の活性試験手順
1.0mgの乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を計量して３mLキュベットに入れた。100μlの蒸留水を使用して、粉末をキュベットの内壁から底に洗い落とした。次いで、キュベットをパラフィルムで栓をし、63℃に設定した温度浴に所定の実験時間の間置いた。この時間の後、キュベットを温度浴から取り出し、100μlの酵素希釈液を添加した。次いで、キュベットを37℃の温度浴にさらに５分間入れた。
反応混合液Ｉの0.5％ジメチルアニリンに対する比が４：１である溶液を調製して、37℃で平衡化した。この溶液の１mLをキュベットに加えた。この混合物を攪拌し、正確に10分間、37℃で反応を行った。このインキュベーションの直後に2.0mLの反応停止液を添加して、564nmの吸光度（As）を測定した。
この手順を、酵素を含まない1.0mgのシリカゲル粉末を乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の代わりに使用して繰り返した。同じ手順をその後行い、ブランク吸光度（Ab）を測定した。従って、乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の正味の吸光度を、ΔA（ΔA＝As−Ab）によって求めた。ΔAが0.6よりも大きい場合には、アッセイを繰り返した。乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の重量をそれに応じて調節した。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の結果
図13に、時間に対する溶液中での乳酸オキシダーゼの活性低下を示す。酵素の半減期は63℃で6.8分であった。これは、以前に発表された値と一致していた（H.Minagawa、N.NakayamaおよびS.Nakamoto、1995、Biotechnology Letters 17（9）:975）。
図14Aおよび図14Bは、６３℃でのPVI−乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の酵素活性喪失と乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の酵素活性喪失との比較を示す。図14AはPVI−乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲルを示す。図14Bは、PVI−乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル（ａ）と乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル（ｂ）との比較である。63℃において、LOxドープ処理シリカゲル粉末（ｂ）は、溶液中のLOxの半減期と同じ半減期を有していた。しかし、PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末（図14B（a）および図14A）は、63℃で900分後においてその初期活性の60％を維持していた。
図15は、50℃の異なる環境下における乳酸オキシダーゼの活性喪失の時間依存性を示す。この温度で、PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末（Ａ）は、120時間後においてその初期活性の85％を維持していた。一方、LOxドープ処理シリカゲル粉末（Ｃ）の半減期は、10時間にすぎなかった。溶液中のLOx（Ｄ）および溶液中のPVI-LOx（Ｃ）はともに、半減期はこの温度で１時間未満であった。
PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末は、室温で水に11日間浸した後、その初期活性の100％を維持していた。
実施例１１
グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の調製と活性試験
GOxドープ処理シリカゲルの調製
1.527ｇのテトラメチルオルトケイ酸（TMOS）を小バイアルに加えた。このバイアルを氷浴に置き、溶液を約600rpmで攪拌した。360mLの2.44mM HClを添加し、この溶液を10分間攪拌した。バイアルをさらに10分間真空下に置き、ゾルプロセスにおいて生成したメタノールを除去した。真空を解き、100mLの20mMリン酸緩衝液（pH7.4）を添加することによって溶液のpHをpH5.1に調節した。別の小バイアルにおいて、67mgのグルコースオキシダーゼ（GOx、Aspergillus niger由来、カタログ番号：G-7141、183ユニット/mg、Sigmaから入手、St.Louis、MO）および540mLの10mM４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝溶液（pH7.5）を混合した。この溶液を上記のTMOS含有溶液に加え、１分間攪拌した。攪拌した混合物を、ゲルが生成するまで真空下に置いた。真空を解き、ゲルを室温で一晩乾燥させた。乾燥ゲルを最初に集め、乳鉢および乳棒で粉砕して粉末にした。
GOxドープ処理シリカゲルの定性的活性試験
グルコースオキシダーゼでドープ処理したシリカゲルの室温での定性的な活性試験に関して、過酸化物試験片（Reflectoquant▲Ｒ▼ 16974過酸化物試験、Merck、Darmstadt、Germany）を使用した。１〜２mgのグルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を、試験片の活性領域に塗布した。20μlの１Ｍグルコース（リン酸緩衝溶液（pH7.4）で調製）を、試験片のその同じ領域に塗布した。グルコースオキシダーゼ活性の存在が、試験片の活性領域での青色の発色によって示された。
グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末のより高温での活性を試験するために、下記の手順に従って、粉末をガラス製スライドガラスの上に固定化した。26mgのBermocoll▲Ｒ▼ EHM-100（Berol Nobel AB、Stenungsund、Sweden）、１mLのシクロヘキサノン、および１mLの水を小バイアルの中で混合した。このバイアルを炎の上で５分間加熱して攪拌した。溶液を静置して、白色ミセル部分を集めた。90μlのミセルと10mgのグルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末とを混合し、次いで５分間攪拌した。10μlの混合物をスライドガラスに塗布し、一晩乾燥させた。スライドガラスを所定の実験温度で５分間温度浴に浸した。スライドガラスを取り出して乾燥した。10μlの２Ｍグルコースを固定化ミセルに塗布した。過酸化物試験片の活性領域を固定化ミセルの上に置いた。試験片の活性領域での青色の発色によってグルコースオキシダーゼ活性の存在が示された。
GOxドープ処理シリカゲルの定量的活性試験
グルコースオキシダーゼの定量的活性試験を、乳酸オキシダーゼの定量的活性試験とちょうど同じように行った。ただし、１Ｍグルコース溶液を１Ｍ乳酸溶液の代わりに使用し、グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を乳酸オキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の代わりに使用した。
GOxドープ処理シリカゲルの定性的な結果
グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末は、40℃、50℃、60℃、70℃、84℃および92℃で、５分間、水に浸した後に活性を保持していた。一方、DEAEデキストラン、ヘパリン、ラクチトール（Lactitol）、ガフクォーツ（Gafquats）、およびデキストラン硫酸に同様に固定化されたグルコースオキシダーゼは、70℃より高い温度において活性の保持が見られなかった。
次いで、グルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を、より長い期間について92℃での活性に関して試験した。活性は20分までの間は保持されていた。その後、ミセルをスライドガラスから洗い流した。75℃では、活性は60分間以上にわたり保持されていた。
GOxドープ処理シリカゲルの定量的な結果
図16に、６３℃でのグルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末の酵素活性喪失（Ｂ）と溶液中でのグルコースオキシダーゼの酵素活性喪失との比較を示す。この温度において、GOxドープ処理シリカゲル粉末（Ｂ）は、1200分後、その初期活性の60％を維持していた。一方、溶液中でのGOx（Ａ）の半減期は、挿入図に示すように、6.5分であった。
実施例１２
PEI-LOxドープ処理シリカゲルの調製および活性試験
ポリエチレンイミン（PEI）はPVIと化学的に類似しており、酵素を安定化することが示されている。PEI-LOxドープ処理シリカゲル粉末を、PVI-LOxドープ処理シリカゲル粉末に関する手順と同じ手順に従って調製した。図17は、63℃でのPEI-LOxドープ処理シリカゲル粉末の時間に関する活性喪失を示す。900分後、PEI-LOxドープ処理シリカゲル粉末は、その初期活性の18％を維持していた。
実施例１３
コロイドシリカに吸着させたPVI-LOxの調製および活性試験
PVI-LOxもまた下記に手順に従ってコロイドシリカに吸着させた。1.69mgのLOxを、23μlの20mg/mL PVIに溶解した。この溶液を33μLのコロイドシリカ（水での34wt％懸濁物、Aldrich、Milwaukee、WI）と混合した。得られる溶液を乾燥した。固体を最初に集め、乳鉢および乳棒を用いて粉砕して粉末にした。PVI-LOx吸着シリカは、63℃で、溶液中のLOxと同じ半減期を有していた。
実施例１４
シリコーン内のソル−ゲルシリカ固定化GOX粒子を用いた積層センサー
0.29mmのポリイミド絶縁金線（0.02mmのポリイミド絶縁厚、OD 0.25mmの金線）を、
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（Anaytical Chemistry 66:3131-3138、1994）によって記載されているように、KCN溶液中で定電流でエッチングし、深さが約100μmの凹部を形成した。下記の順で液滴を凹部に置き、４層型構造を形成した。最も内側の層は、過酸化水素を検知するダイズペルオキシダーゼおよびレドックスポリマーを含有した。第２層は、過酸化水素透過性絶縁層であった。第３層は、ソル−ゲルシリカ固定化グルコースを含有する粒子が分散されたシリコーン層であった。第４の酢酸セルロース層は、酸素透過性でグルコース流束還元性であった。
これらの４層を電極に形成するために、下記の手順を使用した。実施例１の記載のように調製されたレドックスポリマー溶液を10mg/mLの濃度で使用した。ダイズペルオキシダーゼ（SBP）の脱イオン水溶液を10mg/mLの濃度で使用した。PEGDGEを５mg/mLで使用した。レドックスポリマー、SBPおよびPEGDGEの各溶液を２：２：１の比で混合した。混合溶液の約５nLづつの10滴を凹部内に連続的に堆積させて、検知層を形成した。これを55℃で20分間硬化させた。
第２層の過酸化水素透過性膜が成型される溶液は、0.5重量％の酢酸セルロース（40％アセチル化）を含むシクロヘキサノンからなった。この溶液の５nL液滴の１つを、凹部内の硬化された検知層に塗布した。
過酸化水素生成酵素層（第３層）を、実施例１５のソル−ゲル固定化グルコースオキシダーゼの0.5部、めのう乳鉢で30分間粉砕することによって９部の水に十分に混合されて分散されたDow Corning 3-5025シリコーン水ベースのエラストマーの１部から作製した。この混合物の３滴を酢酸セルロース層に塗布し、50℃で10分間硬化させた。
第４の層を、1.6重量％のTWEEN 80をもまたシクロヘキサノン中に含有する２重量％の酢酸セルロース（40％アセチル化）から、その１滴を第３層に塗布して作製した。
上記のように作製された電極を、pH7.0のリン酸緩衝溶液（20mMリン酸塩、0.14Ｍ NaCl）中で−0.045Ｖ（SCE）に保った。グルコースの非存在下での電流は0.1nAであった。グルコース濃度を５mMにした場合、電流は、20秒以内に3.6nAに上昇した。濃度を10mMにまでさらに増大すると、6.6nAおよび8.5nAのそれぞれの電流が得られた。
実施例１５
２層型グルコース電極
凹部を有するパラジウム電極を、金電極に関して、
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（Anaytical Chemistry 67:1240、1995）によって記載されているように調製した。ただし、パラジウムが定電流制御下でエッチングされる溶液はシアン化カリウム溶液ではなく、６Ｍ HClであった。形成された凹部は、深さが約100μmであった。10mg/mLのダイズペルオキシダーゼ、10mg/mLのPOs-EA、および５mg/mLのPEGDGEの各溶液を調製した。
小バイアルにおいて、20μLのペルオキシダーゼ溶液、20μLのPOs-EA溶液、および10μLのPEGDGE溶液を混合した。この混合溶液の５nLをパラジウム表面に塗布した。溶液を乾燥させた。この塗布工程および乾燥工程を７回繰り返した。電極を室温で一晩硬化させた。
別の小バイアルにおいて、0.1ｇのDow Corning水ベースのエラストマーシリコーン（#3-5025、ロット番号LL059026）および0.9ｇの水を十分に混合した。0.95ｇのこの混合物および0.05ｇのグルコースオキシダーゼドープ処理シリカゲル粉末を混合した。この混合物の５nLを、凹部を有するパラジウム電極の「結線」ダイズペルオキシダーゼ層の上に塗布した。次いで、電極を10分間50℃で硬化させた。
電極を、pH7.0のリン酸緩衝溶液（20mMリン酸塩、0.14Ｍ NaCl）中で−0.045Ｖ（SCE）に保った。その電流を、溶液中のグルコース濃度の関数として測定した。電極の見かけのKmは５mMグルコースであった。すなわち、最大電流の1/2が５mMグルコースで得られた。応答時間（すなわち、最大電流の10％から90％までの電流の増大）は、１分未満であった。電極の感度は0.8nA/mMグルコースであった。
実施例１６
シリカ固定化酵素の活性
上記の「無機ポリマーマトリックスの固定化および安定化」と題する節で記載したように、無機ポリマーマトリックス内における酵素の安定性は、少なくとも一部は、酵素のイオン的挙動および無機ポリマーマトリックス内に固定化された他の任意の分子に依存する。水和したシリカゲルは、pH５付近の等電点（pI）（すなわち、分子上の正味の電荷が０になるpH）を有する。pI＝3.8のグルコースオキシダーゼは、ゾル−ゲル固定化の際、その活性を保持し、水和したシリカゲルマトリックス内に固定化されたときに安定化され、その結果、酵素の半減期は、63℃で約100倍増大した。その一方、乳酸オキシダーゼ（pI＝4.6）およびグリコール酸オキシダーゼ
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はそれぞれ、水和シリカゲル内での固定化に際してその活性の少なくとも70％を失い、この２つの酵素は安定性が大きく向上しなかった。
水和シリカ単独におけるこれらの酵素の活性喪失とは対照的に、ポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）（PVI）
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またはポリ（エチレンイミン）（PEI）
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を使用して、水和ゲル内に付加物を形成した場合、乳酸オキシダーゼ（pI＝4.6）の半減期は63℃で約100倍増大し、活性の著しい喪失はなかった。グリコール酸オキシダーゼ
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とポリ（Ｎ-ビニルイミダゾール）
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との間での付加物の形成は酵素の安定性を改善しなかったが、グリコール酸オキシダーゼ
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とポリ（エチレンイミン）
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との間での付加物の形成によって、グリコール酸オキシダーゼの半減期は60℃で100倍以上増大した。グルコースオキシダーゼ（pI＝3.8）とPVIまたはPEIとの間での付加物の形成は、水和シリカにおけるその固定化後の酵素安定性をさらに改善しなかった。
グリコール酸オキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼは、Ｌ-α-ヒドロキシ酸の酸化を触媒するフラビンモノヌクレオチド（FMN）オキシダーゼのファミリーに属する。グリコール酸オキシダーゼ（Spinicia oleracea）および乳酸オキシダーゼ（Aerococcus viridans）のアミノ酸配列の配列比較を行った場合、Ｌ-α-ヒドロキシオキシダーゼファミリーの他のメンバーとともに下記の表１に示すように、その配列は、34％が同一であり、57％が保存されている。
グリコール酸オキシダーゼの結晶構造が、2.2Åの分解能で決定されている（Lindqvist et al.、1989、J.Mol.Biol．209:151-166）。配列が類似しているために、この構造は乳酸オキシダーゼを表していると考えられる。
グルコースオキシダーゼは、Ｌ-α-ヒドロキシオキシダーゼファミリーのメンバーではないが、FAD結合タンパク質の種類に属する。Aspergillus niger由来のグルコースオキシダーゼの結晶構造は、以前に、2.3Åの分解能で報告されている（Hecht et al.、1993、J.Mol.Biol．229:153）。
グリコール酸オキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼはともに、そのFMN結合ポケット内およびその進入部において、正荷電した残基が多数保存されている。どのような理論も本発明には必要とされないが、上記の事実を説明するためのモデルが提案されている。このような正荷電残基は、水和シリカの負に荷電したポリケイ酸アニオンと相互作用することができ、その結果ゾル−ゲル固定化に際して活性の低下が生じると考えられる。しかし、酵素表面が、流動性のポリカチオン緩衝剤（すなわち、PVIおよび／またはPEI、酵素の等電点に依存）によって包まれる場合、ポリケイ酸アニオンは、カチオン性緩衝剤分子と相互作用するが、酵素のカチオン性残基とは相互作用せず、それによってシリカゲル内に包み込まれることによって酵素を安定化する。従って、PVIおよびPEIは、乳酸オキシダーゼなどの酵素のカチオン性緩衝剤として作用する付加物を形成すると考えられる。PEIはまた、グリコール酸オキシダーゼなどの酵素のカチオン性緩衝剤として作用する。PVIは、その等電点がグリコール酸オキシダーゼの等電点よりも低いために、グリコール酸オキシダーゼの有効な緩衝剤でないと考えられる。
α-ヒドロキシ酸酸化酵素におけるFMN結合部位の解明された構造（Maeda-Yorita et al.、1995、Biochemie、77:631-642）によれば、残基R257、Y24およびY129（グリコール酸オキシダーゼの一次配列に従う番号付け）は基質の結合に重要であり、H254は触媒作用に必要である。フラボタンパク質オキシダーゼのいくつかの活性部位残基は保存されていることが明らかにされている。それには、R257、Y24、Y129およびH254に加えて、K230およびD157が含まれる。表１に示すように、残基のそのように観測された保存はまた、他のα-ヒドロキシ酸オキシダーゼにおいて見出された。残基R164、R289およびR309はまた、すべてのＬ-α-ヒドロキシ酸オキシダーゼにおいて保存されている。
グリコール酸オキシダーゼの活性部位は、そのタンパク質を通り抜けるチャンネル内に位置している。大きい方の開口部が分子の「前面」に位置し、小さい方の開口部は「背後」に位置している。チャンネルに至る前面の進入部は残基R289、R290およびR309によって取り囲まれ、背後の進入部はR164、D167およびR257によって取り囲まれている。酵素表面上の４つの保存された正荷電のアルギニンのいくつかまたはそのすべては、タンパク質表面上の誘引的な電場によって、負に荷電した様々なα-ヒドロキシ酸基質を酵素の活性部位に導くために必要であり得る。
グルコースオキシダーゼの活性部位が明らかにされ、それは、グルコースがその経路で活性部位に通じるチャンネルを有する（Hecht et al.、1993、J.Mol.Biol．229:153）。アルギニンを含有する２群の残基がグルコースオキシダーゼの活性チャンネルの近くに存在する。１つは、D424、R152およびR335の群を含む。もう一方はD416およびR176を含む。従って、正に荷電した残基はまた、活性チャンネルの近くでグルコースオキシダーゼに存在するが、グルコースオキシダーゼにおける正荷電の大部分は、負に荷電したアスパラギン酸残基と釣り合っている。２価の正の表面荷電はそのすぐ近傍の負に荷電した残基により釣り合い、そして第３の荷電は少し離れた負荷電の残基により釣り合っていることによって、グルコースオキシダーゼには顕著な広範囲の電場は存在しない。グルコースは電気的に中性であるため、そのような場は、グルコースを反応チャンネル内に導くために必要とされない。
Ｌ-α-ヒドロキシ酸化酵素の正に荷電した表面残基は、負に荷電したケイ酸と相互作用すると、例えば、シリカゲル内に酵素を固定化した際に酵素活性の減少が認められる。酵素とポリカチオンとの複合体が形成され、その後、ゾル−ゲル固定化することによって、損傷的な相互作用が防止される。酵素上の柔軟性のポリカチオン性緩衝剤によって、本質的に正に荷電した表面残基はケイ酸アニオンから遮蔽される。負に荷電したシリカは、タンパク質よりもむしろ遮蔽しているポリカチオンと相互作用する。
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α-ヒドロキシ酸オキシダーゼファミリーのいくつかのメンバーの複数配列比較：Spinacia oleracea由来のグリコール酸オキシダーゼ（GLYOX-So）、Rattusnorvegicus由来の（S）-２-ヒドロキシ酸オキシダーゼ（HAOX-Rn）、Pichia anomala由来のチトクロームB2前駆体（B2PRE-Pa）、Aerococcus viridans由来の乳酸オキシダーゼ（LOX-Av）、およびMycobacterium smegmatic由来の乳酸オキシダーゼ（LOX-MS）。配列比較は、Clustal-Wプログラム（version 1.7）を使用して行った。B2PRE-Paの最初の180残基は、他の酵素において等価でないために除き、その最後の３残基を示した。LOX-MSの最初の17残基およびLOX-Avの最初の12残基もまた除いた。同一残基には*で印を付け、高度に保存された残基には：で印を付け、中程度に保存された残基には「.」で印を付けている。上記の４個のアルギニン残基には、「*」の代わりに「^」を付けている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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