(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列を有するか、または配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、ホウレン草のクロロプラストのリボソームリサイクリング因子（ＲＲＦ）をコードするｆｒｒ遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載されたｆｒｒ遺伝子を組み込んだプラスミド。
【請求項３】
請求項２に記載されたプラスミドを有する大腸菌。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、ホウレン草のクロロプラストのリボソームリサイクリング因子（ＲＲＦ）としての機能を有するホウレン草ＲＲＦ様蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、真核生物のリボソームリサイクリング因子（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，以下ＲＲＦ）、及び該ＲＲＦをコードする遺伝子（以下ｆｒｒ）に関する。より具体的にはホウレン草のクロロプラストのＲＲＦ及び該ＲＲＦをコードする遺伝子に関する。さらに本発明は、そのＲＲＦをターゲットとした次世代抗菌剤、除草剤を開発する技術に関する。
【０００２】
【従来技術】
蛋白質生合成は、すべての細胞の生命活動において必要不可欠な機能であり、「開始」、「伸展」、「終結」及び「リボソームリサイクリング」の四段階から成り立っている。蛋白質生合成における最終的なステップ（第４ステップ）は、次の「開始」段階へリボソームを再利用する為に、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームからなる終結複合体を各々遊離、解離させることにより終了する。原核生物である大腸菌においては、このリボソームの「再利用」はＲＲＦとエロンゲーション因子Ｇ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｇ，以下ＥＦＧ）により触媒されることが分かっている。
このリボソーム「再利用」の過程はＪａｎｏｓｉ博士らによる総説（１９９６Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２：１２１−２０１）において紹介されている。
一方、近年、従来の抗生物質への耐性獲得菌株が数多く報告されてきており、細菌の発育を直接的に制限し得る部位を標的とする、新たな抗生物質の開発が早急に必要とされているので、ＲＲＦが抗菌剤のターゲットとして近年脚光を浴びつつある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところでこれまでに得られてきた蛋白質翻訳終結複合体の解離に関する結果はすべて、原核生物での研究が中心となっている。真核生物における重要な報告はいまだなされていない。真核生物においてＲＲＦに相当する遺伝子の報告が成されていない理由の一つとして、この蛋白合成における最終段階の仕組みが原核生物のそれと異なることが挙げられる。すなわち真核生物におけるＲＲＦ様の機能蛋白はミトコンドリアやクロロプラストに限られている。もっとも、ミトコンドリアやクロロプラストは遺伝学的に細菌から起源していることがわかっているので、これらのＲＲＦが特に細菌に重要であることが考えられる。
【０００４】
この結論を支持する一つの事実として、海底火山菌のＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉはその蛋白質生合成に関する因子のホモロジーが真核生物のそれぞれの因子と非常に高いことが知られているが（Ｂｕｌｔら  １９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１０５８−１０７３）、ＲＲＦ相当の蛋白は見られない。この細菌は蛋白合成系が真核生物と非常に似通っているにも拘らず、ミトコンドリアやクロロプラストにあたるオルガネルが存在しない。このことは、真核生物において蛋白質翻訳終結複合体の解離はＲＲＦではない他の因子により触媒される可能性を示唆している。
【０００５】
第二に、真核生物のｍＲＮＡはモノシストロニックで原核生物のそれはポリシストロニックてある（Ｋｏｚａｋ  １９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４３８−３４４５；Ｄａｓら１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４７５７−４７６８；Ｓｃｈｏｎｅｒら１９８６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：８５０６−８５１０；Ｓｐｒｅｎｇｅｌら  １９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８９３−９０９）。従って真核生物においてリボソームのｍＲＮＡよりの解離が阻害されても下流のシストロンを影響することはない。然るに原核生物ではこのステップの阻害は原核生物のｍＲＮＡがポリシストロニックであるために下流のシストロンの翻訳を阻害することになる。
【０００６】
このように真核生物における蛋白質生合成の最終段階にあたる蛋白質翻訳終結複合体の解離という第４段階が原核生物のものと異なると考えられるので、新しい型の抗生物質の開発を目的として、専ら原核生物を対象として研究が進められている。従って、これまで真核生物の第４ステップについてはＲＲＦの存在も含めて全く分かっていない。しかしながら、以上のことを勘案すると真核生物について、そのＲＲＦの構造および性状を解析することは、種々の抗菌剤の開発に有用であるばかりか、特に植物のＲＲＦは除草剤の開発にも極めて重要な情報となり得ると考えられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記の現状を踏まえ、ＲＲＦに関する研究を進める中で、真核生物である植物のＲＲＦは植物のミトコンドリアやクロロプラストにおける蛋白合成に関与していること、この形質を同定すれば、ヒトには有害ではない抗生物質を開発する上で重要な情報となり得ること、また、その因子の機能を阻害すれば植物は生存し得ないこと、従って植物ＲＲＦの特異的な阻害剤は除草剤としての活用の可能性が充分考えられること等に着目し、さらに鋭意研究を進めた結果、ホウレン草のクロロプラストのＲＲＦをコードする遺伝子ｆｒｒを発見してそのＲＲＦの一次構造を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、新規なホウレン草のｆｒｒ遺伝子及び該遺伝子がコードするＲＲＦ様蛋白、またホウレン草ｆｒｒ遺伝子を組み込んだプラスミド、該プラスミドを有する大腸菌さらには植物のＲＲＦを除草剤の製造に用いる方法に関する。
ＲＲＦの一次構造の解明は更に二次、三次構造の解明につながり、除草剤をはじめとして、種特異的な阻害剤をラシヨナルドラグデザインにより設計することを可能とするものである。従って本発明によって示されたホウレン草のＲＲＦの一次構造、及びその他の情報は産業上極めて重要な意義を有する。
【０００９】
さらに、前記の考察から分かるように、ＲＲＦをターゲットとした抗菌剤を開発する上でもこれらの情報は非常に重要なものといえるが、驚くべきことに、真核生物ＲＲＦ遺伝子の存在と、それがコードしているＲＲＦの存在によっては、大腸菌におけるｆｒｒ遺伝子変異を補い得る能力は有さず、むしろその阻害作用を示すことが本発明者によるホウレン草ｆｒｒ遺伝子を組み込んだプラスミドを有する大腸菌を用いた実験により判明した。このようにして大腸菌のＲＲＦを阻害すると、大腸菌はその生理学的状況に拘らず死んでしまうことが分かり、ＲＲＦをターゲットとした抗菌剤は生育抑制のみならず殺菌作用を有することを示した。
【００１０】
即ち、本発明者は、ホウレン草ｆｒｒ遺伝子を組み込んだプラスミドによる大腸菌の温度感受性ＲＲＦに対する作用を後記する実験によって確認した（大腸菌の温度感受性ＲＲＦについては特願平１０−１４７４７号及びＰＣＴ／ＪＰ９８／００７３４参照）。このことから、ホウレン草のＲＲＦのどの部分が大腸菌の温度感受性ＲＲＦを阻害するかを調べれば、抗菌剤の探索に極めて重要な情報となり得る。この事実はＲＲＦをターゲットとした抗菌剤の作製に極めて重要な知見であるといえる。
ホウレン草のＲＲＦに関するこれらの情報は、この大腸菌ＲＲＦ機能への阻害作用を有するホウレン草ＲＲＦの構造が考えられるのは勿論のこと、今後この二次元、三次元構造解析および阻害メカニズムを究明し、ＲＲＦ阻害による次世代抗生物質及び除菌剤開発に、とくにラシヨナルドラグデザインにより抗菌剤を開発する際の一つの指標として、極めて重要な意義を有する。
以下、実験例により本発明をより詳細に示す。以下に示す実験例はあくまでその詳細な解説を目的とするものであり、他の方法を制限するものではない。
【００１１】
【実験例】
［実験例１］
ホウレン草からのｆｒｒ遺伝子の同定を行った実験例
本発明におけるホウレン草ｆｒｒ遺伝子の同定は当初、ホウレン草のエンベロープに発現している未知の蛋白の遺伝子をクローニングする為に、葉緑体のエンベロープ膜に対する抗体を用いてλｇｔ１１に入れたホウレン草ｃＤＮＡライブラリ（計１．５ｘ１０５）より検索したことに始まる。検出されたポジティブクローンを精製した後、λｇｔ１１クローニングサイトの両末端に対するプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際３種の異なるクローンが得られたが、それぞれの５’末端は同じものであった。また、この得られたインサートの長さは約１．１Ｋｂｐであった。この得られた配列を用いて作製したα−３２Ｐラベルプローブを用いて、ホウレン草の葉に含まれる全ＲＮＡについてノーザンブロッティングを行ったところ、ほぼ同じ長さのｍＲＮＡが検出された（図１のＡ）。すなわち得られたｃＤＮＡはこの遺伝子の全配列を含むものであったと考えられる。
この得られたインサートｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ／ＳａｃＩで切断した後にベクターｐＵＣ１８へ導入しシーケンスを行った結果を配列表１に示す。
【００１２】
この得られたアミノ酸配列を用いてgene bankを検索した結果、大腸菌のＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列（Ichikawaら 1989, J. Biol. Chem., 264: 20054-20059）と非常に高い相同性を有していることが分かった。また他にもこの遺伝子のアミノ酸配列や大腸菌ＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と非常に高い相同性を有するアミノ酸配列も見つかり、特にDaucus carota(GenBank accession number X72384）のglycine-rich nuclear located protein(NLP）やHaemophiles influenzae(Fleischmannら1995, Science, 269: 496-512)、Mycoplasma genitalium(Fraserら1995, Science, 270: 397-403)、Synechocystis sp. PCC6803(Cyanobase accession number sll0145)の３種の原核生物のＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と比べ良く保存されていた。大腸菌ＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と比べこのホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列のＣ末端部（アミノ酸８７から２７１残基）のみを比べると４６％の同一性（６６％の相同性）となっているがＮ末端が異なっているので細菌特異的又は植物特異的な抗ＲＲＦ剤の創造は充分可能性があると考えられる。従ってこの発見は産業上非常に重要であると考えられる。ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列とニンジンのＲＲＦのアミノ酸配列は７４％の同一性（８９％の相同性）を有している。また、酵母真菌のＲＲＦと予想されている遺伝子（Ouzounisら1995, Protein Sci, 4: 2424-2428)のアミノ酸配列は大腸菌ＲＲＦのアミノ酸配列と比較して２５％の同一性（４６％の相同性）を有し、ホウレン草のＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列と比較して２１％の同一性（４５％の相同性）を有している（配列表２）。
【００１３】
このホウレン草ＲＲＦ様遺伝子は大腸菌のものと比べると、そのＮ末端において８６アミノ酸残基分が長く付け加えられた様になっており、解析の結果この部分の配列はミトコンドリアやクロロプラストへの局在を示すターゲッティング配列を示していることが分った。
【００１４】
［実験例２］
（特に光合成を行なう組織において）単一のホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の検出を行った実験例
得られたｃＤＮＡをもとにしたプローブを用いてホウレン草ゲノムＤＮＡについてサザンブロッティングを行ったところ、単一の遺伝子が検出された（図１のＢ）。さらにホウレン草のさまざまな組織から得た全ＲＮＡを用いてノーザンブロッティングを行った結果、子葉と葉においてはその発育のあいだ恒常的にこの遺伝子を発現していることが分かった（図１のＣ）。古い葉や子葉における発現は、若い葉における発現と比べると若干少ないことも観察され、hypocotylsと根においては明らかに発現していないことが観察された。これらのことから、このＲＲＦ様の遺伝子の発現は特に光合成を行なう組織に制限されていると考えられる。しかし暗所にて育てたホウレン草の葉においても発現が観察されたこと（図１のＤ）は、この発現が組織特異的ではあるが光の刺激とは無関係に起こるものであることを示している。
【００１５】
［実験例３］
大腸菌におけるホウレン草ＲＲＦ様蛋白の過剰発現とその精製及び抗体作製を行った実験例
ｐＥＴ−１５ｂプラスミドを用いてリコンビナントホウレン草ＲＲＦ様遺伝子産物の過剰発現を大腸菌中にて試みた。ＩＰＴＧによる発現誘導２時間３０分後大腸菌抽出液を調べたところ、可溶性蛋白の２０％ほどの割合でリコンビナントホウレン草クロロプラスト局在ＲＲＦ様蛋白（以下ｃｐＲＲＦＨと記述）が発現しているのが観察された。また同時に、上記のものよりやや分子量の小さい蛋白の過剰発現も観察され、この両者の蛋白を含む分画をアフィニティークロマトグラフィーで精製した（図２のＡ）。この分画に存在するホウレン草ＲＲＦ様蛋白をＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィーにて分離した（図２のＢ）。以上の操作により分離精製されたホウレン草ＲＲＦ様蛋白を用いて兎に免疫し抗体を得た。得られた抗体はアフィニティー精製し、ウエスタンブロッティングと免疫組織化学実験に用いた。
【００１６】
［実験例４］
ホウレン草ＲＲＦ様蛋白のクロロプラストへの局在を示した実験例
前述の大腸菌中で過剰発現させたＲＲＦ様遺伝子産物に対する抗体を作製し、葉の抽出液を用いてウエスタンブロッティング解析を行った（図３のＡ及び図３のＢ）ところ、配列から予想された分子量（３０，３００ダルトン）よりやや小さいサイズ（２６，５００ダルトン）のバンドが検出された。これは、前述の通りそのアミノ酸配列からＮ末端部はクロロプラスト局在のターゲッティング配列であり、ここを含む前駆体の形で発現され、目的とする器官へ移行した後、その部位は切断分解されてＲＲＦとして活性を持つ形になると予測していたことと合致するものであった。
図３のＡは、ホウレン草ＲＲＦ様蛋白の発現をさまざまな細胞成分内で見たものである。ホウレン草の葉の各細胞成分分画抽出液を用いて行ったウエスタンブロッティングの結果、このホウレン草ＲＲＦ様蛋白はクロロプラストとミトコンドリアにおいて検出され、葉の全抽出液と比較してそのほとんどはクロロプラストに存在していることがわかる（図３のＡ）。
【００１７】
［実験例５］
クロロプラスト内でＲＲＦ前駆体がＲＲＦにプロセシングされることを示した実験例
図３のＡに示す様にホウレン草ＲＲＦはクロロプラスト内においてはストローマに多く存在し、エンベロープ膜には少なく、チラコイド分画からは全く検出されなかった。さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたホウレン草ＲＲＦ様蛋白前駆体と精製エンドウ豆クロロプラストを用いて、クロロプラスト内におけるプロセシングを証明する実験を行った（図３のＢ）。この実験で生成された前駆体蛋白（分子量３５，０００ダルトン）は、上記（図３のＡ）のウエスタンブロッティングによりクロロプラストやミトコンドリアから検出されたものと同じ分子量（２６，５００ダルトン）で検出された。換言すれば、エンドウ豆のクロロプラストはホウレン草のＲＲＦ様前駆体をプロセシングすることが証明された。
なお、このプロセシングを受けた蛋白はＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ処理後も検出されたことから、クロロプラストへ取り込まれクロロプラスト内にてプロセシングを受けたことがわかる。これらの事実により、ホウレン草ＲＲＦ様前駆体蛋白はクロロプラストへ移行した後、そのクロロプラストターゲット配列であるＮ末端部の切断プロセシングを受けることが明らかになった。
【００１８】
［実験例６］
ホウレン草クロロプラストからＲＲＦ様蛋白を精製した実験例
図４に示す実験では、ホウレン草クロロプラストストローマからホウレン草ＲＲＦ様蛋白の精製を行った。大腸菌内において一過性発現をさせたＲＲＦ様蛋白に対する抗体を用いたＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌカラムにより、単一のポリペプチドすなわちホウレン草ＲＲＦ様蛋白を精製溶出させた。この際、３Ｋｇのホウレン草の葉より０．３ｍｇのＲＲＦ様蛋白を精製出来たが、これはストローマ蛋白の２０００分の１にあたり、このホウレン草ＲＲＦ様蛋白がマイナーなクロロプラスト蛋白であることがわかる（図４のＡ）。この精製ホウレン草ＲＲＦ様蛋白におけるＮ末端のアミノ酸配列を調べたところ、ＡＴＭＥＥＶＥＡＥＫであり、これは前述したｃＤＮＡより予想されるアミノ酸配列の７９から８８残基と合致した。すなわち、一度前駆体蛋白として発現したものがプロセシングを受けて機能蛋白となるという事実を裏付けるものである。このプロセシング後のホウレン草ＲＲＦ様蛋白の分子量は２１，８３８ダルトン（１９３アミノ酸残基）であり、上記事実より前駆体蛋白の７８アミノ酸残基までがクロロプラスト局在部位でプロセシング後切断される部分と定義できる。
【００１９】
［実験例７］
ホウレン草ＲＲＦ様蛋白が大腸菌の中で機能できないことを示した実験例
ＲＲＦ遺伝子変異大腸菌株を用いて、ホウレン草ＲＲＦ様蛋白で大腸菌ＲＲＦの機能を補えるかを見る実験を行った。方法は以下の通りである。染色体上のｆｒｒ（ＲＲＦをコードする遺伝子）のフレームシフト変異の為そのままでは発育能を持たない大腸菌株ＬＪ２７０８は、その発育に野生型ｆｒｒ遺伝子を持つプラスミド（ｐＰＥＮ１０５４ｓａｃＢｎｅｏ）を必要とする。この大腸菌株に、ホウレン草ＲＲＦ様蛋白をコードする遺伝子のうち成熟型ＲＲＦ（切断分解後機能を持つと思われる部分）をコードしている遺伝子を導入したプラスミド（ｐＫＫ２３３−２ＲＲＦＭ）を導入し、インコンパチビリティーの理論を用いてホウレン草のＲＲＦが大腸菌中で機能を発揮するか否かを検討した（表１）。この表に示されている様に、大腸菌が生存するためにはホウレン草のＲＲＦが存在しても大腸菌のＲＲＦを必要とし、ホウレン草のＲＲＦは大腸菌中で機能しないことが示された。
【００２０】
［実験例８］
ホウレン草のＲＲＦの大腸菌における発現は大腸菌に対してＲＲＦ阻害致死作用を有することを示す実験例
表２において、ホウレン草ＲＲＦ様蛋白は大腸菌温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異菌株の発育を阻害することを示している。すなわち、大腸菌株にホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドを導入し発現させた結果、その宿主細胞が温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株を持つ場合には、宿主細胞が野生型ＲＲＦ遺伝子を持つ場合に比べて、１０の５剰分の１の発育能しか示さなかった。プラスミドの導入を行ない又はホウレン草ＲＲＦの発現をさせない条件ではほぼ正常の発育を示した。
【００２１】
また、このホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドは野生型ＲＲＦ遺伝子を持つ大腸菌中では安定であるが、温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株を持つ大腸菌中では不安定であった（図５）ことからも同様のことが分かる。この実験で宿主大腸菌はｌａｃＩｑ遺伝子を持つ。その為ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の発現にはＩＰＴＧの添加による誘導を必要とするが、このようにその発現の誘導が行われない条件下においても温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株を含む大腸菌によるホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドの排除が行われた。このことは微量のホウレン草ＲＲＦでも温度感受性の大腸菌のＲＲＦを低温にの温度感受性ＲＲＦの働く温度）においても阻害し、菌の生育を防ぐことを示す。
また、大腸菌に対するホウレン草ＲＲＦの影響を更に詳しく調べる為に図６に示す実験を行った。すなわち、静止期または増殖期の温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株であるＬＪ２２２１においてホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の発現を誘導したところ、いずれの状態でもその生育が阻害され殺菌作用を示した。
【００２２】
【表１】
0004102482.tif 000002
ＬＪ２７０８とＬＪ２２１１の大腸菌株について、ｐＫＫ２３３−２ＲＲＦＭ（ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むＣｏｌＥｌレプリコン、アンピシリン耐性遺伝子を持つ）、ｐＲＲ２（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆｒｒを含むＣｏｌＥｌレプリコン、アンピシリン耐性遺伝子を含む）、ｐＵＣ１９（ＣｏｌＥｌレプリコン、アンピシリン耐性遺伝子を含む）の三種類のプラスミドを導入し、それぞれ形質転換を行った。形質転換を行った大腸菌はアンピシリンを含む培地にて３２℃で培養し、それらの新たに導入されたプラスミドの存在を確認した。
【００２３】
【表２】
0004102482.tif 000003
大腸菌株ＭＣ１０６１，ＬＪ１４，ＬＪ２８４８，ＬＪ２２２１にホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミド（ｐＫＫ２３３−２ＲＲＦＭ、アンピシリン耐性遺伝子も含む）を導入し形質転換を行った。形質転換された大腸菌株はアンピシリンで選択し、表中に示した条件下においてその発育したコロニー数よりプラスミド５０ｎｇあたりのコロニー数を計算して示した。
【００２４】
以上のように、ホウレン草ＲＲＦ様蛋白は野生型ＲＲＦに弱い阻害作用を示すが温度感受性の大腸菌ＲＲＦには極めて強い阻害作用を示し、これは温度感受性大腸菌ＲＲＦが充分機能し得る温度においてみられた。このことは、大腸菌のＲＲＦを特異的に又非可逆的に阻害すると大腸菌の静止期、成長期に関係なく阻害作用を有すること、即ち、細菌のＲＲＦの阻害剤の中には静止期においても殺菌作用を有するものが存在し得ることを示唆している。従って、上記の実験結果は、本発明により同定されたホウレン草のアミノ酸配列から出発して、細菌のＲＲＦ阻害剤のｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓが得られる可能性を強く示すものであって、従来にない新規な抗菌剤の開発にとって極めて重要な意義を有するものである。
【００２５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１１０９（核酸）、２７１（アミノ酸）
配列の型：核酸及びアミノ酸
配列
0004102482.tif 000004
【００２６】
配列表１
ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のｃＤＮＡとアミノ酸配列
終止コドンは＊で示してある。下線は、後述するホウレン草クロロプラストより精製し解析した天然のホウレン草ＲＲＦ様蛋白のＮ末端１０アミノ酸残基の位置を示してある。太字は、これらより予想される成熟ホウレン草ＲＲＦ様蛋白に相当する部分を示す。
【００２７】
配列番号：２
配列の型：アミノ酸
配列の特徴
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
0004102482.tif 000005
【００２８】
配列表２
予想されるホウレン草ＲＲＦ様アミノ酸配列と他種ＲＲＦを含むアミノ酸配列との比較を示す。
ＮＬＲＲＦＨ：Daucus carotaの核蛋白D2(GenBank accession number X72384）ＥｃｏＲＲＦ：大腸菌ＲＲＦ(J. Biol. Chem., 264, 20054-20059, 1989)
ＨｉｎＲＲＦ:Haemophilus influenzae RRF(Science, 1995, 269, 496-512)
ＳｙｎＲＲＦ:Synechocystis sp. PCC6803(Cyanobase accession number s110145)
ＭｇｅＲＲＦ:Mycoplasma genitalium RRF(Science, 1995, 270, 397-403)
ＳｃＲＲＦＨ：酵母様真菌ミトコンドリアＲＲＦ(Protein Sci., 1995, 4, 2424-2428)
【００２９】
配列番号：３
配列の型：核酸及びアミノ酸
配列
0004102482.tif 000006
【００３０】
配列表３
ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子とDaucus carotaのglycine-nuclear located proteinとの遺伝子配列とアミノ酸配列の比較を示す。
Ｓｏ：ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子
Ｄｃ：Daucus carotaのglycine -nuclear located protein
【図面の簡単な説明】
【図１】ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のノーザンブロッティングとサザンブロッティングによる解析を示した図。
Ａ：ノーザンブロッティングにより、ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のｍＲＮＡが約１．１ｋｂであることを示した図である。葉緑体のエンベロープ膜の葉緑体に対する抗体を用いてλｇｔ１１に入れたホウレン草ｃＤＮＡライブラリより検出したポジティブクローンをプローブとして用いた。
Ｂ：サザンブロッティングにより、ホウレン草様ＲＲＦ遺伝子がゲノムＤＮＡ上にあることを制限酵素ＥｃｏＲＩ（レーン１）とＥｃｏＲＶ（レーン２）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３）を用いて示した図である。
Ｃ：ノーザンブロッティングにより、発芽２０日後のホウレン草の子葉（Ｃ）、葉（Ｌ）、ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ（Ｈ）、根（Ｒ）において、特に光合成組織特異的に発現することを示した図である。Ｌ１とＬ３は夫々古い葉と若い葉を用いた。
Ｄ：ノーザンブロッティングにより、ホウレン草ＲＲＦ様ｍＲＮＡ発現が、光の刺激により影響を受けないことを示した図である。発育条件は以下の通りである。
レーン１：暗所にて１８日間（Ｄ）、
レーン２：暗所にて１４日間の後明所にて４日間（Ｄ＋Ｌ）、
レーン３：明所にて１８日間（Ｌ）と示した。
上記は全て、ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のヌクレオチド２６９から４７７をα−３２Ｐでラベルしてプローブとした。
【図２】    大腸菌株Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現ベクターｐＥＴ−１５ｂを用いて、リコンビナントホウレン草ＲＲＦ様蛋白を過剰発現させ解析した図。  Ａ：大腸菌全抽出液と過剰発現されたホウレン草ＲＲＦ様蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した。
レーン１：ＩＰＴＧによる発現誘導前の大腸菌全抽出液、
レーン２：ＩＰＴＧによる発現誘導２時間３０分後の大腸菌全抽出液、
レーン３，４：ＩＰＴＧで誘導を行った大腸菌全細胞抽出液からニッケルアフィニティークロマトグラフィーにて精製したもの（レーン４）とそのフロースルー（レーン３）、
レーン５：分子量マーカー
Ｂ：ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィーにてホウレン草ＲＲＦ様蛋白を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した図である。
レーン１から４：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む分画、
レーン５から８：ホウレン草ＲＲＦ様蛋白を含む分画。
【図３】Ａ１及びＡ２：ホウレン草ＲＲＦ様蛋白の細胞内局在を観測した図。
ホウレン草の葉の抽出液を成分分画してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、精製抗リコンビナントホウレン草ＲＲＦ様蛋白抗体によるウエスタンブロッティング（Ａ１）とクーマシーブリリアントブルー染色（Ａ２）を行った。
レーン１：葉の全抽出液（ＬＥ）、
レーン２：ミトコンドリア（Ｍｉｔｏ）、
レーン３：クロロプラスト（Ｃｈｌ）、
レーン４：エンベロープ（Ｅ）、
レーン５：ストローマ（Ｓ）、
レーン６：チラコイド（Ｔ）、
レーン７：分子量マーカー
Ｂ：精製エンドウ豆クロロプラスト内でのＮ末端領域を含むホウレン草ＲＲＦ様蛋白の修飾をウエスタンブロッティングにより観測した図。
レーン１：標識蛋白、
レーン２：標識蛋白導入後のクロロプラスト抽出液、
レーン３：標識蛋白導入後のクロロプラストを、クロロプラスト表面（細胞膜側）に存在している標識蛋白を除く為にｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎで処理したもの。
【図４】  ホウレン草クロロプラストより天然のホウレン草クロロプラストＲＲＦ様蛋白を精製し、ウエスタンブロットにより解析した図。
Ａ：ホウレン草ストローマ抽出液のＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィーによる分画を示す図である。
Ｂ：全ての分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析図。
レーン１：ストローマ抽出液（Ｓ）
レーン２から８：それぞれＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィー精製における溶出分画３５，３７，３９，４１，４３，４５
レーン９：大腸菌中において一過性発現させて精製したヒスチヂンタグーホウレン草ＲＲＦ様蛋白（Ｃ）（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、抗ホウレン草ＲＲＦ様蛋白ポリクローナル抗体を用いて行ったウエスタンブロッティングによる解析図。
【図５】ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を持つプラスミドが、大腸菌温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株中において不安定であることを示すグラフ。
温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異（ｔｓ−ｆｒｒ）を持つ大腸菌ＬＪ２２２１（左）と野生型ＲＲＦ遺伝子（ｗｔ−ｆｒｒ）を持つ大腸菌ＬＪ２８４６（共にｌａｃＩｑ遺伝子を持つ）をホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ２３３−２ＲＲＦＭ（上段）もしくはそのベクタ−ｐＫＫ２３３−２（下段）で形質転換させアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて０．０５ＡＢＳ（ＯＤ  ５４０ｎｍ）に合わせた後、それぞれ表記の時間３２℃（温度感受性ＲＲＦが機能できる温度）で培養した。その後、それぞれアンピシリンを含むＬＡアガー（●）もしくは含まないＬＡアガー（○）上にて３２℃で一夜培養してそのＣｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを求めた。縦軸はＣｆｕ／ｍｌ、横軸はＴｉｍｅ（ｈｏｕｒｓ）を示す。
【図６】Ａ：ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の発現が、温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株であるＬＪ２２２１の静止期にある細胞へ与える影響を示すグラフ。
大腸菌温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株ＬＪ２２２１（ｔｓ−ｆｒｒ）（左）もしくは野生型ＲＲＦ遺伝子を持つ大腸菌株ＬＪ２８４６（ｗｔ−ｆｒｒ）（共に１ａｃＩｑ遺伝子を持つ）にホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ２２３−２ＲＲＦＭ（○●）もしくはそのベクターｐＫＫ２３３−２（□▲黒四角▼）を導入した。それぞれアンピシリンを含むＬＢ液体培地において０．０５ＡＢＳ（ＯＤ  ５４０ｎｍ）に希釈し、５ｍＭのＩＰＴＧ存在下（●▲黒四角▼）もしくは非存在下（○□）で表記の時間培養した。その後各培養液よりアンピシリンを含むＬＡアガー上にて一夜培養してそのｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを求めた。縦軸はＣｆｕ／ｍｌ）横軸はＴｉｍｅ（ｈｏｕｒｓ）を示す。
Ｂ：ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の発現が温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株ＬＪ２２２１の増殖期にある細胞へ与える影響を示すグラフ。
ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ２３３−２ＲＲＦＭを導入した大腸菌温度感受性ＲＲＦ遺伝子変異株ＬＪ２２２１（ｌａｃＩｑ遺伝子を持つ）をＬＢ液体培地中にて０．００００５ＡＢＳ（ＯＤ  ５４０ｎｍ）に希釈した後、４時間（左）、６時間（中央）、８時間（右）にて培養した。その後それぞれの培養液を二分して５ｍＭのＩＰＴＧ存在下（●）もしくは非存在下（○）で表記の時間培養し、（Ａ）と同様にしてｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを求めた。縦軸はＣｆｕ／ｍｌ）横軸はＴｉｍｅ（ｈｏｕｒｓ）を示す。なお、培養温度はすべて３２℃で行われた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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