(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＸＩＶのグアニン誘導体：
0004127851.tif 000055
（式中、Ｒ10はブロモ、クロロまたはシアノであり、Ｙ’はＨ、リボシル、デオキシリボシル、アラビノシル、
0004127851.tif 000056
（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ”はＣ1〜Ｃ10アルキルであり、Ｒ”’はＨまたはＣ1〜Ｃ10アルキルである）
またはその置換誘導体である（ここでＲ”はヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ10アルキルであり、Ｒ”’はＨである）。
【請求項２】
Ｙ’がＨ、リボシル、デオキシリボシル、または
0004127851.tif 000057
である（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ”はＣ1〜Ｃ10アルキルであり、Ｒ”’はＨまたはＣ1〜Ｃ10アルキルである）、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ’が（ヒドロキシ−Ｃ1〜Ｃ10アルコキシ）メチルである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ10がブロモである、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニンである、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニンである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニンである、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアノシンである、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−２−デオキシグアノシンである、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
Ｏ6−（４−クロロテニル）グアニンである、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
Ｏ6−（４−シアノテニル）グアニンである、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
Ｏ6−（４−メトキシテニル）グアニン、
Ｏ6−（５−ブロモ−３−チエニルメチル）グアニン、または
Ｏ6−（５−ヨード−３−チエニルメチル）グアニンである、グアニン誘導体。
【請求項１３】
Ｏ6−（４−メチルチオテニル）グアニン、または
Ｏ6−（４−アジドテニル）グアニンである、グアニン誘導体。
【請求項１４】
下記より選択される化合物：
タイプ１  式ＩＩＩの８−ヒドロキシグアニン：
0004127851.tif 000058
（式中、
Ｒはメチレンオキシ基と１，３−関係にあるハロゲンまたはシアノで置換されたチエニルであり、
Ｙ’は請求項１に定めたものであり、
Ｒ2はＮＨ2であり、
Ｒ3はＯＨである）；
タイプ２  式ＩＶの８−アザグアニンまたは８−アザ−７−デアザグアニン：
0004127851.tif 000059
（式中、
Ｒはメチレンオキシ基と１，３−関係にあるハロゲンまたはシアノで置換されたチエニルであり、
Ｙ’は請求項１に定めたものであり、
ＸはＣＨまたはＮであり、
ＡはＮである）；
タイプ３  式ＶＩの８−オキサグアニン、８−チアグアニン、およびプテリン：
0004127851.tif 000060
（式中、
Ｒはメチレンオキシ基と１，３−関係にあるハロゲンで置換されたチエニルであり、
ＺはＯまたはＳまたはＣＨ＝ＣＨである）。
【請求項１５】
Ｒが塩素、臭素、またはフッ素で置換されたチエニルである式ＩＩＩである、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒが塩素、臭素、またはフッ素で置換されたチエニルである式ＩＶである、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒが塩素または臭素で置換されたチエニルである式ＶＩである、請求項１４記載の化合物。
【請求項１８】
Ｏ6−（４−ハロテニル）−８−チアグアニンである、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−８−チアグアニンである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
Ｏ4−（４−クロロテニル）プテリン、または
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−８−ヒドロキシグアニンである、請求項１４記載の化合物。
【請求項２１】
Ｏ6−（４−クロロテニル）−８−アザグアニン、
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−８−アザグアニン、
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−７−デアザ−８−アザグアニン、または
Ｏ4−（４−ブロモテニル）プリテンである、請求項１４記載の化合物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項記載の化合物の薬剤学的に許容しうる塩類。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の化合物および薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項２４】
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニンおよび薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む、請求項２３記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
経口投与に適した、請求項２４記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
さらにアルキル化剤を含む、請求項２３または２４記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
アルキル化剤が１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）およびテモゾロミドから選択される、請求項２６記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
宿主においてＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるための薬剤組成物であって、
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるのに有効な量の、請求項１〜２２のいずれか１項記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項２９】
宿主において腫瘍細胞を殺傷するための薬剤組成物であって、
化学療法用アルキル化剤の有効性を高めるのに十分なほどＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるのに有効な量の、請求項１〜２２のいずれか１項記載の不活性化剤化合物を含む組成物；および
前記不活性化剤化合物と組み合わせた場合に細胞毒性である量のアルキル化剤を含む組成物、
を含む薬剤組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の化合物を含む、腫瘍細胞においてＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるための薬剤組成物。
【請求項３１】
宿主においてＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるための薬剤組成物であって、
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるのに有効な量のＯ6−（４−ブロモテニル）グアニンを含む薬剤組成物。
【請求項３２】
宿主において腫瘍細胞を殺傷するための薬剤組成物であって、
化学療法薬用アルキル化剤の有効性を高めるのに十分なほどＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ活性を減少させるのに有効な量のＯ6−（４−ブロモテニル）グアニンを含む組成物；および
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニンと組み合わせた場合に細胞毒性である量のアルキル化剤を含む組成物、
を含む薬剤組成物。
【請求項３３】
Ｏ6−（４−ブロモ−２−チエニル−［3Ｈ］メチル）グアニン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ピリミジン誘導体およびグアニン誘導体、ならびに腫瘍細胞の処置におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は６−ヘタリールアルキルオキシピリミジン誘導体、Ｏ6−置換グアニン誘導体およびＳ6−置換チオグアニン誘導体に関する。これらの化合物は、腫瘍細胞においてＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＴａｓｅ）活性を減少させる効力を示す。
背景技術
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ減少活性をもつＯ6−アルキルグアニン誘導体を、腫瘍細胞致死のために用いられる化学療法用アルキル化剤（主としてＤＮＡをメチル化またはクロロエチル化するもの）の有効性を高めるために利用することが示唆されている。哺乳動物細胞でのアルキル化剤の毒性や突然変異誘発作用はＤＮＡ中のグアニンのＯ6−位におけるアルキル化の結果によるところが大きいという証拠が増えている。Ｏ6−アルキルグアニンの修復はＡＴａｓｅにより仲介される。これは修復タンパク質であって、自己不活性化プロセスにおいてＯ6−アルキル化グアニン残基に対し、アルキル基をこの修復タンパク質の活性部位にあるシステイン残基へ化学量論的に転移させることにより作用する。アルキル化剤の生物学的作用に対し細胞を保護するのにＡＴａｓｅが重要であることは、クローン化したＡＴａｓｅ遺伝子またはｃＤＮＡをＡＴａｓｅ欠失細胞中へ伝達して発現させることにより、最も明瞭に証明された。すなわちこれは、多様な薬剤、主としてＤＮＡをメチル化またはクロロエチル化するものに対する抵抗性を与える。ＡＴａｓｅ欠失細胞におけるＯ6−メチルグアニンによる細胞致死のメカニズムの詳細はまだ明らかでないが、Ｏ6−クロロエチルグアニンによる致死は環状エタノグアニン中間体を経て反対鎖上のシトシン残基へＤＮＡ鎖間架橋が形成されることにより起きる。このプロセスは、ＡＴａｓｅが仲介するクロロエチル基除去または複合体形成により阻止される。
ＡＴａｓｅ活性を減少させるためにＯ6−メチルグアニンおよびＯ6−ｎ−ブチルグアニンを利用することが研究された（Dolan et al.,Cancer Res.,（1986）46,pp.4500；Dolan et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,（1989）25,pp.103）。ＡＴａｓｅ発現細胞をクロロエチル化剤の細胞毒性に対しより感受性にするために、ＡＴａｓｅ活性を減少させるものとして、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体が提唱された（Moschel et al.,J.Med.Chem.,1992,35,4486）。米国特許第5 091 430号および国際特許出願公開第WO 91/13898号（Moschelら）には、宿主において腫瘍細胞のＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ量を激減させる方法であって、宿主に次式のＯ6−ベンジル化グアニン誘導体を含有する有効量の組成物を投与することを含む方法が開示されている：
0004127851.tif 000002
式中、Ｚは水素または
0004127851.tif 000003
であり、
Ｒaはベンジル基または置換ベンジル基である。ベンジル基はオルト、メタまたはパラ位において、ハロゲン、ニトロ、アリール、たとえばフェニルまたは置換フェニル、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、炭素原子最高４個のアルケニル、炭素原子最高４個のアルキニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、およびＳＯnＲb（ここでｎは０、１、２または３であり、Ｒbは水素、炭素原子１〜４個のアルキル、またはアリールである）などの置換基で置換されていてもよい。Chae et al.,J.Med.Chem.,1994,37,342-347には、ベンゼン環または９位に次第に嵩高い置換基をもつＯ6−ベンジルグアニン類似体についての試験が記載されている。Chae et al.,J.Med.Chem.,1995,38,359-365には、数種の８−置換Ｏ6−ベンジルグアニン、２−および／または８−置換６−（ベンジルオキシ）プリン、置換６（４）−（ベンジルオキシ）ピリミジン、および６−（ベンジルオキシ）−ｓ−トリアジンが記載され、それらがＡＴａｓｅを不活性化する効力につき試験された。ヒトＨＴ２９結腸腫瘍細胞抽出液中のＡＴａｓｅの不活性化において、２種類の化合物が、Ｏ6−ベンジルグアニンより有意に有効であると確認された。これらは８−位に電子吸引基をもつ８−置換Ｏ6−ベンジルグアニン（たとえば８−アザ−Ｏ6−ベンジルグアニンおよびＯ6−ベンジル−８−ブロモグアニン）、および５−位に電子吸引基をもつ５−置換２，４−ジアミノ−６−（ベンジルオキシ）ピリミジン（たとえば２，４−ジアミノ−６−（ベンジルオキシ）５−ニトロソピリミジンおよび２，４−ジアミノ−６−（ベンジルオキシ）−５−ニトロピリミジン）であった。後者の誘導体は、無傷のＨＴ２９結腸腫瘍細胞中のＡＴａｓｅの不活性化においても、Ｏ6−ベンジルグアニンにより有意に有効であった。本出願の優先日より後に公開された国際特許出願公開第WO 96/04281号は、同様な置換Ｏ6−ベンジルグアニンおよび６（４）−ベンジルオキシピリミジンに関する。
本出願人は、国際特許出願公開第WO 94/29312号として公開された国際特許出願PCT/IE 94/00031号の出願人でもある。国際特許出願公開第WO 94/29312号（その内容全体を本明細書に参考として引用する）には、式ＩのＯ6−置換グアニン誘導体：
0004127851.tif 000004
［式中、
ＹはＨ、リボシル、デオキシリボシルもしくは
0004127851.tif 000005
（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ″およびＲ″′はアルキルである）、またはその置換誘導体であり；
Ｒ′はＨ、アルキルまたはヒドロキシアルキルであり；
Ｒは（ｉ）所望により炭素環もしくは複素環がそれに縮合した、少なくとも５員もしくは６員の複素環を有する環式基またはその置換誘導体であって、この複素環またはそれぞれの複素環はＯ、ＮまたはＳから選択される少なくとも１個の異種原子を有し；あるいは
（ii）ナフチルまたはその置換誘導体である］
およびその薬剤学的に許容しうる塩類が記載されている。
ＡＴａｓｅ活性を減少させ、したがって前記の化学療法薬の効果を高めるのに有用であるためには、化合物は以下の点に関して評価した特性を兼ね備えていなければならない
１）組換え体ＡＴａｓｅのインビトロ不活性化
２）安定性
３）溶解性
４）哺乳動物細胞および／または異種腫瘍移植体における、ＡＴａｓｅの不活性化
５）その化学療法薬の致死作用または増殖阻害作用に対する、哺乳動物細胞および／または異種腫瘍移植体の感受性増大
この組合わせ試験における新規化合物の挙動は、予測不能である。この予測不能なＡＴａｓｅ不活性化における、立体的要因を含めた分子相互作用は、ＡＴａｓｅ分子中のシステイン受容体部位の環境の性質に関係すると思われる。
大腸菌（E.coli）由来のＡＴａｓｅタンパク質（Ａｄａ遺伝子）の構造が、Ｘ線結晶学的技術により解明された（M.H.Moore et.al.,EMBO Journal, 1994,13,1495）。ヒトＡＴａｓｅのアミノ酸配列は細菌由来のものとは若干異なるが、既知のＡＴａｓｅ（ヒト、げっ歯類、酵母、細菌）はすべて共通フラグメントＰｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ中にシステイン（Ｃｙｓ）受容体部位を含む。Ａｄａタンパク質の結晶構造からコンピューターにより作成したヒトＡＴａｓｅの相同モデル（J.E.A.Wibley et.al.,Anti-Cancer Drug Design,1995,10,75）は、タンパク質のポケット内に深く埋め込まれたＣｙｓ受容体をもつという点で、それに似ている。無傷のＤＮＡ中にあるＯ6−アルキル化グアニン残基、またはベンジルのような比較的大きな基でアルキル化された遊離グアニンですら、Ｃｙｓ受容体に接近するには構造をかなりひずませる必要がある。これらの立体配置の変化は、二重らせんＤＮＡがこのタンパク質に特徴的に結合することにより開始する（K.Goodtzova et.al.,Biochemistry,1994,33,8385）。
ＡＴａｓｅ活性部位“ポケット”のアミノ酸の成分および寸法は、関与するメカニズムの詳細と同様にまだ分かっていないので、個々のＯ6−アルキル化グアニンまたはこれに類する環系の活性を予測するのは不可能である。
この分野の公表された報文は、主としてＤＮＡ中のグアニンのものと等しい核をもつＯ6−アルキルグアニン誘導体の使用に関する。Chae et al.,J.Med.Chem.,1995,38,359-365には、グアニン環が修飾された限られた数の化合物についての試験を記載している。しかしこれらの化合物はすべて、修飾グアニン環のＯ6−位のベンジル置換またはピリミジン環の６（４）−ベンジルオキシ置換をもつものであった。グアニン環またはプリン骨格の置換基の微妙な変化によりそれらの“親”構造と比較して著しく無効なＡＴａｓｅ不活性化剤である物質が生成する可能性があるという所見は、より実質的な修飾がＡＴａｓｅ不活性化機能を破壊するという可能性も示唆する。
クロルエチル化作用性またはメチル化作用性の抗腫瘍薬のような化学療法薬の効果を高めるために、ＡＴａｓｅ活性を減少させるのに有用な他の新規化合物が要望されている。他の目的は、Ｏ6−ベンジルグアニンより良好なＡＴａｓｅ不活性化特性をもち、かつ異なる溶解度パターンをもつ化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、ＡＴａｓｅ活性を減少させるのに有用な化合物を含有する薬剤組成物を提供することである。本発明の他の目的は、腫瘍細胞においてＡＴａｓｅ活性を減少させる方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、宿主内の腫瘍細胞を、それらが上記のアルキル化剤に対してより感受性になるように処理する方法を提供することである。
本発明は、式ＩＩの６−ヘタリールアルキルオキシピリミジン誘導体：
0004127851.tif 000006
［式中、
Ｒは（ｉ）所望により炭素環もしくは複素環がそれに縮合した、少なくとも１つの５員もしくは６員の複素環を有する環式基（この複素環またはそれぞれの複素環はＯ、ＮまたはＳから選択される少なくとも１個の異種原子を有する）、またはその置換誘導体であるか；あるいは
（ii）フェニルまたはその置換誘導体であり、
Ｒ2はＨ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、ハロゲンまたはＮＨ2から選択され、
Ｒ4およびＲ5は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ＮＨ−Ｙ′またはＮＯnから選択され、ここでＹ′はＨ、リボシル、デオキシボシル、アラビノシル、
0004127851.tif 000007
（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ″はアルキルであり、Ｒ″′はＨまたはアルキルである）、またはその置換誘導体であり、ｎは１または２であり、
あるいは
Ｒ4とＲ5はピリミジン環と一緒に、１個またはそれ以上の異種原子を含む５員または６員の環構造を形成する］
およびその薬剤学的に許容しうる塩類を提供する；ただし
Ｒ4とＲ5が環構造ＩＸ
0004127851.tif 000008
［式中、ＹはＨ、リボシル、デオキシリボシルもしくは
0004127851.tif 000009
（ここでＸはＯまたはＳであり、Ｒ″およびＲ″′はアルキルである）、またはその置換誘導体である］を形成する場合、Ｒ2はＮＨ2ではなく、
かつ以下の状況ａ）〜ｈ）では、Ｒはフェニルではない：
ａ）Ｒ2およびＲ5がＮＨ2であり、かつＲ4がＮＯまたはＮＯ2である場合、
ｂ）Ｒ2がＮＨ2であり、かつＲ4とＲ5が環構造Ｘを形成している場合、
0004127851.tif 000010
ｃ）Ｒ2がＮＨ2であり、かつＲ4とＲ5が環構造ＸＩを形成している場合、
0004127851.tif 000011
ｄ）Ｒ2がＮＨ2であり、かつＲ4がＮＯ2であり、かつＲ5がＨもしくはＣＨ3である場合、
ｅ）Ｒ2、Ｒ4およびＲ5がＮＨ2である場合、
ｆ）Ｒ2およびＲ5がＮＨ2であり、かつＲ4がＨである場合、
ｇ）Ｒ2がＨであり、かつＲ4がＮＯ2であり、かつＲ5がＮＨ2である場合、
または
ｈ）Ｒ2がＦもしくはＯＨであり、かつＲ4とＲ5が環構造ＸＩＩを形成している場合
0004127851.tif 000012
国際特許出願公開第WO 94/29312号中の一般式に含まれるけれどもそこに公開されていない特定のＯ6−置換グアニン誘導体が、国際特許出願公開第WO 94/29312号に定義された群のうちからそれらの誘導体を選択するのを正当化する予想外の有利な特性を兼ね備えていることが見出された。
他の態様において本発明は、式ＸIIIのグアニン誘導体：
0004127851.tif 000013
［式中、
ＥはＯまたはＳであり、
Ｙ′は前記式ＩＩにつき定めたものであり、
Ｒ6は所望により炭素環もしくは複素環がそれに縮合した、少なくとも１つの５員もしくは６員の複素環を有する環式基（この複素環またはそれぞれの複素環はＯ、ＮまたはＳから選択される少なくとも１個の異種原子を有する）、またはその置換誘導体である］
およびその薬剤学的に許容しうる塩類を提供する。ただし、国際特許出願公開第WO 094/29312号に公開された化合物を除く。
特に、本発明は式ＸＩＶの有利な化合物：
0004127851.tif 000014
［式中、
Ｒ10はブロモ、クロロまたはシアノであり、
Ｙ′は式ＩＩにつき定めたものである］
を選択する。
最も好ましくはＲ10はブロモである。特に好ましい選択化合物は、次式ＸＶのＯ6−（４−ブロモテニル）グアニンである：
0004127851.tif 000015
この化合物は、経口投与の可能性を含めた有利な特性を兼ね備えている。
ＲまたはＲ6は、適切には５員もしくは６員の複素環またはそのベンゾ誘導体であり、後者の場合ピリミジン部分はＲまたはＲ6の複素環またはベンゼン環のいずれに結合していてもよい。
好ましい態様において、ＲまたはＲ6はＳまたはＯを含む５員環であって、第２の環がそれに縮合した、または縮合していないものである。
好ましくはＲまたはＲ6は、少なくとも１個のＳ原子を含む複素環である；より好ましくはＲまたはＲ6は、少なくとも１個のＳ原子を含む５員の複素環である；最も好ましくはＲまたはＲ6は、チオフェン環またはその置換誘導体である。あるいはＲまたはＲ6は、少なくとも１個のＯ原子を含む複素環、特に少なくとも１個のＯ原子を含む５員の複素環であってもよく、より具体的にはＲまたはＲ6はフラン環またはその置換誘導体であってもよい。他の態様として、ＲまたはＲ6は少なくとも１個のＮ原子を含む複素環であってもよく、特にＲまたはＲ6は、少なくとも１個のＮ原子をもつ６員の複素環であってもよく、殊にＲまたはＲ6はピリジン環であってもよい。
ＲまたはＲ6において複素環に縮合した炭素環または複素環自体が二環式、たとえばナフタレンであってもよい。
一般に本発明のいずれかの化合物に関して用いる“置換誘導体”という語は、化合物中のその存在がＡＴａｓｅ減少活性をもつ化合物と適合するいかなる置換誘導体をも意味する。
ＹまたはＹ′の定義において“置換誘導体”という語には、さらに以下の基１個またはそれ以上による置換が含まれる：ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アミドまたはウレイド。特に好ましい化合物群において、Ｒ″はヒドロキシ置換アルキルであり、かつＲ″′はＨであり、したがってＹ′はヒドロキシアルコキシメチル、好ましくはアルコキシ基中に１〜１０個の炭素原子をもつものである。
ＲまたはＲ6の定義において“置換誘導体”という語には、以下の基１個またはそれ以上による複素環（１またはそれ以上）および／または炭素環（１またはそれ以上）の置換が含まれる：アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、アジド、ヒドロキシアルキル、ＳＯnＲ7（ここでＲ7はアルキルであり、ｎは０、１または２である）、または式−ＣＯＯＲ8（ここでＲ8はＨまたはアルキルである）のカルボキシルもしくはエステル基。ハロ、ハロアルキル、シアノ、アルキレンジオキシ、ＳＯnＲ7（上記に定義）および−ＣＯＯＲ8（ここでＲ8はアルキルである）が好ましい置換基である。
アルキル、アルコキシ、アルケニルまたはアルキニル基は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個の炭素原子を含む。ハロには、ヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロが含まれる。アリール基は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個の炭素原子、特に５または６個の炭素原子を含む。
本発明の１態様によれば、前記式ＩＩもしくは式ＸIIIの化合物またはその薬剤学的に許容しうる塩、および剤学的に許容しうる賦形剤を含有する薬剤組成物が提供される。所望により組成物は、クロロエチル化剤またはメチル化剤のようなアルキル化剤を含有してもよい。
他の態様において本発明は、前記式ＩＩもしくは式ＸIIIの化合物またはその薬剤学的に許容しうる塩を含有する有効量の組成物、より具体的には前記に定める薬剤組成物を、宿主に投与することを含む、宿主においてＡＴａｓｅ活性を減少させる方法を提供する。あるいはこの方法は、宿主においてＡＴａｓｅ仲介ＤＮＡ修復活性を減少させる方法と定義できる。
本発明はさらに、前記式ＩＩもしくは式ＸIIIの化合物またはその薬剤学的に許容しうる塩を含有する有効量の組成物、より具体的には前記に定める薬剤組成物を、宿主に投与し、かつアルキル化剤を含有する有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において腫瘍細胞を処置する方法を提供する。本方法は、アルキル化剤の作用に対し感受性であることが知られているものを含めた新生物、たとえば黒色腫および神経膠腫その他、アルキル化剤だけによる処置に対する抵抗性を本発明による不活性化剤の使用により克服しうるものの処置に利用できる。
本明細書および請求の範囲で用いる“薬剤学的に許容しうる塩類”という用語は、薬剤産業の分野で既知の種類の塩類を意味し、以下のものを含む：無機酸、たとえば硫酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸または塩酸との塩類、および有機酸、たとえば酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、コハク酸、酒石酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、リンゴ酸、ｏ−（４−ヒドロキシ−ベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、４−メチル−ビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４′−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸またはムコン酸などとの塩類。
前記の条件付きで、好ましい本発明化合物は以下のものである：
タイプ１
式III
0004127851.tif 000016
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたもの、特に、置換されていないか、あるいは好ましくはハロゲン、たとえば塩素、臭素もしくはフッ素、またはシアノで置換された、フリルまたはチエニルであり；
Ｙ′は式ＸIIIにつき定めたものであり、好ましくはＹ′はＨまたはＨＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2−であり；
Ｒ2はＨ、ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、好ましくはメチル、またはハロゲン、好ましくはフッ素であり；
Ｒ3はＨまたはＯＨである。
タイプ２
式ＩＶ
0004127851.tif 000017
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたもの、特に、置換されていないか、あるいは好ましくはハロゲン、たとえば塩素、臭素もしくはフッ素、またはシアノで置換された、フェニル、チエニルまたはフリルであり、あるいはメチレンジオキシ環構造がそれに縮合したフェニルであり；
Ｙ′は式ＸIIIにつき定めたものであり；
ＸはＣＨまたはＮであり；
ＡはＣＨまたはＮであり；好ましくはＸ＝ＮであるときＡ＝ＣＨである。
式Ｖ
0004127851.tif 000018
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたものであり；
ＸはＣＨまたはＮであり；
ＡはＣＨまたはＮである。
タイプ３
式ＶＩ
0004127851.tif 000019
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたもの、特に、置換されていないか、または好ましくはハロゲン、たとえば塩素もしくは臭素で置換された、チエニルまたはフリルであり；
ＺはＯまたはＳまたはＣＨ＝ＣＨである。
このタイプの特に好ましい化合物群はＯ6−（４−ハロテニル）−８−チアグアニン、特にＯ6−（４−ブロモテニル）−８−チアグアニンである。
式ＶII
0004127851.tif 000020
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたものであり；
ＵはＣＨまたはＮであり；
ＶはＣＨまたはＮであり；
ＷはＣＨまたはＮであり；
ただし、Ｕ、ＶおよびＷがすべてＣＨであることはない。
タイプ４
式ＶIII
0004127851.tif 000021
式中、
Ｒは式ＩＩにつき定めたもの、特に、ハロゲン、好ましくは１個またはそれ以上の塩素、臭素またはフッ素で所望により置換された、テニルまたはフリルであり；
ＴはＨ、ＮＨ2またはＮＯnであり、ここでｎは１または２であり；
ＱはＨ、ＮＨ2またはＮＯnであり、ここでｎは１または２である。
タイプ５
式ＸＶＩ
0004127851.tif 000022
式中、
Ｒは式ＸIIIにつき定めたものであり；
Ｙ′は式ＩＩにつき定めたものである。
【図面の簡単な説明】
添付の図面を参照して本発明をより詳細に記述する。
図１〜４は、化合物Ｂ．４３１６による前処置が種々の化学療法薬に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示すグラフである。各グラフには、Ｂ．４３１６の存在下および不在下の化学療法薬の濃度（μｇ／ｍｌ）に対し増殖率をプロットする。
図１は、１μＭのＢ．４３１６による前処置がテモゾロミド（temozolomide）に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示す。
図２は、１０μｍのＢ．４３１６による前処置がＢＣＮＵに対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示す。
図３は、１０μＭのＢ．４３１６による前処置がフォテムスチン（fotemustine）に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示す。
図４は、１０μＭのＢ．４３１６による前処置がメルファラン（melphalan）およびシスプラチン（cisplatin）に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示す。
図５は、１０μＭのＢ．４３１６による前処置が種々の化学療法薬に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示すヒストグラムである。効果はＤ50に基づく増感係数（ＳＦ、後記に定義）として測定された。ただしフォテムスチンの場合はＳＦはＤ80に基づく。
図６は、１０μＭのＢ．４３４９による前処置が種々の化学療法薬に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大に及ぼす効果を示す同様なヒストグラムである。ＳＦは図５の場合と同様である。
図７は、種々の不活性化化合物５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した２時間後の、Ａ３７５Ｍ腫瘍および宿主ネズミ組織におけるＡＴａｓｅ不活性化を示す、一連のヒストグラムである。不活性化は、ｆｍ／ｍｇ（タンパク質）として測定した対照ＡＴａｓｅ活性に対する％として計算された。
図８は、Ｂ．４３６３（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した後の、Ａ３７５Ｍ腫瘍および宿主ネズミ組織におけるＡＴａｓｅの減少と回復の反応速度を示すグラフである。グラフには、対照ＡＴａｓｅ活性に対する％を時間（時間）に対しプロットする。
図９は、漸増する濃度の不活性化剤Ｏ6−ベンジルグアニン（ＢｅＧ）、Ｏ6−テニルグアニン（Ｂ．４２０５）およびＯ6−（４−ブロモテニル）グアニン（Ｂ．４２８０）と共にインキュベートした後の純粋な組換えヒトＡＴａｓｅの活性残存率のグラフである。５０％残存活性のラインをＩ50値、すなわちＡＴａｓｅ活性を５０％低下させるのに必要な不活性化剤濃度の計算に用いる。示したＩ50値はこれらの曲線から外挿したものである。１時間のプレインキュベーション後に［3Ｈ］−メチル化基質を添加して、ＡＴａｓｅ残存活性を測定した。
図１０Ａは、テモゾロミド濃度（μｇ／ｍｌ）に対する細胞増殖率％を示す３つのグラフである。これらはＢｅＧ、Ｂ．４２０５およびＢ．４２８０（最終濃度０．５μＭ）による前処置がテモゾロミドの増殖阻害作用に対するRaji細胞の感受性に及ぼす効果を示す。不活性化剤またはビヒクルをテモゾロミドの２時間前に投与した。
図１０Ｂは、図１０Ａの不活性化剤に関し、テモゾロミドによる増殖阻害に対するＲａｊｉ細胞のＤ50に基づく増感係数を示すヒストグラムである。
図１１は、時間（時間）に対するＡＴａｓｅ活性（ｆｍ／ｍｇ）のヒストグラムであり、ＡＴａｓｅ不活性化剤ＢｅＧ、Ｂ．４２０５およびＢ．４２８０がヌードマウス内で増殖したヒト黒色腫異種移植片のＡＴａｓｅ活性に及ぼす効果を示す。動物に１回量の不活性化剤３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、図示した時間後に屠殺した。
図１２は、ＡＴａｓｅ不活性化剤がヌードマウス内で増殖したヒト黒色腫異種移植片中のＡＴａｓｅ活性（ｆｍ／ｍｇ）に及ぼす効果を示すヒストグラムである。動物にＢ．４２０５もしくはテモゾロミドを単独で、またはＢ．４２０５もしくはＢ．４２８０をテモゾロミド（５０ｍｇ／ｋｇ）と組合わせて、図示した用量で連続３日間（指示した場合以外）腹腔内投与し、最終投与の２４時間後に屠殺した。ビヒクルは、不活性化剤についてはトウモロコシ油、テモゾロミドについてはＰＢＳ（２０％ＤＭＳＯ）であった。
図１３は、ＡＴａｓｅ不活性化剤がヌードマウスの肝臓のＡＴａｓｅ活性に及ぼす効果を示すヒストグラムである。動物にＢ．４２０５もしくはテモゾロミドを単独で、またはＢ．４２０５もしくはＢ．４２８０をテモゾロミド（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）と組合わせて、図示した用量で連続３日間（指示した場合以外）投与し、最終投与の２４時間後に屠殺した。
図１４Ａは、時間（日）に対する腫瘍増殖率％のグラフであり、Ｂ．４２０５がテモゾロミドによる増殖阻害に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性に及ぼす効果を示す。動物を処置せず、またはテモゾロミドのみ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢ．４２０５（５、１０または２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した１時間後にテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を連続５日間投与した。記載に従って腫瘍の増殖を監視した。多数の別個の試験で得たデータを提示する。
図１４Ｂは、時間（日）に対する生存マウス数のグラフであり、図１４Ａに示した試験に用いた動物（腫瘍保有ヌードマウス）の生存数を示す。異種移植片が最大サイズに達した動物群は終結させた。
図１５Ａは、Ｂ．４２８０がテモゾロミドによる増殖阻害に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性に及ぼす効果を示すグラフである。動物を処置せず、またはテモゾロミドのみ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）もしくはＢ．４２８０のみ（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢ．４２８０（１、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した１時間後にテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を連続５日間投与した。記載に従って腫瘍の増殖を監視した。多数の別個の試験で得たデータを提示する。
図１５Ｂは、図１５Ａに示した試験に用いた動物（腫瘍保有ヌードマウス）の生存数を示すグラフである。異種移植片が最大サイズに達した動物群は終結させた。
図１６Ａは、時間（日）に対する腫瘍増殖率％のグラフであり、腹腔内（ｉｐ）および経口（ｐｏ）投与したＢ．４２８０がテモゾロミドによる増殖阻害に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性に及ぼす効果の比較を示す。動物を処置せず、またはテモゾロミドのみ（１００ｍｇ／ｋｇ）もしくはＢ．４２８０のみ（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢ．４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）もしくはＢ．４２８０（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）を投与した１時間後にテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を連続５日間投与した。記載に従って腫瘍の増殖を監視した。多数の別個の試験で得たデータを提示する。
図１６Ｂは、図１６Ａに示した試験に用いた動物の生存数を示すグラフである。異種移植片が最大サイズに達した動物群は終結させた。
図１７は、腫瘍を保有しないＤＢＡ2マウスにおいて、テモゾロミド（ＴＺ）と組み合わせたＢｅＧ、Ｂ．４２０５およびＢ．４２８０が及ぼす結果の比較試験における動物の生存数を示すグラフである。動物にテモゾロミドのみ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢｅｇ（１０または２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、Ｂ．４２０５（１０または２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）もしくはＢ．４２８０（１０または２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した１時間後にテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を連続５日間投与した。
図１８〜２１は、Ｂ．４２８０を指示した用量で投与した後の、種々の腫瘍および宿主ネズミ組織におけるＡＴａｓｅの減少と回復の反応速度を示す各対のグラフである。グラフには、ＡＴａｓｅ活性（ｆｍ／ｍｇタンパク質）および対照ＡＴａｓｅ活性に対する％を、時間（時間）に対しプロットする：
図１８は、Ａ３７５Ｍ腫瘍および他の組織におけるＢ．４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）に関する。
図１９は、Ａ３７５Ｍ腫瘍および他の組織におけるＢ．４２８０（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）に関する。
図２０は、ＭＣＦ−７腫瘍および他の組織におけるＢ．４２８０（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）に関する。
図２１は、ＤＵ−１４５腫瘍および他の組織におけるＢ．４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）に関する。
図２２は、時間（日）に対する腫瘍増殖率％のグラフであり、Ｂ．４２８０がテモゾロミドによる増殖阻害に対するＭＣＦ−７腫瘍の感受性に及ぼす効果を示す。動物を処置せず、またはテモゾロミドのみ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）もしくはＢ．４２８０（PaTrin−２）のみ（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢ．４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した１時間後にテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を連続５日間投与した。
図２３は、時間（日）に対する腫瘍増殖率％、生存マウス数および平均体重（ｇ）のグラフからなり、１回投与したＢ．４２８０（PaTrin−２）が１回投与したフォテムスチンによる増殖阻害に対する黒色腫の感受性に及ぼす効果を示す。動物にフォテムスチンのみ（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与し、またはＢ．４２８０（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）を投与した１時間後にフォテムスチン（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した。
図２４は、時間（日）に対する腫瘍増殖率％および生存マウス数のグラフからなり、Ｂ．４２０５（PaTrin−１）およびＢ．４２８０  20ｍｇ／ｋｇ前処置後、図２２と同様に５日間方式のテモゾロミド１５０ｍｇ／ｋｇによる、Ａ３７５Ｍ腫瘍の感受性増大につき示す。
図２５は、時間に対する腫瘍増殖率％、生存マウス数および平均体重（ｇ）のグラフからなり、２０ｍｇ／ｋｇのＢ．４３４９またはＢ．４３５１（腹腔内）投与後のテモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）に対するＡ３７５Ｍ腫瘍の感受性増大を示す。
図２６は、９０ｍｇ／ｋｇのＢ．４３３５腹腔内投与後、２時間目および２４時間目のＡ３７５Ｍ腫瘍および宿主ネズミ組織におけるＡＴａｓｅ活性を示す図である。
本明細書中、“１ｈ”または“２ｈ”などの略号は“１時間”、“２時間”などを意味する。図面において略号“Ｔｅｍｏ”および“Ｔｚ”はテモゾロミドを意味する。
図２７は、時間（日）に対する腫瘍増殖率％および体重（１日目の数値に対する％）のグラフからなり、テモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ／日）および／またはＢ．４２８０（PaTrin−２）（２０ｍｇ／ｋｇ／日）１〜５日間投与後の腫瘍ＤＵ−１４５前立腺異種移植片の増殖を示す。各点は少なくとも４匹のマウスから得た数値の平均である。各群の増殖の遅れ（ｐ値）は以下のとおりであった：PaTrin−２のみ０．１日（＞．０５）；テモゾロミドのみ７．８日（＞．０５）；両薬剤１５．３日（０２３８）。
図２８は、Ｏ6−［3Ｈ］−（４−ブロモテニル）グアニンの合成のための反応経路である。
図２９は、基準Ｂ．４２８０とＯ6−［3Ｈ］−（４−ブロモテニル）グアニン合成反応生成物中の放射能の同時クロマトグラフィーである。陰影部は回収したカウント数（ＬＨ軸）、線は２５４ｎｍにおけるＯＤ（ＬＨ軸）を示す。
図３０は、３７℃で１時間インキュベートした後の、Ｏ6−［3Ｈ］−（４−ブロモテニル）グアニンからｒｈＡＴａｓｅへの放射能の伝達を示す。
好ましい態様の記述
本発明化合物の例を表１ａおよび１ｂに示す。それらは以下に提示する方法を適宜採用して合成された。
タイプ１
Ａ．Ｏ6−置換ヒポキサンチンは、アルコキシドＲＣＨ2ＯＮａを第四級塩Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１Ｈ−プリン−６−アミニウムクロリドに作用させることにより製造された。1
Ｂ．Ｏ6−置換２−メチルヒポキサンチンは、同様にジアザビシクロオクタン（Ｄ    ＡＢＣＯ）から得た第四級塩および６−クロロ−２−メチルプリンからなる製造された。2
Ｃ．Ｏ6−置換２−フルオロヒポキサンチンは、対応するグアニン類を亜硝酸ナトリウムおよび濃フルオロホウ酸により−２５℃でジアゾ化することにより製造された。3
Ｄ．Ｏ6−置換９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニンは、対応するグアニン類をシリル化した後、シアン化水銀の存在下に臭化２−アセトキシエトキシメチルと縮合させ、次いでＯ−アセチル基をけん化することにより製造された。4
Ｅ．Ｏ6−置換８−ヒドロキシグアニンは、６−ヘタリールメチル−２，４，５−トリアミノピリミジンおよび１，１−カルボニルジイミダソールからＤＭＦ中で製造された。5 ６−クロロ−２，４−ジアミノピリミジンとアルコキシドをＤＭＳＯ中で反応させ、次いで酢酸水溶液中で亜硝酸ナトリウムによりニトロソ化し、水性ＤＭＦ中で亜硫酸水素ナトリウムにより還元して、２，４，５−トリアミンを得た。
タイプ２
Ａ．Ｏ6−置換８−アザグアニンは、上記トリアミンおよび亜硝酸ナトリウムから酢酸水溶液中で製造された。6
Ｂ．Ｏ6−置換８−アザ−７−デアザグアニンは、アルコキシドＲＣＨ2ＯＮａおよび２−アミノ−６−クロロ−８−アザ−７−デアザプリン7からスルホラン中で、またはそれより誘導されたＤＡＢＣＯ第四級塩から（ＤＭＳＯ溶剤中で）製造された。
タイプ３
Ａ．Ｏ6−置換８−オキサグアニンは、タイプ１Ｅと同様にして得た６−ヘタリールメチル−２，４−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンの四酢酸鉛酸化8により製造された。
Ｂ．Ｏ6−置換８−チアグアニンは、タイプ１Ｅのトリアミン中間体およびＮ−トシルチオニルイミンからピリジン中で製造された。9
Ｃ．Ｏ6−置換プテリンは、これらのトリアミンおよびグリオキサールから、メタ重亜硫酸ナトリウムにより製造された。10
タイプ４
ＡおよびＢ．
これらのピリミジン類はタイプ１Ｅと同様にして得られた。
Ｃ．Ｏ6−置換２，４−ジアミノ−５−ニトロピリミジンは、アルコキシドＲＣＨ2ＯＮａをＤＭＳＯ中で６−クロロ−２，４−ジアミノ−５−ニトロピリミジンに作用させることにより製造された。11
タイプ５
Ｓ6−置換６−チオグアニンは、チオレートＲＣＨ2ＳＮａおよび第四級塩２−アミノ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１Ｈ−プリン−６−アミニウムクロリドから製造された（国際特許出願公開第WO 94/29312号）。
表６ａおよび６ｂに挙げたＯ6−置換グアニンは、国際特許出願公開第WO 94/29312号に記載された標準法により、通常は第四級塩１ｍｍｏｌにつき３ｍｍｏｌのアルコールＲＣＨ2ＯＨを用いて製造された。
これらのアルコール類は、国際特許出願公開第WO 94/29312号に記載されたように、対応するアルデヒド類の水素化ホウ素ナトリウム還元により製造された。２種の例外がある。Ｂ．４２８０に必要な４−ブロモテニルアルコール12については、そのアルデヒドが市販されている。５−クロロチオフェン−２−アルデヒド13および５−メチルチオチオフェン−２−アルデヒド14は、それぞれ２−クロロチオフェンおよび２−メチルチオチオフェンのフィルスマイヤー（Vilsmeier）反応により製造された。メチルチオアルデヒドの水素化ホウ素ナトリウム還元、次いで得られたメチルチオアルコールの過ヨウ素酸ナトリウム酸化15により、Ｂ．４２９４に必要なメチルスルフィニルアルコールを得た。上記クロロアルデヒドを還元して、Ｂ．４２８１に用いる５−クロロテニルアルコール16を得た。
適切なチオフェンアルデヒドまたはフルフラールのハロゲン化により、他の数種のアルデヒド類を得た。たとえば直接臭素化により５−ブロモフルフラール17を、それからＢ．４３３６に用いるアルコール18を得た。ハロゲンを塩化アルミニウムの存在下でチオフェン−２−アルデヒドに作用させると４−クロロチオフェン−２−アルデヒド19（Ｂ．４２９８用のアルコールに用いる）が得られ、チオフェン−３−アルデヒドに作用させると２−ブロモチオフェン−４−アルデヒド20（最終的にＢ．４３１３）が得られ、５−クロロチオフェン−２−アルデヒドに作用させると４，５−ジクロロチオフェン−２−アルデヒド21（Ｂ．４３１８用のアルコール22に用いる）が得られた。
シアノアルデヒドはシアン化銅および対応するブロモアルデヒドから、還流ジメチルホルムアミド中で得られた。次いで５−シアノチオフェン−２−アルデヒド23およびその４−シアノ異性体24から、それぞれＢ．４２８３およびＢ．４３１７に用いる５−シアノおよび４−シアノ25アルコールが得られた。
４−メトキシテニルアルコール26（Ｂ．４３００用）は、記載に従って２，３−ジブロモコハク酸およびチオグリコール酸メチルから、メチルエステル（この場合はアルデヒドでなく）を水素化アルミニウムリチウムで最終還元することにより製造された。２−クロロ−４−ピコリルアルコール27（Ｂ．４３２１用）は、対応する酸塩化物の水素化ホウ素ナトリウム還元により28製造され、この酸塩化物はオキシ塩化リン／五塩化リンをイソニコチン酸Ｎ−オキシドに反応させることにより29製造された。
Ｂ．４２８２については、３−ピリジンメタノールＮ−オキシドが市販されている。５−メチルスルホニルテニルアルコール（Ｂ．４３０９用）は、５−メチルチオ−２−チオフェンカルボキシアルデヒドの還元により得たアルコールのｍ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）酸化により得られた。30
６−クロロ−３−ピリジンメタノール（Ｂ．４３１９用）および５−ブロモ−３−ピリジンメタノール（Ｂ．４３２０用）は、それぞれ６−クロロおよび５−ブロモニコチン酸をオキシ塩化リン／五塩化リンで処理し、得られた酸塩化物を水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより製造された28。イソチアゾール−４−メタノール（Ｂ．４３５４用）は、対応するメチルエステル（A.Adams and R.Slack, J.Chem.Soc. 1959, 3061）を水素化アルミニウムリチウムで還元することによりにより得られた（M.Hatanaka and T.Ishimaru, J.Med.Chem.16,1973,978）。
４−ブロモ−２−チオフェンカルボキシアルデヒドをそのエチレンアセタールの４−リチオ誘導体（A.L.Johnson,J.Org.Chem.41,1976,1320）に変換し、この有機金属化合物をジメチルジスルフィドと反応させ、次いで酸加水分解して、４−メチルチオ−２−チオフェンカルボキシアルデヒドを得た（R.Noto,L.Lamartina,C.Arnone and D.Spinelli,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.2,1987,689）。このアルデヒドを水素化ホウ素ナトリウム還元して４−メチルチオアルコール（Ｂ．４３５６用）となし、次いでこれを１または２当量のＭＣＰＢＡと反応させて、４−メチルスルフィニルアルコールおよび４−メチルスルホニルアルコール（それぞれＢ．４３７７およびＢ．４３６１用）を得た。上記の有機金属化合物をナフタレン−２−スルホニルアジド（A.B.Khare and C.E.McKenna, Synthesis,1991,405）およびピロリン酸ナトリウムと反応させ、次いで他のアジドチオフェンアルデヒドの製造に用いた方法（P.Spagnolo and P.Zanirato, J.Org.Chem.43,1978,3539）で加水分解すると４−アジド−２−チオフェンカルボキシアルデヒドが得られ、これをＢ．４３７３用のアルコールに誘導した。
５−ヨード−３−チオフェンメタノール（Ｂ．４３５７用）は、３−チオフェンカルボキシアルデヒドをヨウ素−ヨウ素酸−硫酸で処理することにより得たアルデヒドから得られた（R.Guilard, P.Fournari and M.Person, Bull.Soc.Chim.France.1967,4121）。
２−ナフト［２，１−ｂ］チエニルメタノール（Ｂ．４３６６用）は、対応するカルボン酸の水素化アルミニウムリチウム還元により製造された（M.L.Tedjamulia,Y.Tominaga,R.N.Castle and M.L.Lee,J.Heterocycl.Chem.,20,1983,1143）。５−フェニルテニルアルコール（融点９１．５℃、Ｂ．４３７８用）は、２−フェニルチオフェン（塩化ベンゼンジアゾニウムおよびアルカリとチオフェンのゴンバーグ−バッハマン（Gomberg-Bachmann）反応（N.P.Buu-Hoi and N.Hoan, Rec.trav.chim.,69,1950,1455）による）のフィルスマイヤー反応により得たアルデヒド（P.Demerseman,N.P.Buu-Hoi and R.Royer,J.Chem.Soc..1954,4193）の水素化ホウ素ナトリウム還元により得られた。
具体例として、Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン（Ｂ．４２８０）の製造につき以下に記載する。
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニンの製造
ＤＭＳＯ（４ｍｌ）中における４−ブロモテニルアルコール12［４．６３ｇ，２４ｍｍｏｌ；ＴＬＣ（ＰｈＭｅ−ＭｅＯＨ，４：１）におけるＲf０．３８］の溶液を、水素化ナトリウム（油中６０％；０．６４ｇ，１６ｍｍｏｌ）で慎重に処理した。１時間の撹拌後に、２−アミノ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１Ｈ−プリン−６−アミニウムクロリド（１．８３ｇ，８ｍｍｏｌ）を添加した。さらに１時間の撹拌後に、酢酸（１．３ｍｌ）、次いでエーテル（２４０ｍｌ）を添加し、１〜２時間後に固体を濾別した。溶剤および過剰のアルコール（沸点８５〜９０℃／０．４ｍｍ）を濾液から除去して、無視できる量の第２画分（１７ｍｇ）を得た。主画分を水（１０ｍｌ）で摩砕処理して、ＴＬＣ（ＰｈＭｅ−ＭｅＯＨ，４：１）におけるＲf０．２２の実質的に純粋な生成物（１．８９ｇ，７３％）を得た。これを熱メタノール（１００ｍｌ）に溶解し、次いで濃縮することにより再結晶した。分析データを他の化合物のデータと共に表６ａおよび６ｂに挙げる。他の一般的合成法を、たとえば本明細書に後記の特別な節に例示的に記載する。
式ＩＩまたはＸIIIにおいて、Ｙ′が
0004127851.tif 000023
であり、Ｒ″′がアルキルである化合物（ｓｅｃｏ−ヌクレオシド）は、Ｏ6−ベンジルグアニンとクロロエーテル類との反応（MacCoss et al.,Tetrahedron Lett.；欧州特許出願第184,473号，上記引用文中）、または臭化アルキルとの反応（たとえばKjellberg, Liljenberg and Johansson, Tetrahedron Lett. 1986,27,877；Moschel, McDougall,Stine and Pegg,J.Med.Chem..1992,35,4486）と同様な製造方法で製造できる。
ｓｅｃｏ−ヌクレオシドを生成する、Ｒ″ＸＣＨＲ″′に相当する典型的な“糖”成分は、たとえばMcCormick and McElhinney,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,1985,93；Lucey,McCormick and McElhinney,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,1990,795に記載の方法で製造される。
式ＩＩまたはＸIIIにおいて、Ｙがリボシルまたはデオキシリボシルである化合物（ヌクレオシド）は、Ｏ6−ベンジルグアニンリボシドおよび２−デオキシリボシドの合成と同様な方法で製造できる（Moschel et al.,1992；比較：Gao,Fathi,Gaffney et al.,J.Org.Chem.,1992,57,6954；Moschel Hudgins and Dipple,J.Amer.Chem.Soc.,1981,103,5489）（前記リボシドの製造を参照）。
産業上の有用性
本発明化合物の使用量は、腫瘍細胞の処置に必要な有効量に従って変化する。適量は、適切なアルキル化剤による化学療法の前に、処置すべき腫瘍細胞中にＡＴａｓｅ活性を減少させる濃度の本発明化合物が得られる量、たとえば約１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜８００ｍｇ／ｋｇ体重、特に１〜１２０ｍｇ／ｋｇ体重である。
本発明の薬剤組成物は、たとえば国際特許出願公開第WO 91/13898およびWO 96/04281号、ならびに米国特許第5,091,430および5,352,669号に記載されるように、慣用される賦形剤を用いて慣用される剤形に配合することができる。それらの内容全体を本明細書に参考として引用する。本発明組成物は本発明による不活性化剤を適切なアルキル化剤と共に含有するか、または本発明組成物は２部分からなり、一方が不活性化剤を含有し、他方がアルキル化剤を含有してもよい。本発明化合物を宿主に投与する方法も、たとえば国際特許出願公開第WO 91/13898号に記載されるような常法であってよい。本発明の不活性化剤を患者に投与するために薬剤組成物は、静脈注射のためには不活性化剤を好適なベヒクル、たとえば食塩溶液中の４０％ポリエチレングリコール４００中、または食塩溶液中、または３％エタノール（食塩溶液中）中に含有し、あるいは経口投与のためには好適なカプセル内の粉末状であるのが好適である。
アルキル化剤は、たとえば国際特許出願公開第WO 91/13898号に記載されるように既知の手法で、慣用される投与形態により投与でき、または好ましくは、１回量として、ＡＴａｓｅ不活性化剤投与の直後または最高２４時間後、好ましくは約２時間後に、かつ標準的処置方式で使用するより低い用量で投与できる。一般に不活性化剤がアルキル化剤の毒性を高めると予想されるので、用量を減らすことが必要であろう。クロロエチル化剤の例には、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソ尿素（ＣＣＮＵ）、フォテムスチン、ミトゾロミド（mitozolomide）およびクロメゾン（clomesone）、ならびにMcCormick,McElhinney,McMurry and Maxwell J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,1991,877、およびBibby,Double,McCormick,McElhinney,Radacic,Pratesi and Domont Anti-Cancer Drug Design,1993,8,115に記載のものが含まれる。メチル化剤の例には、テモゾロミド（英国特許GB 2,104,522号および米国特許第5,260,291号、それらの内容全体を本明細書に参考として引用する）、ならびにダカルバジン（dacarbazine）、プロカルバジン（procarbazine）およびストレプトゾシン（streptozocin）が含まれる。
方法
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼアッセイ
種々の量の組換えＡＴａｓｅまたは細胞／組織抽出物を、［3Ｈ］−メチルニトロソ尿素−メチル化ウシ胸腺ＤＮＡ（比放射能、１７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と共に、３７℃で１時間、組換えＡＴａｓｅおよび組織抽出物についてはウシ血清アルブミン（ＩＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝液Ｉ［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］３００μｌ、または細胞抽出物については緩衝液Ｉ  １．１ｍｌの全容量でインキュベートした。インキュベーション後、ウシ血清アルブミン（緩衝液Ｉ中１０ｍｇ／ｍｌのもの１００μｌ）および過塩素酸（４Ｍ過塩素酸を、容量３００μｌについては１００μｌ、１．１ｍｌについては４００μｌ）および１Ｍ過塩素酸２ｍｌを添加した。次いで試料を７５℃に５０分間加熱してＤＮＡを加水分解した。次いで試料を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を１Ｍ過塩素酸４ｍｌで１回洗浄した後、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム３００μｌに再懸濁し、水性シンチレーション液（エコシント（Ecoscint）Ａ、ナショナル・ダイアグノスティックス）３ｍｌに溶解した。計数効率は約３０％であった。活性が抽出物添加量に比例する領域からＡＴａｓｅ比活性を計算した。これより高い量の抽出物では、反応が基質制限性になるからである。ＡＴａｓｅ活性を、抽出物中の全タンパク質１ｍｇにつきタンパク質へ転移したメチルのｆｍｏｌとして表す。
組換えＡＴａｓｅの精製法
ヒトＡＴａｓｅのｃＤＮＡクローン化および過剰発現は、これまでに報告されている30。組換えタンパク質の精製は、Wilkinsonら31，32が記載したＤＮＡ−セルロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィー、またはＤＥＡＥ−セルロース−イオン交換クロマトグラフィーにより行われた。後者については、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに装填する前に、ＡＴａｓｅタンパク質を硫酸アンモニウム沈殿法（３０〜６０％）により部分精製し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセリンに対し透析した。次いでＡＴａｓｅを０〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配で溶離した。精製したヒトＡＴａｓｅタンパク質は、高濃度で−２０℃において緩衝液Ｉ［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／３ｍＭジチオトレイトール／１ｍＭ−ＥＤＴＡ］中に保存すると、１年より長期間活性を保持し、数回の融解および再凍結を行っても実質的な活性損失はなかった。
不活性化剤とのインキュベーションおよびＡＴａｓｅアッセイ
被験化合物をＤＭＳＯに最終濃度１０ｍＭに溶解し、使用直前に緩衝液Ｉ中に希釈した。ウシ血清アルブミン（ＩＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝液Ｉ中に組換えＡＴａｓｅを希釈し、前記に従って反応が基質制限条件下ではなくＡＴａｓｅ制限条件下で行われるように滴加した。各アッセイで、一定量のＡＴａｓｅ（６０〜７５ｆｍｏｌ）を種々の量のＯ6−ベンジルグアニンまたは被験化合物と共に、１０μｇのウシ胸腺ＤＮＡを含有する全容量２００μｌのＩＢＳＡ中において、３７℃で１時間インキュベートした。次いで［3Ｈ］−メチル化ＤＮＡ基質（４μｇのＤＮＡおよび１００ｆｍｏｌのＯ6−メチルグアニンを含有する１００μｌ）を添加し、反応が完結するまで３７℃で１時間インキュベーションを続けた。前記に従ってＤＮＡを酸加水分解した後、［3Ｈ］−メチル化タンパク質を回収し、液体シンチレーション計数により定量した。Ｉ50は上記の条件下でＡＴａｓｅ活性を５０％低下させるのに要する不活性化剤の濃度である。
細胞培養および抽出物の調製
Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫由来のヒトリンパ芽球細胞系）、Ａ３７５Ｍ細胞（ヒト黒色腫細胞）、ＭＣＦ−７細胞（ヒト胸部癌細胞）、ならびにＰＣ３およびＤＵ１４５（両方ともヒト前立腺癌細胞）を含む哺乳動物細胞を標準条件下で培養した。たとえばＲａｊｉ細胞は、１０％ウマ血清を補充したＲＰＭＩ培地中で懸濁培養で増殖させた。細胞ペレットを、２μｇ／ｍｌのロイペプチンを含有する低温（４℃）の緩衝液Ｉに再懸濁し、ピーク−ピーク間隔１２μｍで１０秒間、超音波処理した。氷中で冷却した後、細胞を１８μｍでさらに１０秒間、超音波処理した。超音波処理の直後に１０μｌ／ｍｌのフッ化フェニルメタンスルホニル（１００％エタノール中のＰＭＳＦ ８．７ｍｇ／ｍｌ）を添加し、超音波処理物を１５０００ｃｐｍで４℃において１０分間遠心して、細胞片をペレット化した。上清を氷上のチューブに移し、ＡＴａｓｅ活性測定用として保存した（前記参照）。
分光測光法による３７℃での不活性化剤の安定性
不活性化剤（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、予熱およびガス抜きしたＰＢＳ（ｐＨ７〜７．２）中に０．１ｍＭに希釈した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）は０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．１５％Ｎａ2Ｈ2ＰＯ4、０．０２％ＫＨ2ＰＯ4である。試料を直ちにＣＡＲＹ１３分光光度計（キュベットブロックを３７℃に保持）に移し、適切な波長（化合物のスペクトル特性による）において５〜１０分間隔で最高８０時間、走査した。結果を時間に対する吸収の変化率％として表し、これからＴ 1/2値（半減期）を推定した。各表において、これらの試験の結果を“ＰＢＳ中”または“分光法”と表示する。
ＡＴａｓｅアッセイによる不活性化剤の安定性
不活性化剤（ＤＭＳＯ中１０μＭ）を、ＤＴＴを含有しない緩衝液Ｉ中に適切な濃度（先のＩ50測定データから計算したＩ90）に希釈し、３７℃で種々の時間インキュベートした。次いで競合アッセイ用試料を採取し、化合物がヒトＡＴａｓｅを不活性化する効力を評価した。結果を時間に対する不活性化活性の低下として表し、これからＴ 1/2値を推定した。
Ｒａｊｉ細胞におけるＡＴａｓｅ活性の不活性化
適切な濃度の不活性化剤または等容量のビヒクル（ＤＭＳＯ）を含有する培地中に、Ｒａｊｉ細胞を５×１０5〜１０6／ｍｌに希釈した。３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を遠心により回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、得られた細胞ペレット（ペレット当たり５×１０6〜１０7細胞）を−２０℃で保存した。ＡＴａｓｅ活性を前記に従って２組ずつの細胞抽出物において測定し、未処理対照（アッセイに応じて３５０〜４５０ｆｍ／ｍｇ）中に存在する活性を基準とした活性残存率％として表した。このデータからＩ50（すなわちＡＴａｓｅ活性を５０％低下させるのに要する不活性化剤の濃度）値を推定した。
細胞毒性物質に対する哺乳動物細胞の感受性増大
不活性化剤による２時間の前処理後、ＢＣＮＵ、テモゾロミドその他の細胞毒性物質の細胞毒性効果に対する哺乳動物細胞の感受性増大を、ＸＴＴ−基準増殖阻害アッセイにより分析した。細胞を９６ウェルのプレートに接種し（たとえばＲａｊｉ細胞の場合は５００細胞／ウェル）、３７℃で３０分間インキュベートした後、適切な濃度の不活性化剤または等容量のビヒクルを含有する培地を添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、漸増する用量の細胞毒性物質または等量のビヒクルを含有する培地を添加し、細胞を６日間増殖させた。この時点でＸＴＴ溶液を添加し、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。得られた赤／オレンジ色のホルマザン反応生成物を、ミクロタイタープレート読取器で４５０ｎｍの吸収を測定することにより定量した。
このデータから、一定用量範囲のＢＣＮＵ、テモゾロミドその他の細胞毒性物質につき、不活性化剤の存在下および不在下での対照ウェルに対する細胞増殖率％を判定した。細胞毒性物質単独につき計算したＤ50（すなわちアルキル化剤で処理しなかった対照に対比して５０％増殖した用量）（Ｄ50・C）を細胞毒性物質プラス不活性化剤につき計算した値（Ｄ50・I）で割ることにより、Ｄ50に基づく増感係数（Ｄ50・C／Ｄ50・I）を判定した。したがって、数値１は不活性化剤による感受性増大がないことを示す。場合により、Ｄ60およびＤ80、すなわち未処理対照と比較してそれぞれ６０％または８０％増殖した用量に基づき、匹敵する増感係数も判定した。表３には増感係数Ｄ50・C／Ｄ50・IをＤ50対照／Ｄ50’Ｂ’として示す。文字’Ｂ’は不活性化剤化合物を表す。
異種移植片試験
動物
体重２０〜３０ｇのスイスマウス由来無胸腺雄マウス（ｏ／ｎｕ）を、ゼネカ・ファーマシューティカルズ（Alderley Park,Macclesfield,Cheshire,SK10 4T6,英国）から入手した。動物をフィルタートップケージにケージ当たり４〜５匹収容し、食物と水を任意に摂取させた。すべての動物を制御された１２時間−明−１２時間−暗サイクル下で飼育した。下記のように図１１および１７ならびに表８に示したもの以外のすべての試験に、これらの動物を用いた。
細胞
Ａ３７５Ｍ細胞（ヒト黒色腫）およびＤＵ１４５（ヒト前立腺癌）細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。ＭＣＦ−７細胞（ヒト胸部癌細胞）は、１００ｉｕインシュリンを補充した１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。
腫瘍
１００μｌのＰＢＳ中におけるＡ３７５Ｍ、ＤＵ１４５およびＭＣＦ−７細胞（１０6）を、８〜１０週齢ｏ／ｎｕ無胸腺マウスの右側腹部に皮下注射した。これらの細胞を３〜４週間（Ａ３７５ＭおよびＤＵ１４５細胞）および４〜６週間（ＭＣＦ−７細胞）、腫瘍にまで増殖させた。樹立した時点で２ｍｍ3のブロックを無胸腺ｏ／ｎｕマウスの右側腹部に皮下移植することにより、腫瘍を維持した。ＭＣＦ−７腫瘍はエストロジェン陽性であり、増殖のためにエストロジェンを要求する。これを腫瘍移植と同時およびその後各月に、尾基部に皮下植込み剤として補給した（後記参照）。
エストロジェンペレットの調製
４６８ｍｇのβ−エストラジオールを９．７ｇのシラスチック（Silastic）に添加し、均一に分散するまで混合した。１．１ｇの硬化剤を添加し、混合物全体を３個の（２６ｍｍ×１２ｍｍ×１ｍｍ）ガラス型に広げた。次いでこれらを４２℃で一夜インキュベートした後、２ｍｍ×２ｍｍ×１ｍｍの立方体に切断した。したがって各ペレットは２ｍｇのエストラジオールを含有していた。
ＡＴａｓｅ減少実験
腫瘍を前記のように移植し、腫瘍のタイプに応じて３〜６週間放置して樹立させた。不活性化剤を腹腔内注射または経口胃管投与により投与する前に、トウモロコシ油に５ｍｇ／ｍｌに均質化した。最高７２時間までの種々の時点でマウスを屠殺し、ＡＴａｓｅアッセイ用に腫瘍およびマウス組織を採取した。試料を瞬間凍結し、分析するまで−２０℃に保存した。
腫瘍感受性増大実験
ｏ／ｎｕマウスを、適量の前記細胞毒性物質（たとえばテモゾロミド６ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ＋２０％ＤＭＳＯ中）またはフォテムスチンもしくはＢＣＮＵ（２ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ＋３％エタノール中）を指示した用量および計画に従って投与する１時間前に、適量の前記不活性化剤（トウモロコシ油中４ｍｇ／ｍｌ）または対照としての適切なビヒクルで処理した。
腫瘍の測定
動物を週２回体重測定し、デジタルカリパスで異種移植腫瘍を測定した。腫瘍の体積を式（ｈ×ｗ×ｌ）π／６により計算した。腫瘍が許容しうる最大体積（すなわち１ｃｍ3）に達するまで測定を続けた。１日目の腫瘍の体積を対照として用いた腫瘍増殖率％として結果を表す。
表６ならびに図９〜１７に示した化合物に関する試験で用いた方法は国際特許出願公開第WO 94/29312号に記載のものである。以下の項目ａ）〜ｃ）も留意すべきである：
ａ）標準ＡＴａｓｅアッセイ法
精製ウシ胸腺ＤＮＡをＮ−［3Ｈ］−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（１８．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム・インタナショナル）と共にインキュベートすることにより、ＡＴａｓｅ基質ＤＮＡを調製した。細胞または組織抽出物を、［3Ｈ］−メチル化−ＤＮＡ基質（６．７μｇのＤＮＡおよび１００ｆｍｏｌのＯ6−［3Ｈ］−メチルグアニンを含有する１００μｌ）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。先に記載されたように33ＤＮＡを酸加水分解して、［3Ｈ］−メチル化タンパク質を回収し、液体シンチレーション計数により定量した。
ｂ）薬物処理
テモゾロミド（１００ｍｇ／ｋｇ、リン酸緩衝食塩液中の２０％ＤＭＳＯ中）投与（常に腹腔内注射）の６０分前に、トウモロコシ油中の懸濁液として腹腔内注射または経口胃管投与することにより、マウスを不活性化剤で処理した。この計画を１日目から５日目まで繰り返した。対照にはビヒクル単独、不活性化剤単独、またはテモゾロミド単独を投与した。
ｃ）動物
図１１および表８に示した試験のマウスは、国際特許出願公開第WO 94/29312号に記載された、パターソン癌研究所（Paterson Institute for Cancer Research）の研究所内繁殖コロニーからのＢＡＬＢ−Ｃ由来無胸腺雄マウス（ｎｕ／ｎｕ無胸腺）であった（アニマル・サービス・ユニット−ＡＳＵマウス）。
図１２〜１６に示した試験のマウスは、前記のようにスイスマウス由来の無胸腺雄マウス（ｏ／ｎｕ無胸腺）であった。
図１７に示した試験のマウスは、パターソン癌研究所の研究所内繁殖コロニーからのＤＢＡ2マウスであった（アニマル・サービス・ユニット）。これは１９７０年のジャクソン・ラボラトリーのものに由来する。
試験結果
表１の化合物についてのＡＴａｓｅ減少アッセイの結果を表２または表３に示す。試験した化合物の多くは、ＡＴａｓｅ不活性化においてＯ6−ベンジルグアニンより有効であった。親出願である国際特許出願公開第WO 94/29312号の結果によれば、Ｒが複素環基である化合物はベンジルオキシ側鎖をもつ匹敵する化合物より有効であった。一般に、ＲＣＨ2が置換または非置換テニルである化合物が最も好ましく、そのハロ置換基をピリミジン残基に結合したメチレンオキシ基と１，３の関係でもつハロ置換テニルが最も好ましい。
表３、４および５に、多数のパラメーターについてのデータをまとめる。表３は、以下のタイプの組換えＡＴａｓｅについての減少アッセイ結果を含む：
ｈＡＴ  ＝  ヒト
ｍＡＴ  ＝  マウス
ｒＡＴ  ＝  ラット
ｃｈＡＴ  ＝  チャイニーズ・ハムスター
ｏｇｔ  ＝  大腸菌（E.coli）ｏｇｔ遺伝子
ａｄａ  ＝  大腸菌（E.coli）ａｄａ遺伝子
各表において種々の不活性化剤が兼ね備えた特性が分かる。特に以下の予想外の点に注目されたい：
Ｂ．４３１６は、予想外に高い水溶性をもつ化合物である。
Ｂ．４３３５は、Ｒａｊｉ細胞の不活性化において純粋な組換えタンパク質より予想以上にはるかに有効な化合物である。一般には、インビトロでの組換えＡＴａｓｅの不活性化に関するＩ50は培養細胞の場合より低いか、またはそれと同様である。
Ｂ．４３４３は、インビトロでＡＴａｓｅに関して極めて低いＩ50をもつ化合物であるが、テモゾロミドの増殖阻害作用に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大においては、より高いＩ50をもつ物質（たとえばＢ．４３３５）ほど有効ではない。同様な例がＢ．４３４９に対するＢ．４３５１である。
Ｂ．４３１６はＢ．４２８０より２倍有効であったが、テモゾロミドに対するＲａｊｉ細胞の感受性増大はほぼ等しい。したがって異なる細胞系がこれらの物質に対し予想外に異なる反応を示す可能性がある。
図１〜３は、テモゾロミド、ＢＣＮＵおよびフォテムスチンはＲａｊｉ細胞の増殖を用量依存性の様式で阻害するが、それぞれ０．１、１．０および１０μＭのＢ．４３１６に暴露することにより感受性が著しく増大することを示す。これに対し、メルファランまたはシスプラチンによるＲａｊｉ細胞の増殖阻害に関しては、Ｂ．４３１６は測定可能な効果を示さなかった（図４）。これは、本発明の不活性化剤が、他のクラスのアルキル化作用化合物に対してではなく、Ｏ6−アルキル化剤に対し特異的に細胞の感受性を増大させることを示す。
図５および６はそれぞれ、Ｒａｊｉ細胞における上記治療薬に関するＢ．４３１６およびＢ．４３４９の増感係数を示す。
図７は、この実験条件下では、試験した不活性化剤のうちＢ．４３１４およびＢ．４３５１の投与後にのみヒト黒色腫異種移植片ＡＴａｓｅの減少が完結したことを示す。宿主動物の肝臓および腎臓のＡＴａｓｅ減少においては前者の方が有効であり、一方、脳においては後者の方が有効であった。これは、血液−脳関門の通過は後者の方が相対的に容易であることを示唆する。注目に値するのは、Ｂ．４３１１はテモゾロミドの毒性に対するＲａｊｉ細胞の感受性増大においては最も有効な物質のひとつであるが、意外にもそれはマウス組織または腫瘍異種移植片のＡＴａｓｅ活性減少においては最も有効性の低い物質のひとつであったという事実である。
図８は、採用した条件下ではＢ．４３６３は、宿主ネズミ組織よりヒト黒色腫異種移植片においてより効果的にＡＴａｓｅを減少させ、脳組織においてはこれより低い効果がみられたことを示す。。これは、それが血液−脳関門を越える能力が低いことを示唆する。
表６の化合物（および表１の若干）に関する試験結果を表７および図９〜２７に示す。
Ｂ．４２８０、すなわちＯ6−（４−ブロモテニル）グアニンであり、そのブロモ置換基がグアニン残基に結合したメチレン基と１，３の関係にあるものは、インビトロでのＡＴａｓｅ不活性化において、その５−ブロモ類似体Ｂ．４２６９、すなわちそのブロモ置換基がメチレン基と１，４の関係にあるものより有効であった。Ｂ．４２８０およびＢ．４２６９はいずれも、これらより非置換テニル誘導体Ｂ．４２０５がかなり大きなＯ6−置換基をもつにもかかわらず、これより有効であった。
他の好ましい化合物はＢ．４３１７、すなわちＯ6−（４−シアノテニル）グアニンである。Ｂ．４３１７はインビトロで、その５−シアノ類似体Ｂ．４２８３または非置換テニル誘導体Ｂ．４２０５より有効な不活性化剤である。
ＢｅＧ（ベンジルグアニン）ならびにＢ．４２０５およびＢ．４２８０に関する典型的なＡＴａｓｅ不活性化プロフィルを図９に示す。
ＡＴａｓｅの不活性化により、テモゾロミドの増殖阻害作用に対するＲａｊｉ細胞の感受性が増大した（図１０）。この点に関してＢ．４２８０はＢ．４２０５またはＢｅＧよりかなり有効であった。
ヒト黒色腫異種移植片のＡＴａｓｅがＢｅＧ、Ｂ．４２０５およびＢ．４２８０により不活性化された（図１１）。ＡＴａｓｅ活性の回復速度は薬剤間で若干異なることが、ある程度示された。試験した用量ではＢ．４２８０が最も有効なインビボ不活性化剤であった。
Ｂ．４２８０は、表８に示した大部分の組織においてＡＴａｓｅを不活性化することができた。たとえば脳、精巣および骨髄での活性は２４時間目までにほぼ対照の水準となったが、肺および脾臓での活性は４８時間目までに完全には回復しなかった。腫瘍の活性は２４時間目には極めて低かったが、４８時間目までに完全に回復した。回復速度の差は、ＣＮＵまたはテモゾロミドと併用する際にＡＴａｓｅ不活性化剤の毒性における重要な要因であろう。
３日間にわたって投与したＢ．４２０５またはＢ．４２８０とテモゾロミドの組合わせは、腫瘍異種移植片のＡＴａｓｅ不活性化において、いずれかの薬剤単独より有効であった（図１２）。Ｂ．４２０５の用量を低下させても、この薬剤がＡＴａｓｅを不活性化する効力に著しい影響はなく、１０ｍｇ／ｋｇが６０ｍｇ／ｋｇと同様に有効であった。Ｂ．４２８０は等量ではＢ．４２０５より有効であった。前記（図１１）のように、ＡＴａｓｅの回復作用は肝臓（図１３）より腫瘍異種移植片（図１２）の場合の方が低いことが、ある程度示された。
Ｂ．４２０５（図１４Ａ）およびＢ．４２８０（図１５Ａ）は、テモゾロミドの増殖阻害作用に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性を増大させるのに有効であった。これら２組のデータを比較すると、この点に関してＢ．４２８０がＢ．４２０５より約２倍有効であることが示される。腫瘍増殖阻害に関して同等に有効な用量では、Ｂ．４２８０はＢ．４２０５より毒性が低いように思われる（図１４Ｂと図１５Ｂ）。
表９に示すように、ＤＢＡ2マウスを用いた実験でＢＣＮＵと併用した場合、Ｂ．４２８０はＢ．４２０５またはＢｅＧよりかなり急性毒性が低かった。テモゾロミドの増殖阻害作用に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性増大において、Ｂ．４２８０の経口投与は腹腔内投与とほぼ同程度に有効であることが示された（図１６Ａ）。さらに、経口併用は腹腔内経路よりわずかに毒性が低いように思われる（図１６Ｂ）。
ＤＢＡ2マウスにおいて２０ｍｇ／ｋｇの不活性化剤をテモゾロミドと併用した場合、Ｂ．４２０５およびＢ．４２８０はＢｅＧより急性毒性が低く、Ｂ．４２８０の方がＢ．４２０５より急性毒性が低いことが示された（図１７）。
図１８および１９は、Ｂ．４２８０（PaTrin−２）（それぞれ２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、および３０ｍｇ／ｋｇ、経口）がヒト黒色腫異種移植片において、宿主組織におけるより完全に、より長期間、ＡＴａｓｅを減少させることを示す。
図２０は、ヒト胸部腫瘍中の方がＡＴａｓｅ活性の初期レベルがかなり高いにもかかわらず、Ｂ−４２８０が宿主ネズミ組織中より完全に、より長期間、腫瘍のＡＴａｓｅを減少させることを示す。３０ｍｇ／ｋｇのＢ．４２８０を腹腔内に用いたこの試験で、脳組織に著しい減少がみられた。これは血液−脳関門を越えうることを示す。
図２１は同様に、ヒト前立腺腫瘍中の方がＡＴａｓｅ活性の初期レベルがかなり高いにもかかわらず、Ｂ．４２８０が宿主ネズミ組織中より完全に、より長期間、そのＡＴａｓｅを減少させることを示す。２０ｍｇ／ｋｇのＢ．４２８０を腹腔内に用いたこの試験では、脳組織にみられた減少は比較的少ない。図２０を参照すると、これはＢ．４２８０が血液−脳関門を越える能力は用量依存性である可能性を示す。
図２２は、Ｂ．４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）が、５日間の投与計画によるテモゾロミドの増殖阻害作用に対するヒト胸部腫瘍異種移植片の感受性を、かなり増大させたことを示す。この腫瘍のＡＴａｓｅのレベルが極めて高いにもかかわらず、この感受性増大は起きた。
図２３は、１回量のＢ．４２８０（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）が、１回量のクロロエチル化剤フォテムスチンの増殖阻害作用に対するヒト黒色腫異種移植片の感受性をかなり増大させ、毒性には実質的影響がないことを示す。
Ｏ6−（４−ブロモ−２−チエニル［3Ｈ］メチル）グアニンの合成
４−ブロモ−２−チオフェンカルボキシアルデヒド（０．７９ｍｇ，６６．８μｍｏｌ）を、イソプロパノール（３５０μｌ）中で室温において１時間、ＮａＢ［3Ｈ］4（０．０１６７ｍｍｏｌ，６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と反応させた。得られた［3Ｈ］−４−ブロモテニルアルコールをペンタン中へ抽出し、乾燥させ、秤量し、ＤＭＳＯ（２５０μｌ）中で室温において１時間、ＮａＨ（５．４４ｍｇ）およびグアニンの第四級アンモニウム塩（１５．５５ｍｇ）と反応させた。生成物を酢酸−エーテル（エーテル１．５ｍｌ中の氷酢酸１５μｌ）から沈殿させることにより回収し、エーテルで洗浄し、乾燥させ、Ｈ2Ｏで摩砕処理した。水で洗浄した後、最終生成物を一定重量になるまで乾燥させた。図２８は、放射性識Ｂ．４２８０の合成経路を示す。
高性能液体クロマトグラフィー分析
アリコートの生成物を緩衝液Ａ（７．５％アセトニトリルを含有する１０ｍＭＫＨ2ＰＯ4）に溶解し、ＯＤＳ−５カラム上で高性能液体クロマトグラフィー処理した。１ｍｌ／分で２０分かけて、１００％Ａから２０％Ａ：８０％Ｂ（８０％アセトニトリルを含有する１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4）までの直線勾配で溶離した。溶出液を２５４ｎｍでのＵＶ吸収につ監視し、画分（１分）を採集し、１０ｍｌのエコシントＡを添加した後、放射能を測定した。９６％の放射能が基準試料Ｂ．４２８０と共に溶出したことが示された（図２９）。
アリコートの生成物を既知量の純粋な組換えヒト（ｒｈ）ＡＴａｓｅと共にインキュベートすると、放射能がタンパク質へ転移した（図３０）。これは、ＡＴａｓｅ不活性化のメカニズムがＡＴａｓｅ分子中の活性部位のシステインへのテニル基の転移によるものであることを、強く示唆する。タンパク質へ転移した放射能量の測定により、Ｏ6−（［3Ｈ］−４−ブロモテニル）グアニンは放射性純度＞９６％、比放射能１６Ｃｉ／ｍｍｏｌをもつことが示された。
Ｏ6−（［3Ｈ］−４−ブロモテニル）グアニンは、たとえば細胞または組織抽出物中のＡＴａｓｅ量を測定するための標準法（現在、［3Ｈ］−標識した基質ＤＮＡを使用）の代替として使用できる。それは、腫瘍および他の組織切片中における活性ＡＴａｓｅ分子の存在位置を調べるためにも使用でき、顕微鏡スライド上でそれらの切片と共にインキュベートした後、洗浄、オートラジオグラフィーおよび組織染色する。それは、哺乳動物に投与した後、この物質の分解や代謝による［3Ｈ］−標識生成物の形成を監視するためにも使用できる。それは、全身オートラジオグラフィーにより動物の組織および腫瘍中のＢ．４２８０やその分解生成物の分布を調べるためにも使用できる。
典型的な合成法
タイプ１Ａ
Ｏ6−（４−ブロモテニル）ヒポキサンチン、Ｂ．４２９２
４−ブロモテニルアルコール（１．１６ｇ，６ｍｍｏｌ）を水素化ナトリウム（油中６０％；０．１６ｇ，２ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１ｍｌ）に添加した。この溶液を３０分間撹拌した。次いでトリメチルアンモニウム塩（０．４２７ｇ，２ｍｍｏｌ）を添加し、２０℃で２．５時間撹拌を続けた。この溶液を氷浴中で冷却し、酢酸（０．３２ｍｌ）を含有するエーテル（６０ｍｌ）に注入した。白色沈殿を採集し、水（４ｍｌ）で摩砕処理し、再度採集してＢ．４２９２（４３６ｍｇ，６９％）を得た。メタノールから再結晶。
タイプ１Ｂ
Ｏ6−テニル−２−メチルヒポキサンチン、Ｂ．４３５０
６−クロロ−２−メチルプリンからのＤＡＢＣＯ塩
６−クロロ−２−メチルプリン（０．５ｇ，３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）およびジグリム（diglyme）（２５ｍｌ）の混合物に溶解した。次いでＤＡＢＣＯ（０．６６ｇ，６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１時間撹拌し、沈殿を採集して第四級塩（７００ｍｇ，８２％）を得た。
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：シフト（ｐｐｍ）
2.65(s),3.27(t,J=7.5Hz),3.78(s),4.14(t,J=7.5Hz),8.1(s).
テニルアルコール（６８４ｇ，６ｍｍｏｌ）を水素化ナトリウム（油中６０％；８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に添加した。この溶液を３０分間撹拌した。次いで上記ＤＡＢＣＯ塩を添加し、５時間撹拌を続けた。次いでこの溶液を、酢酸（０．１５ｍｌ）を含有するエーテル（３０ｍｌ）に注入した。沈殿を採集し、水（４ｍｌ）で摩砕処理し、再度採集してＯ6−テニル−２−メチルヒポキサンチン（９６ｍｇ，３５％）を得た。アセトニトリルから再結晶。
タイプ１Ｃ
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−２−フルオロヒポキサンチン、Ｂ．４３５３
浴中で−２５℃に予冷した４０％フルオロホウ酸３．６ｍｌに、Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン（３２６ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら添加した。水（０．１５ｍｌ）中における亜硝酸ナトリウム（０．１１６ｇ，１．７ｍｍｏｌ）の溶液を１０分かけて滴加した。２０分後に溶液を氷に注入した。次いで混合物を０℃に１５時間放置し、次いで採集し、乾燥させて、ほとんど純粋な（ｔ．ｌ．ｃ．）Ｂ．４３５３（１８０ｍｇ，５５％）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、極性を漸次低下）によりＢ．４３５３を得た。
タイプ３Ｄ
Ｏ4−テニル−５−デアザプテリン、Ｂ．４３７６
ａ）Ｎ2−ピバロイル−５−デアザプテリン
５−デアザプテリン33，34（２．０ｇ，１３．３６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．２２ｇ，１．８ｍｍｏｌ）および無水ピバリン酸（１２ｍｌ）の混合物を１６５℃に加熱した。過剰の無水ピバリン酸を留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、シリカゲルのパッドに付与し、ジクロロメタン中の２％メタノールで溶離した。蒸発させ、生成物をエタノールから再結晶して、ピバロイル誘導体の光沢あるクリーム色結晶（２．２５ｇ，７４％）を得た。融点２５８〜２５９℃；λmax（ＭｅＯＨ）２７７ｎｍ；
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ1.28(s),7.44(q),8.43(dd),8.88(dd),11.4(s),12.31(s).
ｂ）Ｎ2−ピバロイル−Ｏ4−テニル−５−デアザプテリン
テトラヒドロフラン（８ｍｌ）中におけるＮ2−ピバロイル−５−デアザプテリン（０．４９２ｇ，２ｍｍｏｌ）の懸濁液を１０分間撹拌し、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（０．６０６ｇ，３ｍｍｏｌ）、テニルアルコール（０．４３２ｇ，３ｍｍｏｌ）およびアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．６０６ｇ，３ｍｍｏｌ）を続けて添加した。反応を室温で２時間進行させ、次いで蒸発させると油が得られた。ヘキサンを添加して結晶化を誘発した。濾過およびヘキサンからの再結晶により、明るい黄色の結晶状のテニル誘導体（０．３２ｇ，４７％）を得た。融点１０７〜１０８℃；λmax（ＭｅＯＨ）２７２，３１１ｎｍ；
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ1.28(s),5.86(s),6.98(q),7.28(dd),7.43(dd),7.52(q),8.46(dd),8.89(dd).
ｃ）Ｂ．４３７６
Ｎ2−ピバロイル−Ｏ4−テニル−５−デアザプテリン（０．２８ｇ，０．８２ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ水溶液（３Ｍ，２ｍｌ）およびエタノール（１ｍｌ）と共に２４時間加熱還流した。溶剤を蒸発除去し、残留固体を水に溶解した。酢酸で酸性化すると白色沈殿が生じた。濾過し、固体をエタノールから再結晶して、白色結晶状のＯ4−テニル−５−デアザプテリン（Ｂ．４３７６）（０．１０７ｇ，５１％）を得た。
タイプ４Ｄ
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−５−ニトロシトシン、Ｂ．４３８０
水素化ナトリウム（油中６０％；８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中における４−ブロモテニルアルコール（２９０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加した。３０分後に４−アミノ−２−クロロ−５−ニトロピリミジン35（１７４ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃に２時間加熱した。ＤＭＳＯを真空中で除去し、酢酸水溶液でｐＨ７に調整した。酢酸エチル中へ抽出した後、生成物Ｂ．４３８０をメタノールから結晶化した（５１ｍｇ，１５％）。
タイプ５
Ｓ6−（４−ブロモテニル）−６−チオグアニン、Ｂ．４３５２
水素化ナトリウム（油中６０％；４４ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）中における４−ブロモテニルメルカプタン（４１８ｍｇ，２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加した。３０分後に２−アミノ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１Ｈ−プリン−６−アミニウムクロリド（２２８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌を続けた。酢酸（０．１２ｍｌ）およびエーテル（３０ｍｌ）を添加し、デカントし、新鮮なエーテルで摩砕処理した後、Ｂ．４３５２（３８ｍｇ，１１％）を濾別した。
９−置換Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン：
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−９−（エトキシメチル）グアニン、Ｂ．４３６９
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン（６５２ｍｇ，２ｍｍｏｌ）をナトリウムエトキシド（１Ｍ；２ｍｌ，２ｍｍｏｌ）に溶解した。１０分後にエタノールを除去し、残渣を乾燥ＤＭＦに溶解した。この溶液に撹拌下でクロロメチルエチルエーテル（１８９ｍｇ，２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に滴加した。４５分後に溶剤を除去した。油状生成物をエタノールから結晶化して、Ｂ．４３６９（１５８ｍｇ）を針状晶として得た。母液をシリカゲル上でＣＨ2Ｃｌ2中の５％エタノールによりフラッシュクロマトグラフィー処理して、さらに１１８ｍｇを得た。総収率３９％。
Ｏ6−（４−ブロモテニル）−９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン、Ｂ．４３３５
Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン（２９４ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（４７ｍｇ）およびヘキサメチルジシラザン（５ｍｌ）の攪拌混合物を３時間加熱還流した。次いで揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をベンゼン（１５ｍｌ）およびＨｇ（ＣＮ）2（３４４ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）と共に還流下で３０分間撹拌した。ベンゼン（１０ｍｌ）中における臭化（２−アセトキシエトキシ）メチル｛参考文献４，ｐ３３｝（１９７ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、２時間還流し続け、混濁液をクロロホルム（１５０ｍｌ）で希釈した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３０ｍｌ）、次いでＫＩ（１Ｍ、３０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて油（３１３ｍｇ）を得た。この油を、シリカゲルカラム上でＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１２：１）を溶離剤として用いてクロマトグラフィー処理し、ほとんど純粋な（ｔ．ｌ．ｃ．）Ｂ．４３３５のＯ−アセテート（１４１ｍｇ）を得た。メタノール（６０ｍｌ）を乾燥アンモニアで飽和し、密栓したフラスコ内のこのＯ−アセテートに注いだ。溶解後に撹拌を止め、フラスコを密閉したまま一夜放置した。メタノールの蒸発によりＢ．４３３５（１３５ｍｇ，４６％）を得た。イソプロパノールから再結晶。
Ｏ6−４−ブロモテニル−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン、Ｂ．４３６３
乾燥テトラヒドフラン（１６ｍｌ）中における２′，３′，５′−トリ−（Ｏ−アセチル）グアノシン36（４０９ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（３０３ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）および４−ブロモテニルアルコール（２９０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）の混合物を室温で４５分間撹拌した。次いでアゾジカルボン酸ジイソプロピル（３０３ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を滴加し、混合物を２時間撹拌した。この溶液を蒸発させると油が残り、これをＴＨＦ／ＭｅＯＨ／２５％アンモニア水（１：１：１；５ｍｌ）に溶解し、４℃に４８時間保持した。シリカゲルに吸着させ、ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１５：１から１０：１まで）を用いてカラムクロマトグラフィー処理し、リボシドＢ．４３６３（２０５ｍｇ，４４％）を得た。
Ｏ6−４−ブロモテニル−９−（β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル）グアニン、Ｂ．４３７９
乾燥テトラヒドフラン（４０ｍｌ）中における３′，５′−ジ−（Ｏ−アセチル）−２′−デオキシグアノシン37（５５４ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（６６６．６ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）および４−ブロモテニルアルコール（６３８ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で１５分間撹拌した。次いでアゾジカルボン酸ジイソプロピル（６６６．６ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）を滴加し、１５分後に反応混合物を冷却し、蒸発させると油が残った。これをＴＨＦ／ＭｅＯＨ／２５％アンモニア水（１：１：１；５ｍｌ）に溶解し、４℃に４８時間保持した。シリカゲルに吸着させ、ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（２０：１）を用いてカラムクロマトグラフィー処理し、２′−デオキシリボシドＢ．４３７９（３３８ｍｇ，５１％）を得た。
９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−Ｏ6−（４−ブロモテニル）グアニン、Ｂ．４４３６８
水素化ナトリウム（油中６０％；６０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）および４−ブロモテニルアルコール（３４４ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）から、乾燥ＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）中で１時間かけて、アルコキシド溶液を調製した。これを２−アミノ−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−６−クロロプリン38（１５１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と反応させ、室温で５分間、次いで６０〜６５℃で１５分間、撹拌した。冷却し、エーテル（５０ｍｌ）で摩砕処理し、濾過して固体を得た。これを水（５ｍｌ）に溶解し、酢酸で中和し、シリカゲルで処理した。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（１９：１）を用いるカラムクロマトグラフィーにより、アラビノシドＢ．４３６８（８７ｍｇ，３８％）を得た。ｔ．ｌ．ｃ．で純粋。
Ｏ6−置換グアニン
これらは第四級塩２−アミノ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１Ｈ−プリン−６−アミニウムクロリドと、ＤＭＳＯ中でアルコールおよび水素化ナトリウムから誘導された適切なアルコキシドとから、標準法により製造された（7/12/95のpp.16d,17,18,47参照）。
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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