(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
・複数のポンプ（５３−５６）、ここに、各ポンプは種々のタイプのモノマーのうちの１種に関連し；
・複数のポンプ（５３−５６）の中からモノマーを選択するための該複数のポンプの流出口に流動連結し、かつ、選択したモノマーを反応容器（１５１）に導入するために供する弁（９４、９６、９８）を含む制御可能な弁開閉配列；
・モノマーの流動の容量を検知するためのフローセンサー（１１２）；および
・センサー（１１２）から信号を受け、かつ、複数のポンプ（５３−５６）および弁（９４、９６、９８）を含む制御可能な弁開閉配列を制御するためのコントローラーを含み、
（ａ）種々のタイプのモノマーを入れた容器（１０、１２、１４、１６）に連結され、
（ｂ）該モノマーを同時に１のタイプで中でオリゴヌクレオチドを合成する反応容器（１５１）に容器から送給するための、および
（ｃ）反応容器（１５１）から排出された液体を受けるための
流動連結を有する、フロースルー工程によってオリゴヌクレオチドモノマーからオリゴヌクレオチドを合成するための機器。
【請求項２】
複数のポンプ（５３−５６）の中の各ポンプの正面に弁（各々、３３−３６）が存在し、該弁がフラッシング剤を受けるためのポート（７３−７６）を有し、弁（３３−３６）が関連するモノマーとフラッシング剤との間を選択するためにコントローラーによって制御可能である請求項１記載の機器。
【請求項３】
さらに、当該機器の内部と外部とを画定するキャビネット（１７０）を含み、複数のポンプ（５３−５６）の各ポンプが当該機器のキャビネット（１７０）の装着されていることを特徴とする請求項１または２記載の機器。
【請求項４】
複数のポンプ（５３−５６）の各ポンプが、液体を受けるための第１の端とポンプ（５３−５６）を制御するための信号を受けるための第２の端とを有し、各ポンプが、該第１の端がキャビネット（１７０）の外部側に存在し、該第２の端がキャビネット（１７０）の内部側に存在するように該キャビネットを通して延在するように装着されていることを特徴とする請求項３記載の機器。
【請求項５】
さらに、キャビネット（１７０）の内部を通してガスを排気するためのガス排気系（２１０、２１２、２１４）を含むことを特徴とする請求項３または４記載の機器。
【請求項６】
存在する場合には弁（３３−３６）、および弁開閉配列中の弁（９４、９６、９８）が空気圧作動し、かつ、ガス排気系が弁を作動するためのガスを供給することを特徴とする請求項５記載の機器。
【請求項７】
ガス排気系がコントローラーによって制御可能であることを特徴とする請求項６記載の機器。
【請求項８】
容器（１５１）中で合成されたオリゴヌクレオチドから保護基を除去するための脱保護剤をポンプ輸送するためのポンプ（１２８）を有することを特徴とする請求項１−７いずれか１項記載の機器。
【請求項９】
さらに、反応容器（１５１）から除去された保護基を検知するための保護基センサー（１５４）、該保護基センサー（１５４）に応答して脱保護剤をポンプ輸送するためのポンプ（１２８）を制御するコントローラーを含むこと特徴とする請求項８記載の機器。
【請求項１０】
さらに、第１のキャッピング剤を受けるための第１の流入口、第２のキャッピング剤を受けるための第２の流入口、およびキャッピング剤を容器（１５１）に供するための流出口を含むことを特徴とする請求項１−９いずれか１項記載の機器。
【請求項１１】
キャッピング剤用の弁（９０）の第１および第２の流入口を同時に開口したまま維持して該第１および第２のキャッピング剤を混合することができ、該弁（９０）がコントローラーによって制御可能であることを特徴とする請求項１０記載の機器。
【請求項１２】
さらに、（ａ）アクチベーターを供し、かつ、ポンプ（５９）および弁（３９）ならびにフローセンサー（１１４）を含む流動連結；および
（ｂ）選択したモノマーを受けるための第１の流入口およびアクチベーターを受けるための第２の流入口を有する混合弁（１１６）、ここに該第１および第２の流入口は同時に開口したまま維持して、選択したモノマーおよびアクチベーターを混合弁（１１６）中で混合することができる
を含むことを特徴とする請求項１−１１いずれか１項記載の機器。
【請求項１３】
ポンプ（５９）が、フローセンサー（１１４）からの信号に応答してコントローラーによって制御可能であることを特徴とする請求項１２記載の機器。
【請求項１４】
弁（９０、１１６）がガス排気系（２１０、２１２、２１４）からのガスによって空気圧作動する請求項１−１３いずれか１項記載の機器。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド合成用機器に関する。
発明の背景
オリゴヌクレオチドは、その各々が糖と塩基とを含むヌクレオシドの配列からなる巨大分子である。各ヌクレオシドは、ヌクレオシドを一緒に結合するよう有効に作用するヌクレオシド間結合によって、隣接するヌクレオシドから離れている。糖は一般的にはペントースであり、最も一般的にはデオキシリボース、リボース、または２’-Ｏ-置換リボースである。多種の異なる塩基を用いることができ、そのうちの最も一般的な４種はアデニン、シトシン、グアニン、およびチミン（各々、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴと略する）である。ヌクレオシド間結合は、最も一般的にはリン酸であり、これは、最も一般的には硫黄もしくはアルキル、エステル、またはアミド基によって、非架橋酸素において種々の置換基で置換され得る。
ホスホルアミダイト法、ホスホトリエステル法、およびＨ-ホスホネート法を包含する種々の方法がオリゴヌクレオチド合成に用いられており、これらの各々は分子生物学の分野で一般的に知られている。本明細書においては、ホスホルアミダイト法を例示的な方法として説明する。この方法を用いて多数のオリゴヌクレオチド分子を生成させるためには、固体支持体を反応容器中に配し、非常に多数のＤＭＴ-保護ヌクレオシドを該支持体に固定する。脱トリチル化機構を介して作用する脱保護剤を添加してヌクレオシドからＤＭＴを除去し、かくしてその１個のヒドロキシルが「脱保護」される。その結果、配列中の最後のヌクレオシドは次のアミダイトを受け取る準備ができている１個のヒドロキシルを有する。アセトニトリル（ＡＣＮ）のごとき溶媒中に溶解したヌクレオシドホスホルアミダイト（本明細書中では以後「アミダイト」という）を容器に導入する。テトラゾールのごときアクチベーターもアミダイトと共に容器に導入する。アミダイト中のリンはヒドロキシル中の酸素と結合し、かくして支持体-結合ヌクレオチドが得られる。支持体-結合ヌクレオチドを形成させた後に、ＡＣＮを用いて過剰量のアミダイトを容器からフラッシングする。
酸化剤を添加して、三価のリンを五価に変換する。酸化剤をフラッシングした後にキャッピング剤を添加して、すべての非保護ヒドロキシルが後のステージで導入するアミダイトと反応するのをブロックする。ＡＣＮを再度導入して、キャッピング剤をフラッシングする。
これらの工程を多数回数繰り返して、支持体-結合ヌクレオシドから、伸長するオリゴヌクレオチド鎖を生成させる。各鎖は、ヌクレオシドの同一の反復配列を有していなければならない。
オリゴヌクレオチドを生成させるこの方法（および他のもの）は時間がかかり、使用する材料、特にアミダイトは高価であって、使用後に特別の操作と処分とを要する。研究室においては、約１マイクロモルのスケールでオリゴヌクレオチドを合成する。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（本発明の譲受人の登録商標）なる商品名で一群の製造された機器によって該方法が改善され、３-４ミリモルほどものオリゴヌクレオチドが生成されている。１回で生成し得るオリゴヌクレオチド数を増やし、それを効率的に行うのが望ましいであろう。
しかしながら、より多量の場合には、オリゴヌクレオチドの生成によって幾つかの懸念が生じる。合成オリゴヌクレオチドをヒト用途に使用することに関心が持たれているため、該オリゴヌクレオチドは高度の均一性を有していなければならない。その一方、競合する関心が、材料、特にアミダイトおよびＡＣＮの効率的な使用に影響している。可能な限り多くの形成されつつあるオリゴヌクレオチドが新たに導入されるアミダイトと反応することを確かなものにするためには過剰量のアミダイトが必要であるが、容器に導入するアミダイト量は過剰すぎたり無駄すぎるものであってはならない。また、使用するが、可能な限り多くの残存アミダイトをなお洗い流し、またはそれを少なくとも希釈しつつ、使用されるＡＣＮ量を減少させるのが望ましい。フラッシングが不十分であれば、容器中またはカラムに通じる種々の導管中に残存したアミダイトが不均一な配列を生成し得る。
（やはり本発明の譲受人の登録商標である）ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  IIとして知られている機器は、種々の導管、ポンプ、および弁が液体で常に満たされているフロースルー（flow-through）設計を用いている。（フロースルー装置において「カラム」と呼ばれている）容器中に導入された液体は、以前に導入された液体と置き換わる。このフロースルー系は、液体を反応容器に導入し、導入した液体を洗い流し、液体を導入してフラッシングする工程を繰り返す「バッチ」系とは区別される。かかるバッチ装置においては、ポンプを用いてではなく、ガス圧によって液体が容器に送給される。バッチ法は液体の流動中に空隙を有するため、本アプローチを用いることができる。
ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  II機器においては、その各々が８個の独立して選択可能な流入口を有する第１および第２の八方弁は、流入口のうちの１個のみが開口したままとなっていなければならないタイプの第１の３-ポート弁の流入口に連結した出力口を有している。２個の各八方弁は、連結して４種の異なるタイプのアミダイトのうちの１種を受ける４個の流入口と、連結してＡＣＮ（フラッシングング剤）を受ける４個の流入口とを有している。
第１の３-ポート弁の流出口は、第１のものと同タイプの第２の３-ポート弁の第１の流入口に結合している。この第２の３-ポート弁への第２の流入口は、ＡＣＮ、酸化剤、キャッピング剤、およびアクチベーターを包含する種々の投入物を有する第３の八方弁に結合している。第２の三方弁の流出口は、試薬ポンプの流出側の弁を通してカラムに液体をポンプ輸送するための試薬ポンプの流入側に結合する弁に供されている。また、この最後の弁も、試薬ポンプよりもより速い流速で脱保護剤およびＡＣＮをポンプ輸送するために専用設計された２個のポンプに結合している。
カラムからの出力液体は、ポンプの流入側の弁を通して、吸光度を検出して置換されたトリチル基を検知するモニターへ、ついで１種の投入物を受け、多数の別々の出力廃棄用物を有する廃棄弁へと送給される。試薬ポンプの流入および流出側の弁上のあるポートを選択することによって、所望の時間で、液体がカラムを通して循環し得る。
ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  II機器においては、次のアミダイトをカラムに導入するために、八方弁のうちの１個が次のアミダイトを受けるために設定され、一方八方弁のうちのもう１個がアクチベーターを受けるために設定される。アクチベーターおよびアミダイトを受ける八方弁は、律動的に前後して（pulse back and forth）、各々の量を交互に導入する。
カラムに送給された液体の量を調節するためには、各ポンプを最初に較正する。操作の間は、該ポンプが一定時間作動して、所望量の液体を送給する。定期的に該ポンプを再チェックし、再較正して、ポンプのドリフトによって生じ得る問題を回避しなければならない。関与する合成スケールには、かかる流動較正は、カラムにデリバリーする試薬量を制御するために十分に正確である。しかしながら、より大きなスケールの合成には、液体のデリバリーを制御するためのより精巧な手段に対する要望が存在する。オリゴヌクレオチドを合成するための機器は、英国特許第2,118,189号および米国特許第4,598,049号にも開示されている。
発明の概要
本発明により、従来のフロースルー機器よりも優れた制御および効率を供する改善されたオリゴヌクレオチド合成用機器が提供される。該機器は、種々のアミダイト、ならびに典型的には、キャッピング剤、酸化剤、およびアクチベーターのごとき他の剤を包含する多種の異なる液体を受ける。各液体は、弁およびポンプを含む各々のポンプ輸送モジュールに連結する。好ましい具体例において、流速センサーが幾つかの位置に配されていて、アクチベーター、アミダイト、ＡＣＮ、キャッピング剤、および酸化剤の容量を測定する。これらのセンサーからコントローラーに送られる信号を用いて、操作の間にポンプが個々に調節される。モジュール中の弁も一対をなして、フラッシングュ剤を受ける。
本発明の機器は、当該機器に結合する各アミダイトおよび他の液体を個々に制御することができる。この制御は、使用するアミダイトの量が約１．５モル当量（すなわち、カラム中で生成する配列の数よりも１．５倍多いアミダイトを有する液体の容量）となるようにポンプ流動を調節するために用いられるフローセンサーで効率的にモニターされる。
高い安全性を供するために、全ての液体はキャビネットの外部で操作され、一方該キャビネットは電気部品を収容する。キャビネット中では、エアが連続的に循環されパージされて、スパークを形成し得る内部に溶媒煙が入るのを防いでいる。
本発明は、導入する液体容量の緻密な制御を行う。該制御系は、操作の間に弁を調節するため、ドリフトに起因する再較正の必要性を回避する。同時に流入口のうちの１個または両方を開口することができ、あるいは両方とも開口しないこともできる三方弁を用いることによって、種々のキャッピング剤を弁中で一緒に混合することができ；アクチベーターおよびアミダイトも同時に導入して混合することができる。他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１および図２は、本発明による合成機器のブロックダイアグラムである。
図３は、本発明の機器の模式的斜視図である。
図４は、図３中の切断線に沿った断面図である。
図５は、本発明による制御系のブロックダイアグラムである。
図６は、オリゴヌクレオチド合成法のフローチャートである。
発明の詳細な説明
本発明は、従来可能であったよりもより大きな量である１００ミリモルのオーダーの量でオリゴヌクレオチドを正確に、大スケールで、効率的に合成するためのフロースルー機器を特徴とする。該機器は、多数のポンプおよび弁を有し、その各々は、多種の異なるアミダイト、ならびにフラッシング、活性化、キャッピング、酸化、および脱保護用の他の剤を包含する、多種の異なるタイプの導入すべき液体に対応する。センサーが配されて液体の流動が計量され、検知した流動を用いてポンプが調節される。
図１を参照すると、オリゴヌクレオチド合成用の機器８は、種々のタイプの液体を保持する多くの容器からの液体を流動的に受けるための流入口、および選択した液体をカラムに送給するための流出口を有する。本明細書の説明はオリゴヌクレオチド合成用のホスホルアミダイト法に関連するが、機器８は、オリゴヌクレオチド合成用の他の方法でも使用し得る。
ホスホルアミダイト法で用いるモノマーである４種の最も一般的に用いるアミダイトは、各々、容器１０、１２、１４、および１６に別々に維持される。これらのアミダイトはデオキシリボース糖を有しており、したがって、該アミダイトは、各々ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴとして知られているデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンである。本明細書中ではｄＸおよびｄＹという、用い得る他のアミダイトは、容器１８および２０中に維持される。全てのアミダイトはＡＣＮに溶解されている。
他の剤も別々の容器に維持される。ＣａｐＡおよびＣａｐＢと表されるキャッピング剤は、容器２２および２４に維持され；アクチベーター、好ましくはテトラゾールは容器２６に維持され；酸化剤は容器２８に維持され；および、脱保護剤、好ましくは脱トリチル化剤は容器１２４に存在する。酸化剤の場合においては、２個の加えた弁およびポンプを用いて２種の異なるタイプの酸化剤の間で選択することができ、その１個をホスホジエステル結合の形成に用い、もう１個をホスホロチオエート結合の形成に用いることができる。
各容器１０−２８は、（対応する順番ではない）各々の導管４０−４９を通して任意の弁３０−３９のうちの１個の第１の流入口に流動結合（fluidly  couple）される。各任意の弁３０−３９は、好ましくは３-ポート／三方弁、すなわち、各々が３個の口、典型的には、１個または両方の流入口を開口したままか、あるいは両方の流入口とも開口していないままにすることができるように、１個の流出口と２個の流入口とを有する。各弁３０−３９の第２の流入口は、対応する導管７０−７９を通して、フラッシングュ剤容器８２からＡＣＮを運搬する導管８０に流動結合している。各弁３０−３９は、その流出口で、導管６０−６９を通して対応するポンプ５０−５９に流動結合している。したがって、導入する各液体は、ポンプおよび弁を含む個々のポンプ輸送モジュールと連動している。
モジュールは、カラムに導入する液体を選択するために制御される弁開閉配列を通して下流に結合されている。ＣａｐＡおよびＣａｐＢを受けるポンプ５０および５１の流出口は、弁９０の流入口に流動結合していて、弁９０の流出口は弁９２の第１の流入口に流動結合している。キャッピング剤を導入すべき場合には、弁９０の両方の流入口を典型的には同時に開口したままとして、該キャッピング剤を等量で合する。弁９２の第２の流入口は、ポンプ５２の流出口から酸化剤を受ける。したがって、弁９２は、ＣａｐＡおよびＣａｐＢを合したもの、酸化剤、およびＡＣＮのうちの１種を選択的に送給することができる。
流動的に結合して、各々ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＸ、およびｄＹを受けるポンプ５３−５８は互いに対をなし、これらのポンプの流出口は、カラムに導入するアミダイト（またはＡＣＮ）のうちの１種を選択するための弁開閉配列の一部分に流動結合している。ポンプ５３および５４の流出口は、弁９４の流入口に流動結合しており、ポンプ５５および５６の流出口は弁９６の流入口に流動結合している。弁９４および９６の流出口は弁９８の流入口に流動結合しており、ついでこの弁９８は、ＡＣＮまたはアミダイトｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴのうちの１種を弁１０２の第１の流入口に送給する。ｄＸおよびｄＹを選択的にポンプ輸送するポンプ５７および５８は、弁１００に流動結合しており、この弁１００はその流出口で液体を弁１０２の第２の流入口に送給する。したがって、弁１０２の流出口は、６種のアミダイトのうちの１種またはＡＣＮを送給する。一度に１種のアミダイトを送給するために、弁９４−１０２は、一般的には、一度にそのうちの１個のみが開口する流入口を有している。
容器２６からアクチベーター、好ましくはテトラゾールをポンプ輸送するためのポンプ５９は、他のポンプと対をなしていない。
弁９２、弁１０２、およびポンプ５９から押出された液体は、対応する流動センサー１１０、１１２、および１１４に送給される。これらのセンサーは、好ましくは、各々が、流体流動の容量を注意深く計量するための回転式タービンを有するＥＧ＆Ｇ/Ａｍｔｅｌｅ  ＡＢ社製のＭｏｄｅｌ  ＦＴＯ-３のごときタービン式流動メーターである。該流動メーターは、信号をコントローラーに送り、このコントローラーはこれらの信号を用いて、ポンプ５０−５９を調節する。
センサー１１２を通って流動するアミダイトまたはＡＣＮ、およびセンサー１１４を通って流動するアクチベーターまたはＡＣＮは、弁１１６の流入口に送給される。弁１１６は三方弁であって、２個の流入口で流体を同時に受けることができるため、アミダイトが弁１０２から送給され、アクチベーターがセンサー１１４から送給された場合には、これらの液体を当該弁１１６内で一緒に混合し得る。センサー１１０を通って流動する液体は、弁１１８の第１の流入口につながり、この弁１１８は、第２の流入口で弁１１６の流出口からの液体を受ける。典型的には、弁１１８の１個の流入口が常に開口していても、一時にはそのうちの１個しか開口していない。
弁１１８の流出口は、弁１２０の第１の流入口に流動結合している。弁１２０の第２の流入口は、容器８２からのＡＣＮか、または容器１２４からの脱保護剤かのいずれかを受ける。ＡＣＮおよび脱保護剤は、各々、弁１２６およびポンプ１２８を含むポンプ輸送モジュールに送給される。ポンプ１２８の流出口は、弁１２０の第２の流入口に流動結合している。ポンプ１２８は、一般的にポンプ５０−５９と同様な設計であるが、ポンプ５０−５９のいずれの流量よりも１０倍大きな流量を有している。
弁１２０の流出口からの液体は、圧電圧力トランスミッター１４０に送給され、このトランスミッターは液体の圧力を検知し、流動する液体の圧力を示す電子信号をコントローラーに送る。
ついで、この液体は、当該液体を運搬する導管中に配されたセンサーユニット、および該センサーユニットに結合する制御ユニットを有する超音波エアセンサー１４２に送給される。該エアセンサーは液体を絶えずモニターしていて、導管の液体中の泡または空隙を検知する。かかる泡または空隙はフロースルー系においては起きてはならない；むしろ、種々の導管は常にその中に液体を有していなければならない。泡が検知された場合には、液体の流動を遮断して、下流のカラムにエアが入るのを防ぎ、警告を発することができる。
ついで、液体は、ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４に送給される。該モニターは好ましくはＭｏｄｅｌ  ＵＶ−Ｍ／１であって、該ＵＶ−トランスミッターは好ましくはＭｏｄｅｌ  ＵＶ−Ｐである。これらの各モデルは、本発明の譲受人によって提供される。該モニターは、光を供給するための光源、第１の選択波長の光を供給するためのフィルター、およびＵＶ吸光度を検知する光検出器を有する。波長は、ＵＶ吸収が液体中のヌクレオチド量を示すように選択される。該モニターは、アナログ信号をトランスミッターに送り、このトランスミッターは高分解アナログ／デジタルコンバーターを有していて、アナログ信号をコントローラーにより使用されるデジタル情報に変換する。
ついで、ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４からの液体は、弁１４６に送給され、この弁は、オリゴヌクレオチドを生成するフロースルーカラム１５１に結合するための第１の流出口１４７と、試験の間または全ての液体導管を注入する始動の間にカラム１５１を迂回するために用いることができる第２の流出口１４８とを有している。
前記したごとく、カラム１５１から液体を洗い流さなければならない（または、少なくとも十分に希釈しなければならない）多くの工程が存在する。したがって、これらのフラッシング工程から送給される液体を受けてモニターするための準備がなされている。カラム１５１は、弁１５０の流入口に結合しており、この流入口は、新たな液体がカラム１５１に導入された際に該カラムから排出される液体を受ける。弁１５０の第２の流入口は、望ましい場合にカラム１５１を迂回するための弁１４６の流出口１４８に結合している。
排出された液体は、弁１５０の流出口で、第１ならびに第２のＵＶモニターおよびトランスミッター１５２、１５４に送給される。これら２つは、ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４と同一の一般的タイプのものである。モニターおよびトランスミッター１５２は、モニターおよびトランスミッター１４４と同一波長を用いて、カラム１５１から排出されたヌクレオシドを検出する。ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４ならびに１５２から信号を受けることによって、コントローラーは、カラム１５１に導入されたヌクレオシド量およびそこから排出されたヌクレオシド量を測定することができ、したがって、形成されつつあるオリゴヌクレオチドとの反応に起因してカラム中に残存する差を測定することができる。
ＵＶモニターおよびトランスミッター１５４は、第１のものとは異なり、脱保護剤によって除去されたＤＭＴ量を検知するための第２の選択波長（紫外線ではなく、可視範囲とすることができる）を用いる。脱保護剤を導入し、モニターおよびトランスミッター１５４によって検知されたＤＭＴ量が第１の閾値を超える場合には、それが、脱保護サイクルの開始を示す。検知されたＤＭＴ量が第２の閾値を下回る場合には、脱保護サイクルを終了することをコントローラーが決定する。この工程ではカラムと弁１２０との間のライン（図１）中に一定量の脱保護剤が残るが、この量はカラム容量に対して小さい。モニターおよびトランスミッター１５４によって行われる検知は、伝導率センサーを用いて行い得る。
ＵＶモニターおよびトランスミッターの後に、液体は流動センサー１５６を通過する。排出された液体流動を一般的に検知することに加えて、センサー１５６はポンプ１２８の流動を調節するためにも用いられる。センサー１５６は、一般的に、センサー１１０、１１２、および１１４と同様であるが、好ましくは、より大容量の液体流動に適用するＭｏｄｅｌ  ＦＴ４-８である。
液体は、流動センサー１５６から、背圧弁に、ついで第１廃棄弁１６０に送給される。弁１６０は単一の流入口と２個の流出口とを有しており、その最初のものは出力廃棄物に送給され、その２番目のものは第２廃棄弁１６２に送給されている。弁１６２も２個の流出口を有している。したがって、弁１６０および１６２の組合せは、カラムのフラッシングから生じた廃棄用の３つの別々の廃棄物を送給する。この分離は有効である。なぜならば、異なる廃棄液体が、操作および処理に異なる要件を有するからである。
前記した各弁は、好ましくは空気圧作動性の３-ポート／三方ダイアフラム弁、好ましくはSweden、Lidingoに位置するＲｏｂｏｌｕｘ  ＡＢ社製のモデルである。弁を制御する空気圧作動を供するエア弁は、コントローラーに結合した電磁弁によって制御される。各ポンプは、好ましくは、Italyに位置するＣａｓｔｏｒ社製の磁気カップリングドライブを有する滑り羽根型回転ポンプである。大部分のポンプは、１時間あたり３−４８リットルの能力を有するＭｏｄｅｌ  ＭＰＡ１１４ＡＰであって、ポンプ１２８は、１時間あたり３０−４８０リットルの能力を有するＭｏｄｅｌ  ＭＰＡ１１６ＡＰである。
図３の模式的斜視図を参照すると、前記のポンプ、弁、およびセンサーはステンレス製スチールキャビネット１７０の外部に設置されている。キャビネット１７０は、望ましい時に運動を提供するホイール１７２によって支持された低位プラットフォーム１７１を含む。
弁３３−３８は、キャビネット１７０の正面パネル１７５の低位部分を横切る第１の垂直高に一列に装着されており、ポンプ５３−５８は第１の垂直高の下方に存在する第２の垂直高に一列に装着されている。該ポンプは、アミダイトを受ける各々の弁３３−３８のすぐ下側に存在する。６種のアミダイトの中から選択するための弁９４−１０２を含む弁開閉配列は、ポンプ５３−５８のわずかに下側に装着されている。センサーの全ての産物の中からの液体および脱保護剤を選択する弁開閉配列、すなわち、弁１１６、１１８、および１２０は、弁１１６および１１８がセンサーを超えてキャビネットの正面に装着されるように装着されており、弁１２０は該キャビネットの側壁１７６上に装着されている。
図４を参照すると、ポンプおよび弁配列の一部分が断面で図示されている。ここに示すごとく、ポンプ５３−５８は、それを通して液体が壁１７８の一方の側に送給される外部部分、および正面パネル１７５の内壁上にモーター部１８２を有している。該モーターは、信号ワイヤー１８０を通して（キャビネット１７０から離れた）コントローラーに結合している。この配列では、液体と電気信号とがパネル１７５によって互いから分離される。ポンプ５３−５８についてしか示していないが、キャビネット１７０上に装着されることによって分離されるこのタイプは、ポンプ５０−５２、５９、および１２８にも適用される。
再度、図３を参照すると、電気、伝達、および空気圧の入力口１８４がキャビネット１７０の上面パネル１８６に装着されている。１個の口は電力供給ケーブルを受けるためのものであり、１個はリモート警報機に連絡するリレーのためのものであり、１個は無停電電源警報機入力を供給するためのものであり、１個はホースを通した機械的なエア供給（air  supply）を受けるためのものである。
図５を参照すると、前記したごとく、コントローラーは種々のセンサーから信号を受け、弁およびポンプに制御信号を送る。これらのコントローラー機能は、適当な制御ソフトウエアを用いてプログラムした、Compaq  DeskPro  XEのごときパーソナルコンピュータシステム２００で実行される。コンピュータシステム２００は、液体操作および処理システム２０４に結合しており、これには、各端部にファイバーオプティク・モデムを有するファイバーオプティク・ケーブル２０６を通して、キャビネット１７０および図３の付属部品が含まれる。このファイバーオプティク伝達によって、コンピュータシステムから部品を電気的に単離する間に、多重化が可能となる。したがって、コンピュータシステム２００は、流動センサー１１０、１１２、１１４、および１５６；ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４、１５２、１５４；圧力トランスミッター１４０；およびエアセンサー１４２を含むシステム２０４中のセンサーからの信号を受け；弁およびポンプを作動させる駆動信号を送る。
システム２０４中の種々の三方弁を空気圧作動させるガス、例えばエアは、弁２１２および電磁弁２１４を介してエア供給器２１０から送給される。このガス供給器も結合して、Ｈ．Ｒｕｆ  Ｇｍｂｈ社製のＭｏｄｅｌ  ４Ｒ２１００のごとき自動圧力負荷密閉系２２０を有するキャビネット１７０内にエアを循環させる。注入の間に、６キャビネット内部容量に等しいエアが、高流量でキャビネット１７０から排出される。操作の間に、エアは絶えず低流速で排出されていて、外側よりもキャビネットの内側をわずかに高圧としている。
システムの種々の部品が、無停電電源装置（UPS）２３０に結合しており、したがって、それによって電源供給されている。
かくして、機器８は、図６のフローチャートに示したごときホスホルアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチドを生成する。このプロセスは、カラム１５１を該機器に結合し、カラムに支持体を供給し、最初のＤＭＴ-保護ヌクレオシドを支持体に結合させ、種々の液体を入れた容器を当該機器に流動結合した後に、開始する。アミダイトを付加する一連の工程を以下に説明する。この例においては、供給すべき次のアミダイトはデオキシシトシンである。
図１および図２に参照すると、支持体-結合-ＤＭＴ-保護ヌクレオチドを最初に脱保護する（工程３００）。脱保護剤は、弁１２６、高速ポンプ１２８を通して容器１２４から弁１２０に送給される。弁１２０は切り替わって、弁１１８からではなくポンプ１２８からのみ液体を受け、該液体を種々のセンサーを通して弁１４６に、ついでカラム１５１に送給する。モニターおよびトランスミッター１５４は、カラムから排出されたＤＭＴの第１の閾値量を超えた場合、および排出されたＤＭＴが第２の閾値量を下回った場合に検知する。液体流動の容量は、センサー１５６で検知される。脱保護剤が最初に導入される際にはカラムおよび種々の導管中に他の液体が存在するため、それが調節ポンプ１２８に存在する場合には、センサー１５６は、実際は脱保護剤のみを測定しているのではない。むしろ、センサー１５６は、それを通って流動するいかなる液体の量も測定する。排出された液体は導入された液体と容量が等しいため、この測定によって、導入された脱保護剤の量が効率的に測定される。
ついで、脱保護を、脱保護剤１２４と同一の経路に沿って、弁１２６、ポンプ１２８、弁１２０他を通してＡＣＮでフラッシングする（工程３０２）。
次の工程は、次のヌクレオシドを生成する工程である（工程３０４）。容器１２からのｄＣは、容器２６からのアクチベーターと共に送給される（工程３０６）。導管７４に結合した流入口が閉口している間に、コンピュータが弁３４を切り替えて容器１２からアミダイトを受ける。ポンプ５３から弁９４への流入口が閉口している間に、該コンピュータが、ポンプ５４によって弁９４の第１の流入口へｄＣをポンプ輸送させる。各弁９８および１０２も１個のポートでのみ開口していて、弁９４および弁９８からの液体を各々受ける。流動センサー１１２は、液体の流動を検知し、コントローラーに信号を送り、ついで、センサー１１２を通過するアミダイト量が十分である場合には、該コントローラーが弁３４をＡＣＮに切り替える。好ましい具体例において、カラム中で生成するオリゴヌクレオチド数よりも（モルベースで）５０％多いヌクレオシド、すなわち、１．５モル当量のヌクレオシドが存在する場合には、該量は十分である。この量の測定することにおいて、コントローラーは、ポンプ５４がその望ましい速度に達する前に注入時の特定量を有することを考慮しており、したがって、ポンプ速度を積分して、液体量を集積する。ついで、弁１１６を設定してセンサー１１２を通る液体を受け、その液体を弁１１８の流入口に送給する。
一方、弁１１６は、弁３９、ポンプ５９、およびセンサー１１４を通して容器２６からアクチベーターを受ける。弁１１６の両方のポートは、ｄＣおよびアクチベーターが弁１１６中で共に混合されて、弁１１８の１個の流入口に一緒に送給されるように、開口したままである。各々、ｄＣおよびアクチベーターをポンプ輸送するポンプ５４および５９は、５０-５０混合用に同一速度で操作することができ、あるいは、６０-４０混合を供するにはポンプ５９をより速く操作することができる。該組合わせ物は弁１２０の第１の流入口に送給され、その間に、流動センサー１１０に結合してキャッピング剤、酸化剤、またはＡＣＮを受ける第２の流入口は閉口している。
ついで、圧力トランスミッター１４０、エアセンサー１４２、およびＵＶモニターならびにトランスミッター１４４を通してｄＣおよびアクチベーターが弁１４６の流入口に送給される。ついで、弁１４６はｄＣおよびアクチベーターをカラムに送給する。ｄＣおよびアクチベーターは、所望の接触時間を確実にする一定速度、例えば、活性化ｄＣが形成されつつあるオリゴヌクレオチド配列と接触した時点から始まってｄＣの流動がカラムを通過する時点までの１分間、で一共にポンプ輸送される。
ついで、ｄＣおよびアクチベーターは、モニターおよびトランスミッターに送給される。モニターおよびトランスミッター１４４および１５２でカラム１５１の流入口側および流出口側で検知されたヌクレオシド量をチェックして、十分な量のアミダイトが消費されていることを確認する。十分なアミダイトが消費されていない場合には、コントローラーが、より多量のアミダイト、例えば、約０．５モル当量を添加させる。
十分な量のｄＣおよびアクチベーターがポンプ輸送され、検知された場合には、弁３４および３９が切り替わって、各々、導管７４および７９からＡＣＮを受ける（工程３０８）。選択されたＡＣＮの量は、カラム１５１まで通じる残っているｄＣおよびアクチベーターの導管をクリアにするのに十分な量である。液体は連続的に流動するため、ｄＣおよびアクチベーターがカラムおよび出力廃棄物をまだ通過している間に、弁３４および３９は実際には切り替わる。
つぎは、酸化工程（工程３１０）であり、ここにおいては、弁３２、ポンプ５２、弁９２、センサー１１０他を通して酸化剤を導入する。弁３２を切り替えてＡＣＮを受けることにより、ついで酸化剤を洗い流す（工程３１４）。
十分な量のＡＣＮを用いて酸化剤のラインをフラッシングする場合には、キャッピング剤ＣａｐＡおよびＣａｐＢを導入し、ポンプ５０、５１で等速でポンプ輸送し、弁９０中で共に混合することによって、キャッピング工程（工程３１６）を供する。その混合物を、弁９２、センサー１１０、弁１１８、弁１２０、圧力トランスミッター１４０、エアセンサー１４２、ＵＶモニターおよびトランスミッター１４４、および弁１４６を通してカラムに送給する（工程３１８）。前記に論じたごとく、該キャッピング剤は、ＤＭＴで保護されたヒドロキシルを除き、支持体上の以前に反応しなかったヒドロキシルをブロックする。
十分な量のキャッピング剤を送給した後に、容器８２からそれをＡＣＮで洗浄する（工程３２０）。ＡＣＮは、ＣａｐＡおよびＣａｐＢと同一の流路に従って、導管７０、７１を通って弁３０、３１に導入され、そこから、ポンプ５０、５１によってポンプ輸送され、ついで弁９０他を通して送給される。
この時点でオリゴヌクレオチドが完成していない場合（工程３２２）には、工程を繰り返す。オリゴヌクレオチドが完成している場合には、支持体に結合した完全に保護されたオリゴヌクレオチドをカラム１５１から除去し、乾燥し、ついで、水酸化アルミニウムのごとき切断および脱保護剤で処理して、該オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、種々の保護基を除去する。
本発明による機器を用いると、１００ミリモルにのぼるオリゴヌクレオチドを生成し得ることが判明した。独立して関連するポンプを用いて液体を注意深く計量し、モニターすることによって、該機器はこれらのオリゴヌクレオチドをより効率的に生成し得る。より多量の液体を用いればより多数のオリゴヌクレオチドが生成するが、材料のより効率的な使用が特に重要である。
本発明の好ましい具体例を説明したが、添付の請求の範囲により定義される発明の範囲から逸脱することなく他の変形を成し得ることは明らかである。例えば、例として特別の部品が命名されているが、これらは例であって、かかる部品の他のモデルまたはタイプも使用し得ることは理解される。ホスホルアミダイト法を用いた使用について該機器を説明したが、該機器を用いて異なる方法でオリゴヌクレオチドを合成する場合には、該アミダイトを他のモノマーで置き換え得る。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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