(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール性尿内容物がクレゾールおよびジヒドロ−３，４−ビス［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−２（３Ｈ）−フラノンからなる群から選択される、妊娠した牝馬の尿から、フェノール性尿内容物の枯渇した、天然の共役エストロゲン混合物を取得する方法において、
ａ）粘液状物および固形物を除去した尿、この尿の濃縮した濃縮物またはこの尿の膜濾過により得られた濃縮した尿保持物質である尿液を、少なくとも１２のｐＨ値の調節のために十分な量の水溶性塩基で処理し、塩基で処理した尿液のｐＨ値を、十分な量の酸水溶液の添加により５〜８．５の範囲内のｐＨ値に調節し、
ｂ）塩基で前処理し、ｐＨ５〜８．５に調節した尿液を、尿液中に含有されている共役エストロゲン混合物の吸着のために十分な量の疎水性化シリカゲルと接触させ、共役エストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルを残りの尿液から分離し、
ｃ）共役エストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルを５〜７のｐＨ範囲に調節した水性緩衝液で洗浄し、および
ｄ）洗浄した疎水性化シリカゲルを、それに吸着された共役エストロゲン混合物の脱着のために十分な量の、水および水と混合可能のエーテル、水と混合可能の１〜４個の炭素原子を有するアルカノールおよび水と混合可能の３〜５個の炭素原子を有する脂肪族ケトンの群からの水と混合可能の有機溶剤からなる混合物である溶離液と接触させ、天然の共役エストロゲン混合物を含有する溶出液を疎水性化シリカゲルから分離することを特徴とする、牝馬の尿からエストロゲンを取得する方法。
【請求項２】
工程ｄ）において疎水性化シリカゲルから分離された、共役エストロゲンの天然の混合物を含有する溶出液を濃縮する請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）において、尿液を塩基と混合し、尿内容物中に含有されているラクトン基の分解のために十分な１／２〜２時間の時間少なくとも１２のｐＨ値に保つことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
塩基として塩基の水溶液を使用する請求項３記載の方法。
【請求項５】
疎水性化シリカゲルとして、ジメチルヒドロキシシリルオキシ基を有するシラン化シリカゲルを使用する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）において、疎水性化シリカゲル１容量部に、尿３０〜８０容量部に相当する量の尿液を負荷する請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、疎水性化シリカゲル１容量部に、尿４０〜５０容量部に相当する量の尿液を負荷する請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）において、尿液を毎時疎水性化シリカゲル１容量部あたり尿５〜２０容量部の通過に相当する通過速度で、疎水性化シリカゲルを含有する反応器に通すことを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）において洗浄液として使用される水性緩衝液は、ｐＨ５に調節した水性酢酸／酢酸塩の緩衝液である請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）において溶離液として、水および水と混合可能の有機溶剤からなる、２０：８０〜４０：６０の範囲内の有機溶剤対水の体積比を有する混合物を使用する請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）において溶離液として、水および水と混合可能の有機溶剤からなる、３０：７０の有機溶剤対水の体積比を有する混合物を使用する請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、妊娠した牝馬の尿からの天然の共役エストロゲン混合物の取得に関する。
エストロゲンは、ホルモン代理療法（Ｈｏｒｍｏｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｔｈｅｒａｐｉｅ）のための医薬において使用される。殊に、エストロゲン混合物は女性において起きる自然または人為的の月経閉止による更年期障害の治療および予防のために使用される。その際、妊娠した牝馬の尿中に存在するような天然の共役エストロゲン混合物がとくに有効で良適合性であることが判明した。
妊娠した牝馬の尿（＝ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｍａｒｅｓ  ｕｒｉｎｅ、下記に“ＰＭＵ”と略記）中の溶存固体含量は、当然広い範囲内で変動し、一般に１リットルあたり乾燥分４０〜９０ｇの範囲内にある。ＰＭＵの固体含量中に、尿素およびその他の通常の尿内容物のほかにフェノール性成分が、乾燥分に対して約２〜５重量％の量で含有されている。これらのフェノール性成分の間には、クレゾールおよびＨＰＭＦとして公知のジヒドロ−３，４−ビス［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−２（３Ｈ）−フラノンが存在する。これらは、遊離形または共役形で存在しうる。ＰＭＵ中には、たとえば硫酸半エステルのナトリウム塩（下記に“スルフェート塩”と略記）として十分に共役形で存在する天然のエストロゲン混合物が含有されている。共役エストロゲンの含量（エストロゲンスルフェート塩として計算）は、乾燥分に対して０．３重量％および１重量％の間でありうる。
通常、ＰＭＵからの共役エストロゲン含有抽出物は、水と全くまたは僅かしか混和しない極性有機溶剤、たとえば酢酸エチルエステル、ｎ−ブタノールまたはシクロヘキサノールでの抽出により得られる。しかし、このような液−液抽出においては強い起泡、沈降物生成、エマルション生成および不良な相分離のような多数の問題が起きる。一般に多くの抽出工程が必要とされ、これはエストロゲン含量の損失および単に部分的な取得を生じるにすぎない。
ガスクロマトグラフィーによるエストロゲンの分析的測定のための少量の尿液および液状血漿の調製のために、ヘイキネン（Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎｎ）等（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２７／７巻、（１９８１年）、１１８６〜１１８９ページ）およびシャクルトン（Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ）等（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｋａ  Ａｃｔａ  １０７巻（１９８０年）２３１〜２４３ページ）により、オクタデシルシラン残基を含有するシラン化シリカゲルを有するカートリッジを用いるエストロゲンの固相抽出（Ｓｅｐ−ＰａｋRＣ18カートリッジ、製造業者Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓ．Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）が提案される。その際、エストロゲンはメタノールでカートリッジから溶出される。しかし、エストロゲン含有溶出液中に含有されている他の物質に関する何の記載もなされていない。
本発明の課題は、ＰＭＵから、従来通常の液−液抽出から公知の欠点を避けて天然の共役エストロゲン混合物を取得する、フェノール性尿内容物の枯渇した十分にクレゾールおよびＨＰＭＦ不含の生成物を生じる工業的方法を開発することである。
ところで、疎水性化シリカゲルを用いる固相抽出で、フェノール性尿内容物の枯渇した十分にＨＰＭＦ不含であるが、ＰＭＵの天然のエストロゲン含量を実際完全に含有する、有効成分としてＰＭＵからの天然の共役エストロゲン混合物を含有する医薬を製造するための出発原料として使用することのできる混合物を取得することのできる方法を見出した。
ＰＭＵからフェノール性尿内容物の枯渇した、天然の共役エストロゲン混合物を取得する本発明による方法は、
ａ）粘液状物および固形物を除去した尿、この尿の濃縮された濃縮物またはこの尿の限外濾過により得られる濃縮された尿保持物質（Ｈａｒｎｒｅｔｅｎｔａｔ）である尿液を、少なくとも１２のｐＨ値の調節のために十分な量の水溶性塩基で処理し、引き続き塩基で処理した尿液のｐＨ値を十分な量の酸水溶液の添加により５〜８．５の範囲内のｐＨ値に調節し、
ｂ）塩基で前処理し、ｐＨ５〜８．５に調節した尿液を、尿液中に含有されている共役エストロゲン混合物の吸着のために十分な量の疎水性化シリカゲルと接触させ、共役エストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルを残りの尿液から分離し、
ｃ）共役エストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルを、５〜７のｐＨ範囲、殊に５に調節した水性緩衝液で洗浄し、
ｄ）洗浄した疎水性化シリカゲルを、それに吸着された共役エストロゲン混合物の脱着のために十分な量の、水および水と混和可能のエーテル、低級アルカノールおよび低級脂肪族ケトンの群からの水と混和可能の有機溶剤からなる混合物である溶離液と接触させ、天然の共役エストロゲン混合物を含有する溶出液を疎水性化シリカゲルから分離し、場合により濃縮することを特徴とする。
本発明による方法に対し、ＰＭＵはそのものとして、それから濃縮によって得られる濃縮物またはそれから膜濾過によって得られる保持物質を使用することができる。全尿から、まず自体公知の方法で粘液状物および固形物を除去する。有利に、粘液状物および固形物を沈降させ、次いでこれらを自体公知の分離法、たとえばデカンテーション、分離および／または濾過により分離する。それで、ＰＭＵをたとえば自体公知の分離装置、たとえば分離器、濾過装置または沈降器に通すことができる。分離装置としては、たとえば砂層が使用できるかまたは市販の分離器、たとえばノズル分離器またはトレー分離器を使用することができる。所望の場合、精密濾過装置または限外濾過装置を使用することもでき、それを使用する場合には同時に濾過したＰＭＵの十分な細菌およびウイルス不含性を達成することができる。
所望の場合、尿に防腐剤、殺微生物剤、殺菌剤、および／または駆虫剤を添加することができる。
ＰＭＵの代わりに濃縮したＰＭＵ保持物質を使用する限り、これはＰＭＵから自体公知の膜濾過により得ることができる。保持物質の固形物含量およびその組成は、使用したＰＭＵおよび膜濾過のために使用した膜、たとえばその孔径、ならびに濾過の条件次第で変化しうる。たとえば、ナノ濾過膜を使用する場合、ＰＭＵ保持物質中のエストロゲン含量の殆どロスのない濃縮が、同時に低分子量ＰＭＵ内容物を５０重量％まで除去して達成することができる。本発明による方法には、約１：１０の割合にまで、たとえば約１：７の割合にまで濃縮され、それと共にその体積がもとのＰＭＵ体積の約１／１０、たとえば約１／７にまで濃縮されていてもよいＰＭＵ保持物質を使用することができる。
工程ａ）において、尿液に少なくとも１２、殊に１３〜１４のｐＨ値の調節のために十分な量の水溶性塩基が添加される。水溶性塩基としては、少なくとも１２のｐＨ値を達成するために完全に十分である、尿液に可溶な不活性の無機塩基または有機塩基が適当である。それで、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物、殊に水酸化ナトリウムが適当であり、または第四級低級アルキルアンモニウム水酸化物のような有機塩基も適当である。とくに、塩基は少なくとも２０重量％、とくに４０〜６０重量％の塩基含量を有する水溶液の形で添加される。殊に、４５〜５５％のカセイソーダ水溶液が有利であることが判明する。このアルカリ性前処理の場合、尿液のｐＨ値は少なくとも１２、たとえば１２〜１４の範囲、とくに約１３に調節され、このアルカリ性ｐＨ値は、尿内容物中に含有されているラクトン基の分解のために十分な時間（一般に１／２〜２時間であってもよい）維持される。処理条件は、共役エストロゲンがその際攻撃されないように選択しなければならない。それで、処理は好ましくは室温で塩基の添加量を、１２〜１４の範囲内の所望のｐＨ値を達成するために必要な量に制限して行われる。１２〜１４の範囲内のｐＨ値を達成するために必要な塩基量は、使用したＰＭＵの組成次第で変化しうる。５０％のカセイソーダ溶液を使用する場合、一般にＰＭＵ１０ｌに対し５０％のカセイソーダ溶液約１００〜７００ｍｌの量が十分であることが判明する。引き続き、尿液を酸水溶液の添加により５〜８．５、とくに７〜８．５の範囲内のｐＨ値に調節する。酸としては、尿液に可溶な不活性の無機酸または有機酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸または酢酸のような低級カルボン酸が適当である。たとえば、濃塩酸水溶液が有利であることが判明する。上述したｐＨ範囲を達成するために必要な酸量は、使用したＰＭＵの組成およびアルカリ性に調節するために使用した塩基量次第で変化しうる。濃塩酸溶液を使用する場合、所望のｐＨ値は一般に、ＰＭＵ１ｌに対し濃塩酸溶液約２５〜１００ｇの添加により達成することができる。
工程ｂ）において使用できる疎水性化シリカゲルは、自体公知の逆相シリカゲル（＝Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｈａｓｅ−Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌｅ、略記“ＲＰシリカゲル”）であり、これは疎水性官能基ないしはリガンドを有する化学的に変性されたシリカゲルである。それでたとえば、疎水性官能基としてｎ−オクタデシルジメチルシリルオキシ基、ｎ−オクチルジメチルシリルオキシ基またはジメチルヒドロキシシリルオキシ基を含有するシラン化ＲＰシリカゲルが適当である。たとえば、１５〜５００μｍの平均粒度を有するシラン化シリカゲルが適当である。ジメチルヒドロキシシリルオキシ基を含有し、０．０５〜０．３ｍｍの範囲内の平均粒度を有するシリカゲル、たとえばＭｅｒｃｋ社の“Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０／ジメチルシラン誘導体”がとくに有利であることが判明した。
本発明により、疎水性化シリカゲルに対する共役エストロゲンの吸着は、工程ａ）において前処理した尿液をシリカゲルを含有する反応器に導入し、この中でエストロゲン含量の吸着のために十分な時間シリカゲルと接触状態に保つことにより、場合により濃縮されたＰＭＵまたはその保持物質と、疎水性化シリカゲルとの接触により行なうことができる。疎水性化シリカゲルに対する共役エストロゲンの吸着が行われた後、共役エストロゲン混合物を負荷したシリカゲルを残りの尿液から自体公知方法で分離することができる。有利に尿液を、シリカゲルを含有するカラムに、接触時間がエストロゲン含量の吸着のために十分であるような通過速度で通すことができる。たとえばＰＭＵ５〜２０容量部／シリカゲル１容量部／時間の通過に相当する通過速度が適当である。吸着は、好ましくは室温で実施される。有利に、反応器を通る尿液の通過速度は僅かな過圧または減圧で作業することにより制御することができる。適用すべき疎水性化シリカゲルの量は、使用したシリカゲルの種類および工程ａ）において前処理した尿液中の固体含量の量次第で変化しうる。前処理したＰＭＵを使用する場合、たとえば疎水性化シリカゲル１容量部に、前処理したＰＭＵ８０容量部までを、著量のエストロゲンが流出する尿液中に検出できることなく負荷することができる。前処理したＰＭＵ濃縮物またはＰＭＵ保持物質を使用する場合、疎水性化シリカゲルの負荷能力は当然、これが濃縮されている程度に応じて減少する。それで、たとえば疎水性化シリカゲル１容量部に、ＰＭＵ３０〜８０容量部、とくに４０〜５０容量部に相当する量の尿液を負荷することができる。
共役エストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルは、工程ｃ）において５〜７のｐＨ範囲、とくに約５に調節した水性緩衝液で洗浄される。洗浄液としては、とくに約ｐＨ５に調節した水性酢酸／酢酸塩緩衝液が使用される。殊に、０．１〜１モル、好ましくは０．１〜０．２モルの酢酸／酢酸塩緩衝液が適当である。洗浄液の量は、フェノール性尿内容物を十分に洗出するために十分であり、その際共役エストロゲンの特記すべき量が一緒に洗出されることもないように選択される。たとえば、疎水性化シリカゲル１層体積（Ｂｅｔｔｖｏｌｕｍｅｎ）あたり洗浄液８〜１５、殊に９〜１０層体積の使用が有利であることが判明する。その際、洗浄液は有利に疎水性化シリカゲルを含有する反応器に、洗浄液５〜２０容量部／シリカゲル１容量部／時間の通過速度で通す。
引き続き工程ｄ）において、共役エストロゲン混合物を負荷した洗浄した疎水性化シリカゲルは、共役エストロゲン混合物の溶離のために十分な量の溶離液で処理され、ＰＭＵの天然の共役エストロゲン混合物を含有する溶出液が得られる。本発明により使用される溶離液は、水および水と混和可能のエーテル、低級アルカノールおよび／または低級脂肪族ケトンからなる混合物である。溶離液のエーテル成分としては、テトラヒドロフランまたはジオキサンのような水と混和可能の環状エーテル、水と混和可能の開鎖エーテル、たとえばエチレングリコールジメチルエーテル（＝モノグリム、ｍｏｎｏｇｌｙｍｅ）、ジエチレングリコールジメチルエーテル（＝ジグリム、Ｄｉｇｌｙｍｅ）またはエチルオキシエチルオキシエタノール（＝カルビトール、Ｃａｒｂｉｔｏｌ）が適当である。低級アルカノールとしては、１〜４個、とくに１〜３個の炭素原子を有する水と混和可能のアルキルアルコール、殊にエタノールまたはイソプロパノールが適当である。低級脂肪族ケトンとしては、水と混和可能の３〜５個の炭素原子を有するケトン、殊にアセトンが適当である。有機溶剤がエタノールである溶離液がとくに有利であることが判明する。溶離液中には、水と混和可能の有機溶剤対水の、４０：６０〜２０：８０、とくに約３０：７０の範囲内の体積比が存在しうる。使用される溶離剤量は、疎水性化シリカゲル１層体積あたり約３〜５層体積であってもよい。有利に、溶離液はエストロゲン混合物を負荷した疎水性化シリカゲルを含有する反応器に、接触時間が共役エストロゲン混合物の完全な溶離のために十分であるような通過速度で通すことができる。テトラヒドロフランおよび／またはエタノールと水との、３０：７０の体積比の混合物を使用する場合、たとえば毎時シリカゲル１容量部あたり溶離液５〜２０容量部の通過速度が適当である。有利に、通過速度はわずかに高めた圧力、たとえば０．２ｂａｒまでの過圧で作業することにより制御され、溶出液は幾つかの画分に捕集する。個々の溶出液画分の、共役エストロゲンおよびクレゾールおよびＨＰＭＦのようなフェノール性尿内容物の含量は、自体公知の方法で高速液体クロマトグラフィー（＝ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、略記“ＨＰＬＣ”）により測定することができる。
溶離の場合、まず弱着色ないし無色の実際にエストロゲン不含の初留画分が得られ、その量は一般に約１層体積に相当する。たとえば出発ＰＭＵ中に存在する共役エストロゲンの８０％および９９％の間の共役エストロゲンの主要量は、後続の暗黄褐色に着色した主溶出液画分中に存在し、その量は一般に１〜２層体積を包含する。後続の後留画分中には、一般にほんの痕跡量の共役エストロゲンしか含有されていない。なお乾燥分に対して１０重量％以上の共役エストロゲン含量および乾燥分に対して０．６重量％以下のクレゾールおよびＨＰＭＦ含量を有する後続画分が得られる限り、これらをさらに処理するためエストロゲン富有主溶出液と合することができる。
上記に記載したようにしてシリカゲルから分離した主溶出液は、ＰＭＵ中に最初に存在するフェノール性尿内容物含量の僅かな分量のほかに、ＰＭＵ中に出現する天然の共役エストロゲン混合物を含有する。この溶出液は、天然の共役エストロゲン混合物を含有する医薬の製造のための出発物質として使用することができる。所望の場合溶出液を、有機溶剤を十分に除去した製剤処理に適当な濃縮物を得るために、自体公知の方法でさらに濃縮することができる。所望の場合、噴霧乾燥により溶離剤不含の固体混合物を製造することもできる。天然の共役エストロゲン混合物を固体医薬の製造のために使用する限り、共役エストロゲン含有溶出液に、既に濃縮または噴霧乾燥する前に固体の担体物質を混入するのが有利でありうる。エストロゲン混合物を含有する溶出液ならびにそれから製造した濃縮物または噴霧乾燥した固体生成物は、自体公知の方法で、たとえば錠剤、糖衣錠、カプセルまたは乳剤のような固体または液体の製剤調製物に加えることができる。これらの製剤調製物は、たとえばデンプン、セルロース、乳糖またはタルクまたは流動パラフィンのような通常の固体または液体の担体物質の使用下および／または通常の製薬助剤、たとえば錠剤崩壊剤、溶解助剤または防腐剤の使用下に、自体公知の方法で製造することができる。それで、共役エストロゲン含有生成物は製薬担体および補助物質と自体公知の方法で混合し、混合物を適当な配量剤形に変えることができる。
次の例は本発明を詳説するが、その範囲を制限するものではない。
例１〜５
フェノール性尿内容物が十分に枯渇した、ＰＭＵ中に含有されている天然の共役エストロゲン混合物を含有する抽出物をＰＭＵから取得するための一般的指示。
Ａ）ＰＭＵの前処理。
高さ５ｃｍの砂層または精密濾過装置を通して濾過したＰＭＵ（乾燥分含量（＝ＴＳ）およびＨＰＬＣにより測定したエストロゲンスルフェート塩、クレゾールおよびＨＰＭＦの含量は後続の例の表参照）１０ｌを、強く撹拌しながら５０％の水酸化ナトリウム水溶液（２０℃における密度＝１．５２ｇ／ｍｌ）の添加によりｐＨ１３に調節し（ＮａＯＨ溶液の添加量は例の表参照）、室温で１時間撹拌する。引き続き、アルカリ性尿液を濃塩酸水溶液（約３５％）の添加により８〜８．５のｐＨ値に調節する。
Ｂ）ＲＰシリカゲルに対するＰＭＵのエストロゲン含量の吸着。
高さ５０ｃｍ、直径５ｃｍのカラムに、ＲＰシリカゲル（＝Ｍｅｒｃｋ社の“Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０／ジメチルシラン誘導体”、注文用番号７７１９、粒度６３〜２００μｍ）１００ｇ（≒約１９３ｍｌの体積＝１層体積）を充填する。カラムを、まず水０．５ｌ、その後メタノール０．２５ｌで洗浄し、もう一度水０．５ｌで洗浄する。
Ａ）で前処理した尿液を、０．２ｂａｒの過圧および６０ｍｌ／分の通過速度でカラムに通す。ＰＭＵのエストロゲン含量は、こうして負荷したＲＰシリカゲルカラムに完全に吸着されていた。流出する尿液は、ＨＰＬＣによりそのエストロンスルフェート塩含量を調べ、実際にエストロゲン不含であることが判明する。流出液は投棄する。
Ｃ）負荷したＲＰシリカゲルカラムの洗浄。
負荷したＲＰシリカゲルカラムを、０．１５モルの酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液２ｌ（≒約１０層体積）で洗浄する。緩衝液は、０．１５モルの酢酸水溶液に固形酢酸ナトリウム（約１０７ｇ）をｐＨ５に達するまで供給することにより製造する。流出する洗浄液は、ＨＰＬＣによりそのエストロンスルフェート塩、クレゾールおよびＨＰＭＦの含量を調べ、該洗浄液は出発ＰＭＵのエストロゲン含量の５％以下を含有する。
Ｄ）洗浄したＲＰシリカゲルカラムからの共役エストロゲンの脱着およびエストロゲン富有溶出液画分の分離。
溶離液（水／溶剤混合物、組成は後続の例の表参照）１ｌを、０．２ｂａｒの過圧および約６０ｍｌ／分の通過速度でカラムに通す。流出する溶出液は、幾つかの画分（体積それぞれ約２００ｍｌ≒約１層体積）に捕集する。個々の画分を、ＨＰＬＣによりそのエストロンスルフェート塩、クレゾールおよびＨＰＭＦの含量を調べる。最初の画分は、溶出液が無色ないしわずかに黄色に着色して見えるまで集める。この画分の体積は、１５０ｍｌ〜２００ｍｌである。この画分は、痕跡量のエストロゲンスルフェート塩を含有するにすぎない。
溶出液の濃暗黄色ないし褐色への変色が起きたら直ちに、約２００ｍｌの次の画分を集める。この画分は、カラムに負荷された全共役エストロゲン量の約８０〜９８％を含有していた。残りの画分は、ほんの少量のエストロゲンスルフェート塩を含有するにすぎない。所望の場合これを、溶剤含量を蒸留した後、もう一度工程Ｂ）に供給することができる。
主要量の共役エストロゲンを含有する第２画分に対して、後続の例の表中に、その都度重量％でＴＳ含量およびＨＰＬＣにより測定したエストロンスルフェート塩、クレゾールおよびＨＰＭＦの含量が記載されている。これらの画分は、製剤処理のために適当な抽出物である。
Ｄ）ＲＰシリカゲルカラムの再生。
再生のために、カラムをまず水２ｌ、その後メタノール０．５ｌで洗浄し、もう一度水２ｌで洗浄する。その後、カラムを改めて方法に使用することができる。カラムは、２回以上、たとえば１０回まで再生し、再び使用することができる。
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