(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来物質を分離する方法において、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料をポジ型フォトレジストで覆う工程、
（ｂ）前記フォトレジストを固化することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）固化された前記フォトレジストの、前記生体由来物質を覆っている部分を露光する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により露光された部分のフォトレジストを溶解液に溶解して、該フォトレジストに包埋された前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）の露光が、可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線照射のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項３】
前記ポジ型フォトレジストが、光変性型ポジ型フォトレジストまたは光分解型フォトレジストであることを特徴とする請求項２に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、フォトレジストの固化が、室温〜１００℃にて加温することにより行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項５】
生体由来物質を分離する方法において、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料を両性フォトレジストで覆う工程、
（ｂ）前記フォトレジストを固化することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）固化された前記フォトレジストの前記生体由来物質を覆っている部分を露光することにより、露光部のフォトレジストの溶解液に対する溶解性を未露光部のフォトレジストの該溶解液に対する溶解性と相違させる工程
（ｄ）工程（ｃ）により得られた露光部のフォトレジストと未露光部のフォトレジストとの溶解液に対する溶解性の相違に基づいて、前記露光部のフォトレジストに包埋されていた前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法。
【請求項６】
前記工程（ｄ）がさらに、前記溶解性の差に基づいて露光部のフォトレジストのみを溶解液に溶解し、該露光部のフォトレジストに包埋されていた前記生体由来物質を回収する工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項７】
前記工程（ｄ）がさらに、
（ｄー１）前記溶解性の差に基づいて未露光部のフォトレジストのみを溶解し、該未露光部のフォトレジストに包埋された部分の前記生体由来試料を除去する工程、及び
（ｄー２）残った露光部のフォトレジストを溶解液に溶解して、該露光部のフォトレジストに包埋されていた前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする請求項５に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項８】
前記露光が、可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線照射のいずれかであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一つに記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項９】
前記両性フォトレジストが、光酸触媒発生物質を含み、露光によりレジスト材料の加水分解を引き起こす性質を有する光変性型フォトレジストであることを特徴とする請求項１に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項１０】
生体由来物質を分離する方法において、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料をネガ型フォトレジストで覆う工程、
（ｂ）前記フォトレジストを固化することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）前記生体由来物質を含む回収されるべき前記生体由来試料の部分以外の領域を覆っている前記フォトレジストの部分を露光することにより該領域を覆っているフォトレジストを溶媒に対して不溶化する工程、
（ｄ）溶媒に対して不溶化されていない未露光部の前記フォトレジストに覆われている前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法。
【請求項１１】
前記工程（ｃ）の露光が、可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線照射のいずれかであることを特徴とする請求項９に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項１２】
前記ネガ型フォトレジストが、光、Ｘ線又は電子線により架橋反応を生起する架橋性フォトレジスト、又はラジカル発生剤を含みかつ露光によりレジストの重合を生起する重合型フォトレジストであることを特徴とする請求項９に記載の生体由来物質の分離方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一つの方法を用いて、生体由来試料よりＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質及び生体内低分子のいずれか一以上を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フォトレジストを用いて目的の生体由来物質を分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フォトレジストは、トランジスターや集積回路の製作において広く用いられている光感受性の樹脂である。
【０００３】
特定の単一細胞あるいは細胞塊、または組織あるいは組織の一部よりＤＮＡやＲＮＡを抽出する方法としては、以下のような技術が報告されている。
【０００４】
（１）マイクロニードルを用いて顕微鏡下で特定の細胞や組織、または染色体の一部を切りだし、取り出された細胞、組織または染色体の一部からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法。（S.Noguchiら, Cancer Research 54, p1849-1853, 1994、Z. Zhuangら, American Journal of Pathology vol.146, No.3, p620-625）（２）マイクロキャピラリーを用いて、顕微鏡下で、特定の細胞や組織にキャピラリーを突き刺し、内容物を吸い出してくる方法。（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.92, p3814-3818, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.89, p3010-3014, 1992）
（３）レーザーを用いて標的細胞又は組織以外の部分を焼ききり、その後、標的細胞又は組織を回収し、回収した細胞又は組織からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法。（ Genomics vol.11, p364-373, 1991）
しかしながら、上記のマイクロキャピラリーを用いる方法は、顕微鏡下で、マイクロキャピラリーを正確に操作すること必要であり、実験者に高度の手技を要求する。そのため、標的の細胞あるいは組織又はそれらの内容物のみを、汚染なく取得することは困難である。また、上記のレーザーを用いる方法は、操作の簡易化は図れるものの、レーザーによって標的細胞又は組織以外の部分を完全に焼きとばすことが困難であり、その結果、標的細胞又は組織以外の周辺部からの汚染が避けがたいという欠点を有する。そのため、上記の方法によりＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、その後増幅を行った場合は、汚染の結果として、バックグランドが高いという欠点を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定の細胞、組織又は生体高分子等の生体由来物質、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ、蛋白質等の生体分子を分離するための、簡便でかつ不純物混入の少ない方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体由来物質を分離するためにフォトレジストを用いることを特徴とする。
【０００７】
本発明はまた、生体由来の試料、例えば細胞、組織等をフォトレジスト中に包埋することを特徴とする。
【０００８】
本発明はまた、ポジ型フォトレジストを用いて生体由来試料を固定化した後、フォトレジストに包埋された生体由来試料から特定の生体由来物質、たとえば標的の細胞や生体高分子等を取得するために、該生体由来物質を覆っているフォトレジストの部分を、可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等で露光することにより、フォトレジストを変性又は分解（以下、単に分解という場合有り）し、該分解されたフォトレジストに包埋された生体由来物質を回収することを特徴とする方法である。
【０００９】
本発明はまた、両性フォトレジストを用いて生体由来試料を固定化した後、フォトレジストに包埋された特定の生体由来物質、たとえば標的の細胞や生体高分子等を取得するために、該生体由来物質を覆っているフォトレジストの部分を可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等で露光することにより、露光部のフォトレジストの溶解液に対する溶解性を未露光部のフォトレジストの溶解液に対する溶解性と異なるようにし、次いで、該溶解性の差に基づいて、露光部のフォトレジシスとを溶解して該露光部のフォトレジストに包埋された生体由来物質を回収する、又は該未露光部のフォトレジスト及び該未露光部のフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を除去した後残った露光部のフォトレジストを適当な溶解液に溶解して該露光部に包埋された生体由来物質を回収することを特徴とする方法である。
【００１０】
本発明はさらに、ネガ型フォトレジストを用いて生体由来試料を覆った後、フォトレジストを固化（溶媒除去成膜化）することにより生地由来試料を固定化し、その後、特定の生体由来物質、たとえば標的の細胞や生体高分子等を取得するために、該生体由来物質を覆っているフォトレジスト部分以外の領域を可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等で露光することによりフォトレジストを溶媒に対して不溶化し、次いで、溶媒に対して不溶化されていないフォトレジストに覆われた生体由来物質を回収することを特徴とする方法である。
【００１１】
【発明の実施の態様】
上記の如く本発明は、標的の生体由来物質を分離するためにフォトレジストを用いることを特徴とする。
【００１２】
本発明において用いられるフォトレジストは特に制限されず、ポジ型フォトレジスト、両性フォトレジスト又はネガ型フォトレジストのいずれのフォトレジストも用いることができる。
【００１３】
本発明の一つの態様は、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料をポジ型フォトレジストで覆う工程、
（ｂ）前記フォトレジストを固化（溶媒除去成膜化）することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）固化された前記フォトレジストの、前記生体由来物質を覆っている部分を露光する工程、
（ｄ）工程（ｃ）により露光された部分のフォトレジストを溶解液に溶解して、該フォトレジストに包埋された前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法である。
【００１４】
本発明の一つの態様は、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料を両性フォトレジストで覆う工程、
（ｂ）前記フォトレジストを固化（溶媒除去成膜化）することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）固化された前記フォトレジストの前記生体由来物質を覆っている部分を露光することにより、露光部のフォトレジストの溶解液に対する溶解性を未露光部のフォトレジストの該溶解液に対する溶解性と相違させる工程
（ｄ）工程（ｃ）により得られた露光部のフォトレジストと未露光部のフォトレジストとの溶解液に対する溶解性の相違に基づいて、前記露光部のフォトレジストに包埋されていた前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法である。
【００１５】
本発明の一つの態様は、
（ａ）該生体由来物質を含む生体由来試料をネガ型フォトレジストで覆う工程、（ｂ）前記フォトレジストを固化（溶媒除去成膜化）することにより、前記生体由来試料を固定化する工程、
（ｃ）前記生体由来物質を含む回収されるべき前記生体由来試料の部分以外の領域を覆っている前記フォトレジストの部分を露光することにより該領域を覆っているフォトレジストを溶媒に対して不溶化する工程、
（ｃ）溶媒に対して不溶化されていない未露光部の前記フォトレジストに覆われている前記生体由来物質を回収する工程
を含むことを特徴とする生体由来物質の分離方法である。
【００１６】
以下、本発明の方法を、詳細に説明する。
【００１７】
（１）生体由来試料
本発明の方法の対象である生体由来試料は特に限定されない。本発明で用いる生体由来試料としては、例えば、いずれかの組織又はその組織の切片、例えば、脳や肝臓又はその切片、細胞、生体高分子、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、各種生理活性物質等を挙げることができる。
【００１８】
組織を用いる場合は、生体より組織を摘出した後、その組織の切片を作製し該切片を用いることもでき、また、組織をホモジナイザー等を用いて破砕した後、そのホモジネートを用いることもできる。
【００１９】
本発明で用いることができる細胞は特に制限されない。例えば、繊維芽細胞や上皮性細胞等の接着性細胞、血球系細胞、一部のガン細胞等の浮遊系細胞を挙げることができ、前記細胞は、生体から採取した細胞、セルライン化した培養細胞のいずれも満足に用いられ得る。
【００２０】
また、生体から採取した物質、例えば血液、羊水、糞便、尿等、細胞又は組織からの抽出物、生体物質の部分精製物等も本発明において用いることができる。
【００２１】
（２）フォトレジストを用いて生体由来物質を分離する工程
本発明の分離方法においては、ポジ型フォトレジスト、両性フォトレジスト又はネガ型フォトレジストのいずれも用いることができる。以下、ポジ型フォトレジストを用いた場合、両性フォトレジストを用いた場合、及びネガ型フォトレジストを用いた場合について説明する。
【００２２】
（Ｉ）ポジ型フォトレジストを用いた方法
本発明の方法においてポジ型フォトレジストを用いる態様においては、生体由来試料をポジ型フォトレジストに包埋し、次いで目的の生体由来試料の部分を覆うフォトレジストの部分のみを可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等で露光することによりフォトレジストを溶解液に可溶性とし、該露光されたフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を回収することを特徴とする。
【００２３】
（Ｉ−１）ポジ型フォトレジストに包埋された生体由来試料の調製方法
本発明の方法においては、前記の生体試料をフォトレジストにより包埋することを特徴とする。生体由来試料を包埋する方法は、用いる生体由来試料に応じて適宜選択可能である。
【００２４】
以下に、生体由来試料を調製しその後該生体由来試料をフォトレジストを用いて包埋する方法を、浮遊細胞を用いる場合及び組織切片を用いる場合を例として幾分詳細に記載する。しかしながら、本発明の態様は以下の例に限定されるものではない。
【００２５】
１）浮遊系細胞をフォトレジストを用いて包埋する方法
浮遊系細胞を適当な培地にて培養した後、遠心分離等により細胞を回収し、適当な溶液に懸濁する。その後、適当な細胞数を含んだ懸濁液を、フォトレジストを適当な溶媒又は水性媒体に溶解又は懸濁した組成物と、適当な割合にて混和する。フォトレジスト組成物と細胞懸濁液の混合割合は、その後の操作においてフォトレジストの固化が満足に起こるのであれば特に問題とされず、用いるフォトレジスト組成物の種類に応じて適宜選択される。たとえば、フォトレジスト組成物と細胞懸濁液を、２０：１〜５：１、好ましくは１０：１〜８：１の割合にて混和することができる。その懸濁液を、固体支持体、例えばスライドグラスやプラスチックプレート上に展開し、所定温度にて所定時間放置することにより、フォトレジストを固化させる。
【００２６】
２）組織切片をポジ型フォトレジストを用いて包埋する方法
脳又は肝臓等の目的の組織を生体より摘出し、凍結法又はパラフィン包埋法等を用いて、数マイクロメートル程度の厚さの超薄切片を作成する。凍結法で作成した切片はそのままスライドグラス等の固体支持体上に展開し、その後、フォトレジスト組成物を組織切片を覆うように展開し、次いで、所定温度にて所定時間放置することにより、フォトレジストを固化させる。
【００２７】
本発明において用いるポジ型フォトレジストは、生体由来試料を包埋する形で固化でき、かつ可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等の露光により分解又は変性される光変性型フォトレジスト又は光分解型フォトレジストであれば特に制限なく用いることができる。例えば、ｏ−ナフトキノンアジド誘導体とフェノールノボラック樹脂との混合系などの光変性型フォトレジスト、ポリメチルメタクリル酸を主成分とする光分解型フォトレジストを用いることができる。
【００２８】
本発明の方法においては、ポジ型フォトレジストの固化は、所定温度にて所定時間放置することにより行うことができる。用いる温度及び放置時間は、用いるポジ型フォトレジスト組成物中の溶媒又は水性媒体、及び回収目的である生体試料に応じて適宜選択されうる。一般的には、フォトレジストの固化は、加温して行われる。例えば、８０℃〜１００℃にて１〜数分間、または３０℃〜６０℃にて十数分〜数時間加温することにより固化が行われる。例えば、本発明の方法を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを回収することが目的ならば、約９５℃の温度にて１〜数分間加温することによりポジ型フォトレジストを固化するという条件が選択できる。固定化する生体由来試料が、加温にて不都合が生じる場合は、室温以下〜低温、例えば数℃にてフォトレジストを固化するのが好ましい。このような場合には、通常用いられているフォトレジスト組成物の溶媒を例えばアセトンなどのように低温で気化しやすいものを用いることが可能である。また、溶媒の蒸発を促進するために減圧下にて固化を行うことも可能である。本発明においては、目的に応じて上記フォトレジストを適宜選択して用いることができる。
【００２９】
ポジ型フォトレジストの分解を可視光、紫外光、Ｘ線又は電子線等の露光により行う場合は、その波長及び出力を調節することにより、フォトレジストの分解を制御することが可能である。
【００３０】
また、本発明の方法において用いるポジ型フォトレジストは、有機溶媒に溶解されたもの、さらには水を加えてエマルジョンとしたもののいずれも用いることができる。目的とする生体由来試料が、高濃度の有機溶媒が混入することによって不都合を生じる場合は、エマルジョンとしたフォトレジストを用いることができる。本発明においては市販のポジ型フォトレジストが満足に使用されうる。市販のフォトレジストは一般に有機溶媒に溶解されているので、エマルジョン系のフォトレジスト組成物が望まれる場合は、それに水を加えてエマルジョンとして用いることができる。また、市販品のフォトレジストの濃度が所望の濃度より高い場合は、適当な溶媒又は水性媒体、たとえば乳酸エチルで希釈して用いることが可能である。
【００３１】
本発明において生体由来試料を固定するために用いる固体支持体は特に制限はされない。例えば、スライドグラスやプラスティックプレート等を用いることができる。用いる固体支持体は、用いる生体由来試料及びフォトレジスト並びに固定化の条件に応じて適宜選択されうるが、フォトレジストの固化を比較的高温で行う場合はスライドグラスを用いるのが好ましい。
【００３２】
上記の如くして得られた、本発明のポジ型フォトレジストを用いて包埋された生体由来組織はその状態にて保存可能である。
【００３３】
（Ｉ−２）目的の生体由来試料又は生体高分子の回収
前記方法によりフォトレジストを用いて固定された細胞又は組織は、光学顕微鏡による位相差法又は微分干渉法を用いて観察することができる。このように、本発明により得られたフォトレジストを用いて包埋された生体由来組織は、包埋された状態にて光学顕微鏡により観察することが可能であるのでその後の操作が容易となる。
【００３４】
また、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法や組織蛍光抗体法等を用いて細胞又は組織を蛍光染色した後、本発明の方法を用いてフォトレジストを用いて生体由来組織を包埋した場合は、包埋された該細胞又は組織に蛍光色素の励起波長の光を照射することより、標的部位の特定が可能である。係る場合は、励起波長によるフォトレジストの光反応を防ぐために、励起波長が露光に用いられる波長よりも長波長になるように、フォトレジスト及び蛍光色素を選択することが必要となる。
【００３５】
上記方法により標的部分を特定した後、標的部分を覆っているフォトレジストを露光により分解する。フォトレジストを分解するために用いる光は、通常光又はレーザー光のいずれであってもよい。回収対象となる生体由来物質を覆っている、分解されるべきフォトレジストの領域が比較的大きい場合は、光源として高圧水銀ランプやキセノンランプ等を用いることができる。かかる場合は、前記ランプを備えた蛍光顕微鏡をそのまま利用することが可能となる。また、回収対象となる領域が比較的小さい場合は、レーザー光を用いることにより、極狭い領域のフォトレジストのみを分解することが可能である。さらには、細胞又は組織を覆っているフォトレジストを特定の形態、たとえば特定のパターンにて分解させたい場合は、スキャン装置を備えたレーザー顕微鏡若しくはレーザー加工装置を用いることができる。
【００３６】
本発明においては、フォトレジストを分解するための光として、可視光、紫外光、deep UV光、電子線、Ｘ線、イオンビーム等を用いることができる。
【００３７】
ポジ型フォトレジストの分解に用いる光の波長は、用いるフォトレジストに応じて適宜選択することができる。さらには、特定の波長の光を照射することが包埋された生体由来試料に不都合な場合は、用いるフォトレジスト及び露光に用いる波長を適宜組み合わせて選択することにより、生体由来試料への影響を回避することができる。
【００３８】
本発明の方法において、分解されたフォトレジストを除去すると共に目的の生体由来物質を回収する方法は特には限定されない。例えば、分解された部分に、適当な溶媒又は溶液例えば緩衝液を滴下し、溶媒又は溶液ごと目的物質を回収することが可能である。また、分解されたフォトレジストが弱アルカリ性の溶液に可溶性である場合は、弱アルカリ溶液を用いることにより、目的の生体由来物質をフォトレジストを溶解して回収することができる。また、分解されたフォトレジストを溶解することが特に必要とされない場合は、目的の生体由来物質を分解されたフォトレジストと共に回収すればよく、回収に用いる溶媒又は溶液は、溶解されたフォトレジストとの相溶性は特に問題とされない。本発明において溶解液とは、分解されたフォトレジストを溶解する液及び懸濁状態で回収する液のいずれをも含む意味である。
【００３９】
また、用いた生体由来試料が用いた固体支持体に強い接着性を有する場合は、分解されたフォトレジストのみを除去することが可能である。かかる場合は、目的の生体由来物質を含む生体由来試料を固体支持体に保持したままの状態にて回収ができるこことなり、その状態で種々の目的に利用可能となる。
【００４０】
回収のために用いる溶媒または溶液は、分解されたフォトレジストの性質及び回収した生体由来物質及びその利用目的に応じて適宜選択されうる。たとえば、ＤＮＡを回収することが目的ならば、弱アルカリ溶液を用いることができ、この場合は、分解されたフォトレジストは弱アルカリ溶液に溶解される。
【００４１】
本発明の方法により得られた回収液は、次いで、目的に応じて、任意の種々の操作に付されうる。たとえば、本発明の方法により得られた目的のＤＮＡを含む回収液は、その後、エタノール沈殿され、次いでプロテイナーゼＫで処理されることにより、目的のＤＮＡが取得されうる。
【００４２】
本発明の方法を用いて回収された生体由来試料又は生体高分子は、生体由来物質として種々の目的に利用可能である。たとえば、ＤＮＡ又はＲＮＡを取得するために本発明の方法を用いた場合は、得られた特定のＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子のクローニング、ｃＤＮＡライブラリーの作成、ＰＣＲ法を用いた遺伝子の同定又は遺伝子診断に用いることが可能である。また、タンパク質を取得するために本発明の方法を用いた場合は、得られたタンパク質はアミノ酸シークエンス等に用いることができる。
【００４３】
（ＩＩ）両性フォトレジストを用いた方法
本発明の方法において両性フォトレジストを用いる場合の一つの態様においては、生体由来試料を両性フォトレジストに包埋し、次いで目的の生体由来試料の部分を覆っているフォトレジストの部分のみを適当な波長の光で露光することにより、露光部と未露光部のフォトレジストの溶解液に対する溶解性を異なるようにし、次いで、該溶解性の差に基づいて該露光されたフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を回収することを特徴とする。
【００４４】
（ＩＩ−１）両性フォトレジストに包埋された生体由来試料の調製方法
本発明の上記態様において用いる両性フォトレジストは、生体由来試料を包埋する形で固化でき、かつ光の露光により、露光部と未露光部のフォトレジストの間に溶媒又は溶液に対する溶解性に差がでるものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、光酸触媒発生物質を含みかつ露光によりレジスト材料の加水分解を引き起こす性質を示す光変性型フォトレジスト用いることができる。
【００４５】
本発明の方法において、両性フォトレジストを用いて前記の生体試料をフォトレジストにより包埋する方法は、前記のポジ型フォトレジストを用いた場合と同様である。
【００４６】
即ち、本発明の方法においては、両性フォトレジストの固化は、所定温度にて所定時間放置することにより行うことができる。フォトレジストの固化を、所定温度にて所定時間放置することにより行う場合は、用いる温度及び放置時間は、用いる両性フォトレジスト組成物中の溶媒又は水性媒体に応じて適宜選択されうる。一般的には、フォトレジストの固化は、加温して行われる。例えば、８０℃〜１００℃にて１〜数分間、または３０℃〜６０℃にて十数分〜数時間加温することにより固化が行われる。例えば、本発明の方法を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを回収することが目的ならば、約９５℃の温度にて１〜数分間加温することによりフォトレジストを固化できる。固定化する生体由来試料が、加温にて不都合が生じる場合は、室温以下〜低温、例えば数℃にて固化しうるフォトレジストを用いるのが好ましい。本発明においては、目的に応じて上記フォトレジストを適宜選択して用いることができる。
【００４７】
両性フォトレジストの変性を光の露光により行う場合は、光の波長及び出力を調節することにより、フォトレジストの変性を制御することが可能である。
【００４８】
また、本発明の方法において用いる両性フォトレジストは、有機溶媒に溶解されたもの、及びさらに水が加えられてエマルジョンとなったもののいずれも用いることができる。目的とする生体由来試料が、高濃度の有機溶媒が混入することによって不都合を生じる場合は、エマルジョン系のフォトレジストを用いることができる。
【００４９】
両性フォトレジストを用いた本発明においても生体由来試料を固定するために用いる固体支持体は特に制限はされず、例えば、スライドガラスやプラスティックプレート等を用いることができる。
【００５０】
上記の如くして得られた、本発明の両性フォトレジストを用いて包埋された生体由来組織はその状態にて保存可能である。
【００５１】
（ＩＩＩ−２）目的の生体由来試料又は生体高分子の回収
前記方法により両性フォトレジストを用いて固定された細胞又は組織は、ポジ型フォトレジストを用いた場合と同様に、光学顕微鏡による位相差法又は微分干渉法を用いて、包埋された状態にて観察することが可能である。
【００５２】
また、ポジ型フォトレジストを用いた場合と同様に、蛍光染色を用いることも可能である。
【００５３】
両性フォトレジストの変性に用いる光の波長は、用いるフォトレジストに応じて適宜選択することができ、さらには、特定の波長の光を照射することが包埋された生体由来試料に不都合な場合は、用いるフォトレジスト及び露光に用いる波長を適宜組み合わせて選択することにより、生体由来試料への影響を回避することができる。
【００５４】
本発明の方法においては、露光部と未露光部のフォトレジストの溶媒又は溶液に対する溶解性の差に基づいて、該露光されたフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を回収する、又は該未露光部のフォトレジスト及び該未露光部のフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を除去した後に該露光されたフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を回収する。回収に用いる溶媒又は溶液は、用いるフォトレジスト及び回収目的の生体由来物質に応じて適宜選択されうる。
【００５５】
例えば、ノボラック・アジド系フォトレジストのような光付加体形成により不溶化する両性フォトレジストを用いた場合は、未露光部は有機溶媒及び弱アルカリ水溶液に可溶性であるが、露光部は有機溶媒には可溶性であるが弱アルカリ水溶液には不溶性であるという性質を有する。この溶解性の差を利用して、まず、回収対象の生体由来物質を含む生体由来試料部分を覆っている固化されたフォトレジストの部分を露光する。次いで、弱アルカリ水溶液を用いて、未露光部のフォトレジスト及び該未露光部のフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を除去する。その後、残った露光部のフォトレジスト及び該露光部のフォトレジストに覆われた生体由来試料の部分をキシレン等の有機溶媒を用いて溶解し、目的の生体由来物質を回収する。また、回収対象の生体由来物質を含む生体由来試料部分以外の部分を覆っている固化されたフォトレジストの部分を露光する。次いで、弱アルカリ水溶液を用いて、未露光部のフォトレジストに包埋された生体由来試料の部分を溶解し、目的の生体由来物質を回収することも可能である。
【００５６】
上記のようにして回収された生体由来物質は、次いで、遺伝子のクローニング等の種々の目的に利用されうる。
【００５７】
（ＩＩＩ）ネガ型フォトレジストを用いた方法
本発明の方法においてネガ型フォトレジストを用いる場合の一つの態様においては、生体由来試料をネガ型フォトレジストで覆い、次いでフォトレジストを固化することにより生体由来試料を固定化した後、目的の生体由来物質を含む回収されるべき生体由来試料の部分以外の領域を覆っているフォトレジストを露光することにより該領域のフォトレジストを溶媒に対して不溶化し、その後、溶媒に対して不溶化されていない未露光部のフォトレジストに覆われている生体由来物質を回収することを特徴とする。
【００５８】
（ＩＩＩ−１）目的の生体由来物質の回収方法
上記の態様においては、目的の生体由来物質を含む回収されるべき生体由来試料の部分以外の領域を覆っているフォトレジストを露光することにより該領域のフォトレジストを溶媒に対して不溶化することを含む。
【００５９】
本発明のこの態様において用いるネガ型フォトレジストは、光の露光により溶媒に対して不溶化されものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、ポリケイ皮酸ビニルのような光架橋性ネガ型フォトレジスト、光重合型フォトレジスト等のネガ型フォトレジストを用いることができる。
【００６０】
フォトレジストの溶媒に対しての不溶化は、前記のポジ型フォトレジストの露光に用いた方法と同様にして光を露光することにより行うことができる。
【００６１】
また、本発明の方法において用いるネガ型フォトレジストは、有機溶媒に溶解されたもの、及びさらに水が加えられてエマルジョンとなったもののいずれも用いることができる。目的とする生体由来試料が、高濃度の有機溶媒が混入することによって不都合を生じる場合は、エマルジョン系のフォトレジストを用いることができる。
【００６２】
ネガ型フォトレジストを用いた本発明においても生体由来試料を固定するために用いる固体支持体は特に制限はされず、例えば、スライドグラスやプラスティックプレート等を用いることができる。
【００６３】
本発明の方法のこの態様においては、露光することにより溶媒に対して不溶化するフォトレジストの領域は、フォトレジストに覆われた生体由来試料を光学顕微鏡による位相差法又は微分干渉法を用いて観察することにより決定することができる。
【００６４】
また、ポジ型フォトレジストを用いた場合と同様に、蛍光染色を用いることも可能である。
【００６５】
上記の如くして、溶媒に対して不溶化する領域を決定した後、該領域を露光する。ネガ型フォトレジストの溶媒に対する不溶化に用いる光の波長は、用いるフォトレジストに応じて適宜選択することができ、さらには、特定の波長の光を照射することが包埋された生体由来試料に不都合な場合は、用いるフォトレジスト及び露光に用いる波長を適宜組み合わせて選択することにより、生体由来試料への影響を回避することができる。
【００６６】
露光によりフォトレジストを溶媒に対して不溶化した後、未露光部のフォトレジストに覆われた生体由来試料の部分を回収する。回収に用いる溶媒又は溶液は、用いるフォトレジスト及び回収目的の生体由来物質に応じて適宜選択されうる。
【００６７】
例えば、ポリケイ皮酸ビニルのような光架橋性ネガ型フォトレジストを用いた場合は、未露光部はキシレン等の有機溶媒に可溶性であるので、有機溶媒を用いて目的の生体由来物質と共に回収することが可能である。
【００６８】
上記のようにして回収された生体由来物質は、次いで、遺伝子のクローニング等の種々の目的に利用されうる。
【００６９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７０】
【実施例】
（実施例１）ポジ型フォトレジストを用いた分離方法（１）
実施例１で用いた方法を、模式的に図１に示す。
【００７１】
（１−１）フォトレジストによる細胞の固定
細胞培養用のシャーレ中に滅菌したスライドグラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ）を敷き、その上に、中心を２０ｍｍ×３０ｍｍの矩形にくり抜いた厚さ３ｍｍのシリコンラバーシートをしき、その中心部にヒト肝由来の細胞株（Ｈｕｌ−１）を播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地を加えて３７℃にて、５％ＣＯ2雰囲気下で細胞をスライドグラス上に単層に培養した。培養後、スライドグラスを取りだし、ＰＢＳ溶液でスライドグラス上の細胞を数回洗浄した後、スライドグラス上に残ったＰＢＳ溶液を、スライドグラスを傾けて、その大部分を除去し、図１ａに示すような、スライドグラス上に保持された細胞を調製した。
【００７２】
スライドグラス上にフォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ社製、ＳＰＲ６１１２）を３００μｌ添加した後、スライドグラスを９５℃で数分間加熱し、フォトレジストを固化させた。固化したフォトレジストの膜層は、約７μｍであった。このようにして、図１ｂに示すような、フォトレジスト中に包埋された細胞が調製された。この状態にて、１カ月以上保存可能であった。
【００７３】
（１−２）標的細胞の回収
得られたサンプルを蛍光顕微鏡下（ツァイス社製、モデル：アキシオプラン）に移動させ、微分干渉法により細胞を観察した。顕微鏡による観察像を図２ａに示す。写真より、２個の細胞が別々の固定されているのが判る。次いで、標的細胞を定めた。本実施例においては、細胞２個を含む領域及び細胞１個のみを含む領域をそれぞれ標的とした。写真においては、左側に観察された細胞を標的とした。
【００７４】
次いで、図１ｃに示すように、標的細胞を含む標的部分をカバーするように、高圧水銀ランプを用いて、波長４４０ｎｍの光を約１０秒間照射した。
【００７５】
光の照射後、図１ｄに示すように、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液にＴｗｅｅｎ２０を０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加した溶液を、照射部分に約１０μｌ添加し、常温にて８〜１０分間放置してフォトレジストの溶解（現像）を行った。現像終了後、図１ｅに示すように、目的以外のフォトレジスト部を破壊するのを防ぐために先端の柔らかいピペットチップを用いて、溶解されフォトレジストを標的細胞の全成分と共に回収した。回収後のサンプルを再び蛍光顕微鏡下で観察した。顕微鏡による観察像を図２ｂに示す。写真より、標的とした細胞のみがきれいに回収されていることが判る。
【００７６】
上記の操作を、細胞２個を標的とした場合、及び細胞１個を標的とした場合のそれぞれについて行った。
【００７７】
（１−３）回収した細胞からのＤＮＡの抽出及びＤＮＡの増幅
以下の操作は、細胞２個を標的とした回収液、及び細胞１個を標的とした回収液のそれぞれについて別々に行った。
【００７８】
操作（１−２）により回収した溶液中には、水酸化ナトリウムや短鎖のフェノール樹脂が存在している。これらの物質は、ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲ法を行う際に用いる酵素の活性を阻害するので、エタノール沈殿法を用いて溶媒の交換を行った。具体的には、回収液と等容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を回収液に加えた後、回収液の約６倍量の冷エタノール（−２０℃に冷却したエタノール）を加え、混合した。次いで、混合液を−２０℃のフリーザー中で数時間冷却した後、マイクロチューブ用遠心分離機で、０℃にて１時間遠心分離を行いＤＮＡを沈殿させた。次いで、７０％エタノールでマイクロチューブの壁面及び沈殿表面等を洗浄した後、風乾してエタノールを蒸発させ、ＤＮＡを得た。
【００７９】
上記操作により得たＤＮＡに対してヒトのベータグロブリン特異的プライマー（プライマー１：5'ーＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣー3'、プライマー２：5'ーＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧー3'）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法の反応条件は、標準的な条件（９４℃、５分間＋４１℃、２分間＋７２℃、３分間、次いで（９４℃、１分間  ＋  ５３℃、５分間  ＋  ７２℃、３分間）を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で３分間反応させた）用いた。。対照として、ＨｕＬ−１細胞より抽出したゲノムＤＮＡに対して同じプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を得た。得られた産物を及び対照のＤＮＡ断片を、２．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動の結果を図３に示す。レーン１には、分子量マーカーとして、φＸ１７４をＨａｅIIIで消化したものを泳動した。また、レーン２が対照であり、レーン３が本実施例により得られたＤＮＡ産物である。図３より、本発明の方法により特定の細胞のみを回収することができ、かつ回収された細胞からＤＮＡを得、次いでそのＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅できることが判った。
さらに、上記の操作により得たＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法に用いる特異的プライマーを適宜選択することにより、目的のＤＮＡの増幅が可能であり、増幅されたＤＮＡを用いて遺伝子診断が可能である。
【００８０】
（実施例２）両性フォトレジストを用いた分離方法
（２−１）フォトレジストによる細胞の固定
実施例１の１−１と同様にして、スライドグラス上に単層に培養された細胞を調製した。なお、実施例１で用いたＳＰＲ６１１２は、両性フォトレジストでもある。
【００８１】
スライドグラス上にフォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ社製、ＳＰＲ６１１２）を３００μｌ添加した後、スライドグラスを９５℃で数分間加熱し、フォトレジストを固化させた。固化したフォトレジストの膜層は、約７μｍであった。この状態にて、１カ月以上保存可能であった。
【００８２】
（２−２）標的細胞の回収
得られたサンプルを蛍光顕微鏡下（ツァイス社製、モデル：アキシオプラン）に移動させ、微分干渉法により細胞を観察し、標的細胞を定めた。
【００８３】
次いで、標的細胞を含む部分に、高圧水銀ランプを用いて、波長４４０ｎｍの光を約１０秒間照射した。
【００８４】
光の照射後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液にＴｗｅｅｎ２０を０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加した溶液中に、スライドガラスを漬け、常温にて８〜１０分間放置してフォトレジストの溶解（現像）を行い、未照射部分を除去した。
【００８５】
残った部分に、１０μｌのキシレンを添加し、フォトレジストを溶解し、標的細胞を回収した。
【００８６】
（２−３）回収した細胞からのＤＮＡの抽出及びＤＮＡの増幅
実施例１の（１−３）と同様にして、ＤＮＡを回収し、ＰＣＲ法を用いて増幅した後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した。その結果、実施例１と同様なＰＣＲ産物が確認された。
【００８７】
（実施例３）ネガ型フォトレジストを用いた分離方法
（３−１）標的細胞の回収
実施例１の１−１と同様にして、スライドグラス上に単層に培養された細胞を調製した。
【００８８】
スライドグラス上にフォトレジスト（東京応化社製、モデルＯＭＲ８５）を３００μｌ添加した。
【００８９】
フォトレジストに覆われた細胞を蛍光顕微鏡下（ツァイス社製、モデル：アキシオプラン）に移動させ、微分干渉法により細胞を観察し、標的細胞を定めた。
【００９０】
次いで、標的細胞を含まない部分に、高圧水銀ランプを用いて、波長４４０ｎｍの光を約１０秒間照射し、フォトレジストの溶媒に対する不溶化処理を行った。
【００９１】
未照射のフォトレジスト部分に、１０μｌのキシレンを添加し、フォトレジストを溶解し、標的細胞を回収した。
【００９２】
（３−２）回収した細胞からのＤＮＡの抽出及びＤＮＡの増幅
実施例１の（１−３）と同様にして、ＤＮＡを回収し、ＰＣＲ法を用いて増幅した後、得られたＰＣＲ産物を電位泳動した。その結果、実施例１と同様なＰＣＲ産物が確認された。
【００９３】
（実施例４）ポジ型フォトレジストを用いた分離方法（２）−浮遊細胞に対する検討
培養シャーレ中にて、マウス由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ（１０％ウシ血清添加）培地中で、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。次いで、細胞にトリプシン処理を行い浮遊細胞を調製した。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞数が５×１０5個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液１０μｌを、９０μｌのポジ型フォトレジスト液（Ｓｈｉｐｌｅｙ社製、ＳＰＲ６１１２）に添加し、軽くピペティングして混和した。その後、スライドグラス上に添加して、スライドグラスを傾けることによりこの混和液を展開した。４５℃、３０分間の温度処理により、フォトレジストの成膜化を行った。実施例１と同様にして、蛍光顕微鏡下で、細胞５０個を標的として得られた試料に４４０ｎｍの光を照射した。照射後、照射部分に１０μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨと２０％のＴｗｅｅｎ２０からなる溶液を加えて常温で７分間放置し、レジストを溶解した。溶解した液をピペットで回収した。回収液に１７μｌの蒸留水を加え、さらに、３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム液（ｐＨ５．２）を加えた。それに更に、７５μｌの冷エタノールを加え良く攪拌した。得られた溶液を、−２０℃の冷蔵庫で１時間放置した後、マイクロチューブ用遠心機にて、１５０００ｒｐｍで１時間遠心を行い沈殿物を回収した。沈殿物を７０％エタノールで１回洗浄した後、風乾した。得られた沈殿物にプロテアーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように加え、最終容積２０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液を調製した。得られた溶液を５５℃で１時間反応させて、系中に存在する蛋白質を消化した。反応終了後、９５℃で１０分間加温することにより酵素を失活させた。得られたＤＮＡ溶液に対し、ｐ５３に特異的なプライマー（プライマー１：5'-ＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡ-3'、プライマー２：5'-ＡＡＡＧＡＴＡＧＧＴＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＴ-3'）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を用い、反応液組成は、添付のプロトコルに従った。温度条件は、９５℃、５分間＋５９℃、５分間、次いで（７２℃、１．５分間＋９４℃、４５秒＋５９℃、１分間）を３０サイクル行い、最後に７２℃、１０分間で反応を行った。対照として、PCR PROTOCOLS, M.A. Innisら編, Academic Press (1990) p146-152に従い、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞より抽出したゲノムＤＮＡに対して同じプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を得た。得られた産物を及び対照のＤＮＡ断片を、２．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動の結果を図４に示す。レーン１には、分子量マーカーとして、φＸ１７４をＨａｅIIIで消化したものを泳動した。また、レーン２が対照であり、レーン３が本実施例により得られたＤＮＡ産物である。図４より、本発明の方法により特定の細胞のみを回収することができ、かつ回収された細胞からＤＮＡを得、次いでそのＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅できることが判った。
上記の実施例において、ＰＣＲ法の代わりにＲＴ−ＰＣＲ法を用いることにより、ｍＲＮＡの回収及び増幅が可能である。
【００９４】
また、露光をレーザー光を用いることにより染色体の特定の位置のみを覆っているフォトレジストのみを露光できるので、染色体の位置特異的な領域のＤＮＡのみを回収・増幅することが可能である。
【００９５】
【発明の効果】
本発明の方法は、簡便な操作にて、選択的に、特定の細胞、組織又は生体高分子等の生体由来物質、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ、蛋白質等を、その周辺部からの不純物混入が少ない状態にて分離できるので有用である。
【００９６】
また、本発明の方法により回収されたＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体由来物質は、遺伝子のクローニング、ｃＤＮＡライブラリーの作成、遺伝子診断、アミノ酸シークエンス等に利用可能であるので有用である。
【００９７】
さらに、本発明のフォトレジストの包埋された生体由来試料は、保存が可能であるので有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の工程を、概略的に示した図である。
【図２】図２ａは、フォトレジストに固定化された状態の細胞の顕微鏡写真であり、図２ｂは、標的細胞を回収した後の状態の顕微鏡写真である。図中のスケールは２０μｍを示す。
【図３】実施例１で得られた、ヒトのベータグロブリン特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物の電気泳動写真である。レーン１は、分子量マーカー（φＸ１７４／ＨａｅIII）であり、レーン２は、対照であり、レーン３は、細胞１個を標的とした場合の結果であり、レーン４は、細胞２個を標的とした場合の結果である。
【図４】実施例４で得られた、ｐ５３特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物の電気泳動写真である。レーン１は、分子量マーカー（φＸ１７４／ＨａｅIII）であり、レーン２は、対照であり、レーン３は、細胞５０個を標的とした場合の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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