(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列におけるＮ末端２０番目のロイシン残基から３４４番目のロイシン残基までの一次配列を有するインターロイキン−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質が配列番号２のリンカー配列を介して融合した融合蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母。
【請求項２】
請求項１の酵母を培養し、培養物から天然配列におけるＮ末端２０番目のロイシン残基から３４４番目のロイシン残基までの一次配列を有するインターロイキン−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質が配列番号２のリンカー配列を介して融合した融合蛋白質を分離することを特徴とする、当該融合蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス種の酵母、及び、該酵母を培養することからなる、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質の製造方法に関するものである（以下、本明細書では、ＩＬ−６レセプターを単にＩＬ−６Ｒと略する）。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６（インターロイキンー６）の標的細胞膜上に発現するレセプター蛋白質として発見された（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、８２５、１９８８年）。ＩＬ−６Ｒは、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域からなるが、膜貫通領域及び細胞内領域を欠失したリコンビナント可溶性ＩＬ−６Ｒであっても、細胞膜上に発現したＩＬ−６Ｒ同様に、ＩＬ−６と結合した後標的細胞膜上に発現したｇｐ１３０蛋白質と結合してＩＬ−６の刺激を伝達することが明らかになっている（Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ、５８巻、５７３頁、１９８９年；Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８巻、６７３頁、１９９０年）。
【０００３】
ＩＬ−６は重要な働きを担うサイトカインであるが、ＩＬ−６Ｒを全く発現しないか又は少量しか発現しない標的細胞にその刺激を伝達するためには、ＩＬ−６のみならず可溶性ＩＬ−６Ｒ（細胞外領域のみからなるＩＬ−６Ｒ）を共存させる必要がある。
【０００４】
ＩＬ−６Ｒの細胞外領域の薬効が種々調査されてきたが、これまで報告されたものの中でも、骨髄幹細胞増幅効果と血小板増多効果は、特に医薬品としての用途開発が期待される薬効である（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、ｐ２８５９、１９９５年、中畑ら、特願平８−３１６６４９号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子工学的手法を用いることにより、天然ではそれぞれ別の蛋白質として存在する２種類の蛋白質を、１本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質として発現させることが可能となる。例えば、天然では別の蛋白質として存在する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を融合蛋白質として発現させる例が報告されている（Ｈｏｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、ｐ５８７９、１９８８年）。
【０００６】
前記のように、それぞれ別の蛋白質として存在するが、両者が結合して生理活性を発現するような２種類の蛋白質については、融合蛋白質として発現させると、解離が起こりにくいため、当該生理活性を安定的に発揮し易いという利点がある。そして、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６も、両者が結合した後にｇｐ１３０蛋白質と結合することから、これらを融合蛋白質として発現させることにより、前記と同様の効果が期待される。
【０００７】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質についても既に報告（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５、ｐ１４２、１９９７年）があり、この結果、配列番号１のような、適当なリンカー配列を利用することにより、両者を結合し得ることが知られるようになった。なおこの報告では、リンカー配列を介して結合されたＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質は、可溶性ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を共存させた場合に比較して、１０００倍近い生理活性を有するとされている。
【０００８】
ところで、ヒトＩＬ−６Ｒでは、Ｎ末端１番目のメチオニン残基から１９番目のアラニン残基までがシグナル領域、２０番目のロイシン残基から３５８番目までが細胞外領域、３５９番目のセリン残基から３８６番目のアスパラギン残基までが膜貫通領域、そして、３８７番目のアルギニン残基から４６８番目のアルギニン残基までが細胞内領域と考えられている。そして、細胞外領域は更にイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域からなり、前者はＮ末端２０番目のロイシン残基から１１１番目のアスパラギン酸残基まで、後者は１１２番目のバリン残基から３２３番目のアラニン残基と考えられている（Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２，ｐ１７０５、１９９３年）。そして、ＩＬ−６Ｒの細胞外領域のうち、ＩＬ−６との結合に必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。
【０００９】
これまでに、リコンビナント可溶性ＩＬ−６Ｒを製造する方法として、動物細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）やサルの腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）を用いた方法やピキア・パストリス種の酵母を用いた方法が報告されている。これらの方法で製造されたＩＬ−６Ｒは、いずれもＩＬ−６と結合し得ることが報告されており（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８，ｐ６７３、１９９０年、Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ．Ｊ．、１２、１７０５、１９９３年）、前記報告と併せれば、動物細胞を用いることで、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質を発現し得ることが理解できる。
【００１０】
しかし、これら報告では、発現されたリコンビナント可溶性ＩＬ−６ＲはＩＬ−６と結合する性質を保持していたものの（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、１０８巻、６７３頁、１９９０年；Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻、１７０５頁、１９９３年）、ＩＬ−６との融合蛋白質ではなかった。しかも、ピキア・パストリス種の酵母を宿主細胞として用いた報告では、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有する可溶性ＩＬ−６Ｒは発現しないとされている（Ｖｏｌｌｍｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ、１９９巻、４７頁、１９９６年）。この理由については、ピキア・パストリス種の酵母で、イムノグロブリン様領域を含むＩＬ−６Ｒを発現させると、イムノグロブリン様領域への糖鎖の付加の様式が、動物細胞の糖鎖の付加の様式とは異なるため、ＩＬ−６Ｒ分子全体が本来の高次構造をとれなくなるためと考えられる。また別の理由として、ピキア・パストリス種の酵母でイムノグロブリン様領域を含むＩＬ−６Ｒを発現させるときに選択し、発現対象としたＩＬ−６Ｒのアミノ酸配列、シグナルペプチドの種類又はその３’末端側の遺伝子配列等が不適当であった可能性もある。
【００１１】
また更には、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質に関する前記報告では、両者をリンカー配列を介して結合させていることから、これを医薬品等として人体に投与する場合に、当該リンカー配列の抗原性等の問題が生じる恐れがある。
【００１２】
そこで本発明の目的は、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母を提供することにある。なお該酵母は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母であり、ＣＨＯ細胞のような動物細胞と比較して経済的に培養できるという利点を有するものである。
【００１３】
また本発明の他の目的は、かかる酵母を培養し、培養物からサイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質を分離することを特徴とする、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質の製造方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために成された本発明は、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母である。
【００１５】
また本発明は、前記形質転換された酵母を培養し、培養物からサイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質を分離することを特徴とする、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６レセプター蛋白質とＩＬ−６蛋白質の融合蛋白質の製造方法である。以下、ヒトＩＬ−６ＲとヒトＩＬ−６の融合蛋白質について本発明を詳細に説明するが、ＩＬ−６ＲやＩＬ−６はヒト以外の哺乳動物にも存在し、その一次構造はマウス等では既に報告されている。従って、本発明をヒト以外の哺乳動物に由来するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の製造に適用する場合にも、以下の説明を参考とすることにより、遺伝子の配列や遺伝子を発現するための配列を適宜変更・選択することで、容易に本発明と同等の効果を達成することが可能となる。
【００１６】
ヒトＩＬ−６Ｒでは、イムノグロブリン様領域はＮ末端２０番目のロイシン残基から１１１番目のアスパラギン酸残基までであり、サイトカインレセプター領域はＮ末端１１２番目のバリン残基から３２３番目のアラニン残基までである。本発明では、サイトカインレセプター域のみを有するＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子、又は、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子のいずれを使用しても良い。
【００１７】
より具体的には、例えば前者であればＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリン残基から３２３番目のアラニン酸残基までをコードする塩基配列を含んでいれば良い。また例えば後者であれば、ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３２３番目のアラニン残基までをコードする塩基配列を含んでいれば良い。いずれの場合にもその５’側には、前記以外に、例えばＩＬ−６ＲのＮ末端１番目から１９番目のアミノ酸残基をコードする部分等があっても良いが、３’側にはＩＬ−６Ｒの膜貫通領域に構成するアミノ酸残基をコードする部分を多く含まないことが好ましい。具体的な例として、後の実施例に示すように、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４４番目のロイシン残基までをコードする遺伝子を用いることを例示できる。ＩＬ−６ＲのＮ末端何番目までのアミノ酸残基を発現させるかについては、例えばＹａｗａｔａらの報告（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻、１７０５頁、１９９３年）を参照して適宜決定することができる。
【００１８】
前記以外に、ＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子は、サイトカインレセプター領域やイムノグロブリン様領域を構成するアミノ酸残基の全てを有している必要はなく、その一部が欠失していたり、他のアミノ酸残基が付加されていたり、他のアミノ酸残基で置換されていても良い。例えば、両領域を有する遺伝子においては、ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３２３番目のアラニン残基までの全てのアミノ酸残基を有する必要はなく、その一部が欠失していたり、他のアミノ酸残基が付加されていたり、他のアミノ酸残基で置換されていても良い。しかしながら、欠失や置換等を生じさせることにより、ＩＬ−６Ｒ本来のＩＬ−６との結合能が影響を受ける恐れがある場合には、当該領域の全て、例えば両領域を有するＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子として、ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３２３番目のアラニン残基までの全てのアミノ酸残基を正確にコードする遺伝子を用いることが好ましい。
【００１９】
前記遺伝子の５’末端、即ち発現されるＩＬ−６ＲのＮ末端の上流側には、ＩＬ−６Ｒ以外の蛋白質等をコードする塩基配列を追加することができる。例えば発現したＩＬ−６Ｒを細胞外に分泌させる働きを有するシグナルペプチドをコードする遺伝子を追加することが例示できる。シグナルペプチドとしては特に制限されないが、前記したＩＬ−６Ｒ本来のシグナルペプチドのほか、発現量の高いα因子のシグナルペプチドが特に好ましく例示できる。
【００２０】
ＩＬ−６との結合性のみであれば、サイトカインレセプター領域を有するＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子を使用すれば良いが、本発明により種々の融合蛋白質が提供されれば、将来、医薬品として有効なものをこれらの中から選択することが可能となる。血液や尿中に可溶性ＩＬ−６Ｒが存在することが報告されているが、これらは細胞膜に結合したＩＬ−６Ｒがプロテアーゼの作用を受けて切断され、可溶化したもので、サイトカインレセプター領域に加えてイムノグロブリン様領域も含んでいる。従って、本発明により提供される、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質は、より抗原性が低く、安定性が高いことが予想される等、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質に比較して好ましいことが予想される。更に加えれば、後の実施例でも示したように、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質は、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質に比較してピキア・パストリス種の酵母における発現量が高い、という、付加的な効果も達成される。
【００２１】
ＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子の３’側に接続されるＩＬ−６遺伝子は、活性を発現し得るＩＬ−６をコードする遺伝子であれば特に制限はないが、例えば、後の実施例に示したように、Ｎ末端２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニン残基までをコードする遺伝子を例示できる。
【００２２】
ＩＬ−６Ｒ遺伝子とＩＬ−６遺伝子は、リンカーとなるアミノ酸配列をコードする遺伝子を介して結合しても良いが、抗原性を低減するという効果を達成するため、これらを直接に結合することが特に好ましい。即ち、ＩＬ−６Ｒの末端をコードする遺伝子の３’側に、ＩＬ−６をコードする遺伝子を結合させるのである。本発明者らの知見によれば、両者を直接結合させても、溶液中でのＩＬ−６ＲとＩＬ−６の動きが制限され、結合し得なくなるという事態は生じない。
【００２３】
本発明のＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質をコードする好ましい遺伝子として、具体的に、ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３２３番目のアラニン残基までをコードする遺伝子の３’側にＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニン残基までをコードする遺伝子を結合させたもの、 ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３３３番目のアラニン残基までをコードする遺伝子の３’側にＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニン残基までをコードする遺伝子を結合させたもの、そして、 ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３４４番目のロイシン残基までをコードする遺伝子の３’側にＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニン残基までをコードする遺伝子を結合させたもの、を例示できる。
【００２４】
前記遺伝子の３’末端、即ち発現されるＩＬ−６のＣ末端をコードする塩基の下流側には、ターミネータ等を配置して、当該部分でｍＲＮＡへの転写が終了するようにする。
【００２５】
結合された、ＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子とＩＬ−６をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、該遺伝子を導入し、ピキア・パストリス種の酵母を形質転換し、該酵母中で増殖し、かつ、該酵母中で前記遺伝子を発現せしめることが可能なものであれば特に制限はない。好ましくは、形質転換酵母を選択可能とする指標となる遺伝子を有していると良い。前記遺伝子を導入するためにはアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列を有していることが好ましく例示でき、形質転換酵母の選択のための指標としてはヒスチジン合成遺伝子を有していることが好ましく例示でき、前記遺伝子を発現せしめるためにはアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列を有することが好ましく例示できる。このような好ましい発現ベクターの一例として、市販のベクター（ｐＰＩＣ９、インビトロジェン社製）を例示することができる。
【００２６】
形質転換操作は、通常の方法に従うことができる。操作を終えた酵母は、ヒスチジン合成遺伝子の働き等を指標として形質転換されたものとそうでないものを分けた後、培養することによりＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質を発現することが可能となる。形質転換されたピキア・パストリス種の酵母を培養する操作は、ジャーファーメンターを用いる通常の操作のほか、本出願人による特許出願（特願平９−３５９８３８号、特願平１０−１４７８号）に記載された方法を採用することができる。培養操作を継続する中で、発現用ベクター中の遺伝子が発現し、培養液中にＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質が蓄積される。培養液から発現された融合蛋白質を取得するには、通常の蛋白質の分離・精製方法を適用すれば良いが、処理能力の高さや操作に要する時間が短いという利点を有することから、ゲル濾過、疎水クロマト等の複数種の液体クロマトグラフィー操作を組み合わせることが特に好ましい（特願平９−３２３１９５号）。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例  １
５’末端から順に、ＩＬ−６ＲのＮ末端２０番目のロイシン残基から３４４番目のロイシン残基までの合計３２５アミノ酸残基をコードする遺伝子、配列番号２の５アミノ酸残基からなるリンカー配列をコードする遺伝子、そしてＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニン残基から２１２番目のメチオニン残基までの合計１８５アミノ酸残基をコードする遺伝子、を含む発現プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６を以下のようにして調製した。
【００２９】
プライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌ（配列番号３）とプライマーＰ３４４ＦＵＦ（配列番号４）を用いて、ＩＬ−６ＲのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをＸｂａＩで切断した後、予めＸｈｏＩ切断し、末端をクレノウフラグメントで平滑化し、更にＡｖｒＩＩで切断したピキア・パストリス種の酵母用の市販の発現プラスミド（ｐＰＩＣ９、インビトロジェン社製）に挿入し、プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬＦＵを得た。
【００３０】
次に、プライマーｐＩＬ６Ｂ（配列番号５）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列番号６）を用いて、ＩＬ−６のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断した後、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬＦＵに挿入して、ＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子とＩＬ−６をコードする遺伝子が配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を介して結合した遺伝子を含む、発現プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６を得た。得られたｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６の構造を図１に示す。なお、得られたｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６中の、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を含む融合蛋白質のアミノ酸一次構造及びこれをコードする遺伝子は配列番号７に記載した通りである。配列番号７において、５’末端の９７６番目のＴから９９０番目のＴが前記リンカー配列をコードする遺伝子である（Ｎ末端の３２６番目から３３０番目）。
【００３１】
実施例  2
市販のピキア・パストリス種の酵母（ＧＳ１１５株、インビトロジェン社）から、通常の方法（Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻、３３７６頁、１９８５年；特開平２−１０４９２０号）に従ってスフェロプラストを調製し、ＢｇｌＩＩによって線状化したｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６を用いてこれを形質転換した。
【００３２】
まずＧＳ１１５株を３０℃条件下、ＹＰＤ培地５０ｍｌ中でＯＤ６００が１になるまで振とう培養した後、集菌し、スフェロプラストを作製し、ｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６を導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選択した。
【００３３】
選択した形質転換菌を、３０℃条件下、試験管に入れた３ｍｌの、５％のメタノールを含むＢＭＧＹ培地（１％（w／v）酵母エキス、２％（w／v）ペプトン、１％（w／v）グリセロール、１．３４％（w／v）ＹＮＢ  ｗｏ  ＡＡ（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））中で９６から１２０時間培養後、上清を集めた。
【００３４】
実施例  3
ＢＡＦ１３０細胞を用いた生物活性評価法により、実施例２における形質転換酵母４種のクローンの培養上清と、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質をコードする発現プラスミド（ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６、特願平１０−２９２１号参照）で形質転換された４種の酵母のクローンの培養上清中の融合蛋白質の活性を測定した。ＢＡＦ１３０細胞は、本来ヒトｇｐ１３０蛋白質を発現していないマウス細胞ＢＡＦにヒトｇｐ１３０蛋白質をコードする遣伝子を導入して形質転換させ、当該蛋白質を発現させた細胞であり、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの共存下で増殖する性質を有する細胞である（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、６３巻、１５４頁、１９８９年）。
【００３５】
ＢＡＦ１３０細胞の懸濁液を、９６穴プレートに２×１０4細胞／穴となるように加え、各種濃度に希釈した培養上清をそれぞれ添加した。２日後、ＢＡＦ１３０細胞の増殖を、市販の試薬キット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、和光純薬工業製）を用いて調べた。
【００３６】
結果を図２に示す。図２から明らかなように、ｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６で形質転換されたピキア・パストリス種の酵母の培養上清中の融合蛋白質は、ｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６で形質転換された酵母の培養上清中の融合蛋白質に比較して、より強いＢＡＦ１３０細胞増殖効果が観察された。これは、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質が、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質に比較して同等以上に機能すること、及び、両領域を有するＩＬ−６Ｒを含む融合蛋白質が、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６Ｒ含む融合蛋白質よりもピキア・パストリス種の酵母において発現量が高いことを示唆している。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６が直接又はリンカー配列を介して結合された遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されたピキア・パストリス種の酵母と、該酵母を培養することによるＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質の製造方法が提供される。
【００３８】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６は、両者が結合して初めてｇｐ１３０蛋白質と結合し得るものであるため、両者を融合蛋白質として発現させることで、解離が起こり難くし、生理活性を安定的に発揮させることが可能となる。特にＩＬ−６ＲとＩＬ−６を直接結合した融合蛋白質では、医薬品等として人体に投与する場合に、当該リンカー配列の抗原性等の問題が生じる恐れが小さいという効果もある。
【００３９】
また本発明において、イムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質をコード遺伝子を用いる場合には、サイトカインレセプター領域のみを有するＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合に比較して、形質転換酵母における融合蛋白質の発現量を高めるという効果を達成することもできる。このイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域の両方を有するＩＬ−６Ｒ部分は、血液や尿中に存在する可溶性ＩＬ−６Ｒと同様の領域を有している。従って、かかる融合蛋白質においては、イムノグロブリン様領域を有していないＩＬ−６Ｒ部分を有する融合蛋白質に比較して、より抗原性が低く、かつ、安定性が高い、という効果が予想される。
【００４０】
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で調製した発現ベクターｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６の構造を示す図である。図中ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、３’ＡＯＸ１はアルコールオキシダーゼ遺伝子の下流配列を、ＨＩＳ４はヒスチジン合成遺伝子を、３’ＡＯＸＴＴはターミネーターを、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子を、Ｓはシグナル配列をコードする遺伝子を、そして５’ＡＯＸ１はプロモーター配列を含むアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流配列をそれぞれ示す。
【図２】図２は、実施例３の結果を示す図であり、参照波長を６００ｎｍとしたときの４０５ｎｍの吸光度を示すものである。図中、白丸、白四角、白三角及び白菱形は、発現プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ２０ＬＬ６で形質転換された任意の４種のクローンについての、黒丸、黒四角、黒三角及び黒菱形は、プラスミドｐＰＩＣ９−Ａ１１６ＥＬ６で形質転換された任意の４種のクローンについての、培養上清中の融合蛋白質によるＢＡＦ１３０の増殖効果の結果を示すものである。
【図１】
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【図２】
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