(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する４（Ｒ）−ヒドロキシ-２-ケトグルタル酸アルドラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡが、バチルス属に属する微生物由来のＤＮＡである請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
バチルス属に属する微生物が、バチルス  エスピーＯＣ１８７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４６）である請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２または３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、該ＤＮＡと９５％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する４（Ｒ）−ヒドロキシ-２-ケトグルタル酸アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
組換え体ＤＮＡが、以下の（１）〜（４）から選ばれる組換え体ＤＮＡである請求項７記載の組換え体ＤＮＡ。
（１）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４６から得られる下記の制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片中の配列番号２で表される塩基配列を含むＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片をｐＳＴＶ２９のＰｓｔＩ−ＳａｌＩサイト間に挿入して得られるｐＫＳＲ２２２
【化１】
0004047958.tif 000017
（２）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５１が保有するｐＫＳＲ３０３
（３）下記の構造を有するｐＫＳＲ３２１
【化２】
0004047958.tif 000018
（４）下記の構造を有するｐＫＳＲ８０３
【化３】
0004047958.tif 000019
【請求項９】
請求項７または８記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１０】
宿主細胞が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、クレブシエラ属またはセラチア属に属する微生物である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
エシェリヒア属に属する微生物が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５１で寄託されたエシェリヒア・コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３である請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項９、１０または１１記載の形質転換体を培地中で培養し、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸アルドラーゼを生成蓄積させ、該培養物より該４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸アルドラーゼを採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸アルドラーゼの製造法。
【請求項１３】
請求項９、１０または１１記載の形質転換体由来であり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成させ、生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法。
【請求項１４】
形質転換体が、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体である請求項１３記載の製造法。
【請求項１５】
ピルビン酸が、請求項１３または１４記載の形質転換体によりピルビン酸に転換することのできる化合物から、該形質転換体により転換されたピルビン酸である請求項１３記載の製造法。
【請求項１６】
ピルビン酸に転換することのできる化合物が、グルコース、フラクトース、マルトース、グリセロール、乳酸または乳酸アンモニウムである請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
請求項９、１０または１１記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミン酸の製造法。
【請求項１８】
形質転換体が、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体である請求項１７記載の製造法。
【請求項１９】
プロリンアナログに対して耐性を有する請求項９、１０または１１記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成させ、生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体中より採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項２０】
形質転換体が、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体である請求項１９記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔以下、４（Ｒ）ＫＨＧと略す〕、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸〔以下、４（Ｒ）ＨＧと略す〕または４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン〔以下、４（Ｒ）ＨＹＰと略す〕の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピルビン酸とグリオキシル酸とから４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ（以下、ＫＡＬと略称す）活性はいくつかの生物に存在することが報告されているが、いずれも４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみならず４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をも同時に生成し、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを特異的に生成する４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔以下、４（Ｒ）ＫＡＬと略す〕は知られていない〔Methods in Enzymology 41 partB, 115, E.E.Dekker & U. Maitra、J. Biol. Chem., 257, 5079 (1972)〕。
【０００３】
４（Ｒ）ＫＨＧの製造法として、エリスロ−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミノする方法（Methods in Enzymology, 17 partB, 275）、オキサロ酢酸とグリオキシル酸から合成したラセミ-4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸から４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を分解除去する方法〔J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1085(1992)〕、ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性を有する生体触媒を、ピルビン酸もしくは該生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル酸に作用させる方法（特開平７−２８９２８４）などが知られている。
【０００４】
前２者の製法は原料が高価であったり、収量が低いため実用的ではない。後者の製法は実用可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれている。
４（Ｒ）ＨＧの製造法としては、化学合成したＤＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸にアンモニアとＮＡＤＰＨ存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４（Ｒ）４（Ｓ）ラセミ体の４−ヒドロキシグルタミン酸をイオン交換クロマトで分割する方法（Methods in Enzymology,17 partB,277）やアミノ基供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＨＧを生成する活性を有する生体触媒をピルビン酸もしくは該生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル酸に作用させる方法(特開平８−８０１９８)などが知られている。
【０００５】
前者の製法は高価な原料と光学分割操作を必要とするために実用に供しがたい。後者の製法は実用可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれている。
４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては、コラーゲン加水分解物より分離精製する方法の他、クロノスタキス属、グリオクラディウム属またはネクトリア属に属する微生物を培養しその培養物中より抽出する方法(特開平５−２３６９８０)、4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸を4-ヒドロキシ-L-プロリンに転換する活性を有する微生物を4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸に作用させる方法(特開平３−２６６９９５)などが知られている。しかしいずれの方法も原料あるいは分離精製に費やすコストが高く、優れた製法とは言い難い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、医薬品などの合成原料として有用である４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧおよび４（Ｒ）ＨＹＰを、工業的に有利に製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔４（Ｒ）ＫＡＬ〕、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００８】
また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬとして、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素であればいずれも用いることができ、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドをあげることができる。
【００１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、Science, 224, 1431 (1984)、PCT WO85／00817(1985) 、Nature, 316, 601 (1985) 、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of Cloned ＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡとして、上記本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡをあげることができ、例えば、配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
【００１２】
本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１３】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、１９８９年刊、以下、モレキュラー・クローニング  第２版と略す〕等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２および３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１４】
本発明のＤＮＡは、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物より取得することができる。  該微生物として、例えばバチルス属に属する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス  エスピーＯＣ１８７株をあげることができる。バチルス  エスピーＯＣ１８７株は本発明者らにより土壌より分離された菌株であって、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４６として寄託されている。
【００１５】
以下に、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物より４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡを取得する方法を記す。
グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物から、通常のＤＮＡ単離法、例えばフェノール法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し該制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組込むことにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築する。このＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体について、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を測定する。親株よりも該活性の増強された形質転換体より目的とする遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００１６】
この一連の操作は、公知のin vitro組換え技法（モレキュラー・クローニング第２版）に準じて行うことができる。
グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーを構築するベクターＤＮＡとしては、大腸菌Ｋ１２株において自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクターなどいずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）, 17, 9494 (1989)〕、λｚａｐ II（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ クローニン グ、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning, A Practical Approach ）, 1, 49 (1985)〕、Lambda BlueMid（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ （ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）, 3, 280 (1983)〕、ｐＵＣ１８ 〔ジーン（Gene）, 33, 103 (1985)〕、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）等をあげることができる。
【００１７】
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli C600〔ジェネティックス（Genetics）、39, 440 (1954)〕、Escherichia coli Y1088〔Science, 222, 778 (1983)〕 、Escherichia coli Y1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、Escherichia coli NM522 〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、166, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、Escherichia coli JM105、Escherichia coli ATCC33625等が用いられる。
【００１８】
４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１９】
このようにして決定された４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号２に示された塩基配列をあげることができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
【００２０】
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡより４（Ｒ）ＫＡＬを宿主細胞中で発現させるために、モレキュラー・クローニング  第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー  サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを発現する形質転換体を得ることができる。
【００２１】
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡの発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔Escherichia coli JM109/pTrS30 （ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Escherichia coli JM109/pTrS32（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Escherichia coli IGHA2（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製〕、ｐＧＫＡ２〔Escherichia coli IGKA2（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社）、ｐＥＴシステム（Novagen社）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＣＧ１、ｐＣＳ１１６（特開平６−２７７０８２）等を例示することができる 。
【００２３】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーター、T7プロモーター、PletIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００２４】
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡは４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡであればいずれも用いることができるが、該ＤＮＡの塩基配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの具体例として、配列番号３で示される塩基配列等をあげることができる。
【００２５】
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＫＳＲ２２２、ｐＫＳＲ３０３、ｐＫＳＲ３２１、ｐＫＳＲ８０３等があげられる。ｐＫＳＲ３０３を含む大腸菌であるEscherichia coli NHK46/pKSR303は、平成９年８月１２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５１として寄託されている。
【００２６】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、クレブシエラ属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue 、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485 、Escherichia coli JM109 、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49 、Escherichia coli W3110 、Escherichia coli NY49、Escherichia coli ATCC33625、Escherichia coli ATCC11303、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Klebsiela oxytoca ATCC8724、Serratia marsecens ATCC13880等をあげることができる。
【００２７】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を用いることができる。
【００２８】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター 、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００２９】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
【００３０】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
【００３１】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979 ；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェ ン社製）ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等が用いられる。
【００３２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００３３】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン 酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００３４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント1-３４、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、４（Ｒ）ＫＡＬを発現することができる。
【００３５】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、４（Ｒ）ＫＡＬを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３  、ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００３６】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・ エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trichoplusia ni の卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００３７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等をおこなうことができる。
【００３８】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを製造することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４０】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１０〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００４１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、EagleのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
【００４３】
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５ 〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製〕等を用いることができる。
【００４４】
培養温度は２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜４日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現させた４（Ｒ）ＫＡＬを単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００４５】
例えば、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４６】
また、該４（Ｒ）ＫＡＬが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該４（Ｒ）ＫＡＬを回収後、該４（Ｒ）ＫＡＬの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度が４（Ｒ）ＫＡＬが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該４（Ｒ）ＫＡＬを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００４７】
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該４（Ｒ）ＫＡＬを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４８】
また、上記方法により発現させた４（Ｒ）ＫＡＬを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（米国Advanced ChemTech社製）、パーキンエルマー ジャパン（米国Perkin-Elmer社製）、ファルマシア バイオテク（スウェーデンPharmaciaBiotech社製）、アロカ（米国Protein TechnologyInstrument社製）、クラボウ（米国Synthecell-Vega社製）、日本パーセプティブ・リミテッド（米国PerSeptive社製），島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００４９】
上記で取得した形質転換体由来であり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性を有する生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＫＨＧを生成させ、生成した４（Ｒ）ＫＨＧを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
【００５０】
生体触媒Ｉとしては、上記で取得した形質転換体の培養物、細胞、細胞処理物のいずれも用いることができる。
細胞処理物としては、細胞の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、細胞の蛋白質分画〔４（Ｒ）ＫＡＬの粗酵素または精製酵素〕、細胞および細胞処理物の固定化物等をあげることができる。
【００５１】
生体触媒Ｉ濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
【００５２】
水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含有した水性溶液があげられる。また必要に応じてトリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンＨＳ２０４（日本油脂社製）などの界面活性剤あるいはトルエンやキシレンのような有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ程度添加してもよい。
【００５３】
ピルビン酸およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。該化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができる。
【００５４】
水性媒体に、生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
生体触媒Ｉとして用いられる細胞の培養初発または途中に、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＫＨＧを製造することもできる。その際、ピルビン酸または該組換え株によってピルビン酸に転換される化合物は、予め培養基質として添加しておいてもよいし、グリオキシル酸とともに添加してもよい。
【００５５】
また、生体触媒Ｉが、上記記載の形質転換体であって、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＫＨＧの製造には好ましい。このような形質転換体の微生物としては、例えば、エシェリヒア  コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株等をあげることができる。エシェリヒア  コリＮＨＫ４０株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５９１９として寄託されている。
【００５６】
上記製造法により製造された４（Ｒ）ＫＨＧは、通常用いられる有機酸の精製法を用いて単離することができる。該精製法として、例えば、遠心分離により固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＫＨＧを単離することができる。
上記記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＧを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＧを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００５７】
形質転換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００５８】
糖質としては、上記形質転換体が資化しうるものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などを用いることができる。
糖質およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００ｇ／ｌである。
【００５９】
水性媒体に、上記形質転換体、糖質およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００６０】
上記形質転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＧを製造することもできる。
また、上記記載の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＨＧの製造には好ましい。このような形質転換体の微生物としては、例えば、エシェリヒア  コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、エシェリヒア  コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損（ｐｐｃ）〕等をあげることができる。エシェリヒア  コリＮＨＫ４６株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５９２０として寄託されている。
【００６１】
上記記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
形質転換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
【００６２】
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００６３】
糖質としては、上記形質転換体が資化しうるものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などを用いることができる。
糖質およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００ｇ／ｌである。
【００６４】
水性媒体に、上記形質転換体、糖質およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
また、上記形質転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
【００６５】
４（Ｒ）ＨＹＰの製造において、上記記載の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しない５）アゼチジン−２−カルボン酸や３，４−デヒドロプロリン、チオプロリン等のプロリンアナログに耐性を有するという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体であることが好ましい。このような形質転換体の微生物として、例えば、エシェリヒア  コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、エシェリヒア  コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損（ｐｐｃ）〕、ＮＨＫ４７株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，ｇｌｃ，ｐｐｃ，アゼチジン−２−カルボン酸耐性〕等をあげることができる。エシェリヒア  コリＮＨＫ４７株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５９２１として寄託されている。
【００６６】
上記のような各種欠損株や耐性株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、目的とする酵素活性が親株に比べて欠損あるいは低下した菌株や親株よりアナログに耐性な菌株を選択することによって得ることができる。またエシェリヒア  コリＫ−１２系統の菌株においては、目的とする欠損または耐性変異を有する別の菌株から所望の菌株にＰ１ファージなどを用いて欠損変異を移すこと（形質導入）によっても各種欠損変異株や耐性変異株を得ることができる。
【００６７】
４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては更に、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧを水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＹＰを製造する方法をあげることができる。
【００６８】
生体触媒IIとしては、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物の培養物、菌体、菌体処理物のいずれも用いることができる。
【００６９】
アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物として、例えばエシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属等に属する微生物があげられる。具体的には、大腸菌由来でプロリンによるフィードバック阻害が緩和された変異型ＰｒｏＢＡ遺伝子を含むプラスミドｐＫＳＲ１９を導入したエシェリヒア  コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５株（ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９）、コリネバクテリウム  アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)ＦＥＲＭ  Ｐ−４９６２株等をあげることができる。より好ましくは、グルタミン酸の要求性を有する変異株をあげることができる。そのような変異株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、生育にグルタミン酸を要求する菌株を選択することによって得ることができる。またエシェリヒア  コリＫ−１２系統の菌株においては、形質導入によっても欠損変異株を得ることができる。このような微生物としてエシェリヒア  コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損変異（ｉｃｄ）を付与したＮＨＫ３株にｐＫＳＲ１９を導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株やｐＫＳＲ１９に大腸菌由来のＰｒｏＣ遺伝子を連結したｐＫＳＲ２１を導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株、さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＫＳＲ５０をも導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。またグルタミン酸の要求性に加え、アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロプロリンやチオプロリンなどプロリンアナログに耐性となった宿主微生物を用いると一層有利である。
【００７０】
そのような微生物は、上記のように親株に変異操作や形質導入を施すことによって得られるほか、プロリンアナログ耐性遺伝子を含むプラスミドを導入することによっても得ることができる。具体的にはエシェリヒア  コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。なおエシェリヒア  コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株は、平成９年８月１２日付で、エシェリヒア  コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株は平成９年８月２６日付で、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０７６として、ブダペスト条約に基づいき工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００７１】
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、菌体の蛋白質分画〔アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する粗酵素または精製酵素〕、菌体および菌体処理物の固定化物等をあげることができる。
【００７２】
生体触媒IIの濃度は、微生物菌体換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
４（Ｒ）ＫＨＧは、単離精製された４（Ｒ）ＫＨＧのほか、４（Ｓ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＨＧを含まない粗精製標品、あるいは上記に記載した微生物に由来する生体触媒反応を利用して生成された４（Ｒ）ＫＨＧを含有する反応液等を利用することができる。４（Ｒ）ＫＨＧの濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。
【００７３】
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
【００７４】
生体触媒IIとして用いられる微生物の培養初発または途中に４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
上記の如くして生成した４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰは、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば遠心分離により固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰを単離することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
【００７５】
【実施例】
実施例１  ４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の取得
バチルス  エスピー(Bacillus sp.)ＯＣ１８７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４６）を１白金耳、１０ｍｌのＬＢ液体培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製） １０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製） ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に植菌し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養菌体から公知の方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)〕に従い染色体ＤＮＡを単離した。精製したバチルス  エスピーＯＣ１８７株の染色体ＤＮＡ ５μｇとｐＳＴＶ２９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇをＳａｌ Ｉ用緩衝液（宝酒造社製Ｋバッファー）１００μｌに溶かし、２０単位の制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行った後、６５℃で１５分間加熱することによって反応を停止させた。該反応停止液に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）１０μｌを添加後、−２０℃に冷却したエタノール３００μｌを加え、−８０℃で３０分間静置した。静置後、該エタノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によって取得した（以下、該操作をエタノール沈殿法と略す）。該沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション  バッファーＡ液（宝酒造社製）４０μｌ、ライゲーション  バッファーＢ液（宝酒造社製）５μｌを加え、混合した後、１６℃で１６時間ＤＮＡ連結反応を行い組換え体ＤＮＡを得た（以下、該操作をライゲーション反応と略す)。該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア  コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って形質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地に寒天２％を加えて固めたもの）に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。生じたクロラムフェニコールに耐性の形質転換コロニー約２０００個についてピルビン酸とグリオキシル酸から４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する活性を測定した。
【００７６】
即ち、各形質転換株をクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３０℃にて２０時間培養し、該培養液に３０μｌのキシレンと２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。
該振盪液の遠心上清を住友化学社製のSUMICHIRAL OA-5000（内径４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ)を用い、１ｍＭ 酢酸銅（II）、０．１ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．５）８５：イソプロパノール１５の混合液を移動層とし、ＵＶ２１０ｎｍの吸光度を測定するＨＰＬＣ法で分析し、４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタルの生成量を測定した。
【００７７】
該測定により、４（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を有する形質転換株を選択し、該形質転換株より、４（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を担う約３．５ｋｂのＳａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＫＳＲ２０１を取得した。
該Ｓａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示す。さらに各種制限酵素を用いて、このＤＮＡ断片上の４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子領域を含むＰｓｔ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ約１．８ｋｂをｐＳＴＶ２９のＰｓｔ Ｉ−Ｓａｌ Ｉサイト間に挿入したｐＫＳＲ２２２を作製した。
【００７８】
ｐＫＳＲ２２２に含まれる４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＤＮＡ配列をジデオキシ法〔Proc. Natl. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕により決定した。４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２に、ＤＮＡ配列より推定される４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００７９】
実施例２  発現プラスミドの作製
４（Ｒ）ＫＡＬ活性を高発現させるために、エシェリヒア  コリのトリプトファン生合成酵素遺伝子由来のプロモーター（Ｔｒｐプロモーター）を４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子上流に連結したプラスミドの造成を行った。また同時に、４（Ｒ）ＫＡＬのＮ末端５アミノ酸に対応するＤＮＡ塩基配列はバチルス  エスピーＯＣ１８７株由来の配列から、エシェリヒア  コリの至適コドンに相応する配列へと改変した。
【００８０】
４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＮ末端に対応し、２残基目のヒスチジン残基、４残基目のロイシン残基および５残基目のセリン残基に相応するコドンをエシェリヒアコリの至適コドンに相応する文字に改変した配列番号４に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＣ末端に対応する配列番号５に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ法〔R.F.Saiki etal., Science, 230, 1350 (1985)〕によって４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を増幅させた。
【００８１】
即ち、ｐＫＳＲ２２２を鋳型とし、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ (パーキンエルマージャパン社製)および、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用い、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして３０サイクル行った後、７２℃で５分間反応させた。
該反応により増幅された約６３０ｂｐｓのＤＮＡ断片をクロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を精製した。
【００８２】
該ＤＮＡ断片２μｇとＴｒｐプロモーターを有する参考例１記載のベクタープラスミドｐＴｒＳ３３１μｇを各々Ｃｌａ ＩおよびＢａｍ ＨＩで２重消化後、各々のＣｌａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ消化ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって精製した。
これら精製された両断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００８３】
該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア  コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００８４】
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について実施例１と同様の方法により（ただし培養時にはクロラムフェニコールに替わりにアンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加した）４（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を測定した。
いずれの形質転換体も高い４（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を有していた。
これらの形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３７℃で１６時間振盪培養し、得られた培養液を遠心分離することにより取得した菌体より公知の方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕でプラスミドを単離した。
【００８５】
これら単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラスミドを有していることが確認された。このようにして作製されたプラスミドをｐＫＳＲ３０３と命名した。
ｐＫＳＲ３０３の制限酵素切断地図を図２に示した。
次に、コリネバクテリウム属細菌中に４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を導入するために、コリネバクテリウム属細菌中で自律増殖できるベクタープラスミドｐＣＳ１１６〔該プラスミドを含有するEscherichia coli KY9002/pCS116（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５５）より取得〕とｐＫＳＲ３０３との連結を行った。
【００８６】
ｐＣＳ１１６およびｐＫＳＲ３０３各々１μｇを４５μｌのＨバッファー（宝酒造社製）に溶解し、１０単位のＢｇｌ IIを加え３７℃で３時間消化反応を行った。
該反応により得られたＤＮＡをフェノール抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を取得した。
【００８７】
該ＤＮＡを５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行い、組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア  コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００８８】
生育してきたアンピシリンおよびスペクチノマイシンに耐性なコロニーから上記同様にプラスミドを単離し、該プラスミドを用い公知の方法（特開平６−２７７０８２）にしたがってコリネバクテリウム  グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換した。
【００８９】
該形質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＢＹ寒天培地〔ブイヨン（極東社製）２０ｇ、酵母エキス（極東社製）５ｇを水１リットルに含みｐＨ７．２に調整し、寒天２％を加えて固めた培地〕に塗布し、３０℃で４８時間培養した。
生育してきたスペクチノマイシンに耐性なコロニー数個から公知の方法（特開昭５７−１８３７９９）にしたがってプラスミドを単離した。
【００９０】
これら単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラスミドを有していることが確認された。このようにして作製されたプラスミドをｐＫＳＲ８０３と命名した。
ｐＫＳＲ８０３の制限酵素切断地図を図３に示した。
【００９１】
実施例３  各種菌株による４（Ｒ）ＫＨＧの生産
エシェリヒア  コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ  オキシトカ(Klebsiela oxytoca) ＡＴＣＣ８７２４株、セラチア  マルセセンス(Serratia marsecens) ＡＴＣＣ１３８８０株を各々ＬＢ培地３ｍｌに１白金耳づつ植菌し、２８℃で１２時間培養した。
【００９２】
培養後、得られた培養液を遠心分離することによりにより各々の菌体を取得した。
これら菌体を各々、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液１ｍｌに懸濁し、これら懸濁液を遠心分離することによりにより各々の菌体を再度取得した。
これら菌体を各々、０．２ｍｌの氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０％グリセロール溶液に懸濁後、氷中に１０分間放置した。
【００９３】
これら菌懸濁液に実施例２で作製したｐＫＳＲ３０３を０．２μｇ添加し氷中に２０分間放置した後、４２℃で３０秒間加熱し、各々に０．８ｍｌのＬＢ培地を加え、３０℃で１時間振盪培養した。
これら培養液を４００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養した。
【００９４】
生育したきたコロニーを選択することにより、ｐＫＳＲ３０３の導入されたエシェリヒア  コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ  オキシトカＡＴＣＣ８７２４株およびセラチア  マルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株を取得した。
エシェリヒア  コリＡＴＣＣ３３６２５株、ＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ  オキシトカＡＴＣＣ８７２４株、セラチア  マルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株の各株、これらの株にｐＫＳＲ３０３を導入した株、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株およびｐＫＳＲ８０３を導入したＡＴＣＣ１３０３２株の各株を３ｍｌのＬＢ培地で１６時間振盪培養した。
【００９５】
これら培養液にキシレン３０μｌ、２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。
これら反応液の遠心上清を、実施例１と同様の方法により４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル生成量を測定した。
【００９６】
結果を第１表に示した。
【００９７】
【表１】
0004047958.tif 000002
【００９８】
実施例４  大腸菌変異株による４（Ｒ）ＫＨＧの生産
エシェリヒア  コリＫ−１２系統の菌株でｐｐｃ、ｌｉｐ、ｅｄａの３重欠損変異を持つＮＨＫ４３株からリンゴ酸シンターゼ活性低下株を誘導した。
即ち、グルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ培地中で対数増殖期まで培養したＮＨＫ４３株の菌体を遠心分離によって集め、０．０５Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
【００９９】
該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理を行った。
該変異処理菌体をグルコース０．５％、グルタミン酸０．０５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に塗布した後、３７℃で２日間培養した。
【０１００】
生育してきた菌株のうち、小さいコロニーを形成する菌株をグルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ寒天培地上に接種し、培養した。
【０１０１】
該培養プレートに生育した菌株をグルコース０．５％、グルタミン酸０．５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地とグルコース０．５％、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地とにレプリカし、前者培地上では生育するが後者培地上では生育できない株を選択した。
【０１０２】
該選択された菌株をＭＳ培地〔グルコース ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、酵母エキス １ｇ、ペプトン １ｇ、リポ酸 ５０μｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕中、３７℃で振盪培養した。
【０１０３】
対数増殖期後期まで培養した段階で、遠心分離により集菌し、５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で該菌体を洗浄後、超音波破砕機で破砕した。該菌体破砕液を遠心分離（１５、０００ｒｐｍ、４５分間）し、得られた上清を細胞抽出液とした。
該細胞抽出液のリンゴ酸シンターゼ活性を、既報〔Methods in Enzymology 5, 633(1962)〕にしたがって測定し、活性の検出されなかったＮＨＫ４６株を目的の変異株として選択した。
【０１０４】
該ＮＨＫ４６株に、Ｐ１ファージによる形質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エシェリヒア  コリＷ３１１０株由来のｌｉｐ+遺伝子を導入し、リポ酸非要求性のＮＨＫ４８株を得た。
ＮＨＫ４３株、ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４８株にマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従ってｐＫＳＲ２２２を導入し（ただし培養はリポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加して行った）、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を得た。
【０１０５】
また同様にしてアンピシリン耐性を指標にＮＨＫ４６株にｐＫＳＲ３０３を導入し、エシェリヒア  コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３株を取得した。
各形質転換株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１６時間振盪培養した。
【０１０６】
これら培養液各々０．５ｍｌずつを滅菌した５ｍｌのＴ培地〔グルコース ５０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １０μｇ、酵母エキス ０．２ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、リポ酸 ５０μｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調整）０．２５ｍｌを添加し３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１０７】
これら培養液を遠心分離して得た培養上清を実施例１と同様の方法により４（Ｒ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＫＨＧの生成量を測定した。
結果を第２表に示す。
４（Ｒ）ＫＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変異とリンゴ酸シンターゼ活性低下変異は４（Ｒ）ＫＨＧ生産に寄与することが明白となった。
【０１０８】
【表２】
0004047958.tif 000003
【０１０９】
実施例５  ジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＫＨＧ生産
エシェリヒア  コリＫ−１２系統の菌株でｌｉｐ、ｅｄａの２重欠損変異を持つＮＨＫ４０株に実施例４と同様にしてｐＫＳＲ２２２を導入し、形質転換体を取得した。
【０１１０】
該形質転換体をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液１０ｍｌを、同じ組成の培地を２００ｍｌ入れ滅菌した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液全量を、Ｊ１培地〔１リットルあたり、ラクトース ３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ酸 ７５μｇ、を含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕を１８００  ｍｌ入れ滅菌した５ｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。
【０１１１】
培養２０時間後に、該培養液にキシレン ２０ｍｌおよび２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調製）３７０ｍｌを添加し、３７℃でさらに１２時間培養した。
該培養上清中の４（Ｒ）ＫＨＧ含量を実施例１と同様の方法により測定した。
該培養上清には、２９９．５ｍＭの４（Ｒ）ＫＨＧが生成されていた。
【０１１２】
実施例６  ４（Ｒ）ＨＧ生産
Ｐ１ファージによる形質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エシェリヒア  コリＷ３１１０株由来のｐｐｃ+遺伝子をＮＨＫ４３株に導入し、グルタミン酸非要求性のＮＨＫ４５株を取得した。
【０１１３】
該株に実施例４と同様の方法でｐＫＳＲ２２２を導入した。
ｐＫＳＲ２２２を保有するＮＨＫ４３株、ＮＨＫ４６株、ＮＨＫ４８株、ＮＨＫ４５株およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株を実施例４と同様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量をメルク社製Lichrospher(C18)カラムを用い、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ 無水硫酸ナトリウム（ｐＨ２．２）、０．４％ ｎ−プロパノール、０．０３％ ＳＤＳを含む溶液を移動層とし、溶出液をo-フタルアルデヒドでポストカラムラベルした後、励起光３５０nm、蛍光448nmの蛍光を測定するＨＰＬＣによって分析し４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量を測定した。
【０１１４】
結果を第３表に示した。
４（Ｒ）ＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変異、リンゴ酸シンターゼ活性低下変異およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異は４（Ｒ）ＨＧ生産に寄与することが明白となった。
またｐＫＳＲ８０３を保有するコリネバクテリウムグル  タミクムＡＴＣＣ１３０３２株をＬＢ培地に植菌し、１６時間振盪培養した。
【０１１５】
該培養液０．５ｍｌを滅菌した５ｍｌのＴＣ培地〔グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．２５ｇ、尿素 ３ｇ、ビオチン １００μｇ、コーンスチープリカー ５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ ５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１リットル中に含有し、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、該培養液に２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）０．２５ｍｌを添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１１６】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量を同様にＯＤＳカラムを用い測定した。
結果を第３表に示した。
【０１１７】
【表３】
0004047958.tif 000004
【０１１８】
実施例７  ジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＨＧ生産
ｐＫＳＲ３０３を保有するエシェリヒア  コリＮＨＫ４６株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液１０ｍｌを、同じ組成の培地２００ｍｌを入れ滅菌した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
【０１１９】
該培養液全量を、Ｊ２培地〔１リットルあたり、グルコース ３０ｇ、グルタミン酸 １２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、イソロイシン ２０ｍｇ、メチオニン １０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ酸 ７５μｇを含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕１８００ｍｌを入れ滅菌した５Ｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。  培養１４時間後、該培養液に２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調製）１９０ｍｌを添加し、３７℃でさらに適宜グルコースを添加しながら６０時間培養を継続した。
【０１２０】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ量を実施例６と同様にＨＰＬＣで分析した。
該培養上清中には、１１７．８ｍＭの４（Ｒ）ＨＧが生成していた。
【０１２１】
実施例８  プロリン合成酵素遺伝子と４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の連結
大腸菌由来の脱感作されたＰｒｏＢＡ遺伝子を有するプラスミドｐＰＲＯ−１１〔該プラスミドを含有するEscherichia coli ATCC33625/pPRO11（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０７７）より取得〕をＰｓｔＩで消化し、該消化物をアガロースゲル電気泳動後Prep-A-Gene DNA Purification System （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２２】
該断片およびマルチプルクローニングサイトを持つプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア  バイオテク社製）のＰｓｔＩ消化物を用い、ライゲーション反応を行い、得られた生成物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
【０１２３】
これら形質転換体を、グルコース ０．５％、チアミン塩酸塩 １００μｇ／ｌ、３，４−デヒドロプロリン １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地にレプリカした。
脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株は１００ｍｇ／ｌの３，４−デヒドロプロリンに耐性を示すため（特開平３−２６６９９５）、上記培地で生育した株を脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株として選択した。
【０１２４】
選択された株から常法にしたがってプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、ｐＴｒｃ９９ＡのＰｓｔＩサイトにＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９Ａのｔａｃプロモーターに対してＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構造を持つｐＫＳＲ１７を取得した。
ｔａｃプロモーターとＰｒｏＢＡの転写開始点を近づけるため、ｐＫＳＲ１７をＥｃｏＲＶで部分消化し、さらにＳｍａＩで消化した後、該消化物をライゲーション反応に供し、自己環化させた。
【０１２５】
該環化物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
数個の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行った結果、いずれのプラスミドも同じ構造を有することが確認された。
該プラスミドをｐＫＳＲ１８と命名した。
【０１２６】
該ｐＫＳＲ１８をＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化し、DNA blunting kit（宝酒造社製）を使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
該ＤＮＡ断片と、高温誘導型プロモーターを有する発現ベクターｐＰＡＣ１〔該プラスミドを含有するEscherichia coli KY8415/pPAC1（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５４）より取得〕をＣｌａＩで消化し、DNA blunting kitを使って平滑末端化したＤＮＡ断片をライゲーション反応によって連結した。
【０１２７】
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出し、ｐＰＡＣ１の高温誘導型プロモーター下流にＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構造を持つｐＫＳＲ１９を取得した。
一方、大腸菌のＰｒｏＣ遺伝子を含むＨｉｎｃII−ＸｈｏＩ処理ＤＮＡ断片をｐＴｒｓ３３のＳｍａＩ−ＳａｌＩ間に挿入したｐＥｐｒｏＣをＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化しDNA blunting kitを使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＴｒｐプロモーターからＰｒｏＣ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２８】
該ＤＮＡ断片とＳｐｈＩで消化後平滑末端化したｐＫＳＲ１９をライゲーション反応によって連結した。
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
【０１２９】
該アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子とＰｒｏＣ遺伝子を有するプラスミドを見出し、ｐＫＳＲ２１と命名した。
該ｐＫＳＲ２１をＢａｍＨＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて約７ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１３０】
該ＤＮＡ断片と、実施例２で作成したｐＫＳＲ３０３をＥｃｏＲＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNAPurification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて単離精製した約２．９ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーション反応によって連結した。
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
【０１３１】
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
該アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ、ＰｒｏＣ遺伝子および４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を有するプラスミドｐＫＳＲ３２１を得た。
【０１３２】
本実施例のプラスミドの構築手順を図４に示した。
【０１３３】
実施例９  グリオキシル酸添加培養による４（Ｒ）ＨＹＰ生産
実施例４で作成したＮＨＫ４６株からプロリンアナログのアゼチジン−２−カルボン酸に耐性となった変異株を誘導した。
即ち、実施例４と同様に培養したＮＨＫ４６株に実施例４と同様に変異処理を施し、グルコース ０．５％、グルタミン酸 ０．５ｇ／ｌ、リポ酸 １００μｇ／ｌ、アゼチジン−２−カルボン酸 １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地に塗布し、３７℃で２日間培養した。
【０１３４】
該培養において、大きなコロニーを形成して生育した、アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株ＮＨＫ４７株を取得した。
ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４７株に実施例８で作成したｐＫＳＲ３２１を導入し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。各形質転換株およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株（実施例４で作成）を実施例４と同様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣを用いて定量した。
【０１３５】
ＨＰＬＣによる定量は以下のように行なった。培養上清液８０μｌに１Ｍ 硼酸緩衝液（ｐＨ９．６）２０μｌ、６ｍｇ／ｍｌ ＮＢＤ−Ｃｌ（7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chloride)を含むメタノール溶液１００μｌを加え、遮光下６０℃、２０分間反応させる。この反応液に１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ添加して反応を停止させた後、ミリポアフィルターで濾過し、その濾液を以下の条件で分析した。
【０１３６】
カラム：資生堂CAPCELLPAK-C18 (4.6 x 150mm)
移動相：Ａ；１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ４）、
Ｂ；Ａとメタノールの等量混合液
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：５０℃
移動相のグラジエントタイムプログラム
時間（min）          B(Vol%)
０−１０            ０−８
１０−２０          ８−８０
２０−２１          ８０−１００
２１−２３          １００
２３−２４          ０
検出：Ｅｘ＝４７０ｎｍ，    Ｅｍ＝５３０ｎｍの蛍光検出
結果を第４表に示した。
【０１３７】
【表４】
0004047958.tif 000005
【０１３８】
実施例１０  ２段反応による４（Ｒ）ＨＹＰ生産
イソクエン酸デヒドロゲナーゼを欠損した大腸菌の変異株ＥＢ１０６株〔E.coli  Genetic  Stock  Center(Yale University, New Haven, CT, USA)より分与〕からＰ１ファージによる形質導入法を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ欠損変異（ｉｃｄ）を導入し、ＮＨＫ３株を作成した。本変異株はｉｃｄ変異のためグルタミン酸要求性を示す。
【０１３９】
実施例８で作成したｐＫＳＲ１９を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を、実施例８で作成したｐＫＳＲ１９およびｐＫＳＲ２１を用いて大腸菌ＮＨＫ３株を、それぞれ形質転換し、アンピシリン耐性を指標に各形質転換体を取得した。
さらに大腸菌のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）を含むＰｓｔＩとＣｌａＩサイトで挟まれた４．２ｋｂのＤＮＡ断片と大腸菌のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を含むＢａｍＨＩとＳｐｈＩサイトで挟まれた約３ｋｂのＤＮＡ断片を持ち、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１７７由来のプラスミドｐＫＳＲ５０（図５に制限酵素地図を示した）を用いてｐＫＳＲ２１を保有する大腸菌ＮＨＫ３株（ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株）を形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコール両薬剤に耐性であることを指標に、ｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を保有するＮＨＫ３株（ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１）を取得した。
【０１４０】
また大腸菌Ｋ−１２株系統で、変異型（ｉｃｄ，ｓｕｃＡ，ｐｕｔＡ，ｅｄａ）を有する変異株ＮＨＫ２３株にも同様にしてｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を導入し、ＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株を取得した。
大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株、上記の様にして造成したＮＨＫ３、ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株を実施例４と同様にＴ培地中で３０℃にて２４時間培養した後、実施例５で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清をミリポア濾過滅菌したものを４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１４１】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣで定量した。
結果を第５表に示した。
コリネバクテリウム  グルタミクムＫＹ１０９１２株をＬＢ培地中で１６時間振盪培養した。
該培養液０．５ｍｌを滅菌した５ｍｌのＴＣ培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、ミリポア濾過滅菌した実施例５で作成したＲ−ＫＨＧを含有する培養上清を４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１４２】
該培養培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣで定量した。
結果を第５表に示した。
【０１４３】
【表５】
0004047958.tif 000006
【０１４４】
実施例１１  マイクロジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＨＹＰ生産
実施例１０で造成したエシェリヒア  コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液０．５ｍｌを、同じ組成の培地１０ｍｌを入れ滅菌した３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
【０１４５】
該培養液全量を、リポ酸を除いたＪ２培地９０ｍｌを入れ滅菌した２００ｍｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２００ｍｌ／ｍｉｎ、撹拌８００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。
【０１４６】
培養１４時間後に、培養温度を４０℃にあげ、さらに８時間培養後、培養温度を３７℃に下げた。
培養２２時間目に、ジャーファーメンターから培養液を２７ｍｌ抜き取り、該ジャーファーメンターに実施例５で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清２７ｍｌをミリポア濾過滅菌後添加した〔４（Ｒ）ＫＨＧ終濃度８０ｍＭ〕。
【０１４７】
３７℃の条件で、該ジャーファーメンターに適宜グルコースを添加しながら４０時間培養を継続した。
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰをＨＰＬＣで分析した。
該培養により４９．９ｍＭ（６．５ｇ／ｌ）の４（Ｒ）ＨＹＰが生成した。
【０１４８】
参考例１  ｐＴｒＳ３３の構築
ＰＴｒＳ３３は特開昭５８−１１０６００および特開平２−２２７０７５に記載された手順に従って容易に構築することができる。以下に該プラスミドの構築方法を示す。
【０１４９】
大腸菌ＩＫＹＰ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−６９６２）より単離したプラスミドｐＫＹＰ−１をＴａｑ１で部分消化後、ＥｃｏＲＩで消化し、得られた、トリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む約２．６ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により精製、取得した。
ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）をＴａｑ１で部分消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動法により約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した。
【０１５０】
得られた約２．６ｋｂのＤＮＡ断片および約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って大腸菌Ｃ６００ＳＦＳ株を形質転換し、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５１】
生育してきたアンピシリンおよびテトラサイクリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＫＹＰ−５を抽出、取得した。
該ｐＫＹＰ−５をＨａｐIIとＨｉｎｄIIIで消化し約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
該約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩとＨｉｎｄIIIで消化したｐＢＲ３２２に挿入してｐＫＹＰ−１０を取得した。
【０１５２】
該ｐＫＹＰ−１０をＢａｎIIIとＮｒｕＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動法により、トリプトファンプロモーターを含む約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）。
トリプトファンプロモーターの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するために、配列番号６および７に示されるＤＮＡ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをトリエステル法によって合成した。
【０１５３】
これら合成ＤＮＡリンカーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、上記で取得したｐＫＹＰ−１０由来のＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片と連結した。
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５４】
生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ２０を抽出、取得した。
該ｐＴｒＳ２０をＳａｃＩとＰｓｔＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片）。
【０１５５】
大腸菌ＩＫＹＰ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６３）より単離したｐＫＹＰ２６をＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｍＨＩ断片）。
またM13mp18RF ＤＮＡ（宝酒造社製）をＳａｃＩとＣｌａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約０．６５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した（ＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片）。
【０１５６】
更に、配列番号８および９に示されるＤＮＡ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸化した。
上記で得られたｐＴｒＳ２０由来のＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片、ｐＫＹＰ２６由来のＢａｍＨＩ断片、M13mp18RF ＤＮＡ由来のＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片および５’りん酸化された上記２つの合成ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【０１５７】
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング  第２版〕に従って大腸菌ATCC33625株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ３３を抽出、取得した。
【０１５８】
【発明の効果】
本発明により、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができる。
【０１５９】
また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができる。
【０１６０】
【配列表】
0004047958.tif 000007
0004047958.tif 000008
【０１６１】
0004047958.tif 000009
【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
0004047958.tif 000013
【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＫＳＲ２０１上にクローニングされたBacillus sp.OC187株由来のＤ片の制限酵素地図を示した図である。
【図２】図２はｐＫＳＲ３０３の制限酵素地図を示した図である。
【図３】図３はｐＫＳＲ８０３の制限酵素地図を示した図である。
【図４】図４はｐＫＳＲ１９、ｐＫＳＲ２１、ｐＫＳＲ３２１の作成手順と構造を示した図である。
【図５】図５はｐＫＳＲ５０の制限酵素地図を示した図である。
【符号の説明】
Ａｍｐ：ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
４（Ｒ）ＫＡＬ：４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼをコードする遺伝子
Ｓｐｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子
ｌａｃｌｑ：過剰生産型lacリプレッサー遺伝子
Ｐｔａｃ：tacプロモーター
ＰｒｏＢＡＲ：フィードバック阻害緩和型変異プロリン生合成遺伝子ProBA
ＰｐＬ：ラムダファージ由来pLプロモーター
ＰｒｏＣ：プロリン生合成遺伝子ProC
ＺＷＦ：グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ＧＤＨ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子
ｏｒｉ１７７：pACYC177複製起点
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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