(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼ。
（１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であり、ゲル濾過で測定した場合に３２０００；
（２）サブユニット構成：モノマー
（３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近（４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付近
（５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である
（６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ2+、Ａｇ+、Ｃｄ2+、Ｈｇ2+
（７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより酵素活性が促進される。
【請求項２】
下記の何れかのポリペプチド。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
下記の何れかのＤＮＡ。
（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列番号２で表される塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
【請求項５】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のＤＮＡあるいは請求項５記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項７】
Ｌ−プロリンアミド、Ｌ−アラニンアミド、Ｌ−ロイシンアミド、Ｌ−イソロイシンアミド、Ｌ−セリンアミド、Ｌ−トレオニンアミド、Ｌ−メチオニンアミド、Ｌ−フェニルアラニンアミド、Ｌ−チロシンアミド、Ｌ−トリプトファンアミド、Ｌ−プロリン−ｐ−ニトロアニリド、（ＲＳ）−ピペラジン−２−カルボキサミド、又は（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドから選択されるカルボン酸アミド類に、請求項１に記載のアミダーゼ、請求項２に記載のポリペプチド、又は請求項６に記載の形質転換体を作用させることにより、（Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、（Ｓ）−体のカルボン酸類または／及び（Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを含む、光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製造方法。
【請求項８】
エチレンジアミン４酢酸の共存下で反応を行う、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規な立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド、そのペプチドをコードするＤＮＡ、それらのＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター、並びに上記ＤＮＡ又は組み換えベクターを保有する組み換え体生物に関する。さらに本発明は、当該ポリペプチドをカルボン酸アミド類に作用させ、医・農薬中間原料として有用なキラルカルボン酸類及び／又はキラルカルボン酸アミド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
ラセミ体の含窒素複素環含有カルボキサミド類を生物工学的に加水分解し、医・農薬中間体として有用なキラルなカルボン酸類及び／又はカルボキサミド類を製造する方法としては以下の手法が知られている。
【０００３】
（Ｒ）−含窒素複素環含有カルボン酸アミド類を選択的に加水分解する方法としては、特開平１０−２７６７９４号公報には、シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３株又はその処理物を、特開平１０−３２７８９０号公報には、シュードモナス  エスピー  ＭＣＩ３４３３株又はシュードモナス  エスピー  ＭＣＩ３４３４株あるいはそれらの処理物をラセミ体Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドに作用させ、高い光学純度の（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸及び／又は（Ｓ）−Ｎ−ピペラジン−２−カルボン酸アミドを取得する方法が知られている。
【０００４】
一方、（Ｓ）−含窒素複素環含有カルボン酸アミド類を選択的に加水分解する手法としては、特開平８−５６６５２号公報には、シュードモナス  プチダ種、シュードモナス  フルオレッセンス種、クレブシエラ  テリゲナ種又はクレブシエラ  ニューモニア種に属する微生物の菌体あるいはその処理物をラセミ体のプロリンアミド、ピペラジン−２−カルボキサミド又はピペコール酸アミドに作用させ、高い光学純度の（Ｓ）−カルボン酸類及び／又は（Ｒ）−カルボン酸アミド類を取得する方法が記載されており、特開平１０−１２７２８０号公報には、マイコプラナ属細菌の菌体又はその処理物をラセミ体のピペリジン−２−カルボキサミド又はＮ−アルキルピペリジン−２−カルボキサミドに作用させ、高い光学純度の（Ｓ）−ピペリジン−２−カルボン酸及び／又は（Ｒ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カルボキサミドを取得する方法が記載されており、特開平１０−２７６７９４号公報には、ロイコバクター属、リゾビウム属、またはミコバクテリウム属細菌の菌体、またはその処理物をＮ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドに作用させ、高い光学純度の（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸、及び／又は（Ｒ）−Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを取得する方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、これらの手法では菌体又はその処理物を加水分解触媒として用いているが、目的の反応を触媒する酵素の含量が少ない又は酵素自体が不安定性であり、十分に反応を触媒するには多量の菌体を用意する必要があるため、経済的に有利な手法ではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、含窒素複素環含有カルボン酸アミド類を立体選択的に加水分解する能力を有する新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡを取得すること、並びに該アミダーゼを用いて光学純度の高い含窒素複素環含有カルボン酸類及び／又はそのアミド類を製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（Ｒ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カルボキサミドを選択的に加水分解する立体特異的アミダーゼの活性を有することで知られているシュードモナス  アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株から（Ｓ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カルボキサミドを選択的に加水分解する酵素を単離し、それをコードするＤＮＡを取得した。このＤＮＡを用いて製造される立体選択的アミダーゼに富んだ組み換え体生物又は高濃度アミダーゼ溶液により、より高い生産性でより高い立体選択的なカルボン酸アミド類の加水分解反応が進行すること見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼが提供される。
（１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であり、ゲル濾過で測定した場合に３２０００；
（２）サブユニット構成：モノマー
（３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近
（４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付近
（５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である
（６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ2+、Ａｇ+、Ｃｄ2+、Ｈｇ2+
（７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより酵素活性が促進される。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのポリペプチドが提供される。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのＤＮＡが提供される。
（１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列番号２で表される塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
（３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡまたは組換えベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、下記一般式（Ｉ）
【化４】
0004116798.tif 000002
（式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、アルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる置換基により置換されていてもよいアルキル基又はＡが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって、含窒素複素環を形成しうる基であり、Ｒは、水素原子、置換されていても良いアルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、本発明のアミダーゼ、ポリペプチド、又は形質転換体を作用させることにより、（Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【化５】
0004116798.tif 000003
（式中、Ａは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）
【化６】
0004116798.tif 000004
（式中、Ａ及びＲは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを含む、光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製造方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、Ａは、Ａが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成しうる基である。
好ましくは、エチレンジアミン４酢酸の共存下で反応を行う。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡと、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を示す１種以上のＤＮＡとをランダムリコンビネーションすることを特徴とする立体選択的アミダーゼ活性を有する新規なポリペプチドの製造方法が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
（Ｉ）本発明のアミダーゼ及びポリペプチド
本発明は、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミダーゼに関するものである。
（１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であり、ゲル濾過で測定した場合に３２０００；
（２）サブユニット構成：モノマー
（３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近
（４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付近
（５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である
（６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ2+、Ａｇ+、Ｃｄ2+、Ｈｇ2+
（７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより酵素活性が促進され、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．５倍以上促進される。
【００１６】
本発明のアミダーゼの具体例としては、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、そのホモログであって立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むポリペプチドである。
【００１７】
本発明のポリペプチドのホモログとは、
配列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；
が挙げられる。
【００１８】
また、「配列番号１のアミノ酸配列を分子内に含むポリペプチド」とは、該ポリペプチドのＮ末端やＣ末端に蛋白質相互作用、リガンド結合機能又は別の特殊な機能を有するポリペプチドを結合させた融合ポリペプチドを意味する。
【００１９】
ちなみに上記ポリペプチドのホモロジー検索は、例えば、ＦＡＳＴＡプログラムやＢＬＡＳＴプログラムなどを用いて行うことができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列番号１に記載のアミノ酸配のホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中で高いアミノ酸アイデンティティーを示したのは、シノリゾビウム  メリオティ  （Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（６６％）、及びメソリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）のプロリンイミノペプチダーゼ（５８％）であった。
【００２０】
融合ポリペプチドの例としては、例えば、通常の分子遺伝学的手法を用いて、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４、７５９−７６７、（１９９０）においてＧｉｌｂｅｒｔ  Ｈ．Ｊ．らが報告している又は米国特許５４９６９３４号公報においてＳｈｏｓｅｙｏｖ  Ｏ．らが報告しているようなセルロース結合機能を有するアミノ酸配列を本願ポリペプチドのＮ末端やＣ末端に付加したもの、ニッケル結合機能を有するヒスチジンのヘキサマーを結合させて該ポリペプチドに特異的結合能を与えたもの、またＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、６８、２１１−２１７、（２０００）においてＫｉｍ  Ｇ．Ｊ．らが報告しているような手法により本発明のポリペプチドを他の機能を有するポリペプチドと融合させたもの等が挙げられる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは立体選択的アミダーゼ活性を有するものであり、ここで、立体選択的アミダーゼ活性とは、化合物中のアミド結合を立体選択的に加水分解して光学活性なカルボン酸及び／又はカルボン酸アミドを生産する活性をいう。
【００２２】
該ポリペプチドは、本発明によりそのアミノ酸配列が明らかになったので、後述するように配列番号１のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いることにより、立体選択的アミダーゼ活性を有する任意の微生物から立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを単離する、あるいはＤＮＡ合成装置を用いて立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを合成することにより、それを用いて分子遺伝学的手法により多量の該ポリペプチドを製造し、そこから通常の方法により単離することができる。また、上記ＤＮＡを有する微生物、例えばシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３株の培養菌体より精製することもできる。
【００２３】
尚、シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株は公知の微生物であり、東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションより入手可能である。
【００２４】
微生物の培養菌体から本願ポリペプチドを単離する方法としては、一般的な蛋白質の精製方法が応用できる。例えば、上記微生物を一般的な微生物用栄養培地、好ましくは窒素源としてニュートリエントブロス及び炭素源としてリンゴ酸を含む培地で培養することで十分に増殖させた後に遠心分離により回収し、超音波破砕処理やフレンチプレス処理により無細胞抽出液とする。この無細胞抽出液から、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、などの操作により蛋白質の物理化学的な性質の差異を利用して求めるポリペプチドを単離することができる。より推奨される手法としては、無細胞抽出液を調製し、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動からのゲルの切り出し、等を用いて本願ポリペプチドを精製できる。別法として、後述するように配列番号２記載のＤＮＡを適当な発現プロモーターとリボゾーム結合配列の下流に保有するベクターを組み込んだ組み換え体生物、好ましくはエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；以下、Ｅ．ｃｏｌｉ）、の培養菌体から、超音波破砕処理及び遠心分離により無細胞抽出液を調製し、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水クロマトグラフィーを用いて本願ポリペプチドを単離する。
【００２５】
以下に、シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株より単離された、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの物理学的、及び酵素学的性質を示す。
１．分子量：  ３４０００（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する。）、３２０００（ゲル濾過）
２．サブユニット構成：  モノマー
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：  ｐＨ９
４．アミダーゼ反応至適温度：  ４５℃
５．耐熱性：４５℃以下で安定である。
６．本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害する化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ2+、Ａｇ+、Ｃｄ2+、Ｈｇ2+。
７．ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより酵素活性が約１．８倍促進される。
【００２６】
さらに、本発明のポリペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２７】
（II）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとは上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はそのホモログである。
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、その具体例としては配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのホモログとは、
配列番号２で表される塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
が挙げられる。
【００２９】
上記ＤＮＡホモログは、配列番号２記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄＥｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより当業者であれば得ることが可能である。
【００３０】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．（ｅｄ．  ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｓｅｌ  Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、 ２００１、以後 "モルキュラークローニング第３版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
該ＤＮＡホモログとしては、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
【００３３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって取得することができる。まず、立体選択的アミダーゼ活性を有する微生物から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法によりプラスミドライブラリー又はファージライブラリーを作製する。次に、該ポリペプチドの部分アミノ酸配列の情報を用いて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの部分断片を取得し、常法によりＤＮＡプローブを作製する。このＤＮＡプローブで上述染色体ＤＮＡライブラリーから本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを特定し、適当なＤＮＡをサブクローニングすることにより該ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得できる。
【００３４】
より具体的には、以下の方法により本発明に係るＤＮＡを取得できる。
１．シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３から本願のアミダーゼを精製し、該アミダーゼのＮ末端及び内部アミノ酸配列の情報を基に、シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３の染色体ＤＮＡを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクションの略）を行い、求める立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの部分断片を得る。これを放射性同位元素を含む核酸により標識し、ＤＮＡプローブを作製する。
２．シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３から染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えばＦｂａＩなど）で部分分解する。
３．２で得られたＤＮＡ断片と、１で作製したＤＮＡプローブを用い、サザンハイブリダイゼーションを行う。
４．３で特定されたＤＮＡを抽出精製し、適当なプラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。
５．１で作製したＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ配列を含むクローンのプラスミドを取得する。
６．５で得られたプラスミドを用いて、ベクターに組み込まれたシュードモナス
アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３由来のＤＮＡの塩基配列を決定する。
７．決定されたＤＮＡ塩基配列中に立体選択的アミダーゼのアミノ酸配列の読み取り枠を見いだし、上記工程で得られたＤＮＡ断片中に、アミダーゼの全コード領域が存在することを確認する。
【００３５】
上記工程中でＤＮＡ、及び組み換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で行われているものであり、例えばモルキュラークローニング第３版に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。特に、上記１．において該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えばＳａｉｔｏら［Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６３）］の方法に準じて行うことができる。また、ＤＮＡの標識化は従来から汎用されている放射性同位元素あるいはジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン等の非放射性化合物のいずれも使用可能であり、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅTMＩＩ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）やＡｌｋＰｈｏｓTM  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）等を用いれば容易に実施できる。また、上記４．におけるベクターとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、等を使用することができる。さらに、上記６．におけるＤＮＡ塩基配列の決定もモルキュラークローニング第３版等に記された公知の方法を用いることができる。例えば、Ｌｉ−ｃｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌ等の機器を付属のマニュアルインストラクションに従って使用すれば容易に実施できる。
【００３６】
（III）本発明の組み換えベクター及び形質転換体
上記の（II）で取得された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することにより、立体選択的アミダーゼ発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した組み換え体生物を培養することにより、立体選択的アミダーゼを取得することができる。
【００３７】
本発明の立体選択的アミダーゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主細胞としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、宿主ベクター系が確立されている細菌、放線菌、酵母、カビなどの微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞が好適に利用できる。具体的には以下に示すような微生物、及び高等生物細胞を挙げることができる。
【００３８】
エシェリヒア属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、蚕、菜種、大豆など。
【００３９】
上記で宿主細胞として好ましくは、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、及びロドコッカス属微生物であり、特に好ましくは、エシェリヒア属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属微生物である。
【００４０】
本発明のポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで製造するには、宿主生物中において安定に存在するベクター中に本発明のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に相同組み換え等の手法により本発明のＤＮＡを導入して組み換えＤＮＡ分子を作成し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４１】
このとき、プロモーター及びリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくは転写終結因子を３’側下流にそれぞれ組み込むことが好ましい。このプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子としては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター、ＲＢＳ及び転写終結因子であれば特に限定されず、これら各種生物において利用可能なベクター、プロモーター、ＲＢＳ、及び転写終結因子に関しては、例えばモルキュラークローニング第３版や「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳述されている。
【００４２】
具体的には、例えばエシェリヒア属、特にＥ．ｃｏｌｉについては、べクターとしてｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ(β−ガラクトシダーゼ)、ｔｒｐ(トリプトファンオペロン)、ｔａｃ、 ｔｒｃ、ｌｐｐ、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結因子としては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、リボゾーマルＲＮＡ由来、及びｌｐｐ由来などが挙げられる。このようにＥ．ｃｏｌｉをポリペプチド合成系として用いる場合には、目的ポリペプチドは本発明のＤＮＡを含むベクターの組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉの生育に伴い構成的に、あるいはイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下ＩＰＴＧ）などのポリペプチド合成誘導剤の添加により誘導的に製造される。
【００４３】
上記記載の方法によりｉｎ  ｖｉｖｏで立体選択的アミダーゼを製造できるほか、Ｅ．ｃｏｌｉや小麦胚芽の無細胞蛋白質合成系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでも該アミダーゼを製造することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉではＫｉｇａｗａら［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４４２、１５−１９（１９９９）］、小麦胚芽を用いた該合成系についてはＭａｄｉｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、５５９−５６４（２０００）］の方法に準じて行うことができる。
【００４４】
本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養し、培養物から公知の方法で本発明のアミダーゼを単離精製することができる。
本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
形質転換体の培養物から、本発明のアミダーゼを単離精製するには、前述のように、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のアミダーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４７】
また、本発明のアミダーゼが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該アミダーゼを回収後、該アミダーゼの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がアミダーゼが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該アミダーゼを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００４８】
（IV）本発明のアミダーゼを用いた光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製造
また、本発明は、下記一般式（Ｉ）
【化７】
0004116798.tif 000005
（式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、アルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる置換基により置換されていてもよいアルキル基、又は、Ａが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって、含窒素複素環を形成しうる基であり、Ｒは、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す。）で表されるカルボン酸アミド類に、本発明のアミダーゼ、ポリペプチド又は形質転換体を作用させることにより、（Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、下記一般式（ＩＩ）
【化８】
0004116798.tif 000006
（式中、Ａは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）
【化９】
0004116798.tif 000007
（式中、Ａ及びＲは前記と同義である。）で表される（Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴とする光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類を製造する方法にも関する。
【００４９】
上記一般式（Ｉ）中、置換基Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、アルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる置換基により置換されていてもよいアルキル基、又は、Ａが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成する基であり、形成される含窒素複素環基としては、窒素原子以外のヘテロ原子が含まれていてもよい。
【００５０】
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、１−メチルプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、チオメトキシメチル基、２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル基、２−（３−インドリル）エチル基等の上述の置換基により置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。
【００５１】
また、上記含窒素複素環基として好ましくは５〜７員の含窒素複素環であり、より好ましくは窒素原子を１又は２個含有し、それ以外のヘテロ原子を含有しない含窒素複素環基が挙げられる。上記含窒素複素環基の好ましい具体例としては、ピペリジル基、ピペラジル基、ピラジル基、ピロリジル基が挙げられる。
【００５２】
また、上記含窒素複素環基は反応を阻害しない限りにおいて置換基を有していてもよく、上記置換基の具体例としては、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、アルコキシ基等が挙げられ、このうち好ましくは炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。
【００５３】
上記一般式（Ｉ）中の置換基Ｒとしては、水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示す。
【００５４】
上記アルキル基は、直鎖、分岐鎖或いは環状のアルキル基が挙げられ、このうち好ましくは炭素数１〜６のものであり、上記アリール基としてはフェニル基又はナフチル基が挙げられる。
【００５５】
上記アルキル基又はアリール基の置換基としては、上記Ａの含窒素複素環の置換基として記載したのと同様の基が挙げられる。
【００５６】
上記置換されていてもよいアルキル基又はアリール基として好ましい具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、トリフルオロメチル基、１−ヒドロキシカルボニルエチル基、フェニル基、トリル基、ニトロフェニル基等が挙げられる。
【００５７】
上記Ｒとして好ましくは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は置換基を有するフェニル基であり、より好ましくは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基及びｐ−ニトロフェニル基である。
【００５８】
この製造方法においては、本発明のポリペプチドを蓄積している組み換え体生物、組み換え体生物処理物、本発明のポリペプチドが蓄積した無細胞蛋白質合成系反応液及び／又はその処理物が酵素触媒として反応系に添加される。具体的には、上記組み換え体生物を培養して得られた細胞そのまま、あるいはトルエン、界面活性剤などの有機化合物による処理、凍結乾燥処理、物理的破砕処理など公知の手法にて処理した処理物、上記無細胞蛋白質合成系の反応液、さらには上記組み換え体生物処理物、及び無細胞蛋白合成反応液から本願の立体選択的アミダーゼ活性画分を粗精製画分、又は精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた組み換え体生物、組み換え体生物処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。以下、「高濃度酵素調製物」という用語を、上記組み換え体生物、無細胞蛋白質合成系反応物、それらの処理物、酵素画分、及び固定化物の全ての概念を包含する言葉として用いる。
【００５９】
本反応において、反応原料であるラセミ体のカルボン酸アミド類は、基質濃度が高すぎると酵素が基質阻害を受ける可能性もあるため、通常、０．１ｍＭ−１Ｍの濃度で、より好ましくは１０−１００ｍＭの濃度で反応液に添加する。これらは、反応開始時に一括して添加しても良いが、生成物の蓄積濃度を向上させために連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
【００６０】
本反応は、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合液中で行われ、上記、水性媒体としては、水、あるいは、リン酸カリウム水溶液、トリス−塩酸水溶液等の緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール類；アセトン等のケトン類；テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；トルエン等の芳香族炭化水素類；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ｎ−ヘキサン等脂肪族炭化水素類；ジメチルスルホキシド等の有機化合物が使用できる。
【００６１】
反応液のｐＨはアルカリ状態で反応が好適に進行するが、ｐＨ６．０−９．５であることが好ましく、ｐＨ７．０−９．５がより好ましい。この条件を満たすために、反応中、必要に応じて、希薄な酸またはアルカリ溶液を随時添加してｐＨを希望の範囲に維持することもできる。
【００６２】
反応温度は０−５０℃で反応は進行するが、２５−４５℃で維持することがより好ましい。
【００６３】
また、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を反応液に添加することにより、酵素活性を促進することができる。この場合、ＥＤＴＡは０．００１−１００ｍＭ、より好ましくは０．５−１０ｍＭの濃度で添加される。反応液は必要に応じ攪拌混合される。
【００６４】
上記反応で製造された（Ｓ）体のカルボン酸及び／又は残存した（Ｒ）体のアミド化合物は、溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により単離することができる。
【００６５】
（Ｖ）ランダムリコンビネーションによる新規ポリペプチドの製造
さらに本発明は、配列番号２に表される塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡホモログと、該ＤＮＡと相同性が５０％以上のＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダムに組換えることにより、アミダーゼ活性を有する新しい塩基配列のＤＮＡを取得する方法に関する。
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＤＮＡをランダムに組み換える方法としては、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、３３３−３３４（１９９９）〕において、Ｃｈｅｒｒｙ  Ｊ．Ｒ．らにより報告された方法が挙げられる。
【００６７】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＮＡをランダムに組み換える方法としては、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１０７４７−１０７５１（１９９４）において、Ｓｔｅｍｍｅｒ  Ｗ．Ｐ．Ｃ．らが報告した方法、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、２５８−２６１（１９９８）において、Ｚｈａｏ  Ｈ．らが報告した方法、及びＮａｔｕｒｅ、３９１、２８８−２９１（１９９８）において、Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａ．らが報告した方法が挙げられ、このうちＣｒａｍｅｒｉ  Ａ．らの方法が特には好ましい。
【００６８】
上述の方法に従えば、お互いに相同性の高い、加水分解酵素をコードするＤＮＡを数種用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み換えを行い、新規な加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを取得することが当業者であれば可能である。また、得られたＤＮＡを、本明細書中上記した方法に準じて、好適な発現系に導入して、コードされるポリペプチドを発現させることにより、アミダーゼ活性を有する新規なポリペプチドを製造することが可能である。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
【００６９】
【実施例】
実施例１：立体選択的アミダーゼの単離
シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株を下記の組成を有するＢＭ培地２５．０リットルに接種し、３０℃で１２時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。菌体１２５ｇを超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
【００７０】
【表１】
0004116798.tif 000008
【００７１】
これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂（東ソ−（株）社製）に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、その５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出画分の立体アミダーゼ活性を有する画分を順次硫酸アンモニウムを用いたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（東ソー（株）社製）、Ｇｉｇａｐｉｔｅカラム（生化学工業社製）、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＭｏｎｏＱ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、及び再度Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、そこから得られた活性画分で最終的にグラジエントゲルＮＰＧ−５２０Ｌ（アトー（株）社製）を用いたＮａｔｉｖｅ−電気泳動を行い、活性の存在する部分をゲルから切り出すことにより本発明のポリペプチドを単離した。該ポリペプチドの分子量を決定するべく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）社製）によるサイズ排除クロマトグラフィーにより決定したところ、それぞれ３４０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及び３２０００（サイズ排除クロマトグラフィー）であり、サブユニット構成はモノマーであると推定された。
【００７２】
実施例２：部分アミノ酸配列の解析
実施例１で得られた精製立体特異的アミダーゼをペプチダーゼにより消化し、高速液体クロマトグラフィー条件Ａ（ＨＰＬＣ）により部分ペプチドを２種類分取した。
ＨＰＬＣ条件Ａ；
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）社製）
溶離液：水／トリフルオロ酢酸／アセトニトリルによるグラジエント溶出
流量：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２１０ｎｍ吸光度
得られたペプチド断片及び実施例１により精製したポリペプチドのＮ−末端のアミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサー  ＨＰ  Ｇ１００５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ヒューレットパッカード社製）を用いて分析した。それぞれのアミノ酸配列は、配列番号３、４、５で示される。
【００７３】
実施例３：本発明ＤＮＡの部分断片の取得
シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株を上述のＢＭ培地５．０ｍＬに接種し、３０℃で１２時間培養した。遠心分離により微生物菌体を取得し、フェノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体ＤＮＡを取得した。実施例２で判明したアミノ酸配列から、配列番号６−１０（ＡＦ１、ＢＦ１、ＢＲ１、ＣＦ１、ＣＲ１）のＰＣＲプライマーを設計し、耐熱型ＤＮＡポリメラーゼ存在下これら５種のプライマーのうち任意の２種を添加してＰＣＲを行った。本ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動したところ、プライマーＡＦ１とＣＲ１を用いた反応液に０．２ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングしてＬｉ−ｃｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）塩基配列を決定した（配列番号１１）。上記Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲにより増幅した０．２ｋｂｐの精製ＤＮＡの残りをＲｅｄｉｐｒｉｍｅTMＩＩ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）により標識した。
【００７４】
実施例４：シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３  染色体ＤＮＡライブラリーのサザンハイブリダイゼーション
実施例３記載の方法によりシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３の染色体ＤＮＡを取得した。本ＤＮＡをＦｂａＩで消化した後、実施例３で作製した０．２ｋｂｐの標識ＤＮＡをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。手法はモルキュラークローニング第３版に従い、ハイブリダイゼーションは４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃で行った。その結果、約２ｋｂｐのＤＮＡバンドが検出され、本ＤＮＡをアガロースゲルから抽出精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入した。
【００７５】
実施例５：コロニーハイブリダイゼーション及びサブクローニング
実施例４において得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の形質転換株を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１Ｌの水溶液中にＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ  １０．０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ｇ、塩化ナトリウム  １０．０ｇ、寒天１５．０ｇを含む）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じたコロニーをニトロセルロース膜ＨｙｂｏｎｄTM  ＥＣＬTM（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）にリフティングし、実施例３で取得したＤＮＡプローブを用い、４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、陽性のクローンからプラスミド（ｐＳＴＢ１０）を取得し、Ｌｉ−ｃｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌを用いて、塩基配列を決定した（配列番号１２）。
【００７６】
実施例６：発現用プラスミドの構築
上記実施例５で得られたｐＳＴＢ１０を鋳型として、プライマーＳＴＢ−ＦとＳＴＢ−Ｒ（配列番号１３及び１４）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株）社製）に連結してｐＳＴＢ２０を作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を得た。
【００７７】
実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）からの立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドの精製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これに硫酸アンモニウムを添加し、５０−７０％飽和の硫酸アンモニウム画分を得た。さらにこれを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解・透析後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸着させ、０−２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（直線濃度勾配）で溶出した。目的の活性を含む画分に３０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを用いた疎水カラムクロマトグラフィーを行い、３０−０％飽和硫酸アンモニウムの直線濃度勾配法で溶出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮し精製標品とした。
【００７８】
実施例８：精製立体選択的アミダーゼの酵素学的性質
基質としてＬ−プロリンアミドを用いて、実施例７で取得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響を、加水分解反応により生じるＬ−プロリンをＨＰＬＣで定量することにより行った。至適温度、温度耐性、及び阻害剤の影響についての測定は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）中で行なった。至適ｐＨの測定はｐＨの異なる各種緩衝液中で行なった。反応は３０℃で５分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬＣのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、３分間インキュベートした後、Ｌ−プロリンアミドを添加し３０℃で５分間インキュベーションした後、エタノールの添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ｂを用いて生成したＬ−プロリンの定量をした。
【００７９】
ＨＰＬＣ条件Ｂ
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−５０００（（株）住化分析センター社製）
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭＣｕＳＯ4  水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
その結果を以下の表２及び表３にまとめた。
【００８０】
【表２】
0004116798.tif 000009
【００８１】
【表３】
0004116798.tif 000010
【００８２】
また、本酵素のＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに対するＫｍ及びＶｍａｘも同様に１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で測定した結果、Ｋｍ値、Ｖｍａｘ値はそれぞれ０．５８３ｍＭ、及び８０．９Ｕ／１ｍｇ・ポリペプチドであった（１Ｕは本酵素が１分間に１μｍｏｌｅのＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドを加水分解するのに必要な酵素量である）。
【００８３】
実施例９：基質選択性の検討
実施例７で取得した精製酵素を用いて、基質選択性を検討した。基質化合物は２０ｍＭの濃度で添加し、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中、３０℃で酵素反応し、分析は下記ＨＰＬＣ条件Ｃで行った。
ＨＰＬＣ条件Ｃ；
カラム：Ｓｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−５０００、またはＯＡ−５０００Ｌ（（株）住化分析センター社製）
カラム温度：３０℃
溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度
Ｌ−プロリンアミドに対する活性を１００として、その相対活性を以下の表４に示す。
【００８４】
【表４】
0004116798.tif 000011
【００８５】
本発明のポリペプチドのアミダーゼ活性は、Ｌ−プロリンアミドまたはＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに特に強い活性を示し、その他ピペラジン−２−カルボキサアミド、Ｌ−アラニンアミド、などに弱い活性を示した。また、Ｎ−アルキルアミド化合物に対しても有意な活性を示した。
【００８６】
実施例１０：組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用いた立体特異的アミド加水分解反応
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地３．０ｍＬに接種し、３７℃で１２時間攪拌培養した。３０００×ｇ、１０分の遠心分離により菌体を取得し、３．０ｍＬの０．９％ＮａＣｌで懸濁後、再度同様の遠心分離により菌体を分離した。この菌体を１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、３．６ｍＬの細胞懸濁液を得た。このうち、４００μＬを４００μＬの４０ｍＭラセミ体プロリンアミド、またはラセミ体ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と混合後、３０℃でインキュベートした。２時間後、エタノールで反応を停止し、上記ＨＰＬＣ条件Ｃにおいて、加水分解により生成したプロリンまたはピペラジン−２−カルボン酸の光学純度を測定した。その結果、Ｄ−プロリンまたは（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の生成は全く見られず、Ｌ−プロリンまたは（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボキサミドの光学純度はほぼ１００％であった。
【００８７】
実施例１１：組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用いた（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの加水分解反応
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌体重量を測定し、２００ｍＭのラセミ体−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬにそれぞれ０．２８％、１．４１％、及び２．８３％になるよう添加し３０℃でインキュベートした。一定時間ごとにサンプリングを行い、エタノールで反応を停止後、上記ＨＰＬＣ条件Ｂにより生成したピペラジン−２−カルボン酸の定量及び光学純度の測定を行った。結果を図１に示す。
図１の結果から分かるように、生成した（Ｓ）−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９５．５％ｅ．ｅ．であった。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、含窒素複素環含有カルボン酸アミド類を立体選択的に加水分解する能力を有する新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供される。  本発明のアミダーゼを、カルボン酸アミド類に作用させることにより、医・農薬中間原料として有用なキラルカルボン酸類及び／又はキラルカルボン酸アミド類を製造することが可能になる。
【００８９】
【配列表】
0004116798.tif 000012
【００９０】
0004116798.tif 000013
0004116798.tif 000014
【００９１】
0004116798.tif 000015
0004116798.tif 000016
0004116798.tif 000017
【００９２】
0004116798.tif 000018
【００９３】
0004116798.tif 000019
【００９４】
0004116798.tif 000020
【００９５】
0004116798.tif 000021
【００９６】
0004116798.tif 000022
【００９７】
0004116798.tif 000023
【００９８】
0004116798.tif 000024
【００９９】
0004116798.tif 000025
【０１００】
0004116798.tif 000026
【０１０１】
0004116798.tif 000027
0004116798.tif 000028
0004116798.tif 000029
【０１０２】
0004116798.tif 000030
【０１０３】
0004116798.tif 000031
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用いた（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの加水分解反応の測定結果を示す。
【図１】
0004116798.tif 000032