【手続補正書】
【提出日】平成18年4月25日(2006.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点画像化システムを用いる、複数の表面上でのバイオフィルムの発達を測定する自動化方法であって、該共焦点画像化システムが、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する手段と、
ｂ）バイオフィルムの１以上の面上に該ビームを指向しかつ集束する手段と、
ｃ）該バイオフィルムから放射される電磁放射線を検出する検出デバイスと、
ｄ）該電磁放射線を用いて複数の面において該バイオフィルムをスキャンする走査デバイスと、
を備え、当該方法が、
ｉ）該複数の表面上で該バイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）複数の面において電磁放射線を用いて該バイオフィルムをスキャンして複数の画像を作成することによって、該バイオフォルム内の１以上の蛍光部分の存在を検出する工程と、
ｉｉｉ）コンピューターソフトウェアの制御下にデータ処理システムによって該画像を解析して該バイオフィルムの構造を決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
ａ）前記ビーム形成手段が電磁放射線の細長いビームを生じ、該ビームは１以上の波長を含み、かつ放射線が伝搬する光学軸に対して横向きに伸び、
ｂ）前記指向しかつ集束する手段が、前記バイオフィルムが位置する第一の面における第一の細長い領域上に該細長いビームを集束して、１以上の第二の細長い領域上に該バイオフィルムから放射された電磁放射線を指向し、各々の第二の細長い領域は、該第一の面に接合する異なる第二の面上であり、
ｃ）該第二の接合面の少なくとも１つにおいて、又は該第二の接合面の少なくとも１つに接合する第三の面において、前記検出デバイスが、検出エレメントの長方形のアレイを備え、その上に対象物から放射された電磁放射線が同時発生し、
ｄ）前記走査デバイスが、該バイオフィルムに対して該細長いビームを動かすことによって、又は該細長いビームに対して該バイオフィルムを動かすことによって該バイオフィルムをスキャンし、その結果、該照射された電磁放射線が、検出エレメントの長方形のアレイに送達されて、該検出デバイスによって、該放射された電磁放射線を代表する複数の電気的シグナルに、該走査と同調して変換される、
方法。
【請求項３】
前記工程ｉｉｉ）の画像解析を行なう前に、各々の画像を修復する工程をさらに包含する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
生成された電磁放射線のビームが、３５０〜７００ｎｍの範囲に１以上の波長を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
複数の時点で、前記バイオフィルムの発達を測定する工程をさらに包含する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光部分が、遺伝子の産物である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｉ、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群より選択される１以上の変異を有する改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記改変ＧＦＰが、Ｆ６４Ｌ−Ｖ１６３Ａ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｓ１７５Ｇ及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｖ１６３からなる群より選択される３つの変異を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光部分が、バイオフィルム内の環境変化又は酵素活性をモニタリングし得るバイオセンサーである、請求項６乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光部分が、化合物上で酵素の作用によって生成される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、βガラクトシダーゼ、ニトロリダクターゼ、アルカリホスファターゼ、及びβラクタマーゼからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
当該方法が、検出工程ｉｉ）を実行する前に前記バイオフィルムに対して蛍光化合物を加える工程をさらに包含する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光化合物が、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  ６３３  ＤＲＡＱ５、Ａｌｅｘａ  ４８８、アクリドン、キナクリドン、蛍光標識されたタンパク質、蛍光標識されたレクチン及び蛍光標識された抗体からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光化合物が、前記バイオフィルム内の環境変化をモニタリングし得る、請求項１３又は請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記表面が容器を形成する、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記容器がマイクロタイタープレートである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
当該方法が、前記バイオフィルム内の微生物クラスターのサイズを決定し得る、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
当該方法が、前記バイオフィルムの３次元構造を決定し得る、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
当該方法が、前記バイオフィルム内の微生物クラスターの間の距離の分布を決定し得る、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
当該方法が、前記バイオフィルムの構造内の微生物クラスターの配向を決定し得る、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
当該方法が、前記バイオフィルムの構造内の任意のチャネルの存在及びサイズを決定し得る、請求項１乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
当該方法が、前記バイオフィルムの構造内の前記チャネルと他の任意のチャネルとの接続性を決定し得、これによってチャネルのネットワークを規定し得る、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
当該方法が、前記チャネルネットワークのフラクタル次元を決定し得る、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオフィルムが、光学的に識別可能な微生物集団を含む、請求項１乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオフィルムが、遺伝子的に識別可能な微生物集団を含む、請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
当該方法が、前記集団の空間的分布を決定し得る、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
ｉ）該試験薬の存在下で請求項１乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法を決定する工程と、
ｉｉ）該試験薬の存在下でのバイオフィルムの発達と、該試験薬の非存在下でのバイオフィルムの発達について公知の値とを比較する工程とを包含し、
該試験薬の存在下での該バイオフィルムの発達と、該試験薬の非存在下での該公知の値との差異が、該バイオフィルムの発達の際の該試験薬の効果の指標である、方法。
【請求項２９】
前記公知の値が電子的データベース又は光学的データベースに記録される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
ｉ）容器中の該試験薬の存在下及び非存在下でバイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）請求項１乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法に従ってバイオフィルムの発達を測定する工程とを包含し
該因子の有無による該バイオフィルムの発達の差異が、該バイオフィルムの発達の際の該試験薬の効果の指標である、方法。
【請求項３１】
前記試験薬の有無によるバイオフィルムの発達における活性の差異が正規化され、光学的又は電子的に記憶され、参照化合物の値と比較される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記試験薬が前記バイオフィルム内の遺伝子発現に影響する、請求項２８乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記試験薬が前記バイオフィルム内の特定の微生物集団の遺伝子発現に選択的に影響する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記試験薬がバイオフィルムの発達を阻害する、請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記試験薬が前記バイオフィルムの発達を促進する、請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記試験薬が、電磁放射線、イオン化放射線、電場、音響エネルギー及び磨耗からなる群より選択される物理的因子である、請求項２８乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記試験薬が、蛍光化合物又は蛍光標識された化合物であり、それによってそのバイオフィルム全体にわたる分布の測定を容易にする、請求項２８乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記試験薬が、有機化合物、無機化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群より選択される、請求項２８乃至請求項３５又は請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
バイオフィルムの発達を測定するための請求項１乃至請求項３８のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項４０】
蛍光画像化システムを用いる、スキャンされる対象物の３次元構造を解析する方法であって、該蛍光画像化システムが、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する放射線源システムと、
ｂ）該対象物の１以上の面上に該ビームを指向しかつ集束する光学的システムと、
ｃ）該対象物から放射された電磁放射線を検出し、画像化データを作成する検出システムと、
ｄ）電磁放射線を用いて複数の面において該対象物をスキャンする走査システムとを備え、
当該方法が、複数の面において対象物をスキャンして複数の画像を含む画像データを作成し、該対象物の３次元構造に関連するデータを決定するために該画像データを処理する工程を包含し、当該方法が、自動化された画像データ閾値化工程を包含し、該閾値化工程は、
ｉ）該画像データにおける強度値を解析する工程と、
ｉｉ）該画像データについての閾値を算出する工程と、
ｉｉｉ）該閾値を用いて該画像データを処理して、閾値画像データを作成する工程とを包含する、方法。
【請求項４１】
当該方法の工程ｉ）が、前記画像データにおける強度値の統計学的特性を計算するように構成される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
当該方法が、統計学的特性の計算の間に強度ヒストグラムを算出するように構成されるとともに、閾値を算出する工程の間に該閾値を算出するために強度ヒストグラムを用いるように構成される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
当該方法が、統計学的特性の計算の間に平均強度及び／又は強度の標準偏差を算出するように構成される、請求項４１又は請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記閾値画像データが二値画像データである、請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記画像データ閾値化工程が、少なくとも１つのバリデーション規則を記憶する工程と、該少なくとも１つのバリデーション規則を用いて該閾値化された画像データをバリデートする工程とをさらに包含する、請求項４０乃至請求項４４のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像を形成する画素の総数に関する規則を包含する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像の予め決定された一部を形成する多数の画素に関する規則を包含する、請求項４５又は請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、多数の個々に単離された画素に関する規則を包含する、請求項４５乃至請求項４７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、閾値を上回るか又は下回るように設定された画素の割合に関する規則を包含する、請求項４５乃至請求項４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
前記画像データ処理が、画像データ修復工程を有し、該修復工程が、該画像データ閾値化工程を実施する前に該画像データを修復する工程を包含する、請求項４０乃至請求項４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
前記対象物がバイオフィルムである、請求項４０乃至請求項５０のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
当該方法が、試験薬の有無によるバイオフィルムの発達における活性の差異を比較するように適合される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
蛍光画像化システムを用いてスキャンされる対象物の３次元構造を解析するためのコンピューターソフトウェアであって、該蛍光画像化システムが、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する放射線源システムと、
ｂ）該対象物の１以上の面上に該ビームを指向しかつ集束する光学的システムと、
ｃ）該対象物から放射された電磁放射線を検出し、画像化データを作成する検出システムと、
ｄ）電磁放射線を用いて複数の面において該対象物をスキャンする走査システムとを備え、
当該コンピューターソフトウェアが、複数の面において対象物をスキャンして複数の画像を含む画像データを作成するスキャンシステムを制御するソフトウェアステップと、該対象物の３次元構造に関連するデータを決定するために該画像データを処理するソフトウェアステップとを実行するように構成され、かつ、自動化された画像データ閾値化ステップを実行し、該閾値化ステップが、
ｉ）該画像データにおける強度値を解析するステップと、
ｉｉ）該画像データについての閾値を算出するステップと、
ｉｉｉ）該閾値を用いて該画像データを処理して、閾値画像データを作成するステップとを包含する、コンピューターソフトウェア。
【請求項５４】
当該コンピューターソフトウェアが、ステップｉ）において画像データにおける強度値の統計学的特性を計算するように構成される、請求項５３記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項５５】
当該コンピューターソフトウェアが、統計学的特性の計算の間に強度ヒストグラムを算出するように構成されるとともに、閾値を算出するステップの間に該閾値を算出するために強度ヒストグラムを用いるように構成される、請求項５４記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項５６】
当該コンピューターソフトウェアが統計学的特性の計算の間に平均強度及び／又は強度の標準偏差を算出するように構成される、請求項５４又は請求項５５記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項５７】
前記閾値画像データが二値画像データである、請求項５３乃至請求項５６のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項５８】
前記画像データ閾値化ステップが、少なくとも１つのバリデーション規則を記憶するステップと、該少なくとも１つのバリデーション規則を用いて該閾値化された画像データをバリデートするステップとをさらに包含する、請求項５３乃至請求項５７のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項５９】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像を形成する画素の総数に関する規則を包含する、請求項５８記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６０】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像の予め決定された一部を形成する多数の画素に関する規則を包含する、請求項５８又は請求項５９記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、多数の個々に単離された画素に関する規則を包含する、請求項５８乃至請求項６０のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、閾値を上回るか又は下回るように設定された画素の割合に関する規則を包含する、請求項５８乃至請求項６１のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６３】
前記画像データ処理が、画像データ修復ステップを有し、該修復ステップが、該画像データ閾値化ステップを実施する前に該画像データを修復するステップを包含する、請求項５３乃至請求項６２のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６４】
前記対象物がバイオフィルムである、請求項５３乃至請求項６３のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６５】
当該コンピューターソフトウェアが、試験薬の有無によるバイオフィルムの発達における活性の差異を比較するように適合される、請求項６４記載のコンピューターソフトウェア。
【請求項６６】
請求項５３乃至請求項６５のいずれか１項記載のコンピューターソフトウェアを記憶するデータキャリア。