【手続補正書】
【提出日】平成18年8月10日(2006.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列と、（ｂ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の相補体と、（ｃ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆相補体と、（ｄ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆配列と、（ｅ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも４０％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｆ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも６０％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｇ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも７５％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｈ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、少なくとも９０％同一のヌクレオチドを有する配列と、（ｉ）上記の（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の２００マーのヌクレオチド配列と、（ｊ）上記の（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の１００マーのヌクレオチド配列と、（ｋ）上記の（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の４０マーのヌクレオチド配列と、（ｌ）上記の（ａ）ないし（ｄ）に列挙された配列の２０マーのヌクレオチド配列とからなるグループから選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドにエンコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列識別番号第６８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番の配列と、（ｂ）（ａ）の配列に対し少なくとも５０％同一の残基を有する配列と、（ｃ）（ａ）の配列に対し少なくとも７０％同一の残基を有する配列と、（ｄ）（ａ）の配列に対し少なくとも９０％同一の残基を有する配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリペプチドをエンコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡコンストラクトを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項７】
５’から３’の方向に、（ａ）遺伝子プロモーター配列と、（ｂ）請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドの少なくとも機能性のある部分をコードするオープン・リーディング・フレームと、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
オープン・リーディング・フレームはセンス方向である、請求項７に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
オープン・リーディング・フレームはアンチセンス方向である、請求項７に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーション配列は植物宿主で機能性がある、請求項７に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１１】形質転換細胞の同定用のマーカーを含む、請求項７に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１２】５’から３’への方向に、（ａ）遺伝子プロモーター配列と、（ｂ）請求項１ないし６及び９のいずれか１つの単離されたポリヌクレオチドのノンコーディング領域と、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項１３】
ノンコーディング領域はセンス方向である、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１４】
ノンコーディング領域はアンチセンス方向である、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１５】
遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーション配列は植物宿主において機能性がある、請求項１２に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１６】
請求項７ないし１５のいずれか１つのＤＮＡコンストラクトを含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物あるいはその部分、零余子又は子孫。
【請求項１８】
植物は木本植物である、請求項１７に記載の植物。
【請求項１９】
植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
請求項７ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコンストラクトを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物の細胞シグナル伝達を改変するための方法。
【請求項２１】
植物は木本植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）トランスジェニック細胞を提供するために請求項７ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換することと、（ｂ）再生及び成熟した植物の成長に導く条件下で前記トランスジェニック細胞を培養することを含む、細胞シグナル伝達を改変された植物を作出する方法。
【請求項２４】
植物は木本植物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項７ないし１５のいずれか１つに記載のＤＮＡコンストラクトを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物のポリペプチドの活性を改変するための方法。
【請求項２７】
植物は木本植物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
植物はユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スイートゴム、チーク及びマホガニーの種からなるグループから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に列挙されたヌクレオチド配列の１０個の連続した残基と相補的な少なくとも１０個の連続した残基を含む、単離されたオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー。
【請求項３０】
請求項２９に記載の複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含むキット。
【請求項３１】
複数のポリヌクレオチドを記録した記録媒体であって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは請求項１に列挙されたヌクレオチド配列を含む、記録媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、環境の変化のような外界からの信号及び発生過程での合図に対する植物細胞の応答を改変することに関する。より具体的には本発明は、植物細胞膜に内在し細胞のシグナル伝達の過程を媒介するポリペプチドをエンコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００２】
本発明の背景
植物はその生涯にわたり所定の発生プログラムを経て成長する。この点は特に胚発生と花の発生において顕著である。植物の特定の細胞によって産生され、他の細胞、特に分裂組織領域での細胞が応答準備を整えている、さまざまなシグナル分子が存在する。これらのシグナル分子は、他と全く別な、例えば花や子葉の形成につながる発生プログラムを、特定の時に開始する引き金となる。前記のプログラム化された発生経路に加えて植物は、温度変化、日照量、水分補給の可能性、機械的な損傷による創傷及び病原体による攻撃のような、さまざまな環境的な刺激に曝されている。光、熱、寒冷、乾燥等への曝露のような環境的因子は、環境シグナルへの適切な応答及びこれを通じての植物の健全な発生に必須な、遺伝子の発現及びタンパク質その他の化合物の合成を活性化する。これらの応答は、発生経路と同様にシグナル分子により媒介される。
【０００３】
これらのシグナル分子に応答するために植物細胞は細胞シグナルの検出器、調節器及び／又は変換器としての役割を果たす表面受容体タンパク質を産生する。シグナルの細胞内伝達は、正常発生のため又は環境からの挑戦に対抗するために適切な細胞の応答を誘発する遺伝子の転写において頂点に達する、分子のリン酸化カスケードを介してしばしば伝えられる。
【０００４】
受容体タンパク質の１つの大きなクラスは１回膜貫通型ファミリーで、これにはいくつかのサブクラスがある。これらのタンパク質は、細胞外シグナル（又はリガンド）の認識／結合ドメインと、細胞膜を１回貫通するドメインと、通常はタンパク質キナーゼである細胞内のシグナル伝達ドメインとの３つのドメインが特徴である。全てではないが多くの植物の１回膜貫通型タンパク質は受容体様キナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＲＬＫ）として知られるサブクラスに属する。植物ＲＬＫの細胞内キナーゼドメインは全てセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであるが、ＲＬＫの細胞外ドメインは異なるタイプである。ＲＬＫの１つのタイプは、自家受粉を阻害する自家不和合性座位糖タンパク質（ｓｅｌｆ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ−ｌｏｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）において最初に記載された細胞外Ｓドメインの存在が特徴である。Ｓドメインは他の保存された残基と組み合わせられた１０個のシステイン残基の配列（ａｒｒａｙ）により認識される。別のクラスのＲＬＫは、タンパク質−タンパク質間相互作用に関与するロイシン含量の高い繰り返し配列（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ、ＬＲＲ）により識別される細胞外ドメインを有する。リガンドの細胞外ドメインへの結合に続いて受容体の２量体化、自己リン酸化及びシグナルの核への伝達に役立つ一連の細胞内タンパク質の活性化が起こる。植物のＲＬＫの構造は動物の細胞シグナル伝達経路に見られる受容体と非常に類似している。
【０００５】
植物ＰＬＫの１つの例は、植物の病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ  ｒａｃｅ  ６に対する耐性を与えるＸａ２１遺伝子である。この遺伝子はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌感受性と耐性のイネの系統を比較する遺伝的な手段を用いてクローン化され（Ｓｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８０４−１８０６、１９９５）、その後シロイヌナズナにおいてもＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌への耐性を与えることが示された。１０２５個のアミノ酸からなるこのタンパク質は、アミノ末端の２３個のアミノ酸残基のシグナルペプチドを含む既知タンパク質ドメインと類似する多数の特徴を示し、このタンパク質は形質膜に局在することを表す。８１番目から６３４番目のアミノ酸は２４個のアミノ酸のＬＲＲの２３回の不完全な繰り返し（ｃｏｐｙ）を含む。６５１番目から６７６番目のアミノ酸は膜貫通ドメインを形成する可能性のある２６個のアミノ酸の疎水性セグメントをエンコードする。Ｃ末端アミノ酸はタンパク質キナーゼに典型的な１５個の不変の（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）アミノ酸からなる１１個のサブドメインを含む細胞内セリンスレオニンキナーゼドメインと予測されるものを含む。サブドメインＶＩ及びＶＩＩＩはセリンスレオニンリン酸化の特異性を表す。Ｘａ２１はシロイヌナズナの受容体様キナーゼタンパク質ＲＬＫ５及びＴＭＫ１のような、他のＲＬＫと類似性が高く、ＬＲＲ及びタンパク質キナーゼの両ドメインの保存が見られる。Ｘａ２１がその病原体認識シグナルをいかなるタンパク質に伝達するかは不明である。
【０００６】
植物細胞で発現される膜受容体分子の別のファミリーは、ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）である。ＨＫは、２要素（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）シグナルシステムの一方の片割れとなる、細菌のシグナル伝達系においてしばらく前から知られてきた。細菌のＨＫは浸透圧調整物（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）、栄養素及び毒物の変化のような細胞外シグナルに対する検出器分子として役立つ。ＨＫはリガンドの結合に反応してヒスチジン残基に自己リン酸化する。このホスホヒスチジンは自らのリン酸基を応答調節体（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、ＲＲ）として知られる２要素システムの第２の構成要素のアスパラギン酸基に供与する。リン酸化されたＲＲは配列特異的にＤＮＡに結合し、前記細胞外刺激に対する応答を媒介するタンパク質をコードする特異的な遺伝子を直的的に活性化する役割を果たす。一定の場合にはＨＫは複合的な構造を有する。具体的には、これらのタンパク質はＲＲドメインをカルボキシル末端に含む。ＨＫのホスホヒスチジンはそのリン酸基をこのＲＲドメインの活性部位のアスパラギン酸残基に転移する。これらの場合においては、前記ＲＲドメインは膜に結合しているため、シグナルはＲＲがＤＮＡに結合することにより直接的に伝達されることはありえない。かわりに、ヒスチジンリン酸転移（ＨＰｔ）タンパク質がさらにシグナルを伝達するのに役割を果たす。複合的なＨＫ／ＲＲタンパク質のホスホアスパラギン酸はリン酸基をＨＰｔタンパク質の活性部位ヒスチジンに供与する。このＨＰｔのホスホヒスチジンは今度はリン酸基を真のＲＲに供与し、その後ＲＲは外界のシグナルに反応して遺伝子発現を活性化させる。
【０００７】
細菌と同様に植物細胞は検出器の要素を持つＨＫとＲＲとからなる２要素シグナル伝達システムを有する。さらに、カルボキシル末端にＲＲドメインを持つ複合的なＨＫタンパク質（以下ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質という）は細菌と植物の両方に見いだされる。ＨＫタンパク質は特異的な順序で生起する良く保存されたアミノ酸モチーフにより識別される。アミノ末端から前記の保存された領域はＨ、Ｎ、Ｇ１、Ｆ及びＧ２ボックスとして識別される。これらのモチーフは通常は前記タンパク質の２００ないし２５０個のアミノ酸の範囲に見いだされる。細菌におけるのと同様に、細胞外シグナルを受け取るとＨＫはＨボックスに含まれるヒスチジン残基を自己リン酸化する。このリン酸基はその後前記ＲＲに転移される。代替策として、一部のＨＫは自らのヒスチジン残基を構成的に自己リン酸化し、この活性は細胞外シグナルの結合により抑制される。全てのＨＫはシグナル伝達の絶対的な（ｏｂｌｉｇａｔｅ）一部としてＲＲをリン酸化すると信じられている。ＲＲはＨＫのホスホヒスチジンによりリン酸化されるアスパラギン酸とリジン残基との絶対的な保存が特徴である。細菌とは異なり、植物のＲＲはＤＮＡと直接は結合しないことが示されている。むしろ、今日までに調べられた全ての植物のＲＲは、一見してシグナルをタンパク質キナーゼカスケードに伝達するようであり、ついにはこのカスケードが転写因子をリン酸化して遺伝子発現を活性化するか不活性化するかのいずれかをする。細菌と同様に、植物はタンパク質のカルボキシル末端にＲＲドメインを含む複合的ＨＫをも含む。この観察にもとづいて予測されるように、植物ゲノムはＨＰｔ遺伝子も有することも見いだされている。しかし、いずれかの植物ＨＰｔタンパク質が複合的ＨＫあるいは可溶性のＲＲとの間で相互作用していることは未だに直接示されてはいない。
【０００８】
エチレン受容体（ＥＴＲ１、Ｃｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：５３９−５４４、１９９３）は最も周知の植物の２要素シグナル伝達システムである。エチレンは受精の調整、老化、暗／光形態形成及び病原体と機械的な損傷に対する応答とともに植物の発生の調節に関与する周知のシグナル分子である。エチレン受容体はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質である。前記シグナルはＲａｆ類似タンパク質キナーゼであるＣＴＲ１タンパク質を介して伝達される。ＣＴＲ１はシグナル伝達経路の下流のステップの負の調節因子である。この経路の詳細は未だ明らかではないが、ＨＫはエチレン非存在下で構成的に活性があり、そして常にＣＴＲ１をリン酸化し、ＣＴＲ１はエチレン応答経路の他の遺伝子を抑制する。エチレンのＥＴＲ１への結合は前記受容体のＨＫ機能を阻害し、エチレンシグナル伝達カスケードの下流のタンパク質の活性化を可能にする。これはエチレン応答遺伝子の活性化で頂点に達する。
【０００９】
植物成長調節因子サイトカイニンに応答して誘導されるＩＢＣ６とＩＢＣ７という２個のＲＲ遺伝子が、最近シロイヌナズナからクローン化され解析された（ＢｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒとＫｉｅｂｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：１００９−１０１９、１９９８）。ＩＢＣ６とＩＢＣ７は植物におけるサイトカイニンシグナルの伝達に関与するらしい。ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＣＫＩ１をエンコードする遺伝子（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９８２−９８５、１９９６）がトランスジェニック植物で異所的に発現されたときにサイトカイニン様の効果を生じる事実に照らしてこれは特に興味深い。したがって２要素ＨＫ／ＲＲシステムはサイトカイニンシグナル伝達に関与することもあり得るようである。サイトカイニンは、栄養代謝、葉の伸長と老化及び側方分枝のような生理学的な事象を含む植物の成長と発生を調節することが知られている。
【００１０】
植物細胞シグナル伝達に関与するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドは一定の植物種については単離されてきたが、多くのかかるタンパク質をエンコードする遺伝子は広範囲の植物種において未だ同定されていない。そこで、この技術分野における細胞シグナル伝達の改変に有効に用いられる材料についての必要性はまだある。
【００１１】
発明の概要
簡潔には本発明は、ユーカリとマツから単離され細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを、かかるオリゴヌクレオチド及びポリペプチドの利用方法とともに提供する。かかるポリペプチドは検出器−調節器又は受容体キナーゼとして機能する。前記の単離されたポリヌクレオチドとポリペプチドは、植物の成長及び発生のにおいてかあるいは病原体又は環境因子を原因とするストレス条件下かのいずれかでの植物細胞応答の改変に有効に用いられる。
【００１２】
第１の局面では本発明は、ＲＬＫ、ＨＫ、ＲＲ、ＨＰｔ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質をエンコードする、ユーカリとマツから入手可能な単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。１の実施態様では、前記単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列、（ｂ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆相補体、（ｄ）配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列の逆配列及び（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）の配列と以下に定義されるところにより４０％、６０％、７５％又は９０％同一である配列を有する配列からなるグループから選択されたＤＮＡ配列を含む。
【００１３】
さらなる局面では、本発明のＤＮＡ配列にエンコードされた単離されたポリペプチドが提供される。ある実施態様ではかかるポリペプチドは配列識別番号第６８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の局面では本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトを単独でか、ここで開示される１以上のポリヌクレオチドとの組合せあるいは１以上の既知のＤＮＡ配列との組合せで、かかるコンストラクトを含むトランスジェニック細胞とともに提供する。
【００１５】
関連した局面では本発明は、５’から３’の方向に、遺伝子プロモーター配列、本発明のポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リーディング・フレーム及び遺伝子ターミネーション配列を含むＤＮＡコンストラクトを提供する。前記オープン・リーディング・フレームはセンス方向又はアンチセンス方向に配列されてもよい。上記のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素をコードする遺伝子の、ノンコーディング領域又はノンコーディング領域に相補的なヌクレオチド配列を、遺伝子プロモーター配列と遺伝子ターミネーター配列とともに含む遺伝子コンストラクトも提供される。遺伝子プロモーターとターミネーション配列は宿主植物で機能するものであることが好ましい。遺伝子プロモーターとターミネーション配列は本来の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）遺伝子のものが最も好ましいが、その他のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモーターのような本発明の技術分野で一般に用いられるものも、Ｋｏｚａｋ配列又はオメガエンハンサーのようなエンハンサー及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子のターミネーターとともにあるいは単独で、本発明において有効に利用できる。組織特異的なプロモーターは１以上の所望の組織を標的として発現させるための用いられる。ＤＮＡコンストラクトはさらに形質転換細胞の同定のためのマーカーを含むこともある。
【００１６】
さらなる局面では、本発明のＤＮＡコンストラクトを含むトランスジェニック細胞、好ましくは植物細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む生物、好ましくは植物と、かかる植物の果実、種子その他の生産物、由来物あるいは子孫とともに提供される。かかるトランスジェニック植物の零余子（むかご、ｐｒｏｐａｇｕｌｅ）も本発明に含まれる。ここで用いられる「零余子」という語は挿し木を含む有性的あるいは無性的な繁殖又は増殖に利用される植物のいかなる部分をも意味する。
【００１７】
さらに別の局面では、植物のような標的生物における細胞シグナル伝達を改変するための方法であって、本発明のＤＮＡコンストラクトを該植物のゲノムに安定的に取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様においては標的植物は木本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるものが好ましく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択されるものが最も好ましい。関連した局面では、細胞シグナル伝達の改変された、植物のような標的生物を作出するための方法であって、トランスジェニック細胞を提供するために本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換することと前記トランスジェニック細胞を再生及び成熟植物の成長に導く条件下で培養することとを含む方法が提供される。
【００１８】
又更なる局面では本発明は、本発明のＤＮＡコンストラクトを植物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物のような標的生物におけるポリペプチドの活性を改変するための方法を提供する。好ましい実施態様においては、標的植物は木本植物であり、ユーカリとマツの種からなるグループから選択されるものが好ましく、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択されるものが最も好ましい。
【００１９】
以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の上記の及びさらなる特徴及びその入手法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示された全ての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも各々が個別に取り込まれたかのごとくに取り込まれる。
【００２０】
詳細な説明
本発明は植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードする単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。上記の通り細胞シグナル伝達は、植物の成長と発生及び環境因子と病原体のような外界刺激に対する細胞の応答に重大な役割を果たすことが知られている。そこで、細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することは、細胞の増殖、分化、伸長及び生存、疾病抵抗性及び栄養代謝のような性質を改変するために利用される。
【００２１】
例えばハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＥＴＲ１は、エチレンシグナル伝達に関与することが知られている。したがってＥＴＲ１の発現の改変は、果実の熟成のようなエチレンで調節される生理学的な性質及び葉と花の老化を改変することにつながる。そこでトランスジェニック植物におけるこのタンパク質の発現の改変は、老化の遅延により切り花の有効期間（ｕｓｅｆｕｌ  ｌｉｆｅ）を延長するために用いられる。さらにＥＴＲ１の発現の改変は、生殖器官の老化を選択的に促進するために用いられ、工学的な不稔植物の作出をもたらす。
【００２２】
ハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質ＣＫＩ１はサイトカイニンのシグナル伝達に関与するとされてきた。このタンパク質の過剰発現は突然変異植物でサイトカイニン様の効果をもたらすことが知られている。サイトカイニンは、生理学的現象の中でも側方分枝、発現の伸展（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、細胞分裂、栄養の分配及び老化の遅延に重要な役割を果たすことが示されてきた。したがってＣＫＩ１の発現の改変は、例えば選択された細胞タイプ又は器官での老化の遅延をもたらす。これは収穫から消費までの果実と野菜の貯蔵期間を延長することにつながる。代替策としてＣＫＩ１の発現の改変は、林産木種での分枝頻度を減少させるのに用いられて、堅い木の家具と合板用の節のない無傷の（ｃｌｅａｒ）長い材木を得ることにつながる。
【００２３】
本発明の方法と材料を用いて、ポリペプチドをエンコードする遺伝子の追加のコピーを植物のような標的生物のゲノムに取り込むことにより、特定の植物細胞ポリペプチドの量を増加又は減少させることができる。同様に、かかる遺伝子のアンチセンスコピーで標的生物を形質転換することによりポリペプチドを増加又は減少させることもできる。
【００２４】
１の実施態様では本発明は、細胞シグナル伝達に関与する植物ポリペプチドをエンコードし又は部分的にエンコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ユーカリとマツ由来のポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第２、８、９、１１、１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３０１、４４８−４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、２０、２６−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７、８７５−８８１及び８８８番）のＲＬＫをエンコードする単離ポリヌクレオチドと、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来（配列識別番号第４２、４８−５２、５５−５８、６７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５７番）及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来（配列識別番号第４３−４７、５３、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番）の２要素シグナル伝達システムの少なくとも１つの構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質）をエンコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。かかる単離ポリヌクレオチドの相補体、かかる単離ポリヌクレオチドの逆相補体及びかかる単離ポリヌクレオチドの逆配列も以下に定義するかかる配列の変異体とともに提供される。
【００２５】
別の実施態様では本発明は、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされた単離されたポリペプチドを提供する。配列識別番号第１−５９、６３、６４、６６、６７、１３１−４８１、８３３−８４８、８５１及び８５３−８８８番のＤＮＡ配列にエンコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列識別番号第６８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番に提供される。そこで一定の実施態様では本発明のポリペプチドは、第６８ないし１３０、４８２ないし８３２、８８９ないし９４５番からなるグループから選択されたアミノ酸配列とその変異体を含む。
【００２６】
ここで開示されるポリペプチドは、林産植物資源、主にＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａに由来した。本発明のポリヌクレオチドの一部は、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を意味しないという点で、「部分的な（ｐａｒｔｉａｌ）」配列である。ここで用いられる「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、本発明の部分的な単離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列にエンコードされたポリペプチドを含む。かかる部分配列は、プライマー及び/又はプローブと周知の雑種形成技術及び/又はＰＣＲ技術とを用いて様々なＤＮＡライブラリを分析し配列決定することにより拡張できる。部分配列は、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドを発現可能な遺伝子あるいは別のゲノムの有用な部分が同定されるまで拡張できる。完全長ポリヌクレオチド及び遺伝子を含むかかる拡張配列は、前記拡張配列が同定された配列又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つの連続した部分（ｘ−マー）又はその変異体を含むとき、ここで開示された配列又はその変異体あるいはここで開示された配列の１つの部分又はその変異体に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」と記載される。同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス配列等は、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて決まり切った手順で（ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ）確認し取得することができる。
【００２７】
上記の通りここに開示されたポリヌクレオチドは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）又はポリペプチドをエンコードする部分的なオープン・リーディング・フレームを含む。さらにポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として提示された配列に対応する拡張配列又は完全長配列の中に同定できることもある。オープン・リーディング・フレームは当業者に周知の技術を用いて同定できる。これらの技術は、例えば既知の開始及び終了コドンの位置の解析、コドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定その他これらに類するものを含む。ＯＲＦ解析のために適当なツールとソフトウェアは、例えばインターネット上ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌで入手可能である。オープン・リーディング・フレーム及びオープン・リーディング・フレームの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）は本発明のポリヌクレオチドの中に同定できる。ひとたび部分的なオープン・リーディング・フレームが同定されると、ポリヌクレオチドは、完全なオープン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドが同定できるまで、当業者に周知の技術を用いて部分オープン・リーディング・フレームの領域を拡張することができる。よって、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは本発明のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
【００２８】
ひとたびオープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチドで同定されると、該オープン・リーディング・フレームは単離及び/又は合成できる。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当なプロモーター、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能なＤＮＡコンストラクトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類等を含む様々な前核及び真核細胞を含む。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドは、その生物活性を決定するために発現され様々な分析法に使用される。かかるポリペプチドは抗体作成に、相互作用する相手の蛋白質又はその他の化合物の単離に及び相互作用する蛋白質又はその他の化合物のレベルの定量的な測定に用いることができる。
【００３０】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基の１本鎖又は２本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ及び対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子でＨｎＲＮＡとｍＲＮＡ分子を入れたＲＮＡ分子とを含み、全合成又は部分合成されたポリヌクレオチドとともにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組み換えＤＮＡを含む。ＨｎＲＮＡはイントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍＲＮＡはイントロンが切り出されたＨｎＲＮＡ及びＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは遺伝子全体又はその部分を含む。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、「ポリヌクレオチド」の定義は全てのかかる操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドが関与する技術は当業者に周知で例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５４（２３）：３６３−３７５、１９９５及びＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ  ２０（８）：８３６−８４８、１９９６に記載される。
【００３１】
ここで使用されたところの「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明のポリペプチドは、精製された天然物であっても、組み換え技術又は合成技術を用いて部分的にあるいは全面的に生産されてもよい。
【００３２】
ここで記載されたポリヌクレオチドとポリペプチドの全ては当業者に慣用される条件で単離精製される。
【００３３】
ここで使用されたところの「相補体」、「逆相補体」、及び「逆配列」という用語の定義は以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に対して、相補体、逆相補体及び逆配列は以下の通りである。
相補体                ３’ＴＣＣＴＧＧ５’
逆相補体              ３’ＧＧＴＣＣＴ５’
逆配列                ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００３４】
ここで使用されるところの「変異体」という用語は、約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらにより好ましくは約７５％以上、最も好ましくは約９０％以上本発明の配列と同一性を示す（ヌクレオチド又はアミノ酸のいずれかの）残基をいう。同一性の百分率は、以下に記載の通り比較する２つの配列のアライメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基の数を決定し、該同一残基の数を本発明の又はクエリーの配列中の全長で除算し、その結果を１００倍したものをいう。
【００３５】
公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のアライメントをとることもでき、特定の領域の同一ヌクレオチドの百分率を別の配列に対して決定することもできる。ポリヌクレオチド配列のアライメントと類似性同定とのための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の同一性の百分率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。前記ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰの両方のソフトウェアとも、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズムとともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７の刊行物とに記載されている。コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上のｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／で入手可能である。説明書に記載され、アルゴリズムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定された、１９９８年８月のバージョン３．１ｔ１１を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲとＬｉｐｍａｎ  ＤＪのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８、１９８８と、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８、１９９０とに記載される。
【００３６】
以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列の以下に説明するＥ値（Ｅ  ｖａｌｕｅｓ）及び同一性百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアライメント及び類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）のランニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ  ｐ  ｂｌａｓｔｎ  ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  ｅ  １０  Ｇ  ０  Ｅ  ０  ｒ  １  ｖ  ３０ｂ  ３０    ｉ    ｑｕｅｒｙｓｅｑ  ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」、パラメーターは以下の通りである。
ｐ    プログラムの名称  ［文字列］
ｄ    データベース  ［文字列］
ｅ    期待値  （Ｅ）  ［実数］
Ｇ    ギャップを空けるためのコスト  （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］
Ｅ    ギャップを拡張するためのコスト  （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］
ｒ    ヌクレオチドのマッチの報酬  （ｂｌａｓｔｎのみ）  ［整数］
ｖ    １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数  （Ｖ）  ［整数］
ｂ    表示するアライメントの数  （Ｂ）  ［整数］
ｉ    クェリーファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］
ｏ    ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］    任意
ＢＬＡＳＴＰについては「ｂｌａｓｔａｌｌ  ｐ  ｂｌａｓｔｐ  ｄ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ  ｅ  １０  Ｇ  ０Ｅ  ０  ｖ  ３０  ｂ  ３０  ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ    ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」というランニングパラメータが好ましい。
ｐ    プログラムの名称  ［文字列］
ｄ    データベース  ［文字列］
ｅ    期待値  （Ｅ）  ［実数］
Ｇ    ギャップを空けるためのコスト  （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］
Ｅ    ギャップを拡張するためのコスト  （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］
ｒ    ヌクレオチドのマッチの報酬  （ｂｌａｓｔｎのみ）  ［整数］
ｖ    １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数  （Ｖ）  ［整数］
ｂ    表示するアライメントの数  （Ｂ）  ［整数］
ｉ    クェリーファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］
ｏ    ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］    任意
【００３７】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ又は同様のアルゴリズムにより作成された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定する。前記のヒットは類似性の程度と重複する配列の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記クエリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００３８】
ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムは、アライメントの「期待」（Ｅ）値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値０．１は、ＥＭＢＬデータベースの規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定基準により、当該ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチした部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、ＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするものを見つける確率は１％未満である。
【００３９】
１の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれに関して「変異体」のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれよりも核酸の数が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドと比べて０．０１以下のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下となる、いかなる配列をもいう。
【００４０】
変異体ポリヌクレオチドは、前記の列挙されたポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下で雑種形成するのが一般的である。ここで用いられるところの「ストリンジェントな条件」とは、６Ｘ  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６Ｘ  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳ中で６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）雑種形成させ、その後１Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄することを指す。
【００４１】
本発明は、開示された配列とは相違するが、ここに開示されるポリヌクレオチドによりエンコードされるポリペプチドと遺伝暗号の縮退の結果同一のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドとともに前記の開示された配列の対立変異体遺伝子も含む。したがって、保存的置換の結果、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として列挙されたポリヌクレオチド配列又はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドは本発明により意図され本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失及び／又は挿入の結果として、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に列挙された配列、又はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失の結果として、配列識別番号第６８−１３０、４８２−８３２及び８８９−９４５番に列挙された配列と異なる配列を含むポリペプチドは、当該変異体ポリペプチドがリグニン生合成経路で活性を有することを条件として、本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。
【００４２】
ここで用いられるところの「ｘ−マー」という用語は、「ｘ」の特定の値に関して、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチドいずれかの少なくとも特定された数（「ｘ」）の連続した残基を含むポリヌクレオチドを指す。ｘの値は、特定の配列に依存して、約２０から約６００までである。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド又はそれらの変異体のいずれかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ−マー）を含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施態様によると、ｘの値は２０以上が好ましく、４０以上がより好ましく、６０以上がさらに好ましく、８０以上が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドは配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチド及び配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番として同定されたポリヌクレオチドの中の１つの変異体の２０マー、４０マー、６０マー、８０マー、１００マー、１２０マー、１５０マー、１８０マー、２２０マー、２５０マー又は３００マー、４００マー、５００マー又は６００マーを含むポリヌクレオチドを含む。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、以下の実施例１及び２に記載される通り、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａから調製されたｃＤＮＡライブラリのハイスループットシーケンシングにより単離されたものでもよい。代替策として、配列識別番号第１−６７、１３１−４８１及び８３３−８８８番に提供された配列にもとづくオリゴヌクレオチドプローブが合成され、雑種形成又はＰＣＲ技術を用いてＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａからのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリのどちらかの中で陽性クローンを同定するのに用いられる。プローブはここに提供された配列より短くてもよいが、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも約１５個、最も好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド長である。かかるオリゴヌクレオチドプローブで用いるのに適する雑種形成及びＰＣＲ技術は本発明の技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）刊、１９８９年に教示するものを含む。陽性クローンは制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定等により解析される。
【００４５】
さらに、本発明のＤＮＡ配列は本発明の技術分野で周知の技術を用いる合成手段によって生成することができる。オリゴヌクレオチドの自動合成用の設備はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のような供給者から商業的に入手可能であり、製造者の指示に従って運転するとよい。
【００４６】
１の実施態様では本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のポリヌクレオチド又はその変異体にエンコードされるポリペプチドの少なくとも機能性のある部分をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。ここで使用されるところのポリペプチドの「機能性のある部分」とは、該ポリペプチドの結合部位又は触媒的なシグナル伝達部位を含む部分をいう。ポリペプチドの機能性のある部分は、本発明の技術分野で周知のプロトコールを用いる標的突然変異解析と改変されたポリペプチド産物のスクリーニングとにより決定することができる。正常では機能性のある部分は１０個ないし２０個のアミノ酸長であるが、より長くても短くてもよい。活性部位は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する離れた部分から構成されることもあり、一般的には高い結合親和性を示す。
【００４７】
オープン・リーディング・フレームは、標的植物への該ＤＮＡコンストラクトの形質転換が野生型植物に比較したポリペプチド量の変化をもたらすように、ＤＮＡコンストラクトにセンス又はアンチセンス方向に挿入される。オープン・リーディング・フレームをセンス方向に含むＤＮＡコンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子の発現の改変という結果をもたらすのが一般的であり、オープン・リーディング・フレームをアンチセンス方向に含む遺伝子コンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子の発現の減少をもたらすのが一般的である。本発明のオープン・リーディング・フレームをセンス又はアンチセンス方向のどちらかに含むＤＮＡコンストラクトで形質転換された植物の集団は、当業者に周知の技術を用いて、問題の遺伝子の発現が増大又は減少していることについてスクリーニングされ、所望の表現型を有する植物が単離される。
【００４８】
代替策として植物細胞のシグナル伝達に関与する遺伝子の発現は、本発明のオープン・リーディング・フレームの部分をセンス又はアンチセンスのいずれかの方向に挿入することにより阻害できる。かかる部分は完全長である必要はないが、本発明のポリヌクレオチドの２５個の残基以上を含むことが好ましく、５０個以上を含むことがより好ましい。しかし、より長い部分又は完全なオープン・リーディング・フレームに対応する完全長ポリヌクレオチドも用いることができる。前記のオープン・リーディング・フレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達成するのに十分な配列類似性があることを条件として、内在配列と正確に同一である必要はない。したがって、１つの種由来の配列が異なる種の遺伝子の発現を阻害するのに用いられてもよい。
【００４９】
別の実施態様では本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング領域を含むＤＮＡ配列又はかかるノンコーディング領域に相補的なＤＮＡ配列を含む。かかるコンストラクトに有効に用いることができるノンコーディング領域の例は、イントロン及び５’ノンコーディングリーダー配列を含む。かかるＤＮＡコンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えばＮａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２９０、１９９０及びｄｅ  Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ｎｉｅｂｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：３４７−３５８、１９９５によって論じられたのと同様の手法の、コサプレッションのプロセスによる植物の合成するイソプレノイド化合物の量の減少をもたらす。
【００５０】
代替策としてポリペプチド発現の調節は、適当な配列又はサブ配列（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）をリボザイムコンストラクトに挿入することにより達成できる（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ＣＬとＭａｎｎｅｒｓ  ＪＭ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ５（４）：２５７−２６２、１９９６）。リボザイムは２つの領域に相補的な雑種形成領域を含む合成ＲＮＡ分子である。各々の領域は、本発明のポリヌクレオチドの１つにエンコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも５個以上の連続したヌクレオチドを含むのが好ましい。リボザイムは非常に特異性の高いエンドヌクレアーゼ活性を有し、自己触媒的に前記ｍＲＮＡを切断する。
【００５１】
本発明の遺伝子コンストラクトは、さらに、転写されるべきＤＮＡ配列に操作可能に結合させた遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列を含み、遺伝子発現を制御する。遺伝子プロモーター配列は一般的には転写されるＤＮＡ配列の５’末端に位置して、該ＤＮＡ配列の転写の開始に用いられる。遺伝子プロモーター配列は一般的には遺伝子の５’ノンコーディング領域に見いだされるが、オープン・リーディング・フレームの下流又はイントロン内に存在することもあり（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ  ＫＲ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：８１−９３、１９９１）、例えば植物防御遺伝子のようにコーディング領域内に存在することもある（Ｄｏｕｇｌａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：１７６７−１７７５、１９９１）。
【００５２】
本発明のＤＮＡコンストラクトに有効に利用できる様々な遺伝子プロモーター配列は本発明の技術分野で周知である。遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列は、標的植物宿主に内在するものでもよく、該標的宿主内で機能性を有するときは、外来のものでもよい。例えば、プロモーター及びターミネーション配列は他の植物種、植物ウィルス、細菌プラスミドその他これらに類するもの由来のものでもよい。遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は本発明の配列自体由来であることが好ましい。
【００５３】
プロモーターの選択に影響を与える要因には、コンストラクトの所望の組織特異性及び転写と翻訳のタイミングが含まれる。例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターのような構成的なプロモーターは、植物の全ての部分における酵素活性に影響を及ぼす。組織特異的なプロモーターを使うことは、関心のある組織においてのみ所望のセンス又はアンチセンスＲＮＡを産生することになる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いる遺伝子コンストラクトでは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度は、光、熱、嫌気性ストレス、栄養条件の変化等のような外界の刺激により変動させることができる。時間的に調節されたプロモーターは、形質転換細胞の発生の間の特定の時にＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度の変動に影響を与えるために用いられる。問題の酵素遺伝子由来の本来のプロモーターか、ユーカリ又はマツのような形質転換される生物の特定の組織にだけ発現する遺伝子由来のプロモーターかを使うのが好ましい。本発明に有効に利用できる遺伝子プロモーターの他の例には、マンノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｍａｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｏｃｓ）及びＣｈｕａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１７４１８１、１９８９により総説されたものが含まれる。
【００５４】
転写されるＤＮＡ配列の３’側に位置する遺伝子ターミネーション配列は、遺伝子プロモーター配列と同じ遺伝子由来のものでもよく、異なる遺伝子由来のものでもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端のように当業者に周知の多くの遺伝子ターミネーション配列が本発明に有効に利用できる。１の実施態様では遺伝子ターミネーター配列は、本来の酵素遺伝子又は形質転換される標的の種に由来するものである。
【００５５】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のコンストラクトを含む形質転換細胞の検出ができるように、植物細胞で有効な選択マーカーを含むこともある。本発明の技術分野で周知のかかるマーカーは、１以上の毒素の耐性を有するのが典型的である。かかるマーカーの１つの例は、その発現により中程度の濃度で植物細胞に通常は毒性のあるカナマイシン又はハイグロマイシンの耐性をもたらすＮＰＴＩＩ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＡとＷｅｉｓｓｂａｃｈ  Ｈ編集、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）刊、１９８８年）。形質転換細胞は問題の抗生物質を含む培地中で増殖する能力により同定できる。代替策として、形質転換細胞中に所望のコンストラクトが存在することは、サザン及びウェスタンブロット法のような本発明の技術分野に周知の他の技術によって決定することができる。
【００５６】
本発明のＤＮＡコンストラクトの構成要素を操作可能に結合させるための技術は本発明の技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社（ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）刊、１９８９年）に記載された、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトは、各操作毎の後に出来上がったコンストラクトがクローン化され配列決定されて操作の正確さを決定することが可能な、例えば、大腸菌のような１以上の複製システムを有するベクターと連結されてもよい。
【００５７】
本発明の遺伝子コンストラクトは、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコシ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）と双子葉類被子植物（例、シロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）及び裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．  Ｐａｐｅｒｓ、第５９５巻、１９９６）、ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：８４−８９、１９９３）、及びカラマツ（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ２７：２０１−２０７、１９９１）の両方を含むさまざまな植物の形質転換に使われる。好ましい実施態様においては、本発明のＤＮＡコンストラクトは、その茎が複数年生存して木質組織の追加により毎年直径が増大するような樹木又は潅木とここでは定義される、木本植物の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカリ及びマツの種を含むグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択される。本発明のＤＮＡコンストラクトで有用に形質転換される他の種には、Ｐｉｎｕｓ  ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃａｒｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｊｅｆｆｒｅｙｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｉｎｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ  ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｐｉｎａｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｒｅｓｉｎｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ、Ｐｉｎｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａのようなマツと、Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ  ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ  ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ  ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌａｒｉｘ  ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ  ｄｅｃｕｒｒｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ  ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ  ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ  ｐｕｎｇｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ  ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ、Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａのような他の裸子植物と、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｏｃｃｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｌａｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃｕｌａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｂｌｉｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｇｎａｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｙｏｕｍａｎｎｉのようなユーカリと、上記の種のいずれかのハイブリッドとを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
ＤＮＡコンストラクトを標的植物のゲノムに安定的に取り込むための技術は本発明の技術分野で周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介した導入法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法、未熟胚注入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、その他これらに類するものが含まれる。技術の選択は、形質転換される標的植物に依存する。例えば、双子葉類植物及びある種の単子葉類及び裸子植物は、例えばＢｅｖａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、１９８４）により記載されたように、アグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明の遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、散布された細胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸およびこれらに類するものが含まれる。ユーカリ及びマツを形質転換する１つの方法は、花粉（例えば、Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．  Ｐａｐｅｒｓ、Ｖｏｌ．  ５９５：５３、１９９６を参照）又は容易に再生可能な胚組織を用いるバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法である。
【００５９】
ひとたび細胞が形質転換されると、ゲノムに取り込まれた本発明のＤＮＡコンストラクトを有する細胞は、上記のカナマイシン耐性マーカーのようなマーカーにより選択できる。トランスジェニックな細胞は、本発明の技術分野で周知の技術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。プロトプラストの場合は細胞壁は適当な浸透圧条件下で再生させられる。種子又は胚の場合には、適当な発芽又はカルス誘導培地が用いられる。外植体については適当な再生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立している。林木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎら、「木本植物における体細胞的胚形成（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔｓ）」、（Ｔｈｏｒｐｅ  ＴＡ編集、植物の試験管内胚形成（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ２０（１２）：４７１−５４０、１９９５）を参照のこと。スプルースの再生についての具体的なプロトコールはＲｏｂｅｒｔｓの「トウヒ（ｓｐｒｕｃｅ）の体細胞的胚形成（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐｒｕｃｅ）」（Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ  Ｋ編集、「シンシード：人工的な種子の収穫の改善への応用（Ｓｙｎｓｅｅｄ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｅｅｄ  ｔｏ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社刊：第２３章、４２７−４４９頁，１９９３年）に説明されている。得られた形質転換植物は、本発明の分野で周知の技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的又は無性的な生殖で増やされることもある。
【００６０】
前記の説明の通り、標的細胞中のＲＮＡ産生は、プロモーター配列の選択により制御できる。標的植物は、２以上の本発明のコンストラクトで形質転換され、２以上のポリペプチド活性を改変し、２以上の組織でのポリペプチド活性に影響を与え、又は２以上の発現時でのポリペプチド活性に影響を与えることもある。同様に遺伝子コンストラクトは、本発明のポリペプチドをコードする２以上のオープン・リーディング・フレームを含むように、又はかかるポリペプチドをコードする遺伝子の２以上のノンコーディング領域を含むように構築されてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、また、植物細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードする他の既知配列との組み合わせで用いてもよい。
【００６１】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ雑種形成及びＰＣＲ技術で決まり切って用いられるような本発明の技術分野で周知の技術を用いて、他の植物種由来の細胞シグナル伝達に関与するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を単離するためのプローブとして用いることもできる。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及びかかるポリペプチドに対する抗体はかかるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドと相互作用し、それにより細胞シグナル伝達を改変する分子をスクリーニングするために用いられる。かかる検定法を実施するための技術は本発明の技術分野で周知である。同様に、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは細胞シグナル伝達経路を解明するためにデザインされた研究に用いられることもある。
【００６３】
以下の実施例は例示として与えられ、限定として与えられるのではない。
【００６４】
実施例１
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来のｃＤＮＡクローンの単離とキャラクタリゼーション
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓｃＤＮＡ発現ライブラリは、以下の通り構築されスクリーニングされた。
【００６５】
ｍＲＮＡは、Ｃｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １１：１１３−１１６、１９９３）のプロトコールに少し修正を加えたものを用いて、幹の木部のような特定の植物組織から抽出された。具体的にはサンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ＣＴＡＢ、２％  ＰＶＰ及び０．０５％  スペルミジン３塩酸塩）に溶解し、クロロフォルム：イソアミルアルコールが２４：１の混合液で抽出された。ｍＲＮＡはエタノールで沈殿され、全ＲＮＡ調製物はポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレーションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）を用いて精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、前記精製ｍＲＮＡから製造者のプロトコールに従ってＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて逆転写酵素合成した後、ｃＤＮＡクローンをラムダＺＡＰへ挿入して構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスに１μｌのサンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングをした。ライブラリの大量切り出し（ｍａｓｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞及びＸＬＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともに用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で希釈され、Ｘ−ｇａｌ及びイソプロピルチオ−ベータ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に播かれた。
【００６６】
ＤＮＡミニプレップ用にプレートされ釣り上げられたコロニーのうち、９９％は配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入りのＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡはアルカリ溶菌法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルがシーケンシング用鋳型に染色体の混入があるかどうかをスクリーニングするために用いられた。ダイプライマー配列はターボカタリスト８００マシン(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カリフォルニア州  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ)を製造者のプロトコールに従って用いて調製された。
【００６７】
陽性クローンのＤＮＡ配列は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーを用いて得られた。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３’末端側からも配列決定された。いくつかのクローンについては、既知配列の末端と雑種形成するプライマーを設計し、これらを配列情報量を拡張するための配列決定用プライマーとして用いることにより、内部の配列が得られた。代替策として内部配列は、公開された方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｎｅ  ２８：３５１−３５９、１９８４）を用いて、関心のある遺伝子の「入れ子になった（ｎｅｓｔｅｄ）」欠失クローンを生成することにより得られた。
【００６８】
配列決定されたｃＤＮＡ配列は、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ及び／又はＢＬＡＳＴＮを用いて、ＥＭＢＬデータベース（リリース５８，１９９９年３月）の既知配列と比較された。冗長な配列のマルチプルアライメントが、信頼できるコンセンサス配列を組み立てるために用いられた。他の植物種由来の既知配列との類似性にもとづき、単離されたＤＮＡは、ＲＬＫ（配列識別番号第２、８、９、１１、１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４、３８、１３１−３０１、４４８−４６３、８４８、８５８−８７４及び８８２−８８７番）又は２要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４２、４８−５２、５５−５８、６７、４６４−４７１、４７４−４７８及び８５０−８５７番）をエンコードするものとして同定された。配列識別番号第２、８、９、１１、１５、１８、１９、２１−２５、３３、３４及び３８番は（上記の通りの決定法により）既知配列と同一の残基が１０％未満しか見つからなかった。配列識別番号第８４８、８５４、８５５、８５６、８５９、８６０、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７１、８７２、８７３、８７４、８８２、８８３及び８８５番は、それぞれ配列識別番号第２３２、４６７、４６８、４８、２８２、２８８、４８８、４５３、２８９、２６８、２９７、２７８、２９０、４４９、２９９、３０１、２７０、２６９、２７６、４５４及び３００番の拡張配列を表し、配列識別番号第８４８、８５４−８５６、８５９、８６０、８６２−８６５、８６８、８６９及び８７１−８７４番は完全長配列である。
【００６９】
実施例２
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のｃＤＮＡクローンの単離とキャラクタリゼーション
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａのｃＤＮＡ発現ライブラリが実施例１に記載の通り木部のような特定の組織から構築され、スクリーニングされた。陽性クローンのＤＮＡ配列はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｒｉｓｍ３７７シーケンサーで順方向及び逆方向プライマーを用いて得られ、決定された配列は上記の通りデータベース中の既知配列と比較された。
【００７０】
他の植物種由来の既知配列との類似性にもとづき単離されたＤＮＡ配列は、ＲＬＫ（配列識別番号第１、３−７、１０、１２−１４、１６、１７、２０、２６−３２、３５−３７、３９−４１、３０２−４４７、８３３−８４７、８７５−８８１及び８８８番）又は２要素シグナル伝達システムの少なくとも１の構成要素（ＨＫ、ＲＲ又はハイブリッドＨＫ／ＲＲタンパク質、配列識別番号第４３−４７、５３、５４、５９−６６、４７２、４７３、４７９−４８１及び８４９番）をエンコードするものとして同定された。配列識別番号第３−７、１０、１２−１４、１６、１７、２０、２６、２８−３２、３５−３７及び３９−４１番の配列は（上記の通り決定された）既知配列と同一の残基が１０％未満であることがわかった。配列識別番号第４８０番の配列はスプライシングされなかったイントロンと予測されるものを含むことがみつかり、翻訳は２つのオープン・リーディング・フレームに切り離される。これらの２つのオープン・リーディング・フレームにエンコードされたアミノ酸配列は配列識別番号第８３０及び８３１番に提供される。配列識別番号第４１１、４１３、３１７、４２１、４１５、４３４及び４１６番はそれぞれ配列識別番号第２６、１７、２８、３９、１６、３０及び４１番の拡張配列を表す。配列識別番号第８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０及び８８８番はそれぞれ配列識別番号第４１１、４１３、３１７、２９、４２１、４１５、４３４、４１６、３５、３７、３６、４０、４３８、４２６、４４５、４１８、４３５、４１１及び４２７番の拡張配列を表し、第８３３−８３７、８３９−８４１、８４４及び８７８−８８１番は完全長配列である。
【００７１】
実施例３
植物の成長を改変するためのエチレン受容体遺伝子の利用
タバコ植物体のＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａエチレン受容体遺伝子ホモログによる形質転換は以下の通りに行われる。Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のエチレン受容体ホモログ（配列識別番号第４３番）のコーディング領域を含むＤＮＡ配列を含むセンス及びアンチセンスコンストラクトを含むＤＮＡコンストラクトが構築され、公開された方法（Ａｎ、バイナリーベクター（Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．）、Ｇｅｌｖｉｎ  ＳＢとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ  ＲＡ編集、植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社刊、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８年）を用いて直接形質転換法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に挿入する。センスＤＮＡのコンストラクトはＰＢＫ−ＣＭＶプラスミドのｃＤＮＡ挿入配列をｐＡＲＴ７プラスミドにクローン化し、次に該ｐＡＲＴ７ベクターからＮｏｔＩで消化した３５Ｓ−インサート−ＯＣＳ３’ＵＴＲ断片をｐＡＲＴ２７植物発現ベクターにクローン化することにより作製される（Ｇｌｅａｖｅ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：  １２０３−１２０７、１９９２）。トランスジェニックコンストラクトの存在と完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、制限酵素消化とＤＮＡ配列決定により確認される。
【００７２】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ）の葉の切片はＨｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１、１９８５の方法にもとづく方法を用いて前記のセンス及びアンチセンスのエチレン受容体コンストラクトで形質転換される。適当なコンストラクトを含む形質転換植物はサザンブロット実験を用いて確認される。前記Ｐｉｎｕｓ属のエチレン受容体ホモログの形質転換植物での発現はセンス及びアンチセンスコンストラクトを用いて作出された独立の形質転換植物株のそれぞれから全ＲＮＡを単離することにより確認される。該ＲＮＡサンプルはノザンブロット実験で分析されそれぞれの形質転換株での外来遺伝子の発現レベルを決定する。センス及びアンチセンスコンストラクトで作出されたそれぞれの形質転換植物株について、Ｐｉｎｕｓ属のエチレン受容体遺伝子と内在性のタバコのエチレン受容体遺伝子とによりエンコードされたエチレン受容体ポリペプチドの発現レベルが、野生型対照実験の植物の発現レベルと比較される。
【００７３】
本発明は明解にするため例示の目的である程度の詳細が説明されているが、請求の範囲のみにより制限されることが意図されている本発明の範囲から逸脱することなく、変更及び改変はなされうる。