【手続補正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本発明のトランスポゾンベクターは、第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子、並びに第二のプロモータと操作可能に連結された所望のタンパク質又はペプチドをコードする配列を包含し、この場合、所望のタンパク質又はペプチドをコードする配列及びその操作可能に連結されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列によりはさまれている。トランスポゾンベクターは、１又は複数の以下の特徴も包含する：ａ）トランスポザーゼの発現を増強するための、第一のプロモータの３'末端に位置する、ＡＣＣＡＴＧを含む１又は複数の改変されたコザック配列；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのＮ末端アミノ酸に対するコドンの改変（この場合、各コドンの第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡ又はＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１又は複数の終止コドンの付加；及び／又はｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するための、トランスポザーゼと操作可能に連結された有効ポリＡ配列の付加。トランスポゾンベクターは、さらに又は代替的に、任意のプロモータ、例えばトランスポザーゼと操作可能に連結されたプロモータの３'末端に１又は複数の以下のコザック配列を含み得る：ＡＣＣＡＴＧＧ、ＡＡＧＡＴＧＴ、ＡＣＧＡＴＧＡ、ＡＡＧＡＴＧＧ、ＧＡＣＡＴＧＡ、ＡＣＣＡＴＧＡ及びＡＣＣＡＴＧＴ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
トランスポザーゼ及び挿入配列
本発明のさらなる実施形態では、トランスポゾンベクター中に見出されるトランスポザーゼは、標的部位改変（altered target site）（ＡＴＳ）トランスポザーゼであり、挿入配列はＡＴＳトランスポザーゼにより認識されるものである。しかしながらトランスポゾンベクター中に位置するトランスポザーゼは改変型ＡＴＳトランスポザーゼに限定されず、任意のトランスポザーゼに由来し得る。従来技術で既知のトランスポザーゼとしては
、ＡＣ７、Ｔｎ５ＳＥＱ１、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００（γδ）、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、点状トランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ｄＳｐｍトランスポゾン及びＩトランスポゾンに見出されるものが挙げられる。本発明に従って、これらのトランスポザーゼ及びそれらの調節配列は、以下の機能改善のために改変される：ａ）トランスポザーゼと操作可能に連結されるプロモータの３'末端にＡＣＣＡＴＧを含む１又は複数の改変されたコザック配列を付加する；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンを変更する（この場合、各コドンの第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡ又はＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１又は複数の終止コドンの付加；及び／又はｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するための、トランスポザーゼと操作可能に連結された有効なポリＡ配列の付加。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
したがって、本発明のトランスポゾンベクター内に含入されるプロモータは完全プロモータ配列又はプロモータ配列の断片であり得る、と理解されるべきである。例えば一実施形態では、目的遺伝子と操作可能に連結されるプロモータは、ニワトリオボアルブミンプロモータの約９００塩基対フラグメントである（配列番号１５）。トランスポゾンベクター内に含入される構成的及び誘導性プロモータは、ＡＣＣＡＴＧからなる１又は複数の改変コザック配列の付加によっても改変され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
このベクターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを用いた。改変されたコザック配列（ＡＣＣＡＴＧ）をプロモータに付加した。トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組コドン中のゆらぎ位置のヌクレオチドをアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）に変えたが、このことは、このコドンによりコードされるアミノ酸を変えない。２つの終止コドンを付加し、合成ポリＡを用いて、強力な終結配列を提供した。このベクターは、安定な組込みの可能性を増大するため（何らの誘導も伴わずに）細胞への進入直後から活性化するよう設計されたプロモータを用いる。付加的な終止コドン及び合成ポリＡは、下流の潜在的遺伝子まで通して読取ることなく、適正な終結を保証する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
このベクターの構築の第一段階は、所望の変化を有するようトランスポザーゼを改変することであった。トランスポザーゼに対する改変は、高効率フォワードプライマー（Ｈｅｆ）改変トランスポザーゼ（ＡＴＳ）−Ｈｅｆ
５'  ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣ  ３'（配列番号３６）
及び改変トランスポザーゼ−高効率リバースプライマー（Ｈｅｒ）
５'  ＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＣ  ３'（配列番号３７、相補的リバースプライマー）
の両プライマーを用いて達成した。５'フォワードプライマーＡＴＳ−Ｈｅｆでは、配列ＣＴＣＧＡＧは、制限酵素ＸｈｏＩの認識部位であり、これは増幅遺伝子の方向性クローニングを可能にする。配列ＡＣＣＡＴＧは、コザック配列及びトランスポザーゼに対する開始コドンを含有し、そして下線を付した塩基は最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのＡ又はＴへのゆらぎ位置における変化を表す（コドンによりコードされるアミノ酸の変化を伴わない）。プライマーＡＴＳ−Ｈｅｒ（配列番号３７）は、天然型終止コドンＴＧＡのほかに付加的終止コドンＴＡＡを含有し、そしてＢｃｌＩ制限部位ＴＧＡＴＣＡを付加して、方向性クローニングを可能にする。これらのプライマーを、トランスポザーゼ及びＦａｉｌＳａｆｅ（登録商標）ＰＣＲ系（酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2及びＰＣＲエンハンサーを含む；Epicentre Technologies, Madison, WI）のための鋳型として、ｐＴｎＬａｃ（ｐはプラスミドを意味し、ｔｎはトランスポゾンを意味し、そしてｌａｃはラクトース遺伝子のβフラグメントを意味する。これはマルチクローニングサイトを含有する）を用いるＰＣＲ反応に用いた。増幅ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して、紫外線トランスイルミネーターで可視化した。予測サイズに対応する帯域をゲルから切り出して、ザイモ・クリーンゲル回収キット（Zymo Clean Gel Recovery Kit）（Zymo Research, Orange, CA）を用いてアガロースから精製した。メーカーのプロトコールに従って、精製ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（５'）及びＢｃｌＩ（３'）（New England Biolabs, Beverly, MA）で消化した。ザイモＤＮＡクリーン及びコンセントレイターキット（Zymo Research）を用いて、消化ＤＮＡから制限酵素を除去して精製した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006512922000001.app