【手続補正書】
【提出日】平成18年10月13日(2006.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解タンパク質、抗凝固タンパク質、およびリンカーペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記血栓溶解タンパク質が、他の血栓溶解因子を活性化させるか、または、それら自体が血栓溶解活性を持っているスタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ウロキナーゼ様プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、毒物、およびこれらの変異体を含む群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記血栓溶解タンパク質が、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）またはこれの変異体である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗凝固タンパク質が、ヒルジン、抗トロンビンＩＩＩ、毒物、およびこれらの変異体を含む群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗凝固タンパク質が、ヒルジンまたはこれの変異体である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーペプチドが、血液凝固因子により認識され得るペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーペプチドが、血液凝固因子ＦＸａにより認識され得るアミノ酸配列ＩＥＧＲ、または、ＩＥＧＲを含有するペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーペプチドが、血液凝固因子ＦＸＩＩａ（トロンビン）により認識され得るアミノ酸配列ＬＧＰＲ（ＬｅｕＧｌｙＰｒｏＡｒｇ）、または、ＬＧＰＲを含有するペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、リンカーペプチドＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２）、リンカーペプチドＰＲＩＥＧＲにより繋がれた組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびヒルジンの融合タンパク質（ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２）、またはリンカーペプチドＧＳＬＧＰＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＬＧＰＲ−ＨＶ２）である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、リンカーペプチドＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２、すなわちＳＦＨ）である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製方法であって、ＩＥＧＲもしくはＬＧＰＲ含有ペプチドをコード化する配列を介して、該血栓溶解タンパク質の遺伝子および該抗凝固タンパク質の遺伝子を一緒にして繋げて、該融合タンパク質の遺伝子を形成させ、次いで、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、イースト、もしくは動物細胞において該融合タンパク質の遺伝子を発現させ、該融合タンパク質を産生させることを含む方法。
【請求項１２】
融合タンパク質と、医薬的に許容可能なキャリアもしくは賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製における、血液凝固因子により認識されるリンカーペプチドの使用。
【請求項１４】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質間のリンカーとしての、血液凝固因子により認識され開裂されるリンカーペプチドの使用。
【請求項１５】
血栓症に関連した疾患または病状の処置方法であって、血栓症を患う患者へと、治療に有効な量の前記融合タンパク質を投与することを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
もう１つ別の態様において、本発明は、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製方法に関し、本方法は、ＩＥＧＲまたはＬＧＰＲをコード化する塩基配列を介して、血栓溶解タンパク質遺伝子および抗凝固タンパク質遺伝子を繋ぎ、該融合タンパク質をコード化する遺伝子を形成させること、ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、イースト、または動物細胞株において、該融合タンパク質をコード化する該遺伝子を発現させ、該融合タンパク質を産生させることを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本明細書中使用される場合、用語「血液凝固因子により認識されるリンカーペプチド」は、テトラペプチドＩＥＧＲ（ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ）、該ＩＥＧＲ配列を含有するペプチド、テトラペプチドＬＧＰＲ（ＬｅｕＧｌｙＰｒｏＡｒｇ）、または該ＬＧＰＲ配列を含有するペプチドに関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、ＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンから構成されるＳＦＨ融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２）、ＰＲＩＥＧＲにより繋がれた組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびヒルジンから構成される融合タンパク質（ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２）、またはＧＳＬＧＰＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンから構成される融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＬＧＰＲ−ＨＶ２）である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【表３】
2006516113.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
表１は、該融合タンパク質ＳＦＨが、無操作のスタフィロキナーゼと同じレベルの血栓溶解活性を呈することを示すものである。表２は、無操作の融合タンパク質ＳＦＨが抗凝固活性を呈さず、しかし、一旦血液凝固因子ＦＸａにより開裂されると、完全なる抗凝固活性を示すことを示すものである。表３は、ＳＦＨが有意な血栓阻害効果を持っていることを実証するものである。これ故に、本発明の本融合タンパク質は、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を、実際に持っている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
［実施例２：融合タンパク質ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２の調製］
ＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位がそれぞれ、ｔＰＡ遺伝子の上流および下流へと加えられる。停止コドンを持たない該ｔＰＡ遺伝子が、ｐＰＩＣ９ベクター中へと導入される。ＰＣＲ法を使用して、プライマーを介して、該ＡｖｒＩＩ制限部位およびＦＸａ認識配列をコードする配列が、ヒルジン遺伝子の上流に取り込まれる。該ヒルジン遺伝子の下流とマッチされた該プライマーは、１つのＮｏｔＩ制限部位を含有する。ＦＸａ認識配列を伴った該ヒルジン遺伝子は、２つの酵素ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩにより消化され、結果得られる断片は、前記のように構築されたベクターｐＰＩＣ９中へと組み込まれ、この導入された断片はｔＰＡ遺伝子の下流に位置し、この融合遺伝子ＰＡＦＨ中へと組み込まれて、ｔＰＡと共に該融合遺伝子ＰＡＦＨを形成する（これを以降、ＴＦＨと略記）。こうして構築されたプラスミドは、ｐＰＩＣ９−ＴＦＨとして表記される。該プラスミドｐＰＩＣ９−ＴＦＨおよびｐＰＩＣ９Ｋは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより消化される。該ＴＦＨ遺伝子はその後、ｐＰＩＣ９Ｋ中へと挿入されて、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＦＨ遺伝子を形成する。該プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＦＨは直線状にされ、電気による形質転換により、イーストゲノム中へと取り込まれる。その発現を誘導するには、メタノールが使用される。所望の融合タンパク質ＴＦＨは、３つのドメイン、つまり、ｔＰＡ配列、ＦＸａ認識配列、およびヒルジンを含む。