【手続補正書】
【提出日】平成18年10月2日(2006.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の
（ａ）配列番号６又は配列番号７に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに
（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸
から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸。
【請求項２】
核酸が、配列番号６又は配列番号７に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が、配列番号６又は配列番号７と少なくとも８５％同一である、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％同一である、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項５】
請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項６】
核酸が、（ａ）又は（ｂ）の核酸に中程度のストリンジェンシー条件下にハイブリダイズする、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項７】
核酸が柑橘類から単離される、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項８】
請求項１記載の核酸を有するベクター。
【請求項９】
請求項１記載の核酸を有する宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸を有する改変された非ヒト生物。
【請求項１１】
生物が植物又は微生物である、請求項１０記載の非ヒト生物。
【請求項１２】
組み換え宿主細胞の作成方法であって、請求項８記載のベクターを宿主細胞に導入することを含む方法。
【請求項１３】
ポリペプチドの製造方法であって、請求項９記載の宿主細胞を該ポリペプチドを産生する条件下に培養することを含む方法。
【請求項１４】
配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％同一である、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の製造方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する改変された宿主を、少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の産生に導く条件下に培養させることを含み、その際、前記の少なくとも１つの核酸が、
（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに
（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸
から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である方法。
【請求項１７】
少なくとも１種のテルペノイドの製造方法であって、
Ａ）少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体と、
（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに
（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸
から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である核酸によってコードされる少なくとも１種のポリペプチドとを接触させ、
Ｂ）少なくとも１種のＡ）で産生されたテルペノイドを単離することを含む方法。
【請求項１８】
少なくとも１種のテルペノイドが、ビシクロゲルマクレン、クベボール、バレンセン、α−クベベン、ゲルマクレンＤ及びδ−カジンから選択されるセスキテルペンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種のテルペノイドが、ビシクロゲルマクレン、クベボール、バレンセン及びδ−カジンから選択されるセスキテルペンである、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種のテルペノイドを抽出及び蒸留から選択される少なくとも１種の方法によって単離する、請求項１７記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸を提供する。有利には、本発明は、（ａ）配列番号６又は配列番号７に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸を提供する。一実施態様において、規定の条件は中程度なストリンジェンシー条件であり、そして更なる実施態様では高いストリンジェンシー条件である。他の実施態様は、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド；本発明の核酸を有する宿主細胞；本発明の核酸を有する改変された非ヒト生物；並びに本発明の宿主細胞を培養することを含むポリペプチドの製造方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
もう一つの実施態様では、本発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。有利には、本発明は、配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
別の実施態様では、本発明の核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示された配列を有する。一実施態様では、核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチドに少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である。一実施態様では、核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。更なる一実施態様では、核酸はセスキテルペン合成酵素であるタンパク質をコードし、これは例えば実施例に記載される酵素アッセイで裏付けられている。一実施態様では、該核酸は配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたポリペプチドをコードする。異種間で保存された領域を有する核酸も提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に示されたアミノ酸配列を有する。有利には、本発明のポリペプチドは配列番号１又は配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたアミノ酸配列を有する。更なる別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である。一実施態様では、ポリペプチドはセスキテルペン合成酵素であり、これは、例えば以下に記載される酵素アッセイにおいて裏付けられている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
【表１】
2006500942.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
該ライブラリーをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブでスクリーニングした。ＤＩＧ−ｄＵＴＰをＤＮＡ断片中にＰＣＲによってＰＣＲ ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）プローブ合成キット（ロシェ・ディアグノスティクス社）を用いてプローブを合成した。１４９塩基対のＧＦＴｐｓＡ由来のＤＮＡプローブを、ライブラリーの一部分から、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＡｐｒｏＦ（配列番号５２）（５′−ＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＡｐｒｏＲ（配列番号５３）（５′−ＴＡＴＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣ−３′）を用いて増幅させた。１０３６塩基対のＧＦＴｐｓＢ由来のＤＮＡプローブを、ｐＥＴ−ＧＦＴｐｓＢ２−２プラスミドから、フォワードプライマーｊｕｎｏｓＦ２（配列番号５４）（５′−ＡＡＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＢＲＲ２（配列番号４１）を用いて増幅させた。１００８塩基対のＧＦＴｐｓＣ由来のＤＮＡプローブを、ｐＥＴ−ＧＦＴｐｓＣプラスミドから、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐｅｔＦ１（配列番号５５）（５′−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣＲＲ１（配列番号４４）を用いて増幅させた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例４：プラスミドの構築と酵素発現
発現プラスミドの構築
該ｃＤＮＡを、セスキテルペン合成酵素の機能的発現のためにｐＥＴ１１ａ発現プラスミド（ノバジェン社）にサブクローニングした。ＧＦＴｐｓＢ、ＧＦＴｐｓＤ及びＧＦＴｐｓＥのために、全長のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、開始コドンを含めて５′末端にＮｄｅＩ部位を導入し、そして３′末端で停止コドン直後にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＧＦＴｐｓＢについては、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＢＮｄｅＩ（配列番号５６）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣ−３′（ＮｄｅＩ部位はイタリックで、開始コドンは下線を引いた）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＢＢａｍ（配列番号５７）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣ−３′（ＢａｍＨＩ部位はイタリックで、開始コドンは下線を引いた）を使用した。同様に、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＤＮｄｅｌ（配列番号５８）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＣＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＤＢａｍ（配列番号５９）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＡＧ−３′をＧＦＴｐｓＤのために使用し、そしてフォワードプライマーＧＦＴｐｓＥＮｄｅｌ（配列番号６０）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＥＢａｍ（配列番号６１）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣ−３′をＧＦＴｐｓＥのために使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
ＧＦＴｐｓＣ−ｐＥＴ１１ａ発現ベクターの構築のために、２つの別個のＰＣＲを用いて、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ接着端に隣接した挿入物を作製した。第一のＰＣＲは前記と同じ条件中で、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ１（配列番号６２）５′−ＴＡＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ１（配列番号６３）５′−ＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３′を用いて行い、そして第二のＰＣＲを、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ２（ＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ１と比較して５′末端でＡＴだけ短い）（配列番号６４）５′−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ２（ＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ１と比較して５′末端でＧＡＴＣだけ長い）（配列番号６５）５′−ＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３′を用いて実施した。２種のＰＣＲ産物を前記のように精製し、合し、５分間煮沸することによって変性させ、そして氷上で５分間冷却した。得られたｃＤＮＡを、ｐＥＴ１１ａプラスミド中にライゲーションするために直接使用した。