【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年9月26日(2006.9.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  患者からの標本におけるママグロビンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在の検出ステップを有し、該ｍＲＮＡは配列番号：１５または配列番号：１５の相補体に特異的にハイブリダイズし、該ｍＲＮＡの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが乳癌細胞の存在を示す、ことを特徴とする患者の乳癌細胞の存在の検出方法。
【請求項２】  前記検出ステップはさらに、
（ａ）配列番号：１５に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供するステップと、
（ｂ）該ポリヌクレオチドが乳房の新形成細胞からのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる条件下で上記標本とともに該ポリヌクレオチドをインキュベートするステップと、
（ｃ）ポリヌクレオチド―ｍＲＮＡハイブリダイゼーション複合体の存在を検出するステップと、
を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】  前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１５の相補体またはそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項４】  前記ポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなるママグロビンポリペプチドをコードするｃＤＮＡであることを特徴とする請求項３記載の検出方法。
【請求項５】  前記標本は、リンパ節組織を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項６】  前記検出ステップはさらに、
（ａ）逆転写法を用いてｍＲＮＡからママグロビンポリペプチドをコードするｃＤＮＡを生成するステップと、
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅される該ｃＤＮＡの領域を定義するために該ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドを提供するステップと、ここで該オリゴヌクレオチドの一方は高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１にハイブリダイズし、他方は高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１の相補体にハイブリダイズする、
（ｃ）該２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して該ｃＤＮＡの領域を該ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅するステップと、
（ｄ）該増幅されたｃＤＮＡ領域の存在を検出するステップと、
を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項７】  前記２つのオリゴヌクレオチドは、一方が配列番号：４を含み他方が配列番号：１６を含むことを特徴とする請求項６記載の検出方法。
【請求項８】  前記標本は、末梢の白血球を含むことを特徴とする請求項６記載の検出方法。
【請求項９】  前記検出ステップはさらに、
（ａ）非対称ギャップリガーゼ連鎖反応によってママグロビンをコードするｍＲＮＡにおける標的領域を増幅するステップと、
（ｂ）該増幅された標的領域の存在を検出するステップと、
を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項１０】  ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーとしての２つのオリゴヌクレオチドが容器に入っており、該オリゴヌクレオチドは増幅される領域を定義するために配列番号：２をコードするｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする、標本における乳房新形成細胞の存在を検出するキット。
【請求項１１】  前記２つのオリゴヌクレオチドは、一方が配列番号：４を含み他方が配列番号：１６を含むことを特徴とする請求項１０記載のキット。
【請求項１２】  患者からの標本におけるママグロビンポリペプチドの存在の検出ステップを有し、該ママグロビンポリペプチドの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが乳癌の存在を示す、ことを特徴とする患者の乳癌の存在の検出方法。
【請求項１３】  前記検出ステップはさらに、精製された抗体をママグロビンポリペプチドと反応させるステップと、該抗体と該ママグロビンポリペプチドの結合を検出するステップとを有し、該抗体は配列番号：１７の少なくとも５個のアミノ酸を含むママグロビンエピトープに特異的であることを特徴とする請求項１２記載の検出方法。
【請求項１４】  前記ママグロビンポリペプチドは配列番号：１７を含むことを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】  前記精製された抗体が多クローン性抗体であり、ママグロビンエピトープが配列番号：１４を含むことを特徴とする請求項１４記載の検出方法。
【請求項１６】  前記精製された抗体が単一クローン性抗体であり、ママグロビンエピトープが配列番号：１４を含むことを特徴とする請求項１４記載の検出方法。
【請求項１７】  前記標本は、乳房腫瘍組織を含むことを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１８】  精製された抗体が容器に入っており、該抗体は配列番号：２の少なくとも５個のアミノ酸を含むママグロビンエピトープに特異的であって、配列番号：１７またはその対立遺伝子変異型を含むママグロビンポリペプチドと反応することを特徴とする、標本における乳癌細胞の存在を検出するキット。
【請求項１９】  前記ママグロビンエピトープは配列番号：１４を含むことを特徴とする請求項１８記載のキット。
【請求項２０】  患者からの子宮内膜組織の標本においてママグロビン発現の検出を含むことを特徴とする、患者における子宮内膜癌の存在の検出方法。
【請求項２１】  患者からの子宮内膜組織のまたは関連したリンパ系組織の標本におけるママグロビンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在の検出ステップを有し、該ｍＲＮＡの子宮内膜組織に関する濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが子宮内膜癌細胞の存在を示す、ことを特徴とする患者の子宮内膜癌細胞の存在の検出方法。
【請求項２２】  患者からの標本におけるママグロビンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在の検出ステップを有し、該ｍＲＮＡの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが子宮内膜癌細胞の存在を示す、子宮内膜癌を患っているまたは患ってきたことが知られている患者の子宮内膜癌細胞の存在の検出方法。
【請求項２３】  患者からの子宮内膜組織のまたは関連したリンパ系組織の標本におけるママグロビンポリペプチドの存在の検出ステップを有し、該ママグロビンポリペプチドの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが子宮内膜癌の存在を示す、ことを特徴とする患者の子宮内膜癌の存在の検出方法。
【請求項２４】  患者からの標本におけるママグロビンポリペプチドの存在の検出ステップを有し、該ママグロビンポリペプチドの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが子宮内膜癌の存在を示す、子宮内膜癌を患っているまたは患ってきたことが知られている患者の子宮内膜癌の存在の検出方法。
【請求項２５】  患者からの標本におけるママグロビンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在の検出ステップを有し、該ｍＲＮＡの濃度が健康体における濃度よりも上昇したことが乳癌細胞の存在を示し、乳癌をもつ患者からの標本の少なくとも約４３％において上昇した濃度にある該ｍＲＮＡの存在の検出が可能であることを特徴とする患者の乳癌細胞の存在の検出方法。
【請求項２６】  乳癌をもつ患者からの標本の少なくとも約６０％において、上昇した濃度にあるｍＲＮＡの存在の検出が可能であることを特徴とする請求項２５記載の検出方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願 
この出願は、1996年5月31日出願のPCT米国特許96/08235の一部継続出願でありまた1995年5月31日出願の米国特許出願番号08/455896すなわち現在米国特許56668267の一部継続出願である、 1997年9月18日出願の米国特許出願番号08/933149の一部継続出願である。
【０００２】
政府補助金への関連 
本発明はPublic Health Service Grants CA76227,CA76223-01およびCA68485のもと、政府の援助でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
（１）発明の分野 
本発明は一般的に乳癌の病原、特に乳癌の発見および治療に有用なｃＤＮＡ配列およびコードされた乳房特異的なタンパク質に関する。
（２）関連技術の記述 
乳癌は最も一般的かつ潜在的に致命的な癌の一つである。早期の診断および治療は、この疾患に関する罹患率および死亡率を減少させることができるが、乳房撮影法による実際的な予測価は約２５％のみと見積られている（Hall et al.,N Engl J Med 327:319-328,1992）。それゆえ乳房撮影法を用いて癌を発見できるよりも早く癌を発見する手段を持つことが望ましく、遺伝的または生化学的な標識（marker）が、乳房撮影法の予測価を補足し増加させるような手段を提供できるかもしれない（Hayes,Hematol Oncol Clin N Am 8:485,1994）。
【０００４】
乳癌の発達には多くの遺伝子の変化が伴う（概観のためにはPorter-Jordan, Hematol Oncol Clin N Am 8:73,1994を参照のこと）。このような変化は全体的な染色体の変質や遺伝子の標識の喪失を含む（Devilee et al,Biochim BioｐＨys Acta 1198:113,1994;Callahan et al,J Cell Biochem Suppl 17:167,1993）。乳房における新形成（neoplasia）の進行はまた、以前に同定された、成長因子およびその受容体（Zajchowsky et al.,Cancer Res 48:7041,1988）、構造タンパク質（Trask et al.,Proc Natl Acad Sci 87:2319,1990）、第二伝達タンパク質（Ohuchi et al.,Cancer Res 26:2511,1986）、転写因子（Harris,Adv Cancer Res 59:69,1992）をコードする遺伝子の発現における定性的かつ定量的な変化に帰着することが示されている。患者の生検試料において乳癌の病原におけるこれらの遺伝子変化の正確な役割はよく理解されていないが、遺伝子の発現におけるこれらの変化は潜在的に乳癌の標識を発達させる基礎を形成し得る。
【０００５】
疾患の早期発見の為に乳癌に対する遺伝的または生化学的な標識を提供することに加えて、予後評価を与える腫瘍の標識、治療法の選択や評価のための手段、治療の標的を定める手段を持つこともまた望ましい。多くの組織標識が同定されているが、診断や一般市民の集団検診に理想的に適合するような十分に鋭敏で腫瘍に特異的なものは無い。このように、患者における乳癌の発症および病原性の発達を特異的かつ選択的に同定するのに使用可能で、腫瘍に特異的な免疫療法に使用できる発現タンパク質を伴った遺伝子のような、乳癌の標識に対する必要性が引き続き残っている。
【０００６】
乳癌から差異表示された配列の標識（tag）を単離するために改良された差異表示ポリメラーゼ連鎖反応法（differential display polymerase chain reaction technique）を用いて、通常の組織である対照群と比較することによって新形成の乳房上皮組織において唯一に表現される、いくつかの配列のフラグメントが単離された（Watson and Fleming,Canver Res 54:4598-4602,1994）。ＤＥＳＴ００２と同定されたこれらの配列の標識の発見は、新しい全長ｃＤＮＡと現在ママグロビンと呼ばれているコードされたタンパク質の発見と単離に導いた。このｃＤＮＡとタンパク質は共に新規である。
本発明の要約
簡単に言えば、それゆえに本発明は、乳癌においてその発現が増加する新規の遺伝子の同定、およびこれらの遺伝子のｍＲＮＡからのｃＤＮＡの単離に向けられる。従って、出願人は新規のｃＤＮＡおよびコードされた乳房に特有の分泌タンパク質、すなわちママグロビンの発見に成功している。ｃＤＮＡは精製および単離された形態であり、配列番号：１５と同定されているヌクレオチドの配列から成っており、コードされたタンパク質、ママグロビンは精製および単離された形態であり、配列番号：２と同定されているアミノ酸配列を持っている。
【０００７】
米国特許5668267号に記載されている小さいスケールの研究において、ママグロビンｍＲＮＡは、ステージIの原発性乳癌腫瘍の２７％に過剰発現した。本発明では、ママグロビンであるタンパク質が検査した腫瘍の約８０％に検出されるような、多くの段階および組織学的な種類における原発性の乳房腫瘍について、より大規模な調査を記載している。これらのデータはママグロビンの遺伝子の制御障害（dysregulation）が乳癌において早期かつ頻繁に起こっていることを示唆する。それゆえにママグロビンおよびそのｃＤＮＡの発見は、ヒトや他の哺乳動物における乳房の新形成疾患の発見および治療のための新しい方法や薬剤成分の進展の為に、その基礎を提供する。
【０００８】
このようにして本発明は試料における乳房の新形成の細胞の存在を検出する新しい方法に向けられる。１つの実施においてはポリヌクレオチドプローブ（polynucleotide probe）が、試料におけるママグロビンｍＲＮＡの存在を検出する為に使用される。その方法は下記の段階からなる。（ａ）試料におけるｍＲＮＡと、配列番号：１５またはその対立遺伝子の変異型を含むママグロビンｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを接触。そして（ｂ）そのプローブと試料のｍＲＮＡのハイブリダイゼーション複合体を検出。
【０００９】
本発明の他の側面は、ハイブリダイゼーションによって試料における乳房の新形成細胞の存在を検出するキットを提供することである。そのキットは、容器に包装された、配列番号：１５またはその対立遺伝子の変異型を含むママグロビンｍＲＮＡを特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを含む。
【００１０】
本発明の別の実施においては、試料におけるママグロビンの発現は、試料におけるママグロビンｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡの存在を検出することにより決定される。この方法は以下の段階からなる。（ａ）患者から得られる試料における逆転写法を使用することによりｍＲＮＡからママグロビンをコードするｃＤＮＡを生成する。（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法のために、ママグロビンをコードするｃＤＮＡの中に存在しているオリゴマーを含む２つのプライマーを与える。そして（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応法によってママグロビンをコードするｃＤＮＡを増幅する。好ましくは２つのプライマーが配列番号：４および配列番号：１６をコードしているヌクレオチド配列をもつことである。
【００１１】
本発明の別の実施はポリメラーゼ連鎖反応によって試料における乳房の新形成細胞の存在を検出するためのキットを提供する。このキットは、容器の中に包装されており、ママグロビンをコードするｃＤＮＡの中に存在しているオリゴマーを含む、ポリメラーゼ連鎖反応法のための２つのプライマーを含む。好ましくは２つのプライマーが配列番号：４および配列番号：１６からなるヌクレオチド配列をもつことである。
【００１２】
本発明の別の実施において、腫瘍細胞によって発現するママグロビン蛋白質の存在がママグロビン蛋白質に特異的な抗体を使用することで試料中に検出される。この特異的な抗体は多クローン性および単一クローン性抗体であり得る。
【００１３】
この発明はまた、ママグロビン発現の腫瘍に対して抗原媒介性の、および／または細胞媒介性の、すなわち活性Ｔ細胞を通じた、免疫反応を誘起する能力のあるママグロビン抗原を使用する乳房の新形成疾患の治療のための新しい薬剤組成および方法に向けられる。
【００１４】
本発明に従った薬剤の一つの実施は、ママグロビンに特異的なＢ細胞を活性化する能力のあるママグロビンＢ細胞抗原を含む。このＢ細胞抗原は、ママグロビンに特異的なＢ細胞エピトープとＴＨエピトープ、またはＴヘルパー細胞に認識される決定基を含む。
【００１５】
別の実施において、ＭＨＣクラスＩの分子に対して、ママグロビン抗原は、ＴＣ細胞エピトープ および結合部位、またはアグレトープ（agretope）を含むママグロビンに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球によって認識されるママグロビンＴＣ細胞抗原である。
【００１６】
さらに本発明に従った薬剤の他の実施はＢ細胞およびＴＣ細胞抗原を含んでいる。
【００１７】
ママグロビン発現の腫瘍をもつ患者を治療する方法は養子免疫療法を含み、それは患者から単離したママグロビンに特異的なリンパ球のママグロビン抗原を伴ったex vivo刺激とそれに引き続く患者への活性化したリンパ球の投与、およびママグロビン抗原を含むワクチンを患者に投与することを含む、抗ママグロビン免疫反応のin vivo刺激を含む。
【００１８】
それゆえに、本発明によって成し遂げられると認められるいくつかの利点の間で、乳癌細胞に対する標識として役立ちうるヌクレオチドの配列やコードされたアミノ酸配列の提供、乳房の新形成細胞の存在を早期に発見する為の方法の提供、乳房撮影法を補足し予想価を増加させることができる乳癌の検出手段の提供、予後の評価を与えることができる方法の提供、治療の標的にすることを許す標識の提供、および腫瘍に対して細胞および液体の免疫反応を刺激する薬剤の提供が注目されるかもしれない。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の一つの側面は、配列番号:２（図２）で同定されるママグロビン、乳房特異的な分泌タンパク質をコードする配列番号：１として同定されるｃＤＮＡの同定と配列に基づいている。以下に記載するように、逆転写された腫瘍細胞のｍＲＮＡから始めて全長ママグロビンｃＤＮＡを単離し、ＰＣＲの技術を用いて増幅し、発現ベクターのサブクローニングした。加えて、ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質、ママグロビンは同定され、特徴付けられた。
【００２０】
ＤＥＳＴ００２と前に指定した特徴のない配列標識を用いて、今まで知られてなくここでママグロビンと同定された、相当する遺伝子産物が乳癌の腫瘍細胞系ＭＤＡ―ＭＢ―４１５に特に豊富であることが証明された。全長ママグロビンｃＤＮＡを単離するために、ｍＲＮＡはこの細胞系から転写され、ＲＡＣＥ ＰＣＲ法を用いてクローン化された（Edwards et al.Nucleic Acids Research 19:5227-32,1991）。この技術は、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの一本鎖ｃＤＮＡの３’末端への連鎖反応法に基づいている。ママグロビンｃＤＮＡが単離される方法は図１に図的に表わしてある。
【００２１】
全長503ｂｐｃＤＮＡ（配列番号：１）は、以前我々の先行研究（Watson and Fleming， supra）で相当するＤＥＳＴ配列（ＤＥＳＴ００２、配列番号：６）（図２）から得られた配列情報に沿ったこの技術によって単離される４０３ｂｐフラグメント（配列番号：５）（図２）から得られる配列情報から推論される。５０３ｂｐｃＤＮＡの中には、９３個のアミノ酸（配列番号：２）（図２）のポリペプチドをコードし、分子質量が１０．５ｋＤと予測される２７９ｂｐオープンリーディングフレーム（配列番号：１５）がある。このオープンリーディングフレームの最初のメチオニンはほぼ完全なKozakのコンセンサス配列（Kozak, Cell 22:7-8,1980）の中にある。この配列の６０ｂｐ上流は他のフレーム内メチオニンや翻訳停止部（translational stop）を含まない。ｃＤＮＡの３’未翻訳の配列は１６３ｂｐを構成し、元来のＤＥＳＴ００２配列の初回感作部分（priming site）の上流１２ｂｐであるポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡを含む。これらのデータは全長ママグロビンｃＤＮＡが単離されたことを示している。コードされたポリペプチドの最初の１９個の残基は疎水性のペプチドシグナル配列と予測され、残基５３−５５および６８−７０はコンセンサスＮ結合グリコシル化部位であり、ママグロビンは分泌糖たんぱく質であることを示している。
【００２２】
BLSATアルゴリズム（Benson et al.,Nucl Acid Res 21:2963-2965,1993;Altschul et al, J Mol Biol 215:403-410,1990）を用いて遺伝子バンクにおけるママグロビンｃＤＮＡに類似したＤＮＡ配列に対する探索は、明らかなＤＮＡ配列の相同を同定しなかった。このようにしてママグロビンｃＤＮＡは新規で、従来未知のＤＮＡ配列であると思われる。
【００２３】
ママグロビンに関係する配列のための他のポリペプチドの探索は、ママグロビンと他のポリペプチドの間のアミノ酸配列の相同を表わした。ママグロビンは、ラットの前立腺ステロイド結合タンパク質（プロスタテインprostatein）サブユニットＣ３（ｒＰＳＣ３）(図３)（配列番号:７）と４２％のアミノ酸同一性を示した（５８％は同類置換を含む）。ラットの前立腺ステロイド結合タンパク質は、２つの異なる二量体サブユニットＣ３/Ｃ１およびＣ３/Ｃ２（Parker et al.,Ann N Y Acad Sci 438:115-124;Parker et al.,J Steroid Biochem 20:67-71,1984）から構成される四分割タンパク質から成る腹部の前立腺における原発性分泌タンパク質である。Ｃ１、Ｃ２およびＣ３の遺伝子は全て約６ｋＤの分泌タンパク質をコードし遺伝子重複から生じると考えられるが、Ｃ１とＣ２の遺伝子はお互いに強い相同性を示す一方、それらはＣ３の遺伝子とはほとんど類似していない。同様にママグロビンはＣ１またはＣ２のタンパク質と配列の相同性がないことを示す。
【００２４】
上記のようにラットの前立腺ステロイド結合タンパク質（プロスタテイン）はラットの腹部の前立腺における原発性分泌タンパク質であり、その発現は雄性ホルモンのステロイドによって調節されている（Parker et al, Ann N Y Acad Sci 438:115-24,1984; Parker et al,J Steroid Biochem 20:67-71,1984）。他のタンパク質、ヒトのエストラマスチン（estramustin）結合タンパク質（ｈＥＭＢＰ）はヒトの前立腺、ヒトの乳癌およびヒトの悪性黒色腫において発現することが報告されている（Bjork et al,Cancer Res 42:1935-1942,1982; bjork et al,Anticancer Res 11:1173-82,1991）。ヒトのエストラマスチン結合タンパク質は、免疫化学的にラットのエストラマスチン結合タンパク質と類似しており、それはラットのステロイド結合タンパク質、プロスタテインと同一であると仮定されている。上記したようにママグロビンのアミノ酸配列はプロスタテインのＣ３サブユニットと４２％のアミノ酸同一性および同類置換を含む５８％の相同性を示した。このようにママグロビンはｈＥＭＢＰにある点で関係付けることが可能である。しかしながら、プロスタテインとｈＥＭＢＰの両方が前立腺で検出される一方、ママグロビンｍＲＮＡはこの組織では完全に欠如している。よって、ママグロビンはｈＥＭＢＰと同じタンパク質でもそのサブユニットのどちらでもなく、さらにｈＥＢＭＰの配列は決定されてないので、ママグロビンとｈＥＢＭＰのあるフラグメントまたはサブユニットとの何か類似性があるのかどうかさえ知られていない。
【００２５】
最近の報告ではＳＶ４０ Ｔ抗体に合同したｒＰＳＣ３プロモーターが遺伝子導入マウスにおいて前立腺癌および乳癌の両方を生成することが証明されているが（Maroulakou et al.,Proc Nat Acad Sci U.S. 91:11236-11240,1994;Sandmoller et al,Oncogene 9:2805-2815,1994）、このタンパク質の本当の生物学的機能は未知である。さらに、ラットの前立腺ステロイド結合タンパク質のヒトのＥＭＢＰへの仮定した関係にもかかわらず、ｒＰＳＣ３に相当するヒトのポリペプチドやヒトの遺伝子は同定されなかった。このようにして、ママグロビンとママグロビンをコードするｃＤＮＡは従来未知の新規な配列であることを表わしている。
【００２６】
ママグロビンとｒＰＳＣ３のタンパク質配列との両方に対してほとんど有意でないＢＬＡＳＴスコアをもつ他の配列のマニュアル配列を用いて、我々は、ヒトのクラーラ細胞１０ｋＤタンパク質（ｈＣＣ１０）（配列番号:8）（Peri et al, J Clin Invest 92:2099-2109,1993）（図３）および、それに加えてウサギとマウスの子宮グロビン（Uteroglobin）（Miele et al.,Endocrine Rev 8:474-90,1987;Cato and Beato,Anticancer Res 5:65-72,1985;Miele et al.,J Endocrinol Invest 17:679-692,1994）のタンパク質との、他の相同性を同定した。これらの相同性は、種に依存して、２６％同一性または同類置換を含めて４０％であった。特に、多くのアミノ酸は、全てのタンパク質の間で完全に保存され、子宮グロビンサブユニット（下記参照）間のジスルフィド結合の生成で役割を果たすことが知られているＣｙｓ−３およびＣｙｓ−６９を含んでいる。これらの相同性は、ママグロビンは上皮細胞によって分泌されるタンパク質の小さな系統群（small family）の新しいメンバーであることを示唆する（Miele et al,1994,supra）。
【００２７】
ｈＣＣ１０遺伝子はウサギやマウスの子宮グロビン遺伝子の相同体である（Peri et al,J Clin Invest 92:2099-2109,1993）。子宮グロビンは元来ウサギの子宮における分泌タンパク質として特徴付けられたが、その後、肺、乳房および前立腺を含む他の上皮器官でも発見された。ラットのプロスタテインとは違って、子宮グロビンは、保存残基（cinserved residue）Ｃｙｓ−２およびＣｙｓ−６９において２つのジスルフィド結合によって連結した同等二量体タンパク質（homodimeric protein）である（Miele et al,1994,supra）。子宮グロビンの遺伝子の転写はステロイドホルモンによって調節されるが、タンパク質自体の他のステロイドホルモンに結合する能力は論争になっており、またこのタンパク質の本当の生物学的機能は未知である（Miele et al,1994,supra）。
【００２８】
ママグロビンの発現は乳腺に制限される。これは、ｒＰＳＣ３が腹部の前立腺に発現し（Perker et al.,Ann N Y Acad Sci 438:115-1124,1984）、ｈＣＣ１０/子宮グロビンが肺、子宮、前立腺および乳房を含む多くの組織で発現する（Miele et al.,1987,supra;Cato and Beato,supra;Miele et al.,1994 supra）こととは対照的である。ママグロビンとこれらのタンパク質の間の配列の類似性により、我々は組織特異的な発現のパターンを決定した。
【００２９】
５００ｂｐママグロビンｍＲＮＡは腫瘍標本２４１０（元来の配列の標識が単離した組織）において容易に検出され、正常なヒトの乳房組織ではほとんど検出されない（図４Ａ）。ママグロビンｍＲＮＡは、致命的ではない（iｍＭortalized）乳房上皮細胞系Ｂ５−５８９においては検出できなかった。ママグロビンの発現はまた子宮グロビンの発現のある２つの部位であるヒトの子宮や肺では検出されなかった。
【００３０】
ＲＴ/ＰＣＲを用いた増幅では、腫瘍２４１０および正常な乳房組織の両方でママグロビンｍＲＮＡを検出したが、通常ｒＰＳＣ３や子宮グロビンを発現する組織、ホルモン反応性およびステロイド産性組織（卵巣、睾丸、胎盤）、および他の分泌上皮器官（結腸）を含む調査した１５個の他の組織では検出されなかった（図４）。それゆえにママグロビンｍＲＮＡの発現は乳房組織に相対的に特異的である。
【００３１】
ママグロビンの発現の乳房に特異的な性質を曖昧でなく証明するために、全長ママグロビンｃＤＮＡが、以下の実施例２Ａで記載したように成人および胎児の組織の蓄積集団からのポリＡ選択ｍＲＮＡ（poly A-selected ｍＲＮＡ）のより広範囲で定量的なパネル（panel）でママグロビンｍＲＮＡのプローブに使用された。ママグロビンｍＲＮＡの発現は、唾液腺のような他の接近して関連のあるアポクリン腺においては完全に欠如しており、また末梢の白血球、リンパ節および骨髄においても検出されなかった。乳腺を除いて、ママグロビンｍＲＮＡは、調査した４３人の成人または７人の胎児の組織の他の全てにおいて検出されなかった。これはママグロビンの遺伝子発現が乳癌に対して非常に特異的な標識になりうることを確認している。
【００３２】
この報告における研究をもとにすれば、ママグロビンは相対的に乳房に特有なタンパク質である。乳癌に過剰発現することが知られている２つの他の遺伝子はerb-BおよびcyclinDである（Jardines et al,Pathobiology 61:268-282,1994;Keyomars and Pardee,Proc Nat Acad Sci U.S.90:1112-1116,1993）。erb-BおよびcyclinDの過剰発現とは違って、ママグロビンの過剰発現は、一般的な増加した成長能力や有糸分裂速度よりむしろ乳房の上皮細胞のより特異的な変性を反映するかもしれない。そのようにしてママグロビンの遺伝子の制御障害は腫瘍の治療上の受傷性または臨床上の方針により特異的な意味をもっているかもしれない。
【００３３】
米国特許5668267号に報告されているように、ママグロビンｍＲＮＡの過剰発現は、１５個の異なる組織学的な形態のステージ１原発性乳癌のうちの4個（27％）と同様に腫瘍標本２４１０においてnorthern ブロットハイブリダイゼーションによって検出された。この割合は、erb-B増幅やp53突然変異のような他の遺伝子の変性の罹患率と同程度である（Slamon et al. Sci 244:707-712,1989;Thor et al,J Nat’l Cancer Inst 84:845-855,1992）。さらに我々は我々の解析をステージＩ腫瘍に制限したので、ママグロビンの過剰発現は実際には、腫瘍のこのサブグループにおいて報告される他の全ての遺伝子変性よりもより罹患率が高いかもしれない（Alllerd et al,J Nat’l Cancer Inst 85:200-206,1993）。これらのデータはママグロビンの過剰発現は１個の腫瘍標本に特有ではなく、実際には原発性乳房腫瘍の間で比較的頻繁であることを示唆する。さらに検査された全ての腫瘍がステージＩであったという事実は、この制御障害は乳房の新形成の進行において比較的早期に生じることを示唆する。
【００３４】
ママグロビンの発現は、一段階のＲＴ/ＰＣＲ分析法によって与えられる感度のレベルにおいて正常なリンパ節または末梢のリンパ球では検出できなかった。しかしながら、以下で報告するように、ママグロビンｍＲＮＡは転移性乳癌の患者からのリンパ節の４０％以上および末梢の血液幹細胞集団（ＰＢＳＣｓ）の60％で検出された。これらの結果は、他の上皮に特異的な遺伝子について提案されてきたように、末梢のリンパ節および血液幹細胞におけるママグロビンの転写の解析が潜伏している乳癌転移酵素の検出に有効であることを示す（Schoenfeld et al.,Cancer Res 54:2986-2990,1994）。
【００３５】
ママグロビンｃＤＮＡが翻訳可能なタンパク質をコードしたことを証明するために、ｃＤＮＡのクローンがin vitroの翻訳分析法で使用された。図５にママグロビンｃＤＮＡでプログラムされたウサギの網状赤血球溶解産物からのタンパク質の生成物を示す。約６ｋＤのタンパク質がママグロビンｃＤＮＡを用いて形成された。見かけの分子量はオープンリーディングフレームの概念上の翻訳から予測されるものより小さいが、この発見は通常、ウサギやヒトの子宮グロビン翻訳生成物でも同様に観察される。
【００３６】
乳癌におけるママグロビンタンパク質の発現の罹患率を調査するために、ウサギの多クローン性の抗ママグロビン抗体がママグロビンタンパク質配列のＣ末端に相当するペプチドに対して形成され、免疫組織化学的解析によってママグロビンタンパク質の発現のために多くの段階および組織学的形態の１００個の原発性乳房腫瘍が検査に用いた。
【００３７】
下表１に要約したように、これらの腫瘍の８０％以上がママグロビンタンパク質に対して強い免疫陽性であり、染色は腫瘍の段階には依存しなかった。この結果は臨床上の標本におけるママグロビンタンパク質の検出を原発性乳癌に対する高感度で特異的な標識として使用することができることを示している。
【００３８】
出願人はママグロビンが分泌タンパク質と考えているので、その存在は、腫瘍がこの遺伝子生成物を過剰発現させている患者からのリンパ液において検出可能であることを期待している。そのようにして、ママグロビンは管理している乳癌の患者に対する前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）および他の固形腫瘍の標識（診断病理学における腫瘍標識、Clin LaＢＭＥd 10:1-250,1990）と同様に臨床上有用でありそうである。
【００３９】
乳癌の標識としてのママグロビンの同定は、ある患者における乳癌の存在を検出する方法を含む本発明の別の側面の基礎を提供する。乳房の新形成疾患の検出の状況においてここで使用されるような検出という言葉は、ある患者において乳癌の存在を決定することの側面を含み、他の疾患から乳癌を区別し、疾患の予想される結果による予後の評価や回復の予想、病状の追跡や病気の再発、患者にとって好ましい治療方法の決定や抗腫瘍治療の標的とすることを意図している。
【００４０】
乳癌を検出する一つの方法はあるポリヌクレオチドを乳房の新形成細胞からのｍＲＮＡにハイブリダイズすることからなる。ポリヌクレオチドは配列番号：１５の相補体または配列番号：１５の相補体の誘導体からなる。ここで使用される場合は、ポリヌクレオチドはＤＮＡおよび/またはＲＮＡおよび、ＤＮＡ配列がまたチミン残基に対して置換されたウラシルを伴う同一のＲＮＡ配列を含むような配列表に列挙されているヌクレオチド配列からなる。ヌクレオチド配列の誘導体は、新形成細胞からのママグロビンｍＲＮＡに明確にハイブリダイズすることを導ける配列に対して同様にストリンジェンシーな状況下で新形成細胞からのママグロビンｍＲＮＡに明確にハイブリダイズすることを導ける配列に対して十分な配列同一性をもつ。誘導されたヌクレオチド配列は必ずしも物理的にそのヌクレオチドから誘導される必要はないが、例えば化学合成またはＤＮＡの複製または逆転写または転写を含む全ての手段で形成される。好ましい誘導体のヌクレオチド配列は、配列番号：１５の相補体のフラグメントおよび配列番号：１５に示された配列をコードするママグロビンの対立遺伝子の変異型の相補体に同一な配列を含む。
【００４１】
乳癌の検出系においてママグロビンをコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、標本を患者から入手した。その標本は組織の生体検査標本または血液、血しょう、血清または同様なものの標本になりうる。その標本はそこに含まれている核酸を抽出するために取り扱われてもよい。好ましくはその標本から結果として得られる核酸はゲル電気泳動法または他のサイズの分離技術に従うべきである。
【００４２】
検出はハイブリダイゼーション重複体（hybridization duplex）を形成するための、核酸と特にポリヌクレオチドプローブを伴った標本のｍＲＮＡとの接触を含む。この言葉“プローブ”は、標的の配列を有するプローブ配列の相補性によって、標的の配列とのハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドからなる構造を述べている。
【００４３】
結果として生じる重複体の検出は既知のどんな方法論でも成し遂げられる。ハイブリダイゼーション重複体は通常、標識化したプローブの使用により成し遂げられる。代わりにプローブは標識化しないで、直接的でも間接的でも標識化したリガンドとの特別な結合によって検出可能としてもよい。プローブやリガンドを標識化するための適切な標識や方法は公知技術であり、例えば既知の方法（例、ニックトランスレーションまたはキナーゼの使用）を併用してもよい放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例ジオキセタン（dioxetan）、特にトリガーされたジオキセタン（triggered dioxetan））、酵素、抗体などを含む。
【００４４】
ママグロビンｃＤＮＡでプローブするときには、間違った結果を避けるためにストリンジェンシーの高い条件が使用できる。配列をコードするママグロビンの相補体から誘導された配列を含むプローブを用いるときには、あまりストリンジェントでない条件を使用できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さやホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーションの間および洗浄操作の間の多くの要素で決定される。これらの要素は例えばSambrook et al.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,1989）に概説されている。
【００４５】
標本においてママグロビンｍＲＮＡの検出感度を増加させるためには、逆転写/重合連鎖反応（ＲＴ/ＰＣＲ）の技術を、ママグロビンをコードするｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを増幅することに使用できる。ＲＴ/ＰＣＲの方法は公知技術である（例えば、Watson and Fleming,supraを参照のこと）。プライマーの増幅に有用なオリゴヌクレオチドは配列番号:３と配列番号：４から成る。好ましくはママグロビン正増幅プライマーが5’−AGC ACT GCT ACG CAG GCT CT-3’（配列番号：１６）からなり、ママグロビン逆増幅プライマーが5’−ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’（配列番号：４）から成る。
【００４６】
あるいは、逆転写ｃＤＮＡにおけるママグロビンの標識の配列を、間隙ＬＣＲ（Ｇ−ＬＣＲ）や他のバリエーションを含むリガーゼ連鎖反応法、または自己持続性配列複製（３ＳＲ）とそのいろいろな改良、のような他の全ての公知の方法論を用いて増幅および検出することができる。加えてママグロビンｍＲＮＡは非対称な間隙ＬＣＲ（ＡＧ―ＬＣＲ）によって直接検出できる。例えば、Leckie et al.,”Infectious Disease Testing by Ligase Chain Reaction” in Molecular Biology and Biotechnology, R.A.Myers,ed.,pp.463-466,VCH Publishers,1995.参照のこと。
【００４７】
本発明の他の実施において、ママグロビンｃＤＮＡ配列または誘導体は、乳癌患者からの標本におけるママグロビン遺伝子の全ての変性（すなわち、遺伝子の再配列、遺伝子の増幅、遺伝子の欠失）を特徴付けることに使用できる。このことは無傷のｍＲＮＡを含んでない患者の標本を遺伝子構造の変化について検査することができるような方法を提供する。
【００４８】
この技術の一つの応用として、ママグロビンｃＤＮＡ配列またはその誘導体は、患者の腫瘍、正常な組織、またはリンパ球から単離され、また１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化された患者のゲノミックＤＮＡ（genomiｃＤＮＡ）にハイブリダイズする。公知技術であるSouthern ブロット 実験を用いて、この分析法で患者または患者の乳房腫瘍が欠失、再配列または増幅したママグロビン遺伝子をもつかどうかを決定する。これらの変化の検出は、または予後の予想や患者の管理にとって有用で重要な情報を提供できる。
【００４９】
乳癌を検出する別の方法は、患者から得られた標本におけるママグロビンポリペプチドの前駆体および/または分泌形態の存在の検出からなる。タンパク質を検出する公知の全ての方法が使用できる。そのような方法は、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、結合剤―リガンド分析法、免疫組織化学的技法、凝集法および相補体測定法を含む、しかし限定はされない（例えばBasic abd Clinical IｍＭunology,Sites and Terr,eds.,Appleton & Lange,Norwalk,Conn.pp217-262,1991参照のこと）。好ましいのは結合剤―リガンド免疫分析法で、これはエピトープまたはママグロビンのエピトープと反応する抗体を含み、標識化されたママグロビンポリペプチドやその誘導体を競争して引き離す。
【００５０】
ここで用いたが、“ママグロビンポリペプチド”という言葉は、非グリコシル化およびグリコシル化前駆体の形態を含む自然発生のママグロビン、グリコシル化された分泌形態、その誘導体およびフラグメントを包含する。自然発生は、自然の発生源から、例えば正常および/または疾患のある生体から単離することができ、またヒトによって故意に修飾されていないポリペプチドを意味する。ここで同定された自然発生のママグロビンポリペプチドは、配列番号：２からなる前駆体の形態、配列番号：１7（配列番号：２のアミノ酸20-93）からなる分泌形態を含む。配列番号：２の対立遺伝子の変異型もまた自然発生のママグロビンポリペプチドの範囲に含める。
【００５１】
ママグロビンポリペプチドの誘導体は、実質的に自然発生のママグロビンの一部分と同一の少なくとも１０個のアミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを参照する。実質的に同一性をもつセグメントは少なくとも約２０個のアミノ酸であることが好ましく、更に好ましくは少なくとも約５０個のアミノ酸であり、最も好ましいのは少なくとも約７５個のアミノ酸である。２つのポリペプチドは実質的に同一性をもつのは、ＢＬＡＳＴのような配列プログラムでgap penaltyや他のパラメータについて既定の設定を使用した時の最適な配列で、それらが少なくとも８０％以上の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましいのは９９％配列同一性を占めることである。好ましくは、同一性のない残基の位置はアミノ酸の同類置換によって異なることである。
【００５２】
アミノ酸の同類置換は類似の側鎖をもつ残基が交換可能であることを述べている。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸の一群であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、水酸基―脂肪族側鎖をもつアミノ酸の一群であるセリンおよびスレオニン、アミド基を含む側鎖をもつアミノ酸の一群であるアスパラギンおよびグルタミン、芳香族側鎖をもつアミノ酸の一群であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、塩基性の側鎖をもつアミノ酸の一群であるリシン、アルギニンおよびヒスチジン、硫黄を含む側鎖をもつアミノ酸の一群であるシステインとメチオニンがある。好ましいアミノ酸の同類置換の群はロイシン―イソロイシン、フェニルアラニン―チロシン、リシン―アルギニン、アラニン―バリンおよびアスパラギン―グルタミンである。
【００５３】
ママグロビンポリペプチドの誘導体は、自然発生のママグロビンやそのフラグメントに特異的である、抗ママグロビン抗体、単一クローン性または多クローン性の抗体と好ましく交叉反応を起こす。
【００５４】
ここで使用したように、“フラグメント”や“ペプチド”という言葉は、アミノ末端および/またはカルボキシル末端の欠失のある全長ママグロビンｃＤＮＡ（例 配列番号：１）から推論されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をもつママグロビンポリペプチドを述べている。典型的に、ママグロビンのフラグメントやペプチドは少なくとも３個のアミノ酸の長さである。好ましくはママグロビンのフラグメントやペプチドは少なくとも６個のアミノ酸残基の長さ、より好ましくは約１２個のアミノ酸残基の長さ、さらにより好ましくは約２５個のアミノ酸残基の長さ、および最も好ましいのはおおよそ５０個のアミノ酸残基またはそれ以上の長さであることである。
【００５５】
多数の競合的および非競合的タンパク質の結合免疫測定法は公知技術である。そのような測定に用いられる抗体は、例えば凝集検査に使用されるのと同様に標識化されてなくても、様々な測定法に使用するために標識化されていてもよい。使用できる標識は放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、酵素基質または共同要素（co-factor）、酵素阻害剤、粒子、色素および放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法例えば酵素連結免疫吸着剤測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法などで使用される同様なものを含む。
【００５６】
Ｂ細胞エピトープからなる、ママグロビンポリペプチドに対する多クローン性または単一クローン性抗体は免疫測定法で使用するために公知技術の多くの方法で作ることができる。ここで使用するように、“Ｂ細胞エピトープ”という言葉はママグロビンポリペプチドの抗原決定に対して述べている。Ｂ細胞エピトープは、そのエピトープ独特の空間配置において３個のアミノ酸から構成できる。一般的に、Ｂ細胞エピトープは少なくとも５個のアミノ酸からなっている。アミノ酸の空間配置の決定法は公知技術にあり、例えばＸ線結晶解析や２次元核磁気共鳴法を含んでいる。
【００５７】
ママグロビンポリペプチドの調製方法は、化学合成に限らず、組換えＤＮＡ法や生物学的標本からの単離を含んでいる。エピトープからなるペプチドの化学合成は、例えば固相のペプチド合成法である古典的なMerrifeld法（Merrifeld,J Am Chem Soc 85:2149,1963）または高速自動多数ペプチド合成系（Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis system）（DuPont Company,Wilmington,DE）（Caprino and Han,J Org Chem 37:3404,1972）におけるＦＭＯＣ法で行うことができる。
【００５８】
多クローン性抗体は、免疫しているウサギに膝窩リンパ接へ抗原を注射し、引き続き２週間の間隔で抗原の腹腔内注射でブーストして調製できる。その動物を出血させ、通常ＥＬＩＳＡによってリンパ液を精製したママグロビンタンパク質に対して測定する。単一クローン性抗体は、MilsteinとKohlerの方法の後、骨髄腫やリンパ腫細胞のような連続して複製している腫瘍細胞をもつ免疫しているマウスか脾細胞を溶かすことによって調製できる（Milstein and Kohler Nature 256:495-497,1975;Gulfre and Milstein,Methods in Enzymology:IｍＭunochemical Techniques 73:1-46,Langone and Banatis eds.,Academic Press,1981）。多くの形成したハイブリドーマ細胞は制限希釈法よってクローン化され、上清液がＥＬＩＳＡやＲＩＡによって抗体生成物に対して測定される。
【００５９】
ママグロビンに対して調製した多クローン性および単一クローン性抗体は、ママグロビンを発現している細胞からママグロビンの前駆体やその選択した形態に単離および精製するのに使用される。例えば以下に示すように、ママグロビンｃＤＮＡから予測される１６Ｃ−端末アミノ酸に生成した多クローン性抗体（Glu-Val-ＰＨe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-ＰＨe,SEG ID NO:14）は、in vitro翻訳系で合成されたママグロビンに対してと同様に、ママグロビンの前駆体やその選択した形態に結合する。抗ママグロビン抗体を用いたママグロビンの単離は、アフィニティークロマトグラフィーのような公知技術の操作を用いて成し遂げられる。
【００６０】
腫瘍細胞によって発現している標的抗原に対する認識や特異的な結合をする抗体の独特の能力は、癌の治療に対するアプローチを与える（復習のためには、LoBuglio and Saleh,Am J Med Sci304:214-224,1992;Bagshawe, Adv ＰＨarmacol 24:99-121,1993を参照のこと）。このようにして、本発明の別の側面は、乳癌細胞による過剰発現が発見されるママグロビンに対する抗体の使用に基づいて、動物の乳癌の治療および発病の回避方法を提供する。
【００６１】
ママグロビンに対して特異的な抗体は、多クローン性でも単一クローン性でも、公知技術の全ての方法で作られる。例えば、マウスやヒトの単一クローン性抗体はハイブリドーマ細胞法によって作ることができる。あるいは、ママグロビン、または免疫学的に活性な誘導体やそのフラグメント、または抗遺伝型抗体、またはそのフラグメントを、ママグロビンが発現している細胞を認識する能力のある、抗体のＢ細胞形成を引き起こすために動物に投与できる。
【００６２】
そのようにして作られた抗体やそのフラグメントは、１個またはそれ以上の、放射性核種、毒素、あるいは細胞毒のような腫瘍崩壊性基質で標識化され、乳癌の疑いのある患者に投与する。乳癌細胞によって発現するママグロビンに対する標識された抗体の結合は癌細胞の死を引き起こすと思われる。
【００６３】
公知の様々な細胞崩壊性基質の全てがそのような標識化された抗体の生成に用いることができる。例えば、免疫毒素は、植物や細菌の毒素と抗体を結合させて作ることができる。このような毒素は例えば、リシン（ricin）、ジフテリア（diｐＨtheria）毒素、プソイドモナス（Pseudomonas）外毒素Ａを含む。薬剤と抗体の複合体は化学療法薬が抗体に連結することによっても作ることができる。このような使用に適切な化学療法薬は、例えばトモキシフェン（tomoxifen）、ドキソルビシン（doxorubicin）、メトトレキセート（methotrexate）、クロラムブシル（chlorambucil）、ビンカアルカロイド（Vinca alkaloids）やミトマイシン（mitomycin）を含む。加えて、放射性免疫複合体は放射性核種が安定に抗体に連結して作ることができる。放射性免疫複合体を作るのに適切な放射性核種は、例えば１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、４７Ｓｃのようなβ線放射性物質、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂのようなα線放射性物質、１２５Ｉ、７７Ｂｒのようなオージェ電子放射性物質、１０Ｂのような核分裂性の核種を含む。
【００６４】
乳房腫瘍のかなりの割合がママグロビンタンパク質を発現するという発見は、ママグロビンの抗原でのママグロビンに特有なＢおよび/またはＴ細胞のリンパ球（ＴＣ）の活性化を含む、発明の別の側面の基礎となる。従って、本発明はママグロビンＢ細胞の抗原およびＴＣ細胞の抗原を提供する：抗体および/または細胞を媒介したママグロビン発現腫瘍に対する免疫応答を誘起するために少なくとも１つのＢ細胞ママグロビン抗原および/または少なくとも１つのＴＣママグロビン抗原からなるワクチン、およびママグロビン発現腫瘍のある乳癌患者の治療法。本発明に従った一つの方法は、活性化したママグロビンに特異的なリンパ球を患者に投与することからなる。別の方法はママグロビンに特異的なワクチンを患者に投与することからなる。
【００６５】
ここで使用したように、“ママグロビン抗原”は、ママグロビンに特異的なＢ細胞やＴＣ細胞によって認識されるＢ細胞やＴＣ細胞を含めて、自然発生のママグロビンポリペプチド、誘導体、そのフラグメントを含む。
【００６６】
ママグロビンＢ細胞抗原はママグロビンに特異的なＢ細胞エピトープとＴＨ細胞エピトープからなる。“Ｂ細胞エピトープ”という言葉は、動物に投与された時にＢ細胞上の抗ママグロビン免疫グロビン受容体によって認識しＴＨ細胞の適切な支援とともに抗体の生成を誘起する能力のある全ての抗原、ハプテン、エピトープ、または抗原決定群を述べている。Ｂ細胞エピトープは少なくとも４個のアミノ酸のアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｂ細胞エピトープは長さがアミノ酸の数で少なくとも６個と２５個の間であり、より好ましくは長さがアミノ酸の数で約１５個と２５個の間である。Ｂ細胞エピトープを構成しているアミノ酸配列は自然発生のママグロビンのフラグメントにおける連続したアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一である。あるいは、Ｂ細胞エピトープを構成しているアミノ酸配列はママグロビンの集められた局所的な決定群を代表する不連続のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一である。
【００６７】
“ＴＨ細胞エピトープ”という言葉は、ＭＨＣクラスＩＩの分子との関連を通じて、Ｔヘルパー細胞によって認識される全ての抗原決定群を述べている。Ｔヘルパー細胞の活性化が、静止しているママグロビン特異的なＢ細胞を親和性の高いＩｇＧ―分泌細胞への特殊化を引き起こす、すなわち二次抗体応答を誘起する。Ｔ細胞の支援を通じて、特異的な抗体を生成するＢ細胞の力価をより高くするために、ＢやＴＨ細胞決定群を含む免疫原性ペプチドの調製および使用は公知である、例としてCheronis et al.,U.S.Patent No.5,573,916, Denton, et al.,Cancer Letters 70:143-150(1993),Borras-Cuesta et al.,Eur. J. IｍＭunol. 17,1213-1215(1987),Good et al.,Science 235:1059-1062(1987)を参照のこと。ＴＨ細胞エピトープはママグロビンからのアミノ酸配列または異種のタンパク質からなっていてもよい。例えば、Denton et al.では、よく知られたヘルパーＴ細胞決定群であるインフルエンザ赤血球凝集素Ａ/Ｘ−３１の配列１１１―１２０に連結したムチンＭＵＣ−１の中心からＢ細胞決定郡領域を含む合成タンパク質で免疫したマウスにおいて分泌上皮に発現し、乳癌や他の癌と関連している糖タンパク質の複合体であるムチンに対する抗体反応の誘発が記載されている。ＴＨ細胞エピトープは、アミノ酸残基が約６個から約２０個の間のアミノ酸配列からなり、好ましくは約８個の残基と約１８個の残基の間であり、さらに好ましいのは９個の残基から１５個の残基の間である。
【００６８】
ママグロビンＴＣ細胞抗原はＴＣ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩアグレトープからなる。この“ＴＣ細胞エピトープ”という言葉は、抗原が存在している細胞の表面でＭＨＣクラスＩの分子が与えられた時にママグロビン特異的なＴＣ細胞によって認識される全ての抗原、エピトープ、または抗原決定群を意味している。“ＭＨＣクラスＩアグレトープ”という言葉は、抗原が存在している細胞（ＡＰＣ）上でＭＨＣクラスＩの分子によってママグロビンの抗原がママグロビン特異的なＴＣ細胞に与えられることを許容するＭＨＣクラスＩの分子によって認識される全てのアミノ酸配列を述べている。ＴＣ細胞エピトープおよびＭＨＣクラスＩアグレトープは、自然発生のママグロビンのフラグメントのアミノ酸配列と同一または実質的に同一である約６個から約１１個の間のアミノ酸をもつアミノ酸配列に含まれる。好ましくはこの配列は長さがアミノ酸の数で８個または９個である。
【００６９】
タンパク質抗原に対してＢおよびＴＣ細胞を同定する方法は公知である。例えば、単離したママグロビン特異的なＢ細胞またはママグロビン特異的なＴＣ細胞が、分泌したママグロビンにわたって重なり合う合成ペプチドに反応する許容量は標準的な免疫生物学的手法で決定してもよい。そのような抗原的と同定されたペプチドは、ママグロビン特異的なＢまたはＴＣ細胞を刺激する能力を最適化する時間で１個または少数のアミノ酸を修飾するかもしれない。
【００７０】
Ｂ細胞エピトープはまた、商業的に入手でき、ポリエチレンの多数のピンにＣ末端で結合している無作為なペプチドの検査を含むエピトープ地図作成キット（epitope mapping kit）を用いて遺伝子地図を作ることができる、例 Cambridge Research Biochemicals。
【００７１】
あるいは、予測されるママグロビンのアミノ酸配列は、既知のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの分子の結合モチーフに一致する配列について調査してもよい。例 Hill et al.,Nature 360:434(1992),Pamer et al.,Nature 360:852(1992),HaｍＭer et al.,J.Exp.Med. 176:1007(1992),falk et al.,Nature 351:290-296(1991)を参照のこと。例えば、乳房腫瘍特異的なＣＴＬｓによって認識可能な抗原的ペプチドは、Peoples et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 92:432-436(1995)によって記載されたＨＬＡ−Ａ２−結合ペプチドに対してママグロビンのアミノ酸配列を調査することで同定される。抗原が存在している分子としてのＨＬＡ−Ａ２の選択は適切で、患者はＨＬＡ−Ａ２を発現する（Caucasians発現ＨＬＡ−Ａ２の約５０％）。予測されたＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドは合成され、合成ペプチドをＴ２細胞系の上に混ぜることにより抗原性を試験できる。Ｔ２細胞の表面の上のＨＬＡ−Ａ２分子のように抗原性の表現に欠陥のあるヒトのＴ細胞/Ｂ細胞融合生成物は外因性ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドと効果的に混ぜられる（Henderson, et al,Science 255:1264-1266(1992)）。ペプチドを混合したＴ２細胞を、ママグロビン発現の乳房腫瘍から単離され、腫瘍が浸透しているリンパ球（ＴＩＬｓ）から誘導した乳房特異的なＣＴＬｓで培養することを含む標準的な細胞毒性作用測定法が実施される、例 Peoples et al.,pages 432-433, Toso et al.,Cancer Research 56:16-20(1996)を参照のこと。
【００７２】
ＴＣ細胞エピトープを含む抗原性のママグロビンペプチドもまた、腫瘍細胞の表面にＨＬＡクラスＩ分子で与えられる酸で溶出する内因性ペプチドによって同定される（例 Peoples et al.,supra,p.433参照）。溶出するペプチドは、ＨＰＬＣ分離のようないくつもの公知技術によって分離される。異なるペプチドの断片をＴ２細胞に混合し、混合したＴ２細胞は乳房腫瘍特異的なＣＴＬｓで培養し、標準的な免疫生物学的手法を用いて、どのペプチドがＣＴＬｓによって認識されるかを決める。
【００７３】
本発明に従ったママグロビン抗原は養子免疫療法で使用される。この治療法は、抗―ママグロビン抗体生成Ｂ細胞のママグロビン抗原および/またママグロビン発現腫瘍をもつ患者から単離したママグロビン特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）によるin vitroでの活性化および拡大を含む。この方法はママグロビンＢ細胞およびＴＣ細胞抗原の両方からなる混合物でもまた実践される。活性化されたリンパ球は養子免疫療法に対する患者に戻す形で導入する。
【００７４】
本発明に従ったママグロビン抗原はママグロビンに特異的なワクチンの成分としてもまた利用できる。このワクチンは免疫原性刺激量のママグロビン抗原からなる。ここで使用したように、免疫刺激量は、乳癌の改善または治療のために受容体における所望の免疫反応を刺激することができる抗原の量を述べている。この量は、過度の実験をせずに、通常の技術をもつ者に良く知られている標準的な手続きによって経験的に決められる。
【００７５】
これらの抗原は、所望の型の免疫反応を誘発するように決める多くのワクチンの組成に一つとして提供されてもよい、例 抗体および/または媒介される細胞。このような組成の決定法は公知である、例 A.Lanzavecchia,science 260:937-944(1993),U.S.Patent No. 5,585,103からRaychandhuriへ 参照。
【００７６】
免疫反応を刺激するのに使用するワクチンの組成の例は、アルミニウム塩のような薬学的に受け入れられる免疫助成剤；スクアレンのエマルジョン、またはスクアレンとムラミルジペプチド；リポソーム；安定化洗浄剤、ミセル生成剤、生分解性および生適合性の油からなる混合物を含む（Raychandhuri,supra）。
【００７７】
ママグロビンに特異的なワクチンはまた、ママグロビン抗原とともに混合した担体細胞を含んでもよい。好ましくは担体細胞は、マクロファージ、樹状細胞、活性化したＢまたはＴリンパ球のように自己のプロフェッショナル抗原存在細胞（antigen presenting cells）（ＡＰＣ）から調整される、例 Lanzavecchia,supra,p.937.参照。プロフェッショナルＡＰＣは、Ｔ細胞のアネルギーや不活性化を回避するシグナル２として知られる、抗原に非特異的な共同刺激因子信号を運搬するためにＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４に結合するリガンドＢ７を発現する。このようにしてワクチンはまた、アネルギーの誘発と拮抗するようにInterleukin-2または別の共同刺激因子信号を含む（Lanzavecchia,supra,p.938）。
【００７８】
ママグロビンに特異的なワクチンの他の組成は、ママグロビン抗原の発現のためにコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを含む。細胞毒性Ｔリンパ球を刺激する病原菌の使用は公知である（Raychaudhuri,supra.）。キメラベクターは、リステリアやＢＣＧのような細菌と同様に種痘診、小児麻痺、アデノおよびレトロウィルスを用いて記述される。例えば、カナリア痘ウィルスベクター、ＡＬＶＡＣは、コードされた異種の遺伝子生成物に対する強い細胞免疫反応を誘導することを示した（Taylor et al,Viology 187:321-328(1991)）。加えて、ＭＡＧＥ−１遺伝子でコードされたＭＺ２―Ｅヒトの黒色腫排出物抗原を表現している組み換えＡＬＶＡＣは、ＭＡＧＥ−１ｍＲＮＡを発現する乳癌から誘導されるＴＩＬpopulationにおいてin vitroでＭＡＧＥ−１ ＣＴＬ活性を刺激できる。米国特許番号第5593972号からWeiner et alまでに記載されている別のアプローチにおいては、標的としている免疫原性タンパク質の抗原をコードしている組み換え表現ベクターは、個々のin vivoに対しても、例えば筋肉細胞に対して、ＤＮＡの細胞への摂取を促進する薬剤と共に個々のex vivoの細胞に対しても直接投与される。
【００７９】
当業者は、所望の免疫反応を達成するために適切なワクチンの組成にする方法を容易に決定できる。例えばin vivoで抗ママグロビン抗体の生成を誘発するためにママグロビンに特異的なワクチンは、Ｂ細胞エピトープおよびＴＨ細胞エピトープからなる、少なくとも１つのママグロビンＢ細胞抗原を含める。ＴＨ細胞エピトープは好ましくは意図したワクチン受領者（recipient）の適当なＭＨＣクラスＩＩの一つのタイプと適合する。あるいは破傷風トキソイドからの“universal”Ｔ細胞エピトープのようにＨＬＡタイプにかかわらず一般的にヒトによって認識されることが知られているＴＨ細胞エピトープは使用することができるかもしれない(Panina-Bordignon et al. Eur. J. IｍＭunol. 19:2237(1989)）。好ましくはワクチンは異なるＨＬＡタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識されているＴＨエピトープとともにママグロビンＢ細胞抗原のpluralityからなる。
【００８０】
ママグロビンに特異的なワクチンの別の実施例は細胞媒介反応を誘発し、ママグロビン特異的なＴＣ細胞を活性化する少なくとも１つのママグロビンＴＣ抗体からなる。好ましくはワクチンがいくつかのＴＣ細胞抗体からなることである。
【００８１】
ママグロビンに特異的なワクチンはまた抗体と細胞媒介反応を誘発するように組成を決めてもよい。この具体例はママグロビンＢ細胞とＴＣ細胞の抗体を含んでいる。
【００８２】
ママグロビン発現腫瘍のある患者は、本発明に従ったママグロビンに特異的なワクチンを免疫刺激量の患者へ投与することで治療される。ワクチンの投与は公知および標準的な方法によって行われる。これらは、しかし制限はしないが、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、または乳房内注射を含む。
【００８３】
本発明の好ましい例は以下の実施例に記述される。ここで請求項の範囲内の他の実施例は、ここで開示したような本発明の明細書や実施例を考慮することで当業者には明白である。明細書と実施例は、以下の例に続く請求項によって示された発明の範囲や主旨で、単に模範的なだけであると考えている。
【００８４】
以下の実施例で、細胞系はAmerican Type Culture Collectionで得られ、また10％ウシ胎児血清を補足したDulbeccoの最小必須培地（Dulbecco’s minmal essential medium）で生長させた。組織生体検査標本はHuman Cooperative Tissue Networkから得た（LiVolsi et al,Cancer 71:1391-1394,1993）。
【００８５】
実施例１
この実施例はママグロビンｃＤＮＡの単離を説明する。
細胞系ＭＤＡ―ＭＢ―４１５からの全細胞ＲＮＡは標準的なグアニジニウムイソチオシアナート法を用いて単離された（Belyavsky et al,supra）。このＲＮＡはAmplifinder kit(Clonetech)を行い業者製造の実験に続くＲＡＣＥ ＰＣＲ操作に用いられた。第一ストランドＤＮＡの合成は、反応体積２０μｌ中に１μｇＲＮＡ、１０μＭ特異的なママグロビンプライマーＤ２Ｒ（5’-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3’）（配列番号：４）,５Ｘ ＲＴバッファ４μｌ(２５０ｍＭ TrisCl ｐＨ８．３, ３７５ｍＭ Ｋｃｌ, １５ｍＭ ＭｇＣｌ２)、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μｌ および２００ユニットのSuperscriptTMII 逆転写酵素（Gibco/BRL）を含む標準的な反応で行われた。４５℃で１時間進行した反応は９５℃で５分間の培養で終了した。ＲＮＡは６５℃で３０分間４００ｍＭのＮａＯＨで加水分解し、４００μＭ酢酸で中和した。
【００８６】
反応混合物には３体積の６Ｍ ＮａＩと１０μｌの処理したガラスビーズを加えた。 ビーズは８０％EtOHおよび核酸で３回洗浄し４５μｌの水でビーズ玉から溶出した。核酸は沈殿させ、１０ｍｌの水で再たび懸濁させた。精製した第一ストランドｃＤＮＡは、２７℃で２０時間 Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、製造業社の供給する固着オリゴヌクレオチド（配列番号:９, ５’-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG-３’）に括り付けられた。１μMの製造業社の固着プライマー（配列番号：１０ ５’-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-３’)、１μＭのママグロビンに特異的なプライマーＤ２Ｒｂ(配列番号：１1, 5’-AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C-3’)、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１Ｘ ポリメラーゼ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｋｃｌ, ２０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ, １０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４, ２ｍＭ ＭｇＳＯ４, ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を含む５０μｌの反応物において連結反応（ligation reaction）の１/１０は、ＰＣＲ増幅の為に使用した。この反応は合計４０回に対して９４℃で２分、９４℃で４５秒、５０℃で１分、７２℃で９０秒、間培養された。
【００８７】
下流においてママグロビンに特異的に群をなす２つのオリゴヌクレオチドはＤ２Ｒ(配列番号：４)とＤ２Ｒｂ(配列番号：１１)であった。上流においてママグロビン特異的なコントロールのヌクレオチドは製造業社推薦によりＤ２Ｆ(５’-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-３’)(配列番号：１２)が使用された。全てのＰＣＲ増幅はＶｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼで実施される（New England Biolabs）。増幅したＲＡＣＥ生成物はEcoRIで消化されプラスミドベクターｐＧＥＭ７Ｚ(Promega,Madison,WI)のEcoRIおよびSmaIの部位に結びつけられる。
【００８８】
全ての配列は製造業社の実験（Promega）のようにTaqＤＮＡ ポリメラーゼ熱サイクル配列キットを用いて行われる。簡単には、使用した操作は以下の通りである。
【００８９】
１０ｐｍｏｌの配列特異性ヌクレオチドを、１０μの反応物中に３７℃で３０分間、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、１０ｐｍｏｌの３２Ｐ-γＡＴＰ（３０００Ｃｉ/ｍＭｏｌおよび１０ｍＣｉ/ｍｌ）で末端をラベルした。１００ｎｑのプラスミドテンプレート、１.５ｐｍｏｌのラベルした配列プライマー、５ユニットの配列等級Taqポリメラーゼを含む重合反応物は１７μｌの製造業社から提供される配列緩衝剤において生成された。この反応物は、製造業社提供のデオキシヌクレオチドとジデオキシ-Ａ,Ｃ,Ｇ,Ｔのどれかとの混合物を含んだ４つの反応チューブに分割された。４つのチューブの１組は、３０回に対して９２℃で２分間、９４℃で４５秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分で培養された。反応完了後、３μlの８０％ホルムアルデヒド/ブロモフェノール青色色素をそれぞれのチューブに加えた。標本は７０℃で２分間加熱されて、６％のアクリルアミド/７．５Ｍ尿素 配列ゲルに混合し６０Ｗ一定の電力で２−４時間でランした。このゲルを乾燥させて、Kodak XAR5 X線フィルムに２から２４時間露出した。
【００９０】
このようにして得られた配列は、図２の実線に示すような４０３ｂｐフラグメント(配列番号:5)であった。以前の研究で、ＤＥＳＴ００２標識配列が単離された(Watson and Fleming, supra)。この配列は図２の二重線で示すような２０６ｂｐフラグメント(配列番号：６)であった。これら２つの二重線からの情報を組み合わせることにより、ママグロビンの全長５０３ｂｐｃＤＮＡの検出が認められる。
【００９１】
実施例２
本実施例は、ママグロビン発現が乳腺腫瘍細胞に制限され、正常な乳腺細胞へのママグロビン発現は更に少ない量に制限されることを示す。
【００９２】
全細胞ＲＮＡ標本は、標準的なクアニジニウム(quanidinium)イソチオシアナート法を用いて単離し、RNase-free ＤＮＡse(Promega)を用いて処置した。RT/ＰＣＲ分析の場合、１μｇの標識付き全ＲＮＡは、オリゴｄＴ２１（配列番号：１３）と、製造元の実験に従ってSuperscript II 逆転写酵素(Gibco/BRL)とを用いて逆転写した。
【００９３】
２００ｎｇのオリゴｄＴ２１（配列番号：１３）及び1μgの全ＲＮＡは、１０μｌ容積中で５分間に亘って６５℃で培養した。標本は、氷上で冷却し、４μｌの５Ｘ ＲＴバッファ（２５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ８．３, ３７５ｍＭ ＫＣｌ, １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、及び、２００ユニットのSuperscriptTM II 逆転写酵素(Gibco/BRL製)を標本に加えた。４５℃で１時間に亘って進行した反応は、９５℃で５分間培養することによって終了した。
【００９４】
各RT反応の１０分の１は、ママグロビンに特異的なプライマーＤ２Ｒ(5'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3')（配列番号：４）と、ｄ２１０２(5'-CAG CGG CTT CCT TGA TCC TTG-3')（配列番号：３）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を４０サイクルさせる標準反応条件でＰＣＲ分析した。
【００９５】
Northern分析の場合、２０μgの全ＲＮＡは、全長ママグロビンｃＤＮＡプローブを用いて上述の通り(Watson and Fleming, supra)分析した。各ＲＮＡ標本の純度及び等価ローディングは、臭化エチジウム染色によって評価された。
【００９６】
図４Ａに示されるように、５００ｂｐママグロビンメッセージは、組織標本２４１０（オリジナルのＤＥＳＴが単離された組織）で容易に検出され、正常ヒト乳房組織では殆ど検出されず、不死(immortalized)乳房上皮細胞ライン、或いは、ヒトの肺、胎盤、子宮、及び、卵巣（図４Ａ）では検出されなかった。ＲＴ/ＰＣＲ分析を用いた増幅の後、ママグロビン発現は、生存した１５組織で検出できなかった（図４Ｂ）。これらの反応中のグリセルアルデヒド ３−リン酸塩 デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)メッセージ（図４Ｂ）及びＥＧＦ受容体メッセージ（データは図示されず）の検出は、発現の不存在が分解ＲＮＡ又はその他の種の事情に起因しないことを示す。
【００９７】
実施例２Ａ 
この実施例は、正常組織におけるママグロビン発現の乳房特異性を確認する。
【００９８】
実施例２で使用されたママグロビンｃＤＮＡプローブは、正常ヒト組織のプールされた集団に由来した規格化された(normalized)ポリ−Ａ強化(enriched)の市販された調製済みのドット・ブロット(Master ブロットTM, Clonetcch, Palo Alto, CA)にハイブリダイズした。このドット・ブロットは、以下のヒト組織、すなわち、健康な脳、扁桃、尾状核、小脳、大脳皮質、前頭葉、海馬、延髄、後頭葉、果核、黒質、側頭葉、視床、側座核、脊髄、心臓、大動脈、骨格筋、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、精巣、卵巣、膵臓、脳下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、小腸、脾臓、胸腺、末梢白血球、リンパ節、骨髄、虫垂、肺臓、気管、胎盤、胎児の脳、胎児の心臓、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の脾臓、胎児の胸腺、及び、胎児の肺臓からのＲＮＡを含む。
【００９９】
ママグロビンｃＤＮＡプローブは、放射線同位元素32P-α-dCTP(10 mCi/ml; > 3000 Ci/ｍＭol)と、Rediprime標識化・キット(Amersham, Arlington Heights, IL.)を供給元の実験に従って使用することにより識別した。ドット・ブロットは、Rapid-Hyb ハイブリダイゼーションバッファ(Amersham, Arlington, Heights, IL.)を用いて、６０℃で16時間に亘って、１×１０６ ＣＰＭＭＩのママグロビンｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。フィルタは、０．２Ｘ ＳＳＣ/０．１％ ＳＤＳ中で、室温で１５分間ずつ２回洗浄した。洗浄後のフィルタは、７２時間に亘って蛍光体強化スクリーンでＸＡＲ５フィルム(Eastman-Kodak, Rochester, NY.)を露光した。
【０１００】
ママグロビンｍＲＮＡは、乳腺からのＲＮＡだけで検出された（データは図示されない）。正常唾液腺及び前立腺中で検出可能なママグロビンｍＲＮＡが欠けることは、ママグロビン発現が、乳房に特異的な標識として使用されたＧＣＤＰ１５のアポクリン細胞の特異性とは異なり、アポクリン表現型と関連しないことを示す。文献：Wick et al., Hum Pathol 20:281-287, 1989、Raab et al., Am J Clin Pathol 100:27-35, 1993を参照のこと。これらの結果は、乳癌に非常に特異的な標識としてママグロビン遺伝子発現を使用する潜在的な利点を示唆する。
【０１０１】
実施例３ 
この実施例は、ママグロビンｃＤＮＡが翻訳可能なヌクレオチド配列をコードし、これにより、適当に予測された分子量を含むタンパク質生成物を生じることを示す。in vitroでの翻訳は、製造元の実験に従って、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Promega)及び３５Ｓ−メチオニン(＞１００ Ｃｉ/ｍＭｏｌ; １０ｍＣｉ/ｍｌ, Amersham)と共に、TNTTMウサギの・網状赤血球・翻訳キットを用いて行われる。
【０１０２】
２５μｌのTNTTMウサギのライゼートに、製造元が調製した２μｌの反応バッファ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、２０μＭのアミノ酸混合物マイナスメチオニン、４０μＣｉの３５Ｓ-メチオニン(１,０００Ｃｉ/ｍＭｏｌと１０ｍＣｉ/ｍｌ)、４０ユニットのリボヌクレアーゼ阻害剤、１μgのママグロビン／ｐＧＥＭ７／プラスミド、及び、５０μlの最終的な反応物体積を生成するために充分なＤＥＰＣ処置された水を添加する。この反応物は、３０℃で６０分間培養され、５μｌの反応物を２０μｌのＳＤＳゲル状バッファに移し、２分間煮沸し、１７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルに加える。
【０１０３】
ママグロビンｃＤＮＡでプログラムされたウサギのリンパ球ライゼートは、６ｋＤのタンパク質を生成し、ｃＤＮＡを使わないでプログラムされたウサギのリンパ球ライゼートはタンパク質生成物を生じなかった。
【０１０４】
実施例４
本実施例は、原発性乳房悪性腫瘍におけるママグロビンの過剰発現の罹患率を実証する。
【０１０５】
乳房悪性腫瘍におけるママグロビン過剰発現の頻度を判定するため、種々の組織学タイプの第１ステージ原発性乳房悪性腫瘍の１５例のパネルを、ママグロビンｃＤＮＡプローブによるNorthern ブロットハイブリダイゼーションを用いて検査した。患者対照用の正常な乳房組織標本を、二人の患者からの組織内で比較した（図６）。５００ｂｐのママグロビンｍＲＮＡが正常な乳房細胞及び腫瘍２４１０と他の三つの腫瘍で検出され、その中の二つ(ＢＯ１５, ＢＯ１６; ＢＯ２２, ＢＯ２３)は、試験時に患者対照用正常組織に殆ど或いは全く発現しなかった（図６）。全体として、検査された腫瘍の中の１５分の４(２７％)は、ママグロビンｍＲＮＡを過剰発現した。
【０１０６】
これらのデータは、ママグロビンの過剰発現が一つの腫瘍の標本だけに限られるのではなく、原発性乳房腫瘍においてかなり頻繁に生じることを示す。さらに、検査した全ての腫瘍が第１ステージであるということは、この制御障害が乳房腫瘍形成の進行のかなり早期に発生することを示唆する。
【０１０７】
実施例５
以下の実施例は、抗ママグロビン多クローン性抗体を使用するママグロビンタンパク質の検出を示す。
【０１０８】
抗ママグロビン多クローン性抗体は、ママグロビンｃＤＮＡ(Glu-Val-ＰＨe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-ＰＨe, 配列番号：１４)から予測された１６Ｃ−末端アミノ酸に対応したペプチドをキーホール・リンパ・ヘモシアニン(Keyhole LymｐＨet Hemocyanin)と結合し、フロインドアジュバントを用いてウサギに注入することにより調製した。接種されたウサギは、３週間隔で抗原を投与し、１２週後に、ウサギは死亡し、乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ―ＭＢ―４１５及びＭＣＦ−７からの血清を含まない馴化培地におけるママグロビンの検出能力について血清を検定した。ＭＤＡ―ＭＢ―４１５は、ママグロビンメッセージを過剰発現する細胞系として先に識別され、ＭＣＦ−７は検出可能なママグロビンｍＲＮＡを生成しない細胞系として予め識別された。
【０１０９】
馴化培地は、２４時間の培養から採取し、緩和した条件（すなわち、ジスルフィド結合を弱めるため、標本は、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)及び２-メルカプトエタノール(ＢＭＥ)を含有するバッファ中で煮沸される条件）において１２％のＳＤＳアクリルアミドゲル上で分離し、Nytranフィルタへブロットし、Ｃ末端ペプチドに対する上記抗体をこの検定の１次抗体として用いる標準Western ブロット実験で分析した。１次抗体の結合後、ブロットを洗浄し、２次抗体（ヤギ 抗ウサギの）を加えた。ママグロビン抗体の複合体は、酵素連鎖化学発光(ECL Western ブロットting Detecting Reagent, Amersham, Arlington Heights, IL)によって可視化された。
【０１１０】
抗ママグロビン多クローン性抗体は、ＭＤＡ―ＭＢ―４１５細胞培養基の馴化培地中で、約２１ｋＤの見かけ上の分子量をもつバンドを検出した（データは示されない）。ＭＣＦ−７細胞培養基の馴化培地でバンドは検出されなかった（データは示されない）。このようにして、ｍＲＮＡデータと矛盾することなく、ＭＤＡ―ＭＢ―４１５細胞はママグロビンタンパク質を分泌し、ＭＣＦ−７細胞はママグロビンタンパク質を分泌しない。
ＭＤＡ―ＭＢ―４１５培養培地に分泌したママグロビンの見かけ上の分子量は、配列番号：２の予測されたアミノ酸配列から計算された分子量10.5ｋＤaよりも大きい。分泌された殆ど全てのタンパク質はグリコシル化するので、分泌したママグロビンを生ずる前駆体が検出できるかどうかを調べるため、ＭＤＡ―ＭＢ―４１５細胞の細胞質ゾルは、抗ママグロビン多クローン性抗体で分析した。
【０１１１】
ＭＤＡ―ＭＢ―４１５細胞は血清を含まない培地で２４時間生長し、培養培地を集め、遠心分離し、上澄みを集めた。付着した細胞を、リン酸塩バッファ・サリン(ＰＢＳ)で洗浄し、１Ｘ LaeｍＭli標本・バッファ(２％ ＳＤＳ, 10％ グリセロール, １００ｍＭ ＤＴＴ, ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ, ｐＨ６．８, ０．００１％ ブロモフェノール・ブルー(BromoｐＨenol Blue))で溶解した。溶菌混合物は5分間煮沸し、細胞くずを沈殿させるため１０,０００gで5分間遠心分離した。細胞ライゼートを新しい管へ移し、後述のWestern ブロットのため使用した。
【０１１２】
培養基の上澄み及び細胞ライゼートは、緩和した条件（すなわち、標本はＤＴＴ及びＢＭＥを含むバッファ中で煮沸する条件）の１２％のＳＤＳアクリルアミドゲル上で動き、標準的な技術を用いてＰＶＤＦ膜へブロットした。ブロットは、抗体を生成するため使用された拮抗ペプチドの存在する条件及び存在しない条件で、Ｃ−末端ペプチドに対する多クローン性抗体を用いて調べた。
【０１１３】
ママグロビン−抗体の複合体の可視化は既に説明した通りである。図７に示されるように、拮抗ペプチドを含まない場合（−）、馴化培地（Ｓ）は、分泌したママグロビンタンパク質を表す２１ｋＤのバンドを有する。細胞ライゼート（Ｃ）は、約１４ｋＤに顕著なバンドを示し、かつ、それ以上の分子量、たとえば、約２１ｋＤのバンドを含む幾つかの帯を示した。Western ブロットが拮抗ペプチドの存在する場合（＋）に行われたとき、分泌したママグロビンと細胞内ママグロビンは可視化されず、これらのタンパク質は、抗体が合成されたペプチドを含むことがわかる。
【０１１４】
細胞ライゼート内だけで検出された１４ｋＤの帯は、ママグロビンの前駆体、又は、処理されていないママグロビンを表す可能性がある。ママグロビンに対し予測されたアミノ酸配列は、配列番号：２の残基５３−５５と残基６８−７０の位置に共通N-グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを有するので、観察された２１ｋＤの分泌形態のママグロビンは、ある種のグリコシル化されたタンパク質を表す可能性がある。
【０１１５】
この仮定は、真核性タンパク質のＮ結合グリコシル化をブロックする薬物であるツニカマイシンの有無におけるＭＤＡ−ＭＢ―４１５細胞を培養することで試験した。ツニカマイシンは、１ｕｇ／ｍｌにおける２つの同一の培養基の一方に追加し、夫々の培養基は更なる時間亘って一晩培養した。処理し制御された培養基からの培養培地及び細胞溶解産物を調製し、上述の通りWestern ブロット解析によって解析した。
【０１１６】
図８に示すように、ツニカマイシン（＋）で処理した培養基（Ｓ）からの培地は、分泌したママグロビンの検出可能なレベルが欠如し、分泌したママグロビンをグリコシル化したことを示唆する。驚くことに、ママグロビン（１４ｋＤ）の細胞サイトソル形態もツニカマイシン（最も右の列）で処理したＭＤＡ−ＭＢ―４１５の溶解産物において検出可能でない。早期のグリコシル化事象をツニカマイシンでブロッキングすることは、ママグロビンの前駆体の不安定さ及び劣化につながり、従って、ツニカマイシンで処理した細胞のサイトリル中の検出可能な１４ｋＤのタンパク質の欠如を説明すると仮定する。
【０１１７】
ママグロビンのC−末端ペプチドに対する多クローン性抗体も原発性のヒト乳房腫瘍標本からの細胞溶解産物中のママグロビンの１４ｋＤ前駆体を検出する。図９に示するように、ママグロビンの前駆体は腫瘍標本ＢＯ２３中に存在するが、同じ患者（ＢＯ２２）からの正常な乳房組織標本において検出可能でない。興味深いことに、ママグロビン転写（即ち、087R,014,75A及び2410）を発現する同じ腫瘍標本は、Western ブロット解析によって分析したようなママグロビンタンパク質の検出可能なレベルを含まない。これらのデータと一貫する一つの仮定は、ママグロビン発現が転写及び翻訳レベルにおいて特異的に調節し、この異なる特異調節は腫瘍の発展ステージを決定することである。
【０１１８】
抗ママグロビン多クローン性抗体は、増殖する乳腺からの乳房分泌における分泌したママグロビンを見つけるためにも使用する。初乳又は成熟ミルク流体（５００μｌ標本）は、誕生時、産後３日、１４日、及び、２１日の第１及び第３期中に妊婦からのマニュアル発現によって収集した。標本は、等体積の２Ｘ標識標本バッファ（４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、２００ｍＭのDTT、１２０ｍＭのトリス、pH６．８、０．００２％のブロモフェノール・ブルー）で希釈した。希釈した標本は、５分間沸騰し、ペレット細胞くずに４℃で５分間１００００ｇでスピンした。変性した標本は、新しい管に移し、上記のWestern ブロット解析の前に−２０℃で保存した。
【０１１９】
図１０に示するように、抗体は、乳房上皮細胞の高い増殖期間である妊娠中に標本化した乳房分泌における２１ｋＤ分泌されたママグロビンを検出した。しかしながら、乳房上皮識別のステージである授乳期のオンセットにおいて、産後３日でママグロビンレベルは著しく減少し、産後１４日ではもはや観察されない。これらの結果は、分泌したママグロビンが増殖する乳房上皮細胞と関連することを示し、これはヒトの乳癌における分泌したママグロビンの検出と一貫する観察である。
【０１２０】
ママグロビンペプチドに対する抗体との反応性は、乳癌の患者の標本のパラフィン固定した部分の免疫組織化学染色によって乳房腫瘍細胞に対しても示される（図１１）。免疫組織化学的染色は、ママグロビンペプチドに対する抗体を原発性抗体として使用することで実施し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び３,３’―ジアミノベンジンテトラクロリド（ＤＡＢ）によって標識をつけられたヤギの抗ウサギの抗体を基質として使用してママグロビン抗体複合体を検出する。ママグロビンタンパク質を発現する細胞は、茶色の染色を示す。
【０１２１】
結果より、ママグロビンタンパク質は先駆タンパク質として合成し、Ｎ結合グリコシル化のような翻訳変容後はその見かけ分子量を分泌の前に増加し、ママグロビンの前駆体の安定性はＮ結合グリコシル化に依存し、ママグロビンタンパク質は乳房腫瘍細胞を増殖することで分泌する。
【０１２２】
実施例６ 
本実施例は、実施例５において説明した抗ママグロビンのウサギの多クローン性抗体を使用して免疫組織化学的解析することで原発性乳房腫瘍におけるママグロビンタンパク質の検出を示す。
【０１２３】
百の保存した乳房腫瘍標本をVanderbilt University Department of Pathology及びWashington University Cancer Center Tumor Respiratoryから任意に選択した。ホルマリン固定し、パラフィンが埋め込まれた組織を５μｍづつで切り、荷電したスライド上に据付け、乾燥した。
【０１２４】
免疫組織化学的解析のためにスライドを脱パラフィンし、エタノール及び蒸留水のグレーデッド溶液中で再水和した。組織部分を３％のウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸塩バッファ・サリン（ＰＢＳ）中の１：１００希釈中の正常なヤギの血清（Vector Laboratories，Burlingame，CA）で予めインキュベートし、室温で１時間１：１０００希釈中の抗ママグロビンのウサギの多クローン性抗体で予めインキュベートした。ＰＢＳで数回すすいだ後、組織部分を正常なヤギの血清（１：１０００）溶液、３％のＢＳＡ、及び、ＰＢＳ中の６μｇ／ｍｌのビオチンが結合したヤギの抗ウサギのIgG（Vector Laboratories，Burlingame，CA）で１時間インキュベートした。２次抗体溶液は、ＰＢＳ中で４回すすぎ、ストレブタビジンペロキシダーゼ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の１：１０００希釈及び３％のＢＳＡ／ＰＢＳの溶液で培養した。
【０１２５】
３０分のインキュベーション後、スライドを再びＰＢＳ中で４回すすぎ、１ｍｇ／ｍｌ3，3’-ジアミノベンジジンテトラクロリド（Dako，Carpinteria，CA）及び０．０２％の過酸化水性を含むクロマジン溶液に３分間曝した。スライドを脱イオン水中で簡単にすすぎ、Harrisのヘモトキシンで対比染色し、カバースリップの下に据付た。
【０１２６】
陰性のコントロールに対して、組織部分を同様に処理するが、１：５００希釈の予め免疫がつけられたウサギのの血清が抗ママグロビン−抗血清の代わりとした。選択的にペプチド競合実験に対して、ママグロビン抗血清を最初に室温で１時間３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中の１００μｇ／ｌの濃度で１６の残留するママグロビンペプチドでインキュベートし、組織部分に適用した。
【０１２７】
免疫陽性は、０：染色されない、１：腫瘍細胞の５０％未満で弱い散発性染色、２：腫瘍細胞の５０％以上で弱い染色、３：腫瘍細胞の５０％未満で強い散在性の細胞質染色、４：腫瘍細胞の５０％以上で強い散在性の細胞質染色として得点をつけた。３又は４を得点する部分だけがママグロビン陽性として考慮される。スコアリングの結果は、以下の表１に示し、３つの腫瘍の型に対する代表的な染色パターンを図１２に示す。
【０１２８】
【表１】
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全般的に、検査した腺管癌の８０％がママグロビンタンパク質に対して強い総体性又は限局性細胞染色を示した。興味深いことに、染色はよく識別され（７８％）、中程度に識別され（６７％）、及び、あまり識別されない（６３％）腫瘍（表１、図１２）中で同等に頻繁である。強い染色は、純粋な腺管癌（ductal carcinoma in situ；ＤＣＩＳ）の３／３ケースにおいて見られた。ママグロビンの細胞性染色パターンは、幾つかの細胞が核に隣接する局部的な染色を示すにも関わらず主に散在性であり細胞質である。通常の乳房組織では、ママグロビン染色を小さいダクト及び小葉内の薄い上皮細胞の中でだけ観察した。
【０１２９】
しかしながら、他の分泌タンパク質で観察したように、ママグロビンの増加された発現は、アポクリン化生の特性と一致した。後形アポクリン上皮を含む良性乳房組織では、ママグロビン免疫反応性が上皮内及びアポクリン包のう流体夫々の中に存在した。陽性の染色のこれらパターンの特異性は、予め免疫がつけられたウサギのの血清（図１２Ｂ、１２Ｄ、１２Ｆ）又は競合するC−末端ペプチドで予めインキュベートされた抗ママグロビン抗血清のいずれかでインキュベートした同一の標本からの信号の欠如によって証明した。
【０１３０】
しかしながら、ママグロビン発現を正常な前立腺及び唾液腺のような他のアポクリン組織中では検出しない。更に、アポクリン及び非アポクリン特性夫々を含む乳房腫瘍細胞は、略等しい周波数及び強度でママグロビンを発現する。明らかに、ママグロビン発現と腫瘍段階の間には相関性がない。従って、ママグロビン発現は、固有の乳房腫瘍表現型の標識であり、分子レベルで乳房腫瘍を更に画成するために他の確立された標識と共に便利となり得る。
【０１３１】
実施例５及び実施例６において説明した結果は、ママグロビンタンパク質の検出がママグロビンタンパク質を乳房腫瘍標識として使用して癌を診断すること、乳房腫瘍の再発を評価すること、腫瘍細胞を汚染するために自己骨髄／幹細胞移植をモニタすること、及び、抗体媒介した複合体を介して治療介入のために乳房腫瘍細胞を標的化することに適用可能であることを示した。精製し分離したママグロビンポリペプチドは乳房腫瘍に対する抗体の生成、及び、他の腫瘍指定免疫治療養生法の発展のために便利である。
【０１３２】
実施例７ 
本実施例は、リンパ節におけるママグロビンｍＲＮＡの検出を示す。
【０１３３】
原発性乳房腫瘍の大部分におけるママグロビンの発現及びリンパ組織におけるその欠如は、ママグロビンがリンパ節内の転移性乳房腫瘍細胞を検出するための鋭敏且つ特異的な標識となることを示唆する。この考えを試験するためにママグロビンｍＲＮＡ発現を組織学的に証明された腫瘍の転移性又は他の非乳房転移性腫瘍のいずれかを含むリンパ節で検査した。ママグロビンの発現を各リンパ節中に存在する悪性の上皮細胞の総数にママグロビン信号を正規化（noramalized）させるために上皮細胞特異的標識であるケラチン１９の発現と比較した。
【０１３４】
転移性の病巣を含む無名化されたリンパ節標本をCooperative Human Tissue Network（LiVolsi他，Cancer 71：1891-1894，1993）及びWashington University Cancer Center Tumor Repositoryから得る。組織標本を細粉化し、１ｍｌ当たり１００ｍｇの濃度の試薬におけるトリゾール試薬（Life Technologies，Rockville，MD）中で均質化した。ＲＮＡ分離は、製造元の実験において推奨された通りに実施され、結果として生じられるＲＮＡはＲＮアーゼの無い水中の２μｇの濃度において再懸濁した。各ＲＮＡの２０μｇは、１０Ｘバッファ及び標準化方法論を使用してホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動され、Nytan Plus膜（Schleicher＆Schuell,Keene,NH）に移した。
【０１３５】
ママグロビンハイブリダイゼーションプローブを生成するために、実施例において使用されるママグロビンｃＤＮＡは供給元の実験に従って３２Ｐ−α―ｄＣＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ；＞３０００Ｃｉ／ミリモル）及びRediprimeラベリング・キット（Amersham，Arlington Heights，IL）で放射線標識した。
【０１３６】
ケラチン１９ハイブリダイゼーションプローブは、次の通りに構成される。ヌクレオチド４７７からフクレオチド１２９８（Stasiak,P.C．及びLane,E.B.,Nucleic Acid Res15：10058,1987）までのコード化領域を囲うｋ１９ｃＤＮＡフラグメントを生成するために、順方向（5'-CGCGGATCCAGGATTGTCCTGCAGAT-3'）（配列番号：１８）及び逆方向（5'-CCGGAATTCCCATCCCTCTACCCAGA-3'）（配列番号：１９）ケラチン１９特異的オリゴヌクレチオド配列を正常なヒトの乳房のｃＤＮＡの標準のＰＣＲ増幅反応において使用した。このフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ末端を生成するために消化し、ｐＧＥＭ３Ｚベクター（Promega,Madison,WI）の対応する場所の中にクローニングし、同定を確認するために配列した。クローニングされた８２１のｂｐｋ１９フラグメントを上述の通り放射性標識した。
【０１３７】
Northern ブロットフィルタをRapid-Hybハイブリダイゼーションバッファ（Amersham,Arlington Heights,IL）を使用して６０℃で１６時間１×１０６ＣＰＭ／ｍｌママグロビンハイブリダイゼーションプローブで最初にハイブリダイズした。フィルタを次に２ＸＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中で１５分間２回洗浄し、０．２ＸＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中６０℃で１時間再び２回洗浄した。洗浄したフィルタは、蛍光体強化スクリーンを含むＸＡＲ３フィルム（Eastman-Kodak,Rochester,NY）で露光した。フィルタを数半減期だけ崩壊し、フィルタを予め処理することなくケラチン１９ハイブリダイゼーションプローブの１×１０６のＣＰＭ／ｍｌで再びハイブリダイズした。ママグロビン及びケラチン１９ｃＤＮＡプローブの等しいカウント及び特定の活動を使用し、各ハイブリダイゼーションを同じ条件下でフィルムに露光した。
【０１３８】
この調査の結果は図１３に示す。組織学的に証明された転移性の乳癌（列１−２０，２７）を含むリンパ節の２１のケースのうち、ママグロビン発現は９のケース中（４３％）（列１，２，７，９，１１，１２，１７，１８、及び，２７）で検出され得る。しかしながら、２１ケースのうち６のケースでは、ママグロビン及びケラチン１９ｍＲＮＡのいずれも検出され得ず（列３，５，６，１０，１３，１４，１６，１９及び２０）、これらのケースからのリンパ節の標本がこの方法によって分析されるべき非常に少ない腫瘍細胞を含んでもよいことを示唆する。これら６のケースが除外されるとき、含まれるケースの６０％（９／１５）が検出可能なママグロビンｍＲＮＡを含む。少なくとも一つのケースでは、ママグロビン発現はケラチン１９発現が無い場合に検出され（列２７）ママグロビンが腫瘍のサブセットにおいてより鋭敏な標識かもしれないことを示唆する。更に、ケラチン１９は非乳房転移性、例えば、喉頭の及び胆管の腫瘍の関わり（列２１−２６）を含むリンパ節の多くの場合において偏在的に発現される一方で、ママグロビン発現は非乳房転移性病巣（列２２）の一つのケースの場合だけに検出される。このケースは、未知の発生源の乏しい識別された腺癌を含む鼠径リンパ節である。子宮癌の前の病歴が証明されているため、この病巣は病気の転移性の再発と推定される。幾つかの原発性子宮癌（データ図示せず）中でママグロビン発現を最近検出し、従って、正常な子宮組織中で発現されない一方でママグロビンが子宮のサブセット並びに乳癌中で発現されるといった考えが確認される。転移性の病気（列２９−３３）の無いリンパ節の全ての場合において、ケラチン１９及びママグロビン発現夫々は検出可能でない。予期した通り、ママグロビンｍＲＮＡは正常乳房組織から分離されたＲＮＡ中で検出される（列３４）。
【０１３９】
実施例８
本実施例は、末梢血幹細胞（peripheral blood stem cell；PBSC）収集物中のママグロビンｍＲＮＡの検出を乳房腫瘍細胞を循環させる標識として示す。
【０１４０】
〜１×１０６の末梢白血球のアリコートは、転移性の乳房癌のために高い服用量の化学療法及び自己幹細胞移植を受ける１５人の患者の白血球除去血輸血（leukopheresis）生成物から得られる。陽性の制御に対して１０１のママグロビン発現ＭＤＡ−ＭＡ１７５のヒトの乳房腫瘍細胞（Watson他,Cancer Res56:860-865,1996）は、１：１０５の乳癌細胞希釈を得るために１０６ののヒトのＯＭ４３１黒色腫細胞と混合される。ＯＭ４３１細胞の純個体数は、陰性コントロールのために使用される。冷凍された細胞のアリコートは、１ｍｌのトリゾール試薬（Life Technologies，Rochville,MD）中に直ぐに溶解され、全ＲＮＡが供給元の実験当たりに対して調製される。ＲＮＡの完全性及び濃度は、アガロースゲル電気泳動によって評価される。
【０１４１】
全ＲＮＡの約１マイクログラムが供給元の実験当たりにＴ１１−１７プライマー及びSuperscriptIIプレ増幅システム（Life Technologies,Rockville,MD）を使用して第１のストランドに変換される。ＲＮアーゼＨの不活性化で処理した後、標本はヌクリアーゼの無い水で倍数希釈され、−２０℃で保存される。合成されたｃＤＮＡの完全性を評価するために、１０％のｃＤＮＡが１ＸＴａｗＤＮＡポリメラーゼバッファ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、０．６μＭのグリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（Glyceraldehyde-3- Phospate Dehydrogenase；ＧＡＰＤＨ）順方向増幅プライマー（5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'）（配列番号２０）、０．６μｍGAPDHの逆方向増幅プライマー（5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'）（配列番号２１）、及び、２．５ユニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies,Rockville,MD）の最終濃度を含む５μｌのＰＣＲ反応液を受ける。反応液は、９４℃で１分間加熱され、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び、７２℃で４５秒間を３０サイクルさせる。ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲル上で解析され、５９９ｎｔの単一の均一に強力なフラグメントが各ｃＤＮＡ合成反応が成功したことを示す。追加的な１０％のｃＤＮＡ反応が１ＸＴａｗＤＮＡポリメラーゼバッファ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、０．６μＭのママグロビン順方向増幅プライマー（5'-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-3'）（配列番号１６）、０．６μｍのママグロビン逆方向増幅プライマー（5'-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3'）（配列番号４）、及び、２．５ユニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies,Rockville,MD）の最終濃度を含む５０μｌのＰＣＲ反応液を受ける。反応液は、９４℃で１分間に加熱され、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び、７２℃で３０秒間を４５サイクルさせる。増幅生成物は、別の研究場所に運搬され、２％のアガロースゲル上で電気泳動にかけられ、０．２μｍのNytran Plus膜及びneutral transfer方法（Schleicher＆Schuell,Keene,NH）のための供給元の実験を使用してSouthern ブロットを受ける。結果として得られるフィルタは、１×１０６ＣＰＭ／ｍｌのママグロビンｃＤＮＡプローブでハイブリダイズされ上述の通り洗浄される。
【０１４２】
この分析の結果は、図１４に示される。１５の乳癌のケース（ＣＡ）のうち、９つの患者（６０％）は夫々のＰＢＳＣから検出可能ママグロビンを得、収集された生成物が汚染乳房腫瘍細胞を含むことを示唆する。残りの６のケースにおいて、原発性腫瘍がママグロビン発現に関して検査されていないため、ＰＢＳＣに対する信号の欠如がママグロビン発現腫瘍細胞の欠如を表わすか否かが知られていない。健康なドナー（ＮＬ）からの収集物の如何なるケースでもママグロビンｍＲＮＡが検出されていない。１：１０５の乳房腫瘍細胞を含む二倍の陽性コントロール（＋）から得られる冗長性のあるハイブリダイゼーション信号に基づき、現在の分析フォーマットに対する検出の限界は１：１０６の細胞のかなり下であるとされる。この分析の検出の頻度及び高い特異性は、より大きい、予想される研究において便利となる潜在循環腫瘍細胞の徴候重要性を研究するための便利なツールとなってもよいことが示唆される。例えば、ママグロビン発現は、サイトカインプライミング（Passos-Coelho他,J.Clin.Oncol14:2569−2575,1996）又は腫瘍細胞をパージする実験（Passos-Coelho他，Cancer Res.54:2366−2371，1994）の後、末梢幹細胞の腫瘍汚染を評価するために便利となり得る。
【０１４３】
上記を鑑みて、本発明の幾つかの利点が実現され他の有利的な結果が達成されることが分かる。
【０１４４】
本発明の範囲から逸脱すること無く上記方法及び構成要素において様々な変化が成され得、上記説明に含まれ及び添付の図面で示される全ての内容は例示的であり制限的でないとされる。
【０１４５】
特許及び特許出願を含む本明細書中で引用される全ての参考文献は、本願では参照として組込まれる。本願の参照の説明は、それらの立案者によって成される主張を要約するために過ぎず、どの参照も従来技術を構成するものは考えられない。出願人は引用された参考文献の正確さ及び適切さを問う権利を有する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Rapid amplification of ｃＤＮＡ Ends:ＲＡＣＥ）ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction:ＰＣＲ）法およびそれに引き続くベクター（vector）ｐＧＥＭ７ＺおよびｐＣＥＶ２７の中へのサブクローニングを含む、全長ママグロビンｃＤＮＡを単離するために使用される方法を説明する図である。
【図２】
ヒトのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）（上記で番号付けされたヌクレオチド）およびコードされた乳房特異的なタンパク質、ママグロビンのアミノ酸配列（配列番号：２）（下記で番号つけられるアミノ酸）を説明する図である。ここで太線はＲＡＣＥ ＰＣＲ法によって単離された４０３ｂｐフラグメント（配列番号：１５）を示し、二重線は２０６ｂｐＤＥＳＴ００２配列（配列番号：６）を示す。
【図３】
太字および二重線で表されたラットの前立腺ステロイドが結合しているタンパク質サブユニットＣ３（ｒＰＳＣ３）（配列番号:7）およびヒトのクラーラ細胞１０ｋＤタンパク質（hCC10）(配列番号:8)、一重線で表された構造の類似したアミノ酸、と比較した乳房特異的なタンパク質、ママグロビンのアミノ酸配列（hMAM）（配列番号：２）を説明する図である。
【図４】
（Ａ）乳房特異的なタンパク質、ママグロビン（hMAM）をコードするヒトのｃＤＮＡ配列を、乳房の新形成の組織、正常な乳房の組織およびその他の成人の組織によって発現するｍＲＮＡにハイブリダイズするNorthern ブロット解析を説明する図である。（Ｂ）乳房の新形成の組織、正常な乳房の組織およびその他の成人の組織の試料を増幅するＲＴ／ＰＣＲの解析を説明する図である。
【図５】
in vitroのウサギの網状赤血球溶解産物分析系における乳房特異的なｃＤＮＡ配列の翻訳を説明する図である。
【図６】
8人の患者のうち３人の腫瘍（太字で示した）における腫瘍２４１０の、またより少数ではあるが正常な乳房組織（イタリックで示した）における、ｍＲＮＡの検出を示すママグロビンをコードするｃＤＮＡに伴うNorthern ブロットハイブリダイゼーション、および２つのケース（右の４つのレーンlane）について腫瘍組織と患者に調和した正常組織のママグロビンｍＲＮＡ発現の比較を説明する図である。
【図７】
細胞培地と細胞溶解産物のそれぞれにおいて、ママグロビンタンパク質の前駆体および分泌形態の検出を示す免疫性ペプチドの不在下（―）および存在下（＋）において、ＭＤＡ―ＭＢ―４１５乳房腫瘍細胞からの馴化培地（Ｓ）および細胞溶解産物（Ｃ）のママグロビンＣ―末端（配列番号：１4）に対する多クローン性抗体を用いるWestern ブロット解析を説明する図である。
【図８】
Ｎ結合グリコシル化が阻害される細胞溶解産物や培地における検出可能なママグロビンタンパク質の欠如を示す、グリコシル化の障害となるツニカマイシンの不在下（―）および存在下（＋）において成長するＭＤＡ―ＭＢ―４１５乳房腫瘍細胞からの馴化培地（Ｓ）および細胞溶解産物（Ｃ）の抗ママグロビン多クローン性抗体を用いるWestern ブロット解析を説明する図である。
【図９】
酵素に結びつけられた化学発光によって視覚化される抗ママグロビン多クローン性抗体およびヤギの抗ウサギ抗体を用いて前駆体ママグロビンタンパク質の検出を示すヒトの乳房腫瘍細胞の細胞溶解産物のWestern ブロット解析を説明する図である。
【図１０】
細胞が増殖している乳腺における分泌ママグロビンタンパク質の検出を示す、妊娠や分娩後の期間のヒトの乳房からの流体分泌物の抗ママグロビン多クローン性抗体を用いたWestern ブロット解析を説明する図である。
【図１１Ａ】
ママグロビンタンパク質を発現する細胞の茶色の染色を示す、ホースラディッシュペルオキシターゼや基質としてのＤＡＢで標識した抗ママグロビン多クローン性抗体やヤギの抗ウサギ抗体を用いて免疫組織化学的に染色させた患者標本からの乳癌細胞のparaffin-fixed 断面をカラーで説明する図である。
【図１１Ｂ】
ママグロビンタンパク質を発現する細胞が茶色の染色を示す、ホースラディッシュペルオキシターゼや基質としてのＤＡＢで標識した抗ママグロビン多クローン性抗体やヤギの抗ウサギ抗体を用いて免疫組織化学的に染色させた患者標本からの乳癌細胞のparaffin-fixed 断面を白黒で説明する図である。
【図１２】
純粋な腺管癌 in situ（ＤＣＩＳ）（Ａ、Ｂ）、よく識別される腺管癌（Ｃ、Ｄ）、およびあまり識別されない腺管癌（Ｅ，Ｆ）、の同じ標本からの組織断面におけるママグロビンの免疫反応性を説明する図である。ここで（Ａ，Ｃ，Ｅ）はママグロビン抗血清で免疫組織化学的に着色され、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）は予備免疫抗血清で染色されている。
【図１３】
原発性乳房腫瘍（レーン１―２０、２７）、頭部および頚部の扁平上皮細胞腫瘍（レーン２１、２３、２４）、子宮内膜癌腫（レーン２２）、結腸のアデノカルチノーマ（レーン２５）、胆管カルチノーマ（レーン２６）および肺のアデノカルチノーマ（レーン２８）から組織学的に証明された転位酵素（metastase）を含むリンパ節標本、陰性コントロールとしての既知の悪性腫瘍が全く無い患者からのリンパ節生検材料（レーン２９−３３）、陽性コントロールとしての通常の乳房組織からの標本（レーン３４）からの、およびママグロビンｃＤＮＡ（一番上のパネル）または角質ｃＤＮＡ（一番下のパネル）とハイブリダイズした、ＲＮＡのNorthern ブロットの写真を示す図である。
【図１４】
末梢の幹細胞の収集物から得られママグロビンｃＤＮＡプローブでプローブされる、転位性乳癌（ＣＡ）をもつ患者または正常なドナー（ＮＬ）からのＲＮＡのＲＴ−ＴＣＲ生成物のSouthern ブロットの写真を示す図である。