【手続補正書】
【提出日】平成17年12月9日(2005.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  単離された酵素およびアセチル基供与体の存在下で10-デアセチルバッカチンまたは10-デアセチルバッカチン誘導体を反応させることを含んでなる、バッカチンおよび／またはバッカチン誘導体の製造方法であって、該酵素が、SDS-PAGEで測定して70〜72kDの分子量、pH5.4〜5.8の等電点、および55〜65μMのアセチル補酵素Aに対するミカエリス・メンテン定数KMを有するアセチルトランスフェラーゼであり、該アセチルトランスフェラーゼがタキサス・キネンシス(Taxus chinensis)の細胞培養物から得られることを特徴とする上記方法。
【請求項２】  10-デアセチルバッカチン-IIIからバッカチン-IIIを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】  14-ヒドロキシ-10-デアセチルバッカチン-IIIから14-ヒドロキシバッカチン-IIIを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項４】  10-デアセチルタクシウナニンCからタクシウナニンCを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項５】  アセチル基供与体としてのアセチル補酵素Aの存在下で前記反応を実施する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】  以下の特性：
a) 10-デアセチルバッカチン-IIIを、アセチル基供与体（特に、アセチル補酵素A）の存在下に、10位で選択的にアセチル化すること、
b) SDS-PAGEで測定して70〜72kDの分子量を有すること、
c) pH5.4〜5.8の等電点を有すること、
d) 55〜65μMのアセチル補酵素Aに対するミカエリス・メンテン定数KMを有すること、
e) 10-ヒドロキシタキサ-O-アセチルトランスフェラーゼであること、
f) タキサス・キネンシスの細胞培養物から得られること、
を特徴とする酵素。
【請求項７】  純度が50％を超えている、請求項６記載の酵素。
【請求項８】  純度が90％を超えている、請求項７記載の酵素。
【請求項９】  請求項６〜８のいずれか１項記載の酵素を調製する方法であって、タキサス・キネンシスから精製により該酵素を単離し、精製後に10-デアセチルバッカチンまたは10-デアセチルバッカチン誘導体とアセチル基供与体を加え、生成されたアセチル化産物を検出することにより該酵素の存在する画分を決定することを特徴とする上記方法。
【請求項１０】  前記精製法がHighQカラムの使用を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】  前記酵素を含有する画分を検出するために10-デアセチルバッカチン-IIIまたは10-デアセチルタクシウナニンCを用いる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】  用いるアセチル基供与体がアセチル補酵素Aである、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】  生成されたアセチル化産物を放射性標識により検出する、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】  生成されたアセチル化産物を重同位体標識により検出する、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】  タキソールおよび／またはタキソール誘導体の製造方法であって、初めに請求項１〜５のいずれか１項記載の方法によりバッカチンまたはバッカチン誘導体を製造し、その後当該バッカチン誘導体の13位のOH基を適切な酸とエステル化により反応させてタキソールまたはタキソール誘導体を得ることを特徴とする上記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明によると、10-デアセチルバッカチンまたは10-デアセチルバッカチン誘導体を単離された酵素およびアセチル基供与体の存在下において反応させることを特徴とする、バッカチンまたはバッカチン誘導体の製造方法によってこれらの目的が達成される。前記酵素は、70〜72kDの分子量（SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって測定）を有するアセチルトランスフェラーゼであり、該アセチルトランスフェラーゼはタキサス・キネンシス(Taxus chinensis)細胞培養物から得られる。10位における位置選択的アセチル化は、タキサス・キネンシス細胞培養物の懸濁液から得られる単離された酵素により触媒されることが見出された。驚いたことに、単離されかつ精製された酵素を用いて、10位のアセチル化に関して高い位置特異性を達成できることがわかった。この特異性は好ましくは＞80％、より好ましくは＞90％、最も好ましくは＞95％である。本発明に従う酵素の使用により＞99％の特異性が達成できることを見出した。本明細書中で＞80％の特異性とは、アセチル化の80％以上が出発原料の10位で、20％以下が他の位置で起こったことを意味する。従って、出発原料に存在する他の水酸基は保護基でブロックする必要はない。なぜなら、本発明の酵素を用いれば、これらその他の水酸基のアセチル化は、生じたとしても非常に限られた程度にすぎないからである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の方法を使用して、7〜13位に10-デアセチルバッカチンIIIと同じ置換基を有するか、それより数少ないまたは小さい置換基を有するタキサン誘導体を10位で選択的にアセチル化することができる。10-デアセチルバッカチンIIIに存在する置換基（すなわち7位のOH、8位のCH3、9位の =O、10位のOH、12位のCH3および13位のOH）が存在するタキサン誘導体、または、該置換基がそれより小さいか若しくは同じ大きさの基（特に水素）によって置換されているようなタキサン誘導体を、本明細書中では用語10-デアセチルバッカチン誘導体に含めるものとし、10位にOH基を有するならば同様に位置特異的にアセチル化できる。このような誘導体の例には、10-デアセチルタクシウナニン(deacetyl taxuyunnanin)C、10,14-デアセチルタクシウナニンC、2,10,14-デアセチルタクシウナニンC、5,10,14-デアセチルタクシウナニンCおよび2,5,10,14-デアセチルタクシウナニンCがある。本発明の方法は、10-デアセチルバッカチンIIIからバッカチンIII、14-ヒドロキシ-10-デアセチルバッカチン IIIから14-ヒドロバッカチン III、または10-デアセチルタクシウナニン Cからタクシウナニン Cを製造するために用いることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
タキソールまたはタキソール誘導体を与えるバッカチン誘導体の反応は特に、バッカチン誘導体の13位のOH基を適当な酸でエステル化することによって行う。このような方法は文献、例えば米国特許第4,814,470号（Colinら）、米国特許Re 34,277（Denisら）、EP 0,400,971 A2、米国特許第4,924,011号（Denisら）、米国特許第5,476,954号（Bourzatら）、およびDenisら、J. Am. Chem. Soc. 110（1988）,5917-5919 に詳細が記載されている。
例として、バッカチンIIIとパクリタキセルの構造式を以下に示す：
2002502613.tif 000001
バッカチンIII
2002502613.tif 000002
パクリタキセル  R1=COC6CH5; R2=CH3CO