【手続補正書】
【提出日】平成18年4月4日(2006.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザウイルスを回収する段階を含むインフルエンザウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項２】
（ａ）インフルエンザウイルスが弱毒インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス及び温度感受性インフルエンザウイルスの少なくとも１種を含むか、または
（ｂ）インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつか、または
（ｃ）インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）インフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０ウイルス又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０の特徴的生物学的特性を変化させる少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＡウイルスと、ｂ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６ウイルス又はＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６の特徴的生物学的特性を変化させる少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＢウイルスの少なくとも１種をコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）インフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＡウイルスと、ｂ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザＢウイルスの少なくとも１種をコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インフルエンザウイルスがａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＡ株ウイルスと、ｂ）ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＢ株ウイルスの少なくとも１種を含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
インフルエンザウイルスがａ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＡ株ウイルスと、ｂ）ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の置換アミノ酸を含むインフルエンザＢ株ウイルスの少なくとも１種を含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザウイルスが複数の置換アミノ酸を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
複数が２、３、４、５、６、７、８又は９個の置換アミノ酸を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
インフルエンザＢウイルスをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、またはインフルエンザＡウイルスをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
〔ａ〕（ａ）第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、または
〔ｂ〕（ａ）弱毒、低温適応、及び／又は温度感受性の第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、または
〔ｃ〕（ａ）弱毒、低温適応、及び温度感受性の第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）第２のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、または
〔ｄ〕（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの少なくとも６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）別のインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも１個のゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの６個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０以外のインフルエンザ株のＨＡ及びＮＡ抗原をコードする２個のゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、または
（ｉｉ）（ａ）インフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はインフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０又はインフルエンザＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６もしくはインフルエンザＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のユニークアミノ酸に対応する少なくとも１個の置換アミノ酸を含む人工構築インフルエンザウイルスの７個の内部ゲノムセグメントと、（ｂ）Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６又はＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０以外のインフルエンザ株のＨＡ抗原をコードするゲノムセグメント又はＮＡ抗原をコードするゲノムセグメントのいずれかをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項１０〔ｄ〕に記載の方法。
【請求項１２】
複数のプラスミドベクターを導入する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）宿主細胞集団がＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞、又はＣＯＳ細胞の１種以上を含むか、または
（ｂ）宿主細胞集団がＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞、及びＣＯＳ細胞の少なくとも２種の混合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）宿主細胞集団を約３２℃〜３５℃の温度で培養する段階、または
（ｂ）宿主細胞集団を約３２℃〜約３４℃の温度で培養する段階、または
（ｃ）宿主細胞集団を約３３℃の温度で培養する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組換えインフルエンザウイルスを回収する段階、またはリアソータントインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザウイルスを不活化する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザＢウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザＢウイルスを回収する段階を含むインフルエンザＢウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項１８】
インフルエンザＢウイルスのヘルパーフリー細胞培養生産方法であって、インフルエンザＢウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターをヘルパーウイルスの不在下に宿主細胞集団に導入する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階、または
（ｂ）宿主細胞集団を約３２℃〜３５℃の温度で培養する段階、または
（ｃ）宿主細胞集団を約３２℃〜約３４℃の温度で培養する段階、または
（ｄ）宿主細胞集団を約３３℃の温度で培養する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
組換えインフルエンザウイルスを回収する段階、またはリアソータントインフルエンザウイルスを回収する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ｉ）インフルエンザウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターをエレクトロポレーションによりＶｅｒｏ細胞集団に導入する段階と；
ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と；
ｉｉｉ）複数のインフルエンザウイルスを回収する段階を含むインフルエンザウイルスの細胞培養生産方法。
【請求項２２】
（ａ）インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつか、または
（ｂ）インフルエンザウイルスが弱毒、低温適応及び温度感受性インフルエンザウイルスを含むか、または
（ｃ）インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）インフルエンザＢウイルスをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、または
（ｂ）インフルエンザＡウイルスをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階、またはＶｅｒｏ細胞を無血清培地で培養する段階を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ｉ）インフルエンザウイルスの複製を許容することが可能な宿主細胞集団にインフルエンザウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階と；
ｉｉ）宿主細胞集団を３５℃以下の温度で培養する段階と；
ｉｉｉ）対象に投与すると免疫応答を誘発することが可能なインフルエンザウイルスを回収する段階を含む組換えインフルエンザウイルスワクチンの生産方法。
【請求項２６】
インフルエンザウイルスが温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される少なくとも１種の表現型属性をもつ請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
インフルエンザＢウイルスをコードする核酸を含む複数のベクターを導入する段階、またはインフルエンザＡウイルスを含む複数のベクターを導入する段階を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
組換えインフルエンザウイルスワクチンがリアソータントインフルエンザウイルスを含むか、または生弱毒インフルエンザウイルスワクチンを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
インフルエンザウイルスを不活化する段階を更に含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
第２のプロモーターと両方向ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含むプラスミドを含む両方向発現ベクター。
【請求項３１】
（ａ）第１のプロモーターと第２のプロモーターが少なくとも１個のクローニング部位の両側に逆方向に配置されているか、または
（ｂ）両方向ポリアデニル化部位がＳＶ４０ポリアデニル化部位を含むか、または
（ｃ）第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスゲノムのセグメントをコードする同一２本鎖ウイルス核酸のどちらかの鎖に機能的に連結されている請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
ｐＡＤ３０００を含む請求項３０に記載のベクター。
【請求項３３】
クローニング部位に挿入されたインフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントをコードする２本鎖核酸を更に含む請求項３０に記載のベクター。
【請求項３４】
第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含むプラスミドを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントをコードする核酸の少なくとも１つの領域の両側に逆方向に配置されている請求項３０に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の１種以上の発現ベクターと、細胞、緩衝液、培養培地、説明書、パッケージング材料、及び容器の１種以上を含むキット。
【請求項３６】
インフルエンザウイルスゲノムの少なくとも１個のセグメントをコードする核酸を各々含む複数の発現ベクターを含むか、または温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される少なくとも１種の表現型属性をもつ第１のインフルエンザ株の少なくとも６個の内部ゲノムセグメントをコードする核酸を含む複数の発現ベクターを含む請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
複数の発現ベクターが変異体ＨＡ及び／又はＮＡ抗原をコードする核酸ライブラリーを含む請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
インフルエンザウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターを含む少なくとも１個の細胞を含む３５℃以下の温度で増殖する細胞培養物を含む組成物。
【請求項３９】
インフルエンザウイルスゲノムをコードする核酸を含む複数のベクターを含む少なくとも１個の細胞を含む増殖性細胞培養物と、培養物を３５℃以下の温度に維持するための調節器を含む細胞培養システム。
【請求項４０】
細胞培養培地を更に含む請求項３８に記載の組成物または請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４１】
複数のベクターが両方向発現ベクターを含む請求項３８に記載の組成物または請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４２】
両方向発現ベクターが第２のプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に挿入された第１のプロモーターを含み、第１のプロモーターと第２のプロモーターがインフルエンザウイルスの少なくとも１個のセグメントをコードする核酸の少なくとも１つの領域の両側に逆方向に配置されている請求項３８に記載の組成物または請求項３９に記載の細胞培養システム。
【請求項４３】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換を含むインフルエンザＡウイルス又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置に１個以上のアミノ酸置換を含むインフルエンザＢウイルスを含む人工構築組換え又はリアソータントインフルエンザウイルス。
【請求項４４】
（ａ）インフルエンザウイルスＡがＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含むか又はインフルエンザＢウイルスがＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含むか、または
（ｂ）ウイルスがＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される複数のアミノ酸置換を含むインフルエンザウイルスＡか、または
（ｃ）ウイルスがＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数のアミノ酸置換を含むインフルエンザウイルスＡか、または
（ｄ）ウイルスがＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される複数のアミノ酸置換を含むインフルエンザウイルスＢか、または
（ｅ）ウイルスがＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数のアミノ酸置換を含むインフルエンザウイルスＢか、または
（ｆ）ウイルスがＰＲ８株インフルエンザＡウイルスを含むインフルエンザウイルスＡか、または
（ｇ）インフルエンザウイルスが温度感受性、低温適応及び弱毒から構成される群から選択される１種以上の表現型属性をもつか、または
（ｈ）インフルエンザウイルスが少なくとも１種の付加的非野生型アミノ酸を更に含むか、または
（ｉ）インフルエンザウイルスがフェレット弱毒アッセイで少なくとも３．０ｌｏｇ５０の複製低下を示すか、または
（ｊ）インフルエンザウイルスがフェレット弱毒アッセイで検出不能な複製を示す請求項４３に記載のインフルエンザウイルス。
【請求項４５】
（ａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階と；
（ｂ）ウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザウイルスゲノムを複製する段階を含む温度感受性（ｔｓ）インフルエンザウイルスの生産方法。
【請求項４６】
インフルエンザウイルスＡゲノムがＰＲ８ゲノムを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階、または
（ｂ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする複数の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする複数の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階、または
（ｃ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数のアミノ酸置換をもたらす突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数のアミノ酸置換をもたらす突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）突然変異インフルエンザウイルスゲノムを鶏卵で複製する段階、または
（ｂ）突然変異インフルエンザＡウイルスゲノムを細胞培養で複製する段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスを鶏卵で増幅する段階か、または３５℃以下の温度で細胞を培養する段階を更に含む請求項４８（ｂ）に記載の方法。
【請求項５０】
細胞培養がＶｅｒｏ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ細胞の１種以上を含む請求項４８（ｂ）に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択されるアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＡウイルスゲノムに導入するか又はＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択されるアミノ酸置換をもたらす少なくとも１個の突然変異をインフルエンザＢウイルスゲノムに導入する段階と；
（ｂ）ウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザウイルスゲノムを複製する段階と；
（ｃ）インフルエンザウイルスを回収する段階を含む生弱毒インフルエンザウイルスワクチンの生産方法。
【請求項５２】
インフルエンザウイルスが少なくとも第２のウイルス株に由来するＨＡ及びＮＡ抗原をコードするゲノムセグメントを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＡ及びＡ抗原が少なくとも１種のインフルエンザウイルス株に対する防御免疫応答を誘発することが可能である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む人工構築組換え又はリアソータント温度感受性（ｔｓ）インフルエンザＡウイルス。
【請求項５５】
（ａ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｂ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｃ）ＰＢ１３９１（Ｋ３９１Ｅ）、ＰＢ１５８１（Ｅ５８１Ｇ）、ＰＢ１６６１（Ａ６６１Ｔ）、ＰＢ２２６５（Ｎ２６５Ｓ）及びＮＰ３４（Ｄ３４Ｇ）から構成される複数の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｄ）温度感受性インフルエンザＡウイルスが３９℃で野生型インフルエンザＡウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示すか、または
（ｅ）インフルエンザＡがフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザＡウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示すか、または
（ｆ）第２のインフルエンザＡウイルス株に由来するＨＡ又はＮＡ抗原の少なくとも１種をコードする１個以上のゲノムセグメントを含む請求項５４に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項５６】
温度感受性インフルエンザＡウイルスが少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、少なくとも約４．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．５ｌｏｇ１０から構成される群から選択される３９℃の増殖低下ｌｏｇ１０値を示す請求項５５（ｄ）に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項５７】
フェレット弱毒アッセイにおける増殖低下が少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．０ｌｏｇ１０から構成される群から選択される請求項５５（ｅ）に記載のｔｓインフルエンザＡウイルス。
【請求項５８】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＡウイルス又はインフルエンザＡウイルス蛋白質を含む組換え又はリアソータントインフルエンザＡワクチン。
【請求項５９】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え又は単離核酸。
【請求項６０】
ＰＢ１３９１、ＰＢ１５８１、ＰＢ１６６１、ＰＢ２２６５及びＮＰ３４から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含む組換え又は単離インフルエンザＡポリペプチド。
【請求項６１】
ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含む人工構築組換え又はリアソータント温度感受性（ｔｓ）インフルエンザＢウイルス。
【請求項６２】
（ａ）ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される少なくとも１個の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｂ）ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｃ）ＰＢ２６３０（Ｓ６３０Ｒ）、ＰＡ４３１（Ｖ４３１Ｍ）、ＰＡ４９７（Ｙ４９７Ｈ）、ＮＰ５５（Ｔ５５Ａ）、ＮＰ１１４（Ｖ１１４Ａ）、ＮＰ４１０（Ｐ４１０Ｈ）、ＮＰ５１０（Ａ５１０Ｔ）、Ｍ１１５９（Ｈ１５９Ｑ）及びＭ１１８３（Ｍ１８３Ｖ）から構成される複数の導入アミノ酸置換を含むか、または
（ｄ）温度感受性インフルエンザＡウイルスが３９℃で野生型インフルエンザＢウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示すか、または
（ｅ）インフルエンザＢがフェレット弱毒アッセイで野生型インフルエンザＢウイルスに比較して約２．０〜約５．０ｌｏｇ１０の増殖低下を示すか、または
（ｆ）第２のインフルエンザＢウイルス株に由来するＨＡ又はＮＡ抗原の少なくとも１種をコードする１個以上のゲノムセグメントを含む請求項６１に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項６３】
温度感受性インフルエンザＢウイルスが少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、少なくとも約４．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．５ｌｏｇ１０から構成される群から選択される３９℃の増殖低下ｌｏｇ１０値を示す請求項６２（ｄ）に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項６４】
フェレット弱毒アッセイにおける増殖低下が少なくとも約２．０ｌｏｇ１０、少なくとも約３．０ｌｏｇ１０、及び少なくとも約４．０ｌｏｇ１０から構成される群から選択される請求項６２（ｅ）に記載のｔｓインフルエンザＢウイルス。
【請求項６５】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される複数の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＢウイルス又はインフルエンザＢウイルス蛋白質を含む組換え又はリアソータントインフルエンザＢワクチン。
【請求項６６】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される位置に１個以上の導入アミノ酸置換を含むインフルエンザＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え又は単離核酸。
【請求項６７】
ＰＢ２６３０、ＰＡ４３１、ＰＡ４９７、ＮＰ５５、ＮＰ１１４、ＮＰ４１０、ＮＰ５１０、Ｍ１１５９及びＭ１１８３から構成される群から選択される１個以上の導入アミノ酸置換を含む組換え又は単離インフルエンザＢポリペプチド。