【手続補正書】
【提出日】平成18年4月24日(2006.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
神経栄養因子
ニューロトロフィンを含む、神経栄養因子は、末梢及び中枢神経系の機能の多くの側面を制御することが知られており、これが次に本質的に全ての他の器官の機能を変調できる。従って、ニューロトロフィンは生物学的重要性が極めて高い。
おそらく最もよく知られている神経栄養因子である神経成長因子(ＮＧＦ)は、末梢神経系の発達中の感覚神経と交感神経に対して顕著な効果を有するタンパク質である。ＮＧＦは特異的細胞表面レセプターを介して応答性ニューロンに作用して、ニューロン生存を支援し、神経突起成長を促進し、神経化学的機能を亢進する。ＮＧＦの作用には、ニューロン膜(Connolly等, 1981, J.Cell.Biol. 90:176; SkaperとVaron, 1980, Brain Res. 197:379)、ニューロンタンパク質のリン酸化状態(Yu等, 1980, J.Biol.Chem. 255:10481; HalqouaとPatrick, 1980, Cell 22:571)、及びニューロンの分化と機能においてある役割を担うと思われるある種のｍＲＮＡｓとタンパク質の豊富さ(TiercyとShooter, 1986, J.Cell.Biol. 103:2367)における変化が伴う。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
末梢神経系におけるそのよく特徴付けされた効果に加えて、ニューロトロフィンファミリーの様々なメンバーが成体中枢神経系を変調させる点においても重要な役割を果たしている。例えば、ＮＧＦは前脳基底核コリン作動性ニューロンの正常な神経化学的分化に対して、また正常な記憶能力に対して必要とされる(Chen等, J. Neurosci. 17(19):7288-96 [1997])。長期増強として知られる現象をＢＤＮＦが変化させることができることも知られており、これはまた認知機能に関連していると考えられる(Kang等, Neuron 19:653-664 [1997])。ニューロトロフィンはまた、セロトニン作動性ニューロンのＢＤＮＦ変調のような他のＣＮＳニューロン機能の他の側面を変調させることができる(Siuciak等, Brain Res. 710(1-2: 11-20[1996])。従って、ニューロトロフィンはＣＮＳの正常な機能と病理の多くの側面に潜在的に関与している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
様々な突然変異誘発の研究により、ＮＧＦ結合に対して重要なアミノ酸配列がヒトｐ７５ＮＧＦＲ細胞外ドメインの第３及び第４のシステインリッチ反復(アミノ酸８０−１６０)内にありそうであることが示されている。ヒトｐ７５ＮＧＦＲの一次構造がリンカー挿入と短い欠失の導入で混乱させられた実験では(Yan, H.とChao, M.V., J.Biol.Chem. 266, 12099-12104 [1991])、最も劇的な効果が、第３及び第４のシステインリッチ反復内に位置しているアミノ酸位置１０５及び１３０に観察された。アミノ酸１３０とその回りの残基がＮＧＦ結合にとって重要であるという知見は、様々な動物腫、例えばラット、ニワトリ、マウス及びヒトにおけるこれらの残基の保存とよく一致している。確かに、アミノ酸１１８−１４２が欠失されたｐ７５変異体はＮＧＦに結合しなかった。独立した研究においてWelcher, A.A.等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 159-163 [1991])は、第１のシステインリッチ反復又は第１及び第２のシステインリッチ反復配列の一部の何れかが除かれてＮＧＦを結合せしめるヒトｐ７５変異体を見出した。しかし、ｐ７５ＮＧＦＲの４つ全てのシステインリッチ配列を欠く欠失変異体はＮＧＦを結合せしめることができなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
他の神経栄養因子の中で、ＢＤＮＦが他のチロシンキナーゼレセプターであるＴｒｋＢに選択的に結合することが示されている一方(Squinto, S.P., Cell 65, 885-893 [1991]; Soppet, D.等, Cell 65, 895-903 [1991]; Klein, R.等, Cell 66, 395-403 [1991])、ＮＴ-３は他の相同体であるＴｒｋＣに結合する(Lamballe, F.等, Cell 66, 967-979 [1991])。ＮＴ-４とＮＴ-５はＴｒｋＢを強く刺激することが知られているが、それ自身の独特のＴｒｋレセプターを有していることはまだ知られていなかった。ＮＴ-３、ＮＴ-４及びＮＴ-５は全てＮＧＦより低い親和性でもってＴｒｋＡに結合するようであるが、このレセプターに対するその効果は議論の余地がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一側面では、本発明は単離されたＦＩＺＺポリペプチドに関する。特定の実施態様では、本発明は、図５（配列番号：１０）のアミノ酸残基２４−１１１、又は図１０（配列番号：１４）のアミノ酸残基２１−１０５、又は図１２（配列番号：１６）のアミノ酸残基２１−１１４、又は図１４（配列番号：１８）のアミノ酸残基２１−１１１、又は図２６（配列番号：２４）のアミノ酸残基１９−１０８をコードするＤＮＡ分子に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡによりコードされたＦＩＺＺポリペプチド配列を含んでなる単離されたポリペプチドに関する。他の実施態様では、単離ポリペプチドは、図５（配列番号：９）、図９（配列番号：１３）、図１１（配列番号：１５）、図１８（配列番号：１７）、図１５（配列番号：１９）、図２５（配列番号：２３）のＤＮＡ分子の補体と厳密条件下でハイブリッド形成するＤＮＡによりコードされるＦＩＺＺ配列を含んでなる。特定の実施態様では、単離ＦＩＺＺポリペプチドは、図５（配列番号：１０）のアミノ酸残基２４−１１１を含んでなるｍ-ＦＩＺＺ１、図１０（配列番号：１４）のアミノ酸残基２１−１０５を含んでなるｍ-ＦＩＺＺ２、図１２（配列番号：１６）のアミノ酸残基２１−１１４を含んでなるｍ-ＦＩＺＺ３、図１４（配列番号：１８）のアミノ酸残基２１−１１１を含んでなるｈ-ＦＩＺＺ１、及び図２６（配列番号：２４）のアミノ酸残基１９−１０８を含んでなるｈ-ＦＩＺＺ３からなる群から選択される。ＦＩＺＺポリペプチドはＮ末端シグナルペプチドを含み得、これは、例えば、天然ＦＩＺＺタンパク質のシグナルペプチド、又は異種性シグナルであり得、他の異種性配列、例えば毒素部分に融合又は結合等しうる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また更なる側面では、本発明は、図５（配列番号：１０）のアミノ酸残基２４−１１１、又は図１０（配列番号：１４）のアミノ酸残基２１−１０５、又は図１２（配列番号：１６）のアミノ酸残基２１−１１４、又は図１４（配列番号：１８）のアミノ酸残基２１−１１１、又は図２６（配列番号：２４）のアミノ酸残基１９−１０８をコードするＤＮＡ分子に少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含み、これを発現可能な発現ベクターに関する。
更に他の側面では、本発明は、図５（配列番号：９）、図９（配列番号：１３）、図１１（配列番号：１５）、図１８（配列番号：１７）、図１５（配列番号：１９）、図２５（配列番号：２３）のＤＮＡ分子の補体と厳密条件下でハイブリッド形成するＤＮＡを含み、これを発現可能な発現ベクターに関する。
本発明はまた上述の発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌、又は真核生物、例えば哺乳動物（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ）あるいは酵母（例えば、サッカロミセス・セレヴィシア）でありうる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
Ｉ.  定義
「ＦＩＺＺポリペプチド」、「ＦＩＺＺタンパク質」及び「ＦＩＺＺ」という用語は、ここで使用される場合、天然配列ＦＩＺＺ及びＦＩＺＺ変異体(これらはここで更に定義する)を包含する。ＦＩＺＺポリペプチドは様々な供給源、例えばマウス又はヒト組織型あるいは他の供給源から単離されるか、組み換え又は合成法により調製される。
「天然配列ＦＩＺＺ」は、天然由来のＦＩＺＺポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。かかる天然配列ＦＩＺＺは、自然から単離することができるか組換えあるいは合成手段によって生産することができる。「天然配列ＦＩＺＺ」なる用語は、ＦＩＺＺタンパク質の天然に生じる又は切断された型、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。本発明の一実施態様では、天然配列ＦＩＺＺポリペプチドは、ｍ-ＦＩＺＺ１（図５、配列番号：１０）のアミノ酸残基１−１１１、又はｍ-ＦＩＺＺ２（図１０、配列番号：１４）のアミノ酸残基１−１０５、又はｍ-ＦＩＺＺ３（図１２、配列番号：１６）のアミノ酸残基１−１１４、又はその断片で、Ｎ末端シグナルペプチドを欠くものを含んでなる成熟あるいは全長の天然配列マウスＦＩＺＺ（ｍ-ＦＩＺＺ）である。他の実施態様では、天然配列ＦＩＺＺポリペプチドは、ｈ-ＦＩＺＺ１（図１４、配列番号：１８）のアミノ酸残基１−１１１、又はｈ-ＦＩＺＺ３（図２６、配列番号：２４）のアミノ酸残基１９−１０８、又はその断片で、Ｎ末端シグナルペプチドを欠くものを含んでなる成熟あるいは全長の天然配列ヒトＦＩＺＺ（ｈ-ＦＩＺＺ）である。例えばｍ-ＦＩＺＺ１／ｈ-ＦＩＺＺ１、又はｍ-ＦＩＺＺ３／ｈ-ＦＩＺＺ３のようなマウス及びヒトＦＩＺＺタンパク質における同様の命名は、同じ接尾辞を使用して命名したマウスとヒトタンパク質の間に高度の配列同一性及び構造的類似性があることを単に示している。しかし、マウス及びヒトタンパク質において同じ接尾辞を使用することは、ヒトタンパク質がマウスタンパク質のヒト相同体であることを必ずしも意味していない。更なるマウス及びヒトＦＩＺＺタンパク質が存在していて同定され得、ここに開示したヒトタンパク質がまだ同定されていない他のマウスＦＩＺＺタンパク質のホモログであることが可能であり、考えられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
全長天然配列ＦＩＺＺ遺伝子、例えばｍ-ＦＩＺＺ１(ＤＮＡ５３５１７、図５、配列番号：９)；ｍ-ＦＩＺＺ２(ＤＮＡ５４２２９、図９、配列番号：１３)、ｍ-ＦＩＺＺ３(ＤＮＡ５４２３１、図１１、配列番号：１５)；ｈ-ＦＩＺＺ１(ＤＮＡ５４２２８、図１８、配列番号：１７)；ｈＦＩＺＺ-３(ＤＮＡ６５３５１、図２５、配列番号：２３)、又はその一部分は、全長ＦＩＺＺ遺伝子の単離のため又はここに特に開示されたマウス又はヒトＦＩＺＺ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＦＩＺＺの天然に生じる変異体又は他の種からのＦＩＺＺポリペプチドをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、配列番号：９、１３、１５、１７又は１９の核酸配列から、又は天然配列ＦＩＺＺポリペプチドのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、天然ＦＩＺＺ遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＦＩＺＺ遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
また、プローブは、ＰＣＲ法において、密接に関連したＦＩＺＺ配列の同定のための配列のプールを作成するために使用することができる。
また、ＦＩＺＺポリペプチドをコードする核酸配列は、そのＦＩＺＺポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
部分的ｃＤＮＡ配列    我々は、我々の配列の最初の７つと最後の７つのアミノ酸に対する推定上ＤＮＡ配列にそれぞれ対応する２つの縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを設計した。
オリゴ＃１：DETIEIをコード、MluIオーバーハング
ACA AAC GCG TGA YGA RAC NAT HGA RAT (配列番号：２)
オリゴ＃２：NPANYPをコード、SphIオーバーハング
TGG TGC ATG CGG RTA RTT NGC NGG RTT (配列番号：３)
正常なマウスの肺から調製されたｃＤＮＡが８８塩基対の生成物を生じたＰＣＲ反応に対する鋳型として使用された。図４に示されるように、この８８塩基対の生成物は、ＰＣＲプライマーをコードする５４の既知の塩基対と、介在アミノ酸をコードする３４の新規な塩基対をＦＩＺＺ配列に含んでいた。図４に示した二本鎖核酸分子のストランドは配列番号４及び５としてそれぞれ同定される一方、コードアミノ酸配列は配列番号：６として示した。
全長ｃＤＮＡクローン    部分配列を使用して、マウスの肺ポリ(Ａ)＋ＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲにより全長ＦＩＺＺクローンを得るために使用されたプライマーを設計した。
オリゴ＃３：
ACA AAC GCG TGC TGG AGA ATA AGG TCA AGG (配列番号：７)
このオリゴはクローンテックからの５'及び３'アンプリマーと組み合わせてＲＴ-ＰＣＲプライマーとして使用された。
オリゴ＃４：
ACT AAC GCG TAG GCT AAG GAA CTT CTT GCC（配列番号：８）
このオリゴはオリゴｄ(Ｔ)と組み合わせてＲＴ-ＰＣＲプライマーとして使用された。
完全ｍ-ＦＩＺＺ１ｃＤＮＡ及びタンパク質配列は図５に示される。全長ｃＤＮＡのコードストランドはまた配列番号：９として含められ、全長推論タンパク質配列は配列番号：１０と命名し；２３のアミノ酸の推定上シグナル配列を含み、成熟Ｎ末端が２４位に始まり、配列モチーフＤＥＴを有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例３
ノーザンブロット分析
ｍ-ＦＩＺＺ１ｍＲＮＡの様々なマウス組織での発現をノーザンブロット分析法により調べた。マウスＲＮＡブロットが、全長ｍ-ＦＩＺＺ１ｃＤＮＡに基づく次の３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズされた。
ATC TGT TCA TAG TCT TGA CAC TAG TGC AAG AGA GAG TCT TCG TTA CAG TG
(配列番号：１１)
マウス多重組織（クローンテック）をＤＮＡプローブでインキュベートした。ブロットをハイブリッド形成バッファー（５ｘＳＳＰＥ；２ｘデンハート液；１００ｍｇ／ｍＬ変性せん断サケ精子ＤＮＡ；５０％ホルムアミド；２％ＳＤＳ）中で４２℃にて６０時間、プローブでインキュベートした。ブロットを２ｘＳＳＣ中で数回、０．０５％ＳＤＳで室温にて１時間、洗浄し、ついで３０分間０．１ｘＳＳＣで洗浄し；５０℃にて０．１％ＳＤＳで洗浄した。一晩暴露した後ホスホイメージャー分析（Fuji）によりブロットを展開した。
図７に示されるように、ノーザンブロットの結果は、肺組織でのＦＩＺＺ１ｍＲＮＡの強い発現を示しているが、ｍＲＮＡはまた心臓組織と骨格筋において、度合いが弱くなるが、検出可能である（図７）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
（ｂ）異なった実験では、ｍ-ＦＩＺＺ１に対して特異的な次のプローブを使用してインシトゥーハイブリッド形成を実施した：
CCCAGGATGC CAACTTTGAA TAGGATGAAG ACTACAACTT GTTCCCTTCT CATCTGCATC TCCCTGCTCC AGCTGATGGT CCCAGTGAAT ACTGATGAGA CCATAGAGAT TATCGTGGAG AATAAGGTCA AGGAACTTCT TGCCAATCCA GCTAACTATC CCTCCACTGT AACGAAGACT CTCTCTTGCA CTAGTGTCAA GACTATGAAC AGATGGGCCT CCT  （配列番号：２８）
結果は次の通りであった：
正常な成体マウスの肺：  大きな気道（気管支／細気管支）上皮細胞にパッチ状の発現がある。発現は粘膜上皮細胞のサブセット内にある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内に、明らかに透過なレベルで発現がある。これらの細胞は、典型的に正の病巣内に１−３であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、リンパ管の末梢神経又はシュワン細胞を提示する。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺(好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び間質性肺炎）：肺の大気道（気管支／細気管支）の全ての粘膜上皮細胞に散らばった線状の発現がある。また、肺胞を裏打ちする上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞に強い発現がある；これらの細胞はＩＩ型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質に希な離散細胞内に存在する発現がある。これらの細胞は、典型的には正の病巣内に１又は少しの細胞であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋、末梢神経又はシュワン細胞を提示しうる。  
正常な成体マウスの小及び大腸：  粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随する支持細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性成体マウス(ＩＬ１０Ｒ ＫＯ)大腸：    炎症性大腸（ＩＬ１０Ｒ ＫＯマウスからのもの）において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少する；これは人為現象的なものであり、炎症との相関であり、あるいはＩＬ１０シグナル伝達を欠く相関でありうる。更なる研究がこれらの可能性を説明するために必要とされる。
マウスの１２日齢及び１５日齢胚：  ｍ-ＦＩＺＺ１の特異的な発現はない。
炎症性及び正常なマウスの足の裏部分：  ｍ-ＦＩＺＺ１の特異的な発現はない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
（ｄ）  インシトゥーハイブリッド形成をｍ-ＦＩＺＺ３に対して特異的な次のプローブを使用して実施した：
CGAGGGGGAC AGGAGCTAAT ACCCAGAACT GAGTTGTGTC CTGCTAAGTC CTCTGCCACG TACCCACGGG ATGAAGAACC TTTCATTTCC CCTCCTTTTC CTTTTCTTCC TTGTCCCTGA ACTGCTGGGC TCCAGCATGC CACTGTGTCC CATCGATGAA GCCATCGACA AGAAGATCAA ACAAGACTTC AACTCCCTGT TTCCAAATGC AATAAAGAAC ATTGGCTTAA ATTGCTGGAC AGTCTCCTCC AGAGGGAAGT TGGCCTCCTG CCCAGAAGGC ACAGCAGTCT TGAGCTGCTC CTGTGGCTCT  GCCTGTGGCT  CGTGGGAC  （配列番号：３０）
脂肪細胞に特異的な中程度のシグナルがある；このシグナルは、首において気管の回りの腸間膜脂肪と間質性脂肪に存在する。発現パターンは成体脂肪に対して特異的であるようである。更なる研究が脂肪組織の他の解剖学的位置における発現を消化するために計画されている。褐色脂肪もまた評価されるであろう。
要約すると、マウスＦＩＺＺ１、ＦＩＺＺ２及びＦＩＺＺ３は異なった発現パターンを有している。炎症性肺粘膜におけるｍ-ＦＩＺＺ１の発現の増加とＭＬＲを刺激するその能力は、ｍ-ＦＩＺＺ１が肺における粘膜免疫応答を亢進するように機能しうることを示唆している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
実施例５
ｍ-ＦＩＺＺ２及びｍ-ＦＩＺＺ３をコードするｃＤＮＡｓの単離
公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース(Merck/Washington University)を全長マウスｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡ(ＤＮＡ５３５１７)でサーチし、ＡＡ２４５４０５(図１６、配列番号：２０)とＷ４２０６９（図１７、配列番号：２１）と命名した、ｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡと相同性を示した二つのＥＳＴを同定した。
ＥＳＴクローンＡＡ２４５４０５及びＷ４２０６９をIncyte(Palo Alto, California)から購入し、全体を配列決定した。
ＡＡ２４５４０５クローンの全ヌクレオチド配列は図９に示す(配列番号：１３)。ＤＮＡ５４２２９と命名されたこのクローンは、ヌクレオチド位置１１６−１１８に見かけ上の翻訳開始部位を持つシングルのオープンリーディングフレームを含む（図９；配列番号：１３）。予想されたポリペプチド先駆体（２０のアミノ酸のシグナル配列を含む）は１０５アミノ酸長である。ｍ-ＦＩＺＺ１に対するその相同性に基づいて(ＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、５１％)、タンパク質をｍ-ＦＩＺＺ２と命名した。クローンＤＮＡ５４２２９-１３６６は１９９８年４月２３日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０３が付された。
Ｗ４２０６９クローンの全ヌクレオチド配列は図１１に示す(配列番号：１５)。ＤＮＡ５４２３１と命名されたこのクローンは、ヌクレオチド位置６６−６８に見かけ上の翻訳開始部位を持つシングルのオープンリーディングフレームを含む（図１１；配列番号：１５）。予想されたポリペプチド先駆体（１０のアミノ酸のシグナル配列を含む）は１１４アミノ酸長である。ｍ-ＦＩＺＺ１に対するその相同性に基づいて(ＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、３４％)、タンパク質をｍ-ＦＩＺＺ３と命名した。クローンＤＮＡ５４２３１-１３６６は１９９８年４月２３日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０４が付された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
実施例６
ｈ-ＦＩＺＺ１をコードするＤＮＡの単離
公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース(Merck/Washington University)を全長マウスｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡ(ＤＮＡ５３５１７)でサーチし、ＡＡ５２４３００(図１３、配列番号：２２)と命名した、ｍ-ＦＩＺＺ１ＤＮＡと相同性を示したＥＳＴを同定した。
ＥＳＴクローンＡＡ５２４３００をIncyte(Palo Alto, California)から購入し、全体を配列決定した。
ＡＡ５２４３００クローンの全ヌクレオチド配列は図１８に示す(配列番号：１７)。ＤＮＡ５４２２８と命名されたこのクローンは、ヌクレオチド位置２１６−２１８に見かけ上の翻訳開始部位を持つシングルのオープンリーディングフレームを含む（図１８；配列番号：１７）。予想されたポリペプチド先駆体（２０のアミノ酸の推定上シグナル配列を含む）は１１１アミノ酸長である。ｍ-ＦＩＺＺ１に対するその相同性に基づいて(ＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、５０％)、タンパク質はｍ-ＦＩＺＺ１のヒト相同体であると信じられ、ｈ-ＦＩＺＺ１と命名した。クローンＤＮＡ５４２２８-１３６６は１９９８年４月２３日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０１が付された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
他の方法では、Sompayrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を一過性的に使用してＦＩＺＺポリペプチドコード化ＤＮＡを２９３細胞内に導入することができる。２９３細胞はスピナフラスコで最大密度まで増殖され、７００μｇのｐＲＫ５-ＦＩＺＺ ＤＮＡが添加される。細胞を遠心分離によりスピナフラスコから最初に濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を４時間の間細胞ペレット上でインキュベートした。細胞を２０％のグリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナフラスコ中に再導入する。約４日後に馴化培地を遠心分離にかけ、濾過して細胞と壊死組織片を除去する。発現されたＦＩＺＺを含む試料をついで濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィーのような選択された任意の方法により精製することができる。
他の実施態様では、ＦＩＺＺポリペプチドはＣＨＯ細胞において発現させることができる。ｐＲＫ５-ＦＩＺＺは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランのような既知の試薬を使用してＣＨＯ細胞内に形質移入することができる。上述したように、細胞培養をインキュベートし、培地を、培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニンのような放射標識を含む培地に置き換える。ＦＩＺＺポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地と置き換えることができる。好ましくは、培養を約６日間インキュベートし、ついで馴化培地を収集する。発現されたＦＩＺＺを含む培地をついで濃縮し、任意の選択された方法により精製することができる。
エピトープタグＦＩＺＺをまた宿主ＣＨＯ細胞において発現させることができる。ＦＩＺＺポリペプチドＤＮＡをｐＲＫ５ベクターからサブクローニングすることができる。サブクローン挿入断片はバキュロウィルス発現ベクター内へのポリ-ｈｉｓタグのような選択されたエピトープタグとインフレームで融合するＰＣＲを受けることができる。ポリ-ヒスタグＦＩＺＺ ＤＮＡ挿入断片はついで、安定なクローンの選択に対するＤＨＦＲのような選択マーカーを含むＳＶ４０推進ベクター中にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞にＳＶ４０推進ベクターを（上述したようにして）形質移入することができる。標識が、発現を証明するために上述したようにして実施される。発現されたポリ-ＨｉｓタグＦＩＺＺタンパク質を含む培地をついで濃縮し、例えばＮｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーのような任意の選択される方法により精製することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
実施例１２
バキュロウィルス発現系におけるＦＩＺＺポリペプチドの発現
次の方法はバキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＦＩＺＺポリペプチドの組換え発現を記載している。
所望のＦＩＺＺポリペプチドをコードするＤＮＡをバキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。そのようなエピトープタグはポリ-ｈｉｓタグと免疫グロブリンタグ(ＩｇＧのＦｃ領域のような)を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）のような市販のプラスミド由来のプラスミドを含む様々なプラスミドを用いることができる。簡潔に述べると、ＦＩＺＺ ＤＮＡ又はＦＩＺＺ ＤＮＡの所望の部分(例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のような)を、５'及び３'領域に相補性であるプライマーを用いるＰＣＲにより増幅する。５'プライマーはフランキング(選択)制限酵素部位を組み込みうる。ついで生成物をその選択された制限酵素で消化させ、発現ベクター中にサブクローニングする。
組換えバキュロウィルスを、リポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を使用してスポンドプテラ・フルギペルダ(Spondoptera frugiperda)(「Ｓｆ９」)細胞（ATCC CRL 1711）中に上記のプラスミドとBaculoGoldTMウィルスＤＮＡ(Pharmigen)を同時形質導入することにより産生する。２８℃で４−５日のインキュベーション後に、放出されたウィルスを収集し、更なる増幅のために使用する。ウィルス感染とタンパク質発現は、Reilly等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)により記載されたようにして実施する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
発現されたポリ-ｈｉｓタグＦＩＺＺは、ついで、例えばＮｉ２＋-キレートアッフィニティクロマトグラフィーにより、次のようにして精製することができる。抽出物を、Ruppert等, Nature, 361: 175-179 (1993)により記載されたように組換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。簡潔に述べると、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理バッファー(２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ)に再懸濁させ、氷上で２０秒の間２回超音波処理する。超音波処理物を遠心分離により清澄にし、上清を添加液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭNaCl、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過する。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagenから市販)を総容積５ｍLで調製し、２５ｍLの水で洗浄し、２５ｍLの添加液で平衡にする。濾過した細胞抽出物を毎分当り０．５ｍLでカラムに充填する。カラムを添加液でベースラインＡ２８０まで洗浄し、その点で分画の収集を開始する。次に、カラムを二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄し、このバッファーが非特異的に結合したタンパク質を溶出させる。再びＡ２８０ベースラインに達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０〜５００ｍＭのイミダゾールで展開する。１ｍＬの画分を収集しＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼに抱合されたＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットにより分析する。溶出したＨｉｓ１０タグＦＩＺＺを含む画分をプールし、添加液に対して透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＦＩＺＺの精製は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を使用して実施することができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
実施例１３
ラット後根神経節(ＲＤＧ)のニューロン生存阻害アッセイ
材料  ＡＳＹマトリックス：１００ｍｌｓ当り次の添加物：Satoミックス(２．２ｍｌ)、PenStrep(１ｍｌ)、トランスフェリン(１０μｌ)、インスリン(１０μｌ)が添加されたF12培地(ギブコ)。Satoミックス：３５％ＢＳＡ(Path-O-Cyte４、２０ｍｌｓ)、プロゲステロン(０．２ｍｌｓ、シグマ、Ｐ８７８３、ＥｔＯＨに０．６２mg/ｍｌ)、プトレッシン（２０ｍｌ、シグマ、Ｔ０３９７、ＥｔＯＨに１．６１ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ-チロキシン(２ｍｌｓ、シグマ、Ｔ０３９７、ＥｔＯＨに０．４ｍｇ／ｍｌ)、亜セレン酸ナトリウム(０．２ｍｌｓ、シグマ、Ｓ９１３３、ＰＢＳに０．３８７ｍｇ／ｍ)、トリ-ヨード-チロシン(２ｍｌｓ、シグマ、Ｔ６３９７、０．３３７ｍｇ／ｍｌ)。
プロトコール  Ｅ１４ラット胎児の背側神経節から新たに単離された神経細胞(異種性集団)をＦ１２完全培地で希釈し、５０μｌのＦ１２完全培地を含みポリオルニチンで前処理されたプレートに５０００細胞／ウェルで配した。試験試料を、全体で１００μｌの更なる培地に添加した。３７℃で３日間インキュベートした後、細胞生存力を評価した。
結果  多くのアッセイシステムを使用して、ニューロトロフィン生物活性と干渉するｍ-ＦＩＺＺタンパク質の能力を評価した。概念図式的ニューロトロフィン効果は、胎児ニューロンのある種の集団の生存を可能にするものである。また、ニューロトロフィンは成体のニューロンにも影響を及ぼすが、多くの場合、これらの細胞にはもはや必要ないものである。例として、胎児後根神経節(ＤＲＧ)の近くニューロンの培養は、ニューロトロフィンの作用を研究するためには典型的なシステムであるとされる。これら神経節にはいくつかの亜集団があり、ニューロトロフィンファミリーの異なるメンバーに対して特異的な反応をする(Snider, Cell 77: 627-638 [1994])。実際、このアッセイシステムはニューロトロシンファミリーの最初に知られたメンバーであるＮＧＦを先ず精製するために使用されたものと非常に類似している(Cohen, J.Biol.Chem. 234:1129-1137 [1959]; Cohen, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 46:302-311 [1960])。しかしながら、成体ＤＲＧ由来の細胞は、生存のために何らのニューロトロフィンも必要としない(Lindsay, J. Neurosci. 8:2394-2405[1988])が、それらは明らかにインビボ(Munson等, J. Neurosci. 17:470-476 [1997])及びインビトロ(Lindsay等, Neurosci. 33:53-65 [1989])の双方においてニューロトロフィンになお反応する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  喘息及び対照マウスに対する免疫化／エアロゾル化処置を示すマウス喘息プロトコール。
【図２】  銀染色された１６％トリシンゲル：レーン１：対照マウスＢＡＬ；レーン２：喘息マウスＢＡＬ；レーン３：８．３ｋＤａ分子量マーカー(ＩＬ-８)。
【図３】  ＰＶＤＦ膜上にブロットしたＦＩＺＺ試料のタンパク配列解析。
【図４】  部分ｍ-ＦＩＺＺ１ｃＤＮＡ配列（配列番号：４及び５）と対応するアミノ酸配列（配列番号：６）。
【図５】  全長ｍ-ＦＩＺＺ１ｃＤＮＡ配列（配列番号：９及び配列番号：３１）と対応するアミノ酸配列（配列番号：１０）。該アミノ酸配列は、推定上シグナルペプチドを残基１−２３間に、また推定上カルシウム結合ＥＧＦ様ドメインタンパク質パターンを残基８４−９３間に含む。
【図６】  ｐＳＴ３１でのＦＩＺＺ発現作成物：（Ｈｉｓ）８-タグｍ-ＦＩＺＺ１融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号：１２及び配列番号：３２）と対応するアミノ酸配列（配列番号：３３）。
【図７】  放射標識されたｍ-ＦＩＺＺ１プローブで探索したマウス組織ノーザンブロット。レーンを左から右に：心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣。
【図８Ａ】  放射標識されたｍ-ＦＩＺＺ１プローブで探索したマウス肺組織切片のインサイツハイブリッド形成：（Ａ）喘息マウス肺。
【図８Ｂ】  放射標識されたｍ-ＦＩＺＺ１プローブで探索したマウス肺組織切片のインサイツハイブリッド形成：（Ｂ）対照マウス肺。
【図９】  ｍ-ＦＩＺＺ２をコードする一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１３）。
【図１０】  ｍ-ＦＩＺＺ２のアミノ酸配列（配列番号：１４）。該配列は、推定上シグナルペプチドを残基１−２０間に、また推定上プレニル基結合部位（ＣＡＡＸボックス）を残基１０２−１０５間に含む。
【図１１】  ｍ-ＦＩＺＺ３をコードする一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１５）。
【図１２】  ｍ-ＦＩＺＺ３のアミノ酸配列（配列番号：１６）。該配列は、推定上シグナルペプチドを残基１−２０間に、推定上ロイシンジッパーパターンを残基４−２５間に、残基３から始まるＮグリコシル化部位を、そして通常ＤＮＡポリメラーゼファミリーＢプロテインに特徴的な配列モチーフを残基３９−４８間に含む。
【図１３】  ＥＳＴ ＡＡ５２４３００のヌクレオチド配列（配列番号：２２）。
【図１４】  ｈ-ＦＩＺＺ１のアミノ酸配列（配列番号：１８）。該配列は、推定上シグナルペプチドを残基１−２０間に、また推定上プレニル基結合部位（ＣＡＡＸボックス）を残基１０８−１１１間に含む。
【図１５】  ヒトｍ-ＦＩＺＺ相同体をコードする仮想的ＤＮＡの一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１９）。ＤＮＡ５３０２８と名前を改めたＥＳＴ ＡＡ３１１２２３。
【図１６】  ＥＳＴ ＡＡ２４５４０５のヌクレオチド配列（配列番号：２０）。
【図１７】  ＥＳＴ Ｗ４２０６９のヌクレオチド配列（配列番号：２１）。
【図１８】  ｈ-ＦＩＺＺ１をコードする一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１７）。
【図１９】  胚性ＤＲＧ培養に対するｍ-ＦＩＺＺ１の添加が用量依存的にニューロトロフィンの組み合わせ(ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ３)により誘発されるニューロンの生存を阻害することを示す棒グラフ。
【図２０】  ＮＧＦ単独又はＢＤＮＦ単独によりＤＲＧ培養に誘発されるｍ-ＦＩＺＺ１によるニューロン生存阻害。
【図２１Ａ】  成体ＤＲＧニューロン培養においてＮＧＦにより誘発されたＣＧＲＰ量の上昇のｍ-ＦＩＺＺ１による阻害。
【図２１Ｂ】  成体ＤＲＧニューロン培養においてＮＧＦにより誘発されたＣＧＲＰ量の上昇のｍ-ＦＩＺＺ１による阻害。
【図２１Ｃ】  成体ＤＲＧニューロン培養においてＮＧＦにより誘発されたＣＧＲＰ量の上昇のｍ-ＦＩＺＺ１による阻害。
【図２２】  ｍ-ＦＩＺＺ３によるＮＧＦ生物活性の阻害。
【図２３】  ｍ-ＦＩＺＺ１の不存在又は存在下でのヒトｔｒｋＡ-ＩｇＧへのＮＧＦの結合。
【図２４】  ｍ-ＦＩＺＺ１（配列番号：１０）、ｍ-ＦＩＺＺ２（配列番号：１４）、ｍ-ＦＩＺＺ３（配列番号：１６）及びｈ-ＦＩＺＺ１タンパク質（配列番号：１８）のアラインメント。
【図２５】  ｈ-ＦＩＺＺ３をコードする一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２３）。
【図２６】  ｈ-ＦＩＺＺ３のアミノ酸配列（配列番号：２４）。該配列は、推定上シグナルペプチドを残基１−１８間に、また５７位に始まる細胞付着配列(ＲＧＤ)を含む。
【図２７】  ｍ-ＦＩＺＺ１（配列番号：１０）及びｈ-ＦＩＺＺ３（配列番号：２４）タンパク質のアラインメント。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2002513037.tif 000001
【図２】
2002513037.tif 000002
【図３】
2002513037.tif 000003
【図４】
2002513037.tif 000004
【図５】
2002513037.tif 000005
【図６】
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【図７】
2002513037.tif 000007
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2002513037.tif 000009
【図９】
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【図１０】
2002513037.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
2002513037.tif 000013
【図１３】
2002513037.tif 000014
【図１４】
2002513037.tif 000015
【図１５】
2002513037.tif 000016
【図１６】
2002513037.tif 000017
【図１７】
2002513037.tif 000018
【図１８】
2002513037.tif 000019
【図１９】
2002513037.tif 000020
【図２０】
2002513037.tif 000021
【図２１Ａ】
2002513037.tif 000022
【図２１Ｂ】
2002513037.tif 000023
【図２１Ｃ】
2002513037.tif 000024
【図２２】
2002513037.tif 000025
【図２３】
2002513037.tif 000026
【図２４】
2002513037.tif 000027
【図２５】
2002513037.tif 000028
【図２６】
2002513037.tif 000029
【図２７】
2002513037.tif 000030