【手続補正書】
【提出日】平成18年2月14日(2006.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細菌感染の処置のための組成物であって、
小胞形成脂質および親水性ポリマーで誘導体化された脂質１−２０モルパーセントから成るリポソームを含んでなり；そして
そのリポソーム内に、アミノ酸に共有結合したキノロン化合物から成る薬物コンジュゲートを封じ込め、該アミノ酸が、リポソーム中でのキノロン化合物の保持に比べて、リポソーム中での薬物コンジュゲートの保持を高めるのに有効である；
組成物。
【請求項２】  キノロン化合物がフルオロキノロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】  キノロン化合物が６−フルオロキノロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】  ６−フルオロキノロンがシプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、ロメフロキサシン、フレロキサシン、ペフロキサシンおよびアミフロキサシンから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】  該アミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリンおよびトレオニンから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】  キノロン化合物がシプロフロキサシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】  該アミノ酸がシプロフロキサシンのピペラジン環に共有結合している、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】  該親水性ポリマーが１,０００−５,０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】  請求項１に記載のリポソーム組成物を製造する方法であって、
第一イオン濃度を有する内部水相を持つようリポソームを製造し；
そのリポソームを、該第一イオン濃度より高い第二イオン濃度を有するバルク相媒体中でインキュベートし、該バルク相媒体には、該薬物コンジュゲートが含まれている；
方法。
【請求項１０】  より低い該第一イオン濃度およびより高い該第二イオン濃度が各々、第一および第二pＨ値を規定する水素イオン濃度であり、ここで、第一pＨは約４.５−７.５であって、外部バルク相媒体の第二pＨより少なくとも２pＨ単位低い、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  リポソームが、約３７℃以上の相転移温度を有する小胞形成脂質から主として形成され、該インキュベーティングを、実質的にはリポソーム形成脂質の相転移温度以上の温度で行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】  該第一および第二pＨ値が、より高い内側／より低い外側のアンモニウムイオングラジエントによるpＨグラジエントを規定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】  該グラジエントを、内部水相での薬物コンジュゲートの溶解度を減少させるのに有効である、対イオンを有するアンモニウム塩により形成する、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
親水性化合物が封入されたリポソームを製造するために、同じタイプの受動充填を使用することもできる。この場合、薬物を、通常、小胞形成脂質の脂質膜を水和するために使用する水性媒体に溶解する。水和条件および薬物の性質により、典型的には、約５−２０％の封入効率が得られ、残りの薬物は、バルク水相(bulk aqueous phase)にある。通常、封入されていない薬物を除去するためのさらなる処理工程が必要となる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
イオン化可能な親水性または両親媒性薬物の場合、さらにより優れた薬物充填効率は、膜内外イオングラジエントに対して薬物をリポソームに充填することにより達せられ得る(Ｎicholsら，１９７６；Ｃramerら，１９７７)。この充填方法は、遠隔充填と一般的に呼ばれ、典型的には、より低い内側／より高い外側のイオングラジエント、しばしば、pＨグラジエントを有するよう製造したリポソームの懸濁液に加えることにより充填する、イオン化可能なアミン基を有する薬物を必要とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別の態様において、本発明には、上に記載したリポソーム組成物を製造する方法が含まれる。その方法には、第一イオン濃度を有する内部水相を持つようリポソームを製造して、そのリポソームを、該第一イオン濃度より高い第二イオン濃度を有するバルク相媒体(bulk phase medium)中でインキュベートすることが含まれ、そのバルク相媒体には、薬物コンジュゲートが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
一態様において、より低い第一イオン濃度およびより高い該第二イオン濃度は各々、第一および第二pＨ値を規定する水素イオン濃度であり、ここで、第一pＨは約４.５−７.５であって、外部バルク相媒体の第二pＨより少なくとも２pＨ単位低い。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
別の態様において、グラジエントを、内部水相での薬物コンジュゲートの溶解度を減少させるのに有効である、対イオンを有するアンモニウム塩により形成する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図面の簡単な説明
図１Ａは、キノロン抗生物質化合物の一般的な構造を示し；
図１Ｂは、６−フルオロキノロン化合物の一般的な構造を示し；
図１Ｃは、６−フルオロキノロンであるシプロフロキサシンの構造を示し；
図２Ａ−２Ｄは、本発明での使用に適当な、他の６−フルオロキノロンを示し；
図３は、シプロフロキサシンのアミノ酸アミドの製造のための一般的な反応スキームであり；
図４Ａ−４Ｄは、シプロフロキサシン−グリシン(図４Ａ)、シプロフロキサシン−リジン(図４Ｂ)、シプロフロキサシン−トレオニン(図４Ｃ)およびシプロフロキサシン−ロイシン(図４Ｄ)を含め、本発明を支持して製造した、例示的なシプロフロキサシン−アミノ酸のコンジュゲートを示し；
図５Ａ−５Ｂは、α−アミノカプロイルシプロフロキサシン(図５Ａ)およびε−アミノカプロイルシプロフロキサシン(図５Ｂ)の構造を示し；
図６は、イオングラジエントに対してシプロフロキサシン−アミノ酸のコンジュゲートをリポソームに充填する際のイオン化事象を説明し；そして
図７は、リポソームに封じ込めたグリシニル−シプロフロキサシン(■)、リポソームに封じ込めたシプロフロキサシン(●)、並びに遊離グリシニル−シプロフロキサシン(◇)および遊離シプロフロキサシン(▲)をラットに投薬した後で血漿中に残っている薬物のパーセンテージを示すプロットである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
サイズ分けした後、リポソームの外部媒体を処理して、典型的には、より低い内側／より高い外側の濃度グラジエントである、リポソーム膜を介してのイオングラジエントを製造する。これは、様々な方法で、例えば、（ｉ）外部媒体を希釈すること、（ii）望ましい最終媒体に対する透析、（iii）例えば、望ましい媒体に対して、セファデックスＧ−５０を使用する、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、または（iv）望ましい最終媒体中でのペレット化リポソームの高速遠心分離および再懸濁により行うことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
pＨグラジエントを作り出すための最も簡単な方法では、サイズ分けした水和リポソームが選択された内部媒体pＨを有する。リポソームの懸濁液は、望ましい最終pＨに達するまで滴定するか、または上のように処理して、外部相の緩衝液を望ましい外部pＨを有する緩衝液と交換する。例えば、元の媒体は、選択された緩衝液、例えば、グルタミン酸またはリン酸緩衝液中で５.５のpＨを有するのがよく、最終外部媒体は、同じまたは異なった緩衝液中で８.５のpＨを有するのがよい。内部および外部媒体は、例えば、緩衝液、塩、またはスクロースのような低分子量の溶質の濃度の適当な調節により、ほぼ同じ浸透圧を含むよう選択するのが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
Ｃ．リポソーム充填
上のように形成したリポソームは、本発明のシプロフロキサシン−アミノ酸の化合物を充填する際に使用する。この方法では、化合物をpＨグラジエントリポソームの懸濁液に加えて、その懸濁液を、外部媒体からリポソームへの化合物の通行を可能とするのに有効な条件下に処理する。薬物充填に適当なインキュベーション条件は、（ｉ）帯電していない形態での誘導体化化合物のリポソームへの拡散を可能とする、および（ii）好ましくは、高い薬物充填濃度、例えば、封入した５０−２００mＭの薬物をもたらすという条件である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
外部リポソーム環境、例えば、リポソーム懸濁液媒体またはバルク相媒体では、薬物コンジュゲート(Ｑ−ＮＨ２と称する)は、そのプロトン化アミノ形態で平衡状態にあり、その平衡バランスは、外部pＨの選択によるものである。典型的には、内部pＨは４.５−７.５であって、典型的には、６.５−９.５である外部pＨより約２pＨ単位低い。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
あるいはまた、薬物充填が、外部媒体の遊離薬物を実質的に取り除くのに有効でないのならば、リポソーム懸濁液を薬物充填後に処理して、封入されていない薬物を除去するのがよい。遊離薬物は、例えば、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、透析、または遠心分離により除去することができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
図面において見られるように、リポソームに封じ込めたグリシニル−シプロフロキサシン(■)を投薬した後で血漿中に残っている薬物のパーセンテージは、リポソームに封じ込めたシプロフロキサシン(●)を投薬した後での血漿中の薬物のパーセンテージより顕著に大きい。２４時間後、リポソームに封じ込めたグリシニル−シプロフロキサシンとして投与した場合には、３０％以上の薬物用量が血液中に残っている。これとは対照的に、リポソームに封じ込めたシプロフロキサシンに関しては、４時間後、ほとんど全ての薬物が血液から一掃された。遊離グリシニル−シプロフロキサシン(◇)および遊離シプロフロキサシン(▲)は両方とも、１時間未満で血液から一掃された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
シプロフロキサシン−アミドをトリフルオロ酢酸で脱保護した後、生成物の物理的および化学的性質に適当な方法により単離した。例えば、水性懸濁液のpＨをpＨ ７に調節することにより、Ｌ−トレオニン−シプロフロキサシンを回収して、結晶性コンジュゲートの分離を引き起こす。pＨ ７−８の水溶液から１−ブタノールで抽出し、続いて、メタノールから再結晶化させることにより、Ｌ−ロイシン−シプロフロキサシンのコンジュゲートを回収した。リンタングステン酸および水酸化バリウムでの処理により、Ｌ−ロイシン−シプロフロキサシンの誘導体をリンタングステン酸に転換した後、希硫酸での処理により、その硫酸塩に転換した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、キノロン抗生物質化合物の一般的な構造を示す。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、６−フルオロキノロン化合物の一般的な構造を示す。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、６−フルオロキノロンであるシプロフロキサシンの構造を示す。
【図２】  図２Ａ−２Ｄは、本発明での使用に適当な、他の６−フルオロキノロンを示す。
【図３】  図３は、シプロフロキサシンのアミノ酸アミドの製造のための一般的な反応スキームである。
【図４】  図４Ａ−４Ｄは、シプロフロキサシン−グリシン(図４Ａ)、シプロフロキサシン−リジン(図４Ｂ)、シプロフロキサシン−トレオニン(図４Ｃ)およびシプロフロキサシン−ロイシン(図４Ｄ)を含め、本発明を支持して製造した、例示的なシプロフロキサシン−アミノ酸のコンジュゲートを示す。
【図５】  図５Ａ−５Ｂは、α−アミノカプロイルシプロフロキサシン(図５Ａ)およびε−アミノカプロイルシプロフロキサシン(図５Ｂ)の構造を示す。
【図６】  図６は、シプロフロキサシン−アミノ酸のコンジュゲートをイオングラジエントに対してリポソームに充填する際のイオン化事象を説明する。
【図７】  図７は、リポソームに封じ込めたグリシニル−シプロフロキサシン(■)、リポソームに封じ込めたシプロフロキサシン(●)、並びに遊離グリシニル−シプロフロキサシン(◇)および遊離シプロフロキサシン(▲)をラットに投薬した後で血漿中に残っている薬物のパーセンテージを示すプロットである。