【手続補正書】
【提出日】平成17年7月22日(2005.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  立体―または位置―選択性が改良された特性を有するヒドロラーゼ変異体の調製並びに同定方法であって、
ａ）出発ヒドロラーゼ遺伝子を、修飾ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって変異誘発させ、但し、増殖させたＤＮＡ中の変異割合および総変異数がＭｇ2+、Ｍｎ2+およびデオキシヌクレオチド類の濃度を調節することによりおよびサイクル数を調節することにより調節されるものである；および／または、
ｂ）一つもしくはそれ以上の出発ヒドロラーゼ遺伝子、一つもしくはそれ以上の、段階ａ）に従って変異させたヒドロラーゼ遺伝子、または、一つもしくはそれ以上の出発ヒドロラーゼ遺伝子と一つもしくはそれ以上の、段階ａ）に従って変異させたヒドロラーゼ遺伝子との混合物を、酵素的に該遺伝子をフラグメント化して変異誘発させ、次いで、生成した各フラグメントを酵素的に再集合させて完全組換え体ヒドロラーゼ遺伝子とし；
ｃ）段階ａ）または段階ｂ）に従って得られた変異ヒドロラーゼ遺伝子を、宿主生物体中に形質転換させ；さらに、
ｄ）特性を改良した、段階ｃ）で得られた形質転換体により発現されたヒドロラーゼ変異体を試験方法で同定する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】  変異させるヒドロラーゼ遺伝子１個当たり１−２塩基置換の平均変異割合を、段階ａ）のＰＣＲにおいて、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+およびデオキシヌクレオチド類の濃度を調節することにより調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  請求項１に従い先立って実施されるＰＣＲで変異誘発させたヒドロラーゼ遺伝子を、段階ａ）において出発ヒドロラーゼ遺伝子として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  段階ｂ）におけるヒドロラーゼ遺伝子の酵素的フラグメント化を、デオキシリボヌクレアーゼを用いて実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】  段階ｂ）における各フラグメントの再集合を、温度パラメーターおよびサイクル周期が調節される温度サイクルを用いる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの手段により酵素的に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  変異割合を、段階ｂ）における酵素的再集合中、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+およびデオキシヌクレオチド類の濃度を調節することにより調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】  完全に再結合されたヒドロラーゼ遺伝子を、再集合反応完了後段階ｂ）におけるポリメラーゼ連鎖反応により増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】  請求項１または２に従って段階ａ）で得た修飾ヒドロラーゼ遺伝子、または、請求項３に従って変異誘発させた数種のヒドロラーゼ遺伝子、のいずれかを、段階ｂ）におけるフラグメント化および再集合に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  合成的に調製した遺伝子フラグメントを、段階ｂ）における再集合に付加的に使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】  互いに少なくとも６０％の相同性ある配列を有する他の生物体由来のヒドロラーゼ遺伝子フラグメントを、段階ｂ）における再集合に使用し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】  ヒドロラーゼ変異体がリパーゼまたはエステラーゼ変異体であり、マグネシウムイオンの濃度が１．５ないし８．０ｍＭ、好ましくは５．８ないし６．４ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が０．０ないし３．０ｍＭ、好ましくは＜０．３ｍＭである、請求項２または６に記載の方法。
【請求項１２】  ヒドロラーゼ変異体がリパーゼまたはエステラーゼ変異体であり、デオキシヌクレオチドトリホスフェート類の濃度が０．０５ないし１．０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭである、請求項２または６に記載の方法。
【請求項１３】  段階ｄ）におけるヒドロラーゼ変異体の立体―または位置選択性の試験のために、触媒による開裂があると分光測定的に測定される吸収または放射の変化を生じる発色団基を有する試験基質を提供し、そして、別の試験容器中で、等量のヒドロラーゼ変異体を試験基質の純粋な立体―または位置異性体に加え、さらに、得られた直線的当初反応速度の比率から立体―または位置選択性を測定し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】  カルボン酸エステルまたはカルボン酸アミド結合を介して結合している、ＵＶ／ＶＩＳ−活性または蛍光―活性分子基を有する化合物の立体―または位置異性体を試験基質として用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】  該ＵＶ／ＶＩＳ−活性分子基がｐ−ニトロフェニル残基である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  段階ｄ）における立体―または位置選択性試験を遊離脂肪酸またはコハク酸濃度の時間的変化の測定により遂行し、別の容器中で対応する立体―または位置異性カルボン酸エステルまたはアミドをヒドロラーゼ変異体の手段により加水分解して遊離脂肪酸またはコハク酸を生成させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】  段階ｄ）における立体―または位置選択性試験を放射能測定により遂行し、ヒドロラーゼ変異体を、一つの官能性基において異なる放射能標識を有する立体―または位置異性体と反応させ、そして、立体―または位置異性体の混合物を支持体上に固定させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】  支持体―結合異性体混合物のうちの一種の立体―または位置異性体が放射性同位元素3Ｈで標識されており、他の立体―または位置異性体が放射性同位元素14Ｃで標識されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】  段階ｄ）における立体選択性試験を、試験反応の反応生成物および排出物のキャピラリー―電子泳動測定により遂行し、立体異性反応生成物および排出物の分離をキラル修飾したキャピラリー中で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】  数種の反応を複数のマイクロタイタープレート内で並行的に遂行させる、請求項１３ないし１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】  変化したアミノ酸をコードするコドンの位置を、段階ｄ）で同定した改良特性の変異体中での配列決定により決定し、続いてこの位置の全ての可能性あるコドンを有するヒドロラーゼ遺伝子の１セットを部位―指向性飽和変異誘発の手段により生成させ、そして、このようにして得た変異ヒドロラーゼ遺伝子をさらに請求項１の段階ｃ）および段階ｄ）と同様に処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】  変化したアミノ酸をコードするコドンの位置決定を、ＤＮＡ配列決定により遂行する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  請求項１ないし２２のいずれか１またはそれ以上に記載の方法により取得し得るヒドロラーゼ変異体。
【請求項２４】  リパーゼ変異体である、請求項２３に記載のヒドロラーゼ変異体。
【請求項２５】  エステラーゼ変異体である、請求項２３に記載のヒドロラーゼ変異体。
【請求項２６】  Ｐ．エルギノーザ株由来の出発リパーゼのリパーゼ変異体である、請求項２４に記載のヒドロラーゼ変異体。
【請求項２７】  形質転換体Ｐ１Ｂ０１−Ｅ４（ＤＳＭ１１６５８）、Ｐ２Ｂ０８−Ｈ３（ＤＳＭ１１６５９）、Ｐ３Ｂ１３−Ｄ１０（ＤＳＭ１１６６０）、Ｐ４Ｂ０４−Ｈ３（ＤＳＭ１２３２２）、Ｐ５Ｂ１４−Ｃ１１（ＤＳＭ１２３２０）またはＰ４ＢＳＦ０３−Ｇ１０（ＤＳＭ１２３２１）からの発現により取得し得る、請求項２６に記載のヒドロラーゼ変異体。
【請求項２８】  配列番号４、６、８、１２、１４または１８に示す成熟たんぱく質のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のヒドロラーゼ変異体。
【請求項２９】  請求項２３ないし２８のいずれか１またはそれ以上に記載のヒドロラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３０】  配列番号３、５、７、１１、１３、１５または１７に示すＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２９に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３１】  請求項２９または３０に記載のＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
【請求項３２】  請求項２９または３０に記載のＤＮＡ配列および／または請求項３１に記載のベクターを含んでなる形質転換体。
【請求項３３】  形質転換体Ｐ１Ｂ０１−Ｅ４（ＤＳＭ１１６５８）、Ｐ２Ｂ０８−Ｈ３（ＤＳＭ１１６５９）、Ｐ３Ｂ１３−Ｄ１０（ＤＳＭ１１６６０）、Ｐ４Ｂ０４−Ｈ３（ＤＳＭ１２３２２）、Ｐ５Ｂ１４−Ｃ１１（ＤＳＭ１２３２０）またはＰ４ＢＳＦ０３−Ｇ１０（ＤＳＭ１２３２１）である、請求項３２に記載の形質転換体。
【請求項３４】  請求項３２または３３に記載の形質転換体を培養することを含む、特性を改良したヒドロラーゼ変異体の製法。
【請求項３５】  別の試験容器中で、等量の触媒を、触媒による開裂があると分光測定的に測定され得る吸収または放射の変化を生じる発色団基を有する試験基質、および、試験基質の純粋の立体―または位置異性体に加え、さらに、得られた直線的当初反応速度の比率から立体―または位置選択性を測定する、触媒の立体―または位置選択性試験方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（発明の記述）
本発明は
（１）立体―または位置―選択性、触媒活性または安定性が改良された特性を有するヒドロラーゼ変異体の調製並びに同定方法であって、
ａ）出発ヒドロラーゼ遺伝子を、修飾ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって変異誘発させ、但し、増殖させたＤＮＡ中の変異割合および総変異数がＭｇ2+、Ｍｎ2+およびデオキシヌクレオチド類の濃度を調節することによりおよびサイクル数を調節することにより調節されるものである；および／または、
ｂ）一つもしくはそれ以上の出発ヒドロラーゼ遺伝子、一つもしくはそれ以上の、段階ａ）に従って変異させたヒドロラーゼ遺伝子、または、一つもしくはそれ以上の出発ヒドロラーゼ遺伝子と一つもしくはそれ以上の、段階ａ）に従って変異させたヒドロラーゼ遺伝子との混合物を、酵素的に該遺伝子をフラグメント化して変異誘発させ、次いで、生成した各フラグメントを酵素的に再集合させて完全組換え体ヒドロラーゼ遺伝子とし；
ｃ）段階ａ）または段階ｂ）に従って得られた変異ヒドロラーゼ遺伝子を、宿主生物体中に形質転換させ；さらに、
ｄ）特性を改良した、段階ｃ）で得られた形質転換体により発現されたヒドロラーゼ変異体を試験方法で同定する、
ことを特徴とする方法；
（２）（１）で定義する方法で取得し得る、ヒドロラーゼ変異体；
（３）（２）で定義するヒドロラーゼ変異体をコードする、ＤＮＡ配列；
（４）（３）で定義するＤＮＡ配列からなる、ベクター；
（５）（３）で定義するＤＮＡ配列および／または（４）で定義するベクターを含んでなる、形質転換体；
（６）（５）の形質転換体を培養することを含んでなる、最適化した特性を有するヒドロラーゼ変異体の調製方法；および
（７）別の試験容器中、等量の触媒を、触媒による開裂があると分光測定的に測定される吸収または放射の変化を生じる発色団基を有する試験基質および試験基質の純粋な立体−または位置異性体に加え、得られた直線的当初反応速度の比率から立体−または位置異性体を測定し得る、立体−または位置選択性について触媒を試験する方法。
新たなバイオ触媒の調製は、たいてい、生物体由来のリパーゼまたはエステラーゼ遺伝子の単離からはじまる。これは、リパーゼまたはエステラーゼ遺伝子を保持するものであれば、微生物、植物、および動物などどんな生物体のものでもよい。これらの遺伝子の単離は、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York）で知られている方法により、効果的に実施できる。通常、ゲノムＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼを使用して断片化し、得られた各遺伝子断片を宿主生物体（例えば大腸菌）中でクローン化する。次いで、リパーゼまたはエステラーゼ遺伝子のセグメントと相同する配列のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリッド化実験および続いての単離により、遺伝子ライブラリー内で遺伝子を同定する。