【手続補正書】
【提出日】平成18年10月6日(2006.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  各融合タンパク質のライブラリーであって、
各融合タンパク質が、
ａ）自己蛍光タンパク質、
ｂ）ペプチド、および
ｃ）該ペプチドと自己蛍光タンパク質の少なくとも一部との間の少なくとも一つの柔軟性リンカー、
を含む、ライブラリー。
【請求項２】  柔軟性リンカーが、自己蛍光タンパク質のＮ末端に融合した、請求項１記載の融合タンパク質のライブラリー。
【請求項３】  柔軟性リンカーが、自己蛍光タンパク質のＣ末端に融合した、請求項１記載の融合タンパク質のライブラリー。
【請求項４】  ペプチドと少なくとも一つの柔軟性リンカーが、自己蛍光タンパク質のループ構造中に挿入される、請求項１記載の融合タンパク質のライブラリー。
【請求項５】  第二リンカーを含み、これによって柔軟性リンカーの各々が、該ペプチドと該自己蛍光タンパク質の間に存在する、請求項４に記載の融合タンパク質のライブラリー。
【請求項６】  ペプチドがランダム・ペプチドを含む、請求項１、２、３、４および５のいずれかに記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項７】  １以上の柔軟性リンカーが−(ｇｌｙ)ｎ−（ｎ＞２）を含む、請求項１、２、３、４、５および６のいずれかに記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項８】  ペプチドが提示構造を含む、請求項１、２、３、４、５、６および７のいずれかに記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項９】  提示構造が、二量化配列、ミニボディ構造、βターン上のループまたはコイルドコイル構造、ジンクフィンガードメイン、システイン結合（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状ペプチド、βループ構造、ヘリックスバレルまたはヘリックス束およびロイシンジッパーモチーフから選択される、請求項８記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１０】  自己蛍光タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８および９のいずれかに記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１１】  自己蛍光タンパク質が、グリーンタンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１−１０のいずれかに記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１２】  ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ペプチドが該ＧＦＰのアミノ酸１３０から１３５を含むループに挿入される、請求項１１記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１３】  ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ペプチドが該ＧＦＰのアミノ酸１５４から１５９を含むループに挿入される、請求項１１記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１４】  ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ペプチドが該ＧＦＰのアミノ酸１７２から１７５を含むループに挿入される、請求項１１の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１５】  ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ペプチドが該ＧＦＰのアミノ酸１８８から１９３を含むループに挿入される、請求項１１記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１６】  ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ペプチドが該ＧＦＰのアミノ酸２０８から２１６を含むループに挿入される、請求項１１記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１７】  ＧＦＰがRenilla種に由来する、請求項１１記載の融合タンパク質ライブラリー。
【請求項１８】  スキャフォルドがβ−ラクタマーゼである、請求項１−１７いずれかに記載の融合タンパク質のライブラリーをコードしている融合核酸のライブラリー。
【請求項１９】  請求項１８記載の融合核酸を含むベクターのライブラリー。
【請求項２０】  ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１９記載のベクターのライブラリー。
【請求項２１】  請求項１８の融合核酸を含む宿主細胞のライブラリー。
【請求項２２】  特定細胞の表現型を付与する生物活性ペプチドについてのスクリーニング法であって、
下記：
ａ）請求項１８の融合核酸のライブラリーの核酸を含有する各細胞を、該核酸を発現する条件下で提供すること、
ｂ）該細胞を同定し得る表現型を有する細胞についてスクリーニングすること、ここで該表現型は核酸の発現によって生じる、
を含む方法。
【請求項２３】  提供される細胞が、請求項１９または２０のベクターライブラリーによって該細胞を形質転換することによって達成される、請求項２２記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は検出可能タンパク質である。「検出可能タンパク質」または「検出タンパク質」（検出可能遺伝子または検出遺伝子によりコードされる）は、直接ラベルとして使用できるタンパク質である。すなわち、このタンパク質はさらなる操作や構造体なしに検出可能（好ましくは、検出可能タンパク質を含む細胞が検出可能）である。本明細書に概記するように、スクリーニングの好ましい実施態様では、細胞選別（例えば、ＦＡＣＳによる）を用いてスキャフォルド（およびペプチドライブラリー）発現を検出する。つまり、この実施態様において、レポーター遺伝子自体のタンパク質産物が、検出可能遺伝子を発現している細胞を識別するのに役立つ。この実施態様において、適当な検出可能遺伝子は、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本分野では種々の自己蛍光タンパク質が知られている。このものはAequoreaおよびその変異型に由来するグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を基とする。それには、限定でないが、次のものがある。ＧＦＰ(Chalfie, et al.,“Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression.”Science 263(5148):802-805994));、増強ＧＦＰ（EGFP;Clontech-Genbank Accession Number U55762))、ブルー蛍光タンパク質（BFP;Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneuve Bivd.West,8th Floor,Montreal(Quebec)Canada H3H 1J9; Stauber,R.H.Biotechniques 24(3):462-471(1998); Heim,R.and Tsien,R.Y.Curr.Biol.6:178-182(1996))、増強イエロー蛍光タンパク質（EYFP;Clontech Laboratories,Inc.,1020 East Meadow Circle,Palo Alto,CA94303)。さらに、最近、Renilla種由来の自己蛍光タンパク質が報告されている。参照、WO92/15673; WO95/07463; WO98/14605; WO98/26277; WO99/49019; U.S.特許 5,292,658; U.S 特許 5,418,155; U.S.特許 5,683,888; U.S.特許 5,741,668; U.S.特許 5,777,079;U.S.特許 5,804,387; U.S.特許 5,874,304; U.S.特許 5,876,995; and U.S.特許 5,925,558;（出典明示により本明細書の一部とする。）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
好ましい実施態様において、ペプチドはＧＦＰ中に、１以上のＧＦＰ残基を欠失して、挿入する。すなわち、ランダム・ペプチド（およびリンカーを含む融合パートナー）が１以上の残基に置換する。一般的に、リンカーを用いたとき、リンカーはＧＦＰに直接結合する。これは、一般的にループの先端でＧＦＰ残基に置換するリンカー残基である。一般的に、残基が置換されるとき、ＧＦＰの１〜５残基が欠失され、１から５のいずれのアミノ酸の欠失も可能である。特に好ましい欠失は下記する。ＧＦＰ構造については、図１および２を参照。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ループ中の好ましい挿入点には、限定でないが、ループ１（アミノ酸130-135）、ループ２（アミノ酸154-159）、ループ３（アミノ酸172-175）、ループ４（アミノ酸188-193）、ループ５（アミノ酸208-216）がある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
好ましい実施態様において、ペプチド（適用できれば、融合パートナーを含む）を一時にスキャフォルドの１以上のループに挿入する。例えば、ＧＦＰのループ２および４の両方にペプチド付加すると、ライブラリーの複合性を増大し得るが、タンパク質の同じ表面にこれらのループを提示することができる。同様に、ペプチドを１以上のループに加えること、および他の融合パートナーを標的配列などの別のループに加えることも可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は間接的に検出可能タンパク質である。レポータータンパク質として、間接的に検出可能タンパク質を含有する細胞は、含有していない細胞と識別できる。しかし、これは２次的事象の結果である。例えば、好ましい実施態様において、色素形成、特に蛍光形成の基質に作用する酵素を含む「酵素的に検出可能」スキャフォルドを使用し、蛍光をつくる。酵素は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼなどである。あるいは、間接的に検出可能タンパク質は、スキャフォルドにより活性化され得る細胞中の組換え構造体を必要とする。例えば、自己蛍光タンパク質に結合のプロモーターに結合するスキャフォルド転写因子またはインデューサーであって、自己蛍光タンパク質の転写が起きる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ＧＦＰについて述べたように、１以上のループ残基を置換するか、あるいは２つの残基間に挿入できる一つの実施態様において、Ｉ８４、Ｄ８５、Ｅ８９は、各側鎖がβ−ラクタマーゼ構造の残りと相互作用をするようなので、ライブラリー中に固定される。なお、これは必要ではない。Ｑ８８も最適に固定される。Ａ８６およびＧ８７は、例えば、ランダム残基またはリンカー残基にはさまれたランダム残基で置換できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
他の好ましい実施態様において、ランダム残基を代替のループ部位中に挿入する。さらに、リンカーなどの融合パートナーを適宜用い得る。好ましい実施態様において、ランダム挿入のいずれかの側に少なくとも１つのグリシン・リンカーを用いると、バックボーンおよびループのいくつかの側鎖の比較的な不動性によって、高率のβ−ラクタマーゼランダムが挿入され、活性酵素中に折り畳まれる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質はβ−ガラクトシダーゼである（Alam and Cook 前掲、Bronstein et al.,前掲）。β−ガラクトシダーゼは、E.coli 由来のlacＺ遺伝子にコードされ、最も多能な遺伝子レポーターであり、インヒドロとインビボの両方で適用できる。E.coli lacＺ遺伝子に加えて、lacＺ遺伝子は様々な種からクローンされており、ヌクレオチド配列が利用できる（例えば、参照、GenBank accession  numberJ01636,AB025433,AF073995,U62625,M57579）。この酵素は、いくつかのβ−ガラクトシドの加水分解を触媒する（例えば、Young et al.,前掲）、この適用は、例えば、Ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いる色素計量検定法、インドールの化学ルミネッセンスに基づく化学ルミネッセンス検定法（Arakawa et al.,J.Niolumin.Chemilumin.13(6):349-54(1998)）、例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド（ＭＵＧ）およびその誘導体である６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシドなどを用いるフルオロ計量検定法［DiFMUG; Gee et al.,Anal.Biochem.273(1):41-8(1999)]でなされる。さらに、化学ルミネッセンス１，２−ジオキセタン基質の開発は、酵素活性の検出感度を非常に改善した。ルミノ計量を用いて、化学ルミネッセンス信号を検出すると、この検出法は色素計量検定法より５万倍も感度が高い。真核細胞β−ガラクトシドによる内因性酵素活性を最小化する条件を用いると、感度をさらに上昇し得る（Young et al.,前掲）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
好ましい態様において、スキャフォルド・タンパク質とランダム・ペプチドライブラリーを含む融合タンパク質は、生体活性であって、例えば酵素活性を有する。しかし、本明細書で概説のように、融合タンパク質はこのような生体活性機能を示す必要は無い。融合タンパク質の好ましい特性は、しかし、可能性のある結合パートナーにランダム・ペプチド配列を提示することである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
ペプチドの細胞内異化作用は、小ペプチドの明確な安定状態レベルを妨げ得る一つの限定因子である。アミノペプチダーゼ[Lee and Goldberg, Biopolymers 37:281-92(1992)]のようなペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼおよびプロテアーゼは、更に下に概説のように、細胞内ペプチドの分解に関与し得る。このように、直鎖状または伸張ペプチドは、その細胞内発現後に容易に分解され得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
オリゴヌクレオチド合成によりコードされる任意のライブラリーにおいて、ペプチド構造に最後に包含されるコドンを完全に抑制することができないことを理解することは重要である。これは、コドンコード停止シグナルの場合に、特に当て嵌まる（ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧ）。ランダム領域としてのＮＮＮでの合成において、３／６４、または４.６９％の、コドンが停止コドンであるチャンスがある。したがって、１０残基のペプチドにおいて、４６.７％のペプチドが早期に停止する許容できない高い見こみがある。遊離ペプチド構造に関して、これは恐らく問題ではない。しかし、本明細書で構想しているようなより大きな構造に関して、このような停止によりペプチド発現が生じなくなる。これを解消するために、ランダム残基をＮＮＫ（Ｋ＝ＴまたはＧ）としてコードする。これは、全ての可能性のあるアミノ酸をコードすることが可能であるが（その相対的表示を僅かに変える）、二つの停止コドン残基ＴＡＡおよびＴＧＡのコードを有力に防止する。このように、１０アミノ酸ペプチドをコードするライブラリーは、１５.６％の早期停止の可能性を有する。しかし、本発明は、ＧＦＰが蛍光でなく、したがってこれらのペプチドが選択されないため、ループ中で停止ペプチドを含むライブラリーのスクリーニングを可能にする。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
他の好ましい態様において、固定残基の別のセットを使用して、平行コイルドコイルに対する偏向を作成する。二つのらせんをβ−ラクタマーゼ構造に配置した（即ち、末端を合わせる）後、固定位置はａおよびａ'のａｌａ、ｄおよびｄ'のｌｅｕ、ｅおよびｅ'のｇｌｕ、ｇおよびｇ'のｌｙｓ、および残りの位置のランダム残基を含む。この態様において、ｇおよびｇ'はまたランダム化し得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
好ましい態様において、偏向ＳＨ−３ドメイン結合オリゴヌクレオチド／ペプチドを作る。ＳＨ−３ドメインは、標的ＳＨ−３ドメインに高い親和性の短いペプチドとしてコードできる、直鎖状配列における約１０から１２残基の短い標的モチーフ（ＳＨ−３ドメイン結合ペプチド）を認識することが示されている。ＳＨ−３ドメイン結合タンパク質のコンセンサス配列は提案されている。このように、好ましい態様において、オリゴ／ペプチドは以下の偏向を有して作られる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
好ましい態様では、該提示構造はミニボディ構造である。「ミニボディ」は実質的に最小の抗体相補性領域からなる。該ミニボディ提示構造は一般に折り畳まれたタンパク質において三次構造の単一面に沿って提示される２個のランダム化領域を提供する。例えば、Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2):649-59(1994)およびそこで引用されている文献参照、なお、すべて出典明示により本明細書の一部とする。研究者らはこの最小ドメインが溶液中で安定であることを示し、組合せライブラリーにおいてファージ選択系を使用して炎症誘発性サイトカインＩＬ−６にＫｄ＝１０−７といった高い親和性を示すペプチド領域を用いてミニボディを選択している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
このように好適な標的配列としては、限定されるものではないが、発現産物の生物活性を維持しつつ発現産物を、予じめ決定した分子または分子クラスと結合させることができる結合配列（例えば、酵素阻害剤または基質配列を用いてある関連する酵素クラスを標的化する）；それ自体またはともに結合しているタンパク質の選択的分解のシグナルを伝達する配列；ならびに、ペプチドを、ａ）ゴルジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、および細胞膜などの細胞下の位置、およびｂ）分泌シグナルを介する細胞外の位置を含む、細胞の所定の場所へ構成的に局在化させ得るシグナル配列が挙げられる。細胞内部位への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に好ましい。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
好ましい態様において、融合パートナーは、リンカーまたはつなぎ鎖配列を包含する。様々な標的配列（例えば、膜標的配列）と構成成分の他の成分（例えば、ランダムペプチド）の間にあるリンカー配列は、そのペプチドが妨害されていない潜在的標的と相互作用させうるのが望ましい。例えば、有用なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリン・ポリマー[例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを包含し、ｎは少なくとも１の整数である]、グリシン−アラニン・ポリマー、アラニン−セリン・ポリマー、およびシェーカー型カリウムチャンネルのつなぎ鎖などの他の柔軟性リンカー、さらに当業者が認める多様な他の柔軟性リンカーを包含する。グリシンおよびグリシン−セリン・ポリマーは、このアミノ酸の両方が比較的非構造的であり、それ故に成分間の中性的つなぎ鎖として働くことができるので、好適である。グリシン・ポリマーは、グリシンは、アラニンよりもよりphi-psi空間に著しく接近し、長い側鎖を有する残基よりも制限されないために、最も好適である（参照：Shachrage, Rev. Computational Chem.III 73-142(1992)）。第二に、セリンは親水性であり、そのため、球状のグリシン鎖であり得るものを可溶化することが可能である。第三に、同様の鎖は、例えば、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを連接するのに有効であることが示されている。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
好ましい実施態様では、融合核酸および／または生体活性ペプチド(すなわち融合タンパク質)を陽性細胞から単離する。これは多くの方法で行い得る。好ましい実施態様では、上記定義したようなレトロウイルス構築体にまたはレスキュー配列のようなライブラリーの特定要素に共通のＤＮＡ領域に相補的なプライマーを用い、特定のランダム配列を“レスキュー”する。他に、融合タンパク質をレスキュー配列を用い単離する。そのため、例えば、エピトープタグまたは精製配列を含むレスキュー配列を用い、免疫沈降または親和性カラムを使用して融合タンパク質を回収する。ある例では、以下に概説しているように、生体活性ペプチドと標的分子の間に強力な結合相互作用が有意に存在するならば、第一標的分子をも回収される。他に当該ペプチドはマススペクトロメトリーを用い検出され得る。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０７】
塞栓現象は、内皮細胞の細胞表面上のタンパク質分解性酵素を活性化し、それにより血塊を消化し得る活性化酵素を放出することによっても解決され得る。そのため、本発明のライブラリーの内皮細胞への送達が行われ、その後に、既知基質に対する細胞表面におけるタンパク質分解活性をモニターし得る標準的蛍光発生性検定法を行い得る。次いで、生体活性ペプチドは、特定基質に対し特定酵素を活性化するように選択され得る。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
循環細胞の表面で提示されるランダムペプチドをツールとして使用し、器官、組織および細胞特異的ペプチド標的化配列を同定し得る。細胞表面を標的とするライブラリーを発現する動物の血流に導入する任意の細胞が、特定の器官および組織標的化で選択され得る。同定された生体活性ペプチド配列を、抗体、酵素、薬剤、イメージング剤または器官標的化が望ましい物質に結合させ得る。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
【表３６】
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これらの結果によると、挿入体が、テトラペプチドリンカーにおいて複数のグリシンによって挟まれるとき、ループ２−４における指定された挿入部位が、ＧＦＰ蛍光の高いレベルを保持する。ゆえに、１９残基の挿入体は、蛍光の高レベルを保持する。このことは、すべての３のループは、ランダム・ペプチドライブラリーの挿入およびそのスクリーニングを可能とするであろうこと示唆している。そのようなスクリーニングは、バックグラウンドから識別できる蛍光のレベルのみ、またはＦＬ１における１０以上の上昇を要する。