【事件の表示】
　特願２００２−　６０２８２「血管の再生方法、そのための細胞の分離回収方法及び装置」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年９月９日出願公開、特開２００３−２５０８２０〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　この出願（以下、「本願」という。）は、平成１４年３月６日の出願であって、以降の手続の経緯は以下のとおりである。
　
平成１７年３月４日　　　　　手続補正書
平成１９年１２月１２日付け　拒絶理由通知
平成２０年２月１５日　　　　意見書、手続補正書
平成２０年４月２２日付け　　拒絶理由通知
平成２０年６月２０日　　　　意見書、手続補正書
平成２０年８月２７日付け　　拒絶査定
平成２０年１０月１日　　　　審判請求書
平成２０年１０月２９日　　　手続補正書
平成２０年１１月５日　　　　手続補正書（方式）
平成２０年１月９日付け　　　前置審査移管
平成２１年１月２８日付け　　前置報告書
平成２１年１月３０日付け　　前置審査解除
平成２３年２月７日付け　　　審尋
　
　
第２　平成２０年１０月２９日付け手続補正書についての補正の却下の決定
１　本件補正
　平成２０年１０月２９日付けの手続補正（以下、「本件補正」という。）は、本件補正前の特許請求の範囲の請求項１の
　
「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する細胞分離フィルターに通液し、
　該細胞分離フィルターに流体を導入して該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収し、
　回収された血管内皮前駆細胞をさらに細胞外マトリックス上で培養し、
　細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有するアタッチング細胞（attaching細胞）を回収し、
　回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にすることを含む血管再生用細胞の製造方法。」
を
「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）に通液し、
　該細胞分離フィルターに流体を導入して該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収し、
　回収された血管内皮前駆細胞をさらに細胞外マトリックス上で培養し、
　細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有するアタッチング細胞（attaching細胞）を回収し、
　回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にすることを含む血管再生用細胞の製造方法。」
とする補正を含むものである。
　
２　補正の適否
（１）補正の目的の適否
　上記補正は、「細胞分離フィルター」について、「親水化処理した」ものであり且つ「（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）」ものに特定するものである。
　上記補正は、補正前の請求項１に記載された発明と産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であり、補正前の請求項に記載された発明を特定するために必要な事項である「細胞分離フィルター」を特定するものである。
　したがって、上記補正は、平成１８年法律５５号改正附則第３条第１項により、なお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法（以下、「平成１８年改正前特許法」という。）第１７条の２第４項第２号に掲げる事項を目的とするものである。
　
　そこで、補正後の請求項１に記載された発明（以下、「本願補正発明」といい、本件補正後の明細書を「本願補正明細書」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか否か（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項の規定に適合するか否か）、具体的には、本願補正発明が、本願出願前に頒布された刊行物に基づいて当業者が容易に発明をすることができたか否かについて、以下に検討する。
　
（２）刊行物に記載された事項
（ア）刊行物１に記載された事項
　本願の出願前である平成１２年６月１日に頒布された刊行物であるToyoaki Murohara, Hisao Ikeda, Junli Duan, Satoshi Shintani, Ken-ichiro Sasaki, Hiroyuki Eguchi, Ichiro Onitsuka, Kazuo Matsui and Tsutomu Imaizumi，Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization，J. Clin. Invest., 2000年, vol. 105, no. 11, p. 1527-1536（以下、「刊行物１」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
（１ａ）「Isolation of MNCCD34+. MNCs were isolated from umbilical cord blood or adult peripheral blood using the Histopaque-density centrifugation method (15). The MNC layer was collected, washed twice with 1 mM EDTA in PBS, and suspended in degassed PBS with 0.5% BSA and 2 mM EDTA. MNCCD34+ were separated from 1-1.5 × 108 MNCs by a magnetic bead separation method (・・・). In brief, MNCCD34+ were labeled with a hapten-conjugated mAb against human CD34 (・・・), followed by an anti-hapten Ab coupled with microbeads. The bead-positive cells (MNCCD34+) were enriched on positive-selection columns set in a magnetic field. Flow-cytometric analysis of purified cells using a different clone (8G12) of FITC-conjugated anti-CD34 mAb showed that 79% (± 5%) of the selected cells were positive for CD34.」（第１５２８頁左欄第１６〜３１行）
（当審訳：ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞の分離。臍帯血単核細胞は、Histopaque密度遠心分離法を用いて、臍帯血又は成人の末梢血から分離された。臍帯血単核細胞層が集められ、ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄され、０．５％のＢＳＡ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む脱気されたリン酸緩衝液に浮遊させられた。ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞は、磁気ビーズ分離法（・・・）によって１〜１．５×１０８の臍帯血単核細胞から分離された。要約すると、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞は、ハプテン標識されたヒトＣＤ３４（・・・）に対するモノクローナル抗体でラベルされ、マイクロビーズと付着した反ハプテン抗体に追随させた。ビーズ陽性細胞（ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞）は、磁場中で、ビーズ陽性選択カラムの中で豊富化された。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４モノクローナル抗体の異なるクローン（８Ｇ１２）を用いて純化された細胞のフローサイトメトリー法の結果は、選別された細胞の７０％（±５％）がＣＤ３４に陽性であった。）
　
（１ｂ）「Cell culture. The medium used for cell culture experiments was Medium-199 supplemented with 20% FBS, bovine pituitary extract as an EC growth supplement, heparin (100 μg/mL), and antibiotics (・・・). MNCCD34+, MNCCD34-, or total MNCs were cultured on human fibronectin-coated plastic plates (・・・). At days 4, 8, and 12 of culture, medium was replaced. The numbers of spindle-shaped and attaching (AT) cells and cell clusters were counted under a phase-contrast microscope at days 7 and 14 of culture. 」（第１５２８頁左欄第３２〜４３行）
（当審訳：細胞培養。細胞培養実験の培地として、２０％のウシ胎児血清、内皮細胞成長補助剤としてのウシ下垂体抽出物、ヘパリン（１００μｇ／ｍＬ）、及び抗生物質（・・・）を含むＭｅｄｉｕｍｕ−１９９を用いた。ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞、ＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞、全ての臍帯血単核細胞のそれぞれは、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプラスチックプレート（・・・）上で培養された。培養の４日目、８日目、１２日目に培地が交換された。紡錘形のアタッチング（ＡＴ）細胞及び細胞集団の数が、培養７日目と１４日目に位相差顕微鏡で計測された。）
　
（１ｃ）「Flow cytometry. Cord blood-derived AT cells at day 7 of culture (n = 8) were subjected to flow cytometric analysis to examine surface expression of KDR, VE-cadherin, CD31, CD34, and CD45. AT cells were isolated from culture plates at day 7 of culture by incubation using PBS with 1 mM EDTA (pH 7.4) for 15 minutes at 37℃. 」（第１５２８頁右欄第２４〜３０行）
（当審訳：フローサイトメトリー法。培養から７日目の臍帯血由来のＡＴ細胞（ｎ＝８）は、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、ＣＤ３４とＣＤ４５の表面上の発現を調べるために、フローサイトメトリー解析の対象となった。ＡＴ細胞は、３７℃で１５分間、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でインキュベートすることにより、７日目の培養プレートから分離された。）
　
（１ｄ）「In vitro angiogenesis model: endothelial network formation in basement matrix gel. At day 7 of culture, cord blood-derived AT cells were isolated from culture plates by incubating them with 1 mM EDTA in PBS for 15 minutes at 37℃.Cells were labeled with PKH2-GL and cocultured with unlabeled HUVECs on basement membrane matrix gel (・・・). At day 3 to day 7 of culture, formation of angiogenesis-like EC networks and incorporation of the fluorescent-labeled AT cells into the EC networks were examined under a fluorescence microscope.
In vivo angiogenesis model: unilateral hindlimb ischemia in immunodeficient nude rats. A rat model of surgically induced hindlimb ischemia was employed to determine whether transplanted cord blood?derived AT cells participated in postnatal neovascularization in vivo.・・・Rats were then transplanted with fluorescence-labeled AT cells (3 × 105 cells/rat) intramuscularly in the ischemic thigh area using a 26-gauge needle. .・・・」（第１５２９頁左欄第２２〜右欄第１０行）
（当審訳：ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの血管形成モデル：血管内皮のネットワークの基底マトリックスゲル状での形成。培養７日目の臍帯血由来のＡＴ細胞は、培養プレートから、ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡで、３７℃、１５分間、インキュベートすることにより分離した。細胞は、ＰＫＨ２−ＧＬでラベルされ、基底膜上（・・・）で、ラベルされていないヒト臍帯静脈内皮細胞と共培養された。培養３日目から７日目に、血管用の内皮細胞のネットワークの形成と蛍光ラベルされたＡＴ細胞の内皮細胞ネットワークへの導入が、蛍光顕微鏡下で観察された。
ｉｎ　ｖｉｖｏでの血管形成モデル：免疫不全ヌードラットの片方の後ろ足の虚血。外科的に片方の後ろ足に虚血を生じさせたラットのモデルは、移植された臍帯血から分離されたＡＴ細胞が生後の血管新生にｉｎ　ｖｉｖｏで関与するかを判断するために用いられた。・・・２６のゲージ針を用いて、ラットの虚血された部分の筋肉内に、蛍光ラベルされたＡＴ細胞（３×１０５ｃｅｌｌ／ｒａｔ）が移植された。・・・） 
　
（１ｅ）「MNCCD34+ developed into AT cells and cord-like structures. Because CD34 is expressed on both hematopoietic and endothelial cell lineages, we tested whether selected MNCCD34+ could give rise to AT cells. MNCCD34+ were separated from cord blood MNC by a magnetic-bead method. Flow cytometric analysis revealed that 79% (± 5%) of the selected MNCCD34+ expressed CD34 (n = 12), whereas less than 0.5% of the remaining cells (MNCCD34-) expressed CD34. In the first set of experiments, we labeled MNCCD34- with a green fluorescent marker and cultured them on fibronectin. From the labeled MNCCD34- alone, most of the cells did not attach to the plates (Figure 3a) when examined for up to 4 weeks. We next labeled MNCCD34+ with the fluorescence marker. From labeled MNCCD34+ alone, limited numbers of cell clusters appeared and AT cells were observed only sporadically (Figure 3b). When fluorescence-labeled MNCCD34- were cocultured with unlabeled MNCCD34+, AT cells and cord-like structures were mostly negative for the fluorescence (Figure 3c). However, labeled MNCCD34- could be identified at the center of the cell clusters (Figure 3c). Conversely, when MNCCD34+ were fluorescence-labeled and cocultured with unlabeled MNCCD34-, AT cells, cell clusters, and cord-like structures were fluorescence positive. These fluorescence-trace experiments suggest that a population of MNCCD34+ gave rise predominantly to AT cells, cell clusters, and cord-like structures. Cell clusters comprised round cells at the center and spindle-shaped AT cells at the periphery (Figure 3,c-e). ・・・Interestingly, coculture of MNCCD34+ with MNCCD34- much increased the number of AT cells (threefold) and cell clusters (sixfold), compared with culture of MNCCD34+ alone (Figure 3g), indicating that the development of AT cells seems to require certain interactions between MNCCD34+ and MNCCD34-.」（第１５３１頁左欄第１行〜右欄第７行）
（当審訳：ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞はＡＴ細胞であってコードのような構造に発達した。ＣＤ３４は、造血系及び内皮細胞系の両方の表現を有するものであるため、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞がＡＴ細胞を生じさせるか否かのテストを行った。ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞は、磁気ビーズ法により、臍帯血単核細胞から分離した。フローサイトメトリー法による解析の結果、選択されたＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞の７９％（±５％）がＣＤ３４を発現し、一方、残りの細胞（ＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞）では０．５％未満のものしかＣＤ３４を発現しなかった。最初の一連の実験では、ＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞に緑色の蛍光マーカーをラベルして、フィブロネクチン上で培養した。ラベルされたＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞のみからは、４週間の間観察しても、細胞のほとんどがプレート上に付着しなかった（図３ａ）。次に、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞に蛍光マーカーをラベルした。ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞のみからは、細胞集団が限られた数のみ現れ、ＡＴ細胞も散発的に観察された（図３ｂ）。蛍光ラベルしたＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞をラベルしないＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞と共培養すると、ＡＴ細胞やコードのような構造があるのは、ほとんど蛍光していない部分だった（図３ｃ）。しかし、ラベルしたＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞は、細胞集団の中心部分で識別することができた（図３ｃ）。反対に、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞に蛍光ラベルし、ラベルしないＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞と共培養すると、ＡＴ細胞、細胞集団、及びコードのような構造は蛍光に陽性の部分であった。蛍光による追跡実験は、主として、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞の個体群が、ＡＴ細胞、細胞集団、コードのような構造を起こしたことを示唆するものである（図３ｃ−ｅ）。・・・興味深いことに、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞とＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞との共培養は、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞のみでの培養に比べて、ＡＴ細胞の数（３倍）、細胞集団の数（６倍）を増加させたのであり、ＡＴ細胞の発達にはＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞とＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞との間のある種の相互作用が必要であることを示している。）
　
（１ｆ）「AT cells had multiple endothelial phenotypes. To examine whether AT cells have endothelial phenotypes, AT cells were subjected to immunocytochemistry. AT cells were positively stained ( 98%) for vWF, CD31, and KDR (figures not shown). In addition, more than 95% of the AT cells at day 7 of culture took up DiI-ac-LDL (Figure 4a), one of the characteristic functions of ECs (28).  ・・・These findings suggest that AT cells express several endothelial markers and have endothelial functions, and thus AT cells have endothelial phenotypes.」（第１５３１頁右欄第８〜３２行）
（当審訳：ＡＴ細胞は多数の内皮細胞の表現型を有していた。ＡＴ細胞が内皮細胞の表現型を有するかどうかを調べるため、ＡＴ細胞を免疫科学的な実験の主題とした。ＡＴ細胞は、ｖＷＦ、ＣＤ３１及びＫＤＲに陽性に反応した（９８％以上）（図示せず）。さらに、培養７日目のＡＴ細胞は、内皮細胞の特徴的な機能の１つである、ＤｉＩ標識されたアセチルＬＤＬの取り込み（２８）を行った（図４ａ）。・・・これらの発見は、ＡＴ細胞がいくつかの内皮細胞のマーカーを発現しており、内皮細胞の機能を有しており、したがって、ＡＴ細胞が内皮細胞の表現型を有することを示唆するものである。）
　
（１ｇ）「We further performed flow cytometric analyses of AT cells at day 7 of culture to examine the expression of KDR, VE-cadherin, CD34, and CD31, as markers for endothelial lineage, and CD45 as a common leukocyte antigen. AT cells (n = 8 in cord blood) were stained positive for KDR, VE-cadherin, CD34, and CD31 (Figure 4e), whereas only few AT cells expressed CD45, a common leukocyte antigen (Figure 4e).」（第１５３１頁右欄第３３行〜第１５３２頁左欄第４行）
（当審訳：内皮細胞の系統のマーカーとして、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１の発現、及び、共通の白血球抗原としてのＣＤ４５の発現を調べるために、培養７日目のＡＴ細胞のフローサイトメトリー解析を行った。ＡＴ細胞（臍帯血あたりｎ＝８）は、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１に陽性に発現したが（図４ｅ）、共通の白血球抗原であるＣＤ４５を発現したＡＴ細胞はほとんどなかった。）
　
（１ｈ）「Transplanted cord blood-derived AT cells participated in neovascularization in the ischemic hindlimb of immunodeficient nude rats in vivo. We examined whether transplanted cord blood-derived AT cells participated in postnatal neovascularization in immunodeficient adult animals in vivo. AT cells were isolated at day 7 of culture and were fluorescence labeled. Unilateral hindlimb ischemia was surgically induced in the nude rats. Three days after surgery, rats (n = 8) were injected with fluorescence-labeled cord blood-derived AT cells (3 × 105 cells/animal) in the ischemic thigh skeletal muscles. At day 14 after induction of limb ischemia, frozen tissue sections were prepared from the ischemic tissues. Fluorescence microscopic examination revealed that numerous labeled AT cells were incorporated and arranged into EC capillaries among the preserved skeletal myocytes in the ischemic hindlimbs (Figure 5, c-f). Moreover, transplanted AT cells often formed tubular structures with a round lumen (Figure 5, d and e). ・・・Because cord blood MNC-derived AT cells expressed multiple endothelial lineage markers and functions (NO release and ac-LDL incorporation) and because AT cells participated in neovascular formation both in vitro and in vivo, we defined AT cells as being a major population of EPCs that derived from cord blood.」（第１５３２頁左欄第２２行〜右欄第２０行）
（当審訳：移植された臍帯血から分離されたＡＴ細胞は、生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生に関与した。移植された臍帯血から分離されたＡＴ細胞が免疫不全の成獣の生体内で、生後の血管新生に関与するかどうかを調査した。ＡＴ細胞は、培養７日目に分離され、蛍光標識された。片方の後ろ足の虚血は、ヌードラットに外科手術により生じさせた。手術の３日後に、ラット（ｎ＝８）は、蛍光標識された臍帯血から分離されたＡＴ細胞（３×１０５ｃｅｌｌｓ／ａｎｉｍａｌ）を、虚血している大腿骨格筋に注入された。足の虚血の１４日後に、凍結組織片が虚血組織から調整された。蛍光顕微鏡検査により、虚血している後ろ足の保存された骨格筋中の内皮毛細血管に、多数の標識されたＡＴ細胞が取り込まれ、配列していることが明らかになった（図５ｃ〜ｆ）。さらに、移植されたＡＴ細胞は、円形の内腔を備えた管状構造を形成した（図５ｄ及びｅ）。・・・臍帯血核単細胞から分離したＡＴ細胞は、多数の内皮細胞系統のマーカーと機能（ＮＯの放出及びアセチル化ＬＤＬの取り込み）を表現したものであり、ＡＴ細胞が、生体外及び生体内の両方で、血管新生に関与したものであったので、ＡＴ細胞は臍帯血から分離できる血管内皮前駆細胞の主要な個体群であると定義した。）
　
（イ）刊行物２に記載された事項
　本願の出願前である平成１１年３月２日に頒布された刊行物である特開平１１−５６３５１号公報（以下、「刊行物２」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
（２ａ）「【従来の技術】近年、全血輸血に代わって、全血から赤血球、血小板、白血球を選択的に取り出し、治療に必要な血球成分を輸血する成分輸血が行われるようになった。また最近では、白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、末梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植することが盛んに行われている。そのほとんどの場合、細胞は移植前まで凍結保存されるが、保存スペース、解凍時の破壊赤血球による副作用が問題となるため、通常凍結前に赤血球除去が行われている。従来、血液から治療に必要な血球成分を分離する方法として、比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重遠心法が採用されている。本法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。特開昭６１−８４５７７号公報、特開平２−１３４５６４号公報等で操作の煩雑さを解決すべく、多くの試みがなされているが、比重液を用いるという点では変わらず、抜本的な解決には至っていない。また、ヒドロキシエチルスターチと混和して、赤血球の連銭形成により赤血球を沈降させ、白血球層を分離する方法がある。本法も作業は煩雑であり、分離性能も十分とは言えない。最近では、簡便法として、特開昭５４−１１９０１６号公報、特開昭５７−１４５６６２号公報等で、血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉し、フィルター内に残存した除去対象細胞をリンス液で洗い流した後、フィルターに振動を与えながら回収液をフィルターに通液することにより回収必要細胞を回収するフィルター法が散見されるようになった。」（段落【０００２】）
　
（２ｂ）「【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、簡便な操作で、細胞集団から除去対象細胞を高率に除去するだけでなく、回収必要細胞を高率に回収可能な細胞捕捉・回収方法を提供することにある。」（段落【０００３】）
　
（２ｃ）「【実施例１】
１（当審注：○の中に１を書く。）細胞分離フィルターの作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃｍ2、内容積１１ｃｍ3）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ2のポリエステル不織布２５枚を、第２層目に平均繊維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2のポリエステル不織布１２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細胞分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は０．８１で、充填密度は、第１層目が０．２９ｇ／ｃｍ3、第２層目が０．２２ｇ／ｃｍ3であった。また、該細胞分離フィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該細胞分離フィルターの液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。
２（当審注：○の中に２を書く。）細胞分離操作
１（当審注：○の中に１を書く。）で作製した細胞分離フィルターに、ＣＰＤ加ヒト末梢全血５０ｃｍ3を液体流入口から落差（流速約５ｃｍ3／分）により通液して白血球を捕捉した後、同じく液体流入口からフィルター内に残存する赤血球、血小板を市販の生理食塩水１５ｃｍ3を落差（流速約５ｃｍ3／分）で通液してリンスした。濾過した血液及びフィルター内を通ったリンス液はドレインボトルに回収した。この場合のリンス液移動距離は２．０６ｃｍであった。その後、市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを３％になるように添加した液体２３ｃｍ3を、液体流出口からポンプを用いて１００ｃｍ3／分で通液し、液体流入口から白血球を回収した。本細胞分離操作での白血球捕捉率、白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ９０％、８０％、８５％、８０％であった。尚、細胞数のカウントは、自動血球計数装置（コールター社製ヘマトロジーアナライザー）を用い、回収率、捕捉率、除去率は以下の式で算出した。
回収率（％）＝１００×（回収液中細胞数／元細胞数）
捕捉率（％）＝１００−１００×（ドレイン液中細胞数／元細胞数）
除去率（％）＝１００−１００×（回収液中細胞数／元細胞数）」（段落【０００８】）
　
（２ｄ）「【実施例２】
１（当審注：○の中に１を書く。）細胞分離フィルターの作製
上容器と下容器から成り、組み立てた後の内寸が縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃｍ2、内容積１１ｃｍ3）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ2のポリエステル不織布２５枚を、第２層目に平均繊維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2のマウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定ポリスチレン不織布１２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細胞分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は０．８１で、充填密度は、第１層目が０．２９ｇ／ｃｍ3、第２層目が０．２２ｇ／ｃｍ3であった。尚、マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体（コールター社製）のポリスチレンへ固定は特開平２−２６１８３３号公報で提案されている公知のハロアセトアミド法にて行った。具体的には、活性基にＮ−ヒドロキシメチル−２−ヨードアセトアミド、溶媒にテトラメチレンスルホン、触媒にトリフルオロメタンスルホン酸を用いた。また、特開平２−２６１８３３号公報で提案されている公知のラジオイムノアッセイ法で測定した抗体固定量は１２０ｎｇ／ｃｍ2であった。
２（当審注：○の中に２を書く。）細胞分離操作
血液としてＣＰＤ加臍帯全血５０ｃｍ3、リンス液として生理食塩水１０ｃｍ3を用いた以外は実施例１と同様な操作を行った。尚、この場合のリンス液移動距離は１．３７ｃｍであった。本細胞分離操作でのＣＤ３４陽性細胞捕捉率、ＣＤ３４陽性細胞回収率、赤血球除去率、血小板除去率、ＣＤ３４陰性細胞除去率はそれぞれ９５％、８５％、８５％、８０％、８５％であった。尚、有核細胞数、赤血球数、血小板数は実施例１と同じ自動血球計数装置を、有核細胞中のＣＤ３４陽性細胞数はＦＩＴＣ標識ＣＤ３４抗体を用い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣに展開するフローサイトメトリー法（宮崎、他：日常診療と血液、第５巻２号、２１〜２４ページ、１９９５年）により、フローサイトメーター（コールター社製ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ）を用いて測定した。」（段落【０００９】）
（２ｅ）「【発明の効果】本発明の細胞捕捉・回収方法は、簡便な操作で、細胞集団から除去対象細胞を高率に除去するだけでなく、回収必要細胞を高率に回収できる。」（段落【００１８】）
　
　
（３）刊行物１に記載された発明
　刊行物１の上記摘記事項（１ｈ）には、「移植された臍帯血から分離されたＡＴ細胞は、生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生に関与した」こと、及び「ＡＴ細胞は、培養７日目に分離され」たものであることが記載されているところ、「臍帯血から分離されたＡＴ細胞」について、上記摘記事項（１ａ）には、「臍帯血単核細胞は、Histopaque密度遠心分離法を用いて、臍帯血又は成人の末梢血から分離された」こと、上記摘記事項（１ｂ）には、「・・・全ての臍帯血単核細胞のそれぞれは、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプラスチックプレート（・・・）上で培養された。・・・紡錘形のアタッチング（ＡＴ）細胞及び細胞集団の数が、培養７日目と１４日目に位相差顕微鏡で計測された」ことが記載されている。プラスチックプレートからの培養７日目の「ＡＴ細胞」の分離について、上記摘記事項（１ｃ）及び（１ｄ）には、「１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳでインキュベートする」ことにより分離することが記載されている。
　
　したがって、刊行物１には、
「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞を、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプラスチックプレート上で培養し、７日間培養したＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むＰＢＳでインキュベートすることにより分離して得られた、臍帯血から分離されたＡＴ細胞を、生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生に関与させる」方法の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されているといえる。
　
（４）対比
　本願補正発明と引用発明とを対比すると、本願補正明細書の段落【００１２】の「本発明において「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液」とは、少なくとも血管内皮前駆細胞を含む細胞浮遊液であれば良く、骨髄液、臍帯血（臍帯血管から採血されたものだけでなく、胎盤血管から採血されたものも含む）、末梢血、リンパ液及びこれらに遠心分離等何らかの処理を施したもの、あるいは各種臓器や組織から抽出した細胞を何らかの液体に再浮遊したものなどがあげられる。その中でも、骨髄液、臍帯血、G-CSF動員末梢血は血管内皮前駆細胞を多く含み本発明で好適に用いられる細胞浮遊液である。」の記載からみて、引用発明における「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血」は、本願補正発明の「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液」に相当するといえる。
　
　引用発明における「ヒトフィブロネクチン」は、本願補正明細書の段落【００１０】の「フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどの細胞外マトリックス」の記載からみて、本願補正発明における「細胞外マトリックス」に相当するといえる。
　
　本願補正発明における「アタッチング細胞」について、本願補正明細書の段落【００１０】には「本発明で言うアタッチング細胞（attaching細胞）とは、骨髄、末梢血、臍帯血などの血液中に存在し、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどの細胞外マトリックスをコートした表面で培養した際に付着する細胞を言う。アタッチング細胞（attaching細胞）の大多数は紡錘形の形態を呈している。」と記載されているところ、引用発明における「ＡＴ細胞」も、刊行物１の上記摘記事項（１ｂ）の記載からみて、「紡錘形」のものであり、「細胞外マトリックス」である「フィブロネクチン」に「attacing（付着）」するものであるから、引用発明の「ＡＴ細胞」は、本願補正発明の「アタッチング細胞」と同じものであるといえる。
　
　本願補正発明の「該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収し、回収された血管内皮前駆細胞をさらに細胞外マトリックス上で培養し」における「血管内皮前駆細胞」について、本願補正明細書の段落【００１０】には「本発明で言う血管内皮前駆細胞とは、骨髄、末梢血、臍帯血などの血液中に存在し、細胞表面に少なくともKDR（Kinase Domain-containing Receptor）を発現している細胞を言う。・・・また、アタッチング細胞（attaching細胞）の表面マーカーを解析するとKDR（Kinase Domain-containing Receptor）を発現している細胞が30〜70%程度あり、アタッチング細胞（attaching細胞）中には血管内皮前駆細胞が豊富に含まれている。」と記載されているが、段落【００３０】には、「回収バッグに回収された単核球は、臍帯血中の単核球の８０％であった。回収された単核球を・・・培養した。・・・培養７日目に得られたアタッチング細胞（attaching細胞）は、播種単核球の１０％で、フローサイトメトリー法によるKDR陽性細胞の解析から血管内皮前駆細胞は原料血液の単核球の６％であった。」と記載されていることから、本願補正発明の「該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収し、回収された血管内皮前駆細胞をさらに細胞外マトリックス上で培養し」における「血管内皮前駆細胞」は、「単核球」を含むものであり、培養後に「KDR（Kinase Domain-containing Receptor）を発現している細胞」となる細胞だけでなくそれ以外の細胞も含むものであるといえる。
　一方、引用発明における「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞」も、「単核細胞」すなわち「単核球」を含むものであり、刊行物１の上記摘記事項（１ｂ）からみて、「ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプラスチックプレート上で培養」すると「紡錘形のアタッチング細胞」となる細胞を含むもので、「アタッチング細胞」は、上記摘記事項（１ｆ）及び（１ｇ）の記載からみて「ＫＤＲ」を発現するものであるから、培養後に「KDR（Kinase Domain-containing Receptor）を発現している細胞」となる細胞だけでなくそれ以外の細胞も含むものであるといえる。
　そうすると、引用発明の「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞」と本願補正発明の「血管内皮前駆細胞」とは、培養後に「細胞表面に少なくともKDR（Kinase Domain-containing Receptor）を発現している細胞」となる細胞及びそれ以外の細胞を含むものといえるから、引用発明の「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞」も、本願補正発明の「血管内皮前駆細胞」であるといえる。
　そして、引用発明の「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞」と、本願補正発明の「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）に通液し、該細胞分離フィルターに流体を導入して該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞」とは、処理方法が異なるものの、「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液」を分離処理して回収した「血管内皮前駆細胞」という点で共通するといえる。
　
　引用発明の「ＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むＰＢＳでインキュベートすることにより分離して得られた」ことは、本願補正発明の段落【００２４】の「本発明で言う「細胞外マトリックス上に付着したアタッチング細胞（attaching細胞）を回収すること」とは、細胞分離フィルターで回収された細胞を細胞外マトリックスがコートされた基材に付着した細胞を回収することを言う。より具体的には、例えば、細胞分離フィルターで回収された細胞を細胞培養用培地に浮遊させ、細胞外マトリックスがコートされた基材表面、例えば細胞培養用プラスチックディッシュに播種し、数日間培養後、赤血球、顆粒球等の非付着細胞を含む上清を除去し、付着したアタッチング細胞（attaching細胞）を・・・、EDTA含PBSを添加して37℃でインキュベートし、浮遊させて回収することを言う」との記載からみて、本願補正発明の「細胞外マトリックス上に付着したアタッチング細胞（attaching細胞）を回収」したことに相当するといえる。
　
　本願補正発明の「回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にする」ことは、本願補正明細書の段落【００２２】の「本発明で言う「回収された血管内皮前駆細胞を血管の再生に使用する」とは、細胞分離フィルターに一旦捕捉させ回収した血管内皮前駆細胞を自己の個体に移植できるのみならず、別の個体への移植、あるいは生体外で血管の再生に利用することを言う。」、段落【００３１】の「ヌードラットの左後足を虚血状態にし、実施例１と同様に分離したアタッチング細胞（attaching細胞）を虚血部に3×105個移植した。移植後に流速を検知するレーザードップラー血流計（LDI；Moor Instruments社製）にて血流を調べた結果、７日目には血流の回復を認め、更に21日目には虚血状態にしなかった右後足と同等の血流を確認できた（図５）」との記載からみて、虚血した後ろ足にアタッチング細胞を移植することを含むものである。そうすると、引用発明の「臍帯血から分離されたＡＴ細胞を、生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生に関与させる」ことと、本願補正発明の「回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にする」こととは、「回収された細胞を血管の再生用にする」という点で共通する。
　
　さらに、引用発明も、「生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生」に利用するために、「臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した臍帯血単核細胞を、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプラスチックプレート上で培養し、７日間培養したＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むＰＢＳでインキュベーションすることにより分離」して「臍帯血から分離されたＡＴ細胞」を調整するものであり、「血管再生用細胞を製造している」といえるから、「血管再生用細胞の製造方法」といえる。
　
　したがって、両者は、
「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を分離処理して血管内皮前駆細胞を回収し、回収された血管内皮前駆細胞を細胞外マトリックス上で培養し、細胞外マトリックス上に付着したアタッチング細胞を回収し、回収された細胞を血管の再生用にすることを含む血管再生用細胞の製造方法。」
という点で一致するが、以下の点で相違する。
　
相違点１：「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液」からの「血管内皮前駆細胞」の分離処理・回収について、本願補正発明では、「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）に通液し、該細胞分離フィルターに流体を導入して該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収」したものであるのに対し、引用発明では、「ヒトの臍帯血又は成人の末梢血から分離された臍帯血単核細胞を、Histopaque密度遠心分離法を用いて分離した」ものである点。
　
相違点２：「回収」される「アタッチング細胞」について、本願補正発明では、「細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有する」ものであるのに対し、引用発明では、そのような細胞の特性が明らかでない点。
　
相違点３：「血管の再生用」にする「細胞」について、本願補正発明では、「表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団」を用いるのに対し、引用発明では、「７日間培養したＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液により分離することにより得られた、臍帯血から分離されたＡＴ細胞」を用いる点。　
　
（５）判断
（ア）相違点１について
　刊行物１の上記摘記事項（１ｅ）には、「臍帯血単核細胞」の培養の結果について、「ＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞のみからは、４週間の間観察しても、細胞のほとんどがプレート上に付着しなかった」こと、「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞のみからは、細胞集団が限られた数のみ現れ、ＡＴ細胞も散発的に観察された」こと、「蛍光による追跡実験は、主として、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞の個体群が、ＡＴ細胞、細胞集団、コードのような構造を起こしたことを示唆するものである」こと、「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞とＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞との共培養は、ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞のみでの培養に比べて、ＡＴ細胞の数（３倍）、細胞集団の数（６倍）を増加させたのであ」ったことが記載されており、「ＣＤ３４陰性臍帯血単核細胞」ではＡＴ細胞を得ることができず、「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞」のみから「ＡＴ細胞」が得られることが開示されているといえる。「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞」は、上記摘記事項（１ａ）の記載からみて、「Histopaque密度遠心分離法」により得た「臍帯血単核細胞」を「磁気ビーズ分離法」によりさらに分離したものといえるから、「Histopaque密度遠心分離法」により、培養後に「ＡＴ細胞」となる「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞」を含む「臍帯血単核細胞」が回収されているといえる。
　
　刊行物２の上記摘記事項（２ａ）には、「血液から治療に必要な血球成分を分離する方法」として、「比重遠心法」よりも簡便な方法として「血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉し、フィルター内に残存した除去対象細胞をリンス液で洗い流した後、フィルターに振動を与えながら回収液をフィルターに通液することにより回収必要細胞を回収するフィルター法」が用いられていたことが記載されており、上記摘記事項（２ｂ）及び（２ｅ）には、細胞分離フィルターを用いることにより、簡便な操作で、細胞集団から除去対象細胞を高率に除去するだけでなく、回収必要細胞を高率に回収できることが記載されている。
　さらに、上記摘記事項（２ｃ）の実施例１には、「第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ2のポリエステル不織布２５枚を、第２層目に平均繊維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2のポリエステル不織布１２枚」からなるフィルターであって、「親水性ポリマーのコーティング」、すなわち親水化処理したものを用いて、白血球を効率よく捕捉・回収し、赤血球及び血小板を効率よく除去することが記載されており、上記摘記事項（２ｄ）には、実施例２として、「第２層目」に「マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定」した不織布を用いたフィルターを用いて、ＣＤ３４陽性細胞を高回収率で回収したことが記載されている。
　刊行物２の上記摘記事項（２ｃ）には、実施例１について、「白血球を捕捉した後、同じく液体流入口からフィルター内に残存する赤血球、血小板を市販の生理食塩水１５ｃｍ3を落差（流速約５ｃｍ3／分）で通液してリンスした。濾過した血液及びフィルター内を通ったリンス液はドレインボトルに回収した」との記載からみて、「白血球」は捕捉され、「赤血球、血小板」はフィルターを通過するものと認められ、さらに、本願補正明細書の段落【００１１】の「本発明で言う夾雑細胞とは、血管内皮前駆細胞が存在する部位にしばしば混在する、赤血球、血小板、顆粒球など血管への分化能を有していない細胞のことを言う」の記載からみて、刊行物２の「赤血球、血小板」は本願補正発明の「夾雑細胞」に相当するといえる。
　上記摘記事項（２ｃ）の実施例１は、「マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定」しない親水化処理した不織布を用いるものであるが、この実施例１と同様の「マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定」しない不織布からなるフィルター材を用いて、ＣＤ３４陽性細胞を単核細胞、有核細胞とともに効率的に捕捉し、赤血球、血小板を効率的に除去できることは本願の出願前に知られていたといえる。
（特開平１０−３１３８５５号公報の段落【００１１】〜【００１４】の実施例１〜４及び段落【００１８】の【表１】には、平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布と平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布であって親水性ポリマーのコーティングを行ったものを用いて、白血球７３％以上や単核球８２％以上、ＣＤ３４陽性細胞８７％以上の回収率で回収し、赤血球９５％以上、血小板８８％以上の除去率で除去したことが記載されている。
　特開２０００−１３９４５４号公報の段落【０００７】、【０００９】の実施例１及び実施例２にも、平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布と平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布であって親水性ポリマーのコーティングを行ったものを用いて、有核細胞７７．２％以上、ＣＤ３４陽性細胞を９８．２％以上の回収率で回収し、赤血球８７．２％以上、血小板７２．１％の除去率で除去したことが記載されている。）
　そうすると、刊行物２の上記摘記事項（２ｃ）の実施例１のフィルターは、「ＣＤ３４陽性細胞」等を捕捉し、「赤血球、血小板」等の「夾雑細胞」を通過させるものであるといえる。そして、「ＣＤ３４陽性細胞」は、刊行物１の上記摘記事項（１ｅ）からみて「ＡＴ細胞」に発達するものであり、上記摘記事項（１ｆ）、（１ｇ）の記載からみて「ＡＴ細胞」は「ＫＤＲ」を発現するものであり、刊行物２の上記摘記事項（２ｃ）の実施例１のフィルターに捕捉される「ＣＤ３４陽性細胞」を含む細胞は、上記（４）でも検討したように、「血管内皮前駆細胞」であるといえるから、刊行物２の上記摘記事項（２ｃ）の実施例１のフィルターは、「マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定」しない親水化処理した不織布であって「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する」ものであるといえる。
　
　したがって、引用発明において、「ＣＤ３４陽性臍帯血単核細胞」を含む「臍帯血単核細胞」を回収する目的で、「Histopaque密度遠心分離法」に代えて、より簡便な方法であるフィルターを用いる方法を採用し、その際に、フィルターとして、「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）」を用いることは当業者が容易に想到し得たことといえる。
　
（イ）相違点２について
　本願補正発明の「細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有する」ことについて、本願補正明細書には、段落【００３０】に「回収バッグに回収された単核球は、臍帯血中の単核球の８０％であった。回収された単核球を・・・で培養した。結果を図２に示した。図２によると、培養４８時間以内に細胞塊が発生し（図２−１）、培養３日目ではプラスチィックディッシュに付着した細胞塊の端から紡錘形のアタッチング細胞（attaching細胞）が現れていることが分かる（図２-２及び図２−３）。これらアタッチング細胞（attaching細胞）の70%以上が内皮細胞の特徴であるレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能とを有していた」と記載されているのみであり、本願補正発明の「細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有する」ことは、「原料血液」のうち、回収すべき細胞を「細胞分離フィルター」に捕捉し、その捕捉した細胞の特性を示したものにすぎないと認められる。
　また、引用発明について、刊行物１の上記摘記事項（１ｆ）には、「培養７日目のＡＴ細胞は、内皮細胞の特徴的な機能の１つである、ＤｉＩ標識されたアセチルＬＤＬの取り込みを行った」ことが記載されている。
　そうすると、上記（ア）で検討したように、引用発明において、「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）」を用いて、回収すべき細胞細胞を捕捉することは当業者が容易に想到し得たことであり、その捕捉した細胞を培養すれば、「細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有する」細胞が得られるものと認められる。
　
（ウ）相違点３について
　本願補正発明の「回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にする」について、本願補正明細書には、以下の記載がある。
「【００２２】
　本発明で言う「回収された血管内皮前駆細胞を血管の再生に使用する」とは、細胞分離フィルターに一旦捕捉させ回収した血管内皮前駆細胞を自己の個体に移植できるのみならず、別の個体への移植、あるいは生体外で血管の再生に利用することを言う。・・・」
「【００３０】
４．再生方法及び評価結果
　・・・
　・・・また、これらのアタッチング細胞
（attaching細胞）はRT-PCRの解析結果から、内皮細胞に特徴的なKDR、CD31、ecNOS、AC133、endothelin-1、LOX-1、GAPDHを発現していた（図２−７）。図３には、図２−１〜図２−６に示した顕微鏡写真を分かりやすく図示した。・・・
　培養７日目に得られたアタッチング細胞（attaching細胞）は、播種単核球の１０％で、フローサイトメトリー法によるKDR陽性細胞の解析から血管内皮前駆細胞は原料血液の単核球の６％であった。７日間培養したアタッチング細胞（attaching細胞）を１ｍMのEDTA含PBSを用いて37℃で15分間インキュベートして浮遊させ、更にPKH2-GLで蛍光標識した後、PKH26標識のHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）と１：１の細胞比率で、Total1×105cells／mlの細胞濃度になるように、前述の細胞培養用培地で調整した。更に、マトリゲル（ベクトンディッキンソン社製）をコートした35mmプラスチックディッシュに2ml播種し、37℃の5%CO2インキュベータ内で共培養した。2〜3時間後に蛍光顕微鏡にて観察したところ、赤色のHUVECと緑色のアタッチング細胞(attaching細胞)が入り混じった血管様のネットワーク構造が現れ、血管への分化を確認できた（図４）。」
「【００３１】
【実施例２】
　臍帯血から細胞分離フィルターを用いて血管内皮前駆細胞を分離し、in vivoで血管を再生する方法を例示する。
・・・
４．再生方法及び評価結果
　ヌードラットの左後足を虚血状態にし、実施例１と同様に分離したアタッチング細胞（attaching細胞）を虚血部に3×105個移植した。移植後に流速を検知するレーザードップラー血流計（LDI；Moor Instruments社製）にて血流を調べた結果、７日目には血流の回復を認め、更に21日目には虚血状態にしなかった右後足と同等の血流を確認できた（図５）。」
　
　本願補正明細書の上記摘記事項をみると、段落【００２２】には、「「回収された血管内皮前駆細胞を血管の再生に使用する」とは、細胞分離フィルターに一旦捕捉させ回収した血管内皮前駆細胞を・・・血管の再生に利用することを言う。」と記載されているのみであり、特に、「回収されたアタッチング（attaching）細胞」のうち、「表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団」であるものを選別することは記載されていない。
　また、段落【００３０】の「血管様ネットワーク構造が現れ、結果への分化を確認できた」実験において用いたものは、「７日間培養したアタッチング細胞（attaching細胞）を１ｍMのEDTA含PBSを用いて37℃で15分間インキュベートして浮遊させ」たものであり、段落【００３１】の「ヌードラット」を用いた「再生方法」において用いたものも、「実施例１と同様に分離したアタッチング細胞」であり、「表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団」を特に選別したものとは認められないから、「回収された・・・細胞集団」とは、特に選別をしなくても「表面マーカーの解析によりKDRを発現している」ものであり、「７日間培養し・・・１ｍMのEDTA含PBSを用いて37℃で15分間インキュベートして浮遊させ」た「アタッチング細胞」であると解するのが自然である。
　そして、引用発明においても、「生体内での免疫不全ヌードラットの虚血した後ろ足の血管新生に利用」したのは、「７日間培養したＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液により分離することにより得られた、臍帯血から分離されたＡＴ細胞」であり、刊行物１の上記摘記事項（１ｆ）の「ＡＴ細胞は多数の内皮細胞の表現型を有していた。ＡＴ細胞が内皮細胞の表現型を有するかどうかを調べるため、ＡＴ細胞を免疫科学的な実験の主題とした。ＡＴ細胞は、ｖＷＦ、ＣＤ３１及びＫＤＲに陽性に反応した（図示せず）。・・・これらの発見は、ＡＴ細胞がいくつかの内皮細胞のマーカーを発現しており、内皮細胞の機能を有しており、したがって、ＡＴ細胞が内皮細胞の表現型であることを示唆するものである」との記載、上記摘記事項（１ｇ）の「内皮細胞の系統のマーカーとして、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１の発現、及び、共通の白血球抗原としてのＣＤ４５の発現を調べるために、培養７日目のＡＴ細胞のフローサイトメトリー解析を行った。ＡＴ細胞（臍帯血あたりｎ＝８）は、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１に陽性に発現した」との記載からみて、「臍帯血から分離されたＡＴ細胞」は「表面マーカーの解析によりＫＤＲを発現している」ものを含んでいると認められるから、本願補正発明と引用発明との間に、この点について差異は認められない。
　
　仮に、本願補正発明の「回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にする」ことについて、「回収されたアタッチング（attaching）細胞」のうち、「表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団」であるものを選別するものと解しても、刊行物１の上記摘記事項（１ｆ）の「ＡＴ細胞は、ｖＷＦ、ＣＤ３１及びＫＤＲに陽性に反応した（図示せず）。・・・これらの発見は、ＡＴ細胞がいくつかの内皮細胞のマーカーを発現しており、内皮細胞の機能を有しており、したがって、ＡＴ細胞が内皮細胞の表現型であることを示唆するものである」との記載、上記摘記事項（１ｇ）の「内皮細胞の系統のマーカーとして、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１の発現、及び、共通の白血球抗原としてのＣＤ４５の発現を調べるために、培養７日目のＡＴ細胞のフローサイトメトリー解析を行った。ＡＴ細胞（臍帯血あたりｎ＝８）は、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４及びＣＤ３１に陽性に発現した」との記載からみて、「表面マーカーの解析によりKDRを発現している」ことは血管内皮細胞の表現型の１つであるといえるから、引用発明において、「７日間培養したＡＴ細胞をＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液により分離することにより得られた、臍帯血から分離されたＡＴ細胞」から、特に「表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団」であるものを選別することも、当業者が容易に想到し得たことといえる。
　
（エ）本願補正発明の効果について
　本願補正発明の効果は、本願補正明細書の段落【００３３】の「本発明によれば、簡便な短時間の操作で且つ非完全開放系で血管内皮前駆細胞を分離回収でき、効率的な血管再生が可能である」との記載からみて、「簡便な短時間の操作で且つ非完全開放系で血管内皮前駆細胞を分離回収でき」ることであるといえる。
　引用発明において、「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する親水化処理した細胞分離フィルター（抗ヒトCD34モノクローナル抗体固定化フィルターを除く）」を用いれば、「非完全開放系」で操作できること、「簡便な短時間の操作」で分離回収できることは、当業者が予測できる範囲内の効果であるといえる。
　
（６）まとめ
　したがって、本願補正発明は、刊行物１〜２に記載された発明及び周知技術に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
３　むすび
　以上のとおり、上記補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、本件補正は、その余のことを検討するまでもなく、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
第３　本願発明について
１　本願発明
　平成２０年１０月２９日付け手続補正書は、上記のとおり却下されたので、本願の請求項１〜７に係る発明は、平成２０年６月２０日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１〜７に記載された事項により特定されるものであり、そのうち請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。なお、本願の明細書を「本願明細書」という。）は、以下のとおりである。
　
「血管内皮前駆細胞と夾雑細胞とを含む細胞浮遊液を、少なくとも夾雑細胞を実質的に通過させ血管内皮前駆細胞は実質的に捕捉する細胞分離フィルターに通液し、
　該細胞分離フィルターに流体を導入して該細胞分離フィルターに捕捉された血管内皮前駆細胞を回収し、
　回収された血管内皮前駆細胞をさらに細胞外マトリックス上で培養し、
　細胞外マトリックス上に付着した７０％以上がレクチン結合能とアセチルLDLの取り込み能を有するアタッチング細胞（attaching細胞）を回収し、
　回収された表面マーカーの解析によりKDRを発現している細胞集団を血管の再生用にすることを含む血管再生用細胞の製造方法。」
　
２　原査定の概要
　原査定における拒絶の理由の概要は、本願発明は、その出願前に頒布された以下の刊行物である引用文献１〜２に記載された発明に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないとするものである。
　
１．特開平１１−５６３５１号公報（上記「刊行物２」に同じ。）
２．J. Clin. Invest., 2000年, vol. 105, no. 11, p. 1527-1536（上記「刊行物１」に同じ。）
　
３　引用文献及び引用発明
　原査定の拒絶の理由に引用された引用文献２（上記「刊行物１」に同じ）の記載事項は、「第２　平成２０年１１月４日付け手続補正についての補正却下の決定」の「２　補正の適否」の「（２）刊行物に記載された事項」に記載したとおりであり、引用発明は同「（３）刊行物１に記載された発明」に記載したとおりである。
　
４　対比・判断
　前記「第２　平成２０年１０月２９日付け手続補正についての補正却下の決定」の「２　補正の適否」の「（１）補正の目的の適否」で検討したように、本願補正発明は、本願発明を特定するために必要な事項を限定したものであるから、本願発明は本願補正発明を包含するものである。
　
　そうすると、本願発明の構成要件の全てを含み、さらに構成要件を減縮したものに相当する本願補正発明は、前記「第２　平成２０年１０月２９日付け手続補正についての補正却下の決定」の「２　補正の適否」の「（４）対比」〜「（５）判断」に記載したとおり、刊行物１〜２に記載された発明及び周知技術に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、これを包含する本願発明も、同様の理由により、本願の出願前に頒布された刊行物１〜２に記載された発明及び周知技術に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものである。
　
５　むすび
　以上のとおり、本願発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものであるから、その余のことについて検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。