【手続補正書】
【提出日】平成18年4月5日(2006.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  関連配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、ここで、該オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基はピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、
（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供する、ここで、前記ポリヌクレオチドの内の一つは前記オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一つは、関連標的配列を有する、
（ｃ）夫々の前記ポリヌクレオチドを、別々に、前記オリゴヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドのそれぞれとの間のハイブリダイゼーション度を測定する。
【請求項２】  請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に、検出可能標識を有する。
【請求項３】  請求項２の方法であって、前記検出可能標識は、蛍光標識である。
【請求項４】  請求項３の方法であって、前記標識は、フルオレセインである。
【請求項５】  請求項３の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、複数の蛍光標識を有する。
【請求項６】  請求項５の方法であって、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長は、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている。
【請求項７】  請求項３の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する。
【請求項８】  請求項７の方法であって、前記蛍光標識はフルオレセインである。
【請求項９】  請求項８の方法であって、前記クエンチング剤は、テトラメチルローダミンである。
【請求項１０】  請求項７の方法であって、更に、ハイブリダイゼーション後に、前記蛍光標識と、前記クエンチング剤との空間関係を変化させる工程を有する。
【請求項１１】  請求項１０の方法であって、前記蛍光標識と前記クエンチング剤との空間関係の変化は、前記オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ加水分解によって行われる。
【請求項１２】  請求項１１の方法であって、エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の放出が起こる。
【請求項１３】  請求項１２の方法であって、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、ハイブリダイゼーション後に前記オリゴヌクレオチドから放出される標識の量によって測定される。
【請求項１４】  請求項１の方法であって、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる。
【請求項１５】  請求項１２の方法であって、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる。
【請求項１６】  請求項１の方法であって、単数又は複数のグアニン残基が、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている。
【請求項１７】  請求項１の方法であって、単数又は複数のアデニン残基が、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項１８】  請求項１の方法であって、単数又は複数のプリン残基が、１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている。
【請求項１９】  請求項１の方法であって、単数又は複数のプリン残基が、ヒポキサンチンによって置換されている。
【請求項２０】  請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に、単数又は複数の浅溝バインダ（ＭＧＢ）モアエティを有する。
【請求項２１】  請求項２０の方法であって、前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される。
【請求項２２】  請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、その長さが２１ヌクレオチド以下である。
【請求項２３】  請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、前記オリゴヌクレオチドのプライミング能力によって測定される。
【請求項２４】  請求項２３の方法であって、プライミングは増幅反応の一部として起こる。
【請求項２５】  請求項２４の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。
【請求項２６】  請求項３の方法であって、一つ以上のオリゴヌクレオチドが使用される。
【請求項２７】  請求項２６の方法であって、二つのオリゴヌクレオチドが使用される。
【請求項２８】  請求項２７の方法であって、前記二つのオリゴヌクレオチドの第１は、蛍光ドナーを含み、前記二つのオリゴヌクレオチドの第２は蛍光アクセプタを含み、更に、前記蛍光ドナーの放出波長は前記蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップしている。
【請求項２９】  ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列の存在をテストされるべきポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、
（ｄ）ハイブリダイズされた核酸を同定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項３０】  請求項２９の方法であって、複数のポリヌクレオチドが前記標的配列の存在に関してテストされ、これらポリヌクレオチドは関連標的配列を有する。
【請求項３１】  請求項３０の方法であって、前記複数のポリヌクレオチドは、前記標的配列中の一つのヌクレオチドが互いに異なる。
【請求項３２】  請求項３１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に、浅溝バインダモアエティを有する。
【請求項３３】  請求項３２の方法であって、前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される。
【請求項３４】  請求項２９の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、伸長可能な３´−ヒドロキシ基を有するプライマーである。
【請求項３５】  請求項３４の方法であって、ハイブリダイズされた核酸が、前記プライマーを重合化酵素によって伸長することによって同定される。
【請求項３６】  請求項３５の方法であって、前記重合化酵素は熱安定酵素である。
【請求項３７】  請求項３４の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、増幅反応のプライマーである。
【請求項３８】  請求項３７の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。
【請求項３９】  プライマー伸長方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する、
（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして
（ｄ）前記ポリヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、前記酵素と、前記基質とを、重合化に適した条件下でインキュベートする、
ここで、前記単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４０】  請求項３９の方法であって、該方法は、増幅反応の一部である。
【請求項４１】  請求項４０の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。
【請求項４２】  請求項３９の方法であって、該方法は、ｃＤＮＡ分子の合成に使用される。
【請求項４３】  ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）互いに異なる既知の配列を有するオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４４】  ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換され、かつ、前記少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの一つが、前記標的配列に対して完全相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも他方が関連標的配列を有する、既知の配列の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記夫々のオリゴヌクレオチドを、別々に、前記ポリヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記各オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度を測定する。
【請求項４５】  請求項４４の方法であって、前記少なくとも一つの他方のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して単一ヌクレオチド不一致を有する。
【請求項４６】  細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記細胞中で発現される前記遺伝子を表わすポリヌクレオチドの集団を提供する、
（ｂ）互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの集団を前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４７】  対象の遺伝子の標的配列中の変異を同定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）互いに配列の異なるオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、ここで、これらの異なる配列は、野生タイプの標的配列と、異なる変異標的配列とを含む、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４８】  改変された所定の配列を有し、ここにおいて、前記所定の配列の単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されているオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４９】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、更に、結合した浅溝バインダを有する。
【請求項５０】  請求項４９のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記浅溝バインダは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される。
【請求項５１】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、更に、検出可能標識を有する。
【請求項５２】  請求項５１のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記検出可能標識は、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、蛍光化学発光剤、電子化学発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識から選択される。
【請求項５３】  請求項５１のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位置している。
【請求項５４】  請求項５１のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置している。
【請求項５５】  請求項５１のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記検出可能標識は、蛍光標識である。
【請求項５６】  請求項５５のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリトリンから選択される。
【請求項５７】  請求項５５のオリゴヌクレオチドプローブであって、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する。
【請求項５８】  請求項５１のオリゴヌクレオチドプローブであって、複数の蛍光標識を有する。
【請求項５９】  請求項５８のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長は、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている。
【請求項６０】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プリン残基は、グアニン残基及びアデニン残基から選択される。
【請求項６１】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プリン残基はグアニン残基であり、前記グアニン残基の全てがピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている。
【請求項６２】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、配列中に４つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている。
【請求項６３】  請求項４８のオリゴヌクレオチドプローブであって、配列中に６つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている。
【請求項６４】  請求項４８のハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
従って、一態様において、本発明は、少なくとも一つのプリンが単数又は複数のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体によって置換された、改変オリゴヌクレオチド組成物を提供する。好適実施例において、グアニン類似体である６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（６−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＧ）によって、グアニンが置換され、及び／又は、アデニン類似体である４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）（ｐｐＡ）によってアデニンが置換される。他の実施例において、グアニン類似体である１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＩ）によって、グアニンが置換される。前記ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン置換オリゴヌクレオチドは、更に、検出可能標識及び／又は浅溝バインダ（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒｓ）及び／又はその他のタイプの改変塩基又は塩基類似体等の他のモアエティ（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の更に別の態様は、核酸のハイブリダイゼーションの方法であって、前記核酸の少なくとも一つが、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基類似体によって置換された改変核酸である方法に関する。この方法によって、高い溶解温度と改善された不一致検出とが提供される。本発明によって改善されたハイブリダイゼーション方法は、これらのものに限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、単一ヌクレオチド多型検出、加水分解可能プローブアッセイ、ｃＤＮＡ合成、ヌクレオチド配列決定、増幅反応、及び、当業者に知られているもの等のその他の技術に使用することができる。
オリゴヌクレオチド中のグアニン塩基が前記グアニン類似体ｐｐＧによって置換されると、これら類似体を含有するプローブのＴm値は、グアニンを含有するオリゴヌクレオチドプローブのそれらよりも僅かに高くなる。従って、Ｇ含有及びｐｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて類似の性能を有する。しかしながら、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドが加水分解可能プローブとして使用された場合（後述するように、又、米国特許５，２１０，０１５を参照）、二つの特性が大幅に向上する。第１に、完全一致ハイブリッドから得られる蛍光信号と、単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドから得られるものとを比較した場合より高いＳ／Ｎ比として測定されるように、ｐｐＧ置換プローブは、不一致識別においてより効果的である。更に、ｐｐＧ置換プローブは、完全一致標的からより高い絶対値の信号を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
つまり、この目的を達成するための本発明の第１特徴構成は、関連配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、ここで、該オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基はピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、
（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供する、ここで、前記ポリヌクレオチドの内の一つは前記オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一つは、関連標的配列を有する、
（ｃ）夫々の前記ポリヌクレオチドを、別々に、前記オリゴヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドのそれぞれとの間のハイブリダイゼーション度を測定する点にある。
本発明の第２特徴構成は、上記第１徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、検出可能標識を有する点にある。
本発明の第３特徴構成は、上記第２特徴構成において、前記検出可能標識が、蛍光標識である点にある。
本発明の第４特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記標識が、フルオレセインである点にある。
本発明の第５特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、複数の蛍光標識を有する点にある。
本発明の第６特徴構成は、上記第５特徴構成において、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長が、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第７特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する点にある。
本発明の第８特徴構成は、上記第７特徴構成において、前記蛍光標識がフルオレセインである点にある。
本発明の第９特徴構成は、上記第８特徴構成において、前記クエンチング剤が、テトラメチルローダミンである点にある。
本発明の第１０特徴構成は、上記第７特徴構成において、更に、ハイブリダイゼーション後に、前記蛍光標識と、前記クエンチング剤との空間関係を変化させる工程を有する点にある。
本発明の第１１特徴構成は、上記第１０特徴構成において、前記蛍光標識と前記クエンチング剤との空間関係の変化が、前記オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ加水分解によって行われる点にある。
本発明の第１２徴構成は、上記第１１特徴構成において、エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の放出が起こる点にある。
本発明の第１３特徴構成は、上記第１２特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度が、ハイブリダイゼーション後に前記オリゴヌクレオチドから放出される標識の量によって測定される点にある。
本発明の第１４特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる点にある。
本発明の第１５特徴構成は、上記第１２特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる点にある。
本発明の第１６特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のグアニン残基が、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている点にある。
本発明の第１７特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のアデニン残基が、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第１８特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のプリン残基が、１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている点にある。
本発明の第１９特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のプリン残基が、ヒポキサンチンによって置換されている点にある。
本発明の第２０特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、単数又は複数の浅溝バインダ（ＭＧＢ）モアエティを有する点にある。
本発明の第２１特徴構成は、上記第２０特徴構成において、前記浅溝バインダモアエティが、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第２２特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドは、その長さが２１ヌクレオチド以下である点にある。
本発明の第２３特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度が、前記オリゴヌクレオチドのプライミング能力によって測定される点にある。
本発明の第２４特徴構成は、上記第２３特徴構成において、プライミングが増幅反応の一部として起こる点にある。
本発明の第２５特徴構成は、上記第２４特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第２６特徴構成は、上記第３特徴構成において、一つ以上のオリゴヌクレオチドが使用される点にある。
本発明の第２７徴構成は、上記第２６特徴構成において、二つのオリゴヌクレオチドが使用される点にある。
本発明の第２８特徴構成は、上記第２７特徴構成において、前記二つのオリゴヌクレオチドの第１が、蛍光ドナーを含み、前記二つのオリゴヌクレオチドの第２が蛍光アクセプタを含み、更に、前記蛍光ドナーの放出波長が前記蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第２９特徴構成は、ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列の存在をテストされるべきポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、
（ｄ）ハイブリダイズされた核酸を同定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第３０特徴構成は、上記第２９特徴構成において、複数のポリヌクレオチドが前記標的配列の存在に関してテストされ、これらポリヌクレオチドは関連標的配列を有する点にある。
本発明の第３１特徴構成は、上記第３０特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、前記標的配列中の一つのヌクレオチドが互いに異なる点にある。
本発明の第３２特徴構成は、上記第３１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドは、更に、浅溝バインダモアエティを有する点にある。
本発明の第３３特徴構成は、上記第３２特徴構成において、前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第３４特徴構成は、上記第２９特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、伸長可能な３´−ヒドロキシ基を有するプライマーである点にある。
本発明の第３５特徴構成は、上記第３４特徴構成において、ハイブリダイズされた核酸が、前記プライマーを重合化酵素によって伸長することによって同定される点にある。
本発明の第３６特徴構成は、上記第３５特徴構成において、前記重合化酵素は熱安定酵素である点にある。
本発明の第３７特徴構成は、上記第３４特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーである点にある。
本発明の第３８特徴構成は、上記第３７特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第３９特徴構成は、プライマー伸長方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する、
（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして
（ｄ）前記ポリヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、前記酵素と、前記基質とを、重合化に適した条件下でインキュベートする、
ここで、前記単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４０特徴構成は、上記第３９特徴構成において、該方法が、増幅反応の一部である点にある。
本発明の第４１特徴構成は、上記第４０特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第４２特徴構成は、上記第３９特徴構成において、該方法は、ｃＤＮＡ分子の合成に使用される点にある。
本発明の第４３特徴構成は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）互いに異なる既知の配列を有するオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４４特徴構成は、ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換され、かつ、前記少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの一つが、前記標的配列に対して完全相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも他方が関連標的配列を有する、既知の配列の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記夫々のオリゴヌクレオチドを、別々に、前記ポリヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記各オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度を測定する点にある。
本発明の第４５特徴構成は、上記第４４特徴構成において、前記少なくとも一つの他方のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列に対して単一ヌクレオチド不一致を有する点にある。
本発明の第４６特徴構成は、細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記細胞中で発現される前記遺伝子を表わすポリヌクレオチドの集団を提供する、
（ｂ）互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの集団を前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４７特徴構成は、対象の遺伝子の標的配列中の変異を同定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）互いに配列の異なるオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、ここで、これらの異なる配列は、野生タイプの標的配列と、異なる変異標的配列とを含む、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４８特徴構成は、改変された所定の配列を有し、ここにおいて、前記所定の配列の単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されているオリゴヌクレオチドプローブである点にある。
本発明の第４９特徴構成は、上記第４８特徴構成において、更に、結合した浅溝バインダを有する点にある。
本発明の第５０特徴構成は、上記第４９特徴構成において、前記浅溝バインダは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第５１特徴構成は、上記第４８特徴構成において、更に、検出可能標識を有する点にある。
本発明の第５２特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、蛍光化学発光剤、電子化学発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識から選択される点にある。
本発明の第５３特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位置している点にある。
本発明の第５４特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置している点にある。
本発明の第５５特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、蛍光標識である点にある。
本発明の第５６特徴構成は、上記第５５特徴構成において、前記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリトリンから選択される点にある。
本発明の第５７特徴構成は、上記第５５特徴構成において、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する点にある。
本発明の第５８特徴構成は、上記第５１特徴構成において、複数の蛍光標識を有する点にある。
本発明の第５９特徴構成は、上記第５８特徴構成において、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長が、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第６０特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記プリン残基が、グアニン残基及びアデニン残基から選択される点にある。
本発明の第６１特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記プリン残基はグアニン残基であり、前記グアニン残基の全てがピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６２特徴構成は、上記第４８特徴構成において、配列中に４つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６３特徴構成は、上記第４８特徴構成において、配列中に６つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６４特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブである点にある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の前記改変オリゴヌクレオチド中に存在する塩基の更に別の改変として、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  １Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＩ）に、単数又は複数のプリン塩基を置換させることができる。ｐｐＩとそれに対応のヌクレオチドとヌクレオチドとは、これら記載されたものに関連する方法によって得ることができる。シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ｂ）Ｌｉｅｂｉｇｓ，Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ：１２１３−１２２１；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ａ）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ａ）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ｂ）前出及び、シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８９）前出。