【手続補正書】
【提出日】平成18年9月27日(2006.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
ラパマイシンとその誘導体およびミコフェノール酸は有効な免疫抑制剤ではあるが、一部の患者においてこれらの薬物投与は血清コレステロールおよびトリグリセリドの上昇を引き起こすこと、すなわち、高コレステロール血症および高脂血症の原因となることが分かっている。これらの症状は共にとりわけ糖尿病患者において、冠動脈疾患（ＣＡＤ）および一般的なアテローマ動脈硬化症アテローム性動脈硬化症の危険因子である。
高コレステロール血症それ自体は一般的な症状であり、数種の主要分類の薬物で処置することができる。これらはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素インヒビターまたはいわゆるスタチン類、胆汁酸結合樹脂およびニコチン酸などである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
さらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬による処置中の患者において生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法であって、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子を含む２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプを判定することを特徴とする方法を提供する。用語“ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ”とは、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１および−３１位置の多形の組合せからなるハプロタイプをいうものとする。両方の染色体が“高コレステロール”ハプロタイプを含む場合、すなわち、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１でＣの代わりにＴおよび−３１でＴの代わりにＣを含む場合、患者は高コレステロール上昇群とし、染色体の一方が“高コレステロール”ハプロタイプを含み、一方が“低コレステロール”ハプロタイプを含む場合、患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の染色体が“低コレステロール”ハプロタイプを含む場合、すなわち、部位−５１１にＣを、部位−３１にＴを含む場合、患者は低コレステロール上昇群とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１β遺伝子のハプロタイプの性質を判定するキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；およびＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；上記の結果から、ハプロタイプを判定するための説明書および指摘されたハプロタイプの性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；を含んでなるキットである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
その他の随伴療法
研究の全処置期間、すなわち、スクリーニングの初日から最終の研究評価がすべて終了するまでの期間、研究薬物、研究予防薬および通常の患者の投薬以外の投薬は実施しなかった。この規則に対する例外は有害事象（ＡＥ）を処置するために必要な投薬にのみ適用した。他の投薬（薬局での投薬およびビタミン類を含む）の管理については事前および随伴投薬事例報告様式（Prior and Concomitant Medications Case Report Form （CRF））に詳細に記載されている。ＡＥについて必要な場合には、随伴投薬法がＡＥｓ ＣＲＦに詳細に記載され、関連文献も引用されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
遺伝子型決定
２４遺伝子に相当する合計４７のユニーク多形について、各臨床試験のために解析した。薬物代謝、高コレステロール血症、高脂肪血症、免疫抑制および炎症に関わる候補遺伝子を本研究用に選択した。ＳＮＰアッセイは、ＯＭＩＭ、ＳＮＰ協会、遺伝子座リンクおよびｄｂＳＮＰ、およびサード・ウエーブ・テクノロジーズ・インク（ＴＷＴ、マジソン、ウィスコンシン）ウエブサイト（http://64.73.25.65:8080/coe/index.jsp）などの公共データベースからの情報を用いて設計した。遺伝子型決定アッセイ用の得られたプローブセットはＴＷＴが作製した。遺伝子型決定はＴＷＴ（９−１０）が開発したインベーダー（INVADER）（登録商標）アッセイを用い、製造業者の指示に従い、ゲノムＤＮＡ６０ｎｇにより実施した。参照文献：Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 （1999）; and Ryan, Mol. Diagn., Vol. 4, pp. 135-144 （1999）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
（−５１１）ＩＬ−１βＳＮＰについてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１０〜７０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１６０μＭ−ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１.５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０.６μＭ−ＩＬ−１β（−５１１）前進プライマー、０.６μＭ−ＩＬ−１β（−５１１）逆進プライマーおよび０.０３Ｕ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アップライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア）を含む２０μＬの反応液中で実施した。以下の条件で３６回の増幅を実施した：９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０秒。次いで、９種のサンプルを２％アガロースゲル上で分画（５μＬ）し、臭化エチジウム染色により可視化し、増幅を確認した。ＰＣＲ産物の１：７希釈は増幅ＤＮＡ用３８４穴バイプレックスプレートにより、ＴＷＴＳＮＰ＃１２８０６９に対し実施した。
プライマー配列は以下のとおりである：
IL-1β（-511）-前進 5’-GCAGAGCTCATCTGGCATTG-3’ （配列番号１）
IL-1β（-511）-逆進 5’-TATGTGGGACAAAG TGGAAG-3’ （配列番号２）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＰＣＲ産物の１：１０希釈は増幅ＤＮＡ用３８４穴バイプレックスプレートにより、ＲＡＤ Ｂ２５１用のＴＷＴ ＳＮＰ＃２７４３３９に対し実施した。ＲＦＬＰ解析はＡｌｕ−Ｉ制限酵素（ニューイングランド・バイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ）を用いて遺伝子型を決定するために使用した。ＲＦＬＰ消化物は、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−ＤＴＴ（ｐＨ７.９）、８ｎｇ増幅ゲノムＤＮＡおよび０.５ｍＭ−Ａｌｕ−Ｉ酵素を含む２０μＬの反応液中で処理した。サンプルはすべて３７℃で１７時間インキュベートし、３％アガロースゲル上で分画（１９μＬ）し、臭化エチジウム染色により可視化し、バンドサイズを確認した。
【表３】
2006500930.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
［統計的解析］
２４ヶ月のlab_ｂ.sd２ＲＡＤＢ２５１臨床データセットを用い、コレステロールレベルに対する遺伝子型と処置の影響を解析するために、共分散モデルの解析を使用した。該モデルの条件は、最終コレステロールレベル、共変量としての初期コレステロールレベル、および主エフェクターとしての遺伝子型と処置である。適用し得る場合、オッズ比、９５％信頼限界、およびカイ二乗解析を計算した。統計解析はすべてＳＡＳ８.０２ソフトウエアにより実施した。多重テストの補正のために、ボンフェロニ補正を行った。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
この相関をさらに解析するために、ＩＬ−１β（−５１１）遺伝子型とＨＤＬおよびＬＤＬのレベル間に関連性があるかどうかを試験した。図３と表６に示すように、両処置群からの患者のＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型は共に、患者の最終訪問時に測定したＨＤＬの最高レベルと相関した（ｐ＝０.０２１４）。
【表８】
2006500930.tif 000002
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
下記表１０に示すように、オッズ比が示すには、患者がＩＬ−１β遺伝子プロモーターの位置（−５１１）にＴを含むならば、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方で処理した場合、総血中コレステロールレベルが最終濃度≧２４０ｍｇ／ｄＬに上昇する可能性は５.６７倍（９５％信頼限界：１.２０〜９.０１）となり、あるいは患者がＩＬ−１β遺伝子プロモーターの位置（−３１）にＣを含むならば、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方で処理した場合、総血中コレステロールレベルが最終濃度≧２４０ｍｇ／ｄＬに上昇する可能性は７.２３倍（９５％信頼限界：１.２０〜９.０１）となる。これらの知見は統計的に有意であり（それぞれ、ｐ＝０.０２０７およびｐ＝０.００９６）、高コレステロール血症を容易に処置し得るため、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方により移植手術患者を処置する際に、予防策として使用することができる。
【表１２】
2006500930.tif 000003
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（−５１１）と（−３１）ＩＬ−１βＳＮＰの連鎖不平衡
ＩＬ−１β（−５１１）Ｃ→Ｔ多形が位置（−３１）に位置するＩＬ−１βプロモーター内のもう一つの多形と強力な連鎖不平衡（９９.５％）にあり、結果としてＴ→Ｃ塩基遷移を生じることは報告されている。参照：El-Omar et al., Nature, Vol. 404, pp. 398-402 （2000）。それ故、ＩＬ−１βプロモーターの位置（−５１１）にＴをもつ患者は、位置（−３１）にＣをもつであることが予知される。この知見はこれら２つの治験において試験した患者で確認される。野生型ＩＬ−１β遺伝子において、Ｔは−３１の位置に見出される。このＴはＩＬ−１βの転写開始に決定的な役割を果たすＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡＡＡＡ）の一部であるため、ＩＬ−１βの発現のために非常に重要である。一般に、ＴＡＴＡボックス配列は、転写が正しい位置で始まることを確かなものとするために、遺伝子内の正しい位置に転写機構を供給し、位置を定めることに関わっている。位置（−３１）でのＴ→Ｃ多形はこの重要なＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡＡＡＡからＣＡＴＡＡＡＡへ）を崩壊させて不活性化し、ＩＬ−１β遺伝子転写の効率的な開始を禁止する。この変化したＩＬ−１βＴＡＴＡボックス配列への転写機構の結合欠如はすでに示されている。上記参照：El-Omar。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ＬＤＬレセプター発現の上昇は、細胞内に取込まれるコレステロール量の増加につながり、その結果、血中の総コレステロールレベルが低下する。これはこの薬物が後期Ｇ１を経てＳに入る細胞の発展に必要な生化学的経路を阻害することが示されているため、ＲＡＤ（エベロリムス）に関連性をもつ。重要なことは、この過程にはＥＲＫの関与が示されていることである。それ故、ＥＲＫ活性はエベロリムスにより低下させることが可能である。エベロリムスはＥＲＫ活性を阻害するため、ＬＤＬレセプターの発現がＩＬ−１βの発現から独立してすべての患者で低下し、その結果、ＬＤＬのレベルを低下させ、したがって、エベロリムスを服用した患者の総コレステロールを低下させる。エベロリムスがＥＲＫの活性化を完全に阻害することはありそうにない。それ故、ＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）およびＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者は、ＬＤＬレセプターの一部発現を誘導することができる。しかし、これらの患者はＩＬ−１βのレベルが非常に低い、そのため、ＬＤＬレセプターの発現が低く、その結果、細胞内に取込まれるコレステロール量が低下し、血中コレステロールレベルが上昇する。したがって、この説明はＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者に観察される最高レベルのコレステロールの説明となる。有意義なことは、ＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型に相当するＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型をもつ患者は、他のＩＬ−１β遺伝子型をもつ患者に比較して、有意に高いＬＤＬ（ｐ＝０.０１５９）を有することであった（図３および表４）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
特に好適な態様において、多形の検出は、いわゆるインベーダー（INVADERTM）技法（サード・ウエーブ・テクノロジーズ・インク（ＴＷＴ、マジソン、ウィスコンシン）から入手可能）により実施し得る。本アッセイ法において、特異的上流“インベーダー”オリゴヌクレオチドおよび部分的に重なり合う下流のプローブが共に相補性ＤＮＡ鋳型に結合したとき、特異的構造を形成する。この構造をクリバーゼ（Cleavase）酵素が特定の部位で認識し、切断する；その結果、プローブオリゴヌクレオチドの５’フラップを放出する。次いで、このフラグメントが反応混合物に含まれる合成二次標的と二次蛍光標識シグナルプローブに関し、“インベーダー”オリゴヌクレオチドとして作用する。これがクリバーゼ酵素による二次シグナルプローブの特異的開裂を生じる。蛍光共鳴エネルギー移動し得る色素分子で標識したこの二次プローブが開裂するとき、蛍光シグナルを発生する。クリバーゼ酵素は重なり合うＤＮＡ配列またはフラップにより形成される構造に相関した緊縮要件を有し、それ故、下流ＤＮＡ鎖上、開裂部位の直ぐ上流の単一塩基対ミスマッチを特異的に検出するために使用し得る。参照：Ryan et al., Molecular Diagnosis, Vol. 4, No 2, pp. 135-144 （1999）; and Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 （1999）; 参照関連米国特許第５,８４６,７１７号および６,００１,５６７号公報（これらの開示はその全文を参照により本明細書の一部とする）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本明細書にて使用する場合、“ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ”とは、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１および−３１位置での多形の組合せからなるハプロタイプをいうものとし、これらのハプロタイプは以下の方法で命名するものとする；ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でＣからＴへの多形（配列Ｘ０４５００の位置１４２３）およびＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でＴからＣへの多形（配列Ｘ０４５００の位置１９０３）の両方がＩＬ−１β遺伝子の１コピーに存在する場合、ハプロタイプは“高コレステロール”と呼ぶものとする。逆に、これら多形の両方がＩＬ−１β遺伝子の所定のコピーに存在せず、したがって、このＩＬ−１β遺伝子の部位―３１のヌクレオチドがＴであり、このＩＬ−１β遺伝子の部位−５１１のヌクレオチドが、ＩＬ−１β遺伝子においてＣである場合、ハプロタイプは記載の染色体中において“低コレステロール”と呼ぶものとする。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
当業者であれば容易に認めるように、個体のクローンは個体に存在する２つのＩＬ−１β遺伝子コピーの１つについて、ハプロタイプの情報を提供するだけである。ハプロタイプの情報が個体の他のコピーについて欲しい場合には、追加のＩＬ−１βクローンを試験する必要がある。一般的に、個体におけるＩＬ−１β遺伝子の両コピーについてハプロタイプ決定する確率を９０％以上とするためには、少なくとも５つのクローンを試験すべきである。特に好適な態様においては、各多形部位でのヌクレオチドを同定する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
好適な態様において、ＩＬ−１βハプロタイプ対は、個体に存在するＩＬ−１β遺伝子の各コピーにおける１ヶ所以上の多形部位でのヌクレオチドの位相配列を同定することにより、個体について判定する。特に好適な態様において、ハプロタイプ決定法は、ＩＬ−１β遺伝子の各コピーにおける各多形部位でヌクレオチドの位相配列を同定することを含む。遺伝子の両コピーについてハプロタイプ決定する場合、同定ステップは、好ましくは別個の容器に収容した遺伝子の各コピーにより実施する。しかし、２つのコピーが異なるタグ標識で標識してあるか、またはさもなくば別々に識別し得るかもしくは同定し得る場合、ある場合には同じ容器中でこの方法を実施することが可能であるとも想定し得る。たとえば、遺伝子の第一および第二コピーをそれぞれ異なる第一および第二蛍光色素により標識し、さらに第三の異なる蛍光色素で標識した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用して多形部位（１または複数部位）をアッセイする場合、第一および第三色素の組合せを検出することで第一遺伝子コピー中の多形を同定し、一方、第二および第三色素の組合せを検出することで第二遺伝子コピー中の多形を同定する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
また、ポリメラーゼ仲介プライマー伸張法を用いて多形を同定することもできる。かかる方法の幾つかは特許および科学文献に記載されており、“遺伝的ビット分析”法（国際特許出願ＷＯ９２／１５７１２号公報）およびリパーゼ／ポリメラーゼ仲介遺伝的ビット分析（米国特許第５,６７９,５２４号公報）を包含する。関連方法は国際特許出願ＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許第５,３０２,５０９および５,９４５,２８３号公報に開示されている。多形を含む伸張プライマーは米国特許第５,６０５,７９８号公報に記載されているように質量分析法により検出し得る。もう一つのプライマー伸張法は対立遺伝子特異的ＰＣＲである。参照：Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 17, p.8392 （1989）; Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 19, pp. 6877-6882 （1991）; WO93/22456;および Turki et al., J. Clin. Invest., Vol. 95, pp. 1635-1641 （1995）。さらに、多重多形部位はワレイスら（Wallace et al. （ＷＯ８９／１０４１４））が記載しているように、対立遺伝子特異的プライマーのセットを用いて核酸の多重領域を同時に増幅することにより検討し得る。