【手続補正書】
【提出日】平成17年12月20日(2005.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、糖残基を脂質連結オリゴ糖構造の１，６アームに移動させる宿主細胞において、１種以上の酵素の活性を減退させるかまたは減少させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞に少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのグリコシダーゼ活性は、マンノシダーゼ活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−グリカンを産生する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２構造を有し、ここでＸは、３、４または５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記宿主細胞内で１種以上の酵素活性を発現させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を作製する工程をさらに包含し、該酵素活性は、グリコシダーゼ活性およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から選択される、方法。
【請求項７】
前記活性は、α−１，２マンノシダーゼ活性、α−１，３マンノシダーゼ活性およびＧｎＴＩＩ活性から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１種の減退または減少された酵素は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素；ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記減退または減少された酵素は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１０】
前記酵素は、該酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の変異によって減退されるかまたは減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異は、前記酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の部分的な欠損または全体的な欠損である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質は、７個またはそれより少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質は、３個またはそれより少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖タンパク質は、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースからなる群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖タンパク質は、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主は、下等真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞は、以下：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞は、開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性の発現をさらに欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は、ＧｎＴＩ活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、インビトロにおいて、前記単離された糖タンパク質を、少なくとも１種のさらなるグリコシル化反応に供し、続いて前記宿主からの単離に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の産生に関与する１種以上の酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の酵素は、マンノシダーゼ活性を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記酵素は、α−１，２−マンノシダーゼ活性を有し、かつマウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に由来する、方法。
【請求項２７】
前記酵素は、α−１，３−マンノシダーゼ活性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコシルトランスフェラーゼ活性は、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１種の酵素は、該酵素の触媒ドメインと細胞標的シグナルペプチドとの間で融合タンパク質を形成することによって局在化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記融合タンパク質は、少なくとも１つの遺伝子構築物によってコードされ、該遺伝子構築物は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントとのインフレームでの結合によって形成される、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記コードされた標的シグナルペプチドは、マンノシルトランスフェラーゼ、ジホスファターゼ、プロテアーゼ、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＧａｌＴ、ＦＴ、およびＳＴからなる群のメンバーに由来する、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記触媒ドメインは、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびＳＴからなる群のメンバーに由来する、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、かつ該触媒ドメインは、細胞小器官内の他の代表的な酵素の平均最適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に最適ｐＨを有し、該細胞小器官おいて、該酵素は、局在化されるか、または該触媒ドメインは、５．１と８．０との間のｐＨにて最適な活性を有する、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記核酸分子は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、方法。
【請求項３５】
前記宿主は、ＧｎＴＩ活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法であって、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性またはドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３９】
前記核酸分子は、α−１，２マンノシダーゼ、ＵＤＰ  ＧｌｃＮＡｃトランスポーターおよびＧｎＴｌからなる群より選択される少なくとも１種の酵素をコードする、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記欠損している宿主細胞に、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２構造をＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に転換するためのα−１，３マンノシダーゼ活性またはα−１，２／α−１，３マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の酵素は、ＧｎＴＩＩである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞に、グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の哺乳動物グリコシル化酵素をコードする少なくとも１種の核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、宿主細胞をＤＮＡライブラリーで形質転換して、該ライブラリーから誘導された少なくとも１種のグルコシル化酵素を発現する、遺伝学的に混合された細胞集団を作製する工程をさらに包含し、該ライブラリーは、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、該構築物のうちの少なくとも一方は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含み、該細胞標的シグナルペプチドは、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントと、インフレームで結合される、方法。
【請求項４５】
請求項１または４４に記載の方法によって産生される、宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１または４４に記載の方法によって産生される、ヒト様糖タンパク質。
【請求項４７】
図６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ  ３遺伝子）の少なくとも４５個連続するヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる、核酸分子。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４９】
請求項４７に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項５０】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞であって、ここで、図６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ  ３遺伝子）の配列は変異しており、それによって、該細胞のグリコシル化パターンが変更される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞。
【請求項５１】
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてα−１，３グリコシルトランスフェラーゼ活性を増加させる工程を包含する、方法。
【請求項５２】
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてオリゴ糖トランスフェラーゼ活性の基質特異性を減退させる工程を包含する、方法。
【請求項５３】
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有する免疫グロブリンポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５４】
分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを産生する、非哺乳動物宿主細胞。
【請求項５５】
請求項５４に記載の宿主細胞によって産生される、免疫グロブリン。
【請求項５６】
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５７】
分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するポリペプチドを産生する、非ヒト宿主細胞。
【請求項５８】
請求項５７に記載の宿主細胞によって産生される、ポリペプチド。
【請求項５９】
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞から、ａｌｇ遺伝子活性を減退または減少させる工程、および該宿主細胞に少なくとも１種のグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
トリマンノースコアに結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するヒト様糖タンパク質を産生するための、方法。
【請求項６１】
組成物であって、該組成物は、糖タンパク質を含有し、該糖タンパク質は、それに結合したＮ−グリカン構造を有し、該Ｎ−グリカン構造は、基本的に以下のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化１】
2005514021.tif 000001
から構成される、組成物。
【請求項６２】
組成物であって、該組成物は、糖タンパク質を含有し、該糖タンパク質は、それに結合したＮ−グリカン構造を有し、該Ｎ−グリカン構造は、基本的に以下のＧｌｃ３Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化２】
2005514021.tif 000002
から構成される、組成物。
【請求項６３】
請求項６１または６２に記載の組成物であって、前記糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞において産生され、該下等真核生物宿主細胞は、糖残基を脂質連結オリゴ糖構造の１，６アームに移動させる宿主細胞中の、１種以上の酵素の活性を減退させるかまたは減少させている、組成物。
【請求項６４】
請求項６１または６２に記載の組成物であって、前記糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞において産生されており、該下等真核生物宿主細胞は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ活性を有する酵素の活性を減退させるかまたは減少させている、組成物。
【請求項６５】
請求項６１、６２、６３または６４に記載の組成物であって、前記宿主細胞は、以下：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ    ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、組成物。
【請求項６６】
請求項６１に記載の組成物であって、該組成物中の前記糖タンパク質は、フコースを欠く、組成物。
【請求項６７】
請求項１６に記載の方法によって産生されるヒト様糖タンパク質であって、該糖タンパク質は、フコースを欠く、ヒト様糖タンパク質。
【請求項６８】
請求項４４に記載の方法によって産生されるヒト様糖タンパク質であって、前記宿主は、下等真核生物細胞であり、そして該糖タンパク質は、フコースを欠く、ヒト様糖タンパク質。
【請求項６９】
請求項５５に記載の免疫グロブリンであって、前記宿主細胞は、下等真核生物細胞であり、該免疫グロブリンは、フコースを欠く、免疫グロブリン。
【請求項７０】
請求項５８に記載のポリペプチドであって、前記宿主細胞は、下等真核生物細胞であり、該ポリペプチドは、フコースを欠く、ポリペプチド。