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　特願２０００−５０４２３９「ヒト細胞におけるヒト変異型タンパク質の相同的組換えによる生産」拒絶査定不服審判事件〔平成１１年　２月　４日国際公開、ＷＯ９９／０５２６４、平成１３年　８月１４日国内公表、特表２００１−５１１３４１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯 ・本願発明
　本願は、１９９８（平成１０）年７月２２日を国際出願日（パリ条約による優先権主張１９９７年７月２３日、欧州特許庁）とする出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２０年６月１８日付で補正された特許請求の範囲の請求項１に記載される以下のとおりのものである。
　
「ヒトポリペプチドのミュテインを生産する方法であって、
　(i) 内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸配列を含む染色体を２より多く含むヒト細胞に、相同的組換えが可能な核酸分子を導入し、ただし、該核酸分子は、
　　(a) 標的核酸配列の遺伝子座にある配列に相同であり、かつ内在性標的核酸配列と比べて成熟標的ポリペプチドのコード領域に突然変異を有する少なくとも１つの配列部分、
および
　　(b) 選択マーカーをコードする核酸部分、
を含むものであり、
　(ii) 該細胞を、導入された核酸分子の相同的組換えが起こる条件下で培養し、それにより該細胞が相同的組換え後に標的ポリペプチドのミュテインを発現することを可能にする変異型標的核酸配列を含み、
　(iii) 相同的組換えが起こった細胞を選択し、そして
　(iv) 該細胞および／または細胞上清からミュテインを単離する、
ことを含んでなる方法。」（以下、「本願発明１」という。）
　
　
第２　引用例
１．当審における拒絶理由通知において引用された、本願の優先日前の１９９６年４月３０日に頒布された刊行物である引用例１「特表平８−５０３８５６号公報」には、下記の事項が記載されている。（下線は合議体による。）
　
（ア）「２．脊椎動物起原の細胞のゲノムＤＮＡにＤＮＡ配列をターゲティングする方法であって、下記の工程を含む方法、
ａ）以下のものを含むＤＮＡ構築物を供給する工程、
    １）脊椎動物起原の細胞内で発現させようとする産物をコードする外因性ＤＮＡ：
    ２）脊椎動物起原の細胞内のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列、および
    ３）それを指標として増幅コピーの選択を実施できるようなマーカーをコードする増幅可能なＤＮＡ配列、
ｂ）（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物を脊椎動物起原の細胞中に導入し、それにより（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物を含む細胞を作成する工程、
ｃ）（ｂ）で作成された細胞を、ゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列との間で相同組換えが起こるのに適した条件下に保持し、それにより該細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた（ａ）のＤＮＡ構築物を有する脊椎動物起原の相同組換え細胞を作成する工程、
ｄ）（ｂ）で作成された相同組換え細胞を、選択マーカーをコードする増幅可能なＤＮＡの増幅を選択させる条件下で培養し、これにより選択マーカーをコードする増幅可能なＤＮＡおよび（ａ）（１）の外因性ＤＮＡを共増幅させ、それにより選択マーカーをコードする増幅されたＤＮＡと共増幅された外因性遺伝子とを含有する相同組換え細胞であって、共増幅された外因性遺伝子を発現することができる細胞を作成する工程。・・・
６．該脊椎動物細胞が不死化細胞（immortalized cell）である請求項１または請求項２記載の方法。・・・
８．該不死化細胞がヒト起原のものである請求項６記載の方法。
９．選択マーカーをコードする増幅可能なＤＮＡが、ジヒドロフォレートリダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびＣＡＤからなる群より選択される選択マーカーをコードするものである請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。・・・
１６．発現させるべき内因性遺伝子または外因性遺伝子が治療目的の産物をコードするものである請求項１〜請求項８いずれか１項記載の方法。・・・
２０．選択マーカーをコードする増幅可能なＤＮＡが、ジヒドロフォレートリダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびＣＡＤからなる群より選択される選択マーカーをコードするものである請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。２０．発現させるべき遺伝子が、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム、並びに自然に現れないタンパク質や核酸からなる群より選択される産物をコードするものである請求項１６〜請求項１９いずれか１項記載の方法。・・・
２１．内因性遺伝子または外来遺伝子がヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、ヒトインスリノトロピン、およびエリスロポエチンからなる群より選択される治療目的の産物をコードするものである請求項２０記載の方法。・・・
２９．治療目的のタンパク質の発現に適した条件下で請求項９記載の相同組換え細胞を培養することを含む、
治療目的のタンパク質のインビトロ生産方法
　
（イ）「本発明の方法によるタンパク質製造または遺伝子治療に有用な不死化ヒト細胞系の例としては、ＨＴ１０８０、
ＨｅＬａ
　
（ウ）「トランスフェクトする（transfecting）ＤＮＡがEPOの上流の相同領域をターゲットした細胞では、mMTプロモーターの制御下でEPOを発現するであろう。10日後、すべてのウエルの
上清
分離
　
（エ）「とくに、外因性ＤＮＡは以下のもののうちの１種をコードすることができる。すなわち、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、エリスロポエチン、アルファ−１型アンチトリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、成長ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅもしくはアポリポタンパク質Ａ−Ｉ）、ＩＬ−２受容体およびその拮抗剤、インスリン、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン類、インスリン様成長因子類、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答物質修飾因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびコロニー剌激因子、そ
して改良され、または新規な生物学的諸性質あるいはインビボで一層望ましい半減期や代謝回転数を有するこれらのタンパク質の改変体
　
（オ）「一次、二次、または不死化細胞にトランスフェクトされたＤＮＡは目的産物全体をコードすることができるが、
該産物のたとえば単数または複数の活性部分または機能性部分をコードすることもできる
　
（カ）「
タンパク質をコードするドメインを置換するためにターゲティングが用いられる状況下では、一つのポリペプチド中に二以上のタンパク質由来の構造的、酵素的、またはリガンド結合、受容体結合的諸性質が結合されているキメラ的多機能タンパク質が製造可能である
　
（キ）「外因性ＤＮＡ、ターゲティング配列および選択マーカーは単一のＤＮＡ構築物上または別々の構築物上にのせて細胞に導入することができる。・・・
外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡと相同組換えを起こすのに十分な相同性を有する構築物の場合、該構築物は単一の成分すなわち外因性ＤＮＡを含む
外因性ＤＮＡは相同性ゆえにゲノムＤＮＡ中への組み込みをターゲティングする（target integation）役目も果たし、追加のターゲティング配列は不要である
常在性ＤＮＡ配列
置換
　
（ク）「トランスフェクト細胞の用途
  本明細書で説明する方法およびＤＮＡ構築物を用いて作成された細胞は様々な目的に用いることができる。１）
レシピエント細胞中にすでに存在するＤＮＡが修復、変化、欠失、または置換
遺伝子の全体または一部が修復、変化、欠失、または置換
　
（ケ）「実施例２．ヒトの成長ホルモンとエリスロポエチンの配列が融合されたキメラ型転写単位を生じさせるターゲティングプラスミドの構築
  以下、得られたままのトランスフェクトされていない状態では検出可能な量のＥＰＯを発現しないような一次あるいは二次の線維芽細胞株において、ヒトＥＰＯ遺伝子の上流に位置する本来の調節配列をｈＥＰＯの発現が可能なように変化させる、という本発明の二つのさらなる態様を説明する。これらの態様において、ターゲティング事象の結果物は、ヒト成長ホルモン遺伝子第１エキソンがＥＰＯのエキソン２−５の上流に位置するようなキメラ型転写単位である。転写、スプライシングおよび翻訳の産物は、ｈＥＰＯのシグナルペプチドのアミノ酸１−４がｈＧＨのアミノ酸残基１−３に置き変わったタンパク質である。２つの態様は、挿入される外来の調節配列の相対的な位置と、プロセッシングされた最終転写産物を生産するのに必要なスプライシングの特異的なパターンは、両者に関して異なる。
  プラスミドpXEPO-10は、ヒトの第７染色体上の内因性ｈＥＰＯ遺伝子へのジーンターゲティングにより、hEPOのエキソン１をhGHのエクンン１で置き換えるためにデザインされる。・・・
  プラスミドpXEPO-11は、ヒト第７染色体上の内因性のhEPO座にあるhEPOの構造遺伝子およびプロモーター領域の上流に、mMT-ＩプロモーターとhGHのエキソン１を配置するように、ジーンターゲティングによりデザインされる。・・・
  プラスミドpXEPO-10は、hEPOの配列を両側に連結したmMT-I/hGH融合物を含む7.3ｋｂの断片をBamHIとXhoIで消化することにより、ジーンターゲティングに使用し得る。この断片（ターゲティング断片１）はhEPOのコード配列を含んでおらず、ヒトのEPOの遺伝子座へのターゲティングを方向づけるための、hEPOのコード領域の上流-620から約-6620の間にある配列とhEPOイントロン１の配列のみを有している。ターゲティング断片１を、実施例１ｃで述べられているのと同様の条件を用いて一次あるいは二次のヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。G418に耐性のコロニーを選んで96ウエルプレートの各ウエルに入れ、ELISAアッセイ（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリスMN）によりEPOの発現をスクリーニングする。トランスフェクトする（transfecting）ＤＮＡがランダムにヒトゲノム中に組み込まれた細胞は、EPOを産生することができない。トランスフェクトするＤＮＡが、内因性のhEPOイントロン１およびhEPO上流配列と相同組み換えをおこした細胞は、mMT-Iのプロモーター及び非転写配列、並びにhGHの５’非翻訳配列及びhGHエキソン１が正常のhEPOのプロモーター及びhEPOエキソン１と置換したキメラ遺伝子を含んでいる（図５参照）。ターゲティング断片１中の非hEPO配列は、hEPOイントロン１の下流のhEPO配列に結合している。天然のhEPO調節領域のmMT-Iプロモーターによる置換は、本来ならEPOを発現しない線維芽細胞中のEPO遺伝子を活性化するであろう。
hEPOエキソン１のhGHエキソン１による置換により、hEPOシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がhGHのアミノ酸1-3で置換されているタンパク質が得られる。そしてこの置換は、翻訳後のプロセッシングにより成熟したタンパク質から除かれ、発現細胞から分泌される機能的なキメラのシグナルペプチドを形成する
　
２．当審における拒絶理由通知において引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物である引用例２「信州医学雑誌,1967,Vol.16,No.1,p.101-108」には、Ｈｅｌａ細胞系の核型は三倍性から四倍性の間に分布していることが記載されている。
　
　
第３　対比
１．引用例１に記載された発明
　上記記載事項（ア）〜（ケ）からみて、引用例１には、
「ヒトポリペプチドを生産する方法であって、
(i) 標的核酸配列を含む不死化ヒト細胞に、相同的組換えが可能な核酸分子を導入し、ただし、該核酸分子は、
　(a)該細胞のゲノムＤＮＡ配列に相同な部分 、および
　(b) 選択マーカーをコードする核酸部分、
を含むものであり、
(ii) 該細胞を、導入された核酸分子の相同的組換えが起こる条件下で培養し、それにより該細胞が相同的組換え後に標的ポリペプチドを発現することを可能にする標的核酸配列を含み、
(iii) 相同的組換えが起こった細胞を選択し、そして
(iv) 該細胞から標的ポリペプチドを単離する方法。」
が記載されているものと認められる。
　
２．対比
　本願発明１と引用例１に記載された発明を対比すると、両者は、
ヒトポリペプチドを生産する方法であって、
(i) 標的核酸配列を含むヒト細胞に、相同的組換えが可能な核酸分子を導入し、ただし、該核酸分子は、
　　(a) 該細胞のゲノムＤＮＡ配列に相同な部分、および
　　(b) 選択マーカーをコードする核酸部分、
を含むものであり、
(ii) 該細胞を、導入された核酸分子の相同的組換えが起こる条件下で培養し、それにより該細胞が相同的組換え後に標的ポリペプチドを発現することを可能にする標的核酸配列を含み、
(iii) 相同的組換えが起こった細胞を選択し、そして
(iv) 該細胞から標的ポリペプチドを単離する、
ことを含んでなる方法である点で一致し、下記の点で相違する。
　
相違点１：相同組換えされるヒト細胞は、本願発明１では、「染色体を２より多く含む」ものであるのに対し、引用例１では、不死化ヒト細胞として、Ｈｅｌａ細胞を用いることができることが記載されているが、染色体を２より多く含むものを用いることが明記されていない点
　
相違点２：本願発明１は、ミュテインを生産する方法であって、相同組換えが可能な核酸分子は、「内在性標的核酸配列と比べて成熟標的ポリペプチドのコード領域に突然変異を有する」ものであるのに対し、引用例１には、ミュテインを生産することについては明記されていない点
　
相違点３： 本願発明１では、相同組換えされる細胞は、「内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸配列を含む」ものであって、相同組換えのためのターゲット領域が、「内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸配列の遺伝子座にある配列に相同な部分」であるのに対し、引用例１では、相同組換えされるヒト細胞が、内在性標的ポリペプチドをコードするものであるか明記されておらず、また、相同組換えのためのターゲット領域が特定されていない点
　
第４　当審の判断
１．相違点１について
　引用例１の記載事項（イ）には、相同組換えされる不死化ヒト細胞として、Ｈｅｌａ細胞が記載されており、 本願明細書の実施例において用いられたのも、Ｈｅｌａ細胞であること、引用例２に記載されるように、Ｈｅｌａ細胞は染色体数が２より多く含むものであることから、相違点１は実質的な相違点とはいえない。
　
２．相違点２について
　上記記載事項（エ）及び（オ）を考慮すれば、引用例１に記載されたポリペプチドの生産方法において、より生物学的性質が改良されたポリペプチドの改変体やポリペプチドの機能性部分、すなわち、ミュテインを生産するようにすることは、当業者が容易に想起することであり、その際、細胞に導入する核酸分子に、「標的ポリペプチドのコード領域に突然変異を有する配列部分」を含むようにすることは、当業者が容易に想到し得ることである。
　
３．相違点３について
　引用例１の記載事項（カ）及び（ク）には、細胞に含まれる内在性標的ポリペプチドをコードする遺伝子を相同組換えにより改変することが記載されている。
　また、引用例１の記載事項（キ）には、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡである外因性ＤＮＡが、内在性遺伝子と相同性を有する場合は、相同組換えのためのターゲティングの役目も果たすことができることが記載されており、この場合、相同組換えのターゲット領域は、「内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸配列の遺伝子座にある相同な部分」であるといえる。
　さらに、引用例１の記載事項（ケ）には、実施例として、内在性エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を有するが、ＥＰＯを発現しない細胞において、内在性ＥＰＯ遺伝子の遺伝子座にある配列に相同な部分をターゲット領域とする相同組換えにより、ＥＰＯ遺伝子の上流に位置する調節配列とともに、内在性ＥＰＯ配列のエキソン１をヒト成長ホルモン配列のエキソン１に置換して、機能的なキメラシグナルペプチドを作り出し、成熟タンパク質としてＥＰＯを得ることが記載されている。この実施例において、置換されたシグナルペプチドは、タンパク質として発現した後、プロセッシングにより除かれるものではあるが、ＥＰＯを標的ポリペプチドとしたときに、内在性ＥＰＯ遺伝子の一部を相同組換えにより置換することにより、発現するタンパク質を改変することを開示するものである。
　このように、引用例１には、相同組換えされる細胞は、内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸配列を含むものを用いることが記載されており、また、相同組換えのためのターゲット領域を内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸の遺伝子座にある配列に相同な部分とすることも記載されていることを考慮すれば、引用例１に記載された発明において、相同組換えされる細胞として、内在性標的ポリペプチドをコードするものを用いること、及び、相同組換えのためのターゲット領域を、内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸の遺伝子座にある配列と相同な部分とすることは、当業者が容易に想到し得ることである。
　
　
　さらになお、細胞に含まれる内在性遺伝子において、成熟ポリペプチドのコード領域に、相同組換えにより変異を導入することは本願優先日前における周知技術であったことを考慮すると（要すれば、例えば、MANSOUR S.L.,Genet.Anal.Tech.Appl.,1990,Vol.7,No.8,p.219-227の特にp.219左欄下８行〜下２行、ROBERTSON E.J.,Biol.Reprod.,1991,Vol.44,No.2,p.238-245の特に表１、Ｉ．及びp.243「Using homologous recombination to disrupt genes」の項、RUBINSTEIN M.et al.,Nucleic. Acids Res.,1993,Vol.21,No.11,p.2613-2617、WALDMAN A.S.,Critical Reviews in  Oncology/Hematology,1992,Vol.12,p.49-64の特にp.50「II Introduction」、p.52-53「IV-A. Targeting natural loci」の項、STEEG C.M. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,Vol.87,p.4680-4684、及び、KIDO M. et al.,Cell Struct.Funct.,1991,Vol.16,p.447-453（原審の拒絶理由の引用例１）参照。）、引用例１に記載された発明において、相同組換えされる細胞として、内在性標的ポリペプチドをコードするものを用いること、及び、相同組換えのためのターゲット領域を、内在性標的ポリペプチドをコードする標的核酸の遺伝子座にある配列と相同な部分として、「成熟標的ポリペプチドのコード領域に突然変異を有する配列部分」を細胞に導入することは、当業者が容易に想到し得ることであるともいえる。
　
４．本願発明１の効果について
　本願発明１の効果について、本願明細書の段落番号【００１２】には、「標的遺伝子が存在する染色体数が増加している出発細胞を使用すると、増大した収量の変異型ヒトタンパク質を産生する細胞を作製され得る」と記載されているものの、本願明細書において、実施例をもって当該効果が具体的に示されているわけではないから、当該効果は、本願発明１の進歩性を判断するにあたり参酌することはできない。
　
　また、当該効果は、以下に述べるように、当業者が容易に予測することができる範囲のものでもあるといえる。
　引用例１には、核酸分子を導入する細胞として、染色体数が増加しているＨｅｌａ細胞が記載されている。
　ところで、一般に、遺伝子のコピー数が増減することにより、その遺伝子の発現量も比例して増減することは周知技術である（必要であれば、「生物学辞典」，株式会社岩波書店，１９９７年４月１０日，第４版，第７９頁「遺伝子量効果」参照）。
　引用例１に記載されたＨｅｌａ細胞は、染色体数が増加しているから、当該細胞に相同組換えにより遺伝子を導入すれば、当該遺伝子のコピー数も増加しているといえ、上記周知技術を考慮すれば、遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドの収量も増大しているものと認められる。
　よって、本願発明１の効果は、従来技術から当業者が予測し得る範囲のものである。
 　
　以上のとおりであるから、本願発明１は、引用例１に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものである。 
　
５．請求人の主張
（１）請求人は、平成２４年２月１日付意見書において、以下のように主張している。
ア「審判官殿は、引用例１に記載されたＨｅｌａ細胞は、本願発明の「染色体を２より多く含むヒト細胞」に相当する、と判断しています。確かに、Ｈｅｌａ細胞は一部の染色体数が増加しているものの、引用例１においてＨｅｌａ細胞は、単に不死化ヒト細胞系の一例として挙げられているだけであり、染色体数が増加している細胞として何ら言及されていません。すなわち、引用例１は本願発明のコンセプトであるところの、標的核酸配列を含む染色体を２より多く含む細胞を出発細胞として使用することによって、細胞における標的タンパク質の生産を増大させることについて、何ら教示・示唆するものではありません。」
　
イ「引用例１においては、本願発明に係るこの種の相同組換えの手法、すなわち、ポリペプチドをコードする核酸を含む外因性のＤＮＡが相同組換えにより、内在性遺伝子の位置に特異的に挿入されること、は明確に述べられていません。引用例１に記載のターゲティング方法おいては、外因性のＤＮＡが含む細胞内のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列が如何なるものであるのか明確に特定されていません。したがって、引用例１に記載のターゲティング方法おいては、従来技術と同様に、導入されるＤＮＡは細胞のゲノムに部位非特異的に組み込まれ得るものであり、本願発明のように、導入されるＤＮＡを、内在性遺伝子の位置に特異的に挿入することを意図するものではないと思料します。」
　
（２）請求人の主張について
主張アについて
　Ｈｅｌａ細胞が本願発明１の「染色体を２より多く含むヒト細胞」に相当する以上、請求人が主張する点は、実質的な相違とはいえない。
　そして、実質的な相違でない以上、引用例１に記載されたＨｅｌａ細胞を用いた標的タンパク質の生産方法は、本願発明１と同じ効果を奏するはずである。
　さらに、請求人が主張する、標的核酸配列を含む染色体を２より多く含む細胞を出発細胞として使用することによって、細胞における標的タンパク質の生産を増大させるという効果は、前記４．で述べたとおり、本願明細書において、実施例をもって具体的に確認されているわけではないから、本願発明１の進歩性を判断するにあたり参酌することはできないし、また、本願発明１の効果は、周知技術を考慮すれば、当業者が予測し得る範囲のものでもある。
　
主張イについて
　前記３．で述べたように、引用例１の記載事項（カ）〜（ケ）によれば、引用例１には、標的ポリペプチドをコードする核酸を含む外因性ＤＮＡが相同組換えにより、内在性遺伝子の位置に特異的に挿入することは記載されているから、請求人が主張するように、引用例１に記載のターゲティング方法は、細胞のゲノムに非特異的に組み込まれるものではない。
　
　よって、請求人の主張は採用することができない。
　
　
第５　むすび
　したがって、本願発明１は、引用例１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
　
　よって、結論のとおり審決する。