【手続補正書】
【提出日】平成18年10月30日(2006.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
養子免疫治療薬の製造方法であって、
第１のハウスキーピングエピトープを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現する単離されたＴ細胞であって、前記ハウスキーピングエピトープは第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する、単離されたＴ細胞を、薬学的に許容可能なアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と合わせることを含む方法であって、
前記Ｔ細胞は最初はドナーから得られたものであり、
前記ドナーはあらかじめ前記第１の抗原に曝露されている、
方法。
【請求項２】
養子免疫治療薬の製造方法であって、
第１のハウスキーピングエピトープを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現する単離されたＴ細胞であって、前記ハウスキーピングエピトープは第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する、単離されたＴ細胞を、薬学的に許容可能なアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と合わせることを含む方法であって、
前記Ｔ細胞は最初はドナーから得られたものであり、
前記ドナーは供与前に前記ハウスキーピングエピトープをワクチン接種されている、
方法。
【請求項３】
養子免疫治療薬の製造方法であって、
第１のハウスキーピングエピトープを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現する単離されたＴ細胞であって、前記ハウスキーピングエピトープは第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する、単離されたＴ細胞を、薬学的に許容可能なアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と合わせることを含む方法であって、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記Ｔ細胞を培養する工程をさらに含む、
方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞がＴ細胞クローンに含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞がＴ細胞のポリクローナル集団に含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作により産生される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞が免疫化した動物から単離される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞は前記ＭＨＣ−ペプチド複合体への曝露により刺激されて増殖する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞はサイトカインへの曝露により刺激されて増殖する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養はｐＡＰＣ、アジュバントまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＡＰＣは樹状細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アジュバントはＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＣＧ、破傷風トキソイド、オステオポンチン／ＥＴＡ−１、ＣＤ４０リガンドおよびＣＴＬＡ−４遮断剤からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
クラスターが標的に関連した抗原に由来し、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有する少なくとも２つの配列を含むかまたはコードするエピトープクラスターであって、該クラスターは抗原の断片であり、該クラスターは、構造式：
【化１】
2005514029.tif 000001
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
ａはＰ２1およびＰ２N間のアミノ酸の数を示し、そして（｜ｂ｜−１）はＰ２NおよびＰΩ1間のアミノ酸の数を表し、
Ｐ２1は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２Nは第Ｎ番目のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
ＰΩ1は前記第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
ＰΩNは前記第Ｎ番目のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、
２≦Ｎ≦Ｎｃであり、Ｎは該クラスターの前記第Ｎ番目のエピトープを示し、Ｎｃは該クラスター中のエピトープの総数を示し、
ａNおよびｂNは前記第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定する）
を有するエピトープクラスター。
【請求項１４】
（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）であり、前記クラスターおよび前記抗原はそれぞれある長さを有し、式中、Ｌｃは前記クラスターの長さであり、Ｌｐは前記抗原の長さであり、そしてＮｐは前記抗原中のエピトープの総数である、請求項１３に記載のエピトープクラスター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のエピトープクラスターを含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が前記抗原のアミノ酸配列の約８０％以下からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドを含む、ワクチンまたは免疫治療薬製品。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ワクチンまたは免疫治療薬製品。
【請求項１９】
ＤＮＡである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ＲＮＡである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
開示する本発明の別の実施形態は、エピトープクラスターを同定する方法であって、標的細胞に関連した抗原の配列を提供する工程、推定ＭＨＣエピトープを同定するために、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性に基づいて、上記配列内の候補ペプチドをスコア付けする(score)工程、および上記抗原内の領域であって、少なくとも２つの推定ＭＨＣエピトープを含み、全体として該抗原中の推定ＭＨＣエピトープ密度よりも高い推定ＭＨＣエピトープ密度を含む領域を同定する工程を含む方法に関する。
別の実施形態は、エピトープクラスターに関する。クラスターは、標的に関連した抗原に由来し得る。クラスターは、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有する少なくとも２つの配列を含むかまたはコードし得る。クラスターは、例えば抗原の断片であり得る。クラスターは、以下の構造式：
【化２】
2005514029.tif 000002
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
ａはＰ２1およびＰ２N間のアミノ酸の数を示し、そして（｜ｂ｜−１）はＰ２NおよびＰΩ1間のアミノ酸の数を表し、
Ｐ２1は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２Nは第Ｎ番目のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
ＰΩ1は第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
ＰΩNは第Ｎ番目のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、
２≦Ｎ≦Ｎｃであり、Ｎはクラスターの第Ｎ番目のエピトープを示し、Ｎｃはクラスター中のエピトープの総数を示し、
ａNおよびｂNは第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定する）
を有し得る。さらに（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）であり得、クラスターおよび抗原はそれぞれある長さを有し、式中、Ｌｃはクラスターの長さであり、Ｌｐは抗原の長さであり、そしてＮｐは抗原中のエピトープの総数である。
さらにまた実施形態は、上記および本明細書に記載したような構造式に従ってエピトープクラスターを含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が例えば抗原のアミノ酸配列の約８０％以下からなるポリペプチドに関する。実施形態は、単離されたポリペプチドを含むワクチンまたは免疫治療薬製品にも関する。別の態様では、単離されたポリペプチドは、例えば単離されたポリヌクレオチドによりコードされ得る。さらに別の態様
では、ワクチンまたは免疫治療薬製品は、ポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡであり得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
種々のその他の計算は、ある条件または別の条件下で案出され得る。概して、エピトープ密度関数は、それが推定クラスター内の予測エピトープの数、それらのスコア、それらの等級等に比例し、その推定クラスター内に含入されるタンパク質のアミノ酸または分画数に反比例するよう、構築される。あるいは関数は、選定数の連続アミノ酸のウインドウに関して評価され得る。いずれのケースでも関数は全タンパク質の全推定エピトープについて評価される。推定クラスター（またはウインドウ）および全タンパク質に関する値の比率が例えば１．５、２、３、４、５またはそれ以上より大きい場合、ＥＣＲが限定される。
エピトープクラスターの構造式
エピトープクラスターはタンパク質のセグメントであり、そういうものとして、ペプチド結合により連結されるアミノ酸の紐である。それがセグメントであるタンパク質内では、その末端は半ペプチド結合である。単離された高分子として、それは一般に他のポリペプチドの末端アミノおよびカルボキシル酸基を有するが、しかし末端に作られるどのような遮断基またはその他の修飾も、エピトープクラスターの特徴的構造を変えない。任意のクラスターはアミノ酸配列を有するが、しかしその配列により直接限定されない。むしろクラスターは、タンパク質配列内の、特定ＭＨＣ分子に関連するエピトープの整列により限定される。
タンパク質内のエピトープのクラスター形成の１例証（図９）は、チロシナーゼにおける予測ＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの位置プロットである。特定配列情報は、このタンパク質またはその任意のセグメント中のエピトープの密度および位置を例証するために記号に一般化されており、これは、クラスターが存在する場所およびそれらが存在しない場所を示す。このようなプロットはタンパク質配列についての知識および予測分析から得られる（実施例２４：表２１〜２４および図１８参照）が、しかし経験的にも得られる。例えばチロシナーゼの９−ｍｅｒ断片の順序集合を作り、ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合に関して各断片を試験することにより、図９と非常によく似たプロットが得られる。したがってこの例により、基本的配列に対するいかなる参照もせずにクラスターが同定され得る。配列についての知識はクラスターの有用性を助長し、増大するが、しかしそれはそれらの直接的決定因子ではない。
したがって、クラスターの個々の構成エピトープ中に存在する配列モチーフを考慮することにより、エピトープクラスターを説明する一般構造式を書くことができる。
最も単純なクラスターは２つの重複エピトープからなり、次式により表され得る：
【化３】
2005514029.tif 000003
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、式中のＸの各出現は、式中の任意の他のＸと異なるかまたは同一であるアミノ酸を示し得、
ａはＰ２1およびＰ２2間のアミノ酸の数を示し、
ｂはＰ２2およびＰΩ1の相対位置を表し、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
｜ｂ｜はｂの絶対値であり、
Ｐ２1は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２2は第２のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
ＰΩ1は第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
ＰΩ2は第２のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基である）。
アンカー残基の同一点は、クラスターが関連するＭＨＣ型の結合モチーフによって、Ｘに関する可能性の特定の部分集合である。種々のＭＨＣ型に関する結合モチーフは当該技術分野において既知であり、いくつかの例が以下で考察される。特に、種々の種からの多数のＭＨＣ分子に対する主要および補助アンカーならびにその他の好ましい残基は、上記の参考文献により援用される「ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフ（MHC Ligands and Peptide Motifs）」に報告されている。これらのデータは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩにより用いられる予測アルゴリズムの基礎を成し、クラスＩ  ＨＬＡに関するそれらのデータが抽出されており、表６に示されている。ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Ｐａｒｋｅｒアルゴリズムにより用いられ、アンカー、好ましいおよび好ましくない残基も明示するクラスＩ  ＨＬＡ係数表が、表７−１〜表７−４１に示されている。これらの表は、当業者にアクセス可能である有用な情報の種類の例証的な実例として提供される。表はこのような情報の完全リストとして示されているわけではない。
９アミノ酸という最も一般的な長さを有するエピトープに関しては、以下に例示されるように「ａ」は０から７まで、そして「ｂ」は６から−１まで変わり得るが、但しａ＋ｂ＝６である。
【化４】
2005514029.tif 000004
【化５】
2005514029.tif 000005
【化６】
2005514029.tif 000006
ＰΩ1および第２のエピトープの第１の位置は、ｂ＝−１である場合、同一残基であり、ｂの負の記号は、式のこの実施形態において、Ｐ２2が左でなくてＰΩ1の右に置かれることを示す。ＰΩ1およびＰ２2（第２のエピトープの第２の位置）は、ｂ＝０である場合に同一残基であり、それらの「間の」長さ｜ｂ｜−１は、−１の式値（formal value）を呈する。
８または１０アミノ酸長であるエピトープも一般に見出される。したがって他の実施形態では、構造式は、０  ａ  Ｌｅ−２およびＬｅ−３  ｂ  −１（ａ＋ｂ＝Ｌｅ−３であり、ここで、Ｌｅはエピトープの長さである）と設定することにより、他の長さのエピトープに関して一般化され得る。その場合クラスターの長さＬｃは、４＋２ａ＋ｂである。
したがってほとんどの実施形態において、「ａ」および「ｂ」は特定範囲で任意の値をとり得る。しかしながらＰΩ1およびＰ２2が一致する場合に関しては、例えば上記の９量体に関してはａ＝６、ｂ＝０であり、アンカー残基の特定化は排除構造式をもたらし得る。Ｐ２がＬまたはＭであり、ＰΩがＶまたはＬである単純ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合モチーフ定義を用いて、ａ＝６、ｂ＝０は、ＰΩ1およびＰ２2がともにＬである場合にのみ含入構造式を説明することが分かる。ａ＝６、ｂ＝０がまさに強制されるわけでないが、排除構造式を説明するような、Ｐ２およびＰΩに関する好ましい残基が互いに素な集合である種々のモチーフが存在する。
上記の構造式は、Ｐ２の位置に主要アンカーが常に存在するかのように上記の構造式は書かれているが、しかしこれは事実とは異なる。いくつかのモチーフ（例えばＨＬＡ−Ａ１）では、Ｐ２の位置の代わりにＰ３に主要アンカー残基が存在する。Ｐ３1およびＰ３2に関して上記の構造を書き直し、ａおよびｂに関する値の容認範囲を調整するには十分簡単であるが、しかしこれは必要でない。エピトープクラスターの特徴の理解によって、クラスＩＩ  エピトープクラスターに適用可能であるよう式を調整することは同様に簡単である。したがってＰ３の位置に主要アンカー残基を有するモチーフを適応させるよう式をより簡単に修正するために、Ｐ２は、好ましいＰ３の残基（のアミノ側）に隣接するＸと定義され得るが、これはＨＬＡ−Ａ１の例ではＤおよびＥである。同様にＨＬＡ−Ｂ８に関する結合モチーフは、ＰΩのほかに、Ｐ３およびＰ５の両方で主要アンカーを有し、そ
れらの位置ではＫまたはＲが選択される。さらにまた、Ｐ２を配列Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒにおける第１の残基と限定することにより、上記の鋳型が依然として用いられ得る。したがって実践者の選択および目的によって、第２のアンカーを含めた、そして結局はマトリックス定義を含めたより複雑なモチーフ定義が適用され得る。
【表６−１】
2005514029.tif 000007
【表６−２】
2005514029.tif 000008
【表６−３】
2005514029.tif 000009
【表６−４】
2005514029.tif 000010
【表６−５】
2005514029.tif 000011
【表６−６】
2005514029.tif 000012
【表６−７】
2005514029.tif 000013
【表６−８】
2005514029.tif 000014
【表６−９】
2005514029.tif 000015
【表６−１０】
2005514029.tif 000016
【表６−１１】
2005514029.tif 000017
【表７−１】
2005514029.tif 000018
【表７−２】
2005514029.tif 000019
【表７−３】
2005514029.tif 000020
【表７−４】
2005514029.tif 000021
【表７−５】
2005514029.tif 000022
【表７−６】
2005514029.tif 000023
【表７−７】
2005514029.tif 000024
【表７−８】
2005514029.tif 000025
【表７−９】
2005514029.tif 000026
【表７−１０】
2005514029.tif 000027
【表７−１１】
2005514029.tif 000028
【表７−１２】
2005514029.tif 000029
【表７−１３】
2005514029.tif 000030
【表７−１４】
2005514029.tif 000031
【表７−１５】
2005514029.tif 000032
【表７−１６】
2005514029.tif 000033
【表７−１７】
2005514029.tif 000034
【表７−１８】
2005514029.tif 000035
【表７−１９】
2005514029.tif 000036
【表７−２０】
2005514029.tif 000037
【表７−２１】
2005514029.tif 000038
【表７−２２】
2005514029.tif 000039
【表７−２３】
2005514029.tif 000040
【表７−２４】
2005514029.tif 000041
【表７−２５】
2005514029.tif 000042
【表７−２６】
2005514029.tif 000043
【表７−２７】
2005514029.tif 000044
【表７−２８】
2005514029.tif 000045
【表７−２９】
2005514029.tif 000046
【表７−３０】
2005514029.tif 000047
【表７−３１】
2005514029.tif 000048
【表７−３２】
2005514029.tif 000049
【表７−３３】
2005514029.tif 000050
【表７−３４】
2005514029.tif 000051
【表７−３５】
2005514029.tif 000052
【表７−３６】
2005514029.tif 000053
【表７−３７】
2005514029.tif 000054
【表７−３８】
2005514029.tif 000055
【表７−３９】
2005514029.tif 000056
【表７−４０】
2005514029.tif 000057
【表７−４１】
2005514029.tif 000058
「ａ」および「ｂ」に関して上記された値の範囲は、エピトープは少なくとも１つのアミノ酸だけ重複することを示す。場合によっては、エピトープは隣接するかまたは１〜数個のアミノ酸のギャップにより分離される情況を考えるのが適切であり得る。このクラスのクラスターの構造は、このような実施形態では、それぞれ接合面に関しては１、２、３・・・だけ、そして１、２・・・個のアミノ酸のギャップだけ、「ａ」の最大値を増大し、そして「ｂ」の最小値を低減することにより説明される。同様に、他の方向の「ａ」および「ｂ」の値の変更は、より大きい最小重複を保証する。
上に示した構造は、２つのエピトープからなるクラスターを限定しただけである。より多数のエピトープのクラスターを限定するための構造式の一般化は、いくつかの修正を要する。それにもかかわらず、アンカー残基、エピトープ長、ならびに「ａ」および「ｂ」の値に及ぼす限界変動の作用に関する種々の考察は、このより一般的な構造に等しく当て
はまる。クラスター中により多くのエピトープを有する可能性は考え得る方法の数を増大するが、この場合、異なる個々のエピトープからの相互排除Ｐ２およびＰΩアンカー残基の重複は、強制または排除構造を限定する。
上に示した構造式はクラスター中のエピトープの任意の隣接対に当てはまり得るため、任意のサイズのクラスター中のエピトープの各連続対に定義を反復的に当てはめるために、指標模式図が考案され得る。あるいは、以下のように、エピトープクラスターの各連続成員と組合せて第１のエピトープに反復的に適用され得るよう、式が適合され得る：
【化７】
2005514029.tif 000059
（式中、２≦Ｎ≦Ｎｃ；
Ｎはクラスターの第Ｎ番目のエピトープを示し、
Ｎｃはクラスター中のエピトープの総数を示し、
ａNおよびｂNは第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定し、
上のａおよびｂと同様に、
【化８】
2005514029.tif 000060
【化９】
2005514029.tif 000061
および
【化１０】
2005514029.tif 000062
上記からの結果、
【化１１】
2005514029.tif 000063
上記は、特定ＭＨＣ分子に対する既知のまたは予測親和性を共有する単一長のエピトープを含むエピトープクラスターを説明する一般構造式である。これは、近接クラスターと呼ばれ得る。上に開示されたエピトープクラスターの一般定義は、クラスター内のエピトープの密度が全タンパク質中のエピトープの平均密度より大きいことを必要とする。したがってこの密度要件は、（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）として表されるが、この場合、Ｎｐはタンパク質中のエピトープの総数であり、Ｌｐはタンパク質の長さである。