【手続補正書】
【提出日】平成17年9月1日(2005.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ステロイドスルファターゼ阻害剤並びにその製造及び使用方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】 化１の式を有する化合物であって：
Ｒ1及びＲ2は、水素と炭素数１〜６の低級アルキル基とからなる群から独立して選択され；
Ｒ3は化２と化３からなる群から選択され、ｍは３〜１３であり；
ＸとＹは両方とも炭素であり、ＸとＹの結合は単結合又は二重結合である(但し、Ｒ3が化３である場合にはＸとＹの結合が単結合である)。
【化１】
2001510200.tif 000001
【化２】
2001510200.tif 000002
【化３】
2001510200.tif 000003
【請求項２】 Ｒ1及びＲ2は、両方とも水素である請求項１の化合物。
【請求項３】 ｍは６〜９である請求項２の化合物。
【請求項４】 Ｒ3は化４であり、ＸとＹの結合は単結合である請求項３の化合物。
【化４】
2001510200.tif 000004
【請求項５】 ｍは６である請求項４の化合物。
【請求項６】 17β-(N-アルキルカルバモイル)エストラ-1,3,5(10)トリエン-3-Ｏ-スルファマートを調製する方法であって、以下のステップを有している方法：
ａ）エストロンを(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｏと混合し、ビストリフラートを生成するステップ；
ｂ）ステップａのビストリフラートを、酢酸パラジウム(II)、トリフェニルホスフィン及びｎ-アルキルアミンと溶媒中で混合し、得られた混合物に一酸化炭素を通してバブリングしながら混合物を加熱するステップ；
ｃ）ステップｂの生成物をメタノールと水の混合物中で溶解するステップ；
ｄ）Ｋ2ＣＯ3をステップｃの混合物に添加し、還流するステップ；
ｅ）ＮａＨを、溶媒中にステップｄの生成物を含む溶液へ、窒素下で添加し、混合物を撹拌するステップ；及び
ｆ）ＣｌＳＯ2ＮＨ2を、ステップｅの混合物に添加するステップ。
【請求項７】 ｇ）ステップｆの生成物をＥｔＯＨとＥｔＯＡｃの混合物中に含む溶液を、水素雰囲気下にて、触媒と共に２〜３時間撹拌するステップをさらに有している請求項６の方法。
【請求項８】 ステップｂ及びステップｅの溶媒はジメチルホルムアミドであり、ステップｇの触媒はＰｔＯ2であり、ステップｂのｎ-アルキルアミンは炭素数４〜１４である請求項６の方法。
【請求項９】 3-スルファモイルオキシ-17β-アルカノイルアミノ-エストラ-1,3,5(10)-トリエン化合物を調製する方法であって、以下のステップを有している方法：
ａ）エストロンを、ＣＨ3ＩとＫ2ＣＯ3のアセトン溶液と混合し、得られた混合物を６０〜８０時間還流するステップ；
ｂ）テトラヒドロフランとメタノール中にステップａの生成物を含む溶液を調製するステップ；
ｃ）ナトリウムシアノボロハイドライド及び酢酸アンモニウムを、ステップｂの溶液に添加し、９０〜１００時間混合するステップ；
ｄ）ステップｃの生成物を、トリエチルアミン及びジメチルアミノピリジンと混合するステップ；
ｅ）アルカノイルクロライドをステップｄの混合物に添加するステップ；
ｆ）ステップｅの生成物を、窒素下で、ＣＨ2Ｃｌ2及びＢＢｒ3と混合し、２〜３時間撹拌するステップ；及び
ｇ）ＮａＨ及びＣｌＳＯ2ＮＨ2を、ステップｆの生成物に添加し、混合物を２０〜３０時間撹拌するステップ。
【請求項１０】 ステップｅのアルカノイルクロライドは炭素数５〜１５である請求項１７の方法。
【請求項１１】 請求項１乃至５のいずれかの化合物と、生理的食塩水及び５％デキストロースからなる群から選択される薬理学的に適当なキャリアーとを含有する、患者に投与するための医薬。
【請求項１２】 請求項１乃至５のいずれかの化合物を含有する、エストロゲンに起因する疾病の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はスルファターゼ阻害剤(sulfatase inhibitors)並びにその製造及び使用方法に関する。これらの方法は、エストロゲンに起因する疾病(estrogen dependent illness)の治療及び予防にこれら化合物を使用することを含んでいる。
【０００２】
背景情報
閉経後の女性の場合、乳房腫瘍中のエストロゲンレベルは、血漿中のエストロゲンレベルよりも１０倍以上高い。これら腫瘍中のエストロゲンレベルが高い理由は、おそらく酵素エストロンスルファターゼによりエストロンスルフェート(estrone sulfate)がエストロンに変化し、エストロゲンがその位置(in situ)に形成されるためである。それゆえ、エストロンスルファターゼの阻害剤は、エストロゲンに起因する乳癌の治療用として強力な薬剤である。多くのエストロンスルファターゼ阻害剤は、ステロイドの性質を有している。エストロン-3-Ｏ-スルファマート(estrone-3-Ｏ-sulfamate;ＥＭＡＴＥ)は最も強力なエストロンスルファターゼ阻害剤と考えられているが、最近、この化合物は強力なエストロゲンであることがわかった。それゆえ、この化合物はエストロゲンに起因する疾病の治療に有用ではない。
【０００３】
リードら(Reed and co-workers)は、エストロン-3-Ｏ-メチルチオホスホナート、エストロン-3-Ｏ-アルキルスルホナート、エストロン-3-Ｏ-アリールスルホナート、エストロン-3-Ｏ-ホスホナート、エストロン-3-Ｏ-チオホスホナート及びエストロンスルファマートのスルファターゼ阻害活性について報告している［Duncan et al., "Inhibition of estrone sulfate activity by estrone-3-methylthiophosphonate", Cancer Res. 53:298-303 (1993); Howarth et al.,"Phosphonates and thiophosphonates as sulfate surrogates: Synthesis of estrone-3-methylthiophosphonate, a potent inhibitor of estrone sulfatase", Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:313-318 (1993); Howarth et al.,"Estrone sulfamates: Potent inhibitors of estrone sulfatase with therapeutic potential", J. Med. Chem. 37:219-221 (1994); and Purohit,et al., "In vivo inhibition of Oesterone Sulphatase and Dehydoepiandrosterone Sulphatase by Oestrone-3-O-sulphamate", Int. J.Cancer, 63:106-111 (1995).］。
【０００４】
リーら(Li and co-workers)は、エストロン核を含むスルホナート及びその類似物、メチレンスルホナート、メチレンホスフェートについて、その合成とスルファターゼ阻害活性について報告している［Li et al., "Synthesis and biochemical studies of estrone sulfatase inhibitors", Steroids, 58:106-111 (1993); Dibbelt et al, "Inhibition of human placental sterylsulfatase by synthetic analogues of estrone sulfate", J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 52 (3):281-286 (1995); and Li et al., "Estrone sulfate analogues as estrone sulfatase inhibitors", Steroids 60:299-306 (1995)］。
エステロン-3-アミノ誘導体はセルサーら(Selcer et al.)によって報告されている［"Inhibition of Placental Estrone Sulfatase Activity and MCF-7 Breast Cancer Cell Proliferation by Estrone-3-amino Derivatives", J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 59:83-91 (1996)］。
【０００５】
米国特許第５５６７８３１号は、非ステロイドのスルファターゼ阻害化合物をエストロゲン起因性疾病の治療に用いることを開示している。
米国特許第５５７１９３３号は、エストラ1,3,5(10)トリエン-17-オン,3-アミノ化合物の誘導体、及びこれら化合物をエストロゲン起因性疾病の治療に用いる方法を開示している。
米国特許第５５５６８４７号は、ステロイドスルファターゼ阻害剤、及びこれら阻害剤を用いて記憶増進効果をもたらす方法を開示している。エストロゲン起因性疾病の治療にこれら阻害剤を用いることは開示されていない。
【０００６】
米国特許第５６１６５７４号は、ステロイドスルファターゼ阻害剤及びその使用方法を開示している。開示された化合物には、Ｃ１７位が置換された1,3,5,(10)トリエンである本発明の化合物が含まれていない。この化合物は強力なエストロゲンであり、代謝(metabolize)によりエストロンを生成する。これは、本発明の化合物がエストロン生成のための代謝を生じない点において異なる。
それゆえ、代謝を起こし難く(metabolically stable)、より多くの選択性を有し、エストロゲン活性のない強力なスルファターゼ阻害剤に対する要請が依然として存在する。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、ステロイドスルファターゼ阻害剤として有用な化合物を提供することにより、上記要請に応えるものである。
これら化合物は、化１３の式で示され、Ｒ1及びＲ2は、水素と炭素数約１〜６の低級アルキル基とからなる群から独立して選択され、Ｒ3は化１４と化１５からなる群から選択され、ｍは約３〜１３であり、ＸとＹは両方とも炭素であり、ＸとＹの結合は単結合又は二重結合である(但し、Ｒ3が化１５である場合にはＸとＹの結合が単結合である)。
【化１３】
2001510200.tif 000005
【化１４】
2001510200.tif 000006
【化１５】
2001510200.tif 000007
化１３中、環系ＡＢＣＤは、ステロイド核であり、より具体的にはエストロン、最も具体的には1,3,5(10)トリエンである。
本発明の範囲に含まれる適当なステロイド環系として、以下の置換エストロン類(substituted estrones)を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
2-ＯＨ-エストロン、
2-メトキシ-エストロン、
4-ＯＨ-エストロン、
6アルファ-ＯＨ-エストロン、
7アルファ-ＯＨ-エストロン、
16アルファ-ＯＨ-エストロン、
16ベータ-ＯＨ-エストロン
本明細書に記載したように機能するその他適当なエストロン化合物もまた、本発明の範囲内に含まれるものである。
【０００８】
望ましくは、Ｒ1とＲ2は両方とも水素、Ｒ3は化１６、ＸとＹの結合は単結合、ｍは約６〜９である。ｍは６であることが最も望ましい。
【化１６】
2001510200.tif 000008
【０００９】
本発明はまた、これら化合物を合成する方法に関するもので、該方法は、一般的には、エストロンをアミンと反応させることを含んでいる。
さらにまた、本発明はこれら化合物をスルファターゼ阻害剤として使用する方法に関する。これらの方法は、一般的には、１種又は２種以上の化合物を、薬理学的に適当なキャリヤーの中に取り込んで、治療又は予防に有効な量の化合物を患者に投与するものである。
【００１０】
本発明の目的は、体内に生成されるステロイドスルファターゼ酵素を実質的に阻害する化合物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、抗腫瘍作用、又は抗エストロゲンとアロマターゼ阻害剤との相乗的活性作用を有するエストロンスルファターゼ阻害化合物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、エストロゲン起因性疾病に対して効果的な活性をもたらすエストロンスルファターゼ阻害化合物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明のスルファターゼ阻害化合物を用いて、患者に治療又は予防の処置を施す方法を提供することである。
本発明の他の目的は、エストロゲン性化合物への代謝を起こさないスルファターゼ阻害化合物の誘導体を提供することである。
【００１２】
本発明の前記目的及びその他の目的については、当該分野の専門家であれば、以下の説明及び請求の範囲の記載を参照することにより、より完全な理解が得られるであろう。
【００１３】
発明の詳細な説明
この明細書で用いられる「患者(patient)」なる語は、ヒトを含む動物を意味するものであり、ヒトに限定されるものではない。
本発明は、化１７の式を有する化合物に関するもので、Ｒ1及びＲ2は、水素と炭素数約１〜６の低級アルキル基とからなる群から独立して選択され、Ｒ3は化１８と化１９からなる群から選択され、ｍは約３〜１３であり、ＸとＹは両方とも炭素であり、ＸとＹの結合は単結合又は二重結合であり(但し、Ｒ3が化１９である場合にはＸとＹの結合が単結合である)、環系ＡＢＣＤは、ステロイド核である。
【化１７】
2001510200.tif 000009
【化１８】
2001510200.tif 000010
【化１９】
2001510200.tif 000011
当該分野の専門家には理解されるように、本発明の化合物はエストロン類であり、より具体的には1,3,5(10)トリエンである。適当なステロイド環系として、以下の置換エストロン類を挙げることができる。
2-ＯＨ-エストロン、
2-メトキシ-エストロン、
4-ＯＨ-エストロン、
6アルファ-ＯＨ-エストロン、
7アルファ-ＯＨ-エストロン、
16アルファ-ＯＨ-エストロン、
16ベータ-ＯＨ-エストロン
【００１４】
望ましくは、Ｒ1とＲ2は両方とも水素、Ｒ3は化２０、ＸとＹの結合は単結合、ｍは約６〜９である。ｍは６であることが最も望ましい。
【化２０】
2001510200.tif 000012
【００１５】
本発明の化合物はスルファターゼ阻害剤として有用である。これらの化合物は、膜挿入領域(Ｃ１７に付加された長いアルキルの鎖)とステロイド核を含んでおり、活性部位指向性であって、エストロンスルファターゼの不可逆阻害剤として機能する。酵素の不活性後に放出されるステロイド分子は、エストロゲン性(estrogenic)でない。
【００１６】
エストロンスルファターゼは膜結合酵素であるから、エストロン核のＣ１７における長鎖アルキル置換基は、化合物を膜の中へ固定する働きがある。図１に示されるように、長鎖アルキル(１２)は、膜の脂質二重層の２つの層(１４)(１６)の間に挿入される。鎖は、疎水性相互作用によって二重層の中に維持される。この結合部位の追加によって、スルファターゼの阻害活性はより強力になる。
【００１７】
本発明はまた、前記化合物の合成に関するものである。この合成は、一般的に、エストロンをアミンで処理することを含んでいる。より具体的には、本発明のスルファターゼ阻害化合物６ａ〜６ｄの合成は図２に要約されている。(１)のエストロンは出発物質として用いられ、ホルトら(Holt el al.)により報告された手順に基づいて、(２)のビストリフラート(bis-triflate)に変換される［"Steroidal A ring aryl carboxylic acids: A new class of steroidal 5α-reductase inhibitors", J. Med. Chem. 33:937-942(1990)］。
アリールトリフラート以上にビニルトリフラートへのＰｄ挿入傾向が大きく、Ｄ環のカルボキサミドの化学選択的導入(chemoselective introduction)が可能となる。ｍが３〜１３、より望ましくは６〜９の異なる脂肪族アミンを用いることにより、アミド３ａ〜３ｄが得られる。ＭｅＯＨ-Ｈ2(９：１)の混合物で還流しながら、Ｋ2ＣＯ3で処理することにより、３ａ〜３ｄのアリールトリフラートを分裂させ、フェノール４ａ〜４ｄを生成する。このフェノールは、ハワースら(Howarth et al.)に開示された標準的方法により、対応するスルファマート５ａ〜５ｄに変換される［"Estrone sulfamates: Potent inhibitors of estrone sulfatase with therapeutic potential", J. Med. Chem. 37:219-221(1994)］
。α，β不飽和アミドの水素化により、化合物６ａ〜６ｄが高収率で得られる。
【００１８】
図３は化合物６ａ〜６ｄの逆型類似体(reverse analogue)の合成の概要を示している。化合物１１ａ〜１１ｄは、化合物６ａ〜６ｄ(図２参照)のアミド結合を反転させた構造である。(１)のエストロンをヨウ化メチルでメチル化した後、(７)の3-メトキシエストラ-1,3,5(10)トリエン-17-オンが還元的アミノ化して、(８)の17β-アミノ化合物が得られる。(８)のアミンを種々の脂肪族カルボン酸クロリドのうちの１つで処理することにより、(８)の粗アミンに基づいて、対応するアミド９ａ〜９ｄが得られる。化合物９ａ〜９ｄのメチルエーテルをＢＢｒ3で分裂させることにより、フェノール１０ａ〜１０ｄが生じ、これがスルファモイル化された最終化合物１１ａ〜１１ｄとなる。
この明細書では、"ａ"を付した化合物のｍは６、"ｂ"を付した化合物のｍは７、"ｃ"を付した化合物のｍは８、"ｄ"を付した化合物のｍは９を意味している。
【００１９】
本発明は、さらに前述の化合物を用いて、エストロゲンに起因する疾病をもった患者を治療及び／又は予防処置する方法に関するものである。このようなエストロゲン起因性疾病として、乳癌、膣癌、子宮内膜癌、卵巣癌及び子宮内膜症を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。その他の適当な置換エストロンを用いることもこれら方法の範囲内である。適当な置換エストロンとして、スルファターゼ阻害活性を有し、Ｃ１７にて脂質二重層へ取り込まれる長鎖アルキルを有するエストロンを挙げることができる。
【００２０】
本発明の方法は、ａ）本発明の化合物を薬理学的に適当なキャリヤーに取り込ませるステップと、ｂ）前記キャリヤーに取り込ませた化合物を、患者に対し、治療又は予防に有効な量投与するステップと、を有している。
【００２１】
適合性(compatibility)の問題が起こらない限り、薬理学的に適当なキャリヤーはどんなものを使用しても構わない。望ましいキャリヤーとして、生理的食塩水(０.９％塩化ナトリウム)、５％デキストロース水を挙げることができる。
患者に対する有効量の投与は、非経口的に、例えば、静脈内、クモ膜下、筋肉内又は動脈内への注入等により行なうことができる。化合物の投与は、経口的、経皮吸収によって行なうこともできるし、その他にも当該分野の専門家にとって既知のその他手段によって行なうことができる。経口投与が望ましい。
【００２２】
この明細書において、「治療に有効な量」とは、本発明の化合物の１種又は２種以上について、患者の治療処置に必要な量を意味する。同じように、「予防に有効な量」とは、本発明の化合物の１種又は２種以上について、患者の予防処置に必要な量を意味する。
【００２３】
化合物の投与量、投与形態及び治療期間等については、エストロゲン起因性疾病患者の具体的な疾病内容、患者の体重、患者が受けているその他の治療内容、患者の状態、臨床反応及び耐薬性などの要因を考慮に入れて、個々に定められべきものであることは、当該分野の専門家であれば理解されるであろう。また、当該分野の専門家であれば、これら要因及び同様な要因を考慮して、化合物の投与量、投与形態及び治療期間を決定できるであろう。患者の代表例として、閉経後の女性や、卵巣を切除した閉経前の女性が挙げられる。化合物の投与量及び投与形態は、患者によって異なるけれども、一般的には、体重１kg当たり１〜２mgが毎日投与される、
【００２４】
実施例
以下に示す実施例は発明の例示として明らかにするものであり、いかなる意味でも発明を限定するものと解すべきでない。
全ての実施例について、化学剤とシリカゲルはアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー(ウイスコンシン州ミルウォーキー)から購入した。化学剤は薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲにより、その純度をチェックした。生化学物質、エストロン及びエストロンスルフェートは、シグマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイス)から入手した。[6,7-3Ｈ]エストロンスルフェートは、デュポン・カンパニーから購入した。融点は、トーマス・フーバの毛細管式融点測定器に基づいて決定し、補正は行なわなかった(uncorrected)。プロトンＮＭＲスペクトルは、Bruker WH-300(300MHz)を用いて得られた。元素分析は、アトランチック・マイクロラブ・インコーポレイテッド(ジョージア州ノークロス)が行なった。放射性試料は、パッカードのTri-Carb 4530の液体シンチレーションカウンタを用いて分析した。液体シンチレーションのカクテルはEcolume(ICN、カリフォルニア州コスタメサ)であった。
【００２５】
実施例１
参照番号は、図２に示した番号に対応している。実施例で説明した全ての化合物"ａ"はｍ＝６、化合物"ｂ"はｍ＝７、化合物"ｃ"はｍ＝８、化合物"ｄ"はｍ＝９である。この実施例に記載した方法は、化合物"ａ"の合成に関するものである。化合物"ｂ"、"ｃ"及び"ｄ"を調製するには、これらの方法において、ＣＨ3(ＣＨ2)6ＮＨ2に代えて、夫々、ＣＨ3(ＣＨ2)7ＮＨ2、ＣＨ3(ＣＨ2)8ＮＨ2及びＣＨ3(ＣＨ2)9ＮＨ2を用いることにより、容易に行なうことができる。
【００２６】
3-[(トリフルオルメチル)スルホニル]オキシ-17-(N-ヘプチルカルバモイル)エストラ-1,3,5(10),16-テトラエン：３ａの合成
化合物１を(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｏと混合して、(２)のビストリフラートを生成した。(２)のビストリフラート約１.８g、酢酸パラジウム(II)約６８mg、トリフェニルホスフィン約１４３mg及びｎ-ヘプチルアミン(ＣＨ3(ＣＨ2)6ＮＨ2，１０ml)を含むジメチルホルムアミド(ＤＭＦ，１５ml)溶液を、６０℃の温度にて、一酸化炭素を通してバブリングしながら５.５時間加熱した。次に、反応混合物を塩化メチレン(ＣＨ2Ｃｌ2)で希釈し、１０％の塩酸水(ＨＣｌ)、１０％の炭酸水素ナトリウム水(ＮａＨＣＯ3)及び塩水で洗浄した。有機層は、硫酸ナトリウム(Ｎａ2ＳＯ4)で乾燥し、濃縮し、残渣(residue)をシリカゲル(石油エーテル：酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)，４：１)を用いたクロマトグラフィーにより精製し、３ａの純粋なα-β-不飽和アミド(５８％)を生成した。
【００２７】
3-ヒドロキシ-17-(N-ヘプチルカルバモイル)エストラ-1,3,5(10),16-テトラエン：４ａの合成
３ａの化合物(ｍ＝６)約２.０５gを、メタノール(９０ml)と水(１０ml)の混合物の中で溶解した。約１.６gの固体炭酸カリウム(Ｋ2ＣＯ3)を加え、反応混合物を２.５時間還流した。メタノールの大部分を取り除いた後、５０mlの１Ｎ ＨＣｌを反応混合物に加えた。生じた析出物を濾過し、水で洗浄して、４ａのフェノール(１.３４g，８７％)を生成した。
【００２８】
3-スルファモイルオキシ-17-(N-ヘプチルカルバモイル)エストラ-1,3,5(10),16-テトラエン：５ａの合成
０℃、窒素下にて、約２０mlの無水ＤＭＦ中に４ａの化合物約２５０mgを溶解し、水素化ナトリウム約２９.６mgを加えた。溶液を３０分間撹拌し、クロロスルホンアミド約１.２２gを少量ずつゆっくりと加えた。次に、溶液を室温で２４時間撹拌した。混合物を、低温の飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いで、得られた溶液を塩化メチレン(３×５０ml)で抽出した。有機層を分離し、乾燥し(Ｎａ2ＳＯ4)、減圧下で濃縮して、５ａの淡黄色の油状物(１８３mg ６１.２％)を生成した。
【００２９】
3-スルファモイルオキシ-17β-(N-ヘプチルカルバモイル)エストラ-1,3,5(10)-トリエン：６ａの合成
ＥｔＯＡｃ約６mlとエタノール(ＥｔＯＨ)約２mlの中に、５ａの化合物(ｍ＝６)約２１０mgを溶解し、水素雰囲気下にて、約４０mgの酸化プラチナ(ＩＶ)(ＰｔＯ2)の存在下２.５時間撹拌した。触媒を濾過によって取り除き、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：ＥｔＯＡｃ，１：１)によって精製し、６ａの純粋化合物(２０１mg，９５.３％)を生成した。
【００３０】
実施例２
参照番号は、図３に示した番号に対応している。全ての化合物"ａ"はｍ＝６、化合物"ｂ"はｍ＝７、化合物"ｃ"はｍ＝８、化合物"ｄ"はｍ＝９である。ここに記載した方法は、化合物"ａ"の合成に関するものである。化合物"ｂ"、"ｃ"又は"ｄ"を調製するには、これらの方法において、ＣＨ3(ＣＨ2)6ＣＯＣｌに代えて、夫々、ＣＨ3(ＣＨ2)7ＣＯＣｌ、ＣＨ3(ＣＨ2)8ＣＯＣｌ又はＣＨ3(ＣＨ2)9ＣＯＣｌを用いることにより、容易に行なうことができる。
【００３１】
3-メトキシ-17β-オクタノイルアミノエストラ-1,3,5(10)-トリエン：９ａの合成
化合物１を、ＣＨ3Ｉ/Ｋ2ＣＯ3及びアセトンと混合し、３日間還流し、化合物７を生成した。テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)６７５mlとＭｅＯＨ2２５mlの中に、約８.９gの化合物７と約２４gの酢酸アンモニウム(ＮＨ4ＯＡｃ)を加え、該溶液にナトリウムシアノボロハイドライド(ＮａＣＮＢＨ3)を３.７g加えた。反応混合物を室温で４日間撹拌した。混合物を、低温の５％ＮａＨＣＯ3溶液３Ｌの中に注いだ。析出物を濾過によって収集し、真空下で乾燥し、粗生成物である化合物８を８.２g(９１.８％)得た。これは、精製することなく、次のアシル化反応のために直接使用した。
約２gの粗生成物８と、約２.２mlのトリエチルアミン(Ｅｔ3Ｎ)と、約１７２mgの4-ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)を６０mlの低温ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、オクタノイルクロライド２.３mlを加えた。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ3(２×３０ml)と水(３０ml)で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。
溶媒と残渣を蒸発させた後、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：ＥｔＯＡｃ，３：２)によって精製し、９ａの化合物(ｍ＝６)を生成した。
【００３２】
3-ヒドロキシ-17β-オクタノイルアミノエストラ-1,3,5(10)-トリエン：１０ａの合成
９ａの化合物(ｍ＝６)約１.３gを５０mlのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、三臭化ホウ素(ＢＢｒ3，１ＭのＣＨ2Ｃｌ2溶液)７.０mlを、０℃の窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を０℃で２.５時間撹拌し、１Ｎ ＨＣｌ約３０mlを加えて反応を終了させた。有機層を分離し、水性層をＣＨ2Ｃｌ2(２×３０ml)を用いて抽出した。複合有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：ＥｔＯＡｃ，１：１)で精製し、１０ａのフェノール(１.１g，８８％)を生成した。
【００３３】
3-スルファモイルオキシ-17β-オクタノイルアミノエストラ-1,3,5(10)-トリエン：１１ａの合成
実施例１にてスルファマート５ａの合成で説明した手順を用いて、１１ａのスルファマート(５０％)を調製した。但し、化合物４ａに代えて、化合物１０ａを用いた。
【００３４】
実施例３
実施例１及び実施例２で調製した化合物について、インビトロコンバージョン測定(in vitro conversion assay)法により、スルファターゼ活性を阻害する生物活性を調べた。この測定は、無傷の培養した乳癌細胞において、エストロンスルファターゼ酵素による3Ｈエストロンスルフェートから3Ｈエストロンへの変換の阻害に基づいて行なうものであり、当該分野の専門家であれば理解されることである。
細胞は、3Ｈエストロンスルフェートの存在下にて、エストロンスルファターゼ阻害剤と共に、又はエストロンスルファターゼ阻害剤なしで培養した。阻害剤なしの場合、細胞は3Ｈエストロンスルフェートを3Ｈエストロンに変換させる。細胞は3Ｈエストラジオールに変換させることもある。非結合型(unconjugated)トリチウム化エストロゲン(エストロンとエストラジオール)を、トルエンを用いて細胞培養培地から抽出し、液体シンチレーション計数法により定量した。エストロンスルファターゼ阻害剤が存在する場合、エストロンスルフェートの非結合型エストロゲンへの変換は極めて少ないか、又は全く起こらない。
【００３５】
ＭＤＡ-ＭＢ-２３１の細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(メリーランド州、ベセスダ)から入手した。細胞培養培地と試薬は全て、シグマ・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。乳癌細胞の日常増殖用の増殖培地には、炭酸水素ナトリウム０.２％(v/v)、熱不活性化ウシ胎児血清５％、ゲンタマイシン１０mg/ml、抗生物質／抗真菌性物質１％(v/v)、アンホテリシンＢ５mg/mlが含まれるＲＰＭＩ-１６４０培地を用いた。無血清培地には、ウシ胎児血清を除いて、前記の全ての成分が含まれている。無エストロゲン培地には、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ-１６４０培地、デキストランコートされチャコール除去された(dextran-coated-charcoal-stripped)ウシ胎児血清５％、Ｌ-グルタミン０.５mM、炭酸水素ナトリウム０.２％(v/v)、ゲンタマイシン１０mg/ml、抗生物質／抗真菌性物質１％(v/v)、アンホテリシンＢ５mg/mlが含まれている。
【００３６】
実施例１及び実施例２で調製したエストロンスルファターゼ阻害剤について、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞の無傷単層(intact monolayers)を用いて、エストロンスルフェートの加水分解阻害活性を調べた。細胞(１×１０6)を６ウエルプレートに播種し(seeded)、増殖培地の中で一晩培養し、接着(adhere)させるようにした。培養後、培地は、後記する濃度範囲約０.０２５nM〜２.５nMの試験化合物と3Ｈエストロンスルフェート(75000dpm/ml)とを含む無血清培地２ml、又は3Ｈエストロンスルフェート(75000dpm/ml)のみを含む無血清培地２mlと取り替えた。１８時間の培養後、プレートを冷却し、０.５mlの培地をピペットにより、１６×１００mmの２本の試験管に移した。非結合型ステロイドを抽出するために、３mlのトルエンを各試験管に添加した。混合物は１分間ボルテックス撹拌し、次に５分間の遠心分離処理を行ない、水層と有機層とを分離した。１mlの有機相(3Ｈラベルされた非結合型ステロイド含有)を、シンチレーションバイアルに移して、液体シンチレーションカクテル５mlを添加した。3Ｈに対する測定効率が５０％のパッカードのTri-carbシンチレーションカウンタにて、放射能を計数した。阻害剤が入れられた試料と、対照試料(阻害剤を含まない)について、生成物の生成を比較した。データは対照(control)に対するパーセントで表している。
【００３７】
インビトロコンバージョン測定の結果を図４乃至図６に示している。図４は、選択化合物と対照について、単一濃度における比較を示している。阻害剤のテストは、２.５nMの濃度でインビトロコンバージョン測定で行ない、種々化合物の相対的効能(relative potency)を測定した。公知のエストロンスルファターゼ阻害剤エストロンスルファマート(ＥＭＡＴＥ)を対照物質として含めた。各化合物は、２試料ずつ、試験を３回行なった。化合物６ａ〜６ｄ、１１ａ〜１１ｄは全てが対照レベルよりも低く、有意にエストロンスルファターゼ活性を阻害した。この阻害レベルについては、エストロンスルファマートと同等か又はそれ以上である。
【００３８】
図５及び図６は、代表的な２つの化合物(６ａと１１ａ)について、投与量との関係を解析したものである。各々の化合物について、０.０２５〜２.５nMの濃度範囲に亘る阻害作用を調べて、用量反応性と、ＩＣ50値の計算結果を得た。化合物１１ａと化合物６ａのエストロンスルファターゼ活性を、夫々、図５と図６に示している。
各濃度について、２試料ずつ、試験を３回行なった。化合物は両方とも、インビトロコンバージョン測定において、投与量に応じたエストロンスルファターゼ活性の阻害を示した。ＩＣ50の値は、この測定でエストロンスルファターゼ活性の５０％阻害を示したときの濃度を表しており、この値の計算結果は、化合物１１ａについては０.４２５nM、化合物６ａについては０.４５０nMであった。ＩＣ50の値は、濃度(log10)に対する対照のパーセントについて、線形回帰分析を行なうことによって求め、得られた式を用いて、５０％阻害をもたらす濃度を求めたものである。
【００３９】
図４乃至図６に示されるように、インビトロコンバージョン測定で得られたデータによれば、本発明の化合物は、ヒトの培養乳癌細胞において、エストロンスルファターゼ活性の阻害能力が非常に強いことを示している。化合物のうち８つは、２.５nM濃度にてエストロンスルファターゼ活性について実質的且つ有意な阻害作用を示した。２つの化合物６ａ及び１１ａについて、所定の濃度範囲を調べた結果、投与量に応じた反応を示すことがわかった。これら化合物のＩＣ50の値は０.５nMの範囲内であった。インビトロコンバージョン測定によるエストロンスルファターゼ阻害結果は、他の２つのエストロンスルファターゼ阻害、つまり、ヒト胎盤のミクロソームエストロンスルファターゼ活性の阻害と、エストロンスルフェートによって刺激されたエストロゲン依存性ヒト乳癌細胞の増殖阻害の測定結果との間に密接な相関関係を示した。このように、インビトロコンバージョン測定は、化合物のエストロンスルファターゼ活性阻害能力の指標として信頼性が高い。このコンバージョン測定により得られたデータは、新たに開発された化合物が、これまで発見された最も強力なエストロンスルファターゼ阻害剤の中に含まれることを示している。
【００４０】
実施例４
エストロゲン様活性(estrogenicity)を調べるためのＭＣＦ−７の細胞増殖測定
細胞増殖測定(cell proliferation assay)は、エストロゲン依存性ＭＣＦ−７細胞の増殖を刺激する化合物の活性を調べるために実施した。ＭＣＦ−７細胞は、９６ウエルプレートの増殖培地(50,000の細胞/ウエル)に播種した。この増殖培地は、細胞をプレートへ適切に接着させるために必要であった。２４時間後、培地は、エストロゲンなしの培地に変更し、細胞を５日間培養した。この際、培地は２日毎に交換した。このステップにより、エストロゲンを細胞から除去することができた。５日経過後、培地を、試験化合物(１μM)を加えたエストロゲンなし培地に変更した。細胞は７日間培養し、この際、培地は２日毎に交換した。各試験には、２組の対照が入れられたウエルが含まれている。
陰性対照(negative control)が入れられたウエルは、５日経過後にエストロゲンなしの培地のみで継続させたこと以外は、試験化合物が入れられたウエルと同じであった。これらのウエルは、細胞増殖の刺激がない細胞の数を表している。陽性対照(positive control)が入れられたウエルは、公知のエストロゲン性剤(エストロン)を含んでいたこと以外は、試験化合物が入れられたウエルと同じであった。これらのウエルは、細胞増殖のエストロン刺激を表している。試験の最後の日、ＭＴＴ(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-yl]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド; シグマ・ケミカル・カンパニー製)の方法を用いて、細胞を計数した。ＭＴＴ測定は、細胞の代謝活性に依存しているので、生存中で無傷の細胞が計数される。２０μlのＭＴＴ溶液(フェノールレッドなしのＲＰＭＩ−１６４０培地中に５mg/ml)を、細胞が入れられた９６ウエルプレートの各ウエルへ添加し、３７℃で３時間培養した。培養期間の終わりに、培地を取り除き、変換された色素(converted dye)を、１００μlの酸性イソプロパノール(無水イソプロパノールの中に０.０５Ｎ ＨＣＬ)で溶解した。変換された色素の吸光度を、BioRad Model 3550のマイクロタイタプレートリーダを用いて、６９０nmのバックグラウンドを差し引いて波長５７０nmで測定した。標準曲線を作成するために、ＭＣＦ−７細胞は、既知の濃度でプレートに播種して(plated)、一晩固着させ、ＭＴＴ法による計数を行なった。変換された色素の吸光度は、細胞の数と直線的な相関関係を示した。
【００４１】
試験化合物６ａと１１ａのエストロゲン様活性を、ＭＣＦ−７細胞増殖試験を用いて調べた(図７参照)。どちらの化合物も、この処理に用いられた１μM濃度では細胞増殖を刺激しなかった。これに対し、エストロンは、細胞増殖を著しく刺激した。これらの結果は、どちらの化合物も、そのＩＣ50値よりも２０００倍多い濃度で存在するときでさえ、エストロゲン様活性を発現しないことを示している。
【００４２】
本発明の具体的な実施例について、例示を目的として説明してきたが、当該分野の専門家にとって、特許請求の範囲に規定された発明から逸脱することなく、発明の詳細について種々の変形を成し得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｃ１７アルキル鎖置換基が脂質二重層に入り込む状態を説明する図である。
【図２】 実施例１の方法に基づいて化合物を調製するときのスキームを示す図である。
【図３】 実施例２の方法に基づいて化合物を調製するときのスキームを示す図である。
【図４】 化合物６ａ〜６ｄ、１１ａ〜１１ｄ及び対照について、エストロンスルファターゼ活性の阻害を示す図であり、実施例３の方法に基づいて、ヒトの無傷乳癌細胞のインビトロコンバージョン測定により求めたものである。図中の表示は、対照の平均％±標準偏差である。
【図５】 化合物１１ａについて、阻害剤投与によるエストロンスルファターゼ活性の用量依存的な阻害を示す図であり、実施例３の方法に基づいて、ヒトの乳癌細胞のインビトロコンバージョン測定により求めたものである。図中の表示は、対照の平均％±標準偏差である。
【図６】 化合物６ａについて、阻害剤投与によるエストロンスルファターゼ活性の用量依存的な阻害を示す図であり、実施例３の方法に基づいて、ヒトの乳癌細胞のインビトロコンバージョン測定により求めたものである。図中の表示は、対照の平均％±標準偏差である。
【図７】 本発明の化合物のエストロゲン様活性を示す図であり、ＭＣＦ-７細胞増殖測定を用いて、実施例４の方法により求めたものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2001510200.tif 000013
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2001510200.tif 000014