【手続補正書】
【提出日】平成18年10月25日(2006.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
故に、本発明のさらなる局面にて、Ｎｄｒ、その機能的相同体またはフラグメント、およびＭＯＢ１（ＭＰＳワンバインダー１）を含む複合体を提供する。ｈＭＯＢ１の配列は、ＧＩ：１１６９１８９８および以下の配列番号：５に記載されており、当業者に明らかなように、ＭＯＢ１の相同体もまた、Ｎｄｒと結合し得る。ＭＯＢ１相同体は、ＧＩ１１６９１８９８または、配列番号：５もしくは６に記載のＭＯＢ１配列と一定量の配列同一性を有するポリペプチドである。配列の同一性とは、一般に５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上である。好ましくは、前記タンパク質はヒトタンパク質である。いくつかの態様にて、１以上のタンパク質を、検出を容易にするために標識し、例えば、蛍光標識を用いて標識する。故に、２つのタンパク質（例えば、Ｎｄｒ１とＭｏｂ１）間の相互作用を、結合した蛍光標識の量によるか、または蛍光消光により検出することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
故に、Ｔｈｒ−７４（または対応箇所）にてリン酸化されたＮｄｒキナーゼ、もしくはその機能的相同体は、特に細胞増殖の異常、例えばガン、免疫系の疾患または障害（例えば、免疫不全）および神経変性疾患の処置のための、医薬として有用であるか、または医薬の調製のために有用であり得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
以下の実施例は、本発明の特定の局面を記載しており、当業者に対して本発明を例証し、本発明を説明するものである。実施例は、本発明の理解および実施に有用な特定の方法を単に提供する例としてであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＨＡ−ＮＤＲ１キナーゼ分析
形質転換され、かつ処理されたＣＯＳ−１細胞を氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４および２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸を含む１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中にラバーポリスマン（rubber policeman）で収集し、その後、５００マイクロリットルのＩＰ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ノニデットＰ−４０、１０％ グリセロール、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２０ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１マイクロモル マイクロシスチン−ＬＲ、５０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、および１錠／コンプレート・プロテアーゼ・インヒビター１０ｍｌ ＩＰ（Roche））中に溶解した。溶解物を、２０分間２００００ｇで遠心し、そして上清の３等分のアリコート（２００ｍｇ）を、６０分間プロテインＡ−セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）で事前にきれいにしておき、そして次に、４℃で３時間１２ＣＡ５抗体と混合し、プロテインＡ−セファロースに事前に結合させた（２マイクロリットル ビーズに対して〜１マイクロｇ抗体）。その後、前記ビーズをＩＰ緩衝液で２度洗浄し、１０分間、１Ｍ ＮａＣｌを含むＩＰ緩衝液で１度洗浄し、再び１０分間、ＩＰ緩衝液で１度洗浄し、そして最後に４マイクロモル ロイペプチンおよび１ｍＭ ベンズアミジンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で２度洗浄した。その後、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００マイクロモル［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（〜０．１マイクロＣｉ／マイクロリットル）、１マイクロモル ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼインヒビター・ペプチドＰＫＩ（Bachem）、４マイクロモル ロイペプチン、１ｍＭ ベンズアミジン、１マイクロモル ミクロシスチン−ＬＲ、および１ｍＭ ＮＤＲ１基質ペプチド（ＫＫＲＮＲＲＬＳＶＡ）を含む３０マイクロリットルの緩衝液中に再懸濁した。３０℃でインキュベーションした６０分後、１５マイクロリットルの上清を除去し、そして基質ペプチドへのリン酸の取り込みを、上記ＧＳＴ−ＮＤＲ１のように判定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
未処理ＧＳＴ−ＮＤＲ１をｍ／ｚ−７９の前駆体イオンスキャンにより分析した場合、ペプチドＰ２およびＰ４に対応する弱いリン酸化シグナルのみを検出することができた。しかしながら、Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの非存在下または存在下のどちらかで自己リン酸化されたＧＳＴ−ＮＤＲ１試料では、多量のリン酸化ペプチドが明らかに増加した。ほとんどのこれらのシグナルの観察されたｍ／ｚ値は、両方の試料にて、リン酸基（７９．９７Ｄａ）を遊離させる際に、期待されるトリプシン性（または、一例としてキモトリプシン性）ＮＤＲ１脱リン酸化ペプチドを生じる４つのＮＤＲ１誘導リン酸化ペプチドＰ１−Ｐ４とした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
野生型ＧＳＴ−ＮＤＲ１は、インビトロで効率的に自己リン酸化されるようになり（０．４ピコモルＡＴＰ／ピコモルＧＳＴ−ＮＤＲ１まで）、そのためＳ１００Ｂホモ二量体の付加が、（Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４の両方における）自己リン酸化の約２倍の増加をもたらし、同時にキナーゼ活性の約５倍の増加をもたらした。キナーゼ不活性変異体が、検出可能な自己リン酸化を示さなかったため、ＮＤＲ１キナーゼ活性が、観察される効果の主な原因であると考えられる。Ｓ２８１Ａ変異体は、（Ｓ１００Ｂの添加に関わりなく）劇的に低下した自己リン酸化割合を示し、故に、この残基が、インビトロにおけるＮＤＲ１の主な自己リン酸化部位であることを確認した。Ｓ２８１Ａのキナーゼ活性は、同じく低下し、ほとんど検出不可能になった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例４：インビボでＳｅｒ２８１は、主な自己リン酸化残基であり、一方Ｔｈｒ４４４は、上流キナーゼにより標的化される
インビボでのＮＤＲ１のキナーゼ活性における個々のリン酸化部位の相対的な影響を判定するため、本発明者らは、３つの同定されたリン酸化部位に、ＨＡ標識したＮＤＲ１野生型、キナーゼ不活性体、そしてアラニン変異体を有する一連の哺乳動物発現ベクターを構築した。
野生型ＨＡ−ＮＤＲ１か、またはその記載した変異体のどちらかを発現するＣＯＳ−１細胞を、１マイクロモル オカダ酸または溶媒のみで１時間処理した。その後、ＨＡタグ標識したＮＤＲキナーゼ変異体を、（１００マイクログラムの界面活性剤抽出物から）１２ＣＡ５モノクローナル抗体で免疫沈降し、そして上記のようなペプチドキナーゼ分析によりキナーゼ活性について分析した。
【表４】
2006506994.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
前記Ｓｅｒ２８１残基は、インビボにて構成的にリン酸化されており（また、このリン酸化はさらに、１ｍＭ オカダ酸での処理後に増大された）、一方、Ｔｈｒ４４４部位は、オカダ酸での処理後にのみリン酸化された。前記Ｓｅｒ２８１のリン酸化は、キナーゼ不活性化Ｋ１１８Ａ変異体が、この部位におけるリン酸化を示さないことから、全体的にＮＤＲ１の活性に依存する。この事実は、Ｓｅｒ２８１が、インビボでもまた自己リン酸化残基であることを示す。このことは、オルトリン酸塩代謝のインビボ標識により確認された。しかしながら、Ｔｈｒ４４４の変異は、Ｓｅｒ２８１のリン酸化を減じることなく、そのことは、ＮＤＲ１自己リン酸化のためのこの残基の低い重要性をさらに示している。しかしながら、Ｔｈｒ４４４残基は、キナーゼ不活性化変異体Ｋ１１８ＡにおけるＮＤＲ１のキナーゼ活性をなくした後でもリン酸化され、上流キナーゼの標的として関与している。最後に、残基Ｔｈｒ７４の変異は、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４両方のリン酸化の著しい低下をもたらしており（オカダ酸処置の有無のどちらにおいても）、キナーゼ活性データと一致している。このことは、Ｔｈｒ７４が、Ｓ１００Ｂを介するＮＤＲ１の自己リン酸化のみでなく、ＮＤＲ１に対する上流キナーゼの標的化にも関係することを示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
実施例６：Ｔｈｒ７４は、ＨＡ−ＮＤＲ１とＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの結合に必要とされる
ＮＤＲ１は、完全なＮＤＲ１のＮ末端ドメインに依存してインビボでＳ１００Ｂを有する機能的複合体を形成する（Millward et al., 1998）。本実施例では、ＮＤＲ１のリン酸化状態に依存する結合を実証する。ＣＯＳ−１細胞を、Ｓ１００ＢおよびＮＤＲ１野生型またはアラニン変異体発現プラスミドで形質転換し、そしてＮＤＲ１−Ｓ１００Ｂ相互作用を、ＮＤＲ１とＳ１００Ｂの共免疫沈降により観察した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
ＨＡ−エピトープ標識したｈＮｄｒ１をコードする哺乳動物発現ベクターを、実施例１に記載する。ＨＡ−ｈＮｄｒ２の発現ベクターを、それぞれ標識していないｃＤＮＡとプライマー５’−ＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：２３）および５’−ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号：２４）ならびに５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：２５）でＰｆｕポリメレース（Promega）を用いて増幅することにより構築し、その後ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＣＭＶ５中にクローニングした。ＧＳＴ−Ｎｄｒ２およびＧＦＰ−Ｎｄｒ２を、Ｎｄｒ２ｃＤＮＡとプライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号：２６）および５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号：２７）でＰｆｕポリメラーゼ（Promega）を用いて増幅することにより構築した。その後ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで切断し、ｐＧＥＸ２Ｔ（Smith,D.B.およびJohnson,K.S. (1988) Single−step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S−transferase Gene 67 (1), 31−40）およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech)中にクローニングした。その後、挿入の方向を、ＫｐｎＩ切断およびシークエンシングにより検査した。ＧＦＰ−Ｎｄｒ１を、Ｎｄｒ１ ｃＤＮＡとプライマー５’−ＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号：２８）および５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：２９）で増殖することにより構築し、そしてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）中にクローニングし、シークエンシングにより検査した。ＧＦＰ−Ｎｄｒ２を、基本的に同様の方法にて構築した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
ＮＤＲキナーゼ サブファミリーを調べるために、ｈＮｄｒ２、ｍＮｄｒ１およびｍＮｄｒ２のｃＤＮＡ配列および遺伝子配列を決定した。推定アミノ酸配列を比較し、ｈＮＤＲ１、キイロショウジョウバエＮＤＲ ＴＲＣ、線虫ＮＤＲ Ｓａｘ−１および酵母ＣＢＫ１の既知の配列に対して位置合わせした。ヒトおよびマウスＮＤＲ１配列は、９９％の同一性を示し、ＮＤＲ２配列は９７％の同一性を示し、一方、ＮＤＲ１およびＮＤＲ２は８６％の同一性を示す。ヒトＮｄｒ２は、進化の過程において、キイロショウジョウバエ、線虫および酵母とそれぞれ６８％、６７％および４７％の同一性を有する高い保存性を示す。ヒトおよびマウスＮＤＲ２は、４６４アミノ酸長であり、推定質量５４．０ｋＤａを有する。遺伝子マッピングにより、ｈＮｄｒ１およびｍＮｄｒ１、ならびにｈＮｄｒ２およびｍＮｄｒ２が、オーソロガス領域に位置することが示される。ｈＮｄｒ１は、６ｐ２１にマッピングされ（Tripodis N. et al.）、ｈＮｄｒ２は１２ｐ１２．３にマッピングされるが、一方、対応するマウス遺伝子は、１７Ｂ１および６Ｇ２−Ｇ３にマッピングされる。さらにＮｄｒ２の偽遺伝子が、マウスゲノムの染色体１Ｄおよび８Ａ１．２にて発見された。イントロン−エキソン境界は、すべてのヒトおよびマウス遺伝子に保存されている。ヒトおよびマウス遺伝子は、保存されたイントロン−エキソン境界を有する１４エキソンを含む。エキソン１は、５’ＵＴＲを含む非コードエキソン；エキソン２は、開始コドンを含む；そして終止コドンは、エキソン１４に位置する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ＮＤＲ１のＳｅｒ２８１およびＴｈｒ４４２に対して作製したリン酸化部位特異的抗体を用いた、制御リン酸化部位変異体Ｓ２８２ＡおよびＴ４４２Ａのウエスタンブロッティング分析は、ＮＤＲ２ｗｔ（野生型）、ならびにＴ４４２Ａ変異体およびＴ７５Ａ変異体のＳｅｒ２８２のＮＤＲのリン酸化を示し、そして、このリン酸化は、ＮＤＲ２ｗｔおよびＴ４４２ＡではＯＡ処理後に増加するが、Ｔ７５Ａでは増加しない。キナーゼ不活性化Ｋ１１９Ａ変異体は、Ｓ２８２でリン酸化されない。Ｔ４４２は、ＮＤＲ２ｗｔ、ならびにＳ２８２Ａ変異体、Ｔ７５Ａ変異体およびＫ１１９Ａ変異体のＯＡ処理にてリン酸化される。このことは、ＮＤＲ１の対応する変異体について上記の通りであった。ウエスタンブロッティング分析により、ｗｔおよび変異体が、同じレベルで発現されることを確認した。これらの結果により、活性ループのリン酸化部位２８２および制御疎水性モチーフのリン酸化部位Ｔ４４２の両方におけるリン酸化が、ＮＤＲ２活性に必要であることが確認された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ＮＤＲ１およびＮＤＲ２間の配列保存はまた、上記のＮＤＲ１のＳ１００結合ドメインを包含する。故に、インビトロでのＮＤＲ２活性におけるＣａ２＋／Ｓ１００Ｂの影響を、時間および濃度に依存的な方法で測定した。Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂは、４時間インキュベーション後、マススペクトル分析により測定してＮＤＲ２自己リン酸化の割合を〜２倍に増加させ、そして濃度依存的方法で特定のＮＤＲ活性を〜４倍まで刺激した。このことは、ＮＤＲ２が、ＮＤＲ１と同様の方法でＣａ２＋／Ｓ１００Ｂにより活性化されることを示す。Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂの存在下および非存在下におけるＧＳＴ−ＮＤＲ２のインビトロでのインキュベーション後、前記タンパク質をトリプシンで切断し、生じた混合物を、−７９前駆体スキャン中ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳにより分析し、断片化後の単一のリン酸基を遊離するすべてのペプチド種の質量変化率（ｍ／ｚ）を測定した。５ＮＤＲ２誘導リン酸ペプチドの同一性を、両方の試料、ＧＳＴ−ＮＤＲ２およびＧＳＴ−ＮＤＲ２／Ｃａ２＋／Ｓ１００Ｂにて測定することができた。
【表６】
2006506994.tif 000002
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例１１：ＮＤＲファミリー活性化ドメインで(ＮＦＡＤ)は、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用を必要とする
本実施例は、Ｔ７４がＮＤＲキナーゼ活性およびＳ１００Ｂとの相互作用に重要であるのみならず、ＮＤＲ−ｍｏｂ相互作用に必要であることを実証するものである。ＨＡ−ＮＤＲ Ｎ末端点変異体およびｍｙｃ−ｍｏｂ１をＣＯＳ１細胞に共トランスフェクションし、それをＯＡで処理した後に溶解した。ＨＡ−ＮＤＲ変異体を免疫沈降し、そして共免疫沈降したｍｙｃ−ｈＭＯＢ１を検出した。ＨＡタグ標識したＮＤＲ変異体およびｍｙｃ−ｈＭＯＢ１の共トランスフェクション、およびその後のｍｙｃ−ＭＯＢとＨＡ−ＮＤＲの共免疫沈降は、キナーゼ活性化に重要ないくつかの保存された残基が、同様に、ＮＤＲ−ＭＯＢ相互作用に必要であることを明らかにした。チロシン３１、アルギニン４１、スレオニン７４またはアルギニン７８のアラニンへの置換は、試験した条件下で、ＭＯＢとの相互作用に認容性がなく、一方、リシン２４、アルギニン４４およびロイシン７９変異体は、低下した相互作用を示した。強力に低下したキナーゼ活性を有する変異体のうち３つのみが、ＭＯＢ結合能における低下を有さなかった：アルギニン４８、リシン７２およびグルタミン酸７３。これらをまとめると、前記結果は、ＮＦＡＤがＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用に重要であることを示している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例１２：ＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用は、オカダ酸が誘導するＭＯＢ１の変形に依存するが、一方、ＮＤＲにおけるオカダ酸が誘導するリン酸化は必要なかった
本実施例は、ＮＤＲ−ｈＭＯＢ１相互作用のＯＡ依存性が、ＮＤＲまたはｈＭＯＢ１のＯＡ誘導修飾に（または細胞のＯＡ処置に）依存するかどうかの疑問を解決する。ＣＯＳ−１細胞を、ＨＡ−ＮＤＲおよびｍｙｃ−ｈＭＯＢ１で別々にトランスフェクトし、そしてＯＡで刺激するか、または刺激せずに溶解した。その後、溶解物（ＨＡ−ＮＤＲ−または＋ＯＡとｍｙｃ−ｈＭＯＢ１−もしくは＋ＯＡ）を集め、抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、そしてｍｙｃ−ｍｏｂ１を検出した。ＯＡ処理した細胞のｍｙｃ−ＭＯＢを含む２つの組合せにて、ｍｙｃ−ＭＯＢは、ＨＡ−ＮＤＲがＯＡ処理した細胞または刺激していない細胞に由来するかどうかに関わらず、ＨＡ−ＮＤＲと強く結合した。刺激していない細胞のＭｙｃ−ｍｏｂは、刺激していない細胞および同様にＯＡ刺激した細胞のＨＡ−ＮＤＲと弱い相互作用を示すのみであった。故に、本発明者らは、ＮＤＲのＯＡ誘導修飾がｍｏｂとの相互作用に必要ないが、一方、ｈＭＯＢ１ ＯＡ修飾が必要であることを結論付け得る。