【手続補正書】
【提出日】平成18年6月2日(2006.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
いくつかの実施形態では、多様化されたＣＤＲＨ３ライブラリーは、１２個のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＴＷ）および１つの終止コドンをコードするＤＶＫのようなコドンセットで作製することができる。ここでは、公知の抗体では稀に見られるアミノ酸は排除される。ＣＤＲＨ３ライブラリーはまた、１１個のアミノ酸（ＡＣＤＧＨＮＰＲＳＴＹ）をコードするが終止コドンおよびトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）をコードしないコドンセットＮＶＴを使っても作製することができる。いくつかの実施形態では、ＮＶＴなどのコドンセットの設計では、Ｔｒｐでドープしてもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
例えば、コドンセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡまたはＧまたはＴであり、ＶはＡまたはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴである。このコドンセットは１８個の異なるコドンを表し、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＣｙｓをコードすることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
上記コドンセットの１つは＜ＤＶＫ＞であった。＜ＤＶＫ＞はＡＣＤＥＧＫＮＲＳＴＹＷと終止コドンをコードする。既知の自然抗体配列に頻繁に発生しないアミノ酸、例えばＬＰＨＱＦＩＭＶなどは除外した。＜ＤＶＫ＞を利用し種々の長さのＨ３領域をコードするオリゴヌクレオチドを図４に示す。ある実施形態では、Ｆ５９、Ｆ６３、Ｆ６４、Ｆ６５、Ｆ６６およびＦ７８を含む一群のオリゴヌクレオチドをプールしたものを利用し、Ｈ３に多様性を備えた分子のライブラリーを形成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】カバットデータベースからのヒト抗体軽鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（１文字コードで同定されている）の頻度を示す図である。特定のアミノ酸位置の各アミノ酸の頻度は、その位置で最も頻度の高いアミノ酸が左に示され、右に行くに従い最も頻度の低いアミノ酸へと続く。アミノ酸の下の番号は、カバットデータベースにおいて、その位置でそのアミノ酸を有する天然配列の数を表す。
【図２】カバットデータベースからのヒト抗体重鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（１文字コードで同定されている）の頻度を示す図である。特定のアミノ酸位置の各アミノ酸の頻度は、その位置で最も頻度の高いアミノ酸が左に示され、右に行くに従い最も頻度の低いアミノ酸へと続く。アミノ酸の下の番号は、カバットデータベースにおいて、その位置でそのアミノ酸を有する天然配列の数を表す。フレームワークアミノ酸位置７１、９３および９４も示す。
【図３】ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２におけるアミノ酸位置に適当なコドンセット設計の具体例を示す図である。このコドンセットは３つのイタリック大文字で同定され、＜＞で括られている（例えば＜ＲＤＴ＞）。このコドンセットによってコードされるアミノ酸は、「多様性＜ＤＮＡコドン＞」と標識された欄の下に１文字コードによって示される。「自然多様性」と標識された欄は、カバットデータベースにおいて、天然抗体可変ドメインのそれらの位置で最も一般的に見られるアミノ酸を示す。良残基率（％）は、コドンセットによってコードされ、その位置の対象アミノ酸であるアミノ酸の割合（％）である。再現残基率（％）は、その位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸を持つ、カバットデータベースにおける天然抗体の割合（％）である。
【図４Ａ】設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図４Ｂ】引き続き設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図４Ｃ】引き続き設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図５】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３の設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットを示す。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。この設計で作製された多様性により、２．９×１０９配列のライブラリーが生じる。
【図６】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。この設計で作製された多様性により、６．１×１０８個の配列が生じる。
【図７】ＣＤＲＬ３アミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図８】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。いくつかの位置では、コドンセットは１つまたは複数のアミノ酸を多めにコードすることができる。例えば、ＣＤＲＬ３の位置９３では、コドンセットＲＶＭはアラニン（Ａ２）、グリシン（Ｇ２）およびトレオニン（Ｔ２）を多めにコードする。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図９】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１０】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１１】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１２】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１３】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１４Ａ】ＳｃＦｖの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２３）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化抗体４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメインおよびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１４Ｂ】引き続きＳｃＦｖの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２３）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化抗体４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメインおよびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１５Ａ】ＳｃＦｖ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２４）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１５Ｂ】引き続きＳｃＦｖ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２４）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１６Ａ】Ｆａｂの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２５）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常領域（ＣＨ１）およびｐ３のＣ末端ドメインをコードする。
【図１６Ｂ】引き続きＦａｂの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２５）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常領域（ＣＨ１）およびｐ３のＣ末端ドメインをコードする。
【図１７Ａ】Ｆａｂ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２６）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端をコードする。
【図１７Ｂ】引き続きＦａｂ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２６）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端をコードする。
【図１８】Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２を含む異なる構築物の提示の概略を示す図である。（Ａ）は、軽鎖ならびに少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した重鎖可変およびＣＨ１ドメインを有するＦａｂを示し、（Ｂ）は、２つの軽鎖、および少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した二量体化ドメイン（ｚｉｐ）を有する１つの重鎖を有するＦ（ａｂ’）２を示し、アンバー終止コドンが二量体化ドメインの後に存在し、（Ｃ）は、２つの軽鎖、ならびにそれぞれ二量体化ドメインを有しそれぞれ少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインの両方を有するＦ（ａｂ’）２を示す。
【図１９】ＨＥＲ−２ｅｃｄ（対象抗原）が増加する中でのＦａｂファージ構築物の結合率（％）を示すグラフである。構築物は、Ｆａｂファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージ（−●−）である。このＦ（ａｂ）ファージまたはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージのそれぞれは、次第に高くなる濃度のＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．００１〜１０００ｎＭ）溶液中で、３７℃で５時間インキュベートした。結合を解かれたファージはＨｅｒ−２ＥＣＤでコーティングしたプレートで捕獲し、ＨＲＰ−抗−Ｍ１３結合体で測定した。
【図２０】Ｆａｂファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージ（−●−）間の解離速度の相違を示す図である。連続希釈のＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭ）を、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングしたウェルに結合したＦａｂまたはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージに加えた。プレートに結合したままになっているファージは、ＨＲＰ−抗−Ｍ１３結合体を用いて定量された。百分率で表した残りの結合ファージの相対比率は、特定のＨｅｒ−２ＥＣＤ濃度におけるＯＤをＨｅｒ−２ＥＣＤがない場合のＯＤで割ることによって計算した。
【図２１】リガンドでコーティングした支持体上の標準ファージＥＬＩＳＡにより検出可能な結合を得るのに必要なファージＦ（ａｂ）（−○−）またはジッパー結合したファージＦ（ａｂ’）２（−●−）の量の相違を示す図である。異なる濃度にファージを希釈し、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングされたプレート上の結合シグナルを、Ｏ．Ｄ．４５０ｎＭで測定してＨＲＰ抗Ｍ１３で検出した。
【図２２】二価提示を使って低親和性結合体を検出する能力を示す図である。ヒト化４Ｄ５変異体は、アルギニン５０をＦ（ａｂ）ファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２（−●−）フォーマットのアラニン（Ｒ５０Ａ）に変えて調製した。ファージを希釈し、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングされたプレート上の結合を、ＨＲＰ抗Ｍ１３で検出した。
【図２３】天然抗体のＣＤＲＨ３領域（べた塗りのバー）およびＮＮＫコドンセットで作製された多様化を有する抗体可変ドメイン（点状のバー）におけるアミノ酸の種類の頻度の比較を示す図である。アミノ酸は以下のように分類される：フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）は芳香族アミノ酸であり、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）およびメチオニン（Ｍ）は脂肪族アミノ酸、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）は塩基性アミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は酸性アミノ酸、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）は極性アミノ酸、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）は配座アミノ酸である。
【図２４】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。その位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図２５】対象抗原Ｈｅｒ−２、ＩＧＦ−２およびｍＶＥＧＦと結合するかどうかでＳｃＦｖライブラリーを選別した結果を示す図である。ＳｃＦｖ−１ライブラリーは、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−２は、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−３は、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ３およびＬ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−４はジッパー領域を持たず、ＣＤＲ多様性はＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３で作製した。ＳｃＦｖ−５は、ジッパー配列を使用せず、ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のＣＤＲ多様性を用いて作製した。選別を３回繰り返した後の各ライブラリーの結果は、対象抗原と結合したクローンの百分率（％）で示す。
【図２６】ＳｃＦｖ−１、ＳｃＦｖ−２およびＳｃＦｖ−３ライブラリーから単離された特異的結合体の結果を示す図である。ＩＧＦ−１またはｍＶＥＧＦに対して選択を３回繰り返して得られたファージクローンは、ＥＬＩＳＡ検定法でＩＧＦ−１およびｍＶＥＧＦを使用して特異的結合を示すか分析した。それに対して選択された対象と結合し、他の抗原とは結合しなかったクローンは特異的と鑑定された。各選択から得られた対象と結合したクローン（全体の）の百分率、およびそれに対して選択された対象だけに結合したクローン（特異的）の百分率を示す。
【図２７】配列の総数、またそれらの配列の中で、選別を２、３回繰り返した後にｓｃＦｖ−１およびｓｃＦｖ−４の各ライブラリーから同定された抗ＶＥＧＦまたは抗ＩＧＦ抗体可変ドメインの特有な配列の数を示す図である。
【図２８】結合体の１セットにおけるＣＤＲＨ３コドン／アミノ酸利用の分布を示す図である。「Ｘ」は図４に示した各オリゴヌクレオチドのコドンセットの利用を表す。ライブラリーから単離された結合体配列におけるオリゴヌクレオチドそれぞれのＣＤＲ−Ｈ３デザインの百分率を示す。
【図２９】Ｆ（ａｂ’）２Ｌ３／Ｈ３ライブラリーに由来するいくつかの抗ＩＧＦ１および抗ＶＥＧＦ結合体のＨ３配列と親和性を示す図である。下線を引いた残基は、クローンのソースライブラリーで固定された残基を表す。（配列番号：７７−７９）
【図３０】クローンの一部に結合したエピトープの同一性を示す図である。ネズミのＶＥＧＦをプレートにコーティングし、ＫＤＲ−７ｉｇｇの存在下で競合的に抑制されるファージクローンを同定した。クローンＶ１（−●−）、Ｖ２（−○−）、Ｖ４（−◆−）、Ｖ５（−▲−）、Ｖ６（−＋−）、Ｖ７（−△−）、Ｖ８（−  −）、Ｖ９（−■−）、Ｖ１０（−▼−）を試験した。
【図３１】クローンの一部に結合したエピトープの同一性を示す図である。ネズミのＶＥＧＦをプレートにコーティングし、Ｆ１ｔ１−Ｄ２の存在下で競合的に抑制されるファージクローンを同定した。クローンＶ１（−●−）、Ｖ２（−○−）、Ｖ４（−◆−）、Ｖ５（−▲−）、Ｖ６（−＋−）、Ｖ７（−△−）、Ｖ８（−  −）、Ｖ９（−■−）、Ｖ１０（−▼−）を試験した。
【図３２】クローンＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ８の細胞培養におけるＦａｂポリペプチドファージＣＤＲＨ３アミノ酸配列、親和性、エピトープ特異性およびＦａｂの生産を示す図である。
【図３３】Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２ライブラリーに由来する重鎖可変ドメインＣＤＲアミノ酸配列およびｍＶＥＧＦおよびヒトＦｃ受容体と結合する結合体の親和性を示す図である。重鎖フレームワークアミノ酸位置４９、７１、９３および９４のアミノ酸配列も示す。（配列番号：８０−１１５）
【図３４Ａ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、Ｆａｂの提示のために別々の転写産物の発現を可能にする二シストロン性ベクターを示す。適当なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーターは二シストロン性メッセージの発現を促す。第１のシストロンは、軽鎖可変および定常ドメインとｇＤタグをコードしている配列に連結したｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）分泌シグナルをコードする。第２のシストロンは、分泌シグナル配列、重鎖可変ドメインと定常ドメイン１（ＣＨ１）およびウイルスコートタンパク質の少なくとも一部をコードする。
【図３４Ｂ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、Ｆ（ａｂ’）２の提示のための二シストロン性メッセージを示す。適当なプロモーターは、第１および第２のシストロンの発現を促進する。第１のシストロンは、分泌シグナル配列（ｍａｌＥまたはｓｔＩＩ）、軽鎖可変および定常ドメインとｇＤタグをコードする。第２のシストロンは、分泌シグナル、重鎖可変ドメインと定常ドメイン１（ＣＨ１）および二量体化ドメインをコードする配列ならびにウイルスコートタンパク質の少なくとも一部をコードする。
【図３４Ｃ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、ＳｃＦｖの提示のための一シストロン性ベクターである。適当なプロモーターは、ペプチドリンカーと結合したＶＬおよびＶＨドメインの発現を促進する。シストロン配列は、５’末端で分泌シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質（ｐＩＩＩ）の少なくとも一部に連結する。
【図３４Ｄ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、ＳｃＦｖ２の提示のためのベクターを示す。このベクターは図３４Ｃと類似しているが、ＶＨとコートタンパク質の間に二量体化ドメインを含む。
【図３５】ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖ２ライブラリーからの重鎖可変ＣＤＲ配列のアミノ酸配列ならびに抗ＶＥＧＦ結合体の親和性を示す図である。（配列番号：１１６−１４３）
【図３６】連続するパッチを形成するＣＤＲ残基を示しているヒト化４Ｄ５の三次元モデル化構造を示す図である。連続するパッチはＣＤＲＬ１のアミノ酸残基２８、２９、３０、３１および３２、ＣＤＲＬ２のアミノ酸残基５０および５３、ＣＤＲＬ３のアミノ酸残基９１、９２、９３、９４および９６、ＣＤＲＨ１のアミノ酸残基２８、３０、３１、３２および３３、ならびに、ＣＤＲＨ２のアミノ酸残基５０、５２、５３、５４、５６および５８によって形成される。
【図３７Ａ】ｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｂ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｃ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｄ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｅ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｆ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３８Ａ】ベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｂ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｃ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｄ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｅ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｆ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３９】異なる二量体化ドメインを有する構築物の概略を示す図である。ヒンジ領域とロイシンジッパーを有するＦａｂ’−ｚｉｐ、システインフリーのヒンジプラスジッパー（Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ）、ジッパーのみ（Ｆａｂ−ｚｉｐ）、システイン１個プラスジッパー（Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ）、ＦａｂとｃＰ３との間に単独のシステインが１個（Ｆａｂ−Ｃ）。
【図４０】二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンの存在下（斜線）、またはアンバー終止コドンの非存在下（べた塗りバー）における、二量体化ドメインの変異を有する変異体のアビディティー指数を示す図である。検定は図２０のように３反復で行い、アビディティー指数は、ＥｒｂＢ２−ＥＣＤなしでインキュベートした試料中の結合したファージと比較した、５００ｎＭのＥｒｂＢ２−ＥＣＤによるインキュベーションの後にも結合したままのファージの百分率である。相違の有意差は、ｔ検定で分析した。アスタリスク１つ（＊）はアンバー終止状態の等しいＦａｂファージと比較した場合の有意差を表す（ｐ値＜０．００１、但しＦａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐ（−アンバー）はｐ値０．００１〜０．００３を持つ）。アスタリスク２つ（＊＊）は、アンバー終止コドンがある場合とない場合を比較した場合の有意差を表す（ｐ＜０．０１）。アスタリスク３つ（＊＊＊）は、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐのアンバーのない構築物をＦａｂ’−ｚｉｐファージと比較した場合の有意差を示す（ｐ＝０．００３〜０．００７）。
【図４１】還元条件（パネルＣおよびＤ）と非還元条件（パネルＡおよびＢ）の下での、異なる二量体化ドメインを有する構築物のウェスタンブロットを示す図である。ファージ試料は各レーンの底に表示され、ＭＷマーカーは左に表示されている。すべての構築物は、軽鎖のＣ末端に融合したｇＤタグを含む。ウェスタンブロット試料は非還元（−ＤＴＴ；パネルＡおよびＢ）または還元（＋ＤＴＴ；パネルＣおよびＤ）条件下で用い、タンパク質は抗ｇＤ標識抗体（パネルＡおよびＣ）または抗ｐ３抗体（パネルＢおよびＤ）で検出された。ファージ感染したＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞は２ＹＴ培地で３０℃で一晩培養し、ファージはＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて沈降により２回精製し、１ｍＬの１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で再懸濁した。ファージ試料（３×１０１１、１ＯＤ２６８＝１．３×１０１３）は、９５℃で５分間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（２％ＳＤＳ、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、１０％グリセリン）中で、２ｍＭのＤＴＴを添加してまたは添加しないでインキュベートした。変性試料は４〜２０％のトリス−グリシンゲル上を流し、ＰＶＤＦフィルターへ電気移動させた。ＰＶＤＦフィルターは、２％ミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の入ったトリスｐＨ７．５、０．１５  ＭのＮａＣｌ（ブロッキング緩衝）で２時間ブロックし、次にブロッキング緩衝中で２ｎＭの抗ｇＤタグ（左）または抗ｐ３（右）抗体と１時間インキュベートした。フィルターはＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ウサギ抗マウスＦａｂ複合体と３０分間インキュベートし、ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロット法検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で視覚化した。
【図４２】天然抗体のＣＤＲＨ３におけるアミノ酸の頻度の比較を示す図である（べた塗りバー）。コドンセット（Ａ）ＤＶＫ（斜線バー）；（Ｂ）ＸＹＺ（斜線バー）；および（Ｃ）ＮＮＫ（斜線バー）によってコードされたアミノ酸。アミノ酸は以下のように分類される：フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）は芳香族アミノ酸であり、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）およびメチオニン（Ｍ）は脂肪族アミノ酸、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）は塩基性アミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は酸性アミノ酸、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）は極性アミノ酸、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）は配座アミノ酸である。
【図４３】ＣＤＲＨ３の配列の多様性および長さの多様性をコードしているオリゴヌクレオチドの実施形態を示す図である。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ１７１、Ｆ１８５、Ｆ１８５ａなどと示されている。各オリゴヌクレオチドを用いたＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５におけるＣＤＲＨ３配列は、Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２である。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＡ（アラニン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ（アルギニン／リジン）でよく；アミノ酸位置１００ａは、Ａ／Ｇ／Ｖ／Ｄ（アラニン／グリシン／バリン／アスパラギン酸）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＮＮＫ、ＸＹＺ、ＮＮＳ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。（配列番号：１４４−１６１）
【図４４】実施例９で記載されている固体担体結合対象（−−−）または溶相対象結合を使って、高親和性抗ＶＥＧＦ抗体可変ドメインをライブラリーから選択する選別方策の概略を示す図である。
【図４５】高親和性抗体可変ドメインを選ぶための２種類の選別方策を図解した図である。選別または選択は、実施例９で記載されているように、固体基質に結合した対象に対して選別すること、および／または溶相対象抗原に対して選別することを含む。
【図４６】実施例８に記載されている競合ＥＬＩＳＡからのＩＣ５０に基づく親和性測定と、同じクローンのＫＤとの相関を示す図である。
【図４７】結合体の単一点競合ＥＬＩＳＡの概略を示す図である。グラフは、約４０のクローンをスクリーニングした結果を示す。結合阻害率は、試料足す対象と試料引く対象とのＯＤ比率を計算することによって算出した。百分率（％）が低いほど潜在的な親和性は高い。結果は、４０のクローンの間で、様々な親和性が観察された。クローンの約１０％は非常に高い親和性であった。