【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ヒトプロトンゲート調節イオンチャンネルタンパク質（hASIC1B）を生産する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を上記タンパク質の産生に対して十分な条件のもとで培養し、培養物から上記タンパク質を回収することを含む上記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
請求項８の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質の活性または発現を阻害する必要のある被験者を治療する方法であって、
(a)被験者に治療上有効な量の、上記hASIC1Bタンパク質に対するアンタゴニストを投与するか；または
(b)被験者に上記hASIC1Bタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害する核酸分子を投与するか；または
(c)被験者に治療上有効な量の、そのリガンドに対して上記hASIC1Bタンパク質と競合するタンパク質を投与することを含んでなる上記方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質の発現または活性に関係する被験者の疾患または疾患に対する感受性を診断する方法であって、
(a)上記被験者のゲノム中の上記hASIC1Bタンパク質をコードするヌクレオチド配列における突然変異の存在または不在を決定するステップ；または
(b)上記被験者に由来するサンプル中のhASIC1Bタンパク質発現の存在または量を分析するステップを含んでなる上記方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のhASIC1Bタンパク質に対するアゴニストを同定する方法であって、
(a)請求項１２に記載の方法により生産した細胞を候補化合物と接触させるステップ；および
(b)候補化合物がhASIC1B受容体により生起される生物学的活性もしくはシグナルを誘導またはモジュレートするかどうかを決定するステップ；または
(c)候補化合物が内向き電流を誘導するかまたはhASIC1B受容体により生起されるプロトン誘導内向き電流をモジュレートするかどうかを決定することを含んでなる上記方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質に対するアンタゴニストを同定する方法であって、
(a)請求項１２の方法により生産した細胞を、低pH溶液（pH＜7.4）または請求項２０に記載のアゴニストを含むいずれかの他のアゴニストと接触させるステップ；および
(b)プロトンまたは上記アゴニストにより生起されたシグナルが候補化合物の存在のもとでモジュレートされるか、減少するかまたは消失するかどうかを決定することを含んでなる上記方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
実施例１：hASIC1Bタンパク質をコードする全長cDNAのクローニング
ラットASIC1B Ｎ末端ポリペプチドの特徴をもつ選択したポリペプチドモチーフを用いる全GenBankデータベースのblastサーチにより、ヒトゲノムポリヌクレオチド分子（GenBank登録番号：AC025154、AC074032、AC025361）を検索した。次いで、上に引用したゲノムcDNA配列の、クローニングしたASICファミリーメンバーとの配列比較およびアラインメントならびにコンセンサスイントロン／エキソンスプライシング部位に基づく方法論的解析により、新規ヒトASICサブユニット（本明細書でhASIC1Bと名づけた）を同定することができた。開示されたラットASIC1Bとのアラインメントは、両方の受容体が5-プライム末端で異なることおよびヒト受容体の開始メチオニンが明らかでないことを直接、示した。同定したヒト配列は３つの潜在的開始部位を含有するので（図１参照）、３つの推定hASIC1B構築物を調製した。機能分析はhASIC1B受容体の最長バージョンだけが機能的であったことを表したので、これが実際のヒト受容体を構成するものであり、それをRT-PCRにより確認した。ASIC受容体のコード領域のアラインメントは、hASIC1B開始セグメントがhASIC4領域と類似性を示すことを表す。hASIC1Bの実際の構築は、特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写ヒト三叉神経節cDNAからhASIC1Bの5-プライム末端のRT-PCR増幅により達成した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、TaqおよびPwoポリメラーゼの両方を含有するEXPANDロングテンプレートポリメラーゼミックス（long-template polymerase mix）（Roche Diagnostics、以前はBoehringer Mannheimから）を用いて実施した。反応条件は製造業者の指示書に従った。簡単に説明すると、反応混合物は：dNTPs 0.5mM、フォワードおよびリバースプライマーそれぞれ1μM、RT-cDNAテンプレート5μL、10x PCRバッファー5μLおよびポリメラーゼ酵素ミックス0.75μLを含み、全部で最終容積50μLとした。サンプルを４℃に保って、酵素ミックスを最後に加えた。次いでチューブを94℃に予熱したサーマルサイクラーに直接移し、その後、サイクリングを始動した
。典型的なサイクリング条件は次の通りであった：最初の変性ステップ：94℃にて２分間、次いで94℃にて45秒、58℃にて45秒および72℃にて２分間の40サイクル、その後に72℃にて10分間の最終伸長ステップ。ヒト三叉神経節由来のRT-cDNAは、RNAまたはmRNAからスーパースクリプト（Superscript）またはサーモスクリプト（Thermoscript）酵素ミックスを用いて製造業者（Gibco Life Sciences）の指示に従って調製した。RNAおよびmRNAは、Maniatisら（上記参照）に記載のような標準分子生物学プロトコルを用いて、または、例えばS.N.A.P.全RNA単離キット、Fast Track 2.0、およびマイクロFast Track 2.0 mRNA単離キット（InVitrogen）などの市販キットを用いて調製した。増幅断片を次いで精製し、HindIIIおよびNotlで制限酵素により消化し、そして両方のスプライス変異体の共通領域であるhASIC1Aの3-プライム断片とライゲートした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
実施例３：ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、遺伝子転写物の存在を検出するために利用する実験室技術であり、標識したヌクレオチド配列と、特定の細胞型または組織由来のRNAを結合した膜とのハイブリダイゼーションを含む（Sambrookら、前掲）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
特定の成人ヒト組織からまたは脳の切片から単離したポリ(A)＋RNAの２μgを含有するノーザンブロットを販売元（Clontech）から入手する。プローブを、無作為プライムラベリング（Pharmacia Biotech Inc.）により、または上記のように、調製する。hASIC1Bの第１エキソンのタンパク質コード配列の5'および3'末端に特異的なPCRプライマーをPCR反応に利用して、全hASIC1B特異的配列を含有する断片を作製した。この断片をpBluescriptベクター中にクローニングし、複数の組織ブロットをプローブするのに用いた。フィルターを、50％ホルムアミド、5 X SSPE、２％ SDS、10 X デンハルト（Denhardt's）溶液、および100μg/mlサケ精子DNAを含有するバッファー中で一夜42℃にてハイブリダイズした。フィルターを、0.1 X SSC、0.1％ SDSを用いて55℃にて洗浄し、そしてKodak X-Omat ARフィルムに４日間、70℃にて露光した。結果は、hASIC1Bが末梢組織中に検出されず、主に神経組織中に発現することを示した。脳においては、hASIC1Bは主に視床、尾側核（caudal nucleus）、皮質のp.g.、小脳、黒質、延髄、被殻に発現し、脳梁に低レベルで発現した。