【手続補正書】
【提出日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細胞標的用リガンド、リポゾームおよびウイルスの複合体を包含する、宿主動物内の標的細胞へウイルスを全身的に送達するためのベクター。
【請求項２】  該ウイルスが治療用核酸を包含する、請求項１に記載したベクター。
【請求項３】  該ウイルスがアデノウイルスまたはレトロウイルスである、請求項１に記載したベクター。
【請求項４】  該ウイルスが組換えウイルスである、請求項１に記載したベクター。
【請求項５】  該ベクターが、（ａ）タンパク質または（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする、請求項１に記載したベクター。
【請求項６】  該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項２に記載したベクター。
【請求項７】  該組換えウイルスが野生型ｐ５３をコードする、請求項４に記載したベクター。
【請求項８】  該細胞標的用リガンドが、腫瘍細胞標的用リガンドである、請求項１に記載したベクター。
【請求項９】  該細胞標的用リガンドが、フォレートまたはトランスフェリンである、請求項１に記載したベクター。
【請求項１０】  該細胞標的用リガンドがフォレートである、請求項９に記載したベクター。
【請求項１１】  該細胞標的用リガンドがトランスフェリンである、請求項９に記載したベクター。
【請求項１２】  該リポゾームが、陽イオン性リピドおよび中性もしくはヘルパーリピドを包含する陽イオン性リポゾームである、請求項１に記載したベクター。
【請求項１３】  細胞標的用リガンド、リポゾームおよび該薬剤を包含する、宿主動物内の標的細胞へ治療用または診断用薬剤を全身的に送達するためのものであり、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する、ベクター。
【請求項１４】  約３０ないし７５ｎｍの平均直径を有する、請求項１３に記載したベクター。
【請求項１５】  約５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１３に記載したベクター。
【請求項１６】  該薬剤が核酸である、請求項１３に記載したベクター。
【請求項１７】  該薬剤が、（ａ）タンパク質または（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする、請求項１３に記載したベクター。
【請求項１８】  該薬剤が、野生型ｐ５３をコードする核酸である、請求項１３に記載したベクター。
【請求項１９】  該リガンドが、腫瘍細胞標的用リガンドである、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２０】  該リガンドが、フォレートまたはトランスフェリンである、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２１】  該リガンドがフォレートである、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２２】  該リガンドがトランスフェリンである、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２３】  該リポゾームが、陽イオン性リピドおよび中性もしくはヘルパーリピドを包含する陽イオン性リポゾームである、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２４】  該リポゾームおよび該核酸が、０.１−５０ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項１６に記載したベクター。
【請求項２５】  該比率が１.０−２４ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲である、請求項２４に記載したベクター。
【請求項２６】  該比率が６−１６ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲である、請求項２４に記載したベクター。
【請求項２７】  該ベクターが非中心性構造を有する、請求項１３に記載したベクター。
【請求項２８】  該ベクターが固体コアを有する、請求項２７に記載したベクター。
【請求項２９】  治療上有効な核酸分子を担腫瘍動物に生体内で送達するベクターであって、フォレートおよびトランスフェリンからなる群から選ばれた細胞標的用リガンド、陽イオン性リポゾームおよび核酸分子の複合体から実質的になり、該ベクターがウイルスを含むものである、ベクター。
【請求項３０】  該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項３０に記載したベクター。
【請求項３１】  担腫瘍動物に治療的に有効な核酸分子をインビボで送達するためのベクターであり、フォレートおよびトランスフェリンからなる群から選ばれた細胞標的用リガンド、陽イオン性リポゾームおよび核酸分子を包含し、該ベクターが約１００ｎｍ未満の平均直径を有するものである、ベクター。
【請求項３２】  該核酸分子が野生型ｐ５３をコードする、請求項３１に記載したベクター。
【請求項３３】  該リポゾームおよび該核酸分子が、０.１−５０ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項３１に記載したベクター。
【請求項３４】  該リポゾームおよび該核酸分子が、１.０−２４ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項３１に記載したベクター。
【請求項３５】  該リポゾームおよび該核酸分子が、６−１６ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲存在する、請求項３１に記載したベクター。
【請求項３６】  該ベクターが非中心性構造を有する、請求項３１に記載したベクター。
【請求項３７】  該ベクターが固体コアを有する、請求項３６に記載したベクター。
【請求項３８】  薬学的に許容される担体中に請求項２９または３１に記載したベクターを含む、医薬組成物。
【請求項３９】  治療用薬剤を、それを必要としている動物に提供する方法であって、該動物に、細胞標的用リガンド、陽イオン性リポゾームおよび該治療用薬剤を含む複合体の治療的有効量を投与することを包含し、該ベクターがウイルスを包含する、方法。
【請求項４０】  治療用薬剤を、それを必要としている動物に提供する方法であって、該動物に、細胞標的用リガンド、陽イオン性リポゾームおよび該治療用薬剤を含む複合体の治療的有効量を投与することを包含し、該ベクターが約１００ｎｍ未満の平均直径を有する、方法。
【請求項４１】  該薬剤が核酸である、請求項４０に記載した方法。
【請求項４２】  該リポゾームおよび該核酸が、０.１−５０ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項４１に記載した方法。
【請求項４３】  該リポゾームおよび該核酸が、１−２４ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項４１に記載した方法。
【請求項４４】  該リポゾームおよび該核酸が、６−１６ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項４１に記載した方法。
【請求項４５】  該複合体が非中心性構造を有する、請求項４０に記載した方法。
【請求項４６】  該複合体が固体コアを有する、請求項４５に記載した方法。
【請求項４７】  該ベクターが全身的に投与される、請求項３９または４０に記載した方法。
【請求項４８】  該ベクターが静脈内投与される、請求項３９または４０に記載した方法。
【請求項４９】  細胞標的用リガンドがフォレートまたはトランスフェリン、リポゾームが陽イオン性リポゾームおよび治療用薬剤が野生型ｐ５３をコードする核酸である、請求項３９または４０のいずれかに記載した方法。
【請求項５０】  ベクターが薬学的に許容可能な媒体を含む薬学的に許容可能な組成物として投与される、請求項３９または４０に記載した方法。
【請求項５１】  温血動物における癌を処置しまたは緩解させる治療方法であって、該動物に、癌細胞標的用リガンド、リポゾームおよび治療用核酸を含む複合体を投与することを包含し、該複合体がウイルスを包含する、方法。
【請求項５２】  温血動物における癌を処置しまたは緩解させる治療方法であって、該動物に、癌細胞標的用リガンド、リポゾームおよび治療用核酸を含む複合体を投与することを包含し、該複合体が約１００ｎｍ未満の平均直径を有する、方法。
【請求項５３】  該リポゾームおよび該核酸が、０.１−５０ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項５２に記載した方法。
【請求項５４】  該リポゾームおよび該核酸が、１−２４ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項５３に記載した方法。
【請求項５５】  該リポゾームおよび該核酸が、６−１６ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲で存在する、請求項５３に記載した方法。
【請求項５６】  該複合体が非中心性構造を有する、請求項５２に記載した方法。
【請求項５７】  該複合体が固体コアを有する、請求項５６に記載した方法。
【請求項５８】  該複合体がフォレートまたはトランスフェリンからなる群から選ばれる細胞標的用リガンド、陽イオン性リポゾームおよび野生型ｐ５３をコードする核酸を包含する、請求項５１または５２のいずれかに記載した方法。
【請求項５９】  該複合体が、担癌温血動物に全身的投与される、請求項５８に記載した治療方法。
【請求項６０】  該複合体が、担癌温血動物に静脈内投与される、請求項５８に記載した治療方法。
【請求項６１】  該複合体が、担癌温血動物に腫瘍内投与される、請求項５８に記載した治療方法。
【請求項６２】  該動物に、さらに、抗癌性化学療法剤または抗癌性放射療法剤を投与することを包含する、請求項５８に記載した治療方法。
【請求項６３】  リピドを含むリポゾーム、リガンドおよび核酸を包含する、１００ｎｍより小さい直径を有する複合体を製造する方法であって：
ａ）リガンドとリピドを混合し、リポゾーム：リガンド複合体を形成する；
ｂ）該リポゾーム：リガンド複合体および該核酸を、０.１−５０ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の比率で混合し、リポゾーム：リガンド：核酸複合体を形成する；そして
ｃ）該リポゾーム：リガンド：核酸複合体を振盪させる
段階を含む、方法。
【請求項６４】  該比率が１−２４ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲である、請求項６３に記載した方法。
【請求項６５】  該比率が６−１６ナノモルリポゾーム／１.０μｇ核酸の範囲である、請求項６３に記載した方法。
【請求項６６】  該リピドがジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールからなる群から選ばれた中性リピドを包含する、請求項６３に記載した方法。
【請求項６７】  該リピドがジオレオイルトリメチルアンモニウム−プロパンおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドからなる群から選ばれた陽イオン性リピドを包含する、請求項６３に記載した方法。
【請求項６８】  該リガンドがフォレートまたはトランスフェリンである、請求項６３に記載した方法。
【請求項６９】  該リポゾーム：リガンド複合体の段階（ａ）を、段階（ｂ）を行う前に５−１５分、振盪させながらインキュベートする、請求項６３に記載した方法。
【請求項７０】  段階（ｃ）を１０−３０分行う、請求項６３に記載した方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、仮出願番号６０／０６６，１８８（１９９７年１１月１９日出願）および６０／０８３，１７５（１９９８年４月２７日出願）に関連する。
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的に、予め選択した細胞型に対して標的化されたリポゾーム複合体を介する治療用分子の全身的送達に関する。さらに具体的には、本発明は、細胞標的遺伝子の導入およびヒト癌の遺伝子治療のための組成物および方法を提供する。この方法では、治療用分子がリガンド／リポゾーム複合体を介して標的癌細胞に送達される。細胞増殖疾患（癌など）を処置すると、放射線や化学療法の効果が実質的に改善される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
癌治療のための様々な核酸送達システム(“ベクター”)は、ウイルスおよびリポゾームを含む他のものにより評価されてきた。ヒト癌の遺伝子治療に理想的なベクターは、全身投与され得、腫瘍が体内のどこに発生しようと、特異的にかつ効率的に腫瘍細胞を標的し得るものである。ウイルス性ベクター法は、高いＤＮＡ導入効率を示すが、いくつかの領域において欠点がある。ウイルスによる方法の限界は、標的能力の欠如と、免疫原、細胞変性原または組換え原となり得る残留ウイルス性成分の存在に関係している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ウイルス性ベクターの主な欠点は、癌細胞特異性がないことである。腫瘍標的能力のないウイルス性ベクターは、転移性疾患に到達する能力がないので、使用上、直接局所送達に限定される。転移は大部分の癌患者にとって最大の死亡原因である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
達成可能な高い力価および細胞親和性は、遺伝子治療および遺伝子導入送達ベクターとしてウイルスを魅力的にするが、いくつかの非常に大きい欠点がある。感染に対する新しい標的を有する新規ウイルスの製造が、文献に記載されているが、これらのベクターの問題は、ウイルスを高い力価にまで生育する必要性である。結果として、実質的な関心は、遺伝子導入および遺伝子治療における使用を含む治療用分子の送達を目的として、非ウイルス性ベクターに向けられた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
多くの重要な細胞経路、特にＤＮＡ損傷に対する細胞の反応における腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の役割は、確立された。これらの経路は、遺伝子転写、ＤＮＡ修復、遺伝子の安定性、染色体分離および老衰を含むだけでなく、細胞周期事象の調節およびプログラムされた細胞死(アポトーシス)の変調も含む。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷を監視する役割からして、“ゲノムの監視者（guardian）”と名づけられた。癌細胞は遺伝子の不安定性によって特徴づけられ、ｐ５３における変異が、ほとんど全ての型のヒト癌において非常に高頻度で生じることがわかった。実際、ｐ５３遺伝子における量的または質的な変化は、全てのヒト悪性腫瘍の半分以上において何らかの役割を果たすことが示唆されている。最も一般的な型のヒトの腫瘍におけるｐ５３変異の存在は、不十分な臨床予後と関係していることが発見されている。さらに、変異体(ｍｔ)ｐ５３は、より治癒可能な型の癌のいくつか、例えば、ウィルムス腫瘍、網膜芽腫、精巣癌、神経芽細胞腫および急性リンパ芽球性白血病などにおいて滅多に発見されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ｐ５３ヌル肺腫瘍細胞系Ｈ１２９９およびＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞を含む異種移植片の化学的敏感性、およびシスプラチンに対するＷｉＤｒ結腸癌異種移植片の敏感性が証明された。ドキソルビシンまたはマイトマイシンＣによる細胞死滅の増加はまた、ｗｔｐ５３のアデノウイルス性形質導入によりＳＫ−Ｂｒ−３乳房腫瘍細胞において見られた。しかしながら、いくつかの相反する報告からすると、ｐ５３発現と化学療法耐性の関係は、組織または細胞の型特異的要因を有する。アデノウイルス性ベクターによるｗｔｐ５３のトランスフェクションはまた、卵巣および結腸−直腸の腫瘍細胞を放射線に対して敏感にすることがわかった。また、アデノウイルス仲介ｗｔｐ５３送達は、放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌(ＳＣＣＨＮ)の腫瘍系における機能的アポトーシスを修復し、インビトロでこれらの細胞の放射線敏感性をもたらした。より有意義には、腫瘍内に注入されたアデノ−ｗｔｐ５３および放射線の組合せは、定着したＳＣＣＨＮ異種移植腫瘍を完全かつ長期間退縮した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
このシステムの手段によって、正常な野生型の腫瘍抑制遺伝子ｐ５３が送達されると、腫瘍が放射線治療および／または化学療法に対して敏感になることを、本発明者らは実証した。このシステムの高いトランスフェクション効率がこのような高程度の敏感性を与えるので、癌の成長が阻害されるだけでなく、すでに存在する腫瘍および転移が伸張された時間的期間で完全に消失する。いくつかの事例において、この時間は疾患が治癒されたと考えられる期間である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
このシステムの優れた効果は、リポゾーム−治療用分子の複合体のリガンド標的化に部分的に基いている。さらに、リポゾーム複合体を含む具体的な陽イオン性および中性のリピドおよびその各々の比率は、治療用分子の取込の効率が特異的な標的細胞型にとって理想的になるように様々に最適化された。リポゾームの治療用分子に対する比率も標的細胞型について最適化された。このようにリポゾーム−治療用分子の複合体を最適化すると、標的リガンドの付加とあいまって、放射線治療または化学療法と併せて投与するとき、実質的に改善された効果が得られる。当業者は、種々の治療用分子を種々の細胞型に送達するために、複合体を最適化できるであろう。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の重要な特性は、治療用分子を標的細胞に静脈内全身投与によって送達し得る能力に存する。静注後に特異的な細胞を効率的に標的とし、トランスフェクトせしめる能力が得られるのは、適当な標的リガンドを選択することとリポゾーム中の陽イオン性リピドの中性リピドに対する比率を最適化することとの、開示したような組み合せによる。腫瘍細胞が標的細胞である場合、リガンド−リポゾーム−治療用分子の複合体の全身的送達によって、治療用分子の転移性および原発性の腫瘍への効率的かつ特異的な送達が可能となる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明は、いかなる標的用リガンドの使用にも限定されない。リガンドは、標的細胞で異なって発現されるような受容体に対するリガンドであればよい。現在のところ好ましいリガンドは、葉酸（リポゾームのリピドにエステル化された）およびトランスフェリンであって、これらのリガンドの各々が好都合な性質を有する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
リポゾーム複合体は、腫瘍における血管を取り囲む約２０層の細胞のみを通過できる。ｗｔｐ５３遺伝子治療は部分的に「傍観者（bystander）」作用によって細胞の成長を制御するものと考えられる。この作用はｗｔｐ５３によるアポトーシスの誘導に関連するのであろう。この「傍観者作用」は、本明細書で述べたインビボ試験の効力を説明するものであり、組み合せ治療の効力をもたらす因子であり得る。しかし、ｐ５３のこのプロセスに関与するメカニズムおよび経路については、現時点ではあまりわかっていない。仮定として、なんらかの未知のアポトーシス性信号が小胞中に含有されていて、アポトーシスで生じ、最終的に周りの細胞が食作用を受けるのではなかろうか。あるいは、このアポトーシス性信号が裂隙接合を介して伝達される。これはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子でリン酸化ガンシクロビルの場合に考えられる。抗脈管形成性因子の導入も傍観者作用に寄与する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ｗｔｐ５３またはｍｔｐ５３のいずれかを含有するＳＣＣＨＮ細胞系から誘導された異種移殖片腫瘍を使用した報告において、注目すべきは、アデノウイルス・ベクターの腫瘍内投与によるｗｔｐ５３の導入が腫瘍内ｐ５３の状態に関係しない異種移植片の発生を阻害し、アポトーシスを起こすことである。同様に、ｗｔｐ５３をグリア芽細胞腫（ＲＴ−２）および乳癌（ＭＣＦ−７）の異種移植片（内因性ｗｔｐ５３を有す）にリポゾーム仲介により導入すると、これらの腫瘍の成長が部分的に阻害された。この試験から、ｐ５３遺伝子状態に関係のないｗｔｐ５３遺伝子治療の広範な可能性がわかる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明は、ある態様においては、全身的投与を介する、リガンド標的化、リポゾーム治療用分子複合体の、標的細胞特異的性が高く効率的な送達のための方法および組成物を提供する。治療用分子の例は、遺伝子、高分子量ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、化学試薬、例えば化学療法分子、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス分子、成長因子サイトカイン、免疫修飾剤および、発現された際、免疫系を刺激もしくは抑制する抗原を提示するタンパク質を含む他のタンパク質を含むがこれらに限られない任意の巨大分子を含む。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
近年、長期間発現する遺伝子治療ベクターの効果的方法が述べられている(Cooper, et al., 1997; Westphal et al., 1998; Calos, 1996 and 1998)。これらのベクターは、開示リポゾーム送達システムの発現レベルの長期化および／または増加に有用となり得る。幾つかの自律性およびエピソームベクターシステムが、米国特許出願番号５，７０７，８３０(Calos, M.P., 13 Jan. 1998)；５，６７４，７０３(Woo, S., et al., 7 Oct. 1997)および５，６２４，８２０(Cooper, M.J., 29 Apr. 1997)(何れも引用によりこの文書に加える)に記載されている。Ｃａｌｏｓは、哺乳類細胞における自律複製に有用なＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ウイルス基礎エピソーム発現ベクターについて述べている。Ｗｏｏらは、動物細胞における複製用のパピローマウイルス基礎エピソーム発現ベクターについて述べている。Ｃｏｏｐｅｒらは、少なくとも１つのパポーベウイルス複製オリジンおよびヒト遺伝子治療における長期エピソーム発現用のパポーベウイルスラージＴ抗原の変異体を含むベクターについて述べている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
リガンドリポゾーム治療用分子複合体は、投与前に適当な時間、無菌状態で調製され得る。治療用分子が、他の治療に対する感受性を促進するもの(化学治療または放射線治療に対する癌細胞の感受性を促進するような)である場合、当該他の治療は、複合体の投与前または後、例えば１２時間ないし７日の間に実施し得る。化学治療および放射線治療、両方のような治療の組合せを、複合体の投与に加えて用い得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
好ましい態様では、ｐ５３発現領域がＲＳＶまたはＣＭＶプロモーターのような強力な構成的プロモーター調節下にあると予想される。一般に、特に好ましいプロモーターはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターである。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本発明はまた、原発性および転移性の両方の癌の処置の、通常、治療を必要とする動物またはヒトに治療上有効なリガンドリポゾーム治療用分子(例えばｐ５３遺伝子)複合体の組合せを投与することを含む処置の改善方法、ならびに放射線または化学療法のような治療を提供する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
その複合体は、医薬的に許容される組成物の形式で動物に、通常、全身的に投与される。好ましい態様では、組成物は静脈経路を通して全身的に送達される。しかし、エーロゾル、腫瘍内、病巣内、経皮、内視鏡、局所または皮下のような投与の他経路も使用し得る。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本発明の腫瘍細胞特異性および腫瘍ターゲッティング能の程度が高いと、フォレート／トランスフェリンリポゾームβ-Ｇａｌ遺伝子複合体による全身的送達後のレポーター遺伝子の発現により明示された。β-ガラクトシダーゼ発現が、ＪＳＱ-３、ＤＵ１４５およびＭＤＡ-ＭＢ-４３５を含む種々のヒト腫瘍細胞の７０％以下の異種移植片において示され、その一方、高い増殖性を示す腸管および骨髄を含む正常組織および器官ではトランスフェクションは証明されなかった。本発明の高効率の腫瘍ターゲッティング能は、転移、殊に僅かな細胞による微小転移(micro-metastase)においてさえ、複合体の全身的送達によって特異的にトランスフェクトさていることがわかるこれらの実験でも証明された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本発明の驚くべき成功は、フォレートリポゾームｗｔｐ５３遺伝子またはトランスフェリンリポゾームｗｔｐ５３遺伝子の何れかの全身的送達であって、放射線および化学治療の何れかと組合せる送達により、ヌードマウスモデルを使用する試験において深遠な結果が生じることを発見し、示されたことである。高い効率であるこのシステムにより、高程度の放射線に対する感作がＪＳＱ-３およびＤＵ１４５ヒト異種移植片腫瘍に生じ、癌の増殖阻害のみならず、ある実験では、事前に存在する腫瘍および転移が長期間にわたり完全に取り除かれる。幾つかの場合、この期間(１年以上、疾患なし)により、疾患が治癒したとみなされ得る。ヒト乳癌ＭＤＡ-ＭＢ-４３５およびヒト膵臓癌ＰＡＮＣＩヌードマウス異種移植片腫瘍もまた、フォレートリポゾームｗｔｐ５３またはトランスフェリンリポゾームｗｔｐ５３を、ドクソルビシン、シスプラチン、ドセタクセルまたはゲムシタブリンを含む化学治療剤と全身的投与することにより高く感作されることが示された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、レセプター仲介エンドサイトシスを介して、治療用分子の腫瘍標的送達用のリガンド／陽イオン性リポゾーム送達複合体の全身的投与に使用される。好ましい態様の１つにおいて、リガンド-標的リポゾームを用い、野生型(ｗｔ)ｐ５３をコードする遺伝子を含む治療用分子を送達する。治療遺伝子は腫瘍細胞を標的とし、腫瘍細胞に効果的に送達され、その結果、多くの腫瘍において欠損している正常のｐ５３遺伝子機能が回復する。この回復は、腫瘍処置能において深遠な効果を有する。他の好ましい態様では、送達される治療用分子は、細胞成長経路の遺伝子を指示するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらの遺伝子のダウンモジュレーションは、放射線および化学治療剤に対し腫瘍細胞および異種移植片の感作を生ずる。また他の態様では、“治療用分子”は、未処理のウイルス性ベクター(例えば、治療用核酸を含むアデノウイルスまたはレトロウイルス分子)であり、それは、リガンド／リポゾーム複合体を介して標的細胞へ送達される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明は、転移を含む腫瘍細胞を特異的に標的とする全身的送達システム(“複合体”)を提供することによる癌遺伝子治療を実施する新規および改善方法を提供し、より効果的な癌処置物理療法を生ずる。この方法は、リガンドを標的とした陽イオン性リポゾームシステムを用い、腫瘍細胞に治療用分子を送達する。ある好ましい態様では、この治療用分子はｗｔｐ５３である。リポゾームＤＮＡ複合体中に細胞ターゲッティングリガンド(例えば、フォレートまたはトランスフェリンリガンド)が含まれるため、ｗｔｐ５３を効率的におよび特異的に腫瘍細胞にインビボでおよびインビトロで導入するリガンド付随の腫瘍ターゲッティングファセットおよびレセプター仲介エンドサイトシスに利点が生ずる。ｗｔｐ５３機能の回復の結果、通常の放射線および化学-治療に対する感作が増加し、そのため、その効果は増大し、および／または全用量は減少する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
このシステムのインビボ腫瘍ターゲッティング能を、３種の型の癌--ＳＣＣＨＮ、乳癌および前立腺癌においてβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を用い評価した。これら試験により、複合体の静脈投与後、腫瘍のみが５０ないし７０％の効率でトランスフェクトされ、その一方、高増殖性骨髄(highly proliferative bone marrow)および腸陰窩細胞を含む正常な器官および組織では、レポーター遺伝子発現の徴候は見られなかった。リガンド-リポゾームＤＮＡ複合体の幾つかは、マクロファージ中で示された。非常に重要なことに、肺、脾臓およびリンパ節中の微小転移でさえ、高効率および特異的トランスフェクションの証明となった。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
全身的に送達されるリガンド-リポゾームｗｔｐ５３複合体を、放射線に耐え得るマウス、耐性ヒトＳＣＣＨＮ異種移植片に投与し、その後、放射線治療し、腫瘍を完全に退行させた。前述の腫瘍部分を組織学的に試験すると、正常および瘢痕組織が残っていることのみがみられ、それは肝臓腫瘍細胞ではみられない。これは、リガンド-リポゾームｐ５３複合体のみか、または放射線のみで処置された動物の腫瘍と対照的であった。これらの動物では、幾つかの細胞が死滅することが明らかであった。しかし、肝臓腫瘍細胞のネスト(nest)が残り、これらの動物の腫瘍が再増殖した。著しく、腫瘍の再発が、複合治療を受けた動物では、最後の処置後１年でも見られなかった。同様の結果が、放射線治療および化学治療剤で処置したヒト前立腺腫瘍異種移植片を生ずるマウスで観察され、そして、化学治療剤で処置したヒト乳癌および膵臓癌異種移植片を有するマウスで観察された。したがって、このシステムは、より効果的な形の癌治療を提供するものとみられる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
実施例３
Ｘ−Ｇal染色によるフォレート−リポゾームの最適化
この実施例は、頭頸部の扁平上皮癌(ＳＣＣＨＮ)に対する本発明のフォレート 陽イオン性リポゾーム(ＬipＦ)複合体の最適化を記載する。ＳＣＣＨＮ細胞系ＪＳＱ−３に関するトランスフェクション効率を最適化するために、プラスミドpＳＶbにおいてＳＶ４０プロモーターにより操作されるＥ．coli ＬacＺ遺伝子をリポーターとして使用した。トランスフェクション効率をＸ−Ｇal染色細胞のパーセントに基づいて計算した。表１に示すように、複合体中のフォレートリガンドの存在は、リポーター遺伝子発現を実質的に増大させた。リガンドが結合していない陽イオン性リポゾーム(Ｌip(Ａ))は、インビトロでは、ＪＳＱ−３において１０％−２０％のトランスフェクション効率を与えたが、ＬipＦ(Ａ)は、６０％−７０％のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する細胞を与えた。トランスフェクションより前に、１mＭ 遊離葉酸を細胞に加えると、細胞上のフォレートレセプターをブロックすることができ、それによって、ＬipＦ(Ａ)で観察されるトランスフェクション効率と同様に、トランスフェクション効率が２０％まで減少した。これらの結果は、フォレートをリガンドとして使用することが陽イオン性リポゾームのトランスフェクション効率を増大させること、そしてこの効果がフォレートレセプターにより媒介されることを説明している。Ｘ−gal染色がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の程度を２０％以上過小評価し得るという最近の報告に基づいて、リガンドを標的化するリポゾームでのトランスフェクション効率は、上述の７０％を実際には上回ると考えられる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例４
ルシフェラーゼアッセイによるＬipＴ(Ａ)システムの最適化
この実施例は、頭頸部扁平上皮癌(ＳＣＣＨＮ)に対する本発明のトランスフェリン 陽イオン性リポゾーム[ＬipＴ]複合体の最適化を記載する。ルシフェラーゼアッセイを使用して、ＬipＴ(Ａ)システムをＪＳＱ−３トランスフェクションに対して最適化した。プラスミド pＣＭＶＬucにおいてサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターにより操作されるホタルルシフェラーゼ遺伝子をリポーター遺伝子(Ｐromega)として使用した。５×１０４個のＪＳＱ−３細胞／ウェルを２４ウェルのプレートに入れた。２４時間後、細胞を、血清を含まないＥＭＥＭで１回洗浄し、血清または抗生物質を含まないＥＭＥＭ０.３mlを各々のウェルに加えた。その細胞に、ＥＭＥＭ０.２ml中に様々な量のプラスミドＤＮＡを１.０μgまで含む、新たに製造したＴf−リポゾーム−pＣＭＶＬuc(ＬipＴ(Ａ)−Ｌuc)複合体を加えた。３７℃および５％ ＣＯ２で５時間インキュベーションした後、２０％ ウシ胎児血清および１μg／ml ヒドロコルチゾンを補ったＥＭＥＭ０.５mlを各々のウェルに加えた。２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μl／ウェル １Ｘ リポーター溶解緩衝液(Ｐromega)で溶解して、発現したルシフェラーゼ活性を照度計でのルシフェラーゼアッセイシステム(Ｐromega)で測定した。各々の測定の間、照度計の読み取り値の相対的光単位(ＲＬＵ)を、発現したルシフェラーゼの当量に変換するために、組換えホタルルシフェラーゼ(Ｐromega)標準を使用した。Ｂio−Ｒad ＤＣ タンパク質アッセイキット(Ｂio−Ｒad Ｌaboratories)を使用して、細胞ライゼートのタンパク質濃度を測定した。その結果を総タンパク質(mg)あたりのルシフェラーゼ当量(μg)として表わした。ＪＳＱ−３細胞に、ＬipＴ(Ａ)−pＣＭＶＬuc(ＬipＴ(Ａ)−Ｌuc)を複合体中の様々なＤＮＡ／リピドの割合でトランスフェクトした。トランスフェリンは、陽イオン性リポゾームのトランスフェクション効率を実質的に高めた。最適条件、すなわち、１ug／１０nmol／１２.５ugでのＤＮＡ／リピド／Ｔfの割合の下、ルシフェラーゼが、１２.５±１.１ug／mg 総タンパク質、または１.２５％ 総タンパク質で、トランスフェリンを含まないリポゾーム単独より７〜１０倍多く発現した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
ＬipＦ(Ａ)−pＳＶbまたはpＳＶb単独をＪＳＱ−３異種移植片を有するヌードマウスに静脈内注射した。４８時間以内に、ＬipＦ(Ａ)−pＳＶbを注射したグループは、インビボでのトランスフェクション効率が約４０−５０％である腫瘍においてリポーター遺伝子発現を示した。これとは対照的に、pＳＶbプラスミド単独では、１％未満の腫瘍細胞がβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子に関して染色された。ＬipＦ(Ａ)−pＳＶbを静脈内投与してから１０日後、腫瘍における青色染色のパーセンテージおよび強度が両方とも実質的に減少し、ＬipＦ(Ａ)が媒介する全身性トランスフェクションが一過性であることを示す。ＬipＦ(Ａ)−pＳＶbを注射したマウスにおける生体臓器は、青色に染色されているクッパー細胞(肝臓)または塵埃細胞(肺)といったようなマクロファージのみを示したが、肝細胞および肺胞細胞自体は染色されないままであった。腫瘍標的化の選択性も示し、ここで、腫瘍は筋肉を侵していることが見出された。ＬipＦ(Ａ)−pＳＶbを腫瘍のみにトランスフェクトしたが、筋細胞は染色されないままであった。より重要なことには、高度に増殖する骨髄および腸陰窩細胞が明らかにトランスフェクトされなかった。陰窩細胞および骨髄は両方とも、リポーター遺伝子が染色されるという何らかの証拠をほとんど(あるとしても１％未満)示さなかった。骨髄および陰窩細胞におけるＬipＦ(Ａ)−pＳＶbトランスフェクションの欠如は、標的化が非選択的な細胞増殖効果ではないことを説明するが、腫瘍細胞を標的化するらしい。これは、ＬipＦ(Ａ)−pＳＶb複合体が血流を介して運ばれるので、血管の内皮細胞が最も高濃度のＬipＦ(Ａ)−pＳＶb複合体にさらされたことにはなるけれども、染色は血管の内皮細胞において明らかではないことによりさらに説明される。加えて、樹状細胞がβ−ガラクトシダーゼ染色を示すとしても、染色は脾臓でのリンパ芽球増殖中心において明らかではなかった。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
実施例７
ＬipＦ(Ａ)−p５３およびＬipＴ(Ａ)−p５３をトランスフェクトしたＪＳＱ−３細胞における外因性野生型p５３タンパク質の発現
この実施例は、この特定の実施例の野生型p５３において、本発明の送達システムにより接触させてトランスフェクトした細胞での外因性遺伝子の発現を説明する。インビトロおよびインビボの両方でのトランスフェクション効率を最適化したら、wt ヒトp５３の１.７kb cＤＮＡを含むp５３発現プラスミド pＣＭＶp５３に、ＬipＦ(Ａ)またはＬipＴ(Ａ)を複合させた(ＬipＦ(Ａ)−p５３)または(ＬipＴ(Ａ)−p５３)となる。p５３遺伝子発現のＤＮＡ用量応答の場合には、２×１０５個のＪＳＱ−３細胞を６ウェルのプレートの各々のウェルに入れた。２４時間後、細胞を、血清および抗生物質を含まないＥＭＥＭで１回洗浄し、ＬipＦ(Ａ)と複合したpＣＭＶp５３プラスミドＤＮＡの量を増大させながら(０.２５−８μg／１０５個の細胞)、ＬipＦ(Ａ)−p５３、または対照として、ＬipＦ(Ａ)−pＲoを含むトランスフェクション溶液１mlをトランスフェクトした。あるいはまた、ＥＭＥＭ中にプラスミドＤＮＡ４μgまで／２×１０５個の細胞をＤＮＡ１μg／リポゾーム１０nmol／Ｔf１５μgの割合で含むＬipＴ(Ａ)−p５３またはＬipＴ(Ａ)−pＲoを、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションしてから５時間後、２０％ ＦＢＳおよび１μg／ml ヒドロコルチゾンを補ったＥＭＥＭ１mlを加えて、もう４８時間培養した。トランスフェクトした細胞を集め、ＲＩＰＡ緩衝液(Ｓanta Ｃruz Ｂiotechnology，Ｉnc)に溶解し、当業者によく知られている標準的な手順を使用して、ウェスタンブロット分析を汎親和性の抗p５３モノクローナル抗体 Ａb−２(Ｓanta Ｃruz Ｂiotechnology，Ｉnc.)で行った。総タンパク質４０μgをレーン毎に充填した。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
実施例９
p５３トランスフェクションおよびγ照射により誘発されるアポトーシス
この実施例は、本発明の最適化トランスフェリン−リポゾーム複合体を使用してのwtp５３の再導入が、機能的なp５３依存的アポトーシス経路を回復させることができることを説明した。ＪＳＱ−３細胞にＬipＴ(Ａ)−p５３またはＬipＴ(Ａ)−pＲo(ＤＮＡ１〜３μg／２×１０５個の細胞)をトランスフェクトして、付着した細胞および浮遊する細胞を両方とも、アポトーシス細胞のパーセント分析用に３日間毎日集めた。放射線により誘発するアポトーシスの場合には、細胞を２日間トランスフェクトした後、トリプシン処理して、上記の実施例８に記載したようにして照射した。４日後、再び入れた細胞をアポトーシス細胞のパーセント分析用に集めた。集めた細胞を製造業者のプロトコルによりＡnnexin Ｖ−ＦＩＴＣキット(Ｔrevigen，Ｉnc.，Ｇaithersburg，ＭＤ)で染色した。Ａnnexin Ｖ−ＦＩＴＣは、アポトーシス細胞に存在するホスファチジルセリンに特異的に結合する。ＦＡＣＳtar サイトメーター(Ｂecton ＆ Ｄickinson)を使用して、染色した細胞を分析した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
アポトーシスの誘発に対するwtp５３回復の効果を試験するために、ＪＳＱ−３細胞にＬipＴ(Ａ)−p５３またはＬipＴ(Ａ)−pＲoをトランスフェクトした。アポトーシスの明らかな誘発は、ＬipＴ(Ａ)が媒介するwtp５３回復において用量依存的方法で観察された。アポトーシス細胞のパーセンテージは、ウェスタンブロット分析により示されるように、細胞におけるwtp５３の発現レベルと関連のあるトランスフェクションの２日目でピークに達した。アポトーシスの誘発に対する照射効果を試験するために、トランスフェクトした細胞を様々な用量のγ照射で処理した。２〜４日後、細胞をＡnnexin Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、ＦＡＣＳtar(Ｂecton ＆ Ｄickinson)を使用して、フローサイトメトリーにより分析した。γ照射は、照射してから４日後に、ＬipＴ(Ａ)−p５３をトランスフェクトした細胞においてのみ、１８.７％(０Ｇy)から３８.７％(４Ｇy)および４６.４％(６Ｇy)までのアポトーシス細胞のパーセントの実質的な増大を誘発した。トランスフェクトしていない(ＵＴ)細胞およびＬipＴ(Ａ)単独またはＬipＴ(Ａ)−pＲoで処理した細胞において、増大は観察されなかった。その増大は、放射線用量依存的であって、ウェスタンブロットデータに見出されるwtp５３発現レベルと関連があり、アポトーシスの放射線増強が細胞におけるwtpレベルに比例することを説明した。すなわち、発現するwtp５３が多ければ多いほど、より多くのアポトーシスが誘発された。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
変異体(mt)型の腫瘍サプレッサー遺伝子 p５３は、様々な種類の悪性腫瘍に関する不十分な臨床的予後での多くの試験に関連した。p５３は、頭頸部扁平上皮癌(ＳＣＣＨＮ)の発生および進行にも関与し得る。様々な検出方法を使用することにより、p５３遺伝子および／またはその発現における異常を３３％−１００％のＳＣＣＨＮ組織において同定した。mt p５３の存在は、ＳＣＣＨＮにおいて、腫瘍の頻度の増大およびより急速な再発も示し得る。野生型(wt) p５３は、正常な増殖および発生の間よりはむしろ、ＤＮＡ損傷またはストレス後の細胞サイクルの調節において機能することを示した。mt p５３の存在は、幾つかのヒト腫瘍および細胞系における放射線耐性(ＲＲ)の増大と関連があることも見出されたことから、そして高いパーセンテージの頭部および頸部の腫瘍は、放射線療法を失敗させるので、大多数のＳＣＣＨＮにおいて見出される機能的wtp５３の欠乏と、この観察されるＲＲとの間には、原因および効果の関係があると考えられる。従って、wtp５３の置換は、従来の放射線療法に対するこれらの腫瘍の増感を生じ得る。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
２．５×１０６  ＪＳＱ−３細胞を、４−６週齢の雌無胸腺ヌードマウス(Ncr nu/nu)の尾の上部の背下部に皮下的に注射した。腫瘍が適当なサイズに到達した時、LipF(A)-p53、pCMVp53またはLipF(A)-pRoのi.v.注射を、８μg  ＤＮＡ／４００μl  ５％デキストロース／マウスで１週間に２回、全５回注射した。最初のi.v.注射４８時間後、動物を鉛拘束により固定し、腫瘍領域のみの照射を可能にし、１３７Ｃｓイオン化照射投与の最初の２.５Ｇｙの分画用量を適用した。その後、動物に２.５Ｇｙを４８時間毎に合計２５Ｇｙまで投与した。比較のために、非トランスフェクトのグループおよびLipF(A)-p53を投与され、照射を受けなかったマウスのグループを使用した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
実施例１１
LipT(A)-p53の全身的送達による、ＪＳＱ−３異種移植片の放射への感作
本実施例において、我々は癌処置の方法としての、全身送達されたトランスフェリン−リポゾーム−治療用分子の使用を説明する。この具体的実施例において、治療用分子は正常ヒト野生型ｐ５３遺伝子(pCMVp53)である。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
２．５×１０６  ＪＳＱ−３細胞を、４−６週齢の雌無胸腺ヌードマウス(Ncr nu/nu)の尾の上部の背下部に皮下的に注射した。７−１０日後、腫瘍は、注射部位で約４０−５０mm３に生育した。新たに調製した、３００ml  ５％デキストロース中に８μg  ＤＮＡを含むLipT(A)-p53またはLipT(A)-pRoをマウス当りに静脈内に、尾静脈を介して１週間に２回、合計５回注射で投与した。最初のi.v.注射４８時間後、動物を鉛拘束により固定し、腫瘍領域のみがγ−放射線照射に曝されるようにし、１３７Ｃｓの最初の分画用量の２.５Ｇｙイオン化照射を適用した。その後、動物に４８時間毎に、合計２５Ｇｙまで、２.５Ｇｙを適用した。比較のために、非トランスフェクトグループおよび、LipT(A)-p53注射され、照射を受けていないマウスのグループをコントロールとして使用した。腫瘍サイズを盲検的方法により１週間内に測定した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例１３
ＪＳＱ−３のシスプラチン(CDDP)へのインビトロでの化学増感
照射に加えて、化学療法はＳＣＣＨＮの処置に、より一般的に使用されるようになっている。機能的wtp53の欠失が化学療法への反応の欠失に関連しているため、本実験において、我々はＳＣＣＨＮ細胞系ＪＳＱ−３の化学療法剤への感作におけるリガンド促進リポゾーム介在ｗｔｐ５３遺伝子の効果を試験した。１×１０４細胞を９６ウェルプレートのウェル当りに蒔いた。２４時間後、細胞をLipT(A)-p53でトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、抗腫瘍薬を漸増濃度(トリプリケートで)で添加した。４−６日後、ＸＴＴ細胞増殖アッセイを行い、５０％生育阻害をする医薬濃度であるＩＣ５０値を計算した。わずか０.２μｇのLipT(A)に複合したｗｔｐ５３  ＤＮＡでの処置により、アジュバント化学療法で頻繁に用いられる二つの医薬であるＣＤＤＰおよび５−ＦＵの療法に対するＪＳＱ−３細胞の実質的な感作が示された。LipT(A)複合体単独、または逆配向でｗｔｐ５３を担持するLipT(A)(LipT(A)-pRo)でのトランスフェクションがＣＤＤＰに対する幾分かの感作をもたらしたが、非トランスフェクト細胞の２４倍のレベルの感作が、LipT(A)-p53形質導入細胞で明白であった。更に、化学療法剤５−ＦＵに対するＪＳＱ−３の１５.４倍の感作がまたLipT(A)-p53複合体でのトランスフェクション後に観察された。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
実施例１４
アポトーシスの促進された誘導により示される、ｐ５３介在化学増感
本実施例は、化学療法剤誘導アポトーシスにおけるリガンド−リポゾーム介在ｗｔｐ５３回復の効果を試験する。ＪＳＱ−３細胞を６ウェルプレートに蒔き、LipT(A)-p53、LipT(A)-pVec(ｐ５３遺伝子無しのベクター)またはLipT(A)単独で、１または２μｇ  ＤＮＡ／２×１０５細胞でトランスフェクトした。２４時間後、化学療法剤を各組のプレートに、各細胞系のＩＣ５０に近い濃度で添加した。更に１日のインキュベーション後、接着および浮遊の両方の細胞を集め、製造者のプロトコールにしたがって、AnnexinV-FITCキット(Trevigan, Inc., Gaithersgurg, MD)を使用して、アポトーシス細胞に提示されたホスファチジルセリンに特異的に結合するAnnexinV-FITCで、染色した。染色細胞をFACStarフローサイトメーターで分析した(Becton and Dickinson)。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を使用した。使用したリガンド−リポゾーム複合体は、乳癌で見られる異なる組織学的細胞系である頭頸部扁平上皮細胞のために最適化された組成物であった。LipT(A)-p53でのトランスフェクションは、非トランスフェクション細胞と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるドキソルビシンの効果を４倍、およびＣＤＤＰの効果を殆ど１２倍増加させた。ＳＣＣＨＮ細胞で見られるように、LipT(A)-pRo複合体での感作が幾分かあった。ここでまた、乳房癌にはまだ最適されていないが、LipT(A)-p53でのトランスフェクションによる乳癌細胞の化学増感が証明された。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
殆どの乳癌の組織学的細胞型であるアデノカルシノーマのために最適化された組成物であるLipF(C)を使用して、より著しい結果が観察された。上記のように、ＩＣ５０値をＸＴＴアッセイにより測定した。LipF(C)-p53でのトランスフェクションは、非トランスフェクト細胞と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるドキソルビシンの効果を７３.６倍に増加し、タキソールの効果を３１.６倍に増加させた。ＳＣＣＨＮ細胞で見られるように、またLipT(C)-pRo複合体での感作が幾分かあった。これらの結果は、トランスフェリンおよびフォレート標的リポゾーム−ｐ５３複合体でのトランスフェクションによる乳癌細胞の化学増感を証明する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
細胞系：
最適化を、以下の細胞系で行った。
頭頸部のヒト扁平細胞癌：ＪＳＱ−３、ＨＮ１７Ｂ、ＨＮ２２ａ、ＨＮ−３８、ＳＣＣ−２５
ヒト乳癌：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７
ヒト前立腺癌：ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、Ｌｎ−３０、Ｐ４−２０。
ヒト卵巣癌：ＳＫＯＶ−３、ＰＡ−１
ヒト膵臓癌：ＰＮＡＣ−１
ヒト大腸癌：ＳＷ４８０、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＫ−ＣＯ−１
ヒト神経グリア芽細胞腫：Ｕ−８７
ヒト子宮頸部癌：ＨＴＢ−３４、ＭＥ１８０
ヒト肺癌；ＣＡＬＵ−３
ヒト胃癌：Ｈｓ７４６Ｔ
ヒト脂肪肉腫：ＳＷ８７２
ヒトメラノーマ：ＳＫ−ＭＥＬ−３１
ヒト絨毛膜癌腫：ＪＥＧ−３
ヒト横紋筋肉腫：Ｈｓ７２９Ｔ
ヒト網膜芽腫：Ｙ７９
ヒト正常乳上皮：Ｈｓ５７８Ｂｓｔ
ヒト内皮：ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ
マウスメラノーマ：Ｂ１６／Ｆ１０
ラット前立腺癌：ＰＡ−III、ＡＴ.６１
ラット脳癌：ＲＴ−２
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
【表５】
2001522871.tif 000001
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例１９
インビボにおける、DU 145異種移植組織の増殖に対する、全身的に送達されたLipF ｐ53および化学治療法の組合せの効果
化学治療法は、前立腺癌の治療において、より一般的に使用されるようになっている。機能性wtp53の欠損は、化学治療法への反応欠如と関連している。この実施例は、インビボにおける前立腺腫瘍異種移植組織の増殖に対するリガンド−リポゾーム−p53および化学療法の組合せの効果を検証している。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
セッティングをインビトロの状況と同様にし、マウス血液中での安定性を試験した。２４時間後でさえ、７５％を超える複合化オリゴヌクレオチドがそのままで残っていた。従って、葉酸標的部送達システムは、腫瘍細胞に有効な到達をさせるよう、充分な期間オリゴヌクレオチドを保護すると結論される。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
実施例２２
トランスフェリンリポゾームによるアデノウイルスの標的化
遺伝子転移の有効性および特異性を改良することは、遺伝子治療の新しい戦略の開発において依然として重要な目的である。アデノウイルス(Ａｄ)は非常に効率的なベクターであるが、腫瘍標的特異性に欠け、実質的な免疫原性を有するという制限がある。カチオン脂質はアデノウイルスと非共有結合複合体を形成し、遺伝子転移効率を高めることが報告されている。しかしカチオン脂質自体は未だ標的特異性が欠けている。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
本実施態様で、本発明のリガンド-リポゾームベクターもアデノウイルス粒子と複合体を形成し、それゆえ遺伝子転移効率を高め、さらには標的特異性を高めることを証明した。そのうえ、治療分子が無処置アデノウイルス粒子の場合、本発明のリガンド-リポゾーム-治療分子送達システムの使用は、有効な腫瘍細胞標的化および治療アデノウイルスの全身投与を可能にし、遺伝子治療への他の新規なアプローチを可能にする。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
組織化学染色
ＬｉｐＴ-Ａｄ５ＬａｃＺ形質導入の組織化学研究用に、２４ウェルプレート中で６０％ コンフルエント細胞を、上述と同様にトランスフェクション溶液を使用して５時間トランスフェクトした。さらに２日間培養した後、細胞を固定してＸ-galで染色した。トランスフェクション効率を青色染色細胞のパーセンテージとして算出した。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
１０００pt/細胞または３ＭＯＩの投与量で(感染の重複度またはTU/細胞)、１０5脂質/ptのＬｉｐＴ-ＲｖＬａｃＺはレポーター遺伝子発現と比べて１.５倍増加を示した。１０6脂質/ptのＬｉｐＴ-ＲｖＬａｃＺは、ＲｖＬａｃＺのみと比較して発現レベルが２.３倍増加した。トランスフェリンを含まないリポゾーム複合体は限られた増強のみ示した。従って、ＬｉｐＴ-ＲｖＬａｃＺ複合体の光学割合は、約１０-１０００カチオン脂質/Ｔｆ分子で約１０4-１０7カチオン脂質/ptを示し、好ましくは約１０-５０カチオン脂質/Ｔｆ分子で約１０6カチオン脂質/ptである。脂質/pt割合が高すぎるときは、沈殿化が起こり得る。
組織化学染色は、ＲｖＬａｃＺ単独では２０−３０％の形質導入率であったが、トランスフェリン-リポゾーム複合体レトロウイルス ＬｉｐＴ-ＲｖＬａｃＺは６０−８０％の形質導入率であったことを示した。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
段階１．幾つかの（４−８またはそれ以上の）Ｔｆ−リポゾームが各ＤＮＡ分子に接触し、電子的相互作用によりＤＮＡ鎖に結合する。
段階２．結合した各Ｔｆ−リポゾームがＤＮＡ鎖を包蔵あるいは凝縮させ、ＤＮＡ鎖に沿って個別の薄板状構造を形成する。
段階３．これらの薄板状構造が凝縮して一つの薄板状コア構造を生成する。この固形コア構造は、４−８個のＴｆ−リポゾームを合計したより小さなサイズのものである。
段階４．最終の凝縮中に、薄板状相から逆六方晶相への相移行が起こり、不規則なまたは非中心性の玉葱様構造を生じる。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
逆六方晶（ＨＩＩ）相は、薄板状（ＬＩＩ）相よりも、トランスフェクションにおいて実質的に一層有効であると信じられ、ＤＮＡの遊離および送達に相関していると思われている(Koltover, I. Science 281:78.1998)。Sternberg, B.(Biochim Biophys Acta 1998; 1375:23-35)は、凍結−破砕電子顕微鏡観察を用いて、トランスフェクション活性がインビボで最強であるＤＤＡＢ／Cholカチオン性リポゾーム−ＤＮＡ複合体における「マップ−ピン(map-pin)」構造を記載している。インビトロの高活性は、六角形の脂質沈殿と相関しているが、この報告者によれば、この高インビボ活性は、小さくて（１００−３００nm）安定化した複合体と相関するものと信じられている。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
文献上、リガンド−カチオン性リポゾーム−ＤＮＡ複合体についての限外構造分析は全く見当たらない。本発明では、トランスフェリンまたはその他のリガンドの存在下において、ＬＩＩがＨＩＩへ移行し易くなり、生成する不規則なまたは非中心性の玉葱様コア構造が、このリガンドによって安定化されるものと信じられる。薄板状から逆六方晶相への移行メカニズムについては、Koltoverにより示唆されていること以外に、このリガンドが重要な役割を果たしているものと思われる。リポゾーム表面に結合しているＴｆ、またはリポゾーム表面に連結している葉酸塩(folate)が、相移行を助長または加速し、有効性が高度な非中心性玉葱様コア構造を生じるものと思われる。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
ＬｉｐＦ(Ｂ)−ＤＮＡ複合体のＴＥＭ構造は、ＬｉｐＴ(Ａ)−ＤＮＡのそれと類似であり、この複合体は、直径が３０−１００nm、好ましくは３５−７５nm（平均５０nm）の範囲のサイズのものである。独特の不規則なまたは非中心性玉葱様のコア構造がこれにも観察される。薄板状から逆六方晶状への相移行も、類似の４段階プロセスで生じ得るが、これはインビボの遺伝子トランスフェクション効率が予想外に高いことを説明する。