【手続補正書】
【提出日】平成18年6月20日(2006.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物から標的核酸を単離するための混合床固相であって、混合床固相が
第一のｐＨを有する第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第二のｐＨを有する第二溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有する第一イオン交換体固相であって、第一のｐＨが第二のｐＨとは少なくとも0.5 pH単位異なる第一イオン交換体固相、及び
第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第一溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有する第二イオン交換体固相を含み、
第一イオン交換体固相と第二イオン交換体固相とが単一容器内で一緒に混合されて、混合床固相を形成しており、
混合床固相の第一イオン交換体固相及び第二イオン交換体固相の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力を有することを特徴とする混合床固相。
【請求項２】  第一のｐＨが少なくとも約４かつ約９までであり、かつ第一溶液がカオトロピック試薬を実質的に含まない請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項３】  第一イオン交換体固相がそれに共有結合された少なくとも一種の第一イオン交換残基を有する第一シリカ材料を含み、かつ、第二イオン交換体固相がそれに共有結合された少なくとも一種の第二イオン交換残基を有する第二シリカ材料を含む、請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項４】  第一シリカ材料が第一シリカ磁性粒子であり、第二シリカ材料が第二シリカ磁性粒子である請求の範囲第３項記載の混合床固相。
【請求項５】  第一イオン交換残基がアミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、ヒスチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステインからなる残基の群から選ばれる請求の範囲第３項記載の混合床固相。
【請求項６】 第一溶液が第二溶液とは少なくとも20％異なる塩濃度を有する請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項７】  溶離緩衝液が約3M以下の塩濃度及び少なくとも約４かつ約9.5までのpHを有する請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項８】  標的核酸がプラスミドDNA、ゲノムDNA、全RNA、及び酵素増幅により生成された核酸からなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項９】  第一固相、第二固相、第一溶液、第二溶液、及び溶離緩衝液は少なくとも一種のエンドトキシン汚染物質が第一溶液又は第二溶液の存在下で混合床固相に結合し、かつ第一溶液、第二溶液、又は溶離緩衝液の存在下でそれから溶離されないことを確実にするように構成される請求の範囲第１項記載の混合床固相。
【請求項１０】  プラスミドDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からプラスミドDNAを単離するための混合床固相であって、混合床固相が
それに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換残基を含む第一磁性シリカ粒子（その第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で混合物と合わされた時にプラスミドDNAに結合する能力を有し、かつ第二溶液の存在下でそれに結合されたプラスミドDNAを放出する能力を有する）、及び
第二磁性シリカ粒子（その第二磁性シリカ粒子は第二溶液の存在下で混合物と合わされた時にプラスミドDNAに結合する能力を有し、かつ第一溶液の存在下でそれに結合されたプラスミドDNAを放出する能力を有する）を含み、
第一磁性シリカ粒子と第二磁性シリカ粒子とが単一容器内で一緒に混合されて、混合床固相を形成しており、
混合床固相の第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合されたプラスミドDNAを放出する能力を有することを特徴とする混合床固相。
【請求項１１】  第一磁性シリカ粒子に共有結合された陰イオン交換残基がアミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、ジエタノールアミン、ヒスチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステインからなる群から選ばれる請求の範囲第１０項記載の混合床固相。
【請求項１２】  少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、かつ第二シリカ磁性粒子が実質的にカオトロピック試薬を含まない第一溶液又は第二溶液の存在下でエンドトキシンに結合する能力を有する請求の範囲第１０項記載の混合床固相。
【請求項１３】  第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を含む請求の範囲第１０項記載の混合床固相。
【請求項１４】  第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約0.5Mのカオトロピック試薬濃度を含む請求の範囲第１０項記載の混合床固相。
【請求項１５】  溶離溶液が約5M以下の塩濃度及び少なくとも約４かつ約９までのpHを含む請求の範囲第１０項記載の混合床固相。
【請求項１６】  a)  第一固相及び第二固相を含む混合床固相を用意し
（第一固相は第一溶液中で標的核酸に結合し、また第二溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力を有し、
第二固相は第二溶液中で標的核酸に結合し、また第一溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力を有し、かつ
第一固相及び第二固相の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力を有する）、
b)  混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、標的核酸を第一固相に結合させ、
c)  混合床固相を第一溶液から分離し、
d)  混合床固相を第二溶液と合わせ、核酸を第一固相から放出させ、第二固相に結合させ、
e)  混合床固相を第二溶液から分離し、そして
f)  混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、標的核酸を混合床固相から溶離緩衝液に放出させることを特徴とする標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からの標的核酸の単離方法。
【請求項１７】  工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピック試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１８】  デカント、真空下の直接除去、遠心分離、濾過、カラム中の重力流、及びカラム中の高圧流からなる群から選ばれた溶液除去手段を使用して、工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程を行なう請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１９】  第一固相及び第二固相が両方とも磁性粒子であり、磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２０】  第一固相がシリカ磁性粒子であり、第二固相がそれに共有結合された陰イオン交換基を有するシリカ粒子を含み、その陰イオン交換基が標的核酸と交換することができる請求の範囲第１９項記載の方法。
【請求項２１】  陰イオン交換基がアミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、ジエタノールアミン、ヒスチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステインからなる群から選ばれる請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２２】  第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２３】  工程(a)で用意された混合床固相の第一固相及び第二固相が陰イオン交換固相であり、第一固相及び第二固相の夫々が互いに少なくとも0.5 pKa単位だけ異なっている異なるpKaを有する請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２４】  標的核酸がプラスミドDNA、ゲノムDNA、全RNA、及び酵素増幅により生成された核酸からなる群から選ばれる請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２５】  工程(d)で混合床固相と合わされる混合物が標的核酸及びアガロースを含む混合物である請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２６】  工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも１回行なった後にのみ、単離された標的核酸の溶液を工程(g)で混合床固相から溶離する請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２７】  少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、混合物中に存在するエンドトキシンの少なくとも90％が工程(g)で混合床固相から溶離された溶液中に存在しない請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２８】  プラスミドDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からのプラスミドDNAの単離方法であって、その方法が
a)  第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子を含む混合床固相を用意する工程
（第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下でプラスミドDNAに結合し、また第二溶液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、
第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下でプラスミドDNAに結合し、また第一溶液の存在下でプラスミドDNAを放出する能力を有し、かつ
第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合されたプラスミドDNAを放出する能力を有する）、
b)  混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、プラスミドDNAを第一固相に結合させる工程、
c)  混合床固相を第一溶液から分離する工程、
d)  混合床固相を第二溶液と合わせ、プラスミドDNAを第一固相から放出させ、第二固相に結合させる工程、
e)  混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び
f)  混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、プラスミドDNAを混合床固相から溶離緩衝液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
【請求項２９】  工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピック試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３０】  磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３１】  第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３２】  第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第３１項記載の方法。
【請求項３３】  第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３４】  第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第３３項記載の方法。
【請求項３５】  工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも２回行なった後まで、混合床固相を工程(f)で溶離緩衝液と合わせない請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３６】  少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、エンドトキシンの少なくとも90％が工程(g)で混合床固相から溶離された溶液中に存在しない請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３７】  ゲノムDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からのゲノムDNAの単離方法であって、その方法が
a)  第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子を含む混合床固相を用意する工程
（第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下でゲノムDNAに結合し、また第二溶液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、
第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下でゲノムDNAに結合し、また第一溶液の存在下でゲノムDNAを放出する能力を有し、かつ
第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合されたゲノムDNAを放出する能力を有する）、
b)  混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、ゲノムDNAを第一固相に結合させる工程、
c)  混合床固相を第一溶液から分離する工程、
d)  混合床固相を第二溶液と合わせ、ゲノムDNAを第一固相から放出させ、第二固相に結合させる工程、
e)  混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び
f)  混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、ゲノムDNAを混合床固相から溶離緩衝液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
【請求項３８】  工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピック試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項３９】  磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項４０】  第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項４１】  第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第４０項記載の方法。
【請求項４２】  第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項４３】  第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項４４】  工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも２回行なった後まで、混合床固相を工程(f)で溶離緩衝液と合わせない請求の範囲第３７項記載の方法。
【請求項４５】  核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からの酵素増幅により生成された核酸の単離方法であって、その方法が
a)  第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子を含む混合床固相を用意する工程
（第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で核酸に結合し、また第二溶液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、
第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下で核酸に結合し、また第一溶液の存在下で核酸を放出する能力を有し、かつ
第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された核酸を放出する能力を有する）、
b)  混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、核酸を第一固相に結合させる工程、
c)  混合床固相を第一溶液から分離する工程、
d)  混合床固相を第二溶液と合わせ、核酸を第一固相から放出させ、第二固相に結合させる工程、
e)  混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び
f)  混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、核酸を混合床固相から溶離緩衝液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
【請求項４６】  磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第４５項記載の方法。
【請求項４７】  第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第４５項記載の方法。
【請求項４８】  標的RNA及びDNAを含む混合物からの標的RNAの単離方法であって、その方法が
a)  第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子を含む混合床固相を用意する工程
（第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で標的RNAに結合し、また第二溶液の存在下で標的RNAを放出する能力を有し、
第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下で標的RNAに結合し、また第一溶液の存在下で標的RNAを放出する能力を有し、かつ
第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的RNAを放出する能力を有する）、
b)  混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、標的RNAを第一固相に結合させる工程、
c)  混合床固相を第一溶液から分離する工程、
d)  混合床固相を第二溶液と合わせ、標的RNAを第一固相から放出させ、第二固相に結合させる工程、
e)  混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び
f)  混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、標的RNAを混合床固相から溶離緩衝液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
【請求項４９】  磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第４８項記載の方法。
【請求項５０】  第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第４８項記載の方法。
【請求項５１】  第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第４８項記載の方法。
【請求項５２】  第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む請求の範囲第４８項記載の方法。
【請求項５３】  第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第５４項記載の方法。
【請求項５４】  夫々がジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基に共有結合された第一シリカ磁性粒子を含む、多数の第一シリカ磁性粒子を含むことを特徴とする、標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からの標的核酸の単離用のシリカ磁性粒子。
【請求項５５】  ジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基がプロピルジメトキシシランリガンドにより第一シリカ磁性粒子に共有結合されている請求の範囲第５４項記載のシリカ磁性粒子。
【請求項５６】  多数の第二シリカ磁性粒子を更に含み、多数の第一シリカ磁性粒子及び多数の第二シリカ磁性粒子が混合床固相の形態で一緒に混合されている請求の範囲第５４項記載のシリカ磁性粒子。
【請求項５７】  多数の第一シリカ磁性粒子が第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第二溶液の存在下でそれらに結合された標的核酸を放出する能力とを有し、
多数の第二シリカ磁性粒子が第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第一溶液の存在下でそれらに結合された標的核酸を放出する能力とを有し、かつ
多数の第一シリカ磁性粒子と多数の第二シリカ磁性粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれらに結合された標的核酸を放出する能力を有する請求の範囲第５６項記載のシリカ磁性粒子。