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　特願２００３−１０６７０８「アルカリプロテアーゼ」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年１１月　４日出願公開、特開２００４−３０５１７５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　出願の経緯・本願発明
　本願は、平成１５年４月１０日の出願であって、その請求項２に係る発明は、平成２０年１２月８日付手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項２に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。
　
「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（ａ）６３位、（ｂ）８９位、（ｃ）１２０位、（ｄ）６３位及び１８７位、（ｅ）２２６位、（ｆ）２９６位、（ｇ）３０４位又はこれに相当する位置から選ばれる位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：セリン、
（ｂ）位置：ヒスチジン、
（ｃ）位置：アルギニン、
（ｄ）位置：セリン、
（ｅ）位置：チロシン、
（ｆ）位置：バリン、
（ｇ）位置：セリン、
に置換された、親アルカリプロテアーゼに比べて耐熱性が向上した変異アルカリプロテアーゼ。」（以下、「本願発明」という。）
　
　
第２　引用例
１．原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願出願日前の平成１４年８月６日に頒布された刊行物である特開２００２−２１８９８９号公報（以下、「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（１）「配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン残基、
（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、
（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン残基、
（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、
（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基、
（ｈ）位置：グルタミン残基、
（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。」（請求項１）
　
（２）「プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されている。ところが、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんどであり、かかる実際の複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条件下でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。
　しかし、
さらに優れた特性を有するアルカリプロテアーゼが求められていた
本発明者らは前記アルカリプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行ってきたが、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させるには、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。」（【０００２】〜【０００４】）（下線は合議体による。以下、同様。）
　
（３）「実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした
　増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みはTaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精製溶出液３５μＬにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍濃縮液）を５μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロテアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量を５０μＬにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によるリガーゼ反応処理を行った。
　次に、同リガーゼ反応液１０μＬを用いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ったところ約４×１０5個の形質転換体が取得された。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、テトラサイクリン７．５μｇ／mL）上に生育させ、プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形成状態を観察した。その結果、野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質転換体を検出した。」（【００２９】〜【００３１】実施例１）
　
２．原査定の拒絶の理由で引用文献２として引用された本願出願日前の昭和６３年１１月２日に頒布された刊行物である特表昭６３−５０２９５９号公報（以下、「引用例２」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（１）「天然の細菌性プロテアーゼは現在多くの目的のために使用されており、これら目的の中には洗浄用製品への添加剤としてのものがある。布地上のほとんどの汚れはタンパク質であって、広域特異性プロテアーゼはかかる汚れの除去を実質上改善することができる。しかし残念ながら、天然プロテアーゼは洗剤含有溶液中で貯蔵された場合に活性を失ってしまう。典型的には、この活性の衰退は本来幾可級数的であって、即ち活性が一定の率で経時的に失われていく。本発明は、天然プロテアーゼよりも著しく長く液体洗剤中での貯蔵に耐えかつ
高い熱的安定性を有する新規プロテアーゼを開発する
　
（２）「本発明の一態様において、本発明はズブチリシンにおける２１８位のアミノ酸に相当するアスパラギンをセリンで置換したズブチリシン物質についてコードするクローン突然変異ズブチリシン遺伝子に関する。ＧＸ７１５０株によって生産されるこの変異体は７１５０と命名された。本発明は、ズブチリシンの２１８位のアミノ酸において他のアミノ酸、特にアスパラギン酸による置換も含む。・・・
　上記アミノ酸置換体のすべては、
ランダム突然変異誘発により製造され、本発明に従いスクリーニングされた
　ズブチリシン遺伝子の他に、他のセリンプロテアーゼまたは他のタイプの酵素に関する遺伝子も、特性が向上した生成物を製造するために突然変異させることができる。」（第８頁右下欄下９行〜１４行）
　
（３）「残存活性対時間の対数プロットによれば、大部分が半減期の３倍の時間にわたって直線的であることがわかった。したがって、−次速度則が適用可能である。これは第４図で説明され、そこでは１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ及びｐＨ８．０の５０ｍＭトリスＨＣｌの存在下６５℃におけるズブチリシン７１５０及び野生型酵素の活性低下速度を示す。これらの条件下で、野生型酵素は半減期が５９±３分であって、同様の条件で文献に報告された値と一致する［・・・］。
ズブチリシン７１５０の結果によればこの酵素は半減期２２３±１６分であって、野生型の場合のほぼ４倍である
　
（４）「変異体ＧＸ８３１５を３箇所点突然変異により製造した。３箇所点突然変異体はすべて、前記例２のランダム突然変異ズブチリシンをスクリニングすることによって見つけられた。３箇所点突然変異はＡｓｎ２１８→Ｓｅｒ；Ｇ１ｙ１３１→Ａｓｐ；及びＴｈｒ２５４→Ａｌａであった。オリゴヌクレオチド突然変異誘発法（ＯＤＭ）を使って、野生型ズブチリシンにおいてこれら３箇所の変化を生じさせた。
　第８図はこれら突然変異の数例の組合せ体の熱安定性に関する効果を示す。様々なタンパク質をｐＨ８．０の１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ中７０℃でインキュベートした。一部を様々な時間に取出し、残存酵素活性について試験した。これら条件下で、野生型ズブチリシンはその活性を１９．７分毎に半減させる。ＧＸ７１６０はＧＸ７１５０と同様であるが、但しＯＤＭによっては製造されない。
　変異体ＧＸ７１６０（Ａｓｎ２１８→Ｓｅｒ、突然変異誘発法により製造）はその活性を７１．１分毎に半減させるが、
野生型の半減期よりも３．５９倍長い
　変異体ＧＸ７１６９　（Ａｓｎ２１８→Ｓｅｒ及びＧｌｙ１３１→Ａｓｐ）はその活性を１２７．７分毎に半減させるが、
野生型の半減期よりも６．４５倍長い
　変異体ＧＸ８３１５（Ａｓｎ２１８→Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１３１→Ａｓｐ及びＴｈｒ２５４→Ａｌａ）はその活性を２３０．３分毎に半減させるが、
野生型の半減期よりも１１．６４倍長い
　
３．原査定の拒絶の理由で引用文献３として引用された本願出願日前の平成６年９月２２日に頒布された刊行物である特表平６−５０８２６４号公報（以下、「引用例３」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（１）「発明の一つの目的は、野生型プロテアーゼの実験値と比較して
すぐれた熱安定性
　
（２）「本発明の変異型プロテアーゼ類を表３に挙げた。
　　　　　　　　　　　　　」（第１０頁右下欄第８行〜第１１頁下３行）
　
　
第３　当審の判断
１．対比
  本願発明において、択一的に記載された「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」のうち、前者の「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」を選択した場合の本願発明について、その進歩性の有無を判断する。
　
　本願発明と引用例１に記載された発明を対比する。
　引用例１に記載された「配列番号１で示されるアミノ酸配列」と本願発明における「配列番号１で示されるアミノ酸配列」は、同一である。
　してみれば、両者は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼである点で一致し、本願発明では、「（ａ）６３位、（ｂ）８９位、（ｃ）１２０位、（ｄ）６３位及び１８７位、（ｅ）２２６位、（ｆ）２９６位、（ｇ）３０４位から選ばれる位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：セリン、
（ｂ）位置：ヒスチジン、
（ｃ）位置：アルギニン、
（ｄ）位置：セリン、
（ｅ）位置：チロシン、
（ｆ）位置：バリン、
（ｇ）位置：セリン」に置換され、「親アルカリプロテアーゼに比べて耐熱性が向上した変異アルカリプロテアーゼ」であるのに対し、引用例１では、置換するアミノ酸残基の位置が本願発明とは異なるものであり、酵素の耐熱性については特に記載されていない点で相違する。
　
２．判断
　引用例１には、従来のアルカリプロテアーゼよりも、優れた特性を有するアルカリプロテアーゼをさらに取得するという課題が記載されている（上記記載事項（２））。そして、引用例２及び３に記載されるように、プロテアーゼにおいて、耐熱性を向上させることは周知の課題である（引用例２の上記記載事項（１）及び引用例３の上記記載事項（１）参照。）。
　してみれば、引用例１に記載されたアルカリプロテアーゼにおいて、耐熱性の向上した変異アルカリプロテアーゼを取得することは、当業者が容易に想起することであり、そのために、引用例１及び２に記載されるように、本願出願前既に周知のアミノ酸置換変異体の製造方法であるランダム変異を用いて変異アルカリプロテアーゼを作製し、その中から耐熱性の向上した変異アルカリプロテアーゼを選択することは、当業者が容易になし得ることであって、本願発明の変異アルカリプロテアーゼは、そのような手法により得られたものである。
　
　本願発明の変異アルカリプロテアーゼの耐熱性について、本願明細書の図３をみると、活性半減期が野生型に対して１．２倍程度のものがある（実施例３、【００６０】、図３の「Ｉｌｅ２９６Ｖａｌ」及び「Ａｓｎ３０４Ｓｅｒ」）。ただし、加熱による残存活性を測定した実施例３の記載によれば、加熱処理する緩衝液については、組成及びｐＨの異なる３種類記載されており、さらにそれぞれの緩衝液について、塩化カルシウム添加または無添加の場合が記載されており、また、処理温度については６０〜８０℃と幅を持った記載がされており、どの条件で比較した結果であるのか不明である。
　また、酵素のアミノ酸配列が変更されれば、当然、酵素の各種の特性が、ある程度変化することは、当然予想されることであり、この程度の活性半減期の向上が予想できないほど顕著なものであるということはできない。
　さらに、引用例２には、バチルス由来のプロテアーゼ変異体の半減期が野生型に対して、４倍、３．５９倍及び１１．６４倍になったことが記載されており（引用例２の上記記載事項（３）及び（４）参照。）、引用例３の表３、４には、ｐＨ１０．０、６０℃において、バチルス由来のアルカリプロテアーゼの野生型の半減期は３分であるのに対して、例えば、変異体「Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９３Ｋ、Ｖ１９９Ｉ」の半減期は、６７分であり、約２２倍であることが示されている。
　そうすると、本願発明における１．２倍程度の半減期の増加は、引用例２及び３に記載された半減期の延長度合いと比較して、格別顕著であるとも認められない。
　
　また、本願発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなるものの変異体をも包含するものであるが、その中には、親アルカリプロテアーゼと比較して耐熱性が向上していないものも存在するといえ、本願発明に含まれる範囲全体にわたって親アルカリプロテアーゼに比して、耐熱性が向上するという効果を奏するものとはいえない。
　
　以上の点からみて、本願発明は、引用例１〜３に記載された事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
３．請求人の主張
　請求人は、審判請求の理由において、下記のように主張する。
（１）引用例１には、ＫＰ４３アルカリプロテアーゼのアミノ酸置換を行って耐熱性を向上させるという目的が記載されていない。
（２）本願発明において、変異対象となるアルカリプロテアーゼは、４３４アミノ酸より構成されるものであり、個々の位置のアミノ酸を野生型と異なる１９のアミノ酸に置換するだけで８２４６通り存在する。ランダム変異の手法を用いたとしても、これらの変異体の中から耐熱性に優れた酵素を得ることが、当業者が容易になし得ることとはいえない。
（３）本願発明の変異アルカリプロテアーゼは、変異前の親プロテアーゼと比べて、６０〜８０℃で１０分間処理した場合の活性半減期は親アルカリプロテアーゼの１．２〜７倍まで上昇するという優れた耐熱性を有する。耐熱性の向上の程度は、評価条件に左右されると推察され、異なる条件、異なる酵素の耐熱性の向上の程度を半減期の延長度合いだけで比較することには無理があり、あくまでも、変異酵素の効果は、基になる親酵素に対して、顕著な耐熱性の向上が認められることで、評価されるべきものである。
　
　上記主張について検討する。
主張（１）について
　上記２．で述べたとおり、引用例２及び３に記載されるように、プロテアーゼにおいて、耐熱性を向上させることは周知の課題であるから、引用例１に記載されたＫＰ４３アルカリプロテアーゼにおいて、耐熱性の向上した変異体を取得することは、当業者が容易に想起することである。
　
主張（２）について
　上記２．で述べたとおり、本願発明の変異アルカリプロテアーゼは、引用例１及び２に記載されるような、ランダム変異の導入とスクリーニングという手法を繰り返すことにより、容易に得られうるものであって、請求人の主張は採用できない。
　
主張（３）について
　たしかに、本願発明の酵素と、引用例２及び３に記載された酵素は、異なる酵素であるし、耐熱性を測定する条件も異なるものであるから、活性半減期を数値で一概に比較できるものではないと認められるが、引用例２及び３はいずれも本願発明と同様のバチルス由来のプロテアーゼに変異を導入することにより、耐熱性を向上させる点で軌を一にするものであって、本願発明の酵素の親酵素が引用例２及び３に記載された親酵素と比較して、変異により耐熱性が変化しがたい等の特段の事情がない限り、本願発明の変異体における半減期の延長度合いを評価するにあたり、引用例２及び３に記載された半減期の延長度合いは参考となるものであるといえる。そして、引用例２に記載された変異体は、半減期が１１．６４倍、引用例３では２２倍となるものが存在することからみて、本願発明の変異アルカリプロテアーゼが、野生型に対して１．２倍程度活性半減期が延長したことは、格別顕著な効果であるとは認められない。
　
　
第４　むすび
　以上のとおりであるから、本願請求項２に係る発明は、特許法第２９条２項の規定により、特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。