【手続補正書】
【提出日】平成17年8月25日(2005.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
３−（２，４−ジメトキシベンジリデン）アナバセイン（これはまた、「ＤＭＸＢ」または「ＧＴＳ−２１」として知られている）を示しており、これは、α７選択的ニコチン性アゴニスト活性を有するベンジリデン−アナバセインのモデルである。他の３−（ベンジリデン）アナバセインは、ベンジリデン部分が異なる置換基である以外同じである。
【図２】
基底核の両側に外傷を受けたラットにおける受動的回避行動に対するシンナミリデン−アナバセインの効果を示す。外傷を加えていない対照値は、２４７≠３５  Ｓｅｃ  平均±であった。（Ａ）は、３−シンナミリデンアナバセインである；（Ｂ）は、３−（メトキシシンナミリデン）アナバセインである；（Ｃ）は、３−（４−メトキシ−シンナミリデン）アナバセインである。投薬量は、ｍｇ／ｋｇでのＩＰであり、Ａ、ＢおよびＣにおいて左から右へそれぞれ：０；０．１；０．３；１．０および３．０である。*は、生理食塩水対照（１因子ＡＮＯＶＡ）と比較して、ｐ＜０．０５であることを示す。全ての値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６／群）である。
【図３】
脳アポトーシスに対する脳虚血（卒中）の効果、およびこのアポトーシスから保護するためのベンジリデン−アナバセインα７ニコチン性アゴニストの能力を示す。ラットに、それらの共通の頸動脈を縛ることによって、３０分間の虚血発作を与えた；アポトーシスの量（梗塞サイズに比例している）は、２４時間後に決定した。一部の動物には、結紮の１時間前にベンジリデン−アナバセイン化合物であるＤＭＸＢ（１  ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ、塩重量）、または結紮の５分後にニコチン性アンタゴニストであるメカミラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）、またはメカミラミンおよびＤＭＸＢの両方かまたはＤＭＸＢを与えた。結紮前に与えたＤＭＸＢ単独だけが、アポトーシスから保護した（*生理食塩水注射対照と比較して、ｐ＜０．０５；１因子ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４〜５／群）。
【図４】
ＥＣ５０濃度のニコチンへのｎ−アセチルコリンレセプタサブタイプの応答性に対する１００  ｍＭエタノールの効果を示す。
【図５】
生理食塩水の対照の注射と比較して、ＤＭＸＢ（ＧＴＳ−２１）の注射によってラットでのニコチン自己投与の阻害を示す。
【図６Ａ】
培養した新皮質神経細胞でのＥＡＡ誘発細胞毒性に対するＤＭＸＢの効果を示す。処理なし。
【図６Ｂ】
図６Ａと同様であり、細胞を、１ｍＭグルタミン酸で１０分間、次いで、洗浄後グルタミン酸で１時間インキュベートした。
【図６Ｃ】
図６Ａと同様であり、細胞を、グルタミン酸処理の前に、１０μＭ  ＤＭＸＢに２４時間曝露した。
【図６Ｄ】
図６Ａと同様であり、細胞を、グルタミン酸処理の前に、１０μＭ  ＤＭＸＢおよび１ｎＭ  α−ブンガロトキシンの同時適用に曝露した。スケールバー、５０μｍ。
【図６Ｅ】
ＤＭＸＢ前処理による神経毒性の阻害。ＤＭＸＢに曝露した２４時間後、１  ｍＭ  ＥＡＡを１０分間または１時間添加し、続いて、それぞれ、無ＥＡＡ培地を１時間添加するかまたは添加しなかった。対照の％は、これらにＥＡＡを曝露したまたは曝露しないときの生存可能細胞の割合である。
【図６Ｆ】
ＤＭＸＢまたはＭＫ  ８０１（各１０μＭ）を、１０分間にわたって、１  ｍＭグルタミン酸と共に、同時に適用した。*および＃は、それぞれ、グルタミン酸またはＮＭＤＡ単独由来のｐ＜０．０５を意味する。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）を反映している。
【図７】
グルタミン酸細胞毒性からのＤＭＸＢ誘発保護に対するコリン作動性アンタゴニストの効果。各アンタゴニストは、２４時間にわたって、１μＭ  ＤＭＸＢまたは１０μＭニコチンを含有する培地に添加した。ＨＥＸ、１μＭヘキサメトニウム。ＭＥＣ、１μＭメカミラミン。ＭＬＡ、１０  ｎＭメチルリカコニチン。ＢＴＸ、１ｎＭ（α）−ブンガロトキシン。ＡＴＲ、１μＭアトロピン。*および＃は、それぞれ、ＤＭＸＢまたはニコチン単独と比較して、ｐ＜０．０５を意味する（ｎ＝５）。
【図８Ａ】
病巣虚血発作に続いた梗塞サイズに対するＤＭＸＢの効果。前方ポールの５ｍｍ後方の冠状切片であって、この場所で、梗塞サイズが最大であった。斜線領域は、典型的な２８％梗塞（平均値）を有する染色された生理食塩水注射動物に由来する。底部：１９％梗塞（平均値）を有するＤＭＸＢ処理動物の冠状切片（同じ座標）。
【図８Ｂ】
病巣虚血発作に続いた梗塞サイズに対するＤＭＸＢの効果。前方ポールの５ｍｍ後方での全冠状領域の一部分としての梗塞サイズ。虚血の２４時間前に、薬剤を注射した。ＭＥＣ：０．５  ｍｇ／ｋｇ  ＩＰメカミラミン；ＤＭＸＢ：１  ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ。右パネル：虚血中に注射したＤＭＸＢ、*注射した生理食塩水と比較して、ｐ＜０．０５；一元ＡＮＯＶＡ（ｎ＝６〜８）。
【図９】
シンナミリジン構造とベンジリデン（ＧＴＳ−２１）との比較。
【図１０】
受動的回避行動におけるＤＭＸＢ誘発改善に対するメカミラミンの効果。成体ＳＤ白色種ラットを、基底核の両側に外傷を付け、そして教本で記述しているように、１ヶ月後、受動性回避行動について試験した。訓練および試験間隔に対する潜伏は、生理食塩水ビヒクル、０．５  ｍｇ／ｋｇ  ＤＭＸＢ、０．２  ｍｇ／ｋｇメカミラミン（ＭＥＣ）または両方の薬剤をＩＰ注射した１５分後に決定し、そして５匹の動物／群の平均±ＳＥＭとして、記述した。*生理食塩水を注射した群と比較して、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ。
【図１１】
基底核の両側に外傷を付けたラットでのＭｏｒｒｉｓ水課題における訓練に対するＤＭＸＢの効果。外傷を付けたまたは偽手術した動物を、教本で記述しているように、１ヶ月後に、訓練を開始した。外傷群および非外傷群において、毎日、最初の試行の１５分前に、生理食塩水希釈液、０．５  ｍｇ／ｋｇ  ＤＭＸＢ、０．２  ｍｇ／ｋｇメカミラミン（ＭＥＣ）、または両方の薬剤を、ＩＰ注射した。値は、その標的を見つけるのに必要な平均時間である（最大：６０秒）（Ｎ＝５）。群間比較は、表１で記述する。
【図１２】
基底核の両側に外傷を付けたラットでのＭｏｒｒｉｓ水課題における試行成績に対するＤＭＸＢの効果。図３で記述したように、動物に外傷を付け、訓練し、そして注射した。４日目にて、６０秒の試行間隔中にて、その標的象限で費やした時間の断片を、各群に対して決定し、そして５匹の動物／群の平均±ＳＥＭとして表わした。*生理食塩水を注射した外傷群と比較して、ｐ＜０．０５（一元ＡＮＯＶＡ）。
【図１３Ａ】
ラット新皮質での高親和性［3Ｈ］ＡＣｈまたは［125Ｉ］α−ブンガロトキシン（ＢＸＴ）結合に対するＤＭＸＢまたはニコチンの長期的注射の効果。成体オスラットに、生理食塩水ビヒクル、１ｍｇ／ｋｇ  ＤＭＸＢまたは０．２  ｍｇ／ｋｇニコチン（ＮＩＣ）（ＩＰ）を、２週間にわたって、毎日、注射した。その時点で、新皮質を除去し、その教本で記述したように、高親和性［3Ｈ］ＡＣｈまたは［125Ｉ］α−ブンガロトキシン結合についてアッセイした。各値は、４匹の動物／群の平均±ＳＥＭである；*生理食塩水を注射した対照値と比較して、ｐ＜０．０５（一元ＡＮＯＶＡ）。３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡおよび４−ＭｅＯＣＡに対するラットα７  ＡＣｈＲの応答。このラットα７サブユニットをコードするＲＮＡで注射した卵母細胞のピークアゴニスト活性化電流に対する濃度−応答関係。全ての応答は、まず、５００μＭ  ＡＣｈ（これは、薬剤適用の５分前に適用した）に対する個々の卵母細胞−応答に関連して、測定した。応答は、１の応答が完全な効率を表わすように、ＡＣｈで得ることができる最大応答に関連して、規準化した。５００μＭ  ＡＣｈ対照応答のＡＣｈ最大に対する比は、Ｐａｐｋｅら、１９９７から引き出した。
【図１３Ｂ】
ラット新皮質での高親和性［3Ｈ］ＡＣｈまたは［125Ｉ］α−ブンガロトキシン（ＢＸＴ）結合に対するＤＭＸＢまたはニコチンの長期的注射の効果。成体オスラットに、生理食塩水ビヒクル、１ｍｇ／ｋｇ  ＤＭＸＢまたは０．２  ｍｇ／ｋｇニコチン（ＮＩＣ）（ＩＰ）を、２週間にわたって、毎日、注射した。その時点で、新皮質を除去し、その教本で記述したように、高親和性［3Ｈ］ＡＣｈまたは［125Ｉ］α−ブンガロトキシン結合についてアッセイした。各値は、４匹の動物／群の平均±ＳＥＭである；*生理食塩水を注射した対照値と比較して、ｐ＜０．０５（一元ＡＮＯＶＡ）。３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡおよび４−ＭｅＯＣＡに対するラットα７  ＡＣｈＲの応答。特定濃度での３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡおよび４−ＭｅＯＣＡの適用後、ラットα７注射卵母細胞の対照（５００μＭ）ＡＣｈ応答のレジデュアルインヒビション。全ての応答は、５００μＭ
ＡＣｈ（これは、この実験アゴニスト適用の５分前に適用した）に対する卵母細胞応答に関連して表わされる。
【図１４Ａ】
３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡまたは４−ＭｅＯＣＡに対するα４β２  ＡＣｈＲの応答。ラットα４β２サブユニットをコードするＲＮＡで注射した卵母細胞のピークアゴニスト活性化電流に対する濃度−応答関係。応答は、まず、１０μＭ
ＡＣｈ（これは、薬剤適用の５分前に適用した）に対する応答に関連して表され、次いで、１の応答が全効能を表わすように、ＡＣｈで得ることができる最大応答に関連して、規準化した。１０μＭ  ＡＣｈ応答と最大ＡＣｈ応答との間の比は、別個の研究で決定された。
【図１４Ｂ】
３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡまたは４−ＭｅＯＣＡに対するα４β２  ＡＣｈＲの応答。特定濃度での３−ＣＡ、２−ＭｅＯＣＡまたは４−ＭｅＯＣＡの適用後、ラットα４β２注射卵母細胞の対照（１０μＭ）ＡＣｈ応答のレジデュアルインヒビション。応答は、１０μＭ  ＡＣｈ（これは、実験的アゴニスト適用の５分前に適用した）に対する個々の卵母細胞応答に関連して表わされる。
【図１５】
ＮＧＦ欠乏下にて分化したＰＣ１２細胞における神経突起生存率に対するコリンの効果。１週間分化し、次いでＮＧＦ＋血清を欠乏させたＰＣ１２細胞を、４日間にわたって、無血清培地（１００  ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと共にまたはそれなしで、特定コリン濃度±１０μｌメカミラミン）に曝露した。その時点で、ＰＣ１２細胞発現神経突起の画分を定量し、そして３〜４プレート／群の平均±ＳＥＭとして表わした。*未処理細胞と比較して、ｐ＜０．０５（一元ＡＮＯＶＡ）。