【手続補正書】
【提出日】平成18年2月2日(2006.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  体液由来の無細胞試料を、トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）のアポ形態およびハプトコリンと選択的に結合する固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片に接触させることと、続いて前記試料をＴＣＩＩまたはコバラミンに結合したＴＣＩＩ（ホロＴＣＩＩ）特異性の固定化されたまたは固定化され得る結合リガンドと接触させることと、リガンドに結合したフラクションをリガンドに結合していないフラクションと分離することと、そこに含まれるホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したコバラミンを測定することを含む、身体由来の試料（ｂｏｄｙ  ｓａｍｐｌｅ）中のＴＣＩＩに結合したコバラミンを定量するための検定方法。
【請求項２】  体液由来の無細胞試料を、ＴＣＩＩまたはホロ−トランスコバラミンＩＩ（ホロＴＣＩＩ）特異性であり、かつ、磁化可能な粒子上に固定された結合リガンドと接触させることと、磁場を適用することにより、リガンドに結合したフラクションをリガンドに結合していないフラクションと分離することと、および、前記リガンド結合フラクションに含まれるホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したコバラミンを測定することを含む、身体由来の試料中のホロＴＣＩＩを定量するための検定方法。
【請求項３】  前記リガンドに結合したフラクションの、前記リガンドに結合していないフラクションからの分離を、ホロＴＣＩＩの濃度を少なくとも３倍に増加させて行う請求項１または２に記載の検定方法。
【請求項４】  前記検定は、９ｐＭと同様に低い濃度のホロＴＣＩＩを検出することが可能な請求項１から３のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項５】  前記特異性結合リガンドが、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド、小さい有機化学薬品、組み合わせの化学（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）もしくはファージ展示ライブラリ、ＤＮＡもしくはＲＮＡの特定結合配列、または細胞表面レセプターから選択される特定のバインダーを含む群から選択される請求項１から４のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項６】  前記特異性結合リガンドが、ＴＣＩＩに対する高い程度の選択性および特異性を示し、かつ、その他のアポもしくはホロ形態のＴＣタンパク質または任意の他のコバラミン結合タンパク質に対しては低い親和性を示す請求項１から５のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項７】  前記特異性結合リガンドが、ＴＣＩＩに結合するモノクローナル抗体である請求項１から６のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項８】  前記コバラミンが、周囲の媒体の温度またはｐＨを変化させることによりホロＴＣＩＩ分子から放出される請求項１から７のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項９】  前記放出されたコバラミンが、コバラミンのための固定化された結合パートナーを、試料中の解離したコバラミンと、前記固定化された結合パートナーと結合することについて前記単離されたコバラミンと競合する標識リガンドの存在下で、接触させることによって行われる競合アッセイによって定量される請求項８に記載の検定方法。
【請求項１０】  前記標識リガンドが、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、比色定量評価、フルオレッセンス、放射活性または酵素活性により定量することができるシグナル形成ラベルで標識される請求項９に記載の検定方法。
【請求項１１】  前記標識リガンドが、化学ルミネッセンスにより定量することができるシグナル形成ラベルで標識される請求項９に記載の検定方法。
【請求項１２】  前記方法が、ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩ結合リガンドをその上に固定した固形担体を、調査しようとする試料および固定化されていないリガンドと接触させることと、
結合フラクションを非結合フラクションと分離することと、
前記固定化リガンドに結合した前記非固定化リガンド（前記結合フラクション）または非結合かつ溶液中の前記非固定化リガンド（前記非結合フラクション）を直接的にまたは間接的に定量することを含み、
前記固定化リガンドが、ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩ、前記非固定化リガンドまたは前記ＴＣＩＩもしくはホロＴＣＩＩと前記非固定化リガンドとの複合体に結合することが可能であり、かつ、前記非固定化リガンドが、前記固定化リガンドのうち少なくとも一つ、ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩおよび前記固定化リガンドとＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩとの複合体と結合することが可能であり、
前記検定方法がサンドイッチアッセイである場合、少なくとも一つの前記リガンドはホロＴＣＩＩ特異性であり、かつ、前記アッセイが競合アッセイである場合、前記固定化リガンドはホロＴＣＩＩおよびその競争物特異性であり、
ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩにより、前記非固定化リガンドにより、または前記非固定化リガンドとＴＣＩＩもしくはホロＴＣＩＩとの複合体によりそれぞれ結合された前記固定化リガンドの比率が、前記試料中に存在するホロＴＣＩＩの量に依存し、
前記非固定化リガンドが、結合時または非結合時に、直接的にまたは間接的に探知可能なシグナルを生成することが可能であり、
前記試料および前記非固定化リガンドの前記固形担体との接触は、個別に、同時にまたは連続的に行って良く、かつ、個別にまたは連続的に行う場合は、それらはどちらの順序で接触させても良い
請求項１に記載の検定方法。
【請求項１３】  前記ＴＣＩＩに結合したリガンドが、少なくとも１０9Ｍ-1の親和定数を有する請求項１から１２のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１４】  前記親和定数が、１０11Ｍ-1を超える請求項１から１３のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１５】  ホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したリガンドの、ＨＣとの交差反応性の程度が０．１％と１％の間である請求項１から１４のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１６】  ホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したリガンドの、ＨＣとの交差反応性の程度が０．１％以下である請求項１から１４のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１７】  前記ホロＴＣＩＩ複合体を含む前記試料を、前記固定化リガンドの、ホロＴＣＩＩが結合しているのと同じ結合部位を認識する標識されたリガンドが結合されている固層と接触させ、
前記試料中のホロＴＣＩＩは、前記結合した標識リガンドと、前記結合部位について競争し、その競争は、前記系の均衡化の後、前記固形担体から置換され、溶液中で検出可能な標識リガンドの量と、前記当初の試料中に存在するホロＴＣＩＩの量との間に直接比例関係があるような競争であり、前記標識リガンドは、前記固形担体に適切に結合したまたは結合していない標識リガンドの量として直接的にまたは間接的に検出される請求項１に記載の検定方法。
【請求項１８】  前記ホロＴＣＩＩ含有試料を、その上に固定化されたホロＴＣＩＩを有する固形担体および標識された、固定化されていないホロＴＣＩＩ特異性バインダーと接触させる請求項１に記載の検定方法。
ここで、前記サンプル中のフリーなホロＴＣＩＩおよび固定化されたホロＴＣＩＩは、標識された非固定化リガンドと結合することについて競争し、かつ、前記固形担体に結合しているかまたは溶液中に残っている前記標識リガンドの定量は、ホロＴＣＩＩ濃度の定量を可能にする。
【請求項１９】  前記ホロＴＣＩＩ含有試料を標識されたホロＴＣＩＩおよびその（therefor）固定化リガンドと接触させ、前記標識されたおよび標識されていないホロＴＣＩＩ複合体は前記固定化リガンドと結合することについて競争し、かつ、均衡化が到達した後、前記固定化リガンドに結合した標識されたホロＴＣＩＩの量が、前記試料中のホロＴＣＩＩの量と間接的に比例する請求項１に記載の検定方法。
【請求項２０】  前記身体由来の試料が、精液、脳脊髄液、羊水または血液由来の試料を含む群から選択される請求項１から１９のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項２１】  前記血液由来の試料が、血清または血漿である請求項２０に記載の検定方法。
【請求項２２】  前記結合フラクションを、沈殿分離法、遠心分離、濾過またはクロマトグラフィー法により前記非結合フラクションから分離する請求項１に記載の検定方法。
【請求項２３】  アッセイの校正（calibration）を、ホロＴＣＩＩ標準物質を使用することにより作る請求項１から２２のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項２４】  前記標準物質が、ヒトの、天然または組替えホロＴＣＩＩである請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】  ＴＣＩＩおよびハプトコリンのアポ形態と選択的に結合する固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片、ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩ特異性の、固定化されたまたは固定化され得る結合リガンドと、好ましくは既知の濃度のホロＴＣＩＩ溶液またはホロＴＣＩＩ複合体濃度の範囲を有するそのような溶液のセットと、任意にコバラミンをホロＴＣＩＩから放出させる放出剤（release agent）と、任意に標識リガンドとを含む請求項１に記載の、診断上のアッセイに使用するキット。
【請求項２６】  請求項１から２５のいずれか一項に記載の、ホロＴＣＩＩの、ホロＴＣＩＩのためのアッセイの校正物質としての使用方法。