【手続補正書】
【提出日】平成18年1月23日(2006.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作されて天然親株のゲノムよりも少なくとも5%小さいゲノムを有する細菌。
【請求項２】
ゲノムが遺伝子操作されて天然親株のゲノムよりも少なくとも７%小さく、例えば、少なくとも8％、少なくとも14％、または少なくとも20％小さい、請求項１記載の細菌。
【請求項３】
天然親株がE. coli株である、請求項１または２記載の細菌。
【請求項４】
前記細菌のゲノムが、遺伝子操作されて、鞭毛遺伝子、制限修飾系遺伝子、リポ多糖類表面遺伝子、挿入配列、rhs因子、毒素遺伝子、病原性遺伝子、線毛遺伝子、侵入遺伝子、ペリプラズムたんぱく質遺伝子、膜たんぱく質遺伝子、プロファージ、偽遺伝子、K島、バクテリオファージレセプター、前記天然親株のゲノム中の非転写領域、および前記天然親株の同じ種または関連種の任意の２つの細菌株の双方に存在しない遺伝子または他のDNA配列からなる群から選ばれた１つ以上のDNAが前記細菌のゲノムから欠失している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
遺伝子操作されて4.27 Mbよりも小さいゲノム若しくは4.00 Mbよりも小さいゲノムを有するE. coli菌。
【請求項６】
ペリプラズム中に分泌させるまたはペリプラズム中で加工するたんぱく質をコード化する１種以上の遺伝子を欠失させたゲノムを有する細菌。
【請求項７】
前記１種以上の遺伝子が、fliY、yedO、nfnB、tauA、mppA、tynA、chiA、fimC、fecB、ygiH、yagPおよびyhcAからなる群から選ばれる、請求項６記載の細菌。
【請求項８】
天然親と比較したとき、そのたんぱく質コード遺伝子の9％、例えば約15.6％または約21.5％、の欠落を有するE. coli。
【請求項９】
下記の各工程を含むことを特徴とする、既知の配列の選定されたゲノム領域において瘢痕を導入することなしに細菌のゲノム中に欠失を構築する方法：
１端上に、欠失すべきゲノム領域の左側のゲノム配列と同一の配列第１番およびそれに続く欠失すべきゲノム領域の右側のゲノム配列と同一の配列第２番；他端上に、欠失すべきゲノム領域内のゲノム配列と同一の配列第３番；並びに、前記線状DNA分子の１端上の配列第１番および第２番と前記線状DNA分子の他端上の配列第３番との間の配列特異性ヌクレアーゼ認識部位を含み、該認識部位は前記細菌のゲノム中には存在していない人工DNA配列を構築する工程；
前記人工DNA配列を、前記第１番および第３番の配列と前記細菌のゲノム中の配列との間の相同的組換えに有利に作用する条件下において、前記細菌中に導入する工程；
ゲノムが前記線状DNA分子の正確な部位挿入物を含有する前記細菌中に、前記認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターを導入する工程；
前記細菌中の前記配列特異性ヌクレアーゼを発現させる工程；および、
前記配列特異性ヌクレアーゼの発現が残存し且つ正確な欠失を含有する前記細菌を集める工程。
【請求項１０】
前記人工DNA配列を前記細菌中に前記人工DNA配列を担持するベクターによって導入するか、若しくは前記人工DNA配列を前記細菌中に直接導入する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記線状DNA分子と前記細菌との間の相同的組換えの頻度を増大させ得る系をさらに含み、該系がファージRedリコンビナーゼ系である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
下記の各工程を含むことを特徴とする、細菌のゲノムからの既知配列のDNAの欠失を瘢痕を導入することなしに構築する方法：
相同的組換えの頻度を増大させ得る系の発現ベクターと前記細菌のゲノム中には存在しない認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターとを含有し、前記配列特異性ヌクレアーゼの発現は誘発性プロモーターの制御下にあり、前記２つの発現ベクターは和合性である、細菌を調製する工程、；
１端上に、欠失すべきゲノム領域の左側のゲノム配列と同一の配列第１番およびそれに続く欠失すべきゲノム領域の右側のゲノム配列と同一の配列第２番；他端上に、欠失すべきゲノム領域内のゲノム配列と同一の配列第３番；並びに、線状DNA分子の１端上の配列第１番および第２番と線状DNA分子の他端上の配列第３番との間の認識部位を含み、該認識部位が前記細菌の天然ゲノム中には存在していない人工DNA配列を、前記細菌中に導入する工程；
前記配列特異性ヌクレアーゼを発現させる工程；および、
正確な欠失を含有する前記細菌を集める工程。
【請求項１３】
前記線状DNA分子が、前記人工DNAの１端上の配列第１番および第２番と前記人工DNAの他端上の配列第３番との間に、選択性マーカー遺伝子をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記の各工程を含むことを特徴とする、既知の配列の選定されたゲノム領域において瘢痕を導入することなしに細菌のゲノム中に欠失を構築する方法：
テトラサイクリンプロモーター、該テトラサイクリンプロモーターによって制御された複製のラムダ起源および抗生物質耐性遺伝子を含むベクターを調製する工程；
前記ベクター中に、互いに隣接して位置する２つのDNA配列を含み、１つのDNA配列が片側上の欠失すべき上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一であり、他のDNA配列が他方側上の上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一であるDNA挿入物を挿入する工程；
細菌を、前記DNA挿入物を含有するベクターで形質転換させる工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを不活化し、前記細菌を該抗生物質に暴露させて、前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込んだ細菌を選択する工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを、前記ベクターを前記ゲノム中に組込みさせた細菌中で活性化する工程；および、
欠失すべきゲノム領域が欠失している細菌を同定する工程。
【請求項１５】
下記の各工程を含むことを特徴とする、既知の配列の選定されたゲノム領域において瘢痕を導入することなしに細菌のゲノム中に欠失を構築する方法：
テトラサイクリンプロモーター、該テトラサイクリンプロモーターによって制御された複製のラムダ起源、抗生物質耐性遺伝子および配列特異性ヌクレアーゼ認識部位を含むベクターを調製する工程；
前記ベクター中に、互いに隣接して位置する２つのDNA配列を含み、１つのDNA配列が片側上の欠失すべき上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一であり、他のDNA配列が他方側上の上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一であるDNA挿入物を挿入する工程；
細菌を、前記DNA挿入物を含有するベクターで形質転換させる工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを不活化し、前記細菌を該抗生物質に暴露させて、前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込みさせた細菌を選択する工程；
前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込みさせた細菌中に、前記認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターを導入する工程；
前記配列特異性ヌクレアーゼを前記細菌中に発現させる工程；および、
欠失すべきゲノム領域が欠失している細菌を同定する工程。
【請求項１６】
細菌ゲノムの選定された領域をDNA配列で置換する方法であって、該DNA配列と選定された領域とが相同的組換えを起こすことができ、かつ下記の各工程を含む方法：
テトラサイクリンプロモーター、該テトラサイクリンプロモーターによって制御された複製のラムダ起源および抗生物質耐性遺伝子を含むベクターを調製する工程；
該ベクター中に、前記細菌ゲノムの選定された領域を置換えるための前記DNA配列を含むDNA挿入物を挿入する工程；
細菌を、前記DNA挿入物を含有するベクターで形質転換させる工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを不活化し、前記細菌を該抗生物質に暴露させて、前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込みさせた細菌を選択する工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを、前記ベクターを前記ゲノム中に組込みさせた細菌中で活性化する工程；および、
前記選択されたゲノム領域が前記DNA配列で置換されている細菌を同定する工程。
【請求項１７】
前記テトラサイクリンプロモーターの活性化および不活化を、テトラサイクリン誘発剤を添加および除去することによって行う、請求項１４または１６記載の方法。
【請求項１８】
細菌ゲノムの選定された領域をDNA配列で置換する方法であって、該DNA配列と選定された領域とが相同的組換えを起こすことができ、かつ下記の各工程を含む方法：
テトラサイクリンプロモーター、該テトラサイクリンプロモーターによって制御された複製のラムダ起源、抗生物質耐性遺伝子および配列特異性ヌクレアーゼ認識部位を含むベクターを調製する工程；
前記ベクター中に、前記細菌ゲノムの選定された領域を置換えるための前記DNA配列を含むDNA挿入物を挿入する工程；
細菌を、前記DNA挿入物を含有するベクターで形質転換させる工程；
前記テトラサイクリンプロモーターを不活化し、前記細菌を該抗生物質に暴露させて、前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込みさせた細菌を選択する工程；
前記ベクターを前記細菌ゲノム中に組込みさせた細菌中に、前記認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターを導入する工程；
前記配列特異性ヌクレアーゼを前記細菌中に発現させる工程；および、
前記選択されたゲノム領域が前記DNA配列で置換されている細菌を同定する工程。
【請求項１９】
下記の各工程を含むことを特徴とする、既知の配列の選定されたゲノム領域において細菌のゲノム中に欠失を構築する方法：
配列特異性ヌクレアーゼ認識部位と、１つのDNA配列が片側上の欠失すべき上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一であり且つ他のDNA配列が他方側上の上記細菌ゲノム領域に隣接する配列と同一である２つのDNA配列を含み、該２つのDNA配列をベクター上で互いに隣接して位置させ、前記配列特異性ヌクレアーゼ認識部位をベクター上の前記２つのDNA配列の外側に位置させたベクターを調製する工程；
該ベクターを細菌中に導入する工程；
前記の同じ細菌中に、前記認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターを導入する工程；
前記の同じ細菌中に、相同的組換えの頻度を増大させ得る系を導入し、同時に、前記配列特異性ヌクレアーゼを前記細菌中に発現させる工程；および、
欠失させるべき前記ゲノム領域を欠失させた細菌を同定する工程。
【請求項２０】
細菌ゲノムの選定された領域をDNA配列で置換する方法であって、該DNA配列と選定された領域とが相同的組換えを起こすことができ、かつ下記の各工程を含む方法：
配列特異性ヌクレアーゼ認識部位と前記細菌ゲノムの選定された領域を置換するためのDNA配列とを含み、前記配列特異性ヌクレアーゼ認識部位をベクター上の前記DNA配列の外側に位置させたベクターを調製する工程；
該ベクターを細菌中に導入する工程；
該同じ細菌中に、相同的組換えの頻度を増大させ得る系を導入する工程；
該同じ細菌中に、前記認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターを導入する工程；
前記配列特異性ヌクレアーゼを前記細菌中に発現させる工程；および、
置換すべき前記ゲノム領域を置換させた細菌を同定する工程。
【請求項２１】
前記配列特異性ヌクレアーゼがI-SceIである、請求項９、１０、１５及び１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
相同的組換えの頻度を増大させ得る系がファージλRedリコンビナーゼ系である、請求項１３、１９または２０記載の方法。
【請求項２３】
請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法によって産生される細菌。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細菌中に、発現制御配列に操作上結合させたシグナル配列を有するたんぱく質をコード化するDNAを含むベクターを導入し；該細菌を、前記たんぱく質コード化DNAの発現に適する栄養条件下に増殖させることを特徴とする、細菌中での改良された組換えたんぱく質の発現方法。
【請求項２５】
前記発現制御配列を構成的に発現させるか、または前記発現制御配列が誘発性プロモーターである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
１端上に、欠失すべきゲノム領域の左側のゲノム配列と同一であり、欠失すべきゲノム領域の右側のゲノム配列と同一の配列第２番に隣接した配列第１番；他端上に、欠失すべきゲノム領域内のゲノム配列と同一の配列第３番；並びに、線状DNA分子の１端上の配列第１番および第２番と前記線状DNA分子の他端上の配列第３番との間の配列特異性ヌクレアーゼ認識部位を含み、該配列特異性認識部位は前記細菌のゲノム中には存在しない線状DNA配列。
【請求項２７】
前記線状DNA配列の１端上の配列第１番および第２番と前記線状DNA配列の他端上の配列第３番との間に選択性マーカー遺伝子をさらに含む、請求項２６記載の線状DNA。
【請求項２８】
均質組換えの頻度を増大させ得る系の発現ベクターおよび細菌のゲノム中には存在しない認識部位を認識する配列特異性ヌクレアーゼの発現ベクターとを含み、前記配列特異性ヌクレアーゼの発現は誘発性プロモーターの制御下にあり且つ前記２つの発現ベクターは和合性であり得、さらに、１端上に欠失すべきゲノム領域の左側のゲノム配列と同一の配列第１番およびそれに続く欠失すべきゲノム領域の右側のゲノム配列と同一の配列第２番；他端上に欠失すべきゲノム領域内のゲノム配列と同一の配列第３番；並びに、線状DNA分子の１端上の配列第１番および第２番と前記線状DNA分子の他端上の配列第３番との間の配列特異性ヌクレアーゼ認識部位を含む線状DNA配列を含み、該認識部位は前記細菌の天然ゲノム中には存在しないことを特徴とする細菌。
【請求項２９】
前記人工DNAの１端上の配列第１番および第２番と前記人工DNAの他端上の列第３番との間に選択性マーカー遺伝子をさらに含む、請求項２８記載の細菌。
【請求項３０】
相同的組換えの頻度を増大させ得る前記系がファージλRedリコンビナーゼ系である、請求項２８または２９記載の細菌。
【請求項３１】
選択性マーカー遺伝子；プロモーターの制御下の複製起源；第２DNA配列に隣接し且つ同じ配向の第１DNA配列を含み、その１つの配列が欠失すべき細菌ゲノムの１端に隣接する配列と同一であり、他のDNA配列が欠失すべき細菌ゲノム領域の他端に隣接する配列と同一である挿入DNAを含むベクター。
【請求項３２】
前記第１および第２DNA配列間に挿入した第３のDNA配列および/または配列特異性ヌクレアーゼ認識部位をさらに含む、請求項３１記載のベクター。
【請求項３３】
前記選択性マーカーが抗生物質耐性遺伝子、例えばクロラムフェニコールに対して耐性を与えるものである、請求項２７記載の線状ＤＮＡ、請求項２９または３０記載の細菌、または請求項３１または３２記載のベクター。
【請求項３４】
前記配列特異性ヌクレアーゼ認識部位がI-SceIである、請求項２６または２７記載の線状ＤＮＡ、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の細菌、または請求項３２または３３記載のベクター。
【請求項３５】
１以上のバイアルを含み、該バイアルが、請求項２６、２７、３３および３４のいずれか一項に記載のDNAからなる群から選ばれた１種以上のDNA、または請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のベクターからなる群から選ばれたベクターを含み、更に任意に、緩衝液、ヌクレオチド類、制限エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを含有することを特徴とするキット。