【手続補正書】
【提出日】平成18年3月14日(2006.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
細胞外タンパク質の分解／崩壊が重要な役割を担う、様々な他の障害がある。そのような疾患の例には、関節炎、後天性免疫不全症候群(エイズ)、熱傷、褥瘡および静脈瘤性潰瘍といったような創傷、骨折、外傷、胃潰瘍形成、ざ瘡および乾癬といったような皮膚病、苔癬様病変、表皮水疱症、アフタ(反応性口腔潰瘍)、歯周病、インプラント周囲炎(peri-implantitis)、顎および他の嚢胞並びに根管処置または歯内治療処置、関連のある疾患、外部および内部の歯根吸収、齲蝕等といったような歯科病が含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ＭＭＰスーパーファミリーの少なくとも２０のメンバーが知られていて(Ｂirkendal−Ｈansen，１９９５；Ｐei ＆ Ｗeiss，１９９６；Ｌlanoら，１９９７)、ＭＭＰファミリーメンバーおよびそれらの細胞起源の数は増え続けている。ＭＭＰ酵素は各々、酵素において活性部位を構成すると思われる、推定上の三座配位Ｚn２＋結合部位を含む。ごく最近では、cＤＮＡライブラリーを既知のＭＭＰ遺伝子の保存領域に対する相同性に関してスクリーニングすることにより、ＭＭＰファミリーの３つの新たなメンバーが発見されて、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、−２、および−３(ＭＴ−ＭＭＰ−１、−２、および−３)と名付けられた。それらの予想されるアミノ酸配列に基づいて、ＭＴ−ＭＭＰは各々、前に特性決定したＭＭＰはほとんど全て、（ｉ）候補のリーダー配列、（ii）触媒作用的に不活性な状態にあるＭＭＰチモーゲンを安定化するのに役立つ、高度に保存されたＰＲＣＧＸＰＤ配列が含まれるプロペプチド領域、（iii）亜鉛が結合する触媒作用ドメイン、および（iv）それらの各々のＣ末端付近にヘモペキシン様ドメインを含む。加えて、ストロメライシン−３に関して記載されているパターンに似たパターンでは、ＭＴ−ＭＭＰは各々、プロタンパク質転換酵素ファミリーのメンバーに関して可能性のある認識モチーフをコードする、それらのプロドメインと触媒作用ドメインとの間に挟まれた、短いアミノ酸挿入断片を含む。しかしながら、他のＭＭＰファミリーメンバーに対する、それらの相当な類似性にもかかわらず、ＭＴ−ＭＭＰだけが、それらのＣ末端に約７５−１００個のアミノ酸伸張を含み、これらには各々、膜貫通(ＴＭ)ドメインの存在と一致する疎水性ストレッチが含まれる。従って、全ての他のＭＭＰと対比して、ＭＴ−ＭＭＰは、可溶性タンパク質というよりはむしろ、膜に結合した細胞外酵素として発現する(Ｐei ＆ Ｗeiss，１９９６)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ゼラチナーゼＡまたは７２kＤaのＭＭＰ−２およびゼラチナーゼＢまたは９２kＤaのＭＭＰ−９は、当初、それらが基底膜の分解に不可欠な酵素であるらしいことから、IV型コラゲナーゼとして記載されていた(Ｔryggvasonら，１９８７)。細胞は、循環に出入りする間、内皮基底膜を通り抜ける必要がある。これはまた、腫瘍細胞が遠位の臓器に転移し得る前に成し遂げなければならない転移カスケードにおいて極めて重要な工程でもある。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はまた、脈管形成(Ｈanahan ＆ Ｆolkman，１９９６；Ｖolpertら，１９９６)および局所腫瘍浸潤(Ｓtetler−Ｓtevensonら，１９９３)といったような転移カスケードの他の工程における機能も有し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明にはまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ依存状態の処置のための医薬品製剤の製造を目的とした、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の使用、およびそれにまた、ＭＭＰの生化学的な精製および単離方法における、例えば、親和性リガンドとしての、それらの使用も含まれる。ＭＭＰ依存状態には、限定されるものではないが、創傷、熱傷、骨折、病変、潰瘍、結合組織および骨における癌および転移進行、歯周炎、歯肉炎、インプラント周囲炎、嚢胞、根管処置、内部および外部の根管吸収、齲蝕、エイズ、角膜潰瘍形成、胃潰瘍形成、アフタ、外傷、ざ瘡、乾癬、骨内股関節部プロテーゼの弛み、骨髄炎、骨粗鬆症、組織再構築、脈管形成、関節炎(リウマチ、反応性および骨関節炎)、脈管形成、肺疾患(気管支拡張症および慢性閉塞性肺疾患および他の肺疾患)が含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
上に述べたように、我々が開発した新規環状ペプチド阻害剤は、ＭＭＰおよび細胞遊走をブロックするためのペプチド模倣物質を設計するのに有用なリード化合物である。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、２つのＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣペプチドにより別々に阻害されたので、ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣモチーフはまた、ＭＭＰファミリーの個々のメンバーに対してより選択的な阻害剤を開発するのに利用することもできる：ＭＭＰ−２は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣにより、より強く阻害されたが、ＭＭＰ−９は、ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣにより優先的に阻害された。多くの実験系において、腫瘍細胞の転移の可能性は、ＭＭＰ−９活性よりはむしろＭＭＰ−２活性とかなり相関していたので、例えば、ＭＭＰ−２に向けられた選択的な阻害剤は、腫瘍播種を防ぐのにより有効であるかもしれない。最後に、小さなサイズのＭＭＰ標的化環状ペプチドを、薬物を腫瘍へと運ぶために利用することができる。腫瘍脈管系においてファージライブラリーから得られるペプチド標的化受容体は、マウスにおける腫瘍への有用な細胞毒性薬物担体であることが見出された。ＭＭＰは、通常、正常組織と比較して、腫瘍において過剰発現し、脈管形成過程に関与するらしいので、標的化した化学療法に関して可能性のある受容体である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
図４は、セファロースに結合したＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドへのプロＭＭＰ−９の結合を示す。ヒト軟膜細胞のライゼートを各々のペプチドセファロースに適用して、ＳＤＳゲル、続いて、クーマシーブルー染色（レーン１−２）、または抗ＭＭＰ−９抗体での免疫ブロッティング（レーン５−６）により、結合タンパク質を分析した。レーン１および５は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−セファロースから溶出したタンパク質を示す。レーン２および６は、ＧＡＣＬＲＳＧＲＧＣＧＡ−セファロースから溶出したタンパク質を示す。レーン３は、細胞ライゼートのタンパク質染色を示す。レーン４は、２００、９２、７６、および５５kＤaの分子量マーカーを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
図１０は、黒色腫細胞成らし培地のゼラチン酵素電気泳動法を示す。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドは、活性な８２kＤのＭＭＰ−９の形成を阻害するが、対照ペプチドは阻害しない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
図１２は、角化細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
図１３は、角化細胞遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。遊走してから４日後にプレートの写真を撮る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例１．ファージ提示ライブラリーの作製およびＭＭＰ−９に結合するファージの選択
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本質的にはＨibbsら（１９８５）により記載されているように、プロＭＭＰ−９をヒト好中球から精製して、酢酸アミノフェニル水銀(ＡＰＭＡ)で活性化した。ＭＭＰ−９に結合するファージの選択のために、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰ−９を１μg／mlの濃度を使用して、マイクロタイタープレートを４℃で一晩被覆した後、細胞を５％ウシ血清アルブミンで飽和した。最初のパニング(panning)では、１％ウシ血清アルブミンを含む５０mＭ トリス−ＨＣl／０.１Ｍ ＮaＣl緩衝液(pＨ ７.５)(ＴＢＳ)中、ライブラリーを４℃で一晩インキュベートし、何回も洗浄した後、結合ファージを低いpＨの緩衝液で溶出した。その後のパニングでは、増幅したファージを２２℃で１時間結合させた。Ｋoivunenら（１９９４ｂ）により記載されているように、ランダムに選択したクローンを一晩増幅して、配列決定した。ＭＭＰ−９への各々のクローンの結合を結合アッセイにより確かめ、ここでは、ＭＭＰで被覆した、または盲検のマイクロタイタープレートウェル中、クローン化ファージを６０分間インキュベートした。そのウェルを、０.５％ トゥイーン２０を含むＴＢＳで５回洗浄した。ユウロピウム−キレート(Ｗallac Ｌtd.，Ｔurku，Ｆinland)で標識した抗Ｍ１３抗体(Ｐharmacia，Ｕppsala，Ｓweden)を１ウェルあたり５０ng加えることにより、結合ファージを定量した。４５分間インキュベーションし、続いて、洗浄した後、蛍光を１２３０ Ａrcus 蛍光光度計(Ｗallac Ｌtd.，Ｔurku，Ｆinland)で測定した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
我々はまた、ゼラチナーゼに対する基質としてβ−カゼインを使用して、ＳＤＳゲル電気泳動法により分解産物も分析した。２つのＨＷＧＦを含むペプチドは、ＭＭＰによるカゼインの分解を有効に防いだ。ＭＭＰ−２に関して、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣおよびＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプチドは各々、約５μg／mlおよび２５μg／mlのＩＣ５０値を有していた（図３Ａおよび３Ｃ）。ＡＰＭＡで予め活性化しておかなかったプロＭＭＰ−２もまたカゼイン分解を引き起こし、これは各々、５μg／mlおよび２５μg／mlの同じＩＣ５０値でのペプチドによりブロックされた（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＭＭＰ−９によるカゼイン分解は、ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣがこのＭＭＰに対してＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣより僅かに強力な阻害剤であったことを除き、低いマイクロモル濃度でのペプチドにより同様に阻害された。これらのペプチド(０−２００μg／ml)は、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１(ＭＴ１−ＭＭＰ)を阻害せず、腫瘍浸潤および基底膜崩壊におけるゼラチナーゼ(ＭＭＰ−９および−２)の重要性に関する証拠を与えた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
製造業者(Ｐharmacia，Ｕppsala，Ｓweden)の指示によって、ＣＮＢrで活性化したセファロース１mlあたりペプチド２mgを結合させることにより、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣのアフィニティークロマトグラフィー樹脂を作製した。Ｆinnish Ｒed Ｃrossから得たヒト軟膜細胞を、１％ オクチルグルコシドを含む５０mＭ ＴＢＳに溶解して、澄明となった抽出物２０mlを各々のペプチドセファロースに適用した。ＯＤ２８０が０.０１以下となるまで、カラムを洗浄した。１％ オクチルグルコシドの存在下、結合タンパク質を０.１Ｍ グリシン−ＨＣl緩衝液(pＨ ２.２)で溶出した。次いで、そのpＨを１Ｍ トリス塩基で中和した。還元条件下、画分２０μlを８％ アクリルアミドゲルでのＳＤＳゲル電気泳動法により分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。免疫ブロット分析に関して、ニトロセルロースフィルターをポリクローナルＭＭＰ−９抗体と共に１：５００の希釈で１時間、続いて、二次抗ウサギ抗体と共に１：１０００の希釈でもう１時間インキュベートした。高められた化学発光システム(Ａmersham，Ｂuckinghamshire，Ｅngland)を視覚化のために使用した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
白血球から得られた抽出物を、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣと結合させたセファロースカラムに適用して、ＳＤＳゲル電気泳動法および抗ＭＭＰ−９抗体での免疫ブロッティングにより、結合したタンパク質を分析した。ペプチドカラムは、一組のポリペプチドを結合し、このうちの一方は、９２kＤaのプロＭＭＰ−９であった(図４)。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣセファロースに結合したプロＭＭＰ−９は、ＳＤＳゲルを９２kＤaでダブレットとして移動し（レーン１）、この型は両方とも、抗ＭＭＰ−９抗体と免疫反応性であった。幾つかの腫瘍セルラインにより成らされた培養培地のＭＭＰ−９免疫ブロットにおいて、類似のダブレットを観察することができた(データは示しておりません)。ペプチドセファロースはまた、５５−６５kＤaで遊走する一組のポリペプチドも結合し、この同一性は知られておらず、さらに試験しなかった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
使用前に血清を含む培地中で２時間平衡化した、細孔径 ８.０μＭおよび直径 ６.５mmのトランスウェル挿入物(Ｃostar，Ｃambridge，ＭＡ)を使用して、ランダム細胞遊走を試験した。Ｍatrigel(Ｂecton Ｄickinson，Ｂedford，ＭＡ)で予め被覆しておいて、血清を含む培地で平衡化した、直径 ６.４mmのＢoydenチャンバーを使用して、腫瘍細胞浸潤を試験した。血清を含む培地７５０μlを、遊走装置のより低いコンパートメントに加えた。ランダム遊走アッセイに関して、指示した濃度でのペプチドの存在下、細胞を予め２時間インキュベートしておいて、容積１００μl中の２０,０００個の細胞をトランスウェルに塗布した。Ｍatrigel浸潤に関して、容積５００μl中の１００,０００個の細胞を、ペプチドと共に、またはペプチドなしで、各々のウェルに塗布した。細胞を１６−２０時間培養した後、細胞をメタノールで固定し、洗浄して、トリパンブルーで染色した。細胞を膜の上面から綿棒で除去して、膜の下部に遊走した細胞を顕微鏡により数えるか、あるいはまた、走査により定量した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
Ｃ８１６１黒色腫細胞を、１０％ 血清を含む培地中、２４ウェルのプレートにおいて４８時間培養した。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドが図１０において指示した濃度(５００−１０μg／ml)で含まれており、対照ペプチドＲＡＶＲＡＬＷＲＣは、５００μg／mlで含まれていた。成らし培地を、ＳＤＳゲル電気泳動法、続いて、ゼラチン酵素電気泳動法により分析した。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣは、８２kＤaの活性ＭＭＰ−９のレベルを濃度依存的に減少させたが、７２kＤaのプロＭＭＰ−２のレベルには影響を及ぼさなかった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例９．角化細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
ＫＧＭ ５０μl中、３０,０００個のＨaＣat細胞(自発的にトランスフォームした非腫瘍形成性ヒト角化細胞セルライン，Ｒyleら，１９８９)を９６ウェルのプレート(Ｎunclon，Ｄenmark)のウェルに播種して、加湿大気中、３７℃で２４時間結合させた。次いで、その細胞を、１０ng／mlのＴＧＦβと共に、またはなしで、ＫＧＭまたは５０−５００μg／mlのＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣを含むＫＧＭにさらした。一組の培養物を、１、１０または２０ng／mlのＴＧＦβ単独で処理した。２４時間後、培地を収集して、酵素電気泳動法(Ｈeussen ＆ Ｄowdle，１９８０)により分析するまで、−２０℃で保存した。培養培地１２μlを、１.０mg／mlの２−メトキシ−２,４−ジフェニル−３(２Ｈ)−フラノンで標識したゼラチン(Ｏ'Ｇradyら，１９８４)を含む１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて泳動した。ゼラチンの溶解を長波紫外光によりモニターして、ゲルを写真撮影した。コンピューター化デンシトメーター(ＭＣＤＩ−Ｍ４，Ｉmaging research Ｉnc.，Ｓt. Ｃatherines，Ｏntario，Ｃanada)を使用して、写真撮影したゲルからゼラチナーゼの量を測定した。プレートにおける細胞を、５％(ｖ／ｖ) スクロースを含むＰＢＳ中の４％(ｖ／ｖ) ホルムアルデヒドで固定して、ホウ酸(pＨ ６.０)中の０.１％ クリスタルバイオレットで２０分間染色した。１０％ 酢酸で脱染色した後、吸光度をＭultiscan ＭＳ プレート読み取り装置(４.０版，Ｌabsystem，Ｈelsinki，Ｆinland)で５９５nmにて測定した。この方法により得られた相対細胞数を、細胞１個あたりのゼラチナーゼの量を数える場合に使用した。ＭＭＰ−９だけが、細胞１個あたりの酵素の量を計算するための測定可能な切断率を与えた。図１２に示す結果は、２回の実験の平均である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
実施例１０．角化細胞ゲラチナーゼの遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、合成ペプチドを使用しての、ＭＭＰ−９が媒介する[１２５Ｉ]−ゼラチン分解の阻害から得られた結果を示す。
【図２】  図２は、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰまたはそれらのプロ型により誘発されるゼラチン分解を示す。
【図３】  図３は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ａ、Ｂ）およびＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣ（Ｃ、Ｄ）による、ＭＭＰ−２が媒介するカゼイン分解の阻害を示す。
【図４】  図４は、セファロースに結合したＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドへのプロＭＭＰ−９の結合を示す。
【図５】  図５は、どのようにしてＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣがＨＴ１０８０線維肉腫細胞の遊走を阻害するかを示す。
【図６】  図６は、Ｃ８１６１黒色腫細胞の遊走を防ぐためのＭＭＰ阻害剤ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣおよびＣＭＴ−８の効力の比較を示す。
【図７】  図７は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる内皮細胞遊走の阻害を示す。
【図８】  図８は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる腫瘍細胞のＭatrigel浸潤の阻害を示す。
【図９】  図９は、乳癌の増殖がＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドにより明らかに阻害されることを示す。
【図１０】  図１０は、黒色腫細胞成らし培地のゼラチン酵素電気泳動法を示す。
【図１１】  図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドの不存在または存在下における、１０％ 血清中でのＭＢ−４３５乳癌細胞の２日間の増殖を示す。
【図１２】  図１２は、角化細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。
【図１３】  図１３は、角化細胞遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。