【手続補正書】
【提出日】平成18年11月1日(2006.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
当業者が認識するように、文脈から他の意味にならない限り、ポリペプチドまたは核酸が本明細書に記載の本発明の様相および態様において言及されている場合(例えばＴＥＬ、Ｓｔａｔ３)、必須の活性を依然としてコードしていることを条件として、当該ポリペプチドまたは核酸の変異体(例えば誘導体または同族体)も本発明で使用され得る。一般的に、このような変異体は‘野生型'または本明細書に特記の他の配列と実質的に同族的であり、すなわち、それらと配列類似性または同一性を共有する。類似性または同一性は、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列レベルのことであり、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、または７０％、または８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。配列比較は、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰを使用して行い得る(Pearson &amp; Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183:63-98参照)。パラメーターは、好ましくは以下のようにデフォルトマトリックスを使用して設定する：Gapopen(gapにおける最初の残基のペナルティ)：タンパク質に−１２／ＤＮＡに−１６；Ｇａｐｅｘｔ(ｇａｐにおけるさらなる残基のためのペナルティ)：タンパク質に−２／ＤＮＡに−４；ＫＴＵＰ単語長：タンパク質に２／ＤＮＡに６。類似性の分析は、ハイブリダイゼーションを使用してまた行い得る。特異的配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための一つの一般的な式は：Ｔｍ＝８１.５Ｃ＋１６.６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホルムアミド)−６００／二本鎖におけるbp数である(Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本発明はさらにＳｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法を提供するものであり、当該方法は、化合物をＴＥＬ活性に依存する非ヒト動物モデルに投与し、細胞増殖が該化合物の非存在下の場合と比較して影響を受けているか否かを決定することを含む。該非ヒト動物は典型的にマウスまたはラットのような実験動物であり、種々の投与量を経口的に餌と混ぜてまたは他の適当な手段で投与でき、投与法は安定性および標的送達のような化合物の特性に依存して選択し得る。ＴＥＬ活性は、実験動物により発現される遺伝子由来であって異なる種由来のものであり、例えば、方法は、マウスＴＥＬ遺伝子を置換したヒトＴＥＬ遺伝子を含んでいるマウスを使用しており、これはヒト対象を使用せずにヒトＴＥＬに対する薬剤の効果を決定するのに特に有用であろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
したがって、ＴＥＬコード配列、例えば、“長い”二本鎖ＲＮＡ(例えば、Dicerインビトロを使用してｓｉＲＮＡに加工される)を含む二本鎖ＲＮＡは、Ｔｅｌ活性を阻害し、それによってＳｔａｔ３活性を調節するために使用され得る。これらのＲＮＡ産物は、別法として、インビトロで、例えば、慣用の化学合成法により合成し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
したがって、例えば、合成により製造され、所望により分解防止のための保護形である、ＴＥＬ配列の２０から２５bp、より好ましくは２１から２３bpを含む、ｓｉＲＮＡ二本鎖は本発明のひとつの態様を形成する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
本発明の好ましい抗体は、他のポリペプチドと結合できる抗体のような汚染物を含まず、および／または血清成分を含まないという意味で単離されている。モノクローナル抗体がいくつかの目的のために好ましい。抗体は当分野で標準の技術を使用して得ることができる。抗体を産生する方法は、哺乳類(例えばマウス、ラット、ウサギ)を本発明のポリペプチドで免疫することを含む。抗体は当分野で既知の種々の任意の方法を使用して免疫した動物から得ることができ、好ましくは抗体と目的の抗原の結合を使用してスクリーニングする。例えば、ウェスタン・ブロッティング法または免疫沈降を使用し得る(Armitage et al, Nature, 357:80-82, 1992)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
本発明によりまた提供されるのはＳｔａｔ３発現癌細胞増殖、特に黒色腫または癌腫を阻害する方法であり、Ｓｔａｔ３、特にリン酸化Ｓｔａｔ３を発現する癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を阻害するのに十分な量の有効量のＴＥＬアクチベーターを接触させることを含む方法である。好ましくは、細胞増殖はｒａｓと無関係である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
実施例２：ＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合はＴｙｒ７０５リン酸化に依存する
ＳＴＡＴ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞を、本質的に実施例１に記載のように４ＨＴで２４時間処理し、次いでＯＳＭを１５分、３０分、１時間、２時間、４時間または２４時間添加した。Ｓｔａｔ３−ＥＲと内因性Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合を、オリゴヌクレオチド結合タンパク質のウェスタン分析を行うことによりモニターした。Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合はＯＳＭ添加１５分後に検出され、処理１時間後に減少した。４ＨＴでの前処理のため、Ｓｔａｔ３−ＥＲは、ＯＳＭ添加前にＤＮＡ結合した。ＯＳＭの存在下、Ｓｔａｔ３−ＥＲＤＮＡ結合は増強され、内因性Ｓｔａｔ３が実験の全ての経過中結合したままであるのと対照的であった。Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３−ＥＲのＤＮＡ結合動態は、本質的にＴｙｒ７０５リン酸化レベルと相関した。これらの結果は、ＯＳＭ−誘導ｇｐ１３０活性化が、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３−ＥＲの両方のリン酸化を誘導する；Ｓｔａｔ３が急速に脱リン酸化されている間、Ｓｔａｔ３−ＥＲはリン酸化されたままであり、したがって長期間ＤＮＡ結合することを証明する。この結果は、Ｓｔａｔ３依存性転写活性の刺激と、細胞増殖のＳｔａｔ３−誘導阻害における、４ＨＴとＯＳＭの間の相乗性を非常によく説明するようである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
ＴＥＬ発現の阻害がＳｔａｔ３活性に直接影響するか否かを試験するために、Ｓｔａｔ３依存性転写活性を、Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５で、ＴＥＬ  ｓｉＲＮＡの非存在下または存在下、上記のルシフェラーゼアッセイを使用してアッセイした。４ＨＴまたはＯＳＭにより誘導されたルシフェラーゼのＳｔａｔ３依存性転写は、ＴＥＬ発現がｓｉＲＮＡにより減少した場合、有意に増加した(各々コントロールよりも約６から１６倍増加、および約９倍から１８倍増加)。