【手続補正書】
【提出日】平成18年3月9日(2006.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態は、少なくとも「ノックイン単位」および少なくとも「不活性化単位」を含む「ノックイン不活性化」ベクターを提供する。「ノックイン単位」に関しては、その酵素活性が、メチロトローフ酵母株によって産生される糖タンパク質内におけるグリコシル化の減少または改変をもたらすような１つまたはそれ以上のタンパク質を、メチロトローフ酵母株内で発現することのできる発現単位のことをいう。「不活性化単位」は、メチロトローフ酵母株内に導入されると、内在性のＯＣＨ１遺伝子または他のマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性化または破壊する単位を意味する。「ノックインおよび不活性化」ベクターをメチロトローフ酵母株に導入すると、強力な外来性酵素発現と内在性マンノシルトランスフェラーゼ破壊とを同時に達成することができる。好ましいノックインおよび不活性化ベクターはｐＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ５’ＰｐＯＣＨｌＭｕｔである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
【図１】図１はＨＤＥＬタグ付きトリコデルマ  レーセイ由来のα−１，２−マンノシダーゼ発現カセットを保持するベクターの図であり、当該分野で公知の方法に従ってこれらのベクターを構築する方法を説明したものである。構築計画（スキーム）を通して用いる略語は次の通りである。５’ＡＯＸ１またはＡＯＸ１  Ｐ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１プロモーター配列；Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥｌ：ＣｏｌＥ１複製開始点；３’ＡＯＸ１：ピキア  パストリス  ＡＯＸＩ遺伝子の３’配列；ＨＩＳ４：ピキア  パストリスのＨＩＳ４遺伝子；ＡＯＸ−ＴＴ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結配列；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム；Ｓ：分泌シグナル；Ｐ  ＴＥＦ１：サッカロマイセス  セレビシエ転写延長因子１遺伝子のプロモーター配列；Ｐ  ＥＭ７：合成構造的原核プロモーターＥＭ７；ゼオシン：ゼオシン耐性遺伝子；ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエ  ＣＹＣ１遺伝子の３’末端；ＧＡＰ：ピキア  パストリス  グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列；ＰｐＵＲＡ３：ピキア  パストリス  ＵＲＡ３遺伝子。本図からわかるように、トリコデルマ  レーセイ  α−１，２−マンノシダーゼは、Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル配列に対するコード配列に実施可能に連結されており、さらにまた、コード配列の３’末端において、ＨＤＥＬペプチドに関するコード配列に実施可能に連結されている。全融合構築物は、Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ＭＦＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス  ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかに実施可能に連結した。
【図２】図２はＨＤＥＬ−タグ付きハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）  α−ｌ，２−マンノシダーゼＩＢ  発現カセットを保持するベクターを示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を記載したものである。図に示されているように、ハツカネズミ  α−１，２−マンノシダーゼＩＢの触媒ドメインは、Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル配列に関するコード配列に実施可能に連結し、さらにコード配列の３’末端においてＨＤＥＬペプチドに関するコード配列と実施可能に連結した。全融合構築物をＰ．パストリス  ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ｍＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス  ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺｍＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかに実施可能に連結した。さらに、ｃＭｙｃエピトープタグに関するコード配列を、Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル配列に関するコード配列と、ハツカネズミのα−１，２−マンノシダーゼＩＢの触媒ドメインに関するコード配列との間に挿入することによって、発現カセットの異形を得た。この発現カセットもまた、Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス  ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかに実施可能に連結した。
【図３】図３はＭｙｃＨＤＥＬタグ付きトリコデルマ  レーセイのα−１，２−マンノシダーゼを保持するベクターであり、これらのベクターを得た方法を説明したものである。その結果得られた融合構築物を再度、Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ中）またはＰ．ｐｄｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ中）のいずれかに実施可能に連結した。
【図４】図４はＭｙｃＨＤＥＬタグ付きトリコデルマ  レーセイ  α−１，２−マンノシダーゼの細胞内局在化を実証するとともに、免疫蛍光分析によるＥＲターゲティングを示した図である。パネルＡはウェスタンブロッティング。酵母株は１０ｍＬのＹＰＧ培地中でＯＤ６００＝１０になるまで培養し、５倍に希釈し、ＹＰＭ中で４８時間培養した。１／５０培地および１／６５ｔｈの細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマウスモノクローナル９Ｅ１０抗−Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析した。分子量マーカータンパク質の位置を、矢印で示す。レーン１〜５：細胞溶解物。１および２：ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。３：非形質転換ＰＰＹ１２ＯＨ（負の対照）。４および５：ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。レーン６〜１０：培地。６：未形質転換ＰＰＹ１２ＯＨ（負の対照）。７および８：ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。９および１０：ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。パネルＢは免疫蛍光顕微鏡検査法。１：Ｐ．パストリス細胞（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２ＯＨ株）の１０００倍の位相差画像。核は細胞の右下四分円中の楕円形として見える。２：１と同じ細胞であるが、Ｔ．レーセイ  マンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬタンパク質の局在化を示すような蛍光顕微鏡測定モードで示したもの。タンパク質は、主に小胞体静止期分布に典型的な、核周囲（核包膜）に円形に分布して局在化している。３：Ｐ．パストリス細胞（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２ＯＨ株）の１０００倍率の位相差画像。４：同じ細胞を、Ｐ．パストリス  ＰＰＹ１２ＯＨ株におけるゴルジマーカータンパク質ＯＣＨ１−ＨＡの局在化を示すような蛍光顕微鏡測定法で見たもの。１細胞あたりに３〜４個の点で、細胞質のいたるところにある点状の分布は、Ｐ．パストリスにおけるシスゴルジ分布に関して典型的である。
【図５】図５はスクロース密度勾配遠心分離における、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをもつ、マンノシダーゼ−ＭｙｃＨＤＥＬの共沈降を描いたものである。一番上のパネルは、ＯＣＨ１−ＨＡゴルジマーカータンパク質のスクロース勾配の異なる画分にわたっての分布を示す。真ん中のパネルは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲマーカータンパク質に関する該分布を示したものである。最後に下部のパネルは、同じ画分にわたるＭｙｃＨＤＥＬ−タグ付きトリコデルマ  レーセイａのα−１，２−マンノシダーゼの分布を示したものである。マンノシダーゼ−ＭｙｃＨＤＥＬはほぼ正確にＥＲマーカーＰＤＩの分布と一致することから、ピキア  パストリス酵母細胞のＥＲ内に主に所在しているといえる。
【図６】図６はトリコデルマ  レーセイマンノシダーゼ−ＨＤＥＬと共発現させたトリパソーマ  クルーズ  トランス−シアリダーゼのＮ−グリカン分析を示す。パネルＡ：マルト−オリゴ糖サイズ参照ラダー（ｌａｄｄｅｒ）。グリカンのサイズは、該マルトオリゴ糖の移動と電気泳動移動度を比較することにより、グルコース単位（ＧＵ）にて示した。パネルＢ：ピキア  パストリス内で発現させた組み換え  トリパソーマ  クルーズトランスシアリダーゼから得たＮ−グリカンである。ＧＵ＝９，２にあるピークは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。パネルＣは、パネル２と同じ分析物であるが、３Ｕ／ｍＬの精製した組み換えＴ．レーセイのα−１，２−マンノシダーゼで一晩処理した後のものである。パネルＤ：ピキア  パストリス内で、Ｔ．レーセイマンノシダーゼ−ＨＤＥＬ（ＧＡＰプロモーターの制御下で）と共発現させた組み換えトランスシアリダーゼから得たＮ−グリカン。ＧＵ＝７，６にあるピークは、ＲＮａｓｅ  ＢのプロファイルにおけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークに対応する（パネルＦ）。パネルＥ：パネルＤと同じ分析物であるが、３ｍＵ／ｍＬの精製組み換えＴ．レーセイのα−ｌ，２−マンノシダーゼで一晩処理した後のものである。パネルＦ：ウシＲＮａｓｅ  Ｂから得たＮ−グリカン。これらのグリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２で構成される。様々なアイソマーが分割され、これらはＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２のピーク数が計上される。
【図７】図７はＨＤＥＬタグ付きトリコデルマ  レーセイのα−１，２−マンノシダーゼおよびマウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢのＨＤＥＬタグ付き触媒ドメインによる、インフルエンザヘマグルチニンＮ−グリカンのプロセッシングを示す。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２参照オリゴ糖を、該分析のスキャン１８５０に流した（図示せず）。パネル１：マルトオリゴ糖サイズ参照ラダー。パネル２：ピキア  パストリスにおいて発現させた組み換えインフルエンザヘマグルチニンから得たＮ−グリカン。スキャン２２５０におけるピークは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２に相当する。パネル３：Ｔ．レーセイマンノシダーゼ−ＨＤＥＬとともに、ピキア  パストリス中で（ＧＡＰプロモーターの制御下で）共発現させた組み換えヘマグルチニンから得たＮ−グリカン。スキャン１９５０におけるピークは、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２に相当する。パネル４：パネル３に関するものと同様な分析であるが、３０ｍＵの精製組み換えＴ．レーセイ  α−１，２−マンノシダーゼで一晩処理した後のものである。パネル５：マウスマンノシダーゼＩＢ−ＨＤＥＬとともに、ピキア  パストリス中で（ＧＡＰプロモーターの制御下で）共発現させた組み換えヘマグルチニンから得たＮ−グリカン。パネル６：パネル５に対するものと同様な分析であるが、３０ｍＵの精製組み換えＴ．レーセイ  α−１，２−マンノシダーゼで一晩処理した後のものである。
【図８】図８はベクターｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨｌおよびその構築方法を示す。
【図９】図９はｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨｌを用いた単独相同組換えによって、ピキア  パストリス  ＯＣＨ１遺伝子を破壊するためのスキームを示す。
【図１０】図１０はＯＣＨ１で不活性化したクローン、およびｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬを用いた形質転換により該ＯＣＨ１不活性化クローン由来の３種のクローンの細胞壁糖タンパク質Ｎ−グリカン分析を示す。パネル１は、マルトオリゴ糖混合物の分析を示したものであり、その重合度が、図の最上部の数字で示されている。該分析は、他のパネルに関するサイズ参照の役割をする。すべてのパネルの縦軸には、ピーク強度が相対蛍光単位を示す。パネル２〜６：以下の株の細胞壁糖タンパク質Ｎ−グリカンの分析。パネル２：遺伝子操作していないＰ．パストリス株ＹＧＣ４；パネル３、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨｌで形質転換したＹＧＣ４；パネル４−６：さらに、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したパネル３の株の３種のクローン。パネル７：ウシＲＮａｓｅ  Ｂ由来のＮ−グリカンであり、Ｍａｎ５-９ＧｌｃＮＡｃ２の混合物で構成される。パネル２および３の比較とパネル７を参照してわかるように、ｐＢＬＵＲＡ５ＰｐＯＣＨ１を用いた形質転換はＯＣＨ１ｐのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質Ｎ−グリカン（パネル２でピーク１と呼ぶ）の強力な増加をもたらす。ピーク２は、ＯＣＨ１ｐのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２産物を示す。さらに、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬによる追加形質転換によって、３種の独立したクローンの細胞壁糖タンパク質上の主要なグリカンは、Ｔ．レーセイα−ｌ，２−マンノシダーゼのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質分解によりできたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２最終産物（パネル４中のピーク３）である。
【図１１】図１１は図１０と全く同様なグリカン混合物の分析を示したものであるが、ｐＨ＝５．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム中で一晩、３ｍＵ／ｍｌの精製トリコデルマ  レーセイのα−１，２−マンノシダーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化した後のものである。軸の割り当ては図１０と同じである。親株（パネル２）に比べて、より多くのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１形質転換株において（パネル３）形成される。スキャン３９００前のすべてのパネル中のピークは、混入物によるものであり、分析においては無視すべきである。
【図１２】図１２は発現ベクターｐＧＡＰＺＡＧＬＳII（配列番号：１８）を示す。Ｐ  ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ転写延長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ  Ｅｍ７：合成原核プロモーター。ゼオシン：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエ  シトクロムＣ１遺伝子の転写終結因子。Ｃｏｌ  Ｅｌ：細菌の複製起点。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス  ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１３】図１３は発現ベクターｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳII（配列番号：１６）を示す。Ｐ  ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ転写延長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ  Ｅｍ７：合成原核プロモーター。ゼオシン：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエシトクロムＣ１遺伝子の転写終結因子。Ｃｏｌ  Ｅｌ：細菌の複製起点。ＡＯＸ２  Ｐ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ．グルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１４】図１４は発現ベクターｐＰＩＣＺＡＧＬＳII（配列番号：２０）を示す。Ｐ  ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ転写延長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ  Ｅｍ７：合成原核プロモーター。ゼオシン：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエシトクロムＣ１遺伝子の転写終結因子。Ｃｏｌ  Ｅｌ：複製起点。ＡＯＸ１  Ｐ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ．グルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１５】図１５は発現ベクターｐＹＰＴ１ＺＡＧＬＳII（（配列番号：２２）を示す。Ｐ  ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ転写延長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ  Ｅｍ７：合成原核プロモーター。ゼオシン：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエシトクロムＣ１遺伝子の転写終結因子。Ｃｏｌ  Ｅｌ：細菌の複製起点。Ｐ  ＹＰＴ１：Ｐ．パストリス  ＹＰＴ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１６】図１６は発現ベクターｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓII（配列番号：１９）を示す。Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス  ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス  ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｏｅ  グルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１７】図１７は発現ベクターｐＡＯＸ２ＡＤＥ１ｇｌｓII（配列番号：１７）を示す。Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス  ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＡＯＸ２  Ｐ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１８】図１８は発現ベクターｐＰＩＣＡＤＥ１ｇｌｓII（配列番号：２１）を示す図。Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス  ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＡＯＸ１  Ｐ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図１９】図１９は発現ベクターｐＹＰＴ１ＡＤＥ１ｇｌｓII（配列番号：２３）を示す図。Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス  ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。Ｐ  ＹＰＴ１：Ｐ．パストリス  ＹＰＴ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ  グルコシダーゼ  II遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図２０】図２０は発現ベクターｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓIIＨＤＥＬ（配列番号：２５）を示す。Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス  ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス  ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図２１】図２１は発現ベクターｐＧＡＰＺＡｇｌｓIIＨＤＥＬ（配列番号：２４）を示す図。Ｐ  ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ転写延長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ  Ｅｍ７：合成原核プロモーター。ゼオシン：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエシトクロムＣ１遺伝子の転写終結因子。Ｃｏｌ  Ｅ１：細菌の複製起点。  ＧＡＰ：ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエグルコシダーゼII遺伝子。ＡＯＸ１  ＴＴ：Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子。
【図２２】図２２は市販の酵母α−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−５００３）を用いたＧＬＳII活性アッセイ試験を示す。アッセイ混合物には、リン酸クエン酸バッファｐＨ６．８、マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、基質であるシグマ社製の４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシダーゼおよびα−グルコシダーゼが含まれる。１：３７℃で一晩インキュベートした後のＵＶ光で照射したアッセイ混合物。２：１と同じであるが、この場合は、アッセイ混合物はα−グルコシダーゼを含まない。３：１と同じであるが、この場合、アッセイ混合物は基質を含まない。
【図２３】図２３はピキア  パストリスから組み換えによって発現されたＧＬＳIIの活性の結果を示す。すべてのアッセイ混合物は３７℃で一晩インキュベートした後、ＵＶ光で照射した。１：酵母α−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−５００３）によるアッセイ；２：株１８（ｐＧＡＰＺＡＧＬＳIIで形質転換したＰＰＹ１２−ＯＨ）の精製培地によるアッセイ；３：ＷＴ  ＰＰＹ１２−ＯＨ株の精製培地によるアッセイ；４：株Ｈ３（ｐＧＡＰＺＡｇｌｓIIＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２−ＯＨ）の精製培地によるアッセイ。
【図２４】図２４はＳｃＫｒｅ２−タグ付きヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）発現カセットを保持するベクターを示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を記載している。構築スキームを通して用いる略語はそれぞれ次のような意味をもつ。５’ＡＯＸ１またはＡＯＸ１  Ｐ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１プロモーター配列；Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥｌ：ＣｏｌＥｌ複製開始点；３’ＡＯＸ１：ピキア  パストリス  ＡＯＸＩ遺伝子の３’配列；ＡＯＸ  ＴＴ：ピキア  パストリス  ＡＯＸＩ遺伝子の転写終結配列遺伝子；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム；Ｂｌａｓｔｉｓｉｄｉｎ  Ｒ：ブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｓｉｄｉｎ）耐性遺伝子；ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエ  ＣＹＣ１  遺伝子の３’末端。この図面からわかるように、ヒトＧｎＴＩは、コード配列の５’末端において、ＳｃＫｒｅ２のＮ末端部分から得られたペプチドに対するコード配列に実施可能に連結されている。融合構築物全体は、Ｐ．パストリス  ＡＯＸ１プロモーターに実施可能に連結されている。
【図２５】図２５はＰ．パストリスのＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩを用いた形質転換体によって分泌されたタンパク質由来の天然のＮ−グリカンの分析を示し、ＤＳＡ−ＦＡＣＥ手法を用いて分離した。パネル１は、デキストランの分析を示したものである。この分析は、他のパネルのサイズ参照の役割を果たす。全てのパネルの縦軸には、ピーク強度が相対蛍光単位で与えられている。パネル２〜５（Ｔｌ〜Ｔ４）は、形質転換体１〜４由来のＮ−グリカンの分析からの結果を示している。ＷＴまたは非形質転換生物の分析がパネル６に示されている。
【図２６】図２６はＰ．パストリスのＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩをもつ形質転換体の分泌タンパク質から得た天然のＮ−グリカンをタチナタマメ（Ｊａｃｋ  Ｂｅａｎ）β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで消化して分析したものである。
【図２７】図２７は異なる３つの株において産生されたトランスシアリダーゼ（ＴＳ）からのＮ−グリカンを分析したものを示す。パネル１：オリゴマルトース参照。パネル２：ＧＳ１１５において産生されるＴＳ由来のグリカン。２つの主たるピークは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２に由来する。マンノシダーゼＨＤＥＬによって形質転換されたＧＳ１１５において産生されるＴＳは、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与える一方、パネル３に見られるようにまだなおいくらかのＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２ピークは残っていた。しかしながら、マンノシダーゼＨＤＥＬとＫｒｅ２−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩの両方で形質転換されたＧＳ１１５株において産生されたＴＳ由来のグリカンでは、ほとんどすべてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されたことを示した（パネル４）。
【図２８】図２８はトランスシアリダーゼ（ＴＳ）のレクチンブロットを示す。上部：３種の異なる株由来のＴＳのレクチンブロット。レーン１：ＧＳ１１５由来のＴＳ、レーン２：ＧＳ１１５  ＭａｎＨＤＥＬ由来のＴＳ、レーン３：ＧＳ１１５  ＭａｎＨＤＥＬ  Ｋｒｅ２ＧｎＴＩ。下部：紅色レッド（Ｐｏｎｃｅａｕ  ｒｅｄ）で染色した同ブロット。レーン３のバンドのみがレクチンによって染色され、その最終ＧｌｃＮＡｃのみが存在することを示す。
【図２９】タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで処理したＧｎＴＩ形質転換体のＮ−グリカン分析を示した図である。
【図３０Ａ】ＳｒＫｒｅ２タグ付きヒトマンノシダーゼII発現カセットを保持するベクターを示し、これらのベクターを構築する方法を説明している。構築スキームを通して用いる略語は次のような意味をもつ。５’ＡＯＸ１またはＡＯＸ１  Ｐ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１プロモーター配列；Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子；Ｃｏ１Ｅ１：Ｃｏ１Ｅ１の複製開始点；３’ＡＯＸｌ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の３’配列；ＡＲＧ４：ピキア  パストリスのＡＲＧ４遺伝子。ＡＯＸ  ＴＴ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子配列；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム；Ｐ  ＥＭ７：合成構成的原核プロモーターＥＭ７；ゼオシン：ゼオシン耐性遺伝子；ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエ  ＣＹＣ１遺伝子の３’末端；ＧＡＰ：ピキア  パストリスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列；ＰｐＵＲＡ３：ピキア  パストリス  ＵＲＡ３遺伝子。この図に見られるように、ヒトマンノシダーゼIIを、コード配列の５’末端において、ＳｃＫｒｅ２のＮ末端部分由来のペプチドに関するコード配列に実施可能に連結されている。融合構築物全体を、Ｐ．パストリス  ＧＡＰプロモーターに実施可能に連結した。
【図３０Ｂ】ＳｒＫｒｅ２タグ付きヒトマンノシダーゼII発現カセットを保持するベクターを示し、これらのベクターを構築する方法を説明している。構築スキームを通して用いる略語は次のような意味をもつ。５’ＡＯＸ１またはＡＯＸ１  Ｐ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１プロモーター配列；Ａｍｐ  Ｒ：アンピシリン耐性遺伝子；Ｃｏ１Ｅ１：Ｃｏ１Ｅ１の複製開始点；３’ＡＯＸｌ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の３’配列；ＡＲＧ４：ピキア  パストリスのＡＲＧ４遺伝子。ＡＯＸ  ＴＴ：ピキア  パストリス  ＡＯＸ１遺伝子の転写終結因子配列；ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム；Ｐ  ＥＭ７：合成構成的原核プロモーターＥＭ７；ゼオシン：ゼオシン耐性遺伝子；ＣＹＣ１  ＴＴ：Ｓ．セレビシエ  ＣＹＣ１遺伝子の３’末端；ＧＡＰ：ピキア  パストリスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列；ＰｐＵＲＡ３：ピキア  パストリス  ＵＲＡ３遺伝子。この図に見られるように、ヒトマンノシダーゼIIを、コード配列の５’末端において、ＳｃＫｒｅ２のＮ末端部分由来のペプチドに関するコード配列に実施可能に連結されている。融合構築物全体を、Ｐ．パストリス  ＧＡＰプロモーターに実施可能に連結した。
【図３１】図３１はｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したピキア  パストリス細胞における細胞内クラスＩマンノシダーゼ活性の測定を示す。ＤＮＰ−Ｍａｎの加水分解を、４０５ｎｍにおける分光分析によって測定した。すべての形質転換体において、ＧＳ１１５親株と比較して、活性に３から４倍の増加が測定された。
【図３２】図３２はｐＺ５’ＰｐＯＣＨｌＴｒｕｎｃによる形質転換でのゲノム再配列のスキームを示す。ｐＺ５’ＰｐＯＣＨｌＴｒｕｎｃは、ピキア属  ＯＣＨ１のアミノ酸２５〜１５５に対するプロモーターを含まないコード配列に続いて、３’ＡＯＸＩ転写終結因子を含んでいる。このベクターは、ＯＣＨ１−相同部分内でＢｓｔＢＩと一直線上にあり、ＯＣＨ１遺伝子座内に特異的相同組み換えを誘導する。組み込み後、２つのＯＣＨ１配列部分が生成される。最初のＯＣＨ１配列は、ベクターとの組み換え部位までのゲノムＯＣＨ１配列と、これに続くベクター上に存在するＯＣＨ１配列の部分とでなる。該第１ＯＣＨ１配列は、この状態では宿主メチロトローフ酵母のＯＣＨ１プロモーターの制御下にあるが、上述のように、ＯＣＨ１配列は何もコードしないか、あるいはＯＣＨ１タンパク質の不活性断片をコードするために、活性ＯＣＨ１タンパク質を産生することができない。第２のＯＣＨ１配列は、先を切り取ったＯＣＨ１コード配列（最初の２４アミノ酸を欠失している）である。さらに、この先を切り取ったＯＣＨ１コード配列は、既知のどのプロモーター配列にも実施可能に連結されておらず、活性ＯＣＨ１タンパク質の合成のためにメッセンジャーが形成されることは考えられない。
【図３３】図３３は発現ベクターｐＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ５’ＰｐＯＣＨ１Ｍｕｔ（配列番号：４６）を示す。
【図３４】図３４はｐＺ５’ＰｐＯＣＨ１Ｔｒｕｎｃを用いて形質転換したＧＳ１１５クローンの遺伝子分析を示す。ＯＣＨ１遺伝子座内においてプラスミドを正確に組み込んだクローンに関して、プライマー対Ｋａｉ１０／Ｋａｉ  ７の予想される生成物の長さは１０５０ｂｐであり、プライマー対Ｋａｉ１１／Ｋａｉ  ５に関しては、２１００ｂｐである。クローン１，２，３および８が本要件を満たすことは明らかである。ＯＣＨ１遺伝子座はこれらのクローンにおいて破壊されてしまったと判断される。