【事件の表示】
　平成１１年特許願第　８４９６７号「改良されたプライマー伸長プレ増幅ＰＣＲ方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１１年１１月２４日出願公開、特開平１１−３１８４９８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は、平成１１年３月２６日（優先権主張１９９８年３月２６日　ドイツ）の出願であって、平成２０年１２月２６日付で特許請求の範囲について手続補正がなされたが、平成２１年３月３０日付で拒絶査定がなされ、これに対して、平成２１年８月７日に拒絶査定に対する審判請求がなされるとともに、同日付で特許請求の範囲について手続補正がなされたものである。
　
２．平成２１年８月７日付の手続補正についての補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２１年８月７日付の手続補正を却下する。
［理由］
（１）補正後の本願発明 
　上記補正により、補正前の特許請求の範囲の請求項１〜８のうち、請求項１、２が削除され、補正前の請求項３に対応する補正後の請求項１は、
「【請求項１】２つまたは３つの熱サイクル増幅反応を含んでなり、第1の増幅反応において完全にランダム化したプライマーを用い、かつ第2の増幅反応において特異的プライマーを用いる、サンプルからの核酸断片の増幅方法であって、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、第1および第2の、または第1〜第3の増幅反応を、同じDNAポリメラーゼ混合物を用いて行い、大部分のサイクルにおいて、第1の熱サイクル増幅反応中に、2回以上の伸長工程が異なる温度で行われ、かつ前記サンプルが酵素的プロテアーゼ消化を用いる細胞溶解により得られることを特徴とする前記方法。」へと補正された。
　補正前の請求項１〜３は、
「【請求項１】２つまたは３つの熱サイクル増幅反応を含んでなり、第1の増幅反応において完全にランダム化したプライマーを用い、かつ第2の増幅反応において特異的プライマーを用いる、サンプルからの核酸断片の増幅方法であって、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ第1および第2の、または第1〜第3の増幅反応を、同じDNAポリメラーゼ混合物を用いて行うことを特徴とする前記方法。
【請求項２】大部分のサイクルにおいて、第1の熱サイクル増幅反応中に、2回以上の伸長工程が異なる温度で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記サンプルが酵素的プロテアーゼ消化を用いる細胞溶解により得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。」であり、
補正前の請求項３は、請求項１と２を択一的に引用しており、補正前の請求項２は請求項１を引用するものであるから、補正前の請求項３には、補正前の請求項１を直接引用する選択肢と、請求項２を引用する選択肢の２つの態様が包含されており、補正後の請求項１は、請求項１を直接引用する選択肢を削除したものであるから、択一的記載の要素の削除に相当する。そして、その補正前の当該請求項に記載された発明とその補正後の当該請求項に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから、請求項１についての補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　そこで、本件補正後の前記請求項１に記載された発明（以下、「本願補正発明１」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）について、以下検討する。
　
（２）引用例
　原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前の１９９６年２月に頒布された刊行物であるBiotechniques（1996）Vol.20, No.2,p.219-225（以下、「引用例１」という。）には、以下の事項が記載されている。（なお、下線は当審による。）
　
(i)第２１９頁左のINTRODUCTION欄第１行〜第８行には、「
プライマー伸長プレ増幅(Primer-extension preamplification, ＰＥＰ
ＰＥＰは、１５塩基のランダムオクゴヌクレオチドの混合物を使用する、繰り返しプライマー伸長を含む。
　
(ii)第２１９頁中央欄第３３行〜最終行には、「オリジナルの手順の別の改変は、
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ
第２のＤＮＡポリメラーゼ(2)の添加
第２のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅の信頼性と収量を改善するための添加剤として使用される
第２のＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長効率を向上させる（1）
長いＤＮＡ断片を生じさせる伸長反応の割合を増加させる(8)
　これらの改変は、ＰＣＲ手順を強化するために設計されてきたが、ＰＥＰ法での使用についての評価はなされていない。我々は、後の遺伝型判定のためのＰＥＰの効率は、ポリメラーゼの前進性能と関係すると仮定した。この論文の目的は、前進性能において広範に異なるポリメラーゼを用いて、ＰＥＰの後の遺伝型判定の成功を検査することにより、この仮説をテストすことである。」と記載されている。
　なお、上記参照文献１について、第２２５頁参考文献(REFERENCES)欄には、
「文献１　Barnes, W.M. 1994　λバクテリオファージ鋳型から、３５kbまでの高い正確性と高収量なＤＮＡのＰＣＲ増幅　Proc. Natl. Acid. Sci. USA 91:2216-2220」と記載されている。
　
(iii)ＰＥＰの具体的な手順について、第２２０頁左欄第２行〜右欄第９行には、
「
プライマー伸長プレ増幅
鋳型ＤＮＡ
ＤＮＡは、塩抽出法の改変法を用いて、皮膚の生検試料から抽出された（7）
　ＰＥＰの３つの異なるバリエーションが、ＰＣＲからスコア化できる遺伝子型を産生できるそれらの能力を評価するために、本研究で使用された。
ＰＥＰ反応は
Ｔａｑ＋ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ）
用いて行われた
　（…途中省略…）
　
５０回のプライマー伸長サイクルは
サーマルサイクラー
で行われた
５５℃まで１度当たり１０秒でプログラムされた傾斜工程、５５℃で４分間の伸長工程
　なお、上記参照文献７として、Miller,S.A. et al.,Nucleic Acids Res.1988,Vol.16,p.1215が引用されている。
　
(iv)遺伝型判定の具体的な手順について、第２２１頁左欄第１行〜第１７行には、
「
６つの異なるマイクロサテライトマーカー
ＰＥＰの産物
から増幅された
ＰＣＲは、
0.025UのＴａｑポリメラーゼ、0.2μＭの各プライマー、および1μＬのＰＥＰ産物を含む
　
(v)ＰＥＰ後のＰＣＲによる遺伝型判定の結果について、第２２２頁の表１には、プレ増幅処理にＴａｑとＰｆｕのＤＮＡポリメラーゼ混合物を使用（Ｅ欄、総合成功率0.90）したものが、Ｔａｑ単独で使用（Ｔ欄、総合成功率0.61）したものより、高い成功率を示したことが記載されており、第２２４頁中央欄第１行〜第９行には、「低い前進性能（ＴとＳ）での２つの処理で得られた結果は、対照実験や処理Ｅ（混合ポリメラーゼ）での場合と比較すると、かなり低かった。低い前進性能での処理の低い遺伝子型判定の成功率は、プレ増幅でのより不完全なゲノムのカバー度を反映しているかもしれない。」と記載されている。
　
　また、同様に原査定で引用文献２として引用された本願優先日前の１９９８年１月に頒布された刊行物であるBiotechniques(1998 January)Vol.24, p.47-50（以下、「引用例２」という。）は、「パラフィン包埋、ホルマリン固定組織の小領域から単離されたＤＮＡのユニバーサル増幅」という表題の学術文献であって、
(vi)「ユニバーサル増幅産物は、改変ＰＥＰ手順により産生された。標準ＰＥＰ反応は、200pmolのランダム12塩基オリゴヌクレオチド、5UのAmpliTaq DNA Polymerase(Perkin-Elmer)、200μMの各dNTP、5mMのMgCl２、1×PCRバッファーII及び鋳型DNAを含む60μLパラフィン油中で行われた。鋳型は、パラフィン包埋組織部分から抽出された精製ＤＮＡか、10μLのパラフィン包埋組織部分から切り出された
細胞のプロティナーゼＫ消化物
　
(vii)「サーマルサイクル条件は次のとおりであった：９２℃４分の後、９２℃１分、２５℃２分、
３０℃３０秒、３５℃３０秒、４０℃３０秒及び７２℃２分
　
（３）対比
　引用例１には、ＰＥＰの後に、遺伝子判定試験のためのＰＣＲを行ったこと（記載事項(ii)）が記載されているから、該ＰＥＰ及び該遺伝子型判定試験のためのＰＣＲはそれぞれ、本願補正発明１の「完全にランダム化したプライマーを用いる第１の増幅反応」及び「特異的プライマーを用いる第２の増幅反応」に相当し、引用例１にはさらに、ＰＥＰを、Taq DNAポリメラーゼを単独（Ｔ）、またはTaq とPfu DNAポリメラーゼの混合物（Ｅ）を使用して行ったことが記載されている。
　Pfu DNAポリメラーゼは、本願優先日前既に周知の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであるから、引用例１に記載のTaq とPfu DNAポリメラーゼの混合物を使用したＰＥＰは、本願補正発明１の「第１の増幅反応において、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する」ものに相当する。
　そこで、本願補正発明１と引用例１に記載された事項を比較すると、両者は、
「２つまたは３つの熱サイクル増幅反応を含んでなり、第1の増幅反応において完全にランダム化したプライマーを用い、かつ第2の増幅反応において特異的プライマーを用いる、サンプルからの核酸断片の増幅方法であって、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする方法。」である点で一致し、以下の点で相違する。
　
＜相違点１＞
　前者では、第1および第２の増幅反応を、同じDNAポリメラーゼ混合物を用いて行うのに対して、後者では、第２の増幅反応には、ＴａｑDNAポリメラーゼを単独で用いている点。
　
＜相違点２＞
　前者では、大部分のサイクルにおいて、第1の熱サイクル増幅反応中に、「２回以上の伸長工程」が「異なる温度」で行われるのに対して、後者では、第１の熱サイクル増幅反応において、５５℃まで１度当たり１０秒でプログラムされた傾斜のある工程の後、５５℃で４分間の伸長工程で行われている点。
　
＜相違点３＞
　前者では、サンプルが酵素的プロテアーゼ消化を用いる細胞溶解により得られるのに対して、後者では、塩抽出法の改変法を用いたことが記載されている点。
　
（４）判断
（４−１）相違点１について
　引用例１記載事項(ii)には、Taq  DNAポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅において、Pfu DNAポリメラーゼを添加剤として加えると、ＰＣＲ増幅の信頼性と収量を改善させ、長いＤＮＡ断片を生じさせる伸長反応の割合を増加させることが知られていた（参照文献１）ことが記載されているから、引用例１に記載のＰＥＰによる第１の増幅反応だけでなく、特異的プライマーを用いるＰＣＲによる第２の増幅反応反応にも、ＤＮＡポリメラーゼ混合物を使用することは、当業者が必要に応じて適宜なし得ることである。
　
（４−２）相違点２について
　本願補正発明１における「第1の熱サイクル増幅反応中に、２回以上の伸長工程が異なる温度で行われる」とは、温度を上げる場合と下げる場合の態様を包含するが、本願明細書の段落【００１４】には、「 本発明により提供される方法を実施する上で、伸長は、大部分のサイクルにおいて、第1の増幅反応中に、２回以上の伸長工程を用いて行うのが有利であり、この場合、1回の伸長は低めの温度で行い、次に高めの温度で伸長を継続する。この方法を用いれば、第1の増幅反応の間に特に長いアンプリコンの集団が得られる。」と記載されており、本願明細書の記載を参酌すると、本願補正発明１における「異なる温度」とは、伸長工程を低めの温度と高めの温度で行うものであると解される。
　一方、引用例２には記載事項(vii)にあるように、改良されたＰＥＰの熱サイクルとして、「９２℃４分の後、９２℃１分、２５℃２分、３０℃３０秒、３５℃３０秒、４０℃３０秒及び７２℃２分のサイクルを４０回行い、最後に７２℃１５分の伸長を行った。２５℃と３０℃の工程間の傾斜は、０．２５℃／秒に設定」したことが記載されている。上記記載では、２５℃と３０℃の工程間の傾斜のみ設定され、３０℃と３５℃以降の工程間の傾斜は設定されていないから、３５℃で３０秒、４０℃で３０秒及び７２℃で２分という時間で反応を行わせており、しかも、３５℃や４０℃でも、Taqポリメラーゼは、ある程度の活性があることは技術常識である。
　そうすると、引用例２における３５℃で３０秒、４０℃で３０秒もその間に伸長反応が進み、伸長工程であるといえるから、引用例２においても、ＰＥＰを低めの温度と高めの温度で行っており、引用例１に記載のＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いるＰＥＰの伸長工程を、低めの温度と高めの温度で行うことは、引用例２の記載から当業者が容易になし得ることである。
　またたとえ、引用例２に記載の５℃で３０秒、４０℃で３０秒という反応が伸長工程でなく、７２℃で２分のみが伸長工程であると仮定した場合であっても、引用例２には、引用例１のＰＥＰの伸長工程の５５℃という温度よりも高い７２℃で伸長工程を行っており、ＰＥＰの伸長工程の温度を７２℃で行えることが記載されている。
　ランダム化プライマーを用いるＰＥＰでは、増幅産物の長さは不明であり、特異的プライマーを用いて増幅産物の長さが予測できるＰＣＲより、合成されるＤＮＡの長さをより伸ばす必要のあること、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるTaqやPfuポリメラーゼの至適温度は７０℃前後であり、その温度に近い方がより長く伸長することは、当業者にとって本願優先日前既に周知の技術的事項であり、引用例１に記載のＰＥＰにおいて、合成されるＤＮＡの長さをより伸ばすために、引用例２に記載の至適温度に近い温度での伸長工程を付加することは、当業者であれば必要に応じて適宜なし得ることである。
　
（４−３）相違点３について
　引用例１記載事項(iii)には、「ＤＮＡは、塩抽出法の改変法を用いて、皮膚の生検試料から抽出された（7）。」とあり、ここで参照されている参照文献７である、Miller,S.A. et al.,Nucleic Acids Res.1988,Vol.16,p.1215の第１２１５頁第１４行〜第１７行には、細胞をプロテアーゼＫで溶解したことが記載されている。
　してみれば、引用例１に記載の塩抽出法の改変法においても、細胞溶解に酵素的プロテアーゼ消化を用いており、上記相違点３は、実質的な相違ではない。
　さらに、引用例２記載事項(vi)にも、ＰＥＰに使用する鋳型ＤＮＡとして、パラフィンに包埋された組織切片から切り出された細胞のプロテイナーゼＫ消化物を使用したことが記載されているように、ＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡを調製するためにプロテアーゼ消化を行うことは、本願優先日前に既に周知慣用の手段であり、この点に格別の特徴は見出せない。
　
（４−４）効果について
　本願補正発明１において奏される効果については、本願明細書の記載からみて、引用例１、２の記載及び上記周知事項から予当業者が予測できない程の格別なものとはいえない。
　
（４−５）小活
　以上のとおり、本願補正発明１は、引用例１、２の記載及び上記周知事項から当業者が容易になし得たものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。
　
（５）審判請求人の主張
（５−１）相違点１について
　審判請求人は、平成２１年８月７日付審判請求書で、「引用文献１に記載されているようなTaqポリメラーゼと３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとの混合物は、典型的には、忠実度（fidelity）の高い増幅、すなわち正確な配列のDNAの増幅が必要とされる場合に用いられます。このような忠実度の高さは、ランダム化プライマーを使用するPEP-PCR法の最初の増幅工程において特に必要とされます。これに対して引用文献１の第２の増幅工程では、慣用のTaqポリメラーゼが使用されていますが、これは、Taqポリメラーゼと３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとの混合物と比較して忠実度の高い増幅をもたらすものではありません。 
 　一方で、Taqポリメラーゼを単独で使用することによって、感度の高い増幅を行うことができ、増幅対象の標的核酸内のわずかなコピーを高確率で増幅することができるという利点があります。逆に、Taqポリメラーゼと３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとの混合物では、Taqポリメラーゼ単独で使用した場合のような高感度の増幅は期待できません。このようなポリメラーゼ混合物を使用する利点と、Taqポリメラーゼ単独で使用する利点を当業者は認識していましたので、従来のPEP-PCR法、特にマイクロサテライト解析では、引用文献１の記載内容に基づいて、第２の増幅工程においても同じポリメラーゼ混合物を使用することは想定されていませんでした。」と主張している。
　しかしながら、引用例１記載事項(ii)にもあるように、ＰＣＲ増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼとして、上記ＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いると、ＤＮＡの伸長効率を向上させることが既に知られており（参照文献１）、引用例１の研究の目的は、このＰＣＲの改善法が、ランダム化したプライマーを用いるＰＥＰにおいてもあてはまるかを評価することであり、その評価を、ＰＥＰ後に行うＰＣＲでの遺伝型判定の結果により判定することが記載されている。
　このように、ＤＮＡポリメラーゼ混合物を使用することは、特異的プライマーを使用するＰＣＲでは本願優先日前既に知れていたことであり、しかも、引用例１では、ＰＥＰにおいてもTaqポリメラーゼ単独の使用よりも有利であることが確認されている。引用例１においては、ＰＥＰにおけるポリメラーゼ混合物使用の効果を公平に評価するため、あえてその後に行うＰＣＲにはTaqポリメラーゼを単独で用いたものとも解され、引用例２にも記載のように、ＰＥＰの後にＰＣＲを行う場合、通常は同じＤＮＡポリメラーゼを用いることから、ＰＥＰとその後に行うＰＣＲに同じＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いることは、当業者であれば必要に応じて随時なし得ることであるから、審判請求人の上記主張は採用できない。
　
（５−２）相違点２について
　審判請求人は、平成２４年４月２０日付回答書で、「複数回の伸長工程を異なる温度で行う方法を容易に想到しうるものではなく、またそれにより達成される効果も予測できるものではないと資料いたします。」と主張している。
　しかしながら、上記（４−２）に記載したとおり、複数の温度でＰＥＰの伸長反応を行うことは、当業者にとって周知の技術的事項及び引用例２の記載に基づいて、当業者が適宜なし得ることであり、また、そのことにより、当業者が予測できない程の顕著な効果が奏せられるものとはいえず、審判請求人の上記主張は採用できない。
　
（６）むすび
　以上のとおり、本件補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
３．本願発明について
　平成２１年８月７日付の手続補正は上記のとおり却下されたので、本出願に係る発明は、平成２０年１２月２６日付手続補正により補正された明細書及び図面の記載からみて、その請求項１〜８に記載された事項により特定されるとおりのものであり、そのうち請求項１には、以下のとおり記載されている。
「【請求項１】２つまたは３つの熱サイクル増幅反応を含んでなり、第1の増幅反応において完全にランダム化したプライマーを用い、かつ第2の増幅反応において特異的プライマーを用いる、サンプルからの核酸断片の増幅方法であって、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ第1および第2の、または第1〜第3の増幅反応を、同じDNAポリメラーゼ混合物を用いて行うことを特徴とする前記方法。」（以下、「本願発明１」、という。）
　
４．特許法第２９条第２項
（１）引用例
　上記引用例１に記載の事項は、上記２．（２）に記載のとおりのものである。
（２）対比・判断
　本願発明１と引用例１に記載された事項を対比すると、両者は、「２つまたは３つの熱サイクル増幅反応を含んでなり、第1の増幅反応において完全にランダム化したプライマーを用い、かつ第2の増幅反応において特異的プライマーを用いる、サンプルからの核酸断片の増幅方法であって、DNAを増幅するのに少なくとも２種のDNAポリメラーゼの混合物を用い、該DNAポリメラーゼの少なくとも１つが３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする方法。」である点で一致し、前者では、第1および第2の、または第1〜第3の増幅反応を、同じDNAポリメラーゼ混合物を用いて行うものであるのに対して、後者では、第２の増幅反応には、ＴａｑDNAポリメラーゼを単独で用いているものである点、で相違する。
　しかしながら、上記２．（４−１）に記載した理由により、上記相違点の本願発明１の発明特定事項については、当業者が容易になし得たものであり、本願発明１において奏される効果も、引用例１の記載から予測できない程の格別なものとはいえない。
　したがって、本願発明１は、引用例１の記載から当業者が容易になし得たものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
５．むすび
  以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。