【手続補正書】
【提出日】平成17年9月30日(2005.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  スチリルスルホン抗癌剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】  式Ｉ
【化１】
2001519326.tif 000001
（式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択され；及び
Ｒ3は、水素及びフッ素から成る群から選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｒ3が水素であるとき両方塩素であってはならず；
Ｒ1は、同一化合物中でＲ2がフッ素でありＲ3が水素であるとき塩素であってはならない）
の化合物。
【請求項２】  前記化合物は、Ｅ−４−フルオロスチリル−４−フルオロベンジルスルホン、Ｅ−２，４−ジフルオロスチリル−４−フルオロベンジルスルホン、Ｅ−４−フルオロスチリル−４−ブロモベンジルスルホン、Ｅ−４−ブロモスチリル−４−ブロモベンジルスルホン、Ｅ−４−クロロスチリル−４−ブロモベンジルスルホン、Ｅ−４−ブロモスチリル−４−クロロベンジルスルホン、及びＥ−４−ブロモスチリル−４−フルオロベンジルスルホンから成る群から選択される請求項１の化合物。
【請求項３】  医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＩ
【化２】
2001519326.tif 000002
（式中、ｎは、０又は１であり；
Ｒ1は、水素、塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択され；
Ｒ2は、水素、塩素、フッ素、臭素、メチル及びメトキシから成る群から選択され；及び
Ｒ3は水素、塩素及びフッ素から成る群から選択され；
ここで、Ｒ2は、Ｒ1及びＲ3の両方が水素でありｎが０又は１であるときメチル又はメトキシであってはならず；及び
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、ｎが１であるとき全てが水素であってはならないことを条件とする）
の化合物と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】  医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＩＩ
【化３】
2001519326.tif 000003
（式中、Ｒ1は、水素、塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択される）
の化合物と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】  医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＶ
【化４】
2001519326.tif 000004
（式中、Ｒ1は、フッ素及び臭素から成る群から選択され；及び
Ｒ2は、２−クロロフェニル、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル及び２−ニトロフェニルから成る群から選択される）
の化合物と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】  癌の処置用の薬剤の製造のための、式ＩＩ
【化５】
2001519326.tif 000005
（式中、ｎは、０又は１であり；
Ｒ1は、水素、塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択され；
Ｒ2は、水素、塩素、フッ素、臭素、メチル及びメトキシから成る群から選択され；及び
Ｒ3は水素、塩素及びフッ素から成る群から選択され；
ここで、Ｒ2は、Ｒ1及びＲ3の両方が水素でありｎが０又は１であるときメチル又はメトキシであってはならず；及び
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、ｎが１であるとき全てが水素であってはならないことを条件とする）
の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌、特に胸部癌及び前立腺癌の処置のための組成物及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
トランスメンブランレセプターにて受容される細胞外シグナルは、シグナル変換経路によって細胞内に伝達され（ペレック（Pelech）ら、Science ２５７：１３３５（１９９２））、これは、例えば細胞の増殖、分化又はアポトーシスの誘導など、広範な生理学的プロセスに結びつけられてきた（デイビス（Davis）ら、J. Biol. Chem. ２６８：１４５５３（１９９３））。マイトジェン（分裂誘発因子）活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ：Mitogen Activated Protein Kinase）カスケードは、主要なシグナル系であり、これにより細胞外（extracellular）の刺激を細胞内（intracellular）の応答に変換する（ニシダ（Nishida）ら、Trends Biochem. Sci. １８：１２８（１９９３）；ブルマー（Blumer）ら、Trends Biochem. Sci. １９：２３６（１９９４））。このカスケードの多くのステップは、異なる種にて発見されたＭＡＰキナーゼに対して保存されており、又相同である。
【０００３】
哺乳動物細胞において、細胞外シグナル調節キナーゼ類（ＥＲＫ：Extracellular-Signal-Regulated Kinase）、ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２は、典型的、且つ独特の特性を有するＭＡＰＫファミリーの最も良く研究されたメンバーであり、その全てが上流二重特異性キナーゼ（upstream dual specificity kinase）によってトレオニン及びチロシン残基におけるリン酸化で活性化される（ポサダ（Posada）ら、Science ２５５：２１２（１９９２）；ビッグス（Biggs III）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：６２９５（１９９２）；ガーナー（Garner）ら、Genes Dev. ６：１２８０（１９９２））。
【０００４】
最近の研究によって、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ１及び２（ＪＮＫ−１及びＪＮＫ−２））として知られる、ＭＡＰＫ類の更なるサブグループが同定され、これは異なる基質特異性を有し、又これらは異なる刺激により調節される（ヒビ（Hibi）ら、Genes Dev. ７：２１３５（１９９３））。ＪＮＫ類はストレス活性化プロテインキナーゼ類（ＳＰＫ：stress-activated protein kinase）のメンバーである。ＪＮＫ類はＵＶ照射、前炎症性サイトカイン及び環境ストレスでの細胞の処理によって活性化されることが示されてきた（デリジャルド（Derijard）ら、Cell １０２５（１９９４））。活性化されたＪＮＫは、ｃ−Ｊｕｎ蛋白質のアミノ末端に結合し、これをｓｅｒ６３及びｓｅｒ７３においてリン酸化することによって、蛋白質の転写活性を増加する（アドラー（Adler）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：５３４１（１９９２）；クウォック（Kwok）ら、Nature ３７０：２２３（１９９４））。
【０００５】
推定されたＪＮＫ類の一次シーケンスの分析は、これらがＥＲＫ類と遠い関係にあることを示す（デイビス（Davis）、Trends Biochem. Sci. １９：４７０（１９９４））。ＥＲＫ類とＪＮＫ類の双方は、外部刺激に応答するなかでＴｙｒ及びＴｈｒにおいてリン酸化され、その結果活性化する（デイビス（Davis）、Trends Biochem. Sci. １９：４７０（１９９４））。このリン酸化（Ｔｈｒ及びＴｙｒ）位置は、それらの活性化において臨界的な役割を演じ、ＥＲＫ類とＪＮＫ類の間で保存されている（デイビス（Davis）、Trends Biochem. Sci. １９：４７０（１９９４））。しかし、これらのリン酸化の位置は、別個の二重リン酸化モチーフの中に位置している：Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＪＮＫ）及びＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ＥＲＫ）。ＭＡＰＫ類及びＪＮＫ類の外部シグナルによるリン酸化は、幾つかの成長因子レセプター類及び他のシグナル変換分子類を包含する蛋白質の多くのファミリーを構成する、蛋白質チロシンキナーゼ類（ＰＴＫ： protein tyrosine kinase）の活性化を含むことが多い。
【０００６】
蛋白質チロシンキナーゼ類は、良く定義された化学反応、即ち、チロシン残基のリン酸化を触媒する酵素である（ハンター（Hunter）ら、Annu Rev Biochem５４：８９７（１９８５））。特にレセプターチロシンキナーゼ類は、これらキナーゼ類の基質ドメインに対する遮断薬（ブロッカー）類が、効果的且つ選択的な抗増殖作用物質（剤）を産するのに適当であることから、薬剤設計の魅力的なターゲットである。抗増殖作用物質としての蛋白質チロシンキナーゼブロッカー類の使用可能性は、クエルセチンがＰＴＫブロッカーとして示唆された１９８１年という早い時期に認識された（グラジアニ（Graziani）ら、Eur. J. Biochem. １３５：５８３−５８９（１９８３））。
【０００７】
最も良く理解されたＭＡＰＫ経路は、細胞外シグナル調節キナーゼ類を含み、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼカスケードを構成する（ボーデウィジン（Boudewijin）ら、Trends Biochem. Sci. ２０，１８（１９９５））。一度この経路が異なる刺激によって活性化されると、ＭＡＰＫは、核の中に移動して遺伝子転写を活性化する幾つかの転写因子を含む種々の蛋白質をリン酸化する。この経路のネガティブ調節は、おそらくこれら事象のカスケードを阻止できる。
【０００８】
レセプターチロシンキナーゼ類をターゲットとし、又、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼカスケードを阻止する、新規な抗癌化学療法作用物質が必要とされている。一般にオンコプロテイン類（oncoprotein）、及び特にシグナル変換蛋白質は、その活性が細胞増殖にとって基本的なものである蛋白質のサブクラスを代表し、又その活性が増殖性疾患（proliferative disease）において大きく増幅されることから、化学療法のより選択的なターゲットに適当である。
【０００９】
発明の要約
本発明の一実施態様によると、式Ｉ
【００１０】
【化６】
2001519326.tif 000006
（式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択され；及び
Ｒ3は、水素及びフッ素から成る群から選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｒ3が水素であるとき両方塩素であってはならず；
Ｒ1は、同一化合物中でＲ2がフッ素でありＲ3が水素であるとき塩素であってはならない）
の新規な化合物が提供される。
【００１１】
本発明の他の実施態様によると、医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＩ
【００１２】
【化７】
2001519326.tif 000007
（式中、ｎは、０又は１であり；
Ｒ1は、水素、塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択され；
Ｒ2は、水素、塩素、フッ素、臭素、メチル及びメトキシから成る群から選択され；及び
Ｒ3は水素、塩素及びフッ素から成る群から選択され；
ここで、Ｒ2は、Ｒ1及びＲ3の両方が水素でありｎが０又は１であるときメチル又はメトキシであってはならず；及び
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、ｎが１であるとき全てが水素であってはならないことを条件とする）
の化合物と、を含むことを特徴とする医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様によると、医薬組成物は、医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＩ（式中、Ｒ3は水素、又Ｒ1及びＲ2は独立して塩素、フッ素及び臭素を含む群から選択される）の化合物と、を含む。
【００１４】
本発明の他の実施態様によると、医薬上許容しうるキャリアと、式ＩＩＩ
【００１５】
【化８】
2001519326.tif 000008
（式中、Ｒ1は、水素、塩素、フッ素及び臭素から成る群から選択される）
の化合物と、を含むことを特徴とする医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明の他の実施態様によると、胸部又は前立腺癌のために個体を処置する方法であって、前記個体に有効量の式ＩＩ又は式ＩＩＩの化合物を、単独又は医薬上許容しうるキャリアと組み合わせて投与することを含むことを特徴とする方法が提供される。他の実施態様によると、胸部又は前立腺癌に罹患する個体中の胸部又は前立腺腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記個体に有効量の式ＩＩＩの化合物を、単独又は医薬上許容しうるキャリアと組み合わせて投与することを含むことを特徴とする方法が提供される。更に、胸部又は前立腺癌に罹患する個体中の胸部又は前立腺腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、前記個体に有効量の式ＩＩＩの化合物を、単独又は医薬上許容しうるキャリアと組み合わせて投与することを含むことを特徴とする方法が提供される。
【００１７】
本発明は又、前記化合物が、式ＩＶ
【００１８】
【化９】
2001519326.tif 000009
（式中、Ｒ1は、フッ素及び臭素から成る群から選択され；及び
Ｒ2は、２−クロロフェニル、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル及び２−ニトロフェニルから成る群から選択される）
の化合物である、医薬組成物及び上述のような治療的方法に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明に従って、ある種のスチリルスルホン誘導体類は、ＭＡＰＫシグナル変換経路に作用し、それによって腫瘍細胞の成長及び生育力に作用する。その化合物は、胸部腫瘍及び前立腺腫瘍細胞の成長及び増殖を、正常細胞の成長に作用することなく、用量依存型にて阻害する。この細胞成長阻害は、ＥＲＫ及びＪＮＫタイプのＭＡＰＫの調節と関係付けられる。スチリルスルホン類の、これらＭＡＰＫ類を調節する能力、及び細胞成長阻止を誘導する能力は、この化合物中に存在する官能基の性質及び位置によって指示される。
【００２０】
本発明のスチリルスルホン化合物類による胸部腫瘍及び前立腺腫瘍細胞の処理は、細胞増殖の阻害及びアポトーシス細胞死（apoptotic cell deth）の誘導を導く。この効果は、試験された胸部癌細胞ライン（系）である細胞ライン３６１が一度スチリルスルホン類に対してかなりの耐性を示しはしたが、エストロジェンレセプター（ＥＲ）陽性、並びにエストロジェンレセプター陰性細胞に対して観察された。又、細胞増殖の阻害及びアポトーシス細胞死の誘導は、アンドロジェン依存、並びにアンドロジェン非依存前立腺腫瘍細胞に対しても観察されたが、前者の方がかなりスチリルスルホン類に対して敏感であった。
【００２１】
本発明の化合物類で処理された腫瘍細胞は、細胞サイクルのＧ２／Ｍ相に蓄積する。この細胞は、Ｇ２／Ｍ相を出る時にアポトーシスを経るらしい。スチリルスルホン類での正常細胞の処理では、細胞サイクルの進行に同様の効果を生起できなかった。正常細胞は、スチリルスルホン薬剤の存在及び非存在下で、正常な細胞サイクルの進行を示した。
【００２２】
本発明のスチリルスルホン化合物類で処理された細胞と処理されていない細胞の双方は、同様の細胞内ＥＲＫ−２レベルを示す。しかし、ＥＲＫ−２の生化学的活性は、その基質ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ：myelin basic protein）をリン酸化する能力から判断して、薬剤処理された細胞では処理されない細胞と比較してかなり減少される。前立腺腫瘍細胞において、本発明の好ましい化合物ＦＲ−２０は、ＭＢＰのリン酸化ステータスを、模擬（mock）処理された細胞に比べて８０％以上まで減少させた。この薬剤処理及び模擬処理された細胞溶解物の、ＥＲＫ−２抗体を用いたウエスタンブロット分析では、両溶解物において同じ蛋白質量を示した。これは、模擬処理された細胞中におけるリン酸化されたＭＢＰのより高いレベルが、この溶解物中のＥＲＫ−２蛋白質が等量でないことによるものでないことを示している。これらの結果は、本発明のスチリルスルホン類がＥＲＫ−２のリン酸化能力をブロックすることを示唆する。
【００２３】
本発明のスチリルスルホン類は、ＪＮＫがｃ−Ｊｕｎ蛋白質をリン酸化する能力を、模擬処理された細胞に比べて増強する。如何なる理論によっても制限されることを意図するものではないが、この結果は、スチリルスルホン類が、前炎症性サイトカイン又はＵＶ光のように振る舞ってＪＮＫ経路を活性化し、順次、細胞成長阻害及びアポトーシスの原因となる遺伝子のスイッチをオンとすることを示唆する。
【００２４】
スチリルスルホン類の合成
本発明の化合物類は、１つ以上の二重結合が存在することによるｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性によって特徴付けられる。この化合物類は、カーン−インゴールド−プレログ法（Cahn-Ingold-Prelog system）［（有機化学命名法（Nomenclature of Organic chemistry）、ペルガモン、エルムスフォード、ニューヨーク州、１９７９（ブルーブック（Blue Book）））の（ＩＵＰＡＣ  １９７４  推奨（Recommendations）、セクションＥ：立体化学（Stereochemistry））］に従って命名する。又、マーチ（March）、先端有機化学（Advanced Organic Chemistry）［ジョン・ウィリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク州、第４版、１９９２、ｐ．１２７〜１３８］をも参照されたい。二重結合の周囲の立体（ステアリン）の関係は、「Ｚ」又は「Ｅ」として指示する。
【００２５】
（Ｅ）−スチリル及びベンジルスルホン類は、芳香族アルデヒド類と、アリール、ベンジル、スチリルスルホニル酢酸類、フェナシルアリールスルホン類及びスルホニルアセト酢酸などの活性メチレン分子類とのクネベナゲル縮合によって調製される。その手順は、レディー（Reddy）ら［レディーら、Acta. Chim. Hung.１１５：２６９（１９８４）；レディーら、Sulfur Letters １３：８３（１９９１）；レディーら、Synthesis ３２２（１９８４）；及びレディーら、Sulfur Letters ７：４３（１９８７）］によって記述されている。これら全開示を、参照により本明細書に援用する。（Ｚ）−ベンジル及び（Ｚ）−スチリルスルホン類は、芳香族及び脂肪族チオール類のフェニルアセチレンへの求核付加、及び続くその生成物の３０％過酸化水素による酸化によって合成される。
【００２６】
ベンジルスルホニル及びアリールスルホニル酢酸類の調製
アリール及びベンジルスルホニル酢酸類は、（Ｅ）−スチリルアリール及び（Ｅ）−スチリルベンジルスルホン類の合成のための出発化合物である。アリールスルホニル酢酸類は、アリールスルフィン酸ナトリウムとクロロ酢酸とのアルカリ性ｐＨでの縮合によって調製しうる。同化合物類の合成の別法としては、ナトリウムアリールチオレート（sodium arylthiolate）とクロロ酢酸との縮合によって得られた生成物を酸化することが含まれる。
【００２７】
ベンジルスルホニル酢酸類は、塩化ベンジル類とチオグリコール酸ナトリウムとの縮合の縮合生成物の、３０％過酸化水素酸化によって合成しうる。別法として、ベンジルスルホニル酢酸類は、ベンジルチオール類のナトリウム塩とクロロ酢酸類との縮合の生成物の、３０％過酸化水素酸化によって合成しうる。
【００２８】
（Ｅ）−スチリルアリール及び（Ｅ）−ベンジルスルホン類の合成
（Ｅ）−スチリルベンジル及び（Ｅ）−スチリルベンジルスルホン類を調製するために、適当なスルホニル酢酸（例えば、１０ｍｍｏｌ）、芳香族アルデヒド（例えば１０ｍｍｏｌ）及び触媒量の酢酸中ベンジルアミン（例えば１５ｍｌ）の混合物を２〜３時間還流した。冷却した後、脱水エーテル（ドライエーテル）を加え、又反応混合物を一晩冷却した。このエーテルの溶液は、連続的に炭酸水素ナトリウム、亜硫酸水素（重亜硫酸）ナトリウムの飽和溶液、希塩酸及び最終的に水で洗浄する。硫酸ナトリウム脱水エーテル溶液をエバポレーション（気化）して、（Ｅ）−スチリルアリール又はベンジルスルホン類の固体生成物を得、これを２−プロパノール又は９５％エタノールで再結晶させることができる。
【００２９】
（Ｚ）−スチリルアリール及び（Ｚ）−スチリルベンジルスルホン類の合成
（Ｚ）−スチリルアリール及び（Ｚ）−スチリルベンジルスルホン類は、適当なチオール（例えば１０ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（例えば２０ｍｍｏｌ）から調製されたナトリウムアリールチオレート又はベンジルチオレートを、新たに蒸留された、メタノール中のフェニルアセチレンに加えることによって調製しうる。混合物を２４時間還流し、粉砕氷上に注ぐ。この（Ｚ）−スチリルアリール及び（Ｚ）−スチリルベンジルスルフィド類を、３０％過酸化水素で酸化し、それぞれ（Ｚ）−スチリルアリール及び（Ｚ）−スチリルベンジルスルホン類を得る。
【００３０】
（Ｅ），（Ｅ）−及び（Ｅ），（Ｚ）−ビス（スチリル）スルホン類の合成
（Ｅ），（Ｅ）−ビス（スチリル）スルホン類は、スルホニルアセト酢酸と芳香族アルデヒド類とを、触媒としてのベンジルアミンの存在下で縮合することによって調製しうる。反応混合物を氷酢酸中で２時間還流する。冷却した後、無水エーテル（absolute ether）を反応混合物に加え、これを連続的に重炭酸ナトリウム、亜硫酸水素（亜重硫酸）の飽和溶液、希塩酸及び水で洗浄する。脱水エーテル層をエバポレーションし、（Ｅ），（Ｅ）−ビス（スチリル）スルホン類を得る。
【００３１】
（Ｚ），（Ｅ）−ビス（スチリル）スルホン類は、氷酢酸中の（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸とアルアルデヒド及びベンジルアミンとの溶液を混合することによって調製しうる。反応混合物を冷却し、脱水エーテルを加える。分離した如何なる生成物も濾過する。この濾過物（濾液）を、更なるエーテルで希釈し、又炭酸水素ナトリウム、亜硫酸水素（重亜硫酸）ナトリウムの飽和溶液、希塩酸及び水で洗浄する。このエーテル層を分離して脱水し、又エバポレーションして（Ｚ），（Ｅ）−ビス（スチリル）スルホン類を得る。
【００３２】
治療的投与
本発明のスチリルスルホン類は、医薬上許容しうるキャリアとの組み合わせにおいて医薬組成物の形態で投与しうる。そのような処方中、活性成分は０．１〜９９．９９重量％含んで良い。「医薬上許容しうるキャリア」とは、その処方中の他の成分及び受容者（レシピエント）への有毒性に適合する如何なるキャリア、希釈剤若しくは賦形剤をも意味する。
【００３３】
本発明の化合物類は、胸部癌又は前立腺癌に罹患する個体（動物及びヒトを含む哺乳動物）に投与しうる。この化合物類は、経口及び非経口投与を含む如何なるルートによっても投与しうる。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、鼻腔内、直腸、又は皮下投与を含む。活性作用物質は、好ましくは、選択された投与ルート及び標準的な医薬慣例に基づいて選択される医薬上許容しうるキャリアと共に投与される。
【００３４】
活性作用物質は、医薬調整の分野にて標準的な慣例に従った投薬型に処方される。ジェナーロ・アルフォンソ（Gennaro Alphonso）編、レミントン医薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第１８版（１９９０）［マック  パブリッシング  コーポレーション（Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルバニア州］を参照されたい。好適な投薬型は、例えば、錠剤（タブレット）、カプセル、溶液、非経口溶液、トローチ、坐剤、又は懸濁液を含む。
【００３５】
非経口投与のために、活性作用物質は、例えば水、油、塩溶液、水性デキストロース（グルコース）及び関連する糖溶液、又はプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどの適当なキャリア又は希釈剤と混合しうる。非経口投与のための溶液類は、好ましくは、活性作用物質の水溶性塩を含む。安定化剤、抗酸化剤及び保存剤も又含みうる。好適な抗酸化剤は、亜硫酸、アスコルビン酸、クエン酸及びその塩、及びＥＤＴＡナトリウムを含む。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム、メチル−又はプロピル−パラベン、及びクロルブタノールを含む。
【００３６】
経口投与のために活性作用物質は、錠剤、カプセル、又は他の適当な経口投薬型の調製のための１つ以上の個体不活性成分と組み合わせうる。例えば、活性作用物質は、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、マニトール及び澱粉と組み合わせることができ、そして、伝統的な錠剤加工方法（tableting method）によって錠剤に形成することができる。
【００３７】
治療的利点を得るための、本発明に従った特定の化合物用量は、勿論患者の大きさ、重さ、年齢、性別、疾患の性質及び段階、疾患の攻撃性、及び投与ルートを含む、個々の患者の特定の状況によって決定される。例えば、日々の用量として、約０．０５〜約５０ｍｇ／ｋｇ・日を利用しうる。より高い又はより低い用量もまた意図される。
【００３８】
本発明の実施態様を以下の非制限的な例によって説明する。
【００３９】
手順１
スチリル及びベンジルアリールスルホン類合成の一般的手順
メタノール（２００ｍｌ）中の水酸化ナトリウム溶液（８ｇ、０．２ｍｏｌ）に、適当なチオフェノール又はベンジルメルカプタン（０．１ｍｏｌ）をゆっくりと加える。その後、各部分にクロロ酢酸（０．１ｍｏｌ）を加え、反応混合物を２〜３時間還流する。冷却された内容物を破砕氷上に注ぎ、希塩酸（２００ｍｌ）で中和する。生成したアリール及びベンジルチオ酢酸類（０．１ｍｏｌ）を、１〜２時間の還流によって、氷酢酸（２５ｍｌ）中の３０％過酸化水素（０．１２ｍｏｌ）で酸化する。内容物を冷却した後破砕氷上に注ぐ。分離した固体を温水（熱水）から再結晶し、純粋なアリール及びベンジルスルホニル酢酸類を得る。
【００４０】
氷酢酸（１５ｍｌ）中の、適当なアリール又はベンジルスルホニル酢酸（０．００１ｍｏｌ）、芳香族アルデヒド（０．００１ｍｏｌ）及びベンジルアミン（１ｍｌ）を２〜３時間還流する。内容物を冷却し、脱水エーテル（５０ｍｌ）で処理する。分離した如何なる生成物も濾過によって集める。この濾液を更なるエーテルで希釈し、連続的に重炭酸ナトリウム（２０ｍｌ）、亜硫酸水素（重亜硫酸）ナトリウム（２０ｍｌ）の飽和溶液、希塩酸（２０ｍｌ）及び最終的に水（３５ｍｌ）で洗浄する。脱水エーテル層をエバポレーションすると、多くの場合固体を得る。しかし、幾つかの場合には、シロップ状物質分離物を与えることもあり、これは２−プロパノールにて処理することで固体化する。この化合物類の純度は、ＴＬＣ（シリカゲルＢＤＨ、ヘキサン／エチル酢酸塩３：１）によって確認した。
【００４１】
手順２
（Ｅ）（Ｅ）−及び（Ｅ）（Ｚ）−ビス（スチリル）スルホン類合成の一般手順
新たに蒸留されたフェニルアセチレン（５１．０７ｇ、０．５ｍｏｌ）に、メタノール（２５０ｍｌ）中で、チオグリコール酸（４６ｇ、０．５ｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（４０ｇ、１ｍｏｌ）から調製されたチオグリコール酸ナトリウムを加える。この混合物を２４時間還流し、冷却した後破砕氷（５００ｍｌ）上に注ぐ。希塩酸（２５０ｍｌ）で中和した後に形成するスチリルチオ酢酸を濾過し脱水する。収量８８ｇ（９０％）；ｍ．ｐ．８４〜８６℃。
【００４２】
その後、このスチリルチオ酢酸を、次のようにしてスチリルスルホニル酢酸へと酸化する。氷酢酸（３５ｍｌ）中のスチリルチオ酢酸（５ｇ、２５ｍｍｏｌ）及び３０％過酸化水素（１５ｍｌ）の混合物を６０分間の還流の下に加熱し、この混合物を冷却した後破砕氷（２００ｍｌ）上に注ぐ。分離した化合物を濾過し、温水から再結晶させて、（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸の白色結晶性薄片を得る。収量２．４ｇ（４１％）；ｍ．ｐ．１５０〜５１℃。
【００４３】
氷酢酸（６ｍｌ）中の（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸溶液（２．２６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を芳香族アルデヒド（１０ｍｍｏｌ）及びベンジルアミン（０．２ｍｌ）と混合し、３時間還流する。反応混合物を冷却し、脱水エーテル（５０ｍｌ）で処理し、分離した如何なる生成物も濾過によって集める。濾液を更なるエーテルで希釈し、連続的に炭酸水素ナトリウム（１５ｍｌ）、亜硫酸水素（重亜硫酸）ナトリウム（１５ｍｌ）の飽和溶液、希塩酸（２０ｍｌ）及び最終的に水（３０ｍｌ）で洗浄する。脱水エーテル層をエバポレーションし、（Ｅ）（Ｚ）−ビス（スチリル）スルホン類を得る。
【００４４】
（Ｅ），（Ｅ）−ビス（スチリル）スルホン類は、（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸の代わりにスルホニルアセト酢酸が用いられ、又２倍の量の芳香族アルデヒド（２０ｍｍｏｌ）が用いられることを除いて、上述と同様の手順に従って調製する。
【００４５】
手順３
２−（アリールスルホニル）−１−フェニル−３−アリール−２−プロペン−１−オン（ｏｎｅ）類合成の一般手順
これらの化合物類は、異なる反応条件、溶媒及び触媒を採用する２つの方法によって合成される。
【００４６】
方法１：フェナシルアリールスルホン類は、無水エタノール（２００ｍｌ）中でα−ブロモアセトフェノン類（０．０５ｍｏｌ）及びアリールスルフィン酸ナトリウム類（０．０５ｍｏｌ）を６〜８時間還流することによって作成される。冷却によって分離した生成物を濾過し、水で数回洗浄し、臭化ナトリウムを除去する。その後、この生成物をエタノールから再結晶させる：フェナシル−フェニルスルホン、ｍ．ｐ．９０〜９１℃；フェナシル−ｐ−フルオロフェニルスルホン、ｍ．ｐ．１４８〜１４９℃；フェナシル−ｐ−ブロモフェニルスルホン、ｍ．ｐ．１２１〜１２２℃；フェナシル−ｐ−メトキシフェニルスルホン、ｍ．ｐ．１０４〜１０５℃；ｐ−ニトロフェナシル−フェニルスルホン、ｍ．ｐ．１３６〜１３７℃。
【００４７】
酢酸（１０ｍｌ）中のフェナシルアリールスルホン溶液（０．０１ｍｏｌ）を、アルアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）及びベンジルアミン（０．０２ｍｌ）と混合し、３時間還流する。その溶液を冷却し、脱水エーテル（５０ｍｌ）を加える。このエーテル溶液を、連続的に希塩酸、水性１０％ＮａＯＨ、飽和ＮａＨＳＯ3溶液及び水で洗浄する。脱水エーテル層をエバポレーションして固体生成物を得、これを再結晶によって精製する。
【００４８】
方法２：脱水テトラヒドロフラン（２００ｍｌ）を、窒素にてさっと流した５００ｍｌのコニカルフラスコに採る。これに、無水四塩化炭素中の塩化チタン（ＩＶ）（１１ｍｌ、０．０１ｍｏｌ）を、連続攪拌しながら滴下して加える。フラスコの内容物は、この添加過程を通して−２０℃に維持する。フェナシルアリールスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び芳香族アルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の混合物を反応混合物に加え、テトラヒドロフラン（８ｍｌ）中のピリジン（４ｍｌ、０．０４ｍｏｌ）を１時間以上かけてゆっくりと加える。内容物を１０〜１２時間攪拌し、水（５０ｍｌ）で処理し、その後エーテル（５０ｍｌ）を加える。このエーテル層を分離し、１０％水酸化ナトリウム、亜硫酸水素（重亜硫酸）ナトリウム及び塩水（ブライン）の飽和溶液１５ｍｌで洗浄する。この脱水エーテル層をエバポレーションし、２−（アリールスルホニル）−１−フェニル−３−アリール−２プロペン−１−オン類を得る。
【００４９】
例１
Ｅ−スチリルフェニルスルホン
フェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及びベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は６８〜７２％の収率にて得られた。
【００５０】
例２
Ｅ−４−クロロスチリルフェニルスルホン
フェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７８〜８０％の収率にて得られた。
【００５１】
例３
Ｅ−２，４−ジクロロスチリルフェニルスルホン
フェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び２，４−ジクロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は６０〜６５％の収率で得られた。
【００５２】
例４
Ｅ−４−ブロモスチリルフェニルスルホン
フェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７８〜８０％の収率で得られた。
【００５３】
例５
Ｅ−４−クロロスチリル４−クロロフェニルスルホン
４−クロロフェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７０〜７２％の収率で得られた。
【００５４】
例６
Ｅ−４−メチルスチリル４−クロロフェニルスルホン
４−クロロフェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−メチルベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は６０〜６４％の収率で得られた。
【００５５】
例７
Ｅ−４−メトキシスチリル４−クロロフェニルスルホン
４−クロロフェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−メトキシベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は６８〜７０％の収率で得られた。
【００５６】
例８
Ｅ−４−ブロモスチリル４−クロロフェニルスルホン
４−クロロフェニルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８０％の収率で得られた。
【００５７】
例９
Ｅ−２−クロロスチリルベンジルスルホン
ベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び２−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７２％の収率で得られた。
【００５８】
例１０
Ｅ−４−クロロスチリルベンジルスルホン
ベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７８％の収率で得られた。
【００５９】
例１１
Ｅ−４−フルオロスチリル４−クロロベンジルスルホン
４−クロロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４―フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７２％の収率で得られた。
【００６０】
例１２
Ｅ−４−クロロスチリル４−クロロベンジルスルホン
４−クロロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８０％の収率で得られた。
【００６１】
例１３
Ｅ−４−フルオロスチリル４−フルオロベンジルスルホン
４−フルオロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は７３％の収率で得られた。
【００６２】
例１４
Ｅ−２，４−ジフルオロスチリル４−フルオロベンジルスルホン
４−フルオロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び２，４−ジフルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は６８％の収率で得られた。
【００６３】
例１５
Ｅ−４−フルオロスチリル４−ブロモベンジルスルホン
４−ブロモベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８２％の収率で得られた。
【００６４】
例１６
Ｅ−４−ブロモスチリル４−ブロモベンジルスルホン
４−ブロモベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８８％の収率で得られた。
【００６５】
例１７
Ｅ−４−ブロモスチリル４−フルオロベンジルスルホン
４−フルオロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８２％の収率で得られた。
【００６６】
例１８
Ｅ−４−クロロスチリル４−ブロモベンジルスルホン
４−ブロモベンジルスホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は８８％の収率で得られた。
【００６７】
例１９
Ｅ−４−ブロモスチリル４−クロロベンジルスルホン
４−クロロベンジルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順１に供した。表題化合物は９２％の収率で得られた。
【００６８】
例２０
（Ｚ）−スチリル−（Ｅ）−４−フルオロスチリルスルホン
（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−４−フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順２に供した。表題化合物は６８％の収率で得られた。
【００６９】
例２１
（Ｚ）−スチリル−（Ｅ）−４−ブロモスチリルスルホン
（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順２に供した。表題化合物は７０％の収率で得られた。
【００７０】
例２２
（Ｚ）−スチリル−（Ｅ）−４−クロロスチリルスルホン
（Ｚ）−スチリルスルホニル酢酸（０．０１ｍｏｌ）及び４−クロロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順２に供した。表題化合物は６４％の収率で得られた。
【００７１】
例２３
２−［（４−フルオロフェニル）スルホニル］−１−フェニル−３−（４−フルオロフェニル）−２−プロペン−１−オン
フェナシル−４−フルオロフェニルスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び４−フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順３の方法１に供した。表題化合物は６３％の収率で得られた。
【００７２】
例２４
２−［（２−クロロフェニル）−スルホニル］−１−フェニル−３−（４−フルオロフェニル）−２−プロペン−１−オン
フェナシル−２−クロロフェニルスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び４−フルオロベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順３の方法１に供した。表題化合物は５８％の収率で得られた。
【００７３】
例２５
２−［（２−クロロフェニル）スルホニル］−１−フェニル−３−（４−ブロモフェニル）−２−プロペン−１−オン
フェナシル−２−クロロフェニルスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順３の方法１に供した。表題化合物は６６％の収率で得られた。
【００７４】
例２６
２−［（４−クロロフェニル）スルフォニル］−１−フェニル−３−（４−ブロモフェニル）−２−プロペン−１−オン
フェナシル−４−クロロフェニルスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順３の方法１に供した。表題化合物は６０％の収率で得られた。
【００７５】
例２７
２−［（２−ニトロフェニル）スルホニル］−１−フェニル−３−（４−ブロモフェニル）−２−プロペン−１−オン
フェナシル−２−ニトロフェニルスルホン（０．０１ｍｏｌ）及び４−ブロモベンズアルデヒド（０．０１ｍｏｌ）の溶液を手順３の方法１に供した。表題化合物は５６％の収率で得られた。
【００７６】
例２８
スチリルスルホン類による腫瘍細胞成長阻害
Ａ．細胞
胸部及び前立腺の正常細胞及び腫瘍細胞の成長へのスチリルスルホンの効果を、４つの細胞ライン（系）、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０及びＬｎＣａｐを利用して試験した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は正常な線維芽細胞を代表し、一方ＬｎＣａｐはアンドロジェン依存前立腺腫瘍細胞ラインである。ＭＣＦ−７はエストロジェン応答性胸部腫瘍細胞ラインであり、一方ＢＴ−２０はエストロジェン非応答性胸部腫瘍細胞ラインである。ＭＣＦ−７及びＢＴ−２０は、ペニシリン及びストレプトマイシンを補足した１０％胎児牛（bovine）血清を含む、ダルベッコ（Dulbecco's）修飾イーグル（Eagle's）の培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。ＬｎＣａＰはペニシリン及びストレプトマイシンを含む１０％胎児牛血清を伴ったＲＰＭＩ中で培養した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ペニシリン及びストレプトマイシンを補足した１０％子牛（calf）血清を含むＤＭＥＭ中で成長させた。全ての細胞培養を、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
【００７７】
Ｂ．スチリルスルホン類による処理及び生育力検定
細胞は、２．５μＭ又は５．０μＭ濃度の試験化合物で処理し、細胞生育力を４８時間後にトリパンブルー排除法（Trypan blue exclusion method）によって決定した。表１、２及び３に示される化合物類は、様々な程度で細胞成長を阻害し、又細胞死を誘導した。これら各表は、５．０μＭの化合物で処理されたＬｎＣａｐ及びＭＣＦ−７細胞の生存％（percent viable）を列挙する。
【００７８】
【表１】
2001519326.tif 000010
【００７９】
【表２】
2001519326.tif 000011
【００８０】
【表３】
2001519326.tif 000012
最も高い活性を示した、より活性の強い５つの化合物類を、ＦＲＩ−２（Ｅ−２，４−ジフルオロスチリル−４−フルオロベンジルスルホン）、ＦＲＩ−６（Ｅ−４−フルオロスチリル４−ブロモベンジルスルホン）、ＦＲＩ−７（Ｅ−４−ブロモスチリル４−フルオロベンジルスルホン）、ＦＲＩ−２０（Ｅ−４−フルオロスチリル４−クロロベンジルスルホン）及びＦＲＩ−２２（Ｅ−４−クロロスチリル４−クロロベンジルスルホン）として指定する。これらの化合物類は、実質的にＬｎＣａＰ、ＢＴ−２０及びＭＣＦ−７細胞の成長を、２．５ｍＭ（図１Ａ）及び５．０ｍＭ（図１Ｂ）にて、この化合物類での処理の４８時間後に阻害し、又死を誘導することが見出された。同一条件下で、４８時間のインキュベーションの後、８０％以上のＮＩＨ３Ｔ３細胞が生存可能であった（図１Ａ及び１Ｂ）。Ｅ−４−クロロスチリル４−ブロモベンジルスルホン及びＥ−４−ブロモスチリル４−クロロベンジルスルホンもまた活性が高かった。
Ｃ．用量依存検定
スチリルスルホン類の用量依存を、５つの最も活性な化合物中の１つであるＦＲＩ−２０で細胞を処理することによって確認した。ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０及びＬｎＣａＰ細胞を、ＤＭＳＯ中に２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２．５μＭ及び５μＭの濃度で溶解したＦＲＩ−２０にて処理し、それらの４８時間後の増殖及び生育力について試験した（図２Ａ）。生存細胞のパーセンテージを、トリパンブルー排除によって決定した。対照細胞はＤＭＳＯで処理し、細胞への溶媒の影響を決定した。２５０ｎＭの濃度にて、４８時間後に、処理されていない細胞と比較して、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０及びＬｎＣａＰ細胞中に約１０％の細胞死、及び１５〜２０％の細胞分裂の阻害があった。５００ｎＭの濃度で、ＬｎＣａｐ、ＢＴ−２０及びＭＣＦ−７中には、３０〜５０％の細胞増殖の阻害、及び２５〜３０％の細胞死があった。これらの条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ほんの２〜３％だけが両方の濃度で生存不可能であった。ＬｎＣａＰ、ＢＴ−２０及びＭＣＦ−７細胞の成長は、１μＭ濃度のＦＲＩ−２０によって、細胞の生育力の低下を付随して強く阻害された。４８時間のインキュベーションの後、ＬｎＣａＰ、ＢＴ−２０及びＭＣＦ−７細胞の６０〜７５％が２．５ｍＭのＦＲＩ−２０濃度で死滅し、一方ＮＩＨ３Ｔ３細胞の９０％以上が生存可能であった（図２Ａ）。５μＭのＦＲＩ−２０で処理したＬａＣａｐ、ＢＴ−２０及びＭＣＦ７細胞（図２Ａ）は、９０％近い細胞死を示した。ＮＩＨ３Ｔ３は、５μＭ濃度のＦＲＩ−２、−６、−７、−２０又は−２２の存在下で、その成長能力の変質が殆ど無いか若しくは無く、又＞８０％の生育力を維持した。
【００８１】
Ｄ．経時検定
ＦＲＩ−２０の活性の時間経過は次のようにして明らかにされた。ＮＩＨ／３Ｔ３、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０及びＬｎＣａｐを２．５μＭにてＦＲＩ−２０で処理し、生存細胞の数を１２、２４、４８及び７２時間においてトリパンブルー排除によって決定した。３回の独立した実験の平均を図２Ｂに示す。時間経過の研究は、ＭＣＦ−７、ＬｎＣａＰ及びＢＴ−２０細胞の９５％以上が、２．５μＭでのＦＲＩ−２０による処理の７２時間後に死滅することを明らかにした（図２Ｂ）。
【００８２】
例２９
ＦＲＩ−２０による腫瘍細胞成長阻害
Ａ．細胞
正常細胞と、胸部及び前立腺の腫瘍細胞との成長へのＦＲ−２０の効果を、９つの細胞ライン：ＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＦＬ（正常線維芽細胞ライン）；ＭＣＦ−７及び３６１（エストロジェンレセプター陰性胸部腫瘍細胞ライン）；ＢＴ−２０、４３５及びＳＫＢＲ−３（エストロジェンレセプター陽性胸部腫瘍細胞ライン）；ＬｎＣａＰ（アンドロジェン感受性前立腺腫瘍細胞ライン）；ＰＣ−３及びＤＵ−１４５（アンドロジェン非感受性前立腺腫瘍細胞ライン）、を利用して試験した。
【００８３】
Ｂ．ＦＲＩ−２０での処理及び生育力検定
細胞を例２２．Ａのようにして成長させた。ＦＲ−２０をＤＭＳＯ中に溶解し、２．５μＭ及び５．０μＭの濃度にて細胞に加えた。対照細胞には、ＤＭＳＯを、化合物中最も高い濃度にて存在する溶媒（ＤＭＳＯ）の容量に等しくなるように加えた。化合物の活性を、４８時間後にトリパンブルー排除によって評価した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＨＦＬ細胞は、２．５及び５．０μＭの濃度にて８５〜９０％の生存％を維持していることが分かった。ＦＲＩ−２０化合物で処理された７つの胸部腫瘍細胞ライン、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ１２６、Ｔ４７０及び４３５細胞は、２．５及び５．０μＭの薬剤濃度にて、生存が２５％及び１０％という、非常に高い致死率を示した（図３Ａ）。ＳＫＢＲ−３及びＢＴ−２０細胞の５０％近くが２．５μＭ濃度、又７５％近くが５．０μＭ濃度の化合物で死滅した。一方、３６１胸部腫瘍細胞ラインは、２．５及び５．０μＭの濃度にて５０〜７５％の細胞が生存可能という、ＦＲＩ−２０に対するかなりの耐性を示した。ＦＲＩ−２０は、アンドロジェン非依存ＤＵ−１４５及びＰＣ−３前立腺細胞ラインと比較して、アンドロジェン依存ＬｎＣａＰ前立腺腫瘍細胞ラインの生育力に強い作用を有していた。２．５ｍＭのＦＲＩ−２０で、ＬｎＣａＰの８０％、ＰＣ−３の４０％、及びＤＵ−１４５細胞の２０％が死滅した。５．０ｍＭのＦＲＩ−２０で、ＬｎＣａＰの７２％、ＰＣ−３の４７％、及びＤＵ−１４５の４０％が死滅した（図３Ｂ）。
【００８４】
例３０
ＦＲＩ−２０の細胞サイクル調節への効果
アンドロジェン依存前立腺腫瘍細胞ラインＬｎＣａＰを例２２．Ａのようにして成長させ、ＤＭＳＯ中に溶解した２．０μＭのＦＲＩ−２０又は等量（１０ｍｌ）のＤＭＳＯのみで処理した。細胞は、処理後６、１２、２４及び４８時間で集め、ヨウ化プロピデュームで染色し、ＤＮＡ成分（含有量）の分析のためにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ：flow cytometry）に供した。図４に示すように、ＦＲ−２０の培養培地への添加に結果、細胞は細胞サイクルのＧ２／Ｍ相に蓄積し、又細胞が細胞サイクルのこの相を出る時、それらはアポトーシスを受けるようである。ＤＭＳＯのみで処理された細胞は、細胞サイクルのＧ２／Ｍ相におけるこのような阻止を示さず、この効果はＦＲＩ−２０添加に関係付けられることを示唆する。ＦＲＩ−２０での正常細胞ラインＮＩＨ３Ｔ３又はＨＦＬの処理では、細胞サイクルの進行に同様の効果を生起することはできなかった。ＮＩＨ３Ｔ３及びＨＦＬは、薬剤の存在下及び非存在下で、正常な細胞サイクルの進行を示した。
【００８５】
例３１
ＦＲＩ−２０のＭＰＫ経路への効果
Ａ．免疫複合体ＥＲＫ−２検定
ＦＲＩ−２０のＭＡＰＫ経路への効果を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３、ＬｎＣａＰ及びＭＣＦ−７細胞を、ＦＲＩ−２０と共に２．５ｍＭの濃度にて４８時間インキュベーションした。細胞をＦＲＩ−２０の存在下及び非存在下でインキュベーションした後、細胞を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのジチオトレイトール、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、１００μＭのフッ化フェニルメチルスルホニル及び１ｍＭのベンズアミジンを含むＥＲＫ溶解緩衝液を用いて溶解した。１００ｍｇの細胞溶解物中のＥＲＫ−２は、溶解物蛋白質を１ｍｇのＥＲＫ−２ポリクロナール抗体（ＥＲＫ２に対する抗体ｓｃ−１５４は、サンタ  クルス  バイオテクノロジー  インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）から）と共に１時間インキュベーションし、その後２０μｌのプロテインＡ−セファロース（ファルマシア（Pharmacia）と共に更に１時間追加のインキュベーションをすることによって免疫沈降させた。免疫複合体が結合したプロテインＡセファロースビーズは、溶解緩衝液で２度、又２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのヂチオトレイトール及び１００ｍＭのＮａ3ＶＯ4を含むＥＲＫ／ＭＡＰＫ緩衝液で２度洗浄した。
【００８６】
その後、免疫沈降物を、ＭＡＰキナーゼ活性に関して、ＥＲＫ−２の基質としてミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）を［γ−32Ｐ］ＡＴＰの存在下で利用した、インビトロ（生体外：in vitro）検定によって試験した。従って、ビーズは１００μＭの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含むＭＡＰＫ緩衝液の４０μｌに再懸濁し、キナーゼ検定を、基質として５μｇのＭＢＰを用いて２０分間３０℃にて実施した。反応は、ラエムリ（Laemmli's）緩衝液を添加し、続いて試料を３分間煮沸することによって停止した。蛋白質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラムを現像した。その結果は、薬剤処理された細胞及び処理されていない細胞の両方とも、同様レベルの細胞内ＥＲＫ−２を示すことを明らかにした。しかし、ＥＲＫ−２の生化学的活性は、そのＭＢＰをリン酸化する能力から判断するに、ＤＭＳＯのみで処理された細胞と比較して薬剤処理された細胞においてかなり減少された。前立腺腫瘍細胞において、ＦＲＩ−２０は、ＭＢＰのリン酸化ステータスを、模擬処理された細胞（mock-treated cell）と比べて８０％以上まで減少させた（図５）。
【００８７】
Ｂ．ウェスタンブロット分析
ＦＲＩ−２０処理された細胞の細胞溶解物を、ウェスタンブロット分析のために次のようにして調製した。ＮＩＨ３Ｔ３、ＬｎＣａＰ又はＭＣＦ−７細胞を、２×１０5細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートに接種し、２４時間成長させた。新鮮な培地を、ＦＲＩ−２０での処理の２時間前に各ウェルに加えた。化合物をＤＭＳＯに溶解して２ｍＭのストック溶液を作成し、培地に加えて（２ｍｌ）終濃度２．５及び５．０μＭを得た。３７℃にて４８時間後、細胞を１０ｍｌの氷冷リン酸緩衝塩液で２回洗浄し、又、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３００ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１００μＭのＮａ3ＶＯ4、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのジチオトレイトール、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、１００μＭの塩化フェニルメチルスルホニル及び１ｍＭのベンズアミジンを含む溶解緩衝液４００μｌ中に集めた。細胞溶解物を氷上に３０分間保持し、そしてマイクロ遠心分離（１６０００×ｇ）にて１０分間遠心分離した。細胞溶解物を破片から分離し、蛋白質含有量で正規化した。
【００８８】
ウェスタンブロット分析は、薬剤処理及び模擬処理された細胞溶解物について、ＥＲＫ−２抗体を用いて実施した。等総蛋白質量（１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０〜１２％）の各レーンに装填し、イモビロン−Ｐ（Immobilon-P）（ミリポア（Milipore）、アメリカ合衆国）に転写した。転写に続いて、膜を３％ミルク中でブロックし、次いでＥＲＫ−２及びＪＮＫ−１ウサギポリクロナール抗体（サンタ  クルス  バイオテクノロジー  インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology Inc.）、サンタ  クルス、カリフォルニア州）でプローブし、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇ二次抗体（アメーシャム（Amersham）（１：１００００希釈）でプローブした。この抗体はＥＣＬウェスタンブロッティング分析キット（アメーシャム（Amersham））を用い、製造者の指示書に従って検出した。薬剤処理及び模擬処理された細胞溶解物の、ＥＲＫ−２抗体でのウェスタンブロット分析は、両溶解物中で同量の蛋白質を示し（図６）、模擬処理された細胞における高いレベルのＭＢＰリン酸化が、溶解物中のＥＲＫ−２蛋白質の量が等しくないことによるものではないことを示した。これらの結果は、ＦＲＩ−２０がＥＲＫ−２のリン酸化能力をブロックすることを示唆する。
【００８９】
例３２
ＦＲＩ−２０のストレス活性化蛋白質活性への効果
更に、ＪＮＫがそのメンバーであるところの、ストレス活性化プロテインキナーゼ類（ＳＡＰＫ）の活性がＦＲＩ−２０の存在下で弱められるか否かを確かめるために、細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ−７又はＬｎＣａＰ）をＤＭＳＯ中に溶解したＦＲＩ−２０又はＤＭＳＯのみで処理した。４８時間後、細胞をキナーゼ緩衝液で溶解し、この溶解物を、ＪＮＫポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロット分析により各溶解物中に存在するＪＮＫの量を評価するために用いた。又、ＦＲＩ−２０処理及び模擬処理された細胞の溶解物に存在するＪＮＫの生化学的活性をも、ＪＮＫを免疫沈降させ、その後ＪＮＫの基質としてのＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ蛋白質と共に、［γ−32Ｐ］ＡＴＰの存在下でインキュベーションすることによって決定した。
【００９０】
従って、１００ｍｇの細胞抽出物中のＪＮＫ−１は、溶解物を１ｍｇのＪＮＫ−１ポリクロナール抗体（分泌成分（ｓｃ）はサンタ  クルス  バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）から）と共に１時間インキュベーションし、その後２０μｌのプロテインＡ−セファロース（ファルマシア（Pharmacia））と共に更に１時間追加インキュベーションすることによって免疫沈降させた。ビーズを（上述のような）ＪＮＫ溶解緩衝液で２回洗浄し、その後ＪＮＫ反応緩衝液で２回洗浄した。ビーズを２０ｍＭの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含むＪＮＫ緩衝液４０μｌ中に再懸濁し、キナーゼ反応を、基質として３μｇの精製ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いて３０℃にて２０分間実施した。反応を停止し、リン酸化されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ蛋白質中の放射能を定量した。その結果は、ＦＲＩ−２０処理によってＪＮＫが組換えＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ蛋白質をリン酸化する能力を、模擬処理された細胞に比べて６０〜８０％まで増強することを示した（図７）。
【００９１】
ＪＮＫは、ＵＶ照射、前炎症性サイトカイン及び環境ストレスによる細胞処理で活性化されることが示されてきた（デリジャルド（Derijard）ら、Cell １０２５（１９９４））。活性化されたＪＮＫはｃ−ｊｕｎのアミノ末端に結合し、ｓｅｒ６３及びｓｅｒ７３にてリン酸化することによって、その転写活性を増加させる（アドラー（Adler）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：５３４１（１９９２）；クウォック（Kwok）ら、Nature ３７０：２２３（１９９４））。如何なる理論にも束縛されることを意図するものではないが、ここに示されたこの結果は、ＦＲＩ−２０がＪＮＫ経路の活性化において前炎症性サイトカイン又はＵＶ光のように働き、細胞成長阻害及びアポトーシスの原因となる遺伝子のスイッチを順次オンとしうること示唆する。
【００９２】
例３３
ＦＲＩ−２０とシスプラチンの比較
抗腫瘍活性
アンドロジェン感受性（ＬｎＣａＰ）及びアンドロジェン非感受性（ＤＵ１４５）前立腺腫瘍細胞へのＦＲ−２０の致死効果を、抗前立腺癌作用物質として広く用いられているシスプラチン（ｃｉｓ−ジアムミンジクロロプラチニウムＩＩ（cis-diamminedichloroplatinum II））の効果と比較した。細胞を例２６のようにして成長させた。ＦＲＩ−２０又はシスプラチンをＤＭＳＯ中に溶解し、種々の濃度にて細胞に加えた。生育力を７２時間後にトリパンブルー排除法によって決定した。ＬｎＣａＰ及びＤＵ１４５細胞を完全に死滅させるために必要なＦＲＩ−２０の濃度は、それぞれ２．５μＭ及び５．０μＭであった。同一条件下で、シスプラチンにより完全にＬｎＣａＰ及びＤＵ１４５細胞を死滅させるためには、それぞれ２５μＭ及び１５μＭの濃度を必要とした。このように、ＦＲＩ−２０は、ホルモン依存及びホルモン非依存前立腺腫瘍細胞の双方の致死において、少なくとも１０倍、シスプラチンより活性である。
【００９３】
合成、調製及び分析の手順に関して引用した全ての参考文献は、参照によって本明細書に援用する。
【００９４】
本発明は、本発明の精神又は基本的な特質から逸脱することなく、他の特定の態様にて実施することができる。従って、本発明の範囲を示すためには、上述の詳細な説明より寧ろ添付の特許請求の範囲を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び図１Ｂは、化合物類Ｅ−２，４−ジフルオロスチリル−４−フルオロベンジルスルホン（ＦＲＩ−２）、Ｅ−４−フルオロスチリル４−ブロモベンジルスルホン（ＦＲＩ−６）、Ｅ−４−ブロモスチリル４−フルオロベンジルスルホン（ＦＲＩ−７）、Ｅ−４−フルオロスチリル４−クロロベンジルスルホン（ＦＲＩ−２０）及びＥ−４−クロロスチリル４−クロロベンジルスルホン（ＦＲＩ−２２）の、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ７、ＢＴ−２０及びＬｎＣａＰ細胞への効果の棒グラフである。細胞は２．５μＭ（図１Ａ）又は５．０μＭ（図１Ｂ）の濃度の化合物にて処理し、又細胞の生育力は、４８時間後にトリパンブルー排除法により決定した。それぞれのデータポイントは、３回の独立した実験の平均を表す。標準偏差は１０％を越えなかった。
【図２】
図２Ａは、ＭＣＦ７、ＢＴ２０、ＬｎＣａＰ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の、ＦＲＩ−２０での処理による濃度依存阻害の棒グラフである。細胞は、０．２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２．５μＭ及び５．０μＭのＦＲＩ−２０で４８時間処理した。生存細胞のパーセンテージは、トリパンブルー排除によって決定した。３回の独立した実験の平均を示す。
図２Ｂは、ＭＣＦ７、ＢＴ２０、ＬｎＣａＰ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の、異なる時間間隔における生育力の棒グラフである。全ての細胞は２．５μＭのＦＲＩ−２０で処理し、生存細胞の数は１２、２４、４８、及び７２時間において、トリパンブルー排除によって決定した。３回の独立した実験の平均を示す。
【図３】
図３Ａは、化合物ＦＲＩ−２０の、正常細胞ラインＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ及びＨＦＬ；エストロジェンレセプター陽性胸部腫瘍細胞ラインＭＣＦ−７及び３６１；エストロジェンレセプター陰性胸部腫瘍細胞ラインＳＫＢＲ−３、４３５及びＢＴ−２０に対する活性のプロットである。図３Ｂは、処理された細胞がアンドロジェン非依存前立腺細胞ラインＬｎＣａＰ、及びアンドロジェン依存前立腺細胞ラインＤＵ−１４５及びＰＣ−３を含むこと以外は、図３Ａと同様である。全ての細胞は２．５及び５．０μＭ濃度のＦＲＩ−２０で処理し、細胞生育力について４８時間後にトリパンブルー排除によって検定した。３実験の平均を示す。分散は１０％を越えなかった。
【図４】
図４［図４（１／２）及び図４（２／２）］は、ＦＲＩ−２０処理、又は対照処理されたＬｎＣａＰ細胞の、細胞サイクル分析の一群のブロットを含む。ＬｎＣａＰ細胞は、１２０ｍｌのＤＭＳＯ（対照細胞）又は１０ｍｌのＤＭＳＯ中の２．５μＭのＦＲＩ−２０で処理した。細胞は、処理後６、１２、２４及び４８時間で集め、ヨウ化プロピデュームにて染色し、フローサイトメトリーに供した。
【図５】
図５は、ＦＲＩ−２０のＥＲＫ／ＭＡＰＫ活性への効果のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフである。ＦＲＩ−２０処理されたＬｎＣａＰ、ＭＣＦ−７及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＤＭＳＯ処理された細胞（対照）と共に、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）を用いたＥＲＫ／ＭＡＰＫ免疫性複合体キナーゼ試験のために処理した。その後、ＭＢＰに対するＥＲＫ−２の活性を、［γ32Ｐ］ＡＴＰの存在下で検定した。リン酸化されたＭＢＰを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【図６】
図６は、ＥＲＫ−２及びＪＮＫ／ＳＡＰＫ蛋白質のＮＩＨ３Ｔ３、ＬｎＣａＰ及びＭＣＦ−７細胞中の分布のブロットである。１００ｍｇの蛋白質を含む培養細胞の溶解物を１レーン毎に装填した。電気泳動及びポリビニリデン膜への転移の後、蛋白質をＥＲＫ−２及びＪＮＫ−２ポリクロナール抗体に対してブロットし、化学ルミネセンスによって可視した。
【図７】
図７は、ＦＲＩ−２０の、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ活性への効果のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフである。ＪＮＫは、ＪＮＫポリクロナール抗体で１００ｍｇの培養細胞溶解物から免疫沈降し、又基質としてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いて免疫複合体キナーゼ検定を行った。リン酸化された蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。実験は３回繰り返され、同様の結果を得た。