【手続補正書】
【提出日】平成18年5月12日(2006.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一部が欠失したＰＯＸ４遺伝子及び選択マーカー遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ４遺伝子を有するカンジダ・トロピカリス細胞であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端は、前記ＰＯＸ４遺伝子の異なる部分に対応する連続しないＤＮＡ配列に隣接しており、
前記一部が欠失したＰＯＸ４遺伝子が、機能ＰＯＸ４遺伝子の組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項６】
株Ｈ５３を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項７】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項８】
一部が欠失したＰＯＸ５遺伝子及び選択マーカー遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ５遺伝子を有するカンジダ・トロピカリス細胞であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端は、前記ＰＯＸ５遺伝子の異なる部分に対応する連続しないＤＮＡ配列に隣接しており、
前記一部が欠失したＰＯＸ５遺伝子が、機能ＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項９】
染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１０】
選択マーカー遺伝子がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１１】
株Ｈ５３を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１２】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項１３】
一部が欠失したＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子及び選択マーカー遺伝子で置換された、それぞれその染色体ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子を有するカンジダ・トロピカリス細胞であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端は、前記ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の異なる部分のそれぞれに対応する連続しないＤＮＡ配列に隣接しており、
前記一部が欠失したＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子のそれぞれが、機能ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１４】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項１３に記載のカンジダ
・トロピカリス細胞。
【請求項１７】
染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス
細胞。
【請求項１８】
選択マーカー遺伝子がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１９】
株Ｈ５３を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２０】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２１】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方である請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２３】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項２４】
選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するＰＯＸ４遺伝子の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端が、前記ＰＯＸ４遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列に隣接しており、
前記ＰＯＸ４遺伝子の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ４遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項２５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項２４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項２４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２７】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するＰＯＸ５遺伝子の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端が前記ＰＯＸ５遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列に隣接しており、
ＰＯＸ５遺伝子の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項３１】
宿主細胞が染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
選択マーカー遺伝子からなるＤＮＡ断片を有するＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子の両端が前記ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列に隣接しており、
ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項３５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項３４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項３４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３７】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
宿主細胞が染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項３８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項３８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４３】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項３８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の別の側面によれば、β−酸化経路の１以上の遺伝子の一部分を欠失させることによって、それらのβ酸化経路を有する形質転換酵母株を生産する方法を提供する。好ましくは、これらの株が、酵母ゲノムとの相同な組換えの後、宿主細胞における標的遺伝子の部分的な欠失をもたらすベクターで酵母宿主細胞を形質転換することによって生産される。より好ましくは、標的遺伝子がＰＯＸ４又はＰＯＸ５であり、ベクターが、それぞれ、ＰＯＸ４欠失破壊カセット又はＰＯＸ５欠失破壊カセットとして示される。ＰＯＸ４欠失破壊カセットは、ＰＯＸ４遺伝子の一部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ４遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む。ＰＯＸ５欠失破壊カセットは、ＰＯＸ５遺伝子の一部分に対して相同性を有するDNA断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ５遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するDNA断片とを含む。ＰＯＸ４欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ４遺伝子と選択マーカー遺伝子とで置換されたその染色体ＰＯＸ４遺伝子を有する。同様に、上述したＰＯＸ５欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ遺伝子と選択マーカー遺伝子とで置換されたその染色体ＰＯＸ５遺伝子を有する。