【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年8月17日(2006.8.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
（材料および方法）
以下の材料および方法を、実施例において使用した：
（１．プラスミド：）
ｐｃＤＮＡ３．１におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ発現プラスミドを、マウスｃ−ｍｙｂ発現プラスミドおよびＫＣＬ２２細胞由来のｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＦＵポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製し、ここで、ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインに特異的なプライマー（配列番号１３のヌクレオチド１９３〜５９４によってコードされ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を含む）およびＭＥＦのＡＭＬ１結合ドメインに特異的なプライマー（配列番号１２のヌクレオチド２５１〜６１８によってコードされ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含む）を使用した。ＰＣＲ産物を、ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１（ＧＦＰは、配列番号１１のヌクレオチド９１〜８１３に対応する）内に、読み取り方向にクローン化した。同様に、ＧＦＰ−ΔDＭ＆Ｍを、ｃ−ＭｙｂのＤＮＡ結合ドメインの最初の１５９塩基対を欠くＰＣＲフラグメントを使用して、クローン化した。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
（３．免疫ブロッティング：）
タンパク質溶解物を、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭまたはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍについての発現
ベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ細胞から調製した。３種のタンパク質を、モノクローナルマウスＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検出した。検出は、マウスＩｇＧに対するダイコンペルオキシダーゼ結合体化二次ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を介して行った。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
（５．クロマチン免疫沈降）
ＫＣＬ細胞をＦＬＡＧ  ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトした。トランスフェクトの１２時間後、１％ホルムアルデヒドを１０分間添加することにより、細胞のタンパク質を、ＤＮＡに結合させ、次いで、０．１２５Ｍのグリシンを添加することにより反応を停止させた。細胞を氷冷したＰＢＳで二度洗浄し、プロテアーゼインヒビター、２００μＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０μＭ  ＮａＦを含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液１ｍｌ中に溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、クロマチンを、紫外線（５秒間の９パルス）を使用することにより断片化した。細胞の破片を、遠心分離により除去し、５０μｌを入力コントロールとして保存した。残りの溶解物を、５μｇのウサギおよびマウスのＩｇＧを含むタンパク質Ａ／Ｇアガロース４０μｌ中に前精製した。各溶解物の残りを、二つのサンプルに分け、４０μｌのタンパク質Ａ／Ｇアガロースを含む３μｇの抗ＦＬＡＧまたはマウスＩｇＧのどちらかを用いて一晩免疫沈降を行った。この免疫複合体を、低塩濃度を含む緩衝液（０．１％  ＳＤＳ、１５０μＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２μＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０、２０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．１）中で八回洗浄した。次いで、免疫複合体および入力コントロール中のＤＮＡとタンパク質との間の結合を、再分解し、ＤＮＡをその溶液からフェノール／クロロホルム抽出した。その後、ｃ−キットプロモーター領域およびｐ１４ＡＲＦプロモーター領域に対する特異的なプロモーター配列を、ＰＣＲの手段によりそのサンプル中に検出した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
（ｐ１４ＡＲＦプロモーター領域に対するプライマー）
ｐ１４ＡＲＦフォーワード：５’−ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＧＣ−３’（配列番号７）
ｐ１４ＡＲＦリバース：５’−ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＣＣ−３’（配列番号８）
（ｃ−ｋｉｔプロモーター領域に対するプライマー）
ｃ−ｋｉｔフォーワード：５’−ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  Ａ−３’（配列番号９）
ｃ−ｋｉｔリバース：５’−ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣ−３’（配列番号１０）
（６．ルシフェラーゼ検出）
当該分野で公知の方法を使用してプロモーター活性を検出した（Ｍｕｌｌｅｒら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０巻、ｐｐ．３３１６−２９）。これは、全量１５．５μｇの、電気泳動によりトランスフェクトしたプラスミドを必要とする。混合物は、５μｇのｍｙｂ−ＴＫルシフェラーゼ構築物、内部標準化のための０．５μｇのＰＲＬ−ヌルプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および種々の組み合わせにおけるＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのための
５μｇの発現ベクターからなる。空ベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を、同時トランスフェクトし、トランスフェクトしたＤＮＡの総量を等しくした。１８時間後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、Ｐｒｏｍｅｇａのデュアルルシフェラーゼアッセイ系を使用して検出した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、トランスフェクト効率の内部標準のために使用した。平均値および標準偏差を三回の独立した実験から計算した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
（７．メチルセルロース中でのクローンの増殖）
３２Ｄｃ１３細胞およびＫａｓｕｍｉ細胞を、種々の組み合わせにおけるＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのための総量１５ｇの発現ベク
ターを用いて一時的に、トランスフェクトした。クローンの増殖を調べるために、トランスフェクトした細胞を、電気泳動の翌日に、勾配遠心分離により分離し、１ｍｌの培養混合物中で、３５ｍｍのプレートあたり１×１０５個の生存細胞の濃度で播種した。この混合物は、Ｉｓｏｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）、１％  メチルセルロース、２０％  ＦＣＳ、ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）および０．６ｍｇ／ｄｌ  Ｇ４１８からなる。全ての実験を、三連で始め、そのコロニーを、１０日目で計数した。平均値および標準偏差を、三回の独立した実験から計算した（Ｋａｓｕｍｉ細胞に対しては、二回の実験）。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
（８．アポトーシスアッセイ）
３２Ｄｃ１３細胞を、種々の組み合わせにおけるＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭ
Ｌ１−ＥＴＯのための発現ベクターを用いて一時的に、トランスフェクトした。２４時間後、ＧＦＰポジティブ細胞を、フローサイトメトリーにより全ての細胞から選別し、さらに研究した。ＧＦＰポジティブ細胞の中でアポトーシス細胞の割合を、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎからのＡＰＯ−ＢｒｄＵキット）を使用して定量した。その実験は、製造者の指示書に従って実施した。これらの類似した結果を伴った三回の独立した実験の内の一回の結果を示す。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
ＭＥＦ（脊髄様ＥＬＦ因子）のＡＭＬ１結合ドメインを、キメラタンパク質の二番目の部分として使用した。ＭＥＦのアミノ酸８７〜２０６は、インビボおよびインビトロで、ＡＭＬ１およびＡＭＬ１−ＥＴＯに強く結合する（Ｍａｏ  Ｓ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９巻、ｐｐ．３６３５−４４）。三つ全てのドメインを、読み取り方向に、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。この構築物を、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍと称した（図１ｂ）。ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインの最初の５３アミノ酸を欠如する欠失変異体を、コントロール目的で調製した。欠失変異体を、ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍと称した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
組替えタンパク質の発現を、Ｃｏｓ７細胞中の一時的なトランスフェクション後に、抗ＧＦＰ抗体を使用するイムノブロッティング検出方法を用いて分析した（ＧＦＰのみ  ３５ｋＤａ、ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍ  ８０ｋＤａ；ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ  ８５ｋＤａ、図１ｃ）。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
ＡＭＬ１−ＥＴＯ陽性細胞におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの効果およびそのアポトーシスに対する影響を調査する目的で、ＤＮＡ鎖破壊の存在を、ＴＵＮＥＬアッセイによって調査した。３２Ｄ細胞を、ＧＦＰ、ＡＭＬ１−ＥＴＯまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍで、あるいはＡＭＬ１−ＥＴＯとＧＦＰ−Ｍ＆Ｍとの組み合わせで、トランスフェクトした。２４時間後、ＧＦＰ、ＡＭＬ１−ＥＴＯまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ単独を発現する細胞の約１０％が、アポトーシスを起こした。これに対して、ＡＭＬ１−ＥＴＯとＧＦＰ−Ｍ＆Ｍとの両方を発現する細胞の間でのアポトーシス細胞の百分率は、３９％であった。このことは、アポトーシス割合の４倍の増加に対応する（図６ａおよびｂ）。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７４】
（実施例７  ＭＹＢ依存性プロモーターは、ＡＭＬ１−ＥＴＯなしの細胞中で、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによってインビボで抑制されない）
ＧＦＰ−Ｍ＆ＭがＡＭＬ１−ＥＴＯの非存在下でＭＹＢ依存性プロモーターをインビボで抑制しないことを示す目的で、初代マウス骨髄細胞を、ＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでのレトロウイルス形質導入に供した。これにより、ＫＩＴの発現（図７）およびＧＦＰ陽性細胞のアポトーシス割合における有意な差異は生じなかった。このことは、本発明の化合物が、健常な細胞におけるＭＹＢ依存性プロモーターの転写の特異的抑制を誘導しないことを示す。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
【図１Ａ】ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインおよびＭＥＦのＡＭＬ１結合ドメインからなるキメラタンパク質の機能の仮説。
【図１Ｂ】ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。欠損変異体のキメラタンパク質の構造。
【図１Ｃ】ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。細胞にＧＦＰ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍを用いて細胞を形質転換した後の、抗ＧＦＰ抗体を使用した、Ｃｏｓ７細胞溶解物からの免疫ブロッティング検出。
【図２】インビトロの、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのｍｙｂ結合部位に対する特異的結合およびＡＭＬ１−ＥＴＯの結合。ｃ−ｍｙｂ  ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯでトランスフェクとさせたＣｏｓ７の細胞核抽出物を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において分析した。特異的ｍｙｂおよび非特異的オリゴヌクレオチドを用いた競合実験は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ結合の特異性を示す。ＧＦＰ−Ｍ＆ＭのＡＭＬ１−ＥＴＯとの同時トランスフェクションによって産生されるＭ＆Ｍのスーパーシフトは、ＡＭＬ１−ＥＴＯのｍｙｂ結合部位に対する異常局在化を示す。
【図３】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによる、ＡＭＬ１−ＥＴＯの内在性ｃ−ｋｉｔプロモーターに対する結合。ＫＣＬ２２細胞を、ＦＬＡＧ−ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトし、ＤＮＡ結合タンパク質を、ホルムアルデヒドを用いてＤＮＡに強く結合させ、細胞を溶解し、そしてＤＮＡを断片化して抗ＦＬＡＧ抗体または非特異的抗体により免疫沈降させた。ＰＣＲを使用し、免疫沈降させたクロマチンにおいてｃ−ｋｉｔおよびｐ１４ＡＲＦのプロモーター配列を検出した。１つの代表的な実験を示す。
【図４】ＡＭＬ１−ＥＴＯの存在下における、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによるｍｙｂ依存性プロモーターの特異的抑制。ＫＣＬ２２細胞を、ｍｙｂ依存性ルシフェラーゼ構築物およびｃ−ｍｙｂ、ＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ（示す）で一時的にトランスフェクトさせた。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。
【図５Ａ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。３２Ｄ細胞を、ＧＦＰ（コントロールとして）またはＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ（示す）でトランスフェクトし、そして１×１０５個の細胞を、コロニー検出方法のために播種した。写真は、１０日目の代表的なコロニーを示す。
【図５Ｂ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。３２Ｄ細胞を、示したようにトランスフェクトし、そしてコロニー検出方法のために播種した。コロニーを、１０日目に計数した。ＧＦＰによるコントロールトランスフェクション（＝１に設定）と比較したコロニー増殖の抑制を、ここに図示する。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。
【図５Ｃ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。ＡＭＬ１−ＥＴＯを、単独またはＧＦＰ−Ｍ＆ＭもしくはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍと組み合わせて３２Ｄ細胞内にトランスフェクトし、次いでコロニー検出方法のために播種した。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。
【図５Ｄ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍを、天然にＡＭＬ１−ＥＴＯを発現するＫａｓｕｍｉ−１細胞内にトランスフェクトし、次いでコロニー検出方法のために播種した。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。
【図６Ａ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞においてアポトーシスを誘導する。３２Ｄ細胞を、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍまたは両方のベクターでトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトした細胞を、フローサイトメトリで選別した。トランスフェクトした細胞を、次いで、ＴＵＮＥＬ検出方法で分析した。ＢｒｄＵ陽性アポトーシス細胞についてのＦＡＣＳ結果を表示する。影をつけていない曲線は、コントロール目的で、空ベクターでトランスフェクトした細胞のアポトーシス率を表す。
【図６Ｂ】ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞においてアポトーシスを誘導する。３２Ｄ細胞を、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍまたは両方のベクターでトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトした細胞を、フローサイトメトリで選別した。トランスフェクトした細胞を、次いで、ＴＵＮＥＬ検出方法で分析した。トランスフェクトした３２Ｄ細胞におけるアポトーシス細胞の割合を表示する。
【図７】ＡＭＬ１−ＥＴＯを有さない細胞において、ＭＹＢ依存性プロモーターは、インビボでＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによって抑制されない。一次マウス骨髄細胞を、ＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍで形質導入した。その後、ＧＦＰ陽性細胞におけるＫＩＴの発現を、分析した。２回の実験のうち１回の結果を示す。