【手続補正書】
【提出日】平成18年1月23日(2006.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の既定の機能性を有する少なくとも１つの化合物を産生する細胞を進化させる方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を各々有し該異種性配列の少なくとも１つがその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含む細胞組成物を提供する、ここで該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含み、それら細胞は産生細胞と称される、
ｂ）該機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについて該細胞集団の１度のスクリーニングを行い、各パラメーターについて選択基準を決定する、
ｃ）少なくとも１つの既定の選択基準を満たす細胞を選択する、
ｄ）選択された細胞の発現可能ヌクレオチド配列を、互いに、および／または、別の細胞組成物由来の発現可能ヌクレオチド配列と組み合わせ、それにより少なくとも１つの新規細胞組成物を得る、ここで該新規細胞組成物は、少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を有し該異種性配列の少なくとも１つがその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含有する、
ｅ）少なくとも１つの細胞が少なくとも２つの既定の機能性を有する化合物を獲得するまで、工程ｂ）からｄ）を繰り返す。
【請求項２】
該化合物が該産生細胞内に含まれる、または該産生細胞から分泌される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ）が２以上のパラメーターの既定の選択基準を満たす細胞を選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのパラメーターが望ましい薬理学的性質に関するパラメーターであり、別のパラメーターが望ましくない薬理学的性質に関するパラメーターである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのパラメーターが薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのパラメーターが薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターであり、少なくとも１つの更なるパラメーターがＡＤＭＥ特性に関するパラメーターである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターが、リガンドである薬理学的標的との相互作用または非相互作用である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターが、酵素である薬理学的標的との相互作用または非相互作用である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターが、受容体である薬理学的標的との相互作用または非相互作用である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターが、標的遺伝子のプロモーター配列との相互作用、または転写因子との相互作用もしくは相互作用不能である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１１】
薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターが、レポーター細胞の成長の阻害または刺激である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１２】
レポーター細胞が、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、藻類、植物、無脊椎動物、脊椎動物、哺乳類細胞、病原性微生物、農業害虫、細胞内病原体に感染した細胞、ウィルス感染細胞、および腫瘍細胞よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
レポーター細胞が、細菌、真菌、原生動物、藻類、植物、無脊椎動物、昆虫、緩歩動物、寄生虫、または農業害虫の生存生物そのものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該産生細胞が少なくとも１つの薬物代謝酵素を産生するよう形質転換されている、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
薬物代謝酵素が、シトクロムＰ４５０、フラビン・モノオキシゲナーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、およびＮ−アセチル・トランスフェラーゼから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物代謝酵素が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ１８およびそれらの対立遺伝子変異体よりなる群から選択されるシトクロムＰ４５０である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
薬物代謝酵素が、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ２Ｂ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１０、ＵＧＴ２Ｂ１１、およびＵＧＴ２Ｂ１５よりなる群から選択されるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
薬物代謝酵素が異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する産生細胞の外部またはレポーター細胞内部に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの薬物代謝酵素が異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する産生細胞の外部に存在し、および少なくとも１つが該細胞の内部に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２つの相異なる薬物代謝酵素が使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
１つの機能性が、化合物がヒト細胞を含む哺乳類細胞によって取り込まれる能力である、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
１つの機能性が毒性である、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
毒性が細胞増殖アッセイを用いてスクリーニングされる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
１つの機能性が変異原性である、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
１つの機能性が催奇形性である、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
２以上の機能性が同じ標的に関する、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
２以上の機能性に関する少なくとも６つのパラメーターについて少なくとも１度のスクリーニングを行うことを含む、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
選択基準の強さが少なくとも何回か繰り返す間に増強される、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
選択基準のタイプが少なくとも何回か繰り返す間に変更される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
初期のスクリーニング・ラウンドにおける２以上の機能性に関する１つのパラメーターが一般的なパラメーターであり、後期のスクリーニング・ラウンドにおける機能性に関する１つのパラメーターがより特異的なパラメーターである、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
同時にスクリーニングされるパラメーターの数がスクリーニング・ラウンドの数とともに増加する、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１度のスクリーニングが培地に基づくスクリーニングである、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの選択基準が、生存、優れた成長、異常な形態、粘性、スペクトル特性、または酵素活性の調節に基づく選択である、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの選択基準が、少なくとも１つの物理的基準から選択され、生存、優れた成長、異常な形態、粘性、スペクトル特性、酵素活性の調節、受容体の活性化、または受容体への活性化分子の結合の阻害に基づき細胞が選択されることになる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの選択基準が、ある物質を漸増する濃度で含有する培地において培養した場合の、被改変細胞の生存能力と比較した、細胞の生存能力である、請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
２以上の機能性が、非天然代謝物の産生に関する、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
蛍光分析機を使用することを含む、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）によって行われる、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ソーティングが、産生細胞にとって天然または異種性の細胞内レポーターシステムからのシグナルに基づく、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも２つの選択基準がＦＡＣＳによって選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、他の生物の存在下における生存を用いて行われる、請求項１から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、所望の応答を示した場合に細胞の生存に不可欠な化合物を産生するレポーター遺伝子の発現が成長に必要である培地において、成長優位性を有することによって行われる、請求項１から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
選択がいずれかの選択方法を任意の順序で使用することを含む、請求項３３から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
選択が選択方法のいずれかの組み合わせを含む、請求項３３から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
産生細胞がレポーターシステムを含むスクリーニングユニットに閉じ込められている、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
産生細胞が、アガロース、多糖体、炭水化物、アルギン酸塩、カラゲナン、キトサン、セルロース、ペクチン、デキストランまたはポリアクリルアミドを含むゲル液滴に閉じ込められている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
産生細胞が、スクリーニングされる化合物に対して基本的に非透過性である層に閉じ込められている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
非透過性物質が脂肪性物質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
産生細胞が、ＦＡＣＳによるソーティングの前にレポーターシステムを含むゲル液滴に封入される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
産生細胞およびレポーターシステムがゲル液滴の１つの層に封入される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
１つの層が産生細胞および１以上のレポーターシステムを含み、第二の層が１以上の異なるレポーターシステムを含み、任意で第三または第四または更なる層が１以上のレポーターシステムを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
産生細胞がゲル液滴の１つの層に封入されており、少なくとも１つのレポーターシステムが同じゲル液滴の別の層に封入されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、レポーターシステムおよび陽性細胞の手動または自動採取を含むオーバーレイ・アッセイによって行われる、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、レポーターシステムを含むマイクロタイタープレートの１つのウェルに単一クローン化産生細胞株を配置し、陽性細胞を手動または自動で採取することによって行われる、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
レポーターシステムが、レポーター細胞にとって天然である、またはレポーター細胞にとって異種性である細胞基盤レポーターシステムである、請求項４５から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
レポーターシステムが無細胞レポーターシステムである、請求項４５から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、細胞を培地上に播き、陽性細胞を手動または自動で採取することによって行われる、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
細胞組成物が、少なくとも１０３の遺伝学的に相異なる細胞を含む、請求項１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
細胞組成物が１つの種に由来する細胞を集めたものを含む、請求項１から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１つの産生細胞が、少なくとも１０の相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６１】
いずれかの細胞が相異なる発現状態に由来する発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
実質的に全ての異種性発現可能ヌクレオチド配列が１以上の人工染色体上に位置する、請求項１から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
細胞組成物が少なくとも１つの細胞を含み、その少なくとも１つの細胞が以下のものを含む、請求項１から６２のいずれかに記載の方法：
以下の式で示される少なくとも２つの発現カセット：
［ｒｓ２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ１］
（ここで、
ｒｓ１およびｒｓ２は共に制限酵素部位を意味し、
ＳＰはそれぞれスペーサーを意味し、
ＰＲはその少なくとも１つの細胞において機能する能力のあるプロモーターを意味し、
Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を意味し、
ＴＲはターミネーターを意味する）。
【請求項６４】
少なくとも２つの発現可能ヌクレオチド配列が、それぞれ遺伝子および完全長ｃＤＮＡ配列よりなる群から選択される、請求項１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
組成物の少なくとも１つの細胞が、独立したオリゴヌクレオチド・カセットの鎖状体を少なくとも１つ含み、各鎖状体が以下の５’→３’方向の式で示されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から６４のいずれかに記載の方法：
［ｒｓ２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ１］ｎ
（ここで、
ｒｓ１およびｒｓ２は共に制限酵素部位を意味し、
ＳＰはそれぞれ少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを意味し、
ＰＲはその少なくとも１つの細胞において機能する能力のあるプロモーターを意味し、
Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を意味し、
ＴＲはターミネーターを意味し、
ｎ≧２であり、および
少なくとも２つの発現可能ヌクレオチド配列は相異なる発現状態に由来する）。
【請求項６６】
少なくとも２つの相異なる発現状態が、少なくとも２つの相異なる組織、器官、種、または属を表す、請求項６１または６５に記載の方法。
【請求項６７】
いずれかの産生細胞が少なくとも１０の種に由来する発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項６１または６５に記載の方法。
【請求項６８】
２つの相異なる種が、少なくとも２つの相異なる門、網、部門、亜界、または界に由来する、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
実質的に全てのｒｓ１−ｒｓ２配列が同じ制限酵素によって認識される、または実質的に全てのｒｓ１−ｒｓ２配列が実質的に同一である、請求項６３または６５に記載の方法。
【請求項７０】
ｎが少なくとも１０である、請求項６３または６５に記載の方法。
【請求項７１】
産生細胞が、大腸菌、バシラス スブティリス、ストレプトミセス リビダンス、ストレプトミセス コエリカラー、シュードモナス アエルギノサ、およびミクソコッカス キサンタスよりなる群から選択される原核細胞である、請求項１から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
産生細胞が、酵母、繊維状子嚢菌、植物細胞、および哺乳類宿主細胞よりなる群から選択される真核細胞である、請求項１から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも１つの鎖状体のヌクレオチド配列が、該鎖状体における反復配列のレベルを最小限にするように設計されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
該別の細胞組成物が、細胞に少なくとも１つの機能性を与える可能性が高い発現可能ヌクレオチド配列を含有する細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７５】
該別の細胞組成物が事前に第三の機能性についてスクリーニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項７６】
該別の細胞組成物が、所望の機能性のうち少なくとも１つを有する化合物を産生することが知られている発現状態に由来する異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７７】
該別の細胞組成物が、該選択された細胞組成物における異種性発現可能ヌクレオチド配列と同様の酵素活性をコードする異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７８】
該別の細胞組成物が、少なくとも１つの既定のタンパク質／酵素を発現する、または少なくとも１つの既定の化合物または物質を合成する能力がある細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７９】
該別の細胞組成物がランダムに選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８０】
該別の細胞組成物が該選択された細胞組成物と同一であり、および選択された発現可能ヌクレオチド配列の新規組み合わせを得るため発現可能ヌクレオチド配列が混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項８１】
発現可能配列の組み合わせが該細胞における人工染色体の組み合わせである、請求項１から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
染色体の組み合わせが細胞間の有性交配によって得られる、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
実質的に全ての異種性発現可能ヌクレオチド配列が１以上の人工染色体上に位置する、請求項１から８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
異種性発現可能配列の組み合わせが、少なくとも２つの相異なる細胞から異種性発現可能配列を単離し、個々の異種性発現可能配列を組み合わせて新規組み合わせとし、そしてその組み合わせた異種性発現可能配列を細胞に導入して、相異なる組み合わせを有する少なくとも２つの細胞を含む細胞を得ることにより実施される、請求項１から８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
異種性発現可能ヌクレオチド配列の組み合わせが、発現カセットをＰＣＲにより増幅し、増幅した発現コンストラクトを混合し、個々の発現可能ヌクレオチド配列を組み合わせて新規組み合わせとし、そして組み合わせた異種性発現可能ヌクレオチド配列を細胞へ導入して、相異なる組み合わせを有する少なくとも２つの細胞を含む細胞を得ることにより実施される、請求項１から８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
組成物が亜組成物を集めたものである、請求項１から８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
亜組成物が、少なくとも１つの表現型を共通に有する個々の細胞を集めたものである、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
各亜組成物が少なくとも１０の遺伝学的に相異なる細胞を含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
２以上の異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む産生細胞および少なくとも２つのレポーターシステムを含むスクリーニングシステムであって、各レポーターシステムが該細胞によって産生される１つの化合物の１つの機能性に関する１つのパラメーターに対するものであるスクリーニングシステム。
【請求項９０】
少なくとも２つのレポーターシステムと一緒にゲル液滴に封入された産生細胞を含む、請求項８９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９１】
少なくとも２つのレポーターシステムを含む液体環境中に産生細胞を含む、請求項８９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９２】
少なくとも１つのレポーターシステムが産生細胞内部に存在する、請求項８９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９３】
少なくとも１つのレポーターシステムが細胞基盤または無細胞の細胞外レポーターシステムである、請求項８９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９４】
請求項１から８８のいずれかに記載の方法に使用するのに適合している、請求項８９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９５】
少なくとも２つの既定の機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについての産生細胞組成物のスクリーニングを含むリード化合物の生成方法であって、該細胞組成物が、少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を各々有し少なくとも１つの該異種性配列がその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項９６】
リード化合物が薬物リード化合物であり、少なくとも１つのパラメーターが吸収、分布、代謝、排泄または毒性に関し、および少なくとも１つの更なるパラメーターが薬理学的標的に対する活性に関する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
スクリーニングが請求項１から７３のいずれかによって規定される、請求項９５または９６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
発現状態
発現状態は、個々の生物の特定の組織におけるある時点での状態である。遺伝子発現の変化をもたらすどのような状態変化も、違った発現状態をもたらす。相異なる発現状態は、相異なる個体、相異なる種において見られるが、同じ種または個体における相異なる器官においても見られる場合がある。相異なる発現状態は、年齢、疾患、感染、干ばつ、湿度、塩度、生体異物への暴露、生理学的エフェクター、温度、圧力、ｐＨ、光、ガス環境、毒素のような化学物質における変化など（但しこれらに限定されない）の相異なる環境条件に、その組織または器官を暴露することにより、１つの種または個体における同じ器官においても得られる場合がある。