【手続補正書】
【提出日】平成17年9月6日(2005.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ポリカチオン性コンデンス試薬でコンデンスされ25mMより小さいイオン強度の水性媒体に懸濁された、コンデンスされたプラスミド分子、および
ジアシル鎖カチオン性小胞形成脂質、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-[1-(2,3,-ジテトラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)またはN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含むカチオン性リポソームを含み、
該複合体は5nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより大きく25nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより小さい、プラスミドに対するリポソーム脂質の割合を持ち、200nmより小さい均一な大きさを持つ、
プラスミドに含まれる遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、プラスミド−リポソーム複合体の組成物。
【請求項２】  コンデンスされたプラスミド分子が、嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、第VIII因子、インターロイキン-2またはp53をコードしている遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含む、DNAプラスミド分子である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】  コンデンス試薬が、ヒストン、ポリ-1-グルタミン、プロタミン、メリチンおよびポリミキシンBを含む群から選択されるポリカチオンである、請求項1記載の組成物。
【請求項４】  コンデンス試薬が、全ヒストン、ヒストン1およびヒストン4から選択されるヒストンである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】  プラスミドに対するリポソーム脂質の率が8-18nモルリポソーム脂質/μgプラスミドの間である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】  低イオン強度水性媒体が非イオン性の浸透圧性溶質から調製される、請求項1記載の組成物。
【請求項７】  該溶質がグルコース、スクロースおよびデキストランを含む群から選択される、請求項6記載の組成物。
【請求項８】  カチオン性リポソームが、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)、1,2-ジオレリルオキシ-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP)、N-[1-(2,3,-ジテトラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、および3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)から選択される、カチオン性の小胞形成脂質から構成される、請求項1記載の組成物。
【請求項９】  カチオン性リポソームが中性の小胞形成脂質をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】  カチオン性リポソームがコレステロールをさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】  カチオン性リポソームが、そのような親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質を含むことにより親水性ポリマー鎖の表面被覆を持つ、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】  少なくとも親水性ポリマーの一部が、存在するまたは誘導される生理的状態に応答して親水性ポリマー鎖を放出するために有効な結合によって、小胞形成脂質に結合されている、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】  プラスミド-リポソーム複合体が、標的細胞表面上のレセプター分子へのリガンド-特異的結合のための、親水性ポリマー鎖の遠位の端に結合されているリガンドをさらに含む、請求項11または請求項12記載の組成物。
【請求項１４】  親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項11または請求項12記載の組成物。
【請求項１５】  嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項1から12のいずれかに記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【請求項１６】  インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで対象中の腫瘍中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項1から12のいずれかに記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【請求項１７】  プラスミド分子をコンデンスするためのコンデンス試薬として、ヒストン、ポリ-1-グルタミン、プロタミン、メリチンまたはポリミキシンBを含む群から選択されるポリカチオンを選択すること、
該コンデンスされたプラスミド分子を懸濁するための媒体として、25mMより小さいイオン強度の水性媒体を選択すること、および
5nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより大きく25nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより小さい、プラスミドに対するリポソーム脂質の割合を選択すること、の段階を含み、
そのプラスミド-リポソーム複合体が、200nmより小さい大きさの点で均一である、
プラスミド分子をコンデンスし、コンデンスされたプラスミドと、ジアシル鎖カチオン性小胞形成脂質、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-[1-(2,3,-ジテトラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)またはN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を含むカチオン性リポソームの懸濁を混合することによって、宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するためのプラスミド-リポソーム複合体を形成させる、プラスミド-リポソーム複合体を調製する方法。
【請求項１８】  該コンデンス試薬が、全ヒストン、ヒストン1およびヒストン4を含む群から選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】  プラスミドに対する該リポソーム脂質の割合が、8-18nモルリポソーム脂質/μgプラスミドの間である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】  該低イオン強度水性媒体が、非イオン性の浸透圧性溶質から調製される、請求項17記載の方法。
【請求項２１】  該溶質がグルコース、スクロースおよびデキストランを含む群から選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】  そのカチオン性リポソームが、コレステロールおよびDDABから調製される、請求項17記載の方法。
【請求項２３】  該カチオン性リポソームが、親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質を含むことにより、親水性ポリマー鎖の表面被覆を持つ、請求項17記載の方法。
【請求項２４】  第VIII因子、インターロイキン-2またはp53をコードしている遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含むDNAプラスミドで、宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項17にしたがって調製される、プラスミド-リポソーム複合体。
【請求項２５】  嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項17にしたがって調製される、プラスミド-リポソーム複合体。
【請求項２６】  嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項13に記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【請求項２７】  嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項14に記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【請求項２８】  インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで対象中の腫瘍中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項13に記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【請求項２９】  インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択されるDNAプラスミドで対象中の腫瘍中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するための、請求項14に記載のプラスミド-リポソーム複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
ある態様では、コンデンスされたプラスミド分子は、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、第VIII因子、インターロイキン-2またはp53をコードしている遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含むDNAプラスミド分子である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
なおさらなる態様において、そのような親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質を含むことにより、カチオン性リポソームは、親水性ポリマー鎖の表面被覆を持つ。ある態様において少なくとも親水性ポリマー鎖の一部は、例えば存在するまたは誘導される生理的な状態に応答して親水性ポリマー鎖を放出するのに有効な結合のような解放可能な結合により、小胞形成脂質に結合されている。プラスミド-リポソーム複合体は、標的細胞表面上のレセプター分子へのリガンド-特異的結合のための、親水性ポリマー鎖の遠位の末端に結合されたリガンドをさらに含むことができる。例えば、そして好ましい態様では、親水性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
好ましい態様において、プラスミド-リポソーム複合体は、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、または肺癌患者のためには、インターロイキン-2のようなサイトカイン、またはp53のような癌抑制遺伝子を含むDNAプラスミドで、処置対象の肺の中の宿主細胞をトランスフェクトすることに使用するためのものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
図5は、本発明のプラスミド-リポソーム複合体に関し、4Cにおける貯蔵時間の関数としての、動的光散乱により測定されるようなnmにおける、粒子直径のプロットである。
図6は、本発明の標識されたプラスミド-リポソーム複合体の、マウスにおける静脈内注射の後の時間の関数としての、注射された用量のパーセントのプロットである。
図7A-7Eは、全ヒストンで調製されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、肺(図7A)、肝臓(図7B)、心臓(図7C)、脾臓(図7D)および腎臓(図7E)における、相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図11A-11Bは、4℃で貯蔵されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、日における時間の関数としての、肺(図11A)および肝臓(図11B)における、ルシフェラーゼの発現を示す。
図12はルシフェラーゼを運ぶプラスミドのマイクログラムの関数としての、マウスにおけるプラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の２４時間後の、pg/mgタンパク質における、様々な組織におけるルシフェラーゼを示す。
図13は、プラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の24時間後の、様々な組織における、RLU/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの活性を表す；
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
リポソームの残りは、正味電荷をもたないか、または頭部極性基に負の電荷を持つ脂質を小さい割合で含み得る小胞形成脂質を意味する、中性の小胞形成脂質から形成される。この脂質のクラスには、フォスファチジルコリン(PC)、フォスファチジルエタノールアミン(PE)、フォスファチジルイノシトール(PI)およびスフィンゴミエリン(SM) のようなリン脂質およびコレステロール、コレステロール誘導体およびその他の荷電していないステロールが含まれる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
プラスミドをコンデンスするために使用されるポリカチオン性のコンデンス試薬は、スペルミジン、スペルミン、ポリリジン、プロタミン、全ヒストン、H1、H2、H3、H4のような特異的ヒストン分画、および他のポリカチオン性ポリペプチドのような典型的にはバイオポリマーである、多重に荷電したカチオン性ポリマーであるが、ポリミキシンBのような生物学的適合性のポリマーをも含み得る。これらのポリカチオン性コンデンス試薬は、遊離塩基、または例えば硫酸プロタミンおよび臭化水素酸ポリリジンのような塩の形態で使用されることができることが認識される。このましい態様において、ポリカチオン性コンデンス試薬は、ここで言及されるように全ヒストンまたは特異的ヒストン分画を含むヒストンである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
図1は、実施例1に記載されたように調製された、全ヒストンでコンデンスされたルシフェラーゼをコードしているpNSLプラスミドのネガティブ染色した透過型電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である。プラスミドは別々にコンデンスされており、直径約100nmおよびそれより小さい単一粒子である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
前記で簡単に記載されたように、プラスミド-リポソーム複合体は安定的であり、すなわち、例えば4℃での貯蔵の少なくとも30日後まで、複合体の集合はほとんどなく、複合体は治療上の活性を保持するように、複合体は当初のサイズを保持する。図5は、時間の関数として、動的光散乱によって測定されるような、複合体サイズの安定性の証拠を提供し、複合体のサイズを示す。水/グルコースにおけるプラスミド/リポソーム複合体の懸濁は、4℃で貯蔵され、７、１４、２１、２８、６０および９０日の貯蔵の後分析される。複合体の形成の後、最初は平均複合体サイズは150nmであり、90日の貯蔵の後には、複合体は約150nmのままであった。治療上の活性の保持に関して、複合体の安定性は以下に図11A-11Bにおいて記載される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
表1は、ポリカチオン性コンデンス試薬として全ヒストンを使用して調製されたプラスミド-リポソーム複合体の組成物について概要を述べる。全ヒストンの量は、100-500μgの間で変化させ、プラスミド/全ヒストンの割合を0.2-1.0に変化させた。リポソーム脂質/プラスミドの割合も変化させ、８、１４および１８nモルリポソーム脂質/μgプラスミドの割合がテストされた。
【表１】
2002525270.tif 000001
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
図14Cは、pCMVIL2プラスミドを含む複合体で、50μgプラスミドDNA(逆黒三角）および75μgプラスミドDNA(白四角)によって投与され、処置された動物に関する結果を示している。図示のように処置期間の終わりに、約15-20％の間の動物が生存したが、一方、処置されないままの(生食水コントロール、黒四角)のすべての動物は24日までに死亡した。同様にルシフェラーゼをコードするpNSLプラスミド(白丸)を含む複合体で処置された動物は31日までに死亡した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
B.腫瘍接種
80匹のB6C3-F1オスのマウスを、Taconic Farms(German Town,NY)より得、実験の開始に先立ち3日間馴化させておいた。適当な隔離されたケージングに、自由に摂取できる無菌げっ歯類飼料および酸性化された水および12:12の光:暗黒サイクルで、動物を収容した。動物を腫瘍の接種に先立ち、体重に基づき処置群に無作為化した。動物を腫瘍の接種に先立ち、処置群に無作為化した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
すべての動物を一般的な健康に関して毎日観察した。動物を腫瘍細胞の接種に先立ち、およびその後は週に2回体重を測定した。開始時の体重から15％またはそれ以上体重が減少したと観察された動物、または苦痛のある任意の動物を安楽死し、肺、肝臓および脾臓における転移病巣の存在およびサイズについて調査した。