【手続補正書】
【提出日】平成17年11月29日(2005.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質Ｘの特性を改変するように進化させる方法であって、
ａ）タンパク質Ｘをコードする遺伝子を含む核酸で［タンパク質Ｙ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［タンパク質Ｙ＊：：タンパク質Ｘ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性をもつＸの近縁分類に属するタンパク質であり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞を突然変異誘発物質に暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記前変異原ヌクレオシド類似体の作用により改変したタンパク質Ｘがタンパク質Ｙの欠損を相補している細胞を選択する段階を含む前記方法。
【請求項２】
タンパク質ＸがＥＣ分類２．７．１．に属するキナーゼ、ＥＣ分類２．７．７．に属するヌクレオチジルトランスフェラーゼ、特にポリメラーゼ及びＥＣ分類２．４．２．に属するホスホリラーゼから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質Ｘがそれ自体の遺伝子に突然変異を導入する前変異原ヌクレオシド類似体を活性化できることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
キナーゼＸの特性を改変するように進化させる方法であって、
ａ）キナーゼＸをコードする遺伝子を含む核酸で［キナーゼＹ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［キナーゼＹ＊：：キナーゼＸ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性を示すＸの近縁分類に属するキナーゼであり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類２．７．１．に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞をキナーゼＸによりリン酸化することが可能な前変異原ヌクレオシド類似体に所与時間暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記変異原物質の作用により改変したキナーゼＸがキナーゼＹの欠損を相補している細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が原核又は真核細胞、好ましくは大腸菌であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質がヌクレオシドとその類似体から選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キナーゼＸがＥＣ分類２．７．１．７４に属するデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）であることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
キナーゼＹがＥＣ分類２．７．１．２１に属するチミジンキナーゼ（ＴＤＫ）であることを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）段階ａ）で得られた細胞を、
−前変異原ヌクレオシド類似体とチミジル酸シンターゼによるチミジル酸合成を阻止するトリメトプリムから選択される突然変異誘発物質と、
−前記細胞の生存に必要なチミジン
を含む培地で培養して大腸菌Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｐ：：ｄｃｋＨ＋を得る段階と、
ｂ）段階ｂ）後に生存しており、前記前変異原類似体の作用により改変したＤＣＫＨがＴＤＫの欠損を相補している細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
キナーゼＸがデオキシシチジンキナーゼ、好ましくはＧＥＮＢＡＮＫに登録番号Ｍ６０５２７で登録されている配列をもつヒトＤＣＫ１であり、突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加えることを特徴とする請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により獲得可能な突然変異タンパク質Ｘであって、元のタンパク質Ｘよりも拡張した活性をもつことを特徴とする前記突然変異タンパク質Ｘ。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により獲得可能な突然変異キナーゼＸであって、元のキナーゼＸよりも拡張した活性をもつことを特徴とする前記突然変異キナーゼＸ。
【請求項１３】
ＧＥＮＢＡＮＫに登録番号Ｍ６０５２７で登録されている配列をもつヒトＤＣＫ１に突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加えたことを特徴とする請求項１２に記載のキナーゼ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキナーゼのコーディング配列を含む核酸。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキナーゼのコーディング配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
前記配列が真核及び／又は原核細胞で有効なプロモーターに融合していることを特徴とする請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
大腸菌で形質転換し、維持することが可能なプラスミドであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記前変異原類似体を活性化するための請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２０】
超突然変異誘発方法における請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２１】
酵素リン酸化に自然耐性のヌクレオシドを夫々の５’リン酸誘導体に変換するための請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２２】
前変異原による突然変異誘発範囲をｉｎ  ｖｉｖｏ拡張するための請求項１２又は１３に記載のキナーゼと他の酵素（例えばＡＭＫ及び／又はトランスデオキシリボシラーゼ（ＮＴＤ））の併用。
【請求項２３】
ＤＮＡにヌクレオシド類似体を取込ませるための遺伝子治療用医薬の製造における請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２４】
細胞内の所定ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発方法であって、
−少なくとも１種のＤＮＡに前変異原ヌクレオチドを挿入させる酵素系を発現する細胞を使用して少なくとも１種の前変異原ヌクレオシドを前記ＤＮＡ配列に挿入することにより突然変異を行う段階と、
−突然変異配列の存在を検出する段階を含み、酵素系が請求項１２又は１３に記載のキナーゼを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２５】
細胞から発現される特定タンパク質を進化させるための方法であって、細胞の生存に必要な前記特定タンパク質の類縁タンパク質をコードする遺伝子を不活化させ、前記特定タンパク質をコードする遺伝子の突然変異後に相補を検出することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記特定タンパク質と前記類縁タンパク質が４桁番号によるＥＣ国際命名法の少なくとも上３桁が共通の近縁分類に属する酵素であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質がそれ自体の遺伝子を進化させることができる特性をもつことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６３１で寄託されたＤ１３３Ｅ突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１５１。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６３０で寄託されたヒトＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１３４。
【請求項３０】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６５０で寄託されたＤ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑ二重突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７３３８。