【手続補正書】
【提出日】平成17年4月26日(2005.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
RT-PCR分析に全血を使用した場合に遭遇する難点の1つは、RNA抽出の前に起こる細胞溶解である。血漿や赤血球には大量のタンパク質が存在するので、全血からRNAを単離する方法の大半は、RNA抽出実施前の、分析対象mRNAの細胞性発生源の精製または赤血球の排除に関する。これらの中間段階は、mRNA分解および/または遺伝子誘導を伴い、それによって、mRNAレベルの変化を伴う可能性がある。さらに、血液を採取するという簡単なことが、一部のmRNAの分解を招く可能性がある。これは、3'非翻訳領域に位置するAU-リッチ配列により、内在ヌクレアーゼに感受性を示すサイトカインmRNAに特に当てはまる。末梢血IFN-γ mRNAレベルが、実際、血液採取から1時間後にすでに約50%減少したことは、先に立証されている(Stordeurら、(2002) J. Immunol Meth. 261：195)。これは、細胞全体の溶解と同時に核酸沈殿を誘発するCatrimox-14(商標)(Qiagen, Westburg, Leusden, オランダ)と呼ばれる陽イオン界面活性剤であるシュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムなどの4級アミン界面活性剤を使って回避できる。本実施例は、驚くべき事に、PAXgene(商標)採取管で得られる核酸沈殿物をグアニジン/チオシアネート溶液に溶解できることを観察している。前記溶液の例は、mRNA単離用MagNA Pure(商標)LCキット(Roche Applied Science)から提供される溶解緩衝液である。これに促されて、我々は、PAXgene(商標)採取管のMagNA Pure(商標)装置を併用するに到った。この併用は、PCR反応混合液の全成分を自動調製できることによる、後者の装置の高い再現性と精度を活用できる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正２４
【補正方法】追加
【補正の内容】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
【図１．１】破傷風トキソイドへの免疫応答の生体外モニタリング
【図１．２】実施例3において準拠したストーリー
【図１．３】実施例4において準拠したストーリー
【図１．４】実施例5において準拠したストーリー
【図２．１】末梢血中のIFN-γおよびIL-10 mRNAを自発的に産生するRT-PCR。様々な健康なボランティア6名の全血およびPBMCから、既述のとおりに、総RNAを抽出した(1欄〜6欄)。全血：全血0.6 mlに、試料採取後1分以内にCatrimox-14(商標)6 mlを混合した。次に、該試料を12000 gで5分間遠心分離した。生じた核酸ペレットを水で慎重に洗浄し、Tripure(商標)1 mlに溶解した。その後、Tripure(商標)の製造会社の解説書に従ってRNA抽出を実施した。PBMC：ヘパリン化静脈血15 mlから標準手順に従って細胞を調製し、RNA抽出用Tripure(商標) 1 ml中に溶解した。既述に従い(Stordeurら、(1995)、Pradierら(1996))、総RNA 1μgからの全試料について、IFN-γ、IFN-10およびハウスキーピング遺伝子HPRT用RT-PCRを実施した。
【図２．２】全血中のIFN-γおよびIL-10 mRNA安定性に対するリアルタイムPCR。クエン酸化静脈血試料を健康なドナーから採取した。この試料の一部100μlに、血液採取後1分以内にCatrimox-14(商標）900 μlを混合し、1時間毎に5時間、該血液試料の一部づつを採取する間、単に室温に保った。生じた核酸ペレット(図2.1の説明参照)を「MagNA Pure LC mRNA単離キット1」(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)の溶解緩衝液300μlに溶解した。製造会社の解説書に従って、MagNA Pure LC装置(Roche Diagnostic、Molecular Biochemicals)によってｍRNAを抽出した(最終溶出量：100μl）。「Lightcycler−RNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット」(Roche Diagnostics、Molecular Biochemicals)に述べられた標準手順に従って、逆転写とリアルタイムPCRを一段階で実施した。これをmRNA調製液5μlから始めた。プライマーおよびプローブ配列、およびPCR条件は、Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)；55-64, 2002)、並びに、表1および2に述べられている。結果は、一人の代表的なドナーにつき、β-アクチンに対して規格化したmRNAコピー数で表す。
【図３】本発明が提案する方法と比較したPreAnalytix推奨の全血からのRNA抽出法の概略比較。
【図４】破傷風トキソイドによるサイトカイン血中ｍRNA生体外誘導。7年前に破傷風ワクチンの接種を受けた健康なボランティアから採取した全血500μlに破傷風トキソイド(10μg/ml、Aventis)を添加した。5% CO2雰囲気下、37℃での異なる時間経過後、PAXgene採取管に含まれる試薬1.4 mlを添加した。得られたライセートを使って、MagNA Pure装置で総RNAを単離し、RT-PCRを本発明で述べるとおりに実施した。
【図５】LPSによる全血刺激後のIL-1βおよびIL-1 RA mRNA反応速度論。ヘパリン化血液200μlをLPS 10 ng/mlと0(培養開始)、0.5、1、2および6時間培養した。培養終了時、完全細胞溶解と核酸沈殿のために、PAXgene(商標)採取管の試薬500μlを添加した。その後、IL-1β、IL-1RAおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを、本発明で述べるとおりに一段階で実施した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図６】直線回帰：出発血液量におけるmRNAコピー数。各種全血量(20〜200μl、X軸)を、LPS 10ng/mlの存在下で6時間培養した。培養終了時、本発明で述べる通りにIL-1βおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを実施した。Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰に関するものである。6件の実験中、代表的な1件を示す。
【図７】破傷風トキソイドによる全血刺激後のmRNAサイトカイン反応速度論。少なくとも5年前に破傷風のワクチン接種を受けた健康なボランティア5名からヘパリン化血液を採取した。ドナー毎に、全血の一部200μlづつを破傷風トキソイド10μg/mlと共に0(培養開始)、4、8、16、24および48時間培養した。培養終了時、PAXgene(商標)採取管に含まれる試薬500μlを添加し、本発明の方法論によって各種転写物を定量した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図８】LPS静脈内注射後の血中サイトカインmRNAの生体内調節。5名の健康なボランティアに単回量4 ng/kgのLPSを注射した。LPS注射の10分前、並びに、0.5、１、1.5、2、3および6時間後、血液試料2.5 mlをPAXgene(商標）採取管に採取した。サイトカインmRNAの定量は、本発明の方法に従った。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。各時点の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図９】抗破傷風ワクチン応答の経過観察。6名の健康なボランティアを選択し、抗破傷風リコールを与えた。破傷風トキソイド10μg/mlを伴って(黒丸)、あるいは、伴わなず(白丸)に20時間培養した全血からIL-2 mRNAレベルを定量し、リコール時(0日)、リコール14日前、並びに、3、7、14、21および90日後(横軸)に実施した。β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。6枚のパネル(No.1〜6)は、それぞれ、6名の各ドナーの個々のデータを示す(パネル1枚がドナー1名)。
【図１０】実施例7、8、9、10および11において準拠した手順の要約
【図１１】MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。出発生体材料と検出されたコピー数の直接相関。
【図１２】MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰のものである。
【図１３】癌免疫療法に参加した患者の症例報告の要約。1999年7月、黒色腫と診断された。2001年8月、多重転移が認められ、2002年4月、患者は、睾丸摘出直後、癌ワクチン投与に加わった。ワクチンは、アジュバント配合によるMAGE-3精製タンパク(黒色腫細胞により特異的に発現する抗原)の複数回の注射から成った。
【図１４】ワクチン接種プロトコルとリアルタイムPCRによる免疫応答のモニタリングの概略図示。患者に3回のワクチン注射を行い、9週間の間に週1回血液試料を採取した。各患者の全血の一部200μlづつを、MAGE-3タンパク10μg/mlまたは陰性対照TRAP(プラスモジウムファルシパルムplasmodium falciparum抗原)10μg/mlの存在下で培養した。培養終了時、実施例6で述べたように、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、IL-2 mRNAの定量が可能であった。結果を図15に示す。
【図１５】MAGE-3ワクチンブースト(急増)後のMAGE-3刺激全血に高めのIL-2 mRNAレベルが認められる。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表し、X軸は、血液試料を採取した週を表す。ワクチン注射液は、0、2および6週に投与した。褐赤色のカラムはMAGE-3の存在下で培養した全血に関するもので、青色カラムは、TRAPの存在下で培養した全血に関するものである。
【図１６】アレルゲンとの全血培養後のIL-4 mRNA定量を実施した実験の概略図示。ネコアレルギーの被験者と健康な被験者2名から血液試料を採取した。その後、様々な培養時間で、ネコアレルゲン(即ち、Feld 1)の不在下または存在下で全血を培養し、培養の終了時にPAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、実施例6に述べたとおりにIL-4 mRNA定量が可能になった。結果を図17に示す。
【図１７】Feld1アレルゲンは、ネコアレルギー被験者に由来する全血中で、非アレルギー被験者と比較して高めのIL-4 mRNAレベルを有意に誘発する。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表し、X軸は各種培養時間を表す。緑色カラムは、アレルゲンと共に培養した正常全血に認められるIL-4 mRNAレベルを、赤色カラムと黄色のカラムは、アレルギー被験者の全血に認められるIL-4 mRNAレベルを表す(それぞれ、Feld1の存在下および不在下で培養した血液)。
【図１８】この全血系におけるFeld1への応答は、特異的で、用量に関係する。アレルギー被験者からの全血を、1)濃度を増加させたFeld1の存在下(赤色のカラム)；2)別のアレルゲン、β-ラクトグロブリン(BLG)10μg/mlの存在下(青色のカラム)；3)架橋IgE(緑色のカラム)の存在下で2時間培養した。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表す。
【図１９】Feld１による全血刺激後のIL-4 ｍRNAは、健康な対照に比較して、ネコアレルギー患者の方が高い。スライド9〜11で述べる実験は、健康な被験者10名(CTRカラム)とネコアレルギー患者10名(ALLカラム）の血液試料について繰り返したものである。全血を、10μgのFeld1の存在下、もしくは、陽性対照の架橋IgEの存在下で2時間培養した。平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図２０】精製GAD65タンパクとの全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。血液試料をI型糖尿病患者6名と健康な被験者5名から採取した。全血を、10μg/mlのGAD65の不在下または存在下で18時間培養した後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べるとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図21に示す。
【図２１】I型糖尿病患者の全血は、GAD65刺激後、健康被験者に比較して高いIL-2 mRNAレベルを示す。結果は、GAD65不在下で培養した全血中に認められたIL-2 mRNAコピー数に相対的に計算し、β-アクチンに対して補正した該コピー数で表す。対数目盛を使用する。平均値および平均値の標準誤差を表す。健康ドナー：CTRカラム；自己免疫糖尿病患者：PATカラム。
【図２２】異種反応性T-細胞応答の評価を目的に、非血縁樹状突起細胞(DC)との全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。非血縁の健康なボランティア2名(MTとMA)の樹状突起細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で試験管内発生させた。各ドナーからの全血試料を、他のドナー(1)の樹状突起細胞群の存在下、または、自身(2）の樹状突起細胞の存在下で培養した。両ドナーの全血試料を混合し(3）、同時に、両樹状突起細胞調製液を混合した(4)。12時間の培養後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べたとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図23に示す。
【図２３】全血中でのIL-2 mRNA定量による異種反応性T-細胞応答の評価。β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表す。条件は、左から右に：ドナーMAの全血単独、ドナーMAの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMAの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血単独、ドナーMTの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAの全血、ドナーMTのDC＋ドナーMAのDCである。