【手続補正書】
【提出日】平成17年2月23日(2005.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパクト化核酸、ポリカチオン、標的化因子および脂質を含む脂質−核酸複合体であって、ここで：
（ａ）該標的化因子は、特定の外側細胞表面膜レセプターとの相互作用以外の手段によって、該核酸の細胞バイオアベイラビリティーを増大させ；
（ｂ）該複合体は、プロタミンもその塩も含まず；そして
（ｃ）該複合体の平均直径は、約１００ｎｍより大きくかつ約４００ｎｍより小さい、複合体。
【請求項２】
前記標的化因子が膜破壊性ポリマーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体の直径が、約３００ｎｍ以下である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体の直径が、約２００ｎｍ以下である、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
遮蔽剤をさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
請求項５に記載の複合体であって、前記遮蔽剤が、該複合体の循環半減期を増加させるか、該複合体への血清成分の結合を減少させるか、または該複合体の完全なオプソニン作用を減少させる、複合体。
【請求項７】
前記遮蔽剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
前記遮蔽剤が、ＰＥＧである、請求項５に記載の複合体。
【請求項９】
前記遮蔽剤が、ペグ化脂質を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ポリカチオンが、合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチドまたはこれらの塩である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ポリカチオンが、合成ポリカチオンである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ（アルケニルイミン）からなる群より選択される、複合体。
【請求項１３】
前記ポリカチオン性メタクリレートポリマーが、ジメチルアミノメタクリレートから構成される、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１１に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（２−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド）（ＰＭＯＥＴＭＡＢ）およびジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーからなる群より選択される、複合体。
【請求項１５】
前記標的化因子が、膜破壊性合成ポリマーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１６】
請求項１に記載の複合体であって、前記標的化因子が、該複合体の核酸の転写を増加させること、前記細胞への該核酸の取り込みを増加させること、細胞区画への取り込みを増加させること、細胞区画からの該核酸の排出を増加させること、または細胞膜を通る核酸の輸送を増加させることによって、細胞バイオアベイラビリティーを増加させるように機能する、複合体。
【請求項１７】
前記標的化因子が、膜移行ペプチド（ＭＴＬＰ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
前記標的化因子が、核局在化配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１９】
前記核局在化配列が、ＳＶ４０ＮＬＳである、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
共脂質をさらに含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
前記標的化因子が、ＰＥＧ部分に結合体化されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項２２】
前記脂質が、カチオン性脂質である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２３】
前記カチオン性脂質が、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）である、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰである、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２５】
請求項２２に記載の複合体であって、前記共脂質が、コレステロール、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＨＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＭＥ）からなる群より選択される、複合体。
【請求項２６】
脂質−核酸複合体であって、該複合体は、コンパクト化核酸および融合性である少なくとも１種の脂質種を含み、ここで：
ａ）該複合体は、水性コアを有し；そして
ｂ）該複合体の平均直径は、約１００ｎｍより大きくかつ約４００ｎｍより小さい、
複合体。
【請求項２７】
脂質−核酸複合体であって、該複合体は、コンパクト化核酸、ポリカチオン、標的化因子および少なくとも１種の脂質種を含み、ここで：
ａ）該少なくとも１種の脂質種は、アニオン性脂質であり；
ｂ）該複合体は、水性コアを有し；
ｃ）該複合体は、少なくとも１種の融合性部分を含み；
ｄ）該複合体の平均直径は、約１００ｎｍより大きくかつ約４００ｎｍより小さく；そして
ここで、該複合体は、プロタミンもその塩も含まない、
複合体。
【請求項２８】
請求項２６に記載の複合体であって、該複合体の平均直径は、約１００ｎｍより大きくかつ約２００ｎｍより小さい、複合体。
【請求項２９】
請求項２６に記載の複合体であって、該複合体の平均直径は、緩衝液中５０％血清中での約１時間のインキュベーションによって決定される、複合体。
【請求項３０】
前記複合体が、補体Ｃ３ＡおよびＣ５Ａへの減少した結合を有する、請求項２６に記載の複合体。
【請求項３１】
前記融合性脂質が、コア形成脂質である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３２】
請求項２６に記載の複合体であって、該コア形成脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）またはＮ，Ｎジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，６−ヘキサンジアンモニウムクロリド（ＴＯＤＭＡＣ６）である、複合体。
【請求項３３】
前記融合性脂質が、ｐＨ感受性である、請求項２６に記載の複合体。
【請求項３４】
前記脂質が、生理学的ｐＨにおいてアニオン性であり、そして融合性が、生理学的ｐＨと比較して、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ４．５にて増加する、請求項３３に記載の複合体。
【請求項３５】
約ｐＨ４．５にて、前記脂質が中性またはカチオン性である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３６】
前記脂質が、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホエタノールアミン−Ｎ−ドデカノイル］（ＮＣ１２−ＤＯＰＥ）である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３７】
前記脂質が中性またはカチオン性である、請求項２６に記載の複合体。
【請求項３８】
前記ポリカチオンが合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチドおよびこれらの塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の複合体。
【請求項３９】
前記ポリカチオンが、合成ポリカチオンである、請求項３８に記載の複合体。
【請求項４０】
請求項３９に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ（アルケニルイミン）からなる群より選択される、複合体。
【請求項４１】
前記ポリカチオン性メタクリレートポリマーが、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーから構成される、請求項４０に記載の複合体。
【請求項４２】
請求項３９に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（２−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド）（ＰＭＯＥＴＭＡＢ）およびジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーからなる群より選択される、複合体。
【請求項４３】
請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の複合体であって、該複合体が、少なくとも１種の共脂質をさらに含む、複合体。
【請求項４４】
請求項４３に記載の複合体であって、該複合体は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含む、複合体。
【請求項４５】
請求項２６に記載の複合体であって、該複合体は、前記核酸の細胞バイオアベイラビリティーを増大させる少なくとも１種の標的化因子をさらに含む、複合体。
【請求項４６】
請求項４５に記載の複合体であって、前記標的化因子の存在が、前記核酸の転写の増加、前記細胞への核酸の取り込みの増加、細胞区画への核酸の取り込みの増加、細胞区画からの該核酸の排出の増加、または膜を通る核酸の輸送の増加を生じる、複合体。
【請求項４７】
請求項４５に記載の複合体であって、前記標的化因子が、葉酸、インスリン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、膜移行ペプチド（ＭＴＬＰ）および核局在化配列を含む化合物からなる群より選択される、複合体。
【請求項４８】
請求項２６に記載の複合体であって、前記脂質が、生理学的ｐＨとｐＨ約４．５との間で構造変化して、増加した融合性を生じる、複合体。
【請求項４９】
前記複合体が遮蔽されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項５０】
前記複合体が遮蔽されている、請求項２６に記載の複合体。
【請求項５１】
請求項４９に記載の複合体であって、ポリエチレングリコール部分を含む化合物をさらに含む、複合体。
【請求項５２】
請求項５０に記載の複合体であって、ポリエチレングリコール部分を含む化合物をさらに含む、複合体。
【請求項５３】
前記化合物が、ペグ化脂質である、請求項５１に記載の複合体。
【請求項５４】
前記化合物が、ペグ化脂質である、請求項５２に記載の複合体。
【請求項５５】
コンパクト化核酸および融合性である少なくとも１種の脂質種を含む脂質−核酸複合体を調製するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）脂質および少なくとも１種の脂肪親和性界面活性剤を含む水性ミセル混合物を、核酸を含む核酸混合物と混合する工程であって、該脂質は、融合性特徴を有するかまたは融合性特徴を有するかのように挙動し、そして該混合物の少なくとも１つが、該核酸をコンパクト化する成分を含む、工程；および
ｂ）該混合する工程の後、工程ａ）から得られた混合物から、該脂肪親和性界面活性剤を除去する工程、
を包含する、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、工程ａ）の混合物の少なくとも１つ中に、少なくとも１種の標的化剤を含める工程をさらに包含する、方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法によって調製される、脂質−核酸複合体。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法によって調製される、脂質−核酸複合体。
【請求項５９】
請求項５５に記載の方法によって調製される、請求項２６〜３０、３２〜４２または４５〜５４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６０】
請求項５５に記載の方法によって調製される、請求項４３に記載の複合体。
【請求項６１】
請求項５５に記載の方法によって調製される、請求項４４に記載の複合体。
【請求項６２】
請求項５６に記載の方法によって調製される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６３】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項１〜２１、２６〜３０、３２〜４２または４５〜５４のいずれか１項に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６４】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項２２に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６５】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項２３に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６６】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項２４に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６７】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項２５に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６８】
核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項４３に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６９】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記送達が、個体にとってインビボである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記送達が静脈内である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記送達が静脈内である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記送達が静脈内である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記送達が静脈内である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記送達が静脈内である、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記送達が静脈内である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記個体がヒトである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
前記個体がヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記個体がヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
前記個体がヒトである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８５】
前記個体がヒトである、請求項７３に記載の方法。
【請求項８６】
前記個体がヒトである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記個体がヒトである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８８】
前記個体がヒトである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８９】
前記個体がヒトである、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
前記個体がヒトである、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
前記個体がヒトである、請求項７９に記載の方法。
【請求項９２】
前記個体がヒトである、請求項８０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
細胞膜移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ）ペプチド（ＭＴＬＰ）は、細胞膜脂質二重層の脂質と直接相互作用し、そしてそれらを貫通する（Ｆｏｎｇら（１９９４）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：６４）。カポージ（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の中心の疎水性のｈ−領域（ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１））は、膜移行ペプチドであると考えられる。このペプチドは、細胞内のタンパク質機能および細胞内プロセスを研究するために、種々の短いペプチド（２５マー未満）を、脂質二重層を通って生存細胞内へと送達するためのキャリアとして使用されている（Ｌｉｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５３０５；Ｌｉｕら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１８１９；Ｒｏｊａｓら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２３４：６７５）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
複合体の特定の実施形態において、この標的化因子は、膜移行ペプチド（ＭＴＬＰ）である。いくつかの実施形態において、この膜移行ペプチドは、以下からなる群より選択される：Ｈ２Ｎ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＣＯＯＨ（Ｅｌａｎ０９４）（配列番号２）、Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号３）、Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号４）、およびＨ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（ＺＥｌａｎ０９４Ｒ）（配列番号５）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
特定の例において、標的化因子は、以下からなる群より選択される：葉酸、インスリン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、膜移行ペプチド（ＭＴＬＰ）および核局在化配列を含む化合物。特定の例において、この標的化因子は、以下からなる群より選択される：ガラクトース−Ｈ２Ｎ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＣＯＯＨ（Ｅｌａｎ０９４）（配列番号６）、ガラクトース−Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号７）、ガラクトース−Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号８）、およびガラクトース−Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（ＺＥｌａｎ０９４Ｒ）（配列番号９）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
本明細書中で使用される「ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤ」は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−スクシニル−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（配列番号１０）を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
本明細書中で使用される「ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−ＬＨＲＨ」は、ｐｙｒＧＬＵ−ＨＷＳＹＤＫ（εＮＨ−スクシニル−ＰＥＧ５ｋ−ＤＳＰＥ）ＬＲＰＧ−ＣＯＯＨＮＨ２ＣＯＯＨ（配列番号１１）を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
「ＤＯＰＥ−０９４」および「Ｅｌａｎ２１９」は、本明細書中で交換可能に使用され、ＤＯＰＥ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１２）を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
本明細書中で使用される「Ｅｌａｎ０９４」は、ペプチド配列、ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１３）を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
接着分子の非限定的な例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含むペプチドである。適切なＲＧＤモチーフペプチドの非限定的な例は、Ｈ２ＮＨ２Ｎ−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（ＲＧＤ４Ｃ）（配列番号１４）である。ＭＴＬＰの非限定的な例は、Ｈ２ＮＨ２Ｎ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（Ｅｌａｎ０９４）（配列番号２）である。ＭＴＬＰ−含有標的化因子の他の適切な例としては以下が挙げられる：Ｈ２Ｎ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＣＯＯＨ（Ｅｌａｎ０９４）（配列番号２）、Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号３）、Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号４）、Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（ＺＥｌａｎ０９４Ｒ）（配列番号５）；Ｈ２Ｎ−ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ−ＣＯＯＨ（インフルエンザＨＡ−２（ＩＮＦ６））（配列番号１５）；Ｈ２Ｎ−ＧＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＬＬＥＡ−ＣＯＯＨ（ＪＴＳ１）（配列番号１６）；Ｈ２Ｎ−ＨＨＨＨＨＷＹＧ−ＣＯＯＨ（Ｈ５ＷＹＧ）（配列番号１７）；Ｈ２Ｎ−ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ−ＣＯＯＨ（ＧＡＬＡ）（配列番号１８）；Ｈ２Ｎ−ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ−ＣＯＯＨ（ＫＡＬＡ）（配列番号１９）；ＶＰ２２（ＨＳＶ−１）；Ｈ２Ｎ−ＣＰＣＩＬＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬ−ＣＯＯＨ（レトロウイルス細胞内ドメイン（Ｍｏ−ＭｕＬｖ））（配列番号２０）；Ｈ２Ｎ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＣＯＯＨ（ホメオボックスドメイン侵入）（配列番号２１）；Ｈ２Ｎ−ＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫ−ＣＯＯＨ（ホメオボックスドメイン侵入）（配列番号２２）；Ｈ２Ｎ−ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧ−ＣＯＯＨ（ＰｒｅＳ２ドメイン）（配列番号２３）；Ｈ２Ｎ−ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ−ＣＯＯＨ（ＳｙｎＢｌ））（配列番号２４）；タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（例えば、Ｈ２Ｎ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（ＴＡＴ）（配列番号２５）；Ｈ２Ｎ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＣＯＯＨ（Ａｎｔｐ）（配列番号２１）；Ｈ２Ｎ−ＲＲＲＲＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ａｒｇ）（配列番号２６）；およびＨ２Ｎ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨ−ＣＯＯＨ（Ｈｉｓ）（配列番号２７）。特定の実施形態において、ＭＴＬＰは、Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号３）、Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号４）、またはＨ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（ＺＥｌａｎ０９４Ｒ）（配列番号５）であり、ここで小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。さらなる標的化因子としては、以下：Ｈ２Ｎ−Ｋ（ダンシル）ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号２８）、Ｈ２Ｎ−ｋ（ダンシル）ｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号２９）、Ｈ２Ｎ−Ｋ（ダンシル）−Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＺＥｌａｎ０９４）（配列番号３）、Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（ＺＥｌａｎ２０７）（配列番号４）、Ｈ２Ｎ−Ｋ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（ＺＥｌａｎ０９４Ｒ）（配列番号５）、ｄｅｓ−Ｐｒｏ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＳ−ガラクトース（Ｅｌａｎ０９４Ｇ）（配列番号３１）、Ｓ（ガラクトース）ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｇｅｌａｎ０９４）（配列番号３２）、コレステリル−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３３）、ＤＯＰＥ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｅｌａｎ２１９）（配列番号３４）、コレステリル−スクシニル−ｋｋａａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（全てｄ−Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３５）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３６）、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＤＳＭＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３７）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｌａｎ２１９）（配列番号３８）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＤＳＭＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｌａｎ２１９）（配列番号３９）、からなる群から選択される標的化因子含有化合物が挙げられ、ここで、小文字で表されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸を示す。ダンシル（ダンシル化塩化物）および上で「タグ」として列挙されるＥｌａｎ部分中のｄｅｓ−Ｐｒｏタグの取りこみは、分子を標識し、その結果この部分はこれらのタグを含み、実験的に追跡／モニタリングされ得る。当業者は、これが、診断もしくは治療のいずれかのインビボでの用途に依存して処方物中に取りこまれ得るかまたは取りこまれないかを理解する。１つの実施形態において、複合体は、ペグ化脂質をさらに含む。別の実施形態において、この複合体は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＬＨＲＨをさらに含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
あるいは、標的化因子を別の部分（例えば、脂質、疎水性アンカーまたはポリマー）と結合され得る。非限定的な例としては、コレステリル−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３３）、ＤＯＰＥ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｅｌａｎ２１９）（配列番号３４）、およびコレステリル−スクシニル−ｋｋａａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（Ａｌｌ  ｄ−Ｅｌａｎ２１８）（配列番号３５）。これらの標的化因子−脂質結合体は、複合体中に含まれ得るか、または複合体の封入のために、さらにＰＥＧ化脂質に結合体化され得る。例えば、標的化因子を脂質と結合体化する方法の総説についての、Ｈａｒａｓｙｍ，Ｔ．Ｏ．ら，（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２，９９−１１８を参照のこと。標的化因子（例えば、ＭＴＬＰ）を脂質と結合体化する特定の実施例は、本実施例に見出され得る。標的化因子はまた、以下の適切なリンカーによって、この部分とリンカーされ得る：例えば、炭素スペーサー、細胞表面に存在する酵素（例えば、メタロプロテアーゼ）によって酵素的に切断され得る切断可能なリンカー、またはｐＨ変化もしくは温度変化によって切断され得る切断可能なリンカー、アミド−アミドリンカー、アミド−ジスルフィドリンカー、カルバメート−ジスルフィドリンカー、グリコールアミドエステルリンカー、エステル−アミドリンカー、エステル−ジスルフィドリンカー、ヒドラゾンリンカー、およびアミド−チオエステルリンカー。  
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【化５】
2004535388.tif 000001
を含む）、が挙げられる。このような標的化因子はまた、非外側細胞表面レセプター媒介性（または会合性）標的化因子としていわれ得る。非特異的な標的化因子は、複合体の別の成分（例えば、脂質、ＰＥＧ化された脂質（副脂質を含む）またはＰＥＧ化された副脂質）と結合体化され得るか、または複合体の任意の他の成分とは結合体化されずに存在し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
多機能な標的化因子の非限定的な例としては、ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＳ−ガラクトース（Ｅｌａｎ０９４Ｇ）（配列番号４１）、およびＳ（ガラクトース）ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（Ｇｅｌａｎ０９４）（配列番号３２）が挙げられる。あるいは、１つより多い標的化因子は、多機能な標的化活性を有する複合体を生成するように複合体中に含まれ得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−スクシニル−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−ＲＧＤ）（配列番号１０）およびｐｙｒＧＬＵ−ＨＷＳＹＤＫ（εＮＨ−スクシニル−ＰＥＧ５ｋ−ＤＳＰＥ）ＬＲＰＧ−ＣＯＯＨＮＨ２ＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−ＬＨＲＨ）（配列番号１１）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）から入手した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
（膜移行ペプチドの合成）
以下の膜移行ペプチドを、ｆｍｏｃ化学合成法を使用するＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって合成した。適切なｆｍｏｃ化学合成法は、上述した。大文字の文字は、Ｌ−アミノ酸を示し、そして小文字のＤ−アミノ酸を示す。
ＺＥｌａｎ０９４：Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３）
ＺＥｌａｎ２０７：Ｈ２Ｎ−ｋｋｋａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（配列番号４）
ＺＥｌａｎ０９４Ｒ：Ｈ２Ｎ−ＫＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＲＥＤＬ（配列番号５）
（膜移行ペプチド−ガラクトース結合体の合成）
以下の２つの膜移行ペプチド−ガラクトース結合体を、以下のようにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって合成した：
Ｅｌａｎ０９４Ｇ：ｄｅｓ−Ｐｒｏ−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＳ−ガラクトース（式量：１６６０）（配列番号３１）
Ｇｅｌａｎ０９４：Ｓ（ガラクトース）ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（式量：１７５７）（配列番号３２）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
（膜移行配列−脂質結合体の合成）
以下の３つの脂質−ＭＴＬＰ結合体は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって以下に用に合成した。：
Ｅｌａｎ２１８：コレステリル（ｃｈｏｌｏｓｔｅｒｙｌ）−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３３）（式量：１９４３．５）
Ｅｌａｎ２１９：ＤＯＰＥ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３４）（式量：２２９９．４）
全てのｄ−Ｅｌａｎ２１８：コレステリル−スクシニル−ｋｋａａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（配列番号３５）（式量：１９４３．５）
Ｅｌａｎ２１８結合体を、プロリンを予めロードした超酸不安定Ｗａｎｇ型樹脂を使用して固相Ｆｍｏｃ化学法により合成する。次の中間体２アミノ酸（Ａｌａ−Ａｌａ）を保護化したジペプチド単位（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ）として結合して、ジケトピペラジン形成によるプロリンの除去を防ぐ。その後の鎖伸長を、Ｆｍｏｃアミノ酸カップリングによる通常のサイクルによって実施した。二重カップリングを、カップリング効率が９７％を下回って観察された場合に実施した。コレステリル−（Ｃ３）−ヘミスクシネートを、理論的なペプチド置換よりもわずか多くＰｙＢＯＰを使用してカップリングした。リジン残基に対する側鎖の保護は、酸性条件下、すなわち、ヒドラジンハイドレートを使用することなしに直交して切断され得るＤｄｅを使用した。脱保護ペプチドを、蒸留水（ＤＷ）およびメタノールを大量に用いて洗浄し、全ての脱保護夾雑物を取り除く。このペプチドの最終的な切断を、ジクロロメタン中の２％ＴＦＡを用いて実施して、ピペラジン中ですぐに中和する。生成物を、Ｃ４固相支持体でのＨＰＬＣによる精製の前に、溶媒蒸発法およびメタノール中での再懸濁により単離する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
１０ｍｏｌ％のペグ化脂質を含むリポソームのために、６０００ｎｍｏｌ  ＤＯＴＡＰ、４８００ｎｍｏｌコレステロールおよび１２００ｎｍｏｌの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５ｋ］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を、上記の通り調製した。代表的に、１０ｍｏｌ％標的化因子−ペグ化脂質結合体または標的化因子−脂質結合体を含む標的化リポソームを、６０００ｎｍｏｌ  ＤＯＴＡＰ、４８００ｎｍｏｌコレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−スクシニル−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤ）（配列番号１０）、ｐｙｒＧＬＵ−ＨＷＳＹＤＫ（εＮＨ−スクシニル−ＰＥＧ５Ｋ−ＤＳＰＥ）ＬＲＰＧ−ＣＯＯＨＮＨ２ＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＬＨＲＨ）（配列番号１１）、コレステリル−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３３）、ＤＯＰＥ−スクシニル−ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３４）、またはコレステリル−スクシニル−ｋｋａａａｖｌｌｐｖｌｌａａｐ（配列番号３５）のいずれかの１２００ｎｍｏｌを用いて調製した。標的化因子−ペグ化脂質結合体または標的化因子−脂質結合体のｍｏｌ％を、コレステロールのｍｏｌ％の５０〜３０％範囲に対応して、０〜２０％に変動させた。標的化因子−ペグ化脂質結合体を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって合成した。要するに、リポソームを標的化するために、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ｋ−ＲＧＤまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＬＨＲＨおよび／もしくはＭＴＬＰ−脂質を２０ｍｇ／ｍｌにてクロロホルムに可溶化し、そして上記の通り、窒素下でエバポレートした。次いで、脂質フィルムを、メタノール：ジクロロメタン１：１（メタノール、ＶＷＲ製，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡおよびジクロロメタンＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中に再溶解し、５％デキストロースＵＳＰでの水和の前に、窒素下で再エバポレートし、その後、ＤＯＴＡＰ：コレステロールリポソームについて上記の通り処理した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
トランスフェクションをまた、０．１μｇ  ＤＮＡ／ウェルを用いて実施し、減少したＲＧＤを誘導された細胞を培養プレートから剥がし、トランスフェクション媒介性ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤを、３つの異なるＲＧＤペプチドでブロッキングした：ＧＲＧＥＳＰ（配列番号４３）、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４４）およびＧＲＧＤＮＰ（配列番号４５）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｔｔｙｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、競合剤として使用した（図７）。培養培地を、１０，０００倍または１０００倍の過剰ペプチド（６．５μｌ（保存溶液からＨ２Ｏで１０倍希釈した）、６．５μｌまたはペプチド溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）の６５μｌに対応する）で補充したことを除いて、トランスフェクションを上記の通り実行した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
１０ｍｏｌ％のペグ化脂質処方物のために、２１９１．５ｎｍｏｌのＤＯＰＳまたはＤＯＰＧおよび１３９４．５９ｎｍｏｌのコレステロールおよび３９８．４５ｎｍｏｌの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００（ＤＳＰＥＰＥＧ５Ｋ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を、上記の通り調製した。代表的に、１０ｍｏｌ％標的化因子−ペグ化脂質結合体のために、標的化ＤＬＰＤを、２１９１．５ｎｍｏｌのＤＯＰＳまたはＤＯＰＧ、１３９４．５９ｎｍｏｌのコレステロールおよび３９８．４５ｎｍｏｌのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−スクシニル−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＣＯＯＨＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤ）（配列番号１０）または３９８．４５ｎｍｏｌのｐｙｒＧＬＵ−ＨＷＳＹＤＫ（εＮＨ−スクシニル−ＰＥＧ５Ｋ−ＤＳＰＥ）ＬＲＰＧ−ＣＯＯＨＮＨ２ＣＯＯＨ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＬＨＲＨ）（配列番号１１）のいずれか２１９１．５ｎｍｏｌを用いて調製した。結合した脂質を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって合成した。要するに、標的化リポソーム、アニオン性脂質、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＬＨＲＨまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤを、クロロホルム中に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、上記のように窒素下でエバポレートした。次いで、脂質フィルムを、メタノール：ジクロロメタン１：１（メタノール、ＶＷＲ製，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡおよびジクロロメタンＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中に再溶解し、０．１５ｍｌ  ２００ｍＭのＯＧＰでの水和の前に、窒素下で再エバポレートし、その後、上記の通り処理した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
この結果は、１０００倍過剰のＬＨＲＨを用いた、１０００倍の競合効果を実証した（図６Ａ）。しかし、ＬＨＲＨレセプターまたはＬＨＲＨレセプターに特異的な抗体は、リガンド媒介トランスフェクションをブロックし得なかった。１００倍および１０００倍のＬＨＲＨ過剰からのデータを、図６Ｂに再度表す。図６Ｂは、１０００倍過剰のＬＨＲＨを用いた、トランスフェクション活性の明らかな阻害を示す。図７は、１０００倍過剰の遊離ＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４４）およびＧＲＧＤＮＰ（配列番号４５））による、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＲＧＤ含有複合体のトランスフェクション活性の阻害を示す。予想された通り、１０００倍過剰の遊離ＲＧＥペプチド（ＧＲＧＥＳＰ（配列番号４３））は、トランスフェクション活性を阻害しなかった。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４４】
（実施例３０）
（異なるＤＮＡ濃縮剤を使用するコンパクト化ＤＮＡの調製）
種々のＤＮＡ濃縮剤の、ＤＮＡをコンパクト化する能力を、調査した。表１６に示されるデータについて、濃縮されたＤＮＡを、ポリカチオン：ＤＮＡが２：  １および３．５：１の重量比にて濃縮、および０．１４３μｇ  ＤＮＡ／ｍｌのＤＮＡ濃度にて、調製した。ＰＥＩ、Ｅｕｄｇｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）、Ｅ１００、およびＰＭＯＥＴＭＡＢを、Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＩＲ）によって供給した。ＲＲＲＲＲＲＲＨ（配列番号４６）ペプチドおよびＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＲｅｓＧｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）によって合成し、一方、スペルミジンをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。全てのカチオン性ポリマーを、Ｈ２Ｏ  ＵＳＰ中に可溶化し、そしてｐＨを、５．５（硫酸プロタミンＵＳＰ溶液に匹敵するｐＨ）に調整した。プラスミドＤＮＡを、硫酸プロタミンについて上記のような、Ｏｒｉｏｎ  ＳａｇｅＴＭ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）シリンジポンプ混合デバイスを使用して、これらのカチオン性ポリマーと、２：１の比で混合した。ＰＥＩ、Ｅｕｄｇｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００を、Ｈ２Ｏ  ＵＳＰ中に可溶化し、そしてこの溶液を、ＨＣｌで酸性化して安定性を増加させた。これらのポリマー溶液の最終ｐＨは、ｐＨ３．０であった。評価した他のポリマーは、硫酸プロタミンＵＳＰ（ｐＨ約５．５）に匹敵するｐＨを有した。ポリマーＤＮＡ複合体を、直ちにサイズ決定し、そしてアニオン性脂質と混合してＤＬＰＤを生成した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
（実施例３４）
（様々なＤＮＡ濃縮剤を用いるＤＮＡのコンパクト化）
第二の実験において、様々なＤＮＡ濃縮剤の有効性を評価した。２つのカチオン性ペプチドである、ＲＲＲＲＲＲＲＨ（配列番号４６）およびＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）を評価した。次いで、ペプチドでコンパクト化したＤＮＡ粒子を、プロタミンでコンパクト化したＤＮＡ粒子と比較し、その後、脂質を添加した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
ＰＥＩ、Ｅｕｄｇｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００、ＰＭＯＥＴＭＡＢ、ＲＲＲＲＲＲＲＨ（配列番号４６）およびＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを、Ｈ２Ｏ  ＵＳＰに溶解し、そしてｐＨを５．５（硫酸プロタミンＵＳＰに匹敵するｐＨ）に調整した。硫酸プロタミンについて上に記載のように、プラスミドＤＮＡを、これらのカチオン性ポリマーと、２：１の比（μｇ：μｇ）で、０．１４３ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度で、Ｏｒｉｏｎ  ＳａｇｅＴＭ（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）シリンジポンプ混合デバイスを使用して混合した。ポリマー−ＤＮＡ複合体を、即座にサイズ決定し、そしてアニオン性脂質と混合した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５６】
ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドは、ＤＮＡを、２５ｎｍの平均直径を有する非常に小さな粒子にコンパクト化した。  
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
（実施例３６）
（トランスフェクション活性に対する種々のポリマー−濃縮ＤＮＡ複合体の評価）
図３３は、コンパクト化されたＤＮＡへの脂質の添加なしでの、コンパクト化されたＤＮＡの様々な処方物のＫＢ細胞におけるトランスフェクション活性を示す。図３３において、棒は、ＫＢ細胞トランスフェクションの後の、ルシフェラーゼ発現のＲＬＵ／ｍｇを表す。５×１０４個の細胞を２４時間プレート化し、その後、４８ウェルプレート中で、１μｇ  ＤＮＡ／ウェルを送達するポリマーでコンパクト化されたＤＮＡ処方物で、トランスフェクトした。細胞を、無血清培地中で４時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためのトランスフェクションの４８時間後に採取した。１つの処方物群あたりＮ＝６の独立したトランスフェクション。ＫＨは、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを表す。  
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６１】
５×１０４個の細胞を２４時間プレート化し、その後、４８ウェルプレート中で、１μｇ  ＤＮＡ／ウェルを送達する処方物でトランスフェクトした。細胞を、無血清培地中で４時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためのトランスフェクションの４８時間後に採取した。１つの処方物群あたりＮ＝６の独立したトランスフェクション。ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ  ｐＨ感受性処方物を、一般的な処方（１２９ナノモルの脂質  ２μｇカチオン性ポリマー：１μｇ  ＤＮＡ）を使用して作製した。ＫＨは、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを表す。  
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
脂質を含まない、ＰＥＩでコンパクト化されたＤＮＡの２ｌｏｇの減少が、ＰＥＩベースのアニオン性ＤＬＰＤ処方物と比較して、観察された。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００およびＰＭＯＥＴＭＡＢベースのアニオン性ＤＬＰＤ処方物は、脂質を添加しない、対応するポリマーでコンパクト化されたＤＮＡ単独より１ｌｏｇの減少を示した。ＲＲＲＲＲＲＲＨ（配列番号４６）ペプチドの使用は、ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥを用いて処方される場合に、ペプチドでコンパクト化されたＤＮＡ単独と比較して、トランスフェクション活性の２倍の増加を示した。トランスフェクション活性の変化は、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを含む処方物について、観察されなかった。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ＫｐＨ感受性処方物を、一般的な処方（１２９ナノモルの脂質（ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ）；２μｇカチオン性ポリマー：１μｇＤＮＡ）を使用して作製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋを、０．５ｍｏｌ％でＤＬＰＤ処方物に組み込んだ。ＫＨは、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを表す。  
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６６】
（実施例３９）
（様々なＤＮＡ濃縮剤を使用するアニオン性ＤＬＰＤ調製、ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−フォレート処方物でのトランスフェクション活性に対する効果）
図３６において、棒は、ＫＢ細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のＲＬＵ／ｍｇを表す。ＫＢ細胞のトランスフェクションは、実施例３８に記載されるとおりであった。ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−フォレートｐＨ感受性処方物を、一般的な処方（１２９ナノモルの脂質（ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−フォレート）；２μｇカチオン性ポリマー：１μｇＤＮＡ）を使用して作製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−フォレートを、ＤＬＰＤ処方物に０．５ｍｏｌ％で組み込んだ。ＫＨは、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを表す。  
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
（実施例４０）
（様々なＤＮＡ濃縮剤を使用するアニオン性ＤＬＰＤ調製、ＮＣ１２−ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ処方物でのトランスフェクション活性に対する効果）
図３７において、棒は、ＫＢ細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のＲＬＵ／ｍｇを表す。ＫＢ細胞トランスフェクションを、上記実施例においてと同様に実施した。ＮＣ１２−ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ処方物を、一般的な処方（１５６ナノモルの脂質２μｇカチオン性ポリマー：１μｇＤＮＡ）を使用して作製した。ＫＨは、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＧＫＨＫＨＫＨＫＨＫ（配列番号４７）ペプチドを表す。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５６】
【表１８】
2004535388.tif 000002
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５７】
【表１９−１】
2004535388.tif 000003
【表１９−２】
2004535388.tif 000004
表１９の説明：ＤＬＰＤを、１２９ナノモルの総脂質（ＣＨＥＭＳ：ＤＯＰＥの比が、２μｇのカチオン性ポリマー：１μｇのＤＮＡ）および１５６ナノモルの総脂質（ＮＣ１２−ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ処方物の比が、２μｇのカチオン性ポリマー：１μｇのＤＮＡ）で調製した。両方のＤＬＰＤ処方物のＤＮＡ濃度は、７５μｇ／ｍｌであった。ζ電位の測定を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５で実施した。このζ電位についてのＳＤを、同一のサンプルからの５回の読み取りに基づいて計算した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５ＫまたはＥＳＰＥ−ＰＥＧ５Ｋ−葉酸を、ＬＰＤ処方物中に０．５モル％で組み込んだ。