【手続補正書】
【提出日】平成18年5月19日(2006.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  異種ポリペプチドの製造方法であって、
（a）親糸状菌細胞の変異体を前記異種ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し、ここで、前記変異体が、前記異種ポリペプチドをコードする第１核酸配列、及びtri3, tri4, tri5, tri6, tri11, tri12及びtri101から成る群から選択されるトリコテセンの生成に関与する遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の修飾を含んで成る第２核酸配列を含んで成り、そして前記変異体が、同じ条件下で培養される場合、親糸状菌細胞よりもトリコテセンを少なくとも約25％少なく生成し；そして
（b）前記培養培地から前記異種ポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】  前記糸状菌細胞がフサリウム（Fusarium）の株である請求項１記載の方法。
【請求項３】  前記異種ポリペプチドが、ホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はレポーターである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  前記変異体細胞が１又は複数の第３核酸配列の１又は複数の修飾をさらに含んで成り、ここで前記修飾が前記１又は複数の第３核酸配列の発現を低めるか又は排除する、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】  前記１又は複数の第３核酸配列が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼから成る群から選択された酵素を独立してコードする請求項４記載の方法。
【請求項６】  異種ポリペプチドをコードする第１核酸配列、及びtri3, tri4, tri5, tri6, tri11, tri12及びtri101から成る群から選択されるトリコテセンの生成を担当する遺伝子の少なくとも１つの修飾を含んで成る第２核酸配列を含んで成る、糸状菌細胞のトリコテセン−欠失変異体細胞であって、同じ条件下で培養される場合、変異体細胞のトリコテセンの生成が親糸状菌細胞よりも少なくとも約25％少ない、ことを特徴とする変異体細胞。
【請求項７】  前記糸状菌細胞がフサリウム（Fusarium）の株である請求項６に記載の変異体細胞。
【請求項８】  前記異種ポリペプチドが、ホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体又はその一部、抗体又はその一部、又はレポーターである、請求項６又は７に記載の変異体細胞。
【請求項９】  前記変異体細胞が１又は複数の第３核酸配列の１又は複数の修飾をさらに含んで成り、ここで前記修飾が前記１又は複数の第３核酸配列の発現を低めるか又は排除する請求項６〜８のいずれか1項に記載の変異体細胞。
【請求項１０】  前記１又は複数の第３核酸配列が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターぜ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼから成る群から選択された酵素を独立してコードする、請求項９に記載の変異体細胞。
【請求項１１】  請求項６〜10のいずれか１項記載の変異体細胞を得るための方法であって、
（a）トリコテセンの生成を担当する少なくとも１つ遺伝子の修飾を含んで成る核酸配列を、親糸状菌細胞中に導入し；そして
（b）同じ条件下で培養される場合、前記変異体細胞の親糸状菌細胞よりもトリコテセンを低く生成する変異体を、前記段階（a）から同定することを含んで成る方法。
【請求項１２】  トリコジエンシンターゼをコードする単離された核酸であって、当該トリコジエンシンターゼが、
（a）配列番号２アミノ酸配列を含んであるトリコジエンシンターゼ；
（b）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、トリコジエンシンターゼの変異体；
（c）上記（a）又は（b）の対立遺伝子変異体；及び
（d）トリコジエンシンターゼ活性を有する、（a）又は（c）のフラグメント；
から成る群から選択される、トリコジエンシンターゼをコードする核酸。
【請求項１３】  変異体細胞を得るための方法であって、
（a）第１遺伝子生成物をコードする第１核酸配列を有する親細胞中に、選択マーカーとしての硝酸レダクターゼ遺伝子及び前記第１核酸配列の修飾体を含んで成る第１核酸構造体を導入し、前記修飾された第１核酸配列により前記内因性第１核酸配列が置換され、ここで前記第１構造体が親細胞のゲノム中に組み込まれ、同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、前記第１遺伝子生成物の低められた生成をもたらし；そして
（b）前記硝酸レダクターゼ遺伝子の存在、及び前記第１遺伝子生成物の低められた生成について、段階（a）から変異体細胞を選択する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１４】  （c）硝酸レダクターゼ遺伝子が欠失されている培養条件下で段階（b）からの変異体細胞を選択することをさらに含んで成る、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】  （c）段階（b）からの変異体細胞中に、修飾された第１核酸配列の5’及び3’側領域を含んで成る第２核酸配列を含んで成るが、しかし硝酸レダクターゼ遺伝子を欠いている第２核酸構造体を導入し、ここで前記第２構造体が親細胞のゲノム中に組み込まれ、前記第２核酸配列により前記修飾された第１核酸配列が置換され；そして
（d）硝酸レダクターゼ遺伝子が欠失されている培養条件下で段階（c）からの変異体細胞を選択する；
ことをさらに含んで成る請求項13記載の方法。
【請求項１６】  請求項13〜15のいずれか１項に記載の方法により得られる変異体細胞。
【請求項１７】  ポリペプチドの製造方法であって、
（a）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る請求項16に記載の変異体細胞を、前記ポリペプチドの生成を助ける条件下で培養し；そして
（b）前記変異体細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１８】  細胞に含まれる標的核酸配列中に変更を導入するための方法であって；
（a）マーカーカセットを形成するために、ヌクレオチド配列反復体を末端に有する硝酸レダクターゼ選択マーカー遺伝子を含んで成る核酸構造体を、親細胞中に導入することによって親細胞の変異体細胞を得、ここで前記反復体は標的DNAの5’側に隣接するヌクレオチド配列又は3’側に隣接するヌクレオチド配列から成り；そしてさらに、
前記端に接するヌクレオチド配列反復体が標的DNAの5’側ヌクレオチド配列から成る場合、前記核酸構造体がさらに、前記マーカーカセットの3’側に、且つそのカセットに隣接して、前記標的DNA配列の3’側のヌクレオチド配列から成る追加のヌクレオチド配列を含んで成り；そして
前記端に接するヌクレオチド配列反復体が標的DNAの3’側ヌクレオチド配列から成る場合、前記核酸構造体がさらに、前記マーカーカセットの5’側に、且つそのカセットに隣接して、前記標的DNA配列の5’側のヌクレオチド配列から成る追加のヌクレオチド配列を含んで成り；
（b）前記硝酸レダクターゼ遺伝子の存在について選択することによって、段階（a）から変異体細胞選択し；
（c）前記選択された変異体細胞を、前記端に接するヌクレオチド配列反復体間での組換えによる前記硝酸レダクターゼ遺伝子の欠失をもたらす条件下で培養し；そして
（d）前記硝酸レダクターゼ遺伝子が前記変異体細胞から欠失されている標的核酸配列における変更を有する変異体細胞を選択する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】  請求項18に記載の方法により得られる変異体細胞。
【請求項２０】  ポリペプチドを生成するための方法であって、
（a）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る請求項19に記載の変異体細胞を、前記ポリペプチドの生成を助ける条件下で培養し；そして
（b）前記変異体細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る方法。