【手続補正書】
【提出日】平成18年10月13日(2006.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  特異的に修飾されたＴＰＳ遺伝子の構成的、誘導的および／または器官特異的な発現を示す、植物、動物、真菌類などから選択される真核生物の調製方法であって、
ａ）ＴＰＳ遺伝子を準備し、
ｂ）ＴＰＳ遺伝子に対する適切な修飾を、該遺伝子を酵母の対応遺伝子と並べることにより設計し、そして遺伝子のどの部分が酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するかを確証し、
ｃ）トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性の増加を達成するために、酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するＴＰＳ遺伝子のＮ末領域の部分、好ましくはその完全な伸張部分を欠失または不活化し、
ｄ）修飾遺伝子を発現ベクターに構成的、誘導的および／または器官特異的なプロモーターの制御下にクローニングし、
ｅ）得た発現ベクターでもって植物の細胞または組織を形質転換し、
ｆ）形質転換した植物の細胞または組織から完全な植物を再生せしめる、
工程を含む方法。
【請求項２】  酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するＴＰＳ遺伝子のＮ末領域の部分を変異生成により不活性化する、請求項１の方法。
【請求項３】  ＴＰＳ遺伝子が植物由来の遺伝子である、請求項１または２の方法。
【請求項４】  ＴＰＳ遺伝子が Selaginella lepidophylla 由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項５】  ＴＰＳ遺伝子が Arabidopsis thalliana 由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項６】  ＴＰＳ遺伝子がコメ由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項７】  ＴＰＳ遺伝子がリンゴ由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項８】  ＴＰＳ遺伝子がサトウダイコン由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項９】  ＴＰＳ遺伝子がヒマワリ(Helianthus annuus)由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項１０】  ＴＰＳ遺伝子がタバコ(Nicotiana tabacum)由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項１１】  ＴＰＳ遺伝子がダイズ(Glycine max)由来の遺伝子である、請求項３の方法。
【請求項１２】  形質転換される真核生物が植物である、請求項１または２の方法。
【請求項１３】  植物が Selaginella lepidophylla、Arabidopsis thalliana、コメ、リンゴ、サトウダイコン、ヒマワリ(Helianthus annuus)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ダイズ(Glycine max)より選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】  形質転換される真核生物が真菌類である、請求項１または２の方法。
【請求項１５】  真菌がAspergillus niger、Agaricus bisporus、Pictia pastoris、Kluyveromyces lactis、メチロトローフ酵母である、請求項１４の方法。
【請求項１６】  形質転換される真核生物が動物である、請求項１または２の方法。
【請求項１７】  動物が、タンパク質および低分子の生産に使用される哺乳動物および無脊椎動物の細胞培養物、およびバキュロウイルス発現に使用される無脊椎動物の細胞から選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】  植物の全体または特殊な部分において増加された光合成生産能および／または改善された炭素分配および／または形態的または発育的変化を有し、そのゲノム中に請求項１または２に定義の特異的に修飾されたＴＰＳを保持する植物。
【請求項１９】  請求項１−１３いずれかの方法により得られうる、請求項１８の植物。
【請求項２０】  請求項１８および１９いずれかの植物に由来する種子。
【請求項２１】  請求項２０の種子から得られた植物。
【請求項２２】  請求項１８、１９および２０いずれかの植物からの子孫。
【請求項２３】  改善された発酵能を有し、そのゲノム中に請求項１または２に定義の特異的に修飾されたＴＰＳ遺伝子を保持する真菌類。
【請求項２４】  改善された発酵能を有し、そのゲノム中に請求項１または２に定義の特異的に修飾されたＴＰＳ遺伝子を保持する真菌類。
【請求項２５】  細菌由来のホスホトレハラーゼを補助酵素として使用してトレハロース−６−ホスフェートを測定する方法。
【請求項２６】  細菌が Bacillus subtilis である、請求項２５の方法。
【請求項２７】  細菌が Escherichia coli である、請求項２５の方法。
【請求項２８】  A. thaliana または S. cerevisiae 由来のＴＰＳ１およびＴＰＳ２からのＴＰＳとＴＰＰとのドメイン間のキメラＤＮＡ構築体。
【請求項２９】  図１３に示す請求項２８のキメラＤＮＡ構築体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
ａ）ＴＰＳ遺伝子を準備し、
ｂ）ＴＰＳ遺伝子に対する適切な修飾を、該遺伝子を酵母の対応遺伝子と並べることにより設計し、そして遺伝子のどの部分が酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するかを確証し、
ｃ）トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼ活性の増加を達成するために、酵母遺伝子の５’末端を越えて伸張するＴＰＳ遺伝子のＮ末領域の部分、好ましくはその完全な伸張部分を欠失または不活化し、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
ｆ）工程ｅ）で産生されたグルコースを、産生されたグルコース−６−ホスフェートおよび残留の糖ホスフェートから、好ましくは２回目のアニオン交換カラムにより分離すること、
ｇ）グルコースの存在を、好ましくはグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ検定法により測定すること。
測定したグルコースレベルは、細胞抽出物中に元々存在するトレハロース−６−ホスフェートのレベルと等しい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
形質転換する他の真核生物は、真菌、動物、動物細胞である。ＴＰＳ活性の増加に有益な真菌の例として、Aspergillus niger、Agaricus bisporus、Pictia pastoris、Kluyveromyces lactis、メチロトローフ酵母がある。酵母の例は Saccharomyces cerevisiae である。動物細胞は、例えば、タンパク質および低分子の生産に使用される哺乳動物および無脊椎動物の細胞培養物、およびバキュロウイルス発現に使用される無脊椎動物の細胞である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
トレハロースの定量のために、トレハラーゼ４μｌ（約１５ｍＵ）を該抽出物１０ないし３０μｌに加え（シグマ・カタログＮｏ．Ｔ−８７７８）、３０℃で２時間培養した。負対照として、抽出物を入れたが、トレハラーゼは入れなかったチューブを用い、正対照としては、純トレハロース（シグマ・カタログＮｏ．Ｔ−３６６３）を入れたチューブを用いた。５０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７.０）により容量を０.５ｍｌとし、シグマ・キット（カタログＮｏ．５１０−Ａ）からのグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ０.５ｍｌ加えて、グルコースを定量した。インキュベーションは３７℃で４０分間とし、４２５ｎｍでの吸光度を直ちに測定した。グルコース濃度を計算するために、０ないし７５ｍＭ間の値での標準グルコース曲線を用いた。トレハラーゼを入れていないチューブの値をこの酵素で処理した値から差引き、グルコース１モルがトレハロース１／２モルであることを考慮して、トレハロースの量を計算した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
実施例２
構築体の調製
１．植物ＴＰＳ遺伝子を含む酵母発現ベクターの構築
完全長Ｓ１ＴＰＳ１遺伝子を含む３.１ｋｂの断片は、エキスパンド・ハイ−フィデリティ（Expand High-fidelity) ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー；Boehringer）によるＰＣＲ（９４℃、３分、１サイクル；９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、２分、４０サイクル；７２℃、１０分、１サイクル）により増幅して得た。オリゴヌクレオチドとして、ＳＬＴＰＳ−Ｓ１（
【表１】
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、太字は開始コドンを示し、下線はＮcoＩ部位を示す）および共通（
【表２】
2002537759.tif 000002
）プライマーを鋳型としてのｐブルースクリプトＳＫにクローン化したＳ１−ＴＰＳ１ｃＤＮＡと共に使用した。ＰＣＲ−断片をＮcoＩおよびＫpnＩで消化し、ｐＳＡＬ４にクローン化した。酵母ｔｐｓ１Δおよびｔｐｓ１Δｔｐｓ２Δ変異株を形質転換し、ＳＤＧal（−ｕｒａ）プレート上で選択した。相補性はＳＤＧ１ｃ（−ｕｒａ最少培地プラス１００μＭ−ＣuＳＯ４）にて検定した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
抽出液１０μｇを７.５％ＰＡＧＥゲルで泳動させた。ブロッティング後、ニトロセルロース膜を、２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（５×ＴＢＳ：６ｇのトリス＋４５ｇのＮaＣl、ｐＨ７.４；ＴＢＳＴ＝１×ＴＢＳ＋０.０５％トゥイーン２０）中１時間インキュベートした。次いで、濾紙を２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴに１：１０００に希釈した抗ＨＡ抗体（抗ＨＡ高親和性、ラットモノクローナル抗体クローン３Ｆ１０，ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim)）と１時間インキュベートした。濾紙をＴＢＳＴ中３×５分洗浄し、次いで、２％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴに１：２００００に希釈した第二抗体（シグマ（Sigma）Ａ−６０６６；抗−ラット）と４５分間インキュベートした。次いで、濾紙をＴＢＳＴ中３×５分洗浄した。その後、濾紙をＴＢＳ中で５分間洗浄した。アルカリホスファターゼ顕色混合物（１０ｍｌの１００ｍＭトリス、ｐＨ９.５；５０ｍＭＭgＣl２；１００ｍＭ−ＮaＣl、３７.５μｌＸ−ホスフェート塩および５０μｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ））を濾紙に加え、バンドが見えるようになったところで水を加えて反応を停止させた。結果を図１１に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
高度に安定した発現を得るために、遺伝子を、強いＩＰＴＧ誘発性ｔａｃプロモーターの後方にｐＣＹＢ１ベクター(New England Biolabs)内でクローン化した。ｔｒｅＡ遺伝子を、プライマーＣＶＶ５
【表１８】
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およびプライマーＣＶＶ６
【表１９】
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でポリメラーゼ連鎖反応増幅し、ＰＣＲ産物の各末端にＡｓｅＩおよびＳａｐＩ制限部位をそれぞれ導入し、ｐＣＹＢ１プラスミド内でクローンし、ｐＣＶＶ１と名付けた(図７)。’および ，は、制限酵素の挿入部分を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
１.７  ホスホトレハラーゼ反応の条件
報告で最も望ましいとされるｐＨ４または５の場合に、酵素が不安定であったので、より生理学的なｐＨ７を選んでインキュベーションを実行した。インキュベションのための緩衝剤を５０ｍＭ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ緩衝剤(ｐＨ７)とした。インキュベーション中の温度を３７℃とした。２０００Ｕのホスホトレハラーゼを加え、サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。１ユニットは酵素の量であって、上記の条件下で１分間につき１ｎｍｏｌのＴｒｅ６Ｐを加水分解する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
実施例１２
酵母ｔｐｓ１Δ菌株におけるＮ末欠失植物ＴＰＳ１遺伝子の発現は、グルコース上での増殖を回復させるが、糖ホスフェートの過剰蓄積を抑制しない
S.cerevisiaeにおけるＴＰＳ１欠失は、結果として多面発現表現型をもたらす(Van Aelst t al., Mol. Microbiol., 8, 927-943)。表現型の１つは、急速に醗酵可能な糖類上でもはや成長できないような菌株である。なぜｔｐｓ１Δがグルコース上で成長できないのかまだ明らかではない。３つの異なる仮説が提示されている(Hohmann and Thevelein, Trends in Biol. Sciences, 20, 3-10, 1995)。ｔｐｓ1Δ菌株をグリセロールからグルコース含有の培養基に移行させた場合、糖ホスフェートの急速な蓄積とＡＴＰ濃度の急速な降下が起きる。明らかに、ＴＰＳ１遺伝子は、グルコースの糖分解機構への流入を制御する機能を持っている。輸送とリン酸化は共役しているので、細胞に流入するあらゆる糖類はリン酸化される。Ｈｘｋ２の活性を減退させることで、グルコースおよびフルクトース上でｔｐｓ１Δ菌株の増殖欠陥表現型を抑制できる(Hohmann et al., Current genetics 23, 281-289, 1993)。 インビトロ研究により、Ｔｐｓ１タンパク質の産物、すなわちトレハロース-６-ホスフェートがＨｘｋ２の活性を阻害し、そのようにしてグルコースの糖分解機構への流入を制御できることが明らかになった。