【手続補正書】
【提出日】平成18年5月8日(2006.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のハプロタイプを決定する方法であって、該方法は、該被験体由来の伸長ポリヌクレオチドを提供する工程であって、該ポリヌクレオチドが、少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーで各々同じように標識される複数の標的部位を含み、ここで、該少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーは、該被験体のハプロタイプについての情報を提供する、工程；
静止検出ステーションに関連してポリヌクレオチドを移動し、そして該検出ステーションで該複数の標識された部位を検出することにより、被験体のハプロタイプを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
少なくとも第１の集団および少なくとも第２の集団を含んでいる核酸のプールの中の核酸の１集団のハプロタイプを決定する方法であって、該方法が、以下：
伸長ポリヌクレオチドのプールを提供する工程であって、ここで、１集団のポリヌクレオチドが、少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーで各々同じように標識された複数の標的部位を含み、ここで、該少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーが、該プールのハプロタイプについての情報を提供し、さらにここで、該標的部位が、選択された遺伝子マーカーである、工程；
静止検出ステーションを過ぎて、該プールのポリヌクレオチドを移動する工程；
該標識された部位を静止検出ステーションで検出する工程；ならびに
検出器のそばを該ポリヌクレオチドが通るときに、該標識された部位を測定し、それによって、該プール中のポリヌクレオチドの種のハプロタイプを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、標的部位は、一ヌクレオチド多型、多塩基欠失、多塩基挿入、マイクロサテライト繰り返し、ジヌクレオチド繰り返し、トリヌクレオチド繰り返し、配列再編成、およびキメラ配列からなる群から選択される塩基配列バリエーションである、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、第１および第２のユニット特異的マーカーは、識別可能な特徴を有する発光ハイブリダイゼーションプローブである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、識別可能な特徴は、発光放出スペクトル分布、寿命、強度、バースト持続時間、および偏光異方性からなる群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、ここで、発光ハイブリダイゼーションプローブは、単一色素分子、エネルギー移動色素対、ナノ粒子、量子ドット、発光ナノ結晶、インターカレート色素、または分子ビーコンを含む、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、各々の発光ハイブリダイゼーションプローブが、複数の標的部位のうちの１つに特異的にハイブリダイズする、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、発光ハイブリダイゼーションプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックされた核酸、およびペプチド核酸からなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法であって、第３のユニット特異的マーカーをさらに含み、ここで、該第３のユニット特異的マーカーが、被験体またはプールのハプロタイプについての情報を提供する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、第４のユニット特異的なマーカーをさらに含み、ここで、該第４のユニット特異的マーカーは、被験体またはプールのハプロタイプについての情報を提供する、方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、ユニット特異的マーカーは、各々の標的に特異的である単一のプローブ、または標的を同定するために一緒に作用する複数のプローブである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、単一のプローブが、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、オリゴビーコン、オリゴペプチド核酸、オリゴロックされた核酸、およびキメラオリゴからなる群から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、複数のプローブが、ハイブリダイゼーション対、インベーダーオリゴ対、ライゲーションオリゴ対、ミスマッチ伸長５’−エキソヌクレアーゼオリゴ対、エネルギー移動オリゴ対、および３’−エキソヌクレアーゼ対からなる群から選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、ポリヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡである、方法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、静止検出ステーションは、アバランシェフォトダイオードまたは電荷結合素子と光連絡される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、ポリヌクレオチドが、少なくとも一つの分子モータの作動で移動する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、少なくとも一つの分子モータが、溶液中の複数の分子モータである、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、ポリヌクレオチドが、流体力学的力の動作で移動する、方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、検出ステーションが、少なくとも一つのドナー蛍光団を含み、そしてここで、第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーが各々少なくとも１つのアクセプター蛍光団を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、検出ステーションが、少なくとも一つのアクセプター蛍光団を含み、そしてここで、第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーが各々少なくとも１つのドナー蛍光団を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、検出ステーションが、蛍光共鳴エネルギー移動を検出する、方法。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、ポリヌクレオチドの分析が、該ポリヌクレオチドの内の標的部位の線形配置についての情報を提供する、方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、検出ステーションが、同時にポリヌクレオチドの複数の標的部位を検出する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、ユニット特異的マーカーが、共焦点顕微鏡によって検出される、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、複数の部位が、異なる色の発光ハイブリダイゼーションプローブを用いて各々の該複数の部位を標識することによって区別される、方法。
【請求項２７】
被験体のハプロタイプを決定する方法であって、該方法が、少なくとも一つの識別可能なユニット特異的マーカーで各々標識される複数の選択された遺伝子マーカーを含む、該被験体由来の伸長ポリヌクレオチドを、チャネルを通して移動する工程であって、ここで、該複数の選択された遺伝マーカーが、該被験体のハプロタイプについての情報を提供する、工程；
該ユニットが該検出ステーションに対して移動する場合に、該複数の標識された選択された遺伝マーカーを検出ステーションに暴露する工程であって、ここで、該複数の部位が、該検出ステーションと相互作用して、該チャネル内または該チャネルの縁部で検出可能シグナルを生じる、工程；および
該相互作用から生じる該シグナルを連続的に検出して、該ポリヌクレオチドを分析し、それによって、被験体のハプロタイプを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、検出ステーションが、電磁放射線、クエンチング供給源および蛍光励起源からなる群から選択される因子を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、因子が、蛍光励起供給源を含み、そして第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーが、蛍光ハイブリダイゼーションプローブを含む、方法。
【請求項３０】
請求項２に記載の方法であって、ここで、第１の集団が、１つの個体からのポリヌクレオチドを含み、そして、第２の集団が、異なる個体からのポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３１】
請求項２に記載の方法であって、ここで、第１の集団が、被験体の健康状態からのポリヌクレオチドを含み、そして、第２の集団が、同じ被験体の疾患状態からのポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３２】
被験体のハプロタイプを決定する方法であって、該方法が、以下：
ポリヌクレオチド、第１のライゲーションオリゴヌクレオチドおよび第２のライゲーションオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで、該第１のライゲーションオリゴヌクレオチドが、第１の標識された部分と関連し、そして該被験体におけるハプロタイプついての情報を提供する標的ポリヌクレオチドの配列と相補的な第１の一定の配列、該第１のライゲーションポリヌクレオチドの３’末端の問い合わせヌクレオチド、および必要に応じて、該問い合わせヌクレオチドに隣接したミスマッチオリゴヌクレオチドを提供し、そして、ここで該第２のライゲーションオリゴヌクレオチドが、第２の標識された部分と関連し、そして該被験体におけるハプロタイプついての情報を提供する標的ポリヌクレオチドの配列と相補的な第２の一定の配列、該第２のライゲーションポリヌクレオチドの３’末端の問い合わせヌクレオチド、および必要に応じて、該問い合わせヌクレオチドに隣接したミスマッチオリゴヌクレオチドを提供する、工程；
有効量の該第１のライゲーションオリゴヌクレオチドを該ポリヌクレオチドにアニールして、プライムされた第１のテンプレートを得る工程；
ポリメラーゼ活性に充分な条件下で、プライムされたテンプレートと有効量のポリメラーゼ酵素および少なくとも２つの型のヌクレオチド三リン酸と組み合わせて、それによって、第１の伸長ポリヌクレオチドを形成する工程；
有効量の該第２のライゲーションオリゴヌクレオチドを該ポリヌクレオチドにアニールして、プライムされた第２のテンプレートを得る工程；
ポリメラーゼ活性に充分な条件下で、プライムされた第２のテンプレートと有効量のポリメラーゼ酵素および少なくとも２つの型のヌクレオチド三リン酸と組み合わせて、それによって、第２の伸長ポリヌクレオチドを形成する工程；
該伸長された第１のポリヌクレオチドおよび該伸長された第２のポリヌクレオチドを伸長する、工程；ならびに
該第１の標識された部分および第２の標識した部分を検出して、それによって、ハプロタイプを決定する工程、
を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、任意の核酸（例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡまたはＰＣＲ増幅ＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ）を分析するために使用され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、核酸プール中の核酸集団のハプロタイプを決定する方法を含み、この核酸集団は少なくとも第１の核酸集団および少なくとも第２の核酸集団を含み、ここでこの方法は、伸長ポリヌクレオチドのプールを提供する工程であって、ここでこの集団中のポリヌクレオチドは、複数の標的部位を含み、これらの標的部位の各々は、少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーで同様に標識され、そしてここでこの少なくとも第１のユニット特異的マーカーおよび第２のユニット特異的マーカーは、このプールにおけるハプロタイプに関する情報を提供し、さらにここで、この標的部位は、選択された遺伝マーカーである、工程；このプールのポリヌクレオチドを固定検出ステーションに通過させる工程；この固定検出ステーションで、この蛍光ハイブリダイゼーションプローブを検出する工程；ならびに、このポリヌクレオチドが検出器を通過した場合、この蛍光プローブを測定し、それによりこのプール中のポリヌクレオチドの種のハプロタイプを決定する工程、を包含する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
さらなる実施形態において、核酸の集団は、プール中のハプロタイプについての情報を提供する第３のユニット特異的マーカーを含む。さらなる実施形態において、核酸の集団は、プール中のハプロタイプについての情報を提供する第４のユニット特異的マーカーを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド、第１のライゲーションオリゴヌクレオチドおよび第２のライゲーションオリゴヌクレオチドを提供することにより、被験体のハプロタイプを決定する方法を包含し、ここで第１のライゲーションオリゴヌクレオチドは、第１の標識化された部分と結合され、前記被験体におけるハプロタイプについての情報を提供する標的ポリヌクレオチド、前記第１のライゲーションポリヌクレオチドの３’末端での問い合わせヌクレオチド、および、必要に応じて、問い合わせヌクレオチドに隣接するミスマッチオリゴヌクレオチドにおける配列に相補性の第１の定常配列を含む。第２のライゲーションオリゴヌクレオチドは、第２の標識化された部分と結合され、前記被験体におけるハプロタイプについての情報を提供する標的ポリヌクレオチド、前記第２のライゲーションポリヌクレオチドの３’末端での問い合わせヌクレオチド、および、必要に応じて、問い合わせヌクレオチドに隣接するミスマッチオリゴヌクレオチドにおける配列に相補性の第２の定常配列を含む。有効量の第１のライゲーションオリゴヌクレオチドが、ポリヌクレオチドにアニールされ、プライムされた第１のテンプレートを生じ、このテンプレートは、ポリメラーゼ活性のために十分な条件の下で、有効量のポリメラーゼ酵素および少なくとも２つの型のヌクレオチドトリホスフェートと組み合わされ、それにより、第１の延長されたポリヌクレオチドを形成する。有効量の第２のライゲーションオリゴヌクレオチドが、ポリヌクレオチドにアニールされ、プライムされた第２のテンプレートを生じ、このテンプレートは、ポリメラーゼ活性のために十分な条件の下で、有効量のポリメラーゼ酵素および少なくとも２つの型のヌクレオチドトリホスフェートと組み合わされ、それにより、第２の延長されたポリヌクレオチドを形成する。延長された（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）第１のオリゴヌクレオチドおよび延長された（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）第２のオリゴヌクレオチドは、伸長される（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）；そして第１の標識化された部分および第２の標識化された部分は、検出される。これにより、ハプロタイプを決定する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本明細書中で記載される核酸分析を使用して、ポリマーの個々のフラグメントに対する多重プローブのハイブリダイゼーションパターンを分析することにより、ＤＮＡフラグメントを同定し得る。ＤＮＡの未知のフラグメントに結合される多重プローブの数、型、順序およびプローブ間の距離が、決定され得る。この情報を使用して、差示的に発現された遺伝子の数を明白に同定し得る。さらに、本発明の方法は、特定の発現された遺伝子の実際の数を厳密に定量し得る。大量の情報が生成した場合、本発明の方法は、発現した遺伝子の選択もアッセイされるべき未知の核酸の選択も必要としない。本発明の方法は、生成したハイブリダイゼーションパターンのコンピューター分析により未知の発現された遺伝子を同定し得る。次いで、ＤＮＡプローブの段階的分析（ｌｉｎｅａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）から得られたデータを、データベースにおける情報と適合して、標的ＤＮＡの組成または同一性を決定する。このように、本方法を使用して、ハプロタイプを決定し得、ハイブリダイゼーション反応からの情報を分析し得、次いで、この方法は、遺伝子発現パターンの診断および決定に適用され得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
トリプレットを用いる方法などは、ユニット特異的マーカーは、連続的に実施される必要はない。例えば、いくつかのトリプレットは同時にアッセイされ得、なおより迅速な分析の方法を提供する。同時分析における唯一の制限は、用いられるトリプレットユニット特異的マーカーのいずれもが、互いに重複すべきではないことである。従って、１つの特定のトリプレット配列の選択は、その配列と重複し得るトリプレット配列の同時使用を除外する。例えば、トリプレット配列ＡＣＧが分析のために選択される場合、６４セットのトリプレットのうちの４が、このトリプレットを用いる同時分析の間で用いられないかも知れない。これらは、ＸＸＡ、ＸＡＣ、ＧＸＸ、およびＣＧＸを含む。数学的には、トリプレット標識がそれとの同時プロービングを除外し得るフラグメントの最大数は、以下の等式によって決定される：
２［σ４２＋４１］または一般に２［σ４ｎ−１＋４ｎ−２］
ここで、ｎは、標識によってまたがられるヌクレオチドの数である。合計は、当初に選択されたＡＣＧトリプレットでの同時アッセイから最大で４０フラグメントが除外される。従って、合計で２４の異なるフラグメントが一度にアッセイされ得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
分子モーターとして供され得る蛍光標識酵素とタンパク質との複合体の調製は、当該分野で周知である。酵素上の複数のアミン、カルボキシル、およびスルフヒドリル部位の利用可能性は、標識のこれら分子への結合を簡単にする。多くのタンパク質は、官能化され、活性の損失なくして蛍光誘導体を生成し、これには、例えば、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アクチン、およびミオシンを含む。分子モーターは、類似の様式で、機能的活性を損失することなく容易に誘導体化され得る。さらに、米国特許第６，３５５，４２０号に記載のような当該分野で公知の方法を用いて標識がポリマー中に取り込まれ得る。例えば、標識は、市販され利用可能なヌクレオチドまたはアミノ酸ポリマーを用いるか、または一級アミノ基に連結され得るスクシンイミジルエステル誘導体としてポリマー中に取り込まれ得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
ポリマー依存性インパルスを検出するために用いられる方法は、生成される物理量のタイプに依存する。例えば、物理量が電磁放射である場合、ポリマー依存性インパルスは、光学的に検出される。本明細書で用いられるとき、「光学的に検出可能な」ポリマー依存性インパルスは、光検出造影システムによって検出され得る電磁放射の形態にある光を基礎にしたシグナルである。この物理量が化学的コンダクタンスであるとき、このポリマー依存性インパルスは、化学的に検出される。「化学的に検出される」ポリマー依存性インパルスは、化学的コンダクタンスを測定するための標準的な手段によって検出され得るイオンコンダクタンスのような化学的濃度または電荷における変化の形態にあるシグナルである。この物理量が電気的シグナルである場合、このポリマー依存性インパルスは、抵抗または静電容量における変化の形態にある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
本明細書中で使用される場合、「チャネル」は、ポリマーが通過し得る、媒体を通る通路である。チャネルは、ポリマーがこれを通過し得る限り、任意の寸法を有し得る。例えば、チャネルは、非分枝性の直線的な円筒形のチャネルであり得るか、またはチャネルは内部連絡された曲がりくねったチャネルの分枝性のネットワークであり得る。好ましくは、チャネルは直線的なナノチャネルかまたはマイクロチャネルである。本明細書中で使用される場合、「ナノチャネル」は、ナノメートルのオーダーの寸法を有するチャネルである。ナノチャネルの平均径は１ｎｍと９９９ｎｍとの間である。本明細書中で使用される場合、「マイクロチャネル」は、マイクロメートルのオーダーの寸法を有するチャネルである。マイクロチャネルの平均径は、１μｍと１ｍｍとの間である。本発明に従う、有用なチャネルの好ましい仕様および寸法は、以下に詳細に記載される。好ましい実施形態において、チャネルは壁の中に固定される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
【図１】図１は、単一分子分析を使用するフラグメントハプロタイプ化の概略的な表示である。（１）標的ＤＮＡの増幅；（２）種々の対立遺伝子に独特なＤＮＡ配列に相補的な検出可能に標識化されたプローブのハイブリダイゼーション；（３）ＤＮＡ配列上の標識化部分および位置を検出するセンサーによる、伸長され、通過した標識化ＤＮＡの検出；（４）検出される標識の量およびそれが検出される位置を描写するセンサーからの読み出し。
【図２】図２は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）をハプロタイプ化する際の長いＰＣＲおよび蛍光塩基の使用の概略図である。４つの異なるハプロタイプが、４つの異なる色の組み合わせで標識される。この図において、異なる組み合わせが、Ｔ（太字）およびＣ（イタリック体）でハプロタイプＡとして、Ｃ（イタリック体）でハプロタイプＢとして；Ｔ（太字）でハプロタイプＣとしてそしてハプロタイプＤとして示される。
【図３】図３は、図２に示されるＳＮＰについてのハプロタイプ化方法の使用からのサンプルアウトプットである。ハプロタイプＡは、チミジン（本明細書でＴとして示される）上の色１で、シトシン（本明細書でＣとして示される）およびインターカラント（ｉｎｔｅｒｃａｌａｎｔ）上の色２で、標識され得る。ハプロタイプＢは、シトシン（本明細書でＣとして示される）およびインターカラント上の色２で、標識され得る。ハプロタイプＣは、チミジン（本明細書でＴとして示される）およびインターカレント上で色１で、標識される。ハプロタイプＤは、インターカレントで標識される。
【図４】図４は、ＳＮＰをハプロタイプ化するためのプライマー伸長４色分析方法を示す概略図である。この概略図において、Ｔは、第１の色（例えば、オレンジ（ＩＲ−長いダッシュ、続く短いダッシュで表される））、Ｃは、第２の色（例えば、赤（Ｒ−長いダッシュ線で表される））で標識され、Ａは、第３の色（例えば、緑（Ｇ−実線で表される））そしてＤＮＡは、第４の色（例えば、青（Ｂ））で標識されるインターカレーターで標識される。このアッセイは、図３で表される３色分析として設定される。
【図５】図５は、蛍光標識されるｄＮＴＰの同じ混合物を使用する相補鎖をアッセイすることによる１つのＤＮＡ鎖についてのハプロタイプ化結果の確認を表す概略図である。
【図６】図６は、３つのＳＮＰ分析において存在する標識組み合わせを表す概略図である。Ｃは、色１（長いダッシュラインで表される）であり、Ｇは、色２（短いダッシュラインで表される）であり、Ｔは、色３（長いダッシュ、続く短いダッシュで表される）であり、そしてＡは、色４（実線で表される）である。
【図７】図７は、図６のスキームと比べた場合、３つのＳＮＰをハプロタイプ化するためのより効果的な標識化スキームを表す概略図である。１つの可能性のある標識化スキームは、Ａであり、ＴおよびＧは、異なる蛍光物質で標識化され、ＳＮＰの二対立遺伝子特質（ｂｉａｌｌｅｉｃ ｎａｔｕｒｅ）は、８つの異なる、可能性のあるハプロタイプを、独特な色のスキームと合わせることを可能にする。
【図８】図８は、５つのハプロタイプ化アッセイのための標識化スキームを表す概略図である。第１の４つのＳＮＰ、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧは、４つの異なる色で標識化される。５番目のＧは、混合物タグ化アプローチ（ｍｉｘｔｕｒｅ ｔａｇｇｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）の使用を介して識別され、この混合物タグ化アプローチにおいて、ｄＧＴＰは、色４で標識化されたｄＧＴＰ（短い破線で表される）および色５で標識化されたｄＧＴＰ（短い２つのダッシュを伴う長いダッシュで表される）の５０／５０の集合で表される。
【図９】図９は、実施されるべき４色分析を可能にする共焦点光学システムである。
【図１０】図１０は、被験体のハプロタイプを特定の表現型で分析するのに使用される工程を示す概略図であり、そして２つの集団における特定のＳＮＰの存在を示すグラフである。
【図１１】図１１は、プールされたハプロタイプの集団を分析するための２つの方法を示す概略図である。上のスキームにおいて、プールされたＤＮＡは、長いＰＣＲを経、続いてｓｓＤＮＡへと変性する。この型の分析において、異なるプローブが、区別して標識化される必要はない。なぜなら、ハプロタイプを同定するために測定されるのは、ＤＮＡ上の位置であるからである。下のスキームにおいて、プールされたＤＮＡは、蛍光プライマーで標識化され、その各々は、特定のＳＮＰに特異的である。次いで、これらのプライマーは、単一分子分析を使用する直接蛍光読出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を介して検出される。
【図１２】図１２は、上部では、２つのＳＮＰの２つの対立遺伝子の配列：Ａ、ａ、Ｂおよびｂを示す概略図である。下部では、概略図は、オリゴを問題のＤＮＡ（上部に示される）にアニール化する方法を示す。
【図１３】図１３は、ＤＮＡについてのＰＣＲ産物を位置Ａでの異なるＳＮＰで区別した標識化を示す概略図である。同じオリゴの区別した標識化を使用して、結果を確かめ得る。左側の状態では、ＩＲＤ８００で標識化されたオリゴは、１つの遺伝子座での「ｂ」ＳＮＰについて特異的であり、ＴＡＭＲＡで標識化されたオリゴは、「Ａ」ＳＮＰについて特異的であり、そしてＣｙ５で標識化されたオリゴは、「ａ」ＳＮＰについて特異的であるかまたはその逆である。右側の状態において、Ｃｙ５で標識化されたオリゴは、１つの遺伝子座での「ｂ」ＳＮＰについて特異的であり、ＴＡＭＲＡで標識化されたオリゴは、「Ａ」ＳＮＰについて特異的であり、そしてＩＲＤ８００で標識化されたオリゴは、「ａ」ＳＮＰについて特異的であるかまたはその逆である。
【図１４】図１４は、同じことがＢ遺伝子座について当てはまることを示す概略図であり、ここで、「Ｂ」ＳＮＰおよび「ｂ」ＳＮＰを検出するために使用されるオリゴは、ＴＡＭＲＡで区別されて標識化される。
【図１５】図１５は、染色なし(上)および臭化エチジウム染色（下）のＴＡＭＲＡ蛍光を示すゲル写真である。レーン１および４において、存在するＳＮＰは、ＴＡＭＲＡで標識化される。ゲル（下）は、ＰＣＲ産物が、テンプレートが存在しており、このテンプレートがただＴＡＭＲＡで標識されていない全ての場合において産生されたことを示す。
【図１６】図１６は、Ｂ遺伝子座と結合されるＴＡＭＲＡ蛍光を示すゲル写真である。
【図１７】図１７は、臭化エチジウム蛍光に対してＴＡＭＲＡ蛍光について写真濃度計で測定されるゲル写真である。
【図１８】図１８は、種々の標識化および異なるＳＮＰ組み合わせの下で蛍光写真濃度計を示す一連のグラフである。
【図１９】図１９は、以前の蛍光写真濃度計の相関分析の結果を示す２つのグラフである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2005537030.tif 000001