【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年10月12日(2006.10.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】      異所性石灰化を阻害する方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含有する、組成物。
【請求項２】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記異所性石灰化が、アテローム性動脈硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および老化からなる群から選択される状態と関連する、組成物。
【請求項３】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンが、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、組成物。
【請求項４】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与するために処方される、組成物。
【請求項５】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、前記異所性石灰化の部位に投与するのに適している、組成物。
【請求項６】  請求項５に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項７】  請求項６に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項８】  請求項６に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項９】  請求項６に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを発現する細胞の、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項１０】  請求項９に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを組換え発現する、組成物。
【請求項１１】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、ヒドロキシアパタイト結晶に結合しそして鉱化作用を阻害するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項１２】  請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、局所的な微小環境を酸性化しそして鉱化作用を阻害するように細胞を刺激するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項１３】  請求項１２に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、炭酸脱水酵素ＩＩを発現する、組成物。
【請求項１４】  請求項１３に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項１５】  請求項１３に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、マクロファージである、組成物。
【請求項１６】  異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量のマクロファージを含有し、該有効量のマクロファージが、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項１７】  請求項１６に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、炭酸脱水酵素ＩＩを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項１８】  請求項１６に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記マクロファージによる前記局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項１９】  請求項１６に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項２０】  請求項１９に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項２１】  異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量の多核性異物巨細胞を含有し、該有効量の多核性異物巨細胞が、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項２２】  請求項２１に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、炭酸脱水酵素ＩＩを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項２３】  請求項２１に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記多核性異物巨細胞による局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項２４】  請求項２１に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項２５】  請求項２４に記載の組成物であって、ここで前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項２６】  異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位に対して酸生成細胞を補充するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、該異所性石灰化の部位で該酸生成細胞が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項２７】  請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が炭酸脱水酵素ＩＩを発現する、組成物。
【請求項２８】  請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞がマクロファージである、組成物。
【請求項２９】  請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項３０】  異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位で炭酸脱水酵素ＩＩの発現を増加するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、ここで、該異所性石灰化の部位での該炭酸脱水酵素ＩＩの発現が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項３１】  請求項３０に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素ＩＩが、多核性異物巨細胞により発現される、組成物。
【請求項３２】  請求項３０に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素ＩＩが、マクロファージにより発現される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（異所性石灰化を阻害する方法）
本発明は、国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）より授与された助成金番号ＨＬ４００７９−６Ａ２およびＨＬ１８６４５、ならびに全米科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）により授与された助成金番号ＥＥＣ９５２０１６１の下で政府の援助によりなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に医学分野、そしてより特異的には異所性石灰化を阻害する方法に関する。
【０００３】
（背景情報）
歯または骨以外の組織でのカルシウムの結晶の沈着とは、異所性石灰化と言われ、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病および加齢過程と関連して一般的に生じる。腎不全を有する患者、特に長期の血液透析を受け、そして血清の鉱物バランスを適切に調節し得ない患者において、肺、心臓、胃および腎臓を含む内部器官における石灰化が頻繁に見出される。より低い程度で一般的に、血液透析の患者は、有痛性の石灰化した皮膚病変を発生し、その皮膚病変は、非治癒性の潰瘍または壊疽に進行し、そして罹患した肢の切断を必要とする。
【０００４】
異所性石灰化はまた、生体人工心臓弁の移植の通常の合併症であり、そして置換弁不全の主要な原因である。異所性石灰化はまた、アテローム硬化症、糖尿病および心臓血管の疾患に関連して天然の心臓弁および血管に生じる。脈管構造における鉱物の沈着は、口を狭くし、そして罹患した弁および血管の壁を硬化し、心臓および末梢器官への血流の減少を生じる。従って、異所性石灰化は、弁不全、発作、虚血および心筋梗塞の危険を増大する。
【０００５】
異所性石灰化の部位において（例えば、アテローム硬化症プラークおよび石灰化した大動脈弁において）、豊富な１つのタンパク質は、オステオポンチンである。オステオポンチンは、細胞の接着、伝播、および移動の促進を含むいくつかの既知の機能を有する。オステオポンチンは、冠状アテローム硬化症プラークにおける初期の石灰化の部位と共存し、そして、その発現は、アテローム硬化症が進行するにつれて増加する。これらの知見は、インビトロでのオステオポンチンがカルシウム結合特性を有することを示す研究と組み合わされ、オステオポンチンが異所性石灰化に関与し得るという示唆を導いた。以前の研究は、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割に取り及んでいない。
【０００６】
未処置で放置される場合、異所性石灰化は、罹患率および死の増加を生じる。血清の鉱物レベルを正規化するための、または血管組織または移植片の石灰化を阻害するための現在の治療は、効力が制限され、そして受容可能でない副作用を引き起こす。
【０００７】
従って、異所性石灰化を阻害する有効な方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を充たし、そして関連する利点もまた提供する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、個体において異所性石灰化を阻害する方法を提供する。この方法は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、種々の条件（例えば、アテローム硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および加齢）に関連する異所性石灰化を阻害するために使用され得る。本発明はまた、異所性石灰化の部位に対して標的化された個体の酸生成細胞への投与によって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、オステオポンチンの投与によって、異所性石灰化の部位に対する酸生成細胞の補充を促進する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はまた、オステオポンチンの投与により異所性石灰化の部位での炭酸脱水酵素ＩＩの発現を増加する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、異所性石灰化の阻害のための有効な方法に関する。異所性石灰化は、通常、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病、および加齢過程に関連して生じる。脈管構造の異所性石灰化は、心筋梗塞、虚血、発作、血管形成術後の切開および心臓弁不全の個体の危険性を増大する。生体人工心臓弁のようなプロテーゼ移植片の異所性石灰化は、移植片不全の主要な原因である。ゆえに、この方法は、異所性石灰化に関連する疾患および死を減少する。
【００１０】
この方法は、オステオポンチンが異所性石灰化を有効に、かつ特異的に阻害し得るという発見に基づく。従って、異所性石灰化は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを、個体に対応して全身または異所性石灰化の予想部位もしくは既知の部位に投与することによって予防または処置され得る。オステオポンチンが、石灰化した組織および異所性石灰化の部位において通常に見出されることから、それは、最小限の毒性または免疫原性の副作用で投与され得る。
【００１１】
本明細書中で用いられるように、用語「異所性石灰化」とは、骨および歯以外の部位でのカルシウム結晶の異常な沈着を意味することを意図する。異所性石灰化は、細胞外マトリックスにおける巨視的な無定形のリン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイト沈着の蓄積に帰着する。
【００１２】
異所性石灰化は、種々の組織および器官において生じ得、そして多くの臨床状態に関連する。例えば、異所性石灰化は、冒された組織への炎症または損傷の結果であり得るか、全身の鉱物不均衡より生じ得る。一般的に、異所性石灰化は、動脈、静脈、毛細血管、弁および洞を含む血管組織において生じる。血管への炎症または損傷は、例えば、環境要因（例えば、喫煙、高脂肪の食事）の結果として生じる。炎症または損傷はまた、創傷、血管手術、心臓手術または血管形成術から生じる血管への外傷の結果として生じ得る。血管の石灰化はまた、加齢および疾患（高血圧、アテローム硬化症、糖尿病、腎不全およびその後の透析、狭窄ならびに再狭窄を含む）に関連する。
【００１３】
異所性石灰化はまた、腱（Ｒｉｌｅｙら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：１０９−１１５（１９９６））、皮膚（Ｅｖａｎｓら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １２：３０７−３１０（１９９７））、強膜（Ｄａｉｃｋｅｒら、Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２１０：２２３−２２８（１９９６））および子宮筋層（ＭｃＣｌｕｇｇａｇｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：８２−８４（１９９６））のような非血管組織において生じる。（それらの各々は、本明細書中において参考として援用される）。全身の鉱物不均衡という結果を生じる疾患（例えば、腎不全および糖尿病）において、内部器官（肺、心臓、腎臓および胃を含む）における異所性石灰化は、通常である（本明細書中で参考として援用される、Ｈｓｕ、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４：６４１−６４９（１９９７））。さらに、異所性石灰化は、医用材料、プロテーゼおよび医療デバイス（例えば、生体人工心臓弁）の移植の頻繁な合併症である（本明細書中で参考として援用される、Ｖｙａｖａｈａｒｅら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６：２１９−２２９（１９９７））。本発明の方法は、これらの状態のすべてに関連して生じる異所性石灰化に適用可能である。
【００１４】
用語「異所性石灰化」とは、骨の形成および成長の間、骨基質内で通常に生じる石灰化をいうことを意図しない。本明細書中で使用されるように、異所性石灰化はまた、腎尿細管において生じる異常な石灰化、主要なシュウ酸含有カルシウム腎臓結石の形成を生じる尿とは異なる。
【００１５】
本明細書中で使用されるように、用語「阻害する」とは、異所性石灰化を阻害することに関連して、細胞外マトリックスのヒドロキシアパタイト結晶の沈着の形成、増殖または沈着の予防、遅延または逆転を意味することを意図する。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、用語「オステオポンチン」とは、異所性石灰化を阻害し得る分子、およびオステオポンチンとして当該分野において公知な１つ以上の分子に対する認識可能な類似の分子を意味することを意図する。オステオポンチンは、約３４ｋＤａの推定分子量を有するリン酸化されたシアロタンパク質として特徴付けられる。高い陰性、翻訳後修飾および選択的にスプライジングされたアイソフォームに起因して、オステオポンチンは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定されたような約４４ｋＤａと８５ｋＤａの間の見かけの分子量を有すると報告されている（Ｇｉａｃｈｅｌｌｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ  ５：８８−９５（１９９５））。オステオポンチンの翻訳後修飾形態、および選択的にスプライジングされたアイソフォームの全ては、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【００１７】
オステオポンチンは、ラット（Ｏｌｄｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８８１９−８８２３（１９８６））；マウス（Ｃｒａｉｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９６８２−９６８９（１９８９））；ヒト（Ｋｉｅｆｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３３０６（１９８９）およびＹｏｕｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７：４９１−５０２（１９９０））；ブタ（Ｗｒａｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０１１９（１９８９））；ウシ（Ｋｅｒｒら、Ｇｅｎｅ  １０８：２３７−２４３（１９９１））；ウサギ（Ｔｅｚｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：９１１−９１７（１９９２））；およびニワトリ（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２５０２−２５０８（１９９１））を含む種々の種において同定されている。（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。これらの種由来のオステオポンチンおよび他の脊椎動物由来のオステオポンチンは、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義に含まれる。
【００１８】
オステオポンチンは、既知の種にわたって保存される１つ以上のドメインの存在によって特徴付けられる。オステオポンチンを特徴付ける保存されたドメインは、例えば、Ｎ末端シグナル配列、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、選択的にスプライジングされたドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）−含有インテグリン結合細胞接着ドメイン、Ａｓｐ−に富んだカルシウム結合ドメイン、カルシウム結合相同性ドメインおよび２つのヘパリン結合相同性ドメインを含む（Ｇｉａｃｈｅｌｌｉら、前出（１９９５））。従って、オステオポンチンのこれらの特徴的な特性の１つ以上を有する新規に同定された分子もまた、オステオポンチンの定義内に含まれる。
【００１９】
オステオポンチンはまた、骨シアロタンパク質Ｉ、ウロポンチン（ｕｒｏｐｏｎｔｉｎ）、分泌リンタンパク質Ｉ、２ａｒ、２Ｂ７およびＥｔａ  １として当該分野において公知である（Ｇｉａｃｈｅｌｌｉら、前出（１９９５））。当該分野において使用されるこれらの用語のすべてによって包含される分子は、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【００２０】
ヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、Ｋｉｅｆｅｒら、前出（１９８９）によって記載され、そして本明細書中の図１（配列番号１および２）に示される。用語、オステオポンチンは、例えば、配列番号２に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号１に示される配列と実質的に同じヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むことを意図する。
【００２１】
オステオポンチンおよびその機能的なフラグメントの修飾（それらは、異所性石灰化を阻害する能力を増強するか、またはそれほど影響をあたえないかのいずれか）もまた、用語「オステオポンチン」に含まれる。このような修飾は、例えば、構造的または化学的に類似のアミノ酸またはアミノ酸アナログでの、オステオポンチンのネイティブアミノ酸配列からの１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。例えば、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）によって、リン酸化されたアミノ酸（例えば、セリン残基、またはスレオニン残基）の１つ以上の置換が意図される。インビボまたはインビトロのいずれかにおいてリン酸化され得る残基（例えば、キナーゼリン酸化コンセンサス配列）の置換または付加が、意図される。リン酸化のネイティブ部位
の間の残基の修飾（例えば、ヒドロキシアパタイトと相互作用するための、またはリン酸化部位の間の距離を減少するための、リン酸化された残基を有利に指向するような修飾）もまた、意図される。これらの修飾は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの構造、高次構造、または機能的活性を増強するか、または有意に改変しないかのいずれかである。
【００２２】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの活性にそれほど影響しない修飾はまた、糖、リン酸基、または脂質基の付加または除去、ならびに当該分野で公知の他の化学的誘導体を含み得る。加えて、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、その精製を補助し、そしてその活性にそれほど影響しないエピトープタグまたは他の配列の付加によって修飾され得る。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、用語「機能的フラグメント」とは、オステオポンチンと関連して、異所性石灰化を阻害するためのオステオポンチンの能力を維持するオステオポンチンの一部を意味することを意図する。機能的フラグメントは、例えば約６〜約３００の長さのアミノ酸であり得、例えば約７〜約１５０の長さのアミノ酸であり得、より好ましくは、約８〜約５０の長さのアミノ酸であり得る。所望する場合、機能的フラグメントは、異所性石灰化を阻害する能力と有利に協調する活性を有するオステオポンチンの領域を含み得る。例えば、オステオポンチンの機能的フラグメントは、細胞（異所性石灰化の部位での内皮細胞およびマクロファージ）の内殖を促進する配列を含み得る。同様に、オステオポンチンの機能的フラグメントは、例えば、異所性石灰化の部位での細胞接着および生存を有利に促進するＲＧＤ含有ドメインのような配列を含み得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「個体」は、異所性石灰化を示すか、または発症の危険にあるヒトまたは他の哺乳動物を意味することを意図する。そのような個体は、例えば、アテローム性動脈硬化、狭窄症、腎不全、糖尿病、プロテーゼ移植、組織損傷、もしくは年齢関連血管疾患のような状態と関連する異所性石灰化を有し得るか、または発症の危険にあり得る。これらの状態の予後および臨床的徴候は、当該分野において公知である。本発明の方法により処置された個体はまた、血管手術（人工弁置換または血管形成術を含む）のための候補となり得るか、または経験し得る。本発明の方法により処置された個体は、例えば、糖尿病、腎不全、または腎臓透析に関連する全身性無機質不均衡を有し得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、オステオポンチンのアミノ酸配列またはそのフラグメントを参照する用語「実質的アミノ酸配列」は、オステオポンチンのアミノ酸配列と相同であると認識可能であり、かつ異所性石灰化を阻害する配列を意味することを意図される。例えば、オステオポンチンの配列と実質的に同じである配列は、オステオポンチンの配列と約７０％よりも高い相同性、好ましくは、約８０％よりも高い相同性、より好ましくは、約９０％よりも高い相同性を有し得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテーゼデバイス」とは、病気にかかるか、不完全であるか、または欠損している身体の部分の、合成または生物学的に誘導される代用品をいう。本明細書中で使用される場合、用語「バイオプロテーゼデバイス」とは、部分的または完全に生物学的に誘導されるプロテーゼデバイスをいう。プロテーゼデバイスは、初期故障を導く異所性石灰化に影響されやすいが、これは本発明の方法によって阻害され得る。プロテーゼデバイスは、身体（例えば、耳、目、顎顔面領域、頭蓋、四肢および心臓を含む）の種々の部位に移植され得るか、または付着され得る。
【００２７】
本発明の方法は、ステントを用いても、用いなくとも、人工心臓弁（例えば、大動脈弁または房室弁）の異所性石灰化を予防するために有利に使用され得る。置換心臓弁は、種々の材料（金属、ポリマー、および生物学的組織またはそれらの材料の任意の組み合わせを含む）から作製され得る。バイオプロテーゼ弁としては、哺乳動物（例えば、ヒツジ、ウシおよびブタ）に由来する異種移植された置換弁ならびにヒト弁が挙げられる。バイオプロテーゼ心臓弁は、一般的に組織固定に供され、そしてさらに、移植前に失活され得る。
【００２８】
本発明は、個体における異所性石灰化を阻害する方法を提供する。その方法は、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、治療剤として異所性石灰化部位に正常に存在する分子を使用するので、有利である。従って、この方法は、最小の毒性、最小の免疫原性および最小の副作用を生じる。
【００２９】
オステオポンチンは、当該分野において公知の方法（例えば、適切な生物学的供給源からの精製、または化学合成によるものを含む）によって、調製され得るか、または得られ得る。オステオポンチンの適切な生物学的供給源は、オステオポンチンを含むかまたは発現する、組織、生物体液または培養細胞であり得る。特定の供給源におけるオステオポンチンタンパク質の存在および豊富さが、例えば、ＥＬＩＳＡ分析（Ｍｉｎら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５３：１８９−９３（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）または免疫細胞化学（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１６４８−１６５６（１９９４）（本明細書中に参考として援用される））を使用して、決定され得る。
【００３０】
オステオポンチンは、腎臓細胞、肥大性軟骨細胞、ぞうげ芽細胞、骨細胞、骨髄、内耳および脳細胞に存在するか、またはこれらによって発現されることが決定されている。オステオポンチンはまた、生物体液（乳および尿を含む）内に見出される。オステオポンチンはまた、腫瘍、特に転移性腫瘍内に存在し、そしてそれは腎臓結石の成分である（Ｂｕｔｌｅｒら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１６７−１８１頁（１９９６）（本明細書中に参考として援用される））。オステオポンチンはまた、血管損傷部位における平滑筋細胞、マクロファージおよび内皮細胞によって産生され得る（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１６４８−１６５６（１９９４）（本明細書中に参考として援用される））。従って、オステオポンチンは、当該分野において公知の生化学的精製法を使用して、これらの供給源のいずれかから精製され得る。
【００３１】
オステオポンチンはまた、培養において増殖する上記組織系統のいずれかの細胞の分泌培地から得られ得る。例えば、オステオポンチンは、Ｌｉａｗら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７４：２１４−２２４（１９９４）（本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、平滑筋細胞培養の馴化培地から実質的に精製され得る。
【００３２】
以前に記載されたように、種々の種に由来するオステオポンチンのヌクレオチド配列は、公知である。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントはまた、当該分野において、公知の方法を使用して、適切な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生動物細胞、鳥細胞および哺乳動物細胞を含む）によって組換え的に発現され得る。種々の宿主生物体におけるペプチドの組換え発現および精製のための方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７）、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）（これらの両方が本明細書中で、参考として援用される）に記載される。オステオポンチンおよびそれ由来の例示的な機能フラグメントの組換え合成および精製のための方法が、例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：２８４８５−２８４９１（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）において記載される。
【００３３】
組換え合成および精製の後、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、当該分野において公知の酵素的方法を使用して、生理学的に関連する様式（例えば、リン酸化、アシル化またはグリコシル化による）において改変され得る。実施例ＩＶにおいて記載されるように、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生物学的に関連する部位においてリン酸化するために使用され得るキナーゼは、カゼインキナーゼＩＩである。当該分野において公知の他のセリン−スレオニンキナーゼ（例えば、プロテインキナーゼＣ）もまた、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをリン酸化するために使用され得る。
【００３４】
本発明の方法は、異所性カルシウム沈殿を阻害する活性を有するオステオポンチンまたはその任意の機能的フラグメントを使用して、実施され得る。オステオポンチンのフラグメントが、異所性石灰化を阻害するその能力を決定するために、本明細書に記載されるように、選択されて、当該分野において公知の方法によって、産生されて、そしてスクリーニングされる。
【００３５】
オステオポンチンのフラグメントが、例えば、オステオポンチンの酵素的切断または化学的切断によって、産生され得る。酵素的切断および化学的切断のための方法ならびに生じたタンパク質フラグメントの精製のための方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。例として、オステオポンチンは、Ａｒｇ１６９とＳｅｒ１７０との間にトロンビン切断部位を含む。オステオポンチンのＮ末端切断フラグメントまたはＣ末端切断フラグメントのいずれかが、本発明の方法において使用され得る。
【００３６】
オステオポンチンのフラグメントはまた、オステオポンチンの配列を実質的に有するペプチドの化学的合成または組換え合成によって、産生され得る。例えば、オステオポンチンの重複配列にわたるペプチドライブラリーが、当該分野において公知の方法を使用して産生され得、そして本明細書中に記載されるように、それらの機能的活性についてスクリーニングされ得る。さらに、Ｓｍｉｔｈら、前出  ２７１：２８４８５−２８４９１（１９９６）によって記載されるように、オステオポンチンのＮ末端トロンビン切断フラグメントまたはＣ末端トロンビン切断フラグメントが組換え的に産生されて、そして本発明の方法において使用され得る。
【００３７】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接吸着すること、およびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントは、カルシウムまたはカルシウム沈着物と結合する、そのフラグメントの予期される能力に基づいて選択され得る。カルシウムと結合することが意図される領域としては、アスパラギン酸リッチ配列およびカルシウム結合相同性ドメインが挙げられる。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、アスパラギン酸リッチカルシウム結合ドメインの配列（ＤＤＭＤＤＥＤＤＤＤ（配列番号３））を実質的に含み得るか、またはカルシウム結合相同性ドメインの配列（ＤＷＤＳＲＧＫＤＳＹＥＴ（配列番号４））を実質的に含み得る。
【００３８】
さらに、本明細書中に開示されるように、リン酸化が、異所性石灰化を阻害するオステオポンチンの能力を調節し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントが、リン酸化コンセンサス配列の存在によって選択され得る。選ばれるべきオステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、カゼインキナーゼＩＩリン酸化コンセンサス領域（ＳＧＳＳＥＥＫ（配列番号５））またはＣ末端ヘパリン結合相同性ドメインＳＫＥＥＤＫＨＬＫＦＲＩＳＨＥＬＤＳＡＳＳＥＶＮ（配列番号６）の実質的な配列が挙げられ得、これらは、保存された３つのセリンリン酸化部位を含む。あるいは、またはさらに、オステオポンチンの機能的フラグメントは、選択的にスプライシングされたドメイン（ＮＡＶＳＳＥＥＴＮＤＦＫＱＥ（配列番号７））が挙げられ、これらは、２つのセリンリン酸化部位を含む。さらなるセリンリン酸化部位およびスレオニンリン酸化部位が、例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８：２００−２０５（１９９４）（本明細書中に参考として援用される）によって、記載される。オステオポンチンの機能的フラグメントは、１または数個のこれらのリン酸化された残基を、隣接するアミノ酸とともに含み得る。
【００３９】
異所性活性を阻害する能力を有するオステオポンチンのフラグメントは、種間で高度に保存される分子の領域を含む。高度な配列保存性を有するヒトオステオポンチン内の領域は、例えば、Ｇｉａｃｈｅｌｌｉら、前出（１９９５）に示される。例えば、機能的フラグメントは、高度に保存された配列ＳＤＥＳＨＨＳＤＥＳＤＥ（配列番号８）を含み得る。オステオポンチンの機能的フラグメントはまた、保存された細胞接着ドメイン（ＤＧＲＧＤＳＶＡＹＧ（配列番号９））またはヘパリン結合相同性ドメイン（ＲＫＫＲＳＫＫＦＲＲ（配列番号１０）を含み得る。
【００４０】
所望される場合、例えば、機能的活性、選択性、安定性またはバイオアベイラビリティーを最適化するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、Ｄ立体異性体、天然に存在しないアミノ酸ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を含むように改変され得る。改変されたアミノ酸の例は、Ｓａｗｙｅｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）ならびにＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）において示される。
【００４１】
所望される場合、一つ以上のリン酸化されたセリン残基またはスレオニン残基が、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）によって、置換され得る。そのような改変は、ホスファターゼによる不活性化に対するオステオポンチンまたは機能的フラグメントの感受性を減少させるように有利に作製され得る。
【００４２】
本明細書中に開示されるように、直接吸着することおよびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害することに加えて、オステオポンチンはまた、炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）を発現する多核巨細胞およびマクロファージの蓄積および活性化を促進することによって、抗石灰化細胞内応答を媒介することにより作用し得る。多核巨細胞およびマクロファージは、細胞外微小環境を酸性化し、そして鉱化した沈着物を溶解し得る。多核性異物巨細胞（ＦＢＧＣ）およびマクロファージによるＣＡＩＩ発現の調節を通して、オステオポンチンは、リン酸カルシウム沈着物の除去を刺激し得る。
【００４３】
上記のように選択および調製されたオステオポンチンまたはフラグメントの異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野において公知か、または本明細書中に記載される種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイによって、評価され得る。例えば、実施例Ｉに記載されるように、培養された血管細胞（例えば、ウシ大動脈平滑筋細胞）は、β−グリセロホスフェートを含むカルシウム沈着培地で処理された場合、時間依存的な様式でカルシウム沈着を形成する。さらに、実施例ＩＩＩに記載されるように、ヒト血管平滑筋細胞は、増強されたレベルの無機リン酸の存在下において、カルシウム沈着物を形成する。異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果をアッセイするための他の培養系は、当業者によって決定され得る。例えば、異所性石灰化が生じる身体の他の部位（例えば、内蔵、皮膚および内皮細胞を含む）に由来する細胞または組織を使用して、オステオポンチンがアッセイされ得る。
【００４４】
カルシウム沈着の量または程度は、オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与する前と投与した後に、そのような培養系を使用して、視覚的評価もしくは組織化学的評価によって定性的にか、またはより定量的な方法によってかのいずれかで、決定され得る。例えば、カルシウム沈着は、不透明な領域（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色法では黒い領域として、そしてＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ染色法では赤い領域として）として、光学顕微鏡によって視覚的に検出され得る。カルシウム沈着の量および程度はまた、Ｊｏｎｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：１１３５−１１４２（１９９７）（本明細書中に参考として援用される）によって記載される方法、または市販の測色法キット（例えば、Ｓｉｇｍａから入手可能であるＣａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ）を使用することによって定量的に評価され得る。あるいは、カルシウム沈着の量または程度はまた、原子吸光分光という公知の方法を使用して、定量的に評価され得る。
【００４５】
実施例ＩおよびＩＩＩに記載されるように、培養された血管平滑筋細胞において観察されるカルシウム沈着は、組織化学的分析、超微細構造分析および電子回折分析によって評価される場合、異所性石灰化部位に存在するアパタイト沈着物と類似し得る。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの培養細胞によるカルシウムの沈着を阻害する能力は、ビヒクルコントロールまたはタンパク質コントロールと比較して、個体における異所性石灰化を阻害するその能力の正確な指標である。
【００４６】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの異所性石灰化を阻害する能力はまた、対応するヒト病理の信頼できる指標となるために、当該分野において公知の動物モデルにおいて試験され得る。例えば、異所性石灰化は、例えば、Ｖｙａｖａｈａｒｅら、前出（１９９７）に記載されるような動物へのバイオプロテーゼ弁（例えば、ブタ弁、ヒツジ弁またはウシ弁）の皮下移植または循環系統移植によって誘導され得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与による弁のカルシウム沈着の量または速度の減少が検出され得、そしてそれは、調製物の機能的活性の基準となる。
【００４７】
同様に、ヒトアテローム性動脈硬化、腎不全、リン酸塩過剰血症、糖尿病、年齢関連血管カルシウム沈着および異所性石灰化と関連する他の状態の信頼できる指標である動物モデルは、当該分野において公知である。例えば、局所性および全身性カルシフィラキシー、石灰沈着症および誘発性石灰化（これらは、異所性石灰化の実験モデルである）は、例えば、Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：５−６（１９９５）、Ｌｉａｎら、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３５：５５５−５６１（１９８３）およびＢｏｉｖｉｎら、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２４７：５２５−５３２（１９８７）において記載される。血管壁のカルシウム沈着の実験モデルは、例えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．２５：１８５−１９０（１９８４）によって記載される。
【００４８】
異所性石灰化およびオステオポンチン調製物の効果を試験するための好ましい動物モデルは、Ｌｉａｗら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１４６８−１４７８（１９９８）（本明細書に参考として援用される）により記載されるオステオポンチン欠損マウスであり、ここで実施例Ｖにおいて記載されるように、異所性石灰化は、野生型コントロール動物と比較して増強される。
【００４９】
当該分野において公知の医療画像技術（例えば、磁気共鳴画像法、Ｘ線画像、コンピューター断層撮影法、超音波検査法）を使用して、ヒトまたは動物のいずれかにおける異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果を評価し得る。例えば、血管内のカルシウム沈着の存在および程度が、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８６：６４−７０（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）により記載される脈管内超音波画像法により決定され得る。異所性石灰化の量または程度の減少が、容易に同定され得、そしてこれはオステオポンチンまたはそのフラグメントの治療効果の指標となる。
【００５０】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメント（上記のように、それらの機能的活性についてアッセイされる）は、異所性石灰化を阻害するために治療的に効果的な量で個体に投与される。オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与するための送達の適切な処方、投薬量および送達経路は、当業者に周知であり、そしてヒト患者について（例えば、以前に記載されたように動物モデルから）決定され得る。治療的に有効であることが必要とされるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投薬量は、例えば、石灰化の程度、石灰化の部位、投与の経路および形態、投与される分子の生体活性半減期、個体の体重および状態、ならびに以前または現在の治療のような因子に依存し得る。この方法の特定の適用についての治療的に有効な用量であると見なされる適切な量は、本明細書中に提供される手引きを用いて、当業者に決定され得る。当業者は、患者の状態を治療の過程全体にわたってモニターすることが必要であり、かつ投与される組成物の量を調節し得ることを認識する。
【００５１】
ヒトを処置するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの治療的に有効な量は、処置レジメンに依存して、例えば、約１０μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、１日に数回、または１日に１回、または数日毎に１回投与される場合、オステオポンチンまたは機能的フラグメントが１回、１週間に１回、数週間に１回のみ投与された場合より低用量が必要とされる。同様に、オステオポンチンの時限放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）を可能にする処方物は、単回ボーラス用量として投与されるより、より少量のオステオポンチンの連続放出を提供する。
【００５２】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、全身（例えば、静脈内または動脈内）に送達されて、身体全体の異所性石灰化を阻害し得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、異所性石灰化発生することを含むか、またはそれが予測されることが既知の部位に局所的に投与され得る。このような部位は、例えば、アテローム斑（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ）、血管形成術を受けた動脈のセグメントまたはプロテーゼ移植部位であり得る。オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの投与に適切な部位は、処置されている個体の臨床的指標および個体が現在侵襲的外科手術を受けているか否かに依存して、当業者により決定され得る。
【００５３】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与は、オステオポンチンの種々の処方物を用いて達成され得る。所望であれば、オステオポンチンは、薬学的に受容可能なキャリアとともに溶液または懸濁液として投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もしくはリンゲル溶液、または他の生理学的な緩衝化生理食塩水、または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油もしくは注射可能な有機エステルのようなオイル）であり得る。
【００５４】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントの吸収を安定または増大させるように作用する生理学的に受容可能な化合物をさらに含む。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような糖質；アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤；微生物膜を破壊する、ＥＤＴＡのようなキレート剤；カルシウムまたはマグネシウムのような二価金属イオン；低分子量タンパク質；脂質もしくはリポソーム；または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。オステオポンチンはまた、生体分解性ポリマーもしくはマイクロポンプのような材料とともに処方され得、これは、分子の徐放性放出を提供する。さらに、オステオポンチンは、ホスファターゼインヒビターのような分子とともに処方され得、ホスファターゼインヒビターは、オステオポンチンの脱リン酸化を減少または阻害する。
【００５５】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、タンパク質を発現するように遺伝的に改変された細胞から発現され得る。遺伝的に改変された細胞からのオステオポンチンの発現は、タンパク質の、持続して局在するかまたは全身性の発現が生じ得るため、反復投与が不要であるという利点を提供する。
【００５６】
治療目的のために種々の哺乳動物細胞においてタンパク質を組換え発現する方法は、当該分野で公知であり、例えば、以下に記載される：本明細書中に参考として援用される、Ｌｅｅら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＩＩ  ９：９１−１１３（１９８５）。遺伝子操作に特になじみやすい細胞の型としては、例えば、造血幹細胞、肝細胞、血管内脾細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、線維芽細胞およびリンパ球が挙げられる。
【００５７】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントをコードする核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結され、このプロモーターは、適切なレベルの、コードされたタンパク質の構成性発現または（所望であれば）誘導性発現を提供し得る。この方法の特定の適用のために適切なプロモーター配列は、当業者により決定され得、そして例えば、細胞型および所望されるオステオポンチン発現レベルに依存する。
【００５８】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の種々の方法により細胞に導入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出（１９９４）を参照のこと）。このような方法としては、例えば、組換えベクターを用いたトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が挙げられる。ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター）での感染は、細胞を遺伝的に改変するために特に有用である。核酸分子はまた、ベクターへの核酸配列の最初の導入を必要としない公知の方法を用いて、細胞に導入され得る。
【００５９】
本発明の１つの実施形態において、プロテーゼデバイスは、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。プロテーゼデバイスと、オステオポンチンまたは機能的フラグメントとを接触させることは、プロテーゼデバイスの異所性石灰化を効率的に予防または減少し、このことによって、デバイスの不全または早熟置換の必要性を予防する。プロテーゼデバイスは、必要であれば、個体への移植前、移植中、または移植後のいずれかに、オステオポンチンまたは機能的フラグメントと接触され得る。
【００６０】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、プロテーゼデバイスに対して共有結合的または非共有結合的のいずれかでこの分子と結合することによってプロテーゼデバイスと接触し得る。この方法の特定の適用のために適切な結合方法は、当業者によって決定され得る。当業者は、適切な結合方法がヒトにおけるプロテーゼデバイスの移植と適合性であることを知っており、従って、受容可能でない毒性または免疫原性拒絶を引き起こさない。さらに、適切な結合方法は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントがプロテーゼデバイスまたは周辺組織の異所性石灰化を阻害する能力を増強させるか、または有意に低減させない。
【００６１】
ポリマー、金属および組織にタンパク質を共有結合させるための方法は、当該分野で公知である。例えば、オステオポンチンは、化学的架橋を用いてプロテーゼデバイスと結合され得る。化学的架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒドおよび他のアルデヒドが挙げられる。反応性アミノ酸基、糖質部分または付加された合成部分のいずれかを通じてプロテーゼデバイスにオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを連結する架橋剤は、当該分野で公知である。このような薬剤および方法は、例えば、Ｈｅｒｍａｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）に記載され、これは、本明細書中に参考として援用される。これらの方法を用いて、プロテーゼデバイスと、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントとを接触させ得る。
【００６２】
オステオポンチンはまた、プロテーゼデバイスに対して非共有結合的に（例えば、プロテーゼデバイスの表面への吸収により）付着され得る。オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含む溶液または懸濁液は、所望であれば、薬学的に受容可能な賦形剤とともに、治療的に有効な量でプロテーゼデバイス上にコーティングされ得る。
【００６３】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの持続性送達を提供するために、プロテーゼデバイスはまた、プロテーゼデバイスに付着した細胞によって生成されるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。このような細胞は、プロテーゼデバイス上に播種され、そしてエキソビボまたはインビボのいずれかで増殖し得る。適切な細胞としては、オステオポンチンを通常生成し、かつ分泌する細胞が挙げられ、この細胞としては、例えば、マクロファージ、平滑筋細胞または内皮細胞が挙げられる。さらに、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生成するように遺伝的に改変された細胞（例えば、内皮細胞および線維芽細胞を含む）は、プロテーゼデバイスに付着され得る。プロテーゼデバイスに付着される細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受け入れる個体由来の細胞、またはインプラントの拒絶の可能性を減少する免疫学的に適合した個体由来の細胞のいずれかである。
【００６４】
プロテーゼデバイスと接触されるオステオポンチンまたは機能的フラグメントが異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野で公知の種々の方法によって決定され得る。１つのこのような方法は、実施例Ｖに記載のように、プロテーゼデバイスを動物に移植して、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投与に応答したカルシウム沈着を測定することである。外植片の部位におけるカルシウム沈着の速度または量の減少いずれかが、組成物の治療的効力を示す。
【００６５】
本発明は、局所的な微小環境を酸性にする個々の細胞に投与することにより、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。このことにより、この細胞は、異所性石灰化の部位に標的化される。多核性異物巨細胞およびマクロファージは、局所的な微小環境を酸性にし得る細胞の例である。従って、本発明は、個々のマクロファージに投与することによって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、このことによって、マクロファージは、異所性石灰化の部位に標的化される。さらに、本発明は、個々の多核性外来異物巨核細胞に投与することにより異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、これによって、多核性異物巨細胞が異所性石灰化の部位に標的化される。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「局所的な微小環境」とは、酸生成細胞の補充および／もしくは分化、ならびにプロトン生成の促進および細胞プロトンの細胞外放出のいずれかにより酸性にされ得る細胞外空間をいう。例えば、破骨細胞およびマクロファージは、二酸化炭素の炭酸への加水分解を促進する酵素である炭酸脱水酵素ＩＩを発現する。炭酸は、液胞のＨ+−ＡＴＰａｓｅを介して細胞から排出されるプロトンの細胞内供給源として働き、それによって局所的ｐＨを下げ、そして無機物溶解を促進する。従って、本発明は、マクロファージおよび多核性異物巨細胞による炭酸脱水酵素ＩＩのオステオポンチン媒介発現を介して異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【００６７】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接的に、アパタイト結晶表面に結合し、かつ結晶成長を阻害することによるだけでなく（実施例ＩＩを参照のこと）、間接的に、無機質の喪失を調節することにより（実施例Ｖ）、異所性鉱化作用を調節する。具体的には、オステオポンチンは、マクロファージ補充、炭酸脱水酵素ＩＩ発現の増加および細胞外酸性化を促進することによる抗石灰性細胞応答のメディエーターとして作用する。
【００６８】
局所的な微小環境を酸性にし得る細胞（例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞）は、異所性石灰化の部位に標的化される。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、生体プロテーゼ心臓弁に播種され得、そして上記のようにエキソビボまたはインビボで増殖され得る。さらに、炭酸脱水酵素ＩＩまたはその機能的フラグメントを発現するように遺伝的に改変された細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。炭酸脱水酵素ＩＩの機能的フラグメントは、オステオポンチン媒介性調節および触媒活性を保持する。オステオポンチン生成細胞については上記のように、炭酸脱水酵素ＩＩ生成細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受けた個体由来であるか、またはインプラント拒絶の可能性を減少させるように免疫的に適合させた個体由来である。さらに、マクロファージまたは多核性異物巨細胞は、直接的または全身的のいずれかで個体における異所性石灰化の部位に投与され得る。全身的に投与される場合、投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞は、異所性石灰化の部位に標的化され得る。例えば、オステオポンチンまたはオステオポンチン抗体で生体プロテーゼデバイスを予めコーティングすることは、全身的に投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞を異所性石灰化部位に標的化して、局所的な微小環境を酸性にする１つの方法である。
【００６９】
実施例Ｖに記載のように、局所的な微小環境の酸性化はまた、オステオポンチン（マクロファージおよび多核性異物巨細胞により炭酸脱水酵素ＩＩ発現を調節し得る）を投与することによって達成され得る。オステオポンチンを個体に投与する方法は、上記で詳細に記載されている。炭酸脱水酵素ＩＩ発現を刺激するために必要なオステオポンチンの発現レベルは、ヒドロキシアパタイトの増殖を直接阻害するために必要な発現レベルより有意に低くあり得る。従って、炭酸脱水酵素ＩＩを刺激するために治療的に有効な量は、約１×１０-12Ｍ〜５×１０-7Ｍの範囲内であり得る。炭酸脱水酵素ＩＩの発現を刺激するに十分なオステオポンチンの治療的に有効な量はまた、約１×１０-12Ｍ〜１×１０-7Ｍ、１×１０-12Ｍ〜５×１０-8Ｍ、１×１０-12Ｍ〜１×１０-8Ｍ、約１×１０-12Ｍ〜５×１０-9Ｍ、１×１０-12Ｍ〜１×１０-9Ｍ、１×１０-12Ｍ〜５×１０-10Ｍ、１×１０-12Ｍ〜５×１０-10Ｍ、または１×１０-12Ｍ〜５×１０-11Ｍの範囲内であり得る。
【００７０】
従って、本発明は、個体に局所的な微小環境を酸性にする細胞を投与することによって、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位に酸生成細胞の補充を促進する工程を包含する。本発明はまた、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位で酸生成細胞の分化を促進する工程を包含する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位への酸生成細胞の補充および分化を促進する工程を包含する。実施例Ｖに記載のように、１コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスは、異所性鉱化作用に応答して炭酸脱水酵素ＩＩ陽性細胞の形成を促進するに十分高レベルのオステオポンチンを発現する（図１３を参照のこと）。マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、同様な造血起源から誘導された炭酸脱水酵素ＩＩ発現細胞であり、そして１コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスにおいて鉱化したインプラントに隣接して位置することが本明細書中で示される。
【００７１】
実施例Ｖで示されるように、オステオポンチンは、マウスにおいてグルタルアルデヒド固定した大動脈弁（ＧＦＡＶ）リーフレットの移植部位に、酸生成細胞を補充させることによって無機質再吸収を制御し得る。例えば、免疫染色によって示されるように、オステオポンチンは、マクロファージの補充を媒介し得、そしてＣＡＩＩ陽性細胞形成を促進し得る（実施例Ｖを参照のこと）。本明細書中で開示されるように、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、オステオポンチンによって調節される炭酸脱水酵素ＩＩを発現する細胞の例である。オステオポンチンを投与する方法は、上で詳細に記載されている。
【００７２】
本発明はまた、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位における炭酸脱水酵素ＩＩの発現を増大することにより、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本明細書中で開示されるように、オステオポンチンは、炭酸脱水酵素ＩＩ発現細胞（マクロファージおよび多核性異物巨細胞を含む）の分化および活性を調節することによって無機質再吸収を制御する（実施例Ｖを参照のこと）。
【００７３】
本発明の種々の実施形態の営為に実質的に影響を及ぼさない改変もまた、本明細書中で提供される発明の規定内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示するのであって、限定しないことが意図される。
【００７４】
（実施例Ｉ：培養したウシ脈管細胞の石灰化）
本実施例は、培養したウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着が、異所性石灰化の確実なモデルであることを実証する。生理学的に関連した石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法を用いて、オステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物を、異所性石灰化を阻害する能力についてアッセイし得る。
【００７５】
（ウシ大動脈平滑筋細胞の培養）
ＢＡＳＭＣを、本明細書中に参考として援用されるＲｏｓｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５０：１７２−１８６（１９７１）によって最初に記載された外植片法の改変によって入手した。手短に述べると、内側組織を、ウシ胸大動脈のセグメントから分離した。組織小片（１〜２ｍｍ3）を、１６５Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩ型、１５Ｕ／ｍｌエラスターゼＩＩＩ型および０．３７５ｍｇ／ｍＬダイズトリプシンインヒビターを補充した、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ中での３７℃での１時間のインキュベーションによってばらばらにした。部分的に消化された組織を６ウェルプレート中に置き、そして２０％  ＦＢＳを補充した、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ中で、３７℃にて、５％  ＣＯ2を含む加湿雰囲気下で数週間培養した。外植片から移動した細胞を収集し、そして増殖培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、１５％  ＦＢＳおよび１０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）中で維持した。ウシ大動脈壁から単離された細胞が脈管平滑筋細胞であることを確認するために、α−平滑筋アクチン、ビメンチンおよびカルポニン（ｃａｌｐｏｎｉｎ）のレベルを、免疫蛍光顕微鏡法によって調べた。
【００７６】
免疫蛍光顕微鏡法について、ＢＡＳＭＣＳを、１０ウェルヘビー（ｈｅａｖｙ）Ｔｅｆｌｏｎコーティング顕微鏡スライドガラス（Ｃｅｌ−Ｌｉｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で２４時間培養し、冷メタノールで固定し、２％  ＢＳＡおよび１０％正常ウサギ血清を含むＰＢＳでブロックし、そして２％  ＢＳＡを含むＰＢＳでそれぞれ、１：５０および１：２５に希釈した、モノクローナル抗α平滑筋アクチン抗体（１Ａ４，Ｓｉｇｍａ）およびモノクローナル抗ビメンチン抗体（Ｖ９，Ｄａｋｏ）で処理した。モノクローナル抗カルポニン抗体（（ＣＡＬＰ），Ｆｒｉｄら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５３：１８５−１９３（１９９２））を、希釈せずに用いた。二次抗体として、ＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧを、ＰＢＳでの１：３０の希釈後に用いた。マウス非免疫ＩｇＧを、一次抗体についてのコントロールとして用いた。
【００７７】
上記のように得られた９５％を超える細胞が、α平滑筋アクチン抗体、ビメンチン抗体およびカルポニン抗体で、繊維状のパターンで染色された。このことは、培養した細胞が、脈管平滑筋起源の細胞であることを示す。全ての実験について、細胞を、２継代と５継代との間で用いた。
【００７８】
（ウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着）
培養されたＢＡＳＭＣ平滑筋細胞による石灰化を調べるために、石灰化を、本明細書中に参考として援用されるＳｈｉｏｉら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．，１５：２００３−２００９（１９９５）に記載される方法によって誘導した。手短に述べると、ＢＡＳＭＣを、増殖培地中で４日間培養し、次いで石灰化培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（他であると示さない限り）、１０-7Ｍインスリンおよび５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下で１５％  ＦＢＳおよび１０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（高グルコース、４．５ｇ／Ｌ））中に１０日間切り替えた。この培地を、１週間に２回、新鮮な培地で置き換えた。時間経過実験では、石灰化培地中での培養開始日を、０日目と定義した。
【００７９】
石灰化を、本明細書中に参考として援用されるＪｏｎｏら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：１１３５−１１４２（１９９７）に記載される方法の改変によって評価した。手短に述べると、培養物を、０．６Ｎ  ＨＣｌを２４時間用いて脱灰した。ＨＣｌ上清のカルシウム含量を、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ）法（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）による比色定量によって決定した。脱灰後、この培養物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして０．１Ｎ  ＮａＯＨ／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化した。総タンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。細胞層のカルシウム含量を、タンパク質含量に対して正規化した。培養培地中のリン濃度およびカルシウム濃度を、それぞれ、ホスホモリブデート複合体法（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）およびｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン法（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）によって測定した。値を、平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３）として表した。
【００８０】
β−グリセロホスフェートを含む石灰化培地で処理したＢＡＳＭＣは、１４日間の経過にわたって時間依存的様式でカルシウム含有無機質沈着を開始した。対照的に、β−グリセロホスフェートを欠く増殖培地中で培養したＢＡＳＭＣは、石灰化しなかった。β−グリセロホスフェートの添加は、細胞層におけるカルシウム沈着と正に相関する、増加したリン濃度をもたらした。逆に、細胞層が石灰化されるにつれて、カルシウム濃度は、培養培地中で減少した。
【００８１】
カルシウム沈着、培地中のリン濃度およびカルシウム濃度に対するβ−グリセロホスフェートの効果は、用量依存的であった。カルシウム沈着は、β−グリセロホスフェートの開始濃度に依存し、そして約４ｍＭ  β−グリセロホスフェートで最大の半分であった。培養培地中のリン濃度は、０ｍＭ〜１０ｍＭの範囲にわたってβ−グリセロホスフェートの濃度が増加するにつれて増加した。培養培地中のカルシウム沈着は、細胞層中のカルシウム沈着に対して逆に比例した。
【００８２】
観察された石灰化は、１０ｍＭ無機リン酸までの培養培地の補充が、細胞の非存在下で石灰化した沈着物を形成しなかったので、培地からの無機物の自発沈澱に起因しなかった。内皮細胞培養物への石灰化培地の添加も、鉱化作用を誘導しなかった。
【００８３】
これらの結果は、培地中での無機リン酸を上昇させる条件下でＢＡＳＭＣの石灰化が、特異的な、細胞媒介事象およびマトリックス媒介事象であることを示す。
【００８４】
（ＢＡＳＭＣ石灰化の形態）
ＢＡＳＭＣ培養物における石灰化プロセスが、生理学的な型の鉱化作用を表すか否かを決定するために、組織化学的分析、超微細構造分析および電子線回折分析を行った。
【００８５】
ＢＡＳＭＣ培養物による無機物沈着を、フォンコッサ染色（３０分間、５％硝酸銀）および光学顕微鏡法によって、本明細書中に参考として援用されるＭａｌｌｏｒｙ，Ｆ．Ｂ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１５２頁（１９４２）によって記載される方法を用いて組織化学的に評価した。アルカリホスファターゼの発現を、シトレート−アセトン−ホルムアルデヒド固定細胞を室温にて１５分間、Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートすることにより可視化した。
【００８６】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による超微細構造検査のために、プラスチック上で増殖したＢＡＳＭＣ細胞を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ７．２で緩衝化した、１％グルタルアルデヒドおよび１％パラホルムアルデヒドを含むアルデヒド溶液中で一晩固定した。次いで、この培養物を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液単独を用いて洗浄し、段階的な一連のエタノール溶液中で脱水し、そしてＴａａｂエポキシ樹脂またはＬＲ  Ｗｈｉｔｅアクリル酸樹脂（Ｍａｒｉｖａｃ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａ）のいずれかに浸透させ、そして包埋した。この樹脂を、５５℃にて２日間重合させた。エポキシ包埋をされることになっているサンプルをまた、電子顕微鏡においてさらなる膜の対比を提供するために、フェロシアン化カリウム還元４％四酸化オスモニウムを用いて事後固定した。
【００８７】
選択された領域の電子線回折による無機質分析について、他の培養物を、１００％エタノールのみを用いて固定して非水性で処理し、続いてさらなる処理を伴わずに樹脂中での直接包埋した。１マイクロメーターの厚さの調査切片を、培養物の種々の領域から調製し、そして光学顕微鏡法による調査のためにトルイジンブルーで染色した。次いで、選択された領域の薄い切片（８０ｎｍ〜１００ｎｍ）を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅミクロトーム上でダイアモンドナイフを用いて切断し、そして炭素を用いてエバポレートしたＦｏｒｍｖａｒでコーティングしたニッケルグリッド上に配置した。グリッドに取り付けた切片を、エタノール性酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて短時間染色し、そして６０ｋＶで操作するＪＥＯＬ  ＪＥＭ  １２００ＥＸ透過型電子顕微鏡を用いて調べた。無水性で処理し、非染色のままにしたサンプルを、１００μＭ回折口径および８０ｃｍのカメラ長を用いる、選択された領域の電子線回折に用いた。回折パターンを分析し、そして合成アパタイト標準および骨無機質について以前に報告された粉末回折ファイル（本明細書中に参考として援用される、Ｌａｎｄｉｓら，Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃ．Ｒｅｓ．，６３：１８８２２３（１９７８））と比較した。
【００８８】
光学顕微鏡法により、増殖培地中で増殖させたＢＡＳＭＣ培養物は、これらの型の細胞に特有の単層および多層の増殖領域を示した。石灰化培地での１０日間の処置後、この培養物は、主に多層領域における、広範な無機質の沈着を示した。フォンコッサ染色は、これらの培養物におけるリン酸含有無機質の存在を確認した。石灰化は、細胞間の細胞外マトリックスにおいて最も頻繁に観察され、そして代表的に培養物の基礎局面においてより顕著であった。これらの石灰化培養物におけるＢＡＳＭＣはまた、アルカリホスファターゼ活性について陽性であった。
【００８９】
培養１４日目（β−グリセロホスファターゼを用いて１０日目）、ＢＡＳＭＣは、単層または多層であり、そしていくつかの位置では、細胞の小節を形成した。超微細構造的に、外観上多層または小節状である場合、この細胞は、コラーゲン原線維が豊富な多量の細胞外マトリックスと会合している。この細胞外マトリックスの蓄積部位で、細胞は、代表的にはタンパク質の合成および分泌に関連する、充分に発達した細胞小器官を示した。目立った細胞骨格は、アクチンから構成される可能性が最も高い、細胞内細糸の広範なネットワークによって立証された。
【００９０】
β−グリセロホスフェートなしで培養した細胞は、細胞外マトリックスの石灰化の証拠を示さなかったが、添加した有機リン酸供給源とともに培養した細胞は、細胞層と関連したいくつかの形態学的に異なる形態の石灰化を示した。これらは、石灰化したコラーゲン原線維のほぼ球状の凝集物、周囲で増加した無機質密度を有する小節沈着、ならびに細胞外マトリックスの原線維内区画および原線維間区画の両方を含む、より分散した石灰化を含んでいた。これらの後者の部位では、いくらか大きな寸法を有する結晶は、１つのコラーゲン原線維から別のコラーゲン原線維へと広がることが観察された。膜結合型マトリックス小胞はまた、細胞外マトリックスにおいて見出された。無水で処理され、そして染色されていない、石灰化沈着物を含むＢＡＳＭＣ培養物組織切片の、選択された領域の電子線回折は、無機質相をアパタイトとして同定した。このことは、その指数がこの型の無機質に特有であった（格子面００２、２１１、１１２、３００からの）目立った回折反射を示す。
【００９１】
アルカリホスファターゼは、正常なウシの鉱化作用に必要とされ（Ｗｈｙｔｅら  Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１５：４３９−４６１（１９９４））、そしてβ−グリセロホスフェートに応答した骨芽細胞および軟骨細胞の培養物の石灰化に必要とされることが示されている（Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら，Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ，２：１３−２６（１９８７））。アルカリホスファターゼが、これらの研究において用いられる条件下でのＢＡＳＭＣにおける石灰化に必要とされるか否かを決定するために、培養物を、アルカリホスファターゼインヒビターであるレバミゾール、またはビヒクル単独で処理した。ＢＡＳＭＣ培養物におけるカルシウム沈着が、レバミゾールによって用量依存的に阻害された。最大の半分の阻害が、５×１０-5Ｍレバミゾールで観察された。ビヒクル処理は効果を有さなかった。レバミゾール処理は、培養培地におけるリン濃度における減少および高いカルシウム濃度の維持と関連した。
【００９２】
これらの結果は、ＢＡＳＭＣ培養物によって沈着したマトリックスの石灰化が、異所性石灰化の部位で観察された鉱化作用と、無機質の種類（アパタイト）および石灰化した沈着物の微細構造に関して類似することを示す。例えば、鉱化作用は、細胞外マトリックスコラーゲン原線維およびマトリックスビヒクルと関連して主に生じた。類似の小胞構造が、上昇したアルカリホスファターゼ活性と関連して、石灰化したアテローム性動脈硬化斑において報告されている（Ｋｉｍら，Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ，３５：１５６−１６２（１９７６））。さらに、石灰化しているＢＡＳＭＣ培養物において存在する小節状石灰化は、石灰化されたアテローム性動脈硬化斑および弁において通常見られることである、球顆状結晶成長を示す（Ｋｉｍら，Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ，３５：１５６−１６２（１９７６））。
【００９３】
それゆえ、これらの研究において用いられた石灰化しているＢＡＳＭＣ培養物は、石灰化した脈管組織においてインビボで観察された鉱化作用に類似した鉱化作用を行い得る細胞外環境を作製し得、異所性石灰化のモデルとしてのそれらの使用を支持する。
【００９４】
（実施例ＩＩ：オステオポンチンは、ＢＡＳＭＣ石灰化を阻害する）
本実施例は、オステオポンチンが、インビボにおける異所性石灰化の確実なモデルであるＢＡＳＭＣ石灰化をインビトロで阻害することを実証する。それゆえ、オステオポンチンは、異所性石灰化の治療的に有効なインヒビターである。
【００９５】
ラットオステオポンチンを、本明細書中に参考として援用されるＬｉａｗら，前出  ７４：２１４−２２４（１９９４）によって記載されるように、ラット新生仔平滑筋細胞培養物の馴化培地から精製した。この調製物を、クーマシー染色およびＮ末端配列分析に基づいて、９５％を超える純度であると判断した。
【００９６】
インビトロでのＢＡＳＭＣ媒介石灰化に対するオステオポンチンの効果を調べるために、可溶性オステオポンチンまたはビヒクル単独（０．１ｍＭクエン酸ナトリウム）を、石灰化しているＢＡＳＭＣ培養物に添加した。図２ａに示すように、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌのオステオポンチンは、１０日目に評価したとき、石灰化を用量依存的に阻害した。例えば、０．５μｇ／ｍｌのオステオポンチンは、石灰化を約９０％阻害し、そして５μｇ／ｍｌのオステオポンチンは石灰化をほぼ完全に阻害した。対照的に、ビヒクル単独は、効果がなかった（図２ａ）。それゆえ、低濃度の外部から適用したオステオポンチンは、石灰化している脈管細胞培養系において細胞外鉱化作用を顕著に阻害する。
【００９７】
オステオポンチン調製物中の夾雑物が、観察される阻害効果の原因である可能性を排除するために、免疫除去実験を行った。１０μｇ／ｍｌオステオポンチンを含む培地を、Ｌｉａｗら，前出（１９９４）によって記載される方法により調製された２０ｍｇ／ｍｌの抗オステオポンチン（ＯＰ−１９９）抗体または正常ヤギＩｇＧと混合し、そして室温にて１時間インキュベートした。２５０ｍｇプロテインＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、そして室温にて１時間インキュベートした。抗体−プロテインＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ複合体を遠心分離により除去し、そして残りの上清を、石灰化研究において使用するために２０倍希釈した。独立Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を用いて、群を比較し、そして０．０５未満の確率値（ｐ）値を有意とみなした。
【００９８】
０．５μｇ／ｍｌラットオステオポンチンを含む培地は、培養物の石灰化を、１８倍阻害した（オステオポンチン処理したＢＡＳＭＣについて０．３３±０．０６μｍｏｌｅ／ｍｇに対して、ビヒクル処理したＢＡＳＭＣについて５．０５±０．２５μｍｏｌｅ／ｍｇ、ｐ＝０．００２３）。オステオポンチン抗体を用いたオステオポンチン溶液の免疫除去は、阻害活性を有意に減少させた（抗オステオポンチン除去サンプルについて２．６０±０．４３μｍｏｌｅ／ｍｇに対して、非免疫除去サンプルについて０．３３±０．０６μｍｏｌｅ／ｍｇ、ｐ＝０．０３３８）。対照的に、正常ヤギＩｇＧを用いた免疫除去は、ラットオステオポンチン溶液の阻害活性に影響を与えなかった（免疫除去なしについて０．３３±０．０６μｍｏｌｅ／ｍｇに対して、正常ヤギＩｇＧ処理について０．４９±０．１０μｍｏｌｅ／ｍｇ、ｐ＝０．２４８０）。
【００９９】
これらの結果は、オステオポンチン調製物による、観察されたＢＡＳＭＣ媒介石灰化阻害が、夾雑物に起因するのではなく、特異的にオステオポンチンに起因したことを確認する。
【０１００】
オステオポンチン効果の特異性および独特さを決定するために、オステオポンチンに対する制限された構造的および機能的相同性を有する、２つのさらなる非コラーゲン性細胞外マトリックスＲＧＤ含有分子（ビトロネクチンおよびフィブロネクチン）を、ＢＡＳＭＣ媒介石灰化を阻害する能力について試験した。ラットの血漿ビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）およびウシフィブロネクチン（ＴＥＬＩＯＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして使用するまで凍結保存した。図２ｂに示すように、ビトロネクチン（ＶＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）は、オステオポンチンについて有効であった濃度と等しいモル濃度で、カルシウム沈着を阻害できなかった。それゆえ、脈管石灰化を阻害することに対するオステオポンチンの効果は、非常に特異的である。さらに、これらの結果は、オステオポンチンが鉱化作用を調節する能力が、そのＲＧＤ依存性細胞接着機能と関係しないことを示す。
【０１０１】
（オステオポンチン阻害の機構）
オステオポンチンが石灰化を阻害する機構を試験した。１つの可能性は、オステオポンチンが、アルカリホスファターゼ活性に影響を与えることによってレバミゾールに類似した様式で機能し得、それによってβ−グルセロホスフェート由来の無機リン酸の産生を阻害し、そしてリン酸カルシウム沈着を妨害することであった。
【０１０２】
細胞アルカリホスファターゼ活性測定のために、細胞を、種々の濃度のオステオポンチンの存在下において石灰化培地中で培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして細胞タンパク質を０．９％  ＮａＣｌ中の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化し、そして遠心分離した。上清を、Ｂｅｓｓｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４：３２１−３２９（１９４６）（これは、本明細書中で参考として援用される）によって記載される方法によって、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。１単位を、１分間中に１ｎｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する活性として定義した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定した。そのデータを、細胞層のタンパク質含量に対して正規化した。
【０１０３】
図３ａおよび３ｃに示すように、オステオポンチンを用いる処理は、ＢＡＳＭＣ培養物のアルカリホスファターゼ活性に影響を与えなかった。オステオポンチンの添加はまた、培地のリン濃度を減少しなかった。対照的に、レバミゾールは、用量依存的にＢＡＳＭＣアルカリホスファターゼ活性を阻害し（図３ｂ）、そして培養培地中のリン濃度を減少させた。これらの結果は、オステオポンチンがアルカリホスファターゼ活性を阻害することによって作用するのではないことを実証する。
【０１０４】
オステオポンチンが培養培地中でカルシウムをキレートまたは封鎖（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）して、鉱化作用を妨害する可能性もまた、試験した。最初の石灰化培地に、オステオポンチンまたはビヒクル単独の存在下で、増加する濃度のカルシウムを補充した。次いで、培養物を、１０日間の期間にわたってオステオポンチンの存在下または非存在下において行って石灰化させた。図４ａに示されるように、培地のカルシウム含量を増加させることは、カルシウム沈着に対するオステオポンチンの阻害効果を克服し得た。このことは、より多くの無機質が細胞層において沈着されることを可能にする。このことと一致して、培養培地のリン含量（８．２ｍＭ〜７．３ｍＭ）の減少を述べた（図４ｂ）。
【０１０５】
オステオポンチンの存在下において、１０日間の期間の最後での培地のカルシウム含量もまた、測定した。カルシウムを封鎖することによってオステオポンチンが作用する場合、一定量のまたは増加量のいずれかのカルシウムが培地中で観察されることが予測された。このことは、培地中におけるオステオポンチン結合によるカルシウムの保持を反映する。しかし、その反対が観察された。カルシウム培地中のカルシウム濃度は、最初のカルシウム濃度と比較して、１０日間の期間の最後で減少し、そしてカルシウム沈着と反比例した（図４ａおよび４ｃを比較のこと）。従って、鉱化に対するオステオポンチンの阻害効果は、カルシウム依存性である（すなわち、カルシウム濃度の増加によって減少する）が、培地中で利用可能なカルシウムのキレート化には起因しない。この観察は、オステオポンチンの公知のカルシウム結合特性と一致する。約５０分子のカルシウムが、生理学的なカルシウム濃度でオステオポンチンによって結合され得ることが示された（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４８７１−２４８７８（１９９２））。従って、２ｍＭのカルシウムをキレートするためには約４０μＭのオステオポンチン（２．７ｍｇ／ｍｌ）が必要であり、これは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて血管性石灰化を阻害する際に有効であると実証されたオステオポンチンの量（０．５μｇ／ｍｌ）の５０００倍より多い。
【０１０６】
ＢＡＳＭＣ培養物中の内因性および外因性のオステオポンチンの超微細構造的局在化もまた、免疫金標識を用いて決定して、血管性石灰化のオステオポンチン阻害の機構をさらに特徴付けした。ＢＡＳＭＣを石灰化培地中で７日間培養して、石灰化が開始することを可能にした。次いで、精製したラットオステオポンチン（０．５μｇ／ｍｌ）を１０日目まで加えた。培養物を、アルデヒド固定剤を使用して保存し、続いて、免疫細胞化学のためにＬＲ  Ｗｈｉｔｅアクリル樹脂中に包埋した。包埋後免疫標識を、ＭｃＫｅｅら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ．Ｒｅｓ．Ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．３３：１４１−１６４（１９９６）（これは、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるように、オステオポンチン抗体（ＯＰ−１９９）およびプロテインＡ−コロイド金複合体を使用して行った。手短に言えば、培養物の薄い（８０ｎｍ）切片を、ニッケルグリッド上に配置し、そしてＰＢＳ中の１％オボアルブミンとともに５分間インキュベートし、続いて一次抗体とともに１時間のインキュベーション、ＰＢＳでのリンス、オボアルブミンを用いる再度のブロッキング、次いで３０分間のプロテインＡ−金複合体への曝露を行った。蒸留水を用いる最終リンスの後、グリッドを風乾し、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて慣習的に染色し、そして透過型電子顕微鏡によって観察した。ＯＰ−１９９抗体の特異性は、ウェスタンブロッティング（Ｌｉａｗら、前出、（１９９４））ならびに免疫前血清およびプロテインＡ−金複合体単独を用いるインキュベーションによって以前に示された。
【０１０７】
これらの免疫金標識研究のために、オステオポンチンを除外したか（ビヒクル単独）、またはβ−グリセロホスフェートを用いる鉱化作用の開始の７日後に添加した。これらの条件下において、外因的に適用されたオステオポンチン（０．５μｇ／ｍｌ）は、１０日目においてＢＡＳＭＣ培養物石灰化をなお５０％阻害し得た。低レベルの内因性オステオポンチンを、処理していない鉱化培養物中（代表的には、鉱化した領域中の拡散パターン中において）見出した。対照的に、オステオポンチン処理した培養物中では、金粒子は、石灰化の部位で豊富であった（代表的には、小さい石灰化の塊の境界に蓄積するか、または個々の結晶プロフィールと関連する）。免疫前血清およびプロテインＡ−金複合体単独をコントロールとして使用した場合は、金粒子は観察されなかった。このことは、オステオポンチンの、成長しているアパタイト結晶との直接的相互作用が、その阻害機能に必要とされることを示す。オステオポンチンは、鉱化されないマトリックスまたは細胞と結合していることは観察されなかった。
【０１０８】
上記に記載された結果は、オステオポンチンがアパタイト結晶表面へのオステオポンチンの直接的な結合および結晶成長の阻害によって、低濃度で、血管細胞によって媒介される生理学的な石灰化を阻害し得ることを実証する。従って、オステオポンチンは、異所性石灰化を妨害および処理する際に治療的に有用である。
【０１０９】
（実施例ＩＩＩ  培養されたヒト血管細胞の石灰化）
この実施例は、上昇した無機リン酸の存在下で培養されたヒト平滑筋細胞によるカルシウム沈着が異所性石灰化の信頼できるモデルであることを示す。生理学的に関連する石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法は、異所性石灰化を阻害するそれらの能力についてオステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物をアッセイするために使用され得る。
【０１１０】
正常な成人の血清無機リン酸濃度の範囲は、約１．０〜１．５ｍＭである。高い血清リン酸レベル、すなわちリン酸塩過剰血症は、種々の疾患状態（例えば、慢性腎不全および引き続く腎透析を含む）と関連して起こる。このような疾患状態において、血清無機リン酸濃度のレベルは、代表的には２ｍＭを超える。リン酸塩過剰血症と関連する異所性石灰化をモデル化するために、そしてオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの、そのような石灰化に対する効果を決定するために、石灰化についての関連するインビトロモデル系を以下のように開発した。
【０１１１】
ヒト血管平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）を、Ｒｏｓｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５０：１７２−１８６（１９７１）およびＬｉａｗら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：７１３−７２４（１９９５）（これらは、本明細書中で参考として援用される）によって記載されるような酵素的消化によって得た。手短に言えば、内側の組織を、ヒト心臓移植手術および剖検でそれぞれ得たヒト大動脈の切片から分離した。班ＳＭＣについて、冠状動脈内じゅく腫切除術由来の組織を、手術時に得た。組織の小さな断片（１〜２ｍｍ3）を、１６５Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ、１５Ｕ／ｍｌのＩＩＩ型エラスターゼ、および０．３７５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを補充したＤＭＥＭ中で一晩、３７℃で消化した。単一細胞懸濁物を、６ウェルプレート中に配置し、そして５％ＣＯ2を含む加湿した空気中において、２０％  ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で３週間、３７℃で培養した。コロニーを形成した培養物を、コンフルエンスで収集し、そして増殖培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、１５％  ＦＢＳおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ；最終無機イオン濃度は１．４ｍＭであった）中で維持した。培養物の純度を、α−ＳＭアクチンおよびカルポニンについてのポジティブ免疫染色、ならびにＲｏｓｓ、前出（１９７１）およびＬｉａｗら、前出（１９９５）によって記載されるようなフォン  ビルブラント因子の染色の非存在によって評価した。
【０１１２】
初代ヒト成体および胎児の大動脈内側および冠状動脈の班の初代細胞（８継代まで）を、これらの実験において使用した。胎児および成体のＨＳＭＣ培養物もまた、Ｐｅｒｅｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１２２４−１２２８（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）によって記載されるように、ＨＰＶ−Ｅ８Ｅ７を使用して不死化し、そして特徴付けした。
【０１１３】
ＨＳＭＣを、増殖培地中で慣用的にサブクローンした。コンフルエンスの時点で、細胞を石灰化培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、２ｍＭ  無機リン酸の存在下の１５％  ＦＢＳおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）に、１４日目まで切り替えた。その培地を２日毎に新鮮な培地と交換した。時間経過実験のために、石灰化培地中での培養の１日目を０日目と定義した。カルシウム沈着を定量し、そして実施例Ｉにおいて上記に記載されるように組織化学的および細胞化学的に評価した。
【０１１４】
正常なレベルのリン酸（１．４ｍＭの無機リン酸（Ｐｉ））を含む培地中では、ＨＳＭＣは、非常に少ないカルシウム無機質を蓄積した。対照的に、２ｍＭ  無機リン酸の存在下では、カルシウム沈着は、時間依存性の様式で増加した。例えば、９日目において、石灰化ＨＳＭＣ対非石灰化コントロールは、２１０．３＋／−２．４対１５．１＋／−２．４（μｇ／ｍｇタンパク質）（平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＋３））であった。カルシウム沈着に対する無機リン酸の効果は、１．４ｍＭ〜２ｍＭの範囲の無機リン酸にわたって用量依存性であった。上昇した無機リン酸による石灰化の誘導は、ヒト細胞の一般的な特徴であるようであった。なぜなら、異なる供給源（ヒト成体および胎児の大動脈および冠状動脈の班）由来の初代ＨＳＭＣおよびこれらの細胞の不死化された誘導体が、同様の挙動を示したからである。カルシウム無機質の自発的な沈着は、石灰化培地中または１０ｍＭまでの無機リン酸を補充した培地中では起こらなかった。このことは、細胞および／または細胞由来のマトリックスが、鉱化作用のために必要であることを示す。
【０１１５】
ヒト細胞培養系において観察された石灰化が生理学的に関連するか否かを決定するために、形態学的研究を行った。ＨＳＭＣを石灰化培地で１０日間培養した後に、顆粒状の沈着が細胞培養を通して発生した。この沈着を、実施例Ｉにおいて記載するように、フォン  コッサ染色によってリン酸含有無機質として同定した。黒色に染色された粒子を、多層性の病巣に最も多く蓄積している細胞外領域中で優勢的に、細胞層を通して、拡散的に散乱させた。電子顕微鏡分析は、実施例Ｉに記載した系におけるウシＳＭＣ培養物の石灰化と本質的に同一である、アパタイト無機質相、石灰化したコラーゲン原線維、および鉱化した培養物に結合したマトリックスベシクルの存在を確証した。
【０１１６】
これらの結果は、代表的には、リン酸塩過剰血症の個体において見出される無機リン酸濃度を含む培地中で培養された場合に、ＨＳＭＣ培養物が石灰化しやすいことを実証する。さらに、培養されたヒト細胞中で観察された石灰化は、インビボで石灰化した組織において観察された異所性石灰化と同様である。従って、ＨＳＭＣ石灰化培養系を、異所性石灰化のレギュレーターの効果を正確に評価するために使用し得る。
【０１１７】
（実施例ＩＶ  オステオポンチンおよびその機能的フラグメントによるヒト血管細胞の石灰化の阻害）
この実施例は、オステオポンチンおよび典型的なオステオポンチンの機能的フラグメントが、ヒト平滑筋細胞の石灰化を効果的に阻害することを例証する。従って、オステオポンチンを、異所性石灰化を治療的に阻害するために使用し得る。
【０１１８】
オステオポンチンおよび機能的フラグメントを、異所性石灰化を阻害するそれらの能力について、実施例ＩＩＩにおいて記載したＨＳＭＣ石灰化系を使用してアッセイした。オステオポンチンタンパク質は、全長ヒト組換えオステオポンチンならびにＳｍｉｔｈら、前出（１９９６）によって記載されるようなネイティブなタンパク質のトロンビン切断後に形成されるフラグメントと同様の、組換えＮ末端およびＣ末端のヒトオステオポンチンフラグメントを含む。２つのＮ末端フラグメント（１０Ｎおよび３０Ｎ）を使用した。これらは、オステオポンチンの２つの異なるスプライシング改変体を指す。３０Ｎスプライシング改変体は、さらなる１４アミノ酸ＮＡＶＳＳＥＥＴＮＤＦＫＱＥ（配列番号７）を含み、これは、エキソン５（アミノ酸５９〜７２）に対応する。１０Ｎフラグメントは、ネイティブオステオポンチンのアミノ酸１７〜５８および７３〜１６０を含むが、３０Ｎフラグメントはアミノ酸１７〜１６９を含む。１０Ｃフラグメントは、オステオポンチンのＣ末端ドメイン（アミノ酸１７０〜３１７）を含む。
【０１１９】
Ｎ末端およびＣ末端の組換えオステオポンチンフラグメントを、ＧＳＴとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解物から精製し、そしてトロンビンを用いて切断した。全長ヒト組換えオステオポンチンを、Ｈｉｓタグ化タンパク質として調製した。得られる組換えタンパク質のサイズおよび純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｓｍｉｔｈら、前出（１９９６））によって確証した。
【０１２０】
組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントを、カゼインキナーゼＩＩによるリン酸化の前に、またはそのリン酸化の後のいずれかに、ヒト平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）の異所性石灰化を阻害するその能力についてアッセイした。カゼインキナーゼＩＩによるリン酸化によって達成されたオステオポンチン（ＯＰＮ）およびそのフラグメントに取り込まれたリン酸の量を、図５ｂに示す。図５ａに示すように、高いリン酸石灰化培地の存在下において、ＨＳＭＣマトリックスへのカルシウム沈着は、リン酸化された、ＯＰＮ、３０Ｎ  ＯＰＮ、１０Ｎ  ＯＰＮ、または１０Ｃ  ＯＰＮの添加によって基底レベルに減少する。これらのタンパク質の非リン酸化型は、このアッセイにおいてカルシウム沈着に有意な影響を与えない。これらの結果は、オステオポンチンのＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントの両方が、オステオポンチンの機能的フラグメントであること、ならびにセリン−スレオニンリン酸化が、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のために重要であるようであることを示す。
【０１２１】
図６において示されるように、カゼインキナーゼＩＩによってリン酸化された組換えオステオポンチンは、１５ｎＭの濃度でＨＳＭＣ石灰化を阻害し得る。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる脱リン酸化は、この阻害活性を逆転する。これらの結果は、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のためのリン酸化の重要性を確証する。
【０１２２】
ヒトオステオポンチンの異所性石灰化に対する効果は、０．１μｇ／ｍｌ〜５．０μｇ／ｍｌの濃度にわたって用量依存的である（図７）。さらに、オステオポンチンの、異所性石灰化を阻害および逆転することに対する効果は迅速であり、添加後６０分間までに有意に減少したカルシウム沈着が見られ、９０分間までに約５０％の阻害が観察可能である（図８）。
【０１２３】
これらの結果は、オステオポンチンおよびその典型的な機能的フラグメントが、迅速かつ低濃度で、ヒト細胞の生理学的に関連する異所性石灰化を効果的に阻害し得ることを示す。従って、全長オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、異所性石灰化を示すか、または異所性石灰化の危険がある個体において異所性石灰化を阻害する際に治療的に有効である。
【０１２４】
（実施例４）
（オステオポンチンは、インビボにて異所性石灰化を阻害する）
本実施例は、オステオポンチンがインビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【０１２５】
正常なマウスおよびオステオポンチンが欠損したマウスにおけるブタ人工弁の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割を決定した。オステオポンチン遺伝子のうちの１コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスが、Ｌｉａｗら、前出（１９９８）に記載されている。４．０ｍｍ2片のブタグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレットを、オステオポンチンについて野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合型（ＨＴＺ）またはヌル対立遺伝子（ＫＯ）のいずれかを保有する５〜６週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。１４日後、移植片を取り出し、凍結乾燥し、そして酸加水分解した。カルシウムレベルを、実施例１に記載のようにアッセイし、そしてその外殖片の乾燥重量に対して標準化した。
【０１２６】
図９に示されるように、移殖された弁は、野生型またはヘテロ接合型のマウスようりもオスポンチンヌルマウスにおいて有意に大きな程度まで石灰化する。従って、オステオポンチンが関連のインビトロ系において異所性石灰化を阻害するという観察された能力と一致して、これらの結果は、オステオポンチンが、インビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【０１２７】
異物炎症応答もまた、このオステオポンチンヌルマウスにおいて損なわれるようである。例えば、野生型またはヘテロ接合型のマウスと比較して、オステオポンチンヌルマウスにおいては、弁移殖の部位にてマクロファージによる炎症の明らかな減少が存在する。炎症および異所性石灰化の部位に通常は浸潤するマクロファージが、石灰化した沈着物の除去を食作用によって促進すると予期される。従って、オステオポンチンが、ヒドロキシアパタイト形成を阻害することおよびマクロファージによる石灰化沈着物の食作用性吸収を促進することの両方を行うことが、予期される。
【０１２８】
従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与することは、異所性石灰化を阻害することにおいて治療的に有効である。
【０１２９】
（実施例５）
（ＣＡＩＩを発現する異物巨細胞（ＦＢＧＣ）およびマクロファージによる、インビボでの異所性石灰化のオステオポンチン媒介性阻害）
本実施例は、オステオポンチンが、細胞外環境を酸性化しかつ鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素ＩＩを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の蓄積および活性化を促進することを、示す。
【０１３０】
（ＯＰＮ欠損マウス中への大動脈弁リーフレットの移植）
正常マウスおよびオステオポンチン欠損マウスにおける、生体人工グルタルアルデヒド固定大動脈弁（ＧＦＡＶ）の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割をさらに特徴付けた。実施例５に記載のように、オステオポンチン遺伝子のうちの１コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスを、Ｌｉａｗら、前出（１９９８）に従って得た。４．０ｍｍ2片のグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレット（ＧＦＡＶ）を、オステオポンチンについて野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合型（ＨＴＺ）またはヌル対立遺伝子（ＫＯ）のいずれかを保有する５〜６週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。７日、１４日、および３０日後に、オステオポンチン野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合型（ＨＴＺ）またはヌル対立遺伝子（ＫＯ）のマウスから移植片を取り出し、そして鉱質沈着、タンパク質蓄積、および細胞補充についてアッセイした。
【０１３１】
一旦取り出してから、この移植片をメチルカーノイズ溶液を用いて固定し、パラフィン中に包理し、そしてＬｉａｗら、前出により記載されるような抗ＯＰＮ（ＯＰ−１９９）抗体を１０μｇ／ｍｌにて使用して、ＯＰＮ蓄積について５μｍ切片を分析した。切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。ＯＰＮ蓄積を、Ｐｒｏ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用して定量した。さらに、カルシウムレベルを、実施例１に記載のようにアッセイし、そしてその移植片の乾燥重量に対して標準化した。
【０１３２】
図１０Ａに示されるように、オステオポンチンは、オステオポンチンＷＴマウス中への移植の１４日後の弁中で観察される。この時点で、オステオポンチンは、その移植片と周囲の異物応答との間の境界に制限されている。対照的に、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウスは、それぞれ、ＧＦＡＶ移植の１４日目に、ＯＰＮレベルが非常に減少したかまたはＯＰＮレベルが存在しない。
【０１３３】
ＧＦＡＶ石灰化を定量するために、この外殖片を凍結乾燥し、秤量し、次いで０．６Ｎ  ＨＣＬを用いて室温で一晩酸加水分解した。カルシウム定量を、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＩＬ）に指令されるように、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソンによって実施し、そして乾燥重量に対して標準化した。このキットの精度を、原子吸光分光法によって確認した。オステオポンチンＷＴマウスは、アリザリンレッドＳ染色およびカルシウム定量に基づく、検出可能なＧＨＡＶ鉱化作用を示さない。対照的に、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウスは、オステオポンチンＷＴマウスより４〜５倍高いＧＦＡＶ石灰化を示す（図１０Ｂ）。
【０１３４】
３０日以内に、オステオポンチンＫＯマウスは、なおオステオポンチンを蓄積せず、そしてＧＦＡＶ鉱化作用は、１４日目の時点から有意には変化しない（図１０Ａおよび１０Ｂ）。オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＷＴマウスは、１４日目の時点に対して上昇したオステオポンチンレベルを示す。これらのマウスにおいて、オステオポンチンの局在性は、もはや移植片／異物カプセルの境界に限定されないが、ＧＦＡＶ移植片に浸透することもまた見出される。さらに、異物カプセルに位置するオステオポンチンは、移植片に隣接するＦＢＧＣによって最も大いに発現される。３０日目の時点で、オステオポンチンＷＴマウスは、ＧＦＡＶ石灰化を示すが、鉱質レベルは、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウスについて観察されるものの１／４の低さである。また、３０日目の時点で、オステオポンチンＨＴＺマウスは、石灰化の劇的な減少を示し、このことは、オステオポンチンの存在が鉱質沈着を阻害していることのみならず、ＧＦＡＶからの鉱質の除去を媒介していることもまた、示す。６０日目の時点で、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＷＴマウスは、各々の３０日目の時点と比較して、４〜５倍の増加を示す（図１０Ｂ）。同様に、６０日目の時点で、オステオポンチンＫＯマウスにおけるＧＦＡＶ弁石灰化は、３０日目の時点と比較してほぼ２倍増加する（図１０Ｂ）
オステオポンチンＨＴＺマウスにおける３０日目の時点で観察された有意なオステオポンチンレベルの蓄積は、ＧＦＡＶ鉱化作用の減少または反転を伴った。ＯＰＮ単独ではリン酸カルシウムの溶解を媒介し得ないので、観察された鉱質の損失は、むしろオステオポンチン調節性の事象である。リン酸カルシウム除去をすることができる唯一の機構は、食作用および酸性化である。
【０１３５】
（オステオポンチン媒介性マクロファージ補充の分析）
マクロファージ蓄積を試験するために、１４日目および３０日目にオステオポンチンＷＴマウス、ＨＴＺマウスおよびＫＯマウスからＧＦＡＶ移植片を取り出し、そして５μｍ切片を、６μｇ／ｍｌの抗マウスＢＭ−８（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎ．Ｙ．）を使用して、マクロファージ蓄積について分析した。１次抗体との１時間のインキュベーションの後、ビオチン化ヤギ抗ラット抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を添加し、そして４５分後に、反応産物を３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて検出した。この切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。
【０１３６】
ＢＭ−８表面マーカーの免疫化学的位置決定および定量によって示されるように、オステオポンチンＫＯマウスは、ＧＦＡＶ移植部位へのマクロファージの補充の欠如を示す（図１１）。さらに、このオステオポンチンＫＯマウスは、移植の１４日目および３０日目にオステオポンチンＷＴマウスと比較して、それぞれ５０％〜２５％低いレベルのＢＭ−８細胞染色を示した。
【０１３７】
オステオポンチンＷＴマウスにおいて、ＢＭ−８陽性細胞は、早い時点で拡散して蓄積したが、後には、移植片の縁に沿って濃縮した。このことは、これら細胞の活性化を示唆する。対照的に、ＢＭ−８細胞は、オステオポンチンＫＯマウスにおいて移殖片／異物カプセルの境界に沿って濃縮することはなく、このことは、活性化の欠如を意味する。
【０１３８】
オステオポンチンＨＴＺマウスもまたＢＭ−８陽性細胞蓄積の減少を示したが、マクロファージの欠損は、３０日目の時点で観察された鉱質損失パターンと関連がなかった。全体として、試験したどの時点においても、非常に少数のマクロファージしかＧＦＡＶに浸透し得なかった。このことは、食作用単独では、鉱化作用の反転を媒介し得ないことを示唆する。
【０１３９】
（ＧＦＡＶ外殖片のｐＨ分析）
ＧＦＡＶを、移殖の３０日後にオステオポンチンＷＴマウス、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウスから外殖して、オステオポンチンが移殖片酸性化を促進し、オステオポンチンＨＴＺマウスにおいて観察されたようなＧＦＡＶ移殖片からの鉱質の除去に寄与するか否かを調査した。この外殖片を凍結乾燥し、次いでＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）に浸漬した。各移殖片のｐＨを、製造業者に提供された色目盛りに対してＧＦＡＶ溶液の色を３人の別々の観察者によって比較して個々に決定した。
【０１４０】
オステオポンチンＷＴマウス由来のＧＦＡＶ外殖片は酸性のｐＨ（６．０）を有したが、オステオポンチンＫＯマウス由来の外殖片は、中性付近のｐＨ（６．７）を維持した。ｐＨのこれらの差異は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０００２）。オステオポンチンＨＴＺマウス由来のＧＦＡＶ移殖片は、中間のｐＨ（６．２）を有した。未移殖のＧＦＡＶは、ｐＨ６．５を有した（図１２）。アパタイトの安定性は３７℃で７．０未満のｐＨにて減少するので、これらの外殖片の観察されたｐＨは、アパタイト性鉱質沈着物を溶解する能力に関して生理学的に関連があり、そして観察されたＧＦＡＶ鉱化作用の損失を説明する。これらの知見は、オステオポンチンが、宿主細胞がＧＦＡＶ微小環境を酸性化する能力を調節することによって鉱質吸収を制御することを示す。
【０１４１】
（ＧＦＡＶ移殖部位での炭酸脱水酵素ＩＩ発現の分析）
破骨細胞およびマクロファージは、炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）、すなわち、局所の微小環境の酸性化を促進する酵素を発現する。５μｍ切片中のタンパク質を、５μｇ／ｍｌのヒツジ抗ヒトＣＡＩＩ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ、ＭＥ）を使用して位置決定することによって、移植の１４日後および３０日後のオステオポンチンＷＴマウス、オステオポンチンＨＴＺマウス、およびオステオポンチンＫＯマウス由来のＧＦＡＶ外殖片に、ＣＡＩＩおよびカテプシンＫを発現する細胞を位置決定した。室温で１時間１次抗体とともにインキュベートした後、ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とともに４５分間インキュベートした。その反応産物を、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて検出し、そして切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。ＣＡＩＩ発現を、Ｐｒｏ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用して定量し、そして図１３において面積のパーセンテージとして示す。ＦＢＧＣを、外殖片の４つの象限中にて計数した（図１４）。１つより多くの核を含むすべての細胞を、ＦＢＧＣであるとみなした。
【０１４２】
ＣＡＩＩ免疫染色の定量によって、ＣＡＩＩ発現の鉱質依存性およびオステオポンチン依存性の調節が明らかになった（図１３）。１４日目に、オステオポンチンＷＴマウスにおいて、オステオポンチンが存在し、そしてＧＦＡＶ移殖片は、鉱化しない。その後、鉱質除去の必要性がほとんど存在しない場合、ＣＡＩＩレベルは低い。３０日目に、ＧＦＡＶが鉱化し始め、オステオポンチンが蓄積し、そしてＣＡＩＩ発現細胞が劇的に増加する。逆に、オステオポンチンＫＯマウス（観察したすべての時点で上昇した鉱質レベルを示す）は、非常に低いＣＡＩＩレベルを示す。オステオポンチン媒介性ＣＡＩＩ応答が、オステオポンチンＨＴＺマウスにおいて促進される。１４日目に、オステオポンチンＨＴＺマウスは、オステオポンチンのレベルの減少に起因する実質的ＧＦＡＶ鉱化作用を示すが、ＣＡＩＩ陽性細胞を産生することによって、この鉱化作用に応答する。従って、このデータは、オステオポンチンＨＴＺマウスが、鉱化作用を直接阻害するに十分高いレベルのオステオポンチンを発現するわけではないが、その発現レベルが、ＣＡＩＩ発現またはＣＡＩＩ陽性細胞の形成の増進を促進するためために十分であることを、示す。ＣＡＩＩに加えて、カテプシンＫの高発現が、ＣＡＩＩ発現ＦＢＧＣにおいて観察された。カテプシンＫは、破骨細胞において優先的に発現され、そして破骨細胞の吸収活性に重要であることが示された、システインプロテアーゼである。
【０１４３】
オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウスにおいて観察された酸性化の欠如がＦＢＧＣの数の減少という結果であるか否かを決定するために、ＧＦＡＶ外殖片上のＦＢＧＣの数を計数した。ＦＢＧＣを、Ｗａｄａら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．８４、１６６〜１７８（１９９９）（本明細書中に参考として援用される）に記載のように実施して電子顕微鏡によって可視化した。ＦＢＧＣの数は、オステオポンチンＨＴＺマウスおよびオステオポンチンＫＯマウス由来の１４日目のＧＦＡＶ外殖片によって示される、ＯＰＮが欠如した非常に石灰化した状態において２〜３倍に増加する。
【０１４４】
ＦＢＧＣ蓄積のパターンは、カルシウム沈着パターンとほぼ同一であり、そしてＯＰＮ蓄積とは逆である。このデータは、オステオポンチンの欠如が、ＧＦＡＶ移殖片付近でのＦＢＧＣ蓄積の増加を促進するが、これらのＦＢＧＣは、減少したＣＡＩＩレベルによって判断されるように、酸性化能力の減少を示すことを示唆する。
【０１４５】
これらの結果は、オステオポンチンが、細胞外微小環境を酸性化しそして鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素ＩＩを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の蓄積および活性化を促進することを示す。
【０１４６】
（リン酸化オステオポンチンは、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害する）
ＧＦＡＶを、コントロールビヒクル、非リン酸化オステオポンチンまたはリン酸化オステオポンチンのいずれかの１ｍｇ／ｍｌ溶液中で、オステオポンチンＫＯマウスへの移殖の前に３日間インキュベートした。１４日後、カルシウム定量を、上記のように実施した。図１５に示されるように、これらの結果は、リン酸化オステオポンチンが、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｋｉｅｆｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３３０６（１９８９）に記載されるようにヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】
図２は、ＢＡＳＭＣの石灰化に対するビトロネクチンおよびフィブロネクチン（ｂ）と比較したオステオポンチン（ａ）の効果を示す。
【図３】
図３は、ＢＡＳＭＣのアルカリホスファターゼ活性（ａ）および培地中の亜リン酸濃度（ｂ）に対するオステオポンチンの効果、ならびにアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に対するレバミゾールおよびオステオポンチン（ＯＰＮ）の効果（ｃ）を示す。
【図４】
図４は、種々の初期カルシウム濃度でのカルシウム沈着（ａ）、培地亜リン酸濃度（ｂ）および培地カルシウム濃度（ｃ）に対するオステオポンチンの効果を示す。
【図５】
図５は、ＨＳＭＣカルシウム沈着に対する組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの効果（ａ）、ならびにカゼインキナーゼＩＩによる組換えオステオポンチンフラグメントのリン酸化の程度（ｂ）を示す。
【図６】
図６は、ＨＳＭＣ石灰化に対するオステオポンチンのリン酸化および脱リン酸化の効果を示す。
【図７】
図７は、ＨＳＭＣ石灰化に対する種々の濃度のオステオポンチンの効果を示す。
【図８】
図８は、ＨＳＭＣ石灰化に対するオステオポンチンの阻害の時間経過を示す。
【図９】
図９は、マウスに皮下移植された弁の石灰化に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、マウスに皮下移植され、７日、１４日および３０日の時点で取り出された弁におけるオステオポンチン蓄積に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、マウスに皮下移植され、７日、１４日および３０日の時点で取り出された弁におけるカルシウム沈着を示す。
【図１１】
図１１は、マウスに皮下移植された弁の部位へのマクロファージの補充に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１２】
図１２は、マウスに皮下移植された弁のｐＨに対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１３】
図１３は、マウスに皮下移植された弁の部位での炭酸脱水酵素ＩＩ発現に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１４】
図１４は、マウスに皮下移植された弁の多核性異物巨細胞の数に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図１５】
図１５は、インビボでの弁鉱化作用に対するオステオポンチンのリン酸化の効果を示す。