【手続補正書】
【提出日】平成18年5月18日(2006.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラジウム複合体により促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、モノカルボン酸、ヒドロキシ置換した酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ウロン酸、アルドン酸およびアルダル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、封入体の形態で組換え的に発現されるキメラタンパク質であって、反応混合液中封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合液の温度が約５０℃〜７０℃に維持されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
キメラタンパク質の切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’−ビピリジル；1,10-フェナントロリン：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン；3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン；および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2；シス−[Pd(en)(OH2)2]2+；シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+；シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+；シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)またはT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
有機溶媒がマロン酸である、請求項１、２または９に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が約１０：１である、請求項１、２、９または１４に記載の方法。
【請求項１６】
キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒がクエン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、GLP-1、GLP-2、PTH、GRF、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン5、ゲーグリン6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシン、タフトシン、またはこれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチド、インスリン、ならびにこれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項１８および１９に記載の方法。
【請求項２１】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項１８および１９に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞が大腸菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
切断反応の温度が約６０℃である、請求項１または９に記載の方法。
【請求項２４】
クエン酸が３Ｍ クエン酸であり、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic（ピコリルアミン）、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチド精製方法であって、以下の工程：
（ａ）酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸、トリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にキメラタンパク質を可溶化することにより、Cys-His切断部位で、ペプチドのＮ末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質からペプチドを切断し；そして、
（ｂ）限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより工程（ａ）の反応混合液から切断されたペプチドを回収すること（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）
を含む方法。
【請求項２６】
反応混合物中における封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
反応混合液の温度が約５０℃〜約７０℃に維持されている、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’-ビピリジル；1,10-フェナントロリン：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン；3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン；および、ジエチレントリアミンから選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３２】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2；シス−[Pd(en)(OH2)2]2+；シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+；シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+；シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
有機溶媒がマロン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が約１０：１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
有機溶媒がクエン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
ペプチドがGLP-1、GLP-2、GRF、PTH、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチド、インスリン、ならびにそれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態にて宿主細胞から回収されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞が大腸菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
切断反応の温度が約６０℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
クエン酸が３Ｍ クエン酸であり、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】
ペプチドを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）Cys-His切断部位でペプチドのＮ末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現し、封入体の形態で宿主細胞からキメラタンパク質を回収し；
（ｂ）酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸およびトリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中に工程（ａ）で回収した封入体を可溶化することによってキメラタンパク質からペプチドを切断し（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）；そして、
（ｃ）限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーによって工程（ｂ）の反応混合液から切断されたペプチドを回収すること
を含む方法。
【請求項５１】
反応混合物中における封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
反応混合液の温度が約５０℃〜約７０℃に維持されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’-ビピリジル；1,10-フェナントロリン：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン；3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン；および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2；シス−[Pd(en)(OH2)2]2+；シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+；シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+；シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+；および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
有機溶媒がマロン酸である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸塩であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が約１０：１である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ペプチドがGLP-1、GLP-2、GRF、PTH、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
パラジウム複合体により促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸、トリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度は約１〜２２モルである）、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
従って、本発明の方法は、グルカゴン様ペプチド-2(GLP-2)、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、成長ホルモン放出因子(GRF)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン（exendin）、アミリン（amylin）、様々なオピオイドペプチド、カエル皮抗生物質ペプチド、例えばゲーグリン（gaegurin）5および6、ブレビニン（brevinin）1、ラナテリン（ranatuerin）1〜9、およびエスクレチン（esculetin）、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（GIP）、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン（thymopoietin）、サイモシン（thymosin）、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシン（neurotensin）、タフトシン（tuftsin）およびこれらのペプチドの断片ならびに誘導体を含むが、これに限定されないペプチドを包含するキメラタンパク質の切断を提供する。