【手続補正書】
【提出日】平成17年10月3日(2005.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面静電容量が約40〜約240pFであるヒト皮膚同等物を含む組成物。
【請求項２】
ヒト皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の総合含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
皮膚同等物が、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択されるケラチノサイトを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
ケラチノサイトが異種GKLFを発現する、請求項5記載の組成物。
【請求項８】
2種の異なる源に由来するケラチノサイトをさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
GKLFをコードする配列が誘導性プロモーターと機能的に結合したものを含むDNA構築物を含む、単離されたケラチノサイト。
【請求項１０】
請求項9記載のケラチノサイトを含む器官培養物。
【請求項１１】
バリアー機能が改良された皮膚同等物を作製する方法であって、
a）ケラチノサイト、ならびにアスコルビン酸およびリノール酸を含む培地を提供する段階；
b）該ケラチノサイトを、バリアー機能が改良された皮膚同等物が形成される条件下で培養する段階、
を含む方法。
【請求項１２】
アスコルビン酸が約10〜100μg／mlの濃度で提供される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
アスコルビン酸が約50μg／mlの濃度で提供される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
リノール酸が約5〜80μMの濃度で提供される、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
ケラチノサイトが初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ケラチノサイトが、GKLFをコードする配列が外因性プロモーターと機能的に結合したものを含むDNA構築物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
皮膚同等物の表面静電容量が約40〜約240pFである、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項11記載の方法。
【請求項２２】
請求項11記載の方法によって作製された皮膚同等物。
【請求項２３】
バリアー機能が改良された皮膚同等物を作製する方法であって、
a）ケラチノサイト、およびGKLFをコードする配列が外因性プロモーターと機能的に結合したものを含むDNA構築物を提供する段階；
b）該ケラチノサイトに該DNA構築物をトランスフェクトして、トランスフェクトされたケラチノサイトを得る段階；ならびに
c）該トランスフェクトされたケラチノサイトを、バリアー機能が改良された皮膚同等物が形成される条件下で培養する段階、
を含む方法。
【請求項２４】
培養段階がさらに、トランスフェクトされたケラチノサイトを、アスコルビン酸およびリノール酸を含む培地中で培養する段階を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
アスコルビン酸が約10〜100μg／mlの濃度で提供される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
アスコルビン酸が約50μg／mlの濃度で提供される、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
リノール酸が約5〜80μMの濃度で提供される、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
ケラチノサイトが、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ケラチノサイトが、GKLFをコードする配列が誘導性プロモーターと機能的に結合したものを含むDNA構築物を含む、請求項23記載の方法。
【請求項３１】
皮膚同等物の表面静電容量が約40〜約240pFである、請求項23記載の方法。
【請求項３２】
ヒト皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項23記載の方法。
【請求項３３】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項23記載の方法。
【請求項３４】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項23記載の方法。
【請求項３５】
請求項23記載の方法によって作製された皮膚同等物。
【請求項３６】
化合物のスクリーニングの方法であって、
a）表面静電容量が約40〜約240pFである皮膚同等物を提供する段階、
b）該皮膚同等物を該化合物で処理する段階、
を含む方法。
【請求項３７】
段階c）皮膚同等物に対する化合物の影響をアッセイする段階を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
化合物がコンビナトリアルライブラリーから選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
ヒト皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項36記載の方法。
【請求項４１】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項36記載の方法。
【請求項４２】
皮膚同等物が、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択されるケラチノサイトを含む、請求項36記載の方法。
【請求項４３】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ケラチノサイトが異種GKLFを発現する、請求項36記載の方法。
【請求項４５】
表面静電容量が約40〜約240pFである少なくとも1つの皮膚同等物、を含むキット。
【請求項４６】
少なくとも1つの皮膚同等物を培養するための培地をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
皮膚同等物を培養するための説明書をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４８】
少なくとも1つの皮膚同等物を用いて化合物を試験するための説明書をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４９】
皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項45記載のキット。
【請求項５０】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項45記載のキット。
【請求項５１】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項45記載のキット。
【請求項５２】
ヒト皮膚同等物が、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択されるケラチノサイトを含む、請求項45記載のキット。
【請求項５３】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項51記載のキット。
【請求項５４】
ケラチノサイトが異種GKLFを発現する、請求項45記載のキット。
【請求項５５】
皮膚刺激物の疑いのある化合物のスクリーニングの方法であって、
a）i）皮膚刺激物の疑いのある化合物；および
ii）刺激物応答性レポーター遺伝子構築物を含む皮膚同等物
を提供する段階；
b）該皮膚同等物を該化合物と接触させる段階；ならびに
c）該レポーター遺伝子構築物からの遺伝子発現のレベルを測定する段階、
を含む方法。
【請求項５６】
ヒト皮膚同等物の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
皮膚同等物におけるセラミド5、6および7の含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
皮膚同等物におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項55記載の方法。
【請求項５９】
皮膚同等物が、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択されるケラチノサイトを含む、請求項55記載の方法。
【請求項６０】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
ケラチノサイトが異種GKLFを発現する、請求項55記載の方法。
【請求項６２】
刺激物応答性レポーター構築物が、インターロイキン-8およびインターロイキン-1αからなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部分を含む、請求項55記載の方法。
【請求項６３】
部分が調節領域を含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
刺激物応答性レポーター遺伝子構築物を含むNIKS細胞、を含む組成物。
【請求項６５】
NIKS細胞の表面静電容量が約40〜約240pFである、請求項64記載の組成物。
【請求項６６】
NIKS細胞の表面静電容量が約80〜約120pFである、請求項64記載の組成物。
【請求項６７】
NIKS細胞におけるセラミド5、6および7の総合含有量がセラミド総含有量の約20〜約50％である、請求項64記載の組成物。
【請求項６８】
NIKS細胞におけるセラミド2の含有量がセラミド総含有量の約10〜約40％である、請求項64記載の組成物。
【請求項６９】
NIKS細胞が異種GKLFを発現する、請求項64記載の組成物。
【請求項７０】
2種の異なる源に由来するケラチノサイトをさらに含む、請求項64記載のNIKS細胞。
【請求項７１】
GKLFをコードする配列が外因性プロモーターと機能的に結合したものを含むDNA構築物をさらに含む、請求項64記載のNIKS細胞。
【請求項７２】
請求項64記載のNIKS細胞を含む器官培養物。
【請求項７３】
刺激物応答性遺伝子を同定する方法であって、
a）i）皮膚刺激性化合物；
ii）遺伝子発現アレイ；および
iii）皮膚同等物
を提供する段階；
b）該皮膚刺激性化合物を該皮膚同等物と接触させて、刺激物で処理した皮膚同等物を作製する段階；
c）第1のmRNA試料を該刺激物で処理した皮膚同等物から単離して、第2のmRNA試料を該皮膚同等物から単離する段階；
d）該第1および第2のmRNA試料を該遺伝子発現アレイと接触させる段階；ならびに
e）該遺伝子発現アレイを、該刺激物で処理した皮膚同等物において該皮膚同等物よりも高いレベルで発現される遺伝子の実体が決定される条件下で分析する段階、
を含む方法。
【請求項７４】
皮膚同等物が培養ヒトケラチノサイトを含む、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
培養ヒトケラチノサイトが器官培養物として存在する、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
刺激物応答性レポーター構築物が、インターロイキン-8およびインターロイキン-1αからなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部分を含む、請求項73記載の方法。
【請求項７７】
部分が調節領域を含む、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
遺伝子アレイがヒトcDNA配列を含む、請求項76記載の方法。
【請求項７９】
播種された真皮同等物を調製するための工程であって、
a．真皮同等物、ケラチノサイト、および気相界面を有する培地を提供する段階；
b．真皮同等物を該培地中で培養する段階；
c．該真皮同等物を該気相界面まで挙上して、挙上された真皮同等物を得る段階；ならびに
d．該真皮同等物に該ケラチノサイトを播種して、播種された真皮同等物を得る段階、
を含む工程。
【請求項８０】
ケラチノサイトが、初代ヒトケラチノサイトおよび不死化ヒトケラチノサイトからなる群より選択される、請求項79記載の工程。
【請求項８１】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項80記載の工程。
【請求項８２】
真皮同等物がコラーゲンおよび線維芽細胞を含む、請求項79記載の工程。
【請求項８３】
コラーゲンがラット尾腱コラーゲンである、請求項82記載の工程。
【請求項８４】
線維芽細胞がNHDF細胞である、請求項82記載の工程。
【請求項８５】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも6時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項８６】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも12時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項８７】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも18時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項８８】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に約24時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項８９】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に約6時間〜約24時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項９０】
段階e）が、該播種された真皮皮膚同等物を、皮膚同等物が形成される条件下でインキュベートする段階をさらに含む、請求項79記載の工程。
【請求項９１】
皮膚同等物が重層化される、請求項90記載の工程。
【請求項９２】
皮膚同等物が重層化されて扁平上皮となる、請求項90記載の工程。
【請求項９３】
請求項79記載の工程によって作製された、播種された真皮同等物。
【請求項９４】
請求項90記載の工程によって作製された皮膚同等物。
【請求項９５】
皮膚同等物を調製するための工程であって、
a．真皮同等物、ケラチノサイト、および気相界面を有する培地を提供する段階；
b．該真皮同等物を該培地中で培養する段階；
c．該真皮同等物を該気相界面まで挙上して、挙上された真皮同等物を得る段階；
d．該真皮同等物に該ケラチノサイトを播種して、播種された真皮同等物を得る段階；ならびに
e．該播種された真皮同等物を、皮膚同等物が形成される条件下で培養する段階、
を含む工程。
【請求項９６】
ケラチノサイトが、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項95記載の工程。
【請求項９７】
不死化ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項96記載の工程。
【請求項９８】
真皮同等物がコラーゲンおよび線維芽細胞を含む、請求項95記載の工程。
【請求項９９】
コラーゲンがラット尾腱コラーゲンである、請求項98記載の工程。
【請求項１００】
線維芽細胞がNHDF細胞である、請求項98記載の工程。
【請求項１０１】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも6時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項95記載の工程。
【請求項１０２】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも12時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項95記載の工程。
【請求項１０３】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に少なくとも18時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項95記載の工程。
【請求項１０４】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に約24時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項95記載の工程。
【請求項１０５】
挙上が、挙上された真皮同等物を播種の前に約6時間〜約24時間、気相界面でインキュベートする段階をさらに含む、請求項95記載の工程。
【請求項１０６】
皮膚同等物が重層化される、請求項95記載の工程。
【請求項１０７】
皮膚同等物が重層化されて扁平上皮となる、請求項95記載の工程。
【請求項１０８】
多孔性底面および側壁を有するグロースチャンバーを含む組成物であって、該多孔性底面の上に真皮同等物があり、該真皮同等物が該グロースチャンバーの該側壁に実質的に付着している組成物。
【請求項１０９】
グロースチャンバーの多孔性底面が直径約0.1〜20.0cmである、請求項108記載の組成物。
【請求項１１０】
グロースチャンバーの多孔性底面が直径約1.0cmである、請求項108記載の組成物。
【請求項１１１】
皮膚同等物が重層化される、請求項108記載の組成物。
【請求項１１２】
皮膚同等物が重層化されて扁平上皮となる、請求項108記載の組成物。
【請求項１１３】
皮膚同等物が真皮同等物を含む、請求項108記載の組成物。
【請求項１１４】
真皮同等物がコラーゲンおよび線維芽細胞を含む、請求項113記載の組成物。
【請求項１１５】
コラーゲンがラット尾腱コラーゲンである、請求項114記載の組成物。
【請求項１１６】
線維芽細胞がNHDF細胞である、請求項114記載の組成物。
【請求項１１７】
皮膚同等物がケラチノサイトを含む、請求項108記載の組成物。
【請求項１１８】
ケラチノサイトが、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項117記載の組成物。
【請求項１１９】
ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項118記載の組成物。
【請求項１２０】
真皮同等物を含む組成物であって、該真皮同等物が該真皮同等物1cm２当たり約0.2mg〜2.0mgのコラーゲンを含む組成物。
【請求項１２１】
真皮同等物が該真皮同等物1cm２当たり約0.22mg〜1.0mgのコラーゲンを含む、請求項120記載の組成物。
【請求項１２２】
真皮同等物が該真皮同等物1cm２当たり約0.5mgのコラーゲンを含む、請求項120記載の組成物。
【請求項１２３】
ケラチノサイトをさらに含む、請求項120記載の組成物。
【請求項１２４】
ケラチノサイトが、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項120記載の組成物。
【請求項１２５】
ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項124記載の組成物。
【請求項１２６】
真皮同等物がコラーゲンおよび線維芽細胞を含む、請求項120記載の組成物。
【請求項１２７】
コラーゲンがラット尾腱コラーゲンである、請求項126記載の組成物。
【請求項１２８】
BSA、イソプロテレノール、カルニチン、セリン、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、α-トコフェロール、アスコルビン酸およびEGFを含む組成物。
【請求項１２９】
BSA、イソプロテレノール、カルニチン、セリン、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、α-トコフェロール、アスコルビン酸およびEGFが、インビトロ培養皮膚同等物におけるバリアー機能を改良するのに十分な濃度で存在する、請求項128記載の組成物。
【請求項１３０】
血清をさらに含む、請求項128記載の組成物。
【請求項１３１】
塩化カルシウム、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、インスリンおよびアデニンをさらに含む、請求項128記載の組成物。
【請求項１３２】
ウシ血清アルブミンが約0.1〜10.0mg／mlの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３３】
イソプロテレノールが約0.1〜10.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３４】
カルニチンが約1.0〜100.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３５】
セリンが約1.0〜100.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３６】
オレイン酸が約1.0〜100.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３７】
リノール酸が約1.0〜100.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３８】
アラキドン酸が約1.0〜100.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１３９】
α-トコフェロールが約0.1〜10.0μMの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１４０】
アスコルビン酸が約0.005〜5.0mg／mlの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。
【請求項１４１】
上皮増殖因子が約0.1〜10.0ng／mlの濃度で提供される、請求項128記載の組成物。