【手続補正書】
【提出日】平成17年6月3日(2005.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
ヒトパルボウイルスと関連する捕捉核酸を含む固体支持体と、該生物学的サンプルとを、標的核酸鎖が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、該捕捉核酸とハイブリダイズする条件下で接触させることにより、ヒトパルボウイルスを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離し、そして該固体支持体を該サンプルから分離する、工程；
該単離された核酸を、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが６０ヌクレオチド以下であり、それぞれ、標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一部に十分に相補的であって、該プライマーの各々とハイブリダイズする、工程；ならびに
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のヒトパルボウイルスＢ１９の存在の指標として検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記固体支持体がビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉核酸は、前記固体支持体に該捕捉核酸を連結するためのホモポリマー鎖をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホモポリマー鎖が、ポリＡ鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、以下：
配列ＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＧを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＡを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＣＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣを有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列ＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＧを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列ＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＡを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列ＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、および
配列ＣＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣを有するオリゴヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
からなる群より選択される、１以上のオリゴヌクレオチドを含む、方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、以下：
配列番号４９を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５０を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５１を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５２を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５３を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５４を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５５を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
配列番号５４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、および
配列番号５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド、
からなる群より選択される、１以上のオリゴヌクレオチドを含む、
方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、
（ａ）前記センスプライマーは、（ｉ）配列番号６０もしくは配列番号６０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号８８もしくは配列番号８８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；そして
（ｂ）アンチセンスプライマーは、（ｉ）該センスプライマーが配列番号６０もしくは配列番号６０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合に、配列番号５９もしくは配列番号５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）該センスプライマーが配列番号８８もしくは配列番号８８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合に、配列番号８９もしくは配列番号８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド、を含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記増幅する工程は、ＲＴ−ＰＣＲ、転写媒介増幅、蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイ、またはこれらの組み合わせを包含する、方法。
【請求項１０】
前記増幅する工程は、前記センスプライマーおよび前記アンチセンスプライマーを使用する蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイを包含し、前記検出する工程は、検出可能な標識を含む少なくとも１つのプローブを使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される、蛍光標識である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記プローブは、５’末端および３’末端に検出可能な標識をさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記少なくとも１つのプローブは、長さが５０ヌクレオチド以下であり、かつ（ｉ）前記センスプライマーが配列番号６０もしくは配列番号６０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合に、配列番号６１のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）前記センスプライマーが配列番号８８もしくは配列番号８８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合に、配列番号９３のヌクレオチド配列、を含む、方法。
。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、内部コントロール配列が存在する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記内部コントロール配列が、配列番号９２のヌクレオチド配列に由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記内部コントロール配列についての検出可能に標識されたプローブ配列をさらに含む、方法。
【請求項１７】
蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイを使用して、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９を検出する方法であって、
該方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９と関連する、配列番号４９〜５５からなる群より選択される１以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸を含む磁性ビーズと、該生物学的サンプルとを、標的核酸鎖が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、該捕捉核酸とハイブリダイズする条件下で接触させることにより、ヒトパルボウイルスＢ１９を含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離し、そして該サンプルから該磁性ビーズを分離する、工程；
（ｂ）該核酸を、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが６０ヌクレオチド以下であり、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一部に十分に相補的であって、該プライマーの各々とハイブリダイズし、ここで（ｉ）該センスプライマーは、配列番号６０を含み、該アンチセンスプライマーは、配列番号５９を含むか、または（ｉｉ）該センスプライマーは、配列番号８８を含み、該アンチセンスプライマーは、配列番号８９を含む、工程；ならびに
（ｃ）該増幅された核酸の存在を、長さが５０ヌクレオチド以下であって、かつ（ｉ）該センスプライマーが配列番号６０を含む場合に、配列番号６１のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）該センスプライマーが配列番号８８を含む場合に、配列番号９３のヌクレオチド配列、を含むプローブを使用して、該サンプル中のヒトパルボウイルスＢ１９の存在の指標として検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、内部コントロール配列が存在する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記内部コントロール配列が、配列番号９２のヌクレオチド配列に由来する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記内部コントロール配列についての検出可能に標識されたプローブ配列をさらに含む、方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
配列番号４９〜５５からなる群より選択される１以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸分子；
一対のプライマーオリゴヌクレオチドであって、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々は、長さが６０ヌクレオチド以下であり、そして（ｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの一方は、配列番号６０を含み、他方のプライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号５９を含むか、または（ｉｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの一方は、配列番号８８を含み、他方のプライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号８９を含む、一対のプライマー；および
ヒトパルボウイルスＢ１９の存在を同定するための説明書、
を含む、キット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットであって、ポリメラーゼおよび緩衝液をさらに含む、キット。
【請求項２３】
請求項２１に記載のキットであって、検出可能な標識を含む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、キット。
【請求項２４】
請求項２３に記載のキットであって、前記検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
【請求項２５】
請求項２４に記載のキットであって、前記プローブは、その５’末端および３’末端に検出可能な標識をさらに含む、キット。
【請求項２６】
請求項２５に記載のキットであって、前記少なくとも１つのプローブは、長さが５０ヌクレオチド以下であり、かつ（ｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの一方が配列番号６０を含む場合に、配列番号６１のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの一方が配列番号８８を含む場合に、配列番号９３のヌクレオチド配列、を含む、キット。
【請求項２７】
請求項２１に記載のキットであって、配列番号９２のヌクレオチド配列に由来する内部コントロールをさらに含む、キット。
【請求項２８】
図３Ａ〜３Ｃまたは図４Ａ〜４Ｃに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、図３Ａ〜３Ｃまたは図４Ａ〜４Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
図２Ａ〜２Ｕまたは図１１Ａ〜１１Ｚに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイの感度、ＰＣＲプライマーの適合性および至適反応条件を、上に記載した４．７ｋｂフラグメントを含むプラスミドＤＮＡを使用して確立した。このフラグメントは、ＶＰ１領域、ならびにＮＳ１領域およびＶＰ２領域を含む（図１を参照のこと）。ＶＰ１領域に由来するＰＣＲ増幅プライマー（下に詳述する）を使用した。番号付けは、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に対応する。Ｘは、５’−フルオレセインホスホルアミダイトを示し、Ｚは、ＤＡＢＣＹＬ−ｄＴを示す。両方を、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから得た。配列の右に示した数字は、パルボウイルスＢ１９配列からのプライマーのヌクレオチドをいう。
ＶＳＰ１−ＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＣＡ（センスプライマー−ヌクレオチド３３３４−３３５０）（配列番号６０）
ＶＳＰ２−ＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴ（アンチセンスプライマー−ヌクレオチド３４２４−３４４２）（配列番号５９）
ＶＳＰＰＲ１−ＸＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＧＡＴＴＺ（プローブ−ヌクレオチド３３７９−３３９８）（配列番号６１）
Ｖｐａｒａ８：ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡ（ヌクレオチド３２６２−３２８２）（配列番号８８）
Ｖｐａｒａ９：ＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＣ（アンチセンスプライマー−ヌクレオチド３３１５−３３３３）（配列番号８９）
Ｖｐａｒａ１０：ＸＴＡＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＺ、ここでＸは、Ｆａｍであり、そしてＺは、Ｔａｍｒａである。（ヌクレオチド３２８６−３３１０）（配列番号９３）
プラスミドＤＮＡ濃度を、分光光度法で概算し、そして段階希釈を実施して５，０００〜１０コピー／２０μｌを得た。最終容量５０μｌ中の反応ミックスは、２０μｌのサンプル、３．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１ＸＧｏｌｄ  Ｔａｑ増幅緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、３００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｐｍｏｌの各増幅プライマー、０．４ｐｍｏｌのプローブ、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ酵素を含有した。反応条件は、以下を含んだ：ＡＢＩ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて、酵素を活性化するための９５℃１０分間、次いで４５サイクルの、６０℃と交互の９５℃３０秒間。