【手続補正書】
【提出日】平成18年3月22日(2006.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】     
【請求項１】  それにより祖先鋳型のセットがシャッフリングされ、子孫ポリヌクレオチド分子および対応するようにコードされたポリペプチドのライブラリーを産生することができ、かつそれにより子孫ポリヌクレオチドライブラリーのスクリーニングが望ましい特性を有する望ましい種を同定する手段を提供する、全体の非ランダムな集合順序を有するキメラ核酸分子のライブラリーを非確率論的に産生する方法であり、
（a）相互に互換性のあるライゲーション可能末端を有する複数の核酸構築ブロックを非ランダムに産生する段階；および
（b）設計された全体の集合（assembly）順序が達成されるように核酸構築ブロックを集合させる段階
を含む方法。
【請求項２】  それにより祖先鋳型のセットがシャッフリングされ、子孫ポリヌクレオチド分子および対応するようにコードされたポリペプチドのライブラリーを産生でき、かつそれにより子孫ポリヌクレオチドライブラリーのスクリーニングが望ましい特性を有する望ましい種を同定するための方法を提供する、設計により選抜された全体の集合順序を有するキメラ核酸分子の1つ又は複数の分類からなる、規定された数の分類からなる非確率論的にライブラリーを産生する方法であり、以下の段階を含む方法：
（a）相互に互換性のある有用なライゲーション可能末端を有する特定の核酸構築ブロックセットを各分類について設計により産生する段階；および
（b）設計された全体の集合順序が達成されるように該分類にしたがってこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階
を含む方法。
【請求項３】  以下の段階を含む、ポリヌクレオチドを集合させる方法：
（a）各ブロックが、前決定された前駆体鋳型配列に引き続く二本鎖を含む、複数の核酸構築ブロックを提供する段階；
（b）第一のブロックを第二のブロックに、順番にライゲーションする段階であって、ここで、ライゲーションの前に、第一のブロックと第二のブロックが、相互に適合性のある有用なライゲーション可能末端を有し、それによって集合を得る段階；
（c）別の段階において、前の段階で得られた集合に、引き続くブロックを順番にライゲーションする段階であって、ここで、ライゲーションの前に、集合と引き続くブロックが、相互に適合性のある有用なライゲーション可能末端を有し、それによってさらに集合を得る段階；および、
（d）全体の集合順序に従って、ポリヌクレオチドが集合されるように、任意で段階（c）を繰り返す段階。
【請求項４】  ブロックがDNAである、請求項3記載の方法。
【請求項５】  少なくとも１つのブロックが化学合成される、請求項3記載の方法。
【請求項６】  少なくとも１つのブロックがポリメラーゼに基づく増幅法の産物である、請求項5記載の方法。
【請求項７】  縮重コドンを含むブロックが提供される、請求項3記載の方法。
【請求項８】  ブロックが改変したアミノ酸を導入する、請求項3記載の方法。
【請求項９】  ブロックの全体の集合順序がライゲーション可能末端によって特定される、請求項3記載の方法。
【請求項１０】  １つのライゲーション段階におけるライゲーション可能末端が、引き続くライゲーション段階における末端と適合性がない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】  段階（b）または（c）の少なくとも一つにおいて、有用な相互にライゲーション可能末端が、末端リン酸基を有するオーバーハングを有する、請求項3記載の方法。
【請求項１２】  ブロックが5'リン酸基を欠く、請求項3記載の方法。
【請求項１３】  鋳型配列が境界点を有し、それによってブロックに引き続く二本鎖が境界点によって示される、請求項3記載の方法。
【請求項１４】  ブロックがキメラポリヌクレオチドを生産するように、ブロックの設計が鋳型配列の分析によって得られる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】  設計が特異的なブロックである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】  特異的なブロックの設計が、前決定された前駆体鋳型配列に引き続く二本鎖のものである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】  設計がブロックの特異的な相互に適合性のあるライゲーション可能末端である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】  設計がブロックの集合の特定の順序のものである、請求項14記載の方法。
【請求項１９】  設計が紙上で達成される、請求項15、16、17、または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】  設計がコンピューターモデリングで達成される、請求項15、16、17、または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】  所望の特性に従って、予測されたキメラポリヌクレオチドを順位付けする段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】  ブロックが引き続く複数の鋳型配列を含む、請求項3記載の方法。
【請求項２３】  鋳型配列が関連遺伝子のファミリーをコードする、請求項22記載の方法。
【請求項２４】  キメラポリヌクレオチドが集合する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】  複数の鋳型配列が整列した境界点を共有し、それにより、ブロックに引き続く二本鎖が境界点によって示される、請求項22記載の方法。
【請求項２６】  鋳型配列が境界点を有し、かつライゲーション段階の順番が、鋳型配列の境界点の順番に従う、請求項3記載の方法。
【請求項２７】  ライゲーション段階（c）の前に、引き続くブロックが少なくとも１つの他のブロックにライゲーションし、それによって、段階（c）が引き続くブロックと他のブロックの組み合わせを、全体として、集合に結合する、請求項3記載の方法。
【請求項２８】  段階（c）が一度に二つ以上のブロックの組み合わせを結合する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】  所望の特性に対して集合をスクリーニングまたは選択する段階（e）をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項３０】  集合を発現する段階（e1）をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項３１】  集合を発現する段階から得られた発現産物をスクリーニングまたは選択する段階（e2）をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】  以下の段階を含み、それによってポリヌクレオチドライブラリーが作製される、ポリヌクレオチドライブラリーを作製する方法：
（1）ブロックの第一のセットが結合され、それによって、第一のポリヌクレオチドが得られる、請求項3記載の方法を実施する段階；
（2）ブロックの第二のセットが結合され、それによって、第二のポリヌクレオチドが得られる、請求項3記載の方法を実施する段階。
【請求項３３】  ブロックの第一および第二のセットが引き続く複数の鋳型配列を含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】  鋳型配列が境界点を有し、かつ段階（1）および（2）のそれぞれにおけるライゲーション段階の順番が鋳型配列の境界点の順番に従う、請求項33記載の方法。
【請求項３５】  方法が徹底的に実施され、それによって可能性のあるブロックのライゲーション可能な組み合わせの全てがライブラリーに提示される、請求項32記載の方法。
【請求項３６】  請求項3記載の方法を実施することによって得られた、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】  請求項3記載の方法を実施することによって得られた、キメラポリヌクレオチド。
【請求項３８】  請求項32記載の方法を実施することによって得られた、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３９】  請求項32記載の方法を実施することによって得られた、キメラポリヌクレオチドライブラリー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本明細書で使用されるような「規定された配列のフレームワーク」という用語は、作為抽出原理によって、一般的には実験データまたは構造データを元に選択される1組の限定配列を示す；例えば、限定配列のフレームワークはβ-シート構造を形成すると予測される1組のアミノ酸配列を含んでもよく、または他の異型間でロイシンジッパー7つ組の繰返しモチーフ、ジンクフィンガードメインを含んでもよい。「限定配列カーナル(kernal)」とは、変動性について限定される範囲を含む1組の配列である。(1）20個の通常のアミノ酸の完全にランダムな10merの配列は、(20)10の配列のうちの任意のもので、かつ(2）20個の通常のアミノ酸の疑似乱数の10mer配列であることができるが、いくらかの位置および/または全体においてある残基のための偏りを示すと考えられるが、それに対して（3）各々の残基の位置が許容できる20個の通常のアミノ酸（および/または許容できる異例のアミノ酸/イミノ酸）のうちの任意のものであることが可能であった場合には、限定配列カーナルは、配列の部分集合である。定義された配列カーナルは、一般的には可変および不変残基位置を含み、かつ/またはアミノ酸残基の限定部分集合および選択される個々のライブラリーメンバー配列の全長を部分的または全長に渡るようなものなどから選択される残基を含むことができる可変残基位置を含む。限定配列カーナルは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のどちらかを示すことができる。NがA、T、GまたはCに相当し；KがGまたはTに相当し；かつMがAまたはCに相当し例証ではあるが、限定ではない配列（NNK)10と(NNM)10（配列番号：1および2）は、限定配列カーナルである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
本明細書で使用されるような「一本鎖抗体」という用語は、一般的にはスぺーサーペプチド(例えば、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x）（配列番号：3）を介して結合するポリペプチド結合におけるVHドメインとVLドメインを含み、かつアミノ末端および/またはカルボキシ末端の付加的なアミノ酸配列を含んでもよいポリペプチドを示す。例えば、一本鎖抗体は、コードしているポリヌクレオチドに結合するためのつなぎ鎖の部分を含んでもよい。例として、scFVは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、一般的には免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされ（例えば、本明細書に参照として組み入れられている、WilliamとBarclay、1989、pp. 361-368を参照のこと)、最も多くの場合には齧歯動物、ヒト以外の霊長類、鳥類、ブタウシ亜科動物、ヒツジ、ヤギ、またはヒトの重鎖または軽鎖の遺伝子配列によってコードされる、少なくとも10個の隣接するアミノ酸の1つまたはそれ以上のポリペプチド部分からなるタンパク質である。機能的な一本鎖抗体は、一般的には、特定の標的分子、典型的には受容体または抗原(エピトープ)に結合する特性を保持するように免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
1988年に初めてであるが、一本鎖のFv断片アナログとその融合タンパク質が、抗体操作法によって実際に生成された。この第1段階には通常、望ましい結合特性を備えたVH及びVLドメインをコードする遺伝子を得る段階が関与しており、即ちこれらのV遺伝子は、特異的なハイブリドーマ細胞系統から単離してもよいし、組み合わせV遺伝子ライブラリーから選択してもよいし、あるいはV遺伝子合成法によって作製してもよい。この一本鎖Fvは構成要素のV遺伝子を、（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3（配列番号：4）または等価のリンカーペプチドのような適当に設計されたリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと連結することによって形成される。このリンカーは、VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH'のいずれかの順番で、一つ目のV領域のC末端と、二つ目のN末端を橋掛けする。原理的にはscfvブリッジ部位は、その元の抗体結合部位の親和性と特異性の両方を忠実に複製できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０５】
本発明のある局面によると、複数の配列（ただし必ずしも重複でないかもしれない）が、ポリメラーゼに基づく反応でオリゴヌクレオチドを使用することによって、末端選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に導入されうる。関連する場合、ただし限定的な例を意味するのではないが、このようなオリゴヌクレオチドはトポイソメラーゼIに基づく末端選択法で有用な好ましい5'末端領域を提供するために用いることが可能で、そのオリゴヌクレオチドは、接着末端に変換可能な1-10個の塩基配列（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼIによって）、リボソーム結合部位（即ち、「RBS」であり、それは発現クローニングの際に好適に役立てる）、及びATG開始部位と0-100個の塩基からなる鋳型特異性の配列（ポリメラーゼに基づく反応で鋳型へのアニーリングを容易にするための）が続く任意のリンカー配列を含む。このようにこの例によると、利用可能なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマーと言うことができる）は配列、即ち5'[末端配列＝(N)1-10][トポイソメラーゼI部位及びRBS＝AAGGGAGGAG（配列番号：5）][リンカー＝(N)1-100][開始コドン及び鋳型特異性配列＝ATG(N)0-100]3'を持っているとよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０８】
このように増幅された親分子に第2セットのプライマーをアニーリングすることは、トポイソメラーゼIの認識部位に似ているが、機能的なトポイソメラーゼI酵素の認識を阻害するのに充分なほど異なっている第1セットのプライマー（即ち、一セットの親分子を増幅するために用いられるプライマー）の配列を含むことによって容易化できる。例えば、どこかの1個の塩基から5個すべての塩基までにAAGGG部位とは異なる配列を、第1セットのプライマー（突然変異誘発にかける前に親の鋳型を増幅させるために用いられる）に導入することができる。特定すると、ただし非限定的な局面であるが、こうして親分子は次の例示的な-ただし限定を意味していないが-フォワードプライマー及びリバースプライマー（配列番号：6および7）からなるセットを用いて増幅できるようになった。
2004500027.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１０】
特異的で、しかし限定的でない局面によると、この増幅法（正当なトポイソメラーゼIの認識部位に欠如のある開示された第1セットのプライマーを用いている）の後で増幅された親分子は、続いて正当なトポイソメラーゼIの認識部位を持つ一セットまたはそれ以上のセットのフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて突然変異誘発にかけることができる。特定の、しかし限定的でない局面において、こうして親分子が、次の例として挙げた-ただし限定的な意味はない-フォワードプライマー及びリバースプライマー（配列番号：8および9）からなる第2セットを用いて、突然変異した子孫分子の産生に対する鋳型として用いることができるようになっている。
2004500027.tif 000002
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３３】
1.デハロゲナーゼ発現構築物の培養物を増殖させ、そのプラスミドの調整を行った。
2.プライマーはそれぞれのコドンをランダム化させるが、それらは共通構造のX20NN（G/T）X20（配列番号：10）を持っている。
3.25μlの反応混合物を、〜50ngのプラスミド鋳型、125ngの各プライマー、天然の1×Pfu緩衝液、200uMの各dNTP、及び2.5Uの天然のPfu DNAポリメラーゼを含むように調整した。
4.反応は次のようにロボ96グラジエントサイクラー（Robo96 Gradient Cycler）でサイクルした：
95℃で1分間の最初の飽和段階；
95℃で45秒間、53℃で1分間、及び72℃で11分間を20サイクル；
72℃で10分間の最後の延長段階。
5.この反応混合物を、メチル化された鋳型DNAを消化するために10UのDpnIを用いて37℃で1時間消化させた。
6.2ulの反応混合液を用いて50ulのXL1-Blue MRF'細胞を形質転換し、そして完全な形質転換混合物を200-1000コロニーが得られる大きなLB-Amp-Metプレートに載せた。
7.個々のコロニーは、LB-Amp-IPTGを含む96-ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに細棒で入れ、一晩増殖させた。
8.これらのプレートのコロニーについて後日アッセイを行った。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
実施例6
エンドセレクションを用いる直接発現クローニング
エステラーゼ遺伝子を、5'リン酸化プライマーを用いて標準的なPCR反応（10ngの鋳型、PCR条件は3'94C、[1'94C、1'50C、1'30''68C]×30、10'68C）により増幅した。
2004500027.tif 000003
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  エキソヌクレアーゼ活性
酵素エキソヌクレアーゼIII活性を示す。これはポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、再結合、および/または連結するために使用されうる代表的な酵素である。星印は、酵素がポリヌクレオチド基質の3'方向から5'方向に向かって作用することを示している。
【図２】  ポリメラーゼに基づく増幅による核酸構築ブロックの産生
ポリメラーゼに基づく増幅反応（例えばPCR）を用いて2つの突出をもつ二重鎖核酸構築ブロックを産生する方法を図示する。示されるように、最初のプライマーセット、F2およびR1を用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Aと同一な平滑末端産物（反応1、産物1と標記）を産生するために使用される。第二のプライマーセット、F1およびR2を用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Bと同一な平滑末端産物（反応2、産物2と標記）を産生するために使用される。これらの2つの産物はその後混合され、融解およびアニーリングされ、2つの突出を有する潜在的に有用な二重鎖核酸構築ブロックを産生する。図1の例では3'突出を有する産物（産物C）が、例えばエキソヌクレアーゼIII等の3'作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の3産物のヌクレアーゼに基づく破壊により選抜される。示されているように、利用可能なプライマーが重複しうり、かつ更に利用可能なプライマーが異なる長さでありうることを図示するために、代替のプライマーが括弧内に示されている。
【図３】  独特な（unique）突出および独特な結合
各サイズの独特な突出の数（例えば1、2または3等のヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出の使用によりもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示している。例えば単ヌクレオチドからなる4つの独特な3'突出、及び単ヌクレオチドからなる4つの独特な5'突出がある。しかし、全8個の独特な単ヌクレオチド3'突出および単ヌクレオチド5'突出を用いて作製されうる独特な結合の総数は4である。
【図４】  構築ブロックを順次結合することにより達成される独特の全体集合順序
全体で「n」個の核酸構築ブロックを集合させるためには「n-1」回の結合が必要とされる事実を図示している。しかし用途に利用可能な独特な結合の数は「n-1」値より小さいことが時々ある。これら及び他の状況下では、厳密な非確率論的全体集合順序は、一連の段階の集合過程を実施することによってもなお達成されうる。本例においては2回の連続した段階が5個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序を達成するために使用される。この図示では、5個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序は5'-(#1-#2-#3-#4-#5)-3'であり、式中、#1が構築ブロック番号1を表す（以下同じ）。
【図５】  2ヌクレオチド3'突出を用いて利用可能な独特な結合
さらに、各サイズの独特な突出の数（ここでは、例えば2ヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出からもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示する。例えば、示されているような全32個に対しては、2ヌクレオチドからなる16個の独特な3'突出および2ヌクレオチドからなる別の16個の独特な5'突出がある。しかし、全32個の独特な2ヌクレオチド3'突出および2ヌクレオチド5'突出を用いて作製されうる、独特かつ自己結合しない結合の総数は12個である。いくつかの明らかな独特な結合は「一卵性双生児」（同じ影付けでマークされている）であり、それらはこの図示では視覚的に明らかである。さらに他の突出は、この図において示されおよび標識付けられているように回文構造性様式で自己結合できるヌクレオチド配列を含んでいる。それゆえ、それらは全体集合順序に高い厳密性を寄与しない。
【図６】  合成ライゲーション再集合によるキメラ組み合わせの網羅的なセットの産生（配列番号：13〜21）
この例において設計された核酸構築ブロックの全ての可能な組み合わせを網羅的かつ体系的に産生する能力における本発明の力を見せている。特に大きな子孫キメラ分子セット（又はライブラリー）が産生されうる。本方法を網羅的かつ体系的に実施することが可能であるため、新規の境界点（demarcation point）を選抜することにより、かつ対応する新規に設計された核酸構築ブロックを用いて、その方法の適用を繰り返すことが可能であり、過去に試験されたおよび拒絶された分子種を再産生および再スクリーニングする負担は回避される。境界点の頻度を増加させるためにコドンゆらぎ（wobble）を有利に使用することが可能であることは理解される。言い換えると、コドン縮重のために、祖先コドンによりコードされるアミノ酸（すなわち現在変更されたコドン）を変更することなしに、ある特定の塩基がある核酸構築ブロックにしばしば置換されうる。図示されているように、境界点は8個の祖先鋳型のアラインメントに基づいて選抜される。それらの（順序付けられた結合形成に役立つ）突出を含む核酸構築ブロックがその後設計及び合成される。この例では、全144個の核酸構築ブロック（又は二重鎖オリゴ）を得るために、8個の祖先鋳型それぞれの配列に基づき18個の核酸構築ブロックが産生される。ライゲーション合成方法を実行することにより、818（又は1.8×1016超）のキメラ収量量からなる子孫分子のライブラリーが作製されると考えられる。
【図７】  オリゴからの合成遺伝子（配列番号：22〜24）
本発明のある一つの態様によると、二重鎖核酸構築ブロックは複数の祖先核酸鋳型を整列化することにより設計される。好ましくはこれらの鋳型は、多少の類似性および多少のの異質性を含む。核酸は、その関連性が機能もしくは構造またはその両方に基づきうる、関連酵素等の関連タンパク質をコードしうる。3個のポリヌクレオチド祖先鋳型のアラインメントおよび全ての祖先分子により共有されている境界点（囲み表示）の選抜を示す。この特定の例においては、各祖先鋳型由来の核酸構築ブロックは約30ヌクレオチド長から50ヌクレオチド長となるように選抜された。
【図８】  合成ライゲーション遺伝子再集合のための核酸構築ブロック
図7の例からの核酸構築ブロックを示す。本明細書において核酸構築ブロックは、5'突出および3'突出の両方を含む互換的な突出を有する、一般的な漫画の形式で示されている。3個の祖先鋳型の各々に由来する全22個の核酸構築ブロックが存在する。したがってライゲーション合成方法により322（又は3.1×1010超）のキメラ収量からなる子孫分子のライブラリーが作製される。
【図９】  合成ライゲーション再集合によるイントロンの付加
核酸構築ブロック経由でイントロンがキメラ子孫分子内に導入されうることを、一般的な漫画の形式で示している。それらを動作可能にするために、イントロンはしばしば共通配列を両末端に有することが理解される。遺伝子スプライシングを可能にすることに加えて、他の核酸と類似した部位を提供することにより相同性組換えを可能にするという別の目的のためにイントロンがはたらきうることもまた理解される。この目的および潜在的な他の目的のためには、イントロンを導入するために巨大な核酸構築ブロックを産生することが時には望ましくてもよい。もし2つの一重鎖オリゴの直接化学合成により容易に産生されるよりもサイズが非常に大きいならば、図2に示されているように、そのような特殊化された核酸構築ブロックもまた2を超える一重鎖オリゴの直接化学合成により、またはポリメラーゼに基づく増幅反応を用いることにより産生されうる。
【図１０】  突出の全ヌクレオチドより少ない数を用いたライゲーション再集合
関係する突出において全てのヌクレオチドを使用しない様式で結合が起こりうるることを示している。「ギャップライゲーション」または「ギャップド（gapped）ライゲーション」と称されうるものを形成するリガーゼ酵素を用いた処理により結合が補強されるならば、結合は（例えば形質転換された宿主内で）特に存続する可能性が高い。示されているように、この種類の結合は不要なバックグラウンド産物の産生に寄与できるが、また設計されたライゲーション再集合により産生された子孫ライブラリーの多様性を有利に増加させるために使用されうることが理解される。
【図１１】  回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避
上述し、かつ図5に示されているように、ある突出は自己結合を受けることが可能であり、回文構造性結合を形成する。もしリガーゼ酵素を用いた処理により補強されるならば、結合は実質的に強化される。したがって、示されているようにこれらの突出における5'リン酸の欠失は、この種の回文構造性自己結合を阻止するために有利に使用されうることが理解される。したがって本発明により、ライゲーション再集合過程における回文構造性自己結合を阻止するために、例えばウシ小腸アルカリフォスファターゼ（CIAP）等の脱リン酸化酵素を用いた処理により、5'リン酸基を欠失する核酸構築ブロックが化学的に作製（または注文）されうる（また一方それらが除去されうる）。
【図１２】  経路操作
任意で飽和突然変異導入等の他の定方向進化法を用いて、ライゲーション再集合を用いる新規遺伝子経路を作製する方法を提供することが本発明の目標である。この目標を達成するためにとられうる好ましいアプローチを図示している。天然の微生物遺伝子経路は、時に部分的に連結されているに過ぎない天然の真核生物（例えば植物）遺伝子経路よりも、しばしば連結されていることが理解される。ある特定の態様では、本発明はライゲーション再集合過程により産生された子孫遺伝子経路に、（プロモーターを含む）制御遺伝子配列が核酸構築ブロックの形で導入されうることを提供する。それゆえ、本来連結されていない遺伝子および遺伝子経路ならびに元来連結されている微生物遺伝子経路が、植物および他の真核生物における実施可能性を獲得するためにそのように変換されうる。
【図１３】  回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避
新規遺伝子経路の産生に加えて、本発明で開示された定方向進化法（飽和突然変異導入および合成ライゲーション再集合を含む）を用いて改良型子孫分子を達成するため、本発明の別の目標は、天然および人工の両方の遺伝子経路を、突然変異導入および選抜に供することであることが図示されている。本発明で提供されているようにある特定の態様においては、微生物および植物の両経路を定方向進化により改良することができ、かつ示されているように、定方向進化過程を、経路に連結される前の遺伝子および遺伝子経路自身の両方に対して実施することができる。
【図１４】  微生物経路の真核生物経路への変換
ある特定の態様においては、本発明は、微生物経路が植物および他の真核生物種で機能する制御配列の導入によりそれらの種において実施可能な経路に変換されうることを提供する。好ましい制御配列はプロモーター、オペレーターおよびアクチベーター結合部位を含む。示されているようにそのような利用可能な制御配列の導入を達成する好ましい方法は、核酸構築ブロックの形式であり、特にライゲーション再集合過程における結合の使用を介する。これらの結合はA、B、C、DおよびFの文字でマークされている。
【図１５】  対応する推定ポリヌクレオチドを（インビボまたはインビトロ）合成することおよび推定ポリヌクレオチドを定方向進化に供すること、および続いて発現されたポリペプチドを発現スクリーニングすることによるポリペプチドの進化
本発明はライゲーション再集合および部位飽和性突然変異導入がヌクレオチド置換ならびにヌクレオチド欠失およびヌクレオチド付加ならびにそれらの組み合わせを導入するために各々役立つことを提供する。さらに合成ライゲーション再集合は、ヌクレオチドカセットの順序を非確率論的な事前決定された様式で再配列するために、単一の鋳型ならびに複数の開始鋳型において実施されうる。その上、複数の開始鋳型をライゲーション再集合に供する場合、（例えば各結合に関与する）各鋳型から同じ数の核酸構築ブロックが産生される必要はない。それゆえ例えば3個の鋳型が使用されるならば、その後各鋳型に対応する異なる数の核酸構築ブロックが産生されうる。
【図１６】  インシリコトリアージ（triage）
潜在的産物の分類および「構造機能」予測による分類の順位付けを図示しており、その段階は本明細書において「トリアージ」および、コンピュータの支援を用いて実施されるならば、具体的に「インシリコトリアージ」と称されるものの局面である。
【図１７】  固相ライゲーション再集合（配列番号：25〜26）
【図１８】  ポリヌクレオチド再集合
定方向進化の例が示されている。n個の異なるウイルス株がこの図示で使用されているが、技術は、異なる株、種または遺伝子ファミリーが、他の相同な核酸と比較して1つ又は複数のヌクレオチドが変化された相同な核酸を有する任意の核酸、ならびに任意の単一の核酸にも適用可能である。本明細書に記載されているように、異なる変異核酸は実験的に、好ましくは非確率論的に産生され、スクリーニングまたは選抜されて所望の特性を示すそれらの変異体が同定される。さらなる改良を獲得するために定方向進化法およびスクリーニングは1回又は複数回反復されうる。パネルBは、連続した回の定方向進化が次第に増大された特性を産生することができ、かつ個々の有益な変異の組み合わせが、個々の有益な変異により達成される改良と比較して増大された改良をもたらしうることを示している。
【図１９Ａから図１９Ｃ】  ヒトおよび霊長類種由来の2つのCMV由来ヌクレオチド配列のアラインメント（配列番号：27〜28）
ヒトおよび霊長類種の2つのCMV由来ヌクレオチド配列のアラインメントが示されている。このアラインメントは非確率論的ポリヌクレオチド再集合を実施するために役立つ。2配列により共有されるヌクレオチド配列は、再集合点の好ましいがこれに限定されない例を図示するために、赤字で示されている。
【図２０】  ヒト、ネコ、げっ歯類種由来のIFN-γヌクレオチド配列のアラインメント（配列番号：29〜31）
ヒト、ネコ、げっ歯類種由来のIFN-γヌクレオチド配列のアラインメントが示されている。このアラインメントは非確率論的ポリヌクレオチド再集合を実施するために役立つ。再集合点の好ましいがこれに限定されない例を図示するために、2配列により共有されるヌクレオチド配列は青字で、かつ3配列により共有されるヌクレオチド配列は赤字で示されている。