【手続補正書】
【提出日】平成18年10月11日(2006.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】  核酸分子が、
ａ）配列番号１のコード部分の配列を有する核酸、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸、
ｃ）上記ａ）またはｂ）とハイブリダイズし、ここで陽性のハイブダイゼーション形成シグナルが、５５℃で１時間、１ｘＳＳＤおよび０.１％ＳＤＳによる洗浄後に認められる核酸、
よりなる群から選ばれる、請求項１の分子。
【請求項３】  いかなる配列のシグナルペプチド・コード領域をもさらに含む、請求項１の分子。
【請求項４】  真核細胞または原核細胞中で増殖する、請求項１の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】  請求項４の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた真核または原核の細胞。
【請求項６】  配列番号２のアミノ酸配列を含む、細菌自己誘発因子不活化活性を有する単離されたタンパク質。
【請求項７】  植物または動物の疾病耐性を増加する方法であって、該植物または動物の細胞に、細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする核酸配列を導入し、該核酸配列を発現せしめることを含む方法。
【請求項８】  核酸配列が、
ａ）配列番号１のコード部分の配列を有する核酸、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸、
よりなる群から選ばれる、請求項７の方法。
【請求項９】  核酸配列がいかなる配列のシグナルペプチド・コード領域をもさらに含む、請求項７または８の方法。
【請求項１０】  核酸配列がいかなる源の膜結合ドメイン−コード領域をさらに含む、請求項７または８の方法。
【請求項１１】  植物が細菌性軟腐病に感受性である、請求項７の方法。
【請求項１２】  植物がジャガイモ、ナスビ、ハクサイ、ニンジン、セロリよりなる群から選ばれる、請求項１１の方法。
【請求項１３】  植物が細菌性疾病に感受性であり、この毒性遺伝子の発現がＮ−アシルホモセリンラクトン自己誘発因子により調節される、請求項７の方法。
【請求項１４】  植物または動物の細菌性障害を防止または減少する方法であって、かかる防止または減少を必要とする植物または動物に、有効量の細菌自己誘発因子不活化タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１５】  タンパク質が配列番号２の配列を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】  植物または動物の細菌性障害を防止または減少するための組成物であって、下記：
ａ）有効量の細菌自己誘発因子不活化タンパク質、
ｂ）適当な担体、
を含む組成物。
【請求項１７】  タンパク質が配列番号２の配列を含む、請求項１６の組成物。
【請求項１８】  自己誘発因子不活化活性について細菌単離体を選別するための方法であって、下記：
ａ）土壌または植物サンプルから単一のコロニー細菌性培養物を単離すること、
ｂ）自己誘発因子不活化活性について培養物をスクリーニングすること、
ｃ）培養物から粗製のタンパク抽出物を作成すること、
ｄ）粗製のタンパク抽出物による自己誘発因子活性の酵素的不活化を確認すること、を含む方法。
【請求項１９】  請求項１または請求項２の核酸を単離する方法であって、下記の工程：
ａ）適当な宿主生物中に自己誘発因子不活化活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含有するドナー生物から遺伝子バンクを作成すること、
ｂ）遺伝子バンクのクローンをスクリーニングすること、
ｃ）自己誘発因子不活化活性を有するタンパク質をコードする核酸を含有するクローンを単離すること、
を含む方法。
【請求項２０】  大腸菌（E. coli) を宿主生物として使用する、請求項１９の方法。
【請求項２１】  遺伝子バンクを作成し、クローンを選別し、クローンを単離する工程が、自己誘発因子を不活化しない大腸菌株中で行われる、請求項１９の方法。
【請求項２２】  下記：
ａ）請求項１または請求項２の核酸配列を細菌細胞中に導入すること、
ｂ）工程ａ）から得た細菌細胞を、変化した生物機能についてスクリーニングすること、
を含む方法。
【請求項２３】  変化した生物機能が、工程ａ）の結果として消失された機能である、請求項２２の方法。
【請求項２４】  変化した生物機能が、工程ａ）の結果として抑制された機能である、請求項２２の方法。
【請求項２５】  変化した生物機能が、工程ａ）の結果として高められた機能である、請求項２２の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（図面の説明）
図１は、Bacillus sp. 株２４０ＢＩからの細胞抽出物によるＡＩ不活性化の時間経過を示す。１００μｇの全タンパク質を含有する細胞抽出物の０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）を、ＯＨＨＬを含有する同じ緩衝液に、最終濃度２０μＭとして加えた。１.５ｍｌエッペンドルフ遠心管中で最終容量２００μｌで反応せしめ、２８℃でインキュベートした。同じ濃度のＯＨＨＬリン酸緩衝液を対照として用いた。サンプルを１０分間隔で６０分間採取し、３分間煮沸して反応を停止した。サンプルの遠心を５分間ベンチトップ遠心器で最高速度で行い、（Zhang, 1993)に記載のようにＡＩ活性について調べた。青いコロニーが lacZ レポーター遺伝子を活性化するＡＩの存在を表し、白いコロニーがＡＩの不存在を表す。列中、左から右に、１がタンパク質抽出物のないＯＨＨＬ対照、２−７が１０、２０、３０、４０、５０、６０分の酵素反応後のサンプルである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
図３は、Bacillus sp.株２４０Ｂ１ ＡＩ不活性化領域についてのクローニングおよび欠失の分析を示す。欠失分析のために、同じ断片をクローニングベクター pGEM‐7Zf(+) にクローンＥ７−７の生成のためにクローニングした。欠失サブクローンの産生を制限酵素消化およびクローンＥ７−７からの Dnase I 処置により行った。コスミド中の Ptac プロモーターの位置および方向を矢印で表示する。クローンのＡＩ不活化活性を第２列に示す。すなわち、＋：ＡＩ不活化活性あり、−：ＡＩ不活化活性なし。制限酵素：E, EcoRI; H, HindIII; Ev, EcoRV; St, StyI。ａｉｉＡ ＯＲＦ の転写の位置および方向を白い矢印で表示する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
図５は、ａｉｉＡ 遺伝子産物（ＡｉｉＡ) の共通アスパルチルプロテアーゼ活性部位モチーフ（Ａｓｐ）に対するアミノ酸配列の最良対合を示す。記号：ｘ、なんらかのアミノ酸。垂直線は完全な対合を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
配列の植物または動物細胞への導入は、既知方法で行い得る。外因性核酸配列による真核細胞の形質転換またはトランスフェクションの方法には、Agrobacterium tumefaciens によるトランスフェクション法、投射衝撃法、エレクトロポレーション法、感染法がある。これらの方法は、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野での専門家によく知られており、ここで詳細に説明する必要はないであろう。病原性細菌細胞は植物組織の細胞間に閉じ込められており、ＡｉｉＡタンパク質を細胞間への標的にするのが望ましい。このことは、分泌シグナルペプチドをＡｉｉＡタンパク質に融合せしめることで行い得る(Sato, et al., 1995; Firek, et al., 1993; Conrad and Fiedler, 1998; Borisjuk, et al., 1999)。あるいは、植物膜結合モチーフをＡｉｉＡのペプチド配列中に組込んで、ＡｉｉＡ酵素を植物細胞膜の外表面に固定せしめ得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
Erwinia carotovoraにおけるａｉｉＡ遺伝子の発現は、ＡＩ放出を減少させ、病原性を弱める
コスミドクローンＥ７−Ｒ３をErwinia carotovora  ＳＣＧ１株に三つ親接合法によって送達した。該ｐＬＡＦＲ３ベクターは選択圧なくErwinia carotovoraに安全に維持される。バイオアッセイによれば、Erwinia carotovora（Ｅ７−Ｒ３）によって放出されたＡＩは有意に減少し（図６、レーン６）、一方、Erwinia carotovoraにおけるコスミドベクターｐＬＡＦＲ３のみの存在によってはＡＩ生産に影響がなかった（図６、レーン７）。データーは、Erwinia carotovora  ＳＣＧ１株によって生産されたＡＩの殆どがａｉｉＡ遺伝子産物によって不活化されたことを示唆している。