【手続補正書】
【提出日】平成18年5月30日(2006.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＧＥＦ−Ｈ１ｂポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１の配列を含む単離された核酸。
【請求項３】
配列番号２の配列を含む単離されたＧＥＦ−Ｈ１ｂポリペプチド。
【請求項４】
単離されたＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体。
【請求項５】
前記ＧＥＦ−Ｈ１がＧＥＦ−Ｈ１ｂである，請求項４記載の単離されたＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体。
【請求項６】
前記ＧＥＦ−Ｈ１ｂが配列番号２の配列を含む，請求項５記載の単離されたＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体。
【請求項７】
配列番号３のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
配列番号３の配列から本質的になるペプチド。
【請求項９】
配列番号４のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１０】
配列番号４の配列から本質的になるペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸残基１６２−３５４が欠失している，請求項３記載の単離されたＧＥＦ−Ｈ１ｂポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１つのリン酸化されたアミノ酸を含む，請求項３，８，または１０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１３】
サンプルにおいてＰＡＫ４活性を検出する方法であって，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在またはレベルを検出することを含み，ここで，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の検出は少なくとも１つの活性なＰＡＫ４の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ＧＥＦ−Ｈ１が，配列番号２，３または４のいずれかに記載される配列を含む，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＡＫ４が細胞中に存在する，請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が腫瘍細胞である，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が哺乳動物中に存在する，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物が，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルからなる群より選択される，請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって，（ａ）ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを候補物質に曝露して混合物を形成させ，次に（ｂ）前記混合物にＰＡＫ４酵素を導入し；そして（ｃ）前記ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを前記候補物質に曝露する前および後に、リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量を測定する，の各工程を含み，前記候補物質への曝露の後のリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量の減少または増加が，前記候補物質がＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの相互作用を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドが配列番号２，配列番号３または配列番号４のいずれかの配列を有する，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
配列番号３に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２２】
配列番号４に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２３】
配列番号３に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体であって，前記ペプチドはリン酸化されたセリンを含むＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２４】
前記セリンがセリン−８１０である，請求項２３記載のＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２５】
配列番号４に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体であって，前記ペプチドはリン酸化されたセリンを含むＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２６】
前記セリンがセリン−６７である，請求項２５記載のＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
【請求項２７】
ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって，（ａ）ＰＡＫ４を候補物質に曝露して混合物を形成し，そして次に（ｂ）前記混合物にＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを導入し；そして（ｃ）リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量を測定することを含み，ここで，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量がＰＡＫ４が前記候補物質に曝露されていない対照と比較して減少または増加することは，前記候補物質がＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドが，配列番号２，配列番号３または配列番号４のいずれかの配列を有する，請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）においてＧＥＦ−Ｈ１がリン酸化されているか否かを判定する工程が，リン酸化された配列番号２のセリン−８１０またはリン酸化された配列番号２のセリン−６７の少なくとも１つを含むペプチドに対するＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を用いてリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ｂを検出することにより行われる，請求項１９または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記候補物質が，総ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化の減少を引き起こす，請求項１９または２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ｂとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって，（ｉ）候補物質をＧＥＦ−Ｈ１ｂ−ＰＡＫ４複合体と接触させ，そして次に（ｉｉ）前記化合物が前記複合体を破壊するか否かを判定することを含む方法。
【請求項３２】
候補物質が哺乳動物においてＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害するか否かを判定する方法であって，（ｉ）哺乳動物において配列番号２の配列を含むＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを測定し；（ｉｉ）前記哺乳動物を候補物質に曝露し；そして次に（ｉｉｉ）哺乳動物において前記ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを測定することを含み，ここで，工程（ｉ）で測定されたレベルに対して工程（ｉｉｉ）における前記ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルが減少していることは前記候補物質がＰＡＫ４のキナーゼ阻害剤であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物が，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルである，請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がヒトである，請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物において癌を治療するための医薬組成物であって，請求項１９，２７，３０または３２のいずれかに記載の方法により同定された物質を含む医薬組成物。
【請求項３６】
細胞サンプルにおける活性化ＰＡＫ４の存在を判定する方法であって，（ｉ）細胞サンプルから細胞溶解物を取得し；（ｉｉ）細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および／または分離し，そして（ｉｉｉ）ＧＥＦ−Ｈ１ｂのリン酸化変種の存在を検出することを含み，ここで，セリン−８１０またはセリン−６７がリン酸化されていることが検出されることは前記細胞サンプルが活性化ＰＡＫ４を含むことを示すことを特徴とする方法。
【請求項３７】
ＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって，（ｉ）細胞サンプルから細胞溶解物を取得し，（ｉｉ）前記溶解物に候補薬剤を適用し；（ｉｉｉ）前記細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および／または分離し；そして（ｉｖ）ＧＥＦ−Ｈ１ｂのリン酸化変種の存在を検出する，ことを含み，ここで，セリン−８１０またはセリン−６７がリン酸化されていることが検出されることは前記薬剤がＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害しないことを示すことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記細胞サンプルが腫瘍細胞サンプルである，請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号６または配列番号２０の少なくとも１つを含むペプチド。
【請求項４０】
配列番号６または配列番号２０の少なくとも１つから本質的になるペプチド。
【請求項４１】
配列番号６の配列を含む２０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４２】
配列番号６の配列を含む２５アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４３】
配列番号６の配列を含む３０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４４】
配列番号２０の配列を含む２０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４５】
配列番号２０の配列を含む２５アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４６】
配列番号２０の配列を含む３０アミノ酸未満のペプチド。
【請求項４７】
哺乳動物において細胞増殖，細胞運動性および／または細胞侵襲を検出する方法であって，時点Ａおよび少なくとも１つの他の時点Ｂで前記哺乳動物から採取したサンプル中のＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化レベルをモニターすることを含み，ここで、前記時点間の前記サンプルにおけるＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化レベルの増加が、細胞増殖，細胞運動性および／または細胞侵襲を示すことを特徴とする方法。
【請求項４８】
前記ＧＥＦ−Ｈ１が，配列番号２の配列を含むＧＥＦ−Ｈ１ｂ蛋白質である，請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが，前記哺乳動物の皮膚，血液，または細胞のサンプルである，請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が腫瘍細胞である，請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物が，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルからなる群より選択される，請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号２，３または４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５５】
請求項５４記載のベクターを含む細胞。
【請求項５６】
個体において癌を治療するための医薬組成物であって，ＧＥＦ−Ｈ１活性の阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項５７】
前記ＧＥＦ−Ｈ１が，ＧＥＦ−Ｈ１ａ，ＧＥＦ−Ｈ１ｂまたはＧＥＦ−Ｈ１ｃの少なくとも１つである，請求項５６記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記ＧＥＦ−Ｈ１ｂが配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む，請求項５７記載の医薬組成物。
【請求項５９】
ＧＥＦ−Ｈ１活性の阻害剤が，前記ＧＥＦ−Ｈ１をコードする内因性遺伝子の発現を阻害しうる，請求項５６記載の医薬組成物。
【請求項６０】
ＧＥＦ−Ｈ１活性が，前記個体に存在する癌性細胞の集団においてまたはその近傍で阻害される，請求項５６記載の医薬組成物。
【請求項６１】
細胞サンプルにおいて細胞増殖および足場非依存性細胞成長を減少させる方法であって，前記細胞サンプルにおけるＧＥＦ−Ｈ１活性を阻害することを含む方法。
【請求項６２】
前記ＧＥＦ−Ｈ１が，ＧＥＦ−Ｈ１ａ，ＧＥＦ−Ｈ１ｂまたはＧＥＦ−Ｈ１ｃの少なくとも１つである，請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記ＧＥＦ−Ｈ１ｂが配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む，請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって，前記ポリペプチドは，グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合することができ，その際，前記ポリペプチドの前記グアニン−ヌクレオチド交換因子への結合が，ＰＡＫ４によるグアニン−ヌクレオチド交換因子のリン酸化を防止または減少させることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ポリペプチドがＧＥＦ−Ｈ１Ｓのアミノ酸７６３−９２１に結合する，請求項６４記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６７】
配列番号２１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって，前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリヌクレオチド。
【請求項６９】
配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
配列番号２２のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
配列番号２２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって，前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができる前記ポリヌクレオチド。
【請求項７３】
配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが標識を含む，請求項７３記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記標識が，ビオチン，ＨＩＳタグ，および放射性標識からなる群より選択される，請求項７４記載のポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号２２のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド。
【請求項７７】
前記ポリペプチドが標識を含む，請求項７６記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記標識が，ビオチン，ＨＩＳタグ，および放射性標識からなる群より選択される，請求項７７記載のポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号２１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって，前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができる前記ポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号２１と少なくとも７６％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって，グアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリペプチド。
【請求項８１】
ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２７６−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも１つの他のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドであって，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７６で示されるアミノ酸配列も，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２４−９８５で示されるアミノ酸配列も含まない，前記組換えポリペプチド。
【請求項８２】
前記ポリペプチドが標識を含む，請求項８０記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記標識が，ビオチン，ＨＩＳタグ，および放射性標識からなる群より選択される，請求項８２記載のポリペプチド。
【請求項８４】
前記ポリペプチドが標識を含む，請求項８１記載のポリペプチド。
【請求項８５】
前記標識が，ビオチン，ＨＩＳタグ，および放射性標識からなる群より選択される，請求項８４記載のポリペプチド。
【請求項８６】
配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって，グアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリペプチド。
【請求項８７】
ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも１つの他のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドであって，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７６で示されるアミノ酸配列も，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２４−９８５で示されるアミノ酸配列も含まない，前記組換えポリペプチド。
【請求項８８】
ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２７６−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７６で示されるアミノ酸配列も，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２４−９８５で示されるアミノ酸配列も含まない，前記ポリペプチド。
【請求項８９】
ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４により示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７６により示されるアミノ酸配列を含まず，かつｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２４−９８５により示されるアミノ酸配列を含まない，前記ポリペプチド。
【請求項９０】
生物学的サンプル中においてグアニンヌクレオチド−交換因子の存在を検出する方法であって，
（ｉ）生物学的サンプルをｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドとともにインキュベートし，そして
（ｉｉ）前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定し，
ここで，
（ａ）前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４により示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，
（ｂ）前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは、ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７６により示されるアミノ酸配列を含まず，かつ
（ｃ）前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドはｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２４−９８５により示されるアミノ酸配列を含まない
ことを特徴とする方法。
【請求項９１】
前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドが標識を含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記標識が，ビオチン，ＨＩＳタグ，および放射性標識からなる群より選択される，請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定する工程が，未結合の放射性標識ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドを前記生物学的サンプルから除去し，そして次に前記サンプル中の放射活性のレベルを測定することを含む，請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項９５】
グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化を阻害する方法であって，グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露することを含み，ここで，前記ポリペプチドは，前記グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合し，その際前記グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４リン酸化を阻害することを特徴とする方法。
【請求項９６】
前記グアニン−ヌクレオチド交換因子が生物学的サンプル中に存在する，請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記生物学的サンプルが哺乳動物から得られたものである，請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記哺乳動物が，ヒト，マウス，ラット，ブタ，ウシ，イヌ，ネコ，ウマ，またはサルである，請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記哺乳動物がヒトである，請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
前記グアニン−ヌクレオチド交換因子を前記ポリペプチドに曝露する工程が，哺乳動物に前記ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む，請求項９５記載の方法。
【請求項１０１】
前記ポリペプチドを含む前記医薬組成物が，錠剤，エアロゾル，粉体，液体，ゲル，クリーム，坐剤のいずれかである，請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
ＰＡＫ４とグアニン−ヌクレオチド交換因子との間の相互作用を破壊する分子を同定する方法であって，
（ａ）グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露し，ここで前記ポリペプチドは前記グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合して複合体を形成し；
（ｂ）１またはそれ以上の試験分子を前記複合体に加え；そして
（ｃ）前記試験分子を前記複合体に加えた後に前記ポリペプチドと前記グアニン−ヌクレオチド交換因子とが互いに解離するか否かを判定することを含む方法。
【請求項１０３】
ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームのＰＡＫ４リン酸化を阻害する方法であって，配列番号２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞内に導入することを含み，ここで，前記ポリヌクレオチドは前記ポリペプチドを産生するよう発現され，および前記ポリペプチドは前記細胞中のＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合し，このことによりＰＡＫ４リン酸化を阻害する，ことを特徴とする方法。