【手続補正書】
【提出日】平成18年10月5日(2006.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程(a)〜(c)：
(a)  第1核酸配列を用意する工程、
(b)  第1核酸配列をリンカー配列と連結して連結核酸を形成する工程であって、該リンカー配列が、(i)第１認識部位から離れた部位で第1核酸配列の切断を可能にする第1核酸開裂酵素の該第1認識部位と、(ii)第2認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第2核酸開裂酵素の第2認識部位であって、その切断部位が第1認識部位内または第1認識部位近傍に位置する該第2認識部位とを含むものであり、該連結核酸が、5’−第2認識部位−第1認識部位−第1核酸−3’の構造を有するものである、前記工程、
(c)  第1核酸開裂酵素で連結核酸を切断することにより、
(i)第1核酸配列を表すヌクレオチド配列タグと連結したリンカー配列を含みかつその末端部分を含む連結タグ、および
(ii)第1核酸の残部を含む第２核酸配列
を付与する工程、
を含む、核酸の末端からヌクレオチド配列タグを取得する方法。
【請求項２】
第1核酸が、ある遺伝子の5’末端転写配列を含む末端を有する相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を含み、かつリンカー配列が該末端に連結されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
第1核酸が、ある遺伝子の3’末端転写配列を含む末端を有する相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を含み、かつリンカー配列が該末端に連結されている、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
第2核酸開裂酵素が、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはその認識部位が6塩基かそれ以上であるIIS型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはMmeIを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
第1核酸開裂酵素として制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはIIS型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはBseRIを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
それぞれが核酸由来のヌクレオチド配列タグを含む複数の核酸配列を連続的に生成する方法であって、請求項1〜5のいずれか1項に記載の工程(a)から(c)を少なくとも1回繰り返すことを含み、工程(a)の第1核酸配列を工程(c)(ii)の第2核酸配列から付与される、上記方法。
【請求項７】
遺伝子の発現の事実を示す方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法を含み、連結タグまたはヌクレオチド配列タグの存在、配列または同一性を検出して、遺伝子発現の事実を示す工程をさらに含む、上記方法。
【請求項８】
以下の工程(a)〜(c)：
(a)  請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法によってそれぞれ独立に作製した第1連結タグと第2連結タグを用意する工程、
(b)  一方の連結タグのヌクレオチド配列タグ部分を他方の連結タグのヌクレオチド配列タグに連結して、第1および第2遺伝子由来の末端転写配列を含むジタグを形成するように第1連結タグと第2連結タグを連結する工程、および
(c)  ジタグまたはそこに含まれる少なくとも1つのヌクレオチド配列タグの存在または同一性を検出して遺伝子発現を検出する工程、
を含む遺伝子発現の検出方法。
【請求項９】
第1および第2連結タグ中に含まれる各第1および第2リンカー配列が増幅プライマー配列を含み、かつ、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ジタグを増幅する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程(d)〜(f)：
(d)  前記のまたは各第2核酸開裂酵素でジタグを切断する工程、
(e)  生じた複数の削減したジタグを連結してコンカテマーを形成する工程、および
(f)  コンカテマーの少なくとも一部分の核酸配列を取得する工程、
をさらに含む請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
以下の(a)〜(d)：
(a)  ある遺伝子の末端転写配列を含む末端を有する相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を用意する工程、
(b)  第1認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第1核酸開裂酵素、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ、の該第1認識部位を含むリンカー配列に、該cDNAを連結して、それによって連結核酸を形成する工程、
(c)  連結核酸を第1核酸開裂酵素で切断して、該遺伝子の末端転写配列を表すヌクレオチド配列タグを含む連結タグを生じさせる工程、および
(d)  連結タグまたはヌクレオチド配列タグの存在または同一性を検出して遺伝子発現の事実を示す工程、
を含む遺伝子発現の事実を示す方法。
【請求項１２】
cDNAの5’末端が遺伝子の5’末端転写配列に対応する配列を含み、かつリンカー配列が該cDNAの5’末端に連結する、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列タグが遺伝子の5’末端転写配列、好ましくは遺伝子の転写部分の少なくとも最初の16塩基、より好ましくは遺伝子の転写部分の最初の20塩基を含む、請求項11または12に記載の方法。
【請求項１４】
cDNAの3’末端が遺伝子の3’末端転写配列に対応する配列を含み、かつリンカー配列がそのcDNAの3’末端に連結する、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列タグが遺伝子の3’末端転写配列、好ましくは遺伝子の転写部分の少なくとも最後の16塩基、より好ましくは遺伝子の転写部分の最後の20塩基を含む、請求項11または14に記載の方法。
【請求項１６】
工程(a)が、以下の(i)〜(iv)：
(i)  配列5’-NV(T)13CCGGCCGG-3’（ここで、NはA、C、GまたはTであり、かつVはA、CまたはGである。）を含むプライマーによる逆転写により、mRNAからcDNAを誘導すること、
(ii)  該cDNAから二本鎖cDNAを作製し、二本鎖cDNAをFseIで消化して、
【化１】
2006508661.tif 000001
を含む切断cDNAを作製すること、
(iii)  該切断cDNAを、
【化２】
2006508661.tif 000002
を含むリンカーと連結すること、および
(iv)  生じた分子をMmeIで切断して、ポリA/T尾部を欠くcDNAを作製すること、
を含む請求項11、14または15に記載の方法。
【請求項１７】
cDNAが遺伝子の5’末端転写配列、または遺伝子の3’末端転写配列のいずれかを含むか、あるいはその両方を含む、請求項11〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
cDNAが全長cDNA、好ましくは実質的に前記遺伝子のコード配列の全てを含む、請求項11〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子から一連の配列情報を得る方法であって、請求項11またはこれに従属する請求項のいずれかに記載の方法の工程(a)〜(c)を含み、以下の工程(d)〜(h)：
(d)  cDNAの3’残余配列を含む工程(c)からの第2核酸を用意する工程、
(e)  該第2核酸を、認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする核酸開裂酵素、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ、の該認識部位を含むリンカー配列に連結して、これにより連結核酸を形成する工程、
(f)  該連結核酸を該核酸開裂酵素で切断して、(i)第2核酸の5’部分を含むヌクレオチド配列タグに連結したリンカー配列を含む連結タグと、(ii)第2核酸の3’残部を含む第4核酸配列を付与する工程、
(g)   工程(d)〜(f)を少なくとも1回繰り返す工程であって、ここで工程(d)の第2核酸配列が工程(f)(ii)の第4核酸配列から付与される前記工程、および
(h)  少なくとも１の連結タグまたはこれに含まれるヌクレオチド配列タグの存在、同一性または配列を検出する工程、
をさらに含む、上記方法。
【請求項２０】
リンカー配列が、第2認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第2核酸開裂酵素、好ましくは第2制限エンドヌクレアーゼ、の該第2認識部位をさらに含み、該第2認識部位がリンカー配列中の第1認識部位の5’に位置する、請求項11〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
連結タグを第2核酸開裂酵素にさらすときに、第1認識部位に対する第2認識部位の位置が、核酸の切断が第1認識部位内または第1認識部位近傍の位置で生じるような位置である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
第1認識部位または第2認識部位、あるいはそのいずれもがIIS型制限酵素認識部位を含む、請求項11〜21のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
第1制限酵素がMmeIを含むか、または第1認識部位がMmeI認識部位5’-TCC RAC-3’、好ましくは5’-TCC GAC-3’を含む、請求項11〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
第2制限酵素が6塩基以上の長さの部位を認識することが可能な制限酵素、好ましくはBseRIを含むか、または第2認識部位がBseRI認識部位5’-GAGGAG-3’を含む、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
リンカー配列が、配列5’- GAGGAGNNNNNNTC CG AC -3’、好ましくは5’-GAGGAGCGTCTCTCCGAC-3’を含む、請求項11〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
以下の(a)〜(c)：
(a)  請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法によってそれぞれ独立に作製した第1連結タグと第2連結タグを用意すること、
(b)  一方の連結タグのヌクレオチド配列タグ部分を他方の連結タグのヌクレオチド配列タグに連結することにより、第1および第2遺伝子由来の末端転写配列を含むジタグを形成するように第1連結タグと第2連結タグを連結すること、
(c)  ジタグ、またはこれに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列タグの存在または同一性を検出することにより遺伝子発現を検出すること、
を含む遺伝子発現の検出方法。
【請求項２７】
第1連結タグの第1リンカー配列と第2連結タグの第2リンカー配列のそれぞれが、増幅プライマーのハイブリダイゼーション配列を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ジタグを増幅する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記のまたは各第2核酸開裂酵素でジタグを切断して、削減したジタグを与える工程をさらに含む、請求項20〜25のいずれかに従属する請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
削減したジタグが12〜120塩基対、好ましくは18〜46塩基対、好ましくは
40塩基対を含む、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
複数のジタグまたは削減したジタグを連結してコンカテマーを形成する、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
コンカテマーが2〜200個のジタグまたは削減したジタグ、好ましくは10〜40個のジタグまたは削減したジタグ、好ましくは8〜20個のジタグまたは削減したジタグを含む、請求項26〜31のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
１つのまたは各連結タグ、ヌクレオチド配列タグ、ジタグ、削減したジタグまたはコンカテマーの配列を決定する工程をさらに含む、請求項11〜32のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列のデータベースに含まれるヌクレオチド配列と前記配列を比較することにより、発現遺伝子の同一性を判定する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記配列を既知の遺伝子のデータベースと比較して、データベースが該配列を含まない場合、その配列が新規の遺伝子を含むとする、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
以下の(a)〜(e)：
(a)  該疾患に冒されていることが既知である細胞を用意すること、
(b)  請求項1〜35のいずれか1項の方法により、(a)の細胞中にある遺伝子が発現されているか否かを判定すること、
(c)  疾患に罹患していると推測される個体の細胞を用意すること、
(d)  請求項1〜35のいずれか1項の方法により、(c)の細胞中で同一の遺伝子が発現されているか否かを判定すること、および
(e)  (b)の細胞と(c)の細胞との間で該遺伝子の発現またはその欠失を比較すること、
を含む、個体における疾患の診断に有用であることを示す方法。
【請求項３７】
細胞のトランスクリプトムを決定するか、または細胞の遺伝子発現プロファイルを得る方法であって、細胞からcDNAを得ること、該cDNAを請求項1〜36のいずれか1項の方法に供すること、および特定の遺伝子もしくは特定セットの遺伝子が該細胞によって発現されているか否かを判定することを含む、上記方法。
【請求項３８】
個体における疾患の診断に有用であることを示す方法であって、該疾患に冒されていることが既知である細胞の遺伝子発現プロファイルを、該疾患に罹患していると推測される個体の細胞のものと比較することを含み、該遺伝子発現プロファイルのいずれか、または両方を請求項37に記載の方法で作成する、上記方法。
【請求項３９】
以下の(a)と(b)：
(a)  請求項1、2または3のいずれか1項、あるいはこれらに従属する任意の請求項に記載の方法により、ある遺伝子の5’末端転写配列を表すヌクレオチド配列タグを取得すること、
(b)  プロモーターまたはエンハンサーのコンセンサス配列を含む配列であって、 (a)の末端転写配列に対し該遺伝子の5’の配列を取得すること、
を含む、該遺伝子の調節配列、好ましくはプロモーターまたはエンハンサー配列の配列を決定する方法。
【請求項４０】
前記(a)の末端転写配列に対し前記遺伝子の5’の配列を、(a)染色体歩行、(b)SAGE歩行、(c)ゲノムライブラリーの核酸ハイブリダイゼーション、または(d)ゲノム配列のデータベースに照会することにより取得する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
複数の記録を含むデータベースであって、各記録が、請求項1〜40のいずれか1項の記載の方法により与えられる、ある遺伝子が特定の細胞によって発現されるか否かの指標を含む、上記データベース。
【請求項４２】
請求項41に記載のデータベースを含むコンピュータ読取り可能な媒体。
【請求項４３】
請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法により作製されるタグを含む核酸配列。
【請求項４４】
請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法により作製されるジタグを含む核酸配列。
【請求項４５】
請求項43に記載のタグの複数、または請求項44に記載のジタグの複数を含むコンカテマーを含んでなる核酸配列。
【請求項４６】
請求項35に記載の方法により同定される遺伝子、または該遺伝子によりコードされるタンパク質。
【請求項４７】
請求項40に記載の方法により同定される調節配列、好ましくはプロモーター配列。
【請求項４８】
以下の(a)と(b)：
(a)  第1認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする核酸開裂酵素、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ、の認識部位、および
(b)  ある遺伝子の末端転写配列を表すヌクレオチド配列タグ、
を含む核酸配列。
【請求項４９】
(c)第2認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第2核酸開裂酵素、好ましくは第2制限エンドヌクレアーゼ、の第2認識部位であって、該第2核酸開裂酵素の切断部位が第1認識部位内または第1認識部位近傍に位置する、前記第2認識部位をさらに含む、請求項48に記載の核酸配列。
【請求項５０】
以下の(a)と(b)：
(a)  第1認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする核酸開裂酵素、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ、の該第1認識部位、および
(b)  第2認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第2核酸開裂酵素、好ましくは第2制限エンドヌクレアーゼ、の該第2認識部位、
を含むリンカー配列であって、該第2核酸開裂酵素の切断部位が第1認識部位内または第1認識部位近傍に位置する、上記リンカー配列。
【請求項５１】
第1認識部位と第2認識部位が、核酸を第2核酸開裂酵素にさらしたときに、該核酸の切断が第1認識部位内の位置に生じるように離間されている、請求項49に記載の核酸、または請求項50に記載のリンカー配列。
【請求項５２】
前記核酸配列が、配列5’- GAGGAGNNNNNNTC CG AC -3’、好ましくは5’-GAGGAGCGTCTCTCCGAC-3’を含む、請求項48〜51のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項５３】
以下の工程(a)〜(h)： 
(a)  第1遺伝子の末端転写配列を含む末端を有する第１相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を用意する工程、
(b)  第2遺伝子の末端転写配列を含む末端を有する第2相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を用意する工程、
(c)  そのように作製した第1cDNAを、第1認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第1核酸開裂酵素、好ましくは第1制限エンドヌクレアーゼ、の該第1認識部位を含む第1リンカー配列に連結して、それにより第1連結核酸を形成する工程、
(d)  そのように作製した第2cDNAを、第2認識部位から離れた部位で核酸の切断を可能にする第2核酸開裂酵素、好ましくは第2制限エンドヌクレアーゼ、の該第2認識部位を含む第2リンカー配列に連結して、それにより第2連結核酸を形成する工程、
(e)  第1核酸開裂酵素で第1連結核酸を切断して、第1cDNAの末端転写配列を表す第1ヌクレオチド配列タグを含む第1連結タグを付与する工程、
(f)  第2核酸開裂酵素で第2連結核酸を切断して、第2cDNAの末端転写配列を表す第2ヌクレオチド配列タグを含む第2連結タグを付与する工程、
(g)  第1および第2タグを連結してジタグを形成する工程、および
(h)  該ジタグの少なくとも1つのタグのヌクレオチド配列を決定して、遺伝子の発現を検出する工程、
を含む遺伝子発現の検出方法。
【請求項５４】
請求項1〜53のいずれか1項に記載の方法により取得可能なヌクレオチド配列タグ。
【請求項５５】
実質的に、本明細書中に記載されかつ添付した図面の図2〜4に示されるようにしてヌクレオチド配列タグを取得する方法。
【請求項５６】
実質的に、本明細書中に記載されかつ添付した図面の図2〜4に示されるようにして遺伝子発現を検出する方法。
【請求項５７】
実質的に、本明細書中に記載されかつ添付した図面の図3に示されるようにして5’末端SAGEを行う方法。
【請求項５８】
実質的に、本明細書中に記載されかつ添付した図面の図4に示されるようにして3’末端SAGEを行う方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
上で説明したように、従来のSAGEおよびロングSAGE技術は、これらの技術を用いて作製されるタグが実質的に起源（origin）の「内部」（すなわち、これらは発現された遺伝子の内部配列に相当する）にあるという事実に関連する不都合を有する。これは、従来のSAGEは、タグの「出発点」が遺伝子上の5’最末端（または3’最末端）のアンカリング酵素（Anchoring  Enzyme）部位によって規定されるが、その「終点」の位置はタギング酵素認識部位とその切断部位との間のずれによって規定されているからである。既知のSAGEおよびロングSAGE技術では、cDNAの5’末端または3’末端のいずれかを固定(anchored)することができるが、このアンカリングと、cDNAがアダプターまたはリンカーに連結される前にアンカリング酵素によって処理されるという事実は、従来のSAGE法によって生成されるタグが実質的に「内部」配列に対応することを意味する。