【手続補正書】
【提出日】平成17年8月9日(2005.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７から２３ヌクレオチドからなり、宿主細胞における特定のＲＮＡ分子の１７から２３ヌクレオチドのＲＮＡ配列に相補的な第一のポリヌクレオチド配列を含み、該第一の配列は第二の配列がＲＮＡ配列の場合、ステムループ構造を形成することができる第二の配列と共有結合により連結しており、ここで該第一の配列は実質的にＲＮＡ配列、またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡからなる、宿主細胞における該特定のＲＮＡ分子の下方制御または分解に有用な単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
該第一の配列に相補的であり、該第二の配列の遠位末端に共有結合により連結した第三の配列をさらに含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該第二の配列が第二の配列内でステムループ構造を形成することができる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該第一および第三の配列におけるすべてのヌクレオチドが塩基対形成する、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
該第二の配列が酵素によって切断され得る少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも２つの酵素切断部位を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該酵素切断部位の少なくとも１つが該ステムループ構造のステム部分に位置する、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つの酵素切断部位が該第一の配列と該第二の配列の間に挿入されている、請求項５から７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該第一の配列に関連する発現産物の機能が未知である、請求項１から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
該第一の配列が１９から２１ヌクレオチド長である、請求項１から９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
宿主細胞におけるＲＮＡの下方制御または分解に有用な自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドであって、１７から２３ヌクレオチドからなり該宿主細胞の該ＲＮＡ配列の１７から２３ヌクレオチドに相補的な第一のポリヌクレオチド配列、および、第二の配列がＲＮＡ配列である場合、ステムループ構造を形成することができる第二のヌクレオチド配列によって共有結合により連結した第三のヌクレオチド配列を含み、それによって該第一の配列および該第三の配列におけるすべてのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することができ、ここで該第二のヌクレオチド配列が、天然のＲＮＡ配列由来であって、宿主細胞において特定のＲＮＡ分子を機能的に標的としない配列を含むステムループ形成領域を含む、自己相補的一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該第二の配列がｍＲＮＡ以外の天然のＲＮＡ配列由来であって４から３０ヌクレオチド長である、請求項１から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
該第二の配列が４から１３ヌクレオチドである、請求項１から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
さらにＲＮＡ配列またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡを含む第四のヌクレオチド配列を含み、該第四の配列は該第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結しており、該ＲＮＡ配列が宿主細胞において酵素によって切断され得、切断されると該第一または第三の配列の遊離末端となる、請求項２から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
さらにＲＮＡ配列またはそれと均等な一本鎖ＤＮＡを含む第五のヌクレオチド配列を含み、該第五の配列が該第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結しており、該ＲＮＡ配列が宿主細胞において酵素によって切断され得、切断されると該第一または第三の配列の遊離末端となる、請求項１４記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
該第四の配列がベクターへの方向性のクローニングを可能にするように機能する、請求項１４または１５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１から１６記載のポリヌクレオチドおよび該第一の配列の上流に位置するプロモーター配列を含む、宿主細胞をトランスフェクトするのに有用なベクター。
【請求項１８】
該プロモーターがマイクロＲＮＡプロモーターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
該プロモーターがｌｅｔ−７プロモーターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
該プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである、請求項１７から１９のいずれかに記載のベクター。
【請求項２１】
該プロモーターが５Ｓ  ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＶＡ  ＲＮＡ、Ａｌｕ  ＲＮＡ、Ｈ１、またはＵ６核内低分子ＲＮＡからなる群から選択される、請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノム配列に共有結合により連結したＤＮＡからなる、請求項１７から２１のいずれかに記載のベクター。
【請求項２３】
宿主細胞に存在する少なくとも１つのＲＮＡ配列の量を低下させる方法であって、請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドをコードするベクターで該細胞をトランスフェクトすることを含み、ここで該第一の配列が該ＲＮＡ配列に相補的である方法。
【請求項２４】
ステムループ構造を形成するポリヌクレオチド配列によって共有結合により連結した相補的配列を含む自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドの調製方法であって、実質的に少なくとも２つの相補的塩基対を形成できるヌクレオチド配列を含むことによりステムループ構造を形成し、３’ＯＨ末端を有する第二のポリヌクレオチド配列に共有結合によって連結した第一のポリヌクレオチド配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドを、該第一の配列がそれに対する相補的配列の合成のために３’ＯＨ末端から開始する鋳型として働く条件下で処理することを含む自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドの調製方法。
【請求項２５】
請求項１から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列を含むベクターの調製方法であって、該ポリヌクレオチドがＤＮＡ配列であり、さらに該第一の配列の遊離末端に連結した第四の配列を含んでおり、該ポリヌクレオチドを変性し、二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、そして宿主細胞をトランスフェクトすることができ該ポリヌクレオチドを転写することができるベクターへライゲーションする方法。
【請求項２６】
天然のポリヌクレオチド配列の機能を決定する方法であって、請求項１７から２２のいずれかに記載のベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること、ここで該ベクターは該天然のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列を含むものである、および、細胞表現型の変化を検出することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１から１６のいずれかに記載の発現可能なポリヌクレオチド配列および該配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含むベクターのライブラリー。
【請求項２８】
該ベクターがウイルスベクターである、請求項２７に記載のライブラリー。
【請求項２９】
該ベクターが、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスからなる群から選択される請求項２８に記載のライブラリー。
【請求項３０】
該ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２８に記載のライブラリー。
【請求項３１】
該アデノウイルスベクターが複製欠損のものである、請求項３０に記載のライブラリー。
【請求項３２】
請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７から２２のいずれかに記載のベクターによって安定にトランスフェクトされた細胞。
【請求項３３】
該細胞がＰＥＲ．Ｃ６細胞である請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
以下の工程を含む毒性タンパク質をコードするウイルスベクターの産生方法：
（ａ）該毒性タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に含まれる特有の配列に相補的な第一の配列を有する請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を細胞に導入する工程、
（ｂ）該ウイルスベクターを該細胞に導入する工程、
（ｃ）該細胞をポリヌクレオチド配列の発現および該ウイルスベクターの複製を可能とする条件下で培養する工程、および、
（ｄ）該ウイルスベクターを回収する工程。
【請求項３５】
該細胞が該ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされたウイルスパッケージング細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象における特定のＲＮＡまたはＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を低下させる方法であって、請求項１７から２２のいずれかに記載のベクターを、トランスフェクトされた細胞における特定のＲＮＡの量を低下させるのに有効な量で投与する工程、該対象における細胞をトランスフェクトする工程を含む方法。