【手続補正書】
【提出日】平成17年4月7日(2005.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
上記のMusTRDポリペプチドの断片には、USE B1モチーフを含むポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも一つのDNA結合ドメインを含む断片が含まれる。USE B1モチーフは
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からなるポリヌクレオチドとして定義される。USE B1モチーフおよびUSE B1モチーフを含むポリヌクレオチドに対するポリペプチドの結合を決定する方法は、O'Mahoneyら、1998にさらに記述される。結合を評価する方法には、電気泳動移動度シフトアッセイ法（EMSA）が含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
cDNA末端の迅速な増幅（RACE）
マウス骨格筋マラソンレディ(Marathon-Ready)cDNAライブラリ（Clontech）を用いて5' RACE PCRを行った。PCRは、RD2の下流に存在するcDNAクローンに対して特異的なリバースプライマー
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およびAP1フォワードプライマー（マラソンcDNAアダプタープライマー；Clonetech）を、アドバンテージHF PCRポリメラーゼミックス（Clonetech）およびマスターアンプPCR最適化緩衝液D(MasterAmp PCR Optimisation Buffer D)（Epicentre Technologies）と共に用いて、以下の条件：94℃で5秒、72℃で4分を5サイクル；94℃で5秒、70℃で4分を5サイクル；94℃で5秒、68℃で4分を30サイクル、で行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
RT-PCR
ポリ-A RNA（1μg）を40 pmolオリゴd(T)10デカヌクレオチド（Roche）によってプライミングし、製造元の説明書に従ってスーパースクリプトII(Supercript II)逆転写酵素（Life Tehcnologies）によって逆転写した。PCRは、鋳型としてRT反応物の10％を用いて行った。完全なコード配列の増幅は、以下の条件；95℃で3分、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で3分間を35サイクルで、ATGの上流の5' RACE PCR産物から設計したフォワードプライマー
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および開始コドンの下流でポリ-Aテールの上流に存在するそれぞれのcDNAクローンに対して特異的なリバースプライマー
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により、Taq DNAポリメラーゼ（Roche）を用いて行った。PCR産物を1％アガロースゲル上で分析し、Qiaquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製し、pGEM-T Easyベクターにクローニングした。同じリバースプライマーを、エキソン19またはエキソン19に隣接するコード配列（エキソン18の3'領域およびエキソン20の5'領域）に対して設計した二つのフォワードプライマー
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と共に、3'領域のみを以下の条件；95℃で3分の後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を35サイクルによって増幅した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
実施例3において、Impromptu（登録商標）逆転写酵素（Promega）と共に総RNA 2μgを用いて、製造元の説明に従って第一鎖cDNAを合成した。プライマーMusTRDF
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およびMusTRDR
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は、マウスとヒトの間で完全に配列が保存されたオープンリーディングフレーム領域に対して設計した。これらのプライマーを含むPCR増幅は、第一鎖cDNAの5％を鋳型として用い、マスターアンプ緩衝液D(Masteramp Buffer D)（Epicentre Technologies）およびサイクリングパラメータ：95℃で3分の後に35サイクルの95℃で30秒、60℃で1分、72℃で1分を用いた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
イソ型のスクリーニング
分化したC2C12筋管、13.5 dpc胚、成体の四頭筋、ヒラメ筋、およびEDL筋からの総RNAのRT-PCR反応物を1.5％アガロースゲルにおいて分離し、得られたバンドをQiaquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製してpGEM-T Easyベクターにクローニングした。12個もの陽性クローンが増幅され、次いで95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を35サイクルの条件下で、エキソン30およびエキソン31に対して設計された二つのリバースプライマーと共に、エキソン19、エキソン19に隣接するコード配列、エキソン23、およびエキソン23に隣接するコード配列に対して特異的なフォワードプライマー
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を用いるPCR反応の鋳型として、精製したプラスミド100 ngを用いた。PCR産物を1.5％アガロースゲル上で分析した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
プラスミドの構築
ヒトTnIslow遺伝子および変異B1b含有型（O'Mahoneyら、1998）からの157 bp USE要素（nts-1031〜-874）をチミジンキナーゼ（tk）最小プロモーター（nts+81〜+52）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させて、pTnIslowUSEB1tklucおよびpTnIslowUSEB1btklucレポーター構築物を生成した（図1）。p(B1)3xtklucおよびp(B1b)3xtklucレポーター構築物はB1要素
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のタンデムコピー3個と変異B1b型
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のタンデムコピー3個とをtk最小プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させることによって作製した（図1）。CMVプロモーターによって駆動されるマウスMEF2C cDNAを含むpcDNAMEF2C発現構築物は、Richard Harvey博士からの寄贈であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
hMusTRD1α1C末端切断変異体5個を増幅するために用いたヌクレオチド配列を下記に示す。hMusTRD1α1内の特異的アミノ酸部位に対するリバースプライマー5個
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を設計して、それぞれの反復ドメインまたは推定の機能的領域の前に切断が得られた。フォワードプライマー
2005510545.tif 000012
は、pcDNA3.1myc/hisベクター（Invitrogen）へのクローニングを容易にするために5' EcoRI部位（下線）を含むように操作した。この戦略によって、アミノ酸350個、アミノ酸458個、アミノ酸564個、アミノ酸689個、およびアミノ酸786個のエピトープタグMusTRDポリペプチドをコードする哺乳類発現プラスミド5個と共に完全長のアミノ酸944個の構築物（タグを含まない）が生成された。アミノ酸100〜544位の内部欠失を有する第七のプラスミドは、AoCI/BstEII消化および完全長のpcDNA3.1hMusTRD1α1944アミノ酸myc/hisの再ライゲーションによって作製して、それによって、pcDNA3.1hMusTRD1α1ΔN444myc/hisが得られた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
電気泳動移動度シフトアッセイ法
マウスEDLおよびヒラメ筋を用いて、先に記述された方法（O'Mahoneyら、1998）によって核抽出物を調製した。核タンパク質にオリゴヌクレオチドUSE-B1
2005510545.tif 000013
およびUSE-B1b
2005510545.tif 000014
による電気泳動移動度シフト分析を行った。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
5' RACE PCR産物に基づくフォワードプライマー
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と停止コドンの下流でポリA-テールの上流に存在するエキソン30または31のいずれかに対して設計されたリバースプライマーとを用いるRT-PCRを、ヒラメ筋、EDL、または13.5d.p.c.胚総RNAに由来するcDNA上で行ったところ、イソ型8個のオープンリーディングフレームを生じた。1〜1966 bpの間の5'領域の分析により、イソ型8個全ての間に完全な相同性があることが判明した。これらのイソ型の配列分析およびデータベース検索から、これらのイソ型をコードする一つの遺伝子、すなわちエキソン31個を含み、100 kbに及ぶGTF2IRD1遺伝子が第5染色体に存在することが示される（図1A）。この遺伝子は、染色体7q11.23上のヒトGTF2IRD1遺伝子の相同体である。この遺伝子の選択的スプライシングから生じたさらなるイソ型が存在する可能性を調べるために、同じリバースプライマーを用いて分化したC2C12筋管のRNAから合成したcDNAについてRT-PCRを行った。5'領域が全てのイソ型の間で保存されていると仮定して、エキソン19を標的とするフォワードプライマーおよびエキソン19に隣接するコード配列を用いると、次のように、mMusTRDの可変の3'領域のみが増幅された（図1B）。PCR産物をゲル抽出してpGEM-T Easy ベクター（Promega）にクローニングし、陽性クローンをPCRスクリーニングによってスクリーニングして、任意の新規イソ型も配列決定した。クローン3個（1α1、1α4、および3β3）が、新規イソ型の3'領域を含むことが示され、mMusTRDイソ型の数は11に増加した（図1C）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
実施例2−mMusTRDイソ型の発達的および空間的発現
これらのイソ型11個の発達的および空間的発現パターンを決定するために、分化したC2C12筋管、13.5 d.p.c.胚、ならびに成体VL、ヒラメ筋、およびEDL筋から単離したRNAについてRT-PCR分析を行った。PCRは、イソ型を区別することができるフォワードおよびリバースプライマーの組み合わせを用いて行った。エキソン19、エキソン19に隣接するコード配列、またはエキソン23を標的とするフォワードプライマーを、エキソン30または31のいずれかを標的とするリバースプライマーと組み合わせて選択した（図1B）。エキソン19に隣接するコード配列を標的とするフォワードプライマーと、エキソン30を標的とするリバースプライマーを用いるRT-PCRは、1.1 kb付近に単一の十分に明確なバンドを示し、これは調べた全ての起源にmMusTRD3β3が存在することを示しているが、エキソン31を標的とするリバースプライマーを用いた対応する反応は、約1 kbの単一の十分に明確なバンドを生じ、これは筋管および13.5 d.p.c.胚に限ってmMusTRD3α3が存在することを示している（データは示していない）。エキソン19を標的とするフォワードプライマーとエキソン31を標的とするリバースプライマーとを用いるRT-PCRによって、レーン2、3、4、および5では約1.2 kb付近に、そしてレーン7〜11では1.3 kb付近に密集したいくつかのバンドが出現した（データは示していない）。これらの反応は、既に同定されたイソ型に基づき、いくつかの異なるイソ型を、プライマー31を用いる反応では5個まで、およびプライマー30を用いる反応では4個までをおそらく増幅した可能性がある（図2A）。これらの不均一なバンドに存在するイソ型を同定するために、クローニングとPCRとを組み合わせた方法によってPCR産物をスクリーニングした。陽性クローンの同定によって、VLに3α5および3β5が存在すること、13.5 d.p.c.胚に3α5、3α7、および3β5が存在すること、ヒラメ筋およびEDLに1α1、1β4、3α5、3α7、および3β5が存在すること、ならびにC2C12筋管に1α1、1α4、2α5、3α5、3α7、および3β5が存在することが示された。他のイソ型の存在を検出するために、同じリバースプライマーとエキソン23を標的とするフォワードプライマーとを用いてRT-PCRを行った（データは示していない）。フォワードプライマー23とリバースプライマー31とを用いるPCRによって、レーン2〜5において880 bpのバンドが生成され、このことは、ヒラメ筋、EDL、13.5 d.p.c、および筋管に3α7が存在するが、VLには存在しないことを示している。エキソン31を標的とするリバースプライマーを用いた対応するPCRは、レーン7〜11において950 bp付近にバンドを生じ、全ての起源において3β7が存在することを示した。このバンドの他に、同様にレーン9では650 bpにもバンドを認め、EDLにイソ型1β4が存在することを示している（データは示していない）。イソ型2α5は、それがカセット2が除去されたためにRD4が欠損し、エキソン20がエキソン24に結合しているという点において、他のイソ型とは異なる（図1C、1D）。2α5に対して特異的で、エキソン20の3'領域およびエキソン24の5'領域を標的とするプライマー
2005510545.tif 000016
を設計した。このフォワードプライマーとエキソン31を標的とするリバースプライマーとを用いたRT-PCRは、レーン2〜6において850 bpでバンドを生じ、全ての起源に2α5が存在することを示しているが、発現はVLおよびC2C12筋管ではわずかに低いように思われる（データは示していない）。RT-PCRとイソ型スクリーニングとの組み合わせによってそれぞれの起源に認められた様々なイソ型の概要を表1に要約する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
【図１】（A）イントロンの相対的な位置を示す第5染色体上のmMusTRD遺伝子（GTF2IRD1）の略図である。（B）エキソン19、エキソン23、エキソン19に隣接するコード配列、エキソン23に隣接するコード配列を標的とするフォワードプライマー、ならびにエキソン30およびエキソン31を標的とするリバースプライマーを示す、mMusTRD遺伝子のエキソン18〜31の略図。同様に、選択的にスプライシングされた四つのカセット（1〜4）および*印で示す相互に排他的にスプライシングされたエキソン（30および31）も示す。（C）mMusTRDイソ型11個を生じるマウスGTF2IRD1遺伝子（エキソン18〜31）の3'領域における選択的スプライシング事象の略図である。（D）イソ型2α5、3α3、3β3、3α5、3α7、3β5、および3β7においてRD5の5'領域およびRD6の3'領域を構成するカセット4、ならびにこのカセットを選択的スプライシングによって除去した場合の、イソ型1α1、1α4、1β1、および1β4においてRD6を形成するエキソンの略図。
【図２】（A）mMusTRDイソ型11個の略図。完全に配列決定されたイソ型を*で示し、3'領域が配列決定されたイソ型を#で示す。反復ドメインを暗黄色で示し、その中でRD4、RD5の3'半分、およびRD6の5'半分は選択的にスプライシングされ、ポリセリン路を赤、および核局在配列を暗青色、エキソン19、23、31、およびエキソン30の3'領域の選択的スプライシングによって生じるシグナチャーボックスをそれぞれ、緑色、翡翠色、ピンク色、および紫色で示す。（B）起こりうる全てのコード配列から得られたMusTRDのアミノ酸配列（配列番号：35および36）。選択的にスプライシングされたカセットから生じたペプチド配列を斜線および太字で示し、さらに、エキソン30およびエキソン31の選択的にスプライシングされて相互に排他的な5'領域を括弧で示す。エキソン23によってコードされるアミノ酸配列を四角で囲んでより大きいカセットと区別する。同様に、核局在配列（下線）、ポリセリン管（四角）、および推定の同時調節LXXILモチーフ（四角）6個も示す。
【図３】マウスMusTRDイソ型11個のヌクレオチド配列のアラインメント。
【図４】マウスMusTRDイソ型11個のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５】hMusTRD1α1のドメイン構築。hMusTRD1α1944アミノ酸およびhMusTRD1α1458アミノ酸は、長さがアミノ酸944個および458個であり、それぞれ、アミノ酸約86〜95個のTFII-I様反復ドメイン構造（暗黄色）5個および2個を含む。hMusTRD1α1のアミノ酸のアラインメントおよび構造モチーフ検索によって、核局在シグナル（NLS；翡翠色）、myc-ヘリックス-ループ-ヘリックス（HLH；赤色）、ポリセリン管（暗緑色）、および推定のDNA結合ドメイン2個（DBD；青色）が明らかとなった。
【図６】C末端およびN末端切断hMusTRD1α1シリーズ。（A）hMusTRD1α1のC末端およびN末端切断型は、RD1およびRD2を欠損するN末端欠失hMusTRD1α1の他に、分子のカルボキシ末端から始まるそれぞれの反復ドメイン（RD）を段階的に除去することによって作製した。C末端切断型cDNAの梯子をPCR（B）によって作製し、（C）その後の機能分析において用いられるhMusTRD1α1のC末端欠失型をインビトロで翻訳するために、pcDNA3.1 myc/his発現ベクターにサブクローニングした。
【図７】マウス骨格筋におけるMusTRDの発現。（A）COS-7細胞に異所発現させた完全長（レーン3）および切断型ヒトMusTRD1α1（アミノ酸1〜458個；ΔhMusTRD1α1；レーン2）のウェスタンブロット分析。非形質移入COS-7細胞溶解物をレーン1に示す。マウスヒラメ筋の免疫蛍光染色（FITC）から、MusTRDが遅筋および速筋線維（C）の双方の核（B）において発現されることが判明した。（C）抗ミオシン重鎖I型（MHC-Islow）染色は、遅筋（上部）を速筋（下部）筋線維と区別する。抗ジストロフィン免疫染色は、筋線維の細胞質膜を描写する（矢印）。（D）MusTRDを発現する核が筋線維の細胞質膜内に存在することを示す（B）および（C）の併合図。（E）マウス筋肉におけるTnIslow-USE-B1結合タンパク質の検出。マウスヒラメ筋（S）およびEDL（E）核タンパク質抽出物の電気泳動移動度シフト分析およびラット筋核抽出物との比較。B1オリゴヌクレオチドは、hMusTRD1α1の無傷のInr様結合部位を含む；B1bは、結合を防止する3 bpの変異を含む。（F）マウス胚発達の際のマウスMusTRD発現のノーザンブロット分析。5.9、4.4、および3.6 kbの三つのバンドが検出される（dpc＝交尾後の日数）。
【図８Ａ】C2C12細胞におけるhMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1による遅筋および速筋線維特異的プロモーターの調節。hMusTRD1α1またはΔhMusTRD1α1発現プラスミドを、ルシフェラーゼに結合させたMHIIB遺伝子の-2554〜+13、MHCIslow（MHCIB）遺伝子の-3500〜+462、MLC2slow遺伝子の-800〜+12、または157 bpのTnIslowエンハンサーのいずれかを含む発現プラスミドと共に同時移入させた。プラスミドの組み合わせあたりの3つの異なる形質移入培養物からの溶解物において、ルシフェラーゼ活性を決定した。転写活性のMusTRD媒介抑制または活性化は、1に設定した基礎／空の構築物活性に対する倍数変化として表記する。示した値は、3つの異なる実験からの平均値±標準偏差を表す。TR＝ΔhMusTRD1α1、FL＝hMusTRD1α1。
【図８Ｂ】C2C12細胞におけるmMusTRDイソ型による遅筋および速筋線維特異的プロモーターの調節。mMusTRD3α7、1β1、または3β7発現プラスミドを、ルシフェラーゼに結合させたMHIIB遺伝子の-2554〜+13、MHCIslow（MHCIB）遺伝子の-3500〜+462、MLC2slow遺伝子の-800〜+12、または157 bpのTnIslowエンハンサーのいずれかを含む発現プラスミドと共に同時移入させた。プラスミドの組み合わせあたりの3つの異なる形質移入培養物からの溶解物においてルシフェラーゼ活性を決定した。転写活性のMusTRD媒介抑制または活性化は、実際の光単位として表記する。値は、異なる3実験からの平均値±標準偏差を表す。
【図９】hMusTRD1α1およびΔhMusTRD1α1のトランス活性化および二量体形成機能。（A）gal4 DNA結合ドメイン（gal4DBD）に融合させると、hMusTRD1α1（黒いバー）は自己トランス活性化機能を示すが、ΔhMusTRD1α1は示さない（斜線のバー）。（B）YM4271酵母1ハイブリッド細胞において、野生型（wt）hMusTRD1α1（黒いバー）およびΔhMusTRD1α1（斜線のバー）は、TnIslowUSE-B1配列に結合したが、変異結合部位を含むUSE-B1b配列には結合しなかった。白いバーは、基礎β-ガラクトシダーゼレポーター活性を示す。（C）hMusTRD1α1（黒いバー）およびΔhMusTRD1α1（斜線のバー）はいずれも酵母においてホモ二量体を形成したが、二つのタンパク質の間のヘテロ二量体形成は効率的ではない（線状のバー）。これらのデータは、対照系統と比較して表記し、それぞれ1試料あたり3回行った独立した3実験のβ-ガラクトシダーゼ活性の平均誘導倍数を表す。
【図１０】ΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスの作製。（A）-2000HSA：ΔhMusTRD1α1遺伝子組換え構築物は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（bgh）を有するhMusTRD1α1の1597 bp EcoR1-BstEII断片に結合させたHSAプロモーターの2.2 kb Hind III断片を含む。（B）導入遺伝子特異的プローブを用いた、独立した5系統のひ腹筋における導入遺伝子発現（ΔM1）のノーザンブロット（上のパネル）。遺伝子組換え系統におけるΔhMusTRD1α1タンパク質発現のウェスタンブロット（下のパネル）。（C）独立した5系統における導入遺伝子転写物（白色）およびタンパク質（黒色）レベルの定量的分析、n＝個々の子孫4〜5個。X軸表示は遺伝子組換え系統を指す。Y軸のデータは、相対的密度測定単位を表す。（D）左側の年齢および性別をマッチさせた対照と比較して、強い脊柱彎曲および脚拘縮を示すΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウスのマンモグラム。（E）ΔhMusTRD1α1遺伝子組換えマウス（右）は姿勢が悪く（左側に対照）、開いた後肢を示す。（F）MusTRD機能の破壊は成長遅滞を引き起こす。独立した二つの遺伝子組換え系統のF1子孫の体重を離乳直後から生後12ヶ月齢まで測定した。（G）その指数的成長期（生後3〜7週間）における、野生型同腹子（白印）と比較した系統10（黒四角）および11（黒丸）からのΔhMusTRD1α1雄性マウスの増殖速度。（H）遺伝子組換えマウスは12ヶ月齢まで成長が遅滞したままであった。データは、個々のマウス4〜14匹の平均体重（g±SD）を表す。差は、全ての時点で統計学的に有意であった（0.001＜P＜0.05）。雌性遺伝子組換えマウスの成長パターンは、雄性遺伝子組換えのパターンと類似であった。
【図１１】ΔhMusTRD1α1ヒラメ筋の組織形態学的分析。野生型のヒラメ筋断面の免疫染色は、MHC-Islow陽性（A）およびMHC-IIAfast陽性（B）筋線維を示す（茶色の沈殿物によって可視化される）。ΔhMusTRD1α1筋は、MHC-Islow発現が欠損しているが、（C）MHC-IIAfastは、全ての線維において発現される（D）。野生型マウスおよび独立した遺伝子組換え系統4個（70、10、11、29）からのヒラメ筋の定量的画像分析は、ΔhMusTRD1α1系統が、筋の断面積の減少（E）、筋直径の減少（F）、および筋の数のわずかな変化（G）を示すことを示す。データは各系統からの個々のマウス5〜6匹および野生型マウス11匹を表す。E〜Gに関して、*は、野生型と比較してP≦0.05の有意差を示し、***は、P≦0.01を示す。A〜Dにおける較正バーは、1 mmを示す。ΔhMusTRD1α1マウスの速筋線維における退化および再生。野生型（H）およびΔhMusTRD1α1（I）EDL筋切片のH＆E染色。マクロファージ活性化（黒い粒）に関するαナフトールアセテートエステラーゼアッセイ法は、ΔhMusTRD1α1（K）において線維の変性を示すが、野生型の筋（J）では示さない。（K）の挿入図は筋線維に浸潤するマクロファージ集団を示す。筋線維の数は、ΔhMusTRD1α1EDL筋（L）においてわずかに増加し、再生しつつある（核が中心に存在する）線維の数の増加（M）と一致する。分析した筋は、7週齢のマウスから得た。H、Iにおける較正バーは、25 μmを表し、J、Kにおけるバーは10 μmを表す。
【図１２】ΔhMusTRD1α1筋の線維特異的遺伝子発現プロフィール。（A）電気泳動分析後に、系統29（tg）および対照同腹子（wt）からの7週齢のΔhMusTRD1α1マウスの横隔膜筋（上のパネル）およびヒラメ筋（中央のパネル）のタンパク質溶解物の銀染色を行った。MHC-Islow（I）、MHC-IIAfast（IIA）、MHC-IIBfast（IIB）、MHC-IIX（IIX）、MHC胚（emb）、およびMHC新生児（neo）の電気泳動移動度を示す。ΔhMusTRD1α1筋は、MHCneoの存在によって示されるように未成熟な筋原表現型を示す。MHCneoに対する抗体を用いたヒラメ筋溶解物の対応するウェスタンブロット（下のパネル）を、生後1日目（PND1）にマウス筋において通常認められるMHCneoの発現と比較すると、ΔhMusTRD1α1筋においてMHCneoが発現されていることが確認される。（B）遅筋線維表現型はΔhMusTRD1α1マウスにおいて抑制される。7週齢での系統29および系統11のヒラメ筋（S）およびEDL筋（S）から抽出した総RNAのノーザンブロット分析は、野生型（wt）マウスと比較してΔhMusTRD1α1（tg）においてMLC1slowA、TnIslow、αTmslow、およびMLC2slowが発現されたことを示す。試料は18S rRNA発現に対してローディングした。
【図１３】ΔhMusTRD1α1は、遺伝子組換えマウスにおいてTnIslow上流エンハンサー（USE）の発現を抑制する。（A）TnIslowUSE-95X1nucZレポーター構築物は、TnIslow遺伝子のUSE（ヌクレオチド-1035〜-875）、および最小のプロモーター（-95〜+1）、チミジンキナーゼ5' UTRおよびAUG、ならびにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子上流の核局在シグナル（nls）を含む。（B、C）TnIslowUSE-95X1nucZ+/+マウスのヒラメ筋におけるβ-ガラクトシダーゼ発現は、MHC-Islowを発現する線維（茶色の沈殿物として可視化される）に限定される。（D、E）遅筋線維特異的発現は、TnIslowUSE-95X1nucZ+/+×ΔhMusTRD1α1+/-筋ではダウンレギュレートされる。BおよびDにおける較正バーは1 mmを表し、CおよびEにおけるバーは50 μmを表すことに注意すること。グラフにしたデータは、TnIslowUSE-95X1nucZ+/+マウス（白いバー）およびTnIslowUSE-95X1nucZ+/+×ΔhMusTRD1α1+/-マウス（黒いバー）のヒラメ筋（F）およびEDL筋（G）からのタンパク質溶解物のβ-ガラクトシダーゼ活性を表す。それぞれの垂直のバーは、個々のマウスからの筋におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を表す。（*）は、パネルB〜Eにおいて切片にした系統を示す。
【図１４】ヒトMusTRDイソ型4個のアミノ酸配列のアラインメント。
【図１５】hMusTRD1α1は、hTnIslowUSEにおけるB1要素を通してMEF2C活性化を抑制する。C1C12細胞の一過性の同時形質移入を、hMusTRD1α1（1α1944アミノ酸）およびMEF2Cに関する発現構築物、（A）ルシフェラーゼに結合させた無傷のhTnIslowUSE（nts-1031〜-874）および変異USE B1b部位を含むレポーター構築物を用いて行った。（B）C1C12細胞におけるhTnIslowUSEのMEF2C媒介トランス活性化およびMEF2Cトランス活性化のhMusTRD1α1媒介抑制を、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。Cos-7細胞の一過性の形質移入は、hMusTRD1α1（1α1944アミノ酸）および（A）ルシフェラーゼに結合させたhTnIslow USE（nts-977〜-960）からの三量体形成B1およびB1b要素を含むレポーター構築物を用いて行った。（B）Cos-7細胞におけるB1転写活性のhMusTRD1α1媒介抑制は、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。
【図１６】hMusTRD1α1は、その同源の結合部位への結合の非存在下で抑制することができる。hMusTRD1α1の一連のC末端欠失発現構築物および三量体形成B1要素を含むレポーター構築物を用いて、Cos-7細胞の一過性の形質移入を行った。それぞれの切断型構築物の転写活性は、1に設定した基礎（空の）発現ベクター活性の誘導倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーはSEMを表す。
【図１７】hMusTRD1α1およびNcoRは、hTnIslow USEを抑制する。（A）Cos-7細胞における哺乳類の1ハイブリッド同時形質移入アッセイ法を、表記の発現構築物について行った：GAL4 DNA結合ドメイン（GAL4 DBD）、GAL4DBD-hMusTRD1α1944アミノ酸mys/his（GAL4DBD-1α1944アミノ酸）、およびGALDBD-NcoR1-312融合構築物の他の、GAL4結合部位の3コピーによって駆動されるルシフェラーゼレポーター構築物。（B）抑制は、1に設定した基礎GAL4DBD転写活性の抑制倍数として表記する。カラムは1試料あたり3回の実験の平均値を表す；バーはSEMを表す。
【図１８】hTnIslowUSEのhMusTRD1α1媒介抑制のメカニズム。（A）B1要素が、3'MEF2C部位に結合したMEF2Cと相互作用する増強因子（X）によって占有されている場合、hTnIslowUSEによる転写のトランス活性化が得られる。（B）抑制は、NcoR：hMusTRD1α1（1α1）複合体によるMEF2Cの分離または増強因子の結合を防止するhMusTRD1α1によるB1要素の占有のいずれかによって起こる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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