【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  第一機能性ドメインに機能するように結合した核ホルモン受容体から誘導化される二つのリガンド結合ドメインを含む非天然由来のポリペプチド。
【請求項２】  二つのリガンド結合ドメインがペプチドリンカーにより共有結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】  リンカーが約１５〜約４０個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】  リンカーが約１５〜約３５個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】  リンカーが約１８〜約３０個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】  第一および第二リガンド結合ドメインが異なる核ホルモン受容体から誘導化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】  第一および第二結合ドメインが同一の核ホルモン受容体から誘導化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】  核ホルモン受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エクジソン受容体もしくはレチノイドＸ酸受容体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】  少なくとも一つのリガンド結合ドメインがレチノイドＸ酸受容体から誘導化される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】  第一機能性ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】  ＤＮＡ結合ドメインが少なくとも一つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】  ２〜１２個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】  ２〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】  亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフが、式中ＧはグアニジンでありそしてＮはいかなるヌクレオチドである、式(ＧＮＮ)１〜６のヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】  第一機能性ドメインが、転写調節ドメインである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】  一つのリガンド結合ドメインもしくは第一機能性ドメインのどちらかに機能するように結合した第二機能性ドメインをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】  第一機能性ドメインがＤＮＡ結合ドメインでありそして第二機能性ドメインが転写調節ドメインである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】  ＤＮＡ結合ドメインが少なくとも一つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】  ２〜１２個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】  ２〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２１】  亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフが、式中ＧはグアニジンでありそしてＮはいかなるヌクレオチドである、式(ＧＮＮ)１〜６のヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】  転写調節ドメインが活性化ドメインである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２３】  転写調節ドメインが抑制ドメインである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２４】  (ａ)2〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン;(ｂ)ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したレチノイドＸ受容体から誘導化される第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに機能するように結合したエクジソン受容体から誘導化される第二リガンド結合ドメイン；および(ｃ)第二リガンド結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む非天然由来のポリペプチド。
【請求項２５】  (ａ)３〜６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有するＤＮＡ結合ドメイン;(ｂ)ＤＮＡ結合ドメインに機能するように結合したプロゲステロン受容体から誘導化される第一リガンド結合ドメイン、１８〜３６個のアミノ酸残基のペプチドスペーサーを持つ第一リガンド結合ドメインに機能するように結合したプロゲステロン受容体から誘導化される第二リガンド結合ドメイン；および(ｃ)第二リガンド結合ドメインに機能するように結合した転写調節ドメイン、を含む非天然由来のポリペプチド。
【請求項２６】  請求項１に記載のポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド。
【請求項２７】  請求項１７に記載のポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】  請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２９】  請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項３０】  請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項３１】  請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項３２】  請求項２８に記載の発現ベクターで形質転換される、宿主細胞。
【請求項３３】  請求項２９に記載の発現ベクターで形質転換される、宿主細胞。
【請求項３４】  規定した配列を含む標的ヌクレオチドの機能を調節するプロセスであって、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインが規定した配列に結合する、ポリペプチドのリガンド結合ドメインの一つに結合するリガンドの存在下に標的ヌクレオチドを請求項１に記載のポリペプチドに露出させることを含む、プロセス。
【請求項３５】  規定した配列を含む標的ヌクレオチドの機能を調節するプロセスであって、ポリペプチドの機能性ドメインが標的ヌクレオチドの機能を変える、ポリペプチドのリガンド結合ドメインの一つに結合するリガンドの存在下に標的ヌクレオチドを請求項１７に記載のポリペプチドに露出させることを含む、プロセス。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
図２は、ホルモン依存性、単鎖ＥＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図２ＡはＥＲ融合タンパク質の構造である。E２Cは六フィンガータンパク質であり；Ｌは柔軟なペプチドリンカーである。図２Ｂは、二量体として単一のＥＲ−ＬＢＤ結合を持つ融合タンパク質である。ヒーラ細胞は、Ｃ７−ＥＲ−ＶＰ６４発現ベクターおよび、一つもしくは二つのどちらかのＣ７結合部位を保持する、示したＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか(−)もしくは１００ｎＭの４−ＯＨＴを加える(＋)かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値(±ＳＤ)を提示する。図２Ｃは融合タンパク質を発現しない制御プラスミドｐｃＤＮＡ３である。図２Ｃ、Ｄは、二つのＥＲ−ＬＢＤを持つ融合タンパク質により単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよびＴＡＴＡボックスの上流に単一のＥ２Ｃ結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされ、そして４−ＯＨＴ誘導およびルシフェラーゼ活性の測定は図２Ｂでの説明のように行われた。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
図３は、ホルモン依存性、単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図３Ａは単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合タンパク質の構造である。図３Ｂは、単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよび、単一のＥ２Ｃ結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか(−)もしくは５μＭのポナステロンＡを加える(＋)かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値(±ＳＤ)を提示する。ｐｃＤＮＡ３.１は融合タンパク質を発現しない対照プラスミドである。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
図４は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｂのヌクレオチド(配列番号３１)およびアミノ酸残基配列(配列番号３２)を示す。
図５は、亜鉛フィンガー結合ドメイン２Ｃ７のヌクレオチド(配列番号３３)およびアミノ酸残基配列(配列番号３４)を示す。
図６は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｃ２のヌクレオチド(配列番号３５)およびアミノ酸残基配列(配列番号３６)を示す。
図７は、抑制ドメイン(ＫＲＡＢ−Ａ)2のヌクレオチド(配列番号３７)配列を示す。
図８は、抑制ドメイン(ＳＩＤ)2のヌクレオチド(配列番号３８)配列を示す。
図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号３９)およびアミノ酸残基配列(配列番号４０)を示す。
図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号４１)およびアミノ酸残基配列(配列番号４２)を示す。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
この発明のポリペプチドは非−天然由来である。ここで用いる限りでは、用語“非−天然由来”とは、例えば、以下に示す一つもしくはそれ以上のものを意味する：(ａ)非−天然由来のアミノ酸配列を含んでなるペプチド；(ｂ)天然に由来するようなペプチドと関連しない非−天然由来の二次構造を有するペプチド；(ｃ)ペプチドが天然に由来する生物種と通常は関連しない一つもしくはそれ以上のアミノ酸を含むペプチド；(ｄ)立体異性体が天然に由来するように関連しないペプチドを含む、一つもしくはそれ以上のアミノ酸の立体異性体を含むペプチド；(ｅ)天然アミノ酸の一つ以外の化学的部分を一つもしくはそれ以上含むペプチド；または(ｆ)天然由来のアミノ酸配列の離れた一部分(例えば、先端を切った配列)。この発明のポリペプチドは単離体で存在し、そして汚染物質が実質的に無いように精製される。ポリペプチドは現実には合成品である。即ち、ポリペプチドは天然資源から単離されかつ精製されるか、もしくは技術上周知の技法を用いて新規に作製される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
非−天然リガンド、抗−ホルモンおよび非−自生リガンドの例としては以下のものが挙げられる：１１β−(４−ジメチルアミノフェニル)−１７β−ヒドロキシ−１７α−プロピニル−４,９−エストラジエン−３−オン(Ｒｕ３８４８６もしくはミフェペストン)；１１β−(４−ジメチルアミノフェニル)−１７α−ヒドロキシ−１７β−(３−ヒドロキシプロピル)−１３α−メチル−４,９−ゴナジエン−３−オン(ＺＫ９８２９９もしくはオナプリストン)；１１β−(４−アセチルフェニル)−１７β−ヒドロキシ−１７α−(１−プロピニル)−４,９−エストラジエン−３−オン(ＺＫ１１２９９３)；１１β−(４−ジメチルアミノフェニル)−１７β−ヒドロキシ−１７α−(３−ヒドロキシ−１(Ｚ)−プロペニルエストラ−４,９−ジエン−３−オン(ＺＫ９８７３４)；(７β,１１β,１７β)−１１−(４−ジメチルアミノフェニル)−７−メチル−４',５'−ジヒドロスピロイ'エステル−４,９−ジエン−１７,２'(３'Ｈ)−フラン!−３−オン(Ｏｒｇ３１８０６)；(１１β,１４β,１７α)−４',５'−ジヒドロ−１１−(４−ジメチルアミノフェニル)イ'スピロスタ−４,９−ジエン−１７,２'(３'Ｈ)−フラン!−３−オン(Ｏｒｇ３１３７６)；５−アルファ−プレグナン−３,２−ジオン。さらに別の非−天然リガンドとしては、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(ＳＥＲＭＳ)として広く規定されている、合成的非−ステロイドエストロゲンもしくは抗−エストロゲン化合物が一般的に、挙げられる。例示的な化合物としては、タモキシフェンおよびラロキシフェンが、非限定的に、挙げられる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
プロゲステロン受容体から誘導化される、特に好ましいＬＢＤはヒトプロゲステロン受容体からのアミノ酸残基６４５〜９１４を含む。エストロゲン受容体から誘導化される、例示的なＬＢＤはマウスＧ２２５Ｒ変異体からのアミノ酸残基２８２〜５９９を含む。
二つのＬＢＤは、約１０〜約５０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基配列リンカーにより隔てられている。好ましくは、スペーサーは約１５〜約４０個のアミノ酸残基をそして、さらに好ましくは、約１８〜約３５個のアミノ酸残基を含む。例示的でかつ好ましいスペーサーは、１８(Ｌ)、３０(ＬＬ)もしくは３６(ＬＬＬ)個のアミノ酸残基を含む。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
１．ヌクレオチド結合ドメイン
ポリペプチドの機能性ドメインはヌクレオチド結合ドメインであり得る：規定したヌクレオチド配列を認識しそして結合する、アミノ酸残基の配列である。標的ヌクレオチド配列はＲＮＡ配列もしくは、好ましくは、ＤＮＡ配列であり得る。規定したＤＮＡ配列を認識しそして結合する、アミノ酸残基配列は技術上周知である(例えばＧＡＬ４)。いかなるそのようなＤＮＡ結合ドメインは、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ドメインとして使用され得る。しかしながら、本遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ペプチドは一つもしくはそれ以上のＤＮＡ結合亜鉛フィンガーモチーフであることが好ましい。そのようなＤＮＡ結合亜鉛フィンガーモチーフは技術上周知である(例えば、その開示は出典明示により本明細書の一部とする、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ  ９５／１９４２１号および第ＷＯ  ９８／５４３１１号を参照)。かくして、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチのＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、特異的なヌクレオチド標的配列に結合するようにデザインされるところの多重フィンガーで、多指の、亜鉛フィンガーペプチドを含む。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
本開示は、長さで大よそ３０個のアミノ酸の単純なββα折りたたみからなる、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインにユニークな構造的特徴の認識に基づいている。この折りたたみの構造的安定性は、疎水性相互作用により、および保存Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による単一の亜鉛イオンのキレート化によって達成される(Lee, M. S., Gippert, G. P., Soman, K. V., Case, D. A. & Wright, P. E. (1989) Science 245, 635-637)。核酸の認識は、ＤＮＡ配列の３個の塩基対に典型的に結合するところのドメインのα−へリックスから由来する、特異的なアミノ酸側鎖端子を通じて達成される(Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17, Elrod-Erickson, M., Rould, M. A., Nekludova, L. & Pabo, C. O. (1996) Structure 4, 1171-1180)。他の核酸認識モチーフと異なり、多重亜鉛フィンガードメインの単純な共有結合はＤＮＡの拡張非対称的配列の認識を可能にする。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
天然の亜鉛フィンガータンパク質の研究は、三亜鉛フィンガードメインが隣接するＤＡＮ配列の９ｂｐに結合し得ることを示している(Pavletich, N. P. & Pabo, C. O. (1991) Science 252, 809-17., Swirnoff, A. H. & Milbrandt, J. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2275-87)。９ｂｐの配列の認識は大腸菌の小さいゲノム内でさえユニークな部位を特定するには不十分である一方で、六亜鉛フィンガードメインを含む多指のタンパク質は１８−ｂｐ認識を特定する(Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530)。遺伝制御のための万能システムの開発に関して、１８−ｂｐアドレスは十分に、全ての既知ゲノム内で単一の部位を特定することができる。そして、生きているヒト細胞内で遺伝子の活性化および抑制におけるそれらの有効性が最近示されている(Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B. & Barbas III, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530)。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
用語“突然変異を誘発させる”は、ＤＮＡコード化タンパク質のランダムもしくは部位−指向性の突然変異誘発を達成する既知方法のいずれかを実施することにより得られているところの亜鉛フィンガー誘導−ヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡにおいて、突然変異誘発を実施して、コンセンサス配列の一つもしくはそれ以上の繰返し体中で非−保存残基を置換することができる。先端を切った亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質はまた突然変異を誘発させ得る。多例の既知亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質もまた、突然変異を誘発させ得る。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を阻害するために、本発明に従って先端を切り、拡張し、そして／もしくは突然変異を誘発させ得るところの既知の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの例としては、ＴＦＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が挙げられる。他の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質は当業者に公知であるであろう。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
転写抑制ドメインはまた技術上周知である。例示的かつ好ましいそのような転写抑制体としては，ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、ヒストンデアセチラーゼ、ＤＮＡ、メチラーゼ、ならびにそれらの誘導体、多量体および組合せ、例えば、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、(ＫＲＡＢ)2、(ＫＲＡＢ)３、ＫＲＡＢ−Ａ、(ＫＲＡＢ−Ａ)2、(ＳＩＤ)2、(ＫＲＡＢ−Ａ)−ＳＩＤおよびＳＩＤ−(ＫＲＡＢ−Ａ)、が挙げられる。第一抑制ドメインをＫｒηｐｐｌ−関連ボックス(ＫＲＡＢ)ドメインを用いて作製することができる(Margolin et al., 1994)。この抑制ドメインは亜鉛フィンガータンパク質のＮ−末端に普通に見出され、そしておそらく、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することにより、その抑制活性をＴＡＴＡ−依存性転写に距離−および配向−非依存性様式で及ぼすであろう。亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１および９７の間に見出されるＫＲＡＢドメインを利用することができる。最後に、抑制のためのヒストン脱アセチル化の利用を探求するために、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ２相互作用ドメイン(ＳＩＤ)のアミノ酸１〜３６をもう一つのドメインに融合させることができる(Ayer et al., 1996)。この小さいドメインは転写因子ＭａｄのＮ−末端に見出され、そしてその転写抑制をｍＳＩＮ３と相互作用することにより仲介する役割を果たしているが、それは今度は共−抑制体Ｎ−ＣｏＲおよびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用する。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
ＲＸＲ、Ｅ２Ｃおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-DE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-DE- (KRAB-A)2, E2C-RXR-L-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-LLL-BE-(KRAB-A)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-DE(SID)2, E2C-RXR-L-BE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-BE(SID)2, E2C-RXR-L-DE-(SID)2, E2C-RXR-LL-DE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-DE(SID)2, E2C-RXR-L-BE-(SID)2, E2C-RXR-LL-BE-(SID)2, E2C-RXR-LLL-BE(SID)2;
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
ＰＲ、Ｂ３Ｂおよび抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B 7-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B 7-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(KRAB-A)2, B3BPR-LL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-LLL-PR-(KRAB-A)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B 7-PR-L-PR-(SID)2, B3B 7-PR-LL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PRLL-PR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2, B3B-PR-L-PR-(SID)2, B3B-PR-LLPR-(SID)2, B3B-PR-LLL-PR-(SID)2;
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
ＥＲ、Ｂ３Ｃ２および抑制ドメインを用いる遺伝子スイッチ
B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-L-ER-(KRAB-A)2, B3C2 B-ER-LL-ER-(KRAB-A)2, B3C2-ER-LLL-ER-(KRAB-A)2, B3C2ER-L-ER-(SI)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2ER-L-ER-(SID)2, B3C2-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2, B3C2ER-L-ER-(SID)2, B3C2 B-ER-LL-ER-(SID)2, B3C2-ER-LLL-ER-(SID)2。
図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号３９)およびアミノ酸残基配列(配列番号４０)を示す。図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号４１)およびアミノ酸残基配列(配列番号４２)を示す。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
関連した態様において、本発明は、この発明のポリペプチド遺伝子スイッチをコード化するポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、これらのポリヌクレオチドを含む細胞およびこれらの発現ベクターを含む形質変換細胞、を提供する。遺伝子治療に第一に有用なベクターとしては、ヒトアデノウイルスベクター、アデノ−関連ベクター、マウスもしくはレンチウイルス誘導化レトロウイルス性ベクター、または、リポソーム、ポリマーおよび他のＤＮＡ含有複合体を含む、種々の非−ウイルス性組成物が、非限定的に挙げられる。そのようなベクターシステムを使用して、ベクターシステム次第でインビトロもしくはインビボのどちらかで、遺伝子スイッチを送達することができる。例えばアデノウイルでは、ベクターを静脈内投与して；肺内に、または連結反応もしくは他の方法により一時的に局在化した血管区画内に、直接に導入して、肝臓および他の器官を形質導入することができる。そのようなベクターを構築する方法ならびに説明した発明のための方法および使用法は遺伝子治療の分野における当業者に公知である。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
ＥＬＩＳＡ分析．９６−ウエルＥＬＩＳＡ平板中に、ストレプタビジン(Pierce)０.２μｇをそれぞれのウエルに３７℃１時間で加え、それから水で二回洗浄した。ビオチン化した標的オリゴヌクレオチド(０.０２５μｇ)を同一様式で加えた。ＺＢＡ／３％ＢＳＡをブロッキングのために加えたが、インキュベーションの後でウエルを洗浄しなかった。全ての連続したインキュベーションを室温で行った。トップのウエル中で精製ＭＢＰ融合タンパク質２μｇから出発して、２倍順次希釈液を１ｘ結合緩衝液(ＺＢＡ／１％ＢＳＡ／５ｍＭ  ＤＴＴ／０.１２μｇ／μｌせん断ニシン精液ＤＮＡ)中に加えた。試料を室温で１時間インキュベートしてから、水で１０回洗浄した。ＺＢＡ／１％ＢＳＡ中のマウス抗−マルトース結合タンパク質ｍＡｂ(Sigma)をウエルに３０分間加えてから、水で１０回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼに複合したヤギ抗−マウスＩｇＧ  ｍＡＢ(Sigma)をウエルに３０分間加えてから、水で１０回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ基質(Sigma)を加え、そしてＯＤ４０５をSOFTmax 2.35 (Molecular Devices)で定量した。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
ゲル移動度シフトアッセイ．標的オリゴヌクレオチドをそれらの３'末端において[３２Ｐ]でラベルし、そしてゲルを精製した。タンパク質の３倍順次希釈液１１部を２０μｌの結合反応液(１ｘ結合緩衝液／１０％グリセロール／〜１ｐＭの標的オリゴヌクレオチド)中で室温で３時間インキュベートし、それから０.５ｘＴＢＥ緩衝液中で５％ポリアクリルアミド上で分離した。「PhosphorImager and ImageQuant Software」(Molecular Dynamics)を使用して、乾燥ゲルの分析を行い、そしてＫＤをスキャッチャード分析により測定した。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
二つの半部位の最適な間隔と配向を決定するためのレポーター構築体．Ｃ７二量体−ＴＡＴＡフラグメントを、ｐ１７ｘ４ＴＡＴＡ−ｌｕｃ(S. Y. Tsai からの寄贈)を鋳型として使用し、Ｃ７二量体−ＴＡＴＡプライマー(直接繰返しについて、5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A0-5 GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (配列番号１)；逆方向繰返しについて、5'-GAG GGT ACC GCG TGG GCG A0−5 CGC CCA CGC AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (配列番号２)；裏返し繰返しについて、5'-GAG GGT ACC CGC CCA CGC Ao-5 GCG TGG GCG AGT CGA CTC TAG AGG GTA TAT AAT GG-3' (配列番号３)およびＧＬプライマー２(5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC C-3' (配列番号４)；Promega)とのＰＣＲ増幅により生成した。制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ１およびＮｃｏ１との消化を経由して、ＰＣＲ生産物をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ(Promega)内にクローン化した。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌレポーターアッセイ．全てのトランスフェクションについて、ヒーラ細胞を２４−ウエル皿中で平板培養し、そして４０〜６０％の密集度において使用した。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、１７５ｎｇのレポータープラスミド(ｐＧＬ３中のプロモーター構築体もしくは、負のコントロールとして、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ)および２５ｎｇのエフェクタープラスミド(ｐｃＤＮＡ３中の亜鉛フィンガーステロイド受容体融合体もしくは、負のコントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３)をリポフェクタミン試薬(Gibco BRL)を用いてトランスフェクトした。大よそ２４時間後に、１０ｎＭ  ＲＵ４８６(Biomol)、１００ｎＭ  ４−ＯＨＴ(Sigma)もしくは５ｍＭポナステロンＡ(Introgen)の添加により発現を誘導した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞抽出物を作製し、そして MicroLumat LB96P ルミノメータ(EG&G Berthold, Gaithersburg, MD)中で Promega ルシフェラーゼアッセイ試薬を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイした。二重レポーターアッセイのために、シフェラーゼレポータープラスミド８５ｎｇ、ｂ−ｇａｌレポータープラスミド８５ｎｇおよび二つのエフェクタープラスミドそれぞれの１５ｎｇをトランスフェクトした。発光ｂ−ガラクトシダーゼ検出キットＩＩ(Clontech)を使用して、ｂ−ｇａｌ活性を測定した。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
ヘテロ二量体スイッチ構築体．Ｅ２Ｃ−ＥＲ融合体の構築のために、点突然変異マウスＥＲ  ＬＢＤを、プライマーＥＲＦｓe-ＦおよびＥＲＰａｃ−Ｂ(5'-GAG GAG GAG GAG GAG TTA ATT AAG ATC GTG TTG GGG AAG CCC TCT GCT TC-3')(配列番号１７)を使用して、ｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ[Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., and Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690]から増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を構築体ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４内に挿入し、Ｆｓｅ１およびＰａｃ１との消化を経由して、ＶＰ６４コード化領域を置換した。ＥＲ−ＶＰ６４融合体を生成させるために、ＥＲ  ＬＢＤを、プライマーＥＲＡＴＧＢａｍ-Ｆ (5'-GAG GAG GAG GAG GGA TCC GCC ACC ATG CGA AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3')(配列番号１８)およびＥＲＡｓｃ−Ｂを使用して増幅した。それから、ＰＣＲ生産物をｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４[Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1462814633]内に挿入して、ＢａｍＨ１−Ａｓｃ１の消化を経由して、Ｅ２Ｃコード化領域を置換した。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
単鎖スイッチ構築体．２つのＥＲ  ＬＢＤを持つ単鎖融合体の構築のために、点突然変異マウスＥＲ  ＬＢＤを、プライマーＥＲＦｓe-ＦおよびＥＲＳpel−Ｂ(5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA GAT CGT GTT GGG GAA GCC CTC TGC-3')(配列番号１９)を使用するか、またはプライマーＥＲＮhe1-Ｆ１(１８アミノ酸リンカー構築体について；5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3')(配列番号２０)もしくはＥＲＮhe1-Ｆ２(３０アミノ酸リンカー構築体について；5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC AAT GAA ATG GGT GCT TCA GGA GAC-3')(配列番号２１)のどちらか、およびＥＲＡｓｃ−Ｂを使用して、ｐＢａｂｅ／Ｍｙｃ−ＥＲ[Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., and Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690]から増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を、Ｆｓｅ１およびＳｐｅ１もしくはＮｈｅ１およびＡｓｃ１それぞれで消化し、そしてＦｓｅ１−Ａｓｃ１直線化ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４[Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]内に挿入した。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９２】
ＲＸＲ−ＥｃＲ単鎖融合体の構築のために、ヒトレチノイドＸ受容体(ｈＲＸＲα、アミノ酸３７３〜６５４)のリガンド結合ドメインを、プライマーＲＸＲＦｓｅ−Ｆ(5'-GAG GAG GAG GGC CGG CCG GGA AGC CGT GCA GGA GGA GCG GC-3')(配列番号２２)およびＲＸＲＳｐｅ−Ｂ(5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA AGT CAT TTG GTG CGG CGC CTC CAG C-3')(配列番号２３)を用いてｐＶｇＲＸＲ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅した。エクジソン受容体(ＥｃＲ、アミノ酸２０２〜４６２、ショウジョウバエのメラノガステル)のリガンド結合ドメインを、プライマーＥｃＲＮhe-Ｆ１(１８アミノ酸リンカー構築体について；5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3')(配列番号２４)もしくはＥｃＲＮhe-Ｆ２(３０アミノ酸リンカー構築体について；5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGC GGT GGC GGT GGC TCC TCT GGT GGC GGT GGC GGT TCT TCC GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG G-3')(配列番号２５)、およびＥｃＲＡｓｃ−Ｂ(5'-GAG GAG GAG GGC GCG CCC GGC ATG AAC GTC CCA GAT CTC CTC GAG-3')(配列番号２６)を使用して、ｐＶｇＲＸＲからＰＣＲ増幅した。それから、ＰＣＲ生産物を、それぞれ、Ｆｓｅ１およびＳｐｅ１もしくはＮｈｅ１およびＡｓｃ１で消化し、そしてＦｓｅ１−Ａｓｃ１直線化ｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４[Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]内に挿入した。ＤＮＡ結合ドメインをＳｆｉ１消化を経由して交換し、エフェクタードメインをＡｓｃ１−Ｐａｃ１消化を経由して交換した。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９３】
３６アミノ酸リンカー、Ｅ２Ｃ−ＲＬＬＥ−ＶＰ６４融合構築体を生成させるために、ＲＸＲ  ＬＢＤを、プライマーＲＸＲＦｓｅ−ＦおよびＲＸＲＳｐｅＬＬ−Ｂ(5'-GAG GAG GAG GAG GAG ACT AGT AGA GCC ACC GCC CCC TTC AGA ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GG3')(配列番号２７)を使用してｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＲＥ−ＶＰ６４からＰＣＲ増幅した。ＥｃＲ  ＬＢＤを、プライマーＥｃＲＮｈｅＬＬ-Ｆ(5'-GAG GAG GAG GAG GCT AGC GGG GGT TCG GAG GGT GGC GGG TCT GAG GGT GGG GGT GGT TCC ACT AGC TCT TCC-3')(配列番号２８)およびＥｃＲＡｓｃ−Ｂを使用して同一のプラスミドから増幅した。ＰＣＲ生産物を、上述のようにｐｃＤＮＡ３／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４内に挿入した。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９４】
実施例２：遺伝子スイッチ
ホルモン調節亜鉛フィンガーステロイド受容体融合タンパク質の生成．以前の研究は標的遺伝子発現の調節について工学的Ｃ２−Ｈ２亜鉛フィンガータンパク質の潜在性を示してきている[Liu, Q., Segal, D. J., Ghiara, J. B., and Barbas, C. F., III (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530; Kim, J. S., and Pabo, C. O. (1997) J Biol Chem 272, 29795-29800 ;. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633; Beerli, R. R., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1495-1500]。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９５】
しかしながら、工学的亜鉛フィンガータンパク質の潜在性を十分に実現するためには、それら以外の構成的なＤＮＡ結合活性をリガンド依存性にさせることが望ましい。ヒトプロゲステロン受容体(ｈＰＲ)およびマウスエストロゲン受容体(ｍＥＲ)のリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)は、合成的アンタゴニストへの結合を保持しながら、天然のホルモンへの結合を欠如するように修飾した後で、異種のタンパク質の調節に以前から使用されてきている[Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., and Evan, G. I. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 1686-1690; Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., and Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-4411]。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９９】
最適な間隔は二つの半部位の配向に依存する。ＰＲ融合タンパク質の場合には、最適な間隔は、逆方向の繰返し体について２〜３ｂｐに、裏返しの繰返し体について３ｂｐにあるように見えた。直接な繰返し体からなる応答要素は単一の最適な間隔を持たなかった；最良の応答は４〜５ｂｐもしくは全く間隔無しで得られた。ＥＲ融合タンパク質については、最適な間隔は、直接な繰返し体について３〜４ｂｐに、逆方向の繰返し体について１〜２ｂｐに、そして裏返しの繰返し体について３ｂｐにあった。特記すべきことには、テストした応答要素次第で、基礎において、すなわちＰＲおよびＥＲ融合タンパク質リガンド−非依存性活性において有意な変動があったことである。最も注目すべきことには、直接の繰返し体の間隔を３から４ｂｐへ増加させることは、ＶＰ６４−Ｃ−ＰＲの１.９倍高い基礎活性に、そしてＶＰ６４−Ｃ７−ＥＲの場合には３.７倍もの増加に至った。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
意義深いことに、両方のタンパク質はそれらの標的配列を認識し、そしてテストした他の 5'-(GNN)3-3' 配列のいずれにも何も交差反応性を示さなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡにより判断すると、Ｎ１の結合はＢ３の結合よりはるかに弱かった。それ故に、電気泳動移動度シフト分析により親和性を測定した。Ｂ３タンパク質は、我々が先に他の三フィンガータンパク質について報告したＫＤ値に同様の、１５ｎＭのＫＤ値でその標的配列と結合した[Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]。対照的に、その標的に対するＮ１親和性は劇的にさらに低く、我々はそのＫＤ値を５〜１０μＭの範囲にあったと評価する。二つのタンパク質がそれぞれの標的配列に対して非常に異なる親和性を持ったという事実は、それは誘導性発現システムの機能性への親和性の影響を検討することを可能にするので、ポジティブと考えられた。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０５】
Ｂ３およびＮ１  ＤＮＡ標的配列、ならびに上で規定した最適応答要素構造に基づいて合成プロモーターを構築した。１０ｘＢ３−ＴＡＴＡ−ｌｕｃおよび１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ−ｌｕｃプラスミドはそれぞれ、ＴＡＴＡボックスおよびホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流に、３個のヌクレオチドだけ間隔を取った直接の繰返し体からなる、５個の応答要素を含む。応答要素はお互いに６個のヌクレオチドだけ隔てられているが、これは５個の二量体の随伴性結合を可能にし、かくしてプロモーター活性を極大にするであろう。種々の融合構築体の活性を、ヒーラ細胞中で同系のＴＡＴＡレポータープラスミドでの過渡的な共トランスフェクションにより評価した(表１)。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
一般的に、ＥＲ融合タンパク質はさらに強い転写促進体であると判明し、そして４−ＯＨＴ−誘導ルシフェラーゼ活性は、ＰＲ融合タンパク質により仲介される４８６−誘導ルシフェラーゼ活性より普通は３〜６倍高い。しかしながら、ＥＲキメラの基礎の、即ちリガンド非依存性の、活性はしばしば幾らかさらに高かったので、それらのホルモン−誘導性の折りたたみ−刺激は一般的にはさらに良くはなかった。二桁の大きさの過剰にあるホルモン−依存性遺伝子活性化はＰＲおよびＥＲ融合タンパク質の両方で共通して観察されたが、それらの値はＧａ１４−ＰＲ融合タンパク質ＧＬＶＰｃ’について以前に報告されたもの[Wang, Y., Xu, J., Pierson, T., O'Malley, B. W., and Tsai, S. Y. (1997) Gene Therapy 4, 432-441]より有意にさらに良い。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０９】
ＤＮＡ結合ドメインの性質はキメラのリガンド依存性の程度に主要な影響を与えた。ＤＮＡ結合ドメインとしてのＮ１タンパク質の使用は、Ｂ３の使用より、プロモーター活性の有意に良い折りたたみ刺激を持つ、さらに密に調節した融合構築体に至ったが、これはおそらくＮ１およびＢ３の間の劇的な親和性の相違に因るためであろう。特に、Ｎ１−ＥＲ−ＶＰ６４調節体は何の有意な基礎活性を持たないで、そして１０ｘＮ１−ＴＡＴＡ最少プロモーターについて４６４〜１３１９倍の４−ＯＨＴ−誘導活性化を仲介する能力があった(表１)。３桁の大きさの範囲に及ぶ遺伝子発現のリガンド−誘導活性化の程度は、それが遺伝子調節のテトラサイクリン制御システムについてこれまで報告されているだけなので[Gossen, M., and Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551; Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Miiller, G., Hillen, W., and Bujard, H. (1995) Science 268,1766-1769]、特に顕著である。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１３】
さらに別の問題が起きたのはＣ７  ＤＢＤをＥ２Ｃで置換したときであるが、これは六亜鉛フィンガードメインを含みそして１８−ｂｐ配列 5'-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3' (配列番号２９)をがん原遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の５'−ＵＴＲ中で認識する[Yamamoto, T., Ikawa, S., Akiyama, T., Semba, K., Nomura, N., Miyajima, N., Saito, T., and Toyoshima, K. (1986) Nature 319, 230-234; Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., and Barbas, C. F., III (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14628-14633]。Ｅ２Ｃ−ＥＲ−ＶＰ６４融合タンパク質は単一のＥ２Ｃ結合部位を保持するレポーター上で、ＥＲ  ＬＢＤの無いＥ２Ｃ−ＶＰ６４融合体と殆んど同じ活性をもって本質的に活性であったし、かつホルモンに良く応答しなかった。明らかに、高い親和性を持つＤＮＡの拡張ストレッチを認識する、大きいＤＮＡ結合ドメインの使用はキメラをホルモン−および二量化−非依存性にさせる。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
この問題を克服するために、我々は、ホルモン−依存性様式で単一の結合部位を通じて遺伝子発現を調節する能力があるようにデザインした、二つのタイプのＥＲ−ベースのキメラ調節体を生成した。最初の戦略において、ＥＲ  ＬＢＤに融合した工学的亜鉛フィンガータンパク質Ｅ２Ｃ、ならびにＶＰ６４活性化ドメインに融合したＥＲ  ＬＢＤからなる、ヘテロ二量体調節体を生成した(図２Ａ)。このヘテロ二量体調節体をヒーラ細胞中で発現したときに、４−ＯＨＴの不存在下でＥ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミド上に有意な活性を何も持たなかった。ホルモンの添加はルシフェラーゼ発現の３〜５倍の刺激に至ったが、これは機能的へテロ二量体の形成を示す。しかしながら、ホルモン−誘導レポーター遺伝子活性化はＥ２Ｃ−ＶＰ６４融合タンパク質によって誘導されたものより有意に低かったが、おそらく少なくとも部分的にＥ２Ｃ−ＥＲおよびＥＲ−ＶＰ６４ホモ二量体の形成に因るのであろう。Ｅ２Ｃ−ＥＲもしくはＥＲ−ＶＰ６４のどちらも単独ではルシフェラーゼ発現を誘導しなかったので、ホモ二量体は不活性であった。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１５】
第二の戦略において、柔軟なポリペプチドリンカーを通じて、一つの単一ポリペプチド中で二量化パートナーＥ２Ｃ−ＥＲおよびＥＲ−ＶＰ６４を結合することにより、融合タンパク質を生成した。長さが１８および３０アミノ酸の二つのリンカーをテストして、タンパク質Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４およびＥ２Ｃ−ｓｃＥＲ／３０−ＶＰ６４を創成した(図２Ａ)。これらのタンパク質は、分子間よりはむしろ、分子内の二量化を経由して活性化され、それ故に単量体として機能的であると予期された。二つのＥＲ  ＬＢＤの一つの単一鎖融合構築体内への組合せは、さらに効率的なホルモン−誘導二量化を可能にし、それ故にさらに効率的な活性化体を生ずるであろう。実際、Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４およびＥ２Ｃ−ｓｃＥＲ／３０−ＶＰ６４をヒーラ細胞中で過渡的に発現したとき、それらは、大きくホルモン−依存性な様式でＥ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポーターを活性化した(図２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ)。かくして、天然ステロイドホルモン受容体のものと同様な応答要素を必要とする二量体調節体を、単量体、リガンド−依存性の転写因子内で成功裏に変化させた。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１７】
それ故に、ＥｃＲおよびＲＸＲ  ＬＢＤを使用して、上述のｓｃＥＲキメラに類似の単量体遺伝子スイッチを作製した(図３Ａ)。かくして、ヒトＲＸＲαＬＢＤ(アミノ酸３７３〜６５４)およびショウジョウバエＥｃＲ  ＬＢＤ(アミノ酸２０２〜４６２)をＥ２Ｃ  ＤＢＤおよびＶＰ６４活性化ドメインの間に挿入して、Ｅ２Ｃ−ＲＥ−ＶＰ６４を創成した。この融合構築体においては、二つのＬＢＤは、Ｅ２Ｃ−ｓｃＥＲ／１８−ＶＰ６４中で使用されたと同一の１８アミノ酸の柔軟なリンカーにより連結されている。このキメラ調節体を、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミドと一緒にヒーラ細胞中で過度的に発現したときに、有意な基礎活性が観察された。しかしながら、活性をＰｏｎＡにより３−倍増加させることができたので、この人工的構築体はホルモン−応答的であったことを示す。このリガンド依存性を改良するために、ＲＸＲおよびＥｃＲ  ＬＢＤを連結するリンカーの長さを増加したが、これは単鎖ＥＲ構築体の場合に有益であるように見えた手段である。より長いリンカーは、非リガンド化した状態で、ＬＢＤがそれらの接触を最適化してかつ立体配座障害に加えることを可能にするであろう。実際、リンカーを３０アミノ酸(ＥＣ２−ＲＬＥ−ＶＰ６４中)もしくは３６アミノ酸(Ｅ２Ｃ−ＲＬＬＥ−ＶＰ６４中)へ延長したときに、基礎活性は有意に減少し、そしてＰｏｎＡは９〜１０倍の活性化に至ったが、応答性の程度は単鎖ＥＲ融合構築体のものと匹敵した(図３Ｂ)。かくして、核ホルモン受容体ＬＢＤ対の順次連結は、単量体のＤＮＡ結合タンパク質をリガンド−依存性にさせる一般的に応用可能な戦術であるように思われる。
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１９】
それから、キメラ転写調節体を、ホルモン依存性様式で１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ−ｌｕｃレポータープラスミドを調節するそれらの能力についてテストした。１０ｘＣ７−ＴＡＴＡ−ｌｕｃは、ホタルのルシフェラーゼコード化領域の上流で、５個のヌクレオチドにより間隔を取った１０個のＣ７結合部位[5'-GCG TGG GCG-3']およびＴＡＴＡボックスを含む。それぞれの融合タンパク質は、大きくホルモン依存性の様式でルシフェラーゼの発現を上向き調節した。ＲＵ４８６はＶＰ１６−Ｃ７−ＰＲの活性を２６倍刺激したが、一方４−ＯＨＴはＶＰ１６−Ｃ７−ＥＲの４３倍の活性化に至った。ＲＵ４８６およびＥＲの間もしくは４−ＯＨＴおよびＰＲの間に検出可能な交差反応性は何も無かった。いずれかの位置におけるＮＬＳの存在は、それが、おそらく増加した核局在化を通じて、融合構築体の増加した基礎(即ち、ホルモン−非依存性)活性に至ったので、必要としないばかりでなく望ましくさえ無かった。かくして、ｈＰＲ(アミノ酸６４５〜９１４)およびｍＥＲ(アミノ酸２８１〜５９９、Ｇ５２５Ｒ)ＬＢＤはホルモン−依存性を亜鉛フィンガータンパク質Ｃ７に付与することができる。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１は、新規なＤＮＡ結合特異性を持つデザインした亜鉛フィンガータンパク質の生成を示し、図１Ａは三フィンガータンパク質Ｂ３およびＮ１のアミノ酸配列である。肉太の字体で示す、ＤＮＡ認識へリックス位置の−２〜６が、三フィンガータンパク質Ｓｐ１Ｃのフレームワークの中に移植された。逆並行βシートおよびαへリックスの位置、亜鉛フィンガードメインのホールマークは示すごとくである。それぞれのフィンガーのＤＮＡ結合特異性は左に示されている。Ｆ１〜３はフィンガー１〜３である。
【図１Ｂ】  図１は、新規なＤＮＡ結合特異性を持つデザインした亜鉛フィンガータンパク質の生成を示し、図１ＢはＤＮＡ結合特異性のＥＬＩＳＡ分析である。亜鉛フィンガータンパク質は、ＭＢＰ融合体として大腸菌中で発現され、精製されたものである。結合特異性は、示した 5'-(GNN)3-3' 配列を含む固定化、ビオチン化ヘアピンオリゴヌクレオチドへの結合を測定することにより分析された。黒色の棒線はＢ3であり；灰色の棒線はＮ１である。最大のシグナルは１に正規化された。特異的標的配列への結合についてのＫＤ値は、電気泳動移動度シフトアッセイにより測定されたもので、相当する棒線の上にラベルされている。
【図２】  図２は、ホルモン依存性、単鎖ＥＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示し、図２ＡはＥＲ融合タンパク質の構造である。E２Cは六フィンガータンパク質であり；Ｌは柔軟なペプチドリンカーである。図２Ｂは、二量体として単一のＥＲ−ＬＢＤ結合を持つ融合タンパク質である。ヒーラ細胞は、Ｃ７−ＥＲ−ＶＰ６４発現ベクターおよび、一つもしくは二つのどちらかのＣ７結合部位を保持する、示したＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか(−)もしくは１００ｎＭの４−ＯＨＴを加える(＋)かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値(±ＳＤ)を提示する。図２Ｃは融合タンパク質を発現しない制御プラスミドｐｃＤＮＡ３である。図２Ｃ、Ｄは、二つのＥＲ−ＬＢＤを持つ融合タンパク質により単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよびＴＡＴＡボックスの上流に単一のＥ２Ｃ結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡ−ルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされ、そして４−ＯＨＴ誘導およびルシフェラーゼ活性の測定は図２Ｂでの説明のように行われた。
【図３】  図３は、ホルモン依存性、単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合構築体の遺伝子発現の調節を示す。図３Ａは単鎖ＲＸＲ／ＥｃＲ融合タンパク質の構造である。図３Ｂは、単一の結合部位を通じる転写の調節である。ヒーラ細胞は、示した発現ベクターおよび、単一のＥ２Ｃ結合部位を保持する、Ｅ２Ｃ−ＴＡＴＡルシフェラーゼのレポータープラスミドで共トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を未処理で放置するか(−)もしくは５μＭのポナステロンＡを加える(＋)かをした。全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定された。それぞれの棒線は二回測定の平均値(±ＳＤ)を提示する。ｐｃＤＮＡ３.１は融合タンパク質を発現しない対照プラスミドである。
【図４】  図４は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｂのヌクレオチド(配列番号３１)およびアミノ酸残基配列(配列番号３２)を示す。
【図５】  図５は、亜鉛フィンガー結合ドメイン２Ｃ７のヌクレオチド(配列番号３３)およびアミノ酸残基配列(配列番号３４)を示す。
【図６】  図６は、亜鉛フィンガー結合ドメインＢ３Ｃ２のヌクレオチド(配列番号３５)およびアミノ酸残基配列(配列番号３６)を示す。
【図７】  図７は、抑制ドメイン(ＫＲＡＢ−Ａ)2のヌクレオチド(配列番号３７)配列を示す。
【図８】  図８は、抑制ドメイン(ＳＩＤ)2のヌクレオチド(配列番号３８)配列を示す。
【図９】  図９は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−Ｌ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号３９)およびアミノ酸残基配列(配列番号４０)を示す。
【図１０】  図１０は、ポリペプチドＥ２Ｃ−ＥＲ−ＬＬ−ＥＲ−ＶＰ６４のヌクレオチド(配列番号４１)およびアミノ酸残基配列(配列番号４２)を示す。