【手続補正書】
【提出日】平成18年4月6日(2006.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質混合物含有サンプル中の１種または２種以上のタンパク質を同定および定量化するための方法であって：
ａ）タンパク質の混合物を含有するサンプルを提供し；
ｂ）ペプチドを分析するための試薬を提供し、ここで試薬は一般式
A-Y-PRG
を有し、式中、
Aは、支持体材料と可逆的に共有結合または非共有結合するための少なくとも１つの官能基を構成し、
Yは、低同位体性である金属に対する少なくとも１つのキレート機能を含む基であり、かつ、
PRGは、分析されるペプチドまたは他の生体分子と選択的に結合するための反応基である；
ｃ）ペプチドを生産するためにサンプル中のタンパク質を分解し；
ｄ）ペプチドを工程ｂ）の試薬と連結させ；
ｅ）支持体材料と可逆的に共有結合または非共有結合するための官能基を利用して、未結合ペプチドを除去して、工程ｄ）の標識ペプチドを選択し；
ｆ）結合したペプチドを支持体材料から遊離させ、マトリクスから溶出させ；および
ｇ）質量分析によって標識ペプチドを検出し、同定する
工程を含む方法。
【請求項２】
ペプチドの分解を酵素的にまたは化学的に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識ペプチドを、支持体材料から遊離後かつ質量分析による分析前に、特にHPLCによって、相互に分離する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
複数のタンパク質-および／またはペプチド-含有サンプルを共に分析することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識ペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質含有サンプル中のタンパク質の相対的発現を検出するための方法であって：
ａ）タンパク質を含有する生物学的サンプルを提供し；
ｂ）ペプチドを分析するための試薬を提供し、ここで試薬は一般式
A-Y-PRG
を有し、式中、
Aは、支持体材料と可逆的に共有結合または非共有結合するための少なくとも１つの官能基を構成し、
Yは、低同位体性である金属に対する少なくとも１つのキレート機能を含む基であり、かつ、
PRGは、分析されるペプチドまたは他の生体分子と選択的に結合するための反応基である；
ｃ）ペプチドを生産するためにサンプル中のタンパク質を分解し；
ｄ）ペプチドを工程ｂ）の試薬と連結させ；
ｅ）支持体材料と可逆的に共有結合または非共有結合するための官能基を利用して、かつ未結合ペプチドを除去して、工程ｄ）の標識ペプチドを選択し；
ｆ）結合したペプチドを支持体材料から遊離させ、マトリクスから溶出させ；および
ｇ）質量分析によって標識ペプチドを検出し、同定し；
ｈ）親和性標識ペプチドが由来するタンパク質の相対的発現を決定するために、異なる標識を付したペプチドの相対的存在をイオンの別ピークとして測定する
工程を含む方法。
【請求項７】
基A、YおよびPRGの配置が相互に交換されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンデム型技術、例えばマトリクス支援レーザ脱離／イオン化（MALDI）飛行時間（TOF）-TOF-MSおよびエレクトロスプレーイオン化（ESI）-MSによって標識ペプチドを検出することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ペプチドの質量分析のための試薬であって、一般式
A-Y-PRG
を有し、式中
Aは、支持体材料と可逆的に共有結合または非共有結合するための少なくとも１つの官能基を構成し、
Yは、低同位体性である金属に対する少なくとも１つのキレート機能を含む基であり、かつ、
PRGは、分析対象のペプチドまたは他の生体分子を選択的に結合するための反応基である試薬。
【請求項１０】
基A、YおよびPRGの配置が相互に交換されている、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
PRGが、スルフヒドリル反応基、アミン反応基および酵素基質からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の試薬。
【請求項１２】
PRGが、アミン反応性ペンタフルオロフェニルエステル基、アミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、スルホニルハライド、イソシアネート、イソチオシアネート、活性エステル、テトラフルオロフェニルエステル、酸ハライドおよび酸無水物、ホモセリンラクトン反応性一級アミン基およびカルボン酸反応性アミン、アルコールまたは2,3,5,6-テトラフルオロフェニルトリフルオロ-アセテート、ヨードアセチルアミド基、エポキシド、α-ハロアシル基、ニトリル、スルホン化アルキル、アリールチオールおよびマレイミドからなる群から選択される、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
Aが、ビオチンまたは修飾ビオチン、1,2-ジオール、グルタチオン、マルトース、ニトリロ三酢酸基、オリゴヒスチジンおよびハプテンまたは、支持体材料との可逆的結合が可能な他の反応性試薬からなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１４】
基A、Yおよび／またはPRG間にリンカーをさらに含み、該リンカーが化学的および／または酵素的な方法で、ならびに／あるいは放射線または光に曝露することによって分解可能である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１５】
リンカーがジスルフィド基を含有する、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
Yが、マクロ環ランタノイドキレート錯体、官能化テトラアザ-マクロ環、ポリアザ-ポリ酢酸、DOTA、DOTA誘導体、NOTA、NOTA誘導体、1,4,7,10,13,16,19,22-オクタアザシクロテトラコサン-1,4,7,10,13,16,19,22-八酢酸（OTEC）、1,4,7,10,14-17,20,23-オクタアザシクロヘキサコサン-1,4,7,10,14,17,20,23-八酢酸（OHEC）、EDTA、DTPA-BP、DTPA、DO3A、HP-DO3AおよびDTPA-BMAからなる群から選択される、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１７】
キレート錯体が結合する金属が、Ag、Al、As、Au、Be、Cd、Ce、Co、Cr、Cu、Dy、Er、Eu、Fe、Gd、Hg、Ho、In、La、Li、Lu、Mn、Na、Nd、Ni、Pb、Pr、Rb、Rd、Sb、Sm、Sn、Tb、Tl、Tm、V、W、Y、YbおよびZnから選択される、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１８】
キレート形成基がいくつかの異なる金属で標識されている、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１９】
生物学的サンプル中のペプチドを検出し、および／またはタンパク質含有サンプル中のタンパク質の相対的発現を測定するための、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の試薬の使用。
【請求項２０】
動物から採取されたタンパク質含有サンプル中のタンパク質の相対的発現を検出することによる、動物、特にヒトの疾患を診断するための、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の試薬の使用。
【請求項２１】
請求項９〜１７のいずれか一項に記載の試薬を、生物学的サンプル中のペプチドの検出、および／またはタンパク質含有サンプル中のタンパク質の相対的発現の測定に適した追加の物質ならびに／あるいは酵素とともに含有し、特に内部標準を含有する、診断用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、改善されたCATに基づく方法を提供し、ハイスループット条件下でCATを使用することを可能とすることである。さらに別の目的は、本方法に特に適したCAT試薬を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明による方法は、いくつかのタンパク質および／またはペプチド含有サンプルを一緒に分析することを特徴とすることが特に好ましい。これは、例えば別の細胞材料由来の別のサンプルに異なる標識を付することによって達成できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明に基づくさらに別の方法では、基A、YおよびPRGの配置は相互に交換してよい。MeCATの実行性のためのすべての機能的必要条件が依然満たされる限り、実際には、本発明による試薬はその成分が種々の様式で配置された状態で存在してよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明による別の試薬では、基A、YおよびPRGの配置は相互に交換してよい。MeCATの実行性のためのすべての機能的必要条件が依然満たされる限り、実際には、本発明による試薬はその成分が種々の様式で配置された状態で存在してよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明による発明の試薬のさらに別の態様では、この試薬は、基A、Yおよび／またはPRG間に化学的および／または酵素的に分解可能なリンカーを含む。通常、このリンカーはCH2基からなることが可能であり、これは基A、Yおよび／またはPRG間に位置して、これらの基を連結する。１つまたは２つ以上のCH2基は置換可能であり、この場合、置換基の性質は基A、YおよびPRGの機能が影響を受けない限り関連性はない。しかしながら、有利には、リンカーを介してさらに機能を導入でき、例えば上記化学的および／または酵素的分解性である。可能である置換基は、アルキル、アルケニルおよびアルコキシ基、アリール基であって、１つまたは２つ以上のアルキル、アルケニル、およびアルコキシ基で置換されていてもよいもの、酸性基および塩基性基である。さらに、リンカー内には二重および三重結合が存在してよく、またヘテロ原子、例えばO、SおよびNが挿入されていてよく、これは例えばジスルフィド基を含有するリンカーの型で挿入されてもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
高速かつ明確にタンパク質を同定するため、タンパク質反応性試薬内に金属イオンを包含させることができ、この金属イオンは、通常、タンパク質中に見出せず、そして非常に特徴的な同位体パターンを有するものである。このような金属イオンは標識ペプチドの質量スペクトル中で非常に容易に検出できる。コンピュータアルゴリズムにより、実験で観察されたマスフラグメントの同位体パターンは自動的に比較可能であり、それは金属のイオンまたは質量に特異的な標識の有無にはかかわらない。これにより、使用する質量分析計の感度についての要求は大きくならない。対照的に、ペプチドと結合した錯体試薬は検出感度に好影響を与えるが、その理由は、錯体形成試薬はペプチドの質量分析において強力な汚染物質として既知であり、したがって通常は、最も低い濃度であっても、これら回避することが必要であるからである。2DLCまたは別の適切な方法によって分離されたすべてのペプチドの質量スペクトルを自動的にスクリーニングすれば、システイン残基を含まないペプチドを主に含有するペプチド混合物から、その同位体パターンによって、システイン含有ペプチドを非常に高速かつ明確に選択することが可能なはずである。これらの選択ペプチドについて正確に測定された質量のみを使用し、実験データをゲノムおよびタンパク質データベース由来のデータと相関させてタンパク質を同定する。CID-MSによってペプチドの配列を決定すれば、同定が可能となる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
図１：ICATで使用する例示的な試薬の構造。XはHまたはキレート基のいずれかである。
図２：MeCAT法の概略図であり、１）酵素による分解；２）MeCAT試薬との連結；３）標識ペプチドの選択；４）選択ペプチドの溶出；５）標識ペプチドの分離；続いて、質量分析を伴う。
*ここで、サンプルAおよびBをプールすることが可能である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】  ICATで使用する典型的試薬の構造を示す。
【図２】  MeCAT法の概略図を示す。