【手続補正書】
【提出日】平成18年10月12日(2006.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
［一時的トランスフェクション］
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０１２）およびＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル由来のＳＶ４０−形質転換腎臓線維芽細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）を、１０％ＦＣＳ（胎児牛血清）を補ったＤＭＥＭ培地（ダルベッコの修飾イーグルス培地）において常用手順で維持した。一時的トランスフェクションを行うため、細胞を６ウェルプレートまたは４ウェル染色皿（グレイナー）に播種した。１２時間後、それらを、ＦＵＧＥＮＥ−６（それぞれ１、２〜３または４つの異なるプラスミドについて３μｌ、６μｌまたは９μｌ）を用いることにより上記および実施例２（Ｚｉｃ）、実施例４および実施例５における構築物を含む発現ベクター（各ベクター１μｇ）でトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの少なくとも５時間後に以下の物質で４または８時間採取前に処理した：ＡＬＬＮ（２５μｇ／ｍｌ；Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｎｏｒｌｅｕ−ＡＬ；シグマ）；ツニカマイシン（２μｇ／ｍｌ；シグマ）またはラクタシスチン（１０μＭ；例えば、シグマ）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中ですすぎ、本質的には下記要領でルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、ウエスタン・ブロッティングまたは免疫蛍光用に処理した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
［マイクロアレイ解析］
アフィメトリックスＨＧ−Ｕ１３３Ａジーンチップス（GeneChips、登録商標）（アフィメトリックス、サンタクララ、米国）を用いて、マイクロアレイ解析を実施した。アフィメトリックスにより推奨されたプロトコール（GeneChip Expression Analysis: Technical Manual (2001) p. 2.1.14-2.1.16）に従ってｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト・チョイス・システム（ライフ・テクノロジーズ）を用いて、１０μｇの全ＲＮＡ（ＥｃＲ−２９３細胞（インビトロゲン）から単離）を逆転写した。プライミングに使用したオリゴヌクレオチドは、5’-ggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg-(t)24-3’ （配列番号９）であった。二本鎖ｃＤＮＡを、フェノール：クロロホルム抽出により浄化し、水相を、フェーズ−ロックゲル（エッペンドルフ）による遠心分離により除去した。エンツォ・バイオアレイ・高収率ＲＮＡ転写標識キット（エンツォ・ディアグノスティクス、米国）を用い、製造会社のプロトコールに従ってインビトロ転写を１μｇのｃＤＮＡで実施した。ＲＮＡｅａｓｙクリーン‐アップカラム（キアゲン）を用いて、ｃＲＮＡを浄化した。カラムからの収率を改善するため、溶出水を２７ｇでマトリックス中へスピンし、次いでキアゲンにより推奨された標準的８０００ｇ遠心分離の前に１分間放置した。この低速湿潤段階により、溶出ＲＮＡの収率はほぼ２倍になった。１×フラグメント化緩衝液（４０ｍＭのトリス−酢酸ｐＨ８.１、１００ｍＭのＫＯＡｃ、３０ｍＭのＭｇＯＡｃ）中で加熱することにより、ｃＲＮＡをフラグメント化した。標準手順（４５℃、１６時間）を用いて、１０μｇのフラグメント化ｃＲＮＡを、ＨＧ−Ｕ１３３Ａジーンチップ（アフィメトリックス）とハイブリダイゼーションさせた。プロトコールＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４を用いて、洗浄および染色をフルイディクス・ステーション４００（アフィメトリックス）で実施し、アフィメトリックス・ジーンチップスキャナーで走査した。アフィメトリックス・マイクロアレイ総合ソフトウェアｖ５（チップスケーリングに使用した標的強度５００）およびジーンスプリング４.２.１（シリコン・ジェネティクス）を用いて、チップ解析を実施した。符号付きウィルコクソン順位検定（アフィメトリックスにより推奨された通り）を用いて複製間の一致する変化を捜すことにより、遺伝子発現の変化を評価した。「変化」ｐ値の閾値は、増加については＜０.００３であり、減少については＞０.９９７であった。一致分析後、これらの値は、それぞれ＜９×１０−６および＞０.９９９９９１となった。全実験条件において検出ｐ値が＞０.０５である遺伝子は全て、信頼できないデータであるものとして分析から除去された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
実施例７：テネウリンシグナリングにより調節される遺伝子の同定
Ｃ−末端ＶＳＶタグを含むテネウリン−２の細胞質ドメインをコード化するｃＤＮＡを、ベクターｐＩｎｄ（インビトロゲン）にクローン化した。安定して組込まれたプラスミドｐＶｇＲＸＲ（インビトロゲン）を含むＥｃＲ−２９３細胞（インビトロゲン）を、細胞質ドメインをコード化するｐＩｎｄテネウリン−２プラスミドによりトランスフェクションした。安定したクローンを選択し、ポナステロン（インビトロゲン）添加後にテネウリン−２の細胞質ドメインの発現について試験した。Ｋ３と呼ばれる一陽性クローンの細胞を、さらなる分析に使用した。親ＥｃＲ−２９３細胞およびＫ３細胞を培養飽和密度の７０％まで増殖させた後、１０μＭのポナステロンを２４時間両細胞培養物に加えた。ポナステロンの添加を行わずに並行培養物を維持した。２４時間後、４種の異なる培養物：Ｋ３−ポナステロン、Ｋ３＋ポナステロン、ＥＣＲ２９３−ポナステロンおよびＥＣＲ２９３＋ポナステロンからトリゾール試薬（ギブコ）を用いてｍＲＮＡを単離した。この手順を典型的にはデュプリケイトで実施することにより、８ｍＲＮＡバッチを得た。ｍＲＮＡのこれらのバッチの各々を用いてプローブを製造し、２０'０００の潜在的転写物を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むアフィメトリックスチップ（Ｕ１３３）とハイブリダイゼーションさせた。ポナステロンの存在により差次的に発現される遺伝子を含むリストが誘導された。２つの独立して実施されたデュプリケイト試験の両リストに共通する遺伝子をさらに研究し、４リストの項目を作製した：Ｋ３アップ、Ｋ３ダウン（Ｋ３細胞においてポナステロンによりアップまたは下方制御された遺伝子）、ＥｃＲ−２９３アップ、ＥｃＲ−２９３ダウン（ＥｃＲ−２９３細胞においてポナステロンによりアップまたは下方制御された遺伝子）。ポナステロンにより直接影響される遺伝子があればそれを排除するため、ＥＣＲ２９３およびＫ３細胞のリストに共通する項目を排除することにより、テネウリン−２の細胞質ドメインの存在により上方制御される（表１）または下方制御される（表２）遺伝子の最終リストとした。表１は、細胞質ドメインにより上方制御される遺伝子およびアフィメトリックスにより割当てられた各データベースのＩＤ番号を示す。表２は、細胞質ドメインにより下方制御される遺伝子およびアフィメトリックスにより割当てられた各データベースのＩＤ番号を示す。テネウリン−２により上方および下方制御された遺伝子の中で、多くは細胞成長、分化およびアポトーシスの調節においてある一定の役割を演じることが知られている。テネウリン−２により上方制御される一群の遺伝子は、ｐ５３の標的であることが知られている遺伝子（表１における番号７、２３、３３、５１、６５）と相関関係を示す。下方制御される遺伝子の別の一群は、ニューロン分化およびシナプス形成および機能においてある一定の役割を演じることが知られている遺伝子（表１の番号４、５、１１、１２、２７、２８、２９、３０、３４、３５、４０、５６、９０）と対応していた。テネウリン−２により下方制御される遺伝子の一群は、グルタチオニル化され、細胞のレドックス状態の調節に関与していることが知られている遺伝子（表２の番号３、４、１１、４４、４６、６９）と相関関係を示していた。下方制御される遺伝子の別の一群は、ｍｙｃの標的であることが知られている遺伝子（表２の番号１、３、４、１１、１４、３１、６９）と対応していた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
実施例８：増殖検定法
細胞増殖に対するテネウリン−２の細胞質ドメインの発現効果を試験した。Ｋ３細胞（安定して組込まれたプラスミドｐＶｇＲＸＲ（インビトロゲン）および細胞質ドメインをコード化するｐＩｎｄテネウリン−２プラスミドを含むＥｃＲ２９３細胞（インビトロゲン）、実施例７に記載）を、テネウリン−２の細胞質ドメインの発現を誘導するポナステロンの存在または不存在下で培養した。典型的には、５日間にわたって、並行培養物を４％ホルムアルデヒドにより毎日固定し、クリスタルバイオレット（Ｈ２Ｏ中０.１％）で細胞を染色することにより細胞数を測定した。ポナステロンの存在下、すなわちテネウリンの細胞質ドメインの存在下、Ｋ３細胞についてそれらの成長速度を未処理細胞の約５０％に遅らせた。テネウリン−２のトランスフェクション細胞質ドメインを伴わないＥｃＲ−２９３細胞の増殖は、ポナステロンを加えても影響されなかったことから、成長遅延はテネウリン−２の細胞質ドメインの存在に特異的に左右されることが分かった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
長いｔｅｎ−１変異型のＮ末端に対する抗体（抗Ｎ）およびタンパク質のＣ末端に対する抗体（抗Ｃ）を用いて、線虫の初期胚を染色した。抗Ｃは全ての膜を染色し、抗ＮはさらにＴｅｎ−１発現細胞の核も染色した。これはまた胃腸管の内側を覆う細胞においても優勢であり、その場合抗Ｃは細胞膜を染色し、抗Ｎは主に核を染色した。理論に縛られたくはないが、内在性Ｔｅｎ−１は、通常タンパク質分解的にプロセッシングされ得、細胞質ドメインの転移は、Ｔｅｎ−１シグナリングにおける生理学的過程であり得る。Ｔｅｎ−１の長い細胞質ドメインの核転移は、熱ショックプロモーター下でのＧＦＰ融合タンパク質として両細胞質ドメインの過剰発現により確認され得る。これらの構築物の一時的発現は、長い細胞質ドメインが細胞の核に蓄積し、短い形態は細胞質に残存することを示していた。