【手続補正書】
【提出日】平成18年4月3日(2006.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること；
（ｂ）粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること；
（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、第１オリゴ又は第１二本鎖を、上記架橋オリゴにアニーリングすること；
（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、第２オリゴ又は第２二本鎖を、上記第１中間二本鎖にアニーリングすること；
（ｅ）最終的な二本鎖を形成するために、必要に応じてステップ（ｄ）を繰り返すこと；及び
（ｆ）上記普遍的オリゴがライゲーション反応を受けず、且つ上記架橋オリゴが上記第１オリゴ又は第１二本鎖のいずれともライゲーションされない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴと二本鎖を一緒にしてライゲーションすること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）による上記固相支持体に結合した上記普遍的オリゴを提供し、そしてステップ（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すために、上記普遍的オリゴが上記架橋オリゴから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記普遍的オリゴが連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記連結基が、ポリ（オキシアルキレン）部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記連結基がリン酸基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記普遍的オリゴが５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記普遍的オリゴが３‘末端  及び５’末端を有し、上記普遍的オリゴの上記５‘末端が連結基に結合され、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の上記普遍的オリゴのいくつか又は全部にアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記リンカー配列が５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第１オリゴ又は上記第１二本鎖の粘着末端にアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記架橋オリゴが５‘末端及び３’末端を有し、且つ上記５‘末端がリン酸基を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記第１中間二本鎖が、上記普遍的オリゴと上記第１オリゴ又は第１二本鎖の間に位置するヌクレオチドギャップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ヌクレオチドギャップが、1〜５ヌクレオチドの長さである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の：
（ａ）固相支持体に結合した普遍的オリゴ；及び
（ｂ）粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴにアニーリングされた、架橋オリゴ
を含む、組成物。
【請求項１５】
さらに、以下の：
（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、上記架橋オリゴにアニーリングされた、第１オリゴ又は第１二本鎖；
を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
さらに、以下の：
（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、上記第１中間二本鎖にアニーリングされた、第２オリゴ又は第２二本鎖；
を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
さらに、以下の：
（ｅ）第３中間二本鎖を形成するために、上記第２中間二本鎖にアニーリングされた、第３オリゴ又は第３二本鎖；
を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
さらに、リガーゼを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
中間二本鎖のライゲーション条件への露出が、上記普遍的オリゴ又は上記架橋オリゴにライゲーション反応を受けさせることを引き起こさない、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
上記普遍的オリゴが、連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
上記連結基がポリ（オキシアルキレン）部分をふくむ  、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
上記普遍的オリゴが５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
上記普遍的オリゴが３‘末端及び５’末端を有し、且つ上記普遍的オリゴの上記５‘末端が連結基に結合されており、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の普遍的オリゴにアニーリングされる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
上記リンカー配列が５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第１オリゴ又は第１二本鎖にアニーリングする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
上記第１中間二本鎖中の、上記普遍的オリゴと上記第１オリゴ又は第１二本鎖の間に、ヌクレオチドギャップが存在する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
上記ヌクレオチドギャップが１〜５ヌクレオチドの長さである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
普遍的オリゴに結合された固相支持体を含む物品であって、１以上のリン酸基及びポリオキシアルキレン基が、上記固相支持体と上記普遍的オリゴの末端ヌクレオチドの間に位置する、上記物品。
【請求項３０】
上記固相支持体が多孔質のモノリスである、請求項２９に記載の物品。
【請求項３１】
上記固相支持体がビーズ及び繊維から選ばれる、請求項２９に記載の物品。
【請求項３２】
上記固相支持体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート及びポリメタクリレートから選ばれる有機ポリマーを含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３３】
上記固相支持体が金属酸化物を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３４】
上記ポリオキシアルキレン基がポリオキシエチレン基である、請求項２９に記載の物品。
【請求項３５】
リン酸基によって分離された２のポリオキシアルキレン基を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３６】
上記普遍的オリゴが、５〜５０ヌクレオチドから成る、請求項２９に記載の物品。
【請求項３７】
さらに、架橋オリゴを含み、ここで、上記架橋オリゴが、上記普遍的オリゴの５以上のヌクレオチドにアニーリングされているリンカーポリヌクレオチド領域を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３８】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ；
（ａ）請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の物品を提供すること；
（ｂ）上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること；及び
（ｃ）２以上のオリゴヌクレオチドを一緒にして結合し、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片を形成するために、リガーゼを使用すること；
を含む、前記方法。
【請求項３９】
さらに、以下のステップ：
（ｄ）上記架橋オリゴから上記普遍的オリゴを分離すること；
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
他の標的ポリヌクレオチド又はその断片を作製するために、上記物品を再使用することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
水性の環境における固相支持体上でのポリヌクレオチド構築方法において、以下の：
（ａ）直接的に又は連結基を介して、普遍的オリゴを固相支持体に共有結合させること；
（ｂ）開始二本鎖を形成するために、架橋オリゴを上記普遍的オリゴにアニーリングすること、ここで上記開始二本鎖は粘着末端を提供するために、一本鎖形態の上記架橋オリゴの部分を有する；及び
（ｃ）第１オリゴ又は第１二本鎖を、上記開始二本鎖の上記粘着末端にハイブリダイズすること、ここで、上記第１オリゴ又は第１二本鎖が次にライゲーション条件におかれ、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片中に取り込まれる；
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項４２】
固相支持体上での遺伝子の部分の構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体上で第１遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第１断片が少なくとも５０塩基対を有する；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｃ）固相支持体上で第２遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第２断片が少なくとも５０塩基対を有し、且つ上記第１断片と同一でない；
（ｄ）第２断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｅ）固相支持体上で第３断片を構築すること；
（ｆ）より長い遺伝子断片を提供するために、上記第３断片を上記第１断片に結合させること；
（ｇ）最終的な遺伝子を提供するために、上記第２断片をステップ（ｅ）のより長い遺伝子断片に結合させること；及び
（ｈ）上記最終的な遺伝子を上記固相支持体から分離すること；
を含む、前記方法。
【請求項４３】
溶液中で遺伝子の部分を構築する方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで上記第１断片が少なくとも５０塩基対を有する；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｃ）第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで、上記第２断片が少なくとも５０塩基対を有し、且つ上記第１断片と同一でない；
（ｄ）第２断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｅ）上記第１断片と上記第２断片を単一の溶液中で併合すること；そして
（ｆ）最終的な遺伝子を溶液中に提供するために、ステップ（ｅ）の上記第１及び第２断片を共有結合させること；
を含む、前記方法。
【請求項４４】
上記第１及び第２断片が、細菌又は酵母中で相同組換えによって一緒にして結合される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；及び
（ｃ）以下のような方向：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）少なくともステップ（ｂ）の上記溶液のいくらかが上記ds-NAを少なくとも２回通過するように、その方向が少なくとも１回逆行する、のような上記方向に働く力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-NAを通過するという条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項４６】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；及び
（ｃ）以下の：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）力の減少が上記ds-NAの一本鎖部分へアニーリングするss-NAの量を減少させる力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-NAを通過するという以外は一定である条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項４７】
上記固相支持体が多孔質である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）の上記溶液が、上記孔を多数回通り抜けることを必要とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
自動遺伝子構築のための装置であって、以下の：
（ａ）複数の反応容器、ここで、各反応容器が第１オリフィス、第２オリフィス、及び内幅を有し、そして各容器が上記内幅にわたる多孔質固相支持体を含む；そして
（ｂ）上記複数の反応容器と流体連絡している１以上のポンプ；
を含む、前記装置。
【請求項５０】
さらに、流体モニタリング手段を含む、請求項４９に記載の装置であって、ここで、上記流体モニタリング手段が反応容器中の流体レベルをモニターする、前記装置。
【請求項５１】
さらに、温度制御手段を含み、ここで、上記温度制御手段が反応容器内部の温度を制御する、請求項４９に記載の装置。
【請求項５２】
さらに、上記第１オリフィスと上記ポンプの間に位置する弁を含み、ここで、上記弁が液体貯蔵容器と流体連絡しており、液体が上記容器から反応容器中へポンプの作用によって押し出されることのできる、請求項４９に記載の装置。
【請求項５３】
さらに、コンピュータ制御された上記装置の操作を提供する、コンピュータを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５４】
さらに、マイクロプレート貯蔵ステージを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５５】
上記マイクロプレート貯蔵ステージが、上記マイクロプレート貯蔵ステージ上に位置される、マイクロプレートと接触している溶液の温度をモニターし且つ制御するために、温度モニタリング及び制御手段を含む、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
さらに、マルチプレート貯蔵システムを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５７】
上記マルチプレート貯蔵システムが温度制御されている、請求項５６に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
よりきれいな産物を作り出すため、及び後のプロセスのための材料を増量するために、中間断片をPCRによって増幅した。最終的な遺伝子構築を酵母相同組換え技術（yeast homologous recombination technique）(K. Oldenburg, K. Vo, S. Michaelis and C.Paddon, Nuclei Acid Research, (1997), vol.25, 451-452; and P.Gunyuzlu, G. Hollis and J. Toyn, Biotechniques,(2001), vol. 31, 1246-125）によって溶液相中で行った。最終的な構築遺伝子をクローン化し、配列決定した。試験した６の完全な大きさのクローンの中で、それぞれは４〜５のランダムな、修復可能な１ヌクレオチドエラーを含んでいた。このエラーの発生率及び型は、溶液相で構築した類似する大きさの遺伝子中に見出されるものに匹敵する（データは含まない）。４００塩基対の中間断片の一つを配列決定してみると、４の正しい配列を１０のクローンから発見した。エラーはここでもランダムであり、ほとんどが１塩基の置換、欠失又は挿入であった。