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　特願２００３−　４５９１８「サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年１１月１８日出願公開、特開２００３−３２５１８８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続きの経緯
　本願は、特許法第４１条に基づく優先権主張を伴う平成１５年２月２４日（優先日、平成１４年３月６日）を出願日とする出願であって、平成２０年７月１１日付で拒絶査定がなされたところ、平成２０年８月２１日に審判請求がなされ、その後平成２３年９月３０日付けで拒絶理由が通知され、これに対し平成２３年１２月５日に意見書が提出されるとともに手続補正がなされたものである。
　
第２　本願発明について
　本願の請求項１に係る発明（以下、「本願発明１」という。）は、平成２３年１２月５日に提出された手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。
　
「染色体にセリシン遺伝子のプロモーターの下流に結合されたサイトカイン遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの繭糸に組換えサイトカインタンパク質を生産させた後、その繭糸からサイトカインを回収することを特徴とする組換え型サイトカインの製造方法であって、繭糸から水溶性溶媒を用いて活性を有するサイトカインを抽出することを特徴とする、組換え型サイトカインの製造方法。」
　
第３　引用例
１．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である、繊維学会予稿集，２００１年　６月　６日、Vol.56, No.2，p.38-41（以下、「引用例１」という。）には、下記の事項が記載されている。
（１−１）「ベクター化したトランスポゾンを利用して行なったトランスジェニックカイコの作出実験の例を表１に示した。図１ａに示したようにベクターには緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をトランスポゾンpiggyBacに挿入したものを用いた。また、ヘルパーとして転移酵素を産生し、逆位末端反復配列（図１ａ、矢印の部分）にはさまれた領域を染色体に挿入する機能のあるものを一緒に使用した。」（第３９頁第１０行〜第１４行）
　
（１−２）「この実験では、ＧＦＰ遺伝子の発現をカイコの細胞質アクチンプロモーターで制御している。カイコの細胞質アクチン遺伝子はどの細胞でも発現している、最も組織特異性の低い遺伝子の一つである。興味あることは、細胞質アクチンという組織非特異的な発現を促すプロモーターであるにも関わらず、得られたトランスジェニックカイコでは、絹糸腺においてもＧＦＰが大量に作られ、繭糸に分泌されていることである。このことによってもトランスジェニックカイコによって異種のタンパク質を大量に絹糸腺で合成し、繭糸中に分泌することは理論的に可能であることが分かる。
　カイコにおいては遺伝子の研究はよく進んでおり、ゲノム研究も進行中である。特に、各組織中で発現している遺伝子はＥＳＴデータベース（SilkBase）として公開されており、組織特異的に発現している遺伝子を容易に見出すことができる。絹糸線（「腺」の誤記と認められる。）に限れば、フィブロインＨ鎖、Ｌ鎖、Ｐ２５、セリシン１と２などの遺伝子は絹糸線（「腺」の誤記と認められる。）でのみ大量に発現することが分かっている。このような遺伝子のプロモーターを利用することによって、カイコの絹糸線（「腺」の誤記と認められる。）をバイオリアクターとして生命工学材料の生産に用いることができる。また、この組織の分泌機能は、生産システムとして大変好都合であると予想される。タンパク質の合成系では、精製するのに多くの労力を費やするがこの系では繭に直接目的とするタンパク質を分泌することができる。」（第３９頁第下３行〜第４１頁第１３行）
　
（１−３）「ＤＮＡ型のトランスポゾンを利用したトランスジェニックカイコの作出技術が確立された。この方法は比較的簡単にトランスジェニック個体を作出できるため、実用的な技術として利用できる。特に、生命工学材料を作るための基盤技術として有効であると考えられる。具体的には、ヒトのホルモンや各種の絹タンパク質の遺伝子を組み込んだカイコを作出し、医薬品や新しい繊維素材を生産するためのバイオリアクターとしての利用が期待される。」（第４１頁「おわりに」の項）
　
２．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった電子的技術情報である、Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accessin No. AB007831, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB007831 29-Oct-1997 uploaded, [retrieved on 2011-06-27]Matsunami,K.,Definition: Bombyx mori sericin-1 DNA, 5'upstream sequence.（以下、「引用例２」という。）には、カイコ由来のセリシン−１の５’上流塩基配列が記載されている。
　
３．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である、J.Biol.Chem.,1989,Vol.264,No.31,p.18707-18713（以下、「引用例３」という。）には、下記の事項が記載されている。
（３−１）「セリシン−１ｍＲＮＡが特異的に発現されるカイコ中央絹糸腺の細胞核抽出物を用いて、セリシン−１遺伝子のin vitroでの転写を検討した。セリシン−１遺伝子のプロモーター機能のために必要な部位を決定し、これらの部位に結合する因子を特徴付けするため、その上流領域を分析した。フットプリント法は、少なくとも３種の特異的なタンパク質結合部位、ＳＡ(−１０３から−８５)、ＳＢ(−１４９から−１３５)、ＳＣ(−２０４から−１８３)の存在を明らかにした。５’欠失により、ＳＡ、ＳＣを遺伝子から除去するとプロモーター活性が低下した。」（要約）
　
（３−２）「結果　インビトロにおけるセリシン−１遺伝子プロモーターの欠失分析
・・・インビトロでの効率的なセリシン−１遺伝子転写のために必要な領域を決定するため、我々は、５’欠失変異のシリーズの転写活性を試験した。オートラジグラフのデンシトメトリースキャンにより定量された結果は、図１Ｂに示す。−２３９から上流の配列の欠失は、転写にわずかな影響しか及ぼさない（レーン１−５）。そして、−２３９から−１７４の欠失は、活性の５０％を減少させた（レーン５、６）。さらに、−１３２から−９０の欠失は、完全な活性の約１０％に落ち込ませ（レーン８、９）、−５６で終わるテンプレート又はさらなる下流のものは、非常に低い活性であった（レーン１０−１２）。」（第１８７０８頁左欄〜右欄「Deletion Analysis of the Ser-1 Gene Promoter in Vitro」の項）
　
４．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である、農林水産技術研究ジャーナル，２００２年　２月　１日，Vol.25, No.2，p.30-33（以下、「引用例４」という。）には、カイコを利用してネコインターフェロンを生産することが記載されており（第３１頁左欄3)「ＦｅＩＦＮ生産への応用」の項）、カイコからのネコインターフェロンωの抽出は、塩酸中で行うことが記載されている（第３２頁右欄3)「rFeIFNωの抽出方法」の項）。
　
５．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である特開２００１−１６１２１４号公報（以下、「引用例５」という。）には、下記の事項が記載されている。
「組換えコラーゲンの精製　上記の組換えＦ2カイコを正常カイコと交配させ、Ｆ3カイコを得た。このカイコを５齢期まで飼育し、全てのカイコから体液を採取し、ＰＣＲ法により組み換え遺伝子の有無を判定した。その結果、約50%のカイコからヒト・コラーゲン遺伝子が検出された。これら組換えＦ3カイコは正常に吐糸し繭を作ったため、繭からの組換えコラーゲンの抽出・精製を試みた。10個の繭を５% ２−メルカプトエタノールを含む50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.5中で破砕した後、４℃で24時間タンパク抽出を行った。」（第６頁左欄第１０行〜第２０行）　
　
６．当審における平成２３年９月３０日付の拒絶理由で引用された、本願優先日前に頒布された刊行物である、日本蚕糸学雑誌,2000,Vol.69,No.2,p.153-158（以下、「引用例６」という。）には、家蚕繭層の水可溶性蛋白質分画から６つの蛋白質を精製したことが記載されている（第１５３頁左欄下１行〜右欄第６行）。
　
第４　対比
　上記記載事項（１−１）及び（１−２）によると、引用例１には、染色体に、細胞質アクチンプロモーターの下流に結合されたＧＦＰ遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺及び繭糸にＧＦＰを産生させたことが記載されている。
　
　本願発明１と引用例１に記載された発明を対比すると、両者は、「染色体に、プロモーターの下流に結合された外来遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの繭糸に組換えタンパク質を生産させた」点で一致し、下記の点で相違する。
　
相違点１
　プロモーターは、本願発明１では、絹糸腺特異的に発現する「セリシン遺伝子のプロモーター」であるのに対し、引用例１では、組織非特異的に発現する「細胞質アクチンプロモーター」である点
　
相違点２
　本願発明１では、外来遺伝子は、「サイトカイン遺伝子」であって、「繭糸からサイトカインを回収する」工程及び「繭糸から水溶性溶媒を用いて活性を有するサイトカインを抽出する」工程を有するものであるのに対し、引用例１では、「緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子」であって、特にタンパク質を抽出し、回収する工程は記載されていない点
　
第５　判断
１．相違点１について
　引用例１には、セリシン１は、絹糸腺でのみ大量に発現するタンパク質であり、そのプロモーターを利用して、絹糸腺でタンパク質を生産することが示唆されている（記載事項（１−２））。このような記載に接した当業者であれば、プロモーターとして、セリシン１遺伝子プロモーターを用いて、繭糸でタンパク質を生産することは、自然に発想することであり、そのときに、引用例３に記載されたセリシン１プロモーターを用いることは、当業者が容易に想到できることである。
　
　また、引用例３には、セリシン１の５’上流塩基配列において、５’側を様々な長さで欠失させることにより、プロモーターとして機能する領域を決定することが記載されている（上記記載事項（３−１））。そうすると、引用例２に記載された、セリシン１の５’上流塩基配列情報に基づいて、引用例３に記載されるような手法により、プロモーター活性を有する領域を決定することもまた、当業者が容易になし得ることであるともいえる。
　
２．相違点２について
　引用例１には、繭に直接目的とするタンパク質を分泌することができること（上記記載事項（１−２））及び、ヒトのホルモン遺伝子等を組み込んだカイコを作出し、医薬品を生産させることが記載されており（上記記載事項（１−３））、引用例４には、カイコを用いてネコインターフェロンを生産することが記載されていることを考慮すれば、外来遺伝子として、本願優先日前に周知であるサイトカイン遺伝子を用いて、カイコの繭糸に組換えサイトカインを生産させることは、当業者が容易に想到することである。
　
　ところで、水溶性蛋白質を抽出するときの溶媒として、水溶性溶媒を用いることはよく行われていることであり（例えば、日本生化学会編「新生化学実験講座１　タンパク質Ｉ　分離・精製・性質」、株式会社東京化学同人、第１版第４刷、１９９４年７月１１日発行（以下、「参考資料１」という。）の第１２頁下１行〜第１３頁第２行には、蛋白質の抽出に緩衝液を用いることが記載されており、「緩衝液」とは、弱酸とその塩などを溶かした水溶液であることが一般的である。）、繭糸から水溶性物質の抽出に水溶性溶媒を用いることも引用例５及び６に記載されている。
　
　そして、引用例４に記載されるように、サイトカインは水溶性溶媒により抽出可能なものとして知られているのであるから、上記のサイトカインを発現した繭糸から、引用例５及び６に記載されると同様に水溶性溶媒を用いてサイトカインを抽出し、回収することは、当業者が容易になし得ることである。
　また、生理活性を有する蛋白質を抽出する際に、その蛋白質が安定となるｐＨ値やイオン強度を有する溶媒を選択して、活性を有する状態で抽出することは、当業者が適宜なし得ることである（例えば、参考資料１参照）。
　
３．抽出されたサイトカインが活性であることについて
　本願発明１は、引用例１の示唆にしたがって、サイトカインを繭糸に発現させたところ、予想どおり、活性を有するサイトカインを取得することができたものにすぎず、本願明細書の記載をみても、サイトカインを活性のある形で取得するために、格別な工夫もなく、普通に抽出して活性を有するサイトカインを得る程度のことは、当業者が容易になし得ることである。
　
　なお、請求人は、平成２３年１２月５日付意見書において、吐出直後の繭糸の含水率は、約７０％の値を示すものの、経時的に約２０％以下の乾燥状態となるものであり、引用例１に示された、ＧＦＰの蛍光が繭糸で観察された結果をもって、不安定なタンパク質であることが知られていたインターフェロンなどのサイトカインを、タンパク質が乾燥状態となる繭糸から、活性を保った状態で回収することが可能であると理解することはできず、このことは顕著な効果である旨主張する。
　
　しかしながら、引用例４に記載されるように、インターフェロンはカイコでは活性を有する形で発現するものであり、ＧＦＰよりもサイトカインが不安定であるとしても、ヒトインターフェロンはすべて凍結乾燥標品として調整されており、凍結乾燥保存安定性はきわめて高いことを考慮すれば（請求人が平成２３年１２月５日付意見書に添付した参考文献４「現代化学増刊18　サイトカイン、1990年4月26日発行」の特に第１２１頁右欄第９行〜１７行参照）、絹糸腺から吐出された繭糸が乾燥していくにつれて、サイトカインが完全に不可逆的な構造変化を起こすほどとはいえないもので、繭糸からの抽出の際に、水溶液に可溶化させることにより、完全ではないにせよ再生できる程度のものと認められる。
　そして、本願明細書の表４によると、ヒトインターフェロン−βの抗ウイルス活性が、表５によると、ネコ顆粒球コロニー刺激因子の増殖促進活性が、中部絹糸腺よりも絹糸から抽出された場合に低下していることから、本願発明１が格別顕著な効果を奏するものとは認められない。
　
　また、本願発明１において、サイトカインを抽出する際の繭糸の乾燥状態については特定されていないから、繭糸が約２０％以下の乾燥状態となるより前に抽出作業を行うことを排除するものではなく、当業者であれば、繭糸の含水率が減少する前に抽出操作を行うことにより、活性のあるサイトカインを得ることは、当業者が適宜なし得ることである。
　さらに、請求人が平成２３年１２月５日付意見書に添付した参考文献１「日本蚕糸学雑誌,1994,63(3),p.229-234」の第２３１頁〜２３２頁「１．営繭湿度を変えた場合の繭層含水率と解じょ率」の項及び図２に示されるように、営繭時の湿度を高めると繭糸の含水率が高くなり、経時的に含水率が減少しなくなることは、本願優先日前における技術常識であることを考慮すると、営繭時の湿度を高めることにより、繭糸の含水率を高め、サイトカインの失活を防ぐようにすることは、当業者が適宜なし得ることであるともいえる。
　そうすると、活性を有するサイトカインが得られた程度のことは、なおさら格別の効果ではないことになる。
　
　よって、請求人の主張は採用できない。
　
４．まとめ
　したがって、本願発明１は、引用例１〜６に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
第６　むすび
　以上のとおり、本願発明１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
　したがって、本願に係るその他の請求項について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。