【手続補正書】
【提出日】平成18年10月31日(2006.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクター配列を含有する哺乳動物の心筋細胞。
【請求項２】
アデノウイルスベクター配列が、２つの独立のプロモーターの制御下に、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを発現する組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成され
る、請求項１記載の哺乳動物の心筋細胞。
【請求項３】
２つの独立したプロモーターが２つのCMVプロモーターである、請求項２記載の哺乳動
物の心筋細胞。
【請求項４】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳動物の心筋細胞。
【請求項５】
哺乳動物がウサギ、マウスまたはラットである、請求項１〜４のいずれかに記載の哺乳動物の心筋細胞。
【請求項６】
ａ）哺乳動物の心臓を獣医学における現在の技術水準の手術手技により摘出し、
ｂ）心臓をコラーゲナーゼと還流して消化し、
ｃ）単離した心筋細胞に、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを２つの独立し
たプロモーターの制御下に発現する組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成されるアデノウイルスベクターを感染させる、請求項１〜５のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項７】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクタ
ーを含有する心筋を有する哺乳動物。
【請求項８】
アデノウイルスベクター配列がＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを２つの独立したプロモーターの制御下に発現する組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成される
、請求項７記載の哺乳動物。
【請求項９】
２つの独立したプロモーターは２つのCMVプロモーターである、請求項８記載の哺乳動
物。
【請求項１０】
心筋はＧ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項１１】
哺乳動物がウサギ、マウスまたはラットである、請求項７〜１０のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項１２】
ａ）Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベ
クター配列を準備し、
ｂ）哺乳動物を準備し、
ｃ）ａ）のアデノウイルスベクター配列を、ｂ）の哺乳動物の心筋にカテーテルによって移入する、請求項７〜１１のいずれかに記載の哺乳動物の製造方法。
【請求項１３】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2の活性を調節する化合物の同定方法において、
ａ）受容体EDG2または受容体EDG2を含む融合蛋白質を発現する心筋由来のトランスフォームされた細胞を準備し、
ｂ）場合によってはａ）の細胞の処置をイソプロテレノールおよび／またはリソホスファチジル酸の使用によって実施し、
ｃ）化学的化合物を準備し、
ｄ）ａ）またはｂ）の細胞をｃ）の化学的化合物と接触させ、
ｅ）ｄ) の細胞の収縮性を測定し、ａ）の細胞と同じ特性を有するがｃ）の化学的化合物とは接触させていない細胞の収縮性と比較し、この場合、ｄ）による化学的化合物と接触させた細胞の収縮性の化合物による相対的な上昇または低下が、このような化合物の受容体EDG2の活性を調節する能力を証明することによる化合物の同定方法。
【請求項１４】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2の活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）受容体EDG2または受容体EDG2を含む融合蛋白質を発現する心筋由来のトランスフォームされた細胞を準備し、
ｂ）場合によってはａ）の細胞の処置をイソプロテレノールおよび／またはリソホスファチジル酸の使用によって実施し、
ｃ）化学的化合物を準備し、
ｄ）ａ）またはｂ）の細胞をｃ）の化学的化合物と接触させ、
ｅ）ｄ) の細胞の収縮性を測定し、ａ）の細胞と同じ細胞種であるが、受容体EDG2または受容体EDG2を含む融合蛋白質を発現しない細胞の収縮性と比較し、この場合、受容体EDG2または受容体EDG2を含む融合蛋白質を発現する細胞の収縮性の化合物による相対的な上昇または低下が、このような化合物の受容体EDG2の活性を調節する能力を証明する、
上記方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４を実施するための請求項１〜６のいずれかに記載の心筋細胞の製造に使用するための哺乳動物の使用。
【請求項１６】
以下の群：
ａ）配列番号５に特定した配列を有するポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号５のポリヌクレオチドと95％同一であるポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号５のポリヌクレオチドと少なくとも同じ長さであり、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を適用した場合、配列番号５のポリヌクレオチドにハ
イブリダイズするポリヌクレオチド、
の一つのポリヌクレオチドからなる組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
配列番号２の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１６記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2を、少なくとも１つの組織で一過性または永久的に発現するトランスジェニック哺乳動物を構築するための、請求項１６または１７に記載のアデノウイルスベクターの使用。
【請求項１９】
組織は心臓の一部である、請求項１８記載のアデノウイルスベクターの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
Ｇ蛋白質カップリング受容体（GPCR）は、多重な生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしている。ヒトゲノムでは約1000の遺伝子が、この受容体ファミリーをコードしていると推測される。処方箋によって現在使用されている医薬の約60％は、GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストとして働いている。これは、研究開発型製薬産業のためにこの受容体クラスがいかに重要であるかを物語っている。上記蛋白質ファミリーのサイズおよび重要性により、また多くのGPCRでその生理学的リガンドが依然として未知である事実（オーファンGPCR）から考えて、この受容体クラスは、将来における新規な医薬物質の研究に適当な標的蛋白質の最も重要な貯蔵庫の一つであると推定することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
GPCRは、細胞の表面に存在する膜に組み込まれた蛋白質のファミリーである。それらは、細胞外シグナリング物質（たとえば、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、脂質）からのシグナルを受けて、これらのシグナルをグアニンヌクレオチド結合蛋白質、「Ｇ蛋白質」のファミリーを経由して細胞の内部に移送する。受容体の特異性、活性化されるＧ蛋白質およびその細胞種に依存して、これらの受容体は様々なシグナル伝達経路を誘発する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
すべてのGPCRポリペプチド鎖は、細胞膜の脂質二重層を横切って跨ぐ７個のα−ヘリックスに折り畳まれる。７回膜を通過して、細胞外および細胞内ループの形成を生じ、これが細胞外のリガンド結合およびＧ蛋白質の細胞内カップリングを可能にする。この理由から、GPCRはまた、７回膜貫通型受容体とも呼ばれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
すべてのＧ蛋白質カップリング受容体は共通の基本的パターンに従い作用する。細胞外リガンドの結合は受容体蛋白質にコンフォーメーションの変化を導き、これにより受容体蛋白質のＧ蛋白質との接触が可能になる。細胞でのＧ蛋白質により仲介されるシグナル伝達カスケードは最終的に細胞の生物学的応答を導く。Ｇ蛋白質は、サブユニットα、βおよびγから構成されるヘテロトリマーである。それらは脂質アンカーを介して細胞の内側に存在する。活性化GPCRのＧ蛋白質へのカップリングは、ＧαサブユニットにおけるGDP／GTPの交換、ならびにヘテロトリマーＧ蛋白質のαおよびβγサブユニットへの解離を誘導する。活性化αサブユニットおよびβγ複合体はいずれも細胞内エフェクター蛋白質と相互作用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
Ｇαs型Ｇ蛋白質による膜結合アデニレートサイクラーゼ（AC）の活性化は、たとえば細胞内cAMPレベルの上昇を招くが、Ｇαi型Ｇ蛋白質による活性化の場合にはその低下を招来する。Ｇｑ型Ｇ蛋白質は、イノシトール1,4,5−トリホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）の形成を触媒するホスフォリパーゼC（PLC）を活性化する。これらの分子は細胞内貯蔵オルガネラからCa2+の放出またはプロテインキナーゼＣ(PKC）の活性化を招く。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
リソホスファチジン酸（LPA）およびスフィンゴシン１−ホスフェート（S1P）は強力なリン脂質メディエーターであり、様々な生物学的活性を有する。それらの出現および機能的性質は発育、創傷治癒および組織再生にある役割を果たしている可能性を示唆している。成長の刺激作用および他の複雑なLAPおよびS1Pの活性の一部は、多重なＧ蛋白質仲介細胞内シグナリング経路に帰するものである。数種のヘテロトリマーＧ蛋白質ならびにRas−およびRho−依存性経路が、LPSおよびS1Pに対する細胞性応答に中心的な役割を果たしている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は、哺乳動物の心筋細胞に関し、この細胞はＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFP（緑色蛍光蛋白質）の同時発現のためのアデノウイルスベクター配列を含有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
アデノウイルスベクター配列は、好ましくは組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成され、これはＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを２つの独立したプロモーターの制御下に発現する。このようなプロモーターは２個のCMVプロモーターとすることも
できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
上述のアデノウイルスベクター配列を含有する哺乳動物の心筋細胞は、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを発現し、したがってＧ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFP蛋白質を含有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明はまた、心筋細胞の製造に関し、この細胞はＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクター配列を含有し、この場合、
ａ）哺乳動物の心臓を、現在の技術水準の獣医学の手術手技により摘出し、
ｂ）心臓をコラーゲナーゼで還流、消化し、
ｃ）単離された心筋細胞を、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの、２つの独立したプロモーターの制御下における発現を可能にする組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成されるアデノウイルスベクターを用いて感染させることにより製造される。このようなプロモーターは、好ましくは２個のCMVプロモーターである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
さらにまた本発明は、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクターを含有する心筋を有する哺乳動物に関する。この哺乳動物のアデノウイルスベクター配列は、好ましくは組換えE1／E3欠損アデノウイルスから構成され
、これはＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを、２つの独立したプロモーターの制御下での発現を可能にする。このような２個の独立したプロモーターは好ましくは２つのCMVプロモーターである。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はまた、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を含有する心筋を有する哺乳動物に関する。このような哺乳動物、すなわちＧ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクターを有する心筋をもつ哺乳動物、および／またはＧ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を
有する心筋をもつ哺乳動物は、好ましくはウサギ、マウスまたはラットである。さらに本発明はまた、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPを同時に発現するためのアデノウイルスベクターを含有する心筋を有する哺乳動物の製造、および／またはＧ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を含有する心筋を有する哺乳動物の製造に関し、この場合、
ａ）Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクター配列を準備し、
ｂ）哺乳動物を準備し、
ｃ）ａ）からのアデノウイルスベクターシステムをｂ）からの哺乳動物の心筋にカテーテルを用いて移入することによって製造される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明はまた、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2およびGFPの同時発現のためのアデノウイルスベクターを含有する心筋を有する哺乳動物、および／またはＧ蛋白質カップリング受容体EDG2の蛋白質およびGFPの蛋白質を産生する心筋を有する哺乳動物の使用に関し、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2の活性を調節する化合物の同定方法として使用することができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明はさらに、以下の群のポリヌクレオチドの一つから構成されるアデノウイルスベクター、すなわち
ａ）配列番号５に特定される配列を有するポリヌクレオチド、
ｂ）配列番号５のポリヌクレオチドと95％同一なポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号５のポリヌクレオチドと少なくとも同じ長さであり、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を適用した場合、配列番号５のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、から構成されるアデノウイルスベクターを、Ｇ蛋白質カップリング受容体EDG2が一過性または永久的に少なくとも一つの組織において発現されるトランスジェニック哺乳動物を構築するための使用に関する。このような組織は、好ましくは哺乳動物の心臓の部分である。組織はまた、脳、筋肉、脂肪、肝臓、腎臓または哺乳動物の他の臓器の部分から構成される。