【手続補正書】
【提出日】平成17年9月22日(2005.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ起源の肥満細胞を培養し、得られた培養物からヘパリンを回収することを含むことを特徴とするヘパリンを製造する方法。
【請求項２】
肥満細胞の培養物が、ブタ起源の肥満細胞系統であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
肥満細胞が、ブタ胎児骨髄またはブタ胎児肝臓に由来することを特徴とする請求項1および2のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４】
肥満細胞が、漿液肥満細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
肥満細胞が、
−受託番号I-2735の下で、2001年10月17日にCNCM(ナショナルコレクション・オブ・カルチャーズ・オブ・マイクロオーガニズムズ)に寄託された系統；
−受託番号I-2736の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された系統；
−受託番号I-2734の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された系統
から選択される肥満細胞系統に由来することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法により得ることができるヘパリンの調製物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
GAGまたはプロテオグリカンを製造するための、哺乳動物由来の細胞の使用はすでに提案されている。
つまり、特許出願WO 99/26983は、ラット肥満細胞から、プロテオグリカン(HEP-PG)またはグリコサミノグリカン(HEP-GAG)であるヘパリンタイプの化合物を得ることを記載している。これらの化合物はヘパリンではない。このようにして単離された細胞は、樹立された系統ではない。さらに、出願人は単離した細胞を線維芽細胞と共培養することを推奨している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
WangおよびKovanenによる論文(Circulation Research、84、1、74〜83、1999)は、その中でラット漿液肥満細胞の単離、およびこれらの細胞からのプロテオグリカンの製造を記載している。特許出願WO 99/26983におけるように、プロテオグリカンの製造に用いられる細胞は、樹立された系統ではないが、単離され次いでプロテオグリカンを産生するように刺激された単なる細胞である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明者らは、ブタ腸粘膜から抽出したヘパリンの特性に匹敵する特性を有する、かなりの量のヘパリンを、肥満細胞系統の培養物から製造することができることを知った。
原料としての細胞培養物の使用は、ヘパリンの合成のための条件の制御、およびそれにより再現性のある特徴を有する製品を得ることも可能にする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の主題は、ブタ起源の肥満細胞を培養し、得られた培養物からヘパリンを回収することを含むことを特徴とする、ヘパリンを製造する方法である。
好ましくは、上記肥満細胞培養物はブタ起源の肥満細胞系統である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本明細書における「培養物」の語は、一般に、インビトロで培養された細胞または細胞の組を表す。動物から採取された細胞または組織サンプルから直接作製した培養物は、「初代培養物」とよばれる。「系統」の語は、継代培養において少なくとも1継代、および通常はいくつかの連続した継代が成功して行われれば用いられ、これに由来するいずれの培養物をも表す (SCHAEFFER、In Vitro Cellular and Developmental Biology、26、91〜101、1990)。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
有利には、上記肥満細胞は、ブタ肥満細胞培養物に由来し、特に特許出願FR 0113608および"Cultures de mastocytes de porc et luers utilisations [ブタ肥満細胞培養物およびその使用]"の名称でINRA およびENVAにより本出願と同日にファイルされたPCT出願に記載のようにして得られたブタ肥満細胞培養物に由来する。これらのうち、本発明に従った方法の実行のために好ましい系統は：
−受理番号I-2735の下で、INRA (147 rue de l'Universite, 75007 Paris, France)により、2001年10月17日にCNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures of Microorganisms], Pasteur Institut, 26 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France)に寄託された、ブタ胎児肝臓幹に由来する肥満細胞の系統；
−番号I-2736の下で、INRAにより、2001年10月17日にCNCMに寄託された、ブタ胎児肝臓に由来し、SV40ウイルスT抗原でトランスフェクションされた肥満細胞の系統；
−番号I-2734の下で、INRA により、2001年10月17日にCNCMに寄託された、ブタ胎児骨髄に由来し、SV40ウイルスT抗原でトランスフェクションされた肥満細胞の系統
である。
好ましくは、これらの肥満細胞は漿液肥満細胞である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明は、肥満細胞培養物からのヘパリンの製造および得られたヘパリンの特性決定に言及する、以下に続く付加的な記載によってさらに明確に理解される。
実施例1：肥満細胞培養物からのヘパリンの抽出
肥満細胞の培養
ブタ胎児肝臓肥満細胞系統およびSV40ウイルスT抗原でトランスフェクションしたブタ胎児肝臓肥満細胞の系統(それぞれCNCM I-2735およびCNCM I-2736)を用いた。
細胞を、ブタIL3 (2 ng/ml)およびブタSCF (80 ng/ml)の存在下に、完全MEMα培地中に105〜5×105細胞/mlの割合で播種する。
培養物を、培養ディッシュまたは1リットルのスピナーフラスコ中に調製する。細胞の増殖を毎日、4〜12日間監視する。培養物中に産生されるグリコサミノグリカンを分析することにより、ヘパリンの産生量を並行して監視する。結果を図1〜5に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例4：繰返し回分バイオリアクターでの肥満細胞の培養
ブタ胎児肝臓に由来する肥満細胞のトランスフェクションしていない系統を用いた。
細胞を、ブタIL3 (2 ng/ml)およびブタSCF (80 ng/ml)を補った完全DMEM/F12培地中に、ml当たり2.0〜4.0×105細胞の割合で播種する。
用いたバイオリアクターは、2リットルの培地容量を有し、培養物の酸素圧力は飽和の20％〜40%の間に維持され、pHは7.0〜7.4の間に維持され、温度は、バイオリアクタージャケット内の、サーモスタットで調温した水の循環により37℃±0.5℃に維持される。
培養物は、80〜150 rpmの間の速度で、プロペラを用いて攪拌する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
SV40ウイルスT抗原でトランスフェクションした肥満細胞の系統を用いた場合に、類似の結果が得られる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
実施例5：脱顆粒剤を用いた、培養上清中のヘパリンの製造
トランスフェクションされていない胎児肝臓肥満細胞の系統について実験を行った。
762日目(最初の培養から計数して)に、肥満細胞の濃度を2×106細胞/mlに調整し、培養物を、肥満細胞の脱顆粒を誘導する4μg/mlのイオノフォアA23187を含む、MEM培地中に1時間インキュベートした。
細胞により産生された全体のGAGおよび分泌されたGAGを、PAGEにより定量する。図10は、未処理の細胞(0μg/mlのA23187)中の約10%に対して、イオノフォアA23187で処理した後の上清中にGAGの70〜75％が見出されることを示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
培養762日目にGAGの回収を行った肥満細胞を、再び培養に付した。生存力または増殖速度の損失は観察されなかった。
21日後に、これらの肥満細胞をさらに脱顆粒に供し、上述のようにしてGAGを分析した。762日目に脱顆粒をうけていない、同じ齢の肥満細胞培養物をコントロールとして用いた。
結果を図10に示すが、これは分泌されたGAGのパーセンテージが最初の脱顆粒の間に得られたものに匹敵し、同じ齢のコントロール細胞で得られたものにも匹敵することを示す。
SV40ウイルスT抗原でトランスフェクションされた肥満細胞の系統を用いた場合に、類似の結果が得られる。