【手続補正書】
【提出日】平成18年4月12日(2006.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定する方法であって、
（ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形を用意すること（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
（ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡを用意すること、
（ｃ）候補化合物を用意すること、
（ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つが標識されている）、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）を、（ｃ）の存在下および（ｃ）の非存在下で、（ａ）および（ｂ）が複合体を形成するのに十分な時間、混合すること、
（ｅ）段階（ｄ）で形成された複合体の量を検出すること、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を検出すること、
（ｆ）形成された複合体の量、および／または見出された非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を、（ｃ）の存在下と非存在下で比較すること、および
（ｇ）段階（ｆ）で検出された複合体形成に影響する薬物を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ＨｕＲタンパク質が均一溶液として用意されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨｕＲが、組換え全長タンパク質または変異体の可溶性形、または全長タンパク質の可溶性形の変異型であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡフラグメントが蛍光標識されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
検出方法が、１分子分光法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布分析法、定常状態蛍光強度法、蛍光異方性測定、およびエネルギー転移法からなる群から選択される蛍光分光法であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質の複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定するためのスクリーニングアッセイ（キット）であって、主な要素として
ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ、および
ｃ）必要に応じて、該ＨｕＲタンパク質と該ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ間で形成された複合体の量の検出、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種の検出の手段、
を含む、アッセイ（キット）。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により同定される薬物を少なくとも１つの医薬賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項８】
好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓ、およびｃ−ｍｙｃからなる群からされる、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質からなる群から選択される物質の産生と関係する病因を有する疾患の処置のための、請求項７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
位置３２６のＣ末端アミノ酸がエステル化されている、配列番号：１または配列番号：２の全長ＨｕＲタンパク質。
【請求項１０】
ＨｕＲの結合部位である、単離ＲＮＡ配列モチーフ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、特に、ＡＲＥとこの分解に拮抗するタンパク質であるＨｕＲにより介在されるＥＲＧ特異的ｍＲＮＡ減少に焦点をおく、新規スクリーニングコンセプトを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
我々は、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、Ｃｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ２）、および他の標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中のＡＲＥとＨｕＲとの相互作用が、本発明の方法に従い、決定され得ることを見出した。ＨｕＲのその同族ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ配列との相互作用は、炎症性疾患を標的とする新規アプローチとしての免疫処置を指揮する、可能性のある抗ＩＬ−２、抗Ｃｏｘ−２、抗ＴＮＦ−αなどのための興味深い標的を表す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の別の態様において、ＨｕＲタンパク質は、均一溶液として提供される。
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡフラグメントは、合成方法、または試験管内転写により製造される。ｍＲＮＡフラグメントの合成製造のため、オリゴヌクレオチドが、例えば、通常の方法に従い（例えば、類似して）（例えば、（保護）ホスホラミダイト、および適当な溶媒中の結合試薬の使用により）、合成される。より長いフラグメントは、好ましくは、試験管内転写により、製造される。好ましくは、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡフラグメントは、５から８０ヌクレオチド長を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
候補化合物は、本発明に従うＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対するその影響が予測され得る化合物（ライブラリー）を含み、例えば、（ｍ）ＲＮＡフラグメント、ＤＮＡフラグメント、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ミメティックス、小分子（例えば、低分子量化合物（ＬＭＷ）、好ましくは、ＬＭＷ）を含む。
薬物は、複合体形成に対する影響が証明されている、選択された候補化合物の１つである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
検出の目的上、物質（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の少なくとも１つは、検出可能な標識、例えば、固有の標識部分を生じる。標識は、必要に応じて、通常の方法に従い（例えば、類似して）（例えば、任意の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の反応基の、標識物質の反応基との化学反応により）、実行される。該反応基は、アミノ酸残基、例えば、システイン残基、チオエステル、アルデヒド、マレイミド、マレイミドカルボン酸、ビニル、ハロアルキルカルボニル、ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む。好ましくは、それは、標識されたｍＲＮＡフラグメントであり、好ましくは、それは蛍光標識されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ＰＣＲ
ベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１のＮｄｅＩとＳａｐＩ制限部位向きにクローン化するための適当な制限部位を含有するオーバーハングを有する、完全コード配列（ＣＤＳ）（アミノ酸１〜３２６を包含）に隣接するプライマーを設計する。
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴ−３’
リバースプライマー：５’−ＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧ−３’
下線のヌクレオチドは、向き指定のクローニングのため、ＰＣＲ産物に付加した制限部位を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
それぞれのｃＤＮＡ供給源について、標準的ＰＣＲ条件を用いて、７回、同一のＰＣＲ反応を行う。０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（１５×１５×０．８ｃｍ）上、１０μｇ／ｍｌ  エチジウムブロマイド含有ＴＡＥ緩衝液中、８０Ｖ（一定電圧）での９０分間の分取アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ反応産物を精製する。４８０ｎｍのトランスイルミネーションの下、Dark Reader上で、滅菌済みメスでバンドを切り出す。
アガロースゲルスライスから、NucleoSpin Extract 2in1 Kit（Machery&Nagel）を用いて、製造元のプロトコールに従い、試料を抽出する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
制限酵素切断
両ｃＤＮＡ供給源由来のＰＣＲ産物、およびベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１をＮｄｅＩおよびＳａｐＩで２重切断後、ベクターＤＮＡおよびＰＣＲ産物を、分取アガロースＳＧＥ（スラブゲル電気泳動）により、分離する。適当なサイズ（ｐＴＸＢ１／ＮｄｅＩ−ＳａｐＩについては６４５８ｂｐ；ｐＴＹＢ１／ＮｄｅＩ−ＳａｐＩについては７４２６ｂｐ；ＰＣＲ産物については９８５ｂｐ）のバンドを、トランスイルミネーション下、Dark Reader（４８０ｎｍ）上で滅菌済みのメスで切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて、製造元のプロトコールに従い抽出する。LKB Biochrom II分光光度計にて、５０μｌのＵＶ石英セル（LKB Biochrom Ultrospec ＵＶ石英セル、P/N 4001-088）を用いて、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより、溶出したＤＮＡを定量する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
生じた組換えプラスミド全ての配列を、上で示したように、自動ＤＮＡ配列決定により確かめる。ベクターＤＮＡ中に結合部位を有する、ＮｄｅＩ部位の上流およびＳａｐＩ部位の下流の一致配列に対して相補的なプライマーを用いて、ＤＮＡ配列を生成する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
実施例２：
配列番号：１の最初の２つのＲＲＭのみ（配列番号：１のアミノ酸１〜１８９＝配列番号：３）または配列番号：１のアミノ酸２〜１８９（＝配列番号：４）を包含するＨｕＲ変異体（ＨｕＲ１２）
上記のアミノ酸を包含するヒトＨｕＲの短い可溶性変異体を、ＩＭＰＡＣＴ−ＴＷＩＮシステム（New England Biolabs）を用いて、制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｐＩの向きにクローニングすることにより調製する。最近の研究において、該最初の２つのフラグメントを、効率的ＲＮＡ結合に重要かつ十分であると同定し、そして関係タンパク質（ＨｕＤ、Ｓｘｌ）に関する匹敵する発見は、ほぼ、該短い構造物がリガンド結合での十分な特異性を保つという結論を導く。可溶性組換えタンパク質を、細菌培養液から調製する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ａ）クローニング
クローニングを実施例１に記載のように行うが、アミノ酸１〜１８９由来のヒトＨｕＲ（以下、ＨｕＲ１２として言及する）の完全コード配列に隣接するプライマーを適宜設計する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ｂ）発現
E.coliＥＲ２５６６−ｐＴＷＩＮ１／ＨｕＲ１２を、組換えヒトＨｕＲ１２の大スケール精製のための発現システムとして用いる。培養を実施例１に記載のように行う。ＩＰＴＧによる発現の誘導の際の粗細菌細胞ライセートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、クローン化ＨｕＲ１２−Ｍｘｅ−インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質の予測サイズに対応する、〜４８ｋＤの新生タンパク質を現す。
ｃ）精製
アフィニティークロマトグラフィーを、実施例１に記載のように行う。
ＨｕＲ１２の分取ＨＰＬＣ−精製
第２のキチンカラムから溶出した溶液を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製する。概略、溶液中の全タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイ（Bio-Rad）を用いて、製造元のプロトコールに従い評価する。それぞれの分取実施において、タンパク質１から５ｍｇに対応する量を、DeltaPak［登録商標］Ｃ４、１５μｍ、３００Å、２５０×１０ｍｍ  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（WATERS）に注入する。溶出を、１００％  Ａ（５％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）から１００％  Ｂ（９５％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）の直線的勾配、５０分間、一定流速１０ｍｌ／分で行う。２３０ｎｍでのＵＶ吸収、およびλｅｘ＝２８０ｎｍ／λｅｍ＝３４０ｎｍでの蛍光を測定することにより、検出を行う。ＨｕＲ１２は、典型的には、〜６０％  Ｂ（〜５９％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮに対応）により溶出する。分画３ｍｌを集め、変性非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＨｕＲ１２含有分画を集める。溶液を最終的に液体Ｎ２中で容器凍結し、タンパク質を−５９℃、０．００５ｍｂａｒで３６時間凍結乾燥する。凍結乾燥ＨｕＲ１２含有フラスコをアルゴンで洗い流し、連続する精製段階のため−２０℃で貯蔵する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
合成ＯＲＮを脱保護し、分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により、精製し、次に、切り出したゲルスライスから抽出し、そして電気溶出する。２６０ｎｍでの吸収を測定することにより、濃度を決定する。フラグメントの純度を、分析的ＨＰＬＣによりコントロールする。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
ＴＮＦ−α  ＡＲＥに対するＨｕＲの親和性（Ｋｄ＝０．１２ｎＭ＋／−０．０２）は、例えば、Ｃｏｘ−２  ＡＲＥに対するもの（Ｋｄ＝１３．６３ｎＭ＋／−１．０７）より有意に高い。この作用は、配列が著しく異ならないが、同一ではないとき、特に驚くべきことである（表１を参照）。我々は、特に配列依存性、かつＨｕＲ結合に関与する非常に特異的な機序が存在すると結論づける。その結果、我々は、認識は、さらに、１つのＡＵＵＵＡエレメントに対する一般的親和性には基づかないが、該５ヌクレオチドコアの周囲の位置、数および配列が、実質的に重要であると結論づける。実験を全長ＨｕＲおよびＨｕＲ１２（全長ＨｕＲを短くした変異体）により行い、我々は、ＨｕＲ介在性ｍＲＮＡ安定化の特異性が、第３のＲＲＭに起因しないとさらに判断する。ＨｕＲ介在性ｍＲＮＡ安定化の特異性は、２作用：ＨｕＲの第３ドメインが、他の制御タンパク質との特異的相互作用に関与すること、しかし最初の２ドメインは、配列特異性、または少なくとも選択性を示すこと、の組合せに基づく。このことは、最終的には、個々のＨｕＲ−ＡＲＥ標的、またはすでに、ＲＮＡ認識レベルでの標的ファミリーに対して特異的なインヒビターの可能な同定を示唆する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
実施例６：
ＯＲＮの蛍光標識
標識反応
蛍光ダイを５’末端リンカーと共に導入したアミノ基と、安定カルボキサミドの形成を導く、第１のアミンのスクシンイミジルエステル活性化分子との標準的反応により、結合させ得る。該目的上、Ｈ２Ｏ最大２０μｌ中の精製ＲＮＡ５〜１０ｎｍｏｌを、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ９．０）ストック溶液と混合し、最終緩衝液濃度１５０〜３００ｍＭとする。１つの例として、ＴＭＲ−ＮＨＳ（５−カルボキシ−ＴＭＲ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルエステル）を、アルゴン雰囲気下、無水ＤＭＳＯに溶解し、ＲＮＡに添加して２５倍Ｍを超えるものとするが、標識反応物中の最終ＤＭＳＯ濃度は、３０％（ｖ／ｖ）を超えない。インキュベーションを、室温で少なくとも２時間、光から保護したボルテックスミキサー上で行う。非反応ダイを、１．５Ｍ  ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌの添加（５０倍Ｍを超える）、および室温で３０分間、光から保護したボルテックスミキサー上でのインキュベーションにより加水分解する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
標識ＲＮＡの精製
標識後、ＲＮＡを遊離ダイから分離し、分画０．５ｍｌを集め、上記のＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。２６０ｎｍでのＵＶ吸収、ならびに、ＴＭＲの励起／放出最大波長に対応する、λｅｘ＝５４１ｎｍ、λｅｘ＝５６７ｎｍでの蛍光を測定することにより、標識および非標識ＲＮＡの検出、および遊離ダイの検出を行う。ＲＮＡ含有分画を、類似の条件での分取ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製する。両標識および非標識ＲＮＡのピークを、先のとがったフラスコに別々に集め、該溶液量を、Rotavapor上で蒸発させて減少させりる。該溶液をエッペンドルフチューブに定量的に移し、Ｈ２Ｏ／エタノールと共に５〜７回、共蒸発させ、任意の残存ＴＥＡＡｃを除去する。乾燥ＲＮＡをＨ２Ｏに溶解し、濃度２０〜５０μＭとし、さらなる使用のため−２０℃で貯蔵する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
ＩＬ−２：ヒトＩＬ−２の全長３’ＵＴＲを含有する組換えプラスミドを、実施例１に記載の類似の方法に従い、調製する。概略、ヒトＩＬ−２の全長３’ＵＴＲを、ヒトＴリンパ球から調製したｃＤＮＡライブラリーから、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８（New England Biolabs）のＫｐｎＩおよびＳｐｅＩ制限部位の向きでクローン化するための適当な制限部位を含有するオーバーハングを有するよう設計したプライマーで増幅する。ＰＣＲ増幅およびベクターＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｐｅＩで２重切断し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、標準的ヒートショックプロトコールを用いて、ＣａＣｌ２コンピテントE.coli  ＩＮＶαＦ’に形質転換する。選択ＬＢ寒天プレートに播種後、組換えプラスミドＤＮＡ含有シングルコロニー（ブルー・ホワイトセレクションにより決定）をピックアップし、液体ＬＢ−Ａｍｐ培地中で対数増殖期後期まで成長させる。３つのシングルコロニーから単離した組換えプラスミドの配列を、上記の自動ＤＮＡ配列決定により確かめ、アラインメントし、ヒトＩＬ−２の３’ＵＴＲに対して１００％同一性とする（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２５６７６）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
試験管内転写
１つの例として、ＴＮＦ−α  ３’ＵＴＲの最初の６９７ｎｔに対応する転写物を、次のように試験管内転写により調製する。５’末端のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を取り込んでいる、ＴＮＦ−αの３’ＵＴＲのｎｔ１〜６９７に隣接するプライマーから、ＰＣＲ産物を調製する。次に、流出転写物を、MEGASCRIPT  Ｔ７試験管内転写キット（AMBION）を用いて、製造元のプロトコールに従い調製する。転写後、ＤＮＡ鋳型を、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅＩで切断し、そして混合物を、酸性フェノール・クロロホルムによる抽出段階を繰り返すことにより、さらに精製する。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏに溶解し、−８０℃で保存する。該産物を、可視化するためにエチジウムブロマイド染色したＰＡＧＥにより、さらに分析し、これは、１つのバンド移動を予測分子量にて現している。さらに、２６０ｎｍでのＵＶ吸収のＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例２参照）分析物は、従って、ＲＮＡ転写物に対する単一ピークを示す。