【手続補正書】
【提出日】平成18年11月8日(2006.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、食細胞の酸素依存的殺菌作用を図解する。１Ｏ２とＯ２●−の相互変換が示されている。
図２は、amplex red assayが関与する化学変換段階を図説する。抗体(このスキームではＩｇＧとして記載)は１Ｏ２をＯ２●−に変換し、これは過酸化水素から自発的に発生し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素がamplex red基質を脱アセチル化および酸化し、それにより５８７nmの蛍光を発する分子を産生する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
図１２は、基質トリスカルボキシエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)と、１６Ｏ含有Ｈ２Ｏ２または１８Ｏ含有Ｈ２Ｏ２のいずれかによる酸化を説明するマススペクトルを提供する。ＥＳＩ(陰極性)マススペクトルを、Ｈ２Ｏ２での酸化後、ＴＣＥＰ[(Ｍ−Ｈ)−２４９]およびそのオキシド[(Ｍ−Ｈ)−２６５(１６Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−２６７(１８Ｏ)]として取った。
図１２Ａは、Ｈ２１８Ｏ(９８％１８Ｏ)ＰＢ中、１６Ｏ２好気条件でヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７／μＭ)で照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを説明する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に小さなピーク)の混合物を作る。
図１２Ｂは、Ｈ２１６Ｏ  ＰＢ中、富化された１８Ｏ２(９０％１８Ｏ)好気条件下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さいピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。
図１２Ｃは、Ｈ２１６Ｏ  ＰＢ中の１６Ｏ２好気濃度下行ったポリ−ＩｇＧの照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。アッセイ条件および方法は、Ｈ２１６ＯをＨ２１８Ｏに変えた以外、方法および材料(実施例II)と同じである。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。
図１２Ｄは、嫌気(脱気およびアルゴン下)条件下、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢで８時間、２０ＥＣ下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)およびＨ２１６Ｏ２(２００μＭ)照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。ＴＣＥＰの添加は、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。
図１２Ｅは、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢ中の１６Ｏ２好気条件下の３−メチルインドール(５００μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、３−メチル−インドールが小さすぎる分子量であるため、サイズ排除濾過を行わなかった以外、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。したがって、ＴＣＥＰを３−メチル−インドール含有ＰＢ溶液に添加した。
図１２Ｆは、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢ中１６Ｏ２好気条件下のβ−ｇａｌ(５０μＭ)の照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、方法および材料(実施例II)に記載の通りである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
図１３は、材料および方法(実施例II)に記載の抗体４Ｃ６におけるＸｅ結合部位を示す。
図１３Ａは、カラー写真で軽鎖がピンク色であり、重鎖が青色であるＦａｂ  ４Ｃ６のＣαトレースの標準側面図を示す。３つの結合したキセノン原子(カラー写真で緑色)を、５σで合わせた最初のＦｏ−Ｆｃ電子密度マップと共に示す。
図１３Ｂは、保存キセノン部位１の周りのＦａｂ  ４Ｃ６および２Ｃ  αβ  ＴＣＲ(ＰＤＢ／ＴＣＲ)の重層を提供する。ＶＬ主鎖Ｃαトレース(カラー写真でピンク色)および側鎖(カラー写真で黄色)ならびに対応する２Ｃ  αβ  ＴＣＲのＶα(カラー写真で赤色および金色)を重ねる(図はInsight2000を使用して作った)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
図１４は抗体による細菌の殺菌を示す。
図１４Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ株の、異なる実験条件下での生存を示す棒グラフを提供する。生存は回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する。黒色棒および薄灰色棒は、薄灰色グループ(２、４、６、８、１０および１２)が可視光(２.７mWcm−２)に６０分暴露され、黒色グループ(１、３、５、７、９および１１)が暗所に６０分置かれた以外、同じ実験条件に対応する。細菌細胞密度は約１０７細胞／mLであった。報告した各データ点は、大腸菌ＸＬ１−ブルー(グループ１−６)およびＯ１１２ａ,ｃ(グループ７−１２)の、以下の条件下の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.(ｎ＝６)である。グループ１−２  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ３−４  ＨＰＩＸ(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ５−６  ＸＬ１−ブルー−特異的モノクローナル抗体(２５Ｄ１１、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ７−８  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ細胞。グループ９−１０  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＨＰＩＸ(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。グループ１１−１２  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。
図１４Ｂは、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの生存における抗体濃度の効果を説明する。用いた抗体はＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体、１５４０４であった。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する１５４０４抗体の濃度(ＥＣ５０)は８１±６nMであった。
図１４Ｃは大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体１２Ｂ２の殺菌作用における照射時間の効果をグラフ的に説明する。グラフは照射時間(２.７mWcm−２)対ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および１２Ｂ２(２０μＭ)存在下の大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存を提供する。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する照射時間は３０±２分であった。
図１４Ｄは、抗体誘発殺菌作用のヘマトポルフィリンIX濃度依存性を説明する。用いた抗体は大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体２５Ｄ１１であった。グラフは、大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存対暴露したヘマトポルフィリンIX濃度を提供する。以下の条件を用いた：ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分のＸＬ１−ブルー細胞(＞)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃で白色光(２.７mWcm−２)下のＸＬ１−ブルー細胞(△)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◆)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、白色光(２.７mWcm−２)下、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◇)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
図１８は、カタラーゼの存在下および非存在下の抗体のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液のＵＶ照射(３１２nm、０.８mWcm−２)中のインディゴカルミン１(１mM)からイサチンスルホン酸２への光産生の進行を説明する。Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 267, 13425(1992)。各点は、少なくともデュプリケートの測定の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として示す。線形回帰分析をGraphpad Prism v.3.0ソフトウェアで行う。イサチンスルホン酸２の形成速度(ν)は以下の条件下で観察した：ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)(●)ν＝３４.８±１.８nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)(□)ν＝４０.５±１.５nm／分；ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(△)ν＝３３.５±２.３nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(▽)ν＝４１.８±１.２nM／分。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
“非天然”アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸ならびに天然に存在しないアミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジンおよびたのこのようなアミノ酸およびイミノ酸を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
さらに、基質１Ｏ２＊は、抗体が検出可能なレベルの活性酸素種を産生するのに十分な量で食作用または再潅流により産生される。例えば、ファゴソームの容量は約１.０×１０−１５リットルである。故に、本明細書で確認された反応は、僅か数百の分子が、マイクロモル濃度でこのような少ない容量に含まれるため、非常に効率的である必要はない。実際、１Ｏ２＊濃度はファゴソームにおけるのと同程度に高いモル濃度であると計算されている。E. P. Reeves et al., Nature 416, 291(2002)。抗体分子の数に関するいくつかの概算が、細菌と蛍光標識抗体分子の力価測定、および、免疫−金試験からなし得る(図２)。これらの分析は、約１０５抗体分子が各細菌に結合し、このような数は、ファゴソーム内のミリモル濃度の抗体濃度と対応することを示唆する。このように、ほとんどの保守的な概算でさえ、ファゴソーム内の１Ｏ２＊と抗体の濃度は本明細書に記載する説明的例に使用するものを遙かに超える。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
１Ｏ２が非常に反応性であるため、以前は酸素−除去薬剤のカスケードの終点と見なされていた。しかしながら、抗体が、タンパク質のクラスとして、１Ｏ２を妨害し、効率的にそれを活性酸素種に還元する能力を有することが判明し、したがって、１Ｏ２が食細胞作用中に救済され、再使用され、それにより免疫系の殺菌活性が増強される機構を提供する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
活性酸素種の抗体による産生のための最低限の要求は、酸素の存在であり、すなわち、好気条件が一般に必要である。一重項酸素の活性酸素種への生物学的変換は、可視光、赤外線光を含む光中で、および紫外線照射条件下で起こる。可視光条件を用いるとき、一重項酸素の産生は、一重項酸素の供給源を提供できる他の分子の使用により増強できる。一重項酸素を産生する分子は、他の因子またはインデューサーの必要性なしに一重項酸素を産生する分子ならびにインデューサーへの暴露後に一重項酸素を産生する“増感剤”分子を含む。一重項酸素を他の因子またはインデューサーの必要性なしに産生する分子の例は、エンドペルオキシドを含むが、これに限定されない。ある実施態様において、用いるエンドペルオキシドは、アントラセン−９,１０−ジプロピオン酸エンドペルオキシドであり得る。増感分子の例は、プテリン、フラビン、ヘマトポルフィリン、テトラキス(４−スルフォナートフェニル)ポルフィリン、ビピリジルルテニウム(II)錯体、ローズベンガル色素、キノン、ローダミン色素、フタロシアニン、ヒポクレリン、ルブロシアニン、ピナシアノールまたはアロシアニンを含むが、これらに限定されない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
このような抗酸化剤は、反応性オキシダントを産生する酸素の活性化を阻止するものならびにすでに形成されたものを中和するものを含む。抗酸化作用は、触媒作用を含むあらゆる機構により起こり得る。カテゴリーとしての抗酸化剤は、酸素スカベンジャーまたはフリーラジカルスカベンジャーを含む。抗酸化剤は、それらが必要であるときに利用できるようにするために、種々のタイプであり得る。好気性生物全体に酸素が存在するということを考慮すれば、抗酸化剤は、種々の細胞、組織、臓器および細胞外コンパートメントで利用可能である。後者は、細胞外液空間、眼液、滑液、脳髄液、胃腸分泌物、間質液、血液およびリンパ液を含む。抗酸化剤は生物内に存在するがまた食事に補うことにより、および、本発明の方法の使用により提供できる。ある態様において、用いる抗酸化剤は、アスコルビン酸、α−トコフェロール、γ−グルタミルシステイニルグリシン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、α−リポ酸、ジヒドロリポエート、Ｂアセチル−５−メトキシトリプタミン、フラボン、フラボネン、フラバノール、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、メタロチオネインおよびブチル化ヒドロキシトルエンを含むが、これらに限定されない。他の態様において、本発明の方法の意味で抗酸化剤として機能する能力を有する分子は、還元一重項酸素からスーパーオキシドフリーラジカルを産生する能力が減少した、または、好ましくは全く存在しない加工された抗体である。このような抗体分子は、本明細書に記載されている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本発明で使用する“抗体”なる用語は、完全な分子だけでなく、エピトープを結合できるＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖのようなそのフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターと選択的に結合するある程度の能力を保持し、以下のように定義される：
(１)抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有し、全抗体のパパイン酵素による消化により、完全な軽鎖と一つの重鎖の一部をもって産生され得るフラグメントであるＦａｂ；
(２) 全抗体のペプシンによる処理およびそれに続く還元によって、完全な軽鎖および重鎖の一部をもって得られる抗体分子のフラグメントであるＦａｂ'であって、抗体１分子あたり２個のＦａｂ'フラグメントが得られる；
(３) 全抗体を酵素ペプシンで処理し、これに続く還元を行わないで得られる抗体のフラグメントである(Ｆａｂ')２であって、Ｆ(ａｂ')２は、２個のジスルフィド結合によって相互に結合された２個のＦａｂ'フラグメントのダイマーである；
(４)２個の鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子的に加工されたフラグメントとして定義されるＦｖ；および
(５)遺伝子的に融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーによって結合された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子的に加工された分子として定義される１本鎖抗体(“ｓＦｖ”)。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
加工された分子または抗体への還元中心の挿入は、当業者に既知の方法により達成される。組み換え発現法ならびに直接タンパク質合成法を含む好ましい手段が、以前に記載されている。方法の選択は、加工された分子の長さに依らなければならない。用いる方法と無関係に、加工された還元中心の位置、すなわち、挿入場所は、加工された分子が一重項酸素に対して活性の減少を示す能力に基づいて決められる。好ましくは、導入された還元中心は、それらが折りたたまれた分子内に深く包埋され、かつそのために活性酸素種産生が維持され、または増強されるように位置させる。一つの態様において、加工された抗体は抗原結合機能を保持し、そして加工された還元中心の位置は、可変結合ドメインに隣接する。ある態様においては、１個の還元中心が意図される。他の態様においては、２個の還元中心が意図される。さらに、他の態様においては、３個以上の還元中心が意図される。好ましくは、還元中心はインドールを含む。また意図されるのは、トリプトファン残基に存在するようなインドール部分を有する還元中心である。このような還元中心を分子または抗体中に産生する任意の技術が、本発明での使用を意図される。好ましい実施態様において、置換ヌクレオチドが、コード分子の予定した位置でトリプトファン残基をコードするように、加工された抗体をコードするヌクレオチド配列の部位特異的変位誘発により還元中心を挿入する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
抗体フラグメントの別の形態は、１個の相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド(“最小認識部位”)は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製され、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成する。例えば、Larrick, et al., Methods: Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 106(1991)を参照。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
このように、本発明は、所望の位置において、より多くのスーパーオキシドフリーラジカル、オゾンまたは過酸化水素を産生するために加工された抗体を意図する。抗体は、本明細書中の実施例ＩおよびIIに記載の付加的還元中心を含有し、スーパーオキシドフリーラジカルまたは過酸化水素への一重項酸素の還元を増加するように加工される。また、本発明は、一重項酸素から、スーパーオキシドフリーラジカルまたは過酸化水素を産生する能力を少なくとも減少させるように加工した抗体も意図する。この意味で、この抗体は、少なくとも１つのその還元中心を欠き、好ましくは、還元中心を実質的に含まない。このような抗体組成物は、当分野の技術者には既知の方法によって容易に調製される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
好ましい態様において、抗酸化剤は細胞に入り、そして活性酸素種と反応し、それによって、細胞中の活性酸素種濃度を減少させる。別の態様において、抗酸化剤は細胞に入るかまたは周囲の外部細胞環境中に存在し、活性酸素種から産生したオキシダントと反応する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
本発明の治療用組成物、本明細書中に記載の抗酸化剤、抗体(加工された抗体、および抗体活性を増進するために本明細書に記載のような付加的還元中心を含有する他の分子の両方を含む)を、投与製剤に適合する方法で、かつ治療上有効量で投与する。投与される量およびタイミングは、治療される対象、活性成分を利用する対象の全身的能力、および望まれる治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、各々個体について特異的である。しかし、種々のタイプの適用に関する適当な用量範囲は、投与経路に依存する。投与についての適当なレジメンは変えることが可能であるが、治療用処置の所望の結果を生じるように初回投与に続く間隔をおいての反復投与によって類型化される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
本発明における使用に対して意図された抗体、抗酸化剤または酸素スカベンジャーは、例えばリポソームのような組成物の形で、所望の結果を仲介するために目的の部位に送達でき、その製剤はリポソーム−介在送達に関する当分野の技術者には既知である。別の送達手段は、静脈的に、局所的に、経口的に、吸入によって、挿管によって、腹腔内に、筋肉内に、経皮的および皮下的に投与することを含むが、これに限定するものではない。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
生理学的に許容され得る担体は当分野では既知である。液体担体の例示は、活性成分および水、または緩衝溶液、例えば、生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水または両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水以外に他の物質を含まない滅菌水性溶液である。また、さらにまた、水性担体は、１つ以上の緩衝用塩ならびに例えば、ナトリウムおよびカリウムの塩化物のような塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有し得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
また、液体組成物は、水に加えて、または水以外に液体相を含有し得る。このような付加的な液体相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、水−油エマルジョンである。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
以下のＦ(ａｂ’)２フラグメントをPierceから得た：３１１２９(ウサギＩｇＧ)、３１１８７(ウサギＩｇＧ)、３１２１４(ヤギＩｇＧ)、３１１６５(ヤギＩｇＧ)、３１２０３(マウスＩｇＧ)。タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、トリプシン−キモトリプシン阻害剤(Bowman−Birk阻害剤)、β−ラクトグロブリンＡ、α−ラクトアルブミン、ミオグロビン、β−ガラクトシダーゼ、チキンエッグ・アルブミン、アプロチニン、トリプシノゲン、レクチン(ピーナッツ)、レクチン(Jacalin)、ＢＳＡ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼをSigmaから得た。リボヌクレアーゼＩＡをAmersham Pharmaciaから得た。下記の免疫グロブリンをハイブリドーマ法により社内で作成した：ＯＢ２−３４Ｃ１２(マウスＩｇＧ１κ)、ＳＨＯ１−４１Ｇ９(マウスＩｇＧ１κ)、ＯＢ３−１４Ｆ１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＤＭＰ−１５Ｇ１２(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＡＤ１−１９Ｇ１(マウスＩｇＧ２ｂκ)、ＮＴＪ−９２Ｃ１２(マウスＩｇＧ１κ)、ＮＢＡ−５Ｇ９(マウスＩｇＧ１κ)、ＳＰＦ−１２Ｈ８(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＴＩＮ−６Ｃ１１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＰＲＸ−１Ｂ７(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＨＡ５−１９Ａ１１(マウスＩｇＧ２ａκ)、ＥＰ２−１９Ｇ２(マウスＩｇＧ１κ)、ＧＮＣ−９２Ｈ２(マウスＩｇＧ１κ)、ＷＤ１−６Ｇ６(マウスＩｇＧ１κ)、ＣＨ２−５Ｈ７(マウスＩｇＧ２ｂκ)、ＰＣＰ−２１Ｈ３(マウスＩｇＧ１κ)、ＴＭ１−８７Ｄ７(マウスＩｇＧ１κ)。ＤＲＢポリクローナル(ヒトＩｇＧ)およびＤＲＢ−ｂ１２(ヒトＩｇＧ)はDennis R. Burton(The Scripps Research Insutitute)から提供された。１Ｄ４Ｆａｂ(結晶)はIan A. Wilson(The Scripps Research Insutitute)から提供された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
過酸化水素についての定量アッセイ：タンパク質溶液のアリコート(２０μl)を取り、反応緩衝液(８０μl)を含有する９６−ウェルマイクロタイタープレート(Costar)のウェルに加えた。作業溶液(１００μl／４００μＭ Amplex Red試薬１／２単位／mlホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ)を加え、プレートを暗所で３０分間インキュベートした。ウェル成分の蛍光をCytoFluoru Multiwell Plate Reader(Series 4000, PerSeptive Biosystems, Framingham, MA; Ex/Em: 530/580nm)で測定した。過酸化水素濃度を標準曲線を使用して決定した。全ての実験をデュプリケートで行い、速度を少なくとも２回の測定の平均で表す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
さらに、ヒツジ抗体３１２４３を暗所３７ＥＣで１Ｏ２の化学供給源［３Ｎ,３Ｎ−(１,４−ナフチリデン)ジプロピオン酸のエンドペルオキシド］と共にインキュベートすると、過酸化水素が形成する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
可視光中で、ＨＰ(４０μＭ)でのウマＩｇＧによるＨ２Ｏ２の形成比率は、Ｄ２Ｏの存在で増加し、１Ｏ２抑制剤(quencher)ＮａＮ３(４０ｍＭ)で減少する(図５Ｂ)(Hasty, N., Merkel, P. B., Radilick, P. & Kearns, D. R. Tetrahedron Lett., 49−52 (1972))。Ｄ２ＯのＨ２Ｏでの置換は、その寿命の期間を通じて、約１０倍の増加を介して、１Ｏ２仲介プロセスを増強することが知られている(Merkel, P. B., Nillson, R. & Kearns, D. R., J. Am. Chem. Soc., 94, 1030−1031 (1972))。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
理想的な殺作用系が自己傷害を最小にしながら局所的に宿主分子を利用しなければならないとの拘束を考慮して、１Ｏ２以上の妥当な選択を考え得ない。すでにこのような活性分子を有しているので、抗体によるそのさらなる変換の利益が何であるかを問うことが重要である。重要な問題は、一過性一重項酸素分子(寿命４μｓ)のさらに安定なＯ２●−への変換により、それが産生できる過酸化水素およびすべての毒性産物に接近していることである。さらに、スーパーオキシドが、酸素除去カスケードの終了時に残存する唯一の分子酸素同等物である。したがって、この“リサイクリング”が殺微生物プロセスの強化のため主要なメカニズムとして働き得る。一重項分子酸素の他の利点は、この分子が、宿主が攻撃されたときに存在するのみであり、それによってこの分子を“事象誘発性”基質となし得ることである。また、補助系を用いて防御する別の方法があるため、免疫系のこの化学的アームは多くの状況で沈黙しているのであろう。しかし、抗体と一重項酸素がそれら自体並置的に存在し、それが細胞および組織の傷害をもたらす、多くの疾患状態があり得る。ヒトにおける様々な事象が一重項酸素の産生をもたらすことから、抗体によるその活性化は、自己免疫から再潅流傷害およびアテローム性動脈硬化症に至るまでの種々の疾患を起こし得る(Skepper et al., Microsc. Res. Tech., 42, 369−385 (1998))。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
amplex red アッセイがＨ２Ｏ２に加えてタンパク質−過酸化水素誘導体を検出したとの懸念は、この方法で測定された見かけのＨ２Ｏ２濃度が、照射されたタンパク質が(サイズ排除濾過により)サンプルから除去されるかどうかと無関係であることから、度外視される。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
抗体は、供給源または抗原特異性にかかわらず、一重項分子酸素(１Ｏ２)から過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)を産生し、それにより同分子中で認識および殺作用を調整する可能性がある(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。この発見の可能性ある化学的および生物学的意味を考慮して、この過程の抗体内での基本メカニズムおよび構造的位置を検討した。これらの組合せ試験は、他のタンパク質と異なり、抗体が水と一重項酸素との前例のないセットの化学反応を触媒できることを明らかにする。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
反応速度試験：長時間ＵＶ照射試験は、抗体介在Ｈ２Ｏ２産生が非免疫グロブリンタンパク質よりも非常に効率的であることを明らかにする(図８Ａ)。典型的に抗体はＨ２Ｏ２４０モル当量までのＨ２Ｏ２形成を直線的に示し、その後、速度は漸近的に低下し始める(図８Ｂ)。対照的に、非免疫グロブリンタンパク質はＨ２Ｏ２の“突発的(burst)”産生を示し、光酸化が起きるにつれてクエンチする(図８Ａ)。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
通常のタンパク質光−酸化は、１Ｏ２および他の酸素種(ＲＯＳ)、例えば、スーパーオキシドアニオン(Ｏ２●−)、ペルオキシルラジカル(ＨＯ２●)およびＨ２Ｏ２の産生をもたらすプロセスの複雑なカスケードである(Foote, Science, 162, 963 (1968))。現在のメカニズムについての考えは、タンパク質の光−酸化に対する感受性を５つまでのアミノ酸：トリプトファン(Ｔｒｐ)、チロシン(Ｔｙｒ)、システイン(およびシスチン)、メチオニン(Ｍｅｔ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ)と結びつける(Straight and Spikes, in Singlet O2, A.A. Frimer, Ed. (CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1985), vol IV 9, pp. 91−143; Michaeli and Feitelson, Photochem, Photobiol., 59, 284 (1994))。Ｔｒｐおよび分子酸素によるＨ２Ｏ２の光産生は、よく特徴解明されたプロセスであって、少なくとも部分的に、本質的にＨ２Ｏ２および３Ｏ２を不均化する、１Ｏ２からＯ２への形成および還元を含む(McMormick and TThompson, J. Am. Chem. Soc., 100, 312 (1978))。トリプトファンは、個々のアミノ酸としてもまたタンパク質の構成成分としても、近ＵＶ照射(３００−３７５nm)に好気性条件で特に感作性であり、それは、特に効果的な近ＵＶ(λmax３２０nm)光増感剤であるＮ,Ｎ−ホルミルキムレニン(ＮＦＫ)へのその変換による(Walrant and Santus, Photochem, Photobiol., 19, 411 (1974))。しかし、Ｔｒｐ光酸化は、近ＵＶの照射中Ｈ２Ｏ２の半化学量論的産生をともなっており(図１１Ａ)(McMormick and Thompson, J. Am. Chem. Soc., 100, 312 (1978))、Ｈ２Ｏ２光産生時での最も効果的な非免疫グロブリンであるβ−ガラクトシダーゼが、その３９Ｔｒｐ残基からわずか５.９モル当量のＨ２Ｏ２しか産生しない(図８Ａ)(Fowler and Zabin, J. Biol. Chem. 253, 5521 (1978))。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
１Ｏ２の化学ポテンシャルについて、さらに広く考慮した。抗体介在メカニズムにおける分子酸素のこのエネルギー形態の関与は、以前の報告から明確に推論された(Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 10930 (2000))。簡単に、Ｈ２Ｏ２光産生の抗体介在速度はＤ２Ｏ中で増加し、１Ｏ２減少剤であるアジ化ナトリウムの存在下で減少する。さらに、可視光中でヘマトポリフィリンIXおよび暗所での３Ｎ,３Ｎ−(１,４−ナフチリデン)ジプロピオン酸ジナトリウム(化学１Ｏ２源)のエンドペルオキシドでの３Ｏ２の増感により、抗体がＨ２Ｏ２を産生することが示されている。１Ｏ２の関与はまた、抗体介在Ｈ２Ｏ２産生の作用スペクトルおよび抗体成分トリプトファンの吸収スペクトルに非常に類似している(図１０)。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
これらの実験によって、酸素の存在下の抗体のＵＶ照射が水からＨ２Ｏ２への酸素取り込みをもたらすことが明らかになった(図１２Ａおよび１２Ｂ)。Ｈ２１８Ｏ(９８％１８Ｏ)ホスフィン緩衝液(ＰＢ)溶液において飽和１６Ｏ２濃度条件下でのヒツジポリＩｇＧの照射後に、ホスフィン酸化物のＭＳ中に観測される１６Ｏ／１８Ｏ比の相対発生量は、２.２±０.１：１である。Ｈ２１６ＯＰＢ中の１８Ｏに富む分子酸素混合物(９０％１８Ｏ)での逆の実験を行うとき、逆の比(１：２.０±０.２)が観測される(図１２Ｂ)。比率についてのこれらの値は、優れた再現性(＋１０％、ｎ＝１０)を示し、試験したすべての抗体について見られる。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
テルリウム仲介酸化還元プロセスによる１Ｏ２および水の過酸化水素への遷移金属触媒変換についての最近の報告(Detty and Gibson, J. Am. Chem. Soc., 112, 4086 (1990))が、１Ｏ２およびＨ２ＯがＨ２Ｏ２へ変換され得るプロセス、および本プロセスのエネルギー需要が克服され得ることについて実験的証拠を提供する。抗体介在光酸化プロセスについてのメカニズムが１Ｏ２分子への水分子の添加を含み、Ｈ２Ｏ２への経路において最初の中間体として三酸化二水素を形成すると考えられる。触媒としての抗体の機能は、その可逆的形成についての不安定な(critical)中間体を安定にし、かつ、または、そのＨ２Ｏ２への変換をチャネリングして中間体の消費を促進する特異的な分子環境の供給でなければならない。このような環境の基本的な特徴は、抗体特異的周辺により条件付けられる活性部位での組織された水分子の特異的な集合体からなる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
水と１Ｏ２がＨ２Ｏ３をもたらす直接反応は、７０kcal／molの活性化バリアーで全く不利である(式２ａ)。しかし、第２または第３の水分子の付加で、各々３１.５および１５.５kcal／molまで活性化バリアーを減少する共鳴のプロセスを認める。実際、これらの付加的な水が触媒の役割を演じる(式２ｂにおいて、第２の水のＨが産物ＨＯＯＯＨに行き、第１の水のＨがそれに代わるのと同時である)。これらのバリアーは、水の第１のＨＯ結合エネルギー(１１９kcal／mol)および１Ｏ２の結合エネルギー(９６kcal／mol)に比べると小さい。注意すべきは、式２ｂおよび２ｃでの逆反応がそれぞれ１５.５または０kcal／molのバリアーしか持たず、Ｈ２Ｏ３が大量の水または水に富む系において安定でないことを示唆する。このように、Ｈ２Ｏ３を産生し、利用するために抗体構造中の最良な部位が、このような水のない疎水性領域に近接の局在化した水および水二量体の存在する部位であると考えられる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
このように、キセノン実験は、分子酸素にアクセス可能であり、かつ不変のＴｒｐに近接の保存領域(ＶＬ)中にある少なくとも１つの部位を同定した；等価の保存部位もＶＨの折りたたみで可能である。Ｘｅｌ部位周辺の構造および配列は、ＶＨドメインにおいて、ＶＬをＶＨに結びつける疑似的２−折りたたみ(立体構造)回転軸により正確に再製される。キセノン結合部位がこのドメインに位置していなかったが、分子酸素はＶＨ中の対応空洞になお到達し得ると考えられる。結晶が完全な平衡状態を形成するのに不十分な時間である２分間しか加圧しなかったこと、または単に、キセノンがＶＨ側鎖上の対応する空洞について酸素に比較して大きすぎるため、または結晶パッキングのために、提案された重鎖キセノン部位を見つけ得なかった。他の抗体実験において、Ｘｅ結合部位は、結晶パッキングが結晶中のＸｅアクセスを調節できることを示唆する不斉単位の２つの分子のうち１つのみで発見された。これらの部位の周りの配列および構造についての分析は、抗体およびＴＣＲの両方で高度に保存されていることを示し、したがって、なぜ抗体およびＴＣＲにおけるＩｇの折りたたみがこの通常でない化学反応に関与できるのかについて可能な理解を提供する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
抗体は、タンパク質の中で、１Ｏ２をＨ２Ｏ２に触媒的に変換する能力において独特である。このプロセスがＨ２Ｏ２の事象関連産生による殺害に参加すると考えられる。あるいは、抗体は１Ｏ２から生体を防御する機能を満たすことができる。これは、カタラーゼによる過酸化水素の水と三重項酸素へのさらなるプロセッシングを必要としよう。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
【表３】
2006506419.tif 000001
ａ  酸化は、記載の条件下、室温で各々オキシダントをインディゴカルミン１(１mM)のリン酸緩衝液(ＰＢ、ｐＨ７.４)に添加する前後のマイクロタイタープレートリーダーでの、６１０nmでの吸光度変化にしたがい決定した。
ｂ １８Ｏ取り込みは、各オキシダントについて記載の条件下、インディゴカルミン１のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.４)溶液中、Ｈ２ １８Ｏ(＞９５％標識)での酸化、および、陰イオン電子噴霧質量分析による環状α−ケトアミド２の同位体プロフィールのモニタリングにより決定した。アッセイ条件下、α−ケトアミド２のアミドカルボニル中に設置された標識は、水と置換しなかった。
ｃ  インディゴカルミン(１、１mM)をオゾン(〜６００μＭ)のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.０)溶液に添加した。
ｄ １Ｏ２＊の効果は、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)溶液および１(１mM)のＰＢ溶液の、可視光(２.７mW／cm−２)で１時間の照射により試験した。
ｅ  引用文献４２参照。
ｆ  カリウムスーパーオキシド(１０mM)のＤＭＳＯ溶液を、１のＰＢ(１００mM、ｐＨ７.０)溶液に添加し、最終有機共溶媒が５％となるようにした。
ｇ  最終濃度ＰＢ中２mM。
ｈ  測定していない。
ｉ  インディゴカルミン(１、１mM)をＮａＯＣｌ(２０mM)のＰＢＳ(ｐＨ７.４)に添加し、環状α−ケトアミド２の形成を、溶液の退色が完了した後、ＨＰＬＣにより測定した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
インディゴカルミン１のＣ＝Ｃ二重結合の酸化的開裂は、オゾン検出に感受性のプローブである。Takeuchi et al., Anal. Chem. 61, 619(1989); Takeuchi et al., Anal. Chim. Acta. 230, 183(1990)。しかしながら、このような開裂はオゾンに特異的ではない。表２に列記したオキシダントでのさらなる実験を、これらのオキシダントがまたインディゴカルミン１を酸化できるか否か試験するための特異的条件下で行った。このような実験は、一重項酸素(１Ｏ２)がインディゴカルミン１の溶液を退色し、酸化的二重結合開裂により環状α−ケトアミド２を形成することを確認した。１Ｏ２＊は、ｕ.ｖ.照射すると抗体により産生される。Wentworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10930(2000); Wentworth et al., Science 293, 1806(2001)。１Ｏ２＊によるインディゴカルミン１の環状α−ケトアミド２への酸化的開裂とＯ３によるものの間の分析的差異を試験した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
結果
ネズミチフス菌−特異的マウスモノクローナル抗体の一団を産生し、殺菌活性について試験した。試験した各抗体は殺菌性であり、抗体が５μＭより多い濃度で存在している限り、ヘマトポルフィリンIX溶液(１２０μＭ)の存在下で１時間照射後、ネズミチフス菌を５０％以上殺菌した(図２１)。抗体−濃度試験は、殺菌活性の最大効果が、約２０μＭ抗体で達成されることを明らかにした。例えば、９５％より多い細菌細胞の殺菌が、２０μＭ  ６Ｂ５で達成された(図２１参照)。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
コントロールは、コールド・ショックおよびヘマトポルフィリンIX毒性が、コロニー形成単位(ＣＦＵ)の見かけの損失に関係しないことを示唆した。さらに、共焦点顕微鏡は、抗体介在細菌細胞凝集も、抗体処置グループにおけるＣＦＵの損失に寄与しないことを明らかにした。細菌細胞の蛍光分析は、ヘマトポルフィリンIX−処理大腸菌細胞における膜結合増感剤の量が、抗体結合により増加しないことを示唆した。抗体の殺菌作用は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、２０μＭ)が本アッセイシステムで殺菌性を示さないため、単なる非特異的タンパク質効果ではない。最後に、ＥＤＴＡ(２mM)の存在は、用いたアッセイ系では細菌の生存に影響しなかった。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７７】
【図１】図１は、食細胞の酸素依存的殺菌作用を図解する。１Ｏ２とＯ２●−の相互変換が示されている。
【図２】図２は、amplex red assayが関与する化学変換段階を図説する。抗体(このスキームではＩｇＧとして記載)は１Ｏ２をＯ２●−に変換し、これは過酸化水素から自発的に発生し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素がamplex red基質を脱アセチル化および酸化し、それにより５８７nmの蛍光を発する分子を産生する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
【図１２】図１２は、基質トリスカルボキシエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)と、１６Ｏ含有Ｈ２Ｏ２または１８Ｏ含有Ｈ２Ｏ２のいずれかによる酸化を説明するマススペクトルを提供する。ＥＳＩ(陰極性)マススペクトルを、Ｈ２Ｏ２での酸化後、ＴＣＥＰ[(Ｍ−Ｈ)−２４９]およびそのオキシド[(Ｍ−Ｈ)−２６５(１６Ｏ)および(Ｍ−Ｈ)−２６７(１８Ｏ)]として取った。図１２Ａは、Ｈ２１８Ｏ(９８％１８Ｏ)ＰＢ中、１６Ｏ２好気条件でヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７／μＭ)で照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを説明する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に小さなピーク)の混合物を作る。図１２Ｂは、Ｈ２１６Ｏ  ＰＢ中、富化された１８Ｏ２(９０％１８Ｏ)好気条件下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に小さいピーク)および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６７に大きなピーク)の混合物を作る。図１２Ｃは、Ｈ２１６Ｏ  ＰＢ中の１６Ｏ２好気濃度下行ったポリ−ＩｇＧの照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。アッセイ条件および方法は、Ｈ２１６ＯをＨ２１８Ｏに変えた以外、方法および材料(実施例II)と同じである。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。図１２Ｄは、嫌気(脱気およびアルゴン下)条件下、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢで８時間、２０ＥＣ下のヒツジポリ−ＩｇＧ(６.７μＭ)およびＨ２１６Ｏ２(２００μＭ)照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。ＴＣＥＰの添加は、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。図１２Ｅは、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢ中の１６Ｏ２好気条件下の３−メチルインドール(５００μＭ)の照射後のＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、３−メチル−インドールが小さすぎる分子量であるため、サイズ排除濾過を行わなかった以外、方法および材料(実施例II)に記載の通りであった。したがって、ＴＣＥＰを３−メチル−インドール含有ＰＢ溶液に添加した。図１２Ｆは、Ｈ２１８Ｏ  ＰＢ中１６Ｏ２好気条件下のβ−ｇａｌ(５０μＭ)の照射後の、ＴＣＥＰおよびそのオキシドのマススペクトルを提供する。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ(２６５に大きなピーク)のみが観察される。アッセイ条件および方法は、方法および材料(実施例II)に記載の通りである。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
【図１３】図１３は、材料および方法(実施例II)に記載の抗体４Ｃ６におけるＸｅ結合部位を示す。図１３Ａは、カラー写真で軽鎖がピンク色であり、重鎖が青色であるＦａｂ  ４Ｃ６のＣαトレースの標準側面図を示す。３つの結合したキセノン原子(カラー写真で緑色)を、５σで合わせた最初のＦｏ−Ｆｃ電子密度マップと共に示す。図１３Ｂは、保存キセノン部位１の周りのＦａｂ  ４Ｃ６および２Ｃ  αβ  ＴＣＲ(ＰＤＢ／ＴＣＲ)の重層を提供する。ＶＬ主鎖Ｃαトレース(カラー写真でピンク色)および側鎖(カラー写真で黄色)ならびに対応する２Ｃ  αβ  ＴＣＲのＶα(カラー写真で赤色および金色)を重ねる(図はInsight2000を使用して作った)。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８９】
【図１４】図１４は抗体による細菌の殺菌を示す。図１４Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ株の、異なる実験条件下での生存を示す棒グラフを提供する。生存は回復したコロニー形成単位(ＣＦＵ)として、実験開始時(ｔ＝０分)のＣＦＵの割合として報告する。黒色棒および薄灰色棒は、薄灰色グループ(２、４、６、８、１０および１２)が可視光(２.７mWcm−２)に６０分暴露され、黒色グループ(１、３、５、７、９および１１)が暗所に６０分置かれた以外、同じ実験条件に対応する。細菌細胞密度は約１０７細胞／mLであった。報告した各データ点は、大腸菌ＸＬ１−ブルー(グループ１−６)およびＯ１１２ａ,ｃ(グループ７−１２)の、以下の条件下の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.(ｎ＝６)である。グループ１−２  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ３−４  ＨＰＩＸ(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ５−６  ＸＬ１−ブルー−特異的モノクローナル抗体(２５Ｄ１１、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＸＬ１−ブルー細胞。グループ７−８  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ細胞。グループ９−１０  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＨＰＩＸ(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。グループ１１−１２  ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃のＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体(１５４０４、２０μＭ)、ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。図１４Ｂは、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの生存における抗体濃度の効果を説明する。用いた抗体はＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体、１５４０４であった。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する１５４０４抗体の濃度(ＥＣ５０)は８１±６nMであった。図１４Ｃは大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体１２Ｂ２の殺菌作用における照射時間の効果をグラフ的に説明する。グラフは照射時間(２.７mWcm−２)対ヘマトポルフィリンIX(４０μＭ)および１２Ｂ２(２０μＭ)存在下の大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存を提供する。報告する各データ点は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍ(ｎ＝３)である。５０％の細胞を殺すのに対応する照射時間は３０±２分であった。図１４Ｄは、抗体誘発殺菌作用のヘマトポルフィリンIX濃度依存性を説明する。用いた抗体は大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体２５Ｄ１１であった。グラフは、大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存対暴露したヘマトポルフィリンIX濃度を提供する。以下の条件を用いた：ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分のＸＬ１−ブルー細胞(＞)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃で白色光(２.７mWcm−２)下のＸＬ１−ブルー細胞(△)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、暗所、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◆)。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中、４℃、白色光(２.７mWcm−２)下、６０分の２５Ｄ１１(２０μＭ)、ＸＬ１−ブルー細胞(◇)。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
【図１８】図１８は、カタラーゼの存在下および非存在下の抗体のＰＢＳ(ｐＨ７.４)溶液のＵＶ照射(３１２nm、０.８mWcm−２)中のインディゴカルミン１(１mM)からイサチンスルホン酸２への光産生の進行を説明する。Steinbeck et al., J. Biol. Chem. 267, 13425(1992)。各点は、少なくともデュプリケートの測定の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として示す。線形回帰分析をGraphpad Prism v.3.0ソフトウェアで行う。イサチンスルホン酸２の形成速度(ν)は以下の条件下で観察した：ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)(●)ν＝３４.８±１.８nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)(□)ν＝４０.５±１.５nm／分；ヒツジポリクローナルＩｇＧ(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(△)ν＝３３.５±２.３nM／分；マウスモノクローナル抗体３３Ｆ１２(２０μＭ)および可溶性カタラーゼ(１３mU／mL)(▽)ν＝４１.８±１.２nM／分。