【手続補正書】
【提出日】平成18年1月26日(2006.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つ核酸と陽イオン形で用いられる下記式（I）の４官能基コポリマーの少なくとも１つの有機塩または鉱物塩を組み合わせることを特徴とする医薬組成物：
【化１】
2005522433.tif 000001
式中、xおよびｙはそれぞれ別個に１から500の間の整数を表し、ｘは前記分子が少なくとも30質量％のエチレンオキシドユニットを含む値を有する。
【請求項２】
前記組成物がまた少なくとも１つの塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記塩が塩化カルシウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記塩が塩化カリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記塩が塩化リチウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記塩がチオシアン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物がタイロード液、すなわち140ｍMのNaCl、6ｍMのKCｌ、3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、10ｍMのHepes（pH7.4）および10ｍMのグルコースとともにフォーミュレートされることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
一般式（I）の化合物が85質量％を越えないエチレンオキシドユニットを有することを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
一般式（I）の化合物が約35から50質量％のエチレンオキシドユニットを有することを特徴とする請求項１から10のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
一般式（I）の化合物が、少なくとも800g/molの分子量を有することを特徴とする請求項１から11のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
EO/PO比が0.5から1.5のユニット比を有する請求項１から12のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記分子が、EO/PO比15：16については分子量1650g/mol、EO/PO比50：56については分子量5500g/mol、およびEO/PO比61：68については分子量6700g/molを有する分子から選択されることを特徴とする請求項１から13のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
一般式（I）の化合物が、0.005から15質量/容積％の割合で存在することを特徴とする請求項１から14のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
一般式（I）の化合物がまた、少なくとも１つの細胞内または細胞外ターゲテッィングユニットを含むことを特徴とする請求項１から15のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸が化学的に改変されることを特徴とする請求項１から18のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸がアンチセンスであることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記核酸が干渉RNAであることを特徴とする請求項１から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸が治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項１から21のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物がまたターゲッティング成分を組み合わせることを特徴とする請求項1から22のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸および300mMのNaClを含有する溶液並びに４官能基コポリマーを含有する２倍より高く濃縮した水溶液を容積対容積で混合することによって調製される請求項1から23のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記核酸および２倍濃縮タイロード液を含有する溶液並びに４官能基コポリマーを含有する２倍より高く濃縮した水溶液を容積対容積で混合することによって調製される請求項1から23のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの核酸のin vivo細胞伝達を提供することを意図する組成物の調製を目的とする請求項１から25のいずれかに記載の一般式（I）の化合物の使用。
【請求項２７】
前記in vivo伝達が筋肉細胞への伝達である請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記in vivo伝達が心臓細胞への伝達である請求項26に記載の使用。
【請求項２９】
式（I）の化合物が、タイロード液、すなわち140ｍMのNaCl、6ｍMのKCｌ、3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、10ｍMのHepes（pH7.4）および10ｍMのグルコースとともにフォーミュレートされたポロキサミン304であることを特徴とする請求項28に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明の目的は、固有の化学分子であってそれらと組み合わせたDNAのトランスフェクション効率を顕著に増大させる前記化学分子の使用を正確に述べることである。
より正確には、本発明は医薬組成物に関し、前記組成物は、少なくとも１つの核酸と下記式（I）の４官能基コポリマー、またはその有機もしくは鉱物塩もしくは誘導体の１つを組み合わせる（combine）ことを特徴とする：
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
式中、xおよびｙはそれぞれ別個に１から500の間の整数を表し、ｘは前記分子が少なくとも30質量％のエチレンオキシドを含む値を有し、さらに式（I）の化合物は好ましくは陽イオン形で用いられる。
上記の分子（特定のポロキサミンである）は、疎水性セグメント（指数yをもつプロピレンオキシド）、親水性セグメント（指数ｘをもつエチレンオキシド）および陽性荷電をもつ中心のエチレンジアミン成分（NCH2-CH2N）から成る。
本発明者らは、これらのポロキサミン（そのときまで非イオン性ポリマーとして提示されていた（WO00/47186））は実際に陽イオン形を採ることができることをより具体的に示した。
それどころか驚くべきことに、中心のエチレンジアミン成分上にこれら陽性荷電が出現することによって細胞の伝達効率は全く阻害されない。実際のところ、陽イオン性脂質、タンパク質および陽イオン性ペプチド型の陽イオン化学分子は、裸出DNAに関して筋肉組織内の遺伝子伝達を改善しない（M.M. Lluis et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:4262-4267）。
本発明のある特徴は、したがって、少なくとも１つの核酸と、下記式（I）の４官能基コポリマーの少なくとも１つの有機もしくは鉱物塩を組み合わせることを特徴とする医薬組成物である： 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
したがって、一般式（I）の化合物は、好ましくはその塩のうちの１つの形態、より好ましくは陽イオン形で用いられる。前記を実施するために、本発明の組成物は前記化合物と好ましくは鉱物塩、より好ましくはアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を組み合わせる。前記は、特に塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化リチウムおよびチオシアン酸ナトリウム、より好ましくは塩化カルシウム（CaCl2）または塩化マグネシウム（MgCl2）から選択することができる。
前記塩は等張、低張または高張量で導入することができる。
本発明者らはまた、式（I）のコポリマーがその陽イオン形として存在していることを担保するために、前記処方物のpHおよび／またはイオン組成を管理することが有利であることを明らかにした。
pH6.5から８、好ましくは７から7.8、より好ましくは7.4が特に有利であることが判明した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
実施例１
一般式（I）の化合物の存在下における筋肉内へのin vivo遺伝子伝達
＊サンプル調製：
被検生成物の各々について最適化した２つの濃度を考えた。
各試験で、２つの異なる濃度の式（I）の被検化合物と組み合わせた50μLのNaCl（150mM）中の15μgのDNAを用いた。
被検濃度は、それぞれ化合物904については0.01％および0.1％、化合物704については0.25％および0.5％、さらに化合物304については５％および10％である。
コントロールDNAサンプルは一般式（I）の化合物の非存在下でフォーミュレートされる。
前記のようにフォーミュレートした各サンプルを７週齢のスイスマウスの前肢脛側部に注入する。７日後に、前記マウスを殺し、注入を実施した前肢脛側部を切断し、続いて溶解緩衝液中でプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics）の存在下ですりつぶす。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay Sysytem（登録商標））アッセイキット（Promega, Charbonnieres, France）を用い、ルミノメトリー（ベクター２（Perkin Elmer, Les Ulis, France））により上清でアッセイする。
図１は得られた結果を示している。
一般式（I）の化合物の存在は、ルシフェラーゼ活性の発現を10から15の範囲の倍率で顕著に改善できることが観察される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
実施例５
凍結電子顕微鏡法によって可視化したフォーミュレーション媒体の関数としてのポロキサミン／DNA粒子の形態
ポロキサミン904／DNA粒子をNaCl（150mM）またはタイロード液（3mMのCaCl2、2mMのMgCl2、6mMのKCｌ、140mMのNaCl、10mMのグルコースおよび10ｍMのHepes（pH7.4）を含む媒体）のいずれかとともにフォーミュレートした。
例えば、タイロード液中のポロキサミン904のゼータ電位の測定は＋9.5mVの値を示し、これは、前記がタイロード液の存在下でDNAと組み合わせるときポロキサミンの陽イオンを使用することを示している。
続いて粒子の形態を凍結電子顕微鏡法によって可視化した。図5は前記可視化を示している。
NaCl（150mM）でフォーミュレートされたとき、DNA分子はポロキサミン904の存在下で互いに凝集して極めて“ルーズな”大きい構造物を形成し、一方、タイロード液でフォーミュレートされたときは、DNA分子はポロキサミン904との小さな球状粒子を形成する（図5C、DおよびE）。同じことが、ポロキサミン304で観察することができる。
したがって、媒体のpHおよびイオン組成を制御することによって、特にCaCl2の存在によって、小さな球状粒子が生成され、前記はおそらく組織内での拡散能力が高まっているであろう。