【手続補正書】
【提出日】平成18年11月10日(2006.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
図１７Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーに対する抗体の殺菌作用に対するカタラーゼの影響を明らかにしている［実験開始時点（ｔ＝０分）での回復したコロニー形成単位（ＣＦＵ）のパーセントとして、採取されたＣＦＵとして記録されている］。カタラーゼは、Ｈ２Ｏ２を水（Ｈ２Ｏ）および酸素分子（Ｏ２）に変換する。各グループを、４℃で６０分間白色光（２.７ｍＷｃｍ）により照射した。細菌細胞密度は〜１０−７細胞／ｍＬであった。実験グループ（１〜７）を以下の要領で処理した：グループ１は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞およびヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）。グループ２は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および非特異的マウスモノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）。グループ３は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）およびモノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）。グループ４は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、モノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）およびカタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）。グループ５は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）。グループ６は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）。グループ７は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）およびカタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）。各点は、多重実験の平均値±ＳＥＭとして記録されている（ｎ＝６）。記号＊＊は、同じ時点での対照に対する＜０.０１のｐ値を示す。殺菌活性は、暗所対照のいずれからも観察されなかった（データは示さず）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
図２０Ａは、３７℃でＰＢＳ（ｐＨ７.４）中のホルボールミリスチン酸（１μｇ／ｍＬ）で活性化されたヒト好中球（ＰＭＮ、１.５×１０７細胞／ｍＬ）によるインジゴカルミン１（３０μＭ）の酸化（＞）および２の形成（□）の時間経過を示す。インジゴカルミン１の酸化は、活性化されていないＰＭＮでは全く起こらなかった（データは示さず）。前記要領で好中球を調製した。次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）は、好中球により生成されることが知られているオキシダントである。我々の実験では、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中のＮａＯＣｌ（２ｍＭ）は、１（１００μＭ）を酸化するが、１の二重結合を開裂してイサチンスルホン酸２を生じさせることはない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本明細書で使用されている「活性酸素種」の語は、抗体により生成される酸素種を意味する。いくつかの態様によっては、例えば好中球が抗体をそれらの表面上に有することから、活性酸素種が「好中球により生成」される場合もある。これらの活性酸素種は、１個またはそれ以上の不対電子を有し得るか、またはそれらは容易に他の分子と反応するため、他の点で反応性である。かかる活性酸素種は、スーパーオキシドフリーラジカル、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、オゾンおよびオゾンと同じ化学特性を有する他の短命の三酸素（オゾン）付加物を包含するが、これらに限定されるわけではない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
（４）Ｆｖ、２本の鎖として発現された軽鎖の可変域および重鎖の可変域を含む人工フラグメントとして定義される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
（５）１本鎖抗体（「ｓＦｖ」）、遺伝子融合１本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変域、重鎖の可変域を含む人工分子として定義される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
免疫学的および炎症応答
免疫学的および炎症応答の誘因は、一般的に感染性かまたは非感染性のいずれかとして類別される。主に感染および病気と闘うヒト免疫系の細胞は、血液を通して循環している白血球である。白血球は、好中球、血小板、赤血球、リンパ球および他の白血球を生成する骨髄により生成される。全白血球の約５０〜６５パーセントは「好中球」である。造血系が正しく機能しているときには、血小板および好中球は、寿命の長いリンパ球および赤血球とは異なり、急速に増殖し、高速で代謝される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
本発明はまた、付加的還元中心を含むように改変された加工された抗体を含む加工された分子の使用に関するものであり、一重項酸素からの活性酸素種の生成が望まれる場合に、その存在により生成能力が付加される。活性酸素種の産生促進が要望されるときには、２個の保存トリプトファン残基を有する天然抗体と比べて２個を越える還元中心を有する人工分子の使用が正当化される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
１つの態様において、本発明は、微生物増殖の阻害方法であって、一重項酸素からかかる活性酸素種を生成させ得る抗体を含む組成物を微生物と接触させる方法に関するものである。この方法は、非特異的または免疫特異的（抗原結合）な、完全またはフラグメント抗体を用いると有効である。かかる抗体フラグメントとしては、１本鎖抗体ならびに人工分子および本明細書記載の抗体が包含される。しかしながら、微生物に対する局在活性が所望されるとき、抗体は、微生物に随伴する抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、微生物表面上の抗原と選択的に結合し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
本発明の治療組成物である、人工および抗体活性を高めるための本明細書記載の付加的還元中心を含む他分子の両方を含む抗体は、投薬処方物と適合し得る方法で、そして治療有効量で投与される。投与すべき量およびタイミングは、処置される対象、対象の有効成分利用系の受容力、および所望される治療効果の程度により異なる。投与されるのに要求される有効成分の正確な量は、担当医の判断に左右され、各個体独特のものである。しかしながら、様々な適用タイプについての適当な用量範囲は、投与経路により異なる。投与に適切な摂取法も変化し得るが、治療処置の所望の成果を得るために初回投与、それに続いて間隔をあけた反復投与を典型的な特徴としている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
大腸菌(E.coli)ＸＬ−１ブルーに特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ
第０日目、１２９Ｇｉｘ＋マウス（６〜８週、１群当たり４匹）に、５０μｌのリン酸緩衝食塩水、ＰＢＳｐＨ７.４を含む１５０μｌの容量中、加熱殺菌した（６５℃、１５分）化学的感応性大腸菌ＸＬ−１（ＯＤ６００＝１）の腹腔内注射をした。第１４日目、マウスに一回目と同じ方法で二回目の注射をした。第２８日目、マウスに一回目および二回目の注射と同じ方法で三回目の注射をした。第３５日目、マウスから眼内穿刺により採血した。
標準プロトコールを用いて、ＸＬ−１ブルーに特異的な１２のモノクローナル抗体を調製した。抗体調製物を硫酸アンモニウム沈澱により精製し、次いでプロテインＧカラム（アマシャム・ガンマ−バインドＧ、１０ｍｇタンパク質／ｍｌビーズ）へローディングして精製した。結合抗体を３カラム容量のＰＢＳ、ｐＨ７.４で洗浄し、次いで２カラム容量の酢酸（０.１Ｍ、ｐＨ３.０）により溶出した。溶出ピークをトリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９.０）で中和し（４ｍｌ画分中０.５ｍｌ）、次いでＰＢＳへ透析した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
【図１】図１は、食細胞の酸素依存的殺菌作用を示す。１Ｏ２およびＯ２・−の相互変換が示されている。この活性はまた、抗体に固有の能力である。
【図２】図２は、アンプレックス・レッド検定方法に関与する化学変換段階を示す。抗体（この概略図においてＩｇＧとして特定される）は、１Ｏ２をＯ２・−に変換し、これは、過酸化水素を自発的に形成できる。西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下において、過酸化水素は、アンプレックス・レッド基質を脱アセチル化および酸化することにより、５８７ｎｍでの蛍光を放射する分子を生成する。
【図３】図３は、マウスモノクローナルＩｇＧ ＥＰ２−１９Ｇ２（２０μＭ）の存在下（□）または非存在下（△）でのＰＢＳ（ｐＨ７.４）におけるＨ２Ｏ２生成の初期時間経過を示す。エラー・バーは、平均からのデータの範囲を示す。
【図４】図４は、ＵＶ照射およびアンプレックス・レッド試薬によるＨ２Ｏ２検出の後におけるマウス抗体１Ｄ４ Ｆａｂフラグメントの単結晶の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、活性酸素種の抗体を介する触媒についての時間推移および必要とされる反応条件を示す。図５Ａは、３１１２７抗体（ウマＩｇＧ、２０μＭ）の存在下（Ｏ）または非存在下（◆）における、ヘマトポルフィリン（４０μＭ）および可視光線によるＰＢＳ（ｐＨ７.４）中でのＨ２Ｏ２形成の時間推移を示す。図５Ｂは、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中に他に何も添加しない場合（□）、またはＮａＮ３をＰＢＳ（ｐＨ７.４）（Ｏ、１００μＭ）中にもしくはＰＢＳのＤ２Ｏ溶液（ｐＨ７.４）（◇）中に含む場合（◇）の、３１１２７抗体（ウマＩｇＧ、６.７μＭ）の存在下におけるヘマトポルフィリン（４０μＭ）および可視光線によるＨ２Ｏ２生成の初期時間推移を示す。図５Ｃは、Ｈ２Ｏ２形成速度に対する抗体タンパク質濃度（３１１２７、ウマＩｇＧ）の影響を示す。図５Ｄは、３１１２７抗体（ウマＩｇＧ、６.７μＭ）によるＨ２Ｏ２生成速度に対する酸素濃度の影響を示す。測定値は全て、少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラー・バーは、平均値からの実験測定値の範囲である。
【図６】図６は、タンパク質の集団について測定されたＨ２Ｏ２形成の初期速度および抗体との比較（表１からのデータ）を示す棒グラフである。測定値は全て、少なくともデュプリケートの実験測定の平均値である。エラー・バーは、平均値からの実験測定値の範囲である。ＯＶＡ、鶏卵オボアルブミン；ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ。
【図７】図７Ａは、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中におけるウマＩｇＧ（６.７μＭ）のＵＶ照射によるＨ２Ｏ２形成速度を示す。図７Ｂは、Ｈ２Ｏ２形成と同時に測定した、ウマＩｇＧの３２６ｎｍ（励起＝２８０ｎｍ）での蛍光放射を示す。
【図８】図８は、様々な条件下における抗体によるＨ２Ｏ２生成を示す。図８Ａは、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンタンパク質によるＨ２Ｏ２生成を示す。２０ＥＣでの好気的環境条件下にて、トランスイルミネーター（フィッシャー・バイオテック）の密封バイアルに入れたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）［１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７.４）］中における個々の抗体／タンパク質試料（１００μＬ、６.７μＭ）の近ＵＶ（３１２ｎｍ、８００μＷｃｍ−２）照射により検定を実施した。検定の間中、定期的間隔でアリコート（１０μＬ）を除去した。アンプレックス・レッド法によりＨ２Ｏ２濃度を測定した。各データ点を、少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして記録する：●ポリクローナル（ポリ）免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ、ヒト；Ｏポリ−ＩｇＧ、ウマ；□ポリ−ＩｇＧ、ヒツジ；▽モノクローナル（ｍ）ＩｇＧ（ＷＤ１−６Ｇ６）、マウス；△ポリ−ＩｇＭ、ヒト；◇ｍＩｇＧ（９２Ｈ２）、マウス；■β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）；▲鶏オボアルブミン（ＯＶＡ）；▼α−ラクトアルブミン（α−ｌａｃｔ）；◆ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。図８Ｂは、ヒツジポリ−ＩｇＧ（６.７μＭ、２００μＬ）によるＨ２Ｏ２の長期生産を示す。９６ウェル石英板の密封ウェルにおいてＰＢＳ中８時間近ＵＶ照射する。図８Ａ記載の要領でＨ２Ｏ２濃度を測定した。図８Ｃは、時間経過に伴うＨ２Ｏ２の抗体触媒生産に対するカタラーゼの影響を示す。マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ−２１Ｈ３（ＩｇＧ）の溶液（６.７μＭ、２００μＬ）を、９６ウェル石英板の密封ウェルにおいてＰＢＳ中で５１０分間照射した。アンプレックス・レッド法によりＨ２Ｏ２濃度を測定し、次いでオイパーギット（Eupergit）Ｃに固定化したカタラーゼ（１０ｍｇ、２８８ｍＵ）の添加により破壊した。カタラーゼを濾過により除去し、抗体溶液を４２０分間再照射した。速度（０〜５１０分）＝０.３６８μＭ分−１（ｒ２＝０.９９８）；速度（５１１〜９３０分）＝０.３９８μＭ分−１（ｒ２＝０.９８７）。図８Ｄは、ウマポリ−ＩｇＧ抗体による触媒の最大速度パーセントにおけるＨ２Ｏ２濃度の影響を示す。かかるグラフにより、ウマポリ−ＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光生成に対するＨ２Ｏ２のＩＣ５０が測定され得る。ウマ−ＩｇＧの溶液（６.７μＭ）を様々の濃度のＨ２Ｏ２（０〜４５０μＭ）とインキュベーションし、図８Ａ記載の要領でＨ２Ｏ２形成の初期速度を測定した。グラフは、Ｈ２Ｏ２形成速度対Ｈ２Ｏ２濃度のプロットであり、２２５μＭのＩＣ５０を表す。図８Ｅは、Ｈ２Ｏ２によるＨ２Ｏ２の抗体光生成の長期阻害およびＨ２Ｏ２除去後における活性の完全な再確立を示す。この検定法では、Ｈ２Ｏ２（４５０μＭ）の存在下における３６０分間のウマポリ−ＩｇＧ（ＰＢＳ、ｐＨ７.４中６.７ｍＭ）の初期ＵＶ照射を伴う。次いで、Ｈ２Ｏ２をカタラーゼ（オイパーギットＣに固定化）により除去し、ポリ−ＩｇＧ試料をさらに４８０分間ＵＶ光線で再照射した。検定の間中、Ｈ２Ｏ２形成をアンプレックス・レッド検定法により測定した。図８Ｆは、Ｈ２Ｏ２生成に対するカタラーゼの影響を示す。αβ−ＴＣＲの溶液（６.７μＭ、２００μＬ）を、３６０分間、３６７分間および３８９分間、図８Ｃ記載の要領で照射した。図８Ｃ記載の要領で各照射中に生成されたＨ２Ｏ２を検定し、破壊した。速度（０〜３６０分）＝０.６９３μＭ分−１（ｒ２＝０.９６２）。２００μＭを超える増殖曲線（progress curve）における曲率は、予測されたＨ２Ｏ２による阻害と一致する（下記参照）。速度（３６１〜７２７分）＝０.４２７μＭ分−１（ｒ２＝０.９８７）；速度（７２８〜１１１７分）＝０.３８６μＭ分−１（ｒ２＝０.９９１）。
【図９】図９は、天然４Ｃ６ Ｆａｂ（カラー写真における淡青色およびピンク色）およびＨ２Ｏ２の存在下における４Ｃ６ Ｆａｂ（カラー写真における紺青色および赤色）の重なりを示す。図９Ａについては、天然４Ｃ６結晶を、４ｍＭのＨ２Ｏ２中に３分間浸し、ＳＳＲＬ ＢＬ９−１でのデータ収集用に直ちに急速冷凍した。二次および三次構造の全体的構造完全性は、Ｈ２Ｏ２の存在下で明らかに保存されている（ＲＭＳＤ Ｃα＝０.３３オングストローム、側鎖＝０.４９オングストローム）。ＲＭＳＤをＣＮＳ中で計算した。図９Ｂは、Ｆａｂ ４Ｃ６への安息香酸の結合を示す。高解像度Ｘ線構造は、Ｆａｂ ４Ｃ６が安息香酸と交差反応性であることを示す。Ｈ２Ｏ２の存在下および非存在下での４Ｃ６連結部位の重なりにより、結合部位内における側鎖立体構造も保存されていることが立証されている（カラー写真において薄く、そして濃く着色した側鎖は、それぞれ＋Ｈ２Ｏ２および−Ｈ２Ｏ２に対応する）。さらに、安息香酸についての明白な電子密度は、Ｆａｂ ４Ｃ６の結合特性が４ｍＭのＨ２Ｏ２において変化されていないままであることを明らかにしている。電子密度マップは、１.５σで輪郭を示した２ｆ０−ｆｃシグマ加重マップであり、図面をＢｏｂｓｃｒｉｐｔで作製した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ダイオードアレイＨＰ８４５２Ａ分光光度計、Ａｂｓｍａｘ２８０ｎｍで測定されたウマポリクローナルＩｇＧの吸光度スペクトルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、２６０および３２０ｎｍ間の波長における、ウマポリクローナルＩｇＧの作用スペクトルを提供しており、２８０ｎｍでＨ２Ｏ２形成の最大活性を示す。この検定は、デュプリケートで実施され、抗体溶液［ＰＢＳ中（ｐＨ７.４）６.７μＭ］を石英ガラス管へ加え、次いでそれを１時間ＳＬＭ分光蛍光計のキセノンアークランプおよびモノクロメーターにより発せられる光ビーム中に置いた。アンプレックス・レッド検定法によりＨ２Ｏ２濃度を測定した。
【図１１Ａ】図１１Ａは、トリプトファン（２０μＭ）による時間経過に伴うＨ２Ｏ２の生成を示す。条件および検定手順は、図８Ａにおける記載と同様であった。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｈ２Ｏ２の抗体を介する光生成に対する塩素イオンの影響を示す。ヒツジポリ−ＩｇＧ■（６.７μＭ、２００μＬ）またはウマポリ−ＩｇＧ▲（６.７μＭ、２００μＬ）の溶液を、凍結乾燥により乾固し、次いで塩素イオンの最終濃度が０〜１６０ｍＭとなるように脱イオン水またはＮａＣｌ（水溶液）に溶かした。次いで、試料を、２０ＥＣでの好気的環境条件下、トランスイルミネーター（８００μＷｃｍ−２）の密封バイアルにおいてデュプリケートで照射した。検定の間中、アリコート（１０μＬ）を除去し、アンプレックス・レッド検定法によりＨ２Ｏ２濃度を測定した。Ｈ２Ｏ２形成速度を、各抗体試料について平均±ＳＥＭ対［ＮａＣｌ］としてプロットする。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｈ２Ｏ２の抗体を介する光生成に対するＥＤＴＡ含有緩衝液中における透析の影響を示す。２つの抗体調製物である、マウスモノクローナル抗体ＰＣＰ２１Ｈ３およびウマポリクローナルＩｇＧによるＨ２Ｏ２の光生成を、ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（２０ｍＭ）での透析の前および後に比較した。条件および検定手順は、図８Ａにおける記載と同様であった。各データポイントを、少なくともデュプリケートの測定値の平均±ＳＥＭとして記録する：［●透析前のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；■透析後のマウスｍＩｇＧ ＰＣＰ２１Ｈ３；▲透析前のポリ−ＩｇＧ、ウマ；◆透析後のポリ−ＩｇＧ、ウマ］。
【図１２】図１２は、１６Ｏ含有Ｈ２Ｏ２または１８Ｏ含有Ｈ２Ｏ２による基質トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）の酸化を示す質量スペクトルを共する。ＥＳＩ（負の極性）質量スペクトルは、Ｈ２Ｏ２による酸化後のＴＣＥＰ［（Ｍ−Ｈ）−２４９］およびその酸化物［（Ｍ−Ｈ）−２６５（１６Ｏ）および（Ｍ−Ｈ）−２６７（１８Ｏ）］のものを用いた。図１２Ａは、Ｈ２１８Ｏ（９８％１８Ｏ）ＰＢ中における１６Ｏ２好気的条件下でのヒツジ ポリ−ＩｇＧ（６.７／μＭ）の照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での大きいピーク）および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６７での小さいピーク）の混合物が生成される。図１２Ｂは、Ｈ２１６Ｏ ＰＢ中における濃縮された１８Ｏ２（９０％１８Ｏ）好気的条件下でのヒツジ ポリ−ＩｇＧ（６.７μＭ）の照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での小さいピーク）および１８Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６７での大きいピーク）の混合物が生成される。図１２Ｃは、Ｈ２１６Ｏ ＰＢ中における１６Ｏ２好気的濃縮下で実施されたポリ−ＩｇＧの照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。Ｈ２１６ＯをＨ２１８Ｏに変えた以外、検定条件および手順は方法および材料（実施例２）に記載のとおりであった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での大きいピーク）のみ観察される。図１２Ｄは、２０ＥＣで８時間、Ｈ２１８Ｏ ＰＢ中、嫌気的（脱気およびアルゴン下）条件下でのヒツジ ポリ−ＩｇＧ（６.７μＭ）およびＨ２１６Ｏ２（２００μＭ）の照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。ＴＣＥＰの添加は、方法および材料（実施例２）における記載と同様であった。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での大きいピーク）のみ観察される。図１２Ｅは、Ｈ２１８Ｏ ＰＢ中での１６Ｏ２好気的条件下での３−メチルインドール（５００μＭ）の照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での大きいピーク）のみ観察される。３−メチルインドールは分子量が低すぎるため、サイズ排除濾過を実施しなかったこと以外、検定条件および手順は、方法および材料（実施例２）に記載のとおりであった。従って、ＴＣＥＰを、３−メチルインドール含有ＰＢ溶液に加えた。図１２Ｆは、Ｈ２１８Ｏ ＰＢ中での１６Ｏ２好気的条件下、β−ｇａｌ（５０μＭ）の照射後におけるＴＣＥＰおよびその酸化物の質量スペクトルを示す。１６Ｏ含有ＴＣＥＰ（２６５での大きいピーク）のみ観察される。検定条件および手順は、方法および材料（実施例２）に記載のとおりであった。
【図１３】図１３は、材料および方法（実施例２）に記載された抗体４Ｃ６におけるＸｅ結合部位を示す。図１３Ａは、Ｆａｂ ４Ｃ６のＣαトレースの標準側面図であり、カラー写真においてピンク色は軽鎖および青色は重鎖である。３個の結合したキセノン原子（カラー写真における緑色）を、５σで輪郭を示した初期Ｆ０−Ｆｃ電子密度マップと共に示されている。図１３Ｂは、保存されたキセノン部位１の周囲のＦａｂ ４Ｃ６および２Ｃ αβ ＴＣＲ（ＰＤＢ／ＴＣＲ）のオーバーレイである。ＶＬ主鎖Ｃαトレース（カラー写真におけるピンク色）および側鎖（カラー写真における黄色）、ならびに２Ｃ αβ ＴＣＲの対応するＶα（カラー写真における赤色および金色）を重ね合わせる（Ｉｎｓｉｇｈｔ２０００を用いて作製された図面）。
【図１４】図１４は、抗体による細菌致死力を示す。図１４Ａは、異なる実験条件下における大腸菌（E.coli）ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ株の生存を示す棒グラフである。生存は、実験開始時点（ｔ＝０分）でのコロニー形成単位（ＣＦＵ）のパーセントとして、回復したＣＦＵとして記録されている。黒色（斜線）バーおよび淡灰（白）色バーは、淡灰色グループ（２、４、６、８、１０および１２）が可視光線（２.７ｍＷｃｍ−２）に６０分間暴露され、黒色グループ（１、３、５、７、９および１１）が６０分間暗所に置かれたこと以外、同一実験条件に対応している。細菌細胞密度は約１０７細胞／ｍＬであった。記録された各データポイントは、以下の条件下における大腸菌ＸＬ１−ブルー（グループ１〜６）およびＯ１１２ａ,ｃ（グループ７〜１２）の平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。グループ１〜２は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＸＬ１−ブルー細胞。グループ３〜４は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＨＰＩＸ（４０μＭ）、ＸＬ１−ブルー細胞。グループ５〜６は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＸＬ１−ブルー−特異的モノクローナル抗体（２５Ｄ１１、２０μＭ）、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、ＸＬ１−ブルー細胞。グループ７〜８は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＯ１１２ａ,ｃ細胞。グループ９〜１０は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＨＰＩＸ（４０°Ｍ）、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。グループ１１〜１２は、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＯ１１２ａ,ｃ−特異的モノクローナル抗体（１５４０４、２０μＭ）、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、Ｏ１１２ａ,ｃ細胞。図１４Ｂは、大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃの生存に対する抗体濃度の影響をグラフに示したものである。使用した抗体は、Ｏ１１２ａ,ｃ特異的モノクローナル抗体である、１５４０４であった。記録された各データポイントは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。細胞の５０％の致死（ＥＣ５０）に対応する１５４０４抗体の濃度は、８１±６ｎＭであった。図１４Ｃは、大腸菌ＸＬ１−ブルー−特異的マウスモノクローナル抗体１２Ｂ２の殺菌作用に対する照射時間の影響をグラフで示したものである。グラフは、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および１２Ｂ２（２０μＭ）の存在下における照射時間（２.７ｍＷｃｍ−２）対大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存を示す。記録された各データ点は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。細胞の５０％の致死に対応する照射時間は、３０±２分であった。図１４Ｄは、ヘマトポルフィリンＩＸ濃度に対する抗体駆動殺菌作用の依存性を示す。使用した抗体は、大腸菌ＸＬ１−ブルー特異的マウスモノクローナル抗体２５Ｄ１１であった。グラフは、大腸菌ＸＬ１−ブルーの生存対ヘマトポルフィリンＩＸの一連濃度への暴露を示す。以下の条件を使用した：６０分間（＞）、暗所中４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＸＬ１−ブルー細胞。白色光（２.７ｍＷｃｍ−２）中、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中におけるＸＬ１−ブルー細胞（△）。６０分間暗所中、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中における２５Ｄ１１（２０μＭ）、ＸＬ１−ブルー細胞（◆）。６０分間白色光（２.７ｍＷｃｍ−２）中、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７.４中における２５Ｄ１１（２０μＭ��、ＸＬ１−ブルー細胞（◇）。
【図１５】図１５は、抗原特異的マウスモノクローナルＩｇＧ（１５４０４、２０μＭ）、ＰＢＳ中のヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および可視光線への、４℃で１時間の暴露後の大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ細胞の電子顕微鏡写真である（＜５％生存可能）。抗体付着部位を視覚化するため、金標識したヤギ抗マウス抗体を殺菌検定完了後に加えた。抗原非特異的抗体の殺菌活性の効力は、抗原特異的抗体と非常に類似していることが観察された。典型的には、２０μＭの抗体（非特異的）は、本検定系において＞９５％殺菌性であった。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、非特異的マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（８４Ｇ３、２０μＭ）、ＰＢＳ中のヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および可視光線への４℃で１時間暴露後の大腸菌ＸＬ−１−ブルー細胞の電子顕微鏡写真である（１％生存可能）。図１６Ａにおける矢印は、細胞質内容物からの細胞膜の予備的分離に向いている。図１６Ｄは、抗原特異的マウスモノクローナルＩｇＧ（１５４０４、１０μＭ）、ＰＢＳ中のヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および可視光線への室温で１時間暴露後の大腸菌Ｏ１１２ａ,ｃ血清型の電子顕微鏡写真である（＜５％生存可能）。当業界で利用可能な手順を用いて金標識を実施した。
【図１７Ａ】図１７Ａは、大腸菌ＸＬ１−ブルーに対する抗体の殺菌作用に対するカタラーゼの影響を明らかにしている［実験開始時点（ｔ＝０分）での回復したコロニー形成単位（ＣＦＵ）のパーセントとして、採取されたＣＦＵとして記録されている］。カタラーゼは、Ｈ２Ｏ２を水（Ｈ２Ｏ）および酸素分子（Ｏ２）に変換する。各グループを、４℃で６０分間白色光（２.７ｍＷｃｍ）により照射した。細菌細胞密度は〜１０−７細胞／ｍＬであった。実験グループ（１〜７）を以下の要領で処理した：グループ１は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞およびヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）。グループ２は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および非特異的マウスモノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）。グループ３は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）およびモノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）。グループ４は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、モノクローナル抗体８４Ｇ３（２０μＭ）およびカタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）。グループ５は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞および特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）。グループ６は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）および特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）。グループ７は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞、ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）、特異的ウサギポリクローナル抗体（２０μＭ）およびカタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）。各点は、多重実験の平均値±ＳＥＭとして記録されている（ｎ＝６）。記号＊＊は、同じ時点での対照に対する＜０.０１のｐ値を示す。殺菌活性は、暗所対照のいずれからも観察されなかった（データは示さず）。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、大腸菌ＸＬ１−ブルーおよびＯ１１２ａ,ｃ血清型の生存能力に対するＨ２Ｏ２の濃度依存的毒性を示す。垂直な点線は、上記図１４およびHofman らの、Infect.Immun.６８、４４９（２０００）に記載の条件を用いることによる、６０分間インキュベーション中に抗体により生成されると予測されるＨ２Ｏ２の濃度である。３５±５μＭ Ｈ２Ｏ２の値は、１２の異なるモノクローナル抗体の少なくともデュプリケートの検定から測定された平均値である。
【図１８】図１８は、カタラーゼの存在下および非存在下でのＰＢＳ（ｐＨ７.４）中における抗体のＵＶ照射（３１２ｎｍ、０.８Ｗｃｍ−２）中におけるインジゴカルミン１(１ｍＭ)からのイサチンスルホン酸２の光生成の進行を示す（Steinbeck et al.、J.Biol.Chem.２６７、１３４２５（１９９２））。各ポイントは、少なくともデュプリケートの測定の平均±ＳＥＭとして記録されている。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ.３ソフトウェアにより一次回帰分析を実施した。イサチンスルホン酸２の形成速度（ν）は、以下の条件下で観察された：ヒツジ ポリクローナルＩｇＧ（２０μＭ）（●）ν＝３４.８±１.８ｎＭ／分；マウス モノクローナル抗体３３Ｆ１２（２０μＭ）（□）ν＝４０.５±１.５ｎｍ／分；ヒツジ ポリクローナルＩｇＧ（２０μＭ）および可溶性カタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）（△）ν＝３３.５±２.３ｎＭ／分；マウス モノクローナル抗体３３Ｆ１２（２０μＭ）および可溶性カタラーゼ（１３ｍＵ／ｍＬ）（▽）ν＝４１.８±１.２ｎＭ／分。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、様々な条件下における室温でのＨ２ １８Ｏ（＞９５％１８Ｏ）リン酸緩衝液（ＰＢ、１００ｍＭ、ｐＨ７.４）中におけるインジゴカルミン１（１ｍＭ）の酸化中に生成されたイサチンスルホン酸２［（ＭＨ）−２２６、（Ｍ−Ｈ）−２２８（１８Ｏ）および（Ｍ−Ｈ）−（２×１８Ｏ）］の電子スプレーイオン化（負の極性）質量スペクトルを示す。図１９Ａは、５分間化学的オゾン分解（ＰＢ中６００μＭ）によりインジゴカルミン１の酸化中に生成されたイサチンスルホン酸２の質量スペクトルである。図１９Ｂは、４時間ヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）およびヒツジポリＩｇＧ（２０μＭ）の白色光（２.７ｍＷｃｍ−２）での照射によりインジゴカルミン１の酸化中に生成されたイサチンスルホン酸２の質量スペクトルを示す。図１９Ｃは、４時間白色光（２.７ｍＷｃｍ−２）でのヘマトポルフィリンＩＸ（４０μＭ）の照射によりインジゴカルミン１の酸化中に生成されたイサチンスルホン酸２の質量スペクトルを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、３７℃でＰＢＳ（ｐＨ７.４）中のホルボールミリスチン酸（１μｇ／ｍＬ）で活性化されたヒト好中球（ＰＭＮ、１.５×１０７細胞／ｍＬ）によるインジゴカルミン１（３０μＭ）の酸化（＞）および２の形成（□）の時間経過を示す。インジゴカルミン１の酸化は、活性化されていないＰＭＮでは全く起こらなかった（データは示さず）。前記要領で好中球を調製した。次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）は、好中球により生成されることが知られているオキシダントである。我々の実験では、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中のＮａＯＣｌ（２ｍＭ）は、１（１００μＭ）を酸化するが、１の二重結合を開裂してイサチンスルホン酸２を生じさせることはない。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図２０Ａ記載の条件下、活性化されたヒト好中球によるインジゴカルミン１の酸化中に生成されたイサチンスルホン酸２の陰イオン電子スプレー質量スペクトルを示す。