【手続補正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｉ
【化１】
2006501267.tif 000001
で示されるＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジンまたは医薬上許容されるその塩および（ｂ）遊離の形態またはその医薬上許容される塩の形態の少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる、同時的、個別的または逐次的使用のための組合せ剤。
【請求項２】
（ｂ）が酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、ＳＡＨＡ、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ ２２８、トリコスタチンＡ、式ＩＩ
【化２】
2006501267.tif 000002
で示される化合物もしくは医薬上許容されるその塩および式ＩＩＩ
【化３】
2006501267.tif 000003
で示される化合物もしくは医薬上許容されるその塩および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体からなる群から選択される、請求項１に記載の組合せ剤。
【請求項３】
（ｂ）が酪酸ナトリウム、ＳＡＨＡ、式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物からなる群から選択される、請求項２に記載の組合せ剤。
【請求項４】
白血病の処置における医薬の製造のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
【請求項５】
白血病が化合物Ｉ−耐性白血病である、請求項４または５のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
【請求項６】
白血病に対して共同で治療上有効量の請求項１〜３に記載の医薬組合せ剤および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ＨＤＡのインヒビターは、癌細胞に対する治療効果について研究されてきた。たとえば、酪酸および誘導体、たとえばフェニル酪酸ブチルは、インビトロでヒト結腸カルシノーマ、白血病および網膜芽腫細胞系においてアポトーシスを誘導することが報告されている。しかしながら、酪酸およびその誘導体は有用な薬理学的剤ではない。なぜなら、それらはインビボで急速に代謝され、そして非常に短い半減期を有する傾向があるからである。抗癌活性について広く研究されたＨＤＡの他のインヒビターは、トリコスタチンＡおよびトラポキシンである。トリコスタチンＡは抗真菌性および抗菌性であり、そして哺乳類ＨＤＡの可逆的インヒビターである。トラポキシンは環状テトラペプチドであり、これは哺乳類ＨＤＡの不可逆的インヒビターである。トリコスタチンおよびトラポキシンは抗癌活性について研究されてきたが、該化合物のインビボでの不安定性のため、これらは抗癌性薬物としてあまり適していない。腫瘍（癌性腫瘍を含む）の処置に適し、非常に有効および安定である活性化合物の必要性が未だ存在する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
最終生成物、医薬調製物および上で挙げた特許請求の範囲の発明主題を、出典明示により本願の一部とする。これらの文献において開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変態、たとえば溶媒和物および結晶多形も同様に含まれる。本明細書において開示した組合せ剤中の活性成分として使用される化合物は、特記しない限り、それぞれ、先に挙げた文献に記載されているように製造され、そして投与され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本明細書において使用する場合、「組合せ調製物」なる用語は、上記に定義した組合せパートナー（ａ）および（ｂ）が独立に投与し得るか、または組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の識別し得る量での異なる一定の組合せで投与し得る、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与し得るという意味で、「パーツのキット（kit of parts）」と特に定義される。「パーツのキット」のパーツは、したがって、同時に投与するか、または時間的にずらして、すなわち、異なる時点で、「パーツのキット」のいずれかに対して、同じまたは異なる時間間隔で、投与する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
さらに、本発明は、白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該動物に増殖性疾患に対して共同で治療上有効量の「本発明の組合せ剤」を投与することを含み、そして組合せパートナーは、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在し得る方法に関する。本発明の１つの実施態様において、かかる方法において、「本発明の組合せ剤」は抗下痢剤と共投与される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本発明は、好ましくは、増殖性疾患、好ましくはＢＣＲ／ＡＢＬ＋ ヒト骨髄性白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該増殖性疾患に対して共同で治療上有効な量の（ａ）化合物Ｉ、とりわけそのモノメタンスルホン酸塩の形態のもの、および（ｂ）ＳＡＨＡ、酪酸ナトリウム、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩから選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビターを含んでなる組合せ剤を該動物に投与することを含んでなる方法（ここで、化合物は、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在し得る。）に関する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
Ｓ−１００フラクションの調製およびチトクロームＣ放出の評価：Ｕ９３７細胞を、６００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離することにより過去に記載された（Yu et al., 2001, BBRC 286:1011-18）ように薬物処置後に回収し、そしてＰＢＳ中で洗浄する。細胞（４×１０６）を、７５ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および３５０μｇ／ｍｌ ジギトニンを含む溶解バッファー（１００μｌ）中で３分間インキュベートすることにより溶解させる。溶解物を１２,０００×ｇにて５分間遠心分離し、そして上清を集め、そして等容積の２×ＬＡＥＭＭＬＩバッファーを添加する。タンパク質試料を定量し、そして１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
一過性トランスフェクション：ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期（immediate-early）プロモーター（ｐＥＧＦＰ−Ｃ２）の転写制御下の高感度緑色フルオレセインタンパク質をコードしているプラスミド、およびＨＡ−タグ化活性化ＭＥＫ１（ｐＵＳＥＥａｍｐ中のＳ２１８Ｄ／Ｓ２２２Ｄ）は、それぞれ、クローンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）（Palo Alto, CA）およびアップステート・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）（Lake Placid, NY）から得られる。ＭＥＫ１ ｃＤＮＡを含む１２８５ｂｐのフラグメントを、Ａｐａ Ｉおよび部分ＥｃｏＲ Ｉ消化により得、そしてｐＥＧＦＰ−Ｃ２の（Ｃ末端）多重クローニング部位にインフレームにて挿入する。融合構成物中の全ＭＥＫ１ ｃＤＮＡを配列決定し、そしてリーディングフレームを確認する。対数増殖期のＫ５６２細胞を、ＢＴＸエレクトロマニュピレーター６００を用いるエレクトロポレーション・ハイポオスモル・バッファー（Eppendorf）にトランスフェクトする。２０μｇのＤＮＡおよび２.０×１０７細胞をそれぞれの条件について使用する。インキュベーションの１２時間後、２０％〜３０％の細胞が緑色の蛍光を示した。最も明るい１０％〜２０％の総細胞集団を、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｏＦＬＯセルソーターを用いる蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）により単離する。次いで、細胞を上で示した薬物に曝露させ、そして上記したようにアポトーシスの形態学的エビデンスについて試験する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
薬物なしの培地に曝露させたＫ５６２細胞と比べて、２５０ｎＭ化合物Ｉ＋２.０μＭ ＳＡＨＡに２４時間曝露させたＫ５６２細胞におけるアポトーシスは顕著に増加する；ＳＡＨＡ ２.０μＭ（２４時間）；化合物Ｉ ２５０ｎＭ（２４時間）をＴＵＮＥＬ−染色細胞の顕微鏡写真（示していない）により証明される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
化合物ＩおよびＨＤＩ（たとえばブチレート）の両方がＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞の成熟を誘導することが示されたので、かかる剤の組合せ曝露がＫ５６２細胞の分化の増加をもたらすかどうかを調べることを試みる。この目的で、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）産生を、ＳＡＨＡ±化合物Ｉで処置されたＫ５６２細胞において監視する。Ｋ５６２細胞を、上で示した間隔で２.０μＭ ＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露させた後に、分化を、「方法」で記載したようにＨｇｂの細胞内レベルを定量することにより監視した。それぞれの場合において、値は３つの個別の実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。２４時間の曝露後、ＳＡＨＡ−処置細胞はＨｇｂ産生の顕著な（すなわち約５０％）増加を示したが、化合物Ｉはこれに関して比較的有効ではない。しかしながら、両方の剤で処置した細胞は、Ｈｇｂレベルの上昇を示さない。４８時間後、ＳＡＨＡ−および化合物Ｉ−処置細胞は、Ｈｇｂ産生の実質的な増加を示す。しかしながら、両方の剤に暴露させた細胞（この時点で多くはアポトーシスを起こしている）のＨｇｂレベルは、対照よりも低い（データは示していない）。これらの知見は、化合物ＩおよびＳＡＨＡでのＢｃｒ／Ａｂｌ＋ Ｋ５６２細胞の共処置は分化を促進しないことを示しているが、これらの条件下で起こる過度のアポトーシスがこのプロセスを妨げることを示唆している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
１.０μＭ ＳＡＨＡまたは２００ｎＭ化合物Ｉのいずれかへの２４時間のＬＡＭＡ ８４細胞の曝露は細胞死に対して極めて小さい効果を発揮した。しかしながら、これらの剤を組み合わせた場合、大部分の細胞（すなわち、７０％）がアポトーシスを起こし、このことはアネキシン陽性により示される。対照的に、ＳＡＨＡをいくつかのＢｃｒ／Ａｂｌ−白血病細胞株（Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＮＢ４、およびＪｕｒｋａｔを含む）と組み合わせた場合、相乗効果の証拠は観察されない（表５）。
【表９】
2006501267.tif 000004
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
表８：ＧＦＰを発現している精製集団（たとえば、＞９５％）を、「方法」において記載したＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｏＦＬＯセルソーターを用いて単離する。非トランスフェクトＫ５６２細胞は９１％の生存および０.０１％のＧＦＰ発現を示した；ＧＦＰのみをトランスフェクトされたＫ５６２細胞；ソートされた細胞は９５％の生存および９５％のＧＦＰ発現を示した；ＧＦＰ／構成的に活性なＭＥＫ１／２融合ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞；ソートした細胞は、９５％の生存および９６％のＧＦＰ発現を示した。ＧＦＰ単独またはＧＦＰ／構成的に活性なＭＥＫ１／２融合ｃＤＮＡをトランスフェクトしたソート細胞を、薬物なしの培地中で５時間培養し、次いで２.０μＭ ＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露した後に、アポトーシスを、上記のようにライト−ギムザ染色サイトスピン調製物を試験することにより監視する。値は２つの個別の測定についての平均±Ｓ.Ｄ.を表す。＊＝ＧＦＰのみをトランスフェクトした細胞について値より有意に小さい；Ｐ＜０.０５；＊＊＝Ｐ＜０.０１。この期間の終わりに、アポトーシスの程度を上記のように監視する。構成的に活性なＭＥＫ１／２をトランスフェクトした細胞は、ＧＦＰ単独対照よりも、僅かではあるが、有意に化合物Ｉ−介在性致死性に対して耐性であり（Ｐ＜０.０５）、このことは、薬理学的ＭＥＫ１／２インヒビターによる化合物Ｉ−誘導アポトーシスの増強を示す以前の報告と矛盾しない。さらに、変異型ＭＥＫ１／２細胞での一過性トランスフェクションは、ＳＡＨＡ／化合物Ｉレジメンの致死性から細胞を極めて有意に保護する（Ｐ＜０.０１）。これらの知見は、ＨＤＩと組み合わせた化合物Ｉに曝露させたＫ５６２細胞におけるＲａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼカスケードの脱調節が致死性の増加に重要な機能的役割を果たすことを示唆している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
当該試験の結果は、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼインヒビター化合物Ｉおよび臨床的に関係のあるＨＤＩの共投与は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋ ヒト白血病細胞におけるミトコンドリア損傷およびアポトーシスの劇的な増加をもたらす。ヒト白血病細胞において、ＨＤＩは、おそらくクロマチンの弛緩を促進することにより、分化プロセスに関与する遺伝子の転写活性化を可能にすることが従来から知られている。この点に関して、ＳＢのようなＨＤＩはＫ５６２のようなＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞株における赤血球の変異を誘導することが示された。さらに近年、ヒト白血病細胞において変異プログラムよりもむしろアポトーシスを引き起こすＨＤＩ、特に比較的新しい世代の化合物の能力が注目されている。ＨＤＩがかかる細胞において細胞死と分化のいずれを誘導するかを決定する因子は十分には解明されていないが、活性酸素種の発生がこのプロセスにおいて役割を果たす可能性が示唆されている。いずれにしても、Ｋ５６２細胞は、おそらく、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼおよびその下流の細胞保護標的の構成的活性化により与えられるアポトーシスに対する一般的耐性により、ＨＤＩ−介在性細胞死に比較的非感受性である。ＨＤＩおよび化合物Ｉの共投与がＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞におけるアポトーシスの閾値の顕著な低下をもたらす知見について、いくつかの可能性のある説明が存在する。たとえば、化合物Ｉは、細胞保護標的の下流の１またはそれ以上のＢｃｒ／Ａｂｌの抗アポトーシス作用を干渉することにより、細胞死を引き起こすＨＤＩの能力を増強し得る。逆に、ＨＤＩにより誘導される種々のシグナル伝達および細胞周期調節経路における変化は、化合物Ｉにより引き起こされるものと組み合わせて、ミトコンドリア損傷およびアポトーシスの増幅をもたらす。さらなる可能性は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞における変異を誘導することが報告されている化合物Ｉが、ＨＤＩと組み合わせた場合に、分化よりもむしろアポトーシスをもたらす矛盾シグナルを起こし得ることである。これに関して、白血病細胞の脱調節が強力なアポトーシス性刺激を表すという知見が十分に証明されている。これらのメカニズムは互いに排他的ではないので、これらのうちの１以上が細胞死の顕著な増加に貢献している可能性を排除することはできない。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
ＭＥＫ１／２／ＥＲＫ経路の遮断に加えて、ＣＤＫＩ ｐ２１ＣＩＰ１の脱調節は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞における化合物ＩおよびＨＤＩの間の相乗的相互作用において重要な役割を果たし得る。たとえば、ｐ２１ＣＩＰ１誘導（たとえば、アンチセンス構築物を発現している細胞またはＣＤＫインヒビター フラボピリドールに曝露した細胞において）での干渉は、いくつかの分化誘導剤、たとえばＰＭＡ、ブリオスタチン１、および最近、酢酸塩およびＳＡＨＡを含むＨＤＩでの処置後の白血病細胞アポトーシスを促進することが示された。この現象の根拠ははっきりとは分からないが、キャスパーゼ−３と結合し、そして阻害するｐ２１ＣＩＰ１の能力と関係しているかもしれない。ＨＤＩによるヒストンのアセチル化がｐ２１ＣＩＰ１プロモーターを特異的に活性化し、そしてｐ２１ＣＩＰ１が特に成熟中の細胞白血病細胞における、ＨＤＩにより規則的に誘導されるという観察は、このＣＤＫＩの発現の増加がＨＤＩ−介在性成熟において重要な役割を果たすことを示唆している。化合物ＩがＨＤＩ−処置細胞においてｐ２１ＣＩＰ１誘導をブロックするメカニズムは明らかではないが、ｐ２１ＣＩＰ１の上流で機能することが知られているＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ軸の途絶から派生し得る。あるいは、特にＨＤＩと組み合わせた化合物Ｉの投与は、Ａｋｔ経路に干渉し得るが、これは、ｐ２１ＣＩＰ１の調節にも関係するＢｃｒ／Ａｂｌの下流標的である。Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞におけるＨＤＩおよび化合物Ｉの間の相乗的相互作用のｐ２１ＣＩＰ１誘導でのＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ対化合物Ｉ−介在性相互作用のＨＤＩ−関連下方調節の相対的貢献は、もし存在するとしても、依然として明らかではない。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
ヒストンのアセチル化およびアンコイリングを誘導することにより、ＨＤＩは成熟プロセスに関与する遺伝子の発現を促進する。結果的に、特に白血病における、他の剤の分化誘導能を促進するためのＨＤＩの使用について関心がある。たとえば、オール−トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）に耐性の白血病細胞を克服する酪酸塩のようなＨＤＩの能力が近年報告された。化合物Ｉは、限られた程度ではあるが、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞において分化を誘導できるので、ＨＤＩの共投与がこのプロセスを増強する可能性が存在する。しかしながら、本明細書において提示したデータは、化合物ＩおよびＨＤＩの間の相乗効果は、主に、成熟よりもむしろアポトーシスの誘導を反映することを示唆している。ヒトでの臨床試験への数種の新規ＨＤＩの近年の導入の観点から、ＣＭＬおよび関連障害を有する患者の処置のためにかかる剤を化合物Ｉと組み合わせるコンセプトは、実施可能であり得る。したがって、このストラテジーを開発するさらなる試みが進行中である。