【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年1月30日(2006.1.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  生理学的および医学的状態に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードするヒト以外の霊長類のポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、ここにおいて該ポリペプチドがヒト以外の霊長類において生理的状態と関連し、以下の工程：
（ａ）ヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒトの蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を比較し、ここにおいて該ヒトが生理的状態を有さない工程；および
（ｂ）ヒトの対応する配列と比較して、ヌクレオチド変化を包含するヒト以外の霊長類のポリヌクレオチド配列を選択し、ここにおいて該変化が進化的に有意である工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記生理的状態が疾患に耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患が癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が感染症である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記感染症がウィルス疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ウィルス疾患がＡＩＤＳである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト以外の蛋白質をコードする配列が生理的状態の進行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト以外の霊長類が霊長目ヒト上科の一員である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）に従って決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の同義率（ＫＳ）に対する非同義置換率（ＫＡ）の比によって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドをコードするヒトのポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、ここにおいて該ポリペプチドがヒトにおいて生理的状態と関連し、以下の工程：
（ａ）ヒトの蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を比較し、ここにおいて該ヒト以外の霊長類が生理的状態を有さない工程；および
（ｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列と比較して、ヌクレオチド変化を包含するヒトのポリヌクレオチド配列を選択し、ここにおいて該変化が進化的に有意である工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項２０】
前記生理的状態が寿命である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生理的状態が脳機能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記脳機能が認知機能である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒトの蛋白質をコードする配列が生理的状態の進行と関連する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト以外の霊長類が霊長目ヒト上科の一員である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）に従って決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の同義率（ＫＳ）に対する非同義置換率（ＫＡ）の比によって決定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ヒト脳の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列において進化的に有意な変化を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）ヒト脳の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の対応する配列を比較する工程；および
（ｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列と比較して、ヌクレオチド変化を包含するヒトのポリヌクレオチド配列を選択し、ここにおいて該変化が進化的に有意である工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項３６】
前記ヒト以外の霊長類が霊長目ヒト上科の一員である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒト以外の霊長類がチンパンジーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒト脳の蛋白質をコードするヌクレオチド配列がヒト脳のｃＤＮＡに対応する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）に従って決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレオチド変化の進化的有意性がヌクレオチド配列の同義率（ＫＳ）に対する非同義置換率（ＫＡ）の比によって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類由来の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列間の大規模な配列比較のための方法であって、以下の工程：
（ａ）ヒトのポリヌクレオチド配列を、配列相同性に従ってヒト以外の霊長類由来の対応するポリヌクレオチド配列と並べる工程；および
（ｂ）ヒト以外の霊長類由来の相同配列と比較して、ヒトの配列中のいかなるヌクレオチドの変化をも同定し、ここにおいてその変化が進化的に有意である工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項４９】
前記蛋白質をコードする配列が脳由来である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生理的状態を調節する剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１で同定したポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした細胞に対して、試験されるべき少なくとも１つの剤を接触させることを含んでなり、ここにおいて剤がポリヌクレオチド配列の機能を調節するその能力によって同定される、前記方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法によって同定された、剤。
【請求項５２】
生理的状態を調節する剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１９で同定したポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした細胞に対して、試験されるべき少なくとも１つの剤を接触させることを含んでなる、ここにおいて剤がポリヌクレオチド配列の機能を調節するその能力によって同定される、前記方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法によって同定された、剤。
【請求項５４】
生理的状態を調節する剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１で同定したポリヌクレオチド配列内にコードされたポリペプチド、または該ポリペプチドを含む組成物に対して、試験されるべき少なくとも１つの剤を接触させることを含んでなる、ここにおいて剤がポリペプチド配列の機能を調節するその能力によって同定される、前記方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法によって同定された、剤。
【請求項５６】
生理的状態を調節する剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１９で同定したポリヌクレオチド配列内にコードされたポリペプチド、または該ポリペプチドを含む組成物に対して、試験されるべき少なくとも１つの剤を接触することを含んでなる、ここにおいて剤がポリペプチド配列の機能を調節するその能力によって同定されることを含む、前記方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法によって同定された、剤。
【請求項５８】
進化的に有意なヒトのヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態に相関させる方法であって、以下の工程：
適切なモデルシステムにおいて、もしあれば請求項１で同定したポリヌクレオチド配列の機能的効果を解析し、ここにおいて機能的効果の存在が進化的に有意なヌクレオチド変化と生理的状態間の相関性を示す、工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項５９】
進化的に有意なヒトのヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態に相関させる方法であって、以下の工程：
適切なモデルシステムにおいて、もしあれば請求項１９で同定したポリヌクレオチド配列の機能的効果を解析し、ここにおいて機能的効果の存在が進化的に有意なヌクレオチド変化と生理的状態間の相関性を示す、工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項６０】
進化的に有意なヒトのヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態に相関させる方法であって、以下の工程：
適切なモデルシステムにおいて、もしあれば請求項１で同定したポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの機能的効果を解析し、ここにおいて機能的効果の存在が進化的に有意なヌクレオチド変化と生理的状態間の相関性を示す、工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項６１】
進化的に有意なヒトのヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態に相関させる方法であって、以下の工程：
適切なモデルシステムにおいて、もしあれば請求項１９で同定したポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの機能的効果を解析し、ここにおいて機能的効果の存在が進化的に有意なヌクレオチド変化と生理的状態間の相関性を示す、工程；
を含んでなる前記方法。
【請求項６２】
治療介入に適当である標的部位を同定する方法であって、請求項１９に記載の方法によって同定されたポリヌクレオチド配列にコードされるヒト以外のポリペプチドと対応するヒトポリペプチドと比較し、ここにおいてもしあれば分子相違の位置が標的部位を示す、ことを含んでなる前記方法。
【請求項６３】
治療介入に適当である標的部位を同定する方法であって、請求項１に記載の方法によって同定されたポリヌクレオチド配列にコードされるヒトのポリペプチドと対応するヒト以外のポリペプチドと比較し、ここにおいてもしあれば分子相違の位置が標的部位を示す、ことを含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒトの疾患、または特有のまたは強まったヒトの脳機能、より長くなったヒトの寿命、（ＡＩＤＳやＣ型肝炎のような）感染症の発症に対する感受性または耐性、癌の進行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に対する感受性または耐性、および毛髪の成長、にきびに対する感受性または耐性、若しくは増強した筋肉量のような美的特徴いったヒトの状態に関連する、進化した特徴に相当するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための分子技術および進化技術を用いることに関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトは、ヒトの健康や福祉に重要な分野に関係する生理的および機能的な、ある種の特徴において、最も近い進化論的類縁、すなわちチンパンジーのようなヒト以外の霊長類とは区別される。例えば、（１）ヒトは、チンパンジーと比べて特有のまたは強まった脳機能（例えば、認知能力など）を有する；（２）ヒトは、ヒト以外の霊長類より長い寿命を有する；（３）チンパンジーは、ヒトを苦しめるＡＩＤＳやＣ型肝炎のようなある種の感染症に耐性がある；（４）チンパンジーは、ヒトよりある種の癌の発病率が低いようである；（５）チンパンジーは、にきびや脱毛症（はげ）に罹らない；（６）チンパンジーは、脂肪に対する筋肉の割合がより高い；（７）チンパンジーは、マラリアに耐性がある；（８）チンパンジーは、アルツハイマー症に対する感受性が小さい；そして（９）チンパンジーは、アテローム性動脈硬化症の発病率が低い。現在、上述したヒト／チンパンジーの相違の基礎をなす遺伝子は知られておらず、さらに重要なことは、遺伝子がこれらの能力を与える遺伝子において進化した特異的な変化であるということである。ヒトと我々に近い進化論的類縁間でのこうした相違を理解することは、関連するヒトの状態や疾患に対する効果的な治療法を開発するための有効な情報を与える。
【０００３】
古典的な進化的解析は、主に動物の解剖学的特徴を比較するというものであるが、ヒトとヒト以外の霊長類間の劇的な形態的および機能的相違を示していた；けれども、ヒトゲノムは他の霊長類のゲノムと顕著な配列類似性を共有することが知られている。例えば、一般的に、ヒトのＤＮＡ配列はチンパンジーＤＮＡに約９８．５％が同一であり、ゴリラＤＮＡではほんの僅かしか類似していないことが結論づけられている（ＭｃＣｏｎｋｅｙ及びＧｏｏｄｍａｎ、ＴＩＧ  １３：３５０−３５１，  １９９７）。ヒトとそれに近い関係にある霊長類間のゲノムの相違は比較的小さい割合であるが、おそらくそうではないにしても、ゲノム配列における比較的少数の変化が、上述したようなヒトの健康や福祉に関わる特徴の原因となる可能性はある。したがって、これら特徴の基礎をなす遺伝子を同定し、ヒトの健康や福祉に利益を与え得る治療法を開発するために、その遺伝子がコードする蛋白質において進化した変化から情報を収集することが望ましく、またこのことは可能である。これらの配列変化を同定し、さらにその特性を明らかにすることは、疾患を取り除き、若しくは最小化し、あるいは特有のまたは強まった機能を与えるという進化論的解決から利益を得るために極めて重要である。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトにおける最近の進展により、ヒト遺伝子配列に関する大量の情報が与えられた。さらに、多くのヒト遺伝子や蛋白質産物の構造や活性が、ヒトの培養細胞や、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラダニオやマウスのようないくつかの動物モデルシステムで直接的に研究されている。これらのモデルシステムは、比較的簡単で、操作が容易であり、しかも世代時間が短いという多くの利点を有する。多くの重要な遺伝子の基本構造や生物学的活性は、進化を通じて保存されているため、巨大分子の配列を比較することによって、相同遺伝子を多くの種で同定することができる。より下等な種から得られる重要な遺伝子産物や機能性ドメインに関する情報は、ヒトにおける相同遺伝子または機能性ドメインを同定する手助けとして使用され得る。例えば、ショウジョウバエで最初に発見されたＤＮＡ結合活性を有するホメオドメインが、同じような活性をもつヒト相同染色体を同定するのに使用された。
【０００５】
ヒトと下等なモデル生物間の相同遺伝子または蛋白質の比較は、進化的に保存された分子配列や機能的特徴に関して有効な情報を提供するが、このアプローチでは、その配列が自然淘汰によって変化した遺伝子を同定することにおいて、その使用が制限されてしまう。精巧なアルゴリズムや分析方法が開発されるようになって、ＤＮＡ配列の変化についてのさらに多くの情報を引き出すことが可能になった。これらの方法の中でもっとも強力な方法である「ＫＡ／ＫＳ」は、（非同義部位当たりの非同義ヌクレオチド置換（ＫＡ）／同義部位当たりの同義置換（ＫＳ））
の比の、一列に並べた、蛋白質をコードするヌクレオチド配列間における対の比較に関するものである（ここで、非同義はコードされるアミノ酸が変化する置換を意味し、また同義はコードされるアミノ酸が変化しない置換を意味する）。「ＫＡ／ＫＳ型方法」というときは、この方法および同様の方法を含むものとする。これらの方法は、ダーウィン学説の分子レベルでの正の選択の出現、すなわち相同蛋白質でのアミノ酸の相違に帰着することを立証するために使用された。いつくかのグループは、特定の蛋白質が中立置換速度より急速に進化したこと、つまりその蛋白質がダーウィン学説の分子レベルでの正の選択の存在を支持することを証明するためにそのような方法を使用した。例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＫｒｅｉｔｍａｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：６５２−６５４，  １９９２）は、１つの遺伝子座のコードしている領域内でのアミノ酸置換数と同義置換数の比較に基づいた中立蛋白質進化仮説を統計的に試験することを提案している。彼らは、この試験を３種のショウジョウバエのＡｄｈ遺伝子座に適用し、その遺伝子座が選択的優位性突然変異の適応固定を受けるというよりは、ほとんどの蛋白質進化の説明として、適応突然変異の選択的固定が中立突然変異の正確な蓄積に対する生存可能な選択肢となり得ると結論づけている。Ｊｅｎｋｉｎｓら（Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ｂ２６１：２０３−２０７，  １９９５）は、適応進化が転写を制御している配列（コードしていない配列）内に起こっているのか調べるためにＭｃＤｏｎａｌｄ  ＆  Ｋｒｅｉｔｍａｎ試験を用いている。
【０００６】
Ｎａｋａｓｈｉｍａら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：５６０６−５６０９，  １９９５）は、２種のヘビから得た１０個のＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列の対比較を行うために、Ｍｉｙａｔａ及びＹａｓｕｎａｇａの方法を使用している；この方法は、イントロンを含むコードしていない領域に対する、部位当たりのヌクレオチド置換数（ＫＮ）と、ＫＡとＫＳを比較することに関するものである。彼らは、蛋白質をコードする領域が、イントロンを含むコードしていない領域より速い速度で進化していると結論づけている。高加速した置換速度は、獲物を捕らえるため、または捕食動物に対する防御のために強力な選択的利点を与えたにちがいない新しい生理活性を生産しようとするＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のダーウィン学説の分子レベルでの進化に起因する。Ｅｎｄｏら（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（５）：６８５−６９０，  １９９６）は、正の選択が操作する候補遺伝子を同定することを目的として、Ｎｅｉ及びＧｏｊｏｂｏｒｉの方法を使用た。ここでｄＮは非同義置換数を意味し、ｄＳは同義置換数を意味する。Ｍｅｔｓ及びＰａｌｕｍｂｉ（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（２）：３９７−４０６，  １９９６）は、Ｎｅｉ及びＧｏｊｏｂｏｒｉ、Ｎｅｉ及びＪｉｎ、そしてＫｕｍａｒ、Ｔａｍｕｒａ及びＮｅｉに帰する方法と同様のＭｃＤｏｎａｌｄ  ＆  Ｋｒｅｉｔｍａｎ試験を使用し、ウニの結合遺伝子が種形成のための準備として急速に進化するのかどうかを調べ、この遺伝子に関する正の選択の証拠を探すために、ｐＮ；置換部位当たりの置換代替数、とｐＳ；サイレント部位当たりのサイレント代替数の平均比率を調べている。Ｇｏｏｄｗｉｎら（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（２）：３４６−３５８，  １９９６）は、特定のマウス遺伝子ファミリーの進化を調べるために同様の方法を使用し、その方法が、試験的に操作可能なシステムで、どのようにして選択が遺伝子分岐を行うのかという重要な根本的洞察を与えると結論づけている。Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９５）は、多種の鳥やワニからＭＨＣ遺伝子座を引き出すために変性プライマーを使用し、その後、ＭＨＣ研究を哺乳類でない脊椎動物に拡張するために、Ｎｅｉ及びＧｏｊｏｂｏｒｉの方法（ｄＮ：ｄＳ比）によって解析している。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：７１３−７１５，  １９９３）は、ＳＲＹ遺伝子（雄性を決定するもの）において保存された領域を側面に配置する領域内で、指向的選択を探すためにＫａ／Ｋｓ解析を使用している。彼らは、ＳＲＹの急速な進化が、新種に導く生殖隔離の重要な原因であることを示唆している。Ｗｅｔｔｓｅｔｉｎら（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  Ｅｖｏｌ．  １３（１）：５６−６６，  １９９６）は、リスや関連するげっ歯類動物でのＭＨＣクラスＩ遺伝子の多様性を調べるために、Ｋｕｍａｒ、Ｔａｍｕａ及びＮｅｉのＭＥＧＡプログラムと系統発生的解析を利用している。Ｐａｒｈａｍ及びＯｈｔａ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：６７−７４，  １９９６）は、遺伝子組換えと同様に、選択のための試験を含む集団生物学的アプローチと曖昧な流れが、ヒトＭＨＣクラスＩの多型性の発生と維持���解析するために必要であることを述べている。Ｈｕｇｈｅｓ（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １４（１）：１−５，  １９９７）は、脊椎動物の免疫システムの細胞内で発現する蛋白質が異常なほど急速に進化するという仮説を調べるために、Ｎｅｉ及びＧｏｊｏｂｏｒｉ（ｄＮ：ｄＳ比）の方法を使用して、ヒトとげっ歯類間で百以上のオルソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）イムノグロブリンＣ２ドメインを比較した。Ｓｗａｎｓｏｎ及びＶａｃｑｕｉｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：７１０−７１２，  １９９８）は、溶解素と溶解素のための受卵器間での協調的な進化を立証するためにｄＮ：ｄＳ比を使用し、新種形成（種分化）について、そのような協調的進化の役割を検討している。
【０００７】
ヒトとヒトより下等な動物間の離れた進化的関係によると、自然淘汰によって固定した適応性のある有益な遺伝子変化は、しばしば時を超えて、中立あるいは任意な突然変異の蓄積によって隠れてしまう。さらに、蛋白質の中には偶然的手段で進化するものもあるが、比較した２つのゲノムが十分に近くないとすれば、そのような偶然的な変化は隠され、要領を得ない結果になってしまう（Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７）。実際に、蛋白質進化において適応選択の発生は、顕著に離れた関係にある配列を比較すると、しばしば軽視されることを研究は示していた（Ｅｎｄｏら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３７：４４１−４５６，  １９９６；  Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７）。
【０００８】
霊長類族内での分子進化の研究が報告されているが、これらは主に、分子進化の速度とパターンを評価し、そのような変化の原因となる進化メカニズムを探索するために、少数の既知である個々の遺伝子と遺伝子産物を比較することに焦点を当てている。一般的には、Ｌｉ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ，  １９９７を参照。さらに、配列比較データは系統発生的解析に使用され、ここで霊長類の進化の履歴は、異なる霊長類から調べた分子の中で関連する範囲の配列類似性に基づいて再構築される。例えば、異なる霊長類から得た酵素ライソゾームに関するＤＮＡとアミノ酸配列データは、霊長類での蛋白質進化の研究や特定のリネージ内の適応選択の出現を研究するのに使用された（Ｍａｌｃｏｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：８６−８９，  １９９０；  Ｍｅｓｓｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，  １９９７）。霊長類での分子進化研究に当てられた他の遺伝子は、ヘモグロブリン、チトクロームＣ酸化酵素、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を含む（Ｎｅｉ及びＨｕｇｈｅｓ  ｉｎ：  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｖｅｌ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  ２２２−２４７，  １９９１；  Ｌｉｅｎｅｒｔ及びＰａｒｈａｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７４：３４９−３５６，  １９９６；  Ｗｕら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４４：４７７−４９１，  １９９７）。多くのコードしていない配列もまた霊長類の分子系統発生的解析で使用された（Ｌｉ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  １９９７）。例えば、霊長類のリネージ中での遺伝子距離は、ベータタイプのグロビン遺伝子座と、側面に配置している領域のオルソロガスなコードしていないヌクレオチド配列から判断され、ヌクレオチド配列オルソログのために構築した進化樹は、形態学的特徴の系統発生的解析から得られる図と大まかに一致する枝別れパターンを描いた（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３０：２６０−２６６，  １９９０）。
【０００９】
Ｚｈｏｕ及びＬｉ（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（６）：７８０−７８３，  １９９６）は、霊長類の遺伝子にＫＡ／ＫＳ解析を適用した。遺伝子変換事象は、ヒトの進化の過程で、赤と緑の網膜色素間のイントロン２と４で起こっているらしいということが、以前に報告された。しかしながら、１人のヨーロッパ人から得た赤と緑の網膜色素に対するイントロン４配列は、完全に同一であり、このことは最近遺伝子変換が起こっていることを示唆している。遺伝子変換事象が個人で起こるのか、ヨーロッパ人の共通した先祖、あるいはさらに前の人類の先祖で起こったのかを決定するために、著者らは、男性アジア人、雄チンパンジー、そして雄ヒヒから得た赤と緑の網膜色素遺伝子のイントロン４の配列を調べ、ＫＡ／ＫＳ解析を適用した。彼らは、２つの遺伝子間の相違は、取り囲んでいるエキソンよりイントロン４で極めて低いことを観察し、このことは強い自然淘汰が配列均質化に対して行われたことを示唆している。
【００１０】
Ｗｏｌｉｎｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：５３７−５４２，  １９９６）は、ＨＩＶウィルス自身（すなわち、宿主類でない）が個々のヒト患者内で適応進化を受けやすいことを示すために、非同義塩基置換と同義塩基置換の比較を使用した。彼らの目的は、単に、短い時間枠（ヒト患者の病気への進行の時間枠）で正の選択発生することを立証することである。Ｎｉｅｗｉｅｓｋ及びＢａｎｇｈａｍ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４２：４５２−４５８，  １９９６）は、ＨＴＬＶ−１ウィルスについての関連した疑問、すなわちウィルス自身に作用する選択力は何かをという質問を発するために、Ｄｎ／Ｄｓアプローチを使用した。おそらく試料サイズが不十分であったために、彼らは選択力の本質を決定することができなかった。これらの場合において、ＫＡ／ＫＳ型方法がヒトウィルスに関して使用されるが、こうした方法を治療目的（本出願のような）で使用したという試みはなされていないし、むしろ狭い学術的な目的を追うために行われた。
【００１１】
上述した報告書から見てわかるように、急速に進化している遺伝子を同定するための分子進化の解析方法（ＫＡ／ＫＳタイプ方法）は、数多くの異なる目的を達成するために利用され、最も一般的には、ダーウィン学説の分子レベルでの正の選択の存在を確かめるために利用され得る。さらに、ダーウィン学説の分子レベルでの正の選択の頻度を評価し、系統発生的関係を理解し、新種が形成されるメカニズムを明らかにし、または特定の遺伝子の多型性の単一または複数の起源を確立するためにも使用され得る。上述した報告書や文献的な書物から明らかなことは、著者のうち誰も、進化論的解決、すなわち、さらにヒトの状態または疾患を予防したり治療したり、あるいは特有のまたは強まったヒト機能を調節するための治療法の開発に模倣したり使用したりする特異的な進化的変化を同定するためにＫＡ／ＫＳタイプ方法を適用した者はいなかった。この著者らは、進化的に有意な配列変化を含むヒトまたはヒト以外の霊長類の遺伝子を同定し、またヒトの状態や疾患の治療法の開発にそのような遺伝子や同定した変化を利用するためのシステマティックな手法としてＫＡ／ＫＳタイプ解析を使用しなかった。
【００１２】
相同的なチンパンジー遺伝子に比べて特有のまたは強まったヒト機能を与えるよう進化したヒト遺伝子の同定は、こうした特有のヒト機能を調節し、または遺伝子に欠陥がある時に機能を回復する剤を開発することに利用され得た。進化してきた基礎をなすチンパンジー（または他のヒト以外の霊長類）の遺伝子や特定のヌクレオチド変化の同定、さらにこれらの進化した遺伝子によってコードされた蛋白質における生理学や生化学的変化の特徴づけは、例えば、ＡＩＤＳのような感染症に対する感染性または耐性を何が決めているのか、ある種の癌の進行に対する感染性または耐性を何が決定しているのか、にきびに対する感染性または耐性を何が決定しているのか、毛髪の成長はどのように制御されているのか、そして筋肉と脂肪の形成はどのように制御されているのかといったような価値ある情報を提供し得た。この価値ある情報は、ヒト蛋白質にチンパンジーの相同染色体であるように振舞うようにさせる剤の開発に適応され得た。
【００１３】
ここで引用された全ての参考文献は、参照することにより、明確に組み込まれている。
発明の開示
本発明は、進化的に有意な変化を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定する方法を提供し、該変化は、医学的状態を含む生理的状態に関連するものである。本発明は、生理的状態、例えば、医学的にまたは商業的に関連ある進化した特徴に関連し、すなわち、こうした特徴の原因となる特定の遺伝子変化を同定するために、比較による霊長類のゲノムを利用し、このような進化した遺伝子から得られた情報をヒトの治療法の開発に使用する。ここに記載した方法の中で用いたヒト以外の霊長類の配列は、いかなるヒト以外の霊長類であってよく、好ましくは霊長目ヒト上科の一員であり、さらに好ましくは、チンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ及び／又はオランウータンであり、最も好ましくはチンパンジーである。
【００１４】
１つの好ましい態様では、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、正の進化的に有意な変化の起因となる自然淘汰を受ける（すなわち、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは、ヒトでは存在しない正の特性を有する）。この態様では、正に選択されたポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは、ある種の疾患に対する感受性または耐性、あるいは他の商業的に関わる特徴に関連する。この態様の例は、ヒト以外の霊長類、好ましくはチンパンジーにおいて正に選択され、感染症や癌に対する感受性または耐性に関連するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むが、それらには限定されない。商業的に関わる特徴の例としては、毛髪の成長、筋肉量、にきびに対する感受性または耐性というような美的特徴を含む。この態様の例は、ＨＩＶの播種、まん延、及び／又はＡＩＤＳの発症に対する感受性または耐性に関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。つまり、本発明は、ＨＩＶの播種、まん延、及び／又はＡＩＤＳの発症に対する耐性の基礎をなす分子メカニズムに洞察を付加することに有効であり、ＡＩＤＳの発症を予防し、及び／又は遅らせる薬剤のような剤を発見すること、及び／又は設計することにも有効となる情報を提供するものである。ＡＩＤＳまたは他の感染症に関わり、チンパンジーで正に選択された特異的な遺伝子はＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３およびＭＩＰ−１−αである。１７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプＩＶは、チンパンジーで正に選択された癌に関わる特異的な遺伝子である。
【００１５】
別の好ましい態様では、ヒトのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、正に進化的に有意な変化を引き起こした自然淘汰を受けている（つまり、ヒトのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトでない霊長類にはない正の特性を有する）。この態様の１つの例は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒト以外の霊長類と比較して、ヒト脳の特有のまたは強まった機能的能力に関連するということである。他には、ヒト以外の霊長類と比較して、ヒトのより長くなった寿命がある。つまり、本発明は、特有のまたは強まったヒト機能の基礎をなす分子メカニズムに洞察を付加することに有効であり、そのような特有のまたは強まったヒト機能を調節する薬剤のような剤を設計し、およびヒトに関わる疾患または状態の治療法を設計することに有効となり得る情報を提供するものである。一例としては、本発明は、このようにヒトの認知機能の基礎をなす分子メカニズムに洞察を付加することに有効であり、ヒトの脳機能を強める薬剤のような剤を設計すること、およびヒト脳に関係する疾患の治療法を設計することに有効となり得る情報を提供することにある。ヒト以外の霊長類と比較した場合、正に進化的に有意な変化を有するヒト遺伝子の特異的な例は、チロシンキナーゼ遺伝子ＫＩＡＡ６４１である。
【００１６】
したがって、一面において、本発明は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、ここで該ポリペプチドは、（医学的若しくは商業的に関わる正に進化的に有意な変化のような）生理的状態と関連するものである。正に進化的に有意な変化は、ヒトまたはヒト以外の霊長類に見出すことができる。
【００１７】
本発明の一面では、ポリペプチドをコードしているヒト以外の霊長類のポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、ここで該ポリペプチドは、ヒトでない霊長類での生理的状態に関わるものであり、リストとして挙げた（明細書を通して）生理的状態であり、例えば医学的に関連する疾患状態の進行に対する感受性または耐性であり、例えば感染症（ＡＩＤＳのようなウィルス性疾患を含む）あるいは癌を含むが、それらに限定されるものではない。いくつかの態様では、ａ）ヒト以外の霊長類、好ましくはチンパンジーの蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒトの蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を比較し、ここで該ヒトは生理的状態を有さない工程；および、ｂ）ヒトの対応する配列に比較してヌクレオチド変化を包含するヒト以外のポリヌクレオチド配列を選択し、ここで該変化は進化的に有意である工程、を含んでなる方法を提供する。いくつかの実施例では、ヒト以外の蛋白質をコードする配列はｃＤＮＡに一致する。いくつかの態様では、比較すべき配列は脳由来である。ヌクレオチド変化やヌクレオチド変化の性質を評価するために使用する方法がここに記載され、態様のいくつかないしは全てに利用される。これら方法（ここに記載された方法に似た他の方法においても同様に）において、ヒト以外の蛋白質をコードする配列（及び／又はその中にコードされたポリペプチド）は、生理的特徴の進行及び／又は維持と関連する。
【００１８】
本発明のいかなる態様に対しても、生理的状態は、いかなる生理的状態であってもよく、ここで取り挙げられたもの、例えば癌および感染症（ＡＩＤＳのようなウィルス性疾患を含む）のような疾患（疾患に対する感受性または耐性を含む）；寿命；認知機能を包含する脳機能を含む。
【００１９】
本発明の一面で、ヒトのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、ここで該ポリペプチドはヒトに存在する生理的状態と関連し、ａ）ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を比較し、ここで該ヒト以外の霊長類が生理的状態を有しない工程；および、ｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列と比較して、ヌクレオチド変化を包含するヒトのポリヌクレオチド配列を選択し、ここで該変化が進化的に有意である工程、を含んでなる前記方法を提供する。いくつかの態様では、ヒト蛋白質をコードしている配列（及び／又はその中にコードしているポリペプチド）は生理的状態の進行及び／又は維持に関連している。いくつかの態様では、ヒト蛋白質をコードする配列はｃＤＮＡに対応する。いくつかの態様では、比較すべき配列は脳由来である。いくつかの態様では、生理的状態は寿命である。他の態様では、生理的状態は脳機能である。他の態様では、脳機能は認知機能である。ヌクレオチド変化およびヌクレオチド変化の性質を評価するために使用する方法は、ここに記載されており、いかなるないしは全ての態様に利用するものとする。
【００２０】
他の態様では、（ａ）ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列と、医学的に関わる特定の疾患状態に耐性であるヒト以外の霊長類、好ましくはチンパンジーの蛋白質をコードするヌクレオチド配列を比較し、ここでヒト蛋白質をコードする配列は、疾患の進行に関連する工程；および、（ｂ）ヒトの対応する配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を包含するヒト以外のポリヌクレオチド配列を選択し、ここでその変化は、進化的に有意である工程、を含んでなる方法を提供する。これらの方法によって同定された配列は、さらに疾患の進行や状態と関連することを確かめるために特徴づけられ、及び／又は解析される。これらの方法に適用可能な最も好ましい疾患状態は、癌、およびＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、およびらい病を含む感染症である。
【００２１】
他面では、本発明はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、ここで該ポリペプチドはＡＩＤＳの進行に対する耐性に関連し、（ａ）ＡＩＤＳに耐性なヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列とヒト蛋白質をコードする配列を比較し、ここでそのヒト蛋白質をコードする配列はＡＩＤＳの進行に関連する工程、および（ｂ）対応しているヒトの配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を包含するＡＩＤＳに耐性なヒト以外の霊長類の配列を選択し、ここでそのヌクレオチド変化は進化的に有意である工程、を含んでなる前記方法を提供する。ここで示したように、これらの方法は、例えば、配列相同性に従って配列を並べたり、対応しているヒト以外の霊長類のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの特有のヌクレオチド変化を含むヒトポリヌクレオチド配列を同定することによって達成され得て、ここで特有のヌクレオチド変化は（この中で記載されているように）進化論的分析に従えば正に選択されているものとする。
【００２２】
他面では、ヒト脳の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列において進化的に有意な変化を同定するための方法であって、ａ）ヒト脳の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の対応する配列を比較する工程、およびｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列と比較して、１つのヌクレオチド変化を包含するヒトのポリヌクレオチド配列を選択し、ここで該変化は進化的に有意である工程、を含んでなる前記方法を提供する。いくつかの態様では、ヒト脳の蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、ヒト脳のｃＤＮＡに対応する。
【００２３】
本発明の他の面は、正に選択されたヒトの進化的に有意な変化を同定するための方法を含む。これらの方法は、（ａ）ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を比較する工程、および（ｂ）ヒト以外の霊長類の対応している配列と比較して、少なくとも１つ（すなわち、１以上）のヌクレオチド変化を包含するヒトのポリヌクレオチド配列を選択し、ここで該変化は進化的に有意である工程、を含んでなる。この方法によって同定された配列は、ヒトにおいて特有のまたは強まった、生物学的または医学的に関わる機能と関連している可能性に対して、さらに特徴づけられ、及び／又は解析されるものとする。
【００２４】
本発明の他の態様は、ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー由来の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列間の大規模な配列比較のための方法であって、（ａ）ヒトのポリヌクレオチド配列を、配列相同性に従ってヒト以外の霊長類由来の対応するポリヌクレオチド配列と並べる工程、および（ｂ）ヒト以外の霊長類由来の相同配列と比較して、ヒト配列中のいかなるヌクレオチド変化をも同定し、ここでその変化が進化的に有意である工程を含んでなる前記方法である。いくつかの態様では、蛋白質をコードする配列は脳由来である。
【００２５】
いくつかの態様では、ここに記載した方法のいずれかによって同定されたヌクレオチド変化は非同義置換である。いくつかの態様では、ヌクレオチド変化の進化的有意性は、ヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）に従って決定される。いくつかの態様では、進化的に有意な変化は、ヒト遺伝子とヒト以外の（チンパンジーのような）霊長類から得た相同遺伝子間のＫＡ／ＫＳ比を決定することによって評価され、好ましくは、その比は少なくとも約０．７５であり、さらに好ましくは約１（一致）より大きく（すなわち、少なくとも１である）、さらに好ましくは少なくとも約１．２５であり、さらに好ましくは少なくとも約１．５０であり、さらに好ましくは約２．００であるものとする。他の態様では、一度正に選択された遺伝子がヒトとヒト以外の（チンパンジーのような）霊長類間で同定されれば、ヒトあるいはヒト以外の（チンパンジーのような）霊長類の遺伝子が正に選択を受けたかどうかを確かめるために、他のヒト以外の霊長類でさらに比較がなされる。
【００２６】
他面において、本発明は、進化的に有意なヒトのヌクレオチド変化をヒト（又は人類）における生理的状態に相関させる方法であり、もしあれば、ここで述べた方法のうちいずれかによって同定されたポリヌクレオチド配列（の存否）の機能的効果（機能的効果の存在を決定することを含む）を解析し、ここで機能的効果の存在は、進化的に有意なヌクレオチド変化と生理的状態間の相関を示すことを含んでなる前記方法を提供する。あるいは、これらの方法において、（もしあれば）機能的効果は、ここに記載した方法のいずれかによって同定されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列（またはポリペプチド配列の一部）を用いて評価される。
【００２７】
本発明はまた、進化的に有意な変化の構造的または生化学的重要性を決定するために技術的に広く使用されている物理学的および生化学的方法によって、同定されたポリペプチドの比較を提供するものである。物理的方法は、適用進化を受けてきたと見られる遺伝子によってコードされた蛋白質に構造変化を調べるために使用される方法を含むものと解する。ある蛋白質（ヒトまたはヒト以外の霊長類のいずれか）と進化した相同蛋白質（ヒトまたはヒト以外の霊長類のいずれか、それぞれに対応させる）の３次元構造の近接比較は、関連したヒトの状態と疾患の治療法を開発するために価値ある情報を提供するであろう。例えば、本発明の方法を使用することによって、チンパンジーのＩＣＡＭ−１遺伝子が、ヒトのＩＣＡＭ−１と比較して正の進化的変化を有するものとして同定された。ヒトＩＣＡＭ−１蛋白質の２つの機能性ドメインの３次元モデルでは、チンパンジーで変化していた６個のアミノ酸のうち５個が、ＩＣＡＭ−１対抗受容体であるＬＦＡ−１に結合するのに極めて重要であることが知られているアミノ酸残基にまさに隣り合わせ（すなわち、物理的には接触している）になっており、それぞれの場合に、ヒトのアミノ酸は、チンパンジーのＩＣＡＭ−１におけるより大きなアミノ酸によって置換されていた。そのような情報は、適切な治療介入の設計に洞察を与える。
【００２８】
したがって、他面において、本発明は、治療介入に適切である標的部位（１以上の標的部位を含むものとする）を同定するための方法であって、ここに記載した方法のいずれかによって同定された配列にコードされるヒトのポリペプチドと対応するヒト以外のポリペプチド（またはそのポリペプチドの一部）と比較し、ここでもしあれば、分子相違の位置が標的部位を示す、ことを含んでなる前記方法を提供する。他面において、本発明は、治療的介入に適している標的部位（１以上の標的部位を含むとする）を同定するための方法であって、ここに記載した方法のいずれかによって同定された配列にコードされるヒト以外のポリペプチド（またはポリペプチドの一部）と対応するヒトのポリペプチド（またはポリペプチドの一部）を比較し、ここでもしあれば、アミノ酸の違いのような分子相違の位置が標的部位を示す、ことを含んでなる前記方法を提供する。
【００２９】
生化学的方法は、適応進化を受けた遺伝子によってコードされた蛋白質に対する機能的相違、例えば結合特異性、結合強度、または最も望ましい結合状態などを調べるために使用される方法を含むと解する。ある蛋白質（ヒトかヒト以外の霊長類のいずれか）と進化した相同蛋白質（ヒト以外の霊長類またはヒトのいずれか、それぞれに対応させる）との生化学的特徴の近接比較は、関連するヒトの状態および疾患に対する治療法を開発するために価値ある情報を明らかにするであろう。
【００３０】
他面において、本発明は、生理的状態を調節するような剤を同定するための方法であって、当該方法は、ここに記載した方法のいずれかによって同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクトした細胞に対して、１つの剤（すなわち、試験されるべき少なくとも１つの剤）を接触させることを含んでなり、ここで剤は、ポリヌクレオチド配列の機能を調節するその能力によって同定される、前記方法を提供する。他の態様では、本発明は、生理的状態を調節するような剤を同定するための方法であって、当該方法は、試験される１つの剤（少なくとも１つの剤）をここに記載した方法のいずれかによって同定したポリヌクレオチド内または内部にコードされているポリペプチド（あるいはポリペプチドの断片および／またはポリペプチド若しくはポリペプチドの断片からなる組成物）に接触することを含んでなり、ここで、剤はポリペプチドの機能を調節するその能力によって同定される。本発明はまた、ここに記載したスクリーニング法を用いて同定した剤を提供するものとする。
【００３１】
他面において、本発明は、特有のまたは強まったヒトの機能を調節し、またはヒト以外の霊長類の関心ある特徴、例えば、ＡＩＤＳのような疾患の発症に対する感受性あるいは耐性といった特徴を模倣するヒトのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性を調節する剤をスクリーニングする方法を提供するものである。これらの方法は、ポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされた細胞に試験すべき剤を接触させること、およびポリヌクレオチドの機能を調節する能力に基づいて剤を同定すること、またはポリペプチド調製物に試験すべき剤を接触させること、およびポリペプチドの機能を調節する能力に基づいて剤を同定することを含むものとする。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、医学的または商業的に関連する進化した特徴のような生理的状態に関連し、すなわちそれらの状態に一因し、または原因となる特異的な遺伝子変化を同定するために比較ゲノミックスを利用するものである。本発明は、ヒトと他のヒト以外、とりわけ霊長類、最も好ましくは知られた２種、つまり一般的なチンパンジーとコビトチンパンジー（ピグミーチンパンジー）を含むチンパンジーとを区別している機能や疾患における相違の原因となる特定の遺伝子変化を同定するために比較ゲノムアプローチから構成される。例えば、チンパンジーとヒトは、ＤＮＡ配列レベルで９８．５％同一であり、そして本発明は、多くの地域での種間で相違の基礎をなす適応分子変化を同定することができ、特有のまたは強まったヒトの認知能力、ＡＩＤＳやある種の癌に対するチンパンジーの耐性を含むもとのする。単に遺伝子を同定するにすぎない典型的なゲノミックスではなく、本発明は、疾患を排除し、特有の機能を提供する進化論的解決に正確な情報を提供するものである。本発明は、進化的な利点を付与するように進化してきた遺伝子とその特異的に進化した変化を同定する。
【００３３】
本発明は、ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチドが、ヒト以外の霊長類のようなヒトに進化論的に近い関係を有する種においてではなく、ヒトにおいて、進化の間の適応選択の結果として見つけられた配列の変化を含むという観察に起因する。
【００３４】
さらに、本発明は、ヒト以外の霊長類の遺伝子情報が、進化の間の適応選択として、ヒトにおいてではなく、特定のヒト以外の霊長類において見つけられた変化を含むという観察に起因している。この態様では、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが正に進化的に有意な変化に帰着する自然淘汰を受けた（すなわち、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトでは存在しない正の特性を有している）。この態様では、正に選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある種の疾患または他の商業的に関連する特徴に対する感受性または耐性と関連する。この態様の医学的に関連する例は、ヒト以外の霊長類、好ましくはチンパンジーにおいて正に選択され、感染症や癌に対する感受性または耐性と関連するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むが、その範囲を限定しようとするものではない。この態様の例は、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症への進行に対する感受性または耐性に関連するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。つまり、本発明は、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症への進行に対する耐性の基礎をなす分子メカニズムに洞察を加え、ＡＩＤＳの発症を予防し、及び／又は遅延する薬剤のような剤を発見し、及び／又は設計することにも有効となり得る情報を提供することに有効である。商業的に関連する例は、毛髪の成長、にきび、または筋肉量といった美的特徴に関連するヒト以外の霊長類で正に選択されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むが、その範囲を限定しようとするものではない。
【００３５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列における正に選択されたヒトの進化的に有意な変化は、特に、最も近い進化論的な類縁であるチンパンジーと比較した場合、特有のまたは強まったヒトの脳機能のような競争上の利点をヒトに提供するヒトの能力に起因している。本発明は、特有のまたは強まったヒトの認知能力を提供するように進化したヒトの遺伝子を同定し、機能的相違を付与する実際の蛋白質変化が、一般的な人々に対する認知能力を高めるとともに、認知能力の欠乏を治療するための治療的アプローチにかなり有効となるであろう。
【００３６】
本発明の実施は、他に指示がなければ、通常の技術の範囲内にある分子生物学、遺伝学および分子進化の典型的な技術を使用する。そのような技術は文献で十分に説明されており、例えば：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｃｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編集、１９８４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７）；「ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｌｉ、１９９７）である。
【００３７】
定義
ここで用いている「ポリヌクレオチド」とは、いかなる長さのヌクレオチド、またはリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド、またはアナログ類の高分子形体に言及する。この用語は、分子の一次構造に言及し、すなわち二本鎖および一本鎖ＤＮＡを含み、二本鎖および一本鎖ＲＮＡも同様とする。メチル化及び／又はキャップしたポリヌクレオチドのような修飾したポリヌクレオチドをも含む。「ポリヌクレオチド」と「ヌクレオチド配列」は取り替え可能なものとして使用される。
【００３８】
ここで用いている「遺伝子」は、蛋白質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部に言及する。遺伝子は、コードしていない配列、イントロンと同じく５’と３’の側面に配置している配列（プロモーター、エンハンサー、レプレッサー、および他の制御配列など）からも構成されることも、技術的によく理解されていることである。
【００３９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」はここでは取り替え可能なものとして使用し、あらゆる長さのアミノ酸の高分子に言及する。こうした用語はまた、糖鎖付加、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通して、翻訳後に修飾された蛋白質を含む。
【００４０】
「生理的状態」は、技術的によく理解された用語であり、測定され、及び／又は観察されたいかなる状態あるいは態様を意味する。「生理的状態」は、体脂肪の程度、脱毛症（はげ）、にきびのような身体的状態、平均余命、癌や感染症のような（疾患に対する感受性または耐性を含む）疾患態様を含み、その範囲を限定しようとするものではない。生理的状態の例としては、以下に示され（例えば、「ヒトの医学的に関連する医療状態」、「ヒトの商業的に関連する状態」、「医学的に関連する進化した特徴」、および「商業的に関連する進化した特徴」の定義を参照）、および明細書を通して提示され、また、これらの用語や例は生理的状態に言及することが理解される。ある生理的状態は、必ずしも必然的であるとは言えないが、多因子の結果であり、そのうちのいずれかが、引き続いて１つの生理的状態とみなされる。ヒトまたはヒト以外の霊長類に「存在」する生理的状態は、一定の個体群の中で進行し、他の個体群と比較した場合、一定の個体群に特有であり、及び／又は強められる生理的状態を含む。
【００４１】
「ヒトの医学的に関連する状態」または「ヒトの商業的に関連する状態」という用語は、医学的または非医学的（それぞれに対応）な介入が望まれるヒトの状態に言及するのにここでは使用する。
【００４２】
「医学的に関連する進化した特徴」という用語は、ヒトまたはヒト以外の霊長類で進化した特徴に言及するものとしてここでは使用し、その解析は、ヒトの医学的治療法の開発に関連する情報（例えば、身体的または生化学的データ）を提供し得る。
【００４３】
「商業的に関連する進化した特徴」という用語は、ヒトまたはヒト以外の霊長類で進化した特徴に言及するものとしてここでは使用し、その解析は、ヒトが使用する非医学的産物または治療法の開発に関連する情報（例えば、身体的または生化学的データ）を提供し得る。
【００４４】
「ＫＡ／ＫＳ型方法」という用語は、相同遺伝子における非同義置換数と同義置換数間の相違であり、（常にというわけではないが）しばしば比として示され、この相違を評価する方法を意味する（非同義と同義部位を決定する、より正確な方法を含む）。これらの方法は、ＫＡ／ＫＳに限定されず、ｄＮ／ｄＳ、ＤＮ／ＤＳを含むいくつかの用語体系を用いて設計される。
【００４５】
「進化的に有意な変化」または「適用進化の変化」という用語は、正の選択的圧力に原因があるとされる２種間での１以上のヌクレオチドまたはペプチド配列の変化に言及する。進化的に有意な変化の存在を決定するための１つの方法は、ＫＡ／ＫＳ比を測定するようなＫＡ／ＫＳ型解析法を利用することである。典型的には、ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５、さらに好ましくは少なくとも約１．０、さらに好ましくは少なくとも約１．２５、さらに好ましくは少なくとも約１．５、そしてさらに好ましくは少なくとも約２．０であることが正の選択の作用を示し、そして進化的に有意な変化であると考えられる。
【００４６】
「正の進化的に有意な変化」という用語は、他の関連ある種と比較して正である適用変化に帰着する特定の種における、進化的に有意な変化を意味する。正の進化的に有意な変化の例は、ヒトにおいて強まった認知能力に帰着した変化であり、また、末期ＡＩＤＳへの進行に耐性なＨＩＶに感染したチンパンジーの能力に帰着したチンパンジーにおける適用変化である。
【００４７】
「耐性な」という用語は、チンパンジーのような生命体が、疾患状態及び／又は疾患の発症を避けたり、またはその程度を減らす能力を示し、好ましくは非耐性な生命体、典型的にはヒトと比較した場合による。例えば、チンパンジーはＨＩＶによるある種の影響や他のウィルスの感染に耐性であり、及び／又はチンパンジーは究極の疾患であるＡＩＤＳを発症しない。
【００４８】
「感受性」という用語は、ヒトのような生命体が、疾患状態及び／又は疾患状態の発症を避けることができず、またはその程度を減らせず、好ましくは耐性であることが知られている生命体、例えばチンパンジーのようなヒト以外の霊長類と比較した場合による。例えば、ヒトはＨＩＶによるある種の影響や他のウィルス感染、及び／又は究極の疾患であるＡＩＤＳの発症に罹りやすい。
【００４９】
耐性や感受性は個体間では様々であり、この発明の目的として、これらの用語は種内の個体群に適用し、種内比較が使用されるが、一般的に耐性と感受性の比較は、種間の全体的あるいは平均的相違に言及する。
【００５０】
「相同性」、「相同な」または「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」という用語は、技術的には知られ、十分に理解されており、共通の先祖をもち、配列同一性の程度に基づいて決定される関連した配列に言及する。これらの用語は、１つの種で見つかった遺伝子と他の種において対応しているか、または等しい遺伝子間の関係を述べている。本発明の目的としては、相同配列が比較される。「相同配列」、「相同性」または「オルソログ」は、機能的に関連するものとして考えられ、信じられ、または知られている。機能的な関係は、多くの方法の中のいずれか１つの方法で示され、例えば（ａ）配列同一性の程度；（ｂ）同じかまたは似た生物的機能により示されるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。配列同一性の程度は異なり、その程度は、好ましくは少なくとも５０％（技術的に知られた基準配列の整列プログラムを使用した場合）であり、さらに好ましくは少なくとも６０％であり、さらに好ましくは少なくとも７５％であり、さらに好ましくは少なくとも８５％である。相同性は、当技術分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラムを使用して決定することができ、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７）  増刊３０号、７．７１８章、表７．７１で検討されたものがある。好ましい整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）とＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。他の好ましい整列プログラムは、ディフォルトパラメーターを用いているＳｅｑｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００５１】
「ヌクレオチド変化」という用語は、技術的に十分に理解されているように、ヌクレオチド置換、欠失、及び／又は付加に言及する。
ここで使用される「ＡＩＤＳに対する感受性と関連」する「ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列」という用語は、ＨＩＶ播種（生命体内、すなわち生命体内での伝染性）、ＡＩＤＳの伝播及び／又は発症と関連する蛋白質をコードするヒトのヌクレオチド配列に言及する。ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症への進行の基礎をなすメカニズムの広範な研究によると、多数のヒトの候補遺伝子が１以上のこうした現象に関連するものと信じられ、または知られている。ＡＩＤＳに対する感受性と関連するポリヌクレオチド（その中にコードされるいかなるポリペプチドをも含む）配列は、ＨＩＶ播種、複製、及び／又はそれに続く末期のＡＩＤＳへの進行において役割を果たすことが知られ、または関わっている１つである。そのような候補遺伝子の例を以下に示した。
【００５２】
「ＡＩＤＳ耐性」は、チンパンジーのような生命体が、ＨＩＶ感染（伝播や播種など）を避け、またはその結果の程度を減らし、及び／又はＡＩＤＳの発症を避ける能力を提示し、好ましくはＡＩＤＳに罹りやすい人と比較した場合である。
【００５３】
ＡＩＤＳに対する「感受性」は、ヒトのような生命体が、ＨＩＶ感染（伝播や播種など）の結果及び／又はＡＩＤＳ発症を避けられず、またはその程度を減らすことができないことを意味し、好ましくは、ＡＩＤＳに耐性であることが知られる生命体、例えばヒト以外の霊長類、例えばチンパンジーと比較した場合である。
【００５４】
ここで使用される「脳蛋白質をコードするヌクレオチド配列」という用語は、蛋白質をコードする脳内で発現するヌクレオチド配列に言及する。「脳蛋白質をコードするヌクレオチド配列」の一例は、脳のｃＤＮＡ配列である。
【００５５】
ここで使用される「ヒトにおいて特有のまたは強まった脳機能」、「ヒト脳の特有の機能的能力」または「ヒトにおいて特有であり、または強められる脳の機能的能力」という用語は、その種類または程度において、他のヒト以外の霊長類と比較して、ヒトで強められることが同定され、及び／又は観察されるいかなる脳機能に言及される。そのような脳機能は、高度な情報処理能力、貯蔵および修復能力、創造性、記憶、言語能力、脳を介した情緒反応、運動、苦痛／快感、嗅覚、および気性を含むが、それらに限定しようとするものではない。
【００５６】
「ハウスキーピング遺伝子」は、技術的に十分に理解された用語であり、増殖、分化、静止、代謝、及び／又は死を含むが、それらに限定しようとするものではなく、全般的な細胞機能と関連する遺伝子を意味する。「ハウスキーピング」遺伝子は、一般的に１以上の細胞種で見つかった機能を果たす。対照的に、細胞特異的遺伝子は、一般的に、特定の細胞種（神経系など）及び／又はクラス（神経細胞など）で機能する。
【００５７】
ここで使用される「剤」は、単一のまたは混合の有機分子または無機分子、ペプチド、蛋白質、またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的な化合物を意味する。巨大な数の一連の化合物、例えば、オリゴペプチドやオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー、および多種の核構造に基づいた合成有機化合物および無機化合物が合成され、これらも「剤」という用語に含まれる。さらに、植物や動物抽出物などの様々な自然資源は、スクリーニング用の化合物を提供する。化合物は、単一または他の化合物との組み合わせで試験され得る。
【００５８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調節すること」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が、剤を添加していない場合と比べて変化することを意味する。調節は、機能に影響するいかなるレベルでも起こり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能は直接的または間接的であり、および直接的にまたは間接的に測定される。
【００５９】
「ポリヌクレオチドの機能」は、複製、翻訳、発現パターンを含むが、それらに限定しようとするものではない。ポリヌクレオチド機能はまた、そのポリヌクレオチド内にコードされたポリペプチドと関連する機能を含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、蛋白質の発現、コンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、制御及び／又は蛋白質構造または機能の他面に影響する剤は、ポリヌクレオチド機能を調節したと考えられる。
【００６０】
「ポリペプチドの機能」は、コンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、制御及び／又は蛋白質構造または機能の他面を含むが、それらに限定しようとするものではない。例えば、ポリペプチドに作用し、コンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他の分子（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、制御及び／又は蛋白質構造または機能の他面に影響する剤は、ポリペプチド機能を調節したと考えられる。有効な剤がポリペプチドの機能を調節するように作用する目安は、１）コンフォメーション、フォールディングまたは他の物理的特徴を変化させること、２）本来のリガンドに対する結合力を変化させ、あるいはリガンドへの結合の特異性を変化させること、および３）ポリペプチドの活性を変化させることを含むが、それらに限定しようとするものではない。
【００６１】
ここで使用している「ＡＩＤＳの発症に対する感受性を調節する」および「ＡＩＤＳの発症に対する耐性を調節する」という用語は、生命体内での細胞間のＨＩＶ伝達または感染を調節することを含む。さらにこれらの用語は、ＡＩＤＳの発症及び／又はＨＩＶの細胞間伝達または感染に対する感受性を減らすことを含む。さらにこれらの用語は、ＡＩＤＳの発症及び／又はＨＩＶの細胞間伝達または感染に対する耐性を増加させることを含む。ある剤がＡＩＤＳの発症に対する感受性または耐性を調節するものであるかどうか評価する１つの手段は、ここで述べた細胞を基礎としたシステムを適切な対照と比較して用いることであり、ＨＩＶ感受性の少なくとも１つの指標が影響されるかどうかを測定することである。ＨＩＶ感受性の特徴は、ＨＩＶに感染した細胞の全体数と融合細胞の形成によって測定されるので、ウィルスの細胞間伝達を含むが、それらに限定しようとするものではない。
【００６２】
「標的部位」という用語は、例えば、結合部位、二量化ドメイン、または触媒活性部位といった構造及び／又は機能中心の単一のアミノ酸であり、及び／又はその一部であるポリペプチドでのある位置を意味する。標的部位は、治療薬のように、剤との直接的または間接的相互作用に有効である。
【００６３】
「分子相違」という用語は、いかなる構造的及び／又は機能的な相違を含む。そのような相違を検出するための方法は、そのような相違の例と同様に、ここに記載されている。
【００６４】
「機能的効果」は、技術的に十分知られた用語であり、直接的か間接的かを問わず、いかなる活性レベルで示されるいかなる効果をも意味する。
技術的に知られた一般的方法
本発明の目的に対して、ヒトおよびヒト以外のポリヌクレオチドの供給源は、例えば遺伝子配列またはｃＤＮＡ配列のようないかなる適切な供給源でもあり得る。好ましくは、ヒトおよびヒト以外の霊長類から得たｃＤＮＡ配列が比較される。ヒト蛋白質をコードする配列は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  ＢａｎｋおよびＧｅｎＢａｎｋのような公開データベースから得られる。これらのデータベースは、進行中の研究成果によって発生する分子配列データの貯蔵場所としての役割を担っている。選択的に、ヒト蛋白質をコードする配列は、例えば、技術的に良く知られた方法に従って、ヒト細胞で発現したｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡの配列、またはＰＣＲ増幅後の配列から得られる。選択的に、ヒトゲノムの配列は、配列比較に使用することができる。ヒトゲノムの配列は、公開データベース、商業的に利用可能なヒトゲノムＤＮＡライブラリーの配列、またはＰＣＲ後のゲノムＤＮＡから得ることができる。
【００６５】
ヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列は、例えば、ヒト以外の霊長類のｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンをシークエンシングすることによって得られる。ヒト以外の霊長類のｃＤＮＡライブラリーは、技術的に標準的な技術を用いて、霊長類の細胞内で発現したトータルｍＲＮＡから構築することができる。いくつかの態様では、ｃＤＮＡは、限定した発生段階での組織、または霊長類がある環境条件下に置かれた後に得た組織からのｍＲＮＡから調製される。本発明の配列比較で使用されるｃＤＮＡライブラリーは、技術文献で十分に説明されている、決まりきったｃＤＮＡライブラリー構築技術を用いて構築され得る。トータルｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを逆転写するために鋳型として使用される。転写したｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーを確立するために適切なベクターにサブクーロンされる。全長より短いｃＤＮＡは使用できるが、確立したｃＤＮＡライブラリーは、全長ｃＤＮＡも内容物とするように最大化される。さらに、配列頻度は、例えばＢｏｎａｌｄｏら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：７９１−８０６，  １９９６）に従って標準化される。構築したｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンは、標準的な自動シークエンシング技術を用いてその配列を決定することができる。好ましくは、全長ｃＤＮＡクローンがシークエンシングに使用される。ｃＤＮＡライブラリーから得たｃＤＮＡクローンの全体または大部分をシークエンシングするが、１つのｃＤＮＡクローンまたはいくつかのｃＤＮＡクローンのような少数クローンをシークエンシングすることによって、この発明のいくつかの態様を実行することもできる。
【００６６】
本発明の好ましい１つの態様では、シークエンシングされるべきヒト以外の霊長類のｃＤＮＡは、それらの発現特異性に従って、あらかじめ選択され得る。特異的に発現した活性遺伝子に対応するｃＤＮＡを選択するために、同じ動物の他の器官、組織または細胞から得たｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをサブトラクションハイブリダイゼーションにかけることができる。適切な緊縮および濃度を有するある種のハイブリダイゼーションの条件下で、組織非特異的なｍＲＮＡでハイブリダイズすることで、「ハウスキーピング」遺伝子を表しているようなｃＤＮＡをｃＤＮＡプールから取り除くことができるであろう。したがって、シークエンシングされるべき残りのｃＤＮＡは、組織特異的機能と最も関連がありそうなｃＤＮＡである。サブトラクションハイブリダイゼーションの目的として、組織非特異的なｍＲＮＡは１つの器官、または好ましくは異種の器官と細胞を混ぜ合わせたものから得られる。組織非特異的なｍＲＮＡの量は、組織特異的ｃＤＮＡを飽和するように最大化して用いる。
【００６７】
選択的に、オンラインの公開データベースからの情報は、特異的機能と最も関連がありそうなｃＤＮＡを選択し、あるいは優先順位をつけるのに使用される。例えば、シークエンシング用のヒト以外の霊長類のｃＤＮＡ候補は、候補となるヒトｃＤＮＡ配列から設計したプライマーを用いたＰＣＲによって選択される。候補のヒトｃＤＮＡ配列は、例えば、脳のような特定の組織のみで見つけられるものであり、または脳機能のような特定の機能で重要でありそうな遺伝子に対応したものである。そのようなヒト組織特異的なｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋのようなオンラインのヒト配列データベースを検索することによって得られ、データベース中にｃＤＮＡ配列の発現プロフィール及び／又は生物的活性に関しての情報が特定されている。
【００６８】
既知のヒト遺伝子に相同性のあるヒト以外の霊長類の（例えば、ＡＩＤＳ耐性のヒト以外の霊長類から得た）配列は、技術的に標準的な方法を用いて得られ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのような公開データベースまたはＰＣＲ法（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて）から得られる。例えば、シークエンシング用のヒト以外の霊長類のｃＤＮＡ候補は、候補のヒトｃＤＮＡ配列から設計したプライマーを用いたＰＣＲによって選択され得る。ＰＣＲ用のプライマーは、技術的に標準的な方法を用いてヒトの配列から作製することができ、ＰＲＩＭＥＲ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のような公衆に利用可能なプライマー設計プログラムを含む。その後、増幅した配列は、技術的に標準的な方法や装置、例えば自動化シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いてシークエンスされる。
【００６９】
発明の一般的な方法
本発明の一般的な方法は、以下のとおりである。簡単には、ヒトの供給源およびヒト以外の霊長類の供給源からヌクレオチド配列を得る。相同性のある配列を同定するために、ヒトおよびヒト以外の霊長類の配列を互いに比較する。相同的な配列は、２種間で核酸配列の相違がある配列を同定するために解析される。その後、分子進化解析が、その相違の進化的有意性を定量的および定性的に評価するためになされる。２種間、例えばヒトとチンパンジーで正に選択された遺伝子に対して、その相違が他のヒト以外の霊長類で起こるかどうかを決定することは有効である。次に、その配列は、分子的／遺伝的同一性および生物的機能に関して特徴づけられる。最後に、その情報は、ヒトの医学的または商業的に関連する状態の診断法および治療法に有効な剤を同定するために使用され得る。
【００７０】
本発明の一般的方法は、ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列とヒト以外、好ましくは霊長類、最も好ましくはチンパンジーの蛋白質をコードするヌクレオチド配列とを比較することを要する。他のヒト以外の霊長類の例は、コビトチンパンジー、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、旧世界ザル、および新世界ザルである。霊長目ヒト上科内の霊長類に対する系統樹を図１に示す。バイオインフォマティックスを比較に応用して、進化的に有意な変化であるヌクレオチド変化を含む配列が選択される。本発明は、ある進化的な利点を付与するように進化した遺伝子の同定および特異的に進化した変化の同定を可能にする。
【００７１】
ヒトおよび他のヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列は、相同配列を同定するために比較される。この比較を完成するためのいかなる適切なメカニズムも、本発明によって意図される。並列は、手作業でも、ソフトウェア（適切な整列プログラムの例は技術的に知られている）でも行うことができる。好ましくは、ヒト以外の霊長類から得た蛋白質をコードする配列は、データベース検索、例えばＢＬＡＳＴ検索などによるヒト配列と比較される。高い得点である「ヒット件数」、すなわちＢＬＡＳＴ解析後に有意に類似していることを示す配列は、回収され、解析されるであろう。有意な類似性を示している配列は、配列同一性が少なくとも約６０％であり、さらに好ましくは少なくとも約７５％であり、さらに好ましくは少なくとも約８０％であり、さらに好ましくは少なくとも約８５％であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％である配列である。好ましくは、約８０％以上の同一性を示す配列は、さらに解析される。データベース検索によって同定された相同配列は、技術的に知られ、利用可能な配列整列法およびプログラム、例えば一般的に使用されている簡単な整列プログラムであるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓらによる、ＣＡＢＩＯＳ  ８；１８９−１９１）を用いて配列の全体が並べられる。
【００７２】
選択的に、ヒトとヒト以外の霊長類間の蛋白質をコードする配列のシークエンシングと相同性比較は、新しく開発されたシークエンシングチップ技術を用いて同時に実行される。例えば、Ｒａｖａら、米国特許第５，５４５，５３１号を参照。
【００７３】
並べられたヒトと他のヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列は、特定の場所でのヌクレオチド配列の相違を同定するために解析される。一方、この解析を達成するためのいかなる適切な方法も、本発明によって意図される。ヌクレオチド配列に相違がないならば、ヒト以外の霊長類の蛋白質をコードしている配列を、通常はそれ以上解析しない。検出された配列の変化は、一般的に、および好ましくは初めに精度のために確認される。好ましくは、最初の確認は、次の段階の１つ以上を実行することを含み、これらのいずれかないし全ては技術的に知られたものである：（ａ）ヒト以外の霊長類とヒトの配列間で変化が存在する点を見つけること；（ｂ）ヒト以外の霊長類に特有であると思われる塩基類が呼応する塩基に対して特異的で強く明確な信号に一致するかどうかを決定するために配列のフルオログラム（クロマトグラム）を確認すること；（ｃ）配列変化に対応するヒトの配列が１以上かどうかを見るためにヒトのヒット件数を確認すること。ヒト以外の霊長類の配列に異なるヌクレオチドが存在する位置に同じヌクレオチドを有する同じ遺伝子に対する多様なヒト配列の登録は、そのヒトの配列が正確であり、およびその変化が有意である独立の支持を提供する。そのような変化は、こうしたヌクレオチド配列変化がコードされた蛋白質のアミノ酸配列における変化に起因するのかどうかを決定するために、公開データベース情報と遺伝子コードを用いて調べられる。「ヌクレオチド変化」の定義は明らかなので、本発明は、ヒト以外の霊長類から得た、対応している配列と比較して、ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列中に置換、欠失、または付加といった少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。好ましくは、その変化はヌクレオチド置換である。さらに好ましくは、１以上の置換が、同定されたヒト配列中に存在し、分子進化解析に委ねられる。
【００７４】
いくつかの異なる分子進化解析のいずれか、またはＫＡ／ＫＳ型方法が、ヒト遺伝子配列とヒト以外の霊長類の遺伝子配列間で同定されたヌクレオチド変化の進化的有意性を定量的および定性的に評価するために使用され得る（Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＡｋａｓｈｉ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｃｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  ２６：４０３−４２２，  １９９５；Ｌｉ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ，  １９９７）。例えば、蛋白質に関する正の選択（すなわち、分子レベルの適用進化）は、非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換数（ＫＡ）と同義部位当りの同義置換数（ＫＳ）の比の対の比較によって、蛋白質をコードする遺伝子中に検出され得る（Ｌｉら、１９８５；Ｌｉ、１９９３）。ＫＡとＫＳの２変数を比として比較することはとりわけ便利であり、最も有効的であるが、ＫＡとＫＳのいかなる比較も使用される。配列は、標準の統計学的方法を用いてＫＡとＫＳ間の統計的な有意差を示すことによって同定される。
【００７５】
種間の正に選択された遺伝子を検出できる他の解析プログラムも使用できるが、好ましくは、ＬｉらによるＫＡ／ＫＳ解析が本発明を実行するために使用される（Ｌｉら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２：１５０−１７４，  １９８５；さらにＬｉ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６−９９，  １９９３も参照；Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７；Ｎｅｉ、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），  １９８７）。ＫＡ／ＫＳ法は、比に関して相同蛋白質をコードする遺伝子領域間で非同義部位当りの非同義置換率と同義部位当たりの同義置換率を比較することからなり、進化中に中立選択に対立して適応選択によって余儀なくされた配列置換を同定するのに使用される。同義（「静の」）置換は、遺伝子コードの縮重に起因し、コードされたアミノ酸配列には何ら変化がないものをいい、非同義置換はアミノ酸置換に帰着する。各タイプの変化の程度は、ＫＡとＫＳ、それぞれ同義部位当たりの同義置換数と非同義部位当たりの非同義置換数として評価され得る。ＫＡ／ＫＳの計算は、手作業でもソフトウェアを用いても行うことができる。適切なプログラムの例は、ＭＥＧＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）である。
【００７６】
ＫＡとＫＳを評価する目的として、完全または部分的にヒト蛋白質をコードする配列が、同義置換と非同義置換の総数を計算するのによく使用され、非同義部位と同義部位と同様である。解析されたポリヌクレオチド配列の長さは、いかなる適当な長さであり得る。好ましくは、いずれかないしは全ての有意変化を決定するために、全コード配列が比較される。Ｌｉ９３  （Ｌｉ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６−９９，  １９９３）またはＩＮＡのような公衆に利用可能なコンピュータプログラムは、全ての対比較に対してＫＡとＫＳを計算するために使用され得る。この解析はさらに、少数の重要な変化が全配列によって隠されないように「引き窓」式に配列を調べるために適用する。「引き窓」は、連続的で、重なっている遺伝子の小区分の調査に言及する（小区分はいかなる長さにもなり得る）。
【００７７】
非同義置換率と同義置換率の比較は、ＫＡ／ＫＳ比によって表わされる。ＫＡ／ＫＳは、適用進化が研究中の配列において作用したという程度の反映であることを示した。コードしている配列の全長または断片は、ＫＡ／ＫＳ解析に使用することができる。ＫＡ／ＫＳ比が高くなるにつれ、１つの配列が適応進化を受け、非同義置換が進化的に有意であるということが尤もらしくなる。例えば、Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ  （１９９７）を参照。好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は、少なくとも約０．７５であり、さらに好ましくは少なくとも約１．０、さらに好ましくは少なくとも約１．２５、さらに好ましくは少なくとも約１．５０、さらに好ましくは少なくとも約２．００である。好ましくは、統計学的解析は、全ての高いＫＡ／ＫＳ比について行い、Ｙａｎｇ（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３７：４４１−４５６，  １９９８）によって述べられた学生のｔ検定や尤度比検定のような標準方法を含み、その範囲に限定されるものではない。
【００７８】
１より十分に大きなＫＡ／ＫＳ比は、正の選択が、偶然のみの結果として期待され得たよりも多数のアミノ酸置換を固定し、その比が１以下である一般に観察されるパターンとは対照的であることを強く示唆している（Ｎｅｉ、１９８７；Ｈｕｇｈｅｓ及びＨｅｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：１６７−１７０，  １９９８；Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ４：９１１−９１３，  １９９４；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＡｋａｓｈｉ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｅｃｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  ２６：４０３−４２２，  １９９５；Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、１９９７）。１より小さな比は、一般的に、負の役割、または選択を純化することを意味する：機能的で効果的蛋白質の一次構造において変化しないままであるという強い力が存在する。
【００７９】
ＫＡ／ＫＳ比を計算するためのいかなる方法も、関連する種から得た蛋白質をコードする相同遺伝子の領域に対して、非同義部位当たりの非同義置換数と同義部位当たりの同義置換数の対比較に基づいている。各方法は、「多数のヒット件数」（すなわち、同じ位置に１以上のヌクレオチド置換がある）を評価するために異なる修正を履行する。各方法はまた、進化時間中、ＤＮＡ配列がどのように変化するのかに対する異なるモデルを使用する。つまり、好ましくは、異なるアルゴリズムから得られた結果の組み合わせは、正に選択された遺伝子の検出感度とその結果の信頼性のレベルを上げるのに使用される。
【００８０】
好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は、パラロガス（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ）遺伝子対に対するオルソロガス遺伝子対（すなわち、遺伝子重複の結果である遺伝子とは反対に、種分化に由来する遺伝子）として計算されるべきである（Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ，  １９９７）。この区別は、ゴリラやオランウータンのような他のヒト以外の霊長類でさらに比較を行うことによってなされ、系統樹の作成に許容する。系統樹作成で使用されるオルソロガス遺伝子は、既知の「種の樹」を与え、すなわち、既知の生物的な樹を生き返らせる樹を生産するであろう。対照的に、パラロガス遺伝子は、既知の生物学的な樹を侵害する樹を生むであろう。
【００８１】
ここに記載した方法は、ヒト蛋白質をコードする配列に機能的に関連するヒトのポリンヌクレオチド配列の同定に導けたことは理解される。そのような配列は、コードしていない配列またはヒト蛋白質をコードしていないコードする配列を含み、その範囲を限定しようとするものではない。例えば、これらの関連した配列は、ヒトゲノム中のヒト蛋白質をコードする配列、例えばイントロン、または５ ’−および３ ’−側面に配置している配列（プロモーターおよびエンハンサーのような制御因子を含む）に物理的に隣接し得る。これらの関連した配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような公開ヒトゲノムデータベースを検索することにより、または選択的に、１つの蛋白質をコードする配列をプローブとして使用し、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングおよびシークエンシングすることによって得られる。関連したコードする配列を用いてコードしていない配列を得るための方法および技術は、当業者にとって十分に知られている。
【００８２】
進化的に有意なヌクレオチド変化は、ＫＡ／ＫＳ解析のような分子進化解析によって検出されるが、ヒト（またはヒト以外の霊長類）においてそれらの特有な発生、またはヒト（またはヒト以外の霊長類）においてそれらの変化が特有であるという程度に対して、さらに評価され得る。例えば、他のヒト以外の霊長類の配列で有無に対して、同定した変化を試験され得る。ヒトとヒト以外の霊長類間で少なくとも１つの進化的に有意な変化を有する配列は、他のヒト以外の霊長類蛋白質をコードする配列のＰＣＲ解析に対するプライマーとして使用され、結果として得られたポリヌクレオチドは、同じ変化が他のヒト以外の霊長類に存在するかどうかを調べるためにシークエンスされる。さらに、これらの比較は、適応進化の変化が他のヒト以外の霊長類と比較してヒトのリネージに特有であるのか、あるいは適応変化がヒトおよび他のヒト以外の霊長類と比較して、ヒト以外の霊長類（すなわちチンパンジー）に特有であるのかについて区別を許容する。他の霊長類ではなくヒトにおいて検出されるヌクレオチド変化は、ヒトの適応進化の変化を尤もらしく表している。選択的に、ヒト以外の霊長類で検出され、またはヒト若しくは他のヒト以外の霊長類では検出されないヌクレオチド変化は、チンパンジーの適用進化の変化を尤もらしく表している。比較のために使用された他のヒト以外の霊長類は、ヒトとの系統的な関係に基づいて選択され得る。密接に関連した霊長類は、チンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンのような霊長目ヒト上科サブリネージ内の霊長類であり得る。ヒト以外の霊長類はまた、霊長目ヒト上科から外れ、すなわち、旧世界ザルや新世界ザルのように、ヒトにそれほど密接に関連しない。そのような比較の統計的有意性は、確立した利用可能なプログラム、例えばＭｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ（Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７）によって使用されたようなｔ検定を用いて決定される。統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示すそうした遺伝子は、適応進化を受けたようである。
【００８３】
有意変化を有する配列は、その配列変化が１以上のヒト個体群によって共有されるかどうかを調べるために、複数のヒト個体群から得たゲノムにおいて、プローブとして使用され得る。異なるヒト個体群から得た遺伝子配列は、例えばＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ヒトゲノム多様性プロジェクトによって利用可能となったデータベース、または選択的に、多数の関連していない異なったヒト個体群から得たＤＮＡをＰＣＲで増幅し、直接的なシークエンシングから得られる。さらに、異なるヒト個体群内で同定された変化の存在は、その変化の進化的有意性を示すであろう。有意変化を有するチンパンジーの配列は、配列変化が多くのチンパンジーで共有されるかどうかを決定するために同じような方法を用いて得られ、また評価され得る。
【００８４】
種間で有意変化を有する配列は、通常の知識を有する者に知られた方法や技術を用いて、それらの分子的／遺伝子的同一性および生物的機能に関して、さらに特徴づけられる。例えば、その配列は、公衆に利用可能となったバイオインフォマティックスプログラムを用いて、ヒトゲノム内で遺伝学的および物理的に位置づけられる。そのヌクレオチド配列内で新しく同定された有意変化は、ヒトの進化における遺伝子の潜在的な役割とヒトで特有の機能的能力との潜在的な関連を示唆するものである。その同定した配列を有する推定遺伝子は、例えば、相同性検索によってさらに特徴づけられる。その推定遺伝子と既知の遺伝子の共有した相同性は、同じような生物的役割または機能を示すものといえる。推定遺伝子配列を特徴づけるための別の典型的な方法は、既知の配列モチーフに基づいている。ある種の配列パターンは、シグナル配列、ＤＮＡ結合ドメイン、またはトランスメンブレンドメインのように特異的な生物的特徴を有する蛋白質の領域に対してコードしていることが知られている。
【００８５】
有意変化を有するヒトの同定した配列はまた、組織または細胞種特異性という点で遺伝子が発現している場所を調べることによってさらに評価され得る。例えば、同定したコード配列は、配列の発現パターンを示すｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを行うためのプローブとして使用され得る。ある種の組織内で発現する遺伝子は、例えば脳組織のように、その組織と関連する重要なヒトの機能と関係しているものとして、より良い候補者となり得る。ヒトの発生の各段階における遺伝子発現の時期も決定され得る。
【００８６】
配列の特徴づけの別の典型的な方法として、有意変化を有する同定したヌクレオチド配列の機能的役割は、同定された遺伝子の異なる対立遺伝子に対する機能的アッセイを、酵母、線虫、ショウジョウバエ、およびマウスのようなモデルシステムで行うことによって評価され得る。モデルシステムは、細胞を基本としたシステム、あるいはトランスジェニック動物のようなｉｎ  ｖｉｖｏでシステムである。好ましくは、トランスジェニックマウスが使用される。細胞を基本としたシステム、及び／又はトランスジェニック動物システムを作成する方法は、技術的に知られ、ここでは詳細に記載するに及ばないものである。
【００８７】
配列の特徴づけの別の典型的な方法として、コンピュータプログラムが、ヒトおよびチンパンジーから得た相同蛋白質の３次元構造をモデル化したり、目に見えるように許容される。アミノ酸がチンパンジーの蛋白質で置換されていたという特別で正確な理解が、機能的相違と関連する構造変化の検出を許容する。つまり、モデリング技術の使用は、前段落で議論した機能的役割の同定と密接に関連する。こうした技術の１個または組み合わせによる使用が、本発明の部分を構成する。チンパンジーのＩＣＡＭ−３は、ヒトのＩＣＡＭ−３がプロリン残基（Ｐ１０１）をなす箇所でグルタミン残基（Ｑ１０１）からなる。ヒトの蛋白質は、この地点で鋭く湾曲していることが知られている。チンパンジーの蛋白質でグルタミンをプロリンに置換することは、この地点で、それほどではないにせよ、鋭く湾曲する結果になるようである。これは、ＩＣＡＭ−３のチンパンジー蛋白質をＨＩＶウィルスにパッケージすることに明らかに密接な関係がある。
【００８８】
この中に記載した方法によって同定した配列は、医学的または商業的に関連するヒトの状態の診断法および治療法に重要な用途を有する。したがって、本発明は、こうした配列の使用により、ヒトに独特なまたはヒトで強まった機能的能力を調節し、及び／又はこうした配列中の欠失を訂正することに有効な剤を同定するため方法を提供する。これらの方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステム、細胞を基礎とした発現システム、およびトランスジェニック動物システムのような技術的に知られたスクリーニング技術を使用する。本発明によって提供されるアプローチは、進化した遺伝子を即座に同定するだけでなく、その遺伝子が他の種にも存在するため、あまり毒性でないような蛋白質に対してなされる調節も指摘する。
【００８９】
スクリーニング法
本発明はまた、上述した方法を用いて同定したおよび特徴づけたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用したスクリーニング法を提供する。これらのスクリーニング法は、ヒトの治療法に対して有効であるようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調節する剤を同定するために有効である。一般的に、その方法は、上述した方法によって同定したポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞、またはそのようなポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの調製物で試験した少なくとも１つの剤を接触することを必要とし、ここで剤は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチドの機能を調節する能力によって同定される。
【００９０】
ここで使用しているように、「剤」という用語は、単一または複合化した有機分子または無機分子、ペプチド、蛋白質またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的な化合物を意味する。化合物の巨大な整列は、例えば、オリゴペプチドやオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー、および多種の核構造を基本にした合成有機化合物または合成無機化合物のように合成され、これらはまた「剤」という用語に含まれる。さらに、植物や動物抽出物などの様々な自然資源は、スクリーニングのための化合物を提供する。化合物は、単独で、またはお互いに組み合わせて試験され得る。
【００９１】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調整する」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が、剤を添加していない場合と比べ、変化していることを意味する。調節は、機能に影響するいかなるレベルでも起こり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接的または間接的であり、また直接的または間接的に測定され得る。ポリヌクレオチドの「機能」は、置換、転写、および発現パターンを含み、それらの範囲に限定されるものではない。ポリヌクレオチド機能は、ポリヌクレオチド内にコードされたポリペプチドに関連する機能も含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、蛋白質の発現、コンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（他の機能的特徴）、蛋白質の構造や機能の制御及び／又は他の側面に影響する剤は、ポリヌクレオチド機能を調節したと考えられる。効果的な剤が、ポリヌクレオチドの発現を調節するために作用するやり方は、１）ポリヌクレオチドにおいて転写因子反応要素への転写因子の結合を変化させること；２）ポリヌクレオチドの発現に必要な２種の転写因子間の相互作用を変化させること；３）細胞核に入るためのポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子の能力を変化させること；４）ポリヌクレオチドの転写に関係する転写因子の活性を阻害すること；５）通常、リガンドと相互作用し、リガンドの結合が、ポリヌクレオチドの発現に起因する細胞表面受容体を変化させること；６）ポリヌクレオチドの発現に至る情報伝達カスケードの構成要素の相互作用を阻害すること；および７）ポリヌクレオチドの転写に関係する転写因子の活性を増強することを含み、その範囲を限定しようとするものではない。
【００９２】
ポリペプチドの「機能」はコンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、及び／又は蛋白質の構造若しくは機能の多面を含み、その範囲を限定しようとするものではない。例えば、ポリペプチドに作用し、そのコンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、及び／又は蛋白質の構造若しくは機能の多面に影響を与える剤は、ポリペプチド機能を調節したと考えられる。効果的な剤が、ポリペプチドの機能を調節するために作用し得るやり方は、１）コンフォメーション、フォールディング、または他の物理的特徴を変化すること；２）通常のリガンドへの結合力を変化させ、またはリガンドに結合特異性を変化させること；および３）ポリペプチドの活性を変化させることを含み、その範囲を限定しようとするものではない。
【００９３】
一般に、スクリーニングされるべき剤の選択は、いくつかのパラメーター、例えば特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的、その知覚される機能、その３次元構造（もし知られているか、推定されるなら）、および合理的な薬剤設計の他面によって支配される。コンビナトリアナル・ケミストリーの技術も候補の無数の組合せを生むのに使用され得る。当業者は、試験のために適切な剤を発明し、及び／又は入手することができる。
【００９４】
この中で記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイは、典型的なドラッグスクリーニングアッセイに勝っていくつかの利点を有する：１）ある剤が期待された治療効果を達成するために細胞に入れなければならない場合、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、その剤が細胞に入ることができるかについて指示を与え得る：２）ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイは、剤がアッセイシステムに添加させる状態で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能を調節することに関係する少なくとも１つの特徴を導き出す効果がないような剤でも、一度細胞内に入ると効果的な剤になるといったように細胞の構成要素によって調節される剤を同定し得る：３）最も重要であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイシステムは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能と関連する特徴に最終的に起因する経路のいかなる構成要素にも影響を与える剤の同定を可能にする。
【００９５】
一般に、スクリーニングは、本発明の方法を用いて同定したポリヌクレオチドで形質転換した適切な細胞試料に剤を添加し、その効果、すなわち、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド内にコードされたポリペプチドの機能の変化を追跡することによって行うことができる。実験は、好ましくは、候補剤を受けない対照試料を含む。それ後、処理細胞および未処理細胞は、どの適当な表現型の特徴によっても対比され、顕微鏡解析、生存性試験、複製能力、組織学的試験、細胞と関連する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物によって発現した酵素活性レベル、ＨＩＶのような感染性の剤にさらされた時の細胞との相互作用、および他の細胞や化合物と相互作用する細胞の能力を含み、その範囲を限定しようとするもではない。例えば、形質転換された細胞は、試験すべき剤にさらされ、剤の処置前、処置中、処置後で、細胞はＨＩＶのようなウィルスに感染され、ウィルス感染に対する細胞の感受性のいかなる指示をも試験され、例えば、細胞間でのウィルス感染に対する細胞の感受性、ウィルスの複製、ウィルス蛋白質の産生、及び／又はウィルスによる感染に続く融合細胞の形成を含む。処理細胞と未処理細胞間の相違は、候補剤に起因した影響である。最適には、その剤が対照細胞より実験細胞に大きな効果を有している。適切な宿主細胞は、真核細胞で、好ましくは、哺乳類の動物細胞を含み、その範囲を限定しようとするものではない。細胞の選択は、少なくとも部分的には、企図したアッセイの性質によるであろう。ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートする剤に対して試験するために、ポリヌクレオチドが発現するような（ここで使用する発現とは翻訳及び／又は転写を含む）関心あるポリヌクレオチドで形質転換された適切な宿主細胞が、試験すべき剤に接触される。ある剤は、ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの増加した発現に起因する能力に対して試験されるであろう。ベクターの作成や形質転換の方法は、技術的によく知られている。「トランスフェクション」は、外因性の配列を導入するいかなる方法、例えば、リポフェクション、導入、感染、または電気穿孔法を含む。外因性のポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター（プラスミドのような）として維持されるか、あるいは宿主ゲノム内に組込まれるかもしれない。
【００９６】
転写を特異的に活性化する剤を同定するために、転写制御領域をレポーター遺伝子に結合し、その構造物を適切な宿主細胞に添加する。ここで使用する「レポーター遺伝子」という用語は、同定され得る遺伝子産物（すなわち、レポーター蛋白質）をコードする遺伝子という意味である。レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびグリーンフルオロレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）を含み、その範囲を限定しようとするものではない。レポーター遺伝子産物の同定法は、酵素アッセイおよび蛍光定量アッセイを含み、その範囲を限定しようとするものではない。それらの産物を検出するためのレポーター遺伝子やアッセイは、技術的に良く知られ、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）や周期的な改訂で記載されている。レポーター遺伝子、レポーター遺伝子アッセイ、および剤キットも商業源から容易に利用可能である。適切な細胞の例は、真菌、酵母、哺乳類、および他の真核細胞を含み、その範囲を限定しようとするものではない。通常の知識を有する者は、真核細胞にトランスフェクトするための技術であって、ウィルスベクターのような適切なベクターの調製を含み、電気穿孔法などによって細胞内にベクターを導入し、例えばレポーターまたは薬剤感受性因子を用いて形質転換した細胞を選択することに対して十分通じているだろう。こうした構造物における制御領域からの転写における剤の効果は、レポーター遺伝子産物の活性を通して評価されるであろう。
【００９７】
上述したように通常抑制される条件下での発現の増加を除いて、通常に発現する場合には、発現が減少する。ある剤は、転写率における減少を通してこれを達成し、上述したレポーター遺伝子システムはこのためのアッセイ手段となるであろう。そのような剤をアッセイするための宿主細胞は、発現に寛容である必要があるだろう。
【００９８】
（関心のあるポリヌクレオチドから得た）ｍＲＮＡを転写する細胞は、ｍＲＮＡの半減期及び／又はｍＲＮＡの翻訳を特異的に調節する剤を同定するために使用され得る。そのような細胞はまた、ポリペプチドの進行中及び／又は翻訳後の修飾における剤の効果をアッセイするために使用される。剤は、ポリペプチドの代謝回転（すなわち、半減期の増減）を変更することによって、細胞内のポリペプチド量を調節し得る。ｍＲＮＡとポリペプチドに関する剤の特異性は、剤がない場合の産物を調べ、関連しないｍＲＮＡおよびポリペプチドの産物を調べることによって決定される。ｍＲＮＡの半減期、蛋白質加工、および蛋白質の代謝回転を調べる方法は、当業者にとって十分知られている。
【００９９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法はまた、ポリペプチドとの直接的な相互作用を通じてポリペプチド機能を調節する剤を同定するこのにも有効である。そのような剤は、通常のポリペプチド−リガンド相互作用を遮断し、もしあれば、そのような相互作用を強め、または安定化させることができるであろう。そのような剤はポリペプチドのコンフォメーションも変化させ得る。その剤の効果は、免疫沈降反応を用いて決定することができる。適切な抗体は、ポリペプチドとそれに強固に関係するいかなる蛋白質をも沈降するのに使用される。処理細胞と未処理細胞から免疫沈降したポリペプチドを比較することによって、もしあれば、ポリペプチド−リガンド相互作用を増加または阻害する剤が同定される。ポリペプチド−リガンド相互作用はまた、ポリペプチド間の密接であるが、共有結合でない相互作用を共有結合的な相互作用に変換する架橋剤を用いてアッセイされ得る。蛋白質−蛋白質間相互作用を調べる技術は、当業者に十分知られている。蛋白質コンフォメーションをアッセイする技術も当業者に十分知られている。
【０１００】
スクリーニング法は、無細胞系での転写および翻訳システムのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関係することも理解されている。こうしたシステムにおいて、転写または翻訳が起こることが許容され、剤が機能を調節する能力に対して試験される。ある剤がｍＲＮＡまたはポリヌクレオチドを調節するかどうかを決定するアッセイに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムが使用され得る。こうしたシステムは、商業的に利用可能であり、関心のあるポリヌクレオチド配列に一致するｍＲＮＡを生産するｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法を提供する。ｍＲＮＡの作製後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳され、翻訳産物が比較される。いかなる剤をも含まない（ネガティブコントロール）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現システムと剤を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現システム間の翻訳産物の比較は、剤が翻訳に影響しているかどうかを指示する。対照と試験ポリヌクレオチド間の翻訳産物の比較は、剤が、このレベルで作用するものとしたら、（一般的、非選択的、または非特異的な翻訳に影響することとは対照的に）選択的に翻訳に影響しているかどうかを指示する。ポリペプチド機能の調節は、蛋白質調製物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイと同様に、上で列挙したｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含む多くの方法で達成され、その範囲を限定しようとするものではない。ポリペプチドは、蛋白質調製物を作製するために自然資源または組換え体から抽出及び／又は精製され得る。ある剤が蛋白質調製物試料に添加され、剤がポリペプチドに作用するのかどうか、及びどのように作用するのか、またその剤がポリペプチドのコンフォメーション、フォールディング（または他の物理的特徴）、他のモイエティー（リガンドのような）への結合、活性（または他の機能的特徴）、及び／又は蛋白質の構造または機能の他面に影響するかどうか、またはどのように影響するのかなどを測定した効果は、ポリペプチド機能を調節したものと考えられる。
【０１０１】
ここで述べた方法によって同定したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する剤に対するアッセイの例では、ポリペプチド（上述したように同定したポリヌクレオチドによってコードされる）が、よく特徴づけられたエピトープまたは蛋白質と複合化する天然の又は融合蛋白質として、ポリペプチドがはじめに原核細胞または真核細胞の発現システムで組換え体として発現される。その後、組換えポリペプチドは、例えば適当な抗体または抗エピトープ抗体を用いた免疫沈降法、または複合体を固相化リガンドに結合させることによって精製される。その後、ポリペプチドまたは融合蛋白質からなるアフィニティーカラムは、適当に標識化した化合物の混合物をスクリーニングするのに使用される。適当な標識剤は、蛍光色素団、放射性同位元素、酵素およびケミルミネッセンス化合物を含み、その範囲を限定しようとするものではない。非結合および結合化合物は、当業者によって通常使用されるような様々な条件（例えば、高塩、界面活性化剤）を用いて洗浄することによって分離され得る。アフィニティーカラムへの非特異的な結合は、複合体またはエピトープのどちらか一方のみからなるアフィニティーカラムを用いて化合物の混合物をあらかじめ洗浄することによって最小化できる。同じような方法が、ポリペプチドへの結合に競合する剤についてもスクリーニングとして使用できる。アフィニティークロマトグラフィーに加えて、他の分子への結合を変化させるであろう蛋白質の融解温度の変化、または蛍光の異方性の変化を測定するような他の技術もある。例えば、ポリペプチドに共有結合させるセンサーチップを用いたＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって供給、Ｓｔｉｔら、Ｃｅｌｌ  ８０：  ６６１−６７０，  １９９５）が、異なる剤の結合活性を決定するのに実行される。
【０１０２】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法は、構造的または合理的な薬剤設計を含み、ここでは、アミノ酸配列、３次元原子構造、または蛋白質の他の性質は、ポリペプチドに結合することが期待される剤の設計に対する基礎を提供する。一般的に、この文脈での剤の設計及び／又は選択は、ヒトおよび相同的なヒト以外の霊長類のポリペプチド構造を並べた比較、その３次元構造（もし知られ、または推定されるのなら）、および合理的な薬剤設計の他面といったいくつものパラメーターによって支配される。コンビナトリアル・ケミストリーの技術も候補剤の無数の組み合わせを生むのに使用される。
【０１０３】
本発明のスクリーニング法にトランスジェニック動物システムも熟慮され、これは技術的に知られていたものである。
上述したスクリーニング法は、１次スクリーニングを示し、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調節する活性をいかなる剤をも検出するように設計されている。当業者は、さらに剤を評価するための２次試験が必要となるであろうことを認めるであろう。例えば、２次スクリーニングは、マウスや他の動物モデル（ラットのような）を用いた感染アッセイに剤を試験することを含み、これらは技術的に知られていることである。加えて、毒性試験は、１次スクリーニングで正の結果を出した剤が、生命体での使用に適しているであろうという更なる確証として行われるであろう。いかなる毒性試験もこの目的にふさわしく、例えばＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。
【０１０４】
本発明は、ここに記載したスクリーニング法によって同定される剤も含む。
正に選択されたヒト以外の特徴を同定するための有効な方法
本発明の一面において、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは正の進化的に有意な変化に起因する自然淘汰を受けた（すなわち、ヒト以外の霊長類のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが正の特性を有し、ヒトには存在しないこと）。本発明のこの面において、正に選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある疾患に対する感受性または耐性に関与し、または他の商業的に関わる特徴に関連するものであり得る。この態様の例は、ヒト以外の霊長類、好ましくはチンパンジーで正に選択されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含み、それらは、感染症、癌、またはにきびに対する感受性または耐性に関連し、または、毛髪の成長若しくは筋肉量のようなヒトにとって関心のある美的状態と関連するものを含み、その範囲を限定しようとするものではない。この態様の例は、ＨＩＶからＡＩＤＳへの進行に対する感受性または耐性と関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。したがって、本発明は、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症への進行に対する耐性の基礎をなす分子メカニズムに洞察を加えることに有効であり、ＡＩＤＳの発症を予防し、及び／又は遅延させる薬剤のような剤を発見する、及び／又は設計することにも有効である情報を提供するものである。商業的に関連する例としては、毛髪の成長、にきび、または筋肉量のような美的特徴と関連する、ヒト以外の霊長類で正に選択されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含み、その範囲を限定しようとするものではない。
【０１０５】
したがって、一面では、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、ここで当該ポリペプチドは医学的に関連する正の進化的に有意な変化と関連するものである。正の進化的に有意な変化は、ヒトまたはヒト以外の霊長類で見つけられ、しかし、正に選択されたヒト以外の霊長類の進化的に有意な変化は、ここで初めて記載されるであろう。その方法は、（ａ）ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を比較する工程、（ｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド変化を含むヒトのポリヌクレオチド配列を選択する工程を含んでなり、ここで当該変化は、進化的に有意である。この方法によって同定した配列は、さらに特徴付けられ、及び／又はヒトに特有のまたは強まった生物学的または医学的に関連する機能と関連する可能性について解析される。
【０１０６】
本発明でまた提供されるのは、ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列内での正の進化的に有意な変化を同定するための方法であって、（ａ）ヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列とそれに対応するヒト以外の霊長類の配列とを比較する工程、（ｂ）ヒト以外の霊長類の対応する配列に比較して少なくとも１つヌクレオチド変化を含むヒトのヌクレオチド配列を選択する工程を含んでなり、ここで当該変化は進化的に有意である、前記方法である。
【０１０７】
正に選択されるヒトの特徴を同定するために有効な方法
本発明は、ヒトの特有のまたは強まった機能的能力、例えば、脳機能または寿命の長期化などと関連するヒトのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を特異的に提供する。さらに特異的には、こうした方法は、ヒトで特有のまたは強まった能力と関連する遺伝子配列を同定し、高度な情報処理能力、貯蔵および修復能力、創造性、および言語能力のような脳機能を含み、その範囲を限定しようとするものではない。さらに、こうした方法は、ヒト脳が他のヒト以外の霊長類に比較して強まったレベルで機能することに関して、他の脳機能の特徴に関連する配列を同定する：こうした相違は、脳を介した情緒的反応、運動、苦痛／喜びの感覚、嗅覚、気性および寿命の長期化を含む。この方法において、本発明の一般的な方法は、上述したように利用される。一般的に、ここで記載した方法は、（ａ）ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とヒト以外の霊長類の配列を比較すること：および、（ｂ）ヒト以外の霊長類と比較して、ヒトの特有のまたは強まった機能的能力と関係する進化的に有意な変化を有するヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを必要とする。
【０１０８】
この態様では、ヒト配列は、進化的に有意な配列を含む（すなわち、そのような変化が選択的圧力に反応していることを示唆する方法で、ヒトの配列が、１以上、ヒト以外の霊長類の配列と異なっている）。進化的に有意な変化を含む遺伝子によってコードされた蛋白質の同一性と機能性が特徴づけられ、その蛋白質が特有のまたは強まったヒトの機能に関わるのかどうかの決定がなされる。もし、その蛋白質が特有のまたは強まったヒトの機能に関連するならば、その情報は、特有のまたは強まったヒトの機能を補うか、あるいはそうでなければ、調節することが可能な剤を同定する手段として有効である。
【０１０９】
本発明の範囲を限定しない例として、ヒト脳の機能的特有の基礎をなす遺伝子的（すなわち、ヌクレオチド配列）相違を同定することは、ヒトの脳機能を調節し、及び／又は機能的失陥を補う手助けをする剤を設計するための基礎を提供するものである。こうした配列は、診断薬、及び／又はバイオメディカルな研究手段の開発にも使用され得る。本発明はまた、ヒトの脳蛋白質をコードする配列とヒト以外の霊長類の配列を大規模に比較する方法を提供する。
【０１１０】
同定したヒト配列の変化は、ヒトの脳機能に関与する候補的なヒト遺伝子のデータベースを確立するのに使用され得る。候補は、その遺伝子が、チンパンジーまたは他のヒト以外のヒト霊長類と比較してヒト脳で見つけられた特有のまたは強まった機能的能力の原因となる可能性のあるものに関して、並べられる。さらに、データベースは、候補遺伝子の規則正しい収集物を提供するばかりでなく、ヒトとチンパンジー（および他のヒト以外の霊長類）間に存在する正確な分子配列の相違をも提供し、つまり、機能的相違の基礎をなす変化を定義する。この情報は、医薬に対する有効な標的として役立つ蛋白質上の可能な部位を同定するのに有効となり得る。
【０１１１】
したがって、本発明はまた、進化的に有意なヌクレオチド変化とヒトにおいて特有のまたは強まった脳機能の能力との相関を明らかにするための方法を提供し、（ａ）上述した方法に従ってヒトのヌクレオチド配列を同定すること、（ｂ）モデルシステムで同定した配列の有無の機能的効果を解析することから構成される。
【０１１２】
さらに研究が、推定機能を確かめるために実行され得る。例えば、推定機能は、一時的若しくは安定にトランスフェクトした動物の培養細胞、あるいはコードしたポリペプチドの発現しない効果を評価するために同定したポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスクローンでトランスフェクトした動物細胞を用いて、適切なｉｖ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験される。１回ないし２回のハイブリッド研究のようなものは、例えば、ポリペプチドが他のどんな高分子と相互作用するのかを決定するために実施され得る。トランスジェニック線虫またはショウジョウバエは、行動学を含む様々な機能的アッセイに使用され得る。適切な研究は、同定したポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド内にコードしたポリペプチドの性質に依存し、それは当業者にとっては明らかなことである。
【０１１３】
ＡＩＤＳの具体例の詳細（正に選択されたヒト以外の特徴の例）
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の流行は、世界中で３千万人を脅していることが見積もられている（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ，  １９９８．  「世界のＨＩＶ／ＡＩＤＳ流行病に関する報告書」）。先進国のまさに百万人以上の人々が感染し、サハラ以南のアフリカ地域では、現在、成人の４人に１人がウィルスの保有者である（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ，  １９９８）。ワクチンを開発する努力は進行中であるが、近日中のワクチン成功の見通しは、厳然的である（Ｂａｌｔｅｒ及びＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５９−１６０，  １９８８；  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ及びＨｅｉｌｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍ．  ２７９：９８−１０３，  １９９８）。さらに治療法の開発を困難にしているのは、ＨＩＶ（ＡＩＤＳの原因となるヒトの免疫不全ウィルス）の急速的な突然変異速度であり、それはウィルス蛋白質に急速な変化を生む。こうした変化が、結局、ウィルス蛋白質を標的とする現在の治療からウィルスを逃れさせてしまう（Ｄｏｂｋｉｎ、Ｉｎｆ．  Ｍｅｄ．  １５（３）：１５９，  １９９８）。初期には多大な約束を示した薬剤カクテルでさえ、薬剤耐性突然変異体の出現に服従している（Ｂａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  １９９８；Ｄｏｂｋｉｎ，  １９９８）。つまり、ＨＩＶに感染した人々にＡＩＤＳの波及を遅延または妨げる治療法の開発に対して、今だ深刻な不足がある。Ｃｈｕｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１３１９３−１３１９７，  １９９７；Ｄｏｂｋｉｎ，  １９９８）。
【０１１４】
ヒトの類縁であるチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）は、ＨＩＶ−１による感染後の病気の進行には好ましくないモデルであることが期待を反して証明されている（Ｎｏｖｅｍｂｒｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１（５）：４０８６−４０９１，  １９９７）。ＨＩＶ−１に一度感染すると、チンパンジーは病気の伝播に耐性を示す。現在までのところ、捕らえた１００頭以上のチンパンジーに感染したが、たった１頭のチンパンジーのみが、末期ＡＩＤＳに発病したことが知られている（Ｎｏｖｅｍｂｒｅら、１９９７；Ｖｉｌｌｉｎｇｅｒら、  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ２６（１−２）：１１−１８，  １９９７）。明らかに、チンパンジーにおける病気の伝播に対する耐性を与えるメカニズムの理解が、ＨＩＶに感染したヒトに対する治療薬を開発する努力にとって非常に貴重であることを証明する。
【０１１５】
最近のヒトへの交差種伝達以前に、（おそらく何千年も）野生のチンパンジー個体群はＨＩＶ−１ウィルスを潜在していたことが一般的に信じられている（Ｄｕｂｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２：３７９−３８９，  １９９４；Ｚｈｕ及びＨｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５０３−５０４，  １９９５；Ｚｈｕ  ら、１９９８；Ｑｕｉｎｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２４０７−２４１４，  １９９４）。この長期間、ウィルス／宿主の共進化が明らかに順応に起因し、ＡＩＤＳ伝播に対するチンパンジーの耐性を説明している（Ｂｕｒｎｅｔ及びＷｈｉｔｅ  、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），１９７２；Ｅｗａｌｄ、Ｈｕｍ，  Ｎａｔ．  ２（ｉ）：１−３０，  １９９１）。ここに記載した全ての文献は、参照することによりここに組込まれる。
【０１１６】
本発明の一面は、（ａ）チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）は、ＨＩＶ感染に感受性を示すが、ＡＩＤＳの発症に対しては耐性を示し（Ａｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：５４９−５５２，  １９８４；Ｆｕｌｔｚ、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５８：１１６−１２４，  １９８６；Ｎｏｖｅｍｂｒｅ  ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１（５）：４０８６−４０９１，  １９９７）、一方、ヒトはこの破壊的な病気の発症に感受性を有するので、チンパンジーにある遺伝子がこの耐性に貢献している、（ｂ）他の種（チンパンジーのような）から得た相同遺伝子を比較した場合、ヒト遺伝子内の変化が、進化的に有意（すなわち、正の選択的圧力）であるという観察から発生している。つまり、ポリヌクレオチドをコードする蛋白質は、ヒトではなく、チンパンジー（他のＡＩＤＳ耐性霊長類と同じく）において見つけられた、進化中の正の適応選択の結果として尤もな配列変化を含む。さらにポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列におけるそのような進化的に有意な変化が、ＡＩＤＳの発症に抵抗するＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）の能力に帰着するものといえる。本発明の方法は、ＡＩＤＳに対する感受性または耐性と関連する候補遺伝子を同定するために選択的比較解析を使用し、耐性を与えるように進化した変化に関する特異的な情報と同様に、治療介入に対する新しい宿主標的を提供し得る。宿主蛋白質（ウィルス蛋白質及び／又はメカニズムとは対照的に）に関与する治療的アプローチの開発は、耐性ウィルス突然変異体の出現を遅延及び／又は避けることであるとさえいえる。本発明はまた、同定した配列および構造的相違を用いたスクリーニング法を提供する。
【０１１７】
本発明は、感染後のＡＩＤＳ発症に対する感受性に関連するヒトのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。逆に、本発明は、ＡＩＤＳの発症に対する耐性と関連するＡＩＤＳ耐性のヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）から得たポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法も提供する。ＡＩＤＳの発症に対する感受性および耐性の基礎をなす遺伝的（すなわちヌクレオチド配列）およびその結果としての蛋白質構造と生化学的相違を同定することは、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行に対する予防及び／又は治療を提供することができる剤の発見及び／又は設計に対する基礎をおそらく提供するだろう。こうした相違は、診断薬及び／又はバイオメディカル研究手法の開発にも使用され得る。例えば、耐性を付与する蛋白質の同定は、耐性蛋白質が関与する疾患経路の崩壊に基づいた診断薬またはバイオメディカル研究手法の開発に導くことができる。
【０１１８】
一般的に、この中に記載した方法は、（ａ）ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）の配列を比較すること、ここでヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＩＤＳの発症に関連するものであり、および（ｂ）ＡＩＤＳの発症に対する感受性と関連する進化的に有意な変化を有するヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを必要とする。他の具体例では、その方法は、（ａ）ヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列とＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）の配列を比較すること、ここでヒト蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＩＤＳの発症に関連するものであり、および（ｂ）ＡＩＤＳの発症に対する耐性と関連する進化的に有意な変化を有するヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを必要とする。
【０１１９】
明らかに、この中で記載された方法は、他の感染症に応用可能である。例えば、その方法は、ヒト以外の霊長類がある重要な期間（すなわち、正の選択を許容するのに十分な時間）に感染症を潜在していたことが知られ、または信じられており、および疾患の発症に抵抗するといった状況において使用され得る。つまり、他の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、ここで当該ポリペプチドは感染症の発症に対する耐性と関連するものであり、さらに（ａ）感染症耐性のヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列とヒト蛋白質をコードする配列と比較し、ここでヒト蛋白質をコードする配列は、感染症の発症と関連することを含み、および（ｂ）一致しているヒトの配列と比較して少なくと１つヌクレオチド変化を含む感染症に耐性なヒト以外の霊長類の配列を選択し、ここでヌクレオチド変化は進化論的に有意であることを含む段階から構成されるものである。他の具体例では、本発明は、ヒトのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、ここで当該ポリペプチドは感染症の発症に対する感受性と関連するものであり、さらに（ａ）ヒト蛋白質をコードする配列と感染症に耐性なヒト以外の霊長類の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を比較すること、ここでヒト蛋白質をコードする配列は、感染症の発症と関連するものであり、および（ｂ）感染症に耐性なヒト以外の霊長類の一致している配列と比較して、少なくとも１つヌクレオチド変化を含むヒトのポリヌクレオチド配列を選択すること、ここでヌクレオチド変化は進化論的に有意であるといった段階より構成されるものである。
【０１２０】
本発明において、ＡＩＤＳ耐性のヒト以外の霊長類から得た相同配列と比較すべきヒト配列は、ＨＩＶ伝播（すなわち、複製）、播種、及び／又はそれに続くＡＩＤＳへの進行との関連性について知られ、または含意することに基づいて選択される。そのような知識は、例えば刊行物及び／又は公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースを含む）から得られる。ＡＩＤＳの発症（ウィルス複製を含む）に関わる経路は多くの遺伝子と関連するので、多数の適切な候補が本発明の方法を用いて試験され得る。表１は、試験した遺伝子の例証を含む。一般的に、配列は技術的に知られている。
【０１２１】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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ヒトとチンパンジーのようなＡＩＤＳ耐性のヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする整列した配列は、特定の部位でのヌクレオチド配列の相違を同定するために解析される。検出された配列変化は、一般的に、好ましくは、上述したように精度のために初めに確認される。進化的に有意なヌクレオチド変化は、ＫＡ／ＫＳ解析のような分子進化解析によって検出され、さらにヒト以外の霊長類遺伝子またはヒト遺伝子が正の選択を受けたかどうかを決定するために評価され得る。例えば、同定した変化は、他のＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類配列においての有無について調べられる。ヒトとＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類間での少なくとも１つの進化的に有意な変化を有する配列は、他のヒト以外の霊長類の蛋白質をコードする配列のＰＣＲ解析のためのプライマーとして使用され、結果としてのポリヌクレオチドは同じ変化が他のヒト以外の霊長類に存在するかを調べるためにその配列が調べられる。こうした比較は、適応進化的な変化が、他のヒト以外の霊長類と比較して、ＡＩＤＳ耐性なヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）に独特であるのかに関して、さらに区別を許容する。例えば、他の霊長類ではなくチンパンジーで検出されるヌクレオチド変化は、おそらくチンパンジー遺伝子における正の選択を表している。比較のために使用した他のヒト以外の霊長類は、ヒトとの系統学的関係に基づいて選択され得る。密接に関連する霊長類は、チンパンジー、コビトチンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンのような霊長目ヒト上科のサブリネージ内に存在し得る。ヒト以外の霊長類は、霊長目ヒト上科の外側に位置し、つまりヒトにあまり密接な関係になく、旧世界ザルや新世界ザルがこれに該当する。そのような統計学的な有意性は、確立した利用可能なプログラム、例えば、Ｍｅｓｓｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ（Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７）
によって使用されたようなｔ検定を用いて決定され得る。
【０１２２】
さらに、有意変化を有する配列は、その配列変化が１人以上の個体によって共有されるのかどうかを調べるために異なるヒトから得たゲノムに対してプローブとして使用され得る。例えば、ある種の個体群では、ＡＩＤＳへの進行がゆっくりであり（「遅い進行者」）、（ａ）チンパンジー配列と遅い進行者群から得た相同配列間の比較、及び／又は（ｂ）ＡＩＤＳ感受性群と遅い進行者群との間の比較は、関心があるものとなるであろう。異なるヒト個体群から得た遺伝子配列は、例えば、ヒトゲノム多様性プロジェクトによって利用可能となったデータベースから得られ、または選択的に、多くの無関係で異なったヒト個体群からのＰＣＲで増幅したＤＮＡの直接的なシークエンシングから得られる。ヒトの遅い進行者で同定された変化の存在は、さらにその変化の進化的有意性を指示するものである。
【０１２３】
次に示す例は、通常の知識を有する者にさらに手助けとなるように提供される。そのような例は、例証となることが意図され、したがって、本発明を限定するものとしてみなされるべきではない。多くの例証的な修飾や変化は本出願で記載されており、その他も当業者に明白なものとなるであろう。そのような変化は、記述した発明の範囲とここでの請求項の中に含まれるものと考えられる。
【０１２４】
実施例
実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの構築
チンパンジーｃＤＮＡライブラリーはチンパンジー組織を用いて構築した。
【０１２５】
トータルｍＲＮＡはその組織から抽出し（ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ，  Ｑｕｉａｇｅ；  ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔ，  ５  Ｐｒｉｍｅ−  ３Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）、ＲＮＡの保持と精製は、典型的な分子クローニング方法に従って決定した。ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し（Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ，  ５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとするｃＤＮＡの逆転写用の鋳型として使用される。合成したｃＤＮＡは、商業的に利用可能なキットを用いてクローニング用に処理し、修飾する。その後、組換え体は、宿主細胞株内にパッケージし、増殖する。パッケージしている混合物の一部を増幅し、残りを増幅する前に保持する。ライブラリーを標準化し、ライブラリー中の独立した組換え体の数を決定した。
【０１２６】
実施例２：配列比較
候補的なヒト遺伝子に基づいた適切なプライマーを調製し、ｃＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから、チンパンジーｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用に使用した。ｃＤＮＡライブラリーから得た選択したチンパンジーｃＤＮＡクローンをＡＢＩ３７７のような自動化シークエンサーを用いて、その配列を調べる。Ｍ１３ユニバーサルのようなクローニングベクターに関して一般的に使用されるプライマーとリバースプライマーをスクリーニングを行うのに使用する。末端シークエンシングによって完全には配列が調べられていないインサートに対して、色素標識したターミネーターは、残っている隙間を埋めるのに使用される。
【０１２７】
例えば、チンパンジーとヒトの配列間で相違がある場所をみつけること；ヒトに特有であると思われる塩基が呼応する塩基に特異的に強力ではっきりとしたシグナルに相当するかどうかを決定するために、配列フルオログラム（クロマトグラム）を調べること；配列変化に相当する１以上のヒト配列があるかどうかをみるために、ヒトのヒット件数を調べること；および必要とされる技術的に知られた他の方法によって、検出された配列の相違を初めに精度について調べる。異なるチンパンジーヌクレオチドが存在する場所に同じヌクレオチドを有する同じ遺伝子に対しての多様なヒト配列の侵入は、ヒト配列が正確であり、チンパンジー／ヒトの相違が実在するという独立した支持を与える。そのような変化は、公開データベース情報とこれらのＤＮＡ配列変化が、コードした蛋白質のアミノ酸での変化に起因するのかを決定する遺伝子コードを用いて調べられる。その配列は、コードした蛋白質の直接的シークエンシングによっても調べられる。
【０１２８】
実施例３：分子進化解析
比較に委ねられるチンパンジーおよびヒト配列は、ＫＡ／ＫＳ解析を受ける。この解析において、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような一般に利用可能なコンピュータプログラムを使用し、上述した研究に委ねられるそれぞれの配列に対して、部位当たりの同義変化数（ＫＳ）／部位当たりの非同義変化数（ＫＡ）を決定する。全長のコード領域またはコード領域の断片を使用することができる。ＫＡ／ＫＳ比が高いほど、配列が適応進化を受けていたらしい。ＫＡ／ＫＳ値の統計的有意性は、確立した統計学的方法およびｔ検査のような利用可能なプログラムを用いて決定した。
【０１２９】
高いＫＡ／ＫＳ比の有意性にさらに支持を与えるために、研究に委ねられる配列を多彩なチンパンジー個体群とゴリラ、オランウータン、コビトチンパンジーのような他のヒト以外の霊長類について比較することができる。こうした比較はさらに、適応進化の変化が他のヒト以外の霊長類に比べてヒトのリネージに特有であるのかについて区別を許容する。その配列はまた、どの程度、その配列がヒトに保存されているのかを評価するためにいくつかの異なるヒト個体群の見本から得た関心のある遺伝子を直接シークエンシングすることによって調べられる。
【０１３０】
実施例４：正に選択されたＩＣＡＭ−１，  ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の同定
この中で記載した本発明の方法を用いて、細胞間接着分子であるＩＣＡＭ−１，  ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３が強力に正に選択されたことが示された。ＩＣＡＭ分子は、いくつかの免疫反応相互作用に関与し、ＨＩＶに感染したヒトにおけるＡＩＤＳへの進行に役割を演じていることが知られている。ＩＣＡＭ蛋白質は、イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、インテグリンの白血球関連因子−１分子（ＬＦＡ−１）に対するリガンドである（Ｍａｋｇｏｂａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８６−８８，  １９８８）。ＬＦＡ−１は、ほとんどの白血球の表面に発現しているが、一方、ＩＣＡＭは、白血球と他の細胞タイプの表面に発現している（Ｌａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０８：７０３−７１２，  １９８９）。ＩＣＡＭとＬＦＡ−１蛋白質は、いくつかの免疫反応相互作用に関与し、Ｔ細胞機能を含み、炎症域に白血球を導く（Ｌａｒｓｏｎら、１９８９）。
【０１３１】
霊長類組織（チンパンジーの脳と血液、ゴリラの血液と腎臓、オランウータンの血液）または次のＢ白血球細胞株：ＣＡＲＬ（チンパンジー）、ＲＯＫ（ゴリラ）、およびＰＵＴＩ（オランウータン）から採取した細胞からトータルＲＮＡをＲＮｅｓｅ  ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ）またはＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）を用いて調製した。ｍＲＮＡは、Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルローススピンカラム（５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）を用いてトータルＲＮＡから単離した。ｃＤＡＮは、ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてオリゴｄＴ及び／又はランダムプライミングをｍＲＮＡから合成した。公開されたヒト配列から手で設計したプライマー（濃度＝１００  ｎｍｏｌ／μｌ）を用いて、霊長類ＩＣＡＭ−１遺伝子の蛋白質コード領域をｃＤＮＡから増幅した。ＩＣＡＭ−１増幅に対するＰＣＲ条件は、初めに９４℃であらかじめ融解（４分）させ、続いて９４℃（１５秒）、５８℃（１分１５秒）、７２℃（１分１５秒）を３５サイクル、そして最後に７２℃で１０分間延長した。ＰＣＲは、５０μｌのトータル反応容量でＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ＲＣＲ  ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて完成した。Ｑｉａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースゲルから適当な大きさの産物を精製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて直接、増幅産物のストランドをシークエンスし、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で解析した。
【０１３２】
ヒト、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）、およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ）のＩＣＡＭ−１遺伝子の蛋白質をコードしている部分とチンパンジーの該当する部分の比較は、統計的に有意なＫＡ／ＫＳ比を与えた（表２）。ヒトとチンパンジーのＩＣＡＭ−１遺伝子の蛋白質をコードする部分は以前に公開され、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ）のＩＣＡＭ−１遺伝子の蛋白質をコードしている部分を、図３と図４にそれぞれ示す。
【０１３３】
この実施例では、対のＫＡ／ＫＳ比をＬｉ（１９８５；  １９９３）のアルゴリズムを用いて成熟蛋白質に対して計算した。統計的な有意比（ｔ検査によって決定された）は太字で示している。ゴリラとヒトの比較は、チンパンジーのＩＣＡＭ−１が正に選択されたことを示すには十分であるが、アフリカのゴリラの前提となる歴史上の範囲は、ゴリラがＨＩＶ−１ウィルスにさらされ得たことを示唆するので、オランウータンも同様に比較した（Ｎｏｗａｋ及びＰａｒａｄｉｓｏ、Ｗａｌｋｅｒ’ｓ  Ｍａｍｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），  １９８３）。しかしながら、オランウータンはいつも東南アジアに限られており、つまり進化的時間を通してＨＩＶにさらされることはないものと思われる（Ｎｏｗａｋ及びＰａｒａｄｉｓｏ，  １９８３）（ゴリラは、ヒトとチンパンジーに最も近い関係にあり、一方、オランウータンは遠い関係にある）。
【０１３４】
【表２】
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正の選択を示した蛋白質の中でさえ、ＩＣＡＭ−１比較と同じ高さのＫＡ／ＫＳ比を示すものは少ない（Ｌｅｅ及びＶａｃｑｕｉｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｂｕｌｌ．  １８２：９７−１０４，  １９９２；Ｓｗａｎｓｏｎ及びＶａｃｑｕｉｅｒ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：４９５７−４９６１，  １９９５；Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ，  １９９７；Ｓｈａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１１１−１１２，  １９９７）。結果は、チンパンジーＩＣＡＭ−１分子での適応変化に起因する強力な選択圧と矛盾していない。ＬＦＡ−１に結合するＩＣＡＭ−１分子のドメイン（Ｄ１とＤ２）が証明された（Ｓｔａｕｎｔｏｎら、Ｃｅｌｌ  ６１：２４３−２５４，  １９９０）。霊長類のＩＣＡＭ−１遺伝子間の対のＫＡ／ＫＳ比較、すなわちＫＡ／ＫＳ比は、Ｌｉ（１９８５；  １９９３）のアルゴリズムを用いて、ドメインＤ１とＤ２のみ計算した（表３）。統計学的有意比較は（ｔ検査によって決定した）、太字で示している。ドメインＤ１とＤ２に対するかなり高い、統計的に有意なＫＡ／ＫＡ比は、蛋白質のこうした領域がとても強く正に選択されたことを示唆する。チンパンジーのＩＣＡＭ−１のこうした領域は、全蛋白質比較に対して見られたものより、著しいＫＡ／ＫＳ比（表３）を示し、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用が異常に強い選択圧を受けていたことを示唆している。
【０１３５】
【表３】
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基本的には、正に選択されたチンパンジーのＩＣＡＭ−２とＩＣＡＭ−３として同定するのに同じ手法を使用した（表４参照）。ＩＣＡＭ−１のリガンド結合ドメインは、ＩＣＡＭ−２とＩＣＡＭ−３とは対照的に、とりわけ強く正の選択を提示するものとして位置づけられ、正の選択は蛋白質を通してアミノ酸置換に起因する。すなわち、この比較ゲノミック解析は、チンパンジーのＩＣＡＭ−１での正の選択が蛋白質の一次構造、例えば重要な結合ドメインを変化させたことを表している。これらの変化は、チンパンジーにおけるＡＩＤＳ進行に対する耐性を与えたのかもしれない。
【０１３６】
【表４】
2002501761.tif 000006
ＩＣＡＭ−１，  ２，  および３の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ感染細胞での融合細胞（すなわち、巨大、多核細胞）の形成に本質的な役割をしていることを示している（Ｐａｎｔａｌｅｏら、Ｊ．  Ｅｘ．  Ｍｅｄ．  １７３：５１１−５１４，  １９９１）。融合細胞の形成は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ−細胞の減少に続く（Ｐａｎｔａｌｅｏら、１９９１；Ｌｅｖｙ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５７：１８３−１８９，  １９９３；Ｂｕｔｉｎｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２１９１−２１９５，  １９９４；Ｆｉｎｋｅｌ及びＢａｎａｄ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：６０５−６１５，  １９９４）。融合細胞の形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出することは困難であるが、感染した細胞の塊が感染した個体のリンパ節中に見られる（Ｐａｎｔａｌｅｏら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２８：３２７−３３５，  １９９３；  Ｆｉｎｋｅｌ及びＢａｎｄａ、１９９４；Ｅｍｂｒｅｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３５９−３６２，  １９９３；Ｐａｎｔａｌｅｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３５５−３５８，  １９９３）。融合細胞は体内から急速に取り除かれるので、検出ができないだけである（Ｆｏｕｃｈｉｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１９：８７−９５，  １９９６）。Ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ４４細胞の融合細胞を介した欠失が、起こることが推測され、これは免疫システムの障害に直接関わり、日和見感染と末期ＡＩＤＳを導く（Ｓｏｄｅｏｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４７０−４７４，  １９８６；Ｈｉｌｄｒｅｔｈ及びＯｒｅｎｔａｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０７５−１０７８，  １９８９；Ｆｉｎｋｅｌ及びＢａｎｄａ、１９９４）。つまり、チンパンジーのＩＣＡＭ−１，  ＩＣＡＭ−２，  またはＩＣＡＭ−３における決定的な変化が、チンパンジーにおいて融合細胞の形成を阻止するかもしれないし、ＡＩＤＳに対するチンパンジーの耐性を説明する手助けとなり得る。ＩＣＡＭ−１の多機能的性質のため、ＩＣＡＭ遺伝子におけるこれらの正に選択された変化が、他の感染症に対する耐性を付加的に与え、ヒトの治療法の開発にも価値があるような他の炎症過程において役割を果たすものといえる。ＩＣＡＭ−１，  −２および−３のポリペプチド配列の整列は、それぞれ図５、図６および図７に示してある。
【０１３７】
実施例６：ＩＣＡＭ−１，  ＩＣＡＭ−２，  およびＩＣＡＭ−３の正に選択された配列の特徴づけ
本発明の方法によって同定された配列は、細胞トランスフェクション試験によってさらに試験され、特徴づけられ得る。例えば、ヒトの培養細胞は、ここに記載した方法によって同定されたチンパンジーのヌクレオチド（ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３、下記参照）でトランスフェクトした場合、技術的に標準的なアッセイを用いて減少したウィルスの播種及び／又は伝播に対して試験され、対照細胞と比較され得る。試験されるべきポリヌクレオチド／ポリペプチドの認められた、または見かけの機能的性質に依存して、他の特徴も測定され得る。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）の場合、融合細胞の形成が測定され、対照（トランスフェクトしていない）細胞と比較され得る。これは感染した細胞の融合細胞の形成阻害から耐性が起こるかどうかを試験するであろう。
【０１３８】
本発明の方法によって同定した配列とＨＩＶ−１によって細胞間感染におけるそれらの効果を特徴付けることに有効な細胞は、ＨＩＶ−１の感染に寛容なヒトＴ細胞株であり、例えば、ＡＴＣＣから利用できるＨ９およびＨＵＴ７８細胞株を含む。
【０１３９】
細胞トランスフェクションアッセイに対して、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡ（またはここに記載された方法によって同定したいかなるｃＤＮＡ）は、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。最大の発現を得るために、クローニングされたＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）をコードする領域は、例えば、ＩＬ−２プロモーターのようなヒトＴ細胞に活性的であるプロモーターに操作的に連結させる。選択的に、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡは、強力な構造性プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下に置かれ得る。発現システムは、技術的によく知られ、細胞内に発現ベクターを導入するための方法である。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡを構成している発現ベクターは、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、または他のいずれか知られた方法によって細胞内に導入され得る。その後、クローニングしたＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）分子が細胞表面に発現する。ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡが細胞表面に発現したかの決定は、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）に特異的な抗体を用いて完成する。ヒトＴ細胞表面に発現したチンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）の場合、チンパンジーとヒトのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を区別する抗体が使用され得る。この抗体は、検出可能な標識、例えば蛍光色素で標識され得る。表面にチンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞は、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）や適切に標識した抗体ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）抗体を用いて、または十分に確立した技術を用いて検出され得る。
【０１４０】
その後、細胞表面にチンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現しているトランスフェクトしたヒト細胞は、融合細胞形成、及び／又はＨＩＶ複製、及び／又は細胞間感染を指標として感染した細胞数について調べられる。チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞に適切な投与量でＨＩＶ−１を感染させる。例えば、組織培養感染投与量５０、すなわち、細胞の５０％に感染できる投与量を意味する。適切な組織培養液中に約５００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる細胞密度で細胞を播種し、感染後、融合細胞形成、及び／又はウィルス複製、対照の感染していない細胞と比較した場合の感染細胞の数を観察する。チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）でトランスフェクトしていない細胞も対照として使用する。融合細胞形成は、一般的に、感染後約１０日でＨＩＶ−１に感染した細胞（チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現していない）中に観察される。
【０１４１】
ＨＩＶ複製の観測には、細胞上清がｐ２４抗原の存在と量に対してアッセイされる。ｐ２４を検出するいかなるアッセイも使用でき、例えば、捕捉抗体としてはウサギ抗ｐ２４抗体を使用し、検出抗体としてはビオチン標識したウサギ抗ｐ２４抗体を使用し、アッセイは西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたアビジンで発現されるＥＬＩＳＡを含む。感染した細胞数の決定には、間接的免疫蛍光法を含むいずれか知られた方法が使用され得る。間接的免疫蛍光法では、ヒトＨＩＶに正の血清が、感染した細胞に結合するための抗ＨＩＶ抗体の原料として使用され得る。結合した抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出し、蛍光顕微鏡で細胞を視覚化し、細胞数を測定する。
【０１４２】
ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）のような分子の役割を評価するための他の方法は、ＨＩＶによる細胞の継続的な感染を含む。ヒト細胞株、好ましくは、内因性のＩＣＡＭを発現していないヒト細胞株（内因性のＩＣＡＭは発現していない細胞株も使用できるが）は、ヒトまたはチンパンジーのＩＣＡＭ−１または−２若しくは−３でトランスフェクトされる。一連の実験では、ＨＩＶは、ＨＩＶを感染したヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現しいる細胞の上清から回収され、チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞またはヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞に感染するのに使用する。上述のように測定されるが、チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）およびヒトのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞の初期の感染性は、高いことが期待される。数回の複製の後、チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）が耐性を与えるならは、細胞から細胞への感染は、チンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞では、減少することが期待されるであろう。第２の一連の実験では、ＨＩＶは、ＨＩＶに感染したチンパンジーのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞から回収し、ヒトのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞に感染するために使用される。この場合、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２若しくはＩＣＡＭ−３）がＨＩＦ伝播に対する感受性に関与しているならば、初期の感染性は、はじめの一連の実験よりもかなり低くなることが予想される。数回の複製の後、細胞から細胞への感染は、増加することが期待されるだろう。
【０１４３】
同定したヒト配列は、ＡＩＤＳの感受性または耐性の付与または寄与に関与するヒトの候補遺伝子のデータベースを確立することに使用され得る。さらに、そのデータベースは、候補遺伝子の整列した収集物を提供するだけでなく、ヒトとＡＩＤＳに耐性なヒト以外の霊長類（チンパンジーのような）との間に存在する正確な分子配列の相違を提供し、つまり、機能的相違の基礎をなす変化を明確に定める。
【０１４４】
実施例７：ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の分子モデリング
ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の３次元構造のモデリングは、ＡＩＤＳの進行に対するチンパンジーの耐性を説明する上で、これらの蛋白質の役割に対する付加的な証拠を提供するものである。
【０１４５】
ＩＣＡＭ−１の場合、チンパンジーのリネージに独特である６個のアミノ酸置換のうち５個は、ＬＦＡ−１の結合に重要なものとしてミュータジェニック研究によって同定されたアミノ酸にまさに隣接（すなわち、物理的に接触）している。これら５個のアミノ酸置換は、ヒトＬ１８をチンパンジーＱ１８に、ヒトＫ２９をチンパンジーＤ２９に、ヒトＰ４５をチンパンジーＧ４５に、ヒトＲ４９をチンパンジーＷ４９に、およびヒトＥ１７１をチンパンジーＱ１７１に置換したものである。この位置決めは、一次構造（すなわち、アミノ酸の実際の配列）からは予測できない。結合に重要なアミノ酸残基のうち、チンパンジーＩＣＡＭ−１で変化したものはない。
【０１４６】
そのような位置決めは、チンパンジーＩＣＡＭ−１蛋白質の基本的な機能が、ヒトとチンパンジーとの間で変化しないことを強く立証するが、しかしながら、進化は、ＡＩＤＳの進行に対する耐性をチンパンジーに付与する手助けをする微調整した変化を引き起こした。アミノ酸置換の特徴は、治療介入のための剤を開発するに３次元構造情報の活用を許容するように調べられつつある。著しく、チンパンジーの５残基のうち４個が、Ｎ結合型糖鎖付加部位として同定された重要な結合残基に隣接している。これは、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１の（ＬＦＡ−１に対する）結合定数に差があることを示唆している。これらの結合定数は測定されている。結合定数がチンパンジーのＩＣＡＭ−１で低いことが証明されれば、ＨＩＶに感染したヒトに対する可能な治療戦略として結合定数の変化を（立体障害の方法で）模倣する小さな分子剤を発明することも可能である。同様に、もしチンパンジーのＩＣＡＭ−１に対して観察されるならば、より強い結合定数は、ＨＩＶに感染したヒトに対する治療介入を開発するための選択的な戦略を示唆する。
【０１４７】
ＩＣＡＭ−３の場合、プロリン（７人のヒトで観察された）からグルタミン（３頭のチンパンジーで観察された）への重要なアミノ酸残基置換は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１のドメイン２およびドメイン３間の位置角度を有意に変化することが我々のモデリング研究から予測される。ヒト蛋白質は、このつなぎ目で急な角度を示す（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７：２３９  ２０−２７，  １９９６）。この鋭い角度（曲がり目）の消失は、ＨＩＶ−１ビリオンに容易にはパッケージ化されないチンパンジーのＩＣＡＭ−３を表すことが予想される（感染したヒトにおいて、ＩＣＡＭがＨＩＶビリオンにパッケージされた後、細胞間の感染が劇的に増加する（Ｂａｒｂｅａｕ，  Ｂ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：７１２５−７１３６，  １９９８））。このチンパンジーのＩＣＡＭ−３を容易にＨＩＶ−１ビリオンにパッケージできないことが、感染したヒトに見られた細胞間感染における増加を妨げることができるであろう。これによって、チンパンジーのＡＩＤＳ進行に対する耐性について説明がつくであろう。
【０１４８】
ヒトのプロリン残基に適切に設計した小分子を結合させることが、ヒトＩＣＡＭ−１蛋白質をより大きな（すなわち、急ではない）角度のチンパンジーＩＣＡＭ−３に模倣させる（立体障害の結果として）小分子治療介入を可能にする。重要な結合残基の２蛋白質間での保持（およびヒトとチンパンジー間の免疫応答の一般的な類似性）は、この角度の変化が、ヒトＩＣＡＭ−３の基本的機能を危うくしないことを立証する。しかしながら、ヒトＩＣＡＭ−３蛋白質は、ＨＩＶビリオンへのパッケージ化に耐性を示さず、つまり、感染したチンパンジーがＡＩＤＳへの進行に抵抗する前提とされる経路を（ＨＩＶに感染したヒトにおいて）模倣することに耐性を示しているのであろう。
【０１４９】
実施例８：ＭＩＰ−１αの正の選択を同定すること
ＭＩＰ−１αは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト細胞においてＨＩＶ−１複製を抑制することを示した部位カインである（Ｃｏｃｃｈｉ，  Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８１１−１８１５，  １９９５）。
ヒトＭＩＰ−１α遺伝子のチンパンジーの相同物は、ＰＣＲで増幅し、シークエンスを解析した。ＫＡ／ＫＳ比の計算（２．１、Ｐ＜０．０５）およびゴリラの相同性との比較はチンパンジー遺伝子は正の選択がなされていたことを示している。この中で議論した他の遺伝子に関しては、チンパンジーのアミノ酸置換の特徴が、治療介入にチンパンジー蛋白質をどのように活用するのかを決定するために調べられている。
【０１５０】
実施例９：１７−β−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの正の選択を同定すること
本発明の方法を用いて、ヒトの相同物（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．＃Ｘ８７１７６）と比較して正に選択された（ＫＡ／ＫＳ＝１．６）脳で発現したチンパンジー遺伝子が、同定された。ヒト遺伝子、１７−β−  ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶは、２つの最も強力なエストロジェンであるβ−エストラジオールと５−ジールを弱めることで知られた蛋白質をコードしている（Ａｄａｍｓｋｉ，  Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１１：４３７−４４３，  １９９５）。エストロジェンに関連した癌（例えば、肺癌および前立腺癌を含む）は、ヒト癌のおよそ４０％を占める。興味深いことに、文献における報告では、チンパンジーは、腫瘍形成、とりわけエストロジェン関与の腫瘍形成に耐性があることが示唆されている。この蛋白質は、エストロジェンのより効果的な消耗を許容するように、つまり、そのような癌に対する耐性をチンパンジーに付与するために、チンパンジーにおいて正に選択されたものであるのかもしれない。もしそうならば、チンパンジー蛋白質において観察された特異的なアミノ酸置換は、ヒト癌における治療介入に対して重要な情報を提供するものである。
【０１５１】
実施例１０：ｃＤＮＡライブラリーの構築
チンパンジー脳のｃＤＮＡライブラリーは、チンパンジーの脳組織を用いて構築した。チンパンジーの脳組織は、自然死後に得ることができたので、この研究のために動物を殺す必要はなかった。しかしながら、脳で発現しているｍＲＮＡをそのままの形で得る機会を増やすために、動物の死後、できるだけ速やかに脳を得た。好ましくは、動物の体重や年齢を、死ぬ前に測定する。ｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用した脳組織は、好ましくは、全脳であり、全脳で発現するｍＲＮＡの含有量を最大にするためである。標準的な外科的手法に次いで、脳組織を動物から切り出した。
【０１５２】
トータルＲＮＡは脳組織から抽出し、ＲＮＡの保持と純度は、典型的な分子クローニング法に従って測定した。ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを選択し、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）でｃＤＮＡの逆転写のための鋳型として使用した。合成したｃＤＮＡを処理し、商業的に利用可能なキットを使用してクローニング用に修飾した。その後、組換え体は、宿主の細胞株にパッケージし、増殖させた。パッケージングした混合物の一部を増幅し、残りを増幅する前まで保持した。ライブラリーを標準化し、ライブラリー中の個々の組換え体の数を測定した。
【０１５３】
実施例１１：配列比較
ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したチンパンジー脳のｃＤＮＡクローンをＡＢＩ３７７のような自動シークエンサーを用いてシークエンシングした。Ｍ１３ユニバーサルのようなクローニングベクターに関して一般的に使用されるプライマーとリバースプライマーをスクリーニングを行うのに使用する。末端シークエンシングによって完全には配列が調べられていないインサートに対して、色素標識したターミネーターを残っている隙間を埋めるのに使用する。
【０１５４】
結果として得られたチンパンジーの配列は、例えばＢＬＡＳＴ検索のようなデータベースによるヒト配列と比較した。ＢＬＡＳＴ解析後の有意な（例えば、＞８０％）
類似性を示す高い得点である「ヒット件数」、すなわち配列を回収し、解析する。その後、２つの相同配列は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．によって開発された配列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖを用いて整列する。ヌクレオチド置換、付加および欠失を含むいかなる配列多様性も整列によって検出され、記録される。
【０１５５】
チンパンジーとヒトの配列間で相違がある場所をみつけること；ヒトにユニークであると思われる塩基が対応する塩基に特異的に強力ではっきりとしたシグナルに相当するかどうかを決定するために、配列フルオログラム（クロマトグラム）を調べること；配列変化に相当する１以上のヒト配列があるかどうかをみるために、ヒトのヒット件数を調べること；および必要とされる技術的に知られた他の方法によって、検出された配列の相違は、初めに精度について調べられる。異なるチンパンジーヌクレオチドが存在する場所に同じヌクレオチドを有する同じ遺伝子に対しての多様なヒト配列の侵入は、ヒト配列が正確であり、チンパンジー／ヒトの相違が実在するという独立した支持を与える。そのような変化は、公開データベース情報とこれらのＤＮＡ配列変化がコードした蛋白質のアミノ酸での変化に起因するのかを決定する遺伝子コードを用いて調べられる。
【０１５６】
実施例１２：分子進化解析
比較に委ねられるチンパンジーおよびヒト配列は、ＫＡ／ＫＳ解析を受ける。この解析において、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような一般に利用可能なコンピュータプログラムを使用し、上述した研究に委ねられるそれぞれの配列に対して、部位当たりの同義変化数（ＫＳ）／部位当たりの非同義変化数（ＫＡ）を決定する。この比、ＫＡ／ＫＳは、適応進化、すなわち正の選択が研究に委ねられた配列に作用した程度を反映するものであることを示す。典型的に、全長をコードしている領域は、これらの比較解析で使用される。しかしながら、コードしている断片も効果的に使用され得る。ＫＡ／ＫＳ比が高いほど、配列が適応進化を受けていたらしい。ＫＡ／ＫＳ値の統計的有意性は、確立した統計的方法およびｔ検査のような利用可能なプログラムを用いて決定した。チンパンジーとヒト間で統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示す遺伝子は、もっとも適応進化を受けたように思われる  高いＫＡ／ＫＳ比の有意性にさらに支持を与えるために、研究に委ねられる配列を、例えば、ゴリラ、オランウータン、コビトチンパンジーのような他のヒト以外の霊長類内で比較することが可能である。こうした比較はさらに、適応進化の変化が他のヒト以外の霊長類に比べてヒトリネージに独特であるのかについて区別を許容する。その配列はまた、どの程度、その配列がヒトに保存されているのかを評価するためにいくつかの異なるヒト個体群の見本から得た関心のある遺伝子を直接シークエンシングすることによって調べられる。
【０１５７】
実施例１３：さらに配列の特徴づけ
進化的に有意な変化を含むヒト脳ヌクレオチド配列は、さらに生物学的機能と同様に、分子的および遺伝学的性質に関して特徴づけられる。同定したコードする配列は、その配列がどの組織およびどの細胞型に発現するのか、及び／又はいつその配列が発生の過程あるいは細胞周期の中で発現するのかに関して、遺伝子の発現パターンを表すｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを行うためにプローブとして使用される。脳で発現した配列は、重要なヒト脳機能と関連するものとして候補者となる。さらに、同定した配列を有する推定遺伝子は、その配列がどんな機能類に属するのかを決定するために相同性検索を受ける。
【０１５８】
さらに、ある蛋白質にとって、同定したヒト配列変化は、変化の機能的重要性を評価することに有効である。そのような特徴を用いることによって、候補遺伝子のデータベースが作成される。候補者は、その遺伝子が、チンパンジーまたは他のヒト以外の霊長類と比較して、ヒト脳で見つかった特有のまたは強まった能力、例えば、他と同様に、高度な情報処理能力、貯蔵および複製能力、言語能力などに起因する見込みに関してランクづけされる。この方法で、このアプローチは、そのような遺伝子が同定され得るという新しい戦略を提供する。結論として、データベースは、候補遺伝子の整然とした収集物を提供するだけでなく、ヒトとチンパンジー（および他のヒト以外の霊長類）間に存在する正確な分子配列の相違をも提供し、すなわち機能的相違の基礎をなす変化を明確にする。
【０１５９】
いくつかの場合には、機能的相違は、適切なモデルシステムにおいて評価され、長期持続増強（ＬＴＰ）の特徴のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析、およびトランスジェニック動物または他の適切なモデルシステムの使用を含み、それらの範囲に限定されるものではない。これらは当業者にとって速やかに明白となるであろう。
【０１６０】
実施例１４：ヒトチロシンキナーゼ遺伝子における正の選択の同定
本発明の方法を用いて、脳内で発現したヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．＃ＡＢ０１４５４１）が同定され、チンパンジー相同物と比較して正に選択されていた。この遺伝子は、チロシンキナーゼをコードし、よく特徴づけられたマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．＃ＡＦ０１１９０８）に相同的であり、その遺伝子産物はＡＡＴＹＫと呼ばれ、アポトーシスを引き起こすことが知られている（Ｇａｏｚｚａ，  Ｅ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：３１２７−３１３５，  １９９７）。文献は、この蛋白質が発達中のマウス脳内でアポトーシスを制御すること（つまり、要するに、発達している脳を「刻むこと」）を示唆している。この蛋白質のチロシンキナーゼドメインは、マウス、チンパンジー、およびヒト間でよく保存されている（ほとんどがチロシンキナーゼである）。しかしながら、興味深いことに、シグナリング蛋白質が結合する蛋白質の領域は、ヒトでは正に選択されているが、チンパンジーやマウスでは強固に保存されている。シグナリング蛋白質が結合するヒト蛋白質の領域は、ヌクレオチドの点突然変異の結果として正に選択されたというだけではなく、マウスやチンパンジーでは単一のコピーとしてのみ存在するいくつかのＳＨ２結合ドメインのニ量化を付加的に示す。これは、異なる一連のシグナリング蛋白質がヒト蛋白質に結合し、その後、マウスやチンパンジーと比較して発達中のヒト脳内でアポトーシスの異なる経路を引き起こせることを示唆する。つまり、そのような遺伝子は、特有のまたは強まったヒトの認知能力に貢献するものといえる。
【０１６１】
前述の発明は、明瞭および理解の目的で、図解および例として幾分詳細に記載してあるが、ある種の変化や修飾は実施可能であることは、当業者にとって明白であろう。したがって、記載および例は、請求の範囲を限定するものとして構成しておらず、添付した請求項によって詳述されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、霊長目ヒト科群内の霊長類に対する系統樹を示す。枝別れの順番は、十分に支持されるミトコンドリアＤＮＡ系統に基づいている（Ｍｅｓｓｉｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４，  １９９７）。
【図２】  図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−３）は、ヒトとチンパンジーのＩＣＡＭ−１配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｘ０６９９０およびＶ８６８４８に対応）間のヌクレオチド配列の比較である。チンパンジーの配列のアミノ酸翻訳を列の下に示す。
【図３】  図３は、ゴリラＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。
【図４】  図４は、オランウータンＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
【図５】  図５（Ａ）−（Ｅ）は、いくつかの霊長類のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列の比較を示す。
【図６】  図６（Ａ）−（Ｂ）は、いくつかの霊長類のＩＣＡＭ−２のポリペプチド配列の比較を示す。
【図７】  図７（Ａ）−（Ｐ）は、いくつかの霊長類のＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列の比較を示す。
【図８】  図８は、ヒト／霊長類の脳のポリヌクレオチドを比較し、進化的に有意な変化を有する配列を選択し、さらに選択した配列を特徴づけるための手順の説明図を示す。図８の図式は、本発明の優先体系を説明するもので、記述は本発明の原理を説明するのに役立ち、詳述とオプショナルな付加段階を含む。いかなるヒト／霊長類のポリヌクレオチド配列も同じ手順で比較することができ、その手順は脳ポリヌクレオチドに限定されないということが分かる。