【手続補正書】
【提出日】平成17年7月26日(2005.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）の化合物（ジベレリン）：
【化１】
2005501864.tif 000001
ならびに／または、そのラクトン、グリコシド、エステル、活性エステルおよび塩を含む薬学的に受容可能な誘導体の、糖尿病ならびにその合併症および関連する状態の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造における使用であって、ここで、
Ｒ１は、Ｈまたは基−Ｏ−Ｒ２０であり、ここで、Ｒ２０は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）、Ｃ１〜６アルキル基であるか、あるいはＲ１は、Ｒ２またはＲ１０と一緒になって、結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ１−Ｃ１０二重結合）を形成し、
Ｒ２は、Ｈまたは基−Ｏ−Ｒ２１であり、ここで、Ｒ２１は、Ｈ、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ４と一緒になって、結合を形成するか（ラクトン）、あるいはＲ２は、Ｒ１またはＲ３と一緒になって、結合（それぞれ、Ｃ１−Ｃ２二重結合またはＣ２−Ｃ３二重結合）を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、＝Ｏまたは−Ｏ−Ｒ２２であり、ここで、Ｒ２２は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ３はＲ２と一緒になって結合（Ｃ２−Ｃ３二重結合）を形成し；
Ｒ４は、ＯＨまたは−ＯＲ２３であり、ここで、Ｒ２３は、非置換もしくは置換の、Ｃ１〜２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、アミジン、−ＮＲ２４Ｒ２５、または窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１個以上のヘテロ原子を含む、不飽和もしくは飽和環であり；Ｒ２４およびＲ２５は、同じでも異なってもよく、水素、もしくはＣ１〜２０アルキル、アリル、アリール、アリールアルキル、または窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１個以上のヘテロ原子を含む、不飽和もしくは飽和環であるか；あるいはＲ４は、Ｒ２１またはＲ２８と一緒になって結合を形成し（ラクトン）；
Ｒ５は、Ｈまたはグリコシルエステル（グリコシドエステル）基、または非置換もしくは置換の、Ｃ１〜２０アルキルエステル、アリルエステル、アリールエステル、アリールアルキルエステル、活性エステルであり；
Ｒ６は、ＨまたはＯＨであるか、あるいはＲ７と一緒になって結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ７は、Ｈ、＝Ｏまたは−ＯＲ２６であり、ここで、Ｒ２６は、Ｈまたはグリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であるか、あるいはＲ７は、Ｒ６と一緒になって、結合（Ｃ１１−Ｃ１２二重結合）を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、ヒドロキシル、メルカプタン、またはハロゲン、アミノ、アジド、ＮＲ２４Ｒ２５、非置換もしくは置換の、Ｃ１〜２０アルキル、アリル、アリールもしくはアリールアルキル、または−ＯＲ２７であり、ここで、Ｒ２７は、グリコシルエーテル基（グリコシドエーテル）であり；
Ｒ９は、ＨまたはＯＨであるか、あるいは、Ｒ１５と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨＯ、ＣＯＯＨもしくは該ＣＯＯＨのグリコシルエステル（グリコシドエステル）、ＣＨ２Ｏ−Ｒ２８または−ＯＲ２８であり、ここで、Ｒ２８は、Ｈであるか、またはＲ４と一緒になって結合を形成するか（ラクトン）、あるいはＲ１０は、Ｒ１と一緒になって、結合（Ｃ１−Ｃ１０二重結合）を形成し；
Ｒ１１は、ＨもしくはＯＨであるか、または存在せず；
Ｒ１２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨもしくは該ＣＯＯＨのグリコシルエステル（グリコシドエステル）であり；
Ｒ１３は、メチレンまたは二価ヘテロ原子またはＮＲ２９であり、ここで、Ｒ２９は、ＮＨＲ３０またはＯＲ３０であり、ここで、Ｒ３０は、Ｈ、またはＣ１〜２０アルキル、アリール、アルキルアリールであり；そしてＲ１１が存在しない場合には、二重結合がＣ１６とＲ１３との間に存在するか；あるいは、Ｒ１１がＨまたはＯＨである場合、Ｒ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３ＣＨＯ、ＣＨ２Ｘ（ここで、Ｘはハロゲンである）、ＣＨＮＲ２９（ここで、Ｒ２９は、ＮＨＲ３０である）またはＯＲ３０（ここで、Ｒ３０は、ＨもしくはＣ１〜２０アルキル、アリール、アルキルアリールである）であり；但し、Ｒ１１がＯＨである場合、Ｒ１３はＯＨではなく；
Ｒ１４は、ＨまたはＯＨであり；
Ｒ１５は、Ｈであるか、またはＲ９と一緒になって結合（Ｃ９−Ｃ１５結合）を形成する、使用。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の使用であって、前記糖尿病の合併症および関連する状態が、以下：肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシー、眼疾患、糖尿病性潰瘍、のうちの１つ以上である、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物の使用であって、前記ジベレリンが、ジベレリンＡ３である、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物の使用であって、前記ジベレリンが、ジベレリンＡ３およびジベレリンＡ４および／またはジベレリンＡ７の混合物である、使用。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物の使用であって、前記薬学的に受容可能な誘導体が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属およびアンモニウムまたは有機塩基の塩を含む塩である、使用。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物の使用であって、前記有機塩基が、リドカインまたはＮＲ１６Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９であり、ここで、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は同じであってもなくてもよく、水素または置換もしくは非置換のＣ１〜２０アルキル基、アルカノール基もしくはアリール基である、使用。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物の使用であって、前記薬学的に受容可能な誘導体が、ラクトン、グリコシド、またはエステルおよび活性エステルである、使用。
【請求項８】
糖尿病ならびにその合併症および関連する状態の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造における式（１）の化合物（ジベレリン）またはその薬学的に受容可能な誘導体の使用であって、該医薬がまた、インスリン、そのフラグメント誘導体、ＩＧＦ、増殖因子、および他の薬学的に適合性の抗糖尿病剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、使用。
【請求項９】
糖尿病ならびにその合併症および関連する状態の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造における式（１）の化合物（ジベレリン）またはその薬学的に受容可能な誘導体の使用であって、該医薬がまた、鎮痛薬、抗高血圧剤、鎮静剤、催眠薬、脂質低下剤、および抗感染剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される適合性の治療剤を含む、使用。
【請求項１０】
１型糖尿病およびその関連する状態の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
２型糖尿病およびその関連する状態の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
インスリン抵抗性糖尿病の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
糖尿病関連合併症および関連する状態、すなわち、肥満、微小血管疾患および大血管疾患、ネフロパシー、ニューロパシーおよび眼疾患の処置において使用するための抗糖尿病剤の製造のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
抗糖尿病剤であって、該抗糖尿病剤は、活性成分として式（１）の化合物および／またはその誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、抗糖尿病剤。
【請求項１５】
前記糖尿病剤が、薬物適用器を用いた投与に適切な医薬である、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項１６】
抗糖尿病剤であって、該抗糖尿病剤は、活性成分として式（１）の化合物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に含み、ここで、該抗糖尿病剤は、緩徐放出組成物である、抗糖尿病剤。
【請求項１７】
前記抗糖尿病剤が、経口投与のためのものである、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項１８】
前記抗糖尿病剤が、吸入投与のためのものである、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項１９】
前記抗糖尿病剤が、経皮投与のためのものである、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２０】
前記抗糖尿病剤が、非経口注射のためのものである、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２１】
前記抗糖尿病剤が、局所投与、直腸投与または膣投与のためのものである、請求項１４に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２２】
請求項１４、１５または１６のいずれか１項に記載の抗糖尿病剤であって、前記式（１）の誘導体が、ラクトン、エステル、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、アンモニウム塩および有機塩基からなる群より選択される、抗糖尿病剤。
【請求項２３】
前記誘導体が、式（１）のナトリウム塩である、請求項２２に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２４】
前記誘導体が、式（１）の亜鉛塩である、請求項２２に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２５】
前記誘導体が、式（１）のエチルエステルである、請求項２２に記載の抗糖尿病剤。
【請求項２６】
請求項１４に記載の抗糖尿病剤を製造する方法であって、該方法は、式（１）の化合物および／またはその誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を包含する、方法。
【請求項２７】
ジベレリンＡ３を含むジベレリンの調製のためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）発酵ブロスにおいて、ジベレリン産生微生物株をインキュベートする工程；
（ｂ）該発酵ブロスのｐＨを、ｐＨ６．５〜７．０に調節し、そして濾過して、微生物菌糸体の濾過ケーキおよび濾液を得る工程；
（ｃ）該濾過ケーキを水で洗浄し、そして洗浄液を該濾液と合わせて、水溶液を形成する工程；
（ｄ）該水溶液を濃縮する工程；
（ｅ）５〜１０℃の温度で、該水溶液を有機溶媒と混合し、そして該混合物のｐＨを、２．０未満に調節する工程；
（ｆ）該混合物を水相および第一の有機相に分離し、そして該第一の有機相を除去する工程；
（ｇ）工程（ｆ）の水相を、有機溶媒を用いて再抽出して、第二の有機相を得る工程；
（ｈ）該第一の有機相および第二の有機相を合わせ、そして濃縮して、濃縮有機溶液を形成する工程；
（ｉ）該濃縮有機溶液を、攪拌しながら３〜４時間にわたって、固形物の沈殿が止まるまで、６０〜７０℃にて加熱する工程；
（ｊ）該濃縮有機溶液を室温まで冷却し、そして濾過して沈殿物を得る工程；
（ｋ）該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥して、約８０％のジベレリンＡ３、約４％のジベレリンＡ４および約４％のジベレリンＡ７を含むオフホワイトの固体を得る工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｌ）３２．６％のメタノール、２．２％の水および６５．２％のアセトンの混合物中に、前記オフホワイトの固体を溶解して、ジベレリン溶液を得る工程；
（ｍ）該ジベレリン溶液を、有機溶媒と水との１０：１混合物で希釈する工程；
（ｎ）該希釈したジベレリン溶液を濾過し、そして該濾液を真空エバポレーションによって濃縮する工程；
（ｏ）該濃縮物を、攪拌しながら、２〜３時間にわたって、６０〜８０℃の温度で加熱し、室温まで冷却し、そして濾過して、固体結晶性沈殿物を得る工程；
（ｐ）該沈殿物を冷有機溶媒で洗浄し、そして乾燥してジベレリンＡ３結晶を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項２９】
前記ジベレリン産生微生物株が、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記工程（ｄ）および（ｈ）の溶液の濃縮が、真空エバポレーションを用いて達成される、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記有機溶媒が酢酸エチルである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記有機溶媒が酢酸エチルである、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３３】
請求項２８に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）前記ジベレリンＡ３をメタノール中に溶解する工程；
（ｒ）該ジベレリン溶液を、等モルのＮａＨＣＯ３水溶液に添加する工程；
（ｓ）該混合された溶液を乾燥するまでエバポレートして、固体残渣を得る工程；
（ｔ）該残渣を水中に溶解し、そして凍結乾燥して、ジベレリンＡ３ナトリウム塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項３４】
請求項３３に記載のプロセスであって、
水中に前記ジベレリンＡ３ナトリウム塩を溶解する工程、
該溶液を、亜鉛イオン交換樹脂をロードしたカラムを通過させる工程、
該カラムを水で洗浄する工程、
該流出液および洗浄液を収集し、そして合わせる工程、ならびに
水を除去して、ジベレリンＡ３亜鉛塩を得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項３５】
請求項２８に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ｑ）アセトンの水に対する、５０：１の比率の混合物中に、ジベレリンＡ３を溶解する工程；
（ｒ）該ジベレリンＡ３溶液を、等モル量のトリエチルアミンおよびクロロ蟻酸エチル、ならびに１／１０モル量のＮ−メチルモルホリンを混合し、そして−１５℃で２０分間攪拌する工程；
（ｓ）該得られた混合物を無水エタノールで希釈し、そして室温で攪拌する工程；
（ｔ）該希釈した混合物を乾燥するまでエバポレートし、そして６：１の比で、酢酸エチルと水との間で残渣を分配する工程；
（ｕ）該酢酸エチル層を分離し、次いで２％ＨＣｌで洗浄し、次いで水で洗浄し、次いで５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで水で洗浄し、そして減圧下で乾燥するまでエバポレートして、ジベレリンＡ３エチルエステルを得る工程、
をさらに包含する、プロセス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
一般に、適切な用量は、１日あたり、０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
（実施例１）
（ジベレリンの発酵、単離および精製）
（ａ）発酵：ジベレリンＡ３、Ａ４およびＡ７生成株Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉを、１００ｇのグルコース、１００ｇのスクロース、２．５ｇのＮＨ４ＮＯ３、０．２５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４、０．０１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＫＣｌ、１０ｇのペプトン、３ｇのＣａＣＯ３、１０００ｍｌのＨ２Ｏを含む培地中で接種し、そして２８℃で３〜４日間増殖させた。次いで、１０００ｇのグルコース、１００ｇのペプトン、２４ｇのＮＨ４ＮＯ３、１００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、８ｇのＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、２０リットルのＨ２Ｏを含む生成培地（ｐＨ４．５）に移した（２８℃で８〜１０日間）。ジベレリンの生成がピーク（約３０００μｇ／ｍｌブロス）に達した場合、発酵を停止させた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【表１】
2005501864.tif 000002
実験３．１および実験３．３は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）が、細胞増殖にとって重要であることを示した。実験２は、ＥＧＦおよびジベレリンＡ３の両方の存在が、細胞増殖の速度に、相加的効果を有さないことを示した。実験４は、ジベレリンＡ３単独が、ＥＧＦと同様に効率的に細胞増殖を刺激し得ることを示した。