【手続補正書】
【提出日】平成18年6月29日(2006.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下の段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法：
（a）一本鎖核酸鋳型の集団を提供する段階であって、各々の鋳型がコード配列及び機能的に連結したプロモーター配列を含む段階；
（b）該一本鎖核酸鋳型よりも長さが短い実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物と、該一本鎖核酸鋳型の集団とをハイブリダイズさせる段階；
（c）該断片が、該核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）の各ハイブリダイゼーション産物を、鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階；並びに
（d）該第二の核酸鎖から転写されるRNAライブラリーを製造するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階。
【請求項２】  一つ又は複数の変異をライブラリーに導入するために用いられる、請求項1記載の方法。
【請求項３】  以下の段階を含む、核酸分子の集団における配列の多様性を減少させるための方法：
（a）様々な配列を有する一本鎖核酸鋳型の第一の集団を提供する段階であって、実質的に全ての鋳型の各々が、コード配列と機能的に連結したプロモーター配列とを含む段階、
（b）該核酸鋳型よりも長さが短くかつ該核酸鋳型に実質的に相補的である一本鎖核酸断片の第二の集団と、該第一の集団のメンバーとをハイブリダイズさせる段階であって、該第二の集団のサブ集団が実質的に同一の配列を有しかつさまざまな配列のある領域にハイブリダイズする段階；
（c）該断片が、該核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）のハイブリダイゼーション産物を、鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階；並びに
（d）該第二の核酸鎖から転写され、かつ該一本鎖核酸鋳型の第一の集団と比較して配列の多様性が減少したRNA分子の第三の集団を製造するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階。
【請求項４】  一本鎖核酸鋳型の第一の集団から一つ又は複数の変異を取り除くために用いられる、請求項3記載の方法。
【請求項５】  実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物が、二本鎖核酸分子の切断又はランダム・オリゴヌクレオチドの合成により製造される、請求項1又は3記載の方法。
【請求項６】  実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物が、少なくとも約100個の異なる種類の核酸断片を含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項７】  第二の核酸鎖から相補鎖を製造する段階、該相補鎖を一本鎖核酸鋳型の集団又は第一の集団として提供する段階、および段階(b)および(c)を一回もしくは複数回繰り返し、続いて段階(d)を繰り返す段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項８】  一本鎖核酸鋳型とホモ二重鎖を形成する一つ又は複数の一本鎖核酸断片を提供する段階、及び該ホモ二重鎖形成断片の存在下で段階（b）を実施する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】  プロモーターがT7プロモーターである、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１０】  DNAポリメラーゼがT4 DNAポリメラーゼである、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１１】  接触段階（d）の前に段階（c）の産物を増幅させる段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１２】  （e）タンパク質ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１３】  （e）RNAライブラリーの実質的に全ての各メンバーのコード配列の3’末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階；および任意で（f）RNA−タンパク質融合体ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１４】  以下の段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法：
（a）一本鎖核酸鋳型の第一の集団を提供する段階であって、各々の鋳型がコード配列を含む段階；
（b）様々な配列を有する一本鎖核酸分子の第二の集団を提供する段階であって、該一本鎖核酸鋳型の第一の集団と様々な配列を有する一本鎖核酸分子の該第二の集団が実質的に相補的である段階；
（c）二重鎖を形成するために十分な条件下で、一本鎖核酸鋳型の該第一集団と、様々な配列を有する一本鎖核酸分子の該第二集団とをハイブリダイズさせる段階；並びに
（d）酵素が該二重鎖内のミスマッチ塩基対を修正することを可能にする条件下で、該二重鎖を一つ又は複数の除去／修復酵素と接触させる段階。
【請求項１５】  段階（d）の産物に由来しコード配列を含む一本鎖核酸鋳型の新しい集団を提供する段階、鋳型の第一集団を鋳型の該新しい集団で置き換える段階、並びに段階（b）、（c）及び段階（d）を一回もしくは複数回繰り返す段階を段階（d）の後にさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】  以下の段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法：
（a）コード配列を各々が含む、一本鎖核酸鋳型の集団を提供する段階；
（b）該核酸鋳型よりも長さが短い実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物と、該一本鎖核酸鋳型の集団とをハイブリダイズさせる段階；
（c）該断片が、該核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）の各ハイブリダイゼーション産物を、鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階；並びに
（d）酵素が該産物内のミスマッチ塩基対を修正することを可能にする条件下で、段階（c）の産物を一つ又は複数の除去／修復酵素と接触させる段階。
【請求項１７】  コード配列を含みかつ段階（d）の産物に由来する一本鎖核酸鋳型の新しい集団を提供する段階、該一本鎖核酸鋳型の集団を該鋳型の新しい集団に置き換える段階、および段階（b）〜（d）を一回もしくは複数回繰り返す段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】  除去／修復酵素との接触がインビボ又はインビトロで実施される、請求項14又は16記載の方法。
【請求項１９】  除去／修復酵素との接触が細菌細胞内で実施される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】  一本鎖核酸鋳型が、該核酸鋳型を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼもしくはラムダ・エキソヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸鋳型の一方の鎖の分解、ビオチン化された一本鎖核酸のストレプトアビジンを用いた捕捉、又はRNAの逆転写により製造される、請求項1、3、14又は16記載の方法。
【請求項２１】  段階（b）が、一本鎖核酸鋳型1個当たり1個からおよそ1000個までの、様々な配列を有する一本鎖核酸分子又は一本鎖核酸断片を用いて実施される、請求項1、3、14又は16記載の方法。
【請求項２２】  （e）段階（d）の産物を増幅させる段階をさらに含む、請求項14又は16記載の方法。
【請求項２３】  各コード配列がプロモーター配列と機能的に連結している、請求項14又は16記載の方法。
【請求項２４】  （e）RNAライブラリーを製造するために、段階（d）の産物を転写する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  （f）タンパク質ライブラリーを製造するために、RNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】  （f）RNAライブラリーの実質的に全ての各メンバーのコード配列の3’末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階；および任意で（g）RNA−タンパク質融合体ライブラリーを製造するために、該RNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。