【手続補正書】
【提出日】平成18年2月15日(2006.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液のプロテインＣ−抗凝固系において抗凝固活性を示すことができる野生型血液凝固成分に対してアミノ酸配列が実質的に相同であり、そしてプロテインＣ（ＰＣ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択されるバリアント血液凝固成分であって、該バリアント成分は対応する野生型の血液凝固成分により発現される抗凝固活性に比べて強化された抗凝固活性を示すことができ、そして該バリアント成分は該野生型の成分と比較して、最初の４５Ｎ−末端アミノ酸残基を含んでなり、そしてＧｌａ−ドメインと命名されたＮ−末端アミノ酸残基配列において少なくとも１つのアミノ酸残基修飾、および野生型成分のセリン−プロテアーゼ（ＳＰ）ドメインに対応するアミノ酸残基配列の領域中に少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含む点が各野生型成分とは異なる、上記バリアント血液凝固成分。
【請求項２】
バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、かつ、該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
【表１】
2005518801.tif 000001
を有する、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項３】
ＳＰ−ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾が、野生型成分のアミノ酸残基番号２９０〜３２０、適切には３００から３１４の間のアミノ酸範囲に対応する領域に含まれており、かつ、野生型のアミノ酸残基番号３００〜３１４に対応する修飾された領域が、削除Δ303,304,305,308および置換Ｅ３０７Ｄ／Ａ３１０Ｔを含み、そして式ＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）により表される、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項４】
バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、そして該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
【表２】
2005518801.tif 000002
を有する、請求項３に記載のバリアント成分。
【請求項５】
野生型血液凝固成分がヒト起源である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のバリアント成分。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡセグメントの生産法であって；
（ａ）野生型血液凝固成分をコードするＤＮＡを準備し；
（ｂ）ヌクレオチドの修飾を該野生型ＤＮＡに導入して、該バリアント血液凝固成分をコードする修飾されたＤＮＡセグメントを形成し；そして
（ｃ）該修飾されたＤＮＡセグメントを複製させる、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分の生産法であって；
（ａ）該バリアント成分をコードするＤＮＡ−セグメントを準備し；
（ｂ）工程（ａ）で準備した該ＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入し；
（ｃ）該ＤＮＡセグメントを含む該ベクターを、コンパチブルな宿主細胞に導入し；
（ｄ）工程（ｃ）で準備された宿主細胞を、該バリアント成分の発現に必要な条件下で培養し；そして
（ｅ）発現したバリアント成分を培養した宿主細胞から単離する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項８】
Ｇｌａ−ドメインが突然変異Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄを含む、請求項３に記載のバリアント成分。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
マウス血漿を使用して、ＡＰＴＴおよび組織因子の両方で得られた結果は、ラット血漿で得られた結果に類似した(図２４および２５)。両系で、効率に関してはスーパー―ＡＰＣが最も有力であり、ＡＬＬ−ＡＰＣが次に並ぶ。ＡＰＴＴ系では、ＳＰ−ＡＰＣがｗｔＡＰＣよりもわずかに効力的であったが、２つとも組織因子に基づく系での効率は類似した。特に組織因子に基づく系は、大変明瞭な結果をもたらし、スーパー―ＡＰＣが試験した他のすべてのバリアントよりも優れていた。なお、本発明の特徴または主たる態様は、次の通りである：
＜態様１＞
血液のプロテインＣ−抗凝固系において抗凝固活性を現すことができる野生型血液凝固成分に対してアミノ酸配列が実質的に相同であり、そしてプロテインＣ（ＰＣ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択されるバリアント血液凝固成分であって、該バリアント成分は対応する野生型の血液凝固成分により発現される抗凝固活性に比べて強化された抗凝固活性を現すことができ、そして該バリアント成分は該野生型の成分と比較して、最初の４５Ｎ−末端アミノ酸残基を含んでなり、そしてＧｌａ−ドメインと命名されたＮ−末端アミノ酸残基配列に少なくとも１つのアミノ酸残基修飾、および野生型成分のセリン−プロテアーゼ（ＳＰ）ドメインに対応するアミノ酸残基配列の領域中に少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含む点が各野生型成分とは異なる、上記バリアント血液凝固成分。
＜態様２＞
対応する野生型成分と少なくとも９０％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様３＞
対応する野生型成分と少なくとも９５％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様４＞
対応する野生型成分と少なくとも９７％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様５＞
上記の少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾が置換、削除または挿入されたアミノ酸残基を含んでなる、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。
＜態様６＞
上記成分が野生型成分と比較して強化された膜−結合親和性を現すバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣである、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。
＜態様７＞
野生型プロテインＣに比較して強化されたカルシウム親和性をさらに現す、態様６に記載のバリアント成分。
＜態様８＞
上記バリアント成分が少なくとも６個、そして場合により７〜１０個のアミノ酸残基の修飾を上記Ｇｌａ−ドメインに含む、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。
＜態様９＞
上記バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＱＧＮＬＥＲＥＣＩＥＥＩＣＳＦＥＥＡＫＥＩＦＥＤＶＤＤＴＬＡＦＷＳＫＹＶ（配列番号５）
を有する、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様１０＞
上記Ｇｌａ−ドメインが１０、１１、２８、３２または３３位から選択される位置にアミノ酸置換を含み、そして少なくとも１つのさらなる修飾をＧｌａ−ドメインに含み、場合により該少なくとも１つのさらなる修飾が１２、２３または４４位から選択される、態様１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
＜態様１１＞
Ｇｌａ−ドメイン中の上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾が１２、２３および４４位から選択される位置での置換突然変異であり、該置換突然変異がＳ１２Ｎ、Ｄ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される、態様１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
＜態様１２＞
Ｇｌａ−ドメイン中の上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾が１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位から選択される位置に配置され、そして場合によっては置換突然変異であり、そして場合により１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位のすべてが修飾されている、態様１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
＜態様１３＞
上記成分が野生型成分と比べて、強化されたタンパク質分解活性、適当にはアミド分解活性を現すバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣである、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。
＜態様１４＞
野生型プロテインＣと同じグリコシル化部位を含み、該部位のアミノ酸残基がＡｓｎである、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様１５＞
ＳＰ−ドメイン中の上記少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾が、野生型成分のアミノ酸残基番号２９０〜３２０、適切には３００から３１４の間のアミノ酸範囲に対応する領域に含まれる、態様１に記載のバリアント成分。
＜態様１６＞
野生型のアミノ酸残基番号３００〜３１４に対応する修飾された領域が、削除Δ303,304,305,308および置換Ｅ３０７Ｄ／Ａ３１０Ｔを含み、そして式ＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）により表される、態様１５に記載のバリアント成分。
＜態様１７＞
上記バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、そして該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＱＧＮＬＥＲＥＣＩＥＥＩＣＳＦＥＥＡＫＥＩＦＥＤＶＤＤＴＬＡＦＷＳＫＹＶ（配列番号５）
を有する、態様１６に記載のバリアント成分。
＜態様１８＞
Ｇｌａ−ドメイン中の上記修飾（１つまたは複数）が置換である、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。  
＜態様１９＞
さらに少なくとも１つの保存的置換を含む、前記態様のいずれかに記載のバリアント成分。
＜態様２０＞
上記の野生型血液凝固成分がヒト起源である、態様１ないし１９のいずれか１項に記載のバリアント成分。
＜態様２１＞
前記態様のいずれかに記載のバリアント血液凝固成分をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡセグメント。
＜態様２２＞
適切には発現ベクターである複製可能なベクター、およびその中に挿入された態様２１に記載のＤＮＡセグメントを含んでなる組換えＤＮＡ分子。
＜態様２３＞
適切には中に安定に包含された態様２２に記載の組換えＤＮＡ分子を持つ微生物または動物細胞、適切には培養された動物細胞系を含んでなる宿主細胞。
＜態様２４＞
アデノウイルスでトランスフェクトしたヒトの腎臓細胞である、態様２３に記載の宿主細胞。
＜態様２５＞
態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分をコードする態様２１に記載のＤＮＡセグメントの生産法であって；
（ａ）野生型血液凝固成分をコードするＤＮＡを準備し；
（ｂ）ヌクレオチドの修飾を該野生型ＤＮＡに導入して、該バリアント血液凝固成分をコードする修飾されたＤＮＡセグメントを形成し；そして
（ｃ）該修飾されたＤＮＡセグメントを複製させる、
ことを含んでなる上記方法。
＜態様２６＞
態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分の生産法であって；
（ａ）該バリアント成分をコードするＤＮＡ−セグメントを準備し；
（ｂ）工程（ａ）で準備した該ＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入し；
（ｃ）該ＤＮＡセグメントを含む該ベクターを、コンパチブルな宿主細胞に導入し；
（ｄ）工程（ｃ）で準備された宿主細胞を、該バリアント成分の発現に必要な条件下で培養し；そして
（ｅ）発現したバリアント成分を培養した宿主細胞から単離する、
ことを含んでなる上記方法。
＜態様２７＞
有効量の態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分および製薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでなる製薬学的組成物。
＜態様２８＞
血液のプロテインＣ−抗凝固系に参加する成分をアッセイするための診断試験システム、適切にはキット形態であって、該システムが態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分を含んでなる上記システム。
＜態様２９＞
バリアント血液凝固成分がバリアントＡＰＣであり、そして上記試験システムがプロテインＳまたは完全な抗凝固第Ｖ因子の機能活性をアッセイするシステムである、態様２８に記載の診断試験システム。
＜態様３０＞
患者の凝血を抑制する方法であって、該患者に凝固抑制量の態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分を含んでなる生理学的に耐容可能な組成物を投与することを含んでなる上記方法。
＜態様３１＞
血栓症が抑制される、態様３０に記載の方法。
＜態様３２＞
血液凝固障害ＡＰＣ耐性を有する患者で凝血が抑制される、態様３１に記載の方法。
＜態様３３＞
血栓症のような凝固障害を処置または防止するための薬剤の製造における態様１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント成分の使用。
＜態様３４＞
バリアント成分がバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣをバリアントＰＳと組み合わせて含んでなる、態様３３に記載の使用。
＜態様３５＞
ＡＰＣ耐性の処置のための薬剤の製造における態様３３に記載の使用。
＜態様３６＞
Ｇｌａ−ドメインが突然変異Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄを含む、態様１６に記載のバリアント成分。
＜態様３７＞
ＳＰドメイン中の上記の少なくとも１つの修飾が３０２または３１６位の修飾である、態様９に記載のバリアント成分。