【手続補正書】
【提出日】平成17年10月6日(2005.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６５】
(N)n3が、配列
2005537028.tif 000001
（配列番号：79）である、請求項60記載の核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
【図１】LS3（Dz選択ライブラリー）法の図式による概観である。
【図２】LS3法に関する3つのパネルを含む。パネルAは、1つの鎖がDzのライブラリーを含有する二本鎖DNAを生成するのに用いるPCR反応の図式である。TS-17（配列番号：1）及びBS-17（配列番号：2）プライマーを標識する。増幅された鋳型（配列番号：3；相補鎖は配列番号：80）は、プライマー配列及び触媒性コア配列（下線を引いてある）の側面に位置するランダムヌクレオチド伸長部を含有する。パネルBは、DzライブラリーのPCR産物のシークエンシングゲルの写真である。パネルCは、リボースヌクレオチド（TSR及びBSR）を含有するプライマー及び2-デオキシリボース（TSD及びBSD）プライマーを用いたいくつかの増幅反応の図である。右向きの太線は、活性なDz配列を含有する鎖を表している。
【図３】炭素スペーサーを含有する核酸分子の図である（それぞれ、配列番号：81（5'末端）及び配列番号：82（3'末端））。
【図４】示されたRz（A）及びDz（B）を用いて、インビトロアッセイ中で生成された分解産物を分離しているゲルの写真を含む。
【図５】図5Aは、示したCLIP及びCHOP部分を有するSNIPAA発現カセットを図表により表したものである。S1及びS2は、CLIP中のシス作用Rzに対する自己触媒切断部位を同定する一方、S3及びS4は、CHOP中のシス作用Rzに対する自己触媒切断部位を同定する。dITRzは遊離のトランス作用Rzについて表されるが、単一のITRzをdITRzの代わりに用いることができる。ポリ（A）領域は、SNIPAAカセット中の遊離のdITRz又はITRzの3'末端の近くにある。CHOP部分は、それらの自己触媒活性を増強するシス作用Rzのためのより長い相補的な隣接配列を含む。図5Bは、（1）HPV11 E6/E7標的mRNAを発現するように設計された構築物、及び（2）示した標的部位を標的とするITRz又はdITRzを発現するように設計された構築物で同時トランスフェクションされた細胞中のHPVl1 E6/E7 mRNAの相対量をプロットした棒グラフである。図5Cは、安定的にHPV11 E6/E7標的mRNAを発現し、かつ、示した部位を標的にするように設計されたDzをトランスフェクトした細胞中のHPV11 E6/E7 mRNAの相対量をプロットした棒グラフである。
【図６】ライブラリーにより選択された部位を標的するRzによるHPV16 E6/E7 RNAのインビトロ切断を実証するゲルの2つの写真を含む。パネルA：40nMの個々のRz及び10nMの5'末端32P標識HPV16標的RNA（782ヌクレオチド）を、25mMのMgCl2を含有する20mMのTris-HCl（pH7.4）中、37℃で30分間インキュベートした。パネルB：1、2.6、6.4、16、40、及び100nMのRz59及び10nMの5'末端32P標識HPV16 E6/E7 RNA（782ヌクレオチド）を、25mMのMgCl2を含有する20mMのTris-HCl（pH7.4）中、37℃で30分間インキュベートした。
【図７】mFoldプロットを用いて決定されたHPV16 E6/E7 mRNAの予測構造の図である。ライブラリー選択により同定されたRz部位の位置をsRz部位として標識し、mFoldモデリングに基づいて選択されたRz部位の位置をmRzとして標識する。
【図８】図8Aは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中のHPV16 E6/E7 RNAのレベルを定量化するのに用いたゲルの写真である。「AA」は、空のSNIPAAカセット（すなわち、E6/E7を標的とするトランス作用Rzを含まない）を表す。図8Bは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中の相対HPV16 E6/E7 mRNAレベルをプロットした棒グラフである。空のSNIPAAカセットを対照として用いた。図8Cは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中の相対HPV16 E6/E7 mRNAレベルをプロットした棒グラフである。空のSNIPAAカセットを対照として用いた。mRz59及びmRz427は、それぞれRz59及びRz427の触媒不活性型を含有するSNIPAA構築物を表す。IRzは、B型肝炎ウイルスを標的とするトランス作用Rzを含有する、関連性のないSNIPAA構築物を表し（Panら、RNA, 7:610-621（2001））、pVAX1はベクター対照を表す。
【図９】図9Aは、標的RNAと相互作用するRz及びDz（それぞれ、配列番号：83及び配列番号：84）の図である。Rz及びDz切断部位を矢印により示す。切断部位の側面に位置する標的RNAと相互作用するRz及びDzヌクレオチドの数をN1〜5及びQ1〜5として標識する。図9Bは、種々のRz及びDz変異体に対する標的RNA切断の量を測定するのに用いたゲルの写真である。特定の変異体を表4に記載する。
【図１０】図10Aは、トランスフェクション（CMVプロモーター）後1日目に以下の核酸を含有する細胞中のHPV16mRNAの相対レベルをプロットした棒グラフである：カラム1：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；カラム2:p1CLIPAS/HPV16C+68-50+GUU；カラム3：pSIR/HPVI6siC+50-68+GUU；カラム4：p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム5：pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム6：p2CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム7：p2CHOPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム8：pSNIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム9：p2CLIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム10：p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；列11：pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；及び列12：pSNIP（空のカセット）。図10Bは、トランスフェクション（U6プロモーター）後2日目に以下の核酸を含有する細胞中のHPV16mRNAの相対レベルをプロットした棒グラフである：カラム1：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；カラム2：p1CLIPAS/HPV16C+68-50+GUU；カラム3：pSIR/HPV16siC+50-68+GUU；カラム4：p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム5：pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム6：p2CLIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム7：p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム8：pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム9：sRz59を含有するpSNIPカセット；及びカラム10：pSNIP（空のカセット）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005537028000001.app