【手続補正書】
【提出日】平成18年7月25日(2006.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的核酸配列を含有していると思われる試料に、前記標的配列に対して特異的な蛍光標識されたプローブと、該プローブ上の前記蛍光標識から生じる蛍光エネルギーを吸収することができるが可視光を発しないＤＮＡ二重鎖結合物質とを添加すること、
（ｂ）このようにして形成された混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
（ｃ）前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
（ｄ）前記試料から得られる蛍光をモニターすること、
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が縮合共役環系を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が、ミトキサントロン（１，４−ジヒドロキシ５，８−ビス［［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］−９，１０−アントラセンジオン）又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン（２Ｒ−（２α，３β，４α，５β，６α，１１β，１３α，１４α）］−１１−［６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−マンノピラノシル）オキシ］−４−（ジメチルアミノ）−３，４，５，６，９，１１，１２，１３，１４，１６−デカヒドロ−３，５，８，１０，１３−ペンタヒドロキシ−６，１３−ジメチル−９，１６−ジオキソ−２，６−エポキシ−２Ｈ−ナフタセノ［１，２−ｂ］オキソシン−１４−カルボン酸メチルエステル）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合物質がミトキサントロンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合物質が式（Ｉ）
【化１】
2006501836.tif 000001
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｘ、ＮＨ−ＡＮＨＲ及びＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”から独立に選択される（式中、Ｘはヒドロキシ、ハロ、アミノ、Ｃ１−４アルコキシ又はＣ２−８アルカノイルオキシであり、ＡはＮＨとＮＨＲ又はＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”との間の鎖長が少なくとも２炭素原子であるＣ２−４アルキレン基であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、Ｃ１−４アルキル及びＣ２−４ヒドロキシアルキル及びＣ２−４ジヒドロキシアルキルから各々独立に選択されるか（但し、窒素原子に結合した炭素原子はヒドロキシ基を有しておらず、何れの炭素原子も２個のヒドロキシ基によって置換されていないものとする。）、又はＲ’とＲ”は、両者で、Ｃ２−６アルキレン基であり、Ｒ’及びＲ”が結合する窒素原子とともに、３ないし７個の原子を有する複素環を形成しており、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１個はＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”基である。）。］
の化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）におけるプローブへのハイブリダイゼーションに先立って前記標的核酸が一本鎖にされる、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅反応のすべてのサイクル中に前記プローブが前記標的核酸とハイブリダイズする、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅反応全体を通して前記試料から生じた蛍光がモニターされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生成された蛍光データがプローブハイブリダイゼーションの割合を測定するために使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光データが前記試料中に存在する標的核酸の量を定量するために使用される、請求項８から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光標識がローダミン色素、Ｃｙ５、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体である、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光標識が前記プローブの末端領域に結合されている、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光標識が前記プローブの３’末端に結合されており、ポリメラーゼによるプローブの伸長を防止する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが伸長段階以外の増幅工程の段階の間に前記標的配列から無傷の状態で放出されるように、前記プローブが設計されている、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、増幅工程の伸長段階の間に、前記ポリメラーゼの作用によって前記標的配列から無傷の状態で放出され、前記増幅反応が５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼを用いて行われる、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）核酸ポリメラーゼと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズできる少なくとも一つのプライマーと、（ｃ）前記標的ポリヌクレオチド配列に結合でき、蛍光標識を含有するオリゴヌクレオチドプローブと、（ｄ）前記蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収することができ且つスペクトルの可視域で光を発しないＤＮＡ二重鎖結合物質と、の存在下において、標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を実施すること、及び増幅反応中の蛍光の変化をモニターすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
１対の増幅プライマーを使用して前記増幅が好適に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸ポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらなる工程において、ハイブリダイゼーションアッセイが実施され、前記配列に特有のハイブリダイゼーション条件が測定される、請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記条件が温度、電気化学的ポテンシャル又は酵素若しくは化学物質との反応である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記条件が温度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的配列中の対立遺伝子変異又は多型を検出するために使用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）配列を含有すると思われる試料に、標的配列に対して特異的な蛍光標識プローブと、該プローブ上の蛍光標識から生じる蛍光を吸収することができるがスペクトルの可視域において放射を発しないＤＮＡ二重鎖結合物質とを添加すること、
（ｂ）前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
（ｃ）前記試料から生じる蛍光をモニターし、前記プローブの前記試料へのハイブリダイゼーションの結果として又は前記プローブと前記標的核酸配列との間で形成された前記二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する、前記配列に特有の反応条件を決定すること、
を含む、配列の特徴を決定する方法。
【請求項２５】
前記配列に特有の前記反応条件が、温度、電気化学的ポテンシャル又は酵素若しくは化学物質との反応である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記条件が温度である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
２個の配列から得られた結果が、その間の多型又は変異の存在を決定するために比較される、請求項２４から２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が、ミトキサントロン（１，４−ジヒドロキシ５，８−ビス［［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］−９，１０−アントラセンジオン）又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン（２Ｒ−（２α，３β，４α，５β，６α，１１β，１３α，１４α））−１１−［６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−マンノピラノシル］オキシ］−４−（ジメチルアミノ）−３，４，５，６，９，１１，１２，１３，１４，１６−デカヒドロ−３，５，８，１０，１３−ペンタヒドロキシ−６，１３−ジメチル−９，１６−ジオキソ−２，６−エポキシ−２Ｈ−ナフタセノ［１，２−ｂ］オキソシン−１４−カルボン酸メチルエステル）である、請求項２４から２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が請求項５に定義した式（ＩＡ）の化合物である、請求項２４から２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｉ）蛍光エネルギーを吸収することができるがスペクトラムの可視域で放射を発しないＤＮＡ二重鎖結合物質と、（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に特異的な蛍光標識プローブ又は（ｉｉｉ）増幅反応を実施するのに必要な１若しくは複数の試薬のうち何れかと、を備えた、請求項１から２９の何れか１項に記載の方法で使用するためのキット。
【請求項３１】
（ｉｉｉ）を含有し、前記試薬がプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、又はＰＣＲを改良することが知られた補助剤から選択される、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が、ミトキサントロン（１，４−ジヒドロキシ５，８−ビス［［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］−９，１０−アントラセンジオン）又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン（２Ｒ−（２α，３β，４α，５β，６α，１１β，１３α，１４α）］−１１−［６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−マンノピラノシル）オキシ］−４−（ジメチルアミノ）−３，４，５，６，９，１１，１２，１３，１４，１６−デカヒドロ−３，５，８，１０，１３−ペンタヒドロキシ−６，１３−ジメチル−９，１６−ジオキソ−２，６−エポキシ−２Ｈ−ナフタセノ［１，２−ｂ］オキソシン−１４−カルボン酸メチルエステル）である、請求項３０又は３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が請求項５に定義した式（ＩＡ）の化合物である、請求項３０又は３１に記載のキット。
【請求項３４】
（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を備えた、請求項３０から３３の何れか１項に記載のキット。
【請求項３５】
標的核酸を増幅することによって試料中の標的核酸配列の存在を検出するための方法における、蛍光エネルギーを吸収できるが可視光を発しないＤＮＡ二重鎖結合物質の使用。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が共役芳香環系を含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質がアントラサイクリン又はアントラキノンを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が必要に応じて置換された構造（Ｉ）のアントラキノン
【化２】
2006501836.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、官能基、又は例えば官能基によって必要に応じて置換されたヒドロカルビル基から独立に選択されるか、又は、Ｒ１とＲ２又はＲ３とＲ４が、必要に応じて互いに結合されて、ヘテロ原子を必要に応じて含有し及び／又は官能基又はヒドロカルビル基によって必要に応じて置換された環を形成する。）である、請求項３５乃至３７の何れか１項に記載の使用。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が、ミトキサントロン（１，４−ジヒドロキシ５，８−ビス［［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］−９，１０−アントラセンジオン）又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン（２Ｒ−（２α，３β，４α，５β，６α，１１β，１３α，１４α））−１１−［６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−マンノピラノシル］オキシ］−４−（ジメチルアミノ）−３，４，５，６，９，１１，１２，１３，１４，１６−デカヒドロ−３，５，８，１０，１３−ペンタヒドロキシ−６，１３−ジメチル−９，１６−ジオキソ−２，６−エポキシ−２Ｈ−ナフタセノ［１，２−ｂ］オキソシン−１４−カルボン酸メチルエステル）である、請求項３５から３８の何れか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質が請求項５に定義した式（ＩＡ）の化合物である、請求項３５から３８の何れか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記ＤＮＡ二重鎖結合物質がミトキサントロンである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
（ａ）標的核酸配列を含有していると思われる試料に、前記標的配列に対して特異的な蛍光標識されたプローブと、ダウノマイシン（８Ｓ，−シス）−８−アセチル−１０−［３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−ｌｙｘｏ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンとを添加すること、
（ｂ）このようにして形成された混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
（ｃ）前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
（ｄ）前記試料から得られる蛍光をモニターすること、
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法。