【手続補正書】
【提出日】平成17年6月28日(2005.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む標的核酸配列の簡便かつ改良された検出および／または定量方法：
(i)少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを、該標的配列の増幅のためのプライマー対として提供する工程;
(ii)該標的配列を増幅に供し、該プライマー対の３’末端が、最終増幅産物において２つの反対の鎖上にあり、互いに0-25 ヌクレオチド対離れるようにする工程;および、
(iii) 各サイクルにおいて変性工程および少なくとも選択的アニーリング工程を行う工程。
【請求項２】
ハイスループットPCRまたは核酸標的分析のための各サイクルにおいて該変性を20 秒未満行い、該アニーリングを15 秒未満行い、伸長を10 秒未満行う請求項１の方法。
【請求項３】
核酸増幅反応の２つのオリゴヌクレオチドの１つの３’末端または３’末端の近くが蛍光または発光シグナリング部分で標識され、それは標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合にはクエンチ化されたままであり、同標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれた場合には、シグナリング部分からクエンチャーが離れることによりクエンチングの解除を介してシグナルを発生するようになる、請求項１または２の方法。
【請求項４】
第一のオリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端の近くをドナーMET部分によって標識し、第二のオリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端の近くをアクセプターMET部分によって標識し、該ドナーおよびアクセプターMET部分が分子エネルギー移動対に属し、ドナーおよびアクセプター部分がMET距離の範囲内に、即ち、10−80 オングストローム以内に位置し、あるいはMET 部分が結合しているヌクレオチドが2−20 ヌクレオチド離れて位置する請求項1〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
標識化オリゴヌクレオチドが、直鎖状、ヘアピンまたはその他の構造から選択される請求項1〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
増幅産物に組み込まれていない場合、アクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドまたはドナーまたはアクセプター部分によって別々に標識された両方のオリゴヌクレオチドが１または複数のクエンチャーによって、またはヘアピンステム構造とすることによってクエンチされた状態になり、アクセプターまたはアクセプターおよびドナーの両方の放射エネルギーがクエンチされた状態になる、請求項1-５のいずれかの方法。
【請求項７】
該クエンチングが以下のいずれかによって達成される請求項６の方法:
a.少なくとも、アクセプターで標識したオリゴヌクレオチドがヘアピンクエンチ化構造に供され、ここで、アクセプターがクエンチャーによってクエンチされるか、またはドナーとアクセプター標識化オリゴヌクレオチドの両方がヘアピンクエンチ化構造となることによって、ドナーおよびアクセプター部分の両方が２つの別々のクエンチャーによってクエンチされ、ここでクエンチャーは上記と同一のオリゴヌクレオチド上にそれぞれの５’末端においてまたは５’末端の近くに結合して提供され、クエンチャーとアクセプターまたはドナーが、上記と同一のオリゴヌクレオチドのステム構造およびその一部の２つの反対の鎖上にあり、ヘアピンステム構造が形成された場合、ドナーまたはアクセプター部分が結合しているヌクレオチドが、クエンチャーが結合しているヌクレオチドと相補的および反対側であり、あるいはドナーまたはアクセプター部分が結合しているヌクレオチドとクエンチャーが結合しているヌクレオチドの相補鎖が5ヌクレオチド以内となり、ドナー標識化および／またはアクセプター標識化ヘアピンクエンチ化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合クエンチされた状態となる：
b.場合によっては、５’末端においてまたは５’末端の近くに別々にそれぞれアクセプターまたはドナー MET 部分に好適なクエンチャーを標識しているさらなる１または２のオリゴヌクレオチドを用い、クエンチャー標識化したさらなるオリゴヌクレオチドの一方のメンバーが、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であり、その結果、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合はアクセプターのクエンチングが起こり、クエンチャー標識化したさらなるオリゴヌクレオチドの第二のメンバーが、ドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であり、その結果、ドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合はドナーのクエンチングが起こる;および、
c.アクセプター標識化オリゴヌクレオチドに部分的にまたは完全に相補的な別の好適なオリゴヌクレオチドに結合したそのアクセプター標識化オリゴヌクレオチドであって、その５’末端においてまたは５’末端の近くにおいて非ヌクレオチド有機性リンカーまたはリンカーおよびスペーサーを介してクエンチャーで標識したアクセプター標識化オリゴヌクレオチドを提供することにより、または、アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的な２つの別々のさらなる好適なオリゴヌクレオチドにそれぞれ非ヌクレオチド有機性リンカーまたはリンカーおよびスペーサーを介して結合しており、５’末端においてまたは５’末端の近くにそれぞれ２つのクエンチャーを標識したそのアクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドの両方を提供することにより、クエンチャーが、アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合にはアクセプターおよびドナーをクエンチすることが出来る。
【請求項８】
第二のオリゴヌクレオチドプライマー対が請求項1 -７のいずれかの標識化オリゴヌクレオチドプライマー対である場合、標的核酸の第一のセグメントを増幅するよう選択した第一のオリゴヌクレオチドプライマー対をネスト化 PCRに使用するのに適当な濃度で用い、第一のセグメントの第二のセグメントを増幅するよう選択された第二のオリゴヌクレオチドプライマーをネスト化 PCRに使用するのに適当な濃度で用いる請求項1−７のいずれかの方法。
【請求項９】
標的核酸の第一のセグメントを増幅するよう選択した第一のオリゴヌクレオチドプライマー対を適当な濃度で用い、ここで、該オリゴヌクレオチドプライマー対の一方が請求項1 -８のいずれかの標識化または非標識化プライマー対の第一のメンバーであり、非標識またはMETで好適に標識した第三のオリゴヌクレオチドであって、上記第一のメンバーと協同して第一のセグメントの第二のセグメントを増幅するよう設計したその第三のオリゴヌクレオチドを、ネスト化し、標的核酸の該選択的増幅の際に、シグナルが生ずる、請求項1-８のいずれかの方法。
【請求項１０】
該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応を含む既知の核酸増幅反応を含み、その核酸増幅反応は、ポリメラーゼ、反応緩衝液、有効量の増幅プライマーに加えて、デオキシヌクレオチド三リン酸をサンプルに添加する工程、サンプルを少なくとも変性温度とアニーリング温度の間でサイクルさせる工程、反応混合物をドナー励起放射または光で励起する工程、アクセプター MET 部分の放射、所望によりドナーの放射を測定する工程を含む請求項1-９のいずれかの方法。
【請求項１１】
標的配列の該増幅工程が、標的配列増幅反応の２つの増幅プライマーの１つとして１つの標識化オリゴヌクレオチドと、別の非標識化プライマーおよび増幅産物のための第三の標識化オリゴヌクレオチドを用いて行う核酸増幅反応を含み、該標識化オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端または３’末端の近くをドナー-アクセプター MET 対のドナーまたはアクセプター MET 部分で標識しており、該第三のオリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端の近くをそれぞれ上記MET対のアクセプターまたはドナーMET部分で標識しており、そして、標的配列の増幅が成功すると、標識化プライマーが増幅産物の２本の鎖の一方に取り込まれ、第三の標識化オリゴヌクレオチドが、標識化オリゴヌクレオチドプライマーが取り込まれた増幅産物のこの鎖にハイブリダイズし、それによってドナーおよびアクセプター MET 部分がMET 距離である0-20 ヌクレオチド以内に互いに近接する結果、上記２つの部分の間でのMET が生じる;上記該増幅反応が、有効量の増幅プライマーに加えて、ポリメラーゼ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド三リン酸をサンプルに添加する工程、少なくとも変性温度と伸長温度の間をサンプルをサイクリングさせる工程、反応混合物をドナー励起放射または光で励起する工程、アクセプター MET 部分の放射、そして所望によりドナー放射の減少を測定する工程を含み、それによって増幅反応を阻害することなく核酸標的が検出され、シグナルが喪失することなくシグナルが測定できる請求項1-9のいずれかの方法。
【請求項１２】
以下を含む請求項１−１１のいずれかの方法：
a.少なくともアクセプターで標識したオリゴヌクレオチドをクエンチされた構造に供し、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれないかハイブリダイズしない場合、アクセプターをクエンチされた状態であり、それによってバックグラウンドを低下させ、増幅産物に組み込まれたかハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチドを開いた構造にてクエンチされない状態となり、シグナルが生じる、
b.ドナー MET 部分が吸収した光で増幅サンプルは発光する、そして、
c.アクセプターからの増感放射および所望によりMET対部分のドナーからの放射をモニターする。
【請求項１３】
直鎖状またはヘアピン構造の第一のオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近くにて、ドナー部分で標識しており、第二のオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近くにてアクセプター部分にて一重に標識しており、アクセプター部分はドナーから放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるものであり、ここで、アクセプターがフルオロフォアまたはDABCYLまたはそのアナログまたはナノゴールド粒子ブラックホールクエンチャーを含むクエンチャーから選択され、第一のオリゴヌクレオチドのドナー部分が第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれない場合は、以下のいずれかによってクエンチされた状態になる、
別々に、または有機性非ヌクレオチドリンカーを介して第一のオリゴヌクレオチドに結合した、第一のオリゴヌクレオチドに対して完全にまたは部分的に相補的な第三のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端または５’末端の近くにてクエンチャー部分で標識したものを提供すること、または、第一のドナー標識化オリゴヌクレオチドをその５’末端または５’末端の近くにクエンチャーを備えたヘアピンオリゴヌクレオチドとして提供すること、
そしてステム構造においてクエンチャーがドナー部分に近接するように配置される、クエンチャーはドナーによって放射されるエネルギーまたは光を吸収することが出来るように選択され、かつ、フルオロフォアまたはDABCYLまたはそのアナログまたはナノゴールド粒子、ブラックホールクエンチャーを含む非放射性クエンチャーとなるように選択される、第一および第二のオリゴヌクレオチドが核酸増幅反応の２つのプライマーであり、プライマーダイマーが形成された場合のみ、ドナーの放射が第二のオリゴヌクレオチド上のクエンチャー/アクセプターによってクエンチされる、特異的増幅産物形成の場合には上記第二のオリゴヌクレオチドのクエンチャー/アクセプターが、第一のオリゴヌクレオチドを介して増幅産物に組み込まれたドナー部分から少なくとも10 塩基離れた状態となり、同時に第一のオリゴヌクレオチドのクエンチャーが第一のオリゴヌクレオチドを介して増幅産物に組み込まれたドナー部分から少なくとも10塩基離れた状態になり、それによって、ドナー部分がその特有のエネルギーまたは光を放射し、ノイズに対するシグナルの比が向上した標的核酸配列の検出または定量ができるシグナルが発生する、請求項1−12のいずれかの方法。
【請求項１４】
３’末端またはその近くを、ドナー-1部分で標識した第一のオリゴヌクレオチド、３’末端またはその近くを、ドナー-1によって放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるアクセプター部分で一重標識された第二のオリゴヌクレオチド、および５’末端または５’末端の近くにてドナー-2 部分で一重標識された第三のオリゴヌクレオチドを提供し;ドナー-1はドナー-2によって放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるものであり、第三のオリゴヌクレオチドは相補性が維持されるように完全にまたは部分的に相補的であり、そうして第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれない場合は、ドナー-2 部分はドナー-1 部分によってクエンチされた状態となり;第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれると、ドナー-2 部分で標識した第三のオリゴヌクレオチドがドナー-1で標識した第一のオリゴヌクレオチドと離れ、ドナー-2 部分の放射が測定される、請求項1 -13のいずれかの方法。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが10−40 塩基の長さであり、該ヘアピンオリゴヌクレオチドが以下の何れかを含む請求項1 -13のいずれかの方法:
a. 標的核酸配列に完全に相補的な10−40 塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端に5−9 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドが結合し、第二のオリゴヌクレオチドは標的配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第一のオリゴヌクレオチドの３’末端に完全に相補的であり、それによってステム・ループ構造を形成する、
b.標的核酸配列に完全に相補的な15−40塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端に2−12 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドが結合し、第二のオリゴヌクレオチドの５’末端が5 − 9 塩基長の第三のオリゴヌクレオチドに結合し、第二および第三のオリゴヌクレオチドは標的核酸配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第三のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近くの5−9塩基と完全に相補的であり、それによってステム・ループ構造を形成する、
c. 標的核酸配列に完全に相補的な、15−40 塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであり該第一のオリゴヌクレオチドの５’末端が5 −9 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドに結合し、該第一のオリゴヌクレオチドの３’末端が5− 9 塩基長の第三のオリゴヌクレオチドに結合し、第二および第三のオリゴヌクレオチドが互いに完全に相補的であって、標的核酸配列に完全にまたは部分的に相補的であってもなくてもよく、それによって、該ヘアピンオリゴヌクレオチドのステム・ループ構造を形成する、
d. 標的核酸配列に完全に相補的な15−50塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであって、、その５’末端が非ヌクレオチド有機性リンカーを介して10 −30塩基長の第二のオリゴヌクレオチドに結合し、第二のオリゴヌクレオチドが標的核酸配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第二のオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近くの塩基と相補的である。
【請求項１６】
ヘアピン、直鎖状またはその他のオリゴヌクレオチドがクエンチされた場合、ドナーまたはアクセプター MET 部分が結合しているヌクレオチドが、それぞれドナーまたはアクセプターのためのクエンチャーに結合しているヌクレオチドの反対側または5 ヌクレオチド以内にあり、ドナー/アクセプター MET 部分とクエンチャーがステムの反対の鎖上にある請求項1 -15のいずれかの方法。
【請求項１７】
該オリゴヌクレオチドが、DNAまたはRNAまたはそのキメラ混合体または誘導体または修飾物から選択され、増幅反応のプライミングまたは増幅産物へのハイブリダイズに適しており、デオキシオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸あるいは修飾オリゴヌクレオチドであり、標的核酸配列がゲノムDNA、mRNA、RNA、cDNA、化学合成DNAまたはRNAから選択される、請求項1−16のいずれかの方法。
【請求項１８】
該オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写 PCR (RT-PCR)、アレル特異的PCR、メチル化状態 PCR、インサイチュ PCR、三重増幅、核酸配列に基づく増幅、イムノ PCRの増幅プライマー(フォワードおよびリバース)である、請求項1 −17のいずれかの方法。
【請求項１９】
大量のmRNAまたはcDNAを、個々のmRNAまたはcDNAから選択される好適に標識されたオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、同時に定量することによる、リアルタイム RNA 発現プロファイリングに用いる請求項1−18のいずれかの方法。
【請求項２０】
以下の工程を含み、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる請求項1−19のいずれかの方法：
個々のmRNAまたはcDNAの５’末端付近の配列から選択したプールからの大量の各mRNAまたはcDNAのための第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、および、第二の増幅プライマーとして、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNAに共通である)を提供する工程、ここで、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマーはすべてのmRNAまたは増幅反応に供する前のプールまたはサンプルにおいて逆転写により合成されたcDNAの５’末端に結合または連結した配列に相補的であり、それらのオリゴヌクレオチドプライマーは該標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをドナーまたはアクセプター MET 部分で標識しており、第二の共通オリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをアクセプターまたはドナー MET 部分で標識しており、それぞれクエンチ化に供されうる。
【請求項２１】
以下の工程を含む、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる請求項1−19のいずれかの方法：
個々のmRNAのcDNAの制限部位の３’または５’末端の近くの配列から選択したプールからの大量のmRNAまたはcDNAのそれぞれのための第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、および第二の増幅プライマーとして単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNAに共通である)を提供する工程、ここで、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマーは増幅反応に供される前のプールまたはサンプルにおいて逆転写によって合成されたすべてのcDNAの制限断片の３’末端および５’末端に結合または連結した配列に相補的であり、それらのオリゴヌクレオチドプライマーが該標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一の特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、あるいは、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをドナーまたはアクセプター MET 部分で標識しており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをアクセプターまたはドナー MET 部分で標識しており、それぞれクエンチ化に供されうる。
【請求項２２】
標的ヌクレオチド配列がmRNAまたはcDNAであり、標識化オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、逆転写 ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、NASBA を含む多くの核酸増幅反応の増幅プライマー(フォワードおよびリバース)、１つのエキソンの３’末端由来のものおよび隣接するエキソンの５’末端由来の他のものであるか、あるいは、PCR、RT-PCRを含む多くの核酸増幅反応の２つの増幅プライマーの１つであって、１つのエキソンの３’末端由来のものであり、該隣接するエキソンの５’末端に相補的なプローブである、RNA スプライスバリアント検出に用いられる請求項1− 20のいずれかの方法。
【請求項２３】
アクセプター MET 部分/ MET 部分により放射される検出可能なシグナルがMETがない場合にアクセプター MET 部分/ MET 部分により放射されるシグナルより大きくかつより強度であり、オリゴヌクレオチドが、MET 部分が近接してドナーとアクセプター部分間のMETが生じるように設計され、FRETがMETの好ましい形態である請求項1−21のいずれかの方法。
【請求項２４】
標的核酸配列が伝染病病原体の増幅産物または配列であるか、障害または疾患の存在に関係する、ヒト、動物、植物またはその他のいずれかの生体突然変異体のゲノム配列であるか、または存在または不在が障害または疾患に関係するヒト、動物または植物ゲノム配列であるか、あるいは存在または不在が伝染病病原体への感染しやすさに関係するヒト、動物または植物ゲノム配列であるか、あるいは存在または不在が植物またはその他の生物の遺伝形質または遺伝子型に関係する植物またはその他の生物のゲノム配列であるか、あるいは存在または不在が株タイピングに関連する伝染病病原体のゲノム配列である、請求項1 − 22のいずれかの方法。
【請求項２５】
ドナーおよびアクセプター対部分がいずれかのドナー - アクセプター MET−FRET 対から選択され、ドナー部分が以下を含む群から選択され；フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン(FAM)、クマリン、5-(2’アミノエチル)アミノナフチレン−1- スルホン酸(EDANS)、ローダミン、アントラニルアミド、反応性レッド- 4、ユウロピウムおよびテルビウムキレート誘導体、吸収の減衰係数の大きい有機性部分の組み合わせおよび、フルオロフォア、そして、該アクセプター部分が以下を含む群から選択され;フルオレセイン、JOE等のフルオレセイン誘導体、エチジウム、テキサスレッド、エオシンニトロチロシン、マラカイトグリーン、ピレンブチラート、Cy- 3 色素、Cy- 5 色素 、DABCYL、DABCYL誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、ナノゴールドブラックホールクエンチャー、そして該クエンチャーは以下からなる群から選択される；DABCYLおよびその誘導体、ローダミン、ナノゴールド粒子、ブラックホールクエンチャーおよび多くのその他のアクセプター部分である、請求項1-23のいずれかの方法。
【請求項２６】
増幅された標的核酸の検出および／または定量が、臭化エチジウム、CYBER（商標）グリーン I、ピコグリーン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ Yo PRO-1およびクロモマイシン A3を含む群から選択される二本鎖 DNA 結合性蛍光色素を提供する工程によって達成される、請求項１，２，１９−２１または２３のいずれかの方法。
【請求項２７】
増幅された標的核酸配列の検出および／または定量が、以下を含む群から選択される結合性部分で標識した第一のオリゴヌクレオチドプライマー；ビオチン、磁性粒子、ミクロスフィア、ハプテンまたは直接またはリンカーを介して結合したアンカーオリゴヌクレオチド、これらはそれぞれストレプトアビジンまたは磁石または遠心分離または抗-ハプテン抗体、捕捉オリゴヌクレオチドなどによって捕捉される、および以下を含むシグナリング部分によって標識した第二のオリゴヌクレオチドプライマー；フルオロフォア、希土類金属キレート、ビオチンまたはハプテン、を提供する工程、ここでハプテンは、抗ハプテン抗体-酵素結合体、ストレプトアビジン- 酵素結合体および酵素基質、およびその他の結合体の利用によって検出される、あるいは非標識化第二のオリゴヌクレオチドプライマーの使用および反応混合物において適当な濃度にて蛍光標識化ヌクレオチドを提供する工程、によって達成される、請求項１，２，１９−２１または２３のいずれかの方法。
【請求項２８】
ノイズに対するシグナルのより高い比の改善は、ドナーおよびアクセプター部分間のMET/FRETを用いる、核酸標的配列の検出においてヘアピンクエンチ化標識化オリゴヌクレオチドを適用する工程および、フォワード増幅プライマーの大きさとリバース増幅プライマーの大きさと0-25 塩基の和の大きさの増幅産物選択する工程によって達成される、請求項1−26のいずれかの方法。
【請求項２９】
複数の標的の検出または定量のためにMET 標識化オリゴヌクレオチドの複数の対を伴う多重化を含む、請求項1 -28のいずれかの方法。
【請求項３０】
異種相検出を含み、ここで、PCR、RT-PCR、NASBAを含む多くの増幅反応の２つの増幅プライマーの一方が５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、他方の増幅プライマーが固相に接触した水相にあり、標識化オリゴヌクレオチドが結合している該固体支持体が非多孔性および透明または半透明およびガラスまたはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンを含むプラスティックまたはデキストランである、請求項1−28のいずれかの方法。
【請求項３１】
PCR、RT-PCR、NASBAを含む多くの増幅反応についての多くの標的核酸の２つの増幅プライマーの第一が５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーが固相と接触している水相にあり、標識化オリゴヌクレオチドが結合している該固体支持体が非多孔性および透明または半透明およびガラスまたはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンを含むプラスティックまたはデキストランである、ハイスループット異種相標的核酸検出のための請求項1 -28のいずれかの方法。
【請求項３２】
以下の工程によってPCR、RT-PCRおよびNASBAを含む多くの核酸増幅反応によるハイスループットRNA発現プロファイリングに用いる請求項1 -28の方法：
個々のmRNAまたはcDNAの５’末端の近くの配列から選択したプールから大量の各mRNAまたはcDNAのための第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、ここで、該第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーは固相と接触した水相にある、そして、第二の増幅プライマーとして、プールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNAの５’末端に連結または結合した配列に相補的な単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー(プールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNAに共通である)を提供する工程、ここで、増幅反応に供する前に該オリゴヌクレオチドプライマーは標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、あるいはそれぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをドナーまたはアクセプター MET 部分で標識しており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをアクセプターまたはドナー MET 部分で標識されており、またクエンチ化に供され得る。
【請求項３３】
以下の工程による、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含む多くの核酸増幅反応によるハイスループット RNA 発現プロファイリングに用いる請求項1 -28の方法：
個々のmRNAまたはcDNAの制限部位の３’または５’末端近くの配列から選択したプールからの大量の各mRNAまたはcDNAのための第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、ここで該第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーが固相と接触した水相にあり、そして、第二の増幅プライマーとしてプールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNA 制限切断断片の３’および５’末端に連結または結合した配列に相補的な単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのmRNAまたはcDNA について共通である)を提供する工程、ここで、増幅反応に供する前に該オリゴヌクレオチドプライマーは標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをドナーまたはアクセプター MET 部分によって標識しており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’末端またはその近くをアクセプターまたはドナー MET 部分によって標識しており、またクエンチ化に供されうる。
【請求項３４】
プライマーの一方または両方がドナーまたはアクセプター部分および、それぞれ好適な濃度でアクセプターまたはドナーとして作用するのに好適な、二本鎖 DNAにインターカレートする色素による標識に供され、それにより増幅が成功すると、ドナー/アクセプター 標識化プライマー/プライマー群が増幅産物に組み込まれ、そして、二本鎖DNA結合(インターカレートする)色素が増幅産物にインターカレートされ、それによって場合によってはそれがドナーまたはアクセプター部分に近接し、測定可能なMET/FRETが生じ、より具体的には、フルオレセイン標識化プライマーおよび二本鎖 DNA結合色素である臭化エチジウムが用いられ、ここでフルオレセインがドナーであり、エチジウムが両者間におこるFRETのアクセプターとして作用する、請求項1、２、１９−２１および２３いずれかの方法。
【請求項３５】
１または複数の核酸標的配列の検出または定量のための閉管チューブ形式において用いられる請求項1 -32のいずれかの方法。
【請求項３６】
用いられるオリゴヌクレオチドが以下から選択される請求項1-33のいずれかの方法:
【化１−１】
2005528121.tif 000001
【化１−２】
2005528121.tif 000002
【請求項３７】
サンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似の検出および／または定量の方法に用いる以下を含むキット：
a.１または複数のポリメラーゼ
b.増幅の後、該プライマー対の３’末端が最終増幅産物において２つの反対側の鎖の上にあり、互いに 0-25ヌクレオチド対離れるような、該標的配列の増幅のためのプライマー対としての少なくとの２つのオリゴヌクレオチド、
c. 溶液 (水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド;
d.核酸増幅反応のための反応緩衝液。
【請求項３８】
プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの３’末端の近くまたは３’末端をドナーまたはアクセプター MET/FRET 部分で好適に標識しており、該オリゴヌクレオチドはポリメラーゼが伸長するための遊離の３’水酸基を含み、ここで該ドナーおよびアクセプターMET 部分が分子エネルギー移動対に属し、ドナーおよびアクセプター 部分が増幅産物においてMET/FRET距離内となり、ドナーおよびアクセプター 部分が結合しているヌクレオチドが0-25ヌクレオチド対離れるように配置される請求項37のキット。
【請求項３９】
アクセプター部分が増幅産物に組み込まれない場合、 アクセプターMET部分標識化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくともアクセプター部分がクエンチ化され、または標識化オリゴヌクレオチドプライマーのドナーおよびアクセプターMET 部分の両方がそれぞれ、ドナーおよびアクセプターMET 部分が増幅産物に組み込まれない場合、クエンチ化され、上記クエンチ化されたオリゴヌクレオチドプライマーが請求項７または１５のいずれかのオリゴヌクレオチドプライマーである請求項３８のキット。
【請求項４０】
さらに陽性対照鋳型および好適な MET/FRET 標識化プライマーも増幅反応の対照として含まれる請求項３５または３６のいずれかのキット。
【請求項４１】
第一のオリゴヌクレオチドの３’末端近くをドナー MET/FRET 部分で標識し、ドナー部分が放射するエネルギーまたは光を吸収することが出来、エネルギーまたは光を放射することが出来る二本鎖 DNA インターカレート色素が備えられる請求項３６または３７のキット。
【請求項４２】
第一のオリゴヌクレオチドの３’末端近くをアクセプター MET/FRET 部分により標識され、照明の際、エネルギーまたは光を放射することができる二本鎖 DNA インターカレート色素が備えられ、アクセプター部分がインターカレート色素によって放射されるエネルギーまたは光を吸収し、エネルギーまたは光を放射することができる、請求項３６〜４０のいずれかのキット。
【請求項４３】
複数の標的配列の検出および／または定量に要求される複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む請求項３６〜４０のいずれかのキット。
【請求項４４】
請求項５− １１のいずれかの方法において使用されるオリゴヌクレオチドを用いる１または複数の標的核酸配列の検出用キットであり、ここで増幅された標的核酸配列の検出および／または定量が以下のように達成される、第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二のオリゴヌクレオチドプライマーを提供すること、ここで、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端においてまたは５’末端の近くに、ビオチン、または磁性粒子またはミクロスフィアまたは ハプテンを含む結合性部分で標識されているか直接またはリンカーを介してアンカーオリゴヌクレオチドに結合しており、それぞれストレプトアビジンまたは磁石または遠心分離または抗-ハプテン 抗体、捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉され得、そして、第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、フルオロフォア、希土類金属キレート、ビオチンまたはハプテンを含むシグナリング部分によって標識され、ハプテンは抗-ハプテン抗体酵素結合体によって、ストレプトアビジン- 酵素結合体および酵素基質およびその他の結合体によって検出され、あるいは非標識化第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより達成され、そして蛍光標識化ヌクレオチドを反応混合物中にて適当な濃度にて提供すること。
【請求項４５】
検出のためのオリゴヌクレオチドを用いる請求項５− １１のいずれかの方法において用いられるすべてのまたはより多くの成分を提供する、標的核酸配列の検出用の１または複数のキットであり、増幅された標的核酸の検出および／または定量が臭化エチジウム、CYBER（商標）グリーン I、ピコグリーン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ Yo PRO- 1およびクロモマイシン A3を含む群から選択される二本鎖 DNA 結合性蛍光色素を提供することにより達成されるキット。
【請求項４６】
用いられるオリゴヌクレオチドが以下から選択される請求項36-43のいずれかのキット:
【化２−１】
2005528121.tif 000003
【化２−２】
2005528121.tif 000004
【化２−３】
2005528121.tif 000005
【請求項４７】
以下の工程を含むサンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似検出および／または定量の方法に使用するキットの製造方法：
a.１または複数のポリメラーゼを提供する工程、
b. ３’末端またはその近くをドナー MET/FRET 部分で好適に標識した標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチドを提供する工程、
c. ３’末端またはその近くをアクセプター MET/FRET 部分で好適に標識された標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接するヌクレオチド配列に相補的な第一のヌクレオチド配列の５’末端の配列の第二のオリゴヌクレオチドを提供する工程、
d.溶液(水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチドを提供する工程、
e. 核酸増幅反応のための反応緩衝液を提供する工程、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が多くの核酸増幅反応の２つのプライマー(フォワードおよびリバース)を含み、２つのオリゴヌクレオチドが増幅産物の２つの反対の鎖に組み込まれ、近接した場合検出可能なシグナルを生成し、第一および第二のオリゴヌクレオチドが請求項1 -24のクエンチ化オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかである。
【請求項４８】
請求項1-33のいずれかの標的核酸配列の検出/定量方法を用いる、同種または異種相において行う、mRNAの絶対量の分析のためのハイスループット RNA 発現プロファイリング方法。
【請求項４９】
２つの増幅プライマー オリゴヌクレオチドを含み、一方がドナー MET部分で３’末端近くを標識しており、他方が３’末端近くをアクセプター MET 部分で標識しており、標的増幅反応を行い、かくして増幅された１または複数の増幅産物の熱変性分析を行い、同方法において、標識化オリゴヌクレオチドがクエンチ化構造に供される、異種突然変異検出のための請求項1 -３６，４７、４８のいずれかの方法。
【請求項５０】
PCR、RT-PCRを含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる請求項１−３６、４７−４９のいずれかの方法。
【請求項５１】
ドナー部分が吸収の減衰係数が大きい有機性部分と、フルオロフォアの組み合わせである請求項１−３６、４７−５０のいずれかの方法。
【請求項５２】
ノイズに対する高いシグナルの比がヘアピンクエンチ化標識化オリゴヌクレオチドをリガーゼ連鎖反応に用いることにより達成される請求項１−３６、４７−５１のいずれかの方法。
【請求項５３】
ノイズに対するより高いシグナルの比の向上が、ヘアピンクエンチ化またはその他のクエンチ化標識化オリゴヌクレオチドを標的配列の一方の鎖に対して設計されている２つのオリゴヌクレオチド上のドナーおよびアクセプター部分の間のMET/FRETを用いる核酸標的配列の検出に適用することにより達成される、請求項１−３６、４７−５２のいずれかの方法。
【請求項５４】
増幅プライマーの一方またはその両方の３’末端またはその近くを１または複数のアクセプターまたはドナー部分で標識し、４つのデオキシヌクレオチドの１つをドナーまたはアクセプター部分でそれぞれ適当な濃度および組成にて標識し、アクセプター標識化プライマーまたはプライマー群およびドナー標識化ヌクレオチドが増幅産物に組み込まれると、ドナーおよびアクセプター部分間でMET/FRETが起こる請求項１−３６、４７−５３のいずれかの方法。
【請求項５５】
ポリメラーゼが逆転写酵素、T7RNA ポリメラーゼまたは DNA ポリメラーゼである、請求項３７−４６のいずれかのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のＭＥＴ／ＦＲＥＴに基づく方法