【手続補正書】
【提出日】平成18年8月1日(2006.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】  液体試料中の少なくとも１つの分析体の存在を決定するための分析試験装置であって、該装置は：
毛管作用によって試料が流れることができる乾燥多孔担体；
試料を装置に適用することができそしてそこの流入することができる試料分配手段；
末端が閉じており、担体の領域に外接している試料循環チャンネル；
担体の上記領域の少なくとも１つのセグメントをカバーする少なくとも１つの検出領域であって、試料循環チャンネルの少なくとも１つのセグメントが検出領域の境界に一致しており、そして該検出領域と作用上連続しており、その境界を横切って試料が、検出領域に同時に複数の異なった方向から流入し、上記境界から流出する流れを形成することができ、而も当該検出領域は少なくとも１つの分析物に対する少なくとも１つの可動性且標識特異的結合試薬を含有し、その結合試薬の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析体と反応して、上記流れに沿って移動することができる少なくとも１つの標識複合体を形成することのできる領域；および
流入端および閉鎖している末端を有する少なくとも１つの捕捉領域チャンネルであって、その流入端は検出領域と作用上連結して上記流れを検出領域から捕捉領域チャンネルへ流れるようにし、上記の境界のすべての点と上記流入端との間の距離は本質的に同じであり、捕捉領域チャンネルは少なくとも１つの固定化特異的結合試薬を含有しており、その結合試薬の少なくとも１つは、少なくとも１つの上記標識複合体と反応し濃縮して少なくとも１つの検出することができる反応産物を形成するチャンネル；
を含む分析試験装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】  ２またはそれ以上の検出領域が担体の該検出領域上に配列され、等しい数の捕捉領域チャンネルがあり、それぞれは相当する検出領域と作用的な連結を有している、ことを含む請求項１または３記載の装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】  小容量の液体生物試料中に含まれる少なくとも１つの抗原の存在を
決定するに適し、而も抗原決定の反応が起こる少なくとも１つの決まった経路を通して試料が急速かつ効果的に流れるようにした分析試験装置であって、該装置は：
試料を添加するための貫通した孔が形成された上表面を有する頂上層であって、その貫通孔は試料輸送チャンネル、即ち上記頂上層の低い表面中に形成されて、試料循環チャンネルと作用的に連結している輸送チャンネルとして作用し、上記循環チャンネルはその両端が閉じ、内、外壁が上記の低い表面中を流れる流路となっており、上記内壁が頂上層の上記低い表面中に凹みを画定しているような頂上層；
頂上層に接した支持層；
上層と下層の間にはさまれた毛管作用により試料が流れることができる乾燥多孔性担体層で、該多孔性担体層は、少なくとも１つの検出領域を含むよう配置され、上記検出領域は試料循環チャンネルのセグメントに作用的に連結された境界と、捕捉領域チャンネルに作用的に連結された第２の反対側端とを有し、上記捕捉チャンネルは、流入端および閉鎖末端を有するもので、流体試料が、試料循環チャンネルから捕捉領域チャンネルの末端に毛管作用により流れる導管を提供するようになっている担持層；
液体試料が貫通孔から捕捉チャンネルの末端まで流れるよう決められた経路を形成している、輸送チャンネル、循環チャンネル、検出領域および捕捉領域チャンネル；
検出領域で抗原と特異的に反応し、毛管作用により捕捉領域チャンネルに移動する標識複合体を形成する、少なくとも１つの可動性の標識試薬；
標識複合体と反応して濃縮し、検出し得る反応産物となる捕捉領域チャンネル中の固定化試薬；
を含む、分析試験装置。標識複合体と反応して濃縮し、検出し得る反応産物となる捕捉領域チャンネル中の固定化試薬；
を含む、分析試験装置。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３１】  ｉ）毛管作用によって試料が流れることができる乾燥多孔担体を用意し；
ｉｉ）少なくとも該担体の領域のセグメントをカバーする少なくとも１つの検出領域を用意し、上記試料が、複数の異なった方向から該検出領域に流入するようにし、また、該検出領域が、該少なくとも１つの分析物に対する少なくとも１つの移動性の標識結合試薬を含み、結合試薬は該分析体と反応して標識複合体を形成するようにし；
ｉｉｉ）検出領域から捕捉領域チャンネルへ試料が流れるように検出領域と作用的に連結した流入端を有する少なくとも１つの捕捉領域チャンネルを設け、該試料が該検出領域に入ることのできる全ての点と、該流入端との間の距離は本質的に同じとし、該捕捉領域チャンネルは固定化特異的結合試薬を含有しており、その結合試薬は、該標識複合体と反応および濃縮して検出することができる反応産物を形成するようにし；
ｉｖ）該液体試料の一定量を該検出領域に流し；
ｖ）該複数の異なった方向からの検出領域から捕捉領域チャンネルの検出領域への試料の流れと、その中の該分析物とが該捕捉領域で検出し得る反応産物を形成するに充分な時間を経過させ；
ｖｉ）該液体試料中の少なくとも１つの分析物の存在を該捕捉領域における該検出反応物で検出する；
一連のステップを含む液体試料中の少なくとも１つの分析物の存在を決定する方法
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４４】  固定化試薬がストレプトアビジンおよびアビジンからなる群から選択されたものである請求項４３記載の装置。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６６】  固定化試薬がストレプトアビジンおよびアビジンからなる群から選択されたものである請求項５９記載の装置。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７６】  該試料輸送チャンネルが、該少なくとも１つの分析体の該決定を行うに必要な試料の量に相当する、前以て決められた容量を有し、該試料輸送チャンネルは、該試料輸送チャンネルが該前以て決められた容量に満たされるときに、該試料輸送チャンネルから該試料循環チャンネルへの該前以て決められた容量に導く手段を有している請求項５８記載の装置。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７７】  該試料輸送チャンネルと作用的に連結している該試料輸送チャンネルが該試料循環チャンネルに導かれている狭まった毛管部分を含み、試料輸送チャンネルが該狭まった毛管部分と接触点まで該試料で満たされたとき、該試料は試料循環チャンネルに導かれる請求項７６記載の装置。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分析試験装置および液体試料中の分析体の存在を決定する分析アッセイに有用な方法に関する。本発明は、限定はされないが、全血中の心臓の分析物の存在を決定するのに特に有用である。
【０００２】
（背景技術）
本発明の製品および方法は、哺乳類の疾病および治療処置の経過を追跡する多くの診断目的に利用することができる。全血、血清、血漿および尿のような多くの哺乳類の体液に適用され得る。本発明は心臓の分析体を検出するのに応用するとして主に考察されるが、抗原／抗体または同等の反応が利用される他の分野に応用することができる。
【０００３】
特に免疫アッセイを含む多くの関連するアッセイは、本発明の装置およびその開示された変形を使用して実行することができる。例えば、血漿からの赤血球の分離および側面の液体経路を使用した免疫アッセイまたは非免疫アッセイを利用することができる。妊娠または排卵を決定するホルモン、消化管潰瘍に対するＨ．ｐｙｌｏｒｉを含むウイルス性、細菌性および眞菌感染微生物、習慣性および耽溺性薬物および腫瘍マーカーのような分析体は非制限的例である。色素原の形成による血液中のグルコースおよびその他の分析体のレベルを測定するような酵素アッセイは、本発明により予想されることである。
【０００４】
発泡膜のような乾燥多孔性担体を用いた反応を利用する多くの免疫手段が近年開発され、そこでは、分析される試料が毛管作用によって流動し、反応産物が可視化されるか反射計のような装置により検出されている。それほど限定されないが、これらの手段は、一般的に、抗原／抗体反応を含み、反応性ペアーの１つのメンバーが検出し得る標識で標識される。典型的には、標識は、酵素標識あるいは粒子状、例えば金のようなゾル標識、の直接的標識である。多くの有用な標識およびそれらの操作方法が公知技術として知られている。
【０００５】
この性質の典型的な免疫クロマトグラグ装置は、いくつかの米国および外国特許に記載されている。例えば、米国特許４，８６１，７１１は、分析体が、一連の端対端接触した同一平面の膜で起こった抗原／抗体反応によって検出される装置を記載している。その他の装置が米国特許４，７７４，１９２；４，７５３，７７６；４，９３３，０９２；４，９８７，０６５；５，０７５，０７８；５，１２０，６４３；５，０７９，１４２；５，０９６，８０９、５，１１０，７２４；５，１４４，８９０；５，５９１，６４５；５，１３５，７１６に記載されている。全てのこれら特許は、積層構造について記載している。
【０００６】
上記に確認した特許に記載されたような発泡多孔性膜を含む装置は、しばしば製造が困難である、なぜならそれらは多層であり、正確な結果を保証する多孔性のいくつかの層およびろ過ストリップであるからである。
【０００７】
全血中の心臓分析体の検出には、赤血球を分離する必要があり、そうすることによって可視化または別にその免疫アッセイ反応において通常生産された色のついた反応産物の検出が阻害されない。
【０００８】
免疫アッセイ装置は全血で心臓の分析物を検出に採用したとき、検出し得る産物を産生するようなそれらの抗原と反応する標識抗体を利用する。抗原／抗体反応を利用するそのような診断または分析手段に広く利用されている一つの方法は、多孔性膜ストリップの検出領域において形成される標識抗体／抗原複合体を生成する抗原のエピトープと反応する、標識した検出抗体を採用している。複合体は、毛管作用によって膜に沿って、捕捉抗体を含んでいる固定されたラインと接するまで移動し、そこで抗原の別のエピトープと反応し、検出し得る反応産物を濃縮し形成する。典型的には、産物は、着色しているので可視的に検出される。ある構成では、色は肉眼に明らかである。より洗練された装置においては、抗原の存在または濃縮は、産物の産生した色または他の性状の強度を適当な機器、例えば光学センサーで測定することによって決定される。この方法は、全血で心臓の分析物を検出するのに使用されるいくつかの装置において利用されている。これらの全ての装置において、赤血球が色の展開または捕捉領域に入るのを予防する必要がある、なぜならそれは赤血球の強い色相のために呈色した反応産物の適切な可視化を妨害するからである。
【０００９】
そのような妨害を防ぐために多くの努力が費やされてきた。その結果、全血の分析にこれまでに提案されたこの性質の産物は、赤血球を分離し血漿を生成するある種のフィルターのような手段を含んでおり、それで産生された色の可視化が阻害されない。
【００１０】
米国特許５，１３５，７１６は、赤血球の分離を助ける凝集試薬を利用している。その他の特許は、紙またはプラスチックフィルターの使用を記載している。
【００１１】
ガラス繊維フリースの使用が米国特許４，４７７，５７５に、赤血球をろ過するために、記載されている。しかしガラス繊維フリースは、別の層を装置に単に加えているだけである。膜状構造において適当な作用場所を柔軟性のある薄いストリップのいくつかの層に正確に設置し、同時に試料設置領域、反応領域および膜ストリップのその他の領域を残して、互いに適当に連結を行うには、困難性がある。膜を動くことを防止するため、あるいはケーシングの直視窓その他の開口部に関して選択された膜領域を適当な位置に保持するために、固定したピラーやスロットを含む、分離し得る上部および下部のメンバーを有する中空のケーシングである、適当なプラットフォーム中または上に、完成した膜を設置する困難性によって、問題は更に複雑となる。
【００１２】
一般的な法則として、上記したような診断装置は、しばしば、分析される試料が加えられる適用領域を有することが記載されている。試料は、毛管作用によって、通常ニトロセルロースの、基質中の前以て定められた経路に沿って、検出領域に流れる。検出領域は、探している分析体に対する移動性の標識抗体を担持している。もし分析体が存在すれば、標識抗体／分析体複合体が生成し、固定された、即ち検出領域の下流にある、捕捉領域中の固定化捕捉抗体と反応して、検出される産物、通常着色しており肉眼に見える、が生成する。
【００１３】
時々、標識抗体／分析体複合体は非常に容易に生成するが、しかし容易に検出し得るシグナルを生じる捕捉抗体と充分に結合しない。これは、もし充分な量の複合体が捕捉抗体と結合しないあるいは検出し得る反応産物を形成するに至適でない配位で接触する、ことによって起こるのであろう。他の可能性のある問題は、不充分なインキュベーション時間または低い抗体の親和性である。
【００１４】
これらの困難性は、当業者によく知られた、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン反応または類似反応の利用により避けることができる。これらの反応は、しばしば診断方法の感受性の増加に使用される。
【００１５】
この方法の一応用として、検出領域に２つの抗体が分離可能性に置かれており、ストレプトアビジンが捕捉領域に固定されている。検出抗体は、好ましくは金のような金属で標識され、そして分析体の１つのエピトープと反応する。ビオチンで標識されている他の抗体は、分析体の他のエピトープと反応する。抗体混合物は、分析体の存在を検出するのに使用される試薬系として考慮されている。もし、分析体が存在すれば、金標識検出抗体／分析物／ビオチン標識検出抗体が検出領域に生成する。複合体は、毛管作用により発泡膜を通り捕捉領域へと移動する。複合体が捕捉領域の固定化ストレプトアビジンに到達すると、ストレプトアビジンはビオチンと結合し、小領域の複合体に濃縮され検出し得る反応産物を形成する。
【００１６】
この反応にはいくつかの変形が知られている。例えば、検出領域は、金のような着色標識で標識されたストレプトアビジンと共に、ビオチン標識抗体を含んでいる。捕捉領域に形成されそして移動する複合体は、分析体／ビオチン標識抗体／ストレプトアビジン金−標識複合体で、これは捕捉領域に移動し、捕捉抗体との反応により捕捉領域で濃縮され、検出し得る反応産物を形成する。
【００１７】
上記の方法は、一般的に、一端にフィルター層を持った試料適用領域を有する延長された、矩形の、積層した装置で起こる反応の関与を記載している。試料は、ろ過後、検出領域で移動性の標識と接触し複合体を形成し、発泡膜に沿って遠位の特異的結合試薬、即ち膜を横断してラインに固定化された捕捉試薬、に移動する。複合体は、試薬と反応し、試薬ラインに沿って濃縮され可視化される。
【００１８】
典型的には、分析される試料は、領域の中心に数滴加えられまたは適応領域に少量の試料を浸すことによって適応領域に置かれる。
【００１９】
これらの配置には、特に終点が高感度で結果がほんの数分で可視化されるときに、多くの問題がある。
【００２０】
高感度は、例えば、検出領域の巾と比較して小さな巾を有する捕捉領域の捕捉ラインによって、それで標識反応産物は小捕捉領域で捕捉され、より強いシグナル色を与えるので達成することができる。
【００２１】
更に、感度は、試験中に捕捉ラインを横断して移動する、より標識された容量として増加させることができる。より標識された容量は、しかし、より大きくなければならない検出領域を必要とする。
【００２２】
もし、領域が、延長されたチャンネルの形を有し、その長さを単純に増大することによって増加させられるなら、結果はかなり増加した時間を必要とする、なぜなら、移動する液体の先端の速度は湿潤化された総距離に対数的に減速するからである。
【００２３】
大きな巾の検出領域と小さな幅の捕捉領域チャンネルを導くこの領域（例えば、長さに対し巾の比率が高い）の別の形は、流れが少ないか、無いような停滞領域をこしらえるので不利である。極端な場合、試料のかなりの量が、検出産物を形成する反応に関与しなくなる。
【００２４】
本発明は、取り扱いに充分に小さく、もっともこれは必要ではないが、そして迅速かつ効果的な分析される液体の流れをもたらす装置を提供することにより前記の問題の多くを解消するものである。最も重要な本有用性は心臓の分析物の存在を診断するための全血の分析であるが、例えば別の抗体を使用したサンドイッチアッセイにおけるような後に検出される抗体と複合体を形成する抗原を担持する体液のような液体中の他の成分の存在を試験するのに適用され得る。上にあげた特許のいくつかに記載されたような心臓の分析物は、胸痛の原因を診断し、痛みが心臓の出来事であるかどうかを決定するのに、救急室での医師に援助するために使用し得る。
【００２５】
上記した発明の特徴におけるいくつかの改良は、本出願が目指しているものである。
【００２６】
（発明の概要）
ここに説明したこれらの問題に対する回答は、本発明の第一の態様によれば、試料は、多くの異なった方向から検出領域に同時に流入するようにし、そして検出領域は、異なった方向の全ての点から、捕捉領域チャンネルの入口への流れの結果と、検出領域へ流入から該入り口への全ての距離が、本質的に同じであるように、設計されている。
【００２７】
本発明は、取り扱いに充分に小さく、もっともこれは必要ではないが、そして迅速かつ効果的な分析される液体の流れをもたらす装置を提供することにより前記の問題の多くは解消するものである。最も重要な本有用性は心臓の分析物の存在を診断するための全血の分析であるが、後で検出される、抗体と複合体を形成する抗体を担持する体液のような液体中の他の成分の存在を試験するのに、例えば別の抗体を使用したサンドイッチアッセイに、適用され得る。
【００２８】
分析される液体の迅速かつ効果的な流れは、多孔性チャンネルを配置することにより、停滞がほとんど、あるいは全くない、そして複数の点から、試料循環チャンネルから、検出領域に液体が入ることによって、達成される。検出領域は、液体の先端が捕捉領域の流入端の方向に移動するように設計される。
【００２９】
全血が採用されるときの、本発明の特に進歩した態様は、血漿から赤血球をクロマトグラフィで分離する多孔性基質の選択である。クロマトグラフィ分離は、実際のろ過では媒体中の赤血球が凝固し、流れを阻害しあるいは、むしろ停止するので特定の物質の濾過に比較して特に重要である。更に、上記に考察したように、ろ過は通常付加層を必要とする。クロマトグラフィ分離においては、しかし、粒子状物質は、担体の流体よりもよりゆっくりとしているが連続して流れるので、流れの遅延が少ないか全くない。他の生体試料ではクロマトグラフィ分離は多分必要ではない。
【００３０】
以下に説明するように、本発明の別の重要な特徴は、全ての流れが、前以て選定された点で停止することである、なぜなら、多孔性担体における試料の経路の全容積は、湿潤であり、赤血球のような粒子状物質は検出され得る反応産物の検出を妨害しないからである。
【００３１】
本発明の第一の態様による装置は、過去の装置のいくつかの改良に有効である、即ち、個々に説明したように問題点の解消であり、試料は、多くの異なった方向から同時に検出領域に入るようにされており、そして検出領域は、異なった方向の全て点から、捕捉領域チャンネルの入口への流れの結果と、検出領域へ流入から該入り口への全ての距離が本質的に同じであるように、設計されている。分析される液体の迅速かつ効果的な流れは、多孔性チャンネルを配置することにより、停滞がほとんど、あるいは全くない、そして複数の点から、試料循環チャンネルから、検出領域に液体が入ることによって、達成される。検出領域は、液体の先端が捕捉領域の流入端の方向に移動するように設計されている。
【００３２】
更なる改良は、本発明の第二の態様による以下の装置により達成することができる。例えば、小多孔性膜を使用し、小さくすることができるので、構築に少量の材料が使用され、より速い作用が得られる。最も重要な進歩は、以下の説明から明らかになるように、複数の分析体が同定されなければならないときでも、必要な構造の変化は、多孔性膜の構造のみであり、支持層ではないことである。
【００３３】
ここでの改良は、装置の配置および血液細胞と血漿との分離が起こる多孔性膜と、膜を正確な位置に保持するため共慟している頂上および下層、との間の相互作用を指向している。更に，頂上および下層は、赤血球から血漿のクロマトグラフ分離が行われる際の適用孔から膜を通して捕捉抗体に試料を処理するチャンネルを提供している。第１の改良は、適用孔から膜へ装置の頂上および底層を含むチャンネルを通して液が導かれるように試料輸送チャンネルの再配置を行う。本発明の第１の態様に従った装置に比べ、試料輸送チャンネルには膜が存在しない。この位置に膜が存在しないことは、装置に必要な多孔膜の量が減らされ、試料輸送チャンネルに存在する膜の多孔性を除く必要に関する心配をしなくてもすむ、あるいは装置の頂上および底辺部品（層）を含む以外の材料と液体試料の接触に関する心配もしなくてもよいことである。出来上がった製品は材料および製造労力の両者で低経費である。必要とされる多孔膜の程度は、検出領域と捕捉領域に限定される。試料輸送チャンネルを含む装置の部分と膜と試料循環チャンネルを含む間の配置の境界面は、試料の道からそれた分配の原因とならず、装置に従った膜につながる血液試料に対する毛管導管を形成することである。
【００３４】
本発明の更なる利点は、装置の同じ頂上および底層成分が多くの異なった分析試験の装置の製造に使用されることである。膜のみが特定の分析体または測定されるべき分析体の検出に仕立てられる。例えば、蓄えられたまたは膜に結合した試薬およびその位置および膜の液体の経路の形はそれぞれのアッセイについて個別化される。試料輸送チャンネルと試料循環チャンネルの頂上および底層は、全てのアッセイにつき同じである。
【００３５】
試料輸送チャンネルは、試料の前以て決められた容量を含むように、そして更に、所望の窓または透過度により、試料輸送チャンネルが満たされたとき、そして適当な試料が適用されるときをユーザーに指示するように配置される。更なる改良は、チャンネルが一杯のとき、その中に含有される試料は試料循環チャンネルに分配されそして免疫アッセイが開始されるような試料輸送チャンネルの配置である。
【００３６】
更なる実施態様において、標識検出抗体のような試薬は、膜より前の液体経路中に試薬が試料と混合するように装置のチャンネル内に備えられる。試薬は、ビーズ、マイクロビーズ、または凍結乾燥粉末として、前記したチャンネルにおける非限定的例のように、供給される。
【００３７】
本発明の装置の主な特徴は、膜が試料輸送チャンネルの全長にわたって延長されないことである。別の特徴は、試料輸送チャンネルは、試料の判っている前以て決められた量が装置の操作部門に分配されるように設計されていることである。
【００３８】
本発明の目的は、上記したように、頂上層の底面に形成された試料輸送チャンネルと、チャンネルと底層の頂上面によって決められる壁を有する、上に記載したような分析試験装置を提供することである。試料輸送チャンネルの領域には膜はほとんど存在しない。一実施態様において、試料輸送チャンネルは、平行した側に配置され、試料循環チャンネルと作用的に連結している。本発明の別の実施態様において、試料輸送チャンネルは、装置において分析を行うに必要な試料の容量を含むように形成されている。この実施態様において、試料循環チャンネルと作用的に連結した試料輸送チャンネルの末端は、試料循環チャンネルと合うところの試料輸送チャンネルの狭部を備えるよう形作られている。この実施態様において、試料輸送チャンネルが液体が狭まった部分と接触する点まで液体で満たされたとき、毛管作用が試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへ、そして装置の膜に、液体を導く。そして試料は、試料輸送チャンネルがその前以て決められた容量を排出するまで流動し、そして分析が実行される。上に記載したように、試料輸送チャンネルと試料循環チャンネルの接合点に必要により観察窓が、適当な試料が装置に試験を行うように加えられ、試料輸送チャンネルが血液で完全に満たされ、試料が試料循環チャンネルに導かれたとき、観察窓が試料の存在を指示するように、オペレーターに指示するように備えられている。
【００３９】
本発明の第１の態様に従った装置の場合におけるように、本発明の第２の態様による装置は、先行技術の装置の問題を解消している、なぜなら、試料は、多くの異なった方向から同時に検出領域に流入するようにされ、そして検出領域は、全ての点の異なった方向から、補足領域チャンネルの入口までの結果として起こったの流れと、検出領域への流入から該入口までの全ての距離は、本質的に同じであるように、設計されているからである。分析される液体の迅速かつ効果的な流れは、多孔性基質（膜）を配置することにより達成され、それによって停滞がほとんど、あるいは、全くなく、そして複数の点から、試料循環チャンネルから、検出領域に液体が入る。検出領域またはチャンネルは、液体の先端が捕捉領域チャンネルの流入端の方向に移動するように設計されている。
【００４０】
更なる改良は、本発明の第三の態様による以下の装置により達成することができる。本発明の第三の態様による装置の改良は、装置の配置および血液細胞から血漿の分離が起こる多孔性膜と膜を正確な位置に保持するための頂上および底面層との間の相互作用を指向している。本出願は、試料輸送チャンネルが頂上層の頂上面に位置しており、カバーでカバーされており、そして試料が、頂上層の頂上面の試料輸送チャンネルの端から、試料循環チャンネルまで延長されたチャンネルを通して試料循環チャンネルに導かれている、装置を目指している。試料が入り試料循環チャンネルを満たしたとき、それはクロマトグラフ的に、複数の点から同時に膜に移動し、そして赤血球から血漿をクロマトグラフィで分離と複数の点から検出領域に液体の流入が開始される。本発明の試料輸送チャンネルは、頂上層の上面に位置によって、いくつかの利点が提供される。一つの利点は、装置に必要な膜の量の減少である。この位置に膜が存在しないことは、装置に必要な多孔膜の量が減らされ、試料輸送チャンネルに存在する膜の多孔性を除く必要に関する心配をしなくてもすむ、あるいは装置の頂上および底辺部品（層）を含む以外の材料と液体試料の接触に関する心配もしなくてもよいことである。出来上がった製品は材料および製造労力の両者で低コストである。第２の利点は、チャンネルの位置が、チャンネルの充満をユーザーに示すことである。試験は、チャンネルが満たされるまで開始されない。それゆえ、外部の試料測定装置は必要とされない。もし試料輸送チャンネルの容量が、試験を実施するに必要な試料量に等しければ、チャンネルが満たされたとき、更に試料が加えられるのは停止される。更に、装置の試料収集部分は、フィンガープリックによって得られた一滴の血液でアクセスできるように形作られ、少量の血液およそ３０−５０μｌ、で試料輸送が満たされ、アッセイが開始される。
【００４１】
本発明の第３の態様による装置の更なる利点は、試薬が試料輸送チャンネルに、適用層またはチャンネルを通過するように試料が溶解される１またはそれ以上の固形粒子の形で設置されることである。この位置での試薬の適用は装置の製造に容易であり、同時に試料が膜に到達する前に試薬が試料と混合するようになる。
【００４２】
本発明の第３の態様によるより更なる利点は、装置の同じ頂上および底層成分が多くの異なった分析試験の装置製造に使用されることである。膜のみが特定の分析体または測定されるべき分析体の検出に仕立てられる。例えば、蓄えられたまたは膜に結合した試薬およびその位置および膜の液体の経路の形はそれぞれのアッセイについて個別化される。試料輸送チャンネルと試料循環チャンネルの頂上および底層は、全てのアッセイについて同じである。
【００４３】
上記したように、試料輸送チャンネルは、試料の前以て決められた容量を含むように、そして試料輸送チャンネルが満たされたとき、そして適当な試料が適用されるときをユーザーに指示するように配置される。更なる改良は、チャンネルが一杯のとき、その中に含有される試料は試料循環チャンネルに分配されそして免疫アッセイが開始されるような試料輸送チャンネルの配置である。付加的な、選択的な特徴は、試験が完了し、読むことができ、そしてタイマーの必要性をなくすることを指示する試験終了インジケーターである。試験結果および試験終了インジケーターを見るために使用され得る窓は装置の頂上層に開口部としてあり、あるいは装置全体が、遮光しなければならない領域は印刷または表面処理によって不透明にされた、透明材料で製造することができる。
【００４４】
本発明の第３の態様による装置の主な特徴は、膜が試料輸送チャンネルの全長にわたって延長されないように、装置の頂上層の頂上面に試料輸送チャンネルの位置があることである。別の特徴は、試料輸送チャンネルは、試料の判っている前以て決められた量が装置の操作部門に分配されるように設計されていることである。更なる特徴は、試料を溶解するために試料輸送チャンネル内に試料がおかれることである。
【００４５】
それゆえに、本発明の目的は、頂上層の頂上面に形成された試料輸送チャンネルを有する上に記載した分析試験装置を提供することである。試料輸送チャンネルはカバー、好ましくは透明体、によってカバーされている。試料輸送チャンネルの領域には膜は存在しない。一実施態様において、試料輸送チャンネルは、平行した側に配置され、試料循環チャンネルと作用的に連結している。本発明の別の実施態様において、試料輸送チャンネルは、装置において分析を行うに必要な試料の容量を含むように配置されている。この実施態様において、試料循環チャンネルと作用的に連結している試料輸送チャンネルの末端は、試料循環チャンネルと合うところの試料輸送チャンネルの狭部を備えるよう形作られている。この実施態様において、試料輸送チャンネルが、液体が狭まった部分と接触する点まで、液体で満たされたとき、毛管作用が、試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへ、そして装置の膜に、液体を導く。そして試料は、試料輸送チャンネルがその前以て決められた容量を排出するまで流動し、そして分析が実行される。
【００４６】
上記したように、本発明の第３の態様に従った装置は、先行技術の問題を解消している、なぜなら、試料は、多くの異なった方向から同時に検出領域に流入するようにされ、そして検出領域は、異なった方向の全ての点から、補足領域チャンネルの入口までの流れの結果と、検出領域への流入から該入口までの全ての距離は、本質的に同じであるように、設計されているからである。分析される液体の迅速かつ効果的な流れは、多孔性基質（膜）を配置することにより達成され、それによって、停滞がほとんど、あるいは全くなく、そして複数の点から、試料循環チャンネルから、検出領域に液体が入ることになる。検出領域は、結果として起こった液体の先端が捕捉領域チャンネルの流入端の方向に移動するように設計されている。
【００４７】
（用語解説）
以下の用語は、本発明および特許請求の範囲で使用されているような、以下の一般的な意味を有する。
【００４８】
「乾燥多孔担体」および「乾燥多孔担体層」は、分析される試料が毛管作用により移動することができるセルロース性製品をいう。図面のよって見られるようにおよび本発明の記載によって理解されるように、乾燥多孔担体（層）、この技術においてはしばしば膜と表す、は多孔領域のいくつかを閉鎖することによって配置され、それで分析される液体は、選択されたチャンネルを通り決められた経路に沿って移動する。
【００４９】
「頂上層または頂上片」は分析試験装置における層であり、頂上および底層が、装置を通って分析される試料の流れの方向を制御する経路を、乾燥多孔層と協力して、与えるようレジストリーに置かれるとき、乾燥多孔担体（膜）を保持するよう、底層または底片と協力するよう配置される。
【００５０】
「抗原」は、動物において、抗体の形成を誘導する分子である。本発明の装置は、液体中の抗原の存在を決定するのに有用である。それらは、体液、特に全血、血清、血漿および尿を分析するのに特に有用である。抗原はしばしば「分析体」と称せられる。
【００５１】
「心臓の分析体」は心組織の障害の結果として血液中に放出される分析体である。
【００５２】
「チャンネル」は形成された導管で、それを通して分析中の液体試料が分析試験装置中を流動する。チャンネルは、頂上層あるいは多孔担体層それ自体中に形成され得る。頂上層は、一般的にポリアクリレートまたはポリメタクリレートのような固いプラスチックであるので、チャンネルは、成形、打ちぬき、マシニング、その他の同等なプロセスによって形成される。多孔層において、チャンネルは、層中に所望の配置に打ちぬきによって形成され得る。それらは、非多孔性境界をワックスまたはインクで形成することによって多孔層中にデザインされ得る。チャンネルは、１つのチャンネルの液体が他のチャンネルに直接流れるとき、作用的に連結されていると云われる。
【００５３】
「半円形」、ここで使用される用語としては、円の半分に限定されないが、一般に、扇形が除かれたあるいはこの扇形自体である円形領域を称する。
【００５４】
「外接する」、ここで使用される用語としては、多孔膜の半円形の周囲および半円形に似たものアーチ型チャンネルに限定されない。用語は、この記述が続けば明らかになるように、試料循環チャンネルが他の形の１ないしそれ以上の検出領域の境界と一致する他の形、例えば担体の領域が多角形または多角形の一部であるような場合、を含む。
【００５５】
「本質的に」は、検出領域に試料が流入する点と捕捉領域チャンネルの入口の端との間の距離に関して使われる用語である。これらの距離は、できるだけ類似しているべきである。明らかに、アーチ型の試料循環チャンネルが一致している担体の半円形領域は、検出領域のアーチ型境界と捕捉領域チャンネルの入口の端との間の全ての得られた距離は同じであるから、非常に好ましい配置である。
【００５６】
「迅速」は、検出される産物が充分に短い時間内に生成することで、例えば約５分から約１５分、医療従事者が意味のある有益な結論を出し得る時間を意味する。
【００５７】
「効果的」は、抗原がトロポニンＩのような心臓分析体の場合のように非常に低い濃度で存在するときでさえも、試薬の低い量を利用して小容量の液体、例えば数滴の全血（約１０μｌから約８０μｌ）で、検出し得る産物が形成され得ることを意味する。
【００５８】
図１、２および３は、先行技術の装置である。図において、似た数字は類似した意味を有する。
【００５９】
図１は、上記した問題を避けるために試みで形作られた先行技術の装置の図である。図において、１はニトロセルロースのような多孔性セルロース膜である。分析される試料は領域２に加えられる。
【００６０】
検出領域３は、移動し得る反応性試薬、例えばプラズマキャリヤー中のトロポニンＩに対する検出抗体４、を含む。抗体４は、金のような標識５で標識されている。    
【００６１】
便宜上、図１、２および３の装置は、単層膜として示されている。しかし、実際はそれらのほとんどは、領域２にわたって一連のろ過層を有しており、それで血漿を担持した分析体のみが領域２に到達し得る。代りに、試料中の赤血球は、凝集により血清を生じて分離できる。しかし、これは、装置の外側で行われる分離ステップであり、通常、試験前に、凝集した血液細胞と血清の混合物の分離が必要である。
【００６２】
もし分析体が存在すると、それは標識抗体４と反応して標識抗体／分析体複合体を形成し、それは毛管作用によって血漿と共に捕捉領域６に移動し、捕捉領域６に固定され固定化された捕捉抗体７と反応する。その結果、標識抗体／分析体複合体が、捕捉抗体７の領域に、検出され得る反応産物を形成する。通常、抗体７は、捕捉領域６を横切るラインに固定されており、反応産物は、肉眼で見ることができる。もし標識が金であれば、ラインは赤ないし紫となる。
【００６３】
図１に示したような配置で生じる問題は、分析体を担持する血漿は領域２から全ての方向に移動することである。一部は、検出領域３および捕捉領域６の方に移動する。しかし、他の部分は、反対の方向に移動し、捕捉領域６には到達しない。
【００６４】
図２は、試料が流れるべき経路の長さを増加するために、フローバリアー手段８を採用した装置である。この装置の問題は、検出領域３の頂上周辺のデッドスポットが滞留した流れを領域を作り出すことである。
【００６５】
図３は、延長された矩形の多孔性基質で、図１および２と同様な反応が起こる。液体の滞留および液体の捕捉もない。この図３の標準的装置での主な問題点は、もし装置が短すぎる場合、充分でない標識量が検出される反応産物の充分な量を産生するために捕捉抗体と接触し反応することである。もし、装置が長すぎると、試験結果が得られるまで非常に長い時間が経過する。
【００６６】
（発明の詳細な説明）
以下は、本発明の第１の態様を記述する。上記に考察したように、本発明の装置は、抗原の存在に対し種々の液体生物試料が分析に採用され得る。装置は、その主な心臓の分析体の存在に対する全血の診断としての有用性が見出されることが、現時点で予測される。分析体の例は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ミオシン軽鎖、カルボニックアンヒドラーゼ、脂肪酸結合タンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、アクチンおよび狭心症または心筋梗塞のような虚血状態に次いでおこる心臓組織の損傷として血中に見出される公知のその他の分析体である。従って、この外延の例示として、本発明は、心臓のイベントの診断に利用されるものとして主に記載される。
【００６７】
先行技術およびその欠点は、上記で一般的に、および図１、２ないし３に関して考察された。
【００６８】
図４は、分析体と抗体対の間の反応による１つの分析体または複数の分析体に対する全血の分析のため配置された本発明の乾燥多孔層１を示す。ここで、抗体対は、選択された対の１メンバーが標識されているポリクローナルまたはモノクローナル抗体対を利用した古典的抗原／抗体反応で、分析体の異なったエピトープと反応する。
【００６９】
図は、担体層１を示し、そこで、層の選択されたセクションの多孔性が、例えばフローバリヤー手段によって壊され、境界１１を有する半円形の検出領域３および末端１２に近接した捕捉領域チャンネル６で定義される１つだけの多孔性領域を残している。
【００７０】
この膜１は、好ましくはニトロセルロースまたは同等の材料で、赤血球をクロマトグラフィで分離し、赤血球先端１３および血漿先端１４を下流に形成する。
【００７１】
検出領域３は標識した検出抗体４および５を含み、それは分析体があれば反応して標識抗体／抗原複合体を形成する。
便宜上、１つの抗体だけを示すが、検出領域３は数種類の標識抗体を含み得る。
【００７２】
標識抗体４は移動性であり、即ち、いくつかの公知の手段により検出領域に移動して沈殿する、それで一度生じた標識抗体／分析体複合体は遊離し下流に移動し捕捉領域チャンネル６に入り、捕捉領域チャンネル６を横断して固定された捕捉抗体７と反応し、検出し得る反応産物を形成する。
【００７３】
便宜上、１つの捕捉抗体ライン７を示す、しかし複数のラインを有しており、夫々の分析体の一つが検出される。
【００７４】
捕捉領域チャンネル６は、産物１５を含んでもよく、それは血液、血清またはその他の試料中に通常存在する物質と反応し、目に見える対照産物を生じる。対照反応の使用は任意であるが、好ましい。
【００７５】
図５は、頂上層１６の低表面の配置を示し、それは、図４の膜１とレジストリーをもたらし、本発明の装置を提供する。
【００７６】
頂上層１６は、試料を適用する「通し穴（スルーホール）」または「適用孔」１７を有する。それは試料輸送チャンネル１８と作用的に連結しており、更に試料循環チャンネル１９と連結している。試料循環チャンネル１９は、図４の半円形検出領域３の境界１１と一致するためアーチ型の配置を示している。
【００７７】
試料循環チャンネル１９は、両端２０で閉じている。それは、内壁２１と外壁２２で形成され、毛管トラップ２３により囲まれている。毛管トラップは、試料の流れが、境界１１の全ての点で、図４の検出領域３に入り、そして捕捉チャンネル６にその入口端６ａに入ることを確実にするように機能している。
【００７８】
図６、７および８は、それぞれ、図５のＡ−Ａ、Ｂ−ＢおよびＣ−Ｃの線に沿った断面図である。同じような番号は、同じ意味を有する。寸法（ｍｍ）は単に例示のためである。寸法はスケールに合っていない。
【００７９】
図９および１０は、検出領域３は形が矩形であり、境界１１に外接する試料循環チャンネル１９は同様に矩形であることを除き、図４および５に類似している。図４および５と同様に、装置は１つは、移動性で標識された検出抗体４および５で、１つは捕捉抗体７の固定ラインを示す。
【００８０】
図９および１０の装置は、実質的な交差反応の量がないとして、１または１以上の分析体を検出するのに採用することができる。
【００８１】
図１１は、ビオチン／ストレプトアビジン反応を利用して全血試料を診断し、３つの分析体の存在を求める際の本発明の現時点で好ましい膜１の配置を示す。頂上層のチャンネルの配置は、前の説明および後の説明から容易に工夫することができる。図において、似た数字は、他の図におけるように同じ意味を有する。設計は、１つの小試料における分析体、ミオグロビン、トロポニンＩまたはＴおよびＣＫ−ＭＢの存在を明らかにするために採用され得る。
【００８２】
膜１は、３つの異なった経路で形成されるが、３つの分離した検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃから導かれる各分析体に対し夫々１つずつである。検出領域はブロッキングセグメント２４で分離されている。全作業領域は、装置の上層１６の低表面（図示せず）上で試料循環チャンネル１９と境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃで作用的に連結している３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃを備えるように形成されている。検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれの捕捉領域チャンネルの相当する入口端６ａ、６ｂおよび６ｃと作用的に連結している。
【００８３】
検出領域３ａは、２つの標識抗体、例えばＣＫ−ＭＢに対するビオチン標識抗体およびＣＫ−ＭＢに対する金標識抗体を含む。
【００８４】
一般に、図１１において、黒丸は金標識抗体、そして白丸はビオチン標識抗体を示す。参照番号はこの図を混乱させないため、これら検出抗体にはつけない。
【００８５】
図１１の装置の操作中の赤血球から血漿の分離の例として、３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの各々における赤血球先端を、それぞれ、１３ａ、１３ｂおよび１３ｃとして示す：それぞれの血漿先端の位置は、それぞれ１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとして示す。
【００８６】
もしＣＫ−ＭＢが試料中に存在すれば、生成する複合体は入口６ａの捕捉チャンネルに入り、ストレプトアビジンライン７ａでストレプトアビジンと最後に反応し、目に見える産物を産生する。
【００８７】
類似した反応が他の分析体、例えばトロポニンＩまたはトロポニンＴおよびミオグロビンと図に示す別の経路で起こる。
【００８８】
図１２から図１６ｃは、本発明を更に説明するためおよびその有用性を示すために提供される。
【００８９】
同様なまたはその他の分析体が通常の抗原抗体反応で同様に検出され得る。
【００９０】
図１２は、１分析体例えばトロポニンＩに対する全血の分析を示す、本発明の多孔担体層１を図示する。
【００９１】
図は、多孔担体層１を示し、層の多孔性は検出領域３および末端１２に近接する捕捉領域チャンネル６を決めるいくつかの領域では壊されている。
【００９２】
膜１は、好ましくはニトロセルロースまたは等価材料であり、赤血球をクロマトグラフ的に分離し、赤血球先端１３および血漿先端１４を形成する。
【００９３】
本発明の本実施態様においては、検出領域は標識５を構成する標識検出抗体４を含む。抗体は、分析体と、もしあれば、反応し標識抗体／抗原複合体を形成する。
【００９４】
標識抗体４、５は移動する、即ちそれらは、検出領域３でいくつかの公知手段により移動性に析出し、それで一度生成した標識抗体／分析体複合体は、下流に自由捕捉領域チャンネル６に移動し、捕捉領域チャンネル６を横切るライン７において捕捉抗体と反応し、検出し得る反応産物を形成する。
【００９５】
捕捉領域チャンネル６は、血液、血清、血漿またはその他の体液中に正常に存在する物質と反応し、目に見える産物を産生する、産物１５を含んでいてもよい。対照反応の使用は選択的であるが、好ましいので、オペレーターは、充分な血液またはその他の液体が、診断反応を起こすために装置に適応され得ることを知るであろう。
【００９６】
検出領域３と捕捉領域チャンネル６は作用的に連結されていることが注目される、即ち、検出領域３の液体は毛管作用によって直接捕捉領域チャンネル６に入口端６ａを通り、直接流入する。
【００９７】
検出領域３は半円形の幾何構造を有し、それゆえアーチ型境界１１を有することが、注目される。検出領域３が捕捉領域チャンネル６と作用的に連結している、このアーチ型の中心は、検出領域３の第２の、または反対の端であると考えることができ、それを通って液体が捕捉チャンネル６の入口端６ａに流入することができる。この配置の結果、境界１１の全ての点は捕捉領域チャンネル６の入口端６ａから本質的に等距離であり、検出領域における液体の全ては、捕捉領域チャンネル６に均一に、試料の連続したセグメントと共に入口端６ａに実質的に同じ時間で到達する。このいくつかの方向からの流れの均一性は、以下に示す頂上層の記述に関連して明確に理解されるであろう。
【００９８】
本発明の装置の主な特徴は、検出領域３および捕捉領域チャンネル６を通って流れる血漿流は、捕捉抗体ライン７に達することである。先行技術の構造におけるように検出領域３に捕捉された標識された抗体／抗原が少しあるか全くない。代りに、検出領域３から捕捉領域チャンネル６への液体の急速かつ効果的な毛管流がある。捕捉抗体７は標識抗体／分析体複合体と反応しそしてこれを濃縮し、最大効率で検出し得る産物を生成する。この新規な配置の一つの有利な結果は、診断装置のサイズを最小に減少することができることである。
【００９９】
当業者に入手できるどのような標識も、本発明の装置において利用し得る。金属または酵素標識が好ましい。金属標識は、それらの顕著な感受性のゆえに本質的に好ましい。金属としては、原理的に金が最も好ましい、なぜならば、このタイプの反応に広く採用されており、その性質がよく理解されているからである。更に、金のシグナルは、公知の処理に従って、可溶性銀塩および還元剤の使用により、容易に目に見えるように増強される。金標識は、銀塩を、目に見える産物として析出する金属銀に還元する触媒として作用する。典型的な反応性ペア−は乳酸銀であり、これは還元し得る銀イオンの起源として働き、還元剤としてはハイドロキノンがある。金属銀は、金の各粒子の周囲に、たやすく識別できる黒色沈澱を形成する。
【０１００】
本発明で使用される金標識抗体の好ましい粒子サイズは、分析体の濃度や反応体の親和性などのようによく知られた因子に応じて許容することができる変化があるが、約３５から６５ｎｍである。
【０１０１】
もし、西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素標識が採用されると、反応は、標準的方法にしたがって、過酸化水素およびオルトフェニレンジアミンのような色素の添加によって検出することができる。
【０１０２】
本発明の特徴には必要がないが、検出領域にプレインキュベーション領域がある。プレインキュベーション領域は、所望の反応を妨害する可能性がある、あるいは検出を困難にするような、血液中に存在する産物を除去するために採用される。例えば、もし装置が心臓の分析体を検出するために使われているなら、典型的な妨害物質は、クレアチンキナーゼ、ＣＫ−ＭＭのイソフォームである。イソフォームＣＫ−ＭＢに対する抗体はＣＫ−ＭＭと交叉反応し、誤った読みを与える。これは、ＣＫ−ＭＢに対する可動性抗体の上流のプレインキュベーション領域にＣＫ−ＭＭに対する固定化抗体の充分な量を備えることによって避けることができ、それでＣＫ−ＭＭの全量が、移動している試料が検出抗体に到達する前に除かれる。
【０１０３】
図１２の装置は、固定化捕捉抗体ラインにある１つまたは複数の標識検出抗体および捕捉抗体を利用する。いくつかの標識検出器が採用されているときは、妨害交叉反応を避けるために注意しなければならない。別の図に関して以下に説明する、特別の分析体と反応する１以上の検出領域中に抗体を配置することが、しばしば最良である。
【０１０４】
図１２、１３の装置は、上記したような変形を利用するビオチン／アビジン反応を採用するのに準備され得る。図１２の装置に応用される現在好ましい変形において、ビオチン標識抗体および金標識抗体が検出領域３に移動的に設置される、そこではそれらの各々が分析体の異なったエピトープと反応し、ビオチン標識抗体／分析体／金標識抗体の三元からなる複合体を生成し、それは毛管作用によって、捕捉チャンネル領域６へ、またそこを通って、移動し、そこでアビジンまたはストレプトアビジンと反応し検出し得る反応産物に濃縮し生成する。
【０１０５】
もちろん、本発明で採用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。同様に、ビオチン／アビジン反応の等価物も採用することができる。ここにあげたすべての試薬は、等価物と交換でき、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【０１０６】
当業者は、全血から赤血球と血漿をクロマトグラフ的に分離するどのような多孔性物質も本発明において採用し得ることは、認識するであろう。しかし、ニトロセルロースは、適度の値段で容易に手に入るので好ましい。ニトロセルロースはクロマトグラフィおよび関連分野で長年採用されてきたので、科学者および技術者にはその性質はよく知られている。
【０１０７】
市販のニトロセルロースシートはチャンネルのどのような選択された配置を有するどのような選択された形にも容易に形成することができる。
【０１０８】
本発明のニトロセルロース膜は膜内に毛管作用を与える種々のサイズおよび寸法の複数の内部連結したミクロポアを有するスポンジ様のものとして特徴づけられる。これにより、検査中の生物試料が選択された経路に沿って移動することができる。
【０１０９】
本発明の実施において赤血球から血漿の分離には、種々の装置の領域、配置、寸法が、液体試料が前もって設計された経路を移動するので、前もって選択された領域において所望の反応が起こるように選択される。全血の心臓診断には、これらの領域が、赤血球の流れおよび血漿の流れの先端の相対的速度、所望の反応の動力学、それぞれのエピトープに対する抗体の親和性、およびその他を基礎にして選択される。これらは、当業者に公知であり、または通常の試験処置によって容易に決定される。
【０１１０】
種々のニトロセルロース材料が、種々のセルサイズで得られるが、現時点で好ましい多孔担体は、垂直に膜の水平表面へ流れる液流から粒子をろ過するフィルターとして使用するには、３から１２μｍより大きな粒子の通過を防止するものである。本発明の実際において、孔サイズ約５から１２μｍ、好ましくは３−８μｍの膜が好適である。いくつかの変形が可能である。しかし、孔サイズが減少すると、膜内の液体の移動は減少する、それで診断に要する時間が増加する。もし孔サイズが余りにも大きいと、通過時間は減少するが、反応体は診断反応が起こるに充分な時間、互いに充分に接触せず、あるいは所望の情報を与えることのない限られた程度にしか起こらない。
【０１１１】
支持体ポリエステルまたは他のフィルムを有するニトロセルロース膜は、市販されている。それらは、不支持膜は非常に壊れやすく、破損に弱く、大量生産環境において取り扱いが困難な傾向がある。更に、フィルムは、流れている液体に不浸透性であるので、本発明の装置の選択された経路を通る液体試料の流れを妨害しない。そのような膜は、Ｇｅｒｂｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｇｅｒｂｅｒｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ、から種々の孔サイズのものが入手し得る。
【０１１２】
本発明で採用されている抗体は標準の技術で調製される。例えば、Ｆａｌｒｅ，Ｈｏｗｅ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２６６，７，５５０−５５２，１９９７，４月、を参照。このセミナーのモノクローナル抗体の調製に関する主題の該当する開示はここに参照することによりとり入れられている。
【０１１３】
ニトロセルロースのような基質に抗体を固定する手段は知られており、本発明の装置の製造に使用され得る。ニトロセルロースはタンパク質に対し、強い結合体である。それゆえ、固定捕捉抗体は、前以て決められた捕捉領域に適用するだけでよい。標識検出抗体は、ビオチン血清アルブミンのような別のタンパク質で検出領域をまず飽和することによって膜に移動的に固定され得る。
【０１１４】
図１３は、３分析体用に使われる３つの液体経路を有する代りの多孔性膜の配置を示す。膜の配置および操作は、他の装置の操作の説明から明らかである。
【０１１５】
図１４は、頂上層１６およびその下の多孔担体で、多孔担体層に、それぞれ、検出領域３ａおよび３ｂ、および捕捉領域チャンネル６ａおよび６ｂとして示される，２つの分析体を検出する２つの経路を有する、本発明の実施態様を示す。アーチ型循環チャンネル１９は頂上層１６に示される。装置は、選択的に傾斜しており、頂上層において、その頂上面から内部表面まで、浅い、狭い試料輸送チャンネル１８と連結し、それはその底面に形成された試料輸送チャンネル１９に連結している、開口部１７を示す。傾斜した開口部は更に以下に示す図１５および１６Ａに提示される。
【０１１６】
図１５は、透視図であり、図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、頂上層１６「支持層」（または「底面層」または「底面片」）２８、それらの間に挟まれたプラスチック裏打ち層２９を有する多孔担体１、で示された、本発明の装置の分解図である。貫通孔１７は、上表面３０から底表面３１まで通り、頂上層１６の底面３１に形成された輸送チャンネル１８に刻み込まれ走っている。
【０１１７】
更に図１５および１６を参照して、試料輸送チャンネル１８が、頂上層１６の底面３１に形成された循環チャンネル１９に作用的に連結している。図５に示したのと異なった設計を有する循環チャンネル１９は、番号２０で示すように両端が閉鎖されている。循環チャンネル１９は、内壁２１および外壁２２を有して形成されている。図１６ａに示すように、内壁２１は、毛管トラップ２３と称せられ、頂上層１６の底面３１に形成されたくぼみの境界を形成する。毛管トラップ２３は、領域３３に延長されているが、しかしそのようにすることは必ずしも必要ではない。
【０１１８】
図１６Ａおよび１６Ｂを参照して、頂上層１６は、対応する孔３５に合わせてピン３４により支持層２８に接着している。別の均等な接着手段が採用され得、そして２層１６および２８は、永久的に、または、着脱可能に固定されている。
【０１１９】
多孔抗体は図１６Ｂに、ポリエステルフルムのような裏打ち体２９を有して、示される。それは層１６と２８の間に保持される。担体１は、貫通孔１７を経て加えられた液体は、輸送チャンネル、循環チャンネル、検出領域、および捕捉領域チャンネルを通過し、捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、および循環チャンネル１９のそれぞれの、閉鎖端１２および２０のそれぞれに至る、操作経路がある限り、層１６および２８と同じ外部寸法を有することができる。図１６Ｃに示す多孔膜１は、分析体の検出用の図１１の多孔担体に類似して配置されている。従って、それは、３つの捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂおよび２７ｃのそれぞれと連結する３つの検出領域２４、２５および２６を含む。（ここに使われる番号２４、２５および２６は、それぞれ、前記図１１の番号３ａ、３ｂおよび３ｃに相当していること、および番号２７ａ、ｂ、ｃは、前記図４の番号６に相当していることを注意されたい）検出領域のアーチ型境界１１は、循環チャンネル１９の内壁２１を超えて延長されており、それで液体の流れが端２０で停止したときは、毛管作用によって検出領域２４、２５および２６に流れる。
【０１２０】
毛管トラップ２３の目的は今や明らかである。もし、毛管トラップ３３がないと、多孔担体１は頂上層１６の平らな底面に接しており、循環チャンネル１９の液体は、貫通孔１７から捕捉領域チャンネルの末端への、前もって選択された経路における膜を通るよりもむしろ表面と多孔担体１の間を流れるであろう。
【０１２１】
流れは、試料のサイズを制御することが可能であるように循環チャンネルの末端で停止する。図１５および１６ａの点線構造として示された試料循環チャンネルの選択的な延長上の選択的な窓３９は適当な試料がチャンネルを満たすまで適用されたことを示すよう備えられている。
【０１２２】
もし頂上層１６が透明なら、目で見える反応産物の生成が、容易に明らかであろう。もし頂上層１６が不透明なら、３６、３７、３８として示される１ないしそれ以上の視認窓が構成される。図１５に示したような窓は、捕捉領域チャンネルにくっついているので、オペレーターは、呈色産物の生成を視認することができ、あるいは、検出し得る反応産物が生成したかどうかを決めるためにレフラクトメーターのような装置を設置することができる。
図１５の装置は、例示的に３つの分離した窓を有する。好適な装置においては、頂上層３０を横切って延長された１つの窓を有し、それで反応の全ての結果を、直ちに視認することができる。
本発明の１つの利点は、１、２ないし３つの抗原を測定しようとする際に、装置は同じ寸法を有していることである。もちろん、多孔担体層１はそれぞれの場合において異なった寸法で設計され得る。しかし、頂上層１６は、異なって設計された担体層１に合わせるのに、いかなる変更も必要としない。
【０１２３】
図１７Ａは、本発明の分解図である図１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｄの透視図であり、頂上層１６、支持層２８、は多孔担体１を有し、これはそれらに挟まれたプラスチックの裏打ち層２９を有している。貫通孔１７は、上表面３０から頂上層１６の底表面３１までを通り、頂上層１６の底面３１に形成された試料輸送チャンネル１８に刻み込まれ走っている。試料輸送チャンネル１８が、頂上層１６の底面３１に形成された循環チャンネル１９に作用的に連結している。循環チャンネル１９は、番号２０で示すように両端が閉鎖されている。循環チャンネル１９は、内壁２１および外壁２２を有して形成されている。図１７Ｂに示すように、内壁２１は、毛管トラップ２３と称せられ、頂上層１６の底面３１に形成されたくぼみの境界を形成する。毛管トラップ２３は、領域３３に延長されているが、しかしそのようにすることは必ずしも必要ではない。
【０１２４】
更に、図を参照して、頂上層１６は、対応する孔３５に合わせてピン３４により支持層２８に接着している。別の均等な接着手段が採用され得、そして２つの層１６および２８は、永久的に、または、着脱可能に固定されている。
【０１２５】
多孔抗体１は図１７Ｃに、ポリエステルフルムのような裏打ち体２９を有して、示される。それは支持層１６と２８の間に保持される。担体１は、貫通孔１７を経て加えられた液体は、輸送チャンネル１８、循環チャンネル１９、検出領域５０、５１、５２、および捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂおよび２７ｃ、を通過し、循環チャンネル１９および捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂ、２７ｃそれぞれの閉鎖端２０および１２に至る、操作を得る経路がある限り、層１６および２８と同じ外部寸法を有することである。（ここに使われる番号５０、５１および５２は、それぞれ、前記図１１の番号３ａ、３ｂおよび３ｃに相当していること、および番号２７ａ、ｂ、ｃは、前記図４の番号６に相当していることを注意されたい）。試料輸送チャンネル１８に接して位置する多孔担体１の部分の多孔性は、膜における試料の流れを防止するために壊されている。図１７Ｃに示す多孔膜１は３つの分析体の検出用に形成されている。従って、それは３つの捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂおよび２７ｃ、のそれぞれと連結する、３つの検出領域またはチャンネル５０、５１および５２を含んでいる。検出領域５０、５１および５２の接触したアーチ型境界１１は、循環チャンネル１９の内壁２１を超えて延長されており、それで液体の流れが端２０で停止したときは、毛管作用によって検出領域５０、５１および５２に流れる。
【０１２６】
更に図１７を参照して、流れは、試料のサイズを制御することが可能であるように循環チャンネルの末端２０で停止する。図１７Ａおよび１７Ｂの点線構造５３として示された試料循環チャンネルの選択的な延長上の選択的な窓３９は、適当な試料がチャンネルを満たすまで適用されたことを示すように備えられている。担体１の相当する部分は、同様に、試料輸送チャンネルの下の担体の相当する部分と共に、選択的チャンネルへの流れを制限するように阻止されている。本発明の装置の設計の更なる利点は、同じ頂上と底面層片が、種々の異なった装置に使用され得ることである。
【０１２７】
もし頂上層１６が透明なら、目で見える反応産物の生成が、容易に明らかであろう。もし頂上層１６が不透明なら、この実施例において単一窓３７、およびテストエンド指示窓３８として示される１ないしそれ以上の視認窓が構成される。図１７Ａに示したようなこれら、１ないしそれ以上の窓は、捕捉領域チャンネルにくっついているので、オペレーターは、呈色産物の生成を視認することができ、あるいは、検出し得る反応産物が生成したかどうかを決めるためにレフラクトメーターのような装置を設置することができる。
【０１２８】
任意の試験終了指示窓３８は、例えば試験終了指示窓３８の上流であるが、しかし、窓３７および捕捉領域７の基にある多孔担体１の部分から下流の多孔担体１中の色素の存在によって、試験が終了したことを指示するために備えられる。色素は、試料が捕捉領域を通過したとき、試験終了指示窓に運ばれる。図１８に示すように、別の実施態様において、捕捉領域チャンネル６は、通常血液、血漿、血清またはその他の体液中に存在する物質と反応して、目に見える産物を産生する、産物１５を選択的に含有することができる。この配置は、窓３７または試験終了指示窓３８中のいずれかの多孔担体１に備えられる。
【０１２９】
図１７Ａに描いた装置は、例示目的であげたものであるが、捕捉領域を見るための単一窓および試験終了指示窓を有する。好適な装置においては、頂上表面３０を横切って延長する１つの窓があり、それで全ての反応の結果を、直ちに視認することができる。
【０１３０】
図１７Ａ−１７Ｄから、試料輸送チャンネル１８の寸法は、その長さにわたって均一であり、膜１は、輸送チャンネル中に充分に延長されていることが注目される。また、同じ輸送チャンネル１８の基に位置する膜の部分の多孔性は、膜の多孔性に沿っての拡散から試料を保護するために、壊されていることが注目される。
【０１３１】
以下は、本発明の第２の態様を記載する。上記したように、本発明の装置は、種々の液体試料、特に検出し得るシグナルを放出する標識反応体を利用する競合またはサンドイッチ法の変形のいずれかの通常の抗原／抗体反応により分析し得る生物試料の分析に利用され得る。当業者は、本発明の装置のいくつかの応用があることを認識するであろう。
【０１３２】
本発明は、心臓の分析体の存在に対する全血の診断としての主要な有用性が見出されることが、現時点で予測される。分析体の例は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ミオシン軽鎖、脂肪酸結合タンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、アクチンおよび狭心症または心筋梗塞のような虚血状態に次いでおこる心臓組織の損傷として血中に見出される公知のその他の分析体である。従って、本発明は、心臓のイベントの診断に利用されるものとして主に記載される。しかし、装置は、本発明の装置のクロマトグラフ的液体の流れにおいて赤血球から血漿の分離を有利に行う免疫およびその他のアッセイフォーマットによって大幅に種々の分析体を検出するための使用に適用することができる。事実、そして以下に見られるように、単一の装置は、１フォーマットより多い複数のアッセイ、例えばイムノアッセイおよび酵素に基づいたアッセイ、を装置において使用し得る別々の液体の経路の各々において特別なアッセイ成分を備えることによって実行するように配置されている。
【０１３３】
本発明の構成は、米国特許５，７４７，２７４、５，２９０，６７８および５，７１０，００８で、ここに参照することによってとり入れられている該当する内容に記載されたように、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ミオシン軽鎖、トロポニンＩ、トロポニンＣ、トロポニンＴ、および少なくとも２つのトロポニンサブユニットを含むトロポニンＩ、トロポニンＣ、トロポニンＴの複合体について血液、血清および血漿を分析するのに特に有用である。
【０１３４】
図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｄから注目されるように、公知の装置の輸送チャンネル１８は循環チャンネル１９への流入口の直下にある角度をもって設置されている。このことは、膜１の全長を短くすることを可能ならしめる。試料輸送チャンネル１８の全長に延長された多孔担体１の延長がある、ことがまた注目される。
【０１３５】
多孔担体（膜）１の長さは、試料輸送チャンネル１８から試料循環チャンネル１９および膜までの液体の経路を決定付けるに必要である限りの試料循環チャンネルの下の部分から延長するだけで減らせることが見出された。試料輸送チャンネルへと延長するに必要とされる膜１の小延長１０５は、試料が膜を横切って流れないよう、そして液体経路が試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルおよび膜までであるように、その多孔性が壊されている。
【０１３６】
試料輸送チャンネル１８は、直線か角度をもつことができる。
【０１３７】
本発明の別の利点は、循環チャンネル１９に入る輸送チャンネル１８のセクションが、断面で減少させることができ、それで、小さな寸法を有する試料輸送チャンネル１８のセクションに試料が毛管移動するようになる。この配置の特によい利点は、大きな容量を有する試料輸送チャンネル１８のセクションが、実際、分析を行うのに必要とされる正確な量を保持するように設計することができる、ことである。
【０１３８】
以下に説明するように視認窓の賢明な設置は、オペレーターに全操作を完全に制御することができる。
【０１３９】
上に注意したように、本発明の一改良点は、装置の多孔性担体１のサイズの減少、経費の減少、および試料輸送チャンネル１８の領域において試料と接触する膜の部分の多孔性を除く必要性を、例えば特別のインクで印刷することによって、避けることである。更なる改良は、上記した容量輸送手段を有する試料輸送チャンネルであり、ここでは、一度試料輸送チャンネル１８が、試料でその前以て決められた容量に満たされると、イムノアッセイを開始するために全ての試料容量が試料循環チャンネル１９に注がれる。試料輸送チャンネルと試料循環チャンネル１９の接合部において、またはそれに近接した任意の窓９１は適当な試料が装置に加えられた、ことを示すように働く。
【０１４０】
図１８は、本発明の乾燥多孔担体層１（または膜１とも称する）を示す。このものは、１分析体または複数の分析体に対する全血の分析用に配置され、分析体と抗体対の間の反応によって行われる。抗体対はポリクローナルまたはモノクローナル抗体対を利用し、選択された対の１つのメンバーが標識されており、古典的な抗原／抗体反応において分析体上の異なったエピトープと反応する。
【０１４１】
図は、担体層１を示し、層の選択されたセクションまたは層の境界線が確定された、決められた多孔領域を残して破壊されており、該多孔領域は境界１１および捕捉領域チャンネル６、これは末端１２に近接している、を有する半円形検出領域３を含む。境界１１は、小延長１０５を含み、それは、組み立てられた装置において、試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネル１９の間の上の接合部に密接しており、これらは図２１の横断面図から明らかに見とれる。この延長１０５は、分析される液体と接触する。その多孔性は破壊されている。膜の部分、および試料循環チャンネルを超えて試料輸送チャンネルの方に延長された付随する延長１０５は非常に小さなサイズに減少させ得る、または完全に除かれる、ただし、チャンネルおよび膜を正しい位置に保持する、相当する構造は、試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルそして膜までの液体経路を規定する。ここに記載した種々の毛管トラップおよび空洞は、この規定された液体の経路を保つのに協同する。前記した液体の経路を達成するこれら部品の他の変形は、本発明に含まれる。
【０１４２】
全血分析用の、この膜１は、好ましくはニトロセルロースまたは同等の材料であり、赤血球をクロマトグラフ的に分離して、赤血球先端１３とその下流の血漿先端１４を形成する。他の液体試料の分析には、別の材料が好適である。
【０１４３】
検出領域３は、検出し得る標識５を有する検出抗体４を含み、標識は分析体と、もしあれば、反応して標識抗体／抗原複合体を形成する。
【０１４４】
便宜上、一つだけ抗体を示したが、検出領域３はいくつかの標識抗体を含み得る。
【０１４５】
標識抗体４は移動性であり、即ち、いくつかの公知の手段により検出領域３に移動して沈殿する、それで一度生じた標識抗体／分析体複合体は遊離し下流に移動し捕捉領域チャンネル６に入り、捕捉領域チャンネル６を横断して固定された捕捉抗体７と反応し、検出し得る反応産物を形成する。
【０１４６】
便宜上、１つの捕捉抗体ライン７を示す、しかし複数のラインを有しており、夫々の分析体の一つが検出される。
【０１４７】
捕捉領域チャンネル６は、産物１５を含んでもよく、それは分析される液体中に通常存在する物質と反応し、目に見える対照産物を生じる。対照反応の使用は任意であるが、好ましい。この反応は、液体が捕捉領域を通ってそして試験終了指示体として機能することを示している。
【０１４８】
乾燥多孔担体層１（膜１とも云う）は、図１８に示す成分を含むに充分大きい必要性のみがあり、試料輸送チャンネルを含む装置の部分に延長される必要はない。以下で見られるように、本発明の装置は小さな乾燥多孔担体層１を装着して配置され、そして本発明の目的を達成する。装置に必要な乾燥多孔膜の量を減らすことによって、材料のコストが減じる。乾燥多孔担体層の減少したサイズの更なる利点は、以下にあげられ、特に試料輸送チャンネル中に膜が存在しないことである。
【０１４９】
図１９Ａは、頂上層１６の低表面２３の配置を示し、それは、領域１０３において間に図１８の膜１を有し、図１９Ｂに示すように底層８の頂上面にレジストリーをもたらし、本発明の一実施態様を提供する。
【０１５０】
頂上層１６は試料を適用する貫通孔１７を有する。それは試料循環チャンネル１９と連結する試料輸送チャンネル１８と作用的に連結している。試料輸送チャンネル１８はチャンネルを決める壁、試料をチャンネルにとじこめる壁、そして並列した頂上層の底面と底層の頂上面との間を、流れから試料を保護する壁をこえる毛管トラップ２３を有する。
【０１５１】
これは図２０の横断図に示される。試料循環チャンネル１９は、図１８の半円形検出領域３の境界１１に一致するためにアーチ型配置で示される。
【０１５２】
試料循環チャンネル１９は、両端２０で閉鎖されている。それは内壁２１と外壁２２で形成され、試料の流れが境界１１の全ての点で、図１８の検出領域３に入り、そしてその入り口端６ａで捕捉チャンネル６に入ることを保証する機能を有する、毛管トラップ２３により周囲を囲まれている。
【０１５３】
図１９Ｂは底層２８の頂上面の配置を示す。低層２８の頂上面９８に逆行する平らな矩形領域１０３は膜１を保持する。頂上面９８から領域１０３の深さは、膜１の頂上面が頂上面９８と同じレベルであることで充分である。領域１０３の他の配置は、例えば頂上セクション２８の境界に入るように、本発明によって予想される。別の実施態様において、逆行は提供されないが、しかし、頂上層１６と底層２８は膜１を正しい配位に保持するよう配置される。頂上層と底層は、貫通孔１７から膜チャンネル１２の末端まで液体経路が決まるように間に膜を共に有することが唯一必要である。種々のチャンネルの厚さは、調節され得る。
【０１５４】
膜１は、試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネル１９の間の境界面に位置する空洞１０２の表面９９に接触して位置する。図３０Ｃは、この空洞を装置の部品間の関係および機能を運ぶ一助にするために３次元表示で示した。頂上層１６と底層２８が、装置の操作のために並べられるとき、頂上層１６の底面における試料輸送チャンネルは、循環チャンネル１９に合うまで延長１０１にそって過ぎる。空洞１０２、端９９を有する膜の接合部、および試料輸送チャンネル１８とその上の試料循環チャンネル１９の接合点の、相対的位置は、液体が試料輸送チャンネル１８から膜上の試料循環チャンネル１９へと流れるように導管を形成する。液体の流れは、膜１と端９９の間の接触は、液体に対し代りの毛管導管を提供する他の表面接触から空気によって分離されているから、試料循環チャンネル１８と、膜１にどじこめられている。試料輸送チャンネル１８の壁は、毛管トラップ２３にかこまれ、貫通孔１７から試料循環チャンネル１９の方に延長されており、頂上層１６の底面の毛管トラップ２３が、底層２８の頂上層の空洞１０２の部分に相当するように、延長１０１にそって延長されている。これらの関係は、以下の横断面図および図２０−２３を参照して、さらに説明される。そのように、壁と毛管トラップはエアージャンクションで終り、液体が試料循環チャンネル１８の壁をこえて流れるのを防止し、毛管作用によって試料循環チャンネル１９に継続して流れるようにしている。
【０１５５】
図２０，２１、２２、２３は、図１９Ａの線Ａ−Ａ、Ｂ−Ｂ、Ｃ−ＣおよびＤ−Ｄに沿った断面図である。似た番号は同じ意味を有する。寸法（ｍｍ）は、単なる例示である。寸法は、スケールに合っていない。図２０は、試料輸送チャンネル１８を示し、頂上層１６に毛管に逆行するように形成され、更に装置の底層２８の頂上面の並列部分から形成された底壁によって定められ、更に、チャンネル内の流体の流れを含む毛管トラップ２３によって更に囲まれている各々の側の壁によって規定されている。チャンネルのいずれかの側の毛管トラップの寸法の程度は任意であり、頂上層の周囲の程度かそれに近い。
【０１５６】
図２１は、試料輸送チャンネル１８が試料循環チャンネル１９と合うところでの方向に沿った縦断面を示し、更にその下の膜の位置およびその空洞１０２（図１９Ｂを参照）との端９９との接触を示す。上記したように、膜は、試料輸送チャンネルからの導管のみが試料循環チャンネルに入り、そして膜に入るように位置しており、別の可能性のある導管は以下に記述するように、両側の毛管トラップ２３によって規定された、試料循環チャンネル１８の壁の厚さ以外にこの領域から延長されない。試料輸送チャンネルの底は、図１９Ｂに示すように端９９でのみ膜の端に接触しており、それで膜は、下に延ばされ、そして底層２８の頂上面の延長１０１の側に延長された空洞１０２によって装置の他の部分との接触から空気によって、分離されている。それゆえ、液体の流れは、決められたチャンネルに限定されている。図１８に示すように試料循環チャンネルの小延長１０５は、膜１の一部分に相当し、試料循環チャンネル１９との接合点で試料輸送チャンネルの下に延長され、そして空洞１０２の端９９に隣接する。この延長は開放されており、または好ましくは、その多孔性が壊されて、例えば特定のインクでプリントすることによって、ブロックされている。その目的は、膜１上に規定された試料通路の外側への移動から赤血球を防御するためであり、そして試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへ、そして膜への液体通路を規定するためである。
【０１５７】
図２２は、試料輸送チャンネル１８のレベルで、それが延長１０１が空洞１０２に延長されている点における装置の横断面図を示す（図１９Ｂも参照）。毛管トラップ２３との組合せで空洞１０２は液導管が、液導管が次いで膜１上で試料循環チャンネル１９と合致しているところで、試料輸送チャンネル１８にとじこめられているように協同している。試料輸送チャンネル１８の壁の巾は、液体の流れが，試料輸送チャンネル１８の壁の厚さをこえることを防止して壁の外側が毛管トラップ２３と空洞１０２が合うように、延長１０１の巾以内に制限されている。試料輸送チャンネル１８の外側の毛管トラップ２３の巾は装置の構造によって変わる。
【０１５８】
図２３は、試料循環チャンネル１９の横断面図を示す。操作では、試料は試料循環チャンネル１９に入り、毛管作用によって試料循環チャンネル１９の端２０に急速に移動する。一度チャンネルが満たされると、試料は、試料循環チャンネル１９の全てに沿って膜１に接触し、膜に本質的に同時に、試料循環チャンネル１９の全アーチから境界１１および検出領域３へと通過する。
【０１５９】
図２４は、検出領域３は形が矩形であり、境界１１に外接する試料循環チャンネル１９は同様に矩形であることを除き、図１８に類似している。図１８と同様に、装置は１つは、移動性で標識された検出抗体４および５で、１つは捕捉抗体７の固定ラインを示す。図２４の装置は、実質的な交差反応の量がないとして、１または１以上の分析体を検出するのに採用することができる。
【０１６０】
図２５は、３つの分析体の存在で、全血試料を診断するのにビオチン／ストレプトアビジン反応が利用される本発明の現時点で好ましい膜１の配置を示す。膜１の部分における小延長１０５は、試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネル１９の間の接合点に接触している以外は、上記の図１１に記載したのと同じである。頂上層のチャンネルの配置は、前の説明および後の説明から容易に理解することができる。図において、似た数字は、他の図におけるように同じ意味を有する。設計は、１つの小試料における分析体、例えば、ミオグロビン、トロポニンＩまたはＴおよびＣＫ−ＭＢの存在を明らかにするために採用され得る。
【０１６１】
膜１は、３つの異なった経路で形成されるが、３つの分離した検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃから導かれる各分析体に対して夫々１つづつの経路である。検出領域はブロッキングセグメント２４で分離されている。全作業領域は、装置の上層１６の低表面上で試料循環チャンネル１９と境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃで作用的に連結している３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃを備えるように形成されている。検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれの捕捉領域チャンネルの相当する入口端６ａ、６ｂおよび６ｃと作用的に連結している。
【０１６２】
検出領域３ａは、２つの標識抗体、例えばＣＫ−ＭＢに対するビオチン標識抗体およびＣＫ−ＭＢに対する金標識抗体を含む。
【０１６３】
一般に、図２５において、黒丸は金標識抗体、そして白丸はビオチン標識抗体を示す。参照番号はこの図を混乱させないため、これら検出抗体にはつけない。
【０１６４】
図２５の装置の操作中の赤血球から血漿の分離の例として、３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの各々における赤血球先端を、それぞれ、１３ａ、１３ｂおよび１３ｃとして示す：それぞれの血漿先端の位置は、それぞれ１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとして示す。
【０１６５】
もしＣＫ−ＭＢが試料中に存在すれば、生成する複合体は入口６ａの捕捉チャンネルに入り、ストレプトアビジンライン７ａでストレプトアビジン最後に反応し、目に見える産物を産生する。
【０１６６】
類似した反応が他の分析体、例えばトロポニンＩまたはトロポニンＴおよびミオグロビンと図に示す別の経路で起こる。同じか別の分析体が、同様に常法の抗原抗体反応により検出され得る。
【０１６７】
図２６から図３０ｃは、本発明を更に説明するためおよびその有用性を示すために提供される。
図２６は、１分析体例えばトロポニンＩに対する全血の分析を示す、本発明の多孔担体層１を図示する。図は、多孔担体層１を示し、層の多孔性は検出領域３および末端１２に近接する捕捉領域チャンネル６を決めるいくつかの領域では壊されている。膜１は、好ましくはニトロセルロースまたは等価材料であり、赤血球をクロマトグラフ的に分離し、赤血球先端１３および血漿先端１４を形成する。本発明の本実施態様においては、検出領域３は標識５を構成する標識検出抗体４を含む。抗体は、分析体と、もしあれば、反応し標識抗体／抗原複合体を形成する。
【０１６８】
標識抗体４は移動する、即ちそれらは、検出領域３でいくつかの公知手段により移動性に析出し、それで一度生成した標識抗体／分析体複合体は、下流に自由に捕捉領域チャンネル６に移動し、捕捉領域チャンネル６を横切るライン７において捕捉抗体と反応し、検出し得る反応産物を形成する。
【０１６９】
捕捉領域チャンネル６は、血液、血清、血漿またはその他の体液中に正常に存在する物質と反応し、目に見える産物を産生する、産物１５を含んでいてもよい。対照反応の使用は選択的であるが、好ましいので、オペレーターは、充分な血液またはその他の液体が、診断反応を起こすために装置に適応され得ることを知るであろう。
【０１７０】
検出領域３と捕捉領域チャンネル６は作用的に連結されていることが注目される、即ち、検出領域３の液体は毛管作用によって直接捕捉領域チャンネル６に入口端６ａを通り、直接流入する。
【０１７１】
検出領域３は半円形の幾何構造を有し、それゆえアーチ型境界１１を有することが、注目される。検出領域３が捕捉領域チャンネル６と作用的に連結している、このアーチ型の中心は、検出領域３の第２の、または反対の端であると考えることができ、それを通って液体が捕捉チャンネル６の入口端６ａに流入することができる。この配置の結果、境界１１の全ての点は捕捉領域チャンネル６の入口端６ａから等距離であり、検出領域チャンネル３における液体の全ては、捕捉領域チャンネル６に均一に、試料の連続したセグメントと共に入口端６ａに実質的に同じ時間で到達する。このいくつかの方向からの流れの均一性は、ここに示す頂上層の記述に関連して明確に理解されるであろう。
【０１７２】
本発明の装置の主な特徴は、検出領域３および捕捉領域チャンネル６を通って流れる血漿流が捕捉抗体ライン７に達するとき、先行技術の構造におけるように、検出領域３に捕捉された標識された抗体／抗原が少しあるか全くない。代りに、検出領域３から捕捉領域チャンネル６への液体の急速かつ効果的な毛管流がある。捕捉抗体７は標識抗体／分析体複合体と反応しそしてこれを濃縮し、最大効率で検出し得る産物を生成する。この新規な配置の一つの有利な結果は、診断装置のサイズを最小に減少することができることである。
【０１７３】
当業者に入手できるどのような標識も、本発明の装置において利用し得る。金属または酵素標識が好ましい。金属標識は、それらの顕著な感受性のゆえに本質的に好ましい。金属としては、原理的に金が最も好ましい、なぜならば、このタイプの反応に広く採用されており、その性質がよく理解されているからである。更に、金のシグナルは、公知の処理に従って、可溶性銀塩および還元剤の使用により、容易に目に見えるように増強される。金標識は、銀塩を、目に見える産物として析出する金属銀に還元する触媒として作用する。典型的な反応性ペア−は乳酸銀であり、これは還元し得る銀イオンの起源として働き、還元剤としてはハイドロキノンがある。金属銀は、金の各粒子の周囲に、容易に識別できる黒色沈澱を生じる。
【０１７４】
本発明で使用される金標識抗体の好ましい粒子サイズは、分析体の濃度および反応体の親和性などのよく知られた因子に応じて許容することができる変化があるが、約３５から６５ｎｍである。
【０１７５】
もし、西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素標識が採用されると、反応は、標準的方法にしたがって、過酸化水素およびオルトフェニレンジアミンのような色素の添加によって検出することができる。
【０１７６】
本発明の特徴には必要がないが、検出領域にプレインキュベーション領域がある。プレインキュベーション領域は、所望の反応を妨害する可能性がある、あるいは検出を困難にするような、血液中に存在する産物を除去するために採用される。例えば、もし装置が心臓の分析体を検出するために使われているなら、典型的な妨害物質は、クレアチンキナーゼ、ＣＫ−ＭＭのイソフォームである。イソフォームＣＫ−ＭＢに対する抗体はＣＫ−ＭＭと交叉反応し、誤った読みを与える。これは、ＣＫ−ＭＢに対する可動性抗体の上流のプレインキュベーション領域にＣＫ−ＭＭに対する固定化抗体の充分な量を備えることによって避けることができ、それでＣＫ−ＭＭの全量が、移動している試料が検出抗体に到達する前に除かれる。
【０１７７】
図２６の装置は、固定化捕捉抗体ラインにある１つまたは複数の標識検出抗体および捕捉抗体を利用する。いくつかの標識検出器が採用されているときは、妨害交叉反応を避けるために注意しなければならない。別の図に関して以下に説明する、特別の分析体と反応する１以上の検出領域中に抗体を配置することが、しばしば最良である。
【０１７８】
図２６、２７の装置は、上記したような変形を利用するビオチン／アビジン反応を採用するのに用いられる。図２９の装置に応用される現在好ましい変形において、ビオチン標識抗体および金標識抗体が検出領域３に移動的に設置される、そこではそれらの各々が分析体の異なったエピトープと反応し、ビオチン標識抗体／分析体／金標識抗体の三元からなる複合体を生成し、それは毛管作用によって、捕捉チャンネル領域６へ、またそこを通って、移動し、そこでアビジンまたはストレプトアビジンと反応し検出し得る反応産物に濃縮し生成する。
【０１７９】
もちろん、本発明で採用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。同様に、ビオチン／アビジン反応の等価物も採用することができる。ここにあげたすべての試薬は、等価物と交換でき、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【０１８０】
当業者は、全血から赤血球と血漿をクロマトグラフ的に分離するどのような多孔性物質も本発明において採用し得ることは、認識するであろう。しかし、ニトロセルロースは、適度の値段で容易に手に入るので好ましい。ニトロセルロースはクロマトグラフィおよび関連分野で長年採用されてきたので、科学者および技術者にはその性質はよく知られている。市販のニトロセルロースシートはチャンネルのどのような選択された配置を有するどのような選択された形にも容易に形成することができる。
【０１８１】
本発明のニトロセルロース膜は膜内に毛管作用を与える種々のサイズおよび寸法の複数の内部連結したミクロポアを有するスポンジ様のものとして特徴づけられる。これにより、検査中の生物試料が選択された経路に沿って移動することができる。
【０１８２】
本発明の実施において赤血球から血漿の分離には、種々の装置の領域、配置、寸法が、液体試料が前もって設計された経路を移動するので、前もって選択された領域において所望の反応が起こるように選択される。全血の心臓診断には、これらの領域が、赤血球の流れおよび血漿の流れの先端の相対的速度、所望の反応の動力学、それぞれのエピトープに対する抗体の親和性、およびその他を基礎にして選択される。これらは、当業者に公知であり、または通常の試験処置によって容易に決定される。
【０１８３】
図２７は、３つの分析体に使用する、３つの液体経路を有する代りの多孔性膜の配置である。膜の配置と操作は、別の装置の操作説明から明らかである。
【０１８４】
前に述べたように、本発明の診断装置は、１つ以上の分析体を検出するように好ましくは設計されているが、１つの捕捉チャンネルおよび複数の捕捉ラインで、各分析体に対し１つづつ、または、各々１捕捉ラインを有する複数の捕捉チャンネルを有するように設計もできる。しかし、後者の設計は、反応が全てのチャンネルで行われることを確かめるために、増大した試料容量が必要なので好ましくない。このことは本発明の少量の試料で有益な結果を得ることが可能である、という主な特徴を減じることになる。
【０１８５】
ある程度の妥協ではあるが、しかし問題を完全に解消しないということは、チャンネルをできるだけ小さくし、そして互いに可能な限り近づけるよう設計することである。しかし、チャンネルの接近は、信頼をもって結果を読むことの困難性が増大する。なぜなら１つのチャンネルの捕捉ラインを他のラインの捕捉ラインと区別するのに困難だからである。
【０１８６】
本発明の装置は複数のチャンネルを、テストチャンネルおよび／または陰性および陽性対照チャンネルを含む１つ以上のチャンネルを有する、多チャンネルに配列することができる。設計は当業者に明らかであろう。
【０１８７】
１チャンネル、通常中間チャンネルは、推定される分析体に対する１つの固定抗体を含有する。陽性対照チャンネルは、チャンネルの入口にある移動する標識抗体および、チャンネルのより深いところにある固定した抗体を含む。陰性対照チャンネルは、固定した抗体を含むが、しかし、試験試料が入るのを防止するため入口にブロックされる。陰性試験チャンネルは、捕捉抗体と移動するバッファーのような分析体フリーの物質を加えられるように支持体をとおして入口の孔に設計される。
【０１８８】
上記に詳細に記載した心臓の分析体についての試験の価値に加えて、本発明の産物および手順は、他の医学手段、例えば妊娠、排卵試験において有用である。それらは特定のウイルスの感染の試験に特に有用である。この有用性のために、競合およびサンドイッチアッセイの両者が設計され得る。これらは抗原、抗体、表面抗原、およびエイズウイルスのgp120のようなウイルス粒子の試験に使用することができる。
【０１８９】
更に製品は薬物乱用を含む医薬の試験に採用することができる。
【０１９０】
本発明の実際において採用される種々の診断方法においてとられる反応は、一般に当業者に公知である。それらは、新しい有用フォーマットがとられるＥＬＩＳＡテストである。本発明の利点は、新規且有用なフォーマットを提供することである。即ち小さな、手で持てる装置上で少量の試料液を用い、反応が速か且効率的に行なわれる。操作者も結果に大いなる自信を以て実施出来る。
【０１９１】
前に記載したのは１またはそれ以上の抗体が、検出領域３に移動性に沈殿するものであったが、検出抗体の代りの位置、およびその他の試薬は、本発明に含まれる。検出抗体は、例えば凍結乾燥ビーズ、例えば一つの大きなビーズ、または複数の小さなビーズを膜の少し上流の液体経路にビーズが液体に溶解するようにおかれる。
【０１９２】
そのようなビーズの非限定的実施例は、共通して所有する同時係属出願（米国代理人Docket  No.  1112-1-999,  1999年７月１４日出願）に記載されている。この係続出願は、以下を開示する：即ち複数の均一な、冷結乾燥、硬い、界面活性剤フリーの試薬粒子を形成する方法で、各粒子はカーボハイドレイトマトリックスを含有し、体液中の１つ以上の抗原の存在を決定するのに有用な少なくとも１つの抗体が全体に分布している。その方法はカーボハイドレイトおよび抗体の界面活性剤フリー水溶液を生成し、溶液の均一な滴を生成し、そしてそれらを容器中の液体チッソに、各滴が分離した凍結小粒を窒素中でつくるように加え；凍結粒滴を液体窒素で覆われた容器内に保持し、粒滴を凍結乾燥して窒素を除き、乾燥小粒をつくるものである。
【０１９３】
ビーズは試料輸送チャンネル試料に循環チャンネルまたはそれらの接合点に備えられ；小空洞が試料輸チャンネルまたは試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネル１９との間の接合点に材料を保持するために備えられる。別の実地態様において、抗体がチャンネル内に凍結乾燥形でおかれる。他の試薬例えば前述のように不純物を除く試薬も備えられる。更に１つ以上のアッセイを実施するため、膜中に１つ以上の液体経路を有する装置では、アッセイに共通の試薬が膜の前の液体経路に備えられ、各アッセイに特異的な試薬が、上記したように、膜の特定の検出領域に備えられる。これらの種々の配置は本発明に抱含される。
【０１９４】
図２８Ａ，２８Ｂに示すように、装置の頂上層１６の底面にある試料輸送チャンネル１８は、装置の液体経路を満たすためそして、上記したアッセイを行うことを許容するために、前以て選択された容量に設計される。試料は貫通孔１７に適用され、試料が貫通孔１７に近い末端からはじまる試料輸送チャンネルを満たし、反対側の端に向って満たす。一度試料輸送チャンネルが満たされると、前以て選択された容量の試料が加えられる。以下に記するように、試料輸送チャンネルが、容量を満たしたことを示すように、窓９１がおかれる：試料輸送チャンネルの上に位置する頂上層またはその一部は充満が容易に見えるように透明な材料でつくられる。更に、そして図２８Ａにおけるような装置で示されるように、頂上層１６の試料輸送チャンネル１８は、以下のように設計される。上に記するように、即ち一度試料輸送チャンネル１８が試料でその前以って選択された量に満され、試料の移動する先端がチャンネルの反対の端で狭まったくびれ９２に接触し、狭い毛管チャンネルと試料循環チャンネル１９に導かれると、試料輸送チャンネル中の試料が、毛管作用によって試料輸送チャンネル１８の外側と試料循環チャンネル１９中へ導かれ、膜１へと導かれる。図２８Ｂは、Ｅ-Ｅにそって、図２８Ａの装置の横断面であり、試料適用貫通孔１７、試料輸送チャンネル１８、および窓９１が試料輸送チャンネル１８の末端と試料循環チャンネル１９の間の接合部で試料輸送チャンネル１８が、試験を行う適当な試料で満されたことを示すものである。
【０１９５】
任意の窓９１は、頂上層の頂上面での発色場所に毛管チャンネルとして、全血の存在が場所で容易に示されるように設計される。窓の他の配列もここに包含される。上記したように、代りの配置として、試料輸送チャンネルの充満が見えるように透明にすることもできる。別の例において、貫通孔への試料の適用は、窓が、試料輸送チャンネルが満たされたことを示すか、充満した試料輸送チャンネルを直視することで、中止することもできる。
【０１９６】
図２９は、組立てられた診断装置の透明な上面図であり、図３０Ａ−Ｃ、頂上層１６、膜１、および底層２８をそれぞれ示す。例示した装置は３つの分析体を診断するのに使われる。多孔担体が、３つの検出領域５０、５１、５２に、それぞれ３つの捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂ、２７ｃと作用的に連結されるように配置されている。簡単にするため、新規装置で、図は抗体、赤血球先端、血漿先端その他を含んでいない。これらの成分は以前の図で示される。
【０１９７】
頂上層１６は貫通孔１７を有し、それは傾斜していてもよく、その頂上面から内面へと続き、浅く、狭い試料輸送チャンネル１８に連結している。試料輸送チャンネルは、浅い、狭い試料循環チャンネル１９に連結している。該チャンネルは、頂上層１６の底面に検出領域５０、５１、５２のアーチ型境界１１と正確に一致するように形成されている。循環チャンネル１９は両端２０で閉じられている。任意に試料循環チャンネルの末端の延長５３は、適当な試料が装置に加えられたことの指示計として働くための視認窓を有している。
【０１９８】
図３０Ａ、３０Ｃを参照して、頂上層１６は底層２８にピン３４によってくっついている。それは対応する孔３５に合わせられる。その他の均等な接触手段も援用し得、そして２つの層１６と２８は永久的にまたは着脱可能に固定される。
【０１９９】
多孔抗体１は、図３０Ｂに示され、ポリエステルフィルムのような裏打ち２９がついている。それは層１６と２８との間に、膜が空洞１０２の端９９に接するように、任意の凹凸領域に保持される。頂上層１６と底面層２８との間の膜１のいかなる配置も、任意で、貫通孔１７を通して加えられた液体が、輸送チャンネル、循環チャンネル１９、検出領域及び捕捉領域チャンネルを通って捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂ、２７ｃの閉塞端に達するような作用的な通路がある限り、本発明に包含される。図３０Ｂに示される多孔膜１は、３つの分析体を検出する多孔体、図２５と類似して配置される。従って、それは、３つの捕捉領域チャンネル２７ａ、２７ｂおよび２７ｃに連結した、３つの検出領域５０、５１、５２を含む。検出領域のアーチ型境界１１は循環チャンネル１９の内壁２１に延長され、それにより液体の流れは、端２０で停止したとき、毛管作用で検出領域５０、５１、５２に流れ込む。
【０２００】
毛管とラップ２３の目的は明らかである。もし毛管トラップ２３がないと、多孔担体１は頂上層１６の平らな底面と接触し、循環チャンネル１９内の液はその貫通孔１７から捕捉領域チャンネルの末端へと、前以って選択された経路の膜を通って、流れるよりもむしろその表面と多孔担体１を流れる。流れは循環チャンネルの端で停止し、試料のサイズを制御することを可能ならしめる。上記したように、試料循環チャンネルの任意の延長５３上に任意の窓３９を設けて、適当な試料がチャンネルを満すよう注入されたことを示すようにしてもよい。図２８Ａに示したように、適当量の試料の注入を示す窓９１を設けてもよい。
【０２０１】
もし、頂上層１６が透明なら、目に見える反応の生成は容易に明らかである。もし頂上層１６が不透明なら、１ないしそれ以上の可視窓を、ここでは３８として示される、任意の窓３７と共に構成する。図３０Ａに示すこれらの窓は、捕捉領域チャンネルに備えられており、オペレーターは着色物質の生成をみることができ、あるいは機器、例えば検出し得る産物が生じたことを決めるレフレクトメーターのようなものを調節することができる。
【０２０２】
装置は、各分析体用の捕捉領域を見る窓を分離している。好適な装置においては、一つの窓が頂上層３０に横切って延長されているので、全ての反応の結果が一度に見れる。更に、下記の試料循環チャンネルの延長に相当する任意の窓３９（図３０Ｂ）があり、適当な試料が装置を満たすために加えられたことを示すのに使われる。試料特に血液が光学窓下に表れたことは、適当な試料が注入されたことを示すものである。
【０２０３】
本発明の一つの利点は、測定しようとする１，２又は３つの抗体が同じ寸法であることである。もちろん、多孔抗体１は、各場合によって異なったように設計される。しかし、頂上層１６および底層２８は異なって設計された担体層１に合わせるのに変更を必要としない。
【０２０４】
これまで記載されたことは、液体試料、例えば全血、血清又は血漿中の心臓の分析体の成分の検出を、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイで酵素または直接標識を利用した抗原／抗体反応により可能ならしめる装置と方法を記載したものであることが判るであろう。本発明の装置において、反応体は支持体と膜の異なった面に連続的に結合されたチャンネルにより形成された経路にそって移動する。
【０２０５】
種々のニトロセルロース材料が、種々のセルサイズで得られるが、現時点で好ましい多孔担体は、垂直に膜の水平表面へ流れる液流から粒子をろ過するフィルターとして使用するには、３から１２μｍより大きな粒子の通過を防止するものである。本発明の実際において、孔サイズ約５から１２μｍ、好ましくは３−８μｍの膜が好適である。いくつかの変形が可能である。しかし、孔サイズが減少すると、膜内の液体の移動は減少する、それで診断に要する時間が増加する。もし孔サイズが余りにも大きいと、通過時間は減少するが、反応体は診断反応が起こるに充分な時間、互いに充分に接触せず、あるいは所望の情報を与えることのない限られた程度にしか起こらない。
【０２０６】
支持体ポリエステルまたは他のフィルムを有するニトロセルロース膜は、市販されている。それらは、不支持膜は非常に壊れやすく、破損に弱く、大量生産環境において取り扱いが困難な傾向がある。更に、フィルムは、流れている液体に不浸透性であるので、本発明の装置の選択された経路を通る液体試料の流れを妨害しない。そのような膜は、Ｇｅｒｂｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｇｅｒｂｅｒｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ、から種々の孔サイズのものが入手することができる。
【０２０７】
本発明で採用されている抗体は標準の技術で調製される。例えば、Ｆａｌｒｅ，Ｈｏｗｅ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２６６，７，５５０−５５２，１９９７，４月、を参照。このセミナーのモノクローナル抗体の調製に関する主題の該当する開示はここに参照することによりとり入れられている。
【０２０８】
ニトロセルロースのような基質に抗体を固定する手段は知られており、本発明の装置の製造に使用され得る。ニトロセルロースはタンパク質に対し、強い結合体である。それゆえ、固定捕捉抗体は、前以て決められた捕捉領域に応用するだけでよい。標識検出器抗体は、ビオチン血清アルブミンのような別のタンパク質で検出領域をまず飽和することによって膜に移動的に固定され得る。上記したように、抗体およびその他の試薬は、膜の前に液体のバス中にビーズとして沈殿または備え付けられる。試料がアッセイで使われるのが全血であり、血漿から赤血球の分離が必要であるときは、分離が行われるために、装置に供給される試薬は試料中の赤血球の溶解があってはならない。
【０２０９】
本発明の装置は公知の方法で製造することができる。
【０２１０】
上記したように、他のアッセイ手段が本発明の装置を使用し、その開示された変形を使って実行される。これには定量的、定性的アッセイを含み、イムノアッセイ、非イムノアッセイフォーマットを含む。酵素を基本としたアッセイ、例えばグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの組合せを使用した全血中のグルコースの定量、試料中のグルコースレベルに比例して色を生成する適当な反応体および色原体の使用、は本発明の装置を用いての操作に配置され得る。当業者は他のアッセイフォーマットを本装置に適応することを認識するであろう。
【０２１１】
以下は、本発明の第３の態様を記載する。上記したように、本発明の装置は、種々の液体試料、特に検出し得るシグナルを放出する標識反応体を利用する競合またはサンドイッチ法の変形のいずれかの通常の抗原／抗体反応により分析し得る生物試料の分析に利用され得る。当業者は、本発明の装置のいくつかの応用があることを認識するであろう。
【０２１２】
本発明は、心臓の分析体の存在に対する全血の診断としての主要な有用性が見出されることが、現時点で予測される。分析体の例は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ミオシン軽鎖、脂肪酸結合タンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、アクチンおよび狭心症または心筋梗塞のような虚血状態に次いでおこる心臓組織の損傷として血中に見出される公知のその他の分析体である。従って、本発明は、心臓のイベントの診断に利用されるものとして主に記載される。しかし、装置は、本発明の装置のクロマトグラフ的液体の流れにおいて赤血球から血漿の分離を有利に行う免疫およびその他のアッセイフォーマットによって大幅に種々の分析体を検出するための使用に適用することができる。事実、そして以下に見られるように、単一の装置は、１フォーマットより多い複数のアッセイ、例えばイムノアッセイおよび酵素に基づいたアッセイ、を装置において使用し得る別々の液体の経路の各々において特別なアッセイ成分を備えることによって実行するように配置されている。
【０２１３】
本発明の構成は、米国特許５，７４７，２７４、５，２９０，６７８および５，７１０，００８で、ここに参照することによってとり入れられている該当する内容に記載されたように、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ミオシン軽鎖、トロポニンＩ、トロポニンＣ、トロポニンＴ、および少なくとも２つのトロポニンサブユニットを含む、トロポニンＩ、トロポニンＣ、トロポニンＴの複合体について血液、血清および血漿を分析するのに特に有用である。
【０２１４】
図１３は、本発明の乾燥多孔担体層１（膜１と同様にいう）を例示し、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体対で選択された対の１つのメンバーは標識されているものを利用した古典的な抗原／抗体反応において分析体の異なったエピトープと反応する抗体対と分析体の間の反応によって、１つの分析体または複数の分析体に対する全血の分析用に配置されている。
【０２１５】
当該図は、担体層１を示し、層の選択されたセクションの多孔性が境界１１と末端１２で閉じられた捕捉領域チャンネル６とで半円形検出領域３を画定するような１つの多孔領域のみを残して、こわされているものを示す。代りに、或は、好ましくは、多孔性は、試料を境界線の内側に保持する上記領域の境界線に沿って多孔性をこわされている。
【０２１６】
この膜１は全血の分析用で、好ましくはニトロセルロースまたはその同等品であり、赤血球細胞をクロマトグラフ的に分離して赤血球細胞先端１３とその下流に血漿先端１４を生成する。他の液体試料の分析には、他の物質が好ましい。
【０２１７】
検出領域３は、分析体（もしあれば）と反応して標識抗体／抗原複合体を生成する検出可能な標識５を有する検出抗体４を含んでいる。
【０２１８】
便宜上、１抗体のみ示したが、検出領域３はいくつかの標識抗体を含む。
【０２１９】
抗体４は移動性である。即ち、それは、いくつかの公知の手段で検出領域３に折出する。それによって一度生じた標識抗体／分析体複合体は遊離されて下流へと移動し、捕捉領域チャンネル６に入り、捕捉抗体７と反応し、固定されて捕捉領域チャンネル６を横切って、検出し得る反応産物を生成する。検出抗体は、膜の前の液体経路に備えられ、例えば、試料輸送チャンネル、試料循環チャンネル、またはそれらの間のチェンバーにビーズまたは折出物の形で備えられることが、以下の記載から注目される。
【０２２０】
便宜上。１つの抗体のライン７のみ示すが、そのようなラインは検出される分析物につき１つあり、複数のラインがある。
【０２２１】
捕捉領域チャンネル６は、分析される液体中に通常存在する物質と反応し、液体が捕捉領域を通過したことを示す可視対照産物を生成するような産物１５を含有してもよい。対照反応は任意であるか、しかし好ましい。
【０２２２】
本出願は、上記した装置をこえて更に改良される。本発明の装置は、図３２−３４の実施例に示すように、装置の頂上面をこえて拡がった、カバー片７５でカバーされた輸送チャンネル１８、（図３４Ａ）を有する。本装置の成分の非限定的実施例を更に、下記に、詳しく記載する。装置の頂上面の試料輸送チャンネルの利点は数倍である。第一に、試料輸送チャンネルの充填は、装置のオペレーターによって見ることができ、そして、試料輸送チャンネルの容量が、試験を実行するように必要な試料の量に等しいなら試料の適用は、オペレーターがチャンネルは完全に満たされたと注意して、停止される。第２に、試料輸送チャンネルを装置の頂上層のどんな適当な場所に置いてもよい。即ち膜を収納した装置の部分をこえた場所を含め、頂点片の頂上面の試料輸送チャンネルが、膜、あるいは装置の頂上と底面の間にあるその他の成分、と干渉しない限り、その結果を見て或は読んで場所を決めてもよい。それによって提供される装置が小型化され、そのサイズは膜のサイズによってのみ、そのサイズが限定されることになる。試料輸送チャンネルを含む膜のサイズの減少、装置の拡大の減少、除去は、膜のより少い小さな装置、製造コストの減少、包装、輸送コストの減少をもたらし、更にユーザーフレンドリーおよび環境にやさしい機器を提供する。
【０２２３】
試料輸送チャンネルの１つの便利な位置は、装置の試料適用孔が、装置上の位置にあり、図３２に示すように点がしぼられることである。これによって指穿刺
よって得られた全血を装置に満たすのに便利であり、試料の開口６０へ血液の滴を適用するために、試料は、通常３０−５０ulを毛管作用で引いて、試料輸送チャンネルに満たし、その後、試料を試料循環チャンネル、そして膜へと送られる。
【０２２４】
更に、試料輸送チャンネルは、乾燥した試験試薬、例えば、分析体に対する金複合体、および／または分析体に対するビオチン化抗体でプレロードして後ここに記載するようにイムノアッセイに用いてもよい。プレロードするには、試薬を含む溶液を加え、それを試料輸送チャンネル中で乾燥させるか、あるいは粒子、例えば試験試薬を含む凍結乾燥ビーズを、チャンネル中の画定された凹部または空洞中に設置するようにしてもよい。試料と接触すると、乾燥試薬は試料中に溶け、液体経路にそって運搬される。
【０２２５】
本発明の装置の別の特徴は、循環チャンネル１９の接合部近くの位置９２で、試料輸送チャンネル１８のセクションを横断的に減少することであり、それによって小さな容積を持つ試料輸送チャンネル１８のセクションへの試料の毛管移動があるということである。この配置の特別の利点は、分析を行うに必要な試料の正確な量を保持するように、試料輸送チャンネル１８を設計できることである。試料輸送チャンネルが試料で満たされ、そして試料が横断面で減少したチャンネル部分と接触するから、毛管作用によって、試料は更に小さな横断部分に移動し、試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへ試料が移って、血液から血漿がクロマトブラフ的に分離され、イノムアッセイプロセスが開始される。
【０２２６】
図３２−３４は、本発明の装置の例の成分の詳細を示す。多くの代替配置が可能であり、それらは本発明に包含される。当業者には、別の配置が可能であり、特に、図３５Ａに示し以下により詳しく述べるように、膜部分にわたり試料輸送チャンネルをおくことによって、装置のサイズを更に減少できることは容易に理解されるであろう。図３２Ａは装置の頂上片１６の正面図で、多孔質担体１（膜１）を、それと３３図に示された底片２８との間に保存するよう設計されている。頂上片１６には窓１４があり、操作者が捕捉領域７と同時に膜１の任意の試験終点指示領域１５を見れるようにする。他の態様としては窓４３を設けて流体通路の端部を見、試験の終了を知る。頂上片１６は、図３２Ｄの下に見るように、試料輸送チャンネル１８の部分、試料循環チャンネル１９をも含んでいる。後者は、例えば上記図５に記載されたと同じ性状を有している。図３２Ｂは頂上片の正面図、図３２Ｃは頂上片の側面図である。
【０２２７】
図３２Ｅは、本発明の組立てた装置の例の組立横断面図を示し、頂上片１６、底片２８、試料輸送チャンネルカバー片７５を示す。図は、また、液体の経路、試料適用ポート６０、試料輸送チャンネル１８、試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネルをつなぐ狭まった接合部９２、膜１、捕捉領域４１を見るための窓および試験終了指示窓４３を示している。
【０２２８】
捕捉領域および任意の試験終了指示領域を見るための装置の窓は、装置の頂上層に開口しているか、あるいは、頂上層を、見る必要がない部分を不透明化表面処理、または印刷によって、不透明にした透明材料でつくってもよい。一つの実施態様において、試験終了指示領域１５は、分析される液体中に通常存在する物質と反応して、窓４３から見える可視対照産物を産生するような製品を含む。別の実施態様において、色素のような産物が、窓を通しては見ることのできない部分１５にある膜１上に折出される。色素は液体に溶け、液体の経路１２の末端に進み、そこで窓４３を通して見ることができる。
【０２２９】
頂上層１６は、試料を適用する開口部６０を有する。装置の操作において、試料輸送チャンネル１８は試料で満たされる。試料が、狭まった場所９２の試料輸送チャンネルの一部に到達すると、毛管作用で試料を試料計数チャンネル１９の方向に移動させ、そして膜１に至る。試料輸送チャンネルカバー７４は、もし透明なら、オペレーターが、試料輸送チャンネルの充満を見ることができ、それが完全に満たされたときを指示する。
【０２３０】
試料は、試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへとそして膜へと、導かれる。上に述べたように、試料循環チャンネルは、試料が膜上に通過するよう設けられている。試料循環チャンネル壁２１、２２と、例えば特別なインクで印刷された膜上に画定された液体経路は、試料を液体経路に保持するように配置されている。
【０２３１】
上記したように、本装置は、イノムアッセイ処理、酵素に基づいたアッセイを含むその他の方法を用いて１またはそれ以上の分析体の測定に適している。ここでの考察は、非限定的実施例によるイノムアッセイ処理に関する。上記の考察のように、試料が捕捉チャンネルの方向に移動するにつれて標識検出抗体を採りあげ、その間、試料中の分析体は検出抗体と抗体抗原複合体を試料中に形成する。前方赤血球先端より前方で、該先端から分離された血漿先端を有する試料は、捕捉領域に到達し、そこで分析体は、結合した標識抗体と共に、捕捉抗体と相互反応し、サンドイッチを形成する。捕捉領域における標識抗体の蓄積は、試料中に分析体が存在することを示す。試験の結末において、例えば試験終了指示窓が、試験完了したことを指示すると、オペレーターは窓で捕捉領域での呈色を観察する。上に述べたように、標識検出抗体、その他の試薬は試料輸送チャンネル中に置いてもよい。
【０２３２】
上に注意したように、試料輸送用チャンネル１８は試料循環チャンネル１９と作用的に連結している。試料循環チャンネル１９は、図３１の半円形の検出領域３の境界１１と一致するためにアーチ形配置で示される。試料循環チャンネル１９は、両端２０で開口または閉鎖にすることができる。それは内壁２１および外壁２２で形成され毛細管トラップ２３で囲まれている。上記トラップは試料が境界１１の全ての点で図３１の検出領域３中に、そして更に捕捉チャンネル６の入口端６ａ中に確実に流れるよう作用するものである。
【０２３３】
図３３は、本発明の底片２８の例の詳細を示す。底部は、場所に膜１を保持し、示したようにタブ６６，６８を有し、これは頂上片１６のノッチに相当し、膜を正しい位置に保持し、互いに各部分が合致するようにする。図４Ｂは、底片２８の正面図を示し、末端からタブ６８がみえる。図３３Ｃは側面図である。
【０２３４】
図３４Ａ及び３４Ｂは、試料輸送チャンネルカバー片を、上および側面から図を示す。ノッチエンド６２は試料適用領域を示し、この末端は、頂上片１６の末端が並列して開口６０を形成している。カバーの先端は、試料輸送チャンネル１８の部分を覆う様子を表わし、試料輸送チャンネル１８は狭められ、試料循環チャンネルと連結する毛管チャンネル９２を形成している。カバー片７５は、カバー片を、試料輸送チャンネルにそって頂上片にスライドすることによって頂上片１６に接着している、カバー片７５の側面に角度をつけた延長６４は、頂上片の試料輸送チャンネルの内壁にそって走る相当する縦方向のグローブ６９にスライドする。別の手段が、頂上片にカバー片を付着するのに利用し得る。例えば接着剤、溶接等である。
【０２３５】
図３５−３６は、本発明の別の実施態様、特に、試料輸送チャンネル１８の位置の他の位置を示す。平面図、底面図および縦断面は位置を示す。２つの例のもので図Ａは頂上片１６の上面を示し、図Ｃは頂上片１６の底面図を示し、図Ｂは、頂上片１６の縦断面を示し、図Ｄは背面片２８を示す。図３５で、試料輸送チャンネルは、膜を含む装置のセクションをこえて位置しており、装置を小型化させられる。試料適用ポート６０は装置の側面にある。図３６は装置の膜を保持している部分から延長する装置を示し、装置の端に試料適用ポート６０を有するより長い装置を提供している。
【０２３６】
図３８（前記、図１１に相当）は、ビオチン／ストレプトアビジン反応を利用して全血試料を診断し、３つの分析体の存在を求める際の本発明の現時点で好ましい膜１の配置を示す。設計は、１つの小試料における分析体中に、ミオグロビン、トロポニンＩまたはＴおよびＣＫ−ＭＢの存在を明らかにするために採用され得るようにしたもので、膜１は、３つの異なった経路で形成されるが、その経路は３つの分離した検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃから導かれる各分析体に対して夫々１つづつである。検出領域はブロッキングセグメント２４で分離されている。全作業領域は、装置の上層１６の低表面（図示せず）上で試料循環チャンネル１９と境界１１ａ、１１ｂおよび１１ｃで作用的に連絡している３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃを備えるように形成されている。検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれの捕捉領域チャンネルの相当する入口端６ａ、６ｂおよび６ｃと作用的に連続している。
【０２３７】
検出領域３ａは、２つの標識抗体、例えばＣＫ−ＭＢに対するビオチン標識抗体およびＣＫ−ＭＢに対する金標識抗体を含む。
【０２３８】
一般に、図３７において、黒丸は金標識抗体、そして白丸はビオチン標識抗体を示す。参照番号はこの図を混乱させないため、これら検出抗体にはつけない。
【０２３９】
図３７の装置の操作中の赤血球から血漿の分離の例として、３つの検出領域３ａ、３ｂおよび３ｃの各々における赤血球先端を、それぞれ、１３ａ、１３ｂおよび１３ｃとして示す：それぞれの血漿先端の位置は、それぞれ１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとして示す。
【０２４０】
もしＣＫ−ＭＢが試料中に存在すれば、生成する複合体は入口６ａの捕捉チャンネルに入り、ストレプトアビジンライン７ａでストレプトアビジンと最終的に反応し、目に見える産物を産生する。
【０２４１】
類似した反応が他の分析体、例えばトロポニンＩまたはトロポニンＴおよびミオグロビンと図に示す別の経路で起こる。
【０２４２】
同様なまたはその他の分析体が通常の抗原抗体反応で同様に検出され得る。上記実施例に描いたサンドイッチイムノアッセイに加えて、競合アッセイを含め他のイムノアッセイフォーマットが提供される。定量または定性が種々の異なったアッセイ成分を利用して提供される。さらに装置はイムノアッセイ以外のアッセイも行われる。例えば、適当な補助因子、色原体の存在下で、酵素または一連の酵素と分析体の相互作用は、試料中に分析物が存在することを示す試料の呈色をもたらす。呈色は、窓４１で観察される。
【０２４３】
前記したように、本発明の診断装置を１つ以上の分析体を検出するように設計するのが好ましく、単一捕捉チャンネルおよび多捕捉ライン、１つを各分析用に、複数の捕捉チャンネルを夫々単一捕捉ラインとして使うように、設計することも可能である。この後者のデザインは、しかしながら、反応が全てのチャンネルで確実の行えるよう増大した試料の量を確保しなければならないので好ましくない。これは本発明の特徴、即ち、有用な結果を得ることが可能で、少量の試料を使う、という本発明の特色を失わせる。
【０２４４】
ある程度の妥協をするとしても、完全には問題の解決にはならないことは、チャンネルをできるだけ小さく、そして互いにできるだけ接近してデザインする、ということである。しかし、チャンネルを接近すると結果を正確に読む困難性が増大する、なぜなら１つのチャンネルにおける捕捉ラインを別のチャンネルにおける捕捉ラインから区別するのは困難である。
【０２４５】
本発明の装置は、テストチャンネルおよび／または陰性および陽性対照チャンネルを含む１つ以上のチャンネルを設定することができる。多チャンネルは、それぞれ１つ以上の捕捉ラインを有することができる。設計は、当業者に容易に明らかである。
【０２４６】
１チャンネル、通常は真中のチャンネル、は疑わしい分析体に対する固定された抗体のみを含む。陽性対照チャンネルは、チャンネルの入口に移動しうる標識抗体を含み、そしてチャンネルのより深いところに固定した抗体を含んでいる。陰性対照チャンネルは、固定した抗体を含みうるが、試験する試料が入るのを防止するためその入口でブロックされている。陰性試験チャンネルは、入口孔を有し、支持メンバーを通って分析体フリーの物質、例えば捕捉抗体の方に移動するバッファー、が加えることができるように設計される。
【０２４７】
本発明の産物および方法は、上記に詳細に記載したように、心臓の分析体を試験する価値に加えて、妊娠および排卵試験のようなその他の医学的処置に有用に採用される。特定のウイルスに起因する感染を試験するのに特に有用である。この有用性のために、競合およびサンドイッチアッセイの両者について設計することができる。それらは、抗原、抗体、表面抗原、およびエイズウイルスのｇｐ１２０のようなウイルス粒子を試験するのに使用することができる。
【０２４８】
更に、製品は、薬物乱用を含む医薬品を試験するのに採用することができる。
【０２４９】
本発明の実施で採用される種々の診断処置において行われる反応は、一般的に当業者によく知られている。それらのほとんどは、新規および有用なフォーマットで行われるＥＬＩＳＡ試験である。本発明の利点は、反応が小さな手持サイズの機器で、低容量の検体液を使用して迅速かつ効果的に行えることであり、同時にオペレーターが結果に大きな信頼性を有することが可能であるような新規で有用なフォーマットを提供することである。
【０２５０】
当業者に入手できるどのような標識も、本発明の装置において利用し得る。金属または酵素標識が好ましい。金属標識は、それらの顕著な感受性のゆえに本質的に好ましい。金属としては、原理的に金が最も好ましい、なぜならば、このタイプの反応に広く採用されており、その性質がよく理解されているからである。更に、金のシグナルは、公知の処理に従って、可溶性銀塩および還元剤の使用により、容易に目に見えるように増強される。金標識は、銀塩を、目に見える産物として析出する金属銀に還元する触媒として作用する。典型的な反応性ペア−は乳酸銀であり、これは還元し得る銀イオンの起源として働き、還元剤としてはハイドロキノンがある。金属銀は、金の各粒子の周囲に、容易に識別できる黒色沈澱を生じる。
【０２５１】
本発明で使用される金標識抗体の好ましい粒子サイズは、分析体の濃度および反応体の親和性などのよく知られた因子に応じて許容することができる変化があるが、約３５から６５ｎｍである。
【０２５２】
もし、西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素標識が採用されると、反応は、標準的方法にしたがって、過酸化水素およびオルトフェニレンジアミンのような色素の添加によって検出することができる。
【０２５３】
本発明の特徴には必要がないが、検出領域にプレインキュベーション領域がある。プレインキュベーション領域は、所望の反応を妨害する可能性がある、あるいは検出を困難にするような、血液中に存在する産物を除去するために採用される。例えば、もし装置が心臓の分析体を検出するために使われているなら、典型的な妨害物質は、クレアチンキナーゼ、ＣＫ−ＭＭのイソフォームである。イソフォームＣＫ−ＭＢに対する抗体はＣＫ−ＭＭと交叉反応し、誤った読みを与える。これは、ＣＫ−ＭＢに対する可動性抗体の上流のプレインキュベーション領域にＣＫ−ＭＭに対する固定化抗体の充分な量を備えることによって避けることができ、それでＣＫ−ＭＭの全量が、移動している試料が検出抗体に到達する前に除かれる。
【０２５４】
図３７の膜を採用する装置は、１ないし複数の標識検出抗体と固定化捕捉抗体ラインにある捕捉抗体を利用する。いくつかの標識検出器が採用されるとき、交叉反応を妨害するのを避けるよう注意を払わねばならない。抗体を特異的な分析体と反応するように１つ以上の検出領域を配列するのが最善であり、これについては別の図で以下において説明される。
【０２５５】
本発明の装置は、上記したような変形を利用するビオチン／アビジン反応を採用するのに用いられる。装置に応用される現在好ましい変形において、ビオチン標識抗体および金標識抗体が検出領域３に移動的に設置される、そこではそれらの各々が分析体の異なったエピトープと反応し、ビオチン標識抗体／分析体／金標識抗体の三元からなる複合体を生成し、それは毛管作用によって、捕捉チャンネル領域６へ、またそこを通って、移動し、そこでアビジンまたはストレプトアビジンと反応し検出し得る反応産物に濃縮し生成する。
【０２５６】
もちろん、本発明で採用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。同様に、ビオチン／アビジン反応の等価物も採用することができる。ここにあげたすべての試薬は、等価物と交換でき、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【０２５７】
当業者は、全血から赤血球と血漿をクロマトグラフ的に分離するどのような多孔性物質も本発明において採用し得ることは、認識するであろう。しかし、ニトロセルロースは、適度の値段で容易に手に入るので好ましい。ニトロセルロースはクロマトグラフィおよび関連分野で長年採用されてきたので、科学者および技術者にはその性質はよく知られている。市販のニトロセルロースシートはチャンネルのどのような選択された配置を有するどのような選択された形にも容易に形成することができる。
【０２５８】
本発明のニトロセルロース膜は膜内に毛管作用を与える種々のサイズおよび寸法の複数の内部連結したミクロポアを有するスポンジ様のものとして特徴づけられる。これにより、検査中の生物試料が選択された経路に沿って移動することができる。
【０２５９】
本発明の実施において赤血球から血漿の分離には、種々の装置の領域、配置、寸法が、液体試料が前もって設計された経路を移動するので、前もって選択された領域において所望の反応が起こるように選択される。全血の心臓診断には、これらの領域が、赤血球の流れおよび血漿の流れの先端の相対的速度、所望の反応の動力学、それぞれのエピトープに対する抗体の親和性、およびその他を基礎にして選択される。これらは、当業者に公知であり、または通常の試験処置によって容易に決定される。
【０２６０】
図３７は、３つの分析体に使用するために３つの液体経路を有する多孔膜の配置を示したが、３つの捕捉領域を有する一つの液体経路のものを、また提供され、上記したように、これも好ましい。
【０２６１】
本発明の１つの利点は、１，２または３抗原を測定しようとするときに同じ寸法であることである。もちろん、多孔担体層１は夫々の場合において異なって設計される。しかし、頂上層１６は、異なって設計された担体層１に会わせるのに、いかなる変化も必要ない。
【０２６２】
以上、液体試料中の成分を検出する、例えば心臓の分析体を全血、血清または血漿で、抗原／抗体反応により、酵素または直接標識で、競合またはサンドイッチアッセイを行う場合の装置および方法について記載した。本発明の装置では反応体は、支持体および膜の異なった面で連続的に相互連結したチャンネルによって形成される経路にそって、移動する。
【０２６３】
前記は、検出領域３に沈殿した移動性の１ないしそれ以上の抗体について示したが、検出抗体の別の配置や他の試薬は本発明に含まれる。検出抗体は、例えば、凍結乾燥ビーズ、例えば１つの大きなビーズ、または多数の小ビーズの形であり、ビーズが液に溶解するように膜の上流の流体経路内におかれるように、提供される。
【０２６４】
ビーズは試料輸送チャンネル、試料循環チャンネルまたはその接合点に備えられ、小空洞が試料輸送チャンネル内に、または試料輸送チャンネル１８と試料循環チャンネル１９の間の接合部に、材料を保持して備えつけられる。別の実施態様では、抗体はチャンネル内に凍結乾燥形態でおかれる。上に記載したように、他の試薬、例えば妨害物質を除く試薬が提供される。更に、１つ以上のアッセイを行なうための膜に１つ以上の液体経路を有する装置で、通常のアッセイに使われる試薬は膜の前の液体経路に備えられ、各アッセイに特異的な試薬が、上記したように、膜の特別な検出領域に備えられる。これらの種々の配置は本発明に包含される。
【０２６５】
種々のニトロセルローズ材料が種々のセルサイズで得られるが、現時点で好適な孔サイズの担体は、もしフィルターとして使用するなら、膜の水平面に垂直に流れる液体から粒子を濾過するもので、３から１２μmより大きな粒子の通過を防止するものである。本発明の実施においては、粒径が約５から１２μm、好ましくは３ないし８μm、の膜が好ましい。いくつかの変形が可能である。しかし、粒子径が減じると、膜内の液の移動も減少し、それで診断に要する時間が増加する。もし粒径が余りにも大きいと、時間経過は減少するが、反応剤が診断反応がおこるに充分な時間、互いに接触せず、あるいはそのような限度がおこると所望の情報が得られない。
【０２６６】
ポリエステルまたは他のフィルムで支持されているニトロセルローズ膜は市販されている。これらは本発明での使用に好ましい。なぜなら支持のない膜は大変こわれやすい傾向があり、破損に敏感で大量生産環境で使用することは難しい。更に、フィルムは流体の流れには不浸透性であり、本発明の装置の選択された経路を通る流体試料の流れを妨害しない。そのような膜は種々の孔サイズのものが市販されており、Gerbermembrene,  Gerberhausen、ドイツから購入できる。
【０２６７】
本発明で使用される抗体は標準技術で調製し得る。例えばFalfre,  Howe,  Milstein  et  al.  Nature,  Vol.  266,7,  550-552,  1977,  ４月を参照。モノクローナル抗体の調製についての関連する開示は、ここに参照することによって取り入れられる。
【０２６８】
抗体を基質例えばニトロセルローズに固定する方法は公知であり、本発明の装置の製造において使用し得る。ニトロセルローズはタンパク質の強い結合剤である。それ故、固定化捕捉抗体は、前以て決められた領域に捕捉領域を適用するだけでよい。標識検出抗体は膜に、ウシ血清アルブミンのような別のタンパク質で検出領域を先ず飽和することによって膜に移動性に固定化される。検出抗体の別の場所については上記した。図３８Ａー３８Ｂに描写したように、空洞１００は試料輸送チャンネルと試料循環チャンネルの間の接合部にビーズまたは他の型の試薬、例えば装置のこの領域を通過するときに分析体に対する液体に溶解される凍結乾燥標識検出抗体を含有して提供される。液体はこの試薬を溶解し、運搬して窓４３に見えるように入り、試験が完了したことを示す。
【０２６９】
図３９に示す他の実施態様において、位置１００における検出抗体は試料輸送チャンネル中に存在する。図４０Ａー４０Ｂおよび４１Ａー４１Ｂは、試薬を乾燥またはビーズの形、特に、くぼみの型で含む空洞を含む装置のデザインの変形を示す。上記に述べたように、液体経路に備えられた試薬は、標識検出抗体および試験を行なうに必要な他の試薬、例えば試料中に存在する妨害物質を除去するに必要な試薬を含んでもよい。試薬は必要により膜上および液体経路中に備えられる。当業者には選択された分析体に適する分析が行なえるよう種々の組合せがあろう。アッセイに使用される試料が全血のときには、赤血球の血漿からの分離が要求され、装置に供給される試薬は試料の赤血球の溶解を起し、分離させるものであってはならない。
【０２７０】
本発明の装置は、公知のよく知られた技術により容易に製造し得る。
【０２７１】
上記したように、他のアッセイ処理が本発明およびその開示された変型の装置を使用して実行され得る。これは、定量および定性アッセイの両者、イムノアッセイと非イムノアッセイフォーマットの両者を含む。酵素を基本としたアッセイ、例えばグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼとの組合わせを使って全血中のグルコースの定量で、適当な試薬および色原体を用い、試料のグルコースレベルに比例して呈色する方法は、本発明の装置を使用して操作することにより実施できる。当業者は、本発明の装置に対するその他のアッセイフォーマットの適応性を認識するであろう。
【０２７２】
次に実施例を示すが、説明のためのみであって、これに限定するものではない。
【０２７３】
実施例１
全血ＣＫ-ＭＢ試験
１Ａ）ポリエステル支持硝酸セルロース膜（３μｍ公称孔径、Ｇｅｒｂｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｂｅｒｓｈａｕｓｅｎ、ドイツ）、図４に示した輪郭、をＰａｉｎｔＭａｒｋｅｒ７５１ｙｅｌｌｏｗ（ＥｄｄｉｎｇＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で線を引いた。捕捉ラインを１３ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン水溶液で調製した（ストレプトアビジン、ポリ、ＭｉｃｒｏｃｏａｔＧｍｂＨ，Ｂｅｎｒｉｅｄ、ドイツ）。対照ラインは、４％（ｗ／ｖ）ショ糖（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＧｍｂＨ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）溶液８０μｌ、水１０μｌおよび組換えＣＫ−ＭＢ（ＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）１ｍｇ／ｍｌ溶液１０μｌを含有する溶液で調製した。乾燥した後、膜を最終濃度：０．０６％（ｗ／ｗ）オクチル−β−Ｄ−グルコ−ピラノシド（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｅＡＧ，Ｂｕｃｈｓ、スイス）、１：３０希釈カゼイン−Ｂｉｎｄｅｍｉｔｔｅｌ（Ｈ．Ｓｃｈｍｉｎｅｋｅ＆Ｃｏ．，Ｅｒｋｒａｔｈ、ドイツ）および３０ｍＭ１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＧｍｂＨ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）、最終ｐＨ６．２、を含有するブロッキング溶液で含侵した。乾燥後、金共役溶液２．７μｌおよびビオチン化抗体溶液２μｌを適用し、そして膜を再び乾燥した。金共役溶液およびビオチン化抗体溶液２μｌを適用し、膜を再び乾燥した。上記金共役溶液は、抗体５ＣＫ−ＭＢ−６[ＯＤ（５２０ｎｍ）１０で、ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ製造、ＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，トロントより購入]２２μｇ／ｍｌを負荷した４０ｎｍ金ゾルより作られた。この金共役（ＯＤ１０）４５μｌに、水４５μｌおよびＣｒｏｔｅｉｎＣ（ＣｒｏｄａＣｈｅｍｉｃａｌｓＬｔｄ．，ＵＫ）の２．５％（ｗ／ｖ）水溶液１０μｌを加えそして混合した。ビオチン化抗体溶液は、抗体ＩｒＣＫＭＢ−２８（ＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）で、調製し、記載されているように、水５７μｌに、ＣｒｏｔｅｉｎＣの６％（ｗ／ｖ）水溶液２０μｌおよびビオチン化抗体溶液２ｍｇ／ｍｌ保存溶液３μｌを加えそして混合した。
【０２７４】
１Ｂ）比較のため、ビオチン化抗体溶液を含まない以外は１Ａ）と同様に調製し、そしてストレプトアビジン捕捉ラインの代りに抗体捕捉ラインを抗体ＩｒＣＫＭＢ−２８（ＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）で１３ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。
【０２７５】
ヘパリン化全血にｒＣＫＭＢを指示濃度に加え、２８μｌを試験に使用した。結果（６−７分以内）は以下の通りである：
2002522767.tif 000001
全ての対照線は陽性である。
【０２７６】
実施例２
半円形と矩形のＣＫ−ＭＢ比較試験
概念の有用性を明らかにするため、半円形領域（円形セグメント）（図４および５）での試料流入を矩形配置、即ち３側面（図９および１０）、における試料流入と比較した。試験領域（輪郭線領域）は両者において、同じである。輪郭線形および血液流入方向の外に、その他の全ての手順は実施例１Ａ）と同じである。
2002522767.tif 000002
【０２７７】
実施例３
半円形領域−３分析物−１検出領域
実施例１Ｂ）におけると同様の試験を用意した、ただしＣＫＭＢ抗体捕捉ラインに加えて、ＴＮＩ抗体捕捉ラインおよびミオグロビン抗体捕捉ラインがある。
ＴＮＩ捕捉：１３ｍｇ／ｍｌポリクローナルヤギＴＮＩ
ＣＫＭＢ捕捉：１３ｍｇ／ｍｌＩｒＣＫＭＢ−２８
ミオグロビン捕捉：１３ｍｇ／ｍｌポリクローナルウサギミオグロビン
全ての抗体はＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏから購入した。
３分析物の金共役物はＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌＩｎｔｅｒｎ．，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫから購入した。
ＴＮＩ−金−ａ：８μｇ／ｍｌ８Ｉ−７抗体に４０ｎｍ金ゾルを負荷（ＯＤ１０）
ＴＮＩ−金−ｂ：１６μｇ／ｍｌ２Ｉ−１４抗体に４０ｎｍ金ゾルを負荷（ＯＤ１０）
ミオグロビン−金：９０μｇ／ｍｌ２Ｍｂ−２９５抗体に１５ｎｍ金ゾルを負荷（ＯＤ１０）
ＣＫＭＢ−金：２２μｇ／ｍｌ５ＣＫＭＢ−６に４０ｎｍ金ゾルを負荷（ＯＤ１０）
全ての抗体はＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏから購入した。
ＴＮＩ−金共役溶液は：ＯＤ３３で１５μｌＴＮＩ−金―ａを、ＯＤ３３で３０μｌＴＮＩ−金―ｂを、４５μｌ水およびＣｒｏｔｅｉｎＣ２．５％（ｗ／ｖ）水溶液１０μｌを含む。この溶液２．７μｌを試験領域に適用した。
ＣＫＭＢ／ミオグロビン金共役体は：ＯＤ３３でＣＫＭＢ−金４８μｌ、ＯＤ６でミオグロビン−金２５μｌ、１７μｌ水およびＣｒｏｔｅｉｎＣ２．５％水溶液１０μｌを含む。この溶液２μｌを試験領域に適用した。
【０２７８】
ヘパリン化全血をｒＣＫＭＢ、ＴＮＩおよびミオグロビンで指示された濃度に加え、２８μｌを試験に使用した。結果は以下の通りである：
2002522767.tif 000003
痕跡：健常人からの非添加血液でも微量のミオグロビンを含み得る。
【０２７９】
実施例４
半円形領域−３分析物−３検出領域
１以上の高感度分析体用に、図１１の輪郭を用いた。捕捉ラインは実施例１Ａ（ブロック処理のように）におけるようにストレプトアビジン（１３ｍｇ／ｍｌ）で調製した。この例では、輪郭線はＰａｉｎｔＭａｒｋｅｒ７８０白（ＥｄｄｉｎｇＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）で描いた。
【０２８０】
全ての金ゾル−共役体はＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫにより調製した。全ての抗体はＳｐｅｃｔｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏから購入した。
ＴＮＩ−金共役溶液：以下の溶液を混合した。
ＯＤ５５の金共役Ａ（ＯＤ１０で、抗体８Ｉ−７の１８μｇ／ｍｌを負荷した５０ｎｍ金ゾル）１８μｌ、ＯＤ５５の金共役Ｂ（ＯＤ１０で、抗体２Ｉ−１４の１０μｇ／ｍｌを負荷した６０ｎｍ金ゾル）３６μｌ、水３６μｌおよび２．５％（ｗ／ｖ）ＣｒｏｔｅｉｎＣ水溶液１．８μｌを試験領域に適用した。
ビオチン化ＴＮＩ−抗体：以下の用益を混合した：水６７μｌ、６％（ｗ／ｖ）ＣｒｏｔｅｉｎＣ水溶液２５μｌ、１ｍｇ／ｍｌビオチン化ヤギＴＮＩ抗体の保存溶液３．５μｌおよびＣｈｒｏｍＰｕｒｅヤギＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）の２７．６ｍｇ／ｍｌ溶液５μｌ。この溶液２．１μｌを試験領域に適用した。
ＣＫＭＢ−金共役体：保存溶液のＯＤが３３であることを除いて、他は実施例１Ａ）と同様に行い、混合物の１．１μｌを適用した。
ビオチン化ＣＫＭＢ−抗体：１．４μｌを適用した以外は、実施例１Ａ）と同様に行った。
ミオグロビン−金共役体：以下の溶液を混合した：ＯＤ６の金共役体１７μｌ（ＯＤ１０で、抗体２Ｍｂ−２９５の９０μｌを１５ｎｍ金ゾルに負荷）、水７３μｌおよびＣｒｏｔｅｉｎＣ２．５％（ｗ／ｖ）水溶液１０μｌ。この混合物０．８μｌを試験に供した。
ビオチン化ミオグロビン−抗体：以下の溶液を混合した：水４５μｌ、ＣｒｏｔｅｉｎＣの６％（ｗ／ｖ）水溶液２５μｌ、およびビオチン化ウサギ抗体の１ｍｇ／ｍｌ保存溶液３０μｌ。この混合物０．５μｌを試験に供した。
【０２８１】
ヘパリン化全血をｒＣＫＭＢ、ＴＮＩおよびミオグロビンを指示した濃度に加え、７０μｌを試験に使用した。結果（１０ないし１２分以内）は以下の通りである：
2002522767.tif 000004
【０２８２】
本発明は、ここに記載し示した例示に限定されるものでないことは理解されるべきである。それらは、単に本発明を実行するためのベストモードの例示であり、そして本発明の精神または範囲から離れることなしに、形、サイズ、部品の配列および操作の詳細の変形は可能である。本発明は、むしろ、請求項の精神および範囲内である全てのそのような変形を包含することを意図しているものである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
【図２】
【図３】
図１、２および３は、先行技術の提示である。図１および２は、標識された容量を増大させた、または、補足領域にわたる検出領域の巾の比率を増大せしめた試みの配置をそれぞれ示す。図３は、多孔担体、即ち膜、の巾がその長さにわたって均一である通常の標準配置である。
【図４】
図４は、１つの半円形検出領域および１つの狭い補足領域チャンネルの１ないし数個の分析体を検出するに適した、本発明の装置の膜配置を示す。半円形検出領域の境界は試料円形チャンネルにつながっている。
【図５】
図５は、図４の膜の使用に適した本発明の装置の頂上層の低い面の配置を示す。
【図６】
【図７】
【図８】
図６、７および８は、図５のＡ−Ａ、Ｂ−ＢおよびＣ−Ｃ線に沿った断面図である。
【図９】
図９は、１つの矩形検出領域および１つの狭い補足領域チャンネルを有する１または数個の分析物を検出するための、本発明の装置の膜配置を示す。
【図１０】
図１０は、図９の膜の使用に適した本発明の装置の頂上層の低い面の配置を示す。
【図１１】
図１１は、ビオチン／ストレプトアビジン経路を経由する３つの異なった分析体の検出のために適した本発明の現在好適な膜の配置である。
【図１２】
【図１３】
図１２および１３は、それぞれ、１ないし３つの液体経路を有する別の多孔膜の配置を示す。
【図１４】
図１４は、２つの経路および頂上層にアーチ型円形チャンネルを有する本発明の実施態様を示す。
【図１５】
図１５は、本発明の装置の斜視図である。
【図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ】
図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、図１１の配置の、頂上膜、支持膜および多孔担体を有する本発明の装置の分解図を示す。
【図１７Ａ−Ｄ】
図１７Ａ−Ｄは、図１５および１６Ａ−Ｃに示したのとは異なった試料循環チャンネルを有する本発明の装置を示す。
【図１８】
図１８は、１つの半円形検出領域および１つの狭い補足領域チャンネルの１ないし数個の分析体を検出するに適した、本発明の装置において使用する膜配置を示す。半円形検出領域の境界は試料円形チャンネルにつながっている。
【図１９Ａ−Ｂ】
図１９Ａ−Ｂは、図１８の膜の使用に適した本発明の装置の、それぞれ、頂上層の低い面および底面の頂上面の配置を示す。横断線Ａ−Ａ、Ｂ−Ｂ、Ｃ−ＣおよびＤ−Ｄは、組み立てた装置の断面図を表す、以下の図において示される。
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
図２０−２３は、図１９Ａの、それぞれ、Ａ−Ａ、Ｂ−Ｂ、Ｃ−ＣおよびＤ−Ｄにそった断面図を表す。断面にハッチングをつけた頂上部分は、装置の頂上層の横断部分を示し、空白の下面部分は底面の横断面部分を示す。
【図２４】
図２４は、１つの矩形検出領域および１つの狭い補足領域チャンネルを有する１または数個の分析物を検出するための、本発明の装置の膜配置を示す。
【図２５】
図２５は、ビオチン／ストレプトアビジン経路を経由する３つの異なった分析体の検出のために適した本発明の現在好適な膜の配置である。
【図２６】
【図２７】
図２６および２７は、それぞれ、１ないし３つの液体経路を有する別の多孔膜の配置を示す。
【図２８Ａ−Ｂ】
図２８Ａ−Ｂは、チャンネルが一杯であることを示す窓つきの前もって決められた容量の試料輸送チャンネルを含む本発明の装置の頂上層の底面の配置、および試料輸送チャンネルから試料循環チャンネルへの液体をつなぐ構造を示す。横断線Ｅ−Ｅの装置の頂上層の横断面は図２８Ｂに示す。
【図２９】
図２９は、本発明の装置の斜視図である。
【図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ】
図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、図２５の配置の、頂上膜、支持膜および多孔担体を有する本発明の装置の分解図を示す。
【図３１】
図３１は、１つの半円形検出領域および１つの狭い補足領域チャンネルの１ないし数個の分析体を検出するに適した、本発明の装置において使用する膜配置を示す。半円形検出領域の境界は試料円形チャンネルにつながっている。
【図３２】
【図３３】
【図３４】
図３２−３４は、本発明の装置の実施例の配置、および膜ホルダー、底部部品、頂上部品、および試料輸送チャンネルカバーを含む、その構成部品を示す。
【図３５】
【図３６】
図３５−３６は、断面図を含む、本発明の装置の実施例の分解図を示す。
【図３７】
図３７は、３つの液体の経路と共に、ビオチン／ストレプトアビジン経路を経由する３つの異なった分析体の検出のために適した本発明の膜の配置を示す。
【図３８】
【図３９】
【図４０】
図３８−４０は、試料輸送チャンネルに中に蓄積されたテスト試薬を有する本発明の装置を描いたものである。
【符号の説明】
１    多孔担体（膜）
２    領域
３    検出領域
４    検出抗体
５    抗（標識）
６    捕捉領域チャンネル
７    捕捉領域（捕捉抗体）
８    フローバリアー手段
１１    境界
１２    閉鎖端
１３    赤血球先端
１４    血漿先端
１５    産物
１６    頂上層
１７    開口部（貫通孔）
１８    チャンネル
１９    チャンネル
２０    端
２１    内壁
２２    外壁
２３    毛管トラップ
２４    検出領域
２５    検出領域
２６    検出領域
２７ａ、２７ｂ、２７ｃ    捕捉領域チャンネル
２８    支持層
２９    裏打ち層
３０    上表面
３１    底表面
３３    領域（毛管トラップ）
３４    ピン
３６    窓
３７    窓
３８    窓
３９    窓
５０    検出領域
５１    検出領域
５２    検出領域
５３    点線構造
１００    空洞