【事件の表示】
　特願２００３−６７４５５「イヌリン定量法および定量試薬」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年１０月７日出願公開、特開２００４−２７５０１７〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成１５年３月１３日の出願であって、以降の手続の経緯は以下のとおりのものである。
　
　平成２０年　９月　３日付け　　拒絶理由通知
　平成２０年１１月　７日付け　　意見書・手続補正書
　平成２１年　１月１４日付け　　拒絶理由通知（最後）
　平成２１年　３月１９日付け　　意見書・手続補正書
　平成２１年　５月１４日付け　　拒絶査定
　平成２１年　５月１４日付け　　平成２１年３月１９日付け手続補正書の
　　　　　　　　　　　　　　　　補正の却下の決定
　平成２１年　８月１８日付け　　審判請求書
　　　　　　　　　　同日付け　　手続補正書
　平成２１年１０月２７日付け　　手続補正書（方式）
　平成２１年１１月１６日付け　　前置報告書
　平成２４年　１月１８日付け　　審尋
　平成２４年　３月２３日付け　　回答書
　
第２　本願発明
　本願の請求項１〜１２に係る発明は、「第１　手続の経緯」のとおり、平成２１年３月１９日付け手続補正書は却下されたので、平成２０年１１月７日付け手続補正書の請求項１、２、９、及び１０の「エキソキナーゼ」を「エキソイヌリナーゼ」と誤記の訂正を目的とする、平成２１年８月１８日の手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１〜１２に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ、その請求項１に係る発明は以下のとおりのものである。
　
「【請求項１】
　平均分子量２０００〜７０００のイヌリンをイヌリン分解酵素を用いてフルクトースに分解する工程を含み、さらにそれに続いて、得られたフルクトースを測定する工程を含む、イヌリンの定量法であって、当該イヌリン分解酵素が分離精製されたエキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを含み、および当該イヌリンをフルクトースに分解する工程における反応液中のイヌリン分解酵素の、（ｉ）エキソイヌリナーゼ活性が１５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であるか、（ｉｉ）エキソイヌリナーゼ活性が５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であり、かつエンドイヌリナーゼ活性が０．５Ｕ／ｍＬ以上１０Ｕ／ｍＬ以下であるか、または（ｉｉｉ）エキソイヌリナーゼ活性が２．５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であり、かつエンドイヌリナーゼ活性が１．５Ｕ／ｍＬ以上１０Ｕ／ｍＬ以下であるイヌリンの定量法。」（以下、「本願発明」という。）
　
第３　引用例の記載事項及び引用発明
１　原査定に引用された本出願前である２０００年に頒布された刊行物である「ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＯＡＣ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２，ｐ．３５６〜３６４」（原査定の引用文献１。以下、「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている。なお、引用例１は英文のため引用例１の記載事項は翻訳文で示す。以下、下線は当審で付した。
　
（１ａ）「食品成分及び添加物
酵素／分光光度法による
食品中の総フルクタン量の測定
　
（１ｂ）「
ＡＯＡＣのコラボラティブスタディは混合材料及び食品中のオリゴフルクタン及びフルクタンポリサッカライド（イヌリン）を測定するための酵素分析キット手法の正確さ及び信頼度を評価するために行なわれた
フルクタンは、精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼ混合物（フルクタナーゼ混合物）を使用してフルクトース及びグルコースに加水分解される。産生された還元糖（フルクトース及びグルコース）は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドとの反応後に分光光度計で測定される
　
（１ｃ）「
コラボラティブスタディ
　
チョコレート（Ａ，Ｍ）、粉乳（Ｂ，Ｆ）、ビタミン剤（Ｃ，Ｅ）、麦の穂（Ｉ，Ｌ）、スクロース／セルロース（Ｋ，Ｑ）、低脂肪スプレッド（Ｓ，Ｔ）、玉ねぎ粉末（Ｄ，Ｏ）、フルクタンコントロール（Ｇ，Ｒ）、純粋なフルクタン（Ｈ，Ｐ）、及びキクイモ（Ｊ，Ｎ）の１０の（コード化された）均質な試験サンプル（フルクタンを含む、あるいは、それにフルクタンは追加として加えられる）が、１５人の共同研究者に２０のブラインド複製物として提供された
　
（１ｄ）「Ａ．原則
　サンプルはフルクタンを溶かすために熱湯で抽出される。抽出物のアリコートは、スクロースをグルコース及びフルクトースへ加水分解するために特定のスクラーゼで、そしてデンプンをグルコースへ加水分解するために純粋なデンプン分解酵素の混合物で処理される。その後、還元糖はすべてアルカリホウ素水素化物との処理によって糖アルコールに還元される。その溶液は中和され、過剰のホウ素水素化物は稀酢酸で除去される。
その後、フルクタンは、精製フルクタナーゼ（ｅｘｏ−イヌリナーゼとｅｎｄｏ−イヌリナーゼ）でフルクトース及びグルコースに加水分解され
　Ｂ．装置
　・・・
　（ｍ）ガラス試験管。−１６×１２０ｍｍ、丸底、１７ｍＬ容量。
　・・・
　
Ｃ．試薬
　
すべての試薬は分析的精製等級であるべきである
　（ａ）マレイン酸ナトリウム緩衝液。−１００ｍＭ、ｐＨ６．５。９００ｍＬの蒸留水中に１１．６ｇのマレイン酸を溶かし、２ＭのＮａＯＨ溶液で６．５にｐＨを調節する。容量フラスコ中で１Ｌに容量を調節する。４℃で緩衝液を貯蔵する。
　（ｂ）酢酸ナトリウム緩衝液。−１００ｍＭ、ｐＨ４．５。９００ｍＬの蒸留水に５．８ｍＬの氷酢酸（１．０５ｇ／ｍＬ）をピペットで移す。１ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨ４．５に調節する。水で１Ｌに希釈する。４℃で貯蔵する。
　（ｃ）ＰＡＨＢＡＨ還元糖分析試薬。−（１）溶液Ａ。−電磁撹拌機上の２５０ｍＬビーカー中の６０ｍＬの水に１０ｇのＰＡＨＢＡＨ（例えばＳｉｇｍａ　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　Ｈ−９８８２、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）を加える。スラリーを撹拌し、１０ｍＬの濃ＨＣｌを加える。蒸留水で２００ｍＬに調節し、室温（約２２℃）で貯蔵する。少なくとも２年間安定している。（２）溶液Ｂ。−５００ｍＬの蒸留水に２４．９ｇのクエン酸三ナトリウム塩を加え、溶かすためにかき混ぜる。２．２０ｇの塩化カルシウム二水和物を加え、攪拌して溶かす。次に、４０．０ｇのＮａＯＨを加え、攪拌して溶かす。（溶液は白濁しているかもしれないが、稀釈すると透明になる）。２Ｌに容量を調節する。その溶液は室温（約２２℃）で少なくとも２年間安定している。（３）ＰＡＨＢＡＨ作動試薬。−使用直前に、１８０ｍＬの溶液Ｂに２０ｍＬの溶液Ａを加え、徹底的に混合する。この溶液は氷上に貯蔵されるべきで、約４時間安定している。
　（ｄ）水酸化ナトリウム（５０ｍＭ）。−９００ｍＬの蒸留水中に２．０ｇのＮａＯＨを溶かす。１Ｌに容量を調節する。室温（約２２℃）で貯蔵する。
　（ｅ）アルカリホウ素水素化物（５０ｍＭのＮａＯＨ中の１０ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム）。−正確にポリプロピレン容器（ねじ蓋を備えた１０ｍＬ容量）へ５０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　Ｓ−９１２５）を採る。チューブの重量（利便性のため約１０）を記録し、チューブを密閉し、今後使用できるようにデシケーターでそれらを貯蔵する。使用直前に、５０ｍＭのＮａＯＨ溶液［試薬Ｃ（ｄ）］で水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ／ｍＬ）を溶かす。この溶液は室温で４〜５時間安定である。
　（ｆ）酢酸（１００ｍＭ）。−蒸留水に５．８ｍＬの氷酢酸を加え、１Ｌに容量を調節する。室温（約２２℃）で貯蔵する。
　（ｇ）スクラーゼ／アミラーゼ製剤。−２．２７ユニット（Ｕ）スクラーゼ／ｍＬ。２２ｍＬのマレイン酸ナトリウム緩衝液Ｃ（ａ）中のスクラーゼ（５０Ｕ）と、β−アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、５００Ｕ）、プルラナーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、１００Ｕ）及びマルターゼ（酵母、１０００Ｕ、凍結乾燥した粉体として）を含む１バイアルの内容物を溶かす。５ｍＬのアリコート中へ酵素溶液を分配し、微生物汚染を防ぐためポリプロピレン容器中で冷凍貯蔵する。もし緩衝液中で希釈されなければ、−２０℃で貯蔵された場合、凍結乾燥された酵素は５年間安定である。１ユニットのスクラーゼ活性は、ｐＨ６．５及び４０℃でスクロースから１μｍｏｌｅのグルコース／分を放出するのに必要な酵素の量である。
　（ｈ）フルクタナーゼ溶液。−
３５０Ｕ／ｍＬのｅｘｏ−イヌリナーゼ及び３５Ｕ／ｍＬのｅｎｄｏ−イヌリナーゼ
　（ｉ）フルクタンコントロール細粉。−α−セルロース存在下で凍結乾燥されたダリアフルクタンの既知量を含む。室温で乾燥して貯蔵された場合安定している。
　（ｊ）スクロースコントロール細粉。−α−セルロース存在下で凍結乾燥されたスクロース。室温（約２２℃）で乾燥して貯蔵された場合安定している。
　（ｋ）Ｄ−フルクトース標準貯蔵溶液。−０．２％安息香酸中の１．５ｍｇ／ｍＬ。溶液を調製する前に真空下の６０℃で１６時間乾燥した粉末結晶のフラクトース（純度＞９７％）。」（３５７頁右欄９行〜３５９頁左欄３行）
　
（１ｅ）「Ｄ．試験サンプル、標準、試薬ブランク及びスクロースコントロール粉末の準備
　（ａ）試験サンプル。
　・・・
　（ｂ）フルクトース標準作動溶液。−０．９ｍＬの酢酸緩衝溶液、Ｃ（ｂ）に０．２ｍＬのフルクトース標準貯蔵溶液［１．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃ（ｋ）］を加え、徹底的に混合する。４通りで４本のガラス試験管、Ｂ（ｍ）の底にこの溶液（５４．５μｇのフルクトースを含む）の０．２ｍＬのアリコートを分配する。各チューブに、０．１ｍＬの酢酸緩衝溶液、Ｃ（ｂ）を加える。熱湯浴中のインキュベーションの直前に、５．０ｍＬのＰＡＨＢＡＨ作動試薬、Ｃ（ｃ）を加える。
　（ｃ）試薬ブランク。−試験管へ０．３ｍＬの酢酸緩衝溶液、Ｃ（ｂ）を移し、Ｅ（ｃ）（３）からの標準分析手順へ進む。
　（ｄ）約１０％のスクロースを含むスクロースコントロール粉末。
　・・・
　
Ｅ．サンプルの総フルクタン量の決定
　（ａ）フルクタンの抽出。
・・・
　（ｂ）スクロース、デンプン及び還元糖の除去。−（１）２本のガラス試験管Ｂ（ｍ）の底に、０．２ｍＬの分析される濾液（約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬのフルクタン、あるいはコントロールを含む）を移す。
　（２）各チューブへ０．２ｍＬの希釈スクラーゼ／アミラーゼ溶液、Ｃ（ｇ）を加え、３０分間４０℃でインキュベートする。
　（３）各チューブへ０．２ｍＬのアルカリホウ素水素化物溶液、Ｃ（ｅ）を加える。チューブを勢いよく撹拌し、糖アルコールへの還元糖の完全な還元のために３０分間４０℃でインキュベートする。
　（４）ボルテックスミキサー上で勢いよく撹拌しながら各チューブに、０．５ｍＬの酢酸（１００ｍＭ）、Ｃ（ｆ）を加える。ホウ素水素化物が新しければ、活発な沸騰が観察される。そうでなければ、ホウ素水素化物に問題があり、分析は新鮮なホウ素水素化物で繰り返されなければならない。（この処理物は過剰のホウ素水素化物を除去し、約４．５にｐＨを適合させる）。これは溶液Ａと名付けられる。
　（ｃ）
フルクタンの加水分解
ガラス試験管、Ｂ（ｍ）の底に、０．２ｍＬのアリコート溶液Ａ（２通り）を移す
　（２）
各試験管に、０．１ｍＬのフルクタナーゼ溶液、Ｃ（ｈ）を加え
フルクトース及びグルコースへのフルクタンの完全な加水分解のために２０分間４０℃でチューブをインキュベートする
　（３）フルクトース標準作動溶液、Ｄ（ｂ）、試薬ブランク、Ｄ（ｃ）、及びフルクタンコントロールサンプルの抽出物、Ｃ（ｉ）、及びスクロースコントロールサンプル、Ｃ（ｊ）を含むすべてのチューブの内容物をＰＡＨＢＡＨ作動試薬（５．０ｍＬ）で処理し、ちょうど６分間熱湯浴中でインキュベートする。
　（４）熱湯浴からチューブをすべて取り除き、直ちに冷水（１８〜２０℃）中に約５分おく。
　（５）冷却後のできるだけ早くに試薬ブランクと対照して４１０ｎｍですべての溶液の吸光度を測定する。ＰＡＨＢＡＨ色複合体は時間とともに衰退する。室温で、僅かな変化（＜５％）が１０〜１５分間で見られる。同じ変化は標準溶液で見られる。」（３５９頁左欄９行〜３６０頁左欄最下行）
　
（１ｆ）「さらに、現在の手順で、
高度に精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼの混合物が使用される。これらはα−ガラクトシダーゼを取り除くためにクロマトグラフィーで精製され、著しくペクチナーゼ及びβ−グルカナーゼ（セルラーゼ）を減少する
フルクタナーゼ製剤中のペクチナーゼ及び／又はβ−グルカナーゼの重要なレベルの存在（商用Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ
Ｒ
製剤、Ｎｏｖｏｚｙｍ　ＳＰ　２３０
Ｒ
、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ、ＳＡ、フランス）は、フルクタンの測定及びＡＯＡＣの総食物繊維方法の統合方法における製剤の使用を妨げる。ペクチナーゼは、熱処理（７）によって効果的に除去できるが、β−グルカナーゼの除去はクロマトグラフィー精製（６）を要求する
現在の手順の中で使用した精製フルクタナーゼ製剤で、総食物繊維を測定するＡＯＡＣ方法のフルクタン（イヌリン）の決定を統合することは可能である
　
２　原査定に引用された本出願前である平成１５年１月２９日に頒布された刊行物である「特開２００３−２６６１０号公報」（原査定の引用文献２。以下、「引用例２」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（２ａ）「【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、診断薬として有用なイヌリンを含有する安定な医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎疾患患者の症状の進行確認のために行われる糸球体濾過量の測定には、イヌリン製剤が用いられる
　
（２ｂ）「【０００８】
【発明の実施の形態】本発明で用いるイヌリンとしては、現在イヌリンを医薬品として認めている国がごく少数であり、医薬品原料としてのイヌリンが入手困難であるため、
食品用として市販されているイヌリン又はこれを精製して用いることができる
食品用イヌリンは、通常、平均分子量３０００〜７０００であり
　
３　原査定に引用された本出願前である平成１４年４月２３日に頒布された刊行物である「特開２００２−１１９２９８号公報」（原査定の引用文献３。以下、「引用例３」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（３ａ）「【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンを酵素的に分解することにより生成したフルクトースを測定するに際し
　
（３ｂ）「【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、
イヌリンを正確に測定するための方法
　
（３ｃ）「【０００４】
イヌリンクリアランスを測定
イヌリンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色させる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースなど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘されている
【０００５】
そこで、イヌリンを簡便で正確に測定する方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開発されてきた
　
（３ｄ）「【００１４】本発明に使用するイヌリン分解酵素は、イヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限定されない。例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の微生物等から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）などがあり、
市販品ではエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物である「Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ」（ノボ・ノルディスク社製）
反応時の濃度として好ましくは１〜５００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在させるのがより好ましい
　
（３ｅ）「【００２３】実施例１：イヌリン測定（日立７１７０自動分析機への適用）
１．試薬の調製
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
Ｒ１（濃度はＲ１中）
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）　０．０５ｍｏｌ／Ｌ
イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ）　３０単位／ｍＬ
フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績株式会社製ＦＣＤ−３０１）　１００Ｕ／ｍＬ
１−メトキシ−ＰＭＳ　１００ｍｇ／Ｌ
Ｒ２（濃度はＲ２中）
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）　０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＰＥＯ−３０１）　１０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　０．１ｇ／Ｌ
アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ）　１ｇ／Ｌ
ネオペレックスＦ−６５（花王製）　２０ｇ／Ｌ
【００２４】２．試料の調製
イヌリン水溶液は、０，１０，２０，３０，４０，５０ｍｇ／ｄＬの各濃度に調製して用いた。
【００２５】３．測定
日立７１７０自動分析機を使用した。
試料をそれぞれ２．０μＬ添加後すぐＲ１を１８０μＬを添加し混和後３７℃にて５分間静置した後
【００２６】
【数１】
　　　　　　　　　　　　　（試料の吸光度）−（ブランクの吸光度）
イヌリン濃度［ｍｇ／ｄＬ］＝―――――――――――――――――×２０
　　　　　　　　　　　　（基準液の吸光度）−（ブランクの吸光度）
【００２７】４．結果
表１に示す。５０ｍｇ／ｄＬまで
良好な直線性が得られている
　
４　原査定に引用された本出願前である平成１４年５月２１日に頒布された刊行物である「特開２００２−１４２７９８号公報」（原査定の引用文献４。以下、「引用例４」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（４ａ）「【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンを酵素的に分解することにより生成したフルクトースを測定するに際し
　
（４ｂ）「【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、
イヌリンを正確に測定するための方法
　
（４ｃ）「【０００４】
イヌリンクリアランスを測定
イヌリンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色させる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースなど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘されている
【０００５】
そこで、イヌリンを簡便で正確に測定する方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開発されてきた
　
（４ｄ）「【００１４】本発明に使用するイヌリン分解酵素は、イヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限定されない。例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の微生物等から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）などがあり、
市販品としては、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物である「Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ」（ノボ・ノルディスク社製）
濃度についても特に限定はなく、例えば反応時の濃度として１〜５００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在させるのが好ましい
　
（４ｅ）「【００２４】実施例１：イヌリン測定（日立７１７０自動分析機への適用）
１．試薬の調製
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
Ｒ１（濃度はＲ１中）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）　０．０５ｍｏｌ／Ｌ
１−メトキシ−ＰＭＳ　３０ｍｇ／Ｌ
Ｒ２（濃度はＲ２中）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）　０．１５ｍｏｌ／Ｌ
イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ）　６０単位／ｍＬ
フルクトースデヒドロゲナーゼ　２００Ｕ／ｍＬ
テトラゾリウム塩　０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
【００２５】２．試料の調製
イヌリン水溶液を、０，２０，４０，６０，８０，１００ｍｇ／ｄＬの各濃度に調製したものを用いた。
【００２６】３．測定
日立７１７０自動分析機を使用した。試料をそれぞれ６．０μＬ添加後すぐにＲ１を１８０μＬを添加し混和後３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を６０μＬ添加し５分間静置した後の２ポイントエンド法で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランク、基準液（２０ｍｇ／ｄＬ）についても同様に測定し、次の式によりイヌリン濃度を求めた。
【００２７】
【数１】
　　　　　　　　　　　　　（試料の吸光度）−（ブランクの吸光度）
イヌリン濃度［ｍｇ／ｄＬ］＝―――――――――――――――――×２０
　　　　　　　　　　　　（基準液の吸光度）−（ブランクの吸光度）
【００２８】４．結果
表１に示す。１００ｍｇ／ｄＬまで
良好な直線性が得られている
　
５　原査定に引用された本出願前である平成１４年４月２日に頒布された刊行物である「特開２００２−９５４９８号公報」（原査定の引用文献５。以下、「引用例５」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（５ａ）「【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンを酵素的に分解し、生成したフルクトースを測定するイヌリン測定方法
イヌリンを分解する工程にグルコースを基質とする酵素のコンタミネーション率が０．０１％以下である酵素を用いる
　
（５ｂ）「【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、
イヌリンを正確に測定するための方法
　
（５ｃ）「【０００４】
イヌリンクリアランスを測定
【０００５】
イヌリンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色させる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースなど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘されている
【０００６】
そこで、イヌリンを簡便で正確に測定する方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開発されてきた
　・・・
【００１０】
ところが、実用上はこれらの方法においてもグルコースを基質とする酵素のコンタミネーションにより特異性が損なわれる可能性がある
中でもイヌリン分解酵素の場合、体外診断薬用グレードの酵素が市販されていないからといって食品用等のグレードをそのまま用いると問題となり易い
　
（５ｄ）「【００１４】
【発明の実施の形態】本発明のイヌリン測定方法に使用するイヌリン分解酵素は、イヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限定されないが、具体的には、エキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）等が例示される。これらは、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、キリベロマイセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の微生物などより得ることができる。また、
市販のイヌリン分解酵素としては、アスペルギルス属由来のエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物である「Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ」（ノボ・ノルディスク社製）
　
（５ｅ）「【００２１】以下に、イヌリン分解酵素のコンタミネーション率を低減させる事例を示す。
例えば、市販のイヌリン分解酵素としてＦｒｕｃｔｏｚｙｍｅ（ノボ・ノルディスク社製）を選び、それに含まれるグルコースオキシダーゼ含量を測定した。イヌリン分解酵素活性を１００％として０．６％であった
【００２２】
本発明のイヌリン測定方法における精製されたイヌリン分解酵素の濃度については特に限定されないが、例えば、反応時の濃度として１〜５００単位／ｍＬ、さらに好ましくは３〜１５０単位／ｍＬ程度存在させるのがよい
　
（５ｆ）「【００２７】実施例１および比較例１：イヌリンおよびグルコースの測定
１．試薬の調製
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。以下、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ試薬１、試薬２の略号を表す。
Ｒ１（濃度はＲ１中）
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）　０．０５ｍｏｌ／Ｌ
イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）　３０単位／ｍＬ
Ｒ２（濃度はＲ２中）
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）　０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＦＣＤ−３０１）１０　Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　０．１ｇ／Ｌ
アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ）　１ｇ／Ｌ
【００２８】（実施例１）上記Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅを、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）にバッファ置換後、５５℃で２４時間処理を行った。
試薬中におけるグルコースデヒドロゲナーゼのコンタミネーション率は０．００１％
【００２９】（比較例１）上記Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅをそのまま用いた。
試薬中におけるグルコースデヒドロゲナーゼのコンタミネーション率は０．２％
【００３０】試料の調製
精製水（ブランク）
基準液（２０ｍｇ／ｄＬ　イヌリン水溶液）
イヌリン水溶液
グルコース水溶液　２．０ｇ／ｄＬ
【００３１】測定
Ｒ１　２．００ｍＬに試料をそれぞれ０．０６ｍＬ添加し３７℃にて５分間静置した後
【００３２】
【数２】
　　　　　　　　　　　　　（試料の吸光度）−（ブランクの吸光度）
イヌリン濃度［ｍｇ／ｄＬ］＝―――――――――――――――――×２０
　　　　　　　　　　　　（基準液の吸光度）−（ブランクの吸光度）
【００３３】結果
表１に示す。
実施例ではグルコースを測定しても測定値はほぼ０であるが、比較例ではイヌリン濃度が０であるにもかかわらず正の値を示し、グルコースの影響を受けていることがわかる
　
６　引用例１の上記（１ａ）、（１ｂ）によれば、引用例１には、
「食品中のフルクタンを、精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼ混合物（フルクタナーゼ混合物）を使用してフルクトース及びグルコースに加水分解し、産生された還元糖（フルクトース及びグルコース）を、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドとの反応後に分光光度計で測定する、食品中の総フルクタン量の測定方法。」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
第４　対比
　そこで、本願発明と引用発明とを対比する。
　
１　引用発明の「フルクタン」は、「ＡＯＡＣのコラボラティブスタディは混合材料及び食品中のオリゴフルクタン及びフルクタンポリサッカライド（イヌリン）を測定するための酵素分析キット手法の正確さ及び信頼度を評価するために行なわれた。」（上記（１ｂ））、「現在の手順の中で使用した精製フルクタナーゼ製剤で、総食物繊維を測定するＡＯＡＣ方法のフルクタン（イヌリン）の決定を統合することは可能である。」（上記（１ｆ））との記載からも明らかなとおり、イヌリンと同義に用いられている。そして、イヌリンはフルクトースの任意の重合体であることは技術常識である。
　したがって、引用発明の「食品中のフルクタン」と、本願発明の「平均分子量２０００〜７０００のイヌリン」とは、「所定の平均分子量のイヌリン」である点で共通する。
　
２　引用発明の「精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼ混合物（フルクタナーゼ混合物）」は、本願発明の「イヌリン分解酵素が分離精製されたエキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを含」むことからもわかるとおり、「イヌリン分解酵素」といえる。
　したがって、引用発明のフルクタンを、「精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼ混合物（フルクタナーゼ混合物）を使用してフルクトース及びグルコースに加水分解」することは、本願発明のイヌリンを「イヌリン分解酵素を用いてフルクトースに分解する工程を含」むことに相当する。
　
３　引用発明は、食品中のフルクタンの含有量を測定して決定するものであるから、引用発明の測定方法は定量法と同義といえる。
　また、本願発明のフルクトースの測定方法は、本願明細書に段落【００３９】に「以下（１）〜（４）にその事例を示すが、本発明はこの事例に限定されるものではない。」と記載されているように特定の方法に限定されない。
　したがって、引用発明の「産生された還元糖（フルクトース及びグルコース）を、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドとの反応後に分光光度計で測定する、食品中の総フルクタン量の測定方法」は、本願発明の「さらにそれに続いて、得られたフルクトースを測定する工程を含む、イヌリンの定量法」に包含される。
　
４　以上のことから、両者は、以下の一致点、及び相違点１、相違点２を有する。
　
一致点：「所定の平均分子量のイヌリンをイヌリン分解酵素を用いてフルクトースに分解する工程を含み、さらにそれに続いて、得られたフルクトースを測定する工程を含む、イヌリンの定量法。」
　
相違点１：「所定の平均分子量のイヌリン」が、本願発明では、「平均分子量２０００〜７０００のイヌリン」であるのに対し、引用発明では「食品中のフルクタン」であり、分子量の特定がない点。
　
相違点２：「イヌリン分解酵素」が、本願発明では、「分離精製されたエキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを含み」、「当該イヌリンをフルクトースに分解する工程における反応液中のイヌリン分解酵素の、（ｉ）エキソイヌリナーゼ活性が１５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であるか、（ｉｉ）エキソイヌリナーゼ活性が５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であり、かつエンドイヌリナーゼ活性が０．５Ｕ／ｍＬ以上１０Ｕ／ｍＬ以下であるか、または（ｉｉｉ）エキソイヌリナーゼ活性が２．５Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であり、かつエンドイヌリナーゼ活性が１．５Ｕ／ｍＬ以上１０Ｕ／ｍＬ以下である」であるのに対し、引用発明では、「精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼ混合物（フルクタナーゼ混合物）」である点。
　
第５　判断
　そこで、上記相違点１、相違点２について検討する。
　
１　相違点１について
　引用例１は、食品中の総フルクタン（イヌリン）量を測定するための酵素分析キット手法の正確さ及び信頼度を評価することに関し（上記（１ａ）、（１ｂ）参照）、１５の共同研究者によるコラボラティブスタディが、チョコレート、粉乳、ビタミン剤、麦の穂、スクロース／セルロース、低脂肪スプレッド、玉ねぎ粉末、フルクタンコントロール、純粋なフルクタン、及びキクイモについて実施され、これらの試験サンプルは、それ自体フルクタンを含むか、あるいはそれにフルクタンが追加として加えられたものとされている（上記（１ｃ）参照）。
　引用例１には、測定されたサンプル中のフルクタンの平均分子量について記載されていないが、キクイモなどの植物に含まれるイヌリンの分子量がおよそ６０００程度であることは、本出願前周知の事項である（五十嵐脩他編、「丸善食品総合辞典」、平成１０年３月２５日、丸善株式会社、９０頁参照）。また、上記（２ｂ）に、「食品用イヌリンは、通常、平均分子量３０００〜７０００であり」と記載されているように、食品に添加するイヌリンは平均分子量３０００〜７０００の範囲にあるものが市販されている。
　そうしてみると、引用例１に記載の食品中の総フルクタン（イヌリン）量の測定対象となるイヌリンの平均分子量は３０００〜７０００程度と認められ、この点は実質的な相違点ではない。
　
　ここで、本願発明のイヌリンの定量法は、測定対象となるイヌリンについて平均分子量以外は特定されておらず、請求項１（すなわち、本願発明）を引用する請求項７又は請求項８で初めて血液中又は尿中のイヌリンであることやクリアランス測定用であることが特定されていることから、特定の平均分子量を満たすイヌリンであればどのようなものも本願発明の測定対象となるイヌリンに含まれる。
　しかしながら、本願明細書段落【００３０】には、「本発明の測定対象であるイヌリンは、医薬品原料、または食品用として市販されているイヌリンまたはこれを精製して用いることができる。」と記載されていること、審判請求書等で特にクリアランス測定におけるイヌリンの定量法に関する旨主張をしていることから、仮にこの点を相違点とした場合についても念のため検討する。
　上記のとおり、引用例１には、純粋なフルクタンの測定も行ったことが示されているうえ、測定対象は、食品などから抽出し、スクロース、デンプン及び還元糖を予め除去した後、フルクタン量を測定したことが記載されている（上記（１ｅ）のＥ．参照）。
　また、引用例２には、クリアランス測定用のイヌリンについて、市販の食品用のイヌリンは平均分子量が３０００〜７０００であり、これを精製して用いることができることが記載されている（上記（２ａ）参照）。
　さらに、引用例３〜５にあるとおり、クリアランス測定を被験者の静脈にイヌリンを投与し、血液中又は尿中のイヌリンを測定して行うことは本出願前周知の事項である（上記（３ｃ）、（４ｃ）、及び（５ｃ）参照）。
　これらのことから、引用発明のフルクタンの測定方法を、食品中に含有されているものに限らず、市販の食品用イヌリンを精製したものや、クリアランス測定のためのイヌリンの定量に応用することも、当業者が適宜なし得たことである。
　
２　相違点２について
（１）分離精製されたエキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを含むことについて
　引用例１には、用いる試薬について、「Ｃ．試薬　すべての試薬は分析的精製等級であるべきである。」（上記（１ｄ））、「高度に精製されたｅｘｏ−及びｅｎｄｏ−イヌリナーゼの混合物が使用される。これらはα−ガラクトシダーゼを取り除くためにクロマトグラフィーで精製され、著しくペクチナーゼ及びβ−グルカナーゼ（セルラーゼ）を減少する。」、「フルクタナーゼ製剤中のペクチナーゼ及び／又はβ−グルカナーゼの重要なレベルの存在（商用ＦｒｕｃｔｏｚｙｍｅＲ製剤、Ｎｏｖｏｚｙｍ　ＳＰ　２３０Ｒ、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ、ＳＡ、フランス）は、フルクタンの測定及びＡＯＡＣの総食物繊維方法の統合方法における製剤の使用を妨げる。ペクチナーゼは、熱処理（７）によって効果的に除去できるが、β−グルカナーゼの除去はクロマトグラフィー精製（６）を要求する。」（上記（１ｆ））のように記載されており、分析等級程度に精製されたものとであること、市販のイヌリナーゼ製剤に熱処理やクロマトグラフィー精製などを実施し、高度に精製されたエキソイヌリナーゼ及びエンドイヌリナーゼの混合物を使用することが示されているといえる。
　よって、分離精製されたものである点は実質的な相違点ではない。
　
　ここで、本願明細書段落【００３４】には、「このとき、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼを含む混合物を用いることもできるが、更に好ましくは定量試薬の反応性のロット間差を低減する目的で、エキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを分離精製し、各々の活性値を元にエキソイヌリナーゼまたはエンドイヌリナーゼを一定の範囲、一定の比率で混合して用いることもできる」と記載されているので、本願発明の「分離精製」を、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼを別々に分離して精製すると解した場合についても、念のため補足して検討する。
　引用例１に記載されている精製が、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼをそれぞれ分離して精製することを意味するかどうかは不明である。
　しかしながら、引用例１には、イヌリナーゼに夾雑物として含まれるα−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、及びβ−グルカナーゼを除去して精製することが記載されており（上記（１ｆ）参照）、この場合、精製後のイヌリナーゼは精製されたエキソイヌリナーゼと精製されたエンドイヌリナーゼの混合物となっているといえ、これらをそれぞれ単離精製して混ぜたものと物として相違するとはいえない。
　また、他の酵素の混入を防ぐ目的で精製する必要があることが示されていることを考慮すると、イヌリナーゼ自体もそれぞれ単離して、より高度に精製されたものを使用することは、当業者が適宜なし得たことである。
　
（２）イヌリンをフルクトースに分解する工程における反応液中のイヌリン分解酵素の活性が特定されている点について
　引用例１には、フルクタン（イヌリン）は精製されたエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物を用いてフルクトースに加水分解することが記載されている（上記（１ｂ）、（１ｄ）参照）。
　その具体的な試薬について、３５０Ｕ／ｍＬのｅｘｏ−イヌリナーゼ及び３５Ｕ／ｍＬのｅｎｄｏ−イヌリナーゼ（上記（１ｄ）のＣ．試薬（ｈ）参照）を用いることが記載され、フルクタンの加水分解は、０．２ｍＬのアリコート溶液Ａに対し、上記Ｃ．（ｈ）で示されたフルクタナーゼ溶液の０．１ｍＬを加えて実施することが記載されている（上記（１ｅ）のＥ．サンプルの総フルクタン量の決定（ｃ）フルクタンの加水分解及び測定を参照）。
　そうすると、フルクトースに加水分解する際には、試薬は１／３に希釈されているから、約１１６．７Ｕ／ｍＬのエキソイヌリナーゼと約１１．７Ｕ／ｍＬのエンドイヌリナーゼを含む状態で行われていることになる。
　そこで本願発明の条件と比較すると、本願発明では、エキソイヌリナーゼのみを用いる場合、すなわち（ｉ）の他、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物を用いる場合、すなわち（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が選択肢としてあげられている。
　そして、混合物を用いる場合の各酵素の上限値は、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）いずれの場合もエキソイヌリナーゼが１００Ｕ／ｍＬ、エンドイヌリナーゼが１０Ｕ／ｍＬであり、引用例１に記載されている条件より僅かに少ない量が規定されている。
　ところで、引用例１は、酵素分析キットの正確さ及び信頼度を評価するために、複数の研究機関に正確に同一の条件で確実に分析を実施してもらい、その結果からの評価を示したものであって、その詳細な手順を記載したものといえる（上記（１ａ）、（１ｃ）など参照）。
　そうしてみると、引用例１に記載の試薬の酵素活性は、用いるべき酵素活性の下限値を示したものとはいえず、経済性や実施する定量法への適用を考慮して、用いる酵素活性を検討して最適化することは、当業者が容易になし得たことであり、引用例１に示された具体的な数値より任意に少ない酵素活性となる濃度として用いることに困難を要するとはいえない。
　
　そのうえ、引用例３〜５には、市販品であるエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物であるＦｒｕｃｔｏｚｙｍｅを用いることができ、その反応時の濃度も３〜１５０Ｕ／ｍＬ程度が好ましいことが記載されている（上記（３ｄ）、（４ｄ）、及び（５ｅ）参照）。
　そして、引用例３の実施例では、測定試料２．０μＬに３０単位／ｍＬの濃度でイヌリナーゼ含む試薬Ｒ１の１８０μを添加して用いており、引用例４の実施例では、測定試料６．０μＬと試薬Ｒ２の１８０μＬの混合溶液に６０単位／ｍＬの濃度でイヌリナーゼを含む試薬Ｒ２の６０μＬを添加して用いており、また、引用例５の実施例では、測定試料０．０６ｍＬに３０単位／ｍＬのイヌリナーゼを含む試薬Ｒ１の２．００ｍＬを添加して用いており、それぞれ反応時の濃度は、３０×（１８０／（２．０＋１８０））≒２９．７Ｕ／ｍＬ、６０×（６０／（６．０＋１８０＋６０））≒１４．６Ｕ／ｍＬ、及び３０×（２．００／（０．０６＋２．００））≒２９．１Ｕ／ｍＬで用いたことが記載されている（上記（３ｅ）、（４ｅ）、及び（５ｆ）参照）。
　引用例３〜５に記載のＦｒｕｃｔｏｚｙｍｅは、審判請求人の提出した平成２４年３月２３日付けの回答書によると、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの比が、１００対１程度のものであると認められるが、引用例１で使用されている市販品（上記（１ｆ）参照）中のエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの比率は１０対１程度である。
　そうしてみると、上記引用例３〜５に記載の方法で、引用例１に記載されているような市販品の酵素を精製して用いた場合には、エキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼを１０対１程度の活性で含む、すなわち、２７Ｕ／ｍＬと２．７Ｕ／ｍＬ、１３．３Ｕ／ｍＬと１．３Ｕ／ｍＬあるいは２６．５Ｕ／ｍＬと２．６Ｕ／ｍＬ程度の量で使用することも普通のこといえ、本願記載の数値範囲が格別なものということもできない。
　
３　本願発明の効果について
　審判請求人は、本願発明について、より正確性の高いクリアランス測定を可能とするイヌリンの定量法であること、測定対象となるイヌリンの分子量に多少の幅があってもその影響を小さくすることができ、短時間で簡便且つ正確に定量できるものであることを主張している。
　また、引用例１の場合は、フルクタンをフルクトース及びグルコースに完全に加水分解するために４０℃で２０分間インキュベートしたことが記載されているのに対し（上記（１ｅ）のＥ．（ｃ）（２）参照）、本願明細書記載の実施例では、３７℃で１０分間の反応時間で測定を行って測定誤差が小さい結果が得られている旨も主張している。
　しかしながら、本願発明は、クリアランス測定ではなく、イヌリンの定量法であり、引用発明のような食品を対象とした定量法も含むから、審判請求人の上記主張は採用できない。
　
　仮に、これらの課題、効果を考慮しても、これまで検討したとおり、本願発明と引用発明の実質的な相違点は、酵素活性のみといえ、引用例１に記載の測定方法の方が、本願発明の定量法より酵素活性が高いので、より短時間で定量可能、かつ、フルクタンが充分に分解されるから正確に定量可能であることは自明な事項といえる。そして、引用例１に記載されている酵素活性との差は僅かであり、測定の正確性や測定時間に関して顕著に相違するとは考えられず、本願発明の酵素活性の数値限定に臨界的意義があるとはいえない。
　また、引用例１に記載の方法は精製された酵素を用い、任意の食品中のフルクタン（イヌリン）を正確かつ信頼性よく分析できるキットの評価に関するから、平均分子量の違いによらず測定誤差が少ない手法となっていることも予測される。
　さらに、引用例３〜５に記載されているように、イヌリンクリアランスを測定するのに、従来の酸による加水分解にかえて酵素分解法を用いることで正確性を高めることが知られており、イヌリンクリアランスの測定は正確性が要求されることも、当業者に周知の技術課題である（上記（３ａ）〜（３ｃ）、（４ａ）〜（４ｃ）、（５ａ）〜（５ｃ）参照）。
　特に、引用例５には、酵素のコンタミネーションが問題となること、食品用のグレードをそのまま用いると問題となることが示され、イヌリンを分解する工程にグルコースを基質とする酵素のコンタミネーション率が０．０１％以下である酵素を用いることが示されている（（５ａ）、（５ｃ）、（５ｅ）、及び（５ｆ）参照）。
　そして、引用例３〜５の実施例によれば、それぞれ市販品のエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼの混合物である「Ｆｒｕｃｔｏｚｙｍｅ」（ノボ・ノルディスク社製）を（精製して）用いて、特に分子量が特定されていないイヌリンの加水分解を３７℃にて５分間静置して行って、精度よく測定が行えたことが示されている（上記（３ｄ）、（３ｅ）、（４ｄ）、（４ｅ）、（５ｄ）、（５ｆ）参照）。
　これらのことから、イヌリンクリアランスを正確に行うために、精製した酵素を最適な酵素活性となる濃度で用いることによって、短時間で正確に測定できること、測定対象のイヌリンの平均分子量に多少の差があってもそれに影響を受けることなく測定できることは、当業者が容易に予測し得たことであって、格別なこととはいえない。
　
４　その他
　審判請求人は、審判審尋に対する平成２４年３月２３日付けの回答書において、引用例３〜５の実施例で使用されている市販の酵素を用いた比較実験を行い本願発明の効果を主張しているので、その点についても補足して検討する。
　引用例１及び５には、先にも示したとおり市販の酵素には夾雑物が混入し、これが測定に影響を与えることが示されている（上記（１ｆ）、（５ｃ）、（５ｅ）、及び（５ｆ）参照）。
　一方、回答書の実験では、市販の酵素を精製することなく高濃度で用いていることが明らかであり、そうすると、夾雑物による影響が大きいことも自明であるから、この結果によって、本願発明が引用例１に記載の方法に比べて格別な効果を奏するものということはできない。
　
第６　むすび
　以上のとおり、本願発明は、引用例１〜５に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって、その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。