【手続補正書】
【提出日】平成18年9月21日(2006.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  表面が永久的により親水性となるようにプラズマの強度を選択すること、および表面を続いて水、水混和性溶媒およびそれらの混合物から選択される純粋溶媒で洗浄する所望の段階を有することを特徴とし、ここで、該表面が深さ≦１０００μmの溝が存在する液体輸送システムを含む、非重合可能ガスのガスプラズマ中での処理により、プラスチック物質製支持体表面により親水性を提供する方法。
【請求項２】  プラズマ強度が≧５Ｗ／cm３／分であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】  力が≧２５０Ｗおよび流れが≦５０cm３／分であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】  プラスチック物質が即時水接触角≧２０°を有するプラスチックから選択されており、そして
(ａ)プラズマ処理条件が、プラズマ処理および続く純粋水／エタノール(７０％ｗ／ｗ)での洗浄後の即時水接触角が≦３０°であるように設定する
ことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】  プラスチック物質が
(ａ)モノマーが(ｉ)アルケン／アルカジエン、および１個以上のアルケン基を含む酸、エステル、アミド、ニトリル等；および(ii)ビニル基が所望により低級アルキル基(Ｃ１−６)で置換されていてもよいアリール基に結合しているビニルアリール化合物のような不飽和であるポリマー／コポリマー；
(ｂ)モノマーがアミノ、ヒドロキシ、カルボキシ等からなる群から選択される２個以上の基を示す化合物である縮合ポリマー／コポリマー
から選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】  プラズマが電磁波および／またはマイクロ波により誘導されることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】  プラズマガスが酸素、窒素、またはアルゴンのような希ガス、またはこれらのガスの混合物であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】  プラズマ処理に続き、支持体表面がアニオン交換基、カチオン交換基、両性基、ヒドロキシ基、バイオアフィニティー基およびキレート化基から選択される基を示すために誘導体化されることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】  表面の少なくとも一部が、深さ≦１０００μmを有する溝を含む液体輸送システムを含むを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】  剥き出しの形である表面が即時水接触角≦３０°を有し、該水接触角が純粋エタノール／水混合物(７０％ｗ／ｗ)での洗浄により±２０％以下および／または±５°以下の変化であることを特徴とする、プラズマ処理されている、プラスチック物質製支持体表面。
【請求項１１】  プラスチック物質が
(ａ)モノマーが(ｉ)アルケン／アルカジエン、および１個以上のアルケン基を含む酸、エステル、アミド、ニトリル等；および(ii)所望により例えば低級アルキル基(Ｃ１−６)で置換されていてもよいビニルアリール化合物のような不飽和であるポリマー／コポリマー等；
(ｂ)モノマーがアミノ、ヒドロキシ、カルボキシ等からなる群から選択される２個以上の基を示す化合物である縮合ポリマー／コポリマー
から選択され、該ポリマー物質は所望により架橋しおよび／または所望によりポリマー／コポリマーの２個以上の混合物であることを特徴とする、請求項１０記載の支持体。
【請求項１２】  ガスプラズマ処理に付される前の表面が≧３０°の即時水接触角を示すことを特徴とする、請求項１０または１１に記載の支持体。
【請求項１３】  表面の少なくとも一部が深さ≦１０００μmを有する溝を有する液体輸送システムを含むことを特徴とする、請求項１０から１２のいずれかに記載の支持体。
【請求項１４】  細胞培養のための、請求項１０から１３のいずれかに記載のおよび／または請求項１から９のいずれかに記載の方法により得られる支持体の使用。
【請求項１５】  (ａ)プラスチック物質から製造され、そして深さ≦１０００μmの溝を含む液体輸送システムを含む支持体表面を含むマイクロデバイス、および
(ｂ)デバイス中で検出する蛍光物質(プラスチックの蛍光強度が、該物質が発光する波長での該物質の蛍光強度の≦５０％である)
を含むことを特徴とする、キット。
【請求項１６】  プラスチックが、不飽和部分を有する脂肪族モノマーの重合化により得られた重合化産物を含むことを特徴とする、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】  支持体表面が即時水接触角≦３０°を有するプラスチック物質から製造されることを特徴とする、接着依存性細胞および、そのライフサイクルの一部支持体表面に接着することを必要とする非接着依存性細胞の培養法。
【請求項１８】  支持体表面が、請求項１から９のいずれかに記載のガスプラズマ処理法により得られることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  接着依存性細胞に関して、培養細胞の少なくとも３０％が支持体表面に接着するという条件が付いた、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】  最大１５％の培養培地が血清であることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】  培養を細胞の数が少なくとも２倍になる期間行うことを特徴とする、請求項１７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】  細胞培養をマイクロデバイスのチャンバーで行い、そこには(ａ)≦１０００μmの深さを有する溝を含む液体輸送システムおよび(ｂ)該支持体表面をまた提供する該チャンバーが含まれることを特徴とする、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
酸素およびアルゴンプラズマでポリカーボネート表面を処理することに関する多くの刊行物がある。安定性試験(Morra et al, Angew. Makromol. Chem. 189 (3184) (1991) 125-136)は、処置された表面の親水性の殆どが水を抜き取るかまたは３日間の乾燥貯蔵の後に損失することを示した。水抜き取り後の親水性損失は、プラズマ処理中の低分子量水溶性表面種の形成によるものであった。貯蔵不安定性は、表面におけるポリマー鎖の再配置に帰するものであった。ＥＳＣＡ試験(Greenwood et al, Macromolecules 30 (1997) 1091-1098)は、酸素プラズマ処理によりポリカーボネート表面に包含された酸素の７９％が１：１シクロヘキサン／イソプロパノール混合物での洗浄後に除去されたことを示した。これは、プラズマ処理中のポリマー鎖の分解に帰する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
WO9618498は、プラスチック製の永久的親水性化表面の製造の試みを記載している。方法は、表面に電荷を導入するための無機ガスプラズマ中の第１段階、および逆の電荷を有する多イオンポリマーが表面に吸着される第２段階を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
GB2,061,969は、無機ガスプラズマ中での処理による、親水性および静電気防止性塩化ビニルポリマーの製造を記載する。プラスチックに永久的親水性を与える問題は記載されていない。
DE3712491は、様々な合成ポリマー製の多孔性膜ガスプラズマ親水性化を記載する。プラスチック物質は記載されていない。親水性膜の貯蔵安定性は示されているが、水性媒体での洗浄条件中の安定性に関する記載はない。液体接触角は測定されているが、多孔性表面は典型的に無孔平滑表面と比較して著しく低下した値を有するため、これらの値は本明細書に記載の値と単純に比較はできない。
EP106662は、ウェルにおける蛍光測定を改善するための暗色プラスチック物質製のマイクロタイタープレートを記載する。マイクロタイタープレートは、通常微小形態の液体輸送システムがない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
マイクロデバイス(microfabricated device)における細胞培養は、以前に、例えば、１９９８年４月２７日の優先日でWO9955827に記載されている。
WO972190は、遠心力を使用して液体を駆動させる、微小流体デバイスに関する。ミクロ培養および病原体の同定が該デバイス内でできることが示唆されている一つの文章はあるが、適切な表面特性の選択に関するヒントは何らない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ＣＨＯ細胞の、ガスプラズマ親水性化された表面へのＨ２Ｏ蒸気中での接着は、プラスチック表面の最適細胞培養特性を探すために試験されている(Lee et al., Biomaterials 12 (5) (1991) 443-448)。殆どの親水性表面における欠しい細胞接着が観察されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
・第３の目的は、内部表面が第２の目的で定義された通りであり、再現性のある方法での水性液体の反復導入が可能である、例えば、キャピラリー／溝／チャンバーを有するマイクロ加工形のキャピラリー／溝／チャンバーシステムの提供である。
・第４の目的は、内部表面の少なくとも一部が第２の目的に従っている、液体輸送システムの提供である。
・第５の目的は、細胞培養、アッセイ反応等に使用できるプラズマ処理表面の提供である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の方法は、ガスプラズマ処理段階に続く所望の洗浄段階を含み得る。この洗浄工程は、ガスプラズマ処理表面を、水性溶液、またはある他の極性液体を接触させ、緩く保たれた親水性化合物を除去することを意味する。洗浄溶液は好ましくは水、水混和性液体またはこれらの混合物である。水混和性液体の例は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｔ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフオキシド、アセトンおよび、水に同様の溶解性を有する他の液体化合物である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
適当なガス流速度と合わさった充分に高いパワーのアウトプットを可能にするプラズマリアクター容器は、商品として入手可能である。上記のように、リアクター容器は、例えば、マイクロ波または電磁波の範囲の、電気的励起力インプットを可能にしなければならない。適当なプラズマリアクターは、０−５００Ｗの無線周波数(ＲＦ)力および０−１００または０−１０００スタンダードcm３／分のガス流を可能にするPS0500(BOC Coating Technology, USA)である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
処理の結果は、使用したリアクター容器の設計に依存し得、ある程度への最適区間が１つのリアクター設計から別のものへ変わることを意味する。結果はまたリアクター中のどこに表面を処置中に置くかにも依存し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
モノマーは、例えば、モノ−、ジ−およびポリ／オリゴ−不飽和化合物、例えばビニル化合物および、不飽和部分を含む他の化合物から選択され得る。モノマーは、フルオロおよび／またはクロロのようなハロゲン置換基を含んでも含んでいなくてもよい。説明的モノマーは：
(ｉ)アルケン／アルカジエン(例えば、エチレン、ブタジエン、プロピレン、およびビニルエーテルのような置換形を含む)、シクロアルケン、モノフルオロビニルおよびジおよびポリフルオロビニル炭化水素(例えば、テトラフルオロエチレン)、アルケン含有酸、エステル、アミド、ニトリル等、例えばメタクリル／アクリル化合物；および
(ii)所望により例えば低級アルキル基(Ｃ１−６)等で置換されていてもよいビニルアリール化合物(例えば、モノ−、ジ−およびトリビニルベンゼン)である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
特に興味深いポリマーは、２００−８００nmの区間の励起波長および４００−９００nmの区間の放出波長に関して無視できる蛍光を有するものである。無視できる蛍光なる用語は、上記放出波長区間における蛍光強度が、対照プラスチック(＝蛍光付加なしのビスフェノールＡのポリカーボネート)の蛍光強度の５０％より小さくなければならないことを意味する。実際、プラスチックの蛍光強度が、対照プラスチックの蛍光強度の＜３０％または＜１５％より低い、例えば＜５％または＜１％である場合、害にならない。許容できる蛍光を有する典型的プラスチックは、重合可能炭素−炭素二重結合を含む脂肪族モノマーのポリマー、例えば、シクロアルケン(例えば、ノルボルネンおよび置換ノルボルネン)、エチレン、プロピレンなどのポリマー、ならびに高純度の他の非芳香族ポリマー、例えば、一定グレードのポリメチルメタクリレートである。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
プラズマ処理の後、所望により緩く保たれた親水性化合物を除去するための洗浄工程の後、表面は、１個以上の反応性基、即ち、あるタイプの親和性を介して、または共有結合的結合を介して他の化合物に結合できる基を示すために更に誘導体化され得る。誘導体化は、好ましくは洗浄工程後に行われ、例えば、誘導体化に使用できる付加的親水性基を担持するコーティングを表面に提供する、コーティング段階より前であり得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
親水性化表面は、水性液体の輸送を意図したシステムにおける液体接触表面の大部分を提供し得る。これらのシステムは、キャピラリー寸法、例えば、二つの逆の壁の間が＜１０００μm、例えば＜１００μm、または＜１０μm、例えば＜１μmの距離でさえある、溝を有し得る。これらのシステムはまた溝に接続する１個以上のチャンバーを含み得、＜５００μl、例えば＜１００μl、およびまた＜１０μl、例えば＜１μlでさえある容量を有し得る。チャンバーの深さは典型的に＜１０００μmの区間、例えば＜１００μm、例えば＜１０μm、または＜１μmさえあり得る。下限はまた使用する試薬の最大より常に有意に大きい。下限は典型的に乾燥形で送達するデバイスに関しては、０.１−０.０１μmの範囲である。このタイプの１個以上の液体輸送システムは一般的なプレート、例えば、回転可能な、例えば、ＣＤタイプのディスク上に置き得る。回転可能形の場合、液体はディスクの回転(求心力)により、輸送システムの１個以上のセグメントを介して押しつけられ得る。この後者の場合、液体輸送システムは放射状に置く。他のタイプの圧力発生システムをまた上記の液体輸送システムにおける液体の輸送に使用し得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
表面は無機および／または有機／生化学的性質の化学反応の実施に使用し得る。表面はクロマトグラフィーにおける、細胞培養のための、オリゴ／ポリペプチド、オリゴ／ポリヌクレオチド、他の有機ポリマーおよび他の有機化合物の固相化学合成のための、担体マトリックスとして使用し得る。本発明の表面で行う反応の説明的例は、慣用の化学反応、または幾何学的適合性を介した認識および水素結合、ファンデルヴァールス結合、双極子−双極子相互作用、電荷−双極子相互作用、電荷−電荷相互作用等に基づいた相互作用が関与する親和性に基づく反応である。細胞培養に関して、更なる詳細を下に記載する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
マイクロデバイス
第５の本発明の態様は、上記のようなマイクロデバイスであり、液体輸送システムがポリマー物質(材料)中／上に形成され、プラスチックは本質的に上記の種類の１個以上の脂肪族モノマーの重合化により得られる１個以上のポリマーから成る。この態様において、デバイスは本明細書に記載の他の本発明の態様の１個以上の性質を有し得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
細胞、特に接着依存性細胞の培養は、プラスチックから成る支持体表面の存在下で成されている。即時水接触角は４０°−６０°である。マイクロデバイス中での細胞培養に関して、この相対的に低い親水性に関する液体流体工学の問題がある。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明により、様々な種類の細胞の培養が、４０°−６０°より有意に低い即時水接触角を有する、超親水性支持体との接触により行うことができることが判明した。マイクロ装置に適用したとき、この発見は、流体に関する状態を改善する。第６の態様は、従って、細胞培養が、即時水接触角＜３０°、例えば＜２０°を提供するプラスチックから成る表面の存在下で行われることを特徴とする。表面は主に培養容器の内壁上に提供されるが、例えば、容器中に懸濁した粒子によりまた提供され得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本明細書に記載されているガスプラズマ処理により親水性化された表面が好ましい。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
好ましいプラズマは、一つでまたは組合わせて下記の荷電／極性基の混合物に挿入できる１個以上のガスを含む。試験したガスの中で、酸素と窒素の混合物が好ましく、一つのガスはあまり好ましくなく、アルゴンがもっとも好ましくない。二酸化硫黄および五酸化二リン(diphosphorous pentoxide)のようなガスは、それらがもたらす取扱い問題を無視した場合、酸素および／または窒素と共に使用することが有利である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
接着依存性細胞の十分な培養および行動の最も重要な因子は、細胞が生育する表面である。このタイプの細胞をそれらが接着できないまたは殆ど接着しない表面で培養した場合、それらは生育しない。細胞機能は細胞とその基底との間の動的相互作用を必要とする。これらの相互作用は、経膜タンパク質(インテグリン；Hynes RO, Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell 69: 11-25, 1992)が細胞の内部が外部基底と結合する場所である、分化した接触部位で起こる。表面官能基およびそれらの荷電特性特性ならびに親水性／疎水性、および表面遊離エネルギーが細胞行動に重要である(Lee JH et al., Biomaterials 18:351-358. 1997)。適当な密度でのアミン(アンモニウム)、アミド、ヒドロキシル、カルボキシル(カルボキシレート)およびスルホニル(スルホネート)およびスルフェート基が細胞表面または接着タンパク質との静電気的相互作用の部位として、および細胞外マトリックス成分上の接着を模倣するとして考えられる(Maroudas, J. Theor. Biol. 49 (1975) 417-442; Lee et al., Biomaterials 15 (1994) 704-711; and Lee et al., Biomaterials 18 (1997) 351-358)。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
ポリマー表面物質は、培養する細胞に毒性であってはならない。我々は、例えば、アクリロニトリルモノマーまたはアクリル酸モノマーから構築されたガスプラズマ処理ポリマーが、恐らく、ポリマーの分解のために毒性であり得ることを認識している。これは、これらの種類の材料を避けることにより、または使用する前の物質の適切な後処理により、回避し得る。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
プラズマ処理物質の切片を多ウェルプレートに入れ、細胞培地中の細胞の懸濁液を各ウェルに添加し、プレートを細胞培養雰囲気中、種々の時間インキュベートした。細胞接着、形態学および増殖を顕微鏡的に、および時々細胞接触マーカーおよび接着性接触に対する免疫細胞化学の使用により評価した。予備的結果は、プラズマ処理表面が細胞培養に使用でき、細胞が最適行動のための必要な特性を示すことを明らかにした。このような特徴は、正常細胞運動性および細胞分割の徴候である材料表面上の均質にパターン化された、適切な細胞拡散における殆ど全ての培養細胞の接着を含む。空胞、過剰な量のリソゾーム顆粒、気泡、または膜破壊を含む病理的徴候は、有意ではない。現在まで試験した細胞系は、MRC5(正常胚線維芽細胞)、HeLa(上皮様起源の頸部癌細胞)、Chang(肝癌、肝臓細胞)を含む。細胞は、表面上の広範囲の要求をカバーするように選択している。非接着依存性細胞は、それ自体、非常に小さな要求を表面上にした。このような細胞の例(Rajiリンパ腫)は、プラズマ処理表面の存在下で十分培養されている。