【手続補正書】
【提出日】平成17年10月24日(2005.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
免疫賦活性ジヌクレオチドが、CpG, C*pG, CpG*およびC*pG*からなる群より選択され、ここで、Cはシチジンまたは 2'-デオキシシチジンであり、C*は 2'-デオキシチミジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、 2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン, 2'-O-置換-アラビノグアノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、かつpはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群より選択されるインターヌクレオシド結合であり、ある好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは CpGではない、請求項１に記載のイムノマー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
構造            
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3'     (III)
式中:
Yはシチジン、2'-デオキシシチジン、アラビノシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり; 
Zはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシン、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、 2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
N1は、各場合において、好ましくは天然に存在するまたは合成のヌクレオシド、あるいは、無塩基（abasic）ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、および、ホスホジエステルまたは３’側に隣接するヌクレオシドへの修飾されたインターヌクレオシド結合により結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、長さが約2オングストロームから約200オングストロームまでの長さを有するリンカー、C2-C18アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、2-アミノブチル-1, 3-プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、および、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートインターヌクレオシド結合から無制限に選択される;
Nnは、各場合において、天然に存在するヌクレオシドもしくは合成ヌクレオシドまたは免疫賦活性部分である；
で表される、構造を有する請求項１に記載のイムノマー。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
天然に存在しないピリミジンが、構造(I)
【化２】
2005518402.tif 000001
式中:
Dは水素結合ドナーであり；
D'は水素、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基、臭素を除く電子供与基よりなる群より選択され；
Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
A'は 水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基よりなる群より選択され；
Xは炭素または窒素であり；かつ
S'は五単糖または六単糖環、あるいは、天然に存在しない糖である、
で表される構造を有する、請求項１に記載のイムノマー。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３３】
ワクチンを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３４】
イムノマーまたはワクチン、あるいはその両者が免疫原性タンパクと結合している、請求項３１の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３５】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
【表３】
2005518402.tif 000002
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【表４】
2005518402.tif 000003
【表５】
2005518402.tif 000004
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表１５】
2005518402.tif 000005
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
実施例１０：イムノマーの安定性
オリゴヌクレオチドは10%ウシ血清を含むPBS中、37℃で 4、24または48時間インキュベートした。インタクトオリゴヌクレオチドはキャピラリーゲル電気泳動により測定した。 その結果を表14に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
実施例１１：免疫賦活活性におけるアクセス可能な5'末端の効果
BALB/cマウス(4-8週齢) の脾臓細胞をRPMI 完全培地中で培養した。マウスマクロファージ様細胞であるJ774 (American Type Culture Collection,Rockville, MD) は 、10% (v/v)FCS および抗生物質(ペニシリンG/ストレプトマイシン100IU/mL)とを補充したダルベッコ修飾イーグル培地中で培養した。他の全ての培養試薬は メディアテック(Gaithersburg, MD)より購入した。. 
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
実施例１２：サイトカイン分泌におけるリンカーの効果
下記のオリゴヌクレオチドを本研究のために合成した。各修飾されたオリゴヌクレオチドはイムノマー中に取り込まれうる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【表２２】
2005518402.tif 000006
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
リンカー８および９を含むCpG DNAの免疫賦活効果を比べるため、我々は、5'フランキング配列中に置換があるCpG DNA145および152を選んで BALB/cマウスの脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導能を分析した。CpG DNA145および152のいずれも濃度依存的なサイトカイン分泌を引き起こした。図１６はもとのCpG DNA4と比べて、マウス脾臓細胞培養における0.3μg/mLの濃度での145および152によって誘導されるIL- 12およびIL-6の濃度を示す。いずれのCpG DNAも、CpG DNA4よりもより高い濃度のIL- 12およびIL-6を誘導した。グリセロールリンカー（８）を含むCpG DNAはアミノリンカー（９）を含むCpG DNAよりもわずかに高い濃度のサイトカイン（特にIL-12)が誘導された（図１６）。これらの結果により、疎水基を含むリンカーは、CpG DNAの免疫賦活活性にとってより好ましいことがさらに確認された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
修飾されたCpG DNAについて、もとのCpG DNA 4と比較したBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカイン産生の誘導能を調べた。全ての CpG DNAは濃度依存的にサイトカイン産生を誘導した。この分析では、もとのCpG DNA 4 は、１μg/mLの濃度で、967±28 pg/mLのIL-12、 1593±94.pg/mLのIL-6、および14±6pg/mLのlL-10の分泌を誘導した。データは、リンカー置換基の数が減少するにつれ、IL-12の誘導が減少することをことを示唆している。しかし、 CpG DNA123および124によるIL-12の分泌のより低い濃度の誘導はCpG DNAの長さがより短いことの結果となりうる。修飾されていない15-ヌクレオチドより短いCpG DNAを用いた我々の研究は、わずかな免疫賦活活性を示した（データには示していない）。長さもリンカー置換基の数も、IL-6の分泌にほとんど影響を与えない。IL-10の分泌はリンカー置換基によって増加したが、これらのCpG DNAによる全体的なIL-10の分泌は最小であった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
実施例１３：サイトカイン誘導におけるホスホジエステル結合の効果
イムノマーにより惹起されるサイトカイン誘導におけるホスホジエステル結合の効果を調べるため、下記の分子を合成した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
実施例１４：短いイムノマー
サイトカイン誘導における短いイムノマーの効果を調べるため、下記のイムノマーを用いた。 これらの結果は、セグメントあたり５ヌクレオチドの短さのイムノマーがサイトカイン産生の誘導において効果的であることを示している。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
【図１】本発明の代表的なイムノマーを模式的に図示したものである。
【図２】いくつかの本発明の代表的なイムノマーを表す。
【図３】本発明のイムノマーの直鎖合成に適した一連の代表的な小分子リンカーを表す。
【図４】本発明のイムノマーのパラレル合成に適した一連の代表的な小分子リンカーを表す。
【図５】本発明のイムノマーの直鎖合成の合成模式図である。DMTr = 4, 4'-ジメトキシトリチル ; CE = シアノエチル.
【図６】本発明のイムノマーのパラレル合成の合成模式図である。DMTr = 4, 4'-ジメトキシトリチル ; CE = シアノエチル.
【図７Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-12の誘導のグラフ図である。これらのデータは、アクセス可能な5'末端を持つイムノマー２は単量体のオリゴ1 よりも IL-12をより強く誘導し、また、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー3はオリゴ1 と比べて等しいかまたはより弱い免疫刺激しか起こすことができないことを示唆している。
【図７Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-6の誘導のグラフ図である（上から下）。これらのデータは、アクセス可能な5'末端を持つイムノマー２は単量体のオリゴ1 よりも IL-6をより強く誘導し、また、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー3はオリゴ1 と比べて等しいかまたはより弱い免疫刺激しか起こすことができないことを示唆している。
【図７Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-10の誘導のグラフ図である（上から下）。
【図８Ａ】それぞれ到達不可能な5'末端およびアクセス可能な5'末端を持つイムノマー5および6の異なる濃度による、培養系におけるBALB/cマウス脾臓細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図８Ｂ】CpGモチーフの5'フランキング配列に免疫原性化学修飾を有するイムノマー4-6によるBALB/cマウスの脾臓拡張のグラフ図である。この場合もやはり アクセス可能な5'末端を持つイムノマー6は、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー5および単量体のオリゴ4 と比べてより脾臓拡張を増大しうる。
【図９Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-12誘導のグラフ図である。
【図９Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-6誘導のグラフ図である。
【図９Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-10誘導のグラフ図である。
【図１０Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、イムノマー14、15および16による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１０Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、異なる濃度のイムノマー14、15および16によるIL-12の誘導のグラフ図である。
【図１０Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、異なる濃度のイムノマー14、15および16によるIL-6の誘導のグラフ図である。
【図１１Ａ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、オリゴ4および17とイムノマー19および20による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１１Ｂ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4および17とイムノマー19および20によるIL-12の誘導のグラフ図である。
【図１１Ｃ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4および17とイムノマー19および20によるIL-6の誘導のグラフ図である。
【図１２】オリゴヌクレオチド4とイムノマー14、23および24を用いたBALB/cマウス脾臓拡張のグラフ図である。
【図１３】オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオシドの模式図であり、非ヌクレオチド結合は核酸塩基、3'または2'の位置で、ヌクレオシドに取り付け得ることを示す。
【図１４】例13において用いられる化学的置換基を示す。
【図１５】例13において修飾されたオリゴヌクレオチドを用いて得られたサイトカインのプロファイルを示す。
【図１６】アミノリンカーと比較したグリセロールリンカーによる相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図１７】種々のリンカーとリンカーの組み合わせによる相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図１８】A-Eは種々のPSおよびPOイムノマーとオリゴヌクレオチドの相対的なヌクレアーゼ抵抗性を示す。
【図１９】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、PSイムノマーと比較したPOイムノマーの相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図２０】C3H/Hejマウス脾臓細胞の培養における、PSイムノマーと比較したPOイムノマーの相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図２１】インビボでのPOイムノマー化合物の抗腫瘍活性を示す。