【手続補正書】
【提出日】平成18年4月21日(2006.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無性発生段階におけるＳｐｏｒｏｚｏｅａ網の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化哺乳類宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程；
（ｂ）感染段階のＳｐｏｒｏｚｏｅａ網の偏性細胞内原虫と該宿主細胞とを接触させ、該宿主細胞において無性段階における連続増殖が可能であるメロゾイト集団の増殖を生じる工程であって、ここで、該接触させる工程が、該宿主細胞の感染に有効な条件下において行われる、工程；および
（ｃ）無性生殖の分裂形態において、該メロゾイト集団を繁殖させる工程、
を包含し、ここで、該偏性細胞内原虫が、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｉｍｅｒｉａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される属に属する種であり、そして、該Ｅｉｍｅｒｉａ種はトリ宿主に感染し得る、方法。
【請求項２】
前記細胞培養系が、前記宿主細胞および前記Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種生物を維持するのに適した増殖培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖培地が、還元剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記還元剤は、生殖が無性生殖であるライフサイクル段階において、無限培養でＳｐｏｒｏｚｏｅａ種生物を維持するのに有効な濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記還元剤が、β−メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン、２，３−ジメルカプトコハク酸、ペニシラミン、β−ラクタム、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルベート、グルタチオンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記還元剤が、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭにわたる濃度のβ−メルカプトエタノールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、哺乳類網内皮細胞由来の食作用活性を保持する不死化細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記網内皮細胞が、単球である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養物を分割し、メロゾイトの連続産生を確実にする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘおよびＥｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、トリ宿主を感染し得るＥｉｍｅｒｉａ種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａまたはＥｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞における前記メロゾイト集団が、少なくとも１８日間の無性発生段階の連続増殖が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞における前記メロゾイト集団が、少なくとも１５０日間の無性発生段階の連続増殖が可能である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって繁殖されたメロゾイト集団を含む、抗原虫ワクチン組成物。
【請求項１５】
原虫メロゾイトまたはオーシストを伴うメロゾイトの単離された集団であって、ここで、該原虫が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘおよびＥｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、メロゾイトの単離された集団。
【請求項１６】
保護性の抗原虫免疫を誘発するために、トリにワクチン接種する方法であって、該方法が、請求項１に記載の方法によって産生された生存可能な生物を、それを必要とするトリに投与する工程を包含し、ここで、生存可能な生物の数がトリに保護免疫を誘発するのに有効である、方法。
【請求項１７】
前記トリが家畜のトリであり、前記原虫がＣｏｃｃｉｄｉｏｓｉａである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トリが、Ａｎａｔｉｄａ、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａ、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅおよびそれらの種からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記トリが、シチメンチョウまたはニワトリである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記生存可能な生物の数が、メロゾイトまたはオーシストまたはそれらの混合物を含み、該生存可能な生物の総数が１０〜１０６個にわたる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記生存可能な生物の数が１０２〜１０５個のメロゾイトまたはオーシストを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生存可能な生物が、経口投与、羽の粉付けもしくは噴霧、インオボ注射およびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって投与される、メロゾイト、オーシストまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養系であって、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ種を増殖するのに適した不死化食宿主細胞、および還元剤なしで培養されたＳｐｏｒｏｚｏｅａ種の生存と比較して無期限細胞培養において、ライフステージを無性生殖的に生殖するＳｐｏｒｏｚｏｅａ種の生存を増強するのに有効な量の還元剤を含む細胞培地を含む、細胞培養系。
【請求項２４】
薬学的に受容可能なアジュバントを含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
混合された食品組成物をさらに含む、請求項２４に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
スクリーニングされる因子との接触が有りおよび無しで、請求項１に記載の方法によって、目的のＳｐｏｒｏｚｏｅａ種を培養する工程、および目的の因子の非存在下において増殖の阻害または増殖に関する生存度を検出する工程を包含する、Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ網の原虫の増殖を破壊するかまたは阻害する因子をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の、無性発生段階における偏性細胞内原虫の連続培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）不死化ウシ単球を含む細胞培養系を提供する工程であって、ここで、該不死化ウシ単球細胞は、食作用によって原虫を取り込み得；
ここで、該細胞培養系は、該不死化ウシ単球の増殖に適切な培地および約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭにわたる濃度のβ−メルカプトエタノールを含む、工程；
（ｂ）宿主細胞においてメロゾイトの増殖を生じる、該宿主細胞の感染に有効な条件下で、感染段階の原虫と該宿主細胞を接触させる工程；および
（ｃ）無性生殖の分裂形態において、メロゾイト集団を繁殖させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記原虫は、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘおよびＥｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａ種である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法はさらに、増殖が少なくとも８０％のコンフルーエンシーに達する時はいつでも、前記培養系における宿主細胞の濃度を減少させる工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
原虫の一つ以上のＥｉｍｅｒｉａ種に対してニワトリまたはシチメンチョウを免疫するためのワクチンであって、トリＥｉｍｅｒｉａ種のメロゾイト；メロゾイトから発生したオーシスト、またはそれらの混合物を含み；ここで、該メロゾイトは、不死化哺乳類食細胞の連続培養で増殖された、ワクチン。
【請求項３１】
前記哺乳類食細胞が単球である、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記単球がウシ単球である、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記Ｓｐｏｒｏｚｏｅａ網の偏性細胞内原虫の前記感染段階が、オーシストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、
（ｄ）オーシストおよびスポロシストが培地中に放出されるように、前記培養物の密度を増やす工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
（ｅ）スポロシストを回収する工程
をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ｄ）メロゾイトを回収する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１５に記載の原虫メロゾイトまたはオーシストを伴うメロゾイトの単離された集団を含む、抗原虫ワクチン組成物。
【請求項３８】
保護性の抗原虫免疫を誘発するために、トリにワクチン接種する方法であって、該方法が、請求項３７に記載の抗原虫ワクチン組成物を、それを必要とするトリに投与する工程を包含し、ここで、前記メロゾイトまたは前記オーシストを伴うメロゾイトの数がトリに保護免疫を誘発するのに有効である、方法。