【手続補正書】
【提出日】平成18年6月21日(2006.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ヒト膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団であって、該膵臓前駆細胞は、腺房細胞、管細胞、および膵島細胞に分化する多能性を保持している、ヒト膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２】  前記膵臓前駆細胞が、単離され、そして無血清培地中に維持されている、請求項１に記載の膵臓前駆細胞。
【請求項３】  前記膵臓前駆細胞が、少なくとも１つの細胞マーカーの発現によって同定可能である、請求項１または請求項２に記載の膵臓前駆細胞。
【請求項４】  前記細胞マーカーが、以下：サイトケラチン−１９、癌胎児抗原、炭酸脱水素酵素ＩＩ、および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子からなる群より選択される、請求項３に記載の膵臓前駆細胞。
【請求項５】  前記膵臓前駆細胞が、小さくかつ丸い、約１０μｍ直径の細胞の形態、および非常に圧縮された円柱状の上皮形態を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の膵臓前駆細胞。
【請求項６】  請求項１〜５のいずれか１項に記載の膵臓前駆細胞であって、該膵臓前駆細胞は、アミラーゼを発現する腺房細胞にさらに分化し得、そして該腺房細胞が、腺房を形成する大きなクラスターの外観を有する、膵臓前駆細胞。
【請求項７】  請求項１〜５のいずれか１項に記載の膵臓前駆細胞であって、該膵臓前駆細胞は、サイトケラチン１９を発現する管細胞にさらに分化し得、そして該管細胞が、小さくかつ丸い、約１０μｍ直径の細胞の形態、および圧縮された立方形円柱状の上皮形態を有する、膵臓前駆細胞。
【請求項８】  請求項１〜５のいずれか１項に記載の膵臓前駆細胞であって、該膵臓前駆細胞は、インスリンおよびグルカゴンを発現する膵島細胞にさらに分化し得、そして該膵島細胞が、腺房外分泌単位によって囲まれた上皮島の外観を有する、膵臓前駆細胞。
【請求項９】  請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団を単離する方法であって、以下の工程：
（ａ）ヒト胎児膵臓前駆細胞のエキソビボ供給源を顕微解剖して、膵臓前駆細胞を含む膵臓細胞の混合集団を得る、工程；
（ｂ）該膵臓前駆細胞の生存を維持するのに十分な培養条件下で、栄養性培地中に該膵臓細胞の混合集団を配置する工程であって、該栄養性培地は、以下：インスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、セレン、トリヨードサイロニン、プロゲステロン、ヒドロコルチゾン、フォルスコリン、ヘレグリン、アプロチニン、およびウシ下垂体抽出物を含む栄養素を含む、工程；
（ｃ）膵臓前駆細胞が凝集形態または単層形態を形成することを可能にするのに十分な適切な培養条件を維持する工程；ならびに
（ｄ）該凝集形態または単層形態を継代培養して、膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】  異種レシピエントに対して免疫原の供給源を提供するための組成物であって、該組成物は、該レシピエントにおける免疫応答を誘導するのに有効な量で、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複数の膵臓前駆細胞を含み、該組成物は該レシピエントに対する投与に適している、組成物。
【請求項１１】  免疫不全または免疫無防備状態の非ヒト哺乳動物レシピエントにおいて、ヒト膵臓組織モデルを生成する方法であって、該方法は、間葉組織と再結合された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の実質的に純粋な集団由来の複数のヒト膵臓前駆細胞を、該レシピエント内のある位置で該レシピエントに投与する工程であって、該位置は、該膵臓前駆細胞の増殖および分化を支持し得る、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】  ヒトレシピエントに対して細胞療法を提供するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜８のいずれか１項に記載の実質的に純粋な集団由来の複数のヒト膵臓前駆細胞を含み、該組成物は該レシピエント内のある位置での該レシピエントへの投与に適しており、該位置は、該膵臓前駆細胞の増殖および分化を支持し得る、組成物。
【請求項１３】  １つ以上の薬物の薬学的開発において膵臓組織特異的生物学的成分の供給源を提供する方法であって、該方法は、以下：請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト膵臓前駆細胞の集団を単離する工程、および薬物開発のための標的として、該膵臓前駆細胞、または該細胞の任意の細胞部分を用いる工程、を包含する、方法。
【請求項１４】  バイオアッセイの開発において核酸またはタンパク質の供給源を提供する方法であって、該方法は、以下：請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト膵臓前駆細胞由来の核酸またはタンパク質を単離する工程、および該バイオアッセイにおける１つ以上の主成分として該核酸またはタンパク質を用いる工程、を包含する、方法。
【請求項１５】  免疫抑制薬をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】  請求項１２に記載の組成物であって、前記膵臓前駆細胞をさらに含み、該膵臓前駆細胞は、該膵臓前駆細胞に対する前記レシピエントの免疫系応答を制限するバリアデバイス中に提供される、組成物。
【請求項１７】 請求項９に記載の方法によって得られ得る腺房細胞、管細胞、および膵島細胞に分化し得る、ヒト膵臓前駆細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項１８】 前記位置が、前記ヒトレシピエントの腎臓被膜である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】 前記ヒトレシピエントが糖尿病を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】 前記ヒトレシピエントが、機能欠損の腺房細胞、管細胞または膵島細胞を欠くか、あるいは機能欠損の腺房細胞、管細胞または膵島細胞を有する、請求項１２に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
１つの実施形態では、ヒト膵臓モデルを、ＳＣＩＤ（重篤複合免疫不全）マウスにおいて生成することができる。このヒト膵臓モデルを、本明細書中に開示した方法で単離および培養したヒト膵臓前駆細胞の使用および移植組換え体を作製するためのヒト膵臓前駆細胞の使用によって作製することができる。次いで、移植片組換え体を、マウスの腎臓被膜下に置く。腎臓被膜下での移植から約１〜１０週間後、好ましくは約６〜８週間後に、その移植片またはその一部を回収し、免疫組織化学によって分析した。外分泌機機能または内分泌機能に特異的なマーカー（インスリンまたはグルカゴンなど）を使用して、組織モデル系の有効性を分析する。あるいは、膵臓組織に特異的なマーカー（膵島細胞（すなわち、ＰＤＸ−１）、腺房細胞（すなわち、アミラーゼ）、管細胞（すなわち、ＣＫ１９）など）を使用する。膵臓前駆細胞分化の結果のさらに別の評価法は、形態学によるものである。膵臓前駆細胞は、小さな円形で細胞の直径が約１０μｍであり、非常にコンパクトな円柱状の上皮形態の外観を有する。腺房細胞は、腺房を形成する巨大なクラスターの外観を有する。管細胞は、小さな円形で細胞の直径が約１０μｍであり、コンパクトな円柱状の立方上皮の外観を有する。膵島細胞は、外分泌腺房単位に取り囲まれた上皮膵島の外観を有する。さらに、より完全に評価するために、形態学をインスリンおよびグルカゴンの機能的マーカーならびに特異的細胞の細胞表面マーカーと組み合わせる。したがって、組換え組織は、マウスにおいて完全なヒト小膵臓を示す。これらのヒト膵臓組織モデルを使用して、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、膵炎、膵癌、および他の膵臓不全症の処置のために開発されている薬物候補の有効性および毒性を評価することができる。これらを使用して、任意の薬物を膵臓毒性についてスクリーニングすることもできる。さらなる用途では、手術でまたは化学的（すなわち、ストレプトアゾチシン）にレシピエンド動物の膵臓または膵島β細胞が剥離されるので、産生されたインスリンが移植片に由来する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
膵臓組織組換え移植片移植の結果を、形態学によって評価した。膵臓前駆細胞は、小さな円形で細胞の直径が約１０μｍであり、非常にコンパクトな円柱状の上皮形態の外観を有する。腺房細胞は、腺房を形成する巨大なクラスターの外観を有する（図３Ｅ）。管細胞は、小さな円形で細胞の直径が約１０μｍであり、コンパクトな円柱状の立方上皮の外観を有する（図３Ｄ）。膵島細胞は、外分泌腺房単位に取り囲まれた上皮膵島の外観を有する（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および図７）。