【手続補正書】
【提出日】平成17年9月21日(2005.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  真核細胞における原核細胞性β-リコンビナーゼおよびその特異的標的配列の使用。
【請求項２】  真核細胞におけるトランスジェニック操作(transgenic work)のための原核細胞性β-リコンビナーゼの使用。
【請求項３】  真核生物における遺伝子発現を調節するための請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】  トランスジェニック植物の作成における植物ゲノムを操作するための請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】  真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】  病原性細菌およびグラム陽性細菌を操作する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】  真核細胞における２つのｓｉｘ部位の間の部位特異的分子内組換えのための、請求項１から６の何れかに記載の使用。
【請求項８】  同時に２以上の異なる特異的組換えの促進のための、請求項７に記載の使用。
【請求項９】  排他的な分子内反応を媒介する、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】  原核細胞性β-リコンビナーゼが哺乳類細胞の直列方向(directly oriented)ｓｉｘ部位の間に位置するＤＮＡ配列の欠失を促進する、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】  原核細胞性β-リコンビナーゼが哺乳類細胞の逆位反復ｓｉｘ部位の間に位置するＤＮＡ配列の逆位を促進する、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】  原核細胞性β-リコンビナーゼが２つの直列方向ｓｉｘ部位の間にあるＤＮＡ断片の欠失を促進する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】  原核細胞性β-リコンビナーゼが２つの逆方向(inversely oriented)ｓｉｘ部位の間にあるＤＮＡ断片の逆位を促進する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】  原核細胞性β-リコンビナーゼがダイレクト・リピート特異的認識配列の間にあるＤＮＡ断片の欠失を促進する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】  原核細胞性β-リコンビナーゼが逆位反復特異的認識配列の間にあるＤＮＡ断片の逆位を促進する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】  特異的認識配列が染色体外ＤＮＡ基質として位置する、請求項１０、１１、１２または１３に記載の使用。
【請求項１７】  真核細胞に導入した染色体外標的中のＤＮＡ配列の部位特異的分離を触媒するための、β-リコンビナーゼをコードする遺伝子の使用。
【請求項１８】  染色体外標的がプラスミドであるときにＤＮＡ配列の部位特異的分離を触媒する、請求項１７に記載の遺伝子の使用。
【請求項１９】  導入をトランスフェクションにより行う、請求項１７または１８に記載の遺伝子の使用。
【請求項２０】  分離が欠失を意味する、請求項１７から１９の何れかに記載の遺伝子の使用。
【請求項２１】  分離が逆位を意味する、請求項１７から１９の何れかに記載の遺伝子の使用。
【請求項２２】  ＤＮＡ配列がｓｉｘ部位の間に配置される、請求項１７から２１の何れかに記載の遺伝子の使用。
【請求項２３】  ｓｉｘ部位がゲノム中にクロマチン関連(chromatin associated)構造として組込まれている、請求項１７から２２の何れかに記載の遺伝子の使用。
【請求項２４】  ｓｉｘ部位が、数箇所で、ゲノム中に組込まれ、ヌクレオソーム上で覆われているときの、請求項１７から２２の何れかに記載の遺伝子の使用。
【請求項２５】  ヒト遺伝子治療における遺伝子送達用に新技術を発達させるための請求項１に記載の使用。
【請求項２６】  請求項１-２１の何れかに記載のβ-リコンビナーゼの使用を含む、トランスジェニック動物の発生の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、真核細胞における原核生物性リコンビナーゼの使用、特に真核生物におけるトランスジェニック操作(transgenic work)のための使用に関係する。真核細胞における分子内組換えのための、そして分子内反応を排他的に媒介するための原核生物性β-リコンビナーゼの使用にも関係する。プラスミド(染色体外標的)における２つの標的配列(ｓｉｘ部位を含むＤＮＡ配列)をトランスフェクションにより細胞中に導入するとき、または標的配列が幾つかの位置にクロマチン関連(chromatin associated)構造としてゲノム中に組込まれるときＤＮＡ配列の部位特異的分離(欠失)を触媒するためのβ-リコンビナーゼをコードする遺伝子の使用をも開示する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
部位特異的リコンビナーゼは２つの主なファミリーを構成し得る。最初に、１つ(Ｉｎｔファミリー)は、同一ＤＮＡ分子(分離または逆位を生ずる分子内組換え)中か、別のＤＮＡ分子(組込みを生ずる分子内組換え)中のいすれかに位置する部位の間の組換えを触媒する酵素を含む(４-７)。後者の特性が開発され、正確な位置に特異的配列が標的挿入できるようになった(８、９)。哺乳類ゲノムの操作に使用するリコンビナーゼは、主にＣｒｅおよびＦｌｐタンパク質であり、それらは、Ｉｎｔファミリーに属する(３)。Ｃｒｅ酵素ではｌｏｘＰ部位およびＦｌｐではＦＲＴと名付けた、これら酵素の標的配列は、タンパク質が結合するショート・インバーテット・リピートからなる。その組換え法は、ゲノム中で離れた位置(７０ｋｂまで)であっても操作できる。これら酵素を用い、数人の著作者たちは、ネズミのモデルで部位-および組織-特異的ＤＮＡ組換え(１０-１３)、植物および動物でクロモソームトランスロケーション(１４-１６)ならびに特異的遺伝子の標的導入(１７)について報告している。例えば、ｌｃｋ近位プロモーターからのＣｒｅ発現により、胸腺において特異的組換えが生ずる(１０)。ＤＮＡポリメラーゼβをコードする遺伝子は、同じストラテジーを用い組織特異的に欠失した(１１)。他のアプローチでは、ＳＶ４０ラージ腫瘍抗原がマウスの水晶体で特異的に活性化し、その位置で腫瘍が生じ、動物の他の部分では生じなかった(１８)。また、Ｃｒｅ-ｌｏｘＰストラテジーを、インターフェロンγ誘導プロモーターの場合のように誘導プロモーターと組合せて使用し、肝臓では効率が高く他の組織では効率がそれより低い遺伝子切除(gene ablation)の誘発に使用した(１２)。しかし、この強力な部位特異的組換えシステムは、同じゲノム内で数少ない組換えが誘発されるのみである。各組換え反応がゲノム中の交差部位で標的配列がリコンビナーゼのために残されており、そして、インテグラーゼ(例えばＣｒｅおよびＦｌｐ)が分子内組換えを触媒することができるため、過程全体から望ましくないクロモソームの再配列が生じ得る。この全体的な制限が提唱され、ｌｏｘＰ配列の変異バージョンの使用により部分的に解明された(１８)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
早くから知られているＣｒｅシステムは、同じマウスゲノム内で数少ない組換えが導入され得るという意味で限定されている。条件付ノックアウトマウスを、このシステムを用いて作成するとき、ｌｏｘＰ部位はゲノム中に残ったままであり、未知の結果を生ずる他の組換えの可能性がある標的を構成する。この問題は、排他的な分子内部位特異的リコンビナーゼを用い、十分に克服出来た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
我々の結果によると、β-リコンビナーゼは、宿主細胞により提供される機構／因子を用いて真核生物性環境でも活性があり、β-リコンビナーゼは哺乳類ゲノムにおいて正確に、および効率よく部位特異的組換えを触媒する。我々は、原核生物性β-リコンビナーゼが真核細胞において機能的に発現でき、哺乳類細胞における直列方向標的部位(directly oriented target site)(β-タンパク質により媒介される分子内組換え活性、ＩＲＡＰ)の間に位置するＤＮＡ配列の欠失を促進できることを示す。分子内部位特異的組換えを触媒し得るのみのＩＲＡＰシステムのようなツールの有用性により、真核生物性ゲノムのプログラム修飾に多様な可能性が生じ、特に既存の方法と組み合わせる場合に生じる。例えば目的の遺伝子は、エキソンまたはｌｏｘＰ／ＦＲＴおよびｓｉｘ部位に隣接するエキソン群を有するため、工作した。これにより、異なる発生段階の２つの別個の組織(distinct tissue)または同じ組織における遺伝子産物の影響を、Ｃｒｅ／ＦｌｐおよびＩＲＡＰ発現の異なる調節を通じ、研究することができた。他に、２つの関連遺伝子が、同時に、または２つの関連する段階で不活性化した。誘導性プロモーターの使用がまた、より特異的な空間-時間的な組換えの調節を可能とした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
異なるゲノム部位にランダムに挿入したｐＣＢ８ＤＮＡを有する安定な細胞クローンが、ｐＣＢ８ＤＮＡ ２０ｍｇおよびネオマイシン耐性をコードするマーカーＤＮＡを１０：１の割合を用い、２２０Ｖ、９６０ｍＦで、２ｘ１０６ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のＢｉｏ-Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ(Hercules, CA)中でエレクトロポレーションにより得られた。ネオマイシン耐性細胞を、約２週間、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８(Sigma)で選択した。得られた安定なクローンを、述べられているような、サザン実験(２８)または間接免疫蛍光法で分析した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
トランスフェクトした細胞を、カバースリップ上で増殖させた。４８時間後、細胞を、メタノール：アセトン(１：１)中に、-２０℃で５分間、固定化させ、風乾し、ＰＢＳで再度水和した。次いで、細胞を、ポリクローナル抗-β-リコンビナーゼ抗体(１：５０００希釈)と共に室温で３０分間インキュベーションし、５分間、３回、ＰＢＳで洗浄し、再び、蛍光結合抗ＩｇＭ抗体(DAKO, Glostrup, Denmark)と共に、１時間、３７℃でＰＢＳ中でインキュベーションした。細胞を顕微鏡のスライドにマウントし、蛍光顕微鏡で写真撮影した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
結果
哺乳類細胞における原核細胞性β-リコンビナーゼの発現
β-リコンビナーゼのコーディング配列を、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターからの発現を指示するｐＳＶ２βグロビン中にクローニングした。得られた構成、ｐＳＶβ(図１Ｂ)を、ＳＶ４０ Ｔ-抗原を発現するＣＯＳ-１細胞に一時的にトランスフェクトした。これらの条件下、初期ＳＶ４０プロモーター(ｐＳＶβ中に含まれる)を含むプラスミドによる発現が増幅する。β-リコンビナーゼ遺伝子を含まない対照プラスミド(ｐＳＶｃと名付けた)も作成した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
付加的なタンパク質因子を必要としないＣｒｅおよびＦｌｐといった単純な組換え部位を有するインテグラーゼと異なり(４、５、７)、β-リコンビナーゼはＤＮＡ組換えを媒介ためにするクロマチン関連タンパク質を強力に必要とする(２０、２２)。β-リコンビナーゼは、ｓｉｘ部位に結合し、クロマチン関連タンパク質の助けと共に図１Ａに示すように鎖交換を促進する。哺乳類ＨＭＧ１／ＨＭＧ２クロマチン関連タンパク質は、類似のＢ．ＳｕｂｔｉｌｉｓまたはＥ．ｃｏｌｉタンパク質、それぞれＨｂｓｕおよびＨＵの機能を、少なくともインビトロで代理できる(２２)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
真核性細胞がこの宿主因子に関係するかどうか決定するために、β-リコンビナーゼに起因する組換え活性を、プラスミドｐＳＶβ(β-リコンビナーゼ遺伝子を生ずる)およびｐＣＢ８(ｘｙｌＥ遺伝子に隣接する直列方向のβ-リコンビナーゼの２つの標的部位を含む基質ＤＮＡ、図１Ｂ参照)を有するＣＯＳ-１細胞中の一過性の共トランスフェクションにより、最初にチェックした。組換えにおいて、単一のｓｉｘ部位を有するｐＣＢ８の誘導体が得られた。この組換え産物の存在は、１つのｓｉｘ部位の上流に位置する配列(図１Ｂ、ならびに物質および方法中のプライマー)、および２つ目のｓｉｘ部位の下流に位置する配列(図１Ｂ、ならびに物質および方法中のプライマー)に相補的なプライマーを用い、Ｈｉｒｔ抽出のＰＣＲ増幅により、容易にモニターできる。ｐＣＢ８において、これら２つのプライマーが２．７ｋｂ以上離れて位置する配列とハイブリダイズする。我々のＰＣＲ条件下では、この断片は効率よく増幅しない。一方、５５５ｂｐＤＮＡセグメントは、組換え産物から増幅した。同様の長さのバンドが、同じプライマーおよび単一のｓｉｘ部位を含むプラスミドｐＢＴ３３８を用いたときに得られ、陽性対照として使用した(図１Ｂ)。そのため、ＣＯＳ-１細胞のトランスフェクション後(４８時間)、細胞の染色体外画分(Ｈｉｒｔ抽出)を精製し、組換え産物の存在をＰＣＲにより分析した。予想される長さ(５５５ｂｐ)の明瞭な増幅バンドが、ｐＣＢ８およびｐＳＶβプラスミドの両方を共トランスフェクトしたときのみ、観察された(図３参照)；このバンドは、２つのＤＮＡを別々にトランスフェクトしたとき、またはｐＣＢ８をｐＳＶｃ、陰性対照プラスミドと共トランスフェクトしたとき、見られなかった。増幅バンドの特異性は、更に、ｓｉｘ部位に特異的なプローブを用いるサザンハイブリダイゼーション(下記パネル)により確認した(図１Ａ参照)。適当な大きさの陽性シグナルが、陽性対照レーン(図３、ｐＢＴ３３８)、およびｐＣＢ８／ｐＳＶβ共トランスフェクトサンプルでのみ検出された。ｐＳＶβプラスミドを含むトランスフェクションに相当するレーンにおいて、アガロースゲルで検出されたより小さい大きさの付加的なバンドは、プローブとハイブリダイズしなかったので非特異的であるといえた。これらの結果が示すのは、宿主細胞により提供される機構／因子を用いる真核細胞性環境においてβ-リコンビナーゼは活性があることである。β-リコンビナーゼはクロマチン構造において組換えを促進する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
これら問題は、空間-時間的なターゲッティングの調節が可能な、部位特異的組換え技術の発達および適用(７にレビュー)により、部分的に克服されてきた。これはＣｒｅ-ｌｏｘＰおよびＦｌｐ-ＦＲＰシステムの場合である(４および３にレビュー)。それにも拘わらず、Ｃｒｅシステムは非常に有用であることが証明されているが、同じマウスゲノム内で起きる少数の組換えのみが可能となるという意味で制限されているように思われる。条件ノックアウトマウスを、このシステムを用い作成すると、ｌｏｘＰ部位はゲノム中に維持され、未知の結果となる他の組換えの可能な標的を構成する。この問題は、排他的に分子内部位特異的リコンビナーゼが使用される場合に克服された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
この報告において、我々が示すのは、原核生物性β-リコンビナーゼが機能的に真核細胞中で発現でき、哺乳類細胞中の直列方向標的部位(βタンパク質により媒介される分子内組換え活性、ＩＲＡＰ)の間に位置するＤＮＡ配列の欠失を促進できることである。間接免疫蛍光法において非常に圧縮され、斑点を有するパターンを形成する核領域中で主にトランスフェクション後検出されるため、タンパク質は核画分に対し高い活性を有すると思われる。この様子は、Ｃｒｅ酵素で観察される場合と同様である(１３)。Ｃｒｅまたはβ-リコンビナーゼは何れも、最初の配列、標準的または二分した核局在モチーフ中に存在しない(３５、３６)。それらは核画分にアクセスするため、この局在化は、核膜を通して、または次の、有糸分裂間のこの膜の一過性分裂による拡散により生ずると我々は仮定している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
最初の結果が示すのは、ＮＩＨ／３Ｔ３中の構造性ＩＲＡＰ発現は通常の細胞発生と一致することである(示さず)。タンパク質のインビボ発現のトランスジェニックマウスモデルは開発中である。これにより、正確な標的の修飾のための、ＩＲＡＰ-ｓｉｘシステムのインビボの効力が説明された。