【手続補正書】
【提出日】平成17年7月1日(2005.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロアミダイト化学を使用してオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、フリーヒドロキシ若しくはチオール基を有するヌクレオシド又は新生（nascent）オリゴヌクレオチドとヌクレオシドホスホロアミダイトをカップリング剤の存在下でカップリングすることを含んでなり、ここでカップリング剤は、以下の構造式：
【化１】
2004533488.tif 000001
［式中：
ｐは、０であるか、又は１〜４の整数であり；
Ｘ7は、Ｏ又はＳであり；そして
Ｒは、それぞれの存在につき、置換基である］により表される１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンである、前記方法。
【請求項２】
それぞれのＲが、独立して、ハロ、置換又は非置換脂肪族基、−ＮＲ11Ｒ12、−ＯＲ13、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ13、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ13、シアノ、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロシクリル、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ13、−ＮＨＣＯＲ13、置換又は非置換アラルキル、又は−ＳＲ13であるか；又は２つの隣接Ｒ基が、それらへ付いた炭素原子と一緒に６員の飽和又は不飽和環を形成し；ここで：
Ｒ11及びＲ12は、それぞれ、独立して、−Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル基であるか；又はそれらへ付いた窒素原子と一緒にヘテロシクリル基を形成し；そして
Ｒ13は、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、又は置換又は非置換アラルキル基である、請求項１の方法。
【請求項３】
有機塩基がカップリング反応の間にカップリング剤とともに存在する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
有機塩基がアミンである、請求項３の方法。
【請求項５】
アミンが三級アミンである、請求項４の方法。
【請求項６】
三級アミンが、トリアルキルアミン、置換又は非置換Ｎ−アルキルピロリジン、置換又は非置換Ｎ−アリールピロリジン、置換又は非置換Ｎ−アルキルピロール、置換又は非置換Ｎ−アリールピロール、置換又は非置換Ｎ−アルキルモルホリン、置換又は非置換Ｎ−アリールモルホリン、置換又は非置換Ｎ−アルキルピペリジン、置換又は非置換Ｎ−アリールピペリジン、置換又は非置換Ｎ，Ｎ−ジアルキルピペラジン、置換又は非置換Ｎ，Ｎ−ジアリールピペラジン、置換又は非置換Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールピペラジン、置換又は非置換キヌクリジン、及び置換又は非置換１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンからなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
アミンが置換又は非置換アザヘテロシクリル化合物である、請求項４の方法。
【請求項８】
アザヘテロシクリル化合物が、置換又は非置換ピリミジン、置換又は非置換１−アルキルピラゾール、置換又は非置換１−アリールピラゾール、置換又は非置換ピラジン、置換又は非置換Ｎ−アルキルプリン、置換又は非置換Ｎ−アリールプリン、置換又は非置換Ｎ−アルキルピロール、置換又は非置換Ｎ−アリールピロール、置換又は非置換ピリジン、置換又は非置換Ｎ−アルキルイミダゾール、置換又は非置換Ｎ−アリールイミダゾール、置換又は非置換キノリン、置換又は非置換イソキノリン、置換又は非置換キノキサリン、置換又は非置換キナゾリン、置換又は非置換Ｎ−アルキルインドール、置換又は非置換Ｎ−アリールインドール、置換又は非置換Ｎ−アルキルベンゾイミダゾール、置換又は非置換Ｎ−アリールベンゾイミダゾール、置換又は非置換トリアジン、置換又は非置換チアゾール、置換又は非置換１−アルキル−７−アザインドール、置換又は非置換１−アリール−７−アザインドール、置換又は非置換ピロリジン、置換又は非置換モルホリン、置換又は非置換ピペリジン、及び置換又は非置換ピペラジンからなる群より選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
アザヘテロシクリル化合物が、ピリジン、３−メチルピリジン、又はＮ−メチルイミダゾールである、請求項８の方法。
【請求項１０】
ヌクレオシドホスホロアミダイトがモノマーである、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
ヌクレオシドホスホロアミダイトがダイマーである、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
ホスホロアミダイトが、以下の構造式：
【化２】
2004533488.tif 000002
［式中：
それぞれのＸ1は、独立して、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
それぞれのＸ2は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ14−であり；
それぞれのＸ3は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）2−であり；
Ｒ1は、アルコール保護基又はチオール保護基であり；
Ｒ2は、−Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、又は−ＳＲ9であり；
Ｒ3は、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、置換又は非置換脂肪族基、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、又は−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2であり；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキルであるか；又は
Ｒ4及びＲ5は、それらへ結合した窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成し；そして
Ｒ6は、−Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル、ヒドロキシ保護基、又は−（ＣＨ2）q−ＮＲ18Ｒ19であり；
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、又はアミン保護基であるか；又は
Ｒ7及びＲ8は、それらへ付いた窒素と一緒にヘテロシクリル基となり；そして
Ｒ9は、Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、又はチオ保護基であり；
Ｒ10は、それぞれの存在につき、独立して、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、又は置換又は非置換アラルキル基であり、
Ｒ14は、−Ｈ、アルキル基、アリール基、又はアラルキル基であり；
Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、−Ｈ、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換ヘテロアリール基、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換へテロアラルキル基、又はアミン保護基であるか；又は
Ｒ18及びＲ19は、それらへ付いた窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成し；そして
ｑは、１〜約６の整数であり；そして
それぞれのＢは、独立して、−Ｈ、天然又は非天然ヌクレオ塩基、保護化天然又は非天然ヌクレオ塩基、複素環、保護化複素環である］の１つにより表される３’−ホスホロアミダイトである、請求項１０の方法。
【請求項１３】
Ｘ7がＯであり、ｐが０である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンのヌクレオシドホスホロアミダイトに対するモル比が約０．２：１〜５：１の範囲にある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
以下の構造式：
【化３】
2004533488.tif 000003
［式中：
それぞれのＸ1は、独立して、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
それぞれのＸ2は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＲ14−であり；
それぞれのＸ3は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、又は−（ＣＨ2）2−であり；
それぞれのＸ4は、独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｘ5は、−ＯＨ又は−ＳＨであり；
それぞれのＲ2は、独立して、−Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、又は−ＳＲ9であり；
それぞれのＲ3は、独立して、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、置換又は非置換脂肪族基、−ＯＲ10、−ＳＲ10、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、又は−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2であり；
それぞれのＲ6は、独立して、Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル、ヒドロキシ保護基、又は−（ＣＨ2）q−ＮＲ18Ｒ19であり；
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、又はアミン保護基であるか；又は
Ｒ7及びＲ8は、それらへ付いた窒素と一緒にヘテロシクリル基となり；そして
Ｒ9は、Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、又はチオ保護基であり；
Ｒ10は、それぞれの存在につき、独立して、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、又は置換又は非置換アラルキル基であり、
それぞれのＲ14は、独立して、−Ｈ、アルキル基、アリール基、又はアラルキル基であり；
Ｒ16は、ヒドロキシ保護基、チオ保護基、アミノ保護基、−（ＣＨ2）q−ＮＲ18Ｒ19、固形支持体、又は固形支持体へ付いた切断可能リンカーであり；
Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、−Ｈ、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換ヘテロアリール基、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換へテロアラルキル基、又はアミン保護基であるか；又は
Ｒ18及びＲ19は、それらへ付いた窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成し；そして
ｑは、１〜約６の整数であり；
それぞれのＢは、独立して、−Ｈ、天然又は非天然ヌクレオ塩基、保護化天然又は非天然ヌクレオ塩基、複素環、保護化複素環であり；そして
ｎは、０であるか又は正の整数である］により表されるＮマー（Ｎ−ｍｅｒ）オリゴヌクレオチド、又はヌクレオシドを、以下の式：
【化４】
2004533488.tif 000004
［式中：Ｒ2、Ｒ3、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＢは、先述のように定義され；
Ｒ1は、アルコール保護基又はチオール保護基であり；そして
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキルであるか；又は
Ｒ4及びＲ5は、それらへ結合した窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成する］により表されるヌクレオシドホスホロアミダイトと縮合する方法であって、
該オリゴヌクレオチド又はヌクレオシドを該ヌクレオシドホスホロアミダイトと以下の構造式：
【化５】
2004533488.tif 000005
［式中：
ｐは、０であるか、又は１〜４の整数であり；
Ｘ7は、Ｏ又はＳであり；そして
Ｒは、それぞれの存在につき、置換基である］により表される１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンと接触させる工程を含んでなり、
それにより以下の構造式：
【化６】
2004533488.tif 000006
により表される、５’末端の３価リン連結を有する（ｎ＋１）オリゴヌクレオチドを生じる、前記方法。
【請求項１６】
それぞれのＲが、独立して、ハロ、置換又は非置換脂肪族基、−ＮＲ11Ｒ12、−ＯＲ13、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ13、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ13、シアノ、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロシクリル、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ13、−ＮＨＣＯＲ13、置換又は非置換アラルキル、又は−ＳＲ13であるか；又は２つの隣接Ｒ基が、それらへ付いた炭素原子と一緒に６員の飽和又は不飽和環を形成し；ここで：
Ｒ11及びＲ12は、それぞれ、独立して、−Ｈ、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル基であるか；又はそれらへ付いた窒素原子と一緒にヘテロシクリル基を形成し；そして
Ｒ13は、置換又は非置換脂肪族基、置換又は非置換アリール基、又は置換又は非置換アラルキル基である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド又はヌクレオシドをホスホロアミダイト及び１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンと接触させるときに、有機塩基が存在する、請求項１５又は１６の方法。
【請求項１８】
有機塩基と１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンの濃度が約０．０１Ｍ〜約２Ｍである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オ
ンのヌクレオシドホスホロアミダイトに対するモル比が約０．２：１〜５：１の範囲にある、請求項１５〜１８のいずれか１項の方法。
【請求項２０】
ａ）５’末端の３価リン連結を有する（ｎ＋１）オリゴヌクレオチドを酸化剤若しくは硫化剤と接触させることによって、以下の構造式：
【化７】
2004533488.tif 000007
により表される５価リン骨格を有するオリゴヌクレオチドを生じる工程；
ｂ）場合により、ホスホロアミダイトと反応しなかったＸ5基を、該Ｘ5基を酸塩化物又は無水物と反応させることによってキャッピングする工程；
ｃ）５価リン骨格を有する（ｎ＋１）オリゴヌクレオチドを、Ｒ1を除去する試薬とそれを反応させることによって脱保護する工程；
ｄ）場合により、先のカップリング工程、酸化若しくは硫化工程、キャッピング工程、及び脱保護工程を１回以上繰り返す工程をさらに含んでなる、請求項１５〜１９のいずれか１項の方法。
【請求項２１】
酸化若しくは硫化工程が最終工程であり、オリゴヌクレオチドが以下の構造式：
【化８】
2004533488.tif 000008
［式中：
ｍは、ｎより大きい整数である］により表される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
脱保護工程が最終工程であり、製造されるオリゴヌクレオチドが以下の構造式：
【化９】
2004533488.tif 000009
［式中：
ｍは、ｎより大きい整数である］により表される、請求項２０の方法。
【請求項２３】
Ｒ16が固形支持体へ付いた切断可能リンカーである、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）オリゴヌクレオチドが各カップリング工程の後で酸化され、該オリゴヌクレオチド
がホスホジエステルオリゴヌクレオチドとなる；
ｂ）オリゴヌクレオチドが各カップリング工程の後で硫化され、製造される該オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとなる；又は
ｃ）オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのカップリング工程の後で酸化され、そして少なくとも１つのカップリング工程の後で硫化され、製造される該オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドとなる、請求項２０の方法。
【請求項２５】
Ｘ7がＯであり、ｐが０である、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが、その後に引き続いて精製される、請求項２１又は２２の方法。
【請求項２７】
ヌクレオシドホスホロアミダイトを、フリーヒドロキシ基を含んでなるヌクレオシド又は新生オリゴヌクレオチドとアクチベーターの存在下でカップリングすることを含んでなるオリゴヌクレオチドの合成法であって、ここで該アクチベーターは、１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オン及びＮ−アルキルイミダゾールの混合物を含む、前記方法。
【請求項２８】
ヌクレオシドホスホロアミダイトがヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトであり、ヌクレオシド又は新生オリゴヌクレオチドがフリー５’−ヒドロキシ基を含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
Ｎ−アルキルイミダゾールがＮ−メチルイミダゾールである、請求項２７又は２８の方法。
【請求項３０】
ホスホロアミダイトが式：−Ｐ（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）2の部分を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オン及びＮ−アルキルイミダゾールのそれぞれの濃度が０．１〜０．２５Ｍである、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンのＮ−アルキルイミダゾールに対するモル比が約１：１〜約１．５：１である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンのホスホロアミダイトに対するモル比が０．５：１〜２：１である、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｎ−アルキルイミダゾールと、以下の構造式：
【化１０】
2004533488.tif 000010
［式中：
ｐは、０であるか、又は１〜４の整数であり；
Ｘ7は、Ｏ又はＳであり；そして
Ｒは、それぞれの存在につき、置換基である］により表される１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンを含んでなる、塩複合体。
【請求項３５】
ｐが０であり、Ｘ7がＯであり、そしてＮ−アルキルイミダゾールがＮ−メチルイミダゾールである、請求項３４の塩複合体。
【請求項３６】
ホスホロアミダイト化学によってオリゴヌクレオチドを合成するための、以下の構造式：
【化１１】
2004533488.tif 000011
［式中：
ｐは、０であるか、又は１〜４の整数であり；
Ｘ7は、Ｏ又はＳであり；そして
Ｒは、それぞれの存在につき、置換基である］により表される１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンの使用。
【請求項３７】
１，１−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−１λ6−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オンがＮ−アルキルイミダゾールを含む塩複合体として用いられ、Ｘ7がＯであり、そしてｐが０である、請求項３６の使用。