【手続補正書】
【提出日】平成17年6月27日(2005.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｈｅｍＲ２３に結合する物質（以下、「結合物質」という）の同定方法であって、
ａ）候補結合物質の存在及び不在下において、配列ＩＤ  Ｎｏ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドまたは該末端切断型ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドを、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに結合することを許容する状態下で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと接触させる工程；及び
ｂ）前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドと前記ＣｈｅｍＲ２３との結合を測定し、前記候補結合物質の不在下での前記結合に対して、前記候補結合物質の存在下での前記結合が減少していれば、当該候補結合物質を、ＣｈｅｍＲ２３に結合する物質であると同定する工程
を含む同定方法。
【請求項２】
前記物質は、サンプル中に存在している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性を減少させる物質を同定する方法であって、
ａ）前記物質の存在又は不在下で、配列ＩＤ  Ｎｏ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドと、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとを接触させる工程；
ｂ）前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
ｃ）前記ＣｈｅｍＲ２３と、前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドとを含み、前記物質は含まない反応で測定された前記活性量を、
前記ＣｈｅｍＲ２３と、前記末端切断型ＴＩＧ２又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドと、前記物質とを含む反応で測定された前記活性量を比較し、
前記物質の不在下での活性に対して、前記物質の存在下での該活性が減少していれば、前記物質を、ＣｈｅｍＲ２３に対するアンタゴニストであると同定する工程
を含む方法。
【請求項４】
前記物質はサンプル中に存在している請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣｈｅｍＲ２３のシグナリングを増大させる物質の同定方法であって、
ａ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをある物質と接触させる工程；
ｂ）前記物質の存在下でのＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
ｃ）前記物質の存在下で測定されたシグナル活性と、
配列ＩＤ  Ｎｏ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドと、前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとが接触している反応で測定された前記シグナル活性とを比較し、
前記物質の存在下で測定された前記シグナリング活性量が、前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドによって誘導されるシグナリング活性量の少なくとも１０％であれば、前記物質をＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリングを増大させるアゴニストであると同定する工程
を含む方法。
【請求項６】
前記物質は、サンプル中に存在している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドが検出可能な標識で標識付けされている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は前記ＴＩＧ２ポリペプチドが、ラジオアイソトープ、発蛍光団、蛍光消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる１種で検出可能に標識付けされている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で、前記接触が行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
合成リポソーム内又は合成リポソーム上で、前記接触が行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを含む、ウィルス誘導されて出芽している膜内または膜上で、前記接触が行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて行われる請求項１〜９又は１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光分極から選択される方法を用いて行われる請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
前記物質は、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体の抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性の測定工程は、セカンドメッセンジャーのレベル変化の検出工程を含む請求項３〜６及び９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
シグナリング活性の前記測定工程は、グアニンヌクレオチドの結合若しくは変換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸（arachinoid acid）、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含む請求項３〜６及び９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナリング活性の測定工程は、エクオリンベース分析（aequorin-based assay）を用いる工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣｈｅｍＲ２３の結合若しくはシグナリング活性をモジュレートする物質、又はＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断するための物質をスクリーニングするためのキットであって、
単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと；単離された、配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドと；これらをパッケージングする材料とを含んでいるキット。
【請求項１９】
ＣｈｅｍＲ２３の結合若しくはシグナリング活性をモジュレートする物質、又はＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾病又は疾患を診断するための物質をスクリーニングするためのキットであって、
ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドと；配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドと；これらをパッケージングする材料とを含んでいるキット。
【請求項２０】
細胞内のＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性をモジュレートするインビトロの方法であって、
配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドを、前記細胞に配達する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記ＴＩＧ２をコードしているヌクレオチドはアプタマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣｈｅｍＲ２３のシグナリングをモジュレートする物質のスクリーニング用キットの製造のための、又は癌、腫瘍の転移、炎症疾患、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌の診断用キットの製造ための、
配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
【請求項２３】
ＣｈｅｍＲ２３のリガンドとしての、配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
【請求項２４】
単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと；
単離された、配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチド又は該末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチドと
を含む組成物。
【請求項２５】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドが、末端切断型ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含む請求項１〜１７、２０及び２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドが、末端切断型ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含む請求項１８又は１９のキット。
【請求項２８】
前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドが、末端切断型ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含む請求項２２又は２３の使用。
【請求項３０】
前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドが、末端切断型ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
配列ＩＤ  ＮＯ：４８で示される切断されたＴＩＧ２ポリペプチド、又は該切断されたＴＩＧ２ポリペプチドについて付加、挿入、欠失若しくは置換を含むが前記切断されたＴＩＧ２ポリペプチドのシグナリング活性及び結合活性の少なくとも５０％を保持するＴＩＧ２ポリペプチド、又はこれらを含む融合タンパク質。
【請求項３４】
請求項３３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
図９は、ヒトのＴＩＧ２配列（≪ｔｉｇ２）≫配列ＩＤ  ＮＯ：８）、ラットのＴＩＧ２配列（配列ＩＤ  ＮＯ：３１）、マウスのＴＩＧ２配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１０）、ｓｕｓＴＩＧ２配列（sus Scrofa）（配列ＩＤ  ＮＯ：３２）、ｂｏｓのＴＩＧ２配列（BOS taurus）（配列ＩＤ  ＮＯ：３３）、及びｇａｌｌｕｓのＴＩＧ２配列（Gallus gallus）（配列ＩＤ  ＮＯ：３４）を示す。この図は、リストに挙げたいずれの２つの種も交差するアミノ酸のアイデンティティ％を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
図１７は、末端切断型ヒトＴＩＧ２のポリペプチド（配列ＩＤ  ＮＯ：４６）とポリヌクレオチド（配列ＩＤ  ＮＯ：４７）を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
この分析に対する基質は、ミリストイル化（myristoylated）アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）から誘導されるペプチドＡｃ‐ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列ＩＤ  ＮＯ：３５）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。この分野で既知のほかの基本的なプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、この分析で要求されるこれらのＫｍコファクターの少なくとも２−３倍の濃度で、用いられることができる。当該コファクターとしては、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン、及びジアシルグリセロールが含まれる。ユーザーの意向に依存して、この分析は、ＰＫＣ存在量（活性化条件）又は活性ＰＣＫ存在量（非活性化条件）を決めるために行われる。本発明の最も多くの目的は、むしろ、活性化されることができるＰＫＣを測定するよりも、それが単離されるときにサンプル内で活性であるＰＫＣが測定されるように、非活性化条件が用いられることである。非活性化条件のために、分析内でＥＧＴＡを支持して、カルシウムが省かれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
ＮＦ−κＢ結合要素は、一致配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列ＩＤ  ＮＯ：３６）を有する。大量の遺伝子が、ＮＦ−κＢ応答として同定され、これらのコントロール要素は、レポータ遺伝子に連結されて、ＧＰＣＲ活性をモニタする。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子の小さなサンプルは、ＩＬ−１βをコードする遺伝子（Hiscottら，1993年，Mol.Cell.Biol.  13:6231-6240），ＴＮＦ−α（Shakhovら，1990年，J.Exp.Med.171:35-47），ＣＣＲ５（Liuら，1998年，AIDS Res.Hum.Retroviruses14:1509-1519），Ｐ−セレクチン（Pan＆McEver，1995年,J.Biol.Chem.270:23077-2308３），Ｆａｓリガンド（Matsuiら，1998年，J.Immunol.  161:3469-3473），ＧＭ−ＣＳＦ（Schreck＆Baeuerle，1990年，Mol.Cell.Biol.10:1281-1286）及びＩκＢα（Haskillら，1991年，Cell 65:1281-1289）を含む。これらの参考文献のいずれも参考として本明細書に組み入れられる。ＮＦ−κＢ応答レポータをコードするベクターは、当該分野でも既知で、あるいは例えば合成ＮＦ−κＢ要素及び最小プロモータを用いて、あるいはＮＦ−κＢ調節に従うと知られている遺伝子のＮＦ−κＢ応答配列を用いて当業者によって容易く作られることができる。さらにＮＦ−κＢ応答レポータ構成成分は、例えばクローンテック社から市販されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
ノックアウト動物
ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２又はこれらの変異体のいずれかをコードする染色体配列の中でのホモ接合欠失を有する動物は、レセプター及びリガンドの機能の研究に用いられることができる。特別な興味は、ＴＩＧ２ノックアウトが識別できる表現型を有しているかどうかである。この表現型は、ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３に結合する唯一のリガンドか否か、それがファミリーのメンバーであるかどうかということを指し示すことができる。さらに特別の興味は、特異的な生理学上及び／又は病理学的プロセスにおけるＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２の同定である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
ｉ．標準的ノックアウト動物
ノックアウト動物は、相同的組換えで遺伝子欠失を作り出す方法によって製造される。この技術は、胚から誘導される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の発達に基づき、培養の中で保持されて宿主の胚盤胞の中に誘導されるとき、動物の中の各組織の発達に参加できる可能性を有する。ノックアウト動物は、ＥＳ細胞に特異的な標的遺伝子との相同的組換えを行うことによって製造され、これにより、ヌル対立遺伝子を生産する。ノックアウト動物を生産する技術がよく説明されている（例えば、Huszarら、1997年，Cell,88:131；及びOhki-Hamazakiら，1997年,Nature,390:165,を参照。これらはいずれも参考のために、本明細書に組み入れられる）。当業者は、ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２の配列を用いて、ホモ接合のＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２ノックアウト動物（例えばマウス）を生産し（当該分野で知られており、本明細書に開示されている）、遺伝子標的構成成分をつくることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
実施例１０：ＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３の組織分布
半定量ＲＴ−ＰＣＲが、種々のヒト組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡと全ＲＮＡ（クローンテックとアンビオン）上で、ｈＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３に対する遺伝子特異的プライマーを用いて、行われた。要するに、血液細胞由来の全ＲＮＡがＲｎｅａｓｙ・Ｍｉｎｉ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製された。ｈＴＩＧ２プライマーは、進行方向が（５’−ＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３７）で、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＡＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３８）、逆方向は（５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：３９）である。このｈＣｈｅｍＲ２３プライマーは、進行方向が（５’−ＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４０）、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４１）、逆方向は、（５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４２）である。プライマーはハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに進行方向（５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４３）で、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４４）で逆方向（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’；配列ＩＤ  ＮＯ：４５）に設計されたプライマーが用いられて、参考ｍＲＮＡプロファイルを製造した。様々な組織内でのｈＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３の分布は、それぞれ図１５及び図１６に示される。ｈＴＩＧ２又はＣｈｅｍＲ２３の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ参考ｍＲＮＡ発現に対するｈＴＩＧ２又はＣｈｅｍＲ２３の比として表される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８−１】
2005500047.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８−２】
2005500047.tif 000002
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８−３】
2005500047.tif 000003
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８−４】
2005500047.tif 000004