【手続補正書】
【提出日】平成18年5月18日(2006.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性媒質中でパラジウム・プロモーターにより促進される反応にて基質ポリペプチドを切断することを含む（ここに、基質ポリペプチドは、切断されたときカルボキシル末端でアミド化される所望のペプチドを生産する、少なくとも１つのパラジウム切断部位を含む）、所望のペプチドのカルボキシル末端をアミド化する方法。
【請求項２】
パラジウム切断部位が、X1-Ｃｙｓ-X2-X3（ここに、X1およびX2は任意のアミノ酸であり、X3はシステイン、ヒスチジンまたはメチオニンからなる群から選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
X1が、所望のペプチドのカルボキシル末端におけるアミノ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基質ポリペプチドが(所望のペプチド-X1)-(システイン-X2-X3)、(所望のペプチド-X1)-(システイン-X2-X3-末端配列)、(リーダー・ポリペプチド-パラジウム切断部位)-(所望のペプチド-X1)-(システイン-X2-X3-末端配列)、および(リーダー・ポリペプチド-パラジウム切断部位)-(所望のペプチド-X1)-(システイン-X2-X3)（ここに、X1およびX2は任意のアミノ酸であり、X3はシステイン、ヒスチジンまたはメチオニンからなる群から選択される）からなる群から選択される構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
パラジウム切断部位が、システイン-ヒスチジンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
基質ポリペプチドが、２つまたはそれ以上のパラジウム切断部位にて切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのパラジウム切断部位が、所望のポリペプチドのアミノ末端に位置しており、かつ少なくとも１つのパラジウム切断部位が、所望のポリペプチドのカルボキシル末端に位置している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸性有機溶媒とパラジウム・プロモーターとの反応混合液中で基質ポリペプチドを反応させることにより、所望のペプチドが切断およびアミド化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
反応混合液中におけるＣｙｓに対するパラジウム・プロモーターのモル比が、約0.1〜約20である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
反応時間が約１〜２時間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
反応混合液の温度が約５０℃〜約７０℃に維持されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酸性有機溶媒が、モノカルボン酸、ヒドロキシ置換した酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ウロン酸、アルドン酸およびアルダル酸からなる群から選択される有機酸である、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１３】
切断部位がシステイン-ヒスチジンであって、その切断部位がシステインに隣接しているリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リンカーが、DDDD(配列番号:36)、DDDK(配列番号:37)、DTRL(配列番号:38)およびGGPR(配列番号:39)からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2；シス−[Pd(en)(OH2)2]2+；シス−[Pd(pn)(OH2)2]2+；シス−[Pd(pic)(OH2)2]2+；シス−[Pd(bp)(OH2)2]2+；シス−[Pd(phen)(OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH)(OH2)2]2+；および[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質が、封入体（inclusion body）の形態で宿主細胞から回収されるキメラタンパク質として組換え的に宿主細胞中で発現されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）宿主細胞が大腸菌であり；そして、
（ｂ）キメラタンパク質が、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CACLE(配列番号:11)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CACDE(配列番号:40)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CACKK(配列番号:19)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CKCLE(配列番号:41)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CAMLE(配列番号:20)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CAHLE (配列番号:21)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CGHLE(配列番号:22)、T7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CLHLE(配列番号:23)からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
末端配列が、CACLE(配列番号:12)、CACDE(配列番号:42)、CACKK(配列番号:14)、CKCLE(配列番号:15)、CAMLE(配列番号:16)、CAHLE(配列番号:17)、CGHLE(配列番号:34)またはCLHLE(配列番号:33)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
基質ポリペプチドがT7-Vg-D4KCH-GRF(1-44)-CACLE(配列番号:11)であり、有機酸が約４Ｍ〜５Ｍの濃度のマロン酸であり、反応混合液中におけるマロン酸に対するキメラタンパク質の濃度がマロン酸１mlに対してキメラタンパク質約0.1mg〜3mgの範囲であり、パラジウム・プロモーターがNa2PdCl4（反応混合液中のモル濃度が、基質ポリペプチドのシステインに関して約４〜６倍）であり、反応時間が約６０分〜９０分であり、そして反応温度が約６０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
基質ポリペプチドが合成されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
基質ポリペプチドが天然に生じるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
X1-Ｃｙｓ切断部位が、アミド化される前に基質ポリペプチドのカルボキシル末端に合成的に付加されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
所望のペプチドが、GLP-2、GLP-1、GRF、PTH、副甲状腺ホルモン関連ホルモン、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、オピオイド、ゲーグリン5または6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンおよびタフトシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
所望のペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記基質ポリペプチドが、切断およびアミド化の前に組換え的に宿主細胞中で発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質ポリペプチドが、切断およびアミド化の前に組換え的に宿主細胞中で発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が大腸菌である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
所望のペプチドをアミド化する方法であって、酸性有機溶媒およびパラジウム・プロモーターの反応混合液中にて基質ポリペプチドを反応させることにより、基質ポリペプチドを（ｉ）所望のペプチドを規定する第一のアミノ酸配列のＮ末端と、リーダー配列を規定する第二のアミノ酸配列のカルボキシル末端とを連結する第一の切断部位、および（ｉｉ）第二のX1-システイン切断部位（ここに、X1はペプチド・カルボキシル末端のアミノ酸であり、システインは配列システイン-X2-X3を含む末端配列の第一のアミノ酸である。また、X2は任意のアミノ酸であってよく、そしてX3はシステイン、ヒスチジンまたはメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸である。）にて同時に切断すること（ここに、有機溶媒の濃度は約２〜２２モルの間であり、そして所望のペプチドのカルボキシル末端が第二のX1-システイン切断部位にて切断の際にアミド化される）、を含む方法。
【請求項３０】
所望のペプチドをアミド化する方法であって、酸性有機溶媒およびパラジウム・プロモーターの反応混合液中にて基質ポリペプチドを反応させることにより、基質ポリペプチドを（ｉ）所望のペプチドを規定する第一のアミノ酸配列のＮ末端と、リーダー配列を規定する第二のアミノ酸配列のカルボキシル末端とを連結する第一の切断部位、および（ｉｉ）第二のX1-システイン切断部位（ここに、X1は所望のペプチド・カルボキシル末端のアミノ酸であり、システインは配列システイン-X2-X3を含む末端配列の第一のアミノ酸である。また、X2は任意のアミノ酸であってよく、そしてX3はシステイン、ヒスチジンまたはメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸である。）にて同時に切断すること（ここに、有機溶媒の濃度は約２〜２２モルの間であり、そして所望のペプチドのカルボキシル末端が第二のX1-システイン切断部位にて切断の際にアミド化される）、を含む方法。