【手続補正書】
【提出日】平成18年7月14日(2006.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子、および
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基
を含む組成物であって、
抗原または抗原決定基がＡβ１−６ペプチドであり、そして
第二付着部位が、
（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および
（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位
から成る群から選択されるものであり、
第二付着部位が第一付着部位と会合し得、そしてＡβ１−６ペプチドおよびコア粒子がその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する組成物。
【請求項２】
コア粒子が、
ｉ）ウイルス、
ii）ウイルス様粒子、
iii）バクテリオファージ、
iv）ＲＮＡ−ファージのウイルス様粒子、
ｖ）細菌線毛
vi）ウイルスキャプシド粒子、および
vii）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）または（vi）の組換え形態
から成る群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
コア粒子がウイルス様粒子を含み、好ましくは、ウイルス様粒子であり、好ましくはウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である、請求項１または２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４】
ウイルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、
（ｂ）麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
（ｃ）シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
（ｄ）ロタウイルスの組換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、
（ｆ）レトロウイルスの組換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、
（ｈ）アルファウイルスの組換えタンパク質、
（ｉ）ヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質、
（ｊ）ポリオーマウイルスの組換えタンパク質、
（ｋ）バクテリオファージの組換えタンパク質、
（ｌ）ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質、
（ｍ）Ｔｙの組換えタンパク質、
（ｎ）Ｑβ−ファージの組換えタンパク質、
（ｏ）ＧＡ−ファージの組換えタンパク質、
（ｐ）ｆｒ−ファージの組換えタンパク質、
（ｑ）ＡＰ２０５ファージの組換えタンパク質、および
（ｑ）（ａ）〜（ｑ）からの組換えタンパク質のいずれかのフラグメント
から成る群から選択される組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項２または３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ウイルス様粒子がＢ型肝炎ウイルスコア抗原である、請求項２〜３項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
ＲＮＡ−ファージが、
（ａ）バクテリオファージＱΒ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
から成る群から選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱΒの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージｆｒの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、ＲＮＡ−ファージのコートタンパク質を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される、請求項３〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
アミノ酸を有するＲＮＡファージのコートタンパク質が、
（ａ）配列番号４、
（ｂ）配列番号４および配列番号５の混合物、
（ｃ）配列番号６、
（ｄ）配列番号７、
（ｅ）配列番号８、
（ｆ）配列番号９、
（ｇ）配列番号９および配列番号１０の混合物、
（ｈ）配列番号１１
（ｉ）配列番号１２、
（ｋ）配列番号１３、
（ｌ）配列番号１４、
（ｍ）配列番号１５、
（ｎ）配列番号１６、および
（ｏ）配列番号２８
から成る群から選択される、請求項１１項記載の組成物。
【請求項１３】
組換えタンパク質が、ＲＮＡ−ファージの突然変異コートタンパク質を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される、請求項３〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＮＡ−ファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも１個のリシン残基の除去により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、少なくとも１個のリシン残基の欠失により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、挿入による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
第二付着部位が第一付着部位と少なくとも１個の共有結合を介して会合し得る、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
第二付着部位が第一付着部位と少なくとも１個の非ペプチド結合を介して会合し得る、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
Ａβ１−６ペプチドがコア粒子と融合している、請求項１〜２０のいずれかの記載の組成物。
【請求項２２】
Ａβ１−６ペプチドが、
（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を有するヒトＡβ１−６ペプチド、
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を有するマウスＡβ１−６ペプチド、
（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を有する霊長類Ａβ１−６ペプチド、
（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を有するウサギＡβ１−６ペプチド、
（ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエルＡβ１−６ペプチド、
（ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するラットＡβ１−６ペプチド、
（ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列を有するモルモットＡβ１−６ペプチド
から成る群から選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
Ａβ１−６ペプチドが配列番号７５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
さらにアミノ酸リンカーを含み、そのアミノ酸リンカーが第二付着部位を含むか、またはそれにより構成される、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
第二付着部位または第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、そのＣ−末端でＡβ１−６ペプチドに結合している、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
第二付着部位または第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、
（ａ）ＧＧＣ、
（ｂ）ＧＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｃ）ＧＣ、
（ｄ）ＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｅ）Ｃ、および
（ｆ）Ｃ−ＣＯＮＨ２
から成る群から選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも第二付着部位をもつＡβ１−６ペプチドが、ＮＨ２−ＤＡＥＦＲＨＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号７７）である、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
（ａ）請求項１記載の組成物、および
（ｂ）許容される医薬用担体
を含む医薬組成物。
【請求項３０】
さらにアジュバントを含む、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ワクチン組成物がアジュバントを欠く、請求項２９または請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれかに記載の組成物を含むワクチン組成物。
【請求項３３】
さらにアジュバントを含む、請求項３２記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
ワクチン組成物がアジュバントを欠く、請求項３２または請求項３３記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３４のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージｆｒの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
Ａβ１−６ペプチドが、
（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を有するヒトＡβ１−６ペプチド、
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を有するマウスＡβ１−６ペプチド、
（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を有する霊長類Ａβ１−６ペプチド、
（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を有するウサギＡβ１−６ペプチド、
（ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエルＡβ１−６ペプチド、
（ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するラットＡβ１−６ペプチド、および
（ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列を有するモルモットＡβ１−６ペプチド
から成る群から選択される、請求項３２〜３８のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
さらにアミノ酸リンカーを含み、そのアミノ酸リンカーが第二付着部位を含むか、またはそれにより構成される、請求項３２〜３９のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、そのＣ−末端でＡβ１−６ペプチドに結合している、請求項４０記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、
（ａ）ＧＧＣ、
（ｂ）ＧＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｃ）ＧＣ、
（ｄ）ＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｅ）Ｃ、および
（ｆ）Ｃ−ＣＯＮＨ２
から成る群から選択される、請求項４０〜４１のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
少なくとも第二付着部位をもつ抗原または抗原決定基が、ＮＨ２−ＤＡＥＦＲＨＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号７７）である、請求項３２〜４２のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である、請求項４３記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
（ａ）少なくとも１個の第一付着部位をもつコア粒子を提供し、
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位をもつ少なくとも１個の抗原または抗原決定基を提供し、
ただし、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、そして
第二付着部位が、
（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および
（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位
から成る群から選択されるものであり、そして
第二付着部位が第一付着部位と会合し得、そして
（ｃ）コア粒子および少なくとも１個の抗原または抗原決定基を合わせ、抗原または抗原決定基およびコア粒子がその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する
ことを含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項４６】
医薬として使用される、請求項１〜４４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４７】
アルツハイマーおよび関連疾患処置用医薬の製造を目的とする、請求項１〜４４のいずれか１項記載の組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
アルツハイマー病の主たる病理学的徴候は、年齢に関連した行動上の変化、老人斑またはＡＤ斑と呼ばれる不溶性斑へのβ−アミロイド沈着、ニューロン内におけるタウタンパク質により構成される神経原線維錯綜、および前脳全体におよぶニューロンの消失である。高齢（６５歳およびそれ以上）で発生する晩期発症型ＡＤに加えて、３５〜６０歳間で発生する早期発症型ＡＤ、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）がある。ＡＤの病理学的異常は、晩期発症型または孤発性ＡＤよりもＦＡＤの方が広範囲におよび、重症であり、早期に発現する。ＡＰＰ遺伝子、プレセニリン１およびプレセニリン２遺伝子における突然変異はＦＡＤと相関関係を示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
他に、アジュバントと組み合わせたＡβペプチド投与の使用により、Ａβ１−４２に対する細胞性または体液性免疫応答を誘導する方法もある。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、動物は、突然変異ＡＰＰ（７１７）Ｖ−Ｆを含むヒトアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する（PDAPP-マウス; Johnson-Wood, K. et al., Proc. Natl. Acad. USA 94: 1550-1555, Games, D. et al., Nature 373: 523-527 （1995a）））ことによって、Ａβ１−４２が過剰産生され、斑、ジストロフィー神経炎、シナプス前部末端の消失、星状細胞増加症および小膠細胞症を発現する。最近の研究において、Schenk, D. et al., （Nature 400:173-77 （1999）および国際公開第99/27944号）は、６週令のＰＤＡＰＰ−マウスに対する、最初の４免疫化における、ヒトでは使用され得ない強いアジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）と混合した凝集Ａβ１−４２の投与、次いで後続免疫化におけるＰＢＳ中の凝集Ａβ１−４２の投与により、斑形成および付随するジストロフィー神経炎が本質的に阻止されたことを報告している。同著者らは、同じ戦略を用いた年長マウス（１１ヶ月齢）の免疫化は、アルツハイマー病（ＡＤ）様神経病状の程度および進行を著しく低減化させることを報告した。上記戦略を用いて免疫化されたマウスからの脾臓細胞の増殖は、国際公開第９９／２７９４４号の実施例III（確立されたＡＤに対する治療効力についてのスクリーン）で報告されており、Ａβ１−４２特異的Ｔ細胞がワクチン接種手順により誘導されることが示されていた。ヒツジ抗マウスＩｇＧへのＡβフラグメントのカップリング、およびアジュバントＣＦＡ／ＩＦＡの存在下におけるカップリングされたフラグメントの免疫化については、国際公開第９９／２７９４４号に報告されている。Ａβに対する免疫応答促進を目的とするポリペプチド、たとえばジフテリア毒素に結合されたＡβフラグメントを含む組成物の使用はまた、国際公開第９９／２７９４４号に開示されている。しかしながら、免疫化のデータは全く提供されていない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ＡβのＮ−末端（１−１６）内のエピトープを認識するモノクローナル抗体（抗体６Ｃ６）は、原線維β−アミロイドの神経毒性からＰＣ１２細胞を防御し、インビトロでβ−アミロイドを脱凝集することが示された（Solomon B. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA （1997））。Ａβ１−２８に対して産生したモノクローナル抗体はまた、インビトロでβ−アミロイド凝集を抑制することが示された（Solomon B. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA （199６））。Frenkel et al., （J. Neuroimmunol. 88: 85-90 （1998））は、エピトープ「ＥＦＲＨ」であるものとして、後に２種の抗凝集性抗体、１０Ｄ５および６Ｃ６のエピトープを同定した（すなわちＡβ３−６）。対照的に、Ａβ１−７に特異的な抗体は、β−アミロイド凝集を阻止できなかった（Frenkel D. et al., J. Neuroimmunol. 95: 136-142 （1999））。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明において、Ａβ１−６ペプチドは、典型的には特定方向に指向した形で、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合されており、規則正しい反復性Ａβ１−６ペプチド抗原アレイを生成する。さらに、コア粒子およびＶＬＰの各構造は、高度に規則正しい反復性で組織されており、高度に組織された反復性抗原アレイに至る高度に規則正しい反復的な形でＡβペプチドの呈示を仲介する。さらに、コア粒子およびＶＬＰは、コア粒子−Ａβ１−６ペプチドアレイおよびＶＬＰ−Ａβ１−６ペプチドアレイにより個々に免疫化された宿主にとっては異質であるため、コア粒子およびＶＬＰへのＡβ１−６の個々の結合によりＴヘルパー細胞エピトープが提供される。上記アレイは、特にそれらの高度に組織化された構造、寸法およびアレイ表面における抗原の反復性の点で先行技術のコンジュゲートとは異なる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
図８は、ＡＰ２０５ＶＬＰへのマウスＡβ１−６のカップリングのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
図９は、ＥＬＩＳＡ検定法で測定されたＡＰ２０５にカップリングされたマウスＡβ１−６によるマウス免疫化の結果を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
図１０は、９.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
図１２は、９.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６、ＱβまたはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図１３は、１３.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
南アメリカ原産の木キラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から誘導されたアジュバント活性を有する免疫学的活性サポニンフラクションは、当業界では公知である。たとえば、ＱＡ２１としても知られているＱＳ２１は、キラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の木からのＨｐｌｃ精製フラクションであり、その製造方法は米国特許第５０５７５４０号に（ＱＡ２１として）開示されている。キラジャサポニンはまた、Scott et al, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によりアジュバントとして開示されている。モノホスホリル脂質Ａおよびその誘導体は当業界では公知である。好ましい誘導体は、３脱−ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａであり、英国特許第２２２０２１１号により知られている。さらなる好ましいアジュバントは、国際公開第００／００４６２号に開示されており、出典明示で援用する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
抗体：本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープまたは抗原決定基と結合し得る分子をいう。この語は、１本鎖抗体を含む、全抗体およびその抗原結合性フラグメントを包含するものとする。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗原結合性抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインを含むフラグメントを包含するが、これらに限定されるわけではない。抗体は、鳥類および哺乳類を含むあらゆる動物に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ブタ、ラクダ、ウマまたはニワトリに由来するものである。本明細書で使用されている「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、たとえば、Kucherlapati et alによる米国特許第５９３９５９８号に記載されている通り、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたは一またはそれ以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物から単離され、内在性免疫グロブリンを発現することのない抗体を包含する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
付着部位、第二：本明細書で使用されている「第二付着部位」の語は、コア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれ表面上に位置する第一付着部位が会合し得る抗原または抗原決定基に伴うエレメントをいう。抗原または抗原決定基の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはその組合せ、またはその化学反応基であり得る。少なくとも１個の第二付着部位は、抗原または抗原決定基に存在する。したがって、「少なくとも１個の第二付着部位をもつ抗原または抗原決定基」の語は、少なくとも抗原または抗原決定基および第二付着部位を含む抗原性構築物をいう。しかしながら、特に非天然由来である、すなわち抗原または抗原決定基内に天然には存在しない第二付着部位の場合、これらの抗原または抗原性構築物は「アミノ酸リンカー」を含む。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
免疫応答を「高める」物質とは、物質を加えずに測定される免疫応答と比べたとき、物質の添加により大きいかまたは強化されたかまたは何らかの意味で偏向した同免疫応答が観察される物質をいう。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、免疫化中に物質を使用し、および使用せずに得られた試料において、たとえば５１Ｃｒ放出検定法を用いることにより測定され得る。物質を加えない場合のＣＴＬ溶解活性と比べて、ＣＴＬ溶解活性が高められる物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに充分な量であるといわれている。好ましい態様では、免疫応答は、少なくとも約２の係数、さらに好ましくは約３またはそれ以上の係数により高められる。分泌されるサイトカインの量またはタイプも改変され得る。別法として、誘導される抗体またはそれらのサブクラスの量が改変され得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
当業者には明らかなことであるように、本発明のある種の態様は、組換え核酸技術、たとえばクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核生物および真核生物細胞における組換えタンパク質の発現などの使用を含む。上記方法は当業者には熟知されており、好都合には出版された実験方法のマニュアルから見出され得る（例、Sambrook, J. et al.編, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）; Ausubel, F. et al.編、Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. （1997））。組織培養セルラインによる作業についての根本的実験技術（Celis, J.編、 Cell Biology、アカデミック・プレス、第２版（１９９８））および抗体に基く技術（Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1988）; Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification," Meth. Enzymol. 128、アカデミック・プレス、サンディエゴ（1990）; Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice、第３版、スプリンガー−フェルラーク、ニューヨーク （1994））もまた十分に文献に記載されており、これらを全て、出典明示で援用する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
２．免疫応答を高める組成物および方法
開示されている発明は、動物においてＡβ１−６ペプチドに対する免疫応答を誘導し、Ａβアミロイド斑および可溶性Ａβに結合し得る抗体を誘導する組成物および方法を提供する。本発明組成物は、（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子、および
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含むか、またはそれらにより構成され、その場合、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、そして第二付着部位は、（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位から成る群から選択されるものであり、第二付着部位は第一付着部位と会合し得、そして抗原または抗原決定基およびコア粒子はその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。さらに具体的には、本発明組成物は、ウイルス様粒子および少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含むかまたはそれらにより構成され、その場合、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、少なくとも１個の抗原または抗原決定基は、規則正しい反復性抗原−ＶＬＰアレイを形成するようにウイルス様粒子に結合されている。さらに、本発明は、好都合なことに実施者が、特にアルツハイマー病の処置および／または予防的阻止用の上記組成物を構築することを可能にする。本願明細書におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子と類似してはいるが、病原性ではない構造をいう。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムを欠くため、非感染性である。また、ウイルス様粒子は、異種発現により大量に製造され得、容易に精製され得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
細菌性ピリンタンパク質は、一般に、プロセッシングにより、細菌ペリプラズムへのタンパク質輸送に先行してＮ−末端先導配列が除去される。さらに、当業者が認識しているように、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ製造するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、一般的に天然に存在する先導配列を有しない。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
好ましい実施態様において、コア粒子は、ウイルス様粒子であり、ウイルス様粒子は組換え体ウイルス様粒子である。当業者であれば、組換えＤＮＡ技術および公的に容易に入手できるウイルスコーディング配列を用いてＶＬＰを製造することは可能である。たとえば、ウイルスエンベロープまたはコアタンパク質のコーディング配列は、市販されているバキュロウイルス発現ベクターを用いて、ウイルスプロモーターの調節制御下、コーディング配列を調節配列に機能し得るように結合させ得る適切な修飾を配列に加えることにより、バキュロウイルス発現ベクターでの発現用に遺伝子操作され得る。ウイルスエンベロープまたはコアタンパク質のコーディング配列はまた、たとえば細菌発現ベクターでの発現用に遺伝子操作され得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
本発明組成物の製造に使用され得るバクテリオファージコートタンパク質の特に好ましい例には、ＲＮＡバクテリオファージ、たとえばバクテリオファージＱβ（配列番号４；ＰＩＲデータベース、Ｑβ ＣＰと称される受入番号ＶＣＢＰＱβおよび配列番号５；Ｑβ Ａ１タンパク質と称される受入番号ＡＡＡ１６６６３）、バクテリオファージＲ１７（配列番号６；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号９；ＳＰ ＣＰと称されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３０３７４、および配列番号１０；ＳＰ Ａ１タンパク質と称される受入番号ＮＰ６９５０２６）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１１；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号１６）、およびバクテリオファージＡＰ２０５（配列番号２８）のコートタンパク質がある。さらに、バクテリオファージＱβ（配列番号５）のＡ１タンパク質またはそのＣ−末端から１００、１５０または１８０ものアミノ酸を失ったＣ末端切頭化（truncated）も、Ｑβコートタンパク質のキャプシド集合に組込まれ得る。一般的に、キャプシド集合におけるＱβ ＣＰに対するＱβ Ａ１タンパク質のパーセントは、キャプシド形成を確実にするために制限される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
ＡＰ２０５ゲノムは、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼおよび関連ファージには存在しない２つの読み枠により構成され、溶菌遺伝子および読み枠は成熟遺伝子の翻訳においてある一定の役割を演じる（Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33  （2002））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、ｐＱｂ１０（Kozlovska, T. M.. et al., Gene 137:133-37 （1993））の誘導体であり、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号２７）から発現され得る。別法として、ＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流でｐＱｂ１８５へクローン化され得る。同時係属中の「分子抗原アレイ」と題する２００２年７月１７日付の米国仮特許出願（代理人処理番号１７００.０３１００００）で記載されている通り（これについては出典明示で援用する）、両方法ともタンパク質の発現およびキャプシドの形成を誘導する。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから誘導されるベクターであり、これらのベクターでクローン化された遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターにより制御される（Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 （1993））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号２７）は、ＡＰ２０５コートタンパク質のＸｂａＩ部位の下流であり、ＡＴＧ開始コドンの上流に近接している以下の配列において推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む：tctagaATTTTCTGCGCACCCAT CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg（配列番号５７）。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位から下流および開始コドンの上流にシャイン−ダルガルノ配列を含む（tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg（配列番号５８）、シャイン−ダルガルノ配列は下線部）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
すなわち、本発明のこの好ましい実施態様は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。上記タンパク質は組換え技法により発現されるか、または天然供給源から製造される。電子顕微鏡（ＥＭ）および免疫拡散法により立証されているところによると、細菌で産生されるＡＰ２０５コートタンパク質は自発的にキャプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号２８）により形成されるキャプシドおよびＡＰ２０５ＲＮＡファージのコートタンパク質により形成されるキャプシドの構造特性は、ＥＭで見たときほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５ ＶＬＰは、高免疫原性であり、抗原および／または抗原決定基と結合されることにより、反復的な形で配向された抗原および／抗原決定基を呈示するワクチン構築物を生成させ得る。かくして呈示された抗原に対して高い力価が誘発されることから、結合された抗原および／または抗原決定基は抗体分子との相互作用に向けて接近し得、免疫原性であることが示されている。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
一般に、順応性のあるアミノ酸リンカーが有利である。アミノ酸リンカーの例は、（a） CGG; （b） N-末端 ガンマ 1-リンカー; （c） N-末端 ガンマ 3-リンカー; （d） Ig ヒンジ領域; （e） N-末端グリシンリンカー; （f） （G）kC（G）n ただし ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５（配列番号３４）; （g） N-末端グリシン-セリンリンカー; （h） （G）kC（G）m（S）l（GGGGS）n ただし n=０〜３, ｋ＝０〜５, ｍ＝０〜１０, １＝０〜２ （配列番号３５）; （i） GGC; （k） GGC-NH2; （l） C-末端 ガンマ 1-リンカー; （m） C-末端 ガンマ ３−リンカー; （n） C-末端グリシンリンカー; （o） （G）nC（G）k ただし ｎ=0-12およびｋ=0-5 （配列番号３６）; （p） C-末端グリシン−セリンリンカー; （q） （G）m（S）l（GGGGS）n（G）oC（G）k ただし ｎ＝０〜３、 ｋ＝０〜５、 m＝０〜１０、l=０〜２、および ｏ=０〜８（配列番号３７）から成る群から選択される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
ＲＮＡファージコートタンパク質ＶＬＰにおけるエピトープ密度は、架橋剤および他の反応条件の選択により調節され得る。たとえば、架橋剤スルホ−ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨは、一般に高いエピトープ密度に到達させ得る。誘導体化は高濃度の還元剤により明確に影響され、反応条件の操作を用いることにより、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰへカップリングされる抗原の数を制御し得る。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
融合はまた、サブユニット配列の一部が欠失されたＶＬＰサブユニットの変異型へＡβ１−６ペプチド配列を挿入することにより実施され得、さらにそれらは切頭化突然変異体と称される。切頭化突然変異体は、ＶＬＰサブユニットの配列のＮ−またはＣ−末端、またはその一部の内部欠失を有し得る。たとえば、アミノ酸残基７９〜８１の欠失を伴うたとえば特異的ＶＬＰ ＨＢｃＡｇは、内部欠失をもつ切頭化突然変異体である。また、切頭化突然変異体ＶＬＰ−サブユニットのＮ−またはＣ−末端へのＡβ１−６ペプチドの融合により、本発明の実施態様がもたらされる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合はまた置換により実施され得、その場合、たとえば特異的ＶＬＰ ＨＢｃＡｇについては、アミノ酸７９〜８１が外来エピトープにより置換される。すなわち、以後称するように、融合は、ＶＬＰサブユニットの配列におけるＡβ１−６ペプチド配列の挿入により、Ａβ１−６ペプチドによるＶＬＰサブユニットの配列の一部の置換により、または欠失、置換または挿入の組合せにより実施され得る。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
モザイク粒子の製造は多くの方法で実施され得る。Kozlovska ら、Intervirology, 39:9-15 （1996）は、３つの方法を記載しており、それらは全て本発明の実施において使用され得る。第一の方法では、ＶＬＰにおける融合エピトープの有効な提示を、ＴｒｐへのＵＧＡコドンの翻訳を誘導するクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコード化するプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Smiley B.K., et al., Gene 134:33-40 （1993））））を含むエシェリキア・コリ（E.coli）株において、ＣＰおよびＣＰ伸長部間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ Ａ１タンパク質融合体をコード化するプラスミドを発現させることにより伝達させる。別の方法では、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡへ修飾し、Ａ１タンパク質−Ａβ１−６ペプチド融合体を発現する第二プラスミドを同時形質転換させる。第二プラスミドは、異なる抗生物質耐性をコード化し、複製起点は、第一プラスミドと適合し得る（Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39:9-15 （1996））。第三の方法では、Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 （1996）の図１における記載にしたがって、ＣＰおよびＡ１タンパク質−Ａβ１−６ペプチド融合体を、プロモーター、たとえばＴｒｐプロモーターへ機能し得るように結合させたバイシストロン方法でコード化する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
ヒトＡＰＰの突然変異形態を過剰発現するトランスジェニックマウスに基づいた多くの動物ＡＤモデルが報告されている（Games, D. et al., Nature 373: 523-527 （1995a）; Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 （1997）; Hsiao, K., et al., Science 274: 99-102 （1996）; Chen, G. et al., Nature 408： 975- 979 （2000）; Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 （2000）; Morgan, D. et al., Nature 408: 982-985 （2000））。それらのマウスモデルは、導入遺伝子の過剰発現レベル、導入遺伝子に存在するＡＤ突然変異および導入遺伝子の過剰発現が指令されるプロモーターの点が互いに異なる。これらの動物モデルは、特に年齢に関連した行動の変化、不溶性斑へのβ−アミロイドの沈着、ニューロン内における神経原線維錯綜、および前脳全体に及ぶニューロン消失である、ＡＤの病理学的徴候の全てを必ずしも示すことはできない（Chapman, P.F. Nature 408: 915-916 （2000））。しかしながら、記憶欠損およびそれらの鑑定方法は、それらのモデルにおいて確認され得、動物モデルにおける本発明組成物の効果の試験で使用され得る（Chen, G. et al., Nature 408: 975- 979 （2000）; Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 （2000）; Morgan, D. et al., Nature 408: 982-985 （2000））。さらに、年齢に関連したアミロイド斑へのＡβ沈着は、星状細胞増加症および小膠細胞症をも発現する、それらのモデルで試験され得る。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
Ｑβ−２４０の発現および精製
細胞（エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９、プラスミドｐＱβ−２４０により形質転換された）を、ＬＢに再懸濁し、１５秒間５回超音波処理（水氷ジャケット）し、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離にかけた。さらなる処理工程まで上清を４℃で貯蔵し、細胞屑を、９ｍｌのＬＢ、および最後にＬＢ中の０.７Ｍ尿素９ｍｌで２回洗浄した。全上清をプールし、セファロースＣＬ−４Ｂカラムにローディングした。プールされたピーク画分を硫酸アンモニウムで沈澱させ、遠心分離にかけた。次いで、再可溶化タンパク質をセファロース２Ｂカラムおよび最後にセファロース６Ｂカラムでさらに精製した。最後に、キャプシドピークを水に対して充分透析し、上記要領で凍結乾燥した。コートタンパク質のキャプシドへの集合を電子顕微鏡により確認した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
さらに硫酸アンモニウム沈澱を用いることにより、ＡＰ２０５ ＶＬＰが精製され得る。第一工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが沈澱しない硫酸アンモニウム濃度を選択する。生じたペレットを廃棄する。次工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが大量沈澱する硫酸アンモニウム濃度を選択し、ＡＰ２０５ ＶＬＰをこの沈澱工程のペレットから遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２０分間）により単離する。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液中で可溶化する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
実施例１４
ヒトＡＰＰトランスジェニックマウスの免疫化
ヒトＡＰＰ導入遺伝子（Sturchler-Pierrat et al.,  Proc.Natl. Acad.Sci. USA 94: 13287-13292 （1997））をもつ８ヶ月齢雌ＡＰＰ２３マウスをワクチン接種に使用する。滅菌ＰＢＳで希釈した２５μｇのワクチンをマウスに皮下注射し、１４日後同量のワクチンで追加抗原を投与する。免疫化開始前およびブースター注射の７日後にマウスの尾部静脈から採血する。実施例１３記載の要領でＡβ１−６、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２に特異的な抗体の存在について血清を分析する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
実施例１５
Ｑβ ＶＬＰへのマウスＡβ１−６ペプチドのカップリング、マウスにおけるワクチン注射、および免疫応答の分析
ネズミＡβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFGHGGC-CONH2）（配列番号７８）を化学合成し、実施例１３記載の要領でＱβ ＶＬＰへのカップリングに使用する。ワクチンをＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、マウスＡβ１−６、マウスＡβ１−４０およびマウスＡβ１−４２に対して誘発された抗体の力価を測定する。免疫化およびＥＬＩＳＡ測定を実施例１３と同様にして実施する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２２】
実施例１６
Ａβ１−６に対して誘導された血清のヒトＡＰＰトランスジェニックマウス斑およびＡＤ斑への結合
脳薄片における免疫組織化学
１８ヶ月齢異型接合ＡＰＰ２３マウスの連続的パラフィン脳薄片およびＡＤ患者ブラークIII段階（インスティテュート・オブ・パソロジー、ユニバーシティー・バーゼル）からの内嗅野薄片を、染色に使用した。濃蟻酸で５分間ヒト脳薄片を処理し、マウス脳薄片を３分間９０℃で電子レンジ加熱することにより抗原性を高めた。ヒトＡβ１−６（実施例１３記載の要領で得た）に対して誘導されたマウス血清を、３％ヤギ血清を含むＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、一晩インキュベーションした。すすいだ後、薄片を、ＰＢＳ中で１：２００に希釈したビオチニル化抗マウス二次抗体と１時間インキュベーションした。すすいだ後、薄片をさらにアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（ＡＢＣ−エリートキットＰＫ６１００；ベクター・ラボラトリーズ）により処理した。最後に、薄片をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）金属高感度基質（ベーリンガー、コード１７１８０９６）と反応させ、ヘマルムで対比染色し、脱水し、キシレン中で清澄化し、カバーグラスで覆った。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
実施例１７
マウス斑の組織学評価による、ヒトＡβ１−６に対して誘導された血清の特異性
脳剥片における免疫組織化学
ヒトＡＰＰを過剰発現する３ヶ月および１８ヶ月齢異型接合ＡＰＰ２３マウスの連続的パラフィン脳薄片を、実施例１６の記載と同様にして、実施例１３に記載されたヒトＡβ１−６に対して誘導された代表的マウス血清、またはマウスまたはヒトＡＰＰの最後の２０アミノ酸に特異的であるため、Ａβを認識しないウサギポリクローナル抗体により染色した。ウサギポリクローナル抗体とインキュベーションした薄片を実施例１６記載の要領で処理するが、ただし、ビオチニル化抗ウサギ二次抗体（ＢＡ１０００、ベクター・ラボラトリーズ）を使用した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２５】
組織染色の結果を図５Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに示す。薄片の下方左に印されたＡβ１−６は、Ａβ１−６に対して誘導された血清が染色に使用されたことを示しており、「Ｐａｂ」は、薄片が、ＡＰＰ６９５における６７６〜６９５位に相当する、マウスまたはヒトＡＰＰの最後の２０アミノ酸に特異的なポリクローナル抗体により染色されたことを示している。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
１８ヶ月齢マウスからの薄片の染色（図５ＡおよびＣ）比較結果は、Ａβ１−６に対して誘導された血清は脳で発現されたＡＰＰとは交差反応しないが、薄片は対照ポリクローナル抗体により染色されることを示している。図５Ｂは、アミロイド沈着がまだ見られない時点である、３ヶ月齢マウスからの脳薄片を示し、ＡＰＰに特異的なポリクローナル抗体により染色される。図５Ｄおよび５Ｅは、それぞれ図５Ａおよび図５Ｂからの海馬のＣＡ１錐体層の拡大写真を示す。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３４】
９７、１１０、１１７、１２４、１３８、１４３、１５２、１５９、１６６日目に２匹のサル（上記）から採血し、１１０日目に２５μｇのワクチンで３回目のブーストを投与した。血清をプールし（９９ｍｌ）、Ａβ１−６−特異抗体のアフィニティー精製に使用した。これらの抗体を、１.５μｇ／ｍｌの濃度で免疫組織化学的染色に使用し、ビオチニル化二次抗サル抗体を検出に使用した。１８ヶ月齢の異型接合ＡＰＰ２３マウスおよびＡＤ患者（ブラークIII段階）のパラフィン脳薄片を染色に使用した。ＡＰＰ２３マウス脳薄片およびＡＤ患者脳薄片の両方において斑特異的染色が観察された（図７）。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３６】
実施例２０
ＡＰ２０５ ＶＬＰへのマウスＡβ１−６のカップリング、マウスの免疫化および免疫応答の分析
Ａ．ＡＰ２０５ ＶＬＰへのマウスＡβ１−６ペプチドのカップリング
ペプチドマウスＡβ１−６（ｍＡβ１−６、配列：NH2-DAEFGHGGC-CONH2）（配列番号７８）を化学的に合成した。最初のＮＨ２基は、ペプチドが遊離Ｎ−末端を有することを示し、最後のＮＨ２基は、ペプチドがアミド化されたカルボキシ末端を有することを示す。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０（ＨＢＳ、ｐＨ８.０）中のＡＰ２０５ ＶＬＰ（実施例１記載の要領で発現および精製された）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度（ブラッドフォード検定法で測定）で、室温（ＲＴ）で３０分間、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックから希釈した、２.８６ｍＭのＳＭＰＨ（ピアス、ロックフォード、イリノイ）と反応させた。次いで、反応混合物を、４℃で２時間、１０００倍容量のＨＢＳ、ｐＨ７.４に対して２回透析した。生成した透析および誘導体化ＡＰ２０５ ＶＬＰを液体窒素中で瞬間冷凍し、一晩−２０℃で貯蔵した。誘導体化ＡＰ２０５ ＶＬＰを、１体積の２０ｍＭのＨＢＳ、ｐＨ７.４で希釈し、ＤＭＳＯ中５０ｍＭのストックから反応混合物中で希釈した７１９μＭのｍＡβ１−６ペプチドと振とうしながら１５℃で２時間反応させた。カップリング反応物を、２時間および一晩、１０００倍体積のＨＢＳ、ｐＨ７.４に対して２回透析した。透析反応混合物をアリコートに分けて液体窒素中で瞬間冷凍し、さらなる使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
ＱβｈＡβ１−６による免疫化の治療効力を評価するため、マウスＴｈｙ−１プロモーターの制御下で「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（ＡＰＰ２４；Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ；Ｖ７１７Ｉ、特許番号ＷＯ９８０−３６−４４２３）を使用した。このマウス系統は、１８ヶ月齢で新皮質、海馬、尾状被殻および視床における多数のアミロイド斑を特徴とする。斑は、９ヶ月齢で初めて観察され得る。組織学的に、ＡＰＰ２４マウスにおけるアミロイド斑は主として拡散型に属し、すなわちそれらはコンゴ−レッド染色において陰性である。程度は劣るが、密集したアミロイド斑（コンゴ−レッド陽性）も見出され得る。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４３】
Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたヒトＡβ１−６ペプチド（ＱβｈＡβ１−６）を実施例１３記載の要領で製造した。本発明を記載または実施可能にするのに必ずしも必要ではないが、用いた実験手順に関して言えば、０日目に、ＡＰＰ２４トランスジェニックマウス（９.５ヶ月齢）に対し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）中の２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１６）または陰性対照としてＰＢＳ（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）（ｎ＝９）またはカップリングさせた抗原を欠くＱβウイルス様粒子（ｎ＝１１）を皮下注射した。その後、１５、４９、７６、１０６、１４０、１６９、２００、２３０、２５９および２９１日目に、マウスに２５μｇのＱβｈＡβ１−６ワクチン、ＱβまたはＰＢＳを注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および５６、９０、１１８、１８８、２１４、２４６および２７２日目に尾部静脈から採血した。血清もまた３０５日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：１９.５ヶ月）。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４７】
第二の試験では、ＡＰＰ２４トランスジェニックマウス（１３.５ヶ月齢）に対し、０日目、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）中の２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１５）、または陰性対照としてＰＢＳ（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）（ｎ＝１５）の皮下注射をした。その後、１６、４６、７６、１０９、１４０および１７０日目に、マウスに２５μｇのＱβｈＡβ１−６ワクチンまたはＰＢＳを注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および３１、５９、１２８および１５４日目に尾部静脈から採血した。血清もまた１８４日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：１９.５ヶ月）。Ａβ１−４０に特異的な抗体の力価を、上記と同様にして測定および表現したところ、同じく免疫化マウスは全て、少なくとも１：２０００より上の血清ＯＤ５０％力価でＱβｈＡβ１−６免疫化に応答することが見出された（示さず）。半ＯＤ５０％力価は、免疫化期間全体と通して１：１００００〜１：５００００の範囲であった。アミロイド沈着の定量を上記と同様にして行った。免疫化を早く（すなわち９.５ヶ月齢で）開始した実験と比較すると、斑沈着数（−５５％）および面積（−３２％）の低減化は、新皮質ではそれほど劇的なものではなかったが、それでも非常に明白で（図１３）非常に有意であった（ｐ＞０.００１対ＰＢＳ、マン−ホイットニー検定）。皮質下領域では、斑沈着数および面積は、ＱβｈＡβ１−６免疫化群において６０〜９０％低減化されていた。皮質と比べた場合のこれらの領域におけるより明白な効果は、これらの領域における斑形成の延長された時間経過と関連していると思われる。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
図１０：「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける血清抗Ａβ４０／４２抗体力価（ＯＤ５０％）。９.５〜１９ヶ月齢のマウスをＱβｈＡβ１−６により免疫化した。個々の値（黒点）および四角が示されており、四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している（特定範囲外のものはドットとして示されている）。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５１】
図１２：免疫化後の「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（９.５〜１９ヶ月齢）における斑沈着の定量。（Ａ）皮質斑密度。（Ｂ）皮質斑領域。（Ｃ）尾状被殻における斑密度。（Ｄ）尾状被殻における斑領域。（Ｅ）海馬における斑密度。（Ｆ）海馬における斑領域。（Ｇ）視床における斑密度。（Ｈ）視床における斑領域。斑密度を斑／ｍｍ２で表しており、斑領域を、アミロイド・ベータにより覆われた組織面積のパーセントで表している。個々の値（黒点）および四角としてデータを示している。四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している。＊＊ｐ＜０.００１（マン−ホイットニー検定）。ＰＢＳ、ｎ＝９、Ｑβ，ｎ＝１１、ＱβｈＡβ１−６、ｎ＝１６。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５２】
実施例２２
ＱβｈＡβ１−６での免疫化により、「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおけるアミロイド斑は低減化される。
この実施例は、ＱβｈＡβ１−６による免疫化が、アミロイド斑病状の非常に進行した段階で免疫化を開始した場合でも、アルツハイマー病の有効な処置方法となることを立証している。この実施例で使用したＡＤマウスモデルにおけるアミロイド斑沈着過程は、約６ヶ月齢で既に始まっている（Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292）。本明細書記載の試験では、ＱβｈＡβ１−６による免疫化は、１８ヶ月齢で開始されており、既に多数の小型斑が皮質で形成されていた。この実施例はまた、かなりの高齢動物におけるＱβｈＡβ１−６のＡβ４０／４２抗体誘導能力を立証している（１９免疫化マウスにおいて非応答は無し）。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたヒトＡβ１−６ペプチド（ＱβｈＡβ１−６）を、実施例１３記載の要領で製造した。本発明を記載または実施可能にするのに必ずしも必要ではないが、用いた実験手順に関して言えば、０日目に、ＡＰＰ２３トランスジェニックマウス（１８ヶ月齢）に対し、リン酸緩衝食塩水（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）に溶かした２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１９）または陰性対照としてリン酸緩衝食塩水（ｎ＝１７）を皮下注射し、１３、２７〜３４、６１〜６３、９０〜９６、および１２３〜１３０日目に、２５μｇのワクチンをブースター注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および４１〜４５、および６８日目に尾部静脈から採血した。血清もまた１５２〜１５４日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：２３ヶ月）。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
図１４：「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける血清抗Ａβ４０／４２抗体力価（ＯＤ５０％）。１８〜２３ヶ月齢のマウスをＱβｈＡβ１−６により免疫化した。個々の値（黒点）および四角が示されており、四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している（特定範囲外のものはドットとして示されている）。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
図１６：免疫化後の「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（１８〜２３ヶ月齢）における斑沈着の定量。（Ａ）皮質斑密度。（Ｂ）皮質斑領域。斑密度を斑／ｍｍ２で表しており、斑領域を、アミロイド・ベータにより覆われた組織面積のパーセントで表している。個々の値（黒点）および四角としてデータを示している。四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している。＊＊ｐ＜０.００１（マン−ホイットニー順位和検定）。ＰＢＳ、ｎ＝１７、ＱβｈＡβ１−６、ｎ＝１９。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
【図１】図１は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰへのＡβ１−６ペプチド（NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）のカップリングの結果を示す、還元条件下で実施された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】図２は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−６に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図３】図３は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−４０に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図４】図４Ａ−Ｂは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片（Ａ）およびＡＤ患者からの内嗅野薄片（Ｂ）を示す。
【図５】図５Ａ−Ｅは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清、またはヒトまたはマウスＡＰＰのＣ−末端に特異的なポリクローナルウサギ抗血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片を示す。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡ検定法において測定されたＱβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６によるアカゲザルの免疫化の結果を示す。
【図７】図７は、ヒトＡＤおよびトランスジェニックマウス斑に関する組織学により測定された、Ｑβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６により免疫化されたサル血清の斑への結合の結果を示す。
【図８】図８は、ＡＰ２０５ＶＬＰへのマウスＡβ１−６のカップリングのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡ検定法で測定されたＡＰ２０５にカップリングされたマウスＡβ１−６によるマウス免疫化の結果を示す。
【図１０】図１０は、９.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【図１１】図１１は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【図１２】図１２は、９.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６、ＱβまたはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【図１３】図１３は、１３.５〜１９ヶ月齢のＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【図１４】図１４は、ＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【図１５】図１５は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスからの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【図１６】図１６は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。