【手続補正書】
【提出日】平成17年5月17日(2005.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【図２】図２Ａ〜２ＦはＴＲＰＶ３の配列とゲノムの存在部位を示す。図２Ａ：ＴＲＰＶイオンチャンネル系統群の異なるメンバーのタンパク質配列関連性を示す系統樹。図２Ｂ：マウス（１１Ｂ４）およびヒト（１７ｐ１３）染色体上の配列をコードするＴＲＰＶ１（ＶＲ１）とＴＲＰＶ３の相対的位置。図２Ｃ：ＴＲＰＶ類に対するマウスＴＲＰＶ３タンパク質配列の比較（膜貫通ドメインを含むＣ末端の半分は除く）。一致する配列は暗灰色で、保存残基は明るい灰色で強調してある。予測多重らせんとアンキリンドメインには標しを付けたが、これはＴＲＰＶ３のみの領域に相当する。タンパク質の整列には、http://biowb.sdsc.edu/CGI/BW.cgiのメガラインとボックスシェイドを用いる。多重らせんドメインはプログラムコイル（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html）を使用して予測する。アンキリンドメインはＰＦＡＭタンパク質検索（http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml）を使用して予測する。図２Ｄ：ＴＲＰＶ３の図解と予測膜トポロジー。図２Ｅ：６回の膜貫通ドメイン（１〜６）と細孔ドメイン（Ｐ）を示すＴＲＰＶ３配列のカイト・ドゥーリットル（Kyte Doolittle）疎水性プロット。図２Ｆ：らせんによるＴＲＰＶ３配列の多重らせんドメインの予測では、アンキリン配列の前のＮ末端に２つの１４マーのピークを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【図７】図７Ａ〜７Ｅ：冷温およびメントールに反応するＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加。図７Ａ：ｍＴＲＰＭ８ＣＨＯ細胞は温度が約１５℃となったときに［Ｃａ２＋］ｉの急速な増加を示す。非形質導入ＣＨＯ細胞は冷温に対し反応しない。外部Ｃａ２＋を除くと、冷却に対しての反応性を完全に失う。図７Ｂ：［Ｃａ２＋］ｉが増加し始める予想平均閾値温度はｍＴＲＰＭ８について約２３℃である。ＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞は３３℃から２３℃に冷却すると、それによるＣａ２＋の増加が観察される。該細胞を継続して２０℃まで冷却すると、Ｃａ２＋の顕著な増加を示し、３３℃に加温したときの略元のレベルに急速に戻る。図７Ｃ：２３℃の温度刺激を繰返し適用することで生じるＴＲＰＭ８の応答は、カルシウム含有標準浴溶液中でわずかな減感作を示す。図７Ｄ：ＴＲＰＭ８は２５℃でメントールに応答する。ＴＲＰＭ８の応答強度はメントール濃度に依存する。メントール濃度を１０倍増加すると、Ｃａ２＋の流入がより大きくなる。この応答は細胞外Ｃａ２＋の不存在下で抑制される。非形質導入ＣＨＯ細胞はメントールを加えることで、［Ｃａ２＋］ｉの増加を示さなくなる。図７Ｅ：３３℃での１０μＭメントールはＣａ２＋の流入を誘発しない。浴溶液の温度を３０℃に下げると、細胞内Ｃａ２＋の顕著な増加が観察される。さらに、メントールを繰返し適用すると、ＴＲＰＭ８発現細胞を減感作しなくなる。これらの実験が示唆することは、メントールがＴＲＰＭ８発現細胞の冷却効果を促進することである。熱受容に関与する冷感ＴＲＰチャンネルをこのように同定すると、体細胞知覚検出におけるこのファミリーのより広い役割が明らかとなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
本発明はＴＲＰＭ８哺乳動物タンパク質をコードする単離した核酸を提供する。これらは配列番号８に示したアミノ酸配列を有するマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードする単離および／または組換え核酸分子を含む。例えば、本発明は配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列を有する単離および／または組換え核酸分子を提供する。上流および下流の非コード化領域も提供する。本発明はまた配列番号８に示したアミノ酸配列を含む単離したマウスＴＲＰＭ８ポリペプチドを提供する。さらに、このマウスＴＲＰＭ８ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する。これら核酸のヌクレオチド配列は配列番号９に示すとおりである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
開示した遺伝子の一つによりエンコードされたタンパク質に対する抗体の製造のために、種々の宿主動物にポリペプチドまたはその一部を注射して免疫し得る。かかる宿主動物は、限定されるものではないが、その二三を例示すると、ウサギ、マウスおよびラットである。種々のアジュバントを使用して免疫応答を高めることが可能であるが、アジュバントは宿主の種に応じて、限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性剤、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（Bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
このハイブリダイゼーション法に利用されるオリゴヌクレオチドは、一般に固形の支持体に結合する。固形支持体の例としては、限定されるものではないが、メンブラン、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウエハー、ファイバー、磁性もしくは非磁性ビーズ、ゲル、チューブ、ポリマー、塩化ポリビニル皿などである。オリゴヌクレオチドを直接または間接的に、あるいは共有結合または非共有結合により結合し得る固形表面は、いずれも使用することができる。とりわけ好適な固形基板は高密度アレイまたはＤＮＡチップである。これらの高密度アレイは特定のオリゴヌクレオチドプローブをアレイの予め選択した部位に含む。各予め選択した部位は１分子以上の特定のプローブを含むことができる。オリゴヌクレオチドは基板上の特定の位置にあるため、ハイブリダイゼーションのパターンと強度（これらは共にユニーク発現プロフィールまたはパターンとなる）は、特定遺伝子の発現レベルにより解釈することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
アンチセンスヌクレオチドで処置する場合、当該方法は開示遺伝子の少なくとも１つから誘導したアンチセンスヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸分子の治療有効量を投与することからなり、その場合のアンチセンスヌクレオチドは当該遺伝子の１つの転写／翻訳を減少させる能力を有する。“単離した”核酸分子という術語は、該核酸分子がその当初の環境（例えば、それが自然に存在するならば、自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、自然に存在する核酸分子は単離されていないが、同じ核酸分子は自然界の共存する物質の一部または全部から分離され、引き続き自然界に戻すとしても、単離されている。かかる核酸分子はベクターの部分であるかまたは組成分の部分であるが、さらに、かかるベクターまたは組成分がその自然環境の部分ではない状態に単離し得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
新規ＶＲの同定
Ａ．ＶＲ検索
戦略：既知ＶＲ配列をＮＣＢＩからダウンロードし（ＧＩ Ｎｏ．６７８２４４、５３０５５９８、７１０６４４５、４５８９１４３、６６３５２３８、２５７０９３３、５２６３１９６および４５８９１４１）、クラスタル（Clustal）（メガライン−ＤＮＡスター（Megalign-DNAstar）、マディソン、ウィスコンシン）を用い、以下のパラメータによりまとめる：ギャップ・ペナルティ１０、ギャップ・レングス・ペナルティ１０、Ｋタプル１、ウインドウ５および保存対角線５。この整列は＊.ＭＳＦファイルとして保存される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
マウスＴＲＰＶ３の全長配列は、エキソン予測ソフトウエア、新生児マウスＤＲＧと皮膚ｃＤＮＡからのＰＣＲおよびＲＡＣＥの組合わせから導く。ＰＣＲクローニング用には、プライマー（５’−ＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＧ−３’（配列番号１９）および５’−ＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴ−３’（配列番号２０））を、アンキリンと膜貫通ドメインに対するＢＬＡＳＴヒットの結果として、ＴＲＰＶ３についてＨＭＭ配列から設計し、新生児ＤＲＧｃＤＮＡからのＴＲＰＶ３の６９９−ヌクレオチドフラグメントの増幅に使用する。この最初のフラグメントから、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲ（クロンテック（Clontech））を用いて、マウス新生児皮膚とＤＲＧｃＤＮＡからＴＲＰＶ３の５’および３’末端を得る。ＶＲ１とＴＲＰＶ３のゲノム位置を特定するために、予測したＨＭＭのＴＲＰＶ３エキソン配列からプライマーを設計し、ゲノムＢＡＣマウス（ＲＰＣＩ２２）ライブラリー（ロスウエル・パーク癌研究所）をスクリーニングするのに使用する。利用したプライマーを表１に示す。さらに、マウスＶＲ１ＢＡＣは、マウスＶＲ１アンキリン領域にわたる３２０ｂｐのプローブを同じＢＡＣライブラリーにハイブリッド形成させることにより同定する。陽性のＢＡＣクローンについて、さらに制限消化マッピング、パルスフィールドゲル電気泳動法、およびＶＲ１およびＴＲＰＶ３遺伝子の５’と３’末端に特異的なプローブを用いる前記同様のサザーンブロッティング法により特性化する。ＴＲＰＶ３に陽性のＢＡＣクローンは５Ｊ３を含んでいた。ＶＲ１とＴＲＰＶ３の双方に陽性のＢＡＣクローンは、９ｅ２２、２７Ｉ１４、８２ｃ１および１１２ｇ１７を含んでいた。ＶＲ１に陽性のＢＡＣは、１３７Ｎ１３、１３７Ｏ１３、２３４Ｊ２３、２４６Ｄ９および２８５Ｇ１１を含んでいた。
【表１】
2005500028.tif 000001
【表２】
2005500028.tif 000002
【表３】
2005500028.tif 000003
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
ヌクレオチド配列から予測されるように、ＴＲＰＶ３は７９１個のアミノ酸残基からなる。マウスＴＲＰＶ３の全体の配列はＴＲＰＶ１（ＶＲ１）とＴＲＰＶ４に対し４３％の同一性；ＴＲＰＶ２（ＶＲＬ１）に対して４１％；およびＴＲＰＶ５（ＥＣＡＣ）とＴＲＰＶ６に対して２０％の同一性を有する（図２Ｃ参照）。ＴＲＰＶ３は、通常は３種であるが、この場合は４種の、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられる予測されるＮ末端アンキリンドメイン、ＴＭ６ドメインおよび最終の２つの膜貫通領域間の細孔ループ領域を有する。ＴＲＰＶ３のアンキリンドメインのＮ末端側の２つの多重らせんドメインも同定されている（図２Ｆ参照）。多重らせんドメインはＧＡＢＡ−Ｂチャンネルのオリゴマー形成に関係しており、すでに一部のＴＲＰチャンネルに存在するが、ＴＲＰＶには存在しないことが報告されている。さらなる実験では、ＶＲ１が、ＴＲＰＶ系統群の他のメンバーにはないが、同じＮ末端位置に推定多重らせんドメインを有する。系統発生分析は、ＴＲＰＶ３は事実上ＯＴＲＰ／ＴＲＰＶサブファミリーのメンバーであり、大型ＴＲＰイオンチャンネル系統群の一部であることを示す（図２Ａ参照）。公的データベースにおいて同じＢＡＣゲノムクローンはＴＲＰＶ３およびＶＲ１の配列を含む。両方の遺伝子がヒト染色体１７ｐ１３とマウス染色体１１Ｂ４に書き込まれている。これらＢＡＣクローンを位置づけ分析し、ヒトおよびマウスのゲノム配列を統合すると、２つの遺伝子間には約１０ｋｂの距離のあることが分かる（図２Ｂ参照）。このことは、ＴＲＰＶ３とＶＲ１が１回の複製事象から誘導されることを示唆している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
図１Ａは３回の独立した実験におけるチャンモデルからのＬ４およびＬ５ＤＲＧニューロンのＴＲＰＶ３（ＶＲＬｘ）の平均折りたたみ制御を示す。図１Ａに示すように、陽性対照、ＮＰＹおよびＴＲＰＶ３メッセージは、擬似および非結紮ＤＲＧと比べて傷害ＤＲＧにおいて上昇を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
ＰＣＲクローニングのために、ＢＬＡＳＴヒットの結果としてのＴＲＰＭ８のＨＭＭ配列から、プライマー１６３ｆ（５’−ＣＡＡＧＴＴＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＣ（配列番号９８））および１６４ｒ（５’−ＡＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＴ（配列番号９９））を設計し、新生児ＤＲＧ ｃＤＮＡからＴＲＰＭ８の６９９ヌクレオチドフラグメントを増幅するために使用する。この当初の配列とエキソン予測プログラムから、ＲＡＣＥ ＰＣＲ（クロンテック）を用い、製造業者のプロトコールに従い、マウス新生児ＤＲＧ ｃＤＮＡからのＴＲＰＭ８の５’および３’末端を得る。これらの実験に使用したプライマーを表３に示す。
【表５】
2005500028.tif 000004
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
Ｂ．体組織ハイブリダイゼーション
体組織ハイブリダイゼーションのために、新生児および成熟組織を切除し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結保護して、ＯＣＴ封入剤中に液体窒素で凍結する。クリオスタット切片（１０μｍ）を加工処理し、インビトロ転写により生成させたジゴキシゲニンｃＲＮＡプローブ（ロシュ・バイオケミカルス）とハイブリッド形成する。マウスＴＲＰＭ８ｍＲＮＡ特異アンチセンスリボプローブはｍＴＲＰＭ８配列のヌクレオチド１４１０〜１９８０に相当する。蛍光検出および二重標識実験は、以前に記載したように、本質的にチラミドシグナル増幅キット（ＴＳＡ；ＮＥＮ）により実施する（参照：Dong et al., Cell, 106:610-632 (2001)）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
ジゴキシゲニン−標識プローブは、新生児および成熟マウスにおいて、ＤＲＧと三叉神経節（口と顎の神経を支配する頭蓋知覚ニューロン）に特異発現を示すが、１３日目の胎児ではこれがない。ＴＲＰＭ８の発現は成熟ＤＲＧニューロンの約５〜１０％に限定される。ＴＲＰＭ８に陽性のニューロンの平均サイズは１８±３.１μｍ（平均±標準偏差、ｎ＝６９）であり、小径ｃ−ファイバー含有ニューロンとして分類され、マウスでは２５μｍ未満と定義される。ＴＲＰＭ８は神経フィラメント（ＮＦ）抗体によりマークされる高密度有髄ニューロンには発現されず、小径ニューロンにおけるＴＲＰＭ８発現とよく相関する。ＴＲＰＭ８＋ニューロンはしたがって、成長に際し、ＮＧＦレセプター、ｔｒｋＡを発現する侵害受容または熱受容ニューロンのサブセットに属すると思われる（参照：Huang and Reichardt, Ann. Rev. Neurosci., 24:677-736 (2001)）。ＮＧＦまたはｔｒｋＡの不在下、通常このレセプターを発現するＤＲＧニューロンは胎児成長に際し、アポトーシスにより死滅する（Huang and Reichardt、上記）。ＴＲＰＭ８がｔｒｋＡ依存性ニューロンにて発現されることを証明するために、新生児ｔｒｋＡのないマウスからのＤＲＧにてＴＲＰＭ８発現を評価する。ＴＲＰＭ８の発現は変異神経節では完全に消滅している。さらに、ＴＲＰＭ８はＶＲ１と同時発現せず、カプサイシンおよび有害熱に反応する一群の侵害受容器を特徴付ける。この観察は、侵害受容ニューロン上に見出される２つのよく解明された抗原マーカー、ＣＧＲＰまたはＩＢ４とのＴＲＰＭ８同時発現の欠失により確認される（参照：Snider and McMahon, Neuron, 20:629-632 (1998); Tominaga et al., Neuron, 21:531-543 (1998)）。このデータはＴＲＰＭ８がＶＲ１、ＣＧＲＰまたはＩＢ４によりマークされるよく解明された熱および疼痛感知ニューロンとは異なる熱受容／侵害受容ニューロンの下位集団において発現されることを示している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
マウスＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞株を生成させるために、マウスＴＲＰＭ８ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５（インビトロゲン）にサブクローンし、フュージン（Fugene）６（ロシュ）によりＣＨＯ−Ｋ１／ＦＲＴ細胞に移入する。移入細胞は２００μｇ／μＬのハイグロマイシン（ギブコＢＲＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖することにより選択する。個体集団を初期継代数段階で凍結し、これらのストックをさらなる検討に使用する。ｍＲＮＡを発現する安定なクローンをノーザンブロット分析ならびにサザーンブロッティングにより同定し、組込み部位を確認する（非開示）。ＣＨＯ細胞は内在性ＴＲＰＭ８イソ型を発現せず、したがって、ＶＲ１発現プラスミドを安定的に移入した細胞株と共に対照として働く。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
カルシウム画像化実験は本質的に以前の記載どおりに実施する（参照：Savidge et al., Neuroscience, 102:177-184(2001)）。簡単に説明すると、細胞をガラスカバースリップに塗布し、フラ−２・アセトキシメチルエステル（２.５〜５ｍＭ）を負荷し、ＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（２ｍＭ−Ｃａ２＋）中１.５ｍＭのプルロン酸（モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン）にて室温で３０〜６０分間インキュベートする。カバースリップを層流灌流チャンバー（ワーナーインスツルーメント（Warner Instrument Corp.））に容れ、局部灌流ピペット経由でＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（２ｍＭ−Ｃａ２＋）を定常的に灌流し、該ピペットからバッファーおよび冷却溶液も供給する。冷却刺激は灌流温度３３℃から１０℃の直線的下降（約１〜１.５℃ｓｅｃ−１）とする。灌流温度は制御ペルチエ（Peltier）装置によりコントロールし、細胞チャンバー中ミニ熱電対によりモニターする。別法として、細胞を２４穴組織培養プレートに塗布し、フラ−２を負荷し、溶液の添加は３ｃｃシリンジにより１０秒間で実施する。３４０ｎＭと３８０ｎＭの励起波長間で変化させたときのフラ−２負荷細胞のイメージを冷気ＣＣＤカメラで捉える。バックグランド蛍光を差し引いた後、２つの波長での蛍光強度比を計算する。２０〜４０個の細胞群の比のレベルをメタフルオア（MetaFluor）（ユニバーサル・イメージング・コーポレーション）により分析する。グラフはすべて代表的な単回実験における２０〜３０個の細胞群からの平均的応答である。実験はすべてそれぞれ３回繰返し、同様の結果を得る。ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）および細胞培養試薬のすべてはギブコ（Gibco BRL）から入手する。ルテニウムレッド、カプサイシンおよびメントールはシグマ（Sigma）から入手する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
細胞を記録目的のポリ−Ｄ−リジン被覆カバースリップに塗布し、１８〜２４時間後に記録を実施する。実験は、アキソパッチ（Axopatch）２Ｂ増幅器、５ｋＨｚフィルター、およびｐクランプ総合ソフトウエア（アキソン（Axon）インスツルーメンツ）による全細胞電圧クランプ技法を用い、室温で実施する。すべての実験で直列抵抗補償は２〜５ＭΩ抵抗、火炎処理ピペットを用い、８０％である。記録溶液は以下のとおりである：すべての実験についてピペット溶液は、１４０ｍＭ−ＣｓＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２、１０ｍＭ−ＥＧＴＡ、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＭｇＡＴＰからなり、ＣｓＯＨでｐＨ７.４に滴定する。メントールおよび冷温活性化電流のため、浴溶液は、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２からなり、ＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定する。電流−電圧の関係を用い、−１００ないし＋８０ｍＶ（２秒間）の電圧ランプにより逆転電位を評価する。一価のイオンの透過性検討のために、単純化した浴溶液（１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２）中のＮａＣｌを等モルのＣｓＣｌまたはＫＣｌと置き換える（ＣｓＯＨまたはＫＯＨで滴定）。カルシウム透過性推定のために、該浴溶液は１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨで滴定）および１もしくは３０ｍＭ−ＣａＣｌ２を含有する。溶液の浸透圧はスクロースの添加により調整する。Ｎａ（Ｐｘ／ＰＮａ）に対する一価カチオンの透過性比を以下のように計算する：
Ｐｘ／ＰＮａ＝Ｅshift＝｛ＲＴ／Ｆ｝ｌｏｇ（Ｐｘ／ＰＮａ［Ｘ］０／［Ｎａ］０）
ただし、式中、Ｆはファラデー定数、Ｒは気体定数、およびＴは絶対温度を示す。カルシウム透過性測定のために、ＰＣａ／ＰＮａを以下のように計算する：
Ｅshift＝{ＲＴ／Ｆ}log｛[Ｎａ]０＋４Ｂ’[Ｃａ]０(２)｝／｛[Ｎａ]０４Ｂ’[Ｃａ]０(１)｝
ただし、式中、Ｂ’＝Ｐ’Ｃａ／ＰＮａおよびＰ’Ｃａ＝ＰＣａ／（１＋ｅＥＦ／ＲＴ）および[Ｃａ]０(１)および[Ｃａ]０(２)は、２つの異なるカルシウム濃度をいう。メントールの局所灌流はＴＣ２ｂｉｐ温度コントローラー経由とする。マーロウ（Marlow）温度コントローラーを冷却ランプに使用する。