【手続補正書】
【提出日】平成17年7月4日(2005.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法であって、
パッケージング細胞株をレトロウイルス構築物でトランスフェクトする工程と、
前記パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収する工程と、及び、
標的細胞を前記組換えレトロウイルスに感染させる工程とを含み、
前記組換えレトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域
、第一ＲＮＡコード領域、および第一終結配列を含み、並びに、
前記ＲＮＡコード領域は、病原性ウイルスゲノム、若しくはゲノム転写物、または病原性ウイルスの生活環に関与する標的細胞遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である配列を含む、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２】
前記レトロウイルス構築物はさらに、５'レンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）および自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列を含む、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有するＲＮＡ分子をコードし、かつ前記センス領域は前記アンチセンス領域と実質的に相補的である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項４】
前記ループ領域は約２〜約１５ヌクレオチド長である、請求項３に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項５】
前記標的領域は、約１５〜約３０の間のヌクレオチド長である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項６】
前記標的領域は、１８〜２３ヌクレオチド長である、請求項５に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項７】
前記病原性ウイルスはヒト免疫不全ウイルスである、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項８】
前記標的領域は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４からなる群より選択されるヒト遺伝子転写物の領域である、請求項６に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項９】
前記標的領域はヒト免疫不全ウイルス転写物の領域である、請求項６に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１０】
前記病原性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、およびポリオウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１１】
前記第一ＲＮＡコード領域は第一ＲＮＡ分子をコードし、かつ前記レトロウイルス構築物はさらに第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび該第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結した第二ＲＮＡコード領域を含み、ここで該第二ＲＮＡコード領域は前記標的領域で前記第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的な第二ＲＮＡ分子をコードする、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１２】
前記レトロウイルス構築物はさらに、前記第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの前記第一ＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子の合成をもたらし、かつ前記第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの前記第一ＲＮＡコード領域の発現が前記標的領域で前記第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的な第二ＲＮＡ分子の合成をもたらすように、前記第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域を含む、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１３】
前記パッケージング細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１４】
前記５'ＬＴＲ配列はＨＩＶに由来する、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１５】
前記自己不活性化３'ＬＴＲはエンハンサー配列が欠失したＵ３要素を含む、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１６】
前記自己不活性化３'ＬＴＲは改良ＨＩＶ３'ＬＴＲである、請求項１５に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１７】
前記組換えレトロウイルスはシュードタイプである、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１８】
前記組換えレトロウイルスは水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質を有するシュードタイプとなっている、請求項１７に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項１９】
前記５'ＬＴＲ配列はモロニーマウス白血病ウイルスに由来する、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２０】
前記５'ＬＴＲ配列はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２１】
前記標的細胞はヒト細胞である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる
方法。
【請求項２２】
前記標的細胞は造血細胞である、請求項２１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２３】
前記標的細胞はＣＤ３４−陽性造血細胞である、請求項２２に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２４】
前記標的ＣＤ３４−陽性造血細胞を患者から単離することをさらに含む、請求項２３に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２５】
前記感染したＣＤ３４−陽性造血細胞を患者へ再導入することをさらに含む、請求項２４に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２６】
前記細胞は培養細胞である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【請求項２７】
前記細胞はｉｎ  ｖｉｖｏヒト細胞である、請求項１に記載の、細胞内でＲＮＡ分子を発現させる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
本発明のさらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第一ＲＮＡ分子合成をもたらし、かつ第二ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第二ＲＮＡ分子合成をもたらすように、第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第一ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、および反対方向で同じ第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡ  ＰＯＬ  ＩＩＩプロモーターを含む。そのような１実施形態において、その両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列、好ましくは５個の連続したＴ残基を有する終結配列によりＲＮＡコード領域と分断されている。図４は、ＲＮＡコード領域１１０に連結した第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、ＲＮＡコード領域１１５（１１０と逆順で同じ配列）に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
ＲＮＡコード領域１１０に連結した第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、１１０と逆順で同じ配列のＲＮＡコード領域１１５に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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