【手続補正書】
【提出日】平成16年6月23日(2004.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−第一級アミノ基を有する少なくとも１つのアミノ糖で誘導体化した固体支持体を確立し、
−種々のレクチン分子を含む調製物を該固体支持体に適用し、
−該固体支持体にカップリングしたアミノ糖 にレクチンを結合させ、
−洗浄液で固体支持体を洗浄して、未結合汚染物を除去し、次いで、
−所望により、固体支持体から該レクチン(類)を回収する;
ことを特徴とする該調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法。
【請求項２】
該アミノ糖がガラクトサミン、マンノサミン、グルコサミン、アロサミン、アルトロサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、フコサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミン、ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミンおよびフルクトサミンよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
該アミノ糖がＤ−マンノサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−アロサミン、Ｄ−アルトロサミン、Ｄ−リボサミン、Ｄ−アラビノサミン、Ｌ−グロサミン、Ｌ−イドサミン、Ｌ−ガラクトサミン、Ｌ−フコサミン、Ｌ−タロサミン、Ｌ−キシロサミンおよびＬ−リキソサミンよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
該アミノ糖がＤ−マンノサミンおよびＤ−グルコサミンよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
該レクチンが該固体支持体から回収される請求項１ないし４いずれか１記載の方法。
【請求項６】
該レクチンが実質的に純粋な形態で回収される請求項５記載の方法。
【請求項７】
該固体支持体がクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂、フィルター、プラスチック表面、ガラス表面および磁性粒子から選択される請求項１ないし６いずれか１記載の方法。
【請求項８】
該カラムがＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂、エポキシ活性化樹脂、Amersham BiosciencesからのECH セファロース(Sepharose)4BおよびAmersham Biosciencesからの活性化CH-セファロース(Sepharose)4Bから選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
プラスチック表面が活性化されたマイクロタイタープレートである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該レクチンがＭＢＬである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該洗浄液が、レクチンに結合することができる糖、レクチンに結合することができる糖誘導体、および二価金属イオンキレート剤よりなる群から選択される１以上の成分を含む請求項１ないし１０いずれか１記載の方法。
【請求項１２】
該糖がマンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フルクトース、フルクトサミン、Ｎ−アセチルフルクトサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、サッカロースおよびマルトースよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
種々のレクチン分子を含む組成物の比率Rを増加させる方法であって、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、当該方法は、低分子量レクチンおよび高分子量レクチンを含むレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ０を有し、該調製物を請求項１ないし１２いずれか１記載の単離方法に適用し、回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む該方法。
【請求項１４】
種々のレクチン分子を含む組成物の製法であって、該レクチン分子の実質的に全てはダイマーレクチンについての所定の分子量を超える分子量を有し、当該方法は、所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を有するレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ０を有し、ここにＲは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、請求項１ないし１２いずれか１記載の単離方法に該調製物を適用し、回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを特徴とする該方法。
【請求項１５】
所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子およびダイマーレクチンについての分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むレクチン調製物から、種々のレクチン分子を含む組成物を分離する方法であって、該レクチン分子の実質的に全ては所定の分子量を超える高分子量を有し、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ０を有し、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、当該方法は該レクチン調製物を得、請求項１ないし１２いずれか１記載の単離方法に該調製物を適用し、回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを特徴とする該方法。
【請求項１６】
種々のレクチン分子を含む組成物の製法であって、ここに、該レクチン分子の実質的に全ては所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有し、当該方法は、所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むレクチン調製物を得ることを含み、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ０を有し、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
請求項１ないし１２いずれか１記載の単離方法に該調製物を適用し、洗浄液の未結合レクチン分子を含む組成物を得ることを特徴とする該方法。
【請求項１７】
種々のレクチン分子を含む調製物の比率Ｒを増加させる方法であって、ここに、Ｒは高分子質量および低分子質量を有するレクチン分子の濃度に対する中間的分子質量を有するレクチンの濃度の比率であり、ここに、中間的分子質量は第一の所定の分子量未満であって、第二の所定の分子量を超える分子量であり、高分子質量は第一の所定の分子量を超えるかまたはそれと同等の分子質量であり、低分子質量は第二の所定の分子質量未満またはそれと等しい分子質量であり、
当該方法は、
ａ）低分子質量レクチン、中間的分子質量レクチンおよび高分子質量レクチンを含むレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ０を有し、次いで、
ｂ）請求項１ないし１２いずれか１記載の単離方法に該調製物を適用し、
ｃ）回収されたレクチン分子を含む組成物を得、次いで、
ｄ）所望により工程ｂ）を反復する；
工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項１８】
該レクチンがマンノース−結合レクチン（ＭＢＬ）である請求項１３および１７いずれか記載の方法。
【請求項１９】
該組成物の高分子量ＭＢＬの少なくとも５０％が２２５ｋＤａを超える、２５０ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超えるごとき２００ｋＤａを超える分子量を有する請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
低分子量ＭＢＬが２００ｋＤａ未満の分子量を有するＭＢＬを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ＭＢＬ調製物が組換えＭＢＬ調製物である請求項１ないし２０いずれか１記載の方法。
【請求項２２】
該ＭＢＬ調製物が、
−ヒトＭＢＬペプチドをコードする遺伝子発現構築体またはその機能的同等体を調製し、
−宿主細胞培養を該構築体で形質転換し、
−宿主細胞培養を培養基中で培養し、それにより、ポリペプチドの発現およびポリペプチドの培養基への分泌を得、
−種々のＭＢＬ分子を含む調製物を得る；
ことによって得られる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該遺伝子発現構築体がヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも１つのイントロン配列またはその機能的同等体を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該遺伝子発現構築体がヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも２つのエクソン配列またはその機能的同等体を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該遺伝子発現構築体がＭＢＬサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列またはその機能的同等体を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該宿主細胞培養がイン・ビトロで培養される請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞培養が真核生物宿主細胞培養である請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞培養が哺乳動物宿主細胞培養である請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
それに共有結合した、所定濃度の、第一級アミノ基を有する少なくとも１つのアミノ糖を有する固体支持体。
【請求項３０】
該アミノ糖がガラクトサミン、フコサミン、マンノサミン、グルコサミン、アロサミン、アルトロサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、ガラクトサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミン、ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミンおよびフルクトサミンよりなる群から選択される請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３１】
該固体支持体がクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂、フィルター、プラスチック表面、ガラス表面および磁性粒子から選択される請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３２】
該カラムがＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂、エポキシ活性化樹脂、ＡＰＢｉｏｔｅｃｈからのＥＣＨセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４ＢおよびＡＰ−Ｂｉｏｔｅｃｈからの活性化ＣＨ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂから選択される請求項３０記載の固体支持体。