【手続補正書】
【提出日】平成18年2月24日(2006.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターであって、該核酸はエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する１つのサブユニットの原核生物酵素をコードし、該酵素はＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒する、発現ベクター。
【請求項２】  前記核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＥＦ  Ｂポリペプチドと少なくとも６０％同一であるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】  前記核酸が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】  前記ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ  ＹＥＦ  Ｂポリペプチドである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】  前記核酸が、ＹＥＦ  Ｂをコードする核酸に実質的に同一である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｗｃａＨコード領域を欠く、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】  前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】  前記プロモーターが誘導可能プロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】  前記プロモーターが二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】  請求項１に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１１】  前記細胞が原核生物細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】  前記細胞が透過される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１３】  ＧＤＰ−フコースを合成するための反応混合物であって、該反応混合物は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、ならびにエピメラーゼおよびレダクターゼの両方の活性を有する１つのサブユニットの原核生物酵素を含み、ここで該原核生物酵素はＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒し得る、反応混合物。
【請求項１４】  前記原核生物酵素がＥ．ｃｏｌｉ  ＹＥＦ  Ｂと実質的に同一である、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】  請求項１３に記載の反応混合物であって、ここで前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースが：
ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ+を含む反応混合物を提供する工程；ならびに
少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程、
によって形成される、反応混合物。
【請求項１６】  請求項１３に記載の反応混合物であって、ここで前記原核生物酵素は、発現ベクターを含む細胞の溶解物として提供され、該発現ベクターは該原核生物酵素をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含む、反応混合物。
【請求項１７】  ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換のための方法であって、該方法は以下：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤ+を含む反応混合物を提供する工程であって、ここで該ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換させる、工程；
ｂ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを、該反応混合物に添加する工程；
ｃ）該ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースに転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
を包含し、
ここで該方法は、以下の方法：
ｄ）少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースを、ｂ）を行う前に、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換するのに十分な時間、工程ａ）の該反応混合物をインキュベートする工程；または
ｅ）該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを、
１）該反応混合物に、フコシルトランスフェラーゼおよびアクセプターサッカリドを添加する工程；および
２）該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを、該アクセプターサッカリドに転移させるのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程、
によって該アクセプターサッカリドに転移させる工程、
の１つまたは両方によって、ＧＤＰ−フコースが媒介する該ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのフィードバック阻害を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】  請求項１７に記載の方法であって、該方法は、工程ｂ）の反応混合物中に、ＮＡＤＰ+またはＮＡＤ+を還元し得る酵素および該酵素の基質を含むことによって、産生されたＮＡＤＰ+またはＮＡＤ+を、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨへのレダクターゼ活性によってそれぞれ再利用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】  前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】  前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  前記工程がそれぞれ同じ反応容器中で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】  前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドが、実質的にすべての前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースがＧＤＰ−フコースに転換される後に、工程ｂ）の産物に添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】  前記ＧＤＰ−フコースが、前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドを添加する工程に先立って精製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】  前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドが、工程ｂ）の実行とほぼ同時に、工程ａ）において産生された前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】  請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、工程ｅ）の前記反応混合物にホスファターゼを添加する工程をさらに含み、そして該ホスファターゼがＧＤＰ由来のリン酸を切断するが、ＮＡＤＰＨ由来のリン酸を切断しない、方法。
【請求項２６】  請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、工程ｅ）の前記反応混合物にキナーゼおよびキナーゼの基質を添加する工程をさらに含み、そして前記ＧＤＰ−フコース由来のフコースの転移の結果として産生されたＧＤＰがＧＴＰに転換される、方法。
【請求項２７】  前記キナーゼが、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、およびアセチルキナーゼからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、そして前記キナーゼの基質がホスホエノールピルビン酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】  請求項１７に記載の方法であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、方法。
【請求項３０】  前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】  前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】  前記フコシルトランスフェラーゼが、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ  ＩＩＩ）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、細菌α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】  前記α１，３フコシルトランスフェラーゼが、Ｆｕｃ−Ｔ
ＩＶ、Ｆｕｃ−Ｔ  Ｖ、Ｆｕｃ−Ｔ  ＶＩ、およびＦｕｃ−Ｔ  ＶＩＩからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】  前記α１，２フコシルトランスフェラーゼが、Ｆｕｃ−Ｔ
ＩおよびＦｕｃ−Ｔ  ＩＩからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】  マンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための酵素系をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】  請求項３５に記載の方法であって、ここでマンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための前記酵素系が、以下：
マンノースをマンノース−６−リン酸へ転換する、ヘキソキナーゼ；
該マンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に転換する、ホスホマンノムターゼ；および
該マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに転換する、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、
を含む、方法。
【請求項３７】  単一のポリペプチドがＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性の両方を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】  前記ポリペプチドが原核生物酵素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】  前記ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＥＦ  Ｂポリペプチドと実質的に同一である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】  前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】  前記原核生物酵素がＥ．ｃｏｌｉ由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】  前記ポリペプチドが真核生物由来のＦＸポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】  請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、反応の過程で失われた二価カチオンの一部を回復させるために、反応媒体に十分な該二価金属カチオンを添加する工程をさらに含み、それによって該反応媒体中の該二価金属カチオンの濃度を、約１ｍＭと約７５ｍＭとの間で達成するか、またはその濃度を維持し、そして前記酵素的転換の妨害なしで該二価金属カチオンの添加が生じる、方法。
【請求項４４】  フコシル化されたオリゴサッカリドの調製方法であって、該方法は、アクセプターサッカリドをフコシル化反応混合物と接触させる工程を含み、該フコシル化反応混合物は、ＧＤＰ−フコースおよび該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを転移させて該フコシル化されたオリゴサッカリドを提供するフコシルトランスフェラーゼを含み、ここでフコシル化の効率は、以下：
１）以下によりＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換によって該ＧＤＰ−フコースを形成する工程：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ+を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
ｃ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース  ３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを工程ｂ）の産物に添加する工程；ならびに
ｄ）該ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースに転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
２）キナーゼおよびキナーゼの基質を、該フコシル化反応混合物に添加する工程であって、ここで該ＧＤＰ−フコース由来のフコースの転移の結果として産生されたＧＤＰが、ＧＴＰに転換される、工程；そして
３）可溶性の二価金属カチオンを含む反応媒体中でフコシル化を行う工程であって、ここで該媒体に、該二価金属カチオンの濃度を約２ｍＭと約７５ｍＭとの間に維持するために該可溶性二価金属カチオンを補充する、工程、
からなる群から選択される１つ以上の効率増強工程によって増強される、方法。
【請求項４５】  前記フコシルトランスフェラーゼが、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースがＧＤＰ−フコースへ転換される後に、前記反応混合物に添加される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】  前記フコシルトランスフェラーゼならびにＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼおよびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼを有するポリペプチドが、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−マンノースがＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換される後に、前記反応混合物に添加される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】  それぞれの前記反応工程が同じ反応容器中で行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】  請求項４４に記載の方法であって、該方法は、工程ｃ）の前記反応混合物中に、ＮＡＤＰ+またはＮＡＤ+を還元し得る酵素および該酵素の基質を含むことによって、産生されたＮＡＤＰ+またはＮＡＤ+を、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨへのレダクターゼ活性によってそれぞれ再利用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４９】  前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】  前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】  請求項４４に記載の方法であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、方法。
【請求項５２】  前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】  請求項５２に記載の方法であって、ここで、前記アクセプターサッカリドが、シアル酸が化合物の非還元糖に転移される条件下で、シアル酸のＣＭＰ誘導体の存在下で、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して、化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを、シアリルトランスフェラーゼを用いてシアル酸付加することによって形成される、方法。
【請求項５４】  請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲが、式ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物を、前記化合物を形成するのに十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、それぞれガラクトシル化することによって形成される、方法。
【請求項５５】  前記発現ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｗｃａＩコード領域を欠く、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５６】  前記反応混合物が、ＮＡＤＰ+またはＮＡＤ+をＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨにそれぞれ還元し得る酵素および該酵素の基質をさらに含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項５７】  前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項５６に記載の反応混合物。
【請求項５８】  前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項５７に記載の反応混合物。
【請求項５９】  前記反応混合物が、フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのアクセプターサッカリドをさらに含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項６０】  ＧＤＰ由来のリン酸を切断し得るが、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来のリン酸を切断し得ないホスファターゼをさらに含む、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６１】  キナーゼおよびキナーゼの基質をさらに含む、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６２】  前記キナーゼが、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、およびアセチルキナーゼからなる群から選択される、請求項６１に記載の反応混合物。
【請求項６３】  前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、そして前記キナーゼの基質がホスホエノールピルビン酸である、請求項６２に記載の反応混合物。
【請求項６４】  請求項５９に記載の反応混合物であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、反応混合物。
【請求項６５】  前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項６４に記載の反応混合物。
【請求項６６】  前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項６５に記載の反応混合物。
【請求項６７】  前記フコシルトランスフェラーゼが、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ  ＩＩＩ）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、およびα１，２フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６８】  マンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための酵素系をさらに含む、請求項１５に記載の反応混合物。
【請求項６９】  請求項６８に記載の反応混合物であって、ここで前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための前記酵素系が、以下：
マンノースをマンノース−６−リン酸へ転換する、ヘキソキナーゼ；
該マンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に転換する、ホスホマンノムターゼ；および
該マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに転換する、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、
を含む、反応混合物。
【請求項７０】  前記反応混合物が、約１ｍＭと約７５ｍＭとの間の濃度の二価金属カチオンを含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項７１】  請求項７０に記載の反応混合物であって、ここで、反応の過程の間に失われた前記二価カチオンの一部を回復させるために、十分な二価金属カチオンが該反応混合物に添加されて、それによって該反応混合物中の該二価金属カチオンの濃度を、約１ｍＭ〜約７５ｍＭの間を達成するか、またはその濃度を維持し、そして二価金属カチオンの添加は、酵素反応の妨害なしで進行する、反応混合物。
【請求項７２】  ａ）の前記反応混合物が、ｂ）を行う前に、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−マンノースを、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換するのに十分な時間インキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項７３】  ａ）およびｂ）が同時に行われる、請求項１７に記載の方法。