【手続補正書】
【提出日】平成17年12月2日(2005.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  少なくとも第１及び第２のハイブリダイズする領域並びに少なくとも２つの触媒領域を含んで成る、エンドリボヌクレアーゼ活性を有する、ポリリボザイムと呼ばれる核酸分子であって、前記第１及び第２のハイブリダイズする領域が、ポチイウィルス（potyvirus ）のゲノム（＋）RNA 又はポチイウィルスの複製（−）鎖RNA における、それぞれ第１及び第２標的領域に対して相補的であり、前記第１及び第２標的領域が、
−同じRNA 鎖上の非翻訳領域又は異なった遺伝子内に存在するかもしくはそれらを含んで成り、又は
−異なったRNA 鎖上に存在し、又は
−前記複製（−）鎖RNA 上のシストロン又は１つの遺伝子に対応する領域内に存在する、
ことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】  少なくとも２つの単位“R１”及び“R２”を含んで成る、エンドリボヌクレアーゼ活性を有する、ポリリボザイムと呼ばれる核酸分子であって、前記“R１”及び“R２”の個々が、下記一般式：
3'[(X)n−Q−(X')n']p5’
[ 式中、−X 及びX’は、それぞれ独立して、いずれかのリボヌクレオチドを表し；(X)n及び (X')n’はポチイウィルスゲノム（＋）RNA の標的領域の少なくとも一部、又はその（−）鎖複製RNA の少なくとも一部に対して実質的に相補的なリボヌクレオチド配列を表し；
−前記R１の相補的配列 (X)n 及び (X')n’が、ポチイウィルスゲノム（＋）RNA 又は複製（−）鎖RNA の第１標的領域Z１の部分に対して相補的であり、領域Z１は第１遺伝子又は非翻訳領域（UTR ）内に存在するか又はそれを含んで成り；そしてR２の (X)n 及び (X ’)n’が、ポチイウィルスRNA 又は（−）鎖複製中間体の第２標的領域Z２の部分に対して相補的であり、領域Z２は第２遺伝子又は非翻訳領域内に存在するか、又はそれを含んで成り；
Z１及びZ２は、
−同じRNA 鎖上の非翻訳領域又は異なった遺伝子、又は
−ポチイウィルスRNA の異なった鎖上の非翻訳領域又は同じかもしくは異なった遺伝子であり、又は
−（−）鎖複製RNA 上の同じ遺伝子であり；
−n 及びn ’はそれぞれ、４に等しいか又はそれ以上であり、好ましくは８に等しいか又はそれ以上であり；
−Q はリボザイムの触媒領域を表し；
−p は≧２である]
で表されることを特徴とする核酸分子。
【請求項３】  前記R 単位の個々が、下記式：
【化１】
2003521218.tif 000001
[ 式中、個々のX は、同じでも又は異なっていてもよいリボヌクレオチドを表し、(X)n及び(X)n’はポチイウィルスゲノム又は複製（−）鎖RNA における２種のRNA 配列の１つに対してそれぞれ実質的に相補的なヌクレオチド配列を表し、前記2 種のポチイウィルス配列はゲノム又は複製（−）鎖RNA における少なくとも１つのヌクレオチドによりお互いから分離され；（＊）は相補的リボヌクレオチド間での塩基対を表し；Y はいずれかのリボヌクレオチドを表し、そして個々のY は同じであっても又は異なっていてもよく；Y’及びY”はオリゴヌクレオチド間での塩基対合を可能にするために、それらの長さの少なくとも一部にそっての相補的配列のリボヌクレオチドを表し、又はY’及びY”は単一のRNA配列を一緒に形成し、ここで前記配列の少なくとも一が相補的ヌクレオチド間での塩基対合により形成されるステムを含んで成り；そして任意には、A, G, C 又はU のいずれか１つから選択された追加のヌクレオチドが１Aの後に挿入されている] により表される請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】  前記R１の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、前記ゲノム（＋）RNA 上のU.T.R.又は第１遺伝子内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的であり、そしてR２のX 及びX'が前記ゲノム（＋）RNA 上のU.T.R.又は第２遺伝子内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的である請求項２又は３記載の核酸分子。
【請求項５】  前記R１の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、前記複製（−）鎖RNA 上のU.T.R.又は第１遺伝子に対応する領域内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的であり、そしてR２のX 及びX ’が前記複製（−）鎖RNA 上のU.T.R.又は第２遺伝子に対応する領域内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的である請求項２又は３記載の核酸分子。
【請求項６】  前記R１の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、前記ゲノム（＋）RNA 上のU.T.R.又は遺伝子内の又はそれを含んで成る領域Z１に対して相補的であり、そしてR２のX 及びX’が、前記複製（−）鎖RNA 上のU.T.R.又は遺伝子に対応する領域内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的である請求項２又は３記載の核酸分子。
【請求項７】  前記R１の相補的配列が、前記（＋）鎖RNA 上のシストロン“C ”内の又はそれを含んで成る、領域Z１に対して相補的であり、そして前記R２の相補的配列が、前記同じシストロン“C ”に対応する領域内の又はそれを含んで成る、前記（−）鎖上の領域Z２に対して相補的である請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】  R 単位をさらに含んで成り、その相補的配列 (X)n 及び(X’)n’が、前記ゲノム（＋）鎖又は複製（−）鎖上の追加の遺伝子内の又はそれを含んで成る領域に対して、及び/ 又は、Z１及び/ 又はZ２と同じ遺伝子内の領域に対して相補的である、請求項６記載の核酸分子。
【請求項９】  前記少なくとも１つのR 単位の相補的配列 (X)n 及び(X’)n’が、キャプシドタンパク質遺伝子、NIa 遺伝子、NIb 遺伝子、ポチイウィルスの3 ’未翻訳領域、又は複製（−）鎖RNA における対応する配列内の又はそれらを含んで成る領域に対して相補的である請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項１０】  前記少なくとも１つのR 単位の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、キャプシドタンパク質（CP）遺伝子、又は複製（−）鎖RNA における対応する配列内の又はそれらを含んで成る領域に対して相補的である請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項１１】  前記R１の相補的セグメント (X)n 及び(X')n’が、前記複製（−）鎖RNA 上のCP遺伝子内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的である請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】  前記R１の相補的セグメント (X)n 及び(X')n’が、前記ゲノム（＋）鎖RNA 上のCP遺伝子内の又はそれを含んで成る領域に対して相補的である請求項10記載の核酸分子。
【請求項１３】  前記R１及びR２の両方の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、複製（−）鎖RNA 上のCP遺伝子内の領域に対して相補的である請求項11記載の核酸分子。
【請求項１４】  前記R１及びR２の相補的配列 (X)n 及び(X')n’が、前記ゲノム（＋）鎖RNA の3'−非翻訳領域及びCP遺伝子内の領域に対してそれぞれ相補的である請求項４、10及び12記載の核酸分子。
【請求項１５】  前記R１及びR２の相補的配列(X)n及び(X')n’が、前記CP遺伝子及びNIb 遺伝子内の領域、又は前記NIb 遺伝子及びNIa 遺伝子に対応する複製（−）鎖RNA の領域に対してそれぞれ相補的である請求項５及び９記載の核酸分子。
【請求項１６】  少なくとも２つのR 単位、R１及びR２を含んで成り、ここで前記R１の相補的配列 (X)n 及び (X')n’が、ゲノム（＋）鎖RNA のCP遺伝子に対して相補的であり、そして前記R２のハイブリダイズする領域が複製（−）鎖RNA 上のCP遺伝子に対して相補的である請求項11及び12記載の核酸分子。
【請求項１７】  少なくとも３種のR 単位R１, R２及びR３を含んで成り、ここで前記R１の相補的配列 (X)n 及び (X ’)n’がゲノム（＋）鎖RNA の3'−非翻訳領域（3'NT）又はCP遺伝子内の領域に対して相補的であり、前記R２の相補的配列 (X)n 及び (X')n’が複製（−）鎖RNA 上のNIb 遺伝子内の領域に対して相補的であり、そして前記R３の相補的配列 (X)n 及び (X ’)n’が複製（−）鎖RNA 上のCP遺伝子又はNIa 内の領域に対して相補的である請求項８及び９記載の核酸分子。
【請求項１８】  少なくとも２種のR 単位“R１”及び“R２”を含んで成り、ここでR１の相補的配列 (X)n 及び (X')n’が複製（−）鎖RNA における所定の非翻訳領域又は遺伝子に対応する領域内の標的領域Z１の部分に対して相補的であり、そしてR２のハイブリダイズする配列X 及びX ’が同じRNA 鎖上のZ１のそれと同じ遺伝子又は未翻訳領域内の標的領域Z２に対して相補的である請求項２又は３記載の核酸分子。
【請求項１９】  “p”が、２〜20、たとえば４〜10の値を有する請求項１〜18のいずれか１項記載核酸分子。
【請求項２０】  少なくとも1 つのR 単位の相補的配列 (X)n 及び(X')n’の個々が独立して、50個よりも多くのヌクレオチド、たとえば60〜300 個のヌクレオチドを含んで成る請求項1 〜19のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２１】  少なくとも1 つのR 単位の相補的配列 (X)n 及び(X')n’の個々が独立して、4 〜50個のヌクレオチド、たとえば8 〜12個のヌクレオチドを含んで成る請求項1 〜19のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２２】  少なくとも第１のR 単位が50個よりも多くのヌクレオチドをそれぞれ含んで成る相補的配列(X)n及び(X')n’を有し、そして少なくとも第２のR 単位が4 〜50個のヌクレオチドをそれぞれ含んで成る相補的配列(X)n及び (X')n’を有する請求項20及び21記載の核酸分子。
【請求項２３】  所定のR 単位の3 ’(X)n 配列及び隣接するR 単位の5'(X')n’配列が、ポチイウィルスゲノム（＋）鎖RNA 又は複製（−）鎖RNA において隣接する配列に対して相補的である請求項1 〜22のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２４】  所定のR 単位の3'(X)n配列及び隣接するR 単位の5'(X')n’配列が、ポチイウィルスゲノム（＋）鎖RNA 又は複製（−）鎖RNA の非隣接部分に対して相補的である請求項1 〜22のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２５】  前記ウィルスゲノム又は複製（−）鎖RNA に対して非相補的である、少なくとも1 つのヌクレオチド又はヌクレオチド“A ”の配列が、２個の連続したR 単位間に含まれる請求項１〜24のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２６】  前記非相補的配列“A ”がポリリンカー又はスペーサーである請求項25記載の核酸分子。
【請求項２７】  第１のR 単位の相補的配列(X)n及び(X')n'並びに第２のR 単位の相補的配列(X)n及び(X')n'が、ポチイウィルスの少なくとも２種の異なった種のゲノム又は（−）センスRNA における標的配列に対して相補的である請求項１〜26のいずれか1 項記載の核酸分子。
【請求項２８】  １又は複数の触媒領域が、ヘアピン・リボザイム触媒領域を含んで成るか又はそれから誘導される請求項１又は２記載の核酸分子。
【請求項２９】  前記ハイブリダイズする領域が、下記群：
ズキニ黄斑モザイクウィルス（Zucchini yellow mosaic virus）       (ZYMV),
スイカモザイクウィルス（Watermelon mosaic virus ）               (WMV2),
タバコ斑葉ウィルス（Tobacco vein mottling virus ）               (TVMV),
タバコ腐食ウィルス（Tobacco etch virus）                         (TEV),
ジャガイモY ウィルス（Potato virus Y）                           (TVY),
コショウ斑点ウィルス（Pepper mottle virus ）                     (PepMoV),
大豆モザイクウィルス（Soyabean mosai virus）                     (SbMV),
パパイヤリングスポットウィルス（Papaya ringspot virus ）         (PRSV),
エンドウ豆−担持モザイクウィルス（Pea seed-borne mosaic virus ） (PSbNV),
カブモザイクウィルス（Turnip mosaic virus ）                     (TuMV),
ジョンソングラスモザイクウィルス（Johnson grass mosaic virus）   (JGMV),
スモモポックスウィルス（Plum pox virus）                         (PPV),
トウモロコシ矮性ウィルス（Maize Dwarf Virus ）                   (MDV),
豆の一般モザイクウィルス（Bean common mosaic virus）             (BCMV),
豆の黄モザイクウィルス（Bean yellow mosaic virus）               (BYMV),
カーネーション斑葉ウィルス（Carnation vein mottle virus ）       (CarVMV),
セロリモザイクウィルス（Celery mosaic virus ）                   (CeMV),
クローバー黄葉脈ウィルス（Clover yellow vein virus）             (ClYVV),
ヒヨスモザイクウィルス（Henbane mosaic virus）                   (HMV),
レタスモザイクウィルス（Lettuce mosaic virus）                   (LtMV),
サトウキビモザイクウィルス（Sugarcane mosaic virus）             (SCMV),
ピーナッツストライプウィルス（Peanut stripe virus ）             (PStV)
を包含する、アリマキ、ダニ及びコナジラミにより伝達されるポチイウィルスから選択された１又は複数のポチイウィルスの標的領域に対して相補的である請求項１〜27のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項３０】  前記相補的配列 (X)n 及び(X')n'が、ZYMV及び/ 又はWMV2の標的領域、又はそれらの変異体又は誘導体に対して相補的である請求項29記載の核酸分子。
【請求項３１】  ポチイウィルス、特にZYMV又はWMVZの3'未翻訳領域のすべて又は一部を、その3'末端で、さらに含んで成る請求項１〜30のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項３２】  ポチイウィルスゲノム（＋）鎖RNA 又は複製RNA を開裂することができ、それにより、ウィルス複製、感染、アセンブリー、細胞から細胞への移動及び/ 又は徴候を減じることができる請求項１〜31のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項３３】  エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、そして
ａ）図18に示される配列の（−）鎖のヌクレオチド1704〜1873から成る核酸分子、又は、前記分子の少なくとも20個の連続ヌクレオチドから成り、位置（−）1748〜（−）1750で示されるGTA を含む前記核酸分子のフラグメント；
ｂ）図18の位置（−）1748〜（−）1750で示されるGTA を含み、前記ａ）に記載の分子と少なくとも75％の同一性及び好ましくは、少なくとも85％の同一性を有する配列から成る核酸分子；
ｃ）前記ａ）3又はｂ）に記載の分子のいずれかを含んで成るが、しかし完全なウィルス（−）センス複製RNA ではない核酸分子；
ｄ）前記ａ）又はｂ）に記載の分子を含んで成り、第２核酸分子に対して翻訳又は転写融合体として連結された核酸分子；
ｅ）前記第２核酸分子が、たとえばレポータータンパク質をコードする配列、又は興味あるいずれか他の遺伝子を含んで成る、前記ｄ）に記載の核酸分子；
から成る群から選択された分子にハイブリダイズすることができ、そしてそれらを分解することができる、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項３４】  植物細胞において機能する5'及び3'転写調節シグナルに作用可能に連結され、そして転写の際に請求項１〜33のいずれか１項記載の１又は複数の核酸分子を生ぜしめるDNA 配列を含んで成るキメラ遺伝子。
【請求項３５】  １つの核酸分子、又は転写される場合、請求項１〜33のいずれか１項記載の核酸分子を生ぜしめる核酸分子、又は請求項40記載のキメラ遺伝子、及び任意には、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、及び/ 又は植物細胞ゲノムにDNA を移行することができる機能的配列を含んで成るベクター。
【請求項３６】  請求項１〜33のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項34記載のキメラ遺伝子、又は転写の際に請求項１〜33のいずれか１項記載の核酸分子を生ぜしめるDNA 配列を含んで成る植物細胞。
【請求項３７】  請求項１〜32のいずれか１項記載の核酸、又は請求項34記載のキメラ遺伝子を含んで成り、そしてポチイウィルスの複製、感染、細胞から細胞への移動、及び/ 又はアセンブリーを低めることができるトランスジェニック植物。
【請求項３８】  請求項33に記載の核酸を含んで成るトランスジェニック植物。
【請求項３９】  前記植物が、次の属：キューカルビタセアエ（Cucurbitaceae ）、ケノポジアセアエ（Chenopodiaceae）、クルシフェラセアエ（Crusiferaceae ）、グラミナセアエ（Graminaceae ）、レグミノセアエ（Leguminoseae）、オンベリフェラセアエ（Ombelliferaceae ）、ローザセアエ（Rosaceae）、及びソラナセアエ（Solanaceae）から選択される請求項37に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】  前記植物が、ズキニ、メロン、ビート、カラスムギ、小麦、サトウキビ、大麦、ライグラス、インゲン豆、エンドウ豆、大豆、ピーナッツ、ニンジン、セロリ、パースニップ、スモモ、ジャガイモ、トマト、タバコ、コショウである請求項39に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】  請求項37〜40のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の種子。
【請求項４２】  請求項37〜40のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の子孫。
【請求項４３】  請求項37〜40のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の果実。
【請求項４４】  植物にポチイウィルス耐性を付与するための方法であって、請求項1 〜32のいずれか１項記載の核酸を含んで成るか又はそれをコードする核酸を、植物又は植物の一部に導入し、任意には、続いて、必要とされる耐性を示すトランスジェニック植物を再性し、そして任意には、子孫を生成するために繁殖せしめることを含んで成る方法。