【事件の表示】
　平成１１年特許願第　２３８０４号「アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬」拒絶査定不服審判事件〔平成１１年１１月　２日出願公開、特開平１１−２９９４９８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成１１年２月１日（優先権主張平成１０年２月１９日）の出願であって、平成２０年１０月２９日付けで拒絶理由通知書が出され、同年１２月２２日付けで手続補正がなされたが、平成２１年３月１０日付けで拒絶査定がなされ、これに対し、同年４月９日に拒絶査定不服審判の請求がされるとともに、同年４月２３日付けで手続補正がなされたものである。
　
第２　平成２１年４月２３日付けの手続補正の補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２１年４月２３日付けの手続補正を却下する。
　
［理由］
１　補正後の本願発明
　平成２１年４月２３日付けの手続補正は特許請求の範囲を補正するものであって、平成２０年１２月２２日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に
「２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド、Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体および最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩および／または最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩を含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。」とあったのを、
「２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド、Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体および最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩を含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。」（以下、「本願補正発明」という。）と補正することを含むものである。
　上記補正は、補正前の請求項１に記載された、「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩および／または最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩」との選択的事項から、「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩および最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩」である場合と、「最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩」である場合とを削除して、「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩」である場合のみに限縮するものであるから、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　そこで、本願補正発明が特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）について以下に検討する。
　
２　引用刊行物およびその記載事項
　原査定で引用され、本願優先日前に頒布された刊行物である刊行物１〜２には、以下の事項が記載されている。なお、下線は当審で付した。
　刊行物１：Clin. Chim. Acta.，１９９７年，Vol.259，p.147-160（原査定の引用文献１）
　刊行物２：特開平６−３１５３９９号公報（原査定の引用文献２）
　
（１）刊行物１に記載された事項
［１ａ］「Abstract
   A reagent and assay conditions for the determination of the catalytic concentration of α-amylase (E.C.3.2.1.1) in serum with 2-chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotrioside as substrate are described. The selected reaction mixture contains 50 mmol/l 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer at pH 6.1 (37℃), 300 mmol/l sodium chloride, 5 mmol/l calcium chloride and 450 mmol/l potassium thiocyanate. The described method is suitable for the measurement of total as well as pancreatic α-amylase by including antibodies against the salivary isoenzyme.」（第１４７頁の「Abstract」第１〜８行）
当審訳「
血清中のα−アミラーゼの（E.C.3.2.1.1）の触媒的濃度を決定するために、2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシドを基質として用いた試薬及び測定条件が記載されている。該選択された試薬組成は、50 mmol/lの2-(N-morpholino)エタンスルホン酸バッファー（pH 6.1(37℃)）、300 mmol/lの塩化ナトリウム、5 mmol/lの塩化カルシウム及び450 mmol/lのチオシアン酸カリウムを含むものである。上記の方法は、唾液アイソザイムに対する抗体を含むことで、膵臓α−アミラーゼ及び全α−アミラーゼの測定にも適している。
 　
［１ｂ］「Abbreviations: ・・・CNP-G3; 2-chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotrioside;・・・ 」（第１４７頁の「Abstract」欄外）
当審訳「略称：・・・
CNP-G3; 2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド
　
［１ｃ］「The stimulating efect of azide and thiocyanate on α-amylase activity when measured using CNP-G3 as substrate has been described [2,3]giving an approximately 5-fold increase in the enzyme catalytic activity. 」（第１４８頁の「1.  Introduction」第１７〜１９行）
当審訳「CNP-G3を基質として用いて測定されたα−アミラーゼ活性における、アジ化物とチオシアン酸塩の刺激効果については、該酵素触媒活性が約5倍増加することが知られている［2,3］。」　　　
　
［１ｄ］「2.  Materials and methods
2.1.　Reagents
・・・The monoclonal antibodies (66C7 and 88E8) specific against human salivary α-amylase were from Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany.・・・
2.2.  Measurement of α-amylase activity
The final reaction conditions selected for the CNP-G3 method are shown in Table 1. For the pancreatic α-amylase assay, 6 μl of sample was preincubated for 3.4 min with 250 μl of the reagent without CNP-G3 but containing the antibodies (30 mg/l 88E8 and 5 mg/l 66C7). The reaction was then started by adding 50 μl of CNP-G3 13.5 mmol/l. ・・・
」（第１４９頁第１〜最終行「2.  Materials and methods」）
当審訳「2.　材料と方法
2.1.　試薬
・・・
モノクローナル抗体（66C7と88E8）は、ヒト唾液α−アミラーゼに対する特異的な抗体であって、ドイツ・マンハイムのベーリンガーマンハイム社から入手した。
2.2　α−アミラーゼ活性の測定
　
CNP-G3を用いた手法のための、最終的な反応の条件は表１に示されている。膵臓α−アミラーゼ測定のために、6μlのサンプルが、CNP-G3無しだが抗体(30 mg/l 88E8 及び 5 mg/l 66C7)を含む、250μｌの試薬と3.4分間プレインキュベーションされた。その後、反応は50μｌの13.5mmol/lのCNP-G3を添加することで開始された。
（当審訳では「Table 1」は省略）」
　
［１ｅ］「3.2.4. Effect of activators
   The α-amylase activity of the pancreatic reference material and purified salivary α-amylase specimens were determined using varying sodium azide or potassium thiocyanate concentrations. Table 2 summarizes the results. A 5.1-fold increase of pancreatic α-amylase activity was observed using azide and 4.4-fold using thiocyanate. Salivary α-amylase was more sensitive to the thiocyanate effect and was activated up to 9.8-fold.・・・
   The effect of thiocyanate on the assay for pancreatic α-amylase using the CNP-G3 method and immunoinhibition of the salivary isoenzyme was also investigated. Pancreatic α-amylase was slightly inhibited by the antibodies against salivary α-amylase at thiocyanate concentration below 600 mmol/l (Fig.5). Salivary α-amylase was effectively inhibited by the antibodies at thiocyanate concentration between 150 and 450 mmol/l. At the selected thiocyanate concentration (450 mmol/l), the salivary isoenzyme residual activity was 4%, and the pancreatic isoenzyme was 9% inhibited.」（第１５２頁第１１行〜１５３頁下から第３行）
当審訳「3.2.4　活性化剤の効果
　膵臓由来の対照試料と唾液α−アミラーゼ精製標本のα−アミラーゼ活性は、アジ化ナトリウムあるいはチオシアン酸カリウムの濃度を変化させることによって、特定できた。表２に結果が示されている。膵臓α−アミラーゼの活性は、アジ化物を用いることで5.1倍増強され、チオシアン酸塩を用いることで4.4倍増強された。唾液α−アミラーゼの活性はチオシアン酸塩に対して更に敏感であって9.8倍まで増強された。・・・
　
CNP-G3手法と唾液アイソザイムの免疫阻害を用いることで、膵臓α−アミラーゼの測定に対するチオシアン酸塩の効果も調べられた。600mmol/lより低濃度でのチオシアン酸塩の存在下、唾液α−アミラーゼに対する抗体によって、膵臓α−アミラーゼはわずかに阻害された（図５）。150から450mmol/lでのチオシアン酸塩の存在下、上記抗体によって、唾液α−アミラーゼは効果的に阻害された。選択されたチオシアン酸塩濃度（450mmol/l）では、唾液アイソザイムの残存活性は４％であり、膵臓アイソザイムは９％阻害された。
　
［１ｆ］「
」（第１５５頁）
　
［１ｇ］「
」（第１５６頁）
　
［１ｈ］「Thiocyanate plays an important role in the assay as it increases the substrate conversion rate up to values similar to those obtained using longer chain substrates. Thiocyanate (and azide) is a chaotropic ion, solubilizing non-polar moieties of the molecules [19] though affecting the conformation of proteins and as a consequence the interaction between enzyme and substrate. In the assay of α-amylase with CNP-G3, this effect results in an increase of the conversion rate and of the enzyme affinity for the substrate. However, thiocyanate concentrations greater than 500 mmol/l interfered with the pancreatic α-amylase assay, possibly by altering the antibodies conformation and affecting their interaction with the salivary isoenzyme. A thiocyanate concentration of 450 mmol/l was chosen as this gave sufficient α-amylase activation but did not interfere in the pancreatic assay.」（第１５９頁第６〜１７行）
当審訳「
チオシアン酸塩は、基質の変換速度を、
高めるので、測定に重要な役割を果たす。チオシアン酸塩(またアジ化物)は、蛋白質の構造及びその結果による、酵素と基質の相互作用に影響を与えるのであるが、分子の無極性部分を可溶化させる[19]、カオトロピックなイオンである。CNP-G3を用いたα−アミラーゼ測定において、この効果は、基質の変換速度及び基質の酵素親和性の増加に帰結する。しかしながら、500 mmol/lより高いチオシアン酸塩濃度は、恐らく抗体の構造を変化させて、唾液アイソザイムとの相互作用に影響を与えることにより、膵臓のα−アミラーゼ測定に対して干渉するものであった。450 mmol/lというチオシアン酸塩濃度は、十分なα−アミラーゼの活性化を与えるが、膵臓α−アミラーゼの測定に干渉しないことにより選ばれた。
　
（２）刊行物２に記載された事項
［２ａ］「【請求項１】  一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬。
【請求項２】  (a) 一般式（Ｉ）
【化２】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、(b) 遊離した測定可能な物質の量を測定することよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。」（特許請求の範囲参照）
　
［２ｂ］「【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なα−アミラーゼ活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関する。さらに詳しくは非還元末端グルコースの４位あるいは６位にβ−ガラクトピラノシル基を有するグルコース数が２〜４個のマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追随酵素を使用しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、ならびに当該試薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより各種疾患の診断が行われている。このようなα−アミラーゼの活性測定法には、例えば次のような方法がある。
【０００３】（２）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた誘導体を基質とする方法：・・・
【０００４】（３）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端のグルコースの４位および／または６位のヒドロキシル基が何らかの手段で修飾された誘導体を基質とする方法：・・・
【０００５】（４）
２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドを基質とする方法
この方法は、追随酵素を必要としないので低コストであり、ブランク値上昇も少ないが、感度が不良であるという問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来のα−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミラーゼ活性測定試薬の欠点を解消しようとするものであり、その目的とするところは、追随酵素が不要であって（すなわち低コストであり、また基質が追随酵素分解を受けないため安定である）、かつα−アミラーゼに親和性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬を提供することにある。また本発明の目的は、追随酵素が不要であり、かつ高感度のα−アミラーゼ活性測定方法を提供することにある。
　
［２ｃ］「【００１７】
一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体としては、さらに具体的には、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、
特に好ましくは２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドである。
　
［２ｄ］「【００２２】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として含有し、追随酵素を含有しないことを特徴とする。本発明において追随酵素とは、非還元性末端からグルコシド結合を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどがこれに含まれる。
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、必要に応じてその他の添加剤を含有していてもよい。
　
［２ｅ］「【００３０】
【発明の効果】本発明の試薬および測定方法は、α−グルコシダーゼあるいはβ−グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼなどの追随酵素が不要であり、また基質がこれらの追随酵素による酵素分解を受けないため安定である。
さらに基質とα−アミラーゼの親和性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法である。
　
［２ｆ］「【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
実施例
実施例として後記表１に記載したマルトオリゴ糖誘導体を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定試薬をそれぞれ調製した（実施例ＡおよびＢ）。
試薬組成：
５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０）
ＣａＣｌ2                     １ｍＭ
基質                          ２ｍＭ
なお、比較例として後記表１に示した基質を用いて上記と同様の試薬を調製した（比較例Ａ−１、Ａ−２および比較例Ｂ−１、Ｂ−２）。
【００３２】
【表１】
【００３３】実験例  α−アミラーゼの活性測定
上記実施例および比較例で調製した各試薬３mlに三種類の血清１、２および３をそれぞれ０．２５ml添加し、３７℃にて３分間放置したのち、４１５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化を算出した。その結果を表２に示した。なお、表２には試薬ブランクの１分間当りの吸光度の変化も伴せて記載した。
【００３４】
【表２】
【００３５】表２に示したように、実施例Ａと比較例Ａ−１の比較と、実施例Ｂと比較例Ｂ−１の比較から、β−ガラクトピラノシル基がα−アミラーゼとの親和性に優れ、非還元末端の修飾基として好ましいことがそれぞれわかる。
また、実施例Ａと比較例Ａ−１、Ａ−２との比較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１、Ｂ−２との比較から、本発明の試薬の測定感度が高いことがそれぞれわかる。
　
３　対比・判断
（１）刊行物１記載の発明
　上記の記載［１ａ］［１ｂ］［１ｄ］から鑑みるに、刊行物１には、以下の発明（以下、「刊行物１発明」という。）が記載されていると認められる。
「膵臓α−アミラーゼの活性測定用試薬であって、該試薬は、2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシドを基質として用いており、その試薬組成として50 mmol/lの2-(N-morpholino)エタンスルホン酸バッファー（pH 6.1(37℃)）、300 mmol/lの塩化ナトリウム、5 mmol/lの塩化カルシウム及び450 mmol/lのチオシアン酸カリウム、唾液アイソザイムに対するモノクローナル抗体を含む試薬。」
　
（２）本願補正発明と刊行物１発明との対比
ア　本願補正発明に係る「アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬」は、本願明細書の段落【０００２】には「【従来の技術】膵液や尿等の体液に含有されるα−アミラーゼは、主として膵臓由来のＰ型アミラーゼおよび主として唾液腺由来のＳ型アミラーゼの２種類のアイソザイムに大別され、これらを測定することにより、各種疾患の診断が行われる。その中でも、Ｐ型アミラーゼは臓器特異性が高く、急性膵炎のマーカーとして有用であると言われている。」と記載されているように、該試薬とは、膵臓由来又は唾液腺由来のアミラーゼアイソザイムの活性を測定するためのものである。
　そして、刊行物１発明の「膵臓α−アミラーゼの活性測定用試薬」は、アイソザイムの一つである膵臓由来のα−アミラーゼの活性を測定するものであるから、これは、本願補正発明の「アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬」に相当する。
　
イ　本願補正発明に係る「アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬」は、「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」を「含む」ものである。
　該「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」について、本願明細書の段落【００１１】に「本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討し、アミラーゼ活性測定基質として、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドを使用すると所期の目的が達成することを見出し、本発明に到達した。」と記載されていることから、該物質は「アミラーゼ活性測定基質」であると認められる。
　一方、刊行物１発明の「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」は、「膵臓α−アミラーゼの活性測定用試薬」において「基質」として用いられており（［１ａ］）、「CNP-G3」と略称された「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」（［１ｂ］）についての、「CNP-G3を用いた手法のための、最終的な反応の条件は表１に示されている。膵臓α−アミラーゼ測定のために、6μlのサンプルが、CNP-G3無しだが抗体(30 mg/l 88E8 及び 5 mg/l 66C7)を含む、250μｌの試薬と3.4分間プレインキュベーションされた。その後、反応は50μｌの13.5mmol/lのCNP-G3を添加することで開始された。」（［１ｄ］）との記載を鑑みると、「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」は、該試薬に用いられる基質であるものの、該試薬に当初から含まれているとまではいえない。
　したがって、本願補正発明に係る、「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」を「含む」「アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬」と、刊行物１発明の「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」を基質として用いる「膵臓α−アミラーゼの活性測定用試薬」とは、基質を用いるアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬という点で共通する。
　
ウ　本願補正発明に係る「Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体」は、本願明細書の「膵液や尿等の体液に含有されるα−アミラーゼは、主として膵臓由来のＰ型アミラーゼおよび主として唾液腺由来のＳ型アミラーゼの２種類のアイソザイムに大別され、・・・」（段落【０００２】）、「本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬に用いられるＳ型アミラーゼ阻害抗体とは、選択的にＳ型アミラーゼと結合することにより、Ｓ型アミラーゼと基質との反応を高率で阻害し、かつＰ型アミラーゼと基質との反応をほとんど阻害しないものをいう。・・・また、該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。・・・該抗体としては、例えば、市販のＳ型アミラーゼ阻害抗体として、ベーリンガーマンハイム社の６６Ｃ７と８８Ｅ８、・・・の２種の抗体の組み合わせなどが挙げられる。」（段落【００１７】〜【００１８】）との記載を鑑みると、アイソザイムの一つである唾液腺由来のα−アミラーゼの活性を阻害する抗体であって、ベーリンガーマンハイム社から６６Ｃ７と８８Ｅ８の２種の抗体の組み合わせとして市販されているものと認められる。
　一方、刊行物１発明の「唾液アイソザイムに対するモノクローナル抗体」は、「モノクローナル抗体（66C7と88E8）は、ヒト唾液α−アミラーゼに対する特異的な抗体であって、ドイツ・マンハイムのベーリンガーマンハイム社から入手した」（［１ｄ］）ものであるから、これは、本願補正発明に係る「Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体」に相当する。
　
エ　刊行物１発明の「チオシアン酸カリウム」と、本願補正発明の「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩」とは、「チオシアン酸塩」である点で共通する。
　
　したがって、両発明は、
「Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩を含み、基質を用いる、アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。」という点で一致し、次の相違点を有する。
　
（相違点１）
　基質について、本願補正発明では「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」であるのに対し、刊行物１発明では「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」である点
（相違点２）
　基質について、本願補正発明では、アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬に「含む」のに対し、刊行物１発明では、アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬に当初からは含むものでない点
（相違点３）
　チオシアン酸塩が、本願発明では「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩」と、その濃度を特定するのに対し、刊行物１発明ではそのような特定がなされていない点
　
（３）相違点についての検討
（相違点１について）
　刊行物２には、α−アミラーゼ活性測定試薬の基質として２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドが従来から用いられてきたものの、感度が不良であるという問題点があったこと（［２ｂ］）、そして、上記従来のα−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミラーゼ活性測定試薬の欠点を解消するために、基質として、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを用いることで、α−アミラーゼに親和性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬が得られること（［２ｂ］［２ｅ］）が記載されている。
　さらに刊行物２には、５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０）、ＣａＣｌ2 （１ｍＭ）、基質（２ｍＭ）の組成からなるα−アミラーゼ活性測定試薬に血清を添加して、吸光度の変化値を測定したところ、基質として、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを用いた実施例Ａと、２−クロロ−４−ニトロフェニル  α−マルトトリオシドを用いた比較例Ａ−２とでは、実施例Ａの方が試薬の測定感度が高いことが記載されている（［２ｆ］）。
　してみると、上記刊行物２の記載に基づいて、刊行物１発明に係るアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬の測定感度を高めるべく、その基質である「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」を、「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」へと代えることは、当業者であれば容易になし得たことである。
　
（相違点２について）
　アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬における基質の添加態様について検討するに、刊行物１では、「CNP-G3を用いた手法のための、最終的な反応の条件は表１に示されている。膵臓α−アミラーゼ測定のために、6μlのサンプルが、CNP-G3無しだが抗体(30 mg/l 88E8 及び 5 mg/l 66C7)を含む、250μｌの試薬と3.4分間プレインキュベーションされた。その後、反応は50μｌの13.5mmol/lのCNP-G3を添加することで開始された。」（［１ｄ］）と記載されているように、アミラーゼアイソザイム活性の実際の測定時には、基質は混合される成分であるから、刊行物１発明において、当該基質は最終的に反応液に含まれるものであって、ここにおいて、基質を予め試薬に含有させて用いても支障が無いかを確かめ、基質を試薬に添加することは、当業者が容易になし得たことである。
　さらに、基質を抗体と共に含む態様の膵臓α−アミラーゼ活性測定試薬が周知である（例えば、特開昭６３−２２６００号公報の請求項１２〜１４及び実施例１〜３、特開昭６３−７７９８号公報の請求項１３〜２５及び実施例３、特表平５−５０７０９４号公報の請求項２５及び実施例２、６を参照されたい）ことを鑑みると、刊行物１発明に係る試薬に当初から基質を含有させることに、阻害要因が存するものとも認められない。
　
（相違点３について）
　刊行物１では、チオシアン酸カリウムについて「活性化剤」として言及されており（［１ｅ］［１ｆ］）、さらに、「CNP-G3を基質として用いて測定されたα−アミラーゼ活性における、アジ化物とチオシアン酸塩の刺激効果については、該酵素触媒活性が約5倍増加することが知られている」（［１ｃ］）、及び「チオシアン酸塩は、基質の変換速度を、さらに長鎖の基質を用いた場合に得られる変換速度の値にまで高めるので、測定に重要な役割を果たす。チオシアン酸塩(またアジ化物)は、蛋白質の構造及びその結果による、酵素と基質の相互作用に影響を与えるのであるが、分子の無極性部分を可溶化させる[19]、カオトロピックなイオンである。CNP-G3を用いたα−アミラーゼ測定において、この効果は、基質の変換速度及び基質の酵素親和性の増加に帰結する。」（［１ｈ］）と記載されていることから、刊行物１発明に係る、活性化剤であるチオシアン酸塩は、基質の変換速度及び基質の酵素親和性をともに増加させて、測定に重要な役割を果たしているものといえる。
　さらに、刊行物２に係る「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定用試薬は「必要に応じてその他の添加剤を含有していてもよい」（［２ｄ］）ものであるから、該基質は、活性化剤の添加を妨げるものでないことは明らかである。
　したがって、上記「（相違点１について）」で述べたように、刊行物１発明に係るアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬の測定感度を高めるべく、その基質である「2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシド」を、「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」へと代えた場合、基質の種類に伴って、活性化剤であるチオシアン酸塩の必要な濃度が変化することは自明である。
　チオシアン酸塩の濃度については、刊行物１においても、チオシアン酸塩の濃度変化がもたらす、膵臓α−アミラーゼ活性の測定効果を既に検討している。詳細には、チオシアン酸塩の添加濃度と膵臓α−アミラーゼ活性化との関係が調べられており（［１ｅ］［１ｆ］）、150〜450mmol/lでのチオシアン酸塩の存在下、唾液アイソザイムに対する抗体によって唾液アイソザイムは効果的に免疫阻害されており、450mmol/lでは唾液アイソザイムの残存活性は４％にまで阻害されること（［１ｅ］［１ｇ］）、並びに、チオシアン酸塩が500mmol/lである場合は、抗体の構造を変化させてしまうため測定に好ましくないのに対し、450mmol/lとの濃度は「十分なα−アミラーゼの活性化を与えるが、膵臓α−アミラーゼの測定に干渉しないことにより選ばれた。」とも記載されている（［１ｇ］［１ｈ］）。
　したがって、刊行物１発明に係る基質を「２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド」へと代えた場合、刊行物１［１ｆ］［１ｇ］と同様に、チオシアン酸塩の濃度に応じた、膵臓α−アミラーゼの活性化との関係性、並びに、膵臓及び唾液由来の各アイソザイムの免疫阻害の程度を調べて、膵臓α−アミラーゼ活性測定に悪影響を及ぼさないようなチオシアン酸塩の濃度範囲を導くことは、当業者であれば容易になし得たことであり、かつ、測定感度が高い基質を用いれば、チオシアン酸塩の濃度が低減されることも自明である。
　
　また、刊行物１［１ｅ］〜［１ｈ］及び刊行物２［２ｆ］の記載事項を参酌すると、本願補正発明に係る効果は十分予測し得るものでしかない。
　
　４　むすび
　したがって、本願補正発明は、刊行物１に記載された事項及び刊行物２に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。
　以上のとおり、本件補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
第３　本願発明について
１　本願発明
　平成２１年４月２３日付けの手続補正は上記のとおり却下されたので、本願請求項１〜６に係る発明は、平成２０年１２月１１日付けの手続補正書により補正された特許請求の範囲請求項１〜６に記載された事項により特定されるとおりのものであり、その請求項１に係る発明（以下、同項記載の発明を「本願発明」という。）は、下記の事項により特定される発明である。
「２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド、Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体および最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩および／または最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩を含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。」
　
２　引用刊行物およびその記載事項
　原査定の拒絶の理由に引用された引用刊行物、および、その記載事項は上記「第２　２」に記載のとおりである。
　
３　対比・判断
　本願発明は、前記「第２」で検討した本願補正発明から、活性化剤の種類について、「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩」から「最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩および／または最終濃度が１〜９０ｍＭのアジ化塩」へと、選択肢の限縮を解除するものである。
　そうすると、本願発明に含まれる本願補正発明が、前記「第２　３」に記載したとおり、刊行物１に記載された事項及び刊行物２に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願発明も、同様の理由により、刊行物１に記載された事項及び刊行物２に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
４　むすび
　以上のとおり、本願発明は、刊行物１に記載された事項及び刊行物２に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって、その他の請求項に係る発明についての判断を示すまでもなく本願は拒絶すべきものである。
　
　なお、念のため、平成２４年１月２７日付け回答書に記載の補正案について検討する。該補正案は、請求項１に係る発明を「２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド、Ｓ型アミラーゼ活性を阻害する抗体および最終濃度が５０〜４００ｍＭのチオシアン酸
塩を含み、アジ化ナトリウムを含まない
　
　よって、結論のとおり審決する。