【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体キャリヤー中に、気体充填マイクロバブルを含む、標的に結合するマイクロバブル組成物であって；該マイクロバブルが実質的に鈍鋸歯状のマイクロバブル膜を有し；そして該マイクロバブル膜が標的に結合する標的結合分子を含む、前記マイクロバブル組成物。
【請求項２】
該マイクロバブル膜が、脂質、タンパク質、ポリマーまたは他の界面活性剤あるいはこれらの組合せを含む、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項３】
気体が実質的に血液に不溶である、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項４】
気体がフッ素含有気体である、請求項３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項５】
マイクロバブルが約１〜約１０マイクロメートルの平均直径を有する、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項６】
標的がレセプターであり、標的結合分子がレセプターに結合する、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項７】
レセプターが細胞外マトリクスタンパク質、接着分子、レセプターに結合するＧ−プロテイン、細胞表面タンパク質、サイトカイン、糖タンパク、ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項８】
標的化分子がペプチド、擬ペプチド、アプタマー、タンパク質、抗体と抗体フラグメント、オリゴ糖、及び小さい有機分子からなる群から選択される、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項９】
液体キャリヤー中の、気体充填マイクロバブルの懸濁液を含む、標的に結合するのに有用なマイクロバブル組成物であって、該マイクロバブルが表面突起を有するマイクロバブル膜を実質的に有し、該マイクロバブル膜が標的に結合する標的結合分子をさらに含む、前記マイクロバブル組成物。
【請求項１０】
表面突起が膜の折り畳みを含む、請求項９に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１１】
マイクロバブル膜が脂質、タンパク質または界面活性剤を含み、マイクロバブルが約１〜約１０マイクロメートルの平均直径を有する、請求項９に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１２】
気体が実質的に血液に不溶である、請求項９に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１３】
標的が細胞膜結合レセプターであり、標的結合分子がレセプターに結合する、請求項１２に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１４】
標的化結合分子がペプチド、擬ペプチド、アプタマー、タンパク質、抗体と抗体フラグメント、オリゴ糖及び小さい有機分子からなる群から選択される、請求項９に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１５】
レセプターが細胞外マトリクスタンパク質、接着分子、レセプターに結合したＧ−プロテイン、細胞表面タンパク質、サイトカイン、糖タンパク、ペプチド、脂質、糖脂質またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１６】
液体キャリヤー中の、気体充填マイクロバブルの懸濁液を含む、標的に結合するのに有用なマイクロバブル組成物であって、該マイクロバブルが主に非球形マイクロバブル膜を有し、該非球形マイクロバブル膜が剪断応力下で、対応する球形マイクロバブル膜よりも高い変形度を示し、該マイクロバブル膜が標的に結合する標的結合分子を含む、前記マイクロバブル組成物。
【請求項１７】
マイクロバブル膜が脂質、タンパク質、ポリマーまたは他の界面活性剤またはこれらの組合せを含む、請求項１６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１８】
気体が実質的に血液に不溶である、請求項１６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項１９】
マイクロバブルが約１〜約１０マイクロメートルの平均直径を有する、請求項１６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項２０】
標的が細胞膜結合レセプターであり、標的化分子がレセプターに結合する、請求項１６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項２１】
マイクロバブルを標的に結合させる方法であって、請求項１、９及び１６のいずれか１項に記載のマイクロバブル組成物に標的を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２２】
マイクロバブル組成物のマイクロバブル膜がスペーサー腕により接着された標的化分子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的に向けられたマイクロバブル組成物の製造方法であって、
液体キャリヤーに懸濁され、球形マイクロバブル膜を有する、気体充填マイクロバブルを形成し；
球形マイクロバブルを非球形マイクロバブルに変化させ；そして
該マイクロバブル膜に、標的に結合する標的化分子を接着あるいは導入する
ことを含む、前記方法。
【請求項２４】
標的化分子が、該変化より前に膜に接着あるいは導入される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的化分子が、該変化より後に膜に接着あるいは導入される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該変化が、球形マイクロバブル膜内からの気体の部分的放出を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該変化が、球形マイクロバブル膜を圧力にかけることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該圧力が、静水圧、超音波、またはマイクロバブル膜の浸透圧差により適用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
標的化分子がペプチド、擬ペプチド、アプタマー、タンパク質、抗体と抗体フラグメント、オリゴ糖、及び小さい有機分子からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１、９及び１６のいずれか１項に記載のマイクロバブル組成物を含む薬剤組成物であって、液体キャリヤーが薬学的に許容可能な液体キャリヤーである、前記薬剤組成物。
【請求項３１】
治療用組成物である、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
診断用組成物である、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
超音波造影剤である、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
患者において超音波造影を行う方法であって：
患者に請求項３３に記載の超音波造影剤を導入し；そして
該組成物を基準に超音波像を現像する
ことを含む、前記方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の治療用組成物を患者に投与することを含む、患者の治療的処置を行う方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
【図１】図１は、in vitro接着能の検討を行うのに使用する逆平行フローチャンバーを示す線図である。標的基質（P-セレクチン．Fc）をフローチャンバープレート上板に吸着させ、標的化マイクロバブルの分散液を既知の剪断速度でフローチャンバーに注入する。
【図２】図２は、変形度の検討を行うのに使用する修正フローチャンバーを示す線図である。標的基質（アビジン）で薄カバーガラスを被覆し、これを標準３５ｍｍ培養皿内に置く。高倍率水浸漬対物レンズとカバーガラスとのカップリングを可能とするために培養皿を通過する小さな観察穴を切る。フローチャンバーの残りの部分は、記載したとおりに組み立てる。
【図３】図３は、本発明のある種の態様のしわ状形状を示す線図である。マイクロバブルへの圧力の負荷により脂質単分子膜が折れ曲がり、二重のしわを形成する。ＰＥＧ分子は太黒線、固定化標的化抗体はＹ字形黒線で示される。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、それぞれしわ状及び球形マイクロバブルの蛍光像（上）及び明視野像（下）である。バブルはプラスチックカバーガラスに静的に吸着され、１００倍の高解像度デジタルカメラで写真撮影される。エピ蛍光により脂質殻の視角化が可能となり、ここではしわが生じており、明視野は気体核の視角化を可能とする。上のパネルの右下の隅にある線は１０μｍである。
【図５】図５は実験部でさらに説明したとおり、マイクロバブルのサイズ特性を示す：（A)フローチャンバー実験に用いたバブルの平均マイクロバブル直径の棒グラフ；（B)球形及びしわ状マイクロバブルのCoulterカウンターサイズ分布；（C)しわ状及び球形マイクロバブルのサイズパラメータの表
【図６】図６は、皿表面の標的レセプターP-セレクチン．Fcのサイト密度を表すグラフであり、この点はさらに実験部に記載されている。ビオチン化Rb40.34を適切な量のP-セレクチン．Fcで被覆した皿と共にインキュベートする。結合した抗体をEu結合ストレプトアビジンでラベル化し、P-セレクチン．Fcサイト密度をλem＝３６０ｎｍ、λex＝６１０ｎｍで時間分解スペクトロスコピーにより定量した。
【図７】図７は、フローチャンバー実験におけるしわ状及び球形マイクロバブルの強固な接着を表し、この点はさらに実験部に記載されている。強固な接着の接着能は、結合距離内にいる総流量に対して、１０秒間以上接着したままでいるマイクロバブルの割合として定義される。（A、B、C)種々のP-セレクチン．Fcサイト密度に対するしわ状及び球形マイクロバブルの強固な接着能；（D)負対照条件における強固な接着能：Rb40.34バブルのカゼインへの接着能及びアイソタイプ対照バブルの２５０ｎｇ／皿P-セレクチン．Fcへの接着能。
【図８】図８は、フローチャンバー実験における強固に接着したマイクロバブルの割合を示し、この点はさらに実験部に記載されている。強固な接着は、強固な接着能を捕捉能で割ることにより計算した。
【図９】図９A−９Cは、フローチャンバー実験における球形及びしわ状マイクロバブルの休止持続時間を示し、この点はさらに実験部に記載されている。頻度を各バブルのタイプの接着行動の総数に対して標準化し；標準化した頻度の実際値を各カラムの上に記載した。休止時間のデータを各オフラインでの接着行動の持続時間を計算することにより接着能フローチャンバーの結果から集めた（実験、セクション２．４．２）。＞１０秒接着したバブルを「強固に接着した」とし、１０秒のカラムで示した。全ての一時的接着バブルの平均休止時間は実質的に１０秒以内であり、したがって二つの行動群のカットオフと１０秒を用いることを正当化する。
【図１０】図１０は、種々の剪断下におけるしわ状及び球形マイクロバブルの変形度を示し、この点はさらに実験部に記載されている。ビオチン化蛍光しわ状または球形マイクロバブルを、意図した剪断速度で５分間アビジンの基質に接着させた。接着したマイクロバブルの映像を高分解能カメラで１００倍でとらえた。変形指数を流れの方向における伸長度（ｘ）を流れと垂直の方向におけるバブルの長さ（ｙ）で割って算出した。ｘとｙの方向の間にピクセルサイズの偏りはなかった。
【図１１】図１１は、しわ状及び球形マイクロバブル群に関して、P-セレクチン標的化マイクロバブルのin vivoでの蓄積を示す。しわ状（Di-Iラベル化）及び球形（Di-Oラベル化）P-セレクチン標的化またはアイソタイプ対照マイクロバブルの２．５×１０6の混合分散物を、手術の２時間前に５００ｎｇマウスTNF-αで予め処理したc57B1/6またはP-/-マウスの静脈内に注射した。炎症マウス挙睾筋におけるマイクロバブルの接着を、小静脈中で接着したしわ状及び球形マイクロバブルを１０箇所数えることにより測定した。（Ａ）炎症微小循環におけるしわ状及び球形マイクロバブルの接着；（Ｂ）生理学的パラメータ。