【手続補正書】
【提出日】平成18年1月27日(2006.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピノシン生合成酵素をコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該酵素が配列番号２−６、７−２４、２６、２７、２９、３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列により特定されるか、または該酵素がその酵素の機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている配列番号２−６、７−２４、２６、２７、２９、３３から選択されるアミノ酸により特定されるものである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
該ＤＮＡ配列がｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＳ、ＯＲＦＬ１５、ＯＲＦＬ１６、ＯＲＦＲ１、ＯＲＦＲ２、サッカロポリスポラ・スピノサｇｔｔ、サッカロポリスポラ・スピノサｇｄｈ、サッカロポリスポラ・スピノサｅｐｉ及びサッカロポリスポラ・スピノサｋｒｅよりなる遺伝子の群から選択され、該遺伝子が配列番号：１の塩基２１１１１−２８８９８、２８９１６−３５３７４、３５４１９−４４９３１、４４９６６−５９７５２、５９８０３−７６５６９、２０１６８−２０９９５、１８５４１−１９７１３、１７７４９−１８５０１、１６５５６−１７７４３、１４７９９−１６４１８、１３５９２−１４７８５、１２６９６−１３５４７、１１５３０−１２４９２、１０４３６−１１４３４、８９６７−１０４２７、７０８３−８４５０、５３６３−６７５１、４１６８−５３２５、３４１６−４１６５、２０２４−２７９１、１１３５−１９７１、７６９３２−７７５２８及び７７７２９−７９９８４、配列番号：２７の塩基３３４−１１１９、配列番号：２４の塩基８８−１０７７、配列番号：３１の塩基２２６−８３４並びに配列番号：２４の塩基１１６５−１９９２により示される請求項１の単離されたＤＮＡ分子
【請求項３】
スピノシンポリケチドシンターゼドメインをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該ドメインが、それぞれ、配列番号：２のアミノ酸配列６−４２３、５２８−８５３、８９５−９７７、９９８−１４１３、１５２５−１８５８、２１５８−２３３７及び２４３２−２５１３に対応するＫＳｉ、ＡＴｉ、ＡＣＰｉ、ＫＳ１、ＡＴ１、ＫＲ１及びＡＣＰ１から選択されるか、または該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基２１１２６−２２３７９、２２６９２−２３６６９、２３７９３−２４０４１、２４１０２−２５３４９、２５６８３−２６６８４、２７５８２−２８１２１及び２８４０４−２８６４９よりなる群から選択される請求項３の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】
スピノシンポリケチドシンターゼドメインをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該ドメインが、それぞれ、配列番号：３のアミノ酸配列１−４２４、５３６−８６６、８９２−１０７７、１３３８−１６８３、１６８７−１８６６及び１９５５−２０３４に対応するＫＳ２、ＡＴ２、ＤＨ２、ＥＲ２、ＫＲ２及びＡＣＰ２から選択されるか、または該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基２９０２４−３０２９５、３０６２９−３１６２１、３１６９７−３２２５４、３３０３５−３４０７２、３４０８２−３４６２１、３４８８６−３５１２５よりなる群から選択される請求項５の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項７】
スピノシンポリケチドシンターゼドメインをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該ドメインが、それぞれ、配列番号：４のアミノ酸配列１−４２３、５３１−２８０、１１５９−１３３７、１４２５−１５０６、１５２９−１９５２、２０６６−２３９６、２７００−２８８０及び２９７２−３０５３に対応するＫＳ３、ＡＴ３、ＫＲ３、ＡＣＰ３、ＫＳ４、ＡＴ４、ＫＲ４及びＡＣＰ４から選択されるか、または該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項８】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基３５５１８−３６７８６、３７１０８−３８０９７、３８９９２−３９５２８、３９７９０−４００３５、４０１０２−４１３７３、４１７１３−４２７０５、４３６１５−４４１５７及び４４４３１−４４６７６よりなる群から選択される請求項７の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
スピノシンポリケチドシンターゼドメインをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該ドメインが、それぞれ、配列番号：５のアミノ酸配列１−４２４、５３９−８６６、８９３−１０７８、１３８４−１５６５、１６４５−１７２６、１７４８−２１７２、２２８３−２６１３、２９１６−３０９５、３１８８−３２６９、３２９１−３７１３、３８２５−４１５３、４３４４−４６３８及び４７２５−４８０６に対応するＫＳ５、ＡＴ５、ＤＨ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５、ＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６、ＫＳ７、ＡＴ７、ＫＲ７及びＡＣＰ７から選択されるか、または該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１０】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基４５０７７−４６３４８、４６６９１−４７６７４、４７７５３−４８３１０、４９２２６−４９７７１、５０００９−５０２５４、５０３１８−５１５９２、５１９２３−５２９１５、５３８２２−５４３６１、５４６３８−５４８８３、５４９４７−５６２１５、５６５４９−５７５３５、５８１０６−５８９９０及び５９２４９−５９４９４よりなる群から選択される請求項９の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１１】
スピノシンポリケチドシンターゼドメインをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該ドメインが、それぞれ、配列番号：６のアミノ酸配列１−４２４、５３０−８４８、８８３−１０７０、１３６９−１５５２、１６４８−１７２６、１７４９−２１７３、２２８７−２６１４、２６４０−２８００、３１５７−３３４１、３４２２−３５００、３５３４−３９４８、４０６０−４３９０、４４１３−４５９７、４９００−５０７８、５１７２−５２５３及び５３０２−５５５５に対応するＫＳ８、ＡＴ８、ＤＨ８、ＫＲ８、ＡＣＰ８、ＫＳ９、ＡＴ９、ＤＨ９、ＫＲ９、ＡＣＰ９、ＫＳ１０、ＡＴ１０、ＤＨ１０、ＫＲ１０、ＡＣＰ１０及びＴＥ１０から選択されるか、または該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１２】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基５９９０２−６１１７３、６１４８９−６２４４５、６２５４８−６３１１１、６４００６−６４５５７、６４８４３−６５０７９、６５１４６−６６４２０、６６７６０−６７７４３、６７８１９−６８３０１、６９３７０−６９９２４、７０１６５−７０４０１、７０４７１−７１７４５、７２０７９−７３０７１、７３１３８−７３６９２、７４５９９−７５１３５、７５４１５−７５６６０及び７５８０５−７６５６６よりなる群から選択される請求項１１の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１３】
スピノシンポリケチドシンターゼモジュールをコードするＤＮＡ配列よりなる単離されたＤＮＡ分子であって、ここで、該モジュールが配列番号：２のアミノ酸配列６−１４１３、配列番号：２の１５２５−２５１３、配列番号：３の１−２０３４、配列番号：４の１−１５０６、配列番号：４の１５２９−３０５３、配列番号：５の１−１７２６、配列番号：５の１７４８−３２６９、配列番号：５の３２９１−４８０６、配列番号：５の１−１７２６、配列番号：６の１−１７２６、配列番号：６の１７４９−３５００及び配列番号：６の３５４３４−５５５５よりなる群から選択されるか、または該モジュールがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換がなされている該アミノ酸配列のいずれかである単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１４】
該ＤＮＡ配列が配列番号：１の塩基２１１２６−２４０４１、２４１０２−２８６４９、２９０２４−３５１２５、３５５１８−４００３５、４０１０２−４４６７６、４５０７７−５０２５４、５０３１８−５４８８３、５４９４７−５９４９４、５９９０２−６５０７９、６５１４６−７０４０１及び７０４７１−７６５６６よりなる群から選択される請求項１３の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１に記載されたＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載された組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
１）生合成経路によりスピノシンまたはスピノシン前駆体を生産する微生物を組換えＤＮＡベクターまたはその一部で形質転換し、該ベクターまたはその一部が該経路において律速である活性の発現をコードする請求項１のＤＮＡ配列を含んでなり、そして
２）該ベクターで形質転換された該微生物を細胞増殖及び分裂、該ＤＮＡ配列の発現並びにスピノシンの生産のために適当な条件下で培養する、
という工程を含んでなるスピノシンの製造方法。
【請求項１８】
工程１）が、それぞれ配列番号：２９及び２６に対応する、サッカロポリスポラ・スピノサｇｔｔ及びサッカロポリスポラ・スピノサｇｄｈをコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターまたはその一部で該微生物を形質転換することを含んでなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
スピノシン生合成遺伝子をゲノム中に有する形質転換されたスピノシン産生微生物であって、ここで、ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＳ、サッカロポリスポラ・スピノサｇｔｔ、サッカロポリスポラ・スピノサｇｄｈ、サッカロポリスポラ・スピノサｅｐｉ及びサッカロポリスポラ・スピノサｋｒｅから選択されるスピノシン生合成遺伝子の少なくとも１つが重複しており、該遺伝子が配列番号：１の塩基２１１１１−２８８９８、２８９１６−３５３７４、３５４１９−４４９３１、４４９６６−５９７５２、５９８０３−７６５６９、２０１６８−２０９９５、１８５４１−１９７１３、１７７４９−１８５０１、１６５５６−１７７４３、１４７９９−１６４１８、１３５９２−１４７８５、１２６９６−１３５４７、１１５３０−１２４９２、１０４３６−１１４３４、８９６７−１０４２７、７０８３−８４５０、５３６３−６７５
１、４１６８−５３２５、３４１６−４１６５、２０２４−２７９１、１１３５−１９７１、７６９３２−７７５２８及び７７７２９−７９９８４、配列番号：２７の塩基３３４−１１１９、配列番号：２４の塩基８８−１０７７、配列番号：３１の塩基２２６−８３４並びに配列番号：２４の塩基１１６５−１９９２により示される形質転換されたスピノシン産生微生物。
【請求項２０】
サッカロポリスポラ・スピノサｇｔｔ及びサッカロポリスポラ・スピノサｇｄｈが重複しており、該遺伝子がそれぞれ配列番号：２８の塩基３３４−１１１９及び配列番号：２５の塩基８８−１０７７により示される請求項１９の形質転換されたスピノシン産生微生物。
【請求項２１】
請求項２０の形質転換されたスピノシン産生微生物を培養することを含んでなるスピノシン化合物の製造方法。
【請求項２２】
サッカロポリスポラ・スピノサｇｔｔ、サッカロポリスポラ・スピノサｇｄｈ及びサッカロポリスポラ・スピノサｋｒｅが重複しており、該遺伝子がそれぞれ配列番号：２８の塩基３３４−１１１９、配列番号：２５の塩基８８−１０７７及び配列番号：２５の塩基１１６５−１９９２により示される請求項１９の形質転換されたスピノシン産生微生物。
【請求項２３】
請求項２２の形質転換されたスピノシン産生微生物を培養することを含んでなるスピノシン化合物の製造方法。
【請求項２４】
請求項１９の形質転換されたスピノシン産生微生物を培養することを含んでなるスピノシン化合物の製造方法。
【請求項２５】
マクロライド産生微生物のゲノムライブラリーを作製すること及びハイブリダイゼーションプローブとして少なくとも２０塩基の長さである配列番号：１、配列番号：２５、配列番号：２８または配列番号：３２の標識されたフラグメントを用いることを含んでなるマクロライド生合成遺伝子の単離方法。
【請求項２６】
微生物がスピノシン産生微生物である請求項２５の方法。