【手続補正書】
【提出日】平成18年9月13日(2006.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦレセプターシグナル伝達の阻害方法であって、細胞表面にＥＧＦレセプターとフリズルド（Ｆｚ）を有する細胞と、当該細胞中でＥＧＦレセプターシグナル伝達を低減させるのに十分な量のＷｎｔアンタゴニストとを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
当該ＥＧＦレセプターがＥｒｂＢ１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該ＷｎｔアンタゴニストがＷｎｔ１またはＷｎｔ５ａのアンタゴニストである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該アンタゴニストがＷｎｔに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該アンタゴニストがＦｚに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該アンタゴニストがｓＦＲＰである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該細胞が上皮細胞である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
当該細胞が固形腫瘍細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＥＧＦレセプターシグナル伝達を阻害するためのＷｎｔアンタゴニストの使用。
【請求項１１】
Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を変調するために有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｗｎｔレセプター（Ｆｚ）とＷｎｔとを候補化合物の存在下に接触させる工程；
（ｂ）Ｗｎｔまたは当該候補化合物と当該Ｗｎｔレセプターとの結合を検出する工程；および
（ｃ）当該候補化合物と当該Ｗｎｔレセプターとの結合を、またはＷｎｔと当該Ｗｎｔレセプターとの結合における変化を、当該候補化合物の存在しないときと比較して、潜在的ＥｒｂＢモジュレーターと相関させる工程；
からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
当該方法が細胞にもとづくものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらにＥｒｂＢシグナル伝達を検出する工程を含んでなる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達をＥＲＫ活性、ＭＡＰＫ活性、ＥｒｂＢホスホチロシンまたはサイクリンＤの存在により検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達をレポーター遺伝子産物の存在により検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
当該候補化合物がＥｒｂＢシグナル伝達を阻害するものである請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）Ｗｎｔ、Ｆｚ、および／またはＷｎｔおよび／またはＦｚを発現する細胞；および
（ｂ）ＥｒｂＢシグナル伝達の検出手段；
を含んでなるキット。
【請求項１８】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達の検出手段が抗体である請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
該抗体が検出可能なタグまたは標識を含んでなる請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
患者のＥｒｂＢシグナル伝達を阻害する方法であって、患者の細胞にてＥｒｂＢシグナル伝達を低減させるために十分な量のＷｎｔアンタゴニストを含有してなる組成物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２１】
該アンタゴニストがＷｎｔに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該アンタゴニストがＦｚに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
障害が癌である請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
当該癌が乳癌または直腸癌である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
当該癌がＥｒｂＢ１を発現する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＥｒｂＢを発現する癌の処置用医薬の製造におけるＷｎｔアンタゴニストの使用。
【請求項２７】
Ｗｎｔアンタゴニストにより処置する必要のある患者の診断方法であって、ＥｒｂＢレセプターのシグナル伝達を検出することを特徴する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明方法は、ＥｒｂＢレセプターとＷｎｔのレセプターを発現する広範囲の細胞、組織および臓器においてＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害するために、Ｗｎｔアンタゴニストを使用することを含む。該細胞、組織または臓器は、好ましくは、ＥｒｂＢ１、ならびにＦｚ、特にＦｚ６、７および／または８を発現する。さらに、当該方法は培養により調製する細胞（インビトロ）または動物全体の細胞（インビボ）上にて実施し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
適切な細胞は代表的にはＥｒｂＢレセプターおよびＦｚ（またはＷｎｔレセプター）を発現する細胞であり、たとえば、これらは限定されるものではないが、上皮細胞または上皮由来の細胞、筋肉細胞、間充織細胞、グリア細胞またはグリオブラストーマ細胞など、または神経冠由来の細胞、メラニン細胞およびメラノーマ細胞などである。下記実施例では乳腺細胞およびヒト胎児腎臓細胞を用いて本発明を説明する。細胞は細胞増殖を持続させ得る既知の培地、たとえば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などに、細胞の代謝に必要な補助添加物、たとえば、グルタミンと他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよびトランスフェリンなどの有用なタンパク質などを加えた培地に入れる。培地は酵母、細菌およびかびなどでの汚染を防ぐために、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質を含んでいてもよい。場合によっては、該培地はウシ、ウマ、ニワトリなど由来の血清を含んでいてもよい。該培地はまた他の生物学的に活性な分子、たとえば、増殖因子、特にＥＧＦなどを含んでいてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
培養条件は生理的条件に近いものとすべきである。培地のｐＨは生理学的ｐＨに近いものとすべきであり、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７近辺、さらにより好ましくは約ｐＨ７.４とする。細胞は生理的温度に近い温度、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは３２〜３８℃、最も好ましくは３５〜３７℃で培養すべきである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
無細胞アッセイについては、一般に、ＷｎｔまたはＷｎｔレセプターのいずれかを固定化して、レセプター複合体と複合体を形成しなかったタンパク質（および／またはアンタゴニスト）の一方との分離をし易くすること、ならびにアッセイの自動化を図ることが望ましい。一態様においては、融合タンパク質を準備し、タンパク質がマトリックスに結合するようにドメインを加える。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／レセプター（ＧＳＴ／レセプター）融合タンパク質をグルタチオンセファロース・ビーズに、またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ、これを次いで結合パートナー（または潜在的結合パートナー）、たとえば、標識Ｗｎｔ、および試験化合物と組合せ、複合体形成に資する条件下、たとえば、塩およびｐＨについて生理的な条件下にインキュベートするが、僅かにより緊縮な条件が望ましい場合もある。同様に、（ヒスチジン）６タグを用いてニッケル結合を介して固定化するか、またはエピトープ（例、ＨＡタグ）を用いて抗体により固定化し得る。インキュベーションに続き、ビーズ（または他の表面）を洗浄して結合しなかったリガンドを除き、マトリックスビーズ結合標識を直接定量する（たとえば、放射標識の場合にはビーズをシンチレーターに入れる）か、または複合体を解離させた後の上清で定量する。別法として、複合体をビーズから解離させ、標準的技法を用いて定量することができる。一部の態様においては、ＷｎｔおよびＷｎｔレセプターの双方を標識する；候補化合物がＷｎｔとＷｎｔレセプターの結合を妨害し、検出可能なシグナルを生成する（たとえば、ＷｎｔをＦｚに接近させ蛍光をクエンチングすると、もし化合物がＷｎｔレセプターからＷｎｔを放出すると、蛍光を発する）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
一般に、かかるスクリーニング手法はＷｎｔレセプターおよびＥｒｂＢシグナル伝達経路の成分を発現する適切な細胞の産生を伴う。かかる細胞は哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞を含む。該レセプターを発現する細胞（または発現したレセプターを含む細胞膜）は次いで候補化合物と接触させ、結合、または機能的応答の促進もしくは阻害を観察する。したがって、Ｆｚ−発現細胞はＦｚタンパク質を自然に発現する細胞（代表的には哺乳動物細胞）または異所性にＦｚを発現するように遺伝子工学的に設計した細胞でよい。この細胞のその他の特徴も望ましいものである（たとえば、アッセイがＥｒｂＢシグナル伝達にもとづく場合にはＥｒｂＢシグナル伝達の能力）。さらに、組換え細胞はＷｎｔ−および／またはＥｒｂＢ−依存性シグナル経路に関与するタンパク質をエンコードする他の異種遺伝子を含むように設計し、Ｗｎｔ−および／またはＥｒｂＢ−シグナル伝達カスケードの機能的再構成に感受性であるアッセイ法を設計することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
これを実施するために、ＴopＴ ＫＨＣ１１にＬＮＣＸレトロウイルス（Miller AD, Rosman GJ, 1989, Biotechniques 7:980-990）に感染させたが、このものはネオマイシン耐性のための遺伝子をエンコードし、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ５ａ発現を推進するＣＭＶプロモーターを使用する（Aberle et al 1997 EMBO J. 16:3797-3804）。細胞の二重薬物耐性（ピューロ／ネオ）プールを選択し、Ｗｎｔ１−ＨＣ１１、Ｗｎｔ５ａ−ＨＣ１１および対照（Ｃ）−ＨＣ１１と呼称する。これらの細胞はそのまま検討するか、またはＷｎｔ含有順化培地の起源として使用した。Ｗｎｔ含有ＣＭを調製するために、ＥＧＦとインスリンを欠く培地で細胞を一夜増殖し、培地を除去して、試験すべき培地に加えた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
Ｃ−ＨＣ１１細胞はＦｚ６、−７および−８、およびＷｎｔ４および−７bのｍＲＮＡを発現する。高レベルのＷｎｔ１およびＷｎｔ５ａのｍＲＮＡはそれぞれの形質移入細胞株にて検出した。
細胞質ゾルのベータ−カテニン・レベルの上昇は、ＴＣＦに結合してその転写を活性化するベータ−カテニンの能力の特質と考えられる（Bienz, 1998）。それ故、各細胞株からの細胞質ゾル・フラクションについてベータ−カテニンを分析し、ＴＣＦが活性化されているか判定した。簡単に説明すると、細胞質ゾル・フラクションは文献記載の方法“細胞成分分画・実用法”（Subcellular Fractionation, A Practical Approach, Edited by JM Graham and D. Rickwood, pp21-22）にしたがって調製し、５０μｇをベータ−カテニン用に免疫ブロットし、また負荷対照としてチューブリンを本質的にすでに記載されている（Lane et al., 2000）とおりに免疫ブロットした。ベータ−カテニンとチューブリンの抗体は市販品として入手し得る（たとえば、トランスダクション・ラボラトリーズ、ネオマーカーズ）。Ｃ−ＨＣ１１細胞に比べて、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞からの細胞質ゾル・フラクションは高レベルのベータ−カテニンを有し、一方、チューブリンレベルは一定のままであった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
短期Ｗｎｔ誘導シグナル伝達を試験するために、Ｃ−ＨＣ１１細胞をＷｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の培養物から取得した順化培地（ＣＭ）で処理した。Ｗｎｔ含有順化培地（ＣＭ）は、ＥＧＦとインスリンを含まない培地中一夜増殖したＷｎｔ１−またはＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の培養物から集め、ルシフェラーゼのアッセイに先立つ４８時間Ｃ−ＨＣ１１培養物に加えた。両培養物からのＣＭはルシフェラーゼ活性を４〜５倍増大させ、ＴＣＦ経路の誘導における分泌Ｗｎｔタンパク質の生物活性を確認した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ホスホチロシン染色の低かったＣ−ＨＣ１１細胞からのＥｒｂＢ１と対照的に、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞においてはＥｒｂＢ１が高度にリン酸化された。ＨＣ１１細胞において、ＥＧＦ（ＥｒｂＢ１活性因子）での処理がＥｒｂＢ１リン酸化を強力に増大したが、Ｗｎｔ発現細胞ではそうならず、後者では該レセプターがすでに最大に活性化されていることを示唆した。ＥｒｂＢ２もＥｒｂＢ３も対照またはＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞ではリン酸化されなかった（抗ＥｒｂＢ２、（２１Ｎ）；Lane et al., 2000）。したがって、ＥｒｂＢ１の特異的リン酸化は、ＥｒｂＢ１がＷｎｔ発現細胞において活性化されたことを示している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例５
ＥｒｂＢ１とＥＲＫのＷｎｔ仲介活性化はメタロプロテイナーゼ活性を必要とする
上記実施例の結果は、ＨＣ１１乳腺細胞においてＷｎｔがＥｒｂＢ１をトランス活性化し、ＭＡＰＫ経路を刺激する能力を有することを示している。これらの結果についてその可能性を説明すると、Ｆｚに結合するＷｎｔがＥｒｂＢ１活性化リガンドの利用能を増大させるということである。ＨＣ１１細胞は、乳腺のように（Troyer and Lee, 2001）、ＥｒｂＢ１リガンドを発現する。これらはトランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）（Hynes et al., 1990）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびアンフィレグリン（ＡＲ）などである。これらリガンドのエクトドメインをメタロプロテイナーゼが処理加工して、可溶性増殖因子を発散させる（Massague and Pandiella, 1993）。これらの可溶性ペプチドは、膜結合形状と対照的に、活性レセプターの生物作用の大半に関与していると思われる（Dong et al., 1999）。本実施例では、Ｗｎｔがこれらのリガンドを切断する特定のメタロプロテイナーゼの活性を増大させるか否かを決定した。ここで証明されたことは、ＧＰＣＲ−結合リガンドのエンドセリンおよびトロンビンによるＥｒｂＢ１トランス活性化が、メタロプロテイナーゼ介在プロＨＢ−ＥＧＦの開裂から生じたことである（Prenzel et al., 1999; Gschwind et al., 2000）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
いずれのインヒビターでの処理も、ホスホ−ＥｒｂＢ１のレベルを強力に低下させ、またＷｎｔ発現細胞でのホスホ−ＥＲＫ１／２のレベルを低下させた。Ｃ−ＨＣ１１細胞では、ＥｒｂＢ１およびＥＲＫ１／２が基本的活性を発揮し、その両方がさらにメタロプロテイナーゼインヒビターの存在下に低下した；このことはオートクリン活性化ＥｒｂＢ１が基本的ＥＲＫ１／２の活性を生じさせていることを示唆する。Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞において、この過程が強調されたと思われる。