【手続補正書】
【提出日】平成17年7月11日(2005.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−類義コドンによる置換のために親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも哺乳動物の第１細胞においてより高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、を含む方法。
【請求項２】  該第１コドンおよび該類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞中で各コドンの翻訳効率を比較すること、
−該比較に基づいて、第１コドンおよび類義コドンを選択すること、
によって選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】  各コドンの翻訳効率が、第２細胞に比して第１細胞中の各コドンに対応するイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項２記載の方法。
【請求項４】  該類義コドンが、第２細胞に比して第１細胞において高い存在量であるイソｔＲＮＡに対応する、請求項３記載の方法。
【請求項５】  第１コドンおよび類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞において異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定すること、
−該測定を基にして第１コドンおよび類義コドンを選択すること、該類義コドンは、第２細胞に比して第１細胞で存在量が高いイソｔＲＮＡに対応する、
を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】  該類義コドンが、第２細胞中に存在するイソｔＲＮＡのレベルの少なくとも１１０％であるレベルで、第１細胞中に存在するイソｔＲＮＡに対応する、請求項３記載の方法。
【請求項７】  該類義コドンが、（１）第１細胞の遺伝子によって、比較的高頻度で使用されるコドン、（２）哺乳動物の遺伝子によって、比較的高頻度で使用されるコドン、（３）第２細胞の遺伝子によって、比較的低頻度で使用されるコドン、（４）哺乳動物以外の生物体の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、よりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項８】  第１コドンおよび類義コドンが、
第１細胞で親ポリペプチドから発現されるポリペプチドのレベルの少なくとも１１０％のレベルで第１細胞における合成ポリヌクレオチドからポリペプチドが発現されるように、選択される、請求項１の方法。
【請求項９】  第２細胞が第１細胞の前駆体細胞である、請求項１の方法。
【請求項１０】  該第２細胞が第１細胞から誘導される、請求項１の方法。
【請求項１１】  該ポリペプチドが第２細胞中では実質的に発現され得ない、請求項１の方法。
【請求項１２】  第１細胞が第２細胞と同じ型であるが、分化が異なる段階である、請求項１の方法。
【請求項１３】  第１細胞が第２細胞と同じ型であるが、細胞周期が異なる段階である、請求項１の方法。
【請求項１４】  哺乳動物の第１細胞においてポリペプチドを選択的に発現する方法であって、
−類義コドンによる置換のために、ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも第１細胞においてより高い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−該第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること
；そして合成ポリヌクレオチドを、第１細胞または第１細胞の前駆体細胞からなる群から選択された細胞中に導入し、また該合成ポリヌクレオチドは調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合されており、これによって該ペプチドが第１細胞で選択的に発現されること、
を含む方法。
【請求項１５】  該類義コドンが、第２細胞よりも第１細胞において高い翻訳効率を有する、請求項１４の方法。
【請求項１６】  哺乳動物細胞中の第１ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを発現する方法であって、
−他のイソｔＲＮＡを、このイソｔＲＮＡが他のｔＲＮＡよりも通常低い、細胞中の存在量にあること、および第１ポリヌクレオチドのコドンに対応することを基にして、選択すること； 
−この選択されたイソｔＲＮＡをコードし、調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合されている第２ポリヌクレオチドを該細胞に導入すること；および
−該細胞中で第２ポリヌクレオチドを発現し、これにより該ポリヌクレオチドが該細胞中で発現されること、
を含む方法。
【請求項１７】  哺乳動物細胞中の第１ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを発現する方法であって、
−他のイソｔＲＮＡを、このイソｔＲＮＡが他のｔＲＮＡよりも通常低い、細胞中の存在量にあること、および第１ポリヌクレオチドのコドンに対応することを基にして、選択すること；
−選択されたイソｔＲＮＡをコードし、調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合される第２ポリヌクレオチドを細胞前駆体に導入すること、該前駆体は、細胞を生成するのに充分な条件で暴露される；および
−該細胞中の第２ポリヌクレオチドを発現し、これにより該ポリヌクレオチドが該細胞中で発現されること、
を含む方法。
【請求項１８】  
周期中動物細胞でウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、その集合に必要なポリペプチドを含んでおり、該ポリペプチドは、親ポリヌクレオチド由来の該細胞中で発現されるが、ウイルス集合ができるのに充分なレベルではない、
次の工程、
−該親ポリヌクレオチドの第１コドンを類義コドンで置換し、該ポリペプチドが、そのウイルス集合ができるのに十分なレベルで、該細胞中で合成ポリヌクレオチドから発現可能であるように、該ポリヌクレオチドに比べると増強された翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生すること；および、
−調節ポリヌクレオチドに操作可能に結合した合成ポリヌクレオチドを該細胞に導入し、それによって該ポリヌクレオチドが発現され、該ウイルス粒子が細胞中で産生されること、
を含む方法。
【請求項１９】  類義コドンが、第１コドンよりも該細胞中で高い翻訳効率を有する、請求項１８の方法。
【請求項２０】  周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、その粒子の集合に必要な少なくとも１つのポリペプチドを含んでおり、該ポリペプチドは、第一ポリヌクレオチド由来の細胞において発現されるが、ウイルス集合ができるのに十分なレベルではなく、第一ポリヌクレオチドのコドンに特異的なイソｔＲＮＡの存在量が、ポリペプチドの産生速度を制限する、
次の工程、
−イソｔＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを該細胞中に導入すること、
−該細胞中の第２ポリヌクレオチドを発現し、これによってウイルス粒子が周期細胞中で産生されること、
を含む、方法。
【請求項２１】  周期中真核生物細胞においてウイルス粒子を産生する方法であって、該ウイルス粒子は、該粒子の集合に必要なポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、親ポリヌクレオチドからの該細胞中で発現されるが、ウイルス集合ができるのには十分なレベルではない、
下記工程、
−親ポリヌクレオチドの第一コドンを類義コドンで置換し、親ポリヌクレオチドに比べると増強された翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生すること、該ポリペプチドは、そのウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞中で合成ポリヌクレオチドから発現が可能である；
−該細胞の前駆体中に、調節ポリヌクレオチドに操作可能なように連結した合成ポリヌクレオチドを導入すること；および
−該前駆体が該細胞を産生する条件に暴露し、該細胞は、そのウイルスの集合に必要なポリペプチドを含むこと、
それによって該ポリヌクレオチドが発現され、該ウイルス粒子が細胞中で産生される、
を含む方法。
【請求項２２】  ポリヌクレオチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築するための方法であって、
−類義コドンによる置換のための親ポリヌクレオチドの第１コドンを選択すること、該類義コドンは、哺乳動物の第２細胞よりも哺乳動物の第１細胞における低い翻訳効率を示すことを基にして選択される、
−第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。
【請求項２３】  該第１コドンと該類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞における各コドンの翻訳効率を比較すること；および
−この比較に基づいて、第１コドンおよび類義コドンを選択すること、
によって選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】  各コドンの翻訳効率が、第２細胞に比して第１細胞中で各コドンに対応するイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】  該類義コドンが第２細胞に比して第１細胞中の存在量がより低いイソｔＲＮＡに対応する、請求項２４の方法。
【請求項２６】  第１コドンおよび類義コドンが、
−第２細胞に比して第１細胞において異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定すること、
−該測定を基にして第１コドンおよび類義コドンを選択すること、該類似コドンは、ここで第２細胞に比して第１細胞で存在量が低いイソｔＲＮＡに対応する、
を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】  ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−哺乳動物の細胞内の各コドンの翻訳効率の比較を提供すること、
−類義コドンの置換のための親ポリヌクレオチドの第一コドンの比較から選択されること、該類義コドンは、第１コドンよりも該細胞中の高い翻訳効率を示すことを基にして選択される；および
−第一コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。
【請求項２８】  類義コドンが、第１コドンに対応するイソｔＲＮＡに比して、該細胞中において高い存在量であるイソｔＲＮＡに対応する、請求項２７の方法。
【請求項２９】  第１コドンおよび類義コドンが、
該細胞中の第１細胞で親ポリペプチドから発現されるレベルの少なくとも１１０％のレベルで該細胞における合成ポリヌクレオチドからポリペプチドが発現されるように選択される、請求項１の方法。
【請求項３０】  該比較が、該細胞中で各コドンの翻訳効率を比較することによって提供される、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】  翻訳効率が、該細胞中で異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定することによって比較される、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】  ポリペプチオドをコードしている合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、
−類義コドンが、哺乳動物細胞中の各コドンの翻訳効率の比較を提供すること；
−類義コドンによる置換のための親ポリヌクレオチドの第１コドンを該比較から選択すること；および
−第１コドンを類義コドンで置換して、合成ポリヌクレオチドを構築すること、
を含む方法。
【請求項３３】  該類義コドンが、第１コドンに対応するイソｔＲＮＡに比して、該細胞における存在量がより低いイソｔＲＮＡに対応する、請求項３１の方法。
【請求項３４】  該比較が、該細胞中の各コドンの翻訳効率を比較することによって提供される、請求項３１の方法。
【請求項３５】  翻訳効率が、細胞中の異なるイソｔＲＮＡの存在量を測定することにより比較される、請求項３４の方法。
【請求項３６】  実質的に図および／または実施例を参照して前記されている、請求項１〜３５いずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明の１つの観点は、一つのタンパク質が哺乳動物の標的細胞または組織において選択的に発現しうるが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しない合成ポリヌクレオチドを構築する方法を提供するものであって、該方法は、親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在するコドンを類義コドンで置換して、該合成ポリヌクレオチドを形成する工程を包含する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
適切には、該方法は、上記類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡが、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するように類義コドンを選択する工程をさらに包含する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
好ましくは、選択工程が、下記工程によってさらに特徴付けられる；
（ａ）該標的の細胞または組織および１以上の他の細胞または組織において相違のイソ受容 t ＲＮＡの相対存在量を測定すること、および
（ｂ）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
好ましくは、選択工程は、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
あるいは、上記工程は、該類義コドンがイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、標的の細胞または組織から誘導された細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものであることをさらに特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
好都合には、該選択工程は、該標的の細胞または組織における該対応イソｔＲＮＡが、該１以上の他の細胞または組織において発現されるイソｔＲＮＡに比べて、少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで存在することをさらに特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
あるいは、該方法は、次の（１）〜（８）よりなる群から該類義コドンを選択する工程をさらに包含する；（１）標的の細胞または組織の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（２）該１以上の他の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（３）哺乳動物の遺伝子、好ましくは高度発現遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（４）標的の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（５）該１以上の他の細胞または組織の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（６）哺乳動物の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン、（７）他の生物体の遺伝子により比較的高頻度で使用されるコドン、（８）他の生物体の遺伝子により比較的低頻度で使用されるコドン。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
好ましい実施態様において、該方法は、該タンパク質が、該標的の細胞または組織における該親ポリヌクレオチドから発現されるタンパク質に比べて少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも５００％、最も好ましくは少なくとも１０００％のレベルで、該標的細胞または組織における該合成ポリヌクレオチドから発現するように、少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを選択する工程を包含する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別の観点において、本発明は、上記方法のいずれかに従って構築された合成ポリヌクレオチドを提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
好ましくは、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化細胞である。
より具体的には、該類義コドンは、gca（Ala）、cuu（Leu）およびcua（Leu）からなる群から選択され、該標的細胞は分化ケラチノサイトである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の標的細胞または組織においてタンパク質を選択的に発現するための方法であって、該方法は下記工程を包含する；
（ａ）該タンパク質をコードする親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該タンパク質が該標的細胞または組織で選択的に発現され得るが、哺乳動物の１以上の他の細胞または組織において実質的に発現しないように該親ポリヌクレオチドに比べると異なる翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生すること；
（ｂ）１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを、哺乳動物に投与し、該標的の細胞または組織、または該標的の細胞または組織の前駆細胞または前駆組織に導入すること；
（ｃ）該標的の細胞または組織において該タンパク質を選択的に発現させるが、１以上の他の細胞または組織において発現しないこと。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
好ましくは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む；
（ｉ）該標的の細胞または組織および該１以上の他の細胞または組織において相違のイソ−tＲＮＡの相対存在量を測定する。
（ii）該測定を基礎として該少なくとも１つの存在コドンおよび類義コドンを同定すること、ここで、該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、１以上の他の細胞または組織に比較して該標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
適当には、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、前駆の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
あるいは、上記工程（ii）は次のことをさらに特徴とする。該類義コドンはイソｔＲＮＡに対応し、このイソｔＲＮＡは、少なくとも１つの存在コドンに対応するイソｔＲＮＡに比べると、元の細胞または組織に比較して標的の細胞または組織が高い存在量を有するものである。
あるいは、この方法は工程（ａ）の前に次の工程をさらに含む。（Ｉ）標的の細胞または組織の遺伝子、（II）各々他の細胞または組織の遺伝子、（III）哺乳動物の遺伝子および（IV）他の生物体の遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子により使用される特定のコドンの夫々の比較頻度に基づいて該少なくとも１つの存在コドンおよび該類義コドンを同定すること。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
他の観点において、本発明は、第１ポリヌクレオチドから標的の細胞または組織でタンパク質を発現さす方法を提供する。この方法は、該標的の細胞または組織、またはその前駆細胞または前駆組織中に、少なくとも１つのイソ受容tＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを導入すること、ここで、該第２ポリヌクレオチドは１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結しており、該少なくとも１つのイソtＲＮＡは該標的の細胞または組織において比較的低量で正常に存在し、該第１ポリヌクレオチドのコドンに対応する、からなる工程を含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
さらなる観点において、本発明は周期中真核細胞におけるウイルス粒子を産生する方法に及ぶ。該ウイルス粒子はその集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに充分なレベルでは親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該方法は次の工程を含む。
（ａ）該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンを類義コドンで置換し、該親ポリヌクレオチドに比べると変化した翻訳速度を有する合成ポリヌクレオチドを産生する。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで該細胞中で該合成ポリヌクレオチドから発現が可能である。
（ｂ）該細胞またはその前駆体細胞中に、１以上の調節ヌクレオチド配列に操作的に連結した該合成ポリヌクレオチドを導入する。
（ｃ）少なくとも１つのタンパク質を該細胞中で、該ウイルス粒子の集合に必要な他のウイルスタンパク質の存在下で発現し、もって該ウイルス粒子を産生する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明のさらなる観点において、周期中細胞においてウイルス粒子を産生する方法が提供される。該ウイルス粒子はその粒子の集合に必要な少なくとも１つのタンパク質を含む。該少なくとも１つのタンパク質は、ウイルス集合ができるのに十分なレベルで親ポリヌクレオチドから該細胞中で発現されない。該親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの存在コドンは、該少なくとも１つのタンパク質の産生を該レベルにまで律速的にする。該方法は、該細胞中に、該少なくとも１つのコドンに特異的なイソ受容 t ＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチドを、導入する工程を含む。