【手続補正書】
【提出日】平成17年12月8日(2005.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  野生型とは異なる受容体結合特異性を有する細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールを野生型の細胞毒性タンパク質から作製する方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程からなる方法：
（Ａ）毒性ドメインまたはサブユニットおよび結合ドメインまたはサブユニットを有するヘテロメリックタンパク質毒素を選択する工程、
（Ｂ）該ヘテロメリックタンパク質毒素の結合ドメインまたはサブユニットをコードするＤＮＡに変異を組み込むことによって、複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するようにする工程、
（Ｃ）複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生する微生物クローンのライブラリーを生成する工程、
（Ｄ）該ライブラリーの変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を、当該スクリーニングに用いる毒素濃度では野生型のヘテロメリックタンパク質毒素に不感受性であるスクリーニング細胞集団に対してスクリーニングする工程であって、
（ｉ）該複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するクローンまたはクローンのプールを単離し、
（ｉｉ）単離されたクローンまたはクローンのプールにより産生された複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素で該スクリーニング細胞集団の調製物を処理し、
（ｉｉｉ）処理された該スクリーニング細胞集団の調製物を毒性について観察し、
（ｉｖ）上記毒性の観察に基づき、該スクリーニング細胞集団を野生型の細胞毒性タンパク質より強く阻害するかまたは殺す、野生型の結合タンパク質とは異なる受容体結合特異性を有する細胞毒性変異タンパク質または細胞毒性変異タンパク質のプールを選択することにより、当該スクリーニングを行なう工程、および
（Ｅ）選択された細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールのさらなるコピーを作製する工程。
【請求項２】  該ヘテロメリックタンパク質毒素が、志賀毒素、志賀様毒素１を含む志賀様毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、クロチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、サポリン、モモルジン、モデシン、サルシン、ジフテリア毒素および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】  該ヘテロメリックタンパク質毒素が志賀毒素または志賀様毒素１であり、該変異がアミノ酸残基１５〜１９番、３０〜３３番または５８〜６４番のループ領域に組み込まれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】  該結合ドメインまたはサブユニットが、志賀毒素もしくは志賀様毒素のＢサブユニット鋳型から誘導されるか、または大腸菌（E. coli）易熱製エンテロトキシン、コレラ毒素、百日咳毒素もしくはリシンの受容体結合ドメインの相同物から誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項５】  標的細胞を請求項１に記載の方法により作製された細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールで処理することからなる標的細胞を殺すかまたは阻害する方法であって、該標的細胞が該細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールと特異的に結合する受容体を発現している方法。
【請求項６】標的細胞に対し結合特異性を有する治療タンパク質を同定する方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｂ）の工程からなる方法：
（Ａ）請求項１に記載の方法によって細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールを作製する工程、および
（Ｂ）標的細胞の調製物および非標的細胞の調整物を該細胞毒性変異タンパク質またはタンパク質のプールで処理することにより、該標的細胞および該非標的細胞に対して該細胞毒性変異タンパク質をスクリーニングし、該標的細胞を阻害するかまたは殺すには有効であるが、該非標的細胞を阻害するかまたは殺すには該標的細胞を阻害したり殺したりするほど有効ではない治療タンパク質または治療タンパク質のプールを選択する工程。
【請求項７】  結合特異性を有する薬剤の構築法であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程からなる方法：
（Ａ）請求項６に記載の方法によって、結合特異性を有する治療タンパク質を選択する工程、
（Ｂ）該毒性サブユニットを分離または不活化することによって、該治療タンパク質を任意に修飾する工程、および
（Ｃ）該結合サブユニットに薬物を結合させて薬剤を形成する工程。
【請求項８】  ホスト生物体内に生じた標的細胞に対して薬物を向ける必要があるような症状を治療する方法であって、請求項７に記載の方法によって薬剤を選択し、該ホスト生物体に有効量の該薬剤を投与することからなる方法。
【請求項９】  細胞毒性サブユニットおよび結合サブユニットからなる細胞毒性ヘテロメリックタンパク質を含んでなる組成物であって、該細胞毒性ヘテロメリックタンパク質が志賀毒素または志賀様毒素の結合サブユニット内の１以上の部位における変異により誘導されたものであり、該部位がＣＤ７７の受容体結合裂部の生成に関与するアミノ酸残基を包含するループ内に位置し、該変異の結果、該細胞毒性タンパク質がＣＤ７７に結合せず、１以上の他の受容体に細胞毒性効果を伴って結合することを特徴とする組成物。
【請求項１０】  該志賀様毒素が志賀様毒素１であり、該変異が該結合サブユニットのアミノ酸残基１５〜１９番、３０〜３３番または５８〜６４番に位置する請求項９記載の組成物。
【請求項１１】  結合部および薬剤部からなる、細胞表面マーカーを有する標的細胞に送達するための標的指向薬剤を作製する方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｂ）の工程からなる方法：
（Ａ）次のステップ（ｉ）〜（ｖ）からなるプロセスにより細胞表面マーカーに結合する結合サブユニットを同定する工程：
（ｉ）毒性ドメインまたはサブユニットおよび結合ドメインまたはサブユニットを有するリボソーム不活化タンパク質であるヘテロメリックタンパク質毒素を選択するステップ、
（ｉｉ）該ヘテロメリックタンパク質毒素の結合ドメインまたはサブユニットをコードするＤＮＡに変異を組み込むことによって、複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するようにするステップ、
（ｉｉｉ）複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生する微生物クローンのライブラリーを生成するステップ、
（ｉｖ）該ライブラリーの変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を、当該スクリーニングに用いる毒素濃度では野生型のヘテロメリックタンパク質毒素に不感受性であるスクリーニング細胞集団に対してスクリーニングするステップであって、
（ａ）該複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するクローンまたはクローンのプールを単離し、
（ｂ）単離されたクローンまたはクローンのプールにより産生された複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素で該スクリーニング細胞集団の調製物を処理し、
（ｃ）処理された該スクリーニング細胞集団の調製物を毒性について観察し、
（ｄ）上記毒性の観察に基づき、該スクリーニング細胞集団を野生型の細胞毒性タンパク質より強く阻害するかまたは殺す、野生型の結合タンパク質とは異なる受容体結合特異性を有する細胞毒性変異タンパク質または細胞毒性変異タンパク質のプールを選択することにより、当該スクリーニングを行なうステップ、および
（ｖ）標的指向薬剤の結合部として用いるために選択された細胞毒性変異タンパク質の結合ドメインまたはサブユニットの配列を決定する工程、ならびに
（Ｂ）該結合部を該薬剤部に結合する工程。
【請求項１２】  複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を発現する複数の微生物クローンからなるコンビナトリアルライブラリーであって、各ヘテロメリックタンパク質毒素が毒性ドメインまたはサブユニットおよび結合ドメインまたはサブユニットを有し、各変異型がヘテロメリックタンパク質毒素の結合ドメインまたはサブユニット内の変異の結果により他の変異型と異なることを特徴とするライブラリー。
【請求項１３】  野生型の細胞毒性タンパク質の変異体である、野生型とは異なる受容体結合特異性を有する細胞毒性変異タンパク質または細胞毒性変異タンパク質のプールをコードする核酸配列または核酸配列のプールを作製する方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程からなる方法：
（Ａ）毒性ドメインまたはサブユニットおよび結合ドメインまたはサブユニットを有するリボソーム不活化タンパク質であるヘテロメリックタンパク質毒素を選択する工程、
（Ｂ）該ヘテロメリックタンパク質毒素の結合ドメインまたはサブユニットをコードするＤＮＡに変異を組み込むことによって、複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するようにする工程、
（Ｃ）複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生する微生物クローンのライブラリーを生成する工程、
（Ｄ）該ライブラリーの変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を、当該スクリーニングに用いる毒素濃度では野生型のヘテロメリックタンパク質毒素に不感受性であるスクリーニング細胞集団に対してスクリーニングする工程であって、
（ｉ）該複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素を産生するクローンまたはクローンのプールを単離し、
（ｉｉ）単離されたクローンまたはクローンのプールにより産生された複数の変異型ヘテロメリックタンパク質毒素で該スクリーニング細胞集団の調製物を処理し、
（ｉｉｉ）処理された該スクリーニング細胞集団の調製物を毒性について観察し、
（ｉｖ）上記毒性の観察に基づき、該スクリーニング細胞集団を野生型の細胞毒性タンパク質より強く阻害するかまたは殺す、野生型の結合タンパク質とは異なる受容体結合特異性を有する細胞毒性変異タンパク質または細胞毒性変異タンパク質のプールを選択することにより、当該スクリーニングを行なう工程、および
（Ｅ）選択された細胞毒性変異タンパク質または細胞毒性変異タンパク質のプールをコードする核酸配列または核酸配列のプールのさらなるコピーを作製する工程。