【手続補正書】
【提出日】平成18年8月29日(2006.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  MPVにより惹起又は悪化される疾病状態の処置に有用な化合物を同定する方法であって、MPV遺伝子によってコードされたキレート化金属カチオンドメインを含むタンパク質分子を、該キレート化金属カチオンドメインの破壊を容易ならしめるに充分な時間と条件下において、該化合物の有効量と接触させ、キレート化金属カチオンドメインの破壊の指標である、放出されたキレート化金属カチオンの量を直接的又は間接的に決定することを含む方法。
【請求項２】  金属が亜鉛である、請求項１記載の方法。
【請求項３】  亜鉛の放出が亜鉛選択的フルオロホアの蛍光における変化によって決定される、請求項２記載の方法。
【請求項４】  フルオロホアがＴＳＱである、請求項３記載の方法。
【請求項５】  MPVにより惹起又は悪化される疾病状態の処置に有用な化合物を同定する方法であって、MPV遺伝子によってコードされたキレート化金属カチオンドメインを含むタンパク質分子を、該キレート化金属カチオンドメインの破壊を容易ならしめるに充分な時間と条件下において、該化合物の有効量と接触させ、リガンドに対する該タンパク質の結合の存在又は不存在を直接的又は間接的に決定することを含み、結合の不存在がキレート化金属カチオンドメインの破壊の指標となる、方法。
【請求項６】  リガンドがE6AP、E6BP、パキシリン又は類似若しくは同族体モチーフである、請求項５記載の方法。
【請求項７】  MPVがHPVである、請求項１又は５記載の方法。
【請求項８】  HPVがHPV-６、HPV-11、HPV-16又はHPV-18から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】  HPVがHPV-16である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】  タンパク質がHPV-16E6又はE7オンコプロテインである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】  HPVがHPV-18である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】  タンパク質がHPV-1８E6又はE7オンコプロテインである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】  MPV遺伝子によってコードされたタンパク質のキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易化することができる化合物の有効量を、その必要のある哺乳類に対して投与することを含む、MPVにより惹起又は悪化される疾病状態を処置又は予防する方法であって、該化合物が、一般式（I）又は（II）：
【化１】
2002524442.tif 000001
で示され、
式中、ｎは１〜５から選択され、
R1〜R4は独立して水素、任意に置換されていることもあるアルキル、任意に置換されていることもあるアルケニル、任意に置換されていることもあるアルキニル、任意に置換されていることもあるアリール、任意に置換されていることもあるアリールアルキル、任意に置換されていることもあるアシル、任意に置換されていることもあるヘテロ環状基、ハロアルキル、アリールアルキル、カルボキシ、カルボキシエステル及びカルボキシアミドから選択され、
R1とR2は一緒になって及び／又はR3とR4は一緒になって独立して式（ａ）：
【化２】
−(ＣＨ２)ｌ−Ｕｍ−(ＣＨ２)ｎ−              (a)
（式中、UはCH2、O、NH又はSから選択され、ｌとｎは独立して０〜６から選択され、ｍはUがCH2であるとき0又は１であり、UがO、NH又はSであるとき１であるが、ｌ＋ｍ＋ｎは２に等しいか又は２より大であり、一つ又はそれ以上の（CH2)又はNH基は更に任意に置換されていてもよい）の基を形成する、方法。
【請求項１４】  R1とR2が一緒になって及び／又はR3とR4が一緒になって独立して式（ａ）：
【化３】
−(ＣＨ２)ｌ−Ｕｍ−(ＣＨ２)ｎ−              (a)
（式中、UはCH2、O、NH又はSから選択され、ｌとｎは独立して０〜６から選択され、ｍはUがCH2であるとき0又は１であり、UがO、NH又はSであるとき１であるが、ｌ＋ｍ＋ｎは２に等しいか又は２より大であり、一つ又はそれ以上の（CH2)又はNH基は更に任意に置換されていてもよい）の基を形成する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】  UがCH2である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】  式（ａ）が−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−又は−（ＣＨ２）７−の１つから選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  ＵがNH、O又はSであり、ｍが１である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】  R1とR2及び／又はR3とR4がそれらが結合する窒素原子と一緒になって独立して次の群から選択される基を形成する、請求項１４記載の方法：
【化４】
2002524442.tif 000002
（ただし、これらの基は炭素原子において及び／又はＵがＮＨである場合には窒素原子において任意に置換されていてもよい）。
【請求項１９】  R1とR2及び／又はR3とR4がそれらが結合する窒素原子と一緒になってそれぞれ独立して任意に置換されていることもあるモルホリノ、チオモルホリノ又はピペラジノ基を形成する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】  式（ａ）の−ＣＨ２−基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ヒドロキシ、ハロ、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、アセトキシ、任意に置換されていることもあるベンジル、任意に置換されていることもあるピリジル、任意に置換されていることもあるピリミジル及び任意に置換されていることもあるフェニルから選択される１つ又はそれ以上の基によって任意に置換されていることもある、請求項１４〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】  R1〜R4の少なくとも１つが独立して水素、任意に置換されていることもあるフェニル、任意に置換されていることもあるシクロプロピル、任意に置換されていることもあるシクロブチル、任意に置換されていることもあるシクロペンチル、任意に置換されていることもあるシクロヘキシル、ホルミル及びアセチルから選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】  任意の置換基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ヒドロキシ、ハロ、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、アセトキシ及びフェニルから選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】  R1〜R4の少なくとも１つが本明細書で定義されるグループ１〜６の任意の化合物で示されたとおりである、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】  ｎが１、２又は３から選択され、好ましくは１又は２である、請求項１３記載の方法。
【請求項２５】  MPVがHPVである、請求項１３記載の方法。
【請求項２６】  HPVがHPV-1、2、3、4、6、11、16、18、27、31、33、35、45及び57から成る群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  HPVがHPV-16である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】  タンパク質がHPV-16E6又はE7オンコプロテインである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】  HPVがHPV-1８である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】  タンパク質がHPV-1８E6又はE7オンコプロテインである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】  キレート化金属カチオンドメインがキレート化亜鉛カチオンドメインである、請求項１３記載の方法。
【請求項３２】  キレート化亜鉛カチオンドメインが配列モチーフ：Cys-X2-Cys-X29-Cys-X2-Cysである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】  請求項１３記載の化合物の有効量を、その必要のある哺乳類に対して投与することを含む、MPVにより惹起又は悪化される疾病状態を処置又は予防する方法。
【請求項３４】  化合物がTSQ検定において少なくとも３０％の亜鉛放出をもたらすことが可能である、及び／又はE6AP又はE6BPに対するE6タンパク質の結合を阻止又は抑制することが可能である、及び／又はMPV-感染細胞に対する選択的細胞毒性を発揮することが可能である、請求項１３又は３３記載の方法。
【請求項３５】  疾病又は状態が子宮頸癌又はそのＨＰＶ関連前駆的病変又はその他のＨＰＶ関連癌及び／又は疣贅である、請求項１３又は３３記載の方法。
【請求項３６】  MPV遺伝子によってコードされたタンパク質のキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易化することができる化合物を、医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と一緒に含む組成物であって、該化合物が請求項１３に記載された一般式（I）又は（II）の化合物である、組成物。
【請求項３７】  MPVにより惹起又は悪化される疾病又は状態を処置又は予防する薬剤の製造における、ＭＰＶ遺伝子よってコード化されたタンパク質のキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易化することが出来る、請求項１３に記載された一般式（I)又は（II)の化合物の使用。
【請求項３８】  MPVにより惹起又は悪化される疾病又は状態を処置又は予防する薬剤の製造における、請求項１３に記載された、一般式（I)又は(II)の少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項３９】  MPVにより惹起又は悪化される疾病状態の処置又は予防に有用な薬剤であって、該薬剤は、MPV遺伝子によってコード化されたタンパク質の活性を低下させ、阻止し又は減少させることが出来る化合物を含み、ここで該薬剤は、該タンパク質中に存在するキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易ならしめ、該化合物が、請求項１３に記載された一般式（I）又は（II）の化合物である、薬剤。
【請求項４０】  MPVにより惹起又は悪化される疾病状態を処置又は予防する方法であって、該方法は、MPV遺伝子によってコード化されたタンパク質のキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易化することが出来る化合物を、その必要のある哺乳類に有効量投与することを含み、該化合物が、請求項１に記載の方法で同定された化合物である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的にウイルス媒介疾病状態の処置又は予防に有用な薬剤に関する。特に、本発明は、哺乳類パピローマウイルス（MPV)によって惹起されたか、又は悪化された子宮頸癌（cervical cancer)、尖形コンジローム（genital warts）又は無症候性感染（asymptomatic infections）の処置に有用な、治療剤を提供するものである。本発明は、また、上記薬剤を使用する処置方法及び当該薬剤を同定する方法に関するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
（本発明の背景）
ウイルス媒介疾病状態は、人間や動物に影響を与える多くの衰弱性疾病のいくらかを代表するものであって、顕著な致死率や疾病率の原因になっている。これは、特に宿主細胞のウイルス移転に関連した癌に対する場合がそうである。癌の一つの特に重篤な形態は、子宮頸癌である。ヒト・パピローマウイルス（HPV)のようなMPVによる、子宮頚の変形ゾーンの頑固な感染は、子宮頸癌の一次的原因と認められる。約50万人にのぼる婦人が毎年、子宮頸癌のために死亡する反面、それよりも遥かに多数の患者が前侵襲性疾病や尖形コンジロームに曝されており、これらのウイルス起因性腫瘍の処置は、長期にわたる外科的技術の確立にもかかわらず、なお不十分であると結論せざるを得ない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ＭＰＶゲノムは、細胞培養及び自然状態において細胞形質転換に必要な分子的性質を持ったタンパク質をコードする。ヒト・パピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）は、悪性腫瘍における最も普通のＨＰＶタイプであって、すべての子宮頸癌の約６０％に認められる一方、約20種に及ぶ他のＨＰＶタイプがこれらの悪性腫瘍の他の３０％に認められる。ＨＰＶ−６やＨＰＶ−１１のような生殖器粘膜や皮膚に感染する他のＨＰＶタイプは、多くの場合、尖形コンジロームのような良性腫瘍に関連する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の更に他の態様は、ＭＰＶ遺伝子によってコードされたタンパク質のキレート化金属カチオンドメインの破壊を容易ならしめることが出来る化合物の有効量を、必要な哺乳類に対して投与することを含む、ＭＰＶに起因する叉は悪化される疾病状態を処置叉は予防する方法に関する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
他の態様において、本発明は、後記する式Ｉ又はＩＩの少なくとも1つの化合物を、必要な哺乳類に対して投与することを含む、ＭＰＶに起因する叉は悪化される疾病状態を処置叉は予防する方法に関する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（図面の簡単な説明）
第1図は、最も顕著な二次的構造を形成する２つのＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２９−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ亜鉛フィンガーを有する、158個のアミノ酸から成るＥ６タンパク質の模式図である；丸で囲んだ文字で示されるアミノ酸残基は、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８の間で保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ものである；ＨＰＶ−１６とＨＰＶ−１８は、子宮頚前駆性病変の腫瘍において最も優勢なパピローマウイルスである。
第2図は、Ｅ６ＢＰ及びＥ６ＡＰに対する実験的なＩＶＴ‐検定条件下における、Ｃ１６に対する有効濃度を示すグラフである；３５Ｓ−ＣｙｓＥ６をＣ１６の示された濃度で培養し、Ｅ６ＢＰ又はＥ６ＡＰとの複合体形成を検定した；ＧＳＴは、ＧＳＴ−ビーズ上のＩＶＴＥ６タンパク質のバックグラウンド結合を反映するものである。
第3図は、Ｃ１６及びアゾジカルボンアミド（Ｃ４）と共に培養されたＨＰＶ−感染セルラインの生存性検定結果を示すグラフである；すべての値は、DMSOのみの存在下に得られた値に換算された。
第4図は、C16化合物で処理したときのSiHa、HeLa、444及びHaCat細胞の生存性を示す写真である。
第5Ａ図は、セルラインHeLa、SiHa、MCF７及びHaCatに対するｐ５３タンパク質発現を示す図である。
第５Ｂ図は、Ｃ１６と共に一夜培養されたHeLa細胞（ただし、C16で処理されたHaCat細胞ではない）におけるポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（PARP)の開裂を示す図である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（好ましい実施態様の記載）
本発明の薬剤は、特にHPVのようなMPVによって惹起される疾病状態の処置に有用なものである。HPV感染は、子宮頸癌、尖形コンジローム、尋常性疣贅、足底疣贅及び扁平疣贅と関係がある。HPV感染による癌症状は、悪性の状態により、例えば次ぎのように分類される：
子宮頚悪性腫瘍−（CaCx)；
正常所在子宮頚腫瘍−ＣＩＳ（CIN IIIとも呼ばれる）；
子宮頚上皮内腫瘍−CIN I及びCIN II（SIL‐扁平上皮病変とも呼ばれる）；
ＡＳＣＵＳ−パパニコロウ塗抹標本によって検出される病変やDNAハイブリダイゼーションによって検出される潜在性ＨＰＶ感染のような、意義未決定の変則的扁平疣贅細胞。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明によって特に処置され得る疾病状態は、子宮頸癌又は子宮頚上皮内腫瘍（ＣＩＮ）や扁平上皮病変（ＳＩＬ）と呼ばれるこの悪性腫瘍の前駆的病変である。本発明薬剤は、また、DNA診断によって同定された患者の子宮頚の無症候性感染、子宮頸癌、CIN又はSILの外科的処置後に残ると推定される無症候性感染若しくは疫学的理由により存在すると予想される無症候性感染の処置に有用である。また、処置される疾病状態には、尖形コンジローム、尋常性疣贅及び足底疣贅が含まれる。これら状態のすべては、また、多数の他のHPVタイプによって原因され、本発明の薬剤、化合物及び方法がこれらのウイルスに対して有用に使用され得る。これら病変のすべては、恐らくしばしば診断されない無症候性感染から誘導されるものと推定される。本発明は、また、これらの無症候性感染のすべてを標的するのに有用であり得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
子宮頸腫瘍にしばしば関連するHPVには、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５及びＨＰＶ−４５がある。尖形コンジロームにしばしば関連するものにはＨＰＶ−６とＨＰＶ−１１があり、尋常性疣贅に通常関連するものにはＨＰＶ−２、ＨＰＶ−１７及びＨＰＶ−５７があり、足底疣贅に関連するものにはＨＰＶ−１があり、扁平疣贅に関連するものにはＨＰＶ−３とＨＰＶ−４がある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
子宮頸癌の病因おけるE6の詳細な役割を直接評価することは困難であって、むしろ多くは細胞培養又は動物系若しくはイン・ビトロにおける分子的研究におけるE6機能についての情報から推定しなければならない。現在役立つ知識は、三つの異なった病理的シナリオにおけるＥ６（及びＥ７）の機能を示唆する。すなわち、（ｉ）重層上皮において、未感染上皮細胞は、基礎層から離れ、上基礎層の一部となった後、更に有糸分裂することなく分化する。ＨＰＶによる感染後、Ｅ６及びＥ７タンパク質は、この有糸分裂の正常な抑制を阻害する。その結果として、ＨＰＶゲノムによる分化及び拡大した細胞増殖と、臨床的潜在性感染から良性上皮内腫瘍への進展が起こる。（ｉｉ）これらの良性病変において、Ｅ６とＥ７は、高頻度の異常有糸分裂を維持することにより、染色体異常や異数倍数体を誘導し、増強された腫瘍形成性細胞変種発生の機会を高める（参考文献３２）。（ｉｉｉ）Ｅ６とＥ７の連続的発現は、悪性腫瘍の連続的増殖及び転移のために必要である可能性がある（参考文献３３、３４、２４）。抗Ｅ６及び抗Ｅ７医薬は、これら発癌の三つの段階のすべてにおいて、HPV病変を妨害できることが望ましい。従って、ここに記載する化合物は、これらの病理的シナリオが関係している治療的又は予防的適用において有用である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
医薬スクリーンにおけるGSHの役割
GSHは、大抵の細胞タイプ中に１〜１０ｍMの濃度で存在する、最も豊富な細胞内チオールであって、医薬的化合物を不活性化することが出来る生化学反応に関係している。本来のTSQ検定において、GSHは５〜１０ｍMで存在した。このような条件下では、C16を含む少数の化合物しか亜鉛を放出することが出来なかった。C16の高い濃度がGSTプルダウン検定においても必要とされたが、これは恐らく網内分解物（reticulolysate）抽出物中のGSHの内因性レベルに打ち勝つためであろう。同様に、細胞生存性検定において、C16は、TSQ検定における使用量の５倍を越える、５０ｕＭの濃度で有効であったに過ぎない。  GSHの不活性化機能を克服するために、C16はイン・ビトロよりもイン・ビボでより多い量が必要であった。TSQ検定は、リード化合物を同定するハイスループット能力ということになると、遥かに簡便である一方、GSHの存在下におけるイン・ビボ検定とイン・ビトロ検定は充分に高い濃度で、化学的に未変化形において、細胞内E6に到達する化合物を選択するのに有用である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
ウエル当たり10 000個の細胞を24ウエル・プレート上に置き、一夜付着させた後、10μM及び50μMのC16で3日の内に3度処理した。C16の活性は、また、HIV-1 NCp7からの亜鉛の放出を惹起し、現にAIDSの処置に臨床的に使用されているC4(アゾジカルボンアミド)の活性と比較された。第3図は、C4がこれら６種のセルラインの何れの成長阻止をも惹起しなかったのに対し、C16は50μMの濃度において子宮頸上皮癌細胞(SiHa, Caski, HeLa)のようなHPV陰性セルラインにおいて細胞生存性の本質的かつ特異的阻止をもたらすことを示す。C16は、子宮頸上皮癌細胞  (HT3)、乳房上皮癌細胞(MCF7)及び不死化皮膚上皮細胞(HaCat)のようなHPV陰性細胞や、非癌性の(参考文献23、24)HeLa-繊維芽細胞ハイブリッドセルライン444に対して殆ど又は全く効果を示さない。
顕微鏡観察（第4図）は、更に、E6-依存性細胞(SiHa及びHeLa)とE6-独立性細胞(444及びHaCat)に対するC16の異なる効果を証明する。式（Ｉ）及び（ＩＩ）の他の多くの化合物についても、細胞生存性及び細胞毒特異性を試験した。結果を表３に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  第１図は、最も顕著な二次的構造を形成する２つのＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２９−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ亜鉛フィンガーを有する、158個のアミノ酸から成るＥ６タンパク質の模式図である；丸で囲んだ文字で示されるアミノ酸残基は、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８の間で保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ものである；ＨＰＶ−１６とＨＰＶ−１８は、子宮頸前駆性病変の腫瘍において最も優勢なパピローマウイルスである。
【図２】  第２図は、Ｅ６ＢＰ及びＥ６ＡＰに対する実験的なＩＶＴ‐検定条件下における、Ｃ１６に対する有効濃度を示すグラフである；３５Ｓ−ＣｙｓＥ６をＣ１６の示された濃度で培養し、Ｅ６ＢＰ又はＥ６ＡＰとの複合体形成を検定した；ＧＳＴは、ＧＳＴ−ビーズ上のＩＶＴＥ６タンパク質のバックグラウンド結合を反映するものである。
【図３】  第３図は、Ｃ１６及びアゾジカルボンアミド（Ｃ４）と共に培養されたＨＰＶ−感染セルラインの生存性検定結果を示すグラフである；すべての値は、DMSOのみの存在下に得られた値に換算された。
【図４】  第４図は、C16化合物で処理したときのSiHa、HeLa、444及びHaCat細胞の生存性を示す写真である。
【図５】  第５Ａ図は、セルラインHeLa、SiHa、MCF７及びHaCatに対するｐ５３タンパク質発現を示す図である。第５Ｂ図は、Ｃ１６と共に一夜培養されたHeLa細胞（ただし、C16で処理されたHaCat細胞ではない）におけるポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（PARP)の開裂を示す図である。