【手続補正書】
【提出日】平成17年11月4日(2005.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
多くの自己免疫疾患において、組織損傷は、元の組織に対する抗体の産生によって引き起こされる。この抗体は自己抗体と言われている。哺乳動物によって産生され、哺乳動物自体の組織に対する結合部位を持つためである。この異常のうちいくつかは、循環する抗体量の特有な漸増と漸減を有し、やがて徴候に変化をもたらす。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
インターロイキン-２(ＩＬ-２)は、これまで抗原非特異的Ｔ促成遺伝子細胞の産生で重要な役割を果たすと考えられている。マウスに与えられる抗-ＩＬ-２抗体(移植片対宿主病の誘導物と一致する)はＳＬＥの特色をもたらす(Via, C.S. et al. (1993), Intemational Immunol. 5:565-572)。ＩＬ-２が抑制の産生において直接的または間接的に重要であるかどうかが議論されている(Fast, L.D. (1992), J. Immunol. 149:1510-1515; Hirohata, S. et al. (1989), J. Immunol. 142.3104-3112; Baylor, C.E. (1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125-135)。最近、ＩＬ-２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で非分解メカニズムによりＨＩＶ複製を促成するＣＤ８＋細胞を誘発することがわかった。この効果はサイトカイン仲介であるが、特定のサイトカインは同定されていない(Kinter, A.L. et a1. Proc. Nalt Acad. Sci. USA 92:10985-10989; Barker, T.D. et al. (1996), J. Immunol. 156.4478-4483)。ＩＬ-２のＴ細胞産生はＳＬＥで減少する(Horwitz, D.A. et al. (1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83-96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃによって示されるのは、抗体産生におけるＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果である。(Ａ)健康人のＩｇＧ産生の抑制におけるＮＫ細胞とＣＤ８＋細胞の相乗作用。ＣＤ４＋細胞およびＢ細胞を抗ＣＤ２で刺激し、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞の効果を調べた。ＮＫおよびＣＤ８＋細胞の組み合わせは、我々が以前報告した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248-2254; Gray, J.D. et al., (1994), J Exp Med 180; 1937-1942)抗ＣＤ２誘発性ＩｇＧ産生を顕著に阻害した。(Ｂ)ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞はＳＬＥにおけるＩｇＧ合成を促進する。活動性ＳＬＥの患者由来のＣＤ４＋細胞および正常人由来の休止Ｂ細胞とを、抗ＣＤ２で刺激した。ＳＬＥ ＣＤ８＋細胞によるＩｇＧ産生の促進は、ＮＫ細胞の添加により顕著に増加した。(Ｃ)ＳＬＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞機能のサイトカインによる正常化。図４Ｂに示す研究と平行して、この患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または非存在下、抗ＣＤ２で刺激した。指示された場合にＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)および／またはＴＧＦ-β(２ｐｇ／ｍｌ)を加えた。これらサイトカインにより、ＣＤ８＋細胞の助力効果が喪失し、その細胞がＩｇＧ産生の７５％を阻害した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
「患者」とは、処置の対象となる哺乳動物を意味するが、ヒトが好ましい。ある場合において、本発明方法は、実験動物、獣医学分野、疾患モデル動物にも使用され、これらの動物には、限定ではないが、マウスラット、ハムスターなどのゲッシ類および霊長類がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明では、患者から血液細胞を取り出す。一般に、標準的な方法で患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取り出す。「末梢血単核細胞」すなわち「ＰＢＭＣ」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）および単球を意味する。詳しく下記するように、阻害組成物の主要な作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＧ産生を抑制することである。好ましくは、ＰＢＭＣのみを採取する。赤血球または多形核白血球を患者に残すようにするか、これらを患者にもどす。これは既知の方法、例えば、白血球分析法(leukophoresis)で行う。一般に５から７リットルの白血球分析法の工程がなされる。患者からＰＢＭＣを基本的に採取するには、他の血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、既知方法により行われるのが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
好ましい態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法で取り出す。一般に、生理媒質または緩衝液が加えられて、遠心法が行なわれる。必要に応じて繰り返す。ＰＢＭＣを生理培養液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血清不含培地（Ｔechnologie）に再懸濁するが（血清がかなりの量の阻害剤を含有するので）、Ｈanksバランス塩溶液（ＨＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
好ましい態様において、ＰＢＭＣは１以上の細胞型を富ます。例えば、ＰＢＭＣはＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を富ます。このことは既知である（Gray et al.(1998),J.lmmunol.160:2248,出典明示により本明細書の一部とする。）。一般に、これは市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行なわれる（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出の非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、免疫磁気ビードで処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団とする）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
細胞に必要な前処理を一旦ほどこしてから、細胞を阻害組成物で処置する。「処置」とは、細胞を阻害組成物と共に十分な時間でインキュベートし、Ｉｇおよび自己抗体産生を阻害する能力が、特に患者にもどしたときに、発生するようにすることを意味する。インキュベーションは一般に生理的温度で行なわれる。上記したように、阻害が起きるのは、処置細胞によるＩｇ産生の直接的抑制の結果か、患者リンパ様臓器におけるＩｇ産生を下方調節する調節細胞の誘導の結果である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
「阻害組成物」、「Ｉｇ産生阻害組成物」または「体液性阻害組成物」は、自発的Ｉｇおよび自己抗体産生を阻害し得る組成物を意味する。一般に、これらの組成物はサイトカインである。適切な阻害組成物には、限定でないが、ＩＬ−２、ＴＧＦ−β、ＣＤ２アクチベーター、例えば、抗ＣＤ２抗体およびＣＤ２リガンド、ＬＦＡ−３、およびこれらの混合物や組合せ物がある。好ましい阻害組成物はＩＬ−２とＴＧＦ−βの混合物である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
阻害組成物での処置に加えて、いくつかの態様においては、細胞を活性化するためにマイトジェンの使用が望まれる。すなわち、多くの残留相細胞はｒ多量のサイトカイン受容体を含有していない。コンカナバリンＡなどのマイトジェンを使用すると細胞が刺激されて、サイトカイン受容体が産生し、本発明方法をさらに効果的にする。ＣonＡなどのマイトジェンを用いるとき、既知方法で知られているように、その濃度範囲は１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。さらに、既知方法のように、ＣonＡを離す成分、例えばα−メチルマンノシドと共に細胞を洗うのが望ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
好ましい態様において、移植前に全または活動性ＴＧＦ−βの量も検査できる。記載のように、ＴＧＦ−βは移植後に活性化される潜在的前駆物質としてつくられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
処置は必要に応じて繰り返えされる。例えば、週１回、または一週間に数回、例えば、２週間に３−５回なされる。一般に、自己免疫疾患の症状の改善はなんらかの期間、好ましくは少なくとも数カ月続く。その間に、患者が症状の再発を感じると、その時点で処置が繰り返される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
我々は、ＳＬＥまたはＲＡの患者由来のＰＢＬにより産生される構成的および刺激ＴＧＦ−β１を測定し、正常対照の値と比較した。培養上清中に検出されるサイトカインは、イソ型（アイソフォーム）１、２および３を認識するｍＡｂで中和されたが、イソ型２および３に対するｍＡＢではされず、結果としてＴＧＦ−β１の産生を確認する。正常対照と比較して、活動性ＴＧＦ−β１の構成的産生はＳＬＥで有意に減少した(１４±４対５６±２１pg／ml、ｐ＝０.０２、図５)。抗ＣＤ２刺激活性ＴＧＦ−β１も減少した(８７±２２対３９９±１０３pg／ml、ｐ＝０.００３)。ＲＡにおいて、構成的ＴＧＦ−β１の平均値は、ＳＬＥ(１９±５pg／mg)と同様であり、抗ＣＤ２により刺激された後は正常とＳＬＥの中間値であった(１９７±５４pg／ml)。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
先に、我々は、ＮＫ細胞がＴＧＦ−βの主なリンパ球源であり、このサイトカインを活性形に構成的に産生する唯一のリンパ球集団であることを証明した(Gray, J. D. et al., (1988), J. Immunol. 169:2248-2254)。従って、ＮＫ細胞由来ＴＧＦ−βの構成的産生はＳＬＥで減少しているとの発見は、興味深かった。我々はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの両方が活動性ＴＧＦ−βの産生を促進できることを知った。これらのサイトカインの両方の産生は、ＳＬＥで減少する(Gray J. D. et al., (1994), J Exp Med 180:1937-1942)。しかし、殆どの患者において、外来性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αはＴＧＦ−βの産生を正常まで回復できなかった(実施例２)。ＩＬ−１０産生はＳＬＥで増加し(Llorente, L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421))、増加したレベルと疾病活動性の相関関係は報告されている(Housslau, F. A. et al. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. et al. (1996), Arthritis Rheum 39:379)。ＩＬ−１０はＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β産生を阻害できる(実施例２およびMoore, K. W. et al. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190)。活動性ＴＧＦ−βの産生が軽いおよび活動性の疾病の患者で減少し、ＩＬ−１０の拮抗によってのみ産生欠失を部分的に回復できたということは(実施例２)、増加したＩＬ−１０産生が、それ自体、ＳＬＥでの活動性ＴＧＦ−β１の減少したリンパ球産生の説明となり得ないことを示す。いくつかの機構が恐らく関与する。成熟体の活性な形態への潜伏性前駆体の細胞外変換における１つまたはそれ以上の欠失が、この異常性を説明し得る。