【手続補正書】
【提出日】平成18年10月31日(2006.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は特に、式（１）で表される構造の類似体に関する。具体的には、式（１）中のＮ−アセチルラクトサミン残基の少なくとも１つが２型Ｎ−アセチルラクトサミン類似体構造、好ましくはラクトース残基、で置換されている、下記式（３）で表される類似体である。
R1Galβ4Glc[NAc]u1β3{(R2Galβ4Glc[NAc]u2β6)}s1Gal{β4Glc[NAc]u3β3Gal}s2−
{β4Glc[NAc] s3}s4    （３）
（式中、R1およびR2は各々独立に末端単糖置換基または末端オリゴ糖置換基であるか、あるいは存在しないが、但し、R1およびR2の少なくとも１種はNeuNAcα3またはNeuNAcα3Galβ4Glc[NAc]u4β3であり；
s1、s2、s3およびs4は各々独立に０または１であり、［ ］または｛ ｝の中の構造の存在または不在を示し；そして
u1、u2、u3およびu4は各々独立に０または１であり、非還元末端または鎖中のラクトサミン残基に結合したＮ−アセチル基の存在または不在を示すが、但し、u1、u2、u3およびu4の少なくとも１種は０である。）
本願明細書で開示する２型Ｎ−アセチルラクトサミン類似体構造にはGalβ4Glc2-X構造が含まれ、この構造においてはGlc-環の２位の炭素が置換基Ｘに結合している。Ｘとしては、-NH2基（GalβGlcN−類似体となる)、Ｎ−アルキル基（Galβ4GlcN-アルキル基類似体となる）またはＮ−アルカノイル基が好ましい。好ましいアルカノイル基はプロパノイル基である。２位の炭素は、Ｏ−アセチル基などのＯ−エステルまたはＯ−メチル基などのＯ−エーテルによって誘導されていてもよい。特に、以下のジシアリル化構造および直鎖モノシアリル化構造が好ましい：
NeuNAcα3Lac[NAc]u1β3(NeuNAcα3Lac[NAc]u2β6)Lac[NAc]u3β3Gal{β4Glc[NAc]s3}s4、
NeuNAcα3Lac[NAc]u1β3(NeuNAcα3Lac[NAc]u2β3Lac[NAc]u3β6)Gal{β4Glc[NAc]s3}s4、
NeuNAcα3Lac[NAc]u1β3Lac[NAc]u2β3(NeuNAcα3Lac[NAc]u3β6)Gal{β4Glc[NAc]s3}s4、そして
NeuNAcα3Lac[NAc]u1β3Lac[NAc]u2β3Gal{β4Glc[NAc]s3}s4    。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
NeuNAcα3Galβ4Glc(NAc) がより効果的に提示された最小エピトープ 
セラミドの近くに位置する構造は、ＴＬＣ結合アッセイにおいて他の位置の構造よりも立体構造に制限がある。遊離の一価阻害剤や多価の結合体として用いるオリゴ糖配列としては、NeuNAcα3Galβ4GlcNAcβ3GalβおよびNeuNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、特にNeuNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcが、シアリルラクトースやNeuNAcα3Galβ4GlcNAcよりも高い活性を示す。ネオ糖脂質構造の使用により、還元的アミノ化構造であるNeuNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc-ヘキサデシルアニリンは、還元的結合後の還元末端グルコースが環状ではないにもかかわらず、活性を有することが示された。この活性は、三糖糖脂質であるNeuNAcα3Galβ4GlcβCer（即ち、ＧＭ３）が不活性であるにもかかわらず、糖脂質構造であるNeuNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerが示す活性に類似していた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
非疎水性アグリコン構造とは、天然のセラミド構造よりも疎水性が実質的に低い構造を意味する。このような構造は、有機炭素をベースとした炭素数の少ない構造や、親水性基（例えば、脂肪族構造中の−ＣＨ2−と関連した酸素原子または窒素原子）を天然の糖脂質よりも実質的に大きな比率で含有する構造により得られる。親水性基の−ＣＨ2−構造に対する割合は少なくとも１：４であることが好ましく、より好ましくは少なくとも１：３であり、さらに好ましくは少なくとも１：２であり、最も好ましくは約１：１であり、特定のより好ましい態様においては、１：１未満である。アグリコンは、３を越える数の互いに結合した−ＣＨ2−構造を含有する脂肪族構造を１つを越えて有していないことが好ましい。アグリコン構造は炭素数が２３未満であることが好ましく、さらに好ましくは炭素数は１５未満であり、さらに好ましくは１０未満である。好ましい態様においては、アグリコン構造は環構造（より好ましくは六員環構造または五員環構造、さらに好ましくは六員環構造）、および／または少なくとも１つの水酸基（好ましくは少なくとも２つの水酸基、より好ましい態様においては、少なくとも３つの水酸基）、および／または少なくとも１つのアミド構造［好ましくはアセトアミド（Ｎ−アセチルともいう）−構造またはGlcNAc-残基のアセトアミド−構造を模倣する構造］を含むことが好ましい。アグリコンは、環構造と水酸基または環構造とアミド構造を含むことがさらに好ましい。好ましい六員環としては、シクロヘキサンやベンゼン環およびそれらの置換誘導体、並びに５個の炭素原子と共に窒素へテロ原子、酸素へテロ原子または硫黄へテロ原子を含む複素環構造が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
ヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する、炭素修飾した中性または酸性の新規なシアル酸誘導体 
本発明はさらに、ヘリコバクター ピロリに対する結合親和性を有する新規なシアル酸誘導体を開示する。このような誘導体は下記式で表される。
ＳＡ（Ｘ−Ｒ）
（式中、ＳＡはシアル酸であり；
Ｘはシアル酸のＣ１位に結合している結合原子または結合基、および／またはシアル酸の７位、８位または９位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であって、この場合にシアル酸は８位の炭素原子または８位と９位の炭素原子を欠失しているシアル酸誘導体でもよく；
特に、Ｒで表される置換基がシアル酸のＣ７位またはＣ８位に結合している時、シアル酸はＣ７位とＣ８位を含む構造またはＣ９位を含む構造をそれぞれ欠失した、短いシアル酸誘導体であることが好ましく；そして
Ｒは水素原子または炭素数が３を超える有機ラジカルである。）
上記式中のＸは、シアル酸残基のカルボキシル基と共にアミド構造を形成する−ＮＨであることが好ましい。また、上記式中のＲは、水素原子あるいは環構造および脂肪鎖の少なくとも１種を含むＣ4〜Ｃ30有機ラジカルであることが好ましく、Ｃ6〜Ｃ24有機ラジカルであることがより好ましく、Ｃ6〜Ｃ24脂肪族アルキル鎖であることが最も好ましい。ＳＡは、NeuNAcであることが好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
本発明の好ましい態様においては、コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーは、本発明のヘリコバクター ピロリ結合性物質に結合されている。より好ましい態様においては、ライブラリーは少なくとも６種の異なる分子を包含する。このようなライブラリーは、本発明のオリゴ糖配列に対する微生物性の結合を検出するために用いるのが好ましい。アミノ酸または有機アミド類のコレクションは市販されており、このような物質はウロン酸アミドのコンビナトリアルケミストリーによるライブラリーを合成するために用いることができる。コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーから高親和性のバインダーを同定することは、例えば阻害アッセイによって可能であり、ここでは本発明で開示する糖脂質または糖結合体に対する細菌の結合を阻害するために、ライブラリー中の化合物を用いる。本発明において好ましい構造類似体や誘導体は、本発明のヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列がヘリコバクター ピロリに結合するのを阻害することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
細菌結合性物質は、クラスター、即ち、細胞膜上の糖脂質、ミセルまたはリポソームとして提示されるか、あるいはアッセイに用いるＴＬＣプレートのような固相に提示されていることが好ましい。正しい空間配置によって提示されたクラスターは高い結合親和性を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
可撓性親水性リンカーを有する結合体は下記式ＩＶで表される。
[OS-O-(X)n-L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z （ＩＶ）
（式中、
ＯＳはヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列であり；
Ｘは炭素（−Ｃ−）、窒素（−Ｎ−）、または硫黄（−Ｓ−）で置換可能な糖残基であり；
Ｌ1およびＬ2は結合基であって、各々独立に酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子である結合原子あるいは置換基を形成する結合に含まれる２個の原子を包含し、該結合原子および該置換基を形成する結合は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、−Ｎ−、−Ｎ（ＣＯＣＨ3）−、−ＣＯ−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−で表されるアミド基、−Ｎ−Ｎ−（ヒドラジン誘導体）、あるいは−Ｏ−Ｎ−または−Ｎ−Ｏ−で表されるアミノオキシ結合であり；
Ｌ1は該Ｘの還元末端単糖のＣ１位に結合した結合基であり、ｎが０の場合には、Ｌ1は−Ｏ−を置換して、該ＯＳの還元末端のＣ１位に直接結合しており；
p1、p2、p3およびp4は各々独立に０〜７の整数であるが、但し、p1、p2、p3およびp4の少なくとも１種が１以上の整数であり；
｛ＣＨ1-2ＯＨ｝p1が側鎖構造を示す場合には、末端基となるＣＨ1-2ＯＨはＣＨ2ＯＨであり、p1が１を超える場合には、該末端基をスペーサーである該Ｙの残りの部分に結合させるための第二級アルコール基である−ＣＨＯＨ−が存在し；
Ｒは好ましくはアセチル基（−ＣＯＣＨ3）、Ｚに連結する結合、類似体形成基、水素原子または式中でアミンを形成するＣ1-4アルキル基であり、Ｒが結合である場合にはＬ2は糖鎖末端基の１個または２個の原子であり、該類似体形成基は、アミド構造を有するＣ1-4アシル基（好ましくは親水性の基、例えばヒドロキシアルキル基）を含み、；
ｍは１を超える整数であり；
Ｚは多価の担体である。）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
エレクトロスプレーイオン化質量分析法および衝突誘起解離法 − ヒト赤血球由来の、パーメチル化ヘリコバクター ピロリ結合性ガングリオシドを１０％（容量比）アセトニトリル水溶液に溶解した。エレクトロスプレーイオン化は、Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（英国、Micromass製）でナノフローエレクトロスプレーオプションを用いて、約１５〜４０ｎＬ／分の一定流速で行った。噴霧はナノスプレーニードルに９００Ｖの電圧をかけることにより行った。イオン源温度は８０℃とした。流速１５０リットル／時間の窒素を乾燥用ガスとして用いた。質量スペクトルにおいてｍ／ｚ１５９４．４で観察された二価荷電ピークを、衝突誘起解離を行うために選択した。衝突誘起解離は、アルゴンを３０〜８０Ｖの衝突エネルギーで用いることにより達成した。データは５０〜２６００質量単位に渡って回収した。ここでは、ドモン（Domon）とコステロ（Costello）の命名法（Domon and Costello, 1988）を使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
化学的に修飾されたＳ−３−ＰＧ 
ヘリコバクター ピロリとの相互作用における、グリセロール尾部およびNeuAcのカルボキシル基の重要性を試験するために、Ｓ−３−ＰＧを種々の方法で化学的に修飾した。具体的には、次の誘導化を行った：（ａ）シアル酸グリセロール尾部の過ヨウ素酸による穏やかな酸化とそれに続く還元、あるいは過ヨウ素酸による穏やかな酸化とそれに続くメチルアミンまたはエタノールアミンとのカップリング、（ｂ）カルボキシル基の一級アルコールへの還元、（Ｃ）カルボキシル基の種々のアミドへの転化、および（ｄ）ラクトンの合成。こうして得られた誘導体を、その構造の特性を確認するために陰イオンＦＡＢ ＭＳで分析した（図１２参照）。全ての分子イオンの質量が予想質量と一致し、変更はシアル酸残基に限られていた（表２）。後者は、糖鎖主鎖（core chain）中の糖配列に帰属するｍ／ｚ１３３９、１１７６、９７３および８１１に観測されるフラグメントイオン（現行の命名法によるとＹシリーズイオン；Domon and Costello, 1988, Harvey, 1999）に変化がないことによって示された。破壊されていないセラミド部分の存在はｍ／ｚ６４９に観測されたフラグメントイオン（Ｙ0イオン）（１８：１−２４：０）により示された。いずれの分子イオンもサテライトイオン（−２８質量単位）と共に出現し、サテライトイオンの出現は、ｄ１８：１−２２：０で表されるセラミドがＳ−３−ＰＧ調製物中に少量存在するためである（例えば、図１２Ａ中のｍ／ｚ１６２９と１６０１や、図１２Ｃ中のｍ／ｚ１５８２と１５５４）。唯一の例外は図１２Ｂであり、ｍ／ｚ１５９９と１５６９に観測されるイオンは、ｍ／ｚ１６２９に観測される主成分（図１２Ａ）に由来する２種の異なる誘導体を表している。図１２Ｂにおいては、ｄ１８：１−２２：０成分に帰属されるイオンはバックグラウンドに溶け込んでいた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
他の糖脂質およびネオ糖脂質 
種々の天然ガングリオシドおよびネオガングリオシドのパネルをヘリコバクター ピロリとの相互作用に関して試験した（表３）。ガングリオ系のガングリオシド、Ｓ−６−ＰＧ、NeuAcα8NeuAcα3−ＰＧ、またはラクト（Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc）主鎖に基づくシアリル化オリゴ糖から調製したネオガングリオシドに対するヘリコバクター ピロリの結合は見られなかった。一方、糖がＨＤＡまたは分岐脂質鎖とカップリングしたＳ−３−ＰＧは、同じオーバーレイ条件下で活性を示した。本発明者らの研究室で合成したネオ糖脂質へのヘリコバクター ピロリの結合を図１４に示す。主要なバンドに含まれる物質の構造は、プレートからバンドに相当する部分をかき取り、質量分析により確認した。レーン２の矢印はそれぞれＨＤＡ誘導体（下のバンド）および分岐状誘導体（上の２重のバンド）に相当するバンドを示す。これらの画分のＦＡＢスペクトルを図１５に示す。分子イオンおよびフラグメントイオンは予想通りだった。上記バンドに対応する、図１４のレーン３〜５の画分についても、同様のＦＡＢスペクトルを得た。結合系列（binding series）に含まれる他のシアリル化分子を少量含有するＳＰＧ調製物から、糖であるNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを得た（図１４のレーン１、図１１も参照）。このような微量の結合画分が誘導化後でさえ観測された（図１４のレーン２）。実験を繰り返すことにより、ＴＬＣプレート上のＨＤＡネオ糖脂質に対するヘリコバクター ピロリの結合の再現性は、分岐脂質鎖を有する誘導体よりも低いことが分かった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
２．ＰＧＣの分岐ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖に関連した結合エピトープ 
上記で説明したとおり、この選択的な結合性は、液体培地で培養したヘリコバクター ピロリの数株が発現した。例として、ＰＧＣへは結合するがＳ−３−ＰＧへは結合しないことを示す図１７を参照されたい。典型的な実験において、ＴＬＣプレート上で陽性反応を得るのに必要なＰＧＣの最小量は０．１６ｐｍｏｌ NeuAc／ｍｍ2であった。ＰＧＣのNeuAcのグリセロール尾部を過ヨウ素酸による穏やかな酸化とそれに続く還元（R-CHOH-CHOH-CH2OH  →  R-CHOH-CH2OH/R-CH2OH）またはエタノールアミンとのカップリング（R-CHOH-CHOH-CH2OH  →  R-CH2-NH-CH2-OH）により修飾し、カルボキシル基を還元（R-COOH  →  CH2OH）により修飾した。修飾したＰＧＣをパーメチル化してＥＩ ＭＳにより分析した結果を図１６に例示した。図１６には、還元前（図１６Ａ）および還元後（図１６Ｂ）の末端シアリル酸残基に対応するイオンが観察された。予想通り、NeuAcに帰属するｍ／ｚ３７６および３４４に観測されたフラグメントイオンは、還元したNeuAcに帰属する、ｍ／ｚ３６２および３３０に観測されるイオンで置換されていた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
放射線標識細菌によるＴＬＣプレートのオーバーレイを用いた結合試験は、修飾がＰＧＣとヘリコバクター ピロリとの相互作用に負の影響を与えることを示した。修飾したＰＧＣへのヘリコバクター ピロリの結合の一例を図１７に示し、その結果を表４にまとめた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
Ｓ−３−ＰＧの誘導化とそれに続く結合試験により、ヘリコバクター ピロリの結合はグリセロール尾部とカルボキシル基に提示されたシアリル化エピトープに依存することが分かった。カルボキシル基の重要性はＣＯＯＨの還元およびアミドの合成によって実証された。遊離アミドおよびベンジルアミドは、ＴＬＣプレート上でヘリコバクター ピロリに対する結合能をいくらか示したが、これらの反応は常に再現性があるわけではなく、親和性の減少を示した。ベンジルアミド中の大きな疎水性部分と遊離アミド中の正の電荷を帯びたＮＨ2基は非特異的結合を引き起こすことができる。一方、ＳＰＧのオクタデシルアミドへの結合性はより低いピコモルレベルであり（図４）、この結合が特異的な相互作用であることを示した。未修飾カルボキシル基はオクタデシルアミド中のアミドによって置換されてもよいという事実は、相互作用にはカルボキシル基の１つの酸素原子しか必要ではないことを示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
ヒトや動物の種々の糖結合体の一部であるNeuAcα3Galβ4GlcNAcが、天然のシアリル化ヘリコバクター ピロリ結合性糖の最適末端部を表していると考えられる。重要なのは、ヘリコバクター ピロリ関連感染症に積極的に関与するヒトの好中球が（Rautelin et al., 1993, Fiocca et al., 1994）、特にＳ−３−ＰＧと他のネオラクトガングリオシドを豊富に含んでいる（Fukuda et al., 1985, Muthing 1996, Stroud et al., 1996）ということである。上で述べたように、Ｓ−３−ＰＧは、ＴＬＣプレート上でヘリコバクター ピロリを結合した、ヒト好中球由来のガングリオシドの中で最も単純なものである。図１１は、より複雑な構造のガングリオシドに対して比較的強い結合が生じることを示す。ＴＬＣ表面でエピトープがより効果的に提示されていることがこの強い相互作用の最も大きな理由であると考えられる。研究段階で、糖鎖長および脂質部分の構造が結合に影響を及ぼすかもしれないことに気が付いた。例えば、ヘキサデシルアニリンを有するネオ糖脂質へのヘリコバクター ピロリの結合は、分岐脂質鎖を有するネオ糖脂質への結合よりも再現性が低く、また、ＴＬＣプレート上の結果（図１１参照）から判断すると、シアロネオヘキサオシルセラミドに対する結合はシアロネオテトラオシルセラミドに対する結合よりも強い。しかし、他の要因、例えば繰返しエピトープ単位、フコース側鎖または他の置換基なども考慮に入れる必要がある。より大きな種に強く結合するのは、長く伸びた主鎖の末端領域と内部領域の両方を認識する様々な細菌付着因子の結合の組み合わせによるものであると考えられる。ヘリコバクター ピロリは、シアリル化糖鎖および中性糖鎖の両者に関与する様々な結合特異性を示すことが分かっている（Karlsson 1998）。近年、Roche N. et al. によって、ヒトの胃癌細胞から調製した繰返しラクトサミン単位を有するガングリオシドへのヘリコバクター ピロリの結合が報告されている（Roche et al., 2001）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】ヒト赤血球由来ガングリオシドの陰イオンＦＡＢ ＭＳスペクトル。スペクトルの解読を容易にするために、スフィンゴシンと非ヒドロキシ脂肪酸（２４：０）を有する化合物種の簡略化した式をスペクトルの上方に示した。分析は、「実施例」に記載の方法で行った。２種類のスペクトルＡとＢ、具体的には、加速電圧を１０ｋＶとしたスペクトルＡと、加圧電圧を８ｋＶとしたスペクトルＢをそれぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。スペクトルＡにおいては、１００〜２４００質量単位に渡ってスキャニングし、一方のスペクトルＢにおいては、２０００〜３２００質量単位に渡ってスキャニングし、２．４分間のデータを回収した。
【図２】パーメチル化したヒト赤血球由来ガングリオシドの、電子衝突イオン化マススペクトル。スペクトルの解読を容易にするために、スフィンゴシンと非ヒドロキシ脂肪酸（２４：０）を有する化合物種の簡略化した式をスペクトルの上方に示した。分析は、「実施例」に記載の方法で行った。スペクトルの記録温度は３８０℃とした。ｍ／ｚ ３５４に観測されたピークは混入物に帰属されるものである。
【図３】パーメチル化したヒト赤血球由来ガングリオシドの、エレクトロスプレーイオン化質量分析および衝突誘起解離によって得たマススペクトル。スペクトルの解読を容易にするために、スフィンゴシンと非ヒドロキシ脂肪酸（２４：０）を有する化合物種の簡略化した式をスペクトルの上方に示した。分析は、「実施例」に記載の方法で行った。
【図４】パーメチル化と還元処理を行ったヒト赤血球由来ガングリオシドの、電子衝突イオン化マススペクトル。スペクトルの解読を容易にするために、スフィンゴシンと非ヒドロキシ脂肪酸（２４：０）を有する化合物種の簡略化した式をスペクトルの上方に示した。分析は、「実施例」に記載の方法で行った。スペクトルの記録温度は３４０℃とした。
【図５】ヒト赤血球由来ガングリオシド（３０℃）の、６００ＭＨｚにおけるプロトンＮＭＲスペクトル。試料は、重水素置換後に、ジメチルスルホキシド／Ｄ2Ｏ（９８：２、容量比）に溶解した。約４．８ｐｐｍを中心とする幅広のピーク（記号＊で示した）は、未同定の混入物に帰属されるものである。
【図６】末端NeuAcを有するガングリオシド、および末端NeuGcを有するガングリオシドに対するヘリコバクター ピロリの結合。Ａはアニスアルデヒドによる化学的検出結果であり、ＢとＣはそれぞれ、35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリのＣＣＵＧ １７８７４株とＪ ９９株の結合によって得られたオートラジオグラムである。ガングリオシドは、アルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５０：４０：１０、容量比）を溶媒系として分離し、「実施例」に記載の方法で結合アッセイを行った。レーンは以下の通りである：  ヒト肝細胞癌由来のNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、２μｇ（レーン１）；  ウサギ胸腺由来のNeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuGc-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、２μｇ（レーン２）；  ヒト赤血球由来のNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-G-10ガングリオシド）、２μｇ（レーン３）；  ウシ赤血球由来のNeuGcα3Galβ4GlcNAcβ6(NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuGc-G-10ガングリオシド）、２μｇ（レーン４）；  ウシ赤血球由来のGalα3Galβ4GlcNAcβ6(NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、２μｇ（レーン５）；  ヒト赤血球由来のGalα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｇ９−Ｂガングリオシド）、２μｇ（レーン６）。オートラジオグラフィーは１２時間行った。
【図７】ヘリコバクター ピロリのＣＣＵＧ １７８７４株とＪ ９９株の結合の比較。Ａはアニスアルデヒドによる化学的検出結果であり、ＢおよびＣはそれぞれ、35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリのＣＣＵＧ １７８７４株およびＪ ９９株の結合によって得られたオートラジオグラムである。ガングリオシドは、アルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５０：４０：１０、容量比）を溶媒系として分離し、「実施例」に記載の方法で結合アッセイを行った。各レーンは以下の通りである：  ヒト好中球由来のガングリオシド、２０μｇ（レーン１）；  ウサギ胸腺由来のNeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuGc-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、２μｇ（レーン２）；  ヒト肝細胞癌由来のNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、１μｇ（レーン３）；  ヒト赤血球由来のNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβich4Glcβ1Cer（NeuAc−Ｇ−１０ガングリオシド）、１μｇ（レーン４）；  ヒト赤血球由来の Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｇ９−Ｂガングリオシド）、１μｇ（レーン５）；  ヒト赤血球由来のGalα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ６ ２型ヘキサグリコシルセラミド）、４μｇ（レーン６）；  マウス糞由来のGalβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer（ガングリオテトラオシルセラミド）、４μｇ（レーン７）。オートラジオグラフィーは１２〜２４時間行った。
【図８】段階希釈したガングリオシドに対するヘリコバクター ピロリの結合。Ａは、クロマトグラム結合アッセイを用いた、ヘリコバクター ピロリ ＣＣＵＧ １７８７４株の結合によって得られたオートラジオグラムである。レーン１〜７はそれぞれ、以下の糖の段階希釈系列（１〜１００ｐｍｏｌ）である：  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAcα3-ネオラクトテトラオシルセラミド）、  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAcα3-ネオラクトヘキサオシルセラミド）および   NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAcα3-ネオラクトオクタオシルセラミド）。レーン８は、１ｍｍｏｌのNeuAcα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（シアリルＬｅaヘキサグリコシルセラミド）である。結合アッセイは、「実施例」に記載の方法で行った。３回の実験のうち、最も代表的な実験結果をＡに示す。Ｂは，デンシトメトリーによって結合を定量化した結果である。Ａに示したオートラジオグラムはＮＩＨイメージプログラムで分析した。
【図９】段階希釈したガングリオシドに対するヘリコバクター ピロリの結合。Ａは、クロマトグラム結合アッセイを用いた、ヘリコバクター ピロリ １７８７４株の結合によって得られたオートラジオグラムであり、レーンは以下の段階希釈系列である：  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、（１０〜１００ｐｍｏｌｅ）（レーン１〜５）；  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ＶＩＭ−２ガングリオシド)、（１０〜１００ｐｍｏｌｅ）（レーン６〜１０）；  NeuAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-２量体-Ｌｅxガングリオシド)、（１０〜１００ｐｍｏｌｅ）（レーン１１〜１４）；  NeuAcαich3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（シアリルＬｅxヘキサグリコシルセラミド）、１ｍｍｏｌｅ（レーン１５）。結合アッセイは、「実施例」に記載の方法で行った。３回の実験のうち、最も代表的な実験結果をＡに示す。Ｂは，デンシトメトリーによって結合を定量化した結果である。Ａに示したオートラジオグラムはＮＩＨイメージプログラムで分析した。
【図１０】段階希釈したガングリオシドに対するヘリコバクター ピロリの結合。Ａは、クロマトグラム結合アッセイを用いた、ヘリコバクター ピロリ ＣＣＵＧ １７８７４株の結合によって得られたオートラジオグラムであり、以下の糖の段階希釈系列（１〜１００ｐｍｏｌ）を使用した：  NeuAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-Lex）、  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAcα3-ネオラクトヘキサオシルセラミド）、  NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc−Ｇ−１０ガングリオシド）およびGalα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ6(NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｇ９−Ｂガングリオシド）。結合アッセイは、「実施例」に記載の方法で行った。３回の実験のうち、最も代表的な実験結果をＡに示す。Ｂは，デンシトメトリーによって結合を定量化した結果である。Ａに示したオートラジオグラムはＮＩＨイメージプログラムで分析した。比較のために、薄層クロマトグラム上の段階希釈したＧＭ１ガングリオシドに対する、125Ｉで標識したコレラトキシンＢ−サブユニット（ＣＴＢ）の結合に関するデンシトメトリーの結果もＡに示した。
【図１１】放射線標識したヘリコバクター ピロリを用いた、ＴＬＣプレート上の顆粒球由来ガングリオシドの検出レベル。プレートは、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５０：４０：１０、容量比）で展開し、アニスアルデヒドを噴霧するか、または35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリ ＣＣＧＵ １７８７４株をオーバーレイして視覚化した。レーン１〜１０は、顆粒球由来ガングリオシドの２倍希釈系列（レーン１には合計１２μｇをアプライした）であり；レーン１１は、ウシ脳由来ガングリオシド、２μｇ（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂの混合物）である。図中のＳ−３−ＰＧとＳ−６−ＰＧはそれぞれ、NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcCer と NeuAcα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcCerを表す。「７ｓ」および「８ｓ」という注釈は、それぞれ１分子中に７個か８個の単糖単位を含むガングリオシドに対応するクロマトグラフィー領域を示す。
【図１２】シアル酸の -CH2CH2CH2OH 基および -COOH 基が誘導化されたＳ−３−ＰＧの陰イオンＦＡＢ ＭＳスペクトル。Ａは未修飾のＳ−３−ＰＧ、Ｂは酸化還元されたＳ−３−ＰＧ、Ｃは酸化後メチルアミンにより誘導化したＳ−３−ＰＧ、Ｄは酸化後エタノールアミンにより誘導化したＳ−３−ＰＧ、Ｅは-COOH基を還元したＳ−３−ＰＧ、Ｆは遊離アミド、Ｇはメチルアミド、Ｈはエチルアミド、Ｉはプロピルアミド、Ｊはベンジルアミド、Ｋはオクタデシルアミドの結果である。
【図１３】修飾したＳ−３−ＰＧに対するヘリコバクター ピロリ（ＣＣＧＵ １７８７４株）の結合の一例。糖脂質をＴＬＣプレート上で分離し、アニスアルデヒド（左側のプレート）または35Ｓで標識した細菌（ヘリコバクター ピロリ、右側のプレート）で視覚化した。クロマトグラフィーの条件に関しては図１を参照のこと。レーン１はＳ−３−ＰＧだが、結合系列に属するより長い物質が痕跡量含まれている；レーン２はＳ−３−ＰＧのエチルアミドであり；レーン３はＳ−３−ＰＧのプロピルアミドであり；レーン４はＳ−３−ＰＧのベンジルアミドであり；レーン５は酸化還元したＳ−３−ＰＧであり（表３を参照）；レーン６はヘリコバクター ピロリの正の対照であり；レーン７はウシ脳由来ガングリオシドであり（上から：ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ)；レーン８はスルファチド混合物であり；レーン９はウサギ胸腺由来の五糖含有ガングリオシドの混合物であり；レーン１０はヒト顆粒球から調製した複合ガングリオシド混合物である。
【図１４】ＴＬＣプレート上のネオ糖脂質に対するヘリコバクター ピロリ（ＣＣＧＵ １７８７４株）の結合。クロマトグラフィーの条件に関しては図１を参照のこと。左側のプレートは、アニスアルデヒドを用いて炭水化物を染色したものであり、右側のプレートは35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリをオーバーレイしたものである。レーン１はＳ−３−ＰＧだが、図３と同様に、ＳＰＧ調製物には結合系列に属するより長い物質が痕跡量含まれている；レーン２はNeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcより得られたネオ糖脂質であり；レーン３はNeuAcα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcより得られたネオ糖脂質であり；レーン４はNeuAcα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcより得られたネオ糖脂質であり；レーン５はGalβ3(NeuAcα6)GlcNAcβ3Galβ4Glcより得られたネオ糖脂質であり；レーン６はウシ脳由来ガングリオシドである（上から：ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ)。レーン２に示した二つの矢印は、それぞれ、ヘキサデシルアニリン誘導体（下側のバンド）および分岐した脂質鎖を有するネオ糖脂質（上側の２重のバンド）を示す。レーン２の矢印で示した２つの画分と、それぞれに相当するレーン３〜５の画分をかき出し、マススペクトロメトリーで分析した（図６参照）。
【図１５】NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ4Galβ4Glcから誘導化したネオ糖脂質の陰イオンＦＡＢ ＭＳスペクトル。Ａはヘキサデシルアニリン誘導体の結果であり；Ｂは分岐した脂質部を有するネオ糖脂質の結果である。
【図１６】パーメチル化ポリグリコシルセラミドのＥＩ質量スペクトルの一例であり、NeuAcと還元NeuAcに相当するフラグメントイオンを示す。
【図１７】ＴＬＣプレート上の誘導化ＰＧＣに対する、ヘリコバクター ピロリ（０３２株）の結合。左側のプレートは、アニスアルデヒドを用いて炭水化物を染色したものであり、右側のプレートは35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリをオーバーレイしたものである。レーン１と２はヒト赤血球由来の未誘導化ＰＧＣであり；レーン３は還元ＰＧＣ（COOH  →  CH2OH）であり；レーン４はウシ脳由来のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂの混合物）であり；レーン５はＳ−３−ＰＧである。（液体培養した０３２株は、直鎖構造を表すＳ−３−ＰＧには結合しないことに注意されたい。）