【手続補正書】
【提出日】平成18年7月25日(2006.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム科の細菌から得ることができるシンターゼまたはトランスフェラーゼであるポリペプチドであって、
（a）アミドシンターゼまたはホスホ-、ヌクレオチジル-もしくはアリール-トランスフェラーゼとして作用するか；または
（b）ＥＣ6.3.1-、ＥＣ2.7.7-、ＥＣ2.7.8-またはＥＣ2.5.1.17内の活性を有するか；および／または
（c）プロピオニバクテリウム亜目またはプロピオニバクテリウム=フリューデンレイキーに属する微生物から得ることができる、上記ポリペプチド。
【請求項２】
（ｉ）配列番号:２、４、６もしくは８のアミノ酸配列；または
（ii）シンターゼもしくはトランスフェラーゼである（ｉ）の変種；または
（iii）シンターゼもしくはトランスフェラーゼである（ｉ）または（ii）のフラグメントを含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記（ii）の変種が配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％または85％の同一性を有し、および／または前記（iii）のフラグメントの長さが少なくとも150アミノ酸である請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
グラム陽性細菌から得ることができ、および／またはコビリニン酸-a,c-ジアミドシンターゼ、コビンアミドキナーゼ、コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼ、コバラミン（5'-ホスフェート）シンターゼまたはアデノシルトランスフェラーゼである請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下を含むポリヌクレオチド：
（a）配列番号：１、３、５もしくは７の核酸配列、または請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする配列；
（b）（a）に定義された配列のいずれかと相補的であるか、または前記とハイブリダイズする配列；
（c）（a）または（b）の配列のフラグメント；
（d）（a）、（b）もしくは（c）に定義された配列と少なくとも60％の同一性を有する配列；または
（e）（a）から（d）に定義された配列のいずれかに対する遺伝暗号の縮退に基づく配列。
【請求項６】
前記（b）のハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下であり、（c）のフラグメントの長さが少なくとも20塩基であり、および／または（d）の同一性が少なくとも70％または80％である請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
以下を含む請求項５または６に記載のポリヌクレオチド：
（a）シンターゼまたはトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列であって、（1）配列番号:１、３、５もしくは７のコード配列；（2）（1）に定義された配列の相補鎖と選択的にハイブリダイズする配列；（3）（1）または（2）に定義された配列に対する遺伝暗号の縮退に基づく配列である前記の配列、または
（b）（a）に定義されたポリヌクレオチドと相補的な配列。
【請求項８】
ＤＮＡ配列である請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５から８のいずれかに記載の１つまたは２つ以上のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１０】
以下を含む請求項９に記載のベクター：
a）核酸配列が以下から選択される請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ホスホ）トランスフェラーゼもしくは（ヌクレオチジル）トランスフェラーゼとして作用するか、または
ＥＣ2.7.1-もしくはＥＣ2.7.7-内の活性を有するか、または
配列番号:４のアミノ酸配列もしくは前記配列番号:４の変種もしくは前記配列番号:４のフラグメントであるか、または
配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％もしくは85％の同一性を有する、
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列、あるいは
配列番号：３の核酸配列；および
b）核酸配列が以下から選択される請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（アリール）トランスフェラーゼとして作用するか、または
ＥＣ2.7.8-内の活性を有するか、または
配列番号:６のアミノ酸配列もしくは前記配列番号:６の変種もしくは前記配列番号:６のフラグメントであるか、または
配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％もしくは85％の同一性を有する、
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列、あるいは
配列番号：５の核酸配列。
【請求項１１】
CobAタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む請求項９または１０に記載のベクター。
【請求項１２】
CobAタンパク質をコードする核酸配列がP. フリューデンレイキーに由来する請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
発現ベクターである請求項９から１２のいずれかに記載のベクター。
【請求項１４】
請求項５から８のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか、または１つまたは２つ以上の前記ポリヌクレオチドのマルチコピーを含むホスト細胞。
【請求項１５】
異種配列として、請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むホスト細胞。
【請求項１６】
請求項５から８のいずれかに記載のＤＮＡ配列または請求項９から１３のいずれかに記載のベクターで形質転換されたホスト細胞。
【請求項１７】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドまたはビタミンＢ12もしくはその前駆体を製造または合成する方法であって、前記方法が、前記ポリペプチドの発現またはビタミンＢ12もしくはその前駆体の合成を提供する条件下で請求項１４から１６のいずれかに定義されたホスト細胞を培養することを含む前記製造または合成方法。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１９】
アミンを製造する方法であって、前記方法が、プロピオン酸菌由来のアミドシンターゼ、または配列番号：２を含むポリペプチド、または請求項３２で定義されたその変種もしくはフラグメント、または請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞と基質を接触させることを含む前記アミンの製造方法。
【請求項２０】
以下の（a）から（d）に当てはまる請求項１９に記載の方法：
（a）前記方法はグルタミンの存在下で実施され、前記グルタミンは場合によってグルタメートに変換され；
（b）カルボキシル基はアミド化されてカルボキシアミド基を形成し；
（c）前記基質はコビリニン酸またはコビリニン酸c-ジアミド（式ＩまたはＩＡ）であるか、および／または前記方法の生成物はコビリニン酸c-ジアミドまたはコビリニン酸a,c-ジアミド（それぞれ式ＩＡまたはＩＢ）であり；および／または
（d）前記方法は基質のアミド化を含む。
【請求項２１】
ホスフェート含有化合物を製造する方法であって、前記方法が、プロピオン酸菌由来のホスホトランスフェラーゼ、配列番号：４を含むポリペプチド、または請求項２で定義されたその変種もしくはフラグメント、または請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞と基質を接触させることを含む前記ホスフェート含有化合物の製造方法。
【請求項２２】
以下の（a）から（d）に当てはまる請求項２１に記載の方法：
（a）前記方法はヌクレオシド三リン酸の存在下で実施され；
（b）前記基質はアデノシンを含み；
（c）前記方法はリン酸化を含み；さらに
（d）前記基質はアデノシルコビンアミド（式ＩＩ）を含み、および／または前記反応の生成物はアデノシルコビンアミドホスフェート（式ＩＩＡ）である。
【請求項２３】
ヌクレオチジル含有化合物を製造する方法であって、前記方法が、プロピオン酸菌由来のヌクレオチジルトランスフェラーゼ、配列番号：４を含むポリペプチド、または請求項２で定義されたその変種もしくはフラグメント、または請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞と基質を接触させることを含む前記ヌクレオチジル含有化合物の製造方法。
【請求項２４】
以下の（a）から（d）に当てはまる請求項２３に記載の方法：
（a）前記方法は基質のグアニジル化を含み；
（b）前記方法はリン酸基のヌクレオチジル化を含み；
（c）前記方法はヌクレオシル三リン酸の存在下で実施され；および／または
（d）前記基質はアデノシルコビンアミドホスフェート（式ＩＩＡ）を含み、および／または前記反応の生成物はアデノシル-ＧＤＰ-コバミド（式ＩＩＢ）である。
【請求項２５】
アリール含有化合物を製造する方法であって、前記方法が、プロピオン酸菌由来のアリールトランスフェラーゼ、配列番号：６を含むポリペプチド、または請求項２で定義されたその変種もしくはフラグメント、または請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞と基質を接触させることを含む前記アリール含有化合物の製造方法。
【請求項２６】
以下の（a）から（d）に当てはまる請求項２５に記載の方法：
（a）前記アリール成分が、１つまたは２つの環をもつ芳香環系（場合によって１つから４つのＣ1-8アルキル基で置換されてある）を含み、かつ０、１つまたは２つのへテロ原子を有し；
（b）前記反応の生成物は、遷移金属、および炭素原子、場合によってはまたリボース基に結合したアリール基を有し；
（c）前記方法はリボゾールの存在下で実施され；および／または
（d）前記基質はアデノシル-ＧＤＰ-コバミド（式ＩＩＢ）を含み、および／または前記生成物はアデノシル-5,6-ジメチルベンゾイミダゾリルコバミド（ビタミンＢ12、式ＩＩＣ）を含む。
【請求項２７】
アデノシン含有化合物を製造する方法であって、前記方法が、プロピオン酸菌由来のアデノシルトランスフェラーゼ、配列番号：８を含むポリペプチド、または請求項２で定義されたその変種もしくはフラグメント、または請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞と基質を接触させることを含む前記アデノシル含有化合物の製造方法。
【請求項２８】
以下の（a）から（d）に当てはまる請求項２７に記載の方法：
（a）前記方法は基質のアデノシル化またはアデノシンの移転を含み；
（b）前記方法は金属原子へのアデノシンの結合を含み；
（c）前記方法はヌクレオシル（三）リン酸の存在下で実施され；および／または
（d）前記基質はコビリニン酸a,c-ジアミド（式ＩＢ）を含み、および／または前記生成物はアデノシルコビリニン酸-a,c-ジアミド（式ＩＣ）を含む。
【請求項２９】
ビタミンＢ12またはその前駆体製造する方法であって、前記方法が、請求項１４から１６のいずれかで定義されたホスト細胞を、ビタミンＢ12またはその前駆体が産生または合成される条件下で培養または発酵させることを含む前記ビタミンＢ12またはその前駆体の製造方法。
【請求項３０】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項９から１３のいずれかに記載のベクター、または請求項１４から１６のいずれかに記載のホスト細胞のビタミンＢ12またはその前駆体の製造または合成における使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
発明の要旨
ここにビタミンB12の生合成に必要な新規な酵素が提供される。
本発明の第一の特徴は、放線菌目に由来するグラム陽性細菌、例えばプロピオン酸菌科（例えばプロピオニバクテリウム属、例えばプロピオニバクテリウム=フリューデンレイキー）から得られるシンターゼまたはトランスフェラーゼに関する。これらの酵素は（例えばアミド）シンターゼまたは（例えばホスホまたはヌクレオチジル）トランスフェラーゼである。好ましくは、それらはEC6.3.1.-、2.7.7-、2.7.8-、または2.5.1.17活性を有する。
より好ましくは、本発明は第一の特徴において、以下を含む（単離および／または精製）シンターゼまたはトランスフェラーゼポリペプチドを提供する：
（i）配列番号:2、4、6もしくは8のアミノ酸配列；または
（ii）シンターゼもしくはトランスフェラーゼである（i）の変種；または
（iii）シンターゼもしくはトランスフェラーゼである（i）または（ii）のフラグメント。
本発明の第二の特徴にしたがえば、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
（a）配列番号:1、3、5もしくは7の核酸配列、または本発明のポリペプチドをコードする配列；
（b）（a）に定義された配列のいずれかと相補的であるか、または前記とハイブリダイズする配列；
（c）（a）または（b）のいずれかの配列のフラグメント；
（d）（a）、（b）もしくは（c）に定義された配列のいずれかと少なくとも60、65または70％の同一性を有する配列；または
（e）（a）から（d）に定義された配列のいずれかに対する遺伝暗号の縮退に基づく配列。
本発明はまた以下を提供する：
−本発明のポリヌクレオチドを含み、さらに本発明のポリペプチドを発現することができる（発現）ベクター（第三の特徴）；
−本発明のベクターを含むホスト（第四の特徴）、例えば細胞系または株；
−本発明のポリペプチドを製造する方法（前記方法は本発明の細胞系または株を前記ポリペプチドの発現を得るために適した条件下で維持し、必要な場合には前記ポリペプチドを単離することを含む）；および
−ビタミンB12またはその前駆体を製造する方法（第五の特徴）（前記方法は基質を本発明のポリペプチドまたはホスト細胞と接触させることを含む）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明の詳細な説明
Ａ．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする（例えば単離および／または精製）ポリヌクレオチドを提供する。本発明はしたがって、ポリヌクレオチド、好ましくはシンターゼまたはトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドのアミノ酸配列は配列番号:2、4、6および／または8に示されている。本発明はさらに、配列番号:2、4、6および／または8に示されたアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらにまた包含されるものは以下から選択されるポリヌクレオチドである：
（a）配列番号:1、3、5および／または7に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含むポリヌクレオチド；
（b）配列番号:1、3、5または7に示されるヌクレオチド配列と（例えば選択的に）ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド；
（c）配列番号:1、3、5または7に示されるヌクレオチド配列の相補鎖と（例えば選択的に）ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド；
（d）（a）、（b）または（c）に定義された配列に対する遺伝暗号の縮退に基づくポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドは本発明の2つ、3つまたは4つ以上の配列、例えば配列番号:3および5、又は配列番号:1、3および5（または上記の（b）、（c）および（d）に定義されたその変種）を含むことができる。
本発明のポリヌクレオチドにはまた以下のポリヌクレオチドが含まれる：
（a）シンターゼまたはトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列であって、（1）配列番号:1、3、5または7のコード配列；（2）（1）に定義された配列の相補鎖と選択的にハイブリダイズする配列；（3）（1）または（2）に定義された配列に対する遺伝暗号の縮退に基づく配列、または
（b）（a）に定義されたポリヌクレオチドと相補的な配列。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
同族体：配列番号:1、3、5または7の配列をコードするDNA（例えばその相補鎖）と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、配列番号:1、3、5または7のコード配列と少なくとも50％または60%、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性（または相同性）を有するであろう。前記同一性は、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40または50、例えば少なくとも60または80、より好ましくは少なくとも100、200、400、500または600もの連続したヌクレオチドの領域に及ぶか、または場合によって配列番号:1、3、5または7の完全長に及ぶであろう。個々の配列については、前記配列同一性は以下のとおりであろう：
（a）配列番号:1については、少なくとも85％または90％；
（b）配列番号:3については、少なくとも70％；
（c）配列番号:5については、少なくとも90％または95％；および／または
（d）配列番号:7については、少なくとも85％、90％、95％または98％。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
BLAST分析実施用ソフトは公的に利用可能である（National Center of Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。前記アルゴリズムは先ず初めに、調査配列の中の長さWをもつ短いワード（前記はデータベースの配列中の同じ長さのワードとアラインメントを実施したとき何らかの正の値をもつ閾値スコアTと合致するかまたは満足させる）高スコア配列対（HSP）を特定することを必要とする。Tは近傍ワードスコア閾値と称される(6,7)。これらの最初のワードヒットは、それらを含有するHSPを見つけるための検索開始シードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って延長される。各方向における前記ワードヒットの延長は以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ低下したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアをもつ残基のアラインメントのためにゼロまたはそれより小さくなったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムW、TおよびXはアラインメントの感度および速度を決める。BLASTプログラムはデフォルトとして、11のワードの長さ（W）、50のBLOSUM62スコアマトリックス(8)アラインメント（B）、10の期待値（E）、M＝5、N＝4、および両鎖の比較を用いる。
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計分析を実施する(9)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の測定値の1つは、最少合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第一の配列と第二の配列との比較の最少合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、もっとも好ましくは約0.001未満ならば、前記配列はもう1つの配列に対して類似していると考えられる。
フラグメント、同族体および他の変種は、長さが少なくとも500、510または550（例えば配列番号:7の場合）ヌクレオチドであり、対応するタンパク質の少なくとも（例えば最初の）170、180または200アミノ酸をコードする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
B1．（ホスホ）トランスフェラーゼ（リン酸化）：［cobU］：本発明はまたリン酸化プロセス、またはホスフェート含有化合物の製造プロセスに関し、前記プロセスは基質を本発明のポリペプチドと接触させることを含む。前記ポリペプチドは、好ましくは上記で定義したように配列番号:4またはその変種もしくはフラグメントを含む。また別には、前記ポリペプチドは、マイコバクテリウム科の細菌、例えばプロピオニバクテリウム属の細菌、特にプロピオニバクテリウム=フリューデンレイキーに属する種に由来するホスホトランスフェラーゼであろう。本プロセスはしたがって基質のリン酸化（または基質へのリン酸基の付加）を含む。
前記プロセスはヌクレオチジル（例えばトリ）ホスフェート（例えばATP）の存在下で実施することができる。前記基質はヌクレオチド（例えばアデノシンを含むもの）を含むことができる。
好ましくは、前記プロセスは、（1つの化合物から別の化合物（例えば基質）へ）ホスフェート成分を転移させて（例えばヒドロキシル（OH）基をリン酸化して）、リン酸基（-PO-4）を生成することを含む。したがって、前記ポリペプチドは、アクセプターとしてアルコール基（例えばヒドロキシ基）を用いるホスホトランスフェラーゼとして機能することができる。
好ましくは、前記基質はアデノシルコビンアミド（式II）であり、および／または前記生成物はアデノシルコビンアミドホスフェート（式IIA）である。前記プロセスはさらに、ヌクレオチド三リン酸からヌクレオチド二リン酸への変換を含むことができる（例えばATPからADP）。したがって、前記ポリペプチドはコビンアミドキナーゼ（例えばcobU）である。好ましくは、前記ポリペプチドはEC2.7.1.-内の活性を有する。