【手続補正書】
【提出日】平成17年8月30日(2005.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  試料中の１以上の標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であって：
(a)少なくとも1種の捕獲オリゴヌクレオチドを、いずれかの標的オリゴヌクレオチドが前記捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするために適切なハイブリダイゼーション条件下で試料と接触させる工程であって、前記捕獲オリゴヌクレオチドが少なくとも1個の非-標準塩基を含む分子認識配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドは支持体に結合しており、前記標的オリゴヌクレオチドが前記捕獲オリゴヌクレオチドの前記分子認識配列に相補的なタグ配列を含む、前記工程；および、
(b)前記標的オリゴヌクレオチドと前記捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を含む、前記アッセイ方法。
【請求項２】  標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であって：
(a)検体-特異的配列を含む検体を第一のプライマー及び第二のプライマーと接触させる工程であって、前記第一のプライマーがタグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含み、前記第二のプライマーが検体の第二の配列に相補的な配列及び非-標準塩基を含む前記工程；
(b)前記第一及び前記第二のプライマーを酵素的に伸長し、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、前記標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの一方は前記検体-特異的配列を含み、他方は前記検体-特異的配列に相補的な配列を含む、前記工程；
(c)前記第二のプライマーの非-標準塩基に対向させて、相補的非-標準塩基を伸長させた第一のプライマーに取込む工程；
(d)支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするに適切な条件下で標的オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記標的オリゴヌクレオチドは前記標的オリゴヌクレオチドのタグ配列及び前記検体-特異的配列又は前記検体-特異的配列の相補配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドは前記標的オリゴヌクレオチドの前記タグ配列に相補的である分子認識配列を含む、前記工程；及び
(e)前記標的オリゴヌクレオチドの前記捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを検出する前記工程、
を含む、前記アッセイ方法。
【請求項３】  少なくとも一つの標的オリゴヌクレオチドを検出するための、以下の工程を含む方法：
(a)試料と、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む少なくとも一対のプライマーとを、前記プライマー対の前記第一及び前記第二のプライマーが、標的DNA存在するのであれば前記標的DNAにハイブリダイズする条件下で、接触させる工程；
(b)前記標的DNAが存在するのであれば、前記標的オリゴヌクレオチドを増幅する工程；
(c)工程(b)において増幅されたいずれかの標的オリゴヌクレオチドを、少なくとも１つのタグ付けられたプライマーとハイブリダイズさせる工程であって、前記プライマーが、5'から3'方向へ順に、少なくとも1個の非-標準ヌクレオチドを含む5'タグ配列、及び工程(b)で増幅された標的ヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能な3'配列を含むプライマーである、前記工程；
(d)標識された三リン酸塩基の存在下で工程(c)の少なくとも１つのプライマーを酵素的に伸長し、標識された伸長産物を形成させる工程であって、前記標識された伸長産物は少なくとも１つの非-標準塩基を含む前記タグ配列を含む、前記工程；
(e)工程(d)の標識された伸長産物を、支持体に結合した、前記標識された伸長産物のタグ配列に相補的な分子認識配列を含む少なくとも１つの捕獲オリゴヌクレオチドと、前記標識された伸長産物にハイブリダイズするに適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；及び
(f)工程(e)のハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項４】  以下の工程を含む、少なくとも２つの標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法：
(a)検体-特異的配列を含有する検体を第一のプライマー及び第二のプライマーと接触させる工程であって、前記第二のプライマーが、5'から3'方向へ順に、前記検体-特異的配列に相補的でない配列、非-標準塩基、及び前記検体-特異的配列を含む、前記工程；
(b)プライマーを酵素的に伸長して伸長産物を形成させる工程；
(c)工程(b)の第二のプライマーの伸長産物に、5'から3'方向へ順に、少なくとも一つの非-標準塩基を含む5'タグ配列、及び前記第二のプライマーの伸長産物に相補的な3'配列を含むタグ付けした少なくとも１つのプライマーをハイブリダイズさせる工程；
(d)工程(c)のタグ付けしたプライマーを酵素的に伸長する工程；
(e)工程(a)の第二のプライマーの前記検体-特異的配列に相補的でない配列に相補的なレポーターオリゴヌクレオチドを、工程(b)の伸長産物にハイブリダイズさせる工程；
(f)工程(d)のタグ付けされた伸長産物を、少なくとも一つの非-標準塩基を含み支持体に結合した少なくとも一つの捕獲オリゴヌクレオチドに、前記タグ付けされた伸長産物が前記少なくとも一つの捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で接触させる工程；および
(g)工程(f)のハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項５】  検体をアッセイするためのキットであり：
支持体；
支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドであって、少なくとも1個の非-標準塩基を有する分子認識配列を含む前記捕獲オリゴヌクレオチド；
タグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含む第一のプライマー；および、
検体の第二の配列に相補的な配列を含む第二のプライマー、
を含む前記キット。
【請求項６】  以下の工程を含む、標的ヌクレオチドをアッセイする方法：
(a)検体-特異的配列を含む検体を第１のプライマーおよび第２のプライマーと接触させる工程であって、前記第２のプライマーは、5’から3’の順に、前記検体特異的配列と相補的でない配列、非-標準塩基および前記検体-特異的配列を含む、前記工程；
(b)プライマーを酵素的に伸長して標的オリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、前記標的オリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの一方が前記検体-特異的配列を含み、他方が前記検体-特異的配列に相補的な配列を含む、前記工程；
(c)工程(b)の第２のプライマーの伸長産物に、5’から3’方向へ順に非-標準塩基、リンカー、前記第２のプリマーの伸長産物に相補的な3’配列を含む、タグ付けしたアレル-特異的プライマーをハイブリダイズさせる工程；
(d)工程(c)のアレル-特異的プライマーを酵素的に伸長する工程；
(e)工程(a)の第２のプライマーの検体-特異的配列に相補的でない配列に相補的なレポーターオリゴヌクレオチドを工程(d)の伸長産物にハイブリダイズさせる工程；
(f)支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを工程(f)の産物と接触させる工程；および
(g)前記捕獲オリゴヌクレオチドへの前記レポーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
【表１】
2004531205.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
【表２】
2004531205.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
【表４】
2004531205.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
【表５】
2004531205.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表８】
2004531205.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
【表９】
2004531205.tif 000006
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
実施例3及び比較例
位置ゲート(Site Gated)取込み
第一のプライマー  5'AGAACCCTTTCCTCTTCC (配列番号：154)
標的  5' AAGAACCCTTTCCTCTTCCGATGCAGGATACTTAACAATAAATATTT(配列番号：155)
第二プライマー  CTACGTCCTATGAATTGTTATTTATAAAXAGGACAGACG 5'(配列番号：156)
X=イソCTP
第一のプライマー、標的、及び第二のプライマーの配列を、各々、配列番号：154、配列番号：155、及び配列番号：156に示した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
【表２１】
2004531205.tif 000007
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
【表２２】
2004531205.tif 000008