【手続補正書】
【提出日】平成18年1月6日(2006.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  結合してヒトリポタンパク質（ａ）を産生できるヒトアポリポタンパク質（ａ）ポリペプチドとヒトアポリポタンパク質Ｂポリペプチドをコードする配列を、ゲノムＤＮＡに有するトランスジェニックウサギ。
【請求項２】  コレステロール豊富な食餌を与えられたとき、上記ウサギは、ヒト様アテローム性動脈硬化病巣を発症することを特徴とする請求項１に記載のウサギ。
【請求項３】  ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡからなる群から選択される外来ＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１に記載のウサギ。
【請求項４】  ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡからなる群から選択される外来ＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項２に記載のウサギ。
【請求項５】  上記配列を発現する肝細胞を有することを特徴とする請求項１に記載のウサギ。
【請求項６】  上記配列を発現する肝細胞を有することを特徴とする請求項２に記載のウサギ。
【請求項７】  上記配列を発現する精巣細胞を有することを特徴とする請求項１に記載のウサギ。
【請求項８】  上記配列を発現する精巣細胞を有することを特徴とする請求項２に記載のウサギ。
【請求項９】  性的成熟中、安定な血漿レベルのアポリポタンパク質（ａ）ポリペプチドを有することを特徴とする請求項１に記載のウサギ。
【請求項１０】  ヒトリポタンパク質（ａ）を産生できるトランスジェニックウサギの作出方法であって、
ヒトアポリポタンパク質（ａ）を発現できる第１のウサギの生殖ライン細胞を、ヒトアポリポタンパク質Ｂを発現できる第２のウサギの生殖ライン細胞と結合させる工程を含む方法。
【請求項１１】  ヒトリポタンパク質（ａ）を産生できるトランスジェニックウサギの作出方法であって、
ヒトアポリポタンパク質（ａ）を発現できる第１のウサギを、ヒトアポリポタンパク質Ｂを発現できる別のウサギと交配する工程を含む方法。
【請求項１２】  アポリポタンパク質Ｂタンパク質を発現できるウサギは、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子を有するファージミドを、ウサギ胚に注入することによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  アポリポタンパク質（ａ）を発現できるウサギは、ヒトアポリポタンパク質（ａ）遺伝子を有する酵母人工染色体を、ウサギ胚に注入することによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】  アポリポタンパク質（ａ）を発現できるウサギは、ウサギ胚性幹細胞に、アポリポタンパク質（ａ）タンパク質をコードする少なくとも一つのヒトＤＮＡ断片を導入し、上記幹細胞とウサギ胚盤胞を一緒にし、胚をレシピエントメスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】  アポリポタンパク質Ｂを発現できるウサギは、ウサギ胚性幹細胞に、アポリポタンパク質Ｂタンパク質をコードする少なくとも一つのヒトＤＮＡ断片を導入し、上記幹細胞とウサギ胚盤胞を一緒にし、胚をレシピエントメスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】  アポリポタンパク質（ａ）を発現するウサギは、ウサギ卵割球に、アポリポタンパク質（ａ）タンパク質をコードする少なくとも一つのヒトＤＮＡ断片を有するレトロウイルスを感染させ、上記卵割球をレシピエントメスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】  アポリポタンパク質Ｂを発現するウサギは、ウサギ卵割球に、アポリポタンパク質Ｂタンパク質をコードする少なくとも一つのヒトＤＮＡ断片を有するレトロウイルスを感染させ、上記卵割球をレシピエントメスウサギに移すことによって提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】  化合物が、リポタンパク質（ａ）発現又は代謝に関連する疾患を阻害できるかどうかを決定する方法であって、
ヒトリポタンパク質（ａ）を産生でき、ヒトリポタンパク質（ａ）と関連する疾患を発症し、上記化合物で治療された第１のトランスジェニックウサギを、ヒトリポタンパク質（ａ）を産生でき、ヒトリポタンパク質（ａ）と関連する疾患を発症し、上記化合物で治療されなかった第２のトランスジェニックウサギと比較することを特徴とする上記方法。
【請求項１９】  上記疾患は、アテローム性動脈硬化、心臓血管疾患、虚血、脳卒中、再発狭窄症、冠動脈疾患、末梢閉塞性動脈疾患、心筋梗塞、血栓、及び望ましくない脂質プロフィールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】  化合物が、リポタンパク質（ａ）粒子のアッセンブリィを阻害できるかどうかを決定する方法であって、
上記化合物で治療され、ヒトリポタンパク質（ａ）を産生できる第１のトランスジェニックウサギにおけるリポタンパク質（ａ）産生のレベルを、上記化合物で治療されず、ヒトリポタンパク質（ａ）を産生できる第２のトランスジェニックウサギにおけるリポタンパク質（ａ）産生のレベルと比較することを特徴とする上記方法。
【請求項２１】  上記化合物は、アンチセンス核酸及び細胞内結合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
アポリポタンパク質Ｂ−１００（ａｐｏＢ）は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度タンパク質（ＬＤＬ）及びリポタンパク質Ｌｐ（ａ）の主要タンパク質構成分である。このタンパク質は、ＬＤＬレセプタの生理的リガンドであり、その血漿濃度は、アテローム性動脈硬化の発症と陽性に関連する（Brunzellら, 1984 Arteriosclerosis 4, 79-93）。ApoB-100は、公知の最大のタンパク質の一つであり、分子量は５５０ｋＤａであり、４５３６個のアミノ酸を含む（Chenら, 1986 J.Biol.Chem, 261, 12919-21 ）。このリポタンパク質は肝臓でのみ合成される。その血漿濃度は、1.0-1.2g/Lである。ApoB-100は、肝臓で合成されるコレステロールを血漿を通り、生物の他の細胞に輸送するのに主要な役割を荷う。ａｐｏＢの別の型、即ち、ａｐｏＢ−４８は、キロミクロンに存在する。ヒトにおいて、ａｐｏＢ−４８は、腸で合成される。ＡｐｏＢ−４８は、２６０ｋＤａの分子量を有し、２１５２個のアミノ酸を含み、それは、直線的のａｐｏＢ−１００のＮ末端の４８％に対応する（Powellら, 1987, Cell 50, 831-40 ）。ａｐｏＢ−１００のＣ末端部分は、ａｐｏＢ−１００がＬＤＬレセプターと結合する領域を含むので、ａｐｏＢ−４８は、ＬＤＬレセプターとは結合せず、代謝的に異なるように振舞う。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
ヒトａｐｏ（ａ）遺伝子を有するＹＡＣクローン（ＣＥＰＨライブラリィでクローン３６６Ｈ２）が以前に記載された（Frazer,K.A., Narla,G., Zhang,J.L., and Rubin,E.M., Nat Gen (1995) 9, 424-431）。ヒトａｐｏ（ａ）遺伝子を単離するために、パルスフィールド電気泳動によって、酵母染色体からＹＡＣは分離されることができる。次いで、ＹＡＣを含むバンドが、SeaPlaque GTG アガロース（FMC, Rockland,MD）から切り出され、ベータ−アガロース（NEB, Beverly, MA）で処理され、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに対し透析された（Couto,L.B., Spangler,E.A. and Rubin,E.M., Nuc Acid Res (1989) 17(19), 8010）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
ヒトａｐｏＢ遺伝子を含む９０ｋｂ  Ｐ１ファージミドが以前に記載された（Callowら，Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1994) 91, 2130-2136）。あるいは、それ自身のプロモータの制御下にヒトａｐｏ（ａ）又はａｐｏＢをコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片は、ヒトゲノム又はｃＤＮＡ発現ライブラリィをスクリーニングすることにより、得ることができる。これを行なうために、ヒトアポリポタンパク質（ａ）又はａｐｏＢに相補的であったＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションによってスクリーニングされる。次いで、このスクリーニングで単離されたａｐｏ（ａ）又はａｐｏＢ  ＤＮＡ含有クローンは、それぞれの報告された配列（Frazer,K.A., Narla,G., Zhang,J.L. and Rubin,E.M., Nat Gen (1995) 9,424-431；Callowら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1994) 91, 2130-2136 ）と比較して解析される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
実施例１  ヒトａｐｏ（ａ）とａｐｏＢのＤＮＡ調製と特徴づけ
ヒトａｐｏ（ａ）遺伝子を含むＹＡＣクローン（ＣＥＰＨライブラリィ中でクローン３６６Ｈ２）は、以前に記載された（Frazer,K.A., Narla,G., Zhang,J.L., and Rubin,E.M., Nat Gen (1995) 9, 424-431）。パルスフィールド電気泳動によって、ＹＡＣは、酵母染色体から分離された。ＹＡＣを含むバンドは、SeaPlaque GTG アガロース（FMC ，Rockland, MD）から切り出され、ベータ−アガロース（ＮＥＢ，Beverly, MA ）で処理し、次いで、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに対し透析された（Couto,L.B., Spangler,E.A. and Rubin,E.M., Nuc Acid Res (1989) 17(19), 8010）。ヒトａｐｏＢ遺伝子を含む９０ｋｂ  Ｐ１ファージミドは、以前に記載された（Callowら，Proc Natl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136）。