【手続補正書】
【提出日】平成17年7月4日(2005.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  カスパーゼ−９欠損動物およびその使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  カスパーゼ−９遺伝子に操作された変異についてへテロ接合性であるゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物または胚であって、ここで、ホモ接合性状態においては、該変異が、機能的に欠損したカスパーゼ−９遺伝子および異常な脳の発生を生じる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物または胚。
【請求項２】  カスパーゼ−９遺伝子に操作された変異についてホモ接合性であるゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその胚であって、ここで、該哺乳動物または胚が、機能的なカスパーゼ−９遺伝子を欠き、そして異常な脳の発生に特徴付けられる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその胚。
【請求項３】  前記動物がマウスである、請求項１または２に記載の遺伝的に変化された動物。
【請求項４】  カスパーゼ−９遺伝子に操作された変異についてホモ接合性であるゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその胚を産生する方法であって、以下の工程：
ａ．ペンタペプチドモチーフＱＡＣＸＧを含まないカスパーゼ−９をコードするゲノムＤＮＡ配列を含む、単離されたＤＮＡ配列を提供する工程であって、ここで、「Ｘ」が、アルギニンまたはグリシンである、工程、
ｂ．該ＤＮＡ配列を胚性幹細胞に導入する工程であって、ここで、該ＤＮＡ配列が該幹細胞の染色体に安定に組み込まれるような条件下で行われる、工程、
ｃ．該幹細胞を該動物の胚盤胞に組み込んで、キメラ動物を産生する工程、
ｄ．該キメラ動物を機能的なカスパーゼ−９を発現する動物と交配して、機能的なカスパーゼ−９についてヘテロ接合性の動物を産生する工程、
ｅ．機能的なカスパーゼ−９発現についてヘテロ接合性の該動物を同系交配して、カスパーゼ−９発現を欠損する該動物を産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】  前記ＤＮＡ配列がさらに選択マーカー遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】  前記マーカー遺伝子がｎｅｏ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】  ヒトまたは他の動物における発生異常、神経細胞死、平滑筋もしくは心筋の変性、またはウイルス感染に関連する細胞死を処置または防止するための薬剤の製造における、カスパーゼ−９の発現またはカスパーゼ−９の活性のいずれかを阻害する分子の使用。
【請求項８】  前記分子が、カスパーゼ−９に特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、機能的なカスパーゼ−９  ｍＲＮＡの転写を妨げるようにカスパーゼ−９  ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、カスパーゼ−９発現を妨げるようにカスパーゼ−９  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはカスパーゼ−９  ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】  請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物または胚から単離された細胞。
【請求項１０】  前記細胞が胸腺細胞である、請求項９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、プログラムされた細胞死に関与するタンパク質であるカスパーゼ−９の発現を欠損する、遺伝的に操作した動物に関する。本発明はさらに、カスパーゼ−９の活性化に関連する特定の型の細胞死を妨げるための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アポトーシスは、多細胞生物体におけるホメオスタシスの維持にとって重要な生物学的機能である。この過程は、遺伝的に決定され、そして進化の過程で保存された基本的な機構の１つであるとして示されている（Ｍ．Ｄ．Ｊａｃｏｂｓｅｎら，Ｃｅｌｌ，８８，３４７−５４頁（１９９７））。
【０００３】
哺乳動物における細胞死の過程は、カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーを必要とする。このファミリーは、少なくとも１０のメンバーからなる（Ｅ．Ｓ．Ａｌｎｅｍｒｉら，Ｃｅｌｌ，８７，１７１（１９９６））。全てのカスパーゼが、システインプロテアーゼであり、そして前駆体形態として合成される。カスパーゼは、特定のＡｓｐ残基でのその前駆体の切断により活性化される。これにより、２０ｋＤａサブユニットおよび１０ｋＤａサブユニットからなる活性なヘテロ二量体が生成される。次いで、このヘテロ二量体は、自身と二量体化して四量体を形成する。カスパーゼの活性化は、おそらく、自己触媒的なプロセスまたはカスパーゼプロテアーゼ間のカスケードにより媒介される。一旦カスパーゼが活性化されると、これらは種々の標的タンパク質を切断してアポトーシスに関連する変化を細胞内に引き起こす。
【０００４】
アポトーシス過程についての最近の研究により、カスパーゼ−３の活性化がＤＮＡのフラグメント化に関連することが明らかにされた（Ｘ．Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ，８９，１７５−８４頁（１９９７））。３つの因子、すなわち、Ａｐａｆ−１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子）、シトクロム−Ｃ（ミトコンドリア機能にとって必須の要素である）およびカスパーゼ−９が、カスパーゼ−３の活性化に関与する（Ｚｏｕら（１９９７）；Ｘ．Ｌｉｕら（１９９６），Ｃｅｌｌ，８６，１４７−５７頁；およびＰ．Ｌｉら，Ｃｅｌｌ  ９１，４７９−８９頁（１９９７））。
【０００５】
プログラムされた細胞死の機構を理解することは、発生異常の防止にとって、ならびに神経細胞死、平滑筋および心筋の変性、およびウイルス感染に関連する細胞死の防止において重要な意味をもつ。したがって、アポトーシスを研究するためのツールを得ることの必要性、ならびにアポトーシスのインヒビターを開発する必要性が大いに存在する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、カスパーゼ−９の発現を欠損する動物、特にマウスを産生する方法を提供する。本発明はまた、機能的なカスパーゼ−９を発現しない遺伝的に変化した動物に関する。このような動物は、本発明の方法または関連した方法によって産生され得る。
【０００７】
本発明のカスパーゼ−９欠損動物は、脳に異常を示す。前脳、菱脳および脊髄において過剰の細胞が見出される。さらに、アポトーシスおよびＤＮＡのフラグメント化が、本発明のカスパーゼ−９欠損動物から採取されたデキサメサゾン処理された胸腺細胞において減少される。本明細書に提示されるこれらのデータおよび他のデータは、カスパーゼ−９が、カスパーゼカスケードにおける１つ以上の他のカスパーゼの活性化を担う上流のカスパーゼであることを実証する。したがって、カスパーゼ−９は、ニューロンのアポトーシス、心筋および平滑筋のアポトーシス、ならびにウイルス感染に関連するアポトーシスにおいて重要な役割を果たす。
【０００８】
したがって、本発明の別の局面は、カスパーゼ−９活性を阻害することにより、アポトーシスを防止するための方法に関する。このようなインヒビターとしては、カスパーゼ−９に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、カスパーゼ−９のＤＮＡまたはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、カスパーゼ−９  ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムに類似の目的に合わせて作製された酵素学的ヌクレオチド、ならびに以下で考察される他の分子が挙げられる。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、カスパーゼ−９の発現を欠損する遺伝的に変化した動物を提供する。用語「動物」は、本明細書で使用される場合、ヒトを除く全ての動物を含む。好ましくは、遺伝的に操作された動物は、げっ歯類である。さらに好ましくは、この動物は、マウスである。
【００１０】
本発明の遺伝的に変化した動物の作出における最初の工程は、カスパーゼ−９ゲノムクローンの取得である。これは、ゲノムライブラリーをカスパーゼ−９に特異的なプローブを用いてプロービングすることにより達成され得る。このようなプローブは、ＰＣＲ技術と共に使用された場合に、カスパーゼ−９に特異的なゲノムＤＮＡを増幅するカスパーゼ−９に特異的なプライマーであり得る。あるいは、このプローブは、カスパーゼ−９のｃＤＮＡまたはそのフラグメントであり得る。このようなｃＤＮＡはまた、ｃＤＮＡライブラリーをカスパーゼ−９に特異的なプライマーを用いてプロービングし、続いてＰＣＲを行うことによって入手され得る。あるいは、このｃＤＮＡは、カスパーゼ−９をコードするｍＲＮＡを、カスパーゼ−９に特異的なプライマーを使用することにより特異的に逆転写することによって作製され得る。カスパーゼ−９に特異的なプライマーは、以下の実施例に示される。
【００１１】
一旦ゲノムクローンが単離されると、このＤＮＡは、機能的なカスパーゼ−９タンパク質をコードし得ないようにするように変異されなければならない。これは、当該分野において周知の種々の方法により達成され得る。このような方法としては、例えば、その遺伝子のコード領域の一部分の部位特異的変異誘発または切除が挙げられ、切除したＤＮＡの代替ＤＮＡとの同時置換を伴うかまたは伴わない。
【００１２】
ペンタペプチドモチーフＱＡＣＸＧ（ここで、「Ｘ」はアルギニンもしくはグリシン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、カスパーゼファミリーのメンバー間で保存されており、そして活性に必要であるようであることが公知である。したがって、カスパーゼ−９のこの部分をコードするＤＮＡの欠失または変異は、得られた遺伝子が機能的なカスパーゼ−９を発現し得ないようにする。得られたＤＮＡで形質転換された細胞が容易に同定され得るように、カスパーゼ−９のこの部分をコードするＤＮＡを、マーカー遺伝子をコードするＤＮＡと置換することが好ましい。好ましくは、ペンタペプチドモチーフを含むゲノムクローンの領域を、ｎｅｏ遺伝子（これは後に、形質転換体のためのマーカーとして利用され得る）をコードするＤＮＡで置換する。
【００１３】
次いで、非機能的なカスパーゼ−９遺伝子を含む最終的な構築物を線状化し、そしてこれを、形質転換するために使用される、所望の遺伝的に変化した動物と同じ種に由来する細胞型に導入またはトランスフェクトする。好ましくは、この細胞型は、胚性幹細胞である。最終的な目標は、細胞の染色体中の野生型のカスパーゼ−９遺伝子と、ベクター中の変異カスパーゼ−９遺伝子との間で相同組換えを生じさせることである。この変異させたカスパーゼ−９遺伝子を含む細胞は、マーカー遺伝子により同定される。
【００１４】
ｎｅｏマーカー遺伝子の場合、本発明者らは、Ｇ４１８およびガンシクロビルに対して耐性である細胞を探索した。相同組換えは、マーカー遺伝子に特異的なプローブを使用して、サザンブロッティングにより確認する。
【００１５】
一旦組換え細胞が同定されると、この組換え細胞は、所望の種からの胚盤胞に注入される。次いで、得られたキメラ動物を正常な動物と交配させて、ヘテロ接合性の子孫を産生する。次いで、これらの子孫は、非機能的なカスパーゼ−９遺伝子についてホモ接合性の動物を得るために同系交配（ｉｎｔｅｒｂｒｅｄ）させる。
【００１６】
カスパーゼ−９産生を欠損する遺伝的に変化した動物が産生されたことの確認は、その動物のｍＲＮＡまたは発現されたタンパク質を、カスパーゼ−９に対応する分子（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の欠損について分析することにより達成され得る。
【００１７】
別の実施態様に従って、本発明は、カスパーゼ−９の発現に関連する疾患または状態を処置または防止する方法を提供する。特に、本発明は、発生異常、神経細胞死、平滑筋および心筋の変性、ならびにウイルス感染に関連する細胞死を処置または防止する方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、上記の疾患または状態に罹患する患者に、薬学的に受容可能な組成物を投与する工程を包含する。この薬学的に受容可能な組成物は、カスパーゼ−９の発現またはカスパーゼ−９の活性のいずれかを阻害する分子を含む。このような分子としては、カスパーゼ−９に特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体またはそれらのエピトープ、機能的なカスパーゼ−９  ｍＲＮＡの転写を妨げるようにカスパーゼ−９  ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、カスパーゼ−９発現を妨げるようにカスパーゼ−９  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ならびにカスパーゼ−９  ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
カスパーゼ−９のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列のいずれもが公知のものと仮定すると、上記で言及した種々のカスパーゼ−９のインヒビターの（ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでの）作製は、当業者の範囲内である。
【００２０】
本発明がより完全に理解されるされるように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示目的のみのためであり、そしていかようにも本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。
【００２１】
（実施例１）
（カスパーゼ−９欠損マウスの作製）
ヒトｃａｓｐａｓｅ−９  ｃＤＮＡを、Ｊｕｒｋａｔ細胞から、ｃａｓｐａｓｅ−９特異的プライマー（５’−ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  Ｃ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号２））を使用して、ＰＣＲによって増幅した。１２９ＳＶ／Ｊゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、このｃＤＮＡを用いてスクリーニングして、マウスｃａｓｐａｓｅ−９ゲノムクローンを得た。カスパーゼファミリーのメンバー間で保存されているペンタペプチドモチーフをコードする部分を含む８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。得られたプラスミドをＸｂａＩを用いて消化し、そして平滑化した。そのｎｅｏ遺伝子カセット［Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１５８４〜８８頁（１９９３）］のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをもまた平滑化し、そしてこのマウスｃａｓｐａｓｅ−９ゲノムフラグメントを含むプラスミドに連結した。次いで、このプラスミドをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そしてｔｋカセットベクター［Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、（１９９３）、前出］にサブクローニングした。得られたベクターは、図１Ａに示されるように、ｎｅｏ遺伝子カセットを含む。このｎｅｏ遺伝子は、活性ペンタペプチドモチーフ（ＱＡＣＧＧ）をコードする１．０ｋｂのＸｂａＩフラグメントに取って代わり、７ｋｂのｃａｓｐａｓｅ−９ゲノム配列に隣接する。
【００２２】
この構築物をＮｏｔＩによって線状化し、そしてＷ９．５  ＥＳ細胞にトランスフェクトした。Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性であるクローンを選択し、そして相同組換えをサザンブロッティングにより確認した。スクリーニングした３２個のクローンのうち１つが相同組換えについてポジティブであり、そしてこの構築物の単一の組み込みを、ｎｅｏ特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションによって確認した。
【００２３】
キメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞にこのクローンを注入することによって作製した。得られた雄のキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配させ、ヘテロ接合体マウスを得た。
【００２４】
このヘテロ接合体マウスの異種交配を行って、カスパーゼ−９欠損マウスを作製した。ヘテロ接合体マウスの異種交配は、スクリーニングしたマウスの総数の２％未満の頻度で、出生後のカスパーゼ−９  −／−マウスを生じたが、胚性日齢（Ｅ）１６．５までのそのノックアウト胚を、メンデル比で収集した（表１（下記）を参照のこと）。従って、ほとんどのホモ接合体マウスは、その周産期の間に死んだ。
【００２５】
表１．ヘテロ接合体交配から作製されたマウスの遺伝子型
【００２６】
【表１】
2002517202.tif 000001
出生前に、カスパーゼ−９  −／−胎児は、カスパーゼ−３ノックアウトマウス［Ｋ．Ｋｕｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８４、３６８〜７２頁（１９９６）］における観察と類似する、非常に反復性のＣＮＳ異常（例えば、過剰細胞充実性（ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）および心室肥大）を示した。興味深いことに、ヘテロ接合性マウスは、他の器官において、肉眼で観察できるいかなる異常をも示さなかった。出産を生き延びたまれなホモ接合体マウスは、もしあったとしても、その脳にほとんど微妙な差異しか有さなかった。本発明者らは、個々のマウスの遺伝学的バックグラウンドが、ｐ５３欠損マウス［Ｖ．Ｐ．Ｓａｈら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０、１７５〜８０頁（１９９５）］において観察されたのと同様に、出生後のカスパーゼ−９  −／−の表現型におけるこの変異性に影響したと考える。
【００２７】
（実施例２）
（ｃａｓｐａｓｅ−９  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析）
総ＲＮＡを、このカスパーゼ−９ノックアウトマウスの腎臓から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって単離した。５マイクログラムの総ＲＮＡを、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、逆転写させ、そして得られた鋳型を、以下を用いるＰＣＲ反応に供した：ｃａｓｐａｓｅ−９特異的プライマー（５’−ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＧ（配列番号４）、またはγアクチンに特異的なプライマー［Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０、１３６７〜７４頁（１９９４）］）。
【００２８】
インタクトなｃａｓｐａｓｅ−９  ｍＲＮＡがカスパーゼ−９  −／−マウスに存在しないことを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した（図１Ｂ）。
【００２９】
（実施例３）
（ノーザンブロット分析）
カスパーゼカスケードに関係する遺伝子のｍＲＮＡの発現を試験するために、ノーザンブロット分析を、野生型マウスの発生にわたって、ｃａｓｐａｓｅ−９に特異的なプローブ、ｃａｓｐａｓｅ−３に特異的なプローブ、およびａｐａｆ−１に特異的なプローブを用いて行った。
【００３０】
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ランダムにプライムされた（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ）ヒトｃａｓｐａｓｅ−９  ｃＤＮＡ、ハムスターｃａｓｐａｓｅ−３  ｃＤＮＡ［Ｗａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１５、１０１２〜２０頁（１９９６）］、またはヒトａｐａｆ−１  ｃＤＮＡを用いて、３７℃にてＥｘｐｒｅｓｓ−ｈｙｂ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で一晩ハイブリダイズさせた。このａｐａｆ−１  ｃＤＮＡは、ＨｅＬａ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ａｐａｆ−１特異的プライマー（５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＧＡ−３’（配列番号５）および５’−ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ
ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＡＡＧ−３’（配列番号６））を使用してＰＣＲによって増幅した。これらのブロットを、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを用いて室温で１時間、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを用いて５０℃で１時間洗浄した。次いで、これらのブロットを、Ｆｕｊｉ  ＢＡＳ−１５００バイオ画像分析機を用いて分析した。
【００３１】
図１Ｃに示されるように、ｃａｓｐａｓｅ−９  ｍＲＮＡは、Ｅ７と同じ程度早くに発現され、次いで、Ｅ１５の後にダウンレギュレートされる。対照的に、ｃａｓｐａｓｅ−３およびａｐａｆ−１の両方のｍＲＮＡは、アップレギュレートされ、これはＥ１１で始まり、そしてその後、安定に発現される。従って、３つすべての遺伝子が、一緒に発現される。そしてこれらは、Ｅ７の後に、機能性アポトーシス経路（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）を形成するようである。
【００３２】
（実施例４）
（組織学および免疫細胞化学）
４％パラホルムアルデヒド中に固定された胎児を、パラフィン中に包理し、そして１０μｍインクリメント試料（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）に切断した。冠状脳切片または水平身体切片を０．１％クレジル（ｃｒｅｓｙｌ）バイオレットを用いて染色した。半薄切片用に、胚を４％パラホルムアルデヒドおよび１．５％グルタルアルデヒド中に固定し、プラスチック中に包理し、そして連続する１μｍ切片を、１％トルイジンブルーを用いて染色した。
【００３３】
カスパーゼ−９  −／−マウスのニューロンの表現型は、中脳と菱脳との間の接合部の背側の神経管の閉鎖における欠損として、Ｅ１０．５になるや否や外見上明らかである（図２Ａおよび図２Ｂ）。Ｅ１３．５において（図２Ｃおよび図２Ｄ）、この背側の欠損は、なお明らかであるが、他のＣＮＳ構造（例えば、終脳および脊髄）においては、外見上は何の欠損も明らかではない。しかし、Ｅ１６．５まで（図２Ｅおよび図２Ｆ）、顕著な脳ヘルニアが存在し、脳全体が、菱脳のレベルを超えて、頭の外側に露出される。さらに、その突出した脳は、形態が、より大きくかつ変化されているようである。おそらく、これらの変化は、頭の標識点に関して脳の位置を変える。
【００３４】
このカスパーゼ−９  −／−  の組織学的切片の検査により、前脳および中脳における増殖性集団の広範な増大、ならびに脳室の狭窄が明らかになる。Ｅ１３．５において（図３Ａおよび３Ｂ）、視床はより大きく、そして側脳室および第３脳室は塞がれている。さらに、終脳壁（ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｗａｌｌ）において明らかな、不連続性および異所性が存在し、増殖性の心室領域および分裂後の皮質性板（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｌａｔｅ）は、完全に阻害され、そして陥入している（図３Ｃおよび図３Ｄ）。Ｅ１６．５まで、この脳の外見は、脳の頂部に突出した、拡大した中脳集団による終脳胞の変位によって顕著に変化している（図３Ｅおよび図３Ｆ）。カスパーゼ−９  −／−脳切片における黒い染色は、コントロールと比較して、より増殖性の細胞が存在することを示す。対照的に、脊髄の大きさおよび発達は、カスパーゼ−９  −／−マウスにおいて影響されないようであり、それは、他の非神経器官（例えば、心臓および肺）と同様である（図３Ｇおよび図３Ｈ）。
【００３５】
カスパーゼ−９  −／−前脳における、肉眼で見える構造変化の基礎となる機構を決定するために、本発明者らは、アポトーシスによって死ぬ細胞の発生に対するこのノックアウトの効果を試験した。Ｅ１０．５における水平半薄切片において（図４Ａおよび図４Ｂ）、拡大した終脳の上皮は、この変異体の脳室をわかりにくくする。さらに、正常な脳発達の間に通常観察されるピクノーゼの細胞が、カスパーゼ−９  −／−胚には存在しなかった。例えば、前脳の終板のピクノーゼのクラスターは、最終的には半球を分離する形態発生細胞死を示すが（図４Ｃおよび図４Ｄ）、これは、細胞の数の増加および細胞密度の増加に起因して、生じる板の厚化（ｔｈｉｃｋｅｒ）によって除去される。
【００３６】
（実施例５：ＴＵＮＥＬ染色）
ＤＮＡフラグメント化を検出するためのＴＵＮＥＬ染色について、４％のパラホルムアルデヒド固定化Ｅ１２の頭部を３０％スクロース中で凍結保護し、凍結し、そして水平に切り出した。凍結した２０μｍの水平脳切片を０．２６Ｕ／ｍｌ  ＴｄＴおよび１倍の供給緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに２０μＭのビオチン化−１６−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で、３７℃にて６０分間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３回洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％ＢＳＡを用いて３０分間ブロックした。次いで、この切片をＦＩＴＣ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ中１：１００で、３０分間インキュベートし、リンスし、次いで核染色ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。
【００３７】
Ｅ１２脳切片におけるＴＵＮＥＬアッセイの結果を図４Ｅに示す。本発明者らは、カスパーゼ−９ノックアクト体における脳の全体にわたって、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数における約１０倍の減少を測定した（図４Ｆ）。これらのデータは、カスパーゼ−９  −／−マウスにおける脳の先天異常が減少したアポトーシスに起因すること、そしてそれ故カスパーゼ−９が媒介するアポトーシスがインビボでの正常な脳の発生において重要であることを明らかに示す。
【００３８】
（実施例６：胸腺細胞を用いたアポトーシスアッセイ）
他の系におけるアポトーシス経路におけるカスパーゼ−９の役割を調べるために、本発明者らは、胸腺細胞の一次培養物を用いた。カスパーゼ−９  −／−動物由来の胸腺細胞は、胸腺細胞の数の差異またはＣＤ４、ＣＤ８もしくはＣＤ３のような表面マーカーの比率の差異がなく正常に発生した（データを示さず）が、本発明者らは、この胸腺細胞をいくつかのアポトーシス性刺激薬：デキサメタゾン、スタウロスポリン、および抗Ｆａｓ抗体を用いてチャレンジした。
【００３９】
胸腺細胞を、野生型マウスおよびカスパーゼ−９  −／−マウスから単離した。百万の細胞を、２μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１μＭのスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ）、１μｇ／ｍｌの抗マウスＦａｓ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）および３０ｍｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を用いてか、または１０％ＦＣＳ培地のみを用いて、６時間または２４時間処理した。サンプルをＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（Ｓｉｇｍａ）で染色し、ＦＡＣＳ  Ｓｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のためにアポトーシス細胞を標識した。
【００４０】
胸腺細胞生存の反応速度における差異は、野生型マウスとカスパーゼ−３  −／−マウスとの間に以前には観察されなかった（Ｋ．Ｋｕｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８４、３８６〜７２頁（１９９６））が、カスパーゼ−９  −／−胸腺細胞は、これらのアポトーシス誘導刺激に対する様々な応答を示した。カスパーゼ−９欠乏胸腺細胞は、デキサメタゾン誘導細胞死に対して抵抗性であった。カスパーゼ−９  −／−スタウロスポリン誘導胸腺細胞は、コントロールにおいて見られた死に匹敵する生存の減少を示した（図５）。さらに、ノックアウト胸腺細胞は、野生型細胞と同様の様式で、抗Ｆａｓ抗体の適用に応答してアポロトーシスを受けた。
【００４１】
（実施例７：ＤＮＡフラグメント化アッセイ）
ＤＮＡ単離キット（ＬｅＭａｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ＤＮＡを単離し、そして２％アガロースゲルでの電気泳動に供した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、そしてスキャナにより画像を得た。
【００４２】
カスパーゼ−９欠乏胸腺細胞は、デキサメタゾンでの処置の２４時間後でさえ、ＤＮＡラダーリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を受けなかった。スタウロスポリンに応答して、ＤＮＡラダーリングもまた取り除いた。さらに、ノックアウト胸腺細胞は、ＤＮＡラダーリングを受けた。
【００４３】
これらのデータは、カスパーゼ−９がデキサメタゾン誘導細胞死に必要であり得るが、他の機構がスタウロスポリンおよびＦａｓ死の経路を媒介することを示唆する。従って、異なる傷害は、同じ細胞型においてさえ、別々のアポトーシス性経路を用いるようである。しかし興味深いことに、カスパーゼ−９  −／−胸腺細胞は、継続的なデキサメタゾンおよびスタウロスポリン処理の３６および４８時間後に、それらのＤＮＡを切断し始めた（データは示さず）。このことは、長期の傷害が結局、カスパーゼ−９の欠損により課せられるＤＮＡラダーリングに対する障壁をバイパスし得ることを示す。
【００４４】
（実施例８：カスパーゼ−３の切断アッセイ）
カスパーゼ−９欠損の機能的因果関係を調べるために、本発明者らは、カスパーゼ−３のような下流カスパーゼの活性化をアッセイするインビトロ方法を用いた。
【００４５】
全長のヒトｃａｓｐａｓｅ−３  ｃＤＮＡを、ＴＮＴクイック結合化転写／翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）および35Ｓメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、転写しそして翻訳した。組換えカスパーゼ９を作製するために、全長のｃａｓｐａｓｅ−９  ｃＤＮＡを同じ系を用いて翻訳した。Ｓ−１００サイトゾル画分を、Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ、８６、１４７〜５７頁（１９９６）によって記載されるように得た。インビトロで翻訳したカスパーゼ−３のアリコートを、シトクロムｃもしくはｄＡＴＰを伴うかまたは伴わないさらなる１ｍＭのＭｇＣｌ2の存在下で、２０μｇのＳ−１００のサイトゾル画分とともに、最終容量２０μｌにおいて３０℃で１時間インキュベートした。カスパーゼ−９活性の再構成のために、５μｌの翻訳反応物または網状赤血球溶解物をその反応物に添加した。インキュベーション終了時に、７μｌの４×ＳＤＳサンプル緩衝液を、各反応物に添加し、そしてサンプルを１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてホスホイメージングプレートに曝露し、そしてＦｕｊｉ  ＢＡＳ−１５００  ｂｉｏ−ｉｍａｇｅ分析機により分析した。
【００４６】
野生型Ｓ−１００サイトゾル画分は、カスパーゼ−３を切断し得たが、一方、カスパーゼ−９  −／−細胞から単離されたサイトゾル画分は、カスパーゼ−３を切断し得なかった（図５Ａ）。これらのデータは、カスパーゼ−９が活性化経路の上流に必要なカスパーゼであること、および本発明者らがカスパーゼ−９  −／−動物において観察した表現型が、カスパーゼ−３のような下流カスパーゼの活性化の欠損に起因することを実証する。
【００４７】
さらに、インビトロで翻訳されたカスパーゼ−９の、カスパーゼ−９  −／−脳細胞からのＳ−１００サイトゾル抽出物への添加は、カスパーゼ−３を切断する能力を再構成した。このことは、他の全ての必要な要素が、カスパーゼ−９  −／−細胞中に存在することを示唆する（図５Ｂ）。
【００４８】
そして、興味深いことに、以前の報告（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ、８６、１４７〜５７頁（１９９６））とは対照的に、下流カスパーゼを切断し得るコントロール細胞からの溶解物は、さらなるｄＡＴＰを必要としなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。このことは、本発明者らが使用した組織における細胞内ｄＡＴＰ濃度がＡｐａｆ−１を活性化するのに十分に高かったこと、およびシトクロムｃの放出が活性化プロセスの開始に必要な要素であることを示唆する。
【００４９】
カスパーゼ−９  −／−脳溶解物においてインビトロでカスパーゼ−３の切断がないことは、変異体における脳の先天異常が、インビボでの譲歩したカスパーゼ−３依存性アポトーシス経路により引き起こされ得ることを示唆した。この可能性を試験するために。本発明者らは、活性化カスパーゼ−３のみを認識する、カスパーゼ−３のｐ２０サブユニットに特異的な抗体（ＣＭ１）を用いて、カスパーゼ−３のインビボでの活性化を調べた。Ｅ１２．５日胚をブワン溶液中で固定し、３０％スクロース中で凍結保護し、次いで水平に切片化した。
【００５０】
Ｅ１２．５野生型胚およびヘテロ接合胚において、活性化カスパーゼ−３についての陽性染色は、外胚葉表面において見出され、そして発生している神経系全体にわたって散発的に分布した（図６Ａ）。高い倍率下では、活性カスパーゼ−３の染色が、細胞質および凝縮した核の両方において存在した（データは示さず）。対照的に、ＣＭ１陽性細胞がカスパーゼ−９  −／−胚の髄膜、および外胚葉表面において見られたが、神経組織内ではそのような染色が見られなかった（図６Ｂ）。従って、これらの結果は、カスパーゼ−９は上流にあり、そして発生している神経系におけるインビボでのカスパーゼ−３の活性化に重要であることを示す。
【００５１】
本発明者らは、本発明の多くの実施態様を記載しているが、本発明者らの基本的な構成は、本発明の産物、処理および方法を利用する他の実施態様を提供するために変更され得ることが理解される。従って、本発明の範囲は、実施例により示される特定の実施態様によるよりもむしろ、添付の特許請求の範囲により規定されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１のパネルＡは、非機能的なカスパーゼ−９遺伝子を作製するためのクローニング戦略を示す。
【図１Ｂ】
図１のパネルＢは、カスパーゼ−９ノックアウトマウス、およびカスパーゼ−９に特異的なプライマーを用いてプライムした野性型マウスもしくはアクチンに特異的なプライマーを用いてプライムした野性型マウスに由来の、逆転写ＰＣＲによって増幅させたｍＲＮＡの電気泳動を示す。
【図１Ｃ】
図１のパネルＣは、異なる齢の野生型マウス胚に由来する総ｍＲＮＡを、カスパーゼ−９特異的プローブ、カスパーゼ−３特異的プローブ、およびａｐａｆ−１特異的プローブを用いてプローブしたノーザンブロットを示す。
【図２】
図２は、Ｅ１０．５（パネルＡおよびＢ）、Ｅ１３．５（パネルＣおよびＤ）およびＥ１６．５（パネルＥおよびＦ）でのカスパーゼ−９  ＋／−マウス胚およびカスパーゼ−９  −／−マウス胚におけるニューロン表現形を示す。
【図３】
図３は、Ｅ１３．５でのカスパーゼ−９  ＋／−マウス胚およびカスパーゼ−９  −／−マウス胚からのＮｉｓｓｌ染色した脳の切片（パネルＡおよびＢ）、同じ切片のより高い倍率（パネルＣおよびＤ）；Ｅ１６．５でのカスパーゼ−９
＋／−マウス胚およびカスパーゼ−９  −／−マウス胚からのＮｉｓｓｌ染色した脳の切片（パネルＥおよびＦ）、ならびにＥ１６．５でのカスパーゼ−９  ＋／−マウス胚およびカスパーゼ−９  −／−マウス胚からの脊髄の切片（パネルＧおよびＨ）を示す。
【図４】
図４は、Ｅ１０．５でのカスパーゼ−９  ＋／−マウス胚およびカスパーゼ−９  −／−マウス胚の前脳の半薄（ｓｅｍｉ−ｔｈｉｎ）Ｎｉｓｓｌ染色した水平切片（パネルＡおよびＢ）を示す。パネルＡおよびＢ内の囲み領域のより高い倍率を、パネルＣおよびＤに示す。パネルＥは、Ｅ１２でのカスパーゼ−９  −／−マウス胚のＴｕｎｅｌ染色の水平脳切片を示す。パネルＦは、カスパーゼ−９  ＋／−胚およびカスパーゼ−９  −／−胚におけるＴＵＮＥＬ+細胞の分布を示す。図５は、カスパーゼ−９  ＋／−胸腺細胞およびカスパーゼ−９  −／−胸腺細胞の、培地単独（「ＭＥＤ」）、２μＭ  デキサメサゾン（ＤＥＸ）、１μＭ  スタウロスポリン（「ＳＴＡ」）または１μｇ／ｍｌ  抗マウスＦａｓ抗体＋３０ｍｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（「ＦＡＳ」）の存在下での６時間後（パネルＡ）または２４時間後（パネルＢ）の生存％を示す。上記に記載したように処理した胸腺細胞から単離したゲノムＤＮＡを、パネルＣおよびＤに示す。
【図５Ａ】
図５のパネルＡは、ｄＡＴＰおよび／またはシトクロムＣの存在下または非存在下でのカスパーゼ−９  ＋／＋  Ｅ１５．５およびカスパーゼ−９  −／−の胚の脳または胸腺細胞からのＳ−１００サイトゾル画分で処理した、35Ｓ−メチオニン標識したカスパーゼ−３のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図５Ｂ】
図５のパネルＢは、ｄＡＴＰ、シトクロムＣおよび／またはインビトロで転写されそして翻訳されたカスパーゼ−９の存在下または非存在下でのカスパーゼ−９  −／−  Ｅ１５．５の胚の脳からのＳ−１００サイトゾル画分で処理した、35Ｓ−メチオニン標識したカスパーゼ−３のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図６】
図６は、活性化カスパーゼ−３に特異的な抗体で染色した、カスパーゼ−９  ＋／＋（パネルＡ）または−／−（パネルＢ）のＥ１２．５胚からの脳の切片を示す。
【００５２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Vertex Pharmaceuticals, Inc.
Yale University
<120>  CASPASE-9 DEFICIENT ANIMALS AND THE USE THEREOF
<130>  F1-0048P40
<140>  JP 2000-552291
<141>  1999-05-28
<150>  US 60/087,711
<151>  1998-06-02
<160>  7
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400>  1
atggacgaag cggatcggcg gc                                            22
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400>  2
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<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400>  3
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<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400>  4
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<210>  5
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<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400>  5
gggaagatgg atgcaaaagc tcga                                          24
<210>  6
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide primer
<400> 6
atggctgcaa ttcttctctg taag                                          24
<210>  7
<211>  5
<212>  PRT
<213>  mammalian
<220>
<221>  UNSURE
<222>  (4)
<223>  X is arginine or glycine
<220>
<221>  DOMAIN
<222>  (1)..(5)
<223>  Pentapeptide motif common to all known caspases
<400>  7
Gln Ala Cys Xaa Gly
1               5