【手続補正書】
【提出日】平成18年1月12日(2006.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において遺伝子産物の不所望なアイソフォームがなく、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸に哺乳類細胞を曝露すること（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分は、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している）；および
（ｂ）該哺乳類細胞に、該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有している）、
を含む方法。
【請求項２】
該共通核酸配列が少なくとも１９の連続ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該共通核酸配列が、該細胞中の該遺伝子産物の全内在性アイソフォームで共通する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該核酸の２本鎖部分が、該共通核酸配列に対して１００％同一である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該核酸が１９から２５ヌクレオチド長である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸が、少なくとも１９ヌクレオチドの２本鎖部分、および少なくとも１つの２ヌクレオチド１本鎖３’オーバーハングを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該所望のアイソフォームが、該核酸の該２本鎖部分に対する２以上のミスマッチを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームをコードする内在性配列とは異なる少なくとも１つのコドンを用いて、該所望のアイソフォームをコード化する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームをコードする対応する内在性配列とは異なる２つのコドンを用いて、該所望のアイソフォームをコード化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該所望のアイソフォームが、対応する内在性アイソフォームに対して同一のタンパク質配列を有する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該所望のアイソフォームが、細胞中の変異型アイソフォームと取って代わる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該変異型アイソフォームが、発癌性、アポトーシス性、腫瘍抑制性、炎症誘導または抑制性、または血管新生性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該所望のアイソフォームの機能を決定することをさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該細胞が癌細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該細胞が、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、およびＭＣＦ−７からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該所望のアイソフォームが、内在性プロモーターの制御下で転写される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した構造プロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した誘導可能なプロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した組織特異的プロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞において遺伝子産物の不所望のアイソフォームがなく、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる試薬を含むキットであって、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸、そして該２本鎖部分が、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を含むキット。
【請求項２１】
請求項１〜１９に記載の方法のいずれかにより達成される、アイソフォーム特異的発現を示す哺乳類細胞。
【請求項２２】
疾病を処置する方法であって、処置の必要な対象に、有効量の、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分が、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ａ）少なくとも１つの核酸（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分は、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する）に、哺乳類細胞を曝露すること；
ｂ）該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームが、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）に、該哺乳類細胞を曝露すること；
ｃ）該所望のアイソフォームが存在しない場合と比較して、該哺乳類細胞の表現型を同定すること、および
ｄ）該所望のアイソフォームに該表現型または機能を決定すること、
を含む、所望のアイソフォームに機能を決定する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ｄｓＲＮＡ仲介性ｍＲＮＡ分解の無細胞システムを用いて、ｄｓＲＮＡと同一の領域を含むショウジョウバエの胚細胞抽出物において、ｍＲＮＡが切断されることが示された（Zamore et al., 2000）。しかしながら、虫およびハエでのＲＮＡｉの効果は、ｄｓＲＮＡが触媒様に作用し、かつ／または増幅されることを示す（Zamore, 2001, Nature Structural Biology 8, 746-750）。C. elegansにおいて、ｓｉＲＮＡは内在性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで複製されないと説示されたが、現在では、C.elegansおよびショウジョウバエの両方で、ｓｉＲＮＡが実際に細胞ポリメラーゼのプライマーとして働き、伸長してｄｓＲＮＡを形成するという、モデルを支持するデータが存在する（Lipardi et al., 2001, Cell 107, 297-307; Sijen et al., 2001, Cell 107, 465-476; Nishikura, 2001, Cell 107, 415-418）。この方法におけるｍＲＮＡの他の領域へのＲＮＡｉの伝搬は、関係配列への遺伝子サイレンシングの広がりを生じ、これにより、アイソフォーム特異的ｄｓＲＮＡの阻害が不可能となる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
発明の要約
本発明は、細胞において遺伝子産物の不所望なアイソフォームがなく、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法を提供し、これは、
（ａ）少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸（該２本鎖部分は、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは１００％の配列同一性を有している）を含む少なくとも１つの核酸に、哺乳類細胞を曝露すること；および
（ｂ）該哺乳類細胞に、遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（核酸は、細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対して１以上のミスマッチを含む配列を有する所望のアイソフォームをコード化している）の段階を含む。好ましくは、共通核酸配列は、少なくとも１９の連続ヌクレオチド長であり、かつ課題とする細胞中の遺伝子産物の全内在性アイソフォームに共通する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
該核酸は、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長であり、該核酸の２本鎖部分は、好ましくは、共通核酸配列に対して１００％同一である。特に、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド、より好ましくは１９ヌクレオチドの２本鎖部分を含有し、かつ少なくとも１つの、２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハング、好ましくは、上方鎖および下方鎖が共に２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハングを有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡ特性の核酸が所望のアイソフォームの発現に影響しないことを確実にするために、所望のアイソフォームは、核酸の２本鎖部分に対して少なくとも１つのミスマッチを含む配列によりコード化される。それゆえ、変更されたコード配列が所望の産物をコード化している限り、所望のアイソフォームは、核酸の２本鎖部分に対して１、２またはそれ以上のミスマッチを有する配列によりコード化され得る。従って、所望のアイソフォームをコード化する少なくとも１つのコドン（例えば、２以上）は、同じ位置で内在的に用いられたコドンとは異なり得る。多くのアミノ酸が１以上のトリプレットコドンで表されることは、当該技術分野においてよく知られている。アイソフォーム配列に対するアミノ酸置換、欠損、または付加、特に保存的置換が許容されるが、好ましくは、所望のアイソフォームは、対応する内在性アイソフォームと同一のタンパク質配列を有する（内在性変異型アイソフォームを矯正するために、内在性野生型配列が用いられない場合は、野生型配列が用いられる）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
発明の詳細な説明
該広範な観点において、本発明は、少なくとも１つの核酸に哺乳類細胞を曝露すること（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分は、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している）；および哺乳類細胞に、遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（該所望のアイソフォームは、該細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有している）により、細胞において遺伝子産物の不所望のアイソフォームがなく、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
核酸は、典型的には、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する２本鎖形のリボ核酸（ＲＮＡ）である。阻害に好ましいＲＮＡ分子は、少なくとも１５〜２５連続塩基、好ましくは、少なくとも１９連続塩基の遺伝子産物の２以上のアイソフォームで共有される共通核酸配列と同一の配列を含む。好ましくは、該共通核酸配列は、課題とする細胞により発現される全内在性アイソフォームで共通する。ＲＮＡ配列は、好ましくは、エクソン配列と同一性を有するように選択される。ＲＮＡの２本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が阻害の標的とされる配列特異的方法で、遺伝子発現は阻害される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
細胞への核酸の十分な送達を可能とするため、および細胞の任意のタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）応答を回避するため、核酸は典型的に比較的短い。または、ｄｓＲＮＡに対する非特異的細胞応答を回避する別の方法、またはより有効な送達方法が用いられ得る。従って、該核酸は少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡ特性であり、そして典型的には１８から２５ヌクレオチド長である。該２本鎖ＲＮＡ特性は、２以上のアイソフォームの所望の遺伝子により共有される共通核酸配列に対して、好ましくは１００％同一である、少なくとも１８ヌクレオチド長、好ましくは１９ヌクレオチド長の配列により与えられる。好ましい実施態様において、該核酸は、少なくとも１つに２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハング、好ましくは、上方鎖および下方鎖が共に２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハングを含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡは、自己相補的ＲＮＡ鎖（例えば、相対する繰り返しを有する転写物）により、または２以上の相補的ＲＮＡ鎖により形成され得る。該ＲＮＡ２本鎖形成は、細胞内または外のいずれかで開始される。該ＲＮＡは、適用に依存して、細胞当たり少なくとも１コピー、好ましくは、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００コピーの送達を可能とする量で導入される。該導入量は所望の効果に依存し、そして経験上容易に決定され得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
非経腸投与用の医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射用の本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または、生理食塩水の様な生理的に両立性のバッファー中で製剤される。水性注射用懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランの様な、懸濁剤の粘性を増す物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として製造され得る。適当な親油性溶媒または賦形剤は、ゴマ油の様な脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドの様な合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。必要に応じて、該懸濁剤は、高濃縮溶液の製造を可能とするために、安定剤、または化合物の溶解性を増す薬品も含有し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
次の２１ｍｅｒのオリゴリボヌクレオチド対を、ｓｉＲＮＡとして用いた：ｎｔ６７７〜６９７（ＰＴＢドメイン中）由来のｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡ、５’−ＣＵＡ  ＣＵＵ  ＧＧＵ  ＵＣＧ  ＧＵＡ  ＣＡＵ  ＧＧＧ−３’（配列番号：１）および５’−ＣＡＵ  ＧＵＡ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＧＵＡ  ＧＧＡ−３’（配列番号：２）。該配列は、ヒトｐ６６ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの配列（受託番号：ＨＳＵ７３７７）由来であり、そしてその相補体およびそれぞれの対は、各部位で２ｎｔの３’オーバーハングを有する。設計したＲＮＡオリゴヌクレオチドを、データベース（ＧＥＭＢＬ）で検索し、遺伝子特異性を確かめた。該ＲＮＡオリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Balgach, Switzerland）から入手した。Elbashir et al.（2001, Nature 411, 494-498）に従い、アニーリングを行った。アニーリングバッファー（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）２００μｌ中の相補的な２つの鎖（各２０μＭ）を、９０℃で１分間温め、続いて３７℃で１時間インキュベートした。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ）のヌクレオチド７５３〜７７３に対応するｓｉＲＮＡを、負の対照として用いた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
本実施例は、ｐ６６ＳｈｃＡアイソフォームに限定したｐ６６−ｓｃｈ  ｓｉＲＮＡの効果により、ｓｉＲＮＡの効果の特異性を例示する。ｐ６６およびｐ５２／ｐ４６  ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ部位の３’領域のほとんどで配列同一性を有するが、ｐ５２／ｐ４６  ＳｈｃＡの発現は影響を受けなかった。このことは、サイレンシングシグナルが、哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡに対するｍＲＮＡ３’領域に伝搬しないことを示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
実施例１で既に示した様に、ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡは、内在性ＳｈｃＡの３つのアイソフォーム全てをほぼ完全にノックダウンした。個々のアイソフォームの変異体発現ベクターで３つの細胞をトランスフェクションし、対応するアイソフォームのみ発現させた。野生型発現ベクターでトランスフェクションされた細胞において、タンパク質はほとんど検出されなかった。このことは、ｓｉＲＮＡがベクターにより発現した内在性ＳｈｃＡで作用することを示している。ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしていない細胞は、発現ベクター中の変異の存在または非存在には関係しないＳｈｃＡアイソフォームを、上昇したレベルで発現する。対照的に、ｓｉＲＮＡは変異配列では作用せず、これにより任意のＳｈｃＡアイソフォームのアイソフォーム特異的発現が可能となる。ｐ６６ＨＡ−ＭＬ−ｓｍでトランスフェクションした細胞は、ｐ６６のみの特異的発現を明確に示し、一方ｐ４６ＨＡ−ｓｍおよびｐ５２  ＨＡ−ＭＬ−ｓｍでは、それぞれｐ４６およびｐ５２のみの発現を生じた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本実施例において、各アイソフォームの野生型ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡおよび変異型ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの中央に位置するｓｉＲＮＡ認識部位の２つのヌクレオチド以外、同一である。該２つのヌクレオチド変化は、所望のアイソフォームの発現に対するｓｉＲＮＡの影響を回避するのに十分であった。サイレンシングシグナルがｓｉＲＮＡの５’または３’のいずれかに広がると、該配列の少なくともいくつかが同一であるため、野生型および変異型ｍＲＮＡ由来のＳｈｃＡ発現が抑制される。野生型ｍＲＮＡ由来だが、変異型ｍＲＮＡ由来ではない発現が抑制された。このことは、ｓｉＲＮＡ仲介性ｍＲＮＡ分解のストリンジェントな特異性、および哺乳類細胞においてＲＮＡｉの伝搬がないことを強く示す。これは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより合成された高分子量ｄｓＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉの中間体であり、ｓｉＲＮＡの効果を増幅し、そして維持すること（これはｓｉＲＮＡからのサイレンシングシグナルの５’方向への広がりを示している）を示した昆虫無細胞システム（Lipardi et al., 2001, Cell  107, 297-307）、およびC. elegans（Sijen et al., 2001, Cell  107, 465-476）の結果と全く対照的である。増幅が哺乳類細胞におけるサイレンシングでも含まれるなら、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドのみが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプライマーとして働き、従って、遺伝子ダウンレギュレーションが十分となるはずである。我々は、アンチセンスＲＮＡがサイレンシングに含まれないことを見出した。