【手続補正書】
【提出日】平成18年1月11日(2006.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  Ｒ６５ＬとＡ４８６Ｖの二重変異またはＲ６５ＬとＡ１４２とＡ４８６Ｖの三重変異を有するＧＲＫ４タンパク質をコードする単離され精製された核酸。
【請求項２】  Ｒ６５Ｌ変異、Ａ１４２Ｖ変異、Ａ４８６Ｖ変異、Ｒ６５ＬとＡ１４２Ｖの二重変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６の二重変異またはＲ６５ＬとＡ１４２とＡ４８６Ｖの三重変異をコードする配列を有するＧＲＫ４遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】  ＧＲＫ４遺伝子のエキソン３、５、８、１４または１６にハイブリダイズし、そして、該遺伝子のヌクレオチド４３１−５０３（エキソン３）、５９４−６９７（エキソン５）、８５７−９９５（エキソン８）、１６６２−１７９８（エキソン１４）または１９３７−１９９１（エキソン１６）を含むＤＮＡ配列を増幅するのに有用であるオリゴヌクレオチド・プライマー。
【請求項４】  本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって、
ＧＲＫ４またはその断片をコードする核酸を、該個体から、細胞中でドーパミン作動性シグナルを適切に形質導入しないでＧＲＫ４遺伝子が発現されるようにするＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異について、分析すること（なお、ＧＲＫ４遺伝子の該多形性または変異の存在は、本態性高血圧症の素因についての指標である）、
を含む方法。
【請求項５】  ＧＲＫ４遺伝子の該多形性または変異が、ＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異を含有する該細胞におけるＤ１受容体／アデニリルシクラーゼ共役欠損を起す、請求項４の方法。
【請求項６】  ＧＲＫ４遺伝子の該多形性または変異が、ＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異を含有する該細胞におけるＤ１受容体／Ｇタンパク質共役欠損を起す、請求項４の方法。
【請求項７】  該核酸がＤＮＡである、請求項４の方法。
【請求項８】  該核酸がＲＮＡである、請求項４の方法。
【請求項９】  該核酸がゲノムＤＮＡである、請求項４の方法。
【請求項１０】  分析される核酸がｃＤＮＡである、請求項４の方法。
【請求項１１】  ＧＲＫ４をコードする核酸の断片を分析する、請求項４の方法。
【請求項１２】  Ｒ６５Ｌを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項４の方法。
【請求項１３】  Ａ１４２Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項４の方法。
【請求項１４】  ＧＲＫ４核酸を変異Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項１５】  Ｒ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項４の方法。
【請求項１６】  Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項４の方法。
【請求項１７】  Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２、Ａ４８６Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項４の方法。
【請求項１８】  該分析がＰＣＲでなされる、請求項４の方法。
【請求項１９】  本態性高血圧症に関連するＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異を検出する方法であって、
ＧＲＫ４をコードする核酸を、高血圧の個体から、ＧＲＫ４遺伝子の多形性のまたは変異された形態の存在について分析すること、
を含む方法。
【請求項２０】  急性または慢性のナトリウム負荷を排泄する能力の低下の素因を有する個体を同定する方法であって、
ＧＲＫ４をコードする核酸を、該個体から、細胞中でドーパミン作動性シグナルを適切に形質導入しないでＧＲＫ４遺伝子が発現されるようにするＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異の存在について、分析すること（なお、ＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異の存在は、急性または慢性のナトリウム負荷を排泄する能力の低下の素因についての指標である）、
を含む方法。
【請求項２１】  ナトリウム停留または血圧上昇の素因を有する個体を同定する方法であって、
ＧＲＫ４をコードする核酸を、該個体から、細胞中でドーパミン作動性シグナルを適切に形質導入しないでＧＲＫ４遺伝子が発現されるようにするＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異の存在について、分析すること（なお、ＧＲＫ４遺伝子の多形性または変異の存在は、ナトリウム停留または血圧上昇の素因についての指標である）、
を含む方法。
【請求項２２】  Ｒ６５Ｌを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】  Ａ１４２Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２４】  ＧＲＫ４核酸を変異Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２５】  Ｒ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２６】  Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２７】  Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２、Ａ４８６Ｖを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【請求項２８】  Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２およびＡ４８６Ｖの少なくとも１つを含有するＧＲＫ４をコードするＧＲＫ４多形性についてＧＲＫ４核酸を分析する、請求項２０または２１の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
２つのＤ１様受容体：各々げっ歯類のＤ１ＡおよびＤ１Ｂとして知られている。２つの付加的Ｄ１様受容体、Ｄ１ＣおよびＤ１Ｄは、非哺乳類において発現する。Ｄ１様受容体はアデニリルシクラーゼの刺激に関係している。Ｄ１Ａ受容体はまた、ホスホリパーゼＣ活性を刺激するが、アデニリルシクラーゼの刺激に対して補助的である。Ｄ１様受容体は、まだクローン化されてなく、百日咳毒素非感受性のＧタンパク質、Ｇｑを通してホスホリパーゼＣ(ＰＬＣ)に結合し、Ｄ１およびＤ５受容体とは異なるようである(Jose et al, Pharmac. Ther. 80:149-182(1998)。３つのＤ２様受容体は哺乳動物において発現する：Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体である。Ｄ２様受容体はアデニリルシクラーゼおよびＣａ2+チャネルの阻害に関連する。Ｄ２およびＤ３受容体はＮＧ１０８−１５細胞における電位依存性カリウム電流を減少すると報告されているが、Ｄ２様受容体はまたＫ＋チャネルを刺激する。シナプス前神経に存在するＤ２およびＤ３受容体の両方がまた、ドーパミンおよびノルエピネフリン両方の放出を減少するのに役立ち得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の実際上の態様は、３つの基本的領域、つまり診断、薬剤の発見、治療に分類される。従って、本発明の第１の態様は、本態性高血圧にかかりやすい個体を同定する方法に関する。該方法は、個体から単離したＤ１受容体およびＧＲＫ４を発現する腎臓細胞のサンプルを用いて行い得る。該方法において、細胞をアッセイして、例えばリン酸化またはパルミトイル化などのＤ１受容体の翻訳後修飾の範囲を測定する。正常血圧者から単離した細胞に関する受容体の翻訳後修飾の変化は、本態性高血圧の素因を示唆している。別法として、ＧＲＫ遺伝子またはその断片を分析して、本態性高血圧に関連のＧＲＫ４を検出するために、核酸サンプルを個体から単離する。本発明において本態性高血圧に関連するとして同定した具体的な変異体には、次のものが含まれる：Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、Ａ４８６Ｖ、２つ二重変異体Ｒ６５ＬとＡ４８６ＶおよびＲ６５ＬとＡ１４２Ｖおよび３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖ。本態性高血圧に関連の他の変異体ＧＲＫ４をさらに同定することは、単に、本態性高血圧と診断された個体から単離したＧＲＫ４を分析し、ＧＲＫ４遺伝子の配列を分析することにより行い得る。さらに本発明において、非腎臓細胞におけるこれらのＧＲＫ４の発現により、これらの非腎臓細胞がドーパミン作動性シグナルを“適切に”（例えば、正常に）形質導入し得ないことが明らかになった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
いかなる特定の作用理論にも拘束されるわけではないが、出願人の考えでは、ヒト被験者において腎欠陥は高血圧のなんらかの原因であり、ＧＲＫ４変異は特に、Ｄ１受容体の直接または間接のリガンド非依存性セリン過剰リン酸化を引き起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複合体の結合をはずす。結果、ドーパミンのナトリウム利尿作用が低下され、腎臓がナトリウムと水分の適切な平衡を保てなくなり、ナトリウムの滞留と血圧の上昇をもたらす。特に、正常血圧の被験者からではなく、高血圧の被験者から得た近位尿細管は、ドーパミンＤ１受容体のアデニリルシクラーゼによる欠損結合を示す。欠損結合はＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化に関連する。出願人は、少なくとも６つの変異をキナーゼ型４(ＧＲＫ４)関連Ｇタンパク質に発見し、該遺伝子は高血圧の被験者におけるＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化を調節する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＧＲＫ４のｍＲＮＡ発現の変化は、当分野で既知の方法で検出できる。これらは、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。減少したｍＲＮＡ発現は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化は、また野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化に関するスクリーニングにより検出できる。例えば、ＧＲＫ４に免疫反応性のモノクローナル抗体は、組織のスクリーニングに使用できる。同源抗原の欠失は、ＧＲＫ４遺伝子変異を示す。変異対立遺伝子に特異的な抗体は、また変異ＧＲＫ４遺伝子生産物の検出にも使用する。このような免疫学的アッセイは、当分野で既知の簡便な形態で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。変化したＧＲＫ４を検出する任意の手段を野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化の検出に使用できる。変異ＧＲＫ４遺伝子産物の発見は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
出願人は、上記の６個のＧＲＫ４変異体以外のＧＲＫ４変異体が、本態性高血圧症に関連することを推測する。このような変異体のインビトロでの同定は、変異体挿入のＤ１受容体含有細胞がドーパミン作動性シグナルを伝達し得なくする変異体の能力を測定することによりなされる。このことは、ドーパミン受容体がＧタンパク質ユニットの活性化をしないか、またはナトリウム輸送体を阻害するために必要な細胞質性二次メッセンジャーの産生をしないことを意味する。ドーパミン作動性シグナルを形質導入できないことは、特に、Ｄ１受容体／アデニリルサイクラーゼ(ＡＣ)またはＧタンパク質結合欠陥、および上記のタイプの翻訳後修飾でとりわけ明白である。これらの減少の測定は、ドーパミンまたはそのアゴニストの刺激に対する能力：(ａ)アデニリルサイクラーゼ活性またはｃＡＮＰ産生または活性化タンパク質キナーゼＡ、(ｂ)活性化ホスホリパーゼＣまたは活性化タンパク質キナーゼＣ、(ｃ)ホスホリパーゼＡ２活性および(ｄ)Ｇ−タンパク質活性またはナトリウム／水素交換体またはナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅのようなナトリウム輸送タンパク質の阻害の測定で行える。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
抗高血圧症特性を有すると推定される物質または薬剤は、物質または薬剤のＧＲＫ４システムへの添加によるＧＲＫ４の立体配座または活性の変化の測定により同定し得る。ＧＲＫ４活性は、アデニリルシクラーゼ活性の測定のように間接的に、または培養に添加したリン酸化可能な物質のリン酸化の程度の測定のように直接的に測定し得る。ＧＲＫ４活性化または不活性化変異体、例えば、各々ＧＲＫ４活性の増加またはＧＲＫ４活性の減少を導くＧＲＫ４の変異体または多形性は興味深い。ＧＲＫ４活性の変化は、Ｄ１受容体により例示されるＧタンパク質結合受容体の機能の変化を導くことができる。ＧＲＫ４は、レニン−アンギオテンシン系、カリクレイン−キニン、エンドセリン、房および脳のナトリウム排泄増加性ペプチド、セロトニン、バソプレッシン、カルシウム検出受容体および上皮ナトリウムチャンネルのような本態性高血圧症に関与する他のタンパク質の機能を調節し得る。