【手続補正書】
【提出日】平成17年10月20日(2005.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  特許請求の範囲【請求項１】  細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップを含む、方法。【請求項２】  細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、前記細胞が、前記遺伝子の一つのアレルに、物理化学的変異原により誘導された変異を含有し、前記方法が、前記遺伝子の第二アレルが挿入により変異するように、前記細胞を挿入変異原に曝すステップを含む、方法。【請求項３】  細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、前記細胞が、前記遺伝子の一つのアレルに、挿入変異原により誘導された変異を含有し、前記方法が、前記遺伝子の第二アレルが物理化学的に変異するように、前記細胞を物理化学的変異原に曝すステップを含む、方法。【請求項４】  物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法が同時に適用される、請求項１に記載の方法。【請求項５】  物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法が順に適用される、請求項１に記載の方法。【請求項６】  前記挿入変異原により前記遺伝子を特定するステップを更に含む、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。【請求項７】  所望の表現型について前記細胞をスクリーニングするステップと、挿入変異原により、前記表現型と相関する変異遺伝子を特定するステップとを更に含む、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。【請求項８】  細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させる方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、  前記２つ以上の遺伝子が物理化学的に変異又は挿入により変異するが、前記２つ以上の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子は挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップを含む、方法。【請求項９】  細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させる方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、前記方法が、充分な数の遺伝子が物理化学的に変異して前記表現型を生じるように前記細胞に物理化学的変異誘発法を行うステップを含み、前記細胞が、前記表現型を生じるのに必要な、前記遺伝子のうちの少なくとも１つの挿入変異を含有する、方法。【請求項１０】  細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させ、前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを特定する方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、前記方法が、充分な数の遺伝子が物理化学的に変異して前記表現型を生じるように前記細胞に物理化学的変異誘発法を行うステップであって、前記細胞が、前記表現型を生じるのに必要な、前記遺伝子の少なくとも１つの挿入変異を含有する、ステップと、前記挿入変異原により、少なくとも１つの挿入変異した遺伝子を特定するステップと、を含む、方法。【請求項１１】  前記挿入変異原により前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを特定するステップを更に含む、請求項８乃至１０のいずれかに記載の方法。【請求項１２】  前記挿入変異原により、挿入変異した細胞を選抜するステップを更に含む、請求項１乃至５及び８乃至１０のいずれかに記載の方法。【請求項１３】  前記物理化学的変異原が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラー・プローンDNA複製たんぱく、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、エチルメタンスルホネート（EMS）及びICR191、から成る群より選択される、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項１４】    前記エラー・プローンDNA複製たんぱくがエラー・プローンDNAポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。【請求項１５】  前記挿入変異原が、以下の多重クローニング部位：転写終了部位、転写調節配列、翻訳シグナル配列、開放読み取り枠、停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる配列、mRNA不安定化因子、ヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる配列、レポータ遺伝子、スプライス受容側配列、スプライス供与側配列、内部リボゾーム進入部位、トランスポゾン、部位特異的組換え部位配列、制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列、選択マーカ、3'遺伝子トラップ、5'遺伝子トラップ、局在化シグナル、複製開始点、プロテアーゼ開裂部位、及び、5'もしくは3'ポリヌクレオチドのテールをコードする配列、のうちの一つ以上から成る群より選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。【請求項１６】  前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。【請求項１７】  前記挿入変異誘発法が、トランスポゾン挿入及びウィルス挿入から成る群より選択される方法により達成される、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項１８】  前記ウィルスが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アルファ-ヘルペスウィルス、レンチウィルス、偽性狂犬病ウィルス及び単純疱疹ウィルスから成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。【請求項１９】  in vitro細胞であって、前記細胞中の遺伝子の一つのアレルが、挿入により変異しており、そして前記遺伝子の第二のアレルが物理化学的に変異している、in vitro細胞。【請求項２０】  ２つ以上の遺伝子に変異を含有する細胞であって、前記変異のうちの少なくとも１つが挿入変異であり、また前記変異は、前記細胞中である表現型を生じるのに累積的に必要である、細胞。【請求項２１】  前記細胞が胚性幹細胞又は生殖細胞である、請求項１９又は２０に記載の細胞。【請求項２２】  前記細胞が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラー・プローンDNA複製たんぱく、ENU、EMS及びICR191、から成る群より選択される少なくとも１つの物理化学的変異原で処理されている、請求項１９又は２０に記載の細胞。【請求項２３】  前記エラー・プローンDNA複製たんぱくがエラー・プローンDNAポリメラーゼである、請求項２２に記載の細胞。【請求項２４】  前記挿入変異原が、以下の多重クローニング部位：転写終了部位、転写調節配列、翻訳シグナル配列、開放読み取り枠、停止コドン、��止コドンを変異又は消失させる配列、mRNA不安定化因子、ヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる配列、レポータ遺伝子、スプライス受容側配列、スプライス供与側配列、内部リボゾーム進入部位、トランスポゾン、部位特異的組換え部位配列、制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列、選択マーカ、3'遺伝子トラップ、5'遺伝子トラップ、局在化シグナル、複製開始点、プロテアーゼ開裂部位、及び、5'もしくは3'ポリヌクレオチドのテールをコードする配列、のうちの一つ以上から成る群より選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１９又は２０に記載の細胞。【請求項２５】  前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項２４に記載の細胞。【請求項２６】  前記挿入変異原がウィルス内に含有されている、請求項１９又は２０に記載の細胞。【請求項２７】                前記ウィルスが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アルファ-ヘルペスウィルス、レンチウィルス、偽性狂犬病ウィルス及び単純疱疹ウィルスから成る群より選択される、請求項２６に記載の細胞。【請求項２８】  前記細胞が、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、トリ類の細胞、ウシの細胞、ブタの細胞、ヒツジの細胞、イヌの細胞、ネコの細胞、植物細胞、魚類の細胞、昆虫細胞及び蠕虫細胞から成る群より選択される、請求項１９又は２０に記載の細胞。【請求項２９】  前記細胞がin vitroである、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項３０】  前記細胞がin vivoである、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項３１】  前記細胞が単離及びクローニングされた細胞である、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項３２】  前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項３３】  前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、及びネコの細胞から成る群より選択される、請求項３２に記載の方法。【請求項３４】  前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。【請求項３５】  請求項１９乃至２８のいずれかに記載の細胞を含有するトランスジェニック生物。【請求項３６】  前記細胞を用いてトランスジェニック生物を作製するステップを更に含む、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。【請求項３７】  前記挿入変異原が、プロモータに作動的に連結した非対スプライス供与側配列を含まない、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。【請求項３８】  前記挿入変異原が、非対スプライス供与側配列を含まない、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。【請求項３９】  前記挿入変異原が、プロモータに作動的に連結した非対スプライス供与側配列を含まない、請求項１９乃至２８のいずれかに記載の細胞。【請求項４０】  前記挿入変異原が、非対スプライス供与側配列を含まない、請求項１９乃至２８のいずれかに記載の細胞。【請求項４１】  物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリであって、前記物理化学的に変異したクローンのうちの一つ以上に挿入変異誘発法がなされている、細胞ライブラリ。【請求項４２】  １−１０５個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項４１に記載の細胞ライブラリ。【請求項４３】  １−１０３個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項４１に記載の細胞ライブラリ。【請求項４４】  ５０−１００個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項４１に記載の細胞ライブラリ。【請求項４５】  約３０−約４００個の物理化学的に変異したクローンを含み、但し前記物理化学的に変異したクローンのうちの一つ以上に挿入変異誘発法がなされている、細胞ライブラリ。【請求項４６】  ２、５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、６００又は８００個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項４１に記載の細胞ライブラリ。【請求項４７】    １−１０６個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項４１に記載の細胞ライブラリ。【請求項４８】  物理化学的に変異したアレルのゲノム中での総網羅率が０．１Ｘ乃至１０Ｘである、請求項４１乃至４７のいずれかに記載の細胞ライブラリ。【請求項４９】  物理化学的に変異したアレルのゲノム中での総網羅率が０．１Ｘ、１．０Ｘ、５Ｘ又は１０Ｘである、請求項４８に記載の細胞ライブラリ。【請求項５０】  細胞一個当たりの物理化学的に変異したアレルの平均数が、１０−１００、２５０−５，０００、５０−１０，０００又は１０，０００−５０，０００である、請求項４１乃至４７のいずれかに記載の細胞ライブラリ。【請求項５１】  変異誘発された細胞ライブラリを作製する方法であって、物理化学的に変異させたクローンを含む細胞ライブラリを、挿入変異誘発するステップを含む、方法。【請求項５２】  前記細胞ライブラリが１−１０６個の物理化学的に変異したクローンを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５３】  １−１０５個の物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリを挿入変異誘発するステップを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５４】  １−１０３個の物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリを挿入変異誘発するステップを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５５】  ５０−１００個の物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリを挿入変異誘発するステップを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５６】  約３０−約４００個の物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリを挿入変異誘発するステップを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５７】  ２、５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、６００又は８００個の物理化学的に変異したクローンを含む細胞ライブラリを挿入変異誘発するステップを含む、請求項５１に記載の方法。【請求項５８】  前記細胞ライブラリ中、物理化学的に変異したアレルのゲノム中での総網羅率が０．１Ｘ−１０Ｘである、請求項５１乃至５７のいずれかに記載の方法。【請求項５９】  前記細胞ライブラリ中、物理化学的に変異したアレルのゲノム中での総網羅率が０．１Ｘ、１．��Ｘ、５Ｘ又は１０Ｘである、請求項５１乃至５７のいずれかに記載の方法。【請求項６０】  前記細胞ライブラリ中、細胞一個当たりの物理化学的に変異したアレルの平均数が、１０−１００、２５０−５，０００、５０−１０，０００又は１０，０００−５０，０００である、請求項５１乃至５７のいずれかに記載の方法。