【手続補正書】
【提出日】平成17年6月3日(2005.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
胚性幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換胚性幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４】
ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって真核生物細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項５】
ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって幹細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって胚性幹細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換胚性幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項４、５、または６に記載の方法であって、前記転写活性な座に対する遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化；新規なコード配列、新規な遺伝子セグメント、もしくは新規な調節エレメントの挿入；条件的対立遺伝子の生成；またはある種に由来するコード配列もしくは遺伝子セグメントを、同じ種もしくは異なる種に由来する相同性コード配列もしくはオルソログコード配列で置換すること；を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化が、置換、付加、または融合を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記融合が、エピトープタグまたは二機能性タンパク質を含む、方法。
【請求項１０】
請求項３または６に記載の方法であって、前記胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞、ラット胚性幹細胞、または他の齧歯類の胚性幹細胞である、方法。
【請求項１１】
遺伝子改変されたＲＯＳＡ２６座を含む非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を胚盤胞中に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する方法により生成される、非ヒト生物。
【請求項１２】
遺伝子改変された転写活性な座を含む非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、転写活性な遺伝子に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した真核生物細胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する方法により生成される、非ヒト生物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記転写活性な座に対する遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化；新規なコード配列、新規な遺伝子セグメント、もしくは新規な調節エレメントの挿入；条件的対立遺伝子の生成；またはある種に由来するコード配列もしくは遺伝子セグメントを、同じ種もしくは異なる種に由来する相同性コード配列もしくはオルソログコード配列で置換すること；を包含する、非ヒト生物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の非ヒト生物であって、前記コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化が、置換、付加、または融合を包含する、非ヒト生物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の非ヒト生物であって、前記融合が、エピトープタグまたは二機能性タンパク質を含む、非ヒト生物。
【請求項１６】
請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記真核生物細胞が、幹細胞である、非ヒト生物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の非ヒト生物であって、前記幹細胞が、胚性幹細胞である、非ヒト生物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の非ヒト生物であって、前記胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞、ラット胚性幹細胞、または他の齧歯類の胚性幹細胞である、非ヒト生物。
【請求項１９】
請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記胚盤胞が、マウス胚盤胞、ラット胚盤胞、または他の齧歯類の胚盤胞である、非ヒト生物。
【請求項２０】
請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記代理母が、マウス、ラット、または他の齧歯類である、非ヒト生物。
【請求項２１】
マウスである、請求項１１または１２に記載の非ヒト生物。