(57)【要約】【課題】保水性が向上した改変プロテオグリカン、この改変プロテオグリカンを含む化粧品、およびこの改変プロテオグリカンの製造方法を提供する。【解決手段】本発明は、乾燥重量で約０．０８ｍｍｏｌ／ｇ以下の二価カチオンを含む、改変プロテオグリカンを提供する。本発明はまた、改変プロテオグリカンの製造方法であって、プロテオグリカンを二価カチオン捕捉樹脂によって処理する工程を包含する、製造方法を提供する。本発明の改変プロテオグリカンは、高い保水性を有し、化粧品として特に有用である。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二価カチオン量が飽和値の約５％以下である改変プロテオグリカン。
【請求項２】
乾燥重量で約１重量％以下の二価カチオンを含む、改変プロテオグリカン。
【請求項３】
乾燥重量で約０．０８ｍｍｏｌ／ｇ以下の二価カチオンを含む、改変プロテオグリカン。
【請求項４】
前記二価カチオンがカルシウムである、請求項１〜３のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
【請求項５】
乾燥重量で約５重量％以上のアルカリ金属イオンを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
【請求項６】
前記アルカリ金属イオンがナトリウムまたはカリウムを含む、請求項５に記載の改変プロテオグリカン。
【請求項７】
ウロン酸含量が約３４〜４１重量％である、請求項１〜３のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
【請求項８】
タンパク質含量が約４〜７重量％である、請求項１〜３のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
【請求項９】
改変プロテオグリカンの製造方法であって、
プロテオグリカンを二価カチオン捕捉樹脂によって処理する工程
を包含する、製造方法。
【請求項１０】
前記二価カチオン捕捉樹脂が陽イオン交換樹脂またはキレート樹脂である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記二価カチオン捕捉樹脂が強酸性陽イオン交換樹脂である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記プロテオグリカンにおける９０％以上の二価カチオンが交換される条件下で前記処理を行う、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記二価カチオンがカルシウムイオンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記陽イオン交換樹脂がアルカリ金属イオン型である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオンである、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記アルカリ金属イオンが、カリウムイオンである、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記改変プロテオグリカンのウロン酸含量が前記プロテオグリカンのウロン酸含量の約９０〜約１２５％となる条件下で前記処理を行う、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記改変プロテオグリカンのタンパク質含量が前記プロテオグリカンのタンパク質含量の約７０〜約１１５％となる条件下で前記処理を行う、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変プロテオグリカン、または請求項９〜１８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された改変プロテオグリカンを含む、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い保水性を有する改変プロテオグリカンおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、グリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物の総称であり、動物に存在して、結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している。
【０００３】
近年、保水性物質としてプロテオグリカンが注目されてきている。プロテオグリカンを単独、またはキトサン、コラーゲン、ヒアルロン酸などと併用し、わた体に付着させて使用すること（特許文献１）、美容液や化粧品においてプロテオグリカンを１０重量％以上のコラーゲンと併用すること（特許文献２）、プロテオグリカンをアシル化アルカリ処理コラーゲンと併用すること（特許文献３）などが知られている。しかし、これらの方法では、わた体に付着させてもプロテオグリカン自体の保水能力は変わらず、保水能力を補うにはコラーゲンと併用しなければならないという煩わしさがある。また、水に不溶のコラーゲンを利用するため、透明または清澄な製品への利用は困難である。
【０００４】
さらに、プロテオグリカンは上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様作用を有することも明らかになり、化粧品や健康食品への応用がますます注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２５５７２６号  公報
【特許文献２】特開平６−１６６６１６号  公報
【特許文献３】特開平６−１７９６１２号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、保水性が向上した改変プロテオグリカン、この改変プロテオグリカンを含む化粧品、およびこの改変プロテオグリカンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、プロテオグリカンに存在する二価カチオンの量を減らすことによって、処理前のプロテオグリカンと比較して保水性の向上した改変プロテオグリカンを得ることができることを予想外に見出した。
【０００８】
本発明者らはまた、二価カチオンの量を減らすことによって、プロテオグリカンのＥＧＦ様作用に影響を及ぼすことなく、保水性を向上させることができることを見出した。
【０００９】
本発明者らはさらに、二価カチオン捕捉樹脂（例えば、陽イオン交換樹脂）を用いることによって、簡便に、プロテオグリカンと比較して、ＥＧＦ様作用を保持し、かつ高い保水性を有する改変プロテオグリカンを製造することができることを見出した。
【００１０】
本発明者らはさらに、ナトリウムイオン型またはカリウムイオン型の二価カチオン捕捉樹脂（例えば、陽イオン交換樹脂）を用いることによって、簡便に、プロテオグリカンと比較して、高い保水性を有し、かつ高い安定性を有する改変プロテオグリカンを製造することができることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、特に酢酸抽出されたプロテオグリカンについては、保水性向上が好ましいと考えていたが、本発明によって、酢酸抽出されたプロテオグリカンの顕著な保水性向上が達成された。
【００１２】
したがって、本発明は、代表的に以下を提供する。
（１）二価カチオン量が飽和値の約５％以下である改変プロテオグリカン。
（２）乾燥重量で約１重量％以下の二価カチオンを含む、改変プロテオグリカン。
（３）乾燥重量で約０．０８ｍｍｏｌ／ｇ以下の二価カチオンを含む、改変プロテオグリカン。
（４）前記二価カチオンがカルシウムである、項１〜３のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
（５）乾燥重量で約５重量％以上のアルカリ金属イオンを含む、項１〜４のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
（６）前記アルカリ金属イオンがナトリウムまたはカリウムを含む、項５に記載の改変プロテオグリカン。
（７）ウロン酸含量が約３４〜４１重量％である、項１〜６のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
（８）タンパク質含量が約４〜７重量％である、項１〜７のいずれかに記載の改変プロテオグリカン。
（９）改変プロテオグリカンの製造方法であって、
プロテオグリカンを二価カチオン捕捉樹脂によって処理する工程
を包含する、製造方法。
（１０）  前記二価カチオン捕捉樹脂が陽イオン交換樹脂またはキレート樹脂である、項９に記載の製造方法。
（１１）  前記二価カチオン捕捉樹脂が強酸性陽イオン交換樹脂である、項９または１０に記載の製造方法。
（１２）前記プロテオグリカンにおける９０％以上の二価カチオンが交換される条件下で前記処理を行う、項９〜１１のいずれかに記載の製造方法。
（１３）前記二価カチオンがカルシウムイオンである、項９〜１２のいずれかに記載の製造方法。
（１４）前記陽イオン交換樹脂がアルカリ金属イオン型である、項１０〜１３のいずれかに記載の製造方法。
（１５）前記アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオンである、項１４に記載の製造方法。
（１６）前記アルカリ金属イオンが、カリウムイオンである、項１４に記載の製造方法。
（１７）前記改変プロテオグリカンのウロン酸含量が前記プロテオグリカンのウロン酸含量の約９０〜約１２５％となる条件下で前記処理を行う、項９〜１６のいずれかに記載の製造方法。
（１８）前記改変プロテオグリカンのタンパク質含量が前記プロテオグリカンのタンパク質含量の約７０〜約１１５％となる条件下で前記処理を行う、項９〜１７のいずれかに記載の製造方法。
（１９）項１〜８のいずれか１項に記載の改変プロテオグリカン、または項９〜１８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された改変プロテオグリカンを含む、化粧品。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＥＧＦ様作用と高い保水性とを有する改変プロテオグリカンが提供された。このような改変プロテオグリカンは、そのＥＧＦ様作用および高い保水性から、特に化粧品の成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の改変処理を施していない原料の鮭由来プロテオグリカンの濃度と保水性の関係を示す。
【図２】図２は、実施例１の改変プロテオグリカンの保水性と、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性との比較を示す。
【図３】図３は、実施例４の改変プロテオグリカンの保水性と、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの保水性との比較を示す。
【図４】図４は、実施例７の改変プロテオグリカンの保水性と、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性との比較を示す。
【図５】図５は、種々の改変プロテオグリカンの保水性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
本発明者らは、プロテオグリカンにおいて二価カチオンの量を減らすことによって、プロテオグリカンの保水性を向上させることができることを予想外に発見した。したがって、１つの実施形態において、本発明は、乾燥重量で二価カチオンが約１重量％以下、二価カチオン量が理論的飽和値の約５％以下または乾燥重量で約０．０８ｍｍｏｌ／ｇ以下である改変プロテオグリカンを提供する。そのような本発明の改変プロテオグリカンは、改変前のプロテオグリカンと比較して高い保水性を有し得る。
【００１７】
プロテオグリカンは、グルコサミノグリカン部分とタンパク質部分を含み、グルコサミノグリカン部分はウロン酸を含むが、１つの実施形態において、本発明は、改変プロテオグリカンであって、プロテオグリカン中のウロン酸含量が約３４〜４１重量％である、および／またはタンパク質含量が約４〜７重量％である改変プロテオグリカンを提供する。ウロン酸含量が約３４〜４１重量％である、および／またはタンパク質含量が約４〜７重量％である改変プロテオグリカンは、改変前のプロテオグリカンが有しているＥＧＦ様作用を保持し得る。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、アルカリ金属イオンが約５重量％以上である改変プロテオグリカンを提供する。そのような本発明の改変プロテオグリカンは、高い安定性を有し得る。
【００１９】
本発明者らはさらに、二価カチオン捕捉樹脂（陽イオン交換樹脂）によってプロテオグリカンを処理することによって、プロテオグリカンの二価カチオンの量を減らし、簡便に高保水性改変プロテオグリカンを製造することができることを発見した。
【００２０】
本発明者らはさらに、ナトリウムイオン型またはカリウムイオン型の二価カチオン捕捉樹脂（例えば、陽イオン交換樹脂）を用いることによって、簡便に、プロテオグリカンと比較して、高い保水性を有し、かつ高い安定性を有する改変プロテオグリカンを製造することができることを見出した。
【００２１】
上記のとおりプロテオグリカンは、グルコサミノグリカン部分とタンパク質部分を含み、グルコサミノグリカン部分はウロン酸を含むが、１つの実施形態において、本発明は、改変プロテオグリカンであって、プロテオグリカン中のウロン酸含量および／またはタンパク質含量が変化せず、かつ二価カチオンの量を減らす条件下で、陽イオン交換樹脂処理を行うことを含む、改変プロテオグリカンの製造方法を提供する。そのような製造方法によって得られる改変プロテオグリカンは、処理前のプロテオグリカンと比較して、ＥＧＦ様作用を保持し、かつ高い保水性を有するものであり得る。
【００２２】
（定義）
本明細書において、「プロテオグリカン」とは、グリコサミノグリカン側鎖がタンパク質に結合した分子群であって、任意の生物から抽出された任意のプロテオグリカンをいう。プロテオグリカンの特徴はウロン酸含量およびタンパク質含量で表現することができる。
【００２３】
本明細書において、「改変プロテオグリカン」とは、プロテオグリカンの任意のパラメーターの少なくとも１つが改変されたプロテオグリカンをいう。
【００２４】
本明細書において、物質Ａが物質Ｂと比較して「保水性が高い」または「高保水性」とは、ある一定期間に物質Ａが吸水した水分の重量が、同期間かつ同条件で物質Ｂが吸水した水分の重量よりも多いことをいう。なお、本明細書においては、この吸水した水分量は、測定対象の物質の水溶液を透析用セルロースチューブに入れて水中に浮遊させ、水に対して透析した結果の透析用セルロースチューブ内部の重量増加により測定される。
【００２５】
本明細書において、「二価カチオン捕捉樹脂」とは、プロテオグリカンの二価カチオンを捕捉できる任意の樹脂をいう。本発明の二価カチオン捕捉樹脂は、具体的には陽イオン交換樹脂およびキレート樹脂を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書において、「強酸性陽イオン交換樹脂」とは、強酸（例えば、スルホン酸）を交換基とする任意の陽イオン交換樹脂をいう。本明細書において、強酸とは酸解離指数ｐＫが３以下の酸をいう。強酸性陽イオン交換樹脂における交換基は、スルホン酸基、スルホプロピル基、スルホエチル基を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書において、「弱酸性陽イオン交換樹脂」とは、弱酸（例えば、カルボン酸）を交換基とする任意の陽イオン交換樹脂をいう。本明細書において、弱酸とは電離定数Ｋが１０−３以下の酸をいう。弱酸性陽イオン交換樹脂において用いられる酸は、カルボン酸、リン酸エステル、カルボキシメチルを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書において、「上皮細胞増殖因子様作用」または「ＥＧＦ様作用」とは、表皮成長因子作用のことであり、哺乳類やニワトリ表皮の増殖・ケラチン化および／またはヒト線維芽細胞の増殖などを促進する作用をいう。
【００２９】
本明細書において、プロテオグリカンまたは改変プロテオグリカンの「安定性」とは、分子量減少の程度をいう。プロテオグリカンまたは改変プロテオグリカンの分子量減少は、そのプロテオグリカンまたは改変プロテオグリカンにおいて分解が起こったことを示す。ＡがＢよりも安定性が「高い」とは、Ｂにおける分子量減少の程度と比較して、Ａにおける分子量減少の程度が小さいことをいう。
【００３０】
本明細書において、プロテオグリカンまたは改変プロテオグリカンの「分子量」とは、ゲルろ過法によって測定される分子量をいう。例えば、プロテオグリカンまたは改変プロテオグリカン溶液をゲルろ過法に供し、目的物質の溶出時間を、標準物質（例えば、デキストラン）を用いた検量線上にプロットすることによって目的物質の分子量を求めることができる。
【００３１】
本明細書において、「約」とは、後に続く数字の±１０％の範囲内をいう。
【００３２】
（好ましい実施形態の説明）
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行なうことができることは、当業者に明らかである。
【００３３】
・プロテオグリカン
本発明において原料とするプロテオグリカンは、任意の生物から抽出された任意のプロテオグリカンを含む。プロテオグリカンの原料となる生物としては、体内にプロテオグリカンを含む限りどのような生物であってもよく、牛、鶏、鯨などの哺乳類・鳥類の軟骨や、鮭、鮫、エイなどの魚類の軟骨であってもよい。本発明のプロテオグリカンの原料となる生物としては、鮭または鮫が好ましい。特に、鮭の鼻軟骨由来のプロテオグリカンにはＥＧＦ様作用が確認されており、本発明において好ましい。
【００３４】
本発明のプロテオグリカンの抽出法は、原料となる生物からプロテオグリカンを抽出できるものである限りどのような方法であってもよい。１つの実施形態において、プロテオグリカンの抽出においては、有害試薬を用いないことが好ましい。改変プロテオグリカンの化粧品、健康食品、医薬品などへの応用が容易であるからである。本発明に適したプロテオグリカン抽出法としては、例えば、熱水、酢酸、過酢酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸、アルカリ（水酸化ナトリウム等）、尿素またはグアニジン塩酸を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、プロテオグリカン抽出のために使用する試薬や、温度または時間などの具体的な条件を適切に決定することができる。好ましくは、本発明においては、プロテオグリカンは、原料となる生物から酢酸（例えば、４％酢酸）抽出されたものであり得る。
【００３５】
・改変プロテオグリカン
二価カチオンの量が減少すればするほど、プロテオグリカンの保水性が向上することが本発明者らによって発見された。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、約１重量％以下の二価カチオンを含む。より好ましい実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、約０．８重量％以下の二価カチオンを含む。より好ましい実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、約０．５重量％以下の二価カチオンを含む。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、二価カチオン量の飽和値の約５％以下、より好ましくは二価カチオン量の飽和値の約３％以下の二価カチオンを含み、さらに好ましくは二価カチオン量の飽和値の約１％以下の二価カチオンを含み、特に好ましくは二価カチオンを含まない。二価カチオン量の飽和値は、実施例１３で使用したプロテオグリカンの場合１．５８ｍｍｏｌ／ｇであるので、この場合、本発明の改変プロテオグリカンは、約０．０８ｍｍｏｌ／ｇ以下の二価カチオンを含み、より好ましくは約０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以下の二価カチオンを含み、特に好ましくは二価カチオンを含まない。
【００３８】
本明細書において改変プロテオグリカンの二価カチオン量の「飽和値」とは、原料となるプロテオグリカンを二価カチオンで飽和したと仮定した場合の二価カチオン１ｇ当たりの二価カチオンのモル数をいう。具体的には、「飽和値」は硫酸基とカルボキシル基のモル数から算出することができる。硫酸基は元素分析による硫酸エステル基の定量法により測定し得る。プロテオグリカン中の硫黄原子には、糖鎖由来（硫酸エステル基由来）とタンパク質由来があると考えられる。糖鎖由来の硫黄原子とタンパク質由来の硫黄原子の総量の推定値を計算で求めると、プロテオグリカン中の糖鎖由来（硫酸エステル基由来）の硫黄原子の量は、タンパク質由来の硫黄原子の量の約７０倍と算出されたことから、本明細書において、元素分析によって得られる硫黄原子の量を、糖鎖由来（硫酸エステル基由来）の硫黄原子の量として表すものとする。カルボキシル基はウロン酸由来であり、ウロン酸量から算出できる。
【００３９】
実施例１３で使用した角弘プロテオグリカン研究所のプロテオグリカンを元素分析装置（全自動元素分析装置（ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ＣＵＢＥ、ｅｌｅｍｅｎｔａｒ）で測定した結果、硫黄原子は４．６７重量％、硫酸エステル基に換算すると１４．１重量％（＝１．４５ｍｍｏｌ／ｇ）含まれること、およびカルバゾール硫酸法によりウロン酸を定量した結果、３３．３重量％（グルクロン酸換算）となり、カルボキシル基に換算すると７．７重量％（＝１．７１ｍｍｏｌ／ｇ）であることが分かった。二価カチオンは、硫酸エステル基とウロン酸に結合するにはそれぞれモル換算で２倍要することから、飽和値は、{（硫酸エステル基のモル数／ｇ）＋（カルボキシル基のモル数／ｇ）}／２で算出することができるため、本例では、
（１．４５＋１．７１）／２＝１．５８ｍｍｏｌ／ｇ
であると算出することができる。このようにして、本発明では、対象となるプロテオグリカンの二価カチオン量の飽和値が知られていない場合でも、元素分析による硫黄原子を測定により硫酸エステル基を測定して硫酸基の量を測定し、カルバゾール硫酸法等でカルボキシル量を測定することで、二価カチオン量の飽和値を推定することができる。このように求めた二価カチオン量の推定値に基づいて、本発明の改変プロテオグリカンが含む二価カチオン量を特定することができる。
【００４０】
なお、二価カチオン量の飽和値は、本発明において使用され得る鮭由来プロテオグリカンについては、一般的には約１ｍｍｏｌ／ｇ〜約５ｍｍｏｌ／ｇの範囲にあることが分かっているため、鮭由来プロテオグリカンを原料として使用する場合、この範囲の量を指標に除去すべき二価カチオン量等を検討することができる。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、改変前のプロテオグリカンに含まれる二価カチオンの量の約１０％以下の二価カチオンしか含まない。より好ましくは、本発明の改変プロテオグリカンは、改変前のプロテオグリカンに含まれる二価カチオンの量の約５％以下の二価カチオンしか含まず、特に好ましくは、二価カチオンを含まない。
【００４２】
本発明において、代表的な二価カチオンは、カルシウムおよび／またはマグネシウムであり、より代表的にはカルシウムである。このような二価カチオンが減少した改変プロテオグリカンは、プロテオグリカンから二価カチオンを除去し得る任意の公知の方法によって調製され得るが、以下に説明する陽イオン交換樹脂を使用する方法が、二価カチオン除去効率が高いこと、および／または処理が簡便であることから、特に好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、約５重量％以上のアルカリ金属イオンを含む。上述のとおり、本発明は、プロテオグリカンにおける二価カチオンの量を減少させることによってプロテオグリカンの保水性が向上することに基づくが、本発明者らはさらに、そのように保水性が向上した改変プロテオグリカンにおいてアルカリ金属イオンの量を増加させるようにすることによって、改変プロテオグリカンの安定性が増すことも見出した。より好ましい実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは約９重量％以上のアルカリ金属イオンを含み、特に好ましくは約１２重量％以上のアルカリ金属イオンを含む。本発明の、二価カチオン量が減少し、かつアルカリ金属イオン含量が増加した好ましい改変プロテオグリカンは、高い保水性と、高い安定性（すなわち、改変前のプロテオグリカンと比較して、分子量の変動が約５０％以内、好ましくは約３０％以内、より好ましくは約１０％以内）とを有し得る。
【００４４】
別の実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンは、ウロン酸含量が約３４〜４１重量％であり、かつ／またはタンパク質含量が約４〜７重量％である。ウロン酸含量が約３４〜４１重量％であり、かつ／またはタンパク質含量が約４〜７重量％である改変プロテオグリカンは、二価カチオンの減少、および必要に応じてアルカリ金属イオンの増加以外にはプロテオグリカンの組成または構造が実質的に変化していないため、改変前のプロテオグリカンが有していたＥＧＦ様作用を保持し得る。
【００４５】
・改変プロテオグリカンの製造方法
二価カチオンが減少した本発明の改変プロテオグリカンは、プロテオグリカンから二価カチオンを除去し得る任意の公知の方法によって調製され得るが、二価カチオン捕捉樹脂を使用する方法が、処理が簡便であることから好ましい。二価カチオン捕捉樹脂としては、陽イオン交換樹脂およびキレート樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の改変プロテオグリカンの製造のためには、陽イオン交換樹脂（特に好ましくは、強酸性陽イオン交換樹脂）を使用する方法が、二価カチオン除去効率が高いこと、および／または処理が簡便であることから、特に好ましい。
【００４６】
したがって、本発明の代表的な実施形態においては、原料となる生物から抽出されたプロテオグリカンを、陽イオン交換樹脂によって処理して、プロテオグリカンから二価カチオンを除去する。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明は、プロテオグリカンにおける約９０％以上の二価カチオンが交換される条件下で、プロテオグリカンを二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）によって処理する工程を包含する、改変プロテオグリカンの製造方法を提供する。このようにして得られた改変プロテオグリカンは、処理前のプロテオグリカンと比較して保水性が向上している。本発明の好ましい実施形態において、プロテオグリカンにおける約９５％以上の二価カチオンが交換（例えば、ナトリウムやカリウムなどに交換）される条件下で、特に好ましい実施形態においては、プロテオグリカンにおける約１００％の二価カチオンが交換される条件下で、二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）による処理が行われ得る。このような約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約１００％の二価カチオンが交換され得る条件は、具体的には、交換容量、樹脂との接触時間、処理温度などを含み、当業者が適切に決定し得る。本発明のプロテオグリカンでは、二価カチオンのほとんどは、カルシウムイオンが占めることから、本発明の改変プロテオグリカンの製造方法においてプロテオグリカンにおける約９０％以上（または約９５％以上もしくは約１００％等の別の比率）の二価カチオンが交換されたかどうかは、実質的に、カルシウムイオンを指標として評価することもできる。その場合、本明細書では、当該条件は、プロテオグリカンにおける約９０％以上（または約９５％以上もしくは約１００％等の別の比率）のカルシウムイオンが交換される条件とも称される。
【００４８】
本発明における陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂および弱酸性陽イオン交換樹脂を含む。好ましい実施形態において、本発明において用いられる陽イオン交換樹脂は強酸性陽イオン交換樹脂である。強酸性陽イオン交換樹脂による処理は、弱酸性陽イオン交換樹脂による処理と比較して、プロテオグリカンの回収率が優れているからである。強酸性陽イオン交換樹脂処理によるプロテオグリカンの回収率（処理後のプロテオグリカン／抽出後のプロテオグリカン）は約７５％以上であるのに対して、弱酸性陽イオン交換樹脂処理によるプロテオグリカンの回収率は約６０％程度であった。弱酸性陽イオン交換樹脂に結合したプロテオグリカンを回収しようとすると、イオン強度の高い溶離液またはアルカリ性溶離液などを使用する必要があるため、得られる改変プロテオグリカンの性質が変化し得る。強酸性陽イオン交換樹脂は、代表的に、担体にスルホン酸基のイオン交換基が導入された水不溶性の高分子樹脂である。担体としてはスチレン系やフェノール系、ビニル系、アクリルアミド系などの合成樹脂やセルロース系、アガロース系、デキストラン系などがある。
【００４９】
上述のとおり、本発明の好ましい改変プロテオグリカンは、アルカリ金属イオンの増加した改変プロテオグリカンであるが、このような好ましい改変プロテオグリカンは、アルカリ金属イオン型の二価カチオン捕捉樹脂処理によって調製され得る。アルカリ金属イオン型の二価カチオン捕捉樹脂とは、二価カチオンを捕捉し、それをプロトンないし金属イオンに交換する樹脂をいう。アルカリ金属イオン型二価カチオン捕捉樹脂による処理は、二価カチオンの減少とアルカリ金属の付加とを同時に行い得るため、本発明の改変プロテオグリカンの製造のために特に好ましい。アルカリ金属イオン含量の増加した改変プロテオグリカンは、好ましくは、アルカリ金属イオン型の陽イオン交換樹脂処理によって調製され得る。
【００５０】
アルカリ金属イオン型二価カチオン捕捉樹脂は、二価カチオン捕捉樹脂（例えば、陽イオン交換樹脂）をナトリウム、カリウム、リチウムなどの周期表第１族に属するアルカリ金属のイオン型とし、用いる。金属イオン型としては数種の金属の混合物でも構わない。樹脂を使用する前には、常法により酸やアルカリなどで予備洗浄し、使用する金属イオン型に活性化する必要がある。本発明における好ましいアルカリ金属は、ナトリウムまたはカリウムである。アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）イオン型二価カチオン捕捉樹脂処理によって得られる改変プロテオグリカンは、プロトン型二価カチオン捕捉樹脂処理によって得られる改変プロテオグリカンと比較して、安定性が高いものであり得る。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の処理前のプロテオグリカンの分子量からの処理後の分子量への変動が約５０％以下である条件下で（すなわち、処理前をＸ，処理後をＹとした場合に、｜（Ｘ−Ｙ）／Ｘ｜＜０．５である条件下）、プロテオグリカンを二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）によって処理する工程を包含する、改変プロテオグリカンの製造方法を提供する。このようにして得られた改変プロテオグリカンの分子量は、処理前のプロテオグリカンの分子量と比較して約５０％〜約１５０％の範囲内である。本発明の好ましい実施形態において、処理前のプロテオグリカンの分子量からの処理後の分子量への変動が約３０％以下（すなわち、約７０％〜約１３０％）である条件下で、特に好ましい実施形態においては、処理前のプロテオグリカンの分子量からの処理後の分子量への変動が約１０％以下（すなわち、約９０％〜約１１０％）である条件下で、二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）による処理が行われ得る。
【００５２】
本発明の改変プロテオグリカンの製造方法は、原料から抽出されたプロテオグリカンを含む溶液を、二価カチオン捕捉樹脂（好ましくは、強酸性陽イオン交換樹脂、より好ましくは、アルカリ金属イオン型強酸性陽イオン交換樹脂）に接触させることを含む。このとき原料から抽出されたプロテオグリカンを含む溶液には、プロテオグリカン以外の物質、特にイオン性物質は入っていないほうが好ましい。もしくは、原料から抽出されたプロテオグリカンを含む溶液のイオン強度は低いほうが好ましい。
【００５３】
プロテオグリカン溶液と二価カチオン捕捉樹脂との接触方法は、カラムなどに樹脂を充填し、プロテオグリカン溶液をカラムに通過させる方式やバッチ式などがある。接触時間は、数分以上必要であり、接触する温度は室温以下が好ましい。使用するアルカリ金属イオン型二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）の量は、樹脂の種類により異なるが、出発原料となる元のプロテオグリカン１ｇ当たり、陽イオン交換樹脂の交換容量２ｍｅｑ量相当の樹脂量に、安全率を乗じた以上の樹脂量であることが好ましい。
【００５４】
次いで、二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）と接触させたプロテオグリカンを、ろ過などの方法により、樹脂から分離する。ろ過後の二価カチオン捕捉樹脂（例えば、強酸性陽イオン交換樹脂）を水で洗浄し、樹脂に付着している改変プロテオグリカンを回収する。得られた改変プロテオグリカンは、原料から抽出されたプロテオグリカンより二価カチオンが減少し、保水性が向上した改変プロテオグリカンである。この時点では樹脂から分離された状態は水溶液の状態であり、そのまま化粧品などに使用してもよいし、噴霧乾燥や凍結乾燥などにより粉末化、または、アルコールやアセトンなどの有機溶剤により沈殿、風乾して、粉末化してもよい。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の改変プロテオグリカンの製造方法において、改変プロテオグリカンのウロン酸含量が、改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量の約９０〜１２５％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理を行うことが好ましい（すなわち、改変前のプロテオグリカン中のウロン酸の含量をＸ％（ｗ／ｗ）とし、改変後のプロテオグリカン中のウロン酸の含量をＹ％（ｗ／ｗ）とした場合、Ｙ／Ｘが約０．９〜約１．２５となることが好ましい）。より好ましくは、改変プロテオグリカンのウロン酸含量が、改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量の約９５〜１１０％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われ、特に好ましくは、改変プロテオグリカンのウロン酸含量が、改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量の約１００％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われる。
【００５６】
別の実施形態において、陽イオン交換樹脂処理を用いる本発明の改変プロテオグリカンの製造方法において、改変プロテオグリカンのタンパク質含量が、改変前のプロテオグリカンのタンパク質含量の約７０〜１１５％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理を行うことが好ましい（すなわち、改変前のプロテオグリカン中のタンパク質の含量をＸ％（ｗ／ｗ）とし、改変後のプロテオグリカン中のタンパク質の含量をＹ％（ｗ／ｗ）とした場合、Ｙ／Ｘが約０．７〜約１．１５となることが好ましい）。より好ましくは、改変プロテオグリカンのタンパク質含量が、改変前のプロテオグリカンのタンパク質含量の約８０〜１１０％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われ、特に好ましくは、改変プロテオグリカンのタンパク質含量が、改変前のプロテオグリカンのタンパク質含量の約１００％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われる。
【００５７】
別の実施形態において、陽イオン交換樹脂処理を用いる本発明の改変プロテオグリカンの製造方法において、改変プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量が、それぞれ改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量のそれぞれ約９０〜１２５％および約７０〜１１５％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理を行うことが好ましい。より好ましくは、改変プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量が、それぞれ改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量のいずれも約９０〜１１０％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われ、特に好ましくは、改変プロテオグリカンのウロン酸含量およびタンパク質含量が、それぞれ改変前のプロテオグリカンのウロン酸含量タンパク質含量のいずれも約１００％となる条件下で陽イオン交換樹脂処理が行われる。これらのウロン酸含量および／またはタンパク質含量について改変の前後で変動の少ない改変プロテオグリカンは、二価カチオンの減少、および必要に応じてアルカリ金属イオンの増加以外にはプロテオグリカンの組成または構造が実質的に変化していないため、改変前のプロテオグリカンが有していたＥＧＦ様作用を保持し得る。
【００５８】
上述のようなウロン酸含量および／またはタンパク質含量が実質的に変化しない陽イオン交換樹脂処理条件は、当該分野で公知であり、当業者は適切にその条件を決定し得る
【実施例１】
【００５９】
（改変プロテオグリカンの製造１）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。これは、鮭の鼻軟骨から公知の酢酸抽出法によって抽出されたプロテオグリカンであった（例えば、特許3731150号）。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学（株）））をガラス製カラムに充填し（内径２ｃｍ、高さ８ｃｍ）、１Ｍ塩酸５０ｍＬと脱イオン水２００ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液１００ｍＬを流下し、樹脂をナトリウムイオン型に活性化した。過剰の塩化ナトリウムを除くため、脱イオン水約２００ｍＬを流下した後、原料の鮭由来プロテオグリカン０．３１ｇを脱イオン水２５ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１３０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１５０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２８ｇの白色綿状固体である本発明の改変プロテオグリカンを得た。
【実施例２】
【００６０】
（改変プロテオグリカンの保水性の測定１）
原料の鮭由来プロテオグリカン０．３０ｇ、０．２０ｇ、０．１０ｇをそれぞれ脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬずつを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカン水溶液１００ｍＬずつをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００６１】
図１は、原料の鮭由来プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図１中のプロットのうち、「×０．３０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．３０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「▲０．１０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．１０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。いずれのプロテオグリカン濃度でも吸水・保水量は経過日数にほぼ比例して増えること、また、プロテオグリカン濃度が０．１０ｗ／ｖ％、０．２０ｗ／ｖ％、０．３０ｗ／ｖ％と高くなるほど吸水・保水量が多くなることが分かる。
【００６２】
原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１の改変プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンおよび実施例４の改変プロテオグリカンのそれぞれ０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬと実施例１の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００６３】
図２は、原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例１の改変プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図２中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例１、ナトリウムイオン型）」は実施例１の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例４の改変プロテオグリカンは７．４ｇ／日であった。原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、実施例４の改変プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例３】
【００６４】
（改変プロテオグリカンの化学分析１）
実施例１の改変プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、５．２重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３７．６重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例１の改変プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、それぞれ原料の鮭由来プロテオグリカンの約８０％および約１０９％であり、改変処理前からほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００６５】
水分含量は、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８２１０、（株）リガク製）にて、１２５℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分とした。その結果、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１３重量％であった。同様に、原料の鮭由来プロテオグリカンの水分含量について分析したところ、１７重量％であった。
【００６６】
また、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの各金属含量を、キャピラリー電気泳動装置（Ａｇｉｌｅｎｔ７１００キャピラリー電気泳動システム、アジレント・テクノロジー（株）製）を用いて定量した。各金属の定量法については、ＵＶ吸収を有する緩衝液で満たしたキャピラリーカラムに、試料を注入して電圧をかけることで、試料中の各金属イオンを分離しながら移動させ、ＵＶ検出部を通過する時のＵＶ吸収の減少分により検出するという間接吸光法を採用した。カラムにフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、有効長５６ｃｍ、アジレント・テクノロジー（株）製）、緩衝液に陽イオン分析バッファ（ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０３、アジレント・テクノロジー（株）製）を用い、電圧２５ｋＶで、陽イオン標準液（５〜１００ｐｐｍ、ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０５、アジレント・テクノロジー（株）製）から作成した検量線より、ナトリウム、カリウム、カルシウム含量を求めた。
【００６７】
実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．１７４重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．２９重量％であった。測定の結果、ナトリウムは９．３重量％、カルシウム、マグネシウムおよびカリウムのいずれも検量線の測定下限より低い濃度であったため０．２９重量％未満であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．１６６重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．３０重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、ナトリウムは１．８重量％、カルシウムは５．６重量％であり、カリウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため０．３０重量％未満であった。なお、上記金属含量は、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン中に含まれる水分含量（１３重量％）および原料の鮭由来プロテオグリカンに含まれる水分含量（１７重量％）をそれぞれ除去した乾燥重量を基に計算した。
【００６８】
実施例１の改変プロテオグリカンの相対粘度を、オストワルド相対粘度計（粘度計Ｎｏ．１、毛細管内径０．５ｍｍ、柴田科学（株）製）で、純水の粘度を基準として測定した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカン２５．０ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量は１３重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、実施例１で得られた高保水性プロテオグリカンの相対粘度は６．４であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同一の相対粘度計を用いて分析した。原料の鮭由来プロテオグリカン２６．３ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。原料の鮭由来プロテオグリカンの水分含量は１７重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、原料の鮭由来プロテオグリカンの相対粘度は４．４であった。
【００６９】
実施例１の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．５であり、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であった。
【実施例４】
【００７０】
（改変プロテオグリカンの製造２）
本発明の改変プロテオグリカンの製造にあたって、原料となるプロテオグリカンを常法により鮫から調製した。市販の鮫軟骨粉末１００ｇに対して、５％酢酸（関東化学）を１Ｌ加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により固形分を除去し、溶液を得た。この溶液を分画分子量１０万の限外ろ過膜（ミリポア社）を装着した卓上循環式濃縮装置（（株）トライテック）に通し、加水しながら、分子量１０万以上の成分を集めた。残っている低分子成分を除去するため、透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に分子量１０万以上の画分を入れ、４℃の低温室で、水に対して３日間透析した。外液の水は定期的に交換した。透析用セルロースチューブ内の溶液を凍結乾燥し、固形分の重量を測定したところ、０．８ｇの白色綿状固体である鮫酢酸抽出プロテオグリカンを得た。
【００７１】
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ水酸化カリウム水溶液１５０ｍＬを流下し、樹脂をカリウムイオン型に活性化した。過剰の水酸化カリウムを除くため、脱イオン水約２５０ｍＬを流下した後、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカン０．３１ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１７０ｍＬ流下し、得られた溶出液約２００ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．２９ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例５】
【００７２】
（改変プロテオグリカンの保水性の測定２）
原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと、実施例４の改変プロテオグリカンそれぞれ０．１０ｇを、脱イオン水５０ｍＬに溶解し、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬ、実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬを得た。この原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬと実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液５０ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００７３】
図３は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと、実施例４の改変プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図４中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例７、カリウムイオン型）」は実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮫酢酸抽出プロテオグリカン」は原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカン１．９ｇ／日に対して、実施例７の改変プロテオグリカンは５．１ｇ／日であった。原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンと比較して、実施例７の改変プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。よって、プロテオグリカンの由来する生物に拘わらず、陽イオン交換樹脂処理による改変によって保水性の向上効果が得られることが分かる。
【実施例６】
【００７４】
（改変プロテオグリカンの化学分析２）
実施例４の改変プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、４．５重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３４．５重量％であった。原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は５．９重量％、ウロン酸含量は３３．８重量％であった。これらの結果から、実施例４の改変プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンのそれぞれ約７６％および約１０３％であり、改変前からほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００７５】
実施例４の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは７．５であり、原料の鮫酢酸抽出プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは４．２であった。
【実施例７】
【００７６】
（改変プロテオグリカンの製造３）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学（株）））をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水１５０ｍＬを順次流下して樹脂を洗浄した後、１Ｍ塩化カリウム水溶液４００ｍＬを流下し、樹脂をカリウムイオン型に活性化した。過剰の塩化カリウムを除くため、脱イオン水約３５０ｍＬを流下した後、原料の鮭由来プロテオグリカン０．３０ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１５０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１７０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、０．３０ｇの白色綿状固体である高保水性プロテオグリカンを得た。
【実施例８】
【００７７】
（改変プロテオグリカンの保水性の測定３）
原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例７の改変プロテオグリカンそれぞれ０．２０ｇを、脱イオン水１００ｍＬに溶解し、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬ、実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを得た。この原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬと実施例１３の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬをそれぞれ、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株））に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水した透析用セルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した透析用セルロースチューブ風袋重量を控除し、吸水・保水した重量を求めた。
【００７８】
図４は、原料の鮭由来プロテオグリカンと、実施例７の改変プロテオグリカンの保水性を測定した結果を示すものである。グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は風袋重量を控除した透析用セルロースチューブ内液の重量（ｇ）を示す。図４中のプロットのうち、「◇０．２０ｗ／ｖ％高保水性プロテオグリカン（実施例１３、カリウムイオン型）」は実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を、「■０．２０ｗ／ｖ％鮭由来プロテオグリカン」は原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液の重量変化を示す。３０日間の測定結果を平均すると、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、実施例７の改変プロテオグリカンは７．３ｇ／日であった。原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、実施例７の改変プロテオグリカンは約２．７倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【実施例９】
【００７９】
（改変プロテオグリカンの化学分析３）
実施例７の改変プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、７．０重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、４０．６重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例７の改変プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンのそれぞれ約１０７％および約１１７％であり、改変前とほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００８０】
実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの水分含量を上記実施例３と同様に測定したところ、１４重量％であった。また、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンの各金属含量を、上記実施例３と同様に測定した。実施例７で得られた高保水性プロテオグリカンについては、乾燥重量を基にして０．０６４５重量％水溶液で測定したため、作成した検量線による各金属含量の測定下限は０．７８重量％であった。測定の結果、ナトリウムは１．７重量％、カリウムは１２．０重量％であり、カルシウムおよびマグネシウムは検量線の測定下限より低い濃度であったため０．７８重量％未満であった。なお、上記金属含量は、実施例７で得られた高保水性プロテオグリカン中に含まれる水分含量（１４重量％）を除去した乾燥重量を基に計算した。
【００８１】
実施例７の改変プロテオグリカンの相対粘度を実施例３と同一の相対粘度計を用いて分析した。実施例７の改変プロテオグリカン２５．３ｍｇを５ｍＬの蒸留水に溶解し、この水溶液５ｍＬをオストワルド相対粘度計に移し、粘度を測定した。実施例７の改変プロテオグリカンの水分含量は１４重量％なので、乾燥重量で換算すると、２１．８ｍｇ／５ｍＬ水溶液となり、濃度は０．４４ｗ／ｖ％となる。水温２６．５℃の水槽中で純水の粘度を１としたとき、実施例７の改変プロテオグリカンの相対粘度は６．０であった。
【００８２】
実施例７の改変プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であり、原料の鮭由来プロテオグリカンの０．２０ｗ／ｖ％水溶液のｐＨは６．２であった。
【実施例１０】
【００８３】
（改変プロテオグリカンの製造４）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。プロトン型の強酸性陽イオン交換樹脂（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ、商品名：ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ（バイオラッド社））に、原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。溶出液をウォーターバスで４７℃に加温しながら約１０ｍＬになるまで４５分間減圧濃縮した後、凍結乾燥し、０．３２ｇの改変プロテオグリカンを得た。
【００８４】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、６．３％（重量比）であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、３８．３％（重量比）であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５％（重量比）、ウロン酸含量は３４．６％（重量比）であった。これらの結果から、本実施例で製造した改変プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンのそれぞれ約９７％および約１１１％であり、改変前とほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００８５】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの相対粘度をオストワルド式で測定した。測定器具にはオストワルド相対粘度計Ｎｏ．１（柴田科学（株）製）を用い、溶媒は脱イオン水とし、本実施例で製造した改変プロテオグリカンの５ｍｇ／ｍＬ水溶液の粘度を２６．５℃の水浴中で測定した。結果、本実施例で製造したプロテオグリカン分解物５ｍｇ／ｍＬ水溶液の相対粘度は１．１であった。原料の鮭由来プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液について同様の条件で測定したところ、相対粘度は３．７であった。
【００８６】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの分子量をゲルろ過法により測定した。ゲルろ過用樹脂はトヨパールＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。本実施例で製造した改変プロテオグリカン１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。その結果から、本実施例で製造した改変プロテオグリカンの分子量は３２ｋＤａと算出された。
【００８７】
なお、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量測定については、ゲルろ過用樹脂はＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００ ＨＲ（内径２．８ｃｍ、高さ１２０ｃｍ、ＧＥヘルスケア社製）、ポンプはＡＣ−２１２０ペリスタ・バイオミニポンプ（アトー（株）製）、フラクションコレクターはＡＤＶＡＮＴＥＣＦＲＣ−２１２０ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（アドバンテック東洋（株）製）を用いた。原料の鮭由来プロテオグリカン１０ｍｇを０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解した溶液を、カラム上方から添加した。溶離液は０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、５．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量１，４００，０００、６７０，０００、４１０，０００、１５０，０００、シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。その結果から、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上と確認された。
【００８８】
原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量との比較より、本実施例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮭由来プロテオグリカンが約４４分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【００８９】
上記実施例と同様に吸水・保水量を測定したところ、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、本実施例で製造した改変プロテオグリカンは７．６ｇ／日であった。本実施例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、約２．８倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００９０】
以上の結果から、プロトン型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンは、高い保水性を有するものの、分解されており、そして粘度も下がっていることが明らかになった。なお、ナトリウム型陽イオン交換樹脂またはカリウム型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンにおいては、そのような分解は観察されず、安定であった。
【実施例１１】
【００９１】
（改変プロテオグリカンの製造５）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。プロトン型の強酸性陽イオン交換樹脂（内径２ｃｍ、高さ８ｃｍ、商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ、三菱化学（株）製）に、原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１００ｍＬ流下した。溶出液をウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで３０分間減圧濃縮した後、凍結乾燥し、０．３５ｇの改変プロテオグリカンを得た。
【００９２】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンのタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、６．３％（重量比）であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、３７．２％（重量比）であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５％（重量比）、ウロン酸含量は３４．６％（重量比）であった。これらの結果から、本実施例で製造した改変プロテオグリカンのタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンのそれぞれ約９７％および約１０８％であり、改変前ととほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００９３】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの相対粘度をオストワルド式で測定した。測定器具にはオストワルド相対粘度計Ｎｏ．１（柴田科学（株）製）を用い、溶媒は脱イオン水とし、本実施例で製造した改変プロテオグリカンの５ｍｇ／ｍＬ水溶液の粘度を２６．５℃の水浴中で測定した。結果、本実施例で製造した改変プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液の相対粘度は１．２であった。原料の鮭由来プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液について同様の条件で測定したところ、相対粘度は３．７であった。
【００９４】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの分子量をゲルろ過法により測定した。ゲルろ過用樹脂はトヨパールＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。本実施例で製造した改変プロテオグリカン１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。その結果から、本実施例で製造した改変プロテオグリカンの分子量は１２ｋＤａと算出された。
【００９５】
実施例１０に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。本実施例で製造したプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、本実施例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮭由来プロテオグリカンが約１２０分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【００９６】
上記実施例と同様に吸水・保水性を測定したところ、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮭由来プロテオグリカン２．７ｇ／日に対して、本実施例で製造した改変プロテオグリカンは７．６ｇ／日であった。本実施例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮭由来プロテオグリカンと比較して、約２．８倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【００９７】
以上の結果から、プロトン型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンは、高い保水性を有するものの、分解されており、そして粘度も下がっていることが明らかになった。なお、ナトリウム型陽イオン交換樹脂またはカリウム型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンにおいては、そのような分解は観察されず、安定であった。
【実施例１２】
【００９８】
（改変プロテオグリカンの製造６）
原料となるプロテオグリカンを常法により鮫から調製した。市販の鮫軟骨粉末１００ｇに対して、５％酢酸（関東化学（株）製）を１Ｌ加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により固形分を除去し、溶液を得た。この溶液を分画分子量１０万の限外ろ過膜（ミリポア社製）を装着した卓上循環式濃縮装置（（株）トライテック製）に通し、加水しながら、分子量１０万以上の成分を集めた。残っている低分子成分を除去するため、透析用セルロースチューブ（エーディア（株）製）に分子量１０万以上の画分を入れ、４℃の低温室で、水に対して３日間透析した。外液の水は定期的に交換した。透析用セルロースチューブ内の溶液を凍結乾燥し、０．８ｇの鮫由来プロテオグリカンを得た。
【００９９】
プロトン型の強酸性陽イオン交換樹脂（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ、商品名：ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ、バイオラッド社製）に、原料の鮫由来プロテオグリカン０．２ｇを脱イオン水２０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１００ｍＬ流下した。溶出液をウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで３０分間減圧濃縮した後、凍結乾燥し、０．１７ｇの改変プロテオグリカンを得た。
【０１００】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの相対粘度をオストワルド式で測定した。測定器具にはオストワルド相対粘度計Ｎｏ．１（柴田科学（株）製）を用い、溶媒は脱イオン水とし、本実施例で製造した改変プロテオグリカンの５ｍｇ／ｍＬ水溶液の粘度を２６．５℃の水浴中で測定した。結果、本実施例で製造した改変プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液の相対粘度は１．１であった。原料の鮫由来プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液について同様の条件で測定したところ、相対粘度は１．６であった。
【０１０１】
本実施例で製造した改変プロテオグリカンの分子量をゲルろ過法により測定した。ゲルろ過用樹脂はトヨパールＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。本実施例で製造した改変プロテオグリカン１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めたその結果から、本実施例で製造したプロテオグリカン分解物の分子量は１２ｋＤａと算出された。
【０１０２】
原料の鮫由来プロテオグリカンと、本実施例で製造した改変プロテオグリカンそれぞれ０．１ｇを、脱イオン水５０ｍＬに溶解し、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株）製）に入れ、上下の口を封じ水中に浮遊させ、４℃の低温室で、水に対して透析した。水の交換は１週間に一度行った。吸水したセルロースチューブの重量を不定期に３０日間測定し、あらかじめ測定した風袋重量を控除し、吸水・保水した量を求めた。その結果、１日当たりの重量の増加量は、原料の鮫由来プロテオグリカン１．９ｇ／日に対して、本実施例で製造した改変プロテオグリカンは４．８ｇ／日であった。本実施例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮫由来プロテオグリカンと比較して、約２．５倍の吸水・保水量があり、高保水性を有することが明らかとなった。
【０１０３】
以上の結果から、プロトン型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンは、高い保水性を有するものの、分解されており、そして粘度も下がっていることが明らかになった。なお、ナトリウム型陽イオン交換樹脂またはカリウム型陽イオン交換樹脂での処理によって製造された改変プロテオグリカンにおいては、そのような分解は観察されず、安定であった。
（比較例１）
【０１０４】
（塩酸との混合処理による改変プロテオグリカン）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水１６０ｍＬに溶解し、撹拌しながら、塩酸の終濃度が０．０５Ｍになるように１Ｍ塩酸を８．４ｍＬ滴下した。４℃で３時間撹拌した後、反応液を透析用セルロースチューブ（エーディア（株）製）に入れ、外液を２５ｍＭ塩酸にし、４℃で一晩透析した。その後、外液を脱イオン水に変え、３日間透析した。外液の脱イオン水は１日３回交換した。セルロースチューブ内液を回収し、ウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで３０分間減圧濃縮した。濃縮液を凍結乾燥し、０．３４ｇの改変プロテオグリカンを得た。
【０１０５】
本比較例で製造した改変プロテオグリカンの分子量をゲルろ過法により測定した。ゲルろ過用樹脂はトヨパールＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。本比較例で製造した改変プロテオグリカン１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。その結果から、本比較例で製造した改変プロテオグリカンの分子量は１２ｋＤａと算出された。
【０１０６】
実施例１０に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。本比較例で製造した改変プロテオグリカンと原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、本比較例で製造した改変プロテオグリカンは、原料の鮭由来プロテオグリカンが約１２０分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【実施例１３】
【０１０７】
（種々の改変プロテオグリカンの製造および性質）
上記の実施例により、原料のプロテオグリカンにおける二価カチオン（特に、カルシウム量）を減らすことによって、プロテオグリカンの保水性が向上することが明らかになったが、さらに詳細にプロテオグリカンの保水性向上の条件を検討するために、種々の改変プロテオグリカンを製造し、その性質を検討した。
【０１０８】
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた。この原料のプロテオグリカンは、４．４重量％のカルシウムおよび０．２重量％のマグネシウムを含み、サンプル１ｇ当たりの二価カチオンを１．１８ｍｍｏｌ／ｇ含んでいた。タンパク質含量は６．５重量％であり、中性糖含量は４．０重量％、コンドロイチン硫酸含量は８０．８重量％だった。分子量は（１．３０４±０．１７１）×１０６であった。
【０１０９】
このプロテオグリカンの４００ｍｇ／３０ｍＬ溶液を、ナトリウム型、カリウム型、プロトン型、カルシウム型、マグネシウム型の強酸性陽イオン交換樹脂（ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８；バイオラッド）に、室温で添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１５０ｍＬ流下し、得られた溶出液約１７０ｍＬをエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥し、３２５〜３８３ｍｇの白色綿状固体である改変プロテオグリカンを得た。以下、ナトリウム型陽イオン交換樹脂を用いて改変した改変プロテオグリカンをＮａ−ＰＧと、カリウム型陽イオン交換樹脂を用いて改変した改変プロテオグリカンをＫ−ＰＧと、カルシウム型陽イオン交換樹脂を用いて改変した改変プロテオグリカンをＣａ−ＰＧと、プロトン型陽イオン交換樹脂を用いて改変した改変プロテオグリカンをＨ−ＰＧと、マグネシウム型陽イオン交換樹脂を用いて改変した改変プロテオグリカンをＭｇ−ＰＧと、それぞれ称する。
【０１１０】
また、プロテオグリカンを塩酸と混合して撹拌し、カルシウム含量が０．５重量％（Ｃａ減少ＰＧ１と称する。）および２．４重量％（Ｃａ減少ＰＧ２と称する。）となったカルシウム減少プロテオグリカンも製造した。なお、陽イオン交換樹脂を用いないこのような方法では、二価カチオンを完全に除去するための条件を見出すためには、塩酸処理等の条件について試行錯誤が必要である。さらに、このような陽イオン交換樹脂を用いない方法では、一般的にプロテオグリカンが分解しやすい傾向にあるため、二価カチオンの完全な除去とプロテオグリカンの分解の防止とのバランスを取る条件についても試行錯誤の必要がある。それに対して、陽イオン交換樹脂（特に、ナトリウム型陽イオン交換樹脂またはカリウム型陽イオン交換樹脂）を用いた場合には、プロテオグリカンの分解を防ぎつつ二価カチオンのほぼ完全な除去が達成された。
【０１１１】
各種改変プロテオグリカンの保水性は上記実施例と同様に測定した。
【０１１２】
以下に、原料のプロテオグリカン（表中「非改変」と称する。）および各種改変プロテオグリカンのカルシウム量、マグネシウム量、二価カチオン量、保水性、Ｈ−ＰＧを１としたときの保水性の比率を表にまとめる。
【０１１３】
【表１】
2017125164.tif 000003
この原料のプロテオグリカンについて二価カチオン量の飽和値を求めた。ここでは、元素分析による硫黄原子を測定により硫酸エステル基を測定して硫酸基の量を測定し、カルバゾール硫酸法等でカルボキシル量を測定した。なお、飽和値を求めるに当たり、予備実験を行ったところ、ＰＧ中の糖鎖由来（硫酸エステル基由来）の硫黄原子の量は、タンパク質由来の硫黄原子の量の約７０倍という計算結果となった。よって、本実施例では、元素分析によって得られる硫黄原子の量を、糖鎖由来（硫酸エステル基由来）の硫黄原子の量として表すことを前提に測定を行った。カルボキシル基はウロン酸由来であり、ウロン酸量から算出した。
【０１１４】
本サンプルの飽和値について具体的に特定したところ、元素分析装置（全自動元素分析装置  ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ＣＵＢＥ、ｅｌｅｍｅｎｔａｒ社製）で測定した結果、硫黄原子は４．６７重量％、硫酸エステル基に換算すると１４．１重量％（＝１．４５ｍｍｏｌ／ｇ）含まれることが分かった。また、カルバゾール硫酸法によりウロン酸を定量した結果、３３．３重量％（グルクロン酸換算）となり、カルボキシ基に換算すると７．７重量％（＝１．７１ｍｍｏｌ／ｇ）であることが分かった。二価カチオンは、硫酸エステル基とウロン酸に結合するにはそれぞれモル換算で２倍要することから、飽和値は、
（１．４５＋１．７１）／２＝１．５８ｍｍｏｌ／ｇ
であると算出された。したがって、Ｃａ−ＰＧおよびＭｇ−ＰＧについてはほぼ飽和値に近い値にまで二価カチオンが付加されていることが分かった。
【０１１５】
表１に示されるように、二価カチオン量の減少と保水性の増加とに相関性が観察された。より具体的には、原料のプロテオグリカンと比較してカルシウム量が増加したＣａ−ＰＧと、マグネシウム量が増加したＭｇ−ＰＧとは、いずれも原料と比較して保水性が悪化していた。Ｃａ−減少ＰＧ１およびＣａ−減少ＰＧ２については保水性の向上は観察されたが、不十分であった。他方で、原料のプロテオグリカンと比較して二価カチオン量が減少したＮａ−ＰＧ、Ｋ−ＰＧ、Ｈ−ＰＧはいずれも顕著に保水性が向上していた。
【０１１６】
Ｃａ減少ＰＧ以外の改変プロテオグリカンと、原料のプロテオグリカンの保水性を図６にまとめた。原料の非改変のプロテオグリカンに対して、Ｎａ−ＰＧ、Ｋ−ＰＧおよびＨ−ＰＧはいずれも２．８倍ほどの保水性の増加を示した。
【実施例１４】
【０１１７】
（改変プロテオグリカンを含む化粧品の製造）
実施例１の改変プロテオグリカンを含む美容液を試作した。実施例１の改変プロテオグリカン６ｍｇ（水分含量１３重量％）とビタミンＣ２５０ｍｇ、グリセリン１０ｍＬを蒸留水４０ｍＬに溶解し、ガラス瓶に入れ、完成である。得られた美容液は、無色透明、清澄であり、肌に塗布したとき、べたつき感がなくさらさらしているが、しっとり感が感じられるものであった。
【実施例１５】
【０１１８】
次に、実施例１の改変プロテオグリカンを含むクリ−ムを試作した。実施例１の改変プロテオグリカン５ｍｇ（水分含量１３重量％）を水１２ｍＬに溶解し、オリ−ブオイル１０ｍＬ、乳化ワックス３ｇを混合し、広口のプラスチックの瓶に入れた。また、プロテオグリカンを含まないクリームを同様に試作した。水１２ｍＬにオリ−ブオイル１０ｍＬ、乳化ワックス３ｇを混合し同様に試作した。結果、両者のクリ−ムを肌に塗布したとき、プロテオグリカンを含むクリームは、含まないクリームよりしっとり感が感じられるものであった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の改変プロテオグリカンは、化粧品、健康食品、栄養補助食品または医薬に有用であり、保水性が高いため特に化粧品に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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