【手続補正書】
【提出日】平成18年8月30日(2006.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ヒトエリスロポエチンの生産
【特許請求の範囲】
【請求項１】  宿主細胞を適切な栄養条件で培養する段階を含む、哺乳動物宿主細胞中におけるヒトエリスロポエチンの生産方法であって、該宿主細胞が骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターにより制御されるヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされており、該栄養条件が血清を含まず蛋白質も含まない培地であることを含むものである方法。
【請求項２】  ＤＮＡ配列がゲノミッククローンに由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  宿主細胞が腎臓細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】  細胞がベビーハムスター腎臓細胞、好ましくはＢＨＫ２１細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  血清を含まず蛋白質も含まない培地がツルボドーマ(Turbodoma)培地である、請求項１ないし請求項４の何れかに記載の方法。
【請求項６】  宿主細胞がそのトリプトファン産生能力により選択される、請求項１ないし請求項５の何れかに記載の方法。
【請求項７】  宿主細胞が大腸菌のトリプトファンシンセターゼ（trpB）遺伝子の発現によりトリプトファンを生産し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  さらに、宿主細胞の培養後、細胞培養培地からエリスロポエチンを回収する段階を含む、請求項１ないし請求項７の何れかに記載の方法。
【請求項９】  骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターにより制御されるヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、血清を含まず蛋白質も含まない培地中で培養された哺乳動物宿主細胞。
【請求項１０】  大腸菌のトリプトファンシンセターゼ（trpB）遺伝子の発現によりトリプトファンを生産し得る、請求項９に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項１１】  細胞が腎臓細胞、好ましくはベビーハムスター腎臓細胞、最も好ましくはＢＨＫ２１細胞である、請求項９または請求項１０に記載の哺乳動物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターにより誘導されるヒトエリスロポエチン遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換された哺乳動物細胞、特に腎臓細胞中における、組換え体ヒトエリスロポエチンの生産に関する。さらに本発明は、選択可能マーカーとして大腸菌(Escherichia coli)由来のトリプトファンシンセターゼ遺伝子を用いるエリスロポエチン生産細胞の調製に関する。本発明はさらに、血清を含まず蛋白質も含まない培地を用いる細胞培養プロセスの改良にも向けられている。
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポエチンは、循環しているエリスロポエチン量の生理学的レベルを調節し維持する主要なホルモンであり、赤血球生成の早い段階で骨髄幹細胞の細胞分化を刺激し、最終的に赤血球になる分化細胞の増殖と成熟を促進する。エリスロポエチンは、３４ないし３８ｋＤａの範囲の分子量を有し、その約４０ないし５０％が炭化水素部分とみられる糖蛋白質である。それは原始的には成人の腎臓内、および哺乳動物胎児の肝臓内に産生する。身体が健常状態にあり、組織が赤血球の現存数により充分に酸素供給を受けているときは、エリスロポエチンは血漿内に極めて低い濃度で存在している。この通常の低濃度は、通常の加齢によって失われてゆく赤血球の置換を刺激するには充分である。低酸素血症状では循環する赤血球により輸送される酸素が減少し、循環系内のエリスロポエチン量が増加する。低酸素血症は、出血による大量の失血、放射線への過度の曝露による赤血球の破壊、高い高度あるいは人事不省による酸素取り込みの減少、または各種型の貧血により生じる。健康な生物ではホメオスタシス機構が、貧血の程度に応じて最適ヘマトクリット値を維持するように血中のエリスロポエチン濃度の増加を誘導する。
【０００３】
しかしながら、慢性腎不全による貧血の場合は、進行性の腎実質および肝機能破壊のためエリスロポエチンが産生され得ず、従って、循環系中のエリスロポエチン濃度が増加しない。
エリスロポエチンは今や各種貧血症、特に慢性腎不全症の認容された処置として定着するに至っている。エリスロポエチンを含有する医薬製品は、さらに赤血球生成刺激による、腎機能低下のためあるいは腎摘出後のため血液透析を受けている患者の貧血予防および術後患者の回復促進などでも、臨床的に適用されている。
【０００４】
組換え体ヒトエリスロポエチンは、哺乳動物細胞中で産生された最初の組換えバイオ医薬品として貧血症の処置のために入手可能となったものである。例えば、ドイツではＣＨＯ−Ｋ１セルライン中で産生された組換え体エリスロポエチンがJanssen-CilagからErypoの商品名（登録商標）で販売されている。
【０００５】
ヒトエリスロポエチン遺伝子は、既に１９８５年に単離され、特性を調べられている(Lin et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7580-7584; Jacobs et al. (1985) Nature 313, 806-810)。この遺伝子の全コード化領域は5.4キロベースHindIII-BamHI断片内に含まれており、この遺伝子は４つのイントロン(1562塩基対)と５つのエクソン(582塩基対)とを含み、ヒトエリスロポエチン分泌のための２７アミノ酸シグナルペプチド、および１６６アミノ酸の成熟蛋白質をコードしている。さらに、エリスロポエチンは、インビボでの活性に必要なシアル酸を含有している。非グリコシル化（糖鎖付加のない）エリスロポエチンはインビトロの活性は有するが、インビボでは全く活性を示さない。これは、非グリコシル化（糖鎖付加のない）蛋白質の半減期がヒトの循環系では極端に短いことによる。従って、治療に使用するためのエリスロポエチンは、天然ヒト糖タンパク質と類似のグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞で製造しなければならない。
【０００６】
Lin et al.（前記）は、ＳＶ４０後期プロモーターにより誘導されるゲノミックエリスロポエチン遺伝子を含有する発現ベクターで安定的に形質転換した、ＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞中での組換え体ヒトエリスロポエチン産生を記載しており、他方、前記のJacobs et al.は、アデノウイルスの主要後期プロモーターの制御下にヒトエリスロポエチンｃＤＮＡを含有するベクターでトランスフェクトした、ＣＯＳ細胞（組み込まれたＳＶ４０ＤＮＡのセグメントを含有する猿細胞由来のセルライン）中の一過性発現実験でのエリスロポエチン産生を開示している。
【０００７】
さらに、欧州特許出願No.0148605には、猿エリスロポエチンｃＤＮＡクローンおよびヒトゲノミッククローンの単離および性質特定、および、ＣＯＳ−１およびＣＨＯセルライン中での組換え体エリスロポエチンの産生が記載されている（但し、猿およびヒトのエリスロポエチン遺伝子発現はＳＶ４０後期プロモーターの制御下で行う）。
【０００８】
欧州特許出願No.0225231には、エリスロポエチン遺伝子をアデノウイルス−２主要後期プロモーター、またはマウスのＭＴ−Ｉ（metallothionein-I）プロモーターのいずれかの制御下に発現させる、安定的にトランスフェクトした哺乳動物のセルライン中でのエリスロポエチン産生プロセスが記載されている。
【０００９】
さらに、欧州特許出願No.0232034には、ヒト細胞中での、即ち、ナマルワ（Namaluwa）細胞中での、ＳＶ４０プロモーターを用いてエリスロポエチンの発現を誘導し、ネオマイシン耐性(neor)遺伝子を選択可能なマーカーとして用いる、組換え体エリスロポエチンの産生が記載されている。
【００１０】
同様に、欧州特許出願No.0236059には、Ｍ−ＭｕＬＶ(Moloney murine leukemia virus)ＬＴＲプロモーターの制御下で、neor遺伝子を選択可能なマーカーとする、ヒトエリスロポエチン遺伝子を保持する発現ベクターでトランスフェクトした、腎臓細胞中でのエリスロポエチンの産生が開示されている。
しかしながら、大規模なエリスロポエチンの生産に適する効果的な発現システムがなお必要とされている。
【００１１】
（発明の開示）
本発明の目的の一つは、従って、哺乳動物細胞中で高レベルにエリスロポエチンを発現させるエリスロポエチン発現ベクターを提供すること、および、該発現ベクターをベースとする組換え体エリスロポエチンの生産プロセスを提供することである。
【００１２】
驚くべきことに、ＭＰＳＶ(骨髄増殖性肉腫ウイルス、myeloproliferative sarcoma virus)プロモーターおよびゲノミックエリスロポエチンＤＮＡ配列をベースとする新しい宿主ベクター系を用いると、哺乳動物細胞におけるエリスロポエチン生成物を、細胞培養液上澄み中の全蛋白質の５０％以上にも及ぶ大画分となし得ることが判明した。
【００１３】
本発明は、従って、ＭＰＳＶ（骨髄増殖性肉腫ウイルス)プロモーターにヒトエリスロポエチン遺伝子を作動可能なように連結させてある新規発現ベクターを提供するものである。さらに、該新規発現ベクターをトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞を適切な栄養条件下に培養する段階を含む、哺乳動物宿主細胞中にエリスロポエチンを生産させるプロセスを提供するものである。
【００１４】
骨髄増殖性肉腫ウイルスは、以前、Ostertage et al. (1980) J. Virol. 33,573-582;よって報告され；ネズミの線維芽細胞（murine fibroblasts）を形質転換し、さらに血液生成系の細胞中に変化を起こさせるものとして知られている。この本発明で用いるＭＰＳＶプロモーターは、既に、例えば、Artelt et al.(1988) Gene 68, 213-219によって研究されている。
【００１５】
好ましい態様では、哺乳動物宿主細胞中でエリスロポエチンを生産させるこのプロセスは、（１）エリスロポエチンの発現がＭＰＳＶプロモーターの制御下にあるエリスロポエチン発現ベクターの調製、（２）該エリスロポエチン発現ベクターの哺乳動物宿主細胞中への導入、（３）該細胞の培養によるエリスロポエチンの生産、および（４）該細胞培地からのエリスロポエチンの回収、の各段階を含むものである。
好ましくは、哺乳動物宿主細胞は腎臓細胞であり、最も好ましくは、ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞、例えば、ＢＨＫ２１である。
【００１６】
先行技術の多くは、ＤＨＦＲ遺伝子によりコードされる酵素ジヒドロフォレートリダクターゼ（dihydrofolate reductase;ＤＨＦＲ）が、メトトレキセート（methotrexate）薬剤によって阻害され得るという事実およびヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地中で増殖した細胞がメトトレキセートによって阻害または殺滅されるという事実に依拠する、ＤＨＦＲ選択系を使用している。適当な条件下、例えばメトトレキセートの最小濃度においては、メトトレキセート含有培地中で耐性があり生育し得る細胞を取得することができる。これらの細胞は、それらのＤＨＦＲ遺伝子数が増幅すること、そのためＤＨＦＲ酵素産生の増加を来すことからメトトレキセート耐性であることが分る。
【００１７】
これらの生存細胞は、順次メトトレキセートの濃度増加処理を受けてより多くのＤＨＦＲ遺伝子数を含有する細胞株となり得る。興味の対象である、ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に発現ベクター上に運び込まれた、またはＤＨＦＲ遺伝子と共に形質転換された遺伝子、例えば、エリスロポエチン遺伝子は、しばしばそれらの遺伝子コピー数を増加して見出される。従って、このＤＨＦＲ系は概して選択／増幅の組合わせアプローチで用いられる。しかしながら、このＤＨＦＲ選択／増幅系の使用には、それに伴う若干の問題点がある。メトトレキセートの強い毒性のために、全生産プロセスを通して選択圧を維持することができない。高度生産も、培地からメトトレキセートを一旦除去すると、普通の生産性に戻ってしまうことが多い。
【００１８】
さらに、先行技術でよく用いられている別の坑代謝物耐性マーカー、neoマーカーには、哺乳動物細胞中で形質転換体を選択するのに高価な薬剤であるＧ４１８を比較的に大量使用しなければならないという本質的な不都合がある。
従って、本発明の他の目的は、エリスロポエチン生産についての先行技術中で記載されている選択マーカーシステムの不都合を克服し、かつ有毒添加物を用いずに、哺乳動物細胞中でエリスロポエチンを大量生産させるプロセスを提供することにある。
【００１９】
本発明によれば、トリプトファン生成能力に基づいて選択される哺乳動物宿主細胞中でエリスロポエチンを生産させるプロセスが提供される。
【００２０】
多くの哺乳動物細胞は、ある種の、所謂必須アミノ酸合成に必要な酵素性経路を欠落しており、そのためそれらを外部ソースから得なければならない。必須アミノ酸１種の不存在だけでも蛋白質合成のほぼ５０％が阻害される；基礎的な速度は明かに内在性蛋白質の代謝回転によって維持される。1988年、Hartman and Mulligan (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047-8051)は、形質転換した哺乳動物細胞の代謝性選択用マーカーとしてトリプトファンを適用できることを発見した。このマーカーシステムは、インドールのトリプトファンへの変換を触媒する大腸菌のトリプトファン合成遺伝子（trpB）をベースとするものである。しかしながら、これまでのところ、trpB遺伝子がエリスロポエチン生産に有用な選択マーカーとして記載されたことは全くない。
【００２１】
驚くべきことに、trpBを選択マーカーとして使用することにより、選択した宿主細胞中で、遺伝子増幅なしに高いエリスロポエチンの発現レベルを観測できることが判明した。
【００２２】
好ましい態様では、トリプトファンシンセターゼ遺伝子を、エリスロポエチン発現ベクターと共に、宿主細胞にコトランスフェクトする。しかしながら、適切なプロモーター、好ましくはＭＰＳＶプロモーターの制御下のヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列と、やはり適切なプロモーターの制御下のtrpB遺伝子とを含有する単一核酸分子で、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトすることも勿論可能である。
【００２３】
細胞培養培地に普通加えられている血清、例えば、牛胎児血清が、トリプトファンバックグラウンドを示すという事実があるため、血清は透析してトリプトファンを除去しておくべきである。それ故、このtrpB選択システムは、トリプトファンを無毒かつ安価なインドールでより容易に置き換え得る、血清を含まない培地中での大規模生産に特に有用である。
それ故、好ましい態様では、このエリスロポエチン大量生産プロセスは、外因性トリプトファンを欠く血清を含まない培地中で、哺乳動物宿主細胞を培養する段階を含む。好ましくは、この宿主細胞は腎臓細胞、好ましくはＢＨＫ細胞、例えば、ＢＨＫ２１である。
【００２４】
上で言及したように、現今の生産プロセスは、例えば牛胎児血清を含有する培地中で生育する組換え体チャイニーズハムスター卵巣細胞のような組換え体哺乳動物細胞のローラーボトル培養をベースとするものである。血清の添加は、細胞増殖のために必要な増殖因子を供給するために必須である。この添加物の存在は、しかしながら、幾つかの観点から有害なものであり：主たる懸念は生成物の安全性である。製造プロセスから医薬製品を経由して患者に病原性因子を移送する危険については、特に狂牛病（ＢＳＥ; bovine spongiform encephlopathy）が広範囲に蔓延したとき以来、格別の考慮が払われている。下流の工程の間に不活化されないプリオン（purions）は、ウイルスと同様に、プロセスに際して重大な危険を与える。この心配があるために、この危険を最小化するために必要な安全性の基準は、原材料（血清）についてのおびただしい試験から最終製品の性状検査に至るまで、すさまじいものとなっている。
【００２５】
製造プロセスにおいて全ての生物学的誘導材料を排除することが製品の品質および安全性を顕著に増加させるばかりでなく、同時に製造コストを低減し製品の承認も簡易化するので、血清を含まず蛋白質も含まない培地を使用することは、組換え体哺乳動物細胞の培養に少なからぬ利点を与えるものである。
【００２６】
例えば、EP-A-0148605は、0.1mM非必須アミノ酸およびL−グルタミンを補った高グルコースＤＭＥＭ、または、0.05mM非必須アミノ酸およびL−グルタミンを補った、高グルコースＤＭＥＭとHam'sF12との50−50混合物である、血清を含まない生育培地中でのＣＨＯ細胞からのエリスロポエチンの製法を開示している。
さらに、欧州特許出願No.0513738には、動物インシュリンの代わりに原核細胞由来の組換え体インシュリンおよびトランスフェリン、並びに水溶性鉄化合物を含有する、血清を含まない培地中での哺乳動物細胞の培養が記載されている。
【００２７】
EP-A-0531911は、ポリビニールフォルマルおよびポリビニールブチラル由来の培地表面を使用し、細胞が好ましくは連続単層として培養された、蛋白質を含まない培地中でのベロ細胞（vero cell）の培養プロセスを記載している。
しかしながら、多くの場合、血清を含まない培地中での培養は、その前に特別の適合ストラテジーにより血清を含まない培地中での生育に適合させたセルライン、例えば、Zang et al. (1995) により Bio/Technology 13, 389-392に記載されている適合させたＣＨＯ ＳＳＦ３セルライン、または Sinacore et al.(1996) により Biotechnology and Bioengineering 52, 518-528に記載されているＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞系譜（cell lineage）、との関係おいてのみ言及されている。
【００２８】
ＢＨＫ２１細胞が、適合化または遺伝子操作しなくても、血清を含まず蛋白質も含まない培地製剤である Turbodoma および Turbodoma HP-1（Dr. F. Messi Cell Culture Technologies Buhnrain社、14, 8052 Zurich, Switzerland製品）中で生育することが見出された。この細胞は、10％の胎性子牛血清と2mMのL-グルタミンを含有するEagle's 最小必須培地からTurbodoma 培地中に移したのちも、有意な生育力および生育速度の下降を伴わずに細胞増殖を継続した。しかも、この培地製剤で、ＢＨＫ２１細胞の培養は、懸濁液中でも担体に結合させてもいずれの場合も可能であった。従って、反応系およびプロセスパラメーターを多様に選択適用できる。
【００２９】
本発明の好ましい態様では、本発明の血清を含まず蛋白質も含まない培地中で培養した、好ましくはＢＨＫ２１セルラインである哺乳動物セルラインは、ヒトエリスロポエチンを生産する能力を有する。最も好ましくは、この血清を含まず蛋白質も含まない培地は、インドールを含有するが、しかし、トリプトファンは含有しないものとし、そのためトリプトファンシンセターゼ活性によりトリプトファンを産生し得るような細胞のみが生育し得るようにする。このトリプトファンシンセターゼ酵素活性は、細胞を、大腸菌由来のtrpB遺伝子を保有する核酸分子でトランスフェクトすることにより具備するに至る。このtrpB遺伝子は、任意のプロモーター、即ち、哺乳動物細胞中での転写をプロモートするプロモーター、例えば、ウイルス性プロモーター類例えばシミアンウイルス(simian virus)４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、ＨＩＶおよびＭＰＳＶのプロモーター、などの制御下に置くことができる。
【００３０】
それ故、好ましい態様では、本発明は、ヒトエリスロポエチンの生産プロセスであり、（１）エリスロポエチンの発現がＭＰＳＶプロモーターの制御下にあるエリスロポエチン発現ベクターの調製、（２）該エリスロポエチン発現ベクターのＢＨＫ２１細胞中への導入、（３）インドールは含有するがしかし外因性のトリプトファンは欠落している、蛋白質を含まず血清も含まない培地中での該細胞の培養、の各段階を含むものである。
【００３１】
エリスロポエチンの発現がＭＰＳＶプロモーターの制御下にあるエリスロポエチン発現ベクターを使用し、この発現ベクターで形質転換した真核宿主細胞を、蛋白質を含まず血清も含まない培地中で培養することにより、ＥＰＯ発現レベルが、先行技術に記載されているプロモーター／エリスロポエチン融合構成物を使用する場合より際立って高くなることを見出した。同じことが、通常の培地との対比において、あるいは先行技術に記載されているような予め血清を含まない培地中で生育するように適合化させたセルラインとの対比において、蛋白質を含まず血清も含まない培地中で、ＭＰＳＶ／エリスロポエチン融合構成物で形質転換した真核細胞中にエリスロポエチンを産生させる場合にも当てはまる。
【００３２】
本明細書中では、「エリスロポエチン」の用語は、エリスロポエチンの生物学的活性を有する；即ち、赤血球生成を刺激する能力がある、蛋白質を定義していることを意味する。この蛋白質は、ゲノミックＤＮＡ配列により、またはｃＤＮＡクローンによりコードされ得る。さらに、「エリスロポエチン」の用語は、天然に存在するエリスロポエチンの生物学的活性を有する蛋白質断片をも含んでいる。好ましくは、組換え体蛋白質は、アミノ酸配列および数（成熟蛋白質では１６６アミノ酸）、その約４０％ないし５０％が炭水化物部分に基づく約３４ないし３８ｋＤａの分子量について、完全にまたは少なくとも実質的に、天然に存在するヒトエリスロポエチンと対応している。
【００３３】
ヒトエリスロポエチンに対する遺伝子は、例えば、American Type Culture Collectionから、ＡＴＣＣ No.40381のラムダ HE 1 ファージ凍結乾燥物として入手可能である。
【００３４】
さらに、「プロモーター」の用語は、核酸分子中で遺伝子（ゲノミックまたはｃＤＮＡクローン）に先行し、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写開始部位を提供しているＤＮＡ配列を定義していることを意味する。従って、「発現ベクター」の用語は、その中で、発現させようとしている遺伝子にプロモーターが作動可能なように連結しており、該ベクターを宿主細胞内に導入したのち、宿主細胞を該遺伝子によりコードされている蛋白質を産生し得るようにする、核酸分子を定義している。しかしながら、作動可能なようにプロモーター（特にＭＰＳＶプロモーター）に融合している有用な遺伝子（特にエリスロポエチン遺伝子）に加えて、発現ベクターはさらなるプロモーター配列または他の調節配列、例えば、エンハンサー配列例えばＳＶ４０、アデノウイルス、レトロウイルスのＬＴＲ、またはイムノグロブリン遺伝子、ポリアデニル化配列、または選択可能なマーカー配列を含有していてもよい。適切な発現ベクターは、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York による標準マニュアルに記載されているような通常のクローン化技術を用いて取得できる。
【００３５】
用語「宿主」は、非相同の（異種起源の、heterologous）核酸分子で安定的に形質転換される、従って、そのゲノム中に該核酸分子または少なくともその部分を含有し、そして該核酸分子は該細胞により発現される、即ち転写および翻訳される遺伝子を保有しており、そして所望により遺伝子生成物が該細胞によって分泌される、細胞を含む。
【００３６】
組換え体セルラインを確立するためには、種々の形質転換技法を採用できる。好ましくは、これらの細胞は、リン酸カルシウム法でトランスフェクトする（実施例２に記載）。しかしながら、他の通常のトランスフェクション法、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション技術、リゾチーム融合、プロトプラスト融合または赤血球融合、スクラッピング、直接取り込み、浸透性または蔗糖ショック、直接マイクロインジェクション、間接マイクロインジェクション、例えば赤血球媒介技術を介するもの、または宿主細胞への電流付加も使用できる。
【００３７】
一般に、トランスフェクションまたは形質転換による、とは、単離したＤＮＡ、ＲＮＡ、または組換え体ＤＮＡ技術による合成ヌクレオチドポリマーを用いる、遺伝情報、殊にｃＤＮＡまたはゲノミックエリスロポエチンクローンによりコードされる情報の細胞中への移送を意味する。遺伝情報、特にヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列情報の細胞中への移送は、選択可能マーカー、好ましくは大腸菌由来の選択可能マーカーであるトリプトファンシンセターゼ遺伝子との細胞のコトランスフェクションにより確認できる。
【００３８】
哺乳動物細胞の培養には、通常の培養方法、例えば、通常の組織培養に使用されるフラスコまたは皿を用いる懸濁培養、紡錘型容器中で培地を攪拌して懸濁液中で細胞を生育させる方法、その中に培地を連続的に循環させる中空の繊維内で細胞を生育させる方法、および動物細胞の培養用のジャーファーメンター中で細胞を生育させる方法、などを適用できる。
【００３９】
哺乳動物細胞の培養後、組換え体発現生成物を、培地から通常の精製技術、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（ハイドロキシアパタイト)、ゲル濾過法、染料クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィー、を用いて実質的に精製形態で回収できる。
最終的に、回収したエリスロポエチンの生物学的活性は、数種の異なる方法により測定できる。Kurtz および Eckardt は、Nephron (1989);51 Suppl 1:11-14 中で最近のアッセイを総説している。
【００４０】
（図面の簡単な説明）
図１は、８つの選択したＢＨＫ２１ｐＭＰＳＶｇＥＰＯ、および８つの選択したＣＨＯ Ｋ１：ＣｙｃＥｐＭＰＳＶｇＥＰＯクローンの上澄みからのWestern Blot を示す。
図２は、ＢＨＫ２１ｐＭＰＳＶｇＥＰＯクローン２由来の細胞培養液上澄みの銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１は濃縮していない上澄み液を示し、他方、レーン２は１０倍濃縮上澄み液を示す。
図３は、Coomassie 染色ＳＤＳ ＰＡＧＥ で分析した精製組換え体エリスロポエチンサンプルを示す。
【００４１】
本発明は、以下さらに詳しく例示的に説明する。
（実施例）
実施例１
エリスロポエチン発現ベクターｐＭＰＳＶｇＥＰＯの調製
【００４２】
American Type Culture Collectionから、ヒトエリスロポエチン遺伝子を、凍結乾燥ラムダHE 1ファージ（Lin et al., 前記ＡＴＣＣ No.40381）として入手した。ヒトエリスロポエチンのためのゲノミックＤＮＡを含有する断片を保有するラムダファージを充分量、この凍結乾燥ファージをＳＭ緩衝液（Sambrook et al.,前記）中に懸濁させ、そして該ファージを、0.3％グルコース、0.075mM ＣａＣｌ２、0.004mM ＦｅＣｌ３、2mM ＭｇＳＯ４および１mg/mlマルトースを含有するＬＢ寒天中でＬＥ392大腸菌細胞上にプレートすることにより調製した。このファージ粒子を、l5cmペトリ皿当たり10mのＳＭで一夜集めた。このライセート(lysate)50mlのファージＤＮＡを、Qiagen Lambda キットを用い、製造業者(Qiagen, Hilden, Germany)の指示どおりにして精製した。得られたＤＮＡの50％を20μlＨ２Ｏ中に取り込み、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびBamHI (New England Biolabs (NEB), Schwalbach, Germany)各30ユニットで消化した。5.4 kb 断片を 0.8％アガロースゲルから、Bio 101 (Vista CA, USA)のGene Cleanキットを用いて溶出させた。この5.4 kb 断片は、４つの介在配列と５つのエクソンとを含む、ヒトエリスロポエチン遺伝子の完全コードを含有していた（Lin et al., 前記参照）。
【００４３】
ＭＰＳＶプロモーターを保有するベクターｐＭＰＳＶＨＥ(Artelt et al.,前記)は、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびBamHIにより、製造業者(NEB)の指示どおりにして消化し、リニヤー化したベクターＤＮＡを、Gene CleanキットBio 101を用いてゲル精製した。ベクターＤＮＡほぼ0.5μgと精製エリスロポエチン挿入遺伝子２μgを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)を用いてライゲートし、生成物をＲｂＣｌ２コンピテントＤＨ５アルファ大腸菌細胞（Sambrook et al.,前記）中に形質転換した。制限分析により正確な挿入物を有するコロニーを同定し、Qiagen Midiprep キットによりプラスミドＤＮＡを大量調製したのち、該ベクターを緩衝液２(NEB)の存在下に制限酵素HindIIIおよびBstEII(NEB)で消化して、エリスロポエチン遺伝子挿入の５’末端から575bp断片を除去した；エリスロポエチン遺伝子挿入の制限マップについては前記Lin et al.,を再参照）。粘着末端を、全４ヌクレオチドの存在下に37℃で30分間、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(NEB)で充填した。この充填反応生成物を、16℃で30分間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)の存在下にライゲートし、次いでＲｂＣｌ２コンピテントＤＨ５アルファ大腸菌細胞中に形質転換した。制限分析後、正しいベクターコンストラクトを有する大腸菌クローンを同定し、製造業者の指示どおりにQiagen Midiprep キットを用い、大量の当該ベクターＤＮＡを調製した。生成したベクターは、ＭＰＳＶプロモーターの制御下のゲノミックエリスロポエチン遺伝子を保有している、消化されたｐＭＰＳＶｇＥＰＯであった。
【００４４】
実施例２
ｐＭＰＳＶｇＥＰＯベクターによる、ＢＨＫ２１およびＣＨＯ Ｋ１:cycＥ細胞の安定なトランスフェクション
大腸菌のトリプトファンシンセターゼ遺伝子（trpB）を、安定なｐＭＰＳＶｇＥＰＯベクターの選択に使用した。この系では、トランスフェクトした細胞を、トリプトファンシンセターゼ遺伝子（trpB）の遺伝子生成物の酵素活性による、インドールを必須アミノ酸トリプトファンに変換する能力で選択する。
【００４５】
ＣａＰＯ４トランスフェクションの前に、発現ベクターを制限酵素AatIIによりリニヤー化し、trpB選択プラスミドｐＳＶ２ｔｒｐＢ（前記Hartman and Mulliganに記載）を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIでリニヤー化した。5.7μgのｐＭＰＳＶｇＥＰＯと0.3μgのｐＳＶ２ｔｒｐＢとの混合物を、30μlのＨ２Ｏ中に調製した。30μlの１ＭＣａＣｌ２溶液を加えて混合した。60μlのリン酸塩溶液(50mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4、pH 7.05、滅菌濾過済み、オートクレーブ処理せず)を加えて５秒間ボルテックスした。室温で25秒間インキュベートした後、沈殿を胎児子牛血清(FCS)２％を含むTurbodoma培地２mlを含むポリプロピレンのチューブに移した。
【００４６】
６ウエルプレート中の、８０％コンフルエントのＢＨＫ２１およびＣＨＯ Ｋ１:cycＥ細胞培養の培地（Renner et a. Biotech. Bioeng. 47, 476-482, 1995）を除去し、細胞を一度血清を含まないTurbodoma培地で洗った。沈殿を含む培地２mlを加えた後、細胞培養物を、37℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。沈殿を除去し、グリセロール（Sigma) 15％およびＦＣＳ２％を含有するTurbodoma培地を加えた。30秒後、グリセロールを含む培地を除去し、ＦＣＳ10％を含有する培地５mlを加え、さらにプレートを数回ゆすった。培地を血清を含まない新鮮な培地３mlと置き換え、18時間後、細胞を、トリプトファンの代わりに300μＭのインドールと５％の透析した胎児子牛血清(Life Technologie)を含有する50mlの選択培地を満たしたペトリ皿中に移した。最初のクローンは、10日間培養した後視認できるようになるので、培養物を0.8％アガロースで積層してから拾った。1.6％アガロース溶液をMgおよびCaを含まないＰＢＳ中に調製し、オートクレーブし、そして42℃まで冷ました。この溶液を１：１比で予め加温した培地（42℃）と混合し、この溶液30 mlでプレートを積層した。室温でゲル化させたのち、コロニーをピペットで拾った。残りの細胞培養プラスチックに粘着した細胞をトリプシンで脱着した。
【００４７】
最初のクローンを、24ウエルプレート内の次いでＴ25フラスコ内の、血清を含まないTurbodoma培地中で生育させた。８つの選択したＢＨＫ２１およびＣＨＯ Ｋ１:cycＥ細胞クローンの生産性を、Western Blot分析で測定した。Western Blot分析では、全ＢＨＫ２１細胞クローン中での生産性は、ＣＨＯ Ｋ１:cycＥ細胞の場合より少なくとも１０倍高かった（図１参照）。全ＢＨＫ２１クローンは、組換え体エリスロポエチンをかなりの量で生産した。
最良結果を生成した２種（クローン２および１０）を、異なった細胞培養系中懸濁およびマイクロキャリヤー内で試験した。実施例３および４に詳述する。
【００４８】
実施例３
懸濁培養での組換え体ヒトエリスロポエチンの生産
ＢＨＫ２１ ｐＭＰＳＶｇＥＰＯ、クローン２を、スピナーフラスコ（Integra Bioscience）内の血清を含まず蛋白質も含まないTurbodoma培地中で懸濁して生育させた。Ｔ−フラスコ内で生育した2000万個の細胞を細胞解離溶液（Sigma）で脱着し、さらにスピナーフラスコ内で0.5g/l Puluronic F68（Sigma）を補った Turbodoma培地200ml中に接種した。培養条件は、37℃、５％ＣＯ２、回転数20 rpmであった。100,000細胞/mlの密度から出発し、細胞を４日間でほぼ100万細胞/mlの密度になるまで生育させた。７日後、細胞培養物を集め、培養液を３分間250ｇで遠心分離した。上澄みをＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、分子量約34−38ｋＤ（図２）のところに強いバンドを検出した。Western Blot分析により、このバンドが坑エリスロポエチン抗体(Research Diagnostics, USA)と交差反応性であることを確認した。図２で観察できるように、生成物は上澄み中の総蛋白質の約５０％を占めている。
【００４９】
実施例４
マイクロキャリヤー培養での組換え体ヒトエリスロポエチンの生産
ＢＨＫ２１ ｐＭＰＳＶｇＥＰＯ、クローン２を、スピナーフラスコ（Integra Bioscience）内の、血清を含まず蛋白質も含まないTurbodomaHP-1培地(F. Messi Cell Culture Technologies)中でマイクロキャリヤーに付着させて生育させた。Ｔ−フラスコ内で生育した2000万個の細胞を細胞解離溶液（Sigma）で脱着し、さらにTurbodoma HP-1培地25ml中で、５％ＣＯ２の存在下、37℃で５時間の間に、0.6gのCytodex 1 マイクロキャリヤー(Pharmacia) に接種した。このマイクロキャリヤーは、製造業者の指示どおりに調製した。0.5g/l Puluronic F68（Sigma)を補ったTurbodoma HP-1培地200mlを入れたスピナーフラスコ内に、培養物を移した。培養条件を、37℃、５％ＣＯ２、回転数20 rpmとした。100,000細胞/mlの密度から出発し、４日間で細胞が集合体となるまで生育させた。４日後、マイクロキャリヤーを沈殿させ、培地の70％を新鮮培地で置き換えた。５日後および６日後、それぞれ、培地の40％を新鮮培地で置き換え、７日後細胞培養物を集めた。上澄みは、ELISA (EPO ELISA, Beohringer Mannheim)で測定すると、10mg/l濃度の組換え体ヒトエリスロポエチンを含有していた。この組換え体エリスロポエチン生成物を、実施例５に記載したようにして精製した。
【００５０】
実施例５
組換え体ヒトエリスロポエチンの精製
この実施例は、細胞培養物上澄み液からの組換え体ヒトＥＰＯの精製に関する。このプロセスは、下記各段階を含み：
Ａ．青色セファロース上の染料クロマトグラフィー、
Ｂ．ブチル−トヨパール（Toyopearl）上の疎水性相互作用クロマトグラフィー、
Ｃ．ヒドロキシルアパタイト上のクロマトグラフィー、
Ｄ．リソースＱ上のアニオン交換クロマトグラフィー、
Laemmli, U.K.に従うＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Coomassie または銀染色したとき、約34,000ＭＷのポリペプチド成分と示される。
【００５１】
Ａ．染料クロマトグラフィー
細胞を含まない培養物上澄みのｐＨを、酢酸でｐＨ5.0に調節し、４℃ないし10℃で0.45μmフィルターを通してロ過した。ロ液、この実施例では200ml、を、予めpH 5.0、4ml/min、10℃で、20mMの酢酸ナトリウム、５mMのCaCl2および100mMのNaClとで平衡化した、５mlの青色セファロースＣＬ−６Ｂ(Pharmacia)カラム上に適用した。このゲルを、pH 5.0において20mMの酢酸ナトリウム、５mMのCaCl2および250mMのNaClの５ＣＶで、pH6.5において20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2の５ＣＶで洗った。蛋白質は、pH 9.0で、100mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、および１MのNaClの２ＣＶで溶出した。
【００５２】
Ｂ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
青色セファロースカラムからの溶出液を、クロマトグラフィーの直後に１ＮＨＣｌでpH 6.9とし、負荷する前に10％イソプロパノールとした。５mlカラムにブチル−トヨパール(TosoHaas)を室温で負荷し、pH 6.9で、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、750mMのNaCl、10％のイソプロパノールで平衡化した。蛋白質試料を負荷させたのち、カラムを、pH 6.9において、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、750mMのNaCl、19％のイソプロパノールで洗った。ＥＰＯ含量が優勢な蛋白質を、pH 6.9で、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、750mMのNaCl、27％のイソプロパノールで溶出させた。この画分を、pH 6.9で、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2により、３分の１希釈した。
【００５３】
Ｃ．ヒドロキシルアパタイト上のクロマトグラフィー
カラム５mlにヒドロキシルアパタイトUltrogelを室温で負荷し、pH 6.9で、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、250mMのNaCl、９％のイソプロパノールで平衡化した。前段階からの希釈溶出液を負荷後、カラムをpH 6.8において、10mMのTris-HCl、５mMのCaCl２の５ＣＶで洗った。蛋白質を、pH 6.9で、20mMのTris-HCl、５mMのCaCl2、750mMのNaCl、および27％のイソプロパノールで溶出させた。この画分を、pH 6.9において10mMのTris-HCl、10mMのリン酸ナトリウム、および５mMのCaCl2により、３分の１希釈した。
【００５４】
Ｄ．アニオン交換クロマトグラフィー
最終精製段階として、１mlのリソースＱカラム(Pharmacia)を15℃で適用した。このカラムを、pH 7.0において10mMのリン酸ナトリウムで平衡化した。ヒドロキシルアパタイトカラムからの溶出液を負荷し、続いて平衡緩衝液の２ＣＶで洗った。最後に、pH 7.0において10mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClで溶出することにより、結合したエリスロポエチンを、カラムに痕跡のＤＮＡを残して遊離させた。蛋白質画分をultrafree-15 5k ultrafilter (Millipore)により１０倍濃縮し、さらにpH 7.0において10mMのリン酸ナトリウムで２倍量に希釈した。
【００５５】
得られたエリスロポエチン生成物の試料を、Coomanssieで染色した SDS PAGE上で分析した。精製組換え体ヒトエリスロポエチン70μgを負荷し、そして図３に示すように、生成物は宿主細胞由来の如何なる蛋白質をも実質的に含んでいなかった。
本発明は好ましい実施態様に関連させて記述しているが、前記明細書を読めば当業者ならば多様なその変形、置き換えまたは均等物、並びに本書中に記載した方法の別の態様を実施できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、８つの選択したＢＨＫ２１ｐＭＰＳＶｇＥＰＯ、および８つの選択したＣＨＯ Ｋ１：ＣｙｃＥｐＭＰＳＶｇＥＰＯクローンの上澄みからのWestern Blot を示す。
【図２】  図２は、ＢＨＫ２１ｐＭＰＳＶｇＥＰＯクローン２由来の細胞培養液上澄みの銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１は濃縮していない上澄み液を示し、他方、レーン２は１０倍濃縮上澄み液を示す。
【図３】  図３は、Coomassie 染色ＳＤＳ ＰＡＧＥ で分析した精製組換え体エリスロポエチンサンプルを示す。