【手続補正書】
【提出日】平成17年12月20日(2005.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されるＰＭＲ計算を使用して分析した。
結果：正常試料の平均ＰＭＲは０．１９であり、標準偏差は０．７９であった。正常試料のいずれも正規平均に関する２つの標準偏差よりも大きくなかったが、腫瘍試料３３個のうち１８個がメチル化のこの程度にまで達した。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意であった（ｐ＝０．００２）。その結果を図１に示す。有意にも腫瘍試料は正常コントロール組織に比べて大幅に高メチル化されていた。該アッセイのＲＯＣ曲線も測定した。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは０．８０であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
対応するコントロールアッセイを上記したようにして実施した（実施例２）。
結果：正常試料の平均ＰＭＲは０．１３であり、標準偏差は０．５８であった。正常試料のいずれも正規平均について２つの標準偏差よりも大きくなかったが、腫瘍試料３３個のうち、１９個はメチル化のこの程度にまで達した。腫瘍試料と正常試料とのメチル化の程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．０００４）。その結果を図１に示す。該アッセイのＲＯＣ曲線もまた、測定した。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイは０．８４である（図１３）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
カルシトニンおよびＥＹＡ４遺伝子を含む遺伝子パネルを分析するリアルタイムアッセイの感度および特異性を評価するために、該アッセイのＲＯＣを、ロジスティックモデルを使用して、２つの遺伝子（上記した）のＲＯＣを組み合わせてインシリコ(insillico)で決定した。該曲線のＡＵＣは０．９７である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは３．９３であり、標準偏差は３．５７であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２３．０６であり、標準偏差は２０．２３であった。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意である（ｐ＝０．０００００３０６３）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１４に示す。ＡＵＣは０．８４である。
これは、さらに二重Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを使用するバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
対応するコントロールアッセイを上記したようにして実施した（実施例１）。
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されるＰＭＲ計算を使用して分析した。
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは３．０４であり、標準偏差は４．２１であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２１．３８であり、標準偏差は２４．０８であった。腫瘍試料と正常試料とのメチル化程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．００００１０１９７３）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１５に示す。ＡＵＣは０．８０である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは２．２５であり、標準偏差は２．４２であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２５．６７であり、標準偏差は１７．５７であった。腫瘍試料と正常試料とのメチル化程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．００００００００１１８）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１６に示す。ＡＵＣは０．９４である。
このことは、さらにＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ二重プローブ技術を用いる二重Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを使用し、Ｈ−カドヘリン−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
以下のようにして増幅を４０サイクル、実施した。９５℃で１５分の変性、続いて５５℃で４５秒のアニーリング、６５℃で２分のプライマー伸長、６５℃での最終伸長は１０分行った。
次いで、各ＣｐＧ位置の１対の固定化オリゴヌクレオチドを有するガラススライドに、各個人試料から得た全てのＰＣＲ産物をハイブリダイズさせた。これらの検出オリゴヌクレオチドのそれぞれは、最初から非メチル化（ＴＧ）またはメチル化（ＣＧ）のいずれかである１つのＣｐＧ部位のまわりの重亜硫酸塩変換配列にハイブリダイズするように設計した。使用した全ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドのさらなる詳細は、表３を参照（参考および非参考の両方）。ハイブリダイゼーション条件は、ＴＧ変異体およびＣＧ変異体の単一ヌクレオチド差異を検出することができるように選択した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
次いで、アルゴリズムを使用して、２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従い、ランク付けされたマトリックス中へデータを分類した（図１７〜１９に示される）。最も有意なＣｐＧ位置は、上部へ向かって減少する有意性を有するマトリックスの下部にある。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定の位置にメチル化を有しないことを示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各カラムは１つの試料の異なるＣｐＧにおけるメチル化プロファイルを示す。左側にＣｐＧと遺伝子認識物が示される。これは問題の遺伝子と使用された検出オリゴヌクレオチドを確認するための表（表２〜７）を相互参照する。右側に、個々のＣｐＧ位置におけるｐ値を示す。ｐ値は観測される分布がデータセットで偶然生じた確率である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【表２】
2005518219.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
【表３】
2005518219.tif 000002
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
【表４】
2005518219.tif 000003
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
【表５】
2005518219.tif 000004
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
【表６】
2005518219.tif 000005
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【表７】
2005518219.tif 000006
2005518219.tif 000007
2005518219.tif 000008
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
【図１】異なるＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイによって測定されたメチル化の程度を示す。Ｙ軸はメチル化度を示す。腫瘍試料は白点で示され、正常結腸組織試料は黒点で示される。有意に高いメチル化度は健康な組織試料中よりも腫瘍試料中に観察された。
【図２】実施例１の腺癌のＥＹＡ４−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．９４である。
【図３】実施例２の腺癌のＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．９１である。
【図４】結腸試料（腺癌２５、正常３３および腺腫１３）の別なセットを試験する実施例２のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定されたメチル化の程度を示す。Ｙ軸は検査するＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。腺癌試料を白四角で、正常結腸組織試料を黒ダイヤで示す。有意に高いメチル化度が健康な組織試料よりも腫瘍試料に見られた。ｔ−検定を使用して測定した有意水準は、０．００４２４であった。
【図５】実施例２（別な試料セット）の腺癌および腺腫におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８１である。
【図６】実施例２（別な試料セット）の腺癌におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８４４である。
【図７】実施例２（別な試料セット）の腺腫におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．７４８である。
【図８】実施例３のＥＹＡ４−Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された、異なる腫瘍および健康な組織のメチル化の程度を示す。Ｙ軸は検査したＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。結腸癌試料に加えて、２つの乳癌組織のうち１つのみがメチル化された。
【図９】実施例３のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された、異なる乳癌組織のメチル化の程度を示す。たった１つがメチル化されていた。
【図１０】実施例４のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された血清試料のメチル化の程度を示す。Y軸は検査したＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。
【図１２】実施例５のカルシトニン−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８５である。
【図１３】実施例６のカルシトニン−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８１である。
【図１４】実施例９のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８４である。
【図１５】実施例１０のＴＢＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８０である。
【図１６】実施例１２のカドヘリン−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９４である。
【図１７】健康組織と非健康組織の区別を示す。非健康試料片は結腸腺腫または結腸癌腫のいずれかから得た（実施例１３）。評価は２７個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用して実施した。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表３に記載する。
【図１８】１５個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用する健康組織と癌腫組織の区別を示す（実施例１３）。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表４に記載する。
【図１９】４０個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用する健康組織と腺腫組織の区別を示す（実施例１３）。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表５に記載する。
【図２０】実施例１１のＴＰＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｈｔｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す（第１試料セット）。ＡＵＣは０．９３である。
【図２１】実施例１１のＴＰＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｈｔｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す（第２試料セット）。ＡＵＣは１である。
【図２２】ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙｍｅｔｈｙｌ変異体を使用する各試料のＥＹＡ４遺伝子内の算出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。
【図２３】ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ変異体を使用する各試料のカルシトニン遺伝子内の算出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。