【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解を達成するためのサイズまたは質量に基づく分画と組み合わせて定量的アフィニティー補助溶液ハイブリダイゼーションを用いてポリヌクレオチド混合物中の複数の個別のポリヌクレオチド配列またはその亜群の量または相対的比率を測定する方法であって、以下の連続工程を含むことを特徴とする方法:
(a)あらかじめ決定された任意の数の可溶性ポリヌクレオチドプローブを含む、１または複数の組織化されたプールを用意する工程、ここで各プローブはサンプルにおける個別の標的リボポリヌクレオチドに相補的であり、分析物ポリヌクレオチド配列と比較してモル量において過剰に存在し、そして各プローブのハイブリダイズするヌクレオチドはおよそ同数であり、かつプローブは該ポリヌクレオチドプローブにサイズまたは質量を変化させる１または複数の分解可能化タグを付与することにより区別可能となるものであり、それによって、ハイブリダイゼーションまたは捕捉反応に影響を与えることなく、分画、分離または記録システムにおいてポリヌクレオチドプローブが異なる易動度を有することになる;
(b)標的リボポリヌクレオチド配列の混合物を含むサンプルから単離した分析物ポリヌクレオチド配列に少なくとも１つのアフィニティータグを付与する工程;そしてその後、
(c)工程(i)および(ii)を同時に、または(i)から(ii)の順で連続して行う工程;ここで工程(i)および(ii)は以下である：
(i)工程(a)からのモル量において過剰の可溶性ポリヌクレオチドプローブおよび工程(b)からの分析物リボポリヌクレオチド配列の間でハイブリダイゼーション反応を起こさせ、可溶性ハイブリッドの定量的形成を導く工程;
(ii)分析物ポリヌクレオチドのアフィニティータグのアフィニティーペアを備えた分離補助手段にハイブリッドを定量的に捕捉することにより、工程(i)で定量的に形成したハイブリッドを回収する工程;
(d)分離補助手段に捕捉されたハイブリッドから非修飾形態におけるポリヌクレオチドプローブを定量的に遊離させる工程;
(e)その量がサンプルにおける分析物リボポリヌクレオチド混合物中の相補的標的リボポリヌクレオチド配列の量に対応する、区別可能なプローブを分離し、その量または相対的比率を記録する工程。
【請求項２】
個体におけるポリヌクレオチド転写産物またはその亜群の量または相対的比率の動的変化を測定するための請求項１の方法であって、可溶性ポリヌクレオチドプローブが、生物において発現する転写産物の亜群、種、亜種に特異的なゲノム内配列からの選択されたある程度保存された領域または超可変領域とハイブリダイズする種または群-特異的リボポリヌクレオチド配列から設計される方法。
【請求項３】
混合標的集団を含むサンプルから単離された分析物ポリヌクレオチド配列がメッセンジャーRNA (mRNA)であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
標的集団における個体またはその亜集団を表すポリヌクレオチド配列の量または相対的比率の動的変化を測定するための請求項１の方法であって、可溶性デオキシリボポリヌクレオチドプローブが異なる系統発生レベルに特異的および／または異なる系統発生レベルを表すゲノム内配列からの選択されたある程度保存された領域または超可変領域とハイブリダイズする種または群-特異的リボポリヌクレオチド配列から設計され、混合標的集団における亜群、種、亜種の同定を可能にする方法。
【請求項５】
混合標的集団を含むサンプルから単離されたリボポリヌクレオチド分析物がリボゾームRNAを含むことを特徴とする請求項４の方法。
【請求項６】
分解可能化タグが、同時にトレーサー、アフィニティーおよび／またはプライマータグとしても作用しうることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項７】
分解可能化タグが篩媒体において分離可能であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項８】
アフィニティーおよび／またはプライマータグとしても作用しうる分解可能化タグがオリゴヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】
アフィニティーおよび／またはトレーサータグとしても作用しうる分解可能化タグがアミノ酸またはペプチドであることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項１０】
トレーサータグとしても作用しうる分解可能化タグが蛍光、発光、赤外吸収、電磁気特性、放射能および酵素活性によって記録可能な標識からなる群から選択されることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項１１】
プール中の可溶性ポリヌクレオチドプローブのあらかじめ決定された任意の数が２以上であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１２】
個別の、定量的に捕捉され、遊離したポリヌクレオチドプローブの量が、適用した分解可能化タグに応じて選択される完全にまたは部分的に自動化された記録システムによって記録されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１３】
記録システムが分解可能化タグに応じて質量分析、電気泳動またはクロマトグラフィー技術から選択されることを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１４】
定量的に回収されたプライマータグ付加されたプローブの量が、プローブが遊離され、その後増幅され、所望によりPCR-反応前、反応中あるいは反応後にトレーサータグ付加された後に、分解可能化タグに応じて選択された記録システムによって記録されることを特徴とする請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
プライマーが普遍的プライマーであることを特徴とする請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドプローブが、安定なDNA断片、合成または組換えポリヌクレオチド配列あるいは修飾ポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
複数の試験キットのセットを提供することにより、ポリヌクレオチド配列の集団または混合物における個別のポリヌクレオチド配列または生物またはその亜群の量の変動を比較、定量評価する請求項１の方法であって、比較される各サンプルについて少なくとも１つの試験キットが提供され、該試験キットはそれぞれあらかじめ決定された任意の数の可溶性ポリヌクレオチドプローブを含む１または複数の同一の組織化されたプールを含み、各プローブがサンプルにおける個別の標的リボポリヌクレオチド配列に相補的なDNAであり、サンプルにおける標的ポリヌクレオチドと比べてモル量において過剰に存在し、そして各プローブのハイブリダイズするヌクレオチドはおよそ同数であり、かつ各プローブは該ポリヌクレオチドプローブにサイズまたは質量を変化させる１または複数の分解可能化タグを付与することより区別可能になるものであり、それによって、ハイブリダイゼーションまたは捕捉反応に影響を与えることなくポリヌクレオチドプローブが分画、分離または記録システムにおいて異なる易動度を有するものとなり、ポリヌクレオチドプローブの各プールが分離していても互いに結合していてもよい独自の容器に組織化されて配置されていることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１８】
個別の試験キットにおける分解可能化タグがトレーサータグではなく、複数の試験キットのセットが発光シグナルによって互いに区別可能なトレーサータグを備えていることを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１−１８のいずれかの方法を行うための試験キットであり、試験キットがあらかじめ決定された任意の数の可溶性ポリヌクレオチドプローブを含む１または複数の組織化されたプールを含み、各プローブがサンプルにおける個別の標的リボポリヌクレオチド配列に相補的であり、サンプルにおける分析物リボポリヌクレオチドと比べてモル量において過剰に存在し、それぞれのハイブリダイズするヌクレオチドはおよそ同数であり、かつ、各プローブにサイズまたは質量を変化させる１または複数の分解可能化タグを付与することよりポリヌクレオチドプローブが区別可能になるものであり、それによって、ハイブリダイゼーションまたは捕捉反応に影響を与えることなくポリヌクレオチドプローブが分画、分離または記録システムにおいて異なる易動度を有するものとなり、ポリヌクレオチドプローブの各プールが分離していても互いに結合していてもよい独自の容器に組織化されて配置されている試験キット。
【請求項２０】
個体におけるポリヌクレオチド転写産物またはその亜群の量または相対的比率の動的変化を測定するための請求項１９の試験キットであって、可溶性ポリヌクレオチドプローブが生物において発現する転写産物の亜群、種、亜種に特異的なゲノム内配列からの選択されたある程度保存された領域または超可変領域とハイブリダイズする種または群-特異的ポリヌクレオチド配列から設計されることを特徴とする、請求項１９の試験キット。
【請求項２１】
混合標的集団を含むサンプルから単離されたポリヌクレオチド分析物がメッセンジャーRNA(mRNA)を含むことを特徴とする請求項１９の試験キット。
【請求項２２】
標的集団における個体またはその亜集団を表すポリヌクレオチド配列の量または相対的比率の動的変化を測定するための請求項１９の試験キットであって、可溶性ポリヌクレオチドプローブが異なる系統発生レベルに特異的および／または異なる系統発生レベルを表すゲノム内配列からの選択されたある程度保存された領域または超可変領域とハイブリダイズする種または群-特異的ポリヌクレオチド配列から設計され、混合標的集団における亜群、種、亜種の同定を可能にする試験キット。
【請求項２３】
混合標的集団を含むサンプルから単離されたポリヌクレオチド分析物がリボゾームRNAを含むことを特徴とする請求項２２の試験キット。
【請求項２４】
分解可能化タグが、同時にトレーサー、アフィニティーまたはプライマータグとしても作用しうることを特徴とする請求項１９の試験キット。
【請求項２５】
分解可能化タグが篩媒体において分離可能であることを特徴とする請求項２４の試験キット。
【請求項２６】
アフィニティータグおよび／またはプライマータグとしても作用しうる分解可能化タグがオリゴヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項２５の試験キット。
【請求項２７】
アフィニティーおよび／またはトレーサータグとしても作用しうる分解可能化タグがアミノ酸またはペプチドであることを特徴とする請求項２５の試験キット。
【請求項２８】
さらにトレーサータグとしても作用しうる分解可能化タグが蛍光、発光、赤外吸収、電磁気特性、放射能および酵素活性によって記録可能な標識からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５の試験キット。
【請求項２９】
プール中の可溶性ポリヌクレオチドプローブのあらかじめ決定された任意の数が２以上であることを特徴とする請求項１９の試験キット。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドプローブの可溶性プールがマイクロタイタープレート上のウェルに配置されることを特徴とする請求項１９の試験キット。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドプローブが、安定なDNA断片、合成または組換えポリヌクレオチド配列あるいは修飾ポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１９の試験キット。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド配列の集団または混合物における個別のポリヌクレオチド配列または生物またはその亜群の量の変動の比較、定量評価のための、２以上の請求項１９の試験キットのセットであって、該セットが、比較される各サンプルのため、同一のポリヌクレオチドプローブのプールを含む少なくとも２つの同一の試験キットを含むことを特徴とするセット。
【請求項３３】
該セットにおける各個別の試験キットが、発光シグナルによって互いに区別可能なトレーサータグを備えていることを特徴とする請求項３２のセット。
【請求項３４】
衛生学的状況、疫学的状況、微生物集団に対する外部刺激または処置手段の効果の評価のための請求項３２のセット。
【請求項３５】
外部刺激または処置が抗生物質処置または衛生学的手段からなる群から選択される、請求項３４のセット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、およそ同数のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプローブ混合物を用いてポリヌクレオチド配列の混合物から、存在する複数の個々の標的ポリヌクレオチド配列の量または相対的比率の定量を同時に行うための方法および試験キットに関する。該方法および試験キットにより、生物の混合物を含むサンプル、即ち標的集団に存在する多数の個体および関連亜集団の動的変化の定量が可能となる。本発明は、定量的アフィニティ補助溶液ハイブリダイゼーションおよび分解提供分画(resolution providing fractionation)の組み合わせに基づく。本発明は国際特許出願WO02/055734号に開示の発明と密接に関連しており、該出願においては、プローブ混合物の個々のポリヌクレオチド配列が異なる区別可能なサイズを有する。これに対して、本発明の認識用プローブはおよそ同数のヌクレオチドを有する。本発明の方法および試験キットは、保健医療、環境調査、医薬産業および食品産業に有用であり、多くのその他の、診断、生物工学および科学目的に適用することが出来る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明および国際特許出願WO02/055734号に記載の方法および試験キットの利点には、分析すべきポリヌクレオチド調製物、特にRNAの質が重要ではないという事実が含まれる。例えば、RNAはその不安定性のために特別の処理が必要であることが知られているが、定量的評価のための分解可能化タグを付加することなく用いることが出来る。固定化工程および特定の市販の試薬を含める必要が無い試験キットの製造により、所与の生物または関連生物における遺伝子の特定のサブセットに着目する、容易に適用できるテイラーメード試験の調製が可能となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
サンプルにおけるポリヌクレオチド配列、即ち分析物はいずれのサイズであってもよいことに注目されたい。一般に、それらはある程度断片化したポリヌクレオチド配列である。本発明において同定に用いられる試薬またはプローブは、およそ同数のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドプローブに分解可能化タグを付与することによって区別可能なサイズにより識別できるものとなる。分解可能化タグは、例えば、アフィニティータグ、プライマータグとして作用するものであってもよいし、単に分解可能化トレーサータグとして作用するものであってもよい、ポリヌクレオチド配列である。本発明において、オリゴヌクレオチドは2-12塩基対からなり、プローブは15塩基対より大きい、例えば18-35 塩基対であるのが好ましい。特に、PCR-増幅が用いられるより感受性の高い本発明の方法の態様では、プローブはより多い塩基対、好ましくは少なくとも30塩基対であるのがよい。それゆえ、本発明のプローブはポリヌクレオチド配列として定義される。原則として、上限はないが、短いプローブがより経済的で調製および操作が容易であることは自明である。長いプローブはまた、短い分解可能化タグの付加によって区別可能にすることがより困難である。したがって、本発明の特徴によって解決される特定の課題はポリヌクレオチドプローブの長さではなく、およそ同数のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド配列を、結果の正確な読みを可能にするためにいかに有効に区別可能とするかということである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明において、「区別可能性」はいわゆる「分解可能化タグ」を備えたプローブを提供することによって達成される。生物の関連群の同定を可能にし、本発明の用途に特に有用な本発明のポリヌクレオチドプローブは一般に、およそ同数のヌクレオチドを有する。使用前に、該ポリヌクレオチド配列に、サイズに基づく分離、分画または記録システムにおいてそれらを区別可能とする特徴を修飾または付与するとよい。これはポリヌクレオチド配列の末端に「分解可能化タグ」を付加することによって達成され、かかるタグによりプローブの質量が変化し、それによって用いられる分画、分離、または記録システムにおいて異なる易動度を備えさせることが出来る。好ましくは、分解可能化タグは同時にアフィニティー、トレーサーまたはプライマータグとしても作用するものである。好ましくは、該タグは所望の複数の機能を有するのがよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
例えば、定量される標的ポリヌクレオチドに対して過剰に存在するポリヌクレオチドプローブに以下のようなポリヌクレオチド配列を備えさせてもよい：ポリA、ポリT、ポリU、ポリC、ポリG、混合ポリヌクレオチド、例えば、ポリAT、ポリGCまたはその他のヌクレオチドの組み合わせあるいはその他のこれらの混合物を含むその他のオリゴヌクレオチド配列。分解可能化タグであるだけでなく、これらのオリゴヌクレオチド配列は、アフィニティータグおよびプライマータグとしても作用することが出来る。トレーサータグまたは標識、例えば異なるサイズのフルオロフォアは検出を可能にするだけでなく、サイズまたは質量において充分な差を有する場合、分解可能化タグとしても有用である。ハイブリダイゼーション反応を阻害しないアミノ酸またはペプチドも分解可能化タグとして利用できるが、これらもアフィニティータグおよびトレーサータグとして作用しうる。ペプチド・オリゴヌクレオチド接合体の合成にはいくつかの戦略が報告されており、いずれも本発明に適用することが出来る。ハイブリダイゼーションを阻害しないように、分解可能化タグはプローブの一方の末端にのみ付着させるのが推奨される。しかし、プライマーをタグとして用いる場合、それらは当然プローブの両端に位置づけられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
「トレーサータグ」は、プローブの検出および／または記録を可能にする標識またはマーカーを意味する。本発明の基本的な態様において、トレーサータグは検出可能または記録可能なマーカーまたは標識、例えばフルオロフォアである。トレーサータグは好ましくはプローブの一方に末端に付着させるのがよいことに注目されたい。プローブはトレーサーがプローブと分析物との間のハイブリダイゼーション反応を阻害することがないように末端タグ付加される。本発明において、トレーサータグは異なる質量を有するプローブを備えさせることによって分解可能化タグとしても機能することが出来、それにより異なる易動度を有するようになる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の特定の態様においては、非常に少量の分析物ヌクレオチドを同定しなければならず、より感度の高い試験が要求される。かかる場合には、プローブに末端プライマー配列の対、即ち「プライマータグ」を備えさせて、定量的に回収されたプローブの増幅を可能にする。プローブにさらに任意のトレーサータグ、例えば異なるサイズのフルオロフォアを、特にPCR-増幅工程中に備えてもよい。かかるプローブの3'-および5'-末端に配置するプライマータグは、アフィニティータグ付加された分析物にハイブリダイズしたプローブの定量的回収後のプローブの増幅を可能にする。プライマー配列の一方は非常に短いものでもあってもよく、他方はより長く、同時にアフィニティータグおよび分解可能化タグとして作用するものであってもよい。この態様において、プローブに任意のトレーサータグを増幅中または増幅後に備えさせてもよい。質量分析を記録に用いる場合、トレーサーは不要である。分解を可能にするタグ、例えばプライマーまたはアフィニティータグとして作用するオリゴヌクレオチドを個別のプローブが備えていれば十分である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ハイブリダイゼーション反応を阻害しないアミノ酸およびペプチドを付着させてもよく、好ましくはポリヌクレオチドプローブの末端に付加してもよい。ペプチド・オリゴヌクレオチド接合体の合成についてはいくつかの戦略が報告されており、そのいずれも本出願に適用することが出来る(例えば、Lonnberg, H. Annu. Rep. Prog. Chem., Sect B 1999, 95, 207-234および2001, 97, 177-208を参照)。異なるサイズのプローブの類似の化学的調製方法を用いてペプチド以外の有機化学残基をポリヌクレオチドに結合させてもよい。該アミノ酸またはペプチド配列は同時に「アフィニティータグ」および／または「トレーサータグ」として作用しうる。アミノ酸ヒスチジンは有用な例である。リガンドを含むペプチドを「アフィニティータグ」として用いてもよい。酵素活性を有するペプチドは「トレーサータグ」として作用しうる。抗体-抗原対として機能するペプチドは、アフィニティーおよびトレーサーならびに分解可能化タグとして作用しうる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
分解可能化タグとしても適用される「アフィニティータグ」は例えば、オリゴヌクレオチド残基、アミノ酸残基等から見いだされ、例えば、ヒスチジン、ペプチドまたは糖残基が挙げられ、ハプテン、例えばビオチンも含まれる。かかるタグの中にはトレーサータグとしても機能するものがある。例えば、標識または非標識オリゴヌクレオチド残基は、アフィニティータグ、プライマータグおよび分解可能化タグとして用いることが出来る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
「アフィニティータグ」との語は、分析物ポリヌクレオチドに別の物質に対して高アフィニティーを有する標識またはマーカーが備えられていることを意味する。言い換えると、アフィニティータグはその対応物即ちアフィニティーペアと強い結合を形成する傾向にある。アフィニティーペアの間に形成される強い結合により、アフィニティーペアが所望の物質の捕捉の手段として作用することが出来る。有用なアフィニティーペアは、例えば、ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジンであるが、その他の合成または非合成の「アフィニティーペア」即ち結合性物質を適用することが出来る。好適な「アフィニティーペア」は例えば、受容体とリガンド、抗原と抗体、およびそれらの断片である。本発明の好ましい「アフィニティータグ」には小分子、例えば、ビオチン、ヒスチジンオリゴヌクレオチド、ハプテン、グリカンなども含まれるが、好ましい「アフィニティータグ」の対応物はより大きい分子、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート、抗体、レクチンなどであり、「分離補助手段」の被覆に用いられる。本発明において特に好ましいアフィニティータグは、ポリヌクレオチド、例えば、ポリ(dA)、ポリ(dT)、ポリ(dG)、ポリ(dC)およびそれらの混合物である。アフィニティータグだけでなく、それらによって異なるサイズの分解可能化タグも提供される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
特徴付けされているプローブの使用が好ましいが、あまり特徴付けされていないゲノムから国際特許出願WO02/055734号に記載のようにしプローブのプールを調製することも可能であり、その後、かかるポリヌクレオチドプローブに上記の分解可能化タグを備えて、その分離および記録を可能とすることが出来る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
１または複数の可溶性プールは、あらかじめ決定された、しかし任意の数の、好ましくは2-500、より好ましくは5-400、もっとも好ましくは10-300の可溶性ポリヌクレオチド配列を含む。本方法の前提条件は、およそ同一のサイズのポリヌクレオチドプローブが、ポリヌクレオチドプローブに「分解可能化タグ」を結合または末端付加することによって区別可能になることであり、分解可能化タグは、分離および分画を可能にし、例えば、電気泳動技術、質量分析またはクロマトグラフィーにより正確な同定および結果の計算が可能になるように個別のポリヌクレオチドプローブの分解を可能にするものである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
可溶性ポリヌクレオチドプローブは例えば質量分析を用いてトレーサータグを用いずに同定することも出来る。そうではなく、可溶性ポリヌクレオチドプローブに本発明の基本的態様において直接検出可能または記録可能であって分解可能化タグとしても機能する標識およびマーカートレーサータグを備えさせてもよい。本発明のより進展した超高感度の検出または比較評価を可能にする態様においては、ポリヌクレオチドプローブと短かすぎないオリゴヌクレオチドの使用が好ましく、ポリヌクレオチドプローブに一対の末端プライマータグを備えることにより、プローブの定量的回収の後にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を可能にするとよい。増幅の際、プローブに例えばトレーサータグ付加されたプライマーまたは標識ヌクレオチドを用いてトレーサータグを付加してもよい。この場合、分解可能化タグはトレーサータグであってはならない。可溶性プールは、分離しているか、緩く結合しているか、あるいは取り外し可能の独自の容器に組織化して配置される。組織化されたプールはよりコンパクトな構造の中または上に配置してもよく、ここで容器はある程度強固に互いに結合したものであり、例えばマイクロタイタープレート上のウェルである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の基本的な態様において、ポリヌクレオチドプローブのサイズまたは質量対電荷比に差を与える分解可能化タグは、トレーサーまたはプライマータグの存在下または不在下で標的集団を含むサンプルからの単離によって得られた分析物ポリヌクレオチド調製物とハイブリダイズする。サンプリングされた標的集団に存在する分析物ポリヌクレオチド配列は、公知の方法によって単離される。一般に標的集団からの測定すべき分析物ポリヌクレオチドは、リボゾームRNA(rRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)あるいはそれらに対応する遺伝子(DNA)である。該分析物に少なくとも１つのアフィニティータグ、例えば、ビオチン、ヒスチジン、オリゴヌクレオチド配列、例えば、オリゴ(dT)、-(dA)、-(dC)、-(dG)またはそれらの混合物やハプテンまたはグリカンを備えさせる。分析物ポリヌクレオチドは好ましくはビオチンで標識する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
上述のように溶液中でのハイブリダイゼーションによって、DNA:RNA(DNA:DNA)ハイブリッドが形成する。一般に、溶液ハイブリダイゼーションはハイブリッド、例えば、DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:RNA、PNA:DNA、PNA:RNA、LNA:DNA、LNA:RNAなどの形成を導くハイブリダイゼーションが起こる条件下でおこなう。最適条件はポリヌクレオチドプローブ、分析物などに依存して変動する。その後、アフィニティータグを有する分析物ポリヌクレオチド配列のその対応物に対するアフィニティーによる助けにより、ハイブリッドはアフィニティータグの対応物で被覆された分離補助手段に回収または捕捉される。分析物配列にハイブリダイズすることができたポリヌクレオチドプローブのみが、分離補助手段に収集され、定量的に回収され、所望により増幅された後記録される。捕捉および収集されたハイブリッドはハイブリダイゼーション溶液から除去または分離され、その他の試薬や未反応のプローブを含まないようにするために洗浄される。アフィニティータグ付加されたポリヌクレオチド分析物とハイブリッドを形成しなかったポリヌクレオチドプローブはハイブリダイゼーションまたは洗浄溶液に残り、したがって除かれる。捕捉および収集されたハイブリッドは過剰のプローブを含まないよう洗浄される。過剰のプローブとは例えば、アフィニティータグ付加された分析物配列にハイブリダイズすることができなかったプローブである。ハイブリダイズすることができない場合とは、標的集団において特定の個体または亜群を表す、該ポリヌクレオチドプローブに対応する分析物配列がサンプルに存在しなかった場合である。分析物から分離または遊離した収集されたポリヌクレオチドプローブには任意にトレーサータグを付加してもよい。この場合、分解可能化タグはトレーサータグであってはならない。プールに存在する、対応するプローブが無いためにハイブリダイズすることができなかった、余ったアフィニティータグおよびアフィニティータグ付加された分析物配列は当然固体分離補助手段に捕捉されるが、ハイブリッドから溶出およびその後の分離工程にて分離される。プローブ内に相補鎖が無いアフィニティータグ付加された分析物も、分離補助手段に捕捉されるが、それらはハイブリダイゼーション工程が化学量論的に起こることを妨げるものではなく、その結果の分析工程を妨げるものではない。それらは、例えば、プローブがハイブリッドおよび／または分離補助手段から単離または遊離される際に破壊または除去すればよい。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
以下の方法フローチャートにより本発明の実施方法を説明する:
調製工程
工程1-およそ同一のサイズを有する可溶性ポリヌクレオチドプローブの組織化されたプールの調製
ケース1-リボゾームRNAからの領域の選択
rDNA断片を細菌または微生物の特定の種または群を表すある程度保存された領域または可変領域を表すように選択する。DNA断片に分解可能化タグまたはテイルまたは標識を備えて、サイズ分画-段階において良好に分解されるようにする。
(a)ポリヌクレオチドテイル付加(工程2参照)
(b)トレーサー標識(工程2参照)
(c)タンパク質-テイル付加(工程2参照)
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
タグが同時に分解可能化タグとしても作用する末端プライマータグである場合、試験キットは同一であるが、増幅の後、回収および／または増幅されたプローブは任意に区別可能なトレーサータグを備えられてもよい。あるいは、相補的プライマーペアにトレーサータグを備えてもよく、増幅中のトレーサータギングが可能となる。これらの補助的試薬は任意に試験キットに含めてもよいし、その他の市販あるいはその他の起源から提供してもよい。サンプル中のポリヌクレオチド量 における変動の簡便な比較評価を可能にするためには、異なる発光波長で発光する異なる区別可能なトレーサータグを備えた試験キットを調製するのが便利であり、かかる発光は自動または半自動装置で記録できる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
【図１】図1は、キャピラリー電気泳動による異なるフルオロフォアを有する一本鎖DNA断片およびポリヌクレオチドの分離を示す。
【図２Ａ】図2Aは、トレーサー(星印)タグ付加されたプローブ(P)とアフィニティー即ちビオチン(B)タグ付加された一本鎖RNA分析物配列とのハイブリダイゼーション工程および分析物(A)とプローブ(P)とのハイブリッド(H)の形成を示す。
【図２Ｂ】図2Bは、分解可能化タグとしても同時に作用するトレーサータグ(星印)を備えたプローブ(P)とアフィニティー即ちビオチン(B)タグ付加された二本鎖ポリヌクレオチド即ちRNA分析物配列とのハイブリダイゼーション工程、および、分析物(A)とプローブ(P)とのハイブリッド(H)形成を示す。分析物配列と一致しないプローブまたはモル過剰に存在するプローブは溶液中に遊離のまま残る。
【図３Ａ】図3Aは、アフィニティータグ(B)の対応物により被覆された固体分離補助手段(SAT)へのアフィニティー(B)タグ付加されたハイブリッド(H)の捕捉を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、アフィニティー(B)タグ付加されたハイブリッド(H)の、アフィニティータグ(B)の対応物により被覆された固体分離補助手段(SAT)への捕捉を示す。アフィニティータグ付加された分析物配列にハイブリダイズしなかったトレーサータグ付加されたプローブ配列は捕捉されない。当然、分離補助手段(SAT)は遊離のアフィニティータグおよびプローブ配列にハイブリダイズしていないアフィニティータグ付加された分析物にも結合する。
【図４】図4は、トレーサータグ付加されたプローブ(P)の固体分離補助手段(SAT)からの溶出を用いた遊離/分離補助手段(SAT)を備えたアフィニティータグ付加された分析物配列(A)およびトレーサータグ付加されたプローブ(P)の溶液中への放出を示す。
【図５】図5A-Bは、微生物生態学における16S rRNAアプローチを示す。図5AはリボゾームRNA遺伝子オペロンを示し、これには、16S、23Sおよび5S rRNAが含まれ、16S rRNAのそして可変領域1-9が強調されている。図5Bは種の同定を可能にする可変領域およびある程度保存された微生物群の同定を可能にする領域を含む16S rRNAの構造を示す。
【図６】図6はクロストリジウムおよび関連する細菌の系統発生樹を示す。
【図７】図7は、実施例１による本発明の比較方法を実施した際に、電気泳動図およびデータファイルから記録された結果を示す。すべてのプローブは、C. symbiosum E981051 RNAとのハイブリダイゼーションにおいて機能的である。BactおよびErecプローブは異なるサイズ(それぞれ18および19塩基)および異なる易動度を有する。Erec-5A プローブの電気泳動易動度は、A-テイルの付加により、Erec プローブの易動度と異なる。
【図８】図8A-Bは、実施例２による本発明の比較方法を実施した際に、電気泳動図およびデータファイルから記録された結果を示す。図8Aは、プローブBactおよびChisによる結果を示す。Chisプローブは株 C.tyrobutyricum E99908のみを認識するのに対し、Bactプローブはすべての細菌株を認識する。いずれのプローブも真菌 Trichoderma reeseiは認識しない。図8Bは、プローブBactおよびErecによる結果を示す。Erecプローブ は、株C.symbiosum E981051のみを認識するのに対し、Bactプローブはすべての細菌株を認識する。いずれのプローブも真菌Trichoderma reeseiは認識しない。
【図９】図9は実施例３による本発明の定量的方法を実施した際に、電気泳動図およびデータファイルから記録された結果を示す。BactおよびChis プローブのシグナル強度はハイブリダイゼーションに用いたC.tyrobutyricum E908 RNAの量に対応する。
【図１０】図10A-Bは実施例４による本発明の定性的かつ定量的方法を実施した際に、電気泳動図およびデータファイルから記録された結果を示す。図10Aは、プローブBactおよびErecを用いてC.symbiosum E1051からのRNAを、プローブBactおよびChisを用いてC.tyrobutyricum  E908からのRNAを、そしてプローブBact、ChisおよびErecを用いてC.butyricum  E908、C.symbiosum E1051およびC.lituseburense  E1853からのRNAを含む微生物集団を分析した際に得られた結果を示す。Bact プローブはすべての株を認識するのに対し、Chis プローブは株 E908のみを、Erec プローブは株 E1051のみを認識する。プローブBactおよびChisを標識するフルオロフォアのレベルは同じである一方、プローブ Erecのレベルはより低い。各株からのRNAの比率をハイブリダイゼーションに用いた全RNAのパーセンテージとして示す。 図10Bは、プローブBactおよびChisを用いてC.tyrobutyricum E908およびC.symbiosum E1051を含む微生物集団を分析した結果を示す。Bact プローブは両方の株を認識する一方、Chis プローブは株E908のみを認識する。各株からのRNAの比率をハイブリダイゼーションに用いた全RNAのパーセンテージとして示す。
【図１１】図11は、方法の半自動化実行をフローシートとして示す。
【図１２】図12は、本発明の実施例５による定性的かつ定量的方法を行った場合の質量スペクトルおよびデータファイルから記録された結果を示す。BactおよびChis プローブのシグナル強度はサンプル中のそれらの濃度に対応する。
【図１３】図13は、PCRによるプローブの調製の模式図である。
【図１４】図14は、PCR-増幅(=15サイクルのPCR)を行った、行っていない(=未増幅)ならびにネガティブコントロールの等量のmRNAについてのアッセイからのプローブ面積(蛍光単位)を示す電気泳動図である。サンプルはBI 310 遺伝子分析器で泳動した。