【手続補正書】
【提出日】平成18年10月19日(2006.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体であって、該変異体が、野生型プロテオロドプシン変種の保存残基に変異を含み、野生型プロテオロドプシン変種に比して、より低い pKrh または、より小さい塩基性形と酸性形との最大吸収波長の差異を有する、プロテオロドプシン変異体。
【請求項２】
該保存残基が保存ヒスチジン残基である、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項３】
該保存残基が保存アルギニン残基である、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項４】
該野生型プロテオロドプシン変種が、配列番号: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, または 161 の自然界に存在するプロテオロドプシン変種、あるいはそれらと少なくとも 90% のアミノ酸同一性を共有する他のプロテオロドプシン変種である、請求項２または３のプロテオロドプシン変異体。
【請求項５】
該保存ヒスチジン残基が、配列番号：1 のアミノ酸部位 77 または配列番号: 2 のアミノ酸部位 75 にある、請求項２のプロテオロドプシン変異体。
【請求項６】
該プロテオロドプシン変異体が、野生型プロテオロドプシン変種に比して、より低い pKrh を有する、請求項２のプロテオロドプシン変異体。
【請求項７】
該保存ヒスチジン残基が、水素結合を形成し得るアミノ酸に変異されている、請求項２のプロテオロドプシン変異体。
【請求項８】
水素結合を形成し得る該アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項７のプロテオロドプシン変異体。
【請求項９】
水素結合を形成し得る該アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項８のプロテオロドプシン変異体。
【請求項１０】
該保存アルギニン残基が、配列番号：1 のアミノ酸部位 96 または配列番号: 2 のアミノ酸部位 94 にある、請求項３のプロテオロドプシン変異体。
【請求項１１】
該プロテオロドプシン変異体が、野生型プロテオロドプシン変種に比して、より小さい塩基性形と酸性形との最大吸収波長の差異を有する、請求項３のプロテオロドプシン変異体。
【請求項１２】
該保存アルギニン残基が、アラニン、グルタミン酸またはグルタミンに変異されている、請求項１０のプロテオロドプシン変異体。
【請求項１３】
請求項１のプロテオロドプシン変異体をコードする単離された核酸配列。
【請求項１４】
配列番号: 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181 および 183 よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むプロテオロドプシン変異体。
【請求項１５】
配列番号: 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182 および 184 
よりなる群から選ばれる単離された核酸配列。
【請求項１６】
改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体を調製する方法であって、下記の工程：
(a) 野生型プロテオロドプシン変種の保存アミノ酸残基を同定すること、
(b) 保存アミノ酸残基を変異生成し、プロテオロドプシン変異体を得ること、
(c) プロテオロドプシン変異体の光学特性を決定すること、および
(d) 改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体を選択すること、
を含む方法。
【請求項１７】
該保存アミノ酸残基がヒスチジンである、請求項１６の方法。
【請求項１８】
該保存アミノ酸残基がアルギニンである、請求項１６の方法。
【請求項１９】
該保存アミノ酸残基が、部位特異的変異誘発法により変異誘発されている、請求項１６の方法。
【請求項２０】
該改善された光学特性が、野生型プロテオロドプシン変種に比して、より低い pKrh またはより小さい塩基性形と酸性形との最大吸収波長の差異である、請求項１６の方法。
【請求項２１】
光学的データを保存および検索する方法であって、下記の工程：
(a) 請求項１のプロテオロドプシン変異体を固定しているマトリックスを含むフィルムを準備すること、
(b) そのフィルムを、予め定めたパターンにおける静止状態でプロテオロドプシン変異体により吸収される波長の光に暴露すること、
(c) フィルムの選択的部分を励起状態に変換し、その中に光学的データを保存すること、
(d) 工程 (c) のフィルムを、静止状態または励起状態でプロテオロドプシン変異体に吸収される波長の光に暴露すること、および
(e) 光学的記録機器により保存の光学データを検出すること、
を含む方法。
【請求項２２】
光駆動エネルギー発生器であって、下記 (a) 請求項１のプロテオロドプシン変異体、(b) 細胞膜、(c) オール-trans-レチナールの源、および (d) 光源を含み、ここで、プロテオロドプシン変異体が細胞膜に入り込み、組み込まれたプロテオロドプシン変異体をつくり、この組み込まれたプロテオロドプシン変異体がオール-trans-レチナールに共有結合し、光吸収色素をつくる、発生器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
用語 "プロテオロドプシン変種" は、既知であろうが未知であろうが、種々の自然界に存在するプロテオロドプシンおよびその同族体を包含する。これらは、"M-状態" または "M-様状態" を含有する光サイクルを受け得る。図 1-1 〜 1-81 は 81 プロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。これらのプロテオロドプシン変種は互いに 53 〜 99.6% のアミノ酸配列の同一性を示す。用語 "プロテオロドプシン変種" は、図 1-1 〜 1-81 に記載のいずれかのプロテオロドプシン変種とアミノ酸配列が少なくとも 53%、好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%、最も好ましくは 97 または 98% 同一であるタンパク質を含む。用語 "プロテオロドプシン変種" はまた、２以上の天然に存在するプロテオロドプシンからのアミノ酸配列の融合により構築された融合プロテオロドプシンであって、各アミノ酸配列が得られたプロテオロドプシンの均等部位を占めるものを包含する (たとえ、これらの融合プロテオロドプシンが自然界に存在しなくても)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本願の目的のために用語 "pKrh" は、等しい濃度でプロテオロドプシン分子の酸性および塩基性スペクトル形が存在する pH を意味する。出願人は、この用語を、等しい濃度で分子の酸性形および塩基形が存在する pH を同定する用語である pKa から得た。あるプロテオロドプシンの pKrh が具体的な値であると決定されると、その特定値は塩基性形と酸性形が等しい濃度で存在する pH である。pKrh に関する環境の pH を動かすと、存在する塩基性形または酸性形の濃度が、動かされた方向 (より酸性またはより塩基性) および pH 単位に従って移動する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
略号
IPTG、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド、
MES、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、
MOPS、(3-N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、
TAPS、N-([トリ(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ) プロパンスルホン酸、
CHES、2-(N-シクロヘキシルアミノ) エタンスルホン酸、
EDTA、エチレンジアミンテトラアセテート。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
変異体が誘導される元のプロテオロドプシン変種は、配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 のものを含み、限定でないが、自然界に存在するプロテオロドプシン変種またはこれらの列挙した配列とアミノ酸同一性が少なくとも 70% もしくは 80% もしくは 90% もしくは 95% であるプロテオロドプシン 変種であり得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
異なるアミノ酸で置換された保存アルギニンを有するプロテオロドプシン変異体は、塩基性形と酸性形との最大吸収波長の相違が野生型プロテオロドプシンよりも小さくなる改変された光化学性を有する。好ましいプロテオロドプシン変異体は、アラニン、グルタミン酸またはグルタミンに変えられた保存アルギニン残基を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
プロテオロドプシン変種のヌクレオチド／アミノ酸配列
種々のプロテオロドプシンのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-1 〜 1-29) がジーンバンクに寄託番号 AF349976-AF350003 および AF279106 (これは Bac31A8 プロテオロドプシンをコードする遺伝子を含む 105 kilobase ゲノム領域のヌクレオチド配列を含有する) で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-30 〜 1-51) がジーンバンクに寄託番号 AY210898-AY210919 で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-52 〜 1-79) がジーンバンクに寄託番号 AY250714-AY250741 で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-80 〜 1-81) がジーンバンクに寄託番号 AY372453 および AY372455 で寄託されている。これらの全配列は、本出願で引用により具体的に組み込む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
これらの天然型プロテオロドプシンのアミノ酸配列のいずれかを用いて、プロテオロドプシン変異体をつくることができる。例えば、天然型プロテオロドプシン変種には、Hot75m1、Bac31A8、Bac40E8、Bac41B4、Bac64A5、Hot0m1、Hot75m3、Hot75m4、Hot75m8、MB0m1、MB0m2、MB20m2、MB20m5、MB20m12、MB40m1、MB40m5、MB100m5、MB100m7、MB100m9、MB100m10、PalB1、PalB2、PalB5、PalB7、PalB6、PalB8、PalE1、PalE6、PalE7、MED 26、MED27、MED36、MED101、MED102、MED106、MED25、MED202、MED204、MED208、REDA9、REDB9、REDF9、RED19、RED2、RED23、RED27、RED30、RED4、RED5、REDr6a5a14、REDr6a5a6、REDr7_1_4、REDs3_7、REDr7_1_15、REDs3_15、medA15r8ex6、REDr7_1_16、medA15r11b9、medA15r9b5、medA15r8b3、medA15r11b3、medA15_r8_1、medA17R9_1、medA15r8b9、medA19_R8_16、medA19_R8_19、medA17_R8_6、medA15r9b7、medA15_R8_3、medA15r10b5、medA19_r9_9、medA15_r8ex7、medA19_R8_20、medA15_R8ex9、medA15_r9_3、medA17_r8_15、medA17_r8_11、medA15r8b8、medA15r8ex4、ANT32C12 PR および HOT2C01 PR がある。好ましい天然型プロテオロドプシン変種は Hot75m1 および Bac31A8 プロテオロドプシンである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
上記プロテオロドプシン遺伝子のいずれのヌクレオチド配列も Beja, et al. (2000) または WO 01/83701 の方法を用いて、取得または誘導できる。プロテオロドプシン変種をコードする遺伝子の例は、バクテリオプランクトン Bacterial Artificial Chromosome (BAC) クローン Bac31A8 (EBAC31A08 としても知られる)である (参照、WO 01/83701)。当業者は、異なるプロテオロドプシン変種をコードする他の遺伝子を、上記と同様の方法を用いて得ることができる。当業者はまた、プロテオロドプシン遺伝子を、天然型生育物から得られる生物体から、プライマーを設計し、DNA の縮重 PCR、異型ハイブリダイゼーションまたはランダム配列決定を用いることにより、取得またはクローン化し得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
無傷細胞におけるプロテオロドプシンスペクトルの測定
プロテオロドプシン発現プラスミドおよびコントロール・プラスミド pTrcHis2-LacZ (Invitrogen) を株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) のコンピテント細胞中に、製造業者の説明に従い、形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコールのプレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を 6 ml LB + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコール + 10 μM オール-trans-レチナール媒体のガラス管中で 37 ℃、6 時間生育した。細胞は早期に定常期に達する。細胞はプロテオロドプシンを非誘発 pTrc プロモーターから構成的に発現する。細胞を遠心分離、4,500xg 6 分間で集め、培地を除き、細胞を 5 ml 無菌水中に再懸濁した。900 μl サンプルの細胞を 100 μl アリコートの濃縮緩衝液 (1.0 M アセテート (pH 4.9)、1.0 M MES (pH 5.8)、1.0 M MOPS (pH 6.7)、1.0 M TAPS (pH 8.1) または 1.0 M CHES (pH 9.1)) に加えた。21 天然型プロテオロドプシンのスペクトルを無傷の細胞中で、５の異なる細胞外 pH 値で、スペクトル光メーター (On-Line Instrument Systems, Inc.) により測定した。これは、サンプルクベットに隣接の光増幅検出器を置くことにより混濁状サンプルでの使用に適合する。コントロール・プラスミド (pTrcHis2-LacZ) を含有する株からの吸収をプロテオロドプシン含有のサンプルから控除した。サンプルと対照との間の細胞密度により起きる背景光拡散の相違を補正するために、各スペクトルにおける最初の１０および最後の１０の波長および吸光度値についての最少平方フィッティングにより決定された直線的ベースラインを、各スペクトルから控除した。ついでスペクトルを同じ最小値に、最小値における相違を控除することにより調整した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
pTrcHis Forward プライマー (Invitrogen) を用いてプラスミドの配列決定を行い、所望の変異がプラスミド中に導入されていることを確認した。
これらのプロテオロドプシン変異体を発現させた。異なるpH 値での無傷細胞中のこれらのスペクトルを測定し、pKrh 値を上記のように計算した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
(a) ヒスチジン残基
表 5 は、Bac31A8.の野生型および変異体の pKrh 値および酸性および塩基性スペクトルの吸収最大を要約する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
プロテオロドプシン (野生型または変異体) 発現プラスミドを株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) 中のコンピテント細胞に製造業者の説明に従い形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコールのプレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を 200 ml LB + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 10 μM オール-trans-レチナール 媒体中で 37 ℃で 500 ml バッフル付振盪フラスコにおいて生育した。培養物を新鮮な形質転換プレートから直接接種した。異なる培養物中のプロテオロドプシン発現が、培養物の OD600 が約 0.8 (4 時間生育後) のとき、0.5 mM IPTG + 10 μM オール-trans-レチナールを加えることにより誘導し、培養物をさらに 4 時間 37 ℃で培養した。細胞を遠心分離 3,500xg 10 分間で集菌し、-80 ℃で保存した。細胞を、40 mM MOPS pH 7.0、20 mM MgCl2、0.2 mg/ml リゾチーム、0.2 mg/ml DnaseI、2% ドデシル-β-D-マルトシドおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液 (完全、EDTA-なしのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠、Roche Applied Science）中に再懸濁し、超音波により 0 ℃で分解した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
精製された野生型および変異体 Hot75m1 プロテオロドプシンについてのこれらの結果によると、Hot75m1 の保存 H77 ヒスチジンがアスパラギンまたはグルタミンに変えられたとき、pKrh 値が 酸性 pH 側に有意に移動した。精製 Hot75m1 H77Q は値 pKrh 6.3 を有し、精製 Hot75m1 H77N は pKrh 値 6.5 を有し、一方、野生型タンパク質は 8.4 であった。ヒスチジンをリシンに変えた精製 Hot75m1 H77K 変異体は、試験した pH 域 (pH 4.9-9.1) でスペクトル特性において pH 依存性変化がないか、ほとんどなく、１塩基性形のみを有しているようである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
実施例５：プロトン・ポンピングの測定
プロテオロドプシンの塩基性形は、励起 M-状態 (または M-様状態)の形成および細胞の内側から外側にプロテオロドプシン含有膜を通過するプロトンのポンピングを含む光サイクルを受ける。プロテオロドプシン変種が生産的光サイクルを受けるかどうかを調べるために、これらの変種のポンプ・プロトンに対する能力を決定した。プロトン・ポンピングを、細胞の内側から細胞外媒体へのプロトンのポンピングに起こされる、プロテオロドプシンを発現する細胞の照射での細胞外 pH の変化として測定した。Bac31A8 野生型および H75N 変異体のプロトン・ポンピングの pH 依存性も決定した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
細胞の産生および調製
プロテオロドプシン (野生型または変異体) 発現プラスミドを、株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) のコンピテント細胞中に、製造業者の説明に従い形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコール・プレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 10 μM オール-trans-レチナール媒体中で 37 ℃で 250 ml バッフル付振盪フラスコにおいて生育した。培養物を新鮮な形質転換プレートから直接インキュベートした。異なる培養物におけるプロテオロドプシンが、培養物の OD600 が約 0.8 (4 時間生育後)のとき 0.1 mM IPTG + 10 μM オール-trans-レチナールを加えることで誘導され、培養物をさらに 4 時間 37 ℃でインキュベートした。細胞を遠心分離 3,500xg 10 分間で採取し、-80 ℃で保存した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
装置および方法
10 ml ホウケイ酸ガラス管中の 2.0 ml 細胞サンプルについての pH 値を、電圧出口を National Instruments (Austin, TX) データ取得ボードに接続された Beckman (Fullerton, CA) Phi40 pH を用いて測定し、これを１秒間隔でシグナルを平均化し Pentium に基づくパーソナルコンピューターでデータを保存した。細胞サンプルを磁気攪拌し、ふたつの側から Melles Griot (Irvine, CA) の赤外フィルター (03FC569) および Oriel Instruments (Stratford, CT) の 450 nm カットオン色ガラスフィルター (51284) を備えた Dolan-Jenner Industries (Lawrence, MA) の 150-watt 照射器 (Fiber-Lite A3200) に連結されたスピリットファイバー光ケーブルにより照射した。シャッターの手動開閉により光を調節した。光の入射角度を注文作成の細胞ホルダーの使用で一定とした。照射前 3 分間の pH の測定後、細胞サンプルの pH を一定照射の 3 分間測定した。ついで、照射中止後 3 分間 pH 測定した。この工程を各細胞サンプルにつき２回以上繰り返し、各細胞サンプルにつき３回の反復測定値を得た。