【手続補正書】
【提出日】平成17年4月20日(2005.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ・アレイであって、該プローブ・アレイ上でのプローブ分子と標的分子との分子相互作用によりサンプル中の標的分子を定性的かつ／または定量的に検出するためのプローブ・アレイであり、アレイ表面と、該アレイ表面の定められた部位に固定されたプローブ分子とからなり、
該プローブ分子が少なくとも１つの標識を有し、さらに同プローブ分子内に、該アレイ表面へのプローブ分子固定化部位と該標識との間に少なくとも１つの選択的に切断可能な結合も有することを特徴とするプローブ・アレイ。
【請求項２】
前記プローブ分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、およびこれらの類似体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のプローブ・アレイ。
【請求項３】
前記プローブ分子がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載のプローブ・アレイ。
【請求項４】
前記プローブ分子が、１０〜１００塩基長のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３に記載のプローブ・アレイ。
【請求項５】
前記選択的に切断可能な結合が、前記アレイ表面へのプローブ分子固定化部位と前記プローブ分子の標識との間のほぼ中央に位置していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項６】
前記選択的に切断可能な結合が、酵素的方法によって選択的に切断することができないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項７】
前記選択的に切断可能な結合が、化学的方法および物理的方法のうち少なくともいずれかによって選択的に切断可能であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項８】
前記選択的に切断可能な結合が、酸の陰イオン、塩基の陽イオン、フッ化物イオン、な
らびに水銀イオンおよび／または銀イオンなどの重金属イオンのうち少なくともいずれかによって選択的に切断可能であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項９】
前記選択的に切断可能な結合が、光分解によって選択的に切断可能であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１０】
前記プローブ分子が式Ａ１−Ｓ−Ａ２の核酸からなり、式中、Ｓは少なくとも１つの選択的に切断可能な結合を含む核酸であり、Ａ１およびＡ２は任意の核酸または核酸類似体であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１１】
Ｓが、選択的に切断可能な結合によって架橋されたヌクレオチドダイマーであることを特徴とする、請求項１０に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１２】
Ｓが、下記の式ＩおよびＩＩを有するダイマーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載のプローブ・アレイ。
【化１】
2005500855.tif 000001
（式中、ＸおよびＹは独立に、Ｏ、ＮＨ、およびＳからなる群から選択され、ただしＸおよびＹが同時にＯではないことを条件とし、Ｂは、プリン誘導体であるアデニンおよびグアニンならびにピリミジン類であるシトシンおよびチミンなどの核酸塩基を表す。）
【化２】
2005500855.tif 000002
（式中、ＸおよびＹは、ＰＧが不安定な保護基ではない場合、独立にＯ、ＮＨ、およびＳからなる群から選択され、ただしＸおよびＹが同時にＯではないことを条件とし、Ｂは、プリン誘導体であるアデニンおよびグアニンならびにピリミジン類であるシトシンおよびウラシルなどの核酸塩基を表し、ＰＧは、Ｈ、および下式
【化３】
2005500855.tif 000003
などの不安定な保護基からなる群から選択される。）
【請求項１３】
前記選択的に切断可能な結合がホスホチオエート結合であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１４】
前記標識が、標識済みのレポーター・プローブとのハイブリダイゼーションによって検出可能な、蛍光標識、発光標識、金属標識、酵素標識、放射性標識、ポリマー標識、および核酸からなる群から選択される検出可能なユニットであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１５】
前記検出可能なユニットがアンカー基を介して前記プローブ分子に結合していることを特徴とする、請求項１４に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１６】
前記アンカー基がジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群から選択されることを特徴
とする請求項１５に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１７】
少なくとも１つの標識を有し選択的に切断可能な結合を持たないプローブ分子が、前記プローブ・アレイの少なくとも１つのアレイ要素上に配置されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１８】
選択的に切断可能な結合を備えていない前記プローブ分子が、その化学的性質により選択的に切断可能な結合を備えたプローブ分子に相当する分子から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載のプローブ・アレイ。
【請求項１９】
選択的に切断可能な結合を備えていない前記プローブ分子が、定められた配列またはランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１７または１８に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２０】
プローブ分子と結合していない検出可能なユニットが、少なくとも１つのアレイ要素上に配置されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２１】
選択的に切断可能な結合を備えていないプローブ分子またはプローブ分子と結合していない検出可能なユニットが、標識度が異なる状態で種々のアレイ要素上に配置されることを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２２】
標的分子に対して親和性がないかまたは少なくとも特異的な親和性を持たないプローブ分子が、少なくとも１つのアレイ要素上に配置されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２３】
標的分子に対して親和性がないかまたは少なくとも特異的な親和性を持たないプローブ分子が、定められた配列またはランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２２に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２４】
サンプルに外部から加えられる標的分子に対し特異的な親和性を有するプローブ分子が、少なくとも１つのアレイ要素上に配置されることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２５】
標識および該標識とアレイ表面へのプローブ固定化部位との間に位置する選択的に切断可能な結合を有し、かつ外部から加えられた標的分子または十分な濃度でサンプル中に存在する標的分子に対して特異的な親和性を有するプローブ分子が配置されたアレイ要素が、アレイの表面全体に分布していることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のプローブ・アレイ。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイを製造する方法であって、
ａ）標識され、かつアレイ表面へのプローブ分子固定化部位と該標識との間に切断可能な結合を有するプローブ分子を合成する工程と、
ｂ）プローブ分子内に定められた位置を介して該プローブ分子をアレイ表面へ部位特異的に固定化する工程と
からなる方法。
【請求項２７】
アレイ表面の所定位置にプローブ分子をｉｎ  ｓｉｔｕ合成することにより、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイを製造する方法であって、
ａ）適切な試薬で活性化することが可能であるか、または保護基を備えたアレイ表面を
準備する工程と、
ｂ）合成しようとするプローブ分子のサブユニットを該アレイ表面の所定部位に結合または固定化する工程と、
ｃ）標識と、該アレイ表面のプローブ分子固定化部位と標識との間の選択的に切断可能な結合とを組み込むことによって、工程ｂ）で固定化または結合したサブユニットの後にプローブ分子をｉｎ  ｓｉｔｕ合成する工程と
からなる方法。
【請求項２８】
工程ｂ）における所定部位への結合が、アレイ表面の活性化または脱保護を行った後にサブユニットを結合することによって行われることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アレイ表面へのプローブの固定化が共有結合であることを特徴とする、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチド・プローブの合成が、ホスホロアミダイト法によって実施されることを特徴とする、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択的に切断可能な結合が、ホスホチオエート基で２つのヌクレオシドを架橋することによって生成されることを特徴とする、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
同じ反応性を有する標識済みモノマーと非標識モノマーの混合物を、合成の過程で添加することによって、アレイ要素上に段階的に異なる標識度が実現されることを特徴とする、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイまたは請求項２６〜３２のいずれか一項に従って製造されたプローブ・アレイの品質を管理する方法であって、
ａ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイを準備する工程と、
ｂ）アレイ表面に合成され固定化されたプローブ分子をシグナル強度の形式で検出する工程と
からなる方法。
【請求項３４】
前記検出が、直接検出される標識を介して実施されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標識が、蛍光標識および放射性標識のうち少なくともいずれかである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
プローブ分子を有するアレイ要素の占有密度が、前記標識によって生成されたシグナルの強度を用いて検出することにより決定されることを特徴とする、請求項３３〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出が、グレイスケールの形式でシグナル強度を映像化する撮像法を用いて行われることを特徴とする、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記品質管理の結果をデータベースに保存することを特徴とする、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
プローブ・アレイ上でのプローブ分子と標的分子との分子相互作用によって、分析サン
プルから標的分子を定性的かつ／または定量的に検出する方法であって、
ａ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイを準備する工程と、
ｂ）分析サンプルと共にプローブ・アレイをインキュベートする工程と、
ｃ）該プローブ分子内の選択的に切断可能な結合を選択的に切断する工程と、
ｄ）標的分子との相互作用によって該アレイ表面に保持されている標識済みプローブ分子断片を、シグナル強度の形式で検出する工程と、
からなる方法。
【請求項４０】
ａ．１）工程ａ）の後で、アレイ表面に合成または固定化したプローブ分子をシグナル強度の形式で検出する工程と、
ｂ．１）工程ｂ）の後で、標的分子とプローブ分子との特異的な相互作用が非常に安定したままの状態にあり、かつ非特異的に結合している標的が除去される条件下で洗浄する工程と、
ｂ．２）工程ｂ）またはｂ．１）の後で、シグナル強度の形式で検出を実施する工程と、
ｃ．１）工程ｃ）の後で、標的分子との相互作用によって該アレイ表面に保持されていない標識済みプローブ分子断片を除去するために、洗浄する工程と、
ｄ．１）工程ｄ）で得られたシグナル強度を標準化する工程と
のうち少なくとも１つの工程からさらになる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｄ．１）の標準化が、
ａ）工程ｄ）で得られたシグナル強度と、請求項４０に記載の工程ａ．１）または請求項３３に記載の工程ｂ）で得られたシグナル強度を用いて決定された補正係数との数学的関連付けによる標準化方法、
ｂ）工程ｄ）で得られた強度と、対照アレイ要素のシグナル強度を用いて決定された補正係数との数学的関連付けによる標準化方法であって、該対照アレイ要素はアレイの全領域に分布しており、かつ該対照アレイ要素上に、標識および該標識とアレイ表面へのプローブ固定化部位との間に位置する選択的に切断可能な結合を有し、外部から加えられた標的分子または十分な濃度でサンプル中に存在する標的分子に対して特異的な親和性を有するプローブ分子が配置されていることを特徴とする標準化方法、
ｃ）サンプルからの標的分子との相互作用または検出可能な相互作用を生じないプローブ分子が配置されているバッククラウンド・アレイ要素の検出シグナル強度を、工程ｄ）で得られたシグナル強度から減じることによる標準化方法、および
ｄ）あるアレイ要素に関して得られたシグナル強度と、標識されているが選択的に切断可能な結合を備えていないプローブ分子が配置された検出標準アレイ要素のシグナル強度とを比較することによる標準化方法
のうち少なくとも１つによって実施されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記選択的に切断可能な結合が、化学的方法および物理的方法のうち少なくともいずれかによって選択的に切断されることを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記選択的に切断可能な結合が、酸の陰イオン、塩基の陽イオン、フッ化物イオン、ならびに水銀イオンおよび／または銀イオンなどの重金属イオンのうち少なくともいずれかを添加することによって選択的に切断されることを特徴とする、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的分子が、酵素的、物理的、または化学的な方法によってインキュベーション前に断片化されることを特徴とする、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
インキュベーションを、標識済み標的のサンプルと共に行うことを特徴とする、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記選択的に切断可能な結合の切断を、高イオン強度および低温の少なくともいずれかの条件で行うことを特徴とする、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
プローブ・アレイ上でのプローブ分子と標的分子との分子相互作用によってサンプルから標的分子を定性的かつ／または定量的に検出するためのキットであって、
ａ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイと、
ｂ）プローブ分子内の選択的に切断可能な結合を選択的に切断するための試薬と、
ｃ）ハイブリダイゼーション緩衝液と、
からなるキット。
【請求項４８】
洗浄緩衝液をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記試薬が重金属イオンおよび酵素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４７または４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記重金属イオンが水銀イオンおよび銀イオンのうち少なくともいずれかから選択されることを特徴とする、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
反応チャンバからさらになることを特徴とする請求項４７〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
検出器からさらになることを特徴とする請求項４７〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
温度制御ユニットからさらになることを特徴とする請求項４７〜５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記プローブ・アレイならびに請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の構成要素が、高度に統合された自律的ユニットの形をとることを特徴とする、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
プローブ・アレイ上でのプローブ分子と標的分子との分子相互作用によって、サンプルから標的分子を定性的かつ／または定量的に検出するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプローブ・アレイまたは請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法または請求項４７〜５４のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項５６】
細胞の遺伝子型の状態を分析するための請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
細胞の生理的状態を分析するための請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
プローブ分子内の不安定な結合の形成に使用することが可能な、ＤＮＡ合成に適切なモノマー構成単位を製造する方法であって、
ａ）脱離基として適切な酸と共にヌクレオシドの５’−ＯＨ基をエステル化する工程と、
ｂ）該エステルとチオエステルを反応させる工程と、
ｃ）該チオエステルをけん化してチオールを形成する工程と、
ｄ）リン酸トリエステル法またはホスホロアミダイト法に適した保護基で該チオール官
能基を保護する工程と、
ｅ）リン酸トリエステル法またはホスホロアミダイト法を使用して、保護されたチオールの３’位を活性化する工程と
からなる方法。
【請求項５９】
プローブ分子内の不安定な結合の形成に使用することが可能な、ＤＮＡ合成に適切なモノマー構成単位を製造する方法であって、
ａ）リン酸トリエステル法またはホスホロアミダイト法で保護基として適切な化合物を反応させて、チオールを形成する工程と、
ｂ）脱離基として適切な酸と共にヌクレオシドの５’−ＯＨ基をエステル化する工程と、
ｃ）工程ａ）からのチオールと工程ｂ）からのエステルとを反応させる工程と、
ｄ）リン酸トリエステル法またはホスホロアミダイト法を使用して、保護されたチオールの３’位を活性化する工程と
からなる方法。
【請求項６０】
５’−Ｓ−（ジメトキシトリチル）−メルカプト−５’−デオキシヌクレオシド−３’−Ｏ−（２−シアノエチル，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−ホスファイト）。