【手続補正書】
【提出日】平成17年9月9日(2005.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉起源の、単離された哺乳類c-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞。
【請求項２】
細胞がヒト細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項３】
細胞がマウス細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項４】
細胞が、胎児(胎仔)、小児(小仔)または成人(成獣)由来の、請求項1記載の細胞。
【請求項５】
細胞が、浮遊液中にある、請求項1記載の細胞。
【請求項６】
細胞が、直径約3μm〜10μmである、請求項1記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、直径およそ4μmである、請求項6記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、心筋細胞に分化する、請求項1記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、自発的に拍動する心筋細胞に分化する、請求項1記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、ウイルスベクターにより導入されるかまたは不死化遺伝子により形質転換される、請求項1記載の細胞。
【請求項１１】
ウイルスベクターが、異種核酸を含む、請求項10記載の細胞。
【請求項１２】
心筋細胞が、GATA-4、トロポニン-T、L型カルシウムチャンネル、もしくはNkx2.5、またはそれらの組合わせを発現している、請求項8記載の心筋細胞。
【請求項１３】
筋肉起源のc-kit-c-met-CD34-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を単離する方法であって：
筋肉細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程；
これらの細胞を、固形基板上の組織培養用の培地において培養する工程；および
培地中の浮遊液内の細胞を単離し；これにより、筋肉起源のc-kit-c-met-CD34-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を単離する工程を含む、方法。
【請求項１４】
c-kit-c-met-CD34-Pax(3/7)-細胞の単離が、Sca-1細胞表面マーカーの発現を基にこれらの細胞を選別する工程を更に含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程が：
細胞浮遊液を、孔径約50〜200μmの第一のフィルターを通過させ、直径が約50μmより大きくおよび約200μm未満である細胞を含む第一の溶出液を収集する工程；および
第一の溶出液を孔径約40μmの第二のフィルターを通させ、直径が約40μm未満の細胞を含む第二の溶出液を収集する工程を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
第一のフィルターが、少なくとも100μmの孔径を有しおよび第二のフィルターが約40μmの孔径を有する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
組織培養用の培地が増殖培地である、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
増殖培地に増殖因子が補充されている、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
増殖因子が、上皮増殖因子、もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子、またはそれらの組合わせである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
上皮増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
上皮増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
上皮増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
請求項13記載の方法に従い単離された、筋肉起源の哺乳類c-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞。
【請求項２７】
筋肉起源のc-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を分化する方法であって：
筋肉細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程；
これらの細胞を、固形基板上の増殖因子の存在下で組織培養用の培地において培養する工程；
培地中の浮遊液内の細胞を単離する工程；および
増殖因子を除去し、これにより筋肉起源のc-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を、心筋細胞へ分化する工程を含む、方法。
【請求項２８】
心筋細胞が、自発的に拍動する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
増殖因子が、上皮増殖因子、もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子、またはそれらの組合わせである、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
上皮増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
上皮増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
上皮増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
請求項27記載の方法に従い、筋肉起源のc-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞から分化した哺乳類心筋細胞。
【請求項３７】
c-kit-c-met-CD34-Pax(3/7)-Sca-1+細胞を添加する工程を更に含む、請求項27記載の方法。
【請求項３８】
筋肉起源の哺乳類c-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を、薬学的に許容される担体中に含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
心筋細胞に対する物質の作用を決定するために、物質をスクリーニングする方法であって：
筋肉起源の哺乳類c-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞を提供する工程；
この細胞を物質と接触する工程；および
物質の細胞に対する作用を観察し、これにより物質をスクリーニングする工程を含む、方法。
【請求項４０】
作用の観察が、物質の細胞の分化に対する作用を決定することを含む、請求項46記載の方法。
【請求項４１】
分化に対する作用を決定することが、GATA-4の発現、心臓トロポニン-Tの発現、L型カルシウムチャンネルの発現、もしくはNkx2.5の発現、またはそれらの組合わせをアッセイすることを含む、請求項47記載の方法。
【請求項４２】
作用の観察が、この細胞の心筋細胞機能のパラメータをアッセイすることを含む、請求項47記載の方法。
【請求項４３】
パラメータが、細胞の自発的拍動を含む、請求項49記載の方法。
【請求項４４】
筋肉起源の哺乳類c-kit-c-met-CD34-Sca-1-Pax(3/7)-心筋細胞前駆細胞の精製された集団を含む容器を備える、心筋細胞分化を促進するためのキット。
【請求項４５】
哺乳類c-kit-c-met-CD34-Pax(3/7)-Sca-1+細胞の精製された集団を含む容器を更に備える、請求項51記載のキット。
【請求項４６】
増殖因子を含む容器、培地を含む容器、キットの使用に関する使用説明書、またはそれらのいずれかの組合わせを更に備える、請求項51記載のキット。