(57)【要約】      （修正有）【課題】複数波長のレーザ光を照射して多重染色された試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得する。【解決手段】波長の異なるレーザ光を射出するレーザ光源部８，９と、対物レンズ２と、そのＳ光軸に直交する方向にレーザ光を走査させる走査部１３と、走査されるレーザ光の試料Ａ内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部５と、試料内におけるレーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部１７，１８と、レーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部１０，１１と、集光位置を試料Ａの表面から深さ方向に順次切り替えて走査部１３によりレーザ光を走査させ、検出した蛍光から試料Ａの断面画像を順次取得し、断面画像に基づいて算出される各走査位置における表面から焦点面までの試料Ａの厚さに基づいて、次の各走査位置において試料Ａに照射するレーザ光の強度を調節する制御部６とを備えるレーザ顕微鏡１。【選択図】図１
2017003700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長の異なる複数のレーザ光を射出するレーザ光源部と、
該レーザ光源部から射出された複数の前記レーザ光を試料に集光する対物レンズと、
該対物レンズの光軸に直交する方向に複数の前記レーザ光を走査させる走査部と、
該走査部により走査される複数の前記レーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、
前記試料内における複数の前記レーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記レーザ光源部から射出される複数の前記レーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、
これらを制御する制御部とを備え、
該制御部が、前記集光深さ調節部により、前記集光位置を前記試料の表面から深さ方向に順次切り替えて前記走査部により少なくとも一方の前記レーザ光を走査させ、前記蛍光検出部により検出した蛍光から前記試料の断面画像を順次取得するとともに、取得された前記断面画像に基づいて算出される、各走査位置における前記表面から焦点面までの深さに基づいて、次の各走査位置において試料に照射する複数の前記レーザ光の強度を前記レーザ光強度調節部により調節するレーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記レーザ光強度調節部が、いずれかの前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した前記試料の断面画像に基づいて前記試料の厚さを算出し、算出された前記試料の厚さに基づいて、複数の前記レーザ光の強度を調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記レーザ光強度調節部が、複数の前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した複数の前記断面画像に基づいて前記試料の厚さをそれぞれ算出し、各前記レーザ光を照射したときの前記断面画像により算出された前記試料の厚さに基づいて、対応する前記レーザ光の強度をそれぞれ調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ光強度調節部が、複数の前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した複数の前記断面画像に基づいて前記試料の厚さをそれぞれ算出し、各前記走査位置において、各前記レーザ光を照射したときの前記断面画像により算出された前記試料の厚さを合計し、合計された厚さに基づいて複数の前記レーザ光の強度を調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
各前記走査位置において、蛍光を発生する前記レーザ光の強度を調節し、蛍光を発生しない波長の前記レーザ光の強度を所定の基準強度に下げる請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させながら、レーザ光を２次元的に走査して対物レンズの焦点面に広がる断面画像（蛍光画像）を試料の表面から深さ方向に取得することにより、各走査位置における試料の表面からの深さに応じてレーザ光の強度を調節するレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２１２１３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１のレーザ顕微鏡は、単一波長のレーザ光を照射する場合を開示しており、異なる複数波長のレーザ光を照射する場合については言及されていない。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、複数波長のレーザ光を照射して多重染色された試料の蛍光画像を取得する場合に、凹凸のある表面形状を有する試料に対しても、試料へのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、波長の異なる複数のレーザ光を射出するレーザ光源部と、該レーザ光源部から射出された複数の前記レーザ光を試料に集光する対物レンズと、該対物レンズの光軸に直交する方向に複数の前記レーザ光を走査させる走査部と、該走査部により走査される複数の前記レーザ光の試料内における集光位置の深さを調節する集光深さ調節部と、前記試料内における複数の前記レーザ光の集光位置から発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と、前記レーザ光源部から射出される複数の前記レーザ光の強度を調節するレーザ光強度調節部と、これらを制御する制御部とを備え、前記制御部が、前記集光深さ調節部により、前記集光位置を前記試料の表面から深さ方向に順次切り替えて前記走査部により少なくとも一方の前記レーザ光を走査させ、前記蛍光検出部により検出した蛍光から前記試料の断面画像を順次取得するとともに、取得された前記断面画像に基づいて算出される、各走査位置における前記表面から焦点面までの深さに基づいて、次の各走査位置において試料に照射する複数の前記レーザ光の強度を前記レーザ光強度調節部により調節するレーザ顕微鏡を提供する。
【０００６】
本態様によれば、レーザ光源部から発せられた波長の異なる複数のレーザ光が走査部により走査されて対物レンズにより試料の各走査位置に集光されると、試料内に存在する蛍光物質が励起されて、各走査位置において蛍光が発生する。発生した蛍光は蛍光検出部により検出され、検出された蛍光強度を走査位置に対応づけて記憶することにより、焦点面に沿う蛍光画像を取得することができる。そして、制御部が集光深さ調節部により焦点面の深さ位置を試料の表面から深さ方向に順次切り替えることにより、切り替えられた各位置において試料の断面画像を順次取得することができ、これにより、試料の３次元的形状を把握することが可能となる。
【０００７】
すなわち、試料の３次元的形状が把握できれば、集光深さ調節部により調節された各焦点面の深さ位置において、試料の表面から焦点面まで深さがわかるので、レーザ光強度調節部により試料の表面からの深さに基づいた適正に調節された強度のレーザ光を試料の各位置に照射することができる。すなわち、試料の深い位置に照射されるレーザ光は、試料自体による減衰が大きいので、検出された試料の表面からの深さに基づけば、次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【０００８】
上記態様においては、前記レーザ光強度調節部が、いずれかの前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した前記試料の断面画像に基づいて前記試料の厚さを算出し、算出された前記試料の厚さに基づいて、複数の前記レーザ光の強度を調節してもよい。
【０００９】
このようにすることで、いずれかのレーザ光の照射によって取得した複数の断面画像により試料の３次元的形状を把握して試料の厚さを算出することができ、算出された試料の厚さに応じて複数のレーザ光の強度を調節して、次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１０】
例えば、第１の波長のレーザ光によって第１の蛍光を発生する部位の内部に、第２の波長のレーザ光によって第２の蛍光を発生する部位が存在する場合に、第１の波長のレーザ光の照射によって発生した第１の蛍光による３次元的形状の把握により、第１の波長のレーザ光のみならず第２の波長のレーザ光の強度についても同様に調節する。これにより、次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記レーザ光強度調節部が、複数の前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した複数の前記断面画像に基づいて前記試料の厚さをそれぞれ算出し、各前記レーザ光を照射したときの前記断面画像により算出された前記試料の厚さに基づいて、対応する前記レーザ光の強度をそれぞれ調節してもよい。
【００１２】
このようにすることで、複数のレーザ光の照射によってそれぞれ取得した複数の断面画像により各波長の蛍光を発生する試料の３次元的形状をそれぞれ把握して試料の部位毎の厚さを算出することができ、各部位の厚さに応じて対応するレーザ光の強度を調節して、各部位における次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１３】
例えば、第１の波長のレーザ光によって第１の蛍光を発生する部位と、第２の波長のレーザ光によって第２の蛍光を発生する部位とが独立して存在する場合に、第１の波長のレーザ光の照射によって発生した第１の蛍光による３次元的形状の把握により、第１の波長のレーザ光の強度を調節し、第２の波長のレーザ光の照射によって発生した第２の蛍光による３次元形状の把握により、第２の波長のレーザ光の強度を調節する。これにより、各部位における次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１４】
また、上記態様においては、前記レーザ光強度調節部が、複数の前記レーザ光を前記試料に照射したときに前記蛍光検出部により検出した蛍光から取得した複数の前記断面画像に基づいて前記試料の厚さをそれぞれ算出し、各前記走査位置において、各前記レーザ光を照射したときの前記断面画像により算出された前記試料の厚さを合計し、合計された厚さに基づいて複数の前記レーザ光の強度を調節してもよい。
【００１５】
このようにすることで、複数のレーザ光の照射によってそれぞれ取得した複数の断面画像により各波長の蛍光を発生する試料の３次元的形状をそれぞれ把握して、各３次元形状から求まる表面から焦点面までの厚さを合計により算出することができる。そして、合計により求められた各部位の厚さに応じて対応するレーザ光の強度を調節して、次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１６】
例えば、第１の波長のレーザ光によって第１の蛍光を発生する部位と、第２の波長のレーザ光によって第２の蛍光を発生する部位とが厚さ方向に重なって存在する場合に、第１の波長のレーザ光の照射によって発生した第１の蛍光による３次元的形状と第２の波長のレーザ光の照射によって発生した第２の蛍光による３次元形状とをマージして、全体の厚さを求めることにより、２つの波長のレーザ光の強度を調節する。これにより、次の各走査位置において、該試料における減衰を考慮して、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができる。
【００１７】
また、上記態様においては、各前記走査位置において、蛍光を発生する前記レーザ光の強度を調節し、蛍光を発生しない波長の前記レーザ光の強度を所定の基準強度に下げてもよい。
このようにすることで、試料の３次元形状の把握により、次の走査位置がどちらの蛍光を発生する部位であるが想定でき、蛍光を発生する波長のレーザ光の強度を調節し、蛍光を発しない波長のレーザ光については強度を下げることにより、試料に与えるダメージを低減することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数波長のレーザ光を照射して多重染色された試料の蛍光画像を取得する場合に、凹凸のある表面形状を有する試料に対しても、試料へのダメージや輝度の飽和を防止しつつ、試料の深い位置においても明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡により観察する標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面におけるレーザ光強度マップの一例を示す図である。
【図３】図１のレーザ顕微鏡により取得された（ａ）第１の波長の蛍光画像、（ｂ）第２の波長の蛍光画像である。
【図４】図１のレーザ顕微鏡による画像取得動作を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡により観察する標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【図６】図５よりも深い焦点面における標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【図７】図５および図６のレーザ顕微鏡による画像取得動作を説明するフローチャートである。
【図８】本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡により観察する標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面における蛍光断面画像、（ｃ）（ａ）の焦点面における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【図９】図８のレーザ顕微鏡による画像取得動作を説明するフローチャートである。
【図１０】図８のレーザ顕微鏡の変形例により観察する標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面における蛍光断面画像、（ｃ）（ａ）の焦点面における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【図１１】図１０のレーザ顕微鏡における標本の（ａ）縦断面、（ｂ）（ａ）の焦点面における蛍光断面画像、（ｃ）（ａ）の焦点面における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、標本Ａに対向して配置される対物レンズ２と、該対物レンズ２を介して標本（試料）Ａに照射する極短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光という。）を射出する照明光学系３と、レーザ光の照射により標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系４と、対物レンズ２を光軸Ｓ方向に駆動するＺ駆動部（集光深さ調節部）５と、該Ｚ駆動部５および照明光学系３を制御するとともに、検出光学系４により検出された蛍光強度に基づいて蛍光画像を生成するコントロールユニット（制御部）６と、生成された蛍光画像を表示するモニタ７とを備えている。
【００２１】
照明光学系３は、異なる波長の第１レーザ光および第２レーザ光を射出する第１および第２のレーザ光源（レーザ光源部）８，９と、これらのレーザ光源８，９から発せられる第１、第２レーザ光の強度をそれぞれ調節する音響光学素子（ＡＯＭ、レーザ光強度調節部）１０，１１と、強度調節された第１、第２レーザ光を合波するダイクロイックミラー１２と、合波された第１、第２レーザ光を２次元的に走査するスキャナ（走査部）１３とを備えている。図中、符号１４はミラーである。スキャナ１３は、いわゆる近接ガルバノミラーである。
【００２２】
検出光学系４は、対物レンズ２により集光された標本Ａからの蛍光を第１、第２レーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１５と、該ダイクロイックミラー１５により分岐された蛍光を波長ごとに分岐するダイクロイックミラー１６と、分岐された蛍光の強度を波長ごとに検出する２つの光検出器（蛍光検出部）１７，１８とを備えている。光検出器１７，１８は、例えば、光電子増倍管である。
【００２３】
コントロールユニット６は、プロセッサにより構成され、Ｚ駆動部５を制御して、対物レンズ２の光軸Ｓ方向位置を設定することにより、対物レンズ２の焦点面を光軸Ｓ方向に移動させることができるようになっている。また、コントロールユニット６は、スキャナ１３に指令して、標本Ａにおけるレーザ光の走査範囲を調節するようになっている。
【００２４】
さらに、コントロールユニット６は、Ｚ駆動部５の制御により設定された対物レンズ２の各光軸Ｓ方向位置において、光検出器１７，１８により検出された蛍光の強度と、蛍光が検出された時点におけるスキャナ１３の走査位置とを対応づけることにより、蛍光画像を生成するようになっている。
【００２５】
具体的には、超短パルスレーザ光を用い、標本Ａ内の蛍光物質の多光子吸収により発生する蛍光を検出することで、対物レンズ２の光軸Ｓ方向位置毎に、焦点面のみの蛍光断面画像を取得することができる。また、１光子吸収による蛍光を検出する場合には、共焦点光学系を用いることで、対物レンズ２の光軸Ｓ方向位置毎に、光軸Ｓに直交する焦点面に沿って広がる標本Ａの蛍光断面画像を取得することができる。したがって、対物レンズ２を光軸Ｓ方向に送りながら各光軸Ｓ方向位置で蛍光断面画像を取得することにより、標本Ａの３次元形状を把握することができるようになっている。
【００２６】
また、本実施形態においては、コントロールユニット６は、より広い範囲に存在する蛍光物質を励起可能な波長のレーザ光（例えば、第１のレーザ光源８から発せられる第１レーザ光）の照射により取得された標本Ａの３次元形状に基づいて、第１および第２のレーザ光源８，９からそれぞれ射出された第１レーザ光および第２レーザ光の強度を調節するようになっている。各種機能は、コントロールユニット６内のメモリに記憶された制御プログラムをプロセッサが実行することで実現されるようになっている。
【００２７】
すなわち、図２（ａ）に示されるように、第１レーザ光により第１の波長の蛍光を発生する部位Ａ１が標本Ａのほぼ全体を占めており、その内部に、第２レーザ光により第２の波長の蛍光を発生する部位Ａ２が点在している場合に、第１レーザ光により発生する第１の波長の蛍光により把握された標本Ａの３次元形状に基づいて、図２（ｂ）に示されるように、第１および第２レーザ光の強度を同様に調節するようになっている。
【００２８】
Ｚ駆動部５を作動させて対物レンズ２を光軸Ｓ方向に送りながら蛍光断面画像を順次取得していき、各光軸Ｓ方向位置の焦点面に沿う蛍光断面画像が取得されたときに、それまでに取得された蛍光断面画像と焦点面（焦準機構）の移動量（例えばＺ駆動部５の移動指令値や座標値等）を用いて、標本Ａの表面から現在の焦点面までの距離（厚さ寸法）を走査位置（光軸Ｓ方向に直交するＸＹ座標）毎に算出するようになっている。
【００２９】
そして、コントロールユニット６は、算出された厚さ寸法に基づいて、次に蛍光断面画像を取得する光軸Ｓ方向位置において各走査位置に照射する第１、第２レーザ光の強度を設定するようになっている。例えば、コントロールユニット６は、次の光軸Ｓ方向位置における各走査位置と第１、第２レーザ光の強度とを対応づけたレーザ光強度マップを生成するようになっている。各走査位置における第１、第２レーザ光の強度は、算出された標本Ａの厚さ寸法に対応付けられて設定されている。
【００３０】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａの観察を行うには、図４に示されるように、コントロールユニット６がＺ駆動部５を作動させて、焦点面が標本Ａに到達する手前の位置（Ｚ初期位置）に対物レンズ２の光軸Ｓ方向位置を調節するとともに（ステップＳ１）、ＡＯＭ１０，１１によって、標本Ａにおいて蛍光を発生させることができる十分に低い強度（基準強度）に各レーザ光の強度を設定する（ステップＳ２）。
【００３１】
そして、第１、第２のレーザ光源８，９から射出され、ダイクロイックミラー１２によって合波された第１レーザ光および第２レーザ光を、スキャナ１３によって２次元的に走査させ、Ｚ初期位置における２次元画像を各チャンネル（光検出器１７，１８）で取得する（ステップＳ３）。対物レンズ２によって集光される標本Ａからの光は、ダイクロイックミラー１５によって第１、第２レーザ光の光路から分岐された後、ダイクロイックミラー１６によって波長ごとに分岐され、２つの光検出器１７，１８によってそれぞれ検出される。そして、レーザ光の走査位置の座標と対応づけられて、当該焦点面に沿う断面画像が取得される。
第1レーザ光は第１の波長の蛍光を励起し、第２レーザ光は第２の波長の蛍光を励起する。光検出器１７，１８は、それぞれ、第１の波長の蛍光、第２の波長の蛍光を検出する。
次に、Ｚ駆動部５の作動により、所定の送り量だけ対物レンズ２を光軸Ｓ方向に標本Ａに近づける（ステップＳ４）。
以降、Ｚ初期位置からＺ終了位置までの所定のＺ範囲において、所定間隔で焦点面をずらしながら、ステップＳ５〜Ｓ８を繰り返して実行する。
【００３２】
図２に示す例では、第１の波長の蛍光が標本Ａの全体形状を表すので、第１の光検出器１７によって検出された第１の波長の蛍光断面画像に基づいてレーザ光強度マップを作成する。
【００３３】
コントロールユニット６は、標本Ａからの蛍光の有無を判定するために、光検出器１７による蛍光断面画像を所定の閾値で２値化してメモリに記憶する。ステップＳ８によるループの２回目以降の断面画像取得において、それまでに蓄積された各焦点面の２値化画像と重ね合わせることで、等高線マップのような３次元形状データを生成し（ステップＳ５）、次の蛍光断面画像を取得する際の第１、第２レーザ光の強度分布を決定する。すなわち、上記により取得された第１の波長の蛍光断面画像において蛍光強度を有する各走査位置については、次の焦点面では対物レンズ２の送り量分だけ標本Ａの表面からの距離が深くなるので、その分を考慮してレーザ光強度を高めるように補正するレーザ光強度マップが生成される（ステップＳ６）。レーザ光強度マップは、第１、第２レーザ光の両方について同じものが適用される。
【００３４】
そして、コントロールユニット6は、生成されたレーザ光強度マップの強度に従って、各走査位置における第１レーザ光および第２レーザ光の光量をＡＯＭ１０，１１によってそれぞれ調節しながらスキャナ１３にレーザ走査を行わせ、光検出器１７，１８からの出力に基づいて第１、第２の波長の蛍光断面画像をそれぞれ生成する（ステップＳ７）。そして、所定のＺ範囲における全ての蛍光断面画像が取得されるまで、ステップＳ４からの工程が繰り返される（ステップＳ８）。
【００３５】
これにより、焦点面の標本Ａの表面からの深さにかかわらず、第１、第２レーザ光の照射強度が焦点面においてほぼ均一になるように補正されるので、２つの波長の蛍光について、図３（ａ），（ｂ）に示されるように、標本Ａの表面の凹凸にかかわらず、標本Ａの深い位置においてもムラのない明るい蛍光画像を取得することができる。
【００３６】
すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、第１の波長の蛍光の断面画像情報に基づいて作成したレーザ光強度マップを第１、第２の両方のレーザ光に対して適用することで、図２の標本Ａのように第１レーザ光により励起される第１の波長の蛍光が標本Ａ全体の表面形状を現している場合には、全てのレーザ光について光軸Ｓ方向に異なる各焦点面での適切な強度補正が行われる。これにより、第２のレーザ光により励起される第２の波長の蛍光が標本Ａ内の一部分でしか発生しない場合でも、標本Ａの深さにかかわらず、焦点面におけるレーザ光強度が略均一な第２レーザ光を焦点面に照射することができる。したがって、第２レーザ光により励起される第２の蛍光による断面画像についても、図３（ｂ）に示されるように、標本Ａの深さにかかわらず、明るい蛍光画像を取得することができる。
【００３７】
なお、本実施形態においては、第１レーザ光および第２レーザ光を射出する２つのレーザ光源８，９を有する場合について例示したが、これに代えて、３以上の波長のレーザ光源を有する場合に適用してもよい。
また、２つのレーザ光源８，９からの第１、第２レーザ光を合波して同時に標本Ａに照射する場合について説明したが、１つの波長可変レーザ光源や２波長出射型レーザ光源を用いて波長を切り替えてシーケンシャルに観察する場合に適用してもよい。
【００３８】
また、本実施形態においては、焦点面を光軸Ｓ方向にずらして順次蛍光画像を取得しながら、画像取得した焦点面までの標本Ａの３次元形状データ（厚さ寸法）を都度算出し、その次の焦点面の蛍光画像取得に際して第１、第２レーザ光の強度を直前に算出された３次元形状データに基づいてリアルタイムに調節する場合について説明したが、これに限定されるものではない。
すなわち、まず蛍光を発生可能な最低限の強度を変更することなく、全ての光軸Ｓ方向位置において実施されたプリ撮影により取得された１セットの蛍光断面画像から３次元形状を把握し、全ての光軸Ｓ方向位置および全ての走査位置におけるレーザ光強度マップを予め生成しておいてもよい。また、タイムラプス観察においては、１サイクル前の撮影により取得された１セットの蛍光断面画像から次のサイクルにおける全ての光軸Ｓ方向位置および全ての走査位置におけるレーザ光強度マップを予め生成しておいてもよい。
【００３９】
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００４０】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、コントロールユニット６による制御において第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と相違している。
すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図５（ａ）および図６（ａ）に示されるように、第１レーザ光によって第１の波長の蛍光を発生する標本Ａの部位Ａ１と、第２レーザ光によって第２の波長の蛍光を発生する部位Ａ２とが互いに独立して存在している場合に適用される。第１の波長、第２の波長のそれぞれの蛍光断面画像から、第１、第２のレーザ光のそれぞれに対応したレーザ光強度マップを作成し、第１、第２のレーザ光の強度を対応するレーザ光強度マップに従って個別に補正する。
【００４１】
本実施形態においては、コントロールユニット６は、ＡＯＭ１０，１１を以下のように制御する。
すなわち、図７に示されるように、Ｚ駆動部５の作動により対物レンズ２を初期位置に移動し（ステップＳ１）、２つのレーザ光源８，９からそれぞれ発せられる第１、第２レーザ光の強度を基準強度に設定して（ステップＳ２）、蛍光画像を取得する（ステップＳ３）。対物レンズ２を所定の送り量だけＺ方向に移動させる（ステップＳ４）。
【００４２】
コントロールユニット６は、第１の実施形態と同じように、光検出器１７に対応した第１の波長の蛍光断面画像を所定の閾値で２値化してメモリに記憶するとともに、標本Ａの３次元形状データを生成する（ステップＳ１０）。また、光検出器１８に対応した第２の波長の蛍光断面画像を所定の閾値で２値化してメモリに記憶し３次元形状データを生成する（ステップＳ１１）。このようにして取得した２つの３次元形状データに基づいて、第１、第２のレーザ光にそれぞれ対応した２つのレーザ光強度マップを生成する（ステップＳ１２）。
【００４３】
そして、レーザ光強度マップの強度に従って各走査位置における第１レーザ光および第２レーザ光の光量を制御しながら、レーザ光を走査して第１、第２の波長の蛍光断面画像をそれぞれ生成する。この際、コントロールユニット６は、第１のレーザ光に対しては第１の波長の蛍光に基づく強度マップを適用し、第２レーザ光に対しては第２の波長の蛍光に基づく強度マップを適用する。（ステップＳ１３）。そして、所定のＺ範囲における全ての蛍光断面画像が取得されるまで、ステップＳ４からの工程が繰り返される（ステップＳ８）。
【００４４】
この場合に、第１レーザ光の強度調節は、図５（ｂ）および図６（ｂ）に示されるように、当該第１レーザ光を標本Ａに照射した結果得られた第１の波長の蛍光画像によって把握された標本Ａの３次元形状に基づいているので、第１の波長の蛍光を発生する部位Ａ１の厚さ寸法が大きくなるほど第１レーザ光の強度が高くなる。そして、第１レーザ光の強度は、第２の波長の蛍光を発生する部位Ａ２の厚さ寸法には影響されることがない。
【００４５】
同様に、第２レーザ光の強度調節も、図５（ｂ）および図６（ｂ）に示されるように、当該第２レーザ光を標本Ａに照射した結果得られた第２の波長の蛍光画像によって把握された標本Ａの３次元形状に基づいているので、第２の波長の蛍光を発生する部位Ａ２の厚さ寸法が大きくなるほど第２レーザ光の強度が高くなる。そして、第２レーザ光の強度は第１の波長の蛍光を発生する部位Ａ１の厚さ寸法には影響されることがない。
【００４６】
すなわち、標本Ａの内、第１の波長の蛍光が発生しない部位については、第１レーザ光の強度は基準強度に維持され、第２の波長の蛍光が発生しない部位については、第２レーザ光の強度は基準強度に維持されるので、蛍光を発生しない領域には高強度のレーザ光が照射されないようになり、標本Ａが褪色等のダメージを受けることを防止することができるという利点がある。
【００４７】
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００４８】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１も、コントロールユニット６による制御において第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と相違している。
【００４９】
すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図８（ａ）に示されるように、第１レーザ光によって第１の波長の蛍光を発生する標本Ａの部位Ａ１と、第２レーザ光によって第２の波長の蛍光を発生する部位Ａ２とが互いにＺ方向に重なって存在している場合に適用される。第１の波長、第２の波長のそれぞれの蛍光断面画像から標本Ａの３次元形状データをそれぞれ作成してマージし、マージされた３次元形状データに基づいてレーザ光強度マップを作成して第１、第２のレーザ光の補正に適用する。
【００５０】
本実施形態においては、コントロールユニット６は、ＡＯＭ１０，１１を以下のように制御する。処理フローは９のようになる。
すなわち、２つのレーザ光源８，９からそれぞれ発せられる第１、第２レーザ光の強度を基準強度に設定して、蛍光画像を取得する。対物レンズ２を所定の送り量だけＺ方向に移動させる。
【００５１】
コントロールユニット６は、図９に示されるように、第２の実施形態と同じように、光検出器１７，１８に対応した第１の波長、第２の波長の蛍光断面画像をそれぞれ所定の閾値で２値化してメモリに記憶するとともに、標本Ａの３次元形状データをそれぞれ生成する（ステップＳ２０）。このようにして取得した２つの3次元形状データをマージし（ステップＳ２１）、マージにより得られた３次元形状データに基づいてレーザ光強度マップを生成する（ステップＳ２２）。
【００５２】
そして、レーザ光強度マップに従って各走査位置における第１レーザ光および第２レーザ光の光量を制御しながら、レーザ光を走査して第１、第２の波長の蛍光断面画像をそれぞれ生成する。この際、コントロールユニット６は、第１、第２の両方のレーザ光に対して同じレーザ光強度マップを適用する。（ステップＳ２３）。そして、所定のＺ範囲における全ての蛍光断面画像が取得されるまで、ステップＳ４からの工程が繰り返される（ステップＳ８）。図８（ａ）の焦点面Ｐ２におけるレーザ光の強度制御は、図８（ｃ）のようになる。
【００５３】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、異なる波長の蛍光を発生する部位Ａ１，Ａ２が光軸Ｓ方向に重なっている場合には、各部位Ａ１，Ａ２の厚さ寸法ｄ１，ｄ２が小さくても、レーザ光の減衰が両方の合計の厚さ寸法ｄ１＋ｄ２において発生するので、これらを合計した厚さ寸法として、第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布を表すレーザ光強度マップが作成される。これにより、対物レンズ２と焦点面との間に複数種類の部位が重なって存在していても、焦点面におけるレーザ光強度が略均一になるように照射強度を補正することができるという利点がある。
【００５４】
本実施形態による３次元画像取得を所定の時間間隔を置いて繰り返すタイムラプス観察に適用する場合、２サイクル目以降の観察時において次のように変形してもよい。
すなわち、１サイクル目の画像取得の結果、第１の波長の蛍光を発する領域Ａ１と第２の波長の蛍光を発する領域Ａ２が図８（ａ），（ｂ），（ｃ）のような構造で光軸Ｓ方向に重なっていることが、それぞれの蛍光断面画像から生成された３次元形状データによって把握される。すなわち、２サイクル目の３次元画像取得においては、図１０（ｂ），（ｃ）に示されるように、焦点面Ｐ１に到達するまでの範囲（図１１のｄ１の範囲）では、第１の波長の蛍光のみが検出されることが予測できるので、図９に示されるように、標本Ａの３次元形状データに基づいてレーザ光強度マップを生成したのち、第２レーザ光の強度については基準強度に維持されるようレーザ光強度マップを変更する。
この際、前回の観察時から今回の観察時までの間に標本Ａの移動や形状変化が起こる可能性があるので、前回観察で得られた３次元形状データに対し標本Ａの移動や変化を見込んだ膨張処理を施し、この形状データを用いて上述したレーザ光強度マップを作成することが望ましい。膨張処理は、例えば図１０（ａ）から図１０（ｃ）に破線で示したような形である。
【００５５】
同じように、図１１（ａ）から図１１（ｃ）に示されるように、対物レンズ２が焦点面Ｐ２となる位置では、右半分の領域において第１の波長の蛍光のみ、左半分の領域において第２の波長の蛍光のみがそれぞれ検出されることが予め把握される。したがって、マージにより生成した標本Ａの３次元形状データに基づいてレーザ光強度マップを生成したのち、第２の波長の蛍光のみが検出される左側の領域については第１レーザ光の強度を基準強度に落とし、第１の波長の蛍光のみが検出される右側の領域については、第２レーザ光の強度は基準強度に維持されるように、第１、第２のレーザ光の各レーザ光強度マップを変更する。膨張処理を施した場合は図１１（ａ）から図１１（ｃ）に破線で示した形となる。
【００５６】
このような変形例によれば、タイムラプスの前サイクルでの観察等により標本Ａの３次元形状データが既知であり、蛍光が発生しない領域が予め把握できている場合には、その領域について対応するレーザ光の強度を基準強度に設定したレーザ光強度マップを作成することによって、蛍光を発生しない領域には高強度のレーザ光が照射されないようになり、標本Ａが褪色等のダメージを受けることを防止できるという利点がある。
【００５７】
なお、上記各実施形態においては、スキャナ１３を近接ガルバノミラーにより構成し、Ｚ駆動部５の作動により所定の送り量だけ光軸Ｓ方向に対物レンズ２の焦点面を移動させ、スキャナ１３の作動により蛍光断面画像を取得する都度に、次の焦点面における各走査位置のレーザ光の強度分布を算出することとした。これに代えて、スキャナ１３としてレゾナントスキャナ等の取得画像のフレームサイクルが短いものを用いる場合には、レーザ高強度マップを作成する時間がない。
【００５８】
そこで、レゾナントスキャナを用いるのは、タイムラプス観察の場合とし、タイムラプス観察のインターバル中に、直前に取得された複数の蛍光断面画像に基づいて標本Ａの３次元形状を把握し、次の撮影時のレーザ光強度マップを作成することにすればよい。
この場合に、インターバルが長い場合には、標本Ａの移動や形状変化の可能性があるため、把握された標本Ａの３次元形状に膨張処理を施して、異なる波長の蛍光を発生する部位毎に、直前の観察時の標本Ａよりも若干大きな標本Ａが存在するものとしてレーザ光強度マップを作成することが好ましい。
【００５９】
また、取得された複数の蛍光断面画像において所定の閾値以上の輝度を有する領域に標本Ａが存在するものとして抽出する場合に、蛍光強度のムラにより輝度が閾値に達しない場所には標本Ａが存在しないものとして扱われる。このため、閾値によって標本Ａを抽出した後に、標本Ａの境界線が滑らかに変化するエッジを有するものとする領域検出を行い、標本の３次元形状を把握することにしてもよい。
【符号の説明】
【００６０】
１  レーザ顕微鏡
２  対物レンズ
５  Ｚ駆動部（集光深さ調節部）
６  コントロールユニット（制御部）
８  第１のレーザ光源（レーザ光源部）
９  第２のレーザ光源（レーザ光源部）
１０，１１  音響光学素子（ＡＯＭ、レーザ光強度調節部）
１３  スキャナ（走査部）
１７，１８  光検出器（蛍光検出部）
Ａ  試料（標本）
Ｓ  光軸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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