【手続補正書】
【提出日】平成17年8月18日(2005.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの[A]PG[R,S]ドメインを有し、神経細胞遊走促進活性、神経細胞増殖促進活性、神経突起伸長促進活性および神経細胞生存性促進活性から選ばれる少なくとも一つの生物学的効果を有する少なくとも一つのアミノ酸配列を含む神経再生ペプチド(NRP)化合物。
【請求項２】
更に、[A]PG[R,S]、PE、[A,G]RRおよびARGからなる群より選ばれる少なくとも一つの追加的アミノ酸ドメインを含む、請求項１記載のNRP。
【請求項３】
約0.8kD〜約2.7kDの分子量を有する、請求項１記載のNRP。
【請求項４】
約6.5〜約10の等電点を有する、請求項１記載のNRP。
【請求項５】
配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のNRP。
【請求項６】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号19からなる群より選ばれる、NRPをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７】
遺伝コードの冗長性によってのみ請求項６記載のヌクレオチド配列と異なる、NRPをコードする核酸。
【請求項８】
NRP化合物の薬理学上効果的な量を含む、神経再生を促進するための医薬組成物。
【請求項９】
神経再生が、神経細胞生存、神経細胞増殖、神経細胞遊走および神経突起伸長からなる群より選ばれる、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
NRPが請求項１記載のペプチドを含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
NRPが請求項２記載のペプチドを含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１２】
NRPが請求項５記載のペプチドを含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１３】
NRPが請求項６記載の核酸によってコードされる、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１４】
NRPが請求項６記載の核酸、または、遺伝コードの冗長性によってのみ請求項６記載の核酸と異なる配列を有する核酸によってコードされる、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項６記載のヌクレオチド配列の全体に対して少なくとも85％のヌクレオチド配列同一性を有する、NRPをコードする核酸分子。
【請求項１６】
NRPを発現し得る、請求項６記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
プラスミドである、請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１８】
ウイルスベクターである、請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
原核細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
真核細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項６記載の配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16または配列番号19のヌクレオチド配列において、「t」が「u」に置換されたヌクレオチド配列。
【請求項２３】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号19からなる群より選ばれる鎖の相補鎖を含むヌクレオチド配列。
【請求項２４】
長さが少なくとも15塩基対であり、NRPをコードするゲノムDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選ばれるアミノ酸配列の全体配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２６】
動物の脳幹神経節において神経再生を促すための、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項２７】
神経組織がパーキンソン病、アルツハイマー病、低酸素症、虚血症またはハンチントン病のために変性している危険性がある、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
生物体において神経変性によって特徴付けられる神経学的疾病の治療用医薬組成物であって、NRP化合物の薬理学上効果的な量を含む前記医薬組成物。
【請求項２９】
神経学的疾病が、パーキンソン病、アルツハイマー病、低酸素症、虚血症およびハンチントン病からなる群より選ばれる、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
神経細胞増殖および／または神経細胞遊走を誘導する医薬組成物であって、NRP化合物の神経細胞に対する効果的な量を含む前記医薬組成物。
【請求項３１】
神経突起伸長促進用医薬組成物であって、NRP化合物の神経細胞に対する効果的量を含む前記医薬組成物。
【請求項３２】
神経細胞生存性促進用医薬組成物であって、NRP化合物の神経細胞に対する効果的量を含む前記医薬組成物。
【請求項３３】
神経細胞増殖および／または神経細胞遊走を誘導する医薬組成物であって、NRP化合物の神経細胞に対する効果的量を含む前記医薬組成物。
【請求項３４】
神経細胞が生きた動物内に存在している、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３５】
神経細胞が動物の体内に存在していない、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３６】
神経細胞が動物の中枢神経系に存在している、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３７】
神経細胞が動物の体内に存在していない、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３８】
NRP化合物の効果的量を含む脊髄損傷治療用医薬組成物。
【請求項３９】
保存的アミノ酸置換により配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25または配列番号26のアミノ酸配列と異なる配列を有する、請求項５記載のペプチド。
【請求項４０】
以下の工程を含む、NRPの存在を決定する方法：
（ａ）以下を含む組織培養系を提供する工程：
１．組織培養基質；
２．前記基質上に置かれた皮質組織；および、
３．前記皮質組織と少なくとも2mm離れて前記基質上に置かれた視床組織；
（ｂ）前記皮質組織および前記視床組織を試験分子の存在下でインキュベーションする工程；
（ｃ）神経細胞生存性、神経細胞増殖、神経細胞遊走または神経突起伸長の１以上の生物学的効果を検出する工程；および、
（ｄ）前記試験分子の存在下で検出される前記生物学的効果と前記試験分子の非存在下で検出される前記生物学的効果とを比較する工程。
【請求項４１】
皮質組織および視床組織がラット由来である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
試験分子がNRP化合物である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
以下の工程を含むNRPの薬理学的効力を決定する方法；
（ａ）以下を含む組織培養系を提供する工程：
１．組織培養基質；
２．前記基質上に置かれた皮質組織；および、
３．前記皮質組織と少なくとも2mm離れて前記基質上に置かれた視床組織；
（ｂ）前記皮質組織および前記視床組織を試験分子の存在下でインキュベーションする工程；
（ｃ）神経細胞生存性、神経細胞増殖、神経細胞遊走または神経突起伸長の１以上の生物学的効果を検出する工程；および、
（ｄ）前記試験分子の存在下で検出される前記生物学的効果と前記試験分子の非存在下で検出される前記生物学的効果とを比較する工程。
【請求項４４】
以下の工程を含む、試験分子の効力を比較する方法：
（ａ）以下を含む組織培養系を提供する工程：
１．組織培養基質；
２．前記基質上に置かれた皮質組織；および、
３．前記皮質組織と少なくとも2mm離れて前記基質上に置かれた視床組織；
（ｂ）前記皮質組織および前記視床組織を試験分子の存在下でインキュベーションする工程；
（ｃ）神経細胞生存性、神経細胞増殖、神経細胞遊走または神経突起伸長の１以上の生物学的効果を検出する工程；および、
（ｄ）前記試験分子の存在下で検出される前記生物学的効果と既知量のNRP化合物存在下で検出される前記生物学的効果とを比較する工程。
【請求項４５】
以下の工程を含むNRP-様活性の存在を決定するためのキット：
（ａ）以下を含む組織培養系を提供する工程：
１．組織培養基質；
２．前記基質上に置かれた皮質組織；および、
３．前記皮質組織と少なくとも2mm離れて前記基質上に置かれた視床組織；
（ｂ）前記皮質組織および前記視床組織を試験分子の存在下でインキュベーションする工程；
（ｃ）神経細胞生存性、神経細胞増殖、神経細胞遊走または神経突起伸長の１以上の生物学的効果を検出する工程；および、
（ｄ）前記試験分子の存在下で検出される前記生物学的効果と前記試験分子の非存在下で検出される前記生物学的効果とを比較する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
配列番号６および７
9          18          27          36
5'  atg aaa ata aat gta tta att aaa tta atg acc aag tca gat 
Met Lys Ile Asn Val Leu Ile Lys Leu Met Thr Lys Ser Asp 
45          54          63          72          81
tct ttt aaa agc caa gcc agg ggc caa gtt ccc cca ttt cta 
Ser Tyr Lys Ser Gln Ala Arg Gly Gln Val Pro Pro Phe Leu 
90          99         108         117         126
ggg ggg gtg ggg tgc ccc tgg ttt ttt caa aca agg ttt tgg 
Gly Gly Val Gly Cys Pro Trp Phe Phe Gln Thr Arg Phe Trp 
135         144         153         162
ggc cat agt ttt gca gtt aaa ctg gcc tcc aac ctt tcc cag 
Gly His Ser Phe Ala Val Lys Leu Ala Ser Asn Leu Ser Gln 
171         180         189         198         207
gca gag aaa ttg gtc ctt cag caa acc ctt tcc caa aaa ggc 
Ala Glu Lys Leu Val Leu Gln Gln Thr Leu Ser Gln Lys Gly 
216         225         234         243         252
cta gac gga gca aaa aaa gct gtg ggg gga ctc gga aaa cta 
Leu Asp Gly Ala Lys Lys Ala Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu 
261         270         279         288     
gga aaa gat gca gtc gaa gat cta gaa agc gtg ggt aaa gga 
Gly Lys Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val Gly Lys Gly 
297         306         315         324         333 
gcc gtc cat gac gtt aaa gac gtc ctt gac tca gta cta tag 3' 配列番号:6
Ala Val His Asp Val Lys Asp Val Leu Asp Ser Val Leu *stop  配列番号:7
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
配列番号８および９
9          18          27          36
5’  atg gct gtt gtg tta ctt gca cca ttt ggg gac atc agc cag 
Met Ala Val Val Leu Leu Ala Pro Phe Gly Asp Ile Ser Gln 
45          54          63          72          81
gaa atc aca aag gtt ggg aca ggg act cca ggg agg gct gag 
Glu Ile Thr Lys Val Gly Thr Gly Thr Pro Gly Arg Ala Glu 
90          99         108         117         126
gcc ggg ggc cag gtg tct cca tgc ctg gcg gcg tcc tgc agt 
Ala Gly Gly Gln Val Ser Pro Cys Leu Ala Ala Ser Cys Ser 
135         144         153         162
cag gcc tat ggc gcc atc ttg gct cac tgc aac ctc tgc ctc 
Gln Ala Tyr Gly Ala Ile Leu Ala His Cys Asn Leu Cys Leu 
171         180         189         198         207
cca ggt tca atg att aaa aaa aag aag aaa ttt ata gtt gaa 
Pro Gly Ser Met Ile Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ile Val Glu 
216         225         234         243         252
ata gaa agt caa cct tta aag tct tac agg gaa aat tct acc 
Ile Glu Ser Gln Pro Leu Lys Ser Tyr Arg Glu Asn Ser Thr 
261         270         279         288
cat ttt ccc aga cca gtc cta aat ctt atg cga aaa cac tgt 
His Phe Pro Arg Gly Val Leu Asn Leu Met Arg Lys His Cys 
297         306         315         324         333
ggg gaa aag ggg gaa gaa ggg cct tgt ttc tct ccc aag caa  
Gly Glu Lys Gly Glu Glu Gly Pro Cys Phe Ser Pro Lys Gln  
342         351         360         369         378
atg ggg gag agg cga gnn tgt ggc gga ggg cta ggg ttg gct  
Met Gly Glu Arg Arg XXX Cys Gly Gly Gly Leu Gly Leu Ala  
387         396         405         414
cgc gag atc act aat tta aca tcc gct cat ctg ttg gtc ttg  
Arg Glu Ile Thr Asn Leu Thr Ser Ala His Leu Leu Val Leu  
423         432 435    
aat atc agc aac cag tga 3’      配列番号: 8
Asn Ile Ser Asn Gln *stop        配列番号: 9
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
NRP-5タンパク質全体は266個のアミノ酸からなる。
アノテーションした翻訳NRPアミノ酸配列NRP-5は３番染色体上にあるヒトカルシウム依存性分泌活性化因子タンパク質（GenBank XP_036915）に76％類似性を有している。さらに、翻訳されたヒト７番染色体NRP-5のエキソン１（339核酸）は翻訳されたマウス5' EST（RIKEN BB632392）に95.5％ホモロジーを有している。このタンパク質は、NRP-1および他のNRPに存在する、神経突起伸長、神経性存、神経細胞増殖および神経細胞遊走という生物学的特性を示すドメインを共通にする。
我々は、６番染色体の逆相補鎖上の領域116668725-116667697番に位置する（NCBIヒトゲノムアノテーション計画による領域）ヒトゲノムのDNA配列をアノテーションしている。タンパク質コード配列は以下の位置にある３つのエキソンからなっている：エキソン１：116668725-116668697；エキソン２：116668333-116668305；エキソン３：116667872-116667697。この配列は、本明細書ではNRP-6と称するが、78個のアミノ酸をコードする234核酸からなっている。この配列はNRPのヒト遺伝子ファミリーに属する。ヒトESTに対して見出された最も高いホモロジーは、ヒト胎盤組織から単離されたヒトcDNAクローンGenBank CS0DK001Y119に比較した場合の核酸59-234番からの同一性を示している。このクローンをその3'プライミング末端からシーケンシングすると、924核酸からなっていた。我々のホモログは234核酸の後の停止コドンTGAが末端を形成しているため、この遺伝子産物を扱っていない。NRPをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）および、ペプチドのアミノ酸配列（配列番号13；NRP-6）は以下の通りである：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
NRP-6のアミノ酸配列は、アノテーションされたヒト13番染色体上のNRPパラログ、NRP-2と14.1％同一性、および44.9％類似性を有している。このタンパク質は、NRP-1および他のNRP（例えば、NRP2-5）に存在する、神経突起伸長、神経細胞生存性、神経細胞増殖および神経細胞遊走という生物学的特性を示すドメインを共通にする。
さらに、他のNRP-1オルソログ、マウスNRPファミリーメンバーが同定されている。マウスNRPファミリーメンバー（本明細書ではタンパク質２、配列番号17として示され、NRP-7と称する）はNCBIのarachne contig_191157内に位置し339核酸からなり、読み取り枠１を使用する。重複領域内に、アノテーションされたNRPパラログの位置29から開始し、読み取り枠３を使用する198核酸の第２のORFが存在する。このORFは短縮されたヒトDNA修復タンパク質に高い同一性を有するタンパク質（本明細書では、タンパク質１と称する）をコードする。検索プログラムtBLASTNと生物学的に活性なNRPペプチド配列KDPEARRAPGSLHPCLAASCSAAG（配列番号５のアミノ酸20-43番）を用いてマウスEST RIKENデータベース中にblastヒットを得た。この5'-生成マウスESTはアクセッション番号GenBank AK012518を有し、以下の配列を有している（配列番号１４）：
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
２．走触性遊走アッセイ
同時にパラログペプチドの細胞接着および神経細胞遊走誘導特性をテストするため、走触性遊走細胞アッセイが開発された（Luら、2001）。この目的のため、12μm孔サイズの適合インサートを備えたTranswell（登録商標）細胞培養ディッシュ（Costar）を用いて線条体細胞および新皮質細胞を培養した。
このインサートをPDL（0.1mg/ml PBS溶液−細胞培養等級、Sigma社より）で15分間室温にてコーティングした。培養ディッシュを初めにNRP-1化合物でコーティングした。この目的のため、１３番染色体上に位置するヌクレオチド配列にコードされるアノテーションしたヒトNRPの19mer形態（NRP-11：KDPEARRAPGSLHPCLAAS；配列番号２３）および、アノテーションされたマウスarachne_contig 191157遺伝子NRPオルソログ（配列番号16）のNRPmfsの24mer形態（NRP-12：SEPEARRAPGRKGGVVCASLAADW：配列番号24）を選択した。凍結乾燥したペプチドをPBS中の100μg/mlヒトトランスフェリンまたはウシ血清アルブミン（BSA）で再構成し、さらにそれぞれのタンパク質が10μg/mlで存在するようにNRP希釈を行った。0.01〜１μg/mlのペプチド濃度およびブランクトランスフェリンおよびBSA対照を使用した。NRPの最終量は15〜1500ng/110mm2とした。ペプチドコーティングは37℃にて２時間行った。PBS洗浄後、培養ディッシュを続いてPDL(0.1mg/ml)で２時間37℃にてコーティングして、PBSで洗浄した。
線条体細胞の播種については、1.5mlのNeurobasal/B27培地を培養ディッシュに入れ、0.5mlのNeurobasal/B27培地をインサートに入れた。細胞播種のためのアッセイの準備を整えた。皮質細胞の播種のため50％Neurobasal/B27培地および50％の星状細胞コンディション培地を培養ディッシュおよびインサートに加え、細胞を播種した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
結果：神経細胞増殖誘導活性および神経細胞生存性活性および神経細胞遊走誘導活性
13番染色体上に位置するヒトNRP（アミノ酸配列を配列番号５に示した）の生物学的活性をテストするため、このペプチドのNRP-2 KGおよびNRP-2KSを用いた。NRP-2KGはアノテーションしたアミノ酸配列（配列番号５）のアミノ酸20〜43番に位置し、ペプチドKDPEARRAPGSLHPCLAASCSAAG(NRP-2KG)を生成し、19mer形態（NRP-2KS）は配列番号５のアミノ酸位置20〜38番に位置する。小脳培養物のヒトNRP-2KGによる５〜100nMの濃度における15時間の前条件づけ（図15）は、酸化／興奮性トキシン傷害からの完全な神経保護を生じさせた。このデータにより、広範な用量、１〜200nMにおいて、NRP-2KGは細胞毒性を示さないことが示された。1nMの濃度において、NRP-2KGは3-NP/グルタミン酸塩傷害からの42.4％の回復を示し、これは損傷においてヒトNRP-2KGによる1nMという濃度で見られる46.0％回復に類似している（図15および16に比較）。NRP-2KGの効果的な投与量範囲は損傷細胞においてずっと大きく、すなわち0.1pM〜1nMであった。比較すると、損傷細胞における用量は５nM〜100nMの範囲で生物学的活性を有していた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
神経細胞遊走誘導因子の化学誘因活性をアッセイするため、走触性遊走アッセイ（Luら、2001）を行った。ヒトNRP-2KGをBSAまたはトランスフェリン存在下でTranswell（登録商標）培養ディッシュ上にコーティングし、続いてPDL-コーティングした。播種した胚性線条細胞は培養ディッシュインサートから培養ディッシュの底へ１mmの距離にわたって遊走した。NRP-2KGをBSA中で再構成した場合、遊走誘導活性は有意ではなかったが、NRP-2KGをヒトトランスフェリン中で再構成して続いて150ngのNRP-2KGを固定化した場合は、トランスフェリン対照単独に比較してin vitroで２日後に466.0％を越える神経細胞が培養ディッシュの底まで遊走した（図18を参照せよ）。
３番染色体上に位置するヒトNRP（配列番号６）の生物学的活性を、アノテーションしたNRPタンパク質コード配列（配列番号６）のアミノ酸13〜23番に位置する11merペプチド（NRP-13：SDSFKSQARGQ：配列番号25）を用いてテストした。NRP-13は小脳微小外植片神経毒性アッセイにおいて100pM〜１nMの適用で最大生物学的活性を表した（図21を参照せよ）。48時間後、100pMのNRP-13は酸化剤／興奮毒素損傷からの回復を27.7％増大させた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
【図１】  図１は、基質上の視床皮質共培養、および続く精製NRP-1への曝露後３〜４日後の視床細胞間橋の生成を含む、本発明のin vitroバイオアッセイの一つの配置を示したものである。背側視床内の大脳辺縁系の一部である手綱核内において遊走に対する選択性が存在した。
【図２】  図２は、小脳微小外植片における神経細胞遊走を定量するために使用する方法の模式図を表したものである。直径100μmの連続した10個の環を含む透明な被覆を微小外植片の回りに載せた。遊走細胞のパーセンテージを計算するために、それぞれの連続環内の全ての細胞を計数し、環１〜10に分布する全細胞数で割った。
【図３】  図３は、in vitroインキュベーション４日後の視床皮質OTCにおける視床と皮質組織間の神経細胞間橋の形成の顕微鏡写真を表す。インキュベーションの開始時に、培養物に300ng/mlのNRP（ヒドロキシアパタイトタンパク質の総蛋白質として）を加えた。図3Aは２つの遊走細胞鎖の全体像を示す。上の神経細胞鎖は皮質への道のりを完了しているが、下の細胞鎖は皮質組織への道程の半分に達している。細胞鎖が神経細胞起源であることは図3Bから3Dに示すように遊走細胞のMAP-2発現パターンによって確認した。A/Bにおける二重矢印は同じ位置を示している。図3Cおよび3Dにおいて、遊走細胞鎖の顕微鏡写真は皮質組織の近くで撮られている。バー：500μm（図3A）；100μm（図3Bから3D）。
【図４】  図４は、視床皮質系内に生じている細胞鎖の組織特異性を示した顕微鏡写真である。遊走細胞鎖／細胞列は視床組織から開始している（図4A）。最大の効果を示す濃度は3nM NRP-1であった。皮質遊走鎖が生じており、それは図4Bに示してある。倍率を大きくすると、遊走しているMAP-2陽性神経細胞は神経突起構造により相互連絡していることが明らかにされた（図4C中の矢印）。図4Dにおいて、視床細胞の遊走開始を見ることができる。黒い矢印は核を表し、白の矢印は遊走細胞の先導過程を示す。バー：500μm（図4Aおよび4B）；100μm（図4C）；80μm（図4D）。
【図５】  図５は，NRP-1添加（高度に精製した陽イオン交換溶出物 3nM）OTCのインキュベーション開始24時間後における視床領域の位相差顕微鏡写真である。黒い線は手綱核（中抜き矢印）の元の辺縁を表す。手綱核の大量の「組織拡大」が起こった。白い矢印は遊走過程にある細胞鎖を示す。遊走細胞鎖から多数の神経突起が由来し、皮質組織へ向かって伸びている（黒い矢印）。バー：1000μm。
【図６】  図６は、視床皮質OTCにおけるNRP-1に対する用量応答関係のグラフを表す。NRP-1の生物学的活性範囲をアッセイするため、均一に精製した（陽イオン交換体）タンパク質をインキュベーション開始時に視床皮質OTCに加えた。用量応答曲線のため、２，４，６、20および600ng/mlという濃度のNRP-1をテストした。2ng/ml（1nM）にて、生物学的活性（神経細胞遊走の誘導）が明瞭に検出された。最大の遊走促進を生じる濃度は６ng/ml（3nM）であった。約20〜60ng/ml（10〜30nM）の濃度にて、NRP-1は神経細胞遊走を増大させなかった。全ての濃度はアッセイ中で６回テストした。
【図７】  図７は、in vitroにて４日後の視床皮質細胞間橋の生成を示す。共培養物に3nMの高度に精製したNRP-1を添加した。図7Aでは２つの視床皮質連結（矢印）が確立されていることが示され、MAP-2陽性細胞が明らかになっている。四角部分はより高い倍率で図7Bに示した。図7Bは軌道状に整列して遊走している双極形態のパルブアルブミン陽性神経細胞を含む細胞列を示している。図７Ｃは視床細胞列の起点近くのMAP2-陽性神経細胞を示している。細胞列は神経組織の高度に秩序だった配向によって特徴付けられる。一次神経突起は細胞間橋の中央部の軸索層へ向かって突出している（小さな矢印）。図7Dは手綱、形成された視床皮質細胞間橋、および皮質層に位置するBrdU陽性増殖細胞（矢印）を示している。円は高度に増殖している領域を示す。図7Eは細胞間橋内のBrdU陽性細胞を示す。亜集団（矢印）がバルブアルブミンと共局在している（図7Fの矢印）。バー：500μm（図7Aおよび7D）；100μm（図7B、7Eおよび7F）；50μm（図7C）。
【図８】  図８はMAP-2の細胞発現の増強および遊走過程との相関関係を示した顕微鏡写真である。強いMAP-2発現が遊走皮質神経細胞の先端突起内に観察され、これは遊走開始時の先導的過程である。白矢印は皮質層Ｉの位置を示しており、約500μmである。２次および３次樹状突起は見られない。バー：40μm。
【図９】  図９は視床皮質共培養物の視床および皮質組織の間にあるパルブアルブミン-ir視床神経細胞の増殖および遊走を示した顕微鏡写真である。３nMの高度に精製したNRP-1およびBrdUを視床皮質OTCに24時間添加し、4DIV後に固定した。図9Aは遊走細胞列がパルブアルブミンおよびBrdUについて陽性である増殖神経細胞（太い白の矢印で示した）を含むことを明らかにしている共焦点画像である。いくつかの神経細胞はパルブアルブミンについてのみ陽性である（細い矢印）。白の長い矢印は視床組織の位置を示している。図9Bおよび9Cは遊走列内の大部分のパルブアルブミン-ir細胞（図9B）は増殖細胞であることを示している（図9C；矢印）。繊維の免疫反応性に注目し、神経細胞が神経線維に沿って「移行」いることに注目する。バー：100μm（図9A）；50μm（図9Bおよび9C）。
【図１０】  図１０は視床のパルブアルブミン-ir神経細胞における増殖開始の定量的解析を示す。BrdUおよび３nMのNRP-1を共培養開始時に投与した。24時間後に培地を交換した。視床組織内（手綱核、外側膝状核、視床網様体核および視床正中核を含む）のパルアルブミンおよびBrdUの共局在性をin vitroにて５日後に評価した。全パルブアルブミン-ir視床集団の6.8％が増殖性特徴を有していた。ビヒクルに比較してNRP-1は強い増殖誘導を示した。Nは評価した視床組織の数を表す。
【図１１】  視床組織内の増殖パルブアルブミン-ir細胞の定量を表した図である。NRP-1投与の５日後に、視床の中枢部内のパルブアルブミン-ir細胞において顕著な増殖誘導（白い矢印）があった。パルブアルブミン発現細胞の大部分は非増殖性のままであった（図11Aの矢尻）。手綱核内では、ごく一部のパルブアルブミン発現細胞のみがBrdUで二重標識される（図11B）。ビヒクル処理培養物では、二重標識パルブアルブミン発現細胞は極めてまれにしか見られなかった（図11Cの矢印）。図11Dでは、示した皮質層VI近くに遊走したカルレチニン/BrdU陽性細胞が存在した。バー：50μm。
【図１２】  図１２は、NRP-1で誘導された増殖の特異性を表す。GFAPの発現パターンおよびBrdU取込を監視することにより星状細胞の増殖状態をテストした。視床皮質OTCに３nMの高度に精製した遊走誘導因子を添加し、in vitroにて４日後に固定した。図12Aは増殖的特徴を有する星状細胞（図12B、白矢尻）のごく一部の集団のみを含む神経細胞遊走列を伴った非増殖GFAP陽性星状細胞（白矢印）を表す。神経細胞遊走列のごく近傍の星状細胞のおよそ30％が増殖性特徴を有していた。バー：50μm。
【図１３】  図１３は、小脳遊走誘導の定量化を示したものである。NRP-1投与２日後、小脳細胞の大規模な誘導が見られた。大部分の細胞は小脳辺縁から200〜300μmの間に分布した。細胞のかなりの数は辺縁から約500〜600μmに分布した。ビヒクル処理培養物の細胞は300μmという最大分布を示した。実験データは３つの異なる培養物由来の９個の評価微小外植片に由来するものである。
【図１４】  図１４は、小脳微小外植片における神経細胞遊走を示したものである。カバー・スリップ上で沈降時間、３時間の後に微小外植片に75nMの精製NRP-1を加えた。共培養開始時に（細胞培養液の添加）、NRP-1を最終濃度３nMで加えた。図14Aは、微小外植片起源の、主として小さな細胞（直径10〜15μm）の大規模な遊走および神経突起伸長があったことを示している。直径15μmを越える遊走細胞を矢尻で示してある。小さな抑制性神経細胞が遊走細胞列として（図14A、14Bおよび14C）、または、微小外植片を連結する神経ネットワーク上に幾分大まかに整列して（図14D）遊走している。図14Eおよび14Fにおいて、MAP-2発現が示されている。図14F中の矢印は遊走神経細胞を示している。
【図１５】  図１５はプレインキュベーション法を用いたNRP-2断片KG（ヒト13番染色体）による生存性アッセイの結果を示す。小脳微小外植片をNRP-2断片KGと共に15時間プレインキュベーションし、続いて3-NP／グルタミン酸塩で９時間損傷させた。72時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより、神経細胞生存性を評価した。５〜100nMで用いると、NRP hc 13は完全に損傷の効果を逆転させた。５、10および100nMのNRP-2断片KG hc 13は培養神経細胞の増殖を誘導した。
【図１６】  図１６は、NRP-2断片KGを用いた生存性アッセイの結果を示す。小脳外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させ、同時にNRP-2断片KGでレスキューした。48時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより神経細胞生存性を評価した。同時適用した損傷におけるNRP-2の生存性に関する最大生物学的活性は100pM〜1nMにあった。
【図１７】  図１７は、NRP-2断片KGおよびラットNRP-1を用いた、無損傷増殖誘導の結果を示す。初期神経生存または接着効果によるアッセイにおける妨害を減少させるため、培養開始24時間後にペプチドを添加した。培養物はin vitroにて３日後に固定した。NRP-2断片KGの300pMにて大規模な神経細胞増殖があった。
【図１８】  図１８は、NRP-2断片KSを用いた走触性遊走アッセイの結果を示す。NRP-2断片KS（0.01μg/mlおよび0.1μg/ml）を０μg/ml BSAまたは10μg/mlヒトトランスフェリン中でそれぞれ希釈した。被覆したNRP-2断片KSを続いて100μg/ml PDLコーティングにかけた。線条細胞をPDL-被覆インサート中に播種し、遊走行動を48時間後に測定した。培養ディッシュを150ngのNRP2断片KSでコーティングした場合に、大規模な線条体神経細胞の遊走誘導があった。
【図１９】  図１９はヒトNRP-4断片GQを用いた生存性研究の結果を示す。小脳微小外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させ、同時にNRP-4断片GQ（ヒト15番染色体）でレスキューした。48時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより神経細胞生存性を評価した。生存性に関するNRP-4断片GQの最大生物学的活性は10nM〜100nMにあった。
【図２０】  図２０はNRP-4断片GQを用いた損傷条件下における増殖誘導に関する研究の結果を示す。小脳外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させた。NRP-4断片およびBrdUを同時に24時間投与した。72時間後、各培養物について４つの顕微鏡視野内のBrdU陽性核を計数した。増殖誘導はペプチドの10nM濃度にて観察された。
【図２１】  図２１はNRP-3断片SQ（ヒト３番染色体）による生存性アッセイの結果を示す。小脳微小外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させ、同時にNRP-3断片SQでレスキューした。48時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより神経細胞生存性を評価した。生存性についてNRP-3の最大生物学的活性は100pM〜1nMにあった。
【図２２】  図２２は、マウスNRP-7断片SWを用いた生存性アッセイの結果を示す。小脳微小外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させ、同時にヒトトランスフェリン存在下でマウスNRP-7によりレスキューした。48時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより神経細胞生存を評価した。生存性についてNRP-7断片SWの最大生物学的活性は0.1pM〜1pMにあった。
【図２３】  図２３は、マウスNRP-7断片SWを用いた生存性アッセイの結果を示す。小脳微小外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させ、同時にヒトトランスフェリンなしでNRP-7(SW)によりレスキューした。48時間後、神経突起伸長を示した細胞を計数することにより神経細胞生存を評価した。生存性についてNRP-7断片SWの最大生物学的活性は100pM〜1nMにあった。
【図２４】  図２４は、NRP-7断片SWマウスペプチドを用いた、損傷条件下における増殖誘導の研究結果を示す。小脳微小外植片を3-NP/グルタミン酸塩で損傷させた。NRPおよびBrdUを同時に24時間投与した。72時間後、各培養物について４つの顕微鏡視野内のBrdU陽性核を計数した。マウスNRP-7の0.1pMおよび100pMにより大規模な増殖誘導があった。損傷および非損傷小脳細胞間で増殖の相違は見られなかった。このことは、小脳微小外植片系内の損傷誘導増殖星状細胞の数が非常に少ないことを間接的に示している。
【図２５】  図２５は、NRP-7断片SWを用いた走触性遊走アッセイ研究の結果を示す。NRP-7（0.1μg/mlおよび１μg/ml）を10μg/ml BSA中で希釈してコーティングを行い、続いて50μg/mlのPDLコーティングを行った。皮質細胞をPDL被覆インサート中に播種し、１pg/mlの24merペプチドを溶液中に添加した。in vitroにて１日後に細胞計数を行った。
【図２６】  図２６はNRP-1精製に使用した工程のフローチャートを示す。
【図２７】  図２７は、均一精製NRP-1を得るための陽イオン交換精製工程の結果を示す。精製はHigh S(Biorad)陽イオン交換体上で、Bioradの低圧クロマトグラフユニットを用いて行った。10mMクエン酸塩（pH4）に対して徹底的に脱塩した、ゲルろ過クロマトグラフィーからの80％アセトン-沈殿生物学的活性ピークを0.01Mクエン酸塩中でクロマトグラフィーにかけた（１ml／分）。0.01Mクエン酸塩（pH4.5）中の1M NaClを用いてカラムを溶出した。遊走-促進活性は溶出体積43〜53mlに溶出された。254nmの波長で吸光度を測定した。得られたNRPの純度をN-末端アミノ酸配列により確認したが、明瞭な結果を与えた。
【図２８】  図２８は、MALDI-TOF質量分光測定によるNRP-1分析の結果を示す。陽イオン交換からの主要ペプチドの純度および質量（M＋H+）をMALDI-TOF MSによって確認した。主要なピークを表す単一の荷電ペプチドNRP-1は2046という質量を有していた。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  NeuronZ, Ltd.
NeuronZ Biosciences, Inc.
Sieg, Frank
Hughes, Paul
<120>  Neural Regeneration Peptides and Methods for Their Use In 
Treatment of Brain Damage
<130>  X1L0301
<150>  60/314,952
<151>  2001-08-24
<160>  26    
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Rat
<400>  1
tatgatccag aggccgcctc tgccccagga tcggggaacc cttgccat                  48
<210>  2
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Rat
<400>  2
Tyr Asp Pro Glu Ala Ala Ser Ala Pro Gly Ser Gly Asn Pro Cys His 
1               5                   10                  15      
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  A general variant of sequence ID 1.
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (3)..(48)
<223>  In this sequence includes nucleotides wherein y is c or t/u, r is
g or a and n is a, t, c or g
<400>  3
taygayccng argcngcntc ngcnccnggn tcnggnaayc cntgycay                  48
<210>  4
<211>  333
<212>  DNA
<213>  Human
<400>  4
atgagagtca gagtacaact caagtctaat gtccaagttg gagcaggaca ctcagcaaag     60
gatccagagg caaggagagc acctggaagc ctacatccct gtctagcagc atcatgctca    120
gctgctggcc tgcacacaag ctcgtggaag aacctgtttt tgatagaagg actagtaagt    180
atttgcctag ggcacatagt tgtacaagag acggacgttt ttaggtcctt gcggtttctt    240
gcatttccag aaaacttgct tcaaatattt ttccagatgc aaaattcctt ggatccttgt    300
tttagaatga atctattaaa aacttcacat taa                                 333
<210>  5
<211>  110
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  5
Met Arg Val Arg Val Gln Leu Lys Ser Asn Val Gln Val Gly Ala Gly 
1               5                   10                  15      
His Ser Ala Lys Asp Pro Glu Ala Arg Arg Ala Pro Gly Ser Leu His 
20                  25                  30          
Pro Cys Leu Ala Ala Ser Cys Ser Ala Ala Gly Leu His Thr Ser Ser 
35                  40                  45              
Trp Lys Asn Leu Phe Trp Ile Glu Gly Leu Val Ser Ile Cys Leu Gly 
50                  55                  60                  
His Ile Val Val Gln Glu Thr Asp Val Phe Arg Ser Leu Arg Phe Leu 
65                  70                  75                  80  
Ala Phe Pro Glu Asn Leu Leu Gln Ile Phe Phe Gln Met Gln Asn Ser 
85                  90                  95      
Leu Asp Pro Cys Phe Arg Met Asn Leu Leu Lys Thr Ser His 
100                 105                 110 
<210>  6
<211>  336
<212>  DNA
<213>  Human
<400>  6
atgaaaataa atgtattaat taaattaatg accaagtcag attcttttaa aagccaagcc     60
aggggccaag ttcccccatt tctagggggg gtggggtgcc cctggttttt tcaaacaagg    120
ttttggggcc atagttttgc agttaaactg gcctccaacc tttcccaggc agagaaattg    180
gtccttcagc aaaccctttc ccaaaaaggc ctagacggag caaaaaaagc tgtgggggga    240
ctcggaaaac taggaaaaga tgcagtcgaa gatctagaaa gcgtgggtaa aggagccgtc    300
catgacgtta aagacgtcct tgactcagta ctatag                              336
<210>  7
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  7
Met Lys Ile Asn Val Leu Ile Lys Leu Met Thr Lys Ser Asp Ser Phe 
1               5                   10                  15      
Lys Ser Gln Ala Arg Gly Gln Val Pro Pro Phe Leu Gly Gly Val Gly 
20                  25                  30          
Cys Pro Trp Phe Phe Gln Thr Arg Phe Trp Gly His Ser Phe Ala Val 
35                  40                  45              
Lys Leu Ala Ser Asn Leu Ser Gln Ala Glu Lys Leu Val Leu Gln Gln 
50                  55                  60                  
Thr Leu Ser Gln Lys Gly Leu Asp Gly Ala Lys Lys Ala Val Gly Gly 
65                  70                  75                  80  
Leu Gly Lys Leu Gly Lys Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val Gly 
85                  90                  95      
Lys Gly Ala Val His Asp Val Lys Asp Val Leu Asp Ser Val Leu 
100                 105                 110     
<210>  8
<211>  438
<212>  DNA
<213>  Human
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (353)..(354)
<223>  n = a or g or c or t/u
<400>  8
atggctgttg tgttacttgc accatttggg gacatcagcc aggaaatcac aaaggttggg     60
acagggactc cagggagggc tgaggccggg ggccaggtgt ctccatgcct ggcggcgtcc    120
tgcagtcagg cctatggcgc catcttggct cactgcaacc tctgcctccc aggttcaatg    180
attaaaaaaa agaagaaatt tatagttgaa atagaaagtc aacctttaaa gtcttacagg    240
gaaaattcta cccattttcc cagaccagtc ctaaatctta tgcgaaaaca ctgtggggaa    300
aagggggaag aagggccttg tttctctccc aagcaaatgg gggagaggcg agnntgtggc    360
ggagggctag ggttggctcg cgagatcact aatttaacat ccgctcatct gttggtcttg    420
aatatcagca accagtga                                                  438
<210>  9
<211>  145
<212>  PRT
<213>  Human
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (118)..(118)
<223>  Xaa is V, A, D, E or G
<400>  9
Met Ala Val Val Leu Leu Ala Pro Phe Gly Asp Ile Ser Gln Glu Ile 
1               5                   10                  15      
Thr Lys Val Gly Thr Gly Thr Pro Gly Arg Ala Glu Ala Gly Gly Gln 
20                  25                  30          
Val Ser Pro Cys Leu Ala Ala Ser Cys Ser Gln Ala Tyr Gly Ala Ile 
35                  40                  45              
Leu Ala His Cys Asn Leu Cys Leu Pro Gly Ser Met Ile Lys Lys Lys 
50                  55                  60                  
Lys Lys Phe Ile Val Glu Ile Glu Ser Gln Pro Leu Lys Ser Tyr Arg 
65                  70                  75                  80  
Glu Asn Ser Thr His Phe Pro Arg Gly Val Leu Asn Leu Met Arg Lys 
85                  90                  95      
His Cys Gly Glu Lys Gly Glu Glu Gly Pro Cys Phe Ser Pro Lys Gln 
100                 105                 110         
Met Gly Glu Arg Arg Xaa Cys Gly Gly Gly Leu Gly Leu Ala Arg Glu 
115                 120                 125             
Ile Thr Asn Leu Thr Ser Ala His Leu Leu Val Leu Asn Ile Ser Asn 
130                 135                 140                 
Gln 
145 
<210>  10
<211>  801
<212>  DNA
<213>  Human
<400>  10
atgctggacc cgtcttccag cgaagaggag tcggacgagg ggctggaaga ggaaagccgc     60
gatgtgctgg tggcagccgg cagctcgcag cgagctcctc cagccccgac tcgggaaggg    120
cggcgggacg cgccggggcg cgcgggcggc ggcggcgcgg ccagatctgt gagcccgagc    180
ccctctgtgc tcagcgaggg gcgagacgag ccccagcggc agctggacca tgagcaggag    240
cggaggatcc gcctgcagct ctacgtcttc gtcgtgaggt gcatcgcgta ccccttcaac    300
gccaagcagc ccaccgacat ggcccggagg cagcagaagc ttaacaaaca acagttgcag    360
ttactgaaag aacggttcca ggccttcctc aatggggaaa cccaaattgt agctgacgaa    420
gcattttgca acgcagttcg gagttattat gaggtttttc taaagagtga ccgagtggcc    480
agaatggtac agagtggagg gtgttctgct aaggacttca gagaagtatt taagaaaaac    540
atagaaaaac gtgtgcggag tttgccagaa gtggatggct tgagcaaaga gacagtgttg    600
agctcatgga tagccaaata tgatgccatt tacagaggtg aagaggactt gtgcaaacag    660
ccaaatagaa tggccctaag tgcagtgtct gaacttattc tgagcaagga acaactctat    720
gaaatgtttc agcagattct gggtattaaa aaactggaac accagctcct ttataatgca    780
tgtcaggtaa gtggtctctg a                                              801
<210>  11
<211>  266
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  11
Met Leu Asp Pro Ser Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Glu Gly Leu Glu 
1               5                   10                  15      
Glu Glu Ser Arg Asp Val Leu Val Ala Ala Gly Ser Ser Gln Arg Ala 
20                  25                  30          
Pro Pro Ala Pro Thr Arg Glu Gly Arg Arg Asp Ala Pro Gly Arg Ala 
35                  40                  45              
Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Ser Val Ser Pro Ser Pro Ser Val Leu 
50                  55                  60                  
Ser Glu Gly Arg Asp Glu Pro Gln Arg Gln Leu Asp Asp Glu Gln Glu 
65                  70                  75                  80  
Arg Arg Ile Arg Leu Gln Leu Tyr Val Phe Val Val Arg Cys Ile Ala 
85                  90                  95      
Tyr Pro Phe Asn Ala Lys Gln Pro Thr Asp Met Ala Arg Arg Gln Gln 
100                 105                 110         
Lys Leu Asn Lys Gln Gln Leu Gln Leu Leu Lys Glu Arg Phe Gln Ala 
115                 120                 125             
Phe Leu Asn Gly Glu Thr Gln Ile Val Ala Asp Glu Ala Phe Cys Asn 
130                 135                 140                 
Ala Val Arg Ser Tyr Tyr Glu Val Phe Leu Lys Ser Asp Arg Val Ala 
145                 150                 155                 160 
Arg Met Val Gln Ser Gly Gly Cys Ser Ala Asn Asp Phe Arg Glu Val 
165                 170                 175     
Phe Lys Lys Asn Ile Glu Lys Arg Val Arg Ser Leu Pro Glu Ile Asp 
180                 185                 190         
Gly Leu Ser Lys Glu Thr Val Leu Ser Ser Trp Ile Ala Lys Tyr Asp 
195                 200                 205             
Ala Ile Tyr Arg Gly Glu Glu Asp Leu Cys Lys Gln Pro Asn Arg Met 
210                 215                 220                 
Ala Leu Ser Ala Val Ser Glu Leu Ile Leu Ser Lys Glu Gln Leu Tyr 
225                 230                 235                 240 
Glu Met Phe Gln Gln Ile Leu Gly Ile Lys Lys Leu Glu His Gln Leu 
245                 250                 255     
Leu Tyr Asn Ala Cys Gln Val Ser Gly Leu 
260                 265     
<210>  12
<211>  237
<212>  DNA
<213>  Human
<400>  12
atgagagaca aacaacatct aaatgcaaga cataaaaagg aaaggaagga gagatcatat     60
agtacaacac tacaaggtgt tctcaacaaa aagtctttgt tagacttcaa taatactatt    120
tggtacttct atcagcaaat aggaagcatt ccaatactta ttagatcctc taccatcaga    180
cacagaaatt acctagaaaa cagaaatgta ttgccaaatc tcaaacaaga gggctga       237
<210>  13
<211>  78
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  13
Met Arg Asp Lys Gln His Leu Asn Ala Arg His Lys Lys Glu Arg Lys 
1               5                   10                  15      
Glu Arg Ser Tyr Ser Thr Thr Leu Gln Gly Val Leu Asn Lys Lys Ser 
20                  25                  30          
Leu Leu Asp Phe Asn Asn Thr Ile Trp Tyr Phe Tyr Gln Gln Ile Gly 
35                  40                  45              
Ser Ile Pro Ile Leu Ile Arg Ser Ser Thr Ile Arg His Arg Asn Tyr 
50                  55                  60                  
Leu Glu Asn Arg Asn Val Leu Pro Asn Leu Lys Gln Glu Gly 
65                  70                  75              
<210>  14
<211>  450
<212>  DNA
<213>  Mouse
<400>  14
ggcagcctcg agatggggaa gatggcggct gctgtggctt cattagccac gctggctgca     60
gagcccagag aggatgcttt ccggaagctt ttccgcttct accggcagag ccggccgggg    120
acagcggacc tgggagccgt catcgacttc tcagaggcgc acttggctcg gagcccgaag    180
cccggcgtgc cccaggtagg aaaggaggag tagtgtgtgc cagcctagcg gccgactggg    240
ccacccgaga ctgggccgcc tccggccggc tttggaggga agcccctgct gggcctgtcc    300
agtgagctgt aatgtcgagc gatgagcgac cagctgcctc gctgtcccaa cgctcggcca    360
cggcttgtgc cttgccgcca tttcccccaa cccacgcggg ccacggcttg tgccctgccg    420
ccatttcccc caacccacgc gaccttgctc                                     450
<210>  15
<211>  66
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  15
Met Gly Lys Met Ala Ala Ala Val Ala Ser Leu Ala Thr Leu Ala Ala 
1               5                   10                  15      
Glu Pro Arg Glu Asp Ala Phe Arg Lys Leu Phe Arg Phe Tyr Arg Gln 
20                  25                  30          
Ser Arg Pro Gly Thr Ala Asp Leu Gly Ala Val Ile Asp Phe Ser Glu 
35                  40                  45              
Ala His Leu Ala Arg Ser Pro Lys Pro Gly Val Pro Gln Val Gly Lys 
50                  55                  60                  
Glu Glu 
65      
<210>  16
<211>  342
<212>  DNA
<213>  Mouse
<400>  16
atgaatcgaa accctggagt ccctcgagat ggggaagatg gcggctgctg tggcttcatt     60
agccacgctg gctgcagagc ccagagagga tgctttccgg aagcttttcc gcttctaccg    120
gcagagccgg ccggggacag cggacctggg agccgtcatc gacttctcag aggcgcactt    180
ggctcggagc ccgaagcccg gcgtgcccca ggtaggaaag gaggagtagt gtgtgccagc    240
ctagcggccg actgggccac ccgagactgg gccgcctccg ggccggcttt ggagggaagc    300
ccctgctggg cctgtccagt gagctgtaat gtcgagcgat ga                       342
<210>  17
<211>  113
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  17
Met Asn Arg Asn Pro Gly Val Pro Arg Asp Gly Glu Asp Gly Gly Cys 
1               5                   10                  15      
Cys Gly Phe Ile Ser His Ala Gly Cys Arg Ala Gln Arg Gly Cys Phe 
20                  25                  30          
Pro Glu Ala Phe Pro Leu Leu Pro Ala Glu Pro Ala Gly Asp Ser Gly 
35                  40                  45              
Pro Gly Ser Arg His Arg Leu Leu Arg Gly Ala Leu Gly Ser Glu Pro 
50                  55                  60                  
Glu Ala Arg Arg Ala Pro Gly Arg Lys Gly Gly Val Val Cys Ala Ser 
65                  70                  75                  80  
Leu Ala Ala Asp Trp Ala Thr Arg Asp Trp Ala Ala Ser Gly Pro Ala 
85                  90                  95      
Leu Glu Gly Ser Pro Cys Trp Ala Cys Pro Val Ser Cys Asn Val Glu 
100                 105                 110         
Arg 
<210>  18
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  18
Lys Asp Pro Glu Ala Arg Arg Ala Pro Gly Ser Leu His Pro Cys Leu 
1               5                   10                  15      
Ala Ala Ser Cys Ser Ala Ala Gly 
20                  
<210>  19
<211>  426
<212>  DNA
<213>  Mouse
<400>  19
atgtgcactc tgcaggtatg gtcttcctcc ctcccttccc tcccccacct ctctgagggg     60
tcaggggtca gcatttggat gctgctccca ccaggcccag ctttagaaat gaattcctcc    120
ggcctccttt atactcttga gacctcctgg ggaaccagga ccctcttggc tcctctggtg    180
acatacatgg gatctgatgc atctgaggtg gatgcaagaa gagcaaaaaa gagtctccac    240
tgcatcctgt ctgacaccag ccatccccgg ggccatgccc ggaatgagag gaggcttggc    300
cttggggttt ggaagaccga gctttgggtc cagaccctgc tatcactgat ggtgacatcc    360
tgggaagttt atgaaactcg ttcgtgcctc agtttcccca tcaggccttt agctcactgg    420
ggataa                                                               426
<210>  20
<211>  141
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  20
Met Cys Thr Leu Gln Val Trp Ser Ser Ser Leu Pro Ser Leu Pro His 
1               5                   10                  15      
Leu Ser Glu Gly Ser Gly Val Ser Ile Trp Met Leu Leu Pro Pro Gly 
20                  25                  30          
Pro Ala Leu Glu Met Asn Ser Ser Gly Leu Leu Tyr Thr Leu Glu Thr 
35                  40                  45              
Ser Trp Gly Thr Arg Thr Leu Leu Ala Pro Leu Val Thr Tyr Met Gly 
50                  55                  60                  
Ser Asp Ala Ser Glu Val Asp Ala Arg Arg Ala Lys Lys Ser Leu His 
65                  70                  75                  80  
Cys Ile Leu Ser Asp Thr Ser His Pro Arg Gly His Ala Arg Asn Glu 
85                  90                  95      
Arg Arg Leu Gly Leu Gly Val Trp Lys Thr Glu Leu Trp Val Gln Thr 
100                 105                 110         
Leu Leu Ser Leu Met Val Thr Ser Trp Glu Val Tyr Glu Thr Arg Ser 
115                 120                 125             
Cys Leu Ser Phe Pro Ile Arg Leu Leu Ala His Trp Gly 
130                 135                 140     
<210>  21
<211>  498
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium tuberculosis
<400>  21
Met Ser Phe Val Val Thr Ile Pro Glu Ala Leu Ala Ala Val Ala Thr 
1               5                   10                  15      
Asp Leu Ala Gly Ile Gly Ser Thr Ile Gly Thr Ala Asn Ala Ala Ala 
20                  25                  30          
Ala Val Pro Thr Thr Thr Val Leu Ala Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser 
35                  40                  45              
Ala Ala Met Ala Ala Leu Phe Ser Gly His Ala Gln Ala Tyr Gln Ala 
50                  55                  60                  
Leu Ser Ala Gln Ala Ala Leu Phe His Glu Gln Phe Val Arg Ala Leu 
65                  70                  75                  80  
Thr Ala Gly Ala Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ala 
85                  90                  95      
Pro Leu Glu Gly Val Leu Asp Val Ile Asn Ala Pro Ala Leu Ala Leu 
100                 105                 110         
Leu Gly Arg Pro Leu Ile Gly Asn Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Thr 
115                 120                 125             
Gly Ala Asn Gly Gly Asp Gly Gly Ile Leu Ile Gly Asn Gly Gly Ala 
130                 135                 140                 
Gly Gly Ser Gly Ala Ala Gly Met Pro Gly Gly Asn Gly Gly Ala Ala 
145                 150                 155                 160 
Gly Leu Phe Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Asn Val Ala 
165                 170                 175     
Ser Gly Thr Ala Gly Phe Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu 
180                 185                 190         
Tyr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Arg Ala Gly Gly Gly 
195                 200                 205             
Val Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu 
210                 215                 220                 
Leu Phe Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Leu Ala Ala Asp 
225                 230                 235                 240 
Ala Gly Asp Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Leu Phe Phe Gly Val 
245                 250                 255     
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Asn Val Thr Gly Gly 
260                 265                 270         
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Leu Phe Gly Ala Gly Gly 
275                 280                 285             
Val Gly Gly Val Gly Gly Asp Gly Val Ala Phe Leu Gly Thr Ala Pro 
290                 295                 300                 
Gly Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Leu Phe Gly Val Gly 
305                 310                 315                 320 
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ile Gly Leu Val Gly Asn Gly Gly Ala 
325                 330                 335     
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu Leu Trp Gly Asp Gly Gly Ala Gly 
340                 345                 350         
Gly Ala Gly Gly Val Gly Ser Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 
355                 360                 365             
Gly Asn Ala Gly Leu Leu Val Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 
370                 375                 380                 
Ala Leu Gly Gly Gly Ala Thr Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly 
385                 390                 395                 400 
Gly Thr Ala Gly Leu Leu Phe Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Phe Gly 
405                 410                 415     
Phe Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Leu Gly Gly Lys Ala Gly Leu 
420                 425                 430         
Ile Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Thr Gly Ala 
435                 440                 445             
Lys Gly Gly Asp Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ile Leu Val Gly Asn 
450                 455                 460                 
Gly Gly Asn Gly Gly Asn Ala Gly Ser Gly Thr Pro Asn Gly Ser Ala 
465                 470                 475                 480 
Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Gly Lys Asn Gly Met Asn Gly 
485                 490                 495     
Leu Pro 
<210>  22
<211>  641
<212>  PRT
<213>  Epstein Barr Virus
<400>  22
Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu 
1               5                   10                  15      
Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln 
20                  25                  30          
Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 
35                  40                  45              
Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro 
50                  55                  60                  
Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile 
65                  70                  75                  80  
Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly 
85                  90                  95      
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 
100                 105                 110         
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly 
115                 120                 125             
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 
130                 135                 140                 
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 
145                 150                 155                 160 
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly 
165                 170                 175     
Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly 
180                 185                 190         
Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly 
195                 200                 205             
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala 
210                 215                 220                 
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala 
225                 230                 235                 240 
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 
245                 250                 255     
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 
260                 265                 270         
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 
275                 280                 285             
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 
290                 295                 300                 
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 
305                 310                 315                 320 
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 
325                 330                 335     
Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 
340                 345                 350         
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg 
355                 360                 365             
Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro 
370                 375                 380                 
Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro 
385                 390                 395                 400 
Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 
405                 410                 415     
Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 
420                 425                 430         
Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 
435                 440                 445             
Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 
450                 455                 460                 
Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 
465                 470                 475                 480 
Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 
485                 490                 495     
Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 
500                 505                 510         
Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 
515                 520                 525             
Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 
530                 535                 540                 
Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys 
545                 550                 555                 560 
Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys 
565                 570                 575     
Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn 
580                 585                 590         
Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro 
595                 600                 605             
Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly 
610                 615                 620                 
Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln 
625                 630                 635                 640 
Glu 
<210>  23
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  23
Lys Asp Pro Glu Ala Arg Arg Ala Pro Gly Ser Leu His Pro Cys Leu 
1               5                   10                  15      
Ala Ala Ser
<210>  24
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  24
Ser Glu Pro Glu Ala Arg Arg Ala Pro Gly Arg Lys Gly Gly Val Val 
1               5                   10                  15      
Cys Ala Ser Leu Ala Ala Asp Trp 
20                  
<210>  25
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  25
Ser Asp Ser Phe Lys Ser Gln Ala Arg Gly Gln 
1               5                   10      
<210>  26
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Human
<400>  26
Gly Thr Pro Gly Arg Ala Glu Ala Gly Gly Gln 
1               5                   10