【手続補正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドカセットは、個体のＤＮＡ中へのカセットの取り込みを可能にするトランスポゾン系ベクター（transposon-based vector）中に位置する。本発明のトランスポゾン系ベクターは、第一プロモータに操作可能に結合されたトランスポザーゼと第二プロモータに操作可能に結合された目的のタンパク質またはぺプチドをコードする配列とを含み、上記目的のタンパク質またはペプチドをコードする配列およびその操作可能に結合されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接される。また、上記トランスポゾン系ベクターは、以下の特性を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧを含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えることなく、各コドンの３番目の塩基位置のヌクレオチドがＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する、1つ以上の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するのにトランスポザーゼに操作可能に結合された効果的なポリＡ配列の付加。いくつかの実施形態において、効果的なポリＡ配列は、鳥類に最適化したポリＡ配列である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
一実施形態において、上記トランスポゾン系ベクターは、鳥類に最適化したポリＡ配列を含むが、ＡＣＣＡＴＧを有する改変されたＫｏｚａｋ配列を含まない。かかるトランスポゾン系ベクターの一例は、ｐＴｎＭＣＳベクター（配列番号５６）である。別の実施形態において、上記トランスポゾン系ベクターは、ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧを含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えることなく、各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンの改変；ｃ）
トランスポザーゼ合成の終了を増強する、1つ以上の終止コドンの付加；およびｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するのにトランスポザーゼに操作可能に結合された効果的なポリＡ配列の付加、を含む。かかるトランスポゾン系ベクターの一例は、ｐＴｎＭｏｄベクター（配列番号５７）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明のトランスポゾン系ベクターは、第一プロモータに操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子を含み、第二プロモータに操作可能に結合された所望のタンパク質またはペプチドのコード配列を含み、所望のタンパク質またはペプチドのコード配列およびその操作可能に連結されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接される。また、トランスポゾン系ベクターは、以下の１つ以上の特性を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧを含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えずに各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸配列に対する１つ以上のコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する１つ以上の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強する、トランスポザーゼに操作可能に連結された有効なポリＡの付加。一実施形態において、トランスポゾン系ベクターは、鳥類に最適化したポリＡ配列を含み、ＡＣＣＡＴＧを含む改変されたＫｏｚａｋ配列を含まない。かかるトランスポゾン系ベクターの一例としては、ｐＴｎＭＣＳベクター（配列番号５６）がある。別の実施形態において、トランスポゾン系ベクターは、ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧを含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えずに各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸配列に対する１つ以上のコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する１つ以上の終止コドンの付加；およびｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強する、トランスポザーゼに操作可能に連結される有効なポリＡ配列の付加、を含む。かかるトランスポゾン系ベクターの一例としては、ｐＴｎＭｏｄベクター（配列番号５７）がある。トランスポゾン系ベクターは、別にまたは代替的に、トランスポザーゼに操作可能に連結されたプロモータを含む、任意のプロモータの３’末端に以下の１つ以上のＫｏｚａｋ配列を含む：ＡＣＣＡＴＧＧ、ＡＡＧＡＴＧＴ、ＡＣＧＡＴＧＡ、ＡＡＧＡＴＧＧ、ＧＡＣＡＴＧＡ、ＡＣＣＡＴＧＡ、およびＡＣＣＡＴＧＴ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
トランスポザーゼおよび挿入配列
本発明のさらなる実施形態では、トランスポゾン系ベクター中に見出されるトランスポザーゼは、変更標的部位（ＡＴＳ）トランスポザーゼであり、挿入配列はＡＴＳトランスポザーゼにより認識されるものである。しかしながらトランスポゾン系ベクター中に位置するトランスポザーゼは改変ＡＴＳトランスポザーゼに限定されず、任意のトランスポザーゼに由来し得る。従来技術で既知のトランスポザーゼとしては、ＡＣ７、Ｔｎ５ＳＥＱ１、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔ
ｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００（γδ）、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、点状トランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ｄＳｐｍトランスポゾンおよびＩトランスポゾンに見出されるものが挙げられる。本発明に従って、これらのトランスポザーゼおよびそれらの調節配列は、以下の機能改善のために改変される：ａ）トランスポザーゼに操作可能に結合されるプロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧを含む１つまたは複数の改変されたコザック配列の付加；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのアミノ酸に関するコドンの変更（この場合、各コドンのうち１つまたは複数の第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡまたはＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１つまたは複数の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するためにトランスポザーゼに操作可能に結合される有効ポリＡ配列の付加。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
したがって、本発明のトランスポゾン系ベクター内に含入されるプロモータは完全プロモータ配列またはプロモータ配列のフラグメントであり得る、と理解されるべきである。例えば一実施形態では、目的遺伝子に操作可能に結合されるプロモータは、ニワトリオボアルブミンプロモータの約９００塩基対フラグメントである（配列番号７０）。トランスポゾン系ベクター内に含入される構成性および誘導性プロモータは、ＡＣＣＡＴＧの１つまたは複数の改変されたコザック（Ｋｏｚａｋ）配列の付加によっても改変され得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
このベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを用いた。改変されたコザック配列（ＡＣＣＡＴＧ）をプロモータに付加した。トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組コドン中のゆらぎ位置のヌクレオチドをアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に変えたが、これは、このコドンによりコードされるアミノ酸を変えなかった。２つの終止コドンを付加し、合成ポリＡを用いて、強力な終結配列を提供した。このベクターは、安定組込みの可能性を増大するために（任意の誘導を伴わずに）細胞の進入後直ぐに活性であるよう設計されたプロモータを用いる。付加的終止コドンおよび合成ポリＡは、下流の潜在的遺伝子まで通して読取ることなく、適正な終結を保証する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
このベクターの構築の第一段階は、所望の変化を有するようトランスポザーゼを改変することであった。トランスポザーゼに対する改変は、プライマー高効率正プライマー（Ｈｅｆ）変更トランスポザーゼ（ＡＴＳ）−Ｈｅｆ５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣ３’（配列番号９１）および変更トランスポザーゼ−高効率逆プライマー（Ｈｅｒ）５’ＧＡＴＴＧＡＴＣ
ＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＣ３’（配列番号９２、逆相補プライマー）を用いて成し遂げた。５’正プライマーＡＴＳ−Ｈｅｆでは、配列ＣＴＣＧＡＧは、制限酵素ＸｈｏＩに関する認識部位であり、これは増幅遺伝子の方向性クローニングを可能にする。配列ＡＣＣＡＴＧは、コザック配列およびトランスポザーゼに関する開始コドンを含有し、そして下線を付した塩基は最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのＡまたはＴへのゆらぎ位置における変化を表す（コドンによりコードされるアミノ酸の変化を伴わない）。プライマーＡＴＳ−Ｈｅｒ（配列番号９２）は、ネイティブ終止コドンＴＧＡのほかに付加的終止コドンＴＡＡを含有し、そしてＢｃ１Ｉ制限部位ＴＧＡＴＣＡを付加して、方向性クローニングを可能にする。これらのプライマーを、トランスポザーゼおよびＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ系（酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ’ｓ、ＭｇＣｌ2およびＰＣＲエンハンサーを含む；Epicentre Technologies, Madison, WI）のための鋳型として、ｐＴｎＬａｃ（ｐはプラスミドを意味し、ｔｎはトランスポゾンを意味し、そしてｌａｃはラクトース遺伝子のβフラグメントを意味する。これはマルチクローニングサイトを含有する）を用いるＰＣＲ反応に用いた。増幅ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動処理し、臭化エチジウムで染色して、紫外線トランスイルミネーターで可視化した。予測サイズに対応する帯域をゲルから切り出して、ザイモ・クリーンゲル回収キット（Zymo Clean Gel Recovery Kit）（Zymo Research, Orange, CA）を用いてアガロースから精製した。メーカーのプロトコールに従って、精製ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（５’）およびＢｃｌＩ（３’）（New England Biolabs, Beverly, MA）で消化した。ザイモＤＮＡクリーンおよびコンセントレイターキット（Zymo Research）を用いて、消化ＤＮＡを制限酵素から精製した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006512921000001.app