【手続補正書】
【提出日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質結合受容体のアンタゴニストであり、アゴニスト活性を実質的に有さない化合物であって、下記の一般式：
【化１】
2005515973.tif 000001
［式中、Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＮＨ−アシル、ＮＨ−ベンゾイル、ＮＨＳＯ３、ＮＨＳＯ２−アルキル、ＮＨＳＯ２−アリール、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり；
Ｂは、アルキル、アリール、ベンジル、ナフチルもしくはインドール基、またはＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−フェニルグリシンの側鎖であり；
Ｃは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、プロリン、ヒドロキシプロリンまたはチオプロリンの側鎖であり；
Ｄは、Ｄ−ロイシン、Ｄ−ホモロイシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−ホモノルロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−テトラヒドロイソキノリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタメートまたはＤ−チロシンの側鎖であり；
Ｅは、Ｌ−１−ナフチルもしくはＬ−３−ベンゾチエニルアラニンであり、またはＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−ホモトリプトファンよりなる群から選ばれるアミノ酸の側鎖であり；
Ｆは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−カナバニンの側鎖、あるいはこれらのバイオ同配体であり；
Ｘは、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−または−（ＣＨ２）ｎＳ−、ｎが１〜４の整数；−（ＣＨ２）２Ｏ−；−（ＣＨ２）３Ｏ−；−（ＣＨ２）３−；−（ＣＨ２）４−；−ＣＨ２ＣＯＣＨＲＮＨ−；あるいは−ＣＨ２ＣＨＣＯＣＨＲＮＨ−、Ｒが普通のまたは稀なアミノ酸の側鎖である］
を有する環状ペプチドまたはペプチド様化合物（ただし、この化合物は AcF-[OPdChaWR]（化合物１）ではない）である化合物。
【請求項２】
ｎが２または３である、請求項１の化合物。
【請求項３】
Ａが、アセトアミド基、アミノメチル基または置換もしくは非置換スルホンアミド基である、請求項１または２の化合物。
【請求項４】
置換スルホンアミド上の置換基が、１〜６炭素原子のアルキル鎖またはフェニルもしくはトルイル基である、請求項３の化合物。
【請求項５】
アルキル鎖が１〜４炭素原子を有する、請求項４の化合物。
【請求項６】
化合物が、Ｃ５ａ受容体、バソプレシン受容体またはニューロキニン受容体に対するアンタゴニスト活性を有する、請求項１−５のいずれかの化合物。
【請求項７】
化合物が、Ｃ５ａＲに対するアンタゴニスト活性を有するが、Ｃ５ａアゴニスト活性を有さない、請求項６の化合物。
【請求項８】
化合物が、アンタゴニスト活性をサブマイクロモル濃度で有する、請求項１−７のいずれかの化合物。
【請求項９】
化合物が、受容体親和性ＩＣ５０＜２５μＭおよびアンタゴニスト力価ＩＣ５０＜１μＭを有する、請求項８の化合物。
【請求項１０】
化合物が、化合物２〜６、１０〜１５、１７、１９、２０、２２、２５、２６、２８、３０、３１、３３〜３７、３９〜４５、４７〜５０、５２〜５８および６０〜７０よりなる群から選ばれる、請求項９の化合物。
【請求項１１】
化合物が、化合物３３、化合物６０または化合物４５である、請求項１０の化合物。
【請求項１２】
請求項１−１１のいずれかの化合物を、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに含む組成物。
【請求項１３】
Ｇタンパク質結合受容体により媒介される病的状態の処置方法であって、請求項１−１２のいずれかの化合物の有効量を、該処置を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
Ｇタンパク質結合受容体により媒介される状態が、Ｃ５ａ受容体により媒介される状態である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
状態が、Ｃ５ａの過剰発現または過小調節を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
状態が、関節リューマチ、成人呼吸切迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、組織拒絶反応症、虚血性心疾患、再灌流障害、敗血症ショック、歯肉炎、腺維症、粥状動脈硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、喘息、痴呆、中枢神経系障害、肺創傷疾患、体外透析後症候群、および乾癬、湿疹、接触性皮膚炎などの皮膚炎症性障害よりなる群から選ばれる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
再灌流障害の処置方法であって、請求項１−１２のいずれかの化合物または化合物１の有効量を、該処置を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の環状化合物は、好ましくはヒトまたは哺乳動物の細胞上のＣ５ａ受容体のアンタゴニストである。この細胞には、限定でないが、ヒト多形核白血球およびヒトマクロファージがある。本発明の化合物は、Ｃ５ａ受容体に好ましくは強力かつ選択的に結合し、さらに好ましくはサブマイクロモル濃度で強力なアンタゴニスト活性を有する。さらにより好ましくは、化合物は受容体親和性ＩＣ５０＜２５μＭおよびアンタゴニスト力価ＩＣ５０＜１μＭを有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
図１９は、試験完了時のラット後足筋肉の浮腫量（湿潤対乾燥比率）を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
医薬組成物は、無菌の注射用水性または油性の懸濁液であり得る。この懸濁液は、上記のような適当な分散剤や湿潤剤および懸濁剤を用いる既知の方法により製剤できる。無菌の注射用製剤は、非経口的に許容される希釈剤すなわち溶媒中無菌の注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であり得る。使用し得る許容のビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム液がある。さらに、無菌の不揮発性油を溶媒または懸濁媒体として通常的に使用できる。この目的のために、すべての緩和な不揮発性油を使用でき、合成モノまたはジグリセリドがある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射用の調製に使用できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本発明の式Ｉの化合物についての用量レベルは、体重ｋｇ当たり約０.５ｍｇから約２０ｍｇの範囲に通常あり、好ましい用量は１日体重ｋｇ当たり約０.５ｍｇから約１０ｍｇの範囲である（患者１人あたり１日に約０.５ｇから約３ｇ）。１回量をつくるための担体材料と組合せ得る活性成分の量は、処置される対象および投与の特定の状態によって変わってくる。例えば、ヒトへの経口投与を意図する製剤は、約５ｍｇから１ｇの活性化合物を、適当で便利な量の担体材料とともに含有し得る。担体は全組成物の約５から９５％であり得る。用量単位形態は、約５ｍｇから５００ｍｇの活性成分を一般的に含有し得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
化合物１についてのＮＭＲデータをSilicon Graphics Ind 計算センターでのTRIAD ソフトウェアー(Tripos Assoc.)で処理した。２Ｄ  ＮＯＥ交差ピークを積分し、強(１.８−２.５Å)、中程度(２.３−３.５Å)および弱(３.３−５.０Å)に分類した。暫定的３次元構造を、Ｄiana２.８(６９距離制約、隣接残基について２７およびさらに離れるもの６を含む)を用いて重複２面角制約法(ＲＥＤＡＣ)で上限および下限距離制限ファイルから計算した。上限および下限距離制約をMARDIGRASで正確に計算した。この段階で、可能な水素結合についてペプチドを調べ、結合を距離制約として加えた。５０最低エネルギーＤiana構造を制約分子動力法(ＲＭＤ)および制約エネルギー最小化(ＲＥＭ)の対象とした。ＲＥＭは、最初に５０段階急勾配低下、次いで１００段階共役傾斜最小化法からなる。ＲＭＤは、構造の模擬加熱で行い、１ps につき３００Ｋ、次いで１ps につき５００Ｋで行った。温度を徐々に下げ、２ps 以上で３００Ｋ、最終的に２ps につき２００Ｋとした。ＲＥＭを再び５０段階急勾配低下、２００段階勾配、次いで３００段階 Powell最小化を行った。最終構造を調べて、骨格重原子(Ｎ、ＣαおよびＣ)を越える平均対の平方自乗平均差異を得る。５０構造中２０ですべての骨格原子(Ｏ、Ｎ、Ｃ)につき平方自乗平均＜０.５であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
アンタゴニスト活性についてのミエロペルオキシダーゼ放出アッセイ
細胞を(Sanderson et al, 1995)記載のように単離し、サイトカラシンＢとともにインキュベートした(５μg/mL、１５分間、３７℃)。０.１５％ゼラチンおよびペプチドを含む Hank's Balanced Salt 溶液を９６ウエルプレート(全量１００μｌ/ウエル)に加え、次いで２５μｌ 細胞４×１０６/mL)を加えた。Ｃ５ａに拮抗する各ペプチドの能力を調べるために、細胞を５分間３７℃各ペプチドとともにインキュベートし、Ｃ５ａ(１００nM)を加え、さらに５分間インキュベートした。次いで、５０μｌ のリン酸ナトリウム(０.１Ｍ、ｐＨ６.８)を各ウエルに加え、プレートを室温に冷やし、等量のジメトオキシベンジジン(５.７mg/mL)とＨ２Ｏ２(０.５１％)からなる２５μｌ の新鮮混合物を各ウエルに加えた。反応を１０分で、２％アジドナトリウムを加えて停止した。吸光度を４５０nmで Bioscan ４５０ plate reader により測定し、対照値(ペプチドなし)で修正し、非直線回帰で解析した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
薬物動態
雄および雌のウィスターラット（２００−２５０ｇ）を、ゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ；Lyppard, Australia）の腹腔内投与により麻酔した。面積５ｘ１０ｃｍの毛を剃り、ラットの下腹部に印をつけて、その上に薬物を適用した。１０ｍｇ／ｋｇのＣ５ａアンタゴニストを含有する保存液を溶媒プロピレングリコールまたはジメチルスルホキシド中に水で種々の濃度として溶解し、へらでラットの剃毛下腹部に均等に塗った。足の加熱でラットの体温を保持し、血液サンプルを最初の１時間は１５分の間隔で、その後は１時間の間隔で計３時間で採取した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
好中球アッセイ
ＰＭＷ計測のために血液(５０μｌ）を、ヘパリン処理チューブ中に入れ、次いで等量のhistopaque 1083 (Sia, U. S. A.)を重層し、ＰＮＦを単離し、細胞数をヘマトメーター上で計測した。ＰＭＮ値の濃度は、ＳＭＡ閉塞の直前に得られた値の平均％±ＳＥＭ値として示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
２００-２５０g重量の雌ウィスターラットを、全てのＣ５ａ受容体アンタゴニストのin vivo試験に使用した。ラットを、上記方法を用いて麻酔し、加熱パッドに移し、体温が実験中維持するようにした。カテーテルを、大腿部静脈に挿入し、縫合して固定し、ヘパリン化した生理食塩水（１００μL）で洗浄した。アンタゴニストまたはビヒクルのいずれかをラットに、静脈注射(１０％エタノールを含有する生理食塩水２００μL中１mg/kg、ＬＰＳ攻撃の１０分前)または局所的に(５０％ジメチルスルホキシド/Ｈ２Ｏ中、部位あたりｌ０mg、攻撃の完了６０分前)で投与した。ラットを、ＬＰＳ(生理食塩水(１００μL)中 ２μg kg-1 i.v)、組換え体ヒトＣ５ａ(１００μL中２μgkg-1)、ビヒクル対照のいずれかを用いて、アンタゴニストまたはビヒクル対照の、i.v 投与１０分後または局所投与の６０分後に、大腿部のカテーテルからi.v注入した。全ての薬剤を、２分間にわたってi.vで注射し、その後生理食塩水（１００μL）の注入により、薬物の送達を完全にした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
全血液試料(０.１mL)を、薬物およびＬＰＳまたはＣ５ａ投与時に尾静脈から採取した。試料を、ＬＰＳ(０時)の注射に対して-１５、０、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０および１５０分で採取し、ヘパリン含有チューブ中に(５００Units/mL)入れた。ＰＭＮを単離し、血液(１００μL)をHistopaque 1077 (Sigma U. S. A.)溶液(２００μL)上に重層し、４００xg、室温(２５℃)、３０分間で遠心分離した。血小板を多く含む血漿の上清層、単核白血球およびリンパ球の境界面およびHistopaqueの分離層を除去し、廃棄し、ＰＭＮおよび赤血球細胞を多く含む層を残す。冷蒸留水(４℃)（９mL)を、残存ペレットに加え、４０秒間振とうし、赤血液細胞を溶解させた。ダルベッコ・リン酸緩衝食塩水(１０x濃度)を添加し、等張に戻した。次いで、細胞を、４００xg、１５分間、１０℃で遠心分離した。得られる上清を廃棄し、ＰＭＮのペレットを残した。ＰＭＮを、さらに生理食塩水(９mL)で洗浄し、再度４００xg、１０分間、１０℃で遠心分離した。得られる上清をもう一度廃棄し、残存ペレットを、生理食塩水と混合ウェル(１００μL)に再懸濁した。ＰＭＮの数を、血球計上で計測した。各時点での細胞数を、攻撃完了前またはＬＰＳの前の０時点での全細胞数の％として計測した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
データ分析は、Graphpad Prism 3.0 software (GraphPad Software, Inc.USA)を用いて行った。統計学的比較を、シャム手術群、およびＩ／Ｒ単独群に対して、１元配置分散分析、次いでDunnett comparison post-test分析を用いて行った。統計学的有意差を、Ｐ＜０.０５で評価した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
（ｂ）アラニントランスアミナーゼおよびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼの阻害
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)およびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)の循環レベルを、試験完了時、続く２および３時間の再潅流時に採取した血漿試料で測定した。止血帯解放１０分後に、Ｉ／Ｒ単独動物におけるＡＬＴおよびＡＳＴの測定のために、血清を採取した。ＡＬＴおよびＡＳＴの濃度を、４℃で保存した採取血漿を２４時間以内に、ＡＬＴ／ＡＳＴキット(GPT/GOT;Sigma)で、製造業者の指示書に従って測定した。
結果を、ＳＦunits/mLとして表現した。