【手続補正書】
【提出日】平成18年8月24日(2006.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属の細菌、特にレジオネラ・ニューモフィラの血清群および／または菌株から分離された本質的にタンパク質非含有の糖質抗原を含む多糖質抗原に関しており、特に、L.ニューモフィラ血清群1のO-多糖質抗原を含むものに関し、ならびにレジオネラ生物に対応する多価抗体のアフィニティ精製におけるこれらの抗原の使用に関する。より詳細に述べると、本発明は、活性化されたクロマトグラフィーカラムへレジオネラ菌から分離された糖質または多糖質抗原が結合する段階、ならびにレジオネラと同一の種、または同一の種の血清群に対するポリクローナル抗体をアフィニティ精製するためにそのカラムを使用する段階を包含している。本発明はさらに、例えばヒト患者におけるレジオネラ症およびポンティアック熱のようなレジオネラに起因した疾患の検出、ならびにレジオネラ感染物質の環境起源の検出のための免疫化学アッセイ法において、製造されたアフィニティ精製多価抗体の使用を包含している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は、任意のレジオネラ菌に由来し、特に、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原のレジオネラ菌における任意の血清群の細菌に由来する抽出、この抗原とスペーサータンパク質との複合体の調製、この複合体のアフィニティカラムへの結合、対応するレジオネラ菌、例えばL.ニューモフィラ血清群の細菌に対する多価抗体の精製のためのこのカラムの使用、ならびにこのようにしてICT免疫アッセイ法で精製された抗体において、レジオネラ菌またはその抗原でのL.ニューモフィラ血清群もしくはそれらに対応する細菌の抗原を含む、検出のための使用を含み、これについては以下でより詳細に説明する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明により、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原が、他のレジオネラ種の菌由来、およびL.ニューモフィラの他の血清群の菌由来であることを含む、レジオネラ菌の各々から同様に分離することができること、このような抗原は、対応するレジオネラ種または血清群の菌およびその抗原に対する多価抗体のアフィニティ精製に同様に利用することができること、ならびにこれらのアフィニティ精製抗体は、L.ニューモフィラ血清群1に対するアフィニティ精製抗体について本明細書において詳細に説明されたICTおよび他の免疫アッセイ法に利用することができることが考察されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明において使用される多価抗体はさらに、抗体が精製剤として反応性であるような抗体に対して、同一の細菌の本質的にタンパク質非含有の（多糖質を含む）糖質抗原を用いて特異的に調製されたクロマトグラフィーカラム上でアフィニティ精製される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
従って抗体のアフィニティ精製に先立ち、本発明は、所望の種または種の血清群の公知のレジオネラ菌の培養物から、本質的にタンパク質非含有の精製された糖質抗原を調製することが必要とされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
下記の実施例IおよびIIは、精製されたタンパク質非含有の糖質抗原を得るための方法について説明する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
抽出された糖質抗原に由来する対応する細菌に対する多価抗体のアフィニティ精製において使用するためのクロマトグラフィーカラムに、実施例Iの本質的にタンパク質非含有のO-多糖質生成物または実施例IIの糖質を結合させるためには、糖質抗原およびカラムの両方が安定して結合し、かつそれ自身はアフィニティ精製工程期間は不活性であり続けることを確実にするために適当に調製されたタンパク質スペーサー分子と、カラムを結合することが必要である。好ましいスペーサー分子として、変性されたウシ血清アルブミン(「BSA」)が選択され、かつ実施例IIIのように調製された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
L.ニューモフィラ血清群1のO-多糖質抗原を同定するための完成した試験装置の使用は、下記実施例VIIIに詳細に説明されている：
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
実施例VIII -- L.ニューモフィラ血清群1のO-多糖質抗原のICT試験の実施
実際には、各装置に備えられたスワブを、液体試料中に、スワブヘッドが完全に浸漬されるように浸す。尿、血液、リンパ液などの液体生体試料中、ならびに液体環境試料中に存在する不溶性の固形、半固形、およびコロイド状物質のためにフィルターとして作用するようなスワブの使用は、1998年3月19日に出願されたNorman MooreおよびVincent Syの同時係属出願であり、間もなくBinax社に譲渡されるであろう、米国特許出願第09/044,677号の主題である。スワブは、装置の底の穴(図1Aの印B)に挿入され、かつゆっくり上側に押し上げられ、その結果スワブの先端が上側の穴(図1Aの穴A)の中に見えるようになる。試薬Aのバイアルを、穴Bの上に垂直に保持し、かつ試薬Aを2滴静かに加える。その後接着性裏当てを迅速に装置の右端から剥がし、かつ装置を閉じ固く密閉し、次にスワブウェル中のスワブを金複合体パッドに対して押し付ける。15分後、結果を装置のウインドウに読むことができる。陰性試料（すなわち、L.ニューモフィラ血清群1のO-多糖質抗原を含まない）は、ウインドウの上側半分に対照線のみを示すであろう。標的抗原を含有する陽性試料は、2本の線を示し、そのうちの下側の線は、患者(または試料)の線であり；かすかな試料線であったとしても、試料中の標的抗原の存在を示している。15分後にウインドウに線が全く現れないか、またはウインドウの下側部分に試料線のみ現れる場合は、その試験は無効であり、再試験しなければならない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  下記の段階を含む、液体中のレジオネラ菌またはその糖質抗原性成分の存在をアッセイする方法：
(a)レジオネラ菌の公知の種または種の血清群を湿潤細胞ペレットの形状で回収する段階；
(b)湿潤細胞ペレットを、アルカリ水溶液中に懸濁し、次に強酸性を添加することによりそのｐHを酸性ｐHに調整し、遠心分離する段階；
(c)段階(b)の上清を分離し、そのpHをほぼ中性に調整し、そこに広域スペクトルを有するプロテアーゼ酵素調製物を添加する段階；
(d)広域スペクトルを有するプロテアーゼ酵素で段階(c)の中和された上清混合物を消化し、残留タンパク質を破壊する段階；
(e)弱アルカリ水溶液で段階(d)から得られた消化された混合物に添加し、そのｐHをアルカリ側に調整し、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原を、弱アルカリ溶液で平衡化したサイズ排除カラム上で分離し、最初のピークで溶離した物質をプールし、そのpHをほぼ中性に調整する段階；
(f)段階(e)のほぼ中性の水溶液から本質的にタンパク質非含有の糖質抗原を回収し、該抗原をスペーサー分子に結合し複合体を形成する段階；
(g)段階(f)から得られた複合体を、クロマトグラフィーアフィニティカラムに結合させる段階；
(h)段階(a)で用いられたレジオネラ菌の同一で公知の種または種の血清群に対する粗抗体を、段階(f）のスペーサー分子と本質的にタンパク質非含有糖質抗原の複合体が結合している段階(g)のクロマトグラフィーアフィニティカラム通過させることにより精製し、精製された抗原特異的抗体を生成する段階；および
(i)段階(h)において精製された抗体を用いて、抗体に対する抗原性結合パートナーが存在するかどうかを、それを含有すると疑われる液体試料中で検出する段階。
【請求項２】  細菌がL.ニューモフィラ血清群1であり、かつ段階(e)で回収された本質的にタンパク質非含有のO-糖質抗原が、L.ニューモフィラ血清群1の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３】  細菌がL.ニューモフィラ血清群5であり、かつ段階(2)で回収された本質的にタンパク質非含有の抗原が、L.ニューモフィラ血清群5のO-糖質抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項４】  請求項１の段階(a)から(e)の方法により、レジオネラ・ニューモフィラの種である細菌もしくは種の血清群から得られた本質的にタンパク質非含有の糖質抗原。
【請求項５】  L.ニューモフィラ血清群1から得られたO-多糖質抗原である、請求項４記載の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原。
【請求項６】  L.ニューモフィラ血清群5から得られたO-糖質抗原である、請求項４記載の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原。
【請求項７】  段階(b)のアルカリ溶液が、0.1M水酸化ナトリウム水溶液中に湿潤細胞ペレットを約20ml/g含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】  段階(b)において、調整された酸性pHが約3.0である、請求項１記載の方法。
【請求項９】  段階(e)において、pHが約10〜約11の間に調整される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】  段階(e)の後に凍結乾燥段階を行う、請求項１記載の方法。
【請求項１１】  レジオネラ菌の種、または種の血清群に対する粗抗体の精製法であって、
(a)請求項１を含む段階（a)から(f)の方法を用いて、レジオネラ菌の同一の種、または種の血清群から、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原を分離する段階；
(b)該抗原を、両端が同じ形のスペーサー分子の一方の端に結合し、該本質的にタンパク質非含有の抗原と該スペーサー分子との複合体を形成する段階；
(c)複合体を、活性化されたクロマトグラフィーカラムに結合させる段階；
(d)段階(c)のカラム上で、該粗抗体をアフィニティクロマトグラフィーにかけて、精製された抗原特異的抗体を得る段階；および
(e)精製された抗原特異的抗体を該カラムから溶離させる段階。
【請求項１２】  粗抗体が、L.ニューモフィラ血清群1に対する抗体であり、かつ本質的にタンパク質非含有の糖質抗原が、請求項５記載の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】  粗抗体が、L.ニューモフィラ血清群5に対する抗体であり、かつ本質的にタンパク質非含有の糖質抗原が、請求項６記載の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】  請求項12記載の方法により生成された、L.ニューモフィラ血清群５およびその０-多糖質抗原に対する精製された抗原特異的抗体。
【請求項１５】  請求項13記載の方法により生成された、L.ニューモフィラ血清群5およびその糖質抗原に対する精製された抗原特異的抗体。
【請求項１６】  請求項11記載の方法により得られたL.ニューモフィラの少なくとも1つの種、または種の血清群の細菌に対する、精製された抗体であって、該精製された抗体は、その種の糖質抗原に対する特異性、または種の血清群に対する特異性を表す、抗体。
【請求項１７】  下記の段階を含む、レジオネラ菌またはその糖質抗原性成分の存在におけるアッセイ法：
(a)公知のレジオネラ菌の種、または種の血清群の培養物から、請求項１の段階（a)から(e)の方法を用いて、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原を抽出する段階；
(b)該本質的にタンパク質非含有の抗原を、スペーサー分子に結合させて、複合体を形成する段階；
(c）本請求項の段階(b)から得られた複合体を、クロマトグラフィーアフィニティカラムに結合させる段階；
(d)該公知のレジオネラ菌に対する粗抗体を、本請求項の段階(c)のクロマトグラフィーアフィニティカラムで精製し、精製された抗原特異的抗体を生成する段階；および
(e)本請求項の段階(d)において精製された抗体を使用し、液体中の対応するレジオネラ菌もしくはその抗原が存在するか否かを検出する段階。
【請求項１８】  段階(b)のスペーサー分子がタンパク質分子である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】  公知のレジオネラ菌の培養物が、レジオネラ・ニューモフィラの血清群の1つに由来する細菌を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】  公知のレジオネラ菌の培養物が、L.ニューモフィラ血清群1の細菌を含む、請求項19記載の方法であって、段階(a)において得られた本質的にタンパク質非含有の抗原が、その本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原であり、かつ段階(d)から得られたL.ニューモフィラ血清群1細菌に対する精製抗体が、段階(e)においてL.ニューモフィラ血清群1細菌もしくはそのO-多糖質抗原が存在するか否かについて測定するために使用される、方法。
【請求項２１】  段階(e)の液体が水である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】  段階(e)の液体が哺乳類を起源とする天然の液体である、請求項22記載の方法。
【請求項２３】  液体がヒト尿である、請求項23記載の方法。
【請求項２４】  液体が肺炎型疾患の臨床徴候を示している患者から得られる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  段階(e)が免疫アッセイ法である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】  段階(e)がイムノクロマトグラフィー(「ICT」)アッセイ法である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】  段階(d)から得られた精製された抗原特異的抗体の一部が、該抗体が対応する抗原と反応する場合に可視色を呈することが公知である標識物質と結合している、請求項25記載の方法。
【請求項２８】  標識物質が細かく粉砕された金属金である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】  公知のレジオネラ菌が、L.ニューモフィラ血清群5の細菌を含み、段階(a)において得られた抗原が、その本質的にタンパク質非含有の糖質抗原であり、かつ段階(d)から得られた精製抗体が、液体中に血清群1、2、4および5からのL.ニューモフィラ細菌またはそれらの糖質抗原性成分を検出することが可能である、請求項19記載の方法。
【請求項３０】  L.ニューモフィラ血清群5に対する精製された抗原特異的抗体が、液体中のL.ニューモフィラ血清群1、2、4および5細菌またはそれらの抗原のいずれかまたは全ての存在をアッセイするために使用される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】  液体が水である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】  段階(e)が免疫アッセイ法である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】  段階(e)がイムノクロマトグラフィー(「ICT」)アッセイ法である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】  段階(d)から得られた精製された抗原特異的抗体の一部が、該抗体が対応する抗原と反応する場合に可視色を呈することが公知である標識物質と結合している、請求項33記載の方法。
【請求項３５】  標識物質が細かく粉砕された金属金である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】  検出物質が、同一のレジオネラ菌から得られた本質的にタンパク質非含有の糖質抗原であって、請求項１の段階（a)から(e)の実施により該同一のレジオネラ菌の培養物から得られた該糖質抗原の複合体が結合しているクロマトグラフィーアフィニティカラム上において粗抗レジオネラ抗体の精製により得られた抗原特異的レジオネラ抗体から成り、レジオネラ菌の少なくとも1つの種もしくは種の血清群、または液体培地内においてその糖質抗原の存在を検出する方法。
【請求項３７】  抗原特異的レジオネラ抗体が、L.ニューモフィラ血清群に対する抗体であり、かつ複合体が、同一のL.ニューモフィラ血清群の細菌から得られた本質的にタンパク質非含有の糖質抗原の複合体である、請求項36記載の方法。   
【請求項３８】  L.ニューモフィラ血清群が、血清群1である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】  L.ニューモフィラ血清群が、血清群5である、請求項37記載の方法。
【請求項４０】  請求項36記載の免疫アッセイ法。
【請求項４１】  請求項37記載の免疫アッセイ法。
【請求項４２】  請求項38記載の免疫アッセイ法。
【請求項４３】  請求項39記載の免疫アッセイ法。
【請求項４４】  請求項40記載のICT法。
【請求項４５】  請求項41記載のICT法。
【請求項４６】  請求項42記載のICT法。
【請求項４７】  請求項43記載のICT法。
【請求項４８】  下記の段階を含む、レジオネラ菌の少なくとも1つの種もしくは種の血清群、または該細菌の糖質抗原を検出するためのICTアッセイ法：
(a)該細菌またはその糖質抗原性成分を含有すると疑われる液体試料を、以下の(i)を有する吸湿性材料の細片（strip）を含むICT装置と接触させる段階；
(i)(1)抗体とそれらに対応する抗原性結合パートナーとの反応時に、可視色の変化を示す標識物質；および
(2)検出しようとするレジオネラ種、または種の血清群に対する、精製された抗原特異的抗体であって、検出しようとするレジオネラ種、または種の血清群の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原であって、請求項１の段階(a)から(e)の方法を用いて、同一のレジオネラ菌または種の血清群の培養物から得られる該糖質抗原が結合しているクロマトグラフィーアフィニティカラム上を通過することにより精製されている抗体
からなる複合体が包埋されているゾーン；
(b)該試料を、試験細片に沿って、該第一ゾーンまで側方に流す段階；
(c)該試料を、アフィニティ精製した抗体および標識物の複合体とともに、該試験細片に沿って、該第二ゾーンまで側方に流す段階；ならびに
(d)段階(a)開始から約15分以内に、色の線が該第二ゾーンに出現したかどうかが該ウインドウから観察され、これにより試料中における検出しようとしているレジオネラ菌の種もしくは種の血清群、または該種の糖質抗原もしくは種の血清群の糖質抗原の存在を示す段階。
【請求項４９】  レジオネラ菌の少なくとも1つの種、または種の血清群を含有することが疑われる液体が水である、請求項45記載の方法。
【請求項５０】  レジオネラ菌の少なくとも1つの種、または種の血清群を含有することが疑われる液体が、哺乳類を起源とする天然の液体である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】  哺乳類を起源とする天然の液体がヒト尿である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】  抗体とそれらに対応する抗原性結合パートナーとの反応時に可視色の変化を示す標識物質が、細かく粉砕された金属である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】  標識物質が、細かく粉砕された金である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】  検出されるべき細菌またはその抗原が、L.ニューモフィラ血清群1もしくはO-多糖質抗原であり、精製された抗原特異的抗体が、L.ニューモフィラ血清群1に対する抗体であり、抗体の精製に使用されるクロマトグラフィーカラムに結合された本質的にタンパク質非含有の抗原が、請求項１の段階(a)から(e)の実施により得られたL.ニューモフィラ血清群1の培養物から得られたL.ニューモフィラ血清群の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項50記載の方法。
【請求項５５】  精製された抗原特異的抗体が、L.ニューモフィラ血清群5に対する抗体であり、かつ抗体の精製に使用されるクロマトグラフィーカラムに結合された本質的にタンパク質非含有の抗原が、請求項１の段階(a)から(e)の方法の実施により得られたL.ニューモフィラ血清群5の培養物から得られた、L.ニューモフィラ血清群5の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原である、請求項50記載の方法。