【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
「ベクター」分子は、それに異種核酸を挿入することができ、それは、次いで適当な宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは、好ましくは、1以上の複製起点、および組換えDNAを挿入することができる1以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを持つ細胞をそれを持たないものから選択することができる便宜な手段を有し、例えば、それらは薬物抵抗性遺伝子をコードする。通常のベクターはプラスミド、ウイルスゲノム、および(一義的には、酵母および細菌における)「人工染色体」を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
例えば、当業者によく知られた技術であるPCRを用いることによって、突然変異体遺伝子のcDNAを単離することができる。この場合、突然変異体対立遺伝子を保有していると推定される個体で発現されることが知られているまたはそれが疑われる組織から単離されたmRNAにオリゴ−dTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、および新しいストランドを逆転写酵素で延長することによって、第1のcDNAストランドを合成することができる。次いで、正常な遺伝子の5’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、cDNAの第2のストランドを合成する。これらの2つのプライマーを用い、次いで、産物をPCRを介して増幅し、適当なベクターにクローン化し、当業者によく知られた方法を介してDNA配列分析に付す。突然変異体遺伝子のDNA配列を正常な遺伝子のそれと比較することによって、突然変位体遺伝子産物の機能の喪失または改変の原因となる突然変異（複数突然変異）を確認することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
特別な具体例において、ウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（例えば、米国特許第5,219,740号；第5,604,090号；および第5,834,182号参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要でないレトロウイルス配列を欠失するように修飾されている。遺伝子治療で用いるべき核酸をベクターにクローン化し、これは、遺伝子の患者への送達を容易とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
遺伝子治療に対するもう1つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のごとき方法によって遺伝子を組織培養中の細胞に転移することを含む。通常、転移の方法は選択マーカーの細胞への転移を含む。次いで、転移された遺伝子を取り込み、それを発現する細胞を単離するための選択下に細胞を置く。次いで、それらの対象に送達する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
この具体例において、得られた組換え細胞のイン・ビボでの投与に先立って、核酸を細胞に導入する。そのような導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体−媒介遺伝子転移、マイクロセル−媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合などを含めた当該分野で知られたいずれの方法によって行なうこともできる。外来性遺伝子の細胞への導入については、多数の技術が当該分野で知られており、本発明に従って用いることができ、但し、受容体細胞の必要な発生的および生理学的機能は破壊されないものとする。該技術は、核酸が細胞によって発現でき、好ましくは、その細胞の子孫によって受け継ぐことができ、発現することができるように、核酸の細胞への安定な転移を供するべきである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
核酸を遺伝子治療の目的で導入することができる細胞はいずれかの所望の利用できる細胞型を含み、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝臓細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のごとき血液細胞；種々の幹または先祖細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血液、末梢血液、胎児肝臓等から得られる造血幹または先祖細胞を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
組換え細胞を遺伝子治療で用いる具体例において、核酸は、それが細胞またはその子孫によって発現できるように細胞に導入され、次いで、組換え細胞は治療効果のためにイン・ビボに投与される。特別な具体例において、幹または先祖細胞が用いられる。単離し、イン・ビトロで維持することができるいずれの幹および／または先祖細胞も本発明のこの具体例により潜在的に用いることができる。そのような幹細胞は、限定されるものではないが、造血幹細胞（HSC）、皮膚および腸のライニングのごとき上皮組織の幹細胞、胚心筋細胞、肝臓幹細胞（例えば、WO 94／08598）、および神経幹細胞（Stemple and Anderson，1992，Cell 71：973−985参照）を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
上皮幹細胞（ESC）またはケラチノサイトは、公知の手法によって皮膚および腸のライニングの組織から得ることができる（Rheinwald，1980，Meth．Cell Bio．21A：229）。皮膚のごとき層化上皮組織において、胚芽層内の幹細胞の有糸分裂によって再生が起こり、該層は基部ラミナに最も近い。腸のライニング内の幹細胞は、この組織の迅速な再生速度を供する。対象またはドナーの皮膚または腸のライニングから得られたESCまたはケラチノサイトは組織培養で増殖させることができる（PittelkowおよびScott，1986，Mayo Clinic Proc．61：771）。もしESCがドナーによって提供されれば、宿主−対−移植片反応性を抑制する方法（例えば、照射、中程度の免疫抑制を促進するための薬物または抗体投与）を用いることもできる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
造血幹細胞（HSC）に関しては、HSCの単離、増殖、および維持を供するいずれの技術も本発明のこの具体例で用いることができる。これが達成できる技術は（a）将来の宿主またはドナーから単離された骨髄細胞からのHSC培養の単離および確立、または（b）同種異系または異種間であり得る従前に確立された長期HSC培養の使用を含む。好ましくは、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と組み合わせて非−オートロガスHSCを用いる。本発明の特別な具体例において、ヒト骨髄細胞は、針吸入によって後腸骨稜から得ることができる（例えば、Kodoら，1984，J．Clin．Invest．73：1377−1384参照）。本発明の好ましい具体例において、HSCは高度に富化でき、または実質的に純粋な形態にできる。この富化は長期培養の前、間または後に達成することができ、当該分野で知られたいずれかの技術においてなすことが出来る。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改良されたDexter細胞培養技術（Dexterら，1977，J．Cell Physiol．91：335）またはWitlock−Witte培養技術（WitlockおよびWitte，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79：3608−3612）を用いることによって確立し、維持することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
機能不全に関連する検出は、遺伝子の過小発現、過剰発現または変化した空間または時間的発現に由来する病気、または該病気に対する罹患性の診断に付け加えるか、または確定することが出来る診断ツールを提供する。遺伝子中に突然変異を保有している個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
診断用の核酸は血液、尿、唾液、組織バイオプシーまたはオートプシー物質からのごとく、対象の細胞から得ることができる。ゲノムDNAを検出のために直接的に用いることができるか、あるいは分析に先立って、PCRまたは他の増幅技術を用いることによって酵素により増幅することができる。RNAまたはcDNAも同様に用いることができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅されたDNAを標識されたヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によって、または融点の変化によって、ミスマッチした二本鎖から区別することができる。また，DNA配列の差は、変性剤を含むまたは含まないゲルにおけるDNA断片の電気移動移動度の変化によって、または直接的DNA配列決定によって検出することもできる（例えば、Myersら，Science（1985）230：1242）。特異的位置における配列の変化は、RNaseおよびS1保護または化学的切断方法のごときヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにすることもできる（Cottonら，Proc Natl Acad Scis USA（1985）85：4397−4401）。もう1つの具体例において、ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプロ−ブのアレイを構築して、例えば、遺伝子突然変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ技術方法はよく知られており、一般的な適用可能性を有し、それを用いて、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝子変動性を含めた分子遺伝学における種々の問題に取り組むことができる（例えば、M．Cheeら，Science，Vol 274，頁610−613（1996）参照）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
前記した戦略をサイズが30および45kbの間の種々のユニークなコスミドクローンに適用し、各々は、ブタゲノムDNAのユニークな領域によって挟まれた、Please  Descriveプローブenv−Aおよびgag  DNAプローブでのサザーンブロットならびにRFLP分析によって測定して、PERVプロウィルスの単一コピーを含む。2つのPCR産物を、LPとカップリングした各LTRプライマーにつき予測でき−1つは全く内部PERV  DNAよりなり、もう1つはフランキング配列／LTR  DNAを含む。フランキングDNA配列では、PCR産物のサイズは、プロウィルスLTRの上流または下流の選択された制限酵素部位の近接性によって規定される。ある範囲の平滑−切断制限酵素を用いて、PERVフランキングDNA配列を含むPCR産物を得る尤度を増加させる。それにもかかわらず、Sma  IおよびPvu  II制限酵素は、分析したほとんど全てのコスミドクローンにつきフランキング配列を得るのに充分である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
以下のごとく、Megaprimeランダムプライムド標識キット（Amersham  Pharmacia  Biotech）を用い、三組のレプリカフィルターセット（セットA、BおよびC）を、α32P‐dCTPで標識したプローブでスクリーニングする：フィルターセットAはPERV  gagに対するプローブ（配列AF038600，塩基585‐2159）でスクリーニングし、他方、セットBおよびCはPERV  A  envに対するプローブ（配列Y12238塩基745−1101）でスクリーニングする。一体化されていないヌクレオチドは、Sephadex  G50カラムでのスパンカラムクロマトグラフィーによって除去する。6×SSC、20mM  NaH2PO4、5×デンハルト溶液、0.4％SDSおよび500μg／ml変性サケ精子DNAを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中、フィルターを65℃にて3時間プレハイブリダイズさせる。プローブを添加し、フィルターを一晩ハイブリダイズさせる。フィルターを2×SSC、0.1％SDS中で室温にて1回、0.5×SSC、0.1％SDS中で65℃にて30分間2回、ついで、0.1×SSC、0.1％SDS中で65℃にて30分間2回洗浄する。フィルターを、増感スクリーンを用いて、−70℃にてX−線フィルムに24ないし48時間、または貯蔵ホスフォルスクリーンに1ないし5時間暴露し、続いて、Molecular  Dynamics  Stormホスフォルイメージャーでホスフォルイメージングを行なう。ホスフォルイメージしたブロットをアセテートフィルム上にプリントし、しかる後、他の関連フィルターと共に光ボックス上に整列させる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
ラムダFix  IIライブラリーでは、製造業者の指示（Stratagene）に従い、合計1.5×106pfuをNZY寒天プレート上で平板培養する。Hybond  NX（Amersham）を用いて二組のフィルターをリフトし、Sambrookら（1988）に記載されているごとく変性し、中和する。フィルターを前記したごとくUV架橋し、Quickhyb溶液（Stratagene）中で30分間プレハイブリダイズさせる。Prime−it  II（Stratagene）を用いて、プローブをα32P‐dCTPで標識する。gagプローブ（AF038600、塩基585ないし2159）を1つのフィルターに加え、envプローブ（Y12239、塩基1387ないし1735）を二組のフィルターに加える。フィルターを一晩ハイブリダイズさせ、次いで、コスミドフィルターにつき前記したごとく洗浄する。フィルターを−70℃にて1週間までX−線フィルムに暴露し、Compact×4自動フィルムプロセッサー（X−ograph  Imaging  Systems）を用いて現像する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
オープンリーディングフレームについての蛋白質切形テストは、ビオチニル化‐リシンtRNAを用いる非−放射活性検出と共に、ウサギ網赤血球溶解物（PCR用のTNT  T7  Rapid，Promega）における転写翻訳共役を用いて行なう。各25μl反応は：2.5μlの未精製PCR産物、1μlを超えるtRNA（Promega）、20μlのTNT  T7  PCR  Quick  マスターミックス（Promaga）を含み、20μMのメチオニンを補足したものであった。反応を30℃にて90分間インキュベートし、2μlを4ないし12％のNuPAGE  Bis−Trisゲル上のSDS−PAGE（Novex／Invitrogen）に付す。ゲルをHybond  ECL膜（Amersham  Pharmacia  Biotech）に半乾燥ブロットする。ストレプトアジビン／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（1／3750希釈，  Roche）でブロットし、続いてECL検出（Amersham  Pharmacia  Biotech）を行なうことによって、ビオチニル化翻訳産物を検出する。公知の配列の翻訳されたgagまたはenvプラスミドクローン、およびビオチニル化蛋白質分子量マーカー（Roche）を参照することによって、産物のサイズを評価する。高親和性ラット抗−HA抗血清（1／500，  Roche）、および二次ヒツジ抗―ラットHRPコンジュゲート（1／10000、Sigma）でブロットし、続いてECL検出することによって、HAエピトープタグド産物を検出する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
陰性コスミドクローンの分析
加えて、SmaI消化したコスミドDNAのサザーンブロットを、プライマー結合部位（PBS）5’−ビオチンGCCTTTCATTTGGTGCGTTGGCCGGGAAATCCTCGCGACCACCCCTTACAC−3’（nt661−711，  受託番号AJ133817）の周りの領域およびenv5’−ビオチン−ACTGACCTCTAGCCTTCCCAGTTCTAAGATTAGAACTATTAACAAGACAA−3’（nt8121−8171，  受託番号AJ133817）の3’−末端に相同なビオチン標識オリゴヌクレオチドでプローブする。これらのプローブは初期ライブラリースクリーニングで用いるプローブ配列に対して、およびgagおよびenv  PCRプライマーセットに対して外部である。サザーンブロットしたDNAを40℃にて6時間プレハイブリダイズさせ、次いで、40℃にて緩衝液中の27nMのビオチン標識プローブオリゴと一晩ハイブリダイズさせた。次いで、ブロットを42℃にて1×SSC、0.1％SDS中で3回の30分間洗浄し、次いで、ストレプトアジビン‐西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートで展開し、前記PTTについて記載したごとくECL検出した。全ての公知のPERVにおけるこれらの領域について観察された配列保存のため、これらのオリゴに結合しない変種は欠失したプロウイルスを示すであろうと推定される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
プロウイルスフランキング配列分析
プロウイルスフランキング配列は、PERV  LTR中のプライマーおよび平滑末端切断DNAに連結されたリンカー中のプライマーの間のリンカー媒介PCRによって生じる。この戦略には、二重にアダプター連結された断片の望ましくない増幅を減少させる抑制効果が取り込まれる（Siebertら，1995）。7μlの反応中の10UのT4  DNAリガーゼ（Life  Technologies）を用い、0.5μgのPvuII消化コスミドまたはラムダDNAを60pmolのdsアダプターに、15℃にて16ないし48時間で連結させる。アダプターは、アニールされた上方ストランドオリゴ（5’−GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT−3’）および3’−アミンブロックした下方ストランドオリゴ（5’−ACCAGCCC−NH2−3’）よりなる。この反応の1マイクロリットルの1：100希釈を、50mMのKCl、10mMのトリス‐HCl（pH  8.3）、1.5mMのMgCl2、50nMのLTR特異的プライマー、50nMのアダプタープライマー（5’−GTAATACGACTCACTATAGGGC−3’）、200nMの各dNTPおよび2.5UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する25μlのPCR反応で鋳型として用いる。反応を以下の通りサイクルする：94℃9分、続いての30サイクルの（94℃、30秒；58℃30秒；72℃4分）；および10分間の72℃。LTR特異的プライマーを、全ての公知のPERV変種の間で保存されたU5領域で用い；プライマーLTR−5’（5’−GTGAACCCCATAAAAGCTGTC−3’）を用いて5’−フランキング配列を単離し、他方、プライマーLTR−3’（5’−GACAGCTTTTATGGGGTTCAC−3’）を用いて3’−フランキング配列を単離する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
コスミド78プロウイルスでは、各反応は、各300nMのプライマー78ltrs（5’−GAA  CCC  CAT  AAA  AGC  TGT  CC−3’）および78ltras（5’−GAT  CCT  ATG  TTG  GGT  GCA  TTT−3’）、50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH  8.3）、1.5mMのMgCl2、200nMの各dNTP、および2UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する50μlの反応中で約60ngの鋳型DNAを用いた。反応は以下の通りにサイクルする：94℃9分、続いての35サイクルの94℃30秒、54℃30秒、72℃30秒、および最終の72℃における10分（予測された産物のサイズは配列分析に基づいて323bpである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
gag  PCRは、PERV  AでスクリーニングしたコスミドライブラリーおよびPERV  Bでスクリーニングしたラムダライブラリーとの間の主な差を示す。32／34のラムダクローンがgag  PCR産物を与えたのに対し、13／54コスミドクローンのみがgag  PCR産物を与えた。コスミドMCSからの配列決定は、これが、いくつかの場合におけるenv遺伝子でのクローニング欠失によって引き起こされたことを示す。しかしながら、gag  PCR産物を与えないクローンの大部分については、MCSに隣接する配列はPERV配列ではなく、これはクローニング欠失が起こっていないことを示す。内部欠失を持つプロウイルスを表す予測されたより小さいgag産物はいずれのライブラリーからも検出されない。コスミドクローンについての見掛け上全長のgag遺伝子の蛋白質切形テストは、8／13クローンが無傷gagオープンリーディングフレームを有し、1／15が切形ORFを有することを示し、他方、4／13クローンは、それらが切形env遺伝子に基づく分析からすでに排除されていたのでテストしない。対照的に11／32ラムダクローンのみが無傷gagORFを有し、20／34は切形gagORFを有する。1／32は、それが以前に欠陥があることが判明しているのでPTTによって分析しない。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
env  PCRでは、18／54コスミドクローンは約2kbにおいてORFの予測されたサイズのPCR産物を与え、35／54はPCR産物を与えず、1つはテストしなかった。ラムダライブラリーから、31／34は全長産物を与え、3／34は産物を与えない。env内部欠失を表すより小さな産物は同定されない。PTTをPCR産物で行なう。2／18コスミドクローンのみが翻訳産物を与え、これは前記したごとくカルボキシ末端エピトープタギングPTTによって確認される。16／18は切形された非機能的env翻訳産物を与える。全長gag産物も与える唯一のクローンの配列分析により、これは、事実、PERV  bクローンであることが明らかにされた。多数の他のクローンの配列分析は、それらが予測されたごとくPERV  Aであることを示す。対照的に、PERV  Bクローンの13／31がPTTにつき全長env翻訳産物を与え、10／31は切形された産物を与え、他方、8つは既にgag欠陥であることが観察されているので分析しない。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
単離された多数のgagおよびenv陽性コスミドクローンはgag、polまたはenvプライマーセットで増幅されない。これらが公表されたPERVプロウイルスについての主な配列変種を表し、よって、用いられるPCRプライマーによって増幅されない可能性を排除するために、これらを2つの方法でさらに分析する。クローニング部位からインサートへと配列決定して、プロウイルスがクローニングプロセスの間に切形されているかを検出する。さらに、Smalで消化されたコスミドDNAのサザーンブロットを、プライマー結合部位（PBS）およびenv  LTR接合のまわりの領域に相同なビオチン標識オリゴヌクレオチドでプローブする。全ての公知のPERV変種におけるこれらの領域について見られる配列保存性により、これらのオリゴに結合しないことは大きく欠失されたプロウイルスを示すであろうと推測される。これらのクローンのほとんどはこれらのプローブのいずれによってもシグナルを示さず、それらは両末端で欠失されていることを示す。残りは一方の末端または他方の末端いずれかで欠失されている。コスミドクローン74は、プライマー結合部位およびenv−LTR双方についてのシグナルを示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ラムダクローン65321、2441および310518は共通のフランキング配列を与え、それらが単一プロウイルスを表したことが確認される。ラムダクローン73414および35121は共に2つの異なるLTR−3’−フランク配列（73414iおよび73414ii、35121iおよび35121iiと呼ばれる）を与え、73414iiおよび35121iiは同一であり、他方、他の配列は類似性を示さず、ラムダクローンが連続しており、3つの縦列配列したプロウイルス／プロウイルスの残りを含むことが示される。コスミド78の3’−フランク配列はこれらのいずれとも同一ではない。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
コスミドクローンの要約
gagおよびenvに対して陽性のコスミドクローンについての全ての結果を以下に表にまとめる。クローンは最初のピッキングに応じて順次番号付けする。以下に示すクローンは、RFLPパターンの欄中の「U」によって示されるごとくユニークである。複製クローンが同定される場合、そのような複製物の数はこの欄に記載する。表にはないクローンの番号は第1ラウンドのスクリーニングから回収されなかったか、あるいは他のクローンの複製であった。正しいサイズの産物が得られた場合は、PCRの結果は＋として報告し、産物が得られなかった場合には、−として報告する。CDは、gag配列がクローニング欠失の結果としてベクター配列に隣接する、べクターアームからの配列決定に際して、もし陰性結果がenv遺伝子で得られた場合のみ、そのようなクローンを欠陥があるとして記録することを示す。クローン56の場合、該クローンは切形されているが、陰性PCR結果がpolおよびenvで得られており、これは、さらに分析しなかったのでクローニング欠失として記録する。加えて、polでは、＋単独は、予測されたサイズの産物が得られたことを意味し、1またはs付の＋は、各々、予測された産物の不存在下でより大きなまたはより小さな産物が観察されたことを意味する。PTT結果については、FLは、全長蛋白質が翻訳されたことを意味し、TPは、対照と比べて切形された蛋白質が産生されたことを意味する。env  HA  PTTでは、＋はシグナルが観察されたことを意味し（全長蛋白質の確認）、−はシグナルが観察されなかったことを意味する（切形された蛋白質の確認）。