【手続補正書】
【提出日】平成17年9月21日(2005.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  第１および第２活性剤が夫々、第１リンカーを介して担体上の第１官能基に、および第２リンカーを介して担体上の第２官能基に結合している不溶性担体を含む医薬コンジュゲート。
【請求項２】  担体がタンパク質であり、官能基がＳＨ、ＮＨ2およびＣＯＯＨから選択される、請求項１のコンジュゲート。
【請求項３】  担体がヒト血清アルブミンである、請求項２のコンジュゲート。
【請求項４】  担体がマイクロカプセルの形態にある、請求項１−３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】  第１剤が糖タンパク質である、請求項１−４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６】  第１剤が第８因子である、請求項５のコンジュゲート。
【請求項７】  第２剤がフィブリノーゲンである、請求項５または６のコンジュゲート。
【請求項８】  第１官能基がＮＨ2またはＣＯＯＨである、請求項１−７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】  第１リンカーがジヒドラジドから誘導される、請求項１−８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１０】  第１リンカーが少なくとも１０ｎｍの長さである、請求項１−９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１１】  患者の体内部位でのある症状の処置用の医薬を製造するための、請求項１−１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用であって、１つの活性剤が症状を処置するのに有効であり、もう１つの活性剤が部位の標的用剤として作用する使用。
【請求項１２】  症状が出血、例えば血友病であり、部位が損傷箇所であり、１つの活性剤が第８因子であり、もう１つの活性剤がフィブリノーゲンである、請求項１１の使用。
【請求項１３】  不溶性担体と第８因子とのコンジュゲートであって、担体が遊離のＳＨ基を有するコンジュゲート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
他の型のリンカー、典型的にはヘテロ二重官能性化合物は、マレイミドである。マレイミドは、無水マレイン酸とアンモニアまたは第１級アミン化合物との反応による産物である。マレイミドの二重結合が遊離のスルヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。このアルキル化反応の最適ｐＨはｐＨ６．５−７．５である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
ＥＤＣを使用しないのが好ましい。例えば、好ましいリンカーは、マレイミド基と結合したＮＨＳエステルの組合せ（上記参照）である。ＮＨＳエステルは、ＥＤＣの代りとなって、遊離アミノ基と反応するように設計され、何らの活性化なしに安定なアミド結合をつくる。これは、例えば、フィブリノーゲンをスペーサーに共有結合的に結びつける。マレイミド基は、遊離チオールに高度に反応性を有し、マイクロカプセル上のＣｙａ３４残基と特異的に反応して、チオエーテル結合をつくる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
用い得る別の二重官能性リンカーはジヒドラジド試薬、例えばＨ2Ｎ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−ＮＨ2（式中、ｎは４−２０）である。具体的な例としては、ｎが６（アジピン酸ジヒドラジドすなわちＡＡＤＨ）である。これを適当な条件で用いると、結合糖タンパク質が得られることは当業者に明らかであろう。この化合物は、アルデヒド基と容易に反応して、カルボジイミドアクチベーターを介してカルボン酸と結合し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ヒドラジド官能基に基づくクロスリンカー・スペーサーは、フィブリノーゲンや第８因子などの糖タンパク質のＨＳＡマイクロカプセルとの共有結合に特に適している。これはカルボハイドレート部分を介しており、すなわちタンパク質部分に影響を与えない。最初の段階として、シアル残基の修飾が必要である。糖側鎖に存在するジオールの選択的過ヨウ素酸酸化は活性アルデヒドを形成する。過ヨウ素酸の濃度および反応温度を調整すると、シアル酸ジオールのみが開裂したかどうか、また、酸化が非選択的かどうかを調べることができる。ヒドラジド官能基とさらにインキュベートすると、ヒドラゾンが形成する。水素化シアノホウ素ナトリウムを加えると、ＥＤＣの必要なしに、ヒドラゾン結合の還元および安定化が起きる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
３−（２−ピリジルシジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）は、この型の好ましいクロスリンカーである。これは、フィブリノーゲンとのヒドラゾン形成およびＨＳＡマイクロカプセルとの遊離チオール反応の両方に関与し得る。ヒドラゾン誘導フィブリノーゲンのジスルフィド結合は分解して、ＨＳＡマイクロカプセル上のＣｙｓ−３４残基との遊離チオール交換を行い、第２ジスルフィド結合を形成する。これはピリジル−２−ジチオンの放出をおこし、その存在は３４３ｎｍでの吸収で検出できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の産物はまた、例えば、ＧＰＩｂ受容体（フォン・ウイレブランド因子と相互作用を起こす）、あるいはコラーゲンまたはその他の内皮下マトリック要素に対する受容体を有しており、送達されて、この内皮下マトリックスを覆うことによって腫瘍細胞の結合部位を強力に遮断する。本発明の産物はさらに損傷箇所において血小板と相互に作用できるが、固定化した腫瘍細胞による血管壁への侵襲も制限する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の産物を治療剤として使用する場合、そのままあるいは当業界で普通に知られている適当な担体と混ぜて投与できる。本産物の投与量は、おおむね損傷の程度または治療すべき他の症状にしたがって決められる。典型的な投与量はｋｇ体重について１.５ｘ１０9マイクロカプセルである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
下記の実施例で本発明を説明する。
実施例で使用したＨＳＡマイクロカプセルは、ＷＯ−Ａ−９６１５８１４のように噴霧乾燥法で調製し、次いで加熱して安定させた。ＨＳＡマイクロカプセル上の二つの官能基は共有接着すなわちアミンおよび遊離チオール部分を標的とした。両方のタンパク質がそれらの相異した二つの官能基を利用できるように、具体的なクロスリンカーを選定した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
アルファネイト（商標）第８因子をＧｒｉｆｏｌｓ ＵＫ から入手して、終始それを使用した。１国際単位の第８因子／ｍｌ蒸留水の溶液のアリコートを−２０℃で貯蔵して使用に備えた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
反復実験において、最終産物を５１mg/mlマンニトール、リン酸ナトリウム緩衝液、25mM、pH7.0を使用して調整した。標本計数をCoulter Multisizerで行い、ｍｌにつき１５１００万のマイクロカプセル標本濃度を得るのに要する処方剤の量を計算した。標本を３５００ｒｐｍ で２分間遠心分離機に供し、上清を除いて、計量した処方化緩衝液中で再懸濁した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
次に、ＨＳＡマイクロカプセルにフィブリノーゲン溶液を加え、さらに室温で３０分間反応させた。産物を反応緩衝液で２度洗って、すべての未反応フィブリノーゲン余剰分を除去した後に、上清を除いて、１Ｕ第８因子（１Ｕ第8因子の蒸留水溶液）を加えた。反応総量は１ｍｌである。ＨＳＡマイクロカプセルを１％のＴｗｅｅｎ８０中に３０分間沈め、それぞれのタンパク質標本に加える前に、蒸留水で２度洗い、リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５、２０ｍＭで１度洗った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
同じ緩衝液の０.０２ｍｇ／ｍｌＥＤＣ溶液を調製するために、１ｍｇ／ｍｌ溶液の２００μｌのアリコートを緩衝液１０ｍｌに加えた。次に、ＥＤＣ（４１μl、０.８２ｍｇ、５ｍｏｌ等価）をタンパク質溶液に導入して、室温で４時間反応させた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
１つのタンパク質とＨＳＡマイクロカプセルとの間の反応時間が経過した後に、第２の誘導タンパク質を加える前に、標本を洗った。フィブリノーゲンが最初に反応した場合、標本を緩衝液で２度洗い、２度目の洗浄後の上清を除いて、誘導の第８因子を導入した。第８因子が最初に反応した場合は、洗浄は１段階のみとした。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
スライドテストの活性は、実施例１の産物についてよりも低かった。この活性の消失の理由は、組み換え型フィブリノーゲンの担持が用いた実験条件によって減ったことにあろう。明らかに、最終産物の活性を最善にするために修正が必要であろう。