【手続補正書】
【提出日】平成17年9月27日(2005.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
本明細書で述べられた全ての刊行物および特許は、本発明が属する当業者の技術レベルを示し、それぞれ個々の刊行物または特許が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のマーカー分子のセグメントAとして用いられるペプチドの固相合成を示すスキームを示す。この例において、チオエステルで連結されたグリシンを含む樹脂リンカーが存在する。さらに、テトラメチルローダミン(TMR)で標識されているNα-Fmoc- Nε-TMR-リジンが構成要素アミノ酸として用いられる。N末端アミノ酸はイミノビオチンで標識されたグリシンである。標識されたペプチドはベンジルチオール(Ph-CH2-SH)処理によって固相から放出され、ペプチド生成物は逆相HPLC(RP-HPLC)によって精製される。
【図２】  セグメントA(TMRおよびビオチンで標識されたペプチド)と、N末端システイン含有タンパク質(セグメントB)との連結を示すスキームを示す。システインチオールでチオエステルをトランスチオエステル化するとS→Nアシルシフトが起こって、アミド結合によって接続された2つのセグメントを有する連結生成物が生成される。これにより、既知分子量およびpIの標識されたタンパク質である最終生成物が生成される。
【図３】  蛍光染料(例えば、テトラメチルローダミン)で標識された有機チオエステルと、N末端システインを有するタンパク質(セグメントB)とのカップリングによるTMRで標識されたタンパク質の調製を示すスキームを示す。図3Aは、トリエチレンテトラミン(TREN,アルドリッチ,Milwaukee,WI,カタログ番号90462から入手可能)を3.5当量のカルボキシテトラローダミン(TMR)活性化エステル(モレキュラープローブス,OR(カタログ番号e-6123)から入手可能)でアシル化して(TMR)3-TREN 5を形成することによって、標識されたタンパク質を形成するスキームを示す。Nα-Fmoc-リジンを2-イミノビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ビオチン-NSエステル)でアシル化すると、Nε-Fmoc- Nα-ビオチン-リジン6が生成される。6のα-アミノ基を脱ブロックし、その後に、ブロモアセチルクロリドでアシル化すると、Nε-ブロモアセトアミド- Nα-ビオチニル-リジン8が形成される。8とα-トルエンチオールとのカルボジイミドカップリングによって9が得られる。ヨウ化ナトリウムの存在下で5をチオエステル9でアルキル化すると、第4級アンモニウム塩10(セグメントA)が生成され、前記と同じ条件下で10とセグメントBをカップリングすると、11(発色団対タンパク質比=3)が得られる。図3Bは、まず最初に、チオールベンジルエステル(13)を調製することによって、TMRで標識されたタンパク質を形成するためのスキームを示す。トリフルオロ酢酸の存在下で13のアミノ基を脱保護することによって、14が生成され、その後に、14とTMRのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルとカップリングすることによって、N-TMR-8-ヘプタン酸のベンジルチオエステル誘導体15が生成される。チオエステル15(セグメントA)と、N末端システインを有する組換えタンパク質(セグメントB)との反応によって、透析によって精製することができるTMR-タンパク質16(発色団対タンパク質比=1)が形成される。
【図４】  TMRで標識されたペプチド(セグメントA)の固相合成を示す。樹脂リンカーは、チオエステルで連結されたヒスチジンであり、Nα-Fmoc-ε-TMR-リジンは、TMRで標識された構成要素アミノ酸である。このスキームにおいて、N末端アミノ酸はシステインである。トリフルオロ酢酸(TFA)で処理した後、結果として生じた生成物は、発色団TMRで標識され、金属親和性結合(ヒスチジン)6配列でタグ化されたオリゴペプチドである。
【図５】  インビトロ化学連結を介したタンパク質の標識を示すスキームを示す。この方法において、C末端チオエステルを有する組換えタンパク質(セグメントB)が、トルエンチオール、ベンジルチオール、およびチオフェノールの存在下で、N末端システインを有する、TMRで標識されたポリヒスチジンタグ化ペプチド(セグメントA)に連結する。反応によって、既知の分子量およびpIの生成物が得られる。
【図６】  N末端スレオニンまたはシステインを含むタンパク質の部位特異的修飾を示すスキームを示す。N末端アルデヒドを有するタンパク質(17,セグメントB)を形成するために、N末端アミノ酸の隣接する炭素にあるアミノ基およびヒドロキシル基を容易に酸化することができる。セグメントBと19(セグメントA)のカップリングによって、既知の分子量およびpIを有する目で見える色のついたタンパク質(21)が得られる。
【図７】  Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂またはスクノルザー(Schnolzer),M.ら,Intl.J.Peptide Protein Research 40:180(1990)により述べられた任意のアミド樹脂を用いた、N末端システインを有するペプチド(セグメントA)の固相合成を示すスキームを示す。
【図８】  インビトロ化学連結を介したタンパク質の標識を示すスキームを示す。この方法において、C末端チオエステルを有する組換えタンパク質MBP-95aa(マルトース結合タンパク質の95アミノ酸セグメント)(セグメントB)が、N末端システインを有する、TMRで標識されたペプチドに連結する。
【図９】  N末端システインのないペプチドを用いたインビトロ化学連結を示すスキームを示す。Nα-(1-フェニル-2-メルカプトエチル)補助基が、固相ペプチド合成を用いてオリゴペプチドN末端にカップリングされる。連結すると、補助基は穏やかな条件下で除去される。
【図１０】  MBP-110aa-(TMR)2を特徴付けるNU-PAGE(登録商標)4-12％Bis-Trisゲルの写真である。レーン1は、Multimark(インビトロジェン,Carlsbad,CA)タンパク質マーカーである。レーン2は、MBP-110aa-(TMR)2(最大分子量)、MBP-95aa、未反応
2004506221.tif 000001
を含む反応混合物である。レーン3はブランクである。レーン4は、MBP-110aa-(TMR)2(最大分子量)、MBP-95aa、未反応
2004506221.tif 000002
を含む反応混合物である。レーン5はMBP-95aaである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Invitrogen Corporation
<120>  Highly Homogeneous Molecular Markers for Electrophoresis
<130>  SK-A0305
<140>  JP   2002-518988
<141>  2001-08-13
<150>  US   60/224,345
<151>  2000-08-11
<160>  10    
<170>  PatentIn version 3.0
<210>  1
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Modified with fluorescein
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Modified with fluorescein
<400>  1
Cys Lys Lys Arg Lys Lys His His His His His His 
1               5                   10          
<210>  2
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic Peptide
<400>  2
Cys Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His Val 
1               5                   10                  15      
<210>  3
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<400>  3
Cys Leu Lys Asp Ala Leu Asp Ala Leu Asp Ala Leu Lys Asp Ala 
1               5                   10                  15  
<210>  4
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<400>  4
Asp Ala Leu Asp Ala Leu Asp Ala Leu 
1               5                   
<210>  5
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Modified with TMR
<400>  5
Asp Ala Leu Asp Ala Leu Asp Ala Leu Lys Asp Ala 
1               5                   10          
<210>  6
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<400>  6
Cys Asp Asp Lys Asp Asp Asp Asp Leu Ala Asp Asp Asp Lys Asp 
1               5                   10                  15  
<210>  7
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Modified with TMR
<400>  7
Cys Asp Lys Asp Ala Asp Asp Leu Ala Asp Leu Asp Lys Asp Ala 
1               5                   10                  15  
<210>  8
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<400>  8
Cys Gly Lys Ser Gly Ser Gly Lys Ser Gly Lys Gly Lys Ser Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  9
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<400>  9
Cys Ala Lys Leu Lys Ala Lys Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala 
1               5                   10                  15  
<210>  10
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Synthetic peptide
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Modified with TMR
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  AMIDATION
<400>  10
Cys Lys Lys Lys Ala Lys Leu Lys Ala Lys Lys Lys Lys Lys Ala 
1               5                   10                  15