【手続補正書】
【提出日】平成17年11月24日(2005.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインはビオチン結合性活性を含むものである、タンパク質。
【請求項２】  さらに細胞質ドメインを含むものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】  細胞外ドメインがアビジンまたはストレプトアビジン官能性活性を含む、請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】  スカベンジャーレセプタークラスＡ由来のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項３の何れかに記載のタンパク質。
【請求項５】  タンパク質が配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項３の何れかに記載のタンパク質。
【請求項６】  請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質をコードしている、核酸分子。
【請求項７】  請求項６に記載の核酸分子を含む、組換え体発現ベクター。
【請求項８】  請求項７に記載の組換え体発現ベクターで細胞ラインをトランスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞中で該タンパク質を発現させることを含む、請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質の製法。
【請求項９】  標的を含む溶液に分子を添加することを含む、標的部位に分子をインビトロ送達する方法であって、該分子がビオチン化されたものであり、該標的が請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質を含むものである、方法。
【請求項１０】  標的部位に投与する医薬の製造における請求項６に記載の核酸分子の使用であって、該核酸分子によってコードされているタンパク質が該標的部位で発現されるものである、使用。
【請求項１１】  標的部位に投与する医薬の製造におけるビオチン化分子の使用であって、該標的部位が請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質を含むものである、使用。
【請求項１２】  疾患処置目的で標的部位に投与する医薬の製造におけるビオチン化分子の使用であって、該標的部位が請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質を含み、そしてビオチン化分子が標的部位でその作用効果を及ぼす、使用。
【請求項１３】  細胞外ドメインがビオチン結合性ドメインを有するアビジンを含むものである、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項１４】  治療用である、請求項１ないし請求項５の何れかに記載のタンパク質。
【請求項１５】  治療用である、請求項６に記載の核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
背景技術
ビオチン(ビタミンＨ)は、血中および組織中に、低濃度でみられる易水溶性物質である。ビオチンの生物学的役割は活性化ＣＯ2の担体としてであり、それは、自由エネルギーの追加を必要とすることなく、アクセプターへのＣＯ2の移動を可能とする。活性化されたカルボキシビオチンは、通常、カルボキシビオチン形成で必要とされる酵素に結合している。例えば、ビオチンをピルビン酸カルボキシラーゼに結合させることができる（但し、この酵素は、アセチルＣｏＡの存在下でカルボキシビオチンの形成およびその後の活性化カルボキシル基のピルビン酸への移動を触媒して、オキサロ酢酸を形成するものである。）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
発明の概要
アビジンおよびストレプトアビジンのビオチン結合性活性を、ビオチン化分子と結合できる膜貫通タンパク質の製造で利用し得ることが判明した。
本発明のタンパク質は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン(membrane-spanning domain)および細胞外ドメインを含むことができ、ここで細胞外ドメインがビオチン結合性活性を有する。この細胞外ドメインはアビジンまたはストレプトアビジン官能性活性を有してもよい。
本発明のタンパク質または核酸分子を使用して、ビオチン化分子を組織中の特定部位へ標的化することができる。この方法で標的化した分子は、エンドサイトーシスによって組織または細胞に取り込ませ、細胞内でまたは細胞上で該分子にそれらの作用を発揮させることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
略記すると、ＳｃＲのｃＤＮＡは、前もって内部Rous SarcomaウイルスプロモーターおよびＨｉｎｄIII制限部位を含むＳｃＲ ｃＤＮＡを含むプラスミド(ＰＬＳｃＲＮＬ)で、トランスフェクトした培養細胞から得た。単離したｃＤＮＡを次いでレトロウイルスベクター ｐＬＳｌＡＲＮＬのＨｉｎｄIII部位中に挿入した。アビジンｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法によって調製し、それからレトロウイルスベクター中にＳｃＲ ｃＤＮＡ上のＳｔｙ１制限部位で挿入した。本発明を具体化するｃＤＮＡを配列番号１で示す。ヌクレオチド１−９８９はＭｏ-ＭｕＳＶ由来の長い末端反復配列に相当し；ヌクレオチド１０７１−２２７０はこの融合タンパク質のコード化領域に相当し；ヌクレオチド２３７６-３１０１はウシスカベンジャーレセプターＩｃＤＮＡ由来の非翻訳領域に相当し；ヌクレオチド３１０７-３３７６はＲＳＶプロモーター領域に相当し；ヌクレオチド３７２７-４５２２は neo R 遺伝子に相当し；そしてヌクレオチド４５４０-５１７７はＭｏ-ＭｕＬＶ由来の長い末端反復配列に相当する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ベクターでトランスフェクトされた細胞中における、この融合タンパク質の発現は、ノーザンブロット法およびアビジンに対して生成された抗体を用いた免疫細胞化学染色によって確認することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
実験により、ｍＲＮＡの完全な転写物が、５５kDa単量体に翻訳されることが明らかになった。この単量体は非還元条件下でＳ−Ｓ結合によって結合した１１０kDa二量体の二次構造を形成することができた。変性条件を使用して約１１０kDa二量体ペプチドおよび５５kDa単量体ペプチドを検出した。結果は単量体の融合タンパク質のコンピューター計算結果である４５kDaに匹敵した。非変性条件において(すなわちウエスタンブロット法に先だってアセチル化を使用)、最強のシグナルは約２２０kDaであった。これは約１１０kDa二量体および５５kDa単量体に変性され、四量体の形成を示唆する。２２０kDaタンパク質の存在は、例えばＮＨＳ-エステルのような化学架橋剤を使用しても確認できる。この結果は、アビジンはエンドサイトーシスレセプターの膜貫通ドメインに結合したときであっても可溶性のままであり四量体を形成できることを示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
この融合タンパク質は、共焦点顕微鏡法および原子間力顕微鏡法で分析したとき、ＦＩＴＣ-ビオチン結合能力がある官能性タンパク質であることがわかった。非形質導入細胞およびＬａｃＺ遺伝子を含むレトロウイルスベクターでトランスフェクトした細胞を対照として使用した。ビオチンプローブのＬａｃＺ形質導入対照細胞に対する非特異的結合は、原子間力顕微鏡法で検出されなかった。予想通り、トランスフェクト細胞は特定結合を示し、固定されていないサンプル中で繰返し測定可能であった。測定された結合力は平均１４９＋１９pN(平均＋sd)の倍数であり、これも、予想通り、初期に報告されたビオチン-ストレプトアビジン結合力の１６０pNの範囲内である(Florin et al (1994), Science 264:415-417)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
インビボでの融合タンパク質の官能性活性を、ラット悪性神経膠腫モデルで分析した。ＢＴ４Ｃ野生型神経膠腫細胞を、同系ＢＤＩＸ雌ラットの脳内で、２.５mm深さで右脳梁に頭蓋内移植した。腫瘍の増殖を高分解能ＭＲＩ(磁気共鳴映像法)で頻繁に観測した。腫瘍細胞接種から３週間後、力価がそれぞれ２×１０６cfu/mlおよび１.３×１０6cofu/mlである融合タンパク質またはＬａｃＺ遺伝子用のシュードタイプレトロウイルス担持ｃＤＮＡを、初めに２.５mmの深さおよびそれから１.５mmの深さで、１０分間の間隔をおいて腫瘍中へ移した。２日間の増殖の後に、遺伝子の移動を繰り返した。最後の注射から３日後、動物を屠殺し、４％ ＰＦＡに灌流固定した。脳を取り出し、注射部位で２つの冠状片に分割し、氷上で切片化し、抗アビジン抗体に対する免疫活性を分析した。得られた結果から、融合タンパク質はインビボでラット悪性神経膠腫中で発現していることがわかった。タンパク質が神経膠腫細胞中および、腫瘍血管中の血管内皮細胞に類似する環様構造中で検出された。