【手続補正書】
【提出日】平成18年7月13日(2006.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存するGGTA 1欠損ブタ。
【請求項２】
ブタがミニチュアブタである、請求項１に記載のブタ。
【請求項３】
GGTA 1欠損細胞を選択する方法であって、
（ａ）GGTA 1ヘテロ接合体ブタまたは胎仔から細胞系を得る工程；
（ｂ）GGTA 1欠損細胞について細胞を濃縮する工程；および
（ｃ）GGTA 1欠損生細胞について株をスキャンする工程
を含む、前記方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、細胞が、
（ａ）補体の存在下で、該細胞に抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体を処置すること；
（ｂ）抗gal試薬に結合している磁性マイクロビーズを用いて、該細胞を枯渇させること；
（ｃ）該細胞に抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体を処置し、抗抗体に結合している磁性マイクロビーズを用いて該細胞を枯渇させること；および
（ｄ）該株にgalエピトープリガンドを処置し、そして抗リガンド抗体に結合している磁性マイクロビーズを用いて該株を枯渇させること
からなる群から選択される少なくとも１つの処置または複数の処置により濃縮される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、細胞が、下記の各処置：
（ａ）補体の存在下で、該細胞に抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体を処置すること；
（ｂ）該細胞にgalエピトープリガンドを処置し、そして抗リガンド抗体に結合している磁性マイクロビーズを用いて、株を枯渇させること
を３回行うことにより濃縮される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞系がブタ胎仔線維芽細胞系であるか、あるいは細胞系がブタ胎仔線維芽細胞のクローン集団である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ブタ胎仔線維芽細胞がミニチュアブタ由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞系が幹細胞系である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
幹細胞が始原幹細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体が霊長類の抗体であるか、あるいは、抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体が、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１１】
抗gal試薬が、抗ガラクトース−α(1,3)−ガラクトース抗体およびレクチンからなる群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１２】
galエピトープリガンドがIB4結合体であり、抗エピトープリガンドが抗IB4結合体である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１３】
IB4結合体がIB4ビオチンおよびIB4-FITCからなる群から選択され、抗IB4結合体が抗ビオチンおよび抗FITCからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ブタGGTA 1欠損細胞。
【請求項１５】
細胞がGGTA 1遺伝子についてホモ接合体であり、かつ前記GGTA 1遺伝子は破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、細胞がGGTA 1遺伝子について半接合体であり、かつ１つのみのGGTA 1アレルが破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、細胞がGGTA 1遺伝子について複合ヘテロ接合体であり、かつ前記GGTA 1遺伝子は２つの異なる変異アレルを含む、請求項１４に記載のブタ細胞。
【請求項１６】
細胞がQ2、Q9、Q32またはQ37由来である、請求項１７に記載のブタ細胞。
【請求項１７】
ガラクトース−α(1,3)−ガラクトースエピトープの発現を欠損しているブタ臓器。
【請求項１８】
臓器がGGTA 1遺伝子についてホモ接合体である細胞を含み、かつ前記GGTA 1遺伝子は破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、臓器がGGTA 1遺伝子について半接合体である細胞を含み、かつ１つのみのGGTA 1アレルが破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、臓器がGGTA 1遺伝子について複合ヘテロ接合体である細胞を含み、かつ前記GGTA 1遺伝子は２つの異なる変異アレルを含む、請求項１７に記載のブタ臓器。
【請求項１９】
ブタ臓器が、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、甲状腺および皮膚を含む群から選択される、請求項１７または１８に記載のブタ臓器。
【請求項２０】
ガラクトース−α(1,3)−ガラクトースエピトープの発現を欠損しているブタ組織。
【請求項２１】
組織がGGTA 1遺伝子についてホモ接合体である細胞を含み、かつ前記GGTA 1遺伝子は破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、組織がGGTA 1遺伝子について半接合体である細胞を含み、かつ１つのみのGGTA 1アレルが破壊されているかまたは機能しないようにされているか、あるいは、組織がGGTA 1遺伝子について複合ヘテロ接合体である細胞を含み、かつ前記GGTA 1遺伝子は２つの異なる変異アレルを含む、請求項２０に記載のブタ組織。
【請求項２２】
GGTA 1欠損細胞を選択すること、卵母細胞を除核すること、前記卵母細胞を前記GGTA 1欠損細胞と融合させてNT由来の胚を産生すること、および代理母にNT由来の胚を移植することを含む、生存するGGTA 1欠損ブタを作製する方法であって、前記代理母は発情を開始しているが排卵を完了していない、前記方法。
【請求項２３】
GGTA 1欠損細胞が、ブタ胎仔線維芽細胞系またはブタ胎仔線維芽細胞のクローン集団由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ブタ胎仔線維芽細胞がミニチュアブタ由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ブタ胎仔線維芽細胞がGGTA 1 ノックアウトについてヘテロ接合体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
GGTA 1欠損細胞がQ2、Q9、Q32またはQ37由来である、請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
図面の簡単な説明
図１．抗体および補体による選択を複数のラウンド行った後の、野生型(F-12)およびGGTA 1ヘテロ接合体(355-F3)の胎仔細胞のフローサイトメトリー解析。細胞は、α(1,3)-galエピトープ特異的なレクチンIB4を用い、染色前(塗りつぶしなしのトレース)または染色後(塗りつぶしのトレース)に解析した。細胞は、各選択から５〜９日後に解析した。処置後の解析は、F12細胞の最後の選択から１７日後および355-F3細胞の最後の選択から２２日後に行われた。抗体／補体選択直後の細胞リカバー率を示し、これは処置中の細胞の喪失の全てを含んでいる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
８番目の側面においては、本発明は、卵母細胞を除核すること、前記卵母細胞をQ2由来の細胞と融合させてNT由来の胚を産生すること、および代理母に前記NT由来の胚を移植することを含む、生存するGGTA 1欠損ブタを作製する方法であって、前記代理母は発情を開始しているが排卵を完了していない、前記方法を提供する。他の全ての条件は、７番目の側面に記載した通りである。
９番目の側面においては、本発明は、卵母細胞を除核すること、前記卵母細胞をQ9由来の細胞と融合させてNT由来の胚を産生すること、および代理母に前記NT由来の胚を移植することを含む、生存するGGTA 1欠損ブタを作製する方法であって、前記代理母は発情を開始しているが排卵を完了していない、前記方法を提供する。他の全ての条件は、７番目の側面に記載した通りである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
１０番目の側面においては、本発明は、卵母細胞を除核すること、前記卵母細胞をQ32由来の細胞と融合させてNT由来の胚を産生すること、および代理母に前記NT由来の胚を移植することを含む、生存するGGTA 1欠損ブタを作製する方法であって、前記代理母は発情を開始しているが排卵を完了していない、前記方法を提供する。他の全ての条件は、７番目の側面に記載した通りである。
１１番目の側面においては、本発明は、卵母細胞を除核すること、前記卵母細胞をQ37由来の細胞と融合させてNT由来の胚を産生すること、および代理母に前記NT由来の胚を移植することを含む、生存するGGTA 1欠損ブタを作製する方法であって、前記代理母は発情を開始しているが排卵を完了していない、前記方法を提供する。他の全ての条件は、７番目の側面に記載した通りである。