(57)【要約】【課題】本発明は、様々な癌の治療のために有効な医薬、または医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明は、rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、癌を治療するための医薬組成物である。該医薬組成物は、静脈内投与によっても、腫瘍を退縮させる効果を有し、原発巣から転移した癌に対しても効果を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記癌が、転移癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌、肺癌または大腸癌である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindの投与量が、1 x 107 TCID50以下であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを静脈投与することにより用いられることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
治療対象がイヌであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、および、該腫瘍溶解性麻疹ウイルスを用いた癌の治療のための医薬組成物、ならびに、癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
麻疹ウイルス（Measles virus;MV）は、パラミクソウイルス科モービリウイルス属に属し、ヒトを自然宿主として感染し、免疫抑制や呼吸器症状を引き起こす、非常に強い病原性ウイルスである。麻疹ウイルスが腫瘍細胞に感染し、腫瘍の退縮を誘導することが明らかになったことから（非特許文献１）、麻疹ウイルスは、癌のウイルス治療のツールとして注目されてきた。現在までのところ、ワクチン株に基づく麻疹ウイルスを用いたウイルス治療の臨床的研究として、卵巣癌、ミエローマについて行われている（非特許文献２）。
【０００３】
麻疹ウイルスは、宿主細胞へ感染する際に、３つの分子をレセプターとして使用する。これらの分子は、CD46（非特許文献３および非特許文献４）、SLAM(signaling lymphocyte activation molecule)（非特許文献５）およびPVRL4(Poliovirus recptor related 4)(Nectin-4とも称される)（非特許文献６および非特許文献７）である。麻疹ウイルスのワクチン株は、これら３つの全ての分子をレセプターとして使用することができるが、野生型の麻疹ウイルス株は、PVRL4およびSLAMを使用することができるものの、CD46を使用できない。CD46は、ヒトの有核細胞に偏在的に存在しているが、特に、腫瘍細胞において多く発現している（非特許文献８および非特許文献９）。そのため、麻疹ウイルスワクチン株を用いたウイルス治療開発研究には、主要なレセプターであるCD46をターゲットとすることを目的とするものがある。しかしながら、CD46は正常細胞においても発現しているため、副作用の問題や、ターゲットの腫瘍細胞への感染率への影響が懸念されていた。また、ワクチン接種者では免疫による早期の排除も懸念されている。
【０００４】
PVRL4は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、肺癌細胞を含む腫瘍細胞において、選択的にその発現が上昇している（非特許文献１０〜非特許文献１３）。通常、PVRL4は、ヒトの胎盤に発現しているが、他の組織での発現はほとんど認められない（非特許文献１４）
発明者らは、PVRL4を選択的にターゲットとするため、麻疹ウイルスの野生株を用いることを考えた。野生型麻疹ウイルスが病原性を示すためのレセプターはSLAMである。SLAMは免疫細胞に選択的に発現しており、麻疹ウイルスによる、深刻な免疫抑制やウイルスの全身への拡散を可能ならしめている（非特許文献１５）。そこで、発明者らは、野生型麻疹ウイルスHL株をベースにして、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルス（rMV-SLAMblind）を作製した（非特許文献１６および特許文献１）。インビトロまたはインビボにおいて、rMV-SLAMblindを乳癌細胞に感染させると、これを死滅させることができる。その抗腫瘍活性は、従来の麻疹ウイルスワクチン株よりも高い。また、rMV-SLAMblindは、完全に弱毒化されており、サルへ皮下接種しても麻疹の典型的な臨床症状を引き起こすことがなく、安全性も高いことが確認されている（非特許文献１６および特許文献１）。
【０００５】
以上のように、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスであるrMV-SLAMblindは、癌治療のためのツールとして、非常に有効であると期待されている。特に、原発性の癌のみならず、転移性の癌の治療に対する期待度も大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2013-216609
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Groteら,Blood 97:3746-3754 2001.
【非特許文献２】Galanisら, Cancer research 70:875-882 2010.
【非特許文献３】Dorigら, Cell 75:295-305 1993
【非特許文献４】Nanicheら, Journal of virology 67:6025-6032 1993
【非特許文献５】Tatsuoら, Nature 406:893-897  2000
【非特許文献６】Muhlebachら, Nature 480:530-533 2011
【非特許文献７】Noyceら, PLoS pathogens 7:e1002240 2011
【非特許文献８】Liszewskiら, Annual review of immunology 9:431-455 1991
【非特許文献９】Fishelsonら, Molecular immunology 40:109-123 2003
【非特許文献１０】Takanoら,Cancer research 69:6694-6703 2009
【非特許文献１１】Fabre-Lafayら, BMC cancer 7:73 2007
【非特許文献１２】Fabre-Lafayら, The Journal of biological chemistry 280:19543-19550  2005
【非特許文献１３】Deryckeら, American journal of clinical pathology 134:835-845 2010
【非特許文献１４】Reymondら, The Journal of biological chemistry 276:43205-43215 2001
【非特許文献１５】Delpeutら, Current opinion in virology 2:773-783 2012
【非特許文献１６】Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記状況に鑑み、本発明者らは、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスが、乳癌以外の種々の癌にも効果を示すかどうか、および、治療が困難とされている癌（例えば、転移した癌、トリプルネガティブ乳癌など）に対する治療効果を示すかどうか等につき、さらに詳細な検討を行った。
そこで、本発明は、様々な癌の治療のために有効な医薬、または医薬組成物の提供を目的とする。
【０００９】
本発明者ら、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスを含む医薬、または医薬組成物の治療対象となる癌について、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスとして、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを用い、様々な検討を行った結果、非常に治療が困難とされているトリプルネガティブ乳癌、および、転移した癌の治療が可能であることを見出した。
さらに、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスを含む医薬、または医薬組成物が、腫瘍内投与のみならず、静脈内投与によっても腫瘍の退縮効果を示し、かつ、従来のウイルス医薬と比較して、より低い投与量によっても腫瘍の退縮効果を示すことを初めて見出した。
以上の知見に基づいて本発明は完成された。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）である。
（１）rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、癌を治療するための医薬組成物。
（２）前記癌が、転移癌である、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記癌が、トリプルネガティブ乳癌、肺癌または大腸癌である、上記（１）または（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindの投与量が、1 x 107 TCID50以下であることを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを静脈投与することにより用いられることを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）治療対象がイヌであることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、治療困難な癌の治療のための医薬、あるいは、医薬組成物の開発が可能となる。また、本発明により、様々な種類の癌の治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】肺癌細胞株における麻疹ウイルスレセプターの発現状況。  細胞表面上における麻疹ウイルスレセプターの発現状況について、フローサイトメトリーを用いて解析した結果である（麻疹ウイルスレセプター；濃灰色のグラフ、アイソタイプコントロール；灰色のグラフ）。
【図２】肺癌細胞株におけるPVRL4の発現状況。  肺癌細胞株におけるPVRL4の発現を、MFI(Mean Fluorescent Intensity)の割合として表示した。黒のグラフは非小細胞肺癌株の結果を、白のグラフは小細胞肺癌株の結果を示す。
【図３】rMV-SLAMblindのPVRL4発現肺癌細胞株への感染能力を検討した結果。  各種細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=0.1または2で感染させた。代表的な細胞の写真を示す。
【図４】インビトロにおける肺癌細胞に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。 各種肺癌細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=1で感染させた。細胞の生存率は、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpiおよび7 dpiの時点で測定した。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。Viablity；生存率、dpi；days post infection
【図５】肺癌細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。（ＡおよびＢ）皮下投与したNCI-H441の腫瘍の大きさを、rMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍内投与後に測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。*：p<0.05。（Ａ）ウイルス（●）または培地（△）を最初の投与（0 日）から、10日、19日の時点で、さらに投与した（n=4）。（Ｂ）ウイルス（●）または培地（△）を１回投与した（mockにつきn=8、ウイルス投与につきn=9）。（Ｃ）NCI-H441/CMV-Luc細胞をマウスに静脈投与により移植した。rMV-EGFP-SLAMblindを数回にわたり静脈内投与した。（Ｃ）ウイルス（i-iii）または培地（d）を投与したマウスの肺および腫瘍を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。（Ｄ）蛍光を発する腫瘍細胞の割合を示した。各ドットは個々のマウスのデータを示している。
【図６】大腸癌細胞株における麻疹ウイルスレセプターの発現状況。（Ａ）細胞表面上における麻疹ウイルスレセプターの発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した（麻疹ウイルスレセプター；白のグラフ、アイソタイプコントロール；灰色のグラフ）。（Ｂ）各大腸癌細胞株のRT-PCR解析の結果を示す。左図はPCR産物を電気泳動した結果を示す。また、右図は、GAPDHの発現量に対するPVRL4の発現量の割合を示す。3回の実験のPVRL4/GAPDH±SD値を示す。DLD1細胞のPVRL4/GAPDHの値を1とした。
【図７】rMV-SLAMblindの大腸癌細胞株への感染能力を検討した結果。（Ａ）細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させた。代表的な細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。（Ｂ）PVRL4ポジティブ細胞の生存率を示す。（Ｃ）PVRL4ネガティブ細胞の生存率を示す。（Ｂ）（Ｃ）については、細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させ、グラフの示すdpiにおいてWSTアッセイを行った。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。
【図８】大腸癌細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。（ＡおよびＢ）皮下投与したDLD1細胞（Ａ）およびHT29細胞（Ｂ）の移植片の体積は、rMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍内投与後の値である。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。*, **：p<0.05、p<0.01。ウイルス（○）または培地（●）を最初の投与（0日）から、7日, 14日の時点で、さらに、投与した（n=7）。（Ｃ）最初の感染から20日目にマウスを安楽死させ、DLD1細胞およびHT29細胞由来の腫瘍の重量を測定した。（Ｄ）蛍光を発する細胞の割合を示した。各ドットは個々のマウスのデータを示している（各グループにおいてn=7）。*, p<0.05。
【図９】トリプルネガティブ乳癌細胞株におけるPVRL4の発現状況。（Ａ）細胞表面上におけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。（Ｂ）rMV-EGFP-SLAMblindのトリプルネガティブ乳癌細胞株への感染能力を検討した結果である。代表的な細胞の写真を示す。
【図１０】インビトロにおけるトリプルネガティブ乳癌細胞に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。  各種トリプルネガティブ乳癌細胞にrMV-EGFP-SLAMblindおよびrMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを感染させた。（Ａ）各種トリプルネガティブ乳癌細胞の生存率を、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpi, 7 dpiおよび9dpiの時点で測定した。（Ｂ）PVRL4を発現していないコントロール細胞のB95aの生存率を測定した結果である。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。Viablity；生存率、dpi；days post infection
【図１１】トリプルネガティブ乳癌細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindの抗腫瘍効果。皮下投与したHCC70（Ａ）とMDA-MB-468（Ｂ）が増殖した腫瘍の体積（Tumor volume）を測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。1 x 106TCID50のrMV-SLAMblind、rMV-V(-)-SLAMblindまたは培地（control）を、最初の投与（0日）から、7日、17日の時点（HCC70）、あるいは、7日、13日の時点で、さらに投与した。
【図１２】乳癌細胞由来の腫瘍に対するrMV-SLAMblindの静脈内投与の効果を調べた結果。rMV-SLAMblindを最初の投与（0日）から、さらに4日の時点で投与した。
【図１３】イヌ乳癌細胞におけるPVRL4の発現状況。（Ａ）細胞表面上におけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。rMV-EGFP-SLAMblindのイヌ乳癌細胞株（Ｂ）および初代培養細胞株（Ｃ）への感染能力を検討した結果である。代表的な細胞の写真を示す。
【図１４】インビトロにおけるイヌ乳癌細胞株に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。各種細胞にrMV-EGFP-SLAMblindを感染させ、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpiおよび7 dpi時点で生存率を測定した。Viablity；生存率、dpi；days post infection
【図１５】イヌ乳癌細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。  （Ａ）免疫不全マウスに皮下移植したイヌ乳癌由来細胞株CF33細胞が増殖した腫瘍の体積（Tumor volume）を測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。1 x 106TCID50のrMV-SLAMblind（n=8）、または培地（control）（n=8）を、最初の投与（0日）から、さらに6日の時点で投与した。（Ｂ）（Ａ）の実験で、最初のウイルス投与から５０日目採取した腫瘍の重量を表した。数値は実験値の平均値±SDとして表した。
【図１６】rMV-SLAMblindの投与量と腫瘍内での増殖量との関係を検討した結果。MB-468細胞をマウスに移植し、移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった４４日目に、1 x 103 TCID50、1 x 104 TCID50、1 x 105 TCID50および1 x 106 TCID50のrMV-Luc-SLAMblindを腫瘍内投与し、グラフに示す時点において、腫瘍からの発光強度を測定した。縦軸は発光強度の相対値を示し、横軸はrMV-Luc-SLAMblindの投与後の日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態の一つは、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを含む、癌を治療するための医薬、または医薬組成物である。
本発明者らは、すでに報告している乳癌以外の、治療が困難とされるヒトのトリプルネガティブ乳癌細胞の他、ヒト肺癌細胞、ヒト大腸癌細胞、さらには、イヌ乳癌細胞に対し、rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindが細胞死を効率的に引き起こすことを確認した。rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindは、SLAM陽性の細胞に対する感染性を喪失しており、また、CD46陽性細胞に対しても、もともと感染せず細胞障害作用を誘導しないが、細胞への感染のためのレセプターとして、PVRL4/Nectin-4（本明細書では、主として、「PVRL4」と記載する）を使用するため、PVRL4陽性の癌細胞に特異的に感染し、その細胞死を誘導する。rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindが感染した細胞内では、これらのウイルスが増殖し、細胞を破壊して、細胞外に放出され、その結果細胞死が誘導される。
【００１４】
rMV-SLAMblindは、麻疹ウイルス株のHタンパク質のアミノ酸配列の533番目のアミノ酸残基を、野生型株などにおけるアルギニンをアラニンに置換したものである。他方、rMV-V(-)-SLAMblindは、Hタンパク質のアミノ酸配列の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンに置換し、さらにP遺伝子中の687、690番目の塩基をそれぞれUからC、CからUに置換したものである。
rMV-SLAMblindは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL(7+)を使用して、そのHタンパク質の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）を調製し、これを利用して、リバースジェネティクス手法により調製することができる。ここで使用される533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAは、配列番号１に示される塩基配列を含んでおり、この塩基配列によってコードされるタンパク質のうち、Nタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、Ｐタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、Mタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、Fタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、Hタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、Lタンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。これらのタンパク質によって、ウイルスが構成される
他方、rMV-V(-)-SLAMblindは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL(7+)を使用して、そのHタンパク質の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）のP遺伝子にさらに２カ所の変異（687番目をUからC、690番目をCからU）に置換したベクター（pMV-V(-)SLAMblind）を調製し、これを利用して、リバースジェネティクス手法により調製することができる。なお、pMV-V(-)SLAMblindによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、rMV-SLAMblindと全く同じである。
【００１５】
MV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを作製するための、元のウイルス株は、野生型MV-HL株以外の株であってもよい。従って、本発明のrMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindは、上述のpMV-SLAMblindベクターやpMV-V(-)SLAMblindを利用したものには限定されない。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、原発巣から他の組織に転移した癌（転移癌と記載する）に対しても有効に治療効果を発揮する。癌細胞は、しばしば、最初に発生した場所から、血管やリンパ管に侵入して、血液やリンパの流れに乗って別の臓器や器官に移動し、そこで、増殖を行うことがある。このように、原発巣とは異なる部位で生じた転移癌は、体内のどの組織、あるいは、臓器において生じるか、予測することは難しく、転移が見つかった時点では、治療の開始時期としては、すでに、遅い場合もあり得る。そのため、体内のいずれかの組織に転移した癌細胞を死滅させるためには、腫瘍内投与のみならず、静脈内投与によっても、癌細胞の殺傷効果を示す医薬組成物が必要である。本発明の医薬組成物は、実施例において示すように、静脈内投与によっても、癌細胞を死滅させる効果を発揮することから、転移癌の治療にも非常に有効である。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、細胞表面にPVRL4を発現している癌細胞であれば、死滅させることができる。癌細胞表面上におけるPVRL4の発現は、定常的に発現している必要はなく、細胞質と細胞表面上における存在比率が変化することで、細胞表面上のPVRL4の存在量に増減が生じてもよい。
本発明の医薬組成物の治療対象となる癌の種類としては、特に限定はしないが、例えば、大腸癌、肺癌、さらに、乳癌の中でも、トリプルネガティブ乳癌と称される治療が困難とされる癌も含まれる。トリプルネガティブ乳癌とは、乳癌の発症と増殖に関わる２つのホルモン（エストロゲン、プロゲステロン）と１つのタンパク質（HER2）に対する受容体が陰性の乳癌のことで、現在の治療法として有力なホルモン療法や、抗HER2（トラスツズマブなど）療法による治療が効果を示さないため、治療が困難な癌の一つである。乳癌全体の10〜15%を占め、極めて予後不良である。
【００１８】
本発明の医薬は、有効成分であるrMV-SLAMblindおよび／またはrMV-V(-)-SLAMblindを投与してもよいが、一般的には、有効成分であるこれらのウイルスの他、１または２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。また、本発明の医薬組成物には、その有効成分として、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindの他、これら以外の腫瘍溶解性ウイルス、抗癌剤、または、補助成分（例えば、CTLA-4 blockersやPD-1 antibodiesなどの免疫チェックポイント阻害剤、及び、GM-CSFなどの免疫賦活剤など）が含まれていてもよく、医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としても、腫瘍溶解性ウイルスを投与する形態として適したものであれば、如何なるものであってもよく、例えば、液体製剤などとして使用することができる。
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬組成物が注射剤として製造される場合、その有効成分を、必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２０】
本発明の医薬または医薬組成物は、腫瘍の溶解効果を発揮し得る経路であれば、如何なる投与経路であってもよく、例えば、腫瘍内投与の他、静脈内投与であってもよい。
本発明の医薬または医薬組成物は、投与量および投与回数は特に限定されず、治療の目的、癌の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
また、本発明の医薬または医薬組成物を投与する場合、様々な単位投与量を含んでいてもよい。単位投与量は、所定量の本発明の組換え麻疹ウイルスの含有量のことであり、この単位投与量を1回の注入として投与してもよく、あるいは、設定された期間にわたる連続的注入を含んでもよい。本発明の単位投与量は、すでに報告されている、腫瘍溶解性ウイルスの有効投与量（腫瘍の増大抑制効果を示す投与量）（Russellら、Mayo Clin Proceedings、89(7):926-33、2014）よりも少ない投与量により、腫瘍の増大を抑制する効果を有している。本発明の麻疹ウイルスの投与量としては、腫瘍内投与の場合、例えば、103TCDID50（50%組織培養感染量；例えば、Reed-Muench法、Reedら, Am J Hyg 1938，27:493-497）以上、104TCDID50以上、105TCDID50以上、好ましくは、106TCDID50以上である。腫瘍内発光強度の実験（実施例を参照のこと）から、107TCDID50程度で十分な腫瘍増大抑制効果が期待できる。
【００２１】
さらに、本発明には、本発明の医薬または医薬組成物を患者（ヒト以外の哺乳動物を含む）等に投与して、癌の治療（腫瘍の退縮など）を行う、治療方法が含まれる。本発明の癌の治療方法には、すでに発生している腫瘍の退縮を目的とする治療、転移が予想される場合の転移した癌細胞の殺傷を目的とする治療などが含まれ、外科的手術の術前または術後の補助療法なども含まれる。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物など、如何なる動物  であってもよい。好ましくは、ヒト、イヌなどである。
【００２２】
以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
材料と方法
１．細胞
１−１．ヒト肺癌細胞株
NCI-H358、NCI-H1666およびNCI-H2170は、ATCC(American Type Culture Collection) (Rockville, MD, USA)から購入した。NCI-H441/CMV-Lucは、独立行政法人医薬基盤研究所（National Institute of Biomedical Innovation）（Osaka, Japan）から購入した。細胞は、指示書に従って維持を行った。ABC-1, Calu-3, A431, PC14, NCI-H441, VMRC-LCD, RERF-LC-MS, NCI-H522, SKLU1, RERF-LC-OK, SBC-1, SBC-2, SBC-3, SBC-5, NCI-H69, N417, Lu139, and Lu134Aは、すでに開示されている方法により、維持を行った（Kikuchiら, Clinical cancer research 11:2954-2961 2005）。 具体的には、ABC-1, Calu-3, RERF-LC-MS, RERF-LC-OK, VMRC-LCD, SK-LU-1, SBC1, SBC2, SBC3およびSBC5は、10% FCS、1 mM ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸を添加したMEM（Minimum Essential Medium）中で維持した。NCI-H441, NCI-H522, PC-14, NCI-H69, N417, Lu134AおよびLu139は、10% FCSを添加したRPMI 1640 中で維持した。
【００２４】
１−２．ヒト大腸癌細胞株
CaCo-2, DLD1, HCT116, HT29, LoVo, LS174, RKO, SW48, SW480およびSW948は、ATCC(American Type Culture Collection) (Rockville, MD, USA)から購入した。DLD1, HT29および SW48細胞は、10% FCSを添加したRPMI 1640 中で維持した。その他の細胞は、10% FCSを添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) (Life Technologies)中で維持した。
【００２５】
１−３．ヒト乳癌細胞株
トリプルネガティブ乳癌細胞である、HCC1599, HCC1187, HCC70, MDA-MB-468, HCC38, HCC1143, HCC1937, BT-20, HCC1806, DU4475およびBT549Cは、ATCCから購入した。BT-20は10％FCSを添加したEMEM中で、それ以外の細胞は10％FCSを添加したRPMI中で維持した。
MCF7ヒト乳癌細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター；The Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japan）は、従前の方法により維持を行った（Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013）。
【００２６】
１−４．イヌ乳癌細胞株
CF33は日本大学生物資源科学部獣医学科、 CTBp, CTBmおよびCHMmCは東京大学農学生命科学研究科から分与された。CF33は、10％FCSを添加したDMEM、CTBp, CTBmおよびCHMmCは10％FCSを添加したRPMI中で維持した。
【００２７】
２．ウイルス
EGFP遺伝子を保持するrMV-SLAMblind（rMV-EGFP-SLAMblind）は、すでに報告されている方法により調製した（特開2013-216609；Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013、なお、特開2013-216609の全開示内容は参照によって本願に組み込まれる）。また、rMV-V(-)-SLAM-blindは、rMV-SLAMblindのゲノムのP遺伝子に２カ所の変異（687、690番目の塩基をそれぞれUからC、CからU）を導入して調製した。
各ウイルスをMCF7細胞に感染させ、ウイルスが感染した細胞を培養上清と共に回収し、回収物に対し8秒間の超音波処理を3サイクル行い、ウイルスを放出させた。超音波処理後、回収物を3,000rpm(1,940 x g)で10分間、4℃で遠心を行い、ウイルスを上清に回収した。インビボでの投与用に、高力価でウイルスを得るために、ウイルス溶液を濃縮した。200mlのウイルス懸濁液を、19krpmで2時間、4℃で、遠心した。遠心後、ペレットを回収し、約1 mlの培地に最懸濁し、-70℃で保存した。ウイルスの力価は、すでに報告されているようにして（特開2013-216609；Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013）、MCF7細胞に対する、TCID50/ml（50%組織培養感染量）として決定した。
【００２８】
３．細胞へのウイルス感染
３−１．肺癌細胞株への感染
肺癌細胞株を24ウェルプレートで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi = 0.1または2で感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
【００２９】
３−２．大腸癌細胞株への感染
大腸癌細胞株を96ウェルプレートで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi = 2で感染させた。感染3日後に、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて観察した。
【００３０】
３−３．乳癌細胞株への感染
トリプルネガティブ乳癌細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、また、rMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
イヌの乳癌細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、感染させた。また、乳癌を発症したイヌ由来の初代培養細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =0.1で、感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
【００３１】
４．RT-PCRおよび配列解析
大腸癌細胞をTRIzol LS reagent (Life Technologies)で溶解させ、全RNAを指示書に従って抽出した。cDNAは、RT-PCRキット(PrimeScript; Takara)を使用して合成した。ヒトPVRL-4およびGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)に対するPCRは、AmpliTaq polymerase (Life Technologies)を用いて行った。PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
PVRL4-specific forward primer；5’- ACATCCTCCACGTGTCCTTC-3’（配列番号８）
PVRL4-specific reverse primer；5’-CAAAGTGTCCCCATCCACTC-3’（配列番号９）
GAPDH-specific forward primer；5’-CACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’（配列番号１０）
GAPDH-specific reverse primer；5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’（配列番号１１）
PVRL4の全コード領域を除くために、LA Taq(Takara)を用いてPCRを行った。PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
KIT-specific forward primer；5’-GGTCAGTTCCTTATTCAAGTCTGC-3’（配列番号１２）
KIT-specific reverse primer；5’-GCTAAAATCTCCCATGTCAACAG-3’（配列番号１３）
PCR産物は、TA cloning vector (pGEM-T; Promega)にクローニングし、配列決定を行った。決定した配列は、GenBankに登録されている配列（アクセッション番号；NM030916.2）と比較した。
【００３２】
５．フローサイトメトリー
５−１．細胞株
細胞をPBSで洗浄した後、0.025% トリプシン、0.24 mM EDTAにより、培養プレートから剥がした。回収した細胞を遠心し、得られた細胞のペレットを、2% FCS を含むHBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)( Life Technologies)に再懸濁した。細胞懸濁液は、抗ヒトNectin-4モノクローナル抗体(Clone 337516, R&D Systems)（肺癌細胞株）、抗PVRL4 mAB (Clone N4.61; Millipore)（大腸癌細胞株）、抗ヒトSLAM抗体[A12 (7D4) BioLegend, San Diego, CA]、抗CD46抗体(M177, HyCult Biotech, Uden, Netherland)、または、マウスIgG(R & D Systems)と共に、氷上で、インキュベートした。インキュベート後、細胞を、2% FCSを含むPBSで洗浄し、抗マウスIgG-Alexa 488 (Life Technologies)と共に、氷上で、インキュベートした。その後、細胞は、2% FCSを含むPBSで洗浄した後、FACSCalibur (BD Biosciences)を使用して、蛍光強度を測定した。各種抗体で染色した細胞の蛍光強度平均値（MFI; Mean Fluorescent Intensity）を、アイソタイプを使用したコントロールの値で除し、PVRL4/ Nectin-4、SLAMおよびCD46の相対的な発現レベルとして表示した。
【００３３】
５−２．腫瘍細胞
マウスから切除した大腸癌細胞由来の腫瘍は、5mM HEPES, 2% FCS, 1mg/mL コラゲナーゼ（和光純薬）および0.1% DNase I（Life Technologies）を含むHBSSで処理した。腫瘍から採取した細胞を、7AADAAD（7-amino-actinomycin D）および抗マウスH2Kd-PE-Cy7 Ab（clone SF 1-1.1; BD Biosciences）で染色し、4% パラホルムアルデヒドで固定し、BD FACS Verse analyzer (BD Biosciences)を使用して解析を行った。
【００３４】
６．細胞の生存率
細胞の生存率は、WST-1細胞増殖キット（Takara）を使用して測定した。細胞毎に適したmoiでウイルスを感染させ、培養を行った。いくつかのdpi（days post first inoculation；最初の感染からの日数。以下、同じ）の時点で、WST-1細胞増殖キットに添付の指示書に従い、細胞の生存率を測定した。
【００３５】
７．異種移植モデル
全ての動物実験は、東京大学実験動物委員会による承認を受けて行った。
皮下移植の場合は、移植した腫瘍細胞が正着し、十分な大きさ（100 mm3〜250 mm3、場合によっては500 mm3）に成長してから治療効果を検証するためのウイルス投与を行った。腫瘍塊が十分な大きさに成長するまでの期間は、癌細胞の種類や増殖速度によって異なる。
７−１．肺癌細胞株
5週齢の雌のscid(severe combined immune deficiency)マウスをクレアジャパンから購入した。
NCI-H441細胞（肺癌細胞株）を、1 x 108細胞/mlになるように、2% FCSを含むHBSSに懸濁し、等容量のマトリゲル（BD Biosciences）と混合した。100μlの細胞懸濁液(5 x 107細胞)を、scidマウスに皮下注射した（5 x 107細胞/1マウス）。移植後、腫瘍塊が400〜500mm3に成長した時点で、ウイルス投与を開始した。0日、10日、19日の計3回、106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindをマウスに腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。JMP software (JMP Pro 10.0.2, SAS Institute Inc., Cary, NC) を使用して、ウィルコクソンログランク検定（Wilcoxon-log-rank test）により腫瘍体積を解析した。また、腫瘍塊が小さい時点（150〜200mm3）で同ウイルスを１回腫瘍内投与する実験も行った。
静脈内投与した肺癌細胞が肺において増殖するかどうか、および、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍に蓄積するかどうかを検討するために、NCI-H441/CMV-Luc細胞 (1 x 105 cells in 100μl)をマウスの静脈内に投与した。その後、200μlのD-ルシフェリン(10 mg/ml, Gold Biotechnology, Inc.)を皮下投与した。腫瘍の増殖をモニターするために、Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen/Caliper Life Sciences) を用いて、ルミネッセンスを測定した。イメージングパラメーターは、露光を1分間、ビニングを8とし、15 cmの視野で行った。肺癌細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを100μl、マウスに静脈内投与した。さらに、最初のrMV-EGFP-SLAMblind の投与から、14日、 41日、および48日の時点においても、rMV-EGFP-SLAMblindを250μl、マウスに静脈内投与した。その後、マウスを安楽死させ、蛍光顕微鏡を用いて、肺を観察した。
【００３６】
７−２．大腸癌細胞株
5 x 106細胞数のDLD1細胞またはHT29細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスの脇腹に皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、2または3日毎に大きさを測定した。移植後、腫瘍塊腫瘍塊が150mm3に達した時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを、週毎に3回腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
【００３７】
７−３．乳癌細胞株
トリプルネガティブ乳癌細胞株については、5 x 106細胞数のHCC70細胞またはMB-468細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、2または3日毎に大きさを測定した。トリプルネガティブ乳癌細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点から、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを、週毎に3回腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
ヒト乳癌細胞MCF7をマウスに移植し、増殖した乳癌腫瘍細胞に対し、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍退縮効果を調べた。この場合、1.5 x 106細胞数のMCF7細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。MCF7細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindをマウスに静脈内投与した。さらに、最初の投与後4日の時点においても、rMV-EGFP-SLAMblindの投与を行った。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
【００３８】
７−４．イヌ乳癌細胞
5 x 106細胞数のCF33細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、腫瘍塊が十分な大きさになった時点において、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
【００３９】
〔実施例１〕ヒト肺癌に対する効果
PVRL4陽性肺癌細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
14種の非小細胞肺癌および8種の小細胞肺癌を含む肺癌細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べた。PVRL4は、8種の非小細胞肺癌細胞株（ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, NCI-H358, Calu-3, PC14, A431およびNCI-H1666）と、1種の小細胞肺癌細胞株（SBC-2）において、発現していた（図１および２）。
また、麻疹ウイルスレセプターとして機能する他の分子がこれらの細胞株において発現しているかどうかを検討するために、CD46およびSLAMの発現レベルを調べた。CD46は、全ての細胞株において発現していたが、SLAMは発現していなかった（図１）。moi = 0.1 または 2で、rMV-EGFP-SLAMblindを感染させると、PVRL4を発現している全ての細胞は、いずれのmoiによる感染においても蛍光を発し、合胞体を形成した（図３）。
【００４０】
インビトロにおけるrMV-SLAMblindの肺癌細胞の殺傷効果
rMV-SLAMblindの感染により、PVRL4発現肺癌細胞株が死滅するかどうかを調べるため、8種の非小細胞肺癌細胞株（ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, Callu-3, NCI-H358, PC14, A431, and NCI-H1666）の生存率について、rMV-EGFP-SLAMblindの感染後検討を行った。ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, NCI-H358, Calu-3およびNCI-H1666の生存率は、7 dpiの時点で、40%以下にまで低下した（図４）。ABC1, NCI-H441, H2170, H358およびCalu-3は、比較的多くPVRL4を発現しており（図１）、これら5種の細胞株は、全て、rMV-SLAMblindの感染により死滅した。NCI-H1666, PC14およびA431におけるPVRL4の発現量は低かった。そして、7 dpiまでに、PC14およびA431は、rMV-SLAMblindの感染後、明白な生存率の低下は認められなかったが、NCI-H1666の生存率は低下した。rMV-EGFP-SLAMblindによる殺傷効果は、PVRL4の発現レベルと相関していた。
【００４１】
インビボにおけるrMV-SLAMblindの肺癌由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
次に、rMV-SLAMblindのインビボにおける抗腫瘍効果について、マウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いる肺癌細胞株としてNCI-H441を選択した。NCI-H441は、PVRL4を多く発現しており、rMV-EGFP-SLAMblindの感染により生存率の低下が明らかに認められた細胞株であり、また、Scidマウスへの移植が可能であることが報告されている。移植した腫瘍が増殖し始め十分な塊になった後、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを、3回、マウスに腫瘍内投与した。その結果、コントロールのマウスと比較して、腫瘍の増殖が顕著に抑制された（図５Ａ）。ウイルス治療をより小さな腫瘍に対して行った場合には、rMV-SLAMblindの1回の投与で腫瘍を明らかに退縮させた（図５Ｂ）。これらの結果は、rMV-SLAMblindが抗腫瘍効果をインビボにおいて発揮することを示している。
【００４２】
静脈内投与
さらに、rMV-SLAMblindが肺で増殖した腫瘍をターゲットにすることができるかを調べるため、ルシフェラーゼ遺伝子を保持するNCI-H441/CMV-Lucを静脈内投与することにより、異種移植を行った。腫瘍の増殖は、Xenogen IVIS Imaging System 100を用いて、発光を測定することによりモニターした。増殖した腫瘍がはっきりと視覚化されてから、rMV-EGFP-SLAMblind を数回にわたり静脈内投与した。IVISによる解析により、移植した腫瘍細胞由来の発光と腫瘍細胞で複製したウイルス由来の蛍光が、同一エリアにおいて観察された。IVISによる蛍光観察は、解像度がそれほど高くないため、マウスを安楽死させ、蛍光顕微鏡下にて、肺の観察を行った。蛍光顕微鏡観察により、増殖した複数の腫瘍が肺に存在することが明らかとなった。腫瘍の数は、１つの肺あたり、16〜36の範囲であった。そして、rMV-SLAMblind-EGFPからの蛍光シグナルは、rMV-SLAMblind-EGFPの投与に依存して、これらの腫瘍の多くに検出された（図５ＣおよびＤ）。このことは、rMV-SLAMblindは、肺の異なる部位に存在する複数の腫瘍に対し、静脈内投与により、感染することが可能であることを示している。
後述の乳癌に対するrMV-SLAMblindの静脈内投与の結果を考慮すると、rMV-SLAMblindは、転移した癌（静脈等を経由して原発巣以外の部位に着床し増殖した癌）等に対しても、静脈内投与による、有効な治療効果を示す可能性が示唆される。
【００４３】
〔実施例２〕ヒト大腸癌に対する効果
PVRL4陽性大腸癌細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性。
大腸癌細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べた。10種の大腸癌細胞株のうち、CaCo-2, DLD1, HT29, LS174, RKO, SW48, SW480およびSW948において、PVRL4の発現が認められた（図６Ａ）。他方、CD46およびSLAMの発現については、全ての細胞株において、SLAMの発現はなく、CD46は、全ての細胞株において、発現していた（図６Ａ）。
また、PVRL4のmRNAの発現について、RT-PCRで調べたところ、PVRL4mRNAの発現は、PVRL4の細胞表面上における発現と一致していた（図６ＡおよびＢ」）。
【００４４】
インビトロにおけるrMV-SLAMblindの大腸癌細胞の殺傷効果
各種細胞株に対し、rMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させ、3dpiの時点で蛍光顕微鏡観察を行ったところ、PVRL4陽性細胞においてのみ、EGFP由来の蛍光が細胞全体に広がって観察された（図７Ａ）。次に、PVRL4に対するrMV-EGFP-SLAMblindの殺傷能力を調べるために、WSTアッセイを行った。PVRL4陽性細胞にrMV-EGFP-SLAMblindを感染させてインキュベートすると、経時的に細胞の生存率が低下した（図７Ｂ）。これに対し、PVRL4陰性細胞の生存率は、rMV-EGFP-SLAMblind存在下においても変化しなかった（図７Ｃ）。
【００４５】
インビボにおけるrMV-SLAMblindの大腸癌細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
次に、DLD1細胞およびHT29細胞をマウスに移植し、増殖した腫瘍に対するrMV-EGFP-SLAMblindの効果について検討した。図８Ａに示すように、毎週、rMV-EGFP-SLAMblindを投与すると、DLD1細胞を移植して生じた腫瘍に対し、培地を投与したコントロールと比較して、およそ55％の腫瘍退縮が確認された。同様に、HT29細胞を移植した腫瘍に対しても、およそ60%の腫瘍の退縮が確認された（図８Ｂ）。最初の感染から20日後、各マウスを安楽死させ、腫瘍の重量を測定した。rMV-EGFP-SLAMblindを投与したグループの腫瘍の重量は、培地を投与したコントロールグループの腫瘍と比較すると、明らかに軽かった（図８Ｃ）。
次に、最後のrMV-EGFP-SLAMblindの感染から1週間後において、rMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍内に止まっているかどうか、検討を行った。フローサイトメーターを用い、7-ADDの取り込み状況に基づいて、7-AADで染色されない生細胞を選択した。そして、EGFPポジティブな細胞（rMV-EGFP-SLAMblindが止まっている細胞）の比率を調べたところ、DLD1細胞由来の腫瘍細胞では、1〜6%（平均2.9%）の細胞が、また、HT29細胞由来の腫瘍細胞では、0.2%〜2%（平均1.0%）の細胞が、EGFPポジティブであった（図８Ｄ）。培地で処理したrMV-EGFP-SLAMblind非投与の腫瘍細胞においては、EGFPはネガティブであった（図８Ｄ）。
【００４６】
〔実施例３〕ヒトトリプルネガティブ乳癌に対する効果
トリプルネガティブ乳癌細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
11種のトリプルネガティブ乳癌細胞におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べたところ、9種の細胞（HCC1599, HCC1187, HCC70, MDA-MB-468, HCC38, HCC1143, HCC1937, BT-20およびHCC1806）において発現していた（図９Ａ）。そこで、moi =２で、rMV-EGFP-SLAMblindを感染させると、PVRL4を発現している細胞は、蛍光を発し、合胞体を形成した（図９Ｂ）。
【００４７】
インビトロにおけるrMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindのトリプルネガティブ癌細胞の殺傷効果
rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindの感染により、PVRL4発現細胞株が死滅するかどうかを調べるため、3種のPVRL4陽性のトリプルネガティブ乳癌細胞株（HCC70, HCC38,およびMDA-MB-468）の生存率について検討した。その結果、7dpiの時点で、HCC38の生存率は40%程度まで、HCC70については10〜20%程度、MDA-MB-468については、ほぼ0%程度にまで生存率が低下した（図１０Ａ）。なお、コントロールとして用いたB95a細胞（マーモセットBリンパ球芽細胞由来）に対しては、殺傷効果を示さなかった（図１０Ｂ）。
【００４８】
インビボにおけるrMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindのトリプルネガティブ癌細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
次に、rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindのトリプルネガティブ乳癌細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果について、Scidマウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いるトリプルネガティブ乳癌細胞株として、HCC70とMDA-MB-468を選択した。移植した腫瘍が増殖し始めた後、図１１のＡおよびＢに矢印で示す時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindを、マウスに腫瘍内投与した。その結果、rMV-EGFP-SLAMblindおよびrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindのいずれを投与した場合においても、コントロールのマウスと比較して、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１１ＡおよびＢ）。
【００４９】
〔実施例４〕rMV-SLAMblindの静脈投与によるヒト乳癌由来の腫瘍退縮効果
次に、乳癌（非トリプルネガティブ乳癌）由来の腫瘍に対し、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍退縮効果を示すかどうかについて検討を行った。移植に用いる乳癌細胞株として、MCF7を選択した。MCF7由来の腫瘍に対しては、rMV-EGFP-SLAMblindを腫瘍内投与すると腫瘍が退縮することを確認している（特開2013-216609）。移植後、腫瘍塊が約100mm3に達した時点、および最初の投与から4日目の時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを尻尾の静脈内に投与し、経時的に腫瘍の体積を測定した（図１２）。その結果、rMV-EGFP-SLAMblind非投与のコントロール群と比較して、rMV-EGFP-SLAMblind投与群においては、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１２）。
この結果から、rMV-SLAMblindは静脈内投与によっても、腫瘍増殖を著しく抑制する効果を示すことが分かった。
【００５０】
〔実施例５〕イヌの乳癌に対する効果
イヌの乳癌細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
本発明のrMV-SLAMblindの野生型は、ヒトを自然宿主として感染するウイルスであることから、他の動物に対する感染性は低く、麻疹ウイルスを実験感染させてもイヌは全く発症しない。一方イヌにおいても近年乳癌症例が増加し、ヒトと同様に有効なイヌの乳癌治療法の開発が求められている。そこで、イヌの乳癌細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性について検討を行った。
9種のイヌの乳癌細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べたところ、4種の細胞（CF33, CTBp, CTBmおよびCHMm）において発現していた（図１３Ａ）。そこで、moi =2で、rMV-EGFP-SLAMblindを感染させると、PVRL4を発現している細胞は、蛍光を発し、合胞体を形成した（図１３Ｂ）。
さらに、乳癌を発症しているイヌから採取した乳癌細胞（初代培養細胞株）2例についても、PVRL4の発現について調べたところ、2例ともPVRL4を発現しており、moi =0.1で、rMV-EGFP-SLAMblindが感染し、合胞体を形成した（図１３Ｃ）
【００５１】
インビトロにおけるrMV-SLAMblindのイヌ乳癌細胞の殺傷効果
rMV-EGFP-SLAMblindの感染により、PVRL4陽性のイヌ乳癌細胞が死滅するかどうかを調べるため、4種のPVRL4陽性のイヌ乳癌細胞株（CF33, CTBp, CTBmおよびCHMm）の生存率について検討した。その結果、7dpiの時点で、CTBm の生存率は80%程度であったが、CF33, CTBmおよびCHMmの生存率は40%程度にまで低下していた。従って、rMV-EGFP-SLAMblindはイヌの乳癌細胞に対しても有効な殺傷効果を示すことが分かった（図１４）。
【００５２】
インビボにおけるrMV-SLAMblindのイヌ乳癌細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
次に、rMV-EGFP-SLAMblindのイヌ乳癌細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果について、Scidマウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いるイヌ乳癌細胞株として、CF33を選択した。移植後、腫瘍塊が十分な大きさに達した時点を0dpiとし、0dpiおよび8dpiの時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを、腫瘍内投与した。その結果、rMV-EGFP-SLAMblindを投与した場合、コントロールと比較して、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１５Ａ）。
また、最初の感染から５０日後、マウスを安楽死させ、腫瘍の重量を測定した。rMV-EGFP-SLAMblindを投与したグループの腫瘍の重量は、培地を投与したコントロールグループの腫瘍と比較すると、明らかに軽かった（図１５Ｂ）。
【００５３】
〔実施例６〕rMV-SLAMblindの投与量と腫瘍内での増殖量との関係
マウスへの異種移植モデルにおける、腫瘍内投与実験では、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを投与し、腫瘍増大抑制効果に著効を認めている。MDA-MB-468細胞をマウスに移植し、移植後、腫瘍塊が十分な大きさに達した時点で、1 x 103 TCID50、1 x 104 TCID50、1 x 105 TCID50および1 x 106 TCID50のrMV-luc-SLAMblindを腫瘍内投与し、グラフに示す時点において、腫瘍からの発光強度を測定した。その結果、1 x 105 TCID50の投与量においては、1 x 106 TCID50投与した場合に比較し、やや発光強度は落ちるものの、ほぼ同等であった（図１６）。投与量をさらに増やし、1 x 107 TCID50のであれば、さらなる治療効果が認められると考えられ、1 x 108 TCID50を投与した場合とそれほどウイルスの増殖量には差がないことから、rMV-EGFP-SLAMblindは1 x 107 TCID50の投与量で、十分な腫瘍増大抑制効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、腫瘍溶解性組換え麻疹ウイルスを含む医薬または医薬組成物を提供するものであり、特に、治療が困難な癌や転移した癌細胞を有効に退縮させることができる。従って、癌の治療分野によいて極めて有用な技術である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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