【手続補正書】
【提出日】平成17年7月27日(2005.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｋ．ら、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０：５８９（１９９４）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
上記で同定された配列を含むフラグメントは、実施例１に記載のように、ヒト尿から出願人らにより単離および配列決定された。第１のペプチドのアミノ酸配列（配列番号１と呼ぶ）は、コラーゲンα１（Ｉ）鎖の残基６２０〜６３３に対応し、そして本明細書中で「ヘリコペプチドＩ」または「ヘリコペプチド／α１（Ｉ）620-633」と呼ばれる。第２のペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）は、コラーゲンα１（Ｉ）鎖の残基２５３〜２６１に対応し、そして本明細書中で「ヘリコペプチドＩＩ」または「ヘリコペプチド／α１（ＩＩ）253-261」と呼ばれる。これらの配列を有する合成ペプチドは、実施例２に記載のように調製された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
Ｂ．モノクローナル抗体
本発明に従うモノクローナル抗体試薬を調製するために、上記のような免疫原を使用して動物（例えば、マウス）を免疫し、これから不死化のための抗原特異的リンパ球が得られ得る。周知のＢａｌｂ／ｃマウスならびに免疫応答を高めたマウス株（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手可能な「自己免疫」ＭＲＬ／ＭｐＪ−ｌｐｒマウス）を含む、多数の適切なマウス株がこの目的のために開発されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
通常、脾臓細胞は、最初の免疫の約８週間後に採集され、そして不死細胞株（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞株）と融合される。成功した融合産物の選択は、公表された方法（一般的に、Ｈａｒｌｏｗら、１９６〜２１２頁、１９８８を参照のこと）に従って馴化Ｓ−ＤＭＥＭ培地中のＨＡＴで行われ得る。１つの有用な補充培地は、以下の処方に従って補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ，ＮＹから入手可能）である：ＤＭＥＭ（８０％）、ＮＣＴＣ−１０９（１０％）、ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅウシ血清（１０％）、オキサロ酢酸（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、およびインスリン（１０μｇ／ｍＬ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
＜培地＞ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（カタログ番号３２０−１９９５ＡＪ）、ＮＣＴＣ−１０９（カタログ番号３２０−１３４０ＡＪ）、Ｌ−グルタミン、およびゲンタマイシンを、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから購入した。ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅウシ血清製品を、ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈから得た。オキサロ酢酸およびインスリンを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。Ｓ−ＤＭＥＭを、以下を含むように処方した：１０％  ＮＣＴＣ−１０９、１０％胎児クローンウシ血清製品、１ｍＭオキサロ酢酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、および１０μｇ／ｍＬインスリンを補充した８０％  ＤＭＥＭ（ここでパーセンテージは培地中の最終容量パーセンテージを示す）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
透析したＳＰＤＰ誘導体化アルカリホスファターゼ溶液を、各々２０倍モル過剰の合成ヘリコペプチド（１ａ）または（２ａ）を含む２個の反応容器に分けた。室温で４時間静置した後、反応を、最終濃度７５ｍＭ（メタノール中の１Ｍストック溶液）までのＮ−エチルマレイミドの添加により止め、そして１時間静置した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
代替アプローチにおいて、アルカリホスファターゼ結合体を以下の通りに調製し得る：１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７）に対して透析した１２．５ｍｇのアルカリホスファターゼを、１５０μＬの１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７〜７．５）中で３．２ｍｇのペプチド（１ａ）または（２ａ）と混合する。アルカリホスファターゼ濃度を、１００ｍＭ  ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに調整した後に、２．３ｍｇのビス（スクシンイミジル）スベレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を粉末として添加し、続いてボルテックスする。反応を、室温で１．５時間進行させる。反応を、１００ｍＭ  ＰＢＳ中の１Ｍグリシンでクエンチングし、そして２リットルの１０ｍＭ  ＰＢＳに対して透析した（３日間で５回交換した）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表１】
2001512143.tif 000001
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
【表２】
2001512143.tif 000002
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
（実施例５：ポリクローナル抗体）
ニュージーランド白ウサギを、アジュバントＲｉｂｉ（ＣＷＳ）と共に、実施例３からの２００μｇ／ウサギの免疫原（３）または（４）ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−ヘリコペプチド結合体を用いて３週間毎に免疫した。抗血清を、３回目の免疫後に、およびその後の各免疫の１０日後に収集した。以下の手順を用いて力価を分析した。マイクロタイタープレートの各ウェルに、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の３μｇ／ｍＬヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）１００μＬを添加し、続いて４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの正確に希釈されたウサギポリクローナル血清を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した後に、標準（５０μＬ／ウェル）および尿（アッセイ緩衝液で１：２希釈）を添加し、続いてアッセイ緩衝液中のアルカリホスファターゼ結合体（５）および（６）（実施例３Ｂ）（５０μＬ／ウェル）を添加した。混合物を室温で１時間インキュベートし、３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして２ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ基質溶液１５０μＬ／ウェルを添加した。室温で１時間のインキュベーション後に、Ａ405読み取りを行った。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
無水メタノール中２ｍｇ／ｍＬのスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；０．０８７ｍｇ、２．００×１０-4ｍｍｏｌｅ）１０モルを、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中６．０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ精製ペプチド特異的ＩｇＧ抗体（２．００×１０-5ｍｍｏｌｅ）に直ぐに滴下し、そしてアルゴンガスを用いて酸素除去し、そしてこれを室温で２．２５時間静置した。得られたＩｇＧ−マレイミドを、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に対する透析により精製し、そしてアルゴンガスを用いて酸素除去した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
精度。ＥＬＩＳＡは、４〜７％のアッセイ内変動係数（ＣＶ）および５〜７％のアッセイ間変動係数（ＣＶ）を有して良好な分析能力を示した。これらの結果を以下の表２に要約する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
【表３】
2001512143.tif 000003
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
表２における結果は、本発明のヘリコペプチドマーカーを検出するための抗ヘリコペプチドモノクローナル抗体を含む、代表的な逆ＥＬＩＳＡの良好な総合的分析能力を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
アッセイの結果に基づいて、正常集団（ｉ）および（ｉｉ）におけるペプチド／α１（Ｉ）620-633（Ｉ）の平均尿レベルは、３０．０±１７．９ｎｇ／ｎｍｏｌクレアチニンであった。パジェット病患者におけるマーカー（Ｉ）の平均レベルは２４１．７であり、３０のサンプルのうち２７は、＞６０．０ｎｇ／ｎｍｏｌクレアチニンを含んでいた（対正常Ｐ＜０．０００１）。骨粗鬆症女性（集団（ｉｖ））におけるマーカー（Ｉ）の平均レベルは、４０．４±３３．５ｎｇ／ｎｍｏｌクレアチニンであった。これらの結果を、図を用いて図５におよび以下の表３に示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
【表４】
2001512143.tif 000004
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
結果。結果を以下の表４〜６に要約する。パミドロネートで処置した２４人の骨粗鬆症患者において（表５）、尿ペプチド／α１（Ｉ）620-633の排出は平均６９％減少し、そして２４人の患者のうち２２人において４０％を超えて減少した。同様に、アレンドロネートで処置した１１人の骨粗鬆症患者において（表６）、尿ペプチド／α１（Ｉ）620-633の排出は平均８０％減少し、そして１１人の患者のうち９人において６０％を超えて減少した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
【表５】
2001512143.tif 000005
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
【表６】
2001512143.tif 000006
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
【表７】
2001512143.tif 000007
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
（実施例１３：甲状腺ガンに対するパミドロネート処置）
抑制用量のチロキシンを使用している４２人の甲状腺ガン患者に、３０ｍｇの注入によるパミドロネートまたはプラシーボを投与した。血清および尿サンプルを、ベースライン（薬物投与前）、ならびに薬物投与開始の１、２、３、および１２ヶ月後に収集し、そしてヘリコペプチドＩレベルを、実施例９および１２Ｂのアッセイプロトコルを用いて決定した。最小有意変化（ＭＳＣ）を、（プラシーボについてのベースライン、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月のレベルに基づく）長期個体内（ｉｎｔｒａｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）変化の２倍として定義した。結果を表７に示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２２】
【表８】
2001512143.tif 000008