【手続補正書】
【提出日】平成17年5月26日(2005.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的材料の標識及び寿命検出のための試薬の使用であって、上記色素が次式で表される色素である、使用。
【化１】
2005500406.tif 000001
［式中、Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は、独立して、単環系、２縮合環系又は３縮合環系芳香族又は複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子と適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２個以下の原子とから選択される５又は６個の原子を有しており、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1は、水素、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ1が−（ＣＨ2−）nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
【請求項２】
前記色素が蛍光色素であって、
Ｒ2及びＲ3がＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5がＺ2環構造に結合しており、Ｚ1及びＺ2が前記で定義した通りであり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1が、水素、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｅ、Ｆ、Ｙ及びｎが前記で定義した通りである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記蛍光色素が２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を有する、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記色素が非蛍光性又は実質的に非蛍光性色素であって、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｚ1及びＺ2基が前記で定義した通りであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、請求項１記載の使用。
【請求項５】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個が−Ｅ−Ｆ基であり、Ｅ及びＦが前記で定義した通りである、請求項１乃至請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記標的結合基Ｆが、標的材料の官能基と反応するための反応基、又は標的材料の反応基と反応するための官能基を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記反応基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、リン酸基及びチオリン酸基から選択される、請求項６記載の使用。
【請求項９】
スペーサー基Ｅが以下の基から選択される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の使用。
−（ＣＨＲ’）p−
−｛（ＣＨＲ’）q−Ｏ−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）ｑ−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
［式中、Ｒ’は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はアリールであって、適宜スルホネートで置換されていてもよく、Ａｒは、適宜スルホネートで置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、ｓは１〜５である。］
【請求項１０】
標的生物材料の標識法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、次式の色素を加え、
【化２】
2005500406.tif 000002
［式中、Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、Ｚ1及びＺ2は前記で定義した通りであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（Ｅ及びＦは前記で定義した通りである。）、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ1基は水素、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択されるが、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ1が−（ＣＨ2−）nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは前記で定義した通りである。）であることを条件とする。]
ii）標的を標識するのに適した条件下で色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法。
【請求項１１】
前記標的生物材料が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、リン酸及びチオリン酸基を含むか又は含むように誘導体化されているヌクレオチド、及び１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、リン酸及びチオリン酸基を含むか又は含むように誘導体化されているオキシ又はデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ）被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適した条件下で被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、被検体及び特異的結合パートナーのうちの一方を次式の蛍光色素で標識し、
【化３】
2005500406.tif 000003
［式中、Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、Ｚ1及びＺ2は前記で定義した通りであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ1基は水素、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択されるが、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ1が−（ＣＨ2−）nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。]
ii）標識複合体から放出された蛍光を測定し、及び
iii）放出された蛍光と試料中における被検体の存在又は量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法。
【請求項１３】
前記被検体−特異的結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質又は補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
２種以上の異なる蛍光色素セットであって、当該色素セットの各色素が次式を有し、当該セットの各色素が、当該セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有する、セット。
【化４】
2005500406.tif 000004
［式中、Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、Ｚ1及びＺ2は前記で定義した通りであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ1基は水素、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択されるが、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ1が−（ＣＨ2−）nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
【請求項１５】
４種の異なる色素を含み、セットの各色素が異なる蛍光寿命を有するものである、請求項１４記載のセット。
【請求項１６】
当該セットにおける蛍光色素の各々が、２〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を呈する、請求項１４又は請求項１５記載のセット。
【請求項１７】
上記２色素の蛍光放出寿命の差異が、寿命が短い方の色素の値の少なくとも１５％である、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項記載のセット。
【請求項１８】
次式で表される色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも１個のニトロ基を−ＮＨＯＨ又は−ＮＨ2に還元することを特徴とする方法。
【化５】
2005500406.tif 000005
［式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｚ1及びＺ2は、前記で定義した通りであるが、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む。］
【請求項１９】
組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって、
ｉ）ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を次式で表される色素と混合し、
【化６】
2005500406.tif 000006
［式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｚ1及びＺ2は、前記で定義した通りであり、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む。］
ii）ニトロレダクターゼ活性の量の尺度となる蛍光の増加を測定する
ことを含む方法。
【請求項２０】
ｉ）特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii）成分間の結合を促す条件下で、特異的結合対の第２成分であってニトロレダクターゼ酵素で標識された第２成分を加え、
iii）次式で表される色素を加え、
【化７】
2005500406.tif 000007
［式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｚ1及びＺ2は、前記で定義した通りであり、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
iv）結合したニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法。
【請求項２１】
前記特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ｉ）ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクションした宿主細胞を、次式で表される色素と接触させ、
【化８】
2005500406.tif 000008
［式中、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｚ1及びＺ2は、前記で定義した通りであり、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
ii）ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法。
【請求項２３】
遺伝子発現に対する効果を測定すべき試験剤の存在下で検定を実施する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
次式で表される色素。
【化９】
2005500406.tif 000009
［式中、Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合し、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は、独立して、単環系、２縮合環系又は３縮合環系芳香族又は複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子と適宜酸素、窒素及び硫黄から選択される２個以下の原子とから選択される５又は６個の原子を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個は−Ｅ−Ｆ基であり（ただし、Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうちのいずれかが−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4アルキル−置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｒ1基が−Ｅ−Ｆ基でないときは、そのＲ1基は水素、モノ−もしくはジ−ニトロ−置換ベンジル、Ｃ1−Ｃ20アルキル、アラルキル及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択され、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5基のうち少なくとも１個がスルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム及び−（ＣＨ2−）nＹ基から選択される水溶性基であるか、及び／又はＲ1が−（ＣＨ2−）nＹ基（ただし、Ｙ及びｎは上記で定義した通りである。）であることを条件とする。］
【請求項２５】
前記標的結合基Ｆが、
ｉ）カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択される反応基、又は
ii）ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、リン酸及びチオリン酸基から選択される官能基
を含む、請求項２４記載の色素。
【請求項２６】
前記スペーサー基Ｅが以下の基から選択される、請求項２４又は請求項２５記載の色素。
−（ＣＨＲ’）p−
−｛（ＣＨＲ’）q−Ｏ−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−（ＣＨ＝ＣＨ）−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−Ａｒ−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）q−ＣＯ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
−｛（ＣＨＲ’）ｑ−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ’−（ＣＨＲ’）r｝s−
［式中、Ｒ’は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はアリールであって、適宜スルホネートで置換されていてもよく、Ａｒは、適宜スルホネートで置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、ｓは１〜５である。］