【手続補正書】
【提出日】平成18年1月6日(2006.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中での発現のための融合ポリペプチドであって、TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体及び非TolAポリペプチドを含み、ここで、上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体が上記融合ポリペプチドのN末端側に配置され、且つ上記非TolAポリペプチドが上記融合ポリペプチドのC末端側に配置される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
さらにシグナルペプチドをふくむ、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
上記シグナルペプチドが上記融合ポリペプチドのN末端に又はその近くに配置される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体が、上記宿主細胞中での発現のためにコドン最適化された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体と上記非TolAポリペプチドとの間のリンカーをさらに含む、請求項１〜４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
上記リンカーがエンドペプチダーゼのための切断部位を少なくとも１含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
上記切断部位がアミノ酸配列DDDDK（配列番号：３）及び／又はLVPR（配列番号：４）及び／又はIEGR（配列番号：５）を含む、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
さらにアフィニティー精製タグを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
上記アフィニティー精製タグが上記融合ポリペプチドのN末端又はその近くに配置される、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
上記アフィニティー精製タグが、ｎが４，５，６，７，８，９又は１０であり（それぞれ、配列番号：６〜１２；好ましくはｎが６（配列番号：８）である）、場合により上記融合ポリペプチドに１以上（好ましくは２）のセリン残基で結合される、N末端Hisnタグである、請求項９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
上記TolAIIIドメインが大腸菌TolA配列（SwissProt 引き受け番号P19934）のアミノ酸残基329〜421（配列番号：１３）から成る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
上記宿主細胞が細菌細胞（例えば、大腸菌）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
上記非TolAポリペプチドがBCL-XLである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードしている、DNA分子。
【請求項１５】
転写された場合に、上記DNA分子のｍRNA特性が宿主細胞中における発現のために最適化される、請求項１４に記載のDNA分子。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの発現のための、請求項１４又は１５に記載のDNA分子を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
上記融合ポリペプチドの発現を推進する、誘導プロモーター（例えば、IPTG誘導T7プロモーター）を有する、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
抗生物質耐性マーカー（例えば、アンピシリン及びクロラムフェニコールに対する耐性を与えるbla遺伝子）を有する、請求項１６又は１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体をコードしているDNAを、上記非TolAポリペプチドをコードしているDNAのフレーム内挿入を可能とするクローニング部位の上流又は下流に含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の発現ベクターを産生するためのクローニングベクター。
【請求項２０】
エンドペプチダーゼのための少なくとも１の切断部位（例えば、アミノ酸配列DDDDK（配列番号：３）及び／又はLVPR(配列番号：４)及び／又はIEGR（配列番号：５））をコードしているDNAをさらに含む、請求項１９に記載のクローニングベクターであって、上記切断部位が上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体をコードしているDNA及び上記クローニング部位の間に配置される、前記クローニングベクター。
【請求項２１】
上記クローニング部位が少なくとも１の制限エンドヌクレアーゼ（例えば、BamHI及び／又はKpnI）標的配列を含む、請求項１９又は２０に記載のクローニングベクター。
【請求項２２】
請求項８または９に記載されたアフィニティー精製タグをコードしているDNAをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
【請求項２３】
誘導プロモーター（例えば、IPTG誘導T7プロモーター）をさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
【請求項２４】
抗生物質耐性マーカー（例えば、アンピシリン及びクロラムフェニコール耐性を与える、bla遺伝子）をコードしているDNAをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
【請求項２５】
（説明に関して図２に示した）pTolE、pTolT又はpTolXの構造を有する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの産生のための、上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体の使用。
【請求項２７】
請求項１４又は１５に記載のDNA分子の産生のための、上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体の使用。
【請求項２８】
請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の発現ベクターの産生のための、上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体の使用。
【請求項２９】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のクローニングベクターの産生のための、上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体の使用。
【請求項３０】
請求項１３に記載のDNA及び／又は請求項１６〜１8のいずれか１項に記載の発現ベクター及び／又は請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のクローニングベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
上記非TolAポリペプチドを固定化するための、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ：
上記融合ポリペプチドをTolA結合ポリペプチド（例えば、コリシンN又は他のコリシンのTolA認識部位、バクテリオファージg3p-D1タンパク質のTolA結合領域、或いはTolB又は他のTolタンパク質のTolA結合領域）に結合させるステップ；
を含む、前記使用。
【請求項３２】
上記非TolAポリペプチドの固定化のための、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ：
上記融合ポリペプチドの上記アフィニティータグを結合部分に結合するステップ；
を含む、前記使用。
【請求項３３】
上記非TolAポリペプチドの精製及び単離のための、請求項５〜１３のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ：
（ｉ）上記融合ポリペプチドをTolA結合ポリペプチド（例えば、コリシンN又は他のコリシンのTolA認識部位、バクテリオファージg3p-D1タンパク質のTolA結合領域、或いはTolB又は他のTolタンパク質のTolA結合領域）に結合させるステップ；
（ｉｉ）上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から上記非TolAポリペプチドをエンドペプチダーゼを使用して切断するステップ；及び
（ｉｉｉ）上記切断された非TolAポリペプチドを上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から分離するステップ；を含む、前記使用。
【請求項３４】
上記非TolAポリペプチドの精製及び単離のための、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ：
（ｉ）上記融合ポリペプチドの上記アフィニティータグを結合部分に結合させるステップ；
（ｉｉ）上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から、上記非TolAポリペプチドをエンドペプチダーゼを用いて切断するステップ；及び
（ｉｉｉ）上記切断された非TolAポリペプチドを上記TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から分離するステップ；
を含む、前記使用。
【請求項３５】
上記非TolAポリペプチド又は上記融合ポリペプチドの相互作用の特性、例えば、分子内相互作用、他の分子との相互作用又は物理的刺激との相互作用、を研究するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用。
【請求項３６】
宿主細胞中における融合ポリペプチドとしてのポリペプチドの高い発現のための方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドとして上記ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるステップを含む、前記方法。