【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年6月26日(2006.6.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成輸送実体を用いることで、細胞内または該細胞上の特定の位置に、目的の核酸を生体膜を越えて輸送、および／または該目的の核酸を誘導する方法であって、
（ａ）目的の核酸と結合因子（ＢＥ）標的配列とを含み、該結合因子（ＢＥ）標的配列がペプチド核酸（ＰＮＡ）標的である担体分子を提供するステップと、
（ｂ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその誘導体もしくは類似体である結合因子（ＢＥ）に対して、少なくとも１つの機能因子（ＦＥ）を結合することによって、複合体を提供するステップと、
（ｃ）前記複合体の前記ＢＥを前記担体の前記ＢＥ標的にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記輸送実体を前記生体膜に接触させて、前記膜を越える前記目的の核酸の輸送に提供するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）で、前記ＢＥおよび前記ＦＥがリンカー因子によって分離される複合体が提供される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）で、提供された前記担体が、前記目的の核酸と少なくとも１つのＢＥ標的配列とを含むプラスミドまたはオリゴヌクレオチドである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ａ）で、検出可能なマーカー因子もまた前記担体に挿入される請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記目的の核酸が、ペプチド、タンパク質、またはＲＮＡをコードする遺伝子である請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記生体膜が細胞壁である請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）で、アンテナペディア・ペプチドを含むＦＥが前記複合体に与えられ、前記細胞壁を越える前記目的の核酸の前記輸送を可能にする請求項６記載の方法。
【請求項８】
生体膜が核膜である請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）で、核局在化シグナルを含むＦＥが前記複合体に与えられ、前記目的の核酸の前記輸送が核膜を越えることを可能にする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）で、ＨＩＶタンパク質（例えば、ＴＡＴ）等のタンパク質を含むＦＥが前記複合体に与えられ、前記目的の核酸の膜輸送および核輸送を可能にする、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
細胞内または該細胞上の特定の位置に、目的の核酸を生体膜を越えて輸送、および／または該目的の核酸を誘導することが可能な輸送実体を作るための成分を含むキットであって、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその誘導体もしくは類似体の形状にある結合因子（ＢＥ）と、機能因子（ＦＥ）と、前記目的の核酸を含む所望のプラスミドへのクローニングに適当な前記ＦＥに対する標的を含むオリゴヌクレオチドと、そのような輸送および／または誘導に適した任意の試薬とを含むキット。
【請求項１２】
前記機能因子（ＦＥ）がアンテナペディア・ペプチドである請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記機能因子（ＦＥ）がＳＶ４０ラージＴ抗原タンパク質等の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または核局在化シグナル特性を示すそのフラグメントである請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
前記機能因子（ＦＥ）が膜輸送および核輸送を可能にするタンパク質である請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法での使用に適した合成輸送実体であって、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその誘導体もしくは類似体の形状にある結合因子（ＢＥ）と複合体を形成する少なくとも１つの機能因子（ＦＥ）と、ベクター内に少なくとも１つのＢＥ標的配列および目的の核酸を含む核酸担体とから構成され、前記複合体がＢＥ−ＢＥ標的相互作用を用いて前記担体にハイブリダイズする合成輸送担体。
【請求項１６】
前記ベクターがプラスミドまたはオリゴヌクレオチドである請求項１５記載の輸送実体。
【請求項１７】
前記担体が検出可能なマーカー因子を含む請求項１５または１６記載の輸送実体。
【請求項１８】
前記目的の核酸がペプチド、タンパク質、またはＲＮＡをコードする遺伝子である請求項１５から１７のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項１９】
前記ＢＥおよびＦＥがリンカー因子によって分離される請求項１５から１８のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項２０】
２つ以上のＦＥ−ＢＥ複合体を含み、該ＦＥ−ＢＥ複合体の各々が、同一の担体上にある別のＢＥ標的に結合する請求項１５から１９のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項２１】
各々のＦＥ−ＢＥ複合体が２つ以上のＦＥを含み、該２つ以上のＦＥが好ましくはリンカーによって離間している請求項２０記載の輸送実体。
【請求項２２】
前記ＦＥがアンテナペディア・ペプチドである請求項１５から２１のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項２３】
前記ＦＥが、ＳＶ４０ラージＴ抗原タンパク質等の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または核局在化シグナル特性を表すそのフラグメントである請求項１５から２１のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項２４】
前記ＦＥが、膜輸送および核輸送を可能にする特性を表すＨＩＶタンパク質（例えば、ＴＡＴ）等のタンパク質である請求項１５から２１のいずれか一項記載の輸送実体。
【請求項２５】
請求項１から１０のいずれか一項に定義される方法または請求項１５から２４のいずれか一項に定義される輸送実体の使用によって提供される１つ以上の遺伝的修飾を含む組換え細胞。
【請求項２６】
遺伝子治療での請求項１５から２４のいずれか一項記載の輸送実体または請求項２５にもとづく細胞の使用。
【請求項２７】
ＤＮＡワクチン接種での請求項１５から２４のいずれか一項記載の輸送実体または請求項２５にもとづく細胞の使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】核酸の細胞特異的局在化のための輸送方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の合成輸送実体を用いて、細胞内または細胞上の特定の位置へ、核酸、その誘導体または類似体を、生体膜を介した輸送、および／あるいはその誘導をおこなう方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外来遺伝物質を宿主細胞に輸送してその機能を与える遺伝学的修飾の方法は、一般に細胞に輸送された遺伝物質の取り込み率によって限定される。真核細胞では、核取り込みがしばしば制限されている。しかし、この場合、直接注射法が使用されるにもかかわらず、該方法は遅くて、労働集約的である。したがって、より大規模に使用するためには、核酸を細胞内に輸送するための標準的な方法はむしろ、核酸の異なる化学成分間で形成された複合体の取り込みに、基づいている。次に、遺伝物質は、受動的に細胞の核に入るまで放置される。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）がこのような状況下で提案されている。一例として、セベスチエン（Sebestyen）他（ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）第１６巻（１）８０〜８５頁（１９９８年））は、ジギトニン透過性細胞を用いてＮＬＳペプチドをプラスミドに対して化学的に結合させた後に、核転移が可能になることを示唆した。
さらに、非特許文献２は、９７０ｋＤａを上回る大きさのタンパク質を核に転移させることを報告した。より具体的には、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質を細胞の核に輸送する。
ニールセン（Nielsen）他を名義とする特許文献１は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られる一類の化合物を開示している。ここに記載されたＰＮＡは、適当なリンカーを介してペプチド骨格に結合したＤＮＡ塩基等のリガンドを含むものと考えられる。特許文献１にもとづくＰＮＡを利用して、例えば細胞内の特定の遺伝子およびウイルスを標的にすることが可能であり、一方でＰＮＡの性質は電荷の欠如および水溶性によって特徴づけられる。
さらに、同じくニールセン（Nielsen）他を名義とする特許文献２は、コンジュゲート、例えば多数ある核（それらのすべてがＰＮＡに対して所望の特性を与えることを目的としている）のうちのいずれか一つに化学的に結合したＰＮＡから構成されるＰＮＡコンジュゲートを提案している。したがって、ＰＮＡは、例えば診断薬または治療薬として有用である。上記ＰＮＡは、上記した特許文献１と同様に、細胞内でそれの有利な機能を発揮することことを意図している。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，５３９，０８２号公報
【特許文献２】ＷＯ９６／１１２０５公報
【非特許文献１】セベスチエン（Sebestyen）他（ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）第１６巻（１）８０〜８５頁（１９９８年））
【非特許文献２】ヨネダ（Yoneda）他（エクスピリメンタル・セル・リサーチ（Exp. Cell. Res.）第２０１巻２１３頁（１９９２年）
【発明の開示】
【０００４】
本発明の目的は、遺伝学的修飾に関する一般的かつ効率的方法を提供することであり、新規の合成輸送実体（synthetic transport entity）によって、目的の核酸、またはその誘導体もしくは類似体を、生体膜を介して輸送すること、および／またはそれを細胞内もしくは細胞上に導くことである。本輸送実体は、本発明によれば、なんらかの種類の生物学的特性を示すと思われる機能的実体（ＦＥ）と、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の結合要素（ＢＥ）とを、必要に応じて上記ＦＥおよび上記ＢＥを分離させておくためのリンカー分子とともに、結合させること、ならびにそれを目的の核酸の担体上に存在するＢＥ標的にそれをハイブリダイズさせることによって、提供される。本発明はまた、新規の輸送実体に関するものであることから、それに加えて該輸送エンティティの種々の有利な用途にも関する。
（図面の簡単な説明）
【０００５】
図１は、本発明にもとづくセンスＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドに対するアンチセンスＣｙ−５オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションでの標的部位を示す模式図である。  
図２は、蛍光標識オリゴヌクレオチドの核転移を説明する図である。
図３は、核、細胞質、およびゴルジ様のＣｙ−５／Ｃｙ−３蛍光比である。
図４は、本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドによるアンチセンスおよびセンス・オリゴヌクレオチドのシフト・アッセイを示す図である。
図５は、本発明にもとづく輸送実体の効果を説明する図である。すなわち、ＥＧＦＰプラスミドを含むＰＮＡ標的にハイブリダイズした場合のＰＮＡ−ＮＬＳの効果と、トランスフェクション混合物から過剰なＰＮＡ−ＮＬＳ分子を除去する効果とを示す。
図６は、過剰なＰＮＡ−ＮＬＳの精製後、ＰＮＡ−ＮＬＳの添加または無添加でのｌａｃＺおよびＥＧＦＰトランスフェクションを示す。
（定義）
【０００６】
本明細書では、以下の用語および略語を以下の通りに使用する。
本明細書で用いられるように、用語「目的の核酸（nucleic acid of interest）」は、細胞の遺伝学的修飾を実施する上で有用な、任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のヌクレオチド、ならびにその任意の類似体または誘導体に関する。すなわち、そのような「目的の核酸」を生体膜を介して細胞内または細胞核内に輸送すること、および／または上記「目的の核酸」をそのような新たな環境内の特定の位置に誘導することが、求められる場合がある。例えば、「目的の核酸」は、結合部位等の調節機能を付与する酵素等のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【０００７】
「機能因子（functional
element）」（ＦＥ）は、任意の部分であって、この部分に結合した分子に対して一種類以上の特異的な生物学的機能または特性を与えることができる部分である。例えば、輸送能を与えることが可能である。本機能因子については、以下の本発明の詳細な説明でさらに例示する。
「結合因子（binding
element）」（ＢＥ）は、特異的標的に対して、好ましくはハイブリダイゼーションによって、特異的に、強く、しかも耐久性を持って結合することができる任意の天然または合成核酸、核酸誘導体、または核酸類似体である。そのようなＢＥの一例は、以下に説明するＰＮＡである。
したがって、「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid）のことをいい、より詳しくは、アミノエチル・グリシン単位からなる疑似ペプチド骨格を持つＤＮＡ模倣体のことをいい、これに対して核酸塩基がメチレンカルボニルリンカーを介して結合する（例えば、ニールセン（Nielsen）、Ｐ．Ｅ．：  ペプチド核酸（ＰＮＡ）：「遺伝子治療薬の先例（A lead for gene
therapeutic drugs）」、薬物発見および設計の展望（Perspectives in
Drug Discovery and Design）、第４巻７６〜８４頁、およびデューホルム（Dueholm）他、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー（New J. Chem.）、第２１巻１９〜３１頁（１９９７年）：「ＰＮＡの化学、特性、および適用（Chemistry, Properties and applications of ＰＮＡ）」を参照せよ）。ＰＮＡ分子は、相補的ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ標的に対してハイブリダイズする能力を持つ。本特許出願では、用語「ＰＮＡ」とは上記の骨格および核酸塩基から構成される任意のＤＮＡ類似体のことをいい、したがってこの用語は本明細書に示した参照文献に開示された特定の構造に限定されるものではない。
【０００８】
「ＮＬＳ」とは、ある種の輸送タンパク質上にある残基を認識して特異的に結合する任意のタンパク質／ペプチドであると考えられる核局在化シグナルのことをいう。より具体的には、ＮＬＳドメインはポリペプチドによって包含されたアミノ酸配列であり、細胞質から核へのポリペプチドの移動が促進される。ＮＬＳドメインを含む特異的核ポリペプチドは、核へのポリペプチドＲＮＡ複合体の輸送を可能にすることが示された（マッタージ（Mattaj）およびデロベルチス（DeRobertis）、１９８５年）。
用語「ベクター（vector）」は、本明細書では、遺伝学的修飾過程での核酸の保持および／または移動が可能であるプラスミド、オリゴヌクレオチド、または任意の他の分子もしくはコンストラクトを示すために用いられる。したがって、用語「ベクター」は、上に例示したものの任意の類似体または誘導体にも関わる。
用語「細胞壁（cell
wall）」は、本明細書では生物を囲む働きをする任意の膜、例えば真核細胞膜、植物細胞もしくは細菌等を囲む膜に関する。
「トランスフェクション（transfection）」は、細胞が培地から遺伝物質を何らかのかたちで取り込むことについての一般的用語として用いられる。
本文脈中で、「形質転換配列（transforming sequence）」は、宿主細胞内での遺伝学的修飾現象に関与する任意の配列に関し、例えばタンパク質コード配列、調節因子、全遺伝子等であってもよい。
【０００９】
細胞について言及する場合、用語「組換え体（recombinant）」とは、本明細書中では細胞内で生じた遺伝学的修飾を単に示すにすぎない。より具体的には、その改変が外来核酸の導入によって、または天然の核酸による変化によって得られること、あるいはその細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す際に用いられる。
「細胞（cell）」または「宿主細胞（host cell）」は、異種または外来の任意の遺伝物質が導入された任意の細胞を示すために、本明細書中で用いられる。最も広義の意味では、遺伝子操作された細胞を示すために「宿主細胞」が用いられる。
用語「ポリマー（polymer）」、例えば「タンパク質（protein）」、「ポリペプチド（polypeptide）」、および「ペプチド（peptide）は、本明細書中では同義的に用いられ、アミノ酸残基からなる任意の短い、または長いポリマーに関する。天然のアミノ酸ポリマーに加えて、この用語は一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。さらに、本文脈中で、用語「ポリマー（polymer）」は、任意の糖タンパク質、脂質、リポタンパク質等を包含するとも理解される。
「標識（label）」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。
用語「ハイブリダイズ（hybridise）」とは、本明細書中では、核酸またはペプチド核酸あるいはその任意の誘導体または類似体の相補的塩基の塩基対合による任意の結合、二本鎖化、またはハイブリダイゼーションのことをいう。
用語「特異的ハイブリダイゼーション（specific hybridisation）」とは、特定のヌクレオチド配列が細胞環境等の中にある複合混合物、またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡに存在する場合に、その特定のヌクレオチド配列に対してのみに行われる分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダイゼーションのことをいう。
本明細書で用いられるように、「相同（homologous）」配列は、標的化配列と細胞ＤＮＡとが特異的な塩基対合を行い得るように細胞ＤＮＡと同一または十分に類似している配列である。
本明細書で用いられるように、「標的化配列（targeting sequence）」は、標的細胞に含まれるゲノムまたは染色体外ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列にある所望の部位に、目的の核酸を誘導する配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、合成輸送実体（synthetic transport entity）を使用することで、細胞内もしくは細胞上の特定の位置に、生体膜を介して目的の核酸を輸送し、および／またはそのような核酸を誘導する方法に関し、該方法は、
（ａ）目的の核酸と結合因子（ＢＥ）標識配列とを含む担体分子を、必要に応じて一つの分子として、提供するステップと、
（ｂ）少なくとも一つの機能因子（ＦＥ）をＢＥに結合することで、複合体を提供するステップと、
（ｃ）上記複合体のＢＥを上記担体のＢＥ標的にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）上記膜を介して目的の核酸を輸送するために、上記輸送実体を上記生体膜に接触させるステップとを、含む。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、結合因子（ＦＥ）はＰＮＡ標的配列に対する特異的かつ持続性のあるハイブリダイゼーションをおこなうことができる、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその誘導体もしくは類似体である。生体膜は、例えば、細胞壁または核膜であってもよい。ステップ（ｂ）で生成された複合体もまた、スペーサー因子（例えば、リンカー（Ｌ）分子）を含むものであってもよく、該スペーサー因子はＢＦとＦＥとを分ける。以下により詳しく論じられる特定の実施形態では、複合体は複数のＦＥから構成され、この場合、分離のために複数のリンカーを用いることが可能である。ステップ（ａ）は、検出可能なマーカーまたは標識を担体内に挿入することも含むものであってもよく、この担体によって、この方法によって実行される遺伝学的修飾の効率についてのその後の分析が容易になる。
したがって、本方法では、結合因子（ＢＥ）、好ましくはＰＮＡまたはＰＮＡ様分子の有利な特性は、目的の核酸の効果が求められる細胞または核へ、その目的の核酸を実際に移すのに先立って、遺伝子輸送の最初のステップで主として用いられる。したがって、本明細書のはじめに述べられた先行技術特許とは逆に、本発明にもとづく方法の利点は、細胞または核に入るＰＮＡもしくは結合因子の能力にもとづくものではなく、また依存したりするものではない。むしろ、ＰＮＡまたは任意の等価な結合因子を本発明にもとづいて使用することで、目的の核酸の担体に対して、ＰＮＡ／ＰＮＡ標的相互作用を介して、機能因子（ＦＥ）を強力かつ満足のいくかたちで結合させる。したがって、ＦＥは、生体膜を介した輸送実体全体を実際に輸送するために、本発明にもとづいて使用される。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態で使用されるＰＮＡは、合成ＤＮＡ類似体であり、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＲＮＡ結合よりも高い親和性で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して強く結合する。その特異的配列は、ハイブリダイゼーションによって結合することが意図される核酸に対して特異的であるように、設計される。ＰＮＡは、非常にゆっくりと代謝され、また非毒性を示すもので、このことは医薬分野で使用した場合に明らかに大きな利点である。また、ＰＮＡは、相補的である核酸の配列に対して高特異的結合をおこなうことができ、そのことによって、ＰＮＡが遺伝的形質転換のために本方法でＢＥとして使用される場合、正しく形質転換された細胞を高頻度で提供する。したがって、本方法でのＢＥとしてのＰＮＡの使用によって、形成された複合体に対して優れたＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイゼーション特性と生物学的安定性とが得られる。ＰＮＡは、固相ペプチド合成によって当業者により容易に作られる（例えば、国際特許出願公報ＷＯ９５／０１３７０およびＷＯ９２／２０７２ならびにニールセン（Nielsen）、Ｐ．Ｅ．：ペプチド核酸（ＰＮＡ）：「遺伝子治療薬の先例（A lead for gene
therapeutic drugs）」、薬物発見および設計の展望（Perspectives in Drug
Discovery and Design）、第４巻７６〜８４頁を参照せよ）。
【００１３】
好ましい実施形態では、上記リンカー配列は、実施的または完全には帯電していない。この場合、「非反応性（non-reactive）」という用語を用いて、リンカーが用いられる環境下で該リンカーがいっさいの不要または有害な化学反応を引き起こさないこと、例えばトランスフェクション過程でそれが接触する細胞および／または核の他のいずれの成分とも反応しないことが説明される。それはまた、本発明で使用されるあらゆる試薬に関して、同様にＰＮＡ等のＢＥならびに機能因子（ＦＥ）、担体等を鑑みて、本質的に非反応性でなければならない。本リンカーは、所望の結果を妨げることなくスペーサー因子として機能する任意の他の分子が使用される場合もあることが理解されるにもかかわらず、例えば適当な数のアミノ酸残基からなるポリマーから構成されるものであってもよい。リンカー配列の大きさおよび性質は、周囲の因子に依存するもので、なぜならその主な機能がそれらの因子間に十分な空間を設けることで所望の機能の効果を可能にするからである。さらに、それは、膜を介しての輸送後、目的の核酸の所望の効果または発現を妨げるものであってはならない。
【００１４】
特定の実施形態では、本リンカーを細胞性プロテアーゼまたはヌクレアーゼ等の酵素によって開裂可能であることから、生体膜を介した輸送および／または細胞表面受容体に対する粘着が可能となり、それに続いて標的内、例えば細胞質または核内で不要である部分または複数の部分を捨てることが可能となる。一つの具体的実施形態では、挿入された目的の核酸がより有効な効果を生ずるようにＢＥを切断する。本方法の別の典型的な実施形態では、リンカーは、例えば不要の生物学的分解（例えば、プロテアーゼによる）から、本輸送実体を実質的に隠蔽またはマスキングすることができる。さらに、あるいはその代わりとして、リンカーは、さらに別の有利な特性（例えば、それ自体の中に別の生物学的機能を与える特性）を持つものであってもよい。
【００１５】
本機能因子（ＦＥ）は、任意の数の機能（例えば、細胞膜標的分子への結合等の構造的機能またはインテグラーゼ活性等の酵素的機能）を提供することで、転移されたＤＮＡの部位特異的挿入を向上させる。本発明にもとづく使用に適した有利なＦＥの具体例として、細胞付着の機能（例えば、トランスフェリン受容体を介したもの）、細胞膜貫通（例えば、アンテナペディア・ペプチドを介したもの）、核輸送（以下により詳しく説明）、核酸濃縮ペプチド（好ましくは、強い正荷電）、エンドゾーム／リボゾーム（例えば、アデノウイルス・カプシド・タンパク質、およびＤＮＡ組み込み（例えば、インテグラーゼを介したもの）が挙げられる。一つの具体的実施形態では、本発明にもとづくＦＥは、ＴＡＴと示されたＨＩＶウイルスのタンパク質である。本発明の別の具体例では、ＦＥはエンドゾーム妨害成分であり、転移された生物学的因子がリソソーム分解の細胞過程によって分解されるのを防ぐ。
【００１６】
本発明の一実施形態では、貫通すべき生体膜は、真核細胞または原核細胞を囲む膜または壁である。追加または別の実施形態では、本方法は目的の核酸を真核細胞の核に挿入するために用いられる。最後に指摘した実施形態では、効率的な輸送を、ＢＥ（例えば、ＰＮＡ）とＦＥまたはＦＥの一部としての適当な核局在化シグナル（ＮＬＳ）との複合体を生成することによって、おこなうことが可能である。
本方法では、目的とする用途および所望の結果に応じて、適当な順番で、ＢＥと複数の上記ＦＥおよびリンカーとから構成される輸送実体を用いてもよい。したがって、一例として、ＢＥ−リンカー−ＦＥ−リンカー−ＦＥ等の順序で用いることも可能である。さらに、特定の実施形態で、担体は複数のＢＥ標的配列を含むことから、該配列上に複数ある種々のＢＥ−リンカー−ＦＥ複合体のハイブリダイゼーションが可能となる。この特定の実施形態では、ＢＥおよび／またはＦＥが同一である必要はない。これに反して、異なるものを含むことが有利である場合もある。したがって、特定の実施形態では、複合体はＰＮＡ−リンカー−ＦＥ−リンカー−ＦＥ配列を含むものであってもよい。リンカーは、例えば因子の大きさおよび他の特性に応じて、適当な空間が生ずるように作られる。さらに、本担体は、ＢＥ、例えばＰＮＡに対する複数の標的を含むものであってもよい。したがって、そのような担体は、本明細書に例示される複数の複合体に対してハイブリダイゼーションすることが可能である。
さらに、本発明は診断目的で使用される上記の方法に関する。したがって、目的の核酸が診断用マーカーまたは標識をコードするものであってもよく、またこの方法を生体内（in vivo）でおこなうことも可能であり、その場合、後で診断を必要としている患者に対して該診断がおこなえるようにする。
また、本発明は本明細書に開示された方法のいずれか一つを実行するのに適したキットに関する。そのようなキットは、結合因子（ＢＥ）、例えばＰＮＡまたはその機能的フラグメントと、機能因子（ＦＥ）、例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）またはアンテナペディア・ペプチドと、上記ＢＥに対する標的部位を有する二重鎖オリゴヌクレオチド、例えばＰＮＡ標的配列とを、含むものであってもよい。別の実施形態では、本発明にもとづくキットは、輸送（transfer）および／または誘導（direction）のための適当な試薬も含む。本発明にもとづくキットは、適当な容器に入れられており、必要に応じて、適切な方法で該キットの使用を容易にする指示書を具備する。
【００１７】
第２の態様では、本発明は新規の輸送実体に関することから、該輸送実体は上記方法のいずれか一つで有用である。本ＢＥ−ＦＥ複合体を、一般式Ｉによって表すことが可能である。
... ＢＥ−Ｌ−ＦＥ...   （Ｉ）
この式中、ＢＥは結合因子、Ｌはリンカー（しかし、任意の因子である）、およびＦＥは機能因子を示す。
次に、上記複合体は、担体上に存在するＢＥ標的に対して配列特異的にハイブリダイゼーションすることが可能であり、それに加えて、あるいは本ＢＥの一部として、複数の目的の核酸を含む。担体は、例えば、プラスミドまたはその機能的部分（例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド、もしくはキメラプラスト）を含むものであってもよい（例えば、コール・ストラウス（Cole Strauss）、Ａ．他、サイエンス（Science）第２７３巻、１９９６年９月：「ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドによる鎌状赤血球貧血に関与する突然変異の修復（Correction of the Mutation Responsible for Sickle Cell Anemia by an
RNA-DNA Oligonucleotide）」を参照せよ）。上記したようにＢＥは、好ましくはＰＮＡであってもよい。本発明にもとづくリンカーの使用は、任意ではあるが、好ましいものであり、また本発明の第一の態様に関連しては詳しく上記されている。
したがって、この第２の態様の一実施形態は、目的の核酸を、膜（例えば、細胞壁）を介して輸送すること、および／または上記核酸を細胞内もしくは細胞上の特定の位置に誘導することに適した合成輸送実体である。
さらに、本発明のこの第２の態様では、輸送実体が、意図した用途および所望の結果に応じて適当な順番で、上記した複数のＦＥおよびリンカーを含むことができると考えられる。したがって、特定の実施形態では、複合体はＢＥ−リンカー−ＦＥ−リンカー−ＦＥ配列を含むものであってもよい。使用した担体は、好ましくは、目的とする複数の核酸と同様に複数のＢＥ標的を含むプラスミドまたはオリゴヌクレオチドである。したがって、配列特異性が高いＢＥ／ＢＥ標的ハイブリダイゼーションによって複合体が担体に結合し、ＦＥは問題となっている膜を介した輸送を好ましくは提供する。必要に応じて、リンカー分子を含む。
さらに、この第２の態様の別の実施形態では、本発明は、目的とする複数の核酸を真核細胞の核膜を介して輸送することに特に適している輸送実体に関し、該輸送実体は、ＢＥ、好ましくはペプチド核酸（ＰＮＡ）から構成され、ＦＥ（この場合、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む）と複合体を形成している。したがって、本輸送実体は、真核細胞を形質転換すること、目的の核酸を細胞の核に誘導することを目的とした任意の方法での使用に、特に適している。しかし、いずれの場合も、特定のＢＥ、ＦＥ、および核酸に応じて、本輸送実体を、任意の遺伝子または遺伝要素による任意の核の効果的かつ特異的形質転換を可能にするように、設計することができる。
【００１８】
したがって、より具体的には、第２の態様の有利な実施形態は、本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳ複合体であり、該複合体は一般式によって記載される。
．．．ＢＥ−Ｌ−ＦＥ．．．          （ＩＩ）
この式中、ＢＥは複数のＰＮＡ塩基からなる一つの配列、Ｌはリンカー配列、およびＦＥはＮＬＳ配列である。
次に、上記ＰＮＡ−ＮＬＳ複合体は、ＰＮＡ標的および目的の核酸、例えばペプチド、タンパク質、もしくはＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドとハイブリダイズする。上記ＲＮＡは、例えばリボザイム、すなわち酵素機能を持つＲＮＡであってもよい。特定の実施形態では、ＮＬＳ配列はＳＶ４０大型Ｔ抗原タンパク質またはそのフラグメントであり、それは所望の核局在化シグナル特性を示す。しかし、当業者が明確に理解するように、適当なＮＬＳの選択は、将来の意図された用途に応じておこなわれる。したがって、宿主細胞の膜を介して、またその核の中に、本発明にもとづいて輸送実体を輸送する所望の機能を満たす限り、本ＮＬＳは、任意の他の起源または組成物のものであると考えられる。
【００１９】
一つの具体的かつ例証となる実施形態では、本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳ複合体は、式ＩＩＩによって記載される。
ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  Ｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ          （ＩＩＩ）
この式中、Ｌは式ＩＶによって表される。
ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ      （ＩＶ）
しかし、当業者が明確に理解することが容易であるように、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に有利な合成輸送実体をなおも得られるかたちで、これらの配列に変更を加えることが可能である。本発明を用いることで、核酸または細胞に輸送される任意の他の生体分子および／もしくは複合体に対して、機能を直接付加させることで、ウイルスおよび微生物の異なる機能を模倣することが可能である。同時に、本輸送実体の使用によって、天然のウイルス・ベクターの有害な特性が回避される。
したがって、本発明の例示として使用される複合体を含むＰＮＡによって、優れたＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイゼーション特性および生物学的安定性が得られ、また該ＰＮＡは固相ペプチド合成によって容易に作られる（例えば、国際特許出願ＷＯ９５／０１３７０およびＷＯ９２／２０７２と、ニールセン（Nielsen）、Ｐ．Ｅ．：  ペプチド核酸（ＰＮＡ）：「遺伝子治療薬の先例（A lead for gene
therapeutic drugs）」、薬物発見および設計の展望（Perspectives in
Drug Discovery and Design）、第４巻７６〜８４頁を参照せよ）。
【００２０】
より具体的には、本発明にもとづく輸送実体の構築では、ベクターのＢＥ標的に対する複合体のＢＥのハイブリダイゼーションによって、本複合体および担体が互いに結合する。したがって、特定の実施形態では、ＰＮＡはＰＮＡ標的配列にハイブリダイズする。そのような配列特異的ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に実行される（ハイブリダイゼーション技術については、例えば、一般に、「核酸ハイブリダイゼーション、実践的なアプローチ（Nucleic Acid Hybridisation, A practical Approach）」、ハムズ（Hames）、Ｂ．Ｄ．、およびヒギンズ（Higgins）、Ｂ．Ｄ．、ＩＲＬプレス（IRL  Press）（１９８５）、ガル（Gall）およびパーデュー（Pardue）：米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA）、第６３巻３７８〜３８３頁（１９６９）、ならびにジョン（John）他、ネイチャー（Nature）第２２３巻５８２〜５８７頁（１９６９）に記載されている）。オリゴヌクレオチドは、直接化学合成法等の当業者が周知の任意の適当な方法によって合成可能であり、該方法としてナラング（Narang）他、メソッド・オブ・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）第６８巻９０〜９９頁（１９７９）のホスホトリエステル法、ブラウン（Brown）他、メソッド・オブ・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）第６８巻１０９〜１５１頁（１９７９）のホスホジエステル法、ビューケージ（Beaucage）他、テトラヒドロン・レターズ（Tetra. Lett.）第２２巻１８５９〜１８６２号（１９８１）のジメチルホスホルアミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持法が挙げられる。
担体の構築に使用される異なるベクターおよび核酸が当該技術分野で周知であり、当業者によって容易に選択される（使用可能な実験方法についての一般参照として、例えば、サムブルーク（Sambrook）他、モレキュラー・クローニング、ラボラトリー・マニュアル（Molecular
Cloning, A Laboratory Manual）、第２版、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を見よ）。
【００２１】
本発明にもとづく輸送実体の具体的実施形態では、その輸送実体を含んだ細胞の検出および同定を可能にするために、担体もまたマーカーまたは標識（例えば、蛍光標識）を含む。プラスミド担体の場合、標識は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。オリゴヌクレオチド担体の場合、マーカーは、例えばＣｙ−３等の蛍光マーカーである。それらの標識および検出は、この分野の当業者に周知であり、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７４，１４９号、および第４，３６６，２４１号に開示されている。
本発明の最後に述べた実施形態にもとづいて新規の輸送実体を用いることで、目的とする任意の核酸配列、例えば遺伝子を、核に入るＮＬＳ能によって宿主細胞に効率的に導入することが可能である。遺伝要素を効率的かつ特異的に移す効果的な複合的能力を持つ本発明にもとづくトランスフェクション実体は、多くの異なる用途で大きな価値を有し、そのいくつかを以下に、より詳しく説明する。
【００２２】
本発明を例示するように、細胞を形質転換させる方法は、
（ｉ）少なくとも１つのＰＮＡ標的を含む担体をＰＮＡ−ＮＬＳコンジュゲートのＰＮＡドメインにハイブリダイズすることによって、本発明にもとづく複合体を提供するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で形成された複合体とトランスフェクション試薬の存在下でトランスフェクトされる細胞とを接触させるステップと、
（ｉｉｉ）複合体が細胞の核に入るのを可能にするステップと、
（ｉｖ）遺伝的形質転換を起こさせるステップとによって表され、上記ＰＮＡ複合体が核転移開始因子として用いられる。したがって、必要不可欠な位置にあるベクター内に事前に含まれた任意の形質転換配列を、細胞の核に入るＮＬＳ能と目的の核酸配列を含むベクター上のＰＮＡ標的に特異的に結合するＰＮＡ能とにより効率的に輸送することが可能である。
【００２３】
ステップ（ｉ）に関しては、種々のハイブリダイゼーション・フォーマットがこの分野の当業者に知られており、例えばサンドイッチ・アッセイおよび競合または置換アッセイがある。ハイブリダイゼーション技術は、例えば、一般に「核酸ハイブリダイゼーション、実践的なアプローチ（Nucleic Acid Hybridisation, A practical Approach）」、編集。ハムズ（Hames）、Ｂ．Ｄ．およびヒギンズ（Higgins）、Ｂ．Ｄ．、ＩＲＬプレス（IRL  Press）（１９８５）、ガル（Gall）およびパーデュー（Pardue）：米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA）、第６３巻３７８〜３８３頁（１９６９）、ならびにジョン（John）他、ネイチャー（Nature）第２２３巻５８２〜５８７頁（１９６９）に記載されている。
したがって、最初に、本発明の方法はＮＬＳの輸送能を利用することで、ＮＬＳを該ＮＬＳに結合した任意の因子とともに宿主細胞の核に入れる。ひとたび核の中に置かれると、ＮＬＳタンパク質複合体が分解してＦＥ（ＮＬＳ）の結合相手であるタンパク質が核を出て分解し、その一方で輸送された担体が核の中に残る。したがって、次に、担体に存在する目的の核酸が利用されて標的細胞内での遺伝的形質転換をおこなう。その一方で、ＦＥ（ＮＬＳ）の相手であるタンパク質が、別の実体を核の中に随伴することで、その機能を繰り返すことができることから、本発明にもとづいて得られるかなり高い形質転換頻度に貢献する。
したがって、上記したように、セベスチエン（Sebestyen）他は、細胞での遺伝学的修飾法で、プラスミドに対する核局在化シグナルの化学的結合を用いておらず、ここではＰＮＡは用いられていない。しかし、そのことは彼らの方法がプラスミドの機能までも損ねてしまうという重大な欠点があることがわかる。したがって、得られた形質転換頻度の実質的な差を説明可能であると考えられるセベスチエン（Sebestyen）他と本発明との方法での本質的な違いが存在する。
したがって、具体的な実施形態では、トランスフェクション試薬（transfection reagent）はポリマー・トランスフェクション試薬、例えばＰＥＩ（ポリエチレン・イミン）である。ＰＥＩは、すでに遺伝子治療の実験構成に用いられており、それに該当する用量で非毒性でありながら高いトランスフェクション効率（transfection efficiency）を与える能力を持つことが報告されている。ＰＥＩトランスフェクションの経路は、今日一般に使われている脂質ベースの標準的なトランスフェクション試薬とは異なる。ポリマーは、プロトン・アクセプターとして機能し、浸透ストレスによってエンドソームを崩壊させて核酸を放出させると考えられている。この状況では、本発明の他の実施形態で、他の特異的な機能因子（例えばＰＥＩおよび脂質等と同様のトランスフェクション試薬）を除外してもよい。このことは、輸送実体に含まれた機能因子が所望の膜を通過する輸送をおこなうことができるかどうかに依存している。本発明の具体例では、本発明にもとづく方法は、さらに別のステップ（ｖ）を有し、ここでは結果として得られた形質転換がすでに導入された標識またはマーカーによって確認される。そのような標識またはマーカーの性質および同一性もまた、この出願の別の場所で議論する。
【００２４】
本発明にもとづく上記に開示した方法の有利な一実施形態では、ステップ（ｉｖ）に適宜した形質転換が、プラスミド・ベクターによって１種類以上のタンパク質を導入する。それによって、外来性または非天然のタンパク質またはポリペプチド等を発現する効率的な形質転換が得られる。本発明の別の実施形態では、ステップ（ｉｖ）にもとづく形質転換は、１種類以上の遺伝子調節配列を宿主細胞に導入するために用いることが可能であり、それによって他のサイレント遺伝子が発現される可能性がある。この後者の実施形態は、遺伝子活性化として知られている技術を用いるもので、該技術は米国特許第５，６４１，６７０号等に記載されている。本発明の２つの上記開示された実施形態のいずれか一方で、結果として生ずる形質転換細胞を、薬物として有用なタンパク質等の物質の生産に用いてもよい。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態では、ステップ（ｉｖ）に定義された形質転換は、宿主細胞での突然変異の修復を目的としており、例えば、塩基特異的ＤＮＡ修復によって得ることが可能である。別の実施形態では、上記形質転換は、宿主細胞での突然変異を誘導することを目的とする。このことは、例えば発現産物の性質によって遺伝子の発現が必要ではない場合、あるいは種々の遺伝子疾患の研究に関する動物モデルの生産で必要とされない場合に、求められることがある。
本発明のさらなる利点は、例示されているＰＮＡ−ＮＬＳ複合体が幅広い適用性を有していることから、本発明を用いて、世界中の研究室で日常的に従来用いられる全プラスミドのうちの９０％を上回るプラスミドの輸送をおこなうことが可能であるということである。
【００２６】
したがって、本発明の別の態様は、上に開示された方法によって生産された組換え細胞である。本発明はまた、何らかのゲノム上の欠陥を研究するために特別に設計された動物モデル、例えばマウスに関する。培養細胞の一般的クローン技術および方法は、当業者に周知である（例えば、サムブルーク（Sambrook）他、モレキュラー・クローニング、ラボラトリー・マニュアル（Molecular
Cloning, A Laboratory Manual）、第２版、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratoary）、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、およびフレッシュニー（Freshney）、動物の培養、基本技術マニュアル（Culture of Animal
Cell, A Manual of Basic Technique）、第３版、ウイリー・リス（Wiley-Liss）、ニュー・ヨーク、Ｎ．Ｙ（１９９４）を参照せよ）。
【００２７】
本発明の特に有利な一態様は、上記のトランスフェクション方法およびＰＮＡ−ＮＬＳ複合体を遺伝子治療で用いることである。そのような用途では、コンジュゲートをオリゴヌクレオチド・ベクター（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ、または任意の他の組み合わせのキメラ・コンストラクト）にハイブリダイズさせることが可能である。遺伝子治療の手法は、いくつかの状況で、獲得性および遺伝子性の遺伝的欠陥を正すために使われている。ヒト、または動物（例えば哺乳類）で人口遺伝子を発現する能力は、しばしば他の治療法による処置が適さない多くの重要な疾患の予防および／または治療を容易にする。しかし、遺伝子治療のための現在利用可能なアプローチは、発現すべき遺伝物質が含まれる感染性のベクター（例えば、レトロウイルス・ベクター）を利用する。そのようなアプローチは限界を有しており、そのような限界として、例えば、ベクター生産過程で複製能を持つウイルス（replication-competent virus）を生成する可能性と、新規な細胞特異性を持つ感染性の因子を生成する可能性のある治療用ウイルスと内因性レトロウイルス因子との間の組換えと、宿主範囲、もしくは増加した病原性および細胞毒性と、腫瘍形成性の挿入現象が生ずる危険性が増加する多数の細胞への独自の組み込みと、レトロウイルスでの限定されたクローニング能力（治療的適用性を制限）と、目的とする産物の一時的な生体内（in vivo）発現とが挙げられる。したがって、本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳコンジュゲートまたは複合体が使用される本発明にもとづく用途は、従来のウイルス方法に関連して制限およびリスクを回避する。例えば、すでに、嚢胞性線維症との関連では、アデノウイルス・ベクターが遺伝子治療のベクターとして用いられていた。そのようなベクターは、不要な免疫応答を生ずる場合があり、したがって、そのことは本発明にもとづく新規のＰＮＡ−ＮＬＳコンジュゲートによって回避される。
【００２８】
したがって、本発明はまた、それ自体として遺伝子治療法に関するもので、本発明にもとづくコンジュゲートまたは複合体が特定の用途で、少なくとも１種類のトランスフェクション試薬、例えば上記したポリエチレン・イミン（ＰＥＩ）とともに用いられる。そのような方法は、しばしば、突然変異遺伝子または欠損遺伝子を修復することを目的とするけれども、例えば、不要なタンパク質の発現を防ぐために、または何らかの欠損の研究用に動物モデルを作るために突然変異を誘導するために用いることも可能である。遺伝治療によって処置可能な疾患の一例は、かなりの数の患者を苦しめている嚢胞性線維症（ＣＦ）である。ＣＦは、実際に手が届きやすい肺が標的器官であることから、プラスミド媒介遺伝子移入の影響を受けやすいと考えられる。しかし、遺伝的欠陥が確認される疾患の数が着実に増加の一途をたどることから、将来、多数の別の遺伝子関連症状または疾患が本発明にもとづく遺伝子治療による処置にかなり適していることが確認されると予測される（例えば、遺伝子治療法の総説については、アンダーソン（Anderson）、サイエンス（Science）（１９９２）２５６：８０２〜８１３と、ナベル（Nabel）およびフェルグナー（Felgner）（１９９３）、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１〜２１７と、ミタニ（Mitani）およびカスケイ（Caskey）（１９９３）、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２〜１６６と、ムリガン（Mulligan）（１９９３）、サイエンス（Science）９２６〜９３２と、ジロン（Dillon）（１９９３）、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７〜１７５と、ミラー（Miller）（１９９２）、ネイチャー（Nature）３５７：４５５〜４６０と、バン・ブルンド（Van Brundt）（１９８８）、バイオテクノロジー（Biotechnology）６（１０）：１１４９〜１１５４と、ビニュ（Vigne）（１９９５）、修復神経学および神経科学（Restorative Neurology and Neuroscience）８：３５〜３６と、クレメール（Kremer）およびペリコーデット（Perricaudet）（１９９５）、英国医学会会報（British Medical Bulletin）５１（１）３１〜４４と、微生物学および免疫学の今日の話題（Current Topics in Microbiology and Immunology）内のハダッダ（Haddada）他（１９９５）と、ユー（Yu）他、遺伝子治療（Gene Therapy）（１９９４）１：１３〜２６とが挙げられる）。
【００２９】
本発明の同様の態様は、本発明にもとづく輸送実体または複合体を用いて、遺伝子治療に使用される細胞を遺伝学的に修飾することである（細胞治療の基本を開示したものとして、例えば、ゲージ（Gage）、Ｆ．Ｈ、ネイチャー（Nature）第３９２巻１９９８年４月３０日を参照せよ）。したがって、本発明はまた、そのような細胞治療法と該細胞治療法に使用される細胞（本発明にもとづく方法によって遺伝学的に修飾されている）とに関する。
したがって、最後の態様では、本発明はまた、処置の方法を包含し、該方法では本輸送実体の有効量を、遺伝子治療による処置を必要としている被検体に投与する。上記処置は、予防的および／または治療的であってもよく、さらに任意の疾患または症状に向けられるものであってもよい。そのような症状として、限定されるものではないが、種々の遺伝的欠損が挙げられる。むしろ、さらに別の症状もまた考えられる可能性があり、遺伝的環境を、例えば所望の治療的機能をコードする遺伝子を含むプラスミドの挿入によって、変えることが望まれる。そのような処置方式に関する詳細は、処置すべき症状、患者の年齢および体重等の因子に依存した個々の症例に関わる医師によって決定される。そのような方法での使用に適した製剤もまた、本発明の範囲内である。
【００３０】
（図面の詳細な説明）
図１は、本発明にもとづくセンスＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドにハイブリダイズするアンチセンスＣｙ−５オリゴヌクレオチドの標的部位を示す模式図である。ＰＮＡ−ＮＬＳ／オリゴヌクレオチド複合体は、カリオフェリンα／βタンパク質に結合する。その後、この結合体は核内に送られる。同様に、ＰＮＡ標的部位は、ＥＧＦＰプラスミドにクローニングされ、ＰＮＡ−ＮＬＳハイブリダイゼーション後の核輸送が可能となる。略語：  ＡＳはアンチセンス、Ｓはセンス、ＳＶ４０ＮＬＳはシミアン・ウイルス４０核局在化シグナル、およびＰＮＡはペプチド核酸である。
図２（ａ）は、蛍光標識したオリゴヌクレオチドの核転移を示す図である。矢印は、Ｃｙ−５オリゴがエンリッチされている核を示す。図２（ｂ）は、Ｃｙ−５ＡＳ−オリゴヌクレオチドの位置を表すＣｙ−５チャンネルを示す。図２（ｃ）は、Ｃｙ−３−Ｓ−オリゴヌクレオチドの位置を示すＣｙ−３チャンネルを示す。
図３は、Ｃｙ−５／Ｃｙ−３蛍光の核、細胞質、およびゴルジ様比率を示す。（ａ）アンチセンス・オリゴ、核、（ｂ）アンチセンス・オリゴ、ゴルジ様、（ｃ）アンチセンス・オリゴ、細胞質、（ｄ）センス・オリゴ、核、（ｅ）センス・オリゴ、ゴルジ様、および（ｆ）センス・オリゴ、細胞質。
図４は、本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドによるアンチセンスおよびセンス・オリゴヌクレオチドのシフト・アッセイである。（ａ）ＰＮＡに対する標的配列（ＡＳ）を持つオリゴヌクレオチド、（ｂ）（ａ）と同様ではあるけれども、長時間露出して１：１０ハイブリダイゼーションのより弱いシフトが示されたオリゴヌクレオチド、（ｃ）ＰＮＡに対する標的配列を持たないオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド濃度を、各々のレーンで２．６４ｐｍｏｌとした。ＰＮＡ−ＮＬＳを異なるモル比で５’標識オリゴヌクレオチドに加えた。すなわち、レーン１は１：１０、レーン２は１：１、レーン３は１０：１、レーン４は１００：１、レーン５は１０００：１、およびレーン６は０：１である。
図５は、本発明にもとづく輸送実体の効果を示す図である。すなわち、ＥＧＦＰプラスミドを含むＰＮＡ標的に対してハイブリダイズした場合のＰＮＡ−ＮＬＳの効果とトランスフェクション混合物から過剰なＰＮＡ−ＮＬＳ分子を取り除く効果とを示す。（ａ）ＰＮＡ−ＮＬＳ無しでトランスフェクトしたＥＧＦＰを含むＰＮＡ標的部位、（ｂ）ＰＮＡ−ＮＬＳに対してハイブリダイズしたＥＧＦＰプラスミドを含むＰＮＡ標的部位（ＥＧＦＰプラスミドとＰＮＡ−ＮＬＳとの比が１：１００）、（ｃ）ＰＮＡ−ＮＬＳに対してハイブリダイズしたＥＧＦＰプラスミド（ＥＧＦＰプラスミドとＰＮ−ＮＬＳとの比が１：１００）を含み、かつトランスフェクション前に過剰のＰＮＡ−ＮＬＳが除去されたＰＮＡ標的部位。
図６は、ＰＮＡ−ＮＬＳの添加有りまたは添加無しのＬａｃＺおよびＥＧＦＰトランスフェクションを示す図である。ＥＧＦＰトランスフェクションもまた、未結合ＰＮＡ−ＮＬＳ（精製）の除去後に調べた。
【００３１】
実験
以下、例を挙げながら本発明をさらに詳しく説明する。実施例は単に発明を例証しているだけであり、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものとして解釈されないことが理解される。この出願の以下または他の箇所に記した全ての参照文献を、本明細書中に援用する。
【００３２】
材料および方法
細胞株および培地
【００３３】
ＣＯＳ−７、３Ｔ３、およびＨｅＬａ細胞をトランスフェクションに用い、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＬ−グルタミン、１０％牛胎仔血清、および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで培養した。
【００３４】
ＰＮＡ−ＮＬＳ
ペプチド核酸（ＰＮＡ）の合成は、パースペクティブ・バイオスンセシス社（Perspective BioSynthesis Ltd.）でおこなった。ＰＮＡの配列の選択は、起こり得る非特異的結合を避けるために、既知の真核ＤＮＡ配列と同様に、プラスミドからの排除の判定によっておこなった。ＰＮＡペプチドを、疎水性スペーサーＦｍｏｃ−ＮＣ６０３Ｈ１１−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨ）によって、ＳＶ４０コアＮＬＳである一続きのアミノ酸残基ＰＫＫＫＲＫＶに結合させた。完全な配列は、ＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣ−リンカー−ＰＫＫＫＲＫＶである。ペプチドと同様に、ペプチドアミド・リンカーを有するポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）支持体上で、ＰＮＡの合成をおこなった。このリンカーは最終産物の分解の際にＰＮＡアミドを生成した（http://www.pbio.com/cat/synth/pna/pnacycle.htm）。
【００３５】
蛍光色素標識オリゴヌクレオチド  
２種類の蛍光色素標識オリゴヌクレオチド、すなわちＡＳ−Ｃｙ−５標識されたＰＮＡ−ＮＬＳ二元機能ペプチドに対するアンチセンスとＳ−Ｃｙ−３標識されたＰＮＡ−ＮＬＳ二元機能ペプチドに対するセンスとを、サイバージーン（Cybergene）ＡＢで合成した。これらのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製した。オリゴヌクレオチドに結合するためのＣｙ−３およびＣｙ−５蛍光色素サブユニットは、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）から購入した。
【００３６】
低イオン強度ＰＡＧＥを用いた移動度シフトＤＮＡ結合アッセイ 
γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（＞５０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を用いて、アンチセンスおよびセンス・オリゴヌクレオチをＴ４−ポリヌクレオチド・キナーゼによって末端標識した。種々の濃度のＰＮＡ−ＮＬＳとともに、室温で標識オリゴヌクレオチドをインキュベートした。オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ−ＮＬＳ複合体を分離するために、１５％の低イオン強度の非変性ポリアクリルアミド・ゲルを用いた（「低イオン強度ＰＡＧＥを用いた移動度シフト・アッセイ」（”Mobility shift assay using low-ionic-strength PAGE）、分子生物学における簡単なプロトコール（Short protocols in molecular biology）、編集：  フリーデリック（Frederick）Ｍ）。アウスベル（Ausbel）。ロジャー・ブレント（Roger Brent）、ロバート（Robert）Ｅ．キングストン（Kingston）、デビッド（David）Ｄ．ムアー（Moore）、Ｊ．Ｇ．セイドマン（Seidman）、ジョン（John）Ａ．スミス（Smith）、ケビン・ストルール（Kevin Struhl）、第２版、１９９２）。
【００３７】
ＰＮＡ−ＮＬＳ蛍光色素標識オリグヌクレオチドによるトランスフェクション
トランスフェクションは、以下のように２５ｋＤａＰＥＩによっておこなった。ＰＮＡ−ＮＬＳ：Ａｓ：Ｓを１：１：１のモル比で混合し、９０℃で加熱した。この混合物をゆっくりと室温に冷やすことで、ＡＳ−オリゴに対するＰＮＡ−ＮＬＳのハイブリダイゼーションを最適化する条件を得た。この混合物を水で希釈して、０．０５μｇ／μｌの濃度にした。オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡ−ＮＬＳの混合物に対して、ヌクレオチド２μｇあたり１．４４μｌの０．１Ｍ２５ｋＤａＰＥＩ溶液を加えた。トランスフェクション溶液による複合体の形成を室温で１０分間おこなった後、１０％牛血清および１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む１ｍｌのＤＭＥＭと混合した。次に、培地／トランスフェクション複合体混合物を細胞に添加した。トランスフェクションをおこなうために、該トランスフェクションの８時間前に１０５ＣＯＳ−７細胞を６穴プレートの各穴の培地２ｍｌに播種して細胞を付着させた。オリゴヌクレオチド・トランスフェクションのインキュベーション時間を１０時間とした。全てのインキュベーションは、５％ＣＯ２中、３７℃でおこなった。
【００３８】
ＰＮＡ−ＮＬＳ、ＥＧＦＰ、およびｌａｃＺプラスミドによるトランスフェクション
ＰＮＡ−ＮＬＳハイブリッド用の標的配列を取り込むために、プラスミドＥＧＦＰ−Ｎ３（増強緑色蛍光タンパク質（クローンテック（Clonetech））を修飾した。ＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミドをＡｆｌＩＩで消化し、Ａｆ１ＩＩ部位でフランキングしたＰＮＡ標的配列を含むオリゴヌクレオチド・フラグメントによって連結した。このフラグメントを、ＥＧＦＰ遺伝子機能またはプラスミド機能にとって必須であることが知られている任意の配列の外側の位置に、クローニングした。このコントラストの種々のクローンを単離したところ、異なる数のＰＮＡ標的部位を有していた。ＥＧＦＰおよびｌａｃＺ遺伝子の発現によって、陽性細胞の数を直接記録することによって測定されるように、レポーター遺伝子の機能性に関してプラスミドの状態についての情報が得られた。トランスフェクションは、以下のようにして２５ｋＤａのＰＥＩによっておこなった。ＰＮＡ−ＮＬＳ：プラスミド試料を１００：１のモル比で混合し、９０℃に加熱した。混合物をゆっくりと室温にまで冷やし、プラスミド標的部位に対する本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳのハイブリダイゼーションを最適化した。この混合物を０．０５μｇ／μｌの濃度に希釈した。混合物に対して、プラスミド２μｌあたり１．４４μｌの０．１Ｍ２５ｋＤａＰＥＩ溶液を添加した。トランスフェクション溶液による複合体の形成を室温で１０分間おこなった後、１０％牛血清および１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンが追加された１ｍｌのＤＭＥＭと混合した。次に、トランスフェクション混合物を標的細胞に加えた。ｌａｃＺに関する手順は上記した通りにおこなった。トランスフェクションのために、１０５ＣＯＳ−７細胞を６穴プレートの穴あたり２ｍｌの培地に播種した。このことは、細胞の付着を目的として、トランスフェクションの８時間前におこなった。遺伝子発現を最大とするために、インキュベーション時間を４８時間とした。全てのインキュベーションは、５％ＣＯ２中、３７℃でおこなった。
【００３９】
ＬａｃＺ染色 
トランスフェクト細胞を、２％パラホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド含有１×ＰＢＳで固定した。染色溶液Ａは、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、および２ｍＭ塩化マグネシウムを含むものとした。Ｘ−ｇａｌを濃度４０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解した。溶液Ａを１：１の比率でＸ−ｇａｌ／ＤＭＳＯ溶液と混合し、３７℃で予熱し、さらに固定細胞に添加した。次に、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、光学顕微鏡で記録した。
【００４０】
蛍光顕微鏡および画像分析 
冷却フレームＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを装着したライカ（Leica）ＤＭＲＸＡ顕微鏡下で、生細胞の蛍光顕微鏡観察をおこなった。それに続く画像分析は、インテリジェント・イメージング・イノベーションズ社（Intelligent Imaging Innovations Ltd.）のスライドブック（Slidebook 2.1.4）というソフトウェアを用いておこなった。核取り込みの増加を、核をマスキングすることによって計算し、Ｃｙ−５（図２ｂ）およびＣｙ−３（図２ｃ）スペクトルからの蛍光の測定をそれぞれおこない、さらにバックグラウンドの蛍光を差し引いた。
【００４１】
結果：
ＰＮＡ−ＮＬＳハイブリダイズ・オリゴヌクレオチドの核転移
第１の実験群では、Ｃｙ−３およびＣｙ−５蛍光標識１５量体オリゴヌクレオチドとＰＮＡ−ＮＬＳとをモル比１：１でハイブリダイズさせた。この技術の原理を模式的に図１にまとめた。ＰＥＩ媒介トランスフェクションの後、対照Ｃｙ−３蛍光色素標識オリゴヌクレオチドと比較して、２００〜８００％に及ぶＣｙ−５蛍光色素標識オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ−ＮＬＳ複合体の核転移の増加（図２および３）が観察された。分析した際、細胞は異なる細胞区画で異なる蛍光レベルを有していた。蛍光レベルは、全ての陽性細胞の核のものと同様であった。細胞質蛍光は、低強度から高強度に変化した。オリゴヌクレオチド内の同族配列にＰＮＡ−ＮＬＳが結合することを確認するために、放射性標識オリゴヌクレオチドをＰＮＡ−ＮＬＳとともにインキュベートし、低イオン強度の非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。図４から明らかなように、ＰＮＡ−ＮＬＳ結合は特異的であり、ＰＮＡ−ＮＬＳと対応オリゴヌクレオチドとのモル比を１：１０で用いることで、シフトが一目瞭然となった。一方、１０４：１の比は、標的部位が欠けたオリゴに影響を及ぼすことはなかった。
【００４２】
ＰＮＡ−ＮＬＳハイブリダイズ・プラスミドの核転移
ＰＮＡ−ＮＬＳ分子を、ＰＮＡ標的配列含有プラスミドとハイブリダイズさせた。ＬａｃＺまたはＥＧＦＰレポーター・コンストラクトを用いた。遺伝子導入の効率を、ｌａｃＺ活性について染色した後のＥＧＦＰ発現細胞の頻度または青色細胞の数として、測定した。ｌａｃＺまたはＥＧＦＰプラスミドのＰＥＩ媒介トランスフェクションは、ＰＮＡ−ＮＬＳペプチドを１００：１の比で添加することで、３〜８倍に増強した（図５、６）。プラスミドは、両方とも、既知の機能を持たない領域（レポーター遺伝子のポリアデニル化シグナルの３’に位置）にクローニングされた１１個のコンカテマーＰＮＡ標的部位を有した。最初に、用量応答分析を実行したところ、ＰＮＡ−ＮＬＳ：プラスミドの比率１００：１が最適であった（データ不図示）。２個のコンカテマーＰＮＡ標的部位を含むｌａｃＺプラスミドは、野生型の効率（不図示）と変わらなかったことから、それ以上調べなかった。トランスフェクション効力（transfection efficacy）は、ＥＧＦＰプラスミドの場合（図５、６）に示されるように、プラスミド−ＰＮＡ−ＮＬＳ複合体を遊離のＰＮＡ−ＮＬＳから精製した場合に、増強された（対照と比較して８倍）。このことは、遊離のＰＮＡ−ＮＬＳがプラスミド／ＰＮＡ−ＮＬＳ複合体の核輸送を阻害することで核の転移を損なうことが示されている。対照プラスミドをＰＮＡ−ＮＬＳと混合した場合、トランスフェクション効力に対して何ら効果が見られなかった。プラスミド／ＰＮＡ−ＮＬＳ相互作用は、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰプラスミドのいずれかを含む複合体でのレポーター遺伝子の発現によって示されるように、マーカー遺伝子の正常な機能を妨げるようには見えない。さらに、１００倍以上の遊離のＮＬＳペプチド（ＮＬＳ：プラスミドの比率が１０４：１）を亜添加することで、ＰＮＡ部位を含むプラスミドのトランスフェクション効力が著しく減少した（不図示）。
【００４３】
考察
本発明は、ＳＶ４０ＮＬＳペプチドに結合したＰＮＡ分子が、蛍光標識オリゴヌクレオチドに対して、またはレポーター遺伝子を含むプラスミドに対して結合した場合に、核標的シグナルとして作用し得ることを示す。同様の結果は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＣＯＳ−７細胞でＤＯＴＡＰまたは２５ｋＤＰＥＩをトランスフェクション試薬として用いることで得られることから、技術の汎用性が示された（データ示さず）。本発明にもとづく方法は、一般にトランスフェクションについての潜在的価値についてであり、また遺伝子治療もしくはＤＮＡワクチン接種の場面で適用することも可能である。標的細胞への核酸の取り込みの増大は、遺伝子発現にとって、同様にアンチセンス・コンストラクトの送達にとって、もしくは突然変異誘発オリゴヌクレオチドの送達にとっても、重要であると考えられる。アンチセンス活性の場面では、ＰＮＡ−ＮＬＳコンストラクト単独の適用も可能でなければならない。本発明によれば、研究された未修飾ＥＧＦＰまたはＬａｃＺプラスミドには存在しないＰＮＡ標的配列であるCGCGAGCCGGGAAGGを使用した。ＰＮＡとその標的配列との相互作用は、かなり特異的であり、ＰＮＡは非関連配列とは相互にハイブリダイズしない。ＤＮＡとＰＮＡとの間の強力な相互作用もまた、複合体が分離するのを防止する（クヌーセン（Knudsen）Ｈ．、ニールセン（Nielsen）Ｐ．Ｅ．：二重鎖および三重鎖形成ＰＮＡのアンチセンス特性（Antisense properties of duplex- and triplex-forming ＰＮＡs）、核酸研究（Nucleic Acid Research）２４（３）４９４〜５００（１９９６））。
【００４４】
本発明が進められている最中に、ＮＬＳペプチドをプラスミドに化学的に結合させ、それを細胞質に注射した後の核転移についての研究に、ジギトニン透過性ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞が用いられるという報告が出現した（セベスティエン（Sebestyen）Ｍ．Ｇ、ルドケ（Ludtke）Ｊ．Ｊ．、バシック（Bassik）Ｍ．Ｃ．、チャン（Zhang）Ｇ．、バドカー（Budker）Ｖ．、ラクタノフ（Lukhtanov）Ｅ．Ａ．、ハグストロム（Hagstrom）Ｊ．Ｅ．、ウオルフ（Wolff）Ｊ．Ａ．、ＤＮＡベクター・ケミストリー：  プラスミドＤＮＡに対するシグナル・ペプチドの共有結合（DNA vector chemistry:  The covalent attachment of signal
peptides to plasmid DNA）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature
Biotechnology）１６（１）：８０−５（１９９８））。セベスティアン（Sebestyen）等によって得られた結果もまた、ＮＬＳ結合プラスミドを用いた核内への輸送増加を示している。しかし、この技術に特有の化学的修飾により、修飾プラスミドでのレポーター遺伝子の発現が阻害される。対照的に、ＰＮＡ−ＮＬＳペプチドを用いることで、発現が保たれた。このために、おそらく非不可欠な地域のＰＮＡ標的部位の位置が必須であった。プラスミドについては、２つのＰＮＡ標的部位はトランスフェクション効力に対して何ら効果を有しなかった。その一方で１１個の部位が著しく効率を高めた。プラスミドの同一領域に全ての標的部位を局在化することが重要であるかどうか、あるいはそれらが均一に広がるかどうかについての研究を実施しなかった。しかし、これらの選択肢は両方とも、添付した特許請求の範囲によって定義されるように、保護の範囲内にある。さらに、セベスティアン他（１９９８）のデータから推定されるように、Ｓ配列の数を１１５以上（＞１１５ＮＬＳ）とした場合に何ら効果が見られなかったことから、ＮＬＳ濃度が局所的に高いことが必須であることが提案される。一方、本発明によれば、１１個のＰＮＡ−ＮＬＳ標的部位を持つ２５０ｂｐコンカトマー・ストレッチを用いることで、取り込みの促進が見られる。しかし、現時点では、ＰＮＡ−ＮＬＳ配列が各標的部位に結合するかどうかは、完全には明らかにされておらず、したがって、このことは本発明にもとづいた方法を使用するこの分野の当業者によって試験されなければならない。ＳＶ４０コアＮＬＳが最も研究されたＮＬＳ配列のうちの一つであることから、実用上の理由でＳＶ４０コアＮＬＳを選択した。９７０ｋＤａを上回る大きさのＳＶ４０結合タンパク質が核の中に転移することが報告されている（ヨネダ（Yoneda）Ｙ．、センバ（Semba）Ｔ．、カネダ（Kaneda）Ｙ．、ノーブル（Noble）Ｒ．Ｌ．、マツオカ（Matsuoka）Ｙ．、クリハラ（Kurihara）Ｔ．、オカダ（Okada）Ｙ．、イマモト（Imamoto）Ｎ．：「核局在化シグナルとそのＳＶ４０Ｔ抗原のフランキング配列とを含む長い合成ペプチドは、核内へのＩｇＭの効率的な輸送を導く（A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal
and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into
the nucleous efficiently）」、 実験的細胞研究（Experimental Cell
Research）２０１（２）：３１３〜３２０（１９９２）。このことは、２８００ｋＤａのＥＧＦＰプラスミドを含むＰＮＡ標的配列の分子量と比較すべきである。さらに、ザンタ（Zanta）他（ザンタ（Zanta）Ｍ．Ａ．、ベルギーズ・バランジエール（Belguise-Valladier）Ｐ．、ベール（Behr）Ｊ．、遺伝子送達（Gene delivery）：「単一核局在化シグナルペプチドは、ＤＮＡを細胞核に運ぶのに十分である（A single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry
DNA to the cell nucleus）」、米国科学アカデミー紀要（Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９９９  ９６：９１〜９６）は、本特許出願の最も早い優先日よりも後に、精製したレポーター遺伝子フラグメントにハイブリダイズするＮＬＳ−ＤＮＡのリゲーションが用いられる興味深い論文を開示している（８）。その著者は、ＮＬＳアプローチの実現可能性をはっきりと示している。しかし、ザンタ（Zanta）他（上掲）によって使用される方法は、本方法よりも扱いにくい。なぜなら、プラスミドの制限酵素による切断とその後のレセプター遺伝子フラグメントに対するオリゴヌクレオチド担持ＮＬＳのリゲーションとを伴うからである。
【００４５】
本方法および輸送実体（例えば、ＰＮＡ−ＮＬＳ方式）は、突然変異修復のために修復コンストラクトが核の中へ送り届けられる方式で有効であると同様に、一時的なトランスフェクションを伴う方式および治療でも有効である。ＳＶ４０コアＮＬＳに基づいた核転移の方式は、蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いることによって核蛍光のプラトーが達成されたことにより、飽和しているように見えた。このことは、オリゴヌクレオチドの細胞質レベルが異なることで標的オリゴヌクレオチドが同様の核内レベルとなる一方で非標的オリゴヌクレオチドが相対的に幅広い変動を示すという事実によって、示される（図３ｂ）。Ｃｙ−５標識アンチセンスによるオリゴヌクレオチドの核転移の記録は、Ｃｙ−５フルオロフォアを赤外線放射することから、客観性が与えられた。ＳＶ４０ＮＬＳの結合相手は、カリオフェリンαであり、このカリオフェリンαは続けてカリオフェリンβと複合体を形成する（ミヤモト（Miyamoto）Ｙ．、イマモト（Imamoto）Ｎ．、セキモト（Sekimoto）Ｔ．、タチバナ（Tachibana）Ｔ．、セキ（Seki）Ｔ．、タダ（Tada）Ｓ．、エノモト（Enomoto）Ｔ．、ヨネダ（Yoneda）Ｙ．、異なる３つのクラスのＮＬＳレセプターによる核局在化シグナル（ＮＬＳ）の異なったモード（Differential modes of nuclear localization signal (ＮＬＳ) recognition by three distinct classes of ＮＬＳ receptors）、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Journal
of Biological Chemistry）、２７２（４２）：２６３７５〜８１（１９９７））。この輸送メカニズムが飽和し得ることから、ＮＬＳの全量は重要であり、本方法を用いて当業者によって測定される（ミショー（Michaud）Ｎ．、ゴールドファーブ（Goldfarb）Ｄ．Ｓ．、「ほとんどの核タンパク質が単一の経路によって導入される（Most nuclear proteins are imported by a single pathway）」、実験的細胞研究、２０８（１）：１２８〜１３６（１９９３））。核内移入方式の飽和もまた、遊離のＮＬＳの添加が核輸送を妨げるという本発明にもとづく知見を適切に説明するものである。オリゴヌクレオチドの核内移入をさらに高めるために、異なるＮＬＳ経路を標的にする一組のＮＬＳ配列を含むＰＮＡ−ＮＬＳペプチドの混合物を用いることができた（ミショー（Michaud）他、上掲）。このことは、ひとつの経路の飽和が導入生体分子の核転移を制限しないことを確実にする。このため、Ｑｉｐ１、Ｒｃｈ１、およびＮＰＩ−１等の少なくとも３つの異なるＮＬＳレセプター・ファミリーが報告されている（ミヤモト（Miyamoto）他、上掲）。本発明によれば、レンチウイルスの核への侵入を模倣する一つの方法は、ＰＮＡ−ＮＬＳペプチドを介してＨＩＶ−マトリックス結合（ＭＡ）タンパク質を核酸コンストラクトに結合させることであることが示唆される。次に、複合体はＶｐｒに結合し、前一体化複合体（pre-integration complex）として続いて処理されると考えられる（バクリンスキー（Bukrinsky）Ｍ．Ｉ．、ハファー（Haffar）Ｏ．Ｋ．、「ＨＩＶ−１核内移入：  今回はＶ
ｐｒとともに、マトリックス・タンパク質が中心段階にもどる（HIV-1 nuclear import: Matrix
protein is back on center stage, this time together with Vpr.）」、分子医学（Molecular Medicine）、４（３）：１３８〜１４３（１９９８））。ＭＡ−Ｖｐｒ複合体の機能が、シャオ（Ｘｉａｏ）等（１９９７）によって記載された拡張ＳＶ４０ＮＬＳ配列（extended SV40 NLS sequence）に類似するということが提案されている（シャオ（Xiao）Ｃ．Ｙ．、ハブナー（Hubner）Ｓ．、ジェーンズ（Jans）Ｄ．Ａ．、核局在化配列をフランキングする二重鎖ＤＮＡ依存型タンパク質キナーゼ部位（セリン１２０）によってＳＶ４０巨大腫瘍抗原の核内移入を調節する（SV40 large tumor antigen nuclear import is regulated by the
double-stranded DNA-dependent protein kinase site (serine 120) flanking the
nuclear localization sequence）、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Journal
of Biological Chemistry）、２７２（３５）：２２１９１〜２２１９８（１９９７））。従来技術では、核酸送達の種々の態様を強化するタンパク質が研究されている（ブッシフ（Boussif）Ｏ．、レゾーウルチ（Lezoualch）Ｆ．、ザンタ（Zanta）Ｍ．Ａ．、マーグニイ（Mergny）Ｍ．Ｄ．、シャーマンＤ．、デメネイクス（Demeneix）Ｂ．、ベール（Behr）Ｊ．Ｐ．、培地および生体内での細胞への遺伝子およびオリゴヌクレオチド輸送のための万能因子：ポリエチルイミン（A versatile factor for gene and oligonucleotide transfer into cells
in culture and in vivo: polyethylenimine）、米国科学アカデミー紀要（National
Academy of Sciences of the United States of America）、９２（１６）：７２９７〜７３０１（１９９５））。本発明によれば、そのような機能は、ＭＬＳ媒介輸送に加えて、ＰＮＡによるアプローチを用いて核酸を直接標的にすることが可能であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明にもとづくセンスＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドに対するアンチセンスＣｙ−５オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションでの標的部位を示す模式図である。
【図２】蛍光標識オリゴヌクレオチドの核転移を説明する図である。
【図３】核、細胞質、およびゴルジ様のＣｙ−５／Ｃｙ−３蛍光比である。
【図４】本発明にもとづくＰＮＡ−ＮＬＳ二重機能ペプチドによるアンチセンスおよびセンス・オリゴヌクレオチドのシフト・アッセイを示す図である。
【図５】本発明にもとづく輸送実体の効果を説明する図である。すなわち、ＥＧＦＰプラスミドを含むＰＮＡ標的にハイブリダイズした場合のＰＮＡ−ＮＬＳの効果と、トランスフェクション混合物から過剰なＰＮＡ−ＮＬＳ分子を除去する効果とを示す。
【図６】過剰なＰＮＡ−ＮＬＳの精製後、ＰＮＡ−ＮＬＳの添加または無添加でのｌａｃＺおよびＥＧＦＰトランスフェクションを示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2002525066.tif 000001
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2002525066.tif 000002