【手続補正書】
【提出日】平成17年7月29日(2005.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害と関係がある状態を治療するための医薬品の製造のためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４−ＨＡＢＤ）の非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらの非ＨＡ結合性アナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又はその断片を含む分子の使用。
【請求項２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤがそれを非ＨＡ結合性にする変異を少なくとも１個含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（１個以上の）変異がＦ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ及びＦ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも７５％という配列番号：２の配列との相同性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
組換えバリアントがＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分とＧＳＴ部分とを有する融合タンパク質であり、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が非ＨＡ結合性型である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアントを含む分子が、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：２）、イヌＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：４）、ニワトリＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：６）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１Ａ（配列番号：８）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１０）、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１２）、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ(２１−１００)（配列番号：２３）及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ(６１−１００)（配列番号：２６）を含む群より選択され、これらの配列がこれらの配列を非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の修飾をさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
分子がヒト、イヌ、ニワトリ、霊長類の動物、ラット又はマウスを起源とする分子である請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療される状態が、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び網膜低酸素状態のような失明又は視覚障害を引き起こす眼疾患、慢性関節リウマチのような慢性炎症の状態、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、並びに癌の増殖及び転移、並びに乳房、前立腺、結腸、肺、皮膚、肝臓、脳、卵巣、精巣、骨格、上皮、内皮、膵臓、腎臓、筋肉、副腎、腸、内分泌腺、口腔、頭部及び頸部、又はその他の固形組織起源の癌、又は任意の型の白血病、及び血管腫のようなあらゆる型の癌疾患及び腫瘍より選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
内皮細胞のターゲティングのためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又は断片を含む分子の使用。
【請求項１０】
分子が化学療法特性及び／又は遺伝子治療特性を示す部分をさらに含む請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）ＧＳＴ部分、（ｉｉ）化学療法特性を示す部分、（ｉｉｉ）遺伝子治療特性を示す部分及び（ｉｖ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｈｉｓ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及びＥＧＦＰから選択されるタグから選択される部分、及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分を含む組換え分子であって、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、Ｆ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ、Ｆ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される変異型の如き、それを非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の変異型により変異されている組換え分子。
【請求項１２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：２３、配列番号：２６のアミノ酸配列のうちのいずれか１個の修飾されたバリアントにより規定される請求項１１に記載の組換え分子。
【請求項１３】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかと少なくとも５５％の相同性、好ましくは６５％の相同性、より好ましくは７５％の相同性を有する配列、最も好ましくは修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかである配列によりコードされる請求項１１又は１２に記載の組換え分子。
【請求項１４】
医学的使用のための請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換え分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の少なくとも１個を少なくとも１個の薬学的に許容される担体又は賦形剤との混合物として、又はそれらと共に含む薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の薬学的な用量を投与することを含む患者における腫瘍又はその他の疾患の治療方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナーのスクリーニング方法：
ａ）ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子を準備する；
ｂ）可能性のある結合パートナーを前記分子と接触させる；及び
ｃ）前記可能性のある結合パートナーに対する前記分子の効果を決定する。
【請求項１８】
可能性のある結合パートナーがタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、脂質、グリカン、配糖体及び糖類を含む群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
可能性のある結合パートナーが受容体分子、受容体分子の一部、細胞表面受容体分子もしくは受容体分子ではない細胞表面に位置する分子と結合する分子である請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法により見出された請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナー。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子と請求項２０に記載の可能性のある結合パートナーを別々のバイアルに含む請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
従って、様々な癌性状態のような血管形成に関係のある状態を治療するための薬物が、本発明者らにより提示された新規のメカニズムを活用し、本発明によって容易に提供される。さらに、そのスクリーニング方法によって、細胞増殖及び／又は血管形成に影響を与えるその他の分子が見出され得る。
図面の簡単な記述
図１は組換えのＧＳＴタンパク質及びＧＳＴ−ＣＤ４４タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーにより染色された。分子量マーカーが右側に示されている。
図２は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ａ、野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、固定化されたＨＡと結合するが、Ｒ４１Ａ変異体、Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ変異体又はＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ変異体は結合しない。ｂ、ＣＤ４４ＨＡＢＤはヒト大動脈内皮細胞のＨＡへの遊走を阻害するが、Ｒ４１Ａ  ＨＡ非結合性変異体には効果がない。ＨＡ結合を阻止するＣＤ４４に対するモノクローナル抗体Ａ３は、内皮細胞遊走も阻害する。
図３は組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ａ、血管形成がｂＦＧＦにより誘導された典型的な血管形成実験からのフィルターディスク及び関連ＣＡＭ。ｂ〜ｄ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
図４は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）及び肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
図５は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ａ、ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又は対照としてのＧＳＴにより処理されたヌードマウスにおけるｓ．ｃ．ＳＭＭＵ−１腫瘍の増殖曲線（各群ｎ＝８）。ｂ、１６日目の腫瘍重量（黒線は中央値を表している）。ｃ、示されたようにして処理された１６日目のマウスの代表的な写真。ｄ、高倍率視野（ＨＰＦ）１個当たりの腫瘍辺縁における血管密度。＊（Ｐ＜０．００５）、＊＊（０．０５）有意な結果。
図６ではＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質はヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（四角）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（三角）又は対照としてのＧＳＴ（菱形）により処理されたヌードマウスにおけるＢｘＰＣ−３膵臓腺癌腫瘍（ｎ＝６〜７）（ａ）。ｂ、実験終了時の平均ＢｘＰＣ−３腫瘍重量。グラフ内の値及びバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。
図７では組換えＣＤ４４ＨＡＢＤは内皮細胞周期を特異的に阻止する。ＧＳＴ（黒）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（薄い影）又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（濃い影）により処理された場合の、Ｓ期の細胞の割合。ＨＵＶＥＣ、ヒト血管内皮細胞；ＣＰＡＥ、ウシ肺動脈内皮細胞；ＮＨＤＦ、正常ヒト皮膚線維芽細胞；ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞。
図８は内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）が、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理された。細胞増殖は、顕微鏡写真（ｂ）、又はＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（ｃ）によりアッセイされた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
実施例２−組換え野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、用量依存的にヒアルロン酸（ＨＡ）と結合することができ、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）のＨＡへの走触性を阻害することができるが、変異型はそうでない
１ｍｇ  ｍｌ−１の高分子量ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを使用して、室温（ＲＴ）で一夜、マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）（Ｎｕｎｃ）プレートをコーティングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＲＴで２時間２％ＢＳＡによりブロッキングした。ＰＢＳで希釈された精製されたタンパク質をウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄の後、マウス抗ＧＳＴ抗体Ｂ−１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＲＴで１時間インキュベートした後、さらに洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｄａｋｏ）と共にＲＴで１時間インキュベートした。ＨＡ結合をＯＰＤ発色性基質（Ｓｉｇｍａ）により可視化し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。図２ａに示されるように、野生型ＣＤ４４融合タンパク質は、濃度依存的にＨＡと結合するが、変異体はそうでなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
対数増殖期のウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）を、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理した。細胞増殖を、顕微鏡写真撮影（図８ｂ）、又はＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（図８ｃ）によりアッセイした。図８ｃに示されるように、ＣＤ４４ＨＡＢＤ  ａａ２１〜１００、しかし２１〜６０又は９３〜１３０はそうでない。従って、内皮細胞増殖の阻害にとって重要な配列は、例えばＣＤ４４ＨＡＢＤのａａ６１〜１００（配列番号２６）の領域にマッピングされた配列を含む。しかしながら、完全ＣＤ４４ＨＡＢＤ内の隣接配列による寄付も、否定はされない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【図１】組換えのＧＳＴタンパク質及びＧＳＴ−ＣＤ４４タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーにより染色された。分子量マーカーが右側に示されている。
【図２ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ａ、野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、固定化されたＨＡと結合するが、Ｒ４１Ａ変異体、Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ変異体又はＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ変異体は結合しない。
【図２ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ｂ、ＣＤ４４ＨＡＢＤはヒト大動脈内皮細胞のＨＡへの遊走を阻害するが、Ｒ４１Ａ  ＨＡ非結合性変異体には効果がない。ＨＡ結合を阻止するＣＤ４４に対するモノクローナル抗体Ａ３は、内皮細胞遊走も阻害する。
【図３ａ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ａ、血管形成がｂＦＧＦにより誘導された典型的な血管形成実験からのフィルターディスク及び関連ＣＡＭ。
【図３ｂ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｂ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図３ｃ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｃ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図３ｄ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｄ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図４ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
【図４ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）及び肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
【図４ｃ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）の増殖を阻害することを示す。
【図５ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ａ、ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又は対照としてのＧＳＴにより処理されたヌードマウスにおけるｓ．ｃ．ＳＭＭＵ−１腫瘍の増殖曲線（各群ｎ＝８）。
【図５ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｂ、１６日目の腫瘍重量（黒線は中央値を表している）。
【図５ｃ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｃ、示されたようにして処理された１６日目のマウスの代表的な写真。
【図５ｄ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｄ、高倍率視野（ＨＰＦ）１個当たりの腫瘍辺縁における血管密度。＊（Ｐ＜０．００５）、＊＊（０．０５）有意な結果。
【図６ａ】ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質は、ヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（四角）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（三角）又は対照としてのＧＳＴ（菱形）により処理されたヌードマウスにおけるＢｘＰＣ−３膵臓腺癌腫瘍（ｎ＝６〜７）（ａ）。
【図６ｂ】ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質は、ヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ｂ、実験終了時の平均ＢｘＰＣ−３腫瘍重量。グラフ内の値及びバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。
【図７】組換えＣＤ４４ＨＡＢＤは内皮細胞周期を特異的に阻止する。ＧＳＴ（黒）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（薄い影）又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（濃い影）により処理された場合の、Ｓ期の細胞の割合。ＨＵＶＥＣ、ヒト血管内皮細胞；ＣＰＡＥ、ウシ肺動脈内皮細胞；ＮＨＤＦ、正常ヒト皮膚線維芽細胞；ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞。
【図８ａ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。
【図８ｂ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）が、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理された。細胞増殖は、顕微鏡写真（ｂ）。
【図８ｃ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（ｃ）によりアッセイされた。