【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年5月13日(2005.5.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン伝導ヒトＧＡＢＡA レセプター。
【請求項２】
少なくとも１つのＧＡＢＡA レセプターサブユニットを含み、前記サブユニットが、その第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中に１つまたはそれ以上の変異を持つ、請求項１に記載のレセプター。
【請求項３】
ＴＭ２に従って番号付けした場合に、−６' 〜−１' アミノ酸位置にて変異した、請求項２に記載のレセプター。
【請求項４】
少なくとも１つの変異αサブユニット、および／または少なくとも１つの変異βサブユニット、および／または少なくとも１つの変異γサブユニットを含む、請求項３に記載のレセプター。
【請求項５】
少なくとも１つの変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットを含む、請求項４に記載のレセプター。
【請求項６】
第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中に、１つまたはそれ以上の変異を含む、変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニット。
【請求項７】
ＴＭ２に関して番号付けした場合に、−６' 〜−１' アミノ酸位置にて変異した、請求項６に記載のレセプターサブユニット。
【請求項８】
１つの変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットである、請求項６〜７いずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項９】
配列Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 を含み、式中
Ｘ1 はＤまたはＥを表し、
Ｘ2 はＳ、ＣまたはＡを表し、
Ｘ3 はＧ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ4 はＥまたはＤを表し、および
Ｘ5 はＫまたはＲを表す、
請求項６〜８のいずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項１０】
配列ＤＳＧＥＫまたはその代配列（サブシークエンス）を含む、請求項６〜８のいずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項１１】
配列ＧＥ、ＳＧＥ、ＤＳＧＥ、ＧＥＫ、ＳＧＥＫ、ＤＳＧＥＫ、ＤＳ、ＤＳＧ、ＥＫおよびＧＥＫから選別された配列を含む、請求項１０に記載のレセプターサブユニット。
【請求項１２】
請求項６〜１１に記載の変異サブユニットをコードしている、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットをコードしている、請求項１２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１２〜１３に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１３に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターの活性を阻害するため、活性化するため、または調節するための、化学化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、スクリーニングすべき化学化合物の作用を受けること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、ＧＡＢＡまたは任意の他のＧＡＢＡ作用基質による活性化を受けること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の作用を決定すること、
の段階を含む方法。
【請求項１７】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−ｋ１細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＰＣ１２細胞、ＨｉＢ５細胞、ＲＮ３３ｂ細胞、またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）、または任意のカチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを発現可能な細胞株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターのイオン流束のモニタリングが、蛍光または放射リガンド方法を用いて実施される、請求項１６〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、蛍光インディケーターまたは放射リガンドとロードまたはインキュベートされ、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを通した、イオン流束の変化を決定可能である、請求項１６〜１８の任意に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光インディケーターが、ＦＬＵＯ−３、ＦＬＵＯ−４、カルシウム  グリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、ＦＵＲＡ−２、ＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ＣＤ２２２、ＢＣＥＣＦ、ＤＩＢＡＣ4 （３）、ＤｉＯＣ５（３）またはＤｉＯＣ２（３）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
放射リガンドが、Ｒｂ+ 、またはＴＰＰ+ 等の有機カチオンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターのイオン流束のモニタリングが、たとえばＦＬＩＰＲアッセイ（蛍光イメージプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）、モレキュラー  ディバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）より入手可能）を用いた、分光学的方法によって実施される、請求項１６〜２１の任意に記載の方法。
【請求項２３】
カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターのイオン流束のモニタリングが、パッチクランプ技術によって実施される、請求項１６〜２１の任意に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６〜２３に記載の方法にしたがって同定された、化学化合物。
【請求項２５】
疾患、疾病または状態が、ＧＡＢＡA レセプター不全に関連している
ヒトを含む哺乳動物の疾患または疾病または状態の診断、治療、予防または緩和のための、請求項２４にしたがって同定された化学化合物の使用。
【請求項２６】
前記疾患、疾病または状態が、喘息、急性心不全、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺癌、パーキンソン病、精神疾患および神経疾患、不安症、統合失調症、躁病、鬱病、ジスキネジー、記憶障害、睡眠障害、痙攣性疾患およびてんかんである、請求項２５に記載の使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
イオンチャネルの好ましい薬物スクリーニング方法には、通常９６または３８４ウェルの標準マイクロタイタープレートに数多く並んだウェル内の細胞へロードされるインディケーター化合物とともに、試験化合物および生物学的試薬の混合物を使用する、標準のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が含まれ、各ウェルからのシグナル、蛍光発色、細胞内ｐＨ、光学密度、放射活性などのいずれか、を測定する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
ＧＡＢＡA レセプターは、新規薬物の開発のための魅力的な対象である。しかしながら、ＧＡＢＡA レセプターは、塩化物チャネルであり、従来のＨＴＳ方法とは、互換性がない。さらに、ＧＡＢＡA レセプターを機能的に発現可能である細胞のほとんどが、その膜を介した適切な塩化物濃度勾配を維持しない。これらの標的を評価するためには、コストと時間がかかる電気生理学的方法が未だに好ましい方法である。                      
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｗａｎｇ  Ｃｈｉｈ−Ｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．：「ショウジョウバエからの変異ＧＡＢＡ−作動性塩化物チャネルにおける、カチオン浸透性およびカチオン−アニオン相互作用（Ｃａｔｉｏｎ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃａｔｉｏｎ−Ａｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  ＧＡＢＡ−Ｇａｔｅｄ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）」；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９９  ７７  ６９１−７００］は、Ｍ２領域に近い部分での変異によって、カチオン浸透可能となった、昆虫ＧＡＢＡレセプターを記述している。しかしながら、このレセプターは、薬物によって影響を受ける調節部位を含まず、ハイスループット薬物スクリーニングには適さない。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
Ｋｅｒａｍｉｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｋｅｒａｍｉｄａｓ  Ａ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ  ＡＪ，  Ｆｒｅｎｃｈ  ＣＲ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ＰＲ  ＆  Ｂａｒｒｙ  ＰＨ：「Ｍ２孔変異は、アニオン−からカチオン−感受性に、グリシンレセプターチャネルを変換する（Ｍ２  Ｐｏｒｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｖｅｒｔ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｉｎｇ  Ａｎｉｏｎ−  ｔｏ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）」；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．  ２０００  ７８  ２４７−２５９］は、塩化物伝導α１相同グリシンレセプターのＭ２膜貫通領域内で実施した３つの変異が、どのように前記レセプターをアニオン−からカチオン−選択性に変えるのかを記述している。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
第六の観点において、本発明は、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターの活性を阻害するため、活性化するため、または調節するための、化学化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、スクリーニングすべき化学化合物の作用を受けること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、ＧＡＢＡまたは任意の他のＧＡＢＡ作用基質による活性化を受けること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の作用を決定すること、
の段階を含む方法を提供する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
ＧＡＢＡA レセプターは、中枢神経系の主要な抑制性レセプターであり、会合して塩化物チャネルを形成する、５つのサブユニットからなる。現在まで、６つの主要な型のＧＡＢＡA レセプターサブユニット、すなわちαサブユニット（６つ、すなわちα１〜６が記述されている）、βサブユニット（３つ、すなわちβ１〜３が記述されている）、γサブユニット（３つ、すなわちγ１〜３が記述されている）、δサブユニット、ρサブユニット（ρ１〜３）、εサブユニットおよびθサブユニット、が記述されている。野生型（ｗｔ）ＧＡＢＡA レセプターは、主として、２つのα−、２つのβ−、および１つのγ−サブユニットからなると考えられているが、他の組み合わせも機能的であり、たとえば、αおよびβサブユニットのみからなるレセプターも機能的である。                      
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
本発明にしたがって、ＴＭ１およびＴＭ２膜貫通領域を橋渡ししている細胞内ループ内、および／またはＴＭ２それ自身内に挿入された一組の変異が、このレセプターが、塩化物イオンをもはや伝導せず、むしろカチオンを伝導することによって、カチオン−伝導ＧＡＢＡA レセプターを構成する様式で、変異レセプターの生理学に影響を与えることが分かってきた。                                                                    
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
さらに好ましい実施様態において、本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターは、少なくとも１つの変異αサブユニット、および／または少なくとも１つの変異βサブユニット、および／または少なくとも１つの変異γサブユニットを含む。さらに好ましい実施様態において、サブユニットは、変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットである。
（変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニット）
他の観点において、本発明は、その第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ内、および／または第二膜貫通領域（ＴＭ２）内に、１つまたはそれ以上の変異を含む、変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットを提供する。本発明の変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットは、野生型ＧＡＢＡA レセプターサブユニットの機能的誘導体であり、変異により野生型ＧＡＢＡA レセプターサブユニットより誘導され、したがって                                                                      、変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットであると特徴付けされうる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
本発明の変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットは、とりわけ、変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２またはγ３サブユニットでありうる。                                                                              
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチド配列と、操作可能に組み合わせた、制御配列を含んでよい。本明細書で定義したように、語句「操作可能な組み合わせ（ｉｎ  ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、操作可能要素、すなわち遺伝子（群）および制御配列が、望む発現に影響を与えるように、操作可能に連結されることを意味する。
（宿主細胞）
またさらなる観点において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチド配列、および／または本発明の組換え体発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
本発明の産出細胞は、好ましくは真核細胞、とりわけヒト細胞、または酵母細胞または糸状真菌細胞等の、真菌細胞であり得る。好ましい細胞には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ−ｋ１、ＢＨＫ、ＣＯＳ７、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ細胞、およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）、または本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを発現可能な、任意の他の細胞株が含まれる。
（薬物スクリーニングの方法）
本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターは、はじめて、薬物スクリーニング工程を、従来のハイスループットスクリーニング技術を用いて実施することを可能にする。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
好ましい実施様態において、本発明の方法には、以下の、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、スクリーニングすべき化学化合物の作用を受けること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞が、ＧＡＢＡまたは任意の他のＧＡＢＡ作用基質による活性化を受けること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の作用を決定すること、
の段階が含まれる。
（カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞）
本発明の方法にて使用される、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞は、好ましくは以上で記述したように、本発明の宿主細胞である。
（イオン流束のモニタリング）
本発明の方法にしたがって、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを介したイオン流束を、前記化学化合物によって引き起こされるイオン流束の阻害、活性化、または調節を決定するためにモニタする。イオン流束は、確立された方法を用いて、直接または間接的にモニタしてよい。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
より好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプター含有細胞は、化学試験基質およびＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ作用化合物の添加によって引き起こる、カチオン伝導ＧＡＢＡA レセプターを介したイオン流束の変化を決定可能である、蛍光色素または放射リガンドとともにロード、またはインキュベートする。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
変異挿入と、変異レセプターの発現
レセプターのイオン選択性が決定づけられる上での、ＧＡＢＡA レセプターサブユニットの影響を調査するために、変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットβ3 を、部位特異的変異導入によって設計した。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
結合アッセイ
結合研究を、標準の方法を用いて実施した。膜を、組換えＧＡＢＡA Ｒサブユニットを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞より調製した。この細胞を、ＰＢＳ（ライフ  テクノロジーズ）中で洗浄し、トリプシン処理し、トリス−クエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）中で２回洗浄し、５，０００ｇにて１０分間遠心分離した。
（［3 Ｈ］−ムシモール結合）
膜を膜洗浄緩衝液［２０ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 ／Ｋ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０２５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3 、および種々のプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ塩化ベンズアミジン、０．１ｍＭ塩化ベンゼトニウム、５０Ｕ／ｍｌバシトラシン、０．３ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｇ／ｌオボムコイドトリプシン阻害剤、１０ｍｇ／ｌダイズトリプシン阻害剤）］中に再懸濁させ、１７７，０００ｇ、４℃にて３０分間遠心分離した。ペレットを、結合アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 ／Ｋ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．５、および１００ｍＭ  ＫＣｌ）中に、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで再懸濁させ、使用の直前に均質化させた。結合を、２００μｇのタンパク質を含む、最終容量２５０μｌにて、１、３、１０、３０、１００または３００ｎＭの［3 Ｈ］−ムシモール（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）で３回実施し、非特異的結合を、１ｍＭ  ＧＡＢＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の存在下で測定した。試料を４℃にて３０分間インキュベートし、標識膜を、ＧＦ／Ｂフィルター（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））を用いて、ブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ）細胞回収機上で回収した。フィルターを、３×４ｍｌ結合アッセイ緩衝液で洗浄し、放射活性量を、液体シンチレーション計数機にて測定した。
（［3 Ｈ］−フルマゼニル結合）
膜をトリス−クエン酸緩衝液中に再懸濁させ、２２，０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。ペレットをタンパク質濃度１００〜２００μｇ／ｍｌまで、トリス−クエン酸緩衝液中で懸濁させた。結合を、５０〜１００μｇタンパク質を含む最終容量５５０μｌで、０．５、１、２、３または６ｎＭ  ［3 Ｈ］−フルマゼニル（８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー）にて３回実施し、非特異的結合を、１μＭクロナゼパム（ロシュ）の存在下で測定した。試料を、４℃にて４０分間インキュベートし、標識膜を、ＧＦ／Ｃフィルター（ワットマン）上での急速濾過によって回収した。フィルターを、２×５ｍｌのトリス−クエン酸緩衝液にて洗浄し、放射活性量を、液体シンチレーション計数機にて測定した。
（［35Ｓ］−ＴＢＰＳ結合）
膜をトリス−クエン酸緩衝液中に再懸濁させ、２２，０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。ペレットを、２００〜４００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで、２００ｍＭ  ＫＣｌを含む２０ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 緩衝液（ｐＨ  ７．４）中に再懸濁させた。結合を、１００〜２００μｇのタンパク質を含む、５５０μｌの最終容量で、５ｎＭ  ［35Ｓ］−ＴＢＰＳ（８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー）および０．６μＭ  ＧＡＢＡにて、３回実施し、非特異的結合を２００μＭのピクロトキシン（シグマ）の存在下で測定した。試料を、２０〜２２℃にて１５０分間インキュベートし、結合を、ワットマンＧＦ／Ｃフィルター上での急速濾過によって終了させた。フィルターを２００ｍＭ  ＫＣｌを含む、２×５ｍｌの２０ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 緩衝液（ｐＨ  ７．４）にて洗浄し、放射活性を、液体シンチレーション計数機によって測定した。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
特性化
実施例１〜２に従って得た、変異ＧＡＢＡA レセプターサブユニットβ3 を、逆転電位に関して、電気生理学的に特性化した。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６８】
すべての実験を、従来の全細胞パッチクランプ法を用いて、電位固定にて実施した。増幅器は、ＩＴＣ−１６インターフェースを介して、マッキントッシュＧ３コンピュータによって実行される、ＥＰＣ−９（ＨＥＫＡ−エレクトロニクス、ランブレクト（Ｌａｍｂｒｅｃｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ））であった。実験条件は、増幅器に付随するパルス−ソフトウェアにて設定した。データを、ローパスフィルターに通し、カットオフ周波数３回の割合で、ハードディスクに直接サンプリングした。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６９】
ピペットを、水平電極作製器（ツァイト−インストゥルメント（Ｚｅｉｔｚ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）を用いて、ホウケイ酸ガラス（モジュローム（Ｍｏｄｕｌｏｈｍ））より引き伸ばした。ピペット抵抗は、１．６〜２．６ｍΩであり、ピペットを、ｐＨ＝７．２に調整した、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液で満たした。ピペット電極は、銀線を塩化し、参照電極は、実験チャンバーに固定した塩化銀ペレット電極（イン  ビボ  メトリック（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｅｔｒｉｃ））であった。電極を密封直前に、バス中で、オープンピペットによってゼロとした。培養細胞を含むカバースリップを、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学およびマーキュリーランプ（オリンパス（Ｐｌｙｍｐｕｓ））を付属した、倒立顕微鏡（ＩＭＴ−２、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））の試料台上に取り付けした、１５μｌ実験チャンバーに移した。実験のために選んだ細胞は、マーキュリーランプからＵＶ光を曝露したときに、明緑色蛍光を発光した。ギガ−シール形成の後、全細胞構造を吸引によって得た。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 およびｐＨ＝７．４に調整した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液で、２．５ｍｌ／分の速度にて、連続的に洗い流した。５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１３５ｍＭ  グルコン酸ナトリウムおよびｐＨ＝７．４に調整した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む低塩化物細胞外溶液（グルコン酸−Ｒ）を使用して、塩化物浸透性を取り扱い、１４ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１２６ｍＭ  ＮＭＤＧおよび塩酸でｐＨ＝７．４に調整した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む低ナトリウム細胞外溶液（ＮＭＤＧ−Ｒ）を用いて、カチオン浸透性を取り扱った。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
ＧＡＢＡ含有溶液を、その先端を、細胞よりおよそ５０μｍに配置した、カスタムメイド重力依存フローパイプを通して、チャンバーに移送した。パルスソフトウェアによって制御したバルブを伴うフローパイプに連結した、チュービングの圧縮によって、添加を始動させた。一般的に、ＧＡＢＡを、各３０〜４０秒ごとに、０．５〜１秒間添加した。添加の間のサンプリング間隔は１ｍ秒であった。パッチクランプ実験は、室温（２０〜２２℃）にて実施した。電流を、応答のピークの時点で測定し、逆転電圧（Ｖｒｅｖ）を、各細胞に関して、Ｉ−Ｖプロットより直接読んだ。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
野生型および変異ＧＡＢＡA レセプターを、異なる細胞外溶液中の逆転電位に関連して特性化し、カチオンまたはアニオン伝導性を同定した。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
【表１】
2005506056.tif 000001
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７６】
＊（＋）は、野生型レセプターの結合の２５％以上を示し、（÷）は２５％以下を示す。
ＮＤ＝測定していない
表１で示したように、Ｎａ−Ｒからグルコン酸−Ｒへの逆転電位の移行は、野生型レセプターの塩化物伝導性を示しているが、変異レセプターは伝導性を示さず、一方で、Ｎａ−ＲからＮＭＤＧ−Ｒへの逆転電位の移行は、野生型レセプターに関してではなく、変異レセプターに関するカチオン伝導性を示唆している。