【手続補正書】
【提出日】平成17年11月30日(2005.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
糖尿病またはその発症の処置に有効な薬物が依然必要であり、本発明がその必要性を満たす。候補薬物の存在下でＰＡＩ−１活性についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較してＰＡＩ−１活性の減少を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けることにより、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニン方法が提供される。好ましくは、該候補化合物はＰＡＩ−１発現を減少させる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
さらに、本発明は、αｖβ３インテグリン活性を増加させるのに有効な薬物の医薬的有効量を個体に投与することによる、糖尿病または糖尿病の素因のある個体の処置方法を提供する。該薬物は、αｖβ３インテグリン自体またはその活性フラグメント（例えば、ＰＡＩ−１活性を阻害可能なフラグメント）、または個体のαｖβ３インテグリン活性を増加させる薬物、例えば、以下の実施例６で例示される活性化抗体である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
プラスミノーゲン活性化因子の強力な阻害因子であるＰＡＩ−１は様々な組織で発現されるが、最近、脂肪組織がその主な供給源であることが明らかにされた。肥満および２型糖尿病に罹患する患者の高い脂肪組織含有は、高レベルの血中循環ＰＡＩ−１を生じ（Loskutoff, D.J. et al., 1998, Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18(1):1-6; Juhan-Vague, I., et al., 1997, Thromb Haemost 78(1): 656-60）、ひいては血栓症およびアテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）の様な循環器系合併症を生じる。本発明者は、ＰＡＩ−１発現の上昇は、ＮＩＤＤＭの原因であって、単にＮＩＤＤＭの結果ではないことを提唱した。従って、本発明は、糖尿病に対して、または特に脂肪細胞でのＰＡＩ−１発現の阻害に基づいて糖尿病の発症を予防する際に有効な薬物のスクリーニング方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本明細書の実施例では終末まで分化した細胞として脂肪細胞を用いるが、本発明は、インシュリンＰＡＩ−１誘導が類似の機序によっても抑制されるか、あるいは他の遺伝子の実質的なＲｂ−Ｅ２Ｆ制御が所望される、他の細胞、特に、平滑筋細胞または肝細胞（これらに限らない）を含む終末まで分化した細胞でも適用される。それにもかかわらず、本発明のスクリーニングアッセイは特定の細胞に依存せず、実際には構成要素を用いて試験管内で行われる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
活性薬物は、医薬的に許容されかつ該活性薬物と相性の良い添加剤と、上記の治療方法での使用に適当な量で混合される。適当な添加剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールまたは同等のもの、およびその組合せであり、植物性油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびベンジルアルコール（点滴または液体調製物用）；およびワセリン、植物性油、動物性脂肪、およびポリエチレングリコール（外用調製物用）を含む。さらに所望なら、該組成物は、湿潤剤または乳化剤、等張剤、溶解促進剤、安定剤、着色剤、防腐剤、無痛化剤および同等の添加剤（従来通りの医薬調製物に対する補助添加剤）、ｐＨ緩衝剤、および有効成分の効果を増強する同等のものを含有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
脂肪細胞分化をオイルレッドＯでの脂質染色によりモニターした。要約すると、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド溶液で１時間固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞をオイルレッドＯ［０．５％ストック溶液（ｖ／ｖ、イソプロパノール中）の水中６０：４０（ｖ／ｖ）希釈］で１時間染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回、そして水で２回洗浄した。脂質−陽性細胞が誘導の３日目に明らかとなり始め、８日目までに９０％より多くなった。脂肪細胞分化の別のマーカーであるＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）ｍＲＮＡも３日目に明らかになり始め、５日目までにプラトーに達した。ＲＮＡ分析のため、酸性グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法で調製した総ＲＮＡ（１２μｇ）を、変性条件下でのアガロースゲル電気泳動で分離し、上記のナイロン膜に移した（ノーザンブロット）（Ziegler, A., et al., 1991, J Biol Chem 266(31): 21067-74）。当量のＲＮＡ添加し、そしてナイロン膜への移動をメチレンブルーでのｒＲＮＡ染色により確認した（Herrin, D. L. and G. W. Schmidt, 1988, Biotechniques 6(3): 196-7, 199-200）。プラスミド由来のＤＮＡインサートを、ランダムオリゴ開始反応を用いて｛α−３２Ｐ｝ｄＡＴＰで標識した（Feinberg, A. P. and B. Vogelstein, 1983, Anal.Biochem., 132: 6-13）。特異的なＲＮＡレベルをMolecular Dynamic社のホスホイメージャーを用いて測定した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
Ｅ２Ｆ１タンパク質のレベルを調べるために、６０ｍｍプラスチックディッシュの細胞をＰＢＳで洗浄し、４００μｌ溶解緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、１％Triton−Ｘ１００、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１０ｍＭ  ＤＴＴ］（ジチオスレイトール）で回収した。試料（２０μｇのタンパク質）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、二フッ化ビニリデン樹脂膜にブロットし、Ｅ２Ｆ１、２、および３に対するポリクローナル抗体を用いて分析した。増強化学発光検出法（ＥＣＬ；Amersham）を利用し、該膜をKodak Biomax MRフィルムに露光した。Ｅ２Ｆ１タンパク質のレベルの調査により、細胞がコンフルエントに至った後増殖を止めるが、それは実験期間中一定であったことを示した。このことは、それが、脂肪細胞終末分化中ダウンレギュレートされるＥ２Ｆタンパク質のレベルではなく、Ｅ２Ｆ活性である可能性を生じる。このことと一致して、別のＥ２Ｆ１ファミリーメンバーのＥ２Ｆ２および３（我々がＰＡＩ−１プロモーターの負の制御因子であると示した（Koziczak, M., et al., 2000, Mol Cell Biol 20(6): 2014-22））の分析も、細胞が分化する際、全く減少しないことを示した；Ｅ２Ｆタンパク質レベルは増加し、そしてＥ２Ｆ３はＥ２Ｆ１同様一定のままであった。異なるステージの細胞由来の核抽出物を用いる電気移動度シフトアッセイによるＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合活性の測定（実施例２参照）は、分化−依存性の減少を示した。このことはＥ２Ｆの制御が転写後、おそらく翻訳後であることを示している（実施例４参照）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
実施例２：Ｅ２ＦのＤＮＡ結合パターンの変化
脂肪生成の間のＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合パターンの変化を調べた。核抽出物を、分化誘導中の異なる時間でＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞から調製し、そのＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合活性を、アデノウイルスＥ２プロモーターの２つのタンデムＥ２Ｆ結合部位に対応する放射性Ｅ２ｐｒｏオリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡゲルシフトアッセイにより評価した。該オリゴヌクレオチドプローブを、Ｅ．ｃｏｌｉポリヌクレオチドキナーゼおよび｛γ−３２Ｐ｝ＡＴＰを用いて放射性標識した。電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に用いた該オリゴヌクレオチドは以下である（上方鎖のみ示す）：Ｅ２ｐｒｏ（アデノウイルスＥ２プロモーターの−７２から−３２領域に対応する；Ｅ２Ｆ結合部位）、５’−ＡＴＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＣＴＡＧ−３’（配列番号：１）；ＣｙｃＤ１（サイクリンＤ１プロモーター由来のＥ２Ｆ結合部位）、５’−ＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２）；ＣｙｃＤ１ｍ、５’−ＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：３、下線のヌクレオチドが変異）。核抽出物（４μｇ）をまず、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸］（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、８％グリセロール、１μｇサケ精子ＤＮＡ、６μｇウシ血清アルブミン、および１ｍＭ  ＤＴＴからなる２０μｌの結合反応液中で、貫通型ペプチドおよび抗体ありまたはなしで１５分間室温でインキュベートし、続いて０．３ｎｇの放射性標識オリゴヌクレオチドプローブの添加後、さらに１５分間インキュベートした。一定分量（５μｌ）の反応混合液を、０．２５×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液中の４．５％ポリアクリルアミドゲル泳動で室温で分離した。ゲルを乾燥させ、ホスホイメージャーを用いて分析した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例３：ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ相互作用の阻害
脂肪細胞分化中のＤＮＡ−タンパク質複合体の高分子量形へのシフトは、低分子量形が遊離し、活性化Ｅ２Ｆおよび高分子量形が、可能なら網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲＢとの巨大な複合体中の不活性化Ｅ２Ｆであることを示す（Helin, K., 1998, Curr Opin Genet Dev 8(1): 28-35; Nevins, J. R., 1998, Cell Growth Differ 9(8): 585-93）。従って、脂肪細胞でのＥ２Ｆ再活性化、そしてこれにより、可能なｐＲＢ−Ｅ２Ｆ複合体を阻止することによりＰＡＩ−１発現を調節するための可能性が検討される。生理学的に、ｐＲＢを、ｐ１６ＩＮＫおよびｐ１９ＡＲＦの様な低分子量の様々な阻害分子の負の制御下にあるｃｄｋ４／６が仲介するｐＲＢの過剰リン酸化を通じて、Ｅ２Ｆから分離できる。しかしながら、脂肪細胞でのＥ２Ｆの再活性化は明らかになっておらず、この実施例はｐＲＢ−Ｅ２Ｆ相互作用の物理的競合を示すことで本発明を例示する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
競合を、Ｅ２Ｆ１のｐＲＢ−結合領域に対応するＥ２Ｆ１のアミノ酸４０２〜４１９（Helin, K., et al., 1992, Cell 70(2): 337-50）に由来する配列の過剰量特異的ペプチド、または特異的ペプチドと同じアミノ酸組成だがランダムに入れ替えた配列の対照ペプチドを用いて、ＥＭＳＡ（実施例２参照）により調べた。放射性Ｅ２ｐｒｏオリゴヌクレオチドおよび８日目のＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞由来の核抽出物を用いたＥＭＳＡにおいて、特異的干渉ペプチドを結合反応液に増加濃度で添加した。高分子量形のＤＮＡ−タンパク質複合体から低分子量型の複合体へのシフトが見られた。対照ペプチドでは何も見られなかった。これらの結果は、ｐＲＢとＥ２Ｆとの相互作用を干渉するために特異的ペプチドを使用することの実行可能性を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
結合ペプチドの細胞−貫通を可能にする１８アミノ酸長のＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の特異的領域を干渉ペプチドのアミノ末端に結合することにより、細胞貫通性を改善するために特異的ポリペプチドを修飾した（Schwarze, S. R., et al., 1999, Science 285(5433): 1569-72）。この長くした干渉ペプチドのＥ２Ｆへの作用を、まず上記の試験管内で評価した。アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ２Ｆ−結合部位のＤＮＡ−タンパク質複合体は、増加濃度で特異的な細胞貫通型ペプチドを結合混合液に加えると低分子量形にシフトしたが、対照細胞−貫通型ペプチドは何の作用も示さなかった。該結果は、干渉ペプチドのアミノ末端への１１アミノ酸の添加がＥ２Ｆ−ｐＲＢ複合体の分離能力には影響しないことを示す。続いて、ペプチドが試験管内でＥ２Ｆ−ｐＲＢ相互作用と干渉するかどうかを調べた。このため、まず脂肪細胞（誘導後８日）を異なる濃度の細胞−貫通型干渉ペプチドで１６時間処理し、核抽出物をＥＭＳＡによる分析のため調製した。細胞−貫通型干渉ペプチドはＤＮＡ−タンパク質複合体を低分子量形にシフトしたが、対照ペプチドはしなかった。これらの結果は、特異的な細胞−貫通型ペプチドが実際に細胞を貫通し、Ｅ２Ｆ−ｐＲＢ複合体を遊離Ｅ２Ｆに変換することを示す。