【手続補正書】
【提出日】平成17年6月21日(2005.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化の幹細胞を中胚葉性の細胞へと分化させる非自然的かつ制御された分化を起こす方法であって、未分化幹細胞の中胚葉細胞への分化を誘導する分化シグナルを未分化の幹細胞に適用することを含む、方法。
【請求項２】
中胚葉性細胞系譜の分化細胞のサブ集団を含む細胞集団を得る方法であって、分化細胞は、細胞集団において未分化幹細胞に由来し、請求項１の方法により未分化幹細胞の分化を引き起こすことを含む方法。
【請求項３】
分化シグナルは、幹細胞の分化を誘導できる影響因子の存在下で、未分化幹細胞を培養することにより適用される請求項１又は２の方法。
【請求項４】
影響因子が、胚細胞から分泌され、分化を制御及び誘発する小分子、成長因子及びサイトカインを含む細胞外因子並びに胚細胞から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
胚細胞が、内胚葉細胞又は外胚葉細胞である請求項４の方法。
【請求項６】
胚細胞が、内胚葉細胞である請求項５の方法。
【請求項７】
細胞が、内臓内胚葉の組織又は内臓内胚葉様の組織に由来する請求項５又は６の方法。
【請求項８】
内臓内胚葉の組織又は内臓内胚葉様の組織が、初期の原腸形成後胚に由来する請求項７の方法。
【請求項９】
内臓内胚葉様の組織が、胚細胞系である請求項７又は８の方法。
【請求項１０】
胚細胞系が、ＥＮＤ−２細胞系である請求項９の方法。
【請求項１１】
胚細胞系が、マウス胚Ｅ７．５に由来する請求項４〜１２のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
幹細胞が、胚性幹細胞、多能性幹細胞、血球系幹細胞、全能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される請求項１〜１１のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
幹細胞が、胚性幹細胞である請求項１２の方法。
【請求項１４】
幹細胞が、多能性幹細胞である請求項１２又は１３の方法。
【請求項１５】
幹細胞が、ヒトのものである請求項１〜１４のいずれか１項の方法。
【請求項１６】
胚細胞を実質的に集密な単層にまで予備培養することと、
胚細胞単層及び／又は胚細胞単層の細胞外培地の存在下で、幹細胞を共培養することと
をさらに含む請求項１〜１５のいずれか１項の方法。
【請求項１７】
幹細胞と胚細胞単層が、フィルター又は細胞マトリクスにより分離されている請求項１６の方法。
【請求項１８】
未分化幹細胞が、筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、血球細胞又は神経細胞からなる群から選択される細胞又は細胞系譜に分化する請求項１〜１７のいずれか１項の方法。
【請求項１９】
幹細胞が、筋細胞又は血管内皮細胞に分化する請求項１８の方法。
【請求項２０】
筋細胞が、心筋細胞又は骨格筋細胞に分化する請求項１９の方法。
【請求項２１】
幹細胞が心筋細胞又は心筋細胞の細胞系譜に分化し、
胚内臓内胚葉の細胞及び／又は胚内臓内胚葉の細胞の細胞外培地の存在下で幹細胞を培養することにより、分化シグナルを適用することを含む請求項２０の方法。
【請求項２２】
幹細胞が骨格筋細胞又は骨格筋細胞の細胞系譜に分化し、
胚外胚葉の細胞及び／又は胚外胚葉の細胞の細胞外培地の存在下で幹細胞を培養することにより、分化シグナルを適用することを含む請求項２０の方法。
【請求項２３】
幹細胞が血管内皮細胞又は血管内皮細胞の細胞系譜に分化し、
胚外胚葉の細胞及び／又は内胚葉の細胞の存在下で、及び／又は、胚外胚葉の細胞及び／又は内胚葉の細胞の存在下で幹細胞を培養することにより、分化シグナルを適用することを含む請求項２０の方法。
【請求項２４】
外胚葉組織及び／又は内胚葉組織が、胚体外のものである請求項２３の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦの存在下で幹細胞を培養することをさらに含む請求項２４の方法。
【請求項２６】
幹細胞が遺伝的に改変されている請求項１〜２５のいずれか１項の方法。
【請求項２７】
サブ集団が心筋細胞から本質的になる請求項２〜２１及び２６のいずれか１項の方法。
【請求項２８】
サブ集団が骨格筋細胞から本質的になる請求項２〜２０、２２及び２６のいずれか１項の方法。
【請求項２９】
サブ集団が血管内皮細胞から本質的になる請求項２〜２０及び２３〜２６のいずれか１項の方法。
【請求項３０】
細胞集団中の未分化幹細胞に由来する、細胞系譜の分化細胞のサブ集団を含む単離細胞集団。
【請求項３１】
分化した細胞のサブ集団は、細胞集団中の５％より多い請求項３０の単離細胞集団。
【請求項３２】
細胞系譜の分化した細胞のサブ集団から本質的になる請求項３０又は３１の単離細胞集団。
【請求項３３】
分化した細胞のサブ集団は、筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、血球細胞及び神経細胞からなる群から選択される請求項３０〜３２のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項３４】
分化した細胞のサブ集団は、筋細胞又は血管内皮細胞から本質的になる請求項３０〜３３のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項３５】
筋細胞は、心筋細胞又は骨格筋細胞である請求項３４の単離細胞集団。
【請求項３６】
筋細胞は、心筋細胞である請求項３５の単離細胞集団。
【請求項３７】
筋細胞は、骨格筋細胞である請求項３５の単離細胞集団。
【請求項３８】
分化した細胞のサブ集団が、血管内皮細胞から本質的になる請求項３４の単離細胞集団。
【請求項３９】
幹細胞が、胚性幹細胞、多能性幹細胞、血球系幹細胞、全能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される請求項３０〜３８のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項４０】
幹細胞が、胚性幹細胞である請求項３０〜３９のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項４１】
幹細胞が、多能性幹細胞である請求項３０〜４０のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項４２】
幹細胞がヒトのものである請求項３０〜４１のいずれか１項の単離細胞集団。
【請求項４３】
請求項２〜２９のいずれか１項の方法により調製された単離細胞集団。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか１項の方法により調製された分化した細胞。
【請求項４５】
請求項２１又は２７の方法により調製した心筋細胞。
【請求項４６】
請求項２２、２６又は２８の方法により調製した骨格筋細胞。
【請求項４７】
請求項２３〜２６又は２９のいずれか１項の方法により調製された内臓内皮細胞。
【請求項４８】
胚細胞又は培養された胚細胞の細胞外培地に由来する、幹細胞の特異的分化を引き起こす単離された因子。
【請求項４９】
胚細胞が、内胚葉細胞又は外胚葉細胞である請求項４８の因子。
【請求項５０】
胚細胞が、内臓の内胚葉組織又は内臓の内胚葉様組織である請求項４８又は４９の因子。
【請求項５１】
内臓の内胚葉組織又は内臓の内胚葉様組織が、初期の原腸形成後胚に由来する請求項５０の因子。
【請求項５２】
内臓の内胚葉様組織が、胚細胞系である請求項５０又は５１の因子。
【請求項５３】
胚細胞系が、ＥＮＤ−２細胞系である請求項５２の因子。
【請求項５４】
胚細胞が、マウス胚Ｅ７．５に由来する請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の因子。
【請求項５５】
外胚葉組織に由来する請求項４８又は４９の因子。
【請求項５６】
内胚葉組織及び外胚葉組織に由来する請求項４８又は４９の因子。
【請求項５７】
外胚葉組織及び内胚葉組織が、胚体外のものである請求項５６の因子。
【請求項５８】
請求項４８〜５４のいずれか１項の因子の存在下で、幹細胞を培養することを含む、幹細胞の細胞系譜への分化を引き起こす方法。
【請求項５９】
請求項５５の因子の存在下で、幹細胞を培養することを含む、幹細胞の細胞系譜への分化を引き起こす方法。
【請求項６０】
請求項５６又は５７の因子の存在下で、幹細胞を培養することを含む、幹細胞の細胞系譜への分化を引き起こす方法。
【請求項６１】
請求項５８〜６０のいずれか１項の方法により調製された分化した細胞。
【請求項６２】
請求項５８の方法により調製された心筋細胞。
【請求項６３】
請求項５９の方法により調製された骨格筋細胞。
【請求項６４】
請求項６０の方法により調製された血管内皮細胞。
【請求項６５】
請求項３０〜４３のいずれか１項により調製された単離細胞集団及び／又は該細胞集団の創始細胞を患者に導入することを含む、患者の心臓疾患又は心臓の状態を治療または予防する方法。
【請求項６６】
単離細胞集団は、心筋細胞又は心筋細胞の創始細胞から本質的になる請求項６０の方法。
【請求項６７】
心筋細胞又は心筋細胞の創始細胞が、胚内臓内胚葉細胞及び／又は胚内臓内胚葉細胞の細胞外培地の存在下で、幹細胞を共培養した培養物に由来する請求項６６の方法。
【請求項６８】
心臓疾患又は心臓の状態が、心筋梗塞又は心臓肥大からなる群から選択される請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項３０〜４３のいずれか１項の単離細胞集団及び／又は該細胞集団の創始細胞を、損傷した心臓組織に導入することを含む、損傷した心臓組織を修復する方法。
【請求項７０】
単離細胞集団が、心筋細胞又は心筋細胞の創始細胞から本質的になる請求項６９の方法。
【請求項７１】
心筋細胞又は心筋細胞の創始細胞が、胚内臓内胚葉細胞及び／又は胚内臓内胚葉細胞の細胞外培地の存在下で、幹細胞を共培養した培養物に由来する請求項７０の方法。
【請求項７２】
損傷した心臓組織が、心臓の虚血の結果によるものである請求項６９〜７１の方法。
【請求項７３】
請求項３０〜４３のいずれか１項の単離細胞集団及び／又は該細胞集団の創始細胞を、患者の筋肉に導入することを含む、患者の筋肉疾患を治療又は予防する方法。
【請求項７４】
単離細胞集団が、骨格筋細胞又は骨格筋細胞の創始細胞から本質的になる請求項７３の方法。
【請求項７５】
骨格筋細胞が、胚外胚葉細胞及び／又は胚外胚葉細胞の細胞外培地の存在下で、幹細胞を共培養した培養物に由来する請求項７３又は７４の方法。
【請求項７６】
筋肉疾患が、筋ジストロフィーである請求項７３〜７５のいずれか１項の方法。
【請求項７７】
胚外胚葉細胞及び／又は内胚葉細胞、及び／又は胚外胚葉細胞及び／又は内胚葉細胞の細胞外培地の存在下で、共培養された請求項３０〜４３のいずれか１項の単離細胞集団及び／又は前記細胞集団の創始細胞を、患者の筋肉に導入することを含む、血管組織における血管疾患を治療又は予防する方法。
【請求項７８】
単離細胞集団は、血管内皮細胞又は血管内皮細胞の創始細胞を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
血管内皮細胞又は血管内皮細胞の創始細胞は、胚外胚葉細胞及び／又は内胚葉細胞、及び／又は胚外胚葉細胞及び／又は内胚葉細胞の細胞外培地の存在下で、幹細胞を共培養した培養物に由来する請求項７７又は７８の方法。
【請求項８０】
血管疾患は、遺伝性出血性毛細血管拡張症及び糖尿病又は喫煙の結果による血管機能低下からなる群から選択される請求項７７〜７９のいずれか１項の方法。
【請求項８１】
請求項４５の心筋細胞又は心筋細胞の創始細胞を移植により受容できる、心機能の測定可能なパラメーターを有する免疫不全動物と、
心筋細胞の移植の前後に前記動物の心機能を決定する手段と
を含む、心臓移植のための心筋細胞の適合性を試験するためのモデル。
【請求項８２】
免疫不全動物が、梗塞後の心筋変性のモデルとして作成された請求項８１のモデル。
【請求項８３】
心機能のパラメーターが収縮機能である請求項８１又は８２のモデル。
【請求項８４】
請求項８１〜８３のいずれか１項のモデルにより決定された心臓の修復のために選択された心筋細胞。
【請求項８５】
インビトロの幹細胞に由来する心筋細胞。
【請求項８６】
幹細胞の指向された分化に由来する心筋細胞。
【請求項８７】
幹細胞が胚性幹細胞である請求項８６の心筋細胞。
【請求項８８】
幹細胞が、ヒトの胚性幹細胞である請求項８５〜８７のいずれか１項の心筋細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
（ｄ）イオンチャンネル発現のための半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
１％ジメチルスルホキシド（ＲｕｄｎｉｃｋｉおよびＭｃＢｕｒｎｅｙ著、１９８７年）の存在下、凝集プロトコールによりＰ１９ＥＣ細胞を収縮筋に分化させた。これらの培養条件で１６日後、収縮心房を切除し、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて単離し、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて逆転写した。心臓アクチン（Ｌａｎｓｏｎら著、（１９９２年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第８５巻、１８３５〜１８４１頁）、ＭＬＣ２ｖ（Ｍｅｙｅｒら著、（２０００年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，第４７８巻、１５１〜１５８頁）、ＥＲＧ（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒら著、（１９９７年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第８１巻、７１９〜７２６頁）およびＫｉｒ２．１（Ｖａｎｄｏｒｐｅら著、（１９９８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７３巻、２１５４２〜２１５３３頁）用のプライマーを、前述のように用いた。マウスＬ型カルシウムチャンネルサブユニットα１ｃ（センス５−ＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡ（配列番号１）；アンチセンス５'−ＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号２）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０１７７６；生成物寸法７４５ｂｐ）、Ｓｃｎ５ａ（センス５'−ＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号３）；アンチセンス５'−ＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＧ（配列番号４）；ＡＪ２７１４７７、７７０ｂｐ）およびβ−チューブリン（センス５−ＴＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＡＣＣ（配列番号５）；アンチセンス５'−ＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＴＧＣ（配列番号６）；Ｘ０４６６３、３１９ｂｐ）用のプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ製、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて設計した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
ｉｖ）（半定量的）ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて単離し、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて逆転写した。α１ｃ（Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら著、１９９９年）、Ｋｖ４．３（Ｃａｌｍｅｌｓら著、２００１年、Ｒｅｆ）およびＡＮＦ（Ｋｅｈａｔら著、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０８巻、４０７〜４１４頁）様のプライマーは前述の如くである。ヒトＫｖＬＱＴ１（センス５'−ＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣ（配列番号７）；アンチセンス５'−ＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＣＴＴＧ（配列番号８）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０００５７１；生成物寸法７２３ｂｐ）およびβ−チューブリン（センス５'−ＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡ（配列番号９）；アンチセンス５'−ＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡ（配列番号１０）；ＡＦ１４１３４９、３６９ｂｐ）用のプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ製、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて設計した。アニーリング温度および増幅サイクル数：ＡＮＦ、５８℃、３５サイクル；α１ｃ、５６℃、３８サイクル；Ｋｖ４．３、５５℃、３５サイクル；ＫｖＬＱＴ１、５８℃、３２サイクル；β−チューブリン、６１℃、３０サイクル。エチジウムブロミド１．５％染色アガロースゲル上で生成物を分析した。