【手続補正書】
【提出日】平成17年9月8日(2005.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項２】
第一の一本鎖核酸プローブ配列が、チオール末端アルキル鎖などのチオール末端5'末端を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAまたはRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
インターカレート性酸化還元活性部分がメチレンブルーである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
非インターカレート性酸化還元活性部分がフェリシアン化物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分と非インターカレート性酸化還元活性部分とを含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項７】
誘導体化核酸プローブ配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
電極が金または炭素である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
二本鎖核酸を電極に沈着させる前に、二本鎖核酸にMgCl2などの塩を加える、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
添加した塩が、100 mMの濃度などの10 mMより大きい濃度を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層が、約50 pmol/cm2などの約35 pmol/cm2から約60 pmol/cm2、または約1 pmol/cm2などの約0.5 pmol/cm2から約35 pmol/cm2である、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させて、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレートしてスタッキングされるインターカレート性酸化還元活性部分、および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項１４】
インターカレート性酸化還元活性部分がメチレンブルーである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
非インターカレート性酸化還元活性部分がフェリシアン化物である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
インターカレート性酸化還元活性部分が核酸改変被膜に共有結合していない、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基ミスマッチを検出する方法：
a）第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブを含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列ミスマッチを有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列ミスマッチの有無が示される段階。
【請求項１８】
一塩基ミスマッチがグアニン-アデニン対形成；またはアデニン-アデニン対形成；またはグアニン-グアニン対形成、チミン-チミン対形成、シトシン-シトシン対形成、グアニン-チミン対形成、シトシン-チミン対形成、またはシトシン-アデニン対形成である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
一つまたは複数の一塩基配列損傷が疾患に関連する、遺伝子配列の一部における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）遺伝子の配列の誘導体化部分を含む第一の一本鎖核酸プローブ配列を、遺伝子の野生型部分を含む配列の第二の一本鎖核酸部分に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、遺伝子配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階（ここで塩基スタッキング障害または一塩基配列損傷が疾患に関連する）。
【請求項２１】
遺伝子配列の一部が、長さ200ヌクレオチドまで、または長さ10ヌクレオチドから50ヌクレオチド、または長さ15ヌクレオチドから35ヌクレオチドである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子がヒトp53遺伝子である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の天然に存在するDNA損傷を検出する方法：
a）DNA損傷を含む第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数のDNA損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数のDNA損傷の有無が示される段階。
【請求項２４】
DNA損傷が、8-オキソ-アデニンなどの酸化ヌクレオチドである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
DNA損傷が、5,6-ジヒドロチミンなどのヒドロキシピリミジンである、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
DNA損傷が脱塩基部位である、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
DNA損傷がヌクレオチドの脱アミノ化（シトシンなど）である、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
DNA損傷が、グアニンと対形成したデオキシウラシルである、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、位置づけ可能な多電極アレイ上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を位置づけ可能な多電極アレイに付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が位置づけ可能な多電極アレイに付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項３０】
多電極アレイが金電極または炭素電極を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
多電極アレイの電極の直径が500 μmまたはそれ未満である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が超微小電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を超微小電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が超微小電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項３３】
以下の段階を含む、DNAとRNAとのハイブリッドにおける一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、DNAとRNAとのハイブリッドにおける一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項３４】
第一の一本鎖核酸プローブ配列がDNAであって、第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
RNAがmRNAである、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
DNAがcDNAである、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
誘導体化野生型標的核酸試料の一部における、一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、誘導体化野生型標的核酸試料の一部を含む第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、誘導体化野生型標的核酸試料の一部における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項３８】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAまたはRNAである、請求項1から32または37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列における塩基フリッピングを検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が、電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合による塩基フリッピングの有無が示される段階。
【請求項４０】
タンパク質が、メチルトランスフェラーゼHhaI（M.HhaI）、Q237W、またはウラシル-DNAグリコシラーゼである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列における塩基スタッキング障害を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、そして第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖における一つまたは複数の塩基スタッキング障害の有無が示される段階。
【請求項４２】
タンパク質が、TATAボックス結合タンパク質（TBP）、または制限エンドヌクレアーゼPvuII（R. PvuII）である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応を電気的にモニターする方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が、電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖における酵素反応の有無が示される段階。
【請求項４４】
第一の一本鎖誘導体化核酸配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項39、41、または43記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
電極が金である、請求項39、41、または43記載の方法。
【請求項４７】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられる、請求項39、41、または43記載の方法。
【請求項４８】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられない、請求項39記載の方法。
【請求項４９】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられない、請求項41または43記載の方法。
【請求項５０】
二本鎖核酸を電極上に沈着させた後に、電極表面をメルカプトヘキサノールと接触させる、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
二本鎖核酸を電極に沈着させた後に、電極表面がメルカプトヘキサノールによって埋め戻される、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
電気化学プローブがダウノマイシン（DM）である、請求項39、41、または43記載の方法。
【請求項５３】
ダウノマイシンが、第一の一本鎖核酸配列の二本鎖末端近傍のグアニン残基に、共有結合によって架橋される、請求項39、41、または43記載の方法。
【請求項５４】
タンパク質が、PvuIIなどの制限エンドヌクレアーゼである、請求項43記載の方法。