【手続補正書】
【提出日】平成17年9月27日(2005.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも0.2 ng/mlのブタIL-3および少なくとも8 ng/mlのブタSCFを含む培地中で、ブタ胎児の肝臓または骨髄から得られた幹細胞を培養に付すことからなることを特徴とするブタ肥満細胞培養物を獲得する方法。
【請求項２】
細胞が、少なくとも60〜70日、前記培地中の培養物で維持されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
不死化腫瘍遺伝子で前記培養物の細胞を形質転換することも含むことを特徴とする請求項1および2のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法を用いて得ることができるブタ肥満細胞培養物。
【請求項５】
−受託番号I-2735の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された系統；
−受託番号I-2736の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された系統；
−受託番号I-2734の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された系統
から選択される請求項4に記載のブタ肥満細胞培養物。
【請求項６】
肥満細胞活性化の研究のためのモデルとしての、請求項4および5のいずれか1項に記載のブタ肥満細胞培養物の使用。
【請求項７】
肥満細胞活性化を誘導することができる抗原をインビトロでスクリーニングするための、請求項4および5のいずれか1項に記載のブタ肥満細胞培養物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
肥満細胞培養は、種々の炎症および／または免疫現象、例えば種々の病原体、特に寄生生物による攻撃に対するアレルギー応答もしくは免疫応答の範囲内に関与する機構の研究に有用な手段を構成する。しかしながら、現在まで、肥満細胞培養は、ヒトまたはげっ歯類の細胞の場合にのみ、インビトロで分化および維持することに成功している；加えて、わずかな数の肥満細胞系統のみが、現在、利用可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の目的は、ブタを起源とする肥満細胞培養物、およびこれらの培養物に由来する細胞系統を提供することである。実際、その経済的な興味のほかにも、ブタは、生理学上および臨床上の研究の範囲内においてますます用いられているモデルを構成する。さらに、ブタはヒトに伝染性の寄生生物(トリキネラ(Trichinella)、シスチセルクス(cysticercus)、トキソプラズマ(toxoplasm))を有し、これらの寄生生物に対する防御の機構における肥満細胞により演じられる役割についての研究は、動物の健康および公衆衛生（医療上の予防）の観点から、非常に有用である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
以前の研究は、腫瘍（肥満細胞腫）からのみ単離されたヒトおよびげっ歯類の肥満細胞系統の樹立が、培地中で単一の特定のサイトカインの存在を要求することを示している。
ブタ肥満細胞腫の存在は、非常に希に起こり、これが、この種から肥満細胞系統を得ることを現在まで妨げている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は、本発明のブタ肥満細胞培養物から得られる肥満細胞のいずれの副次集団、系統またはクローンをも特に包含する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本明細書における「培養物」の語は、一般に、インビトロで培養された細胞または細胞の組を表す。動物から採取された細胞または組織サンプルから直接作製した培養物は、「初代培養物」とよばれる。「系統」の語は、継代培養において少なくとも1継代、および通常はいくつかの連続した継代が一旦成功して行われれば用いられ、これに由来するいずれの培養物をも表す。「クローン」の語は、初代培養物または系統の単一の細胞に由来する細胞の組を表す(SCHAEFFER、In Vitro Cellular and Developmental Biology、26、91〜101、1990)。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
よって、本発明の主題は、より特異的には：
−受理番号I-2735の下で、2001年10月17日にCNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [French National Collection of Cultures and Microorganisms], Institut Pasteur, 26 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France)に寄託された、ブタ胎児肝臓幹細胞に由来する肥満細胞の系統；
−番号I-2736の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された、ブタ胎児肝臓幹細胞に由来し、SV40ウイルスT腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた肥満細胞の系統；
−番号I-2734の下で、2001年10月17日にCNCMに寄託された、ブタ胎児骨髄幹細胞に由来し、SV40ウイルスT腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた肥満細胞の系統である。
これらの全ての細胞は、上記で定義した条件下で培養することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
例えばトリキネラの場合、これらの抗原は、動物における旋毛虫症の診断（野猪科の動物(Suidae)における旋毛虫症の早期診断）、またはワクチンの開発（例えば粘膜ワクチン化）に適用することができる。
本発明は、本発明に従ってブタ肥満細胞培養物および系統を得ることを記載する、限定しない例について言及する、次の更なる記載からより明確に理解されるであろう。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
IgE受容体
種々の培養時間における直接染色を、FITC抗−マウスIgE抗体を用いて、培養における肥満細胞についてのフローサイトメトリーにより行った。RBL細胞(肥満細胞中に形質転換したラット好塩基球の系統)を、ポジティブコントロールとして用いた。
−培養中の細胞1 mlを、約106 細胞/mlで各チューブに用いる。
−細胞を遠心分離して培地を除去する。
−ペレットをPBS+1% BSA 1 mlに採取し、+4℃で30分間インキュベートする。
−チューブを遠心分離し、ペレットを、4/100に希釈したFITC抗−マウスIgE抗体100μlに採取し、+4℃で30分間インキュベートする。
−PBS 2 mlでリンスを行い、次いでチューブを遠心分離する。
−ペレットをPBS 1 ml中に回収する。
FACSにより読み取りを行う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例2：腫瘍遺伝子でトランスフェクションされたブタ肥満細胞の系統の取得
培養における細胞の不死化
培養202日における2×105の胎児肝臓肥満細胞のサンプルを、人工リポソームFuGENE6 (BOEHRINGER-MANNHEIM)と組合わせた、Sca1制限酵素で予め線状化したベクターpLM13を用いたリポフェクションによりトランスフェクションする。ベクターpLM13は、SV40空胞化シミアンウイルスのT腫瘍遺伝子(Tts)の熱感受性変異体をエンコードする配列、およびネオ遺伝子（ゲネチシン(geneticin)に耐性）をエンコードする配列を含む。これらの配列は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
得られた系統の特性決定
トランスフェクションされた肥満細胞の培養物は、その形態およびヘパリンの存在の点で、トランスフェクションされていない肥満細胞の培養物と同じ特徴を示す。
これらは、同じc-キット受容体の特徴をも有する。しかしながら、IgE受容体に関して
は、トランスフェクションされていない肝臓肥満細胞の培養物の場合にD639において観察された2つの細胞集団の代わりに、単一の集団が観察された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例3：培養における肥満細胞によるヒスタミンの産生
肥満細胞中のヒスタミンアッセイ：
培養976日目において、CNCM I-2735 (肝臓)、CNCM I-2736 (SV40 Tts腫瘍遺伝子によりトランスフェクションされた肝臓)およびCNCM I-2734 (SV40 Tts腫瘍遺伝子によりトランスフェクションされた骨髄)の3つの細胞系統におけるヒスタミンを分析した。細胞を血清を含まない完全MEMα培地におく。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
1）細胞の調製：
各系統の50000の細胞を、5% CO2の存在下、カルシウムイオノフォアA23187 500μMおよびPMA (ホルボール  ミリステート  アセテート) 5μMとともに37℃で30分間活性化した。非活性化コントロールとして用いるために、各系統の同じ数の細胞を37℃においた。
次いで細胞を遠心分離し、上清とペレットも回収し、ヒスタミンを分析するときまで-80℃で凍結した。