【手続補正書】
【提出日】平成18年5月24日(2006.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の遺伝子型、表現型、演出型、および遺伝的バックグラウンドをすべてが有する複数の非ヒト変異動物を確立する方法であって、以下の工程：
（ａ）性的に未熟な雌性非ヒト変異創始動物（Ｇ０）において過排卵を誘発させる工程；
（ｂ）該過排卵する性的に未熟な雌性非ヒト変異創始動物を受精させる工程；
（ｃ）妊娠期の完了時に第一世代非ヒト変異動物（Ｆ１）を分娩させる工程；
（ｄ）該第一世代非ヒト変異動物において、該変異の安定性、遺伝子型、表現型、演出型、および遺伝的バックグラウンドの同一性を確認する工程；および
（ｅ）さらなるすべての世代の非ヒト変異動物を用いて、少なくとも２０世代の間、工程（ａ）から工程（ｃ）を反復する工程
を包含し、ここで各工程において、遺伝的要因および環境的要因がモニタリングされ、全ての非ヒト動物に対して厳密に同一であるように保たれ、
各世代において、該変異の安定性、ならびに遺伝子型、表現型、演出型、および遺伝的バックグラウンドの同一性が、定期遺伝的モニタリングおよび環境的要因のスポットチェックに供され；そして
各世代の変異体は、該定期遺伝的モニタリングおよびスポットチェックによって、該変異が安定であり、かつ該遺伝子型、表現型、演出型、および遺伝的バックグラウンドが該非ヒト変異創始動物の遺伝子型、表現型、演出型、および遺伝的バックグラウンドとそれぞれ同一であることが確認された場合にのみ、受精させられる、方法。
【請求項２】
受精が、前記雌性非ヒト動物と雄性非ヒト動物との自然交配によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、受精が、
（ｂ．１）前記過排卵する成熟前非ヒト動物から得られる卵母細胞をインビトロ受精に供する工程；
（ｂ．２）該受精した卵母細胞を初期胚期までインビトロで培養する工程、および
（ｂ．３）該胚をレシピエント雌性非ヒト動物に導入する工程
によって実施される、方法。
【請求項４】
工程（ｂ．２）において、前記受精した卵母細胞が、二細胞胚期にまで培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記初期胚が、レシピエント非ヒト動物への導入前に、胚バンクに貯蔵される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記初期胚が、液体窒素温度で貯蔵される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト変異動物が、トランスジェニック動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスジェニック変異体が、トランスジェニックマウスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスジェニック創始マウスが、過排卵を成し遂げる時点で３〜４週齢である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスジェニック創始マウスが、過排卵を成し遂げる時点で４週齢である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
過排卵が、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）によって誘発される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法であって、工程（ｄ）において、遺伝子型が、以下：
（ｄ１）トランスジェニック非ヒト動物および対応する非トランスジェニック非ヒト動物から単離されたゲノムＤＮＡに対して、以下のＰＣＲプライマー：
（ｉ）５’トランスジーン／ゲノム連結部の確認のための、染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーであって、該染色体特異的プライマーおよびトランスジーン特異的プライマーは、５’トランスジーン／ゲノム連結部近傍の染色体およびトランスジーンに対して、互いに対向する方向で結合する、プライマー；および
（ｉｉ）トランスジーン／トランスジーン連結部の確認のための、２つのトランスジーン特異的プライマーであって、該２つのトランスジーン特異的プライマーは、５’末端近傍のトランスジーンのセグメントに対して、反対方向で結合する、プライマー
を用いてＰＣＲ反応を行う工程、
（ｄ２）大きさまたはシグナルの分別によって、該増幅されたＰＣＲ産物を分離する工程、ならびに
（ｄ３）組み込まれたトランスジーンのコピー数を示す該増幅されたＰＣＲ産物の大きさまたはシグナルパターンに基づいて遺伝子型を決定する工程、
によって決定される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、工程（ｄ１）において、３’トランスジーン／ゲノム連結部の確認のための、トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し、該トランスジーン特異的プライマーおよび染色体特異的プライマーは、３’トランスジーン／ゲノム連結部の近傍のトランスジーンおよびゲノムに対して、互いに対向する方向で結合する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、工程（ｄ１）において、プレ組み込み部位の確認のための、２つの染色体特異的プライマーの使用をさらに包含し、該２つの染色体特異的プライマーは、染色体／トランスジーン連結部に対して近傍の染色体に対して、互いに対向する方向で結合する、方法。
【請求項１５】
前記大きさまたはシグナルパターンが、サザンブロットによって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記環境的要因が、発生上かつ近接する環境の要因を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｆ１変異体を生産するために前記創始非ヒト動物と交配させられる系統は、標的疾患に対する感受性および該系統の生殖指標に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝的バックグラウンドが、広範な遺伝的多様性を達成するために広げられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的疾患のモデリングにおける前記選択されたバックグラウンド系統の有用性が、最終選択の前に検証される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法によって生産された非ヒト変異動物。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって生産された、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２２】
請求項１２に記載の方法によって生産された、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２３】
マウスである、請求項２１または２２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスである請求項２３に記載のトランスジェニックマウスであって、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーンを保有する、トランスジェニックマウス。
【請求項２５】
毒性試験および発癌性試験について検証されている、請求項２４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
ＴｇＰＶＲ２１マウスである請求項２３に記載のトランスジェニックマウスであって、ヒトポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）遺伝子を保有する、トランスジェニックマウス。
【請求項２７】
請求項２６に記載のトランスジェニックマウスであって、３型または２型の経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）の神経毒性の評価について検証されている、トランスジェニックマウス。
【請求項２８】
前記非ヒト動物が、標的疾患のモデルとして使用される、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【化５】
2005530509.tif 000001
および
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【化６】
2005530509.tif 000002
（配列番号１４））を用いるＰＣＲによってＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２から得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
図１２は、５’ゲノム／トランスジーン連結部（５’Ｊ）（配列番号１７）および３’トランスジーン／ゲノム連結部（３’Ｊ）（配列番号２０）の配列を、宿主ゲノム配列（配列番号１６および配列番号１９）および注入したＤＮＡ配列（配列番号１８および配列番号２１）と比較する。これら両連結部に共通した顕著な特徴は、親配列間の短い相同性の存在であった。５’Ｊ（配列番号１７）の全長を見ると、注入された配列の５’末端に１４８ｂｐ欠失があり、親配列間で４ｂｐの相同性（ＣＣＡＧ）が最終組み込み体の５’末端に存在した。３’Ｊ（配列番号２０）の全長を見ると、トランスジーン組み込み体の３’末端で配列間に１０ｂｐ（ＴＣＣＴｇＣＴＧＣＣ（配列番号１５）；小文字はミスマッチ位置を示す）が相同であったストレッチ内で９０％の相同性があり、このトランスジーン組み込み体は、この３’末端および親配列では２４ｂｐの欠失を有した。本発明者らの結果は、この短い相同性の対合部分が染色体組み込み事象に寄与したという仮定を支持する。哺乳動物トポイソメラーゼＩの切断部位のコンセンサス配列が、宿主ゲノムの５’Ｊおよび３’Ｊの付近で見出された。この配列はまた、５’Ｊ部位および３’Ｊ部位近辺で、注入されたＤＮＡ中で見られた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
【図１】図１は、動物実験の結果に影響する主要因子の模式図である。
【図２】図２は、本発明に従う遺伝的要因および環境的要因の制御を説明する。
【図３】図３は、本発明の動物実験システムを開発する際の質保証試験の一部として制御される要因を示す。
【図４】図４は、本発明の「超速」コンジェニック法の模式図である。
【図５】図５は、目的に依存した２つのタイプの遺伝学的質試験を説明する。
【図６】図６は、二重（ｄｕｐｌｅｘ）ＰＣＲによるトランスジェニック動物の遺伝子型決定を説明する。
【図７】図７は、ＦＩＳＨ法によって決定される、Ｎ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおける組み込まれたトランスジーンの染色体局在を示す。両方の場合とも、このトランスジーン位置を表す対になった蛍光シグナルが、染色体１５Ｅ３領域上で観察された。Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスはヘミ接合体であり、そのため、このハイブリダイゼーションシグナルは、一対の姉妹染色分体でのみ検出された。
【図８】図８は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるトランスジーン組み込みのサザンブロット分析の結果を示す。（Ａ）Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるト  ランスジーンの制限マップおよび構造（ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の７．０ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメント）。白のボックス部は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓタンパク質をコードする４つのエキソンを表す（Ｅｘ１〜Ｅｘ４）。ＸｂａＩから上流の領域を認識するＤＩＧ標識５’−プローブを白丸および棒線で示した。（Ｂ）非トランスジェニックマウス、およびＮ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化し、０．６％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。ＤＮＡサンプルを、非トランスジェニックマウス（レーン１）、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス（Ｎ１５）（レーン２およびレーン３）、およびＴｇ−ｒａｓＨ２マウス（Ｎ２０）（レーン４およびレーン５）から得た。（Ｃ）Ｎ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ消化し（レーン１；ＢａｍＨＩ、２；ＨｐａＩ、３；ＸｈｏＩ、４；ＸｂａＩ、５；ＮｃｏＩ、６；ＢｇｌＩＩ、７；ＳａｃＩ、８；ＨｉｎｄＩＩＩ）、０．６％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識５’−プローブとハイブリダイズさせた。シグナルを、Ｘ線フィルム上で化学発光アルカリホスファターゼ基質を用いて検出した。
【図９】図９は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウス発現における組み込みについてのノーザンブロット分析の結果を示す。Ｎ１５およびＮ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの発現。１０μｇの全ＲＮＡサンプル（Ｂ、Ｌ、およびＦはそれぞれ、脳、肺、および噴門洞を示す）をホルマリン−アガロースゲル上に分画し、ナイロン膜に転写した。この膜を［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）プローブとハイブリダイズさせ、次いで［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ）プローブと再ハイブリダイズさせた。ｎＴｇおよびＴｇはそれぞれ、非トランスジェニックマウスおよびＴｇ−ｒａｓＨ２マウスから得たサンプルを示す。シグナルをＸ線フィルム上で検出した。
【図１０】図１０は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおける組み込まれたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の正確なコピー数の決定のためのサザンブロットハイブリ  ダイゼーションの結果を示す。Ｎ２０のＴｇ−ｒａｓＨ２マウス由来のゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（レーン１）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２）で完全消化  した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡを、種々の濃度のＢａｍＨＩでさらに消化した（レーン３〜５）。次いで、この消化されたＤＮＡを、０．４％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に転写した。この膜をＤＩＧ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。シグナルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を用いてＸ線フィルム上で検出した。レーンは、Ｍ，Ｅｘｐａｎｄ  ＴＭ  ＤＮＡ分子量マーカー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）でマークした。
【図１１】図１１は、ゲノム／トランスジーン連結部のＰＣＲ検証の結果を説明する。（Ａ）Ｔｇ−ｒａｓＨ２（Ｔ）マウスおよび非トランスジェニック（Ｎ）マウス由来のゲノムＤＮＡに対して、以下のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを実施した：５’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため；染色体特異的プライマーＡおよびトランスジーン特異的プライマーＣ、３’トランスジーン／ゲノム連結部の検証のため；トランスジーン特異的プライマーＤおよび染色  体特異的プライマーＢ、プレ組み込み部位の同定のため；染色体特異的プライマーＡおよび染色体特異的プライマーＢ、ならびにトランスジーン／トランスジーン連結部の検証のため；トランスジーン特異的プライマーＣおよびトランスジーン特異的プライマーＤ。（Ｂ）ＤプライマーおよびＣプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、トランスジーン／トランスジーン連結部の完全性を確認した。１００ｂｐ  ＤＮＡラダーをＤＮＡサイズマーカーとして使用した。（Ｃ）マウスゲノム中の中断された遺伝子座での３つのトランスジーン。ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓトランスジーンは、ヘッド−テイルの並びで存在する（塗りつぶしボックス部はエキソンを示す）。矢印は、使用したオリゴヌクレオチドの位置および方向の両方を示し、矢印の先端は、オリゴヌクレオチドの３’末端を表す。
【図１２】図１２は、Ｔｇ−ｒａｓＨ２マウスにおけるゲノム／トランスジーン連結部（５’トランスジーン連結部（配列番号１７）および３’トランスジーン連結部（配列番号２０））の配列分析の結果を示す。非トランスジェニックマウスＤＮＡ（配列番号１６および配列番号１９）および注入されたＤＮＡ（配列番号１８および配列番号２１）の対応する領域もまた、比較のために示す。アスタリスクは、同一のヌクレオチドを示し、囲まれた領域は、組換え部位でのヌクレオチドとの同一性を示す。水平方向の矢印は、トポイソメラーゼＩコンセンサス配列（５’−Ａ／Ｔ−Ｇ／Ｃ−Ｔ／Ａ−Ｔ−３’）を表す。
【図１３】図１３は、微生物制御および計画生産に関して胚バンク施設を説明する。
【図１４】図１４は、代替的微生物制御法の模式図である。
【図１５】図１５は、本発明の計画生産および供給システムの模式図である。
【図１６】図１６は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおける組み込まれたＰＶＲトランスジーンのＦＩＳＨ分析および染色体局在の結果を示す。
【図１７】図１７は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるＰＶＲトランスジーンのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１８】図１８は、ＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるＰＶＲ  ｍＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するための、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、および直接配列決定分析の結果を示す。
【図１９】図１９は、ＰＶＲ−α  ｍＲＮＡ、ＰＶＲ−β  ｍＲＮＡ、およびＰＶＲ−γ  ｍＲＮＡの構造、ならびにプローブ、プライマー、および配列決定の部位を示す。
【図２０】図２０は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の構造を示す。
【図２１】図２１は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の制限マップを示す。
【図２２】図２２は、ＴｇＰＶＲ２１トランスジェニックマウスにおける５’ゲノム／トランスジーン連結部の配列決定の結果を示す。
【図２３】図２３は、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．２８３３６８５に対するＴｇＰＶＲ２１マウスにおけるトランスジーン／マウスゲノム連結領域の上流部位の構造の決定を説明する。
【図２４】図２４は、本発明の生産および検証システムの模式図である。
【図２５】図２５は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）陽性コントロールについての腫瘍発生率を示す；噴門洞乳頭腫（単回腹腔内（ｉ．ｐ．）／７５ｍｇ／ｋｇ）。
【図２６】図２６は、ＭＮＵ陽性コントロールについての腫瘍発生率を示す；悪性リンパ腫（単回腹腔内（ｉ．ｐ．）／７５ｍｇ／ｋｇ）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005530509.tif 000003
【図２】
2005530509.tif 000004
【図３】
2005530509.tif 000005
【図４】
2005530509.tif 000006
【図５】
2005530509.tif 000007
【図６】
2005530509.tif 000008
【図７】
2005530509.tif 000009
【図８】
2005530509.tif 000010
【図９】
2005530509.tif 000011
【図１０】
2005530509.tif 000012
【図１１】
2005530509.tif 000013
【図１３】
2005530509.tif 000014
【図１４】
2005530509.tif 000015
【図１５】
2005530509.tif 000016
【図１６】
2005530509.tif 000017
【図１７】
2005530509.tif 000018
【図１８】
2005530509.tif 000019
【図１９】
2005530509.tif 000020
【図２０】
2005530509.tif 000021
【図２１】
2005530509.tif 000022
【図２２】
2005530509.tif 000023
【図２３】
2005530509.tif 000024
【図２４】
2005530509.tif 000025
【図２５】
2005530509.tif 000026
【図２６】
2005530509.tif 000027
【図１２】
2005530509.tif 000028