【手続補正書】
【提出日】平成16年11月5日(2004.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２】
前記増幅プライマーがフォワードプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅プライマーがリバースプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程で少なくとも1つのフォワードおよび1つのリバースプライマーを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変性工程を、標的核酸と非標的核酸の融解温度の間の温度で行う、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸を増幅させるために、前記変性工程を、非標的核酸の融解温度より低い温度であるが、標的核酸の融解温度で、または、十分に超える温度で行う、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
異なるが関連している核酸配列を選択的に増幅するための方法であって、前記差異が、少なくとも1つの標的核酸と少なくとも1つの非標的核酸の間における1つ以上の欠失、付加および/または塩基変化である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
【請求項１１】
2つ以上の標的種（標的核酸）および1つ以上の非標的種（非標的核酸）から得られた核酸混合物を含むサンプル中の、種の選択および/または同定方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程に前記サンプルを供すること；および
増幅産物の存在を決定すること；
を含む方法。
【請求項１２】
前記種を動物種、細菌種、真菌種および植物種から選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記種の集団中の1種以上の種を選択するために使用するときの、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
劣勢種の融解点が優勢種の融解点よりも低い場合において、劣勢種および優勢種からの核酸の混合物である単離核酸の選択的増幅のために使用するときの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸がDNAである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸がRNAである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記種が細菌種である、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸の増幅の間において、望まない、または偽増幅産物を抑制し、または除去するための方法であって、
望まない産物の融解温度が標的核酸の融解温度よりも高く、
望まない偽産物の増幅を実質的に抑制するために、標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、望まない産物の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２０】
望まない増幅産物が非変換のまたは部分的に変換された核酸であり、前記標的核酸を化学処理に供して、変換した核酸を産生する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸を重亜硫酸塩との処理に供し、前記望まない増幅産物が重亜硫酸塩と部分的に、または、不完全に反応した核酸に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
(a) 標的核酸の融解温度が非標的核酸の融解温度よりも低く、標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度が変化するように、標的核酸および/または非標的核酸を修飾する工程；および
(b) 非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、工程(a)の標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、工程(a)の少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く増幅工程；
を含む方法。
【請求項２３】
工程(a)前に、前記少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の融解温度が実質的に同じであり、前記化学修飾工程により標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度に差異を生じさせる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程(a)前に、前記標的核酸が非標的核酸より低い融解温度を有しており、工程(a)での修飾により標的核酸と非標的核酸の間の融解温度の差異を増大させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記修飾が少なくとも1つの塩基対の変換である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
修飾化剤が重亜硫酸塩である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾により非メチル化シトシンを修飾して、変換した核酸を産生する、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
更に、標的核酸を単離する工程、および、任意に、単離した標的核酸を配列解析に供する工程を含む、請求項１から１０、２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
(i) 異常な低いメチル化核酸を含み、任意にメチル化核酸を含むと疑われるサンプルを重亜硫酸塩処理に供する工程；
(ii) 選択的増幅が1サイクル以上の核酸変性工程を含み、
異常な低いメチル化核酸を含む核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化核酸を含む核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含む、核酸の異常な低いメチル化のためのアッセイ。
【請求項３０】
対象の病気または癌の診断または予後アッセイであり、前記病気または症状が核酸の異常な低メチル化により特徴付けられ、
(i) 対象から採取した核酸サンプルを重亜硫酸塩と反応させる工程；
(ii) 選択的増幅が、1サイクル以上の増幅工程に先立つ変性工程を含み、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、異常な低いメチル化核酸を含む標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化または実質的にメチル化された非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
(i)由来の核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含むアッセイ。
【請求項３１】
前記症状または病気が癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頚部形成異常および頚癌、大腸癌、前立腺癌および肝臓癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項３４に記載の方法。