【手続補正書】
【提出日】平成18年9月13日(2006.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  Ａsp90→Ｇlu、Ｓer91→Ｃys、Ａsp95→Ｈis、Ｇlu161→Ｇly、Ｇlu161→Ｌys、Ａsn65→Ｈis、Ａsp80→ＧlyおよびＧlu62→Ｌysから選択されるキノロンの抵抗性に関連する Neisseria gonorrhoeae ＧyrＡの突然変異。
【請求項２】  化合物への抵抗性を与える１または２以上の突然変異を同定および特徴解析する方法において、
突然変異が可能なＰＣＲ条件下に重複するＰＣＲ産物を発生させ、ここで該ＰＣＲ産物は約１０kb〜約１５kbであって、その重複するＰＣＲ産物は染色体配列が知られている野生株の細菌の完全な染色体を包含し；
発生したＰＣＲ産物の１または２以上を、野生株の細菌の染色体に導入させ；
化合物への抵抗性を示す細菌株を単離し；ついで
抵抗性に関与する突然変異を同定する
ことを含む方法。
【請求項３】  化合物への抵抗性を与える１または２以上の突然変異を同定する方法において、
ａ）化合物への抵抗性を示す細菌株からの完全染色体を包含する、約１０kb〜約１５kbの重複するＰＣＲ産物を発生させ；
ｂ）野生株の細菌の染色体に、１または２以上の発生したＰＣＲ産物を導入させ；
ｃ）化合物への抵抗性を示す細菌株を単離し；ついで
その抵抗性に関与する突然変異を同定する
ことを含む方法。
【請求項４】  該細菌はNeisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis または Escherichia coli の群から選択される請求項２または３記載の方法。
【請求項５】  化合物はフルオロキノロンである請求項２記載の方法。
【請求項６】  化合物はシプロフロキサシンである請求項２記載の方法。
【請求項７】  化合物はクリナフロキサシンである請求項２記載の方法。
【請求項８】  化合物はジヒドロキシジフェニルエーテル（ＤＨＤＰＥ）である請求項２記載の方法。
【請求項９】  化合物はトリクロサンである請求項２記載の方法。
【請求項１０】  化合物への抵抗性を示す細菌株は化学的突然変異誘発物質で処理された培養液から単離される請求項３記載の方法。
【請求項１１】  化合物への抵抗性を示す細菌株は紫外線で処理された培養液から単離される請求項３記載の方法。
【請求項１２】  化合物への抵抗性を示す細菌株は、細菌の染色体へのＤＮＡの挿入からなる突然変異誘発プロトコールに付した培養液から単離される請求項３記載の方法。
【請求項１３】  ４０のアミノ酸の連続ストレッチは Neisseria gonorrhoeae ＧyrＡの残基７５〜１１４と少なくとも３０％が同一であり、そして残りは類似しており、
６２がリジン、または
６３がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
６５がヒスチジン、または
１３５がバリン、または
１６１がグルタミン酸もしくはリジンもしくはグリシン
であるタンパク質を含む細菌。
【請求項１４】  アミノ酸は Neisseria gonorrhoeae ＧyrＡのアミノ酸に類似しており、
６２がリジン、または
６３がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
６５がヒスチジン、または
１３５がバリン、または
１６１がグルタミン酸もしくはリジンもしくはグリシン
であるＧyrＡタンパク質を含む Escherichia coli 株。
【請求項１５】  アミノ酸残基の
６２がリジン、または
６３がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
６５がヒスチジン、または
８０がアラニンもしくはグリシン、または
９０がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
９１がチロシンもしくはアラニンもしくはシステイン、または
９２がプロリン、または
９５がアルギニンもしくはアラニンもしくはバリンもしくはチロシンもしくはヒスチジンもしくはグリシン、または
１１４がヒスチジン、または
１３５がバリン、または
１６１がグルタミン酸もしくはリジンもしくはグリシン
であるＧyrＡタンパク質を含む Neisseria gonorrhoeae 株。
【請求項１６】  ＮＧ-2707、ＧＣ318、ＮＧ-2721、ＮＧ-2711、ＮＧ-2706、ＮＧ-2717、ＮＧ-2687、ＧＣ158、ＮＧ-2690、ＧＣ219、ＧＣ291、ＮＧ-2691、ＮＧ-2720、ＮＧ-2723、ＧＣ156、ＮＧ-2698、ＮＧ-2709、ＮＧ-2716、ＮＧ-2719 およびＮＧ-2712からなる群より選択される Neisseria gonorrhoeae株。
【請求項１７】  ４０のアミノ酸の連続ストレッチはNeisseria gonorrhoeae ＧyrＡの残基７５〜１１４と少なくとも３０％が同一であり、そして残りは類似しており、
６２がリジン、または
６３がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
６５がヒスチジン、または
１３５がバリン、または
１６１がグルタミン酸もしくはリジンもしくはグリシン
であるタンパク質。
【請求項１８】  残基の
６２がリジン、または
６３がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
６５がヒスチジン、または
８０がアラニンもしくはグリシン、または
９０がアルギニンもしくはグルタミン酸、または
９１がチロシンもしくはアラニンもしくはシステイン、または
９２がプロリン、または
９５がアルギニンもしくはアラニンもしくはバリンもしくはチロシンもしくはヒスチジンもしくはグリシン、または
１１４がヒスチジン、または
１３５がバリン、または
１６１がグルタミン酸もしくはリジンもしくはグリシン
のアミノ酸置換を含む Neisseria gonorrhoeae ＧyrＡタンパク質。
【請求項１９】  相当するアミノ酸残基の
１５がバリン、または
２０がスレオニン、または
２３がグリシン、または
２５がバリン、または
５１がスレオニン、または
９１がスレオニン、または
９３がシステインもしくはセリン、または
９５がバリン、または
１０４がロイシン、または
１０５がヒスチジン、または
１４４がバリン、または
１４７がヒスチジン、または
１５９がアラニン、または
１６０がイソロイシン、または
１６２がバリン、または
１９３がアスパラギンもしくはバリン、または
２０１がバリン、または
２０３がチロシンもしくはバリン、または
２０４がセリンもしくはロイシンもしくはイソロイシンもしくはバリン、または
２１２がスレオニンもしくはバリン、または
２４７がアスパラギン
である Neisseria gonorrhoeae ＦabＩ タンパク質の配列と少なくとも３０％は同一であるタンパク質を含む細菌。
【請求項２０】  ＮＧ-2669、ＮＧ-2654、ＮＧ-2651、ＮＧ-2670、ＮＧ-2660、ＮＧ-2641、ＮＧ-2639、ＮＧ-2638、ＮＧ-2640、ＮＧ-2648、ＮＧ-2657、ＮＧ- 2656、ＮＧ-2653、ＮＧ-2658、ＮＧ-2663、ＮＧ-2642、ＮＧ-2671、ＮＧ-2652、ＮＧ-2661、ＮＧ-2644、ＮＧ-2667、ＮＧ-2665、ＮＧ-2655、ＮＧ-2643、ＮＧ- 2666、ＮＧ-2664、ＮＧ-2647、ＮＧ-2646、ＮＧ-2650、ＮＧ-2649、ＮＧ-2645、ＮＧ-2659、ＮＧ-2662およびＮＧ-2672 からなる群より選択される Neisseria gonorrhoeae株。
【請求項２１】  残基
９３のアラニンもしくはセリンもしくはシステインもしくはバリン、
１５９のスレオニン、または
２０３のロイシン
への変化を生じる突然変異以外は請求項１９記載のものと類似のアミノ酸を有するＦabＩ
タンパク質を含む Escherichia coli 株。
【請求項２２】  相当するアミノ酸残基の
１５がバリン、または
２０がスレオニン、または
２３がグリシン、または
２５がバリン、または
５１がスレオニン、または
９１がスレオニン、または
９３がシステインもしくはセリン、または
９５がバリン、または
１０４がロイシン、または
１０５がヒスチジン、または
１４４がバリン、または
１４７がヒスチジン、または
１５９がアラニン、または
１６０がイソロイシン、または
１６２がバリン、または
１９３がアスパラギンもしくはバリン、または
２０１がバリン、または
２０３がチロシンもしくはバリン、または
２０４がセリンもしくはロイシンもしくはイソロイシンもしくはバリン、または
２１２がスレオニンもしくはバリン、または
２４７がアスパラギン
である Neisseria gonorrhoeae ＦabＩタンパク質の配列と少なくとも３０％は同一であるタンパク質。
【請求項２３】  相当するアミノ酸残基の
１５がバリン、または
２０がスレオニン、または
２３がグリシン、または
２５がバリン、または
５１がスレオニン、または
９１がスレオニン、または
９３がシステインもしくはセリン、または
９５がバリン、または
１０４がロイシン、または
１０５がヒスチジン、または
１４４がバリン、または
１４７がヒスチジン、または
１５９がアラニン、または
１６０がイソロイシン、または
１６２がバリン、または
１９３がアスパラギンもしくはバリン、または
２０１がバリン、または
２０３がチロシンもしくはバリン、または
２０４がセリンもしくはロイシンもしくはイソロイシンもしくはバリン、または
２１２がスレオニンもしくはバリン、または
２４７がアスパラギン
を含む Neisseria gonorrhoeae ＦabＩタンパク質。
【請求項２４】  化合物への抵抗性を与える１または２以上の突然変異を同定する方法において、
ａ）ランダムな点突然変異を含有する重複ＰＣＲ産物を発生させ、ここでＰＣＲ産物は、染色体配列が知られている野生株の細菌の完全な染色体を包含し：
ｂ）約１０kb〜約１５kbの工程（ａ）のＰＣＲ産物を単離し；
ｃ）染色体の約１００kbに対応する工程（ａ）からのＰＣＲ産物のプールを調製し；
ｄ）細菌の野生株を、工程（ｃ）で調製した該プールで形質転換し、そして化合物に抵抗性である得られた細菌株を単離し；
ｅ）工程（ｄ）で単離された得られた細菌株から個々のＰＣＲ産物を単離し；
ｆ）野生株を、工程（ｄ）で単離された抵抗性株からのＰＣＲ産物で形質転換し、そして化合物に抵抗性である得られた細菌株を単離し；
ｇ）工程（ｆ）で同定された少なくとも１つの得られた株からのＰＣＲ産物を包含する、約１〜４kbのより小さいＰＣＲ産物を発生させ；
ｈ）野生株を、工程（ｇ）からのより小さいＰＣＲ産物の１つで形質転換し、そしてこの株が化合物に抵抗性であるかどうかを決定し；
ｉ）このより小さいＰＣＲ産物のそれぞれについて、化合物に抵抗性の株が見つかるまで、または全てのより小さいＰＣＲ産物が評価されるまで、工程（ｈ）を反復し；
ついで
ｊ）化合物に抵抗性の株から単離されたより小さいＰＣＲ産物の配列を決定し、そして化合物への抵抗性を与える変異（単一または複数）を決定するために、その配列を野生株の相当する配列と比較する
ことを含む方法。
【請求項２５】  薬物−標的相互作用を同定および特徴解析する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】  細菌はNeisseria、Haemophilus、Streptococcus、Staphylococcus またはEscherichia属の群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】  化合物は任意の条件下に野生型の細菌の増殖または生存を阻害する請求項２４記載の方法。
【請求項２８】  化合物は培養液中の野生型の細菌の増殖または生存を阻害する請求項２４記載の方法。
【請求項２９】  化合物は動物宿主内の野生型の細菌の増殖または生存を阻害する請求項２４記載の方法。
【請求項３０】  化合物はII型トポイソメラーゼの阻害剤である請求項２４記載の方法。
【請求項３１】  化合物はＦabＩの阻害剤である請求項２４記載の方法。
【請求項３２】  化合物は、脂肪酸の生合成に関与する酵素の阻害剤である請求項２４記載の方法。
【請求項３３】  抗菌性活性について化合物をスクリーニングする方法において、
ａ）請求項２、３または２４に記載の方法を用いて、化合物への抵抗性を与える突然変異を同定し；
ｂ）化合物をこの突然変異を含む細菌株と接触させ；そして
ｃ）抗菌性活性について化合物を評価する
ことを含む方法。