【手続補正書】
【提出日】平成18年9月25日(2006.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体中の１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的な量で該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
上記個体に、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗原生動物剤からなる群から選択される１以上の化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記個体に、１以上の他の抗ウイルス化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記抗ウイルス化合物が、１以上のアジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、ｄ４Ｔ、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ）、ネビラピン、ラミブジン（エピビル、３ＴＣ）、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α（ＩＦＮ）またはリバビリンである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記組成物が筋肉内、皮内または腹腔内に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物が、ウイルス複製を測定するためのアッセイにおいて５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するほどに約１ｍＭ未満の濃度で効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、１週間あたり約４０ＩＵ／ｍ2から約１６０ＩＵ／ｍ2の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が１週間あたり約１６０ＩＵ／ｍ2である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、血漿アルギニンレベルを５μＭ未満に下げる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合し、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基およびヒスチジン基、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
連結基がスクシンイミジルスクシネートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
約９〜約１２個の上記ポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記アルギニン  デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記微生物がマイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ  アースリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）およびそれら
の組み合わせから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アルギニンデイミナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アルギニンデイミナーゼが配列番号１または４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスがＨＣＶである請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスがＨＣＶ１ｂである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体を処置する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２４】
１以上のウイルスについて危険がある個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
１以上のウイルスに感染したと同定された個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
個体中の腫瘍を処置すると同時に１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、腫瘍の増殖を抑制し、そしてウイルス複製を阻害するために効果的な該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２７】
個体が組成物の投与前に１以上のウイルス感染に感染したと同定された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍がメラノーマ、肉腫または肝癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
腫瘍が肝細胞癌である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記ウイルスがＨＣＶである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記腫瘍が肝細胞癌であり、そして上記ウイルスがＨＣＶである請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
個体の一酸化窒素レベルを調節する方法であって、一酸化窒素を調節するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３４】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基またはヒスチジン基の１以上である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
約７〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
上記アルギニン  デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
アルギニンのレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少がアルギニンデイミナーゼに対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４０】
一酸化窒素のレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少が一酸化窒素に対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４１】
上記化合物が、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物の投与と同時に該個体に投与される、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
治療にまたは予防に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、ウイルス複製の阻害が必要な個体におけるウイルス複製を選択的に阻害する方法。
【請求項４３】
ウイルスがＨＣＶである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
治療に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、個体の肝機能を改善する方法。
【請求項４５】
肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患スコアを使用して評価される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
肝機能が少なくとも１つの肝機能のマーカーを測定することにより評価され、マーカーがビリルビン、アルブミン、プロトロンビン時間、腹水の存在または脳障害の等級である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＢである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＣである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
１以上のウイルス感染を有すると同定された個体がアルギニン除去療法に感受性であると同定する方法であって：
ａ）個体から１以上のウイルスを含んでなるサンプルを得；そして
ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の不存在下でのサンプル中のウイルス複製に対して、ウイルス複製に適する条件下でポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触したサンプル中のウイルス複製を比較することを含んでなり、該サンプル中の少なくとも４０％のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補であることの指標となり、そして４０％未満のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補ではないことの指標となる上記方法。
【請求項５１】
個体中の１以上のウイルスを処置する方法であって：
ａ）個体が請求項５０に記載のアルギニン除去療法の候補であるかどうかを決定し；
ｂ）個体がアルギニン除去療法の候補であるならば、個体をアルギニン除去療法で処置し；そして
ｃ）個体がアルギニン除去療法の候補でないならば、個体を通常の抗ウイルス処置で処置する、ことを含んでなる上記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、患者に由来する生物学的物質を指す。本発明によりアッセイされるサンプルは、いかなる特別な種類にも限定されない。サンプルには非限定的例として、単細胞、多数の細胞、組織、腫瘍、生物学的流体、生物学的分子、または前記の上清もしくは抽出物を含む。例には生検用に採取した組織、切除中に採取した組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜および糞便サンプルを含む。使用するサンプルはアッセイ形式、検出法およびアッセイする腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づき変動する。サンプルを調製する方法は当該技術分野では周知であり、そして利用する方法に適合するサンプルを得るために容易に調整することができる。
ＡＤＩ
アルギニンデイミナーゼはアルギニンのシトルリンへの転換を触媒し、そしてアルギニンを排除するために使用することができる。本発明では、アルギニンデイミナーゼ遺伝子を誘導し、クローン化するか、あるいは例えば微生物、組換えバイオテクノロジー、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の起源から生産することができる。アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物からクローン化することができる。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ  アースリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、またはそれらの任意の組み合わせからクローン化することができる。幾つかの態様では、本発明で使用するアルギニンデイミナーゼは、配列番号１〜１０および１３〜２１の１以上のアミノ酸配列を有することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
アルギニンデイミナーゼ酵素の化学的および遺伝的修飾は、その生物学的活性に影響を及ぼすことができる。例えばアルギニンデイミナーゼは多くは抗原性であり、そして患者の循環から素早く排出されることが示された。しかしポリエチレングリコールを含むアルギニンデイミナーゼの製剤は抗原性を下げ、そして酵素の循環半減期を上げることも示された。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６（１９８４）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６（１９７７）。特にアルギニンデイミナーゼはポリエチレングリコールで共有的に修飾することができる。ポリエチレングリコールで共有的に修飾されたアルギニンデイミナーゼ（連結基を含むか、または含まない）は、今後"ＡＤＩ−ＰＥＧ"と呼ぶ。米国特許出願第０９／０２３，８０９号明細書でＣｌａｒｋは、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）（配列番号１）、マイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）（配列番号５）およびマイコプラズマ  アースリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）（配列番号７）に由来するアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールで改善された修飾を記載し、それらの開示は引用により全部、本明細書に編入する。天然のアルギニンデイミナーゼと比較した時、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性をほとんど保持し、はるかに抗原性が低く、大きく延びた循環半減期を有し、そして腫瘍の処置にさらに一層効果的である。本発明の目的のためのポリエチレングリコールを用いたアルギニンデイミナーゼの修飾をペグ化と呼ぶことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
他の生物に由来するアルギニンデイミナーゼも、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位に対応するペグ化部位を有するかもしれないと理解される。例えばストレプトコッカス  ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、１０４位にリシンを有し、マイコプラズマ  ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１０６位にリシンを有し、そしてジアルジア  インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１１４位にリシンを有する。さらに数種の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位と同じ全体的に位置に対応するリシンを有し得る。そのような生物に由来するアルギニンデイミナーゼのリシンの位置を以下に示すことができる：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【表１】
2006515281.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
幾つかの態様では、本発明はアルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、ペグ化で活性の損失が少ない修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供し、すなわちペグ化で、修飾されたアルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少は、非修飾アルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少よりも少ない。酵素の触媒領域での、またはそれに隣接するペグ化部位を排除することにより、最適なペグ化がこれまでの活性の損失無しに達成される。上記で検討したように特定の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖上の様々な位置に配置されるペグ化部位を有する。本発明を限定するわけではないが、現在、アルギニンデイミナーゼは酵素の触媒領域、またはそれに隣接するアミノ酸リシンを有する可能性があり、そしてこれら部位のペグ化が酵素を不活性化し得ると考えられる。これらペグ化部位の少なくとも１つを排除することにより、ペグ化を行い、そしてより多くの酵素活性を保持することができる。本発明に従い、幾つかの態様でリシンはグルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはそれらの組み合わせと置換される。幾つかの態様ではリシンはグルタミン酸に置換される。本発明の幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ112、Ｌｙｓ374、Ｌｙｓ405、Ｌｙｓ408またはそれらの組み合わせまたは副次的組み合わせでアミノ酸置換を有する。幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ112からＧｌｕ112、Ｌｙｓ374からＧｌｕ374、Ｌｙｓ405からＧｌｕ405、Ｌｙｓ408からＧｌｕ408またはそれらの組み合わせへのアミノ酸置換を有する。幾つかの態様ではマイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、グルタミン酸に置換される１１２位のリシンを有する（配列番号２）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
このように本発明は、アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。そのようなアミノ酸置換はアルギニンデイミナーゼのペプチド鎖中で問題の多い特徴的構造を排除することができる。そのようなアミノ酸置換は、修飾されたアルギニンデイミナーゼの改良された復元を提供する。これらのアミノ酸置換は、減少させたバッファー量を使用して修飾されたアルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能とする。これらのアミノ酸置換はまた、復元した修飾アルギニンデイミナーゼの収量の増加も提供する。本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼはＰｒｏ210で１つのアミノ酸置換を有する。上記のように、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸プロリンを有する。本発明を限定するわけではないが現在、２１０位のアミノ酸プロリンの存在が、アルギニンデイミナーゼの復元（すなわちリフォールディング）の難しさを増す正常なポリペプチド鎖中に曲がりおよびよじれを生じると考えられている。２１０位でのプロリンの置換は、減少したバッファー量を使用して修飾アルギニンデイミナーゼの迅速な復元性を可能とする。２１０位のプロリンの置換は、復元される修飾アルギニンデイミナーゼの収量の上昇も提供することができる。幾つかの態様では２１０位のプロリンは、セリンに置換される（配列番号３）。本発明の観点に従い、２１０位での他の置換も行うことができると理解される。置換の例には、Ｐｒｏ210からＴｈｒ210、Ｐｒｏ210からＡｒｇ210、Ｐｒｏ210からＡｓｎ210、Ｐｒｏ210からＧｌｎ210またはＰｒｏ210からＭｅｔ210を含む。野生型アルギニンデイミナーゼの２１０位のアミノ酸に伴うこれらの構造的特徴を排除することにより、酵素の正しいリフォールディングを達成することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼが多数のアミノ酸置換を有する。この修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の触媒領域で、またはそれに隣接したペグ化部位を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換を有することができる。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の復元を妨害するこれら構造的特徴を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換も有することができる。このようにアミノ酸置換は、本発明の修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供することができる。アミノ酸置換は、酵素活性を失う事なく修飾されたアルギニンデイミナーゼのペグ化を提供することができる。アミノ酸置換は、減少したバッファー量を使用して迅速に復元することができる修飾アルギニンデイミナーゼを提供することができる。またアミノ酸置換は、上昇した収量の復元された修飾アルギニンデイミナーゼを提供することもできる。幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼはセリンに置換される２１０位でのプロリン、およびグルタミン酸で置換される１１２位のリシンを含む（配列番号４）。しかし上記に検討したように、修飾されたアルギニンデイミナーゼは他の置換を含んでもよいと理解される。幾つかの態様では、保存的置換を野生型アルギニンデイミナーゼの１１２位および／または２１０位に作成してもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
修飾されたアルギニンデイミナーゼはＪＭ１０１細胞でＴａｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，同上に記載されたように発現された。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、１１２位のグルタミン酸および２１０位のセリンを含んだ。幾つの態様ではマイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４の配列である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
幾つかの態様ではアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ  ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、ジアルジア  インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム  パーフリンゲス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ）、バチルス  リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ボレリア  ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア  アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）、エンテロコッカス  フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス  ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトバチルス  サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）またはキアルジア  インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来する（配列番号１）。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒへの置換を含んでなる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号２）。幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号３）。幾つかの態様では、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換、および配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号４）。幾つか態様では、マイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号５の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号６）。幾つか態様では、マイコプラズマ  アーソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１および１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号８）。幾つか態様では、マイコプラズマ  アーソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号９）。幾つか態様では、マイコプラズマ  アーソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号１０）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
一般にＰＥＧはＡＤＩの一級アミンに結合する。アルギニンデイミナーゼ上のポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者に知られているようなタンパク質の活性ドイメイン内の各部位の役割により決定される。ＰＥＧは酵素活性の実質的な損失無しでアルギニンデイミナーゼの一級アミンに結合することができる。例えばマイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ  アーソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）およびマイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）からクローン化されたＡＤＩは、この手順により修飾され得る約１７個の残基を有する。換言すると１７個のリシンは、ＡＤＩをＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳのような生物適合性連結基を介してＰＥＧに結合させることができるすべての可能な点である。またＰＥＧは当業者には本開示の観点から明白であるように、ＡＤＩの他の部位に結合することもできる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
処置法
幾つかの態様では、本発明は個体中のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法は連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含んでなる、治療にまたは予防に有効な量の化合物を該個体に投与することを含んでなり、ここで各ポリエチレングリコール分子は、約１０，０００〜約３０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では、ＡＤＩはポリエチレングリコール分子で修飾され、各分子は約２０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では連結基はスクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの態様では、連結基はスクシンイミジルスクシネートである。幾つか態様では、約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様では、約９〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様ではアルギニン  デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ  アースリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）およびそれらの組み合わせに由来する。幾つかの態様ではウイルスＨＣＶである。幾つかの態様では、方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する工程を含んでなる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
組換えＡＤＩの生産
マイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）（ＡＴＣＣ２３２４３）、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）（ＡＴＣＣ２３１１４）およびマイコプラズマ  アルソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ２３１９２）のカルチャーは、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ  アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ  ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）およびマイコプラズマ  アーソリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）からクローン化し、そしてＳ．Ｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により以前に記載されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。特異的な酵素活性、Ｋm、Ｖmaxおよび最適ｐＨに関して、当業者に知られている方法による各タンパク質の特性決定は、それらが生化学的に互いに区別できることを明らかにした。最適ｐＨはクエン酸バッファー（ｐＨ５〜６．５）、リン酸バッファー（ｐＨ６．５〜７．５）およびホウ酸バッファー（ｐＨ７．５〜８．５）を使用して測定した。ＫmおよびＶmaxは酵素を種々の濃度のアルギニンとインキュベーションし、そしてシトルリン生産を定量することにより測定した。種々の酵素に関するＫmは約０．０２〜０．０６μＭであり、そしてＶmaxは約１５〜２０μｍｏｌ／分／ｍｇであり、これらの値は互いに標準誤差内であった。