【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年5月27日(2005.5.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  軟組織異種移植片
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ヒトに移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造品。
【請求項２】  異種移植片を、下記：
ａ）加工された天然の外因性軟組織の部分；
ｂ）加工された天然の外因性軟組織；
ｃ）加工された天然の外因性メニスカス、随意に、この加工された天然の外因性メニスカスは、加工された天然の外因性内側メニスカス及び加工された天然の外因性外側メニスカスからなる群より選び；
ｄ）加工された天然の外因性靱帯又は腱、随意に、この加工された天然の外因性靱帯又は腱は、その第一の端部に骨の第一のブロックを結合させて有しかつ更に、随意に、この加工された天然の外因性靱帯又は腱は、骨の第二のブロックを第一の端部と反対の第二の端部に添えさせて有し；並びに
ｅ）加工された天然の外因性関節軟骨、随意に、この加工された天然の外因性関節軟骨は、骨層下層を有する
から選ぶ請求項１の製造品。
【請求項３】  下記：
ａ．非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部を取り去って異種移植片を供し；
ｂ．この異種移植片を水及びアルコール中で洗浄し；
ｃ．この異種移植片に細胞破壊処理を施し；及び
ｄ．この異種移植片をグリコシダーゼで処理して複数の第一の表面炭水化物部分を除き、それにより異種移植片は、天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有し、グリコシダーゼは、α−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼにすることができる
を含む、ヒトに移植するための軟組織異種移植片を調製する方法。
【請求項４】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの前に、異種移植片に穴をあけ；
ｂ）工程ｃの後に、異種移植片を第二の酵素で処理し、随意に、この第二の酵素は、フィシン及びトリプシンからなる群より選び；
ｃ）工程ｃの後に、異種移植片を抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質、及び成長因子からなる群より選ぶ一種又はそれ以上の剤で処理し；
ｄ）工程ｃの後に、異種移植片を殺菌し、随意に殺菌工程は、グルタルアルデヒドによる処理、ホルムアルデヒドによる処理、エチレンオキシドによる処理及びプロピレンオキシドによる処理からなる群より選び；
ｅ）工程ｃの後に、異種移植片をポリエチレングリコールで処理し；
ｆ）工程ｄの後に、異種移植片上の複数の第二の表面炭水化物部分を複数のキャッピング分子で処理して第二の表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャップし、それにより異種移植片は、実質的に非免疫原性になり、随意にキャッピング分子の少なくとも一部は、複数のフコシル分子又は複数のＮ−アセチルグルコサミン分子であり；及び／又は
ｇ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含む請求項３の方法。
【請求項５】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に除去工程は、上部主表面及び下部主表面を含み、上部表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、上部表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）靱帯又は腱、随意に除去工程は、部分で部分の第一の端部に結合された第一のブロックを除くことを含みかつ更に随意に除去工程は、部分で第一の端部と反対の部分の第二の端部に結合された第二のブロックを除くことを含み；及び／又は
ｃ）関節軟骨、随意に除去工程は、部分で肋軟骨下骨の層を除くことを含む
である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】  請求項３、４及び５のいずれか一の方法によって製造される、ヒトに移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造品。
【請求項７】  非ヒト動物からの軟組織の一部を含むヒトに移植するための軟組織異種移植片であって、その一部は、グリコシダーゼ消化を受けやすい表面炭水化物部分を実質的に持たず、それによりその一部は、天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有する軟組織異種移植片。
【請求項８】  軟組織の一部は、細胞外成分及び複数の実質的に死細胞だけを有し、細胞外成分及び死細胞は、表面α−ガラクトシル部分を持たず、随意に軟組織の一部は、複数のキャッピング分子を異種移植片上の複数の表面炭水化物部分の少なくとも一部に結合させ、それにより軟組織の一部は、実質的に非免疫原性になり、更に随意にキャッピング分子の少なくとも一部は、複数のフコシル分子又は複数のＮ−アセチルグルコサミン分子である請求項７の軟組織異種移植片。
【請求項９】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に内側及び外側メニスカスは、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）関節からの関節軟骨、随意にその部分は、肋軟骨下骨の層を結合しており；及び／又は
ｃ）靱帯又は腱、随意にその部分は、骨の第一のブロックをその部分の第一の端部に結合させて有しかつ更に随意にその部分は、骨の第二のブロックを第一の端部と反対の部分の第二端部に添えさせて有する
である請求項７又は８の軟組織異種移植片。
【請求項１０】  下記：
ａ．非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部を取り去って異種移植片を供し；
ｂ．この異種移植片を水及びアルコール中で洗浄し；
ｃ．この異種移植片に細胞破壊処理を施し；及び
ｄ．この異種移植片をグリコシダーゼで処理して複数の第一の表面炭水化物部分を除くことを含み、グリコシダーゼは、約１ｍＵ／ｍｌ〜約１０００Ｕ／ｍｌの範囲の濃度を有し、それにより異種移植片は、天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有し、グリコシダーゼは、α−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼにすることができるヒトに移植するための軟組織異種移植を調製する方法。
【請求項１１】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）更に下記の工程：
ａ）グリコシダーゼ消化の後に、異種移植片上の複数の第二の表面炭水化物部分を複数のキャッピング分子で処理して第二の表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャップし、それにより異種移植片は、実質的に非免疫原性になり、随意にキャッピング工程は、異種移植片上の第二の表面炭水化物部分を約０．１ｍＭ／ｍｌ〜約１００ｍＭ／ｍｌの範囲の濃度を有するキャッピング分子で処理することを含み、キャッピング分子の少なくとも一部は、シアル酸分子であり；及び／又は
ｂ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項１０の方法。
【請求項１２】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に除去工程は、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）靱帯又は腱、随意に除去工程は、部分で部分の第一の端部に結合された第一のブロックを除くことを含みかつ更に随意に除去工程は、部分で第一の端部と反対の部分の第二の端部に結合された第二のブロックを除くことを含み；及び／又は
ｃ）関節軟骨、随意に除去工程は、部分で肋軟骨下骨の層を除くことを含む
である請求項１０又は１１の方法。
【請求項１３】  請求項１０、１１及び１２のいずれか一の方法によって製造される、ヒトに移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造品。
【請求項１４】  下記：
ａ．非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部を取り去って異種移植片を供し；
ｂ．この異種移植片を水及びアルコール中で洗浄し；
ｃ．この異種移植片に細胞破壊処理を施し；及び
ｄ．この異種移植片をグリコシダーゼで処理して複数の第一の表面炭水化物部分を除き；及び
ｅ．異種移植片上の複数の第二の表面炭水化物部分を複数のシアル酸分子で処理して第二の表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャップし、それにより異種移植片は、実質的に非免疫原性になりかつ天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有し、
グリコシダーゼは、α−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼにすることができる
を含む、ヒトに移植するための軟組織異種移植片を調製する方法。
【請求項１５】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）キャッピング工程は、異種移植片上の第二の表面炭水化物部分を約０．０１ｍＭ／ｍｌ〜約１００ｍＭ／ｍｌの範囲の濃度を有するシアル酸分子で処理することを含み；及び／又は（ｉｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項１４の方法。
【請求項１６】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に除去工程は、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）靱帯又は腱、随意に除去工程は、部分で部分の第一の端部に結合された第一のブロックを除くことを含みかつ更に随意に除去工程は、部分で第一の端部と反対の部分の第二の端部に結合された第二のブロックを除くことを含み；及び／又は
ｃ）関節軟骨、随意に除去工程は、部分で肋軟骨下骨の層を除くことを含む
である請求項１４又は１５の方法。
【請求項１７】  請求項１４、１５及び１６のいずれか一の方法によって製造される、ヒトに移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造品。
【請求項１８】  非ヒト動物からの軟組織の一部を含むヒトに移植するための軟組織異種移植片であって、その一部は、細胞外成分及び複数の実質的に死細胞だけを有し、細胞外成分及び死細胞は、表面α−ガラクトシル部分を持たずかつ複数のシアル酸分子を異種移植片上の複数の表面炭水化物部分の少なくとも一部に結合させ、それにより軟組織の一部は、実質的に非免疫原性になりかつ天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有する軟組織異種移植片。
【請求項１９】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に内側及び外側メニスカスは、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）関節からの関節軟骨、随意に部分は、肋軟骨下骨の層を結合しており；及び／又は
ｃ）靱帯又は腱、随意に部分は、骨の第一のブロックを部分の第一の端部に結合させかつ更に随意に部分は、骨の第二のブロックを第一の端部と反対の部分の第二の端部に添えさせる
である請求項１８の軟組織異種移植片。
【請求項２０】  下記：
ａ．非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部を取り去って異種移植片を供し；
ｂ．この異種移植片を水及びアルコール中で洗浄し；
ｃ．この異種移植片に細胞破壊処理を施し；及び
ｄ．この異種移植片上の複数の表面炭水化物部分を複数のキャッピング分子で処理して表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャップする
ことを含み、それにより異種移植片は、実質的に非免疫原性になりかつ天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有するヒトに移植するための軟組織異種移植片を調製する方法。
【請求項２１】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの前に、異種移植片に穴をあけ；
ｂ）工程ｃの後に、異種移植片を第二の酵素で処理し、随意に第二の酵素は、フィシン及びトリプシンからなる群より選び；
ｃ）工程ｃの後に、異種移植片を抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質、及び成長因子からなる群より選ぶ一種又はそれ以上の剤で処理し；
ｄ）工程ｃの後に、異種移植片を殺菌し、随意に殺菌工程は、グルタルアルデヒドによる処理、ホルムアルデヒドによる処理、エチレンオキシドによる処理及びプロピレンオキシドによる処理からなる群より選び；
ｅ）工程ｃの後に、異種移植片をポリエチレングリコールで処理し；
ｆ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項２０の方法。
【請求項２２】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）キャッピング工程は、異種移植片上の表面炭水化物部分を約０．０１ｍＭ／ｍｌ〜約１００ｍＭ／ｍｌの範囲の濃度を有するシアル酸分子で処理することを含み；及び／又は（ｉｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの後に、異種移植を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項２０の方法。
【請求項２３】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）キャッピング工程は、異種移植片上の表面炭水化物部分を約０．０１ｍＭ／ｍｌ〜約１００ｍＭ／ｍｌの範囲の濃度を有するＮ−アセチルグルコサミン分子で処理することを含み；及び／又は（ｉｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項２０の方法。
【請求項２４】  （ｉ）細胞破壊処理が、凍結／解凍サイクリング又はガンマ線への暴露を含み；及び／又は（ｉｉ）キャッピング工程は、異種移植片上の表面炭水化物部分を約０．０１ｍＭ／ｍｌ〜約１００ｍＭ／ｍｌの範囲の濃度を有するフコシル分子で処理することを含み；及び／又は（ｉｉｉ）更に下記の工程：
ａ）工程ｃの後に、異種移植片を蒸気状形態の架橋剤に暴露する
ことを含むのいずれかである請求項２０の方法。
【請求項２５】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に除去工程は、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）靱帯又は腱、随意に除去工程は、部分で部分の第一の端部に結合された第一のブロックを除くことを含みかつ更に随意に除去工程は、部分で第一の端部と反対の部分の第二の端部に結合された第二ブロックを除くことを含み；及び／又は
ｃ）関節軟骨、随意に除去工程は、部分で肋軟骨下骨の層を除くことを含む
である請求項２０、２１、２２、２３又は２４の方法。
【請求項２６】  請求項２０、２１、２２、２３及び２４のいずれか一の方法によって製造される、ヒトに移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植を含む製造品。
【請求項２７】  非ヒト動物からの軟組織の一部を含むヒトに移植するための軟組織異種移植片であって、その一部は、細胞外成分及び複数の実質的に死細胞だけを有し、細胞外成分及び死細胞は、複数のキャッピング分子を異種移植片上の複数の表面炭水化物部分の少なくとも一部に結合させ、それにより軟組織の一部は、実質的に非免疫原性になりかつ天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的な性質を有する軟組織異種移植片。
【請求項２８】  軟組織が、下記：
ａ）膝関節からの内側及び外側メニスカス、随意に内側及び外側メニスカスは、上部主表面及び下部主表面を含み、主表面の外部部分は外部外側表面によって接合され、主表面の内部部分は内部外側表面によって接合され；
ｂ）関節からの関節軟骨、随意に部分は、肋軟骨下骨の層を結合しており；及び／又は
ｃ）靱帯又は腱、随意に部分は、骨の第一のブロックを部分の第一の端部に結合させかつ更に随意に部分は、骨の第二のブロックを第一の端部と反対の部分の第二端部に添えさせる
である請求項２７の軟組織異種移植片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は欠損したヒトの膝関節の治療分野に関し、より詳しくは欠損又は傷害を受けたヒトの膝関節軟組織を、ヒト以外の動物の免疫学的に実質的に適合性の組織を使用して交換又は修復することに関する。
【０００２】
ヒトの膝は様々な運動を生成するように相互作用する空間的に入り組んだ骨と軟組織とを有する複雑な関節を含む。
用語「軟組織」はここでは半月板及び関節作用をする軟骨のような軟骨組織、前部十字形靱帯のような靱帯、及び腱をしめす。
【０００３】
（従来の技術）
半月板軟骨
具体的には大腿骨の骨頭は、軟骨性の内側及び外側半月板の軟組織を通じて脛骨の表面プラトーとともに回動するもので、これらのすべての構造体は各種の靱帯により所定位置に保持されている。内側及び外側半月板は繊維軟骨細胞と呼ばれる細胞と、コラーゲンの細胞外マトリックスと、弾性繊維と、各種のプロテオグリカンを含む構造体である。健全な半月板は、適正な力の分散と、安定化と膝関節内の相互作用する骨表面に対する潤滑性とを確保することにより、日常的に反復印加される圧縮付加に曝される膝への衝撃を吸収する。内側及び外側半月板が障害、疾病、又は炎症により損傷を受けると、関節炎的な異変がひざ関節内に生じ、機能を喪失することになる。
【０００４】
成人の関節軟骨は、一度破壊されると充分には自然再生しないので、損傷を受けた成人の半月板は従来各種の外科手術により処置されている。損傷した半月板は除去され、補綴部材と交換される。堅いプラスチック製の大腿骨部材と金属脛骨とを有する人工膝関節は米国特許第４０３４４１８号に記載されている。シリコンゴムや天然ゴムのような弾性材料を使用した多数の半月補綴部材が米国特許第４３４４１９３号及び第４５０２１６１号等により知られている。更に、コラーゲン、腱、繊維質靱帯のような半月板補綴部材に対する変形性の可撓性の弾性材料が米国特許第５０９２８９４号及び第５１７１３２２号に記載されている。小さいボールベアリングを充填したポリウレタン又はゼラチン質液から構成した軟骨交換装置が米国特許第５３５８５２５号に記載されている。しかし、公知の人工補綴部材は、弾性が不足しており、そのため天然の半月板に特徴的な衝撃吸収性が不十分なので、損傷した半月板を処置するには不適当である。更に、公知の人工装置は日常的な膝関節作用に特有の力に対して充分耐えることができない。
【０００５】
本発明者の一人は改良された補綴用半月板を米国特許第４８８０４２９、５００７９３４、５１１６３７４、５１５８５７４号において提案した。これらの特許は一般に再生した架橋コラーゲン（場合によりグリコサミノグリカン分子を含むことがある）のような処理された天然繊維の乾燥した多孔質のマトリックスから形成した補綴用半月板を記載している。一般に、これらの補綴用半月板のためのコラーゲン原料は動物のアキレス腱又は皮膚である。再生処理により、糖蛋白質、プロテオグリカン、脂質、ネイティブグリコサミノグリカン等を除去し、追加の弾性特性を元の組織に賦与する。
【０００６】
関節軟骨
関節軟骨軟組織はヒト又は動物の関節を形成する全ての骨の端部を覆う。関節軟骨は、繊維軟骨細胞、コラーゲン繊維の細胞外マトリックス、及び各種のプロテオグリカンから構成される。軟骨は関節内で力を分散するための機構として作用するとともに、骨の接触領域で潤滑剤として作用する。関節軟骨が失われると、苦痛を伴う関節炎を生じ又、関節運動を低下させる。
【０００７】
損傷した成人の関節軟骨は従来修復、交換又は切除等の各種の外科手術により処置されている。修復や切除では組織の再生が起こり得るが、その組織は通常一時的なものであり通常の力に抵抗するには不十分である。
【０００８】
関節軟骨の交換は同種移植( (1974) J. BoneSuro, 56B(1)167-177, (1978) Clin. Orth. 134: 342-349)、骨膜移植、又は金属及び又はプラスチック部材によるのが通例である。同種移植用の死滅軟組織が何年にもわたり試みられているが、殆ど成功していない。このアプローチは宿主の移植片に対する免疫応答、低温保存の失敗、移植場所での失敗などのために僅かに成功しているにすぎない。全体の関節表面を金属及びプラスチック部品と交換することは、老年で座ったままの患者に対しては優れた成果を収めているが、運動の衝撃を許容するには充分であるとは考えられておらず、正常な関節機構を回復することは示されていない。
【０００９】
従来の他のアプローチでは、関節軟骨は骨及び／又は人工材料から構成される補綴部片により交換される。例えば米国特許第４６２７８５３号は脱ミネラル化した同種又は異種骨セグメントを置換物として使用する。これらの置換物の適正な作用は骨セグメントの示差的脱ミネラル化に依存する。米国特許第４８４６８３５号は関節軟骨の傷の治癒を促進するために繊維軟骨細胞を移植するための技術を記載している。米国特許第４６４２１２０号は胚芽の繊維軟骨細胞を含むゲル状組成物の使用を記載している。米国特許第５３０６３１１号は乾燥した多孔質の容積マトリックスを含み、イン・ビボで自然の関節軟骨と実質的に同一の外形を有するように適合した補綴用関節軟骨を記載している。
【００１０】
これらの発達にもかかわらず、関節軟骨を永久的な人工材料よりなる構造体と交換することは満足には遠いものであり、関節軟骨として適当な構造で、天然の再吸収性材料又はその類似体から構成されたものは開発されていない。哺乳動物の関節の対向している関節軟骨は脆すぎるので、従来技術の人工軟骨の移植から結局生ずるように摩擦面に抵抗できず、正常位置からの従動性変化がない。更に、関節の力は膝及び腰の場合には年間百万回に及び加わる体重の何倍もある。これまでのところ、従来の永久的関節軟骨は自然の関節軟骨の特性を有する材料から構成されたことはないし、それらはかかる日常的に加わる力に抵抗するに充分でない。
【００１１】
靱帯
膝の前部十字形靱帯軟組織（ＡＣＬと略す）はあらゆる屈曲位置での大腿骨から脛骨の前部変位に抵抗するように作用する。ＡＣＬは又、過伸展に抵抗し、内部及び外部脛骨の回転中に完全に伸張した膝の回転安定性に資する。ＡＣＬは又、自己受容感覚において役割を持つ。ＡＣＬは細胞、水、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン、その他の糖蛋白より構成される結合性組織構造からなる。構造的にはＡＣＬは外側大腿骨骨頭の内側壁に向けて後部上方に延びる脛骨の顆間隆起の前部における凹入部に固着する。
【００１２】
損傷したＡＣＬの好ましい処置は、骨−靱帯−骨の形の自己移植片を使用した靱帯再構成である。十字形靱帯再構成は直接的な安定性があり、直接的な強いリハビリに対する潜在能力を有する。しかし、ＡＣＬ再構成の欠点は重大である。例えば、膝蓋腱又は膝腱が再構成に使用されたときには通常の解剖組織は分断され、関節内ハードウエアが靱帯の固定のために必要となり、前部膝痛が頻発する。更に、十字靱帯の再構成に関する最近の見解では、関節内ＡＣＬ再構成には大きな患者群で関節炎の悪化の増大した危険があることが示されている。
【００１３】
ＡＣＬ障害の処置の第２の方法は、一次修復とよばれており、破れた構造を縫合して所定位置に戻すことを含む。この一次ＡＣＬ修復は限定された関節鏡でのアプローチにより、最小限度の解剖学的分断及び局所麻酔下での外来患者用手順ですむという利点を有する。一次十字靭帯修復の潜在的不利益は、長期間にわたってＡＣＬ修復が十分な人数の患者において安定性を与えず、その後の再構成を後日に必要とし得るという理解である。前部十字靱帯修復の成功率は、一般に、６０〜７０％の範囲をさまよってきた。
【００１４】
異種移植片
元の軟組織の構造の殆ど及び特性の多くは、異種移植片材料即ち移植片レシピエント以外の種々の種に由来する軟組織の利用を通して、移植物において維持させることができる。例えば、米国特許第４，４００，８３３号では、ウシその他の動物に由来する腱又は靭帯を、合成のメッシュで覆って異種宿主に移植する。平らな組織例えばブタの心膜も異種移植に適しているとして米国特許第４，４００，８３３号に開示されている。人工弁、血管移植片、火傷その他の傷用の包帯に適した生体材料に加工されたウシの腹膜が、米国特許第４，７５５，５９３号に開示されている。ウシ、ヒツジ又はブタの血管異種移植片が、ＷＯ８４／０３０３６に開示されている。しかしながら、これらの開示の何れも、軟組織置換のための異種移植片の利用を記載していない。
【００１５】
一度個体内に移植されれば、異種移植片は、免役原性反応例えばその異種移植片の慢性的又は超急性の拒絶を誘発する。用語「慢性的拒絶」は、ここで用いる場合、個体に移植された異種移植片に対するその個体における免疫学的反応をいう。典型的には、慢性的拒絶は、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＧ天然抗体と異種移植片の細胞及び／又は細胞性マトリクス及び／又は細胞外成分上に発現されている炭水化物部分との相互作用により媒介される。例えば、非霊長類哺乳動物(例えば、ブタ又はウシ起源)からヒトへの軟組織軟骨異種移植片の移植は、主として、ヒトの血清中に存在するＩｇＧ天然抗Ｇａｌ抗体と異種移植片で発現されている炭水化物構造Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ(α−ガラクトシル又はα−ｇａｌエピトープ)との間の相互作用により妨げられる。K.R.Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645 (1997); U.Galili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 646-651 (1997)。慢性的拒絶においては、免疫系は、典型的には、異種移植片の移植から１〜２週間以内に応答する。
【００１６】
「慢性的拒絶」と対照的に、「超急性拒絶」は、ここで用いる場合、個体に移植された異種移植片に対するその個体における免疫学的反応であって、拒絶が、典型的には、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＭ天然抗体と細胞上で発現されている炭水化物部分との相互作用により媒介される当該免疫学的反応をいう。この相互作用は、受容個体において、数分から２〜３時間以内に、血管床の溶解及び血流の停止を引き起こす補体系を活性化する。
【００１７】
用語「細胞外成分」は、ここで用いる場合、任意の細胞外の水、コラーゲン及び弾性繊維、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン及び軟組織内に存在する他の糖タンパク質をいう。
【００１８】
異種移植片材料を、レシピエントへの移植前に化学処理して、免役原性を減じることができる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号に詳細に記載されているように、グルタルアルデヒドを用いて、異種移植片組織をその抗原性を減じるために架橋し又は「なめす」。他の薬剤例えば脂肪族及び芳香族ジアミン化合物は、コラーゲンポリペプチドのアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の側鎖カルボキシル基による更なる架橋を与えることができる。グルタルアルデヒド及びジアミンなめしは、異種移植片組織の安定性をも増大させる。
【００１９】
異種移植片組織は又、移植のための準備において、様々な物理的処理にかけることもできる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号は、異種移植片組織を引張による機械的緊張にかけて移植用の一層薄く且つ一層堅い生体材料を生成することを開示している。同種異系移植のための組織は、一般に、貯蔵中の細胞の生存力を最適化するために、例えば米国特許第５，０７１，７４１号；米国特許第５，１３１，８５０号；米国特許第５，１６０，３１３号及び米国特許第５，１７１，６６０号に開示されているように低温保存する。米国特許第５，０７１，７４１号は、組織を凍結させることは、細胞外及び細胞内での氷の結晶の形成及び浸透性脱水の故に、細胞に機械的損傷を引き起こすことを開示している。
【００２０】
（課題を解決するための手段）
本発明は軟組織の修復又は交換の必要がある場合に、ヒトに移植するための、実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を提供する。本発明は更に減少した免疫原性を有するが、実質的に生得的な弾性を有し且つ負荷支持能力を有するヒトへの異種移植ために異種軟組織を処理する方法を提供する。
【００２１】
ここで使用する用語「異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）」とは、異種間移植片（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔ）と同義であり、ある種の動物から他の種の動物への移植した移植片を意味する。（ステッドマン医学辞典参照）。
【００２２】
ここで使用する用語「異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）」とは、異種軟骨組織のようにある種の動物から他の種の動物への移植されることを意味する。
【００２３】
本発明の方法は、放射線による処理、冷凍及び解凍の一回以上のサイクル、化学架橋剤による処理、アルコールによる処理、又はオゾン処理の単独又は組み合わせた処理を含む。これらの方法に加えて、又は代えて本発明の方法は細胞破壊処理、炭水化物部分のグリコシダーゼ消化を含む。随意にグルコシダーゼ消化の次に例えば異種移植片の炭水化物部分をキャップ分子により処理してもよい。更に、これらの方法に加えて、或いはその代わりに、本発明の方法は、細胞破壊処理、及び移植片の炭水化物部分の約１〜１０００ｍＵ／ｍｌの濃度範囲でのグリコシダーゼ消化を含んでいてもよい。又、グルコシダーゼ消化に続いて、異種移植片をシアル酸により処理してもよい。上記の処理の後に、本発明の方法は生得的な軟組織と実質的に同等な機械特性を有する異種移植片を提供する。
【００２４】
ここで使用する用語「細胞破壊」は細胞を死滅させる処理をいう。
【００２５】
ここで使用する用語「キャッピング分子」は異種移植片がもはや対象動物の免疫系により異物として認識されないように炭水化物鎖に結合している分子をいう。
【００２６】
ひとつの具体例おいて、本発明はヒトへの移植のための、実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片よりなる製造物を提供する。
【００２７】
他の具体例において、本発明はヒトへの移植に適した軟組織異種移植片を調製するための方法を提供する。この方法は非ヒト動物から軟組織の少なくとも部分を取り出して異種移植片を用意し、水中及びアルコール中で異種移植片を洗浄し、異種移植片を紫外線放射、アルコールへの浸漬、オゾン処理、及び凍結解凍サイクルから選択した少なくともひとつの処理に付し、それにより異種移植片を生得の軟組織の対応した部分と同等の機械特性を有するものとする。
【００２８】
ここで使用する「部分」とは軟組織の部分又は第２の表面炭水化物部分のような、軟組織又は第２の表面炭水化物部分の全て又は部分を意味する。
【００２９】
本発明の他の具体例では、本発明はヒトへの移植に適した軟組織異種移植片を調製するための他の方法を提供する。この方法は非ヒト動物から軟組織の少なくとも部分を取り出して異種移植片を用意し、水中及びアルコール中で異種移植片を洗浄し、異種移植片を細胞破壊処理にかけ、それをグリコシダーゼにより消化して第１の表面炭水化物部分を除去し、それにより異種移植片が実質的に生得の軟組織の対応する部分と同等な特性を有するようにする。ここに、グリコシダーゼはα−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼであり得る。
【００３０】
ここで使用する用語「第１の表面炭水化物部分」とは炭水化物鎖の非還元末端にある末端α−ガラクトシル糖を指す。
【００３１】
更に他の具体例において、本発明の方法は例えばキャッピング分子で第２の表面炭水化物部分を処理することにより、第２の表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャップし、それにより異種移植片を実質的に非免疫原性にする。ここに、任意にキャッピング分子の少なくとも一部は複数のフコシル（ｆｕｃｏｓｙｌ）分子又はｎ−アセチルグルコサミンである。
【００３２】
ここで使用する「第２の表面炭水化物部分」とは炭水化物鎖の非還元末端にあるＮ−アセチルラクトサミン残基を指す。この残基は自然に、又はα−ガラクトシルエピトープの事前の解裂の結果、キャッピングされていない。
【００３３】
更なる具体例では、本発明はヒトへの移植に適した軟組織異種移植片を調製するための他の方法を提供する。この方法は非ヒト動物から軟組織の少なくとも部分を取り出して異種移植片を用意し、水中及びアルコール中で異種移植片を洗浄し、異種移植片を細胞破壊処理にかけ、それを約１ｍＵ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度範囲での炭水化物部分のグリコシダーゼ消化により消化して第１の表面炭水化物部分を除去し、それにより異種移植片が実質的に生得の軟組織の対応する部分と同等な機械的特性を有するようにする。ここにグリコシダーゼはα−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼであり得る。
【００３４】
更に他の具体例では、本発明はヒトへの移植に適した軟組織異種移植片を調製するための更に他の方法を提供する。この方法は非ヒト動物から軟組織の少なくとも部分を取り出し異種移植片を用意し、水中及びアルコール中で異種移植片を洗浄し、異種移植片を細胞破壊処理にかけ、その第２の表面炭水化物部分をシアル酸により処理して第２の表面炭水化物部分の少なくとも一部をキャッピングし、それにより異種移植片が実質的に非免疫原性で且つ生得の軟組織の対応する部分と同等な機械的特性を有するようにする。ここにグリコシダーゼはα−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼであり得る。
【００３５】
ここに「キャップする」又は「キャッピング」とは炭水化物単位のようなキャッピング分子を、炭水化物鎖の末端へ結合することを言い、例えば炭水化物を異種移植片の表面炭水化物部分に共有結合することなどである。
【００３６】
本発明の更に他の具体例では、本発明は上記１つ以上の方法で製造された実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造物を提供する。
【００３７】
本発明の他の具体例では、本発明は非ヒト動物由来の軟組織部分を含む、ヒトへ移植するための実質的に非免疫原性の軟組織異種移植片を含む製造物を提供する。ここに軟組織部分は実質的にグリコシダーゼ消化感受性の表面炭水化物部分を有しないので、この部分は生得の軟組織の対応した部分と実質的に同等の機械特性を有する。
【００３８】
本発明の更に他の具体例においては、本発明は非ヒト動物由来の軟組織部分を含むヒトに移植するための軟組織異種移植片を提供する。この軟組織部分は細胞外マトリックスと、実質的に死細胞のみを含み、これらの細胞外マトリックスと死細胞とは、実質的に表面αガラクトシル部分をもたないが、表面炭水化物部分の少なくとも一部に結合したシアル酸分子を有する。この軟組織部分は実質的に非免疫原性であり、実質的に生得の軟組織と実質的に同等の機械的特性を有する。
【００３９】
（好ましい具体例）
本発明は、人体移植用の異種移植片の慢性拒絶反応に関する。従って、本発明の方法に従い製造される軟組織異種移植片は、実質的に非免疫原性を有しつつ、自然の軟組織の機械的特性をおおむね維持したものである。
【００４０】
軟組織は処理中に幾分収縮し得るものであるが、本発明に従い調製した軟組織異種移植片は、自然の軟組織異種移植片の一般的外観を呈する。例えば、本発明に従い調製した内側半月板異種移植片は自生の内側半月板の一般的外観を呈し、本発明の側方半月板異種移植片は自然の側方半月板の一般的外観を呈する。軟組織異種移植片はまた、切断してセグメント化し、各セグメントを、以下に説明するようにレシピエントの関節内に移植することができる。
【００４１】
本発明は、その１具体例において、人体に移植するための異種軟組織を調製あるいは処理するための方法を提供する。本発明の異種移植片を調製するための軟組織は人間以外の任意の動物から採取され得る。トランスジェニック非ヒト動物あるいは遺伝子変換した非ヒト動物から採取した軟組織もまた、本発明に従う異種移植片として用いることができる。内側及び側方の半月板や関節軟骨軟組織の原材料となる、牛、ヒツジあるいは豚の膝関節を使用して異種移植片を調節するのが好ましい。若い動物の関節を軟組織の原材料とするのが更に好ましい。なぜなら、若い動物の軟組織は大人の動物のそれよりも弾力性及び移植性が高いからである。採取対象動物の屠殺時の月齢は６〜１８月齢であるのが最も好ましい。更には、膝蓋腱、前方あるいは後方の膝十字靱帯、アキレス腱あるいは膝腱を動物から採取し、それらをドナー靱帯として使用することができる。
【００４２】
本発明の方法の第１段階において、非ヒト動物から無傷の軟組織を取り出す。非ヒト動物の膝関節から内側あるいは側方の半月板を取り出す。非ヒト動物の任意の関節から関節軟骨が切除される。非ヒト動物から、靱帯及び腱、例えば、アキレス腱もまた取り出す。対応する関節から切除した軟組織を使用して本発明の軟組織異種移植片を作製するのが好ましい。例えば、大腿脛骨（膝蓋）関節から採取した関節軟骨を使用して、膝に移植するための関節軟骨異種移植片が作製される。同様に、ドナー動物の股関節から採取した関節軟骨を使用して、ヒトの股関節のための関節軟骨異種移植片が作製される。
【００４３】
軟組織の原材料としての関節は、屠殺したばかりの、また好ましくは、屠殺直後に好適な無菌等張液その他の組織保全溶液に浸した動物から採取されるべきである。関節の採取は、動物を屠殺した後できるだけ早急に実施するべきであり、酵素による組織の劣化を最小限とするために、低温、即ち約５〜２０℃の温度範囲で実施するのが好ましい。
【００４４】
軟組織は、低温の中で、厳密な無菌技術を使用して採取される。
半月板異種移植片に関しては、先ず、膝蓋腱を横切開して関節を開く。半月板角を付着組織を伴わないように切開する。これらの角に、直径約５ミリメートル、深さ５ミリメートルの、実質的に円筒状のプラグを呈する少量の骨を付着したまま残しておくことができる。半月板の滑膜性の連結部を半月板組織そのものから注意深く識別し且つ切除して異種移植片を形成する。
【００４５】
関節軟骨軟組織に関しては、肋軟骨下層を少量有する関節軟骨の薄皮をドナー動物の関節から削り取り、これを使用して異種移植片を形成する。
靱帯軟組織に関しては、ドナー動物の関節を標準的な外科技法を使用して切開する。靱帯は、骨塊を一端あるいは両端に付着して有する状態で採取するのが好ましいが、本発明の幾つかの形態においては靱帯のみを採取する。本発明の１形態において、直径約９〜１０ミリメートル、長さ約２０〜４０ミリメートルの、実質的に円筒状のプラグを呈する骨塊を、靱帯に付着させたままにすることができる。靭帯を注意深く識別し且つ付着組織から切り出して異種移植片を形成する。
【００４６】
次いで、形成した異種移植片を、これを約１０容積の無菌冷水で洗浄して残留する血液タンパク質及び水溶性物質を除去した後、室温でアルコールに約５分間浸して組織を殺菌すると共に非コラーゲン物質を除去する。
半月板軟組織の異種移植片は、上部側の主表面（上面）が全体に三日月形状で、底部側の主表面（下面）が全体に三日月形状の、Ｃ字形状の光沢のある繊維組織の外観を有し、これら上面及び下面の外側部分は外側側方表面により連結され、内側部分は内側側方表面により連結される。
【００４７】
膝関節軟組織の異種移植片は、骨基質に支えられたガラス質組織の如き外観を有し、先端側の主表面（上面）が全体に球形で、骨の下側の表面（下面）は粗くなっている。
この異種移植片には、アルコールに浸した後、直接移植するかあるいは以下の処理、即ち、放射線処理、アルコールを使用した処理、オゾン処理、１サイクル以上の凍結及び解凍サイクル、及びあるいは、化学的架橋剤を使用した処置、の少なくとも１つが施される。異種移植片にこれらの処置を１つ以上施す場合、それら処置を任意順に実施することができる。
【００４８】
本発明の方法の１具体例において、異種移植片に約１５分間紫外線を照射し、あるいは、約０．５〜３メガラドの照射量のガンマ線を照射する処置を施すことができる。
他の具体例において、異種移植片を再度アルコール溶液中に配置する処置を施すことができる。この処置のために任意のアルコール溶液を使用し得るが、異種移植片を室温で７０％のイソプロパノール溶液中に配置するのが好ましい。
更に別の具体例では異種移植片をオゾン処理することができる。
【００４９】
本発明の方法の更に別の具体例において、異種移植片に凍結／解凍サイクル処置を施すことができる。例えば、異種移植片を、この異種移植片が完全に凍結する、即ち、未凍結の軟組織を含むウォームスポットが内部に残らない限りにおいて、任意の凍結方法を使用して凍結することができる。異種移植片を、約５分間液体窒素に浸漬してこの段階を実施するのが好ましい。異種移植片を凍結装置内に配置してゆっくりと凍結させるのが更に好ましい。凍結／解凍サイクル処置の段階の後、異種移植片を室温（約２５℃）で約１０分間、等張食塩水浴中に浸して解凍する。繊維の劣化を最小限とするために、何らの外部熱源あるいは照射源も使用しない。
【００５０】
更に他の具体例において、随意的に、異種移植片を、その細胞外成分に含まれるタンパク質をなめしあるいは架橋させる化学薬剤に暴露させ、それにより、異種移植片中の免疫原性の決定基を一層減少させることができる。この処置のために任意のなめし剤あるいは架橋剤を使用し得る。架橋段階を２回以上実施する、あるいは２つ以上の架橋剤を使用して架橋が完全に実施されることを保証し、斯くして、異種移植片の免疫原性を最適に減少させることもできる。例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピン酸ジアルデヒド、その他のようなアルデヒドを使用して、本発明の方法により異種移植片の細胞外コラーゲンを架橋させることができる。その他の好適な架橋剤には、脂肪族や芳香族のジアミン、カルボジイミド、ジイソシアナートその他が含まれる。
【００５１】
グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する場合、例えば、異種移植片を、約０．００１％〜約５．０％、好ましくは約０．０５％〜約５．０％のグルタルアルデヒドを含有し、ｐＨが約７．４である緩衝溶液中に配置する。架橋反応期間としての１日〜１４日、好ましくは１日から５日、最も好ましくは３日から５日の間溶液のｐＨの管理を維持することが可能である限りにおいて、任意の好適な緩衝剤、例えば、リン酸緩衝塩溶液あるいはトリスヒドロキシメチルアミノメタンその他を使用することができる。
【００５２】
あるいはまた、異種移植片を蒸気形態の架橋剤に暴露させることができる。蒸気形態の架橋剤には、これに限るものではないが、蒸気アルデヒド架橋剤、例えば、蒸気ホルムアルデヒドが含まれる。蒸気架橋剤は濃度とｐＨとを有し得、異種移植片は、架橋反応を生じさせるために好適な時間、蒸気架橋剤に暴露され得る。例えば、異種移植片を、約０．０１％〜約５．０％の濃度、好ましくは０．０５％〜約５．０％の濃度及び約７．４のｐＨを有する蒸気架橋剤に、１日〜１４日、好ましくは１日から５日、最も好ましくは３日から５日間暴露させることができる。蒸気架橋剤に暴露させることにより、異種移植片内に残留する化学物質は減少され得る。
【００５３】
架橋反応は、免疫原性の決定基が異種移植片軟組織から実質的に排除されるまで継続されるべきであるが、この反応は、異種移植片の機械的特性が著しく変化する前に終了させるべきである。架橋剤としてジアミンも使用する場合、ジアミン架橋後にグルタルアルデヒド架橋が生じ、未反応のジアミンがキャップ（ｃａｐ）される。架橋反応が上述した如く完了した後、異種移植片を洗浄して残留化学物質を除去し、未反応のまま残ったアルデヒド群をキャップするための０．０１〜０．１０Ｍグリシンを、好ましくは０．０１〜０．０５Ｍグリシンを添加することができる。
【００５４】
上述の処置に加え、あるいは上述の処置に代えて、異種移植片に、グリコシダーゼによるこの異種移植片の消化に先立ってあるいは引き続き、細胞破壊処置を施して異種移植片の細胞を殺し、異種移植片から第１の表面炭水化物部分を除去することができる。グリコシダーゼの濃度範囲は、約１ｍＵ／ｍｌ〜約１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約１０Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは約１００Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌである。グリコシダーゼ消化により、結局、シアル酸のようなキャッピング分子との結合が生じ、異種移植片の炭水化物鎖の表面Ｎ−アセチルラクトサミン末端がキャップされる。
【００５５】
本発明の方法の具体例において、異種移植片には、イン・ビトロでのグリコシダーゼによる異種移植片の消化に先立ち、軟組織の細胞を殺すための細胞破壊処置が施される。代表的には、表面炭水化物部分が生細胞及び細胞外マトリクスから除去された後、生細胞が表面炭水化物部分を再発現させる。異種移植片の抗原性部分が再発現することで、異種移植片の免疫原性の拒絶反応が継続して引き起こされ得る。対照的に、死んだ細胞からは表面炭水化物部分は再発現しない。異種移植片の死んだ細胞及び細胞外成分から抗原性の表面炭水化物部分を除去することで、異種移植片の免疫原性の拒絶反応源としての抗原性の表面炭水化物部分が実質的に恒久的に除去される。
【００５６】
従って、上述の具体例において、本発明の異種移植片は、軟組織の細胞を破壊即ち殺すための、以上議論したような凍結／解凍サイクルを受ける。あるいはまた、本発明の異種移植片は、０．２メガラド〜約３メガラドの量でのガンマ線照射を受ける。そうした照射により、軟組織細胞が殺され、異種移植片は殺菌される。殺された軟組織細胞はもはや、移植した異種移植片の免疫原性の拒絶反応の要因であるα−ｇａｌエピトープのような抗原性の表面炭水化物部分を再発現することができない。
【００５７】
軟組織細胞を殺す前あるいは後の何れかにおいて、異種移植片に、グリコシダーゼ、特には、α−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼによる異種移植片のイン・ビトロ消化処置を施し、酵素により抗原性の表面炭水化物部分を除去させる。詳しくは、α−ｇａｌエピトープは、以下の反応に示されるようなα−ガラクトシダーゼによる酵素的処置により除去される。
2002505144.tif 000001
【００５８】
Ｎ−アセチルラクトサミン残基は、通常、ヒトや哺乳類の細胞で発現し、それ故に、免疫原性でないエピトープである。グリコシダーゼによる異種移植片のイン・ビトロ消化は様々な方法で達成される。例えば、異種移植片はグリコシダーゼを含有する緩衝溶液中に浸漬あるいは培養させることができる。更に、下記のように異種移植片に穴をあけて浸透性を増大させることができる。或は、グリコシダーゼを含有する緩衝溶液を、脈動性の洗浄プロセスを介して異種移植片に圧入することができる。
【００５９】
異種移植片からα−ｇａｌエピトープを排除することにより、異種移植片に対する免疫応答が減少する。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類の哺乳動物と新世界猿類（南米の猿類）において、細胞外成分のプロテオグリカンのような巨大分子においてのみならず、１×１０6−３５×１０6のエピトープとして発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他のＭａｎ，ａｐｅｓ，ａｎｄ  Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｄｉｆｆｅｒ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｍｍａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ，２６３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７７５５（１９８８）を参照されたい。しかしながら、このエピトープは、旧世界猿類（アジア及びアフリカの猿類及び類人猿）及びヒトには存在しない。同書。抗Ｇａｌは人類及び霊長類においては、腸内バクテリアのα−ｇａｌエピトープ炭水化物構造に対する免疫応答の結果として生成される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他の、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉ−α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｌｏｒａ，５６  Ｉｎｆｅｃｔ，  Ｉｍｍｕｎｅ．１７３０（１９８８）、Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ他の、Ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉ−Ｇａｌ  ＩｇＧｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，８９Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２２３（１９９２）を参照されたい。非霊長類の哺乳動物はα−ｇａｌエピトープを生成するので、これらの哺乳動物からの異種移植片を霊長類に異種移植すると、霊長類の抗Ｇａｌが異種移植片のこれらエピトープに結合することによる拒絶反応が生じる。霊長類の抗Ｇａｌが異種移植片のエピトープに結合すると、補体結合及び抗体依存性の細胞毒性により、異種移植片は破壊される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他の、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉ−Ｇａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ：Ａ  ｍａｊｏｒ  ｏｂｓｔａｃｌｅ  ｆｏｒ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，１４  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４８０（１９３３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ他の、Ａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅａｃｔ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｇａｌα１−３−Ｇａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ，９０Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１３９１（１９３３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｂｉｎｄ  ｈｕｍａｎａｎ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｃｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｎ．２４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔａｌ．，Ｃａｒｄｉａｃ  ｘｅｎｏｇｆｒａｆｔｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｓｐｅ��ｉｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒａｃｕｔｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，１５４Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５００（１９９５）を参照されたい。更には、異種移植によって、免疫システムの主要な活性化が生じて、高親和性の抗Ｇａｌを増大量生成する。従って、異種移植片の細胞及び細胞外成分からα−ｇａｌエピトープを実質的に排除し、細胞からのα−ｇａｌエピトープの再発現を防止することで、抗Ｇａｌ抗体がα−ｇａｌエピトープと結合することに関連する異種移植片に対する免疫応答は減少される。
【００６０】
更に、本発明の軟骨軟組織の異種移植片は、イン・ビトロでの酵素によるα−ｇａｌエピトープ排除のために特に適している。臓器その他の組織と対照的に、軟骨細胞外マトリクスの代謝回転は極めて遅い。しかも、一度軟骨細胞、即ち、繊維軟骨細胞が死ぬと、上述したように、これらの細胞からα−ｇａｌエピトープが再発現することはない。
それに加え、軟組織異種移植片に、グリコシダーゼによる処置に先立って、あるいは同時に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による処置を施すことができる。ＰＥＧは、酵素及びコラーゲン細胞外成分と共有結合することにより、グリコシダーゼのための担体として作用する。また、ＰＥＧ処置した異種移植片は、免疫原性が低減される。
【００６１】
グリコシダーゼによる処置の後、異種移植片に残る炭水化物鎖（例えば、クリコサミノグリカン）を、キャッピング分子を使用する随意的処置により、その少なくとも一部分をキャップする。このキャップ処置には、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、最も好ましくは、約１ｍＭ〜約４ｍＭの範囲の濃度を有するキャッピング分子が含まれる。キャッピング分子を使用する処置は、グリコシダーゼ処置を施した及び施してない異種移植片に対し共に適用することができる。例えば、α−ｇａｌエピトープを持たない、ノックアウト動物からの異種移植片に、キャッピング分子による処置を施してこの異種移植片の炭水化物部分をキャップすることにより、異種移植片の免疫原性を低減させることができる。本発明で使用するキャッピング分子の例には、シアル酸、フコシル及びＮ−アセチルグルコサミンが含まれる。
【００６２】
加えて、シアル酸のような選択されたキャッピング分子は陰荷電される。陰荷電分子によるα−ｇａｌエピトープの取り替えは、異種移植片の免疫原性の拒絶を更に減少させることができる。キャッピング分子によって与えられる陰電荷は免疫系の陰荷電抗体分子及び／又は細胞と反発し、これによって異種移植片の免疫原性拒絶をマスクするので、異種移植片の免疫原性の低下が生じると理論づけられる。
【００６３】
一般的には、“ゼータ電位”と称される静電反撥は身体においてリガンド及びそれらの対応する受容体以外の分子間の相互作用を妨げ、そして非特異的な相互作用に対するバリヤとして働く。例えば、エンベロープ糖蛋白質の炭水化物鎖にあるシアル酸は、感染性ウイルスが抗体による及び抗原提示細胞による有効な認識を回避するのを助ける。ティー・ダブリュー・ラデマッチャー氏他のGlycobiology,Anm.Rev.Biochem.,57:785(1988)。ネイスセリア・ゴノーレア（Neisseria gonorrhea）のような細菌は、細菌性シアリルトランスフェラーゼを使用してそれら自身をシアル酸で被覆することによってそれらの免疫による破壊を防止することができる。アール・エフ・レスト氏他のNeisseria sialyltransferases and their role in pathogenesis,Microbial Pathogenesis,19:379(1995)。同様に、原生動物であるトライパノソマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）は、シアル酸を宿主の糖蛋白から寄生体の膜上の炭水化物鎖に移送する酵素トランシアリダーゼの使用によるその細胞表面糖蛋白質のシリアン酸での有効なシリアン酸化のために人間に感染してチャガス病を引き起こすことができる。オー・プレビアト氏他のIncorporation of sialic acide into Trypanosoma cruzi macromolecules,A proposal for new metabolic route,Mol.Biochem.Parasitol.,16:85(1985)、並びに、ビー・ジンゲルズ氏他のDirect sialic acid transfer from a protein donor to glycolipids of trypomastigote forms Trypanosoma cruzi,Mol. Biochem.Parasitol.,26:1335(1987)。シアル酸による免疫原性の低下は、哺乳動物細胞によっても使用される方法である。通常の抗原提示細胞は、シアロホリンと称される（ＣＤ４３とも称される）高シアリル酸化蛋白質の発現によってＴ−リンパ球との非特異的接着を防止する。イー・ファモル−ベラシオ氏他のAntibodies against sialophorin（ＣＤ４３）enhance the capacity of dendritic cekks to cluster and activate Tlymphocytes.,J.Immunol.,159:2203(1997)。転移性を得る多くの悪性細胞型は、それらの細胞表面糖蛋白質上のシアル酸の発現を増加し、かくしてそれらの腫瘍抗原をマスクし、そして免疫系によるそれらの検出及び破壊の可能性を減少させる。ジー・ヨゲスワーレン氏他のMetastatic potential is positively correlated with cell surface sialylation of cultural murine cekks,Science,212:1514(1981)、ジェイ・ダブリュー・デニス氏のChanges in glycosylation associated with malignant transformation and tumor progression.In:Cell surface carbohydrates and cell development、並びに、エム・フクダ氏のEd.CRC Press,pp.161-213(1992)。
【００６４】
免疫認識の防止のための同じ戦略は、α−ガラクトシダーゼ処理済み異種移植片を陰荷電分子で処理することによって実施することができる。異種移植片内の抗原の多くは、高密度の炭水化物鎖によって宿主の免疫系から効果的にマスクされる。これらの鎖の大部分は陰荷電され、そして様々な哺乳動物種におけると同じである。ディー・ヘインガード氏他のStructure and biology of cartilage and bone matrix noncolagenous macromolecules,FASEB J.,3:2042(1989)、並びに、ユー・リンダール氏他のGlycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules,Ann.Rev.,Biochem,47:385(1978)。しかしながら、他の抗原は、高密度化した炭水化物鎖によってマスクされず、それ故、異種移植片に対する免疫応答を誘出する可能性がある。例えば、主として細胞外成分のプロテオグリカンにおけるいくつかのペプチド領域は、ケラタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の高密度化炭水化物鎖によってマスクされず、かくして異種移植片に対する免疫応答を誘出する可能性がある。α−ガラクトシダーゼ処理済み異種移植片の細胞上の、及び／又は細胞外分子上の炭水化物鎖の末端への陰荷電分子の付加は、異種移植片の非−α−Ｇａｌ抗原をマスクすると共に、異種移植片の免疫原性の拒絶を減少させることができる。
【００６５】
シアル酸は、本発明の異種移植片の炭水化物鎖をキャップするのに使用される陰荷電キャピング分子の非限定的な例である。シアル酸は、以下に記載の例示反応においてシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）によって好ましくは約１ｍＵ／ｍｌ〜約１０００Ｕ／ｍｌの濃度でそしてより好ましくは約１０Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌの濃度で異種移植片の炭水化物鎖にインビトロで結合されることができる。
2002505144.tif 000002
【００６６】
また、シアル酸は、以下に記載の例示反応において組換えトランスシアリダーゼ（ＴＳ）によって好ましくは約１ｍＵ／ｍｌ〜約１０００Ｕ／ｍｌの濃度でそしてより好ましくは約１０Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌの濃度で異種移植片の炭水化物鎖にインビトロで結合されることもできる。
2002505144.tif 000003
【００６７】
処理に先立って、異種移植片の外面（例えば、半月軟組織異種移植片の外部側面）は、随意に、異種移植片を実質上非免疫原性にするのに使用される剤の透過性を向上させるために穴をあけることができる。この穿孔工程を実施するのに１８ゲージ針の如き無菌外科手術針を使用することができ、又は別法として、複数の針を収容する櫛様の装置を使用することもできる。穿孔は、異種移植片の内部への所望の接近を達成するために、種々のパターンで、また種々の穴対穴の間隔で実施することができる。また、穿孔は、レーザーで実施することもできる。本発明の１つの形態では、異種移植片の外部側面の周辺に約３ｍｍ離れた穴の１つ又はそれ以上の直線が形成される。
【００６８】
移植に先立って、本発明の軟組織異種移植片は、組織の柔軟性を向上させるためにフィシン又はトリプシンのような蛋白分解性酵素による限定的消化で処理することができ、又は抗石灰化剤、抗血栓被覆、抗生物質、成長因子、若しくはレシピエントの関節への異種移植片の組み込みを高めることができる他の薬品で被覆することもできる。本発明の軟組織異種移植片は、公知の方法を使用して、例えば、追加的なグルタルアルデヒド若しくはホルムアルデヒド処理、エチレンオキシド殺菌、プロピレンオキシド殺菌等で更に殺菌することができる。また、異種移植片は、使用のために要求されるまで冷凍して貯蔵することができる。
【００６９】
本発明の軟組織異種移植片又はその一部分は、当業者によって公知の関節鏡検査法外科手術技術を使用して損傷を受けた人間の関節に移植することができる。軟組織移植の正確で且つ再現性のある配置を保証する関節鏡検査技術を実施するための特定の器具は当業者に知られている。
【００７０】
半月軟骨軟組織異種移植片移植
半月軟骨置換を成功させるために、次の目標が達成されるのが好ましい。
１．生まれながらの半月軟骨の引裂かれた断片は除去されなければならない。
２．半月角の結合部位が解剖的に置かれなければならない。
３．半月移植組織の周辺は、軸方向及び回転方向の負荷を許容するのに十分なだけ確実に結合されなければならない。
４．膝関節の周囲被膜及び靱帯は、過度に妨害されてはならず、また固定技術によって拘束されてもならない。以下に詳細に記載する半月板移植の方法は、ケイ・アール・ストーン氏他のArthroscopy:The Journal of Aryhroscopic and Related Surgery 9,234-237(1993)から誘導される。本発明の異種半月板異種移植片を使用するために他の半月板移植法を使用することもできる。
【００７１】
最初に、公知の方法を使用して、膝関節の完全診断関節鏡検査法が実施される。もしもＡＣＬ外科手術を同時に実施しようとするならば、十字形再形成のための大腿骨及び脛骨トンネルが先ず穿孔されるべきである。半月板軟骨の断裂部分を測定する。もしも組織の引裂き又は悪質さの苛酷度のために半月板補修を達成することができないならば、軟骨組織の断裂部分を除去することによって半月板リムの調製を始めなければならない（図３）。ヒトの半月板全体を本発明の異種半月板異種移植片によって置き換えようとするならば、ヒトの半月板のほとんど全部が除去される。加えて、ヒトの半月板全体を本発明の異種半月板異種移植片によって置き換えるためには、骨プラグを受け入れるためにヒト半月板角の切除及び骨のトンネルの調製が要求される場合がある。半月板の一部分だけを本発明の異種半月板異種移植片の一部分によって置き換えるときには、損傷を受けた部分だけが除去され、かくして異種半月板異種移植片の一部分の結合のための周辺リムや角が保存される。半月板リムが完全に存在しない場合には、半月板の部分的置換は実施されるべきでない。もしも関節が過度に固い場合には、関節伸延器を適用することができ、又は内側の副次的靱帯を一部分離すことができる。
【００７２】
内側及び外側半月板の交換では、関節鏡を中間外側又は前部外側門(portal)に挿入し、脛骨ガイドを後部内側門を通して挿入する。ガイドの先端をまず半月板の後部角にもたらす。後部内側角は脛骨隆起の後部傾斜部に挿入される。ドリルピンを次に脛骨粗面の前部内側から後部角層入部にもたらす（図４）。ピンの設置は関節鏡を顆間切痕を通して挿通し、ピンの出位置を見ることで確認できる。膝の後部被膜を通しての貫通を回避するために非常な用心をして神経血管束を傷つけないようにすべきである。ピン位置が確認されたら、ピンをつぎに４．５ｍｍカヌール付きのドリルビットで（随意にドリルストップで後部被膜貫通を防止する）オーバー穿孔する（図５）。ビットは所定の位置に残され、縫合糸挿通子の通過のためのトンネルとして使用する。縫合糸はジョンソンアンドジョンソン社より市販の＃２Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）などがある。縫合糸はドリルビットの孔に通され、そしてドリルビットは除去され、そして縫合糸は所定位置に残される。
【００７３】
ヒトの前部内側半月板の挿入点はかなり変動し、最も頻繁には内側脛骨隆起の前部に見いだされる。後部半月板の前部角は前部十字形靱帯の後部に挿入される。前部ドリル穴はまず、後部半月板の前部角の挿入点を同定し、ドリルガイドのチップを配置して相対的に垂直穴が形成されるようにする（図６）。ドリルピンを配置し、ついでカニューレを挿入したドリルビットを使用してドリルピン位置を越えてドリルし、後部ドリル穴を形成する。別法として、内側半月板の前部角を縫合アンカーによりドリル穴に対向して骨に直接固定する。
縫合糸が前部及び後部ドリル穴により捕捉されるまえに、前門が約２ｍｍに拡張される。縫合糸の捕捉子は次に拡張された門を通され、前部及び後部縫合糸は同時に引き出される。この技術は縫合糸が脂肪パッド及び被膜組織の２つの面で絡まないようにする。
【００７４】
移植片は今やフィールドにもたらされる。２つの水平マットレス縫合糸は例えば＃２−０Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）等であり、異種半月板移植片の各角を通され、その自由端は内部表面から出る（図７）。２本の後部縫合糸は次に膝を通して引かれ、後部脛骨トンネルを出る（図８）。もしも内側及び外側門からみると、後部外側門は移植片を内側に押して２．５ｃｍの切開を等して所定位置にもたらすためのプローブ挿入に使用できる。挿入カニューレは必要がない。前部縫合糸をついで同様に通過せしめられる。角縫合糸は次に前部脛骨骨ブリッジに渡り結ばれる。
【００７５】
次に、帯域特異的半月板修復カニューレが所定位置にもたらされる。内側挿入のために、後部内側垂直切開が膝の背面から３分の１のところに形成されて、伏在静脈の神経の保護がなされ、又、裏返した半月板修復針の回収の用意がされる。通常、第２の垂直切開が、前部内側関節鏡門に接して前部に更に必要であり、それにより前部に出る針を捕捉するようにする。これらの２つの切開部を通じて縫合針は捕捉でき、結び目は被膜の上に直接置かれる（図９）。
半月板修復針を使用するとき、まず垂直且つ均等に離間した縫合糸を有する後部カニューレを使用すべきである。修復は後部から前部に進行し、その結果異種移植片の内部に座屈が生じないようにする。各結び目は縫合糸の絡みを生じないようにそのまま結束される。結び目はほぼ４ｍｍの間隔にされる。膝は数個の完全な運動範囲でサイクルし、異種移植片の運動が円滑になるように保証する。
【００７６】
外側半月板の取り替えを行うときは、内側門が異種移植片の挿入に適当である。これには靱帯粘膜の切除と脂肪パッドの一部の除去が必要となろう。外側半月板の前部角に対するドリルガイドが前部内側門を通して挿入される。外側脛骨棘の後部傾斜が、正確な半月板角挿入のために同定されなければならない。前部角は前部十字形靱帯の外側に近接して外側脛骨棘の前部傾斜に挿入される。これらの穴を内側からあける利益は、トンネルの拡開が大きくなり、各角挿入体の間の大きい骨ブリッジを提供できることである。挿入技術の残りは同じであるが、後部角を縫合するときに神経血管束を注意深く保護すべきである。後部外側からの接近は、共通の腓骨神経を保護し、外側被膜を露出するために必要である。もしも縫合場所の疑問があれば、解放した後部角縫合は標準法に従って行うべきである。別法として、半月板の及び又は安定化装置例えば矢又は綴針などを使用することができる。Ｂｏｎｉｘ，Ｉｎｃにより製造されている安定化矢はかかる安定化矢の一例である。他の安定化装置は当業者に知られているものが使用できる。
【００７７】
日常的な皮膚クロージャー及び手当て用品も使用できる。エピネフィリンを使用する３０ｍｌのＭａｒｃａｉｎｅ（Ａｓｔｏｒａ社製）を必要ならば注入できる。術後ヒンジ膝補強材を適用して屈伸の範囲を９０度、伸縮の範囲を３０度に限定することができる。
術後的には、患者はヒンジ膝補強材を装着した状態で部分的な加重負荷が許容される。支持部材は睡眠のために除去することができ、支持部材を越えた範囲の運動が可能である。術後一日すると、足をあげたり、座ったり、片足自転車こぎをしたり、強化運動を開始できる。６週間後には膝の屈伸運動と、両足自転車こぎ、水中歩行などが開始できる。最大強度が達成されたら、旋回運動が術後４〜６週間で再開できる。
【００７８】
関節軟骨軟組織異種移植片の移植
レシピエントの関節の下にある骨床を、骨バーを用いて準備して、海綿状の出血床を生成する。移植は、関節表面又は関節表面の一部分を含むことができる。この発明の実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片をレシピエントの関節に覆いとして適用し、それを少なくとも一の縫い糸アンカー、吸収性のピン、スクリュー、ステープル等により適所に保持する。フィブリン血餅も又、実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片を適所に保持するために利用することができる。
【００７９】
靭帯軟組織異種移植片の移植
回復できないダメージを受けた靭帯は、外科用シェーバーを用いて除去する。この靭帯の解剖学的挿入部位を同定し、穴をあけて骨プラグを適応させる。この骨プラグの大きさは、幅約９〜１０ｍｍ、深さ約９〜１０ｍｍ、長さ約２０〜４０ｍｍであってよい。この異種靭帯を、ドリル穴を通して運び、干渉スクリューを用いて固定する。日常的閉鎖を行う。
この発明を、更に、下記の実施例により説明するが、これは、制限と解するべきではない。この出願中で引用されるすべての参考文献並びに公開された特許及び特許出願の内容を、本明細書中に参考として援用する。
【００８０】
実施例１：α−Ｇａｌエピトープのα−ガラクトシダーゼによる軟組織からの排除
この実施例においては、軟組織からのα−ｇａｌエピトープの排除を評価するためにＥＬＩＳＡアッセイを行う。
【００８１】
糖蛋白質上のα−ｇａｌエピトープに対して高度に特異的であるモノクローナル抗−Ｇａｌ抗体(Ｍ８６と呼ぶ)を、抗−Ｇａｌを産生する１，３ガラクトシルトランスフェラーゼについてのノックアウトマウス由来の脾臓細胞とマウスハイブリドーマ融合パートナーとの融合により生成する。
【００８２】
Ｍ８６の糖蛋白質上のα−ｇａｌエピトープに対する特異性は、図１１において説明される。Ｍ８６は、●−ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)に結合された、▲−ウシチログロブリン(これは、１１のα−ｇａｌエピトープを有する、R.G.Spiro等,Occurrence ofα-D-galactosyl residues in the thyroglobulin from several species. Localization in the saccharide chains of complex carbohydrates, 259 J.Biol.Chem.9858(1984))に結合された；又は、■−マウスラミニン(これは、５０のα−ｇａｌエピトープを有する、R.G.Arumugham等、Structure of the asparagine-linked sugar chains of laminin. 883 Biochem.Biophys.Acta 112(1986))に結合された合成のα−ｇａｌエピトープに結合するが、□−ヒトチログロブリン又はヒトラミニン、○−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ)及びＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(ＢＳＡに結合されたＰ１抗原)(これらすべては、α−ｇａｌエピトープを完全に欠く)に結合された合成のα−ｇａｌエピトープには結合しない。結合は、Ｍ８６組織培養培地の種々の希釈物にて測定する。
【００８３】
一度Ｍ８６抗体が単離されれば、そのモノクローナル抗体を約１：２０〜１：１６０に(好ましくは、約１：５０〜１：１３０に)希釈する。この抗体を、約５〜２４時間の予め決めた時間だけ、約３〜８℃の予め決めた範囲の温度でインキュベートする。この抗体を、一定の回転で、約５〜１００μｍの大きさの軟組織の断片(一層好ましくは、約１０〜５０μｍの大きさの軟組織断片)を、様々な軟組織濃度(約２００ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ)で用いて維持する。その後、これらの軟組織断片を、遠心分離(約２０，０００〜５０，０００×ｇ)により除去する。軟組織に結合したＭ８６の割合を、上清中の残留Ｍ８６活性を、従来技術(例えば、U.Galili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997))に記載されたように、α−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡで測定することにより評価する。Ｍ８６の軟組織への結合の程度は、その後のα−ｇａｌ−ＢＳＡへの結合の阻害パーセンテージとして定義する。軟組織中のα−ｇａｌエピトープの量と軟組織断片と複合体化され、それ故上清から除去されたＭ８６の割合(即ち、阻害パーセンテージ)との間には、直接的関係がある。
【００８４】
このアッセイの例を、図１２に示す。ホモジェナイズされた半月軟骨(○)又はα−ガラクトシダーゼで処理した半月軟骨(●)を、Ｍ８６モノクローナル抗体(１：１００希釈)と２０時間４℃でインキュベートする。その後、これらの半月軟骨断片を、３５，０００×ｇでの遠心分離により除去し、上清中の残留Ｍ８６を固相抗原としてα−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡで評価する。図１２は、半月軟骨の２００Ｕ／ｍｌα−ガラクトシダーゼでの３０℃で４時間の処理とその後のリン酸塩緩衝液(ＰＢＳ)での５回の洗浄がα−ｇａｌエピトープを完全に除去することを示している。それ故、その後は、２００ｍｇ／ｍｌの高い半月軟骨断片濃度でさえも、α−ｇａｌ−ＢＳＡへのその後のＭ８６の結合の阻害はない。
【００８５】
実施例２：移植されたα−ガラクトシダーゼで処理したブタの半月軟骨軟組織に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、ブタの半月の及び関節の軟骨並びにウシの靭帯の軟組織移植物をα−ガラクトシダーゼで処理してα−ガラクトシルエピトープを除去し、これらの移植物をカニクイザルに移植して、この軟組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【００８６】
ブタの後膝関節を無菌的に準備して半月軟骨及び関節軟骨並びに他の周辺に付着する軟組織を外科的に取り出す。この半月軟骨及び関節軟骨軟組織の試料を、少なくとも５分間、アルコール(例えば、エタノール又はイソプロパノール)で洗って滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。この半月軟骨及び関節軟骨軟組織試料を約−３５〜−９０℃の温度で(好ましくは、約−７０℃以下の温度で)凍結させて試料の繊維軟骨細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【００８７】
ウシの後膝関節も又、無菌的に準備して、靭帯(各々一端又は両端に付着した骨のブロックを伴う)を、低温で、厳格な無菌技術下で取り出す。骨のブロックの各々は、約９ｍｍの直径の約４０ｍｍの長さの実質的に円筒状のプラグを表す。各靭帯軟組織試料を注意して同定して、結合組織を切除し、それにより、異種移植片を形成する。これらの靭帯軟組織異種移植片試料を、次いで、少なくとも５分間アルコール(例えば、エタノール又はイソプロパノール)で洗って滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。その後、これらの試料を約−７０℃の温度で凍結して、この靭帯試料中の細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【００８８】
各半月軟骨、関節軟骨及び靭帯軟組織異種移植片試料を、２つの部分に切断する。各第１の部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝液に浸す。これらの試料をこの緩衝液中で予め決めた時間予め決めた温度でインキュベートする。各第２の部分を、対応する第１の部分と同様の条件下で、α−ガラクトシダーゼの非存在下で緩衝液中でインキュベートし、これは、対照として働く。
【００８９】
インキュベーションの最後に、軟組織異種移植片試料を、酵素が拡散する条件下で洗う。アッセイを行って、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確実にする。
【００９０】
各半月軟骨軟組織異種移植片試料を、６匹のカニクイザルの膝蓋骨上の嚢(pouch)内に移植する。一般的吸入麻酔下の動物を用いて、約１ｃｍの切開を直接膝蓋骨上嚢に近位に延びる膝蓋骨の内側上膝縁に作る。ブタの約０．５〜１ｃｍの長さの軟骨軟組織片を、この嚢内にマーキングタグとしての単一の３−０ナイロンステッチと共に置く。
【００９１】
これらの関節軟骨異種移植片試料を、実質的に上記の移植手順に従って、６匹のカニクイザルの膝蓋骨上嚢に移植する。
【００９２】
これらの靭帯軟組織異種移植片試料を、下記の移植手順を用いて、６匹のカニクイザルに移植する。一般的吸入麻酔下の動物を用いて、異種移植用靭帯のための外科的切開部位を同定して、実質的に直径９ｍｍで長さ４０ｍｍの骨プラグを収容するために錐で穴をあける。異種移植用靭帯を錐穴を通して運び、インターフェレンススクリューを添付する。
【００９３】
これらの移植手順を無菌的外科技術下で行い、傷を３−０ビクリル(又は当業者に公知の適当な同等物)で閉じる。これらの動物に非制限的ケージ活動をさせて、不快、腫脹、感染又は拒絶の如何なる徴候をもモニターする。血液試料(例えば、２ｍｌ)を、抗体をモニターするために周期的に(例えば、隔週で)採取する。
【００９４】
異種移植片に対する免疫応答の出現は、移植を受けたサル由来の血清試料中の抗−Ｇａｌ及び非抗−Ｇａｌ抗軟組織抗体(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の軟組織抗原に結合する抗体)を測定することにより評価する。少なくとも２ｍｌの血液試料を、これらの移植を受けたサルから、移植手術の日に採取し且つ手術後に周期的間隔(例えば、２週間間隔)で採取する。これらの血液試料を遠心分離し、血清試料を凍結して抗Ｇａｌ及び他の非抗Ｇａｌ抗−軟組織抗体について評価する。
【００９５】
抗−Ｇａｌ活性を、血清試料中で、固相抗原としてα−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡで、当業者に公知の方法(例えば、Galili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997)に記載された方法)により測定する。
【００９６】
アッセイを行って、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が抗−軟組織抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗−軟組織抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、当業者に公知の方法(例えば、K.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法)に従って行う。
【００９７】
軟組織異種移植片試料は、移植後１〜２ヶ月の時点で、適宜、外植し、切片化して炎症性浸潤物の組織学的評価のために染色する。抗−Ｇａｌ及び他の抗−軟骨軟組織抗体活性の移植後の変化は、移植後１〜２ヶ月で、外植した軟組織内の炎症性組織学的特性(即ち、顆粒球又は単核細胞浸潤物)と相関する(当分野で公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法を使用)。
【００９８】
軟組織を外植する場合には、それらの軟組織異種移植片を、麻酔手順、関節の外科的露出、移植片を取り出すこと及び軟組織を閉じることを用いて無菌的に採取する(動物を回復させる場合)。異種移植片を取り出すときに、関節液を(吸引するだけ十分な量あるならば) 移植物の肉眼的及び組織病理学的評価が移植された軟組織の優れた性能を示すかどうかについての可能な免疫学的試験のために後膝関節から集める。
【００９９】
半月軟骨又は関節軟骨異種移植片の移植をされた動物を回復させて、切開が癒えて歩きぶりが正常になるまで綿密にモニターする。これらの異種移植片試料を集めて、処理して、顕微鏡により調べる。
【０１００】
これらの半月軟骨、関節軟骨及び靭帯移植物並びに周囲の組織の部分を、免疫組織化学評価のために、包埋モールド中で、当分野で公知の方法により、凍結組織試料用に包埋メディウム中で凍結させる。「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物(約１０％ｗ／ｗのポリビニルアルコール、約４％ｗ／ｗのポリエチレングリコール及び約８６％ｗ／ｗの非反応性成分を含み、Sakura FinTek, Torrence, カリフォルニア在により製造されている)は、本発明での使用のための可能な包埋メディウムの非制限的例である。当業者に公知の他の包埋メディウムも又、用いることができる。残りの移植物及び周囲の組織を、組織病理学的試験のために、１０％の中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１０１】
実施例３：α−ガラクトシダーゼ、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理した移植された半月軟骨、関節軟骨及び靭帯軟組織に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタの半月軟骨及び関節軟骨軟組織移植物及びウシの靭帯軟組織移植物を、実施例１に記載のように、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ｇａｌエピトープを除去する。これらの軟組織移植物を、更に、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して、残留炭水化物鎖にフコシルをキャップする。フコシルトランスフェラーゼは、フコシルの異種移植片へのトランスファーを促進する。このフコシルは、残留炭水化物鎖に結合し、それ故、それらをキャップする。フコシルでのキャッピングは、異種移植片を外来物として認識する患者の免疫系の能力を邪魔する。これらの軟組織移植物をカニクイザルに移植して、それらの軟組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【０１０２】
ブタの後膝関節由来の半月軟骨及び関節軟骨移植物並びにウシの後膝関節由来の靭帯移植物を、実施例１で移植物を調製したようにして(α−ガラクトシダーゼ処理を含む)調製する。しかしながら、サルに移植する前に、これらの移植物を、更に、予め決めた量のフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで、予め決めた濃度で、予め決めた時間、予め決めた温度で処理して、残留炭水化物鎖にフコシルをキャップする。例えば、これらの移植物を、緩衝液に、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼの予め決めた濃度で浸す。これらの移植物を、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。
【０１０３】
対応するグリコシルトランスフェラーゼと組み合わされた他の分子例えばＮ−アセチルグルコサミンも又、これらの移植物の炭水化物鎖をキャップするために用いることができる。
【０１０４】
その後、これらの移植物を洗って酵素を除去してサルに移植し、異種移植片に対する免疫応答の出現を、実施例１で記載したように評価する。
【０１０５】
実施例４：α−ガラクトシダーゼ処理したブタの関節軟骨に対するシアリルトランスフェラーゼ及びトランス−シアリダーゼを用いる炭水化物部分のシアル酸でのキャッピングの評価
この実施例では、α−ガラクトシダーゼ処理したブタの関節軟骨を、α−２６シアリルトランスフェラーゼ(ＳＴ)又はα−２３トランス−シアリダーゼ(ＴＳ)を用いて、シアル酸で処理して、軟骨の炭水化物部分をシアル酸でキャップする能力を確実にする。
【０１０６】
α−ガラクトシダーゼで処理した関節軟骨を、ホモジェネートとしてＥＬＩＳＡウェルに、ウェル当たり５μｌの軟骨ホモジェネートを乾燥させることにより付着させる。選択したウェルにおいて、ウシ血清アルブミンでブロックした後、１０Ｕ／ｍｌのα−２６ＳＴ(カリフォルニア、San Diego在、Calbiochemにより製造)及び２ｍＭの糖供与体のシチジンモノホスフェート−シアル酸(ＣＭＰ−ＳＡ)(ミズーリ、St. Louis 在、Sigma, Inc.)をそれらのウェルに加える。次いで、ＳＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープに特異的なレクチンのニワトコニグラレクチン(ＳＮＡ)(カリフォルニア、Burlingame在、Vector Labs)を、これらのウェルに、最大で２０μｇ／ｍｌの濃度で加える。ＳＮＡレクチンのＳＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープへの結合の程度は、シアリル化α−ガラクトシダーゼ処理した軟骨を含むウェル及びα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨(シアリル化なし)を含むウェルにて測定する。ＳＮＡレクチンのシアリル化した及び脱シアリル化したフェチュイン(ミズーリ、St. Louis 在、Sigma, Inc.)への結合も又、α−ガラクトシダーゼ処理した軟骨におけるシアル酸キャッピングを公知の分子におけるシアル酸キャッピングと比較するために測定する。図１３Ａは、ＳＮＡレクチンのシアリル化なしでα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨への結合(○)、シアリル化したα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨への結合(●)、脱シアリル化したフェチュインへの結合(□)及びシアリル化フェチュインへの結合(■)を示している。
【０１０７】
図１３Ａに示したように、シアリル化なしでα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨は、レクチンの軟骨への基底レベルの結合を示している。この結合は、レクチンが、この軟骨の炭水化物鎖の幾つかの上の自然に生成したＳＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープに結合するので生じる。しかしながら、α−２６ＳＴでの処理後に、軟骨の炭水化物鎖上のＳＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープのデ・ノボ合成とその後のシアル酸でのキャッピングの故に、ＳＮＡレクチンの軟骨への結合の有意の増加がある。
【０１０８】
上記の手順を、α−２３ＴＳ(ペンシルベニア、Horsham在、Neos Technologies, Inc.)をα−２６ＳＴの代わりに用い；糖供与体のシアル酸−ラクトース(ＳＡ−Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ)(ペンシルベニア、Horsham在、Neos Technologies, Inc.)をＣＭＰ−ＳＡの代わりに用い；そしてレクチンのMaackiaアムレンシスレクチンＩＩ(ＭＡＬＩＩ)(カリフォルニア、Burlingame在、Vecor Labs)(これは、ＳＡα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープに特異的である)をＳＮＡの代わりに用いて繰り返す。ＭＡＬＩＩレクチンのα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨(シアリル化ありのもの及びなしのもの)中のＳＡα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープに対する結合の程度を、ＭＡＬＩＩレクチンのシアリル化した又は脱シアリル化したフェチュインに対する結合と共に測定する。図１３Ｂは、ＭＡＬＩＩレクチンのシアリル化なしでα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨への結合(○)、シアリル化したα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨への結合(●)、脱シアリル化フェチュインへの結合(□)及びシアリル化フェチュインへの結合(■)を示している。
【０１０９】
図１３Ｂに示したように(そして、図１３Ａと同様に)、シアリル化なしでα−ガラクトシダーゼ処理した軟骨は、基底レベルのＭＡＬＩＩレクチンの結合を示している(このレクチンは、この軟骨の炭水化物鎖の幾つかの上の自然に生成したＳＡα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープに結合する)。しかしながら、α−２３ＴＳでの処理後には、シアル酸キャッピングの結果としての軟骨の炭水化物鎖上のＳＡα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒエピトープのデ・ノボ合成の故に、ＭＡＬＩＩレクチンの軟骨への結合の有意の増加がある。
【０１１０】
当業者は、この発明がその精神又は本質的特性から離れることなく他の特定の形態で具体化され得るということを認識するであろう。それ故、現在記載されている具体例は、説明のためのものと考えるべきであって制限するものではなく、この発明の範囲は、前述の記載よりは添付の請求の範囲により示されている。そして、それらの請求項の同等物の意味と範囲内に包含されるこの発明のすべての変法は、それ故、その中に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
内側及び外側半月板がそれらの本来の位置にあるヒトの膝関節の概略図である。
【図２】
生体内で脛骨の内側及び外側顆の上方に位置決めされるときの内側及び外側半月板を示すヒトの膝関節の破断図である。
【図３】
ヒトの膝の断裂した外側半月板の切除術及び半月板移植片の受け入れのための膝の準備を示す図である。
【図４】
ヒトの膝への後方外側半月板角挿入のための好ましいドリルガイド配置を示す図である。
【図５】
ヒトの膝への後方外側半月板角挿入におけるカニューレ挿入ドリルオーバードリルガイドワイヤを示す図である。
【図６】
半月板角挿入のための後方及び前方ドリル孔を設けたヒトの膝の様子を示す図である。
【図７】
ヒトの膝関節中に半月板移植片を引き込むための好ましい縫合糸通し器具の配置を示す図である。
【図８】
挿入段階の間の半月板移植片を収納したヒトの膝の様子を示す図である。
【図９】
半月板移植片を収納し、ゾーン特異的半月板修復縫合糸をこの半月板修復縫合糸を最終的に縛るための位置に備えたヒトの膝の様子を示す図である。
【図１０】
大腿骨２の関節端部上の関節軟骨７及び脛骨４の関節端部上の関節軟骨８の正常な位置を示すヒトの膝関節３を表す図である。
【図１１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチログロブリン、マウスラミニン、Galβ1-4 GlcNAc-BSA（Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ）、Galα1-4Galβ1-4 GlcNAc-BSA（ＢＳＡに結合したＰ１抗原）、及びヒトチログロブリン又はヒトラミニン上のα−ガラクトシルエピトープに対するモノクローナル抗Gal抗体の特異性を表すグラフである。
【図１２】
α−ガラクトシダーゼ処理された半月板軟骨からのα−ガラクトシルエピトープの除去を表すグラフである。
【図１３Ａ】
軟骨炭水化物鎖の末端上においてSAα2-6Galβ1-4GlcNAc-R残基を形成させるためにシアリル基転移酵素を用いた、α−ガラクトシダーゼ処理された関節軟骨上における炭水化物部分のシアル酸でのキャッピング｛サンブクス・ニグラ（Sambucus nigra）レクチンの前記残基への結合によって測定した｝を表わすグラフである。
【図１３Ｂ】
軟骨炭水化物鎖の末端上においてSAα2-3Galβ1-4GlcNAc-R残基を形成させるためにトランスシアリダーゼを用いた、α−ガラクトシダーゼ処理された半月板軟骨上における炭水化物部分のシアル酸でのキャッピング｛マーキア・アムレンシス（Maackia amurensis）レクチンIIの前記残基への結合によって測定した｝を表わすグラフである。
【符号の説明】
２  大腿骨
３  膝関節
４  脛骨
７、８  関節軟骨