【手続補正書】
【提出日】平成17年11月11日(2005.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ分子を調製する方法であって、該方法は、以下；
ＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の該ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に公知である配列を有するプライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の該プライマー連結フラグメントを増幅する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２】
前記複数のプライマー連結フラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、水力学的剪断、超音波処理もしくは噴霧化のような機械的フラグメント化によるか、酸性触媒の加水分解、アルカリ性触媒の加水分解、金属イオンによる加水分解、ヒドロキシラジカル、照射もしくは加熱のような化学的フラグメント化による、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化学的フラグメント化が、加熱による、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記加熱が、約４０℃〜１２０℃、約８０℃〜１００℃、約９０℃〜１００℃、約９２℃〜９８℃、約９３℃〜９７℃、約９４℃〜９６℃の温度で行われ、該加熱は、好ましくは約９５℃までの温度である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ分子の前記加熱が、０から２００ｍＭの濃度の塩を有する溶液、約０から約１０ｍＭの濃度の塩を有する溶液、または約０．１から約１ｍＭの濃度の塩を有する溶液、または約０．１から約０．５ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記加熱が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記加熱は、水の溶液中で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、ＤＮＡｓｅＩを用いた消化を包含するような、酵素的フラグメント化による、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化が、約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のようなＭｇ２＋イオン存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーが、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に既知である配列を有するプライマーの前記結合が、該ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の作製を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホモポリマー伸長が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製され、ここで具体的には、該ホモポリマー伸長が、ポリＧ路を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に既知である配列の前記結合は、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の連結を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項１５】
前記アダプターが、少なくとも一つ平滑末端を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アダプターが、一本鎖領域を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、さらに、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウまたはその組み合わせにより作製されるような、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの平滑末端の作製を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
少なくとも一つの該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の該ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知である配列を有するプライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の該プライマー連結フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記複数のプライマー連結フラグメントを同時に配列決定することをさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、機械的フラグメント化による、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡの前記機械的フラグメント化が、水力学的剪断、超音波処理もしくは噴霧化による、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、化学的フラグメント化による、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学的フラグメント化が、酸性触媒の加水分解、アルカリ性触媒の加水分解、金属イオンまたは複合体による触媒、ヒドロキシラジカル、照射あるいは加熱による、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学的フラグメント化が、加熱による、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記加熱が、約４０℃〜１２０℃、約８０℃〜１００℃、約９０℃〜１００℃、約９２℃〜９８℃、約９３℃〜９７℃、約９４℃〜９６℃の温度で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記加熱が、約９４〜約９６℃までの温度で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記加熱が、約９５℃までの温度で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ分子の前記加熱が、０から約１００ｍＭの濃度の塩を有する溶液、約０〜約１０ｍＭの濃度の塩を有する溶液、約０．１〜約１ｍＭの濃度の塩を有する溶液、または約０．１〜約０．５ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記加熱は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、酵素的フラグメント化による、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記酵素的フラグメント化が、ＤＮＡｓｅＩを用いた消化を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化が、Ｍｇ２＋イオン存在下で行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライマーが、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に既知である配列を有するプライマーの前記結合が、該ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の作製を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ホモポリマー伸長が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ホモポリマー伸長が、ポリＧ路を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に既知である配列を有するプライマーの前記結合は、該ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端にアダプター分子の連結を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３８】
前記アダプターが、少なくとも一つ平滑末端を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アダプターが、一本鎖領域を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの平滑末端の作製をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記平滑末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウまたはその組み合わせにより作製される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１８の方法により作製されたライブラリー。
【請求項４３】
ＤＮＡテンプレートのライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該複数のＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の該ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知である配列を有する第１プライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の該プライマー連結フラグメントを増幅する、
を包含する、方法であって、
ここで、該増幅する工程は、以下：
該ＤＮＡフラグメント中の既知である配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー
を使用する、
方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡフラグメントにおいて前記既知配列に相補的な第４プライマーを用いて、該複数のＤＮＡフラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法により作製された、ライブラリー
【請求項４６】
複数のＤＮＡフラグメントを同時に配列決定する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
複数の該プライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、ここで、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー、
を利用する工程；および
該ＤＮＡフラグメントにおいて該既知配列に相補的な第４プライマーを用いて、該複数のＤＮＡフラグメントを配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記第４プライマーは、前記第２プライマーである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
核酸配列の一連の連続重複を配列決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
重複配列を有する複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該複数のＤＮＡ分子において既知配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子の第１領域を同時に配列決定する工程；および
該第１領域配列決定する工程から決定された配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子の第２領域を同時に配列決定する工程、
を包含し、ここで該核酸配列の一連の重複における領域の次の連続配列決定は、先の重複配列決定産物で得た配列から配列決定を開始することにより生成される工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項７６に記載の方法であって、前記得る工程は、少なくとも一つの親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー
を利用する工程、としてさらに規定される、方法。
【請求項５０】
複数のＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、該方法は、以下：
親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化することによって該複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該複数の分子における既知配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子を同時に配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記方法は、前記複数のＤＮＡ分子の増幅をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記増幅は、以下：
前記複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおける既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー、
を利用する、工程、としてさらに規定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記分子において二次構造を生成する配列を有するＤＮＡ分子を調製する方法であって、該方法は、以下：
該配列を有するＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、複数のＤＮＡフラグメントを生成する工程であって、該複数のＤＮＡフラグメントは、該二次構造を生成する配列の一部もしくは全てを有するＤＮＡフラグメントを含む、工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有するプライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記複数のプライマー結合フラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数のＤＮＡフラグメントは、前記二次構造を生成する配列を有さないＤＮＡフラグメントをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記二次構造は、ヘアピン、Ｇの四重項もしくは三重らせんである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記得られたＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
ＤＮＡ分子の３’末端を条件付けする方法であって、該３’末端をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに曝露する工程を包含する、方法。
【請求項５９】
前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を含むようにさらに規定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記曝露する工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＤＮＡ分子の末端に３’エキソヌクレアーゼ活性を提供する方法であって、該分子の末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを導入する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記導入する工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
プローブを調製する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも一つのＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する標識化プライマーを結合して、標識化プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項６４】
前記標識化プライマーを結合する工程は、前記ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の生成を包含し、該伸長は該標識を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ホモポリマー伸長は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより生成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記標識化プライマーを結合する工程は、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の連結を包含し、該アダプター分子は該標識を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団、もしくは発蛍光団を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６３の方法から生成される、標識化プローブ。
【請求項６９】
請求項６３の方法から生成されるプローブを含む、キット。
【請求項７０】
少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端を修復する方法であって、該３’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを提供する工程を包含する、方法。
【請求項７１】
前記提供する工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端を修復するためのキットであって、該キットは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む、キット。
【請求項７３】
請求項７２に記載のキットであって、該キットは、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を含む、キット。
【請求項７４】
損傷されたＤＮＡ分子を検出する方法であって、該損傷されたＤＮＡ分子にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、および標識化グアニンリボヌクレオチド、標識化グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程を包含する、方法。
【請求項７５】
前記損傷されたＤＮＡは、ニック、二重鎖切断、もしくは双方を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記提供する工程は、前記損傷されたＤＮＡ分子に修復を提供するようにさらに規定される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団、もしくは発蛍光団を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記損傷されたＤＮＡは、細胞の外側にあり、具体的には、該損傷されたＤＮＡは、照射、紫外光、酸素、ラジカル、金属イオン、ヌクレアーゼ、もしくは機械的な力の結果である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記損傷されたＤＮＡは、細胞内にあり、具体的には、該細胞は、アポトーシス細胞であり、具体的には、該損傷されたＤＮＡは、照射、熱、紫外光、酸素、ラジカル、一酸化窒素、カテコールアミン、もしくはヌクレアーゼの結果である、請求項７４に記載の方法。