【手続補正書】
【提出日】平成17年7月14日(2005.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
リンカーペプチドの機能は、抗病原体タンパク質またはタンパク質ドメインを、それらの機能を妨害することなく結合することである。天然リンカーは、一般に約３から１５アミノ酸の長さを有する。Gly、SerおよびThrのみのペンタペプチドが天然リンカーで最も多く存在し、最良の一般的リンカーを形作る。グリシンは柔軟性を提供し、他の二つは極性であり、溶媒またはその主鎖窒素に結合する水素と相互作用する。これは、ある構造的およびエネルギー的安定を達成する。それらは、結合タンパク質またはタンパク質ドメインの他の部分と相互作用していないようであり、宿主プロテイナーゼによる開裂に感受性ではないようである。また好ましいと考えられるのは、Ala、Pro、Asp、Lys、GlnおよびAsnである。各々最大の塩基性および酸性残基であるArgおよびGluのような疎水性残基は避ける。広範囲に分布するプロテイナーゼの開裂に感受性のリンカーは、しばしば該好ましくない組成を１個またはそれ以上含む。例えば、Xがしばしば疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるGly−Gly−Xは、タンパク質分解的処理部位であり得る。これらの事項および有用な可能性のあるリンカーのリストは、Argos, P, J. Mol. Biol. 211, 943-958, 1990に記載されている。開裂可能なリンカーを有する価値は考慮しない。リンカーは、広範囲の分野で使用されている。本発明で最も適切なものは、植物内の一本鎖抗体のような、機能的抗体分子の発現のためのリンカーの使用である。完全なおよび操作された抗体の両方が植物内で発現されている。抗体の一本鎖Fvフラグメント(ScFv)が、抗体遺伝子(V)の可変性重鎖(VH)および可変性軽鎖ドメイン(VL)の結合により操作できる。これを達成する一つの試みは、ペプチドリンカーの使用である。多くのペプチドが、コンピューター補助プログラム、および３次元ペプチド配列のライブラリーの調査を使用して、設計されている。十分なリンカーは、アミノ酸配列KESGSVSSEQLAQFRSLDを有する隣接残基を伴う天然免疫グロブリンリンカーである(Bird et al. Science 242 423-427, 1988；配列番号１２)。アミノ酸配列EGKSSGSGSESKPを有する他のペプチド(Bird et al. Science 242 423-427, 1988；配列番号１３)は、Gly、SerおよびThrが優勢である。これは植物内でScFvを発現するのに、十分に使用されている(Owen et al. Biotechnology 10, 790-794; 1992)。アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号１４)を有するリンカーが、VHドメインのC−末端とVLドメインのN−末端の間のユークリッド距離の決定に基づいて、ScFv抗体に関して推奨されている(Huston et al. Proc. Natl. Acad Sci 85, 5879-5883; 1988)。このリンカーは柔軟性を有し、溶液中で安定性および形態をまだ保つ(Argos, P, J. Mol. Biol. 211, 943-958, 1990)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
(実施例)
実施例１：二阻害剤発現カセットの製造
リンカー配列により分離しているOc-IΔD86およびCpTIコード領域の両方を含むタンパク質は、２段階PCR法で製造する。Oc-IΔD86コード領域は、先在する構築物(Urwin et al., Plant J 8:121-131, 1995)から、コード領域の５'末端に対応するオリゴヌクレオチドプライマーP1(5'-ATGTCGAGCGACGGACGGCCGGTGCTTGGC-3'；配列番号３)、植物メタロチオネイン様PsMTa遺伝子配列から得られるOc-IΔD86コード領域の３'末端、および下線のプロテアーゼ開裂可能リンカー配列の５'部分に相補的な第２プライマーP2(5'-GATCTTCGCCGGACCGACGCCAAGAATCACGGCATTTGCACTGGCATC-3'；配列番号４)を使用して、増幅する。同様に、CaMV 35Sプロモーターの制御下にCpTI cDNAを含むバイナリーベクターpROK/CpTI+5のCpTI遺伝子(Hilder et al, Nature 330:160-163, 1987)を、下線を引いたプロテアーゼ開裂可能PsMTaリンカー配列の３'部分をコードするように設計したプライマーP3(5'-GTCGGTCCGGCGAAGATCCAGTTTGAAGGTAGTAATCATCATGATGAC-3'；配列番号５)およびCpTIコード領域の３'末端に相補的なP4(5'-TTCTTACTCATCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3'；配列番号６)を伴うCpTIコード領域の５'末端で増幅する。増幅Oc-IΔD86およびCpTI配列は、その３'および５'末端に各々１８bp相補的領域を含み、SOEingのPCR法により(Ho et al., Gene 77:51-59, 1989, およびHorton et al., Gene 77:61-68, 1989)と、プライマーP１およびP4を使用して結合させた。これは、開裂可能リンカーにより、アミノ酸配列VIL↑GVGPA↑KIQ↑FEG(矢印の部分が推定の開裂部位を示す)と分離された、Oc-IΔD86およびCpTIをもたらす(Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI融合タンパク質)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
実施例４：E. coli発現
一および二エフェクター構築物の両方からの発現を、Urwin et al, Plant J 8:121-131, 1995に記載のように行う。タンパク質を、pQ30およびpQE32ベクターにより各々コードされるような６個のHis N−末端を含む融合タンパク質として発現させ、Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI融合タンパク質から放出されるCpTI以外、ニッケル樹脂を使用して、精製する。後者の場合、非形質転換E. coli由来の粗ホモジネートの阻害レベルを、これらのCpTIサンプルから引く。Oc-IΔD86を、Urwin et al. (Urwin et al., 1995, 前掲)により記載されたポリクローナル抗体で、CpTIをLiddellおよびCryer, “A practical guide to monoclonal antibodies”, John Wiley and Sons, New York, USA, 188頁, 1991にしたがって産生したモノクローナル抗体で検出する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
CpTIおよびOcIΔD86に対して産生された抗体は、一PI構築物を発現するArabidopsisの均質物中で、正確なMrのタンパク質バンドと反応する。植物均質物中の非同族PIのいずれかと、またはサンプルに存在する他のタンパク質と検出可能な程度に交差反応する抗体は存在しない。E. coliおよびArabidopsisの両方において、Oc-IΔD86/go/CpTI構築物は、約２３kDaの主要な生産物を産生し、これは両方の抗体により認識され、したがって両方のPIを含む。低分子量の個々のPIに対応する弱いシグナルが各抗体で検出され、融合タンパク質の低いレベルでの解離を示した。Oc-IΔD86/PsMTa/CpTI構築物は、反対のウェスタンブロットパターンを作り、高いMr生産物よりも低いMrとの高い反応性を示す。これは、開裂PIがこの場合優勢であることを示す。相対的阻害アッセイを、E. coliで産生された生産物Oc-IΔD86/PsMTa/cptiおよびOc-IΔD86/go/CpTIの生産物で行う。両方ともパパインおよびトリプシン活性の９５％阻害を提供し、タンデムPI分子が両方のプロテイナーゼを阻害し、二つのPIがPsMTa由来リンカーにより開裂された後もまた有効であることを示す。