【手続補正書】
【提出日】平成18年7月19日(2006.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
RNAを抽出には異なる供給源を使用した：
- 最後の抗原注射4日後と10日後との間の免疫血液150ml
- 最後の抗原注射4日後のリンパ節生検
密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque Plus Amersham Biosciences）によって、末梢血液リンパ球（PBL）を単離した。PBLおよびリンパ節を使用して総RNAを抽出（ChomczynskiおよびSacchi 1987）した。オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用するMMLV逆転写酵素（Gibco BRL）を用いて、200μgの総RNAについてのcDNAを調製した（de Haardら、1999）。cDNAを、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、鋳型として使用してVHHレパートリーを増幅した。
第１のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント（1.6kb）および重鎖抗体遺伝子セグメント（1.3kb）の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー（5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3'（配列番号85））およびオリゴd(T)プライマー（5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号86））を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー（国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043）および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第２のPCRを行った。
PCR産物を、（FR1プライマーに導入された）SfiIおよび（フレームワーク4に天然に存在する）BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1にエレクトロポレーションした後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物との融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
結果を表２に要約する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３００】
実施例９：レパートリークローニング
オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し、MMLV逆転写酵素（Gibco BRL）を用いて、200μgの総RNAについてcDNAを調製した（de Haardら、1999）。cDNAを、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、VHHレパートリーを増幅させるための鋳型として使用した。
第１のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント（1.6kb）および重鎖抗体遺伝子セグメント（1.3kb）の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー（5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3'（配列番号87））およびオリゴd(T)プライマー（5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号88））を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー（国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043）および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第２のPCRを行った。
PCR産物を、（FR1プライマーに導入された）SfiIおよび（フレームワーク4に天然に存在する）BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1にエレクトロポレーションの後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物を含む融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。TG1細胞のエレクトロポレーションの後に得られた多様性を表８に示す。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
実施例１８：レパートリークローニング
オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し、MMLV逆転写酵素（Gibco BRL）を用いて、200μgの総RNAについてcDNAを調製した（de Haardら、1999）。cDNAを、フェノール/クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、VHHレパートリーを増幅させるための鋳型として使用した。
第１のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント（1.6kb）および重鎖抗体遺伝子セグメント（1.3kb）の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー（5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3'（配列番号89））およびオリゴd(T)プライマー（5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号90））を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー（国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043）および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第２のPCRを行った。
PCR産物を、（FR1プライマーに導入された）SfiIおよび（フレームワーク4に天然に存在する）BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1のエレクトロポレーションの後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物を含む融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。TG1細胞のエレクトロポレーションの後に得られた多様性を表１に示す。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
治療用VHH断片
実施例２４：抗-TNFα VHH#3EのVHH-CDR3断片の発現
VHH#3EのCDR3領域を、フレームワーク4領域に位置するセンスプライマー（順方向：CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG（配列番号91））およびフレームワーク3領域に位置するアンチセンスプライマー（逆方向：TGTGCAGCAAGAGACGG（配列番号92））を用いて増幅した。
pAX10中のCDR-3断片をクローン化するために、2回目のPCR増幅を、必要な制限酵素部位を導入する以下のプライマーを用いて行った：
逆方向プライマーSfi1：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG（配列番号93）
順方向プライマーNot1：
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG（配列番号94）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３２】
実施例３３：レパートリークローニング
RNA抽出について以下の異なる供給源を使用する：
- 最後の抗原注射4日後と10日後との間の免疫血液150ml
- 最後の抗原注射4日後のリンパ節生検
密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque Plus Amersham Biosciences）によって、末梢血液リンパ球（PBL）を単離する。PBLおよびリンパ節を、全RNAの抽出（ChomczynskiおよびSacchi 1987）に使用し、次いでヘキサヌクレオチドランダムプライマーを用いてcDNAの合成を行う。2つのヒンジ特異的プライマーである：AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG（配列番号95）およびAACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT（配列番号125）、ならびにフレームワーク1特異的プライマーである：GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG（配列番号96）を使用して、レパートリーを増幅する。断片を、PstIおよびNotIを用いて消化し、ファージミドベクター中にクローン化する。このレパートリーをTG1エレクトロコンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含むLB寒天プレート上にプレートする。ベクター特異的プライマーを用いたPCRによって、挿入の存在についてコロニーをスクリーニングする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
実施例４２：抗血清アルブミンVHHに融合したVHH-CDR3断片を含む二重特異性構築物の構築
機能的部分であるMP2F6SRのCDR3領域を、フレームワーク4領域に位置するセンスプライマー（F6 CRD3順方向プライマー：CTGGCCCCAGAAGTCATACC（配列番号97））およびフレームワーク3領域に位置するアンチセンスプライマー（F6 CDR3逆方向プライマー：TGTGCATGTGCAGCAAACC（配列番号98））を用いて増幅させた。
CDR-3断片を抗血清アルブミンVHH MSA-21と融合させるために、2回目のPCR増幅を以下のプライマーを用いて行った：
F6 CDR3順方向プライマー Sfi1：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCATGTGCAGCAAACC（配列番号99）
F6 CDR3逆方向プライマー Not1：
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCTGGCCCCAGAAGTCATACC（配列番号100）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
【表１３】
2006519763.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
【表１４−３】
2006519763.tif 000002
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９−１】
2006519763.tif 000003
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９−２】
2006519763.tif 000004