【手続補正書】
【提出日】平成17年10月12日(2005.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号２または配列番号２５の配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド；
（b）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（c）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列、および
（d）（a）〜（c）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチド配列が配列番号２または配列番号２５である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
（a）配列番号１または配列番号２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（b）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（d）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号２４、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらの断片の配列を有する標識プローブでライブラリーをスクリーニングすることにより得られた少なくとも１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（e）（a）〜（d）のポリヌクレオチドのＲＮＡ同等物であるポリヌクレオチド；または、上記の単離ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列、および上記ポリヌクレオチドの変異体および断片であるか、もしくは上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的であるポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
（a）配列番号１または配列番号２４のポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（b）配列番号１または配列番号２４の単離ポリヌクレオチド；
（c）配列番号２または配列番号２５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；および
（d）配列番号２または配列番号２５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
発現ベクターが適合宿主細胞に存在する場合に請求項１に記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含んでなる発現系。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターまたは請求項１のポリペプチドを発現する膜を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、そして培養培地からポリペプチドを回収するステップを含んでなる方法。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域および請求項１に記載のいずれか１種のポリペプチドからなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１０】
ＮｇＲＨ１レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（a）化合物を請求項１に記載のポリペプチドを合し；
（b）レセプターに対する化合物の効果を測定する
ことを含んでなる方法。
【請求項１１】
ＮｇＲＨ１レセプターが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなるヒトＮｇＲＨ１レセプターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２もしくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または配列番号２もしくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片と特異的に結合する精製抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントである、請求項１２に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
ポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ）ファミリーのタンパク質をコードし、したがってＮｇＲホモログ１（ＮｇＲＨ１）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、さらに、神経系の再生および保護に有用である可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、ならびにＮｇＲＨ１ポリペプチド、誘導体および抗体の生産に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ＮｏｇｏＡは、３つの異なる変異体（ＮｏｇｏＡ、ＢおよびＣ）のうちＮｏｇｏ遺伝子の最長のスプライス産物であり（Chen et al. （2000） Nature 403, 434-439, GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444, Prinjha et al. （2000） Nature 403, 383-384）、レチキュロン（ＲＴＮ）タンパク質ファミリーに属す。中和抗体、ＮｏｇｏＡの異なるドメインを用いたところ、この分子中の２つの阻害ドメインが示され（Chen et al. （2000） Nature 403, 434-439, GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444, Prinjha et al. （2000） Nature 403, 383-384）、１つは分子のアミノ酸末端に相当し（アミノ−ＮｏｇｏＡ）、もう１つはＣ末端の細胞外ループ領域であり、Ｎｏｇｏ−６６と呼ばれている（GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
最近では、Ｎｏｇｏ−６６のＮ末端の４０アミノ酸を含んでなるＮｇＲアンタゴニストペプチドが脊髄傷害時に再生を誘導し、また機能回復も向上させることが示され、これによって、ＣＮＳ傷害の可能性のある治療薬が提供された（GrandPre and Strittmatter （2002） Nature 417, 547-51）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のもう１つの態様によれば、とりわけ研究、生物学的、臨床的および治療的目的で上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、組成物、工程および方法が提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
さらにもう１つの態様では、本発明は、培養増殖させた際に配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその断片を産生し得る、インビトロで増殖できる細胞、特に脊椎動物細胞を提供し、これらの細胞はヒトＮｇＲＨ１転写制御配列以外の転写制御ＤＮＡ配列を含み、この転写制御配列は配列番号２または配列番号２５のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡの転写を制御する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
好ましくは、ヌクレオチド配列が比較の前にまずアミノ酸配列へと翻訳される場合を含むポリペプチド配列の比較にはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992）が用いられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
「プラスミド」は、通常、本明細書では当業者に知られている標準的な命名慣例にしたがい、小文字のｐではじめ、かつ／または次に大文字および／または数字を続け表記する。本明細書で開示する出発プラスミドは商業的に入手できるか、公的に自由に入手できるか、あるいは周知の公開されている手法の通常の適用により入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明にしたがって使用できる多くのプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターが周知のものであり、当業者ならば容易に利用できる。さらに当業者ならば本発明での使用に好適な他のプラスミドを容易にいくつも構築することができる。本発明におけるこのようなプラスミドならびにその他のベクターの特性、構築および使用は当業者にならば本開示から容易に明らかになろう。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明は核酸分子、好ましくは（１）配列番号１または配列番号２４で示されるヌクレオチド配列を含んでなる単離ＤＮＡ、（２）配列番号１または配列番号２４で示される単離されたＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる単離ＤＮＡ；および（３）上記の（１）または（２）とハイブリダイズする核酸配列などのＤＮＡ分子を含んでなる。このようなハイブリダイゼーション条件は上記のように高ストリンジェントであってもそれほど高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合には、高ストリンジェント条件とは、例えば、３７℃（１４塩基のオリゴ）、４８℃（１７塩基のオリゴ）、５５℃（２０塩基のオリゴ）、および６０℃（２３塩基のオリゴ）で６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をさす。種々の組成の核酸に関するこのようなストリンジェント条件の適切な範囲は、例えばKrause and Aaronson （1991） Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
上記の遺伝子配列のほか、例えば他の種に存在し得るもののような配列のホモログも、当技術分野で周知の分子生物学的技術により、過度な実験を行うことなく同定し、容易に単離できる。さらにこのような遺伝子産物の１またはそれ以上のドメインと高いホモロジーを有するタンパク質をコードするゲノム内のその他の遺伝子座に遺伝子が存在する可能性もある。これらの遺伝子もまた同様の技術によって同定し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
長期間、高収量の組換えタンパク質生産のためには、安定発現が好ましい。例えば示差的発現遺伝子タンパク質を安定発現する細胞株を操作し得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作した細胞を富化培地（enriched media）で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えればよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞にプラスミドを自分の染色体に安定して組み込ませ、細胞叢（foci）を形成するまで増殖させ、次に細胞株中でクローニングおよび拡張する。この方法は示差的発現遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に用いられる。このような操作細胞株は示唆発現遺伝子タンパク質の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
本発明のさらなる実施態様は、上述の治療効果のいずれかを目的にした、医薬上許容される担体をともなう医薬組成物の投与に関する。このような医薬組成物はＮｇＲＨ１、ＮｇＲＨ１のミメティクス、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤からなり得る。これらの組成物は、単独で投与してもよいし、あるいは限定されるものではないが生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水をはじめとする任意の滅菌生体適合性医薬担体にて投与し得る安定化化合物など、少なくとも１種のその他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。これらの組成物は、患者に単独で投与してもよいし、あるいは他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
通常用量は投与経路に応じて０.１から１００,０００μg、総用量約１ｇまで様々であり得る。特定の用量および送達方法についての指針は文献に示されており、当業者ならば通常容易に入手できる。当業者ならば、タンパク質またはそれらの阻害剤よりもヌクレオチドに関する種々の製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も特定の細胞、症状、状況などに特異的である。タンパク質の経口投与に好適な医薬製剤については例えば米国特許第５,００８,１１４号；同第５,５０５,９６２号；同第５,６４１,５１５号；同第５,６８１,８１１号；同第５,７００,４８６号；同第５,７６６,６３３号；同第５,７９２,４５１号；同第５,８５３,７４８号；同第５,９７２,３８７号；同第５,９７６,５６９号；および同第６,０５１,５６１号に記載されている。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
方法：
a）ノーザンブロット：ｈＮｇＲおよびｈＮｇＲＨ１の発現の組織分布を調べるため、マルチプル・ティッシュ・ノーザンブロット（MTN, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）およびマルチプル・ティッシュ・エクスプレション・アレイ（MTEアレイ, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）をα−３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ−放射性標識ヒトＮｇＲおよびＮｇＲＨ１プローブとハイブリダイズさせた。それぞれのｃＤＮＡに対するプローブを以下のように作製した。ＮｇＲプローブはＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ−Ｉ切断によりｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲの切り出しによって作製した。このクローンはヒト背根神経節（ＤＲＧ）ｃＤＮＡライブラリー（Life Technologies Inc., Rockville, Maryland）から得たものである。これはクエリーとしてヒトＮｇＲ ｃＤＮＡを用い、ライブラリーのクローン配列に対してｂｌａｓｔ検索を行って同定した。ｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲのｃＤＮＡインサートは公開されているＮｇＲの配列（受託番号：ＡＦ２８３４６３）と比べて５'末端および３'末端でそれぞれ２４および２９２ｂｐ長い。ＮｇＲＨ１プローブは、ＥｃｏＲＩ切断によるｈＮｇＲＨ２−ｆｌの切り出しにより作製した。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１に対してそれぞれ得られた１．８ｋｂおよび１．４３ｋｂ ｃＤＮＡインサートをゲル精製し（QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAGEN AG, Basel, Switzerland）、各１００ｎｇを、Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡラベリングキット（Roche Biochemicals, Rothkreuz, Switzerland）を用いて３種の異なる標識反応で放射性標識した。組み込まれなかったヌクレオチドはＮｕｃＴｒａｐプローブ精製カラム（Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands）を用いて除去した。ＭＴＮまたはＭＴＥ膜をＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）中で、製造業者の説明書にしたがい（ただし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは除外した）、ＮｇＲまたはＮｇＲＨ１プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。ヒトＮｇＲおよびヒトＮｇＲＨ１に関して、２．４ｋｂに一本のバンドが検出された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ヒトＮｇＲおよびヒトＮｇＲＨ１ｍＲＮＡ発現は、ヒトの脳において最も高い。しかしながら、ヒトＨｇＲＨ１の豊富な発現は、ヒトの肝臓においても見られる。これらの遺伝子は、ともに、他の末梢組織、例えば骨格筋、脾臓、腎臓、肺および胎盤において低いレベルで発現する。脳での発現における可能性のある空間的相違をさらに詳細に考察するために、我々は、また、さまざまな脳の領域からの目印付きＲＮＡを担持しているＭＴＥをプローブ化した。この解析から、両方の遺伝子が異なる脳の領域において示唆的に発現されるように思われた。それらは大脳皮質、扁桃体、海馬および中隔側座核において高度に発現しているが、ＮｇＲのみが大脳皮質における発現に比べて小脳において極めて豊富である。両方の遺伝子の共通点は、脳橋、脳梁、尾状核、延髄、被核、黒質および脊髄においてそれらの発現が弱いことである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
c）エピトープタグ化ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の構築
1.）ＮｇＲ−Ｖ５タグクローニング手順：
Ｖ５−タグと制限切断部位ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩをコードする２つの相補的、合成オリゴヌクレオチド（Microsynth, Balgach, Switzerland）、５'−ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ−３'（配列番号１０）および５'−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＧＡ−３'（配列番号１１）をアニーリングし、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（INVITROGEN, Basel, Switzerland）のＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ部位に連結してｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５を得た。その後、シグナルペプチドを含まないヒトＮｇＲをコードするｃＤＮＡ配列を、フォワードプライマー５'−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＣＣＣ−３'（配列番号１２）およびリバースプライマー５'−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＡＣ−３'（配列番号１３）を用いてｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲ（上記参照）からＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５のそれぞれの切断部位に連結した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
2.）ＮｇＲＨ１−ＨＡタグクローニング手順：ＦＬＡＧ−タグと制限切断部位ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩをコードする２つの相補的、合成オリゴヌクレオチド（Microsynth, Balgach, Switzerland）、５'−ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣ−３'（配列番号１４）および５'−ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡ−３'（配列番号１５）をアニーリングし、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（INVITROGEN, Basel, Switzerland）のＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ部位に連結し、ｐＳｅｃＴａｇ２−ＦＬＡＧを得た。その後、シグナルペプチドを有さないヒトＮｇＲＨ１をコードするｃＤＮＡ配列を、ｈＮｇＲＨ１−ｆｌから、フォワードプライマー５'−ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ−３'（配列番号１６）およびリバースプライマー５'−ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ−３'（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そしてｐＳｅｃＴａｇ２−ＦＬＡＧにおいてそれぞれの切断部位へと連結した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
f）ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の脂質ラフト会合
1.）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）処理：
i）インタクト細胞の処理：コンフルエント状態の細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中で２回洗浄した後、３７℃で４時間、０．２Ｕ／ｍｌ  ＰＩ−ＰＬＣ（GLYKO Inc., Novato, CA）を含む４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中でインキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（Millipore, Volketswil, Switzerland）で細胞培地を６倍濃縮した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞スクレーパーで回収し、５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。細胞の溶解：細胞ペレットを室温で２０分間、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（ROCHE Applied Science, Rothkreuz, Switzerland）を補ったＭ−ＰＥＲ中に溶解させた（１００μ／２５ｍｇ細胞ペレット）。その後、溶解物を１４０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、上清に同バッファーを加えた。同量の溶解液と濃縮培地に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Invitrogen 4-12% Bistris Gels, MOPSバッファー）を行い、ＰＶＤＦメンブランにブロットした。ＰＩ−ＰＬＣ処理の後、ＰＩ−ＰＬＣは、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１および２９３Ｔ細胞から濃縮培地中へＮｇＲおよびＮｇＲＨ１を容易に放出するが、このことはそれらがＧＰＩ−アンカーを持っていることを示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
ＧＰＩ結合タンパク質は脂質ラフトの特徴的な構成成分である。原形質膜のこれらの微小ドメインは、リン脂質生体層として知られているように、原形質膜構造の通常の組織とは機能的にも生物物理学的にも異なっている。コレステロールやスフィンゴ脂質などの特定の脂質の非対称パッキングが、脂質が整列した状態のラフトを決め、その結果、低温下でＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で不溶となる。この挙動は、ラフトまたはカベオラと同義で、技術用語として用いられるいわゆる界面活性剤耐性膜（detergent−resistant−membranes （ＤＲＭ））をもたらす。ＤＲＭは、脂質含量が高いためにスクロース密度勾配で低密度上に浮く。これにより、会合型のタンパク質を細胞のその他の可溶性成分から同定および識別することができる。したがって、我々は、ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１を発現するＣＨＯ細胞を４℃の１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で抽出し、得られた抽出液をスクロース密度勾配遠心分離に適用した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
実施例３：リガンド結合分析
リガンド結合アッセイは受容体の薬理学を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット形式の適用ができる。レセプターｈＮｇＲＨ１の対する精製リガンド（推定されるものとしてはＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧまたはＯＭｇｐ）は結合実験のために高い比活性（５０〜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）まで放射性標識することができる（あるいは、アルカリホスファターゼ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、Ｖ５など）のような、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）に対する好適な検出タグを用いる）。次に、放射性標識（またはその他のシグナル）のプロセスがそのレセプターに対するリガンドの活性を消失させないかどうかの判定を行ない得る。バッファー、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドなどのその他のモジュレーターのアッセイ条件は、膜のソースおよび全細胞レセプターのソース双方に対して働き得るシグナル／ノイズ比を確立するために最適化され得る。これらのアッセイでは、特異的なレセプター結合は、（全会合放射活性）−（過剰量の非標識競合リガンドの存在下、またはＧＰＩアンカーを欠く過剰量の可溶性ＮｇＲＨ１エクトドメインの存在下で測定した放射活性）で定義できる（Domeniconi et al. （2002） Neuron 35, 283-290 （published online Jun 28）, Liu et al. （2002） Science Jun 27 （epub ahead of print）。可能であれば、１またはそれ以上の競合リガンドを用いて残りの非特異的結合を定義してもよい。