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　特願２００３−５５４８６８「組換え宿主細胞におけるヒアルロナンの生成方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年　７月　３日国際公開、ＷＯ０３／５４１６３、平成１７年　８月２５日国内公表、特表２００５−５２５０９１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は、平成１４年１２月２０日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００１年１２月２１日　米国）とする国際出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２０年１２月１日付手続補正書により補正された明細書の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項１に記載された以下のとおりのものである。
　
「ヒアルロン酸の製造方法において、
（ａ）バチルス（Bucillus）宿主細胞を、ヒアルロン酸の生成のために適切な条件下で培養し、ここで前記バチルス宿主細胞はバチルス細胞においてヒアルロン酸を生成するための合成オペロンを含んで成る核酸構造体を含んで成り、前記合成オペロンはプロモーター配列を含んで成り、このプロモーターは、バチルス細胞において作用可能に活性であり、そしてヒアルロナンシンターゼコード配列、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼコード配列及びUDP−グルコースピロホスホリラーゼコード配列に作用可能に結合されており、そして前記プロモーター配列が前記合成オペロンのコード配列の個々に対して外来性であり、前記コード配列の転写を指図し、そして“−35”領域のための配列TTGACA及び“−10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーターであり；そして
（ｂ）前記培養培地からヒアルロン酸を回収する；
　ことを含んで成る、ヒアルロン酸の製造方法。」（以下、「本願発明」という。）
　
２．引用例
　これに対して、原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前の２００１年１１月１３日に頒布された刊行物である特表２００１−５２１７４１号（以下、「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている。
　
(i)「本発明は、ヒアルロン酸を産生する方法であり、本方法は、（１）酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを宿主生物中へと導入するステップ（ここで宿主生物は、UDP−GlcNAcおよびUDP−GlcAを産生する酵素をコード化する核酸セグメントを含んでいる）、（２）この宿主生物を培地中で育成させてヒアルロン酸を分泌させるステップ、および（３）分泌されたヒアルロン酸を回収するステップを含む。」（第２６頁第１２行〜第１７行）
(ii)「spHASはＨＡ伸長を担っていることが明らかになり、同定およびクローニングされ、次いで発現が成功した最初のグリコサミノグリカンシンターゼである。このＳ．ピオジェネスＨＡ合成オペロンは、二つの他のタンパク質をコード化している。ＨａｓＢはUDP−グルコースデヒドロゲナーゼであり、これは、ＨＡ合成の基質の一つであるUDP−GlcAへとUDP−グルコースを変換するのに必要である。ＨａｓＣはUDP−グルコースピロホスホリラーゼであり、これはグルコース１−ホスフェートおよびＵＴＰをUDP−グルコースに変換するのに必要である。」（第１３頁第２行〜第９行）
(iii)「例えば、３つのBacillus subtilis株を構築して、ヒアルロナンシンターゼ（spHAS）およびUDP−グルコースデヒドロゲナーゼのためのStreptococcus pyogenes遺伝子の１つまたは双方を含有させ、その結果を表ＩＩ−Ｂに示す。ＨＡを検出し、定量する感受性の市販のラジオメトリックアッセイに基づいて、両遺伝子を持つ株（株＃３）はＨＡを作成し、培地に分泌すると判断された。親株またはデヒドロゲナーゼ遺伝子を丁度持つ株（株＃１）はＨＡを作成しない。spHAS遺伝子単独を丁度含有する株＃２はＨＡを作成するが、株＃３が作成する１０％に過ぎない。アガロースゲル電気泳動は、株＃３によって培地に分泌されたＨＡが非常に高分子量であることを示した。
【表３】　　　　表ＩＩ−Ｂ（表の内容は省略）
　　
　これらの実験は、蛋白質発現を駆動するのにこれらの遺伝子で通常見い出されれるstreptococcalプロモーターを使用した。B. subtilisプロモーターの制御下でspHASまたはseHASリーディングフレームを持つ株の構築は、より優れた結果さえ生じるであろうと予測される。」（第５０頁第６行〜第５１頁第２行）
　そして、第５０頁の表ＩＩ−Ｂには、Streptococcus pyogenesのヒアルロナンシンターゼ遺伝子のみを含有するBacillus subtilis株＃２が、３５μｇ／ｍｌのＨＡを産生し、これに対して、Streptococcus pyogenesのヒアルロナンシンターゼ遺伝子とUDP−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の双方を含有するBacillus subtilis株＃３は、７倍以上の＞２５０μｇ／ｍｌのＨＡを産生したことが示されている。
　また、同じく原査定の拒絶の理由で引用文献１０として引用された本願優先日前の２０００年１０月に頒布された刊行物であるJ. Ind. Microbiol. Biotechnol.(2000)Vol.25，p.204-212（以下、「引用例１０」という。）には、
(iv)「分泌される酵素をコードする単一コピー遺伝子のBacillus subtilisでの高レベル発現を達成するために、様々な方策が用いられてきた。静止期中の発現レベルをモニターするためのレポーター遺伝子として、Bacillus clausiiからのaprL遺伝子を利用するモデル系が開発された。Bacillus amyloliquefaciensのamyQ遺伝子のプロモーターの−１０及び−３５領域のヌクレオチド配列を変更することにより、非常に強いプロモーターが構築された。」（第２０４頁要約の項第１行〜第５行）、と記載され、Bacillus subtilisで使用するための発現カセットにおいて、−３５領域にTTGACAを、−１０領域にTATAATを有する配列に変更した、コンセンサス配列を有するコンセンサスamyQプロモーター（第２０５頁右欄下から第１９行〜下から第１２行）を使用した場合に、野生型のamyQプロモーターと比較してBacillus subtilisで３〜４倍のAprLが発現したことが、第２０８頁の図２に示されている。
　さらに、同じく原査定の拒絶の理由で引用文献３として引用された本願優先日前の２００１年６月１日に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった電子的技術情報であるDatabase DDBJ/EMBL/GenBank [online]，２００１年６月１日，Accession No.AE006637，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?13623172:OLD13:1038052
（以下、引用例３という。なお、当該ＵＲＬは平成２３年７月２８日現在、下記のように変更されている。
＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sviewer/?db=nuccoreval=13623172sat=8satkey=1667749＞）には、次の事項が含まれている。
(ａ)登録番号AE006637として公開されているヌクレオチド配列は、Streptococcus pyogenes M1 GAS株SF370の完全ゲノム配列からなる167のうちの166番の部分の9844bpからなるDNA断片であり、該断片にhasA、hasB、hasC遺伝子がコードされていること。
(ｂ)246−1505番のヌクレオチドはhasA遺伝子であり、そのコードするヒアルロナンシンターゼの419のアミノ酸からなる推定アミノ酸配列。
(ｃ)1541−2749番のヌクレオチドはhasB遺伝子であり、そのコードするUDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼの402のアミノ酸からなる推定アミノ酸配列。
(ｄ)2931−3845番のヌクレオチドはhasC遺伝子であり、そのコードするUDP−グルコースピロホスホリラーゼの304アミノ酸からなる推定アミノ酸配列。
　　
３．対比・判断
（１）対比
　上記引用例１記載事項(ii)には、Streptococcus pyogenesのヒアルロン酸合成オペロンには、ヒアルロナンシンターゼ、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＨａｓＢ）及びUDP−グルコースピロホスホリラーゼ（ＨａｓＣ）の３つの遺伝子が含まれることが、上記引用例１記載事項(iii)には、そのうちの２つの遺伝子である、Streptococcus pyogenes由来ヒアルロナンシンターゼ及びUDP−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子で組換えたBacillus subtilis株＃３から、ヒアルロン酸（ＨＡ）が産生され培地に分泌されたことが、それぞれ記載されている。
　そこでまず、本願発明と引用例１に記載された事項を比較すると、両者は、
「ヒアルロン酸の製造方法において、
（ａ）バチルス(Buciilus)宿主細胞を、ヒアルロン酸の生成のために適切な条件下で培養し、ここで前記バチルス宿主細胞はバチルス細胞においてヒアルロン酸を生成するための核酸構造体を含んで成り、前記核酸構造体はプロモーター配列を含んで成り、このプロモーターは、バチルス細胞において作用可能に活性であり、そしてヒアルロナンシンターゼコード配列、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼコード配列に作用可能に結合されており、前記コード配列の転写を指図し、そして
（ｂ）該培養培地からヒアルロン酸を回収する；
ことを含んで成る、ヒアルロン酸の製造方法」である点で共通し、両者は次の２点で相違する。
　
＜相違点１＞
　バチルス細胞においてヒアルロン酸を生成するための核酸構造体が、本願発明では、さらにUDP−グルコースピロホスホリラーゼコード配列を含むものであるのに対して、引用例１では、核酸構造体がさらにUDP−グルコースピロホスホリラーゼコード配列を含むことは、記載されていない点。
　
＜相違点２＞
　バチルス細胞において作用可能に活性であるプロモーターが、本願発明では、核酸構造体に含まれるコード配列の個々に対して外来性であり、かつ“−35”領域のための配列TTGACA及び“−10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーターであるのに対して、引用例１では、核酸構造体に含まれるStreptococcus pyogenes由来のコード配列に対して外来性ではないstreptococcusプロモーターであり、かつ、“コンセンサス”プロモーターではない点。
　
（２）当審の判断
（２−１）相違点１について
　上記引用例１記載事項(ii)には、Streptococcus pyogenesのヒアルロン酸合成オペロンには、ヒアルロナンシンターゼ、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＨａｓＢ）及びUDP−グルコースピロホスホリラーゼ（ＨａｓＣ）の３つの遺伝子が含まれること、及びＨａｓＣがグルコース１−ホスフェートをＨａｓＢの基質であるUDP−グルコースに変換する酵素であることがが記載されているから、引用例１に記載の、バチルス宿主細胞でヒアルロン酸の生産が確認されたStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼ、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼコード配列に加え、さらに、元来それらと同一オペロン上に存在し、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの基質を生産するUDP−グルコースピロホスホリラーゼコード配列を加えてStreptococcus pyogenesの合成オペロンを作成し、これがバチルス宿主細胞でも合成オペロンとして機能してヒアルロン酸を生産するかを確認しようとすることは、当業者であれば容易に想到し得ることである。そしてその際、UDP−グルコースピロホスホリラーゼコード配列として、引用例３に記載されたStreptococcus pyogenes 由来のUDP−グルコースピロホスホリラーゼ（hasC）のアミノ酸配列をコードする配列を用いることは、当業者であれば何ら困難なくなし得ることである。
　
（２−２）相違点２について
　上記引用例１記載事項(iii)には「B. subtilisプロモーターの制御下でspHASまたはseHASリーディングフレームを持つ株の構築は、より優れた結果さえ生じるであろうと予測される。」とあり、核酸構造体に含まれる遺伝子のプロモーターに代え、宿主細胞であるバチルスのプロモーター、即ち、核酸構造体に含まれるコード配列の個々に対して外来性であるプロモーターを用いることが、引用例１で示唆されている。
　一方、引用例１０には、Bacillus subtilisで用いるコンセンサスamyQプロモーターが非常に強力なプロモーターであることが記載されているから、上記引用例１の示唆にしたがって、上記引用例１０に記載のコンセンサスプロモーターを用いることは、当業者であれば容易に想到し得ることである。
　さらに、例えばMol. Gen. Genet. (1989)Vol.219,p.129-136には、バチルスと大腸菌のプロモーターで、“−35”領域のための配列TTGACA及び“−10”領域のためのTATAATを有するコンセンサス配列を有するプロモーターがあることが記載され、また、田宮信雄共訳、ヴォート生化学（下）第２版第４刷、１９９８年１０月１日、株式会社東京化学同人、第７９８頁〜第７９９頁、及び八杉龍一共編、岩波　生物学辞典第４版第３刷、１９９７年4月１０日、岩波書店、第１２４５頁の「プロモーター」の項にもあるように、“−35”領域のための配列TTGACA及び“−10”領域のためのTATAATを有するコンセンサス配列を有するコンセンサスプロモーターが真正細菌の強力なプロモーターであることは、本願優先日前、既に周知の技術的事項であり、また、発現量を増加させるためにより強力なプロモーターを用いることも、本願優先日前既に周知手段であったから、引用例１に記載のプロモーターに代え、より強力なプロモーターであり、かつコード配列に対して外来性である周知の“コンセンサス”プロモーターを用いることは、当業者であれば容易になし得ることである。
　
（２−３）本願発明の効果について　
　　本願の図４４には、Bacillus subtilisのＲＢ１６１株（ヒアルロナンシンターゼ／UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ／UDP−グルコースピロホスホリラーゼ）とＲＢ１８４株（ヒアルロナンシンターゼ／UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ）の産生するヒアルロン酸の相対収量が示されているが、UDP−グルコースピロホスホリラーゼが追加されたＲＢ１６１株の方が、追加されていないＲＢ１８４株と比べて、むしろ２０％程度相対収量が下がっており、相違点１の本願補正の発明特定事項により、引用例１の記載に比べ顕著な効果が奏せられるとはいえない。
　また仮に、本願発明においては、引用例１に記載のヒアルロナンシンターゼ遺伝子とUDP−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の双方を含有するBacillus subtilis株＃３よりも、ヒアルロン酸の生産量が多いとした場合であっても、強力なプロモーターを用いたり、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼの基質を増加させれば、最終生成物のヒアルロン酸の収量が増加することは予測できる範囲のことであるから、本願発明において奏せられる効果については、上記引用例１、３及び１０の記載から予測できない程の格別なものとはいえない。
　
（３）審判請求人の主張
　審判請求人は、平成２３年５月２０日付で提出した回答書中で、本願明細書に記載のRB-161株のヒアルロン酸の生産量と、引用例１に記載の菌株＃３のヒアルロン酸の生産量について、本願発明の３遺伝子系オペロンのヒアルロン酸生産性が、引用文献１に記載の２遺伝子系オペロンのそれに比べて約４０倍高いことが明らかであると縷々主張する。
　しかしながら、（３−３−１）で述べたとおり、本願明細書には、３遺伝子系（RB-161株）が２遺伝子系(RB-184株)と比べて顕著な効果を有せず、むしろ相対収量が低下することが図４４で示されているから、審判請求人の上記主張は採用できない。
　また仮に、RB-161株と引用例１に記載の株＃３のヒアルロン酸の生産量に４０倍の違いがあるとしても、上記（２−３）で述べた理由の他にもさらに、微生物（宿主であるバチルス）の株の選択、ベクターの構成、培地の組成、酸素供給量や温度等の培養条件も大きく収量に影響するものであるから、その４０倍の違いが、本願発明の発明特定事項によってもたらされたと推認することはできず、この点からも上記主張は採用できない。
　
（４）小活
　したがって、本願発明は、引用例１、３及び１０の記載から当業者が容易になし得たものであり、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができない。
　
４．むすび
  以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条２項の規定により特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。