【手続補正書】
【提出日】平成18年3月7日(2006.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  液体培地中で細胞増殖および細胞に基づく検定を行うための微細加工された装置であって、その装置には次のものを含む：
イ）複数の微小チャネル部品を支持する基板であって、各微小チャネル部品は細胞増殖チャンバー、それに液体試料を導入する導入チャネルおよびそれから液体試料を除去するための排出チャネルを有する；
ロ）該基板上に配置されたカバープレートであって、該カバープレートは該チャンバーおよび接続チャネルを形成するように該部品の上に拡がっており；該カバープレートには該チャネルへの進入路として複数の開口部を有する；
ハ）細胞付着および細胞増殖のために該細胞増殖チャンバーに組込まれた手段。
【請求項２】  該基板がディスクの中心近くに配置され、輪状の試料リザーバーに接続された試料導入口を提供するように微細加工された回転可能なディスクをなしており、および該微小チャネル部品が該ディスク上に放射状に配置され、その各導入チャネルは該リザーバーから試料を受けるように接続されている請求項１に記載の装置。
【請求項３】  該カバープレートがガス透過性プラスチック材料から加工されている請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】  細胞付着および細胞増殖のための該手段が該細胞増殖チャンバー表面の少なくとも一部の選択的な処理または修飾であることを含む請求項１から３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】  細胞付着および細胞増殖のための手段が該細胞増殖チャンバー内に配置された微小担体ビーズ１個またはそれ以上を含み、各該微小担体ビーズが細胞付着および細胞増殖を提供する請求項１から３までのいずれかに記載の装置。
【請求項６】  細胞増殖チャンバーがさらに細胞増殖チャンバーの基部に配置して柱状物に成形された突起成形構造を有する請求項１から５までのいずれかに記載の装置。
【請求項７】  該導入チャネルの断面積が該排出チャネルの断面積より大きい請求項１から６までのいずれかに記載の装置。
【請求項８】  該排出チャネルの断面積が該導入チャネルの断面積の０．９９倍と０．０１倍との間である請求項７に記載の装置。
【請求項９】  該微小チャネル部品の少なくとも一部がおのおのさらに細胞成分に関する検定を行うための検定チャンバー１個またはそれ以上を有し、該細胞増殖チャンバーと該排出チャネルの間を線状に接続する請求項１から８までのいずれかに記載の装置。
【請求項１０】  単数または複数の検定チャンバーまたはチャンバーが単数または複数の中間チャネルによって相互におよび該細胞増殖チャンバーに次の順序：すなわち導入チャネル、細胞増殖チャンバー、中間チャネル１、検定チャンバー１、中間チャネル２（要すれば）、検定チャンバー２（要すれば）、・・・、排出チャネル、で接続し、および各チャネルの断面積が導入チャネルから排出チャネルに向けて順次減少する請求項９に記載の装置。
【請求項１１】  単数または複数の中間チャネルおよび排出チャネルの断面積が直前（上流）のチャネルの断面積の０．９９倍と０．０１倍との間である請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】  該チャンバー１個またはそれ以上の内部表面上または表面層内に 発光物質を含む層が提供される請求項１から１１までのいずれかに記載の装置。
【請求項１３】  発光物質を含む層がそれに結合して結合成分を有し、該結合成分がビオチン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、抗体、レクチン、ホルモン受容体、核酸プローブ、およびＤＮＡ結合蛋白質から選択される特異的結合ペアの構成員である請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】  請求項１から１３までに記載の装置を使用して被験物質が細胞の活性または物理的パラメータに及ぼす効果を測定する方法であって、この方法には次を含む：
イ）液体培地中の細胞懸濁液を提供する；
ロ）該細胞を該装置に導入し、該細胞を該装置の細胞増殖チャンバー１個またはそれ以上に輸送する；
ハ）細胞に及ぼす効果を測定すべき被験物質の試料１種またはそれ以上を該細胞が該被験物質との接触を起こす条件下に提供する；
ニ）被験物質が該細胞に及ぼす効果を、光学的検出法を用いて測定する。
【請求項１５】  被験物質導入の前に装置内の表面で細胞を培養、付着させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  工程ハ）に続いて検定試薬１個またはそれ以上を添加し、該試薬を該装置内の反応チャンバー１個またはそれ以上に分散させる請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】  該検定試薬の少なくとも１種が螢光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識および放射能標識から選択された検出可能な標識で標識されている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】  請求項１から１３までに記載の装置を使用して細胞の被分析物を測定する方法であって、この方法には以下を含む：
イ）液体培地中で測定すべき被分析物を含む細胞の懸濁液を提供する；
ロ）該細胞を該装置に導入し、装置内の細胞増殖チャンバー１個またはそれ以上に細胞を輸送する；
ハ）細胞を増殖させる；
ニ）検定試薬１種またはそれ以上を添加し、該試薬を該装置内のチャンバー１個またはそれ以上に分散させる；
ホ）細胞の被分析物を光学的方法によって測定する。
【請求項１９】  該検定試薬の少なくとも１種が螢光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識および放射能標識から選択された検出可能な標識で標識されている請求項１８の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
図１ｂに関連して、本発明の装置はディスクの中心近くに配置され、輪状の試料リザーバー（９）に結合し、翻って放射状に分布する微小チャネル検定部品（６）の複数に結合している試料導入口（無記載）を提供するように微細加工された回転可能なディスク（１８）を含むが、該微小チャネル部品は、細胞増殖チャンバー、試料導入チャネル、および液体を除去するための排出チャネル、および閉鎖されたチャンバーおよび結合チャネルが形成されるように該ディスク上に配置されるカバープレートを含む。各微小チャネル部品は一端では中心の試料リザーバー（９）に結合し、反対側の一端では共通の廃液チャネル（１０）に結合している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
微細加工された装置での放射状に分布した微小チャネル検定部品（６）の各々（図１ａに示す）には次を含む：左端でリザーバー（９）に結合する試料導入チャネル（１）、細胞増殖を行うための細胞増殖チャンバー（２）、これがチャネル（４）を経て検定チャンバー（３）に結合し、さらにこれが排出チャネル（５）を経て廃液チャネル（１０）に右端で結合する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の別の形式においては、図２に示すように微小担体ビーズ（１７）の表面で増殖する細胞による装置の使用が可能になるように微小チャネル部品（６）を修飾してある。そこで各微小チャネル部品（６）は左端で試料リザーバー（９）に結合する試料導入チャネル（８）、細胞増殖チャンバー（７）、これがチャネル（１６）を経て検定チャンバー（１１）に接続し、排出チャネル（１２）を経て共通の廃液チャネル（１０）に導く。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
微小チャネル部品（６）はディスク（１８）周囲に放射状に配置し、共通の中心部分に結合させる。チャネル１、４、５、８、１２および１６の寸法はチャネルに沿った細胞の動きに適するものである。適当なものではチャネルとチャンバーがたとえば正方形、矩形、円形、台形および三角形のようないずれの断面型のものであってもよい。細胞増殖チャンバー（２）の寸法は１００ μm２ と１００００００μm２ との間、 好ましくは１０００ μm２ と１００００００ μm２ との間、最も好ましくは１００００μm２ と１００００００ μm２ との 間の床面積を与えるものが適当である。細胞増殖チャンバーのプラスチックまたはポリマー表面は細胞の付着および／または増殖が可能なように選択的に処理または修飾してもよい。好ましくはこの処理には表面に強いＵＶ光を照射してポリマー表面を修飾するか、あるいは知られている技術を用いて高電圧プラズマ放電（Amstein, C,F, and Hartmann, P.A., J. Clin. Microbiol., 2, 1, 46-54 (1975) 参照）を行うがこれは細胞の増殖および付着、および（要すれば）検定目的のために適当なマイナス荷電表面を作製するためである。細胞増殖チャンバーの表面にさらに、たとえばポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、などのコーティングを施して細胞の付着をさらに改善してもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
この装置および方法は細胞の増殖および細胞の完全性または生存能力を損なわない技術である非侵襲的技術を使用して例えば細胞代謝、細胞生存力、レポータ遺伝子の発現などの細胞活性、細胞パラメータの検出および生化学的過程を検出および測定するために使用できる。これとは別に、この装置はたとえばペプチドホルモン、二次メッセンジャーのような細胞から放出され、さもなければ分泌される細胞由来産物の検出および測定に使用してもよい。図３に示す装置の使用によって、この装置は例えば、化学誘引物質をバリアーの一方の側に置き、細胞をバリアーの反対側に置いてバリアーを透過して化学誘引物質に向けて移動する走化性を観察するなど化学的または物理的刺激に応答しての細胞移動の研究が可能になる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明は標準的組織培養用のプラスチック容器上に培養できるいかなる細胞型も使用できる。このような細胞型には種（たとえばヒト、囓歯類、サル）、組織源（たとえば脳、肝臓、肺臓、心臓、腎臓、皮膚、筋肉など）、および細胞型（たとえば上皮、内皮）に関する認識された起源から誘導された正常なおよび形質転換された全ての細胞を含む。これに加えて、組換え遺伝子を遺伝子移入した細胞も本発明を使用して培養してもよい。広範な細胞型の培養に適用可能な確立したプロトコルが存在する。（例えば Freshney, R.I.著「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第２版、Alan R. Liss 社、1987 年参照）。このようなプロトコルは細胞増殖および特異的細胞機能の発現を可能にするために特別のコーティングおよび選択的培地の使用を必要とするかも知れない。これらプロトコルはいずれもこの発明の装置で使用することを排除するものではない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の微小チャネルの構造は好ましくは液体培地中の細胞懸濁液を試料リザーバーに試料導入口から添加し、続いて遠心力によりディスクの周辺に外向に細胞懸濁液の移動を起こすに十分な速度で適当な手段でディスク（１８）を回転させて細胞増殖チャンバー内に同時的接種ができるように選択される。液体の運動で細胞懸濁液を各導入微小チャネル（１、８）に沿って細胞増殖チャンバー（２、７）に向かって分布させる。ディスクの回転速度は液体が流動して細胞増殖チャンバー（２、７）を満たすに十分であるが、液体が細胞増殖チャンバーの反対側にある直径の小さい限定されたチャネル（４、１６）に入るには不十分な遠心力を提供するように選択される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
回転を停止すると、懸濁液中の細胞は重力によって細胞増殖チャンバー（２、７）の底部に沈降し、存在するなら処理済の表面に付着させる。チャネルの中に残留する細胞は無処理の疎水性表面には付着できず、懸濁液中に残留する。細胞の付着が起きるように選択した適当な時間の後に、装置を以前よりも高速で回転して液体および付着していない細胞をすべてディスクの周辺に向けて移動させてディスクの周囲に設置された廃液チャネル （１０）に入れる。チャネルから非付着細胞が消えた後に微小チャネル部品を満たすために用いた最初の速度まで回転を落とし、新鮮な細胞培養培地を試料リザーバーに入れる。ディスクをもう一度回転させ、遠心力により細胞培養培地を流して微小チャネルおよび細胞増殖チャンバーを前記のようにして満たす。この操作で細胞増殖および細胞に基づく検定に適する新鮮な培養培地で細胞増殖チャンバー表面に播種された付着細胞を覆う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
細胞試料を装置に添加し、その付着および後続する細胞増殖の後、検定用の試薬および試料は試料導入口を経て試料リザーバー（９）に入れる。全ての微小チャネル部品に加える試薬は細胞を接種するために前記のように、すなわち全ての微小チャネル、細胞増殖チャンバーおよび検定チャンバーに試薬が分布するように中央の入口に試薬の溶液を加え、ディスクを回転して導入する。特定ウェルへの特定試料の添加は少量の液体を個々の液滴として中心のウェルに直接滴加して達成できる。この中心のウェルは導入チャネルの開口部に隣接しており、この導入チャネルから試料が入るべき細胞増殖チャンバーに導かれる。これは、例えばピエゾ電気分配装置（図示せず）を用いて達成してもよいのであるが、この場合には液体の小滴がおのおのディスク表面に衝突し、遠心力によって隣接する導入チャネル（１、８）に輸送され、また細胞増殖チャンバー（２、７）内の液体と混合するような滴加頻度およびディスクの回転速度の適当な組合せにおいて、装置からの液体の小滴の分配はディスクの回転速度と同期している。