【手続補正書】
【提出日】平成18年3月17日(2006.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズする方法であって、
ｉ）核酸および
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域を有する基質（ここに、ＳＮＡＢＡおよびポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）がそのハイブリダイゼーション領域で基質に結合し、該ＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化可能部分を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む）
を結合溶液中で接触させ、それによって核酸がＳＮＡＢＡとハイブリダイズする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
ＰＣＡＣがその線状末端付近で基質と共有結合する、請求項６記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ＰＣＡＣが、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも１０個の部分を含む、請求項１０記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
ポリペプチドのカルボキシル末端がアミド化されている、請求項１４記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２４】
基質結合ＰＣＡＣが、化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｌｙｓ−Ｈｉｓｎ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、
Ｓｕは基質、
Ｌｋはリンカー、
Ｘはそれぞれ独立して、０から２５個のアミノ酸残基、
ｎは１から５、
ｍは１から１０、および
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分およびＳＮＡＢＡのうちのひとつ］を有する、請求項１記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３２】
基質結合化合物が、化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｈｉｓｎ−Ｌｙｓ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、
Ｓｕは基質、Ｌｋはリンカー、
Ｘはそれぞれ独立して、０から２５個のアミノ酸残基、
ｎは１から５、
ｍは１から１０、および
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分およびＳＮＡＢＡのうちのひとつ］を有する、請求項１記載の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３６】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣがコンジュゲートしている、請求項１記載の方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４９】
第二の結合溶液で基質と接触した後に、第一リンス溶液でさらに基質と接触し、第一リンス溶液が第二結合溶液と異なる温度である、請求項４３記載の方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５１】
ＰＣＡＣの分子量が約１５０００以下である、請求項１記載の方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５２】
結合溶液存在下で核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズさせる装置であって、
ｉ）ＳＮＡＢＡおよび
ｉｉ）ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む、ポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）
が結合しているハイブリダイゼーション領域を有する基質を含む装置。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５３】
核酸をＳＮＡＢＡとハイブリダイズさせる、請求項５２記載の装置。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５５】
ｉ）核酸と
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域とそこに結合した特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）を有する基質
を結合溶液存在下で接触させることにより、核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズさせる方法の改良法であって、基質と核酸が接触するまでに、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含むポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）をハイブリダイゼーション領域と結合させる方法であり、ＰＣＡＣにより核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーション速度が向上する方法。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は核酸と特異的核酸結合剤をハイブリダイズする方法に関する。この方法は、結合容液の存在下で、
ｉ）核酸および
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域を有する基質（例えば、多孔質または非多孔質ガラス、シリコンまたはプラスチック基質）
を接触させる方法である。
ＳＮＡＢＡおよびポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）は基質のハイブリダイゼーション領域に（例えば共有結合的に）結合する。ＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む。好ましくは、基質はさらに、ＳＮＡＢＡもＰＣＡＣも結合しない、１つまたはそれ以上のバックグラウンド領域、ＳＮＡＢＡが結合しＰＣＡＣが結合しない第一調節領域、およびＰＣＡＣが結合しＳＮＡＢＡが結合しない第二調節領域を有する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
別の態様において、ＰＣＡＣは、結合溶液のｐＨにおいて正に帯電する部分を少なくとも５個、１０個または１５個含有する。ＰＣＡＣは好ましくは、結合溶液のｐＨにおいて負に帯電する部分を含まない。ＰＣＡＣは、２５個以下のアミノ酸残基（好ましくは５から約２０個または１０から２０個のアミノ酸残基）を含むようなポリペプチドであり得る。ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、そのカルボキシル末端はキャッピングされていてもよい（例えば、アミド化される、またはＳＮＡＢＡとコンジュゲートする）。ポリペプチドＰＣＡＣは好ましくは、少なくとも１つのヒスチジン残基、少なくとも１つのリジン残基、またはその両方を含む。ポリヌクレオチドＰＣＡＣの例には、配列番号：１、２および９から２２のうちの１つ（好ましくは配列番号：１６から１８のうちの１つ）のアミノ酸配列を有する領域を含むポリペプチド、および配列番号：１、２および９から２２のうちの１つ（好ましくは配列番号：１６から１８のうちの１つ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。一態様において、ＰＣＡＣの分子量は約１５０００以下である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
重要な態様において、ＳＮＡＢＡは、核酸と相補的なポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドである。他のあり得るＳＮＡＢＡには、ポリヌクレオチドアナログ、配列特異的核酸結合タンパク質、構造特異的核酸結合タンパク質、およびコンホメーション特異的核酸結合タンパク質が含まれる。ＳＮＡＢＡはＰＣＡＣと（例えば共有結合的に）コンジュゲートし得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明はまた、結合溶液存在下で核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズする装置に関する。その装置はハイブリダイゼーション領域を有する基質を含む。ハイブリダイゼーション領域はそこで
ｉ）ＳＮＡＢＡおよび
ｉｉ）ポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）
と結合している。
ＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む。本発明は核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズするキットを含む。そのキットは、この装置と、核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズする該装置の使用法を記載した説明書からなる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
「ポリカチオン化可能誘引化合物」（「ＰＣＡＣ」）は、ｐＫ値４から８の少なくとも１個のカチオン化可能部分を含めて、本明細書記載の方法に用いられる結合溶液のｐＨで正に帯電する部分を少なくとも２個持つ化合物である。一態様において、ＰＣＡＣの分子量は少なくとも約２００でありかつ１５０００以下である。例として、約２個から１００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（およびそのアナログ）はＰＣＡＣとして用いることができ、ただしそれらは、ｐＫ値が４から８のアミノ酸残基を含めて、結合溶液のｐＨで正に帯電する側鎖を持つアミノ酸残基を少なくとも２個含む。ストレプトアビジンはＰＣＡＣとして使用するのに適するポリペプチドの一例である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本明細書記載の組成物、キットおよび方法は、結合剤と核酸のハイブリダイゼーションに基づくアッセイの遂行速度の向上に用いることができる。ハイスループットスクリーニング処理のように、大量のアッセイをごく短時間で行う必要がある場合、速度が重要な問題となり得る。本明細書記載の対象は、核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションを検査するハイスループットスクリーニングアッセイの使用に対して柔軟性があり、というのは、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは、現在使用されている同じ分析材料および装置に同時にまたは連続して組み込むことができるからである。例として、多数のハイブリダイゼーション領域（ここに、個々のハイブリダイゼーション領域には一個のＳＮＡＢＡ（例えば、核酸プローブアレイ）が結合している）を持つ基質を含むマイクロアレイが、ハイスループットスクリーニングアッセイに一般に使用されている。本発明は、ハイブリダイゼーション領域の少なくともいくつか（および好ましくは全部）にＰＣＡＣが結合している改良マイクロアレイを含む。核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションを行うために、改良マイクロアレイが核酸を含むサンプルと接触するのに必要な時間は、ＰＣＡＣを含まないマイクロアレイの対応する時間よりも有意に短い。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
ＰＣＡＣの大きさおよび電荷密度は、重要でない。１つの具体例にて、ＰＣＡＣの分子量は、好ましくは約２００以上であり、かつ１５０００以下である。２００より小さい分子量を有する化合物は、ＳＮＡＢＡ、基質または両方により実質的に覆い隠される可能性がある。１５０００より大きい分子量を有する化合物は、核酸とＳＮＡＢＡ間の結合を妨げることがあり得るため、より小さな化合物が望まれうる。ポリペプチド（すなわち、２またはそれ以上のアミノ酸残基またはそのアナログを有するアミノ酸ポリマー）は、本明細書に記載のカチオン化可能部分を含む場合、ＰＣＡＣとして用いられることができる。そのようなポリペプチドの１つの例としては、ストレプトアビジンがある。他の好適なポリペプチドが、本明細書に記載される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
ＰＣＡＣの好ましい群は、ポリペプチドアナログおよびペプチド模倣物質（peptidomimetics）を含むポリペプチドである。ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、ＰＣＡＣは、好ましくは４または５アミノ酸残基以上の長さであり、かつ約１００アミノ酸残基以下の長さである。より長いポリペプチドは、二次または三次構造を取って、正電荷の残基を覆い隠す可能性がある。ｐＨが４〜９．５の範囲にて、リシンおよびヒスチジン残基の側鎖は共に、正に帯電しうる。リシン側鎖は実質的にこのｐＨ範囲全体で正電荷である。ｐＨ６．０にて、ヒスチジン側鎖の約半数が正に帯電し、そして残り半数が帯電しない。より低いｐＨ値にて、より多くのヒスチジン側鎖が正に帯電し、そしてより高いｐＨ値にて、より少ないヒスチジン側鎖が正に帯電する。よってヒスチジン残基は、ポリペプチドに電荷の「可変性」を供し、ヒスチジン残基を含むポリペプチドであるＰＣＡＣが好まれる。いくつかの具体例にて、ポリペプチドは、ｐＨ４〜８の範囲で正に帯電する側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、リシン残基）を含む。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、そのポリペプチドの一端、すなわちポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のどちらかにて基質と結合することが好ましい。ポリペプチドがそのアミノ末端にて結合する場合、カルボキシル末端はその内生的な陰イオン化能を中性化または消去するためにキャップされていなければならない。ポリペプチドであるＰＣＡＣ（または、相当する他のＰＣＡＣ）をキャップする１つの好ましい方法は、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの一端とをコンジュゲートすることである。例として、ＰＣＡＣがポリペプチドであり、ＳＮＡＢＡがポリヌクレオチドである場合、ＳＮＡＢＡはポリペプチドのカルボキシル末端とコンジュゲートすることが可能であり、そしてポリペプチドのアミノ末端は基質との結合が可能である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
式ＩおよびＩＩにて、カルボキシレート・キャッピング部分は、実質的に比較的小さな群（一般に３００以下の分子量の群）であってよく、それらは負電荷とならないカルボキシル末端カルボキシル部分を供し、またはカルボキシル末端陰イオン化可能部分のｐＫ値を結合溶液のｐＨより約２ユニット高いｐＨに少なくとも上昇する（すなわち、キャッピング部分はカルボキシル末端が負電荷となるのを防ぐ）。適したカルボキシルキャッピング部分は、アミド基またはメチル基である。Ｚがアミド基である場合、Ｚの１つの適した構造は−ＮＲ１Ｒ２（ここにＲ１およびＲ２はそれぞれ、独立して水素ラジカル、および１つまたはそれ以上のヒドロキシルあるいはアミン部分で置換されていることもあるＣ１−Ｃ６直鎖アルキルラジカルからなる群から選択される）である。Ｚの他の適した構造は−ＮＲ３Ｒ４であり、ここにＲ３およびＲ４は共に、１つまたはそれ以上のヒドロキシルあるいはアミン部分で置換されていることもあるＣ５−Ｃ８ジアルキレン部分である。上述のように、ＺはＰＣＡＣとコンジュゲートしたＳＮＡＢＡであり得る。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは、それぞれ基質と共有結合していることが望ましいが、それらと結合する手段として非共有結合（例えば、抗体の使用、ビオチン−アビジン結合または疎水結合）が用いられてもよい。１つの具体例にて、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣがコンジュゲートし、一方または両方が基質と結合する。ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣがコンジュゲートしたポリマーもまた、基質と結合しうる。ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣがコンジュゲートした好適な立体構造は以下：
基質−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ；
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ；
基質−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ；
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ；そして、
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ
で示される例を含む。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
常用される基質の形状の１つは平らな表面であって、サンプルが表面にアプライされると同時に別個のハイブリダイゼーション領域それぞれに接触できるように、生体分子のマイクロアレイを平らな表面上の別個のハイブリダイゼーション領域に通常の方法で合成、プリントするか、あるいは別の方法でアプライする。そのような表面を作製する多数の方法が既知であり、該方法には、リソグラフィー技術、光電析技術（例えば、マスクレス・アレイ合成）を用いて生体分子を表面上に合成する方法、接触スポッター（例えば、ピンおよびキャピラリー系）または非接触スポッター（例えば、インクジェットまたは圧電性プリント／析出系）を用いて生体分子を表面上にプリントする方法が含まれる。平らな表面により、これらの製造方法すべてをより容易化することができる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
基質は、個々のＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの両方が結合する１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーション領域を有する単一の物質断片でありうる。前記基質は単一であってよく、それと（ＰＣＡＣと共に）個別に結合する異なるＳＮＡＢＡを有するハイブリダイゼーション領域を多数有していてよい。該基質は、それと（ＰＣＡＣと共に）結合するただ一つのＳＮＡＢＡのみを有する粒子形状をとることができる。そのような多数または多様な粒子を同時に単一試料に用いて、該試料中の核酸を個々の粒子とハイブリダイズさせることができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
個々のハイブリダイゼーション領域内にて、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが個々の部位に結合する相対量は、変化しうる。部位内でのＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ量の最適比は、最適比が核酸およびＳＮＡＢＡの特性、ＰＣＡＣの大きさ、結合溶液のｐＨでのＰＣＡＣの電荷、分析系の幾何学、ハイブリダイゼーションを行う温度、試料内の目的の核酸濃度および試料内の非目的（非ＳＮＡＢＡ結合性）の核酸濃度を含む多数の因子によって変化しうるため、実験的に決定されるのが良い。ハイブリダイゼーション領域におけるＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの適切な比率の決定は、様々な割合のＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ量を有するいくつかのハイブリダイゼーション領域を調整し、模擬（または実際）分析状態下にてハイブリダイゼーションを行い、それぞれの実験部位にて結合する特定の核酸の程度を評価することにより簡単に行うことができる。原則として、ハイブリダイゼーション分析に用いられるべきＳＮＡＢＡ／ＰＣＡＣの分子量比は、結合溶液のｐＨにてＰＣＡＣ上に存在する帯電部分の数が増加するにつれて減少する。例として、ハイブリダイゼーションが、約１５ヌクレオチド残基長の核酸について行われ、結合溶液のｐＨにて１５の正電荷部分を有するＰＣＡＣのハイブリダイゼーション領域において、おおよそ同じ長さのポリヌクレオチド（ＳＮＡＢＡ）が望まれる場合、望ましいＳＮＡＢＡ／ＰＣＡＣの分子量比はおおよそ０．５〜２の範囲にありうることが測定されている。しかし、所望の共結合比の範囲は、用いた実験状態に依存して変化しうる（例えば、結合溶液の組成に依存して変化する）。さらに、その共結合比を成すために必要な共プリント比は、物質の性質、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣと物質を結合する化学的性質、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣ間の相互作用、用いたプリントおよびスポット方法の電位効果およびその他の因子に依存する。しかし、適切な共結合および共プリント比の実験的選択は、本明細書にて提供される指針を鑑みた当業者の知識の範囲内である。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
核酸および基質の接触が起こる結合溶液が何であるかは、重要でない。核酸がＳＮＡＢＡとハイブリダイズすることのできる実質的な液体が用いられ得る。結合溶液の一般例としては、標準的なクエン酸緩衝食塩水およびその希釈液、ＰＣＲ産物溶液、ならびに粗製または脱タンパク質化細胞抽出液を含む。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
結合溶液は、ＰＣＡＣが２以上（好ましくは、平均して少なくとも２、５、１０または１５）の帯電部分を持つようなｐＨを有する。この点にて、結合溶液のｐＨとＰＣＡＣの陽イオン化特性が互いに関係し、前記２つはｐＨ／電荷の関係を維持する実質的な組み合わせにて選択され得る。例として、ＰＣＡＣが結合溶液のｐＨにて完全に正電荷である１つの部分を含み（すなわち、前記部分のｐＫが結合溶液のｐＨより少なくとも約２ユニット上のｐＨである）、そしてＰＣＡＣが結合溶液のｐＨにほぼ等しいｐＫ値を有する陽イオン化部分を含む場合（すなわち、該部分の５０％が結合溶液のｐＨにて正電荷である）、ＰＣＡＣが結合溶液のｐＨにて約＋２またはより高い平均電荷を持つには、ＰＣＡＣは少なくとも２つの陽イオン化部分を含んでいるはずである。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
結合溶液の成分により、核酸とＰＣＡＣとの誘引が妨げられ、それによりハイブリダイゼーション速度の向上が減少する可能性がある。これらの成分は、結合溶液のイオン強度を増加させる物質、結合溶液の粘度を増加させる物質、核酸変性物質および帯電分子を含む。よって、結合溶液中のこれらの成分の濃度は、実用的にまたは可能な限り低く維持されなければならない。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
逆に帯電した分子間（例えば、ＰＣＡＣと核酸）の誘引力は、溶液全体の逆の帯電物との誘引力に依存する。溶液のイオン強度の増加が、溶液中の逆の帯電分子間の誘引を阻害することが知られている。よって、結合溶液は、核酸とＰＣＡＣとの誘引によって起こるハイブリダイゼーション速度の増大の阻害が最低限に抑えられるように、低いイオン強度を有することが好ましい。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
核酸を変性する化合物（例えば、ＤＭＳＯおよびホルムアルデヒド）は、核酸に構造上の変化をもたらし、溶液中での核酸の大きさ（および相当する流体物直径）を増大する。その結果、溶液を介した核酸の移動は一般に、そのような変性剤のある状態では、変性剤のない状態に比べより速度が遅くなり、そのような移動は、少なくともある濃度範囲以上に変性剤の濃度が増加するにつれて阻害されるであろう。溶液を介する核酸の移動が阻害されると、本明細書に記載の方法によるハイブリダイゼーション速度の増大が減少するため、結合溶液は核酸変性剤をできるだけ低い濃度で含有するのが望ましい。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
多くの場合、ハイブリダイゼーション反応のために調製される核酸懸濁液は、本明細書に記載のハイブリダイゼーション速度の増大を妨げ得る１つまたはそれ以上の上記の物質を含む。そのような場合、本明細書に記載のハイブリダイゼーション反応を行う前に、それらの物質を除去する、または濃度を減少するように核酸含有懸濁液を処置するのが望ましい。該物質が何であるかに依拠する多くのそのような方法が、当業者に既知である。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本明細書に記載の方法を用いて行われるハイブリダイゼーション速度の増大は、少なくとも一部にてＰＣＡＣと標的核酸との静電的結合に起因する標的核酸濃縮効果を基にしていると考えられる。標的核酸がいったんＳＮＡＢＡの近傍にて濃縮すると、ＰＣＡＣの役割は果たされたと見なされる。ＰＣＡＣと標的核酸との過剰な相互作用は、標的核酸とＳＮＡＢＡとの結合を妨げうる。さらに、標的核酸とＰＣＡＣとの相互作用を増大する溶液の状態（例えば、低いｐＨ）が、標的核酸とＳＮＡＢＡとの結合を不十分にし得る。よって、標的核酸が基質上にてＰＣＡＣに誘引された後、結合溶液を変更または置換することが効果的でありうる。結合溶液の変更とは、例えば結合溶液のｐＨを変化する物質の付加（例えば、ＨＣｌ、ＮａＯＨまたは緩衝溶液）、結合溶液のイオン強度を増加する物質の付加、またはその両方を含みうる。結合溶液は、例えば結合溶液をデカント、吸引または蒸散し（すなわち、基質上のＰＣＡＣと塩の形状にて結合している標的核酸を取り除く）、そしてそこへ置換溶液を用いることにより置換することができる。例として、ＳＮＡＢＡが特定の核酸配列と特異的に結合するタンパク質であり、ＰＣＡＣが多数のヒスチジン残基を含むポリペプチドである場合、結合溶液のｐＨを低下（例えば、ｐＨ４または５への低下）させると、試料内でのＰＣＡＣと核酸との引力を強めることができる。しかし、ｐＨの低下でタンパク質と核酸との特異的な結合が阻害される程度にまでタンパク質のコンホメーションが変化する可能性がある。この場合、より低いｐＨの結合溶液存在下で、ＰＣＡＣおよび該タンパク質がその一領域上に結合した基質と核酸とを接触させ、その後結合溶液に剤を加えて該タンパク質と核酸間の結合の阻害がより小さくなる値までｐＨを調整することにより、ハイブリダイゼーション速度を増大させることができる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
１つの態様にて、本発明は第一の核酸（例えば、核酸標的分子）とＳＮＡＢＡをハイブリダイズするための装置に関する。該装置は、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣを結合した基質を含み、該ＰＣＡＣは本明細書に記載の特性を有する。上述のように、ハイブリダイゼーション反応が起こる速度は、本明細書に記載のような装置を用いることによって速くなりうる（また、相当するハイブリダイゼーション時間は減少しうる）。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明のもう一つの態様は、核酸ハイブリダイゼーション反応にて用いるためのキットに関する。該キットは、本明細書に記載の装置およびその装置で核酸およびＳＮＡＢＡをハイブリダイズするための装置の使用法を記載した取扱説明書を含む。該キットはさらに、１つまたはそれ以上の洗浄あるいはリンス溶液、結合溶液、色素または他の核酸標識、およびハイブリダイゼーション反応を行うためまたはハイブリダイゼーションを検出するために有用な他の試薬あるいは装置を含む。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
［実施例］
実施例は、核酸ハイブリダイゼーション速度に影響する、ＰＣＡＣの大きさおよび陽イオン化能、基質のハイブリダイゼーション領域におけるＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの相対濃度（実施例にて共プリント比と示す）、および核酸とＳＮＡＢＡ両方の長さおよび配列などの因子について検討する。他に示されなければ、実施例に用いた方法は、Zhang et al.(2001, Nucleoside, Nucleotides ＆ Nucleic Acid 20 (4-7):1251-1254)に記載の方法と同様である。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
ペプチド・ライブラリー構築および性質決定
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
ペプチドＰ０〜Ｐ１４を、活性化したＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ポリアクリルアミドの薄いフィルム基質上に配置し、（ZhangらのＥＤＡＣカップリング技術を用いることなく）標準的なＮＨＳエステル付着力を用いて共有結合させた。それぞれのペプチドは、BIOCHIP ARRAYER（登録商標）スポット装置（Packard Bio Sciences）を用いて１５０ミリモーラー炭酸水素ナトリウム緩衝液中に２００マイクロモーラーペプチド懸濁液（ｐＨ約９．３の懸濁液）の５ナノリットル試料として用い、それぞれのペプチドを５複製ずつスポットした。蛍光標識した１５塩基のポリヌクレオチドは、ｐＨ４．５の２ミリモーラー酢酸ナトリウムを含む結合溶液の存在下にて１５分間薄いフィルム基質と１０ナノモーラー濃度で接触させた。その後基質を、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム２ミリモーラーを含む洗浄溶液にさらすことにより、１０分間洗浄した。ペプチド分析をSCAN ARRAY（登録商標）MODEL 4000XLイメージ装置（Packard Bio Sciences）を用いて蛍光状態下にて画像処理し、その画像を図１Ａに示す。ペプチド配列を示すマップを図１Ｂに示す。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
Ｐ８およびＰ７、Ｐ１１およびＰ１０、そしてＰ１３およびＰ１２のプライマー対を比較すると、対応する非アミノ化ポリペプチドと比較して、カルボキシル末端のアミン部分によりポリヌクレオチドのペプチドへの結合が増強したことは明らかである。さらに、ペプチド中の正電荷残基が増加するほど、ポリヌクレオチドのペプチドへの結合が増加した（Ｐ７、Ｐ１０およびＰ１２、またはＰ８、Ｐ１１、Ｐ１３およびＰ１４の組を比較のこと）。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
本実施例で得られたデータは、蛍光標識したＤＮＡ標的分子の誘引率は、リジン含有量、ヒスチジン含有量およびアミドカップリングなどの操作パラメータによって変化しうることを示している。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
図２Ａに示した配置で、ポリアクリルアミドの薄いフィルム基質にペプチドＰ１０〜Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ１８およびＰ２０〜Ｐ２４を配列し、共有結合させた。それぞれのペプチドは、BIOCHIP ARRAYER（登録商標）スポット装置（Packard Bio Sciences）を用いて１５０ミリモーラー炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ約９．３）中、５０マイクロモーラーペプチド溶液の３ナノリットル試料としてアプライし、それぞれのペプチドは４複製ずつスポットした。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
蛍光標識した１５３塩基対の二本鎖単位複製配列を熱変性し、次に１０ナノモーラー濃度で、ｐＨ４．５の２ミリモーラー酢酸ナトリウムを含む結合溶液の存在下にて１５分間基質と接触させた。その後基質を、ｐＨ４．５の２ミリモーラー酢酸ナトリウムを含む洗浄溶液にさらすことにより、１０分間洗浄した。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
ペプチド配列を蛍光状態下で画像処理し、その画像を図２Ｂに示す。最も大きく、最も正に帯電したペプチドであるＰ１７、Ｐ１８およびＰ２０は、より大きな二本鎖核酸に対するほど、より強い誘引を示した。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
ＰＣＲプライマーを、プラスミドＤＮＡ由来の１５３残基の単位複製配列を増幅することによって合成した。該単位複製配列は、増幅した配列の中ほどにプローブ結合部位を含む。ＰＣＲプライマーはまた、ストレプトアビジンで被覆した電磁ビーズを用いての一本鎖の分離を可能にするため、調査したい鎖上に末端Ｃｙ３タグを含み、調査しない鎖上に末端ビオチン部分を含むように設計した。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
ポリヌクレオチドであるＳＮＡＢＡおよびポリペプチドであるＰＣＡＣとポリアクリルアミド基質とを結合するために同じカップリング反応（Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−塩基）が用いられるため、共プリントしたポリペプチドによるポリヌクレオチドプローブの置換可能性を検討した。これを行うために、プローブ・スポットのセット（各セットは９つの複製を含む）を、ポリアクリルアミドの薄いフィルム基質にプリントした。基質にプリントした液体には、２５マイクロモーラー濃度の蛍光標識したポリヌクレオチドプローブが含まれる。１セットのプローブ・スポットについて、液体には該ポリヌクレオチドプローブのみを含ませた。プローブ・スポットの他のセットについて、液体には、該ポリヌクレオチドプローブの濃度に対して選択した割合に相当する濃度のポリペプチドを含ませた。その比は、１：１（２５マイクロモーラーポリヌクレオチドプローブ＋２５マイクロモーラーポリペプチド）から１：１６（２５マイクロモーラーポリヌクレオチドプローブ＋４００マイクロモーラーポリペプチド）の範囲である。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
プローブ−スポットをプリント、洗浄した後、１００％基底値をポリヌクレオチドプローブのみをプリントすることで確立した。基底値と比較して、シグナルの減少がそれぞれのプローブ：ポリペプチド共プリント比において測定された。この分析結果を図３に示す。プローブ：ポリペプチド比約１：３より上では、ポリペプチドはポリアクリルアミド基質上の結合部位のプローブを圧倒し始めており、その結果として基質に結合するポリペプチドが基質に結合するプローブの量をハイブリダイゼーションシグナルに有意に不利に影響する程に減少させている。プローブ：ポリペプチド率約１：１より下では、ポリペプチドＰＣＡＣの誘引機能が減少している可能性があり、これはおそらく、結合ＰＣＡＣがあまりにも少ないので、標的核酸を基質に誘引するＰＣＡＣの効果によってもハイブリダイゼーションシグナルが有意に増加しないためである。これらの理由から、１：２（つまり、基質の修飾に使用する溶液中のＰＣＡＣの分子数がＳＮＡＢＡ分子数の約２倍）など、１：１から１：３の範囲のプローブ：ポリペプチド比が好ましい。共プリント比に対する共結合比は決定しなかったが、標準の技術を使用して決定できると思われる。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【図３】図３は、ペプチドがない状態でヒドロゲル基質に結合したポリヌクレオチド成分の量に対する、ポリヌクレオチド／ペプチド共プリント比の関数としてのヒドロゲル表面に結合したポリヌクレオチド成分の量のパーセンテージの関係を示したグラフである。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
【図４】図４は、実施例４で用い、図５、６、７および８に示している、オリゴヌクレオチドプローブアレイのマップである。マップ中、４個の（円で表した）複製物上の記号は、その位置にスポットされたプローブを表す。プローブ記号は表２に列記した。そのプローブ記号において、数字はヌクレオチド残基を単位としたプローブの長さを示し、「ｍ」は１ミスマッチ発生を意味し、「ｍ２」および「ｍ３」は１０％のミスマッチ残基の発生、「ｍ４」および「ｍ６」は２０％のミスマッチ残基の発生を意味する。
【補正対象書類名】  明細書
【補正対象項目名】  ０１２５
【補正方法】        変更
【補正の内容】
【０１２５】
【図５】図５は、記載した共プリント比でペプチドＰ１８と共プリントされ、Ｃｙ３がコンジュゲートした１５ｍｅｒ合成標的とハイブリダイズしたプローブアレイ像である。