【手続補正書】
【提出日】平成18年10月5日(2006.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 以下の（１）から（３）までをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって：
（１）制限コピー数複製起点であって、該発現ベクターが、平均プラスミドコピー数が１細胞当たり約２から７５コピーに限定され、該制限コピー数複製起点が、転写的に離れている、複製起点、
（２）少なくとも１つの分離後宿主殺し機能、および
（３）少なくとも1 つの分配機能、
ここで、該少なくとも１つの分離後宿主殺し機能および該少なくとも１つの分配機能が転写的に離れている、発現ベクター。
【請求項２】 前記制限コピー数複製起点がoriE1（配列表の配列番号１（1250位から1936位まで）、ori101（配列表の配列番号３(50位から2004位まで)、およびori15A（配列表の配列番号２（50位から684位まで）からなる群より選択される請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項３】 平均プラスミドコピー数が、1細胞当たり約５から６０コピーの範囲である請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項４】  前記少なくとも１つの分離後宿主殺し機能をコードするヌクレオチド配列がasd 、ssb 、phd-doc、kis-kid およびhok-sokからなる群より選択される請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項５】 前記分配機能が、能動的分配機能である請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項６】  前記少なくとも１つの分配機能をコードするヌクレオチドが、parAを含む請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項７】前記分配機能が受動的分配機能である請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項８】 前記少なくとも１つの分配機能をコードするヌクレオチドがpSC101のpar 遺伝子座である請求項1 記載の発現ベクター。
【請求項９】  プロモーターによって転写制御される対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該プロモーターが転写的に離れている請求項１記載の発現ベクター。
【請求項１０】 前記プロモーターが、誘導プロモーターである請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】 前記プロモーターがompCプロモーターである請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１２】  前記ompCプロモーターが、ompCの転写開始部位を＋１とした場合のヌクレオチド＋70から−389 にわたる大腸菌のポリヌクレオチド断片である請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】  前記ompCプロモーターが、AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG  (配列表の配列番号３６) の配列を含み、ただし、（a ）X1はG 、C およびA からなる群より選択され、（b ）X2は1 〜5 つのヌクレオチドを有するインサートであり、（c ）X3はA 、T 、G およびC からなる群より選択される請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１４】 前記X1がG である請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１５】 前記X2が1 〜4 つのヌクレオチドを有する請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１６】 前記X2が4 つのヌクレオチドを有する請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１７】 前記X2がA 、T およびC からなる群より独立して選択される4 つのヌクレオチドを有する請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１８】 前記X2がATCT、ATC 、AT、TCT 、CT、TC、A 、T 、C 、およびT からなる群より選択されるヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１９】 前記X2がATCT、ATC 、AT、TCT 、CT、TC、A 、T 、C 、およびT からなる群より選択される請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項２０】 前記X2がATCTである請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項２１】 前記X3がA である請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項２２】 前記対象とするタンパク質が抗原である請求項９記載の発現ベクター。
【請求項２３】 前記対象とする抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、癌抗原、および自己免疫抗原からなる群より選択される請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２４】  前記対象とする抗原が無毒化志賀毒素を含む請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２５】 前記対象とする抗原が志賀毒素2 型B サブユニット五量体および遺伝子レベルで無毒化された志賀毒素2 型（Stx2）からなる群より選択される請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２６】 前記無毒化志賀毒素2 型をコードするヌクレオチド配列が、(797)- ACA GCA GAC GCG TTA-(811)(配列表の配列番号３７)、(902)- CTG AAC CTA GGG CGA (916)(配列表の配列番号３８)、(1345)-GAA TTC GCG ACC AGT-(1359)(配列表の配列番号３９) および(1435)-GAA TCA GAT TCT GGA-(1449)(配列表の配列番号４０) 、からなる群より選択される改変されたセグメントを持つ請求項２５記載の発現ベクター。
【請求項２７】  さらに選択可能マーカーをコードするヌクオチド含む請求項１記載の発現ベクター。
【請求項２８】  前記選択可能マーカーが、アミノグリコシド、アンサマイシン、抗真菌剤、ペニシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコール、リノスアミド、マクロライド、ペプトライド、およびテトラサイクリンからなる群より選択される抗生物質に対し耐性を与えるものである請求項２７記載の発現ベクター。
【請求項２９】 前記選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドが、tetA、bla 、aphA-2、およびkanからなる群より選択される請求項２７記載の発現ベクター。
【請求項３０】 請求項１記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項３１】  前記細胞が、原核細胞である請求項３０記載の細胞。
【請求項３２】  前記原核細胞が、腸チフス菌（Salmonella typhi）である請求項３１記載の細胞。
【請求項３３】 請求項３０記載の細胞を含み、免疫応答を誘発する為の、弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３４】前記細胞が、サルモネラである請求項３３記載の弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３５】 前記細胞が、腸チフス菌（Salmonella typhi）である請求項３３記載の弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３６】  哺乳類用である、請求項３３記載の弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３７】  ヒト用である、請求項３６記載の弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３８】  ウシ用である、請求項３６記載の弱毒化細菌生ベクターワクチン。
【請求項３９】  請求項１記載の発現ベクターで細菌株を形質転換することを含む、弱毒化細菌生ベクターワクチンの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
これらのデータは、生ベクター株CVD908-htrA におけるgfpuv の発現を駆動する場合、P ompC1 とP ompC3 が容量オスモル濃度の増加と共に誘導されるが、どちらの場合も転写の基礎レベルは依然として注目に値することを明らかに示している。低容量オスモル濃度の条件で観察された結果は、P ompC1 がP ompC3 より高い異種抗原発現を駆動するという固体培地を使って行なわれた本発明者らの観察をさらに裏付けている。P ompC3 はP ompC1 には検出されない所期の3'末端BglII 部位を持つことがわかっていたので、本発明者らはP ompC1 の強さの説明になるかもしれない点突然変異がおそらく検出されるだろうと考えて、P ompC1 のヌクレオチド配列を決定した。同定された唯一の相違は、そのカセットの3'末端にあった。この領域内の意図した配列は5'-...catataacAGATCTtaatcatccacAGGAGGatatctgATG-3'  (配列表の配列番号４)（大文字は左から右へBglII 部位、リボソーム結合部位およびGFPuv 開始コドンをそれぞれ表す）であり、実際の配列は5'-...catataacAGATCGATCTtaaAcatccacAGGAGGAtAtctgATG-3'  (配列表の配列番号５)（挿入された塩基または変化した塩基を下線部ボールド体の大文字で表す）。基本ompCプロモーター配列にも最適化されたリボソーム結合部位にも自然発生的な変化はないので、ompC1 プロモーター内に検出されるこれらの変化は、観察されたP ompC1 の強さを未知の機序によって増加させる原因になっているらしい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
プライマー1:
5'-gaattcGCGCGCTTCGCGATTCAGTCGCGTTCCTTCACAGCTGGCGCAGGGGCGATTACTGATGAA-3'  (配列表の配列番号６)
プライマー2:
5'-cccggGAGTCTCCTGAATACGTTTCATAAATAGTGTAAACGCGTGAGTGTACCATTTCCACGTAGC-3'  (配列表の配列番号７)  
プライマー3:
5'-cccggGTAAAAAACTCAAAGCGTTATTTGCATTTTCGCTATAGTTCTCGTCTGCTGAAATGCCTGGTGT-3'  (配列表の配列番号８)
プライマー4:
5'-gaattcCATTTCTATCAATAAATTACTATTAGTTTTGTCT TCTAACCAAGCCTCTATTTTATGAGTATCCTCTTCAG-3'  (配列表の配列番号９)
プライマー5:
5'-gctagcATGGCCAGCAGAGGCGTAAACAAGGTGATTCTCGTTGGTAATCTGGGCCAGGACCCGGAAGTACGC-3'  (配列表の配列番号１０)
プライマー6:
5'-gctagcTCAGAACGGAATGTCGTCGTCAAAATCCATTG GCGGTTCGTTAGACGGCGCTGGCGCG-3'  (配列表の配列番号１１)  。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
【表９−１】
2003506007.tif 000001
【表９−２】
2003506007.tif 000002
【表１０−１】
2003506007.tif 000003
【表１０−２】
2003506007.tif 000004
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｃは、本発明の典型的pGEN発現プラスミド（pGEN2 、pGEN3 およびpGEN4 ）の遺伝地図。
【図２】
図２Ａ〜２Ｄは、本発明の典型的oriE1 系発現プラスミド（pJN72 、pJN51 、pJN10 およびpJN12 ）の遺伝地図。
【図３】
図３Aから３Hは、hok-sok 分離後宿主殺し系を持つ発現ベクターを保有するCVD 908-hrtAに関するGFP 蛍光のフローサイトメトリーヒストグラム。
【図４】
図４Ａ〜４Dは、ヌクレオチド1 〜4196を含む、完全なpGEN2 のヌクレオチド配列（配列表の配列番号１）。
【図５】
図５A〜５Bは、ヌクレオチド配列1201〜2397を含み、ori15Aの配列を示す、部分的なpGEN3ヌクレオチド配列（配列表の配列番号２）。
【図６】
図６A〜６Cは、ヌクレオチド配列1201〜3848を含み、ori101の配列を示す部分的なpGEN4ヌクレオチド配列(配列表の配列番号３)。
【図７】
図７Ａ〜７Ｅは、本発明の典型的ori15A系pGEN発現プラスミド（pGEN91、pGEN111 、pGEN121 、pGEN193 およびpGEN222 ）の遺伝地図。 
【図８】
図８A〜８Cは、発現プラスミドpGEN91、pGEN111 、pGEN121 、pGEN193 およびpGEN222 に関するGFP 蛍光のフローサイトメトリーヒストグラム。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2003506007000001.app