【手続補正書】
【提出日】平成17年11月10日(2005.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、
a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、
b)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー、それぞれが結合するのが、
c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー、
を含む組合せ。
【請求項２】  各領域が少なくとも約64種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】  少なくとも約96ないし約1536の実質的に同一な領域を含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】  各領域が約30ないし約100プローブを含み、それぞれが様々な標的に特異的である、請求項1の組合せ。
【請求項５】  約96の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約16、36、46または100種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項６】  約384の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約9、16、または25種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項７】  約1536の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約4または9種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項８】  当該領域を、より小さな小領域に、更に再分割する、請求項1に記載の組合せ。
【請求項９】  領域が、ハイブリダイゼーション効率または特異性の調節を更に含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１０】  領域が、標的に結合する配置の能力の調節を更に含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１１】  当該プローブが核酸である、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１２】  当該プローブがペプチドまたはタンパク質分子である、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１３】  当該ペプチドまたはタンパク質分子を、当該リンカー分子の第1の部分に、結合分子により結合する、請求項12に記載の組合せ。
【請求項１４】  当該結合分子が、ビオチンまたはストレプトアビジンである、請求項13に記載の組合せ。
【請求項１５】  当該プローブが酵素の基質またはレセプターのリガンドである、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１６】  サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、
a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、
b)少なくとも8種のアンカー、それぞれが結合するのが、
c)アンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー、
を含む組合せ。
【請求項１７】  当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件下、当該標的を含むサンプルを請求項1の組合せに接触させることを含む、少なくとも1つの標的検出する方法。
【請求項１８】  a)当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件下、当該標的を含むサンプルを請求項1の組合せと接触させること、
b)当該組合せおよび任意の結合標的を標識検出プローブと接触させること、
c)当該検出プローブを検出すること
を含む、少なくとも1つの標的を検出する方法。
【請求項１９】  当該標識検出プローブにより、化学ルミネセンスシグナルを生じさせる、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】  標的を測定する、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】  当該サンプルにヌクレアーゼ保護法を実施することを更に含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】  RNA発現パターンを決定する方法であって、当該標的が少なくとも2つのRNA分子であり、当該組合せの当該プローブのそれぞれが、少なくとも1つの当該RNA標的に特異的であるオリゴヌクレオチドであり、当該RNA標的による当該プローブへの特異的なハイブリダイゼーションを効率的とする条件下、当該サンプルを当該組合せと共にインキュベーションする方法。
【請求項２３】  RNA発現パターンを修飾する試薬を同定する方法であって、当該試薬の存在下作成するRNA発現パターンを多種の一群の条件下作成するRNA発現パターンに比較することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】  当該標的が保護フラグメントである、請求項17に記載の方法。
【請求項２５】  a)RNA抽出物中、当該保護フラグメントによる目的のRNAへのハイブリダイゼーションを効率的とする条件下、RNA抽出物を1つまたはそれ以上の保護フラグメントとインキュベーションすること、
b)目的のRNAにハイブリダイゼーションする保護フラグメント以外に実質的にすべての核酸、および、所望により、ハイブリダイズする当該RNA部分を効率的に消化する1つまたはそれ以上のヌクレアーゼで当該抽出物を処理すること、
c)目的の当該RNAにハイブリダイズし、標的として保護フラグメントを含むサンプルを提供する当該保護フラグメント以外のすべての核酸物質を実質的に取り除くこと、
を更に含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２６】  当該組合せが多数の当該領域を含み、その方法がハイスループット法である、請求項17に記載の方法。
【請求項２７】  多数のサンプルを素早くアッセイし、請求項1の組合せの別の領域に各サンプルを置くこと、および当該標的の存在を決定することを含む方法。
【請求項２８】  a)当該標的を含むサンプルを、当該標的と当該リンカーとの間の第1のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を含む二官能性リンカーと接触させること、
b)当該第1のハイブリダイゼーション産物と当該組合せ[当該組合せには、当該第1のハイブリダイゼーション産物の添加前に、
1)少なくとも2つは実質的に同一な多数の空間的に分離された領域を含む表面、それぞれの領域に含まれるのが、
2)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー
が含まれる]との間の第2のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、当該第1のハイブリダイゼ−ション産物を組合せと接触させること、
c)当該第1のハイブリダイゼーション産物または当該第2のハイブリダイゼーション産物を標識したディテクタープローブと接触させること、
d)当該検出プローブを検出すること、
を含む少なくとも1つの標的を検出する方法。
【請求項２９】  a)多くの空間的に分離された領域を含み、少なくともその二つが実質的に同一であり、各々の領域が少なくとも8個の異なるアンカー(オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の他のタイプ)を含むものである表面、そして
b)該オリゴヌクレオチドアンカーの少なくとも一部に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2部分を有する2官能性リンカー分子を、該オリゴヌクレオチドの少なくとも1つと結合させるための一連の指示書
を含む、サンプル中の少なくとも一つの標的の検出に有用なキット。
【請求項３０】  c)少なくとも1つの当該オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および少なくとも1つの当該標的に特異的なプローブを含む２番目の部分を有する容器
を更に含む請求項29に記載のキット。
【請求項３１】  1つまたはそれ以上の目的の核酸を検出する方法であって、当該核酸を含むサンプルを、1つまたはそれ以上の保護フラグメントでヌクレアーゼ保護し、そして、ハイブリダイズした二重鎖分子、または一本鎖保護核酸、または保護フラグメントをマススペクトロメトリーで検出すること、
を含む方法。
【請求項３２】  方法がハイスループット法である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】  検出される核酸が保護フラグメントである、請求項32の方法。
【請求項３４】  少なくとも2種の保護フラグメントが検出される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】  少なくとも16種の保護フラグメントが検出される、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】  検出される核酸がハイブリダイズした二重鎖分子である、請求項32に記載の方法。
【請求項３７】  検出される核酸が保護された核酸である、請求項32に記載の方法。
【請求項３８】  当該目的の核酸を測定する、請求項32に記載の方法。
【請求項３９】  測定される核酸が保護フラグメントである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】  当該保護フラグメントが、化学的に修飾されており、保護フラグメントの核酸部分を有するか、または有さない当該化学修飾を検出する、請求項32に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明の背景技術
本発明は、例えば、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しアレイを用いる多種の生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。多数の領域には、それぞれ一般的アンカー分子のアレイが含まれる。アンカーは二官能性リンカー分子を伴い、それぞれ少なくとも1つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分を含む。生成したプローブのアレイを用い、プローブに特異的に相互作用する1つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析する。本発明は、分子相互作用の性質により識別し得る多種分野に関連し、それには医薬探索、分子生物学、生化学、薬理学および医学診断技術が含まれるが、これらに限らない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
これらシステムは、様々なスクリーニング法に有用であり、プローブまたは標的分子の何れかについての情報を得ることができる。例えば、他のものに混じる目的のレセプターに結合するペプチドまたは可能性ある薬物をスクリーニングするため；多くの他のものに混じる、例えば、遺伝的変異、個体群の中の突然変異体(allelic variant in a population)、または特定の病原体もしくは病原株の存在について、サンプルをスクリーニングするため；遺伝子発現の研究をするため、例えば、特定の生理状態、発生段階または疾病状態などに発現が関連するmRNA群を同定するために用いられている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の要旨
本発明は、多種の生物学的または化学的アッセイを同時に行う組成物、装置および方法を提供し、多数のサンプルをハイスループット分析し得、そのサンプルには、例えば、診断アッセイにおいてスクリーニングされる多数の患者サンプル、または薬物探索の方法において試験される多数の可能性ある薬物もしくは治療薬がある。サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せを提供する。この組合せには、多数の空間的に分離された領域を含む表面が含まれ、その領域は試験領域と名付けられ、少なくとも2つの実質的に同一のウェルであり得る。各表面には、少なくとも、2つ、好ましくは20またはそれ以上、例えば、少なくとも約25、50、96、864または1536などの実質的に同一な領域が含まれる。各試験領域は、1つまたはそれ以上の標的を含む(または部分的に含む)サンプルを導入する空間であると定義され、生物学的または化学的アレイを含む。(“標的を含むサンプル”または“サンプル中の標的を検出する”という語句は、標的を含まないかまたは検出されないサンプルまたは測定(検出の試み)を除外することを意味するものではない。通常の意味において、本発明は、標的がサンプル中に含まれるかどうかを、それが検出されるかされないかにかかわらず測定するアレイを含む。)このアレイは、包括的アンカーを含み、それぞれが、アンカーに特異的な第1の部分および少なくとも1つの標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー分子に結合する。本発明の組合せは、1つまたはそれ以上の標的を含むサンプルとの接触にあり、所望により、ディテクター分子と反応し、次いで、試験領域中における標的分子とプローブとの間の反応を検出する検出装置により応答指令信号が送られ、それによりアッセイの結果を得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、特にハイスループット生物学的アッセイに有用な方法および組成物を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明を用い、ハイスループットな薬物探索のスクリーニングができる。例えば、ハイスループットアッセイは、1度に多くの(例えば100)96ウェルマイクロプレートに実施することができる。プレートの各ウェルには、例えば36種の試験物が含まれ、その中で、約36のアンカーおよびリンカーの対のアレイを用いることにより実施される。すなわち、プレートあたり96ウェルを有する100プレートであり、ウェルあたり36の試験物をそれぞれ有し、合計345,000試験物となり得る；例えば、9,600種の薬物候補のそれぞれに、36種のパラメーターまたはアッセイを同時に試験し得る。ハイスループットアッセイにより、1度で1パラメーターのみを試験するアッセイよりも多くの各薬物候補についての情報が提供される。例えば、単一の最初のハイスループットスクリーニングアッセイで、薬物候補が選択的であるか、特異的であるか、および/または非毒性であるかどうか決定することが可能である。非ハイスループット方法は、広範囲の追加アッセイを必要とし、目的の各薬物候補のパラメーターを試験する。幾つかの型のハイスループットスクリーニングアッセイを、例えば実施例15-17に記載する。多様な生物学的アッセイを同時に実施する能力および1度に多くのアッセイを行う能力(すなわち、超ハイスループットにおいて)は、本発明の重要な2つの利点である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ある実施態様では、例えば、アミノ酸または修飾オリゴヌクレオチドのような一級アミンの結合を誘導した表面を有するポリスチレンで作成した96ウェルDNA Bindプレート(Corning Costar)を用い、36種のオリゴヌクレオチドのコレクションをアンカーとしての役割をする各プレートの各ウェルの表面上にスポットし得る。アンカーを誘導ポリスチレンに共有結合し、同じ36のアンカーをすべてのスクリーニングアッセイ使用し得る。任意の特定のアッセイの場合、所定の一群のリンカーを用い、36種ぐらいの目的の標的またはアッセイ型に特異的な各ウェルの表面にプログラムし得、種々の試験サンプルを各プレート中の各96のウェルに適用し得る。同じ一群のアンカーを複数回用い、目的の他の標的およびアッセイのウェルの表面に再度プログラムするか、または同じ一群のリンカーを複数回、再度使用し得る。この順応性および再利用性により、更に本発明の利点が示される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
例として、図1および2は、本発明の組合せおよびmRNA標的の検出にそれを使用する方法を示す。図2に示す本発明の表面は、15の同一試験領域を含む；本発明の特に好ましい実施態様では、これら各試験領域はマイクロタイタープレート中のウェルである。各試験領域は、6種のアンカーを含み、ここでは番号1-6で示す。図1で概要を示しているのは、当該アンカーの1つ、アンカー1であり、本発明の最も好ましい態様では、オリゴヌクレオチドである。アンカー1に、2つの部分を含むリンカー分子、リンカー1を結合させる。第1の部分はアンカーに特異的であり、この図中ではアンカーに特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドである。第2の部分は、目的の標的、ここでは標的mRNA1、に特異的なプローブであり、この図中では当該標的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。この図中では示していないが、残りの5つのアンカーはそれぞれ、自身のリンカーとアンカー特異的部分を介してハイブリダイズし得る；各リンカーは、例えばmRNA1と異なる(またはmRNA1と同一の)mRNAに特異的なプローブ部分を含み得る。この示した組合せを用い、15種ぐらいのサンプルをmRNA1の存在のため同時(または、アレイ中の他の5つのプローブにより特定(プログラム)されるmRNA標的の場合、同時に)にアッセイし得る。アッセイを行うため、この例において、15の独立したセルラインの1つのRNA抽出物となり得る各サンプルを、少量の体積で1つの領域、ウェルに加え、プローブおよび標的のハイブリダイゼーションが効率的となる条件下インキュベーションする。mRNA1がサンプル中に存在するかどうか決定するため、パターンを認識し得、および/またはシグナルの存在のため各領域内の特定位置に応答指令信号を送り得る検出装置を用いる。セルラインを、mRNAがインビボでタグで標識される条件下インキュベーションするならば、そして、mRNA1がサンプル中に存在するならば、ディテクターは、アンカー/プローブ複合体1により決まる位置でタグをつけたmRNAから放射するシグナルを検出する。他に、領域(ウェル)に添加する前または後に、mRNAを直接インビトロで標識し得る。他に、図1に示したように、プローブにハイブリダイズさせる前または後に、例えば、プローブにより認識される以外の配列に相補的であるタグをつけた“ディテクター”オリゴヌクレオチド(標的−特異的レポーターオリゴヌクレオチド)と共にRNAをインキュベーションすることにより、mRNAに間接的にタグをつけることができる。図示した例では、15のサンプルを同時に分析し得る。少なくとも20またはそれ以上、例えば1536ぐらいか、それ以上のサンプルが本発明により同時に分析され得るため、それは超ハイスループットアッセイシステムであるといえる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本明細書中で使用するとき、“標的”とは、存在、活性および/または量を決定することが望まれ、所定のプローブに親和性を有する物質について言及する。標的は、人工的か、または自然に生ずる物質であり得る。また、それらは、不変化の状態か、または他の種類との集合体として用い得る。標的を、共有結合的か、または非共有結合的に、結合メンバーに、直接かまたは特定結合物質を介して結合し得る。本発明で用い得る標的の例には、レセプター(小胞、脂質、細胞膜または様々な他のレセプターにおける)、レセプターに特異的に結合するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト、抗原決定基に特異的に反応するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗血清(ウイルス、細胞または他の物質のような)、薬剤、核酸またはポリヌクレオチド(mRNA、tRNA、rRNA、オリゴヌクレオチド、DNA、ウイルス性RNAまたはDNA、EST、cDNA、RNAまたはDNAから誘導するPCR増幅産物、ならびにそれらの変異、変異体または修飾)、タンパク質(神経伝達物質の切断に応答するようなもの、プロテアーゼ、キナーゼなどの酵素を含む)、酵素の基質、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜、オルガネラなど、ならびに複合、共有結合架橋などの型で存在する分子または他の物質を含むが、これらに限らない。本明細書中で使用するとき、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチドは取り換えることができる。標的はまた抗-プローブとして言及し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本明細書中で使用するときは、“プローブ”は、物質であり、例えば、特定の標的により特異的に認識され得る分子である。可能性あるプローブ/標的または標的/プローブ結合パートナーの型には、レセプター/リガンド、リガンド/アンチリガンド、DNA/DNA、DNA/RNA、PNA(ペプチド核酸)/核酸を含む核酸(ポリヌクレオチド)相互作用、酵素、他の触媒もしくは他の分子と基質、小分子またはエフェクター分子などを含むが、これらに限らない。本発明が目的とするプローブの例は、金属、キレート化剤、または金属、プラスチック、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、トキシンおよびベナム(venom)、ウイルス性エピトープ、ホルモン(例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど)、ホルモンレセプター、脂質(リン脂質を含む)、ペプチド、酵素(プロテアーゼまたはキナーゼのような)、酵素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖、核酸(オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、PNAもしくは修飾もしくは置換核酸を含む)、オリゴサッカロイド、タンパク質、酵素、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖抗体もしくはそのフラグメントと特異的に相互作用する他の化合物を含む有機および無機物質またはポリマーを含むが、これらに限らない。プローブポリマーは、直線状か、環状であり得る。プローブは、特異活性または特異結合の何れかの効力により、リン酸化および非リン酸化タンパク質を識別し得る。レクチンのようなプローブはグリコシル化タンパク質を識別し得る。本明細書中で使用するとき、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチドという語は置き換えることができる。“プローブ”として上記した任意の物質はまた“標的”としての働きをし得、またはその逆もある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
任意の適合性のある表面を本発明と共に用い得る。表面(通常固体)は任意の多種の有機または無機物質またはそれらの組合せであり、ポロプロピレンまたはポリスチレン、セラミック、シリコン、例えばガラス顕微鏡スライドまたはガラスカバースリップの厚さを有する(融合)シリカ、石英またはガラス、フィルターペーパーのような紙、ジアゾ化セルロース、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、またはポリアクリルアミドゲルパッドが単に例として含まれる。光に透明である基体は、アッセイを実施する方法に光学的検出が含まれる際に、有用となる。好ましい態様では、表面は、マルチウェルのプラスチック表面であり、例えば、組織培養ディッシュ、例えば24-、96-、256-、384-、864-または1536-ウェルプレート(例えば、Corning Costar DNA Bind plateのような修飾プレート)である。アンカーは、例えば表面と直接結合し得るか、または1つの型の表面、例えばガラスと結合し得、次いで、例えば、二次表面、例えばマイクロタイターディッシュ中のプラスチック“ウェル”内の表面と接触して位置する。表面の形は重要ではない。例えば、四角、矩形もしくは丸形のような平坦表面、曲線表面、またはビーズ、粒子、繊維、沈殿、チューブ、球のような3次元表面であり得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
表面は、空間的に分離され、アドレサブル(addressable)または同定可能な領域を含む。各領域は、一群のアンカーを含む。どのように領域が分離されるか、それらはどのような物理的性質であるか、そして、どのように相互に相対的に方向付けられるかは、重要ではない。ある実施態様では、領域は、液体の通過を妨げる任意の物理的バリアーにより相互に分離され得る。例えば、好ましい実施態様では、領域は、マルチウェル(例えば、組織培養)ディッシュのウェルとなり得、例えば、24-、96-、256-、384-、864-または1536-ウェルプレートである。他に、ガラス表面のような表面をエッチングすると、例えば、864または1536の分離された浅いウェルとなり得る。他に、表面は、仕切りまたはウェルのない領域を含み得、例えば、平坦表面であり、例えば、プラスチック、ガラスまたは紙の切片であり、そして、個々の領域は、別々の領域を形作る構造(例えばプラスチックまたはガラス片)で覆うことにより更に決定され得る。所望により、表面は、個々の領域が形作られる前に、アンカーまたはリンカーと結合するアンカーの1つまたはそれ以上のアレイを既に含み得る。他の実施態様では、各領域の内のアンカーのアレイは相互に分離され得、それは、アンカーのない表面上のブランクスペース(blank space)によるか、または小滴の分散を防止するワックスまたはシリコンのような化学的境界(chemical boundary)による。また他の実施態様では、領域は、チューブまたは液体調節チャンネルとして決定され得、例えば、Beattie et al (1995) Clin. Chem. 4, 700-706に開示するようなフロースルーアッセイとして設計され得る。表面内または表面上などの領域もまたそれ自身の表面の修飾により決まり得る。例えば、プラスチック表面はまた、修飾または誘導プラスチックで作成した部分を含み、それは、例えば、特定の型のポリマーを加える部位としての働きをし得る(例えば、PEGをポリスチレン表面に結合し得、次いで、カルボキシルまたはアミノ基で、二重結合、アルデヒドなどを誘導する。)。他に、プラスチック表面は突出(protrusion or bump)のようなモールドした構造を含み得、それは、アンカーの添加のためのプラットフォームとしての役割をし得る。試験領域の相対的な方向付けは、任意の多様な型となり、それらには、四角または矩形または他の表面内の平行または垂直なアレイ、丸または他の表面に放射状に伸びるアレイ、または直線状アレイなどを含むがこれらに限らない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の空間的に分離された領域は、マルチプルコピー(multiple copy)内に存在する。すなわち、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも20、または少なくとも約24、50、96、256、384、864、1536、2025、またはそれ以上などの実質的に同一であり、空間的に分離(分断された)領域が存在する。繰り返し領域の数の増加により、ますます、より高いスループットのアッセイをし得る。本明細書中で使用するとき、実質的に同一の領域とは、同一または実質的に同一のアンカーのアレイおよび/またはアンカー/リンカー複合体を含む領域について言及する。本明細書中で使用するとき、実質的に同一とは、本発明に従い標的を分析する前後関係において、アレイまたは領域が、他のアレイまたは領域と本質的に同一の機能として働くことを意味する。機能に実質的に影響しない相違、すなわち、標的の検出可能性は、小ヌクレオチド不完全性(脱落/挿入/置換)またはオリゴ不完全性(弱い表面結合)などの系に沿い、それらは、アッセイの正確性において、標的決定結果に重要な影響を与えない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
もちろん、当業者ならば、表面上のすべての領域が相互に実質的に同一である必要はないことを認識し得る。例えば、2種の一群のアレイが平行に試験され得るならば、単一表面上の一群のアレイを両方含むことが利点となり得る。例えば、2種の一群のアレイを、互い違いにストリッピングしたパターンに配置し、それらの間での比較を促進し得る。他の実施態様では、従事者は、表面上の他の領域と識別し得る方法で検出でき、それによって、“登録領域”として使用し得る1つまたはそれ以上の領域を含むことを希望する。例えば、登録領域は、オリゴヌクレオチドまたはペプチドを含み、それにより、表面上の領域の位置に配置される“開始点”としてスキャンニング検出装置が認識し得る蛍光分子の明瞭なパターンが示される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
領域はまた、領域内の幾つかまたはすべてのアンカーは、例えば、へこみ(indentation)および小さなくぼみ(dimple)によって、隣接するアンカーから物理的に分離されるように、更に再分割される。例えば、多くの領域内の再分割(小区域)は、約10ないし約100またはそれ以上もしくはそれ未満の範囲となり得る。ある実施態様では、1536-ウェルディッシュのウェルである領域を、より小さいウェルに更に再分割し、例えば、約4ないし約900、好ましくは約16ないし約36ウェルとし、それにより、ウェル内のウェルのアレイを形成し得る。図4参照。そのくぼんだ表面により、各設計した空間(位置)に単一のアンカー(またはアンカーの群)を物理的に位置させるのに必要な強度が弱くなり、そして、アンカーを含む領域の大きさが、より均一となり、それにより、プローブへ結合する標的の検出が促進される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
試験領域内または試験領域上のアンカーの物理的空間および相対的方向付けは限定されない。典型的に、アンカー同士の距離は、約0.003ないし約5mmまたはそれ未満、好ましくは約0.03と約1との間である。より長いおよびより短いアンカー空間(および領域)が含まれる。アンカーが、相互および領域の境界に相対的な任意の方向付けで配置され得る。例えば、それらは、四角、矩形、六辺形または他のアレイ、または放射線または同心円の中心から放射するアンカーを有する環状アレイのような二次元的方向付けで配置され得る。アンカーはまた、一次元の直線アレイで配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNA配列に従って特異的位置にハイブリダイズし得、超分子アレイを形成し得る。他に、アンカーは“バーコード”様型となり得る(図6参照)。例えば、アンカーは相互に平行なロングラインとなり得る。各ロングラインの間またはその幅の距離は、調節された方法で変化し得、バーコードのような単純な認識パターンが生じ、例えば、第1のおよび3番目のラインは残りの広さの2倍となり得、ラインは取り除かれるなどされ得る。エクストラエンプティーラインは、1つの試験領域をはっきりと区別する最後のラインの後に位置され得、バーコードパターンは連続的な試験領域で繰り返され得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
アンカーのパターンは、分離したアッセイウェル(試験領域)または分離アッセイ小滴の位置を明確に登録する必要はない。“アッセイ位置”という語は、アッセイサンプルが適用されるアッセイ表面の位置の言及に使用される(これらは、アッセイサンプルの分離した小滴の位置により、または例えばマルチウェルプレート上の個々のアッセイウェルを決める壁または仕切りの位置により決められる)。アンカーパターン自体(例えばオリゴヌクレオチドアンカーの“バーコード”様パターン)を用い、各分離アンカーがパターン認識により正確に決められ、ちょうど各バーコードのラインが残りのラインに相対する位置により認識される。このため、第1のアンカーは、各アッセイ位置の1つの端または1つの角を必要としない。第1のアンカーは、アッセイ位置に相対する位置よりもむしろパターン認識により発見される。各アッセイ位置(例えば、小滴の領域またはウェルの領域)で使用される領域が、アンカーの繰り返しパターンの少なくとも1つの全体の単位を含むのに十分広い限り、次の各アッセイ点は、パターンラインがアッセイ位置の面積内にあるところはどこでも(バーコード)パターンにより特定されるすべての標的のアッセイ位置のサンプルを試験する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明のある実施態様では、アンカーは、可逆的にリンカーと相互作用し得る；そのため、包括的一群のアンカーは再利用され、種々の一群のプローブをプログラムし得る。例えば、オリゴヌクレオチドアンカーは、例えば、2つのオリゴヌクレオチドが解離する加熱段階により、リンカーのオリゴヌクレオチド部分から分離され得、次いで、二次リンカーと再結合する。高価であり、時間がかかり、および/または作成に物理的困難を有する、アンカーアレイを再利用する能力は、本発明の他の利点である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明に使用し得る幾つかの表面は、商業上の提供者より容易に利用できる。好ましい実施態様では、表面は、Corning Costerにより販売されている修飾プレートのような96-、384-または1536-ウェルマイクロタイタープレートである。他に、表面はウェルを含み、次いで、へこみまたは“くぼみ”を含み、アルミニウムまたはスチールのようなミクロ機械加工物質により形成され、モールドを調製し、次いで、プラスチックまたは同様の物質をモールドにミクロ注入し、図4に示すような構造を形成する。他に、図4に示すような構造には、ガラス、プラスチック、セラミックなどが含まれ、例えば、図5に示されるような3つの切片からアセンブリされ得る；ウェル仕切り(図5a)と呼ぶ第1の部分はサンプルウェル間の分離を形成する；サブディバイダー(subdivider)(図5b)と呼ぶ第2の部分は各試験ウェル内に再分割またはくぼみを形成する；そして、基盤(図5c)と呼ぶ3つ目の部分はプレートの基盤および試験ウェルの下側表面を形成する。例えば、仕切りは、物質、例えばシリコンの切片であり、それを通る穴があり、それぞれの穴は、3つの切片が結合するとき試験ウェルの壁を形成する。サブディバイダーは、例えば、薄い物質片、例えば、シリコンであり、スクリーンまたは良好な網の形をしている。基盤は、金属、例えばガラスの平坦切片であり、例えば、生物化学アッセイに用いる典型的なマイクロプレートの下側部分の形となる。基盤の上側表面は、図5cに示すように平坦であるか、またはサブディバイダー型で配置されるへこみを形成し得、各サンプルウェル内に完全な再分割、またはウェルを提供する。3つの切片は標準的な方法、例えばシリコンウェハーのアセンブリを用いる方法により結合され得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の幾つかの実施態様では、開示の組合せを、様々なスクリーニング法に用い、および/またはレベル、活性またはプローブもしくは標的分子構造についての情報を得るために用いる。そのアッセイはMulti Array Plate Screen(MAPS)法またはアッセイと名付けられ、その表面は、アッセイに使用するアンカーまたはアンカープラスアッセイのアレイを含み、MAPSまたはMAPSプレートと名付けられる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
以下に記載するアッセイまたは方法のそれぞれを、ハイスループット法で実施でき、それは、多数のサンプル(例えば、およそ約864、1036、1536、2025またはそれ以上であり、組合せの領域数に依存する)を各プレートまたは表面上で素早く同時にアッセイする。更に、多くのプレートまたは表面を同時に処理し得る。例えば、薬物探索の方法では、それぞれは薬物候補(例えば、様々な小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の物質のような多くのコンビナトリ化学ライブラリー)を含む多くのサンプルを添加し得、既述のように組合せの領域を分離するか、または生物学的または生化学的サンプルに加え、次いで、組合せの領域に分けて加え、そして、領域内に位置するプローブアレイと共にインキュベーションする；ならびにアッセイを各サンプルで行い得る。最近出現し、発展し続けている高密度マイクロプレート、DNAスポッティングツールおよびより高濃度なマイクロプレートから作成しデータを回収する、レーザー技術のような方法、ロボット、改善されたディスペンサー、精巧な検出システムおよびデータ処理ソフトウェアと共に本発明の方法を用い、1日あたり数千または数万またはそれ以上の化合物をスクリーニングまたは分析することができる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
他の実施態様では、本発明の組合せを用い、例えばタンパク質、核酸、小分子などのような生化学的反応をモニターし得る。例えば、抗原および抗体；レセプター(精製レセプターまたは細胞膜に結合するレセプターのような)およびそれらのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト；または酵素(プロテアーゼまたはキナーゼのような)およびそれらの基質の相互作用の効率または特異性、または産物に変換する基質量の増加または減少；ならびに他のものである。その生化学アッセイを、プローブまたは標的の特性解析のために、またはスクリーニングアッセイの基礎として使用できる。例えば、特定のプロテアーゼの存在するサンプルをスクリーニングするため(例えば、血液凝固中に含まれるプロテアーゼXaおよびVIIaのようなプロテアーゼ)、サンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブは、目的の各プロテアーゼに特異的な蛍光発生物質である。標的プロテアーゼが基質に結合し、切断するならば、その基質は、通常、切断および2つのエネルギー転位対間の分離の結果として蛍光を発生し、シグナルを検出し得る。他の例では、特定のキナーゼの存在するサンプルをスクリーニングするため(例えば、Src、チロシンキナーゼ、ZAP70)、目的の1つまたはそれ以上のキナーゼを含むサンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブは目的の1つのキナーゼにより選択的にリン酸化し得るペプチドである。当分野において認識される、通常に決定し得る条件を用い、サンプルを基質のアレイと共に、適当な緩衝液中、および必要な補因子と共に、実験的に決定された時間、インキュベーションし得る(幾つかのアッセイでは、例えば、目的のキナーゼの活性を調節する因子の生化学的研究の場合、各キナーゼの濃度を、各基質が同様の割合でリン酸化されるように調整し得る)。キナーゼおよび望ましくない反応成分を(所望により)取り除くための実験的に決定した条件下、各反応を処理(例えば、洗浄)した後、リン酸化基質は、例えば、蛍光標識抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体(例えば、約10nM濃度、またはそれ以上、またはそれ未満)のような検出可能試薬と共にインキュベーションすることにより検出し得、そのシグナルを検出し得る。他の例では、結合アッセイを行い得る。例えば、GRB2 SH2またはZAP70 SH2のようなSH2ドメインを、適当なリン酸化ペプチドのプローブアレイ上でアッセイし得る；または血清を、免疫欠損の特定レセプターのプローブアレイ上でスクリーニングし得る。また、酵素連結アッセイをアレイ型で実施し得る。本発明の組合せもまた用い得、野生型対照物よりも活性が高いかまたは低い変異酵素を検出し得るか、または除草剤または農薬を含む様々な試薬をスクリーニングし得る。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
他の実施態様では、本発明の組合せを用い、標的および所定のプローブの相互作用を修飾する試薬をスクリーニングし得る。プローブ、標的または標的プラスプローブにより形成される複合体の何れかと直接または間接的に相互作用することにより、試薬が標的/プローブ相互作用を修飾し得る。修飾は様々な型を取ることができ、プローブに対する標的の結合親和性の増加もしくは減少、標的およびプローブが結合する割合の増加もしくは減少、標的に対するプローブの結合の拮抗的または非拮抗的阻害、またはある場合にはプローブ/標的相互作用を増加もしくは減少するプローブもしくは標的の活性の増加もしくは減少が含まれるが、これらに限らない。その試薬は人工または自然に生ずる物質であり得る。また、その試薬を、不変化の状態で、または他の種類との集合体として用い得る；およびそれらを、結合要素(binding member)と共有結合的にまたは非共有結合的に、直接かまたは特定の結合物質を介して結合し得る。例えば、可能性ある“血液シンナー”、または血液凝固の原因となるプロテーゼの1つのカスケードと相互に作用する試薬を同定するために、目的のプロテアーゼのカクテルを、多量の候補試薬で試験し得、次いで、上記のように活性を試験し得る。本発明により用いられ得る試薬の他の例は非常に多様であり、除草剤および農薬を含む。実施例16および17は、特定のキナーゼを選択的に阻害する試薬、またはSH2ドメインとリン酸化ペプチドの間の相互作用の選択的阻害剤のためのハイスループットアッセイについて記載する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
一つの態様において、上記a)のような表面および該アンカーの少なくとも一部に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2部分を有する2官能性リンカー分子を結合するために一連の指示書が提供される。指示書は、例えば(しかしこれに限定されない)、表面上の各々のアンカーの記載、いくつのアンカーがあるか、そしてそれらが表面のどこに位置するか、および特異的にリンカーをアンカーに結合(会合、結合等)させるプロトコールを含むことができる。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドである場合、指示書は各アンカーの配列を含むことができ、そこから、実施者がアンカーと特異的に相互作用(例えば、ハイブリダイズ)するリンカーの相補的アンカー特異的分子を設計できる；アンカーがペプチドである場合、指示書は、例えば、ペプチドと特異的に作用する抗体に関する情報を伝達できる。指示書は、アンカーおよびリンカーが会合するプロトコール、例えば、インキュベーション温度および時間、非会合分子の除去(例えば、洗浄)のための条件および試薬等のハイブリダイゼーション(または他のタイプの会合)の条件および試薬を含み得る。更に、指示書は、本明細書に記載の任意のタイプのコントロールリンカーの構築および使用における情報、および組合わせで行う定量、標準化、“微調整”または較正アッセイの方法における情報を含むことができる。指示書は、本明細書に記載のパラメーター、条件または態様を包含でき、その全て当業者により慣用的に、慣用法で行うことができる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
他の態様において、本発明の組合わせを用いて、EST(発現配列タグ)を位置付けできる。すなわち、MAPSアッセイを用いて、EST群のどれが同じ遺伝子の異なる(または部分的に重なる)部分からつくられたか、またはどれが特有かを(これらが存在すれば)決定できる。図18、19、20、21は、このようなアッセイを示す。この例において、アッセイで16のESTのどれが共通遺伝子に“結合”しているかを(これが存在すれば)決定する。アッセイの第1工程(参照、図18)ではアレイが集合され、位置付けしようとする各ESTが、その対応する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブにより提示される。位置付けしようとするESTの数に等しい(または多い)数のアレイが表面の単離領域(例えば、ウェル)に分散している。表示例において、組合わせの表面は16のウェルを含み、各ウェルが16種のEST特異的オリゴヌクレオチド、番号1-16、を含有する。ESTに“対応する”(“EST特異的”な)オリゴヌクレオチドとは、1つのESTに十分に相補的であって、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、そのESTに特異的にハイブリダイズし、他の非関連ESTとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドである。この型のEST対応オリゴヌクレオチドが特異的に(最適の条件下で)結合できるのは、ESTを本来生成した遺伝子から合成されたcDNAのコード鎖または非コード鎖、またはESTを本来生成した遺伝子から合成されたmRNAである。オリゴヌクレオチドの設計で考慮されるべき要因および特異的ハイブリダイゼーションをなすための最適化ハイブリダイゼーションパラメーターについては、本明細書の別の箇所で述べる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
次の工程において、別個のディテクターオリゴヌクレオチド(表示例ではディテクター＃1-16)を各領域(ウェル)に加える(参照、図19)。ディテクターオリゴヌクレオチドの設計は、位置付けしようとする各ESTについて行う。各EST特異的ディテクターがESTの異なる(少なくとも部分的には非重複の)部分に対応するのは、プローブオリゴヌクレオチドが対応するのよりも大きいので、プローブとディテクターの各オリゴヌクレオチドは互いに干渉しない。例えば、図21に表すESTは、図18-20のEST1、2および6に対応する。図21に表示するように、EST＃1および2の両者は遺伝子Xから得られ(両者に“結合”している)、一方、EST＃6は別の非関連遺伝子から得られた。mRNA混合物含有のサンプルのアリコートが遺伝子Xからつくられた混合物を含み、それを図18-20に示すプローブアレイとインキュベートしたとき、遺伝子XmRNAは、最適条件において、プローブ1および2を持つ位置でハイブリダイズするが、プローブ6を持つ位置ではハイブリダイズしない。(もちろん、各mRNAは、そのハイブリダイズできるプローブの量以上の分子過剰で加えねはならない)。ディテクターオリゴヌクレオチド1を領域(ウェル)1に加えた場合、このオリゴヌクレオチドは、プローブアレイの位置1および2で結合した遺伝子XmRNAとハイブリダイズするが、位置6のものとはしない。同様に、ディテクターオリゴヌクレオチド2を別のウェル、例えばウェル＃2に加えると、このオリゴヌクレオチドは位置1および2で結合するが、位置6ではしない。このようにして、どのESTが結合するのか、すなわち同じ遺伝子の部分をコードするのか、どのESTが特有であるのか、を決定できる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
図20に示す仮定的例において、最初の3つのESTは同じ遺伝子の部分をコードし、最後の5つのESTは他の遺伝子の部分をコードし、残りのESTは結合されないようである。ハイブリダイゼーション条件、所望の洗浄工程、検出方法などについては、MAPSアッセイに関する本明細書の他の箇所で述べる。MAPSアッセイにより得た結合データを確認するためには、PCR反応を行い、センスおよびアンチセンスプライマーとして対のEST特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる。各対の結合ESTがPCR産物を産生する。この対的PCR試験によって、結合MAPSアッセイを用いずに直接的に結合を調べることができる。しかし、多数の反応を必要とするかも知れないし、また、各ESTプライマーをセンスおよびアンチ両方の鎖として合成しなければならないかも知れない。表示例では、180の反応を必要とするであろう。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも1つの領域に接触せしめ、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも1つは該ESTの各々に対応する)のアレイを含み、
b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を、該核酸部分に相補的な該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合せしめ、
c)1以上の該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を含む該領域を、該アレイの所定の1つのオリゴヌクレオチドプローブが対応するESTに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定のオリゴヌクレオチドプローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチドプローブに結合している核酸分子に結合せしめ、
d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイのどのEST対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌクレオチドEST対応プローブに結合する核酸の部分に相補的であるかを検出し、それによってどのESTが該所定の核酸に相補的かを同定する。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
別の態様において、本発明は、複数のどのESTが所定の核酸に相補的かを決定する方法に関し、下記の事項を含む。
a)2官能的オリゴヌクレオチドリンカー分子のコレクション(その各々が、少なくとも1つの該ESTに対応するプローブである第1部分、およびアンカーオリゴヌクレオチドに特異的な第2部分を含む)を、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベートして、該オリゴヌクレオチドと該核酸との第1ハイブリダイゼーション産物を得、
b)該第1ハイブリダイゼーション産物をアンカーオリゴヌクレオチド(各アンカーオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの該リンカー分子のアンカー特異的部分に対応している)の固定化アレイとインキュベートして、該アンカー、該オリゴヌクレオチドプローブおよび該核酸を含む第2ハイブリダイゼーション産物を形成し、
c)該第1または該第2のいずれかのハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの1つが対応するESTに対応するが、ESTの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、
d)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドにより標識されたかを検出する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
勿論、ESTを位置付けするための上記方法は、試験配列(例えば、ポリヌクレオチド)を目的の任意の核酸中へ位置付けするのに使用できる。例えば、1以上のクローン化DNAフラグメントまたはcDNAが同じゲノムDNAに位置付けされるかを調べることができる。このような方法が役立ち得るのは、例えば、長い複雑な遺伝子の構造的解明おいてである。同様に、1以上の継ぎ合わせた配列またはコード配列が同じゲノムDNAに位置付けされるかを調べることができる。このような検査をなし得るのは、例えば、診断試験においてであって、異なるスプライシングパターンを特徴とする正常状態と疾患状態とを識別する。位置付け方法の他の多くの適用については、当業者に明かであろう。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチド保護フラグメントをMAPSプレート上よりも質量分析計で測定する。最も好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチドのいずれもハイブリダイゼーションまたはヌクレアーゼ消化工程中に固相表面に結合(付着)される。ハイブリダイゼーション後、保護フラグメントを残してハイブリダイズ標的をヌクレアーゼまたは化学処理などにより減成し、直接比率で、どれほどのフラグメントが標的にハイブリダイズしていたかがわかる。あるいは、標的の(1本鎖)ハイブリダイズ部分、またはハイブリダイズ標的および保護標的から形成された表面を残すように処理し、さらに分析する。分析すべきサンプルをハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ混合物の残りから分離し(例えば、エタノール沈降、または吸収またはアフィニティクロマトグラフィーなど)、溶出または固定化し、高い情報量のためにループ注入により質量分析計に入れる。好ましい具体的態様において、分析しようとするサンプル(例えば、保護フラグメント)を、よく知られた既知技術で、表面に吸着し、レーザー照射により解析する。最も高感度のためには、フーリエ変換質量分析法(FTMS)(または他の類似の高度な技法)を用いることができ、フェムトモル以下の各保護フラグメントを検出できる。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
一つ(またはそれ以上)のサンプルで検出する保護フラグメントは、使用するマススペクトロメーターに関して独得なシグナルを与えるように設計できる。一つの態様において、保護フラグメントは各々ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理後に独得な分子量を有し、特徴的イオン化および分裂パターンがその濃度の測定に十分である。より感受性を得るためにまたは複合体混合物の分析を助けるために、保護フラグメントを、明確な独得なシグナルを与えるために化学部分で修飾(例えば、誘導体化)できる。例えば、各保護フラグメントは、鎖のハイブリダイズ部分に沿った1個またはそれ以上の位置でアミド結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に結合した異なる天然または非天然アミノ酸で誘導体化できる。適当なエネルギーのマススペクトロメーターで、分裂はアミド結合で起き、アミノ酸の特徴的割合を放出する。中程度のサイズ(おおまかに80から200分子量)の化学部分を質量分析的タグとして使用するこの種の試みは、このサイズの分子が一般に検出が容易であるため、望ましい。他の例において、化学修飾は、例えば、アミノ酸のような他の分子を例えば誘導体化できるようなテトラアルキルアンモニウム基のような、定義された質量分析的シグナルを有する有機分子である。他の例において、陽性または陰性イオンシグナルが多くの試薬との反応により促進される。例えば、陽性イオン検出を促進するために、ピリリウム塩(例えば、2,4-ジチエニル、6-エチルピリリウムテトラフルオロボレートまたは多くの他のもの)とアミンを反応させ、ピリジニウム塩を形成できる；多くの他の促進剤が他の陽性荷電官能基の形成に使用できる(例えば、Quirke et al. (1994) Analytical Chemistry 66, 1302-1315参照)。同様に、多くの当分野で既知の試薬と反応させ、陰性イオン促進種を形成できる。化学修飾は、もちろん、核酸からの開裂後に、または核酸との会合中に検出できる。各保護フラグメントを別々の方法で同定できるようにすることにより、多数の異なる標的(例えば、2、6、10、16またはそれ以上の異なる標的)を1回のアッセイでアッセイ(例えばスクリーニング)可能にする。多くのこのようなアッセイが、速くそして容易に行うことができる。このようなアッセイまたは一連のアッセイは、したがって、本明細書で定義のハイスループットで行うことができる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本発明の方法に関して、標的を当分野で既知の種々の方法でおよび／または本明細書に記載の方法(例えば、ヌクレアーゼ保護フラグメント検出に関して)で標識(タグ付け)できる。例えば、化学ルミネッセント分子、または化学ルミネッセント分子の産生を触媒する酵素、またはフルオレッセインまたはcy5のような蛍光分子、またはキレート化ランタニド金属の一つのような時間解離性蛍光分子、または放射活性化合物のような、検出用シグナルを提供する化学基と、標的分子を直接的または間接的に結合できる。あるいは、標的をそれらがプローブと反応した後に、1個またはそれ以上の標的特異的レポーターで標識できる(例えば、図1に示す抗体、オリゴヌクレオチドまたはプローブおよび標的に関連して上記の一般的タイプの分子)。種々の多くの複合サンドイッチタイプ検出法も用いることができる。例えば、標的を、標的に特異的な第1部分および共通(即ち、同じ)レポーター試薬、例えば、標識ポリヌクレオチド、抗体等により認識され得る第2部分を含む二官能性分子とハイブリダイズできる。二官能性分子は、所望の数の共通レポーターを各アッセイで使用できるように設計できる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
保護フラグメント含有RNAサンプルを90℃で5分加熱し、ハイブリダイゼーションを、サンプルを70℃にし、それらをゆっくり一晩で室温に冷却することにより行う。1：10希釈のS1ヌクレアーゼ(Promega)を、30分、19℃で30μlの1×S1  Nuclease Buffer(Promega)に添加し、1.6μlの10N NaOHおよび2.7μlの0.5M EDTAで停止させる。サンプルを90℃で15分、次いで37℃で15分加熱し、変性させてRNAを破壊し、1.6μlの10M HClで中和し、MAPSプレート上で一晩、200mM HEPES pH7.5添加0.05%SDSと5×SSC中でインキュベートし、それに30nMビオチニル化検出オリゴヌクレオチドを添加する。洗浄およびSA-HRPでの可視化を記載のように行う。シグナルの量は、マウスRNAの量の減少(サンプルは500、170、50、5または0.5μgのマウスRNAを含む)と並行して減少する。二つのコントロールサンプルは、S1ヌクレアーゼが添加されていないものを含む。シグナルは、相補的保護フラグメントにのみ見られる。