【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年8月29日(2006.8.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類の多能性の幹細胞を分化させることで得られる、生体外培養状態の分化した細胞集団であって、前記分化した細胞の少なくとも６０％がドーパミン作動性神経細胞である、細胞集団。
【請求項２】
前記霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
霊長類の多能性の幹細胞を分化させることで得られる、生体外培養状態の分化した細胞集団であって、前記分化した細胞の少なくとも６０％がチロシン・ヒドロキシラーゼを発現する、細胞集団。
【請求項４】
前記霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項５】
霊長類の多能性の幹細胞から、分化した神経細胞集団を生成する方法であって、
（ａ）霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
（ｂ）前記多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
（ｄ）ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方を含む分化培地でネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を培養することで、前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて分化した神経細胞集団を生成するステップと、
を含む、分化神経細胞集団を生成するための方法。
【請求項６】
前記多能性の幹細胞が、レーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト胚幹細胞がレーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分化した神経細胞集団が少なくとも約６０％のドーパミン作動性神経細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化した神経細胞集団が少なくとも約３０％のセロトニン作動性神経細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化した神経細胞集団が少なくとも約２５％のオリゴデンドロサイトを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の前記多能性の幹細胞を培養して胚様体を形成することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記胚様体を培養して、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、多能性の幹細胞を無血清培地で培養することによって選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記無血清培地がＩＴＳＦｎ無血清合成培地である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、前記胚様体を無血清培地で培養することで、選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記無血清培地がＩＴＳＦｎ無血清合成培地である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項１８に記載の無血清培地。
【請求項２１】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項２０に記載の無血清培地。
【請求項２２】
前記神経前駆細胞が、少なくとも約９５％のネスチン陽性細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）によって、ＮＣＡＭ陽性細胞についてエンリッチをおこなうために、ステップ（ｃ）の前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別する、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ネスチン陽性神経前駆細胞が、少なくとも約５０〜６０％のＮＣＡＭ陽性細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性神経前駆細胞を増殖培地で増殖させることを、さらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ラミニン、プトレッシン、プロゲステロン、塩基性線維芽細胞成長因子  （ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子  （ＥＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ  （ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８  （ＦＧＦ−８）、および脳誘導神経向性因子  （ＢＤＮＦ）からなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が６〜１０日間にわたって前記増殖培地で増殖する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１種類以上の集団を倍加させるために、前記細胞を培養し、そして連続的に継代する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が液体窒素中で凍結保存される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記分化培地が、ウシ胎仔血清、Ｂ２７、アスコルビン酸、およびＮ−アセチル・システインが補充された神経基本培地を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３１】
前記分化培地が、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル、システイン・グリア細胞系誘導神経向性因子  （ＧＤＮＦ）、ジブチリル環状ＡＭＰ  （ｄｂ−ｃＡＭＦ）、脳誘導神経向性因子  （ＢＤＮＦ）、ニューチュリン、ソニック・ヘッジホッグ・タンパク質（ＳＨＨ）、および線維芽細胞増殖因子−８  （ＦＧＦ−８）からなる群から選択される１種類以上の分化剤を、さらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化培地で３０〜５０日間にわたり増殖させる、請求項５に記載の方法。
【請求項３３】
神経前駆細胞からドーパミン作動性神経細胞を生成する方法であって、
ネスチンに陽性の細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチし、前記ネスチン陽性細胞をＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方の存在下で培養することで前記ネスチン陽性細胞を分化させて、ドーパミン作動性神経細胞を生成する、ドーパミン作動性神経細胞生成方法。
【請求項３４】
少なくとも約４０％の前記ネスチン陽性細胞がドーパミン作動性神経細胞に分化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＮＣＡＭに陽性の細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチすることを、さらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させてドーパミン作動性神経細胞を生成する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも約６０％の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞が、ドーパミン作動性神経細胞に分化する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
神経前駆細胞からセロトニン作動性神経細胞を生成する方法であって、
ネスチンおよびＮＣＡＭに陽性である細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチすること、ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞をＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方の存在下で培養することで前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、セロトニン作動性神経細胞を生成する、セロトニン作動性神経細胞生成方法。
【請求項３９】
少なくとも３０％の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞がセロトニン作動性神経細胞に分化する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
神経変性障害または神経疾患を持つ患者を処置するための組成物であって、該組成物は、患者の中枢神経系に移植するのに適した、治療上有効量の分化した神経細胞集団を含み、該組成物は、以下の工程：
（ａ）霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
（ｂ）前記多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
（ｄ）ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方を含む分化培地でネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を培養することで、前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて分化した神経細胞集団を生成するステップ
を包含する方法によって生産される、組成物。
【請求項４１】
前記霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記方法が、前記分化した神経細胞集団からドーパミン作動性神経細胞を単離するステップを包含し、該ドーパミン作動性神経細胞が前記患者への投与に適する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記神経変性障害または神経疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、脳卒中、および虚血からなる群から選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記分化した神経細胞集団が、前記患者の脳への移植に適する、請求項４０に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
発明の要約
本発明の開示は、神経前駆細胞、最終的には分化した神経を、多能性の幹細胞（例えば、ヒト幹細胞等の多能性の幹細胞から生産するための改良された方法に関する。例えば、本発明の開示は、ヒト幹細胞の集団が高い割合で、ドーパミン作動性神経細胞の特異的マーカーであるチロシンキナーゼ（ＴＨ）に陽性の神経に分化にする（例えば、少なくとも約６０％）。本発明の開示は、ヒト幹細胞の集団が高い割合でセロトニン作動性神経細胞に分化することも示す。本発明の開示の方法にもとづいて生ずるドーパミン作動性およびセロトニン作動性神経細胞の割合は、既に述べられた方法よりも高い。本明細書に開示される方法もまた、星状細胞およびオリゴデンドロサイトと同様に、ヒト胚幹細胞から、コリン作動性および感覚神経の表現型特徴を持つ細胞を生成するために用いられることが可能である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
本発明の開示は、霊長類の多能性の幹細胞を分化させることで得られる、生体外培養状態の分化した細胞集団であって、前記分化した細胞の少なくとも６０％がチロシン・ヒドロキシラーゼを発現するドーパミン作動性神経細胞、またはチロシン・ヒドロキシラーゼを発現するドーパミン作動性神経細胞である、細胞集団を提供する。他の実施形態では、少なくとも約３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の分化した細胞がドーパミン作動性神経細胞である。本発明は、霊長類の多能性の幹細胞を分化させることで得られる，生体外培養状態の分化した細胞集団であって、少なくとも３０％の分化した細胞がセロトニン作動性神経細胞である。別の実施形態では、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の分化した細胞がセロトニン作動性神経細胞である。好ましい実施形態では、神経前駆体細胞または神経に分化した霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の開示はまた、霊長類の多能性の幹細胞から、分化した神経細胞集団を生成する方法であって、
（ａ）霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
（ｂ）多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチするためのネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
（ｄ）分化培地でネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を培養することで、ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、分化した神経細胞集団を生成するステップと、
を含む、分化神経細胞集団を生成するための方法を提供する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
本発明の開示はまた、本明細書に記載したように霊長類の多能性の幹細胞に由来する対象となる分化した神経細胞に投与することで、神経変成障害または神経疾患を持つ被検体を処置するための方法を提供する。例えば、分化した神経細胞集団を以下のように誘導してもよい。すなわち、
（ａ）霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させ、
（ｂ）多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択し、
（ｃ）ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別し、
（ｄ）分化培地中で、ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を培養し、該細胞を分化させることで、分化した神経細胞集団を生成し、
（ｅ）治療上有効な量からなる分化した神経細胞集団を被検体の中枢神経系に投与する
好ましくは、上記分化培地はＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいはそれら両方を含む。好ましい実施形態では、被検体は患者、より好ましくは、ヒト患者であり、霊長類の多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である。好ましくは、ヒト胚幹細胞は患者と組織適合する。例えば、使用した多脳性の幹細胞が本質的に患者のものと同一のゲノムを有する。特定の実施例において、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、コリン作動性、感覚神経細胞、またはその代わりとして神経膠星状細胞、あるいはオリゴデンドロサイトは、分化した神経細胞集団から分離されて、患者に投与される。これらの細胞は、例えば分化した神経細胞集団を含むもので、被検体に投与されることで、種々の神経変成障害または神経疾患、例えば限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン（舞踏）病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、脳梗塞、および虚血からなる群から選択される。好ましくは、上記細胞を移植によって、例えば所望の細胞を被検体の脳に移植することによって、投与する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
別の実施形態では、上記方法は、胚様体を形成するために、ステップ（ｂ）の多能性の幹細胞を培養するステップを、さらに含む。好ましくは、これらの胚様体を、例えば無血清培地で多能性の幹細胞または胚様体を培養することで、ネスチンに対して陽性である神経前駆体に選ぶ条件下で培養する。好ましい実施形態では、上記無血清培地がＩＴＳＦｎ無血清合成培地であり、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を好ましくは含む。好ましい実施形態では、これらの方法は、好ましくは、少なくとも約６０〜７５％のネスチン陽性細胞、より好ましくは約８０〜９０％ネスチン陽性細胞、およびもっとも好ましくは約９５〜９９％のネスチン陽性細胞を含む神経前駆細胞を生成する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
好ましい実施形態において、本明細書中に使用されるＥＳ細胞およびＥＳ細胞系は、胚盤胞の内細胞塊に由来する。これらの胚盤胞は、回収された生体内受精移植全胚から単離、または生体外受精（ＩＶＦ）（例えば、従来の授精、細胞質内精子注入法、または卵質移植）であってもよい。ヒト胚盤胞は、自発的に余剰胚を寄付する夫婦または提供者から得られる。これらの夫婦または提供者からの書面による自発的同意を獲得した後に、これらの胚を研究目的のために用いる。あるいは、胚盤胞は、ヒトまたはヒト外の除核卵母細胞に、体細胞または細胞核の移動によって誘導することが可能であり、それによって刺激されて胚盤胞段階に成長していく。使用される胚盤胞は凍結保存されたものであってよく、あるいは初期の段階で凍結保存されて胚盤胞段階の胚にまで成長し続けることが可能となる胚から得られたものでもよい。胚盤胞と内細胞塊との両方の成長は、種によって異なるものであり、当業者によく知られている。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
好ましくは、ＥＳ細胞系を、長期間にわたって、例えば１年以上にわたって、未分化状態で培養液中で維持することができ、通常の正倍数体核型を維持することができる。ヒトＥＳ細胞の同定は、核と細胞質との比率が高いこと、顕著な核小体、およびコンパクトなコロニー形成（しばしば明確な細胞境界およびマウスＥＳ細胞よりも多くの場合平坦である）によって形態学的におこなうことが可能である。ヒトＥＳ細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）、およびＢｕｅｈｒ  ａｎｄ  Ｍｃｌａｒｅｎ（１９９３）（各々の内容を特に本明細書の一部を構成するものとして援用する）に開示されているように、好ましくはヒト多能性ＥＳ細胞に対するマーカー（例えば、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原、およびＴＲＡ２−６０）に対して免疫反応性を示す。望ましくは、ヒトＥＳ細胞も、ＯＣＴ−４と同様に、アルカリホスファターゼを発現する。別の実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、非付着培養条件下で胚様体を形成することが可能である（米国特許第６，６０２，７１１号、本明細書の一部を構成するものとして援用）。これらの胚様体を、他の所望の細胞系譜と同様に、内胚葉、中胚葉、および外胚葉胚葉の分化型誘導体を誘導するのに用いることができる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
別の実施形態では、本発明の開示は、神経変性障害または神経疾患を処置するために、１種類以上の神経生存因子と、多能性幹細胞に由来する本発明の開示の神経前駆細胞と分化した神経細胞とを、同時投与することに関する。神経生存因子は、所望の細胞の投与に先立って、同時に、または組み合わせて、またはその後に、投与することが可能である。本明細書で用いられるように、「神経生存因子（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ）とは、因子が存在しない場合よりもより長時間にわたって生きるための因子と接触している神経（生体外または生体内のいずれか）を生ずる任意の物質である。本発明の治療的な実施形態で使用可能な神経生存因子は、限定されるものではないが、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ＦＧＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、さらに形質転換増殖因子β（ＴＦＧ−β、ＴＦＧ−β１）が挙げられる。