【手続補正書】
【提出日】平成17年10月4日(2005.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚盤胞の内部細胞塊から細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）透明帯と、栄養外胚葉と、内部細胞塊とを有する、胚盤胞を単離する工程；
（ｂ）レーザ切除によって、該胚盤胞中に開口部を作製する工程；および
（ｃ）該開口部を通して該胚盤胞から該内部細胞塊に由来する細胞を単離する工程；および
（ｄ）該細胞を培養して、細胞株を樹立する工程
を包含する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記開口部が、前記透明帯を通る、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記開口部が、前記透明帯と前記栄養外胚葉とを通る、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記レーザ切除が、非接触ダイオードレーザを使用して達成される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記非接触ダイオードレーザが、１．４８μｍの連続ダイオードレーザである、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記内部細胞塊に由来する細胞が、前記開口部を通して導入された吸引ピペットを使用する吸引によって単離される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記内細胞塊に由来する細胞を単離する工程が、動物から生成された抗体および動物から生成された血清の非存在下で実施される、方法。
【請求項８】
ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）レーザ切除により胚盤胞期胚中に開口部を作製し、該開口部を通して該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を取り出すことによって、胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を単離する工程；
（ｂ）胚性幹細胞培地および不活化フィーダー層の存在下で該内部細胞塊の細胞を培養
して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程；および
（ｃ）該内部細胞塊由来の塊を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記胚性幹細胞培地が、
（ａ）約７０％〜約９０％の量の、高グルコース含量を含みピルビン酸ナトリウムを含まない、ダルベッコ改変イーグル培地と；
（ｂ）該胚性幹細胞培地の体積のうちの１０％〜３０％の量のウシ胎仔血清と；
（ｃ）β−メルカプトエタノールと；
（ｄ）非必須アミノ酸と；
（ｅ）Ｌ−グルタミンと；
（ｆ）塩基性線維芽細胞増殖因子と；
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の内部細胞塊を機械的に解離する工程；および
該機械的に解離された内部細胞塊由来の塊を新鮮なフィーダー細胞上に再配置する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）の単離された胚盤胞が、従来の胚生検培地中に配置される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記胚生検培地が、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まない、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、マイクロマニピュレータシステムをさらに包含し、該マイクロマニピュレータシステムは、加熱ステージを備える顕微鏡と、保持ピペットと、吸引ピペットと、空気シリンジとを備え、
前記工程（ａ）の単離された胚盤胞は、該加熱ステージ上に配置され、該マニピュレータシステムは、該胚盤胞が該顕微鏡の視野の中心にあるように調整され、そして該胚盤胞は、該空気シリンジを通る吸引により該保持ピペットを用いて確保され、その結果、該内部細胞塊は、該保持ピペットと対向する、方法。
【請求項１４】
請求項２に記載の方法であって、前記開口部が、１．４８μｍダイオードレーザを使用するレーザ切除により作製される、方法。
【請求項１５】
請求項３に記載の方法であって、前記開口部が、１．４８μｍダイオードレーザを使用するレーザ切除により作製され、かつ該開口部は、前記内細胞塊と近接している、方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の方法であって、前記内細胞塊の細胞が、胚性幹細胞培地中で１回以上洗浄され、かつ胚性幹細胞培地の存在下でフィーダー層に配置される、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記フィーダー層が、胚性線維芽細胞フィーダー層
である、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、前記内部細胞塊の単離された細胞が、フィーダーのない条件下で培養される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記単離された胚盤胞が、体外受精の産物である、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記単離された胚盤胞が、細胞質内精子注入の産物である、方法。
【請求項２４】
請求項８に記載の方法であって、前記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
【請求項２５】
請求項８に記載の方法であって、前記フィーダー層が、胚性線維芽細胞フィーダー層である、方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載の方法であって、前記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
【請求項２７】
請求項１０に記載の方法であって、前記フィーダー層が、胚性繊維外細胞フィーダー層である、方法。
【請求項２８】
ヒト胚性幹細胞株を樹立する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）内部細胞塊を含むヒト胚盤胞を単離する工程；
（ｂ）レーザ切除により該胚盤胞を中に開口部を作製する工程；
（ｃ）該開口部を通して該胚盤胞の内部細胞塊から細胞を単離する工程；
（ｄ）該細胞を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記開口部が、前記透明帯と前記栄養外胚葉とを通る、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記レーザ切除が、非接触ダイオードを使用して達成される、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記内部細胞塊の細胞が、前記開口部を通した吸引により単離される、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、前記ヒト胚性幹細胞株が、動物から生成された抗体および動物から生成された血清の非存在下で樹立される、方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記工程（ｃ）が、フィーダー層上に前記内細胞塊の細胞を配置する工程をさらに包含し、内部細胞塊由来の細胞塊が形成される、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記フィーダー層が、胚性繊維外細胞フィーダー層である、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記フィーダー層が、マウス起源またはヒト起源である、方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法であって、前記内部細胞塊由来の細胞塊が、解離され、そしてフィーダー層上に再配置される、方法。
【請求項３７】
請求項２８に記載の方法であって、前記工程（ｃ）が、前記内部細胞塊の細胞をフィーダーのない条件に配置する工程をさらに包含し、内部細胞塊由来の細胞塊が形成される、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、前記内部細胞塊の細胞を細胞外マトリックスに配置することを包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記細胞が、馴化培地の存在下で培養される、方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、前記内部細胞塊由来の細胞塊が、解離され、そして細胞外マトリックス上に再配置される、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記細胞が、馴化培地の存在下で培養される、方法。
【請求項４２】
ヒト胚性幹細胞株を樹立するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）レーザ切除により胚盤胞期胚中に開口部を作製し、該開口部を通して該胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を取り出すことによって、胚盤胞期胚から内部細胞塊の細胞を単離する工程；
（ｂ）フィーダーのない条件下で該内部細胞塊の細胞を培養して、内部細胞塊由来の塊を生成する工程；および
（ｃ）前記内部細胞塊由来の塊を培養して、単離されたヒト胚性幹細胞株を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含む、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、前記工程（ｂ）の内部細胞塊由来の塊を機械的に解離する工程、および該内部細胞塊由来の塊の機械的に解離された細胞を、フィーダーのない条件下に再配置する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、細胞外マトリックスを含む、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記フィーダーのない条件が、馴化培地をさらに含
む、方法。