【手続補正書】
【提出日】平成18年10月11日(2006.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆方向縦列型反復配列を構成する３'および５'相補配列、
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に相補的であり、かつ逆方向縦列型反復配列に関して３'位に位置する、逆転写酵素のためのプライマー結合部位をコードする配列、および
逆方向縦列型反復配列の３'および５'相補配列の間、または逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位をコードする配列との間のいずれかに位置する興味ある配列をコードする配列
を含む、細胞中への送達のための核酸構成体。
【請求項２】
興味ある配列をコードする配列が、逆方向縦列型反復配列の３'および５'相補配列の間に位置する、請求項１に記載の核酸構成体。
【請求項３】
逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位をコードする配列との間に位置する第二の興味ある配列をコードする配列を含む、請求項２に記載の核酸構成体。
【請求項４】
興味ある配列をコードする配列が逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位をコードする配列との間に位置する、請求項１に記載の核酸構成体。
【請求項５】
逆方向縦列型反復配列が、該核酸構成体によりコードされる一本鎖核酸産物においてステム−ループ中間体を形成でき、該逆方向縦列型反復配列が該ステム−ループ中間体のステムを形成する、請求項２から４のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項６】
逆方向縦列型反復配列が１以上の特異的酵素認識配列をコードする配列を含む、請求項２から５のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項７】
特異的酵素認識配列が制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項６に記載の核酸構成体。
【請求項８】
更に、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む、請求項７に記載の核酸構成体。
【請求項９】
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が逆方向縦列型反復配列に関して５'位に位置する、請求項８に記載の核酸構成体。
【請求項１０】
特異的酵素認識配列が、ＨｉｎｄIIIもしくはＮｏｔＩ制限部位、またはエンドヌクレアーゼＩ型、エンドヌクレアーゼII型およびエンドヌクレアーゼIII型からなる群より選択される制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む、請求項６から９のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１１】
逆方向縦列型反復配列が、１以上の真核性、原核性および／またはウイルス性タンパク質ＤＮＡ結合部位をコードする配列を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１２】
逆方向縦列型反復配列がシス−配向様式で作用する、請求項１から１１のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１３】
プライマー結合部位が内因性逆転写酵素に特異的である、請求項１から１２のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１４】
更に、逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１５】
逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子が逆方向縦列型反復配列に関して５'位に位置する、請求項１４に記載の核酸構成体。
【請求項１６】
逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子がモロニーマウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスまたはサル免疫不全症ウイルスに由来する、請求項１４または１５に記載の核酸構成体。
【請求項１７】
プライマー結合部位が逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質遺伝子によりコードされる逆転写酵素に特異的である、請求項１４から１６のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１８】
更に、該第一または第二の興味ある配列をコードする配列、該制限エンドヌクレアーゼ、該逆転写酵素または該逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質遺伝子の各々に対するプロモーターを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項１９】
プロモーターが真核性プロモーターである、請求項１８に記載の核酸構成体。
【請求項２０】
プロモーターが構成的、誘導的、広範囲または組織特異的プロモーターである、請求項１８または１９に記載の核酸構成体。
【請求項２１】
更に、３'プライマー結合部位に関して３'位に位置するポリアデニル化テール配列をコードする配列を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項２２】
第一または第二の興味ある配列をコードする配列が酵素活性を有するｓｓＤＮＡをコードする配列を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の核酸構成体。
【請求項２３】
第一または第二の興味ある配列をコードする配列が、標的ｍＲＮＡ種に相補的な１以上の配列をコードする配列により５'および３'方向の両方にてフランキングされた配列５'−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−３'を含む、請求項２２に記載の核酸構成体。
【請求項２４】
標的ｍＲＮＡ種が、
(ｉ)  ｈ−ｒａｓ、
(ii)  ｃ−ｒａｆキナーゼ、
(iii)  血管新生因子プレイオトロフィン、または
(iv)  サル免疫不全症ウイルス(ＳＩＶ)のｔａｔ領域に対するものである、請求項２３に記載の核酸構成体。
【請求項２５】
(ｉ)請求項２から４のいずれかに記載の核酸構成体を含むカセット、および
(ii)逆転写酵素をコードする遺伝子
を含む、細胞への送達のためベクター中への組み込みに適応した遺伝子要素のセット。
【請求項２６】
逆転写酵素遺伝子が、モロニーマウス白血病ウイルスおよびヒト免疫不全症ウイルスに由来する逆転写酵素遺伝子からなる群より選択される、請求項２５の遺伝子要素のセット。
【請求項２７】
(ａ)逆方向縦列型反復配列を構成する３'および５'相補配列によりフランキングされた興味ある配列をコードする配列、
（ｂ）逆方向縦列型反復配列に関して３'位に位置する逆転写酵素のためのプライマー結合部位（ＰＢＳ）をコードする配列、ここで、ＰＢＳは標的真核細胞内に存在する転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）配列に相補的な核酸配列からなる、および
（ｃ）逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子
を含む、請求項２５に記載の遺伝子要素のセット。
【請求項２８】
興味ある配列が一本鎖核酸分子である、請求項１から２４のいずれかに記載の核酸構成体または請求項２５から２７のいずれかに記載の遺伝子要素のセット。
【請求項２９】
一本鎖核酸分子がｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項２８に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項３０】
一本鎖核酸分子が阻害性核酸分子である、請求項２８または２９に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項３１】
阻害性核酸分子がアンチセンス配列またはアプタマーである、請求項３０に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項３２】
核酸がＤＮＡである、請求項１から３１のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項３３】
(ａ)逆方向縦列型反復配列を構成する３'および５'相補配列、
(ｂ)転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に相補的であり、かつ逆方向縦列型反復配列の３'に位置するプライマー結合部位、および
(ｃ) 逆方向縦列型反復配列の３'および５'相補配列の間または逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位との間に位置する興味ある配列をコードする配列
を含む、ｍＲＮＡ転写体。
【請求項３４】
興味ある配列をコードする配列が逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位との間に位置する、請求項３３に記載のｍＲＮＡ転写体。
【請求項３５】
興味ある配列をコードする配列が酵素活性を有するｓｓＤＮＡをコードする配列を含む、請求項３３または３４に記載のｍＲＮＡ転写体。
【請求項３６】
請求項３２の核酸構成体の転写体である、請求項３３に記載のｍＲＮＡ転写体。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいずれかのｍＲＮＡのｓｓＤＮＡ転写体。
【請求項３８】
逆方向縦列型反復配列を構成する３'および５'相補配列、
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に相補的であり、かつ逆方向縦列型反復配列に関して３'位に位置する逆転写酵素のためのプライマー結合部位をコードする配列、および
逆方向縦列型反復配列の３'および５'相補配列の間または逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位をコードする配列との間にある興味ある配列をコードする配列のための挿入部位
を含む、ベクター。
【請求項３９】
逆方向縦列型反復配列の３'および５'相補配列の間にある第一の挿入部位および逆方向縦列型反復配列と３'プライマー結合部位をコードする配列との間にある第二の挿入部位を含む、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
更に、逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３８または３９に記載のベクター。
【請求項４１】
逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質遺伝子が逆方向縦列型反復配列に関して５'位に位置する、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
請求項１から３２のいずれかの核酸構成体または遺伝子要素のセットを含む、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４３】
請求項３８または３９の第一のベクター、および
逆転写酵素をコードする遺伝子を含む第二のベクター
を含む、ベクターシステム。
【請求項４４】
ベクターがプラスミドまたは改変されたウイルス性構成体である、請求項３８から４３のいずれかに記載のベクターまたはベクターシステム。
【請求項４５】
遺伝子が発現制御配列に作動可能に連結している、請求項３８から４４のいずれかに記載のベクターまたはベクターシステム。
【請求項４６】
請求項３８から４５のいずれかのベクターまたはベクターシステムで安定に形質転換またはトランスフェクションされた、または請求項３３から３７のいずれかの転写体を含む、宿主細胞。
【請求項４７】
真核細胞または細菌細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
請求項１から３２のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセットを標的細胞中に導入する工程、
核酸構成体または遺伝子要素のセットをｍＲＮＡへ転写する工程、および
ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写する工程
を含む、興味ある配列を有する一本鎖核酸分子を産生するin vitroの方法。
【請求項４９】
逆転写を標的細胞に内因性である逆転写酵素により実施する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
更に、逆転写酵素または逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を標的細胞中に導入する工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
更に、逆方向縦列型反復配列により形成されるｃＤＮＡステム−ループ構造を該ループ構造がステムに結合するところでカットすることによりｃＤＮＡ転写体を線状化する工程を含む、請求項４８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
以下によりｃＤＮＡを線状化する、請求項５１に記載の方法：
逆方向縦列型反復配列に制限エンドヌクレアーゼ部位を含める、ここでｃＤＮＡは逆方向縦列型反復配列のワトソン−クリック塩基対形成によってステム−ループ中間体を形成する、および
制限エンドヌクレアーゼによりステム−ループ中間体のステムをカットする。
【請求項５３】
更に、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子またはプロリンに富むリンカーを介して制限エンドヌクレアーゼに結合した逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を標的細胞中に導入する工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
更に、逆転写酵素遺伝子の転写を誘導的に促進する工程を含む、請求項４８から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
請求項２７の遺伝子要素のセットを標的細胞に導入する工程、
遺伝子要素のセットをｍＲＮＡへ転写する工程、
ヒト組織培養細胞の核において逆転写酵素により該カセットのｍＲＮＡ転写体を逆転写する工程、
得られたヘテロ二本鎖をＲＮＡｓｅ  Ｈにより消化する工程、および
フランキング配列を、（ａ）ステム−ループ中間体の制限エンドヌクレアーゼ消化、または（ｂ）自己相補的逆方向縦列型反復配列によるステム−ループ二次構造の形成によるｃＤＮＡ転写体の不完全終結のいずれかにより除去する工程
を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
薬理学的に許容されるアジュバント、賦形剤または担体と共に、請求項１から３２のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット、請求項３８から４５のいずれかに記載のベクターまたはベクターシステム、または請求項４６または４７に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
【請求項５７】
阻害性核酸分子を標的細胞に送達するのに使用するための、請求項１から３２のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット、請求項３８から４５のいずれかに記載のベクターまたはベクターシステム、または請求項４６または４７に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
興味ある配列を有する一本鎖核酸分子を産生するin vivoの方法に使用される、請求項５７に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット、ここで該方法は、
核酸構成体または遺伝子要素のセットを標的細胞中に導入する工程、
核酸構成体または遺伝子要素のセットをｍＲＮＡへ転写する工程、および
ｍＲＮＡ転写体をｃＤＮＡへ逆転写する工程
を含む。
【請求項５９】
逆転写が標的細胞に内因性である逆転写酵素により実施される、請求項５８に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項６０】
該方法が、更に、逆転写酵素または逆転写酵素逆転写／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を標的細胞中に導入する工程を含む、請求項５８に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項６１】
該方法が、更に、逆方向縦列型反復配列により形成されるｃＤＮＡステム−ループ構造を該ループ構造がステムに結合するところでカットすることによりｃＤＮＡ転写体を線状化する工程を含む、請求項５８から６０のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項６２】
以下によりｃＤＮＡが線状化される、請求項６１に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット：
逆方向縦列型反復配列に制限エンドヌクレアーゼ部位を含める、ここでｃＤＮＡは逆方向縦列型反復配列のワトソン−クリック塩基対形成によってステム−ループ中間体を形成する、および
制限エンドヌクレアーゼによりステム−ループ中間体のステムをカットする。
【請求項６３】
該方法が、更に、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子またはプロリンに富むリンカーを介して制限エンドヌクレアーゼに結合した逆転写酵素／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質をコードする遺伝子を標的細胞中に導入する工程を含む、請求項６２に記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項６４】
該方法が、更に、逆転写酵素遺伝子の転写を誘導的に促進する工程を含む、請求項５８から６３のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット。
【請求項６５】
遺伝子発現を調節することにより、または阻害性核酸分子を標的細胞に送達することにより病的状態を軽減するための医薬を製造するための、請求項１から３２のいずれかに記載の核酸構成体または遺伝子要素のセット、請求項３８から４５のいずれかに記載のベクターまたはベクターシステム、または請求項４６または４７に記載の宿主細胞の使用。