【手続補正書】
【提出日】平成17年12月13日(2005.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体異常を検出する方法であって、
（ａ）鋳型ＤＮＡから関心対象座の対立遺伝子の配列を決定すること、
（ｂ）（ａ）の関心対象座から同定されたヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の相対量を定量化し、前記相対量を比率として表し、前記比率によって染色体異常の有無を示すこと、を含んでなる方法。
【請求項２】
前記鋳型ＤＮＡが、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、イノシシ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄牛、牝牛、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽類、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメからなる群より選択される供給源から得られる請求項１記載の方法。
【請求項３】
鋳型ＤＮＡが、任意で細胞溶解阻害剤と混合した、細胞、胎児細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、胚芽、４細胞胚芽、８細胞胚芽、１６細胞胚芽、３２細胞胚芽、６４細胞胚芽、１２８細胞胚芽、２５６細胞胚芽、５１２細胞胚芽、１０２４細胞胚芽、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質、または他の身体滲出液からなる群より選択されるサンプルから得られる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
複数の関心対象座の対立遺伝子が、塩基配列決定され、それらの相対量が定量化され、比率として表される請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記複数の関心対象座が、複数の染色体上にある請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが妊娠女性由来のサンプルから得られる請求項２または３記載の方法。
【請求項７】
前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルマリン、およびホルムアルデヒドの誘導体からなる群より選択される請求項３から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが妊娠女性からの血液である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記血液は、胎児が０〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜３６、３６〜４０、４０〜４４、４４〜４８、４８〜５２週目、および５２週目以上からなる群より選択される懐胎期間の妊娠女性から得られる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型ＤＮＡが、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの混合物を含んでなる請求項３から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）の前に、母体ＤＮＡが、ホモ接合の関心対象座またはヘテロ接合の関心対象座を同定するために塩基配列決定され、さらに前記ホモ接合の関心対象座またはヘテロ接合の関心対象座が、（ａ）の鋳型ＤＮＡにおいて分析された関心対象座である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
対立遺伝子の配列決定が、
（ａ）第１および第２のプライマーを用いて鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の対立遺伝子を増幅し、制限酵素による消化によって関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するように、前記第２のプライマーが、制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること；
（ｂ）前記第２のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により前記増幅ＤＮＡを消化すること；
（ｃ）鋳型として関心対象座を含有する５’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを（ｂ）の消化ＤＮＡに取り込むこと；および
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡ配列を決定することにより関心対象座の対立遺伝子配列を決定すること、を含んでなる請求項１から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２のプライマーが、可変ヌクレオチドを含有する制限酵素認識部位の一部を含有し、制限酵素認識部位全体を増幅後に生成する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記制限酵素認識部位が、ＢｓａＪＩ、ＢｓｓｋＩ、ＤｄｅＩ、ＥｃｏＮＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨｉｎｆＩおよびＳｃｒＦＩからなる群より選択される制限酵素に対する部位である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記制限酵素が、認識部位から離れてＤＮＡを切断する請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記認識部位が、ＩＩＳ型制限酵素に対するものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＩＳ型制限酵素が、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、Ｂｓｔ７ｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳＳｆａＮＩ、およびＳｔｈｉ３２Ｉからなる群より選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅方法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列決定反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ端の高速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、ストランド置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル１のアニーリング温度が、鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域の一部の略融解点である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル２のアニーリング温度が、鋳型ＤＮＡにアニールする第１のプライマーの３’領域の一部の略融解点である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ポリメラーゼ連鎖反応の残りのサイクルのアニーリング温度が、第２のプライマー全体の略融解点である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記配列決定が、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、塩基配列決定、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析からなる群より選択される方法を含んでなる請求項１から２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
染色体上のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する前記比率を総計し、異なる染色体上のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する比率と比較して、比率の相違が染色体異常の存在を示す請求項１から２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
比較される染色体が、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、Ｘ、およびＹからなる群より選択されるヒト染色体である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
染色体１３、１８、および２１のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する比率を比較する請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記関心対象座が単一のヌクレオチド多型または突然変異である請求項１記載の方法。
【請求項２７】
胎児ＤＮＡの関心対象座の配列を決定する方法であって、
（ａ）妊娠女性由来の、細胞溶解阻害剤を添加したサンプルを得ること；
（ｂ）（ａ）の前記サンプル由来の、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとを含んでなる鋳型ＤＮＡにおいて、関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる方法。
【請求項２８】
妊娠女性からの前記サンプルが、組織、細胞、血液、血清、血漿、尿、および膣分泌液からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドの誘導体、およびホルマリンからなる群より選択される請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）の前に、鋳型ＤＮＡが単離される請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の前に、母親または父親の鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の配列が決定される請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３２】
前記関心対象座が単一のヌクレオチド多型または突然変異である請求項２７から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
複数の関心対象座の配列が決定される請求項２７から３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
複数の関心対象座が複数の染色体上にある請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
配列決定が、
（ａ）第１および第２のプライマーを用いて鋳型ＤＮＡ上の関心対象座を増幅し、制限酵素による消化が関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように、前記第２のプライマーが制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること；
（ｂ）前記増幅ＤＮＡを、前記第２のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により消化すること；
（ｃ）鋳型として関心対象座を含有する５’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを（ｂ）の消化ＤＮＡに取り込むこと；および
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡ配列を決定することにより関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる請求項２７から３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記第１および第２のプライマーが、可変ヌクレオチドを含有する制限酵素認識部位の一部を含有し、制限酵素認識部位全体を増幅後に生成する請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記制限酵素が、ＢｓａＪＩ、ＢｓｓｋＩ、ＤｄｅＩ、ＥｃｏＮＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨｉｎｆＩおよびＳｃｒＦＩからなる群より選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記制限酵素が、認識部位から離れてＤＮＡを切断する請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記認識部位が、ＩＩＳ型制限酵素に対するものである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記ＩＩＳ型制限酵素が、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、Ｂｓｔ７ｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳＳｆａＮＩ、およびＳｔｈｉ３２Ｉからなる群より選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記増幅方法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列決定反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ端の高速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、ストランド置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される請求項３５記載の方法。
【請求項４２】
ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル１用のアニーリング温度が、鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域の一部の略融解点である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル２用のアニーリング温度が、鋳型ＤＮＡにアニールする第１のプライマーの３’領域の一部の略融解点である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ポリメラーゼ連鎖反応の残りのサイクル用のアニーリング温度が、第２のプライマー全体の略融解点である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
関心対象座の配列が、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光分極、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光検出、塩基配列決定、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析からなる群より選択される方法を用いて決定される請求項３５記載の方法。
【請求項４６】
胎児ＤＮＡ上の関心対象座の配列を決定する方法であって、
（ａ）第１および第２のプライマーを用いて鋳型ＤＮＡ上の関心対象座を増幅し、制限酵素による消化によって関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するように、前記第２のプライマーが、制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること；
（ｂ）前記増幅ＤＮＡを、前記第２のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により消化すること；
（ｃ）鋳型として関心対象座を含有する５’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを（ｂ）の消化ＤＮＡに取り込むこと；および
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡ配列を決定することにより関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる方法。
【請求項４７】
細胞溶解阻害剤を添加した妊娠女性由来のサンプルから、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含んでなる鋳型ＤＮＡを得ることをさらに含んでなる請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
妊娠女性からの前記サンプルが、組織、細胞、血液、血清、血漿、尿、および膣分泌液からなる群より選択される請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドの誘導体、およびホルマリンからなる群より選択される請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
方法に使用するプライマーセットおよび取扱説明書セットを含んでなる請求項１から４９のいずれか一項記載の方法に使用するためのキットであって、前記第２のプライマーは、制限酵素による消化が関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように、制限酵素に対する認識部位を生成する配列を含有するものとする、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
好ましい実施形態において、制限酵素に対する認識部位としては、限定はしないが、ＢｓａＪＩ（５’Ｃ↓ＣＮＮＧＧ３’）、ＢｓｓＫＩ（５’↓ＣＣＮＧＧ３’）、ＤｄｅＩ（５’Ｃ↓ＴＮＡＧ３’）、ＥｃｏＮＩ（５’ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））、Ｆｎｕ４ＨＩ（５’ＧＣ↓ＮＧＣ３’）、ＨｉｎｆＩ（５’Ｇ↓ＡＮＴＣ３’）、ＰｆＬＦ１（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）、Ｓａｕ９６Ｉ（５’Ｇ↓ＧＮＣＣ３’）、ＳｃｒＦＩ（５’ＣＣ↓ＮＧＧ３’）、Ｔｔｈｌ１１Ｉ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）が挙げられ、より好ましくは、増幅後にＦｎｕ４ＨＩおよびＥｃｏＮＩが生成する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
（数１）
2006508632.tif 000001
【０１３６】
他の実施形態において、第２のプライマーは、ある制限酵素に対する認識配列の一部を含有し得るが、ここで制限酵素による消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように鋳型ＤＮＡ増幅の際に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。例えば、ＢｓｍＦＩに対する認識部位は５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域は鋳型ＤＮＡに相補的である必要はないヌクレオチド「ＧＧＧ」で終止できる。３’アニーリング領域が、約１０〜２０塩基である場合、たとえ最後の３個の塩基がアニールしなくてもプライマーは伸長し、ＢｓｍＦＩ部位を生成する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
（数２）
2006508632.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
アデノシンとシトシンがプライマーに取り込まれて、ＢｓｍＦＩ、５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対する認識部位を形成するように鋳型ＤＮＡの次の２個の塩基がチミジンとグアニンである鋳型ＤＮＡにアニールするように第２のプライマーをデザインできる。ＢｓｍＦＩによる消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するような仕方でアニールするように第２のプライマーをデザインできる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
他の実施形態において、第２のプライマーは、制限酵素に対する認識部位の全体または認識部位の一部を含有できるが、制限酵素による消化によって認識部位が切断され、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡのプライマー依存複製時に認識部位全体が生成される。例えば、制限酵素ＢｓａＪＩは、次の認識部位：５’Ｃ↓ＣＮ１Ｎ２ＧＧ３’と結合する。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域が「ＣＣ」で終止するように第２のプライマーをデザインすることができ、関心対象のＳＮＰは「Ｎ１」として表され、ＳＮＰの下流の鋳型配列は「Ｎ２ＧＧ」である。
（数３）
2006508632.tif 000003
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
ＢｓａＪＩによる消化後、以下の配列の５’オーバーハングが生成すると考えられる：
５’Ｃ            ３’
３’ＧＧＮ１Ｎ２ＣＣ５’
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、３’窪み端は、オーバーハング内の１番目のヌクレオチドに相補的である未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを除去した後、関心対象座を表す次のヌクレオチド、Ｎ１をはめ込むために標識ｄｄＮＴＰ類を用いることができる。限定はしないが、ＢｓｓＫＩ（５’↓ＣＣＮＧＧ３’）、ＤｄｅＩ（５’Ｃ↓ＴＮＡＧ３’）、ＥｃｏＮＩ（５’ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））、Ｆｎｕ４ＨＩ（５’ＧＣ↓ＮＧＣ３’）、ＨｉｎｆＩ（５’Ｇ↓ＡＮＴＣ３’）、ＰｆｌＦＩ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）、Ｓａｕ９６Ｉ（５’Ｇ↓ＧＮＣＣ３’）、ＳｃｒＦＩ（５’ＣＣ↓ＮＧＧ３’）、およびＴｔｈｌ１１Ｉ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）などの他の制限酵素を用いることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
（数４）
2006508632.tif 000004
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
他の実施形態において、第１のプライマーおよび第２のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含有するが、制限酵素による消化によって、関心対象座のを含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡの増幅時に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。限定はしないが、制限酵素ＢｓｓＫＩ（５’↓ＣＣＮＧＧ３’）、ＤｄｅＩ（５’Ｃ↓ＴＮＡＧ３’）、ＥｃｏＮＩ（５’ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））、Ｆｎｕ４ＨＩ（５’ＧＣ↓ＮＧＣ３’）、ＨｉｎｆＩ（５’Ｇ↓ＡＮＴＣ３’）、ＰｆｌＦＩ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）、Ｓａｕ９６Ｉ（５’Ｇ↓ＧＮＣＣ３’）、ＳｃｒＦＩ（５’ＣＣ↓ＮＧＧ３’）、およびＴｔｈｌ１１Ｉ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）などの任意の制限酵素に対する、１個または１個以上の可変ヌクレオチドを含有する認識部位を生成させることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
（数２５）
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000005
第２のプライマー：
2006508632.tif 000006
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000007
第２のプライマー：
2006508632.tif 000008
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000009
第２のプライマー：
2006508632.tif 000010
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000011
第２のプライマー：
2006508632.tif 000012
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
（数２６）
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000013
第２のプライマー：
2006508632.tif 000014
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
（数２７）
第２のプライマー：
2006508632.tif 000015
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２９】
（数２８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000016
第２のプライマー：
2006508632.tif 000017
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３２】
（数２９）
第２のプライマー：
2006508632.tif 000018
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
（数３０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000019
第２のプライマー：
2006508632.tif 000020
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
（数３１）
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000021
第２のプライマー：
2006508632.tif 000022
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000023
第２のプライマー：
2006508632.tif 000024
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000025
第２のプライマー：
2006508632.tif 000026
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000027
第２のプライマー：
2006508632.tif 000028
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００１３１は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000029
第２のプライマー：
2006508632.tif 000030
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006508632.tif 000031
第２のプライマー：
2006508632.tif 000032
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
（数３２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000033
第２のプライマー：
2006508632.tif 000034
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７８】
（数３３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000035
第２のプライマー：
2006508632.tif 000036
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９１】
（数３４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000037
第２のプライマー：
2006508632.tif 000038
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９４】
（数３５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000039
第２のプライマー：
2006508632.tif 000040
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９７】
（数３６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000041
第２のプライマー：
2006508632.tif 000042
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４００】
（数３７）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000043
第２のプライマー：
2006508632.tif 000044
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０３】
（数３８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000045
第２のプライマー：
2006508632.tif 000046
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０６】
（数３９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000047
第２のプライマー：
2006508632.tif 000048
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３４】
（数４０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000049
第２のプライマー：
2006508632.tif 000050
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３７】
（数４１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000051
第２のプライマー：
2006508632.tif 000052
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４０】
（数４２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000053
第２のプライマー：
2006508632.tif 000054
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４３】
（数４３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000055
第２のプライマー：
2006508632.tif 000056
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４６】
（数４４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000057
第２のプライマー：
2006508632.tif 000058
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４９】
（数４５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000059
第２のプライマー：
2006508632.tif 000060
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３８】
（数６５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000061
第２のプライマー：
2006508632.tif 000062
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４１】
（数６６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000063
第２のプライマー：
2006508632.tif 000064
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５７】
（数６７）
2006508632.tif 000065
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６６】
（数７１）
2006508632.tif 000066
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７２】
（数７４）
2006508632.tif 000067
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９８】
【表９−１】
2006508632.tif 000068
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９９】
【表９−２】
2006508632.tif 000069
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６００】
【表９−３】
2006508632.tif 000070
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０１】
【表９−４】
2006508632.tif 000071
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０２】
【表９−５】
2006508632.tif 000072
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０３】
【表９−６】
2006508632.tif 000073
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０４】
【表９−７】
2006508632.tif 000074
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０５】
【表９−８】
2006508632.tif 000075
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０６】
【表９−９】
2006508632.tif 000076
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０７】
【表９−１０】
2006508632.tif 000077
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０８】
【表９−１１】
2006508632.tif 000078
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０９】
【表９−１２】
2006508632.tif 000079
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１０】
【表９−１３】
2006508632.tif 000080
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１１】
【表９−１４】
2006508632.tif 000081
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１２】
2006508632.tif 000082
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３５】
（数７８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000083
第２のプライマー：
2006508632.tif 000084
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３８】
（数７９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000085
第２のプライマー：
2006508632.tif 000086
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４１】
（数８０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000087
第２のプライマー：
2006508632.tif 000088
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４４】
（数８１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000089
第２のプライマー：
2006508632.tif 000090
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４７】
（数８２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000091
第２のプライマー：
2006508632.tif 000092
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５０】
（数８３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000093
第２のプライマー：
2006508632.tif 000094
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５３】
（数８４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000095
第２のプライマー：
2006508632.tif 000096
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９２】
（数９１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000097
第２のプライマー：
2006508632.tif 000098
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９４】
（数９２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000099
第２のプライマー：
2006508632.tif 000100
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７３９】
（数９８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000101
第２のプライマー：
2006508632.tif 000102
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７７０】
（数１０３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000103
第２のプライマー：
2006508632.tif 000104
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８０５】
（数１０４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000105
第２のプライマー：
2006508632.tif 000106
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８０７】
（数１０５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000107
第２のプライマー：
2006508632.tif 000108
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８０９】
（数１０６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000109
第２のプライマー：
2006508632.tif 000110
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８１１】
（数１０７）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000111
第２のプライマー：
2006508632.tif 000112
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８１３】
（数１０８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000113
第２のプライマー：
2006508632.tif 000114
【手続補正６７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８１５】
（数１０９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000115
第２のプライマー：
2006508632.tif 000116
【手続補正６８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８１７】
（数１１０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000117
第２のプライマー：
2006508632.tif 000118
【手続補正６９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８１９】
（数１１１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000119
第２のプライマー：
2006508632.tif 000120
【手続補正７０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２１】
（数１１２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000121
第２のプライマー：
2006508632.tif 000122
【手続補正７１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２３】
（数１１３−１）
2006508632.tif 000123
【手続補正７２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２４】
（数１１３−２）
2006508632.tif 000124
【手続補正７３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２５】
（数１１３−３）
2006508632.tif 000125
【手続補正７４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２６】
（数１１３−４）
2006508632.tif 000126
【手続補正７５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２７】
（数１１３−５）
2006508632.tif 000127
【手続補正７６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２８】
（数１１３−６）
2006508632.tif 000128
【手続補正７７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２９】
（数１１３−７）
2006508632.tif 000129
【手続補正７８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３０】
（数１１３−８）
2006508632.tif 000130
【手続補正７９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３１】
（数１１３−９）
2006508632.tif 000131
【手続補正８０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３２】
（数１１３−１０）
2006508632.tif 000132
【手続補正８１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３３】
（数１１３−１１）
2006508632.tif 000133
【手続補正８２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３４】
（数１１３−１２）
2006508632.tif 000134
【手続補正８３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３５】
（数１１３−１３）
2006508632.tif 000135
【手続補正８４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３６】
（数１１３−１４）
2006508632.tif 000136
【手続補正８５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３７】
（数１１３−１５）
2006508632.tif 000137
【手続補正８６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３８】
（数１１３−１６）
2006508632.tif 000138
【手続補正８７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３９】
（数１１３−１７）
2006508632.tif 000139
【手続補正８８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４０】
（数１１３−１８）
2006508632.tif 000140
【手続補正８９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４１】
（数１１３−１９）
2006508632.tif 000141
【手続補正９０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４２】
（数１１３−２０）
2006508632.tif 000142
【手続補正９１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４３】
（数１１３−２１）
2006508632.tif 000143
【手続補正９２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４４】
（数１１３−２２）
2006508632.tif 000144
【手続補正９３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４５】
（数１１３−２３）
2006508632.tif 000145
【手続補正９４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４６】
（数１１３−２４）
2006508632.tif 000146
【手続補正９５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４７】
（数１１３−２５）
2006508632.tif 000147
【手続補正９６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８４８】
（数１１３−２６）
2006508632.tif 000148
【手続補正９７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８５５】
（数１１４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000149
第２のプライマー：
2006508632.tif 000150
【手続補正９８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８５８】
（数１１５）
2006508632.tif 000151
第２のプライマー：
2006508632.tif 000152
【手続補正９９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６１】
（数１１６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000153
第２のプライマー：
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【手続補正１００】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６４】
（数１１７）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【手続補正１０１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６７】
（数１１８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000157
第２のプライマー：
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【手続補正１０２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７０】
（数１１９）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006508632.tif 000160
【手続補正１０３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７３】
（数１２０）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【手続補正１０４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７６】
（数１２１）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【手続補正１０５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７９】
（数１２２）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006508632.tif 000166
【手続補正１０６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９２８】
（数１２６）
正プライマー：
2006508632.tif 000167
逆プライマー：
2006508632.tif 000168
【手続補正１０７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３０】
（数１２７）
正プライマー：
2006508632.tif 000169
逆プライマー：
2006508632.tif 000170
【手続補正１０８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３２】
（数１２８）
正プライマー：
2006508632.tif 000171
逆プライマー：
2006508632.tif 000172
【手続補正１０９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３４】
（数１２９）
正プライマー：
2006508632.tif 000173
逆プライマー：
2006508632.tif 000174
【手続補正１１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３６】
（数１３０）
正プライマー：
2006508632.tif 000175
逆プライマー：
2006508632.tif 000176
【手続補正１１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３８】
（数１３１）
正プライマー：
2006508632.tif 000177
逆プライマー：
2006508632.tif 000178
【手続補正１１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４０】
（数１３２）
正プライマー：
2006508632.tif 000179
逆プライマー：
2006508632.tif 000180
【手続補正１１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４２】
（数１３３）
正プライマー：
2006508632.tif 000181
逆プライマー：
2006508632.tif 000182
【手続補正１１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４４】
（数１３４）
正プライマー：
2006508632.tif 000183
逆プライマー：
2006508632.tif 000184
【手続補正１１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４６】
（数１３５）
正プライマー：
2006508632.tif 000185
逆プライマー：
2006508632.tif 000186
【手続補正１１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４８】
（数１３６）
正プライマー：
2006508632.tif 000187
逆プライマー：
2006508632.tif 000188
【手続補正１１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４８】
（数１３７）
正プライマー：
2006508632.tif 000189
逆プライマー：
2006508632.tif 000190
【手続補正１１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９５２】
（数１３８）
正プライマー：
2006508632.tif 000191
逆プライマー：
2006508632.tif 000192
【手続補正１１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９５４】
（数１３９）
正プライマー：
2006508632.tif 000193
逆プライマー：
2006508632.tif 000194
【手続補正１２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９５６】
（数１４０）
正プライマー：
2006508632.tif 000195
逆プライマー：
2006508632.tif 000196
【手続補正１２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９５８】
（数１４１）
正プライマー：
2006508632.tif 000197
逆プライマー：
2006508632.tif 000198
【手続補正１２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９６０】
（数１４２）
正プライマー：
2006508632.tif 000199
逆プライマー：
2006508632.tif 000200
【手続補正１２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９６２】
（数１４３）
正プライマー：
2006508632.tif 000201
逆プライマー：
2006508632.tif 000202
【手続補正１２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９６４】
（数１４４）
正プライマー：
2006508632.tif 000203
逆プライマー：
2006508632.tif 000204
【手続補正１２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９６６】
（数１４５）
正プライマー：
2006508632.tif 000205
逆プライマー：
2006508632.tif 000206
【手続補正１２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９６８】
（数１４６）
正プライマー：
2006508632.tif 000207
逆プライマー：
2006508632.tif 000208
【手続補正１２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７０】
（数１４７）
正プライマー：
2006508632.tif 000209
逆プライマー：
2006508632.tif 000210
【手続補正１２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７２】
（数１４８）
正プライマー：
2006508632.tif 000211
逆プライマー：
2006508632.tif 000212
【手続補正１２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７４】
（数１４９）
正プライマー：
2006508632.tif 000213
逆プライマー：
2006508632.tif 000214
【手続補正１３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７６】
（数１５０）
正プライマー：
2006508632.tif 000215
逆プライマー：
2006508632.tif 000216
【手続補正１３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７８】
（数１５１）
正プライマー：
2006508632.tif 000217
逆プライマー：
2006508632.tif 000218
【手続補正１３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９８０】
（数１５２）
正プライマー：
2006508632.tif 000219
逆プライマー：
2006508632.tif 000220
【手続補正１３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９８２】
（数１５３）
正プライマー：
2006508632.tif 000221
逆プライマー：
2006508632.tif 000222
【手続補正１３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９８４】
（数１５４）
正プライマー：
2006508632.tif 000223
逆プライマー：
2006508632.tif 000224
【手続補正１３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９９２】
（数１５５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000225
第２のプライマー：
2006508632.tif 000226
【手続補正１３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９９４】
（数１５６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000227
第２のプライマー：
2006508632.tif 000228
【手続補正１３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９９６】
（数１５７）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000229
第２のプライマー：
2006508632.tif 000230
【手続補正１３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９９８】
（数１５８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000231
第２のプライマー：
2006508632.tif 000232
【手続補正１３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０００】
（数１５９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000233
第２のプライマー：
2006508632.tif 000234
【手続補正１４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１００２】
（数１６０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000235
第２のプライマー：
2006508632.tif 000236
【手続補正１４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１００４】
（数１６１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000237
第２のプライマー：
2006508632.tif 000238
【手続補正１４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１００６】
（数１６２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000239
第２のプライマー：
2006508632.tif 000240
【手続補正１４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１００８】
（数１６３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000241
第２のプライマー：
2006508632.tif 000242
【手続補正１４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０１０】
（数１６４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000243
第２のプライマー：
2006508632.tif 000244
【手続補正１４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０１２】
（数１６５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000245
第２のプライマー：
2006508632.tif 000246
【手続補正１４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０１４】
（数１６６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000247
第２のプライマー：
2006508632.tif 000248
【手続補正１４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０１６】
（数１６７）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000249
第２のプライマー：
2006508632.tif 000250
【手続補正１４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０１８】
（数１６８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000251
第２のプライマー：
2006508632.tif 000252
【手続補正１４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０２０】
（数１６９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000253
第２のプライマー：
2006508632.tif 000254
【手続補正１５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０２２】
（数１７０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000255
第２のプライマー：
2006508632.tif 000256
【手続補正１５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０２４】
（数１７１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000257
第２のプライマー：
2006508632.tif 000258
【手続補正１５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０２６】
（数１７２）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000259
第２のプライマー：
2006508632.tif 000260
【手続補正１５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０２８】
（数１７３）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000261
第２のプライマー：
2006508632.tif 000262
【手続補正１５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０３０】
（数１７４）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000263
第２のプライマー：
2006508632.tif 000264
【手続補正１５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０３２】
（数１７５）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000265
第２のプライマー：
2006508632.tif 000266
【手続補正１５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０３４】
（数１７６）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000267
第２のプライマー：
2006508632.tif 000268
【手続補正１５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０３６】
（数１７７）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000269
第２のプライマー：
2006508632.tif 000270
【手続補正１５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０３８】
（数１７８）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000271
第２のプライマー：
2006508632.tif 000272
【手続補正１５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４０】
（数１７９）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000273
第２のプライマー：
2006508632.tif 000274
【手続補正１６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４２】
（数１８０）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000275
第２のプライマー：
2006508632.tif 000276
【手続補正１６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４４】
（数１８１）
第１のプライマー：
2006508632.tif 000277
第２のプライマー：
2006508632.tif 000278
【手続補正１６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４６】
（数１８２）
第１のプライマー：
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【手続補正１６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４８】
（数１８３）
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006508632.tif 000282
【手続補正１６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【１０８９】
【図１Ａ】図１Ａ。二本鎖ＤＮＡ分子を表している略図。１対のプライマーを曲がった矢印として表し、関心対象の座の側面を塩基Ｎ１４における三角形の記号として表している。関心対象の座は、単一ヌクレオチド多形、点突然変異、挿入、欠失、転座などであり得る。各プライマーは、第１のプライマー領域「ａ」として、第２のプライマーでは領域「ｄ」として表されている５’末端から約１０ｂｙに制限酵素認識部位を含有する。制限認識部位［ａ］は、任意のタイプの制限酵素に対するものであり得るが、認識部位「ｄ」は、制限酵素認識部位から「ｎ」ヌクレオシドを切断し、５’オーバーハングおよび３’窪み端を残す制限酵素に対するものである。このような酵素の例としては、限定はしないが、ＢｃｅＡｌおよびＢｓｍＦＩが挙げられる。５’オーバーハングは３’窪み端にヌクレオチドを取り込むための鋳型として働く。第１のプライマーは、精製の助けになるように、５’端をビオチンで修飾して示されている。前記プライマーの３’端配列は、このプライマーが、関心対象の座の上流および下流の所望の間隔でアニールするような配列になっている。第２のプライマーは、関心対象の座に近接してアニールする。すなわち、第２のプライマーの３’端が関心対象の座から１塩基離れてアニールするように、領域「ｃ」として表されているアニーリング部位が設計されている。第２のプライマー上の領域「ｄ」を認識する制限酵素による消化が関心対象の座を含有する５’オーバーリングを生成するという条件で、第２のプライマーは関心対象の座から任意の間隔でアニールできる。第１のプライマーの領域「ｂ」として表されているアニーリング部位は約２０塩基である。
【図１Ｂ】図１Ｂ。ＰＣＲによる増幅の第１サイクルのアニーリングステップおよび伸長ステップを表している略図。領域「ｃ」として表され、この例では１３塩基対である第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度で、増幅の第１サイクルが実施される。この温度で第１のプライマー、第２のプライマーの双方が各々の相補鎖にアニールし、点線で示される伸長を始める。この第１のサイクルにおいて、第２のプライマーは伸長して、第１のプライマーが次のサイクルでアニールできる領域ｂをコピーする。
【図１Ｃ】図１Ｃ。ＰＣＲ増幅の第２サイクルにおける変性後のアニーリングと伸長ステップを表している略図。第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする領域「ｂ」として表されている３’領域の２０ｂｙの略融解温度であるより高いアニーリング温度（ＴＭ２）において、増幅の第２サイクルが実施される。したがって、ＴＭ２において、領域ｂに相補的な領域ｂ’を含有する第１のプライマーは、前記反応の第１サイクルでコピーされたＤＮＡに結合することができる。しかし、ＴＭ２では、アニーリング温度が高いため、第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡまたは前記反応の第１のサイクルでコピーされ
たＤＮＡにアニールすることができない。第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡにおける１３塩基にアニールできるが、ＴＭ２は２０塩基の略融解温度に決められている。
【図１Ｄ】図１Ｄ。増幅第３サイクル時変性後のアニーリングおよび伸長反応を表している略図。このサイクルでは、アニーリング温度ＴＭ３は、領域「ｃ」および「ｄ」を含む第２のプライマー全体の略融解温度である。領域「ｃ」＋「ｄ」の長さは略２７〜３３ｂｙ長であり、したがってＴＭ３は、ＴＭ１およびＴＭ２よりもかなり高い。このより高いＴＭで、領域「ｃ」および「ｄ」を含む第２のプライマーは、サイクル２で生成したコピーＤＮＡにアニールする。
【図１Ｅ】図１Ｅ。増幅の残りのサイクルに関するアニーリングおよび伸長反応を表している略図。残りのサイクルに関するアニーリング温度は、第２のプライマー全体の略融解温度であるＴＭ３である。ＴＭ３で、第２のプライマーは、領域ｃ’およびｄ’を含む鋳型に結合し、第１のプライマーは、領域ａ’およびｂを含む鋳型に結合する。初めの３つのサイクルの各サイクルにおいて、アニーリング温度をＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３と連続的に上昇させることにより、非特異的増幅はかなり減少する。
【図１Ｆ】図１Ｆ。固体マトリックスに結合した関心対象の増幅座を表す略図。
【図１Ｇ】図１Ｇ。制限酵素「ｄ」による消化後の結合増幅ＤＮＡを表す略図。「下流」端は上澄み液に遊離し、任意の緩衝液による洗浄によって除去できる。関心対象の座を含有する上流端は固体マトリックスに結合したままである。
【図１Ｈ】図１Ｈ。領域ｄｄＮＴＰで「はめ込み」後の結合増幅ＤＮＡを表している略図。関心対象の座（Ｎ１４）に相補的な塩基（Ｎ’１４）を「はめ込む」ためにはＤＮＡポリメラーゼが用いられる。この例では、関心対象の座または関心対象のＳＮＰだけをはめ込むように、ｄｄＮＴＰ類だけがこの反応に存在している。
【図１Ｉ】図１Ｉ。制限酵素「ａ」による消化後の標識結合ＤＮＡを表している略図。標識ＤＮＡは上澄み液に遊離するが、取り込まれた塩基を同定するためにそれを回収する。
【図２】図２。１つのプライマーが、関心対象座の各座にフランクするように特異的にアニールした数ｎの関心対象座および数ｎのプライマー対、ｘ１、ｙ１からｘｎ、ｙｎを有する二本鎖ＤＮＡの鋳型を表している略図。第１のプライマーは、５’端をビオチン化されていて・によって表され、任意のタイプの制限酵素であり得る制限酵素認識部位「ａ」を含有する。第２のプライマーは制限酵素認識部位から「ｎ」ヌクレオチドを切断し、関心対象の座を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成する制限酵素に対する認識部位である制限酵素認識部位「ｄ」を含有する。第２のプライマーは関心対象の各々の座に隣接してアニールする。関心対象座のＰＣＲ産物を制限酵素「ｄ」によって消化することにより関心対象の座を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端が生成されるように、第２のプライマーにおける制限酵素部位「ｄ」の正確な位置が設計される。第１のプライマーのアニーリング部位は、約２０塩基長であり、連続的な第１のプライマーの各々が、第２のプライマーの各々からさらに離れるように選択される。例えば、座１で、第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端がＺ塩基対離れているならば、座２では第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端は、Ｚ＋Ｋ塩基対離れており、ここでＫ＝１、２、３または３以上の塩基である。座Ｎに対するプライマーは、ＺＮ−１＋Ｋ塩基対離れている。連続的な第１のプライマーの各々を第２のプライマーの各々からさらに離す目的は、「はめ込まれた」制限断片（図１Ｂ〜１Ｉに記したように増幅、精製、消化および標識化の後に生成された）の大きさが異なり、例えば、電気泳動により分離でき、関心対象の各個別の座を検出できるようにすることである。
【図３】図３。複数のアニーリング温度を用いるＳＮＰ類のＰＣＲ増幅。３６人のヒト志願者のゲノムＤＮＡ鋳型を含有するサンプルを次の４種のＳＮＰに関して分析した：染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）；染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（レーン２）；染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）；および染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）。各Ｓ
ＮＰは、本願明細書において、低緊縮アニーリング温度；中等度緊縮アニーリング温度；および高緊縮アニーリング温度と称される３つの異なったアニーリング温度プロトコルを用いてＰＣＲにより増幅した。アニーリング温度プロトコルに係りなく、各ＳＮＰは、ＰＣＲの４０サイクルで増幅した。各ＰＣＲ反応の変性ステップは、９５℃で３０秒間実施された。図３Ａ。低緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。図３Ｂ。中等度緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。図３Ｃ。高緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。
【図４Ａ】図４Ａ。（上から下：SEQ ID NO:17、629、630、18）染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を含有する。ＳＮＰはＲ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに対して相補的）によって示されている。
【図４Ｂ】図４Ｂ。（上から下：SEQ ID NO:17、629、630、19）染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を含有する。ＳＮＰはＲ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに対して相補的）によって示されている。
【図４Ｃ】図４Ｃ。（上から下：SEQ ID NO:11、631、632、20）染色体１のＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＴＳＣ００９５５１２配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を有する。ＳＮＰはＳ（Ｇ／Ｃ）およびＳ（Ｃ／Ｇ）（Ｓに対して相補的）によって示される。
【図４Ｄ】図４Ｄ。（上から下：SEQ ID NO:11、631、632、12）染色体１のＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＴＳＣ００９５５１２配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を有する。ＳＮＰはＳ（Ｇ／Ｃ）およびＳ（Ｃ／Ｇ）（Ｓに対して相補的）によって示される。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄ。（上から下：SEQ ID NO:633〜640）図４Ａ〜４Ｄに記したプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図５Ａと５Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図５Ｃと５Ｄ）のヌクレオチド配列を表している略図。プライマー配列における制限部位を太字で示している。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄ。（上から下：SEQ ID NO:633〜640）図４Ａ〜４Ｄに記したプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図５Ａと５Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図５Ｃと５Ｄ）のヌクレオチド配列を表している略図。プライマー配列における制限部位を太字で示している。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄ。（上から下：SEQ ID NO:633〜640）図４Ａ〜４Ｄに記したプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図５Ａと５Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図５Ｃと５Ｄ）のヌクレオチド配列を表している略図。プライマー配列における制限部位を太字で示している。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄ。（上から下：SEQ ID NO:633〜640）図４Ａ〜４Ｄに記したプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図５Ａと５Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図５Ｃと５Ｄ）のヌクレオチド配列を表している略図。プライマー配列における制限部位を太字で示している。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄ。適切なＩＩＳ型制限酵素による消化後の各増幅ＳＮＰのヌクレオチド配列を表している略図。図６Ａ（SEQ ID NO:641（左上）、642（右上）、643（左下）および644（右下））と６Ｂ（SEQ ID NO:641（左上）、645（右上）、646（左下）および647（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の断片を表している。図６Ｃ（SEQ ID NO:648（左上）、649（右上）、650（左下）および651（右下））と６Ｄ（SEQ ID NO:648（左上）、652（右上）、653（左下）および654（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２の断片を表している。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄ。適切なＩＩＳ型制限酵素による消化後の各増幅ＳＮＰのヌクレオチド配列を表している略図。図６Ａ（SEQ ID NO:641（左上）、642（右上）、643（左下）および644（右下））と６Ｂ（SEQ ID NO:641（左上）、645（右上）、646（左下）および647（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の断片を表している。図６Ｃ（SEQ ID NO:648（左上）、649（右上）、650（左下）および651（右下））と６Ｄ（SEQ ID NO:648（左上）、652（右上）、653（左下）および654（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２の断片を表している。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｄ。適切なＩＩＳ型制限酵素による消化後の各増幅ＳＮＰのヌクレオチド配列を表している略図。図６Ａ（SEQ ID NO:641（左上）、642（右上）、643（左下）および644（右下））と６Ｂ（SEQ ID NO:641（左上）、645（右上）、646（左下）および647（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の断片を表している。図６Ｃ（SEQ ID NO:648（左上）、649（右上）、650（左下）および651（右下））と６Ｄ（SEQ ID NO:648（左上）、652（右上）、653（左下）および654（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２の断片を表している。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄ。適切なＩＩＳ型制限酵素による消化後の各増幅ＳＮＰのヌクレオチド配列を表している略図。図６Ａ（SEQ ID NO:641（左上）、642（右上）、643（左下）および644（右下））と６Ｂ（SEQ ID NO:641（左上）、645（右上）、646（左下）および647（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の断片を表している。図６Ｃ（SEQ ID NO:648（左上）、649（右上）、650（左下）および651（右下））と６Ｄ（SEQ ID NO:648（左上）、652（右上）、653（左下）および654（右下））は、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２の断片を表している。
【図７】図７Ａ〜７Ｄ。消化したＳＮＰ部位の５’オーバーハングを３’窪み端を「はめ込む」ための鋳型として用いる、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを表す略図。図７Ａ（SEQ ID NO:655（上）および656（下））と７Ｂ（SEQ ID NO:655（上）および657（下））は、取り込まれた標識ｄｄＮＴＰを有する消化ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７座を表す（＊Ｒ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。図７Ｃ（SEQ ID NO:658（上）および659（下））と７Ｄ（SEQ ID NO:658（上）および660（下））は、取り込まれた標識ｄｄＮＴＰを有する消化ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２座を表す（＊Ｓ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。ｄｄＮＹＰ類を使用することにより、関心対象ヌクレオチドまたは５’オーバーハングに存在するＳＮＰ部位に相補的なヌクレオチド１個分だけ、３’窪み端が伸長することが保証される。図７Ｅ。（上から下：SEQ ID NO:655、656、661、656、662、656、663、656）ＳＮＰ部位を含有する５’オーバーハングへのｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰの取り込みを表している略図。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００００７はＢｓｍＦＩによって消化され、４塩基の５’オーバーハングを生成する。ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物の使用により、３’窪み端をヌクレオチド１個分（先ずｄｄＮＴＰが取り込まれる）；ヌクレオチド２個分（ｄｄＮＴＰの後に１個のｄＮＴＰが取り込まれる）；ヌクレオチド３個分（ｄｄＮＴＰの後に２個のｄＮＴＰが取り込まれる）；またはヌクレオチド４個分（ｄｄＮＴＰの後に３個のｄＮＴＰが取り込まれる）伸長させることができる。４種の産物を全て大きさによって分離することができ、また、取り込まれたヌクレオチドを検出することができる（＊Ｒ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。ＳＮＰまたは座の部位に対応する第１のヌクレオチドおよび次の３つのヌクレオチドの検出により、さらなる品質保証のレベルが提供される。ＳＮＰは、Ｒ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに相補的）によって示されている。
【図８】図８Ａ〜８Ｄ。固体支持マトリックス、すなわちストレプトアビジン被覆ウェルからの「はめ込まれた」ＳＮＰの遊離。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、図８Ａ（SEQ ID NO:664（左上）、665（右上）、666（左下）および667（右下））と８Ｂ（SEQ ID NO:664（左上）、665（右上）、666（左下）および668（右下））に示されており、一方、ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は図８Ｃ（SEQ ID NO:669（左上）、670（右上）、671（左下）および672（右下））と８Ｄ（SEQ ID NO:669（左上）、670（右上）、671（左下）および673（右下））に示されている。「はめ込まれた」ＳＮＰは、溶液中で遊離しており、検出することができる。
【図９】図９Ａ。ＢｃｅＡＩによって消化されたＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列分析。４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。ＢｃｅＡＩによる消化で生成した５’オーバーハングおよびこのＳＮＰ部位において予想されるヌクレオチドが示されている。図９Ｂ。ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２ＳＮＰの配列分析。ＴＳＣ００９５５１２は、ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した第２
のプライマーによって、また別の反応では、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによって増幅された。各ＰＣＲ産物に関して、４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。ＢｃｅＡＩによる消化で生成した５’オーバーハング、およびＢｓｍＦＩによる消化で生成した５’オーバーハングおよび予想されるヌクレオチドが示されている。図９Ｃ。ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＴＳＣ２６４５８０の配列分析。４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。２つの異なる５’オーバーハングが表されており、１つは、センス鎖上の１１個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表し、他方は、センス鎖上の１０個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１４個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表している。また、予想されるヌクレオチドが示されている。図９Ｄ。ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列分析。ＢｓｍＦＩによる消化で生成した５’オーバーハングのはめ込みには、標識ｄｄＮＴＰ類および未標識ｄＮＴＰ類が用いられた。２つの異なる５’オーバーハングが表されており、１つは、センス鎖上の１１個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表し、他方は、センス鎖上の１０個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１４個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表している。ＳＮＰからのヌクレオチド、ＳＮＰ部位におけるヌクレオチド（このサンプルは、３６人の鋳型ＤＮＡを含有したので、双方のＤＮＡがこのサンプル中に存在すると考えられる）およびＳＮＰの下流の３個のヌクレオチドが示されている。
【図１０】図１０。複数のＳＮＰの配列分析。染色体２１上に位置しているＳＮＰ類ＨＣ２１Ｓ００１３１およびＨＣ２１Ｓ０００２７ならびに染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５、ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２を別々のＰＣＲ反応において、ＢｓｍＦ１に対する認識部位を含有した第２のプライマーによって増幅した。各々増幅された関心対象の座が異なる大きさであるように、プライマーをデザインした。増幅後、反応物を１つのサンプルにプールし、本法の引き続く全てのステップはそのサンプルで行った（図１Ｆ〜１Ｉに対し、説明されたように）。各ＳＮＰおよび各ＳＮＰで見られるヌクレオチドを示している。
【図１１−１】図１１。母体血液中の胎児ＤＮＡパーセンテージの定量。血液はヒト妊娠女性からインフォームドコンセントを得て採取した。ＤＮＡを単離し、連続希釈を行って、サンプル中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージを測定した。染色体Ｙ上に位置するＳＲＹ遺伝子を胎児ＤＮＡの検出に用いた。染色体７上に位置するのう胞性線維症遺伝子を、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡ双方の検出に用いた。  図１１Ａ。ＥＤＴＡで処理した血液サンプルから単離した鋳型ＤＮＡを用いたＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子の増幅。  図１１Ｂ。ホルマリンおよびＥＤＴＡで処理した血液サンプルから単離した鋳型ＤＮＡを用いたＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子の増幅。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】図１２。前もってトリソミー２１を有する遺伝子型（ダウン症候群）と決定されている個体の遺伝子分析。前もってトリソミー２１を有する遺伝子型と決定されている個体の遺伝子分析から、インフォームドコンセントを得て血液を採取した。ＤＮＡを単離し、染色体２１上の２種のＳＮＰおよび染色体１３上の２種のＳＮＰの遺伝子型を決定した。ゲルの写真に示されるように、染色体２１上のＳＮＰは、２つのヌクレオチドの比率が不釣合いである。ゲルの肉視検査により、染色体２１に関して分析されたＳＮＰ部位における２つのヌクレオチドのうちの１つがより大きな強度を有していることが証明され、それが５０：５０比で存在していないことが示唆される。しかし、染色体１３上の分
析されたヘテロ接合ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドは、予想された５０：５０比で存在していることが、肉視検査により示唆される。
【図１３】図１３。１種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＳＮＰ、ＴＳＣ０８３７９６９、ＴＳＣ００３４７６７、ＴＳＣ１１３０９０２、ＴＳＣ０５９７８８８、ＴＳＣ０１９５４９２、ＴＳＣ０６０７１８５の両対立遺伝子の配列測定。ＢｓｍＦＩによる消化で生成したオーバーハングをはめ込むために未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下で標識ｄｄＧＴＰを使用した。はめ込まれた鎖上の可変部位の先にあるヌクレオチドはグアニンではなく、また、はめ込まれた鎖上の可変部位の後にあるヌクレオチドもグアニンではなかった。はめ込まれた鎖上の可変部位の２塩基後のヌクレオチドはグアニンであった。可変部位にグアニンを含有する対立遺伝子は、標識ｄｄＧＴＰを用いてはめ込みを行った。グアニンを含有しない対立遺伝子は未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによってはめ込まれ、オーバーハングに相補的な３位に標識ｄｄＧＴＰがはめ込まれるまで、ポリメラーゼはヌクレオチドの取り込みを続ける。
【図１４】図１４。集団内における可変的な対立遺伝子を有するＳＮＰの同定。染色体１３上に位置する７種のＳＮＰの両対立遺伝子の配列は、２４５個体から得られたＤＮＡからなる鋳型ＤＮＡを用いて決定した。ＢｓｍＦＩによる消化によって生成したオーバーハングにはめ込みを行うために未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下、標識ｓｓＧＴＰを用いた。はめ込まれた鎖上の可変部位の先にあるヌクレオチドはグアニンではなく、また、はめ込まれた鎖上の可変部位の後にあるヌクレオチドもグアニンではなかった。はめ込まれた鎖上の可変部位の２塩基後のヌクレオチドはグアニンであった。可変部位にグアニンを含有する対立遺伝子は、標識ｄｄＧＴＰを用いてはめ込みを行った。グアニンを含有しない対立遺伝子は未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによってはめ込まれ、オーバーハングに相補的な３位に標識ｄｄＧＴＰがはめ込まれるまで、ポリメラーゼはヌクレオチドの取り込みを続ける。
【図１５】図１５。ヘテロ接合ＳＮＰにおける１つの対立遺伝子の他の対立遺伝子に対する比率の決定。ＳＮＰＴＳＣ０６０７１８５に関して見られたヌクレオチドは、センス鎖上のシトシン（対立遺伝子１と称す）およびチミジン（対立遺伝子２と称す）である。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、５個体から単離された鋳型ＤＮＡを用いて計算した。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、一定で、１：１であった。ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関して見られたヌクレオチドは、センス鎖上のグアニン（対立遺伝子１と称す）およびアデニン（対立遺伝子２と称す）である。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、５個体から単離された鋳型ＤＮＡを用いて計算した。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、一定で、７５：２５であった。
【図１６】図１６。染色体２１の１つ余分なコピーを含有する鋳型ＤＮＡについて計算すると、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２における対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは線形を維持する。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、４人からの鋳型ＤＮＡをを用いて増幅され、各ＰＣＲ反応に関して、２つの別々のはめ込み反応（ＡおよびＢとして標識）を実施した（標識１〜４）。正常な個体からの鋳型ＤＮＡ上の対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージ計算値は０．４７であった。理論上の予想パーセンテージ０．５０からの偏差は、ダウン症候群を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡについては線形を維持する。
【図１７】図１７Ａ。正常な遺伝子核型を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡからの、染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．５０の中間値であった。図１７Ｂ。トリソミー２１遺伝子核型を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡからの、染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて増幅し、ＩＩＳ
型の制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３０の中間値であった。図１７Ｃ。トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの３：１の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んた。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３１９の中間値であった。図１７Ｄ。トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：１の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３５２の中間値であった。図１７Ｅ。トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：２．３の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３８２の中間値であった。図１７Ｆ。トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：４の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本願明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つのサンプルに分けた。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率（対立遺伝子２／（対���遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３９７の中間値であった。
【図１８】図１８Ａ：鋳型ＤＮＡから増幅された９種のＳＮＰのアガロースゲル分析。９種のＳＮＰの各々は、本願明細書に記載された方法を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。レーン１はＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５に対応し、レーン２はＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３に対応し、レーン３はＳＮＰ  ＴＳＣ１６４９７２６に対応し、レーン４はＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に対応し、レーン５はＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７に対応し、レーン６はＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２に対応し、レーン７はＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に対応し、レーン８はＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７に対応し、およびレーン９はＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７に対応する。図１８Ｂ：染色体１３上の種々の領域にアニールした１２個の塩基プライマーを用いて、元の鋳型ＤＮＡを増幅した。染色体１３の全体に亘った領域を増加するために、１００種の異なるプライマーセットを用いた。９種のＳＮＰの各々に対し、関心対象の座の略１３０個の塩基、および関心対象の座の下流の１３０個の塩基をアニールするプライマーを用いた。関心対象座を含有する領域を増幅するために、合計１００種類のプライマーセットを含有する増幅反応を用いた。生じたＰＣＲ産物は、引き続くＰＣＲ反応に用いたが、ここで、９種のＳＮＰの各々は、第１の
プライマーおよびＩＩｓ型制限酵素ＢｓｍＦＩに対する結合部位を含有した第２のプライマーを用いて、個々に増幅した。ＳＮＰは図１８Ａと同じ順序で入れた。
【図１９】図１９Ａ。元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ０４７００３に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。  図１９Ｂ。元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。  図１９Ｃ。元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ３１０５０７に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。  図１９Ｄ。元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。
【図２０】図２０。妊娠女性から単離した血漿ＤＮＡからの胎児ＤＮＡの検出。血漿ＤＮＡ上の母体ＤＮＡが、ホモ接合である４種のＳＮＰを分析した。ＴＳＣ０８３８３５５（レーン１）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡはホモ接合であったが、血漿ＤＮＡはヘテロ接合パターン（レーン２）を示した。グアニン対立遺伝子は母体の信号から明らかに区別される胎児ＤＮＡを表した。ＴＳＣ０４１８１３４（レーン３および４）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡおよび血漿ＤＮＡの双方ともホモ接合であった。ＴＳＣ０１２９１８８（レーン５）におけるグアニンに関し、母体ＤＮＡはホモ接合であったが、血漿ＤＮＡはヘテロ接合パターン（レーン６）を示した。アデニン対立遺伝子は胎児ＤＮＡを表した。ＴＳＣ０５０１３８９（レーン７および８）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡおよび血漿ＤＮＡの双方ともホモ接合であった。 
【手続補正１６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006508632000001.app