【手続補正書】
【提出日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を特異的に結合することのできる、１つもしくはそれ以上の第１ドメイン、および核周辺部と会合することのできる、１つもしくはそれ以上の第２ドメインを含む核酸標的特異的キメラタンパク質であって、少なくとも１つの前記第１ドメインが、少なくとも１つの前記第２ドメインに対して異種であるキメラタンパク質。
【請求項２】
前記の１つもしくはそれ以上の第１ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰ）、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスドメインタンパク質、前記のタンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合し、ジンクフィンガーのα−ヘリックスの−１、２、３および６位のアミノ酸が、以下のもの：
−１位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
２位において、アミノ酸は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸；
３位において、アミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸；および
６位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である；
より選択されるものである、請求項２のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーは、独立して、式：−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ２−４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｚ−１−Ｘ−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ２−Ｚ６−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ４-  （配列番号：２）
［式中：
Ｘは、独立して、あらゆるアミノ酸であり、Ｘｎは、ポリペプチド鎖におけるＸの存在数を示し；
Ｚ−１は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である］
によって示されるものであり、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合したものである、請求項２もしくは３のキメラタンパク質。
【請求項５】
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
請求項４のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記ジンクフィンガーの少なくとも１つのＸ位が、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガー、Ｓｐ１フィンガーもしくはＳｐ１Ｃフィンガーに由来する対応アミノ酸を含む、請求項４または５のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記の１つもしくはそれ以上の第１ドメインが、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーが、式：−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｚ−１−Ｓｅｒ−Ｚ２−Ｚ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｚ６−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−  （配列番号：３）
によって示されるものであって、前記フィンガーは互いに直接結合しているものであって、ここに、
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である、
請求項１のキメラタンパク質。
【請求項８】
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、もしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
請求項７のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記ＡＺＰが、３から１５個のジンクフィンガーを含み、そのいずれか１つもしくはそれ以上が前記式によって示されるものである、請求項３〜８のいずれか１項のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記ＡＺＰが、７、８もしくは９個のジンクフィンガーを含むものである、請求項９のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記ＡＺＰが、６個のジンクフィンガーを含むものである、請求項１０のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記の１つもしくはそれ以上の第２ドメインが、直接的または間接的に、核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチンもしくはそれらいずれかの組み合わせと会合する、または結合する、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記第２ドメインの１つがＧＣＬタンパク質もしくはＧＣＬタンパク質の結合部分である、請求項１２のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記の１つもしくはそれ以上の第２ドメインが、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、前記タンパク質のいずれかと会合もしくは結合することのできるタンパク質、前記タンパク質のいずれかの結合部分、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１２のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記核ラミナ結合タンパク質、もしくは前記核ラミナ結合タンパク質の結合部分が、ラミンもしくはラミナ結合タンパク質である、請求項１４のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記ヘテロクロマチン結合タンパク質、もしくは前記ヘテロクロマチン結合タンパク質の結合部分が、ＨＰ１およびポリコーム群タンパク質（polycomb-group protein）からなる群より選択されるものである、請求項１４のキメラタンパク質。
【請求項１７】
１から６個の第１ドメイン、および１から６の第２ドメインを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
【請求項１８】
さらに、核局在シグナルを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
【請求項１９】
さらに、細胞取り込みシグナルを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
【請求項２０】
さらに、核局在シグナルを含む、請求項１９のキメラタンパク質。
【請求項２１】
治療上有効量の前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質を、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２３】
請求項２２の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項２５】
キメラタンパク質を調製する方法であって、
（ａ）  前記キメラタンパク質を発現する条件下で、請求項２４のホスト細胞を一定時間培養すること；および
（ｂ）  前記キメラタンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項２６】
前記ベクターが、調節のための標的遺伝子を含む細胞へのトランスフェクトに適合した真核細胞発現ベクターである、請求項２３の発現ベクター。
【請求項２７】
治療上有効量の請求項２２、２３もしくは２６のいずれか１項の核酸または発現ベクターを、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
【請求項２８】
標的核酸をキメラタンパク質と結合させる方法であって、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含む標的核酸を、請求項１−２０のいずれかのキメラタンパク質と、前記タンパク質が前記核酸に結合するのに十分な量および時間にて、接触させることを含む方法。
【請求項２９】
標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートする方法であって、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含む標的核酸を、請求項１−２０のいずれかのキメラタンパク質と、前記キメラタンパク質が前記標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするのに十分な量および時間にて、接触させることを含む方法。
【請求項３０】
前記キメラタンパク質が、タンパク質として、または前記タンパク質をコードする核酸として、細胞もしくは生物に導入される、請求項２８もしくは２９の方法。
【請求項３１】
キメラタンパク質が、さらに、核局在シグナルを含むものである、請求項２８〜３０のいずれか１項の方法。
【請求項３２】
キメラタンパク質が、さらに、細胞取り込みシグナルを含むものである、請求項２８〜３１のいずれか１項の方法。
【請求項３３】
前記標的遺伝子が、哺乳類遺伝子、昆虫遺伝子もしくは酵母遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
【請求項３４】
前記標的遺伝子が、哺乳類に由来するものであって、サイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管形成因子、抗血管形成因子、薬物耐性遺伝子、成長因子または腫瘍サプレッサーをコードするものである、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記標的遺伝子が、ウイルス遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
【請求項３６】
前記ウイルス遺伝子が、ＤＮＡウイルスに由来するものである、請求項３５の方法。
【請求項３７】
標的遺伝子が、植物遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
【請求項３８】
前記植物遺伝子が、ジャガイモ、トマト、トウモロコシ、コメもしくは穀物用植物に由来するものである、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記標的遺伝子が、商業用動物に由来するものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
【請求項４０】
（ａ）  標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することのできる第１ドメイン、および２価のリガンドの第１の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含む、第１の融合タンパク質であって、前記リガンドが、細胞によって取り込まれることのできるものであって、前記第１ドメインが、前記第２ドメインに対して異種である第１の融合タンパク質；ならびに
（ｂ）  核周辺部と会合することのできる第１ドメイン、および前記の２価のリガンドの第２の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含む、第２の融合タンパク質；
を含む分子スイッチシステム。
【請求項４１】
それぞれの融合タンパク質の前記第２ドメインが、２価のリガンドのそれぞれの結合部分に対する特異性を有する抗体の１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である、請求項４０の分子スイッチシステム。
【請求項４２】
（ａ）  標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することができる第１ドメイン、および結合相手に特異的に結合することができる第２ドメインを含み、前記第１ドメインが前記第２ドメインに対して異種である、第１の融合タンパク質、ならびに
（ｂ）  核周辺部と会合することができる第１ドメイン、および前記前記第１の融合タンパク質の第２ドメインの結合相手を含む第２ドメインを含み、前記第１ドメインが前記第２ドメインに対して異種である、第２の融合タンパク質
を含む分子スイッチシステム。
【請求項４３】
第１の融合タンパク質の前記第２ドメインが、Ｓ−タンパク質であって、前記第２の融合タンパク質の第２ドメインが、Ｓ−タグであるか、あるいはその逆である、請求項４２の分子スイッチシステム。
【請求項４４】
前記第１の融合タンパク質の第１ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰ）、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスドメインタンパク質、前記タンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むものである、請求項４０〜４３のいずれか１項の分子スイッチシステム。
【請求項４５】
前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーは、独立して、式：−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ２−４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｚ−１−Ｘ−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ２−Ｚ６−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ４-  （配列番号：２）
［式中：
Ｘは、独立して、あらゆるアミノ酸であり、Ｘｎは、ポリペプチド鎖におけるＸの存在数を示し；
Ｚ−１は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である］
によって示されるものであり、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合したものである、請求項４４の分子スイッチシステム。
【請求項４６】
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
請求項４５の分子スイッチシステム。
【請求項４７】
前記ジンクフィンガーの少なくとも１つのＸ位が、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガー、Ｓｐ１フィンガーもしくはＳｐ１Ｃフィンガーに由来する対応アミノ酸を含む、請求項４５または４６の分子スイッチシステム。
【請求項４８】
前記の第１の融合タンパク質の第１ドメインが、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むものであって、
それぞれのジンクフィンガーが、式：
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｚ−１−Ｓｅｒ−Ｚ２−Ｚ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｚ６−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−  （配列番号：３）
によって示されるものであって、前記フィンガーは互いに直接結合しているものであって、ここに、
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である、
請求項４０〜４３のいずれか１項の分子スイッチシステム。
【請求項４９】
Ｚ−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、もしくはグルタミン酸であり；
Ｚ２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
Ｚ３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
Ｚ６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
請求項４８の分子スイッチシステム。
【請求項５０】
前記ＡＺＰが、３から１５個のジンクフィンガーを含み、そのいずれか１つもしくはそれ以上が前記式によって示されるものである、請求項４４〜４９のいずれか１項の分子スイッチシステム。
【請求項５１】
前記ＡＺＰまたは前記第１ドメインが、６、７、８もしくは９個のジンクフィンガーを含む、請求項５０の分子スイッチシステム。
【請求項５２】
前記第２の融合タンパク質の第１ドメインが、核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチン、もしくはそれらのいずれかの組み合わせと、直接もしくは間接的に、会合または結合するものである、請求項４０〜５１のいずれか１項の分子スイッチシステム。
【請求項５３】
前記第２の融合タンパク質の前記第１ドメインが、ＧＣＬタンパク質もしくはＧＣＬタンパク質の結合部分である、請求項５２の分子スイッチシステム。
【請求項５４】
前記第２の融合タンパク質の前記第１ドメインが、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、前記タンパク質のいずれかと会合もしくは結合することのできるタンパク質、前記タンパク質のいずれかの結合部分、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項５２の分子スイッチシステム。
【請求項５５】
前記核ラミナ結合タンパク質、もしくは前記核ラミナ結合タンパク質の結合部分が、ラミンもしくはラミナ結合タンパク質である、請求項５４の分子スイッチシステム。
【請求項５６】
前記ヘテロクロマチン結合タンパク質、もしくは前記ヘテロクロマチン結合タンパク質の結合部分が、ＨＰ１およびポリコーム群タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項５４の分子スイッチシステム。
【請求項５７】
治療上有効量の請求項４０〜５６のいずれか１項のキメラタンパク質を、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
【請求項５８】
請求項４０〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムの第１もしくは第２の融合タンパク質、またはその両方をコードする核酸。
【請求項５９】
前記第１および第２の融合タンパク質が、協調して調節されるものである、請求項５８の核酸。
【請求項６０】
前記第１および第２の融合タンパク質が、独立して調節されるものである、請求項５８の核酸。
【請求項６１】
請求項５８の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６２】
請求項６１の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項６３】
１つもしくはそれ以上の融合タンパク質を調製する方法であって、
（ａ）  前記の１つもしくはそれ以上の融合タンパク質を発現する条件下で、請求項６２のホスト細胞を一定時間培養すること；および
（ｂ）  前記の１つもしくはそれ以上の融合タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項６４】
前記ベクターが、調節のための標的遺伝子を含む細胞へのトランスフェクションに適合した真核生物発現ベクターである、請求項６１の発現ベクター。
【請求項６５】
治療上有効量の請求項６４の発現ベクターを、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
【請求項６６】
（ａ）  標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する標的ヌクレオチド配列を含む細胞もしくは生物を、請求項４０、４１または４４〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムと接触させること、ついで、
（ｂ）  前記融合タンパク質間の複合体の形成を可能にする時期または位置において、前記細胞または生物を、前記分子スイッチシステムの２価のリガンドと接触させ、そのことにより、前記標的遺伝子の発現を抑制すること
を含む、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項６７】
（ａ）  標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を有する標的ヌクレオチド配列を含む細胞もしくは生物を、請求項４２〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムと接触させること、ついで、
（ｂ）  第１および第２の融合タンパク質の会合を分裂させる時期または位置において、前記細胞または生物をリガンドと接触させ、そのことにより、前記標的遺伝子の発現を抑制解除すること
を含む、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の発現を活性化する方法。
【請求項６８】
前記分子スイッチシステムの融合タンパク質が、タンパク質として、１つもしくはそれ以上の前記タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、またはそれらの組み合わせとして、細胞もしくは生物へ導入されるものである、請求項６６もしくは６７の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
１つの具体例において、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１９）、ＧＧＧＳ（配列番号：２０）およびＧＧＳ（配列番号：２１）（これらの配列は、ＡＺＰにおける付加的な１−１０のアミノ酸の一部となりうる；それぞれ配列番号４、配列番号４の残基２−５および配列番号４の残基３−５）を含むが、それらに限定されない可動性リンカーを用いて、他のマルチフィンガーＡＺＰに結合したマルチフィンガーＡＺＰを使用して、より長いゲノム配列が標的とされる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
【図１】図１は、１つもしくはそれ以上の標的遺伝子を核周辺部の近傍に導くための、本発明のキメラタンパク質を用いた、単量体および重合体の遺伝子抑制を図示する。斜線で示したのは核周囲にある、あるいは核周囲に結合した標的タンパク質であり、白抜きは既知の相互作用タンパク質であり、点々はＡＺＰまたはＺＦＰであり、太実線はＡＺＰまたはＺＦＰの標的部位であり、二重線は遺伝子またはゲノムであり、ＮＥは核エンベロープ、ＮＭは核膜である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005514957.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005514957000001.app