【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体であって、配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関して、または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置において、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑからなる群から選択される少なくとも一つの置換およびＴ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋからなる群から選択される少なくとも一つの置換を含むポリペプチドを含み、当該ポリペプチドの結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量を有する２〜６個のポリエチレングリコール部分を有する結合体。
【請求項２】
３、４または５個の前記置換を含む請求項１記載のポリペプチド結合体。
【請求項３】
さらに置換Ｈ１７０Ｋ、Ｈ１７０ＱまたはＨ１７０Ｒを含む請求項１または２記載のポリペプチド結合体。
【請求項４】
Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、  Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０ＫおよびＱ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋからなる群から選択される置換を含む請求項１〜３記載のポリペプチド結合体。
【請求項５】
Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＲおよびＫ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒからなる群から選択される置換を含む請求項１〜４記載のポリペプチド結合体。
【請求項６】
置換Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒを含み、２３位にリシン残基を含む請求項５記載のポリペプチド結合体。
【請求項７】
前記置換が、配列番号１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置にある請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項８】
前記置換が、配列番号１と少なくとも約９５％、たとえば少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置にある請求項７記載のポリペプチド結合体。
【請求項９】
ポリエチレングリコール部分が少なくとも一つのリシン残基およびＮ−末端アミノ基と結合している請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１０】
配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関して置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含むポリペプチドを含み、かつ当該ポリペプチドの結合基に結合した分子量約１０００〜１００００Ｄａの２〜６個のポリエチレングリコール部分を有する、請求項１記載のポリペプチド結合体。
【請求項１１】
Ｔ１３３でグリコシル化されている請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１２】
３〜５、４〜６、３〜４、４〜５または５〜６個の結合したＰＥＧ部分を有する請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１３】
分子量約５０００〜６０００Ｄａの３〜６個のポリエチレングリコール部分が結合している、請求項１２記載のポリペプチド結合体。
【請求項１４】
約５ｋＤａの４〜５個のＰＥＧ部分が結合している請求項１３記載のポリペプチド結合体。
【請求項１５】
約５ｋＤａの３個のＰＥＧ部分が結合している請求項１３記載のポリペプチド結合体。
【請求項１６】
本明細書に記載するインビトロＧ−ＣＳＦ活性アッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲のインビトロ生物活性を有する請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１７】
配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ当該ポリペプチドの結合基に結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を有し、本明細書に記載されるインビトロＧ−ＣＳＦ活性アッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲であるインビトロ生物活性を有する、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体。
【請求項１８】
アミノ酸位置１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９５（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）から選択されるアミノ酸残基において、配列番号１と比較して、少なくとも一つのアミノ酸変更を含む請求項１７記載のポリペプチド結合体。
【請求項１９】
ポリペプチドの結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量の２〜６ポリエチレングリコール部分を含む請求項１７または１８記載のポリペプチド結合体。
【請求項２０】
ｈＧ−ＣＳＦと比較して減少したレセプター性クリアランスを有する、および／または好中球減少の期間を減少させるＧ−ＣＳＦ結合体を調製する方法であって、配列番号１に示すｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを調製し、かつ少なくとも一つの非ポリペプチド部分を前記ポリペプチドの結合基と結合させることを含み、その結果、本明細書に記載されるインビトロＧ−ＣＳＦ活性アッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲であるインビトロ生物活性を有する結合体が得られる調製法。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列に関してアミノ酸位置１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９１（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基の変更、典型的には置換、および少なくとも一つの変更アミノ酸残基への少なくとも一つの非ポリペプチド部分の結合により所望のインビトロ生物活性が得られる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項２３】
好中球レベルが不十分である哺乳動物を治療するための、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
化学療法または放射線療法、あるいはＨＩＶまたは別のウイルス感染症による好中球減少症の予防および／または処置用である、請求項２３記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】Ｇ−ＣＳＦ結合体
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）活性を示す新規ポリペプチド、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合体、かかるポリペプチドまたは結合体の調製法およびかかるポリペプチドまたは結合体の治療、特に好中球減少症または白血球減少症の治療における使用に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
白血球が増殖し、分割し、分化して骨髄になるプロセスは造血と呼ばれる（Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3:423, 1987）。血液細胞のタイプのそれぞれは多能性幹細胞から生じる。インビボで生じる血液細胞には一般に３つの種類：赤血球、血小板および白血球があり、後者のほとんどは宿主免疫防御に関与する。造血前駆体細胞の増殖および分化は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＧ−ＣＳＦ、およびインターロイキンを含むサイトカインの１種により調節される（Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59:783-836, 1990）。インビボのＧ−ＣＳＦの主な生物学的効果は、好中顆粒球または好中球と呼ばれるある種の白血球の増殖および発生を刺激することである（Welte et al., PNAS-USA 82:1526-1530, 1985, Souza et al., Science, 232:61-65, 1986）。血流中に放出されると、好中顆粒球は細菌および他の感染症と戦う働きをする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列は、Nagata et al. Nature 319:415-418, 1986により報告されている。ｈＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ２分子とレセプター２つとの２：２複合体の形成によりＧ−ＣＳＦレセプターを二量化するモノマータンパク質である（Horan et al. (1996), Biochemistry 35(15): 4886-96）。Aritomi et al. Nature 401:713-717, 1999は、ｈＧ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦレセプターのＢＮ−ＢＣドメイン間の複合体のＸ線構造を記載している。次のｈＧ−ＣＳＦ残基がレセプター結合界面の一部として同定された：Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ｄ１１２、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｅ１２２、Ｅ１２３、およびＬ１２４。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳動物細胞におけるｒｈＧ−ＣＳＦの発現が報告されている(Souza et al., Science 232:61-65, 1986, Nagata et al., Nature 319: 415418, 1986, Robinson and Wittrup, Biotechnol. Prog. 11:171-177, 1985)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
特定の態様において、本発明は置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５Ｋ、およびＳ１５９Ｋ、および任意にＨ１７０の位置、たとえば、配列番号１に示すｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関してＲ、ＫまたはＱ、あるいは配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置に置換を有し、ポリペプチドの１以上の結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量を有する２〜６、典型的には３〜６個のポリエチレングリコールを有するポリペプチドを含む、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体に関する。これらの置換が配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に関連する場合、配列同一性の程度は、典型的には少なくとも約９０％または９５％、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％である。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびかかるヌクレオチド配列または発現ベクターを含む宿主細胞を含む本発明の結合体の調製法に関する。
最後の態様において、本発明は、本発明の結合体またはポリペプチドを含む組成物、医薬組成物の調製法、本発明の結合体または組成物の医薬としての使用、およびかかる組成物で哺乳動物を治療する方法に関する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ある種の放射線治療、化学療法、および骨髄移植を受けている癌患者において感染を予防するため、末梢血前駆細胞移植における採集のために前駆細胞を動員するため、重い慢性または相対的白血球減少症（原因に関係なく）の治療のため、および急性骨髄性白血病の患者の治療をサポートするために用いることができる。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患ならびに細菌感染症の治療のために用いることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
たとえばポリペプチドのアミノ酸配列、使用される活性化ＰＥＧ化合物の性質および特定のＰＥＧ化条件（ＰＥＧとポリペプチドのモル比を含む）などの状況に応じて、様々な程度のＰＥＧ化が得られ、ＰＥＧとポリペプチドの比が高いほど、高い程度のＰＥＧ化が一般に得られる。しかしながら、所定のＰＥＧ化プロセスから得られるＰＥＧ化されたポリペプチドは、通常若干程度が異なるＰＥＧ化を有するポリペプチド結合体の確率分布を含む。望ましいならば、異なる数のＰＥＧ部分が結合したこのようなポリペプチド種の混合物を、たとえば以下の実施例に記載する方法を用いて精製して、さらに均一な程度のＰＥＧ化を有する生成物を得ることができる。
さらにもう一つの具体例において、本発明のポリペプチド結合体は、ＰＥＧ化に利用可能なポリペプチド中のリシン残基およびさらにポリペプチドのＮ−末端アミノ酸残基に結合したＰＥＧ分子を含むことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本発明の医薬組成物およびその使用
さらにもう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドまたは結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を含む。
本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、疾患の治療、特に化学療法、放射線療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症の予防、末梢血前駆細胞移植における採集のための前駆細胞の動員、重い慢性または相対的白血球減少症の治療、急性骨髄性白血病の患者の治療、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の治療、および抗真菌療法、特に全身性または侵襲性カンジダ症の治療用医薬を製造するために用いることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
従って、本発明は様々な形態の白血球減少症または好中球減少症を治療するための組成物および方法を提供する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ある種の放射線療法、化学療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症を予防するため、末梢血前駆細胞移植における採集のために前駆細胞を動員するため、重い慢性または相対的白血球減少症の治療のため、および急性骨髄性白血病の患者の治療をサポートするために用いることができる。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の治療および抗真菌療、特に全身性または侵襲性カンジダ症の治療、および細菌感染症の治療に用いることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性
非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇのＣＰＡおよび１回量（体重１ｋｇあたり１００μｇ）のＧ−ＣＳＦを用いて前記のようにして測定した（「非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図７に示す。３つの化合物は同じ速度で白血球の初期形成を誘発した。従って、結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物が投与直後にインビボで白血球形成を十分に刺激するためには、Ｎｅｕｐｏｇｅｎの４％のインビトロ活性で十分である。３６時間後、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ処置されたラットにおける白血球数（ＷＢＣ）は、未処置群において観察されるレベルまで降下した（＜３×１０９細胞／リットル）。この時点で、ラットは好中球減少状態であった。両群におけるＷＢＣのレベルは１４４時間後に正常なレベル（９×１０９細胞／リットル）に達した。
ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋで処置された２群におけるＷＢＣのレベルは、４８時間後に最低の４ｘ１０９細胞／リットルまで減少し、次いで直ちに増大しはじめた。両群におけるＷＢＣレベルは９６時間後に正常に戻った。従って、２つの結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物は好中球減少症の程度を軽減し、かつＷＢＣレベルが正常に戻るまでの時間（好中球減少の期間）をＮｅｕｐｏｇｅｎ処置群における１１２時間からＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋのいずれかで処置された群における４８時間まで著しく減少させることができる。
ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋは、ＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋとくらべてさらに有効に好中球減少の期間を短縮した。両分子の見かけのサイズは６０ｋＤａより大きい（それぞれ６０ｋＤａおよび８０ｋＤａ）ので、これはＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋの腎臓クリアランスがＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも低いことにより説明できない。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋのインビトロ活性はそれぞれＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４％および７％である。このことは、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋの結合親和力、従ってレセプターによるクリアランスが、ＳＰＡ−ＰＥＧ２０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも、白血球レベルが増大する投与後の最初の４８時間において低いことを意味する。したがって、ラットが４８時間後に好中球減少症になる場合、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋのインビボ濃度は、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも高い。好中球前駆細胞に関するＧ−ＣＳＦレセプターの完全な活性化を得るためにはＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４〜５％の比較的低いインビトロＧ−ＣＳＦ活性で十分であるので（前記参照）、４８時間後のこの高いＧ−ＣＳＦ濃度は、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ−処置群においてＷＢＣレベルが速く増大することを証明する。従って、化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて、見かけのサイズが少なくとも約６０ｋＤａであり、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４％のインビトロ活性を有する本発明の結合Ｇ−ＣＳＦ化合物は、さらに高いインビトロ活性を有する類似したサイズの化合物よりも優れている。