【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  骨髄炎の予防と処置のための骨材料であって、この骨材料は、１０から２５のアミノ酸のドメインを含有するアミノ酸鎖からなる抗微生物性ペプチド（ＡＭＰ）を有し、この半分のドメインのアミノ酸の過半数が陽性荷電アミノ酸であり、もう半分のドメインのアミノ酸の過半数が非荷電アミノ酸であり、ＡＭＰをある期間、周辺領域に放出し得る、骨材料が硬化後に骨セメントを形成し、該ＡＭＰは硬化した骨セメントにおいて均一に分布される、骨材料。
【請求項２】  ドメインが、αヘリックスを形成し、部位１、２、５、６、９（１２、１３、１６、１９、２０、２３、２４）の少なくとも過半数が陽性荷電アミノ酸を含有し、部位８で陽性または非荷電のアミノ酸を、そして部位３、４、７、１０（１１、１４、１５、１７、１８、２１、２２、２５）の少なくとも過半数が非荷電アミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１の骨材料。
【請求項３】  陽性荷電アミノ酸が、オルニチン(Ｏ)、リシン(Ｋ)、アルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２の骨材料。
【請求項４】  非荷電アミノ酸が、脂肪族アミノ酸、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、バリン(Ｖ)、ロイシン(Ｌ)、イソロイシン(Ｉ)、両性側鎖のアミノ酸、メチオニン(Ｍ)、アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)、芳香族側鎖のアミノ酸、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２または３の骨材料。
【請求項５】  陽性荷電アミノ酸の過半数が、陽性荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項２−４いずれかに記載の骨材料。
【請求項６】  非荷電アミノ酸の過半数が、非荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項２−５いずれかに記載の骨材料。
【請求項７】  ドメインが完全長ペプチドを構成することを特徴とする、請求項２−６いずれかに記載の骨材料。
【請求項８】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化１】
2002519155.tif 000001
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項９】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化２】
2002519155.tif 000002
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１０】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化３】
2002519155.tif 000003
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１１】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化４】
2002519155.tif 000004
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１２】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化５】
2002519155.tif 000005
を有する、請求項２−７の骨材料。
【請求項１３】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化６】
2002519155.tif 000006
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１４】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化７】
2002519155.tif 000007
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１５】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
【化８】
2002519155.tif 000008
を有する、請求項２−７いずれかに記載の骨材料。
【請求項１６】  ドメインが、αヘリックスを形成し、部位１−６（または７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数で非荷電アミノ酸を含有し、部位７(または８または９または１０または１１または１２または１３)−２５で陽性荷電のアミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１の骨材料。
【請求項１７】  ドメインが、αヘリックスを形成し、部位１−６（または７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数で陽性荷電アミノ酸を含有し、部位７(または８または９または１０または１１または１２または１３)−２５で非荷電のアミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１の骨材料。
【請求項１８】  陽性荷電アミノ酸が、オルニチン(Ｏ)、リシン(Ｋ)、アルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６または１７の骨材料。
【請求項１９】  非荷電アミノ酸が、脂肪族アミノ酸、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、バリン(Ｖ)、ロイシン(Ｌ)、イソロイシン(Ｉ)、両性側鎖のアミノ酸、メチオニン(Ｍ)、アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)、芳香族側鎖のアミノ酸、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６，１７または１８の骨材料。
【請求項２０】  陽性荷電アミノ酸の過半数が、陽性荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項１６−１９いずれかに記載の骨材料。
【請求項２１】  非荷電アミノ酸の過半数が、非荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項１６−２０いずれかに記載の骨材料。
【請求項２２】  ドメインが完全長のペプチドを構成することを特徴とする、請求項１６−２１いずれかに記載の骨材料。
【請求項２３】  ドメインが下記のアミノ酸配列：
（ペプチド１１）
【化１３】
2002519155.tif 000009
を有する、請求項１６および１８−２２いずれかに記載の骨材料。
【請求項２４】  ドメインが、いわゆるβ鎖を形成し、部位１、３、５、７、９（１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）の少なくとも過半数で陽性荷電アミノ酸を、そして部位２、４、６、８、１０（１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４）の少なくとも過半数で非荷電アミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１の骨材料。
【請求項２５】  陽性荷電アミノ酸が、オルニチン(Ｏ)、リシン(Ｋ)、アルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４の骨材料。
【請求項２６】  非荷電アミノ酸が、脂肪族アミノ酸、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、バリン(Ｖ)、ロイシン(Ｌ)、イソロイシン(Ｉ)、両性側鎖のアミノ酸、メチオニン(Ｍ)、アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)、芳香族側鎖のアミノ酸、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４の骨材料。
【請求項２７】  陽性荷電アミノ酸の過半数が、陽性荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項２４−２６いずれかに記載の骨材料。
【請求項２８】  非荷電アミノ酸の過半数が、非荷電アミノ酸の全数引く１であることを特徴とする、請求項２４−２７いずれかに記載の骨材料。
【請求項２９】  ドメインが完全長のペプチドを構成することを特徴とする、請求項２４−２８いずれかに記載の骨材料。
【請求項３０】  Ｎ末端がアミド化されている、請求項１−２９いずれかに記載の骨材料。
【請求項３１】  Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基により置換されている、請求項１−２９いずれかに記載の骨材料。
【請求項３２】  骨材料が骨セメントへ硬化され、ＡＭＰが硬化した骨セメントにおいて均一に分布される、請求項１−３１いずれかに記載の骨材料を製造する方法。
【請求項３３】  ＡＭＰが、液体媒体、好ましくは水に溶解され、骨材料とそれら硬化後に混合される、請求項３２の方法。
【請求項３４】  硬化した骨セメントが顆粒化される、請求項３２または３３の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
さらに、ドメインがαヘリックスを形成し得る。そのうち、部位１−６（または７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数が非荷電アミノ酸を含有し、部位７(または８または９または１０または１１または１２または１３)−２５が陽性荷電のアミノ酸である。これらのペプチドは縦両親媒性を有する。すなわち、１００℃で最小疎水性モメントを有する。これらのペプチドは、「頂上」が疎水性であり、「底」が親水性である。これらのペプチドを「III型」と呼ぶ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
逆に、ドメインがαヘリックスを形成し得る。そのうち、部位１−６（または７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数が陽性荷電アミノ酸を含有し、部位７(または８または９または１０または１１または１２または１３)−２５が非荷電のアミノ酸である。これらのペプチドは同様に縦両親媒性を有する。すなわち、１００℃で最小疎水性モメントを有する。これらのペプチドは、「底」が疎水性であり、「頂上」が親水性である。これらのペプチドを「IＶ型」と呼ぶ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
最後に、ドメインがいわゆるβ鎖を形成し得る。これは、部位１、３、５、７、９（１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）の少なくとも過半数で陽性荷電アミノ酸を、そして部位２、４、６、８、１０（１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４）の少なくとも過半数で非荷電アミノ酸を含有する。このβ鎖は横両親媒性であって、１８０℃に最大疎水性モメントを有する。β鎖構造はαヘリックス構造よりも平面であり、簡単にいうと、左側が疎水性であり、右側が親水性であり、またはその逆である。これらのペプチドを「Ｖ型」と呼ぶ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
陽性荷電アミノ酸は、オルニチン(Ｏ)、リシン(Ｋ)、アルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)よりなる群から好ましくは選び、一方、非荷電アミノ酸は、脂肪族アミノ酸、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、バリン(Ｖ)、ロイシン(Ｌ)、イソロイシン(Ｉ)、両性側鎖のアミノ酸、メチオニン(Ｍ)、アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)、芳香族側鎖のアミノ酸、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)よりなる群から好ましくは選ぶ。親水性と疎水性の中間にあるアミノ酸は、両群および別のアミノ酸から選ぶことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
陽性荷電アミノ酸のひとつおよび／または非荷電アミノ酸のひとつを任意のアミノ酸で置きかえると、活性の相違を原則的にほとんど検出し得ない。従って、陽性荷電アミノ酸の過半数はこの陽性荷電アミノ酸の全数引く１であり、非荷電アミノ酸の過半数は、好ましくはこの非荷電アミノ酸の全数引く１である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
そのドメインは、より大きなペプチドの一部分であり得るが、それ自体でも完全長のペプチドを構成し得る。ドメインがより大きなペプチドの一部分を形成するとき、付加的に存在するＣ末端および／またはＮ末端のアミノ酸は、任意のアミノ酸であってよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明のペプチドはさらに修飾をも含有し得る。修飾は、例えば、無水酢酸などによるＮ末端アミド環であるか、Ｃ末端が修飾されることによる合成樹脂の選択的開裂などである。後者について、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基によるＣ末端カルボン酸の置換が想定され得る。このような修飾を有するペプチドは、例えば、下記のものである。
【化１１】
2002519155.tif 000010
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
単一ペプチドに加えて、オリゴマーもつくり得る。好ましくは、本発明のペプチドの直線状オリゴマーである。カップリングは、直接合成または合成後の酵素カップリングのいずれかによるヘッドとヘッド、テイルとテイル、ヘッドとテイルであり得る。膜貫通孔形成のためには、最小ペプチド長が必要とされる。本発明のペプチドのオリゴマーは２倍長であるので、基本的に、細菌全細胞膜のリン脂質２重層を１度で上手く橋わたしし得る。これによってペプチドの活性をさらに改善できよう。さらに、ペプチドを伸張すると、ヘリックスの配座が安定する。スペーサーを通常は挿入すべきである。ヘッドとテイルがカップリングされたオリゴマーの直接合成では、スペーサーを挿入して、適当な長さの非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸などの鎖を使用することにより大きくし得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ヘテロ２重機能カップリング試薬、例えば、ペプチド抗原を担体ペプチドにカップリングするのに市販されている試薬、例えば、１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(ＥＤＣ)、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル(ＭＢＳ)、Ｎ−サクシニミジル−３−[ピリジルジチオ]プロピオネート(ＳＰＤＤ)など)を用いて、挿入スペーサーを有する直線状オリゴマーをつくる。ヘッドとヘッドおよびテイルとテイルのカップリングには、３価アミノ酸、例えば、アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)、オルニチン(Ｏ)、リシン(Ｋ)、セリン(Ｓ)、システインを使用できる。このようなオリゴマーは、例えば下記の通りである。
【化１２】
2002519155.tif 000011
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ペプチド１４および１５を追加のＣ末端またはＮ末端システインを有するペプチド２の合成で得、次いで空気酸化でオリゴマーを得る。ペプチド１６、１７、１８を多重抗原性ペプチド(ＭＡＰ)法で得る。このうち、α−およびε−アミノ基の両者上にＦｍｏｃ保護を有するリシンを合成樹脂の第１アミノ酸として使用し、それによって、２つの同一のアミノ酸鎖(ペプチド２、３および９)を１つのリシン分子上で同時に合成した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、硬化後に骨セメントが形成し、ＡＭＰを硬化した骨のセメント中で均一に分布する骨材料を使用する。これは、生体適合性があり、再吸収性であり、化学作用を起こさず、体温で形成する。さらに、最終セメントは骨代替物として働くのに十分な強度と弾性を持つ。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
セメント中にＡＭＰを包含させるために、ＡＭＰを液体媒体、好ましくは水に溶解し、骨の硬化前または後に骨材料と混合する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
最終的に硬化した骨セメント中のＡＭＰの均一分布を確保するために、血液タンパク質、特にアルブミン含有の溶液を使用して、溶液中にＡＭＰを保持する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
好ましい実施態様において、骨材料はリン酸カルシウムを含有する。生体適合性からすると、これは、特にリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウムおよび／または水酸燐灰石の混合物である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明は、本発明による骨材料を製造する方法にさらに関する。そこでは、骨材料が骨セメントへ硬化し、ここでＡＭＰが硬化した骨セメントにおいて均一に分布する。すでに述べたように、ＡＭＰは、液体媒体、好ましくは水に溶解され、その硬化前または後に骨材料と混合される。ＡＭＰは、好ましくは硬化後に骨材料と混合される。そのために、長い徐放期間が提供され、その期間中、骨材料の調整後にＡＭＰが周辺領域に放出され得る。該放出が必要である場所でのみ、ＡＭＰが常時活性であることが、各ケースにおける本発明の出発点である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
１．α−リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム・１酸化物、二塩基性二リン酸カルシウムの７５：２０：５の比率または所望の比率の混合物からなる、無菌のセメント末。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
２．０.１％のウシまたはヒト血清アルブミンおよび２ｘ１０-5％−２％で必要とする濃度のＡＭＰを溶解させた４ｍＭのＨＣｌ水溶液からなる、無菌ＡＭＰ溶液(溶液Ａ)。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
３．１２％コハク酸ナトリウムおよび５％コハク酸コンドロイチンを溶解させた水からなる、第２無菌溶液(溶液Ｂ)。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
５．溶液（Ａ＋Ｂ）の１容量部とセメント末２容量部とを無菌状態で混合する。
これは、下記のように行い得る：
ａ．皿に取り、へらで混合し、その後にセメントペーストをすぐに患者の体内に入れ、硬化させる。
ｂ．２室を有する噴霧器を介し、２室の内の１室はセメント末を含有し、もう１室は溶液（Ａ＋Ｂ）を含有する；噴霧器を用いて、粉末と液体を一緒に体内の必要な場所に適用し、該混合物をその場所で硬化させる。
ｃ．皿、鋳型または容器にとり、混合物を体外で硬化させ、該混合物を所望のサイズの粉末に場合により粉砕して、その後患者の体に適用する。
６．１容量部の溶液Ｂと２容量部セメント末とを無菌状態で皿、鋳型または容器中で混合し、該混合物を硬化させ、所望のサイズの粉末に場合により粉砕する。次いで、硬化セメントを溶液Ａ中で１時間以上インキュベートし、ＡＭＰを吸収したセメントを乾燥させ、患者の身体で適用されるまで乾燥形態で保存される。