【手続補正書】
【提出日】平成18年8月29日(2006.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体の検出法であって、
（ａ）鋳型核酸に検体を固定する段階、
（ｂ）鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及び核酸ポリメラーゼの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階、及び
（ｃ）標識ポリリン酸を分析する段階
を含む方法。
【請求項２】
前記プライマーがヌクレアーゼ耐性プライマーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼ反応が３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分析段階が、（ａ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検体に特徴的な検出可能な化学種を生成させる段階と（ｂ）検出可能な化学種を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記検体を特性決定する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記検体を定量する段階をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記検体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、オリゴ糖、細胞全体又は合成ポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記検体が、非共有結合又は１以上の共有結合で鋳型核酸に固定される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼ耐性プライマーが、ホスホン酸メチル、ボラノホスフェート又はホスホロチオエート結合を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型核酸とプライマーを切り換えてプライマーが検体に固定されるか、或いは鋳型核酸及びプライマーがＤＮＡヘアピン構造の一部であってＤＮＡヘアピン構造が前記固定段階で検体に固定される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能な化学種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、酸化還元電位及びこれらの組合せからなる群から選択される特性によって検出可能である、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの標識が、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ及びこれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが別々の標識を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
検体の存在が、生成した別々の標識の比によって決定される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸ポリメラーゼ反応の実施段階のポリメラーゼ反応に、標識ポリリン酸とは検出性の異なる応答を示す１種以上の追加の検出試薬を添加する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドがデオキシヌクレオチドであって異なる標識を有するものか、或いはポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、請求項１記載の方法。
【化１】
2005537000.tif 000001
式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識であって、好ましくはリン酸が取り除かれたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である。
【請求項１８】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデヒドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖からなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素活性化可能な標識が、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素活性化可能標識が、２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びこれらの誘導体からなる群から選択される蛍光発生部分である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記リン酸化標識が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドキシルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びこれらの誘導体からなる群から選択される発色団である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記化学発光化合物がアルカリホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記１，２−ジオキセタン化合物が２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリクロロ［３，３，１−１3,7］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、クロロアダマンタ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン及びこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
検体の検出用キットであって、
（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｃ）ホスファターゼ
を含むキット。
【請求項２６】
ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼをさらに含む、請求項２５記載の検体の検出用キット。
【請求項２７】
（ａ）１種以上の鋳型核酸、及び
（ｂ）上記１種以上の鋳型核酸に相補的な１種以上のヌクレアーゼ耐性プライマー
をさらに含み、１種以上の鋳型核酸及び／又は相補的ヌクレアーゼ耐性プライマーがアンカー部分を有する、請求項２５記載の検体の検出用キット。
【請求項２８】
ヌクレアーゼ耐性３′−末端を有する１以上のヘアピン構造の鋳型−プライマーの組合せをさらに含む、請求項２５記載の検体の検出用キット。
【請求項２９】
サンプル中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
（ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する特定の鋳型核酸配列を各検体に固定する段階、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階であって、該反応が、鋳型、特定の鋳型配列に相補的なプライマー、異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、
（ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、各検体に特有の検出可能な化学種を生成させる段階、及び
（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階
を含む方法。
【請求項３０】
サンプル中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
（ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する特定の鋳型核酸配列を各検体に固定する段階、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して特有の標識をもつポリリン酸を生成させる段段階であって、該反応が鋳型、上記複数の検体の各々に特有の標的配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有していて各々異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、及び
（ｃ）標識ポリリン酸を検出する段階
を含む方法。
【請求項３１】
反応コンパートメント中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
（ａ）各検体に、特有の鋳型核酸配列を固定する段階、
（ｂ）反応コンパートメントの表面に検体を固定する段階、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階であって、該反応が、検体の１種類に特有の鋳型配列、特有の鋳型配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、
（ｄ）標識ポリリン酸を検出する段階、
（ｅ）固定されていない成分を洗い流す段階、及び
（ｆ）検体すべてが解析されるまで、別の検体に特有の鋳型配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて段階（ａ）〜（ｄ）を繰返す段階
を含む方法。
【請求項３２】
前記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドがポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記検出段階が、
（ａ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、及び
（ｂ）検出可能な化学種を検出する段階
を含む、請求項３１記載の方法。