【手続補正書】
【提出日】平成18年5月17日(2006.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が配列番号：1を含む、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が、配列番号:1と相補的配列にて、有意に高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が配列番号:2をコードする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項５】
ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aポリペプチドのアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号：2を含む、請求項5記載の精製されたポリペプチド。
【請求項７】
ラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が配列番号6を含む、請求項７記載の単離された核酸。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、配列番号:6と相補的配列にて、有意に高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項7記載の単離された核酸。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が、配列番号7をコードする請求項7記載の単離された核酸。
【請求項１１】
ラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドのアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列が配列番号：7を含む、請求項11記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
アポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を調節する薬剤を細胞に投与することを含む、細胞におけるアポトーシスを調節する方法。
【請求項１４】
薬剤がアポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を阻害し、それによりアポトーシスを阻害する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
薬剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号:19,,20,又は21を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なDHSポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
薬剤が、アポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を阻害する化学物質又は薬品である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
薬剤がアポトーシスに特異的なDHSの機能を阻害し、それによりアポトーシスを阻害する、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
薬剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドの1部をコードする核酸配列を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列が配列番号:19,20,又は21を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
薬剤がアポトーシスに特異的なDHSの機能を阻害する、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
薬剤がアポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を増大させ、それにより細胞のアポトーシスを誘発する、請求項13記載の方法。
【請求項２７】
薬剤が発現ベクターを含む請求項26記載の方法。
【請求項２８】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
薬剤が、アポトーシスに特異的なDHS機能を増大させ、それにより細胞のアポトーシスを誘発する、請求項13記載の方法。
【請求項３１】
薬剤が発現ベクターを含む請求項30記載の方法。
【請求項３２】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
上記細胞が動物内に含まれる請求項13記載の方法。
【請求項３５】
薬剤が動物に投与される請求項34記載の方法。
【請求項３６】
アポトーシスに特異的なDHS機能を調節する薬剤を細胞内に投与することを含む、細胞中のアポトーシスを調節する方法。
【請求項３７】
薬剤がアポトーシスに特異的なDHS機能を阻害し、それによりアポトーシスを阻害する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
薬剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号:19,20又は21を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
薬剤が、アポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を阻害する化学物質又は薬品を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
薬剤がアポトーシスに特異的なDHS機能を阻害し、それによりアポトーシスを阻害する、請求項36記載の方法。
【請求項４４】
薬剤がアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
薬剤が、アポトーシスに特異的なDHSの機能を阻害する化学物質又は薬品である、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
薬剤がアポトーシスに特異的なeIF-5Aの機能を増大させ、それによって細胞中のアポトーシスを誘発する、請求項36記載の方法。
【請求項４９】
薬剤が発現ベクターを含む請求項48記載の方法。
【請求項５０】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
薬剤がアポトーシスに特異的なDHSの機能を増大させ、それによって細胞中のアポトーシスを誘発する、請求項36記載の方法。
【請求項５３】
薬剤が発現ベクターを含む請求項52記載の方法。
【請求項５４】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
発現ベクターが、アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
細胞が動物中に含まれる請求項36記載の方法。
【請求項５７】
細胞が動物に投与される請求項56記載の方法。
【請求項５８】
アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、アンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
ヌクレオチド配列が配列番号:19,20,又は21を含む、請求項58記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドの1部をコードするヌクレオチド配列を含む、アンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
アポトーシスに特異的なeIF-5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、発現ベクター。
【請求項６２】
アポトーシスに特異的なDHSのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含む、発現ベクター。
【請求項６３】
[(i)試験細胞の提供する工程；(ii)候補と成り得る薬品と試験細胞を接触させる工程；そして(iii)候補と成り得る薬品の存在下における試験細胞のアポトーシスに特異的なeIF-5Aに対し増殖eIF-5Aとの比率が、変更されたかどうかを決定する工程、ここで、アポトーシスに特異的なeIF-5Aに対し増殖eIF-5Aとの比率の変更が、アポトーシスの調節を明示する]、ことを含むアポトーシスの調節を同定する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
好ましくは、本発明におけるラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードする単離された核酸が、配列番号：6のヌクレオチド配列を有し、そして本発明の精製されたポリペプチドが、配列番号:7のアミノ酸配列を有する。さらに本発明のラットのアポトーシスに特異的なDHS核酸及びポリペプチドが、各配列番号:6及び配列番号:7に実質的に同一又は相同性を有する配列、及び前記の機能的な誘発及びその断片を有する配列を含む。選択肢としてさらに好ましくは、前記本発明の単離された核酸も又配列番号:6の相補鎖と高いストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
さらに別の例において、アポトーシス関連疾患の診断は、アポトーシスに特異的なeIF-5A、及び2つが構造的に相同的するが、カルボキシル末端にて違う、異なるプロモータによって異なる位置から転写される点にて、アポトーシスに特異意的eIF-5Aと異なる増殖するeIF-5Aを用いて行うことができる。本発明の診断方法が、所定細胞に存在するeIF-5Aの増殖量と、同一細胞に存在するアポトーシスに特異的なeIF-5A量とを比較することを含む。通常に機能をしている間、細胞が、アポトーシスに特異的なeIF-5Aより増殖するeIF-5A量が有意に多く有することになる。しかしながら幾つかのガン細胞において、通常の調節機構がなくなり、そして増殖するeIF-5A量と比較してアポトーシスに特異的なeIF-5Aの量が変更される。これは、細胞が何か表現型を変化する前に、ガン腫瘍として細胞を有効に診断することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
電気泳動後そのゲルを、0.2NのHClにて10分間再精製し、その後変性溶液(0.5MのNaOH,1.5MのNaCl)にて2乃至15分間洗浄し、そして2乃至15分間中性緩衝液(1.5MのNaOH,0.5MのNaCl)にて洗浄した。そのDNAをナイロン膜に移しさらにその膜を、ハオブリダイゼーション溶液(40%のホルムアミド、6XSSC,5X Denhart's,solution(1X Denhart's solution is 0.02% Ficoll,0.02%PVP,and 0.02%のBSA)、0.5%のSDS,及び1.5mgのdenatured salmon sperm DNA)にてプレ-ハイブルダイズした。ラットのeIF-5A cDNA(650bpの3'UTR及び50bpのcoding)の3'URTの700bp PCR断片を、[a-32P]-dCTPを用い、ランダムプライミングにて標識化し、そして１X106cpm/mlにてその膜に加えられた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
組み換え型プラスミドの構成及びCOS-7細胞のトランスフェクション
センス配向のラットのアポトーシスeIF-5A、及びアンチセンス配向における3'の翻訳されない領域(UTR)のラット・アポトーシスeIF-5Aの全長コードする配列を輸送する組み換え型プラスミドが、哺乳動物のエピトープ・タグ発現ベクターのpHM6(Roche Molecular Biochemicals)を用いて構成され、それを図21に示す。そのベクターには以下のもの、すなわちCMVプロモータ、ヒト・サイトメガロウイルス介在初期プロモータ/エンハンサー；インフルエンザ・ヘマグルチニンからのHA-ノナペプチド・エピトープタグ;BGH pA-Bovine増殖ホルモンポリアデニール化シグナル;f1 ori-f1 origin;SV40 ori-SV40初期プロモータ及びオリジン;Neomycin-Neomycin耐性(G418)遺伝子;SV40 pA-SV40ポリアデニール化シグナル;Col E1-ColE1オリジン;アンピシリン-アンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ラットのアポトーシスeIF-5A及びラットのアポトーシスeIF-5Aの3'UTRの全長をコードする配列を、pBluescript(配列番号:1)における元来あるラットeIF-5AのRT-PCR断片からPCRにより増幅した。全長eIF-5Aの増幅に使用されるプライマーが以下の様である、つまり前方5'GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3'(Hind3)(配列番号:22)及び逆方5'CTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG3'(EcoR1)(配列番号:23)であった。全長3'UTRのラットeIF-5Aを増幅するために、使用されるプライマー以下のようである、つまり前方5'AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3'(EcoR1)(配列番号:24)及び逆方5'GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'(Hind3)(配列番号:10)である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
【図１】図１は、ヌクレオチド配列及びラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aから誘発される3’末端のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヌクレオチド配列及びラットのアポトーシスに特異的なeIF-5A cDNAから誘発される5’末端のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ラット黄体アポトーシスに特異的なeIF-5A 全長cDNAのヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、ヌクレオチド配列及びラットのアポトーシスに特異的なDHS CDNAから誘発される3’末端のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ヒトeIF-5Aのヌクレオチド配列(Accession number BC000751又はNM 001970,配列番号：3）とラットの黄体アポトーシスに特異的なeIF-5A CDNAの配向した全長ヌクレオチド配列である。
【図６】図６は、ヒトeIF-5Aのヌクレオチド配列(Accession number NM-020390,配列番号：4）とラットの黄体アポトーシスに特異的なeIF-5A CDNAの配向した全長ヌクレオチド配列である。
【図７】図７は、マウスeIF-5Aのヌクレオチド配列(Accession number BC003889）とラット黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5A CDNAの配向した全長ヌクレオチド配列である。マウスのヌクレオチド配列(Accession number BC003889）は、配列番号：５である。
【図８】図８は、ヒトeIF-5Aの誘導されたアミノ酸配列(Accession number BC000751又はNM 001970）とラット黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5Aの配向した誘導された全長アミノ酸配列である。
【図９】図９は、ヒトeIF-5Aの誘導されたアミノ酸配列(Accession number NM 020390）とラット黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5Aの配向した誘導された全長のアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、マウスのeIF-5Aの誘導されたアミノ酸配列(Accession number BC003889）とラット黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5Aの配向した誘導された全長アミノ酸配列である。
【図１１】図１１は、ヒトDHSのヌクレオチド配列(Accession number BC000333、配列番号：8）と、ラット黄体のアポトーシスに特異的なDHS cDNAの配向した部分的長さのヌクレオチド配列である。
【図１２】図１２は、ラット黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5A cDNAの制限酵素地図である。
【図１３】図１３は、ラットのアポトーシスに特異的なDHS codaの部分長の制限酵素地図である。
【図１４】図１４は、ラットの黄体のアポトーシスに特異的なeIF-5A cDNAの32P-dCTPにて標識化され、3'末端にてプローブされた全体RNAのノーザン・ブロット(図14A）、及び臭化エチジウム染色ゲル(図14B）である。
【図１５】図１５は、ラットの黄体のアポトーシスに特異的なDHS cDNAの32P-dCTPにて標識化され、3'末端にてプローブされた全体RNAのノーザン・ブロット(図15A）、及び臭化エチジウム染色ゲル(図15B）である。
【図１６】図１６は、過排卵されたラット黄体のアポトーシスの程度を、PGF-2αの注射後に試験したDNAラダーリング試験示す。
【図１７】図１７は、PGF F-2αにてラットを処理した後、DNAラダリングを示しているアポトーシスのラット黄体から単離されたアガロース・ゲルによるゲノムDNAを示す。
【図１８】図１８は、過剰に排卵させたラット黄体の分散した細胞のアポトーシスの程度を、プロスタグランジンF-(PGF-2α)に暴露する前にスペルミジンにて処理されたラットにて試験したDNAラダーリング試験を示す。
【図１９】図１９は、過剰に排卵させたラット黄体のアポトーシスの程度を、スペルミジン及び／又はPGF-2αにて処理したラットにて試験したDNAラダーリング試験を示している。
【図２０】図２０は、ラット黄体のアポトーシスに特異的なDHS cDNAにおける32P-dCTPで標識化した部分長さにてプローブされたラットゲノムDNAのサーザン・ブロットである。
【図２１】図２１は、エピトープ・タグ発現ベクターであるpHM6を示す(Roche Molecular Biochemicals)。
【図２２】図２２は、ラットの黄体のアポトーシスに特異的なDHS cDNAにおける32P-dCTPで標識化した3'の未翻訳領域にてプローブされた血清を取り出すことによるアポトーシスの誘発後、COS-7細胞から単離された全RNAのノーザン・ブロット(図22A）、及び臭化エチジウム染色ゲル(図22B）である。
【図２３】図２３は、COS-7細胞の一過性にトランスフェクションのための方法を示すフローチャートである。
【図２４】図２４は、pHM6にてトランスフェクション後、COS-7細胞における外来タンパク質の一過性的発現のウエスタンブロットである。
【図２５】図２５は、COS-7細胞が、ラットアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、カスパーゼ活性の増大により反映されるアポトーシスの増強を示す。
【図２６】図２６は、COS-7細胞が、ラットアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長含むpHM6により一過性にトランスフェクトされた場合、カスパーゼ活性の増大により反映されるアポトーシスの増強を示す。
【図２７】図２７は、COS-7細胞が、ラットアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、核の断片化の増大により反映されるアポトーシスの増強を示す。
【図２８】図２８は、COS-7細胞が、ラットアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、核の断片化の増大により反映されるアポトーシスの増強を示す。
【図２９】図２９は、COS-7細胞が、ラットアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて、全長含むpHM6により一過性にトランスフェクトされた場合、ホスファチジルセリン暴露にて反映されたアポトーシスの検出を示す。
【図３０】図３０は、COS-7細胞が、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて、全長含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、フォスファチジルセリンの暴露の増大にて反映されたアポトーシスの増強を示す。
【図３１】図３１は、COS-7細胞が、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、フォスファチジルセリンの暴露の増大にて反映されたアポトーシスの増強を示す。
【図３２】図３２は、COS-7細胞が、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、増強したアポトーシスを示す。
【図３３】図３３は、COS-7細胞が、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされた場合、Bcl-2の下限調節を示す。図３３Aは、クーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット；図３３Bは、相当するウエスタンブロットである。
【図３４】図３４は、プローブとしてc-Mycを用い、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをアンチセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされたCOS-7細胞のクーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット(図34A)及び相当するウエスタンブロット(図34B)である。
【図３５】図３５は、プローブとしてc-Mycを用いラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされたCOS-7細胞のクーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット(図35A)、及び相当するウエスタンブロット(図35B)である。
【図３６】図３６は、p53が、プローブとして使用される場合、ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aをセンス配向にて全長を含むpHM6により、一過性にトランスフェクトされたCOS-7細胞のクーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット(図36A),及び相当するウエスタンブロット(図36B)である。
【図３７】図３７は、抗-[HA]-パーオキサダーゼ・プローブを使用した場合のCOS-7細胞におけるpHM6の全長ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aを発現するクーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット(図37A)及び相当するウエスタンブロット(図37B)、あるいはp53が使用された場合、COS-7細胞におけるpHM6の全長ラットのアポトーシスに特異的なeIF-5Aを発現するクーマシーブルー(Coomassie-buru)染色タンパク質ブロット(図37C)及び相当するウエスタンブロット(図37D)である。
【図３８】図３８は、ヒトeIF5A2(Genbank acession number XM 113401)の配列にてPKO細胞から単離された配向したヒトeIF5A2を示す。
【図３９】図３９は、一過性トランスフェクションの後、PKO及びPKO-E6細胞に起こるアポトーシスの割合を示すグラフである。PKO及びPKO-E6細胞を、pHM6-LacZ又はpHM6eIF5A1にて一過性トランスフェクトした。アクチノマイシンDで処理し、pHM6-eIF5A1にてトランスフェクトしたPKO細胞を、アクチノマイシンDで処理せず、pHM6-LacZにてトランスフェクトした細胞と比較すると、アポトーシスが240%増大したことを示す。アクチノマイシンDで処理し、pHM6eIF5A1にてトランスフェクトしたPKO-E6細胞を、アクチノマイシンDで処理せず、pHM6-LacZにてトランスフェクトした細胞と比較すると、アポトーシスが105%増大したことを示す。
【図４０】図４０は、一過性トランスフェクトの後、PKO6細胞に発生するアポトーシスの割合を示すグラフである。PKO細胞を、pHM6-LacZ、pHM6eIF5A1,pHM6 eIF5A2又はpHM6-切断eIF5A1にて一過性にトランスフェクトした。pHM6 eIF5A1にてトランスフェクトした細胞を、pHM6-LacZにてトランスフェクトしたコントロール細胞と比較してアポトーシスが25%増大したことを示す。
【図４１】図４１は、一過性トランスフェクトの後、PKO細胞に起こるアポトーシスの割合を示すクラフである。PKO細胞が、トランスフェクトされない状態か、pHM6-LacZ又はpHM6eIF-5A1にて一過性にトランスフェクトされたかのいずれかである。トランスフェクト効率を補正した後、pHM6-eIF5A1にてトランスフェクトされた60%の細胞が、アポトーシスであった。
【図４２】図４２は、一過性トランスフェクトの後、PKO6細胞のアポトーシスのフロサイトメトリー(flow sytometry analysis)分析結果を示す。PKO細胞は、トランスフェクトされない状態か、pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A1,pHM6-eIF5A2又はpHM6-切断eIF5A1よる一過性にトランスフェクトされたかのいずれかである。表は、各ゲート下の面積に基づいて計算され、アポトーシスになった割合を示す。トランスフェクトされない細胞のアポトーシスのバックグラウンド、及びトランスフェクト効率用に補正した後、pHM6-eIF5A1によりトランスフェクトされた80%の細胞が、アポトーシスを示した。pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A2又はpHM6-切断eIF5A1よるトランスフェクトされた細胞が、アポトーシスのバックグラウンドのレベルのみ示した。
【図４３】図４３は、0.25μg/mlのアクチノマイシンDで、0,3,7,24及び48時間にて処理されたPKO細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットを提供する。表(panel)の上部は、一次抗体として抗-p53を用いたウエスタンブロットを示す。表(panel)の中間部は、一次抗体として抗eIF5A1を用いたウエスタンブロットを示す。表(panel)下部は、クーマシーブルー(Coomassie-blue)にて染色され、後で、等しく付加していることを証明するため化学蛍光により検出する抗-eIF5A1ブロットのため用いられる膜を示す。p53とeIF5A1が共に、アクチノマイシンDにて処理することにより下部調節される。