【手続補正書】
【提出日】平成18年1月12日(2006.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ここに開示され、クレームされているように、配列番号１〜２０に示されている配列は、「保存的配列改変」、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされた、またはアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、または変更しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変を含む。そのような保存的配列改変は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。改変は、当該技術分野において公知の標準的な方法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって、配列番号１〜２０に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基側鎖（例えば、リジンアルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ヒト抗ＰＳＭＡ抗体の予想される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換されることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
したがって、本明細書において開示されている（重鎖および軽鎖可変領域）ヌクレオチド配列によってコードされた、および/または本明細書において開示されている（重鎖および軽鎖可変領域）ヌクレオチド配列を含む抗体（すなわち、配列番号１〜２０）は、保存的に改変された類似の配列によってコードされているか、またはそれを含んだ実質的に類似する抗体を含む。本明細書に記載の、配列番号１〜２０に示されるような、部分的（すなわち、重鎖および軽鎖可変領域の）配列を基に、どのようにして上記実質的に類似する抗体を作製することができるかについて以下において説明する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
したがって、別の態様において、本発明は、抗ＰＳＭＡ抗体を調製する方法を提供する。その方法は、（１）少なくとも1つのヒト重鎖ＣＤＲは、図１９（配列番号１１〜１５）に示されたＣＤＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖フレームワーク領域およびヒト重鎖ＣＤＲ；および（２）少なくとも1つのヒト軽鎖ＣＤＲは、図２２および２３（配列番号１６〜２０）に示されたＣＤＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖フレームワーク領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ、を含む抗体を調製することを含み、該抗体は、ＰＳＭＡに結合する抗体を保持する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明の抗体がＰＳＭＡに結合する能力は、実施例に記載されているような方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）のような標準的な結合アッセイを用いて決定することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことがよく知られているので、上記のように調製される本発明の組み換え抗体は、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２または１６Ｆ９の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３を含むことが好ましい。さらに該抗体は、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２または１６Ｆ９のＣＤＲ２を含むことができる。該抗体は、さらに４Ａ３、７Ｆ１２。８Ａ１１、８Ｃ１２または１６Ｆ９のＣＤＲ１を含むことができる。したがって、本発明はさらに、（１）および（２）を含み、抗体がＰＳＭＡに結合する抗ＰＳＭＡ抗体を提供する：（１）ヒト重鎖フレームワーク領域ＣＤＲ１、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３、ここでヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、図１９（配列番号１１〜１５）に示される４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２および１６Ｆ９のＣＤＲ３から選択される。（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域、ここでヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、図２２および２３（配列番号１６〜２０）に示される４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２および１６Ｆ９のＣＤＲ３から選択さる。該抗体はさらに、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２または１６Ｆ９の重鎖ＣＤＲ２および/または軽鎖ＣＤＲ２を含んでもよい。該抗体はさらに、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２または１６Ｆ９の重鎖ＣＤＲ１および/またはＣＤＲ２を含んでもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成キット（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて、抗ＰＳＭＡハイブリドーマからポリＡ＋ｍＲＮＡおよび第１鎖ｃＤＮＡを調製した。４Ａ３、７Ｆ１２および８Ｃ１２のＶ領域を、ヒトＶＨおよびＶＩ（またはＶκ）シグナル配列に対応する５’末端プライマーのパネルを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。８Ａ１１および１６Ｆ９のＶ領域は、フレームワーク１内の成熟Ｖ領域配列の５’末端に結合するプライマーを使用して増幅した。３’ＶＨおよびＶκのＰＣＲプライマーはそれぞれ以下の配列、すなわち、ＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ（配列番号２７）およびＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号２８）を含有していた。配列中の潜在的なＰＣＲ誘発性の変化をモニターするためにＰＣＲ、クローニングおよび配列を行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
【図１】図１は、ＨｕＭＡｂ １１Ｃ１０と、全長ＰＳＭＡおよびアミノ酸１〜１７３、１３４〜４３７および４３８〜７５０に対応するＰＳＭＡフラグメントを含有する細菌的に発現した融合蛋白質との反応性（固相ＥＬＩＳＡ）を示す棒グラフである。このアッセイは、マウス７Ｅ１１抗体を対照として用いて行った。
【図２】図２は、ヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体と、ヒト前立腺腺癌のＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ３細胞からの膜画分との反応性（固相ＥＬＩＳＡ）を示すグラフである。４０５ｎｍにおけるバックグラウンド吸収は０．０５であった。
【図３】図３は、単離されたＰＳＭＡの熱変性が抗体の結合に及ぼす影響を示す棒グラフである。熱変性を行った、および熱変性を行っていない精製ＰＳＭＡを９６ウェルプレート上にコーティングし、指示された抗体で処理した。結合した抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。
【図４】図４は、ＨｕＭＡｂを使用した、ＬＮＣａＰ細胞の界面活性剤ライセートからのＰＳＭＡの免疫沈降を示す。免疫沈降した蛋白質は、ＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、マウス抗ＰＳＭＡ４Ｄ８抗体でプローブした（レーン２〜７）。レーン１は、ＬＮＣａＰ細胞ライセートの全体を示す。レーン２〜７は、下記の抗体、すなわち、無関係のヒトＩｇＧ１、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２および１６Ｆ９をそれぞれ用いた免疫沈降を示す。ＰＳＭＡおよびＰＳＭ’の位置を矢印で示している。
【図５】図５は、二人のドナー（パネルＡおよびＢ）からのＰＢＭＣ’とともにＬＮＣａＰ細胞標的を用いたＨｕＭＡｂ ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２および１６Ｆ９の抗体依存性細胞性傷害（ＡＤＣＣ）反応を測定したグラフを示す。それぞれＥ：Ｔの比率は１００：１とした。
【図６】図６は、ＣＤ８９（ＦｃαＲ）およびＰＳＭＡに結合する完全ヒト二重特異性分子、１４Ａ８×８Ｃ１２を示す。この分子は、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ’抗体フラグメント（ヒトモノクローナル抗ＰＳＭＡ抗体、８Ｃ１２に由来）に、ジスルフィド結合によって化学的に結合した抗ＣＤ８９Ｆａｂ’抗体フラグメント（ヒトモノクローナル抗ＣＤ８９抗体、１４Ａ８に由来）を含有している。
【図７】図７のパネルＡは、図６に示した１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介した、ＰＳＭＡ発現細胞の単球媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を、二重特異性分子濃度の関数で示すグラフである。結果は、阻害因子を添加しない、５０μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃＲαＲ（１４Ａ８）Ｆ（ａｂ’）２および５０μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃγＲＩ（Ｈ２２）Ｆ（ａｂ’）２を用いた比細胞溶解率で測定した。パネルＢは、二重特異性分子１４Ａ８×８Ｃ１２およびモノクローナル抗体８Ｃ１２を介した、ＬＮＣａＰ細胞の単球媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示すグラフで、エフェクター：標的比が１００：１である場合を示すグラフである。パネルＣは、阻害因子が存在しない場合の、または過剰量の（１４Ａ８）Ｆ（ａｂ’）２もしくはＨ２２Ｆ（ａｂ’）２の存在下での１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介した、ＬＮＣａＰ細胞の単球媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示すグラフで、エフェクター：標的比が１００：１である場合を示すグラフである。
【図８】図８のパネルＡは、図６に示した１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介した、ＰＳＭＡ発現細胞の好中球媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を、二重特異性分子濃度の関数で示すグラフである。結果は、阻害因子を添加しない、２５μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃＲαＲ（１４Ａ８）Ｆ（ａｂ’）２および２５μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃγＲＩ（Ｈ２２）Ｆ（ａｂ’）２を用いた比細胞溶解率で測定した。パネルＢは、阻害因子が存在しない場合の、または過剰量の（１４Ａ８）Ｆ（ａｂ’）２もしくはＨ２２Ｆ（ａｂ’）２の存在下での、１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介した、ＬＮＣａＰ細胞の単球媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示すグラフで、エフェクター：標的比が２００：１である場合を示すグラフである。
【図９】図９のパネルＡは、図６に示した１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介した、ＰＳＭＡ発現細胞の全血媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を、二重特異性分子濃度の関数で示すグラフである。結果は、阻害因子を添加しない、２５μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃＲαＲ（１４Ａ８）Ｆ（ａｂ’）２および２５μｇ／ｍｌのフリーの抗ＦｃγＲＩ（Ｈ２２）Ｆ（ａｂ’）２を用いた比細胞溶解率で測定した。パネルＢは、阻害因子が存在しない場合の、または過剰量の１４Ａ８ Ｆ（ａｂ’）２もしくはＨ２２Ｆ（ａｂ’）２の存在下での１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子を介したＬＮＣａＰ細胞の全血媒介抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示すグラフである。
【図１０】図１０は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（丸）によるＰＳＭＡ発現（（ＬＮＣａＰ）細胞の二重特異性分子（１４Ａ８×８Ｃ１２）媒介貪食作用を示すグラフである。結果は、阻害因子としての過剰の１４Ａ８抗体（正方形）および対照としてのＨ２２抗体（菱形）の存在下または不存在下の両方における貪食作用の割合を測定した。
【図１１】図１１は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）によるＬＮＣａＰ腫瘍細胞の二重特異性分子（１４Ａ８×８Ｃ１２）媒介貪食作用および抗体（８Ｃ１２）媒介貪食作用を示すグラフである。
【図１２】図１２は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（丸）によるＬＮＣａＰ腫瘍細胞の二重特異性分子（１４Ａ８×８Ｃ１２）媒介貪食作用を示すグラフである。挿入図は、過剰１４Ａ８Ｆ（ａｂ’）２またはＨ２２ Ｆ（ａｂ’）２の存在下で１４Ａ８×８Ｃ１２二重特異性分子（１μｇ／ｍｌ）が媒介する貪食作用を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＬＮＣａＰ細胞腫瘍を持つヌードマウスにおける１２５Ｉ−４Ａ３の体内移動を示す棒グラフである。動物に対して１００μｇの１２５Ｉ−４Ａ３を尾部静脈から注射し、注射の０．２５および２４時間後、動物を殺した。核組織内に存在する放射活性量を測定した。このデータは、それぞれの時間において２つの動物から得られた結果を示している。
【図１４】図１４は、１２５Ｉ-標識ＨｕＭＡｂの、培養液中のＬＮＣａＰ細胞による細胞内在化および処理を示すグラフである。ＬＮＣａＰ細胞をヨード処理した抗体で標識し、十分に洗浄し、ＴＣＡ可溶性製造物に内在化し、変換された標識に結合している細胞表面の量を、指示された時間に測定した。結果は、ヨード処理後、抗原結合性を維持している３つのＨｕＭＡｂ、ならびに陰性対照として無関係のヒトＩｇＧ１について示している。
【図１５】図１５は、１２５Ｉでのヨード処理が、いくつかの抗ＰＳＭＡＨｕＭＡｂの抗原結合能力に及ぼす効果を示すグラフである。この結果は、固定化された未変性の精製ＬＮＣａＰＰＳＭＡに結合した１２５Ｉ標識ＨｕＭＡｂの量を、抗体の希釈因子の関数で示す。
【図１６】図１６は、ＤＯＴＡ標識がいくつかの抗ＰＳＭＡ ＨｕＭＡｂの抗原結合能力に及ぼす影響を示すグラフを含む。この結果は、ＤＯＴＡ標識ＨｕＭＡｂ、またはＰＳＭＡに結合した抱合していない抗体の量を、ＥＬＩＳＡによって測定することによって、抗体の量の滴定の関数で示す（単位：μｇ/ｍｌ）。
【図１７】図１７ＡおよびＢは、各ＨｕＭＡｂ ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、および１６Ｆ９からのＶＨおよびＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１〜１０）をそれぞれ示す。
【図１８】図１８は、ＨｕＭＡｂ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２、１６Ｆ９の重鎖Ｖ領域のヌクレオチド配列（配列番号１、３，５，７，９）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列ヌクレオチド配列（配列番号５４）との配列比較である。
【図１９】図１９は、ＨｕＭＡｂ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ａ１１、８Ｃ１２、１６Ｆ９の重鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１１〜１５）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列アミノ酸配列（配列番号５１）との配列比較である。
【図２０】図２０は、ＨｕＭＡｂ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２の軽（κ）鎖Ｖ領域のヌクレオチド配列（配列番号２、４および８）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列ヌクレオチド配列（配列番号５５）の配列比較である。
【図２１】図２１は、ＨｕＭＡｂ８Ａ１１、１６Ｆ９の軽（κ）鎖Ｖ領域のヌクレオチド配列（配列番号６および１０）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列ヌクレオチド配列（配列番号５６）の配列比較である。
【図２２】図２２は、ＨｕＭＡｂ４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２の軽（κ）鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１６、１７および１９）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列アミノ酸配列（配列番号５２）との配列比較である。
【図２３】図２３は、ＨｕＭＡｂ８Ａ１１、１６Ｆ９の軽（κ）鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１８および２０）と、対応する鎖Ｖ領域の生殖細胞系列アミノ酸配列（配列番号５３）との配列比較である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７Ａ】
2005518789.tif 000001
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2005518789.tif 000002
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】
2005518789.tif 000003
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005518789000001.app