【手続補正書】
【提出日】平成18年1月30日(2006.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中に多分化能性細胞の自己再生を促進するための組成物であって、
（ａ）骨形成因子（ＢＭＰ）レセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターが、ＢＭＰレセプターのアゴニストである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記レセプターのアゴニストが、ＢＭＰである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アゴニストがＢＭＰ４である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターが、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインである、請求項１から４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項６】
前記サイトカインがＬＩＦである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターが、可溶性ＩＬ−６レセプターと組み合わせた可溶性ＩＬ−６である、請求項１から４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項８】
ＥＳ細胞が分化を抑制する薬剤の存在下で培養される、請求項１から７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＥＳ細胞が、ＦＧＦレセプターインヒビターの存在下で培養される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＦＧＦレセプターインヒビターが、ＳＵ５４０２またはＰＤ１７３０７４である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＥＳ細胞が、分化を抑制する薬剤の存在下で最初に培養され、そして続いてこの薬剤が回収される、請求項８から１０のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳動物および鳥類の多分化能性細胞から選択される多分化能性細胞の培養のための、請求項１から１１のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物および鳥類のＥＳ細胞から選択されるＥＳ細胞の培養のための、請求項１から１２のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１４】
齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類の多分化能性幹細胞から選択される多分化能性幹細胞の培養のための、請求項１から１３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１５】
齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、および霊長類のＥＳ細胞から選択されるＥＳ細胞の培養のための、請求項１から１４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１６】
ラットまたはマウスの細胞の培養のための、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１７】
ヒト細胞の培養のための、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＳ細胞が、血清、血清抽出物、フィーダー細胞、およびフィーダー細胞抽出物を含まない培地中で培養される、請求項１から１７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１９】
ＥＳ細胞が、完全限定培地中で培養される、請求項１から１８のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＥＳ細胞の自己再生を促進するための非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
（ｈ）ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｉ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
を含む培地中で該ＥＳ細胞を維持する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
前記ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターが、ＢＭＰレセプターのアゴニストである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターが、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アゴニストが、ＢＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターが、ＬＩＦ、またはＩＬ−６＋可溶性ＩＬ−６レセプターである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が、ＦＧＦレセプターのインヒビターをさらに含む、請求項２０から２２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２６】
非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよび血清または血清の抽出物の存在下、必要に応じてフィーダー上で、該ＥＳ細胞を培養中に多分化能性状態で維持する工程；
該ＥＳ細胞を少なくとも１回継代する工程；
培地がフィーダー、血清、および血清抽出物を含まないように、該培地から該血清または血清抽出物を除去し、そして存在する場合は該フィーダーを除去する工程；および
続いて、
（ｈ）ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｉ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の存在下で、該ＥＳ細胞を多分化能性状態で維持する工程、を含む、方法。
【請求項２７】
分化を抑制する薬剤の存在下で、前記ＥＳ細胞を培養する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分化を抑制する薬剤が、血清または血清抽出物が除去される時期に培養培地に添加される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーターの存在下での細胞の維持と同時またはそれに続いて、前記分化を抑制する薬剤が除去される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
非ヒトＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得るための方法であって、
ＥＳ細胞を、選択可能マーカーをコードする構築物でトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレーティングする工程；
（ａ）ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択可能マーカーを発現するＥＳ細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項３１】
前記選択可能マーカーが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
非ヒトＥＳ細胞の培養方法であって、
個々のＥＳ細胞を培養容器に移す工程；および
（ａ）ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
の存在下で該ＥＳ細胞を培養して、すべてが該ＥＳ細胞の子孫であるＥＳ細胞のクローン集団を得る工程
を含む、方法。
【請求項３３】
前記培養容器が、プレート上の個々のウェルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
非ヒトＥＳ細胞の神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
ｇｐ１３０およびＢＭＰレセプターを介して作用するアゴニストの存在下で、該ＥＳ細胞を維持する工程；および
培地から該アゴニストを除去する工程
を含む、方法。
【請求項３５】
非ヒトＥＳ細胞の非神経外胚葉運命への分化を指示する方法であって、
ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインおよびＢＭＰレセプターのアゴニストの存在下で、該ＥＳ細胞を維持する工程；および
（Ｉ）該ＢＭＰレセプターアゴニストを維持しながら；および／または
（ＩＩ）分化を指示し得るさらなるシグナリング分子を添加しながら
該サイトカインを除去する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
ＥＳ細胞の自己再生のための培地であって、
基本培地；
ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；
ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター；および
鉄トランスポーター；
を含み、該培地が、血清または血清抽出物を含まない、培地。
【請求項３７】
インスリンまたはインスリン様増殖因子をさらに含む、請求項３６に記載の培地。
【請求項３８】
前記培地が、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を含まない、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＥＳ細胞培養培地であって、
（ａ）ＢＭＰレセプターのアゴニスト；
（ｂ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン；および
（ｃ）ＥＳ細胞分化を抑制する薬剤
を含む、培地。
【請求項４０】
ＥＳ細胞培養培地であって、
（ａ）ＢＭＰレセプターのアゴニスト；および
（ｂ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン
を含み、該培地が、血清または血清抽出物を含まない、培地。
【請求項４１】
ＥＳ細胞培養培地であって、
（ａ）ＢＭＰレセプターのアゴニスト；および
（ｂ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン
を含み、該培地が、完全に限定されている、培地。
【請求項４２】
ＥＳ細胞の分化を抑制する薬剤をさらに含む、請求項３９に記載の培地。
【請求項４３】
前記ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインが、少なくとも１０Ｕ／ｍｌの濃度のＬＩＦである、請求項３７から４０のいずれかの項に記載の培地。
【請求項４４】
成体組織由来の多分化能性幹細胞の培養のための、請求項３７から４０のいずれかの項に記載の培地。
【請求項４５】
分化した細胞を得る方法であって、請求項２０から３２のいずれかの項に記載の多分化能性細胞を培養する工程および該多分化能性細胞の分化を可能にするまたは引き起こす工程を含み、該多分化能性細胞が、多分化能性幹細胞を含む他の細胞タイプと比較して所望の分化した細胞中で分別発現を可能にする選択可能マーカーを含み、それによる該選択可能マーカーの分別発現により、該所望の分化した細胞を優先単離および／または生存および／または分割させる、方法。
【請求項４６】
前記分化した細胞が、組織幹細胞または組織祖先細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記分化した細胞が、最終分化細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
多分化能性幹細胞または非ヒト胚を単離する方法であって、
（ａ）ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン；
（ｂ）ＢＭＰレセプターのアゴニスト；および
（ｃ）ＦＧＦレセプターのインヒビター
を含む培地中で、胎児、成体、または非ヒト胚由来の組織を培養する工程
を含む、方法。
【請求項４９】
前記培地が、完全限定培地である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
分化した細胞を得る方法であって、
（ａ）ＢＭＰレセプターの下流のシグナリング経路のアクチベーター；および
（ｂ）ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーター
を含む培地中で非ヒトＥＳ細胞を維持する工程；
該培地から（ａ）および（ｂ）の１つまたは両方を除去する工程；
必要に応じて、該培地に他のシグナリング因子を添加する工程；および
それによって所望の分化した細胞を得る工程
を含む、方法。