【手続補正書】
【提出日】平成18年7月28日(2006.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製する方法であって、前記方法が、 
ａ）細胞を溶解液と接触させ、それにより溶解混合物を形成するステップと、
ｂ）溶解混合物を第一スタティックミキサーを通して流し、溶解細胞溶液を得るステップと、
ｃ）溶解細胞溶液を沈殿液と接触させるステップと、
ｄ）溶解細胞溶液および沈殿液を第二スタティックミキサーを通して流し、それにより沈殿混合物を形成するステップと、
ｅ）沈殿混合物から沈殿を取り除き、それによりプラスミドＤＮＡを含む清澄化した溶液を形成するステップと、
ｆ）沈殿混合物または清澄化した溶液のいずれかを中和するステップと、
ｇ）清澄化した溶液を正に帯電したトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）イオン交換クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップであって、プラスミドＤＮＡが塩類液の段階的または連続的勾配を有するイオン交換クロマトグラフィ樹脂から溶出され、それにより精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を形成するステップと、
を含む方法。
【請求項２】  さらにＲＮａｓｅ消化のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  溶解液がアルカリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  沈殿液が酢酸カリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】  中和のステップが沈殿混合物の遠心分離のステップに先行する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  第一スタティックミキサーを通る溶解混合物の線速度が約０．３８から２．３フィート／秒（約１１．６〜７０．１ｃｍ／秒）であり、かつ第一スタティックミキサーが約３／１６インチから約２インチ（約０．４８〜５．１ｃｍ）の外径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】  第一スタティックミキサーが２４成分を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  第一スタティックミキサーが層流型スタティックミキサーである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】  第二スタティックミキサーを通る溶解混合物の線速度が約０．３８から２．３フィート／秒（約１１．６〜７０．１ｃｍ／秒）であり、かつ第二スタティックミキサーが約３／１６インチから約２インチ（約０．４８〜５．１ｃｍ）の外径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】  第二スタティックミキサーが層流型スタティックミキサーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  第二スタティックミキサーが２４成分を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】  ステップ（ａ）と（ｂ）が同時に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】  ステップ（ｃ）と（ｄ）が同時に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】  ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が同時に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】  任意の一つの実施例に関連して以下に実質的に説明された、請求項１に記載の細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製するための方法。
【請求項１６】  請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法により細菌細胞から精製される、プラスミドＤＮＡ。
【請求項１７】  ａ）少なくとも１つのガラス繊維フィルター及び少なくとも１つのナイロンフィルターを含む一連のフィルターを通してプラスミドＤＮＡ溶液を濾過すること、
ｂ）濾過したプラスミドＤＮＡ溶液を、トリエチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）陰イオン交換樹脂を含むカラムに充填することであって、ここで、ある導電率を有する充填用緩衝液であって、当該伝導率未満ではプラスミドＤＮＡが樹脂から溶出するであろう充填用緩衝液中で、プラスミドＤＮＡ溶液がカラムに充填される；
ｃ）樹脂からエンドトキシンを溶出するがプラスミドＤＮＡを溶出しないのに十分な導電率を有する緩衝液を用いてカラムを洗浄すること；及び
ｄ）導電率を増大させる段階的又は連続的勾配によりプラスミドＤＮＡを溶出させ、それにより陰イオン交換で精製したプラスミドＤＮＡの溶液を生成すること、
を含む、プラスミドＤＮＡ溶液からエンドトキシンを除去する方法。
【請求項１８】  ＴＭＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂がテンタクル（ｔｅｎｔａｃｌｅ）連結ＴＭＡＥ官能基を有するメタクリル酸をベースとした共重合体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】  約５０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する溶液中で樹脂上にプラスミドＤＮＡ溶液を充填する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】  プラスミドＤＮＡが約５０〜約９０ｍＳ／ｃｍの範囲で導電率が増大する一連の緩衝液を用いて段階溶出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  プラスミドＤＮＡ溶液が、プラスミドＤＮＡを含む細菌細胞のアルカリ溶解並びに沈殿タンパク質、染色体ＤＮＡ及び細胞砕片の除去の後に得られる清澄化した溶解物である、請求項１７〜請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】  清澄化した溶解物を更に中和してｐＨを約７〜約８.５とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  陰イオン交換樹脂に直接充填するために、溶解物のイオン強度を減少させる緩衝液を用いて、清澄化した溶解物を更に中和する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】  任意の一つの実施例に関連して以下に実質的に説明された、請求項１７に記載のプラスミドＤＮＡ溶液からエンドトキシンを除去するための方法。
【請求項２５】  請求項１７〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法により調製した、エンドトキシンを除去したプラスミドＤＮＡ。
【請求項２６】  ａ）第一スタティックミキサーを通して流すことによりアルカリ溶解液とプラスミドＤＮＡを含む細菌細胞の溶液とを混合して、溶解物を得ること；
ｂ）第二スタティックミキサーを通して流すことにより溶解物を酢酸カリウム沈殿液と接触させ、それにより沈殿混合物を形成すること；
ｃ）沈殿混合物から沈殿を除去し、それにより清澄化した溶解物を形成すること；
ｄ）少なくとも１つのガラスフィルター及び少なくとも１つのナイロンフィルターを含む一連のフィルターを通して清澄化した溶解物を濾過し、それにより濾過した溶解物を形成すること；
ｅ）プラスミドＤＮＡが樹脂に保持される条件下で、濾過した溶解物をトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂に充填すること；
ｆ）弱く結合した不純物を樹脂から除去する緩衝液を用いて樹脂を洗浄し、段階的又は連続的塩類液勾配を用いてプラスミドＤＮＡを溶出して、それにより陰イオン交換で精製したプラスミドＤＮＡの溶液を生成すること、
を含む、プラスミドＤＮＡを精製するための製薬規模の方法。
【請求項２７】  さらにＲＮａｓｅ消化のステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  濾過ステップの前に、沈殿混合物又は清澄化した溶解物のいずれかのｐＨ及び導電率を、約７〜約８．５の範囲内のｐＨ及び約５０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率に調整するステップをさらに含み、濾過した溶解物が陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂に直接充填されることができる、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】  トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂が、テンタクル連結ＴＭＡＥ官能基を有するメタクリル酸をベースとした共重合体を含む、請求項２６〜請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】  限外濾過の開始前に形成することのできるゲル層の存在下で、限外濾過を用いてプラスミドＤＮＡ溶液を精製するステップをさらに含む、請求項２６〜請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】  限外濾過ユニットがオープンチャネル接線流限外濾過ユニットである、請求項２６〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】  任意の一つの実施例に関連して以下に実質的に説明された、請求項２６に記載のプラスミドＤＮＡを精製するための製薬規模の方法。
【請求項３３】  請求項２６〜請求項３２のいずれか一項に記載の方法により精製されるプラスミドＤＮＡ。
【請求項３４】  少なくとも１つのガラス繊維フィルター及び少なくとも１つのナイロンフィルターを含む一連のフィルターを通してプラスミドＤＮＡ溶液を濾過することを含む、プラスミドＤＮＡ溶液からエンドトキシンを除去するための方法。
【請求項３５】  ガラス繊維フィルター及びナイロンフィルターが約０.２μｍのフィルターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】  イオン交換クロマトグラフィーを用いてプラスミドＤＮＡ溶液をさらに精製する、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】  任意の一つの実施例に関連して以下に実質的に説明された、請求項３４に記載のプラスミドＤＮＡ溶液からエンドトキシンを除去するための方法。
【請求項３８】  請求項３４〜請求項３７のいずれか一項に記載の方法により調製される、エンドトキシンを除去したプラスミドＤＮＡ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は細胞から核酸を精製するための方法に関する。
本発明は、細胞からプラスミドＤＮＡを精製するための自動化可能な方法を提供する。この方法には、細胞と溶解液の制御された、穏やかな混合をもたらすために、細胞と溶解液の混合にスタティックミキサーを使用することが含まれる。さらにスタティックミキサーは、得られる溶解混合物を沈殿液と混合して細胞砕片と、染色体ＤＮＡを含む他の汚染物質とを沈殿させて除くために使用する。これには続いて一般に沈殿した物質を除去するための遠心分離のステップが追加される。本発明の方法は、最終製品を生成するために、イオン交換クロマトグラフィを適用する前の複雑な精製のステップ（例えば限外濾過）を必要としない精製されたＤＮＡ溶液を提供するには十分である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
図１Ａは、本発明のシステムの概略図である。例示したシステムは細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離するのに便利に用いることができる。様々な溶液は、標準的な技術に従ってポンプ（例えば蠕動ポンプ）または圧力を用いてシステムのミキサーおよびラインを通って流れる。細胞の入った槽１０はライン２０によりスタティックミキサー３０に連結している。通常、細胞（一般にはＥ．ｃｏｌｉ）をまず周知の技術に従って培養物からペレットにする。ペレット化の後、細胞の固形分を最高７５％までの密度にし、将来のプラスミド調製用に凍結するか、あるいは本発明の方法に直接使用することができる。一般に細胞は、適切な溶液（例えば、ｐＨ８の２５ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭデキストロース）中で室温、１５０ｒｐｍで１時間撹拌することにより再懸濁される。一般に細胞は、細胞ペースト１ｋｇ当たり約５ｌに再懸濁する。別法ではスタティックミキサーをこの目的に用いることができる。その後のステップにおけるＲＮＡの量を減らすために、ＲＮアーゼをこの時加えることもできる（例えば、細胞ペースト１ｋｇ当たりＲＮアーゼ２４，０００クニッツ（ｋｕｎｉｔｚ）単位）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
スタティックミキサー３０を出て行く溶解混合物は、次いでライン６０を通ってスタティックミキサー７０に流れる。沈殿用液を入れる槽８０がライン９０を介してライン６０と結合している。沈殿用液はタンパク質、染色体ＤＮＡ、および細胞砕片を沈殿させるために用いる。一般にその溶液は酢酸カリウムを含有する。好適な沈殿用液は、酢酸でｐＨ５．５に調整した３Ｍ酢酸カリウムである（最終的には〜５Ｍ酢酸塩）。第一スタティックミキサーと同様に、ライン６０と９０の間の交差点は、溶解混合物および沈殿液が本質的に同時にスタティックミキサー７０に入るように調整することができる。同様の線速度が、タンパク質と細胞砕片は完全に沈殿するがゲノムＤＮＡを後の精製ステップで問題になるサイズまでせん断するほどには高くないような十分な混合を保証するために用いられる。一般に細胞ペースト１ｋｇ当たり沈殿用液約５ｌが使用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
スタティックミキサー７０を出た後、沈殿用液はライン１００を通って遠心機１１０に流れる。幾つかの実施形態においては、緩衝液を入れる槽１２０がライン１３０を介してライン１００と結合している。緩衝液は、溶液のｐＨを上昇させて酸が触媒するＤＮＡの脱プリン化を極力抑え、かつ材料が陰イオン交換カラム上に付着するように条件づけるために用いられ、例えばｐＨは６から９、好ましくは７から８．５の範囲にある。この目的に有効な緩衝液は１Ｍトリスである。より高濃度の溶液をｐＨの調整に用いることができるが、より希釈された緩衝液を使用することには別の利点がある。希釈された緩衝液は、よりよい透明性を得るために遠心機に向かう溶液粘度を低減させる。それはまた陰イオン交換カラム上に直接充填することができるように溶液のイオン強度を下げる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
クロマトグラフィのカラムには陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂が詰められる。カラムの最適容量は使用される樹脂および精製されるべき核酸のサイズに基づいて経験的に決定される。カラムは低圧下、一般には約０．７バール（約７０Ｐａ）未満で詰められる。圧力は使用される樹脂に左右され、また通常は製造業者の仕様に従うことになる。常用のカラム操作圧は、樹脂の細孔中への核酸のトラップを制限するために樹脂の孔径が小さければ低くてもよい。したがって、細孔のない樹脂の場合はカラム操作圧を増加させてもよい。カラムは従来の技術に従って予想される流量の約２倍詰める。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
大規模にプラスミドＤＮＡを精製する好ましい方法は、清澄および中和の後、イオン交換クロマトグラフィのカラム上に直接リゼイトを充填することである。これは追加の精製のステップを避けるために行なってもよく、プロセスをきわめて簡単なものにする。この「直接充填」法においては、リゼイトが遠心分離により清澄化された後にさらに砕片を、例えば深層フィルタを通してデカントすることにより除去してもよい。次いでｐＨおよび導電率を適切な値に調整するが、この値は使用する陰イオン交換樹脂に左右される。好ましい樹脂はＴＭＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ６５０Ｍ樹脂（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｏｆ Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。ＴＭＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ６５０Ｍは、合成のメタクリル酸をベースとしたポリマー樹脂骨格の水酸基に共有結合したトリメチルアミノエチル官能基（ＴＭＡＥ）を有するテンタクル（ｔｅｎｔａｃｌｅ）イオン交換体である。この樹脂の場合、ｐＨは約８．５に調整し、導電率は約５０ｍＳ／ｃｍ未満に調整する。これはリゼイトの容積当たり１Ｍトリスの容積約０．６を加えることにより、または水で０．２５〜０．３倍に希釈し、次いで０．６２Ｍの最終濃度までトリスの基剤粉末を加えることにより達成することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
幾つかの実施形態において、限外濾過をイオン交換クロマトグラフィのステップの前に用いることができる。一般に限外濾過は、前出の米国特許出願第０８／６９１，０９０号に対応する国際出願第ＷＯ９８／０５６７３号の記載に従って行なわれる。
手短に云えば、図１Ｂは接線流限外濾過法の概略図を提供する。供給槽１０は濾過すべき試料溶液が入れられる。溶液は、供給チャネルまたは供給ライン２０を通って濾過装置５０に入る。供給ライン２０中に配置された循環ポンプ３０が溶液の流れを制御する。濾過装置５０は限外濾過膜を備える。限外濾過膜による濾過は、試料溶液を浸透液と濃縮液に分離する。浸透液は浸透液チャネルまたは浸透液ライン６０を通って装置から出る。浸透液チャネルを通る流れは浸透液チャネル６０中に配置された浸透液バルブにより制御することができる。濃縮液は、濃縮液チャネルまたは濃縮液ライン９０に流入し、供給槽１０に循環して戻る。限外濾過膜を横切る圧力（膜間圧力またはＴＭＰ）は、供給チャネル４０および濃縮液チャネル８０中の圧力検出器により測定される。ＴＭＰは濃縮液バルブ１００を調整することにより制御される。ＴＦＵがダイアフィルトレーションのモードで行なわれる場合、ダイアフィルトレーション緩衝液１１０が供給槽１０中の試料溶液に加えられる。しかしながらＴＦＵが試料溶液を濃縮するために用いられる場合、ダイアフィルトレーション緩衝液１１０は供給槽１０には加えられない。システムの制御は手動でもよく、または圧力変換器、流量計、インライン式導電率計、および他のフィードバックループにより自動化してもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
吸光分光分析は波長２５０、２６０、および２８０ｎｍで行なった。精製したＤＮＡの典型的な比率はＯＤ260／ＯＤ250＞１．１、ＯＤ260／ＯＤ280＞１．９である。ＯＤ260／ＯＤ250が１．１０４７、ＯＤ260／ＯＤ280が１．９２９０である全プラスミドＤＮＡ２．３０７ｇを上記手順で単離し、精製した。
回収した全プラスミドＤＮＡは、Ｇｅｌｍａｎ Ｇｒｏｕｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｃａｐｓｕｌｅ ０．４５μｍフィルターを２回通して濾過し、続いてＰａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｎ66 ０．２２μｍフィルターを２回通して濾過した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
実施例５、陰イオン交換クロマトグラフィカラムへの清澄化したライゼートの直接充填による精製： 
発酵ブロス約４０ｌは細胞ペースト約２．２ｋｇを産出する。細胞ペースト、溶解物、および沈殿物を再懸濁させた後、溶液約４０ｌが遠心分離による清澄化のために準備された。非連続遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３ｂ）による７５００×ｇで２５分間の遠心分離は固形物を除去し、清澄化された生成物を産出した。トリスベース（固形物）を加えて清澄化された生成物のｐＨを８．５（０．６７Ｍの最終濃度）に調整した。トリスベースを加えた後、導電率は５３ｍＳ／ｃｍから５０ｍＳ／ｃｍに低下した。中和したライゼートを公称０．２μｍガラスフィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＧＦ）および絶対０．２μｍナイロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｕｌｔｉｐｏｒ Ｎ66）（各５ｆｔ2（約０．４６ｍ2））を直列につないで濾過して細菌の負荷およびエンドトキシンのレベルを低下させた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
プールされた生成物は、ＤＮＡ１７８７ｍｇ、１６ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン量ト、およびゲノムＤＮＡ１．６％を含んでいた。生成物を再び上記の０．２μｍ公称ガラスおよび０．２μｍ絶対ナイロンフィルターを通した。濾過の後、生成物は収率９４％で、１ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン量トおよびゲノムＤＮＡ０．１８％を含んでいた。濾過した生成物は、実施例１の記載に従ってダイアフィルタリングを行ない、最終の０．２μｍ滅菌フィルターにかけた。最終生成物は５．６ｍｇ／ｍｌで、０．４ＥＵ／ｍｇおよびゲノムＤＮＡ０．２％未満を含んでいた。