【手続補正書】
【提出日】平成17年5月30日(2005.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
2006517397.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
2006517397.tif 000002
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
Ｃ末端のタグを付したベクターにおいて発現するためにＮ末端クローンを変換するためのプライマーは以下の通りである。
2006517397.tif 000003
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
全長又は疎水性ペプチド（C3）のバージョンの2C9を、2C9の停止転移（stop transfer）クローン（C1）を鋳型として用い、以下のプライマー：
2006517397.tif 000004
を用いる逆PCRによって生成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
実施例２：NADPH−チトクロームP450還元酵素のクローニング
NADPH−チトクロームP450還元酵素を、胎児肝臓cDNA（Clontech）、PCRプライマー［NADPH還元酵素 F1  5'−GGATCGACATATGGGAGACTCCCACGTGGACAC−3'（配列番号２０）；NADPH還元酵素 R1  5'−CCGATAAGCTTATCAGCTCCACACGTCCAGGGAG−3'（配列番号２１）］から増幅し、クローニングを可能にするために、遺伝子の5'にNde I部位、3'にHind III部位を挿入した。PCR産物を、pJW45発現ベクター（図２Ａ及びＢ）にクローニングし、２つの停止コドンをリバースプライマー上に入れて、Hisタグが翻訳されないようにした。正しい組み換えクローンを、細菌培養物のPCRスクリーニング、及び配列決定によって決定した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
以下のPCRプライマーを用いた。
2006517397.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃ末端のBCCPヘキサヒスチジンコンストラクトの発現用のpBJW102.2のプラスミド地図を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、pBJW102.2のDNA配列（配列番号４８）を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、開始コドンからのpBJW102.2のクローニングサイト（配列番号４９〜５０）を示す図である。ヒトP450のORF、NADPH-チトクロームP450還元酵素のORF、チトクロームb5のORF、及びそれらの切断部分を、DraIII/SmaIで消化したpBJW102.2ベクターにライゲーションした。
【図２Ａ】図２Ａは、pJW45のベクター地図を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、pJW45ベクターの配列（配列番号５１）を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒトP450 3A4の翻訳領域のDNA配列（配列番号５２）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトP450 3A4の全長のアミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒトP450 2C9の翻訳領域のDNA配列（配列番号５４）を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒトP450 2C9の全長のアミノ酸配列（配列番号５５〜６１）を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒトP450 2D6の翻訳領域のDNA配列（配列番号６２）を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒトP450 2D6の全長のアミノ酸配列（配列番号６３）を示す図である。
【図６】E.coli由来のチトクロームP450 3A4の精製物のウェスタンブロット及びクマシーで染色したゲルを示す図である。チトクロームP450 3A4の精製物由来のサンプルを、SDS-PAGEで流し、クマシーを用いてタンパク質を染色するか、又はニトロセルロース膜上にウェスタンブロットし、ストレプトアビジン−HRP複合体で探索し、DAB染色によって可視化した。レーン１：全細胞、レーン２：可溶化液、レーン３：溶解したE.coliの細胞、レーン４：E.coliの細胞の洗浄液由来の上清、レーン５：E.coliの細胞洗浄液由来のペレット、レーン６：膜可溶化後の上清、レーン７：膜可溶化後のペレット、レーン８：分子量マーカー：175、83、62、48、32、25、16.5、6.5 KDa。
【図７】図７は、チトクロームP450 3A4のNi-NTAカラム生成物のクマシーで染色したゲルを示す図である。カラム生成物の総ての段階由来のサンプルをSDS-PAGEで流した。レーン１：マーカー175、83、62、48、32、25、16.5、6.5 KDa、レーン２：膜可溶化物由来の上清、レーン３：カラムのフロースルー液（Column Flow-through）、レーン４：バッファーＣでの洗浄液、レーン５：バッファーＤでの洗浄液、レーン６及び７：バッファーＤ＋50mMイミダゾールでの洗浄液、レーン８〜１２：バッファーＤ＋200mMイミダゾールでの溶出液。
【図８】図８は、基質AMMCを用いた再構成アッセイにおけるチトクロームP450 2D6についての活性のアッセイを示す図である。組み換え、タグを付したCYP2D6を、NADPH−チトクロームP450還元酵素と共にリポソームに再構成した後でのAMMCを回転する能力の点で市販のCYP2D6と比較した。
【図９】図９は、クメンヒドロペルオキシドがチトクロームP450 3A4を活性化したことによるBzResからのレゾルフィン形成の割合を示す図である。チトクロームP450 3A4を、BzResの濃度を160μMまで増加させて、クメンヒドロペルオキシドの活性化を用いて溶液内で検定した。
【図１０】図１０は、固定化したCYP3A4及びCYP2C9への［3H］ケトコナゾールの結合の平衡を示す図である。CYP3A4の場合、データのポイントは、４実験の平均値±標準偏差である。非特異的な結合を、100μMのケトコナゾールの存在下で決定した（データ図示せず）。
【図１１】図１１は、ストレプトアビジンの表面上に固定化し、CHPにより活性化したP450 3A4によるDBFのフルオレセインへの変換を伴う、タグを付し、固定化したP450の化学的な活性化を示す図である。
【図１２】図１２は、アガロースで封入したミクロソームの安定性を示す図である。チトクロームP450 2D6と、NADPH−チトクロームP450還元酵素、及びチトクロームb5を含むミクロソームをアガロースで希釈し、96ウェルプレートにセットした。AMMCの回転を、4℃で、直ちに、及び２日及び７日後に測定した。
【図１３】図１３は、チトクロームP450 3A4のアイソフォームによるBzResの回転を示す図である。チトクロームP450 3A4のアイソフォームである、WT、*1、*2、*3、*4、*5、及び*15（約1μg）を、BzRes（0〜160μM）と、クメンヒドロペルオキシド（200μM）の存在下、室温で、200mMのリン酸カリウムバッファー pH7.4内でインキュベートした。レゾルフィンの形成を時間とともに測定し、割合をプログレス曲線から計算した。従来のミカエリス−メンテン速度式を表す曲線をデータに合わせた。
【図１４】図１４は、チトクロームP450 3A4のアイソフォームのケトコナゾールによる阻害を示す図である。チトクロームP450 3A4のアイソフォームである、WT、*1、*2、*3、*4、*5、及び*15（約1μg）を、BzRes（50μM）と、クメンヒドロペルオキシド（200μM）と、ケトコナゾール（0、0.008、0.04、0.2、1、5μM）の存在下、室温で、200mMのリン酸カリウムバッファー pH7.4内でインキュベートした。レゾルフィンの形成を時間とともに測定し、割合をプログレス曲線から計算した。IC50阻害曲線をデータに合わせた。