【手続補正書】
【提出日】平成18年5月26日(2006.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】LAIT(sCD14)蛋白質による抗生物質ペプチドの誘導
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  デフェンシンの発現を増強するために患者の上皮細胞を化合物に直接曝露することにより患者を治療するための医薬品の調製における、または、化合物を哺乳動物の上皮細胞に直接曝露することによりデフェンシンの発現を増強するための食料品の調製における、可溶性CD14、またはデフェンシンの発現を増強するCD14のポリペプチド部分、またはデフェンシンの発現を増強するその保存的置換変異体を含む化合物の使用。
【請求項２】  上記医薬品の調製における、請求項1記載の使用。
【請求項３】  医薬品が、敗血症の症状の改善用である、請求項2記載の使用。
【請求項４】  医薬品が、患者の胃腸管に沿ったデフェンシンの発現の刺激用である、請求項3記載の使用。
【請求項５】  医薬品が、患者の呼吸器管に沿ったデフェンシンの発現の刺激用である、請求項3記載の使用。
【請求項６】  医薬品が、患者の舌におけるデフェンシンの発現の刺激用である、請求項3記載の使用。
【請求項７】  医薬品が、患者の小腸におけるデフェンシンの発現の刺激用である、請求項3記載の使用。
【請求項８】  上記食料品の調製における、請求項1記載の使用。
【請求項９】  食料品が、敗血症の症状の改善用である、請求項8記載の使用。
【請求項１０】  食料品が、患者の胃腸管に沿ったデフェンシンの発現の刺激用である、請求項9記載の使用。
【請求項１１】  食料品が、患者の舌におけるデフェンシンの発現の刺激用である、請求項9記載の使用。
【請求項１２】  食料品が、患者の小腸におけるデフェンシンの発現の刺激用である、請求項9記載の使用。
【請求項１３】  食料品が食品のバーである、請求項1および8〜12のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】  CD14が、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6もしくは配列番号：7からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその保存的置換変異体を有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】  化合物が配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、または配列番号：7からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14記載の使用。
【請求項１６】  CD14、またはポリペプチド部分、または変異体が組換え型である、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】  CD14、またはポリペプチド部分、または変異体が乳腺分泌物から得られる、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用。
【請求項１８】  乳腺分泌物が乳汁である、請求項17記載の使用。
【請求項１９】  乳汁が濃縮物である、請求項18記載の使用。
【請求項２０】  医薬品が、局所適用のための軟膏である、請求項2記載の使用。
【請求項２１】  軟膏が、ヒト皮膚の創傷への適用用である、請求項20記載の使用。
【請求項２２】  化合物が、細菌感染症の治療用である、請求項1〜21のいずれか一項記載の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
CD14はLPS：LBP複合体に対する単球上の膜受容体である
LPSの形でのエンドトキシンは、インビトロおよびインビボの双方で単球／マクロファージによって炎症性サイトカインを誘導する（ビュートラー（Beutler）ら、1986、Science 232：977；ミシー（Michie, H.R.）ら、1988、N. Engl. J. Med. 318：1481；トレーシー（Tracy, K.J.）ら、1987、Nature 330：662；ワアジ、ハルステンセン＆エスペビク（Waage, A., Halstensen, A., and T. Espevik）、1987、Lancet 1：355）。TNFα、IL-1、およびIL-6を含むこれらの単球由来サイトカインは、最終的に多臓器不全に至る敗血症ショック症候群に関連している。最近の研究から、CD14がLPSに対する単球受容体であると特徴付けされ（ライト（Wright, S.D.）ら、1990、Science 249：1431）、それによってLPSが単球／マクロファージを活性化するメカニズムが初めて特徴付けされた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
現在の典型例では、構成的に発現された血漿蛋白質であるリポ多糖類結合蛋白質（LBP）の関与が提案されており、この蛋白質はLPSと高親和性複合体を形成する（シューマン（Schumann, R.R.）ら、1990、Science 249：1429；ライト（Wright, S.D.）ら、1990、Science 249：1431；ライト（Wright, S.D.）ら、1989、J. Exp. Med. 170：1231）。LBPは、肝臓によって産生される血漿糖蛋白質であり、健康なヒト成人の血漿に構成的に5〜10 μg/ml存在し、これは急性期反応後では濃度が20倍まで増加することが示されている（シューマン（Schumann, R.R.）ら、1990、Science 249：1429；トビアス（Tobias, P.S.）ら、1992、Cell. Mol. Biol. 7：239；トビアス、マチソン＆ウレビッチ（Tobias, P.S., Mathison, J.C., and R. J. Ulevitch）、1988、J. Biol. Chem. 263：13479；トビアス、ソルダウ＆ウレビッチ（Tobias, P.S., Soldau, K., and R.J. Ulevitch）、1986、J. Exp. Med. 164：777；ライト（Wright, S.D.）ら、1990、Science 249：1431；ライト（Wright, S.D.）ら、1989、J. Exp. Med. 170：1231）。LBPに結合すると、マクロファージおよび単球におけるLPSのサイトカイン産生刺激能は増強される（マチソン、トビアス＆ウレビッチ（Mathison, J.C., Tobias, P.S., and R.J. Ulevitch）、1991、Pathobiology 59：185；シューマン（Schumann, R.R.）ら、1990、Science 249：1429；ライト（Wright, S.D.）ら、1990、Science 249：1431；ライト（Wright, S.D.）ら、1989、J. Exp. Med. 170：1231）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
LAIT/sCD14はmCD14-プレB細胞株の分化を誘導する
膜免疫グロブリン陰性（mIg-）マウスプレB細胞株70Z/3（ペイジ（Paige, C.J.）ら、1978、J. Immunol. 121：641）は、免疫蛍光によって検出可能なmCD14を発現せず、ノザンブロット分析およびRT-PCRの双方によって評価したところ、CD14をコードするmRNAに対して陰性である（フィリップ＆ユリウス（Filipp, D. and M. Julius）、未発表所見；リー（Lee, J.D.）ら、1992、J. Exp. Med. 175：1679）。70Z/3は、LPSまたはIFN-Kのいずれかによって刺激されるとmIgP+状態に誘導される（ペイジ（Paige, C.J.）ら、1978、J. Immunol. 121：641）。図2に示す結果は、rBo-LAIT/sCD14がLPSと同程度に効率よく70Z/3をmIgκ+状態に分化誘導することを示している。この結果は、80Z/3細胞上にrBo-LAITの受容体が存在すること、そしてさらに、受容体がmCD14であはありえないことを示している。したがって、このアプローチは、LAIT/sCD14生物活性のmAb 3C10媒介阻害のmCD14依存性を評価するための手段を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
70Z/3分化のLAIT/sCD14誘導はmAb 3C10によって阻害される
図3Aに示す結果はmAb 3C10が70Z/3上でmIgP発現のLAIT/sCD14誘導を阻害することを示している。mIgκのLPS媒介誘導はmAb 3C10によって阻害されず、このことは阻害がLAIT/sCD14媒介誘導に特異的であることを示し、さらに、mAb 3C10媒介阻害の基礎となるメカニズムが70Z/3との直接相互作用を含まないことを示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
図3Bに示す結果は、必ずしも全てのCD14特異的mAbがLAIT蛋白質/sCD14媒介70Z/3のmIgκ+状態への分化を阻害しないことを示している。特にmAb 3C10は、組換え型ヒトLAIT蛋白質/sCD14による70Z/3分化を阻害するが、同様にCD14に対して特異的であるmAb MEM-18も、それぞれのイソ型対照mAbも阻害しない。結果は、mAb 3C10がLAIT/sCD14と相互作用して、70Z/3によって発現されたLAIT/sCD14の推定の受容体と相互作用する決定因子を隠すことを示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
エンドトキシンとLAIT蛋白質/sCD14はシグナル伝達経路を共有する
背景の項で述べたように、LPSが単球の活性化を誘導し、その後前炎症性サイトカインを産生するメカニズムを説明するために多くのモデルが提唱されている。エンドトキシンに対する推定の受容体として機能するmCD14の役割は、仮定されるほとんどのメカニズムの中心である。mCD14の発現によって、細胞の活性化を誘導するために必要なLPSの濃度は一桁減少するが、これはLPS媒介活性化を意味するのではない。特に、mCD14- 70Z/3においてmIg発現を誘導するために必要なLPSの濃度はmCD14+単球によるサイトカイン産生を刺激するために必要な濃度より高い（リー（Lee, J.D.）ら、1992、J. Exp. Med. 175：1697）。さらに、70Z/3をヒトCD14をコードするcDNAにトランスフェクトさせると、mCD14+クローンによるmIg発現を誘導するために必要なLPSの濃度は、70Z/3の野生型のmCD14-親株において必要な濃度より10,000倍低かった。さらに、これらの状況においてLPSによる刺激の効率は血清依存的であり、LBPの関与を反映していた（リー（Lee, J.D.）ら、1992、J. Exp. Med. 175：1697）。このように、LPS-LBP複合体との細胞相互作用を媒介するmCD14の中心的な役割を強調しながら、結果はまた、血清およびこのようにLBP非依存的である、LPSによって利用されるmCD14非依存的活性化経路が存在することも証明している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
70Z/3のLPSとLAIT/sCD14活性化に関与するmCD14非依存的経路がシグナル伝達要素を共有するか否かに関する疑問がある。図4に示す結果は、これが当てはまることを示している。LPSに由来するジホスホリルリピッドAがLPSによる70Z/3の活性化を阻害することはこれまで証明されている（カークランド、クエルシ＆タカヤマ（Kirkland, T.N., Quershi, N., and Takayama, K.）、1991、Infection and Immunity 59：131）。特に、ジホスホリルリピッドA（RSDPLA）と共にプレインキュベートすると、その後のmIgのLPS誘導発現が阻害された。図4Aに示すように、RSDPLA 10 μg/mlを含む培地中で70Z/3をプレインキュベーションすると、LPS媒介Igκ発現が3〜4倍阻害された。図4Aに同様に示すように、RSDPLAはそれ自身調べた濃度範囲、すなわち0.1〜30 μg/mlで70Z/3上のIgκ発現を誘導しない。図4Bは10 μg/ml RSDPLAを含む培地中で70Z/3のプレインキュベーションがIgκ発現のnBo-LAIT誘導を阻害するのみならず、刺激としてLPSを用いた場合より有効性が増加することを示しており、その結果、調べたnBo-LAITの全濃度範囲に対してnBo-LAIT媒介誘導の少なくとも10倍阻害が起こった。図4Cに、RSDPLAは、70Z/3によるmIgκ発現のLPSおよびnBo-LAIT/sCD14誘導をいずれも阻害するが、調べた濃度、すなわち0.03 μg/ml〜10 μg/mlのいずれにおいても70Z/3の増殖を阻害しないことを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
LAIT/sCD14はヒト初乳および乳汁中に豊富に存在する
可溶性Hu-LAITの新生児に対する役割がおそらく重要であることを考慮して、出産後の女性におけるHu-LAITの発現パターンを調べた。初乳および乳汁試料をヒト被験者9人から分娩後の様々な時間に得た。健康なヒト被験者からの血清は1〜5 μg/mlのsCD14を含むことが知られているため、上記の被験者9人からの血清試料を採取して、含まれるsCD14濃度が乳汁分泌において認められた濃度と平衡であるか否かを決定した。CD14は市販のELISAキットを用いて定量して、総蛋白質を市販の比色検出システムを用いて決定した。図6Aに示す結果は、得られた対の乳汁と血清試料のそれぞれについて、総蛋白質1 mgあたりのCD14のμgとして表す。示すように、ヒト乳汁は同じ個体から得た血清よりsCD14を100〜400倍多く含む。同様に血清と比較して乳汁中のsCD14の濃縮は分娩後400日まで持続することが示される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
清澄にしたウシ乳清からの蛋白質の(NH4)2SO4を用いた連続的塩析の結果、62％(NH4)2SO4分画において天然のウシLAIT蛋白質/sCD14が濃縮された（図7Aと7Bを比較）。ウシ乳清および初乳乳清に由来する62％(NH4)2SO4分画における蛋白質濃度はそれぞれ、8〜15 mg/mlおよび47〜65 mg/mlである。乳汁および初乳に由来する62％(NH4)2SO4分画におけるLAIT蛋白質/sCD14濃度はそれぞれ、1〜5 μg/mlおよび5〜12 μg/mlである。このように、これらの2つの起源から得られたLAIT蛋白質/sCD14は、0.15〜0.26 μg/ml蛋白質で同等である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
62％分画の活性をその後濃縮した。62％AS濃縮分画50 mgを陰イオン交換カラムに適用し、材料を10 mMビストリスプロパンにおいて50 mM〜400 mMの塩勾配、同時にpH勾配7.5〜9.5を用いて分離した。図7Cに、乳汁由来ウシLAIT蛋白質/sCD14の部分精製分画と、70Z/3においてmIgκの発現を誘導するために同じ起源からのアフィニティ精製材料の部分精製分画との比較分析を示す。示されるように、62％(NH4)2SO4分画は、アフィニティ精製乳汁由来LAIT蛋白質/sCD14よりおおよそ10,000倍低い特異的活性を有した。同様に、図7Cに、セファデックス75分子ふるい樹脂上での62％(NH4)2SO4分画のさらなる分画によって得られたLAIT蛋白質/sCD14（イムノブロット分析によって評価する）の大部分を含む分画の生物活性を示す。分画47〜49の特異的活性は62(NH4)2SO4分画の特異的活性より100倍高く、LAIT蛋白質/sCD14濃度の同等の増加に相関した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
初代培養ウシ気管上皮細胞は既に記述された方法に従って調製した（ダイアモンド（Diamond, G.）ら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：5156）。24ウェル培養プレートのウェルあたり無血清培地1 ml中に上皮細胞およそ5×105個を含むウェルを調製して、表示の濃度（図9A）のLPS、天然型ヒトおよびウシLAIT蛋白質/sCD14、または哺乳動物発現系（C127）もしくはバキュロウイルス発現系（Sf9）のいずれかを用いて調製した組換え型Bo-LAIT/sCD14によって16時間刺激した。乳汁から得られたウシLAITを実験に用いた。図9Aに示したように、天然または組換え型LAIT/sCD14のいずれか1 μg/mlはLPS 1 μg/mlと同じようにTAP特異的mRNAの同等のレベルを誘導し、その結果非刺激細胞において認められたシグナルが15〜20倍増加した。図9Aには、ウシチューブリン特異的mRNAについて得られたシグナルも同様に示し、これはそれぞれのトラックにおいて同等のRNAがローディングされたこと、そしてTAP mRNAシグナルを標準化するために用いられたことを示している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
図9Bに、初代培養ウシ気管上皮細胞の培養においてLPSまたは天然のウシLAIT蛋白質/sCD14のいずれか1 μg/mlがTAP mRNAを誘導する速度論の比較分析を示す。上皮細胞は図9Aに記載した培養であり、TAP特異的mRNAの発現を表示の時点で評価した。示したように、双方の刺激は、16時間でチューブリンmRNAのレベルと標準化すると（図9B）、TAP mRNAの最高発現を誘導した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
CD14蛋白質を含む状況において、一例として、液体の1日あたりの平均摂取量を約18〜36 mlに基づいて、哺乳動物の体重1 kg当たりポリペプチド約250〜300 μg/kgを、哺乳動物に1日当たり与えることができる。非常に若い哺乳動物の消費量は時間と共に増加すると認識される。投与すべき用量は、ヒト幼児の乳汁摂取量が出生後最初の6ヶ月間では1日当たり約0.11〜約11増加することを考慮して、そしてヒトとラットのあいだの約28という体重比を仮定して、成体の乳汁において10〜20 μg/mlという測定されたsCD14濃度に基づいている。実際に、特にヒト被験者に関する限り、1日量は1日に体重1 kg当たり約250 μg〜約2500 μgまたはそれ以上となる可能性がある。より好ましくは用量は1日に体重1 kg当たり約300 μg〜約1 mg付近であろう。好ましい投与回数は、投与当たりに用いる回数および量と共に、投与経路、簡便性および治療の有効性の変化に応じて1日に1回以上または1回未満であろう。投与すべき用量も同様に、被験者およびそのような投与が生じる作用に依存する。化合物の1つまたはそれ以上の用量は特定の化合物または利用すべき化合物の組合せ、投与用式および治療すべき哺乳動物を含む多くの要因に依存する。特定の化合物または化合物の併用の用量は従来の検討を用いて；例えば、試験化合物の異なる活性の通常の比較、および既知の薬剤、すなわち適当な薬学的プロトコールによって決定することができる。
【図1A】  CD14特異的mAb 3C10およびMEM-18による天然のヒトLAIT（Hu-LAIT、nhCD14）媒介B細胞活性化の異なる阻害を示す（トッド・ジュアン（Todd, S.C. Juan）ら、1995、J. Biol. Chem. 270：5219）。mAbs3C10（―――）、MEM-18（−−−）、またはそのイソ型の非特異的mAbsである12CA5（IgG2b）（……）（フィールド（J. Field）ら、1988、Mol. Cell. Biol. 8：2159）、およびW3/25（IgG1）（−-−-）（ウィリアムス（A.F. Williams）、1977、Cell 12：663）の表示の濃度をそれぞれ、1μg/ml天然（n）Hu-LAIT（黒四角）、または5 μg/ml LPS（黒丸）のいずれかを含む1 Tg/ml96ウェル平底培養プレート（コスター社）において無血清培養培地0.2 mlに加えた。37℃で5時間インキュベートした後、先に記述したように単離した（ラトクリフ（Ratcliffe, M.J.）ら、1983、J. Immunol. 131：581）1.5×105の高い浮遊密度のマウス脾臓B細胞を、培養ウェルのそれぞれに加えた。40時間後、培養を1μCiの3H-TdRによってパルスして、6時間後にフィルターマット上に回収して、チミジン取り込みをシンチレーション分光法によって評価した。結果はmAbの非存在下で2つの刺激のそれぞれによって誘発した反応の百分率として表記する。刺激の非存在下でのバックグラウンド反応は0.7〜1.7×103 cpmの範囲であった；mAbの非存在下での5 μg/ml LPSおよび1 μg/ml nHu-LAITに対する反応はそれぞれ、77.8×103 cpmおよび82.3×103 cpmであった。誤差のバーは3個ずつの培養の平均値に関する1標準偏差を示す。
【図1B】  CD14特異的mAbである3C10による組換え型（r）Hu-およびrBo-LAIT媒介B細胞活性化の阻害を示す。mAb 3C10、またはIgG2bイソ型非特異的mAb OX40（パターソン（Paterson, D.J.）ら、1987、Mol. Immunol. 24：1281）の表示の濃度を、15 μg/mlの可溶性組換え型ヒトCD14（rHu-LAIT）（黒丸）；2 μg/ml可溶性組換え型ウシCD14（rBo-LAIT）（白い四角）、または5 μg/ml LPS（白丸）のいずれかを含む96ウェル平底培養プレート（コスター社）において無血清培地0.2 mlに加えた。37℃で5時間インキュベートした後、先に記述したように単離した（ラトクリフ（Ratcliffe, M.J.）ら、1983、J. Immunol. 131：581）1.5×105の高い浮遊密度のマウス脾臓B細胞を、培養ウェルのそれぞれに加えた。40時間後、培養を1μCiの3H-TdRによってパルスして、6時間後にフィルターマット上に回収して、チミジン取り込みをシンチレーション分光法によって評価した。結果はmAbの非存在下で3つの刺激のそれぞれによって誘発した反応の百分率として表記する。刺激の非存在下でのバックグラウンド反応は0.7〜1.7×103 cpmの範囲であった；mAb 3C10の非存在下での5 μg/ml LPS、15 μg/ml nHu-LAIT、および2 μg/ml rBo-LAITに対する反応はそれぞれ、77.8×103 cpm、10.9×103 cpmおよび82.3×103 cpmであり、複製培養における標準偏差は＜10％であった。OX40によって媒介された阻害は調べた全ての濃度で15％未満であった。
【図2Aおよび2B】  マウスプレB細胞株である70Z/3における膜IgP発現（mIgκ）のLPSおよびrBo-LAIT誘導の比較分析を示す。70Z/3の8×104個を96ウェル平底培養プレート（コスター社）において無血清培地0.1 mlにおいて刺激なし、またはrBo-LAIT（白い四角）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）（シグマ社）由来LPS（白丸）、または大腸菌変異体D31m4に由来するディープラフLPS（黒丸）（カークランド、クレシ＆タカヤマ（Kirkland, T.N., Qureshi, N. and K. Takayama）、1991、Inf. and Imm. 59：131）の表示の濃度の存在下で20時間培養した。細胞を回収して、マウスIgκに対して特異的なフルオレセイン結合mAb 187.1（F187.1）（イェルトン（Yelton, D.E.）ら、1981、Hybridoma 7：5）によって染色し、mIgκ+細胞の割合をB.D.社のFACスキャンを用いてフローサイトメトリーによって評価した。図2Aの上の3つのヒストグラムは、刺激なし（左）、3 μg/mlネズミチフス菌LPSの存在下（中央）、および0.1 μg/ml rBo-LAITの存在下（右）で、37℃で20時間培養後のmIgκ+ 70Z/3細胞の比率を表す。図2Bは3つの刺激の表示の濃度によって誘導されたmIgκ+ 70Z/3細胞の割合を示す。
【図3A】  mAb 3C10によるmIgκ+ 70Z/3細胞のrBo-LAIT媒介誘導の阻害を示す。mAb 3C10の表示の濃度を、さらなる刺激なし（黒い四角）、3 μg/mlネズミチフス菌（S. typhimurium）LPS（白丸）、または0.1 μg/ml rBo-LAIT（黒丸）を含む無血清培地0.1 mlに加え、混合物を96ウェルプレート（コスター社）に入れて、37℃で2時間インキュベートした。このプレインキュベーション期間の後、70Z/3細胞8×104 個を培養ウェルのそれぞれに加えて、37℃で20時間培養した後、細胞を回収してF187.1によって染色して、B.D.社のFACスキャンを用いてフローサイトメトリーによってmIgP+細胞の割合を評価した。％対照反応を示す、すなわちmAb 3C10の表示の濃度の存在下で認められたmIgκ+ 70Z/3の割合をrBo-LAITおよびLPSの誘導のそれぞれについてmAb 3C10の非存在下で認められたmIgκ+ 70Z/3細胞の割合で除したものを示す。イソ型非特異的mAb OX40は、2つの刺激のいずれかに関してmAb 3C10を用いた濃度のいずれで培養しても15％以上の阻害を媒介しなかった。
【図3B】  CD14特異的mAbによるmIgκ+ 70Z/3細胞のrHu-LAIT媒介誘導の異なる阻害を示す。mAb 3C10（黒丸）、MEM-18（黒四角）、またはそれぞれのイソ型非特異的mAb、12CA5（白丸）およびW3/25（白い四角）の表示の濃度を0.75 μg/ml nHu-LAITを含む無血清培地0.1 mlに加えた。37℃で2時間培養した後、70Z/3細胞8×104個を培養ウェルのそれぞれに加え、37℃で20時間インキュベートした後、細胞を回収してF187.1によって染色して、B.D.社のFACスキャンを用いてフローサイトメトリーによってmIgκ+細胞の割合を評価した。％対照反応を示す、すなわち表示の濃度のmAbの存在下で認められたmIgκ+ 70Z/3細胞の割合をmAbの非存在下で0.75μg/ml nHu-LAITの存在下で認められたmIgκ+ 70Z/3細胞の割合で除したものを示す。
【図4A〜4C】  nBo-LAITまたはロドシュードモナス・スファロイデス（Rhodopseudomonas sphaeroides）に由来するジホスホリルリピッドA（RSDPLA）のLPSによる70Z/3細胞におけるmIgκ+の誘導に及ぼす作用を示す。70Z/3細胞8×104個を、96ウェルプレート（コスター社）において10 μg/ml RSDPLAを含む無血清培地0.1 ml中で、37℃で2時間培養した。このプレインキュベーション期間の後、ReLPS（白四角、図4A）、または本来のBo-LAIT（白丸、図4B）の表示の濃度を加えて、37℃で20時間培養した。細胞を回収して、F187.1によって染色して、B.D.社のFACスキャンを用いてフローサイトメトリーによってmIgκ+細胞の割合を評価した。それぞれの刺激について得られる結果を比較するために2つの対照を用いた。RSDPLA（黒三角）を、同様にRSDPLAによって前処置した細胞に表示の濃度で加えた。ReLPSはRSDLPAを加えずに同様にプレインキュベートした細胞に加えた（黒四角、図4A）。nBo-LAITも同様にRSDLPAを加えずに同様にプレインキュベートした細胞に加えた（黒丸、図4B）。図4Cにおいて、同じ96ウェル平底プレート（コスター社）にRSDPLAの表示の濃度を含む無血清培地0.1 ml中に70Z/3細胞8×104個を播種して、37℃で2時間培養した。このプレインキュベーション期間の後、図4Cに示すように、刺激なし（黒三角）、5 μg/ml LPS（黒丸）、または0.3 μg/ml nBo-LAIT（黒四角）を細胞に加えた。プレート1枚を20時間後に回収して、細胞をフィコエリスリン（PE）結合ヤギ抗マウスIgκ特異的抗体（サザンバイオテクノロジー社）によって染色した。mIgκ+細胞の割合はB. D.社のFACスキャンを用いて評価した。％対照反応を示す、すなわちRSDPLAの表示の濃度の存在下で認められたmIgκ+ 70Z/3の割合をRSDPLAの非存在下で認められたmIgP+細胞の割合で除したものを示す（左側の縦軸）。2枚目のプレートに、刺激を加えた14時間後に、1μCiの3H-TdR によってパルスして6時間後にフィルターマット上に回収して、液体シンチレーション分光法によってチミジン取り込みを評価した（右側の縦軸）。
【図5A】  nHu-LAIT/CD14の図を示す。mAb 3C10（アミノ酸7〜14位）、およびMEM-18（アミノ酸57〜65位）によって認識されるエピトープを特徴づける2つの領域を示す。図5Bは、RSDPLAがHu-LAIT媒介70Z/3分化を阻害するためにどのように機能するかを示す図である。RSDPLAは、Hu-LAIT蛋白質のLPS結合部位と相互作用する可能性があり、またはRSDPLAは70Z/3細胞上でLAITの推定の受容体と相互作用する可能性がある。LPSおよびLAIT蛋白質媒介細胞活性化の幾つかのエレメントは共有している可能性がある。mAb MEM-18についても同様に示し、これは考えられる相互作用様式の一つに従ってnHu-LAITとRSDPLAとの相互作用を遮断するであろう。図5CはRSDPLAの存在下でnHu-LAITによる70Z/3細胞におけるmIgκ+細胞の誘導に及ぼすmAb MEM18の様々な濃度の作用を示す。70Z/3細胞8×104個を30 μg/ml RSDPLAを含む無血清培地0.1 mlにおいて37℃で2時間培養した。これらの培養に、mAb MEM-18の表示の濃度と37℃で2時間プレインキュベートした0.75 μg/mlのnHu-LAITを加えた。37℃でさらに20時間インキュベートした後、細胞を回収して、フィコエリスリン（PE）結合ヤギ抗マウスIgκ特異的抗体（サザンバイオテクノロジー社）によって染色した。mIgκ+細胞の割合はB. D.社のFACスキャンを用いて評価した。％対照反応を示す、すなわちRSDPLAの表示の濃度の存在下で認められたmIgκ+細胞の割合を、0.75 μg/ml nHu-LAITの存在下であってRSDPLAの非存在下で認められた（90％）mIgκ+細胞の割合で除したものを示す。
【図6B】  熱変性nBo-LAITのB細胞増殖促進活性の分析を示す。通常飼育C57BL/6マウスからの高浮遊密度マウス脾臓B細胞1.5×105個を既に記載されたように調製して（ラトクリフ＆ユリウス（Ratcliffe, M.J.H. and Julius, M.H.）、1983、J. Immunol. 131：581）、表示の濃度の刺激の存在下で無血清培地0.2 ml中で培養した。nBo-LAITの表示の濃度はパーキンエルマー社のジーンアンプPCRシステム9600において99.9℃で10分間処置した、または無処置のままの10×溶液を希釈することによって得た。この処置の後、試料を氷中で5分間冷却して、B細胞を含む培養に加えた。40時間目に培養を1μCiの3H-TdRによってパルスして、6時間後回収し、液体シンチレーション分光法によってチミジン取り込みを評価した。
【図7A〜7C】  連続的塩析およびサイズ排除クロマトグラフィーを組みあわせて用いて生物活性nBo-LAIT/CD14の部分精製を示す。ウシの乳清を調製して本文に記載のように塩析した。図7Aに、清澄にしたウシ乳清（CM）、アフィニティ精製nBp-LAIT（nBo）、および調べた(NH4)2SO4分画のそれぞれのCD14特異的イムノブロットを示す。イムノブロットは図7Dに関して下記に記述のように実施した。図7Bに、10％SDS-PAGEを用いた後に銀染色を行って、図7Aに記載した分画のそれぞれにおける蛋白質の分解を行った。nBo-LAIT/CD14の最高比率を含む62％（NH4）2SO4分画に、TN緩衝液（10 mMトリス、pH 8.0、150 mM NaCl）で平衡にしたスーパーデックス-75サイズ排除FPLCカラム上で分子ふるいを行った。TN緩衝液を用いて0.4 ml/分の流速で蛋白質を溶出して、蛋白質の溶出プロフィールをモニターするために、OD280 nm検出器を用いて0.2 ml分画を40分間のあいだに回収した。得られた分画のそれぞれについて、図7Dに関して記述したようにイムノブロットによってnBo-LAITs/CD14の有無を評価した。この分離技法からの分画47〜49が、イムノブロット分析によってnBo-LAITs/CD14の最高濃度を含んだ。図7Cは、マウスプレB細胞株である70Z/3において、アフィニティ精製したnBo-LAIT/sCD14（nBo-LAIT）によるmIgκ発現の誘導に関する比較分析を示す。62％(NH4)2SO4分画（白丸）を分子ふるいの開始材料として用い、スーパーデックス-75から単離した分画47（黒四角）、48（黒三角）、および49（黒丸）は、イムノブロット分析によって評価するとnBo-LAIT/sCD14の最高含有量を含んだ。70Z/3細胞8×104個をそれぞれの刺激の表示の濃度の存在下で平底96ウェル培養プレート（コスター社）において無血清培地0.1 ml中で20時間培養した。細胞を回収して、PE結合ヤギ抗マウスIgκ特異的抗体（サザンバイオテクノロジー社）によって染色した。mIgκ+細胞の割合はB. D.社のFACスキャンを用いて評価した。
【図7D】  ウシ初乳および乳汁からアフィニティ精製したnBo-LAITの比較B細胞刺激活性を示す。透明にした初乳および乳清に、図7Aに記載したようにNH4SO2の漸増濃度を用いて連続塩析を行った。62％(NH4)2SO4分画を可溶化して、脱塩し、sCD14をセファデックス4Bに結合させたmAb 3C10上でアフィニティ精製した。初乳（白丸）、および乳汁（黒丸）からのアフィニティ精製した材料を、先に記述したように単離した1.5×105個の高浮遊密度の脾臓B細胞を含む無血清培地0.2 mlの培養に、表示の濃度で加えた。40時間目に、培養を1 μCiの3H-TdRによってパルスして、6時間後フィルターマット上に回収し、チミジン取り込みをシンチレーション分光法によって評価した。図7D中の挿入図は乳汁（M）および初乳（C）ウシ由来sCD14のイムノブロットを表す。蛋白質250 ngを10％SDS-PAGEによって分解して、その後蛋白質をPVDFメンブレンに移した。5％スキムミルク中で1時間ブロッキングした後、ポリクローナルウサギ抗ウシCD14をホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（バイオラド社）と組みあわせて用いて蛋白質を顕色した。シグナルをECL（アマシャム社）によって検出した。
【図9A】  LPS、ウシ由来（nBo-LAIT）およびヒト由来（nHu-LAIT）の天然のLAIT蛋白質、ならびに哺乳動物発現系（rBo-C127）またはバキュロウイルス発現系（rBo-Sf9）のいずれかに由来する組換え型ウシLAIT蛋白質による、初代培養気管上皮細胞における気管抗菌ペプチド（TAP）mRNAの誘導を示す。ウシ気管上皮細胞の初代培養は、これまでに公表された方法に従って調製した（ダイアモンド（Diamond, G.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：5156）。気管上皮細胞5×105個を、様々な刺激の表示の濃度を含む無血清培地1 ml中で培養した。37℃で16時間インキュベートした後、それぞれの培養からの総RNAを、トリゾール法（ギブコ社）を用いて単離し、20 μgを1.2％ホルムアルデヒド／アガロースゲルにローディングした。次に、バキュームブロッター（ファルマシア社）を用いて、分解したRNAを10×SSC中でナイロンメンブレン（ジーンスクリーン、デュポン社）に移し、製造元の説明書に従ってUVクロスリンクさせた。5'末端標識TAPオリゴプローブ（図8Aおよび8Bを参照のこと）を1：1で混合して、50％（容積／容積）ホルムアミド／6×標準生理食塩クエン酸（SSC）／5×デンハート／0.5％（重量／容積）SDS／10％（重量／容積）硫酸デキストラン／100 μg/mlサケ精子DNA中で、固定化RNAと42℃で16〜20時間ハイブリダイズした後、2×SSC、0.1％SDS中で65℃で30分間洗浄した。ローディングはそれぞれのレーンにおいてウシチューブリンのレベルを評価することによって標準化した。ウシチューブリン特異的オリゴプローブとのハイブリダイゼーションは0.1×SSC、1％SDSからなる高ストリンジェンシー洗浄条件で65℃で2時間実施した。TAPのシグナル強度は、ホスホイメージャー（モレキュラーダイナミクス社）を用いて、ローディングした対照プローブのシグナル強度を評価することによって測定した相対的RNA量に標準化した。
【図9B】  初代培養気管上皮細胞における気管抗菌ペプチド（TAP）mRNAのLPSとnBo-LAIT/sCD14誘導の速度論を示す。初代気管上皮細胞は図9Aに記載のように調製して培養した。複製培養は全て、1μg/ml LPSまたは1μg/ml nBo-LAIT/sCD14のいずれかを含んだ。表示の時点で総RNAを単離して、アガロースゲル上で分解して、図9Aに記載したように、TAP特異的オリゴプローブによってまずプロービングした後チューブリン特異的オリゴプローブによってプロービングした。TAPのシグナル強度は、ホスホイメージャー（モレキュラーダイナミクス社）を用いて、ローディングした対照プローブのシグナル強度を評価することによって測定した相対的RNA量に標準化した。