【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年8月4日(2005.8.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当する位置で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び２による野生型と比較してｃＧＭＰに対して、より高いｃＡＭＰに関する感受性及び／又はより高いｃＡＭＰに関する選択性を有するように修飾（改変）されているサブユニットからなる遺伝子修飾（改変）された環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル（ＣＮＧチャネル）。
【請求項２】
ウシ及び／又は別の生物由来のＣＮＧチャネルのサブユニットを有することを特徴とする、請求項１記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項３】
同じサブユニットからなるホモオリゴマー構成（構造）又は種々のサブユニットからなるヘテロオリゴマー構成（構造）を有することを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項４】
少なくとも１つの他の遺伝子修飾を有する、請求項１から３までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項５】
キメラサブユニットを含有することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項６】
ウシのα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸がメチオニン又はバリンによって置換されていることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項７】
サブユニットにおいて、ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸を別のセリンとは異なる１つのアミノ酸で置換することを特徴とする、ＣＮＧチャネルの製造方法。
【請求項８】
ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸をメチオニン又はバリンで置換することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定のための、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルの使用方法。
【請求項１０】
リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、Ｇタンパク質結合型レセプターに対する作用並びにアクチベーター及びインヒビターの、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質に対する作用の測定のための、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルの使用方法。
【請求項１１】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルのサブユニットをコードすることを特徴とする、修飾された核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸を含有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネル、請求項１１記載の修飾された核酸又は請求項１２記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、細胞株。
【請求項１４】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルを発現できることを特徴とする、請求項１３記載の細胞株。
【請求項１５】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するタンパク質を、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項１３又は１４記載の細胞株。
【請求項１６】
Ｇタンパク質結合型レセプター、ホスホジエステラーゼ、アデニル酸シクラーゼを、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の細胞株。
【請求項１７】
請求項１２記載の発現ベクターで形質転換させることを特徴とする、細胞株の製造方法。
【請求項１８】
タンパク質に関する遺伝子を請求項１２記載の発現ベクターにクローニングし、引き続き細胞株の形質転換を実施することを特徴とする、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
真核生物のＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株又はＳＦ９細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の製造方法。
【請求項２０】
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の製造方法。
【請求項２１】
タンパク質が安定に又は一過性に発現されることを特徴とする、請求項１３から１６までのいずれか１項記載の細胞株の製造方法。
【請求項２２】
タンパク質の１つが安定に発現され、かつ別のタンパク質が一過性に発現されることを特徴とする、請求項１５又は１６記載の細胞株の製造方法。
【請求項２３】
細胞内Ｃａ２＋濃度の測定のための、請求項１３から１６までのいずれか１項記載の細胞株の使用方法。
【請求項２４】
蛍光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項２３記載の使用方法。
【請求項２５】
蛍光を発するＣａ２＋指示薬を使用することを特徴とする、請求項２３又は２４記載の使用方法。
【請求項２６】
発光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項２３記載の使用方法。
【請求項２７】
発光するアポエクオリン又はそのアイソフォームを使用すること特徴とする、請求項２３又は２６記載の使用方法。
【請求項２８】
Ｃａ２＋濃度の測定をキュベット測定装置又はＣａ２＋イメージング装置中で実施することを特徴とする、請求項２３から２７までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項２９】
Ｃａ２＋濃度の測定を蛍光リーダもしくは発光リーダ中で実施することを特徴とする、請求項２３から２８までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３０】
マルチウェルプレートを使用することを特徴とする、請求項２３から２９までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３１】
接着性細胞又は懸濁液中の細胞を使用することを特徴とする、請求項２３から３０までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３２】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を高める又は低下させる医薬品作用物質又は薬理物質の特性決定のための、請求項２３から３１までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３３】
ＧＰＣＲ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質の特性決定のための、請求項２３から３１までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３４】
高スループット（ＨＴＳ）又は超高スループット（ＵＨＴＳ）で作業することを特徴とする、請求項３２又は３３記載の使用方法。
【請求項３５】
実時間内での測定を実施することを特徴とする、請求項２３から３４までのいずれか１項記載の使用方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル（ＣＮＧチャネル）をコードする遺伝子修飾（改変）された核酸、有利にはＤＮＡ及び相応の（対応する）タンパク質並びにそれらの使用方法に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
セカンドメッセンジャーの細胞内濃度は、まずシグナル伝達カスケードによって調節され、このカスケードでは細胞の膜中のＧタンパク質共役（結合）型レセプター（ＧＰＣＲ）が細胞外シグナルを感知し、次いで相応するＧタンパク質を活性化し、かつこのＧタンパク質は再び相応のエフェクタータンパク質の活性を刺激するか、又は阻害する（Ｍｏｒｒｉｓ，  Ａ．Ｊ．及びＭａｌｂｏｎ，  Ｃ．Ｃ．著  （１９９９）：“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．，  ７９，  １３７３−１４３０）。更にそれぞれ個々の成分の活性は多様なフィードバック機構の枠組みの中で他のタンパク質によって調節することができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
リガンドの生理学的に正常な濃度の偏移又はシグナル伝達カスケードの経路における、例えばそれに関連する成分の機能欠失によって引き起こされる障害は重度の疾患を引き起こすことがある。ＧＰＣＲは細胞の細胞外及び細胞内の媒体間の特に重要な接点であるので、ＧＰＣＲは多数の生体固有（内因性）及び生体異種（外因性）の化学物質の結合部位もしくは攻撃箇所として用いられ、更に極めて多彩にほぼ全ての生命に重要な器官又は組織で重要な生理学的プロセスを制御することで、これらは医学−薬理学的な介入のために重要な関心が持たれている。特に重要な適用分野は中枢及び末梢神経系の疾患、心臓−循環器系の疾患及び内部器官の疾患である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
こうしたなか多くのレセプターの相補的ＤＮＡがクローニングされ、このレセプターを細胞系において機能的に発現させることができた後で、この研究は主に異種発現されるレセプターで実施される。使用されるストラテジー及び方法並びにその使用に関する先行技術は、例えば文献Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｐ．及びＰｏｐｅ，  Ａ．Ｊ．著  （２０００）：“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ”，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４，  ４４５−４５１；  Ｈｏｗａｒｄ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍａｃ  Ａｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｌｉｕ，  Ｑ．，  Ｎａｒｇｕｎｄ，  Ｒ．Ｐ．，  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｌ．Ｈ．及びＰａｔｃｈｅｔｔ，  Ａ．Ａ．著，  （２００１）：“Ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，  ２２，  １３２−１４０，  Ｃｉｖｅｌｌｉ，  Ｏ．，  Ｎｏｔｈａｃｋｅｒ，  Ｈ．Ｐ，  Ｓａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉｎ，  Ｓ．Ｈ及びＲｅｍｓｃｈｅｉｄ，  Ｒ．Ｋ．著  （２００１）：“Ｎｏｖｅｌ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ  ａｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  ２３０−２３７並びにそこに挙げられる刊行物である。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
異種発現系においては、同一のα−サブユニット（Ｈｏｍｏｏｌｉｇｏｍｅｒｅ；  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ，  Ｎｉｉｄｏｍｅ  Ｔ，  Ｔａｎａｂｅ  Ｔ，  Ｔｅｒａｄａ  Ｓ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ｓｔｕｅｈｍｅｒ  Ｗ．  Ｃｏｏｋ  ＮＪ，  Ｋａｎａｇａｗａ  Ｋ，  Ｍａｔｓｕｏ  Ｈ，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，及びＮｕｍａ  Ｓ，著（１９８９）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  ７６２−７６６）、異なるα−サブユニット（Ｈｅｔｅｒｏｏｌｉｇｏｍｅｒｅ；  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，  Ｌｅｓｔｅｒ  ＨＡ，及びＺｉｎｎ  Ｋ．著（１９９４）  Ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ８８９０−８８９４．；  Ｌｉｍａｎ  ＥＲ及びＢｕｃｋ  ＬＢ．著（１９９４）  Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．Ｎｅｕｒｏｎ  １３，  ６１１−６２１）並びにヘテロオリゴマーとしてα−サブユニット及びβ−サブユニットからなる（Ｃｈｅｎ  ＴＹ，  Ｐｅｎｇ  ＹＷ，  Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ａｈａｍｅｄ  Ｂ，  Ｒｅｅｄ  ＲＲ，及びＹａｕ  ＫＷ．著（１９９３）  Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ７６４−７６７）機能的なＣＮＧチャネルを発現することが可能である。β−サブユニット単独は機能的なチャネルを形成できず、専らヘテロオリゴマーＣＮＧチャネルにおける調節機能を有するのみである（Ｃｈｅｎ  ＴＹ，  Ｐｅｎｇ  ＹＷ，  Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ａｈａｍｅｄ  Ｂ，  Ｒｅｅｄ  ＲＲ，及びＹａｕ  ＫＷ．著（１９９３）  Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ７６４−７６７）。ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰがＣＮＧチャネルに結合すると、このチャネルは用量依存的に開放して、イオンが細胞内に流れ込む。ＣＮＧチャネルの活性化は生理学的条件下に、高められたチャネルのＣａ２＋伝導性を引き起こし、従って細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇をもたらす。かかる濃度変化は光学的なＣａ２＋測定法で測定できる。これらのイオンチャネルは従って原則的に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する全てのレセプターと細胞内タンパク質の調査及び特性決定のための細胞内ｃＡＭＰセンサとして使用できる。直接的なｃＡＭＰ測定と比較して、前記の方法は非常に迅速であり、効率的であり、かつ廉価��ある。この方法は１日あたりに高いスループット（ハイスループット）の試験を可能にし、かつ実時間内での測定を可能にする。従って原則的に前記の方法は薬理学的な作用物質のスクリーニングのために特に十分に適している。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
米国特許第６，００１，５８１号明細書及び国際公開９８／５８０７４号パンフレット並びにＧｏｔｚｅｓ，  Ｆ．著  （１９９５）：“Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ”，  ＩＳＳＮ  ０９４４−２９５２の文献には、鼻の鼻上皮由来のα３−サブユニットからなるＣＮＧチャネルのｃＡＭＰセンサとしての使用が記載されている。しかしながらこのようなＣＮＧチャネルは、このチャネルを医薬品作用物質のスクリーニングにおいて細胞性ｃＡＭＰセンサとして使用する場合に多くの決定的な欠点を有する。これらのＣＮＧチャネルは、ｃＧＭＰに関しては２μＭによって既に半値活性化（最大活性の半分（halbmaximal）まで活性化）されるが、ｃＡＭＰに関しては８０μＭによってようやく半値活性化される（Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ｙａｕ  ＫＷ，  Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ＫＡ及びＲｅｅｄ  ＲＲ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４７，  １８４−１８７；  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｔ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｄ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２７０，  ２４−２９）。しかしながら細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は通常、数μＭにすぎないので、このようなＣＮＧチャネルは基本的にｃＧＭＰセンサとしては確かに適しているが、ｃＡＭＰセンサとしては不十分であるにすぎない。更にｃＡＭＰ濃度の測定は僅かな細胞内ｃＧＭＰ濃度の変動によっても妨害されることがある。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
これらのイオンチャネルは、Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３M−突然変異体と類似のｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関する感受性を有する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
本発明の対象は更に前記のＣＮＧチャネルの製造方法である。また本発明の対象は、修飾されたＣＮＧチャネルのための核酸を含有する発現ベクターである。同様に本発明の対象は、前記の発現ベクターで形質転換され、かつこのＣＮＧチャネルを発現できる細胞株である。ＧＰＣＲ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質を、修飾されたＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できる細胞株が特に有利である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
更に本発明は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を直接的又は間接的に調節する細胞成分の活性に影響を及ぼす化学物質の作用の測定のために、核酸及び相応のタンパク質を有する細胞性測定系を使用することに関する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
このようなＣＮＧチャネルは（１）別の生物のα３−サブユニット、（２）ウシ又は別の生物由来の別のＣＮＧチャネル−サブユニットを含み、並びに（３）これらのサブユニットからなるホモオリゴマーもしくはヘテロオリゴマーの構成（構造）を有することができる。これらのサブユニットは（４）ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニット中の位置Ｔ５３７に相当する位置でそれぞれ遺伝子修飾されていてよい。前記の位置でトレオニンはメチオニン又はバリンによって置換されていてよいが、又は別のアミノ酸（セリンを除く）によって置換されていてもよい。このようなサブユニットは（５）別の位置に更なる遺伝子修飾を有することができる。更にこれらのＣＮＧチャネルは（６）前記の位置で同様に遺伝子修飾されているキメラサブユニットを有することができる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
「キメラサブユニット」として、少なくとも２つの異なる部分のサブユニットから構成されている係るＣＮＧチャネル−サブユニット、従って例えばα１−サブユニットのアミノ末端部及びα３−サブユニットからのカルボキシ末端部から構成されているサブユニットを表す。このようなキメラは当業者によって分子生物学的手法で容易に製造でき、かつあるタンパク質の一定の特性を別のタンパク質の特性と組み合わせるか、又は一定の特性を別のタンパク質に移すか、又は一定の特性を野生型タンパク質に対して変化させるためにしばしば利用される。種々のＣＮＧチャネル−サブユニットからなるキメラは既に記載されている（Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ及びＫａｕｐｐ，  ＵＢ．著（１９９９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｒｅ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：Ｓ５／Ｓ６  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｏｒｅ  ｇｌｕｔａｍａｔｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １８，  １１９−１３０）。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
前記のサブユニットからなるＣＮＧチャネルは更にニューロン細胞及び非ニューロン細胞並びに組織中で検出された（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＭＪ及びＧｏｒｄｏｎ  ＳＥ．著（２０００）  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  １４００３−１４０１１）。更にＣＮＧチャネルは脊椎動物で見いだされるだけでなく、同様に無脊椎動物、例えばドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)（Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０）及び植物（Ｌｅｎｇ  Ｑ，  Ｍｅｒｃｉｅｒ  ＲＷ，  Ｙａｏ  Ｗ及びＢｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＧＡ．著（１９９９）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １２１，  ７５３−７６１）中でも見いだされる。原則的に前記の及び全ての別のＣＮＧチャネルのサブユニットは本発明により修飾できる。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルは細胞性テストシステムにおいて薬理学的調査のためのｃＡＭＰセンサとして
（ｉ）リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する膜局在のＧタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作用を調査するため
（ｉｉ）アクチベーター及びインヒビターの、ｃＡＭＰを合成又は加水分解するエフェクタータンパク質（酵素）に対する作用を調査するため
（ｉｉｉ）アクチベーター及びインヒビターの、同様に調節されてｃＡＭＰ−シグナル伝達カスケードに連動する別のタンパク質に対する作用を調査するため、また
（ｉｖ）ＧＰＣＲ、エフェクタータンパク質又はｃＡＭＰ−シグナル伝達カスケードに関連している別のタンパク質の特性を調査するために使用できる。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
本発明によれば「膜局在のＧタンパク質結合型レセプター」（ＧＰＣＲ）といわれるタンパク質は、系統発生的に極めて多様な、非常に多岐にわたる膜局在レセプターのファミリー（概略文献：Ｍｏｒｒｉｓ  ＡＪ及びＭａｌｂｏｎ  ＣＣ．著（１９９９）  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｈｙｓｉｏ  Ｒｅｖ．，  ７９，  １３７３−１４３０）に属する。ＧＰＣＲのファミリーは恐らく、その配列類似性をもとに（Ｐｒｏｂｓｔ  ＷＣ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＬＡ，  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＤＩ，  Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ及びＳｅａｌｆｏｎ  ＳＣ．著（１９９２）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １１，  １−２０）又はその本来のリガンドの化学的性質に基づいて分類できる１０００を上回る種々のメンバを含む。今まで知られているＧＰＣＲの一覧及び分類は、例えば「ＧＰＣＲＤＢ」データバンク（Ｈｏｒｎ  Ｆ，  Ｗｅａｒｅ  Ｊ，  Ｂｅｕｋｅｒｓ  ＭＷ，  Ｈｏｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ，  Ｃｈｅｎ  Ｗ，  Ｅｄｖａｒｄｓｅｎ  Ｏ，  Ｃａｍｐａｇｎｅ  Ｆ及びＶｒｉｅｎｄ  Ｇ．著（１９９８）  ＧＰＣＲＤＢ：ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２６，  ２７５−２７９）中に見いだされる。以下に概略として個々のクラスの幾つかの代表を挙げる。クラスＡ（「ロドプシン様」）には、ロドプシン自体及びそれらの本来のリガンドをもとに分類される配列類似の種々のレセプターが該当する。これには（１）生体原アミンのためのレセプター、例えばムスカリン性アセチルコリンレセプター、アドレナリンレセプター、ドパミンレセプター、ヒスタミンレセプター、セロトニンレセプター、オクトパミンレセプター、（２）ペプチドのためのレセプター、例えばアンギオテンシンレセプター、ケモカインレセプター、エンドセリンレセプター、神経ペプチドレセプター、（３）ホルモンタンパク質のためのレセプター、例えばＦＳＨレセプター、（４）臭い物質のためのレセプター、（５）プロスタノイドのためのレセプター、例えばプロスタグランジンレセプター又は（６）ヌクレオチドのためのレセプター、例えばアデノシンレセプターが該当する。クラスＢ（「セクレチン様」）には、セクレチンレセプター自体並びに、例えばカルシトニン、グルカゴン、利尿ホルモン又はＣＲＦ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）が該当する。クラスＣ（「代謝型グルタミン酸／フェロモン」）には代謝型レセプター自体並びにＧＡＢＡ−Ｂレセプターなどが該当する。他のクラスは植物、菌類、昆虫、細菌由来のレセプターを含む。全てのクラスは、機能が今までまだ不明であるかもしくは本来のリガンドが分かっていないレセプター（オーファンレセプター）を含む。約２００の種々のＧＰＣＲ型について、それぞれ本来のリガンドが知られており、他の約１００のＧＰＣＲ型はオーファンＧＰＣＲである。７００以上のＧＰＣＲは恐らく臭い物質又は味覚物質によって活性化される。原則的に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する全てのＧＰＣＲを異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの作用を薬理学的に調査することができる。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
また通常、促進性又は抑制性Ｇタンパク質を介さずに細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するＧＣＲＰを調査することもできる。このようなＧＰＣＲを遺伝子修飾によって、このレセプターがｃＡＭＰシグナル経路に連結されるように修飾することができる。遺伝子修飾は、例えばキメラ−ＧＣＲＰの製造によって行うことができる（Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ，  Ｂｌｉｎ  Ｎ，  Ｙｕｎ  Ｊ及びＷｅｓｓ  Ｊ．著（１９９５）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｉｔｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  １１６４２−１１６４６）。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
活性がＧＰＣＲを媒介して制御される「アデニル酸シクラーゼ」は、Ｍｇ２＋−アデノシン三リン酸からのｃＡＭＰの形成を触媒し、かつヒトの身体の殆どの細胞、組織及び器官に存在する大きな膜局在の酵素である（Ｔａｎｇ  ＷＪ及びＨｕｒｌｅｙ  ＪＨ．著（１９９８）  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ５４，  ２３１−２４０）。全体として９種の異なるクラスの前記アデニル酸シクラーゼが知られている。このようなアデニル酸シクラーゼは本発明による細胞性テストシステムにおいても内在的に発現され、かつ異種発現されたＧＰＣＲによって活性化することができる。従ってこれらのアデニル酸シクラーゼはテストシステムの機能化に決定的に重要な役割を果たす。他のクラスは、活性が恐らくＧＰＣＲを媒介せずに調節される可溶性のアデニル酸シクラーゼを含む（Ｂｕｃｋ  Ｊ，  Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＭＬ，  Ｓｃｈａｐａｌ  Ｌ，  Ｃａｎｎ  ＭＪ及びＬｅｖｉｎ  ＬＲ．著（２０００）  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ７９−８４）。原則的に全てのアデニル酸シクラーゼを異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、かつインヒビター及びアクチベーターの作用を薬理学的に調査することができる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
「異種発現系」として、原則的に全ての真核細胞、例えば酵母細胞、アスペルギルス細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞及び、特に哺乳動物細胞が適している。好適な細胞株は、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、例えばＰｒｏ−５変異体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７８１）を含むＫ１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル）、例えばＣＯＳ−１変異体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）及びＣＯＳ−７変異体（ＡＴＣＣ  １６５１）を含むＣＶ−１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＢＨＫ細胞（ハムスター胎児腎臓）、例えばＢＨＫ−２１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、マウスＬ細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）、ヒト癌腫細胞、例えばＨｅＬａ系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、ＩＭＲ−３２系統の神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １２７）、神経２Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬＬ  １３１）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １０）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １１）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２１）並びにＳｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）である。有利にＳＦ変異体（ＡＴＣＣ  １５７３．１）を含むＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎臓）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が使用される。本発明により製造される細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１６が特に有利である。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
「蛍光光学的測定法」とは、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を、蛍光を発するＣａ２＋指示薬で可視化させることを意味する。こうした中、多数の種々のＣａ２＋指示薬が知られている（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ＲＰ，著（１９９６）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）。この指示薬には、例えばＦｌｕｏ−３、カルシウムグリーン、Ｆｕｒａ−２及び本発明により有利なＦｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が該当する。このような指示薬は通常水溶性であり、かつ従って細胞の疎水性の脂質膜を通過できないので、この指示薬はその代わりにアセトキシメチルエステル化合物の形で適用される（Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．著（１９８１）  Ａ  ｎｏｎ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０，  ５２７−５２８）。それに対して前記のエステル化化合物は疎水性であり、かつ細胞によって取り込まれる。細胞内部で、このエステル結合は内因性の細胞内エステラーゼによって分解され、かつこの指示薬は再びその水溶性形で存在する。前記の形において、指示薬は細胞内部に残留し、細胞内部に集積し、かつ従って細胞内Ｃａ２＋指示薬として使用できる。これらの指示薬を次いで好適な波長を有する光で励起すると、細胞内Ｃａ２＋濃度に依存する蛍光を示す。蛍光の程度（規模）と時間的経過（キネティック）は調査されるタンパク質の活性の程度及び経過と相関し、かつ蛍光検出器を用いて実時間内に非常に良好なシグナル／ノイズ比（信号／雑音比）で観察され、かつ好適なソフトウェアで図示できる。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
しかしながら本発明によれば原則的に測定は１日あたりに高いスループット（ハイスループット）で試験を実施することができる。従って新規の薬理学的作用物質のスクリーニングが可能である。この場合、１０００００個までの物質を１日あたりに（ハイスループット−スクリーニング、ＨＴＳ−スクリーニング）もしくは１０００００個を上回る物質を１日あたりに（超ＨＴＳ−スクリーニング、ＵＨＴＳ−スクリーニング）試験することができる。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
測定の結果を以下に示す：（１）野生型チャネルよりも極めて高い絶対的なｃＡＭＰ感受性を有し、（２）ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに関する選択性が逆になったＣＮＧチャネル突然変異体を作成し、かつ同定した。遺伝子修飾によって、前記のＣＮＧチャネルはｃＡＭＰに関する非常に高い選択的な感受性を獲得する。付加的に両方の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルは、より大きな細胞内ｃＧＭＰ濃度の変化でさえもｃＡＭＰ濃度の測定を妨げないほどｃＧＭＰに関して非感受性である。特に本発明により有利なＴ５３７Ｍ−突然変異体は、細胞性ｃＡＭＰセンサとして特に適している。この突然変異体は、例えば細胞内テストシステムにおいて細胞内ｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼしうる物質の作用の調査のために使用でき、このようなテストシステムを初めて実用可能にする。このようなセンサを用いて更に、例えばＧＰＣＲの活性化によって引き起こされるような細胞内ｃＡＭＰ濃度の僅かな変化も非常に良好な信号／雑音比で確実に確認でき、実時間内で観察できる。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
方法
遺伝的に活発化された（genetisch motivierter）ＣＮＧチャネルの部位特異的突然変異誘発による製造
ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニットに関するｃＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＶ及びＮｓｉＩ）を用いてプラスミドｐＣＨＯＬＦ１０２（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ  Ｗ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｋｒａｕｓ  Ｗ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ  ｕｎｄ  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ．（１９９１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ９８６８−９８７２）から切り出し、ｐｃＤＮＡｌａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このプラスミドをｐｃＡ−ｂｏｌｆと表す。このｃＤＮＡ断片を次いでＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩを介してｐｃＤＮＡ３誘導体中にクローニングした。このプラスミドをｐｃ３−ｂｏｌｆと表す。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
Ｔ５３７Ｍ−α３−サブユニットの製造のための突然変異誘発プライマーは以下の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７）を有していた：
５′−ＣＧＡＣＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴ−３′
Ｔ５３７Ｖ−α３−サブユニットの製造のための突然変異誘発プライマーは以下の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）を有していた：
５′−ＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴ−３′
まず前記の突然変異誘発プライマー及びリバースプライマー＃１８１７（５′−ＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）でのＰＣＲをｐｃ３−ｂｏｌｆ上で実施した。１００μｌのＰＣＲ混合物は１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴａｑポリメラーゼ用の１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ及びそれぞれ１５０ｎｇの両者のプライマーを含有していた。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃での２分間の変性、引き続き９４℃で４５秒、４６℃で４５秒、７２℃で４５秒を２５サイクル。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
４０４塩基対の大きさの断片を精製し、かつ重複する６６６塩基対の大きさのＳｍａＩ／ＰｖｕＩＩ−制限断片と一緒に更なるＰＣＲのための鋳型として使用した。増幅のために両側からのプライマー（die flankierenden Primer）＃１８１３（５′−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０）及び＃１８１７を使用した。このＰＣＲ混合物は前記に示したのと同じ組成を有するが、その際、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡの代わりに鋳型として２５０ｎｇの第一のＰＣＲ断片及び１０ｎｇの制限断片を使用した。このＰＣＲ断片をＢｓｒＧＩで切断し、かつｐｃ３−ｂｏｌｆにおいて相応の断片と交換した。修飾されたＤＮＡ断片の配列を配列決定によって調査した。
ｃＤＮＡクローンの単離
ＣＲＦレセプターのクローニングのためにプライマー＃８４３（５′−ＡＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＡ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）及び＃８４２（５′−ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）でのＰＣＲをラット下垂体の第一鎖ｃＤＮＡ上で実施した。１００μｌのＰＣＲ混合物は１０ｎｇの第一鎖ｃＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴａｑポリメラーゼ用の１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ及びそれぞれ１５０ｎｇの両者のプライマーを含有していた。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃での２分間の変性、引き続き９４℃で４５秒、５６℃で４５秒、７２℃で７５秒を４４サイクル。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
１２７１塩基対の大きさの断片をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−中にクローニングした（ｐＢＣＲＦＲ１）。この配列は公表された配列Ｌ２５４３８（Ｃｈａｎｇ，  ＣＰ，  Ｐｅａｒｓｅ  ＲＶＩＩ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ  Ｓ及びＲｏｓｅｎｆｅｄ  ＭＧ著（１９９３）.  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓａｕｖａｇｉｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｎ，  １１，  １１８７−１１９５）と一致した。異種発現のためにこのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ誘導体中に再クローニングした（ｐｃＣＲＦＲ１）。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
安定な細胞株の製造のために細胞を同様にトランスフェクションさせた。所望の遺伝子を安定に発現する細胞クローンの選択のためにトランスフェクションの翌日に２×１０４個の細胞を９ｃｍの細胞培養皿上に播種した。この細胞を２０日間培養し、その際、細胞培養培地にＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを添加した。２０日後に、耐性遺伝子を発現する細胞クローンを単離し、かつＣＮＧチャネル遺伝子もしくはレセプター遺伝子の発現をウェスタンブロット及び機能的調査（電気生理学的測定及び蛍光光学的測定）によって調査した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を溶解バッファー中に均質化し（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、５回急速冷凍（液体窒素中）し、かつ最後に５５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。膜ペレットを溶解バッファー中に再懸濁（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．５％のトライトンＸ−１００）した。それぞれ３μｇの膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、イモビロン（Immobilon）膜上に移し、かつ特異抗体で標識した。免疫活性をＥＣＬ−検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化させた。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８５】
二重安定細胞株の製造のために、ＣＮＧチャネル遺伝子又はレセプター遺伝子のいずれかを安定して発現する細胞クローンを更に培養し、かつそれぞれ別のｃＤＮＡによるトランスフェクションのために使用した。セレクション及び細胞クローンの選択は前記に記載のように実施した。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８７】
安定な細胞株の蛍光光学的測定のために、これらの細胞を測定の１〜２日前に９６個のウェルを有するマルチウェルプレートに播種した。細胞密度は１．５〜４×１０４細胞であった。
電気生理学
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル及び野生型のＣＮＧチャネルをそれぞれＨＥＫ２９３細胞中で異種発現させた（Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ  ｕｎｄ  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ．（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０）。遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルの電気生理学的特性決定を電圧クランプ条件下にパッチ−クランプ法で実施した。チャネルの活性化特性を測定し、かつ野生型のチャネルの特性と比較した（図１〜４）：
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル又は野生型のＣＮＧチャネルを安定に発現する細胞からインサイドアウト−パッチを切り取った。この膜パッチを浴溶液(Badloesung)中の種々の濃度の環状ヌクレオチドで洗浄（umspuelt）した。このパッチ上に、０ｍＶの保持電圧(保持電位)から出発して、−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶ間のいくつかの試験電圧に２０ｍＶのステップ幅で、電圧ジャンプ（Spannungsspruenge）を施した。電流を標準的方法で検知し、かつ分析した。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０１】
図５Ｂは、副腎皮質ホルモン放出因子（ＣＲＦ）レセプターとα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ突然変異体のいずれも安定に発現する細胞中の細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定された変化を示している。アゴニストのＣＲＦでの細胞の刺激の後の蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をＣＲＦで刺激した時点を示している。ＣＲＦレセプターのＣＲＦに誘導される活性化は、細胞中にまず刺激性Ｇタンパク質の活性化をもたらし、かつ最終的にｃＡＭＰを合成するアデニル酸シクラーゼの活性化をもたらす（例えばＥｃｋａｒｔ  Ｋ，  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ  Ｊ，  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ  Ｍ，  Ｊａｈｎ  Ｏ，  Ｂｌａｎｋ  Ｔ，  Ｓｔｉｅｄｌ  Ｏ．  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｓｓ  Ｊ．  （１９９９）  Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＦ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １０３５−１０５３；  Ｐｅｒｒｉｎ，  Ｍ．Ｈ  ａｎｄ  Ｖａｌｅ，  Ｗ．Ｗ  （１９９９）．Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ．  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８５，  ３１２−３２８を参照）。ｃＡＭＰの結合によってＣＮＧチャネルが開放し、かつＣａ２＋イオンが細胞内に流入する。Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はＣＲＦ濃度に依存する。ＣＲＦ濃度は１００ｐＭ（塗りつぶしの三角）、３００ｐＭ（白抜きの丸）又は１０００ｐＭ（塗りつぶしの丸）であった。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
図５Ｃは、この方法が種々のアンタゴニストの作用を定量的に測定するために適している。副腎皮質ホルモン放出因子（ＣＲＦ）レセプター及びα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞をヘリックス型（helikalen）のアンタゴニスト９−４１（Ｒｉｖｉｅｒ  Ｊ，  Ｒｉｖｉｅｒ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｖａｌｅ，  Ｗ．Ｗ．  （１９８４）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ＡＣＴＨ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  ８８９−８９１）で処理し、それからＣＲＦ（１ｎＭ）で刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をＣＲＦで刺激した時点を示している。同じＣＲＦ濃度ではＣａ２＋濃度の変化の速度及び程度はアンタゴニストの濃度に依存する。アンタゴニストの濃度は０ｎＭ（塗りつぶしの丸）、１０ｎＭ（白抜きの丸）又は１００ｎＭ（塗りつぶしの三角）であった。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０４】
図５Ｄは、この方法が一定の酵素アクチベーターの作用を測定するために適していることを示している。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化に対するアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）のアクチベーターの効果を示している。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を種々の濃度のＡＣアクチベーターのフォルスコリンで刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をフォルスコリンで刺激した時点を示している。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
図５Ｅは、この方法が規定の酵素インヒビターの作用を測定するために適していることを示している。細胞内Ｃａ２＋濃度のフォルスコリンに誘導される変化に対するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）インヒビターの効果を示している。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を、まず種々の濃度のＰＤＥインヒビターのＩＢＭＸで処理し、次いで５μＭのフォルスコリンで刺激した。蛍光強度の時間的過程がプロットされている。矢印は細胞をフォルスコリンで刺激した時点を示している。ＰＤＥインヒビターは内因性ＰＤＥの活性を阻害し、かつそれによって内因性ＡＣの刺激によって合成されるｃＡＭＰの分解を低減させる。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の程度はＰＤＥインヒビターの濃度に依存する。ＩＢＭＸ濃度は０μＭ（塗りつぶしの丸）、１０μＭ（白抜きの丸）、５０μＭ（塗りつぶしの三角）又は１００μＭ（白抜きの三角）であった。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
図５Ｆ（１）は、この方法によって定量分析も可能であることを示している。内因性アデノシンレセプター（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｊ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｓ．Ｊ．及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｓ．Ｐ．著（１９９７）：“Ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ａ２Ｂ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  （ＨＥＫ  ２９３）  ｃｅｌｌｓ”，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １２２，  ５４６−５５０）及びα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を種々の濃度のアデノシンで刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をアデノシンで刺激した時点を示している。アデノシンレセプターのアデノシンに誘導される活性化は細胞中にまず刺激性Ｇタンパク質の活性化をもたらし、かつ最終的にｃＡＭＰを合成するアデニル酸シクラーゼの活性化をもたらす。ｃＡＭＰの結合によってＣＮＧチャネルが開放し、かつＣａ２＋イオンが細胞内に流入する。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はアデノシン濃度に依存する。アデノシン濃度は０．９μＭ（塗りつぶしの丸）及び１．５μＭ（白抜きの丸）、３μＭ（塗りつぶしの三角）、６μＭ（白抜きの三角）、２５μＭ（塗りつぶしの四角）又は３７．５μＭ（白抜きの四角）であった。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１２】
図５Ｆ（２）はアデノシンについての用量−作用関係を示している。アデノシンの添加後に蛍光が変化する速度（初期速度）はアデノシンの濃度に相関する。初期速度はアデノシン濃度に対してプロットされている。実線はヒル式：初期勾配（Anfangssteigung）＝ａ×ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）ｎ（ｃ＝アデノシン濃度、Ｋ：初期速度が最大値の半分に達する濃度、ｎ：ヒル係数、ａ＝最大初期勾配）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：ａ＝１４０３ＲＦＵ／秒、Ｋ＝５．１５μＭ、ｎ＝２．１６）。こうして計算されたＫ１／２値は文献に挙げられる５μＭの値と非常に良好に一致する（Ｐｅａｋｍａｎ，  Ｍ．Ｃ．及びＨｉｌｌ，  Ｓ．Ｊ．著  （１９９４）  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ｂ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ａｔｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １１１，  １９１−１９８）。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１３】
図５Ｇはα３−ＣＮＧチャネルの修飾されたサブユニットの使用による測定系の感度の相当の改善を裏付けている。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞は３μＭのアデノシン（白抜きの丸）で最大刺激の半分（halbmaximal）まで刺激され、又は２５μＭのアデノシン（塗りつぶしの丸）で最大刺激された。細胞内Ｃａ２＋濃度（蛍光シグナル）の変化の程度は時間に対してプロットされた。矢印は細胞をアデノシンで刺激した時点を示している。最大刺激の半分を示すアデノシン濃度による刺激の後に、すでに蛍光シグナルの明らかな上昇が観察できる。それに対して、野生型のα３−ＣＮＧチャネルを安定に発現する細胞は２５μＭのアデノシンでの最大の刺激の後でさえも、蛍光シグナル（塗りつぶしの三角）の増大を示さない。比較するとα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｓ−突然変異体を安定に発現する細胞も刺激された。内因性のアデノシンレセプターの最大刺激の後に、非常に僅かな蛍光シグナルの上昇だけが観察できる（塗りつぶしの四角）。