【手続補正書】
【提出日】平成17年5月13日(2005.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の好ましい目的は、ヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂサブユニットポリペプチド（好ましくは、それぞれ配列番号９、１０及び１１に含まれるアミノ酸配列を有する）のそれぞれ、または、当該各サブユニットポリペプチドのＤＮＡ配列又はフラグメントによりコードされる機能的キメラ又は突然変異体を機能的に発現する細胞系を生産することである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（ポリヌクレオチド及びタンパク質の変異体）
本発明はまた、本明細書に開示するヌクレオチド及びタンパク質サブユニット配列の変異体及び突然変異体、特に、そのようなサブユニットから形成されているＣＮＧチャンネルの活性を変化させる突然変異体を含む配列を包含する。ＯＣＮＣ１の特に好ましい突然変異体は、それらが、シスチンのトリプトファンへの変更を生じる１３７４位での変異及び／又はグルタミン酸のメチオニンへの変更を生じる１７４１及び１７４２での変異を有するので、その配列が配列番号１及び９と異なる配列番号４及び１２により表される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（ＧＰＣＲ及びｃＡＭＰ濃度を制御する他のタンパク質のアッセイ）
本発明はまた、環状ヌクレオチド濃度を制御するタンパク質のアッセイを包含する。そのようなアッセイとしては、環状ヌクレオチド濃度の変化で生じるＣＮＧチャンネル活性の変化を測定するように設計されたアッセイが挙げられる。好ましくは、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］（配列番号１２）のようなサブユニット変異体を利用する増感嗅覚器ＣＮＧチャンネルを用いて、これらのアッセイの感度を増加させることができる。このようなアッセイを用いて、アデニル酸シクラーゼ又はホスホジエステラーゼを制御するＧタンパク質に結合するＧＰＣＲの活性を定量し、高処理能力スクリーニングによりＧＰＣＲ調節物質を特定することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
Ｒｉｃｈら（２００１年）は、高いｃＡＭＰ感受性を有するラットＯＣＮＣ１  ＣＮＧチャンネルの突然変異体を構築し、特徴付けを行った。我々は、対応するｈＯＣＮＣ１［Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍ］突然変異体（配列番号１２）を産生させ、プラスミドＳＡＶ２４８０に移入したところ、それがβ１ｂと共に高いｃＡＭＰ感受性と頑強な活性を有することが認められた（図８）。この高い感受性は、このヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル変異体がｃＡＭＰバイオセンサーとして機能することと、ＧＰＣＲ及びｃＡＭＰ濃度を制御する他のタンパク質用の全細胞を用いる蛍光アッセイの開発を可能にするものであることを示唆している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】ヒトゲノムは３種のラット嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットのオーソログを含む。対配列の相同性は、パラログで３０〜５０％、オーソログで８４〜９０％である。ラット及びヒトＣＮＧチャンネルサブユニットのＣ末端環状ヌクレオチド結合ドメインに対応する配列を示す。本発明のヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂ嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットは、それぞれ配列番号９〜１１であり、ラットＣＮＧチャンネルサブユニットＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂのデータベース配列は、それぞれ受入番号ＮＭ＿０１２９２８、ＮＭ＿０５３４９６及びＡＪ０００５１５（それぞれ配列番号５〜７）である。
【図２】ｈＯＣＮＣ１の配列（配列番号１）。このｃＤＮＡ配列は、クローンゲノム区分ＨＳＡＦ００２９９２に含まれているｈＯＣＮＣ１対立遺伝子に対応する。
【図３】ｈＯＣＮＣ２の配列（配列番号２）。このｃＤＮＡ配列は、クローンゲノム区分ＡＣ０２２７６２に含まれているｈＯＣＮＣ２対立遺伝子に対応する。
【図４】ｈβ１ｂの配列（配列番号３）。このｃＤＮＡ配列は、新規の対立遺伝子に相当する。
【図５】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性はサブユニット構成に依存する。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、カルシウム色素を負荷した細胞について、５０μＭフォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図６】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性の膜電位に基づく蛍光アッセイは、頑強である。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０及びＺ因子値を２つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図７】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性のカルシウムに基づく蛍光アッセイは、頑強である。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素（黒色）又はカルシウム色素（灰色）を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌ又はイオノマイシンの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０値を４つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図８】ヒトＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂは、増感ＣＮＧチャンネルを形成する。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０及びＺ因子値を２つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］を「１＊」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図９】嗅覚受容体活性は、異種細胞におけるヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルに連結させることができる。ＨＥＫ−２９３細胞にマウス嗅覚受容体ｍＯＲＥＧ、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂをトランスフェクトし、カルシウム色素を負荷し、嗅覚刺激物質オイゲノールで刺激した。応答細胞の数を蛍光顕微鏡法により測定し、Ｇα１５及びｍＯＲＥＧをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞、ｍＯＲＥＧをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞の数と比較した。
【図１０】安定に発現しているヒトＣＮＧチャンネルサブユニットは、一時的にトランスフェクトされたサブユニットよりもオイゲノールに対して感受性が高い。ＨＥＫ−２９３細胞がヒトＣＮＧサブユニットｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂを安定的又は一時的に発現しており、ｍＯＲＥＧを一時的にトランスフェクトした。細胞を種々の濃度のオイゲノールで刺激し、Ｆｌｕｏ−４を用いた蛍光顕微鏡法を用いてカルシウム流入を測定した。ｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂサブユニットについて同様な結果が得られた（データは示さず）。
【図１１】安定に発現している野生型又は増強ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットは、受容体媒介性活性化及びアデニル酸シクラーゼ活性化化合物に対して応答する。（図１１ａ）ｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂもしくはｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を種々の濃度のβ２受容体リガンドイソプロテラノールで刺激し、カルシウムの流入をＦｌｕｏ−４を用いてＦＬＩＰＲ−１で測定した。（図１１ｂ）ｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂもしくはｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を種々の濃度アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンで刺激し、カルシウムの流入をＦｌｕｏ−４を用いてＦＬＩＰＲ−１で測定した。