【手続補正書】
【提出日】平成18年8月25日(2006.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)送達薬剤；ならびに
(b)(i)ドナー・フルオロフォア；
(ii)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および
(iii)クロストリジウム毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるクロストリジウム毒素認識配列（ここに、クロストリジウム毒素切断部位領域は、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプターとの間にある）
を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素基質を含有する、基質組成物。
【請求項２】
送達薬剤がクロストリジウム毒素基質に共有結合している、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３】
送達薬剤がタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項２に記載の基質組成物。
【請求項４】
クロストリジウム毒素基質に動作可能に縮合している送達薬剤を含むキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項５】
送達薬剤がアンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項６】
アンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメントがアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１）を有する、請求項５に記載の基質組成物。
【請求項７】
送達薬剤がHIV TATタンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項８】
HIV TATタンパク質またはその活性フラグメントがアミノ酸配列YGRKKRRQRRR（配列番号２）を有する、請求項７に記載の基質組成物。
【請求項９】
送達薬剤が単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項１０】
単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の基質組成物。
【請求項１１】
送達薬剤がクロストリジウム毒素基質と非共有結合している、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項１２】
送達薬剤がChariotTMおよびMPGペプチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の基質組成物。
【請求項１３】
クロストリジウム毒素基質が、ボツリヌス毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるボツリヌス毒素認識配列を含むボツリヌス毒素基質を含有する、請求項１１に記載の基質組成物。
【請求項１４】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/A P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項１５】
BoNT/A認識配列が、Gln-Argを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項１４に記載の基質組成物。
【請求項１６】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/B P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/B認識配列を含むBoNT/B基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項１７】
BoNT/B認識配列が、Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項１６に記載の基質組成物。
【請求項１８】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/C1 P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項１９】
BoNT/C1認識配列が、Lys-Alaを含むシンタキシンの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項１８に記載の基質組成物。
【請求項２０】
BoNT/C1認識配列が、Arg-Alaを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項１８に記載の基質組成物。
【請求項２１】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/D P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項２２】
BoNT/D認識配列が、Lys-Leuを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項２１に記載の基質組成物。
【請求項２３】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/E P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/E認識配列を含むBoNT/E基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項２４】
BoNT/E認識配列が、Arg-Ileを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項２３に記載の基質組成物。
【請求項２５】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/F P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/F認識配列を含むBoNT/F基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項２６】
BoNT/F認識配列が、Gln-Lysを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項２５に記載の基質組成物。
【請求項２７】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/G P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/G認識配列を含むBoNT/G基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
【請求項２８】
BoNT/G認識配列が、Ala-Alaを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項２７に記載の基質組成物。
【請求項２９】
クロストリジウム毒素基質が、TeNT P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるTeNT認識配列を含むTeNT基質を含有する、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３０】
TeNT認識配列が、Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物を含む、請求項２９に記載の基質組成物。
【請求項３１】
ドナー・フルオロフォアがフルオレセイン、Alexa Fluor（登録商標）488、DABCYLおよびBODIPYからなる群から選択される、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３２】
アクセプターがアクセプター・フルオロフォアである、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３３】
アクセプター・フルオロフォアが少なくとも１マイクロ秒の蛍光寿命を有する、請求項３２に記載の基質組成物。
【請求項３４】
アクセプターがテトラメチルローダミン、EDANSおよびQSY（登録商標）7からなる群から選択される、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３５】
アクセプターが非蛍光である、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項３６】
ペプチドまたはペプチド模倣物が最大１００残基を有する、請求項４に記載の基質組成物。
【請求項３７】
ペプチドまたはペプチド模倣物が最大５０残基を有する、請求項４に記載の基質組成物。
【請求項３８】
(a)ドナー・フルオロフォア；
(b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および
(c)クロストリジウム毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるクロストリジウム毒素認識配列（ここに、クロストリジウム毒素切断部位領域は、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプターとの間にある）
を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素基質を含有する、細胞。
【請求項３９】
トランスフェクト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
安定なトラスフェクト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４１】
初代細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４２】
株化細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４３】
ヒト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４４】
ニューロンである、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４５】
中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンである、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４６】
末梢ニューロンである、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４７】
神経芽細胞腫、脊髄ニューロン、後根神経節ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンおよび運動ニューロンからなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の細胞。
【請求項４８】
神経芽腫細胞である、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４９】
非神経細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項５０】
膵腺房細胞である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５１】
(a)ドナー・フルオロフォア；
(b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および
(c)クロストリジウム毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるクロストリジウム毒素認識配列（ここに、クロストリジウム毒素切断部位領域は、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプターとの間にある）
を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含む、細胞。
【請求項５２】
核酸分子が安定にトランスフェクトされている、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
ヒト細胞である、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５４】
神経細胞である、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５５】
非神経細胞である、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５６】
核酸分子が構成性調節エレメントに連結されている、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５７】
核酸分子が誘導性調節エレメントに連結されている、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５８】
誘導性プロモーターがテトラサイクリン調節型調節エレメントまたはエクジソン誘導性調節エレメントである、請求項５７に記載の細胞。
【請求項５９】
クロストリジウム毒素基質が、遺伝子的にコードされたドナー・フルオロフォア、遺伝子的にコードされたアクセプター、または遺伝子的にコードされたドナー・フルオロフォアおよび遺伝子的にコードされたアクセプターの両方を含む、請求項５１に記載の細胞。
【請求項６０】
遺伝子的にコードされたドナー・フルオロフォアまたは遺伝子的にコードされたアクセプターが、青色蛍光タンパク質、シアンブルー色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
(a)(i)ドナー・フルオロフォア;
(ii)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター;および、
(iii)クロストリジウム毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるクロストリジウム毒素認識配列（ここに、クロストリジウム毒素切断部位領域は、前記ドナー・フルオロフォアと前記アクセプターとの間にある）
を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素基質を含有する細胞を、試料と接触させること；
(b)該ドナー・フルオロフォアを励起すること；および
(c)前記接触細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して測定すること（ここに、該コントロール細胞と比較した場合の該接触細胞の共鳴エネルギー転移における差異は、クロストリジウム毒素活性を示す）
を特徴とする、クロストリジウム毒素活性を測定する方法。
【請求項６２】
クロストリジウム毒素基質が、ボツリヌス毒素P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるボツリヌス毒素認識配列を含むボツリヌス毒素基質を含有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/A P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/B P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/B認識配列を含むBoNT/B基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/C1 P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/D P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/E P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/E認識配列を含むBoNT/E基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/F P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/F認識配列を含むBoNT/F基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ボツリヌス毒素基質が、BoNT/G P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるBoNT/G認識配列を含むBoNT/G基質を含有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
クロストリジウム毒素基質が、TeNT P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'切断部位領域からなるTeNT認識配列を含むTeNT毒素基質を含有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
試料が未精製の細胞溶解物である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
試料が単離したクロストリジウム毒素である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７３】
試料が製剤化クロストリジウム毒素製品である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７４】
試料がＢＯＴＯＸ（登録商標）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７５】
試料が食品である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７６】
アクセプターがフルオロフォアであり、段階(c)が前記接触細胞のドナー蛍光強度を検出することを含み、基質切断の増加が前記コントロール細胞と比較した該接触細胞のドナー蛍光強度の増加を生じ、その増加したドナー蛍光強度がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項７７】
アクセプターがフルオロフォアであり、段階(c)が前記接触細胞のアクセプター蛍光強度を検出することを含み、基質切断の増加が前記コントロール細胞と比較した該接触細胞のアクセプター蛍光強度の減少を生じ、その減少したアクセプター蛍光強度がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項７８】
アクセプターがフルオロフォアであり、段階(c)が前記接触細胞のアクセプター発光極大およびドナー・フルオロフォア発光極大を検出することを含み、基質切断の増加が該アクセプター発光極大付近から該ドナー・フルオロフォア発光極大付近への発光極大のシフトを生じ、その発光極大のシフトがクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項７９】
アクセプターがフルオロフォアであり、段階(c)がアクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対する比を検出することを含み、基質切断の増加がコントロール細胞と比較した前記接触細胞の比の減少を生じ、その減少した比がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項８０】
アクセプターがフルオロフォアであり、段階(c)が前記接触細胞におけるドナー・フルオロフォアの励起状態寿命を検出することを含み、基質切断の増加が前記コントロール細胞と比較した該接触細胞のドナー・フルオロフォア励起状態寿命の増加を生じ、その減少した比がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項８１】
段階(c)を時間間隔の後に１回以上反復することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項８２】
クロストリジウム毒素活性に適した条件を選択して、アッセイが線形であるようにする、請求項６１に記載の方法。
【請求項８３】
アクセプターがクエンチャーであり、段階(c)が前記接触細胞のドナー蛍光強度を検出することを含み、基質切断の増加が前記コントロール細胞と比較した該接触細胞のドナー蛍光強度の増加を生じ、その増加したドナー蛍光強度がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項８４】
ドナー・フルオロフォアが遺伝子的にコードされたフルオロフォアである、請求項６１に記載の方法。
【請求項８５】
アクセプターが遺伝子的にコードされたフルオロフォアである、請求項６１に記載の方法。
【請求項８６】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターがともに、遺伝子的にコードされたフルオロフォアである、請求項６１に記載の方法。
【請求項８７】
遺伝子的にコードされたフルオロフォアが青色蛍光タンパク質、シアンブルー色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項８４、８５または８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが最大７０残基により分離される、請求項６１に記載の方法。
【請求項８９】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが最大１００残基により分離される、請求項６１に記載の方法。
【請求項９０】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが最大１５０残基により分離される、請求項６１に記載の方法。
【請求項９１】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが最大２００残基により分離される、請求項６１に記載の方法。
【請求項９２】
ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが天然由来クロストリジウム毒素標的タンパク質の全長により分離される、請求項６１に記載の方法。