【手続補正書】
【提出日】平成18年2月13日(2006.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現の低下をモニタリングする方法であって、以下のステップ：
a)  第1領域、第2領域、第3領域および第4領域を含むdsRNAを真核細胞に供給すること、ただし、
i)   第1領域は、標的遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
ii)  第2領域は、標的遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
iii) 第1領域と第2領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、
iv)  第3領域は、前記標的遺伝子とは異なる、前記真核細胞中に存在する第2遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
v)   第4領域は、第2遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの前記19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
vi)  第3領域と第4領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、および
b)  第2遺伝子の発現低下を分析することにより標的遺伝子の発現の低下をモニタリングすること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記真核生物が植物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記真核生物が動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記真核生物が酵母、真菌またはカビである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記真核生物がワタ、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、イネ、サトウキビ、アブラナ、シロイヌナズナ、サトウダイコン、タバコおよびダイズからなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記真核生物が昆虫、甲殻動物、軟体動物、甲殻綱の動物、カニ、ロブスター、エビ、魚類、鳥類、哺乳動物およびヒトからなる群より選択される、請求項1または3に記載の方法。
【請求項７】
第2遺伝子が前記真核細胞中に存在する内在性遺伝子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
第2遺伝子が前記真核細胞のゲノムに安定に組み込まれたトランスジーンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
第2遺伝子がPDS、EIN2、FLCおよびPhyBからなる群より選択される、請求項2または5に記載の方法。
【請求項１０】
前記真核細胞が機能的に発現されるGUSまたはGFP遺伝子を含み、第2遺伝子がGUSまたはGFP遺伝子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
第1および第2領域、ならびに第3および第4領域が約300ntの長さである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記dsRNAが前記真核生物の細胞内に含まれるキメラ遺伝子から転写され、前記キメラ遺伝子が、
a)  前記真核細胞において機能するプロモーター領域、これに機能的に連結された
b)  転写されたとき前記dsRNA分子をもたらすDNA領域、および
c)  前記真核細胞において機能する転写終結およびポリアデニル化領域、
を含むものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラ遺伝子が前記真核生物の細胞のゲノムに安定に組み込まれている、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項に記載されるRNA分子。
【請求項１５】
標的遺伝子の発現の低下を測定するための請求項14に記載のRNA分子の使用。
【請求項１６】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現の低下を測定するためのDNA分子であって、
a)  前記真核細胞において機能するプロモーター領域、これに機能的に連結された
b)  転写されたとき、第1、第2、第3および第4領域を含むdsRNA分子をもたらすDNA領域、ただし
i)   第1領域は、標的遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
ii)  第2領域は、標的遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
iii) 第1領域と第2領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、
iv)  第3領域は、前記標的遺伝子とは異なる、前記真核細胞中に存在する第2遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
v)   第4領域は、第2遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの前記19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
vi)  第3領域と第4領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、および
c)  前記真核細胞において機能する転写終結およびポリアデニル化領域、
を含んでなり、ここにおいて、第2遺伝子は前記真核生物の内在性遺伝子であるか、または前記真核生物の細胞のゲノムに安定に組み込まれたトランスジーンである、上記DNA分子。
【請求項１７】
第2遺伝子の発現の低下を測定することにより標的遺伝子の発現を測定するための請求項16に記載のDNA分子の使用。
【請求項１８】
請求項14に記載のRNA分子を含む非ヒト真核生物。
【請求項１９】
請求項16に記載のDNA分子を含む非ヒト真核生物。
【請求項２０】
植物である、請求項18または19に記載の非ヒト真核生物。
【請求項２１】
動物である、請求項18または19に記載の非ヒト真核生物。
【請求項２２】
酵母、真菌またはカビである、請求項18または19に記載の非ヒト真核生物。
【請求項２３】
dsRNA介在遺伝子サイレンス化真核生物の集団内で、標的遺伝子の所望の程度のサイレンシングを有する生物を同定する方法であって、
a)  前記真核生物の細胞に、第1領域、第2領域、第3領域および第4領域を含むdsRNAを供給すること、ただし、
i)   第1領域は、標的遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
ii)  第2領域は、標的遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
iii) 第1領域と第2領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、
iv)  第3領域は、前記標的遺伝子とは異なる、前記真核細胞中に存在する第2遺伝子のセンスヌクレオチド領域からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
v)   第4領域は、第2遺伝子の前記センスヌクレオチド領域からの前記19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
vi)  第3領域と第4領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、および
b)  第2遺伝子の所望の程度のサイレンシングを有する生物を選択することにより、前記標的遺伝子の所望の程度のサイレンシングを有する生物を同定すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２４】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現の低下を調節する方法であって、以下のステップ：
a)  第1領域、第2領域、第3領域および第4領域を含むdsRNAを真核細胞に供給すること、ただし、
i)   第1領域は、標的遺伝子のセンスヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
ii)  第2領域は、標的遺伝子の前記センスヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
iii) 第1領域と第2領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、
iv)  第3領域と第4領域は、前記標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して50％より低い配列同一性を有しかつ二本鎖RNAを形成することができる相補的ヌクレオチド配列を含むこと、
を含んでなり、ここにおいて、前記標的遺伝子は前記真核細胞中の内在性遺伝子であるか、または前記真核細胞のゲノムに安定に組み込まれたトランスジーンである、上記方法。
【請求項２５】
第3領域と第4領域との塩基対合により形成される二本鎖RNAのサイズが、第1領域と第2領域との塩基対合により形成される二本鎖RNAのサイズに等しいか、またはそれより大きい、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記真核生物が植物である、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２７】
前記真核生物が動物である、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２８】
前記真核生物が酵母、真菌またはカビである、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物がワタ、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、イネ、サトウキビ、アブラナ、シロイヌナズナ、サトウダイコン、タバコおよびダイズからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が昆虫、甲殻動物、軟体動物、甲殻綱の動物、カニ、ロブスター、エビ、魚類、鳥類、哺乳動物およびヒトからなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのRNA分子であって、第1領域、第2領域、第3領域および第4領域を含んでなり、ただし、
i)   第1領域は、標的遺伝子のセンスヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
ii)  第2領域は、標的遺伝子の前記センスヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも94％の配列同一性を有する少なくとも19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこと、
iii) 第1領域と第2領域は、二本鎖RNA領域を形成することができること、
iv)  第3領域と第4領域は、前記標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して50％より低い配列同一性を有しかつ二本鎖RNAを形成することができる相補的ヌクレオチド配列を含むこと、
を特徴とし、ここにおいて、前記標的遺伝子は前記真核細胞中の内在性遺伝子であるか、または前記真核細胞のゲノムに安定に組み込まれたトランスジーンである、上記RNA分子。
【請求項３２】
請求項31に記載のdsRNA分子を生成することができるDNA分子であって、転写されたとき前記dsRNA分子をもたらすDNA領域を含んでなり、前記DNA領域がプロモーターならびに転写終結およびポリアデニル化シグナルと機能的に連結されている、上記DNA分子。
【請求項３３】
真核生物における標的遺伝子の発現の低下を調節するための請求項31に記載のRNA分子の使用。
【請求項３４】
真核生物における標的遺伝子の発現の低下を調節するための請求項32に記載のDNA分子の使用。
【請求項３５】
請求項32に記載のDNA分子を含む非ヒト真核生物。
【請求項３６】
請求項31に記載のRNA分子を含む非ヒト真核生物。