【手続補正書】
【提出日】平成18年6月9日(2006.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞タンパク質に結合したときに、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも２０，０００倍増大した純度を有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも５０，０００倍増大した純度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、ＳＤＳゲル電気泳動によって概算される場合、約４８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、ＳＤＳゲル電気泳動によって概算される場合、約５８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
細胞タンパク質と結合した場合、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画したときに、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも２０，０００倍増大した純度を有する精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記キナーゼが、少なくとも５０，０００倍増大した純度を有する、請求項５に記載の精製タンパク質。
【請求項７】
ＰＫＢペプチド基質が３２Ｐ標識ホスフェートでリン酸化させるキナーゼアッセイで検出される場合、０．２μｇのタンパク質中で測定可能なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、前記キナーゼが、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出する精製細胞抽出物。
【請求項８】
前記キナーゼがゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、約５５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出する、請求項７に記載の精製細胞抽出物。
【請求項９】
前記キナーゼは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗抽出物と比較して、少なくとも５０，０００倍豊富である、請求項７または８に記載の精製細胞抽出物。
【請求項１０】
（ｉ）動物に、免疫原性的に有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ免疫原を投与し；
（ｉｉ）前記動物に、免疫原に対する抗体を産生させ；そして
（ｉｉｉ）前記動物から、またはそこから誘導される細胞培養物から抗体を得る
段階を含む、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質に選択的に結合する抗体を産生する方法。
【請求項１１】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ特異的抗体。
【請求項１２】
ｉ）請求項５または６の精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし；
ｉｉ）ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定し；
ｉｉｉ）前記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における改変を検出し、該改変が、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターを有する
段階を含む、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターについてのスクリーニングをする方法。
【請求項１３】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における前記改変は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における減少であり、前記減少は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの強力な阻害剤を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における前記改変は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における増大であり、前記増大は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの強力なアクチベーターを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーター。
【請求項１６】
医薬品として使用するための請求項１５に記載のモジュレーター。
【請求項１７】
細胞成長に関連した症状の処置または予防的処置のための医薬品の製造のための請求項１５のモジュレーターの使用。
【請求項１８】
前記症状が、腫瘍細胞成長である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記モジュレーターが、アクチベーターである、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害の処置または予防的処置のための医薬品の製造のための請求項１５のモジュレーターの使用。
【請求項２０】
癌細胞を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤と接触させることを含む、癌細胞成長を阻害する方法。
【請求項２１】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤を含む、細胞成長での異常に関連した疾患の処置剤。
【請求項２２】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼアクチベーターを投与することを含む、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害での異常に関連した疾患の処置剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、キナーゼの機構の綿密な生化学的分析を促進し、それは、メカニズムに基づくレギュレーターの開発について洞察力を供し得る。精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼも、ホスホ特異的抗体を含めた、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに対する抗体の作製に有用である。このような抗体は、次に、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する試薬として特に有用であり、癌診断または予後に有用である可能性がある。精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの種々の突然変異体またはフラグメントを設計する上で有用なアミノ酸配列情報を提供する助けにもなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
発明の詳細な記載
タンパク質キナーゼＢの全活性化（ＰＫＢ／Ａｋｔ）は、残基Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３でのリン酸化を必要とする。現在まで、Ｓｅｒ４７３キナーゼの同定は、不明なままである。本発明者らは、ＰＫＢと３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−１（ＰＤＫ−１）の細胞質ゲルの分布と異なった、浮揚性の洗剤不溶性原形質膜ラフトに富んだ、構造的に活性なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を単離、精製および特徴付けした。このＳｅｒ４７３キナーゼ活性は、高塩によって膜から放出され、ゲル濾過分析は、原因であるキナーゼが、約５００ｋＤａの大型複合体中に存在することを有する。４８ｋＤａと５８ｋＤａの２つの主要なホスホプロテインを、部分的に精製されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤で検出した。先の観察と対照的に、本発明者らは、インテグリン連結キナーゼ（ＩＬＫ）免疫沈澱物が、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を保持しないことを証明できた。したがって、本発明者らは、ＰＫＢシグナル発生に役割を果し、ＩＬＫと異なるラフト結合ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３を同定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
「精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ」は、粗ＨＥＫ２９３細胞抽出物より少なくとも２０００倍に増大した相対純度を有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤を示す。本明細書で使用される場合、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤は、その製剤でのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの特異的活性が、本明細書で以下に記載され、実施例１において後記したようなインビトロキナーゼアッセイによって測定される通り、懸濁可能な２９３細胞の粗全細胞抽出物のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの特異的活性より、少なくとも２０００倍大きい場合、２０００倍増大した相対純度を有する。「実質的に純粋な」は、目的種が、存在する主要な種（すなわち、モル基準で、組成物中の他のあらゆる個々の有機生物分子種よりいっそう富んでいる）であること、および実質的に精製分画は、目的種が、存在する全ての有機生物分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を包含する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する約８０％から９０％まで、またはそれ以上の有機生物分子種が、目的の精製種であることを意味する。組成物が、基本的に単一の有機生物分子種から構成される場合、目的種を、基本的に均質（通常の検出方法により、混入種を、組成物中に検出できないこと）になるまで精製する。「有機生物分子」は、生物学的起源の有機分子、たとえば、タンパク質、核酸、炭化水素または脂質を示す。溶媒種、小分子化合物（＜５００ダルトン）、安定化剤（たとえば、ＢＳＡ）、および元素イオン種（elemental ion species）は、この定義の目的のための有機生物分子種と考えられない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
「ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ」または「Ｓｅｒ４７３キナーゼ」は、ここで相互に交換可能に使用され、インビボでＰＫＢのＳｅｒ４７３部位のリン酸化の原因であるキナーゼを示す。Ｓｅｒ４７３について本明細書で参照されるが、この部位の番号付けは、どのキナーゼまたはキナーゼ・イソ型がリン酸化されるかにより変動する可能性があることは、当業者に明らかである。したがって、疎水性モチーフ内に典型的にある、調節リン酸化部位は、ＰＫＢについてＰＫＢαのＳｅｒ−４７３、ＰＫＢβのＳｅｒ４７４、およびＰＫＢγのＳｅｒ４７２である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、これらの部位でのインビボでのこれらのＰＫＢイソ型のリン酸化にのみでなく、類似構造の他のキナーゼの対応の部位にも原因があると考えられる。キナーゼＮＤＲは、この位置で配列ＦＸＸＹ（ここでＸは、あらゆるアミノ酸を表す）を有するが、これらのキナーゼの調節リン酸化部位は、少なくとも４個のアミノ酸の疎水性モチーフ、および典型的に長さ６個のアミノ酸残基を含み、それは、典型的に、配列ＦＸＸＦ、たとえば、ＦＸＸＦＸＹ／ＦまたはＦＸＸＦ（Ｓ／Ｔ）（Ｙ／Ｆ）を含む調節セグメント中で見いだせる。調節リン酸化部位は、典型的には、疎水性モチーフ内にあり、たとえば、ＰＫＢアルファ、ベータおよびガンマは全て、それらの調節セグメント内に配列ＦＰＱＦＳＹを有する。特に、他のキナーゼは、限定なしに、ＳＧＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ９０ＲＳＫ、ＰＫＣ、ＮＤＲ、または疎水性モチーフを有するあらゆるキナーゼを含めたＡＧＣファミリー構成要素を含み、それは、本発明のＳｅｒ４７３キナーゼによってリン酸化され得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法では、しばしば、製剤中でのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの存在または量、またはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定するために有用である。本発明者らは、Ｓｅｒ４７３キナーゼおよびＳｅｒ４７３キナーゼ活性を同定する特異的アッセイを開発した。実施例１で記載される通り、このアッセイで、ＨＥＫ２９３細胞から発生される細胞成分分画中でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性は、２つのペプチドを基質として使用して、インビトロで測定される：ＰＫＢαの最後の１６個のアミノ酸に対応するＲＲＰＨＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡ（ＦＳＹペプチド；配列番号：１）、および対照ペプチド、ＲＲＰＨＦＰＱＦＡＹＳＡＳＳＴＡ（配列番号：２）（Ｓｅｒ４７３がアラニンに代えられている（ＦＡＹペプチド））。これらの２つのペプチドは、いくつかの理由で基質として使用される。ＦＳＹおよびＦＡＹペプチドを使用することによって、Ｓｅｒ４７３部位に特異的なキナーゼ活性を都合よく同定することが可能である。ＦＡＹペプチドを用いた結果は、この配列中の他のＳｅｒ／ＴｈｒまたはＴｙｒ残基をリン酸化する能力のある部分的に精製された分画でのキナーゼ活性の存在を有する。したがって、両方のペプチドを基質として使用しながらキナーゼ活性を監視することによって、特異的Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を検出できる。典型的には、タンパク質濃度も、当業界に知られる方法（たとえば、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）比色定量分析法）を使用して、精製の各段階で、測定される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
使用される特異的精製段階およびそれらの配列は、実施者の随意による。しかし、以下の指針が提供される。一般に、高許容量および比較的低い選択性を有する段階で始まり、続いて、中間体許容性および／または選択性を有する段階、続いて低い許容性および高い選択性を有する段階が開始することが好ましい。実質的精製が、細胞分画を通して達成される場合、細胞の原形質膜分画を使用し、細胞の細胞質ゲルまたは核分画を使用しないことが好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの精製は、好ましくはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性に富んだ、粗細胞抽出物のような、不純源組成物を用いて始まる。セルラインは、それらが、大量に培養および収集され、それにより大規模ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤についての細胞分画を提供し得るので、粗ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤の特に有用な源である。特に、精製ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの作製で、２９３細胞が好ましい。２９３細胞は、アデノウイルス５型ＤＮＡのフラグメントで形質転換されたヒト胚性腎臓起源のものである（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９７７年、３６巻：５９〜７７頁）。単層培養で成長する該セルラインは、ＳｔｉｌｌｍａｎおよびＧｌｕｚｍａｎ、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ、（１９８５年）、５巻、２０５１〜２０６０号による懸濁液中での成長のために適合させた。それらは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である（受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３号）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明は、原形質膜とのＳｅｒ４７３キナーゼの結合の特性を決定する方法も提供する。高イオン強度緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた原形質膜分画の抽出は、脂質二層からＳｅｒ４７３キナーゼを放出し、活性は、Ｓｅｒ４７３キナーゼが内在性膜タンパク質でないが、しかしむしろ、タンパク質／タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合されることを有する上清で主に検出される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
好ましくは、高許容性および中間体精製段階の後に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤と接触させ、親和性剤に結合しない他の有機生物分子から、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを分離し、親和性剤からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを収集することによって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、さらに精製され得る。精製方法のこの段階での親和性剤は、その方法の他の段階での剤であるより、他の有機生物分子よりＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを結合するのに特異的が数桁大きい。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤としては、たとえば、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのエピトープまたはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ結合タンパク質を認識する抗体、およびＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを阻害するか、またはその基質（たとえば、ペプチド、ＡＴＰ）である化合物が挙げられる。好ましくは、親和性剤を、マトリックスに付着させる。その後、親和性剤に結合しなかった分子を、混合物から分離または除去する。親和性剤からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを放出することによって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する。代わりに、選択された親和性剤に結合しないＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３を、マトリックスに結合する混入物から分離させるための、疑われる混入物のための親和性剤を使用できる。したがって、親和性剤は、混入物に特異的な抗体であり得る。典型的には、親和性結合生物有機分子は、たとえば、親和剤または高塩を使用して溶出され得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
モノクローナル抗体は、培養での連続セルラインによる抗体分子の産生を供するあらゆる技術を使用して作製され得る。これらとしては、それに限定されないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されるハイブリドーマ技術（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、（１９７５年）、２５６巻：４９５〜４９７頁）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３年）、４巻：７２頁；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９８３年）、８０巻：２０２６〜２０３０頁）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ、（１９８５年）７７〜９６頁）が挙げられる。免疫アッセイで使用するための多量のモノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術によって得られ得る。簡潔には、所望のタンパク質で免疫化された動物から得られる脾臓細胞を、骨髄腫細胞との融合により一般に不死化させる。不死化の代替法としては、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ、癌遺伝子、またはレトロウイルスを用いた形質転換、または当業界で周知の他の方法が挙げられる。単一不死化細胞から生じるコロニーを、フィブロネクチン分子、その変異体またはフラグメント、テネイシンまたはシンデカンについての所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングする。このような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入を含めた種々の技術により増強され得る。代わりに、ＤＮＡライブラリーを、適切なヒトＢ細胞、すなわち、一般的プロトコールによって免疫化されたものからスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
抗体の産生について、ヤギ、ウサギ、ラットおよびマウスを含めた種々の宿主は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤、その変異体またはフラグメント、または免疫原性特性を保持するあらゆる部分またはフラグメントを用いた注射により免疫化され得る。宿主種により、種々のアジュバントが、免疫学的応答を増大させるために使用され得る。このようなアジュバントは、商品として入手可能であり、それに限定されないが、フロイントのもの、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリソレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、キーホルリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような界面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍは、有用なアジュバントの可能性がある。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
本発明の医薬組成物の投与は、経口または非経口で達成され得る。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（たとえば、腫瘍に直接的に）、筋肉内、皮下、骨髄内、硬膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が挙げられる。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、製薬的に使用され得る製剤への活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤および他の化合物を含む適切な製薬上許容される担体を含むことができる。製剤化および投与についての技術におけるさらに詳細は、レミントンの製薬化学の最新版で見られ得る（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
野生型ＰＫＢαは、主に、欠乏細胞の細胞質ゲル分画に存在した。ＰＫＢαの一部は、ペルバナデート刺激によるＰＭ分画に転位し、そこでは、リン酸化ＰＫＢαの大半が検出された。膜標的ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、ＰＭ分画と粗核分画の両方で見られ、刺激の後に転位は見られなかった。先に報告（Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９７年、２７２巻：３１５１５〜３１５２４頁）された通り、ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、刺激および未刺激の両方の細胞中で、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の両方でリン酸化された。Ｓｅｒ４７３キナーゼが、ＰＭで構造的に活性であるという意図で、ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、アゴニスト依存手段で、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の両方で、ＰＭ分画中で高度にリン酸化された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
次に、膜結合Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が、ＰＩ３キナーゼシグナル発生によるかどうかを試験した。血清欠乏ＨＥＫ２９３細胞を、０．１マイクロＭインスリン、インスリン擬態ペルバナデート（０．１ｍＭ、１０分）、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（５０マイクロＭ、３０分）で処理するか、または未処理のままにした。Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてＰＭ分画を分析し、ホスホ−ＰＫＢおよび総ＰＫＢについて免疫ブロッティングによっても分析した。先の結果（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁；Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年、９３巻：５５９９〜５７０４頁）と一致して、インスリンおよびペルバナデートは、ＰＫＢが、Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３の両方でリン酸化を誘導し、ペルバナデートは、インスリンよりＰＫＢリン酸化のさらに強力なアクチベーターであった。しかし、いずれの刺激も、基準線よりＳｅｒ４７３キナーゼ活性を増大させたものはなかった。ＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２での血清欠乏細胞の処置は、Ｓｅｒ４７３キナーゼの活性を弱めた。ＬＹ２９４００２処置に続く細胞質ゾル分画でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性における増大は観察されず、膜に、または膜に局在化されたそれのコファクターに結合されないときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼが不活性であることを示唆した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
高イオン強度緩衝液（０．５Ｍ）を用いたＰＭ分画の抽出が、脂質二層からＳｅｒ４７３キナーゼを放出し、活性を、主に上清で検出した。これは、Ｓｅｒ４７３キナーゼが、内在性膜タンパク質でないが、しかし、タンパク質／タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合しそうであることを示唆する。興味を持って、ＰＭ分画が、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理したときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、不溶性分画で非常に豊富であった。４℃で、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での不溶性は、脂質ラフト（ＳｉｍｏｎｓおよびＴｏｏｍｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、２０００年、１巻：３１〜３９頁；Ｇａｌｂｉａｔｉら、Ｃｅｌｌ、２００１年、１０６巻：４０３〜４１１頁）と称される原形質膜のコレステロールおよびグリコスフィゴ脂質に富んだミクロドメインの特徴である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが脂質ラフト内に局在化されるかどうかを試験するために、２つのマーカータンパク質を使用して、洗剤抽出物の効率を確認した：脂質ラフトと結合した内在性膜タンパク質（Ｂｉｃｋｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９９７年、２７２巻、１３７９３〜１３８０２頁）であるフロチリン、および非ラフト内在性原形質膜タンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼ。フロチリンに対する抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓから商品として入手可能であるのに対して、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼに対する抗体は、標準手段によって作製される。Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のように、フロチリンは、原形質膜のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性（ペレット）分画中で検出された一方で、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼは、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で可溶化された。内在性膜タンパク質について予想される通り、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼとフロチリンの両方は、０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いた抽出の後にペレット分画に残った。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
ＩＬＫは、原形質膜に配置されると報告される候補Ｓｅｒ４７３キナーゼであるので、これらの分画も、ＩＬＫに対する抗体（たとえば、ＵＢＩから商品として入手可能）と免疫ブロットに付した。ＩＬＫは、洗剤および塩抽出の両方から上清およびペレット分画の両方で検出されたが、しかし高いＰＫＢＳｅｒ４７３キナーゼ活性を有する分画で僅かに富んでいるように見える。これらのデータは、一緒に、ＰＫＢＳｅｒ４７３キナーゼが、細胞中の脂質ラフトと結合されることを示唆する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
ショ糖浮遊勾配分析
４℃で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での不溶性に加えて、脂質ラフトも、ショ糖密度勾配（ＳｉｍｏｎｓおよびＴｏｏｍｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、２０００年、１巻：３１〜３９頁）でのそれらの浮揚性によって特徴づけられる。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの脂質ラフト結合をさらに識別するために、原形質膜のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性分画を、５％〜３５％段階ショ糖勾配にかけ、その後、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性について分析した。簡潔には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性タンパク質を、４０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む１．５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で再懸濁させ、１３．２ｍｌ超遠心管に入れた。段階勾配は、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％および５％のショ糖を含む緩衝液１．５ｍｌの連続的重層による充填の上に形成された。残りの体積を、緩衝液Ａで充填した。１８時間、２５０，０００ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｗ４１ローターで３９，０００ｒｐｍ）の後、１ｍｌ分画を、管の頂部から収集し、基本的に上に記載される通りキナーゼ活性についてアッセイを行った。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
大半のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性タンパク質は、勾配の底部（充填位置）に残り、小さなタンパク質ピークは、分画９で検出された。対照的に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の主要ピークは、勾配の分画５および６に高まり、些細な活性が、分画９および１３で検出された（図１）。適量の分画３から１３までを、インビトロ・リン酸化反応にかけて、これらの分画内にキナーゼの活性を検出した。１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μＭ  ＰＫＩ（最終濃度）および０．５〜１μＣｉ  ［γ３２Ｐ］ＡＴＰを、２０μｌの各分画に添加し、振蘯しながら３０℃で、６０分間インキュベートすることによって、浮遊勾配分画のインビトロ・リン酸化を行った。Ｌａｅｍｍｌｉ  サンプル緩衝液の添加により反応を停止させ、５分間、９５℃で加熱し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。興味を持って、分画４から１０までは、５０と６０ｋＤａの間のいくつかのホスホタンパク質に加えて、４０ｋＤａと８０ｋＤａのホスホタンパク質を包含するリン酸化タンパク質の際立って類似のパターンを示した。浮揚分画（４から１０まで）のホスホタンパク質プロファイルにおける類似性にもかかわらず、フロチリンは、分画７、８でのみ検出され、いくつかの材料は、充填位置に残っていた（分画１３）。実験で使用されたショ糖勾配が、ラフトを、異なる浮揚性で分離させるが、しかしＳｅｒ４７３でのリン酸化は、分画５および６でのみ検出されたように、この見かけの相違は、脂質ラフトでの不均一性による可能性がある。明らかに、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が分画５および６で豊富であった一方で、ＩＬＫは、全ての分画で検出された。
【実施例３】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
溶出液のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を、基本的に実施例２で記載される通りに監視した。キナーゼ活性の主要ピークは、およそ〜５５０ｋＤａの質量で溶出し、キナーゼが、大型タンパク質複合体の一部であることを示唆した。このキナーゼも、ＰＫＢタンパク質をリン酸化することを立証するために、組換えΔＰＨ−ＰＫＢβタンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られた分画を分析するために基質として使用された。ΔＰＨ−ＰＫＢβタンパク質は、質量分光測定法およびホスホ免疫ブロッティングによって測定されるときにＳｅｒ４７３でリン酸化されなかった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム分画によるΔＰＨ−ＰＫＢβのリン酸化を、ホスホ−Ｓｅｒ４７３特異的抗体を使用して監視した。ペプチドキナーゼアッセイで観察される通り、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、分画１７から２０までで溶出した（図２）。明らかに、非常に精製された結晶化等級ＰＫＢを使用して、ＰＫＢの自己リン酸化で、見ることができたものはなかった。ＰＫＢβ製剤のＳｅｒ４７３のリン酸化は、部分的に精製されたＳｅｒ４７３キナーゼの添加に依存性があった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ  ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィー
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００Ｓｅｒ−４７３キナーゼ分画をさらに単離するためにモノＱ  ＦＰＬＣを使用したイオン交換クロマトグラフィー。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２０００カラムから得た分画を、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス／ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭベンズアミジン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で希釈（１０回）させ、緩衝液Ａで平衡にされたＭＯＮＯ  Ｑ  ＨＲ５／５カラムに使用した。カラムを、緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の０から０．６Ｍ  ＮａＣｌまでの３０ｍｌリニアー勾配で展開させた。カラムから溶出する０．５ｍｌの分画を収集し、上に記載される通りＳｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のスタウロスポリン感受性
Ｓｅｒ４７３上でのインスリン刺激リン酸化が、スタウロスポリン感受性の弱いキナーゼを介して起こることが、先に示された（Ｈｉｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、２７６巻：２５６４３〜２５６４６頁）。したがって、部分的に精製されたキナーゼのスタウロスポリン感受性を決定することに興味があった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られるピーク活性分画を貯蔵し、その後、可変濃度のスタウロスポリン（０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０および１００マイクロＭ）の存在下で、基本的に上に記載される通りにＦＳＹペプチドを使用してＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、部分的に精製された分画中で２つの別個のキナーゼ活性の存在を示した：一方は、スタウロスポリンに対して急性に感受性があり、阻害は、１ｎＭで観察される一方で、他方は、１００μＭまでのスタウロスポリンに感受性が弱い。先の結果は、後者の活性のみが、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに応答することを示唆する。
【実施例７】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
ＩＬＫは、Ｓｅｒ４７３でのＰＫＢのリン酸化で活発な役割を果さない
ＩＬＫは、ショ糖勾配分画で、ゲル濾過カラムのピーク分画で検出されたので、ＩＬＫの役割を、原形質膜結合ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性で直接的に評価した。ＩＬＫを、ＮａＣｌで抽出された原形質膜分画から免疫沈降させ、その後、免疫沈降と上清の両方を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。簡潔には、ＮａＣｌで抽出される原形質膜分画（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で）を、４℃で、１時間、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを使用して前もって明確にし、その後、４℃で２時間、プロテインＡ−セファロースに予め結合されたＩＬＫ抗体（ＵＢＩ）を使用して免疫沈降させた。上清を、アッセイのために収集した。免疫沈降物を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で２回、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄してから、キナーゼアッセイを、基本的に上に記載される通り行った。