【事件の表示】
　特願２００３−５８０５０２「ポリペプチド産生を増加させる方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年１０月　９日国際公開、ＷＯ０３／８３０６６、平成１７年　７月２１日国内公表、特表２００５−５２１４０１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は，２００３年３月２７日（パリ条約による優先権主張２００２年３月２７日，米国）を国際出願日とするものであって，本願発明は，平成２０年２月４日付手続補正書により補正された明細書の記載からみて，その特許請求の範囲の請求項１〜２９に記載された事項により特定されるとおりのものであるところ，そのうちの請求項１に係る発明（以下，「本願発明１」という。）は以下のとおりである。
　
「【請求項１】
　組換えポリペプチドを産生する方法であって
　２９℃〜３６℃の温度で哺乳動物細胞株を培養し，そして
　培地にハイブリッド極性化合物を添加する
ことを含んでなり，
　哺乳動物細胞株が，組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作されており，そして
　ハイブリッド極性化合物を添加すると，該組換えポリペプチドの産生が増加する，
前記方法。」
　
２．引用例
　
　これに対して，原査定の拒絶の理由に刊行物２として引用された本願優先日前の１９９９年に頒布された刊行物であるBiotechnol. Bioeng., Vol.63, No.5, p.573-582（以下，「引用例１」という。）は，「ＣＨＯ細胞の生産性,プロテオーム及び蛋白質りん酸化に及ぼす低温度の影響」と題する論文であり，以下の事項が記載されている。
　
１−（１）「哺乳動物細胞の増殖は低い培養温度により制御され得る。しかしながら，細胞の種類や発現システムによって，温度シフトが外来タンパク質の産生に与える異なる効果が報告されてきている。ここで，我々は，モデル生産物の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生するように操作された，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＸＭ１１１−１０の増殖の挙動や生産性について解析する。培養温度の３７℃から３０℃へのシフトは，特異的生産性の最大１．７倍の増加とともに細胞周期の主にＧ１期での増殖停止を引き起こした。低温培養は，３７℃での通常の培養における場合と比較して，全産生量における３．４倍の増加を生み出した。」（第５７３頁左欄Ａｂｓｔｒａｃｔ第１〜１４行）
　
１−（２）「全生産物を定量化するために，Ｔ２５フラスコに１×１０５細胞ずつ播種し，培養を３０℃にシフトする前に，７２時間３７℃で増殖させた。培地中のＳＥＡＰの蓄積を測定し，３７℃の標準的な培養で得られた量と比較した（Ｆｉｇ．５）。細胞が３７℃で増殖した場合は，最大細胞数に到達したのは１２０時間後だった。１４４時間後に細胞が死の段階に入った時には培養を終了した。これに対して，３０℃における培養は最終培養期間を最大９日に延長させた。３７℃の工程の最大産生量を１００％（１５４ｍＵ／ｍＬ）とした。低温培養において，ＳＥＡＰは培養９日後に最大３４２±４％まで蓄積した（Ｆｉｇ．５）。このように，３０℃におけるＣＨＯ　ＸＭ１１１−１０細胞の培養でおよそ３．５倍増の最終産物の力価が得られた。」（第５７７頁右欄第１〜１４行）　　
　
１−（３）「
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
図５．温度シフトバッチ培養における細胞の増殖とＳＥＡＰの産生
ＸＭ１１１−１０細胞を当初細胞密度１×１０５細胞ずつＴ２５フラスコに播種し，毎日細胞数を測定した。低温培養は播種から７２時間後に３７℃から３０℃にシフトさせた（×）。標準培養は全期間３７℃で培養を行った（□）。同時に低温培養（●）及び３７℃培養（▼）におけるＳＥＡＰ濃度を測定した。３７℃培養における最終ＳＥＡＰ収量を１００％とした（１５４ｍＵ／ｍＬ）。」（第５７８頁Ｆｉｇ．５）
　
　以上の記載から，引用例１には，分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生するように操作された，ＣＨＯ細胞株ＸＭ１１１−１０を培養してＳＥＡＰを産生する方法において，培養温度を３７℃から３０℃にシフトしたこと，これにより，ＳＥＡＰの産生が増加したことが記載されているものと認める。
　
　また，同じく，原査定の拒絶の理由に刊行物３として引用された本願優先日前の１９９４年に頒布された刊行物であるAppl. Microbiol. Biotechnol., Vol.40, No.5, p.691-698（以下，「引用例２」という。）は，「形質転換ＣＨＯ細胞におけるα1-抗トリプシン発現の最適化へのアプローチ」と題する論文であり，以下の事項が記載されている。
　
２−（１）「チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における組換えヒトα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の産生を最大にする様々な方法が検討されてきている。高度に活性型で誘導性のヒトサイトメガロウイルスの最初期（ＩＥ）プロモーター／エンハンサーが，一時的に形質導入，あるいは，安定に形質転換されたＣＨＯ細胞における組換えＡＡＴ遺伝子の転写を駆動するために用いられた。・・・血清豊富な培地における細胞の増殖において，これらの修飾により１日あたり最大４４μｇＡＡＴ／ｍｌ分泌した。プロピオン酸，酪酸あるいはヘキサメチレンビスアセトアミドによる化学的な発現誘導で，分泌量は１００μｇＡＡＴ／ｍｌまで増加させることが可能であった。」（第６９１頁左欄Ａｂｓｔｒａｃｔ第１〜１９行）
　
２−（２）「一時的に，あるいは，安定に形質転換された細胞におけるＣＭＶプロモーターからのＡＡＴ発現を活性化する，アデノウイルスＥ１ａ転写制御因子の能力を検討した。Ｅ１ａのように，ＣＭＶプロモーター／エンハンサーに結合する転写制御因子を介して活性化を仲介すると考えられている化学誘導剤である，フォルスコリン，・・・も検討された。他の化学物質であって，様々な細胞分化剤として機能することが知られている，酪酸，プロピオン酸，ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）及びジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）についても試験され，ＡＡＴの収量が顕著に増加することが見出された。」（第６９２頁左欄第４〜１７行）
　
２−（３）「ＨＭＢＡ，ＤＭＳＯ，酪酸，プロピオン酸は全て，いくつかの安定な細胞株におけるＡＡＴの発現を誘導した。これら４つ全ての薬剤の効果は類似しており，ＡＡＴの発現の誘導に加え，培養物の増殖と細胞分裂を停止し，細胞の形態を変化させるものであった（Ｔａｂｌｅ６）。ＨＭＢＡ，酪酸，プロピオン酸は，それぞれ，ＡＡＴの発現レベルを，同じ増殖段階の誘導しない細胞が到達するレベルの３から５倍に誘導することが可能であり，１日あたり最大１００μｇＡＡＴ／ｍｌ分泌した。」（第６９５頁右欄第２２〜３１行）
　
２−（４）「
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
表６．１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中の化学誘導物質の作用
細胞は２５ｃｍ２フラスコにおいて上清中に化学物質を添加することで誘導された。培地は２０−３０日にわたって３−４日ごとに採取され置換された。採取された培地中に存在するＡＡＴ濃度はＥＬＩＳＡで測定され，同じ増殖段階の誘導しない細胞の培地における濃度の割合として表された。ここでは対照と比較して最も高い誘導の時点が示されている。ＡＡＴの最大濃度（１日あたりμｇ／ｍｌ）は角括弧内に示されている。これは実験を通じて記録された一番高いレベルであり，必ずしも最大の誘導割合と同じ時点の試料からではない。・・・」（第６９６頁Ｔａｂｌｅ６）
　
２−（５）「しかしながら，試験された全ての細胞株は化学物質であるＤＭＳＯ，ＨＭＢＡ，酪酸及びプロピオン酸による誘導によく反応した。これらの化学物質の作用はよく理解されていない；・・・。その種々の作用はクロマチン構造の修飾やＤＮＡのメチル化によると考えられ，ＭＡＲｓを介した転写作用を媒介することも報告されてきている（略）。」（第６９７頁左欄下から第７行〜右欄第５行）
　
　以上の記載から，引用例２には，組換えポリペプチドヒトα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を産生するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞，すなわち，組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株を培養して組換えポリペプチドを産生する方法において，培地に，ハイブリッド極性化合物に相当するヘキサメチレン・ビスアセトアミドを添加することにより，組換えポリペプチドの産生が増加したことが記載されているものと認める。　
　
３．対比・判断
　
（１）対比
　
　本願発明１と引用例１に記載された事項を比較すると，引用例１に記載のＳＥＡＰ，及び，ＣＨＯ　ＸＭ１１１−１０細胞は，それぞれ，本願発明１の組換えポリペプチド，及び，組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株に相当する。
　また，引用例１には，組換えポリペプチドを産生するにあたり，哺乳動物細胞株を３０℃で培養したことが記載されているから，「２９℃〜３６℃の温度で哺乳動物細胞株を培養」することが記載されているものと認める。
　
　そうすると，両者は，組換えポリペプチドを産生する方法であって２９℃〜３６℃の温度で哺乳動物細胞株を培養することを含んでなり，哺乳動物細胞株が，組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作されている点で共通し，以下の点で相違する。
　
ア．哺乳動物細胞株の培養に際し，本願発明１においては，培地にハイブリッド極性化合物を添加することを含んでなり，それにより該組換えポリペプチドの産生が増加する，のに対し，引用例１においてはそのような記載はない点。
　
（２）当審の判断
　上記相違点について検討する。
　　　
ア．相違点アについて
　　　
　引用例１及び２は，組換えポリペプチドを産生するように遺伝子操作された哺乳動物細胞株における組換えポリペプチドの産生量に与える各種因子の影響を検討している点で共通している（１−（１），２−（１））。
　ここで，一般に，細胞を遺伝子操作して組換えポリペプチドを産生するにあたり，その産生量を増加させることは，本願優先日前既に周知の技術的課題であった。そして，産生量を増加させるために，複数の因子を組み合わせて適用することも通常行うことであるから（必要ならば引用例２Ｔａｂｌｅ６参照），引用例２において組換えポリペプチドの産生量を増加させることが示された化学誘導剤であるハイブリッド極性化合物を，引用例１に記載された方法においても産生量の増加を期待して添加することは当業者が容易に想到し得たことである。
　また，「組換えポリペプチドの産生が増加する」との記載は，ハイブリッド極性化合物を添加したことで奏される結果を記載したに過ぎず，実質的な相違点とはいえない。
　あるいは，実質的な相違点であると仮定した場合であっても，引用例１に引用例２を適用することにより予想される結果を単に特定することは，当業者が容易に想到し得ることに過ぎない。
　
イ．本願発明の効果について
　　
　本願明細書の実施例７から９の結果をみると，ＨＭＢＡを添加しない場合を１００％とすると，組換えＣＨＯ細胞にＨＭＢＡ２ｍＭを添加することで，１日あたり１０６細胞あたりのタンパク質生産量（μｇ）は最大１６０％にまで増加している。一方，引用例２の表６をみると，ＨＭＢＡを添加しない場合を１００とすると，ＨＭＢＡ２．５ｍＭ添加により細胞株により差はあるが１５７から２９０にまで増加している。これらの結果を比較すると，本願発明１のＨＭＢＡを添加することによる生産量の増加の程度は予想できない顕著な効果とはいえない。
　
　また，本願発明１の「ハイブリッド極性化合物」について，本願明細書の段落【００２５】には「無極性炭素鎖によって分離される２つの極性基を有する化合物である」と記載されており，段落【００４７】から【００５４】にはその構造が記載されている。これらの記載にあるように，ハイブリッド極性化合物には，多種の構造を有する化合物が包含される。
　ここで，ハイブリッド極性化合物の中で，哺乳動物細胞株の培地に添加した場合に，組換えポリペプチドの産生量を増加させたことが本願発明の詳細な説明において実際に示されたのはＨＭＢＡのみであり，ＨＭＢＡが産生量を増加させる作用機序がハイブリッド極性化合物であることに依っている，つまり，無極性炭素鎖によって分離される２つの極性基を有する構造でありさえすれば，組換えポリペプチド産生増強作用を有することが示されているわけでもないから，ハイブリッド極性化合物でありさえすれば同じ作用を同程度にもつということは示されておらず，ハイブリッド極性化合物であっても同様の作用を有するかどうか，あるいは同様の作用を有している場合であっても，それがどの程度のものであるかは不明であり，細胞に対する作用は構造により異なるものと考えられる。
　よって，ＨＭＢＡのみの結果から，その他の広範な化合物を含むハイブリッド極性化合物全般においてまで同様の効果を奏するということはできない。
　
　さらに，本願明細書の段落【０１１３】には，哺乳動物細胞株の違いにより培養の最適温度が異なるので，細胞株によっては３１℃で培養を行ってもタンパク質の産生量が増加しないこと，組換えポリペプチド産生増強作用を有するカフェインを用いた場合でも，細胞株によっては増強作用がみられないこと，細胞株によりカフェインの最適濃度も異なることが記載されている。これらのことから，細胞株が異なれば，最適な培養温度や誘導因子に対する応答性も異なることが読み取れる。
　よって，組換えポリペプチド産生増強作用を有する誘導因子を用いたとしても，哺乳動物細胞株の種類によって，低温で培養を行った場合の反応や誘導因子に対する反応性は異なることが予想されるから，本願実施例７から１０において用いたＣＨＯ細胞株の結果が哺乳動物細胞株一般における同様の効果を示すものではない。
　
　また，本願発明１において，哺乳動物細胞株を培養する温度は，２９℃〜３６℃の温度であると規定されているが，例えば，本願の図４をみると，上記範囲内の温度であっても，３１℃と３４℃とでは組換えポリペプチドの産生量が大きく異なることが読み取れるから，２９℃〜３６℃の全ての温度範囲において顕著な産生増強効果を奏する蓋然性は低い。
　
　したがって，本願発明１の構成全体にわたって，当業者が予測できない顕著な効果が奏せられているとはいえない。
　
エ．小括
　
　したがって，本願発明１は引用例１及び２の記載に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
４．審判請求人の主張について
　
　平成２０年２月４日付意見書において，請求人は，拒絶理由で引用された引例３（合議体注：引用例２に相当）の表６には，細胞系２．７．１９において，ＰＨＡ（フィトヘマアグルチニン）＋ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）の組み合わせは，これらの誘導因子のうち片方のみを含む培養液よりも，低いタンパク質力価の培養液を産生することが示されていること，さらに，参考文献１（Biotechnol. Bioeng. 72:592-601,2001）には，３０℃（本願の低温に相当）での培養，あるいは，ｐ２７（サイクリン依存性キナーゼ抑制因子）の過剰発現のいずれもＣＨＯ細胞によるタンパク質の産生性を増加させうるが，３０℃での培養とｐ２７の過剰発現を組み合わせた場合には，生産性が低くなることが記載されていること，これらの本願出願前の学術論文における記載は，誘導因子のある組み合わせは各誘導因子単独よりも有効性が低くなることを示唆し，参考文献１の結果は，特に「化学物質の誘導因子」と「低温」の組み合わせが有利な効果を奏しないであろう，ということを具体的に示唆していることから，低温培養における化学物質の誘導因子の使用が，３７℃培養における使用よりも，より高いタンパク質力価をもたらすとは考えられないこと，実施例１０及び図４において示された，ＨＭＢＡによって増強されたタンパク質力価が，低温（図４の３１℃又は３４℃）での細胞の培養によって，さらに増強されたという効果は予想できない効果であることを主張している。
　
　しかしながら，３．（２）イにおいて述べたように，各種因子に対する反応性は細胞の種類によって異なるものであり，実際に因子を適用してみないとわからないところであって，請求人が指摘している引用例２における特定の細胞に対する特定の誘導因子の組み合わせの結果が，他の細胞においても同様であるとは必ずしも予測できないし，さらに，引用例２の表６には，単独の誘導因子よりも産生量が高くなる組み合わせも記載されていることからも，引用例２の表６の特定の誘導因子の組み合わせの結果が，因子を組み合わせることに対する阻害要因とはいえず，因子を組み合せて使用することに格別な困難性があったものとは認められない。
　「化学物質の誘導因子」と「低温」の組み合わせについて，参考文献１に記載されたｐ２７過剰発現が「化学物質の誘導因子」といえるかどうか不明である上，ｐ２７は，サイクリン依存性キナーゼの抑制因子であり，引用例２に記載されたＨＭＢＡは分化誘導因子として知られており，２．２−（５）の記載事項をみても，ｐ２７とＨＭＢＡはその作用機構が異なるものである。また，本願明細書の段落【０００６】及び【０００８】に記載されたように，低温処理は細胞を産生相または誘導相にするために行っており，「産生相」について，本願明細書の段落【００３０】には，「産生相は，増殖相中よりも細胞分裂が少なく，そしてポリペプチド産生を最大にするよう設計された培地および培養条件を使用することによって特徴付けられる。」と記載されているから，低温にすることで細胞の増殖を抑制しているものと認められる。このことをふまえると，参考文献１においては細胞の増殖を抑制するという同様の作用により生産性を増強する２つの因子を組み合わせたものであり，一方の因子により十分に増殖が抑制されていれば，他方の因子によりそれ以上の増殖抑制効果が必ずしも期待できるものでなく，併用したことによる効果がないのは予想される結果であるに対し，本願発明１の組み合わせは異なる作用の２因子を組み合わせたものであるから，併用したことによる効果を示すことを期待して組み合わせることは当業者が容易に想到できることである。しかも，参考文献１には３７℃の場合と比較して３０℃の場合で産生量が下がったことが記載されているが，本願発明１には３６℃で培養を行う場合も包含されており，３７℃から３６℃に温度が１℃下がっただけで化学物質の誘導因子であるＨＭＢＡの効果がなくなり産生量が低下するとは考えがたい。よって，参考文献１において示された，低温での培養とｐ２７の過剰発現とを組み合わせた場合に生産性が下がったという結果が，低温での培養とＨＭＢＡとの組み合わせにおいても同様に生産性が下がると予想させるということはできない。
　したがって，低温での培養とＨＭＢＡの添加を組み合わせることに対する阻害要因が，本願優先日前に存在したものとは認められない。
　
　そして，異なる作用を有する因子を組み合わせた場合に，より産生量が増加するという効果は，当業者が予想できる範囲内の効果であって，請求人が主張する顕著な効果は，３．（２）イに述べたように，本願発明１の全体が奏する効果ではない。
　
　よって，請求人の主張は，採用できない。
　
５．むすび
　
　以上のとおりであるから，本願請求項１に係る発明は，特許法第２９条第２項の規定により，特許を受けることができないものであるから，他の請求項に係る発明について検討するまでもなく，本願は拒絶すべきものである。
　
　よって，　結論のとおり審決する。