【手続補正書】
【提出日】平成17年12月8日(2005.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
好ましくは、細胞をトランスフェクションするため、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質（例えば、発光または蛍光タンパク質）をコード化するＤＮＡ配列は、ベクターまたは発現ベクターに存在する。当該技術分野の技術者は、その例をよく知っている。ＤＮＡ配列はまた、適当な発現カセットを含有する組換えウイルスに含有され得る。用いられるのに適したウイルスは、バキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、またはＭＶＭまたはＨ−１の等のパルボウイルスを含む。ベクターはまた、ＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶ、またはＧａＬＶの様なレトロウイルス性でもよい。哺乳類での発現に適したプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス「最初期プロモーター」（ｐＣＭＶ）である。さらに、組織および／または器官特異的プロモーターが有効である。好ましくは、検出可能なタンパク質、または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、高発現を可能とするプロモータと作動可能に結合される。該プロモーター、例えば、誘導可能なプロモーターは、当該技術分野の技術者によく知られている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
当該技術分野の技術者は、本発明を行うために用いられ得る発光または蛍光タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を知っている。過去１０年間、発光に基づき、細菌またはウイルスの追跡を可能とする、Vibrio harveyi（Belas etal., Science 218 (1982), 791-793）およびVibrio fischerii（Foran and Brown, Nucleic acids Res. 16(1988), 177）由来の細菌ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（de Wet et al. , Mol. Cell.Biol. 7 (1987), 725-737）、Aequorea victoria由来のエクオリン（Prasher et al. , Biochem. 26 (1987), 1326-1332）、Renilla reniformis由来のウミシイタケルシフェラーゼ（Lorenz et al. , PNAS USA 88 (1991), 4438-4442）、およびAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（Prasher etal., Gene 111 (1987), 229-233）からの発光タンパク質をコード化する構造遺伝子の同定および単離が記載されてきた。細菌での該遺伝子のトランスフォーメーションおよび発現により、微小光イメージングカメラの下、細菌コロニーの検出、あるいは蛍光顕微鏡の下、個々の細菌の検出が可能となる（Engebrecht etal., Science227 (1985), 1345-1347；Legocki et al. , PNAS 83 (1986), 9080- 9084；Chalfie etal., Science 263 (1994), 802-805）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ルシフェラーゼ遺伝子は、様々な生物体において発現された。ニトロゲナーゼプロモーターと融合させたluxABを用いた、発光に基づくプロモーター活性は、微小光イメージングにより、感染根粒の細胞の細胞質に存在する根粒菌において示された（Legocki et al. , PNAS 83 (1986), 9080-9084；O'Kane et al. , J. Plant Mol. Biol. 10(1988), 387-399）。lux Aおよびlux B遺伝子の融合により、十分な機能を有するルシフェラーゼタンパク質を生じた（Escher et al. , PNAS 86 (1989), 6528-6532）。該融合遺伝子（Ｆａｂ２）は、キシロースプロモーターの下、枯草菌および巨大菌に導入され、次に昆虫の幼虫に与えられ、虫の血リンパに注射された。発光のイメージングは、微小光ビデオカメラを用いて処理された。病原体により活性化されたＰＡＬプロモーター・細菌ルシフェラーゼ融合遺伝子構造物を有する、トランスジェニックシロイヌナズナでの病原体細菌の移動および局在性は、微小光イメージャーの下、シュードモナス属またはエルビニア属感染を局在化することにより示され、トマトおよび山積みのポテトにおいても同様に示された（Giacomin and Szalay, Plant Sci. 116 (1996), 59-72）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
上記の微生物および細胞の好ましい使用において、アテローム性疾患の様な傷ついた組織または炎症組織と関係する疾患の治療に適したタンパク質は、細胞死を引き起こす酵素、または残骸の分解を引き起こす（例えば、アテローム性プラークの内部において、該プラークが腔内血圧の力により崩壊する）酵素である。適当な酵素は、リパーゼ、プロテアーゼ、リゾチーム、アポトーシス促進因子、ＰＰＡＲアゴニストなどを含む。アテローム性動脈硬化症の炎症成分が処置されるべきであると、適当な化合物は、コルチゾール、コルチコステロイド類似体、シクロオキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、コルヒチン、メトトレキセート、ＮＳＡＩＤ、レフルノミド、エタネルセプト、ミノサイクリン、シクロスポリン、サリドマイド、インフリキシマブ、ＩＬ−１０、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、または細胞毒性薬である。該化合物には、プロドラッグの形のものもある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
さらに、本発明の微生物または細胞は、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、ＣＴＧＦなどの様な、特定の経路（例えば、創傷治癒経路）のいくつかまたは全タンパク質をコード化するＢＡＣ（バクテリア人工染色体）またはＭＡＣ（哺乳類人工染色体）を含有し得る。さらに、細胞は、該タンパク質をコード化するサイバーセルまたはサイバーウイルスであり得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ここ２、３年で、アテローム性プラーク内部のクラミジア肺炎菌、ピロリ菌、ＣＭＶ、ＨＳＶ、および他の感染体の証拠を示す多くの報告がなされた。アテローム性プラーク内の該感染体の存在は、該プラーク内部が複製を容易にする保護された環境であることを示唆し、そうでなければ、該感染体は免疫系により取り除かれるであろう。さらに、炎症過程がアテローム性プラーク内部に存在するという多数の証拠が存在する。従って、該疾患が、本発明の微生物または細胞（これは静脈注射後、アテローム性プラーク内に侵入し、ここで複製し始める）により、診断され、そして処置され得ることを仮定するのは理にかなう。適当な時間の経過後、該プラークは、例えば、光感知カメラまたは適当なＭＲＩ装置を用いてイメージされ得る。さらに、該微生物または細胞は、酵素、例えば、上記の酵素をさらに産生し、これによりプラークを除去する。従って、さらに好ましい使用は、アテローム性疾患の診断および処置である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
細菌の分布パターンの差は、動物内に入るとすぐに、該菌株の宿主との相互作用に差が生じることを示唆する。細菌注射の４８時間後の同一動物のイメージングにより、初期時間より検出可能な発光は全て減衰し、切創および耳標領域の様な炎症性の傷ついた組織を除き、注射動物から完全に排除されたことを示した。該組織での炎症を、その赤色で浮腫性の（red and edematous）外観により同定した。発光を、切創および／または炎症耳標領域において、注射後最長５から８日で検出した（より長い光子収集時間、すなわち、１０分間で確認した）（図２Ａ−Ｃおよび図３Ａ−Ｃ）。発光が存在しないのは、プラスミドＤＮＡが無くなったため、あるいは細菌での遺伝子発現がサイレンシングとなったためではなかった。他の実験では、動物での発光を、最大５０日間、一貫して検出できた。類似のデータを免疫適格Ｃ５７ＢＵ６Ｊマウスで得た（図４）。これは、該所見が免疫系の変化を有する動物に限らないことを示した。感染動物から個々に摘出した器官ならびに血液試料の慎重な調査により、この正常非注射組織に発光が存在しないことを確認した。さらに、実験データは、損傷組織への定着がマウスで共通して生じることを示した。該マウスの２９の切創のうち２４（８２．８％）および２９の耳標のうち１２（４１．４％）に、静脈注射した細菌は定着した。静脈注射した細菌の傷ついた組織への定着は、１×１０５細菌細胞と同程度低い濃度のコレラ菌の注射後も生じた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実施例３：発光細菌の大腿静脈注射に続く、カテーテル装着ラットへの定着
既に記載（Santoro and Levison, Infect. Immun. 19 (3) (1978), 915-918；Overholser et al. , J. Infect. Dis. 155(1) (1987), 107-112）の方法に従い、外科的心臓障害を形成した。概略、動物をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔注射）により麻酔した。頚部の正中切開を行い、密接した頚動脈を露出した。ポリプロピレン製カテーテルを挿入し、抵抗が生じる（これは、大動脈弁のレベルへの挿入を示す）まで進めた。次に、該カテーテルを１０〜０縫合糸（AROSurgical Instrument Corporation, Japan）を用いて固定し、創傷を４〜０シルク縫合糸（American Cyanamide Company, Wayne, New Jersey）を用いて閉じた。該カテーテルの装着により、大動脈弁の炎症および継続的炎症を生じる（Santoro and Levison, 1978）。対照動物は、カテーテル法を受けなかった。大腿静脈を介した大腸菌である１×１０８発光細菌細胞の注射により、菌血症を誘導した。注射直後に微小光イメージャーの下で観察すると、細菌の定着は肝臓領域で視覚化できた（図５）。３日後、カテーテルを装着した動物は発光細菌の心臓への定着を一貫して示したが、対照動物は心臓から、発光のサインを示さなかった（図６）。低濃度および検出不可能な濃度の細菌が組織に存在するか否かを決定するために、心臓、肝臓、および脾臓を各動物から摘出し、一晩培養した。細菌クリアランスに直接関与する器官である、ラットの肝臓および脾臓は、両群で発光細菌の存在を示した。強い発光を、対照心臓（全く発光が存在しない）とは対照的に、カテーテルを装着した心臓で検出した（図７）。カテーテルの培養では細菌を検出しなかった。