(57)【要約】【課題】本発明は、生体高分子の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性に優れる分離材及び該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。【解決手段】多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層とを備え、上記水酸基を有する高分子が疎水性基を更に有し、上記水酸基を有する高分子中の構成単位１個当たりの疎水性基の含有割合が０．０２〜０．５個である分離材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層とを備え、
前記水酸基を有する高分子が疎水性基を更に有し、前記水酸基を有する高分子中の構成単位１個当たりの疎水性基の含有割合が０．０２〜０．５個である分離材。
【請求項２】
前記多孔質ポリマ粒子が、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
前記水酸基を有する高分子が、多糖類の変性体である、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記水酸基を有する高分子が、アガロースの変性体である、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項５】
前記水酸基を有する高分子が架橋されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記疎水性基がフェニル基を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記分離材の細孔径分布におけるモード径が０．０１〜０．５μｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
空隙率が３０〜７０体積％の粒子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
比表面積が３０ｍ２／ｇ以上の粒子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１１】
前記多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が３〜１５％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１２】
前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１３】
前記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が０．３Ｍｐａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いる場合、通液時の耐圧性に優れる傾向がある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、上記のデキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点がある。
【０００５】
セライト等の無機多孔質体に、デキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。このゲルには吸着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。
【０００６】
マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体ゲルで埋めた、ハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。
【０００７】
有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５、特許文献６参照）。
【０００８】
メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子の合成が知られている（例えば、特許文献７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、従来の分離材は、生体高分子の非特異吸着が多く、耐久性又は耐アルカリ性が十分でなく、カラムとして用いたときの通液性に劣るという問題がある。
【００１１】
そこで、本発明は、生体高分子の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性に優れる分離材、及び該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記［１］〜［１３］に記載の分離材を提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層とを備え、上記水酸基を有する高分子が疎水性基を更に有し、上記水酸基を有する高分子中の構成単位１個当たりの疎水性基の含有割合が０．０２〜０．５個である分離材。
［２］上記多孔質ポリマ粒子が、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む、［１］に記載の分離材。
［３］上記水酸基を有する高分子が、多糖類の変性体である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］上記水酸基を有する高分子が、アガロースの変性体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］上記水酸基を有する高分子が架橋されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］上記疎水性基がフェニル基を含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］上記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］上記分離材の細孔径分布におけるモード径が０．０１〜０．５μｍである、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］空隙率が３０〜７０体積％の粒子である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］比表面積が３０ｍ２／ｇ以上の粒子である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］上記多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が３〜１５％である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材。
［１２］上記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの上記被覆層を備える、［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材。
［１３］前記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が０．３Ｍｐａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の分離材。
［１４］［１］〜［１３］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、タンパク質の非特異吸着が低減され、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層とを備える。該水酸基を有する高分子は、疎水性基を更に有し、水酸基を有する高分子中の構成単位１個当たりの疎水性基の含有割合は０．０２〜０．５個である。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸またはメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。
【００１６】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、１種以上のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られる粒子である。例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって多孔質ポリマ粒子を合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子としては、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有してもよい。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
【００１７】
スチレン系の多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記のなかでも耐久性、耐酸性、耐アルカリ性の観点より、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。
【００１８】
モノマがジビニルベンゼンを含む場合、その量は、モノマ全質量に対して５０質量％以上であることが好ましく、６０質量％以上であることがより好ましく、７０質量％以上であることが更に好ましく、８０質量％以上であることがより更に好ましい。ジビニルベンゼンを５０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性がより良好となるため好ましい。モノマ全質量に対するジビニルベンゼンの含有量の上限は１００質量％であってもよい。
【００１９】
スチレン系の単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等の、スチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐酸性、耐アルカリ性に優れるという観点からスチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００２０】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２２】
重合反応の溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、モノマの液滴が水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能となる。
【００２３】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、例えば、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル等のジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２４】
これらの油溶性界面活性剤のうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは純度約５０％、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；又はこれらの混合物が好ましい。
【００２５】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。界面活性剤の使用量によって、得られる多孔質ポリマ粒子及び分離材の空隙率、比表面積、細孔径の大きさをコントロールすることができる。
【００２６】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２７】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。
【００２８】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００２９】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００３０】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３１】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３２】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３３】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３４】
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。
【００３５】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３６】
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３７】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、分離性向上の観点から、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、更に好ましくは５０μｍ以上である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０μｍ以上であると、分離材をカラムに充填した後のカラム圧を抑制できる傾向がある。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることが更に好ましい。粒径のＣ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００３９】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、株式会社シスメックス製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。
【００４０】
本実施形態の分離材の細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径）は、０．０１〜０．５μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましい。細孔径分布におけるモード径がこの範囲にあると、粒子中に液が流れやすくなり、動的吸着量を多くしやすい。
【００４１】
多孔質ポリマ粒子及び分離材の細孔容積（空隙率）は、それぞれ多孔質ポリマ粒子及び分離材の全体積（細孔容積を含む）基準で３０〜７０体積％であることが好ましく、４０〜７０体積％であることがより好ましい。細孔容積がこの範囲内にあると、タンパク質等の吸着量を向上させることができる。多孔質ポリマ粒子及び分離材は、細孔径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。また、多孔質ポリマ粒子及び分離材は、平均細孔径が、０．１〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．５μｍであることがより好ましい。平均細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、平均細孔径が０．５μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００４２】
多孔質ポリマ粒子及び分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。
【００４３】
（被覆層）
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。被覆層は、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆している。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材の優れたタンパク質吸着性が得られる傾向にある。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。被覆層は、例えば、多孔質ポリマ粒子の表面に、水酸基を有する高分子を吸着させた後、高分子を架橋することによって、多孔質ポリマ粒子の表面に形成することができる。
【００４４】
（水酸基を有する高分子）
水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子は、疎水性基を更に有する。これにより、分離材の界面吸着能を向上させることができる。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、ポリビニルアルコール等の高分子の変性体を用いることができる。ここでいう変性体とは、疎水性基が導入されたものを指す。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。本実施形態の水酸基を有する高分子としては、アガロースの変性体を用いることが好ましい。水酸基を有する高分子は、例えば平均分子量１万〜３０万程度のものが使用できる。
【００４５】
疎水性基としては、例えば炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。これらの中でもフェニル基が好ましい。疎水性基は、例えば、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水性基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。
【００４６】
水酸基を有する高分子中の疎水性基の含有割合は、水酸基を構成する高分子中の構成単位１個当たり０．０２〜０．５個であることが好ましく、０．０５〜０．３個であることがより好ましく、０．１〜０．２個であることが更に好ましく、０．１２〜０．１７個であることがより更に好ましい。水酸基を有する高分子中の疎水性基の含有割合が上記範囲内であることにより、水酸基を有する高分子を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させるための疎水的相互作用力を保持しつつ、かつタンパク質の非特異吸着を抑制することができる。
【００４７】
本明細書でいう水酸基を有する高分子の構成単位とは、実質的にその繰り返しによって水酸基を有する高分子をなす単位のうち、最小のものである。例えば水酸基を有する高分子が多糖である場合には、その構成単位は、当該高分子を構成する最小単位である単糖、二糖等であり、水酸基を有する高分子が合成高分子である場合には、当該高分子を構成する最小単位であるモノマに由来する構造である。例えば、水酸基を有する高分子がデキストリン又はセルロースに由来する場合には、構成単位はグルコースであり、アガロースに由来する場合には、構成単位はグルコース及び３，６−アンヒドロガラクトースを構成糖とする二糖（アガロビオース）である。
【００４８】
水酸基を有する高分子における、疎水性基の含有割合は、例えば、疎水性基導入剤（水酸基と反応する官能基及び疎水基を有する化合物）の使用量、疎水性基導入時に使用する触媒量、疎水性基導入時の温度等によって調節することができる。
【００４９】
（被覆層の形成方法）
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。この溶液を、多孔質ポリマ粒子の細孔内に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００５０】
多孔質ポリマ粒子の表面に吸着した水酸基を有する高分子は、固定化されていることが好ましい。固定化は、例えば水酸基を有する高分子を架橋することにより行うことができる。架橋は、例えば、多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子に架橋剤を加えて架橋反応させることによって行うことができる。すなわち、本実施形態の分離材において、水酸基を有する高分子は架橋されていてもよい。このとき、架橋して得られた水酸基を有する高分子の架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
【００５１】
架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。
【００５２】
この架橋反応には通常、触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００５３】
架橋剤による架橋反応は、通常、水酸基を有する高分子の溶液等を細孔内に含浸させた多孔質ポリマ粒子を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、１当量の単糖類に対して０．１〜１００当量の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。架橋剤の添加量が上記下限値以上であると、被覆層が多孔質ポリマ粒子上に良好に保持される傾向にある。架橋剤の添加量が上記上限値以下であれば、架橋剤と水酸基を有する高分子との反応率が高い場合でも、水酸基を有する高分子の特性が損なわれにくい。
【００５４】
触媒の使用量は、架橋剤の種類により異なる。通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、更に好ましくは０．１〜５モル倍で触媒が使用される。
【００５５】
架橋剤と水酸基を有する高分子との架橋反応が触媒等の添加により制御可能な場合は、予め架橋剤を混合した水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子に含浸させ、当該多孔質ポリマ粒子を適当な媒体中で分散、懸濁させ、触媒等を添加して架橋反応を行わせることができる。また、触媒等を用いない場合、温度等の架橋反応条件を変化させることにより、架橋反応を生起させてもよい。水酸基を有する高分子、架橋剤及び触媒を溶解した溶液を含浸させた多孔質体を、適当な媒体に分散、懸濁させてから、架橋反応条件（例えば温度）を反応が進行する条件に調整し、架橋反応を行わせることができる。例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。
【００５６】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては水、アルコール等が挙げられる。
【００５７】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００５８】
架橋反応終了後、生成した多孔質ポリマ粒子と架橋ゲルの複合体をろ別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。
【００５９】
本実施形態の分離材における被覆層の量は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇであることが好ましく、５０〜５００ｍｇであることがより好ましく、５０〜４８０ｍｇであることが更に好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して５００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００６０】
（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００６１】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン及びその塩酸塩、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。モノハロゲノカルボン酸としては、例えば、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する３級アミンとしては、例えば、ジエチルアミノエチルクロライド等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６２】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００６３】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。
【００６４】
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６５】
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。
【００６６】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６７】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００６８】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６９】
本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の、平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０  ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７０】
本実施形態の分離材は、タンパク質の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。すなわち、本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備えるものである。
【００７１】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００７２】
本実施形態の分離材は、タンパク質等の生体高分子の分離において、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、天然高分子からなる粒子及び合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有し、分離材表面にイオン交換基及びリガンド等を導入することにより、より顕著な効果を得ることができる。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００７３】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム内の圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離する場合、タンパク質溶液等の通液速度は、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲である。一方、本実施形態の分離材を使用した場合は、従来のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用しても、高吸着量を維持することができる。
【００７４】
分離材の、平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。
【００７５】
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１）
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（株式会社新日鉄住金製、商品名：ＤＶＢ９６０）１６ｇ、多孔質体としてヘキサノール１６ｇ、ジエチルベンゼン１６ｇ、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇをポリビニルアルコール（０．５重量％）分散剤水溶液に加えて混合液を調製した。この混合液を、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、株式会社シスメックス製）で測定し、平均粒径（体積基準）及び粒径のＣ．Ｖ．値（変動係数）を算出した。多孔質ポリマ粒子１の空隙率及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表１に示す。
【００７８】
（水酸基を有するポリマへの疎水性基の導入）
アガロース水溶液（２重量％）４９０ｍＬに水酸化ナトリウム０．９８ｇ、グリシジルフェニルエーテル４．９０ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、沈殿物を洗浄して、変性アガロースを得た。変性アガロースの疎水性基含有割合を下記方法により算出したところ、０．１４２個であった。
【００７９】
（水酸基を有する高分子の変性体の疎水性基導入割合評価）
乾燥状態の粉末アガロース（変性されていないアガロース）と揮発分０．１重量％未満まで乾燥させた疎水性基導入アガロースとをそれぞれ７０℃の純水に溶解させ、０．０５重量％の水溶液サンプルを調製した。分光光度計により各水溶液の２６９ｎｍの吸光度を測定して濃度を求めることで、下記式より、水酸基を有する高分子の構成単位（二糖単位）１個当たりの疎水性基の含有割合を算出した。
・疎水性基含有割合（個）＝ＣＡＧ／（ＣＨＡＧ＋ＣＡＧ）
・ＣＡＧ：変性されているアガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）
ＣＡＧ＝Ａ／εＧＰＥ×１０００
・Ａ：疎水性基導入アガロースの真の吸光度
Ａ＝疎水性基を導入したアガロースの吸光度−変性されていないアガロースの吸収
・変性されていないアガロースの吸収＝変性されていないアガロースの吸光度×（疎水性基を導入したアガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）／変性されていないアガロースのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ））
・εＧＰＥ：グリシジルフェニルエーテルの吸光係数
εＧＰＥ＝１３７２（ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））
・ＣＨＡＧ：変性されていないアガロース構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）
ＣＨＡＧ＝（変性されていないアガロース構成単位の濃度（ｇ／ｌ）／アガロース構成単位（３０６ｇ／ｍｏｌ））×１０００
・変性されていないアガロース構成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝疎水性基を導入したアガロースのサンプル濃度（重量％）×１０−変性されているアガロース構成単位の濃度（ｇ／ｌ）
・変性されているアガロース構成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝（ＣＡＧ×変性されているアガロース構成単位（４５６ｇ／ｍｏｌ））／１０００
【００８０】
また、多孔質ポリマ粒子に吸着した変性アガロースの疎水性基の含有割合は、粒子０．２ｇを１Ｍ硫酸１０ｍＬ中にて、７０℃、５時間処理し、処理液を分光光度計にて２６９ｎｍの吸光度を測定して処理液濃度を求めることで、同様に算出できる。
【００８１】
（被覆層の形成）
２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液７０ｍＬに、多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間攪拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性アガロースを吸着させた。吸着後の多孔質ポリマ粒子１をろ過し、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子への変性アガロースの吸着量（被覆高分子吸着量）は、ろ液中の変性アガロースの濃度から算出した。多孔質ポリマ粒子１ｇあたりの変性アガロースの吸着量が、５０ｍｇ以上を「○」、５０ｍｇ未満３０ｍｇ以上を「△」、３０ｍｇ未満を「×」とした。
【００８２】
多孔質ポリマ粒子の表面に吸着したアガロースは次のようにして架橋した。変性アガロースが吸着した粒子１０ｇを０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、エチレングリコールジグリシジルエーテルを０．６４Ｍとなるように添加し、１０時間室温にて攪拌した。その後、粒子を２重量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液の熱水で洗浄後、純水で洗浄し、乾燥させることで分離材を得た。
【００８３】
（タンパク質の非特異吸着能評価）
分離材０．２ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、２４時間室温で攪拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった。分光光度計で上澄み液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中のＢＳＡ濃度より、分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。分離材１ｍＬあたりのＢＳＡ吸着量が１ｍｇ未満を「○」、１ｍｇ以上１０ｍｇ未満を「△」、１０ｍｇ以上を「×」とした。結果を表３に示す。
【００８４】
（イオン交換基の導入）
分離材（乾燥重量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を溶解した水溶液１００ｍＬを添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、ろ過し、水／エタノール（体積比５／１）で３回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。以降の、比表面積、イオン交換容量、カラム特性の評価には、ＤＥＡＥ変性分離材を用いた。得られたＤＥＡＥ変性分離材を乾燥後、熱重量分析により、被覆された水酸基を有する高分子量を定量した。ＤＥＡＥ変性分離材の平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、空隙率及び比表面積は、水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。
【００８５】
（イオン交換容量評価）
１２時間以上水で膨潤させたＤＥＡＥ変性分離材を０．２〜０．３ｇ定量し、ビーカに移し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬを加え、２５℃、１時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、分離材をビーカに移し、０．１Ｎ塩酸水溶液１０ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の分離材を洗浄液が中性になるまで洗浄した。この洗浄液について自動電位差滴定装置を使用して０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定を行うことによって、ＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を求めた。
【００８６】
＜カラム特性評価＞
得られたＤＥＡＥ変性分離材をメタノールと混合して、濃度３０重量％のスラリーを調製した。このスラリーをφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填して以下の評価に用いた。
【００８７】
（通液性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を充填したカラムに流速を変えながら水を流し，流速とカラム内の圧力（カラム圧）との関係を調べ、カラム圧が０．３ＭＰａの時の線流速（通液速度）を測定した。結果を表２に示す。
【００８８】
（動的吸着量評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を充填したカラムに、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、ＵＶ吸光度測定によりカラム出口での溶出液中のＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を流し、その後、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【００８９】
（耐アルカリ性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間攪拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少が３％未満であるものを「○」、３％以上２０％未満であるものを「△」、２０％以上であるものを「×」とした。結果を表３に示す。
【００９０】
（耐久性評価）
８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１時間通液させた。再度８００ｃｍ／ｈにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上上昇した場合を「×」、１０％以内である場合を「○」とした。結果を表３に示す。
【００９１】
（実施例２）
（多孔質ポリマ粒子２）
変性アガロースを疎水性基の含有割合が０．０５０個のものに変更した以外は、実施例１と同様に多孔質ポリマ粒子の合成及び処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【００９２】
（実施例３）
（多孔質ポリマ粒子３）
変性アガロースを疎水性基の含有割合が０．１２７個のものに変更した以外は、実施例１と同様に多孔質ポリマ粒子の合成及び処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【００９３】
（実施例４）
（多孔質ポリマ粒子４）
変性アガロースを疎水性基の含有割合が０．２８０個のものに変更した以外は、実施例１と同様に多孔質ポリマ粒子の合成及び処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【００９４】
（比較例１）
（多孔質ポリマ粒子５）
変性アガロースを疎水性基の含有割合が０．６７０個のものに変更した以外は、実施例１と同様に多孔質ポリマ粒子の合成及び処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【００９５】
（比較例２）
（多孔質ポリマ粒子６）
ジビニルベンゼンの使用量を４ｇに変更し、更にジヒドロキシプロピルメタクリレート８ｇを使用した以外は実施例１と同様に多孔質ポリマ粒子を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子について、実施例１と同様の方法でＤＥＡＥ変性処理のみを行い、被覆層の形成は行わずに、分離材を得た。得られた多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【００９６】
【表１】
2017125815.tif 000002
【００９７】
【表２】
2017125815.tif 000003
【００９８】
【表３】
2017125815.tif 000004
【００９９】
表２、３の結果からも分かるとおり、スチレン系モノマを使用していても、被覆層に含まれる高分子として疎水性基の含有割合が特定の範囲内である変性アガロースを使用することによって、当該高分子の多孔質ポリマ粒子への吸着量が向上し、非特異吸着がほとんどない分離材を得ることができた。また、実施例で得られた分離材では、耐アルカリ性が改善され、動的吸着量がアルカリ処理前後で変化しないことが分かった。さらに、多孔質ポリマ粒子の粒径Ｃ．Ｖ．が低い分離材では、０．３ＭＰａ時の通液速度が非常に速かった。