【事件の表示】
　特願２００３−１０６７０９「アルカリプロテアーゼ」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年１１月　４日出願公開、特開２００４−３０５１７６〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　出願の経緯・本願発明
　本願は、平成１５年４月１０日の出願であって、平成２０年１２月１日付で手続補正がなされたが、平成２１年２月２３日付で拒絶査定がなされ、これに対して、平成２１年４月２日に拒絶査定に対する審判請求がなされるとともに、同年５月７日付で手続補正がなされたものである。
 
第２　平成２１年５月７日付の手続補正についての補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　
　平成２１年５月７日付の手続補正を却下する。
　
［理由］
１．補正後の本願発明 
　本件補正により特許請求の範囲の請求項２は、補正前の
「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（ａ）１５位、（ｂ）１６位、（ｃ）１６６位、（ｄ）１６７位、（ｅ）１８７位、（ｆ）３４６位、（ｇ）４０５位、又はこれに相当する位置から選ばれる位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；ヒスチジン、
（ｂ）位置；グルタミン、
（ｃ）位置；グリシン、
（ｄ）位置；バリン、
（ｅ）位置；セリン、
（ｆ）位置；アルギニン、
（ｇ）位置；アスパラギン酸、
に置換された、親アルカリプロテアーゼに比べて比活性及び／又はタンパク質分泌量が向上した変異アルカリプロテアーゼ。」
　
から、請求項１の削除に伴い、補正後の請求項１として、
　
「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（ａ）１５位、（ｂ）１６位、（ｃ）１６６位、（ｄ）１６７位、（ｅ）１８７位、（ｆ）３４６位及び（ｇ）４０５位から選ばれる位置又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼであって、配列番号１の前記アミノ酸残基の置換が、
Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ａｓｎ１８７Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐ又はＳｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ａｓｎ１６６Ｇｌｙ＋Ｇｌｙ１６７Ｖａｌ＋Ａｓｎ１８７Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐ
のうちいずれかである親アルカリプロテアーゼに比べて比活性及びタンパク質分泌量が向上した変異アルカリプロテアーゼ。」
へと補正された。
　
　上記補正は、上記補正前の請求項２に記載した発明を特定するために必要な事項である「アルカリプロテアーゼ」のアミノ酸配列について、配列番号１で示されるアミノ酸配列と「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」を「
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及び
　
　そこで、本件補正後の請求項１に記載された発明（以下、「本願補正発明」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）について、以下検討する。
　
２．引用例
　原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願出願日前の平成１４年８月６日に頒布された刊行物である特開２００２−２１８９８９号公報（以下、「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている。
　
（１）「配列番号１の（ａ）６６若しくは２６４位、（ｂ）５７、１０１〜１０６、１３６、１９３若しくは３４２位、（ｃ）４６若しくは２０５位、（ｄ）５４、１１９、１３８、１４８若しくは１９５位、（ｅ）２４７位、（ｆ）１２４位、（ｇ）１０７位、（ｈ）２５６位、（ｉ）２５７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：グルタミン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アラニン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、システイン、バリン、グリシン又はイソロイシン残基、
（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、
（ｃ）位置：チロシン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｄ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニン又はシステイン残基、
（ｅ）位置：トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、メチオニン又はシステイン残基、
（ｆ）位置：アラニン又はリジン残基、
（ｇ）位置：リジン、アルギニン、アラニン又はセリン残基、
（ｈ）位置：グルタミン残基、
（ｉ）位置：バリン又はイソロイシン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。」（請求項１）
　
（２）「しかし、
さらに優れた特性を有するアルカリプロテアーゼが求められていた
本発明者らは前記アルカリプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行ってきたが、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、
比活性を向上させる
　
（３）「実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした
　増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みはTaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精製溶出液３５μＬにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍濃縮液）を５μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロテアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量を５０μＬにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によるリガーゼ反応処理を行った。
　次に、同リガーゼ反応液１０μＬを用いて
Bacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行った
プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形成状態
野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質転換体を検出した
　
（４）「実施例２
　実施例１で得られた変異プロテアーゼの合成基質法または天然基質法によるプロテアーゼ活性の測定結果（１９５位及び２５６位アミノ酸残基変異プロテアーゼは天然基質法、他は合成基質法で測定）を図１に示す。
本発明の変異アルカリプロテアーゼは高比活性であった
　
３．対比
  本願補正発明において、択一的に記載された「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」のうち、前者の「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ」を選択した場合の本願補正発明について、その進歩性の有無を判断する。
　
　本願補正発明と引用例１に記載された発明を対比する。
　引用例１に記載された「配列番号１で示されるアミノ酸配列」と本願補正発明における「配列番号１で示されるアミノ酸配列」は、同一である。
　してみれば、両者は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼであって、親アルカリプロテアーゼに比べて比活性が向上した変異アルカリプロテアーゼである点で一致し、本願補正発明では、アミノ酸残基の置換が、「Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ａｓｎ１８７Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐ又はＳｅｒ１５Ｈｉｓ＋Ｓｅｒ１６Ｇｌｎ＋Ａｓｎ１６６Ｇｌｙ＋Ｇｌｙ１６７Ｖａｌ＋Ａｓｎ１８７Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ３４６Ａｒｇ＋Ａｓｎ４０５Ａｓｐのうちいずれか」であって、「親アルカリプロテアーゼに比べて比活性及びタンパク質分泌量が向上した変異アルカリプロテアーゼ」であるのに対し、引用例１では、置換するアミノ酸残基の位置が本願補正発明とは異なるものであって、親アルカリプロテアーゼに比べて比活性が向上したものであることは記載されているが、タンパク質分泌量について定量的に確認されていない点で相違する。
　
４．判断
（１）アミノ酸残基の置換位置について
　引用例１には、従来のアルカリプロテアーゼよりも、高比活性等のさらに優れた特性を有するアルカリプロテアーゼを取得するという課題が記載されている（上記記載事項（２））。してみれば、優れた性質を有する変異アルカリプロテアーゼをさらに取得するために、引用例１に記載されるように（上記記載事項（３）参照。）、本願出願前既に周知のアミノ酸置換変異体の製造方法であるランダム変異を用いて変異アルカリプロテアーゼを作製し、その中から高い比活性を有する変異アルカリプロテアーゼを選択することは、当業者が容易になし得ることであって、本願補正発明の変異アルカリプロテアーゼは、そのような手法により得られたものである。
　
（２）タンパク質分泌量について
　引用例１の記載事項（３）には、「ハローの形成状態」は、「プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられる」とあり、しかも、「野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質転換体を検出した。」と記載されており、大きなハローを形成する形質転換体は、プロテアーゼ分泌量が多いものであると解釈される。
　してみると、目的タンパク質を培養により生産するに際して、その分泌量が多いことが望ましいことは当然のことであるから、この記載に接した当業者が、変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した形質転換体のスクリーニングに、ハローのサイズを基準とすることは、容易に想到し得ることであり、そのようにして「タンパク質分泌量が向上した」ものが得られるものである。
　
（３）効果について
ア．タンパク質分泌量について
　タンパク質の分泌量が向上した変異アルカリプロテアーゼを取得することは、当業者が容易になし得ることである点は上記（２）で述べたとおりであるが、そもそも、タンパク質分泌量が向上することは、遺伝子工学的手法によりタンパク質を製造する方法の発明における効果といえても、本願補正発明は酵素という物自体の発明であるから、その特定の製造方法における効果を、物自体の発明の効果として参酌できない。
　
　念のため、本願明細書に示されたタンパク質分泌量について検討すると、本願明細書の表２には、本願補正発明に包含される変異体のタンパク質分泌量が野生型に対して「１０７〜１１２％」の範囲にあることが記載されているが、この程度の上昇は、進歩性を認めるに足る程に格別顕著なものであるとはいえない。
　そして、遺伝子工学的手法により作製された形質転換体におけるタンパク質分泌量は、プロモーター等の発現制御配列、分泌シグナル配列、宿主細胞等、タンパク質の発現に関与する様々な要因により影響を受けるものであって、目的タンパク質のアミノ酸配列のみで決まるものではないから、上記のように、本願明細書の実施例において、本願補正発明の変異アルカリプロテアーゼのタンパク質分泌量が特定の発現系において向上したことが確認されたとしても、本願補正発明の変異アルカリプロテアーゼをどのような発現系で発現させた場合であっても生じる普遍的な性質であるとはいえない。
　また、本願補正発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％の相同性を有するアミノ酸配列からなるものの変異体をも包含するものであるが、その中には、親アルカリプロテアーゼと比較して、タンパク質分泌量が向上していないものも存在するといえ、本願補正発明に含まれる範囲全体にわたって親アルカリプロテアーゼに比して、タンパク質分泌量が向上するという効果を奏するものとはいえない。
　
イ．比活性について
　本願補正発明に含まれる変異アルカリプロテアーゼの比活性について、本願明細書の表２をみると、野生型に対する相対比活性が１０３％及び１０４％のものがあり（表２の「S15H+S16Q」及び「S15H+S16Q+K346R+N405D」）、この程度の比活性の上昇では、有意差があるとはいえないし、引用例１に記載された変異アルカリプロテアーゼの相対比活性（図１）と比較して、格別顕著であるとも認められない。
　また、本願補正発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％の相同性を有するアミノ酸配列からなるものの変異体をも包含するものであるが、その中には、親アルカリプロテアーゼと比較して、比活性が向上していないものも存在するといえ、本願補正発明に含まれる範囲全体にわたって親アルカリプロテアーゼに比して、比活性が向上するという効果を奏するものとはいえない。
　
（４）小活
　以上の点からみて、本願補正発明は、引用例１に記載された事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
５．請求人の主張
　請求人は、平成２３年６月２１日付回答書において、下記のように主張する。
（１）４３４個のアミノ酸からなるＫＰ４３をランダム変異させて、所望の変異体を取得しようとした場合には、１９434通りの変異体の所望の効果をひとつひとつ確認していく必要があり、このような膨大な数の変異体の中から、所望の変異体を得ることは多大な試行錯誤を要する。 
　
（２）引用例１では、ＫＰ４３のランダム変異によって得られた実施例１の変異プロテアーゼのタンパク質分泌量については確認されていない。引用例１には、ハローの大きさに関し、「プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられる」と記載されているものの（段落〔００３１〕）、ハローは、タンパク質分泌量が向上した場合だけでなく、野生株と比較して比活性が向上した場合にも大きくなるものであり、大きなハローが形成されたからといって、野生型と比較してタンパク質分泌量が必ず向上しているとはいえず、引用例１においては、ハローの大きさを指標として選抜した変異体では比活性のみの向上が具体的に確認されていることを考慮すれば、ハローの大きさとタンパク質分泌量との関連性でなく、むしろ、ハローの大きさと比活性との関連性を当業者は想起するものである。
　
　上記主張について検討する。
主張（１）について
　上記４．で述べたとおり、本願補正発明の変異アルカリプロテアーゼは、引用例１に記載されるような、ランダム変異の導入とスクリーニングという手法を繰り返すことにより、容易に得られうるものであって、請求人が主張するような多大な試行錯誤を要するほどの格別な困難性を有するものとは認められない。
　
主張（２）について
　そもそも、「タンパク質の分泌量が向上している」点は、物自体の発明の効果として参酌できないことは、上記４．で述べたとおりである。
　念のため、請求人の主張について検討すると、たしかに、引用例１において、タンパク質分泌量を定量的に確認はしていないが、引用例１の「ハローの形成状態」は、「プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられる」との記載（上記記載事項（３）参照。）を読んだ当業者は、引用例１に記載された、「野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きなハローを形成する形質転換体」（上記記載事項（３）参照。）は、プロテアーゼ分泌量が多いものであると文面どおりに解釈するものであって、引用例１において、ハローの大きさは、タンパク質分泌量ではなく、比活性と関連すると当業者は想起するとの請求人の主張は採用できない。
　
６．小括
　以上の理由により、本願補正発明は、引用例１に記載された事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。
　
７．むすび
　以上のとおり、本件補正は、平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
　
第３　本願発明について
　平成２１年５月７日付の手続補正は上記のとおり却下されたので、本出願に係る発明は、平成２０年１２月１日付手続補正により補正された明細書及び図面の記載からみて、その請求項１〜８に記載された事項により特定されるとおりのものであり、そのうち請求項２には、以下のとおり記載されている。
　
「配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列の（ａ）１５位、（ｂ）１６位、（ｃ）１６６位、（ｄ）１６７位、（ｅ）１８７位、（ｆ）３４６位、（ｇ）４０５位、又はこれに相当する位置から選ばれる位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置；ヒスチジン、
（ｂ）位置；グルタミン、
（ｃ）位置；グリシン、
（ｄ）位置；バリン、
（ｅ）位置；セリン、
（ｆ）位置；アルギニン、
（ｇ）位置；アスパラギン酸、
に置換された、親アルカリプロテアーゼに比べて比活性及び／又はタンパク質分泌量が向上した変異アルカリプロテアーゼ。」（以下、「本願発明」という。）
　
　そして、本願発明は、本願補正発明をその一態様として包含するものであり、本願補正発明は上記第２　４．で述べた理由により、引用例１に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願発明も同様の理由により、引用例１に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
　
第４　むすび
　以上のとおりであるから、本願請求項２に係る発明は、特許法第２９条２項の規定により、特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。