【手続補正書】
【提出日】平成18年7月4日(2006.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子が当該グラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられ、
当該哺乳類から得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該粒子が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
前記哺乳類から得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理することを含む、方法。
【請求項３】
前記処理した血液を同じ哺乳類に再度注入することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記吸着カラム・アッセンブリが流動床吸着に適合させられ、特に安定化流動床吸着に適合させられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子が少なくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着により連続的に治療する治療用吸着カラム・アッセンブリの製造のための吸着媒体の使用であって、当該吸着カラム・アッセンブリが、ｉ）哺乳類から連続的に血液を得るための容器、ii）吸着媒体を含むカラム、およびiii）血液を患者に連続的に戻す別の容器を含み、
当該吸着媒体の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該吸着媒体がグラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられ、
当該カラムが、得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、吸着媒体の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理するものである、
吸着媒体の使用。
【請求項１４】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着により治療する治療用吸着カラム・アッセンブリの製造のための吸着媒体の使用であって、当該吸着カラム・アッセンブリが、（ａ）哺乳類から連続的に血液を得るための容器、（ｂ）カラムおよび吸着媒体、および（ｃ）患者に連続的に血液を戻す別の容器を含み、
当該吸着媒体の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該吸着媒体が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる使用であって、
当該カラムが、得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、吸着媒体の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理するものである、
吸着媒体の使用。
【請求項１５】
カラム・アッセンブリを通過する血液の流量が、流動床の膨張比が少なくとも１．３であり、例えば少なくとも１．５となるようなものである、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前に、物質が哺乳類の血流に最初に注入される開始工程が先行する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
哺乳類がヒトである請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記吸着媒体が粒子を含み、当該粒子が少なくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
安定化流動床が、血液物質が予め設定された値に達すると作動しうるスイッチと共に配置され、当該血液物質がデバイスにより監視され、当該デバイスが血液循環に合わせて配置され、当該デバイスが当該値に達したときに作動信号をスイッチに送る、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２４】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
流量が粒子の安定化流動床が形成されるような流量である、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ヒトの患者における敗血性ショックに至る感染症の７０％はグラム陰性菌（エンドトキシン（リポ多糖（ＬＰＳ））を介して作用する）により生じ、３０％はグラム陽性菌（細胞壁成分（ペプチドグリカン、リポタイコ酸）および外毒素（またはエクソトキシン）を介して作用する）により生じると推定されている（Gutierrez-Ramos & Bluethmann、１９９７、敗血性ショックで動作する分子およびメカニズム：ノックアウト・マウスから学ぶこと（Molecules and mechanisms operating in septic shock: lessons from knock-out mice）、Immunology Today 18, 329-334）。精製されたＬＰＳはそれ自体、敗血症候群の殆どを引き起こすことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
開示される安定化流動床が血液から細菌毒素を捕捉する最適な性能は、カラムで良好な流量を達成するために、血液の密度と粒子の密度との間で密度差を大きくすることと組み合わされて、効率的で、高い能力の吸着プロセスを成し遂げるために、非常に大きな粒子表面積を提供することにより、さらに確実となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
さらに別の要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により治療する方法であって、当該体外吸着法が吸着カラム・アッセンブリにより実行され、当該吸着カラム・アッセンブリが、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、グラム陰性菌のＬＰＳ部分に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であり、
ａ）哺乳類から血液を得る工程、
ｂ）得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｃ）処理した血液を同一の哺乳類に再度注入する工程
を含む方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
さらに別の要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により治療する方法であって、当該体外吸着法が吸着カラム・アッセンブリにより実行され、当該吸着カラム・アッセンブリは、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、当該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、
１）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
２）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
ａ）哺乳類から血液を得る工程、
ｂ）得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｃ）処理した血液を同一の哺乳類に再度注入する工程
を含む方法を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ポリマーのベースマトリックスはしばしば、複数のコア材料を一体に被覆し、保持する手段として、また、親和性特異的な分子を結合する手段として使用される。したがって、ポリマーのベースマトリックスは、特定の種類の天然または合成有機ポリマーから求められ、一般には、
Ａ）寒天、アルギン酸塩（またはアルギン酸エステル）、カラーギナン、グアールガム、アラビヤゴム、ガティガム（gum ghatti）、トラガカントガム（gum tragacanth）、カラヤガム（karaya gum）、イナゴマメガム、キサンタンガム、アガロース、セルロース、ペクチン、ムチン、デキストラン、澱粉、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシ澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含む、天然および合成多糖ならびに他の炭水化物系ポリマー、
Ｂ）アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、ビニル化合物の重合体、ポリアルケン、およびそれらの置換された誘導体、ならびに１よりも多いポリマー機能性を含むコポリマーおよびそれらの置換された誘導体を含む、合成有機ポリマーおよびポリマーを生じさせるモノマー、ならびに
Ｃ）それらの混合物
から選択される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
「安定化流動床」は、各粒子の動きが全床体積の限られた体積に制限されることの結果として、吸着体粒子の逆混合の度合いが低い流動床として定義される。これは、各粒子が、低い度合いの軸方向分散を有し、流動床の閉じこめ空間内の任意の位置にて見出される確率が同じでないことを意味する。したがって、安定化床は、逆混合の不存在が相互に異種（または不均一）である床のゾーンの混合を妨げるために、全流動床の不均一な組成を有するものとして特徴づけられ得る。「膨張床」という用語は、サンプルまたは水性緩衝剤の上向きの液体フローを、粒子の床を含むカラムの底部にて入口から加えることによって生成される粒子の安定化流動床を意味し、当該粒子は流動床の閉じこめ空間内にそれらを配置させる密度および／または寸法分布を有する。安定化流動床のように、膨張床は、粒子の逆混合の度合いが低いことにより特徴づけられる。磁気的な安定化流動床を除いては、「膨張床」および「安定化流動床」という用語は、大体において同意語である。本明細書において、「膨張床吸着（もしくは吸収）」または「安定化流動床吸着（もしくは吸収）」という用語は、入口および出口を有するカラムに含まれる吸着媒体がその落ち着いた状態から、流体（例えば、サンプル（体液）もしくは水性緩衝剤）のストリームを上向きのフローで適用することによって上昇させられ、それにより、粒子の間のスペースを増加させる特定の粒子クロマトグラフィー技術を説明する。これは、流体サンプルの導入と同時に又はその前に起こり得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
患者（哺乳類）からの血液、好ましくは全血を、コンテナ・リザーバに送ることができ、連続的体外吸着プロセスが開始される前に、当該リザーバにて十分な量が集められる。吸着カラム・アッセンブリを通過した後、処理した血液はまた、コンテナ・リザーバに集められて、処理した血液が治療中の哺乳類（一般にはヒト）に受動的に戻されるようにする。哺乳類の血液を扱う際に通常使用されるバルブ、ポンプ、チューブ、コンテナ・リザーバ等は、本発明の医療用デバイスに関連して使用することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
別の形態において、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から成る連続的な処置は、患者からの血液を安定化流動吸着媒体に向かわせて患者に戻すスイッチの作動により開始される。この形態において、スイッチは、患者の血液循環に合わせて配置され、安静時の患者へ血液が再び輸送されることを許容している。それは、連続的な血液モニタリングデバイスと接続され、モニタリングデバイスは、適当な生物標識（例えば、Ｃ反応性タンパク質もしくは血清アミロイドＡのような急性期タンパク質、または敗血症状態の開始に反応する他の任意の物質）の血漿中の濃度について、予め設定された変化を記録したときに、スイッチを作動させうる。この方法によって、敗血症を発症する危険のある患者の連続的な無人監視が可能となり、当該方法は、血液を本発明の安定化流動吸着デバイス（スタンバイ体外吸着）を介して分岐させることにより、血液パラメータにおける敗血症のような変化に反応する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
結果：
この実験から、抗体誘導体化粒子は、顕微鏡下で、より小さいＣＤ−８陽性（したがって、Ｃｙ−３蛍光）ＰＢＭＣｓが、何も付着していない若しくは非常に僅かな蛍光細胞が付着している粒子の表面に付着して、目立つようになると考えられる。このパターンはあきらかに、ランダムな蛍光（ＣＤ８陽性）のパターン、および誘導体化されていない集塊状の粒子について見られる非蛍光細胞とは明らかに異なっており、また、免疫吸着粒子への細胞の結合の特異性を示している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
処置：
新しく得たヘパリンで凝血防止したウシの全血を、健康なドナーから、血液をヘパリン管（Venoject、NaHeparin、Terumo Europe）に収集することにより得る。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、標準的な方法（Ficoll（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotech、code no. 17-1440-03）を用いる遠心分離）により標準的な手順（Rickwood ed., 1984、遠心分離：実際的なアプローチ（Centrifugation: a practical approach）、IRL Press）に従って調製され、ＰＢＳ中に約１０６ＰＭＢＣｓ／ｍｌで再懸濁させる。この細胞懸濁液は、新しい血液から調製され、調製後すぐに使用される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
処置：
流動床カラム（直径１ｃｍ）をサプライヤーの指示に従って組み立て、吸着粒子の水性懸濁液を加えて、沈降した床高さが７ｃｍに達するようにする（５．５ｍｌ、約０．７ｍ２のビーズ表面積に相当する）。それから、緩衝液で粒子を流動化させ、洗浄するために、また、カラムに入るときに血液細胞の溶血が最小となるように最適な塩濃度／オスモル濃度を確保するために、約５ｍｌ／分の吸着体平衡緩衝液の上向きのフローを加える。カラム内で均一なフローを確保するために、カラムは完全に垂直な位置に調節される。粒子が流動化させられると（即ち、流動床高さが１０ｃｍをこえると）、カラムの底にあるマグネティック・スターラーが最大速度の約８０％で動かされて、入ってくる液体の均一な分布を確保し、また、流量を２．２ｍｌ／分に調節する。吸着体平衡緩衝液による洗浄は、１５分間続けられ、その間に、１６ｃｍの床高さを有する安定化流動床が形成される。流動床の安定性は、注意深く床を目視することにより確かめられる。安定かつ平衡した流動床を確立した後、３００ｍｌのウシの血液を、一定の流量２．２ｍｌ／分にて、カラムにポンプで注入する。これは、シリンジを介してチューブをウシの適当な静脈に接続し、血液を連続プロセスで底部の入口からカラムにポンプで送り、頂部の出口からウシの別の適当な静脈に戻すことにより為される。実験の間、少量の血液サンプルを頂部の出口から５分ごとに取り出す。吸着は、１時間の間、５ｍｌ／分にて行われ、それから終了させられた。凝固は、ヘパリンＰＢＳ溶液を、血液１ｍｌあたり２５ＩＵの量で、カラムの底部の入口にてバルブを介して連続的に添加することにより防止される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
材料および方法：
使用した実験のセットアップおよび装置は実施例１と同じであった。
吸着粒子（ポリミキシンＢをリガンドとして有する）：
この実験に用いられる吸着体は高密度のジビニルスルホン結合アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにはポリミキシンＢスルフェート（Sigma）が結合している。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：３ｍｇ／ｍｌにてジビニルスルホン介して結合したポリミキシンＢ（Sigma、Mo、code no. P4932）。結合（またはカップリング）は、各ポリミキシンＢの分子の結合をポリミキシンＢ中の最小の数の第一アミノ基を介して得られるように実施する。実施例９参照。