【手続補正書】
【提出日】平成18年10月17日(2006.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明に係る組成物、単離された複合体、および医薬は、Ｂ細胞寛容の研究、自己抗体を産生する物質の同定、および人間の疾病、例えばウイルス感染、慢性炎症、および癌の治療および予防のための、生物学的手段、治療薬、および予防薬として使用される。例えば一つの態様において、自己抗体を産生する物質を同定する方法が提供される。このアプローチでは、本発明に係る組成物を対象に供給し、次にこの対象から抗体を単離し、そして、単離されたこの抗体がその組成物により提示された寛容原と相互作用するかどうかの決定を行う。その後、単離された抗体が寛容原と相互作用する能力によってＢ細胞寛容を破壊するものとして、免疫原を同定する。別の態様では、寛容原に対する抗体を産生する方法が提供されるが、この場合、寛容原に対する抗体を必要とする対象を特定し、次いで治療上有益な量の本発明に係る組成物を供給する。加えて、ＨＩＶ感染、慢性ウイルス感染、癌および炎症の治療および防止の方法が提供され、これは、本発明に係る組成物を含む医薬を提供する工程を含むものである。例えば、乳癌および慢性関節リウマチは、それぞれＥｒｂＢ−２およびＴＮＦ−αに対する抗体の産生を誘導することにより治療することができる（Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．等、Ｉｍｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１４４：１９５−２２３（１９９５）；Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：７３７−４４（１９９６））。さらに、本発明に係るキメラおよび複合体ＶＬＰ上のエピトープに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が、態様である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
この抗体が天然のｍＣＣＲ５と結合する能力を調べるためのもう一つのアプローチとして、本発明者等は、Ｌ１−ＣＣＲ５血清が、ｍＣＣＲ５で一時的にトランスフェクトさせたＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞との結合についてｍＣＣＲ５のケモカインリガンドと競合できるかどうかを調べた（図３）（実施例５を参照）。マウスケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびランテス（ＲＡＮＴＥＳ）はｍＣＣＲ５のリガンドである。さらに、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳのヒト相同体はｍＣＣＲ５と結合することができる（Ｍｅｙｅｒ，Ａ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：１４４４５−１４４５１（１９９６）；Ｎｉｂｂｓ，Ｒ．Ｊ．Ｂ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１２４９５−
１２５０４（１９９７））。この競合検定では、市販品を入手できるヨウ素化ヒトＲＡＮＴＥＳを使用した。１：３０希釈のＬ１−ＣＣＲ５血清が、１：３０希釈の野生型Ｌ１ ＶＬＰ血清を用いた３７％置換と比較して、およそ６６％のヨウ素化ヒトＲＡＮＴＥＳに取って代わった（１００倍過剰のコールドＲＡＮＴＥＳを用いて観察される置換に類似する）。１：７５および１：１５０希釈のＬ１−ＣＣＲ５血清はそれぞれ２５％および１７％のヨウ素化ＲＡＮＴＥＳに取って代わり、一方、これらの希釈での対照血清を使用した場合は有意な置換は観察されなかった。先の研究は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳはｈＣＣＲ５の第２ＥＣループに結合することを示した。何故ならこれらの結合はこのループに対するモノクローナル抗体によってブロックされたがｈＣＣＲ５のアミノ末端に対する抗体によってはブロックされなかったためである（Ｗｕ，Ｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：１３７３−１３８１（１９９７））。これらの実験結果は、これら二つの部位の間に位置するｍＣＣＲ５の第一ＥＣループと結合する抗体は、恐らくはこのループが第２ＥＣループの近位にあるため、ＲＡＮＴＥＳの結合を部分的にブロックできることの証拠を提供している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
したがって、本発明者等はＥ．ｃｏｌｉにおいて、マウスＴＮＦ−αの２０アミノ酸長フラグメントに連結したストレプトアビジン核を含む融合タンパク質を作成した（ＳＡ−ＴＮＦ−αと称する）。この融合タンパク質を不溶性封入体として精製し、グアニジン−ＨＣｌ中に可溶化し、そして生理緩衝液中への透析によって再折り畳みを行った。次いでこの再折り畳みされた融合タンパク質を、上記のように製造したビオチニル化Ｌ１ ＶＬＰと結合させ、ＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰ免疫原を作り上げた。ＳＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質は高い占有性でビオチニル化ＶＬＰに結合した（図６）。次に、ＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰ免疫原をマウスに注射して自己抗体反応を誘起した。複合体ＶＬＰをマウスに２回注射すると（３ｘ５ｇ）、天然のマウスＴＮＦ−αに結合する高力価（ＥＬＩＳＡによる）の抗体が誘導された（第１表を参照）。対照的に、ＳＡ−ＴＮＦ−αのみまたはＶＬＰのみによる免疫は、確実なまたは高い自己抗体反応を誘起できなかった（第２および３表を参照）。３回目のＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰの注射後には、ＴＮＦ−α抗体の力価は全てのマウスで１０5に達した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
これらの結果は、ＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰ免疫原がＢ細胞寛容を効果的に破壊することを確立した。複合体ＶＬＰがＢ細胞寛容を効果的に破壊するというさらなる証拠が、ＴＮＦ−α細胞毒性検定から得られた。これらの実験において、ＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰ免疫原がインディケーターセルライン（Ｌ９２９細胞）のＴＮＦ−α仲介アポトーシスを防止する能力が決定された。ストレプトアビジン結合ＶＬＰ（対照）またはＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰのいずれかを接種したマウスから得られた血清をＴＮＦ−αと共にインキュベートし、血清処理されたまたは血清処理されていないＴＮＦ−α試料を培養中の細胞に添加した。血清がＴＮＦ−α活性を中和する能力を、生存細胞のパーセンテージの増加によって測定した。ＳＡ−ＴＮＦ−α／ＶＬＰ（５％溶液）を接種したマウス由来の血清は
、生存細胞についてバックグラウンドレベルを３倍増加させた（図７）。マウスＴＮＦ−α融合タンパク質での有望な結果を得て、本発明者等はマカークＣＣＲ５の４個の細胞外ドメインの各々について同様のストレプトアビジン融合タンパク質を作成した。全ての４つの融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉの封入体から作成し精製した。４つのうち３つを、それらがビオチニル化ＶＬＰと強固に結合するよう再折り畳みすることができた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
上記の論考および以下の実施例に示すように、寛容原に対応するペプチド配列は、集合されたキメラまたは複合体ウイルスキャプソマーの高度に機能的な配列の状況で提示される時、天然タンパク質に対するＢ細胞寛容を排除することができる。本明細書に記載の方法を用いてＢ細胞寛容を排除する能力は、数多くの適用を有している。例えば、この技術を使用してマウス抗自己モノクローナル抗体を作成することができる。さらに、このアプローチは、実験的動物モデルの正常または疾病プロセスにおけるその機能を調べるために可溶性タンパク質の活性を調節する手段として有効である。その上、自己抗体の誘導は、例えばそれぞれＥｒｂＢ−２およびＴＮＦ−αに対する抗体による乳癌および慢性関節リウマチの治療において、人間の疾病のためのモノクローナル抗体療法に代わる有効な代替療法を提供する（Ｍａｉｎｉ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１４４：１９５（１９９５）；Ｂａｓｅｌｇａ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１４：７３７（１９９６））。以下の議論は本発明の態様に関するさらなる特徴を記載するものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
多数の型の寛容原を支持体またはキャプソマー構造体に提示することができる多数の寛容原 広範な種々の寛容原を用いて、本発明を実施することができる。好ましい実施形態では、寛容原は自己抗原である。好ましい自己抗原には、自己抗原を標的する抗体が有効な治療薬であると認められている抗原がふくまれる。一般には、自己抗原は、ＶＬＰに結合した自己抗原を含む組成物で免疫化される生物の自己抗原に一致する。したがって、ヒトの免疫化用に、ヒト自己ペプチド（ヒトＣＣＲ５ケモカインレセプターなど）を、ＶＬＰ構造体に組み込むことができる。この方法では、ヒトは自己抗体を産生することができる。使用することができ自己抗原の特定の例は、ＴＮＦ−αおよびＣＴＬＡ−４などの中枢自己抗原である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ＴＮＦ−αは、多数のヒト疾患（慢性関節リウマチ（ＲＡ）の原理となる溶解性エフェクターとして最も注目すべきである）に関連している（Ｍａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１４４、１９５、１９９５）。慢性関節リウマチは、世界人口の約１
％が罹患していると考えられている複数の関節の慢性で痛みを伴う疾患である。ＲＡの症状は、薬物療法は無効である。これにより、症状よりもむしろ疾患のエフェクターを標的する別の治療ストラテジーの開発が望まれている。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体治療により、ヒト臨床試験においてＲＡの客観的および主観的指標を劇的に改善した（Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４、３９７、１９９６）。不運にも、この利点は一時的であることが証明されており、この効果の喪失はモノクローナル抗体に対する抗体の発生に相関していた。ＴＮＦ−αが比較的低濃度の血清で生物学的に活性である小さな可溶性タンパク質である事実とあわせて、これらの知見により、ＴＮＦ−αはワクチンを含む自己抗体用の魅力的な標的となった。さらに、この概念を試験するためのＴＮＦ−α媒介ＲＡ用の良好なマウスモデルが存在する（Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、７３７５、１９９２）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
Ｌ１−ＣＣＲ５粒子に対して生成した抗体が未変成のｍＣＣＲ５に結合する能力をさらに検査したが、これはｍＣＣＲ５を発現するトランスフェクションされたＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に結合するための１２５Ｉ−標識化ヒトＲＡＮＴＥＳケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）リガンドとの競合を試験することにより行った。マウスケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはｍＣＣＲ５に対するリガンドである。加えて、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳのヒト相同体はｍＣＣＲ５に結合可能である（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１４４４５（１９９６）；Ｎｉｂｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１２４９５（１９９７））。以下の実施例に示すように、ｍＣＣＲ５発現構築物を用いたトランスフェクションから３日後、マウス血清の希釈液の不存在下または存在下に０．５ｎＭヨウ素化ＲＡＮＴＥＳを用いて細胞をインキュベートした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
これらの手順を行った結果から、Ｌ１−ＣＣＲ５粒子に対して生成された自己抗体は細胞表面に発現されたＣＣＲ５と特異的に結合し、リガンドがレセプターに結合するのを阻害することが確認された。特に、図４に示すグラフ化された結果からわかるように、Ｌ１−ＣＣＲ５血清の１：３０希釈液は（１００倍過剰の冷ＲＡＮＴＥＳを用いた際に観察される置き換えと同様に）ヨウ素化されたヒトＲＡＮＴＥＳの約６６％を置き換え、これに対して野生型Ｌ１ ＶＬＰ血清の１：３０希釈液を用いると３７％が置き換えられた。Ｌ１−ＣＣＲ５の１：７５希釈液および１：１５０希釈液はそれぞれヨウ素化ＲＡＮＴＥＳの２５％および１７％を置き換えたが、対照血清をこれらの希釈率で用いた場合は顕著な置き換えは見られなかった。最大限に結合したヨウ素化ＲＡＮＴＥＳは血清の不存在下で結合検定することにより決定され、図３において水平の点線で示すように約２５５０ｃｐｍに相当する。ヨウ素化ＲＡＮＴＥＳの非特異的結合（約１３００ｃｐｍ）は冷（非ヨウ素化）ヒトＲＡＮＴＥＳの１０００倍過剰（５００ｎＭ）において結合検定することにより決定した。図４に示すデータは１つの実験について２つのウェルの平均値を表す。従前
の研究からＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳがヒト（ｈ）ＣＣＲ５の第２の細胞外ループに結合することが示唆されたが、その理由はそれらの結合が分子のこの部分に対して単クロン抗体により阻害されるからであり、ｈＣＣＲ５のアミノ末端に特異的な抗体により結合を阻害される訳ではないからである（Ｗｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１３７３（１９９７））。ここに述べた知見から示されるように、これら２つの部位の間に位置する、ｍＣＣＲ５の第１の細胞外ループに対する結合特異性を持つ抗体が都合よくＲＡＮＴＥＳ結合を阻害し、さらにこれらの自己抗体のインビボ形成を刺激する方法を提供している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
乳頭腫ウイルスＬ２タンパク質は外来性ポリペプチド配列の大きな挿入物を収容することができ、なおかつウイルス様粒子に導入することができるので、Ｌ２の部位に挿入された全長自己タンパク質を有するＬ１／Ｌ２キメラを調製し免疫原として使用することができる。好適な実施形態では、標的ポリペプチドをＢＰＶ Ｌ２タンパク質の最初の１１０個のアミノ酸に融合させる。これによりキャプシド上の挿入配列はＬ１ ＶＬＰに組み込まれると外側になる。実際、この方法を用いてＴＮＦ−αに対する自己抗体の産生を刺激するための免疫原として使用できるキメラ性ＶＬＰを調製することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
以下の２つの実施例はマウスＴＮＦ−α ＶＬＰをＬ２キメラおよびストレプトアビジン融合物としての両方の場合について作成方法を説明するものである。このタンパク質の既知の原子構造（Ｅｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７５９５（１９８９））に基づいて、Ｌ１キメラも機能的に中和性抗体が結合するエピトープを含むＴＮＦ−αペプチドを挿入することにより調製することができる。ＴＮＦ−α ＶＬＰワクチンにより予防接種したマウス由来の血清をＥＬＩＳＡ検定においてマウスＴＮＦ−αに対する反応性について、およびインビトロにおけるＬ９２９細胞のＴＮＦ−α誘起細胞溶解の阻害について試験することができる（Ｔａｋａｓａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：１２６６（１９９７））。ＴＮＦ−αポリペプチド配列を表すＶＬＰもまたコラーゲンＩＩ型ＲＡを有するＤＢＡ／１マウスをワクチンによる予防接種をするのに使用することができる。疾患の経過におけるこの措置の効果を標準的な脚の腫れおよび組織学的分析を用いてモニターすることができる（Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：７３７５（１９９２））。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
分子クローニングの技術において通常の技能を有する者が熟知している標準的技法を用
いてＬ２−マウスＴＮＦ−αポリペプチドキメラをコードする遺伝子構築物を調製しトランスフェクションされた細胞内でキメラタンパク質として発現した。ついでこれらのキメラタンパク質をＬ１ウイルス様粒子に共組み込みしてキメラ性Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰとした。このＬ１／Ｌ２ ＶＬＰを精製し、アジュバントと組み合わせ、免疫化手順に従って試験動物に投与した。対照として、Ｌ２−ＴＮＦ−αキメラタンパク質および可溶性ＴＮＦ−αを単独で注射した。キメラ性Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ製剤を投与したマウス由来の血清サンプルＥＬＩＳＡ検定で検出可能である抗ＴＮＦ−α抗体を含有する。これに対して、対照動物由来の血清サンプルは抗ＴＮＦ−α抗体を含有していない。この結果はキメラ性Ｌ２タンパク質を含むキメラ性Ｌ１／Ｌ２粒子が自己抗体の産生を刺激するために使用するのに有用であることを示している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
マウス単クロン抗体が治療剤としておよび広範囲の基礎および応用研究用の試薬として有用であることはよく確立されている知識である。しかしながら、たいていの単クロン抗体はマウスまたはラット由来であるため、現在入手可能な抗体セットは、中心抗原が表面に露出しているマウスまたはラットのエピトープをそれらの未変成の立体配座で特異的に認識するものに欠けている。この欠失によりヒトにおける研究には限界があるが、その理由は齧歯動物は哺乳動物の生物学を研究するためのモデルであり、高度に保存されてきたタンパク質のアミノ酸配列は典型的には進化を通じて保存されている重要な機能を有するからである。そこで、本明細書に開示の方法を用いて未変成の立体配座の自己抗体に対するＢ細胞の応答を刺激することが可能である。しかるのち、所望の結合特異性を有する単クロン抗体を産生するハイブリドーマを調製しスクリーニングすることが可能である。詳しくは、ＴＮＦ−αに対する多クロン抗体を生成するのにもっとも有効なＴＮＦ−α ＶＬＰを用いてマウスＴＮＦ−αを特異的に認識し、機能的に不活性化する単クロン抗体を生成するようにすることが可能である。標準脾臓細胞／ミエローマ融合方法を用いて単クロン抗体産生細胞を創成する（Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６６：５５０（１９７７））。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
実施例１０はＴＮＦ−αに対するマウス単クロン抗体を製造するのに使用できる方法を簡単に説明するものである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
［実施例１０］
モノクローナル抗体の製造
まず、上述の方法に従って調製した表面にマウスＴＮＦ−αポリペプチドを露出したウイルス様粒子でマウスを免疫化する。ＥＬＩＳＡ検定を用いてマウス由来の血清が未変成ＴＮＦ−αに特異的な抗体を含有することを確認する。これらのマウスを殺し、脾臓細胞を採取し非分泌性ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマのコレクションを作成する。これらのハイブリドーマを当技術における通常の技能を有する者が熟知している方法によりスクリーニングして、未変成ＴＮＦ−αに対する結合特異性を有する抗体を分泌する細胞を同定する。ついで有効量の抗ＴＮＦ−α抗体を精製する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１ＢはＥＬＩＳＡ検定における血清抗体反応性を示す折れ線グラフである。図１Ａは、ＢＳＡ結合ＣＣＲ５ペプチドに対するＩｇＧ抗体の反応性を示している。図１Ｂは、ＢＰＶ−１ ＶＬＰに対するＩｇＧ抗体の反応性を示している。記号は、フロイントアジュバント存在下でのＬ１−ＣＣＲ５粒子（□）、変性Ｌ１−ＣＣＲ５粒子（◇）、またはＢＰＶ−１ ＶＬＰ（△）、またはアジュバント不在下でのＬ１−ＣＣＲ５粒子（○）を接種したマウス由来の血清を使用した結果を示す。
【図２】
図２Ａ−２Ｇは、一時的にトランスフェクトしたＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に対する抗体結合のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。ＣＣＲ５ ＤＮＡをコードしている組み立て物（太い実線）、またはバックグラウンド染色のための対照としてベクターのみ（影を付したヒストグラム）を、染色の２日前に細胞中にトランスフェクトした。（２Ａ−２Ｄ）。マウスＣＣＲ５またはベクターＤＮＡでトランスフェクトした細胞。（２Ｅ−２Ｇ）。ヒト／マウスＣＣＲ５キメラ（ＨＭＨＨ）またはベクターＤＮＡでトランスフェクトした細胞。細胞を、Ｌ１−ＣＣＲ５で免疫したマウス由来の精製ＩｇＧ（２Ａおよび２Ｅ）、ＢＰＶ−１ ＶＬＰで免疫したマウス由来の精製ＩｇＧ（２Ｂおよび２Ｆ）、またはＫＬＨ結合ＣＣＲ５ペプチドで免疫したマウス由来の精製ＩｇＧ（２Ｄ）と共にインキュベートした。対照として、細胞はヒトＣＣＲ５の第２ＥＣループに対する蛍光標識したモノクローナル抗体で染色した（２Ｃおよび２Ｆ）。
【図３】
図３は、血清によるヨウ素化ヒトランテス（ＲＡＮＴＥＳ）の置換を示す棒グラフである。ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞をｍＣＣＲ５で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトの３日後、細胞を０．５ｎＭヨウ素化ＲＡＮＴＥＳと共にマウス血清の希釈液の不在下または存在下でインキュベートした。血清不在下での結合について検定することにより、最大結合したヨウ素化ＲＡＮＴＥＳを決定したが、これはおよそ２５５０ｃｐｍに相当する（点線で示す）。ヨウ素化ＲＡＮＴＥＳの非特異結合（およそ１３００ｃｐｍ）を、１０００倍過剰（５００ｎＭ）のコールド（非ヨウ素化）ヒトＲＡＮＴＥＳ中での結合について検定することにより、決定した。データは、一つの実験からの２個のウェルの平均値を表す。この検定は、再現性を確実とするため、２回反復した。
【図４】
図４は、Ｌ１−ＣＣＲ５血清、ＢＰＶ−１ ＶＬＰ血清、またはヒトＣＣＲ５の第２ＥＣループに対するモノクローナル抗体（ｍＡＢ１８２）の希釈液を用いたＨＩＶ−１ ＢａＬ感染の阻害を示す折れ線グラフである。血清は３匹の動物からプールした。感染した細胞の核が青色に染まるＨＩＶ−１のインディケーターセルラインである、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞を、ヒトＣＣＲ５遺伝子のバックグラウンド中にマウスＣＣＲ５の第一のＥＣループを含んでいる、ヒト−マウスＣＣＲ５キメラ（ＨＭＨＨ）で一時的にトランスフェ
クトした。トランスフェクトの３日後、細胞をプールしたマウス血清の希釈液または抗体と共に、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで細胞をＭ親和性単離物ＨＩＶ−１ ＢａＬでチャレンジした。感染の３日後、核ウェル中の青色の細胞数を数えることによって、感染した細胞を採点した。血清存在下における青色の（感染した）核の数を血清不在下における青色の核の数と比較することにより、ＨＩＶ−１ ＢａＬ感染の阻害を決定した。データは、一つの実験からの２個のウェルの平均値を表す。再現性を確実とするため、この検定は少なくとも２回反復したが、同様の結果であった。（□）Ｌ１−ＣＣＲ５を接種したマウス、（○）ＢＰＶ−１ ＶＬＰを接種したマウスからの血清、または（△）ｍＡＢ１８２。
【図５】
図５は、ＥＬＩＳＡ検定における霊長類血清抗体の反応性を示す折れ線グラフである。記号は、アジュバントと共にＬ１−ＣＣＲ５粒子（□）を、またはアジュバント不在下に野生型ＢＰＶ−１ ＶＬＰ（◇）を接種したマカーク由来の血清を用いた結果を表している。
【図６】
図６は、ビオチニル化および非ビオチニル化ＶＬＰに対するストレプトアビジンの結合を示す折れ線グラフである。記号は、（□）野生型ストレプトアビジン（ＳＡ）と複合体ビオチニル化ＶＬＰ、（○）ＳＡ−ＴＮＦ−αと複合体ビオチニル化ＶＬＰ、（■）野生型ＳＡと複合体非ビオチニル化ＶＬＰ、および（●）ＳＡ−ＴＮＦ−αと複合体非ビオチニル化ＶＬＰを表す。
【図７】
図７は、ＴＮＦ−α細胞毒性検定の結果を示す棒グラフである。ビオチニル化ＶＬＰと結合させたストレプトアビジン−ＴＮＦ−α融合タンパク質（ＳＡ−ＴＮＦ−α）を接種したマウス由来の血清を、ＴＮＦ−αの存在下でＴＮＦ−α感受性細胞セルライン（Ｌ９２９）と共にインキュベートした。ビオチニル化ＶＬＰと結合させたストレプトアビジンを接種したマウス由来の血清を対照として使用した。細胞の能力。ＳＡ−ＴＮＦ−αを接種したマウス（例えば５％濃度）由来の血清は、バックグラウンドレベルと比較した時、生存細胞の数において３倍の増加を示した。