【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年12月1日(2005.12.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２個の単離されたヌクレオチド分子を含有するアレイであって、各分子は、ミトコンドリア生物学に関与する遺伝子の発現産物である核酸分子に、一意的にハイブリダイズし得る配列を有する、アレイ。
【請求項２】
２つ以上の単離された核酸分子またはスポットを含有するアレイであって、各スポットは、複数の単離された核酸分子を含み、各分子は、ヒトプローブセット番号１の配列（配列番号１〜９９４）、マウスプローブセット番号２の配列（配列番号９９５〜３０４０）、および前出の配列に少なくとも７０％の相同性を有する配列からなる群より選択される配列から本質的になる配列を有する、アレイ。
【請求項３】
ガラススライド上に印刷される、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
約１０より多いスポットを含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項５】
約２５より多いスポットを含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項６】
請求項２に記載のアレイであって、ヒトプローブセット番号１の配列（配列番号１〜９９４）を有する、全ての単離された核酸分子を含む、アレイ。
【請求項７】
請求項２に記載のアレイであって、マウスプローブセット番号２の配列（配列番号９９５〜３０４０）を有する、全ての単離された核酸分子を含む、アレイ。
【請求項８】
コントロール核酸分子（配列番号３０４１〜３０４４）を有する１以上のスポットもまた含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項９】
ＳＵＲＦ−１、ＮＤ４、ＮＤＬ４、ＮＤ６、ＳＯＤ２、７０ｋＤ熱ショックタンパク質、ＡＮＴ２およびグルタチオンペルオキシダーゼ３に対するプローブを含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記プローブの各々が、配列番号１２、１３、１５、７１、７２、４５０、４５１、４９９、９３１、９３２および９２５〜９２９からなる群より選択される配列を有する、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
核酸を含むサンプルの発現プロフィールを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該サンプルを提供する工程；
ｂ）請求項２に記載のアレイを提供する工程；
ｃ）選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、該アレイを該サンプルと接触させる工程；および、
ｄ）該アレイに対する、該サンプル中の核酸のハイブリダイゼーションを測定して、発現プロフィールを作成する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記核酸が、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、マウスまたはヒト由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、胎児期、新生児期、幼児期、小児期、青年期、成熟期、成人期、老人期および死亡からなる群より選択される時期で、生物から収集される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは、生物の組織、器官、細胞、および細胞株の細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織は、筋肉、脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、骨格筋および腓腹筋からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、リンパ芽球腫細胞または線維芽細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞株は、ＬＭＥＢ４  ρ０、５０１−１、ＮＺＢ、ＬＭ（ＴＫ）−（ＧＵＰ）およびＣＡＰＲからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
同等の個体由来の２つの発現プロフィールを比較するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１１に記載の方法をある個体由来の第一のサンプルに行う工程；
ｂ）請求項１１に記載の方法を同等の個体由来の第二のサンプルに行う工程；および、
ｃ）該第一のサンプルの発現プロフィールを該第二の発現プロフィールと比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記第二のサンプルは、前記第一のサンプルが収集されるよりも後に収集される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一のサンプルは、環境条件への該サンプルまたは該サンプルの供給源の曝露前に収集され、そして前記第二のサンプルは、その後に収集される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記環境条件は、治療または環境危険である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸を含む第一の標識されたサンプルの発現プロフィールを、核酸を含む第二の差次的に標識されたサンプルに対して決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該第一の標識されたサンプルを提供する工程；
ｂ）該第二の差次的に標識されたサンプルを提供する工程；
ｃ）請求項２に記載のアレイを提供する工程；
ｄ）選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、該アレイを該第一のサンプルと該第二のサンプルとに接触させる工程；
ｅ）第アレイに対する、該第一のサンプルおよび該第二のサンプルのハイブリダイゼーションを測定する工程；ならびに、
ｆ）該第一のサンプルのハイブリダイゼーションを該第二のサンプルのハイブリダイゼ
ーションと比較して、発現プロフィールを作成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記第二のサンプルが、参照サンプルまたは標準サンプルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エネルギー代謝に関連した生理学的状態の診断上の発現プロフィールを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、請求項２に記載のアレイを、該生理学的状態を有する一人以上の個体の第一の群由来の核酸を含む標識された第一のサンプル、および該生理学的状態を有する一人以上の個体の第二の群由来の核酸を含む差次的に標識された第二のサンプルと接触させる工程；
ｂ）該アレイに対する該第一のサンプルのハイブリダイゼーションおよび該第二のサンプルのハイブリダイゼーションを測定する工程；ならびに、
ｃ）該第一のサンプルのハイブリダイゼーションを該第二のサンプルのハイブリダイゼーションと比較して、該生理学的状態の診断上の発現プロフィールを作成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
生理学的状態を診断するためのキットであって、以下：
請求項２に記載のアレイ；および
以下の工程を行うための指示書：
ａ）該生理学的状態を有し得る個体由来のサンプルを提供する工程であって、該サンプルは、核酸を含む、工程；
ｂ）選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、請求項２に記載のアレイを該サンプルと接触させる工程；
ｃ）該アレイに対する該サンプル中の核酸のハイブリダイゼーションを測定して、該サンプルの発現プロフィールを作成する工程；
ｄ）該生理学的状態の診断上の発現プロフィールを提供する工程；
ｅ）該サンプルの発現プロフィールを該生理学的状態の診断上の発現プロフィールと比較する工程；および
ｆ）該比較を分析して、該個体が該生理学的状態を有することを決定する工程
を備える、キット。
【請求項２７】
前記生理学的状態は、複合ＩＶリー症候群である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
複合ＩＶ型リー症候群を有する第一の個体を診断するためのキットであって、該キットは、複合ＩＶ型リー症候群を有さない第二の個体由来の第二のサンプル中でのＮＤ４、ＮＤＬ４、ＮＤ６、ＳＵＲＦ−１、ＳＯＤ２、７０ｋＤ熱ショックタンパク質、ＡＮＴ２およびグルタチオンペルオキシダーゼ３を含む遺伝子の発現量と比較して、該第一の個体由来の第一のサンプル中で、該遺伝子の発現量の少なくとも約１．７倍の減少を検出するための手段を備える、キット。
【請求項２９】
前記検出することは、ＳＵＲＦ−１、ＮＤ４、ＮＤＬ４、ＮＤ６、ＳＯＤ２、７０ｋＤ熱ショックタンパク質、ＡＮＴ２およびグルタチオンペルオキシダーゼ３に対するプローブを含むアレイを提供することを包含する、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
アレイを作製する方法であって、以下：
ａ）調製された基材を提供する工程；および、
ｂ）該基材上の既知の位置に２以上のスポットを印刷する工程であって、各スポットは、複数の単離された核酸分子を含み、各分子は、ヒトプローブセット番号１（配列番号１〜９９４）、マウスプローブセット番号２（配列番号９９５〜３０４０）、および前出の配列に少なくとも７０％の相同性を有する配列からなる群より選択される配列から本質的になる配列を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記アレイは、ヒトプローブセット番号１（配列番号１〜９９４）における全ての前記単離された核酸分子を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記アレイは、マウスプローブセット番号２（配列番号９９５〜３０４０）における全ての前記単離された核酸分子を含む、方法。
【請求項３３】
少なくとも２つの単離された核酸分子のライブラリーであって、各分子は、ヒトプローブセット番号１（配列番号１〜９９４）、マウスプローブセット番号２（配列番号９９５〜３０４０）、および前出の配列に少なくとも７０％の相同性を有する配列からなる群より選択される配列から本質的になる配列を有する、ライブラリー。
【請求項３４】
少なくとも２つのスポットを含むアレイであって、各スポットは、複数の単離された核酸分子を含み、各分子は、ヒトプローブセット番号１（配列番号１〜９９４）からなる群より選択される配列に少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、アレイ。
【請求項３５】
少なくとも２つのスポットを含むアレイであって、各スポットは、複数の単離された核酸分子を含み、各分子は、マウスプローブセット番号２（配列番号９９５〜３０４０）からなる群より選択される配列に少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、アレイ。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ミトコンドリア生物学発現アレイ
【背景技術】
【０００１】
（関連出願に対するの相互参照）
本出願は、２００１年８月３０日付出願の米国特許出願第６０／３１６，３２３号および２００１年８月３１日付出願のカナダ国特許出願第２，３５６，５４０号に対する優先権を主張するものであり、これら両出願は、本明細書の開示内容と矛盾しない限り、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
ミトコンドリア病は、さまざまな組織におけるエネルギー閾値作用（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｆｆｅｃｔ）の違いおよびｍｔＤＮＡ分離の確率論的性質によって患者の症状がさまざまに異なる、複合的でポリジーン性の病状群である。したがって、ほとんどのミトコンドリア病は、生化学的または表現型的な特徴によるのではなく、それらの遺伝的要因によって最もよく分類されている（Ｓｈｏｆｆｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，（１９９５）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｂｅａｕｄｅｔ，  Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ｖａｌｌｅ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ），ｐｐ．１５３５−１６０９；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，（１９９９）“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１４８２−１４８８）。多くのミトコンドリア病は、核遺伝子の変異によって生じ、それら変異の組み合わせが、ミトコンドリアゲノムを不安定化させるように作用することが知られている。（Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ／ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ，”［１９９７］Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２２６−２３４；Ｓｈｏｆｆｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｏｍｅｓ，”［１９９０］Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２６７−３３０；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，“ＳＵＲＦ１，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ，  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｌｅｉｇｈ‘ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ”［１９９８］Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：３３７−４３）。
【０００３】
培養細胞において、体細胞遺伝学的方法を用いてミトコンドリアの機能を解析するのが、ヒトのミトコンドリア病の特徴を調べる手段であった。エチジウムブロマイドおよびＲ−６Ｇによる処理を用いて、多くのヒトｍｔＤＮＡ変異の母性遺伝と生化学的表現型を解析するためのρ０および無ミトコンドリア細胞系が作出されてきた（Ｃｈｏｍｙｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｌｅｓｓ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｐａｔｈｙ−ｐａｔｉｅｎｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａ，”［１９９１］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２２３６−２２４４；Ｊｕｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｃｙｂｒｉｄｓ  ｔｏ  ａｓｓｉｇｎ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｄｅｆｅｃｔ  ｔｏ
ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ＮＡＤＨ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｍｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐａｉｒ  １４４５９  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  Ｌｅｂｅｒ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｏｐｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｏｎｉａ，”［１９９６］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：７７１−７７７；Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｅｇｒｅｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔＲＮＡ  Ｌｅｕ（ＵＵＲ）  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ，  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｅ−ｌｉｋｅ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ，”［１９９２］。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４８０−４９０；Ｔｒｏｕｎｃｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｔＤＮＡ  ｎｔ  ８９９３  ＴＧ［ＡＴＰ６］ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｉｇｈ‘ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎｔｏ  ｍｔＤＮＡ−ｌｅｓｓ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＡＤＰ／Ｏ  ｒａｔｉｏ，”［１９９４］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：８３３４−８３３８）。同一の核環境をもつが、ｍｔＤＮＡの遺伝子が異なるサイブリッド（ｃｙｂｒｉｄ）細胞系を作出することによって、核ゲノム多型の干渉を受ける可能性なしにｍｔＤＮＡ変異体同士を比較することが可能になる。これらのサイブリッド系統が、酵素学的方法によって細胞呼吸または呼吸複合体に特異的な活性を測定するなどという生化学的手法を用いて広く解析されてきた。遺伝子発現実験も行われてきたが、単一または小グループの遺伝子について行われるのが通常である（Ｈｅｄｄｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＡＴＰ，”［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８：１２１５６−１２１６３；Ｈｅｄｄｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”［１９９９］Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２２９６８−７６）。
【０００４】
遺伝子発現が広く研究されている。転写の変化またはＲＮＡ分解によるｍＲＮＡ量の調節が、細胞におけるタンパク質量を調節する唯一のメカニズムでは決してないが、実質的には、細胞型または細胞の状態の違いはすべて、いくつかの遺伝子のｍＲＮＡ量の変化と関連づけることができる（Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，”［２０００］Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１；ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ
ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓｃａｌｅ，”［１９９７］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：６８０−６８６；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”［１９９５］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−７０；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”［１９９５］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−７０；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｈｕｍａｎ  
ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  １０００  ｇｅｎｅｓ”［１９９６］Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１０６１４−９；Ｗａｌｌａｃｅ  Ｄ．  Ｃ．，ｇｒａｎｔ  ａｂｓｔｒａｃｔ＃２Ｒ０１Ｎ５０２３２８−１８；Ｋｅｒｓｔａｎｎ，Ｋ．Ｗ．［２０００］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１４８４；Ｋｏｋｏｓｚｋａ，Ｊ．Ｅ．［２０００］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１６１８；Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｅ．［２００１］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１５０１；  Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｅ．［２０００］”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｃｏｓｋｕｎ，Ｐ．Ｅ．［２０００］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１６１６；Ｓｌｉｇｈ，Ｊ．Ｅ．［２０００］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ＃５３；Ｍｕｒｄｏｃｋ，Ｄ．Ｇ．［２０００］Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃５５  ；  Ｌｅｖｙ  Ｓ．  Ｅ．  ［２０００］  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １１９；  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｄ．  Ｃ．  ，  Ｅｌｌｉｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｓｅｎｉｏｒ  Ｓｃｈｏｌａｒ  Ａｗａｒｄ  ｉｎ  Ａｇｉｎｇ）。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイ解析を用いて、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）が研究されてきたが、そこでは、ＤＬＢＣＬの診断を拡充するためにマイクロアレイが使用されていた（Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，”［２０００］Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１）。標準的な組織学的および形態学的な技術は、ＤＬＢＣＬのサブセットを規定してきたが、アレイ解析は、臨床学的に異なった２つの分類群を明らかにした。これら２つの新しく発見された分類群は、標準的な病理学によっては区別できないが、発現解析によって、何百もの遺伝子が異なった発現をすることが示された。これら分子レベルでの差異と本病の進行および臨床結果における差異との間に相関関係があることは、これら２つのＤＬＢＣＬ分類群が別個の病気であると考えられうることを明らかに示している（Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，”［２０００］Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１）。
【０００６】
ミトコンドリアＤＮＡの配列は、米国特許第５，６７０，３２０号，第５，２９６，３４９号，第５，１８５，２４４号および第５，４９４，７９４号に記載されているような病理と関係していた。ミトコンドリアの生物学というテーマに関する刊行物には、以下のものなどがある。Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ  Ｉ．Ｅ．（１９９９）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｌｅｓｔｉｅｎｎｅ，Ｐ．，Ｅｄ．（１９９９）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２０００）３２２：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｖ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＣＡ；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ（１９９９）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；Ｐａｐａ  Ｓ，Ｆｅｒｒｕｃｉｉｏ  Ｇ，ａｎｄ  Ｔａｇｅｒ
Ｊ  Ｅｄｓ．（１９９９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｅｎｅ
ｒｇｅｔｉｃｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌｏ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ＮＹ；Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ  Ｊ  ａｎｄ  Ｎｉｅｍｉｎｅｎ  Ａ（２００１）  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／〜Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ；ＭＩＴＯＭＡＰ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎ．ｅｍｏｒｙ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｇｉｎ／ＭＩＴＯＭＡＰ；Ｗａｌｌａｃｅ  Ｄ．Ｃ．（２００１）”Ａ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ，”Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ２３５：  ２４７−２６６；  Ｗａｌｌａｃｅ  ＤＣ”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ”  （Ａｕｇｕｓｔ  １９９７）  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２７７：４０−４７；Ｗａｌｌａｃｅ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ，”（１９９８）ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ  ７：１８７−１９０；Ｈｅｄｄｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ”（１９９９）ＪＢＣ  ２７４：  ２２９６８−２２９７６）；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ，”（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１４８２−１４８８；Ｓａｒａｓｔｅ，Ｍ．”Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｆｉｎ  ｄｅ  ｓｉｅｃｌｅ”（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１４８８−１４９３；Ｋｏｋｏｓｚｋａ  ｅｔ．ａｌ．，”Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｏｄ２（＋／−）ｍｏｕｓｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃｕｌｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，”（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２７８−２２８３；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．（２００１）Ｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ７：１５８−１６６；Ｗａｌｌａｃｅ  Ｄ．Ｃ．（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．１０６：７１−９３；ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．（２００１）  ＥｕｒｏＭｉｔ５  Ａｂｓｔｒａｃｔ。
【０００７】
ミトコンドリア病の分析は、伝統的に、欠損の分子的および生化学的な説明からなっていた（Ｓｈｏｆｆｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，（１９９５）”Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｂｅａｕｄｅｔ，Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ｖａｌｌｅ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ），ｐｐ．１５３５−１６０９）。ｍｔＤＮＡに突然変異を有するヒトにおける、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）遺伝子の発現の変化の解析が僅かながら行われている（Ｈｅｄｄｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｅｎｅｒｇｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ”（１９９９）ＪＢＣ  ２７４：２２９６８−２２９７６）。核にコードされているＯＸＰＨＯＳのサブユニットの不活性化によって作出されたミトコンドリア病のマウスモデルが出現したことで、組織特異的な発現変化を研究するための実験材料が提供された（Ｍｕｒｄｏｃｋ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ
ａｌ．，”Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ
ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ／ｍｕｓｃｌｅ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ，”［
１９９９］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４４２９−３３）。
【０００８】
核酸アレイについては、例えば、米国特許第５，８３７，８３２号、第５，８０７，５２２号、第６，００７，９８７号、第６，１１０，４２６号、国際公開公報第号、第９９／０５３２４号、第９９／０５５９１号、第００／５８５１６号、第９５／１１９９５号、第９５／３５５０５Ａ１号、第９９／４２８１３、ＪＰ１０５０３８４１Ｔ２、ＧＲ３０３０４３０Ｔ３、ＥＳ２１３４４８１Ｔ３、ＥＰ８０４７３１Ｂ１、ＤＥ６９５０９９２５Ｃ０、ＣＡ２１９２０９５ＡＡ、ＡＵ２８６２９９５Ａ１、ＡＵ７０９２７６Ｂ２、ＡＴ１８０５７０、ＥＰ  １０６６５０６およびＡＵ２７８０４９９に記載されている。このようなアレイは、例えば、ＰＣＴ公開国際公開公報第９９／０５５７４号、および米国特許第５，７５４，５２４号、第６２２８，５７５号、第５，５９３，８３９号、第５，８５６，１０１号に記載されているように、アレイを調製された試料と接触させたときのハイブリダイゼーション結果を解析するためにコンピュータ化された方法に取り込むことができる。例えば、米国特許第６，２２８，５８６号、第６，１６０，１０４号、第６，０８３，６９８号、第６，２６８，３９８号、第６，２２８，５７８号および第６，２６５，１７４号に記載されているように、疾患マーカーをスクリーニングする方法も当技術分野において知られている。
【０００９】
本明細書に引用されている文献はすべて、本明細書の開示内容と矛盾しない限り、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。上記文献の引用は、それらが関連先行技術であることを認めるものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本願発明は、ミトコンドリアの生物学に関係する遺伝子のライブラリー、ミトコンドリアの生物学に関係する遺伝子に対するプローブを含むアレイ、該アレイを作成する方法、および該アレイを利用する方法を提供するものである。ヒトおよびマウスのミトコンドリアの生物学に関係する遺伝子およびプローブ配列が提供される。本発明のアレイは、ミトコンドリア生物学の遺伝子発現プロフィールを判定するのに役立つ。ミトコンドリア生物学の遺伝子発現プロフィールは、エネルギー代謝に関連する生理学的状態を診断する発現プロフィールを判定し、該生理学的状態を診断し、該生理学的状態に関係する生化学経路、遺伝子および突然変異を同定し、該生理学的状態を予防および／または治療する上で有用な治療剤を同定し、該治療剤の効果を評価および／または観察し、また、ヒトのエネルギー代謝に関連する生理学的状態についての動物モデルを作出および同定するのに役立つ。ミトコンドリア生物学に関係することが分かっているすべての遺伝子に対するプローブを含むアレイ、ならびに該プローブのサブセットを含むアレイが提供される。本発明に係るミトコンドリア生物学発現アレイは、以前には、ミトコンドリア生物学に関係するとは認められていなかった遺伝子のプローブを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
核遺伝子と細胞質にあるミトコンドリア遺伝子との間の複雑な相互作用を調べる一方法は、ＤＮＡアレイなどのアレイを使用することによる方法である。ＤＮＡマイクロアレイは、千単位までの遺伝子の発現パターンの特徴を同時に調べる方法を提供し、遺伝子がいつどこで発現しているかが分かると、しばしば、その生物学的機能についての洞察をもたらす。また、特定の組織または細胞型における遺伝子発現のパターンは、その状態または状況についての詳細な情報ももたらす。
【００１２】
現在のところ、遺伝子発現の相関的な変化を観察し、分子レベルでの複雑な形質を調べ
るには、ＤＮＡマイクロアレイが最も効率的な方法である。多数の相互作用する実験から集められた発現プロフィールは、複雑な生物学的形質の基礎にある遺伝子発現パターン間の階層的な関連性を判定するために利用される。これらのパターンを用いて、複雑な疾患の分子的基礎をさらに限定することができる。
【００１３】
ミトコンドリアは、タンパク質をコードする核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）およびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のおよそ１０００個の遺伝子から組み立てられる。表１に示すように、タンパク質をコードする１３種類のミトコンドリア遺伝子が知られている。ｍｔＤＮＡのコドン使用頻度表が知られているが、普遍的遺伝子暗号とは僅かに異なっている。例えば、ＵＧＡが、終止ではなくトリプトファンをコードしていたり、ＡＵＡが、イソロイシンではなくメチオニンをコードしていたり、また、ＡＧＡおよびＡＧＧは、アルギニンではなく終止コドンであったりする。
【００１４】
（表１）
【００１５】
【表１】
2005515757.tif 000001
ａ，ｂ  ケンブリッジ配列（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｊ０１４１５、およびＡｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ａ  Ｒｅａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ＤＮＡ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：１４７）に対応して番号を付されているＭｉｔＭａｐ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｇｅｎ．  ｅｍｏｒｙ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＭＩＴＯＭＡＰで定義されているところに従った。
【００１６】
ここで「遺伝子」とは、ユニジーンクラスター（ｕｎｉｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）、発現配列、または、転写されタンパク質に翻訳される配列を意味する。「遺伝子」に対して、当技術分野において使用されるもう一つの単語は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」である。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）が、非重複の遺伝子群を意味するために「ユニジーンクラスター」という用語を制定した。一本のＤＮＡが、同じ配列をもつ、いくつかのスプライス変異体に転写されることがあるが、それらは、一つのユニジーンクラスターに属する
と指定されよう。ここで「スプライス変異体」は、一つの遺伝子から転写される幾種類かの転写産物のうちの一つのバージョンを意味する。ここで「ハウスキーピング遺伝子」とは、ほとんどすべての細胞型で同じような量発現している遺伝子を意味する。
【００１７】
ここで「ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子」とは、中間代謝、ＯＸＰＨＯＳ、ミトコンドリア輸送、細胞の生体エネルギー学、細胞における生合成、細胞周期調節、ＤＮＡ複製、エネルギー、代謝、熱ショック、ストレス、細胞基質、細胞の構造タンパク質、タンパク質合成および翻訳調節、シグナル伝達、転写および翻訳の制御、クロマチン構造、活性酸素種（ＲＯＳ）の生物学、ならびにアポトーシスなど、細胞の構造と機能に関係するミトコンドリア遺伝子および核遺伝子を意味する。
【００１８】
「ｍｔＤＮＡ」はミトコンドリアＤＮＡの意味である。「ｎＤＮＡ」は核遺伝子を意味する。
【００１９】
ここで「ミトコンドリアの生物学発現プロフィール」とは、試料中のミトコンドリアの生物学に関係する遺伝子の発現パターンであって、そのような遺伝子に由来するプローブによって検出されるものなどを意味する。このプロフィールは、試料のプロフィール、または試料が由来する供給源のプロフィールであるということができる。プロフィールは別個に測定することも可能であるが、標準またはコントロールもしくは別の試料と比較して測定することも可能である。完全なミトコンドリア生物学発現プロフィールは、試料が由来する生物種のミトコンドリア生物学に関係することが知られている遺伝子すべてについてのデータを含む。選択された生理学的状態についてのミトコンドリア生物学発現プロフィールは、少なくとも、その生理学的状態の診断となる発現変化を有すると判定されている遺伝子発現パターンであるが、ミトコンドリア生物学に関係する別の遺伝子の発現パターンを含むことも可能である。
【００２０】
ここで「アレイ」とは、単離された核酸分子、または、複数の実質的に同一の単離された核酸分子からなるスポットを順番にならべたセットを意味する。好ましくは、これらの分子は基質に結合している。スポットまたは分子は、それらの各々の（基質上の）位置が分かり、各々の同一性が分かるように順番に並べられている。マイクロ単位のアレイはマイクロアレイと呼ばれることもある。ガラスやセラミックなどのスライドなど、固体基質上のマイクロアレイは、遺伝子チップまたはチップと呼ばれることもある。
【００２１】
ここで「単離された核酸」とは、それが自然界に存在する状況以外にある核酸である。単離された核酸とは、その構造が、いずれの天然の核酸分子の構造と一致しない核酸である。この用語は、例えば、以下のものを対象とする。（ａ）天然のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する生物のゲノム中でその一部分子に隣接するコード配列または非コード配列の両方には隣接していないＤＮＡ；（ｂ）作出された分子が、天然のベクターまたはゲノムＤＮＡと一致しないように、ベクター、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生された断片、または制限酵素断片など分離された分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子または自然には見られない配列を有する改変遺伝子の一部である組換え塩基配列。
【００２２】
ここで「プローブ」とは、固体基質上に置かれたとき、別の核酸とハイブリダイズするのに適した単離核酸を意味する。アレイ用のプローブは、２０〜３０ヌクレオチドの短さでもよく、また、数千ヌクレオチドの長さに及んでもよい。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは、通常、相補鎖の有無および／またはその量を調査または検索するために使用される既知の配列を少なくとも部分的に含む。本発明のアレイ上では、プローブはこのような配列であって、各プローブが、標的試料１個当り１種類の核酸だけに実質
的にハイブリダイズするようなストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件である。
【００２３】
ここで「標的」または「標的試料」とは、核酸の集合体、すなわち、アレイ解析のために調製された試料として使用される、逆転写され標識されたｃＤＮＡを意味する。「標的」または「標的試料」は、いくつかの試料を組み合わせた混合物でもよい。例えば、実験用の標的試料は、異なった標識を付けたコントロール試料と組み合わせてアレイにハイブリダイズさせることもでき、この組み合わされた試料が、アレイのプローブによって検索される「標的」と呼ばれる。ここで「検索される」とは検出されることを意味する。プローブ、標的、およびハイブリダイゼーション条件は、プローブが標的を検索できるように、すなわち、標的試料の中の相補的な配列にハイブリダイズできるように選ばれる。
【００２４】
ここで「生理学的状態」とは、健康または不健康な生理学的状況を意味する。ここで「診断のためにアレイを最適化する」とは、一つ以上の生理学的状態を診断するのに必要な遺伝子由来のプローブだけが含まれるようにアレイ用のプローブを選択することを意味する。
【００２５】
ここで「プリンティング」とは、プローブを固体基質に適用するプロセス、すなわち、プローブのアレイを固体基質に適用して遺伝子チップを作製することを意味する。ここで「ガラス製スライド」とは、標準的な顕微鏡スライドと同じ寸法の小さなガラス片を意味する。ここで「調製された基質」とは、ポリリジンなど、プローブを基質に接着させるための接着用媒体として利用できる物質で調製される基質を意味する。
【００２６】
ここで「選択的ハイブリダイゼーション」とは、適当な相同性をもつ配列だけが結合したままになるような中度から高度なストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションを意味する。選択的ハイブリダイゼーションとは、プローブが、ハイブリダイズさせようとしている標的試料の核酸だけにハイブリダイズするようなストリンジェンシー条件で実施されるハイブリダイゼーションのことである。プローブおよび標的の配列に応じて、適当に選択的になるよう、ハイブリダイゼーション条件を選択する。例えば、ヒトの配列をヒト由来の試料を検索するためのプローブとして使用する場合には、ヒトにおける中立的な多型性を考慮すると、配列は約９９〜１００％一致しているであろうことから、選択的なハイブリダイゼーションは高度なストリンジェンシーで行われることとなろう。チンパンジーの標的調製された試料を、ヒトの配列用プローブを含むアレイに適用するときには、選択的ハイブリダイゼーションは低度ストリンジェンシーとなろう。アレイへの標的のハイブリダイゼーションは、選択された一つのハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーで行われるので、同じハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーで適当な標的分子と選択的ハイブリダイゼーションが行われるようにプローブを選択する。ここで「相同性」とは、ある配列、分子、またはその相補配列に対して塩基配列が一致することを意味する。
【００２７】
ここで「マウス試料」とは、マウス由来の試料またはマウス由来の細胞株を意味する。同様に、ここで「ヒト試料」とは、ヒト由来の試料またはヒト由来の細胞株を意味する。試料は、好ましくは、全ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。ここで「全ＲＮＡ」とは、細胞または一群の細胞から得られる、ｍＲＮＡなど、いくつかの種類のＲＮＡを意味する。ここで「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーＲＮＡ、または３’ポリＡテールを有するＲＮＡを意味する。ここで「調製された試料」または「標的」とは、アレイハイブリダイゼーションに備えて標識されている試料を意味する。「調製された試料」または「標的」は逆転写され、蛍光標識されている。ここで「標準」とは、未知の試料またはデータセットが互いの比較のために標準化できるよう、未知の試料と比較するために一般的に使用される試料またはデータセットを意味する。ここで「コントロール試料」
および「参照用試料」とは、実験用試料に対して比較するために使用される試料を意味する。
【００２８】
ここで「クローン」とは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの生物に保存しておくことができる単離された核酸分子を意味する。クローンは、通常、ベクターと挿入配列とから作成される。挿入配列は、通常、目的とする配列を含む。
【００２９】
ミトコンドリア病に関しては、現在の生化学的および表現型的な技術の正確さが、さまざまな疾患を区別・診断する上で非常に限定されていることが証明されている。最近の技術および解析における進歩によって、ＤＮＡマイクロアレイなどのアレイを用いて、何千もの遺伝子の発現パターンを同時に解析および定量することが実際のものとなっている。本発明は、これらのアレイ技術を、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子を含む特別なマイクロアレイの設計において、ミトコンドリア遺伝子発現の研究に応用するものである。本発明のアレイは、これまでミトコンドリア生物学に関与することが分かっていなかった遺伝子に対するプローブを含む。
【００３０】
ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子、すなわち発現配列は、中間代謝、ＯＸＰＨＯＳ、輸送、細胞の生体エネルギー学、細胞における生合成、細胞周期調節、ＤＮＡ複製、エネルギー、代謝、熱ショック、ストレス、細胞基質、細胞の構造タンパク質、タンパク質合成および翻訳調節、シグナル伝達、転写および翻訳の制御、クロマチン構造、活性酸素種（ＲＯＳ）の生物学、ならびにアポトーシスなど、細胞の構造と機能に関係する。ミトコンドリアの機能における変化は、変性疾患などのさまざまな生理学的状態に関連している。これらの機能は、多くの変性疾患に関係している。本発明は、ヒトおよびマウスのミトコンドリア生物学に関係する配列を編集したものを提供する。
【００３１】
本発明のアレイにおける遺伝子は、原核生物遺伝子の相同遺伝子など、ミトコンドリア生物学と類似したプロセスに関係する遺伝子に関連した配列をデータバンクで検索すること、および、発現パターンが変化している遺伝子についてミトコンドリア変異細胞株および動物の系統をスクリーニングするなど、さまざまな技術によって同定されたものである。マウスなど、ある生物種について関連遺伝子が同定されたときには、ヒトなど、別の生物種の相同遺伝子も、もしそれが既知であれば、その別の生物種関するミトコンドリア生物学に関係する遺伝子のリストの中に含ませた。ミトコンドリア変異細胞株とは、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子に少なくとも一つの突然変異を有する細胞株である。
【００３２】
本発明のマイクロアレイまたは遺伝子チップは、固体基質上の既知の位置に置かれたプローブを含む。有用な固体基質は、特製のガラス顕微鏡スライドである。本発明のアレイには、選択された生物種におけるミトコンドリア生物学に関係する発現配列の一部またはすべてを検出するプローブを含むアレイなどがある。
【００３３】
本発明のアレイは、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子に対するプローブだけでなく、コントロールプローブを含むことも可能である。本発明のアレイ上に含むことができるコントロールには、ハイブリダイゼーションのコントロールおよび走査用のコントロールなどがある。コントロールは、陽性コントロールまたは陰性コントロールである。ハイブリダイゼーション用コントロールの一つのタイプは、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子に対する同一のプローブをチップ上に幾度もスポットし、各スポットが異なった量のプローブをもつようにすることである。これによって、所定の配列のプローブ量を最適にすることが可能になる。スポットしたプローブが少なすぎると、ハイブリダイゼーションシグナルが最大になってデータが失われる結果となる可能性がある。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、陰性のハイブリダイゼーションおよび走査用のコントロールとして使用することができる。ＤＭＳＯのスポットではシグナルは全く出ないはずである。ＤＭ
ＳＯのスポットに少しでもシグナルが出たら、ハイブリダイゼーションまたは走査の段階に問題があったと考えられる。ヒトおよびマウスの配列に対して相同性が十分に低い植物の配列を、陰性のハイブリダイゼーションおよび走査用のコントロールとして利用することができる。植物の配列はシグナルを出さない。植物のスポットに出たシグナルは、ハイブリダイゼーションに問題があったこと、すなわち、低すぎるハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーが用いられたこと、または、走査に問題があったこと、すなわち、スキャナーにチップを間違った方向に挿入したことを示していると考えられる。ポリＡを陽性のハイブリダイゼーション特異性／非特異性のコントロールとして使用することができる。ポリＡのスポットは、常に強いハイブリダイゼーションを生じるはずである。ポリＡスポットにシグナルが出なかったら、高すぎるハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを用いた結果であると考えられる。ＰＣＲ生成物に取り込まれたＣｙ３またはＣｙ５は、陽性の走査用コントロールとなりうる。蛍光標識を含むＰＣＲ生成物またはそれ以外の核酸のアレイ上のスポットは、常にシグナルを生じるはずであるから、もし、この配列が、標的中の他の配列と全く相同性がなければ、その核酸に含まれている標識のシグナルだけが現れるはずである。コントロールプローブおよびミトコンドリア生物学に関係する遺伝子に対するプローブは、プリンティング用のコントロールとしてチップ上で２回、３回など繰り返し使用することができる。アレイ用のコントロールは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入することができる（商標ＳｐｏｔＲｅｐｏｒｔ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３４】
標準用標的および参照用標的も、当技術分野において知られているように本発明のアレイで役に立つ。検索しようとする調製された試料標的を本発明のアレイに適用すると、試験の結果が、すなわち走査によって測定されて記録される。これらの結果は、同様のアレイを使用して、他の試験結果と直接比較することができる。しかし、さまざまに標識された標準用標的を、調製された試料標的とともにハイブリダイゼーション用混合液の中に入れると、より正確になる。そして、実験用の試料標的の結果を標準化すると、他の試料標的のハイブリダイゼーション結果と正確に対比できるようになる。１０種類の調製済み試料標的を、同じ調製済み標準用標的と同時に本発明のアレイにハイブリダイズさせると、この１０種類の試料標的の結果を正確に互いに比較することができる。比較のための調製された参照用またはコントロール標的も、実施されている実験にとって特に適切であるかもしれない。調製された参照用標的は、表現型または処理が異なるなど、一点が異なる以外は、実験用の標的試料と同じ性別、年齢および核背景の動物の同じ細胞型に由来する標的試料であろう。実験用標的の結果を適当な参照用標的の結果と比較すると、試験された一つの相違点に関連するプロフィールが得られる。第一の試料のハイブリダイゼーション結果を、第二の試料のハイブリダイゼーション結果と比較する場合、第一の試料のハイブリダイゼーション結果を測定および記録しながら比較を行うか、事後に、二つの試料の測定および記録済みのハイブリダイゼーション結果を比較することによって行うことができる。
【００３５】
アレイ上のプローブは、約２０〜３０ヌクレオチド長という短さでも、ヌクレオチドが由来する遺伝子またはクローンの全部であって、数キロベースに及ぶ長さになってもよい。プローブの配列は、それがハイブリダイズする遺伝子の部位と同一（１００％相同）であってもよいし、変異配列であってもよい。変異プローブは、約９８％の相同性、約９５％の相同性、約９０％の相同性、約８０％の相同性、または約７５％の相同性もしくはそれ以下など、それらがハイブリダイズする遺伝子の部位に対し１００％よりも低い相同性をもつ。アレイは、アレイ上にあるすべてのプローブが、同一のハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーでそれらの対応遺伝子に結合できるように設計されている。試料を検索するために使用されるアレイ用のプローブは、通常、一つ以上の遺伝子、すなわち転写産物またはｃＤＮＡに由来する核酸に実質的にハイブリダイズすると考えられる反復配列などの配列を含まない。アレイ用のプローブは、用いられるハイブリダイゼーション・
ストリンジェンシーにおいてユニークなものでなければならない。ヒトゲノムにおいてユニークなものであるためには、プローブは、統計的に、約１５ヌクレオチド長以上なければならない。ユニークなプローブは、標的ごとに１種類の核酸だけにハイブリダイズできる。プローブは、別のハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを用いたときにはユニークではなくなり、２種類の異なった遺伝子、すなわち関連遺伝子由来の核酸とハイブリダイズする。遺伝子に対するプローブの配列相同性および使用されるハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーは、選択された試料を試験するときにプローブがユニークであるか否かを判定するのに役立つ。また、プローブは、同一の遺伝子に由来する異なった核酸、すなわちスプライス変異体にハイブリダイズしないかもしれない。プローブに使用される配列の遺伝子内での位置も、選択された試料を試験するときにプローブがユニークであるか否かを判定するのに役立つ。ある遺伝子のスプライス変異体が既知のものである場合には、理想的には、その遺伝子から異なったプローブ配列をアレイ用にいくつか選択して、各プローブが、スプライス変異体の一つに由来する核酸だけにハイブリダイズできるようにする。本発明のアレイにとって有用なプローブの配列の参考資料を表３〜５および配列表にまとめた。表３〜５のプローブが由来した遺伝子配列に由来するその他同等のプローブも、本発明のアレイにとって有用である。本発明のアレイは、選択的ハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーション条件で用いられる。選択的ハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、たった一つの遺伝子に由来する核酸とハイブリダイズする。アレイを、２種類以上の標的または２種類以上の調製済み試料と同時にハイブリダイズさせる場合には、各プローブは、各調製済み試料または標的中の一つの核酸とハイブリダイズすることができる。これら２種類の核酸が同一のユニジーンクラスターに由来するものである場合には、実際には、これらの核酸が異なった標識を含んでいる可能性があっても、そのプローブは１種類の遺伝子にハイブリダイズすると言われる。
【００３６】
別の生物に由来するミトコンドリア生物学に関係する遺伝子の配列を使用して、それらが、アレイ上の他のプローブとほぼ同じハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーでハイブリダイズする限り、本発明のアレイに役立つプローブを作成することができる。植物の配列のように、実質的により低いストリンジェンシーでしかハイブリダイズできない配列は陰性コントロールとして有用である。
【００３７】
本発明のアレイを利用して、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを適当に修正することによって、関連する生物種に関するプロフィールを決定することができる。生物間の配列の相同性が、当技術分野において知られている。例えば、ヒトとチンパンジーの配列は約９８％同一である。したがって、ヒトのアレイは、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを適当に低下させてチンパンジーの特徴を調べる上で有用である。ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーは、当技術分野において知られているように、塩濃度、およびハイブリダイゼーション温度および／または洗浄温度などのハイブリダイゼーション要件を変えることで低下させることができる。
【００３８】
本発明のアレイにとって有用な配列は、他の生物種のアレイを設計するのにも有用である。新しい生物用のアレイを作成するために、発現配列断片（ＥＳＴ）など、その新しい生物に由来する既知の配列を、当技術分野においてに既知の方法によって、他のミトコンドリア生物学用アレイにとって有用なことが既に知られている配列と比較する。配列比較は、核酸またはポリペプチドのレベルで行うことができる。それによって、新しい生物に由来する相同および類似した配列を、その新しい生物のミトコンドリアアレイに用いるために同定および選択する。また、本発明のアレイ上のプローブは、ライブラリーのスクリーニングのような当技術分野において標準的な分子生物学技術を用いて新しい生物のアレイ用の候補を同定するためのプローブとしても有用である。
【００３９】
本明細書に記載した配列はすべて、記載された配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドだけ
でなく、その相補鎖も包含するものである。
【００４０】
本発明のマイクロアレイは、僅か２種類のプローブから、テストすべき選択された生理学的状態を診断するプローブのすべてに至るまでを含むことができる。また、本発明のマイクロアレイは、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子すべてに対するプローブを含むこともできる。本発明のマイクロアレイは、少なくとも約５種類の遺伝子、少なくとも約１０種類の遺伝子、少なくとも約２５種類の遺伝子、少なくとも約５０種類の遺伝子、少なくとも約５００種類の遺伝子、または少なくとも約１０００種類の遺伝子に対するプローブを含むことができる。マウスのアレイは、少なくとも約９５０種類の遺伝子に対するプローブを含むことができ、ヒトのアレイは、少なくとも約６００種類の遺伝子に対するプローブを含むことができる。本発明のアレイは、約５スポットよりも多い、約１０スポットよりも多い、約２５スポットよりも多い、約１００スポットよりも多い、約５００スポットよりも多い、または、約１０００スポットよりも多いスポットを含むことができる。
【００４１】
マイクロアレイを使用するには、ＰＣＲまたは逆転写などによって、目的とする配列の標的配列を増幅する（同一の配列の多数のコピーを作成する）必要がある。核酸がコピーされるにつれて、電球と同じように光を発生させる蛍光標識でタグ付けされる。標識された核酸はマイクロアレイに導入されて、一定の時間反応させられる。プローブが、標識され、増幅された試料核酸に十分に相補的であれば、この核酸は、アレイ上のプローブに貼り付く、すなわちハイブリダイズする。余分な核酸をアレイから洗い流し、プローブに結合している核酸だけを残す。蛍光スキャナーによって、およびハイブリダイズしたアレイの画像を解析するためのソフトウエアを用いて、アレイの画像を得ることによって、アレイ上の特定の位置における蛍光強度を比較して、遺伝子がスイッチオンになっているかオフになっているか、およびその程度を判定したり、配列が存在するか否かを判定したりすることできる。シグナルの強度は、ある配列がどの程度存在するかを示している。発現アレイにおいては、高い蛍光シグナルは、ある遺伝子のコピーが試料中に多数存在することを示し、低い蛍光シグナルは、ある遺伝子の活性が低いことを示している。適当なハイブリダイゼーション条件を選択することによって、この技術は、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出して配列を決定するのに役立つ。マイクロアレイを設計・使用する方法は引き続き改良されているところである（Ｒｅｌｏｇｉｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（１１）：ｅ５１；Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．９（２）：５９−６２；ａｎｄ  Ｌｉｎｄｒｏｏｓ，Ｋ．ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（１４）：Ｅ７０）。
【００４２】
本発明のアレイは、スポッティング技術や固相合成のように、当技術分野において既知のアレイ合成法によって作成することができる。好ましくは、本発明のアレイはフォトリソグラフィとコンビナトリアル化学法を併用した固相合成法によって合成される。プローブ選択およびアレイ設計のキーとなる要素のいくつかは、すべてのアレイの製造と共通している。例えば、プローブのハイブリダイゼーションを最適にする方策は、プローブを選択するプロセスに必ず含まれる。融解温度を考慮し、所望のハイブリダイゼーション作用と相関する経験的なルールを用いることによって、特定のｐＨ、塩および温度の条件下でのハイブリダイゼーションを最適化することができる。プローブのハイブリダイゼーションの強度および濃度依存性を予測するためにコンピュータモデルを使用することも可能である。
【００４３】
ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップとも呼ばれるアレイは、一般的にはガラス上に、時にはナイロン基質上に高速ロボット装置によって加工され、それに、既知の一致率をもつプローブ（Ｐｈｉｍｉｓｔｅｒ，Ｂ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１ｓ：１−６０）を用いて相補的結合を判定する。１個のＤＮＡチップを用いた実
験によって、何千もの遺伝子に関する情報が研究者にもたらされる。以下の各ステップで方法が検討されている。１）ＤＮＡのタイプ；２）チップ加工；３）試料調製；４）アッセイ法；５）読み取り；および６）ソフトウエア。
【００４４】
アレイ技術に関しては、１）遺伝子の発現レベル（量）の測定、および２）配列（遺伝子／遺伝子変異）の同定という、主な応用形式が２つある。知的財産権という点からいえば、一致率が既知のＤＮＡ配列をアレイするアレイ技術には、２つの改良方式があると考えられる。方式Ｉは、ロボットによるスポッティングを用いてガラスなどの固体表面に固定され、一組の標的プローブに個別または一緒に曝露されるプローブｃＤＮＡ（５００〜５，０００塩基長）からなる。この方法は、「伝統的に」ＤＮＡマイクロアレイと呼ばれ、スタンフォード大学で開発されたものと広く考えられている。（Ｒ．Ｅｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆ．Ｗ．Ｃｈｕ”Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：ｔｈｅｉｒ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”［１９９９］Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：２１７−２１８）。方式ＩＩは、インサイツ（チップ上）で合成されるか、または従来からの合成法で合成された後チップ上に固定されたオリゴヌクレオチド（２０〜８０重合体オリゴ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のアレイからなる。このアレイを、標識された試料ＤＮＡに曝露、ハイブリダイズして、相補鎖の一致率／量を測定する。この方法は、「歴史的に」ＤＮＡチップと呼ばれており、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃで開発されて、商標ＧｅｎｅＣｈｉｐの名でフォトリソグラフィ法によって加工された製品として販売されている。多くの会社が、別のインサイツ合成法または沈着技術を用いて、オリゴヌクレオチドを用いたチップを製造している。
【００４５】
アレイ上のプローブは、蛍光標識された標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、ハイブリダイズしたアレイは、走査蛍光顕微鏡を用いてスキャンすることができる。そして、この蛍光パターンを、含まれているミスマッチの程度を判定したり、多型性を同定したり、一般的な配列情報を提供したりするアルゴリズムによって解析する（Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９６］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０）。このシステムでは、非選択的に吸着した物質を低ストリンジェンシーの洗浄で洗い流すことによって選択性がもたらされる。その後、アレイの構成要素から発される対応結合シグナルを解析して、どこの塩基対にミスマッチが存在するかを判定する。そして、この方法は、ストリンジェンシーを最大にするために従来からの化学法に依存するとともに、自動パターン認識処理を用いて、完全に相補的な結合と部分的に相補的な結合を識別する。
【００４６】
標準的な核酸マイクロアレイまたは遺伝子チップなどの装置には、標的配列と装置の表面に固定した配列との間の多型性またはミスマッチレベルを半定量的に解析するためのデータ処理用アルゴリズムと試料重複法を（ｓａｍｐｌｅ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ：すなわち、統計的に有意なデータ解釈および変則性を避けるために同じ種類のアレイ構成要素を多く）用いる必要がある。このように統計解析に有効なアルゴリズムおよびソフトウエアは当技術分野において既知である。
【００４７】
マイクロアレイを利用するには、まず、逆転写によるなどして目的とする遺伝子を増幅（同一遺伝子の多数のコピーを生成）する必要がある。核酸は、コピーされるにつれて、電球のように光を放出する蛍光標識で標識される。標識された核酸をマイクロアレイに導入して一定時間反応させる。この核酸は、プローブが調製された試料中の核酸に十分に相補的であれば、アレイ上のプローブに付着すなわちハイブリダイズする。余分な核酸をアレイから洗い流し、プローブに結合している核酸だけを残す。蛍光スキャナーによって、およびハイブリダイズしたアレイの画像を解析するためのソフトウエアを用いて、アレイの画像を得ることによって、アレイ上の特定の位置における蛍光強度を比較して、遺伝子がスイッチオンになっているかオフになっているか、およびその程度を判定したり、配列が存在するか否かを判定したりすることできる。強度の蛍光シグナルは、調製した試料に
ある遺伝子のコピーが多数存在することを示し、低い蛍光シグナルは、ある遺伝子の活性がより低いことを示している。癌細胞と正常細胞などで、さまざまな遺伝子について発現レベルを直接比較することができる。同様に、薬剤など一定の刺激に応答してどの遺伝子のスイッチがオンになりオフになるかを判定することができる。このような情報は、病気の経路に含まれる遺伝子を同定したり、また、薬剤の有効性または毒性を予測したりするため有益である。
【００４８】
具体的な多型性の検出は２種類のプローブを用いて行うことができる。一方のプローブは、標的配列に完全に相補的になるよう設計され、もう一方のプローブは、その中心に一塩基だけ一致しないよう作成されている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のシステムでは、これらのプローブ対は完全一致プローブ（ＰＭ）とミスマッチプローブ（ＭＭ）と呼ばれる。これらによって、非特異的クロス・ハイブリダイゼーションによって生じるシグナルの定量およびサブトラクションが可能になる。このプローブ対間でのハイブリダイゼーションシグナルの違いが、それらの強度の比率同様、特異的標的の量、したがって配列の量の指標となる。
【００４９】
アレイは、ある配列における個別のヌクレオチドを検索するための多数のプローブに依存する。それぞれが４つの可能な塩基の一つを含む、標的位置だけが異なる４種類の同一プローブを用いて、標的塩基の同一性を導き出すことができる。あるいは、特定のアリル（対立遺伝子）を代表する１つまたは２つのプローブを用いて、コンセンス配列が存在するかを調べることができる。ヘテロ接合または遺伝子的に混合した試料の遺伝子型を決定するために、多数のプローブをもつアレイを作成して重複情報を提供することができ、その結果、明確な遺伝子型判定ができる。
【００５０】
固体基質に固定したプローブを標的（試料中の塩基配列）とハイブリダイゼーション用緩衝溶液中で混ぜ合わせて、アニールが起きるまで適当な温度に保つ。その後、基質を洗浄して余分な物質を除去すると、標的上の核酸がプローブ分子に結合して残るため、オートラジオグラフ、液体シンチレーション計測、および／または蛍光など、当技術分野において既知の方法によって検出および定量することが可能になる。ハイブリダイゼーション法および検出法が進歩したため、当業者によって容易に応用することができる。当技術分野においてよく知られている通り、アニーリング段階と洗浄段階を高ストリンジェンシー条件で行うならば、プローブ分子と標的分子が、２つの分子間で強い非共有結合を形成してハイブリダイズすれば、プローブと標的核酸は本質的に同一であるか、完全に相補的であると合理的に推定することができる。検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを判定する手段を提供する。
【００５１】
ハイブリダイゼーション用プローブとしてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用する場合には、プローブを標識することができる。本発明のアレイでは、その代わりに、当技術分野において既知の方法によって標的を標識することができる。放射活性または非放射活性の標識によって標的を標識することができる。標的は、蛍光標識を含むことが好ましい。
【００５２】
さまざまな程度のハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを用いることができる。条件がよりストリンジェントになるにつれて、二重鎖形成に必要とされる相補性が大きくなる。ストリンジェンシーは、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間などによって調節することができる。例えば、本明細書に参照として組み込まれる、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ（１９８７）ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．，ｐｐ．１６９−１７０に記載されているように、中度から高度のストリンジェンシー条件で、当技術分野においてよく知られている技術によってハイブリダイゼーション実験がしばしば行われる。しかし、当
技術分野において知られているように、配列解析用アレイでは、一般的には、低度のハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーが用いられる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションのための中度から高度のストリンジェンシー条件が当技術分野において知られている。ブロットのための高ストリンジェンシー条件の例は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／０．１％ＳＤＳ中で６８℃でハイブリダイズし、室温において０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することである。中度ストリンジェンシー条件の例は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／０．１％ＳＤＳ中で６８℃でハイブリダイズし、４２℃において０．３×ＳＳＣで洗浄することである。温度および塩濃度のパラメーターを変えて、プローブと標的核酸の間の所望の配列一致レベルを達成することができる。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ  ａｌ．（１９８９）下記参照、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ参照。
【００５４】
融解温度は、以下の式で示される（Ｂｅｌｔｚ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，［１９８３］Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ
Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ［Ｅｄｓ．］Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
１００：２６６−２８５）。
【００５５】
Ｔｍ＝８１．５ｏＣ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（＋Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／二重鎖の塩基数による長さ。
【００５６】
洗浄は一般的には以下のとおり行うことができる。室温において１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで１５分間（低ストリンジェンシー洗浄）を２回、そして、ＴＭ−２０ｏＣにおいて、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで１５分間（中度ストリンジェンシー洗浄）を１回。
【００５７】
本発明において有用な核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって作出することができる。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって確認することができる。ＰＣＲは、反復的で酵素による、核酸配列のプライマーによる合成である。この処理手順は、当業者によって十分に知られており、また、広く利用されている（Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１９８５］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４参照）。ＰＣＲは、標的配列の反対鎖にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーに隣接する、目的とするＤＮＡ断片を酵素によって増幅するために利用される。プライマーは、互いに３’末端を目指す方向になっている。鋳型の熱変性、相補鎖へのプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによる、アニールしたプライマーの伸長というサイクルを繰り返すと、ＰＣＲプライマーの５’末端によって画定されるセグメントの増幅がもたらされる。各プライマーの伸長産物は、もう一方のプライマーに対する鋳型として働くため、サイクル毎に、その前のサイクルで産生されたＤＮＡ鋳型の量が本質的に倍増することになる。この結果、数時間で数百万倍まで特異的標的断片の指数的蓄積がもたらされる。好熱細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｓから単離されたＴａｑポリメラーゼなどの熱安定的なＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、増幅過程を完全に自動化することができる。使用可能な別の酵素も、当業者には知られている。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチド配列を切断および／または変異させて、元の全長配列から得られた断片および／または変異体のあるものが、全長配列の所望の特徴を保持できるよう
にすることもできる。より大きな核酸分子から断片を作成するのに適した制限酵素は、非常に多様なものがよく知られている。また、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを、ＤＮＡの時間制御的制限分解に適宜使用できることがよく知られている。例えば、参照して本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  １３５−１３９参照。また、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５８：１３００６−１３５１２参照。Ｂａｌ３１エキソヌクレオチドを使用すること（一般的に、「塩基消去（ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ）」処理と呼ばれる）によって、当業者は、対象となる核酸の一方または両方の末端からヌクレオチドを消去して、対象核酸配列と機能的に同等な断片を広範なスペクトルで生成することができる。このようにして、当業者は、元の分子にすべて沿った位置から調節されたさまざまな長さの断片を何百も生成させることができる。当業者は、常法によって、生成された断片を、それらの特徴についてテストまたはスクリーニングして、本明細書に記載されているような断片の有用性を判定することができる。また、部位特異的突然変異誘発法によって簡単に変異配列を作成できることもよく知られている。例えば、Ｌａｒｉｏｎｏｖ，Ｏ．Ａ．ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｖ．Ｇ．（１９８２）Ｇｅｎｅｔｉｋａ  １８（３）：３４９−５９；およびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２６５−９４参照。これら両文献は、参照されて本明細書に組み込まれる。当業者は、常法によって欠失型、挿入型、または置換型の変異体を作出して、野生型配列またはその断片の所望の特徴を含んでいる、得られた変異体を同定することができる。
【００５９】
このように、当業者によく知られている方法によって、開示された配列の突然変異型、挿入型、および欠失型の変異体を容易に調製することができる。これらの変異体は、変異体が元の配列と実質的に相同な配列をもつ限り、例示したプライマーの配列と同じように使用することができる。ここで、実質的な配列相同性とは、変異型ポリヌクレオチドが、そのプローブが由来したポリヌクレオチドと同じ能力で機能することを可能にするのに十分な相同性を意味する。相同性は８０％よりも高いか、８５％よりも高いか、９０％よりも高いか、または９５％よりも高い。変異体が、意図した能力で機能するのに必要な相同性または同一性の程度は、意図した配列の用途によって異なる。当業者は、機能が同等であるか、または、配列の機能が向上するよう設計されているか、あるいは方法論的な優位性を提供するよう設計されている突然変異型、挿入型、および欠失型の変異体を適宜作成することができる。
【００６０】
２つの核酸配列の一致率は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムであって、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７で修正されたものを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０２−４１０のＮＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＸＢＬＡＳＴプログラムの中に取り込まれている。ＢＬＡＳＴ塩基検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムによって、スコア＝１００，語長＝１２で行って、所望の配列一致率をもつ塩基配列が得られる。比較を行うためのギャップ付アラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２に記載されているように用いる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用する場合、各プログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）の既定のパラメーターを用いる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。
【００６１】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製、ならびにＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応を行うための標準的な技術、および、ここで有用なさまざまな分離技術は、当業者に既知の広く利用されている技術である。いくつかの標準的な技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ  （ｅｄ．）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１８，Ｐａｒｔ  Ｉ；Ｗｕ（ｅｄ．）（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００  ａｎｄ  １０１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ  （ｅｄ．）（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；Ｓｃｈｌｅｉｆ  ａｎｄ  Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ  （Ｅｄ．）（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｓｅｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に記載されている。略称と学名が使用されている場合には、それらは、当該分野において標準的なものであって、本明細書で引用されている専門誌で広く使用されているものと考えられる。
【００６２】
本発明のアレイは、ＯＸＰＨＯＳ機能不全、酸化ストレス、アポトーシス、および加齢によって起こる臨床的な疾患を区別するだけでなく、ミトコンドリア病の発現のシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）またはプロフィールを定義するのに役立つ。本発明のマイクロアレイは、その基礎に共通の病態生理学メカニズムが存在するミトコンドリア病の全クラスのプロフィールを提供するのに役立つ。これらのアレイを用いて得られたデータは、これらの病気が関係する経路を同定したり、また、これらの病気を治療するための効率的な治療法を計画したりするのに役立つ。
【００６３】
本発明のアレイは、ミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定し、これらのプロフィールを用いて試料を評価するのに役立つ。本発明のアレイは、診断、生理学的状態に関係した経路、遺伝子および変異の同定、ヒトの生理学的状態の動物モデルの作出、ならびに、治療目的および予防目的の療法の計画およびそれらの効果の評価を行う上で有用である。
【００６４】
本発明のアレイは、ヒト、マウス、および関連した生物種などの生物、該生物の組織または器官、該生物の細胞型、および該生物由来の細胞株のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定するのに役立つ。胎児、新生児、幼児、小児、青年、老年、高齢者、および死者など、あらゆる年齢の個体をテストすることができる。標準的な標的を用いて、本発明のアレイは、異なった個体または細胞のミトコンドリア生物学プロフィールを比較するのに有用である。
【００６５】
本発明のアレイは、エネルギー−代謝に関係した生理学的状態などの生理学的状態に関連したプロフィールを決定するのに有用である。生理学的状態は、健常な状態か病的状態である。ヒトの健常状態の例は、１００歳以上で身体が健康なヒトである。ヒトの病的状態の例はリー症候群（ＬＳ）である。このような病的状態をもつ個体ともたない個体のプロフィールを決定し、それらを比較することによって、実施例４〜５においてヒトについて行っているように、その病的状態に代表的でそれを説明するミトコンドリア生物学プロフィールを決定することができる。同様に、実施例１３〜１５にあるように、生理学的状態に関連する表現型または遺伝子型をもつ細胞株についてプロフィールを決定することができる。また、実施例８〜１２、１６および１９に記載されているような生理学的状態を有する、マウス系統などのヒト以外の動物に関するプロフィールを決定することもできる。本発明のアレイは、実施例２０に記載されているように、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子の発現の正常な変動の範囲を決定するのに役立つ。本発明のアレイを用いて生理学的状態に関連したプロフィールを決定する場合には、その生理学的状態をもつ個体ともたない個体であって、それ以外は同じ個体の調製された標的試料またはプールされた標的試料を本発明のアレイにハイブリダイズさせる。調製された試料のハイブリダイゼーションを測定して、可能であれば、その生理学的状態に関連したプロフィールを決定するために比較する。プロフィールは、当技術分野において知られているように、統計解析によって、その生理学的状態を診断するのに必要なプローブに関するプロフィールデータだけが含まれるように最適化することができる。
【００６６】
そして、ある生理学的状態に関連するプロフィールは、実施例７に記載されているように、本発明のアレイを用いた診断または評価を行うために利用することができる。生理学的状態のプロフィールを解析して、その解析結果を、その生理学的状態を診断するためのアレイを最適化するために使用することができる。生理学的状態を診断するための最適化されたアレイは、最小限、その生理学的状態に関連して発現レベルが変化した一つ以上の遺伝子に対する少なくとも一つプローブと、他に可能性のある診断結果を排除するのに十分な数の遺伝子に対するプローブとを含む。診断には、その生理学的状態を有するかもしれない個体から試料を集めること、および、本発明のアレイを用いて、すなわち、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子すべてに対するプローブか、または、その生理学的状態を診断するために最適化されたアレイに必要な数以上の少数のプローブを用いて、調製された試料のプロフィールを決定することが含まれる。そして、個体のプロフィールを、その生理学的状態のプロフィールと比較し、比較結果を解析して、その個体がその生理学的状態にある可能性を決定する。また、本発明のアレイは、特定の生理学的状態にあるとは疑われていない個体をスクリーニングするために利用することもできる。そのような個体から試料を採集し、調製して、本発明のアレイ、例えば、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子すべてに対するプローブを含むアレイを用いて、その個体のミトコンドリア生物学のプロフィールを決定する。そして、この個体のプロフィールを、その個体が有するかもしれない一つ以上の生理学的状態の既知のミトコンドリア生物学プロフィールと比較して、その個体のプロフィールが、診断可能な生理学的状態を示していないかを判定する。実施例１６で実証されているように、本発明のアレイは、他の症状が現れる前に生理学的状態の指標となるプロフィールを検出するのにも役立つ。
【００６７】
また、ある生理学的状態の、またはそれに関連するプロフィールは、その生理学的状態に影響される生化学的経路と、その生理学的状態の原因に関係する遺伝子を同定するのにも役立つ。ある生理学的状態のプロフィールが、ある遺伝子の発現に変化があったことを示していれば、その遺伝子が、その生理学的状態の原因となる変異を同定するための配列決定の候補となる。プロフィールが、いくつかの遺伝子の発現変化を示していれば、それらを制御することが知られている遺伝子が、その生理学的状態の原因となる変異を同定するための配列決定の候補となる。実施例３では、生理学的状態に関連した突然変異を同定
するために本発明のアレイを用いることが記載されている。
【００６８】
ある生理学的状態のプロフィールは、ヒトの生理学的状態の動物モデルを作出および／または同定する上で有用である。ある生理学的状態のプロフィールは、動物において生理学的状態を模倣させるために作出すべきノックアウトなどの変異の種類を示唆している可能性がある。また、本発明のアレイは、遺伝子操作されたか、またはそれ以外の変異をもつ集団をスクリーニングして、類似したプロフィール、すなわち、その生理学的状態に関連した動物個体を同定するのにも役立つ。
【００６９】
本発明のアレイを用いて、長期間繰り返して、またはさまざまな環境条件に曝露した後に、同一の個体のプロフィールを作成して、時間または環境の効果を測定することができる。また、本発明のアレイを用いて、年齢が異なるか、またはさまざまな環境条件に曝露した後、同等の個体のプロフィールを作成して、時間または環境の効果を測定することができる。例えば、特定の遺伝子型と年齢のマウスコントロール集団を、本発明のアレイを用いて、一定の環境汚染に曝露された同じ遺伝子型と年齢の実験マウスのグループと比較して、その環境汚染の効果を測定することができる。実施例１５に記載されているように、生物同様に細胞株も、さまざまな環境条件に曝露した後にプロフィールを作成することができる。本発明のアレイは、加齢の効果を測定する上でも有用である。実施例８および１９で、さまざまな年齢におけるプロフィールの違いを実証している。
【００７０】
治療は環境条件であり、本発明のアレイを用いて、その効果をテストすることができる。ある生理学的状態に関係する経路を同定すれば、その生理学的状態にある個体を治療するのに役立つ治療法を同定することが可能になる。例えば、新しい生理学的状態のプロフィールが作成さえたときに、治療薬の種類の効果に関するプロフィールを決定しておけば、関係のある治療薬を簡単に同定することができる。生理学的状態のプロフィールは、その生理学的状態を有する個体を治療する候補療法をテストするのに役立つ。その生理学的状態の有無に関わらず、ある個体、ヒトの生理学的状態の動物モデル、またはその生理学的状態を有する個体を代表する細胞株を候補療法で処置することができる。プロフィール作成用の試料を処置後に採集し、調製し、本発明のアレイを用いてプロフィールを決定して、処置前の同じ個体、または処置をしなかった同等の個体または細胞のプロフィールと比較して、どの処置の効果を判定することができる。それによって、生理学的状態を元に戻す療法を同定することができる。予防療法および所望の生理学的状態をもたらす療法も同様に同定することができる。
【００７１】
本発明のアレイは、集団だけでなく、特定の個体に関する治療効果を観察するのにも役立つ。本発明のアレイを用いて、診断された個体のプロフィールを決定し、その個体に治療を施した後、再び、その個体のプロフィールを決定することができる。満足のゆく治療プロフィールが得られるまで、その治療法を修正して、そのプロフィールをテストすることができる。
【００７２】
ミトコンドリア生物学に関係するヒト遺伝子に対して中度から高度のストリンジェンシーでハイブリダイズするプローブを含むアレイは、ヒト、ヒト細胞株、および近縁の生物種から調製された試料をアッセイするために使用される。ミトコンドリア生物学に関係するマウス遺伝子に対して中度から高度のストリンジェンシーでハイブリダイズするプローブを含むアレイは、マウス、マウス細胞株、および近縁の生物種から調製された試料をアッセイするために使用される。
【００７３】
本発明のアレイは、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子に対するプローブを用いて作成される。プローブは、表３〜５に列挙されたクローンおよび配列から、または、これらの表には列挙されていない、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子を代表する配列お
よびクローンから選択および作成することができる。プローブは、核酸合成、ＰＣＲ、クローニング技術、または当技術分野において既知の手法によってインビトロで作成することができる。プローブにおいて、近傍またはベクターの配列を最小限にすることも可能である。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓクローン（ＲｅｓＧｅｎ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から作成されたプローブは、実施例２２に記載した通りのＰＣＲによって増幅することができる。選択的には、本発明のアレイのためにコントロールとなるプローブも選択することができる。コントロールプローブを作成するためのクローンおよび配列の例が、表６、配列番号：３０４１〜３０４４に列挙されている。陽性コントロールとしてハウスキーピング遺伝子を選択した場合、通常それらは、コントロールではないプローブと同じ生物種から得られる。ハウスキーピング遺伝子プローブは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｐｏｔ  ＲｅｐｏｒｔＴＭ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能である。
【００７４】
ハウスキーピング遺伝子の例を表２に示す。ハウスキーピング遺伝子は、通常、全ての細胞において一定量発現している。本発明のアレイを用いて、表２に記載されている２５種類のハウスキーピング遺伝子の発現を４種類の細胞株、ＬＭＥＢ４、ＮＺＢ、５０１−１、およびグルコース、ピルビン酸およびウリジン（ＧＵＰ）を添加した培地で増殖させたＬＭ（ＴＫ）細胞株において比較した。細胞間で多少の違いが見られた。また、ハウスキーピング遺伝子を、ＣＡＰＲおよびＮＺＢという２つのマウス系統の６つの異なる組織試料（脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓および筋肉）でテストした。ここでも違いは見られたが、僅かなものであった。
【００７５】
（表２）
【００７６】
【表２】
2005515757.tif 000002
アレイは、例えば、ガラスの顕微鏡スライドなど固体の基質上にプリントすることができる。プリントする前に、実施例２３に記載したように、結合用の基質を提供するよう調製される。アレイは、当技術分野において既知のプリンティング技術および機械を用いてプリントすることができる。実施例２４に記載されているように、プリンティングは、プローブを基質上に置き、プローブを基質に付着させ、また、非特異的ハイブリダイゼーションを防止するためにブロッキングすることを含む。
【００７７】
本発明のアレイを用いる解析に役立つ試料は、全ＲＮＡ試料およびｍＲＮＡ試料などである。ＲＮＡ試料は、実施例２５に記載したとおりに調製することができる。ＲＮＡ試料をｃＤＮＡに逆転写すると同時に、実施例２６に記載されているようなＣｙ３−ｄＣＴＰ／Ｃｙ５−ｄＣＴＰなどの２色蛍光システムの一方の成分で標識する。アレイを調製された試料とハイブリダイズさせて、試料およびアレイのプローブを捕捉するのに適したストリンジェンシーで洗浄する。プローブ配列が、それで検索する遺伝子に対して高い相同性を有し、かつそのプローブが長いときには、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーをより高くすることができる。参照用標的、標準用標的、または直接比較のための他の試料標的は、同一のアレイで同時に調製し、ハイブリダイズさせることができる。調製された試料はハイブリダイゼーションの間分解せず、標識されている。調製された試料は、逆転写され、蛍光標識されている。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの結果は、実施例２７に記載されているように、当技術分野において利用可能な装置およびソフトウエアを用いて測定および解析することができる。データを完成させる前に、好ましくは、予備的な結果を、当技術分野において既知の方法によって標準化する。標準化の一例が、実施例２９に記載されている。解析には、統計的な有意性を判定することも含まれる。測定は、統計解析など、標準化と解析を含むことができる。得られたデータは、一般的には、コンピュータファイルに保存される。
【００７９】
ミトコンドリア生物学の発現アレイは、ミトコンドリア生物学が変化することによって生じる遺伝子発現の変化を検出するのに役立つ。Ｉｎｃｙｔｅ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘなどの会社から市販されている全ゲノム発現アレイは、本発明のアレイの１０倍から２０倍の数の遺伝子に対するプローブを含んでいるが、市販されているアレイには限界がある。本発明のアレイ上に含まれている遺伝子およびプローブのいくつかは、市販されているアレイでは利用できない。また、市販のアレイは非常に高価で、それらから得られるデータセットが大量であるため、解析したり処理したりするのがかなり面倒である。本発明のアレイはより小さく、焦点を絞ってあるため、何百ものミトコンドリア遺伝子の発現パターンを迅速かつ効率的に観察することが可能である。本研究は、ミトコンドリア遺伝子だけでなく核遺伝子に対するプローブも含む、ミトコンドリア生物学発現研究のために特注設計されたマイクロアレイが、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子の変異によってもたらされた機能の変化、またはそれ以外の代謝状態の変化によって生じた遺伝子発現の変化を解析するのに有効なツールであることを示している。実施例１３〜１７および２０における細胞株実験は、本発明のアレイの特異性と感度を実証していて特に有益であり、一方、実施例８〜１２および１６〜１７のマウス組織の実験は、本発明のアレイの一貫性を明らかにしている。
【００８０】
プローブを作成するために使用されたクローンが表３〜５に列挙されている。クローンは、約１ｋｂから約４ｋｂの範囲にある。ほとんどのクローンの挿入配列が、５’末端と３’末端について決定されている。クローンの５’末端と３’末端の配列は、大抵、約２００ｎｔから約８００ｎｔであって、本明細書に記載されている。プローブは、いくつかの方法で作成することができる。例えば、表３〜５に列挙されているクローンは購入することができ、挿入配列を精製してプローブとして使用することができる。あるいは、ライブラリーを検索して、本来の配列を作成するために使用されるクローンと同等なｃＤＮＡ
クローンまたはゲノムクローンを同定するために合成および使用することができるオリゴヌクレオチドを設計するために、本明細書の配列表に記載されている５’末端または３’末端の配列を用いることができる。この新しく同定されたｃＤＮＡまたはゲノムの同等クローンを用いてプローブを作成することができる。あるいは、一つのクローンの５’末端および３’末端を代表する、配列表からの一組の配列を用いて、その５’末端および３’末端が由来した対応クローンの挿入配列と同等の単離核酸をＰＣＲ増幅するために使用することができるＰＣＲプライマーを設計することができる。この単離核酸をプローブとして使用することも可能である。プローブは、試料中の配列とハイブリダイズするベクター配列を含んでいてはならない。ＰＣＲプライマーを設計する方法、および、ライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当技術分野において既知である。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
（ヒトのミトコンドリア生物学用アレイ）
ヒトのミトコンドリア生物学用アレイは、ミトコンドリア生物学に関係する６５０種類の発現配列を代表するクローンから作成される。アレイ上に置かれるプローブを作成するために使用されるクローンは、これらのクローンの５’末端および３’末端の配列を示す、本明細書に記載された配列番号：１〜９９４を参照する表３に示されている。表３で同定されているクローンを用いて、ヒトプローブセット１号（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＃１）と呼ばれる一組のプローブが作られている。制御配列は、このアレイにも置かれている。コントロールは、ＤＭＳＯ、植物配列由来のプローブ、ミトコンドリア生物学に関係しない配列、およびポリアデニン（４０〜６０ヌクレオチド長）などであるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
（表３）
【００８３】
【表３−１】
2005515757.tif 000003
【００８４】
【表３−２】
2005515757.tif 000004
【００８５】
【表３−３】
2005515757.tif 000005
【００８６】
【表３−４】
2005515757.tif 000006
【００８７】
【表３−５】
2005515757.tif 000007
【００８８】
【表３−６】
2005515757.tif 000008
【００８９】
【表３−７】
2005515757.tif 000009
【００９０】
【表３−８】
2005515757.tif 000010
【００９１】
【表３−９】
2005515757.tif 000011
【００９２】
【表３−１０】
2005515757.tif 000012
【００９３】
【表３−１１】
2005515757.tif 000013
【００９４】
【表３−１２】
2005515757.tif 000014
【００９５】
【表３−１３】
2005515757.tif 000015
【００９６】
【表３−１４】
2005515757.tif 000016
【００９７】
【表３−１５】
2005515757.tif 000017
【００９８】
【表３−１６】
2005515757.tif 000018
【００９９】
【表３−１７】
2005515757.tif 000019
【０１００】
【表３−１８】
2005515757.tif 000020
【０１０１】
【表３−１９】
2005515757.tif 000021
【０１０２】
【表３−２０】
2005515757.tif 000022
【０１０３】
【表３−２１】
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【０１０４】
【表３−２２】
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【０１０５】
【表３−２３】
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【０１０６】
【表３−２４】
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【０１０７】
【表３−２５】
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【０１０８】
【表３−２６】
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【０１０９】
【表３−２７】
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【０１１０】
【表３−２８】
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【０１１１】
【表３−２９】
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【０１１２】
【表３−３０】
2005515757.tif 000032
【０１１３】
【表３−３１】
2005515757.tif 000033
【０１１４】
【表３−３２】
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【０１１５】
【表３−３３】
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【０１１６】
【表３−３４】
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【０１１７】
【表３−３５】
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【０１１８】
【表３−３６】
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。
【０１１９】
（実施例２）
（マウスミトコンドリア生物学用アレイ）
マウスのミトコンドリア生物学用アレイを、発現配列を代表するクローンから作成する。アレイ上に置かれたクローンは、これらのクローンの５’末端および３’末端の配列を示す、本明細書に記載された配列番号：９９５〜３０４０を参照する表４に示されている。Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）”Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｄ−ｇｅｓｔａｔｉｏｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏ  ｕｓｉｎｇ  １５ｋ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：９１２７−９１３２参照。プローブとして有用な同等のクローンを表５に示す。表４に挙げたクローンは、表５に挙げたクローンに好適である。表４で同定されているクローンを用いて、マウスプローブセット２号（Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＃２）と呼ばれる一組のプローブが作られている。表５で同定されているクローンを用いて、マウスプローブセット２号（Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＃３）と呼ばれる一組のプローブが作られている。コントロールは、ＤＭＳＯ、植物配列由来のプローブ、ミトコンドリア生物学に関係しない配列、およびポリアデニン（４０〜６０ヌクレオチド長）などであるが、これらに限定されるものではない。マウスのミトコンドリア遺伝子用のプローブを作成するために使用される配列は、マウスミトコンドリアゲノムの全遺伝子を記載しているＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｊ０１４２０にも記載されている。好ましくは、ＡＴＰ８およびＡＴＰ６に使用されるプローブは、互いにクロスハイブリしない。
【０１２０】
（表４）
【０１２１】
【表４−１】
2005515757.tif 000039
【０１２２】
【表４−２】
2005515757.tif 000040
【０１２３】
【表４−３】
2005515757.tif 000041
【０１２４】
【表４−４】
2005515757.tif 000042
【０１２５】
【表４−５】
2005515757.tif 000043
【０１２６】
【表４−６】
2005515757.tif 000044
【０１２７】
【表４−７】
2005515757.tif 000045
【０１２８】
【表４−８】
2005515757.tif 000046
【０１２９】
【表４−９】
2005515757.tif 000047
【０１３０】
【表４−１０】
2005515757.tif 000048
【０１３１】
【表４−１１】
2005515757.tif 000049
【０１３２】
【表４−１２】
2005515757.tif 000050
【０１３３】
【表４−１３】
2005515757.tif 000051
【０１３４】
【表４−１４】
2005515757.tif 000052
【０１３５】
【表４−１５】
2005515757.tif 000053
【０１３６】
【表４−１６】
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【０１３７】
【表４−１７】
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【０１３８】
【表４−１８】
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【０１３９】
【表４−１９】
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【０１４０】
【表４−２０】
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【０１４１】
【表４−２１】
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【０１４２】
【表４−２２】
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【０１４３】
【表４−２３】
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【０１４４】
【表４−２４】
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【０１４５】
【表４−２５】
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【０１４６】
【表４−２６】
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【０１４７】
【表４−２７】
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【０１４８】
【表４−２８】
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【０１４９】
【表４−２９】
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【０１５０】
【表４−３０】
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【０１５１】
【表４−３１】
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【０１５２】
【表４−３２】
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【０１５３】
【表４−３３】
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【０１５４】
【表４−３４】
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【０１５５】
【表４−３５】
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【０１５６】
【表４−３６】
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【０１５７】
【表４−３７】
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【０１５８】
【表４−３９】
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【０１５９】
【表４−４０】
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【０１６０】
【表４−４１】
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【０１６１】
【表４−４２】
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【０１６２】
【表４−４３】
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【０１６３】
【表４−４４】
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【０１６４】
【表４−４５】
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【０１６５】
【表４−４６】
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【０１６６】
【表４−４７】
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【０１６７】
【表４−４８】
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【０１６８】
【表４−４９】
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【０１６９】
【表４−５０】
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【０１７０】
【表４−５１】
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【０１７１】
【表４−５２】
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【０１７２】
【表４−５３】
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【０１７３】
【表４−５４】
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【０１７４】
【表４−５５】
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【０１７５】
【表４−５６】
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【０１７６】
【表４−５７】
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【０１７７】
【表４−５８】
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【０１７８】
【表４−５９】
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【０１７９】
【表４−６０】
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【０１８０】
【表４−６１】
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【０１８１】
【表４−６２】
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【０１８２】
【表４−６３】
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【０１８３】
【表４−６４】
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【０１８４】
【表４−６５】
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【０１８５】
【表４−６６】
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【０１８６】
【表４−６７】
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【０１８７】
【表４−６８】
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【０１８８】
【表４−６９】
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【０１８９】
【表４−７０】
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【０１９０】
【表４−７１】
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【０１９１】
【表４−７２】
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【０１９２】
【表４−７３】
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【０１９３】
【表４−７４】
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【０１９４】
【表４−７５】
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【０１９５】
【表４−７６】
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【０１９６】
【表４−７７】
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【０１９７】
【表４−７８】
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【０１９８】
【表４−７９】
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【０１９９】
【表４−８０】
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【０２００】
【表４−８１】
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【０２０１】
【表４−８２】
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【０２０２】
【表４−８３】
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【０２０３】
【表４−８４】
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【０２０４】
【表４−８５】
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【０２０５】
【表４−８６】
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【０２０６】
【表４−８７】
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【０２０７】
【表４−８８】
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【０２０８】
【表４−８９】
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【０２０９】
【表４−９０】
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【０２１０】
【表４−９１】
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【０２１１】
【表４−９２】
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【０２１２】
【表４−９３】
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【０２１３】
【表４−９４】
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【０２１４】
【表４−９５】
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【０２１５】
【表４−９６】
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【０２１６】
【表４−９７】
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（表５）
【０２１７】
【表５−１】
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【０２１８】
【表５−２】
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【０２１９】
【表５−３】
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【０２２０】
【表５−４】
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【０２２１】
【表５−５】
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【０２２２】
【表５−６】
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【０２２３】
【表５−７】
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【０２２４】
【表５−８】
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【０２２５】
【表５−９】
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【０２２６】
【表５−１０】
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【０２２７】
【表５−１１】
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【０２２８】
【表５−１２】
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【０２２９】
【表５−１３】
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。
【０２３０】
（実施例３）
（病原変異の同定）
ミトコンドリアの呼吸複合体Ｉは、７個のｍｔＤＮＡ遺伝子および３６個のｎＤＮＡ遺伝子から組み立てられる。複合体Ｉ欠陥の患者は、中年になって発症する視神経委縮から致死的な小児性リー病に至るまでの表現型を示す。さまざまな複合体Ｉ欠陥を有する患者のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した。各試料を、標準標的とともに逆転写、標識して、実施例１から選択したプローブを含むヒトアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション測定結果を解析して、新規のｍｔＤＮＡ変異と、優性および劣性のｎＤＮＡ変異をいくつか同定した。
【０２３１】
（実施例４）
（複合体ＩＶ型リー症候群のプロフィール）
複合体ＩＶ型リー症候群（ＬＳ）の患者のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した。ＬＳは、脳幹、大脳基底核、視床および脊髄の壊死斑によって特徴づけられる準急性の神経変性症である。大抵は、運動遅延および／または知的遅滞、異常な呼吸リズム、眼振、眼の麻痺、視神経萎縮、運動失調、および筋失調症などを含む症状が開始して２年以内に死亡する。このリー症候群の患者は、ｓｕｒｆｅｉｔ  １（ＳＵＲＦ−１）遺伝子の変異に関連した、典型的な複合体ＩＶシトクロムｃオキシダーゼ欠陥をもっていた。この患者は近親婚によって生まれた人で、ＳＵＲＦ−１遺伝子のナンセンス変異についてホモ接合であった。この患者の筋肉および培養細胞の試料の発現プロフィールを、実施例１のヒトアレイを用いて、コントロールとなる参照用標準と比較して作成した。ＮＤＵＦＳ８の発現は有意に変化していなかった。しかし、ｍｔＤＮＡ転写物であるＮＤ４、ＮＤＬ４、およびＮＤ６など、核およびミトコンドリアによってコードされている複合体Ｉの遺伝子の多くがダウンレギュレートされていた。核遺伝子であるＳＵＲＦ−１、ＳＯＤ２
、７０ｋＤ熱ショックタンパク質、電圧依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ４）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ２）およびグルタチオンペルオキシダーゼ３がダウンレギュレートされていた。
【０２３２】
（実施例５）
（複合体Ｉ型リー症候群のプロフィール）
複合体Ｉ型リー症候群（ＬＳ）の患者１２人のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した（Ｐｒｏｃａｃｃｉｏ，ＶＦ（２００１）ＥｕｒｏＭｉｔ５  Ａｂｓｔｒａｃｔ）。複合体Ｉの一部であることが知られている４３個の遺伝子すべての配列を各患者につき決定し、一人の患者が、複合体Ｉ型の２３ｋＤ  ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＤＵＦＳ８）の２箇所のミスセンス変異について複合ヘテロ接合体であることが確認された。この患者は、骨格筋および培養したリンパ芽球細胞に明らかな呼吸複合体Ｉの欠損を持っていた。この患者の培養リンパ芽球細胞とコントロールとなる参照リンパ芽球細胞から試料を採集した。試料を逆転写して、示差的に標識して、実施例１から選択したプローブを含むヒトアレイにハイブリダイズさせた。階層的クラスター法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて発現プロフィールを決定した。適当な試料およびコントロールを用いて、その他の患者のミトコンドリア生物学発現プロフィールを同様に決定した。すべての患者の発現プロフィールは、すべてのｍｔＤＮＡといくつかのｎＤＮＡ複合体Ｉ遺伝子のダウンレギュレーションと、アデニンヌクレオチドトランスロケーター遺伝子（ＡＮＴ１およびＡＮＴ２）のアップレギュレーションなど、複合体Ｉの欠陥に特徴的なものであった。
【０２３３】
（実施例６）
（複合体ＩＶ型リー症候群の診断）
実施例４で決定された、リー症候群のＳＵＲＦ−１ナンセンス変異についてのミトコンドリア生物学発現プロフィールを用いて患者を診断する。患者から試料を採取し、少なくともＳＵＲＦ−１、ＮＤ４、ＮＤＬ４、ＮＤ６、ＳＯＤ２、７０ｋＤ熱ショックタンパク質、ＶＤＡＣ４、ＡＮＴ２、およびグルタチオンペルオキシダーゼ３に対するプローブを含むヒト用アレイを用いて、ミトコンドリア生物学発現マイクロアレイをテストする。
【０２３４】
（実施例７）
（マウスＭｉｔｏＣｈｉｐ）
４５２種類の遺伝子に対するプローブを用いてマウスのＭｉｔｏｃｈｉｐをプリントした。これらの遺伝子の中には、２つ以上のプローブで代表されるものもあり、遺伝子発現の定量の再現性に関する内部コントロールとなった。さらに３７個のコントロールスポットもアレイに含まれていた。これらのうち、２５個はハウスキーピング遺伝子であって、試料間の標準化を可能にした。残りの１２スポットは、ハイブリダイゼーションおよびポジショニングに関するさまざまなコントロールであった。表２は、このアレイ上のハウスキーピング遺伝子すべての機能分類と数を示す。各遺伝子を代表するｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムから入手したか、Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによってクローニングされ公表されたものであった（Ｍｕｒｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。各遺伝子の完全なアノテーションをまとめて、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号およびユニジーンクラスター番号を決定した。表５に、このアレイ上のプローブの一覧表を示す。
【０２３５】
（実施例８）
（さまざまな年齢のＳｏｄ２ヘテロ接合変異体マウスのプロフィール）
酸化ストレスが、加齢と変性疾患に関係している。ミトコンドリアが、スーパーオキシド・アニオンなどの活性酸素種の主な供給源であると考えられている。ミトコンドリア由来のスーパーオキシド・アニオンは、通常、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍ
ｎＳＯＤ、Ｓｏｄ２遺伝子）によって解毒される。しかし、フリーラジカル代謝が不安定になると、タンパク質、ＤＮＡ、および脂質への酸化的損傷が生じる可能性がある。年齢によって、スーパーオキシド・アニオンの毒性が増加したときのミトコンドリア生理学に対する作用を明らかにするために、ＭｎＳＯＤ（Ｓｏｄ２＋／−）が５０％減少したマウスのミトコンドリア生物学発現プロフィールをさまざまな年齢について決定した。若い（５ヶ月）、中年の（１０〜１４ヶ月）、および老年の（２０〜２５ヶ月）野生型およびＳｏｄ２＋／−マウスから試料を採集した。試料を逆転写し、対応するコントロールから示差標識した。標識した変異体試料と対応する標識したコントロールとを、実施例２のマウスアレイにハイブリダイズさせた。コントロールマウスと較べて、老齢のＳｏｄ２＋／−マウスは、グルタチオンペルオキシダーゼ３、アポトーシス阻害因子３、カスパーゼ１、および末梢型ベンゾジアゼピン・レセプターなどの抗酸化遺伝子およびアポトーシス遺伝子の誘導を示した。
【０２３６】
（実施例９）
（Ｓｏｄ２ホモ接合変異体マウスのプロフィール）
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ、Ｓｏｄ２遺伝子）は、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子発現産物である。Ｓｏｄ２＋／−動物は、拡張型心筋症をもたらすミトコンドリアの鉄硫黄中心酵素がスーパーオキシドによって不活性化されるため誕生後まもなく死亡する。実施例２のマウスＭｉｔｏＣｈｉｐを用いて、Ｓｏｄ２−／−マウスのミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定する。Ｓｏｄ２−／−マウスとＳｏｄ２＋／＋マウスからＲＮＡ試料を採集する。Ｓｏｄ２−／−試料を逆転写して、Ｃｙ３ホスホラミダイトで標識する。Ｓｏｄ２＋／＋試料を逆転写して、Ｃｙ５ホスホラミダイトで標識する。標識した試料を、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でマウスアレイとインキュベートする。両方の試料のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ読み取り装置で測定する。ハイブリダイゼーション測定値を記録する。
【０２３７】
（実施例１０）
（ＧＰｘＩ変異体マウスのプロフィール）
グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰｘ１）は、ミトコンドリア生物学に関係する発現配列である。ＧＰｘ１−／−動物は、軽度の成長阻害とＯＸＰＨＯＳ効率の低下を示す。実施例２のアレイを用いて、ＧＰｘ１−／−マウスのミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定する。ＧＰｘ１−／−マウスおよびＧＰｘ１＋／＋マウスからＲＮＡ試料を採集する。ＧＰｘ１−／−試料を逆転写して、Ｃｙ３ホスホラミダイトで標識する。ＧＰｘ＋／＋試料を逆転写して、Ｃｙ５ホスホラミダイトで標識する。標識した試料を、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でマウスアレイとインキュベートする。両方の試料のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ読み取り装置で測定する。ハイブリダイゼーション測定値を記録する。
【０２３８】
（実施例１１）
（Ｓｏｄ２ヘテロ接合ＧＰｘ１ホモ接合の二重変異体マウスのプロフィール）
実施例２のアレイを用いて、Ｓｏｄ２−／＋およびＧＰｘ１−／−マウスのミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定する。Ｓｏｄ２−／＋およびＧＰｘ１−／−マウス、およびＳｏｄ２＋／＋およびＧＰｘ１＋／＋マウスからＲＮＡ試料を採集する。Ｓｏｄ２−／＋およびＧＰｘ１−／−の試料を逆転写して、Ｃｙ３ホスホラミダイトで標識する。Ｓｏｄ２＋／＋およびＧＰｘ＋／＋の試料を逆転写して、Ｃｙ５ホスホラミダイトで標識する。標識した試料を、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でマウスアレイとインキュベートする。両方の試料のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ読み取り装置で測定する。ハイブリダイゼーション測定値を記録する。
【０２３９】
（実施例１２）
（Ｓｏｄ２および／またはＧＰｘ１を過剰発現する変異体マウスのプロフィール）
ＭｎＳＯＤを過剰発現するマウス、およびＭｎＳＯＤおよびＧＰｘ１を過剰発現するマウスについて、アレイを用いてミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定する。
【０２４０】
（実施例１３）
（ρ０変異細胞株のプロフィール）
実施例２のマウスアレイを用いて、ミトコンドリア機能不全の最も極端な症例である、マウス変異細胞株ρ０のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した。ＬＭＥＢ４（ρ０）細胞株のプロフィールを、その親株であるＬＭ（ＴＫ）−細胞株と対比して作成した。マウス変異細胞株ρ０にはミトコンドリアＤＮＡがない。培養でＬＭＥＢ４細胞株を維持するためには、グルコース、ピルビン酸、およびウリジンを添加した培地（ＧＵＰ培地）で増殖させなければならない。遺伝子発現比率の散布図を図３に示す。ρ０細胞株の試料およびＬＭ（ＴＫ）細胞株の試料を逆転写して、標準的な２色蛍光システムを用いて示差的に標識し、実施例２のマウスアレイとハイブリダイズさせた。マウスアレイの解析によって、ＬＭＥＢ４細胞には、ｍｔＤＮＡにコードされた転写物は全く存在しないこと、および、ｎＤＮＡのＯＸＰＨＯＳ遺伝子発現、アコニターゼ、および核レセプター結合因子１（ＮＲＢＦ１）が減少していることが確認された。重要な解糖遺伝子、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ＬＯＮプロテアーゼ、熱ショックタンパク質８４（ＨＳＰ８４）、Ｂｃｌ−Ｘ結合タンパク質、および抗酸化タンパク質１の発現が増加していた。核にコードされているＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットも常に３倍から３８倍、平均して４．５倍ダウンレギュレートされていた（平均値は、３８倍ダウンレギュレートされた、中心から離れた複合体Ｉの単一サブユニットであるＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼｍｗｆｅを除いて計算した）。ミトコンドリアタンパク質輸入サブユニット遺伝子Ｔｉｍ１７、およびいくつかのアミノ酸代謝遺伝子と同じように、グルタミン酸−リンゴ酸トランスフェラーゼなどのミトコンドリア輸送タンパク質がダウンレギュレートされた。これに対し、ピルビン酸キナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの解糖系遺伝子が２倍から３倍アップレギュレートされた。ホスホフルクトキナーゼは、１．６倍上昇した。アポトーシスインヒビター２および３などの抗アポトーシス遺伝子は、プロ−アポトーシスＢｃｌ−Ｘ結合タンパク質ＢＮＩＰ３およびカスパーゼ２と同じようにアップレギュレートされた。アレイ上のその他のＢｃｌタンパク質ファミリーのメンバーに有意な変化はなかった。多機能ミトコンドリアＬＯＮプロテアーゼは、２．１倍アップレギュレートされた。
【０２４１】
（実施例１４）
（ＣＡＰＲ変異細胞株のプロフィール）
実施例２のマウスアレイを用いて、クロラムフェニコール耐性（ＣＡＰＲ）に関する変異を有するマウス変異株、および、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子にｍｔＤＮＡ変異を有するＣＡＰＲ５０１−１細胞株のミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した。キメラマウスにＣＡＰＲ変異が起きると、白内障、光受容体反応の低下、網膜色素上皮細胞の空胞化、視神経頭の過誤腫増生の原因となる。ＣＡＰＲ変異を受け継いだマウスは、胚死亡率の顕著な増加を示し、生まれたマウスも、成長遅滞、拡張型心筋症、およびミトコンドリア異常を示しながら２週間以内に死亡した。ＣＡＰＲ５０１−１を、ＣＡＰＳＬＭ（ＴＫ）−細胞株と比較した。これら２つの細胞株は、どちらもマウスＬ９２９細胞に由来している。ＣＡＰＲ細胞株からの試料と野生型細胞からの試料を逆転写して、標準的な２色蛍光システムを用いて示差的に標識し、実施例２のマウスアレイとハイブリダイズさせた。ＣＡＰＲ細胞株は、１３のｍｔＤＮＡ転写産物のすべてのアップレギュレーションを示したが、複数のｎＤＮＡ  ＯＸＰＨＯＳ遺伝子のダウンレギュレーションを示した。ＣＡＰＲ５０１−１細胞株対ＬＭ（ＴＫ）−細胞株の遺伝子発現散布図は、すべてのｍｔＤＮＡ転写産物が３．１〜３．５倍アップレギュレートされる一方で、核にコードされているＯＸＰＨＯＳサブユニットが、２．１〜５．３倍ダウンレギュレートされることを明らかにし
た。
ＩＩＩ型およびＶＩ型プロコラーゲンも、３．５〜４倍アップレギュレートされた。
【０２４２】
（実施例１５）
（細胞株処理のプロフィール）
本発明のマウスアレイを用いて、細胞培養条件の変化など、処理を変化させると、遺伝子発現にどのように影響するのかを明らかにした。標準的な培地で増殖させたコントロールの細胞株ＬＭ（ＴＫ）−のプロフィールを、グルコース、ピルビン酸、およびウリジンを添加した培地（ＧＵＰ培地）で増殖させたＬＭ（ＴＫ）−細胞の培養細胞に対して作成した。処理した線維芽細胞株の試料と非処理線維芽細胞の試料を逆転写して、標準的な２色蛍光システムで示差的に標識し、実施例２のマウスアレイとハイブリダイズさせた。処理の結果、ＬＯＮプロテアーゼとＨＳＰ８４のダウンレギュレーションが生じた。この実験の散布図は、実施例１７に記載されているＮＺＢ細胞株においてアップレギュレートされた遺伝子の中心グループと同じもの以外には、それらの発現が有意に異なったものはほとんどないことを示している。もっとも大きな違いを示した３つの遺伝子のハイブリダイゼーションスポットは、ＨＳＰ７０、ＬＯＮプロテアーゼ、およびＥ．Ｔ．Ｆ．であった。７０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）は、３．４倍ダウンレギュレートされた。ＨＳＰ７０は、ミトコンドリアタンパク質輸入に関係するシャペロンタンパク質であって、ミトコンドリア内膜トランスロカーゼおよび輸送中のポリペプチドとともにＡＴＰ依存型モーターを形成することが分かっている（Ｖｏｏｓ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，”［１９９９］Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４２２：２３５−５４）。ＨＳＰ７０に対するコントロールスポットはすべて中位の強度であったが、実験用のスポットでは中央だけが中位の強度であった。ＬＯＮプロテアーゼは、ＧＵＰで増殖させたＬＭ（ＴＫ）−細胞において９．７倍ダウンレギュレートされた。コントロールのＬＯＮプロテアーゼスポットは、全スポットにわたって中位の強度であったが、実験用のスポットでは強度が低かった。脂質代謝の間に集めた電子を電子伝達系に往復輸送する電子伝達フラビンタンパク質（ＥＴＦ）は、３．８倍ダウンレギュレートされた。Ｅ．Ｔ．Ｆ．のコントロールスポットは強度が高かったが、実験用スポットは非常に低い強度であった。核コードＯＸＰＨＯＳサブユニットのいくつかは、アミノ酸代謝に関係するタンパク質のいくつかと同じように、１．５〜２倍、平均の比率で１．６５倍ダウンレギュレートされた。これらの遺伝子のほとんどは、＋／−１．７という比率というカットオフ値よりも低かったので、この発現パターンが有意なものであるか否かをさらに判定する必要があった。ｍｔＤＮＡの転写産物レベルには差がなく、解糖系遺伝子の一貫したアップレギュレーションパターンもなかった。
【０２４３】
（実施例１６）
（処理後発症前のＳｏｄ２マウスのプロフィール）
Ｓｏｄ２マウスをＭｎＴＢＡＰで処理すると、心臓および肝臓の病気を予防することができるが、１２日後には、ＭｎＴＢＡＰで処理された変異型動物は、顕著な運動障害を発症して、大脳皮質と運動機能に関係した特異的脳幹がスポンジ状に変化するのとグリオーシスを伴って、３週間後までには衰弱してしまう。血液脳関門からのＭｎＴＢＡＰ交換がうまく行かなくなるために重篤な神経病理が起きると考えられている。実施例２のマウスアレイを用いて、ＭｎＴＢＡＰで処理していないＳｏｄ２変異型マウスと、ＭｎＴＢＡＰで処理したＳｏｄ２変異型マウスのミトコンドリア生物学発現プロフィールを決定した。ＭｎＴＢＡＰ処理なしの８日齢のＳｏｄ２マウス、ＭｎＴＢＡＰで処理した８日齢のＳｏｄ２マウス、およびＭｎＴＢＡＰで処理した１２日齢のＳｏｄ２マウスから試料を採集した。同じ日齢のコントロールからも試料を採集した。対応する同じ日齢のコントロールと比較すると、Ｓｏｄ２ノックアウトマウスの３つのグループすべてで約２０種類の遺伝子が異なった発現をするのが見られた。約２０種類の遺伝子には、ミトコンドリアのクレア
チンホスホキナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ３に似た抗酸化酵素、ならびにカスパーゼ１およびアポトーシス阻害因子３などのアポトーシス因子などの生体エネルギー遺伝子が含まれていた。また、興奮性アミノ酸トランスポーター３、フラタキシン、および未知の機能をもつＥＳＴ一つも誘導された。ミトコンドリア生物学発現プロフィール作成によって、神経病理学的変化の前に発現が変化することが明確に示された。
【０２４４】
（実施例１７）
（変異マウスの器官特異的なプロフィール）
ＮＺＢマウス系統のｍｔＤＮＡおよび「普通のハプロタイプ」ｍｔＤＮＡ（１２９／Ｓｖ、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ、Ｃ３Ｈ、ＢＡＬＢ／ｃ、およびその他、一匹の雌の後代として生まれたと考えられる系統（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）は、１０８個のヌクレオチドで異なっており、これらの多型的な違いを用いて、胚融合技術によって作出されたマウスにおけるｍｔＤＮＡのヘテロプラスミックな集団の分離を観察した（Ｊｅｎｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｒａｎｄｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｒｉｆｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｍａｌｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｅｘｐｌａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ，”［１９９６］Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４：１４６−５１；Ｊｅｎｕｔｈ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．，”Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｔＤＮＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｉｃｅ，”（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：９３−５；Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ，Ｆ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．，”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋａｒｙｏｐｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”（１９９７）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４５：４４５−５１；Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ，Ｆ．Ｖ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．，”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｓ，”［１９９８］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８：８７７−８３）。ＮＺＢおよびＣＡＰＲマウスの組織のプロフィールをマウスアレイ上で作成した。ＮＺＢのｍｔＤＮＡについてヘテロプラスミックなオスのマウスと、毛色によって定義されているようにＥＳ細胞由来のＣＡＰＲ細胞について８０％キメラであるオスのマウスの脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、および骨格筋からメッセンジャーＲＮＡを単離した。ＣＡＰＲ変異の深刻さから、ＣＡＰＲｍｔＤＮＡについてホモプラスミックなマウスにおけるミトコンドリア遺伝子発現の変化を解析することは不可能であった。性別、日齢、および核背景が一致しているコントロールマウスから、各組織試料に対するコントロールｍＲＮＡを単離した。組織試料はすべて遺伝子型を判定して、各組織におけるＮＺＢおよびＣＡＰＲのｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーのレベルを判定した。ＮＺＢ  ｍｔＤＮＡ−陽性マウスから解析された６つの組織で、ＮＺＢおよび「普通の」ｍｔＤＮＡが同じレベルであることが分かった。ＣＡＰＲキメラ由来のこの６つの組織は、さまざまなレベルのＣＡＰＲｍｔＤＮＡを有していて、腎臓と脾臓が最も大量で、それぞれ、６５％と５０％のＣＡＰＲｍｔＤＮＡを持っていた。心臓は、約２０％のＣＡＰＲｍｔＤＮＡを含んでいて、一方、脳、肝臓、および筋肉はすべて、５％から１０％のＣＡＰＲｍｔＤＮＡを含んでいた。ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ組織試料を解析しても、心臓、肝���、脳および腎臓では異なって発現されている遺伝子は明らかにならなかった。ＮＺＢの心臓から得られた散布図を図４に示す。肝臓、脳、および腎臓から得られた散布図は、ほとんどすべての遺伝子が発現比率１であるという点で実質的に一致している。ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ脾臓と筋肉の解析によって、この２つの組織で異なって発現された遺伝子がいくつかあることが明らかになった。ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ筋肉では、すべてのｍｔＤＮＡ転写産物が１．５から２．１倍減少することが示され、ピルビン酸デヒドロゲナーゼが２．２倍ダウンし、また、核コードされているＯＸＰＨＯＳサブユニットが１．４から１．８倍ダウンレギュレートされるという一
般的傾向があった。小胞輸送タンパク質であるパントフィシン（ｐａｎｔｏｐｈｙｓｉｎ）は４倍ダウンレギュレートされ、グリコーゲン分解の律速酵素であるグリコーゲンホスホリラーゼは３倍ダウンした。筋肉では有意にアップレギュレートされた遺伝子は全くなかった。ｍｔＤＮＡにコードされた遺伝子の発現の同様のパターンがＮＺＢ−ｍｔＤＮＡの脾臓で見られ、すべての転写産物が１．８から２倍ダウンしていた。しかし、ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ骨格筋で観察されたレベルと同じように、核ＯＸＰＨＯＳサブユニットの発現レベルに差はなかった。ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ筋肉とはコントロール的に、脾臓では、いくつかの遺伝子がアップレギュレートされていた。ＮＺＢ細胞株における結果とは正反対に、ヘム生合成遺伝子コプロポルフィリノーゲン・オキシダーゼＩＩＩの２つのプローブはともに、脾臓で３倍アップレギュレートされるのを検出した。膜内在性タンパク質ＳＵＲＦ４は２倍アップし、アミノ酸代謝遺伝子である２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼは４．８倍アップした。グリコーゲンホスホリラーゼは、筋肉では３倍ダウンし、脾臓では、４．８倍アップした。筋肉と脾臓の結果は、ＮＺＢと「普通の」ｍｔＤＮＡの間の多型性が、機能的な結果をもたらす組織もあり、もたらさない組織もあることを示唆している。ＣＡＰＲ組織試料の解析では、腎臓、心臓、筋肉、肝臓、または脾臓で異なって発現される遺伝子は示されなかった。腎臓は、変異型ｍｔＤＮＡの割合が高いが、ほとんどすべての遺伝子について発現比率はほぼ１であった。腎臓の散布図上には、ダウンレギュレートされているように見える２つの異常値は、コントロール試料中のバックグランドを上昇させるハイブリダイゼーションアーティファクトによって説明することができる。ＣＡＰＲ脳試料が、いくらかの示差的発現された遺伝子があった唯一の組織であった。Ｓｋｄ３が２．２倍アップレギュレートされ、グルタチオンペルオキシダーゼが２．４倍アップし、また、アポトーシス−インヒビター３が２．４倍アップした。１．８倍よりもダウンレギュレートされた遺伝子は脳にはなかったが、脳組織をもっとよく調べたところ、それ以外の組織では見られなかった傾向が明らかになった。核コードのＯＸＰＨＯＳサブユニットのいくつかが１．３から１．６倍ダウンレギュレートされた。これらには、５種類の複合体Ｉサブユニット、３種類の複合体ＩＶサブユニット、および５種類の複合体Ｖサブユニットが含まれ、また、ＶＤＡＣ１および３も含まれていた。複合体ＩＩおよび複合体ＩＩＩのサブユニットやｍｔＤＮＡの転写産物には、この傾向に従ったものはなかった。ＮＺＢおよびＣＡＰＲマウス組織の主成分分析を、別個および細胞株と一緒に行った。
【０２４５】
（実施例１８）
（ミトコンドリアアレイの遺伝子同定）
ミトコンドリア生物学のマウス変異体を用いて、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子を同定した。アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ１）の心臓／筋肉におけるアイソフォームのマウス欠失体は、骨格筋のミトコンドリアの劇的な増殖など、ヒトの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）疾患の特質の多くを示している。ＡＮＴ１および野生型のマウスの腓腹筋から試料を採集し、逆転写して、示差的に標識し、８０００配列以上の確認されたｃＤＮＡを含む、マウスのマイクロアレイチップ（Ｍｏｕｓｅ  Ｕｎｉｇｅｎｅ１，ＩｎｃｙｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果を解析して、異なって発現された遺伝子を１５０よりも多数同定した。これまでミトコンドリア生物学に関係していると認識されていなかった遺伝子配列を用いて、実施例２のマウスアレイ上に置いたプローブを作成した。相同的なヒト遺伝子配列を用いて、実施例１のヒトのアレイ上に置いたプローブを作成した。
【０２４６】
（実施例１９）
（ヒトのミトコンドリアアレイを用いたチンパンジーにおける年齢に関係した変化のプロフィール）
実施例１のヒトのミトコンドリアアレイを用いて、チンパンジーにおけるミトコンドリア生物学発現プロフィールの年齢に関係した変化を判定した。若い成獣チンパンジーの筋
肉からの試料と、年寄りのチンパンジーの最も死にかけている組織の試料を逆転写し、示差標識して、実施例１のヒトアレイとハイブリダイズさせた。
【０２４７】
（実施例２０）
（推定中立変異型マウスのプロフィール）
ＮＺＢ細胞株のプロフィールを作成して、より中立的なｍｔＤＮＡ多型のセットから得られたミトコンドリア遺伝子発現の変化を調べた。既述したように、ＮＺＢのｍｔＤＮＡは、ＬＭ（ＴＫ）に見られる「普通の」マウスｍｔＤＮＡの遺伝子型と比較すると、１０８の配列相違点を含んでいる。これらの違いは中立的な多型であると報告されている（Ｊｅｎｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９６］Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：１４６−１５１；Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ［１９９７］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４５：４４５−４５１）が、この仮説を裏付ける唯一の証拠は、ＮＺＢミトコンドリアを高率で含むトランスジェニックマウスが、明確な表現型を示さないということだけである（Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｅ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＧｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”（２０００）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｅｍｏｒｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｊｅｎｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．［１９９７］Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：９３−９５；Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ［１９９８］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４８：８７７−８８３）。マウスのミトコンドリアアレイ上でＮＺＢサイブリッド細胞株のプロフィールを作成した。ＮＺＢ細胞株と親株であるＬＭ（ＴＫ）−の間（ＧＵＰ添加なし）の遺伝子発現比率の散布図は、脂肪酸代謝遺伝子であるＡｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中位鎖）の両プローブが、３．６倍のアップレギュレーションを検出したことを示している。ＩＩＩ型およびＶＩ型のプロコラーゲンは、それぞれ、６．２倍と６．８倍アップレギュレートされた。ヘム生合成に関係するコプロポルフィリノーゲン・オキシダーゼＩＩＩ遺伝子の２つの独立したプローブが、２．６倍と２．３倍のダウンレギュレートを検出した。また、末梢型ベンゾジアゼピン・レセプターもダウンレギュレートされた。このレセプターは、酸化ストレス下でのミトコンドリアタンパク質輸入の調節、カルシウムのホメオスタシス、およびステロイド生成など、ミトコンドリアのさまざまな機能に関与している（Ｃｕｌｔｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−ｔｙｐｅ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ，”［１９９９］Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：１２３−３０；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｃｈｅｒ，Ｖ．”Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，”［１９９９］Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４６：４４３−５０）。解糖遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース−６−リン酸イソメラーゼが、それぞれ１．７倍および２．１倍アップレギュレートされた。解糖系遺伝子は、ＮＺＢ細胞株においてもアップレギュレートされていた。このことは、ＮＺＢのｍｔＤＮＡと「普通の」ｍｔＤＮＡの間の配列多型性が完全に中立ではなく、ＬＭ（ＴＫ）−核と組み合わされると、ミトコンドリアの機能に変化を生じさせることを示している。このように、ＮＺＢ  ｍｔＤＮＡは、「普通の」ｍｔＤＮＡゲノムと完全に互換的とは考えられない。ＮＺＢ細胞株においてアップレギュレートされた遺伝子の興味深いグループは、前炎症性遺伝子であるカスパーゼ１および血小板活性化因子（ＰＡＦ）アセチルヒドロラーゼ、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ならびにグルタチオンペルオキシダーゼ３であった。
【０２４８】
（実施例２１）
（細胞株の階層的クラスター分析）
すべての試料にわたる発現パターンの類似性に基づいて遺伝子をグループ化するために、細胞株のデータ（実施例１３〜１５および２０）について主成分分析（ＰＣＡ）および階層的クラスター分析を行った。ＰＣＡ分析を用いて、すべての試料における変動をできるだけ多く包含する３つの主要軸を計算することによってデータの次元性を縮退させた。そして、３次元空間におけるそれらの軸の上に試料をそれぞれプロットした。ＰＣＡの結果は、ＮＺＢ細胞株が、その他の細胞株から離れてクラスター形成することを明らかにしたが、この細胞株が、他の試料と同様に、示差的に発現される遺伝子をほとんど持たないことと整合している。おそらく、核ＯＸＰＨＯＳ遺伝子のダウンレギュレーションという共通点があったせいで、ＬＭＥＢ４ρ０細胞株、５０１−１細胞株およびＬＭ（ＴＫ）−（ＧＵＰ）細胞株はすべて、一本の共通の主軸に沿って整列した。しかし、これらは、別の２本の軸では一致しなかった。おそらく、ＯＸＰＨＯＳ遺伝子が部分的に減少し、同時に解糖系遺伝子の発現が同時に誘導されるため、ＬＭ（ＴＫ）−（ＧＵＰ）とＮＺＢが一つの軸を共有する。しかし、これはどちらも、ＣＡＰ  Ｒ  ５０１−１およびＬＭＥＢ４ρ０の試料と比較すると、ほとんど違いを示さなかった。階層的クラスター分析のアルゴリズムを用いて、試料全部にわたって類似している発現プロフィールによって遺伝子をグループ化した。試料だけでなく、どちらの遺伝子も、ユークリッド距離測定法および平均リンケイジを用いて、一緒にクラスター形成された。クラスター分析の結果、細胞株試料においては、類似した発現パターンをもつ遺伝子グループが７つ明らかになった。一定の遺伝子のクラスは一緒に変化することが分かった。ＰＣＡ分析同様、ＬＭ（ＴＫ）−（ＧＵＰ）とＮＺＢの試料で見られる発現の変化が、最も近接して一緒にクラスター形成し、ＣＡＰ  Ｒ５０１−１およびＬＭＥＢ４ρ０の試料は連続して、さらに遠くに枝分かれしていた。グループ１の遺伝子は、脂肪酸代謝に関係している。主にＬＭ（ＴＫ）−（ＧＵＰ）試料でダウンレギュレートされたグループ２の遺伝子には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびいくつかのアミノ酸代謝遺伝子が含まれる。グループ３の遺伝子は、５つの試料全部でそろって発現が変化する遺伝子のさまざまなクラスターである。これには、いくつかの核コードＯＸＰＨＯＳサブユニット、数種類の抗酸化タンパク質および輸送タンパク質、ならびにピルビン酸キナーゼおよびＧＴＰ−結合タンパク質などが含まれる。グループ４は、主に、ＣＡＰ  Ｒ  ５０１−１細胞株でアップレギュレートされる遺伝子の小さく多様なクラスターである。このグループは、ディファレンシャルディスプレイ解析（Ｍｕｒｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）によって、Ａｎｔ１（−／−）マウスでアップレギュレートされるのが発見されたものと同じ遺伝子のいくつかを含む。また、２種類のＮＡＤＰ−トランスヒドロゲナーゼ、炭酸デヒドラターゼ、およびシトクロムｂ５レダクターゼもこのグループである。グループ５は、ほとんど独占的に核コードのＯＸＰＨＯＳサブユニットである。電圧依存性アニオンチャン���ル（ＶＤＡＣ）遺伝子およびいくつかの抗酸化タンパク質も、このグループでクラスター形成している。グループ６は、ほとんど完全にｍｔＤＮＡにコードされている転写産物から構成される。グループ７は、解析された試料のそれぞれでアップレギュレートされた遺伝子の異種のグループであり、カスパーゼ１、ＰＡＦアセチルヒドラーゼ、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼ３を含んでいた。当技術分野においては、階層的クラスター分析パッケージ、すなわち、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＥＰ／  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を利用することができる。ＰＣＡは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００１，ｖｏｌｕｍｅ  １７，ｎｕｍｂｅｒ  ９，ｐａｇｅｓ  ７６３−７７４で説明されている。
【０２４９】
以下の実施例では、ミトコンドリア生物学発現アレイ、試料調製、ハイブリダイゼーション、走査、およびデータ標準化について説明する。
【０２５０】
（実施例２２）
（ＰＣＲ増幅）
標準的なＰＣＲ技術によってＰＣＲ増幅を行った。プローブは、ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣ１，ｐＨ８．３）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，各０．２ｍＭのプライマー、１．２５Ｕ  Ｔａｑ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む１００μｌのＰＣＲ反応液に入ったユニバーサルプライマーセット（フォワードプライマー：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を用いて、当方の増幅用クローンから作成した。各ＰＣＲ反応液に０．５〜１μｌの細菌培養液を加え、以下のとおり温度周期を行った。９４℃で４分間、その後３５サイクル、９４℃で１５秒、６６℃で３０秒、７２℃で１分３０秒。この周期を行った後、すべての伸長反応を完了させるために７２℃に４分間置いた。すべてのＰＣＲ産物を、１．５％ゲルでのアガロースゲル電気泳動によって確認した。十分に増幅した後、ＵＶ２６０／２８０の比率で産物を定量し、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）の中で乾燥させた。そして、アレイを行うために、乾燥した産物を、４００〜６００ｎｇ／μｌの濃度で３×ＳＳＣ（４５０ｍＭ  ＮａＣｌ，４０ｍＭ  クエン酸ナトリウムに再懸濁した。
【０２５１】
（実施例２３）
（スライド調製）
プローブをアレイに並べる前に、アレイ用のガラス製顕微鏡スライドを、ポリ−Ｌ−リジンでコートして、ＤＮＡ結合用の基質を用意した。標準的なガラス製の顕微鏡スライド（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌ，Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、２．５ＭのＮａＯＨ、６０％エタノールで２時間洗浄した。洗浄後、スライドを真水で５回濯いだ。そして、０．０１％ポリ−Ｌ−リジン、１×ＰＢＳの溶液にスライドを１時間浸した後、真水で濯いだ。濯いだ後、真空オーブンの中、４５℃で１５分間スライドを乾燥させた。
【０２５２】
（実施例２４）
（プリンティング）
ＧＭＳ  ４１７アレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたガラススライドにアレイをプリントした。１５０μｍのスポットサイズ（スポット当り約３３μＬの容量）で、スポットの中心から中心までの距離が３７５μｍになるように、４−ピンのプリントヘッドを用いてアレイをプリントした。アレイをプリントしている間は、特注の加湿装置によって湿度を６５〜７０％に保った。プリント後、室温で１時間アレイを乾燥させた。そして、１×ＳＳＣの温溶液で５分間再水和させて処理し、その後、９５℃のヒートブロックで速やかに乾燥させた。乾燥させた後、アレイを６５ｍＪの紫外線エネルギーに曝露して、ＤＮＡをスライドにクロスリンクさせた（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ハイブリダイゼーションの間アレイ上への非特異的な相互作用をブロックするために、次に、スライドを１−メチル−２−ピロリジノン中、６０ｍＭの無水コハク酸および４０ｍＭのホウ酸ナトリウムの溶液によって、１５分間、室温で処理した。そして、このアレイを９５℃の湯の中２分間変性させて、９５％エタノールで速やかに脱水した。そして、２０×ｇで５分間遠心分離して、このアレイを乾燥させた。
【０２５３】
（実施例２５）
（試料調製）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、製造業者の指示にしたがって全ＲＮＡ調製を行った。細胞培養試料に
ついては、９０％コンフルエントになった２２５ｍｌフラスコを、１８ｍｌのＴＲＩｚｏｌをフラスコの中で直接溶解した。各細胞株につき、少なくとも３個のフラスコをまとめて、培養条件によって生じる変動を減らした。各マウス組織については、６ｍｌのＴＲＩｚｏｌで機械的にホモジナイズした約５００ｍｇの組織からＲＮＡを単離した。全ＲＮＡを単離した後、製造業者の指示にしたがってＱｉａｇｅｎ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてポリ−Ａ+ｍＲＮＡを単離した。
【０２５４】
（実施例２）
（逆転写、標識、およびハイブリダイゼーション）
ＭｉｔｏＣｈｉｐアレイにハイブリダイゼーションさせる標的を作成するために、逆転写によって蛍光ヌクレオチドで２μｇのポリ−Ａ＋ＲＮＡを標識した。このポリ−Ａ+ＲＮＡを３ｍｇのアンカー型オリゴ−ｄＴと混合して、７０℃で１０分間インキュベートした後、１０分間氷上に置いた。次に、変性およびアニールしたＲＮＡを、反応用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣ１、３ｍＭ  ＭｇＣ１２  ｐＨ８．３）、１０ｍＭジチオスレイトール、５００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３００μＭ  ｄＣＴＰ、２０Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、および１００μＭのＣｙ５−ｄＣＴＰ（コントロール試料）またはＣｙ３−ｄＣＴＰ（実験用試料）のどちらかを含む３０μｌの反応混合液の中で逆転写させた。この反応液を４２℃で２時間インキュベートした。インキュベートした後、残った鋳型ＲＮＡを分解するために１５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えて、７０℃で１０分間試料をインキュベートした。１５μｌの０．１Ｍ  ＨＣｌを加えて反応液を中和した後、４４０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加えた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いたサイズ排除濾過によって、合成したｃＤＮＡを精製した。精製した後、１０μｇのポリ−Ａ  ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と１０μｇの酵母運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えた。最終的な試料容量を１２μｌに調整し、５２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５２．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．２５％ＳＤＳ。試料を１００℃で２分間変性して、アレイに加えた。試料とアレイを、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。試料およびアレイを、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーチップで覆って、加湿されたハイブリダイゼーション用チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に置いて、６５℃で１２〜１６時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；１×ＳＳＣ；および０．１×ＳＳＣで連続して５分間アレイを洗浄した。最後の洗浄の後、２０×ｇで遠心してアレイを乾燥してから、ＧＭＳ  ４１８アレイ用スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて走査した。
【０２５５】
（実施例２７）
（アレイ走査とデータ解析）
走査したアレイを１６ビットＴＩＦＦファイルに保存して、Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ’ｓ  Ｉｍａｇｅｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて解析した。Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ’ｓＧｅｎｅＳｉｇｈｔソフトウエアを用いてデータマイニングおよびクラスター分析を行った。データ解析の前に、アレイ上のすべてのスポットを用いて、細胞培養試料をすべて標準化した。すべてのマウス組織試料を、アレイ上のハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。局所的なバックグランドをスポット毎に計算して、シグナルの強度がバックグランドの３倍よりも小さいスポットまたは形態が貧弱なスポットは、データ解析から除外した。１．７よりも大きな示差的発現値だけを有意であると見なした。ＧｅｎｅＳｉｇｈｔを用いて行われるデータマイニングおよびクラスター分析はすべて、すべての値の自然対数（Ｉｎ）を採ることによって変換された発現比
率データについて行い、Ｚ−スコアによって標準化した。発現比率の値が非ガウス的分布であるため、データを変換する。比率が、最下限値の０に隣接するため、通常、非ガウス的分布が見られる。さらなる統計処理を可能にするため、より均一な分布になるようデータを変換した。Ｚ−スコアによる標準化法は、すべての測定値から平均値を引くこと、および標準偏差値で割り算することを含み、アレイ上の各スポットを他の全てのスポットに対して効果的に標準化する。
【０２５６】
（実施例２８）
（ミトコンドリアアレイに対する試料のハイブリダイゼーション）
ＬＭ（ＴＫ）−細胞株から単離されたｍＲＮＡからコントロールのｃＤＮＡ試料を調製し、Ｃｙ５色素で標識した。各実験用ｍＲＮＡ試料をＣｙ３色素で標識し、Ｃｙ５コントロール試料と混合し、この混合液を用いてアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたアレイの典型的な画像を図２に示す。赤く見えるアレイ上のスポットは、Ｃｙ５で標識されたコントロールのＬＭ（ＴＫ）−試料が大きな割合でハイブリダイズしたせいであり、緑色のスポットは、Ｃｙ３で標識された実験用試料が大きな割合でハイブリダイズしたせいであった。黄色のスポットは、２つの標的がほぼ等量同時にハイブリダイズしたものである。各スポットについて蛍光比率を定量したところ、２つの試料における各遺伝子のｍＲＮＡの相対的豊富さを計算できるようになった。
【０２５７】
（実施例２９）
（標準化）
ｍＲＮＡの逆転写の間に産生されるｃＤＮＡを標識するために使用される２種類の蛍光色素は、異なった構造と異なった発光最大値を有する。したがって、蛍光標識された各試料のハイブリダイゼーションを代表する２つの画像を互いに標準化して、この２つの画像の間の発現比率を計算する前に、色素の挙動の違いを計上した。各画像中のスポットすべての平均値を出すことによって、一方の画像を他方の画像に対して標準化し、次に、各スポットに適用する定数を誘導した。あるいは、すべての条件下で、２つの試料の中で等量発現した所定の遺伝子セットを用いることもできよう。これらの遺伝子の発現比率を用いて、次にアレイ上の全てのスポットに適用された定数を計算した。表２の２５のハウスキーピング遺伝子のセットは、標準化のためにマウスアレイ上に含まれていて、これらの方法を両方とも、マウスの細胞株および組織試料の解析に用いた。培養細胞におけるハウスキーピング遺伝子の発現は、組織試料におけるよりもずっと大きく変動した。細胞株試料においてハウスキーピング遺伝子の発現パターンが変動したため、標準化をアレイ上の全てのスポットを用いて行った。組織試料では、ハウスキーピング遺伝子の発現は一貫性がずっと高かったため、ハウスキーピング遺伝子を用いても、すべての遺伝子の平均値を用いても同様の結果が得られた。
【０２５８】
（実施例３０）
本発明のアレイのためのコントロールプローブを作成するのに役立つクローンを表６に列挙する。コントロールプローブを作成するのに役立つ遺伝子の配列は、本明細書の配列表に記載されている。
（表６）
【０２５９】
【表６】
2005515757.tif 000148
当業者は、本明細書に具体的に開示されていない試料、試料採集技術、試料調製技術、プローブ、プローブ作成技術、ミトコンドリア生物学に関係する遺伝子、ハイブリダイゼーション技術、アレイプリンティング技術、生理学的状態、細胞株、変異系統、生物、組織、固体基質、およびデータ解析法も、当技術分野において利用することができ、本発明を実施するときに使用できるということを理解している。当技術分野において知られている機能的等価物はすべて、本発明の範囲に包含されるものとする。
【０２６０】
（配列表に対する参照）
表３〜５は、本発明の方法を実施するためのプローブを作成するのに役立つクローンに関する情報を列挙している。クローンの識別番号は、通常、ＮＩＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ），ＲｅｓＧｅｎ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＩＭＡＧＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＬＬＮＬ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのものである。遺伝子の名前および説明は、対応するクローンから作成されたプローブによって検索される遺伝子のために提供されている。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号およびユニジーンクラスターＩＤは、利用可能なものについては記載してある。一定の遺伝子の機能が表４に含まれている。表３〜４に記載されているクローンの５’末端および３’末端の配列は、利用可能なものについては記載してある。５’末端の配列も３’末端の配列も利用できない場合には、そのクローンのために提供されているＧｅｎＢａｎｋ登録番号の遺伝子配列を、場合によっては列挙してある。ＧｅｎＢａｎｋの配列は、クローンの配列よりも長い場合がある。本発明は、本明細書に記載してある配列情報がなくても、クローンまたはＧｅｎＢａｎｋのリストを利用して実施可能である。表３〜５に列挙されているクローンから作成したプローブによって検索される遺伝子に由来する他の配列は、当技術分野において既知の情報を用いて同等のプローブを作成するのに役立つ。すなわち、該遺伝子のユニークなセグメントを利用することができる。
【０２６１】
表３に列挙したクローンに対応する配列表は、配列番号：１〜９９４までをカバーしていて、配列同定番号；表に列挙されている配列またはリストに載っている配列を含むプローブによって検索される遺伝子に対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号；表３に列挙されている配列に関連した、括弧内の別のＧｅｎＢａｎｋ登録番号；配列が由来するクローンを確認するＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＲｅｓＧｅｎ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＩＤ番号；クローンが由来する遺伝子の名前；その遺伝子の説明；その遺伝子のユニジーンクラスターＩＤ番号；およびクローンの５’末端または３’末端として配列を確認できる括弧内の情報；クローンの挿入配列の長さ；クローンの由来原；ｃＤＮＡなど、クローンの種類；および核酸配列などの情報を含む。
【０２６２】
コントロールプローブの配列表を、配列番号：３０４１〜３０４４として提供する。
【０２６３】
表４に列挙したクローンに対応する配列表は、配列番号：９９５〜３０４０までをカバ
ーしていて、配列同定番号；表に列挙されている配列に対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号；対応クローンの５’末端および／または３’末端の配列、または対応するクローンが由来した遺伝子；対応するクローンが由来する遺伝子の名前と機能；対応するクローンが由来する遺伝子のユニジーンクラスターＩＤ番号；本配列が由来したクローンの名前；遺伝子の付加的説明；遺伝子名、再整列配列、親配列、別のＥＳＴ、およびＢｌｓｔ  Ｌｉｎｋ；上記のタイトルの順に、その配列が由来したクローンの名前、クローンの５’末端（−５）または３’末端（−３）の配列として、それを同定できる末尾の記号、親配列の名前、そして、もし存在するのであれば、もう一方の３’末端か５’末端の配列かもしれない別のＥＳＴ（発現配列断片）の名前；提供された配列の長さ；および核酸配列などの情報を含む。
【０２６４】
配列番号：１〜３０４４は、本明細書とともに、コンパクトディスクで、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名で提出され、参照されて本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】図１は、ミトコンドリアのエネルギー論、および、エネルギー生成、活性酸素種（ＲＯＳ）およびアポトーシスの調節の関係を示す哺乳動物ミトコンドリアの図解図である。
【図２】図２は、本発明のハイブリダイズ後のマウスアレイを示したものである。ハイブリダイズしたアレイの写真は、コントロールまたは参照を示す溝と実験用の標的の溝とを重ね合わせると発生する画像を示している。色つきで見ると、各スポットは、さまざまな濃さの赤、緑および黄色に見える。赤色のスポットは、コントロールｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションが優勢であることを示し、一方、緑色のスポットは、実験用の標的試料に対するハイブリダイゼーションが優勢であることを示している。黄色のスポットは、どちらの試料も同等のハイブリダイゼーションをしたことを示している。アレイを色つきで示したときに黄緑色またはオレンジ色になるスポットは、それぞれ、黄色と緑が半々であるか、赤と黄色が半々であることが図示されたものである。
【図３】図３は、ρ０  ＬＭＥＢ４細胞株の遺伝子発現散布図を示している。この散布図は、ρ０  ＬＭＥＢ４試料に対する遺伝子発現比率の分布を示している。対角線の破線は、２つの試料間で比率が１であることを示している。破線よりも上にあるスポットは、ＬＭ（ＴＫ）コントロールと比較して、ρ０  ＬＭＥＢ４試料においてアップレギュレーションされているか、より大量に存在するものである。破線よりも下にあるスポットは、コントロールと比較して、実験用試料においてダウンレギュレーションされているか、より少量しか存在しないものを示している。
【図４】図４は、ＮＺＢの心臓遺伝子発現の散布図を示している。この散布図は、ＮＺＢの心臓組織試料についての遺伝子発現の分布を示している。対角線の破線は、２つの試料間における比率が１であることを示している。破線よりも上にあるスポットは、「一般的な」ｍｔＤＮＡコントロール心臓と比較して、ＮＺＢ−ｍｔＤＮＡ心臓試料においてアップレギュレーションされているか、より大量に存在するものである。破線よりも下にあるスポットは、コントロールと比較して、実験用試料においてダウンレギュレーションされているか、より少量しか存在しないものを示している。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2005515757.tif 000149
【図３】
2005515757.tif 000150
【図４】
2005515757.tif 000151