【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  他の抗癌剤または様式と組み合わせたスクアラミンを使用する癌腫の処置
【特許請求の範囲】
【請求項１】  第一の処置過程のための有効量の少なくとも一つの細胞傷害性化学化合物を含む第１の容器；および第二の処置過程のための有効量のスクアラミンを含む第２の容器、を備える、腫瘍を処置するためのキット。
【請求項２】  細胞傷害性化学化合物が：ニトロソウレア、シクロフォスファミド、ドクソルビシン、５−フルオロウラシル、パクリタキセルおよびその誘導体、シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、エピルビシン、メトトレキセート、メルファラン、チオテパ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、イフォスファミド、ブレオマイシン、プロカルバジン、クロラムブシル、フルダラビン、マイトマイシンＣ、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、カルムスチン、エストラムスチンおよびゲムシタビンから成る群より選択されるメンバーである請求項１に記載のキット。
【請求項３】  細胞傷害性化学化合物がＢＣＮＵである請求項２に記載のキット。
【請求項４】  細胞傷害性化学化合物がシクロフォスファミドである請求項２に記載のキット。
【請求項５】  細胞傷害性化学化合物がシスプラチンである請求項２に記載のキット。
【請求項６】  細胞傷害性化学化合物がカルボプラチンである請求項２に記載のキット。
【請求項７】  細胞傷害性化学化合物がカルボプラチンおよびパクリタキセルの組み合わせである請求項２に記載のキット。
【請求項８】  細胞傷害性化学化合物がシスプラチンおよびエトポシドの組み合わせである請求項２に記載のキット。
【請求項９】  第一の処置過程において、細胞傷害性化学化合物が静脈内に投与される請求項１に記載のキット。
【請求項１０】  第二の処置過程において、スクアラミンが皮下に投与される請求項９に記載のキット。
【請求項１１】  第二の処置過程において、スクアラミンが腹腔内に投与される請求項９に記載のキット。
【請求項１２】  第二の処置過程において、スクアラミンが静脈内に投与される請求項９に記載のキット。
【請求項１３】  第一の処置過程が第二の処置過程に先立って行われる請求項９に記載のキット。
【請求項１４】  第一の処置過程が第二の処置過程の開始前に完了している請求項１に記載のキット。
【請求項１５】  第一の処置過程が細胞傷害性化学化合物の１回注射である請求項１に記載のキット。
【請求項１６】  細胞傷害性化学化合物がＢＣＮＵである請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】  細胞傷害性化学化合物がシクロフォスファミドである請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】  細胞傷害性化学化合物がシスプラチンである請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】  細胞傷害性化学化合物がカルボプラチンである請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】  第二の処置過程において、スクアラミンが皮下に投与される請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】  第二の処置過程において、スクアラミンが経口で投与される請求項１５に記載のキット。
【請求項２２】  第二の処置過程において、スクアラミンが静脈内に投与される請求項１５に記載のキット。
【請求項２３】  第二の処置過程において、スクアラミンが皮下に投与される請求項１５に記載のキット。
【請求項２４】  第二の処置過程において、スクアラミンが腹腔内に投与される請求項１５に記載のキット。
【請求項２５】  腫瘍がＣＮＳ腫瘍である請求項１に記載のキット。
【請求項２６】  腫瘍が乳房腫瘍である請求項１に記載のキット。
【請求項２７】  腫瘍が肺腫瘍である請求項１に記載のキット。
【請求項２８】  腫瘍が卵巣腫瘍である請求項１に記載のキット。
【請求項２９】  腫瘍が肝臓細胞癌腫である請求項１に記載のキット。
【請求項３０】  腫瘍が神経芽腫である請求項１に記載のキット。
【請求項３１】  腫瘍が前立腺腫瘍である請求項１に記載のキット。
【請求項３２】  第一の処置過程のための放射線療法と組み合わせて腫瘍を処置するためのキットであって、第二の処置過程のための有効量のスクアラミンを含む容器を備える、キット。
【請求項３３】  第二の処置過程において、スクアラミンが皮下に投与される請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】  第二の処置過程において、スクアラミンが経口で投与される請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】  第二の処置過程において、スクアラミンが静脈内に投与される請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】  第二の処置過程において、スクアラミンが腹腔内に投与される請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】  腫瘍がＣＮＳ腫瘍である請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】  腫瘍が乳房腫瘍である請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】  腫瘍が肺腫瘍である請求項３２に記載のキット。
【請求項４０】  腫瘍が卵巣腫瘍である請求項３２に記載のキット。
【請求項４１】  腫瘍が前立腺腫瘍である請求項３２に記載のキット。
【請求項４２】  腫瘍が神経芽腫である請求項３２に記載のキット。
【請求項４３】  第三の処置過程のための有効量の少なくとも一つの細胞傷害性化学化合物を含む容器をさらに含んでいる請求項３２に記載のキット。
【請求項４４】  細胞傷害性化学化合物が：ニトロソウレア、シクロフォスファミド、ドクソルビシン、５−フルオロウラシル、パクリタキセルおよびその誘導体、シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、エピルビシン、メトトレキセート、メルファラン、チオテパ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、イフォスファミド、ブレオマイシン、プロカルバジン、クロラムブシル、フルダラビン、マイトマイシンＣ、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、カルムスチン、エストラムスチンおよびゲムシタビンから成る群より選択されるメンバーである請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】  第一の処置過程のための有効量の少なくとも一つの抗ホルモン剤を含む第１の容器；および第二の処置過程のための有効量のスクアラミンを含む第２の容器、を備える、腫瘍を処置するためのキット。
【請求項４６】  抗ホルモン剤がＬＨＲＨアゴニストおよび抗アンドロゲン剤から成る群より選択されるメンバーである請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】  抗アンドロゲン剤がフルタミド、ビクルタミド、ニルタミドおよびルプロリドから成る群より選択される請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】  第一の処置過程のための物理的去勢と組み合わせて腫瘍を処置するためのキットであって、第二の処置過程のための有効量のスクアラミンを含む容器を備える、キット。
【請求項４９】  第一の処置過程のための有効量の細胞増殖抑制剤を含む第１の容器；および第二の処置過程のための有効量のスクアラミンを含む第２の容器を備える、腫瘍を処置するためのキット。
【請求項５０】  細胞増殖抑制剤がカルボキシアミドトリアゾールである請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が静脈内に投与される請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が皮下に投与される請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が腹腔内に投与される請求項４９に記載のキット。
【請求項５４】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が経口で投与される請求項４９に記載のキット。
【請求項５５】  第二の処置過程において、スクアラミンが腹腔内に投与される請求項４９に記載のキット。
【請求項５６】  腫瘍がＣＮＳ腫瘍である請求項４９に記載のキット。
【請求項５７】  腫瘍が乳房腫瘍である請求項４９に記載のキット。
【請求項５８】  腫瘍が肺腫瘍である請求項４９に記載のキット。
【請求項５９】  腫瘍が卵巣腫瘍、卵管腫瘍および腹膜腫瘍から成る群より選択される請求項４９に記載のキット。
【請求項６０】  腫瘍が卵巣腫瘍である請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】  腫瘍が肝臓細胞癌腫である請求項４９に記載のキット。
【請求項６２】  腫瘍が神経芽腫である請求項４９に記載のキット。
【請求項６３】  腫瘍が前立腺腫瘍である請求項４９に記載のキット。
【請求項６４】  第三の処置過程において有効量の少なくとも一つの細胞増殖抑制性化学化合物を投与することをさらに含んでいる請求項３２に記載のキット。
【請求項６５】  細胞増殖抑制性化学化合物がカルボキシアミドトリアゾールである請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が静脈内に投与される請求項６４に記載のキット。
【請求項６７】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が皮下に投与される請求項６４に記載のキット。
【請求項６８】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が腹腔内に投与される請求項６４に記載のキット。
【請求項６９】  第一の処置過程において細胞増殖抑制性化学化合物が経口で投与される請求項６４に記載のキット。
【請求項７０】  第二の処置過程において、スクアラミンが腹腔内に投与される請求項６４に記載のキット。
【請求項７１】  腫瘍がＣＮＳ腫瘍である請求項６４に記載のキット。
【請求項７２】  腫瘍が乳房腫瘍である請求項６４に記載のキット。
【請求項７３】  腫瘍が肺腫瘍である請求項６４に記載のキット。
【請求項７４】  腫瘍が卵巣腫瘍、卵管腫瘍および腹膜腫瘍から成る群より選択される請求項６４に記載のキット。
【請求項７５】  腫瘍が卵巣腫瘍である請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】  腫瘍が肝臓細胞癌腫である請求項６４に記載のキット。
【請求項７７】  腫瘍が神経芽腫である請求項６４に記載のキット。
【請求項７８】  腫瘍が前立腺腫瘍である請求項６４に記載のキット。
【請求項７９】  第三の処置過程と組み合わせて適用される、請求項１、３２、４５または４９の任意の項に記載のキットであって、ここで該第３の処置過程は、細胞傷害性化学物質、放射線、抗ホルモン剤および細胞増殖抑制剤の適用から成る群より選択される、キット。
【請求項８０】  第一および第二の処置が同時に与えられ、または単一組成物として与えられる請求項１、３２、４５または４９の任意の項に記載のキット。
【請求項８１】  有効量が相乗作用的に有効量である請求項１、３２、４５または４９の任意の項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
Ｉ．従来のスクアラミン応用に関する情報
本出願は、１９９８年９月１０日に出願された第０９／１５０，７２４号の一部継続出願であり、これは米国特許法第１１９条に基づいて、１９９６年４月２６日に出願された仮出願番号第６０／０１６，３８７号の利益を主張している、１９９７年４月２５日に出願された第０８／８４０，７０６号の一部継続出願である。これらすべての出願は全文のまま本明細書において援用される。
【０００２】
本発明はスクアラミンを使用する種々の方法に関している。図１に示された構造を持っているスクアラミンはツノザメ（スクアラス  アカンチアス）の肝臓から単離されたアミノステロールである。このアミノステロールはＺａｓｌｏｆｆらによる米国特許第５，１９２，７５６号（この特許は全文のまま本明細書において援用される）の主題である。スクアラミンを合成する方法は、ＷＯ９４／１９３６６（１９９４年９月１日に出願）に記載されているようにすでに考案されている。このＰＣＴ出願は全文のまま本明細書において援用される。このＰＣＴ出願はまた、米国特許出願第０８／０２３，３４７号（１９９３年２月２６日に出願）にも関連しており、この出願もそっくりそのまま本明細書において援用される。スクアラミンを合成する追加の方法もまた、１９９７年１２月５日に出願された米国特許出願第０８／９８５，８７６号に記載されており、この出願も全文のまま本明細書において援用される。
【０００３】
米国特許第５，７３３，８９９および５，７２１，２２６号は抗血管新生剤としてのスクアラミンの使用を開示している。これらの米国特許は全文のまま本明細書において援用される。追加のスクアラミンの使用（例えば、ナトリウム／プロトンエックスチェンジャー（アイソフォーム３）またはＮＨＥ３阻害剤としておよび内皮細胞の増殖を阻害する薬剤として）およびスクアラミン合成技術が米国特許第５，７９２，６３５号に開示されている。この特許もまた全文のまま本明細書において援用される。
ＩＩ．  本発明に関する情報
約５０，０００のＣＮＳ（中枢神経系）腫瘍の症例が毎年診断されている。これらの内、約３５，０００は転移性腫瘍（例えば、肺癌、乳癌、メラノーマ）であり、約１５，０００は原発性腫瘍（ほとんど星状細胞腫）である。悪性グリオーマ（即ち、脳の癌）の中でも星状細胞腫は１５から３４の間の年齢の患者では癌の死因では第三位である。
【０００４】
ＣＮＳ腫瘍の患者のための処置オプションは非常に限られている。現在、手術が選択される処置である。手術は確定的な診断、腫瘍の大きな塊の除去、および患者生存の延長を提供する。ＣＮＳに効果があることが知られている手術後の補助的処置は放射線照射のみであり、それは生存を延長させることができる。しかしながら、放射線処置は多くの望まれない副作用を持っている。それは患者の正常組織（脳組織を含む）を損傷させる。放射線照射はまた患者に吐き気を起こさせ（悪心）、および／または一時、脱毛を起こす。
【０００５】
他に共通の手術後補助癌処置である化学療法は、ＣＮＳ腫瘍に対しては比較的効果がない。特に、ニトロソウレアによるＣＮＳ腫瘍の化学療法は効かない。多くの他の癌処置剤が研究および試験されたが、一般にそれらは生存の延長にほとんど効果がなかった。これらの限られた処置オプションの点から見て、ＣＮＳ腫瘍の患者の予後は良好ではない。手術を受け、補助的処置を行わない悪性星状細胞腫の患者の平均生存期間は約１４週である。放射線療法は手術後の平均生存期間をを約３６週に延長する。すべての形の処置に対し、現在の２年生存率は１０％未満である。
【０００６】
生存を最大にするためには、ＣＮＳ腫瘍発育の初期段階で処置を始めるのが決定的である。典型的には、腫瘍血管新生（即ち、血管の形成）の程度は患者の生存率に相関している。ＣＮＳ腫瘍はすべてのヒト腫瘍の中で最も血管新生的である。しかしながら腫瘍が小さいとき、それは”無血管性”期であり、その増殖は拡散機構により制限されている（即ち、細胞はその栄養その他を細胞内への拡散により受け取る）。この段階では、腫瘍は生存可能であるが増殖はせず、拡がることは不可能である。しかしながらその後、血管新生が始まり、腫瘍は”血管性”期に変換する。この段階では、増殖機構として血流が拡散に取って代わり、腫瘍増殖は指数関数的である（即ち、腫瘍は栄養その他を供給するための自身の血管を持っている）。新血管の周りの有糸核分裂細胞クラスターおよび転移が血管性期に生じる（即ち、腫瘍は体の他の領域へ拡がることができる）。それ故、腫瘍を早期に処置することにより（血管性期に達する前に）、転移性の拡がりを阻害し並びに原発性腫瘍を制御することが期待できる。
【０００７】
他の型の癌もまた既知の癌処置では克服することは困難である。肺癌は続いての４つの最も頻繁に診断される新生物を合わせたよりも多くのアメリカ人を毎年殺している。１９９４年の見積もりは、１７０，０００人以上の肺癌の新しい症例および約１５０，０００の死亡を示している（Ｂｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．１９９４，４４：７−２６）。原発性肺腫瘍の約８０％は非小細胞腫であり、それは扁平上皮細胞および大細胞癌腫ならびに腺癌を含んでいる。
【０００８】
単一様式治療は、初期および後期段階の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のほとんどの症例で適当であると考えられている。初期段階腫瘍は手術、化学療法または放射線療法により潜在的に治療可能であり、後期段階の患者は通常、化学療法または最良の支えとなるケアを受ける。中間段階または局所的に進展したＮＳＣＬＣ（ＮＳＣＬＣすべての症例の２５％から３０％）はより典型的には多様式で処置される。この段階は腫瘍発育の段階であり、血管新生が非常に重要な因子である。新規血管は腫瘍のさらなる増殖および転移の進展を支えるのに必要とされる。従って、この段階は新規血管の発育を防止するために抗血管新生剤で処置することができる。この療法の効能は、抗血管新生療法を、存在する腫瘍を除去するための細胞毒性化学療法または放射線療法と組み合わせることによりさらに改良できる。
【０００９】
乳癌もまた既知の薬剤を使用して処置することが困難である。米国における乳癌の発生は１９８０年以来約２％／年の比率で上昇しており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙは１９９６年に浸潤性乳癌の１８２，０００の症例が診断されたと見積もっている。乳癌は通常、手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法または種々の方法を組み合わせて処置される。他の固形腫瘍と同様に、乳癌はある種のサイズを超えると、その増殖を支えるために新規血管の発育を必要とし、その発育の段階において、抗血管新生剤で処置することができる。
【００１０】
乳癌における癌化学療法失敗の主たる理由は、細胞毒性薬剤に対する耐性の発現である。異なった作用機構を持つ薬剤を用いる組み合わせ療法は受容された処置法であり、それは処置された腫瘍による耐性発現を防止する。抗血管新生剤は、正常宿主組織には作用するが、腫瘍には作用しないので耐性発現を起こさないはずであり、組み合わせ療法で特に有用である。
【００１１】
前立腺癌は新規治療法が必要とされている別の癌である。アメリカ人男性間で悪性と最もしばしば診断される前立腺癌の罹患率にもかかわらず、前立腺癌発生についてはほとんどわかっていない。ヒト前立腺癌の発生、増殖および内転移に関与する多くの因子、ならびにそれらのお互いの関係および相互作用が治療の困難さを増幅している。
【００１２】
前立腺腫瘍細胞増殖および転移の両方が十分な代謝的支持、ならびに血管接触を必要とし、それ故血管新生に頼っている。前立腺癌細胞外マトリックス（ＥＣＭ）／間質相互作用もまたヒト前立腺癌の増殖および拡大に重要である。ＥＣＭに存在する多数の増殖因子の内、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子、ＦＧＦ−２としても知られている）およびＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）は、両方とも悪性表現型を誘導し、および血管新生過程の促進および維持することに関係があるので抜きでている。最終的に、前立腺癌の患者の転帰は、妨げられない増殖のための腫瘍の能力、局所的浸潤、および遠位転移の確立に大きく依存している。従って、抗血管新生剤はそのような腫瘍の増殖および転移を効果的に阻害するであろう。
【００１３】
前立腺癌の現在の治療はアンドロゲン因子の阻害に焦点を当てている。多くの癌でのような放射線照射が最初の治療法であり、しばしばホルモン療法が続いて行われる。そのようなホルモン療法はアンドロゲン剤を特異的に阻害することを捜し求めている。阻害は手術的去勢またはＬＨＲＨ（黄体化ホルモン放出ホルモン）アゴニストおよび抗アンドロゲン剤（フルタミド、ビクルタミド、ニルタミドおよびルプロリドのような）のような薬剤による化学的去勢と同じ結果を生じる。しかしながら、これらの治療はホルモン治療抵抗性病変が存在するほとんどの患者で失敗している。現在、ホルモン治療抵抗性前立腺癌の男性にはわずかな治療オプションしか存在せず、どれも使いものにならない。この点において、腫瘍増殖は加速され、平均余命が６ヶ月から１年を超えることは稀である。実際、これらの患者の７０％はホルモン抵抗性疾患で最後には死亡するであろう。
【００１４】
そのような患者において（抗ホルモン療法が行われている）、残存する前立腺腫瘍細胞は元気を回復した増殖を行うようである。従って、抗血管新生剤はこの段階で最も効果的であり（特に、新芽形成、若い血管に最も強力である薬剤）、それにより新生血管を防止し、さらなる腫瘍増殖および転移を抑制する。
【００１５】
卵巣癌は婦人科腫瘍型で最も重大なものである。すべての癌関連婦人科死因の５０％以上に卵巣癌が寄与しており、その８０−９０％は上皮細胞由来腫瘍である。１９９７年において、２６，７００の卵巣癌の新症例が存在し、１４，０００人以上が死亡している。卵巣癌に対する明白な遺伝子成分が存在する。新しく開発された検出法は、乳癌、卵巣癌および遺伝子マーカー（ＢＲＣＡ１またはｅｒｂＢ−２またはｃ−Ｍｙｃの異常形のような突然変異癌遺伝子を含む）間の強い相関を示した。臨床的有用性を持つ、卵巣癌の別の良好なマーカーは循環分析物ＣＡ１２５であり、その血清レベルは一般に癌進行の状態を反映する。ＣＡ１２５はしばしば卵巣癌でモニターされるが、それは確認されたマーカーではない。乳癌で観察されたように、卵巣癌の癌危険度にホルモンの影響も存在する。
【００１６】
卵巣癌患者の約３分の１は限局性疾患を示している。初期段階の卵巣癌は手術、放射線照射および化学療法のいくつかの組み合わせで処置可能である；限局性卵巣癌の５年生存率は８０％以上である。しかしながら、転移段階ＩＩＩまたはＩＶ卵巣癌の５年生存率は２０％未満である。これらの進行した患者においては（卵巣腫瘍が卵巣被膜から抜け出して腹膜内表面を浸潤している患者）、化学療法による辺縁のみに有益な最も攻撃的な治療が必要である。卵巣癌の第一の化学療法処置は１０年以上にわたって白金に基づいた投与計画の使用であった。タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ゲンシタビン、より新しいビンカアルカロイド（ビノレブビン）およびトポイソメラーゼ阻害剤（トポテカン、イリノテカン）のようなより新しい薬剤の出現により、進行した卵巣癌患者では組み合わせ化学療法がより広く探求されてきた。タキサンおよび白金剤の組み合わせ（連続的または同時に）は進行した卵巣癌患者における標準的第一次処置である。しかしながら、化学療法および手術（放射線療法とともに、またはなしで）の攻撃的使用にも関わらず、これらの患者の予後は悪く、血管新生阻害剤のようなさらなる非細胞毒性薬剤の追加が有益であろう。
【００１７】
世界中で、肝臓癌による死亡は１年で１０６またはそれ以上の多さであるという推定がある。肝臓細胞癌腫（ＨＣＣ）またはヘパトームは最も普通な肝臓癌腫瘍であり、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染に密接に関連した腫瘍型である。アジアおよびアフリカで観察される高頻度の肝炎ウイルス感染は、これらの地域を肝癌（そのほとんどがＨＣＣである）が最も多い場所にしている。ウイルス感染はＨＣＣの必須な素因と考えられるが、感染単独では肝細胞形質転換および増殖に寄与する因子ではない。比較すると、米国では１９９２年に１３，５００人が肝臓癌で死亡しており、その３分の２はＨＣＣであった。
【００１８】
肝臓癌の予後は一般的に悪いが、局所的に浸潤性であるにすぎない腫瘍および都合よく治療手術的に除去できる位置にある癌はわずかな例外である。局所的に進行している疾患に対しては、インターフェロン治療、ポリプレノン酸（ビタミンＡ誘導体）、５−フルオロウラシルまたは凍結除去で限られた効能しか観察されていない。現在までＨＣＣに対するヒト試験において、意味のある組み合わせ化学療法は証明されていないが、緊急な臨床的要求のため種々の治療法の実験評価が続けられている。最近の報告（ＬＸ  Ｑｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ  Ａｃａｄ  Ｍｅｄ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ２８，１４７−５１（１９９９））は血管新生阻害剤がマウス異種移植片腫瘍モデルにおいてヘパトーマ腫瘍増殖を阻害でき、ＨＣＣ切除後の再発および転移を制御する候補薬であることを示唆している。それ故、治療的手術に適さないＨＣＣ患者の、血管新生阻害剤とα−インターフェロン、５−フルオロウラシルのような細胞傷害性薬剤、またはビタミンＡ誘導体のような活性な第二の療法組み合わせ処置を考えることは合理的な方法である。
【００１９】
小児癌は腫瘍学臨床ではあまり普通ではない腫瘍である。１９９４年では、７７００人の１５歳以下の小児が癌であると報告されている。これは癌全体の約１％ではあるが、この特別な問題および小児の癌治療に関する社会的利益へより多くの腫瘍学者による注意が払われている。罹患した小児で最も多い固形腫瘍は神経芽腫であり、それは神経内分泌起源である。小児の他の固形腫瘍はウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫および網膜芽腫である。神経芽腫は全小児癌の９％であるが、小児癌死因の１５％である。多くの小児腫瘍は遺伝子的基礎を持っている；例えば、多分神経芽腫の２０％は本質的に遺伝によることが推定されている。
【００２０】
神経芽腫は最も普通には腹部に見られ、これらの多くは副腎で観察されている。神経芽腫患者診断の平均年齢は２歳である。神経芽腫の初期段階では手術で治療することができるが、ほとんどの子供は転移疾患を示している。手術後に最小残存疾患を持つ子供でさえも、すべての患者の半分以上に再発が観察されている。臨床試験は手術後の化学療法を用いる（放射線治療あり、または無しでの）有益さを強調している。神経芽腫患者では非補助化学療法もまた通常使用されているが、補助環境で化学療法を使用することがより普通になっている。神経芽腫は処置するのが特に困難であり、白金に基づいた投与計画が第一次または第二次の処置でしばしば使用される。小児癌患者での化学療法計画は高度に攻撃的であり、４−６の細胞傷害性薬剤による強力な治療が含まれる。神経芽腫は高度に血管性であり、迅速に増殖しおよび迅速に転移するので、神経芽腫腫瘍は抗血管新生治療の興味深い機会である。細胞増殖抑制性薬剤は最少の付加的毒性副作用しか示さないことが予想され、およびそれらが配合された細胞傷害性薬剤の効能を減衰させるはずがないので、神経芽腫のための抗血管新生治療は細胞増殖抑制性薬剤を含んでいる新規の攻撃的組み合わせ化学療法を可能にする。
発明の要約  他の通常の癌処置剤と組み合わされたスクアラミンを使用した悪性および癌性腫瘍を処置するための方法を提供するのが本発明の一つの目的である。本発明は任意の応答性腫瘍に応用できるが、本発明の特に好適な態様において、処置される腫瘍はＣＮＳ、肺、乳房、卵巣、肝臓、神経内分泌性および前立腺組織に観察される。
【００２１】
本発明の一つの方法に従うと、腫瘍を処置するためにスクアラミンは通常の癌処置と組み合わせて使用される。そのような通常の癌処置には細胞傷害性薬剤ならびに抗ホルモン剤の使用が含まれている。一つの態様において、有効量の細胞傷害性化学化合物を投与することにより、または第一の処置過程での細胞傷害性化合物および有効量のスクアラミンが投与される第二の処置過程の組み合わせにより腫瘍が処置される。
【００２２】
この方法において、第一の処置過程で使用された細胞傷害性化学化合物は通常の癌処置剤である。好適な薬剤には、ニトロソウレア、シクロフォスファミド、ドクソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、トポテカンおよびイリノテカン、カルムスチン、エストラムスチン、パクリタキセルおよびその誘導体、およびシスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチンおよび関連白金化合物が含まれる。これらの通常の癌処置剤は当業者にはよく知られている。Ｍ．Ｃ．  Ｗｉｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１０章，Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉら編，ＭｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８５）を参照されたい。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙは  全体が本明細書において援用される。一つの特に好適なニトロソウレアはＢＣＮＵであり、それはカルムスチンとしても知られている。別の好適な細胞傷害性薬剤はカルボプラチン、イプロプラチンまたはシスプラチンのような白金化合物であり、シクロフォスファミドもそうである。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙに記載されているような他の通常の細胞傷害性化学化合物も、本発明から離れることなく使用できる。
【００２３】
別の態様において、最初に腫瘍に影響するホルモンを阻害し、次に第二の処置過程において有効量のスクアラミンを投与することにより腫瘍が処置される。一つに態様において、ホルモンは特異的に阻害される。腫瘍が前立腺の場合、ホルモン阻害は睾丸除去術（即ち、一つまたは両方の精巣の除去）による。睾丸除去術は手術によるかまたはＬＨＲＨ（黄体化ホルモン放出ホルモン）アゴニストおよび／または抗アンドロゲン剤（フルタミド、ビクルタミド、ニルタミドおよびルプロリドのような）のような化学薬剤の投与による。
【００２４】
第一の処置工程で投与される細胞傷害性および抗ホルモン化学化合物は本分野で使用される、任意の通常技術により投与してよい（即ち、経口、皮下、リンパ節内、腹腔内、静脈内または筋肉内）。本発明の一つの態様において、細胞傷害性化学化合物（好適にはＢＣＮＵ、シスプラチンまたはシクロフォスファミド）は静脈内に投与される。同様にスクアラミンも前記のような本分野では既知の任意の投与法により投与できる。本発明の一つの態様において、１日１または２回のスクアラミンの皮下注射が行われる。本発明の別の態様において、１日１または２回のスクアラミンの静脈投与が行われる。
【００２５】
細胞傷害性化学物質または抗ホルモン化合物による第一の処置過程は第二の処置過程（スクアラミンを用いる）の前、第二の処置過程の後、または第二の処置過程と同時に行われる。さらに、第一の処置過程は、第二の処置過程が開始される前に完了していてもよい（その逆も）。本発明の一つの態様において、第一の処置過程は細胞傷害性化学物質または抗ホルモン化合物（即ち、ＢＣＮＵ、シスプラチンまたはシクロフォスファミド）の１回の静脈内投与であり、第二の処置過程はスクアラミンの毎日の皮下注射を含んでいる。
【００２６】
加えて、本発明は細胞傷害性化合物または抗ホルモン化合物と一緒のスクアラミンの使用または二つまたはそれ以上のこれらの化合物とスクアラミンの使用も含んでいる。本発明はまた、細胞増殖抑制剤と一緒のスクアラミンの使用、またはこれら二つの処置療法と細胞傷害性化合物の使用も含んでいる。細胞増殖抑制剤とは、腫瘍細胞または腫瘍中の正常間質細胞の増殖を停止させるが、薬学的に活性な濃度では毒性ではない化学化合物である。第一の処置過程で使用される細胞増殖抑制剤の薬学的に活性な濃度は任意の既知細胞増殖調節剤の濃度であろうが、好適にはカルシウムポンプ阻害剤カルボキシアミドトリアゾールである。
【００２７】
本発明に従って腫瘍を処置するための第二の方法では、第一の処置過程は放射線処置であり、一回またはそれ以上の通常の放射線療法であり、当業者には既知の通常の照射処置計画を使用する。腫瘍はこの第一の処置過程で放射線に曝される。スクアラミン処置計画に関して適した放射線処置過程の時期は、有効な腫瘍処置を提供するためのルーチンの実験を通して当業者が決定できる。
【００２８】
放射線およびスクアラミン処置に加え、腫瘍はまた第三の処置過程において一つまたはそれ以上の細胞傷害性化合物または抗ホルモン化合物で処置される。さらに、放射線およびスクアラミン処置に加え、腫瘍はまた第三の処置過程において一つまたはそれ以上の細胞増殖抑制性化学化合物で処置される。第三の治療過程で使用される細胞増殖抑制剤は細胞毒性がない任意の既知細胞増殖調節剤であろうが、好適にはカルシウムポンプ阻害剤カルボキシアミドトリアゾールである。放射線、スクアラミンおよび細胞増殖調節剤で処置された腫瘍は、第四の処置過程において一つまたはそれ以上の細胞傷害性化学化合物でまた処置してもよいことが本発明の例でさらに想像される。
【００２９】
もちろん、本発明はまた放射線または任意の他の処置法に加えた、細胞傷害性化合物および／または抗ホルモン化合物両方の使用にも関している。
発明の詳細な説明
スクアラミンは血管新生阻害活性を持っていることが認識されている、即ち、スクアラミンは血管の形成を阻害する。従って、抗血管新生剤としてのスクアラミンは新血管形成に依存するある種の疾患または軽いまたは慢性の病気の処置に有効であろうと信じられている。例えば、スクアラミンは固形腫瘍癌、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、乾癬または慢性関節リューマチ（すべて別の新規血流を必要とする）のような異なった状態を処置するための使用される。
【００３０】
加えて、スクアラミンはある種のナトリウム／プロトンエックスチェンジャー（本出願において”ＮＨＥ”または”プロトンポンプ”とも称される）を選択的に阻害できる。哺乳動物ではＮＨＥのいくつかの異なったイソ形が存在することが知られている（即ち、ＮＨＥ１、ＮＨＥ２、ＮＨＥ３、ＮＨＥ４およびＮＨＥ５）。スクアラミンはＮＨＥ３を特異的に阻害し、ＮＨＥ１またはＮＨＥ２は阻害しないことが観察されている。従って、スクアラミンは癌、ウイルス疾患および虚血再灌流傷害のような、ＮＨＥ３の機能に頼る状態に依存する増殖または活性化を処置するために使用されるであろう。
【００３１】
スクアラミンおよびＮＨＥに関するさらなる研究は、スクアラミンはＮＨＥ３の非常に特異的な部分、即ち、分子の７６カルボキシル末端アミノ酸に作用することを示した。もしＮＨＥ３分子のこの部分が除去されたら、スクアラミンは実際的に分子の活性に何の影響も及ぼさず、しかしながら分子はナトリウム／プロトンエックスチェンジャーとしてなお活性である。
【００３２】
出願者はスクアラミンのさらなる使用法を発見した。特に、出願者は通常の癌処置剤（細胞傷害性化合物および抗ホルモン化合物）および放射線処置と組み合わせたスクアラミンが腫瘍の大きさおよび増殖を減少させるであろうことを発見した。さらにより意義あることは、出願者は該組み合わせが高度に増殖性のＣＮＳ腫瘍、肺腫瘍、乳腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、神経内分泌性腫瘍および前立腺腫瘍の増殖速度を減少させ、生存利益を与えることができることを発見した。
【００３３】
本発明のこの態様の実施において、細胞傷害性化学化合物および抗ホルモン剤は第一の腫瘍処置過程で使用され、およびスクアラミンは第二の腫瘍処置過程で使用される。第一および第二の処置は任意の時系列でまたは同時にさえ行ってもよい。別の態様において、二つまたはそれ以上の細胞傷害性化合物および／または抗ホルモン剤は同時にまたは第一の処置過程のように連続的に投与される。
【００３４】
第一の処置過程で使用される細胞傷害性化学化合物は通常の薬剤であろうが、以下の薬剤の一つが好適である；ニトロソウレア、シクロフォスファミド、ドクソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、トポテカン、イリノテカン、カルムスチン、エストラムスチン、パクリタキセルおよびその誘導体、およびシスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチンおよび関連白金化合物。これらの物質はＭｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（上記文献）に示されているように、当業者には既知の通常の癌処置薬剤である。一つの特別に好適なニトロソウレアはＢＣＮＵであり、それは”カルムスチン”または”１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア”としても知られている。シクロフォスファミドはまたＮ，Ｎ−ビス−（２−クロロエチル）−Ｎ’−（３−ヒドロキシプロピル）ホスホロジアミジン酸環状エステル一水和物としても知られている。ドクソルビシンはまたアドリアマイシンとしても知られている。
【００３５】
よく知られているトポイソメラーゼ阻害剤には、イリノテカン［７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン］、ＣＰＴ１１としても知られている、およびトポテカン［９−ジメチルアミノメチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン］が含まれる。
【００３６】
パクリタキセルは”タキソール”の商品名で入手可能である。タキソテレまたは他の関連タキサンのようなパクリタキセルの種々の誘導体が本発明に従って使用されるであろう。本発明に従って使用される別の細胞傷害性化学化合物であるシスプラチンはまたシス−ジアミンジクロロ白金としても知られている。シスプラチンのよく知られた類似体はカルボプラチンおよびイプロプラチン（ＣＨＩＰシス−ジクロロ−トランス−ジヒドロキソ−ビス［イソプロピルアミン］白金ＩＶとしても知られている。）である。当業者は本発明の過程で使用できる特異的細胞傷害性薬剤にはなじみが深いであろう。
【００３７】
第一の処置過程で使用される抗ホルモン剤は任意の通常の薬剤であるが、アンドロゲン阻害剤が好適である。好適なアンドロゲン阻害剤はＬＨＲＨ（黄体化ホルモン放出ホルモン）アゴニストおよびフルタミド、ビクルタミド、ニルタミドおよびルプロリドのような抗アンドロゲン剤である。これらの薬剤は前立腺癌の処置に好適であるが、他の抗ホルモン剤は当業者により認識されるように他の腫瘍に使用されるであろう。
【００３８】
加えて、本発明は抗ホルモン剤と一緒の細胞傷害性化合物の使用、または二つまたはそれ以上のこれらの化合物の使用を包含している。
さらに、本発明で使用できる化学療法剤には何の制限も存在しない。本発明の方法においてスクアラミンと使用できる他の通常の化学療法剤には、メトトレキセート、メルファラン、チオテパ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、イフォスファミド、ブレオマイシン、プロカルバジン、クロラムブシル、フルダラビン、マイトマイシンＣ、ビノレルビンおよびゲムシタビンが含まれる。
【００３９】
第一および／または第二の処置は経口、”ｓ．ｑ．”、”ｉ．ｐ．”、”ｉ．ｍ．”、”ｉ．ｌ．”または”ｉ．ｖ．”のような適した技術で投与される。本明細書において、用語”ｓ．ｑ．”、”ｉ．ｐ．”、”ｉ．ｍ．”、”ｉ．ｌ．”および”ｉ．ｖ．”は各々、スクアラミンまたは他の物質の皮下投与、スクアラミンまたは他の物質の腹腔内投与、スクアラミンまたは他の物質の筋肉内投与、スクアラミンまたは他の物質のリンパ節内投与、およびスクアラミンまたは他の物質の静脈内投与を意味している。
【００４０】
一つの態様において、ＢＣＮＵは最初に１回静脈内投与量として患者に送達され、その後、スクアラミンが１日２回ｓ．ｑ．で注射される。別の態様において、シクロフォスファミドが細胞傷害性薬剤である。別の態様において、シスプラチンが細胞傷害性薬剤である。さらに別の態様において、カルボプラチンがパクリタキセルと組み合わせて使用される。必要に応じ、細胞傷害性化学化合物およびスクアラミンは共通の医薬担体により同時に送達される（即ち、スクアラミンおよび細胞傷害性化学化合物の両方を含んでいる１回の注射）。投与技術の他の適した組み合わせを本発明から離れることなく使用してもよい。当業者はルーチンの実験を通し、使用される細胞傷害性化合物、容量その他に依存して、適した処置計画を確認することができるであろう。
【００４１】
本発明に従ったスクアラミン処置過程はまた、第一の処置過程として放射線照射（即ち、コバルトまたはＸ−線処理）とも使用される。本発明のこの態様において、第一の処置過程は放射線処置であり、第二の処置過程はスクアラミン投与である。放射線処置は最適の結果を生むように、スクアラミン処置と組み合わせたスケジュールで進行できる。そのような処置過程のスケジュール決定はルーチン実験を通し、当業者により確認できる。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（上記文献）に記載されているように、任意の放射線処置が本発明から離れることなく使用される。放射線およびスクアラミン処置に加え、腫瘍をまた第三の処置過程において一つまたはそれ以上の細胞傷害性化合物または抗ホルモン化合物で処置してもよい。
【００４２】
本発明は種々の特別の実施例および好適な実施態様の点から以下に説明される。これらの実施例および実施態様は本発明を例示するものと考えなければならず、本発明を制限するものではない。
Ｉ．スクアラミンの生理学的特性
Ａ．  抗血管新生活性
スクアラミンは抗血管新生剤として有用であることが示されている（即ち、スクアラミンは血管新生を阻害する）。血管新生（新規血管が形成される過程）は胚形成、排卵および傷治癒のような多くの基本的、生理学的過程で起こる。血管新生はまた糖尿病性網膜症、炎症および悪性病変（腫瘍発育）のような多くの病理学的過程の進行に必須である。その抗血管新生特性の点から、スクアラミンは上に定義したような血管新生に依存する多くの病気を処置するために使用されるであろう。
【００４３】
血管新生は図２に模式的に示されている多工程過程である。第一に、例えば、血管内皮細胞増殖因子（”ＶＥＧＦ”）または塩基性線維芽細胞増殖因子（”ｂ−ＦＧＦ”）のような増殖因子を結合することにより、内皮細胞は活性化されなければならない。細胞は次に移動し、分裂し、細胞外マトリックスを通して隣接する組織内への道を消化する。細胞は次に一緒になって毛細管を形成し、新しい基底膜上に横たわる。この血管新生過程は図２の上部に示されている。血管新生のこれらの発育段階の各々が重要であり、抗血管新生剤により影響を受ける。
【００４４】
抗血管新生化合物と信じられているある種の化合物（即ち、ミノサイクリン，ＳＵ１０１またはマリミスタットのようなマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤）はこの多工程血管新生過程の後期段階で作用する。これらの化合物は”下流”血管新生阻害剤と称されるであろう。マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の議論についてはＴｅｃｈｅｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２０（１９９５），ｐｐ．９−３９を参照されたい。この論文は全体が本明細書において援用される。これらの既知の抗血管新生化合物とは対照的に、スクアラミンは増殖因子細胞活性化を阻害することにより該過程の非常に初期の段階で作用する、即ち、スクアラミンは”上流”血管新生阻害剤である。図２に示したように（下方へ）、スクアラミンは通常活性であり、および増殖因子により活性化されるナトリウム−プロトンポンプを阻害する。プロトンポンプの阻害は細胞を静止状態に置き、この様式で毛細管形成および血管新生が妨げられる。実際、増殖因子シグナルはスクアラミン存在下では中断される。
Ｂ．  毛細管退縮活性
抗血管新生特性に加え、スクアラミンは新規に形成された毛細管に対する毛細管退縮効果を持っていることが示されている。２−３日齢の若いニワトリ胚の毛細管床に１回量の（１００ｎｇ）スクアラミンが加えられた。５分後、この用量のスクアラミンは毛細管床にはほとんど効果が無いようであった。しかしながら２０分後、毛細管床は消滅しているように思われた（即ち、血管が閉じられているようであった）。４０分後、毛細管退縮が観察された。
【００４５】
毛細管床は６０分後にも観察された。この時点で、いくつかの毛細血管が再び現れ始めているのが認められたが、より大きい血管のみが再び現れ始めているようであった。小さな血管はその時点で再び現れなかった。１回のスクアラミンで処理して４から５日後、スクアラミンの効果はもはや明らかではなかったが、胚中で新しく形成された毛細管は、それらが新しく形成された限り、限られた時間はスクアラミン誘導退縮に対して感受性が残っていた。
【００４６】
この試験から、スクアラミン誘導毛細管退縮は、少なくともある種の毛細管に関して可逆的であることが結論された。また、スクアラミンは大きな血管と比較して、小さな微小血管（即ち、微小血管床）に対してより有効であることも結論された。スクアラミンに曝されたニワトリ微小血管の近接組織学的試験は、血管閉塞は血管内腔の周りにまとわれた細胞中の内皮細胞容量の収縮によるものであったことを明らかにした。スクアラミンによる小さな血管の閉塞または退縮は、腫瘍内への栄養および増殖因子の流入を妨げるスクアラミンの能力へ著しく寄与しており、それにより腫瘍の増殖速度を遅くするまたは阻止することが仮定された。
Ｃ．スクアラミンのＮＨＥ阻害活性
細胞増殖および分裂は、血管および毛細管の成長および形成に必須である。毛細管形成は特異的細胞外マトリックスを必要とする。細胞のＮＨＥ交互輸送機構系は細胞外マトリックスに連結されている。ＮＨＥ交互輸送機構の活性化は細胞増殖を誘導するために必要であり、ＮＨＥ交互輸送機構の妨害はマトリックスシグナルを中断し、細胞増殖を妨害する。内皮細胞増殖が中断された場合、毛細管成長が妨げられる。
【００４７】
細胞のＮＨＥ交互輸送機構は異なった様式で活性化されるであろう。例えば、不溶性フィブロネクチンは細胞形に独立して、インテグリンαｖβｌを集合および固定化することによりＮＨＥ交互輸送機構を活性化する（足場依存性細胞の増殖は可溶性分裂促進剤および不溶性マトリックス分子の両方を必要とする）。加えて、細胞外マトリックスへの刺激の結合またはウイルスを含む細胞結合もＮＨＥ交互輸送機構を活性化する。
【００４８】
活性化された場合、ＮＨＥ交互輸送機構は細胞のｐＨを調節することにより細胞増殖を誘導する。図３に示したように、塩素イオン−重炭酸イオンエックスチェンジャーおよびＮＨＥは細胞における相補的ｐＨ調節機構である。塩素イオン−重炭酸イオンエックスチェンジャーは細胞をよりアルカリ性にし、一方ＮＨＥは細胞中の水素イオン濃度調節に寄与している。ＮＨＥが阻害された場合、細胞は酸性となり（より低いｐＨ）、増殖が停止する。このことは細胞が死ぬことを意味しているのではなく；細胞が静止状態に入ったことのみを意味している（即ち、細胞は分裂しない）。もし細胞が正常ｐＨに戻ったならば、増殖が再開される。ＮＨＥが活性化された場合、細胞はよりアルカリ性となり（より高いｐＨ）、プロトンを排出し、増殖が進行する。種々の調節因子（即ち、血清成分、二次メッセンジャーその他）とＮＨＥ細胞質領域の一部との相互作用は交互輸送機構を活性化するが、一方、別の部分との相互作用は交互輸送機構を阻害する。ＮＨＥのこれらの部分はＴｓｅ，ｅｔ．ａｌ．，”Ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎａ＋／Ｈ＋  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ−Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒ．，Ｖｏｌ４（１９９３），ｐｇ．９６９，ｅｔ，ｓｅｑ．に記載されている。この論文は全体が本明細書において援用される。
【００４９】
ナトリウム−プロトンポンプ（ＮＨＥ）はポンプを活性化する異なった増殖刺激に応答する。図２に関連して指摘したように、プロトンポンプは細胞への増殖因子（例えば、ＶＥＧＦおよびｂ−ＦＧＦ）の結合により活性化される。加えて、図３に示したように、ウイルス結合、種々の分裂促進剤の付加、卵への精子の結合その他のような他の刺激もＮＨＥ活性化および細胞のアルカリ性化を起こすことができる。細胞外マトリックスへのこれらの刺激の結合は細胞のＮＨＥ交互輸送機構を活性化し、細胞増殖を誘導する。
【００５０】
少なくとも５つの異なった哺乳動物のＮＨＥのイソ形が存在し、各々は異なった組織分布を持っている。それにも関わらず、すべて同一の様式で作用する。ＮＨＥ１はすべての組織で観察される交互輸送機構である。ＮＨＥ２およびＮＨＥ３はその組織分布がより制限されている。
【００５１】
ＮＨＥ活性に対するスクアラミンの効果が、ＮＨＥのどのイソ形がスクアラミンにより影響を受けるかを決定するために測定された。ＮＨＥ活性は種々の異なった細胞条件で決定できる。酸付加は交互輸送機構のすべてを活性化し、ＮＨＥの測定を可能にする。ＮＨＥ活性はまた、細胞の増殖因子刺激後にも測定できる。加えて、ＮＨＥ活性は非刺激状態にある細胞の場合も測定でき、なぜなら、交互輸送機構はもし刺激されていなくても、遅いがゼロではない速度で連続的に機能しているからである。これらの細胞状態の各々において、ＮＨＥ活性は通常重炭酸イオンの不在下で測定される。
【００５２】
活性化ＮＨＥ交互輸送機構の古典的阻害剤であり、ＮＨＥへ結合するＮａ＋イオンの直接的競合阻害剤であるアミロリドは、非刺激細胞では交互輸送機構活性を消失させない。図４に示しているように、アミロリドおよびアミロリド類似体はＮＨＥ２またはＮＨＥ３よりもＮＨＥ１に対して特異的に作用する。ＮＨＥ３は特にアミロリドによる阻害に対して比較的抵抗性である。アミロリドと対照的に、ＮＨＥ１活性を非刺激メラノーマ細胞で測定した場合、スクアラミンは交互輸送機構の活性を著しく下方制御することが観察された。
【００５３】
以下はスクアラミンがＮＨＥ３を阻害するが、ＮＨＥ１またはＮＨＥ２を阻害しないことを決定するために使用された試験を説明している。個々のヒトＮＨＥ遺伝子でトランスフェクトしたＮＨＥ欠損線維芽細胞（ＰＳ１２０）にｐＨ感受性色素２’７’−ビス（２−カルボキシエチル）−５，６−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＥ）を加えた。ＮＨＥ活性はこの色素を使用した蛍光光度法により、およびアミロリド感受性同位元素２２Ｎａ＋細胞取り込みにより測定した。ナトリウムを除去しおよびプロトンポンプを不活性化するため、ナトリウム不在下で細胞を塩化アンモニウムに曝すことにより細胞を酸性化した。塩化テトラメチルアンモニウムを含む重炭酸イオンフリー媒質へ細胞を曝すことにより塩化アンモニウムを洗い流した。細胞は結果的に酸性化されているが、ナトリウム不在下ではＮＨＥイオンポンプは活性化されなかった。この試験のため、図５ａおよび５ｂに示したように、各々の場合に細胞に７μｇ／ｍｌのスクアラミンが添加された。次に、種々の濃度でナトリウムが加え戻されて（図５ａおよび５ｂの横座標を見られたし）、交互輸送機構を駆動した（図５ａはヒトＮＨＥ３および図５ｂはヒトＮＨＥ１）。細胞ｐＨ変化速度により証明されるように、交互輸送機構は加えられたナトリウムの量に依存して異なった速度で駆動された。図５ａに示されたように、ヒトＮＨＥ３に対するスクアラミンの影響を測定した場合、スクアラミン処理細胞でのｐＨ変化速度は対照群（スクアラミンなし）のｐＨ変化速度よりも遅かった。このことは、スクアラミンがヒトＮＨＥ３を阻害していることを示している。しかしながら図５ｂにおいて、ヒトＮＨＥ１交互輸送機構を測定した場合、スクアラミン処理試料および対照間に有意なｐＨ変化速度の相違は存在しなかった。これらの試験から、スクアラミンはヒトＮＨＥ３を阻害するが、ヒトＮＨＥ１を阻害しないことが結論された。加えて、同様に試験において、ウサギＮＨＥ１およびＮＨＥ２はスクアラミンにより影響されなかったが、ウサギＮＨＥ３はスクアラミン処置により阻害されたことが観察された。
【００５４】
この試験で使用されたトランスフェクト細胞において、スクアラミンにより誘導されたＮＨＥ３阻害効果が観察されるまでには少なくとも３０分かかった。従って、スクアラミンは、古典的ＮＨＥ阻害剤アミロリドまたはアミロリドの類似体（これらはナトリウムの直接的競合阻害剤であり、それ故、ＮＨＥ阻害剤として迅速に作用する）のようには作用していなかった。さらに、スクアラミンのＮＨＥ阻害効果は、細胞からのラクターゼデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の不在下で起こることが観察された。なぜなら、ＬＤＨ漏出は細胞毒性の非特異的マーカーであり、スクアラミンは一般的な細胞傷害性効果は持っていないことが結論された。
【００５５】
スクアラミンのこのＮＨＥ３阻害効果はＮＨＥ３上の７６Ｃ末端アミノ酸へ位置づけられている。もしウサギＮＨＥ３の７６Ｃ末端アミノ酸が分子から除去されたら、スクアラミンは分子の活性に対して実質的に何の効果も持っていないことが観察されているが、分子はナトリウム／プロトンエックスチェンジャーとして活性を維持している。それ故、ＮＨＥ３の７６Ｃ末端アミノ酸はスクアラミンによる阻害部位である。出願者は作用の特定の理論に縛られるのを望んではいないが、これらのＮＨＥ３の補助的タンパク質に対するスクアラミン効果は、チロシンキナーゼ依存性活性に対する阻害効果に結びついていると信じられている。
【００５６】
上に示したように、スクアラミンはＮＨＥ３を阻害するが、ＮＨＥ１を阻害しないことが結論された。しかしながら、スクアラミンのこの阻害効果は、古典的で既知のＮＨＥ３阻害剤とは異なった様式で働くことが観察された。スクアラミンと対照的に、ＮＨＥ３の他の阻害剤（例えば、アミロリド、アミロリド類似体、ゲネステイン、カルモジュリンおよびプロテインキナーゼＣ）はＮＨＥ１も阻害する。そのような阻害剤は、阻害の動力学的特性をみれば、細胞から分泌できるプロトンの絶対数のみに影響する（即ち、”Ｖｍａｘ”）。一方、スクアラミンはＶｍａｘを阻害するだけでなく、Ｋｍ値の減少により証明されるように細胞をより低いｐＨへ下げることも強いている。図５ａの試験で集められたデータに関連する以下の表１に注目されたい。
【００５７】
【表１】
2002524481.tif 000001
従って、スクアラミンはＮＨＥを非アロステリック動力学で阻害する（即ち、非古典的アロステリック阻害）。追加の試験において、スクアラミン（１時間の前処理において）はウサギＮＨＥ３のＶｍａｘを濃度依存的様式で減少させることが観察された（１、５および７μｇスクアラミン／ｍｌで各々１３％、４７％および５７％）。Ｖｍａｘに対するこの観察されたスクアラミン効果は時間依存性であり、最大効果は暴露１時間で生じた。観察された効果は、培地から細胞を除去後３時間以内であれば完全に可逆的であった。
【００５８】
ＮＨＥ３に対するスクアラミンの効果に関連する試験結果の点から、ＮＨＥ３は非刺激細胞のホメオスタシスの維持に重要であると信じられる。さらに、スクアラミンによる細胞活性化、特に病理学的血管形成間の（腫瘍増殖間のような）新規血管の形成に関与する内皮細胞または前駆細胞の活性化の妨害は、スクアラミンが腫瘍増殖を阻害する機構であると信じられる。
【００５９】
さらに出願者はスクアラミンが内皮細胞の形を変化させることを観察している。このことは細胞容量および形を調節する輸送タンパク質がスクアラミンの標的であろうことを示唆している。
【００６０】
スクアラミンの追加の試験はスクアラミンが刷子縁膜ベシクル（ＢＢＭＶ）ＮＨＥを、組織がスクアラミンで前処理されていた場合にのみ阻害したことを示している（３０分暴露で５１％阻害）。エックスチェンジャー活性測定間の、ＰＳ１２０線維芽細胞へのスクアラミンの直接添加は何の影響も与えなかった。
Ｄ．  スクアラミンの薬物動力学
スクアラミンの薬物動力学研究が体内でのスクアラミンの滞留時間を確認するために実施された。図６ａから６ｃはスクアラミンが皮下（５０ｍｇ／ｋｇ、図６ａ）、腹腔内（用量２４０μｇ；１０ｍｇ／ｋｇ、図６ｂ）および静脈内（１０ｍｇ／ｋｇ、図６ｃ）投与された場合の試験結果を示している。静脈内（図６ｃ）に投与された場合のスクアラミンは受容可能であったが（３５分）、腹腔内（図６ｂ、半減期＝１７２分）および皮下（図６ａ、半減期＝５．６時間）投与の場合は幾分高めであった。
【００６１】
これらのスクアラミン半減期試験に加えて、静脈内投与後のマウス中のスクアラミン分布を確認するために試験を行った。図７はｉ．ｖ．投与２時間後のマウス組織中のスクアラミン分布を示している。いくらかのスクアラミンはほとんどの組織に含まれており、ほとんどのスクアラミンは肝臓および小腸に濃縮されていた。図７に示された試験は良好なスクアラミン分布を示している。しかしながら、注目されるのは脳組織中にはスクアラミンが少ないことである。このことから、スクアラミンは多分血液脳関門を通れないであろうことが結論された。脳腫瘍の処置において、スクアラミンは脳の内皮細胞に作用すると信じられるので、この様式では血液脳関門を通過する必要はない。
【００６２】
以下の実施例は本発明の方法におけるスクアラミンの抗血管新生を試験するために使用されたより詳細な実験を説明している。
ＩＩ．治療的投与および組成物
スクアラミンの投与様式は特定の治療使用に適するように選択されるであろう。投与様式には一般的に経皮、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻孔内、吸入、リンパ節内、病巣内および経口経路が含まれるが、それらに制限されるわけではない。スクアラミン化合物は通常の経路、例えば、注入または大量注射により、または上皮または粘膜皮膚ライニングを通した吸収により（例えば、口内粘膜、直腸および腸粘膜その他）投与され、および他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は局所的でもまたは全身的でもよい。
【００６３】
本発明はまた活性成分としてスクアラミンを含んでいる医薬組成物も提供する。そのような組成物は治療的に有効量のスクアラミンおよび医薬として受容可能な担体または賦形剤を含んでいる。そのような担体の例としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、イントラリピッドのような水中油微小乳剤、グリセロールおよびエタノールまたはそれらの組み合わせなどが含まれるが、それらに制限されるわけではない。医薬組成物の処方は投与様式に適するように選択されなければならない。
【００６４】
必要に応じ、医薬組成物は有効量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤を含んでいてもよい。医薬組成物は液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル剤、カプセル、徐放性処方または散剤のような任意の形であろう。組成物はまた、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担体を含む座剤として処方されてもよい。経口処方は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムその他のような標準担体を含んでいるであろう。
【００６５】
種々の送達系が知られており、本発明の治療化合物を投与するために使用されるであろう、例えば、リポソーム中へのカプセル化、微粒子、腸溶性被覆系、微小カプセルなど。
【００６６】
一つの態様において、医薬組成物はルーチン的方法に従って処方され、ヒトへの静脈内投与に適した組成物が提供される。典型的には、静脈内投与のための組成物は５％デキストロースおよび滅菌水またはインターリピッドの溶液である。必要な場合、医薬組成物は可溶化剤および注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬も含んでいてもよい。一般に、医薬組成物の成分は、活性薬剤の量を示しているアンプルまたはサシェットのような密封容器中、例えば、凍結乾燥粉末または水を含んでいない溶液として別々にまたは一緒に混合されて単一剤形として供給される。医薬組成物が注入により投与されるべき場合、滅菌医薬用水、デキストロース、塩または他の医薬として受容可能な担体を含んでいる注入瓶に調合されるであろう。医薬組成物が注射により投与される場合、成分が投与に先立って混合されるように、注射のための滅菌水または塩溶液のアンプルが提供されるであろう。
【００６７】
特定の障害または状態の処置に有効であろう治療的化合物（即ち、活性成分）の量は、障害または状態の性質に依存するであろうし、当業者には既知の標準臨床技術により決定できる。処方で用いられるべき正確な用量もまた、投与経路および障害または状態の重度に依存するであろうから、実施者および患者の環境の判断に従って決定されるべきである。有効治療量はインビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量−応答曲線の外挿から推定されるであろう。
【００６８】
静脈内投与に適した用量は一般的に、体重キログラム当たり約１マイクログラムから４０ミリグラムの活性化合物である。鼻孔内投与に適した用量は一般的に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重である。経口投与に適した用量は一般的に、体重キログラム当たり約５００マイクログラムから８００ミリグラムであり、好適には約１−２００ｍｇ／ｋｇ体重である。坐剤は一般的に、活性成分として０．５から１０重量％のスクアラミンを含んでいる。経口処方は好適には１０％から９５％の活性成分を含んでいる。
【００６９】
抗血管新生または細胞傷害性薬剤としてまたは癌治療におけるスクアラミンの使用に対しては、例示的用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。好適な用量は０．１から４０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００７０】
本発明はまた、本発明の医薬組成物で満たされた一つまたはそれ以上の容器を含んでいる医薬パックまたはキットも含んでいる。そのような容器に付随するものは製造を取り締まっている政府機関により規定された形の注意書き、医薬または生物学的生産物の使用または販売（その注意書きは製造元の代理店による認証を反映する）、ヒト投与のための使用または販売であろう。
【００７１】
本発明に従って使用される通常の細胞傷害性化学品および抗ホルモン化合物は、当業者には既知である任意の適した形で存在する。これらの化学化合物もまた、当業者には既知である任意の適した手段で投与されるであろう（経口、皮下、静脈内、腹腔内、リンパ節内および筋肉内）。
【００７２】
本発明の説明において、出願者は本発明が働く様式においてどのようにおよびなぜ本発明が働いているのかの説明においてある種の理論を述べてきた。これらの理論は情報を伝える目的でのみ示されたものである。出願者は特定の化学的または物理的機構または効能の理論に縛られてはいない。
【００７３】
本発明は種々の特定の好適な態様および特定の実施例に関して説明されてきたが、当業者は付随する請求の範囲に定義されているような本発明の精神および範囲から離れることなく種々の変更および変形が可能であることを認識するであろう。本明細書を通して参照されたすべての特許、出版物および参考文献は、全文のまま本明細書において援用される。
実施例１ウサギ角膜マイクロポケットアッセイ化合物が抗血管形成性であるか否かを調べる場合、ウサギ角膜マイクロポケットアッセイは容認された標準試験である。この試験では、切開はウサギの１眼に行い、刺激物は切開部位に置く。該刺激物は、普段は無血管の角膜部分での血管形成誘導に使用する。例として、重合体マトリックス中の充実性腫瘍を刺激物として角膜内に置くことができる。なぜなら、該腫瘍は新規毛細血管形成を刺激する多数の血管形成促進因子を放出するであろうからである。腫瘍‐由来血管形成促進因子は眼の角膜縁において内皮細胞を刺激し、刺激物に向かって血管形成を開始する。第二の重合体ペレット（例えば、エチレン／酢酸ビニル共重合体）は角膜縁と刺激物との間に置く。この重合体ペレットは空（陰性対照試験ペレット）であるか、または抗血管形成性について試験する化合物を含んでいる。該重合体ペレットは、試験物質を調節放出させるために使用する。ウサギ角膜における無血管角膜バックグラウンドのため、結果を視覚的に定性的に評価できる。さらに、血管数を計数でき、そしてそれらの長さなどを測定できるため、結果のより定量的な評価を提供できる。
【００７４】
ＶＸ２ウサギ癌腫を血管形成刺激物として作用するように、普段は無血管部位の２６のウサギ眼に移植した。スクアラミンを調節放出性エチレン／酢酸ビニル共重合体（重量で、２０％スクアラミンおよび８０％重合体）に取り込ませた。負荷した重合体ペレットを１３の角膜に置き、スクアラミンの持続性局所放出剤とした。重合体ブランクを対照として残りの１３眼に提供した。このように、それぞれのウサギの１眼をスクアラミン試験眼として用い、同じウサギの他の眼を対照眼として使用した。それらの眼は腫瘍移植後３週間、細隙灯立体顕微鏡を使用して毎週検査し、血管形成指数（“ＡＩ”）を計算した（この計算は図８と関連して、以下に詳細に記載されるであろう）。スクアラミン負荷した重合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理期間中、活性スクアラミンを放出することが認められた。試験後、角膜を組織学的に検査した。
この試験を使用して、スクアラミンが腫瘍誘発毛細血管形成の強力な阻害剤であることが認められた。対照角膜と比較して、スクアラミン処理した角膜で認められた血管数はより少なく、これらの血管は一般に対照角膜の血管と比較して短かった。
次に角膜のいくつかを切り分け、腫瘍細胞自体へのスクアラミンの作用を観察した。非処理対照角膜には、腫瘍内および腫瘍に隣接して多くの血管が見られた。スクアラミン処理した角膜中の腫瘍は依然として生存可能であった（すなわち、腫瘍は死んでいなかった）が、腫瘍と関連した血管系は本質的に見られなかった。従って、スクアラミン‐処理腫瘍では対応する対照腫瘍切片と比べ、血管分布の著しい減少が見られた。これらの発見はスクアラミンが血管に対し作用し、腫瘍自体に作用しないことを示唆した。
【００７５】
図８はウサギ角膜マイクロポケットアッセイの結果をグラフに示す。定量的評価を提供するために、それぞれの眼の血管形成指数（“ＡＩ”）を決定した。血管形成指数を決定するために、初めに１眼の血管密度（“Ｄｖｅｓｓｅｌ”）を以下のように０〜３等級に評価した：
【００７６】
【表２】
2002524481.tif 000002
次にそれぞれの角膜の血管長（“Ｌｖｅｓｓｅｌ”）を測定した。血管長は、角膜縁から最も成長した血管の遠位縁まで測定した最長血管の長さである。次いで、これらの測定値から以下の方程式：ＡＩ＝ＤｖｅｓｓｅｌｘＬｖｅｓｓｅｌに従って血管形成指数を決定した。
図８にウサギ角膜マイクロポケットアッセイにおけるそれぞれの角膜群（スクアラミン処理および非処理）の平均血管形成指数を示す。図に示すように、スクアラミンは新規血管成長を強く阻害した。スクアラミン処理眼は、非処理眼に比べ著しく低いＡＩ値を示した（１４日目で３７％低下（ｐ＝０．０５，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ランクサムテスト（ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ）および２１日目で４３％低下（ｐ＜０．０１））。このデータはスクアラミンが長期間にわたり、新規血管あるいは毛細血管形成を阻害することを説明する。より具体的には、スクアラミンは３週間後でさえ強い抗血管形成活性を示す。
実施例２
スクアラミンは炎症を起こさない
ウサギ角膜マイクロポケットアッセイ試験において、もしウサギ角膜が炎症を起こすと、この炎症は角膜の新規血管形成を誘導することができる。かかる炎症は試験結果をゆがめるであろう。従って、スクアラミンが角膜における炎症反応に、本質的におよびそれ自体関与するか否かを調べるために試験を行った。いくつかの非‐生物吸収性エチレン／酢酸ビニル共重合体ペレットを異なる濃度のスクアラミン、すなわち、重量で２％、１０％、および２０％のスクアラミンで負荷した。次に、これらのペレットを血管形成刺激物を含んでいないウサギ角膜に置いた。スクアラミンはこれらの濃度のいずれにおいても炎症を誘導しなかった。従って、スクアラミンは角膜に炎症を起こすことにより新規血管形成を誘導しない。
実施例３
脳腫瘍処置におけるスクアラミンの使用
ウサギ角膜マイクロポケットアッセイ試験の結果は、スクアラミンが血管新生を阻害する強力な抗血管形成薬であってもよいことを出願者に示唆した。脳における充実性腫瘍の急激な成長は血管新生に依存することを認識して、出願者は動物モデルにおける脳の充実性腫瘍の成長に対するスクアラミンの活性を評価した。
【００７７】
充実性脳腫瘍の中で、悪性グリオームは癌性腫瘍の最も一般的な形態である。これらの腫瘍は１５歳から３４歳までの青少年における３番目の主要な死因である。普段は静止性の脳および／またはＣＮＳ内皮細胞を増殖性および浸潤性の強い状態に誘導する能力により、悪性グリオームの性状を決定する。該グリオームは、血管形成誘導因子（“ＶＥＧＦ”）およびパラクリン的にＣＮＳ内皮細胞の誘導受容体を刺激する他の誘導因子を発現する（すなわち、ＶＥＧＦは腫瘍細胞から生じ、内皮細胞を刺激する）。続いてＣＮＳ内皮細胞は血管形成性浸潤を開始し、グリオームに栄養物を提供する。出願者は、グリオームに対するスクアラミンの抗血管形成活性を（１）内皮細胞のＶＥＧＦ‐媒介刺激を選択的に阻害する能力および（２）実験的マウスグリオームに対する作用により、試験した。
【００７８】
初めに、スクアラミンが内皮細胞に特異的に作用することを確かめるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。図２に関連して記載したように、内皮細胞が血管形成の初期段階に関与することから、出願者はかかる細胞を使用した。具体的に言うと、腫瘍血管形成は連続し、重複した一連の段階である。初めに、内皮細胞は活性化され、増殖する。次に、蛋白分解酵素が生成され、該細胞が遊走する。続いて新規基底膜が生成される。このようにして、新規血管が生成され腫瘍サイズが増大する。
【００７９】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析には、以下の細胞系：（ａ）ウシ網膜内皮細胞；（ｂ）９ＬおよびＣ６ラットグリオーム細胞；（ｃ）ヒトＨ８０グリオーム細胞；および（ｄ）  ＶＸ２ウサギ癌腫細胞（先に記載したウサギ角膜マイクロポケットアッセイ試験で移植した腫瘍と同じ型である）を使用した。この解析で使用した内皮マイトジェンは２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦであった。
【００８０】
該細胞は最適増殖培地を含む組織培養平板に一晩付着させた。付着後、該細胞を溶媒のみ、または濃度を変えた（０，１０，２０，３０，６０，および９０μｇスクアラミン／ｍｌ）スクアラミンに暴露した。細胞増殖は、３日間毎日コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を使用して計数した。１ウェルにつき合計１０，０００細胞を平板培養し、それぞれの実験濃度の四重試験を行った。その後、結果を平均した。ウシ網膜内皮細胞は増殖させ、スクアラミン処置前にヒト組み換え型ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌを添加して細胞増殖を測定すること以外は、他の細胞系と同様の方法で処置した。
【００８１】
３０μｇ／ｍｌまでのスクアラミンに２４および４８時間暴露後のすべての腫瘍細胞系および、ＶＥＧＦで処置しない内皮細胞による細胞増殖は統計的に変化が見られなかった。しかしＶＥＧＦ‐刺激内皮細胞の増殖は、上記と同じ時間のスクアラミン暴露により濃度依存的に有意に低下した。内皮細胞増殖阻害百分率（％Ｉ）は以下の方程式：（対照サンプルの細胞数―実験サンプルの細胞数）ｘ１００＝％Ｉ（対照サンプルの細胞数）
により決定した。
以下の表はＶＥＧＦ‐刺激内皮細胞系の４８時間における結果を示す。
【００８２】
【表３】
2002524481.tif 000003
付加的なデータは図９で説明する。この図は、３０μｇ／ｍｌスクアラミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用後、１，２，および３日目の対照群増殖の百分率としての各種細胞系の増殖を示す。図９に示すように、増殖はＶＥＧＦ‐刺激内皮細胞で特に低下するが、他の細胞系（Ｈ８０，Ｃ６，およびＶＸ２）の増殖は著しい影響を受けなかった。
【００８３】
この情報に基づき、出願者はスクアラミンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで劇的および特異的に内皮細胞のＶＥＧＦ‐刺激増殖を阻害すると結論した。従って、スクアラミンは腫瘍誘発血管形成の強力な阻害剤であり、そしてこの作用はＶＥＧＦに誘導される内皮細胞増殖の特異的阻害により促進されると思われる。従って、腫瘍特異的抗血管形成療法のための、腫瘍誘導血管新生の減少または縮小にスクアラミンは十分適していると考えられる。
【００８４】
内皮細胞のＶＥＧＦ‐刺激増殖の阻害に加え、スクアラミンはまた、ｂ‐ＦＧＦ、ＰＤＧＦｂｂ、細胞分散因子（ＨＧＦまたは肝細胞増殖因子）、ならし腫瘍培地、およびヒト脳嚢胞液により誘導されたヒト脳毛細血管内皮細胞の増殖刺激を妨害することが認められてきた。従って、腫瘍は種々の異なる増殖因子を産出し、スクアラミンはそれらのいくつかに阻害作用を持っている。
これらの試験結果から、出願者は脳腫瘍の動物モデルにおいてスクアラミンを試験した。脳に局在する腫瘍に対するスクアラミンの作用を試験するために、ラットグリオームが維持されているラット側腹から生存グリオーム小切片（１ｍｍ３）を採り、２群のラットの脳に移植した。従って、このモデルにおいて、ラット脳に置かれた時腫瘍は生存している。移植３日後、およびいくつかの血管系の発生後に、１群のラットにスクアラミン２０ｍｇ／ｋｇ／日（ｉ．ｐ．）を開始した。対照動物群（図１０の“ベヒクル対照”）にはキャリアベヒクルのみ（無スクアラミン）を与え、他の動物群はスクアラミンで処置した（図１０の“スクアラミン”）。図に示すように、スクアラミン処理動物は平均生存時間が３８％増加した（ｘ＝２４．９日対ｘ＝１８．０日）。図１０は、この動物モデルでスクアラミン処置ラットは一般に生存時間が増加することをさらに説明する。
【００８５】
スクアラミン毒性試験は別の動物モデルにおいて行った。慣用の細胞毒性化合物はかなり毒性である。例えば、慣用の化学療法剤である、ＢＣＮＵは累積的毒性効果を持つ。この理由から、該化合物は患者に１回だけ適用する。ＢＣＮＵの使用に関しては、先にＣａｌａｂｒｅｓｉ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ３０４ページおよび３０５ページに記載されている。スクアラミンの毒性を試験するために、１群のラットにスクアラミン２０ｍｇ／ｋｇ／日（ｉ．ｐ．）を毎日、３０日以上投与し、投与後２００日まで飼育した。この研究に使用した動物は健康であり続けた。この結果は、スクアラミンがほとんどまたは全く毒性がないことを示唆する。
実施例４
スクアラミンと慣用の癌療法との使用
先に記載したように、スクアラミンは増殖因子との相互作用後の内皮細胞活性化を阻害することによる、血管形成過程の上流阻害剤である。血管形成阻害作用を持つため、スクアラミンは増殖に血管新生を必要とする充実性腫瘍の処置に効果的であることが示されてきた。出願者は、スクアラミン（上流血管形成阻害剤）処置とアルキル化剤を使用した慣用の癌療法とを組み合わせることにより腫瘍を処置した場合に有益な結果が得られるか否かを検討した。
ａ．スクアラミン９Ｌグリオーム側腹試験
４群のラット（全体で２０匹のＦｉｓｈｅｒ３４４ラット、２００ｇ）に９Ｌ神経膠肉腫（９Ｌグリオーム）１ｍｍ３の移植片を０日目に皮下適用した。該腫瘍は、十分なスクアラミンの脳レベルによる合併症を避けるためにラット側腹に移植した。
ランダム化および処置は以下のスキームに従って５日目に開始した：
【００８６】
【表４】
2002524481.tif 000004
１本明細書で使用する“Ｂ．Ｉ．Ｄ．”なる用語は成分を１日２回適用する（それぞれの日の異なる２回の時間に１０ｍｇ／ｋｇを投与する）ことを表す。
【００８７】
腫瘍移植後２５または２６日目に、腫瘍サイズを直接測定した。腫瘍サイズ（すなわち、容積“Ｖ”）は測定した腫瘍の長さ（“Ｌ”）、幅（“Ｗ”）、および高さ（“Ｈ”）から決定する容積計算に基づいて推測した（Ｖｔｕｍｏｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ＝０．５ｘＬｘＷｘＨ）。表５はその結果をまとめたものである。表５に示した腫瘍容積は、実験終了まで生存した動物の各処置群の平均腫瘍容積を表す。
【００８８】
【表５】
2002524481.tif 000005
表５はスクアラミンとニトロソウレアＢＣＮＵの組み合わせ（４群）により腫瘍を処置したときに得られた都合のよい結果を説明する。この群ではスクアラミンおよびＢＣＮＵで共に処置したとき、平均腫瘍サイズの９９．８％縮小が観察された。表５はさらにスクアラミン単独（３群）が腫瘍の処置に効果的であることを示す。腫瘍サイズは対照群に比べ、３群では８１．７％縮小した。
【００８９】
出願者は、慣用の細胞毒性化合物と組み合わせてスクアラミンを使用すると脳腫瘍の広がりを遅らせるまたは停止させることができると結論する。腫瘍自体は縮小または壊死する。スクアラミンと細胞毒性化合物との組み合わせ処置は生存を延ばすであろうと期待される。従って、この処置は潜在的に脳腫瘍の処置に有効であろう。
ｂ．乳房腫瘍処置におけるスクアラミンの使用
ヒトＭＸ‐１乳癌細胞系は以前、単独または組み合わせて使用するシクロホスファミドおよび他の細胞毒性化学療法剤のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の証拠を提供するために使用してきた（Ｔ．Ｋｕｂｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｎｎ  ７４，４３７‐４４４（１９８３）；Ｅ．Ｋｏｂａｙａｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４，２４０４‐２４１０（１９９４）；Ｍ．‐Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（Ｎｏ．，  Ｓｕｐｐｌ．１３），３‐１６（１９９５））。これらの参考文献はそれぞれ本明細書中に参照としてそのまま援用する。シクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く補助的療法としてスクアラミンを検討した。シクロホスファミドは腫瘍移植後１４日目の腫瘍が６５〜１２５μｌになった時に注射した。シクロホスファミドはすべての動物に部分退行を起こし、ごく一部の動物に完全な退行を起こした。次に、動物を３つの処置群にランダム化した（それぞれｎ＝２７）：１週間に５回、ベヒクル（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）のみ投与；Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ中のスクアラミン１０ｍｇ／ｋｇ／日投与；およびＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ中のスクアラミン２０ｍｇ／ｋｇ／日投与。実験中どの時点でも腫瘍が２グラムを越えた動物は安楽死させた。実験は、長期治療を経験したマウスのみがなお生存するということを確実にするために９０日間継続した。高用量のスクアラミン投与は、動物の体重低下および潜在毒性の懸念から中断したため、これらの動物は実験の終わりの８週間はスクアラミン投与を受けなかった。低用量のスクアラミン処置は、調べたすべての時点で乳房腫瘍の進行速度を著しく（Ｐ＜０．０１）阻害した（図１１）。高用量のスクアラミン処置は、開始後３０日でのみ、乳房腫瘍進行を著しく（Ｐ＜０．０５）遅延させた（すなわち、スクアラミンをなお投与している時のみ）が、高用量スクアラミンはまたシクロホスファミドのみを投与した対照に比べ、これらの動物の長期治療速度を２倍にした（図１１）。シクロホスファミドおよび高用量のスクアラミンを投与した長期治療動物の病歴の検討から、スクアラミンの相加作用はスクアラミン処置開始後２週間以内に明らかになることが判明した。
ｃ．肺腫瘍処置におけるスクアラミンの使用
成長速度が異なるいくつかのヒト肺癌系を使用して肺癌のヌードマウス異種移植片モデルでの研究を行ってきた。集めたデータは、スクアラミンがシスプラチンとの組み合わせにより相乗活性を持つことを示す（例えば、図１２）。実験肺癌モデルデザインは、５ｘ１０６腫瘍細胞の皮下注射とそれに続く３または４日目の化学療法剤の単回注射からなる。いくつかのマウス群に、ベヒクルとして２０％Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄを含むスクアラミンの毎日の腹腔内注入をその翌日から開始し、７〜１４日後に実験が終了するまで継続した。スクアラミンのみを投与するいくつかのマウス群に、化学療法剤との組み合わせ群のアミノステロール処置として、同じ日にアミノステロール投与を開始した。その後、実験終了時に腫瘍容積を測定し、比較した。攻撃的に増殖するＨ４６０ヒト肺腺癌系およびよりゆっくり増殖するＣａｌｕ‐６ヒト肺腺癌系に対し、単独療法剤としてスクアラミン投与を４または５日後に開始すると、スクアラミンは腫瘍増殖にわずかな作用しか見られないが、１日目に投与開始すれば増殖阻害に関与できることが明らかになった。しかし、シスプラチンと組み合わせて、４または５日目に最大耐容量またはそれに近い用量のスクアラミン投与を開始すると、スクアラミンはＨ４６０およびＣａｌｕ‐６系の両方に用量依存的様式でシスプラチン単独よりまさる、著しく、再現可能な腫瘍増殖阻害作用を示した。
ｄ．転移性肺癌におけるスクアラミンの使用
マウスＬｅｗｉｓ肺腺癌を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス後脚の皮下に移植し、１週間増殖させた。いくつかのマウス群を非処置、またはスクアラミン（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．）、シクロホスファミド（７，９および１１日目に１２５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、シスプラチン（７日目に１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）スクアラミンおよびシクロホスファミドの組み合わせ、またはスクアラミンおよびシスプラチンの組み合わせのいずれかで処置した。２０日目に、動物を屠殺し、各群における肺転移の平均数を測定した。すべての処置は転移の数を減少させた；しかし、最も効果的な処置はスクアラミンと細胞毒性化合物のいずれかの組み合わせであった（図１３）。
実施例５
ヒト前立腺細胞増殖に対するスクアラミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究
ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究に先立って、出願者はヒト前立腺癌細胞に対するスクアラミンの治療効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
【００９０】
スクアラミンの抗増殖作用は、組織培養したＬＮＣａＰ／Ｃ４‐２ヒト前立腺癌進行モデルに対するクリスタルバイオレット染色および［３Ｈ］−チミジン取り込みの両方により評価した。出願者の研究室により開発された、この直系（ｌｉｎｅａｇｅ）由来細胞系はヒト腫瘍性前立腺‐疾患の進行をアンドロジェン依存性で、ほとんど転移性でない状態（ＬＮＣａＰ細胞）から、アンドロジェン非依存性（去勢宿主において増殖可能であると定義される）で非常に攻撃的な状態（Ｃ４‐２亜系）に発生反復する。ＬＮＣａＰ／Ｃ４‐２進行モデルは、前立腺癌治療薬の効力スクリーニングのための有効なモデルであることが以前示されている。
【００９１】
スクアラミンそれ自体は親ＬＮＣａＰまたは直系由来Ｃ４‐２細胞のいずれかの増殖にわずかな作用しか示さなかった。しかし、図１４に示すように外因性ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｉｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡにより提供された）の添加により、ＬＮＣａＰ（図１４ａ）および、Ｃ４‐２増殖（図１４ｂ）の大部分は阻害された。見た目には、結果は増殖が抑制されたというよりむしろ、細胞破壊の結果に思えた。その後の研究（データは示していない）は、この作用が時間、および用量依存的であることを示唆し、ＶＥＧＦ量およびＶＥＧＦへの暴露増加に伴って増強された結果が得られた。さらにこの相乗作用は、初めのＶＥＧＦへの暴露と続くスクアラミンへの暴露に基づいているらしく、逆では作用はみられなかった（データは示していない）。
実施例６
ヒト前立腺癌−マウス異種移植モデルでの前立腺腫瘍増殖および散在に対するスクアラミンの治療効果に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの研究
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭと混合したＬＮＣａＰ細胞を無胸腺マウス５２匹の皮下に移植した。測定可能な腫瘍を発生し、血清前立腺特異的抗原（“ＰＳＡ”）（例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されている標準キットを使用して測定した）量が十分上昇したマウスに精巣摘出を行った。去勢に続き、これらの動物を以下に概説する４群（１〜４）：と去勢してもスクアラミンで処置しない別の対照マウスコホートに分けた。
【００９２】
動物の大部分では、去勢時にＰＳＡレベルはゼロに低下した。３週までには、それらはリバウンドを始め、動物が死ぬか、または屠殺されるまで定常的に上昇を続けた。これら同じマウスにおいて、ＰＳＡリバウンドに対応して腫瘍サイズが増加し始める前、去勢時のサイズはプラトーになる傾向があった。この上記対照コホートの２匹の血清ＰＳＡカーブおよび腫瘍容積測定値をそれぞれ図１５ａおよびｂで説明する。
【００９３】
去勢後、ＰＳＡ低下に付随して１０匹のマウスにスクアラミン処置を開始した（１群）。これらのうち、３匹は精巣摘出後ＰＳＡ底（ｎａｄｉｒ）を一度も経験せず、１匹は病因不明の早期死亡に至った。６匹は、しかし、６〜１０週間の範囲でスクアラミン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）を処置した。これらの動物は去勢時、または精巣摘出後のＰＳＡ低下中にスクアラミン処置を開始した。これらの動物はすべて１ｎｇ／ｍＬ以下の精巣摘出後のＰＳＡ底を経験し、スクアラミン療法中、このごく少量のレベルを維持した。腫瘍塊は、対照動物の反応とは反対に、縮小し、やがては消失する傾向にあった。１群の代表的な２匹の血清ＰＳＡレベルおよび腫瘍容積測定値を、それぞれ図１６ａおよびｂで説明する。ＰＳＡリバウンドの出現後にスクアラミン処置した動物の反応（２〜４群）は対照の、スクアラミン非処理コホートと同様（図１５）であるため、グラフには示さない。
実施例７
ホルモン除去と組み合わせたスクアラミン活性
ヒトアンドロジェン依存的ＬＮＣａＰ細胞（両側腹に２ｘ１０６細胞／側腹）を等しい容積のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭと共に４０匹の無胸腺マウスの皮下に移植した。これらの動物は、血清ヒトＰＳＡレベルが１００ｎｇ／ｍＬを超え、腫瘍容積測定値が１０００ｍｍ３を超えるまで周期的繁殖をさせた（移植後およそ６週間）。その後、すべての動物を外科的に去勢し、１群が８〜１０匹の５つの処置群にランダム化した。１群の動物はそれ以上処置をせず（対照）、２群には直ちにスクアラミン２０ｍｇ／ｋｇ／日（１週間に５日処理し、２日休止）の毎日の腹腔内注射を開始した。３群には、血清ヒトＰＳＡレベルが４‐１０ｎｇ／ｍＬに達したときに、スクアラミン（２０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミン、１週間に５日処理し、２日休止）処置を開始した。４群のマウスには血清ヒトＰＳＡ値が２０‐４０ｎｇ／ｍＬに達したときに、スクアラミン（２０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミン、１週間に５日処理し、２日休止）処置を開始し、５群は血清ヒトＰＳＡレベルが１００ｎｇ／ｍＬに達したときに、スクアラミン処置を開始した。
【００９４】
ヒト腫瘍異種移植片は、去勢後、腫瘍が再び増殖を開始する前２〜４週間、腫瘍増殖を低下または停止させることにより、去勢に反応することが明らかになった。同様に、血清ヒトＰＳＡレベルは去勢後２週間で底をもつ非検出レベルに低下したが、３週目までには血清ヒトＰＳＡレベルはすべての対照動物で上昇し始めた。ＰＳＡリバウンドの出現後にスクアラミン処置した動物では、それらの反応は対照のスクアラミン非処理コホートと同様の反応であった。去勢後にヒトＰＳＡ低下と付随してスクアラミン処置した動物では、１０匹のうち、６匹の動物を６〜１０週間処置した。これらの群の中で３匹は精巣摘出後ＰＳＡ底を全く経験せず、１匹の動物は病因不明の早期死亡に至った。この群の残り６匹の動物は１ｎｇ／ｍＬ以下の精巣摘出後のＰＳＡ底を経験し、スクアラミン処置中このごく微量レベルを維持した。腫瘍塊は時間とともに縮小し、６匹の動物すべてにおいて、やがては消失した。
【００９５】
これら組織中のインテグリン分布を調べるために腫瘍塊（またはスクアラミン処置が成功した動物の場合には、腫瘍移植部位）の組織学的検討を行った。注目に値する一知見は、成功したスクアラミン処置がインテグリンαｖβ３の発現低下および、α６β４発現の増加の所見と一致するというものであった。インテグリンαｖβ３は、腫瘍の血管形成増大および腫瘍の増殖ならびに転移の強い傾向と関連していた（例えば、Ｂ．Ｐ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，１２２７‐１２３０（１９９９）を参照されたい）。従って、スクアラミンが首尾よくＬＮＣａＰ腫瘍増殖を変化させる機序の一部は、腫瘍攻撃性と関連した細胞インテグリン発現を妨害することである。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験もＬＮＣａＰ細胞系で行い、［３Ｈ］‐チミジン取り込みにより細胞増殖を測定した。ＬＮＣａＰ細胞は以前記載した（Ｊ．Ｔ．Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３，２８５２‐２８５７（１９９３）を参照されたい）ように維持した。細胞は２０ｎｇ／ｍｌ血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、２０μｇ／ｍＬスクアラミンまたはＶＥＧＦとスクアラミンとの組み合わせに暴露した。ＶＥＧＦまたはスクアラミン単独では血清を含む培地での細胞増殖にほとんど作用がないが、ＶＥＧＦとスクアラミンの組み合わせでは２４時間暴露後に［３Ｈ］‐チミジン取り込みは９８％以上低下した（表６）。結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬＮＣａＰ腫瘍のスクアラミン処置有効性の基になる機序は、腫瘍細胞成長の直接阻害およびまたは腫瘍細胞死の誘導に関与する。
【００９７】
【表６】
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実施例８
カルボプラチンと組み合わせたスクアラミン活性
２つのヒト肺腫瘍系、Ｈ４６０（速やかに増殖する大細胞癌細胞系、ＡＴＣＣＨＴＢ‐１７７）およびＣａｌｕ‐６（未分化癌、ＡＴＣＣＨＴＢ‐５６）由来の約５ｘ１０６細胞をヌードＢＡＬＢｃマウスの右前脚の皮下に接種した。腫瘍が平均容積約５０〜８０ｍｍ３で肉眼視できる（３〜５日）ようになったとき、６０ｍｇ／ｋｇカルボプラチン（単回用量）もしくは２０ｍｇ／ｋｇスクアラミン（１日１回、５日間）、またはカルボプラチンとスクアラミンの組み合わせをマウスに腹腔内処置した。１群のマウスは８匹であった。腫瘍増殖阻害は、対照腫瘍が１．０グラムのサイズに達したときの腫瘍サイズを定量することおよび、平均処置腫瘍サイズと平均対照腫瘍サイズの比（Ｔ／Ｃ）を求めることにより評点した。従って、腫瘍増殖阻害は１００％ｘ［１―（Ｔ／Ｃ）］として評点した。別の抗腫瘍活性変数、腫瘍増殖遅延は処置群の平均腫瘍サイズが５００ｍｍ３に到達するまでに要する時間を測定することにより評点した（Ｂ．Ａ．Ｔｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，２５６７‐２５７４  （１９９８））。カルボプラチン＋スクアラミンで見られた腫瘍増殖阻害はカルボプラチンまたはスクアラミン単独で見られた阻害より大きかった。このアッセイエンドポイントによる単独薬としてのスクアラミンの相対的不活性は、スクアラミンがこれら２種のヒト肺腫瘍異種移植片の阻害においてカルボプラチンと相乗作用をするという概念を支持する。同様に、スクアラミンはカルボプラチンにより引き起こされた腫瘍増殖遅延を＞２．３の強化因子により強化することが明らかになった（表７）。
【００９８】
【表７】
2002524481.tif 000007
実施例９
カルボプラチンに加えパクリタキセルと組み合わせたスクアラミン活性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
体重およそ２０グラムのメスのスプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ｎｕ／ｎｕマウスに、ヌードマウス宿主において皮下増殖した腫瘍から採取したＭＶ−５２２ヒト肺腫瘍の断片を、トロカールにより、皮下移植した。腫瘍がおよそ５  ｘ  ５  ｍｍに達したとき、動物を処置およびコントロール群に対形成した。腫瘍を持つマウス１０匹を含む各群を、実験中、個々に追跡した。薬剤（スクアラミン、パクリタキセルに加えカルボプラチン、またはパクリタキセルおよびカルボプラチンと一緒のスクアラミン）またはビヒクルの投与は、動物を対形成した日（第１日）に始めた。薬剤用量および計画は、マウスにおけるパクリタキセルにカルボプラチン加えた場合の最大耐容用量の以前の測定に基づき、選択した。静脈投薬の許容しうる代用物として、薬剤の腹腔（ｉ．ｐ．）投薬を選択した。
【００９９】
マウスは、第１日に始まり、週２回体重測定し、そして腫瘍測定は、カリパスにより週２回行った。これらの腫瘍測定値を、周知の公式、Ｌ２  ｘ  ２  Ｗ＝腫瘍重量により、ｍｇ腫瘍に変換した。実験は、コントロール腫瘍が、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍測定に基づき、概算平均腫瘍サイズ１グラムに達したとき、終了した。終了に際し、すべてのマウスの重量を測定し、屠殺し、そしてその腫瘍を切除した。切除した腫瘍を、１０％ホルマリン中で固定する前に重量測定し、そして各処置群に関し、第１日の値からの平均切除腫瘍重量増加を、予定された終了時の屠殺まで生存したすべての動物に関し、計算した。この異種移植モデルにおいて、（平均切除処置腫瘍重量増加を平均切除コントロール腫瘍重量増加で割ったもの（Ｔ／Ｃ））  ｘ  １００％を、１００％から減じ、各群に関する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）値を得た。最初の腫瘍サイズに比べ、実験終了時の腫瘍サイズが減少していたマウスは、ＴＧＩの計算に含まれず、そしてその結果、ＴＧＩ値は、化学療法に対する腫瘍反応の最小の概算を示す可能性がある。
【０１００】
薬剤の組み合わせのいくつかは、ＭＶ−５２２腫瘍異種移植モデルにおいて、いくつかの腫瘍の縮小を引き起こした。これらの組み合わせでは、既定の腫瘍の最終重量（第３１日）を、対応するマウスに関し、第１日の処置開始時のそれ自体の計算された重量から減じた。この相違を最初の腫瘍重量で割り、１００％を乗じたのが、縮小パーセントであった。その後、グループ中で１匹より多いマウスが腫瘍サイズの減少を経験していた場合、平均腫瘍縮小パーセントをデータから計算した。
【０１０１】
研究中いかなる時点でも、腫瘍サイズの減少が＞５０％である場合、腫瘍は、部分的後退を経験したとみなされた。マウスにおいて、腫瘍が完全に消失した場合、これは完全反応または完全腫瘍縮小とみなされ、その後、組織学的検査によりこれを確認した。
【０１０２】
切除腫瘍重量変化の統計解析には、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのまたはＴｕｋｅｙのｔ検定による対比較を用いた（Ｒ．Ｒ．  ＳｏｋａｌおよびＦ．Ｊ．  Ｒｏｈｌｆ，  Ｂｉｏｍｅｔｒｙ，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，サンフランシスコ（１９８１）；  Ｄ．Ｇ．  Ａｌｔｍａｎ，  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ，ニューヨーク（１９９１））。分散の均一性は、Ｌｅｖｅｎｅの試験を用いて評価し、そして非均一（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）分散のデータは、ＡＮＯＶＡに適用する前に、適切にｌｏｇ変換した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてまたはビヒクルコントロールのパーセントとして示した。非正規分布（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験により決定される）および／または等しくない分散を有する腫瘍重量の非母数分析もまた、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ統計検定を用いて行い、対比較にはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を用いた。適切な平均または順位の間の相違は、０．０５以下のｐ値を生じた場合、有意とみなした。スクアラミンを含む療法（ｒｅｇｉｍｅｎ）に関するｐ値は、スクアラミンを含まない同じ療法に比較し、計算する。
【０１０３】
予備実験により、２０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ  ｘ  ５、ｉ．ｐ．投与のカルボプラチンと組み合わせた１０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ  ｘ  ５、ｉ．ｐ．投与のパクリタキセルの使用は、ヌードマウスに耐容され、そして毒性でない最大組み合わせ投薬に相当した。これらの用量およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＶ−５２２ヒト肺腫瘍異種移植モデルにおけるこの投薬療法でのパクリタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせは、第３１日の３６５．９±６６．０ｍｇの平均切除腫瘍サイズまたは６０．３％のＴＧＩを生じ（ｐ＜０．０１）、この処置群において、いかなる動物に関しても腫瘍縮小の徴候はなかった。対照的に、スクアラミン、パクリタキセルおよびカルボプラチンを用いた三重組み合わせ化学療法は、−０．１±１９．３ｍｇの平均切除腫瘍増殖（ｐ≦０．００１）を生じ、または最終屠殺前の三週間、化学療法を行わなかったにもかかわらず、動物の三重療法組み合わせ群に関し、正味腫瘍静止を生じた。本研究のスクアラミン／パクリタキセル／カルボプラチン・アーム（ａｒｍ）に関するＴＧＩ指数は９６．１％であった。腫瘍サイズに対する化学療法の利益は、第７日までに明らかになり、そして本研究の２つのパクリタキセルおよびカルボプラチン含有アームの間の平均腫瘍サイズの相違は、その後増加した。最終屠殺時にスコア化されたスクアラミン処置動物における腫瘍は、パクリタキセルおよびカルボプラチンのみを投与された動物において見られるものより、有意に小さかった。パクリタキセルおよびカルボプラチンのみを投与されたマウスでは、実験終了時に評価されるように、腫瘍縮小を経験したものはなかったが、三重組み合わせ化学療法コーホートにおける４匹のマウスは、実験の経過に渡り、腫瘍縮小を示し、これらの動物に関する腫瘍サイズの平均減少は５４・８％であった。パクリタキセル／カルボプラチンおよび／またはスクアラミンを投与されたいかなる処置群においても、完全な腫瘍後退はなく、そして三重組み合わせ化学療法群においてのみ、部分的後退があった（７匹の生存動物中、６匹）。腫瘍サイズの一過性減少は、スクアラミンにシスプラチンを加えた場合に見られるように、化学療法の第１４日に最大であった。
【０１０４】
スクアラミン用量の最初の選択および組み合わせ化学療法の投薬療法は、げっ歯類におけるスクアラミンの最大耐容１日用量およびスクアラミン薬物動態学での以前での経験に基づいた。より低いスクアラミン用量で、パクリタキセルに加えカルボプラチンと一緒のスクアラミンが維持される可能性を別個に調べた。ＭＶ−５２２肺腫瘍異種移植モデルで、パクリタキセルおよびカルボプラチンと共に、第１−５日および第８−９日に、０．２−２０ｍｇ／ｋｇの一日用量のスクアラミンを用い、用量範囲決定実験を行った。本実験は、第３２日に終了し、そして最終切除腫瘍重量およびＴＧＩ値パーセントを決定し、これらの観察に基づき、平均値を計算した（表７）。最終屠殺時、平均切除コントロール腫瘍増殖は、６７４．３±７５．８ｍｇであり、一方、パクリタキセルおよびカルボプラチンのみで処置した動物における切除腫瘍増殖は、２２３．４±８２．５ｍｇであった。これは、パクリタキセルにカルボプラチンを加えた場合のＴＧＩ、６６．９％に相当し、これはこの二重薬剤処置に関し最初の実験で見られたＴＧＩ、６０．３％と類似である（上記を参照されたい）。スクアラミン処置群の平均切除腫瘍増殖値は、０．２ｍｇ／ｋｇの１日スクアラミン用量で１３２．０±４６．４ｍｇ（ＴＧＩ＝７４．２％）であり（ｐ＞０．０５）、そして２．０、１０．０および２０．０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミンでは７７．０ｍｇ未満（ＴＧＩ≧７８．８％）であった（表７）。多数の１日用量のスクアラミンで見られた最大亢進は、２．０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で起こり；この用量では平均切除腫瘍増殖は、２２．９±２５．０ｍｇであり、９２．１％のＴＧＩに相当した（ｐ＝０．０１７）。統計的に有意な結果は、２．０（ｐ＝０．０１７）および１０．０（ｐ＝０．０３５）ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミンで観察されたのみであり、そして２０ｍｇ／ｋｇ／日（ｐ＞０．０５）スクアラミンでは観察されなかった。しかし、本実験および以前の実験に渡るメタアナリシスは、２０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミンが、パクリタキセルにカルボプラチンを加えた場合の効果を有意に亢進することを示す（ｐ＜０．００１）。ＭＶ−５２２腫瘍のパクリタキセルおよびカルボプラチン処置にスクアラミンを添加する利点は、第５日までにすべての用量であきらかであり、そして実験の経過中、持続された。
【０１０５】
パクリタキセルおよびカルボプラチンのみを投与されたマウスで、腫瘍縮小を有したものはなかったが、実験の経過に渡り腫瘍サイズが減少したマウスは、各スクアラミン処置群に少なくとも２匹あり、２または１０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミンを投与された各群で、第３２日に、腫瘍縮小を示したマウスが１０匹中５匹だったのが最大であった。いかなる処置群においても、完全な腫瘍縮小が観察されたマウスはなかったが、すべての処置群（パクリタキセル／カルボプラチンのみを含む）で有意に部分的な腫瘍後退が見られ、化学療法開始後の第１５日でもっとも明らかであった。最大腫瘍反応を示した２つのスクアラミン処置群（２および１０ｍｇ／ｋｇ／日スクアラミン）において、２０匹のマウスのうち、１９匹が、第１５日に、少なくとも５０％の腫瘍負荷の減少を有した。
【０１０６】
スクアラミンの最終投薬３週間以上後も、パクリタキセルおよびカルボプラチンと組み合わせたスクアラミンの、腫瘍増殖に対する効果が持続することから、その期間にスクアラミン投与が行われることが重要である、必要な期間の研究を行った。先の段落に記載される実験の別個のアームは、パクリタキセルおよびカルボプラチンと共に１日用量０．２−４０ｍｇ／ｋｇとしてスクアラミンを１日２回投与された動物群に関し腫瘍増殖を考慮した。１日用量のスクアラミンに関し、パクリタキセルおよびカルボプラチンの腫瘍増殖阻害の、スクアラミン用量関連亢進があった。最良の反応は、１日スクアラミン用量１０および２０ｍｇ／ｋｇで見られた。これらの用量では、第３２日までに、平均切除腫瘍増殖は、１０ｍｇ／ｋｇで１１３．１ｍｇ、そして２０ｍｇ／ｋｇスクアラミンで９６．６ｍｇであり、コントロール腫瘍に関する平均切除腫瘍値、６７４．３ｍｇおよびパクリタキセルおよびカルボプラチン処置腫瘍の２２３．４ｍｇに比較し、好ましい値であった。しかし、いかなるスクアラミン用量も、パクリタキセルおよびカルボプラチンのみと比較した際、統計的有意に達しなかった。実験中、２−４匹のスクアラミン処置マウスで、部分的腫瘍後退が見られ、そして実験終了時に評価した際、各スクアラミン処置群において、２−３の動物において、永続的な部分的腫瘍縮小が見られたが、パクリタキセルおよびカルボプラチンのみで処置したいかなるマウスでも、腫瘍サイズの減少は見られなかった。また、パクリタキセルおよびカルボプラチンと共に第５日に２０ｍｇ／ｋｇスクアラミンを投与されたマウスにおいて、１つの完全後退が観察された。腫瘍後退を示したスクアラミン処置動物における平均腫瘍縮小パーセントは、２１．０−５０．４％の範囲内だった。
【０１０７】
実施例１０
放射線療法と組み合わせたスクアラミン活性
同系乳癌ＭＣＡ−４腫瘍細胞（５  ｘ  １０５）  を、Ｃ３Ｈｆ／Ｋａｍオスマウス（４ヶ月齢）の右足に筋内注射した。腫瘍が直径６ｍｍに達したとき、マウスに無作為に：（ａ）処置なし、（ｂ）スクアラミンのみ（１１−１４日間、２０ｍｇ／ｋｇ／日  ｂ．ｉ．ｄ．）、（ｃ）１５Ｇｙのガンマ線照射、または（ｄ）スクアラミンに加え１５Ｇｙのガンマ線を投与するよう割り当てた。腫瘍が少なくとも直径１２ｍｍに達するまで、腫瘍増殖を追跡した。腫瘍放射線反応に対するスクアラミンの効果は、絶対および規準化腫瘍増殖遅延（ＡＧＤおよびＮＧＤ）により、決定した。ＡＧＤは、放射線照射（またはスクアラミン）処置した腫瘍が、８ないし１２ｍｍに増殖するための日数から、未処置腫瘍が８ないし１２ｍｍに増殖するための日数を減じたものとして定義される。ＮＧＤは、スクアラミンおよび放射線照射両方で処置した腫瘍が、８ないし１２ｍｍに増殖するための日数から、スクアラミンのみで処置した腫瘍が８ないし１２ｍｍに増殖するための日数を減じたものとして定義される。亢進因子（ＥＦ）は、ＡＧＤに対するＮＧＤの比として定義された。腫瘍増殖に関する観察時間から計算される、１５Ｇｙガンマ線と一緒のスクアラミンに関するＥＦ（表８）は、＞１．５である。
【０１０８】
【表８】
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実施例１１
卵巣癌に関する、シスプラチンと組み合わせたスクアラミン活性
ヒト卵巣腫瘍細胞を、メスのスイスヌードマウスの背部中央領域に皮下注射した（動物当たり５  ｘ  １０７細胞）。ヒト卵巣腫瘍は、親２００８細胞株（ｃｆ．  Ｐｉｅｔｒａｓら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，  １８２９−１８３８（１９９４））またはＨｅｒ−２／ｎｅｕ受容体を過剰発現しているトランスフェクション変異体いずれかであった。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ受容体の過剰発現は、生じた異種移植腫瘍をより血管形成性にし、そして化学療法により反応しにくくするとみなされる。１週間後、動物を、処置を受けない（コントロール）、単回用量のシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ）、スクアラミンでの毎日の処置（２ｍｇ／ｋｇ、第１−１０日）、またはシスプラチンに加えスクアラミンの処置を受ける群に、無作為化した。その後、化学療法の開始に続き、第２８日に腫瘍増殖をスコア化した。結果は、親２００８腫瘍およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ受容体を過剰発現しているトランスフェクション変異体で非常に似ていた。親２００８細胞株での典型的な結果を表９に示す。これらの結果は、各処置群に関し、腫瘍増殖阻害指数を計算することにより、定量化することが可能である。この異種移植モデルにおいて、（第２８日の平均処置腫瘍重量増加を第２８日の平均コントロール腫瘍重量増加で割ったもの（Ｔ／Ｃ））  ｘ  １００％を１００％から減じ、各群に関する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）値を得た。シスプラチンは、本モデルにおいて２００８腫瘍細胞増殖に対し最小限の効果しかもたなかったが、スクアラミンはコントロールに比べ、第２８日の平均腫瘍サイズを有意に減少させた。シスプラチンにスクアラミンを加えた組み合わせは、腫瘍増殖を遅らせるのに非常に有効であった。
【０１０９】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はスクアラミンの一般構造式を示している。
【図２】  図２は血管新生過程の一般的大要を示している。
【図３】  図３はナトリウム水素エックスチェンジャー（ＮＨＥ）過程を例示するために使用された図である。
【図４】  哺乳動物ＮＨＥの種々のイソ形の阻害に対する通常のアミロリドの影響を示している。
【図５】  ５ａおよび５ｂは各々ＮＨＥイソ形３（ＮＨＥ３）およびＮＨＥ１阻害におけるスクアラミンの影響を示している。
【図６】  図６ａ、６ｂおよび６ｃはスクアラミンに関連する薬物動力学の結果を示している。
【図７】  図７はｉ．ｖ．投与後の種々の組織におけるスクアラミン分布を示している。
【図８】  図８はウサギ角膜マイクロポケットアッセイで決定されたスクアラミンを用いる血管新生指標を示している。
【図９】  図９は腫瘍細胞株と比較された、内皮細胞の増殖に対するスクアラミンの阻害効果を示している。
【図１０】  図１０は健康ラット脳内へ導入されたラット９Ｌ神経膠腫を用いた、神経膠腫致死率研究におけるスクアラミンの阻害効果を示している。
【図１１】  図１１はヒトＭＸ−１乳房腫瘍異種移植片を運び、スクアラミンで処置され、続いてシクロフォスファミド処置されたマウスの生存率を示している。
【図１２】  図１２はスクアラミンおよびシスプラチンでのマウス異種移植片−組み合わせ療法研究におけるヒト肺腺癌（Ｈ４６０）の阻害を示している。
【図１３】  図１３はルイス肺癌腫を皮下に移植されたマウスにおける、種々の化学療法処置法後の肺転移の数を示している。
【図１４】  図１４ａおよび１４ｂはＬＮＣａＰヒト前立腺細胞増殖に対する、スクアラミン、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦおよびスクアラミンの組み合わせ処置の効果を示している；図１４ｂはＣ４−２ヒト前立腺細胞増殖に対する、スクアラミン、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦおよびスクアラミンの組み合わせ処置の効果を示している。両方とも［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイが利用された。
【図１５】  図１５ａおよび１５ｂは睾丸摘徐後の対照無胸腺マウスにおけるＰＳＡレベル（ａ）および腫瘍増殖（ｂ）に対するスクアラミンの効果を示している。
【図１６】  図１６ａおよび１６ｂは睾丸摘徐を行い、続いてスクアラミンで処置した無胸腺マウスにおけるＰＳＡレベル（ａ）および腫瘍増殖（ｂ）に対するスクアラミンの効果を示している。