【手続補正書】
【提出日】平成18年3月23日(2006.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞からインビトロで生成された胚性内皮細胞集団。
【請求項２】
前記胚性内皮細胞が脈管形成能を有する、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記胚性内皮細胞の少なくとも４５％が、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ１）、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄ）、血管内皮Ｎ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）のうちの一要素以上を発現する、請求項１に記載の集団。
【請求項４】
前記胚性内皮細胞の少なくとも５５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記胚性内皮細胞の少なくとも６５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項４に記載の集団。
【請求項６】
前記胚性内皮細胞の少なくとも７５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項５に記載の集団。
【請求項７】
前記胚性内皮細胞の少なくとも８５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項６に記載の集団。
【請求項８】
前記胚性内皮細胞の少なくとも９５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
前記胚性内皮細胞の少なくとも４５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項１に記載の集団。
【請求項１０】
前記胚性内皮細胞の少なくとも５５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項９に記載の集団。
【請求項１１】
前記胚性内皮細胞の少なくとも６５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項１０に記載の集団。
【請求項１２】
前記胚性内皮細胞の少なくとも７５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項１１に記載の集団。
【請求項１３】
前記胚性内皮細胞の少なくとも８５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
前記胚性内皮細胞の少なくとも９５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項１３に記載の集団。
【請求項１５】
前記胚性内皮細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１に記載の集団。
【請求項１６】
前記胚性内皮細胞の少なくとも１２％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１５に記載の集団。
【請求項１７】
前記胚性内皮細胞の少なくとも１４％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１６に記載の集団。
【請求項１８】
前記胚性内皮細胞の少なくとも１６％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１７に記載の集団。
【請求項１９】
前記胚性内皮細胞の少なくとも１８％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１８に記載の集団。
【請求項２０】
前記胚性内皮細胞の少なくとも２０％が、ＣＤ３４を発現する、請求項１９に記載の集団。
【請求項２１】
組織工学構築物であって、
細胞支持基材；および
該細胞支持基材により支持されたヒト胚性内皮細胞、
を備える、組織工学構築物。
【請求項２２】
前記ヒト胚性内皮細胞が脈管形成能を有する、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項２３】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも４５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項２４】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも５５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２３に記載の組織工学構築物。
【請求項２５】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも６５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２４に記載の組織工学構築物。
【請求項２６】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも７５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２５に記載の組織工学構築物。
【請求項２７】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも８５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２６に記載の組織工学構築物。
【請求項２８】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも９５％が、ＰＥＣＡＭ１、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一要素以上を発現する、請求項２７に記載の組織工学構築物。
【請求項２９】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ３４を発現する、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項３０】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも１２％が、ＣＤ３４を発現する、請求項２９に記載の組織工学構築物。
【請求項３１】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも１４％が、ＣＤ３４を発現する、請求項３０に記載の組織工学構築物。
【請求項３２】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも１６％が、ＣＤ３４を発現する、請求項３１に記載の組織工学構築物。
【請求項３３】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも１８％が、ＣＤ３４を発現する、請求項３２に記載の組織工学構築物。
【請求項３４】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも４５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項３５】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも５５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項３４に記載の組織工学構築物。
【請求項３６】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも６５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項３５に記載の組織工学構築物。
【請求項３７】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも７５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項３６に記載の組織工学構築物。
【請求項３８】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも８５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項３７に記載の組織工学構築物。
【請求項３９】
前記ヒト胚性内皮細胞の少なくとも９５％が、ａｃ−ＬＤＬを取り込む、請求項３８に記載の組織工学構築物。
【請求項４０】
前記細胞支持基材を注入されたポリマーマトリックスをさらに含む、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項４１】
前記ポリマーマトリックスが、ポリ（グリコール酸）、コラーゲン−グリコサミノグリカン、コラーゲン、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフマレート）、ポリサッカライド、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（カーボネート）およびこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４０に記載の組織工学構築物。
【請求項４２】
前記ポリマーマトリックスが、粒子、管、スポンジ、球、ストランド、コイル型ストランド、毛管ネットワーク、フィルム、繊維、網目およびシートから選択された形状を有する、請求項４０に記載の組織工学構築物。
【請求項４３】
前記ポリマーマトリックスが、共有結合性相互作用および非共有結合性相互作用のうちの一要素によって該ポリマーと結合した増殖因子を含む、請求項４０に記載の組織工学構築物。
【請求項４４】
前記細胞支持基材が、ゲルを含む、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項４５】
前記ゲルが、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭおよびコラーゲン−ＧＡＧのうちの一要素以上を含む、請求項４４に記載の組織工学構築物。
【請求項４６】
前記ゲルが、コラーゲンＩ，コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコアミノグリカン、プロテイナーゼ、コラゲナーゼ、走化性因子、増殖因子および上記の任意の組み合わせからなる群のうちの一要素をさらに含む、請求項４４に記載の組織工学構築物。
【請求項４７】
前記細胞支持基材と混合した液体キャリアをさらに含む、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項４８】
少なくとも一種類のさらなる細胞型をさらに含む、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項４９】
前記胚性内皮細胞と前記さらなる細胞型との間の比が、少なくとも１：９である、請求項４８に記載の組織工学構築物。
【請求項５０】
前記胚性内皮細胞と前記さらなる細胞型との間の比が、少なくとも２．５：７．５である、請求項４９に記載の組織工学構築物。
【請求項５１】
前記胚性内皮細胞と前記さらなる細胞型との間の比が、少なくとも１：１である、請求項５０に記載の組織工学構築物。
【請求項５２】
前記胚性内皮細胞と前記さらなる細胞型との間の比が、少なくとも７．５：２．５である、請求項５１に記載の組織工学構築物。
【請求項５３】
前記胚性内皮細胞と前記さらなる細胞型との間の比が、少なくとも９：１である、請求項５２に記載の組織工学構築物。
【請求項５４】
前記さらなる細胞型と前記胚性内皮細胞との間の比が、少なくとも９：１である、請求項４８に記載の組織工学構築物。
【請求項５５】
前記さらなる細胞型が、筋肉細胞、神経細胞、結合組織細胞または幹細胞から選択される、請求項４８に記載の組織工学構築物。
【請求項５６】
前記細胞支持基材が、管であり、かつ前記胚性内皮細胞が、該管の内側表面に配置される、請求項２１に記載の組織工学構築物。
【請求項５７】
前記管が、脱細胞化血管、合成ポリマー管およびコラーゲン管のうちの一要素である、請求項５６に記載の組織工学構築物。
【請求項５８】
脈管形成能を有するヒト細胞をインビトロで生成する方法であって、
ヒト胚性幹細胞集団を提供する工程；
ＬＩＦおよびｂＦＧＦの非存在下で該幹細胞を培養して、該培養幹細胞を含む胚様体の形成を刺激する工程；および
該胚様体からＰＥＣＡＭ１陽性細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
前記単離する工程が、
前記胚様体を解離させて、前記培養幹細胞を分離する工程；
該培養幹細胞を標識化ＰＥＣＡＭ１抗体とともにインキュベートして、該培養幹細胞のＰＥＣＡＭ１＋である部分を区別する工程；および
該ＰＥＣＡＭ１＋細胞を残りの該培養幹細胞から分離する工程、
を包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記標識が、磁性成分および蛍光成分のうちの一要素である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記提供する工程が、
ヒト胚性幹細胞集団を培養培地でインキュベートする工程；および
該培養幹細胞を少なくとも部分的に脱凝集する工程、
を包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
非ヒト動物においてインビボで脈管形成を刺激する方法であって、
請求項５８に記載の方法を実施する工程；
前記単離されたＰＥＣＡＭ１＋細胞を、液体キャリア、細胞支持基材およびその両方の混合物のうちの一要素の中で懸濁する工程；ならびに
該細胞懸濁物を該動物中の組織へ送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項６３】
挿入工程の前に、ポリマーマトリックスに前記細胞懸濁物を注入する工程をさらに包含し、該挿入工程は、該ポリマーマトリックスを前記動物の中へ移植する工程を包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞支持基材が、ゲルを含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ゲルが、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭおよびコラーゲン−ＧＡＧのうちの一つ以上を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ゲルが、コラーゲンＩ，コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコアミノグリカン、プロテイナーゼ、コラゲナーゼ、走化性因子、増殖因子および上記の任意の組み合わせからなる群のうちの一要素をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ゲルが硬化するのを可能にする工程をさらに包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリマーマトリックスが、粒子、管、スポンジ、球、ストランド、コイル型ストランド、毛管ネットワーク、フィルム、繊維、網目およびシートから選択された形状を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記送達工程が、前記ポリマーマトリックスを血管の外側の周囲に配置する工程を包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリマーマトリックスが、増殖因子を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、骨形成タンパク質、ＴＧＦβ、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ＴＧＦα、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、造血増殖因子、ヘパリン結合増殖因子、ペプチド増殖因子ならびに塩基性線維芽細胞増殖因子および酸性線維芽細胞増殖因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびに筋肉形成因子（ＭＭＰ）から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞懸濁物を管の内側の表面に配置する工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
前記管が、コラーゲン管、合成ポリマー管および脱細胞化血管のうちの一要素から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記送達工程の前に前記細胞が増殖するのを可能にする工程をさらに包含する、請求項６３または７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記可能にする工程の間に前記細胞が血管構造を形成する工程を可能にする工程をさらに包含する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記可能にする工程の間に前記細胞に機械的力を加える工程をさらに包含する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記機械的力が周期的である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記機械的力が、周応力、剪断応力、等方応力、圧縮応力および引張り応力からなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記組織が虚血性である、請求項６２に記載の方法。
【請求項８０】
前記組織が、結合組織、筋肉組織、神経組織および器官組織からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項８１】
前記送達工程が、前記細胞を血管の内側表面に配置する工程を包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞支持マトリックスが、増殖因子を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項８３】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、骨形成タンパク質、ＴＧＦβ、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ＴＧＦα、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、造血増殖因子、ヘパリン結合増殖因子、ペプチド増殖因子ならびに塩基性線維芽細胞増殖因子および酸性線維芽細胞増殖因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）あるいは筋肉形成因子（ＭＭＰ）から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記胚性内皮細胞にさらなる細胞型を合わせる工程を、さらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項８５】
前記さらなる細胞型と前記胚性内皮細胞との比が、１：９と９：１との間にある、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記さらなる細胞型と前記胚性内皮細胞との比が、９：１より大きい、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記胚性内皮細胞の、前記さらなる細胞型に対する比が、９：１より大きい、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞が、結合組織細胞、神経細胞、器官細胞、筋肉細胞、および幹細胞から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
血管構造を生成する方法であって、
請求項５８に記載の方法を実施する工程；
前記単離されたＰＥＣＡＭ１＋細胞を、液体キャリア、細胞支持基材およびその両方の混合物のうちの一要素の中に懸濁する工程；
ポリマーマトリックスに前記細胞懸濁物を注入する工程；および
該ＰＥＣＡＭ＋細胞が、該ポリマーマトリックス上で増殖するのを可能にする工程、
を包含する、方法。
【請求項９０】
前記ポリマーマトリックスが、粒子、管、スポンジ、球、ストランド、コイル型ストランド、毛管ネットワーク、フィルム、繊維、網目およびシートから選択された形状を有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞支持基材が、ゲルを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記ゲルが、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭおよびコラーゲン−ＧＡＧのうちの一つ以上を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ゲルが、コラーゲンＩ，コラーゲンＩＶ、ラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコアミノグリカン、プロテイナーゼ、コラゲナーゼ、走化性因子、増殖因子および上記の任意の組み合わせからなる群のうちの一要素をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ゲルが硬化するのを可能にする工程をさらに包含する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記可能にする工程の間に前記マトリックスに機械的力を加える工程をさらに包含する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記機械的力が周期的である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記機械的力が、周応力、剪断応力、等方応力、圧縮力および引張り応力からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
脈管形成能を有するヒト細胞をインビトロで生成する方法であって、
ヒト胚性幹細胞集団を提供する工程；
ＬＩＦおよびｂＦＧＦの非存在下で該幹細胞を培養して、該培養幹細胞を含む胚様体の形成を刺激する工程；ならびに
該胚様体から、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一つ以上について陽性である細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項９９】
前記単離する工程が、
前記胚様体を解離させて、前記培養幹細胞を分離する工程；
前記培養幹細胞を、ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一つ以上に対する標識化抗体とともにインキュベートする工程；ならびに
ＧＡＴＡ−２、Ｎ−ｃａｄ、ＶＥ−ｃａｄおよびｖＷＦのうちの一つ以上を発現する細胞を残りの該培養幹細胞から分離する工程、
を包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
非ヒト動物においてインビボで脈管形成を刺激する方法であって、
請求項９８に記載の方法を実施する工程；
前記単離された細胞を、液体キャリア、細胞支持基材およびその両方の混合物のうちの一要素の中で懸濁する工程；ならびに
該細胞懸濁物を該動物中の組織へ送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０１】
血管構造を生成する方法であって、
請求項９７に記載の方法を実施する工程；
前記単離された細胞を、液体キャリア、細胞支持基材およびその両方の混合物のうちの一要素の中で懸濁する工程；
ポリマーマトリックスに該細胞懸濁物を注入する工程；ならびに
該単離された細胞が該ポリマーマトリックス上で増殖するのを可能にする工程、
を包含する、方法。