【手続補正書】
【提出日】平成18年2月2日(2006.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した試料中の、PDF、ペプチジル-プロリル・シス-トランス・イソメラーゼ、ガレクチン結合タンパク質、L3抗原、Mac-2結合タンパク質、血清タンパク質90K、腫瘍関連抗原90K、TIMP-1及び配列番号６〜１１で表されるペプチドを含むタンパク質からなる群から選択される、癌発生および転移に関与するタンパク質のＮ結合型糖鎖の変化を測定する方法。
【請求項２】
試料が、血液または尿から採取されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
癌が、大腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、子宮癌、乳癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 
【請求項４】
糖鎖変化が、N-結合型β1,6N-アセチルグルコサミンの糖鎖側鎖変化であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
測定が、ELISAまたは免疫ブロット法を含む抗原-抗体結合反応を利用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
PDF、ペプチジル-プロリル・シス-トランス・イソメラーゼ、ガレクチン結合タンパク質、L3抗原、Mac-2結合タンパク質、血清タンパク質90K、腫瘍関連抗原90K、TIMP-1及び配列番号６〜１１で表されるペプチドを含むタンパク質からなる群から選択される、癌発生及び転移に関与するタンパク質に対する抗体と、L4-PHAとを含む、前記タンパク質の発現及び糖鎖変化を測定して癌を診断するキット。
【請求項７】
癌が、大腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、子宮癌、乳癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
癌が、大腸癌であることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
糖鎖変化が、N-結合型β1,6 N-アセチルグルコサミンの糖鎖側鎖変化であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂製96ウェルプレート、ポリスチレン樹脂製96ウェルプレート及びスライドグラスからなる群から選択される基体を含むことを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼからなる群から選択される発色酵素と、ABTS(2, 2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、OPD(o-フェニレンジアミン)及びTMB(テトラメチルベンジジン) からなる群から選択される発色基質液とを含むことを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１２】
抗体およびL4-PHAが、ビオチンまたはその誘導体で標識されていることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
【請求項１３】
配列番号６〜１１からなる群から選択される一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のペプチドに特異的な抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
発癌及び転移の過程で起きる細胞の生物学的変化を観察すると、細胞膜表面に存在する多くの種類の糖タンパク質や糖脂質が癌遺伝子からの特定のシグナルにより、「異常グリコシル化(aberrant glycosylation)」を生じ、これによる糖鎖の変化が細胞間の接着や認識に変化を起こし、その結果、発癌及び癌転移をもたらす(ハコモリとカンナギ、J. Natl. Cancer Inst.、第71巻、231〜251頁、1983年；フェイジ(Feizi)、Nature、第314巻、53〜57頁、1985年)。細胞外部から刺激を受けると、シグナルは癌遺伝子ras、転写因子ets-1を介して伝達され、N-アセチルグルコサミン転移酵素V(GnT-V)の発現を刺激する。前記GnT-Vは、糖タンパク質の基本糖鎖のβ1,6位にN-アセチルグルコサミンを付加する反応を触媒する酵素であり、癌の侵潤と転移に直接的な関連があることが知られている(デニス(Dennis)等、Science、第236巻、582〜585頁、1987年)。糖タンパク質は、タンパク質が合成された後小胞体ERで基本糖鎖が作られた後、ゴルジ体に移動して細胞の多様な生命現象の結果として色々な糖転移酵素により糖の付加がなされるのであるが、１次的な糖鎖(Primary sugar chain)は６種類のN-アセチルグルコサミン糖転移酵素(I-VI)が触媒して得られ、この中で、β1,6-N-アセチルグルコサミン糖鎖を形成するGnT-Vが癌の発生と転移に深く関与すると考えられている。GnT-Vは、ゴルジ体に位置し、標的タンパク質は糖鎖に変化を受けて細胞表面や細胞外に分泌される。この時、糖タンパク質は標的細胞の表面タンパク質を認識し、これと接着して癌を誘発することになる。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
GnT-Vは、1987年にデニス等により、β1,6側鎖が癌組織の増殖や癌転移が起きる時、高い程度で現れることが初めて報告された(デニス(Dennis)等、Science、第236巻、582〜585頁、1987年)。細胞表面タンパク質であるgp130はGnT-Vの主な標的タンパク質の中の一つであるが、β1,6N-アセチルグルコサミン付加に高い転移活性があることが明らかにされた。胚性管幹細胞においてGnT-Vが欠損したES細胞(GnT-Vノックアウト)マウスを構築し、ウイルス性癌遺伝子であるポリオーマウイルスの中型T抗原(以下「PyMT」と称する)を導入して癌を誘発させると、PyMTだけを過剰発現させた他の正常マウスに比べて、GnT-VノックアウトマウスではPyMTにより誘導される癌の成長と転移が大きく抑制され(グラノフスキ(Granovsky)等、Nature Med.、第 6巻、306〜312頁、2000年)、β1,6の側鎖化が特に乳癌マウスにおいて高い転移性を示した。最近の研究では、３３種類の肝細胞癌(HCC)組織におけるGnT-Vの活性が、正常組織での活性と比べて５０倍、癌周辺組織に比しては４倍高いことが裏付けられた(ヤオ(Yao)等、J Cancer Res. Clin. Oncol.、第124巻、27〜30頁、1998年)。また、大腸癌細胞株WiDrにこのGnT-Vを過剰発現させたものを、免疫不全マウスに導入して大腸癌を誘導した場合、またはCAM分析方法で授精卵を利用して血管新生を調査した場合にも、高い転移活性が確認された(ミヨシ等、未発表データ、2001年)。このようにGnT-Vは、癌の転移過程に関与しており、組織に関係なしに高い転移活性を有するものと考えられている。このGnT-V酵素は、ヒトの肺癌細胞及びマウスの腎臓から精製され、該酵素のcDNAクローニング、ゲノム構造及びプロモータ領域の分析がなされた(グー(Gu)等、J Biochem、第113巻、614〜619頁、1993年；ソレイバ(Soreibah)等、J Biol. Chem.、第268巻、15381〜15385頁、1993年；カン(Kang)等、J. Biol. Chem.、第271巻、26706〜26712頁、1996年)。最近、本発明者らも転写因子であるets-1がGnT-Vの発現に大きく関与することを報告した(コ(Ko)等、J. Biol. Chem.、第274(33)巻、22941〜22948頁、1999年)。一方、最近になって食生活の西洋化により、大腸癌は、現在男女共に４番目に高い発病率を示し、持続的な増加傾向を見せているが、大腸内視鏡の他には正確に大腸癌を診断する方法がないのが実情である。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
まず、標的タンパク質のcDNAを得た後、真核細胞遺伝子発現ベクターにクローニングし、これをWiDr細胞株にクローニングして培養液からタンパク質を各1mg程度精製した後、アジュバンドと混ぜてウサギの皮下に注射してポリクローナル抗体を製造した。前記の抗体を所定量ずつ二枚の96ウェルプレートに吸着させた。即ち、96ウェルプレート(Maxisorb、Nunc社)にバクテリア由来のタンパク質Aを１ウェル当たり1μgずつ0.1M炭酸ナトリウム(pH 9.6)100μlの存在下で被覆し、続けてTBS-T(トリス緩衝食塩水−Tween、0.2M Tris-Cl、0.4 M NaCl、0.05％ Tween-20)で洗浄し、上記で製造した抗体を付着させ、再びTBS-Tで洗浄し、非付着部分をブロッキングして安定化された抗体系を調製した。血液やその他の試料を再現性と統計処理のために連続稀釈してプレートに加えた後、TBS-Tで３回洗浄した。この時、標的タンパク質は各々の特異抗体に付着している。タンパク質の発現は、ビオチン標識された同一抗体で確認し、β1,6 N-アセチルグルコサミンの糖鎖変化は、レクチンにより確認し、ここでビオチン標識されたL-PHAを利用した。ビオチン標識された抗体を製造するために、抗体(5〜10mg/ml)を250mlのSBRB(スクシニミジル−ビオチン反応バッファー)中、２３℃で６時間透析した。NHS-ビオチン(N-ヒドロキシスクシニミジル−ビオチン)またはNHS-LC-ビオチン(長鎖スルホスクシニミジル  6-(ビオチンアミド)ヘキサノエート由来ビオチン)をDMSO(ジメチルスルホキシド)中で、2〜4mg/mlの濃度になるように調整し、それに抗体とビオチン溶液を1：30(Ab：ビオチン)の比率で混ぜた後、３７℃で撹拌し、一時間放置してビオチンと抗体を結合させ、BBS(ホウ酸緩衝食塩水)に透析してビオチン標識された抗体を製造した。レクチンの場合には、市販のビオチン標識 L-PHAを利用した。つぎに、ビオチン標識された抗体とレクチンは市販のアビジン−ペルオキシダーゼキットを利用して検出する。具体的には、ペルオキシダーゼの基質であるO-フェニレンジアミンとH2O2を加えて490nmでの吸光度を測定した。癌患者の血液試料中のタンパク質の発現とβ1,6 N-アセチルグルコサミンのグリコシル化の変化を測定し、これらを正常対照群と比較した。