【手続補正書】
【提出日】平成18年2月8日(2006.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７で表されるポリペプチド断片の少なくとも一つを含み、且つフォスフォジエステラーゼ活性を示すことを特徴とする、NPPaseと名付けられた植物由来の酵素プロダクト。
【請求項２】
配列番号２０または配列番号２２の間から選択されたcDNAから推定されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、NPPaseと名付けられた請求項１記載の酵素プロダクト。
【請求項３】
配列番号２１で表される配列を含むことを特徴とする、請求項２記載の酵素プロダクト。
【請求項４】
配列番号２３で表される配列を含むことを特徴とする、請求項２記載の酵素プロダクト。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトであって、該酵素プロダクトは、等モル条件中でヌクレオチド糖が糖-フォスフェイトおよび対応するヌクレオシド・モノフォスフェイトへ加水分解することを触媒し、フォスフォモノエステル結合を有する分子を加水分解せず、ビス-PNPPを加水分解可能であり、モリブデン酸塩、ヒ酸塩およびリン酸化された分子により阻害され、該酵素プロダクトの活性はフォスフォジエステラーゼの阻害剤である還元剤およびキレート剤によって影響されず、該酵素プロダクトはやや塩基性のpHに対して感受性であって4と7.5の間のpHで非常に安定であり、グリコシル化を受けることができ、それによって該酵素プロダクトはSDS型のイオン性界面活性剤およびプロテアーゼの作用に対して耐性となり、ヌクレオチド糖に加えて、フォスフォジエステルおよびフォスフォスルフェイト結合を有する他の小分子を認識することを特徴とする、上記酵素プロダクト。
【請求項６】
特にG1P、G6P、AMP、3-フォスフォグリセレート、サイクリックAMPを加水分解せず、核酸も加水分解しないことを特徴とする、請求項１から請求項５のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項７】
エフェクターとして、特に二価カチオン、マグネシウム、マンガンまたはコバルトを必要としないことを特徴とする、請求項１から請求項６のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項８】
オルトフォスフェイト、無機ピロフォスフェイト、およびフォスフェイト・エステル、特にAMP、ADP、ATP、または3-フォスフォグリセレートなどより阻害されることを特徴とする、請求項１から請求項７のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項９】
その活性は、特にβ-メルカプトエタノール、EDTA、還元されたシステインまたはアスコルビン酸によって影響されないことを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１０】
それは、特にプロテイナーゼKまたはプロナーゼに対して耐性であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１１】
それは特にADPG、UDPG, GDP-グルコース、ADP-マンノース、APS、PAPSまたはビス-PNPPを基質として認識し、好適な基質はADPGであることを特徴とする、請求項１から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１２】
65℃の温度に対して30分間耐性であり、モノマー型およびホモポリマー型のアイソフォームについてそれぞれ70と270kDa付近にゲル濾過によって測定されたみかけの分子量を有し、加えて反応のKeq’は110であり、その△G’は-2.9kcal/モルであり、ADPGについてのそれのKmは0.5ミリモルであることを特徴とする、請求項１から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１３】
任意の植物種から単離されることを特徴とする、請求項１から請求項１２のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１４】
ヌクレオチド糖ピロフォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼ（NPPase）活性を有する植物由来の酵素プロダクトをその可溶型アイソフォームで得る方法であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７で表されるポリペプチド断片の少なくとも一つを含むアミノ酸配列を有し、その植物由来の材料を緩衝液による蛋白質画分の抽出にかけ、抽出物を濾過し、一連の遠心分離および沈殿による精製の方法が続き、溶媒のpHおよびイオン強度の両者を調整すると共に、好ましくは蛋白質を60℃以上に加熱して氷中で冷却し、およびゲル濾過、等電点電気泳動、変性ゲル電気泳動、または植物組織から抽出された蛋白質を精製する他の同等な方法による精製を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
以下の：（１）Mes型抽出緩衝液（Mes 50mM pH6、EDTA 1mM、DTT 2mM）による植物組織のホモゲニゼーション、（２）濾過、（３）100,000gにおける超遠心分離、（４）上清の蛋白質の硫酸アンモニウム中での沈殿、（５）pH4.2の緩衝液中における沈殿物の再懸濁、（６）60と65℃の間の温度における少なくとも15分間の加熱、引き続いての氷中での冷却、（７）30,000gにおける遠心分離、（８）上清の蛋白質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮およびpH6における再懸濁、および（９）ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点および変性ゲル電気泳動による精製、という工程からなる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２４によって表されるプライマー。
【請求項１７】
イネまたはオオムギの葉に由来するmRNAと共に、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２４によって表されるプライマーを、RT-PCRにより、cDNAを取得するために使用する方法において、そのcDNAをイネおよびオオムギの葉のcDNAライブラリーのプローブとして使用した後に、配列番号２０、配列番号２２によって配列がそれぞれ表されるcDNAの単離が可能となる、上記方法。
【請求項１８】
NPPase活性を有する酵素プロダクトをコードする、配列番号２０によって表されるcDNA。
【請求項１９】
オオムギの葉に由来するmRNAと共に、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２４によって表されるプライマーを、RT-PCRにより、cDNAを取得するために使用する方法において、そのcDNAをオオムギの葉のcDNAライブラリーのプローブとして使用した後に、配列番号２２によって表される配列のcDNAの単離が可能となる、上記方法。
【請求項２０】
NPPase活性を有する酵素プロダクトをコードする、配列番号２２によって表されるcDNA。
【請求項２１】
ヌクレオシドジフォスフェイト糖の測定に適用するためのアッセイ装置および/または組成物の調製において、請求項１から請求項１３のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを使用する方法。
【請求項２２】
ヌクレオシドジフォスエフェイト糖の測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置が請求項３から請求項１３および請求項１９または請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定がNPPaseによって触媒される反応の間に遊離した糖-1-フォスフェイトに基づくような方法であることを特徴とする、上記アッセイ装置。
【請求項２３】
請求項２２記載のアッセイ装置において、その測定は遊離したグルコース-1-フォスフェイトに基づくものであって、グルコース-1-フォスフェイトはフォスフォグルコムターゼ酵素の作用を受けてグルコース-6-フォスフェイトを産生し、グルコース-6-フォスフェイトは次にNAD+およびNADP+との共役反応を受け、グルコース-6-フォスフェイト・デヒドロゲナーゼ酵素の作用により、6-フォスフォグルコネートおよびNADHまたはNADPHを取得し、そのいずれかが通常の分光測定法または何らかの他の種類の方法で測定されることを特徴とする、上記アッセイ装置。
【請求項２４】
ヌクレオシド・ジフォスフェイト糖の測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置が請求項１から請求項１３のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定がNPPaseによって触媒される反応の間に産生したヌクレオシド・モノフォスフェイトに基づくような方法であることを特徴とする、上記アッセイ装置。
【請求項２５】
請求項２４記載のアッセイ装置において、その測定はヌクレオシド・モノフォスフェイトに基づくものであって、ヌクレオシド・モノフォスフェイトは対応する塩基に加えてオルトフォスフェイトを遊離することが可能であり、5’-ヌクレオチダーゼのような酵素の作用により、そのオルトフォスフェイトを例えば比色法などの常法によって容易に測定できることを特徴とする、上記アッセイ装置。
【請求項２６】
請求項２２から請求項２５のいずれか一つの請求項記載のアッセイ装置において、その測定が、アルカリフォスファターゼまたは5’-ヌクレオチダーゼのような酵素の作用により、糖-1-フォスフェイトとヌクレオシド-モノフォスフェイトがオルトフォスフェイトを遊離することが可能であって、そのオルトフォスフェイトは比色法などの常法によって容易に測定されるという事実に基づくものであることを特徴とする、上記アッセイ装置。
【請求項２７】
アッセイ装置および/または組成物を調製ために請求項１から請求項１３のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを使用する方法において、該アッセイ装置および/または組成物は、3’-フォスフォ-アデノシン5’-フォスフォスルフェイト（PAPS）およびアデノシン5’フォスフォスルフェイト（APS）の存在を測定するために適用されるものである、上記方法。
【請求項２８】
NPPaseをコードするcDNAを発現または過剰発現する形質転換植物の作製において、請求項１６記載のプライマーおよび請求項１８または請求項２０記載のcDNAを使用する方法。
【請求項２９】
NPPaseをコードする遺伝子を発現または過剰発現する形質転換植物を作製する方法において、前記NPPaseの遺伝子の配列番号２０で表されるcDNAを含むプラスミドを含んでいる形質転換ベクターを使用することを特徴とする上記方法。
【請求項３０】
NPPaseをコードする遺伝子を発現または過剰発現する形質転換植物を作製する方法において、前記NPPaseの遺伝子の配列番号２２で表されるcDNAを含むプラスミドを含んでいる形質転換ベクターを使用することを特徴とする上記方法。
【請求項３１】
形質転換ベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンスCECT5799であることを特徴とする、請求項２９または請求項３０記載の形質転換植物を作製する方法。
【請求項３２】
請求項１から請求項１３のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを発現または過剰発現し、澱粉および/または細胞壁多糖の含量が低下し、高温および高い塩度に耐性であることを特徴とする、請求項２９から請求項３１のいずれか一つの請求項記載の方法によって取得可能な形質転換植物。
【請求項３３】
スルフォヌクレオチドの測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置は請求項１から請求項１３のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定が遊離した硫酸塩に基づくような方法であることを特徴とする上記アッセイ装置。