【手続補正書】
【提出日】平成18年5月19日(2006.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】創傷治療のためのリポペプチド類またはリポプロテイン類の使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  次の一般構造：
【化１】
2002515446.tif 000001
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルを表し、ＸはＯまたはＣＨ２を表し、Ｚ1およびＺ2は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｈまたはメチルを表し、ＷはＣＯまたはＳ（Ｏ）ｎ（ｎ＝１または２を有する）を表し、かつＹは１ないし１３のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表す）を有する、動物または人間‐創傷治療のための製剤を製造するための、リポペプチドまたはリポプロテインの使用。
【請求項２】  次の一般構造：
【化２】
2002515446.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルを表し、ＸはＯまたはＣＨ２を表し、Ｚ1およびＺ2は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｈまたはメチルを表し、ＷはＣＯまたはＳ（Ｏ）ｎ（ｎ＝１または２を有する）を表し、かつ
（ｉ）  Ｙは１ないし１０のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表し、または
（ii）  Ｙが、Ｎ‐末端からＣ‐末端へＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫのようになるアミノ酸配列を表し、個々のアミノ酸は欠損または交換することができる）を有する、動物または人間創傷治療のための製剤を製造するためのリポペプチドまたはリポプロテインの使用。
【請求項３】  個々のアミノ酸が、Ｙが１ないし１０のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表すことを条件に欠損する、請求項２（ii）に記載の使用。
【請求項４】  Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルがＣ１５‐アルキル、Ｃ１５‐アルケニルまたはＣ１５‐アルキニルである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】  Ｃ７−２５‐アルケニル残基の中に二重結合（群）がシス‐配置を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】  Ｎ‐末端に同じかまたは異なる２つのエステル状に結合した、場合により長鎖の脂肪酸を有するジヒドロキシプロピル‐システイン群をもつ、動物または人間‐創傷治療のための製剤を製造するための、生理学的に許容できるリポペプチドまたはリポプロテインの使用。
【請求項７】  動物または人間‐創傷治療のためのマイコプラズマ‐クローンから得られる、リポペプチドまたはリポプロテインの使用。
【請求項８】  リポペプチドまたはリポプロテインがマイコプラズマ フェルメンタンス‐クローンから得られている、請求項７に記載の使用。
【請求項９】  リポペプチドまたはリポプロテインが水溶性または両性である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】  リポペプチドとしてＳ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２ＲＳ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫの、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】  リポペプチドまたはリポプロテインが皮上適用のための溶液、注射溶剤、軟膏剤、ローション剤、水性懸濁液、それによって含浸または被覆された硬膏剤の形態でリポソームの中に被包形成されたまたは生物学的に分解可能の担体ポリマーに結合して存在することができる、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】  創傷が負傷または外科的手術による創傷であり、慢性の感染創傷、火傷創、慢性潰瘍または静脈潰瘍または、肥満または糖尿病患者または放射線または化学療法を受けている患者の創傷である、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
【０００１】
創傷治療のためのリポペプチド類またはリポプロテイン類の使用。
【０００２】
（背景技術）
創傷治癒の５段階を記述することができる：
１．血小板からのメディエータの血液凝固および放出（数分後）、
２．白血球の流入、すなわち初めに顆粒球、後にマクロファージおよびリンパ球（１−３日）、
３．線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞のような幾つかの細胞の増殖（３−７日）、
４．創傷収縮（７−９日）および
５．瘢痕組織の再建（１年まで）。
【０００３】
段階２における顆粒球の流入は、挫滅組織片の吸収および感染病原菌の壊死を生ぜしめ、これはマクロファージによっても引き受けられる課題である。マクロファージは、さらにシグナルペプチド、増殖因子のような一連のメディエータおよび形質転換増殖因子（ＴＧＦβ１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ‐ＡＡおよび‐ＢＢ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）のファミリーに含まれるＴＧＦ‐αのようなサイトカインの源である。マクロファージは、間接的に線維芽細胞ＦＧＦ７の中に導入するインターロイキン‐１（ＩＬ‐１）も分泌する。全てのこれらの因子は、種々の創傷治癒の段階に参加しもしくはそのために不可欠である。そのための源としてのマクロファージなしには、創傷治癒は大幅に遅れもしくは不可能である。
【０００４】
（課題）
上記のメディエータの幾つかは、単離した形態で創傷治癒に使用することが可能であるにもかかわらず、これは、これらのペプチド類の多くが数分のみの半減期を有するために困難である。さらなる困難は、種々のメディエータの出現の自然の時点、最適の配量およびこれらの物質の相互作用が詳細に知られていず、いわんや投与時に制御できることが知られていないことである。
【０００５】
また外科的創傷の合併症は、一般に遅れた創傷治癒と増大した瘢痕形成とを生じる感染である可能性があり、これは特に化粧料治療で問題である。抗生物質による予防被覆は、抵抗性問題および万一のアレルギー反応にかんがみて多くの場所でもはや一般に行われていない。特定の患者グループ、たとえば糖尿病患者または高齢の患者の場合、創傷治癒が遅れている。
【０００６】
（解決）
マイコプラズマは、当然、たとえば肺の感染部位に、白血球の流入に導く性質を有する。我々がここで示すことができたように、この性質はリポペプチド類の特定のクラスの存在に結び付いていて、該リポペプチドがＮ‐末端に２つのエステル状に結合した、長鎖の脂肪酸をもつジヒドロキシプロピル‐システイン‐グループを有するという特徴がある（ミュールラットらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５（１９９７）１９５１）。前記のようなリポペプチド類は、すでに記述した性質のほかに、マクロファージをインビトロでサイトカインおよびプロスタグランジンの放出のために刺激しなければならず（１ないし３）、また我々によって新たに見出された能力を、インビボで、ケモカインＭＩＰ‐１α、ＭＩＰ‐２、ＭＣＰ‐１およびＫＣで高い滴定量を導入しなければならない。
【０００７】
動物医学では人間医学と同様に、純粋な、合成製造されたリポペプチドならびにリポソームの中に組み込まれた、または生物学的に分解可能のポリマー担体物質に結合しているリポペプチドを、たとえば軟膏剤、ローション剤または注射溶剤の形態で使用することができる。創傷の表面に塗布または創傷付近に注入されて、前記のような製剤は顆粒球およびマクロファージの自然の流入を増大および加速し、かつそれによって感染を予防し、ならびに生合成の刺激によって創傷治癒に参加したメディエータが自然の順序および濃度で創傷治癒を軽減および加速するものである。マイコプラズマからなる前記のようなリポペプチドのインビボ効果は、他の細菌性のリポペプチドとその合成類似物とが動物実験で何の作用も示さないため、驚くべきことでありかつ新規である（エス・ハウスシルトらFEMS Immunol. Med. Microbiol., 8(1994)77参照）。
【０００８】
一実施形態に従って、本発明が解決しようとする課題は次の一般構造：
【化３】
2002515446.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルを表し、ＸはＯまたはＣＨ２を表し、Ｚ1およびＺ2は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｈまたはメチルを表し、ＷはＣＯまたはＳ（Ｏ）ｎ（ｎ＝１または２を有する）を表し、かつＹは１ないし１３のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表す）を有する、動物または人間‐創傷治療のための製剤を製造するためのリポペプチドまたはリポプロテインの使用によって解決される。
【０００９】
さらに本発明は、次の一般構造：
【化４】
2002515446.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルを表し、ＸはＯまたはＣＨ２を表し、Ｚ1およびＺ2は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｈまたはメチルを表し、ＷはＣＯまたはＳ（Ｏ）ｎ（ｎ＝１または２を有する）を表し、かつ
（ｉ）  Ｙは１ないし１０のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表し、または
（ii）  Ｙが、Ｎ‐末端からＣ‐末端へＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫのようになるアミノ酸配列を表し、個々のアミノ酸は欠損または交換することができる）を有する、動物または人間創傷治療のための製剤を製造するためのリポペプチドまたはリポプロテインの使用に関する。
【００１０】
前記（ii）による使用は、個々のアミノ酸が、Ｙが１ないし１０のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表すことを条件に欠損することを特徴とすることができる。
【００１１】
本発明に従って、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルはＣ１５‐アルキル、Ｃ１５‐アルケニルまたはＣ１５‐アルキニルとしてもよい。
【００１２】
本発明に従って、Ｃ７−２５‐アルケニル残基の中に二重結合（群）がシス‐配置を有してもよい。
【００１３】
もう１つの実施形態に従って、本発明が解決しようとする課題は、Ｎ‐末端に同じかまたは異なる、２つのエステル状に結合した、場合により長鎖の脂肪酸を有するジヒドロキシプロピル‐システイン群をもつ、動物または人間‐創傷治療のための製剤を製造するための生理学的に許容できるリポペプチドまたはリポプロテインの使用によって解決される。
【００１４】
請求されないものは、次の一般構造：
【化５】
2002515446.tif 000005
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｃ７−２５‐アルキル、Ｃ７−２５‐アルケニルまたはＣ７−２５‐アルキニルを表し、ＸはＳを表し、Ｚ1およびＺ2は、同じかまたは相互に異なってもよく、Ｈまたはメチルを表し、ＷはＣＯまたはＳ（Ｏ）ｎ（ｎ＝１または２を有する）を表し、かつ
（ｉ）  Ｙは１ないし１０のアミノ酸残基からなる生理学的に許容できるアミノ酸配列を表し、または
（ii）  Ｙが、Ｎ‐末端からＣ‐末端へＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫのようになるアミノ酸配列を表し、個々のアミノ酸は欠損または交換することができる）を有し、かつ＊印を付けた不斉炭素原子が、Ｘ＝Ｓ（硫黄）である場合絶対Ｒ配置を有する、動物または人間創傷治療のためのリポペプチドまたはリポプロテインの使用である。この請求されていない目的は、単に用語“リポペプチド”および“リポプロテイン”の専門用語“ペプチド”もしくは“プロテイン”を説明するものである。
【００１５】
さらに本発明は、動物または人間創傷治療のための製剤を製造するための、マイコプラズマ‐クローンから得られる、リポペプチドまたはリポプロテインの使用に関する。
【００１６】
この使用は、リポペプチドまたはリポプロテインがマイコプラズマ フェルメンタンス‐クローンから得られていることを特徴とすることができる。
【００１７】
本発明による使用においては、リポペプチドまたはリポプロテインが水溶性または両性であってもよい。
【００１８】
本発明に従って、Ｓ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２ＲＳ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫを使用してもよい。
【００１９】
本発明による使用においては、リポペプチドまたはリポプロテインが皮上適用のための溶液、注射溶剤、軟膏剤、ローション剤、水性懸濁液、それによって含浸または被覆された硬膏剤の形態でリポソームの中に被包形成されたまたは生物学的に分解可能の担体ポリマーに結合して存在することができる。
【００２０】
本発明による使用においては、創傷が負傷または外科的手術による創傷であり、慢性の感染創傷、火傷創、慢性潰瘍または静脈潰瘍または、肥満または糖尿病患者または放射線または化学療法を受けている患者の創傷とすることができる。
【００２１】
合成のリポペプチド製剤は、コスト的に好ましく製造可能であり、かつ原則上種々の創傷治癒のメディエータの複雑な調整機構に介入せずに、自然の創傷治癒の経過を増進させるであろう。さらに、抗生物質または他の、創傷治癒、たとえば害を与える静菌剤を使用する必要なく感染予防が生じるであろう。このようなリポペプチド製剤は、通例の静菌剤の毒性の理由から眼または鼻および口腔部位との接触の危険性に注意が促されている顔面創傷でも使用可能であろう。局所使用の場合、熱のような系統的作用の危険性はほぼ除外されている。
【００２２】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明は図および例によってより詳しく説明する。
【００２３】
例１：
前記のようなリポペプチドの中に取り込まれた合成のリポペプチドまたはリポソームの作用の例として、マウスの腹腔の中に顆粒球およびマクロファージの流入のモデルが利用される。発生学上の特殊性を排除するために、ＮＭＲＩ‐飼育マウスが実験動物として使用される。
【００２４】
ラセミ体のリポペプチドＭＡＬＰ‐２は、ミュールラットらによって（６）で合成され、これは引用物７による化合物Ｒ‐ＭＡＬＰ‐２＝Ｓ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２Ｒ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫもしくはＳ‐ＭＡＬＰ‐２＝Ｓ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２Ｓ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫである。ＭＡＬＰ‐含有リポソームは、以下のように構成される：クロロホルムもしくはクロロホルム／メタノール（１＋１）の中に溶解されたリピド（ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルセリン、コレステロール、ＮＢＤ‐ＰＥ、モル比１．０８：１：０．２５：０．００５）が２プロパノール／Ｈ２Ｏ（１＋１）の中に溶解されたＭＡＬＰ‐２と一緒にピペットで取りかつ回転蒸発器によって濃縮される。リピド膜の完全乾燥は夜通し滅菌台下で行われる。オクチルグルコシド（０．０５Ｍトリス緩衝ＮａＣｌ、ｐＨ７の中に１００ｍＭ）の中で、水槽中に３０分３７℃で乾燥リピド膜の再懸濁。室温で５０倍の体積のＮａＣｌ（０．１Ｍトリス緩衝、ｐＨ７）に対して透析、それぞれ２４時間後に外部透析液の交換２回。
【００２５】
得られたリポソーム懸濁液が合計３回ＮａＣｌで洗浄（遠心分離３０分、４７８００ｇで、４℃）され、かつそれに続きＮａＣｌの中に再懸濁される。
【００２６】
時点０で、以下の製剤が滅菌され、かつ生理食塩水溶液の中で実験動物の腹腔に注入される。６マウスのグループは、異なる時間後に殺され、腹腔が１．２ｍｌ滅菌食塩水溶液で洗浄され、かつこの細胞懸濁液の中の白血球数および組成が同定される。
【００２７】
表１に、重要な値すなわち製剤の注入後に生ずる顆粒球の増加と後のマクロファージの増加とをまとめている。顆粒球の未処理の管理動物に比べ約１００倍の増大が生じ、それに対しマクロファージは３日後に２倍ないし３倍まで増大した。
【００２８】
マイコプラズマまたはリポペプチド製剤の投与後２時間で、実験動物の血清中の化学走性に作用するケモカインＭＩＰ‐１α、ＭＩＰ‐２またはＫＣが測定される場合、著しく増大した活性が見出される。
【００２９】
【表１】
2002515446.tif 000006
【００３０】
【表２】
2002515446.tif 000007
６動物のグループが使用された。
ｂ  食塩治療された管理動物に対する著しい違い（Ｐ＜０．０５）（学生のｔ‐試験による）
ｃ  管理リポソーム類を保持した動物に対する著しい違い（Ｐ＜０．０５）（学生のｔ‐試験による）
【００３１】
例２：
ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）から、たとえば１５μｇ内毒素リポポリサッカライドの注入によっても、白血球の流入を達成できるが、実験動物はこの治療下に害を受ける。これは、特に動物の血清中の測定可能の腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ）の増加に還元される。これは、内毒素治療された動物の血清中に１．５時間後２５００および４０００ｐｇ／ｍｌＴＮＦの間で測定された（食塩で治療された管理動物＜２５０ｐｇ／ｍｌ）。それに対し、上記例１でマイコプラズマ製剤の使用後、管理動物に対する著しいＴＮＦの増加は測定されなかった。
【００３２】
例３：
ジヒドロキシプロピルグループのＣ２に対する非対称炭素原子の重要性は表２に示す。この場合、上記のように５ＮＭＲＩマウスのグループに異なる量のＲ‐ＭＡＬＰ‐２＝Ｓ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２Ｒ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫもしくはＳ‐ＭＡＬＰ‐２＝Ｓ‐［２，３‐ビスパルミトイロキシ‐（２Ｓ）‐プロピル］システイニル‐ＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫが腹膜内に投与され、かつ３日後に腹膜白血球の全数ならびに組成が同定された。Ｒ‐ＭＡＬＰ‐２は明らかにより効果的である。
【００３３】
【表３】
2002515446.tif 000008
【００３４】
【表４】
2002515446.tif 000009
【００３５】
例４：
２μｇ自由Ｒ‐ＭＡＬＰまたは２μｇＲ‐ＭＡＬＰが０．１ｍｇリポソームの中に体内輸入皮内にＮＭＲＩマウスの皮膚の中に注入された場合、３日後に注入部位に明らかな白血球の集合が形成（図４Ａおよび４Ｂ参照）され、もしくは６日後に新組織および血管が形成（図５）される。これは、製剤が皮膚の中に作用し、かつ創傷治癒を促進できることを示している。
【００３６】
（引用先行技術）
１．クヴェントマイヤーらInfect. Immun.、58(1990)1273-1280。
２．ミュールラットおよびフリッシュInfect. Immun.、62(1994)3801-3807。
３．ミュールラットおよびシャーデInfect. Immun.、59(1991)3969-3974。
４．メッツガーらInt. J. Pep. Protein Res.、38(1991)545-554。
５．メッツガーらJ. Pept. Sci.、3(1995)184-190。
６．ミュールラットらJ. Exp. Med.、185(1997)1951-1958。
７．メッツガーらJ. Medicinal Chem.、34(1991)1969-1974。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＭＲＩ‐マウスの中に９μｇラセミ体のＭＡＬＰ‐２の腹膜内注射に対する反応としての総白血球もしくは顆粒球の流入を示す（６動物のグループ）。
【図２】ＮＭＲＩ‐マウスの中に、ＭＡＬＰ‐２を含有した０．２ｍｇリポソームの腹膜内注射に対する反応としての総白血球もしくは顆粒球の流入を示す（６動物のグループ）。
【図３】ＮＭＲＩ‐マウスの中に、ＭＡＬＰ‐２を含有しない０．２ｍｇ管理‐リポソームの腹膜内注射に対する反応としての総白血球もしくは顆粒球の流入を示す（６動物のグループ）。
【図４Ａ（１）】リポソームの中で体内輸入された２μｇＲ‐ＭＡＬＰの皮内注射後３日、ＮＭＲＩマウスの背皮膚内への白血球の浸入を示す。
【図４Ａ（２）】リポソームの中で体内輸入された２μｇＲ‐ＭＡＬＰの皮内注射後３日、ＮＭＲＩマウスの背皮膚内への白血球の浸入を示す。
【図４Ｂ（１）】比較で：未治療マウスの背皮膚を示す。
【図４Ｂ（２）】比較で：未治療マウスの背皮膚を示す。
【図５（１）】ＭＡＬＰ注射後に生じた新しい血管を有する新しい組織の部位を示す（図中央）。
【図５（２）】ＭＡＬＰ注射後に生じた新しい血管を有する新しい組織の部位を示す（図中央）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2002515446.tif 000010
【図２】
2002515446.tif 000011
【図３】
2002515446.tif 000012
【図４Ａ（１）】
2002515446.tif 000013
【図４Ａ（２）】
2002515446.tif 000014
【図４Ｂ（１）】
2002515446.tif 000015
【図４Ｂ（２）】
2002515446.tif 000016
【図５（１）】
2002515446.tif 000017
【図５（２）】
2002515446.tif 000018