【手続補正書】
【提出日】平成18年8月31日(2006.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
上記ウィルスベクターは、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである請求項９のベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３８】
それが必要な個体中の、遺伝子ターゲット配列により一部又は全部で引き起こされた病気の改善、治療及び予防用医薬品の製造に使用される請求項７のベクター。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３９】
上記個体はヒトである請求項３８のベクター。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４０】
上記病気は重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、及び血友病の群から選ばれる請求項３８のベクター。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４１】
上記病気は感染症であり、遺伝子ターゲット配列は感染症に対する個体の罹患性に影響する請求項３８のベクター。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４２】
上記感染症はＨＩＶ感染であり、遺伝子ターゲット配列はＨＩＶによる細胞侵入に関与する細胞表面蛋白質のための遺伝子の少なくとも一部であり、ターゲット配列を変更してＨＩＶによる細胞侵入を阻止する請求項４１のベクター。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４３】
上記細胞はＴ細胞又はＴ前駆細胞である請求項４２のベクター。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、全て緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子ターゲッティングシステムを示す。図１Ａは、ＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステムを示す。人工遺伝子ターゲット（Ａ６５８）は、コード配列の塩基対３２７での、停止コドン及びＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｓｃｅ）の認識部位（５’ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ３’）を含有する３５塩基対挿入により突然変異されたＧＦＰ遺伝子から構成される。ＧＦＰ遺伝子は、ハイブリッドサイトメガロウィルスエンハンサー／ニワトリβ３−アクチンプロモーター（「ＣＭＶ／ＣＢＡ」又は「ＣＢＡ」）により作動される。ＧＦＰ遺伝子は、内部のリボソームの侵入部位（ＩＲＥＳ）がヒトＣＤ８α遺伝子（ＣＤ８）の翻訳を可能とするbicistronic転写の一部である。bicistronicメッセージは、メッセンジャーＲＮＡレベルを増加させるウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含有した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：２８８６−９２）。最後に、上記座は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を作動させて抗生物質Ｇ４１８による選択を可能とするホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）を有する遺伝子を含有した。修復基質ＲＳ２１００及びＲＳ２７００も又表現された。それらはコード配列の塩基対３７で短縮されたＧＦＰ遺伝子から構成され、従って開始コドン（ｔｒｕｎｃＧＦＰ）を有さない。短縮されたＧＦＰ遺伝子の次に、Ａ６５８内のようにＲＳ２１００用のＩＲＥＳ−ＣＤ８又はＲＳ２７００用のＩＲＥＳ−ＣＤ８−ＷＰＲＥが連続した。２×１０6細胞を１０μｇのスーパーコイルＡ６５８プラスミドＤＮＡで電気穿孔して、Ａ６５８遺伝子ターゲットを２９３細胞中に導入した。細胞を５００μｇ／ｍｌＧ４１８中２週間で選択操作を行なった。個体コロニーを採集し、フィコエリトリン結合抗−ＣＤ８抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）で染色して高い表面ＣＤ８発現を示したものを特定してモノクローンセルラインを作成した（２９３細胞、通常ＣＤ８を発現しない）。ポリクローンセルラインを「Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗−ＣＤ８マイクロビーズ」商標及び「ＭＡＣＳミニカラム」商標（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して細胞集団を精製して製造した。２９３／Ａ６５８細胞をＳｃｅ発現プラスミドと共に又はそれ無しのＲＳ２１００で、調節プラスミド（ｐＯＮ４０５）と共にトランスフェクトしてトランスフェクション効率を決定し、遺伝子ターゲッティングを測定した。Ｓｃｅ発現の作動のために下記３種の異なるプロモーターを使用した：ＰＧＫ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びＣＢＡ。細胞を次に３日間培養し、ＧＦＰポジティブ細胞の割合をＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使用してフロー血球計算法により測定した。遺伝子ターゲッティング確率を、ＧＦＰポジティブ細胞のトランスフェクション効率に対する測定された割合を標準化して決定した。
【図１Ｂ】遺伝子ターゲッティングの代表的フロー血球計算法プロットを示す。ＧＦＰポジティブ細胞は左のフロープロットに示された領域「Ｒ２」中で定量化された。それは、Ｓｃｅ発現プラスミド単独でトランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。ＧＦＰポジティブ細胞は存在しなかった。真ん中のプロット「Ｓ−ＧＴ」は、ＲＳ２１００単独でトランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。２つのＧＦＰポジティブ細胞が丸くなり自発的遺伝子ターゲッティング減少を示した。右のプロット「ＤＳＢ−ＧＴ」はＲＳ２１００及びＣＢＡ−Ｓｃｅでの共トランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。このプロット中、領域Ｒ２中に多量のＧＦＰポジティブ細胞があった。
【図１Ｃ】２９３細胞中の遺伝子ターゲッティング確率を示す。結果はトランスフェクトされた細胞百万当たりの両方の遺伝子ターゲッティング事象の数（「事象／１０6細胞」）±１標準偏差として、及び全体の確率として示される。結果を４種の異なる遺伝子ターゲットとして示す。「１ｂｐ突然変異」ターゲット中、ナンセンス突然変異が機能性ＧＦＰ発現を排除するコード領域のｂｐ３２１位でＧＦＰ遺伝子中に生成した。「７ｂｐ挿入」ターゲット用に、７ｂｐ配列がＧＦＰコード領域のｂｐ３２７位に挿入された。「３５ｂｐ挿入」用遺伝子ターゲットはＡ６５８であり、「６６ｂｐ挿入」用ターゲットはＱＱＲ８であった（図３Ａに図解する）。「Ｓｃｅ」と表示した列は、Ｓｃｅが共トランスフェクトされたかされないかを示す。「Ｓｃｅ誘起したＤＳＢによるＦｏｌｄ誘発」と表示した行は、Ｓｃｅの発現により誘起したターゲットＡ６５８上の遺伝子ターゲッティング確率の誘発である。
【図１Ｄ】遺伝子ターゲッティングの時間的経過を示す。ＤＳＢ−ＧＴの相対速度は第３日に標準化した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｅは、ＤＳＢ誘起した遺伝子ターゲッティングの確率を調節する変数因子を示す。実験中、トランスフェクションは２４ウェルプレート中でリン酸カルシウム技術で行われた。図２Ａ〜２Ｄ中、遺伝子ターゲッティングの確率は、２００ｎｇのＲＳ２１００及び２００ｎｇのＰＧＫ−Ｓｃｅを使用した標準条件に標準化された。トランスフェクトされた構成要素の量を変化させた実験中、合計ＤＮＡ量はｐＢＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ社製、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を添加して一定に維持した。  図２Ａは遺伝子ターゲッティング確率に対する基質量を示す。結果は、２００ナノグラム（ｎｇ）のＲＳ２１００をトランスフェクトした後に得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｂ】遺伝子ターゲッティング確率に対する相同長さを示す。結果はプラスミドＲＳ２１００で得られた確率に標準化された。８００ｂｐの相同性（ＲＳ８００）を有するプラスミドはＲＳ２１００のＩＲＥＳ−ＣＤ８構成要素を失った。２７００ｂｐの相同性（ＲＳ２７００）を有するプラスミドは、図１Ａに示される。４２００ｂｐの相同性（ＲＳ４２００）を有するプラスミドは、ＲＳ２１００の３’末端へのＷＰＲＥ及びＰＧＫ−ＮＥＯ構成要素の両方の添加を有した。一定量（２００ｎｇ）のそれぞれの修復基質がトランスフェクトされたが、ＤＳＢ−ＧＴの相対速度がトランスフェクトされたモル量に標準化された。
【図２Ｃ】遺伝子ターゲッティング確率に対するトランスフェクトされたＳｃｅ発現プラスミドの量を示す。結果は、２００ｎｇのＰＧＫ−Ｓｃｅがトランスフェクトされた時に得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｄ】遺伝子ターゲッティング確率に対する修復基質の転写状態を示す。「非転写」とは、ＲＳ２１００を使用したＤＳＢ−ＧＴの割合である。「転写」とは、ＲＳ２１００のセンスストランドがＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−ＲＳ２１００）を使用して転写された時のＤＳＢ−ＧＴの割合である。割合はＲＳ２１００を使用して得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｅ】遺伝子ターゲッティングの最適化を示す。「１」と表示した行は、Ｓｃｅ及びＲＳ２１００が同一プラスミド上の場合であり「２」と表示した行は、Ｓｃｅ及びＲＳ２１００が分離されたプラスミド上の場合である。トランスフェクトされた細胞百万当たり３００００ＧＦＰポジティブ細胞は、遺伝子ターゲッティング確率の３％に相当する。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、キメラヌクレアーゼ誘起された遺伝子ターゲッティングを示す。それぞれの実験中、遺伝子ターゲッティングの確率を適切なヌクレアーゼ及び修復基質ＲＳ２７００で共トランスフェクトして測定した（図１Ａ）。  図３Ａはキメラヌクレアーゼ及びキメラヌクレアーゼターゲットの概略図を示す。遺伝子ターゲットは、挿入部位を延長する追加的配列がＳｃｅ認識部位（Ｓｃｅ部位）の近傍のＧＦＰ遺伝子中に挿入された以外はＡ６５８と同じである。ＱＱＲ８及びＱＱＲ６中に、ＱＱＲジンクフィンガートリプレット（５’ＧＧＧＧＡＡＧＡＡ３’）用の結合部位（ＱＱＲ部位）の逆方向反復を、６ｂｐスペーサー「６」（ＱＱＲ６）又は８ｂｐスペーサー「８」（ＱＱＲ８）のいずれかと共に挿入した。ＱＱＲＺＩＦ６中で、Ｚｉｆ２６８トリプレットフィンガー（Ｚｉｆ部位）（５’ＧＣＧＴＧＧＴＣＧ３’）用の結合部位を、部位間に６ｂｐスペーサー（６）を有するＱＱＲ部位に対し逆転配置で挿入した。ポリクローナル２９３セルラインをＱＱＲ８、ＱＱＲ６、及びＱＱＲＺＩＦ６から図１に示されるように作成した。キメラヌクレアーゼをＣＭＶプロモーターＣＭＶにより作動した。それぞれは標準開始コドン「ＡＴＧ」を有しその後ろに核局在化シグナル「Ｎ」がアミノ末端に続いた。トリプレットジンクフィンガードメイン、ＱＱＲジンクフィンガートリプレット用のいずれかの「ＱＱＲ」（Ｓｈｉら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：２８２−２８４）又は、Ｚｉｆ２６８トリプレット用の「Ｚｉｆ」（Ｗｏｌｆｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）、９：７１７−２３）は核局在化シグナルの次に続いた。次に変数因子アミノ酸リンカー、１８アミノ酸（Ｌ１８）がＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ中に、ゼロアミノ酸（Ｌ０）がＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎ中に、又は３アミノ酸（Ｌ３）がＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎ中に、ＦｏｋＩ制限酵素（「ヌクレアーゼ」又は「Ｆｎ」）のエンドヌクレアーゼドメイン前に存在する（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎら、１９９９、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３８０：８４１−８）。ＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎが新規な一方、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ及びＣＭＶ−ＱＱＲ−ＬＯ−Ｆｎは、予め特徴づけられた融合蛋白質からのクローンである（Ｓｍｉｔｈら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２８：３３６１−９）。
【図３Ｂ】キメラヌクレアーゼホモダイマーを使用した遺伝子ターゲッティングを示す。
【図３Ｃ】キメラヌクレアーゼヘテロダイマーを使用した遺伝子ターゲッティングを示す。
【図３Ｄ】キメラヌクレアーゼを使用した遺伝子ターゲッティングの時間的経過を示す。
【図４】鎌状赤血球貧血を引き起こすように突然変異されたコドン（赤）の周囲のヒトβ−グロブリン遺伝子の配列を示す。２対の可能性のあるキメラヌクレアーゼ（ＨＢＧＺＦ１及びＨＢＧＺＦ２；ＨＢＧＺＦ３及びＨＢＧＺＦ４）が示される。キメラヌクレアーゼ用の結合部位が、大文字でハイライトされている。
【図５】単一の文字コードを使用して、それぞれトリプレットを認識する、ＨＢＧＺＦ１及びジンクフィンガードメインの結合部位を示す。
【図６】ＨＢＧＺＦ１の遺伝子ターゲッティング及び、人工ハイブリッドＨＢＧＺＦ１／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図７】ＨＢＧＺＦ４用の設計及びターゲット部位を示す。
【図８】ＨＢＧＺＦ４の遺伝子ターゲッティング及び人工ハイブリッドＨＢＧＺＦ４／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図９Ａ】ヒト共通γ−鎖の構造及び、Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏら、２００２から由来するＳＣＩＤへ導く遺伝子中の突然変異の位置を示す。
【図９Ｂ】エクソン５の配列並びにキメラヌクレアーゼＨＣＧＣＺＦｌ及びＨＣＧＣＺＦ２用の予定結合部位を示す。
【図１０】ＨＣＧＣＺＦ２の結合部位並びに、Ｓｅｒａ及びＵｒａｎｇａ（２００２）からのジンクフィンガーコードに由来するジンクフィンガー１〜３用アミノ酸を使用したＨＣＧＣＺＦ２の構造を示す。
【図１１】ＨＢＧＺＦ２の遺伝子ターゲッティング及び人工ハイブリッドＨＣＧＣＺＦ２／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図１２Ａ】図１２はＧＦＰキメラヌクレアーゼによる遺伝子ターゲッティングを示す。１２Ａは、ＧＦＰ遺伝子中のターゲット配列の配列、及びＧＦＰ遺伝子を切断するように設計されたキメラヌクレアーゼを示す概略図を示す。ＧＦＰキメラヌクレアーゼターゲット部位は、丁度５’からＩ−ＳｃｅＩ認識部位（Ｓｃｅ部位）の挿入まで存在する。
【図１２Ｂ】実施例１に記載された修復基質Ａ７６７で表示ヌクレアーゼを共トランスフェクションした後の、２９３細胞中の遺伝子ターゲッティングの確率を示す。
【図１３Ａ】図１３はＣＤ８キメラヌクレアーゼによる遺伝子ターゲッティングを示す。１３Ａは、キメラヌクレアーゼ用のヒトＣＤ８α遺伝子中のターゲット配列を示す。
【図１３Ｂ】２９３／１１０４細胞の、ＣＤ８ノックアウトプラスミド単独（５％ＣＤ８ネガティブ細胞）又は、ＣＤ８ノックアウトプラスミド及びＣＤ８キメラヌクレアーゼ（２０％ＣＤ８ネガティブ）でのトランスフェクト後のフロー血球計算法プロットを示す。ＣＤ８発現の測定は、ピューロマイシン抵抗性コロニーの採集後、フィコエリトリン結合抗(anti)−ＣＤ８モノクローン性抗体で染色して行った。