【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年5月31日(2006.5.31)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６６】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに高度の同一性または相同性があるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態を保つようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を説明することを意図している。好ましくは、条件は互いの同一性が少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらにより好ましくは少なくとも約85％または90％である配列が互いにハイブリダイズした状態を保つものである。このようなストリンジェントな条件は当業者に周知であり、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、アウスユーベル（Ausubel）ら編、John Wiley & Sons, Inc.（1995）、第2、4および6節に記載がある。このほかのストリンジェントな条件は、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、サムブルック（Sambrook）ら、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY（1989）、第7、9および11章に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約65〜70℃の4×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中でハイブリダイゼーション（または、約42〜50℃の4×SSC＋50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約65〜70℃の1×SSC中で1回または複数回の洗浄を行うことを含む。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約65〜70℃の1×SSC中でハイブリダイゼーション（または、約42〜50℃の1×SSC＋50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約65〜70℃の0.3×SSC中で1回または複数回の洗浄を行うことを含む。ストリンジェンシーを低くしたハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約50〜60℃の4×SSC中でハイブリダイゼーション（または、約40〜45℃の6×SSC＋50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約50〜60℃の2×SSC中で1回または複数回の洗浄を行うことを含む。上に挙げた値の中間の範囲、例えば、65〜70℃または42〜50℃でのものも本発明に含まれるものとする。SSPE（1×SSPEは0.15M NaCl、10mM NaH2PO4および1.25mM EDTA、pH 7.4である）を、SSC（1×SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸ナトリウムである）の代わりにハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄バッファーに用いることができる；洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後にそれぞれ15分間行う。50塩基対未満であると予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Tm）よりも約5〜10℃低い必要があり、ここでTmは以下の式に従って決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドに関しては、Tm（℃）＝2（A＋T塩基の数）＋4（G＋C塩基の数）である。長さが18〜49塩基対のハイブリッドに関しては、Tm（℃）＝81.5＋16.6（log10［Na+］）＋0.41（％G＋C）−（600／N）であり、ここでNはハイブリッド中の塩基の数であり、［Na+］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（1×SSCの場合の［Na+］＝0.165M）。また、膜、例えばニトロセルロースまたはナイロン膜に対する核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、ブロッキング剤（例えば、BSAまたはサケもしくはニシン精子キャリアーDNA）、界面活性剤（例えば、SDS）��キレート剤（例えば、EDTA）、フィコール（Ficoll）、PVPなどを非制限的に含む別の試薬を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄バッファーに添加してもよいことも当業者は認識していると考えられる。特に、ナイロン膜を用いる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の好ましい非制限的な一例は、約65℃の0.25〜0.5M NaH2PO4、7％SDS中でのハイブリダイゼーションに続き、65℃の0.02M NaH2PO4、1％SDS（例えば、ChurchおよびGilbert（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：1991〜1995を参照）または0.2×SSC、1％SDSで、1回または複数回の洗浄を行うというものである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４３】
実施例8：FAD4、FAD5、Fad5-2およびFAD6の酵母における発現
Fad4の機能を確かめるために、完全長cDNAを誘導性プロモーターの制御下で酵母Invsc2株にて発現させた。図7は、培地に22：5（7,10,13,16,19）を補充することにより、Fad4 cDNAを含む酵母細胞がベクター対照と比較して別の脂肪酸を有したことを示している。ピークの保持時間はDHA標準物質と同一であった。遊離脂肪酸のLC／MS分析により、負イオンエレクトロスプレー法でDHA標準物質と同一な脱プロトン化分子イオン（m／z＝279）が生じたことが示された。さらに、FAMEのGC／MS分析により、ピークのスペクトルがDHA標準物質のものと同一であることも示された（図8）。これらの結果は、Fad4が、22：5（7,10,13,16,19）基質の4位に二重結合を導入してΔ4不飽和化脂肪酸DHA（22：6（4,7,10,13,16,19）を生成しうる、Δ4脂肪酸不飽和化酵素であることを示している。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４４】
Fad4の基質特異性をさらに調べるために、18：2（9,12）、18：3（9,12,15）、20：3（8,11,14）および22：4（7,10,13,16）を含む種々の基質を別個に酵母形質転換体に与えた。その結果から、Fad4が22：4（7,10,13,16）を基質として用いて（図9）、別のΔ4不飽和化脂肪酸であるDPA（22：5（4,7,10,13,16）も生成しうることが示された（図10）。検討した残りの脂肪酸は有効な基質ではなかった。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下からなる群より選択される、単離された核酸分子：
（a）配列番号：1に示したヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその相補物；
（b）配列番号：2に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、またはその相補物；および
（c）配列番号：2に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的な天然の対立遺伝子バリアントをコードする核酸分子、またはその相補物。
【請求項２】  以下からなる群より選択される、Fad4（Δ4不飽和化酵素）活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子：
（a）配列番号：1のヌクレオチド配列全長、またはその相補物との同一性が少なくとも約90％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（b）配列番号：1のヌクレオチド配列に、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失が導入されているヌクレオチド配列、またはその相補物を含む核酸分子；
（c）配列番号：2のアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約90％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、またはその相補物；および
（d）1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失が導入されている、配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、またはその相補物；
（ｅ）脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうるΔ4脂肪酸不飽和化酵素分子をコードする核酸分子であって、該不飽和化酵素分子は、配列番号：２に示したアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約70%であり、かつヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフを含む核酸分子、またはその相補物；
（ｆ）脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうるΔ4脂肪酸不飽和化酵素分子をコードする核酸分子であって、該不飽和化酵素分子は、配列番号：２に示したアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約70%であり、さらに配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、アミノ酸残基182〜186、アミノ酸残基216〜223、およびアミノ酸残基453〜462を含む、核酸分子、またはその相補物；
（ｇ）脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうる、ヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフを含むΔ4脂肪酸不飽和化酵素分子をコードする核酸分子であって、配列番号：１に示したヌクレオチド配列全長との同一性が少なくとも約70%である核酸分子、またはその相補物  ；および
（ｈ）脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうるΔ4脂肪酸不飽和化酵素分子をコードする核酸分子であって、さらに該不飽和化酵素分子は配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、182〜186、216〜223、および453〜462を含み、かつ該核酸分子は配列番号：１に示したヌクレオチド配列全長との同一性が少なくとも約70%である核酸分子、またはその相補物。
【請求項３】  請求項1または2記載の核酸分子の相補物と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFad4（Δ4不飽和化酵素）活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項４】  請求項1〜3のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】  発現ベクターである、請求項4記載のベクター。
【請求項６】  請求項5記載の発現ベクターをトランスフェクトした、単離された宿主細胞。
【請求項７】  植物細胞、微生物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項6記載の宿主細胞。
【請求項８】  植物細胞が、アマ（アマ属（Linum sp.））、ナタネ（アブラナ属（Brassica sp.））、ダイズ（ダイズ属（Glycine and Soja sp.））、ヒマワリ（ヒマワリ属（Helianthus sp.））、ワタ（ワタ属（Gossypium sp.））、トウモロコシ（ズィー・メイス（Zea mays））、オリーブ（モクセイ科（Olea sp.））、ベニバナ（ベニバナ属（Carthamus sp.））、カカオ（テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao））およびラッカセイ（ラッカセイ属（Arachis sp.））からなる群より選択される脂肪種子作物から得られる細胞である、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項９】  微生物細胞が、ヤブレツボカビ（Thraustochytrium）、ピティウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）およびクリテコジニウム（Crythecodinium）からなる群より選択される、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項１０】  ポリペプチドを産生させるために請求項6記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】  以下からなる群より選択される、Fad4（Δ4不飽和化酵素）活性を有する、単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的な天然の対立遺伝子バリアント；
（c）配列番号：1のヌクレオチド配列全長との同一性が少なくとも約90％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（d）配列番号：2のアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約90％であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失が導入されている配列番号：１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
（ｆ）配列番号：１からなる核酸分子に対し、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ポリペプチド；
（ｇ）配列番号：２に示したアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約70%であり、さらにヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうるΔ4不飽和化酵素分子である、ポリペプチド；
（ｈ）配列番号：２に示したアミノ酸配列全長との同一性が少なくとも約70%であり、さらに配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、アミノ酸残基182〜186、アミノ酸残基216〜223、およびアミノ酸残基453〜462を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうるΔ4脂肪酸不飽和化酵素分子である、ポリペプチド；
（ｉ）配列番号：１に示したヌクレオチド配列全長との同一性が少なくとも約70%である核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入することによりΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうる不飽和化酵素分子であり、さらにヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフを含む、ポリペプチド；および
（ｊ）配列番号：１に示したヌクレオチド配列全長との同一性が少なくとも約70%である核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、脂肪酸分子22：5（7,10,13,16,19）の4位に二重結合を導入してΔ4不飽和化脂肪酸分子DHA（22：6（4,7,10,13,16,19））を生成しうる、または脂肪酸分子22：4（7,10,13,16）の4位に二重結合を導入してΔ4不飽和化脂肪酸分子DPA（22：5（4,7,10,13,16））を生成しうる不飽和化酵素分子であり、さらに配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、182〜186、216〜223、および453〜462を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】  配列番号：2記載のアミノ酸配列を含む、請求項11記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】  不飽和脂肪酸の生産方法であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離された核酸分子による細胞のトランスフェクションおよび形質転換を行う段階、ならびに不飽和脂肪酸が産生される条件下で細胞を培養または栽培する段階を含む方法。
【請求項１４】  細胞が植物細胞、動物細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】  植物が脂肪種子作物から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】  脂肪種子作物が、アマ（アマ属）、ナタネ（アブラナ属）、ダイズ（ダイズ属（Glycine and Soja sp.））、ヒマワリ（ヒマワリ属）、ワタ（ワタ属）、トウモロコシ（Zea mays）、オリーブ（モクセイ科）、ベニバナ（ベニバナ属）、カカオ（Theobroma cacao）およびラッカセイ（ラッカセイ属）からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】  不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１８】  不飽和脂肪酸が、DPA 22：5（4,7,10,13,16）またはDHA 22：6（4,7,10,13,16,19）である、請求項13記載の方法。
【請求項１９】  不飽和脂肪酸の生産方法であって、少なくとも1つの不飽和化酵素標的分子を含む組成物を、請求項11または12記載の少なくとも1つの単離されたポリペプチドと、不飽和脂肪酸が生成される条件下で接触させる段階を含む方法。
【請求項２０】  不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】  不飽和脂肪酸が、DPA 22：5（4,7,10,13,16）またはDHA 22：6（4,7,10,13,16,19）である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】  請求項1〜3のいずれか一項記載の核酸分子を細胞に導入する段階を含む、不飽和脂肪酸を産生しうる細胞の作製方法。
【請求項２３】  細胞が、植物細胞、動物細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】  植物細胞が脂肪種子植物由来の細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  脂肪種子植物が、アマ（アマ属）、ナタネ（アブラナ属）、ダイズ（ダイズ属（Glycine and Soja sp.））、ヒマワリ（ヒマワリ属）、ワタ（ワタ属）、トウモロコシ（Zea mays）、オリーブ（モクセイ科）、ベニバナ（ベニバナ属）、カカオ（Theobroma cacao）およびラッカセイ（ラッカセイ属）である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】  不飽和脂肪酸が、DPA 22：5（4,7,10,13,16）またはDHA 22：6（4,7,10,13,16,19）である、請求項22記載の方法。
【請求項２７】  不飽和脂肪酸の生産を増強するための方法であって、不飽和脂肪酸の産生の増強が起こるように請求項6記載の細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項２８】  不飽和脂肪酸が、DPA 22：5（4,7,10,13,16）またはDHA 22：6（4,7,10,13,16,19）である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】  産生された不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
【請求項３０】  不飽和脂肪酸の大規模生産のための方法であって、不飽和脂肪酸が産生されるように請求項6記載の細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項３１】  不飽和脂肪酸の産生が増強される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】  不飽和脂肪酸が、DPA 22：5（4,7,10,13,16）またはDHA 22：6（4,7,10,13,16,19）である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】  産生された不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３４】  請求項11または12記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３５】  栄養補助食品として動物飼料中に用いられる、または障害を有する患者を治療するために用いられる、請求項10または13記載の方法によって生産されたポリペプチドまたは不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項３６】  栄養補助食品として動物飼料中に用いられる、または障害を有する患者を治療するために用いられる、請求項19記載の方法によって生産された不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項３７】  請求項22記載の方法によって作製された細胞を含む組成物。
【請求項３８】  動物飼料中に用いられる、請求項34記載の組成物。
【請求項３９】  動物飼料中に用いられる、請求項35〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４０】  栄養補助食品として用いられる、請求項34〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４１】  ヒトまたは動物の食事を補うために用いられる、請求項34〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】  障害を有する患者を治療するために用いられる、請求項34〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】  障害が、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患および心血管疾患からなる群より選択される、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】  配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、アミノ酸残基182〜186、アミノ酸残基216〜223、またはアミノ酸残基453〜462からなる群から選ばれるアミノ酸残基によって示される少なくとも一つのモチーフを有するポリペプチドをコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４５】  ポリペプチドが少なくとも二つの保存的ヒスチジンモチーフを含む、請求項44に記載の核酸分子。
【請求項４６】  配列番号：２のアミノ酸残基41〜44、アミノ酸残基182〜186、アミノ酸残基216〜223、またはアミノ酸残基453〜462からなる群から選ばれるアミノ酸残基によって示される少なくとも一つのモチーフを有する、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
【請求項４７】  少なくとも二つの保存的ヒスチジンモチーフを含む、請求項46に記載のポリペプチド。
【請求項４８】  ヒトまたは動物の食事を補うために用いられる組成物を生産するための、請求項34〜37のいずれか一項記載の組成物の使用方法。
【請求項４９】  障害を有する患者を治療するために用いられる組成物を生産するための、請求項34〜37のいずれか一項記載の組成物の使用方法。
【請求項５０】  障害が、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患および心血管疾患からなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】  少なくとも１２ヌクレオチド長であって、かつ請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、プローブまたはプライマーとして用いうる、単離された核酸分子。