【手続補正書】
【提出日】平成18年9月21日(2006.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ＝３５.７７±５オングストローム、ｂ＝５７.５６±５オングストローム、ｃ＝８０.２０±５オングストローム、α＝６８.９７±５°、β＝８９.８３±５°、γ＝８９.９５±５°の単位格子サイズを有するＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶。
【請求項２】
該触媒ドメインが表１の原子構造座標を含む三次元構造を有する、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶。
【請求項３】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが配列番号２の配列、またはそのフラグメントまたは相同体を含む、請求項１または２記載の結晶。
【請求項４】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが少なくともＡＴＰ−結合部位を含む、請求項３記載の結晶。
【請求項５】
少なくとも１個のリガンドまたは低分子量化合物に結合した請求項１〜４のいずれかに記載の結晶。
【請求項６】
コンピューター可読性データでコード化されたデータ記憶材料を含むコンピューター可読性媒体であって、該データが、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含む表１の原子座標を含む媒体。
【請求項７】
ＺＡＰ−７０キナーゼの結晶の製造方法であって、
（ｉ）配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの精製、
（ii）タンパク質加水分解ドメイン特定
（iii）ＺＡＰ−７０の所望のドメインのタンパク質加水分解的放出を容易にするためプロテアーゼ認識配列を両端に隣接させた配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（iv）適切な宿主細胞における工程（iii）の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（ｖ）プロテアーゼ認識部位における所望のドメインの制御されたタンパク質加水分解
（vi）所望のＺＡＰ−７０ドメインの迅速な精製
の工程を含む方法。
【請求項８】
ドメインが配列番号２のＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＺＡＰ−７０、そのフラグメントまたは相同体の触媒ドメインが、結晶化に先行するいずれかの工程で少なくとも１個のリガンドまたは低分子量化学的化合物と結合されている、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０キナーゼを結晶化すること
（ii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体の三次元構造の決定のために、全体的または部分的に表１の原子座標を用いること
を含む方法。
【請求項１１】
少なくとも１個のリガンドに結合したＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含む複合体の三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）複合体の結晶についてのｘ線回折データを得、
（ii）複合体の三次元構造を測定するために、全体的または部分的に表１の原子座標を用いる
ことを含む方法。
【請求項１２】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合する可能なリガンドまたは低分子量化合物を選択するために、表１の原子座標のセットから全体的または部分的に誘導されたＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの三次元構造を用い、
（ii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択する
工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１１記載のＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが上記ドメインの少なくともＡＴＰ−結合部位を含む方法。
【請求項１４】
ＺＡＰ−７０キナーゼの生物活性を阻害するリガンドの選択で使用される請求項１２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＺＡＰ−７０触媒ドメインに結合し得るリガンドまたは低分子量化合物の設計方法であって、
（ｉ）全体的または部分的に表１の原子座標を用いてＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を測定し、
（ii）候補リガンドまたは低分子量化合物でＺＡＰ−７０の該触媒ドメインをプローブすることにより、どれがＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するかを測定し、
（iii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（iv）結合することにより物理的結合特性、たとえば溶解性、親和力、特異性または有効性を最大化するようにリガンドまたは低分子量化合物を修飾する
工程を含む方法。
【請求項１６】
候補リガンドまたは低分子量化合物をインシリコ・スクリーニングにかける、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＺＡＰ−７０キナーゼの生物活性を阻害するリガンドの設計で使用される請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞およびリンパ球活性化を伴う疾患および状態の処置で使用される請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法により同定されるリガンドを含む医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明の一実施態様では、以下の工程を含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶の製造方法が提供される：
（ｉ）完全長ＺＡＰ−７０キナーゼ（配列番号１）の精製、
（ii）タンパク質加水分解（proteolytic)ドメインの特定
（iii）ＺＡＰ−７０の所望のドメインのタンパク質加水分解的放出を容易にするためプロテアーゼ認識配列を両端に隣接させた配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（iv）適切な宿主細胞における工程（iii）からの完全長ＺＡＰキナーゼの発現
（ｖ）プロテアーゼ認識部位における所望のドメインの制御されたタンパク質加水分解
（vi）所望のＺＡＰ−７０ドメインの迅速な精製。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明結晶性組成物の構造座標は、機械可読性記憶媒体、たとえばコンピューターハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープなどにおいて機械可読性形態で記憶され得、三次元形状として画面に表示されるか、または他に構造座標またはそれらが特定する三次元構造のコンピューター支援による操作またはそれに基づいたコンピューター操作に使用され得る。たとえば、ＺＡＰファミリーのタンパク質、または上記タンパク質の一部分または構造上類似した相同体の三次元構造を特定するデータは、機械可読性記憶媒体に記憶され得、そして典型的には上記記憶媒体からデータを読取り得るコンピューターを用いることにより、タンパク質構造のグラフィカル三次元表示として画面に表示され、上記データからの表示作製についての命令によりプログラム化され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の一実施態様では、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０キナーゼを結晶化し、
（ii）ｘ線回折データを上記結晶についての原子座標形態で集め、
（iii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体の三次元構造を測定するために、表１の原子座標を全体的または部分的に用いる
ことを含む方法が提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明の別の実施態様では、少なくとも１個のリガンドに結合したＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含む複合体の三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）複合体の結晶についてのｘ線回折データを得、
（ii）複合体の三次元構造を測定するために、全体的または部分的に表１の原子座標を用いる
ことを含む方法が提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
ＺＡＰ−７０の触媒結合部位の三次元モデルから得られた知識は様々な方法で使用され得る。たとえば、それを用いることにより、ＺＡＰ−７０に結合し、好ましくはＺＡＰ−７０伝達または関連プロセスまたは事象を遮断または阻止するか、またはＺＡＰ−７０アゴニストとして作用する化学物質、たとえば小有機および生体有機分子、たとえばペプチドミメティクスおよび合成有機分子が同定され得る。ＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を用いることにより、当業者であればＺＡＰ−７０のモデルを構築できるはずである。たとえば、あらゆる原子が適切なファンデルワールス半径の球体として描かれ得、ＺＡＰ−７０触媒ドメインの詳細な表面マップが構築され得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の一実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合する可能なリガンドまたは低分子量化合物を選択するために、表１における原子座標のセットから全体的または部分的に誘導された触媒ドメインの三次元構造を用い
（ii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択する
工程を含む方法が提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明の別の実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインが上記ドメインの少なくともＡＴＰ−結合部位を含むものである方法が提供される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＺＡＰ−７０の阻害性または他の結合性化合物は、コンピューターにより評価され、化学物質またはフラグメントをスクリーニングし、ＺＡＰ−７０の個々の結合部位との会合能力について選択する一連の工程を通して設計され得る。すなわち、当業者であれば、幾つかの方法の一つを用いることにより、ＺＡＰ−７０とのその会合能力について化学物質またはフラグメントをスクリーニングし得る。このプロセスは、たとえば、全体的または部分的に表１の構造座標に基づいたコンピュータースクリーンで結合部位を視覚的に観察することから開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学物質を様々な配向で配置させるか、またはＺＡＰ−７０の触媒結合部位内で「ドッキング」させ得る。ドッキングは、ソフトウェア、たとえばＱｕａｎｔａおよびＳｙＬｙｌ、次いでエネルギー最小化および標準分子力学力場による分子動力学法、たとえばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを用いて実施され得る。専門のコンピュータープログラムは、興味深いフラグメントまたは化学物質を選択するのに有用であり得る。これらのプログラムには、たとえば、英国オックスフォードのオックスフォード・ユニバーシティーから入手され得るＧＲＩＤ、マサチューセッツ、バーリントンのモレキュラー・シミュレーションズから入手され得る５ＭＣＳＳまたはＣＡＴＡＬＹＳＴ、カリフォルニア、ラジョラのスクリップス・リサーチ・インスティテュートから入手され得るＡＵＴＯＤＯＣＫ、カリフォルニア、サンフランシスコのユニバーシティー・オブ・カリフォルニアから入手され得るＤＯＣＫ、英国、ユニバーシティー・カレッジ・オブ・ロンドンから入手され得るＸＳＩＴＥがある。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明は、ＺＡＰ−７０触媒ドメインに結合し得るリガンドまたは低分子量化合物の設計方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を測定するために、全体的または部分的に表１の原子座標を用い
（ii）どれがＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するかを測定するために、候補リガンドまたは低分子量化合物でＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造をプローブし
（iii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（iv）所望により、結合することにより物理的結合特性、たとえば溶解性、親和力、特異性または有効性を最大化するリガンドまたは低分子量化合物を修飾してもよい
工程を含む方法を提供する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
好ましいのは、触媒結合部位で相互作用するＺＡＰ−７０阻害剤の設計方法である。本発明はまた、上記方法により同定される化学物質またはリガンドに関するものである。本発明により可能となる一方法では、ＺＡＰ−７０触媒ドメインの構造座標の使用により、ＺＡＰ−７０キナーゼと結合または会合する化学物質を設計し、種々の点で化学物質の物理特性を改変させる。すなわち、特性、たとえば可溶性、親和力、特異性、有効性、オン／オフ割合、または他の結合特性が全て、改変および／または最大化され得る。種々の物質のライブラリーで触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０結晶をプローブして、候補化学物質およびＺＡＰ−７０間における相互作用に最適な部位を決定することにより、所望の化学物質が設計され得る。たとえば、溶媒で飽和させた結晶から収集された高解像能ｘ線回折データにより、各タイプの溶媒分子が付着する場所が測定され得る。次いで、それらの部位に堅固に結合する小分子を設計し、合成し、所望の活性について試験し得る。一旦所望の活性が得られると、分子はさらに望ましい特性を最大化するように改変され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本発明はまた、小分子データベースのコンピュータースクリーニングまたはＺＡＰ−７０触媒ドメインに全体的または部分的に結合し得る化学物質の設計に関するものである。それらはまた、突然変異体、共複合体、またはＺＡＰキナーゼの少なくとも一部分と相同性であるかまたはそれと会合し得る他のいずれかの分子の結晶性形態の結晶構造の解明に使用され得る。この目的に使用され得る一方法が分子置換である。未知構造であり得る未知結晶構造、たとえばＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインの別の結晶形態、ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン突然変異体またはペプチド、またはＺＡＰ−７０キナーゼとの共複合体、または興味の対象であるＺＡＰ−７０と会合する化学物質の他のいずれかの未知結晶は、表１に示された構造座標の全部または一部を用いて測定され得る。この方法は、本発明によらずに上記情報の測定を試みる場合より迅速かつ有効に未知結晶についての正確な構造形態を提供する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ＺＡＰ−７０モジュレーターの設計においては、以下の局面を考慮すべきである：（ｉ）候補化合物が、物理的および構造的にＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインと会合し得るかどうか、および／または（ii）化合物が、ＺＡＰキナーゼ触媒ドメインとの会合を可能にする立体配座をとるかどうか。有利には、モジュレーターの全体としてまたはそのフラグメントとしてのこれらの能力を評価するプロセスでコンピューターモデリング技術を使用することにより、非有効的候補化合物の合成または試験に要する努力を最小限にする。専門的コンピューターソフトウェアは当業界ではよく知られている。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
実施例６：ＺＡＰキナーゼ触媒ドメインに結合しているスタウロスポリン
限定タンパク質加水分解により特定されたＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン（Ｒ２９８−Ａ６１９；配列番号２）を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−アフィニティー標識を伴うが、２個のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ部位が両端に隣接した完全長ＺＡＰ−７０キナーゼとして再クローン化する。１０リットルのウェーブ（登録商標）バイオリアクター（０.４５ｍ.ｏ.ｉ.；４８時間）で成長させたＳＦ９細胞を用いて、発現を実施する。コンプリート（登録商標）ＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１０％ｖ／ｖグリセリン、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ８.０）中で細胞を溶解する。その精製ライゼートを２０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースカラムに通し、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、次いで緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス、１０％ｖ／ｖグリセリン、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ８.０）により溶離する。クロマトグラフィー工程は全て、氷上または被覆した冷却カラムを用いて実施する。タンパク質を、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、３０％ｖ／ｖのグリセリンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのトリスｐＨ８.０中へ直ちに脱塩し、（５０ｍｌのセファデックスＧ−２５脱塩カラム使用；ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０アマシャム・バイオサイエンシーズ）、濃縮し、スタウロスポリンを加えて２モル過剰とする（ＤＭＳＯに溶かしたスタウロスポリンの正確な量の添加により２ｍｇ／ｍｌとする）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
２つの主要ピークが溶離され、一リン酸化タンパク質は約８０ｍＭのＮａＣｌで溶離し、非リン酸化タンパク質は約１００ｍＭのＮａＣｌで僅かに遅れて溶離する。非−および一リン酸化ＺＡＰキナーゼ触媒ドメインピークを別々に集め、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７.２（５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％ｖ／ｖのエチレングリコール含有）中へ脱塩（ＨｉＬｏａｄ２６／１０カラム）する。スタウロスポリンを、再び１０モル過剰として両形態に加え、それに続いて結晶化するためそれらを１０〜４０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。この脱塩工程により、クロマトグラフィーに要求されるグリセリン（それが無ければタンパク質が沈澱する）が除去され、濃縮工程を通してタンパク質を充分に安定させるが、後続の結晶化を妨げることはない低濃度のエチレングリコールと置き換えられるため、この工程は重大である。他方、３０％ｖ／ｖグリセリンは、蒸発性シッティング・ドロップ工程に対して大きすぎる影響を有するため、結晶化に適切ではない。非リン酸化タンパク質の場合、溶離したピークの半分、３６ｍｌを１３０μｌに濃縮し、３６ｍｇ／ｍｌの最終濃度とする。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
４.０オングストロームの最大解像能までのデータを用いて、ＣＣＰ４における自動分子置換スクリプトにより分子置換を実施する。インプット構造および非対称単位における２分子との５０％フラクション類似性をもつモデルの８０％フラクション完全性が予測される。明瞭な解釈が見出され、標準スクリプトｒｅｆｉｎｅ.ｉｎｐを用いたＣＮＸにおける初回精密化後、構造は４１.７％のＲ因子を有する（ＲＦｒｅｅ４３.５％）。プログラムＯバージョン７.０（Jones et al.、１９９１）によるσＡ−秤量Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを調べると、Ｃ−アルファトレースの大部分および側鎖の大部分についての強い密度が明らかになる。電子密度の外側に見出され、手動で補正しなくてはならない幾つかの挿入および欠失および若干のループが存在する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
全体的構造
結晶構造は非常に明確に特定され、残基３３１および６０３間の完全ｃ−アルファトレースが特定されている。全ループおよび重要な残基は、良好な電子密度を有する。Ｂ−因子分布は予想通りである。スタウロスポリン結合部位およびキナーゼドメインとの全相互作用は詳細に報告され得る。モデルの品質は良好であり、最終Ｒ因子は１８.２％である（Ｒ−ｆｒｅｅ２０.９％）。