【手続補正書】
【提出日】平成18年4月10日(2006.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本明細書および添付のクレームにおいて単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないことが明示されていない限り、複数形も含む。したがって、たとえば、「抗体（ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という場合には、１以上の抗体および当業者に公知のその等価物等を表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
ＭＭＰ７または関連の調節タンパク質に対する好適な抗体は商業ソースから得ることもできるし、あるいは常法にしたがって作製することもできる。たとえば、本明細書には、示唆的に発現される１以上の遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の作製方法が記載されている。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより作製されるフラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本明細書で述べるＭＭＰ７ポリペプチドに対する抗体の作製のためには、種々の宿主動物を、ポリペプチドまたはその一部を注射することで免疫化すればよい。このような宿主動物としては、限定はされないが、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられる。免疫応答を増強するために、宿主の種に応じ、限定されるものではないが、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用いてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本発明の医薬組成物はまた、核酸レベルでＭＭＰ７の発現を阻害する物質を含んでもよい。このような分子としては、ＭＭＰ７核酸の適当なヌクレオチド配列に向けられたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが挙げられる。これらの阻害分子は、当業者ならば過度な労力や実験なく、通常の技術を用いて作出することができる。たとえば、遺伝子発現の改変（たとえば、阻害）は、本明細書で論じるポリペプチドをコードする遺伝子の重要な領域に対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得ることができる。３０００ヌクレオチドのｍＲＡＮならば、約３００００通りの異なる１０〜２０マーの可能性がある。ｍＲＮＡについてのこの３００００通りの可能性のある１０〜２０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドのどれだけのものが、また、どれが有用な活性を有するのかは先験的に推定することができないが、実験では小数が活性を有することが示されている。最適なオリゴヌクレオチドを同定する最も確実な方法は、３００００通り全ての配列を合成し、それらを個々に試験することであろう。これを実施するには膨大な労力がかかる。好適な化合物を提供する１０〜３０の間の異なるアンチセンス配列の小規模なセレクションが文献で数多く報告されている。これは標的ＲＮＡのどの領域がオリゴヌクレオチドの結合のために開放するのかを推定可能とする助けとなるが、ｍＲＮＡのある領域が接近可能かどうかを決定する方法には限りがある。ＲＮＡの二次的相互作用を推定するコンピュータープログラムが利用できるが、比較的原始的な方法であり、長いポリヌクレオチド（たとえば、数百を超えるヌクレオチド）について信頼性のある推定を得ることはできない。ＲＮＡの一本鎖および二本鎖領域を明らかにするために酵素マッピング実験（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：  １２０５５−１２０６１  （１９９２））  が用いられたが、単調で時間がかかり、種々の酵素で何回もインキュベーションを行い、いくつかのポリアクリルアミドゲルを用いる必要がある。短いＤＮＡオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを用いたＲＮＡが接近可能な領域のマッピングは最近導入された技術である（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：６２６−６３８  （１９９７））。ライブラリーのメンバーとこのＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ＲＮアーゼＨを導入して、形成した二重らせんを切断する。次に、これらの領域をポリアクリルアミドゲル上で同定する。この方法もまた、ゲルの分離能に限界があるため単調で時間がかかり、この情報を用いるということは、短いオリゴヌクレオチドにより局在化された一本鎖領域がまたより長いアンチセンス配列に対しても十分な結語部位となると仮定される誤差を伴う。アレイスキャン技術によれば、完全なセットのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合能力を直接読みとることができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる高親和性二重らせん形成のためのＲＮＡ標的の接近可能な領域の同定に向けた大きなステップとなることが明らかである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ��ｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  １３６８−１３７３  （１９９４））。この方法はそれ自体まったく直接的なものであり、同領域の専門家によるいくつかの刊行物に詳細に記載されている（たとえば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  １３６８−１３７３  （１９９４）およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：５３７−５４１  （１９９７）；  Ｓｏｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３：  ６７−７２  （２０００）；  ＷＯ  ９５／１１７４８参照）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
ＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するための上記方法の他、本明細書では、限定されるものではないが、ＭＭＰ７をはじめとする、本明細書で論じられるポリペプチドのインビボ転写を阻害するため、小分子または他の天然産物を同定および使用できるということも意図される。たとえば、当業者ならば、常法を用いて細胞系の培地から得たサンプルに容易に適用できるＭＭＰ７に関するアッセイを確立することができるであろう。このアッセイを用いて細胞系をスクリーニングし、ＭＭＰ７を発現するものを見つけ出すことができる。これらの細胞系は神経起原のものであってもよく、たとえば９６ウェルプレートで培養する。細胞系におけるＭＭＰ７の調節が背根神経節（ＤＲＧ）における発現に密接に関わっているほど、その細胞系におけるＭＭＰ７発現の小分子改変因子がインビボにおけるＤＲＧ中のＭＭＰ７もまた改変するという可能性が高くなる。一次組織ＤＲＧ外植片および細胞系に対していくつか知られている遺伝子発現の改変因子、たとえばデキサメタゾン、ホルボールエステル、熱ショックの作用を比較すれば、使用に最も適した細胞系が選択できる。その後のスクリーニングとしては、単に、各ウェルに種々の化合物を加えて所定の時間細胞を培養した後、ＭＭＰ７の活性／ｍＲＮＡレベルをアッセイすることからなる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
治療上有効な用量とは、慢性痛の病理作用を処置および／または改善するのに有用な有効成分、たとえば化合物Ａ、ＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、ＭＭＰ７または関連の調節タンパク質に対する抗体もしくはそのフラグメントの量をさす。治療効果および毒性は細胞培養系または実験動物において標準的な薬学手順、たとえばＥＤ５０（その集団の５０％に治療上有効な用量）およびＬＤ５０（その集団の５０％に致死的な用量）によって求めることができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒト用の用量範囲の処方に用いられる。このような組成物中に含まれる用量は毒性がほとんど、またはまったくなく、ＥＤ５０値を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。用量は用いる投与形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で可変である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
実施例２
Ｓｅｌｔｚｅｒの慢性痛モデルにおける化合物Ａの活性
上記のようなＳｅｌｔｚｅｒのラット神経痛モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０）において機械的痛覚過敏症および異痛症に対する化合物Ａの作用を検討する。このモデルでは痛覚過敏症および異痛症は術後約１日で同側（結紮）の後足に誘導され、数週間持続する。機械的痛覚過敏症はＡｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ  （Ｕｇｏ−Ｂａｉｌｅ，  Ｍｉｌａｎ）を用いて加圧刺激の上昇に対する両後足の払いのけ閾値を測定することで評価する。機械的異痛症は、両後足の足底表面にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒによって与えた無害な機械的刺激に対する払いのけ閾値を測定することで評価する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
実施例３
ＭＭＰ７阻害剤の同定のための９６ウェル蛍光アッセイ
ＭＭＰ７の阻害は蛍光基質（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｌｅｕ−［Ｎ３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノ−プロピオニル］−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ２  （ＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ（Ｄｐａ）ＡＲ）（Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｇ．Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．  ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  ２９６，  ２６３−２６６  （１９９２））を用いて測定される。０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中の組換えヒトＭＭＰ７（２．３４ｎＭ）（最終量８０μｌ）を１０μｌの試験化合物（５μＭ）とともに２４℃で３０分間インキュベートする。プレインキュベーション期間の後、１０μｌのＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ（Ｄｐａ）ＡＲ（２μＭ），  ｐＨ７．５を各ウェルに加える。触媒作用を２４℃で１０分間継続させる。このインキュベーション期間の後、１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム，  ｐＨ４．０の添加により反応を停止させる。各ウェルの蛍光を励起波長３２８ｎｍ、発光３９３ｎｍを用いて記録し、対照と比較して阻害％を求める。有効化合物を、酵素機能の＞５０％阻害を誘発するものとして同定する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
実施例４
ＭＭＰ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成：
ＭＭＰ７の発現を含む遺伝子発現を阻害するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は常法にしたがって作製することができる。たとえば、インビトロにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯは両末端のヌクレオチドがＭＯＥ（メトキシエトキシ）基で修飾された、完全または部分的ホスホロチオエート化ホスホジエステル１８マーであり得る。たとえば、インビボにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯは両末端をＭＯＥ（メトキシエトキシ）基で修飾されたヌクレオチドを伴う、部分的ホスホロチオエート化または完全ホスホジエステル１８マーであり得る。これらはホスホルアミダイト化学法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、常法にしたがい、エレクトロスプレー質量分析法およびキャピラリー電気泳動法により同定することができる。各々３８〜７２％の間のＧＣ含量を有するＡＳＯを選択し、ＭＭＰ７のコード領域の一部に相補的なものを合成すればよい。誤対合を含むコントロールオリゴヌクレオチドとしては、適合オリゴヌクレオチドに近い塩基組成を維持すればよい。さらに、たとえば一方はラットＧＡＰＤＨコード領域で、もう一方はランダム合成ＡＳＯといったように、２つのコントロールＡＳＯを選択してもよい。抗ラットＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドの形式は抗ＭＭＰ７オリゴヌクレオチドの場合と同様であってよく、合成オリゴヌクレオチドは中央部にホスホロチオエートまたはホスホロジエステルＤＮＡ残基を含む配列の両末端にＭＯＥリボヌクレオチド修飾を持ち得る。