【事件の表示】
　平成１０年特許願第１２３８６５号「ＡＴＰ消去剤含有微生物培養寒天培地」拒絶査定不服審判事件〔平成１１年１１月　２日出願公開、特開平１１−２９９４７６〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は，平成１０年４月２０日の出願であって，平成１９年８月２３日付けの拒絶理由通知に対して，平成２０年２月２８日に意見書が提出され，その後，同年７月１日付けで拒絶査定がなされ，これに対し，同年１０月６日に拒絶査定に対する不服審判の請求がなされるとともに，同年１１月５日付けで手続補正がなされ，同年１２月２５日に審判請求の理由を補正する手続補正書（方式）が提出され，平成２２年１１月２９日付けの審尋に対し，平成２３年５月３１日に回答書が提出されたものである。
　
第２　平成２０年１１月５日付けの手続補正について
　平成２０年１１月５日付けの手続補正（以下，「本件補正」という。）は，補正前の請求項１及び２を削除し，補正前の請求項３を新たに請求項１としたものであり，平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前（以下，「平成１８年改正前」という。）の特許法第１７条の２第４項第１号に規定する請求項の削除を目的とするものに該当する。
　よって，本件補正は適法なものということができる。
　
第３　本願発明
　以上のように，本件補正は適法なものであるから，本願請求項１に係る発明（以下，これを，「本願発明」という。）は，本件補正により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載される次のとおりのものであると認める。
「メンブレンフィルターを適用して濾過，捕集，培養し，増殖した菌に由来するアデノシン５’−三リン酸に基づく発光を輝点として捉え測定する生菌数測定方法において，アデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼを含有する微生物培養寒天培地又はアデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種とを含有する微生物培養寒天培地上で培養することを特徴とする生菌数測定方法。」
　
第４　原査定の理由
　拒絶査定における拒絶理由の概要は，本願発明は，その出願前に頒布された下記引用文献１〜３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができるものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない，というものである。
引用文献１：特開平９−１８２６００号公報
引用文献２：特開平６−２３７７９３号公報
引用文献３：特開平８−２２４０９６号公報　
　
第５　引用刊行物の記載事項
１　刊行物１に記載された事項
　原査定で引用文献２として引用され，本願出願前に頒布された刊行物である「特開平６−２３７７９３号公報」（以下，「刊行物１」という。）には，以下の事項が記載されている。
　なお，下線は当審にて付与したものである。以下，同様である。
　
（刊１−１）「【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，その上から生菌中の発光成分を抽出するための液体抽出試薬を霧状に噴霧し，次いで該発光成分を発光させる液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ，その発光量を発光量測定装置を用いて測定することを特徴とする生菌数を測定する方法
【請求項２】前記発光試薬の濃度が標準濃度の３〜６倍である請求項１項記載の生菌数を測定する方法。
【請求項３】前記発光試薬がルシフェリン−ルシフェラーゼである，請求項１ないし２のいずれかに記載の生菌数を測定する方法。
【請求項４】前記
発光成分がアデノシン三燐酸
　
（刊１−２）「【００１２】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら，上記のように親水性区画と疎水性隔壁とを有する濾過膜要素を用い，ＡＴＰ抽出液と発光液とを順に霧状に噴霧（スプレー）する方法，あるいは更に抽出液を揮発性のものにした方法を，食品，製薬，化粧品あるいは電子工業において実際に使用されている純水，原料，中間品あるいは製品から採取された検体液（実液）中に存在する少数個の生菌を検出・計数する場合には，未だ若干の問題が残されている。
【００１３】例えば食品工業において，中間品あるいは製品であるビールあるいは酒中に含まれる生菌の内，１個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は問題は少ないが，酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程度である細菌類を検出乃至計数する場合には問題が少なくない。
その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自身からのノイズや，実液中に含まれるノイズ発光成分のため，生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合があり
細菌の付着保持されている濾過膜を好ましくは細菌の種類に適した寒天培地
上に置き，２５−３７℃で４−１５時間培養を行って同じ区画内で生菌を増殖させた後濾過膜で捕捉された細菌の捕捉極近傍内でＡＴＰ抽出発光を行い，発光画像解析システムを用いて細菌数の検出・計数を行う必要がある。
　
（刊１−３）「【００２６】本発明の最も好ましい態様は，生菌体中の抽出される成分がＡＴＰの場合である。この場合の抽出試薬はＡＴＰ抽出試薬（例えばルーマック社製のＮＲＢ（商品名））であり，これを噴霧器（例えば松下電工製，超音波式吸入器（商品名））を用いて微粒子状に噴霧し，濾過膜内に捕捉されている生菌のＡＴＰを抽出し，次いで同様にして発光試薬（例えばルーマック社製Lumit-ＰＭ）を上記噴霧器を用いてスプレーし，発光せしめる。次に，上記したように，その標本を前記の生物発光画像解析システムを用い，３０〜１８０秒間の発光を累積させた後，バックグラウンドの発光より強く発光している輝点のみをテレビモニターに残して表示する。すなわち，同一の検体液を無菌処理したものを同量濾過した濾過膜を上記同様の処理を行って発光させた場合に最高輝度（以後閾値とする）をテレビモニター画面から完全に消去する操作を行うことによってテレビモニターに表示される輝点数が直接生菌数を示すことになる。」
　
（刊１−４）「【００２８】さらに，このようにして発光せしめた標本（濾過膜）を生物発光画像解析システムにかけることにより，１個の検体からの微弱発光を２次元検出出来るようになったため，生菌数の極めて少ない場合においても自動的に，高感度でしかも迅速・簡便に生菌数を測定することができるようになったのである。すなわち，テーパーファイバー，光増幅部，撮像管からなるテレビカメラヘッドの採用により生菌由来の発光を非常に強い輝点として捉えること（認識）ができるようになったため，生菌以外からの発光ノイズを閾値として定めることにより消去することが容易に行なわれ，生菌数の極めて少ない場合（例えば数個／１００ｍｌ検体液以下の場合）も，自動的にしかも迅速・簡便に測定可能となったのである。又，食品や清涼飲料水等の大腸菌検査のように検体液中に存在する１個の生菌の有無を検出することが重要な場合がある。本発明はその様な場合でも適用が可能であるが，細菌の場合には好ましくは，検体液を濾過し生菌を捕捉した濾過膜を該生菌の増殖に最も適した栄養を含ませたパッドあるいは栄養寒天平板上に置いて短時間（例えば３時間以内）培養を行ない，同一区画内で生菌を増殖させた後測定に供することにより，極めて強い輝点が得られるのでより正確な判定法が提供されることになる。なお，この程度の培養条件では勿論１個の細胞からコロニーの形成に達することはない。」
　
（刊１−５）「【００３７】実施例５
市販缶ビール（Ｂ社製）３００ｍｌを無菌濾過したものに実施例３と同様に１夜培養した乳酸菌（Lactobacillus brevis  ＩＦＯ  ３３４５）をhepes 緩衝液を用いて約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈し，その０．２ｍｌを
ポリカーボネート膜（商品名アイソポア０．４μｍ，４７ｍｍφ，日本ミリポア・リミテッド製
　
２　刊行物２に記載された事項
　原査定で引用文献１として引用され，本願出願前に頒布された刊行物である「特開平９−１８２６００号公報」（以下，「刊行物２」という。）には，以下の事項が記載されている。　
（刊２−１）「【特許請求の範囲】
【請求項１】アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを特徴とするＡＴＰ消去剤。
【請求項２】アピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とするＡＴＰ消去剤。
【請求項３】ＡＴＰ含有試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを添加することを特徴とするＡＴＰ消去法。
【請求項４】ＡＴＰ含有試料にアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを併用添加することを特徴とするＡＴＰ消去法。
【請求項５】アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを特徴とする生物細胞測定試薬。
【請求項６】アピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ，アデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれた少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とする生物細胞測定試薬。
【請求項７】生物細胞を含有する試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し，次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法。
【請求項８】生物細胞を含有する試料にアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ，アデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し，次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法。」
　
（刊２−２）「【０００３】上記の要求を満たす微生物濃度測定法として，生きた微生物には必ず存在するＡＴＰを生物発光法を用いて測定する方法が知られている。この方法は細胞を含む試料を，界面活性剤，トリクロロ酢酸（ＴＣＡ），トリス緩衝液，エタノール又は溶菌酵素等を含んだ抽出試薬と接触させて，細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した後，抽出したＡＴＰを蛍の発光の基質であるルシフェリンと酵素であるルシフェラーゼを含んだ発光試薬と接触し，ルシフェリン，ルシフェラーゼ及びＡＴＰによる酵素反応により生物発光させ，その生成した発光量を測定して細胞内ＡＴＰを測定し，細胞の測定を行う方法である。ところが，ＡＴＰは本来，その量の差こそあれ，すべての生物の細胞内に含まれるもので，微生物ばかりでなく，単細胞生物にも，そして動植物組織の細胞にもいわゆる体細胞として存在し，
またさらに生物細胞の周辺にはフリー（遊離）のＡＴＰが存在する。従って，ある生物細胞を含有する試料から生物細胞だけに存在するＡＴＰを検出しようとしても，生物細胞中のＡＴＰと，その周辺に存在する遊離ＡＴＰが一緒になって検出されてくる。即ち，生物細胞の測定にＡＴＰを指標にしようと思っても今述べた生物細胞以外の遊離ＡＴＰがバックグランド発光量（ノイズ）として同時に測定され，検出感度の低下を招来する欠点を有する
　
（刊２−３）「【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果，
アデノシンリン酸デアミナーゼに着目し，これを単独で，もしくはこれとアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれた少なくとも一種とを併用することにより，試料に含まれるＡＴＰを極力低い値に消去できることを発見した。またこのＡＴＰ消去法と生物発光法を組合わせるときは，生物細胞以外の遊離ＡＴＰを極力低い値まで消去し，バックグランド発光量（ノイズ）の影響を取り除いて，生物細胞のもつＡＴＰのみを測定することにより，精度良く生物細胞の推定が可能となることを知り
　
（刊２−４）「【００１８】本発明の生物細胞の測定法は，大腸菌等の細菌，酵母菌，乳酸菌等の微生物細胞，植物細胞及び動物細胞等の生物細胞を含有する試料に，
アデノシンリン酸デアミナーゼを単独で，又はこれにアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを併用添加して該試料中の遊離ＡＴＰを予め消去し，次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することにより行なわれる
　
（刊２−５）【００４５】
【実施例３】
（
アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼを併用して
【００４６】実施例２と同様にして，無菌の酵母エキスを５ｍｌづつ６区分に分け，各区分に図４に示す各終濃度となるように，
アピラーゼ酵素液とアデノシンリン酸デアミナーゼ酵素液を入れ，３７℃で９０分反応させ，酵母エキス中のＡＴＰを消去した。得られた遊離ＡＴＰを消去した酵母エキス（両酵素の活性はそのまま維持）１００μｌに，キッコーマン社製ＡＴＰ抽出試薬を用いて希釈した２×１０-11 ＭのＡＴＰ標準液を１００μｌ加え，速やかに実施例１と同様にして発光測定を行ない，その発光量Ａを求めた。
【００４７】図４の結果から，アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼを併用添加するＡＴＰ消去法において，アデノシンリン酸デアミナーゼの濃度が高いとき，即ち終濃度が０．５〜０．２Ｕ／ｍｌであるときは，ＡＴＰ残存率が低く，約６０％以下となるが，終濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以下の濃度であるときは，殆どＡＴＰが分解されることはなく，従ってＡＴＰ残存率を７０％以上保持することができることが判る。そして，図３および図４の結果から，アデノシンリン酸デアミナーゼの終濃度は，低過ぎると酵母エキスの遊離ＡＴＰ消去が充分ではなく，反対に高過ぎると遊離ＡＴＰばかりでなく，抽出されたＡＴＰ（この実施例においては添加したＡＴＰ）をも分解消去し，そのため抽出されたＡＴＰの残存率が低下する危険性を有するので好ましくない。しかし，
アデノシンリン酸デアミナーゼを０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ添加するときは遊離ＡＴＰ消去が充分に行なわれ，しかも該酵素は抽出されたＡＴＰに対しては殆ど影響をもたず，その残存率を７０％以上に保持することができることが判る
　
（刊２−６）「【００６４】
【実施例９】
（
ＡＴＰ消去剤の影響を取り除いた状態で，スタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰ量を測定した例
【００６５】以下の各工程をこの順序で行い，実際の被検微生物スタフィロコッカス・アウレウスの培養液の生物細胞数の測定を行った。
第一工程；被検微生物を標準液体培地で培養して，培養液を調製する。
第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消去
第三工程；標準液体培地を利用した希釈液の調製　
第四工程；遊離ＡＴＰを消去した培養液を希釈液で希釈し被検微生物懸濁液の調製
第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定
第六工程；被検微生物懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し，該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴＰと，抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるトータルＡＴＰの発光測定
第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出
第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出
第九工程；補正値に対するＡＴＰ濃度の算出
第十工程；混釈培養法により，被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出
第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
【００６６】（第一工程；被検微生物を標準液体培地で培養して，培養液を調製する）オートクレーブにより滅菌処理した標準液体培地（０．２５％酵母エキス，０．５％トリプトン，０．１％ブドウ糖，ｐＨ７．１）８ｍｌにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３を一白金耳接種し，３５℃で一晩静置培養して，被検微生物の培養液を得た。
【００６７】（第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消去）該培養液（生菌体を多量に含有する）２ｍｌに，
アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し，３５℃で３０分間処理して，培養液の遊離ＡＴＰを予め消去した。
【００６８】（第三工程；標準液体培地を利用した希釈液の調製）
一方上記微生物を接種しない標準液体培地１００ｍｌにアピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して，３５℃で９０分反応して遊離ＡＴＰを消去し，ついでオートクレーブで１２０℃１５分間滅菌処理して両酵素を失活させ，遊離ＡＴＰが消去された無菌標準液体培地からなる希釈液を調製した
【００６９】（第四工程；
遊離ＡＴＰを消去した培養液を希釈液で希釈して被検微生物懸濁液の調製）第二工程で得られた，遊離ＡＴＰを消去した培養液に第三工程で得られた希釈液を添加して，被検微生物の１００００倍希釈懸濁液を調製した。これを３５℃で３０分間保持して発光測定用の試料とした
【００７０】（第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定）被検微生物の１００００倍希釈懸濁液１００μｌに，滅菌超純水１００μｌを添加し発光試薬１００μｌを添加し，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて発光測定した。この測定により被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（以下フリーの発光量Ｆという）を求める。
【００７１】（第六工程；被検微生物の懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し，該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴＰと，抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるトータルＡＴＰの発光測定）被検微生物の希釈懸濁液１００μｌにキッコーマン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に，発光試薬を１００μｌを添加して，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて，発光測定した。この測定によって試料の遊離ＡＴＰと抽出剤の作用により微生物菌体外に抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）とのトータルＡＴＰの発光量（Ｔ）を求めた。
【００７２】（第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出）前工程のトータル発光量（Ｔ）からフリー発光量（Ｆ）を減ずることにより，菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求めることができる。
【００７３】（第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出）ここに至るまでにおけるルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光反応は，試料に含まれる成分により多少の阻害を受けるため，発光阻害を受けないときの発光量を得るには補正をしなければならない。補正は以下のようにした行なった。即ち，被検微生物懸濁液１００μｌに２×１０-10ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し，２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて発光量を測定し，内標準発光量Ｈを求めた。上記内標準発光量の測定法において，被検微生物懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は，全く同様にして発光量を測定し，本標準発光量Ｇを求めた。内標準発光量Ｈからフリー発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより，発光率Ｋを求め，第七工程で得られた菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより，発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量Ｙ（補正値）を求めた。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００７４】（第九工程；補正値に対応するＡＴＰ濃度の算出）発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求めた。
【００７５】（第十工程；混釈培養法により，被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）滅菌シャーレに適宜希釈した被検微生物懸濁液の一定量を滅菌ピペットで無菌的に加え，約５０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地（０．２５％酵母エキス，０．５％トリプトン，０．１％ブドウ糖，ｐＨ７．１，２．０％寒天）を加え，シャーレの蓋をして，前後左右にゆるく動かし，かつ回すようにして被検微生物懸濁液と培地とを均一に混和し，３５℃で２４時間培養して，出現したコロニー数を計測し，希釈率から原液１ｍｌ当り存在する微生物数（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（ＣＦＵ））を推定する。
【００７６】
（第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定）発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を第十工程で求めた被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍｌ）で除することにより，スタフィロコッカス・アウレウスの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。その結果，２×１０
-17
ｍｏｌ／ＣＦＵを得た
【００７７】
                               表１
スタフィロコッカス・アウレウスのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）
  希釈率 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　10,000倍
  トータル発光値（Ｔ）　　　　　　　　　　　　　　　　　16,198
  フリー発光値（Ｆ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　905
  Ｔ−Ｆ発光値　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15,293
  補正発光値　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21,268
  ＡＴＰ濃度（mol/ml）　　　　　　　　　　　　　　　　　2.54×10-13　
実測値（混釈培養法）（CFU/ml）　　　　　　　　　　　　　1.27×104 　
ＡＴＰ量（mol/CFU）　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.00×10-17」
　
（刊２−７）「【００７８】
【実施例１０】
（実施例９において得られたスタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰの測定値（約２×１０-17ｍｏｌ）を用いて
ＡＴＰ消去剤の影響下，その活性を保持した状態でスタフィロコッカス・アウレウス培養液の希釈懸濁液の生菌体ＣＦＵの測定法
第一工程；培養液を希釈液で所定濃度まで希釈し，被検微生物の希釈懸濁液の調製。
第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去。
第三工程；被検微生物の希釈懸濁液に微存する遊離ＡＴＰの発光測定
第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し，微存する遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるトータルＡＴＰの発光測定
第五工程；菌体内ＡＴＰの算出
第六工程；補正発光量の算出
第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出
第八工程；スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出。
第九工程；比較例（混釈培養法による被検微生物の希釈懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
【００７９】（第一工程；培養液を希釈液で所定濃度まで希釈し，被検微生物の希釈懸濁液の調製）前記実施例の第一工程で得られたスタフィロコッカス・アウレウスの培養液を，オートクレーブにより加熱滅菌処理した標準液体培地（希釈液）で，１万倍，１０万倍，１００万倍，１０００万倍に希釈し，被検微生物の希釈懸濁液を得た。
【００８０】（第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上記被検微生物の希釈懸濁液にアピラーゼとアデノシンリン酸デアミナーゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して，３５℃で３０分反応して，ＡＴＰを消去した
【００８１】（第三工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量測定）
被検微生物の希釈懸濁液１００μｌに滅菌超純水１００μｌを添加し，発光試薬１００μｌを添加し，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて，発光量を測定した。この測定により被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（Ｆ）を求めることができる
【００８２】（第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し，遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるトータルＡＴＰの発光量を求める）被検微生物の希釈懸濁液１００μｌにキッコーマン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に，発光試薬を１００μｌを添加して，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて，発光量を測定した。この測定により，抽出剤の作用により抽出された菌体内ＡＴＰの発光量および懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の和を求めることができるので，これをトータル発光量Ｔとした。
【００８３】（第五工程；菌体内ＡＴＰの算出）このトータル発光量Ｔからフリー発光量Ｆを減ずることにより，菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求める。
【００８４】（第六工程；補正発光量の算出）ここに至る各工程においてルシフェリン−ルシフェラーゼによる生物発光反応は，懸濁液に含まれる成分により多少の阻害を受けるため，以下の方法により補正し阻害を受けない場合の発光量を求める。被検微生物の希釈懸濁液１００μｌに２×１０-10ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し，２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して，キッコーマン社製ルミテスターＫ−１００にて内標準発光量Ｈを求めた。上記内標準発光量Ｈの測定において，被検微生物の希釈懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は，全く同様にして本標準発光量Ｇを求めた。内標準発光量Ｈからフリー発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより発光率Ｋを求め，菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより，補正発光量Ｙを求める。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００８５】（第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出）補正発光量Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求める。
【００８６】（第八工程；スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出）第七工程で求めた補正発光量に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を前記実施例９の第十一工程（最終工程）で求めたスタフィロカッカス・アウレウスのＣＦＵ当たりのＡＴＰ量，約２×１０-17ｍｏｌで除することにより，スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出した。
【００８７】第九工程；比較例（混釈培養法による被検微生物の希釈培養液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）滅菌シャーレに適宜希釈した被検微生物浮遊液の一定量を滅菌ピペットで無菌的に予め加え，約５０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地を加え，シャーレの蓋をして，前後左右にゆるく動かし，かつ回すようにして被検微生物浮遊液と培地とを均一に混和し，３５℃で２４時間培養して，出現したコロニー数を計測し，希釈率から被検微生物浮遊液のｍｌ中に存する微生物数（ＣＦＵ）を測定した。こうして求めたＣＦＵ濃度を混釈法により求めた実測値（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。以上の結果をまとめて表２に示す。
【００８８】
                               表２
スタフィロコッカス・アウレウスの生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定
  希釈率（倍）　10,000     　　100,000    　1,000,000   　 10,000,000 
   
トータル発光値                
  （Ｔ）　　　　10,520 　　　1,212 　　　125  　　　　23
フリー発光値                             
  （Ｆ）　　　　　27 　　　　　18 　　　　12 　　　　13　
　
Ｔ−Ｆ発光値　10,493 　　　1,194　　　　113　　　　10　
　
補正発光値　　22,493 　　　2,558 　　　243　　　　　23
　
ＡＴＰ濃度                        
  （mol/ml）     2.68×10-13  　3.05×10-14 　2.90×10-15 　2.68×10-16　
　
計算値（本実施例）                  
  （CFU/ml）     1.34×104 　　1.53×103   　1.45×102　　1.34×10
　
実測値（混釈培養法）                      
  （CFU/ml）　1.11×104 　 1.34×103 　 1.07×102 　　1.00×10　」
　
（刊２−８）「【００９７】表１〜表６の結果から，本発明の方法によれば，従来最も精度が高く，測定値の信頼性が高いと言われている，混釈培養法に匹敵するＡＴＰの測定法を提供することができる。そして，本発明によれば従来法が必要としていた培養工程を省略することが可能となり，検査に要する時間が数十分にて完了できるので，処理時間を従来法に比べて大幅に短縮することができる。また，希釈するための実験器具，希釈したり培地を調製するための時間と労力を大幅に軽減することができることが判る。また標準液体培地及びＹＭ培地において，遊離ＡＴＰはそれぞれ相対発光値（ＲＬＵ）で９２１００及び１３９３５０もあり，菌数の測定はできなかった。しかし，ＡＴＰ消去試薬により遊離のＡＴＰを消去し，フリー発光値を低下させることにより，スタフィロコッカス  アウレウスや，サッカロミセス  セレビシエのように１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的多い場合では，数１０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能であり，エセリシア  コリのように，１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的少ない場合では，４０から５０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能となった。
よって，ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも，検出感度が十分に高いことが判る。
ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも，正確な菌数の測定が可能であることが判る。ま
　
（刊２−９）「【００９９】
【実施例１６】
（バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法）実質的に無菌の醤油麹２０ｇにバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＨＵ１０３５を図１２に示す添加量（個／麹ｇ）となるように添加し，人為的にバチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹を得た。この醤油麹に０．３ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を８０ｍｌ添加して，よく攪拌し懸濁液を調製した。
次いで，前記懸濁液８ｍｌに，上記実施例１５に記載したＳＣＤ培地の４倍濃度調製液（トリプトン６．０％，ソイトン２．０％，ＮａＣｌ２．０％，ｐＨ７．３）２ｍｌ及び２％ナイスタチン（麹菌の生育阻害剤）の７０％エタノ−ル溶液５０μｌ，アデノシンリン酸デアミナ−ゼ５Ｕ／ｍｌを２０μｌ（終濃度０．０１Ｕ／ｍｌ）を加えて３５℃でバチルス・ズブチリスのみを選択的に静置培養し，この培養の途中において培養液を経時的に１００μｌづつ採取して，キッコ−マン製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌ添加し，２０秒後にキッコ−マン製ルシフェ−ルＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）の１００μｌを添加し，キッコ−マン製ルミテスタ−Ｋ−１００で発光測定（数値は相対発光量で示した）を行なった。
【０１００】前述したように表７の結果からＳＣＤ培地には高濃度の遊離ＡＴＰが存在し，相対発光量値は２７１８を示す。この値は本実施例の５．０×１０3個／ 麹ｇの区分における４時間経過後のバチルス・ズブチリス由来のＡＴＰ濃度（相対発光量＝約３０００）と区別できない。そのため，ＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰを消去しない従来法においてはバチルス・ズブチリスの正確な測定ができないことが判明した。これに対し本発明によれば，図１２の結果から明らかなように，予めＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰを消去することにより，バチルス・ズブチリス由来の正確なＡＴＰ量の測定ができることが判る。」
　
（刊２−１０）図１２
　
　
第６　刊行物１に記載された発明
　刊行物１の摘示（刊１−１）には，
「【請求項１】疎水性の
濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，その上から生菌中の発光成分を抽出するための液体抽出試薬を霧状に噴霧し，次いで該発光成分を発光させる液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ，その発光量を発光量測定装置を用いて測定することを特徴とする生菌数を測定する方法
【請求項４】前記
発光成分がアデノシン三燐酸
「疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，その上から生菌中の
アデノシン三燐酸
アデノシン三燐酸
　そして，上記方法の態様として，摘示（刊１−２）には，
「更に効果的には，
細菌の付着保持されている濾過膜を好ましくは細菌の種類に適した寒天培地
上に置き，２５−３７℃で４−１５時間培養を行って同じ区画内で生菌を増殖させた後濾過膜で捕捉された細菌の捕捉極近傍内でＡＴＰ抽出発光を行い，発光画像解析システムを用いて細菌数の検出・計数を行う必要がある
「疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行って生菌を増殖させた後濾過膜で捕捉された細菌の上から生菌中のアデノシン三燐酸を抽出するための液体抽出試薬を霧状に噴霧し，次いで該アデノシン三燐酸を発光させる液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ，発光画像解析システムを用いて細菌数の検出・計数を行うことを特徴とする生菌数を測定する方法。」
　
第６　対比
　本願発明と引用発明１とを対比する。
１　引用発明１における「疎水性の濾過膜」は，具体的には，「
ポリカーボネート膜（商品名アイソポア０．４μｍ，４７ｍｍφ，日本ミリポア・リミテッド製
　そして，引用発明１においては「その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉」ているから，生菌が，濾過膜で濾過，捕集されていることは明白である。
　さらに，その後，引用発明１においては「細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行って生菌を増殖させ」とあるから，培養がなされている。
　そうすると，引用発明１の「疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行って生菌を増殖させ」た生菌は，本願発明の「メンブレンフィルターを適用して濾過，捕集，培養し，増殖した菌」に相当するといえる。
　
２　引用発明１に係る「アデノシン三燐酸」は，本願発明の「アデノシン５’−三リン酸」のことである。そして，引用発明１においては「細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行って生菌を増殖させた後濾過膜で捕捉された細菌の上から生菌中のアデノシン三燐酸を抽出する」から，培養を行って増殖させた生菌からアデノシン三燐酸が抽出されることとなる。そうすると，このアデノシン三燐酸は，培養を行って増殖させた生菌由来であるということができる。
　そうすると，引用発明１の「疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過し，その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉し，細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行って生菌を増殖させた後濾過膜で捕捉された細菌の上から生菌中のアデノシン三燐酸を抽出」したアデノシン三燐酸は，本願発明の「メンブレンフィルターを適用して濾過，捕集，培養し，増殖した菌に由来するアデノシン５’−三リン酸」に相当することは明白である。
　
３　引用発明１の「濾過膜で捕捉された細菌の上から生菌中のアデノシン三燐酸を抽出するための液体抽出試薬を霧状に噴霧し，次いで該アデノシン三燐酸を発光させる液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ，その発光量を発光量測定装置を用いて測定する」ことについて，摘示（刊１−２）に「その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自身からのノイズや，実液中に含まれるノイズ発光成分のため，
生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラウンド（ノイズ発光）と
その場合は
細菌数の検出・計数を行う必要がある
　そうすると，引用発明１の「濾過膜で捕捉された細菌の上から生菌中のアデノシン三燐酸を抽出するための液体抽出試薬を霧状に噴霧し，次いで該アデノシン三燐酸を発光させる液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ，その発光量を発光量測定装置を用いて測定する」方法は，本願発明の「アデノシン５’−三リン酸に基づく発光を輝点として捉え測定する生菌数測定方法」に相当する。
　
４　引用発明１は「細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養を行」うのものであるが，培地にアデノシン５’−三リン酸の消去剤を加えてはいない。
　そうすると，引用発明１の「細菌の付着保持されている濾過膜を細菌の種類に適した寒天培地上に置き，培養」することと，本願発明の「アデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼを含有する微生物培養寒天培地又はアデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種とを含有する微生物培養寒天培地上で培養すること」とは，「微生物培養寒天培地上で培養する」点で共通する。
　
５　本願発明と引用発明１との一致点
「メンブレンフィルターを適用して濾過，捕集，培養し，増殖した菌に由来するアデノシン５’−三リン酸に基づく発光を輝点として捉え測定する生菌数測定方法において，微生物培養寒天培地上で培養することを特徴とする生菌数測定方法。」
　
６　本願発明と引用発明１との相違点
　微生物培養寒天培地上での微生物の培養が，本願発明では，「アデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼを含有する微生物培養寒天培地又はアデノシン５’−三リン酸の消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種とを含有する微生物寒天培地」上でなされているのに対して，引用発明１では，アデノシン５’−三リン酸の消去剤が添加されていない寒天培地上でなされている点。
　
第７　判断
１　相違点について
（１）刊行物１記載の検体液及び分離膜からのノイズを受けるという課題について
　刊行物１の摘示（刊１−２）には，
「例えば食品工業において，中間品あるいは製品であるビールあるいは酒中に含まれる生菌の内，１個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は問題は少ないが，酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程度である細菌類を検出乃至計数する場合には問題が少なくない。
その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自身からのノイズや，実液中に含まれるノイズ発光成分のため，生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合があり
　この記載によると，ＡＴＰに基づく発光を基点として捉え測定する場合，実液（検体液）中に含まれるノイズ発光成分のほか，細菌が濾過捕捉されている分離膜自身からのノイズ等にも影響を受けるという課題があったと理解できる。
　
（２）アデノシンリン酸デアミナーゼがあっても，ルシフェリンールシフェラーゼによる発光は妨げられないことについて
ア　比較対照実験
　摘示（刊２−６）には実施例９として「（ＡＴＰ消去剤の影響を取り除いた状態で，スタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰ量を測定した例）」が記載されている。この実施例９においては，第一工程から第十一工程のうち，第二工程において，被検微生物を含む培養液に含まれる遊離ＡＴＰを除去するために，ＡＴＰ消去剤であるアピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼを添加してし３０分処理している。
　また，第三工程において，前記被検微生物を含む培養液を希釈し測定するための標準液体培養液からなる希釈液に，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼを添加し，９０分反応させ遊離ＡＴＰを消去させている。その後，この希釈液は，オートクレーブによりアピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼは失活される。
　測定の前処理として，第四工程において，前記被検微生物を含む培養液を前記希釈液で１００００倍に希釈している。前記被検微生物を含む培養液は，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼが活性を持った状態であるものの，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼが失活した希釈液が前記被検微生物を含む培養液の１００００倍添加され発光測定用試料となる希釈混釈液とされるから，希釈混釈液中のアピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼは，実質的に失活しているといえる。
　その後，第五〜十一工程を経て，ルシフェリン−ルシフェラーゼによる発光量を測定し，「被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍｌ）で除することにより，スタフィロコッカス・アウレウスの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。その結果，２×１０-17ｍｏｌ／ＣＦＵを得た。」と結果を記載している。すなわち，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼが失活した状態では，２×１０-17ｍｏｌ／ＣＦＵとなることが理解される。
　
イ　活性のあるアデノシンリン酸デアミナーゼ存在下の実験
　摘示（刊２−７）には実施例１０として「（実施例９において得られたスタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰの測定値（約２×１０-17ｍｏｌ）を用いて
ＡＴＰ消去剤の影響下，その活性を保持した状態でスタフィロコッカス・アウレウス培養液の希釈懸濁液の生菌体ＣＦＵの測定法
　この実施例１０は，「【００８０】（第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上記被検微生物の希釈懸濁液にアピラーゼとアデノシンリン酸デアミナーゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して，３５℃で３０分反応して，ＡＴＰを消去した
　そして，被検微生物の希釈懸濁液，すなわち，被検微生物を含む培養液と希釈液を混合した希釈懸濁液にアピラーゼとアデノシンリン酸デアミナーゼを加え，これら酵素を失活させないまま「（第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し，遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるトータルＡＴＰの発光量を求める）」（摘示（刊２−７））ものである。
　希釈率，10,000，100,000，1,000,000及び10,000,000で実験がなされており，その結果，表２に記載のような結果が得られている。上記「（２）」に記載されたアピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼを失活させた実施例９と比較するため，実施例９と同じスタフィロコッカス・アウレウスの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めると，これは表２の[ＡＴＰ濃度mol]／[実測値CFU（混釈培養法）]を計算したものであるから，次のように計算される。
希釈率（倍）    　10,000 　　　100,000　　1,000,000 　　10,000,000
　
ＡＴＰ濃度                        
  （mol/ml）　　2.68×10-13　　3.05×10-14　2.90×10-15　2.68×10-16　
　
実測値（混釈培養法）                      
  （CFU/ml）　　1.11×104 　　1.34×103 　1.07×102 　　1.00×10　
　
当審にて計算した
１ＣＦＵ当たりの　
ＡＴＰ量
（mol/CFU）　　2.1×10-17　　2.28×10-17　2.71×10-17 　2.68×10-17　
　そうすると，希釈倍率にかかわらず，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼを失活させた実験例９の２×１０-17ｍｏｌ／ＣＦＵよりも高い値となっており，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼがルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光反応による測定に特段の影響を与えていないことが理解される。
　
ウ　「ＡＴＰ消去試薬が活性を維持した状態における測定」に関連する他の記載事項について
　摘示（刊２−８）にも「ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも，検出感度が十分に高いことが判る。」及び「ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも，正確な菌数の測定が可能であることが判る。」と記載されている。
　
エ　培養液にＡＴＰ消去剤を入れて培養する態様について
　摘示（刊２−９）には，実施例１６として，「次いで，前記懸濁液８ｍｌに，上記実施例１５に記載したＳＣＤ培地の４倍濃度調製液（トリプトン６．０％，ソイトン２．０％，ＮａＣｌ２．０％，ｐＨ７．３）２ｍｌ及び２％ナイスタチン（麹菌の生育阻害剤）の７０％エタノール溶液５０μｌ，アデノシンリン酸デアミナーゼ５Ｕ／ｍｌを２０μｌ（終濃度０．０１Ｕ／ｍｌ）を加えて３５℃でバチルス・ズブチリスのみを選択的に静置培養し，この培養の途中において培養液を経時的に１００μｌづつ採取して，キッコーマン製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌ添加し，２０秒後にキッコーマン製ルシフェールＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）の１００μｌを添加し，キッコーマン製ルミテスターＫ−１００で発光測定（数値は相対発光量で示した）を行なった。この発光量を測定することにより，バチルス・ズブチリスの経時的な相対増殖量を調べることができる。その結果を図１２に示す。」と記載されている。
　ここで，アデノシンリン酸デアミナーゼを失活させると記載されておらず，また，失活させるような処理についても記載されていないから，アデノシンリン酸デアミナーゼは失活していないと理解され，仮に，失活していないとまでは記載されていないとしても，上記「第７　１（２）イ」及び「第７　１（２）ウ」に記載のように，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼは失活させなくてもルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光反応に影響がないことを考慮すれば，失活させなくとも測定し得ることは自明なことといえる。
　そして，経時的に１００μｌづつ採取して測定がなされている。図１２（摘示（刊２−１０））は，その結果であり，菌数は増加していることが読み取れるから，培養されているものと理解される。
　そうすると，アデノシンリン酸デアミナーゼを失活させない培養液を用いて，被検微生物を培養することで，キッコーマン製ルシフェールＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）によるルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光の測定が可能であることが理解される。
　
（３）　小活
　「第７　１（２）エ」に記載のように，アデノシンリン酸デアミナーゼを失活させない培養液を用いて被検微生物を増殖させてもルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光反応による測定が可能なことが，刊行物２から理解されるから，寒天培地を使用する引用発明１において，ノイズ除去のため，寒天培地にアデノシン５’−三リン酸消去剤であるアピラーゼとアデノシンリン酸デアミナーゼを加え，これら酵素を失活させずに培養を継続し，相違点記載の本願発明のごとく構成することは，当業者が容易になし得たことといえる。
　
２　本願発明の効果について
　本願発明に係る効果は，本願明細書によると，
「ＡＴＰ分解酵素を含有する本発明の新規な寒天培地を使用すると，寒天培地中の遊離ＡＴＰが分解酵素で分解されるので，菌由来のＡＴＰに基づく発光を観測する生菌数測定方法，即ち直接菌数計数法において，ノイズ発光を低減した，正確かつ迅速な菌計数が可能となり有用である。さらに，濾過膜に存在する濾過膜由来のＡＴＰ，濾過時試料に含まれ菌と共に濾過膜上に捕集された遊離のＡＴＰ，並びに濾過時・更には培養中に環境からもたらされる遊離のＡＴＰが，培養中に寒天培地から濾過膜を介して供給される前述の分解酵素により分解され，培養終了時，菌由来のＡＴＰを菌より抽出する際には，ノイズが低減されているので，より正確かつ迅速な直接菌数計数が可能となり有用である。」（段落【００２５】）である。
　
　しかしながら，刊行物１の摘示（刊１−２）には，
「例えば食品工業において，中間品あるいは製品であるビールあるいは酒中に含まれる生菌の内，１個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は問題は少ないが，酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程度である細菌類を検出乃至計数する場合には問題が少なくない。
その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自身からのノイズや，実液中に含まれるノイズ発光成分のため，生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合があり
「
生物細胞以外の遊離ＡＴＰを極力低い値まで消去し，バックグランド発光量（ノイズ）の影響を取り除いて，生物細胞のもつＡＴＰのみを測定することにより，精度良く生物細胞の推定が可能となることを知り
　そして，培地中の栄養成分は，濾過膜上に捕捉された細菌に供されるのであるから，培地中のＡＴＰ消去剤も，当然に濾過膜へ浸透すると解されることを踏まえると，培地中の遊離ＡＴＰのほか，濾過膜に存在する濾過膜由来のＡＴＰ，濾過時試料に含まれ菌と共に濾過膜上に捕集された遊離のＡＴＰ，並びに濾過時・更には培養中に環境からもたらされる遊離のＡＴＰの影響を取り除くことにより，より正確かつ迅速な直接菌数計数を可能ならしめることは，当業者が，刊行物１及び２に記載された事項から予測されるところである。
　したがって，本願発明の効果は，格別顕著なものであるということはできない。
　
第８　審判請求人の主張について
　審判請求人は，審判請求書及び回答書において，下記主張１乃至主張３をしている。
（主張１）
「疎水性濾過膜を用いた生菌数の測定方法が提供されている（請求項１参照）から，当業者は，次に，上記（i）〜（iv）の解決手段に代えてこの解決手段を検討するものと考えられる。つまり，引用文献２（当審注：本審決の「刊行物１」に相当。）の記載からは，当該文献２において記載されている生菌数測定方法において，画像処理時のノイズ低減や閾値処理といった手段により生菌由来のＡＴＰに基づく発光とノイズ発光との識別が十分可能であることが認識できるので，濾過膜や実液中に存在する遊離ＡＴＰ自体を除去するという発想が生まれることはない。」（審判請求書手続補正書（方式）の「（３）（ｄ−３）」の項）
　
（主張２）
「微生物の培養中に寒天培地中に活性なＡＴＰ消去剤を存在させない理由は，生菌由来のＡＴＰに基づく発光レベルを可能な限り大きくするため培養中に生菌由来のＡＴＰが分解するのを極力避けるためであると考えられる。すなわち，生菌数測定方法において，ＡＴＰ消去剤を含有する寒天培地上で微生物を培養することは，本願出願当時の技術常識では考えられないことであるから，本願発明は単なる当業者の通常の創作能力の発揮ではなく，当業者が容易に想到し得たものではない。」（回答書の「（２）」の項）
　
（主張３）
「引用文献１（当審注：本審決の「刊行物２」に相当。）には，当業者をＡＴＰ消去剤を含む培地で微生物を培養させない方向に導く記載があるからである。例えば，引用文献１には，ＡＴＰ消去剤を作用させる際には微生物が増殖しないように注意することが必要である旨が記載され（段落［００２２］），実際に，生菌数を測定する場合にはＡＴＰ消去剤を含む液体培地中で微生物を培養していない（実施例２０，２２，２４，２６及び２８参照）。」（審判請求書手続補正書「（３）（ｄ−４）」の項）」　
　
１　（主張１）について
　刊行物１においては，ノイズ発光を減らすための手段として，請求項１の事項や請求人がいう（i）〜（iv）の事項しか記載されていないとしても，ノイズ発光を減らそうとする課題は，刊行物１に記載されている。
　ところで，ノイズを減少させるためにノイズの発生原因自体を除去することは，測定系一般において普通に行われていることである。そして，遊離ＡＴＰがノイズ発光の原因となることが記載され，かつ，これを除去する前記技術的事項が記載された刊行物２に接した当業者であれば，刊行物１記載のノイズ発光を減らそうとする課題のもと，同じ課題の別の解決策を開示する刊行物２記載の技術的事項の適用を考えることはあっても，当該適用を阻害するようなことはないものといえる。
　したがって，上記（１）の主張は失当である。
　
２　（主張２）について
　上記「第７　１（２）エ」に記載したように，刊行物２には，アデノシンリン酸デアミナーゼを失活させると記載されておらず，また，失活させるような処理についても記載されていないから，アデノシンリン酸デアミナーゼは失活していないと理解され，仮に，失活していないとまでは記載されていないとしても，上記「第７　１（２）イ」及び「第７　１（２）ウ」に記載のように，アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼは失活させなくてもルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光反応に影響がないことを考慮すれば，失活させなくとも測定し得ることは自明なことといえる。請求人の主張するように「生菌数測定方法において，ＡＴＰ消去剤を含有する寒天培地上で微生物を培養することは，本願出願当時の技術常識では考えられない」との技術常識があったとしても，引用発明１に刊行物２記載の技術的事項を適用し得るものといえる。
　さらに，本願出願前に頒布された刊行物である下記刊行物Ａに記載のように，ＡＴＰ消去剤は，菌から抽出されたＡＴＰを発光させるに際し，１分半は，ルシフェラーラーゼ反応に影響しないことが知られており，しかも，ＡＴＰ消去剤を無菌的に添加して，生地培養した後に，ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰ測定も行われているのであるから，本願出願時に請求人の主張するような技術常識があったとはいえない。
　
刊行物Ａ：渡会輝夫，中島基雄，ルシフェラーゼ法を用いる製麹汚染細菌の迅速測定法，日本醸造協会誌，９２巻，１１号，pp.790-797，１９９７年１１月１５日
（刊Ａ−１）『３）短時間培養法
　短時間培養法には, Soybean Casein Digest（ＳＣＤ）培地(1.5%トリプトン,  0.5%ソイトン，0.5%食塩, pH 7.3)を用いた。まず，このＳＣＤ培地と麹菌分生胞子あるいは枯草菌懸濁液とを混合し，その混合液からのＡＴＰ抽出を試みた。通常は第４表に示す枯草菌の場合のように，ＡＴＰ抽出剤の添加によって微生物由来のＡＴＰによる発光量の増加が認められる。しかしながら，麹菌分生胞子の場合には，そのような発光量の増加は見られずＡＴＰが抽出されない現象を見いだした。この現象を利用すると麹菌分生胞子と汚染細菌の混合系で分離操作なしに，汚染細菌由来のＡＴＰのみを測定できる可能性が示された。この現象は，微生物の種類によりＡＴＰの抽出効率に違いがあり，ＳＣＤ培地の培地成分が麹菌の場合にはＡＴＰ抽出に阻害的に働いたものと思われた。次にＳＣＤ培地中及び麹懸濁液中の遊離ＡＴＰの影響を除き，測定精度をあげる必要から，キッコーマン社より最近市販された「ルシフェールＡＴＰ消去剤」による遊離ＡＴＰの消去を検討した。第５表に示すように培地中のＡＴＰはほぼ１時間で消失し，その発光量が発光試薬ブランクレベルまで低下することが認められた。この時添加した
ＡＴＰ消去剤は第５図に示すように汚染細菌から抽出されたＡＴＰに対しては抽出後１分半程度影響しないことが確かめられた。
　
（刊Ａ−２）　第５図（７９５頁）
　
（刊Ａ−３）「４時間の短時間培養法で汚染菌に対する検出感度を増加させるためには,  SCD培地への試料中の汚染菌接種量を出来るだけ増やす必要がある。そのために測定したい試料の麹懸濁液は，盛り込み時試料20gに0.3mMリン酸緩衝液（pH 7.2）80mlを加えた濃い麹懸濁液を作製し，４倍濃度のＳＣＤ培地(6.0%トリプトン,  2.0%ソイトン,  2.0%食塩, pH ７.3）2mlに麹懸濁液８mlを加えることで短時間培養時の培地濃度は通常のＳＣＤ培地濃度になるようにした。麹菌め増殖をおさえるために2％ナイスタチン（麹菌の増殖阻止剤）の溶液50μｌ，
培地由来のＡＴＰを消去するためにＡＴＰ消去剤20μｌを無菌的に添加し，35°Ｃで４時開静置培養した。そして，４時間後に培養液100μｌを採取しＡＴＰ抽出剤100μｌを添加して20秒間ＡＴＰを抽出し，そこに発光試薬100μｌを添加してＡＴＰを測定した
　
（刊Ａ−４）　図６（７９５頁）
  
　
３　（主張３）について
　請求人は，刊行物２には，ＡＴＰ消去剤を作用させる際には微生物が増殖しないように注意することが必要である旨が記載されていると主張する。その根拠として段落【００２２】を挙げている。
　刊行物２の段落【００２２】には，次のように記載されている。
「【００２２】上記酵素の反応時間は，生物細胞を含有する試料の種類・性状，反応時のｐＨ，酵素の添加濃度，反応温度により多少異なるが，約２時間以内，特に１〜３０分が好ましい。反応時間が長過ぎると，試料に含まれる微生物がその間に増殖するので，目的とする生物細胞数の正確な測定ができなくなり，測定値の精度・信頼性が損なわれる。」
　
　しかしながら，上記「第７　１（２）エ」に記載したように，刊行物２の摘示（刊２−９）記載の実施例１６においては，アデノシンリン酸デアミナーゼを失活させると記載されておらず，また，失活させるような処理についても記載されていないから，アデノシンリン酸デアミナーゼは失活していないと理解され，上記刊行物２の段落【００２２】の記載事項は，実施例１６のような場合には適用されないと理解される。
　したがって，請求人の主張を採用することはできない。
　
第９　むすび
　以上のとおり，本願発明は，刊行物１及び２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることはできないので，本願は，拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。