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　特願２００３−５４５８１１「注目する改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列、それを得るための発現ベクターおよび方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年　５月３０日国際公開、ＷＯ０３／４４１８９、平成１７年　４月１４日国内公表、特表２００５−５０９４３７〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯 ・本願発明
　本願は，２００２年１１月２１日（パリ条約による優先権主張２００１年１１月２１日、仏国）を国際出願日とする出願である。そして，その請求項１に係る発明は，平成２１年１０月２２日付で補正された特許請求の範囲並びに発明の詳細な説明及び図面の記載からみて，次のとおりのものと認める（以下，「本願発明」という。）。
　なお，請求項１に記載された「前記注目する改変タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子と、一連の少なくとも６個のリジン残基をコードする「ポリＫ」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも６個のヒスチジン残基をコードする「ポリＨ」ヌクレオチド断片とを各々が含む、少なくとも４つのベクター」の「改変タンパク質」という用語は，本願明細書の記載（例えば【０００２】）によれば，本来は，未改変のタンパク質にポリＫタグとポリＨタグを付加して改変したものを意味すると認められ，それにさらに別途，ポリＫタグとポリＨタグを付加することは，明細書にも記載がなく，技術的にも無意味であるから，この用語は「タンパク質」の誤記と認められる。したがって，本願発明を以下のように認定した（下線部参照）。
　
「精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を発現させるためのベクターを選択するための方法であって、前記注目するタンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程:
前記注目する
タンパク質
(i)ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片を５’末端から３’末端に含むベクター；
(ii)ポリＫヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＨヌクレオチド断片を５’'末端から３’末端に含むベクター；
(iii)前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、ポリＫヌクレオチド断片、及びポリＨヌクレオチド断片を５’末端から３’末端に含むベクター；
(iv)ポリＨヌクレオチド断片、ポリＫヌクレオチド断片、及び前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイトを５’末端から３’末端に含むベクター；
から選択して準備する工程、
前記ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を精製する工程；
精製された改変タンパク質を固定化する工程；
固定化された改変タンパク質の生物活性を試験する工程；および
最高の発現収率、及び／又は最高の精製収率、及び／又は最高の固定化収率、及び／又は未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を示すタンパク質を発現するベクターを選択する工程
を含むことを特徴とする方法。」
　
第２　引用例
　
１．引用例に記載された事項
　原査定の拒絶の理由に引用例１として引用された，本願の優先日前である１９９８年１２月３０日に頒布された国際公開第９８／５９２４１号（以下「引用例」という。）には，次の事項が記載されている。
　
（１）「１．サンプル中に含まれる標的生物物質を単離するための方法であって、捕捉相が与えられ、前記標的生物物質が少なくとも一の捕捉相と接触させられ、捕捉相に結合した該標的生物物質が検出される方法において、
前記方法は、該捕捉相が、少なくとも一の反応性官能基を含む有機分子及び、特定的且つ直接的または間接的に、前記標的生物物質を認識または結合可能な少なくとも一のタンパク物質を含み、前記タンパク物質は有機分子の反応性官能基への共有結合的な結合のための特定部位を有し、これが少なくとも６の隣接するリジンまたはリジンを主成分とする残基を含む少なくとも一のタグからなることを特徴とする方法。……
１３．タグが、タンパク物質のＮ-またはＣ-末端に配されることを特徴とする請求項１及び／または４に記載の方法。」（特許請求の範囲）
（２）「上述のタグは、タンパク物質の一次構造中、あらゆる場所に見られる。好ましくは、これはタンパク物質のＮ-またはＣ-末端に位置する。」（５頁２５〜２８行）
（３）「実施例１：ＲＨ２４Ｋの発現及び精製
  ｐＭＨ２４（Cheynet et al.，1993）を、ｐ２４遺伝子の３’末端での合成アダプターの挿入により変性させ、Ｃ末端に“ポリリジンテイル”と呼称される共有結合のための特定部位を有し、６つの隣接するリジン残基からなるＲＨ２４に相当するＲＨ２４Ｋを発現させた。
　アダプターは、それぞれ下記の配列：……
を有する二つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、１０mMのトリス、５０mMのＮａＣｌ、１mMのＤＴＥ、１０mMのＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５の緩衝液中で、７０℃で５分間加熱し、次いでまず３０分間かけて３７℃に、次いで３０分間かけて室温までゆっくりと冷却することによって予め調製した。その後、このアダプターを、ＲＨ２４遺伝子の３’末端でＳｍａＩ及びＸｂａＩの間にクローン化した。得られたプラスミドｐＭＨ２４Ｋ３’を、E．coli XLI細菌株(recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, 1ac[F’proAB, lacIPZΔM15, Tn10(tetr)]中で増幅させた後、Taq Dye Deoxy Terminator Matrix Standard method(Applied Biochem)によって配列させた。得られた配列及びＣ末端で得られたタンパク質上の対応する配列は下記の通りであった。
 
　タンパク質を、E．coli XLI細菌株（上記参照）中、Ｔａｃプロモーターの制御の下で発現させた。発現ベクターを含有するE．coli XLIのプレカルチャーを、ＬＢ−ａｍｐ−ｔｅｔ培地（１／４０から１／２５）を接種に用いるため、ルリア培地（ＬＢ）中、アンピシリン（ａｍｐ；５０μｇ/ml）及びテトラサイクリン（ｔｅｔ；１２μｇ/ml）の存在下、３７℃で一晩かけて予め調製した。この培地を、６００nmにおいて０．６のＯＤが得られるまで培養した。その後、培地に、３７℃にてイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を２時間半で１mMの割合で攪拌しつつ添加することにより、タンパク質の発現を誘発した。４℃で１０分間、５０００回転／分での遠心分離（ＪＡ２１ローター、Beckman）を行った後、細菌を、５０mMのトリス−ＨＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１００mMのＮａＣｌ、１０mMのＭｇＣｌ２、ｐＨ８の緩衝液（バイオマス３ml/g）中で、プロテアーゼ抑制剤（２μｇ/mlのアプロチニン及び２μｇ/mlのロイペプチン）の存在下で取り出し、０℃での超音波処理により溶菌した。可溶性フラクションを、４℃で１５分間、１０，０００回転／分での遠心分離（ＪＡ２１ローター、Beckman）して取り出した後、金属キレートアフィニティカラムにおき、ＲＨ２４Ｋを精製した（Chelating Sepharose Fast Flow No．17057501）。提供者の推奨にしたがってゲルをＺｎ2+でプレロードした後、６７mMのＮａＣｌを含有するｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液で、次いで２００mMの酢酸アンモニウム、０．５MのＮａＣｌを含有するｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡させた。ＲＨ２４Ｋを、２００mMの酢酸アンモニウム、０．５MのＮａＣｌ、ｐＨ４を用いて溶離した。収集したフラクションを、５０mM、ｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液で透析した。
　精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動により、またゲル濾過／ＨＰＬＣ中を通すことにより特定した。その純度は、９０％より高く、このためＲＨ２４の純度と同等であった。マススペクトルで分析したところ、その分子量は２８，０２７であり、理論値２７，９９２と一致した。該タンパク質は、ウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法において、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗ｐ２４抗体により認識された。」（９頁２５行〜１１頁２９行）
（４）「（実施例６：ポリリジン標識のリジン残基に関して、カップリング効果に対する組成物の影響）
　ポリリジン標識のリジン残基としてカップリング効果に対する組成物の影響を評価するために使用した生物物質は下記の通り：
・組換タンパク質ＲＨ２４Ｋ；これは、そのアミノ末端部分に金属イオンを用いたキレート化によって精製に役立つポリヒスチジン標識[ＭＲＧＳ（Ｈ）６ＧＳＶＤＥＳＭ]を有し、カルボキシ末端部分にカップリングに供与するポリリジン標識[ＰＧ（Ｋ）６ＳＶＤＥＳＬ]を有し；このタンパク質は下記のように表される：
　　ＭＲＧＳ（Ｈ）６ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４−ＰＧ（Ｋ）６ＳＶＤＥＳＬ
・組換タンパク質ＲＨＫ２４；これは、そのアミノ末端部分にポリリジン標識[ＭＲＧＳＣＨ（Ｋ）２ＨＨ（Ｋ）２ＨＨ（Ｋ）２ＧＳＶＤＥＳＭ]を有し；このタンパク質は下記のように表される：
　　ＭＲＧＳＣＨ（Ｋ）２ＨＨ（Ｋ）２ＨＨ（Ｋ）２ＧＳＶＤＥＳＭ−ｐ２４
・組換タンパク質Ｒ２４；これは、カルボキシ末端ポリリジン標識も、アミノ末端ポリヒスチジン標識も持たず；ｐ２４と表される。
　使用したポリマーは、ＭＡＶＥ（マレイン酸無水物−コーメチルビニルエーテル）である。カップリング条件は、三つのタンパク質と同一とした。
　二種類のカップリング緩衝液、０．１M、ｐＨ８．２のカーボナート緩衝液及び０．０５M、ｐＨ９．０のトリスＨＣｌ緩衝液を使用した。
　二つの異なる反応条件下で実行した組換タンパク質のＭＡＶＥポリマーとのカップリングの収量を示す下記の表に結果を与えた。これには、リジン残基が隣接していることの重要性が示されている。
　その理由は、タンパク質ＲＨ２４Ｋ（６つの隣接したリジン残基）を用いて得られるカップリング収量が、タンパク質ＲＨＫ２４（６つのリジン残基、２つずつのブロック三カ所）を用いて得られるカップリング収量よりも格段に多いためである。
　実際のところ、タンパク質ＲＨＫ２４（６つのリジン残基、２つずつのブロック三カ所）を用いて得られるカップリング収量は、タンパク質Ｒ２４（標識なし）を用いて得られるものと同様である。」（１４頁９行〜１５頁１３行）
　
２．引用発明
　引用例に記載されたタンパク質ＲＨ２４Ｋは，６個のヒスチジン残基からなるポリＨ，ｐ２４及び６個のリジン残基からなるポリＫを，Ｎ末端からＣ末端にかけてこの順番で有するｐ２４の改変タンパク質であり（記載事項（３），（４）），それをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの発現により改変タンパク質ＲＨ２４Ｋを得たことが記載されている（記載事項（３））。そして，このベクターが，ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片を５’末端から３’末端に含むものであり，そのクローニングサイトにｐ２４をコードする遺伝子が挿入されたものであることは明らかである。また，改変タンパク質ＲＨ２４Ｋを固定化した場合に，ポリＫタグを有さないタンパク質よりもカップリング収量が多かったことが記載されている（記載事項（４））。
　引用例には，この固定化されたＲＨ２４Ｋの活性についての記載はないが，固定化されていないＲＨ２４Ｋについては，それが抗ｐ２４抗体により認識されたこと，すなわち未改変のｐ２４と同様の抗原性すなわち生物活性を示したことが記載されている（記載事項（３））。そして，特段の事情がない限り，タンパク質をそのアミノ酸配列の末端で固定化したものが，固定化していないタンパク質の，例えば抗体との結合性や酵素活性等の生物活性を維持している蓋然性が高いこと，及び固定化されたタンパク質を固定化されていないタンパク質と同様の用途にそのまま使用できることは，例えば固定化酵素の例などからみても明らかなように技術常識であるから，引用例に記載された固定化ＲＨ２４Ｋは，未改変で未固定のｐ２４と同様の生物活性を有しており，また，そのことにより直接使用可能であるものと認められる。引用例記載の固定化されたＲＨ２４Ｋがこのようなものであることは，本願明細書において，固定化ＲＨ２４Ｋは未改変で未固定のｐ２４と同様の生物活性を有していることが確認されていることからも裏付けられる。
　これらのことから，引用例には，
「精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を発現させるためのベクターにより改変タンパク質を生産する方法であって、前記注目するタンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程：
前記注目するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子と、一連の少なくとも６個のリジン残基をコードする「ポリＫ」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも６個のヒスチジン残基をコードする「ポリＨ」ヌクレオチド断片とを各々が含むベクターであって
(i)ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片を５’末端から３’末端に含むベクター；
を準備する工程、
前記ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を精製する工程；
精製された改変タンパク質を固定化する工程；
を含むことを特徴とする方法。」
の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
第３　対比
　本願発明と引用発明を対比すると，両者は，
「精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を発現させるためのベクターにより改変タンパク質を生産する方法であって、前記注目するタンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程：
前記注目するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子と、一連の少なくとも６個のリジン残基をコードする「ポリＫ」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも６個のヒスチジン残基をコードする「ポリＨ」ヌクレオチド断片とを含むベクターであって，
ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片を含むベクター；
を準備する工程、
前記ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を精製する工程；
精製された改変タンパク質を固定化する工程；
を含むことを特徴とする方法。」を工程として包含する方法である点で一致するが，
　本願発明が，(i)の「ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片を５’末端から３’末端に含むベクター」以外に，さらに，ポリＨヌクレオチド断片、前記遺伝子の挿入のためのクローニングサイト、及びポリＫヌクレオチド断片の配置の異なる(ii)〜(iv)をも含めた，少なくとも４種類のベクターを準備し，改変タンパク質を固定化した後に，改変蛋白の生物活性を試験する工程，及び，各ベクターの中から最高の発現収率、及び／又は最高の精製収率、及び／又は最高の固定化収率、及び／又は未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を示すタンパク質を発現するベクターを選択する工程が付加された，ベクターの選択方法であるのに対し，引用発明は，このような付加的な工程を含まず，１種類のベクターにより改変タンパク質を発現させて，その生物活性を確認，あるいは該改変タンパク質を固定化しているに留まっている点
で相違する。
　
第４　当審の判断
　
１．相違点についての判断
　上記相違点について検討する。
　精製目的で目的タンパク質にポリＨタグを付加することは，本願の優先日当時，周知慣用の技術であり，その際に，ポリＨタグをＮ−末端またはＣ−末端のいずれに配するかは適宜選択できる事項であって，そのいずれに付加するかによって，タンパク質の生物学的性質に相違が生じる場合があることも周知である（必要であれば，Eur. J. Immunol., 27, 1997, p3447-3455の要約欄5〜7行，3451頁左欄下から10行〜右欄4行, Euro. J. Biochem. 267, 2000, p.1138-1145の要約欄8〜15行，1144頁左欄下から11行〜末行，Protein Expression and Purification, 20, 2000, p.112-123の122頁左欄29〜44行を参照。）。
　さらに，タグを付加したタンパク質一般についても，タグの種類や付加する位置によってタンパク質の性質に影響があることは周知の事項である（例えば，大野茂男他１名監修「細胞工学別冊　実験プロトコールシリーズ　タンパク実験プロトコール　機能解析編」株式会社秀潤社　１９９７年４月１日（２０００年３月１日第２刷），１７頁の「３−２　融合タンパク質の作製と利用」の項を参照。）。
　ここで，引用例には，ポリＫタグについて，それがタンパク物質のＮ−末端またはＣ−末端のいずれに配されてもよいことが記載されている（前記記載事項（１）及び（２））。
　このような引用例の記載に接した当業者であれば，ポリＫタグをＮ−末端に付加した場合とＣ−末端に付加した場合とで，あるいはポリＨタグをＮ−末端に付加した場合とＣ−末端に付加した場合とで，タンパク物質の生物学的活性に差異が生じうることは容易に予測しうることである。
　さらに，発現させるタンパク質の配列の相違によって，発現収率に相違が生じる場合があることも周知であるし，ポリＨタグの位置によって精製収率に影響があることも周知である（例えば，前述のEur. J. Immunol., 27, 1997, p3447-3455を参照。）から，ポリＨタグのみならず，ポリＫタグの位置によっても発現収率や精製収率に影響があることは容易に予測しうることである。
　また，引用例には，ポリＫタグとポリＨタグの両者を付加した改変タンパク質が記載されており，通常，タグ配列は，タンパク質の活性に対する影響が他の位置よりは少ないと考えられるＮ−末端またはＣ−末端に配するのが技術常識であるから，一旦，両タグの位置に関心を持った当業者であれば，ポリＫタグ，ポリＨタグ及び目的タンパク質の位置関係として，例えば，本願発明の(i)〜(iv)のベクターのようなものがあることは容易に理解することができることである。
　そして，選択範囲に含まれる種々のものについて，実際に試験した結果に基づき，目的に最適のものを選択することは，当業者の通常の創作能力の発揮に過ぎないから，このような各種のベクターの中から，タンパク質の収率や生物活性の観点から最適なものを選択することは当業者が容易に想到し得ることである。
　また，本願発明の効果についても，特に予測困難なものは認められない。
　したがって，本願発明は，引用発明に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
２．請求人の主張について
　請求人は，審判請求書において，以下のように主張する。
「当業者が、これら引用例１及び２に接して、タンパク質、特にタンパク質の生物学的活性に関するアッセイを実施したいと考えた場合には、精製のために当該タンパク質のＮ末端にヒスチジンタグを挿入し、固定化及び良好な配向のためにＣ末端にリジンタグを挿入することによって、当該タンパク質を修飾すれば十分であると認識するものと思料致します。
　しかしながら、本願の発明者は、いずれのタンパク質のアッセイにおいてもＮ末端にヒスチジンタグを挿入し、Ｃ末端にリジンタグを挿入すれば良いというわけではないことを見出しました。そして、生物学的試験に使用するための最適なタンパク質を得るために本願請求項に係る発明において使用する４つのベクターを含むツールボックスを想到するに至りました。
　すなわち、本発明者は、ヒスチジンタグ及びリジンタグの挿入位置の異なる４つのベクターを用いて、使用するタンパク質の各々に対して、発現、精製、及び固定化の収率並びに生物学的活性といった各種の要素について試験する必要があることを見出しました。
　したがって、Ｎ末端にヒスチジンタグ及びＣ末端にリジンタグを挿入する修飾をしたタンパク質が良好に固定化されることのみを開示する引用例からは、本願請求項に係る発明のように各々のタンパク質に対して４つのベクターを各種の収率及び活性について比較検討し選択する方法を想到することは容易ではなかったものと思料致します。」
　しかしながら，前述の通り，引用例（請求人の主張における引用例１）には，ポリＫタグをタンパク物質のＮ−末端とＣ−末端とのいずれに付加してもよいことが記載されているし，タグを付加する位置によってタンパク質の生物学的性質に相違が生じうることも周知の事項である。
　また，両端にタグ配列を付加すれば，その付加の仕方によって少なくとも両端の立体構造は相違することになり，いずれかの末端近くにエピトープや活性部位が存在する抗原タンパク質や生理活性タンパク質の場合等は，抗体との結合性や生理活性等の性質も異なるであろうことは当業者であれば容易に予測しうることである。また，注目するタンパク質のアミノ酸残基数が少ない場合には，併せて１２残基またはそれ以上のアミノ酸残基からなるタグ配列を付加した場合の立体構造への影響はより大きなものとなるであろうことも容易に予測しうることである。少なくとも当業者が，このようなタグ配列の付加により，様々な注目するタンパク質の生物活性に全く影響がないと考えるとはいえない。
　したがって，請求人の主張は採用することができない。
　
第５　むすび
　したがって，本願発明は，引用例に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
　よって，結論のとおり審決する。