(57)【要約】【課題】  本発明は、光検出器に対して光を検出させ易くすることを目的とする。【解決手段】  本発明の核酸増幅用試薬１２は、鋳型核酸１１においてフォワードプライマーＦＰの３´末端Ｅ１がアニールする位置とリバースプライマーＲＰの３´末端Ｅ２がアニールする位置とで挟まれる領域ＡＲのうち、標的核酸にアニールする第１プローブＰＢ１と、当該領域ＡＲのうち、標的核酸以外にアニールする第２プローブＰＢ２とを含む。こられ第１プローブＰＢ１と第２プローブＰＢ２は、発光する光の波長帯域の一部が重なる色素Ｐ１２，Ｐ２２を有する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される核酸増幅用試薬であって、
前記鋳型核酸においてフォワードプライマーの３´末端がアニールする位置とリバースプライマーの３´末端がアニールする位置とで挟まれる領域のうち、前記標的核酸にアニールする第１プローブと、
前記領域のうち、前記標的核酸以外にアニールする第２プローブと、
を含み、
前記第１プローブと前記第２プローブは、発光する光の波長帯域の一部が重なる色素を有する、
ことを特徴とする核酸増幅用試薬。
【請求項２】
前記第２プローブは、前記領域における一方の鎖側にアニールするプローブと、前記領域における他方の鎖側にアニールするプローブとを有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項３】
前記第１プローブが有する色素が発光する光と前記第２プローブが有する色素が発光する光との波長帯域は同じである、
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項４】
前記第１プローブが有する色素と前記第２プローブが有する色素との化学構造は同じである、
ことを特徴とする請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項５】
前記フォワードプライマー、前記リバースプライマーを含む、
ことを特徴とする請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項６】
ポリメラーゼ、ｄＮＴＰを含む、
ことを特徴とする請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の核酸増幅用試薬。
【請求項７】
鋳型核酸および請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の核酸増幅用試薬を含む液滴と、
前記液滴が移動する流路を有する容器と、
を備えることを特徴とする核酸増幅用カートリッジ。
【請求項８】
鋳型核酸および請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の核酸増幅用試薬を含む液滴が収容される容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に加熱するとともに、前記第１領域とは異なる第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱する加熱ステップと、
前記第１領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、
を備えることを特徴とする核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増幅用試薬、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ(polymerase chain reaction)法は、核酸における鎖長の違いなどを要因としてその核酸の変性やアニーリングの違いが生じることを利用し、当該核酸に対する温度変化を複数サイクル繰り返して核酸を増幅させる手法である。この手法によって、サイクル数だけ２を累乗したＰＣＲ産物が得られる。
【０００３】
このようなＰＣＲ法を用いた核酸増幅装置として、下記特許文献１のＰＣＲ装置が本出願人により提案されている。下記特許文献１のＰＣＲ装置に装着されるバイオチップには、標的核酸などが含まれる反応液が移動する流路が形成され、その流路には反応液が収容されるとともに、当該反応液よりも比重が小さく反応液とは混和しない液体が充填されている。
【０００４】
下記特許文献１のＰＣＲ装置には、バイオチップが装着される装着部にそのバイオチップを装着した場合において、当該バイオチップに形成される流路の第１領域を加熱する加熱部と、当該第１領域と異なる温度で第２領域を加熱する加熱部が備えられる。また、下記特許文献１のＰＣＲ装置には、装着部および加熱部の配置を、第１の配置と第２の配置との間で切換える駆動機構が備えられる。この駆動機構によって、装着部に装着されるバイオチップの反応液は、互いに異なる温度に加熱される第１の領域と第２の領域との相互に移動される。このような下記特許文献１のＰＣＲ装置によれば、バイオチップ全体の温度を互いに異なる温度に切り替える場合に比べると、増幅反応期間を短縮できるというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、下記特許文献１のＰＣＲ装置などを用いて増幅反応期間を短縮した条件下では、実際に標的核酸が増幅していても光検出器で光が検出されていない傾向になることが分かった。
【０００７】
そこで本発明は、光検出器に対して光を検出させ易くすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される核酸増幅用試薬であって、前記鋳型核酸においてフォワードプライマーの３´末端がアニールする位置とリバースプライマーの３´末端がアニールする位置とで挟まれる領域のうち、前記標的核酸にアニールする第１プローブと、前記領域のうち、前記標的核酸以外にアニールする第２プローブと、を含み、前記第１プローブと前記第２プローブは、発光する光の波長帯域の一部が重なる色素を有する、ことを特徴とする。
【０００９】
また本発明は、核酸増幅用カートリッジであって、上述の核酸増幅用試薬を含む液滴と、前記液滴が移動する流路を有する容器と、を備えることを特徴とする。
【００１０】
さらに本発明は、核酸増幅方法であって、上述の核酸増幅用試薬を含む液滴が収容される容器の第１領域を標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第１領域とは異なる第２領域を標的核酸の合成温度に設定する温度設定ステップと、前記第１領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、を備えることを特徴とする。
【００１１】
上述の核酸増幅用試薬では、第１プローブと第２プローブとは、発光する光の波長帯域の一部が重なる色素を有しているため、当該波長帯域が重なる部分では重なっていない部分に比べて光の強度が強くなる。すなわち、標的核酸にアニールする第１プローブの色素での発色によって標的核酸が標識されているが、当該発色が、第２プローブの色素での発色によって助長されることになる。したがって、従来のように第２プローブがない場合に比べると、標的核酸を標識する発色量が高まり、この結果、光検出器に対して光を検出させ易くすることが可能となる。
【００１２】
ところで、第２プローブは、上述の領域における一方の鎖側にアニールするプローブと、当該領域における他方の鎖側にアニールするプローブとを有する場合が好ましい。この場合、鋳型核酸における一方の鎖に存在する標的核酸を標識する発色が、その一方の鎖側にアニールする第２プローブの色素と、当該鋳型核酸における他方の鎖にアニールする第２プローブの色素との双方によって助長される。したがって、鋳型核酸における一方の鎖または他方の鎖のいずれかだけに第２プローブがアニールする場合に比べると、標的核酸を標識する発色量がさらに高まる。
【００１３】
標的核酸を標識する発色量を高める観点では、第１プローブが有する色素が発光する光と、第２プローブが有する色素が発光する光との波長帯域の一部が同じである場合に比べ、これら波長帯域全体が同じである場合が好ましい。また、第１プローブが有する色素と、第２プローブが有する色素との化学構造が異なる場合に比べ、これら化学構造が同じである場合が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】核酸増幅用カートリッジの断面を示す図である。
【図２】プライマーおよびプローブの説明に供する図である。
【図３】核酸増幅用カートリッジの容器内に核酸試薬溶液が導入される様子を示す図である。
【図４】核酸増幅装置のブロック図である。
【図５】回転機構の様子を概略的に示す図である。
【図６】核酸増幅用カートリッジが装着部に装着された様子を示す図である。
【図７Ａ】熱サイクル処理の様子（Ａ）を示す図である。
【図７Ｂ】熱サイクル処理の様子（Ｂ）を示す図である。
【図７Ｃ】熱サイクル処理の様子（Ｃ）を示す図である。
【図７Ｄ】熱サイクル処理の様子（Ｄ）を示す図である。
【図８】増幅処理手順を示すフローチャートである。
【図９】実施例１および比較例１の増幅曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態を添付図面を用いて例示する。以下に例示する実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができる。
【００１６】
（１）実施形態
実施形態として、鋳型核酸における標的核酸を増幅する核酸増幅装置に対して装脱着可能な核酸増幅用カートリッジを説明した後に、当該核酸増幅装置を説明する。
【００１７】
＝＝＝核酸増幅用カートリッジ＝＝＝
図１は、核酸増幅用カートリッジ１の断面を示す図である。図１に示すように、核酸増幅用カートリッジ１は、液滴１０と容器２０とを備えている。
【００１８】
液滴１０は、核酸の増幅反応を進行させる場であり、鋳型核酸１１と核酸増幅用試薬１２とを含んでいる。なお、鋳型核酸１１と核酸増幅用試薬１２とは、図１では形状を便宜的に示している。
【００１９】
鋳型核酸１１は、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルス粒子などから抽出される２本鎖核酸であり、増幅ターゲットの核酸断片である標的核酸を有している。２本鎖核酸としてはＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）またはＲＮＡ（ribonucleic acid）がある。
【００２０】
核酸増幅用試薬１２は、鋳型核酸１１における標的核酸の増幅に使用される試薬である。この核酸増幅用試薬１２としては、主に、プライマー、プローブ、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ(deoxyribonucleotide triphosphate)が挙げられる。鋳型核酸が２本鎖ＲＮＡの場合、そのＲＮＡのｃＤＮＡ（complementary DNA）を得るため、逆転写酵素や逆転写酵素用プライマーなども核酸増幅用試薬１２に含有される。
【００２１】
プライマーは、標的核酸の３´側と５´側にアニールするよう設計されるオリゴヌクレオチドであり、図２に示すように、鋳型核酸における２本鎖の一方の鎖Ｃ１の一部にアニールするフォワードプライマーＦＰと、当該２本鎖の他方の鎖Ｃ２の一部にアニールするリバースプライマーＲＰとを有する。
【００２２】
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる標識物質であり、図２に示すように、本実施形態では第１プローブＰＢ１と第２プローブＰＢ２とを有する。
【００２３】
第１プローブＰＢ１は、フォワードプライマーの３´末端Ｅ１がアニールする位置とリバースプライマーの３´末端Ｅ２がアニールする位置とで挟まれる領域ＡＲのうち、標的核酸にアニールする。この第１プローブＰＢ１の構成要素としては、標的核酸にアニールするアニール部Ｐ１１と、そのアニール部Ｐ１１に付加される色素Ｐ１２とが含まれる。
【００２４】
アニール部Ｐ１１は、標的核酸にアニールする塩基配列を有している。この塩基配列は、標的核酸の塩基配列のすべてに相補的となる塩基配列であっても、当該標的核酸の塩基配列の一部に相補的となる塩基配列であっても良い。なお、上記の領域ＡＲのうち標的核酸に特異的にアニールする塩基配列を、アニール部Ｐ１１の塩基配列とすることが好ましい。このような塩基配列としては、例えば、ＰＮＡ(peptide nucleic acid)、ＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＥＮＡ（ethylene bridged nucleic acid）などの人工核酸が有用である。
【００２５】
色素Ｐ１２は、所定の波長帯域の光を発する物質である。この色素Ｐ１２は、蛍光色素であっても、蛍光色素以外の色素であっても良い。また、色素Ｐ１２は、アニール部Ｐ１１の塩基配列の末端に付加されていても、当該末端以外に付加されていても良い。さらに、色素Ｐ１２は、アニール部Ｐ１１に付加された状態のまま発光しても、当該アニール部Ｐ１１から分離した状態で発光しても良い。
【００２６】
アニール部Ｐ１１から分離した状態で発光する色素としては、例えばＴａｑＭａｎプローブで用いられるレポーター色素およびクエンチャー色素がある。これらレポーター色素およびクエンチャー色素は、当該クエンチャー色素によってレポーター色素の発光が抑制されるように、アニール部Ｐ２１に付加される。核酸の伸長反応によりアニール部Ｐ１１からレポーター色素が分離すると、クエンチャー色素による発光の抑制が解かれ、当該レポーター色素は発光可能となる。
【００２７】
第２プローブＰＢ２は、上述の領域ＡＲのうち標的核酸以外にアニールする。本実施形態の場合、第２プローブＰＢ２は、上述の領域ＡＲにおける一方の鎖Ｃ１側にアニールするプローブと、当該領域ＡＲにおける他方の鎖Ｃ２側にアニールするプローブとを有している。この第２プローブＰＢ２の構成要素としては、上述の領域ＡＲのうち標的核酸以外にアニールするアニール部Ｐ２１と、そのアニール部Ｐ２１に付加される色素Ｐ２２とが含まれる。
【００２８】
アニール部Ｐ２１は、上記の領域ＡＲのうち標的核酸以外の第１部分領域、もしくは、第１部分領域のさらに一部となる第２部分領域にアニールする塩基配列を有している。この塩基配列は、第１部分領域または第２部分領域の塩基配列のすべてに相補的となる塩基配列であっても、当該第１部分領域または第２部分領域の塩基配列の一部に相補的となる塩基配列であっても良い。
【００２９】
色素Ｐ２２は、色素Ｐ１２と同様に、所定の波長帯域の光を発する物質であり、蛍光色素であっても、蛍光色素以外の色素であっても良い。また、色素Ｐ２２は、色素Ｐ１２と同様に、アニール部Ｐ２１の塩基配列の末端に付加されていても、当該末端以外に付加されていても良い。さらに、色素Ｐ２２は、色素Ｐ１２と同様に、アニール部Ｐ２１に付加された状態のまま発光しても、当該アニール部Ｐ２１から分離した状態で発光しても良い。
【００３０】
本実施形態の場合、第１プローブＰＢ１の色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域との少なくとも一部が重なっている。すなわち、色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域とには、互いに同じ波長帯域部分が存在する状態である。なお、色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域とは全体的に同じであることが好ましいが、わずかでも重なっている波長帯域部分を有している限りずれていても良い。
【００３１】
色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域とがずれている場合、色素Ｐ１２が発光する光のスペクトル分布におけるピークの半値となる部分の波長帯域と、色素Ｐ２２が発光する光のスペクトル分布におけるピークの半値となる部分の波長帯域とで重なる波長帯域が大きいほど好ましい。
【００３２】
また、色素Ｐ１２が発光する光のスペクトル分布のピークと、色素Ｐ２２が発光する光のスペクトル分布のピークとが近づいているほど好ましい。さらに、色素Ｐ１２と色素Ｐ２２とが蛍光色素である場合、分子吸光度係数や蛍光半減期は近いほど好ましい。さらに、色素Ｐ１２の化学構造と色素Ｐ２２の化学構造とは、同じであっても異なっていても良い。
【００３３】
ポリメラーゼは、１本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列となる１本鎖を合成する酵素であり、ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）を混合したものである。
【００３４】
容器２０は、図１に示すように、液滴１０が移動可能な流路となる流路部２１と、当該流路部２１の一端側の開口を塞ぐ底部２２と、当該流路部２１の他端側の開口を塞ぐ蓋部２３とを有する。本実施形態では、流路部２１は例えば円柱状とされ、底部２２は例えば中空半球状とされる。また、蓋部２３は、例えば円錐台状とされ、流路部２１に対して着脱自在とされる。
【００３５】
この容器２０にはオイル３０が収容される。オイル３０は、容器２０内に導入される核酸試薬溶液の比重よりも比重が小さく、当該核酸試薬溶液とは相分離するものであり、例えば２ＣＳシリコーンオイルあるいはミネラルオイルなどとされる。
【００３６】
核酸試薬溶液は、例えば次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によってヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルス粒子などの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて鋳型核酸１１が検体から抽出される。次に、例えば水（蒸留水、滅菌水）やＴｒｉｓ-ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）などの溶媒を用いて、鋳型核酸１１と核酸増幅用試薬１２の各成分とが所定濃度となるように、試験管などで核酸試薬溶液が調整される。この核酸試薬溶液は、ピペットなどの器具を用いて核酸試薬溶液が容器２０内に導入される。
【００３７】
図３は核酸増幅用カートリッジの容器内に核酸試薬溶液が導入される様子を示す図である。図３に示すように、核酸試薬溶液が容器２０内に導入された場合、その核酸試薬溶液に対して界面の表面積を小さくする作用が働くことで、核酸試薬溶液は容器２０内のオイル３０と相分離し、液滴１０となる。この液滴１０の比重はオイル３０の比重よりも大きいため、当該液滴１０は流路部２１に沿って沈降することになる。
【００３８】
＝＝＝核酸増幅装置＝＝＝
図４は、核酸増幅装置のブロック図である。図４に示すように、核酸増幅装置５０は、回転機構６０、光検出器７０および制御部８０を有する。
【００３９】
＜回転機構＞
図５は、回転機構の様子を概略的に示す図である。図５は回転機構６０の側面図である。以下の核酸増幅装置５０の説明では、図５に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置５０のベース５１を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、核酸増幅用カートリッジ１の回転軸ＡＸの軸方向を「左右方向」とし、上下方向および左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。
【００４０】
図５に示すように、回転機構６０は、回転体６１およびその回転体６１を回転させる回転用モーター６６（図４）を有する。回転体６１には、核酸増幅用カートリッジ１を着脱可能な挿入穴６４を有するヒーター部６５が設けられる。回転体６１は、ヒーター部６５とそのヒーター部６５の挿入穴６４に装着される核酸増幅用カートリッジ１との相対位置を変えずに、ベース５１に固定された支持台５２に支持される回転軸ＡＸを中心として回転する。
【００４１】
なお、本実施形態におけるヒーター部６５の挿入穴６４は、核酸増幅用カートリッジ１を出し入れ可能な穴と、当該穴に入れられた核酸増幅用カートリッジ１を装着する装着部を兼ねているが、当該穴と装着部とが別々に核酸増幅装置５０に設けられていても良い。また、装着部が装脱着可能な核酸増幅用カートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でも良い。
【００４２】
回転用モーター６６（図４）は、制御部８０からの指示にしたがって、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された核酸増幅用カートリッジ１が上下反転するように、回転体６１を回転させる。
【００４３】
図６は、核酸増幅用カートリッジが装着された様子を示す図である。図６に示すように、ヒーター部６５は、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱するための第１ヒーター部６５Ｂと、標的核酸の合成反応（アニーリング反応および伸長反応）が進行する温度に加熱するための第２ヒーター部６５Ｃとを有する。
【００４４】
ヒーター部６５の挿入穴６４に核酸増幅用カートリッジ１が装着された場合、容器２０における流路部２１の底部２２側となる第１領域３６Ａが第１ヒーター部６５Ｂに囲まれる。第１ヒーター部６５Ｂは、例えば９５〜１００℃の範囲のなかから設定された温度に第１領域３６Ａを加熱する。
【００４５】
また、ヒーター部６５の挿入穴６４に核酸増幅用カートリッジ１が装着された場合、容器２０における流路部２１の蓋部２３側となる第２領域３６Ｂが第２ヒーター部６５Ｃに囲まれる。第２ヒーター部６５Ｃは、例えば５０〜７５℃の範囲のなかから設定された温度に第２領域３６Ｂを加熱する。
【００４６】
このように核酸増幅用カートリッジ１における容器２０の第１領域３６Ａが標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱され、当該容器２０の第２領域３６Ｂが標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱される。
【００４７】
なお、第１ヒーター部６５Ｂと第２ヒーター部６５Ｃとの間には、第１ヒーター部６５Ｂと第２ヒーター部６５Ｃとの間の熱伝導を抑制するスペーサー６５Ｄが配置されている。このスペーサー６５Ｄには、第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃの挿入穴６４の長手方向に沿った位置に貫通孔が形成され、挿入穴６４に対して核酸増幅用カートリッジ１の容器２０の挿入を妨げることが防止される。
【００４８】
＜光検出器＞
光検出器７０は、核酸増幅用カートリッジ１の容器２０に収容される液滴１０から発光する光の強度を検出する検出器である。この光検出器７０は、図５に示すように、例えば、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着される核酸増幅用カートリッジ１の末端に対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
【００４９】
光検出器７０は、制御部８０からの検出指示に応じて第１プローブＰＢ１の色素Ｐ１２および第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２に対応する光を照射し、当該色素Ｐ１２，Ｐ２２が発光する光の強度を検出する。具体的には、第１プローブＰＢ１の色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域とのうち、双方の波長帯域が重なっている部分の強度が検出される。例えば、色素Ｐ１２および色素Ｐ２２が同じ化学構造の蛍光色素である場合、当該蛍光色素に対応する励起光が照射され、当該色素Ｐ１２および色素Ｐ２２の蛍光強度が検出される。
【００５０】
また光検出器７０は、検出結果として得られる光の強度を示すデータを制御部８０に与える。このデータが示す光の強度は、標的核酸の合成反応（アニーリング反応および伸長反応）が起こった回数を反映している。このため、制御部８０に与えられるデータが示す光の強度が高いほど、標的核酸の数（増幅数）が多くなっていることを表していることになる。
【００５１】
＜制御部＞
制御部８０は、図４に示すように、記憶部９１を有し、当該制御部８０には入力部９２および表示部９３などが接続される。記憶部９１には、プログラムを格納する領域と、入力部９２から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
【００５２】
制御部８０は、記憶部９１に格納されるプログラムおよび設定データに基づいて回転機構６０および光検出器７０を適宜制御し、熱サイクル処理または増幅解析処理を適宜実行する。
【００５３】
≪熱サイクル処理≫
図７Ａ〜図７Ｄは、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図７Ａおよび図７Ｂは標的核酸の合成段階の様子を示し、図７Ｃおよび図７Ｄは標的核酸の変性段階の様子を示す図である。
【００５４】
すなわち、制御部８０は、例えば熱サイクル処理すべき命令を入力部９２から受けると、回転体６１に設けられた第１ヒーター部６５Ｂを駆動し、核酸増幅用カートリッジ１における容器２０の第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱する。また、制御部８０は、回転体６１に設けられた第２ヒーター部６５Ｃを駆動し、核酸増幅用カートリッジ１における容器２０の第２領域３６Ｂを、標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱する。これにより核酸増幅用カートリッジ１の容器２０に充填されるオイル３０には温度勾配が形成される。
【００５５】
第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃが駆動されてから、第１領域３６Ａにおけるオイル３０が例えば９８℃に達し、第２領域３６Ｂにおけるオイル３０が例えば５４℃に達するまでには所定の期間を要する。この期間に標的核酸の増幅反応は適切に進行しないため、制御部８０は当該期間を待機期間として待機する。
【００５６】
このとき、図７Ａおよび図７Ｂに示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器２０における蓋部２３側が上側に配置され、当該容器２０における底部２２側が下側に配置される基準位置に回転体６１が位置している。回転体６１が基準位置に位置している場合、液滴１０は自重により流路部２１を沈降して第２領域３６Ｂに留まる。したがって、液滴１０に含有する標的核酸が１回目の変性段階に移行することはない。
【００５７】
制御部８０は、上述の待機期間を経過した場合、回転体６１を１８０度回転させる。この場合、図７Ｃおよび図７Ｄに示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器２０における蓋部２３側が下側に配置され、当該容器２０における底部２２側が上側に配置される反転位置に回転体６１が位置することになる。回転体６１が反転位置に位置している場合、液滴１０は自重により流路部２１を沈降して第１領域３６Ａに移動する。したがって、液滴１０に含有する標的核酸は変性段階に移行することになる。
【００５８】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点から標的核酸の変性段階の期間として設定された変性反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴１０に含有する標的核酸の変性反応が進行する。なお、変性反応期間は、少なくとも、流路部２１を通じて第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとの間を液滴１０が移動する期間以上の期間とされる。具体的には、５秒以上３０秒未満が一般的な変性反応期間として採用されるが、当該一般的な変性反応期間よりも短い２秒以上５秒未満が変性反応期間として採用されても良い。
【００５９】
次いで制御部８０は、変性反応期間を経過すると、回転体６１を１８０度回転させて、当該回転体６１を反転位置から基準位置に切り替え、図７Ｂに示すように、第２領域３６Ｂに液滴１０を移動させる。これにより液滴１０に含有する標的核酸は合成段階に移行することになる。
【００６０】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点から標的核酸の合成段階の期間として設定された合成反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴１０に含有する標的核酸のアニーリング反応および伸長反応が進行する。なお、合成反応期間は、上述の変性反応期間と同様に、少なくとも、流路部２１を通じて第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとの間を液滴１０が移動する期間以上の期間とされる。具体的には、２０秒以上６０秒未満が一般的な合成反応期間として採用されるが、当該一般的な合成反応期間よりも短い３秒以上２０秒未満が合成反応期間として採用されても良い。
【００６１】
このように制御部８０は、上述の反転位置と基準位置とを交互に切り替えて、第１領域３６Ａに液滴１０を移動させて留める変性段階および第２領域３６Ｂに液滴１０を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す。繰り返すべきサイクル数は制御部８０に設定され、例えば５０回とされる。
【００６２】
≪増幅解析処理≫
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部８０は、光検出器７０に対して合成反応期間ごとに検出指示を与え、当該検出指示の結果として光検出器７０から与えられる光の強度を示すデータを記憶部９１に記憶する。
【００６３】
なお、図７Ａおよび図７Ｂに示したように、合成反応期間では回転体６１が基準位置にあるため、容器２０内の液滴１０は底部２２に向かって沈降していく。しかしながら、回転体６１が基準位置になった直後では、液滴１０が底部２２に到達していない場合がある。したがって、制御部８０が光検出器７０に対して検出指示を与える時期は、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転し終えた時点から所定時間経過した後であることが望ましい。特に、基準位置から反転位置に回転させる直前であることが望ましい。
【００６４】
また制御部８０は、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の光の強度を示すデータを受けた場合、当該回数分のデータに基づいてサイクル数に対する光の強度の推移を示す増幅曲線を生成する。制御部８０は、増幅曲線を生成した場合、その増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部９３に表示させる。
【００６５】
＜増幅処理手順＞
次に、上述した制御部８０における各処理の一連の処理となる増幅処理手順について説明する。図８は、増幅処理手順を示すフローチャートである。図８に示すように、制御部８０は、加熱ステップＳＰ１に進んで、核酸増幅用カートリッジ１における容器２０の第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度として設定される変性温度に加熱する。また制御部８０は、容器２０の第２領域３６Ｂを、標的核酸の合成反応が進行する温度として設定される合成温度に加熱し、増幅ステップＳＰ２に進む。
【００６６】
制御部８０は、増幅ステップＳＰ２の第１段階Ｔ１１では、加熱し始めた時点から加熱対象が目的の温度に達するとして設定される待機期間を経過するまで待機し、当該待機期間を経過した場合には増幅ステップＳＰ２の第２段階Ｔ１２に進む。
【００６７】
制御部８０は、増幅ステップＳＰ２の第２段階Ｔ１２では、回転体６１を基準位置から反転位置にまで回転させて容器２０の変性温度領域（第１領域３６Ａ）に液滴１０を移動させる。次いで制御部８０は、回転体６１を反転位置に位置させた時点から変性反応期間を経過するまで、回転体６１を停止させ続けて容器２０の変性温度領域に液滴１０を留める。制御部８０は、変性反応期間を経過した場合には増幅ステップＳＰ２の第３段階Ｔ１３に進む。
【００６８】
制御部８０は、増幅ステップＳＰ２の第３段階Ｔ１３では、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転させて容器２０の合成温度領域（第２領域３６Ｂ）に液滴１０を移動させる。次いで制御部８０は、回転体６１を基準位置に位置させた時点から合成反応期間を経過するまで、回転体６１を停止させ続けて容器２０の合成温度領域に液滴１０を留める。制御部８０は、合成反応期間を経過した場合には増幅ステップＳＰ２の第４段階Ｔ１４に進む。
【００６９】
制御部８０は、増幅ステップＳＰ２の第４段階Ｔ１４では、第１プローブＰＢ１の色素Ｐ１２が発光する光の波長帯域と、第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２が発光する光の波長帯域とのうち、双方の波長帯域が重なっている部分の強度を光検出器７０に検出させる。また制御部８０は、光検出器７０から検出結果として光の強度を示すデータを受けた場合には増幅ステップＳＰ２の第５段階Ｔ１５に進む。
【００７０】
制御部８０は、増幅ステップＳＰ２の第５段階Ｔ１５では、繰り返すべきサイクル数として設定される繰返数にサイクル終了数が達したかを認識する。ここで、サイクル終了数が繰返数に至っていない場合、制御部８０は、サイクル終了数を１回分だけ増加させた後、増幅ステップＳＰ２の第１段階Ｔ１１に戻って上述の処理を繰り返す。一方、サイクル終了数が繰返数に至った場合、制御部８０は、増幅曲線生成ステップＳＰ３に進む。
【００７１】
制御部８０は、増幅曲線生成ステップＳＰ３では、繰り返すべきサイクル数ごとの光の強度を示すデータを用いて増幅曲線を生成し、容器２０における第１領域３６Ａおよび第２領域３６Ｂの加熱を停止する。その後、制御部８０は増幅処理手順を終了する。
【００７２】
＜小括＞
以上のとおり、本実施形態の核酸増幅用試薬１２は、第１プローブＰＢ１と第２プローブＰＢ２とを含んでいる。この第１プローブＰＢ１は、鋳型核酸においてフォワードプライマーＦＰの３´末端Ｅ１がアニールする位置とリバースプライマーＲＰの３´末端Ｅ２がアニールする位置とで挟まれる領域ＡＲのうち標的核酸にアニールする。一方、第２プローブＰＢ２は、この領域ＡＲのうち、標的核酸以外にアニールする。
【００７３】
これら第１プローブＰＢ１と第２プローブＰＢ２とは、発光する光の波長帯域の一部が重なる色素Ｐ１２，Ｐ２２を有している。このため、波長帯域が重なる部分では、当該波長帯域が重なっていない部分に比べて光の強度が強くなる。すなわち、色素Ｐ１２での発色によって標的核酸が標識されているが、この発色が、色素Ｐ２２での発色によって助長されることになる。
【００７４】
したがって、本実施形態の核酸増幅用試薬１２では、従来のように第２プローブＰＢ２がない場合に比べると、標的核酸を標識する発色量が高まり、この結果、光検出器７０に対して光を検出させ易くすることが可能となる。
【００７５】
また、本実施形態の場合、第２プローブＰＢ２は、上述の領域ＡＲにおける一方の鎖Ｃ１側にアニールするプローブと、当該領域ＡＲにおける他方の鎖Ｃ２側にアニールするプローブとを有する。
【００７６】
このため、鋳型核酸における一方の鎖Ｃ１に存在する標的核酸を標識する発色が、その一方の鎖Ｃ１側にアニールする第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２と、当該鋳型核酸における他方の鎖Ｃ２にアニールする第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２との双方によって助長される。したがって、鋳型核酸における一方の鎖Ｃ１または他方の鎖Ｃ２のいずれかだけに第２プローブＰＢ２がアニールする場合に比べると、標的核酸を標識する発色量がさらに高まり、この結果、光検出器７０に対して光をより一段と検出させ易くすることが可能となる。
【００７７】
標的核酸を標識する発色量を高める観点では、第１プローブＰＢ１が有する色素Ｐ１２が発光する光と、第２プローブＰＢ２が有する色素Ｐ２２が発光する光との波長帯域の一部が同じである場合に比べ、これら波長帯域全体が同じである場合が好ましい。また、第１プローブＰＢ１が有する色素Ｐ１２と、第２プローブＰＢ２が有する色素Ｐ２２との化学構造が異なる場合に比べ、これら化学構造が同じである場合が好ましい。
【００７８】
なお、増幅反応期間（変性反応期間および合成反応期間）が一般的に採用される２５秒よりも短縮される場合、実際に標的核酸が増幅していても光検出器７０で光が検出されていない傾向になる。このため、増幅反応期間が短縮化される場合には本実施形態の核酸増幅用試薬１２が特に有用となる。
【００７９】
（２）変形例
上記実施形態では、第２プローブＰＢ２が、上述の領域ＡＲにおける一方の鎖Ｃ１側にアニールするプローブと、当該領域ＡＲにおける他方の鎖Ｃ２側にアニールするプローブとを有していたが、当該プローブのいずれかが省略されても良い。ただし、標的核酸を標識する発色量を高める観点では、上述したように、上述の領域ＡＲにおける一方の鎖Ｃ１側と、当該領域ＡＲにおける他方の鎖Ｃ２側との双方に有していることが好ましい。
【００８０】
また上記実施形態では、第１プローブＰＢ１が有する色素Ｐ１２の数と、第２プローブＰＢ２が有する色素Ｐ２２の数とは、ともに１つとされたが、当該色素数は２以上であっても良い。また、第１プローブＰＢ１が有する色素Ｐ１２の数と、第２プローブＰＢ２が有する色素Ｐ２２の数とが異なっていても良い。
【００８１】
また上記実施形態では、一般的な変性反応期間および合成反応期間よりも短い期間で増幅反応が実行されたが、当該一般的な変性反応期間および合成反応期間で増幅反応が実行されても良い。
【００８２】
また上記実施形態では、液滴１０の比重がオイル３０の比重よりも大きくされた。しかしながら、液滴１０の比重がオイル３０の比重よりも小さくされていても良い。このようにしても上記実施形態と同様の効果を奏する。
【００８３】
また上記実施形態では、変性反応期間および合成反応期間の始期が回転体６１を１８０度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点とされたが、当該回転体６１を１８０度回転し始める時点とされても良い。
【００８４】
また上記実施形態では、核酸増幅用カートリッジ１における容器２０内の液滴１０を第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとに交互に移動させる機構として回転機構６０が採用された。しかしながら、容器２０において標的核酸の変性温度にされる第１領域３６Ａと、その第１領域３６Ａとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域３６Ｂとに液滴１０を交互に移動させる駆動機構であれば、上記回転機構６０以外の種々の駆動機構を適用することが可能である。また、液滴１０を交互に移動させる駆動機構を有していない通常の核酸増幅装置が適用されても良い。
【００８５】
また上記実施形態では、容器２０内で液滴１０を移動させるべき領域として、標的核酸の変性温度にされる第１領域３６Ａと、その第１領域３６Ａとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域３６Ｂとが配置された。しかしながら３つの領域が配置されていても良い。すなわち、第１領域３６Ａとして、標的核酸の変性温度にされる領域が配置される。また、第２領域３６Ｂとして、互いに異なる２つ領域が配置され、一方の領域は標的核酸の合成反応におけるアニーリング反応が進行する温度として設定されるアニーリング温度にされ、他方の領域は標的核酸の伸長反応が進行する温度として設定される伸長温度にされる。このように、サイクルにおける温度変化が変性段階および合成段階の２段階とされる上記実施形態の場合に限らず、変性段階、アニーリング段階および伸長段階の３段階とされる場合であっても、容器内で液滴１０を移動させることができる。なお、サイクルにおける温度変化が３段階とされる場合であっても、回転機構以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
【００８６】
上記実施形態では、第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃを備えた核酸増幅装置５０が適用された。しかしながら、容器２０の内部に温度勾配を形成できるのであれば、上記実施形態の核酸増幅装置５０以外の核酸増幅装置が適用されても良い。
【実施例１】
【００８７】
（実施例１）
まず、鋳型核酸１１および核酸増幅用試薬１２およびバッファを試験管に投入した後、蒸留水を加えて１０μＬの核酸試薬溶液を調整した。
【００８８】
鋳型核酸１１は、Vircell社製における肺炎マイコプラズマのゲノムＤＮＡ２５０コピーとし、０．６２５μＬだけ試験管に投入した。
核酸増幅用試薬１２に含有されるポリメラーゼは、Life Technologies社製のPlatinumTaqとし、０．４μＬだけ試験管に投入した。
核酸増幅用試薬１２に含有されるｄＮＴＰは、Roche社製のものを使用し、０．５μＬだけ試験管に投入した。
核酸増幅用試薬１２に含有されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ、０．８μＬだけ試験管に投入した。
核酸増幅用試薬１２に含有される第１プローブＰＢ１は、TaqManプローブ（蛍光プローブ）を使用し、０．６μＬだけ試験管に投入した。
核酸増幅用試薬１２に含有される第２プローブＰＢ２は、TaqManプローブ（蛍光プローブ）を使用し、０．６μＬだけ試験管に投入した。
バッファは、MgCl2が２５ｍＭ、Tris-HCl(PH9.0)が２５０ｍＭ、KClが１２５ｍＭの組成のものを使用し、２．０μＬだけ試験管に投入した。
【００８９】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーと、第１プローブＰＢ１および第２プローブＰＢ２との配列は、下記の表１に示すものとされる。なお、第１プローブＰＢ１の色素Ｐ１２と第２プローブＰＢ２の色素Ｐ２２とは同じ化学構造である。
【００９０】
【表１】
2017074007.tif 000003
【００９１】
上記表１における“FAM”は、フルオレセインアミノヘキシル（fluorescein aminohexyl）の略語であり、レポーター蛍光色素の１つである。また、上記表１における“BHQ”は、ブラックホールクエンチャー（Black Hole Quencher）の略語であり、クエンチャー蛍光色素の１つである。
【００９２】
次いで、核酸試薬溶液１．６μｌを容器２０に導入して容器２０内に液滴１０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器２０を装着し、熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００９３】
熱サイクル処理におけるサイクル数は５０回とし、変性反応期間は４秒とし、合成反応期間は６秒とし、第１ヒーター部６５Ｂの温度は９８℃とし、第２ヒーター部６５Ｃの温度は５４℃とした。
【００９４】
（比較例１）
実施例１の第２プローブＰＢ２は用いることなく、上記実施例１と同じとなる条件のもとで、核酸試薬溶液を調整した。
【００９５】
次いで、核酸試薬溶液を容器２０に導入して容器２０内に液滴１０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器２０を装着し、実施例１と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００９６】
（実施例１と比較例１との対比）
上述の実施例１および比較例１における増幅曲線を図９に示す。図９に示されるように、第２プローブＰＢ２が用いられた場合、第２プローブＰＢ２が用いられていない場合に比べて、変性反応期間および合成反応期間が一般的に採用される期間より短縮されても、蛍光強度の変化量が大幅に向上されることが分かった。
【符号の説明】
【００９７】
１・・・核酸増幅用カートリッジ、１０・・・液滴、１１・・・鋳型核酸、１２・・・核酸増幅用試薬、２０・・・容器、２１・・・流路部、３０・・・オイル、５０・・・核酸増幅装置、７０・・・光検出器、ＰＢ１・・・第１プローブ、ＰＢ２・・・第２プローブ。
【図１】
2017074007.tif 000004
【図２】
2017074007.tif 000005
【図３】
2017074007.tif 000006
【図４】
2017074007.tif 000007
【図５】
2017074007.tif 000008
【図６】
2017074007.tif 000009
【図７Ａ】
2017074007.tif 000010
【図７Ｂ】
2017074007.tif 000011
【図７Ｃ】
2017074007.tif 000012
【図７Ｄ】
2017074007.tif 000013
【図８】
2017074007.tif 000014
【図９】
2017074007.tif 000015