(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過性ペプチドの提供。【解決手段】式Xで表される細胞膜透過性を有するペプチド。F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式Ｘ〔ｍは２〜４の整数；ｎは０〜３の整数；Ｆはリンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識；Xaaは特定の構造のカチオン性プロリン誘導体基〕【選択図】図４
2017137256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性を有する下記の式Ｘ
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式Ｘ
〔式中、
ｍは２〜４のいずれかの整数であり、
ｎは０〜３のいずれかの整数であり、
Ｆは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式Ａ、式Ｂ（ｎは１〜５）、式Ｃ（ｎは１〜５）、又は、式Ｄ（ｎは１〜５）の何れかである
【化１】
2017137256.tif 000019
【化２】
2017137256.tif 000020
【化３】
2017137256.tif 000021
【化４】
2017137256.tif 000022
〕で表されるペプチド。
【請求項２】
Ｆはフルオレセイン化合物である請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドと、細胞内に輸送すべきカーゴ分子とを含む構築物。
【請求項４】
前記カーゴ分子は、核酸、タンパク質、薬剤、又は、ナノ粒子の何れかである請求項３記載の構築物。
【請求項５】
細胞内に輸送すべきカーゴ分子と、請求項１又は２に記載のペプチドとを結合させて構築物を得る工程と、
前記構築物を細胞に導入する工程と、を有する、
カーゴ分子を細胞内に輸送する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性を有するペプチドに関し、具体的には、プラスミドDNA等を効率的に細胞内に輸送できる細胞膜透過性を有するペプチドに関する。また、そのペプチドとカーゴ分子とからなる構築物に関する。更に、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞透過性を有するペプチド(以下、細胞膜透過性ペプチド(Cell-Penetrating Peptides;CPPs)と略することがある。)を用いて、細胞内にタンパク質等を導入する手法が注目されている。細胞内に導入したいタンパク質等にCPPsを細胞内導入ベクターとして化学的に結合させるか、又は、遺伝子工学的にCPPsと導入したいタンパク質等との融合タンパク質を調製し、細胞培養液に混合することで，効率よく細胞内に目的分子が導入される。
【０００３】
CPPsとして実際に用いられている代表的なものとして、(1)アルギニン等の塩基性アミノ酸に富むもの、(2)塩基性部分と疎水性部分を有する両親媒性ペプチド、(3)疎水性配列に若干の塩基性配列を含むペプチド、(4)疎水性ペプチド等が挙げられる。
【０００４】
ペプチドベクターは様々な物質の導入に有効であるが、遺伝子（プラスミド）の導入には不向きである場合がある。プラスミドの分子量が非常に大きいこと、負電荷を帯びたプラスミドと正電荷を帯びたペプチドベクターとが不溶性の凝集体を形成すること、細胞内移行に重要な働きを示すベクターのグアニジノ基と細胞表層の相互作用が損なわれたりすること、等がその理由と考えられている。
【０００５】
そこで、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３には、導入目的物がプラスミドであっても効率的な細胞内導入を可能とするCPPsが検討されており、CPPsの膜透過におけるカチオン性官能基の重要性や、オリゴアルギニンのペプチドヘリカル構造が細胞膜透過性の向上に寄与すること等が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. Oba, Y. Demizu, H. Yamashita, M. Kurihara, M. Tanaka, Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 4911-4918.
【非特許文献２】H. Yamashita, Y. Demizu, T. Shoda, Y. Sato, M. Oba, M. Tanaka, M. Kurihara, Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 2403-2408.
【非特許文献３】H. Yamashita, M. Oba, T. Misawa, M. Tanaka, T. Hattori, M. Naito, M. Kurihara, Y. Demizu, ChemBioChem 2016, 17, 137-140.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上述の技術よりも更なる効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過性ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかる細胞膜透過性ペプチドは、下記の式Ｘ
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式Ｘ
〔式中、
ｍは２〜４のいずれかの整数であり、
ｎは０〜３のいずれかの整数であり、
Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式Ａ、式Ｂ（ｎは１〜５）、式Ｃ（ｎは１〜５）、又は、式Ｄ（ｎは１〜５）の何れかである
【０００９】
【化１】
2017137256.tif 000003
【００１０】
【化２】
2017137256.tif 000004
【００１１】
【化３】
2017137256.tif 000005
【００１２】
【化４】
2017137256.tif 000006
〕で表されるペプチドである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過性ペプチドが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ペプチドの生理的条件下における二次構造を示すＣＤスペクトル測定の結果である。
【図２】ペプチドの両親媒環境下における二次構造を示すＣＤスペクトル測定の結果である。
【図３】ペプチドの細胞膜透過性を示すフローサイトメーターでの測定結果であり、そのうち（Ａ）は接着細胞における結果であり、（Ｂ）は浮遊細胞における結果である。
【図４】ペプチドによるプラスミドDNAのデリバリー結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明者らは、細胞膜透過性を有するノナアルギニン(R9)をベースとして、所定のカチオン性プロリン誘導体を導入することにより、親水性環境下でランダム構造を形成するのに対し、細胞膜付近を模した両親媒性環境下ではヘリカル構造へとその二次構造を動的に変化させる新規の膜透過性ペプチドの開発に成功した。この二次構造変化により、膜透過性の向上及びカーゴ分子の効率的なリリースが得られる。
【００１７】
本発明にかかる細胞膜透過性ペプチドは、下記の式Ｘ
F-(L-Arg-L-Arg-Xaa)m-(Gly)n-NH2・・・式Ｘ
〔式中、
ｍは２〜４のいずれかの整数であり、
ｎは０〜３のいずれかの整数であり、
Ｆは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識であり、
Xaaは、下記の式Ａ、式Ｂ（ｎは１〜５）、式Ｃ（ｎは１〜５）、又は、式Ｄ（ｎは１〜５）の何れかである。
【００１８】
【化５】
2017137256.tif 000007
【００１９】
【化６】
2017137256.tif 000008
【００２０】
【化７】
2017137256.tif 000009
【００２１】
【化８】
2017137256.tif 000010
〕で表される。
【００２２】
カチオン性プロリン誘導体は、上述の式Ａ、式Ｂ、式Ｃ又は式Ｄで表される誘導体であるが、好ましくは式Ａで表される誘導体である。
【００２３】
Ｆは、リンカーを介した蛍光標識である場合が好ましく、リンカーとしては例えばβ-Ala等がある。蛍光標識としては特に限定されるものではないが、好ましくはフルオレセイン化合物で標識する。フルオレセイン化合物で標識する場合、例えば下記の式で表される化合物が挙げられる。
【００２４】
【化９】
2017137256.tif 000011
【００２５】
好ましくは式IV(5-FAM)又は式V(6-FAM)である。
【００２６】
また、ｍは３が好ましく、ｎは３が好ましい。
【００２７】
下記に本実施形態にかかる細胞膜透過性ペプチドの好適な場合の構造式を示す。
【００２８】
【化１０】
2017137256.tif 000012
【００２９】
上記式においてＲは-ＮＨＣＮＨＮＨ２である。上記の細胞膜透過性ペプチドは下記の式で表すことも可能である。
【００３０】
FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-ProGu)3-(Gly)3-NH2・・・式３
ここで、ProGuは下記である。
【００３１】
【化１１】
2017137256.tif 000013
本実施形態にかかる細胞膜透過性ペプチドの合成方法は、特に限定されるものではないが、例えばFmoc固相法により合成することが可能である。FmocはFluorenyl-Methoxy-Carbonylの略であり、保護基である。
【００３２】
下記に式Ａで表されるカチオン性プロリン誘導体の合成例を示す。
【００３３】
【化１２】
2017137256.tif 000014
【００３４】
また、下記に式Ｃで表されるカチオン性プロリン誘導体の合成例を示す。
【００３５】
【化１３】
2017137256.tif 000015
【００３６】
本実施形態にかかる構築物は、本実施形態にかかる細胞膜透過性ペプチドと、細胞内に輸送すべきカーゴ分子とを含む。細胞膜透過性ペプチドとカーゴ分子とは共有結合的又は非共有結合的に結合する。
【００３７】
カーゴ分子は、特に限定されるものではないが、例えば、核酸、タンパク質、薬剤、又は、ナノ粒子の何れかである。
【００３８】
カーゴ分子である核酸は、ポリヌクレオチドでもオリゴヌクレオチドでもよく、DNAでもRNA分子でもよい。DNAの場合、プラスミドDNA、cDNA、ゲノミックDNA又は合成DNAでもよい。DNA及びRNAは２本鎖でも１本鎖でもよい。１本鎖の場合、コード鎖又は非コード鎖であり得る。核酸にはDNA誘導体又はRNA誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチオエート結合を有する核酸又は酵素による分解を避ける為にインターヌクレオチドのリン酸部位、糖部分、塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。また、核酸にはアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスも含まれる。核酸がプラスミドDNA又はウイルス等の遺伝子治療に用いられるベクターである場合、細胞内に導入されたときにコードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましい。
【００３９】
本実施形態にかかるカーゴ分子を細胞内に輸送する方法は、細胞内に輸送すべきカーゴ分子と、本実施形態にかかるペプチドとを結合させて構築物を得る工程と、その構築物を細胞に導入する工程と、を有する。
【００４０】
本実施形態にかかる構築物を生体（ヒトを含む動物、特に、ヒトを含む哺乳類）に投与する方法としては、経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収のいずれでも良く、好ましくは注射である。例えば、本実施形態にかかる構築物を静脈注射による全身投与又は患部に注射することによる局所投与が可能である。
【００４１】
本実施形態にかかる構築物によれば、遺伝子又はタンパク質の導入される細胞内での機能を調べることが可能である。例えば、細胞内に機能を調べたい遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを導入して発現させることによりその遺伝子の機能を調べることが可能であり、また機能を調べたい遺伝子の発現を抑制するsiRNA核酸を細胞内に導入して遺伝子の発現を抑制することによってその遺伝子の機能を調べることが可能である。
【００４２】
また本実施形態にかかる構築物によれば、癌、遺伝子疾患、AIDS、慢性関節リウマチ等の様々な疾患を処置し得る候補物質をスクリーニングすることができる。
【００４３】
また本実施形態にかかる構築物によれば、細胞の性質を変えることができる。例えば、特定のmRNAを分解できるsiRNAをカーゴ分子として細胞に投与すれば、そのmRNAがコードする機能性タンパク質の発現量を低下させた細胞が得られる。また例えば特定の細胞内受容体の活性を抑えるアンタゴニストをカーゴ分子として細胞に投与すれば、その細胞はアンタゴニストが投与されていない標的細胞と比較して受容体の活性を低くすることができる。
【実施例】
【００４４】
（１）ペプチド合成
細胞内に導入するプロリン誘導体は全て、有機化学的に合成した。ペプチドはマイクロウェーブを用いたFmoc固相法により簡便に行い、下記３つのペプチドを合成した。
【００４５】
FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-Pro)3-(Gly)3-NH2・・・式１
式１は比較例にかかるペプチドであり、Proは下記である。
【００４６】
【化１４】
2017137256.tif 000016
FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-ProNH2)3-(Gly)3-NH2・・・式２
式２は別の比較例にかかるペプチドであり、ProNH2は下記である。
【００４７】
【化１５】
2017137256.tif 000017
FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-ProGu)3-(Gly)3-NH2・・・式３
式３は本実施例にかかるペプチドであり、ProGuは下記である。
【００４８】
【化１６】
2017137256.tif 000018
（２）ペプチドの二次構造解析
得られた粗ペプチドは逆相HPLCにより精製し、MALDI-MSによって同定した。ペプチドの溶液状態における二次構造は20 mM PBS buffer solution (pH = 7.4)及び1% SDS in PBS buffer solution (pH = 7.4)を用い、CDスペクトル測定によって解析を行なった。
【００４９】
溶液状態における二次構造解析の結果、合成した下記に示す本実施例にかかるペプチド（式３で示される）は、生理的条件下から両親媒環境下への環境変化に応じて、その構造をランダムからヘリカルへと変化させることが示された。
【００５０】
即ち、実際に細胞膜を透過する際、ペプチドはpH＝7.2〜7.4の培地内に分散した状態から細胞膜付近の両親媒環境へと近づき、直接透過ないしエンドサイトーシスを介して細胞内へと移行した後にサイトゾルへと拡散する。したがって、細胞から十分に離れた生理的親水性環境下における二次構造と細胞膜付近及びエンドソーム内を模した両親媒環境下における二次構造の解析をCD（円偏光二色性：Circular Dichroism）スペクトル測定（190〜260 nm）により行った。タンパク質のアミド結合は240 nm以下の遠紫外波長領域にいくつかの電子遷移を有しているが、これらはアミド結合の状態によって異なることが知られている。そのため、190〜260 nmで観察されるCDスペクトルはタンパク質主鎖内によく見られるa-ヘリックスやb-シート、ランダム構造などの二次構造を反映している。例えばa-ヘリックス構造を形成するペプチドのCDスペクトルは、205〜208nm及び220〜225 nm付近に極小値と192 nm付近に極大値を示す。また、208 nmと222 nmの極小値の比R値（[q]222/[q]208）が0.6〜1.2を示す。一方で、b-シート構造では195〜200 nmと216〜218 nmにそれぞれ正と負の極大を示す。また、ランダム構造を有するペプチドのCDスペクトルは200 nm付近に負の極大を持つとされているが、こうした特徴は構成しているアミノ酸の種類や測定溶媒によって若干異なる。親水性環境下においては20 mM PBS buffer (pH=7.4)を、両親媒環境下においては1%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を溶解したPBS buffer（pH=7.4）を用いて100μMのペプチド溶液を調整した。親水性環境下における二次構造解析の結果、全てのペプチドが同様の特徴（243〜247 nm及び200 nm付近に負の極大、215〜220 nm付近に正の極大）を持つスペクトルを示し、本結果からこれらのペプチドが生理的環境下において主にランダム構造を形成していることが示唆された（図１）。図１は、2mM PBS buffer solution(pH＝7.4)中のＣＤスペクトル（ペプチド濃度:0.1mM）である。一方で、両親媒環境下においては、親水性条件下で見られていた243〜247nm付近の負の極大や215〜220 nm付近の正の極大が消失した反面、206 nm及び228 nm付近に負の極大が現れR値は約0.6を示した。本特徴はa-ヘリカル構造を形成するペプチドが示すCDスペクトルパターンに非常に良く似ており、ペプチド３が両親媒環境下でヘリカル構造を形成することを示唆している（図２）。図２は、1%SDS in PBS buffer solution(pH＝7.4)中のＣＤスペクトル（ペプチド濃度:0.1mM）である。ここで図１及び図２において、ペプチド１は（FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-Pro)3-(Gly)3-NH2・・・式１であり、ペプチド２は（FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-ProNH2)3-(Gly)3-NH2・・・式２であり、ペプチド３は（FAM-β-Ala-(L-Arg-L-Arg-ProGu)3-(Gly)3-NH2・・・式３であり、ペプチドR9はオリゴアルギニンである。
（３）ペプチドの細胞膜透過性
ペプチドの細胞膜透過性に関しては、フローサイトメーターを用い、細胞内の蛍光強度から測定した。結果を図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図３（Ａ）は接着細胞における各ペプチドの細胞膜透過性の結果（R9を１とした時の相対的透過性）である（ペプチド濃度:1μM、37℃、２時間培養）。図３（Ｂ）は浮遊細胞における各ペプチドの細胞膜透過性の結果（R9を１とした時の相対的透過性）である（ペプチド濃度:1μM、37℃、２時間培養）である。図３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、本実施にかかるペプチド３は、接着細胞（HeLa, A549, CHO-K1）及び浮遊細胞（Jurkat）に対し、低濃度において高い透過性を示した。
（４）ペプチドのカーゴ分子輸送効率
ルシフェラーゼをコードしたpDNA（Plasmid pCAcc+Luc, coding for firefly luciferase under the control of the CAG promoter, was provided by the RIKEN Gene Bank (Tsukuba, Japan)）を利用したルシフェラーゼアッセイにより、ペプチドのカーゴ分子輸送効率を評価した。結果を図４に示す。図４は、各ペプチドによるプラスミドDNAのデリバリー（37℃、24時間培養）を示す。図４に示されるように、本実施例にかかるペプチドは、HeLa細胞において、オリゴアルギニンと比較して高いpDNA輸送効率を達成した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
標的細胞における遺伝子機能の調査、疾患を処置できるカーゴ分子のスクリーニング、標的細胞の改変等に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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