(57)【要約】【課題】副作用が少なく、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤を提供する。【解決手段】オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を有効成分として含有する、炎症性疾患治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を有効成分として含有する、炎症性疾患治療剤。
【請求項２】
一酸化窒素産生抑制剤である、請求項１に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項３】
炎症性サイトカイン産生抑制剤である、請求項１又は２に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項４】
前記抽出物がエタノール抽出物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項５】
前記炎症性疾患が、慢性炎症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、大うつ病性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の炎症性疾患治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、炎症性疾患治療用組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の炎症性疾患治療剤を含有する、炎症反応抑制用食品組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の炎症性疾患治療剤を含有する、炎症反応抑制用化粧料。
【請求項９】
オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）をエタノールに懸濁して得られた懸濁液を所定時間インキュベートする工程と、
前記懸濁液を固形分と液体とに分離し、前記液体を前記微生物のエタノール抽出物として回収する工程と、
を備える、炎症性疾患治療剤の製造方法。
【請求項１０】
前記エタノールが、濃度９９質量％以上のエタノールである、請求項９に記載の炎症性疾患治療剤の製造方法。
【請求項１１】
前記所定時間が１〜３週間である、請求項９又は１０に記載の炎症性疾患治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患治療剤及びその使用に関する。より具体的には、炎症性疾患治療剤、炎症性疾患治療用組成物、炎症反応抑制用食品組成物、炎症反応抑制用化粧料及び炎症性疾患治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は生体内に異物が侵入したときや有害刺激が作用したときに生じる生体防御反応である。炎症反応は、アテローム性動脈硬化症、神経疾患、癌等の原因になり得ることが知られている。例えば、非特許文献１には、炎症反応が大うつ病性障害に関連することが報告されている。
【０００３】
ところで、オーランチオキトリウムとは、バイオマス生産に利用される従属栄養藻類の一種である。オーランチオキトリウムは、周囲の有機物を吸収して生育し、炭化水素オイルを産出する藻類として知られている（例えば、特許文献１、２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７７７９９号
【特許文献２】特開２０１５−１２８４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Krishnadas R. and Cavanagh J., Depression: an inflammatory illness？, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 83 (5), 495-502, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗炎症薬として、現在では主にステロイド剤や非ステロイド性抗炎症薬が使用されている。しかしながら、これらの薬物は副作用が強く、長期間の使用には適していない。そこで、本発明は、副作用が少なく、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
（１）オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を有効成分として含有する、炎症性疾患治療剤。
（２）一酸化窒素産生抑制剤である、（１）に記載の炎症性疾患治療剤。
（３）炎症性サイトカイン産生抑制剤である、（１）又は（２）に記載の炎症性疾患治療剤。
（４）前記抽出物がエタノール抽出物である、（１）〜（３）のいずれかに記載の炎症性疾患治療剤。
（５）前記炎症性疾患が、慢性炎症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、大うつ病性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌からなる群より選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の炎症性疾患治療剤。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の炎症性疾患治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、炎症性疾患治療用組成物。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載の炎症性疾患治療剤を含有する、炎症反応抑制用食品組成物。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載の炎症性疾患治療剤を含有する、炎症反応抑制用化粧料。
（９）オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）をエタノールに懸濁して得られた懸濁液を所定時間インキュベートする工程と、前記懸濁液を固形分と液体とに分離し、前記液体を前記微生物のエタノール抽出物として回収する工程と、を備える、炎症性疾患治療剤の製造方法。
（１０）前記エタノールが、濃度９９質量％以上のエタノールである、（９）に記載の炎症性疾患治療剤の製造方法。
（１１）前記所定時間が１〜３週間である、（９）又は（１０）に記載の炎症性疾患治療剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、副作用が少なく、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例２の結果を示すグラフである。
【図２】実験例３の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、実験例４で測定された各炎症性サイトカインの産生量を示すグラフである。（ａ）はＭＣＰ−１の結果を示し、（ｂ）はＩＬ−６の結果を示し、（ｃ）はＲＡＮＴＥＳの結果を示し、（ｄ）はＴＮＦ−αの結果を示す。
【図４】実験例７の強制水泳試験の結果を示すグラフである。
【図５】実験例７の尾懸垂試験の結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、実験例９の結果を示すグラフである。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１０の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［炎症性疾患治療剤］
１実施形態において、本発明は、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を有効成分として含有する、炎症性疾患治療剤を提供する。なお、ｔｓｕｋｕｂａ３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した（２０１０年１２月９日に国内寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−２２０４７より移管、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２、株名「Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｔｓｕｋｕｂａ３」）。オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ３株は、オーランチオキトリウム・１８ｗ−１３ａ株とも呼ばれる。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは、ｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物が、炎症反応を誘導させた動物細胞における一酸化窒素及び炎症性サイトカインの産生を顕著に抑制することを見出した。すなわち、上記の抽出物は、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤として利用することができる。また、上記の抽出物は天然物であるため副作用が少ない。
【００１２】
また、上記の抽出物は、動物細胞における一酸化窒素の産生を顕著に抑制することから、一酸化窒素産生抑制剤であるということもできる。また、上記の抽出物は、動物細胞における炎症性サイトカインの産生を顕著に抑制することから、炎症性サイトカイン産生抑制剤であるということもできる。
【００１３】
本実施形態の炎症性疾患治療剤は、医療用途に用いるものであってもよく、健康食品、化粧料等の非医療用途に用いるものであってもよい。
【００１４】
ｔｓｕｋｕｂａ３株の抽出物は、エタノール抽出物であってもよい。
【００１５】
本実施形態の炎症性疾患治療剤が治療対象とする炎症性疾患としては、例えば、慢性炎症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、大うつ病性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌等が挙げられる。
【００１６】
［炎症性疾患治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した炎症性疾患治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、炎症性疾患治療用組成物を提供する。本実施形態の炎症性疾患治療用組成物を生体に投与することにより、炎症性疾患を治療することができる。
【００１７】
炎症性疾患治療用組成物は、常法（例えば、日本薬局方記載の方法）にしたがって、上述した炎症性疾患治療剤、薬学的に許容される担体、及び場合によりその他の添加剤を混合して製剤化することにより製造することができる。
【００１８】
薬学的に許容される担体としては、特に制限されず、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、注射剤用溶剤等を使用することができる。また、その他の添加剤としては、特に制限されず、例えば、防腐剤、ｐＨ調整剤、安定剤紫外線吸収剤、酸化防止剤、着色剤、香料等が挙げられる。薬学的に許容される担体及びその他の添加剤としては、例えば、第十六改正日本薬局方等に記載されている一般的な原料を使用することができる。
【００１９】
炎症性疾患治療用組成物の剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口的に投与する剤型、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の非経口的に投与する剤型等が挙げられる。
【００２０】
皮膚外用剤としては、より具体的には、クリーム、ローション、化粧水、乳液、ファンデーション、パック剤、フォーム剤、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤等の剤型が挙げられる。
【００２１】
炎症性疾患治療用組成物は、炎症反応抑制用化粧料であってもよい。炎症反応抑制用化粧料を生体に適用することにより、例えば皮膚炎等の炎症性疾患を治療又は緩和することができる。
【００２２】
炎症性疾患治療用組成物中の炎症性疾患治療剤の含有量は、固形分換算で、例えば０．０１〜５０質量％であってもよく、例えば０．０１〜３０質量％であってもよく、例えば０．０１〜１０質量％であってもよく、例えば０．０１〜５質量％であってもよく、例えば０．０１〜１質量％であってもよい。
【００２３】
炎症性疾患治療剤又は炎症性疾患治療用組成物の投与方法は特に制限されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
【００２４】
炎症性疾患治療剤又は炎症性疾患治療用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（固形分換算した、ｔｓｕｋｕｂａ３株の抽出物）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜１０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば１日あたり０．０１〜５００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【００２５】
［炎症反応抑制用食品組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した炎症性疾患治療剤を含有する、炎症反応抑制用食品組成物を提供する。食品組成物としては、健康食品、サプリメント等が挙げられる。本実施形態の食品組成物を一時的又は継続的に摂取することにより、副作用をほとんど生じることなく、炎症性疾患を緩和又は予防することができる。
【００２６】
［炎症性疾患治療剤の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ｔｓｕｋｕｂａ３株をエタノールに懸濁して得られた懸濁液を所定時間インキュベートする工程と、前記懸濁液を固形分と液体とに分離し、前記液体を前記微生物のエタノール抽出物として回収する工程と、を備える、炎症性疾患治療剤の製造方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤を製造することができる。
【００２７】
ｔｓｕｋｕｂａ３株は、エタノールに懸濁する前に乾燥させてもよい。乾燥は、例えば凍結乾燥により行ってもよい。
【００２８】
また、上記のエタノールは、濃度９９質量％以上のエタノールであってもよい。また、上記の懸濁液のインキュベートは、例えば懸濁液を室温で静置することにより行ってもよく、例えば懸濁液をシェーカー等を用いて撹拌しながら行ってもよい。また、上記の懸濁液をインキュベートする時間は、例えば１〜３週間であってもよく、例えば１〜２週間であってもよい。
【００２９】
また、インキュベート後の懸濁液を固形分と液体とに分離する工程は、例えば遠心分離により行ってもよく、例えばフィルター処理により行ってもよい。回収したエタノール抽出物は、そのまま炎症性疾患治療剤として用いてもよく、溶媒を除去して固形分のみを回収して炎症性疾患治療剤として用いてもよい。溶媒の除去は、例えば遠心エバポレーターを用いて蒸発乾固させること等により行うことができる。
【００３０】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物の有効量を治療を必要とする患者に投与する工程を備える、炎症性疾患の治療方法を提供する。本実施形態の治療方法は、炎症反応の抑制方法であるということもできる。
【００３１】
１実施形態において、本発明は、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物の有効量を治療を必要とする患者に投与する工程を備える、一酸化窒素の産生抑制方法を提供する。
【００３２】
１実施形態において、本発明は、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物の有効量を治療を必要とする患者に投与する工程を備える、炎症性サイトカインの産生抑制方法を提供する。
【００３３】
１実施形態において、本発明は、炎症性疾患の治療のための、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を提供する。
【００３４】
１実施形態において、本発明は、一酸化窒素の産生を抑制するための、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を提供する。
【００３５】
１実施形態において、本発明は、炎症性サイトカインの産生を抑制するための、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物を提供する。
【００３６】
１実施形態において、本発明は、炎症性疾患治療剤を製造するための、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物の使用を提供する。
【００３７】
１実施形態において、本発明は、一酸化窒素産生抑制剤又は炎症性サイトカイン産生抑制剤を製造するための、オーランチオキトリウム属に属するｔｓｕｋｕｂａ３株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４４２）の抽出物の使用を提供する。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実験例１］
（抽出物の調製）
オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ３株を、暗条件下で２〜３日培養する標準的な条件で培養した。培地には５０％海水ＧＴＹ培地（グルコース２％、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％を５０％海水に溶解）を使用し、培養温度は２５℃であった。続いて、遠心ろ過により菌体を回収した。続いて、回収した菌体を凍結乾燥した。続いて、凍結乾燥した菌体が１０ｗ／ｖ％の濃度となるように９９．５質量％エタノールに懸濁し、常温、暗所で約２週間静置し、菌体成分を抽出した。続いて、エタノール懸濁液を遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した上清をポアサイズ０．２２μｍのフィルターに通してフィルター滅菌を行い、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物とした。得られた抽出物は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４０】
［実験例２］
（細胞毒性の検討）
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に２×１０５個／ｍＬの細胞密度で接種し、３７℃で２４時間培養した。続いて、この細胞の培地に、実験例１で調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物を、培地の１／１０００容量、１／５００容量、又は１／１００容量添加して２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定した。対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物を添加しなかった細胞を使用した。
【００４１】
図１は、細胞の生存率を、対照に対する相対値で示したグラフである。図１中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物は、１／５００容量の希釈濃度では、細胞毒性を示さないことが確認された。
【００４２】
［実験例３］
（一酸化窒素（ＮＯ）産生量の検討）
ＲＡＷ２６４．７細胞を、実験例１で調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物及び１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地に２×１０５個／ｍＬの細胞密度で接種し、３７℃で２４時間培養した。ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物は、培地の１／５００容量添加した。対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに９９．５質量％エタノールを培地の１／５００容量添加した細胞を使用した。
【００４３】
続いて、上記の細胞の培地に炎症反応を誘導することが知られているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に１２時間インキュベートした。
【００４４】
続いて、各培地中に産生されたＮＯの量を測定した。より具体的には、培地上清１００μＬにＧｒｉｅｓｓ試薬［２．５ｗ／ｖ％スルファニルアミド、２．５ｗ／ｖ％リン酸、０．０５ｗ／ｖ％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン］を１００μＬ添加し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。この反応では、ＮＯの存在量が多いほど５４０ｎｍの吸光度が上昇する。
【００４５】
図２は、測定されたＮＯの産生量を、対照に対する相対値で示したグラフである。図２中、「抽出物」は、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物添加群の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物は、ＬＰＳにより誘導されるＮＯの産生を有意に抑制することが明らかとなった。
【００４６】
［実験例４］
（炎症性サイトカイン産生量の検討）
実験例３と同様にして、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の存在下及び非存在下（対照）でＲＡＷ２６４．７細胞のＬＰＳ刺激を行った。続いて、各培地中に産生された炎症性サイトカインをＥＬＩＳＡ法により定量した。
【００４７】
炎症性サイトカインとしては、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを定量した。炎症性サイトカインの定量には市販のキット（型式「ＢＩＯ−Ｐｌｅｘサイトカインアッセイキット」、バイオラッド社）を使用した。
【００４８】
図３（ａ）〜（ｄ）は、測定された各炎症性サイトカインの産生量を示すグラフである。図３（ａ）はＭＣＰ−１の結果を示し、図３（ｂ）はＩＬ−６の結果を示し、図３（ｃ）はＲＡＮＴＥＳの結果を示し、図３（ｄ）はＴＮＦ−αの結果を示す。図３中、「抽出物」は、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物添加群の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物は、ＬＰＳにより誘導される炎症性サイトカインの産生を顕著に抑制することが明らかとなった。
【００４９】
［実験例５］
（過酸化水素による細胞死の抑制効果の検討）
しばしば神経細胞分化に用いられる、ラット副腎褐色細胞腫細胞株であるＰＣ１２細胞を、実験例１で調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物及び１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍＬの細胞密度で接種し、３７℃で２４時間培養した。ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物は、培地の１／５００容量添加した。対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに９９．５質量％エタノールを培地の１／５００容量添加した細胞を使用した。
【００５０】
続いて、上記の細胞の培地に、過酸化水素水を終濃度２５０μＭで添加して２４時間インキュベートすることにより細胞死を誘導し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定した。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の添加により、細胞死の抑制効果が認められた。
【００５１】
［実験例６］
（抗ストレス効果の評価）
実験例１と同様にして調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物を、遠心エバポレーターを用いて蒸発乾固させた。続いて、得られた乾固物を水に溶解し、６週齢のマウス（ＩＣＲマウス、オス）に２週間、毎日１００ｍｇ／ｋｇ体重経口摂取させた。
【００５２】
続いて、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の摂取前、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の摂取開始後２、５、８、１１及び１４日目に、強制水泳試験及び尾懸垂試験により、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の摂取による抗ストレス効果を検討した。
【００５３】
陰性対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに同容量の水を接種させたマウスを使用した。また、陽性対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに抗うつ薬であるイミプラミンを、毎日１００ｍｇ／ｋｇ体重経口摂取させたマウスを使用した。
【００５４】
（強制水泳試験）
強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｓｗｉｍｍｉｎｇ  Ｔｅｓｔ、ＦＳＴ）とは、回避ができない環境で強制的に泳がされたマウスが遊泳しなくなることを利用した試験であり、抗うつ薬のスクリーニング、うつ様行動の指標として用いられている。水を入れた円筒形の容器にマウスを入れると、マウスは脱出しようと動き回るが、次第に遊泳しなくなり動かない時間（無動時間）が増える。抗うつ薬を投与したマウスでは強制水泳試験における無動時間が減少することが知られている。無動時間が長くなることはうつ様行動の増加を示し、無動時間の短縮はうつ様行動の減少を示すと解釈されている。
【００５５】
本実験例においては、高さ２５ｃｍ、直径１４ｃｍの円筒形の容器に２５±１℃の水を深さ１９ｃｍ入れた水槽を使用した。マウスを投入してからの試験時間は５分間とし、無動時間の合計時間を測定した。無動時間の短縮は、抗ストレス効果を示す。
【００５６】
図４は、強制水泳試験の代表的な結果を示すグラフである。図４中、「抽出物」は、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物摂取群の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の摂取により、マウスの無動時間が有意に短縮し、短縮の程度はイミプラミン摂取群と同程度であった。この結果から、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物が抗ストレス効果を有することが明らかとなった。
【００５７】
（尾懸垂試験）
尾懸垂試験（Ｔａｉｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｔｅｓｔ、ＴＳＴ）とは、逆さ向きに吊されたマウスのもがく時間を測定する試験であり、抗うつ薬のスクリーニング、うつ様行動の指標として用いられている。吊されたマウスは脱出しようと動き回るが、次第に動かない時間（無動時間）が増える。抗うつ薬を投与したマウスでは尾懸垂試験における無動時間が減少することが知られている。無動時間が長くなることはうつ様行動の増加を示し、無動時間の短縮はうつ様行動の減少を示すと解釈されている。
【００５８】
本実験例においては、マウスの尾の先端から約１ｃｍの位置にテープを貼り付けた後、そのテープに穴を開けて高さ５０ｃｍに調整されたフックに掛けた。マウスを吊るしてからの試験時間は６分間とし、無動時間の合計時間を測定した。無動時間の短縮は、抗ストレス効果を示す。
【００５９】
図５は、尾懸垂試験の代表的な結果を示すグラフである。図５中、「抽出物」は、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物摂取群の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の摂取により、マウスの無動時間が有意に短縮し、短縮の程度はイミプラミン摂取群よりも顕著であった。この結果から、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物が抗ストレス効果を有することが明らかとなった。
【００６０】
［実験例７］
（ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の分離）
実験例１と同様にして、凍結乾燥したオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ３株の菌体１ｇからｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物を調製した。続いて、調製した抽出物を、遠心エバポレーターを用いて減圧濃縮し、乾固物４１２ｍｇを得た。続いて、得られた乾固物をメタノール及び水の混合溶液（メタノール：水の容量比は９：１）（１６ｍＬ）に溶解し、ｎ−ヘキサン（８ｍＬ）で４回（合計３２ｍＬ）抽出した。続いて、遠心エバポレーターを用いて、回収したｎ−ヘキサン層を減圧濃縮して、ｎ−ヘキサン抽出物３６６ｍｇを得た。
【００６１】
また、上記の含水メタノール層を減圧濃縮し、メタノール及び水の混合溶液（メタノール：水の容量比は６：４）（８ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（４ｍＬ）で４回（合計１６ｍＬ）抽出した。続いて、遠心エバポレーターを用いて、回収したジクロロメタン層及び含水メタノール層を減圧濃縮して、ジクロロメタン抽出物６１ｍｇ及びメタノール抽出物６０ｍｇを得た。
【００６２】
［実験例８］
（細胞毒性の検討）
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地に２×１０５個／ｍＬの細胞密度で接種し、３７℃で２４時間培養した。続いて、この細胞の培地に、実験例７で調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物（ｎ−ヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物又はメタノール抽出物）を水に溶解したものを、１、１０、５０及び１００μｇ／ｍＬの終濃度で添加して２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定した。対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに同容量の水を添加した細胞を使用した。
【００６３】
図６（ａ）〜（ｃ）は、細胞の生存率を、対照に対する相対値で示したグラフである。図６（ａ）はｎ−ヘキサン抽出物の結果を示し、図６（ｂ）はジクロロメタン抽出物の結果を示し、図６（ｃ）はメタノール抽出物の結果を示す。図６中、「＊」は、危険率５％未満で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
【００６４】
その結果、ｎ−ヘキサン抽出物は、１０μｇ／ｍＬの濃度では細胞毒性を示さないことが明らかとなった。また、メタノール抽出物及びジクロロメタン抽出物は、５０μｇ／ｍＬの濃度でも細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
【００６５】
［実験例９］
（一酸化窒素（ＮＯ）産生量の検討）
ＲＡＷ２６４．７細胞を、実験例８で調製したｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物（ｎ−ヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物又はメタノール抽出物）及び１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地に２×１０５個／ｍＬの細胞密度で接種し、３７℃で１２時間培養した。ｎ−ヘキサン抽出物は、１及び１０μｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した。ジクロロメタン抽出物は、１、１０、５０及び１００μｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した。メタノール抽出物は、１、１０及び５０μｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した。また、対照として、ｔｓｕｋｕｂａ３株抽出物の代わりに同容量の水を添加した細胞を使用した。
【００６６】
続いて、上記の細胞の培地にＬＰＳを終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に１２時間インキュベートした。
【００６７】
続いて、各培地中に産生されたＮＯの量を実験例３と同様にして測定した。図７（ａ）〜（ｃ）は、測定されたＮＯの産生量を、対照に対する相対値で示したグラフである。図７（ａ）はｎ−ヘキサン抽出物の結果を示し、図７（ｂ）はジクロロメタン抽出物の結果を示し、図７（ｃ）はメタノール抽出物の結果を示す。図７中、「＊」は、危険率５％未満で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
【００６８】
その結果、ｎ−ヘキサン抽出物及びジクロロメタン抽出物は、終濃度１ｎｇ／ｍＬでＬＰＳにより誘導されるＮＯの産生を有意に抑制することが明らかとなった。一方、メタノール抽出物は、ＬＰＳにより誘導されるＮＯの産生を抑制しないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、副作用が少なく、抗炎症効果が高い炎症性疾患治療剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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