(57)【要約】【課題】日常的に安全に長期間摂取することが可能であり、軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形性関節症、特に、変形性膝関節症などの種々の関節疾患の予防や治療に有用な軟骨機能改善剤及び、軟骨機能改善剤を配合した軟骨機能改善用飲食品、軟骨機能改善用栄養組成物、軟骨機能改善用飼料を提供することを課題とする。【解決手段】牛乳、乳製品に含まれるタンパク質であるラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び／又は、それらの分解物から選択されるいずれか１種類以上を有効成分とする軟骨機能改善剤。本発明の軟骨機能改善剤は、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生する効果が顕著であるため、変形性関節症、特に、変形性膝関節症などの種々の関節疾患の予防や治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び、それらの分解物の中から選択されるいずれか１種類以上を有効成分とする軟骨機能改善剤。
【請求項２】
前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質が哺乳類の乳に由来することを特徴とする請求項１に記載の軟骨機能改善剤。
【請求項３】
前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質が牛乳に由来することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の軟骨機能改善剤。
【請求項４】
前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質の分解物が、それらをタンパク質分解酵素で分解することにより得られたものであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の軟骨機能改善剤。
【請求項５】
前記タンパク質分解酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン及びパパインよりなる群から選択される少なくとも１種類以上であることを特徴とする請求項４に記載の軟骨機能改善剤。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載の軟骨機能改善剤を含むことを特徴とする軟骨機能改善用飲食品、軟骨機能改善用栄養組成物、軟骨機能改善用飼料。
【請求項７】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び／又は、それらの分解物を１日あたり１ｍｇ以上摂取することによる軟骨機能を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生する効果に優れ、変形性関節症、特に、変形性膝関節症などの種々の関節疾患の予防や治療に有用な軟骨機能改善剤に関する。本発明はまた、軟骨機能改善剤を配合した軟骨機能改善用飲食品、軟骨機能改善用栄養組成物、軟骨機能改善用飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の平均寿命は８０歳を超え、およそ４人に１人は６５歳以上という、超高齢社会を迎えた。これに伴って、運動器の障害の罹患率も増加の一途を辿り、２００７年に日本整形外科学会は、運動器の健康維持・増進、介護に関する国民ならびに医師の意識改革を推進するために、「ロコモティブシンドローム（運動器症候群）」という新しい言葉を提唱した。ロコモティブシンドロームは、運動器の機能不全により要介護状態および要介護リスクが高まった状態を示し、運動器には骨・関節・靱帯、脊椎・脊髄、筋肉・腱、末梢神経など、体を支え、動かす役割を有する器官が総じて含まれる。これら運動器で見られる代表的な疾患および機能障害として、骨粗鬆症やサルコペニア、変形性関節症などが挙げられる。
【０００３】
変形性関節症は、５０歳以上の２〜３割が罹患しているとされ、患者数が最も多い関節疾患である。特に近年、その患者数は増加傾向にあり、多くの変形性関節症患者が不自由な生活を余儀なくされている。この疾患の原因は、加齢および遺伝的要因による関節構成要素の変性、あるいは肥満、労働、スポーツによる関節への負荷などと考えられており、骨端表面に存在し骨動を担う軟骨が減少して変形あるいは消失することにより、関節が滑らかに動かなくなることで発症する。
また、軟骨には血管や神経細胞がないため、それが一旦損傷を受けると自然に復元することは難しいとされている。そのため、変形性関節症の症状が軽度の場合、温熱療法やけん引といった理学療法、あるいは鎮痛薬や抗炎症薬を用いた緩和療法がとられるが、その症状が重い場合には、ヒアルロン酸の関節への注入や手術による人工関節置換が実施される。しかし、変形性関節症を根治して患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ、生活の質）を向上させるためには、その疾病の性質上、食品や食品に含まれる有効成分を日常的に安全に長期間摂取することにより、患者自身の変形あるいは消失した軟骨を修復または再生することが求められる。
軟骨は、間葉系幹細胞から分化した軟骨細胞と軟骨細胞が産生したコラーゲンやヒアルロン酸、プロテオグリカンなどの軟骨基質で構成されている。また、一般的に、軟骨は、軟骨細胞が増殖・成熟し、肥大化した後、石灰化するとともに、軟骨基質が変性して、骨組織に置換される。しかし、関節や椎間板では、一生涯にわたり、軟骨細胞がその性質を維持するため、軟骨が骨に置換されることなく身体に滑らかな可動性を与えている。したがって、変形あるいは消失した軟骨を修復または再生して、変形性関節症を根治するためには、軟骨に存在する軟骨細胞の増殖や軟骨細胞における軟骨基質の産生を促進すること、ならびに、軟骨細胞の石灰化を抑制して骨への置換を防止することが重要である。
軟骨に存在する軟骨細胞の増殖や軟骨細胞における軟骨基質の産生を促進する、あるいは、軟骨細胞の石灰化を抑制して骨への置換を防止する効果を有する食品成分としては、例えば、グルコサミン塩酸塩による軟骨細胞における基質産生促進と軟骨細胞の石灰化抑制（非特許文献１）やコラーゲンに由来するジペプチドであるプロリルハイドロキシプロリンによる軟骨細胞における基質産生促進と軟骨細胞の石灰化抑制（非特許文献２）等が開示されている。また、牛乳、乳製品は古来より食されてきた日常的に安全に長期間摂取することができる食品であり、それらに含まれる乳塩基性タンパク質画分やその分解物には軟骨基質の産生を促進する効果があること、ラクトフェリンには軟骨細胞の増殖を促進するとともに軟骨細胞の石灰化を抑制する効果があることが知られている（特許文献１、２、非特許文献３）。しかしながら、牛乳、乳製品に含まれるタンパク質であるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やそれらの分解物が優れた軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生させることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５８６７９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１６４９９２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｋａｔａｎｉら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３０：４３３−４３８（２００７）
【非特許文献２】Ｎａｋａｔａｎｉら，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１７：１６２０−１６２７（２００９）
【非特許文献３】Ｔａｋａｙａｍａら，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ，２３：４７７−４８４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、日常的に安全に長期間摂取することが可能であり、軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生する効果に優れ、変形性関節症、特に、変形性膝関節症などの種々の関節疾患の予防や治療に有用な軟骨機能改善剤並びに軟骨機能改善剤を配合した軟骨機能改善用飲食品、軟骨機能改善用栄養組成物、軟骨機能改善用飼料を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を進めたところ、牛乳、乳製品に含まれるタンパク質であるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質やそれらの分解物が軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の構成によるものである。
（１）ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び、それらの分解物の中から選択されるいずれか１種類以上を有効成分とする軟骨機能改善剤。
（２）前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質が哺乳類の乳に由来することを特徴とする（１）に記載の軟骨機能改善剤。
（３）前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質が牛乳に由来することを特徴とする（１）又は（２）に記載の軟骨機能改善剤。
（４）前記ラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質の分解物が、それらをタンパク質分解酵素で分解することにより得られたものであることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の軟骨機能改善剤。
（５）前記タンパク質分解酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン及びパパインよりなる群から選択される少なくとも１種類以上であることを特徴とする（４）に記載の軟骨機能改善剤。
（６）（１）から（５）のいずれかに記載の軟骨機能改善剤を含むことを特徴とする軟骨機能改善用飲食品、軟骨機能改善用栄養組成物、軟骨機能改善用飼料。
（７）（１）から（５）のいずれかに記載のラクトパーオキシダーゼ、シスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び／又は、それらの分解物を１日あたり１ｍｇ以上摂取することによる軟骨機能を改善する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の軟骨機能改善剤は、軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を有し、変形あるいは消失した軟骨を修正または再生する効果に優れているため、変形性関節症、特に、変形性膝関節症などの種々の関節疾患の予防や治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスを６群に分け、リンを標準量配合した標準食、高リン食及び、高リン食とラクトパーオキシダーゼ等を摂取させ、１０週間飼育した後の右後肢の関節軟骨層の厚さを比較した。
【図２】マウスを６群に分け、リンを標準量配合した標準食、高リン食及び、高リン食とラクトパーオキシダーゼ等を摂取させ、１０週間飼育した後の右後肢の関節軟骨層に存在する軟骨細胞の数を比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の特徴は、牛乳、乳製品に含まれるタンパク質であるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、及び／又は、それらの分解物を有効成分とすることにある。本発明で用いるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質は、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳など哺乳類の乳から調製したものや化学的に合成されたもの、遺伝子工学的手法により生産されたもの、血液や臓器から精製したもの等が使用可能であり、精製され、市販されているラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質の試薬を使用することもできる。また、本発明で用いるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質の分解物は、それらをタンパク質分解酵素で処理することにより調製することが可能である。
【００１２】
本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼを調製する方法としては、例えば、スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体を用いて乳から精製する方法（特開平３−１０９４００号公報）が知られている。また、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼの分解物は、例えば、ラトパーオキシダーゼをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて分子量が１０，０００以下（好ましくは、分子量が５００以上）になるように調製すればよい。
【００１３】
本発明の有効成分であるシスタチンを調製する方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィーを用いて乳から精製する方法（特開２０００−２８１５８７号公報）が知られている。また、本発明の有効成分であるシスタチンの分解物は、例えば、シスタチンをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて分子量が８，０００以下（好ましくは、分子量が５００以上）になるように調製すればよい。
【００１４】
本発明の有効成分であるＨＭＧ様タンパク質を調製する方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィーを用いて乳から精製する方法（特開平９−２２７４０３号公報）が知られている。また、本発明の有効成分であるＨＭＧ様タンパク質の分解物は、例えば、ＨＭＧ様タンパク質をトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて分子量が６，０００以下（好ましくは、分子量が５００以上）になるように調製すればよい。
【００１５】
本発明では、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を、そのまま本発明の軟骨機能改善剤に使用してもよいが、必要に応じて、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化することもできる。
【００１６】
本発明では、有効成分であるラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物を製剤化あるいは飲食品等へ添加する場合、添加方法、配合方法等に特に制限はなく、例えば、溶液中で添加、配合するには、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を脱イオン水に懸濁あるいは溶解し、撹拌混合した後、製剤化、あるいは飲食品や飼料の形態に調製して使用すればよい。
撹拌混合の条件としては、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物が均一に混合されればよく、ウルトラディスパーサーやＴＫホモミクサー等を使用して撹拌混合することも可能である。また、当該組成物の溶液は、製剤化、あるいは飲食品や飼料に使用しやすいように、必要に応じて、ＲＯ膜やＵＦ膜等での脱塩あるいは濃縮してから、あるいは、凍結乾燥してから使用することができる。本発明では、医薬品、飲食品や飼料の製造に通常使用される殺菌処理が可能であり、粉末状では乾熱殺菌も可能である。
以上により、本発明の軟骨機能改善剤は、液状、ゲル状、粉末状、顆粒状等様々な形態とすることが可能であり、また、製剤化した後に栄養剤やヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品や栄養組成物に配合することも可能である。
【００１７】
本発明の軟骨機能改善剤は、有効成分としてラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を含む他、製剤化に際して、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えば、ショ糖、乳糖、デンプン、結晶性セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシルメチルセルロースカルシウム等を１種又は２種以上組み合わせて用いることが可能である。
また、本発明の軟骨機能改善剤では、安定剤や糖類、脂質、フレーバー、ビタミン、ミネラル、フラボノイド、ポリフェノール等を併用することも可能であり、飲食品や飼料を調製する際に、適宜これらを配合して使用することができる。また、他の軟骨機能を改善する効果を示す成分、例えば、グルコサミン塩酸塩やラクトフェリン等とともに使用することも可能である。
【００１８】
本発明の軟骨機能改善剤では、後述する試験例に示すように、マウスに、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を体重１ｋｇあたり１ｍｇ以上経口摂取させることにより、軟骨細胞の増殖を促進する、及び／又は、軟骨細胞の石灰化を抑制することが可能である。実験動物における摂取量は、血中薬物濃度において、成人一人あたりの摂取量に該当することから（中島光好（１９９３）「第８巻  薬効評価」  廣川書店  ２−１８頁）、通常、成人一人一日あたり、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を１ｍｇ以上摂取することにより、軟骨の機能の改善、特に、変形性関節症に対する予防や治療の効果が期待できる。したがって、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を、この必要量を確保できるように製剤化あるいは飲食品等に配合すればよい。例えば、成人一人一日あたり、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を１ｍｇ以上摂取させるためには、医薬、飲食品、飼料の形態にもよるが、最終製品として、全質量に対して、ラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質、ならびに、それらの分解物のいずれか１種類以上を０．０００５％〜５％（重量／重量）、好ましくは、０．０５〜２．５％（重量／重量）含有させればよい。
【００１９】
以下に本発明の実施例及び試験例を示し、詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製）４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０Ｌ（ｐＨ６．７）を流速２５ｍｌ／ｍｉｎで通液した。通液後、カラムを脱イオン水で十分洗浄し、２．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．０） で溶出した。そしてラクトパーオキシダーゼを含有する溶出画分をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） で平衡化した後、０〜２．０Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエントで吸着した画分を溶出し、ラクトパーオキシダーゼを含む画分を回収した。そしてその画分をＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製） を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、ラクトパーオキシダーゼ３．０ｇを得た。なお、このようにして得られたラクトパーオキシダーゼの純度は９４％であり、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品１）として使用可能である。
【実施例２】
【００２１】
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ１ｇを水２００ｍｌに溶解し、最終濃度が０．０１重量％となるようタンパク質分解酵素であるパンクレアチン（シグマアルドリッチ社製） を加え、３７℃で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してラクトパーオキシダーゼ分解物０．８ｇを得た。なお、このようにして得られたラクトパーオキシダーゼ分解物の分子量は、１０，０００以下であり、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品２）として使用可能である。
【実施例３】
【００２２】
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ１ｇを水２００ｍｌに溶解し、最終濃度が０．０１重量％となるようタンパク質分解酵素であるトリプシン（シグマアルドリッチ社製）を加え、３７ ℃ で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してラクトパーオキシダーゼ分解物０．９ｇを得た。なお、このようにして得られたラクトパーオキシダーゼ分解物の分子量は、１０，０００以下であり、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品３）として使用可能である。
【実施例４】
【００２３】
Ｓセファロース３,０００ｇを充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液し、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。得られた画分を９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。そして、シスタチンを含む溶出画分を再度ＭｏｎｏＳイオン交換クロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＦＰＬＣシステムによりＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、さらにＨＰＬＣシステムにてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びＣ４逆相クロマトグラフィーで順次処理し、シスタチン５８ｍｇを得た。なお、このようにして得られたシスタチンは、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品４）として使用可能である。
【実施例５】
【００２４】
５％乳清タンパク質溶液１０，０００Ｌを９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、カルボキシメチル化パパインをトレシルトヨパール（Ｔｒｅｓｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、東ソー社製） に結合させた担体をカラムに充填後、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化し、先の乳清タンパク質溶液を通液した。通液後、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液と０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で順次カラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ 酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液でシステインプロテアーゼを溶出させた。溶出画分を直ちに１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で中和し、ＭｏｎｏＳ陰イオン交換クロマトグラフィー、さらにＨＰＬＣシステムにてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びＣ４逆相クロマトグラフィーで順次処理して分画し、シスタチン４８ｍｇを得た。なお、このようにして得られたシスタチンは、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品５）として使用可能である。
【実施例６】
【００２５】
実施例４で得られたシスタチン２５ｍｇを、水１００ｍｌに溶解し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチン（シグマアルドリッチ社製）を加えて、３７℃で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、シスタチン分解物（実施例品６Ａ）２３ｍｇを得た。また、実施例５で得られたシスタチン２５ｍｇを、同様に処理し、シスタチン分解物（実施例品６Ｂ）２４ｍｇを得た。なお、このようにして得られたシスタチン分解物の分子量は、８，０００以下であり、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品６Ａと実施例品６Ｂ）として使用可能である。
【実施例７】
【００２６】
スルホン化キトパール３，０００ｇ（富士紡績社製）を充填したカラムを脱イオン交換水で充分に洗浄した後、脱脂乳３００Ｌを通液した。その後、脱イオン交換水で充分洗浄した後、０．０２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ６．７)で樹脂に吸着した塩基性タンパク質を０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌを用いて直線濃度勾配で溶出して、回収した。次に、ＨＭＧ様タンパク質を含む溶出画分を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５)で平衝化させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラフィーで０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌを用いて直線濃度勾配で溶出させて分画し、得られた画分を９０℃で１０分間加熱処理した後、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、この画分を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５)で平衝化させたＭｏｎｏ Ｑイオン交換クロマトグラフィーで０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌを用いて直線濃度勾配で溶出させて分画し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５)平衝化させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ １２ゲル濾過クロマトグラフィーでさらに分画した。最後にＣ４逆相クロマトグラフィーを使用した高速液体クロマトグラフィーで処理し、ＨＭＧ様タンパク質１３５ｍｇを得た。なお、このようにして得られたＨＭＧ様タンパク質は、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品７）として使用可能である。
【実施例８】
【００２７】
実施例７で得られたＨＭＧ様タンパク質２５ｍｇを、水１００ｍｌに溶解し、最終濃度が０．０１重量％となるようタンパク質分解酵素であるトリプシン（シグマアルドリッチ社製）を加え、３７ ℃ で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してＨＭＧ様タンパク質分解物２４ｍｇを得た。なお、このようにして得られたＨＭＧ様タンパク質分解物の分子量は、６，０００以下であり、そのまま軟骨機能改善剤（実施例品８）として使用可能である。
（試験例１）
【００２８】
（細胞実験）
実施例品１のラクトパーオキシダーゼ、実施例品２のラクトパーオキシダーゼ分解物、実施例品４のシスタチン、実施例品６Ｂのシスタチン分解物、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質、実施例品８のＨＭＧ様タンパク質分解物、ならびに、実施例品１と４の混合物、実施例品５と７の混合物を用いて、軟骨細胞の増殖を促進する作用を評価した。マウス由来軟骨前駆細胞株（ＡＴＤＣ５）を９６穴細胞培養プレートに、１ウェルあたり５×１０３個ずつ播種し、５％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下の培養器内で２４時間培養した。その後、培地を全量交換した後、実施例品１、２、４、６Ｂ、７、８及び実施例品１と４の混合物、実施例品５と７の混合物をＰＢＳ（−）に溶解したものを、それぞれ最終濃度が１μｇ／ｍＬになるように培地に添加して４８時間培養した。なお、陰性対照には、溶媒として用いたＰＢＳ（−）を使用した。培地を全量除去し、細胞増殖試薬ＷＳＴ‐１（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を培地中に１０分の１量含むように添加した後、６時間培養し、プレートリーダーを用いて４４０ｎｍの吸光度を測定した。ＷＳＴ‐１は生細胞の代謝活性によってフォルマザン色素に還元されるため、フォルマザン色素量は代謝活性を有する細胞数に比例する。そこで、フォルマザン色素量を反映する吸光度の値を軟骨細胞増殖促進作用の指標とした。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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値は、平均値±標準偏差（ｎ＝５）を示す。
※は、ＰＢＳ（−）と比較して有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００３０】
その結果、培地に実施例品１のラクトパーオキシダーゼ、実施例品２のラクトパーオキシダーゼ分解物、実施例品４のシスタチン、実施例品６Ｂのシスタチン分解物、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質、実施例品８のＨＭＧ様タンパク質分解物、ならびに、実施例品１と４の混合物、実施例品５と７の混合物を添加した場合、ＰＢＳ（−）を培地に添加した場合に比べ、軟骨前駆細胞の細胞数が有意に増加した。したがって、本発明のラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質ならびに、それら分解物は、軟骨細胞の増殖を促進することがわかった。
（試験例２）
【００３１】
（細胞実験）
実施例品１のラクトパーオキシダーゼ、実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物、実施例品５のシスタチン、実施例品６Ａのシスタチン分解物、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質、実施例品８のＨＭＧ様タンパク質分解物、ならびに、実施例品１と７の混合物、実施例品４と８の混合物を用いて、軟骨細胞の石灰化を抑制する作用を評価した。マウス由来軟骨前駆細胞株（ＡＴＤＣ５）を９６穴細胞培養プレートに、１ウェルあたり３×１０３個ずつ播種し、５％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下の培養器内で、２４時間培養した。その後、培地を全量交換した後、実施例品１、３、５、６Ａ、７、８及び実施例品１と７の混合物、実施例品４と８の混合物をＰＢＳ（−）に溶解したものを、それぞれ最終濃度が１μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、毎日培地を交換しながら７日間培養した。なお、陰性対照には、溶媒として用いたＰＢＳ（−）を使用した。培養終了後、細胞を、２０％ホルマリン溶液で２０分間固定して、水洗し、水を入れて１５分間静置した後、０．０５Ｍの２‐Ａｍｉｎｏ‐２‐ｍｅｔｈｙｌ‐１,３‐ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ（ＡＭＰ）溶液に、Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ‐ＢＩ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅならびにＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  Ｓａｌｔを溶解することで調製したアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色液を用いて、２０分間、３７℃で染色した。染色後、５回水洗し、風乾した後、スキャナーを用いて取り込んだ培養プレートの染色像から、画像処理ソフトウェアを用いて、被染色エリアの面積を算出した。なお、被染色面積は、陰性対照の値を１とした相対値として示した。また、ＡＬＰ活性は、軟骨細胞における石灰化の初期マーカーとされるため、被染色エリアの面積が小さいほど石灰化が抑制されている。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2017137266.tif 000004
値は、平均値±標準偏差（ｎ＝５）を示す。
※は、ＰＢＳ（−）と比較して有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００３３】
その結果、培地に実施例品１のラクトパーオキシダーゼ、実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物、実施例品５のシスタチン、実施例品６Ａのシスタチン分解物、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質、実施例品８のＨＭＧ様タンパク質分解物、ならびに、実施例品１と７の混合物、実施例品４と８の混合物を添加した場合、ＰＢＳ（−）を培地に添加した場合に比べ、ＡＬＰ染色の被染色面積が有意に減少した。したがって、本発明のラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質ならびに、それら分解物は、軟骨細胞の石灰化を抑制することがわかった。
（試験例３）
【００３４】
（動物実験）
実施例品１のラクトパーオキシダーゼ、実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物、実施例品４のシスタチン、ならびに実施例品７のＨＭＧ様タンパク質を用いて、関節軟骨層の初期変性に対する効果を検証した。１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の雄性マウスを体重にばらつきのないように各群１０匹ずつ６群に分けた。実施例品を摂取させずにリンを標準量（０．２ｇ／１００ｇ−飼料）配合した飼料（標準食）を摂取させる群をＡ群、実施例品を摂取させずにリンを高用量（１．２ｇ／１００ｇ−飼料）配合した飼料（高リン食）を摂取させる群をＢ群とした。また、実施例品１を摂取させる群をＣ群、実施例品４を摂取させる群をＤ群、実施例品７を摂取させる群をＥ群、実施例品３を摂取させる群をＦ群とし、１日あたりの実施例品の摂取量がマウス体重１ｋｇあたり１ｍｇとなるよう高リン食に配合した。１０週間飼育した後、右後肢を摘出して１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬して固定し、膝関節のパラフィン包埋切片を作成して、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。それらを用いて、関節軟骨層の厚さと関節軟骨層に存在する軟骨細胞の数を測定することで、関節軟骨層の初期変性に対する効果を評価した。結果を図１と図２に示す。
【００３５】
その結果、実施例品を摂取させずに高リン食を摂取させたＢ群では、実施例品を摂取させずに標準食を摂取させたＡ群に比較して、リンの過剰摂取により関節軟骨層の厚さと関節軟骨層に存在する軟骨細胞数が有意に減少した。一方、実施例品１、３、４、７を摂取させたＣ群〜Ｆ群では、関節軟骨層の厚さや軟骨細胞の数の減少がＢ群に比べ有意に抑制された。したがって、本発明のラクトパーオキシダーゼやシスタチン、ＨＭＧ様タンパク質ならびに、それら分解物は、関節軟骨の初期変性を抑制することがわかった。
【実施例９】
【００３６】
（軟骨機能改善用錠剤の調製）
表３に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して軟骨機能改善用錠剤を製造した。なお、この錠剤１ｇには、実施例品１のラクトパーオキシダーゼが１ｍｇ含まれていた。
【００３７】
【表３】
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【実施例１０】
【００３８】
（軟骨機能改善用栄養組成物の調製）
実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物０．５ｇを４，９９９．５ｇの脱イオン水に溶解し、４５℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫ  ＲＯＢＯ  ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合して、実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物を０．５ｇ／５．０ｋｇ含有する溶液を得た。この溶液５．０ｋｇに、表４の原材料を添加して、さらに１０分間撹拌混合した後、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機（第１種圧力容器、ＴＹＰＥ:ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製）で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の軟骨機能改善用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。なお、この軟骨機能改善用液状栄養組成物には、１００ｇあたり、実施例品３のラクトパーオキシダーゼ分解物が１ｍｇ含まれていた。
【００３９】
【表４】
2017137266.tif 000006
【実施例１１】
【００４０】
（軟骨機能改善用飲料の調製）
脱脂粉乳１４０ｇを５６９．９５ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品４のシスタチン０．０５ｇを溶解し、４５℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。表５の原材料を添加し、さらに１５分間撹拌混合した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填して、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、本発明の軟骨機能改善用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。なお、この軟骨機能改善用飲料には、１００ｍｌあたり実施例品４のシスタチンが５ｍｇ含まれていた。
【００４１】
【表５】
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【実施例１２】
【００４２】
（イヌ用軟骨機能改善用飼料の調製）
実施例品７のＨＭＧ様タンパク質０．１ｇを９９．９ｇの脱イオン水に溶解し、４５℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで４０分間撹拌混合して、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質を０．１ｇ／１００ｇ含有する溶液を得た。この溶液１００ｇに表６の原材料を添加して、さらに４０分間撹拌混合した後、１２０℃、４分間殺菌して、本発明のイヌ用軟骨機能改善用飼料１ｋｇを製造した。なお、このイヌ用軟骨機能改善用飼料には、１００ｇあたり、実施例品７のＨＭＧ様タンパク質が１０ｍｇ含まれていた。
【００４３】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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