(57)【要約】【課題】ラクトバチルス・パラカゼイを特異的に検出することができるモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体、例えばラクトバチルス・パラカゼイの生菌及び死菌に反応し、ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌に反応しないモノクローナル抗体を用いて、ラクトバチルス・パラカゼイを特異的に検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ラクトバチルス・パラカゼイの生菌及び死菌に反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌に反応しない、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ラクトバチルス・カゼイ、及びラクトバチルス・ファーメンタムと反応し、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイ、及びラクトバチルス・ファーメンタム以外の乳酸菌と反応しない、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３５、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２７３であるハイブリドーマセルラインにより産生される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３４であるハイブリドーマセルラインにより産生される、請求項１、２又は４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体が標識物質で標識された、標識モノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルライン。
【請求項９】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３４、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２７３である、請求項８に記載のハイブリドーマセルライン。
【請求項１０】
乳酸菌を免疫学的に検出する方法において、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法。
【請求項１１】
乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記乳酸菌が生菌及び死菌である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌に対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマセルライン、および同抗体を用いた乳酸菌の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品への有害微生物の混入は、商品の品質低下をもたらす。そのような有害微生物として、例えばビールでは、乳酸菌、特にラクトバチルス属に属する乳酸桿菌がビール汚染菌として知られている。それらのような細菌を特異的に検出する方法として、抗体を用いる方法が知られている。古くから、乳酸菌に対するポリクローナル抗体（抗血清）が作製されており（非特許文献１）、例えばラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）のＢおよびＣ抗原(polysaccharide)を認識するポリクローナル抗体が知られている(非特許文献２)。しかし、ポリクローナル抗体は一般に交差反応性があり、抗血清のロット毎にその抗体価や特異性が変動するという問題があった。
【０００３】
一方、乳酸菌に対するモノクローナル抗体としては、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）を特異的に検出するモノクローナル抗体（特許文献１）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides)、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）からなる群から選ばれるラクトバチルス(Lactobacillus）属第III群に属する乳酸菌を哺乳類に免疫して得られる乳酸菌に特異的なモノクローナル抗体（特許文献２）、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属するラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を哺乳類に免疫して得られる乳酸菌に特異的なモノクローナル抗体（特許文献３）、及び乳酸菌であるペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus)を哺乳類に免疫して得られる乳酸菌に特異的なモノクローナル抗体（特許文献４）が知られている。しかし、ラクトバチルス・パラカゼイを特異的に検出するモノクローナル抗体は知られておらず、前記のラクトバチルス・カゼイに対するモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイには反応しない（特許文献１）。また、特許文献１は、ビール中で増殖する微生物の生菌を対象としており、前記モノクローナル抗体による死菌の検出は開示されていない。
【０００４】
ところで、食品中の乳酸菌は善玉菌と言われ、それを添加した各種食品（ヨーグルトやチーズなど）が市販されて広く消費者に受け入れられているが、乳酸菌（生菌）添加商品の保存中の風味や味の変化、物性変化を抑制するため、近年は加熱殺菌タイプの乳酸菌を各種食品に添加することも少なくない。また、加熱殺菌された乳酸菌が、様々なヒトの免疫活性向上の可能性を期待させるとの報告もある（特許文献２、非特許文献３〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−３１１８９４号公報
【特許文献２】特開平６−４６８８１号公報
【特許文献３】特開平６−１０５６９８号公報
【特許文献４】特開平６−３１１８９５号公報
【特許文献５】特開２０１０−６８０１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shimohashi,H. & Mutai, M., J. Gen. Microbiol., 103, 337 (1977)
【非特許文献２】Kandler, O. and Weiss, N., Bergey's manual of systematic bacteriology Vol.2, p.1208 (1986)
【非特許文献３】Yoshikawa, T. et al. 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:1439-1442
【非特許文献４】Inoue, R. et al.  2010, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 61:94-102
【非特許文献５】Iwabuchi, N. et al. 2012, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 66:230-239
【非特許文献６】Nishibayashi, R. et al. 2015, Plos One, DOI:10.1371/journal.pone.0129806
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）を検出することができるモノクローナル抗体、特にラクトバチルス・パラカゼイの生菌のみならず死菌をも特異的に検出することができるモノクローナル抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体を提供する。
前記モノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイの生菌及び死菌に反応することを好ましい形態としている。
前記モノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌に反応しないことを好ましい形態としている。
前記モノクローナル抗体は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３５、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２７３であるハイブリドーマセルラインにより産生されるモノクローナル抗体であることを好ましい形態としている。
本発明のモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・カゼイ、及びラクトバチルス・ファーメンタムとも反応し、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイ、及びラクトバチルス・ファーメンタム以外の乳酸菌と反応しないことを一形態としている。
前記モノクローナル抗体としては、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３４であるハイブリドーマセルラインにより産生されるモノクローナル抗体であることを好ましい形態としている。
本発明のモノクローナル抗体は、標識物質で標識された標識モノクローナル抗体であることを好ましい形態としている。
【０００９】
本発明はまた、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインを提供する。
前記ハイブリドーマセルラインは、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３４、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２７３であるハイブリドーマセルラインであることを好ましい形態としている。
【００１０】
本発明はまた、乳酸菌を免疫学的に検出する方法において、前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法を提供する。
前記方法は、乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイであることを好ましい形態としている。
また前記方法は、前記乳酸菌が生菌及び死菌であることを好ましい形態としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体が提供される。本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、ラクトバチルス・パラカゼイの生菌及び死菌の両方を特異的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】モノクローナル抗体TA6348とFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体を用いたラクトバチルス・パラカゼイの死菌の検出結果を示す顕微鏡写真。Ａ：凍結乾燥死菌。Ｂ：凍結濃縮死菌。Ｃ：オートクレーブ処理死菌。Ｄ：生菌。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体である。「ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体」とは、ラクトバチルス・パラカゼイに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、「モノクローナル抗体に対するモノクローナル抗体」、「ラクトバチルス・パラカゼイに反応するモノクローナル抗体」、「ラクトバチルス・パラカゼイを認識するモノクローナル抗体」と同義である。また、本発明のモノクローナル抗体は、「ラクトバチルス・パラカゼイを哺乳類に免疫して得られる、ラクトバチルス・パラカゼイに特異的なモノクローナル抗体」でもある。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、ラクトバチルス・パラカゼイに反応し、ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌には反応しないモノクローナル抗体である。ラクトバチルス・パラカゼイとしては、ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849が挙げられる。MCC1849は、2013年6月6日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、NITE P-01633の受託番号で寄託され、2014年1月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、NITE BP-01633の受託番号が付与されている。本発明のモノクローナル抗体が反応するラクトバチルス・パラカゼイは、生菌（live cell又はViable-and-Culturable cell。「生菌体」ともいう。）であっても死菌（Dead cell。「死菌体」ともいう。）であってもよく、生菌及び死菌の両方であることが好ましい。死菌は、死に至る要因は特に制限されず、種々の条件における加熱処理が挙げられる。また、死菌は、損傷菌（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）であってもよい。
【００１５】
ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌としては、ロイコノストック・メセンテロイデス ssp.クレモリス（Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris）等のロイコノストック属細菌、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・デルブルッキーssp.ラクティス（L. delbrueckii ssp. lactis）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、ラクトバチルス・ロイテリ（L. leuteri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・ブルガリカス（L. bulgaricus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・アニマリス（L. animalis）、ラクトバチルス・ペントサス（L. pentosus）、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L. johnsonii）、ラクトバチルス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチルス・アミロボラス（L. amylovorus）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等のストレプトコッカス細菌が挙げられる。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、さらにビフィズス菌、及び腸内細菌には反応しないことが好ましい。ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）があげられる。腸内細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus
faecalis）等のエンテロコッカス属細菌が挙げられる。
【００１７】
ラクトバチルス・パラカゼイに反応し、上記のようなラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌、ビフィズス菌、及び腸内細菌には反応しないモノクローナル抗体としては、Hyb-TA6348、およびHyb-TA6328と名付けられたハイブリドーマセルラインにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイの生菌体、及び、様々な熱履歴を経た殺菌体にも反応する。反応性の強さの観点からは、これらのモノクローナル抗体の中でも、Hyb-TA6348により産生されるモノクローナル抗体が好ましい。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイに反応する限り、ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌にも反応するものであってもよい。ラクトバチルス・パラカゼイ以外の乳酸菌としては、好ましくはラクトバチルス・カゼイ、及びラクトバチルス・ファーメンタムが挙げられる。そのようなモノクローナル抗体としては、Hyb-TA6324Bと名付けられたハイブリドーマセルラインにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。このモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイ、及びラクトバチルス・カゼイに反応し、ラクトバチルス・ファーメンタムともわずかに反応する。また、前記モノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイの生菌体、及び、様々な熱履歴を経て殺菌処理された死菌体にも反応する。
【００１９】
上記ハイブリドーマセルラインのうち、Hyb-TA6324B、およびHyb-TA6348は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１６年４月１日に寄託され、Hyb-TA6324BはNITE P-02234、Hyb-TA6348はNITE P-02235の受託番号が付与されている。また、Hyb-TA6328は、前記NPMDに２０１６年５月３１日に寄託され、NITE P-02273の受託番号が付与されている。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体は公知の細胞融合法により作製できる。以下に、その方法の一例を記載する。
【００２１】
（１）抗原による免疫
ラクトバチルス・パラカゼイ、例えばラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE P-01633）を適当な培地、例えばMRSブロスで培養し、PBSにて洗浄後、96℃、15分加熱処理し、免疫原とする。この死菌体をアジュバントと混合し、BALB/cマウスの腹腔等に免疫する。14日後に２回目の追加免疫を行い、血中の抗体価が上昇したら更に14日後に最終免疫を行う。
【００２２】
（２）細胞融合とスクリーニング
最終免疫３日後に、免疫した動物の脾臓を摘出し、細胞を分散後、適当な融合促進剤、例えばPEGの存在下で、マウスミエローマに対して10:1の割合で細胞融合させる。例えば、96ウェルマイクロプレートに細胞を播き、適当な選択培地（例えば0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン、10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むRPMI-1640培地（ＨＡＴ培地））でハイブリドーマのみを増殖させる。適当な時期に、ハイブリドーマ培養上清中の抗体活性を、免疫学的手法により測定する。
【００２３】
（３）クローニングと腹水作製
抗体陽性のハイブリドーマを限界希釈法で、約２回クローニングを行い、ハイブリドーマクローンを樹立する。モノクローナル抗体を大量に取得するには、予めプリスタンを投与したBALB/cマウス腹腔にハイブリドーマを移植して腹水を回収し、腹水からプロテインＡやプロテインＧカラムを用いてモノクローナル抗体を精製すればよい。精製されたモノクローナル抗体は、免疫学的手法によりラクトバチルス・パラカゼイに反応することを確
認する。
【００２４】
本発明において、モノクローナル抗体のアイソタイプは特に制限されないが、ＩｇＧであることが好ましく、ＩｇＧ１であることがより好ましい。また、「モノクローナル抗体」は、イムノグロブリン分子であってもよく、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片であってもよい。そのような抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ、及びＦｖが挙げられる。さらに、モノクローナル抗体は、組換え体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。キメラ抗体としては、ラクトバチルス・パラカゼイに対する抗体の定常領域を、他の抗体の定常領域で置き換えた抗体が挙げられる。ヒト化抗体は、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイに対するモノクローナル抗体の超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））のみをヒト由来の抗体に組み込むことによって作製することができる（特許第２９１２６１８号）。
【００２５】
また、本発明のモノクローナル抗体は、酵素、ビオチン、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等の標識物質で標識されていてもよい。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体は、乳酸菌、特にラクトバチルス・パラカゼイの疫学的な検出に使用することができる。すなわち、本発明は、乳酸菌を検出する方法において、本発明のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法である。本発明の方法により検出される乳酸菌としては、ラクトバチルス・パラカゼイが挙げられる。「検出」とは、試料中におけるラクトバチルス・カゼイの有無の判定、及び、試料中のラクトバチルス・パラカゼイの量（菌数）の測定の両方を含む。
【００２７】
以下に、ラクトバチルス・パラカゼイ又はそれを含む試料を固相に固定し、本発明のモノクローナル抗体を固相に添加し、固定化されたラクトバチルス・パラカゼイに対して結合したモノクローナル抗体を検出することによって、ラクトバチルス・パラカゼイを免疫学的に検出する方法（抗原固相ELISA）の一例を示す。
【００２８】
ポリスチレン、ナイロン等のマイクロプレート、ニトロセルロースフィルター、ナイロンメンブレン、アガロースビーズ、ラテックス粒子等の固相に試料を含む緩衝液を入れるか、又は試料溶液に固相を浸漬することによって、試料を固相に固定化することができる。
【００２９】
試料を固定化した固相に標識モノクローナル抗体を添加し、洗浄後、標識物質を検出することによって、試料中のラクトバチルス・パラカゼイを特異的に検出することができる。また、試料を固定化した固相に、非標識モノクローナル抗体を添加した後、さらに、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体（二次抗体）を標識物質で標識化した標識化二次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出することによっても、固定化されたラクトバチルス・パラカゼイを検出することができる。
【００３０】
標識物質の検出は、標識の種類により、適宜選択することができる。例えば、酵素としてHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を用いた場合は、基質としてTMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）を加えて酵素反応を行い、青色の発色量を測定することにより、標識量を測定することができる。
【００３１】
また、異なる抗原決定基（エピトープ）を認識する２種類のモノクローナル抗体、又は本発明のモノクローナル抗体と、抗ラクトバチルス・パラカゼイポリクローナル抗体とを組み合わせて用いるサンドイッチELISA法によっても、ラクトバチルス・パラカゼイを検出することができる。その場合には、２種類のモノクローナル抗体の一方、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のうちの一方を固相に固定化し、これに試料中のラクト
バチルス・パラカゼイを結合させた後、他方の抗体を用いて、抗原固相ELISAと同様にして標識を検出すればよい。
Hyb-TA6324Bにより産生されるモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・カゼイにも反応する抗体であるが、サンドイッチELISA法において、ラクトバチルス・カゼイとは反応しないHyb-TA6348、またはHyb-TA6328により産生されるモノクローナル抗体と組み合わせて使用する抗体として好適である。
【００３２】
いずれの方法においても、既知量のラクトバチルス・パラカゼイを含む試料を用いて、菌体量（菌数）と標識との関係を示す標準曲線を作成すれば、被検試料中のラクトバチルス・パラカゼイの菌体量（菌数）を定量することができる。
【００３３】
被検試料は、採取した試料をそのまま用いてもよく、適宜前処理したものを用いてもよい。前処理としては、メンブレンフィルター、遠心分離等による濃縮、洗浄等が挙げられる。
加熱・殺菌処理された乳酸菌の死菌を含む各種食品の製造において、製造工程上、死菌と同じ乳酸菌種の生菌が一部混入する可能性がある。そのような場合、本発明の方法によって生菌と死菌の総量を測定し、別途、微生物の生菌のみを測定する方法（例えばWO2007/094077等）により乳酸菌の生菌量を測定しておけば、前記総量から生菌量を差し引くことにより、乳酸菌の死菌のみを定量することができる。
【００３４】
また、ラクトバチルス・パラカゼイを含む乳酸菌等の死菌数（死細胞数）は、血球計算盤（バクテリアカウンター血球計算盤、ビルケルチュルク血球計算盤等）を用いて、死細胞を顕微鏡下でカウントすることにより測定することができる。
例えば、予めカバーガラス（Hemacytometer Cover glass; size 22×24 mm; thick 0.2
mm; 製品コードA222）をセットしたバクテリアカウンター血球計算盤（SLGC血球計算盤、サンリード硝子（有）社製）の計算室に、ラクトバチルス・パラカゼイの死細胞けん濁液の希釈液5μLを添加（計算室1マスあたり細胞数が5〜10個程度）し、数分間静置して細胞の沈下を待ち、400倍顕微鏡下で細胞をカウントする。
バクテリアカウンターの中央大ブロック（1辺の長さが1mmの正方形）上の2本線で区切られた16マスの集合体（中ブロック）の対角線上にある中ブロック5分画中の細胞をカウントする。中ブロック（80マスに相当）内にある細胞総数をcとすると、死細胞液の原液lmL中の細胞数Ｃは以下で計算される。
【００３５】
【数１】
2017226635.tif 000002
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、ラクトバチルス・パラカゼイを検出するためのキットの一成分とすることもできる。キットは、本発明のモノクローナル抗体の他、標識二次抗体、発色試薬、洗浄液、ラクトバチルス・パラカゼイの標準試料等を含んでいてもよい。また、キットは、本発明のモノクローナル抗体又はラクトバチルス・パラカゼイに反応するポリクローナル抗体を固定化したプレート、標識化されたポリクローナル抗体又は本発明のモノクローナル抗体を含む、サンドイッチELISA用キットであってもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
〔実施例１〕抗乳酸菌モノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製とマウスの免疫
ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）をMRS培地で培養し、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH 7.4）で洗浄した菌体を、96℃で15分加熱処理して死菌を調製した。BALB/cマウスの腹腔に、アジュバント（sigma adjuvant system）と混合した抗原（死菌体）をマウス１匹あたり50μg（投与容量0.2mL）免疫した。14日の間隔で合計２回免疫し、血中の抗体価が上昇した後、マウス１匹あたり死菌体50μgを腹腔に最終免疫した。
【００３９】
（２）細胞融合
最終免疫３日後にマウス脾臓を摘出し、血清を含まないRPMI1640培地（Biocell 社製）中で脾臓細胞を分散させた。脾臓細胞：マウス骨髄腫細胞NS-1（P3/NS1/1-Ag4-1、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より入手）＝10：1の割合で混合し、50％ポリエチレングリコール1500（Roche製）１mlを滴下後、血清を含まないRPMI 1640 １mlを徐々に滴下し、さらに10% FCS（Biocell社製）を含むRPMI1640（FCS-RPMI）８mlを除々に滴下し、遠心分離して細胞を集めた。FCS-RPMIに再懸濁し、96ウェルマイクロプレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに5×105 cells／ウェルずつ分注し、CO2インキュベーター中、37℃で培養した。翌日、HAT培地を加え、以後適当な間隔で培地交換（HAT培地）を行った。ハイブリドーマが増殖したら上清の抗体価を以下のELISAで測定し、抗体陽性細胞をスクリーニングした。
【００４０】
（３）抗原固相ELISAによるスクリーニング
96ウェル平底ELISAプレートHタイプ（住友ベークライト社製MS-8596F）の各ウェルに109 cells／ml（PBS）の抗原（ラクトバチルス・パラカゼイ死菌体）50μlを加え、４℃で１夜インキュベート後、上清を捨てた。ブロッキング試薬（ブロックエース16mg/mL in 10mM Tris-HCl pH7.5 / 150mM NaCl (1.6% BA-TBS)）100μLを各ウェルに入れ、室温で１時間静置後、各ウェルを0.05% Tween20を含む生理食塩水（saline-0.05% Tween20）100μLで５回洗浄した。このようにして調製したプレートの各ウェルに各ハイブリドーマ培養上清50μlを加え、室温で１時間、700rpmにて攪拌し反応させた後、saline-0.05% Tween20にて５回洗浄した。その後、HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体（Abliance製、フナコシより購入（商品コードBI 2413M））を0.4% BA-TBSにて10,000倍希釈した水溶液50μLを加え、室温にて１時間、700rpmにて攪拌して二次反応を行い、saline-0.05 % Tween20にて５回洗浄した。その後、HRP用発色基質（BioFX TMB溶液、SurModics製；TMBW-1000-01）50μLを添加後、室温にて30分静置し酵素基質反応を行った。反応停止液としてBioFX 450 nm Stop Reagent（SurModics製）50μLを加え酵素基質反応を停止させ、450nm（対照630nm）における吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
【００４１】
（４）クローニングと腹水作製
抗体産生が確認されたハイブリドーマを、限界希釈法により２回クローニングした。クローニングされた３種のハイブリドーマのセルラインを、各々Hyb-TA6324B、Hyb-TA6328、及びHyb-TA6348と命名した。このようにして樹立したハイブリドーマクローンを予めプリスタン（Sigma-Aldrich製）を投与したBALB/cマウスの腹腔におよそ107 cells接種し、約２週間後に腹水を回収した。
【００４２】
（５）腹水からのモノクローナル抗体の精製
腹水を8,000×gにて10分間遠心分離し、不溶物を除き、蛋白量として100〜150mg相当の量を市販のプロテインＧカラムキット（HiTrap Protein G HP; GE Healthcare製）にかけ、モノクローナル抗体を精製した。Hyb-TA6324B、及びHyb-TA6328、及びHyb-TA6348が産生するモノクローナル抗体を、各々TA6324B、TA6328、及びTA6348と命名した。 
【００４３】
（６）精製抗体の西洋ワサビペルオシキダーゼによる標識
HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（ベーリンガー・マンハイム社製）４mgを水１mlに溶解後、0.1M過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、室温で20分間攪拌した。１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.4)に透析後、0.2M炭酸ナトリウムを加えて、pHを9.5とした。一方、予め精製抗体８mgを10mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5)に対して透析しておき、これと前記の過ヨウ素酸酸化したペルオキシダーゼを混合し、室温で２時間攪拌して標識した。標識後、４mg/mlのNaBH4を0.1ml加え、４℃で２時間反応させ、PBSに透析した。次いでPBSで平衡化したセファクリルS-200HRカラム（2.5×70cm、GE Healthcare製）でゲルろ過した。280nmおよび403nmの吸光度の一致する溶出ピークをプールし、精製画分とした。
【００４４】
標識抗体は、-80℃で保存した。
【００４５】
（７）抗体のアイソタイプ
得られたモノクローナル抗体のクラス、サブクラスモノクローナル抗体のクラス、サブクラスを市販のキット（バインディングサイト社製）で調べた。その結果、TA6324B、TA6348、およびHyb-TA6328のアイソタイプは、いずれもIgG1であった。
【００４６】
〔実施例２〕抗原固相ELISAによるモノクローナル抗体の特異性の評価（１）
実施例１で作製したモノクローナル抗体の特異性を、実施例１のELISA法と同様にして検討した。具体的には、次のようにして行った。
ラクトバチルス・パラカゼイ等の乳酸菌、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィズス菌、エンテロコッカス・フェカリス、及びエシェリヒア・コリを、MRS、M-17、又はトリプトソイブロスで培養後、PBSにて洗浄した各菌体およそ108〜109 cells/mlオーダー（濁度OD600nm = 0.155〜3.1）の菌体懸濁液50μlを、96ウェル平底ELISAプレートの各ウェルに入れた。４℃、一夜静置後、ウェル内の上清を捨て、1.6% BA-TBS (100μL)で１時間ブロッキングした。ウェルをsaline-0.05% Tween20で５回洗浄後、モノクローナル抗体（TA6324B）の0.37〜0.74μg/mLの溶液50μLを加え、室温、１時間、700rpmにて攪拌し反応させた後、saline-0.05 %Tween20で５回洗浄した。その後、HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体を5,000〜10,000倍希釈した水溶液50μLを加え、室温で１時間、700rpmにて攪拌して二次反応を行い、saline-0.05% Tween20で５回洗浄した。その後、基質BioFX TMB溶液50μLを加え、室温で10〜30分静置し酵素基質反応を行った。反応停止液BioFX 450nm Stop Reagent 50μLを加え酵素基質反応を停止させ、450nm（対照630nm）における吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
【００４７】
結果を表１及び表２に示す。これらの表は、マイクロタイタープレートのウェルの発色（吸光度）を模式的に示したものである。表中の記号は以下のとおりである（表３以降も同様である）。
【００４８】
-  ：0.000 〜 0.070
± ：0.071 〜 0.100
+  ：0.101 〜 0.540
++ ：0.541 〜 2.500
+++：2.501 ＜
【００４９】
表１及び表２の１〜１２列（レーン）の試料及び加熱処理（熱履歴）は以下のとおりである。加熱処理は、オートクレーブ以外は、菌体懸濁液を入れたチューブを所定温度のウォーターバスに浸漬することにより行った。
【００５０】
（表１の試料）
1. ロイコノストック・メセンテロイデスssp.クレモリスATCC19254（65℃、30分）
2. ラクトバチルス・デルブルッキーssp.ラクティスJCM1248（65℃、30分）
3. ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC15707（65℃、30分）
4. エンテロコッカス・フェカリスATCC-SFA（65℃、30分）
5. ラクトバチルス・アシドフィルスATCC4356（65℃、30分）
6. ラクトバチルス・プランタラムJCM1149（65℃、30分）
7. エシェリヒア・コリDH5α（65℃、30分）
8. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633)（65℃、30分）
9. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633）（96℃、15分。培地中で濃縮・凍結保管)
10. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633）（96℃、15分処理後の凍結乾燥品)
11. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633）（96℃、15分）
12. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633)（121℃、15分オートクレーブ）。
【００５１】
（表２の試料）
1〜8. 表１の各列と同じ菌種（未加熱）
9. ラクトバチルス・カゼイATCC334（未加熱）
10. ラクトバチルス・ラムノサスATCC53103（未加熱）
11. ラクトバチルス・サケイATCC15521（未加熱）
12. 緩衝液（PBS）
【００５２】
【表１】
2017226635.tif 000003
【００５３】
【表２】
2017226635.tif 000004
【００５４】
抗体TA6324Bはラクトバチルス・パラカゼイ生菌及び様々な熱履歴を経たラクトバチル
ス・パラカゼイ死菌に反応し、同菌に16S rRNA系統樹にて極めて近縁関係にあるラクトバチルス・カゼイ生菌とは反応したものの、その他の乳酸菌、ビフィズス菌、及びエシェリヒア・コリとは生菌及び死菌（65℃、30分）のいずれにも交差性を示さなかった（表１）。
【００５５】
〔実施例３〕抗原固相ELISAによるモノクローナル抗体の特性の評価（２）
TA6324B以外のモノクローナル抗体（TA6328、TA6348）についても特異性を評価した。
【００５６】
具体的には、前記実施例と同様に108〜109 cells/mL（濁度OD600nm = 0.25〜1.4）のラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（96℃、15分加熱、凍結乾燥品）又は、他の13種類の乳酸菌のPBSけん濁液を96ウェル平底ELISAプレート）に固定した後、ブロックエースにてブロッキングし、各モノクローナル抗体を0.74μg/mLの濃度で室温、１時間、700rpmにて作用させ、150mM NaCl-0.05% Tween20 100μLにて５回洗浄した。その後、HRP標識ヤギ抗マウスIgGを0.4% BA-TBSで10,000倍希釈した水溶液50μLを加え、室温で１時間、700rpmにて攪拌して二次反応を行い、同様に5回洗浄した。その後、基質BioFX TMB溶液50μLを加え、室温で15分、静置し酵素基質反応を行った。反応停止液BioFX 450nm Stop Reagent
50μLを加え酵素基質反応を停止させ、450nm（対照630nm）における吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
【００５７】
結果を表３及び表４に示す。表３及び表４の１〜１２列（レーン）の試料及び加熱処理（熱履歴）は、表１及び２と同じである。
【００５８】
【表３】
2017226635.tif 000005
【００５９】
【表４】
2017226635.tif 000006
【００６０】
モノクローナル抗体TA6348及びTA6328は、ラクトバチルス・パラカゼイの生菌及び死菌（96℃、15分）に反応性を示し、それ以外の全ての乳酸菌群とは交叉反応性を示さなかった。TA6348とTA6328との比較においては、様々な熱履歴のラクトバチルス・パラカゼイ死菌体との反応性の観点からは、TA6348の方が強い反応性を示す（表３及び表４）ことから、TA6348がより優れている。
【００６１】
次に、TA6324B、TA6328、及びTA6348について、菌種を拡大させて、前記と同様にして特異性を評価した。結果を表５〜表７に示す。各表の１〜３０列（レーン）の試料及び加熱処理（熱履歴）は、以下のとおりである。
【００６２】
1. ラクトバチルス・ロイテリJCM1112（65℃、30分）
2. ラクトバチルス・ファーメンタムJCM1173（65℃、30分）
3. ラクトバチルス・ブルガリカスATCC11842（65℃、30分）
4. ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM1120（65℃、30分）
5. ラクトバチルス・アニマリスMCC-0592（65℃、30分）
6. ラクトバチルス・ペントサスMCC-1288（65℃、30分）
7. ラクトバチルス・ガセリATCC33323（65℃、30分）
8. ラクトバチルス・ジョンソニーJCM2012（65℃、30分）
9. ラクトバチルス・クリスパタスJCM1185（65℃、30分）
10. ラクトバチルス・アミロボラスJCM1126（65℃、30分）
11. ラクトバチルス・クルバタスMCC-0748（65℃、30分）
12. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633)（96℃、15分処理後の凍結乾燥品）
13. ラクトバチルス・ロイテリJCM1112（未加熱）
14. ラクトバチルス・ファーメンタムJCM1173（未加熱）
15. ラクトバチルス・ブルガリカスATCC11842（未加熱）
16. ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM1120（未加熱）
17. ラクトバチルス・アニマリスMCC-0592（65℃、30分）
18. ラクトバチルス・ペントサスMCC-1288（未加熱）
19. ラクトバチルス・ガセリATCC33323（未加熱）
20. ラクトバチルス・ジョンソニーJCM2012（未加熱）
21. ラクトバチルス・クリスパタスJCM1185（未加熱）
22. ラクトバチルス・アミロボラスJCM1126（未加熱）
23. ラクトバチルス・クルバタスMCC-0748（未加熱）
24. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633)（96℃、15分処理後の凍結乾燥品）
25. ラクトバチルス・サリバリウスJCM1231T（65℃、30分）
26. ストレプトコッカス・サーモフィラスMCC-1839（65℃、30分）
27. ラクトバチルス・サリバリウスJCM1231T（未加熱）
28. ストレプトコッカス・サーモフィラスMCC-1839（未加熱）
29. 緩衝液（PBS）
30. ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849 (NITE BP-01633)（96℃、15分処理後の凍結乾燥品）
【００６３】
【表５】
2017226635.tif 000007
【００６４】
【表６】
2017226635.tif 000008
【００６５】
【表７】
2017226635.tif 000009
【００６６】
TA6324Bは、表５のレーン２及び表６のレーン１４に示されるように、ラクトバチルス・ファーメンタムと弱いながら交叉性が認められたが、それ以外の乳酸菌群とは反応せず、ラクトバチルス・パラカゼイの死菌とは強い反応性が観測された。前記のとおり、TA6324Bは、ラクトバチルス・カゼイとは交叉性を示したものの、その他乳酸菌、ビフィズス菌、及びエシェリヒア・コリとは交叉性を示さなかったので、特異性の高いモノクローナル抗体である。TA6328、及びTA6348は、ラクトバチルス・パラカゼイの死菌と強い反応性を示し、ラクトバチルス・ファーメンタムを含め、他の乳酸菌、ビフィズス菌、及びエシェリヒア・コリとは交叉性を示さず、特異性が高い抗体である。
【００６７】
〔実施例４〕蛍光標識抗体を利用したラクトバチルス・パラカゼイの死菌の特異的迅速検出
モノクローナル抗体TA6348が、様々な熱履歴を経たラクトバチルス・パラカゼイを検出できるか検討した。加熱処理によって調製された死菌を凍結乾燥したもの（図１Ａ）、同死菌を凍結濃縮したもの（図１Ｂ）、及びオートクレーブ処理（121℃、15分）により調製した死菌（図１Ｃ）、及び、一夜培養後に10倍希釈した生菌（図１Ｄ）の各PBSけん濁液（2×108 cells/mL）50μLを、冷却遠心処理（8,000×g、10分、4℃）し、ペレットにモノクローナル抗体TA6348溶液（0.74μg/mL）を100μl加えて、室温にて１時間作用させた後、400μLの150mM NaCl-0.05% Tween20にて３回洗浄した。その後、2000倍希釈したFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体（ROCK LAND、code:610-102-121、http://www.rockland-inc.com/）を100μl加えて室温にて１時間作用させた後、前記と同様に洗浄した。洗浄したペレットに20μL PBSを加えて、その5μLをバクテリア計算盤にアプライし、蛍光顕微鏡にてFITC標識抗マウスIgG抗体に由来する緑色蛍光を確認した。
【００６８】
結果を図１に示した。ラクトバチルス・パラカゼイ生菌及び様々な死菌において、緑の蛍光を確認することができ、抗原固相ELISA以外でも本発明の抗体の有効性を確認できた。
【００６９】
〔実施例５〕サンドイッチELISAによるモノクローナル抗体の特性の評価
（１）試料の調製
市販のチョコレートを加熱溶融し、96℃で15分加熱して殺菌処理し、続けて溶融状態のままでチョコレート温度を27〜29℃に維持して溶融チョコレートを調製した。
96℃で15分加熱して殺菌処理したラクトバチルス・パラカゼイ死菌を、先に調製した溶融チョコレート１ｇあたりに、それぞれ8×1010 cells/g、4×1010cells/g、2×1010 cells/g、及び1×1010 cells/gとなるように添加したラクトバチルス・パラカゼイ死菌含有溶融チョコレートを調製し、その後、一旦31℃まで昇温させ、31℃に到達後に成形器に入れて自然冷却させて、ラクトバチルス・パラカゼイ死菌含有チョコレート標準試料（以下、「チョコレート標準試料」と記載する）を製造した。
また、ラクトバチルス・パラカゼイの含有の有無が不明なチョコレートをチョコレート試験試料として用意した。
上記のチョコレート標準試料及びチョコレート試験試料のそれぞれ5gと、滅菌蒸留水45mlとを混合し、40℃で15〜20分加温溶解してチョコレート標準試料希釈液及びチョコレート試験試料希釈液（各試料の10倍希釈液）を調製した。チョコレート標準試料希釈液中のラクトバチルス・パラカゼイ死菌含有量は、それぞれ8×109 cells/ml、4×109cells/ml、2×109 cells/ml、及び1×109 cells/mlであった。
調製したチョコレート標準試料希釈液及びチョコレート試験試料希釈液は、それぞれ1mlを分取した後、冷却遠心分離（4℃、10分、8,000×G）を行って沈殿物を回収し、回収した沈殿物に生理食塩水（150mM NaCl）を添加し洗浄して再度沈殿物を回収した。生理食塩水で洗浄した沈殿物に、生理食塩水−0.05% Tween20水溶液を1ml添加し、水槽中で37℃、1時間保温した後、冷却遠心分離（4℃、10分、8,000×G）を行って沈殿物を回収し、回収した沈殿物に300μlの1.6% BA-TBSを添加して沈殿物を懸濁させて被検試料液（1倍希釈液、それぞれチョコレート標準試料又はチョコレート試験試料を含む被検試料液）を調製し、ELISA試験に供した。
さらに当該被検試料液を1.6% BA-TBSを用いて希釈して、それぞれ2倍希釈液、4倍希釈液、及び8倍希釈液を調製して、同様にELISA試験に供した。
なお、前記被検試料液（1倍希釈液）の調製において、生理食塩水−0.05% Tween20水溶液を、生理食塩水−10%アセトニトリル水溶液、又は生理食塩水−5%メタノール水溶液に置換し、それ以外は同様の方法により調製した被検試料液（1倍希釈液）、並びに2倍希釈液、4倍希釈液、及び8倍希釈液を調製して、同様にELISA試験に供した。
【００７０】
（２）ELISA試験
96ウェル平底ELISAプレートHタイプ（住友ベークライト社製MS-8596F）の各ウェルに、コーテイングバッファー（0.05 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6）で4μg/mLに希釈したモノクローナル抗体TA6348の50μlを加え、４℃で１夜インキュベート後、上清を捨てた。その後、各ウェルに1.6% BA-TBS 100μLを入れ、室温で１時間静置後、各ウェルを150mM NaCl-0.05 ％Tween20の100μLで５回洗浄して本実施例に使用するELISAプレートを作製した。
先に調製したチョコレート標準試料又はチョコレート試験試料を含む被検試料（1倍希釈液）、並びに2倍希釈液、4倍希釈液、及び8倍希釈液（いずれもそれぞれ、生理食塩水−0.05% Tween20水溶液、生理食塩水−10%アセトニトリル水溶液、又は生理食塩水−5%メタノール水溶液の系で調製）の50μlを前記ELISAプレートの各ウェルに加え、700rpmにて攪拌しながら、室温で２時間反応させた後、各ウェルを150mM NaCl-0.05% Tween20にて５回洗浄した。その後、HRP標識したモノクローナル抗体TA6324Bを0.4% BA-TBSにて2μg/mLに希釈した水溶液50μLを各ウェルに加え、700rpmにて攪拌しながら室温にて２時間、二次反応を行い、さらに150mM NaCl-0.05% Tween20にて５回洗浄した。
その後、各ウェルに、BioFX TMB溶液を50μL添加した後、室温にて15〜20分静置して酵素基質反応を行った。反応停止液としてBioFX 450 nm Stop Reagent 50μLを加えて酵素基質反応を停止させ、ELISAプレートリーダーにより450nm（対照630nm）における吸光度
を測定した。
【００７１】
試験結果を表８、及び表９に示す。表９は、表８に記載の吸光度を、前記と同様の基準で模式化して示したものである。
【００７２】
【表８】
2017226635.tif 000010
【００７３】
【表９】
2017226635.tif 000011
【００７４】
前記３種類のいずれの最終洗浄法を用いても、チョコレート中のラクトバチルス・パラカゼイ死菌標準試料は0〜8×109 cells/gの濃度において、濃度依存的にOD450nmでの吸光度が変動し、良好な標準曲線が得られた（表８）。
なお、チョコレート試験試料の希釈液におけるラクトバチルス・パラカゼイ死菌含有量は、およそ8.5×108 cells/mlであると算出された。よって、ラクトバチルス・パラカゼイの含有の有無が不明であるとして用意されたチョコレート試験試料には、ラクトバチルス・パラカゼイ死菌が、8.5×109 cells/g含まれていることが判明した。
【図１】
2017226635.tif 000012