(57)【要約】      （修正有）【課題】ニンニク等の栽培作物および栽培圃場における線虫感染被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことのできる抗線虫血清の製造方法を提供すること。【解決手段】抗線虫血清製造方法は、検出対象線虫を破砕してなる線虫破砕物１を抗原として抗体２を得る抗体生成過程Ｐ１と、当該抗体２を含む血清３が非特異的反応を示す反応物４を除去する吸収処理過程Ｐ２とから、大きく構成される。線虫破砕物としては特に、当該線虫の体内容物を好適に用いることができる。本発明に係る抗線虫血清は、イモグサレセンチュウ等の作物または土壌における線虫検出に用いることを主たる用途とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫を特異的に検出する、抗線虫血清（または、線虫を特異的に検出する、精製された抗体。以下、「抗線虫血清」に替えて「精製された抗体」とするものも、本発明の範囲内である。）。
【請求項２】
前記線虫が植物寄生性線虫であることを特徴とする、請求項１に記載の抗線虫血清。
【請求項３】
作物または土壌における線虫検出に用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗線虫血清。
【請求項４】
前記線虫がイモグサレセンチュウであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の抗線虫血清。
【請求項５】
検出対象線虫を破砕してなる線虫破砕物を抗原として抗体を得る抗体生成過程と、該抗体を含む血清が非特異的反応を示す反応物を除去する吸収処理過程とからなる、抗線虫血清製造方法。
【請求項６】
前記線虫破砕物には当該線虫の体内容物を用いることを特徴とする、請求項５に記載の抗線虫血清製造方法。
【請求項７】
前記検出対象線虫は、作物または土壌中の線虫であることを特徴とする、請求項５または６に記載の抗線虫血清製造方法。
【請求項８】
前記検出対象線虫はイモグサレセンチュウであり、前記非特異的反応の対象は大豆トリプシンインヒビター、サツマイモネコブセンチュウ、ヤマノイモネコブセンチュウ、または自活性線虫のうちの少なくともいずれかであることを特徴とする、請求項５ないし７のいずれかに記載の抗線虫血清製造方法。
【請求項９】
被検体と、請求項１ないし４のいずれかに記載の抗線虫血清または請求項５ないし８のいずれかに記載の方法により得られる抗線虫血清とを接触させる抗原−抗体反応過程と、該抗原−抗体反応過程による反応複合体検出のために該抗体を標識処理する標識過程とを備え、該被検体における線虫感染を診断する、線虫診断方法。
【請求項１０】
前記標識過程以後になされる発色または蛍光による可視化によって診断されることを特徴とする、請求項９に記載の線虫診断方法。
【請求項１１】
前記被検体は作物の組織であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の線虫診断方法。
【請求項１２】
前記被検体は作物栽培用の土壌であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の線虫診断方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の線虫診断方法により作物中における線虫感染の程度を診断し、その結果に基づいて収穫時期を判定する、作物収穫時期判定方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の作物収穫時期判定方法により作物を収穫し、種子を得る、作物種子生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗線虫血清、抗線虫血清製造方法、線虫診断方法、作物収穫時期判定方法、および作物種子生産方法に係り、特に、ニンニク等の栽培作物および栽培圃場における線虫感染被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことのできる、抗線虫血清、抗線虫血清製造方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我が国におけるイモグサレセンチュウの発生は、１９７５年、新潟県、奈良県のアイリスで初確認され、その後北海道、兵庫県などでも確認された。１９８４年には、青森県木造町（現・つがる市木造地区）で青森県主力野菜の一つであるニンニクに腐敗や欠株など生育障害が発生し、イモグサレセンチュウによる被害と同定された。そしてその後、瞬く間に県内のニンニク生産地域に拡大した。イモグサレセンチュウの発生は、ニンニクを主体に、北海道、岩手県、秋田県、宮城県、鳥取県、岡山県において確認されており、その被害範囲は拡大しつつある。
【０００３】
特に、２００７年１２月に起きた中国餃子事件以降、国産ニンニクが強く要望されるようになり、また近年は市場価格が高値で経過していることもあり、生食用や加工用も恒常的に不足している状況である。そのため、県内はもとより全国的にニンニクの作付けが増加し、病害虫が感染・寄生した不良な種子が流通しており、県外でも次々と本線虫の発生が確認されるようになってきている。ニンニク国内出荷量の８割を担う青森県においては言うまでもなく、多くのニンニク新興産地においても事態は深刻であり、効果的な線虫駆除法開発への期待が非常に大きい。
【０００４】
平成２７年度青森県農作物病害虫防除指針によると、「ニンニクの生産を確実に行なうためには種子の更新と新しい生産圃場の準備が重要である。」とし、どうしても既発生圃場を利用して栽培せざるを得ない場合には、以下に挙げる有効な防除手法をすべて組み合わせた体系的防除が必要であると述べている。各防除手法は、次の通りである。
【０００５】
１）土壌消毒を行なう。
現在、使用できる土壌消毒剤は、土壌くん蒸剤としてはクロルピクリンくん蒸剤とダゾメット剤があり、殺線虫剤としてはラグビー（登録商標）ＭＣ粒剤とネマトリン（登録商標）エース粒剤がある。土壌くん蒸剤は、土壌を耕起整地した後、クロルピクリンくん蒸剤は１０ａ当り３０Ｌ（リットル）を１穴３ｍＬ注入する。ダゾメット剤は１０ａ当り３０ｋｇをできるだけ均一に散布し土壌とよく混和する。クロルピクリンくん蒸剤の殺線虫効果は地表下２０ｃｍ前後であり、ダゾメット剤の殺線虫効果は混和層に限られる。混和後ただちにポリエチレンフィルム等で被覆し、１４日間以上経過してからガス抜きを行なって植え付ける。殺線虫剤は、ラグビー（登録商標）ＭＣ粒剤を１０ａ当り３０ｋｇ、ネマトリン（登録商標）エース粒剤を１０ａ当り２５ｋｇ全面施用し、土壌とよく混和する、というものである。
【０００６】
２）種子消毒を行なう。
種子重の１％量のチウラム・ベノミル水和剤（ベンレート（登録商標）Ｔ）を種子りん片に湿粉衣する、というものである。この処理は土壌からの線虫の侵入防止に有効である。
【０００７】
３）適期収穫
種子消毒を実施した場合、土壌中の線虫はりん球肥大期の５月下旬頃から収穫期に発根基部から最外葉の葉鞘内に侵入し、時間の経過とともに内側の葉鞘内部へ順次移動する。収穫が遅れるとその分だけりん球（りん片）内への線虫の侵入が進むので、収穫は早めに実施する、というものである。  
【０００８】
４）収穫後の強制乾燥
収穫後速やかに根を切り落とし、温風通風装置などを利用して、およそ３５℃で２週間程度強制乾燥する、というものである。葉鞘内部に生存する線虫が急激な乾燥により死滅または活動休止状態のコイル化となり、貯蔵中のりん球腐敗の進行を防止できる。
【０００９】
線虫駆除方法について出願人および本願発明者は、これまで複数の特許出願を行ってきた。たとえば、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．  ＪＥ１０５８株により生産されるバイオサーファクタントを有効成分として含む線虫誘引剤によって、土壌中の線虫を誘引して駆除する防除方法（特許文献１）、メチイン（Ｓ−メチルシステインＳ−オキシド）またはＳ−プロピルシステインＳ−オキシドを有効成分に含むイモグサレセンチュウ誘引剤によりイモグサレセンチュウを誘引、捕集、処分する方法（特許文献２）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１２−１７６９０６号公報「線虫誘引剤および線虫防除方法」（特許第５７２４０８９号）
【特許文献２】特開２０１０−１００５６８号公報「イモグサレセンチュウ誘引剤およびイモグサレセンチュウ駆除方法」
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】平成２７年度青森県農作物病害虫防除指針（青森県農作物病害虫防除指針編成会議編）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上記体系的対策の各手法には次のような問題点があった。すなわち、土壌消毒を実施しても土壌中の線虫を完全に駆除できないこと、ニンニクへの線虫の侵入状況を的確に把握できないため、収穫が遅くなると被害を生じること、また、強制乾燥だけではニンニク内の全ての線虫は死滅しておらず、さらに５０℃の高温乾熱処理を組み合わせても強制乾燥後に腐敗が進行すること、である。特に近年は、大玉生産を望むことから収穫が遅くなり、線虫が寄生侵入して土壌消毒による被害軽減効果の失われている事例が多々あり、土壌消毒など有効な技術の理解と普及の障害となっている。なお、ニンニクにおけるかかる問題は、他の栄養繁殖性作物等においても観念し得る問題である。
【００１３】
そこで本発明が解決しようとする課題は、かかる従来技術の問題点をなくし、ニンニク等の栽培作物および栽培圃場における線虫感染被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことのできる、抗線虫血清、抗線虫血清製造方法、線虫診断方法、作物収穫時期判定方法、および作物種子生産方法を提供することである。
【００１４】
特に、ニンニクの最重要害虫であるイモグサレセンチュウの被害を回避するために、イモグサレセンチュウ発生圃場において土壌消毒を実施してニンニク栽培を安定的に持続させるのに必要な、抗線虫血清、抗線虫血清製造方法、線虫診断方法、作物収穫時期判定方法、および作物種子生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために本願発明者は、イモグサレセンチュウの土壌や植物体内での行動を検出目的の抗線虫血清を作製し、線虫検出・診断法の開発を検討してきた。すなわち、イモグサレセンチュウを破砕して遠心分離で得られる体内液を家兎に注射・免疫して得られた抗血清についてサツマイモネコブセンチュウや自活性線虫の破砕液を用いて反応特異性を高めた（吸収処理法）。そして、これにより可能となった血清診断を用いることでニンニク内へのイモグサレセンチュウの寄生や侵入状況を把握し、収穫時期を判定可能なことを発見し、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【００１６】
〔１〕  線虫を特異的に検出する、抗線虫血清。（または、線虫を特異的に検出する、精製された抗体。以下、「抗線虫血清」に替えて「精製された抗体」とするものも、本発明の範囲内である。）
〔２〕  前記線虫が植物寄生性線虫であることを特徴とする、〔１〕に記載の抗線虫血清。
〔３〕  作物または土壌における線虫検出に用いることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の抗線虫血清。
〔４〕  前記線虫がイモグサレセンチュウであることを特徴とする、〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の抗線虫血清。
〔５〕  検出対象線虫を破砕してなる線虫破砕物を抗原として抗体を得る抗体生成過程と、該抗体を含む血清が非特異的反応を示す反応物を除去する吸収処理過程とからなる、抗線虫血清製造方法。
【００１７】
〔６〕  前記線虫破砕物には当該線虫の体内容物を用いることを特徴とする、〔５〕に記載の抗線虫血清製造方法。
〔７〕  前記検出対象線虫は、作物または土壌中の線虫であることを特徴とする、〔５〕または〔６〕に記載の抗線虫血清製造方法。
〔８〕  前記検出対象線虫はイモグサレセンチュウであり、前記非特異的反応の対象は大豆トリプシンインヒビター、サツマイモネコブセンチュウ、ヤマノイモネコブセンチュウ、または自活性線虫のうちの少なくともいずれかであることを特徴とする、〔５〕ないし〔７〕のいずれかに記載の抗線虫血清製造方法。
〔９〕  被検体と、〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の抗線虫血清または請求項５ないし８のいずれかに記載の方法により得られる抗線虫血清とを接触させる抗原−抗体反応過程と、該抗原−抗体反応過程による反応複合体検出のために該抗体を標識処理する標識過程とを備え、該被検体における線虫感染を診断する、線虫診断方法。
【００１８】
〔１０〕  前記標識過程以後になされる発色または蛍光による可視化によって診断されることを特徴とする、〔９〕に記載の線虫診断方法。
〔１１〕  前記被検体は作物の組織であることを特徴とする、〔９〕または〔１０〕に記載の線虫診断方法。
〔１２〕  前記被検体は作物栽培用の土壌であることを特徴とする、〔９〕または〔１０〕に記載の線虫診断方法。
〔１３〕  〔１１〕に記載の線虫診断方法により作物中における線虫感染の程度を診断し、その結果に基づいて収穫時期を判定する、作物収穫時期判定方法。
〔１４〕  〔１１〕に記載の作物収穫時期判定方法により作物を収穫し、種子を得る、作物種子生産方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の抗線虫血清、抗線虫血清製造方法、線虫診断方法、作物収穫時期判定方法、および作物種子生産方法は上述のように構成されるため、これらによれば、ニンニク等の栽培作物および栽培圃場における線虫感染被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことができる。特にニンニクの最重要害虫であるイモグサレセンチュウの被害に関しては、本発明によってその被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことができるため、ニンニク栽培を安定的に持続させることができる。
【００２０】
すなわち、ニンニクのように種子繁殖できない栄養繁殖性作物の場合、イモグサレセンチュウ等の線虫寄生種苗を本発明診断方法で簡便に検出できるため、作物の生育障害・商品価値低下を招くことなく生産を安定的に持続することができることになる。したがって本発明により、特にニンニク栽培における種子用の種球を診断できることは、イモグサレセンチュウの発生拡大を有効に阻止することにつながる。
【００２１】
また、本発明によりニンニク内での寄生・侵入状況を検出することはすなわち、イモグサレセンチュウが未侵入であること、または侵入初期であることを知ることになり、これによって収穫時期を判定することができる。そして、収穫適期を判断できることによって適期には直ちに収穫し、強制乾燥することができ、被害を回避することを可能にする。また、特別な施設による５０℃高温乾熱処理も不要となり、生産コストの削減にもなる。
【００２２】
このように本発明によれば、健全種子の確保、被害を出さない収穫、線虫発生圃場の拡大蔓延阻止の各効果を得ることができる。また本発明は、イモグサレセンチュウのみならず、その他の線虫にも有効であり、適用対象作物はニンニクに限定されない。殊に、ジャガイモ、サツマイモ、アイリス、チューリップ、ダリア等といった栄養繁殖性作物における健全種子の確保、被害を出さない収穫、線虫発生圃場の拡大蔓延阻止に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の本発明の抗線虫血清製造方法の構成を示すフロー図である。
【図２】本発明の線虫診断方法の構成を示すフロー図である。
【図３】本発明の作物収穫時期判定方法および作物種子生産方法の構成を示すフロー図である。  以下、実施例に係る図面。
【図４】イモグサレセンチュウ破砕液に対する抗血清の反応性評価結果を示す説明図である。
【図５】吸収処理後の抗イモグサレセンチュウ血清の反応特異性評価結果を示す説明図である。
【図６】イモグサレセンチュウ発生圃場産ニンニクの葉鞘基部からのイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である。
【図７】ニンニク根からのイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である。
【図８】根を用いたティッシュプリント法によるイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である。
【図９】ニンニク葉鞘基部組織片採取方法を示す説明図である。
【図１０】ニンニクの血清診断結果を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を、図面も用いつつより詳細に説明する。
本発明の最も基本的な基本は、線虫を特異的に検出する抗線虫血清であり、中でもとりわけ、その線虫が植物寄生性線虫であるところの抗線虫血清である。さらに本発明抗線虫血清は、作物または土壌における線虫検出に用いることを主たる用途としている。実施例に後述するように本発明は、イモグサレセンチュウを特異的に検出できる抗線虫血清の作製を主としてなされたものであり、イモグサレセンチュウは本発明抗線虫血清の重要な適用対象の一つである。なお本発明は、その他の線虫に対しても適用可能である。また、線虫を特異的に検出する、精製された抗体も、本発明の範囲内である。さらに、以下、「抗線虫血清」に替えて「精製された抗体」とするものも、本発明の範囲内である。
【００２５】
図１は、本発明の抗線虫血清製造方法の構成を示すフロー図である。図示するように本発明の抗線虫血清製造方法Ｍ１は、検出対象線虫を破砕してなる線虫破砕物１を抗原として抗体２を得る抗体生成過程Ｐ１と、当該抗体２を含む血清３が非特異的反応を示す反応物４を除去する吸収処理過程Ｐ２とから、大きく構成される。線虫破砕物としては特に、当該線虫の体内容物を好適に用いることができる。具体的にはたとえば、ショ糖密度勾配遠心分離によって精製したイモグサレセンチュウ等の線虫をビーズ破砕した破砕物を、家兎等の動物に接種することで抗血清を得ることができる。
【００２６】
かかる構成により本発明抗線虫血清製造方法Ｍ１によれば、抗体生成過程Ｐ１において検出対象線虫を破砕してなる線虫破砕物１を抗原として抗体２が得られ、得られた抗体２を含む血清３からは、吸収処理過程Ｐ２において非特異的反応を示す反応物４が除去され、抗線虫血清５が得られる。抗線虫血清５は、線虫破砕物１に対する抗体を含む血清であり、それを用いることによって線虫検出によるにんにく等の収穫時期判定を行うことができる。
【００２７】
本発明の抗線虫血清製造方法Ｍ１は、特に作物または土壌中の線虫を適用対象とすることができるが、これに限定されない。作物または土壌中の線虫としては、たとえばイモグサレセンチュウが挙げられる。また、吸収処理過程Ｐ２における非特異的反応の対象としては、適用対象がイモグサレセンチュウの場合であれば、たとえば大豆トリプシンインヒビター、サツマイモネコブセンチュウ、ヤマノイモネコブセンチュウ、または自活性線虫のうちの少なくともいずれかが挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
上記方法によって得られた抗血清は、検出対象線虫（本線虫）破砕物だけではなく、他の土壌線虫の破砕物にも反応する。したがって、他の線虫の破砕液を抗血清に混合して吸収処理することにより、本線虫のみと特異的に反応する抗血清を得ることができる。たとえばイモグサレセンチュウの場合であれば、サツマイモネコブセンチュウと自活性線虫の破砕液を抗血清に混合して吸収処理するにより、検出対象であるイモグサレセンチュウのみと特異的に反応する抗血清を作製することができる。
【００２９】
抗原となるイモグサレセンチュウ等の線虫の破砕には、乳鉢・乳棒はもちろん、ジルコニアやガラス製ビーズや金属製クラッシャー、メタルコーン等を用いた破砕機、ペレットミキサーやバイオマッシャーなどの手動式または電動式の簡易破砕機等、従来公知の、あるいは市販の器具等を適宜使用することができる。
【００３０】
図２は、本発明の線虫診断方法の構成を示すフロー図である。図示するように本発明線虫診断方法Ｍ２は、被検体６と、図１に示した製造方法により得られる抗線虫血清５とを接触させる抗原−抗体反応過程Ｐ３と、抗原−抗体反応過程により反応複合体が生成した場合にはこれが検出されるようにするために、抗線虫血清５中の抗体２を標識処理する標識過程Ｐ４を備えることを、主たる構成とする。なお、抗原−抗体反応過程Ｐ３は、希釈した抗血清と、ニトロセルロース等の濾紙あるいはポリスチレン製プレート等適宜の媒体上に固相化した被検体（線虫抗原）と反応させる過程である。
【００３１】
かかる構成により本発明線虫診断方法Ｍ２では、抗原−抗体反応過程Ｐ３において、被検体６と抗線虫血清５とが接触せしめられて抗原−抗体反応処理に供され、標識過程Ｐ４において抗線虫血清５中の抗体２が標識処理され、これにより、抗原−抗体反応過程Ｐ３で反応複合体が生成している場合にはその検出がなされて反応複合体検出結果７が得られる。
【００３２】
反応複合体を検出するための標識処理としては、酵素や蛍光物質等による従来公知の処理方法を適宜用いることができる。たとえば、市販の酵素や蛍光物質等で標識した抗ウサギ抗体異種動物抗体液により、発色反応や蛍光発光反応を用いる等して、直接、または間接的に線虫の検出を行うことができる。
【００３３】
標識過程Ｐ４以後になされる可視化による診断において、発色または蛍光を得る方法は、実施例に一部例示するように、従来公知の方法を適宜用いることができる。抗血清を用いた診断の判定法の抗原抗体反応の有無を可視化するものとしては、たとえばアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチン、蛍光色素、ラテックス等があるが、特に限定されるものではない。このように本発明の診断方法においては、抗原抗体反応を可視化して診断することができる。
【００３４】
本発明線虫診断方法Ｍ２の各過程Ｐ３、Ｐ４を経ることに基づいて、被検体６における線虫感染の有無や程度を診断することができる。たとえば、作物の組織を被検体６として、作物組織における線虫感染の有無や程度を診断することができる。また、本線虫診断方法Ｍ２は特に、ニンニク、ジャガイモ、サツマイモ、アイリス、チューリップ、ダリア等の栄養繁殖性作物をその適用対象とすることができる。
【００３５】
本発明線虫診断方法Ｍ２を用いることで、たとえば、本線虫が寄生するニンニクの根や葉鞘、バレイショの塊茎、花き球根等の組織片から、線虫感染有無やその程度を確認することができる。また、本発明を応用することで、サツマイモネコブセンチュウ等の植物寄生性線虫の特異的抗血清を作製することが可能となり、植物寄生性線虫の検出を行うことができる。
【００３６】
本発明線虫診断方法Ｍ２によればまた、たとえば作物栽培用の土壌を被検体６として、作物栽培用の土壌における線虫感染の有無や程度を診断することができる。たとえば、本線虫感染の可能性がある土壌をビーズ破砕処理し、４０％ショ糖を加用した緩衝液で懸濁した上清液を抗原液として本発明方法を用いることにより、被検土壌中の線虫の有無や感染程度を検出することができる。
【００３７】
図３は、本発明の作物収穫時期判定方法および作物種子生産方法の構成を示すフロー図である。図示するように本発明の作物収穫時期判定方法Ｍ１は、先に説明した線虫診断方法により作物８中における線虫感染の有無や程度を診断する線虫診断過程Ｐ５と、線虫診断結果９に基づいて収穫時期を判定する収穫時期判定過程Ｐ６とから構成される。
【００３８】
かかる構成により本発明の作物収穫時期判定方法Ｍ１によれば、線虫診断過程Ｐ５において、作物８中における線虫感染の有無や程度が診断されて線虫診断結果９が得られ、収穫時期判定過程Ｐ６において、線虫診断結果９に基づいて収穫時期を判定されて、適切な収穫時期判定結果１０が得られる。
【００３９】
また、図示するように本発明の作物種子生産方法Ｍ２は、先に説明した作物収穫時期判定方法Ｍ１で得られた収穫時期判定結果１０に基づいて作物を収穫する収穫過程Ｐ７と、収穫作物２０から種子３０を得る採種過程Ｐ８とから構成される。これにより、収穫過程Ｐ７において収穫時期判定結果１０に基づいて作物が収穫され、採種過程Ｐ８において収穫作物２０から、線虫感染のない健全な種子３０が得られる。
【００４０】
以上説明した本発明を、特にニンニクに適用することにより、ニンニクの根、葉鞘、貯蔵葉等の組織から線虫の有無を検出し、鱗球へのイモグサレセンチュウの侵入状況を正確に把握することが可能となり、腐敗被害を出さないための収穫期判定が可能となる。
【００４１】
本発明は特に、我が国で生産量の多い白色六片種のニンニクを主な適用対象として想定し、完成に至った。しかしながら、本発明をニンニクに適用する場合は当該品種に限定されない。たとえば、八幡平系等の着色品種、中国系の多片種、ジャンボニンニク、ネギ、タマネギ、野蒜等においても、本発明の効果を得ることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお、本発明完成に至る過程の記述により、実施例の説明とする。
＜実施例１．反応特異性のある抗イモグサレセンチュウ血清の作製＞
＜１．−１  抗原の調製＞
感染ニンニクからベルマン法で抽出したイモグサレセンチュウを５０ｍｌの遠心チューブに入れ、水道水で満たした後１時間静置し、この操作を２回繰り返した。あるいは、大量の水道水中で沈殿させた後で上清を廃棄することを数回繰り返した。滅菌水で作製した２０％、３０％、４０％のショ糖液を超遠心ローターＰ２８Ｓ（日立製）用の１２ｍｌの遠心チューブに２ｍｌずつ重層し、最上部に線虫懸濁液をのせ、５０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して線虫層を回収し、この作業を繰り返して線虫層を回収した。さらに滅菌水で洗浄を繰り返した。線虫懸濁液は滅菌したリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した。
【００４３】
イモグサレセンチュウ破砕液は、懸濁液１ｍｌに０．５ｇの０．１ｍｍガラスビーズを添加し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）やビーズクラッシャー（タッテック社製）を用いて、３０００ｒｐｍ、１分間処理して得た体内容物を用いた。イモグサレセンチュウ破砕物質（体内容物）と市販の免疫用アジュバント試薬（フロイントの不完全アジュバント）とを等量混合して抗原液とし、これを、家兎の背中６カ所の皮中に約２００μＬずつ注射した。２週間間隔で２回注射した。つまり、２、４週間後にそれぞれ、外耳静脈へ抗原液１００μＬ追加免役し、最終免疫から２〜４週間後に全採血し、３７℃に３０分〜１時間放置後、遠心分離によって上清である血清を得た。
【００４４】
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ウェスタンブロット法の各電気泳動により、線虫体破砕液中は、主として分子量約５０ｋＤａと約４５ｋＤａ、約２６ｋＤａ等のたんぱく質から構成されることが確認された。そのうち、約２６ｋＤａのバンドはトリプシンインヒビターと推定された。線虫に特異的なタンパク質は主として４５ｋＤａタンパク質と推測された。
【００４５】
反応特性を確認するため、各線虫の破砕液を作製した。まず、線虫の懸濁液を作製した。イモグサレセンチュウは感染ニンニクから、サツマイモネコブセンチュウは感染トマトから、ヤマノイモネコブセンチュウは感染ナガイモから、自活性線虫は土壌または市販の園芸培土（サカタのプライムミックス等）から、ベルマン法を用いて各線虫の懸濁液を得た。線虫懸濁液１ｍｌに０．５ｇの０．１ｍｍガラスビーズを添加し、マルチビーズショッカー（安井器械製）やビーズクラッシャー（タッテック製）を用いて、３０００ｒｐｍ、１分間処理し、各線虫破砕液を得た。
【００４６】
５μＬの破砕液を０．４５μｍニトロセルロース膜（バイオラッド社、ＧＥヘルスケア社等製）にスポットし、風乾後、２％仔牛血清アルブミン溶液やブロッキングワン（フナコシ製）などに２０〜３０分間浸漬処理し、抗イモグサレセンチュウ血清を２００〜１０００倍に希釈した溶液に３０分間浸漬した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加用した洗浄用緩衝液で洗浄後、市販の抗ウサギ抗体−アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗体液を推奨の濃度に希釈し、２０〜３０分間浸漬処理した。その後、上述の洗浄用緩衝液で洗浄し、基質液と交換して発色の有無を観察した。
【００４７】
図４は、イモグサレセンチュウ破砕液に対する抗血清の反応性評価結果を示す説明図である（ニトロセルロース膜上のスポット）。図中、陽性は発色（青紫色）あり、陰性は発色なしである。図示するとおり、抗イモグサレセンチュウ血清は、イモグサレセンチュウ破砕物のうち線虫体内容物と反応し、表皮組織とは反応しないことが明らかとなった。すなわち、線虫を破砕し、その体内容物を用いることに基づいて、有効な線虫診断方法を構成できることが明らかとなった。
【００４８】
＜１．−２  特異的抗血清の作製＞
１．−１で調製した抗イモグサレセンチュウ血清は、大豆トリプシンインヒビターの他、サツマイモネコブセンチュウ等の別の線虫破砕液に対しても非特異的反応を示すことから、吸収処理を行った。これは、非特異的反応を起こす物質をイモグサレセンチュウ破砕液に混合して反応させ、その反応物を除去する処理である。
【００４９】
約１０ｇのサツマイモネコブセンチュウ感染トマト根、および約５００ｇの園芸培土から抽出した自活性線虫をビーズ破砕したものを、直接抗イモグサレセンチュウ血清に添加し、室温で２時振とう、４℃に一晩静置して吸収処理し、これを遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分間）して上清を回収した。このようにして得た吸収処理後の抗イモグサレセンチュウ血清と被検体とを接触させて、反応特異性を評価した。被検体は、イモグサレセンチュウ破砕液、イモグサレセンチュウ感染ニンニク破砕液、非感染ニンニク破砕液、およびサツマイモネコブセンチュウ破砕液とした。
【００５０】
図５は、吸収処理後の抗イモグサレセンチュウ血清の反応特異性評価結果を示す説明図である（ニトロセルロース膜上のスポット）。縦に３スポットずつ、左列から、イモグサレセンチュウ破砕液（１）、イモグサレセンチュウ感染ニンニク破砕液（２）、非感染ニンニク破砕液（３）、サツマイモネコブセンチュウ破砕液（４）の各試験結果を示す。陽性は発色あり（青紫色）、陰性は発色なしである。図示するとおり吸収処理抗血清は、イモグサレセンチュウ破砕液およびイモグサレセンチュウ感染ニンニク破砕液とのみ反応が認められ、非感染ニンニク破砕液およびサツマイモネコブセンチュウ破砕液とは反応が認められなかった。これにより、吸収処理抗血清の反応特異性が確認され、イモグサレセンチュウに特異的に反応する診断用抗血清を得ることができた。
【００５１】
＜実施例２．ニンニク組織からの検出＞
＜２．−１  診断方法＞
上記の吸収処理済みの抗イモグサレセンチュウ血清を用いて、イモグサレセンチュウ発生圃場産のニンニクを診断した。
ニンニク組織中のイモグサレセンチュウを検出するために、長さ約３ｃｍの根を数本、または０．５×１．５ｃｍ程度の葉鞘数枚等の組織片を用いた。組織片を１．５ｍｌ遠心チューブに入れ、ジルコニアビーズやガラスビーズ（６ｍｍｘ１個、１ｍｍ×５０個程度、０．３ｍｍ×１５０個程度）を用いて、または金属クラッシャー（タイテック製）やメタルコーン（安井器械製）等によって破砕した。破砕組織にトリス・ＮａＣｌ・ツイーン２０緩衝液等を加えて粗汁液を調製した。
【００５２】
粗汁液をニトロセルロース膜上に滴下して乾固させたもの、または、根や葉鞘組織片を適宜の膜上においてハンマーで叩いたもの等を用意し、ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）溶液等でブロッキングし、ドライヤー等を用いて風乾した後、直ちに１００μＬの診断用抗血清液を滴下した。診断用抗血清液は、適当な抗体用緩衝液により２００〜８００倍に希釈して用いた。
【００５３】
１分間程度放置後、２００μＬの洗浄緩衝液を２回滴下浸透させて膜を洗浄し、直ちにアルカリホスファターゼ等で標識した抗ウサギ抗体液を滴下した。その後、再度２００μＬの洗浄緩衝液を２回滴下して膜を洗浄し、さらにアルカリ溶液で洗浄後、発色基質液と反応させた。基質液としては、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸（ＢＣＩＰ）とＮｉｔｒｏｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の混合溶液を用いた。通常は、ブロッキング２０分間以上、特異的抗体液３０分間以上、酵素標識抗体液３０分間以上、各洗浄１５分間以上、基質反応３０分間前後、合せて２時間以上が必要であるが、本方法によれば、十数分間程度で迅速に検出することが可能である。
【００５４】
＜２．−２  診断結果＞
図６は、イモグサレセンチュウ発生圃場産ニンニクの葉鞘基部からのイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である（ティッシュプリント法）。陽性は発色部（濃青紫色）、陰性は発色なしの部位である。
図７は、ニンニク根からのイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である（ニトロセルロース膜上のスポット）。左の写真は、左から無消毒ニンニク、クロルピクリン消毒ニンニク、ダゾメット消毒ニンニクであり、右に示す評価結果中、上３列は腐敗根、下３列は外観健全根の各診断結果を示す。
【００５５】
各図に示すとおり、ニンニク葉鞘基部や腐敗根において強い発色（濃青紫色）が認められ、ニンニク組織からの検出、すなわち線虫有無の診断が可能であることが示された。なお、図８は、根を用いたティッシュプリント法によるイモグサレセンチュウの検出結果を示す説明図である。ここでも、ニンニク組織からの検出、すなわち線虫有無の診断が可能であることが示された。
【００５６】
＜実施例３．収穫期の判定＞
＜３．−１  判定方法＞
イモグサレセンチュウはニンニク組織内で唯一大量に増殖する線虫である。腐敗した組織にはまれに自活性線虫が観察されるが、上述した吸収処理を行うことで検出結果の信頼性は高まる。ニンニクのイモグサレセンチュウは、土壌消毒して土壌中生息密度を低減しても収穫期になると鱗球に侵入してくるため、収穫が遅くなることで被害が発生する。したがって、線虫の鱗球侵入状況、特に鱗片内への侵入を確認することによって、線虫発生圃場における適期収穫期を判定することができる。たとえば、鱗片発根部周辺を１個ずつ掻き取り、細切して蒸留水中に１時間以上浸漬することで線虫の湧出を促し、それらを検鏡することで侵入状況を知ることができる。しかし、この手法では大量の診断は不可能である。
【００５７】
そこで、鱗球の葉鞘基部付近から組織片を採取し、これを破砕して適当な緩衝液で搾汁し、本発明診断方法を用いて判定することとした。そして、発色程度によって感染程度を診断し、それに基づいて収穫すべき時期を判定することとした。すなわち、濃い発色を示した場合は収穫期を過ぎて被害球が増加する危険性が高く、直ちに収穫するとともに、連続温風乾燥または高温乾熱処理併用を実施する。一方、薄い発色または発色なしの場合は収穫期と判断する。両者の相違は、収穫の緊急性の相違である。
【００５８】
具体的な方法は次のとおりである。イモグサレセンチュウ発生圃場産ニンニクを収穫、強制乾燥後、遮光したビニル温室内に約３か月保管したニンニクで、著しい腐敗が見られない外観健全なニンニクについて、血清診断を行った。発根基部に隣接する鱗球の葉鞘基部組織を、コルクボーラーＮｏ．３等を用いて鱗片までくり抜いて組織片を切り取り、採取した。組織片は２か所から採取した。各組織片を乳鉢や上述のガラスビーズ、フィンガーマッシャー（アシスト製）等を用いて磨砕もしくは破砕し、これを適切な緩衝液で搾汁して破砕液を作製した。そして、各破砕液をニトロセルロース膜にスポットし、上述の本発明診断方法を用いて線虫感染診断、および収穫期判定を行った。全２５被検体について、各２スポットを行った。
【００５９】
＜３．−２  判定結果＞
図９は、ニンニク葉鞘基部組織片採取方法を示す説明図である。また、
図１０は、ニンニクの血清診断結果を示す説明図である。図９に示すように、組織片採取は１被検体あたり２か所から行った。また図１０には、縦５（表中Ａ〜Ｅ）×横５（同１〜５）、合計２５被検体を各２スポットした結果を示した。図中、点線楕円枠で囲んだものは２組織片とも陽性、実線四角枠で囲んだものは１組織片のみ陽性、その他は２組織片とも陰性である。また、各ニンニクを顕微鏡観察したところ、陽性を示したニンニクからは実際にイモグサレセンチュウの寄生侵入が確認され、本発明の実用性が確かめられた。
【００６０】
このように、外観健全なニンニクであっても、調べた２か所ともでイモグサレセンチュウ感染が確認されるもの、一部で感染が確認されるもの、感染が確認されないもののあることが示された。本発明の抗線虫血清を用いた診断方法による感染診断によれば、外観の健全さに惑わされずに適確に、ニンニクの線虫感染有無・程度を把握することができる。しかも本発明によれば、短時間にかつ大量に診断が可能である。収穫が数日遅れることで被害は甚大となることから、適切な収穫期を知ることは線虫発生圃場におけるニンニクの高品質安定生産に大きく貢献できると考えられる。なお収穫期判定の診断は、特定の期間を限定して行えば効果が高いと考えられる。
【００６１】
＜実施例４．血清診断法とリアルタイムＰＣＲによる遺伝子診断法の比較検討＞
＜４．−１  検討方法＞
実施例３と同様の方法で得たニンニクの葉鞘破砕液を用いて本発明血清診断を行い、また同破砕液からＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法や組織染色直接検鏡との比較により、本発明の血清診断法の実用性を検証した。リアルタイムＰＣＲにはＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩＩ  Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アジレント社製）やｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオラッド社製）などの試薬を使用し、装置はＣＦＸ９６（バイオラッド社製）やＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ（ロッシュ社製）を使用した。全３０株を試験に供し、実施例３と同様に２連（材料１、材料２）にて行った。材料１、２は、発根部周辺の葉鞘２か所から、幅０．５ｃｍ×長さ１．５ｃｍのサイズで切り取った。
【００６２】
＜４．−２  検討結果＞
表１に、イモグサレセンチュウ発生圃場産の外観健全なニンニクに対する、各手法による診断結果を示す。表では、左に材料１、右に材料２、計６０被検体の評価結果を示した。各材料について、左から、本発明血清診断法、ＤＮＡによるリアルタイムＰＣＲ法、粗汁液によるリアルタイムＰＣＲ法、組織染色直接検鏡法（酸性グリセリン法）、および観察による鱗片腐敗調査、の各評価結果を示した。評価の表示は次のとおりである。
◎：強陽性で濃い発色または線虫数多、〇：陽性または線虫数少、△：弱陽性、×：陰性、ＮＴ：非試験
【００６３】
試験の結果、試薬や装置による違いは認められなかった。全般的に、本発明血清診断法に比べるとリアルタイムＰＣＲの検出感度は同等かやや高めであった。一方、組織染色直接検鏡よりは高い検出感度であった。
【００６４】
【表１】
2017219423.tif 000003
【００６５】
以上の結果から、本発明の抗イモグサレセンチュウ血清を利用した血清診断法は、ニンニクに寄生するイモグサレセンチュウ検出において十分な実用性が確認された。また、葉鞘基部組織の破砕液を血清診断に用いることで、ニンニク内部（鱗片）におけるイモグサレセンチュウの寄生状況を判断できることが確認された。また、特に発色程度が濃いものは、鱗片内部でのイモグサレセンチュウの増殖が実際に多く、血清診断結果の発色程度によって内部の腐敗程度を予測可能であることも示された。
【００６６】
＜実施例のまとめ、補足＞
イモグサレセンチュウを迅速かつ簡易に診断するため、線虫破砕液を抗原として家兎に免疫して診断用抗血清を作製した。
大豆トリプシンインヒビターやサツマイモネコブセンチュウ等の他線虫破砕液に対して非特異的反応を示すことから、大豆トリプシンインヒビターや他線虫破砕液を抗血清に懸濁して遠心分離により除去することで、イモグサレセンチュウに特異的に反応する診断用抗血清を得ることができた。
線虫診断法としては、ニトロセルロース膜にスポットした抗原を検出する手法やイムノクロマト法等があるが、特にニトロセルロース膜にスポットした抗原を迅速（１０数分程度）に検出可能であることを、確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の抗線虫血清、抗線虫血清製造方法、線虫診断方法、作物収穫時期判定方法、および作物種子生産方法によれば、ニンニク等の栽培作物および栽培圃場における線虫感染被害程度を的確に診断し、適確な収穫、防除を行うことができる。特にニンニクの最重要害虫であるイモグサレセンチュウの被害に関して言えば、イモグサレセンチュウが寄生すると思われる根や葉鞘基部などの組織を用いることで正確なイモグサレセンチュウの寄生の有無を診断することができる。このことは、イモグサレセンチュウの発生拡大がイモグサレセンチュウ汚染種子によることを考えれば、判断が困難な優良種子の確保が可能となるということであり、ニンニク生産の安全で持続的な経営になり、生産者の所得の安定につながるものである。
【００６８】
また、作物組織の血清診断により、作物表皮や内部へのイモグサレセンチュウの寄生・侵入状況が正確に把握され、被害を出さない収穫と適切な乾燥対策が実施できるため、作物の腐敗障害や商品価値低下を招くことがなくなり、特にニンニク栽培ではイモグサレセンチュウ発生圃場における高品質ニンニクの安定生産につながり、さらには適切な圃場対策の実施による生産コスト削減も見込まれる。本発明は上述したように、他の作物・線虫被害に対しても適用可能である。したがって、農業分野およびその関連分野において利用性が高い発明である。
【符号の説明】
【００６９】
１…線虫破砕物
２…抗体
３…血清
４…非特異的反応を示す反応物
５…抗線虫血清
６…被検体
７…反応複合体検出結果
８…作物
９…線虫診断結果
１０…収穫時期判定結果
２０…収穫作物
３０…種子
Ｍ１…抗線虫血清製造方法
Ｍ２…線虫診断方法
Ｍ３…作物収穫時期判定方法
Ｍ４…作物種子生産方法
Ｐ１…抗体生成過程
Ｐ２…吸収処理過程
Ｐ３…抗原−抗体反応過程
Ｐ４…標識過程
Ｐ５…線虫診断過程
Ｐ６…収穫時期判定過程
Ｐ７…収穫過程
Ｐ８…採種過程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2017219423.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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