(57)【要約】      （修正有）【課題】必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法、特にｐ５３欠損癌のためのより有効かつ安全な癌治療の提供。【解決手段】対象中の癌細胞を抑制する方法であって、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を前記癌細胞に接触させるステップを有する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の癌細胞を抑制する方法であって、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を前記癌細胞に接触させるステップを有する、方法。
【請求項２】
前記癌細胞は、Ｐ−５３欠損である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｐ−５３欠損である癌細胞は、大腸癌、肺癌、乳癌および膠芽腫からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞がＰｕｆ−Ａを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｐｕｆ−Ａを発現する癌細胞は、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌および肝癌からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、Ｒａｆ（ｉ）、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、またはレスベラトロールから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｐｕｆ−Ａ抑制剤がレスベラトロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、抗癌剤の前、同時、または後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号：２または配列番号：３と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ａ）プロモーター；および
ｂ）配列番号：２または配列番号：３と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を含む、ベクター。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡをエンコードする、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
（ａ）プロモーター；および配列番号：２または配列番号：３と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター；ならびに
（ｂ）医薬上許容される担体
を含有する、医薬組成物。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡをエンコードする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／１７４，５７２号、及び２０１５年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／１９８，２９０号の優先権を主張し、これらの出願の内容全体を本明細書に組み込んで参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｐｕｆファミリーは、進化的に保存されたタンパク質ファミリーであり、Ｐｕｍｉｌｉｏ（ショウジョウバエ）及びＦＢＦ（Ｆｅｍ−３  ｍＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ，カエノラブディティスエレガンス）にちなんで名付けられている。Ｐｕｆファミリーのメンバーは、通常、〜３５−３９アミノ酸の８回タンデムＰｕｆリピートの存在、及び前記リピートを標的ｍＲＮＡの３９非翻訳領域（ＵＴＲ）における特定の配列に結合することで識別される。Ｐｕｆ−Ａ遺伝子は、最初にＪ．Ｙｕ氏等により報告されており、かつ眼の発達のみならず、始原生殖細胞の遊走にも、生殖細胞系譜の仕様にも重要な役割を果たしていることを見出した（非特許文献１）。
【０００３】
癌は、依然として全世界的に主要な公衆健康問題である。腫瘍タンパク質Ｐ５３、いわゆる腫瘍抑制遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に突然変異するものであり、全てのヒト癌の半分以上は、この特定の遺伝子に突然変異を担持している。とりわけ、突然変異又は欠失したＰ５３を持っている患者は、不良な予後診断及び/又はより高い薬剤耐性を有することになる。この数十年、癌治療法の進歩にもかかわらず、医学界はなお、多くの種類の癌、特にＰ５３の突然変異又は欠失した癌を治療する課題に直面している。従って、特にｐ５３欠損癌のためのより有効かつ安全な癌治療に対するニーズは依然として存在している。本発明は、このニーズ及びその他のニーズに対処するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７４１６８４９号明細書
【特許文献２】米国特許第４９３８９４９号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／１８８６３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９６／１７８２３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５４５９１２７号明細書
【特許文献６】国際公開第９５／２１９３１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９６／２５５０８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｐｕｆ−Ａ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  Ｇｅｒｍ−Ｃｅｌｌｓ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（３）：ｅ４９８０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００４９８０
【非特許文献２】Ｆｅｉｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７
【非特許文献３】Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８０２７−３１
【非特許文献４】Ｕｌｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−８
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：１０６-１０９，２０１１年
【非特許文献６】ＨＣ  Ｃｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＫｒａｓＧ１２Ｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１，７１：  ７２５０−７２５８
【発明の概要】
【０００６】
従って、本発明は、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を癌細胞に接触させることにより、必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、また、必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法を提供し、有効量の治療剤を投与することにより、Ｐｕｆ−Ａの発現が減少又はノックダウンされ、及び／又はＰｕｆＡの活性を低下させる。
【０００８】
本発明は、さらに、癌細胞中のＰｕｆ−Ａの発現を抑制することにより、癌細胞を抑制する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｐｕｆ−Ａの発現を減少するための短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子をエンコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、本明細書で記述される前記Ｐｕｆ−Ａの遺伝子の配列を含む。
【００１０】
その他の実施形態では、プロモーターと、ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドとを含むベクターも提供され、その中、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号：２又は配列番号：３と少なくとも９０％相同である。
【００１１】
本発明は、また、本明細書で記述される前記ベクターと、医薬上許容される賦形剤又は担体とを含有する医薬組成物が開示される。
【００１２】
この特許において用いられている「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「前記発明（ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「この発明（ｔｈｉｓ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、広義には、この特許及び添付の特許請求の範囲の全ての主題事項を指すことを意図している。これらの用語を含んでいる記述は、本明細書に記載される主題事項又は添付の特許請求の範囲の意味もしくは範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。この特許によってカバーされる前記発明の実施形態は、この概要ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。この概要は、前記発明の種々の態様の高レベルの概要であり、後述の「発明を実施するための形態」のセクションでさらに記述される概念のいくつかを紹介する。この概要は、特許請求される主題事項の重要な特徴又は本質的特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題事項の範囲を定めるために単独で用いられることを意図するものでもない。前記主題事項は、明細書全体、任意の図面又は全ての図面及び各請求項の適切な部分を参照することにより理解されるべきである。
【００１３】
前記発明は、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明を読むと、明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本特許又は特許出願は、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含んでいる。カラー図面を備えたこの特許又は特許出願の複写は、必要な手数料の支払いを伴って要請に基づいて特許庁により提供されるものである。
【００１５】
本発明の実施形態については、下記図面を参照しながら後に詳細説明する。
【図１−１】図１Ａは、様々な癌におけるＰｕｆ−Ａの発現を示す。図１Ｂは、より高いＰｕｆ−Ａの発現が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌におけるより低い生存率に関連付けられることを示すグラフ群である。
【図１−２】図１Ａは、様々な癌におけるＰｕｆ−Ａの発現を示す。図１Ｂは、より高いＰｕｆ−Ａの発現が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌におけるより低い生存率に関連付けられることを示すグラフ群である。
【図２−１】図２Ａは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図２Ｂは、カルチノイド腫瘍（ＣＯＩＤ）、肺の腺癌（ＡＤＣ）、肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び正常肺サンプルにおけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（左図）、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（右図）を示す一連のグラフである。図２Ｃは、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
【図２−２】図２Ａは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図２Ｂは、カルチノイド腫瘍（ＣＯＩＤ）、肺の腺癌（ＡＤＣ）、肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び正常肺サンプルにおけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（左図）、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（右図）を示す一連のグラフである。図２Ｃは、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
【図２−３】図２Ａは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図２Ｂは、カルチノイド腫瘍（ＣＯＩＤ）、肺の腺癌（ＡＤＣ）、肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び正常肺サンプルにおけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（左図）、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡレベル（右図）を示す一連のグラフである。図２Ｃは、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
【図３−１】Ｐｕｆ−Ａの発現に対するＫｒａｓの効果を示す画像群である。図３Ａは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とＫｒａｓＧ１２Ｄ導入群とにおけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ活性化の効果を示す。図３Ｂは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とｃ−Ｍｙｃ導入群とにおけるｃ−Ｍｙｃ活性化の効果を示す。図３Ｃは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたＫｒａｓＧ１２Ｄ又はｃ−Ｍｙｃ導入細胞におけるＰｕｆ−Ａプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図３Ｄは、Ｈ１２９９及びＨＣＴ１１６細胞において、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子座のエクソン１とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を示す。図３Ｅは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析によって測定された２種のＫｒａｓ突然変異細胞株（Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ））におけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ枯渇の効果を示す。図３Ｆは、Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ）癌細胞において、Ｐｕｆ−Ａ、リン酸化ＥＲＫ１／２、総ＥＲＫ１／２及びβアクチンの発現に対するＲａｆ抑制剤（Ｒａｆ（ｉ））、ＭＥＫ１抑制剤（ＰＤ９８０５９）及びＭＥＫ１／２抑制剤（ＵＯ１２６）の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
【図３−２】Ｐｕｆ−Ａの発現に対するＫｒａｓの効果を示す画像群である。図３Ａは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とＫｒａｓＧ１２Ｄ導入群とにおけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ活性化の効果を示す。図３Ｂは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とｃ−Ｍｙｃ導入群とにおけるｃ−Ｍｙｃ活性化の効果を示す。図３Ｃは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたＫｒａｓＧ１２Ｄ又はｃ−Ｍｙｃ導入細胞におけるＰｕｆ−Ａプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図３Ｄは、Ｈ１２９９及びＨＣＴ１１６細胞において、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子座のエクソン１とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を示す。図３Ｅは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析によって測定された２種のＫｒａｓ突然変異細胞株（Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ））におけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ枯渇の効果を示す。図３Ｆは、Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ）癌細胞において、Ｐｕｆ−Ａ、リン酸化ＥＲＫ１／２、総ＥＲＫ１／２及びβアクチンの発現に対するＲａｆ抑制剤（Ｒａｆ（ｉ））、ＭＥＫ１抑制剤（ＰＤ９８０５９）及びＭＥＫ１／２抑制剤（ＵＯ１２６）の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
【図３−３】Ｐｕｆ−Ａの発現に対するＫｒａｓの効果を示す画像群である。図３Ａは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とＫｒａｓＧ１２Ｄ導入群とにおけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ活性化の効果を示す。図３Ｂは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析を用いて、対照群とｃ−Ｍｙｃ導入群とにおけるｃ−Ｍｙｃ活性化の効果を示す。図３Ｃは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたＫｒａｓＧ１２Ｄ又はｃ−Ｍｙｃ導入細胞におけるＰｕｆ−Ａプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図３Ｄは、Ｈ１２９９及びＨＣＴ１１６細胞において、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子座のエクソン１とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を示す。図３Ｅは、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析によって測定された２種のＫｒａｓ突然変異細胞株（Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ））におけるＰｕｆ−Ａレベルに対するＫｒａｓ枯渇の効果を示す。図３Ｆは、Ｈ４６０（ＫｒａｓＱ６１Ｈ）及びＨＣＴ１１６（ＫｒａｓＧ１３Ｄ）癌細胞において、Ｐｕｆ−Ａ、リン酸化ＥＲＫ１／２、総ＥＲＫ１／２及びβアクチンの発現に対するＲａｆ抑制剤（Ｒａｆ（ｉ））、ＭＥＫ１抑制剤（ＰＤ９８０５９）及びＭＥＫ１／２抑制剤（ＵＯ１２６）の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
【図４】図４Ａは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化前（左側）、及びＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化１２週後（右側）のマウスの細気管支及び肺胞細胞において、Ｐｕｆ−Ａの免疫組織化学染色を示す画像群である。図４Ｂは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化とｐ５３欠失２週後（左側）、及び８週後（右側）のマウスの細気管支及び肺胞細胞において、Ｐｕｆ−Ａの免疫組織化学染色を示す画像群である。
【図５−１】図５Ａは、Ｐｕｆ−ＡのノックダウンのためのＰｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡの投与の生体内研究デザインを模式的に示す。図５Ｂは、対照ｓｈＲＮＡ又はＰｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡを投与したマウスの腫瘍病巣の数を示す顕微鏡画像群である。図５Ｃは、対照又はＰｕｆ−Ａ−２  ｓｈＲＮＡの投与後、腺癌（左側の棒グラフ）及び腺腫（右側の棒グラフ）のあるマウスの腫瘍病巣（＞２５０μｍ）の計数を示す一連の棒グラフである。
【図５−２】図５Ａは、Ｐｕｆ−ＡのノックダウンのためのＰｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡの投与の生体内研究デザインを模式的に示す。図５Ｂは、対照ｓｈＲＮＡ又はＰｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡを投与したマウスの腫瘍病巣の数を示す顕微鏡画像群である。図５Ｃは、対照又はＰｕｆ−Ａ−２  ｓｈＲＮＡの投与後、腺癌（左側の棒グラフ）及び腺腫（右側の棒グラフ）のあるマウスの腫瘍病巣（＞２５０μｍ）の計数を示す一連の棒グラフである。
【図６−１】図６Ａは、ヒトＰｕｆ−Ａ遺伝子（配列番号：１）のヌクレオチド配列を示す。図６Ｂは、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１（配列番号：２）及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２（配列番号：３）をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。図６Ｃと図６Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析によって測定された大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）及び肺癌細胞（Ｈ１２９９）における対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２のＰｕｆ−Ａのノックダウン効率を示す。
【図６−２】図６Ａは、ヒトＰｕｆ−Ａ遺伝子（配列番号：１）のヌクレオチド配列を示す。図６Ｂは、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１（配列番号：２）及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２（配列番号：３）をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。図６Ｃと図６Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ分析によって測定された大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）及び肺癌細胞（Ｈ１２９９）における対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２のＰｕｆ−Ａのノックダウン効率を示す。
【図７−１】図７Ａは、対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２を下記のｐ５３−欠損及びｐ５３−熟達細胞株：Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｕ８７、ＨＣＴ１１６、Ｈ１２９９、ＣＬ１−５、ＭＢ２３１、ＬＮ２２９及びＴ９８に導入することにより、Ｐｕｆ−Ａの発現及びＰＡＲＰ１の切断型に対する対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２の効果を示す画像群である。図７Ｂは、Ｐｕｆ−Ａ枯渇（ｓｈＰｕｆ−Ａ導入）したｐ５３熟達（ｐ５３野生型）及びｐ５３欠損（ｐ５３欠陥）癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）画像である。図７Ｃは、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６、ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びｐ５３−／−Ｈ１２９９癌細胞株において、Ｐｕｆ−Ａ、ＬＣ３（オートファゴソーム用マーカー）、ＬＡＭＰ２（リソソーム用マーカー）及びｐ６２（オートファジー基質）の発現に対するｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図７Ｄは、ｐ５３−熟達細胞（Ｈ４６０）におけるｐ５３及びＰｕｆ−Ａ阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図７Ｅは、ｐ５３熟達（ｐ５３＋／＋）ＨＣＴ１１６、ｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９癌細胞において、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入により、ＬＣ３（緑色）、Ｌａｍｐ１（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の発現に対するＰｕｆ−Ａサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図７Ｆは、対照ｓｈＲＮＡ導入に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入後のｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
【図７−２】図７Ａは、対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２を下記のｐ５３−欠損及びｐ５３−熟達細胞株：Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｕ８７、ＨＣＴ１１６、Ｈ１２９９、ＣＬ１−５、ＭＢ２３１、ＬＮ２２９及びＴ９８に導入することにより、Ｐｕｆ−Ａの発現及びＰＡＲＰ１の切断型に対する対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２の効果を示す画像群である。図７Ｂは、Ｐｕｆ−Ａ枯渇（ｓｈＰｕｆ−Ａ導入）したｐ５３熟達（ｐ５３野生型）及びｐ５３欠損（ｐ５３欠陥）癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）画像である。図７Ｃは、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６、ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びｐ５３−／−Ｈ１２９９癌細胞株において、Ｐｕｆ−Ａ、ＬＣ３（オートファゴソーム用マーカー）、ＬＡＭＰ２（リソソーム用マーカー）及びｐ６２（オートファジー基質）の発現に対するｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図７Ｄは、ｐ５３−熟達細胞（Ｈ４６０）におけるｐ５３及びＰｕｆ−Ａ阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図７Ｅは、ｐ５３熟達（ｐ５３＋／＋）ＨＣＴ１１６、ｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９癌細胞において、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入により、ＬＣ３（緑色）、Ｌａｍｐ１（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の発現に対するＰｕｆ−Ａサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図７Ｆは、対照ｓｈＲＮＡ導入に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入後のｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
【図７−３】図７Ａは、対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２を下記のｐ５３−欠損及びｐ５３−熟達細胞株：Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｕ８７、ＨＣＴ１１６、Ｈ１２９９、ＣＬ１−５、ＭＢ２３１、ＬＮ２２９及びＴ９８に導入することにより、Ｐｕｆ−Ａの発現及びＰＡＲＰ１の切断型に対する対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２の効果を示す画像群である。図７Ｂは、Ｐｕｆ−Ａ枯渇（ｓｈＰｕｆ−Ａ導入）したｐ５３熟達（ｐ５３野生型）及びｐ５３欠損（ｐ５３欠陥）癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）画像である。図７Ｃは、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６、ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びｐ５３−／−Ｈ１２９９癌細胞株において、Ｐｕｆ−Ａ、ＬＣ３（オートファゴソーム用マーカー）、ＬＡＭＰ２（リソソーム用マーカー）及びｐ６２（オートファジー基質）の発現に対するｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図７Ｄは、ｐ５３−熟達細胞（Ｈ４６０）におけるｐ５３及びＰｕｆ−Ａ阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図７Ｅは、ｐ５３熟達（ｐ５３＋／＋）ＨＣＴ１１６、ｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９癌細胞において、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入により、ＬＣ３（緑色）、Ｌａｍｐ１（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の発現に対するＰｕｆ−Ａサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図７Ｆは、対照ｓｈＲＮＡ導入に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入後のｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
【図８−１】図８Ａは、下記のｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）癌細胞株：Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６において、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入によるｐ５３及びｐ２１の発現の増加及びＰＵＦ−Ａの転写物の減少を示す一連のウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ画像である。図８Ｂは、対照ｓｈＲＮＡ及びｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入後のｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）癌細胞株であるＡ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６細胞、及びｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６癌細胞において、ｐ５３（赤色）及びＤＡＰＩ（青色、内部制御）の発現を示す一連の免疫染色画像である。図８Ｃは、ＦＡＣＳで分析した異なるｐ５３遺伝子型のあるＰｕｆ−Ａ枯渇癌細胞、Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６の細胞周期を示す一連の棒グラフである。図８Ｄは、Ｐｕｆ−Ａの枯渇によるｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）Ａ５４９及びＨ４６０細胞の増殖率の大幅な減少を示す２つのグラフである。
【図８−２】図８Ａは、下記のｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）癌細胞株：Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６において、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入によるｐ５３及びｐ２１の発現の増加及びＰＵＦ−Ａの転写物の減少を示す一連のウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ画像である。図８Ｂは、対照ｓｈＲＮＡ及びｓｈＰｕｆ−Ａ−１導入後のｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）癌細胞株であるＡ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６細胞、及びｐ５３欠損（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６癌細胞において、ｐ５３（赤色）及びＤＡＰＩ（青色、内部制御）の発現を示す一連の免疫染色画像である。図８Ｃは、ＦＡＣＳで分析した異なるｐ５３遺伝子型のあるＰｕｆ−Ａ枯渇癌細胞、Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６の細胞周期を示す一連の棒グラフである。図８Ｄは、Ｐｕｆ−Ａの枯渇によるｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋）Ａ５４９及びＨ４６０細胞の増殖率の大幅な減少を示す２つのグラフである。
【図９】図９Ａは、Ａ５４９肺癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＢ２３１乳癌細胞及びＴ９８膠芽腫細胞において、２５及び５０μＭのレスベラトロールによるＰｕｆ−ａの発現の減少を示すウェスタンブロット画像群である。図９Ｂは、２５及び５０μＭのレスベラトロールによるＡ５４９肺癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＢ２３１乳癌細胞及びＴ９８膠芽腫細胞の増殖の効果的な減少を示すグラフ群である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（定義）
上文と公開全文中で使用される場合、下記の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有するものであると理解されるべきである。
【００１７】
この特許において用いられている「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「前記発明（ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「この発明（ｔｈｉｓ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、広義には、この特許及び添付の特許請求の範囲の全ての主題事項を指すことを意図している。これらの用語を含んでいる記述は、本明細書に記載される主題事項又は添付の特許請求の範囲の意味もしくは範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。この特許によってカバーされる前記発明の実施形態は、この明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。この明細書は、特許請求される主題事項の本質的特徴を特定することを意図するものではなく、この明細書の任意の部分は、特許請求される主題事項の範囲を定めるために単独で用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題事項は、全文と、図面と、各請求項とを含む明細書全体の適切な部分を参照することにより理解されるべきである。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、単数形である「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」とは、文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、複数の言及を含む。
【００１９】
本明細書で用いられる「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、癌の症状及び／又は徴候の減少に十分であるＰｕｆ−Ａ抑制剤の投与量を含み、ここの症状や徴候とは、体重の減少、痛み、及び臨床的に触診可能な腫瘍量又は放射線学的に各種の撮像手段によって得られる腫瘍量を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で用いられる「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防的（例えば、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、緩和的及び治癒的な使用又は結果を含む。
【００２１】
用語「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」及び「減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」は、成長の緩徐、防止又は停止を含む。
【００２２】
用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、癌を有する脊椎動物又は癌治療の必要があると見なされる脊椎動物をいい得る。対象としては、温血動物（例えば、霊長類の動物より好ましくはヒトなどのような哺乳動物）を含む。非ヒト霊長類の動物は、同様に対象である。用語「対象」は、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジやヤギなど）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミやモルモットなど）を含む。このように、獣医学的使用と医療用製剤は、本明細書で企図される。
【００２３】
この発明の特定の核酸配列に対する同一性又は相同性は、最大割合の相同性を達成するために、必要に応じて配列の整列及び空隙の導入後、候補配列において、特定の残基と同一又は相同である核酸残基の割合として本明細書で定義される。ヌクレオチド配列のアラインメントの比較のための方法は、当該技術分野で周知である。ＮＣＢＩ基本的局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ，メリーランド州ベセスダ））と、インターネット上とを含む複数のソースから入手でき、ｂｌａｓｔｎのような配列分析プログラムとの接続に用いられる。ＮＣＢＩのウェブサイトで、このプログラムを用いて配列同一性をどのように決定するかの説明が公開されている。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、単一の核酸、並びに複数の核酸を含むことを意図するもので、かつ単離核酸分子又は構築物を指し、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、従来型ホスホジエステル結合又は非従来型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含んでもよい。用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれた治療用ポリペプチドをエンコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物の他、プラス鎖型及びマイナス鎖型、並びに二本鎖型を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位や転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、又はそれらを含んでもよい。
【００２５】
別段の定めがない限り、ここでの数値範囲の列挙は、単にその範囲内に収まるそれぞれ別個の数値を個別に言及する簡便な方法としての役割を果たすことを意図するものであり、それぞれ別個の数値は、あたかも個別にここに引用されているかのごとく、本明細書に組み込まれる。ここでの全ての数字は、「約（ａｂｏｕｔ）」で修飾されているものと理解されるべきである。一実施形態では、用語「約」は、分量や時の持続時間などの測定可能な数値を指すときは、指定された数値の±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％のばらつきを含むものとし、別段の定めがない限り、これらのばらつきは、相同性の％に相応する。
【００２６】
（癌細胞成長の抑制又は阻害方法）
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞成長を抑制する方法、又は対象中の癌細胞を死滅させる方法に関し、それらは、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を必要のある対象に投与することにより、前記対象中の癌の症状と徴候が減少される。
【００２７】
Ｐｕｆ−Ａは、高度保存されたＰｕｆファミリーの一員である。配列番号：１は、ヒトＰｕｆ−Ａ遺伝子のＤＮＡ配列であり、配列番号：４は、ヒトＰｕｆ−Ａ遺伝子のアミノ酸配列である。より高いＰｕｆ−Ａの発現が、より進行度の高い癌、及びより低い生存率に関連付けられることは、実施例１及び実施例２を参照されたい。
【００２８】
任意の特定の理論に拘束されず、Ｋｒａｓ及び／又はｃ−Ｍｙｃ活性化が、Ｐｕｆ−Ａの発現を増強させると考えられ、ＫｒａｓによりＲａｓ／Ｒａｆ／ＥＲＫ経路を活性化してこの経路を介してｃ−ＭｙｃとＰｕｆ−Ａプロモーターとの結合を促進することにより、癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの発現が誘発されることは、実施例３及び図３Ｄを参照されたい。
【００２９】
本発明の組成物と方法は、癌細胞成長を予防、治療又は抑制するために用いられる。いくつかの実施形態では、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を投与することにより、癌細胞成長を予防又は抑制する方法が提供される。例示的な実施形態では、治療しようとする癌又は抑制しようとする癌成長は、Ｐｕｆ−Ａを発現する癌であり、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌及び肝癌から選択される。別の例示的な実施形態では、治療しようとする癌又は抑制しようとする癌成長は、ｐ−５３欠損癌であり、大腸癌、肺癌、乳癌及び膠芽腫から選択される。
【００３０】
別の実施形態では、治療有効量のＰｕｆ−Ａ抑制剤を投与することにより、腺腫のある対象中の肺癌を防止する方法が提供され、そこで対象中で腺腫から腺癌への進行が減少または停止される。
【００３１】
一実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、単独で投与してもよく、又は例えば、手術前に腫瘍サイズを減少させ、及び／又は手術後に転移の可能性（例えば、血流中の循環腫瘍細胞の成長及び転移の抑制により）を減少させために、手術の補助剤として投与してもよい。さらに別の実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、抗癌剤の前、抗癌剤の前、後、又は同時に投与される。場合によっては、治療法としては、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤と共に投与される抗癌剤の併用を含む。抗癌剤は、従来型化学療法剤、標的癌治療、又は放射線治療を含む。
【００３２】
（Ｐｕｆ−Ａ抑制剤）
Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、Ｐｕｆ−Ａの発現が減少又はノックダウンされ、及び／又はＰｕｆＡの活性を低下させる任意の薬剤である。
【００３３】
Ｐｕｆ−Ａ抑制剤を投与することにより、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子の発現は０．１−１００％を減少することが可能になる。例えば、前記発現は、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、或いは９９％さえ減少することができる。前記発現は、例えば、２−４、１１−１４、１６−１９、２１−２４、２６−２９、３１−３４、３６−３９、４１−４４、４６−４９、５１−５４、５６−５９、６１−６４、６６−６９、７１−７４、７６−７９、８１−８４、８６−８９、９１−９４、９６、９７、９８又は９９のような間隔内の任意の量（％）を減少することができる。遺伝子の発現は、当該技術分野で周知である方法で測定され、例えば、遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、用語「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）」は、ｓｈＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入前の遺伝子の発現に比べて、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子の発現がその中で減少される、遺伝子サイレンシングの技術を指す。例えば、ｓｉＲＮＡの使用に関連するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、植物、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティスエレガンス、トリパノソーマ、プラナリア、ヒドラ、及びマウス及びゼブラフィッシュを含む数種の脊椎動物種において特定の遺伝子の発現をノックダウンさせることに成功した。例えば、米国特許第７４１６８４９号を参照されたい。
【００３５】
一実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、小分子である。Ｐｕｆ−Ａ抑制小分子の非限定的な例としては、Ｒａｆキナーゼ抑制剤（例えば、Ｒａｆ（ｉ）（米国サンタクルーズから商業的に入手可能））、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ酵素を抑制するＭＥＫ抑制剤（例えば、米国Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から商業的に入手可能なＰＤ９８０５９、及び米国Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から商業的に入手可能なＵＯ１２６）、レスベラトロールなどのスチルベンを含む。一実施形態では、レスベラトロールは、Ｐ５３欠損癌細胞を効果的に抑制することができる。さらに別の実施形態では、レスベラトロールは、Ｐ５３熟達癌細胞を効果的に抑制することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、Ｐｕｆ−Ａの発現を減らすために、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡ転写を標的とするｓｈＲＮＡである。別の実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、Ｐｕｆ−Ａ標的化小干渉ＲＮＡの生合成前駆体である。他の実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、天然アンチセンス短干渉ＲＮＡ（ｎａｔｓｉＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など任意のＲＮＡ種であってもよいが、それらに限定されないものであり、その中、前記ＲＮＡ種は、ＮＰＭの発現を減らすために、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡ転写を標的とする。
【００３７】
例示的な一実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、配列番号：２又は配列番号：３と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同であるヌクレオチド配列を有する、ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドである。別の例示的な実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、ここに開示される前記ベクターである。
【００３８】
Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、任意の有効量で投与される。いくつかの実施形態では、約０．０１μｇ〜約５ｇ、約０．１μｇ〜約１ｇ、約１μｇ〜約５００ｍｇ、約１０μｇ〜約１００ｍｇ、約５０μｇ〜約５０ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、約０．５μｇ〜約５μｇ、約１５μｇ〜約５００μｇ、約３μｇ〜約１ｍｇ、約７μｇ〜約１ｍｇ、約１０μｇ〜約２０μｇ、約１５μｇ〜約１ｍｇ、約１５μｇ〜約３００μｇ、約１５μｇ〜約２００μｇ、約１５μｇ〜約１００μｇ、約１５μｇ〜約６０μｇ、約１５μｇ〜約４５μｇ、約３０μｇ〜約６０μｇ、又は約５０μｇ〜約１００μｇの範囲の用量で投与される。特定の実施形態では、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ〜体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１μｇ、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．１μｇ、又は体重１ｋｇあたり少なくとも約０．５μｇの範囲の用量で投与される。
癌細胞を抑制するために投与されるＰｕｆ−Ａ抑制剤の投与量は、扱われる疾患状態の重篤度、特殊な製剤、及び受容者の体重、全身健康状態及び投与経路などの他の臨床要素によって決まる。
【００３９】
Ｐｕｆ−Ａ抑制剤の有用な投与量は、それらのインビトロ活性とインビボ活性とを動物モデルにおいて比較することで決定できる。マウス及び他の動物の有効な投与量のヒトへの外挿法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４９３８９４９号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込んである。
【００４０】
本明細書で提供される方法によれば、Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、注射（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内）、皮膚的、経皮的、経真皮的、経口（例えば、錠剤、丸薬、液剤、可食性フィルムストリップ）、植込式浸透圧ポンプ、坐剤、エアゾールスプレー、局所、関節内、眼、鼻腔吸入、肺吸入、皮膚と膣への圧入を含むが、これに限定されず、様々な経路のいずれかによって投与することができる。
【００４１】
Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、扱われる疾患状態に適した期間にわたって、単剤療法又は多剤併用療法を行うように投与される。Ｐｕｆ−Ａ抑制剤は、少なくとも３ヶ月、又は疾患状態の症状と徴候が解消されるまでの期間にわたって、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、２日１回、３日１回又は１週１回などの適切な時間間隔を隔てて便宜的に投与される。
【００４２】
（ベクター）
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞に投与可能なベクターを利用する。この場合、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、任意のウイルス又は非ウイルスベクターを指し、並びに任意のプラスミド、コスミッド、ファージ、或いは二本鎖、一本直鎖又は環状型のバイナリーベクターを指し、それらは自己伝達可能であってもよいし、動員可能であってもよいし、かつ細胞ゲノムに整合することにより、原核又は真核宿主細胞を変換してもよく、染色体外（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）に存在してもよい。当該技術分野で周知である任意のベクターは、想定どおりにこの発明の実施に用いられる。
【００４３】
ウイルスベクターの制限しない例は、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はマウスベースウイルスベクターを含む。非ウイルスベクターの制限しない例は、ＤＮＡベクター（必要な配列をコードしてリポフェクションによりインビボに導入可能）、又は合成カチオン性脂質（マーカーをエンコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソーム（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）を含む。核酸移送に特に有用である脂質化合物及び組成物は、特許文献３、特許文献４及び特許文献５に記述されている。脂質は、標的を目的とするために他の分子に対して化学的に連結される。標的ペプチドは、例えば、ホルモン又は神経伝達物質であり、タンパク質は、例えば、抗体又は非ペプチド分子であり、リポソームに対して化学的に連結される。インビボの核酸のトランスフェクションの円滑化に有用である他の分子としては、例えば、カチオン性オリゴペプチド（特許文献６参照）、タンパク質に結合するＤＮＡ由来ペプチド（特許文献７参照）、又はカチオン重合体（特許文献６参照）が挙げられる。
【００４４】
本発明によるウイルスベクターは、一般的に、約１０４と約１０１４ｐｆｕの間の用量の剤形で処方及び投与される。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約１０６〜約１０１１ｐｆｕの用量の剤形が特に使用される。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）」）は、ウイルスの懸濁液の感染力に対応し、適切な細胞培養物に感染させ、形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は、当該技術分野で明確に文書化されている。
【００４５】
本発明のベクターは、ｓｈＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号：２又は配列番号：３と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同であるヌクレオチド配列を有する。ポリペプチドは、１つ又は複数のプロモーターと操作可能に結合する。
【００４６】
一実施形態では、プロモーターがヌクレオチド配列であり、通常、上流（５’）  からそのコード配列へ向かって、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に要する他の要素を認識することで、コード配列の発現を指揮及び／又は制御する。例示的な一実施形態では、プロモーターは、最小プロモーターを含み、それは、ＴＡＴＡボックスと、転写開始点の部位を明示するための他の配列とを含む短いＤＮＡ配列であり、その中、発現の制御のために調節エレメントを追加した。さらに別の実施形態では、プロモーターは、最小プロモーターに加えて調節エレメントも含むヌクレオチド配列であり、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能である。この種のプロモーター配列は、近位と、より遠位の上流エレメントとを含め、後者のエレメントは、よくエンハンサーと称される。いくつかの実施形態では、エンハンサーＤＮＡ配列であり、プロモーター活性を刺激し、かつプロモーターの先天的エレメントであってよく、又はプロモーターのレベル又は組織特異性を高めるために挿入した異種エレメントであってよい。それを両向き（センス又はアンチセンス）に操作することができ、かつプロモーターから上流又は下流のいずれかに移動する場合でも、機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロモーターエレメントのいずれも、配列特定のＤＮＡ結合タンパク質に結合することで、その効果を調停する。プロモーターとしては、その全体が天然遺伝子由来であってよく、又は自然の中で見つかる異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてもよく、さらに合成ＤＮＡセグメントから構成されてもよい。プロモーターは、また生理的かつ発達上の状態に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を包含してもよい。当該技術分野で周知である任意のプロモーターは、ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡコード配列の発現を調節して想定どおりにこの発明の実施に用いられる。
【００４７】
ＳｈＲＮＡを、ｓｈＲＮＡに由来する直接転写可能なＤＮＡベクターを用いる遺伝子治療法により、特にヒト細胞のような哺乳動物細胞に送達することができる。このようなｓｈＲＮＡの生産は、短い逆方向リピートを持つＤＮＡベクターを細胞又は組織に導入することにより、生体内で容易に達成され、その短い逆方向リピートは、小さい数（例えば、３、４、５，６、７、８、９）のヌクレオチドで区切られており、短ヘアピンＲＮＡの転写を指揮する。その上、もしメカニズムは、ベクター又はベクターセグメントから宿主細胞ゲノムへの整合を指揮すること、又は転写ベクターの安定性を確保することを含むならば、エンコードしたｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉは、安定かつ遺伝可能に作ることができる。このような技術は、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を「ノックダウン」するために用いられるだけでなく、これらの技術は、現在、外因的に発現した導入遺伝子の発現、並びに生きているマウスの脳及び肝臓における内在性遺伝子の発現をノックダウンすることに成功した。
【００４８】
（医薬組成物）
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で記述される前記ベクターと、医薬上許容される担体とを含有する医薬組成物に関する。
【００４９】
用語「医薬上許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」は、製剤の他の成分と互換性があり、その受容者に対して有害ではないという意味で許容されなければならない。投与用有効成分は、粉末、細粒、溶液、懸濁液、乳剤にした状態であってもよく、又は本明細書の他のところにも記述されている状態であってもよい。
【００５０】
一実施形態では、医薬組成物は、医薬組成物（例えば、ベクター）の活性成分を液体担体、化学担体又はこの両者と均一かつ緊密に混合するころにより調製される。液体担体は、水性製剤、非水性製剤又はこの両者を含むが、これらに限定されない。固体担体は、生物担体、化学担体又はこの両者を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
医薬組成物は、水相懸濁液、乳化油、油中水型乳剤と水中油中水型乳剤にして投与され、かつクリーム剤、ゲル、リポソーム（中性、アニオン性又はカチオン性）、脂質ナノ球体又は微小球、中性の、アニオン性又はカチオン性重合体ナノ粒子又は微粒子、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョン、ナノエマルジョン、微小球、ナノ球体、ナノ粒子とミニポンプを含むが、この限りではない担体にして投与され、及びアニオン性、中性の又はカチオン性多糖と、アニオン性、中性の又はカチオン性重合体又は共重合体とを含む医薬組成物の持続性放出を許容し得る様々な天然又は合成重合体と一緒に投与され、組成物送達の必要な部位付近に植え込まれるミニポンプ又は重合体を介して投与される。さらに、本明細書で提供される医薬組成物の活性成分は、任意の担体、又は担体の任意の組み合わせに有効である。これらは、抗酸化物質、緩衝剤、及び制菌剤を含むが、この限りではなく、かつ懸濁化剤、増ちょう剤又は防腐剤を選択的に含むことが可能である。
【００５２】
以下、さらに実施例を挙げて本発明について説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものに過ぎず、これらの実施例に限定されるものと解釈してはならない。
【００５３】
実施例１
（様々な癌におけるＰｕｆ−Ａの発現）
２０種類の癌において、Ｐｕｆ−Ａの発現は免疫組織化学染色を用いて評価した。大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌及び肝癌において、Ｐｕｆ−Ａの発現は中等度乃至高度である。図１Ａを参照されたい。
【００５４】
図１Ｂは、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌において、患者の全生存率及びＰｕｆ−Ａの発現のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析アセンブリを示す。より高いＰｕｆ−Ａの発現（赤線）が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌患者のより低い全生存率に関連付けられる。
【００５５】
実施例２
（進行ヒト肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａの発現）
Ｐｕｆ−Ａの発現は、正常肺組織、高分化及び低分化肺腺癌において、Ｐｕｆ−Ａに対する抗体を用いて観察した。図２Ａに示すように、この結果は、正常肺組織に比べて、肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａの発現がより高く、かつ差別化の度合いに関連する（即ち、低分化肺腺癌におけるＰｕｆ−Ａが最高）ということを示している。
【００５６】
Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡ発現の発現は、肺癌のある１２６名患者に対し、独立のソース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＭＰＲ／ｌｕｎｇ（ＰＮＡＳ，９８：  １３７９０−１３７９５  ２００１））から得たデータに基づいて評価した。１２６名患者のうち、１０名がカルチノイド（ＣＯＩＤ）腫瘍に罹患、１０９名が腺癌（ＡＤＣ）に罹患、１１名が扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）に罹患、及び６名が小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に罹患、かつ１３個の非腫瘍性肺サンプルを対照群（正常群）として用いる。図２Ｂ（左側）を参照して、正常群に比べて、全ての肺癌にはより多くＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡを発現し、かつ正常群に比べて、ＡＤＣには最高レベルのＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡ（７．８倍）を発現する。５５名のＩ期ＡＤＣ患者及び２２名のＩＩ期〜ＩＩＩ期ＡＤＣ患者、並びに１５個の非腫瘍性肺サンプル（正常群）について、異なるＡＤＣ段階でのＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現を分析した。図２Ｂ（右側）は、正常群に比べて、Ｉ期及びＩＩ−ＩＩＩ期ＡＤでのＰｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現は、それぞれ５．９倍及び１２．０倍増加することを示す。
【００５７】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析によると、より低いＰｕｆ−Ａの発現（青線）に比べて、ＡＤＣのより高いＰｕｆ−Ａの発現（赤線）は、患者のより低い生存率（全生存率又は無再発生存率）に関連付けられるを示している（図２Ｃ）。
【００５８】
実施例３
（Ｐｕｆ−Ａの発現に対するＫｒａｓ活性化のインビトロ評価）
Ｐｕｆ−Ａの発現に対するＫｒａｓ活性化の効果のインビトロ評価は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ導入及び対照ベクター導入したＨ１２９９肺癌細胞を用いて行った。Ｐｕｆ−Ａタンパク質及びＲＮＡの発現レベルは、ウェスタンブロット及びｑＰＣＲによって分析した。
【００５９】
図３Ａに示すように、対照ベクター導入した肺癌細胞に比べて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ導入した肺癌細胞におけるＰｕｆ−Ａタンパク質及びＲＮＡの発現レベルは、それぞれ２倍及び１．５倍増加した。対照ベクター導入した細胞に比べて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ導入した肺癌細胞におけるｃ−Ｍｙｃタンパク質及びＲＮＡの発現レベルは、それぞれ１．８倍及び１．４倍増加した。
【００６０】
Ｋｒａｓ信号伝達は、ｃ−Ｍｙｃ発現の誘発及び活性化可能なｃ−Ｍｙｃ発現（非特許文献５）に関わるので、Ｐｕｆ−Ａの発現に対するｃ−Ｍｙｃ活性化の効果は、ｃ−Ｍｙｃ又はベクター制御ウイルスで感染されたＨ１２９９肺癌細胞を用いて評価した。ベクター制御導入した細胞に比べて、ｃ−Ｍｙｃ導入した細胞におけるＰｕｆ−Ａタンパク質及びＲＮＡの発現レベルは、それぞれ２．５倍及び１．７倍増加した（図３Ｂ）。
【００６１】
加えて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ又はｃ−Ｍｙｃ発現プラスミドが導入された細胞において、Ｐｕｆ−Ａプロモーター活性を観察した。この結果から、対照ベクターに比べて、ＫｒａｓＧ１２Ｄ及びｃ−Ｍｙｃにより、Ｐｕｆ−Ａプロモーター活性は、それぞれ２．２倍及び３．２倍増加したということが分かり（図３Ｃ）、ｃ−Ｍｙｃは、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子の発現の転写制御に関わるかもしれないことを示している。加えて、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６癌細胞に比べて、ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６癌細胞における内在性ｃ−Ｍｙｃタンパク質がもっと多い（データ未表示）。
【００６２】
ｃ−ＭｙｃがＰｕｆ−Ａ遺伝子の発現の転写制御に関わるかどうかを確認するために、Ｈ１２９９細胞をｃ−Ｍｙｃ又はベクター制御レンチウイルスで感染し、クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）アッセイは、Ｐｕｆ−Ａプロモーターにおけるｃ−Ｍｙｃコンセンサス配列の位置を観察するために用いられる。その結果によると、外因性ｃ−Ｍｙｃタンパク質をｃ−Ｍｙｃコンセンサス配列上でＰｕｆ−Ａ遺伝子座のエクソン１に結合し、かつｐ５３＋／＋細胞に比べて、ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞においてより多くｃ−Ｍｙｃタンパク質をＰｕｆ−Ａ遺伝子座のエクソン１に結合することが分かり、ｃ−Ｍｙｃは、ｃ−ＭｙｃをＰｕｆ−Ａプロモーターに結合することによって媒介されるＰｕｆ−Ａ遺伝子の発現を誘発することを示している（図３Ｄ）。
【００６３】
図３Ａのデータによれば、Ｋｒａｓ信号伝達は、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子の発現の本質であり、Ｈ４６０肺癌及びＨＣＴ１１６大腸癌細胞を含む２種類の発癌性Ｋｒａｓを含有する癌細胞株を用いて、Ｐｕｆ−Ａの発現でのＫｒａｓ枯渇の効果を観察した。Ｋｒａｓ枯渇後にはｓｈＫｒａｓを用いて、対照ｓｈＲＮＡ導入した細胞に比べて、Ｐｕｆ−Ａタンパク質及びＲＮＡが著しく減少（図３Ｅ）。
【００６４】
Ｋｒａｓ経路の下流エフェクター（例えば、Ｒａｆｓ、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２）を阻止する様々な小分子（例えば、Ｒａｆ（ｉ）、ＰＤ９８０５９及びＵＯ１２６）の効果は、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６癌細胞に評価された。図３Ｆは、小分子の投与によってＫｒａｓ経路の下流エフェクターを阻止した後、Ｐｕｆ−Ａの発現レベルが減少することを示す。
【００６５】
実施例４
（Ｐｕｆ−Ａの発現に対する内因性Ｋｒａｓ活性化の効果）
ＫｒａｓＧ１２Ｄ誘発肺腺癌のあるＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／ＴｅｔＯ−Ｃｒｅ／ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄｐ５３＋／＋マウスを用いてＰｕｆ−Ａの発現を評価した。細気管支クララ細胞は、Ｋｒａｓが誘発した肺上皮内腫瘍の細胞起点であると指摘された（非特許文献６）。
【００６６】
ＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化前の正常マウスに、細気管支上皮と肺胞上皮の両方とも、Ｐｕｆ−Ａ染色では弱陽性を示した（図４Ａ、左側）。１２週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化を経て、マウス（ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／ＴｅｔＯ−Ｃｒｅ／ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄｐ５３＋／＋）の肺癌組織には、Ｐｕｆ−Ａ陽性細気管支細胞が顕著な増加を示し、一方、Ｐｕｆ−Ａ陽性肺胞細胞が少ししかないのを示した（図４Ａ、右側）。
【００６７】
図４Ｂ（左側）及び図４Ｂ（右側）は、それぞれ２週間及び８週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化及び  ｐ５３欠失を経たＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／ＴｅｔＯ−Ｃｒｅ／ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３ｆｌｏｘ  マウスを示す。２週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化及び  ｐ５３欠失を経た後、肺胞上皮に比べて、より多くＰｕｆ−Ａ陽性細胞が細気管支上皮に見られた（図４Ｂ、左側）。８週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化及びｐ５３欠失を経た後、細気管支上皮と肺胞上皮の両方とも、Ｐｕｆ−Ａ染色の強度がさらに増大し、細気管支上皮の方がより強い（図４Ｂ、右側）。これらの結果は、Ｐｕｆ−Ａの発現は、内因性Ｋｒａｓ活性化及び／又はｐ５３枯渇に関連付けられるのを示唆している。
【００６８】
実施例５
（腫瘍形成におけるＰｕｆ−Ａ抑制の効果）
腫瘍形成におけるＰｕｆ−Ａ抑制のインビボ評価は、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３ｆｌｏｘマウスを用いて行った。
【００６９】
図５Ａは、研究デザインを模式的に示す。ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３ｆｌｏｘマウスは、２週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化及びｐ５３欠失を経て腺腫を発達させた。ｓｈＰｕｆ−Ａ−２（Ｐｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを表現するレンチウイルスベクターを、２週間にわたって腺腫に罹患したＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３ｆｌｏｘマウスに１週２回、鼻腔内投与した。６週間のＫｒａｓＧ１２Ｄ活性化及びｐ５３欠失を経たマウスを犠牲にした。図５Ｂに示すように、その肺組織を観察すると、対照ベクターに比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−２レンチウイルスベクターで治療したマウスの肺の細気管支及び肺胞領域内の腺癌病巣が少ない。ｓｈＰｕｆ−Ａ−２レンチウイルスベクターで治療したマウス内の腺癌又は腺腫病巣の数（＞２５０μｍ）は、対照ｓｈＲＮＡベクターを導入したマウス（図５Ｃ）よりも激減（それぞれ１５．４倍及び２．６倍減）した（図５Ｃ）。これらの結果は、Ｐｕｆ−Ａは、肺腫瘍形成への阻害、及び肺腺腫から肺腺癌への進行の予防には有効であるのを示唆している。
【００７０】
実施例６
（Ｐｕｆ−Ａの発現に対する新規なｓｈＰｕｆ−Ａの効果）
図６Ｂは、２種の新規な短ヘアピンＲＮＡｓ（ｓｈＰｕｆ−Ａ−１（配列番号：２）及びｓｈＰｕｆ−Ａ２＿（  配列番号：３））をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列示す。
【００７１】
Ｐｕｆ−Ａの発現に対する図６Ｂ中のｓｈＲＮＡｓ構築物の効果は、ｐ５３−熟達（ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６）及びｐ５３−欠損（ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びｐ５３−／−Ｈ１２９９）を用いて評価した。対照ｓｈＲＮＡ、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２レンチウイルスベクターを細胞に導入して、Ｐｕｆ−Ａの発現は、リアルタイム定量ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲによって測定された。図６Ｃ及び図６Ｄは、対照ｓｈＲＮＡに比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２レンチウイルスベクターが導入されたｐ５３−熟達及びｐ５３−欠損癌細胞のいずれかにおいても、Ｐｕｆ−Ａ  ＲＮＡの発現レベルが著しく減少することを示す（ＧＡＰＤＨ、内部制御として使用）。Ｐｕｆ−Ａの発現に対するｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２のノックダウン効率は、対照ｓｈＲＮＡに比べて、それぞれ約９０％及び７５％となる（図６Ｄ）。
【００７２】
実施例７
（癌細胞に対するＰｕｆ−Ａサイレンシングの効果）
肺癌細胞（Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９及びＣＬ１−５）、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、乳癌細胞（ＭＢ２３１）及び膠芽腫細胞（Ｕ８７、ＬＮ２２９及びＴ９８）を用いて、癌細胞に対するＰｕｆ−Ａの生体機能を評価した。対照ｓｈＲＮＡに比べて、実施例６のＰｕｆ−Ａ−１及びＰｕｆ−Ａ−２ウイルスベクターが導入されたこれらの癌細胞株において、Ｐｕｆ−Ａタンパク質の発現レベルが著しく減少する。加えて、対照ｓｈＲＮＡ導入に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ導入により、ｐ５３欠損細胞（ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６、ｐ５３−／−Ｈ１２９９、ｐ５３Ｒ２４８ＷＣＬ１−５及びｐ５３Ｒ２８０ＫＭＢ２３１）において、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）の切断型が著しく増加する。ｐ５３−熟達癌細胞（ｐ５３＋／＋Ａ５４９、Ｈ４６０及びＨＣＴ１１６）において、Ｐｕｆ−Ａ枯渇では、切断ＰＡＲＰ１のレベルに影響を与えなかった（図７Ａ）。
【００７３】
図７Ｂを参照して、ｓｈＰｕｆ−Ａウイルスベクターが導入された図７Ａの前記癌細胞株は、続いてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で培養し、ＤＮＡに基づく細胞周期分布をＦＡＣＳで評価する。対照ｓｈＲＮＡ群に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａにウイルスベクターが導入された後、ｐ５３−欠損癌細胞（ｐ５３−／−Ｈ１２９９及びＨＣＴ１１６）におけるサブＧ１細胞集団（青色）が著しく増加する。これは、ｐ５３−欠損癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの枯渇後、切断ＰＡＲＰ１の増加レベルと一致する（図７Ａ参照）。従って、ｐ５３−欠損癌細胞におけるＰｕｆ−Ａの枯渇では、細胞死に繋がるのを示している。
【００７４】
様々な刺激によるｐ５３の損失により、自己貪食フラックス及びＬＣ３蓄積が増加して細胞死を引き起こすことが報告されている（ＰＮＡＳ，１０７：１８５１１−１８５１６，２０１０）。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、ｐ５３−欠損癌細胞（ｐ５３−／−ＨＣＴ１１６及びＨ１２９９細胞）において、ｓｈＰｕｆ−Ａ導入後、ＬＣ３−ＩＩ（オートファゴソーム成分）及びＬＡＭＰ２（リソソーム成分）の発現レベルが著しく増加し、一方、ｐ６２（細胞中、オートリソソームの形成を持つ酵素消化の基質）が低くなり、また同じＰｕｆ−Ａがサイレンシングしたｐ５３−欠損癌細胞において、その発現レベルが著しく減少することを示す。これらの結果は、ｓｈＰｕｆ−Ａベクター導入後、ｐ５３−欠損癌細胞は、オートファジー細胞死を受けることになっているのを示唆している。
【００７５】
ｐ５３−欠損細胞に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入後、ｐ５３−熟達細胞（ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６）におけるＰｕｆ−Ａ枯渇によってＬＣ３−ＩＩ発現のレベルがやや増加する（図７Ｃ）。しかし、Ｐｕｆ−Ａ枯渇のみ（図７Ｃと７Ｄ）に比べて、ｐ５３−熟達細胞（ｐ５３＋／＋Ｈ４６０）において、ｐ５３とＰｕｆ−Ａの同時枯渇により、ＬＣ３−ＩＩ及びＬＡＭＰ２発現が大幅に増大することになる（図７Ｄ）。
【００７６】
図７Ｅ中の免疫螢光染色は、ｐ５３−熟達癌細胞において、核の周りに存在するＬＡＭＰ１がやや増加するのに比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１ベクター導入後、ｐ５３−欠損癌細胞において、ＬＣ３−ＩＩ（緑色）及びＬＡＭＰ１（赤色）の発現及び同時局在が増加することを示す。これは、ｐ５３欠損癌細胞における変型のオートリソソーム形成は、Ｐｕｆ−Ａ枯渇により、自己貪食フラックスが増加して変型のＬＣ３−ＩＩ蓄積及びオートファジー性細胞死を引き起こすのを示している。
【００７７】
対照ｓｈＲＮＡウイルスが導入された同じ癌細胞に比べて、ｓｈＰｕｆ−Ａ−１及びｓｈＰｕｆ−Ａ−２導入後、ｐ５３−欠損及びＰ５３−熟達癌細胞の増殖速度が減少した（図７Ｆ）。この結果から、Ｐｕｆ−Ａ抑制により、癌細胞中のオートファジー性細胞死を誘発することが示唆され、ｐ５３−欠損細胞中ではより一層顕著になる。
【００７８】
実施例８
（ｐ５３熟達癌細胞に対するＰｕｆ−Ａ抑制の効果）
Ａ５４９、Ｈ４６０又はＨＣＴ１１６癌細胞をｓｈＰｕｆ−Ａ−１、ｓｈＰｕｆ−Ａ−２又は対照ｓｈＲＮＡ  ウイルスベクターで感染することにより、ｐ５３熟達癌細胞において、ｐ５３及びｐ２１タンパク質／ＲＮＡの発現レベルに対するＰｕｆ−Ａ抑制の効果が検証された。図８Ａは、対照ｓｈＲＮＡで感染された癌細胞に比べて、ｐ５３−熟達癌細胞において、ｐ５３及びｐ２１タンパク質又はＲＮＡの発現レベルの著しく増加を示す。免疫螢光染色も同様に、Ｐｕｆ−Ａ枯渇後、ｐ５３−熟達細胞のｐ５３核染色（赤色）が増加したことが分かった（図８Ｂ）。同じ癌細胞株の細胞周期進行をＦＡＣＳで分析した。図８Ｃに示すように、ｓｈＰｕｆ−Ａ導入後、ｐ５３−熟達癌細胞において、Ｓ期細胞集団が著しく減少する一方、Ｇ０／Ｇ１期細胞集団が増加した。図８Ｄは、Ｐｕｆ−Ａ枯渇後、ｐ５３−熟達Ａ５４９及びＨ４６０癌細胞の成長率の著しく低下を示す。これらの結果は、ｐ５３熟達癌細胞において、Ｐｕｆ−Ａの発現をサイレンシングすることにより、ｐ５３及びｐ２１の発現が増加して、ｐ５３−熟達細胞の細胞周期を阻止することに繋がるのを示唆している。
【００７９】
実施例９
（肝細胞癌細胞に対するＰｕｆ−Ａ抑制の効果）
肝細胞癌細胞に対するＰｕｆ−Ａ抑制の効果を評価した。Ｐ５３熟達（ｐ５３＋／＋ＨｅｐＧ２）及びｐ５３欠損（ｐ５３−／−Ｈｅｐ３Ｂ及びｐ５３Ｙ２２０ＣＨｕｈ−７）肝細胞癌細胞は、Ｐｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡ又は対照ｓｈＲＮＡに感染している。
【００８０】
対照群に比べて、ｐ５３熟達及びｐ５３欠損肝細胞癌細胞にＰｕｆ−Ａ  ｓｈＲＮＡが感染される場合、Ｐｕｆ−Ａの発現が減少され、かつ細胞死が増加する。
【００８１】
実施例１０
（Ｐｕｆ−Ａの発現及び癌細胞に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価）
Ｐｕｆ−ａタンパク質の発現レベル及び様々な癌細胞における細胞増殖に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価が検証された。下記の癌細胞は、０．２５又は５０μＭのレスベラトロール（米国Ｓｉｇｍａ社から商業的に入手可能）で治療を受けた：Ａ５４９肺癌細胞（ｐ５３熟達）、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞（ｐ５３熟達）、ＭＢ２３１乳癌細胞（ｐ５３欠損）及びＴ９８膠芽腫細胞（ｐ５３欠損）。これらの癌細胞におけるＰｕｆ−Ａタンパク質の発現は、ウェスタンブロットにより分析し、及び細胞増殖は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｅｃｅ  ＲＴＣＡシステム（米国ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）に実行される細胞増殖アッセイで測定された。図９Ａは、Ａ５４９肺癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＢ２３１乳癌細胞及びＴ９８膠芽腫細胞において、２５及び５０μＭのレスベラトロールによるＰｕｆ−ａの発現の減少を示すウェスタンブロット画像群である。図９Ｂは、２５及び５０μＭのレスベラトロールによるＡ５４９肺癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＢ２３１乳癌細胞及びＴ９８膠芽腫細胞の増殖と対照群（レスベラトロール未投与）との比較を示すグラフ群である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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