(57)【要約】【課題】アジュバント活性を充分に示し、且つ安全性が高いアジュバントを提供すること。【解決手段】エラスチン様ポリペプチドを含有する、アジュバント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチン様ポリペプチドを含有する、アジュバント。
【請求項２】
前記エラスチン様ポリペプチドが、下記式（１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のアジュバント。
【化１】
2017160127.tif 000004
〔式（１）中、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示し、
ｎは、２以上の整数を示す。〕
【請求項３】
Ｘ1及びＸ2が、それぞれ独立して、バリン又はイソロイシンである、請求項２に記載のアジュバント。
【請求項４】
以下の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、ワクチン。
（Ａ）エラスチン様ポリペプチド
（Ｂ）抗原
【請求項５】
前記エラスチン様ポリペプチドが、下記式（１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドである、請求項４に記載のワクチン。
【化２】
2017160127.tif 000005
〔式（１）中、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示し、
ｎは、２以上の整数を示す。〕
【請求項６】
Ｘ1及びＸ2が、それぞれ独立して、バリン又はイソロイシンである、請求項５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバント、及び当該アジュバントを含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、投与する抗原に対する免疫応答を持続、増強させるものであり、ワクチン中の抗原含量やワクチンの用量、投与回数を低減させる目的で、抗原と共に投与されている。斯様なアジュバントとして、水酸化アルミニウムが最も一般的に使用されているが（特許文献１）、炎症性サイトカインを過剰に誘導する場合があり、安全性の更なる向上が要求される。
【０００３】
一方、エラスチンは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏの繰り返し配列を主要ペプチド配列とする弾性繊維状のタンパク質であり、水等に溶解させ約４０℃付近まで加熱すると相分離して白濁する温度感受性を示す。また、化粧品テクスチャーの改善や保湿作用の向上を目的として化粧料に配合されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２０６５３９号公報
【特許文献２】特開２０１５−００７０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、エラスチンは、豚の大動脈血管等の抽出物を精製して得られていたが、エラスチンを高純度で精製するのは容易ではなかった。そのため、エラスチン様ポリペプチドの化学的合成法が検討されているが（特許文献２）、斯様なエラスチン様ポリペプチドがアジュバント活性を示すということは知られていない。また、エラスチン様ポリペプチドは、生体適合性が高いため、バイオイナートで異物認識が起こりにくくアジュバント活性を示さないとむしろ考えられるようなものである。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、アジュバント活性を充分に示し、且つ安全性が高いアジュバントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のような背景の下、本発明者らは鋭意検討した結果、エラスチン様ポリペプチドが、安全性が高いだけでなく、全く意外にもアジュバント活性を充分に示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜６＞を提供するものである。
＜１＞  エラスチン様ポリペプチドを含有する、アジュバント。
＜２＞  前記エラスチン様ポリペプチドが、下記式（１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドである、＜１＞に記載のアジュバント。
【０００９】
【化１】
2017160127.tif 000002
【００１０】
〔式（１）中、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示し、
ｎは、２以上の整数を示す。〕
＜３＞  Ｘ1及びＸ2が、それぞれ独立して、バリン又はイソロイシンである、＜２＞に記載のアジュバント。
【００１１】
＜４＞  以下の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、ワクチン。
（Ａ）エラスチン様ポリペプチド
（Ｂ）抗原
＜５＞  前記エラスチン様ポリペプチドが、前記式（１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドである、＜４＞に記載のワクチン。
＜６＞  Ｘ1及びＸ2が、それぞれ独立して、バリン又はイソロイシンである、＜５＞に記載のワクチン。
＜７＞  エラスチン様ポリペプチドと抗原とを投与対象に投与する工程を含む、投与対象を免疫する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアジュバントは、アジュバント活性を充分に示し、且つ安全性が高い。
したがって、本発明のワクチンは、抗原に対する免疫応答性やその持続性に優れ、しかも、安全性も高い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与とＩｇＧ１産生との関連性を示す図である。
【図２】ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与とＩｇＧ２ａ産生との関連性を示す図である。
【図３】ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与と脾臓重量の変化との関連性を示す図である。
【図４】ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与とＩＬ−４  ｍＲＮＡ発現との関連性を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のアジュバントは、エラスチン様ポリペプチドを含有するものである。
ここで、本明細書において、「アジュバント」とは、投与する抗原に対する免疫応答を持続及び／又は増強させるものを意味し、免疫アジュバントのことをいう。また、「アジュバント活性」とは、投与する抗原に対する免疫応答を持続及び／又は増強させる作用を意味する。
【００１５】
本明細書において、「エラスチン様ポリペプチド」とは、温度感受性を示す合成ポリペプチドである。エラスチン様ポリペプチドとしては、アジュバント活性の観点から、下記式（１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドが好ましい。また、温度感受性を示し、水等に溶解させ約４〜４０℃付近の温度としたときに相分離するものが好ましい。
【００１６】
【化２】
2017160127.tif 000003
【００１７】
〔式（１）中、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示し、
ｎは、２以上の整数を示す。〕
【００１８】
式（１）中のＧ、Ｐ、Ｘ1及びＸ2は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載している。Ｇはグリシンを、Ｐはプロリンをそれぞれ示す。
【００１９】
式（１）中、Ｘ1及びＸ2はプロリン以外のアミノ酸残基を示す。なお、エラスチンは、ＧＶＧＶＰの繰り返し配列を主要ペプチド配列とするタンパク質であり、上記ＧＶＧＶＰ中の２つのＶがプロリン以外のアミノ酸残基であればその特性等は保存され、有意な影響や変化はない。
Ｘ1及びＸ2としては、脂肪族アミノ酸の残基が挙げられ、中性アミノ酸（モノアミノモノカルボン酸）の残基が好ましい。
具体的には、Ｖ（バリン）、Ｇ（グリシン）、Ａ（アラニン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｃ（システイン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）が挙げられる。これらの中でも、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）が好ましく、Ｖ（バリン）、Ｉ（イソロイシン）が特に好ましい。
【００２０】
なお、エラスチン様ポリペプチドは、ＧＸ1ＧＸ2Ｐに該当するペプチド配列のうち１種を有していてもよく、また、２種以上を有していてもよい。ＧＸ1ＧＸ2Ｐに該当するペプチド配列のうち１種又は２種を有する場合、これら配列の個数の比率（例えば、ＧＶＧＶＰで表されるペプチド配列とＧＶＧＩＰで表されるペプチド配列とを有する場合は〔（ＧＶＧＶＰ）：（ＧＶＧＩＰ）〕）としては、０：１００〜１００：０が好ましく、５：９５〜９５：５がより好ましい。
【００２１】
式（１）中、ｎは、２以上の整数を示すが、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは２０以上、更に好ましくは３０以上、特に好ましくは４０以上であり、また、好ましくは１０００以下、より好ましくは５００以下、更に好ましくは２５０以下、更に好ましくは１００以下、特に好ましくは８０以下である。
【００２２】
また、エラスチン様ポリペプチドは、アジュバント活性を損なわない限り、式（１）で表されるペプチド配列以外のペプチド配列を含んでいてもよいが、式（１）で表されるペプチド配列を主要ペプチド配列とするポリペプチドが好ましい。式（１）で表されるペプチド配列の含有量は、全ペプチド配列に対して、好ましくは９０〜１００質量％、より好ましくは９５〜１００質量％、特に好ましくは９９〜１００質量％である。また、エラスチン様ポリペプチドとしては、直鎖状の非架橋ポリペプチドが好ましい。
なお、式（１）で表されるペプチド配列の含有量は、ＧＰＣ、ＮＭＲ、Ｔｏｆ−ＭＳ等により測定可能である。
【００２３】
また、エラスチン様ポリペプチドの重量平均分子量としては、１，０００〜２，０００，０００が好ましく、１０，０００〜５００，０００がより好ましく、１５，０００〜５０，０００が特に好ましい。また、分散度は、好ましくは１．２５〜３．００である。
なお、重量平均分子量や分散度はＧＰＣ等により測定可能である。
【００２４】
本発明のアジュバントにおいて、エラスチン様ポリペプチドの含有量は、アジュバント全量に対して、好ましくは０．０１〜１００質量％である。
【００２５】
エラスチン様ポリペプチドは、例えば、特開２０１５−００７０３４号公報等の記載を参考にして合成すればよい。より具体的には、金属塩存在下、ユニットペプチドと水溶性縮合剤を用いた重縮合によって合成できる。なお、このようにして化学合成により得ることで、生体由来の夾雑物の混入を防ぐことができる。
【００２６】
そして、後記実施例に示すように、上記エラスチン様ポリペプチドは、アジュバント活性を充分に示し、且つ安全性が高い。
したがって、エラスチン様ポリペプチドは、そのまま、或いはアジュバントに通常配合される成分と組み合わせてアジュバントとして用いることができ、また、アジュバント製造のために使用することもできる。また、エラスチン様ポリペプチドを抗原等と組み合わせることで、抗原に対する免疫応答性やその持続性に優れ、しかも、安全性も高いワクチンとすることができる。
【００２７】
本発明のワクチンは、上記エラスチン様ポリペプチドの他に、抗原を含有するものである。
本発明のワクチンにおいて、エラスチン様ポリペプチドの含有量は、ワクチン全量に対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％である。
【００２８】
ワクチンに含まれる抗原は特に限定されないが、後述する疾患の予防及び／又は治療に使用される抗原が挙げられる。例えば、アレルギー疾患、ガン疾患、免疫疾患等が挙げられ、より具体的には、血液系疾患、免疫系疾患、内分泌系疾患、代謝系疾患、神経・筋疾患、視覚系疾患、聴覚・平衡機能系疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、皮膚・結合組織疾患、骨・関節系疾患、腎・泌尿器系疾患、染色体や遺伝子に変化を伴う症候群等が挙げられる。なお、抗原は、１種を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
本発明のワクチンにおいて、抗原の含有量は、ワクチン全量に対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％である。
【００３０】
また、本発明のアジュバントはエラスチン様ポリペプチド以外の成分を含んでいてもよく、本発明のワクチンはエラスチン様ポリペプチド及び抗原以外の成分を含んでいてもよい（以下、これらを他の成分と総称する）。
他の成分は、アジュバントやワクチンに通常配合されるものであればよく、例えば、エラスチン様ポリペプチド以外のアジュバント活性を示す物質、薬剤学的に許容可能な担体、希釈剤等が挙げられる。これら他の成分は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
エラスチン様ポリペプチド以外のアジュバント活性を示す物質としては、例えば、水酸化アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウム等の鉱酸塩の他、Ｏ／Ｗエマルジョン系アジュバント、Ｗ／Ｏエマルジョン系アジュバント、サポニン等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
薬剤学的に許容可能な担体としては、例えば、精製水；食塩水；リン酸緩衝液；デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤の他、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸等が挙げられ、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３２】
本発明のアジュバント及びワクチンの投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与でも非経口投与でもよいが、投与対象者の不快感が少なく投与しやすい等の点から、非経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、腹腔内投与、経肺投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、点眼投与、膣内投与等が挙げられる。これらの中では、腹腔内投与、経肺投与、静脈内投与等が好ましい。なお、本発明のアジュバントは、抗原と同時に投与してもよく、抗原投与の前後に投与してもよい。また、本発明のアジュバントをそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤等を適宜使用し、常法により行うことができる。
本発明のアジュバント及びワクチンは、液体状でも粉末等の固体状でもよい。また、本発明のアジュバント及びワクチンの投与形態としては、注射、スプレー、カテーテル、塗布、点眼の他、錠剤、カプセル剤等の経口投与製剤とする形態等が挙げられる。
本発明のアジュバント及びワクチンの投与対象は特に限定されないが、ヒトや他の哺乳動物が挙げられる。なお、本発明のアジュバント及びワクチンのヒトに対する投与量は特に限定されるものではなく、例えば、３０μｇ〜１０００ｍｇ、１００μｇ〜５００ｍｇ又は１００μｇ〜１００ｍｇ等の任意の量を１回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、１μｇ／ｋｇ〜３０００μｇ／ｋｇ又は３μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ等の任意の量を１回又は数回に分けて投与してもよい。なお、この回数や量は特に限定されるものではない。
【００３３】
また、本発明のアジュバント及びワクチンは、各種疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。疾患としては、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、インフルエンザ、肺炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、白血病、結核、コレラ、赤痢、腸チフス、髄膜炎菌感染症、肺炎球菌感染症、日本脳炎、黄熱、流行性耳下腺炎、狂犬病、麻疹、風疹、水痘、天然痘等が挙げられる。また、がん（子宮頸がん、胃がん、大腸がん、悪性腫瘍等）に対する特異的ワクチンとして用いることができる。また、３種混合ワクチン、４種混合ワクチン等として上記疾患を組み合わせたものの予防及び／又は治療に用いてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
〔合成例１  ＰｏｌｙＧＶＧＩＰの合成〕
ＧＶＧＩＰ５．２ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を超純水２５０ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１１ｇ（５８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．７ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、更に、Ｎａ2ＳＯ4  ３５．５ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を室温（２５℃）で１時間、静置した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＩＰの重合体を得た（収率：８０質量％）。
【００３６】
〔合成例２  ＰｏｌｙＧＶＧＶＰの合成〕
ＧＶＧＶＰ５ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を超純水２５０ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１１ｇ（５８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．７ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、更に、Ｎａ2ＳＯ4  ３５．５ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を室温（２５℃）で１時間、静置した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：７２質量％）。
【００３７】
〔合成例３  ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ−ＧＶＧＩＰ（８：２）の合成〕
ＧＶＧＶＰ５ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）およびＧＶＧＩＰ１．３ｇ（２．９ｍｍｏｌ）を超純水２５０ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１４ｇ（７３ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２．２ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）を加え、更に、Ｎａ2ＳＯ4  ３５．５ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を室温（２５℃）で１時間、静置した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰ−ＧＶＧＩＰの重合体を得た（収率：８２質量％）。
【００３８】
〔試験例１〕
（ＯＶＡ感作マウスの作製）
４週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（日本ＳＬＣ社製）を９匹準備し２週間順化飼育した。この６週齢のマウスを、平均体重が均等になるように各群３匹ずつ３群に分け、それぞれ、無処理群（ＮＴ群）、水酸化アルミニウム投与群（ＯＶＡ＋ＡＬ群）、ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与群（ＯＶＡ＋ＥＳＰ１群）とした。ＰＢＳ２００μＬ全量を、無処理群のマウスに２週間隔で３回（６週齢、８週齢及び１０週齢）腹腔内注射した。オボアルブミン（ＯＶＡ）１０μＬ及び水酸化アルミニウムゲル（シグマアルドリッチ社製）１５０μＬをＰＢＳ４０μＬに添加し、この溶液２００μＬ全量を、水酸化アルミニウム投与群のマウスに２週間隔で３回（６週齢、８週齢及び１０週齢）腹腔内注射した。オボアルブミン（ＯＶＡ）１０μＬ及び合成例１で得たＰｏｌｙＧＶＧＩＰ１００μＬをＰＢＳ９０μＬに添加し、この溶液２００μＬ全量を、ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与群のマウスに２週間隔で３回（６週齢、８週齢及び１０週齢）腹腔内注射した。
【００３９】
（脾臓摘出及び血清サンプルの調製）
順化飼育終了日から６週間経過後（１２週齢）に各マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出した。また、マウスの心臓から血液を採取し、ブロックインキュベータ（アステック社製ＢＩ−５１６Ｃ）にて２４℃、３０分間放置した後、４℃冷蔵庫で一晩置いた。翌日、マイクロ冷却遠心機（久保田商事社製３，５００）を用いて、血液を遠心分離（４℃、３，０００×ｇ、１０分間）し、上清（血清）を回収し、この血清サンプルを、測定まで−８０℃で保存した。
【００４０】
（ＥＬＩＳＡ法による血清中ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の測定）
上記血清サンプルをＰＢＳで１００倍希釈し、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、免疫グロブリンＩｇＧ２ａの発現解析を行った。また、上記血清サンプルをＰＢＳで１００，０００倍希釈し、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、免疫グロブリンＩｇＧ１の発現解析を行った。これらの具体的な手順は以下に示すとおりである。
まず、キャプチャー抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ｃｏａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ａ９０−１１５Ａ；  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  ｃｏａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ａ９０−１０７Ａ；  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ｃｏａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ａ９０−１０５Ａ）をＰＢＳで１，０００倍希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに１ウェルあたり５０μＬずつ播き、４℃の冷蔵庫に一晩置いた。翌日、ブロッカー１（ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、以下同じ）＋５質量％ＢＳＡ）を１ウェルあたり１００μＬずつ播き、３０℃で２時間静置した。これに、希釈した血清サンプルを添加し、濃度既知の抗原タンパク質（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，  ＲＳ１０−１０１；  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，  ＲＳ１０−１０１）を１／５段階希釈してスタンダード曲線を作成し、３０℃で２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ及び超純水で各ウェルを洗浄した後、ＨＲＰ標識抗体（Ａ９０−１１５Ｐ；  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ａ９０−１０７Ｐ；  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ａ９０−１０５Ｐ）をブロッカー２（ＰＢＳ−Ｔ＋５質量％ＢＳＡ＋５質量％ＦＣＳ）で１０，０００倍希釈し、１ウェルあたり５０μＬずつ播き、３０℃で１時間静置した。もう一度ＰＢＳ−Ｔ及び超純水で洗浄し、基質ＴＭＢ（ナカライテスク社製）を１ウェルあたり１００μＬずつ播き、遮光して２４℃で発色させ、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸（ナカライテスク社製）を１ウェルあたり１００μＬずつ播き、２Ｎ硫酸を用いて発色反応を止め、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４１】
（脾臓重量の測定）
各マウスから摘出した脾臓の重量を測定した。
【００４２】
（サイトカイン遺伝子の発現解析）
重量を測定した脾臓をシャーレ上ですりつぶし、コンプリートＲＰＭＩ  １６４０培地で回収した。滅菌水を用いて赤血球を溶血させ、セルストレーナー（メッシュサイズ４０μｍ、日本ベクトン・ディッキンソン社製）に通して結合組織や凝集細胞を取り除いた。得られた細胞懸濁液中の生細胞数を、トリパンブルー染色法にてカウントした。この細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの各ウェルに１ウェルあたり１ｍＬ（細胞数：２×１０6個）播き、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３時間、前培養した。前培養終了後、ＯＶＡ（５０μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で７２時間培養した。
培養終了後、遠心（８，０００×ｇ、４℃、１分間）により細胞を回収し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｒｉｃｓ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａバイオ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを水で１０倍に希釈し、インターロイキン（ＩＬ）−４の遺伝子発現量をリアルタイム定量的（ｑ）ＰＣＲにて測定し、ＩＬ−４の遺伝子発現量をβ−アクチン発現量で補正した。
【００４３】
（統計処理）
以上の各操作を２回行い（ｎ＝６）、各試験の結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）又は標準誤差（ＳＥ）で図１〜４に示した。図１にＩｇＧ１産生量を、図２にＩｇＧ２ａ産生量を、図３に脾臓重量の変化を、図４にＩＬ−４  ｍＲＮＡ発現解析結果を、それぞれ示す。各結果において、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）検定を用いてＰ値を算出し、Ｐ値が０．０５未満のときに有意差があると判断した。
【００４４】
図１に示すとおり、ＩｇＧ１の産生に関してエラスチン様ポリペプチド（ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ）は、未処理の系に比較して明らかな有意差を持って、３〜４倍の抗体産生能を惹起する性能があることが判った。さらに、この結果から、エラスチン様ポリペプチドは、生体適合性を有するのにも拘らず、驚くべきことに、水酸化アルミニウムの約７０％ものアジュバント活性を示すことがわかる。
図２に示すとおり、ＩｇＧ２ａの産生に関してエラスチン様ポリペプチド（ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ）は、水酸化アルミニウムと同等に、抗体産生を惹起しないことが判った。この結果から、エラスチン様ポリペプチドは、炎症等の生体反応を発生させることによる非特異的な抗体産生の惹起を促さないことが明らかである。
また、図１、２を併せて考察すると、エラスチン様ポリペプチドは、水酸化アルミニウムと同様にＯＶＡに特異的なＩｇＧ１の産生のみを惹起し、有効なアジュバント活性を持っていることが判る。また、ＩｇＧ２ａの産生を惹起しなかったことから、エラスチン様ポリペプチドは、生体に炎症等の生体反応を引き起こすこと無くアジュバント活性を示していることも明らかである。
【００４５】
図３に示すとおり、ＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与群は、水酸化アルミニウム投与群よりも脾臓重量の増加率が低かった。この結果から、エラスチン様ポリペプチドは、炎症性サイトカインの過剰な誘導が起こりにくく、安全性が高いことがわかる。
【００４６】
図４に示すとおり、エラスチン様ポリペプチドは、Ｔｈ２系のサイトカインであるＩＬ−４の産生を惹起し、ＩｇＧ１の産生を促すアジュバントとしての高い活性を有していることが明らかとなった。また、ＩＬ−４の産生惹起能力は、水酸化アルミニウムの効果とほぼ同等であった。この結果から、エラスチン様ポリペプチドは、生体適合性材料でありながらアジュバントとしての活性を有していることは、明らかである。
【００４７】
〔試験例２〕
ＰｏｌｙＧＶＧＩＰを、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ−ＧＶＧＩＰ（８：２）、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰにそれぞれ変更した以外は試験例１のＰｏｌｙＧＶＧＩＰ投与群と同様にして、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ−ＧＶＧＩＰ投与群、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ投与群についてＩｇＧ１産生量を測定した。
その結果、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ−ＧＶＧＩＰ投与群、ＰｏｌｙＧＶＧＶＰ投与群いずれについても、ＩｇＧ１産生量は概ね１０００μｇ／ｍＬ程度であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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