(57)【要約】【課題】アネキシンＡ５の新たな用途を提供する。【解決手段】アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターを有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項３】
癌細胞にアポトーシスを誘導する、請求項１又は２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
アネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合物質又はアネキシンＡ５遺伝子を増幅するプライマーセットを備える癌の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤及び癌の診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アネキシンは、カルシウムを結合することによってリン脂質への結合性を示す一群のタンパク質の総称であり、現在までに植物からほ乳類まで２０種類以上が見出されている。アネキシンは、分子量３０，０００〜４０，０００（アネキシンＡ６のみ約６６，０００）のタンパク質であり、アミノ末端側に各アネキシンに固有のアミノ酸配列（１１〜１９６残基）を有しており、カルボキシ末端側にアネキシンファミリー内でよく保存された約６０アミノ酸残基からなるαヘリックスを含む相同性の高い４回（アネキシンＡ６のみ８回）の繰り返し構造を有している。カルシウム結合部位やリン脂質結合部位はカルボキシ末端側に存在する。
【０００３】
アネキシンＡ５は、アネキシンファミリーに属する約３６ｋＤａのタンパク質であり、下垂体、卵巣、乳腺等に発現していることが知られている。例えば非特許文献１では、アネキシンＡ５が下垂体前葉で発現し、ホルモンの一種であるプロラクチンと結合することが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kawaminami M., et al., Association of annexin V with prolactin in the rat anterior pituitary gland., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (2), 894-898, 1992.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アネキシンの生理作用には未だ不明な点が多い。本発明は、アネキシンＡ５の新たな生理作用を解明し、アネキシンＡ５の新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
（１）アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤。
（２）アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターを有効成分として含有する抗癌剤。
（３）癌細胞にアポトーシスを誘導する、請求項１又は２に記載の抗癌剤。
（４）アネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合物質又はアネキシンＡ５遺伝子を増幅するプライマーセットを備える癌の診断キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、アネキシンＡ５の新たな用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１の結果を示すグラフである。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図３】実験例３の結果を示すグラフである。
【図４】実験例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【００１０】
アネキシンＡ５タンパク質には、シグナル配列が存在しない。このため、アネキシンＡ５タンパク質は、細胞外に分泌されるものではなく、細胞内で作用するタンパク質であると考えられている。
【００１１】
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、癌細胞の培地にアネキシンＡ５タンパク質を添加することにより、細胞の増殖を抑制できることを見出した。アネキシンＡ５タンパク質は、もともと生体内に存在するタンパク質であることから、本実施形態の抗癌剤は、生体に投与しても副作用が少ないと考えられる。
【００１２】
本実施形態の抗癌剤は、ヒトに投与するものであってもよく、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜；イヌ、ネコ等の愛玩動物；チンパンジー、ゴリラ、カニクイザル等の霊長類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類等に投与するものであってもよい。なかでも、ヒト、乳腺腫瘍の患畜が多いイヌ、及び発症すれば悪性度が高く臨床上重要なネコに投与するものであることが好ましい。
【００１３】
アネキシンＡ５タンパク質としては、投与対象とする動物のアネキシンＡ５タンパク質が好適に用いられる。より具体的には、例えばヒトを投与対象とする場合には、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、例えばイヌを投与対象とする場合には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１４】
本実施形態の抗癌剤は、アネキシンＡ５タンパク質の誘導体を有効成分として含有するものであってもよい。アネキシンＡ５タンパク質の誘導体としては、例えば、アネキシンＡ５タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ投与対象とする動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質（以下、「アネキシンＡ５タンパク質の変異体」という場合がある。）；アネキシンＡ５タンパク質又はその変異体の部分断片であって、かつ投与対象とする動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質；アネキシンＡ５タンパク質又はその変異体に、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したもの等が挙げられる。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜２０個、例えば１〜１５個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。
【００１５】
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターを有効成分として含有する抗癌剤を提供する。実施例において後述するように、発明者らは、癌細胞にアネキシンＡ５タンパク質の発現ベクターを導入することにより、細胞の増殖を抑制できることを見出した。
【００１６】
本実施形態の抗癌剤の投与対象は上述したものと同様である。発現ベクターとしては、投与対象の細胞中でアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を発現可能なものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００１７】
発現ベクターにおいて、アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等が挙げられる。
【００１８】
発現ベクターは、更に、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００１９】
本実施形態の抗癌剤において、発現ベクターに組み込む遺伝子としては、投与対象とする動物のアネキシンＡ５タンパク質をコードする遺伝子が好適に用いられる。
【００２０】
より具体的には、例えばヒトを投与対象とする場合には、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、例えばイヌを投与対象とする場合には、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００２１】
本実施形態の抗癌剤は、アネキシンＡ５タンパク質の誘導体の発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。アネキシンＡ５タンパク質の誘導体としては、例えば上述したアネキシンＡ５タンパク質の変異体；アネキシンＡ５タンパク質又はその変異体の部分断片であって、かつ投与対象とする動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質等が挙げられる。
【００２２】
アネキシンＡ５タンパク質の誘導体の発現ベクターに組み込む遺伝子としては、例えば、投与対象とする動物のアネキシンＡ５タンパク質をコードする塩基配列に対して、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ投与対象とする動物の腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２３】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００２４】
上述したアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体の発現ベクターを有効成分とする抗癌剤は、癌細胞にアポトーシスを誘導する場合がある。
【００２５】
すなわち、アネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体の発現ベクターは、アポトーシス誘導剤であるということもできる。
【００２６】
上述したアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体の発現ベクターは、それ自体を投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。
【００２７】
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
【００２８】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００２９】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００３０】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３１】
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００３２】
本実施形態の抗癌剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
【００３３】
本実施形態の抗癌剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、当業者であれば適切な投与量を適宜選択することが可能である。例えば注射剤の場合、通常成人（体重６０ｋｇ）において、１日あたり例えば０．０１から５０μｇ、例えば０．０１から１０μｇ、例えば０．０１から５μｇ程度を局所投与することが挙げられる。
【００３４】
［癌の診断キット］
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合物質又はアネキシンＡ５遺伝子を増幅するプライマーセットを備える癌の診断キットを提供する。
【００３５】
実施例において後述するように、発明者らは、腫瘍組織中では、正常組織と比較して、アネキシンＡ５の発現量が低下していることを明らかにした。
【００３６】
したがって、生検試料中のアネキシンＡ５の発現レベルをタンパクレベル又は遺伝子レベルで測定することにより、当該生検試料に癌細胞が含まれているか否かを判定することができる。
【００３７】
より具体的には、生検試料中のアネキシンＡ５の発現量が、正常組織中のアネキシンＡ５の発現量と比較して低い場合には、生検試料中に癌細胞が含まれていると判定することができる。
【００３８】
本実施形態の診断キットは、ヒトを対象とするものであってもよく、上述した動物を対象とするものであってもよい。
【００３９】
（アネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にアネキシンＡ５タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。ここで、アネキシンＡ５タンパク質としては、診断の対象とする動物種に由来するものを使用する。
【００４０】
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
【００４１】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。アネキシンＡ５タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、アネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００４２】
特異的結合物質は、アネキシンＡ５タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００４３】
（アネキシンＡ５遺伝子を増幅するプライマーセット）
プライマーセットとしては、診断の対象とする動物種に由来するアネキシンＡ５のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。例えば、ヒトのアネキシンＡ５のｃＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号５に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーのセット等が挙げられる。また、イヌのアネキシンＡ５のｃＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号７に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーのセット等が挙げられる。
【００４４】
（癌の判定方法）
本実施形態の診断キットを用いた癌の診断は、例えば次のようにして行うことができる。
【００４５】
診断キットがアネキシンＡ５タンパク質に対する特異的結合物質を用いるものである場合、まず、患者又は患畜から採取された生検試料及び対照となる正常組織を試料として、上記の特異的結合物質を用いた組織染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等を行うことにより、生検試料及び正常組織中のアネキシンＡ５タンパク質の発現量を測定する。ここで、正常組織は、生検試料が由来する同一の患者又は患畜に由来するものであることが好ましい。
【００４６】
続いて、測定されたアネキシンＡ５タンパク質の発現量に基づいて生検試料中に癌細胞が存在していたか否かを判定する。具体的には、生検試料中のアネキシンＡ５タンパク質の発現量が、正常組織中のアネキシンＡ５タンパク質の発現量と比較して低い場合には、生検試料中に癌細胞が含まれていると判定することができる。
【００４７】
あるいは、正常組織中のアネキシンＡ５タンパク質の発現量を予め測定して基準値を設定しておき、生検試料中のアネキシンＡ５タンパク質の発現量が上記基準値と比較して低い場合には生検試料中に癌細胞が含まれていると判定してもよい。これにより、診断の度に正常組織を準備する必要がなくなる。
【００４８】
診断キットがアネキシンＡ５遺伝子を増幅するプライマーセットを用いるものである場合、まず、患者又は患畜から採取された生検試料及び対照となる正常組織を試料として、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）等を行うことにより、生検試料及び正常組織中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量を測定する。ここで、正常組織は、生検試料が由来する同一の患者又は患畜に由来するものであることが好ましい。
【００４９】
続いて、測定されたアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量に基づいて生検試料中に癌細胞が存在していたか否かを判定する。具体的には、生検試料中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量が、正常組織中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量と比較して低い場合には、生検試料中に癌細胞が含まれていると判定することができる。
【００５０】
あるいは、正常組織中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量を予め測定して基準値を設定しておき、生検試料中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量が前記基準値と比較して低い場合には生検試料中に癌細胞が含まれていると判定してもよい。これにより、診断の度に正常組織を準備する必要がなくなる。
【００５１】
癌の判定において、生検試料及び正常組織中のアネキシンＡ５のｍＲＮＡの発現量は、例えばＲＮＡ−Ｓｅｑ等により網羅的に測定してもよい。
【００５２】
（その他の実施形態）
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える癌の治療方法を提供する。
【００５３】
１実施形態において、本発明は、患者又は患畜から採取された生検試料及び正常組織中のアネキシンＡ５の発現量を測定する工程と、生検試料中のアネキシンＡ５の発現量が、正常組織中のアネキシンＡ５の発現量と比較して低い場合に、生検試料中に癌細胞が含まれていると判定する工程と、を備える、癌の診断方法を提供する。
【００５４】
１実施形態において、本発明は、患者又は患畜から採取された生検試料中のアネキシンＡ５の発現量を測定する工程と、生検試料中のアネキシンＡ５の発現量が、予め設定した基準値と比較して低い場合に、生検試料中に癌細胞が含まれていると判定する工程と、を備える、癌の診断方法を提供する。
【００５５】
１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターを提供する。
【００５６】
１実施形態において、本発明は、抗癌剤を製造するためのアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現ベクターの使用を提供する。
【実施例】
【００５７】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００５８】
［実験例１］
（イヌ乳腺腫瘍におけるアネキシンＡ５の発現量の検討）
イヌの正常乳腺組織及び乳腺腫瘍組織におけるアネキシンＡ５の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検討した。より具体的には、まず、東京大学農学部附属動物医療センターで摘出されたイヌ乳腺組織の一部を−８０℃で保存した。また、残りの組織について病理診断を行い、正常乳腺（ｎ＝８）、良性乳腺腫瘍（ｎ＝８）、悪性乳腺腫瘍（ｎ＝６）に分類した。
【００５９】
続いて、−８０℃で保存したイヌ乳腺組織から約５ｍｍ四方を切り出し、市販のキット（商品名「ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＤｎａｓｅ処理した後、逆転写酵素（商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｑ−ＰＣＲ」、インビトロジェン社）を反応させてｃＤＮＡを合成した。
【００６０】
得られたｃＤＮＡを鋳型として、市販のキット（商品名「ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ」、アプライドバイオシステムズ社；商品名「Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ  ＳＹＢＲ  ｑ−ＰＣＲ  Ｍｉｘ」、東洋紡社）を用いて定量的ＰＣＲを行い、アネキシンＡ５の転写量を定量した。アネキシンＡ５のｃＤＮＡ増幅用プライマーとしては、配列番号７に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いた。
【００６１】
また、対照として、リボソームタンパク質Ｌ３２（以下、「ＲＰ３２」という場合がある。）の転写量をアネキシンＡ５と同様にして定量した。ＲＰ３２のｃＤＮＡ増幅用プライマーとしては、配列番号９に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いた。
【００６２】
図１は、定量ＰＣＲの結果に基づいて、各組織におけるアネキシンＡ５の転写量を、ＲＰ３２の転写量で除することにより標準化した結果を示すグラフである。図中の「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。有意差検定にはＡＮＯＶＡによる群間の有意差を解析した上でＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔによる多重比較検定を行った。
【００６３】
その結果、良性、悪性にかかわらず、イヌ乳腺腫瘍組織中では、イヌ正常乳腺組織と比較して、アネキシンＡ５の発現量が低下していることが明らかとなった。この結果は、アネキシンＡ５の発現量を測定することにより、癌の診断が可能であることを示す。
【００６４】
［実験例２］
（アネキシンＡ５のノックダウンの検討）
イヌ乳腺腫瘍細胞株におけるアネキシンＡ５の発現を、ｓｉＲＮＡの培地への添加によりノックダウンし、細胞の増殖を検討した。
【００６５】
アネキシンＡ５特異的ｓｉＲＮＡとして、ガイド鎖がｓｉＡｎｘａ５−ｇｕｉｄｅ（配列番号１１）であり、パッセンジャー鎖がｓｉＡｎｘａ５−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ（配列番号１２）であるｓｉＲＮＡを使用した。
【００６６】
また、対照ｓｉＲＮＡとして、ガイド鎖がｓｉＣｏｎｔ−ｇｕｉｄｅ（配列番号１３）であり、パッセンジャー鎖がｓｉＣｏｎｔ−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ（配列番号１４）であるｓｉＲＮＡを使用した。
【００６７】
イヌ乳腺腫瘍細胞株ＣＩＰｐに、遺伝子導入試薬（商品名「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ」、インビトロジェン社）を用いて、アネキシンＡ５特異的ｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入した。４８時間後にＭＴＴアッセイ（商品名「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｔｉｎｇ  ｋｉｔ８」、同仁化学社）を用いて各細胞数（相対値）を測定した。
【００６８】
図２は結果を示すグラフである。図中、エラーバーは平均±標準誤差（ｎ＝６）を示す。また、「対照」は対照ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、「ｓｉＡＸ５」はアネキシンＡ５特異的ｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また「＊」は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにより、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００６９】
その結果、アネキシンＡ５の発現をノックダウンすることにより、イヌ乳腺腫瘍細胞の増殖が促進されることが明らかとなった。
【００７０】
［実験例３］
（アネキシンＡ５の強制発現の検討）
イヌ乳腺腫瘍細胞株中でアネキシンＡ５を強制発現し、細胞の増殖を検討した。具体的には、まず、イヌアネキシンＡ５遺伝子の翻訳領域全長を発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ（インビトロジェン社）に組み込み、イヌアネキシンＡ５の発現ベクターを作製した。イヌアネキシンＡ５遺伝子の塩基配列を配列番号４に示す。
【００７１】
続いて、遺伝子導入試薬（商品名「Ｔｒａｎｓ  ＩＴ」、タカラバイオ社）を用いて、イヌアネキシンＡ５の発現ベクター及び対照ベクターをイヌ乳腺腫瘍細胞株ＣＩＰｐに導入した。対照ベクターとしては、空のｐＣＡＧＧＳベクターを使用した。４８時間後にＭＴＴアッセイ（商品名「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｔｉｎｇ  ｋｉｔ８」、同仁化学社）を用いて各細胞数（相対値）を測定した。
【００７２】
図３は結果を示すグラフである。図中、エラーバーは平均±標準誤差（ｎ＝６）を示す。また、「対照」は対照ベクターを導入した結果を示し、「ＡＸ５」はアネキシンＡ５発現ベクターを導入した結果を示す。また「＊」は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにより、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００７３】
その結果、アネキシンＡ５を強制発現することにより、イヌ乳腺腫瘍細胞の増殖が抑制されることが明らかとなった。この結果は、アネキシンＡ５の発現ベクターを抗癌剤として使用できることを示す。
【００７４】
［実験例４］
（腫瘍細胞株へのアネキシンＡ５の添加）
イヌの乳腺腫瘍細胞株の培地にアネキシンＡ５タンパク質を添加し、細胞の増殖を検討した。
【００７５】
アネキシンＡ５タンパク質としてはヒト組換えアネキシンＡ５タンパク質（型番「ＡＲ０９２８９ＰＵ−Ｌ」、Ａｃｒｉｓ社）を使用した。ヒトアネキシンＡ５タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に示す。
【００７６】
イヌ乳腺腫瘍細胞株ＣＩＰｐに、アネキシンＡ５タンパク質を、終濃度０、１０−１２、１０−１１、１０−１０、１０−９、１０−８（Ｍ）となるように添加した（ｎ＝４）。４８時間後にＭＴＴアッセイ（商品名「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｔｉｎｇ  ｋｉｔ８」、同仁化学社）を用いて各細胞数（相対値）を測定した。
【００７７】
図４に結果を示す。その結果、アネキシンＡ５タンパク質の添加により、濃度依存的に細胞数が減少することが示された。この結果は、アネキシンＡ５タンパク質を抗癌剤として使用できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、アネキシンＡ５の新たな用途が提供される。
【図１】
2017039647.tif 000002
【図２】
2017039647.tif 000003
【図３】
2017039647.tif 000004
【図４】
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【配列表】
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