(57)【要約】      （修正有）【課題】赤かび病菌のかび毒抑制剤及び赤かび病菌のかび毒抑制方法の提供。【解決手段】式（１）で表される化合物及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分とする赤かび病菌のかび毒抑制剤、及び該抑制剤による赤かび病菌のかび毒産生を抑制する方法。2017039649.tif 000039（Ｒ１は−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＯＣＨ２ＯＨ又は−Ｃ≡Ｃ；Ｒ２は−Ｈ又は−ＯＨ；Ｒ３は−Ｈ又は−ＯＨ；Ｒ４はアミノ酸又はアミノ酸類縁体）【選択図】図１
2017039649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2017039649.tif 000025
で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤。
（式中Ｒ１は、−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＯＣＨ２ＯＨ、又は−Ｃ≡Ｃを表す。Ｒ２は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ３は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ４は、アミノ酸、又はアミノ酸類縁体を表す。）
【請求項２】
前記（１）で表される化合物のＲ４は、以下から選択されることを特徴とする請求項１記載のトリコテセン系かび毒抑制剤。
【化２】
2017039649.tif 000026
【請求項３】
請求項１又は２記載のトリコテセン系かび毒抑制剤が、
下記式（２）〜（６）で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むことを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制剤。
【化３】
2017039649.tif 000027
【化４】
2017039649.tif 000028
【化５】
2017039649.tif 000029
【化６】
2017039649.tif 000030
【化７】
2017039649.tif 000031
【請求項４】
下記式（１）：
【化８】
2017039649.tif 000032
で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤によって、農産物、その種子、農産物を栽培する圃場、栽培中の農産物の少なくとも１つを処理することを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
（式中Ｒ１は、−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＯＣＨ２ＯＨ、又は−Ｃ≡Ｃを表す。Ｒ２は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ３は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ４は、アミノ酸、又はアミノ酸類縁体を表す。）
【請求項５】
前記（１）で表される化合物のＲ４は以下から選択されることを特徴とする請求項４記載のかび毒抑制方法。
【化９】
2017039649.tif 000033
【請求項６】
請求項４又は５記載のトリコテセン系かび毒抑制方法であって、
下記式（２）〜（６）で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤を用いることを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
【化１０】
2017039649.tif 000034
【化１１】
2017039649.tif 000035
【化１２】
2017039649.tif 000036
【化１３】
2017039649.tif 000037
【化１４】
2017039649.tif 000038
【請求項７】
請求項４〜６いずれか１項記載のトリコテセン系かび毒抑制方法において、
前記農産物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、ピーナッツの少なくとも１つであることを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤かび病菌のかび毒産生を抑制する薬剤に関する。特に、赤かび病菌の産生するトリコテセンと総称されるマイコトキシン生合成の最初のステップに関与する酵素であるトリコジエンシンターゼ（ｔｒｉｃｈｏｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、以下ＴＲＩ５ｐと記載することもある。）の活性を阻害する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フザリウム  グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）やフザリウム  アシアティクム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ）等のかびは畑等の土壌に生息する糸状菌である。これらフザリウム属の菌が、麦、トウモロコシの穂に感染することにより、粒が肥大しなくなったり、穂全体が枯れたりする赤かび病と呼ばれる植物病害が生じる。
【０００３】
赤かび病は、麦等の植物の組織を壊死させるために収穫量の減少を引き起こす。さらに、かび毒を生成することから、摂取したヒト、家畜に健康被害をもたらすことが知られている。フザリウム属は、化学構造からトリコテセン系かび毒、ゼアラレノン、ブテノライド等、数種類のかび毒を生成することが知られている。特に、トリコテセン系かび毒は、真核生物のタンパク合成阻害を引き起こす。そのため、ヒトや家畜が汚染された穀物を摂取すると、食中毒性無白血球症と言われる悪心、嘔吐、腹痛、下痢、造血機能障害、免疫不全を伴う中毒症状を引き起こす。
【０００４】
赤かび病に罹患した作物では、外見上萎縮するなど形態的に異常が認められる穀粒だけではなく、外見健全粒といわれる外見は全く正常な穀粒であってもかび毒によって汚染されている場合がある。そのため、汚染された作物をヒトや家畜が摂取し、重篤な中毒症状が引き起こされることがあった。そのため、農林水産省は、トリコテセン系かび毒の一つであるデオキシニバレノール（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ、ＤＯＮ）については農産物検査規格を改正し、流通上の規制の強化を行っている。かび毒は加工や調理工程において除去することは難しいため、生産段階において防除することがヒト、家畜での健康被害を生じさせないためには重要になっている。
【０００５】
また、トリコテセン系かび毒は宿主の病徴の進展への関与も指摘されている。したがって、トリコテセン系かび毒の合成を阻害することができれば、麦、トウモロコシの植物病害も低減することができる。トリコテセン系かび毒の産生を制御する農薬の開発は、食の安全性の確保に寄与するばかりではなく、植物病害防除に対しても画期的な薬剤を提供することになる。
【０００６】
トリコテセン産生抑制剤としてはプレコセンが開示されている（特許文献１）。プレコセンは昆虫の抗幼若ホルモンとして既知の化合物であるが、新たにトリコテセン産生を抑制する機能が見出された。クロメン誘導体であるプレコセンには、構造式の異なるプレコセン-１、プレコセン-２、プレコセン-３が存在するが、中でもプレコセン-２は培地へ添加した試験の結果から毒素産生抑制効果が高いとされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１６７１３８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yaguchi et al., 2009, J. Agric. Food Chem., Vol. 57,pp.846-851.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、プレコセン−２は、植物体上での赤かび接種試験を行った結果、植物体上では効果が認められなかった。また、特許文献１で用いられている菌株、Ｈ３株以外の赤かび病菌株に対しては抑制効果が全く認められなかったことから、菌株特異的な抑制効果であったと考えられている。したがって、菌株に依存しない有効な防除効果が認められる薬剤の開発が待たれている。
【００１０】
本発明はトリコテセン系かび毒の産生を抑止する薬剤を提供することを課題とする。さらに、該薬剤によって、フザリウム属のかびが産生するかび毒による農産物の汚染を防ぎ、かび毒の汚染の心配のない作物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[１]下記式（１）：
【化１】
2017039649.tif 000003
で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤。
（式中Ｒ１は、−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＯＣＨ２ＯＨ、又は−Ｃ≡Ｃを表す。Ｒ２は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ３は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ４は、アミノ酸、又はアミノ酸類縁体を表す。）
[２]前記式（１）で表される化合物のＲ４は、以下から選択されることを特徴とする上記[１]記載のトリコテセン系かび毒抑制剤。
【化２】
2017039649.tif 000004
[３]上記[１]又は[２]記載のトリコテセン系かび毒抑制剤が、
下記式（２）〜（６）で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むことを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制剤。
【化３】
2017039649.tif 000005
【化４】
2017039649.tif 000006
【化５】
2017039649.tif 000007
【化６】
2017039649.tif 000008
【化７】
2017039649.tif 000009
[４]下記式（１）：
【化８】
2017039649.tif 000010
で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤によって、農産物、その種子、農産物を栽培する圃場、栽培中の農産物の少なくとも１つを処理することを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
（式中Ｒ１は、−ＣＯＣＨ３、−ＯＨ、−ＣＯＣＨ２ＯＨ、又は−Ｃ≡Ｃを表す。Ｒ２は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ３は、−Ｈ、又は−ＯＨを表す。Ｒ４は、アミノ酸、又はアミノ酸類縁体を表す。）
[５]前記式（１）で表される化合物のＲ４は以下から選択されることを特徴とする上記[４]記載のかび毒抑制方法。
【化９】
2017039649.tif 000011
[６]上記[４]又は[５]記載のトリコテセン系かび毒抑制方法であって、
下記式（２）〜（６）で表される化合物、及び薬学的に許容される塩の少なくとも１つ以上を有効成分として含むトリコテセン系かび毒抑制剤を用いることを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
【化１０】
2017039649.tif 000012
【化１１】
2017039649.tif 000013
【化１２】
2017039649.tif 000014
【化１３】
2017039649.tif 000015
【化１４】
2017039649.tif 000016
[７]上記[４]〜[６]いずれか一つに記載のトリコテセン系かび毒抑制方法において、
前記農産物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、ピーナッツの少なくとも１つであることを特徴とするトリコテセン系かび毒抑制方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明者らは、トリコジエンシンターゼと結合し、その活性を阻害する化合物を見出した。本発明の化合物を有効成分とする薬剤は、かび毒の生合成を阻害することが可能であることから、赤かび病によるかび毒を防除するだけではなく、植物病害を防ぐ薬剤を提供することができる。また、これら化合物は作用点があらかじめ明らかになっていることから、作用機序の異なる殺菌剤と混合して使用することにより、より効果的なかび毒抑制剤としての効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】化合物アレイを用いたトリコジエンシンターゼ阻害剤のスクリーニング方法を模式的に示す図。
【図２】本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイ系でのトリコジエンシンターゼ阻害を示す図。
【図３】ＮＰＤ１０１３３及びその類縁体化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ  アッセイ系でのトリコジエンシンターゼ阻害を示す図。
【図４】ＮＰＤ１０１３３及びその類縁体の菌体重量当たりのかび毒産生と菌体重量に対する影響を示す図。（Ａ）ＪＣＭ９８７３株、（Ｂ）ＺＥＡ１株を用いた結果を示す。
【図５】ＮＰＤ３５２、ＮＰＤ１３１２０の濃度依存的阻害効果を示す図。
【図６】ＮＰＤ３５２の速度論的解析を示す図。
【図７】異なる属の菌による異なるトリコテセン系毒素の産生を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、トリコテセン系かび毒の生合成の最初のステップに関与する酵素であるトリコジエンシンテターゼ（ＴＲＩ５ｐ）を標的とする化合物を有効成分として含む阻害剤を用いることによって、かび毒の合成を完全にストップさせることが可能であるという仮説のもとに開発を進めた。
【００１５】
本発明の赤かび病菌かび毒産生抑制剤は、トリコジエンシンターゼ活性を阻害することによるトリコテセン系かび毒の抑制剤である。したがって、フザリウム属の菌に限らず、トリコセシウム属等、トリコテセン系かび毒の生合成のステップに、トリコジエンシンターゼを必要とする全ての菌に有効である。
【００１６】
本発明の赤かび病菌かび毒産生抑制剤は、単独で用いてもよいし、他の農薬と混合して用いてもよい。特に、作用機序の異なるトリアゾール系のエルゴステロール合成阻害剤であるメトコナゾール（商品名ワークアップフロアブル）、テブコナゾール（商品名シルバキュアフロアブル）、ベンズイミダゾール系の細胞分裂（微小管重合）阻害剤であるチオファネートメチル（商品名トップジンＭ）と混合して用いることにより、より高い抑制効果を期待することができる。
【００１７】
本発明の赤かび病菌かび毒産生抑制剤は、農薬製剤の製造方法の定法にしたがって、必要に応じて界面活性剤、その他の補助剤を加えて製剤化してもよい。具体的な製剤例としては、粒剤、粉剤、水和剤、懸濁性剤、乳剤、塗布剤、油剤等を例示することができる。
【００１８】
本発明のかび毒産生抑制剤は、ＮＰＤ１０１３３（後述する理研ＮＰＤｅｐｏ化合物ライブラリー収録されている化合物）に代表されるステロイドホルモン骨格とアミノ酸およびその誘導体が連結した構造を有している。ＮＰＤ１０１３３類縁体の化合物もフザリウム属の菌を用いたアッセイによりかび毒産生を抑制する効果が認められたことから、ステロイドホルモン骨格を有し、アミノ酸及びその誘導体が連結した構造を備えたものであれば、トリコテセン系かび毒の産生抑制剤として作用し得るものと考えられる。
【００１９】
本発明のかび毒産生抑制剤として、例えば、ＮＰＤ３５２（ｍｅｔｈｙｌ  ２−［２−（｛［（２Ｒ，５Ｚ，１５Ｓ）−１４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，１５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｃｙｃｌｏ［８．７．０．０ｔｅ７．０１１，１５］ｈｅｐｔａｄｅｃ−６−ｅｎ−５−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｍｉｎｏ｝ｏｘｙ）ａｃｅｔａｍｉｄｏ］−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）を用いた場合、乳剤で用いるのが好ましいが、水和剤、懸濁性剤等として用いてもよい。また、乳剤で用いる場合には、使用に際して５００〜１０００倍程度の濃度に希釈して使用する形態としてもよい。使用時期としては、開花期で降雨のない時期に散布するのが好ましい。また、濃度は、使用目的、使用時期等によって適宜変更することができる。本発明の他の化合物を用いる場合も、同様に阻害定数から適宜希釈倍率等を設定することができる。
【実施例１】
【００２０】
≪化合物アレイを用いたスクリーニング≫
図１に化合物のスクリーニング方法を模式的に示す。化合物アレイ（「理化学研究所ケミカルバイオロジー研究グループ化合物リソース開発研究ユニット」の化合物アレイ）を用いて、４０００種類の化合物の中から、ＴＲＩ５ｐに結合する化合物の探索を行った。化合物は、トリフルオロメチルジアジリンをリンカーとして、チップ上に固定されている。化合物はいくつかの異なる官能基によって、リンカーと結合させているため、固相への結合形態によらず、化合物とＴＲＩ５ｐとの結合を検出することができる。
【００２１】
ＴＲＩ５タンパク質は、以下のようにして、ＴＲＩ５ｐ発現ベクターを構築し、組換えタンパク質を精製して用いた。
【００２２】
毒素産生培地である米粉煮汁培地（５％（ｗ／ｖ）米粉、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）で培養したＭＡＦＦ  １１１２３３株（農業生物資源研究所ジーンバンクより入手）から、ＲＴ−ＰＣＲによって下記のＴｒｉ５クローニング用プライマーを用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で増幅し、Ｔｒｉ５のｃＤＮＡ全長（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＢ０６０６８９）（１，１２８ｎｔ）を取得した。
【００２３】
[Ｔｒｉ５クローニング用プライマー]
Ｔ５＿ＳＮｄ：５’−ＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＧ−３’
Ｔ５＿ＡＳＳＬ：５’−ＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＧ−３’
【００２４】
増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで消化後、ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社製）に導入し、ＴＲＩ５ｐ発現ベクターであるｐＣｏｌｄ  ＩＩ  Ｈｉｓ−Ｔｒｉ５を構築した。得られた発現ベクターを用いＲｏｓｅｔｔａ（登録商標）２  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を形質転換した。
【００２５】
タンパク質発現のためには、まずＴｒｉ５発現大腸菌を３７°Ｃ、１６０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６００が０．５となるまで旋回培養した。次に氷水中で急速に冷却後、０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、１５°Ｃ、１６０ｒｐｍで旋回培養した。２４時間後に培養液から集菌し、破砕バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）に懸濁した。超音波ホモジナイザーＵＤ−２０１（トミー精工社製）を用いて破砕した後、遠心により上清を回収し、上清を孔径０．２μｍの２５ｍｍシリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で濾過し、ＨｉｓＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（タカラバイオ株式会社製）を用いてアフィニティー精製を行った。イミダゾール溶出画分を回収後、ＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＳＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムを用い、イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った。組換えＴＲＩ５タンパク質（以下、Ｈｉｓタグが付与されている組換えタンパク質はＨｉｓ−ＴＲＩ５ｐと記載することもある。）は３０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。
【００２６】
スクリーニングにはＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＳＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製されたサンプルを脱塩したものを供した。化合物アレイとＨｉｓ−ＴＲＩ５ｐをインキュベートし、抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｋｔｈｃａｒｅ社製）及び蛍光標識された抗マウス抗体で、化合物に結合したＴＲＩ５タンパク質の検出を行なった。下記表１の３１化合物がＴＲＩ５ｐとの結合性を示した。
【００２７】
【表１】
2017039649.tif 000017
2017039649.tif 000018
2017039649.tif 000019
2017039649.tif 000020
【００２８】
化合物は構造に共通性のあるものが４群ほど存在したが（化合物番号５、６、７、９、化合物番号１３、１４、化合物１６、２０、及び化合物２９、３０）、その他の化合物には共通性は見出せなかった。表１に示したＴＲＩ５ｐと結合性を示した上記３１種の化合物が、毒素産生を抑制するか下記実施例３に示す方法によりフザリウム菌を用いた系でアッセイを行った。しかしながら、いずれの化合物もフザリウム菌を用いたアッセイ系では、顕著な毒素産生の抑制が見られなかった。
【実施例２】
【００２９】
≪ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＲＩ５ｐ活性阻害検定≫
表１で示したＴＲＩ５ｐと結合性を示す化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系でＴＲＩ５ｐ活性を阻害するか解析を行なった。活性検定に供するＨｉｓ−ＴＲＩ５ｐは、実施例１で用いたＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＳＰ精製後のタンパク質を、さらに、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ５／５０  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによって高度に精製したものを用いた。
【００３０】
活性測定には、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。反応液の組成の詳細は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、４．６μＭ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＰＰ）、３０ｎＭ  Ｈｉｓ−ＴＲＩ５ｐ、１Ｕ／ｍｌ  ｐｕｒｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、０．１Ｕ／ｍｌ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、０．２ｍＭ  ＭＥＳＧ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、及び１００μｇ／ｍｌの３１種の各候補化合物である。室温で３０分間インキュベートした後、分光光度計にて３６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００３１】
表１の３２化合物のうち、２、５、８、１３、２５、２７番目の化合物である、Ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、  （３ａＲ，６ａＳ）−３ａ，６ａ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，５，６，６ａ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−３ａＨ−２−ｏｘａ−ｆｌｕｏｒａｎｈｅｂｅ−１，３−ｄｉｏｎｅ、  （１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−２−Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−３（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＮＰＤ１０１３３、ＮＰＤ１２３０７、ＮＰＤ１３７１７の６化合物がトリコジエンシンターゼ活性を抑制した。６つの化合物の中でも、ＮＰＤ１０１３３は、１００μｇ/ｍｌ（１８７μＭ）で８５．４％のＴＲＩ５ｐ活性を阻害した。
【実施例３】
【００３２】
≪ＮＰＤ１０１３３類縁化合物を用いたより阻害活性の高い化合物の探索≫
ＮＰＤ１０１３３が高い阻害活性を示したことから、ＮＰＤ１０１３３を構造展開した類縁体を用い、より阻害活性の高い化合物の探索を試みた。ＮＰＤ１０１３３、及び理化学研究所ＮＰＤｅｐｏ化合物ライブラリーに収録されているＮＰＤ１０１３３の類縁化合物２０個の計２１の化合物を用いた（表２）。２１種の化合物は、ステロイドホルモン骨格とアミノ酸およびその誘導体が連結した構造を有している。表２に示した２１種の化合物について、フザリウム属の菌を用いて、トリコテセン系のかび毒の合成を阻害するか解析した。ステロイド骨格にアミノ酸、あるいはその類縁体が結合した化合物は、結合活性を示し、トリコジエンシンターゼ活性を抑制する蓋然性が高い。ここで、アミノ酸とは、必須アミノ酸だけではなく、アミノ基とカルボキシル基の両方の官能基をもつ有機化合物の総称であり、アミノ酸類縁体とは、有機合成の過程で用いた保護機を含む誘導体のことである。
【００３３】
【表２】
2017039649.tif 000021
2017039649.tif 000022
2017039649.tif 000023
なお、表２では、Ｃ及びＨは省略して記載してある。
【００３４】
解析は、以下の方法で行った。菌株は、トリコテセン系かび毒の１種である１５−アセチルデオキシニバレノール（１５−ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ、１５−ＡＤＯＮ）を生産するＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ＪＣＭ９８７３株（ＪＣＭ  （Ｊａｐａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）  理化学研究所微生物材料開発室より入手）を用いた。分生胞子（ｃｏｎｉｄｉａ）の誘導にはＣＭＣ液体培地（１．５％  ＣＭＣ−Ｎａ、０．１％  ＮＨ４ＮＯ３、０．１％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％  ＭｇＳＯ４  ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅ）を用いた。誘導した胞子は３０％グリセロール水溶液中に１ｘ１０７ｃｏｎｉｄｉａ／ｍｌとなるように調整後、−８０°Ｃで保存し、誘導後１ヶ月以内の胞子のみを実験に供した。
【００３５】
毒素生産は、５０ｍｌのＹＧ培地（２％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に１ｘ１０４ｃｏｎｉｄｉａ／ｍｌとなるよう胞子を植菌し、２５°Ｃ、１２５ｒｐｍで１８時間振盪し前培養を行った。本培養は２４ウェルプレートで行い、ＹＳ＿６０培地（６％  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に対して１／１００量の前培養液を植菌後、プレートに１ｍｌずつ分注して、２５°Ｃ、１３５ｒｐｍで旋回培養し、毒素を誘導した。表２に示すＮＰＤ１０１３３及びその類縁化合物は、１０μｇ／ｍｌの濃度に調製して用いた。
【００３６】
ＪＣＭ９８７３株の１５−ＡＤＯＮ産生の抑制効果を評価するために、２４穴プレートに分注した培養液中に化合物を添加した。無処理区として０．１％  ＤＭＳＯと０．４％メタノール添加区を用意した。実験は全て２連で行い、培養開始から４８及び９６時間後に培養液を回収した。毒素抽出のために、培養液を１．５ｍｌチューブに移して遠心分離し０．６ｍｌの培養上清を回収した。チューブ内の菌体は６５°Ｃで一晩乾燥させ、菌体乾物重量を測定した。上清に対して等量の酢酸エチルを加え毒素を抽出した。抽出物のうち培養上清０．５ｍｌ相当をＴＬＣ解析に、０．０５ｍｌ相当をＨＰＬＣ解析に供した。抽出した毒素は、ＴＬＣプレート上にスポットし、酢酸エチル：トルエン＝３：１の展開溶媒により分離した。展開後のプレートは、ＵＶ２５４照射下でＵＶ吸光を示す物質を検出・記録した後、１５−ＡＤＯＮをＮＢＰ−ＴＥＰＡ法によって青〜青紫色のスポットとして検出した。図３は４８時間後に培養液を回収して測定した結果を示したものである。９６時間後に培養液を回収して測定した場合でも同等の結果が得られている。
【００３７】
図３において、Ｓｔｄはスタンダードであり、１５−ＡＤＯＮ（上のスポット）、ＤＯＮ（下のスポット）を各５μｇを展開している。また、Ｎｔは処理を行っていないもの、Ｗｅｌｌ  Ａ、Ｂの各番号は、表２のＷｅｌｌ欄の各番号と対応している。Ｗｅｌｌ  Ａ０２のＮＰＤ３、Ｗｅｌｌ  Ａ０４のＮＰＤ３５２、Ｗｅｌｌ  Ｂ０１のＮＰＤ５４１、Ｗｅｌｌ  Ｂ０６のＮＰＤ１３１２０が顕著な抑制効果を示している。各阻害剤は１０μｇ/ｍｌの濃度で反応を行っている。顕著な阻害効果が見られた化合物については、モル濃度に換算した値を１５−ＡＤＯＮのスポットの下部に記載している。
【００３８】
毒素産生の抑制効果は、ＮＰＤ３５２とＮＰＤ１３１２０が非常に高い阻害効果を示し、次にＮＰＤ３、ＮＰＤ５４１の順であった。
【実施例４】
【００３９】
≪ＮＰＤ１０１３３類縁化合物の定量的解析≫
ＮＰＤ３５２及びＮＰＤ１３１２０が非常に高い阻害効果を示したことから、これら化合物、及び親化合物であるＮＰＤ１０１３３について定量的な解析を行った。実施例３と同様にＪＣＭ９８７３株を用い、培養液に１０μＭの濃度でＮＰＤ１０１３３（５．３４７０μｇ/ｍｌ）、ＮＰＤ３５２（５．２２６９μｇ/ｍｌ）、ＮＰＤ１３１２０（５．７３７４μｇ/ｍｌ）を添加してアッセイを行った。また、対照薬剤としてプレコセンＩＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。プレコセンＩＩは、２．５ｍＭ（５５０μｇ／ｍｌ）濃度でメタノールに溶解して用いた。コントロールとしては、ＮＰＤ化合物のｖｅｈｉｃｌｅであるＤＭＳＯと、プレコセンＩＩのｖｅｈｉｃｌｅであるメタノールを添加したものを用いた。
【００４０】
抽出した毒素は高速液体クロマトグラフィー解析によって分離・検出後、関東化学社製（４９１５０−５３）のトリコテセン標準液Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（Ｂ‐Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）のピーク面積から作成した検量線をもとに定量化した。定量結果と菌体乾物重量の結果から、菌体重量当たりのトリコテセン量（μｇ／ｍｇ）を算出した。＃１、＃２は２連で実験を行った結果を示す（図４（Ａ））。
【００４１】
ＮＰＤ３５２は無処理区（ｖｅｈｉｃｌｅであるＤＭＳＯ処理区）に比べ、６０％ほど毒素産生を抑制していた。一方、既知のトリコテセン産生抑制剤として知られるプレコセンＩＩは無処理区（メタノール処理区）の毒素産生量とほぼ変わらず、毒素産生抑制効果は認められなかった。また、化合物処理による生育への影響はいずれの化合物を処理した場合も認められなかった。
【００４２】
なお、プレコセンＩＩは、Ｈ３株に関しては毒素抑制効果を報告されている（非特許文献１）。本発明者らもＨ３株を用いてプレコセンＩＩの毒素抑制効果を解析したところ、Ｈ３株においてはプレコセンＩＩの毒素抑制効果を確認することができた。したがって、プレコセンＩＩの毒素抑制効果は菌株に依存するものと考えられる。
【００４３】
本発明の化合物の効果の菌株特異性を検討するために、別の菌株を用いて検討を行った。３−ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（３−ＡＤＯＮ）を生産するＺＥＡ１株（ＭＡＦＦ２４０５６０、農業生物資源研究所ジーンバンクより入手）を用いてＮＰＤ３５２、ＮＰＤ１３１２０の２種類の化合物の毒素産生抑制効果を評価した。＃１、＃２は２連で実験を行った結果を示す（図４（Ｂ））。
【００４４】
この菌株に対してはＪＣＭ  ９８７３株では抑制が認められなかったＮＰＤ  １３１２０も毒素を５０％程度抑制した。したがって、幅広い菌株に抑制を示すＮＰＤ３５２をリード化合物として更なる類縁体展開を行うことにより、比活性やスペクトラムの広い化合物を取得できる可能性がある。
【実施例５】
【００４５】
≪ＮＰＤ３５２及びＮＰＤ１３１２の濃度依存的阻害効果≫
ＺＥＡ１株を用いたアッセイで強い阻害効果を示したＮＰＤ３５２及びＮＰＤ１３１２０について、化合物濃度を変えてＴＲＩ５ｐに対する阻害効果の解析を行った。１〜１００μＭのＮＰＤ３５２、又はＮＰＤ１３１２０存在下で１５ｎＭ  Ｈｉｓ−ＴＲＩ５ｐ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１８．４μＭ  ＦＰＰを含む反応液でアッセイを行った。反応の停止は、反応液を液体窒素により急速凍結させ、さらに融解する凍結融解を２回繰り返すことにより行った。反応液中の無機ピロリン酸をＰＰｉＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙキットによって定量し阻害率を算出した。実験は３回試行し、平均値、標準偏差を求めた。その結果、ＮＰＤ３５２とＮＰＤ１３１２０ともに濃度依存的に抑制活性を示すことが明らかとなった（図５）。
【実施例６】
【００４６】
≪ＮＰＤ３５２の速度論的解析≫
幅広い菌株に抑制効果を示し、抑制効果も高い化合物ＮＰＤ３５２について阻害様式の解析を行った。阻害様式は、１５ｎＭのＨｉｓ−ＴＲＩ５ｐ、６〜４８μＭの基質ＦＰＰとともに濃度１０μＭのＮＰＤ３５２と３０°Ｃで５分間反応させることによって行なった。具体的には、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５ｎＭ  Ｈｉｓ−ＴＲＩ５ｐ及び１０μＭ  ＮＰＤ３５２を含む反応液で、ＦＰＰ濃度を６、１２、２４、又は４８μＭと変えてアッセイを行った。反応の停止は、反応液を液体窒素により急速凍結させ、さらに融解する凍結融解を２回繰り返すことにより行った。反応液中の無機ピロリン酸をＰＰｉＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＡｓｓａｙキットとＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ（登録商標）Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）によって定量し、無機ピロリン酸の定量結果をもとにＮＰＤ３５２の阻害定数を算出した。
【００４７】
Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔを作成したところ、ＮＰＤ３５２はＴＲＩ５ｐの見かけのＫｍを上昇させ反応初速度を減少させたことから、混合型の阻害剤であることが判明した（図６）。ＮＰＤ３５２の阻害定数Ｋｉは５．４４μＭ、Ｋｉ’は３５．０３μＭであった。
【００４８】
構造骨格中のアミノ酸の種類と毒素産生抑制効果の間には相関性が認められなかったが、ＮＰＤ３５２はＮＰＤ１０１３３の類縁化合物の中で唯一テストステロン骨格を有しており、ステロイド骨格上のわずかな反応基の違いが菌体内における化合物の安定性やＴＲＩ５タンパク質との相互作用に大きく影響する可能性が考えられた。
【実施例７】
【００４９】
≪フザリウム属以外の異なるトリコテセン生産菌に対する効果≫
フザリウム属菌はＣ−３位が水酸化（図７中、星印を付した水酸基）やＯ−アセチル化されたトリコテセン（生合成的にはｉｓｔｏｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｌ；ＩＴＤｍｏｌに由来するトリコテセン化合物）を生産するが、フザリウム属菌以外のトリコテセン生産菌はＣ−３位が水素のまま修飾されないタイプのトリコテセン（生合成的には１２，１３−ｅｐｏｘｙｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃ−９−ｅｎｅ；ＥＰＴに由来するトリコテセン化合物）を生産する（図７参照のこと。）。このようなＥＰＴに由来するトリコテセン化合物を産生するタイプの菌株としてトリコセシウム・ローゼム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）が知られている。
【００５０】
本発明の化合物はトリコテセン生合成の最初のステップを阻害することから、トリコテセン系毒素として最終的にどのような化合物が合成されるかによらず、毒素産生を抑制することが期待される。そこで、トリコセシウム・ローゼムに対する化合物の抑制効果を検討した。
【００５１】
トリコセシウム・ローゼムＮＢＲＣ  ３１６４７（（独）製品評価技術基盤機構（Ｎｉｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）より入手）を
ＣＭＣ  培地（１．５  ％ＣＭＣ−Ｎａ、０．１％  ＮＨ４ＮＯ３、０．１％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％  ＭｇＳＯ４  ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅ）で培養し、分生子を形成させた。分生子はＦａｌｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ  ４０μｍを用いて無菌的に回収した。
【００５２】
分生子は３００ｍｌ三角フラスコに分注した５０ｍｌのＹＧ培地（２％  ｇｌｕｃｏｓｅ，０．５％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に１ｘ１０４／ｍｌの最終濃度になるように植菌し、２５°Ｃで前培養した。１８時間後、前培養液１ｍｌをとって３００ｍｌ三角フラスコに分注した１００ｍｌのＹＳ＿６０培地（６％  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）に植菌し、１ｍｌずつ２４穴プレートに分配した。各ウェルには１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解させた薬剤ストック溶液を１／１，０００加えて最終濃度１０μＭになるように本培養の開始と同時に添加した。対照区は薬剤を含まないＤＭＳＯのみで処理した。
【００５３】
４８時間後に培地上清５００μｌを等量の酢酸エチルで抽出し、溶媒を蒸発させた後、５０％アセトニトリルに溶解した。溶解させたサンプルはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ１０  ＨＰＬＣシステムを用いて分析した。サンプルの分離、定量には、Ｐｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳ  ＳＰ１００（４．６ｘ２５０ｍｍ，５μｍ，１００Å；Ｓｅｎｓｈｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ）カラムを用い、培養液５０μｌ相当分をインジェクションした。溶出には５０％アセトニトリルを用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎのｉｓｏｃｒａｔｉｃ溶出で２２０ｎｍの吸光度を測定することによって検出した。トリコテシンは１３．６分で溶出された。
【００５４】
２連で行なった実験結果を表３に示す。表中の値は、ＨＰＬＣのクロマトグラムで得られたピーク面積である。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
ＮＰＤ３５２は平均するとトリコテシン産生を４２％抑制することが示された。以上の結果より、本発明の化合物はフザリウム属菌のみならず、ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｌ由来のトリコテセンを生産する他の属の菌にも抑制効果を示すことが判明した。したがって、トリコテセンを生産する様々な菌において毒素産生を抑制することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の阻害剤は、トリコテセン系かび毒の生合成の最初のステップを行う酵素トリコジエンシンターゼを阻害する化合物であることから、トリコジエンシンターゼを初発ステップとするかび毒産生を抑制するものと考えられる。また、ＮＰＤ３５２は菌株に依存することなく、高い阻害活性を示すことから、これを有効成分とする幅広い菌株に対応可能な赤かび病毒産生抑制剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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