(57)【要約】【課題】細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤の提供。【解決手段】硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、骨形成因子を安定に保持する骨形成因子安定保持剤、及び硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、骨形成因子を活性化する骨形成因子活性化剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤。
【請求項２】
硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤。
【請求項３】
骨形成因子が、骨形成因子−２である請求項２に記載の骨形成因子活性化剤。
【請求項４】
硫酸化ポリロタキサン中の環状分子が、α−シクロデキストリンであり、
硫酸化ポリロタキサン中の線状分子が、ポリエチレングリコールである請求項２から３のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
【請求項５】
硫酸化ポリロタキサンが、下記一般式（Ｉ）で示される化合物である請求項２から４のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
【化１】
2017226601.tif 000028
【化２】
2017226601.tif 000029
（但し、前記一般式（Ｉ）、及び前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、又はエーテル結合（−Ｏ−）を示し、ｍは、０〜２０の整数を示し、ｎは、１０〜２５，０００の整数を示し、ｘは、１〜６の整数を示す）
【請求項６】
硫酸化ポリロタキサン中の線状分子の数平均分子量が、５００〜６，０００である請求項２から５のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
【請求項７】
硫酸化ポリロタキサンの環状分子中の硫酸基の平均修飾数が、硫酸化ポリロタキサンの環状分子１分子に対して、０．５〜１である請求項２から６のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
【請求項８】
硫酸化ポリロタキサンの含有量が、骨形成因子全量に対して、１，０００倍〜１０，０００倍である請求項２から７のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
【請求項９】
硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法。
【請求項１０】
硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、及び骨形成因子の活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、骨再生分野では、移植骨の代替品としてポリ乳酸やβ−リン酸三カルシウム等の骨代替材料の利用が検討されている。しかし、前記ポリ乳酸は、強い免疫反応や炎症反応を惹起する場合があるという問題があり、また、前記β−リン酸三カルシウムは、無機材料であるために生体内吸収されずに停滞するといった問題があり、広範囲の骨再生技術の確立には至っていないのが現状である。
【０００３】
近年、骨形成を促進する成長因子である骨形成因子−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２、以下、「ＢＭＰ−２」ともいう。）は、強力に骨の形成を誘導することが知られており、広く注目されている。しかし、前記ＢＭＰ−２は、生体環境下において分解及び失活が早く、非常に不安定であるという問題がある。また、前記ＢＭＰ−２は、広範囲の骨を再生させるには数ヶ月といった長期間を要するため、活性を維持するために多量のＢＭＰ−２を継続的に投与する必要がある。しかし、前記ＢＭＰ−２を多量に投与すると生体内で炎症作用や過剰反応により異常な骨が形成されるという問題が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
そのため、前記問題を解決するために、生体内環境下におけるＢＭＰ−２の不活性化を抑制し、ＢＭＰ−２による分化誘導効率に優れる、ＢＭＰ−２に硫酸化多糖類であるヘパリンを添加し、ＢＭＰ−２／ヘパリン静電複合体を形成させるＢＭＰ−２の活性維持方法が提案されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３、及び特許文献１参照）。
しかしながら、前記提案は、ヘパリンの抗凝固作用を有するため臨床応用することは困難であるという問題がある。
【０００５】
したがって、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子の安定保持方法、並びに骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤、及び骨形成因子の活性化方法の提供が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７４７３２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚａｒａ  ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ，１７（９−１０），１３８９−１３９９（２０１１）
【非特許文献２】Ｔａｋａｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７８（４４），４３２２９−４３２３５（２００３）
【非特許文献３】Ｚｈａｏ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８１（３２），２３２４６−２３２５３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤及び骨形成因子の安定保持方法、並びに骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤、及び骨形成因子の活性化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題は、プラスの電荷を帯びる骨形成因子と、マイナスの電荷を帯びるヘパリンとが静電相互作用により複合体を形成することから、へパリンと同様の化学構造である硫酸基を環状分子に有することによりマイナスの電荷を帯びる硫酸化ポリロタキサンを含有することで、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成することができることを知見した。
また、前記硫酸化ポリロタキサンは、前記硫酸基を有する環状分子と、前記環状分子の中空部を貫通する線状分子とを有するため、前記硫酸基を有する環状分子の自由度が高く、前記環状分子が前記線状分子上を移動することができるため、ヘパリンのような硫酸基の修飾位置が固定されている化合物と比較して、骨形成因子との複合体形成時の立体障害を緩和することで強く相互作用し、骨形成因子を生体内で安定に保持することができ、かつ骨形成因子を活性化することができることを知見した。
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
＜１＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤である。
＜２＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤である。
＜３＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法である。
＜４＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子の安定保持方法、並びに骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤、及び骨形成因子の活性化方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、製造例１の中間生成物であるカルボキシエチル基で修飾されたポリロタキサン（以下、「ＣＥ−ＰＲＸ」ともいう）の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図２】図２は、製造例１で得られた硫酸化ポリロタキサン−１の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図３】図３は、製造例２で得られた硫酸化ポリロタキサン−２の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図４】図４は、製造例３で得られた硫酸化ポリロタキサン−３の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図５】図５は、製造例４で得られた硫酸化ポリロタキサン−４の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図６】図６は、試験例１のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。
【図７】図７は、試験例２のＡＬＰ活性量を測定したウエルの着色結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例３のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例４のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例５のＢＭＰ−２抗体結合率の測定結果を示す図である。
【図１１】図１１は、試験例６のＢＭＰ−２阻害剤添加時のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。
【図１２】図１２は、試験例７の細胞毒性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、及び骨形成因子の活性化方法）
本発明の骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、及び骨形成因子の活性化方法は、硫酸化ポリロタキサン、及び骨形成因子を含有し、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
【００１４】
＜硫酸化ポリロタキサン＞
前記硫酸化ポリロタキサン（以下、「ＳＯ３−ＰＲＸ」ともいう）は、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性、及び骨形成因子との複合体形成作用を向上させるために含有されている。
【００１５】
前記硫酸化ポリロタキサンとしては、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、硫酸化ポリロタキサンとは、環状分子に硫酸基が修飾したポリロタキサンをいう。
【００１６】
前記硫酸化ポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２，０００〜５００，０００が好ましく、１０，０００〜１００，０００がより好ましい。なお、前記数平均分子量は、例えば、プロトン核磁気共鳴スペクトルから得られる化学組成から算出することができる。
【００１７】
−線状分子−
前記線状分子としては、前記環状分子の中空部を貫通することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、線状分子の両端部に、前記環状分子が脱離しないように作用する封鎖基で修飾された構造を有する。なお、「線状分子」の「線状」とは、直鎖であることを意味するが、線状分子上で前記環状分子が移動することができれば、分岐鎖を有していてもよい。
【００１８】
前記線状分子の両端部以外の構成の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的とする硫酸化ポリロタキサンの数平均分子量や、貫通させる環状分子の数に応じて適宜選択することができるが、５００〜１，０００，０００が好ましく、５００〜１０，０００がより好ましく、５００〜６，０００が特に好ましい。前記数平均分子量が、５００未満であると、貫通している環状分子の脱離が発生しやすく、また、前記環状分子の貫通数を制御することが困難となる傾向にあり、１，０００，０００を超えると、溶解性が低下し、前記環状分子の貫通数の制御が困難となる傾向にある。なお、前記数平均分子量は、例えば、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定やプロトン核磁気共鳴スペクトルから得られる化学組成から算出することができる。
【００１９】
前記線状分子の両端部以外の構成としては、特に制限はなく、公知のポリロタキサンの構成を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロック共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのランダム共重合体、ポリメチルビニルエーテル、ポリエチレンイミンなどが挙げられる。
前記線状分子の両端部以外の構成としては、市販品を用いてもよく、適宜合成したものを用いてもよい。
【００２０】
前記線状分子の両端部以外の構成は、後述する環状分子との組合せに応じて適宜選択することが好ましく、例えば、前記環状分子がα−シクロデキストリンの場合には、ポリエチレングリコールとすることが好ましく、前記環状分子がβ−シクロデキストリンの場合には、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体とすることが好ましい。
【００２１】
前記線状分子の両端部の封鎖基としては、前記線状分子の両端をキャップして前記環状分子の脱離を防止することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ−ベンゾイルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン；アミノ酸又はその誘導体；オリゴペプチド；蛍光分子などが挙げられる。これらの中でも、Ｎ−ベンゾイルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンが好ましい。
【００２２】
前記封鎖基を前記線状分子に結合させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００２３】
−環状分子−
前記環状分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シクロデキストリン、クラウンエーテル、カリックスアレンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、シクロデキストリンが好ましい。
【００２４】
前記シクロデキストリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、α−シクロデキストリンが好ましい。
【００２５】
前記硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの前記線状分子に貫通されている前記環状分子の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均５個〜１，０００個が好ましく、平均１０個〜２００個がより好ましく、平均２０個〜５０個が特に好ましい。
【００２６】
前記環状分子としては、少なくとも硫酸基で修飾されている。前記硫酸基を有することにより、前記硫酸化ポリロタキサンがマイナスの電荷を帯びることができ、後述する骨形成因子と静電相互作用することができる。
【００２７】
前記硫酸基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スルホン酸、エチルスルホン酸、プロピルスルホン酸、ブチルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、スルファミン酸（アミド硫酸）等に由来する構造単位、及びこれらの塩に由来する構造単位などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エチルスルホン酸に由来する構造単位が好ましい。
【００２８】
前記硫酸基としては、生理的ｐＨ環境で脱プロトン化し、前記硫酸化ポリロタキサンをマイナスの電荷を帯びることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、環状分子に直接修飾されていてもよく、リンカー及び他の置換基の少なくともいずれかを介して修飾されていてもよく、リンカー及び他の置換基の少なくともいずれかの繰り返し構造を有していてもよい。これらの中でも、リンカー及び他の置換基を介して修飾されていることが好ましく、リンカー及び他の置換基の繰り返し構造を介して修飾されていることがより好ましい。なお、リンカー及び他の置換基の両方を有する場合、前記環状分子に結合する順は、特に制限はなく、リンカー、他の置換基の順であっても、他の置換基、リンカーの順であってもよい。
前記リンカー及び前記他の置換基の少なくともいずれかの繰り返し数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０〜２０が好ましく、０〜１０がより好ましく、０〜３が特に好ましい。
【００２９】
前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。
前記他の置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基などが挙げられる。
【００３０】
前記硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの硫酸基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均１０個〜４００個が好ましく、平均２０個〜８０個がより好ましい。
【００３１】
前記環状分子１分子あたりの硫酸基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均０．１個〜６個が好ましく、平均０．５個〜３個がより好ましく、平均０．５個〜１個が特に好ましい。
【００３２】
前記環状分子を前記線状分子により貫通させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記環状分子を硫酸基で修飾する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００３３】
前記硫酸化ポリロタキサンの好ましい態様としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示される化合物などが挙げられる。
【００３４】
【化１】
2017226601.tif 000002
【化２】
2017226601.tif 000003
但し、前記一般式（Ｉ）、及び前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、又はエーテル結合（−Ｏ−）を示し、ｍは、０〜２０の整数を示し、ｎは、１０〜２５，０００の整数を示し、ｘは、１〜６の整数を示す。
【００３５】
前記硫酸化ポリロタキサンのより好ましい態様としては、例えば、下記構造式（１−Ａ）〜下記構造式（１−Ｅ）で示される硫酸化ポリロタキサンなどが挙げられる。
【００３６】
【化３】
2017226601.tif 000004
【化４】
2017226601.tif 000005
【００３７】
【化５】
2017226601.tif 000006
【化６】
2017226601.tif 000007
【００３８】
【化７】
2017226601.tif 000008
【化８】
2017226601.tif 000009
【００３９】
【化９】
2017226601.tif 000010
【化１０】
2017226601.tif 000011
【００４０】
【化１１】
2017226601.tif 000012
【化１２】
2017226601.tif 000013
【００４１】
前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）で示される硫酸化ポリロタキサンの線状分子は、ポリエチレングリコールであり、環状分子は、エチルスルホン酸を化学修飾したα−シクロデキストリンである。
【００４２】
前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（ｎは、１０〜２５，０００の整数）（構造式（１−Ａ）〜（１−Ｅ）では、括弧内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）中、α−シクロデキストリンはそれぞれ前記式（Ａ）〜（Ｅ）で示され、前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）中では１個のみ記載している。
【００４３】
また、前記式（Ａ）〜（Ｅ）では、α−シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、前記リンカー及び前記他の置換基の少なくともいずれかを介してエチルスルホン酸に由来する構造単位で修飾されている。なお、前記式（Ａ）〜（Ｅ）では、前記置換基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜６）の場合を示している。
【００４４】
前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）で示される硫酸化ポリロタキサンは、後述する製造例１〜４などの方法で好適に製造することができる。
【００４５】
製造された硫酸化ポリロタキサンが、前記前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）で示される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法や赤外分光法により確認することができる。
なお、前記分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、前記硫酸化ポリロタキサンが前記構造式（１−Ａ）〜前記構造式（１−Ｅ）で示される構造を有することは容易に同定することが可能である。
【００４６】
本発明の骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子活性化剤における前記硫酸化ポリロタキサンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、骨形成因子全量に対して、０．１倍〜１００，０００倍が好ましく、１０倍〜１０，０００倍がより好ましく、１，０００倍〜１０，０００倍がさらに好ましく、１，０００倍〜５，０００倍が特に好ましい。
【００４７】
＜骨形成因子＞
前記骨形成因子（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、ＢＭＰともいう）は、異所性骨誘導活性を示す物質であり、皮下組織、筋組織内などの未分化間葉系細胞に作用して、前記未分化間葉系細胞を軟骨芽細胞、骨芽細胞などに分化させ、軟骨、骨などを形成させる活性タンパク質である。
【００４８】
前記骨形成因子としては、特に制限はなく、プラスの電荷を有していれば、マイナスの電荷を有する硫酸化ポリロタキサンと静電相互作用により複合体を形成することができる。
【００４９】
前記骨形成因子の等電点としては、プラスの電荷を有すれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７．５〜１０が好ましい。なお、ＢＭＰ−２の等電点は、８．３〜８．５（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｚｎｅｙ  Ｐｒｏｇ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．  １９８９，  １，  ２６７−２８０）であり、生理的環境下ではプラスの電荷を有する。
【００５０】
前記骨形成因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨形成因子−２；骨形成因子−３；骨形成因子−４；骨形成因子−５；骨形成因子−６；骨形成因子−７；骨形成因子−８ａ；骨形成因子−８ｂ；骨形成因子−９；骨形成因子−１０；骨形成因子−１１；骨形成因子−１５；骨形成因子−２及び骨形成因子−６からなる骨形成因子ヘテロダイマー；骨形成因子−２及び骨形成因子−７からなる骨形成因子ヘテロダイマー；骨形成因子−４及び骨形成因子−７からなる骨形成因子ヘテロダイマー；ＯＩＦ（Ｏｓｔｅｒｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）；骨形成因子様タンパク質などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、骨形成因子−２；骨形成因子−４；骨形成因子−２及び骨形成因子−６からなる骨形成因子ヘテロダイマーが好ましく、骨形成因子−２がより好ましい。前記骨形成因子としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６４，  １３３７７，  １９８９、特表平２−５００２４１号公報、特表平３−５０５０９８号公報、特表平４−５０２３３６号公報、特表平４−５０５１５１号公報、特開平５−８４０８１号公報、特開平５−８５９３９号公報などに詳述されている。
【００５１】
−生物種―
前記骨形成因子の生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ハムスターなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５２】
前記骨形成因子の精製としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞等の哺乳類細胞；昆虫細胞などを使用した遺伝子工学的手法を用いることができる。
【００５３】
−細胞−
前記骨形成因子活性化剤が用いられる細胞としては、例えば、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、歯根膜由来細胞などが挙げられる。
【００５４】
前記骨形成因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、形態等に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
＜形態＞
前記骨形成因子安定保持剤の形態としては、特に制限はなく、例えば、シート、ビーズ、多孔質体などが挙げられる。
前記シート状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不織布、フィルム、紙などが挙げられる。
前記ビーズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スチレンビーズ、メラミンビーズ、アクリルビーズ、アクリル−スチレンビーズ、ポリカーボネートビーズ、ポリエチレンビーズなどが挙げられる。
前記多孔質体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スポンジ、ポリエステル多孔質体、ポリカーボネート多孔質体、ポリウレタン多孔質体などが挙げられる。
前記シート、前記ビーズ、及び前記多孔質体等の支持体を容器に入れて、硫酸化ポリロタキサンを含有する溶液で前記支持体を浸し、前記支持体に骨形成因子を添加することで、前記骨形成因子を長期間安定に保持することができる。
【００５７】
前記骨形成因子活性化剤の形態としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の作用させる方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。
【００５８】
前記注射剤としては、例えば、前記骨形成因子活性化剤に、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５９】
＜作用＞
前記骨形成因子活性化剤の作用させる方法としては、特に制限はなく、例えば、前記骨形成因子活性化剤の形態、患者の状態等に応じて、局所作用、全身作用のいずれかを選択することができる。例えば、局所作用としては、例えば、腫瘍切除等による骨欠損部の再建治療、唇顎口蓋裂患者への骨増生治療や歯科用インプラント埋入前の歯槽骨萎縮部への骨増生治療などが挙げられる。
【００６０】
前記骨形成因子活性化剤の作用対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【００６１】
前記骨形成因子活性化剤の作用量としては、特に制限はなく、作用形態や、作用対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００６２】
前記骨形成因子活性化剤の作用時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記骨形成因子活性化剤の作用回数としては、特に制限はなく、作用対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【００６３】
−用途−
前記骨形成因子安定保持剤としては、例えば、前記硫酸化ポリロタキサンが骨形成因子を安定に保持することができるため、骨形成因子の保存用、カラムクロマトグラフィー等のカラム用などに好適に用いることができる。
前記骨形成因子活性化剤としては、前記硫酸化ポリロタキサンが骨形成因子を活性化することができるため、例えば、医薬用などに好適に用いることができる。
前記骨形成因子の安定保持方法としては、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させることで、骨形成因子を安定に保持することができる。前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記骨形成因子の活性化方法としては、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させることで、骨形成因子を活性化することができる。前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例、及び試験例に何ら限定されるものではない。なお、下記反応式の化合物中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記化合物では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。
【００６５】
（製造例１：硫酸化ポリロタキサン−１の製造）
線状分子として、ポリエチレングリコール（シグマ−アルドリッチ社製、数平均分子量：４，５００、以下、「ＰＥＧ」ともいう）を２０ｇ、１，１’−カルボニルイミダゾール（シグマ−アルドリッチ社製）を９．９４ｇ量り取り、ナス型フラスコへ加えた。テトラヒドロフラン（関東化学株式会社製）を２００ｍＬ加え溶解し、下記反応式１に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、ジエチルエーテルに反応溶液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。前記再沈殿の操作を２回繰り返した後に、前記沈殿物を減圧乾燥することで、両端にカルボニルイミダゾールに由来する構造単位を有するＰＥＧ（以下、「ＰＥＧ−ＣＩ」ともいう）を１４．３ｇ得た。
（反応式１）
【化１３】
2017226601.tif 000014
【００６６】
前記ＰＥＧ−ＣＩ  １３．３ｇをナス型フラスコへ加え、テトラヒドロフラン（関東化学株式会社製）を５０ｍＬ加え溶解した。エチレンジアミン（和光純薬工業株式会社）を１２．５ｍＬ滴下し、下記反応式２に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、ジエチルエーテルに反応溶液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。前記再沈殿の操作を２回繰り返した後に、前記沈殿物を減圧乾燥することで両端に一級アミノ基を有するＰＥＧ（以下、「ＰＥＧ−ＮＨ２」ともいう）を１２．８ｇ得た。
（反応式２）
【化１４】
2017226601.tif 000015
【００６７】
前記ＰＥＧ−ＮＨ２と、α−シクロデキストリン（商品名：デキシパールα−１００、塩水港精糖株式会社製、以下、「α−ＣＤ」ともいう）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した。なお、下記α−ＣＤは、前記ＣＥ基の修飾数がｘ（ｘ＝１〜６）の場合を示している。
前記α−ＣＤを４．９２ｇ量り取り広口瓶に加え、超純水１７．２ｍＬに溶解した。前記ＰＥＧ−ＮＨ２を１．０５ｇ量り取り加え、下記反応式３に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した沈殿物を凍結乾燥することで擬ポリロタキサン（以下、「擬ＰＲＸ」ともいう）を得た。
（反応式３）
【化１５】
2017226601.tif 000016
【化１６】
2017226601.tif 000017
【００６８】
前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ−ベンゾイルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン（シグマ−アルドリッチ社製）に由来する構造単位でキャッピングすることにより、複数のα−ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に封鎖基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」ともいう）を得た。
Ｎ−ベンゾイルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンを３．２ｇ、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（和光純薬工業株式会社製）（以下、「ＤＭＴ−ＭＭ」ともいう）を２．７９ｇ量り取りスクリュー管に加え、メタノール１４０ｍＬに溶解した溶液を得た。前記擬ポリロタキサンに対して、前記溶液を加え、下記反応式４に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、超純水の順で前記沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。さらに、前記沈殿物をジメチルスルホキシド（関東化学株式会社製）に溶解し、超純水に滴下することで再沈殿させた。前記再沈殿を３回繰り返すことで精製した。回収した沈殿物に少量の超純水を加え、凍結乾燥することでポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」ともいう）を３．６２ｇ得た。
（反応式４）
【化１７】
2017226601.tif 000018
【００６９】
前記ＰＲＸのα−ＣＤにカルボキシエチル基（以下、「ＣＥ基」ともいう）を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン（以下、「ＣＥ−ＰＲＸ」ともいう）を得た。
前記ＰＲＸを１５０ｍｇ量り取り、脱水ピリジン（関東化学株式会社製）１０ｍＬに溶解した。無水コハク酸（東京化成工業株式会社製）を１００ｍｇ加え、下記反応式５に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。反応後、ジエチルエーテルに反応液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。再沈殿の操作を２回繰り返した後に、減圧乾燥することで中間生成物であるＣＥ−ＰＲＸを１１６ｍｇ得た。
（反応式５）
【化１８】
2017226601.tif 000019
【００７０】
得られたＣＥ−ＰＲＸについて、重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図１に示す。プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＣＥ−ＰＲＸが下記構造式（２）で示される構造を有することが確認された。また、ＣＥ−ＰＲＸ１分子あたりのα−ＣＤの平均貫通数は２９、ＣＥ−ＰＲＸ１分子あたりのＣＥ基の修飾数は平均７７、α−ＣＤ１分子あたりのＣＥ基の修飾数は平均２．６、ＣＥ−ＰＲＸの数平均分子量は３６，９００であった。なお、下記構造式（２）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記構造式（２）では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（２）中、α−シクロデキストリンは下記式（２−Ａ）で示され、前記構造式（２）中では１個のみ記載している。前記式（２−Ａ）では、前記ＣＥ基の修飾数がｘ（ｘ＝１〜６）の場合を示している。
【００７１】
【化１９】
2017226601.tif 000020
【化２０】
2017226601.tif 000021
【００７２】
前記ＣＥ−ＰＲＸのカルボキシエチル基に以下のようにしてエチルスルホン酸（２−アミノエチルスルホン酸）に由来する構造単位を導入し、硫酸基をエチルスルホン酸基（以下、「ＳＯ３基」ともいう）として有する水溶性の硫酸化ポリロタキサン−１（以下、「ＳＯ３−ＰＲＸ−１」ともいう）を合成した。
前記ＣＥ−ＰＲＸを１１６ｍｇ量り取り、超純水を１５ｍＬ加え、水酸化ナトリウム水溶液を添加し、溶液のｐＨを７に調整した。２−アミノエチルスルホン酸（東京化成工業株式会社製）を１４８ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭを２．０４ｇ加え、下記反応式６に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、溶液を分画分子量３，５００の透析膜（商品名：スペクトラボア６、スペクトラム社製）に加え、超純水に対し３日間透析を行った。得られた溶液を凍結乾燥することでＳＯ３−ＰＲＸ−１を１５２ｍｇ得た。
（反応式６）
【化２１】
2017226601.tif 000022
【００７３】
前記ＳＯ３−ＰＲＸ−１について、重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図２に示す。なお、ＳＯ３−ＰＲＸ１分子あたりのα−ＣＤの平均貫通数は２９であり、ＳＯ３−ＰＲＸ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数は２６．１、α−ＣＤ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数は０．９０１、ＳＯ３−ＰＲＸの数平均分子量は３６，９００であった。
前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３−ＰＲＸ−１が下記構造式（１−Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。なお、下記構造式（１−Ａ）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記構造式（１−Ａ）では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（１−Ａ）中、α−ＣＤは下記式（Ａ）で示され、前記構造式（１−Ａ）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ＳＯ３基の修飾がｘ（ｘ＝１〜６）の場合を示している。
【化２２】
2017226601.tif 000023
【化２３】
2017226601.tif 000024
【００７４】
（製造例２、及び製造例３：硫酸化ポリロタキサン−２、及び硫酸化ポリロタキサン−３の製造）
製造例１と同様にして、無水コハク酸、２−アミノエチルスルホン酸の添加量を変化させることでＳＯ３−ＰＲＸ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数の異なる硫酸化ポリロタキサン−２（以下、「ＳＯ３−ＰＲＸ−２」ともいう）、及び硫酸化ポリロタキサン−３（以下、「ＳＯ３−ＰＲＸ−３」ともいう）を合成した。得られたＳＯ３−ＰＲＸ−２、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３について、前記プロトン核磁気共鳴スペクトルを用いて、重水中で５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定した。ＳＯ３−ＰＲＸ−２のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図３、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図４に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３−ＰＲＸ−２、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３が前記構造式（１−Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。
【００７５】
（製造例４：硫酸化ポリロタキサン−４の製造）
硫酸化ポリロタキサン−４（以下、「ＳＯ３−ＰＲＸ−４」ともいう）について、ＰＥＧを数平均分子量９，８００のポリエチレングリコール（シグマ−アルドリッチ社製）を軸ポリマーの原料として使用した以外は、製造例１と同様にして、ＳＯ３−ＰＲＸ−４を得た。
得られたＳＯ３−ＰＲＸ−４について、前記プロトン核磁気共鳴装置を用いて、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルを重水中で測定した。ＳＯ３−ＰＲＸ−４のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図５に示す。
前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３−ＰＲＸ−４が前記構造式（１−Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。
【００７６】
【表１】
2017226601.tif 000025
【００７７】
（試験例１：アルカリフォスファターゼ活性化試験）
マウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞（独立行政法人理化学研究所  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）、以下、「ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞」ともいう）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ウエルプレートに播種した。２４時間後、前記２４ウエルプレートに、リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」ともいう）を希釈溶液として、ヒトリコンビナントＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ（ＨＵＭＡＮＺＹＭＥ社製）と以下の試料とを３７℃で２時間接触させた溶液を滴下した。７２時間培養後に各ウエルをＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝溶液（和光純薬工業株式会社製）を０．２ｍＬ加えてタンパク質を抽出した。骨形成初期マーカーであるアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」ともいう）産生量を商品名：Ｌａｂ  Ａｓｓａｙ  ＡＬＰ（和光純薬工業株式会社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、ＡＬＰ産生量を定量した。また、タンパク質抽出量は商品名：Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて５６０ｎｍの吸光度をプレートリーダで測定し、総タンパク質を定量した。また、コントロール群として、ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ単体を使用し、前記ＢＭＰ−２のＡＬＰ活性量（ＡＬＰ産生量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（μｇ））を１とした場合のＢＭＰ−２のＡＬＰ活性量に対する各ＡＬＰ活性量（倍）を算出した。結果を図６に示す。
＜試料＞
（１）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ
（２）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ
（３）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
（４）ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ
（５）ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
【００７８】
図６に示すように、ＢＭＰ−２にＳＯ３−ＰＲＸ−１を複合化させることによって、ＢＭＰ−２単体よりもＡＬＰ活性が多く、成長因子活性が亢進されたことが示唆された。また、ヘパリン単体、ＳＯ３−ＰＲＸ−１単体ではＡＬＰ活性の向上は確認されなかったことより、ＢＭＰ−２と、ヘパリン又は硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成によりＡＬＰ活性を向上できることが示唆された。
【００７９】
（試験例２：アルカリフォスファターゼ染色試験）
前記試験例１で使用した試料について、前記試験例１と同様の操作により、各試料を７２時間培養後、培養液を除去し、ＰＢＳでウエルを２回洗浄した。次に、４％中性緩衝ホルムアルデヒド液を滴下し、１０分間静置した後、ＰＢＳでウエルを２回洗浄した。次に、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩（シグマ−アルドリッチ社製）が０．１ｍｇ／ｍＬ、及びレッドバイオレットＬＢ塩（シグマ−アルドリッチ社製）が０．６ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した０．２Ｍトリス塩酸緩衝溶液を各ウエルに０．５ｍＬずつ滴下し、１５分間静置した。次に、ＰＢＳでウエルを２回洗浄し、基質の着色を目視で観察した。結果を図７に示す。なお、前記試料を含有しない未処理群として、ＰＢＳにおける基質の着色を図７の左に示す。
【００８０】
図７に示すように、ＢＭＰ−２とＳＯ３−ＰＲＸ−１を複合化させた試料のウエルにおいては、ＢＭＰ−２のウエルよりも溶液の着色が強く、ＢＭＰ−２単体よりもＡＬＰの活性が亢進されていることが分かる。また、ヘパリン単体、ＳＯ３−ＰＲＸ−１単体では未処理群と着色の程度が同等であり、ＢＭＰ−２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成によりＡＬＰ活性を向上できることが示唆された。
【００８１】
（試験例３：様々な構造の硫酸化ポリロタキサンを使用した場合のアルカリフォスファターゼ活性化試験）
ＳＯ３−ＰＲＸの化学構造がＢＭＰ−２による骨分誘導に与える影響を調べるため以下の試験を行った。前記試験例１で使用した試料を以下の試料に変更した以外は、試験例１と同様にＡＬＰ活性量を定量した。前記試験例１と同様に前記ＢＭＰ−２のＡＬＰ活性量（ＡＬＰ産生量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（μｇ））を１とした場合のＢＭＰ−２のＡＬＰ活性量に対する各ＡＬＰ活性量（倍）を算出した。結果を図８に示す。
＜試料＞
（１）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ
（２）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ
（３）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １０μｇ／ｍＬ
（４）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １００μｇ／ｍＬ
（５）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
（６）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−２  １０μｇ／ｍＬ
（７）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−２  １００μｇ／ｍＬ
（８）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−２  １，０００μｇ／ｍＬ
（９）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−３  １００μｇ／ｍＬ
（１０）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−３  １，０００μｇ／ｍＬ
（１１）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−４  １０μｇ／ｍＬ
【００８２】
図８に示すように、ＳＯ３−ＰＲＸ−１、ＳＯ３−ＰＲＸ−２、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３添加群では硫酸化ポリロタキサンの添加量を増加することで、ヘパリンより有意に高い活性を示すことが示唆された。また、ＳＯ３−ＰＲＸ−１、ＳＯ３−ＰＲＸ−２、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３は、硫酸化ポリロタキサンの添加量が少なくても、ヘパリンと同等以上の活性を有しているため、抗凝固作用を有するヘパリンに代えて使用することができることが示唆された。ＳＯ３−ＰＲＸ−１、ＳＯ３−ＰＲＸ−２、及びＳＯ３−ＰＲＸ−３添加群の比較より、硫酸化ポリロタキサン１分子中に修飾された硫酸基数はＡＬＰ活性の向上に大きく影響せず、いずれの硫酸基修飾数においてもＡＬＰ活性が亢進されることが示唆された。また、軸ポリマーの分子量が異なるＳＯ３−ＰＲＸ−４の添加にＡＬＰ活性の向上が確認された。
【００８３】
（試験例４：ＢＭＰ−２の含有量を変更した場合のアルカリフォスファターゼ活性化試験）
ＢＭＰ−２の含有量を以下の試料のように変更したこと以外は、試験例１と同様にＡＬＰ活性量を定量した。結果を図９に示す。
＜試料＞
（１）ＢＭＰ−２  ２５ｎｇ／ｍＬ
（２）ＢＭＰ−２  ２５ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
（３）ＢＭＰ−２  ５０ｎｇ／ｍＬ
（４）ＢＭＰ−２  ５０ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
（５）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ
（６）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
【００８４】
図９に示すように、硫酸化ポリロタキサンを含有する試料では、ＢＭＰ−２単体の試料と比較して、ＡＬＰ活性が亢進されることが示唆された。また、ＢＭＰ−２  ５０ｎｇ／ｍＬと、ＢＭＰ−２  ２５ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬとのＡＬＰ活性は同等であったことより、硫酸化ポリロタキサン添加により骨再生におけるＢＭＰ−２の使用量を低下できることが示唆された。
【００８５】
（試験例５：ＢＭＰ−２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成の評価）
ＢＭＰ−２と硫酸化ポリロタキサンが静電相互作用による複合体を形成した場合、ＢＭＰ−２と硫酸化ポリロタキサンで覆われると考えられる。そこで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（商品名：ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を用いて、以下のようにしてＢＭＰ−２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成を抗体との結合量変化より評価した。
ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートの各ウエルに、Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液を１μｇ／ｍＬずつ滴下し、室温にて一晩静置した。翌日、前記溶液を除去し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）でプレートを４回洗浄したのち、Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を３００μＬずつ滴下、室温にて１時間静置した。１時間後、前記溶液を吸引し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。次に、各ウエルに、以下の試料を添加し、室温で２時間静置した後、前記溶液を除去して、ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。その後、ＢＭＰ−２標識のＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液を各ウエルに滴下し、室温で１時間、静置した。前記溶液を除去し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）でプレートを４回洗浄し、基質溶媒を添加することで発色させ、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）で測定した。結果を図１０に示す。ＢＭＰ−２単体での検出吸光度を１００％とした場合の、各試料の吸光度の減少率により、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−２抗体と結合率を評価することができる。すなわち、ＢＭＰ−２が複合体を形成することにより抗体認識部位が覆われるため、ＢＭＰ−２への抗体結合量が減少すると推測されることから、前記検出蛍光強度の減少率が大きいほど、ＢＭＰ−２表面の被覆率が高く、複合体の形成を推測できる。
＜試薬＞
（１）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ
（２）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ
（３）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
【００８６】
図１０に示すように、ＢＭＰ−２とヘパリンとの複合体では、検出吸光度の減少が約１０％であった。一方、ＢＭＰ−２とＳＯ３−ＰＲＸとの複合体では、検出蛍光強度の減少が約５０％であった。以上の結果から、ＳＯ３−ＰＲＸは、ヘパリンよりもＢＭＰ−２表面の被覆率が高いため抗体との結合量が減少したと考えられる。よってＳＯ３−ＰＲＸは、ヘパリンよりもＢＭＰ−２と強く相互作用し複合体を形成するが示唆された。
【００８７】
（試験例６：ＢＭＰ−２阻害剤共存下での成長因子活性の評価）
前記試験例１と同様にＢＭＰ−２阻害剤であるＮｏｇｇｉｎ共存下でのＡＬＰ活性量を定量した。前記試験例１と同様にＡＬＰ活性を評価し、Ｎｏｇｇｉｎ無添加群のＡＬＰ産生量を１００％としたときの相対値で算出した。
＜試薬＞
（１）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ
（２）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  ５０ｎｇ／ｍＬ
（３）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  １００ｎｇ／ｍＬ
（４）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ
（５）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  ５０ｎｇ／ｍＬ  ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ  
（６）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  １００ｎｇ／ｍＬ＋  ヘパリン  １，０００μｇ／ｍＬ  
（７）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ
（８）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  ５０ｎｇ／ｍＬ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ  
（９）ＢＭＰ−２  １００ｎｇ／ｍＬ  ＋  Ｎｏｇｇｉｎ  １００ｎｇ／ｍＬ＋  ＳＯ３−ＰＲＸ−１  １，０００μｇ／ｍＬ  
【００８８】
図１１に示すように、ＢＭＰ−２阻害作用を有するＮｏｇｇｉｎを培地中に添加することでＡＬＰ産生量はＮｏｇｇｉｎ濃度依存的に減少した。一方、ＳＯ３−ＰＲＸとＢＭＰ−２との複合体では、ヘパリンとＢＭＰ−２との複合体よりも、Ｎｏｇｇｉｎ添加時のＡＬＰ産生量が高いことが分かる。本結果は、ＳＯ３−ＰＲＸが、ＢＭＰ−２とＮｏｇｇｉｎとの相互作用を阻害することができることが分かる。
【００８９】
（試験例７：硫酸化ポリロタキサンの細胞毒性の評価）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（独立行政法人理化学研究所  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）を用い、以下のようにして硫酸化ポリロタキサンの細胞毒性を評価した。
前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を９６ウエルプレートに播種し（細胞数：１×１０４個／９０μＬ／ウエル）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ社製）を含むイーグル最小必須培地（シグマ−アルドリッチ社製）中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９０μＬのイーグル最小必須培地に交換後、下記試料を１，０００μｇ／ｍＬの濃度で各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、商品名：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁堂製）を１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。その後、プレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、試料の代わりにリン酸緩衝溶液を添加した細胞の吸光度を細胞生存率１００％として、以下のようにして細胞生存率（％）を算出した。結果を図１２に示す。
＜試料＞
（１）ヘパリン
（２）ＳＯ３−ＰＲＸ−１（製造例１で作製）
（３）ＳＯ３−ＰＲＸ−２（製造例２で作製）
＜細胞生存率の算出方法＞
細胞生存率（％）＝〔｛（試料を添加し、培養した細胞の吸光度）−（培養液のみの吸光度）｝／{（リン酸緩衝溶液を添加し、培養した細胞の吸光度）−（培養液のみの吸光度）}〕×１００
【００９０】
図１２中、「□」は「ヘパリン」の結果を示し、「△」は「ＳＯ３−ＰＲＸ−１」の結果を示し、「×」は「ＳＯ３−ＰＲＸ−２」の結果を示す。
図１２に示すように、ＳＯ３−ＰＲＸ−１、及びＳＯ３−ＰＲＸ−２は１６８時間の培養後も細胞生存率の低下を示さないのに対し、ヘパリンは細胞生存率の低下を示すことが明らかとなった。
この結果から、硫酸化ポリロタキサンは、細胞毒性の点から、ヘパリンよりも安全であることが示唆された。
【００９１】
以上の結果から、硫酸化ポリロタキサンは、骨形成因子と複合体を形成して、骨形成因子を安定に保持することができることが分かった。
また、硫酸化ポリロタキサンは、骨形成因子と複合体を形成して、骨形成因子を活性化することができることが分かった。
【００９２】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤である。
＜２＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤である。
＜３＞  骨形成因子が、骨形成因子−２である前記＜２＞に記載の骨形成因子活性化剤である。
＜４＞  硫酸化ポリロタキサン中の環状分子が、α−シクロデキストリンであり、
硫酸化ポリロタキサン中の線状分子が、ポリエチレングリコールである前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
＜５＞  硫酸化ポリロタキサンが、下記一般式（Ｉ）で示される化合物である前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
【化２４】
2017226601.tif 000026
【化２５】
2017226601.tif 000027
（但し、前記一般式（Ｉ）、及び前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、又はエーテル結合（−Ｏ−）を示し、ｍは、０〜２０の整数を示し、ｎは、１０〜２５，０００の整数を示し、ｘは、１〜６の整数を示す）
＜６＞  硫酸化ポリロタキサン中の線状分子の数平均分子量が、５００〜６，０００である前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
＜７＞  硫酸化ポリロタキサンの環状分子中の硫酸基の平均修飾数が、硫酸化ポリロタキサンの環状分子１分子に対して、０．５〜１である前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
＜８＞  硫酸化ポリロタキサンの含有量が、骨形成因子全量に対して、１，０００倍〜１０，０００倍である前記＜２＞から＜７＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
＜９＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法である。
＜１０＞  硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法である。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子の安定保持方法では、硫酸化ポリロタキサンを含有することにより、骨形成因子を安定に保持することができるため、骨形成因子の保存用、カラムクロマトグラフィー等のカラム用などに好適に利用することができる。
また、本発明の骨形成因子活性化剤、及び骨形成因子の活性化方法では、硫酸化ポリロタキサンを含有することにより、骨形成因子を活性化することができるため、薬効の持続性、作用量や作用回数の低減も期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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