(57)【要約】【課題】細胞のアポトーシスを誘導することによって老化を促進するｐ５３の発現を抑制する医薬品、または医薬部外品、または化粧品を提供する。【解決手段】  レスベラトロールを含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールを有効成分とするｐ５３発現抑制剤。
【請求項２】
ｐ５３発現抑制剤がｐ５３のリン酸化を抑制することを特徴とする請求項１記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項３】
ｐ５３発現抑制剤が抑制するｐ５３が皮膚に存在することを特徴とする請求項１または２記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項４】
ｐ５３発現抑制剤が抑制するｐ５３が表皮角化細胞に存在することを特徴とする請求項１〜３記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項５】
ｐ５３発現抑制剤が抑制するｐ５３が真皮線維芽細胞に存在することを特徴とする請求項１〜３記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項６】
ｐ５３発現抑制剤が抑制するｐ５３がメラノサイトに存在することを特徴とする請求項１〜３記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項７】
ｐ５３発現抑制剤が皮膚外用剤であることを特徴とする請求項１〜６に記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項８】
ｐ５３発現抑制剤の効能、効果が皮膚の弾力性を保つことを特徴とする請求項１〜７に記載のｐ５３発現抑制剤。
【請求項９】
ｐ５３発現抑制剤の効能、効果が皮膚のキメを保つことを特徴とする請求項１〜７に記載のｐ５３発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はｐ５３の発現を抑制することにより、細胞機能を調節するｐ５３発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  細胞が正常に活動するためには、細胞機能が正しく働くことが必要であり、その機能を調節するために数多くのたんぱくが関与している。従って、適切なたんぱくに働き掛け、その発現と活性を制御することは、生体を正常に維持する上で極めて重要である。
一方、生体が全体として恒常性を維持していくためには異常化してしまった細胞を除去することが必須といわれている。そのために極めて重要な機能の一つにアポトーシスがある。このアポトーシスには多くのたんぱくが関与しているが、なかでも重要なものの一つにｐ５３がある。ｐ５３はがん抑制遺伝子と言われ、正常に機能することで生体をがんから守ることが知られているが、ｐ５３は生理作用の異なる様々な下流遺伝子群を転写活性化することから、がん抑制以外にも解糖系や活性酸素の調節、ミトコンドリアでの呼吸・エネルギー代謝、オートファジーなど多彩な生理機能を持つことが分かってきている（非特許文献１）。これらのことから、ｐ５３の発現や活性を調節することは生体の機能を調節するために極めて重要である。ｐ５３はリン酸化やアセチル化など様々な翻訳後修飾を受けることによりその発現や活性が制御されている。
ｐ５３の標的因子としてはＰＯＭＣやエンドセリン−１、ＳＣＦなどメラニン産生に関与する因子やｐ２１やＢａｘ、Ｆａｓなどアポトーシスや細胞老化に関与する因子が同定されていることから、ｐ５３の働きを抑制することはメラニンの産生や細胞老化を抑制することにつながる。【０００３】  生体を守るために皮膚は重要な働きを示している。しかし、皮膚は外部から様々な刺激を受け、損傷を受けることが少なくない。
そのような刺激の中でも注目されているのは紫外線である。紫外線は様々な影響を皮膚に与えるが、その中でも紫外線によってアポトーシスが亢進しすぎると、皮膚の老化を促し、さまざまな悪影響が現れると考えられている（非特許文献２）。癌化細胞においてはアポトーシスや細胞老化は有用であるが、正常細胞においてはアポトーシスや細胞老化が抑制されることが望ましい。つまりｐ５３の発現・活性が抑制されることが望ましい。
以上のことから、ｐ５３の発現・活性を抑制できる物質は非常に有用であることが考えられる。しかしながら現在までのところ、このような発現・活性抑制効果が高く、且つ安全性も高く、皮膚外用剤などの成分として利用が可能な成分は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。【０００４】  一方、レスベラトロールはブドウ果皮や赤ワイン、ピーナッツ果皮などに含まれる植物性ポリフェノールの一種で抗ガン作用（非特許文献３）や抗炎症作用（非特許文献４）、神経保護作用（非特許文献５）などを有することが報告されている。また、抗老化に関わる薬剤が幅広く探求されており、レスベラトロールはＳｉｒｔ１を活性化することにより抗老化効果を示すことが知られている（非特許文献６）。しかし、レスベラトロールが皮膚の細胞においてｐ５３の発現を抑制することはこれまで知られていなかった。【０００５】  我々は、皮膚細胞のアポトーシスに着目し、抗老化に関与する化合物とｐ５３との作用を検討したところ、レスベラトロールがｐ５３発現を抑制し、皮膚の恒常性の調節に働き、特に、紫外線照射に対する皮膚の劣化を抑制することを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【０００６】
【非特許文献１】生化学  第８２巻  第３号  ｐｐ．２００−２０９，２０１０
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１３，１４，６４１４−６４３５
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７，２７５，２１８−２２０
【非特許文献４】Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．２００９，５９，３３０−３３７
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５，２８０，４０３６４−４０３７４
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ．２００６，４４４，３３７−３４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の課題は細胞のアポトーシスを誘導することによって老化を促進するｐ５３の発現を抑制する医薬品、または医薬部外品、または化粧品、または食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、レスベラトロールがｐ５３の発現および活性を抑制する作用を有することを見出した。
前記の目的はレスベラトロールを含有することを特徴とするｐ５３発現抑制剤によって達成された。
【発明の効果】
【０００９】  本発明のｐ５３発現抑制剤は、皮膚中のｐ５３発現を抑制し、皮膚の弾力性を保つとともにハリを保つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明においては、発現抑制とは、タンパク質の発現を抑制することで量的活性を低下させる等、機能のネガティブ方向への調節を表すものである。【００１１】  本発明で用いられるレスベラトロールは３，５，４’−トリヒドロキシスチルベンとその誘導体を表し、二重結合は、シスでもトランスでもよく、シスとトランスの混合物でもよい。
レスベラトロール分子内の水酸基は置換されていてもよい。その置換基は、酢酸基、ブチル基のような飽和のエステル基でもよく、安息香酸基、ケイ皮酸基のような芳香族エステル基でもよく、そのエステル基がさらに置換された乳酸エステルや没食子酸エステルでもよい。レスベラトロール分子内の水酸基の置換基は、メチルエーテルなどのエーテル基でもよい。レスベラトロール分子内の水酸基の置換基は、オリゴ糖などの配糖体でもよい。【００１２】  本発明で用いられるレスベラトロールは、有機化学的または発酵によって製造されるレスベラトロールのほか、ブドウなどの植物から抽出されたものでもよく、抽出法については公知の方法が利用できる（特許文献１）。本発明で用いられる最も望ましいレスベラトロールは３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンである。【００１３】  レスベラトロールは、生体がＵＶＢに曝される際、ＵＶＢ照射前、照射後に生体に接触させることにより、ＵＶＢ照射によって誘導されるｐ５３タンパク質発現を抑制する。【００１４】  本発明で発現抑制するｐ５３は生体におけるいずれの組織・器官・細胞に存在するものでもよいが、より高い効果が期待されるのは、皮膚であり、皮膚を構成する細胞である表皮角化細胞・メラノサイト・真皮線維芽細胞であり、より望ましくは表皮角化細胞である。【００１５】  本発明のレスベラトロールを含有するｐ５３発現抑制剤はｐ５３の発現を抑制することで皮膚のたるみ・弾力低下などの皮膚老化を抑制するもので、化粧品や医薬部外品等に配合して外用剤として使用することが望ましいが、食品や医薬品、医薬部外品等に配合して経口摂取してもよい。【００１６】  本発明のｐ５３発現抑制剤を皮膚外用剤として用いる場合、レスベラトロールを水溶性の溶剤に溶解したのち、水で希釈した水溶液として塗付することもできるし、医薬品または医薬部外品または化粧品として一般に使われているようなクリームとして塗付することもできる。【００１７】  使用方法としては、紫外線照射によって誘導されるｐ５３の発現を抑制するためには、紫外線に当たる前に皮膚に塗布し、紫外線に当たった後にも塗布することが望ましい。
【先行技術文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０１４−２４８０８
【００１９】  以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】  （ｐ５３発現抑制作用確認試験）
成人由来正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を、ＣＯ２インキュベータ（３７  ℃，５％ＣＯ２）内でケラチノサイト無血清培地（Ｋｅｒａｔｉｏｎｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｋｉｔ  Ｃｅｌｌ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｃａｔ．Ｎｏ．１３１Ｋ−５００ａ）を用いて培養した。ＮＨＥＫ細胞を６０  ｍｍ  ｄｉｓｈ  に均等に播種してコンフルエントの状態まで培養した後、レスベラトロール（Ｒ５０１０−１００ＭＧ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）  ０，  ５，  １０，  ２５μｇ／ｍＬを含む培地に置換して更に２４時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）に置換して２５  ｍＪ／ｃｍ２の強さで細胞にＵＶＢ照射を行った。照射後、ただちにレスベラトロール  ０，  ５，  １０，  ２５μｇ／ｍＬを含む培地に置換し、更に２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳ（−）で洗ったのち、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．４），１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％  ＮＰ−４０，  １％  デオキシコール酸Ｎａ，  ０．１％ＳＤＳ，  ５０  ｍＭ  ＮａＦ，  １０μｇ／ｍＬ  アプロチニン，  １０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン，  １  ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，  １  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を５０  μＬ添加し、氷上でセルスクレイパーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕液をウェスタンブロット用泳動サンプルとした。【００２１】  アクリルアミドを７．５％含む分離ゲル及び濃縮ゲルをそれぞれ作製し、ゲル１枚あたり４０ｍＡの定電流、還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。その後、このゲルとＰＶＤＦ膜を転写装置にセットし、ゲル内のタンパク質を電気化学的にＰＶＤＦ膜に転写した。転写条件は、ＰＶＤＦ膜１枚あたり１５０ｍＡの定電流で１５０分間実施した。転写された膜を４％スキムミルクを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−）（ｐＨ７．５）（ＰＢＳＴ）に浸し、一晩ブロッキングを行った。【００２２】  １次抗体ｐ５３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ＤＯ−１）（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ）を１％スキムミルクを含むＰＢＳＴに希釈し、その溶液にＰＶＤＦ膜を漬けて、１時間室温で振とうさせた。その後、適量のＰＢＳＴで５分間５回洗浄した。次に、ＰＶＤＦ膜を１％スキムミルクを含むＰＢＳＴで希釈した２次抗体Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に漬け、１時間室温で振とうさせた。その後、再び洗浄工程を５回繰り返した。洗浄工程後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＲＰＮ２２３２，Ａｍｅｒｓｈａｍ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））  に５分間浸漬したのち、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  を使用して、化学発光法によりｐ５３タンパク質の検出を行った。【００２３】  検出されたバンド強度を数値化し、レスベラトロール非添加時のｐ５３の発現を全て抑えた場合を抑制率１００％として、各サンプル添加時の抑制率を算出した。その結果、表１に示す通り、レスベラトロールの濃度依存的にｐ５３のタンパク質発���の抑制が認められた。【００２４】
【表１】
2017039684.tif 000002
【実施例２】
【００２５】  （ｐ５３リン酸化抑制作用確認試験）
ヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ細胞）を、ＣＯ２インキュベータ（３７℃，５％ＣＯ２）内でＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ  Ｄ６４２９，  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）  を用いて培養した。ＨａＣａＴ細胞を６０  ｍｍ  ｄｉｓｈ  に均等に播種してコンフルエントの状態まで培養した後、レスベラトロール（Ｒ５０１０−１００ＭＧ，  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）  ０，  ２５μｇ／ｍＬを含む培地に置換して更に２４時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）に置換して２５  ｍＪ／ｃｍ２の強さで細胞にＵＶＢ照射を行った。照射後、ただちにレスベラトロール  ０，  ２５μｇ／ｍＬを含む培地に置換し、更に２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳ（−）で洗ったのち、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．４），  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％  ＮＰ−４０，  １％デオキシコール酸Ｎａ，  ０．１％ＳＤＳ，  ５０  ｍＭ  ＮａＦ，  １０μｇ／ｍＬ  アプロチニン，  １０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン，  １  ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，  １  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ５  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を５０  μＬ添加し、氷上でセルスクレイパーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕液をウェスタンブロット用泳動サンプルとした。【００２６】  アクリルアミドを７．５％含む分離ゲル及び濃縮ゲルをそれぞれ作製し、ゲル１枚あたり４０ｍＡの定電流、還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。その後、このゲルとＰＶＤＦ膜を転写装置にセットし、ゲル内のタンパク質を電気化学的にＰＶＤＦ膜に転写した。転写条件は、ＰＶＤＦ膜１枚あたり１５０ｍＡの定電流で１５０分間実施した。転写された膜を４％スキムミルクを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−）（ｐＨ７．５）（ＰＢＳＴ）に浸し、一晩ブロッキングを行った。【００２７】  １次抗体Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）  ａｎｔｉｂｏｄｙ（＃９２８４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１％スキムミルクを含むＰＢＳＴに希釈し、その溶液にＰＶＤＦ膜を漬けて、１時間室温で振とうさせた。その後、適量のＰＢＳＴで５分間５回洗浄した。次に、ＰＶＤＦ膜を１％スキムミルクを含むＰＢＳＴで希釈した２次抗体ＨＲＰ−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（６５−６１２０，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に漬け、１時間室温で振とうさせた。その後、再び洗浄工程を５回繰り返した。洗浄工程後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＲＰＮ２２３２，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））  に５分間浸漬したのち、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  を使用して、化学発光法によりリン酸化ｐ５３タンパク質の検出を行った。【００２８】  検出されたバンド強度を数値化し、レスベラトロール非添加時のｐ５３のリン酸化を全て抑えた場合を抑制率１００％として、レスベラトロール添加時の抑制率を算出した。その結果、表２に示す通り、レスベラトロール添加によりｐ５３リン酸化の抑制が認められた。【００２９】
【表２】
2017039684.tif 000003
【実施例３】
【００３０】  （皮膚外用剤の調製）
以下の実施例３および比較例３における表内の配合量は特に断らない限り重量％を示す。
皮膚用クリームの調製（表３、実施例３）
（１）流動パラフィン                                    ６．０（重量％）
（２）ミリスチン酸イソプロピル                          ３．０
（３）シクロヘキサン                                    ２．５
（４）ジメチコン                                        ２．０
（５）ベヘニルアルコール                                ３．４
（６）ワセリン                                          ２．０
（７）ステアリン酸ソルビタン                            １．５
（８）セテス−２０                                      ３．４
（９）トコフェロール                                    ０．０２
（１０）クエン酸                                        ０．０５
（１１）１，３−ブチレングリコール                      １．０
（１２）メチルパラベン                                  ０．１５
（１３）プロピルパラベン                                ０．０７
（１４）ジプロピレングリコール                          １．９
（１５）レスベラトロール                                ０．０２
（１６）精製水                                            残部【００３１】  （製造方法）
上記原料（１）〜（９）、（１５）を混合し、遮光し、８０℃で加熱撹拌した。・・・油相
他方、（１０）〜（１４）、（１６）を混合し、８０℃で加熱撹拌した。・・・水相
遮光した状態で８０℃で油相を撹拌しながら、水相を添加し、ホモジナイザーで均一に乳化した。全行程は、遮光して行うのが望ましく、また、遮光して保存することが望ましい。【００３２】  （比較用クリーム（表３、比較例３）の調製）
前述の皮膚用クリームの調製と、レスベラトロールを加えないことを除けば全く同様にして、比較用クリーム（表３、比較例３）を製造した。製造時と保存時の遮光も、実施例と全く同様にした。【００３３】    （皮膚外用剤の効果確認試験）
２０代から５０代までのボランティア女性によって、実施例３と比較例３（対照群）とで、あまり年代に偏りのない評価パネルを実施例１４人（平均年齢３８歳）、比較例１３人（平均年齢３５歳）で構成した。【００３４】  調製した実施例３のクリームと比較例３のクリームを両目下部に塗った以外は普段と同じ化粧をし、普段と同じ生活を８週間行った。ただし、意図的な日光浴など、紫外線に激しく晒される行動は避けた。【００３５】  肌の弾力について、試験終了後の両目下部の肌状態について、パネルメンバーにアンケートを依頼し、結果を集計した。
肌のキメについて、試験開始前と終了後にテープストリッピング法（非特許文献７）で両目下部の角層最外層を採取し、前後の状態変化を調べた。
パネルには、試験の目的を説明し、日光浴を避けるなどの注意事項を周知したが、各メンバーが実施例に相当するか比較例に相当するかは明かさなかった。
【先行技術文献】
【００３６】
【非特許文献７】Ｊ．  Ｓｏｃ．  Ｃｏｓｍｅｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｊａｐａｎ，  Ｖｏｌ．  ２３，  Ｎｏ．  １，  ５５‐５７  （１９８９）
【００３７】  両目下部の皮膚を何度か軽く押し、跳ね返る強さについて、試験前後の変化について評点し、肌の弾力性の評価を行った。
（５段階評定基準）
評点２：  試験後の方が跳ね返ってくる。
評点１：  試験後の方が跳ね返ってくる気がする。
評点０：  試験前後で変化は感じられない。
評点−１：  試験後の方が跳ね返ってこない気がする。
評点−２：  試験後の方が跳ね返ってこない。
（弾力性の判定基準）
○：  パネルの平均点が０．５以上。
△：  パネルの平均点が−０．５以上０．５未満。
×：  パネルの平均点が−０．５点未満。
【００３８】  肌のキメの評価は以下の様に行った。
角層標本の観察面積は２．４平方ｃｍとした。
一標本当り、重なり合っていない角層細胞のうち、大きい方から５個の細胞を選び、その面積の総和を測定した。
各人について、試験前後の総和の比を計算した。一般に、角層面積が大きいほどキメがよいと判断される。
【００３９】  結果を表３に示した。
実施例３では弾力性とキメについて改善効果が認められた。また、何ら負の差異は認められなかった。
【００４０】
【表３】
2017039684.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４１】  細胞のアポトーシスを誘導することによって老化を促進するｐ５３の発現を抑制する医薬品、または医薬部外品、または化粧品等に利用できる。