(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬の新たなスクリーニング方法を提供する。【解決手段】変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を選択する工程を含む、骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬のスクリーニング方法。変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化の阻害が、変異型ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬとの相互作用の阻害、変異型ＣＡＬＲタンパク質の２量化の阻害又はｃ−ＭＰＬの活性化に関する構造的な変化の阻害であるスクリーニング方法。また、変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を有効成分とする骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を選択する工程を含む、骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化の阻害が、変異型ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬとの相互作用の阻害、変異型ＣＡＬＲタンパク質の２量化の阻害又はｃ−ＭＰＬの活性化に関する構造的な変化の阻害である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を有効成分とする骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄増殖性腫瘍の発生メカニズムの解明及びその予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄増殖性腫瘍（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：ＭＰＮ）は、骨髄において血球細胞あるいは線維芽細胞が異常に増殖する疾患であり、真性多血症、慢性骨髄性白血病、真性多血症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症、及び慢性骨髄増殖性腫瘍が含まれる。これらの腫瘍のうち、例えば慢性骨髄性白血病の治療法としては、異常なフィラデルフィア染色体をターゲットとしたＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害薬であるイマチニブメシル酸塩、ダサチニブ、ニロチニブ、があり、他のＭＰＮの治療法としては、インターフェロンα、ハイドロキシウレア、造血幹細胞移植等がある。
【０００３】
しかしながら、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害薬の適用されないフィラデルフィア陰性骨髄増殖性腫瘍患者では、造血幹細胞移植療法以外の治療薬では十分に効果を奏さない場合も多く、新たな治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
一方、フィラデルフィア染色体陰性骨髄増殖性腫瘍（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｎｅｇａｔｉｖｅｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ＭＰＮｓ）患者の一部では、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＣＡＬＲ）遺伝子の第９エクソンに、塩基欠失や挿入が見出される（非特許文献１、２）。この遺伝子変異は、フレームシフトを引き起こし、ＣＡＬＲタンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸配列を、野生型から変異型に置換する。このようにして生じる変異型ＣＡＬＲタンパク質を、ＩＬ−３依存性に増殖するマウスのリンパ球性白血病細胞株において発現させると、ＩＬ−３非依存的に増殖することが示された。このことから、変異ＣＡＬＲタンパク質が、ＩＬ−３非依存的なＩＬ−３受容体の活性化を引き起こしていることが示唆されていた（非特許文献１）。しかし、ＭＰＮの発症とＩＬ−３受容体活性化との関連が見いだされないことなどから、変異ＣＡＬＲタンパク質によるＭＰＮ発症は、ＩＬ−３受容体の活性化とは異なる分子メカニズムであると考えられていたが、その詳細なメカニズムは全く不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９，２３７９−２３９０（２０１３）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９，２３９１−２４０５（２０１３）
【非特許文献３】Ｂｌｏｏｄ  ８７，４５５２−４５６０（１９９６）
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４，１２４９７８３（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、骨髄増殖性腫瘍の新たな発生メカニズムの解明及びその予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、変異ＣＡＬＲタンパク質とＭＰＮとの関係について種々検討してきたところ、ヒト巨核芽球性白血病細胞株を用いた解析を行い、変異ＣＡＬＲタンパク質の発現が、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）受容体であるｃ−ＭＰＬ（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合することで、ＴＰＯ非依存的に活性化し、ＪＡＫ２をはじめとする下流のシグナル伝達系の活性化を引き起こすことで、サイトカイン非依存性の細胞増殖を惹起していることを見出した。このような変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化は、変異ＣＡＬＲタンパク質のｃ−ＭＰＬに対する特異的な結合と、変異ＣＡＬＲタンパク質間の相互作用により生じる、ｃ−ＭＰＬとＪＡＫ２を含めたタンパク質の構造変化により引き起こされることも明らかにした。これらの知見は、これまでにＭＰＮ患者の巨核球における異常な活性化の観察と合致する。これらのことから、このような変異ＣＡＬＲタンパク質により引き起こされるｃ−ＭＰＬの活性化の阻害を標的とすれば、ＭＰＮの治療薬をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を選択する工程を含む、骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬のスクリーニング方法。
〔２〕変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化の阻害が、変異型ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬとの相互作用の阻害、変異型ＣＡＬＲタンパク質の２量化の阻害又はｃ−ＭＰＬの活性化に関する構造的な変化の阻害である〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔３〕変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を有効成分とする骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新たな作用機序によるＭＰＮの予防又は治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＣＡＬＲタンパク質の変異の例を示す。
【図２】変異ＣＡＬＲタンパク質によるサイトカイン非依存性細胞と増殖の惹起を示す。
【図３】変異ＣＡＬＲタンパク質依存的な細胞増殖におけるｃ−ＭＰＬの必要性を示す。
【図４】変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬ下流シグナル伝達分子（ＪＡＫ２、ｐＪＡＫ２、ｐＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１、ｐＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５）の活性化を示す。
【図５】ＪＡＫ２阻害剤（ＪＡＫ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ：  ＣＡＳ＃４５７０８１−０３−７）による下流因子（ｐＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１、ｐＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５）の活性化阻害を示す。
【図６】変異ＣＡＬＲタンパク質特異的なｃ−ＭＰＬとの相互作用を示す。
【図７】変異ＣＡＬＲタンパク質とＪＡＫ２の相互作用を示す。
【図８】変異ＣＡＬＲタンパク質に特異的な多量体形成作用を示す。
【図９】変異ＣＡＬＲタンパク質特異的なｃ−ＭＰＬの多量体化の促進作用を示す。
【図１０】変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬ活性化のモデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＭＰＮの予防又は治療薬のスクリーニングは、変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を選択する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
変異型ＣＡＬＲタンパク質は、非特許文献１及び２に記載のようにカルレティキュリンタンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸配列が変異したタンパク質であり、具体的な変異型としては、野生型カルレティキュリンタンパク質の３６７番目のロイシンからカルボキシル末端までの配列（LKEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL）（配列番号１）が、フレームシフト変異によりTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA（配列番号２）に変わったタンパク質（図１中、変異型Ｄｅｌ５２）、LKEEEEDKKRKEEEEAEDNCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA（配列番号３）に変わったタンパク質（図１中、変異型Ｉｎｓ５）等がある。本発明においては、これらの変異型のいずれも使用可能である。
【００１４】
ｃ−ＭＰＬは、ＴＰＯ受容体であり、血小板を産生する巨核球の分化・増殖作用を有すること、造血幹細胞の維持や増殖を制御していることが知られている。しかし、ｃ−ＭＰＬと変異型ＣＡＬＲタンパク質とがどのような相互作用をするのかについては全く知られていなかった。
【００１５】
本発明者は、ＭＰＮにおいて異常の見出されている巨核球において、変異ＣＡＬＲタンパク質の機能解析を行う目的で、本発明者が樹立したヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ−７／ＴＰＯ（非特許文献３）に、野生型と変異型のＣＡＬＲタンパク質を発現させて機能解析を行った。その結果、変異ＣＡＬＲタンパク質を発現させると、通常は、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）依存的に増殖するＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が、ＴＰＯを加えていない培地でも増殖することを明らかにした（図２）。さらに、この条件下で、ｃ−ＭＰＬの発現をｓｈＲＮＡにより抑制すると、変異ＣＡＬＲタンパク質によるＴＰＯ非依存的な増殖能は失われた（図３）。これらのことから、変異ＣＡＬＲタンパク質は、ＴＰＯの無い状態においても、ＴＰＯ受容体であるｃ−ＭＰＬの活性化を引き起こし、サイトカイン非依存性の細胞増殖を惹起することが明らかになった。
続いて、変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬ下流のシグナル伝達分子の活性化を検証したところ、変異ＣＡＬＲタンパク質を発現するＵＴ−７／ＴＰＯ細胞株では、下流のＥＲＫ１／２やＳＴＡＴ５の活性化が生じており（図４）、これは、ＪＡＫ２阻害剤により著明に抑制されたことから（図５）、変異ＣＡＬＲタンパク質が、ｃ−ＭＰＬに結合しているＪＡＫ２を活性化することで、下流のシグナル伝達分子の活性化を惹起していることが示唆された。
【００１６】
そこで、変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬとＪＡＫ２の活性化メカニズムを分子レベルで解明する目的で、変異ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬの相互作用を調べたところ、変異型のＣＡＬＲタンパク質が、ｃ−ＭＰＬに結合することが明らかになった（図６）。一方で、このような結合は、野生型ＣＡＬＲタンパク質では、ほとんど検出されなかった（図６）。さらに、変異ＣＡＬＲタンパク質が、ｃ−ＭＰＬに結合し下流のシグナル伝達分子の活性化に必須なＪＡＫ２タンパク質とも相互作用することが示された（図７）。これらのことから、変異ＣＡＬＲタンパク質は、ｃ−ＭＰＬとの結合を介して、ｃ−ＭＰＬに結合したＪＡＫ２を活性化していることが明らかになった。
正常造血におけるｃ−ＭＰＬ依存的なＪＡＫ２の活性化は、ＴＰＯのｃ−ＭＰＬ二量体への結合により、ｃ−ＭＰＬとＪＡＫ２を含む複合体の構造変化が引き起こされた結果生じると考えられている（非特許文献４）。
【００１７】
本発明者は、変異ＣＡＬＲタンパク質が、どのようにしてｃ−ＭＰＬを活性化するかについてさらに検討を行い、変異ＣＡＬＲタンパク質同士が相互作用し、ホモ二量体あるいは多量体を形成していること、そのような相互作用が野生型タンパク質では見られないことを明らかにした（図８）。さらに、変異ＣＡＬＲがｃ−ＭＰＬの相互作用を亢進することを示した（図９）。以上の結果から、変異ＣＡＬＲタンパク質は、複数の分子が会合することで、複数のｃ−ＭＰＬ分子を呼び込み、ＪＡＫ２の活性化を惹起していることが明らかになった（図１０）。
【００１８】
かように、変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が引き起こされ、その結果としてＪＡＫ２が活性化されてＭＰＮが発生するという発がん機構が存在することが明らかとなった。従って、変異型タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化を阻害する薬物を選択すれば、ＭＰＮ予防又は治療薬がスクリーニングできる。
【００１９】
変異型ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化の阻害は、例えば、変異型ＣＡＬＲとｃ−ＭＰＬとの相互作用の阻害、変異型ＣＡＬＲタンパク質の２量化の阻害、ｃ−ＭＰＬの活性化に関する構造的な変化の阻害により検出することができる。
【００２０】
より具体的には、例えば変異ＣＡＬＲタンパク質を発現している細胞の培養系に、ｃ−ＭＰＬ及び被検薬物を添加して培養し、変異ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬの結合を蛍光や発光、発色により評価すればよい。被検薬物の添加により、これらの評価シグナルが低くなれば、被検薬物により変異ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬとの結合が阻害されたことがわかる。
【００２１】
また、例えば変異タンパク質を発現している細胞の培養系に、ｃ−ＭＰＬ及び被検薬物を添加して培養し、ＪＡＫ２の活性化を下流の転写因子であるＳＴＡＴ５の活性化で評価するレポーターシステムを構築し、レポーターの蛍光や発光、発色を計測することで、ＪＡＫ２の活性化の度合いを測定することによっても、被検薬物により変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されることがわかる。
【００２２】
さらに変異ＣＡＬＲタンパク質を発現する細胞の培養系に、ｃ−ＭＰＬ及び被検薬物を添加して培養し、変異ＣＡＬＲタンパク質間の結合を蛍光や発光、発色により評価し、変異ＣＡＬＲタンパク質の２量化を測定することによっても、被検薬物により変異タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されたことがわかる。
【００２３】
また、例えば変異ＣＡＬＲタンパク質を発現し、ｃ−ＭＰＬの発現に依存して増殖している細胞（例えば上記の変異ＣＡＬＲタンパク質を導入したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞株）に被検薬物を添加して培養し、細胞増殖の障害や細胞死の誘導を計測すれば、被検薬物により変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されることがわかる。
【００２４】
また、精製した変異ＣＡＬＲタンパク質間の分子間相互作用力を、被検薬物を添加した上で、化学物理学的に計測し、変異ＣＡＬＲタンパク質の２量化あるいは多量体化を測定することによっても、被検薬物により変異タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されたことがわかる。
【００２５】
また、精製した変異ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬタンパク質間の分子間相互作用力を、被検薬物を添加した上で、化学物理学的に計測し、変異ＣＡＬＲタンパク質とｃ−ＭＰＬとの結合を測定することによっても、被検薬物により変異タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されたことがわかる。
【００２６】
また、精製した変異ＣＡＬＲタンパク質、ｃ−ＭＰＬタンパク質、ＪＡＫ２タンパク質と、ＪＡＫ２のリン酸化基質となる合成ペプチドを混合し、被検薬物を添加した上で、基質のリン酸化を蛍光物質などにより計測し、ＪＡＫ２のキナーゼ活性を測定することによっても、被検薬物により変異タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化が阻害されたことがわかる。
【００２７】
本発明によりスクリーニングされた薬物は、変異タンパク質によるｃ−ＭＰＬの活性化阻害する結果、その下流の反応であるＪＡＫ２の活性化が抑制されるため、ＭＰＮの予防又は治療薬として有用である。ここで、ＭＰＮには、真性多血症、慢性骨髄性白血病、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症及び慢性骨髄増殖性腫瘍が含まれる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
【００２９】
実施例１
変異ＣＡＬＲタンパク質を発現したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を、ＴＰＯを添加又は非添加条件でウシ胎児非働化血清１０％を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ＩＭＤＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で培養し、細胞増殖をＷＳＴ−８試薬を用いたアッセイにより評価した。コントロールとして野生型（ＣＡＬＲＷＴ）、コントロールのベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を導入した細胞を用いた。
その結果、図２に示すように、変異ＣＡＬＲタンパク質を発現したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞（黒三角と黒四角）は、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）を含まない条件（左図）においても増殖するが、野生型（黒丸）あるいはコントロールのベクター（黒菱形）を導入した細胞は、増殖しない。いずれの細胞も、ＴＰＯを加えた培地（右図）では、増殖する。
【００３０】
実施例２
変異ＣＡＬＲタンパク質を発現したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を、ＴＰＯ非添加条件でウシ胎児非働化血清１０％を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ＩＭＤＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で培養し、ｃ−ＭＰＬに対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを感染することにより、ｃ−ＭＰＬの遺伝子発現を抑制し、当該細胞死を評価した。
その結果、図３に示すように、変異ＣＡＬＲタンパク質を発現することで、サイトカイン非依存的な増殖能を獲得したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞において、ｃ−ＭＰＬの遺伝子発現をｓｈＲＮＡにより抑制すると（左図、ｓｈ１−３）、７２時間後に細胞死が誘導された（右図）。一方、ネガティブコントロールのｓｈＲＮＡでは、ｃ−ＭＰＬの発現は不変で（左図、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）、細胞死は誘導されなかった（右図、Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）。
【００３１】
実施例３
変異ＣＡＬＲタンパク質の発現によりサイトカイン非依存的に増殖するようになったＵＴ−７／ＴＰＯ細胞における、ｃ−ＭＰＬ下流のシグナル伝達分子の活性化について、イムノブロット法を用いて検討した。変異ＣＡＬＲタンパク質を発現したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を、ＴＰＯを添加又は非添加条件でウシ胎児非働化血清１０％を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ＩＭＤＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で２４時間培養し、細胞を遠心分離により回収した後、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）を含む電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁し、超音波破砕した上で、遠心分離により可溶性分画を取得する。このようにして得られた分画を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、リン酸化タンパク質に特異的な抗体（例えばセルシグナリング社製品番号９３５９）を用いて、リン酸化タンパク質を検出した。
その結果、図４に示すように、変異ＣＡＬＲタンパク質（Ｄｅｌ５２あるいはＩｎｓ５）を発現すると、培養液中にＴＰＯが存在しない状態でも、ＪＡＫ２のリン酸化や、その下流のＥＲＫ１／２とＳＴＡＴ５の活性化型リン酸化が検出された。
一方、野生型を発現させた細胞や、コントロールのベクターを導入した細胞では、これらのリン酸化は、ＴＰＯ存在下で増強し、ＴＰＯが無い条件では、著明に減少した。
【００３２】
実施例４
変異ＣＡＬＲタンパク質によるｃ−ＭＰＬの下流シグナル伝達分子の活性化が、ｃ−ＭＰＬを介したＪＡＫ２の活性化であることを示す目的で、ＪＡＫ２の活性を阻害した際の、これらの分子のリン酸化状態について、イムノブロット法を用いて検討した。変異ＣＡＬＲタンパク質を発現したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を、ＴＰＯを非添加条件かつ、ＪＡＫ２阻害剤である３マイクロモルのＪＡＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ  （ＣＡＳ＃  ４５７０８１−０３−７）添加条件で、ウシ胎児非働化血清１０％を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ＩＭＤＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で１６時間培養し、細胞を遠心分離により回収した後、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）を含む電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁し、超音波破砕した上で、遠心分離により可溶性分画を取得する。このようにして得られた分画を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、ｃ−ＭＰＬ下流のシグナル伝達分子のリン酸化特異的な一次抗体（例えばセルシグナリング社製品番号９３５９）、一次抗体を認識するペルオキシダーゼ酵素標識された二次抗体（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製品番号ｓｃ−２００４）、化学発光試薬（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製品番号３２１０６）を用いて、リン酸化状態を評価した。
その結果、図５に示すように、変異ＣＡＬＲタンパク質（Ｄｅｌ５２あるいはＩｎｓ５）により惹起されるＥＲＫ１／２やＳＴＡＴ５のリン酸化は、ＪＡＫ２阻害剤により完全に抑制されたことから、変異ＣＡＬＲによるｃ−ＭＰＬ下流のシグナル伝達分子の活性化は、ＪＡＫ２の活性化によるものであることが明らかになった。また、同じ濃度のＪＡＫ２阻害剤は、ＴＰＯによるｃ−ＭＰＬを介した活性化についても、下流シグナル分子の活性化を抑制した。
【００３３】
実施例５
ＦＬＡＧタグで標識した野生型（ＷＴ）あるいは変異型（Ｄｅｌ５２またはＩｎｓ５）のＣＡＬＲタンパク質をＨＡタグで標識したｃ−ＭＰＬと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で共発現させて調製した細胞抽出液を用いて、相互作用を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に、それぞれの遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ発現ベクターに組み込み、リポフェクション法などによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入させた後、ウシ胎児血清１０％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で４８時間から７２時間培養する。その後、細胞を、リン酸緩衝液を用いて回収、洗浄したのち、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液で懸濁した後、超音波破砕することで、細胞抽出液を調製する。得られた抽出液に、ＦＬＡＧタグに対する特異的な抗体（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製品番号７４２５）を添加し、氷上で１時間静置した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズ（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製品番号１０００４Ｄ）を加え、さらに摂氏４度にて連続攪拌する。続いて、磁気ビーズを磁石を用いて回収した上で、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁することで、ビーズに結合したタンパク質を溶出する。得られた溶出物を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、一次抗体として抗ＨＡ抗体（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製品番号ｓｃ−８０５）、一次抗体を認識するペルオキシダーゼ酵素標識された二次抗体（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製品番号ｓｃ−２００４）、化学発光試薬（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製品番号３２１０６）を用いて、相互作用を評価した。
その結果、図６に示すように、ｃ−ＭＰＬは、変異型ＣＡＬＲタンパク質と共沈降したが、野生型ＣＡＬＲでは、共沈降がほとんど検出されなかった。
【００３４】
実施例６
ＦＬＡＧタグで標識した変異型（Ｄｅｌ５２またはＩｎｓ５）のＣＡＬＲタンパク質を、ＨＡタグで標識したｃ−ＭＰＬとＶ５タグで標識したＪＡＫ２と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で共発現させて調製した細胞抽出液を用いて、相互作用を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に、それぞれの遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ発現ベクターに組み込み、リポフェクション法などによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入させた後、ウシ胎児血清１０％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で４８時間から７２時間培養する。その後、細胞を、リン酸緩衝液を用いて回収、洗浄したのち、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液で懸濁した後、超音波破砕することで、細胞抽出液を調製する。得られた抽出液に、ＦＬＡＧタグに対する特異的な抗体（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製品番号７４２５）を添加し、氷上で１時間静置した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズ（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製品番号１０００４Ｄ）を加え、さらに摂氏４度にて連続攪拌する。続いて、磁気ビーズを磁石を用いて回収した上で、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁することで、ビーズに結合したタンパク質を溶出する。得られた溶出物を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、一次抗体として抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品番号４６−０７０５）、一次抗体を認識するペルオキシダーゼ酵素標識された二次抗体（例えばＲｏｃｋｌａｎｄ社製品番号１８−８８１７−３１）、化学発光試薬（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製品番号３２１０６）を用いて、相互作用を評価した。
その結果、図７に示すように、ＪＡＫ２は、ｃ−ＭＰＬの存在下で変異型ＣＡＬＲタンパク質と共沈降した。
【００３５】
実施例７
ＦＬＡＧタグとＶ５タグで標識した野生型（ＷＴ）あるいは変異型（Ｄｅｌ５２またはＩｎｓ５）のＣＡＬＲ蛋白質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で共発現させて調製した細胞抽出液を用いて、相互作用を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に、それぞれの遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ発現ベクターに組み込み、リポフェクション法などによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入させた後、ウシ胎児血清１０％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で４８時間から７２時間培養する。その後、細胞を、リン酸緩衝液を用いて回収、洗浄したのち、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液で懸濁した後、超音波破砕することで、細胞抽出液を調製する。得られた抽出液に、ＦＬＡＧタグに対する特異的な抗体（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製品番号７４２５）を添加し、氷上で１時間静置した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズ（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製品番号１０００４Ｄ）を加え、さらに摂氏４度にて連続攪拌する。続いて、磁気ビーズを磁石を用いて回収した上で、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁することで、ビーズに結合したタンパク質を溶出する。得られた溶出物を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、一次抗体として抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品番号４６−０７０５）、一次抗体を認識するペルオキシダーゼ酵素標識された二次抗体（例えばＲｏｃｋｌａｎｄ社製品番号１８−８８１７−３１）、化学発光試薬（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製品番号３２１０６）を用いて、相互作用を評価した。
その結果、図８に示すように、ＦＬＡＧタグ抗体を用いてＦＬＡＧタグで標識された蛋白質を免疫沈降させたところ、変異型ではＶ５タグで標識された蛋白質が共沈降したが、野生型ＣＡＬＲでは、共沈降が検出されなかった。
【００３６】
実施例８
ＨＡタグで標識したｃ−ＭＰＬとＶ５タグで標識したｃ−ＭＰＬと、ＦＬＡＧタグで標識した野生型（ＷＴ）あるいは変異型（Ｉｎｓ５）のＣＡＬＲタンパク質を共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で共発現させて調製した細胞抽出液を用いて、相互作用を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に、それぞれの遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ発現ベクターに組み込み、リポフェクション法などによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入させた後、ウシ胎児血清１０％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下において摂氏３７度で４８時間から７２時間培養する。その後、細胞を、リン酸緩衝液を用いて回収、洗浄したのち、脱リン酸化酵素とタンパク質分解酵素阻害剤（例えばナカライテスク社製品番号０６８６３−０１）と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液で懸濁した後、超音波破砕することで、細胞抽出液を調製する。得られた抽出液に、Ｖ５タグに対する特異的な抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品番号４６−０７０５）を添加し、氷上で１時間静置した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズ（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製品番号１０００４Ｄ）を加え、さらに摂氏４度にて連続攪拌する。続いて、磁気ビーズを磁石を用いて回収した上で、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、電気泳動解析用バッファー（例えばバイオラッド社製品番号１６１０７３７）に懸濁することで、ビーズに結合したタンパク質を溶出する。得られた溶出物を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、一次抗体として抗ＨＡ抗体（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製品番号ｓｃ−８０５）、一次抗体を認識するペルオキシダーゼ酵素標識された二次抗体（例えばＲｏｃｋｌａｎｄ社製品番号１８−８８１７−３１）、化学発光試薬（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製品番号３２１０６）を用いて、相互作用を評価した。
その結果、図９に示すように、変異型ＣＡＬＲタンパク質は、Ｖ５−ＭＰＬとＨＡ−ＭＰＬの相互作用を増強させたが、野生型ＣＡＬＲでは、相互作用の増強は検出されなかった。
【００３７】
変異ＣＡＬＲタンパク質は、分子間相互作用により多量体を形成すると共に、ｃ−ＭＰＬに結合し、ＪＡＫ２の活性化に必要な複合体の構造形成を促すことで、サイトカイン非依存性のｃ−ＭＰＬの活性化を惹起する（図１０）。これにより細胞が腫瘍化し、ＭＰＮが発症する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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