(57)【要約】【課題】ユニバーサルサポートから目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す際に生じる、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとが切断できていない副生成物の生成を抑制し、且つ、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を増加させることが可能な切り出し方法を提供すること。【解決手段】ＲＮＡオリゴヌクレオチドを担持したユニバーサルサポートを、アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に接触させる工程を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチド切り出し方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユニバーサルサポート上で化学合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該サポートから切り出す方法であって、
アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドを担持した該サポートを接触させる工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記水溶液が、さらにアルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルキルアミンが第１級アルキルアミンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液に含まれる１価の無機塩の含有濃度が、１〜１００ｍＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ユニバーサルサポート上でＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成する工程、及び
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により、該合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該サポートから切り出す工程
を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概しては、核酸の化学合成の分野に関し、より詳細には、固相担体からのＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出し方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＲＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸の化学合成には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。固相ホスホロアミダイト法では、概ね以下の工程により核酸合成を行う。
先ず、合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーと、３’−ＯＨ基を介してエステル結合させ、固相合成用担体上にあらかじめ担持させる（ヌクレオシドリンカー）。次に、このヌクレオシドリンカーが担持された固相合成用担体を、反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。
以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程：（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの５'−ＯＨ基の脱保護を行う工程；
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）を活性化剤（テトラゾール等）の存在下、脱保護した５'−ＯＨ基ヘのカップリングを行う工程；
（３）無水酢酸などにより未反応の５'−ＯＨ基をキャップする工程；及び
（４）含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程：からなる合成反応が行われる。この合成サイクルを繰り返し、３'末端から５'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持った核酸が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（非特許文献１）。また、ＮａＣｌを含有する水酸化ナトリウム水溶液で切り離した例も報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ところで上記のような合成を行う場合、前述したように、出発物質である３'末端となるヌクレオシドを、開裂性リンカーを介してあらかじめ固相合成用担体に担持しておく必要がある。しかも、合成したい核酸の配列により３'末端は異なり、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴの４種類が、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの場合にもｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵの４種類が必要となり、さらに修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合には修飾されたヌクレオシドをあらかじめ担持した固相合成用担体が必要になり煩雑であった。
そこで前記の問題点を克服するため、固相担体と出発物質を繋ぐリンカーとして、これまで一般に用いられてきたヌクレオシド・スクシニルリンカー等に替わり、ユニバーサルリンカーを担持した固相合成用担体（ユニバーサルサポート）が考案されている。ユニバーサルサポートを用いると、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成を開始し、目的の核酸を合成した後、通常と同様の方法でユニバーサルサポートから切り出すだけであり、前述のように種々のヌクレオシド−リンカーを担持した固相合成用担体を準備する必要がないという利点がある。
【０００４】
従来、ユニバーサルサポートからＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す方法として、アルキルアミンまたはアンモニア水／アルキルアミン混合溶液に接触させて切り出す方法が一般的であった（特許文献１）。また、近年、エタノールアミンに接触させて切り出す方法も開発されている（特許文献４）。しかし、これらの方法では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとがうまく切断できず副生成物が多量に生じ、目的物であるＲＮＡオリゴヌクレオチドを純度良く切り出すことができなかった。すなわち、ユニバーサルサポートから目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す方法において、固相担体のみが切断され、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとがうまく切断できず、副生成物が生じる場合があった。ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとの結合はより強い求核試薬やより苛酷な温度条件などにより切断可能であるが、特にＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいては分解が促進されるため、目的物であるＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を低下させる要因となっていると考えられている。一方で、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を増やすために緩やかな条件で切り出した場合、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとが切断できていない副生成物が多量に生じるおそれがある。また、この副生成物と目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドは分子量、極性等の性質が類似しているため、クロマトグラフィーなどの分離精製技術により精製することが難しいという課題もある。主にこれらの理由により、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成においてはユニバーサルサポートを使用することが難しいという現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ５８０４６８３  Ａ
【特許文献２】ＵＳ２００４０１４７７３５  Ａ１
【特許文献３】ＵＳ７０４１８１７  Ｂ２
【特許文献４】ＷＯ２００９１４０１２５  Ａ２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３．１．１−３．１.２８
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）Ｖｏｌ．２７，  Ｎｏ．１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ユニバーサルサポートから目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す際に生じる、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとが切断できていない副生成物の生成を抑制し、且つ、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を増加させることが可能な切り出し方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ユニバーサルサポートから目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す方法において、アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に、固相オリゴヌクレオチドを接触させることによって、副生成物の生成を抑制し、且つ、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ユニバーサルサポート上で化学合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該サポートから切り出す方法であって、
アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドを担持した該サポートを接触させる工程
を含む前記方法。
［２］前記水溶液が、さらにアルコールを含む、上記［１］に記載の方法。
［３］前記アルキルアミンが第１級アルキルアミンである、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記水溶液に含まれる１価の無機塩の含有濃度が、１〜１００ｍＭである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ユニバーサルサポート上でＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成する工程、及び
上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法により、該合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該サポートから切り出す工程
を含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチド切り出し方法により、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとが切断できていない副生成物の生成を抑制し、且つ、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１および比較例１にて得られたＨＰＬＣチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明をその好適な実施形態に即してより詳しく説明する。
本発明は、ユニバーサルサポートからＲＮＡオリゴヌクレオチドを切り出す方法を提供する。すなわち、固相担体に担持させたユニバーサルリンカーと化学合成したＲＮＡオリゴヌクレオチドとの結合体から、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのみを切り出す方法である。また、好ましい実施形態において、本発明の方法により、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのみを切り出すと同時に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端にあるリン酸基を除去することもできる。
その反応機構は、
（ａ）アルキルアミンが固相担体とユニバーサルリンカーとのエステル結合を切断することで、固相担体が除去され、
（ｂ）（ａ）の結果、ユニバーサルリンカーの酸素上に生じた負電荷が、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端にあるリン酸基中のリン原子と新たなＰＯ結合を形成し、
（ｃ）（ｂ）とほぼ同時に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端にあるリン酸基と糖骨格とを結んでいたＰＯ結合が切断することで、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端にあるリン酸基とユニバーサルリンカーが除去されるプロセスから成り、
最終的に３’末端にあるリン酸基が除去されたＲＮＡオリゴヌクレオチドが得られると考えられる。
プロセス（ｂ）において、ユニバーサルリンカーの酸素上に生じた負電荷が、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端にあるリン酸基中のリン原子と新たなＰＯ結合を形成せず、代わりに反応系内に存在する水素原子（プロトン）とＯＨ結合を形成すると、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドとユニバーサルリンカーとが切断できていない副生成物になると考えられる。
本発明の特徴である、アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に固相オリゴヌクレオチドを接触させることにより、プロセス（ｂ）で副生成物が生じる反応を効率良く抑制できると考えられる。前記水溶液には、好ましくはアルコールを含んでもよい。
本発明により、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを高効率で切り出すことが可能となり、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造コストの大幅な削減を達成できる。また、これまで高コストのために実現できていなかったユニバーサルサポートを用いたＲＮＡオリゴヌクレオチドの大量合成も可能とする。すなわち、１種類のユニバーサルサポートで、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成することを可能とする。更に、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを高純度で切り出すことが可能となり、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの産業上の主用途である核酸医薬品の品質向上に寄与できるものと考えられる。
【００１３】
本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。本明細書において「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。
【００１４】
本明細書において「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、上記の「核酸」であって、鎖中に１つ以上のリボヌクレオチド単位を有するものをいう。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、鎖中のヌクレオチド単位の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は全てがリボヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長は特に限定されないが、好ましくは２〜２００ヌクレオチドである。ヌクレオチド長が長すぎると、得られる核酸の収量や純度が低下するためである。
【００１５】
本明細書において「リンカー」とは、共有結合を介して２つの物質を連結する分子をいい、核酸固相合成において固相担体と核酸とを連結するものである。
本明細書において「ユニバーサルリンカー」とは、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させることができるリンカーである。この目的のために、ユニバーサルリンカーは、通常、隣り合う２個の炭素原子が有り、一方の炭素原子には核酸合成の開始点となる−ＯＨ基が、もう一方の炭素原子には保護基を外すと求核基となる基（例えば−ＯＨ基、−ＮＨ２基、−ＳＨ基）を有する。本発明において使用し得る具体的なユニバーサルリンカーとしては、後述の実施例で使用されたもの、特開２０１１−０８８８４３号及び特開２０１３−１７７３７１号に記載のもの、ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（登録商標）（ＩＳＩＳファーマシューティカルズ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「ユニバーサルサポート」とは、ユニバーサルリンカーを担持した核酸固相合成用担体である。
【００１６】
固相担体は、過剰に用いた試薬を洗浄によって簡単に除去できるものであれば特に限定されず、例えば、ガラス系多孔質担体、ポリスチレン系担体又はアクリルアミド系担体等の多孔質合成ポリマー担体等を使用することができる。また、固相担体は、核酸合成に寄与する官能基を有するものが好ましい。「核酸合成に寄与する」とは、核酸合成の開始点になりえる、リンカー付加が可能な官能基であり、具体的には、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。具体的な固相担体としては、特開２０１１−０８８８４３号及び特開２０１３−１７７３７１号に記載のもの等が挙げられ、好ましい実施態様において、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）として市販されている低膨潤性ポリスチレン粒子を使用することができる。
【００１７】
本明細書において「アルキルアミン」とは、好ましくは第１級アルキルアミンであり、より好ましくは、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミンであり、最も好ましくは、メチルアミンである。
【００１８】
本明細書において「１価の無機塩」とは、例えば、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが挙げられる。１価の無機塩を構成するカチオン、アニオン共に原子量が大きい程、本発明の効果が高い傾向にあり、効果、扱い易さ及び入手し易さを考慮すると、好ましくは、臭化ナトリウムである。
また、水溶液中に含まれる１価の無機塩の濃度は、好ましくは１〜１００ｍＭであり、より好ましくは５〜８０ｍＭである。
【００１９】
本明細書において「アルコール」とは、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール（イソプロパノール）、ブタノールである。また、分岐の有無については特に限定されない。効果、扱い易さ及び入手し易さを考慮すると、最も好ましくは、イソプロパノールである。
水溶液中に含まれるアルコールの含有量は、好ましくは１〜８０体積％であり、より好ましくは３〜６０体積％である。
【００２０】
本明細書において、「接触」とは、例えば、浸漬、撹拌浸漬、通液、濾過などが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、アルキルアミンと１価の無機塩とを含む水溶液に固相担体上のオリゴヌクレオチドを接触させる好適な温度及び時間は特に限定されないが、接触温度が２０℃±５℃の場合、接触時間は１〜２４時間が好ましく、接触温度が４０℃±５℃の場合、接触時間は０．２５〜６時間が好ましい。
【００２２】
本発明はまた、本発明による上述の切り出し方法を用いることを含む、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造方法も提供する。該製造方法は、上述のユニバーサルサポート上でＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成する工程（核酸合成反応）、及び、上述の切り出し方法により、該合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを該サポートから切り出す工程を含む。
【００２３】
本明細書において、「核酸合成反応」とは、特に核酸を構成するヌクレオチドの伸長反応を意味する。即ち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法等が挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。
【００２４】
固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応の好ましい実施態様としては、例えば、以下の各工程
（ａ）ユニバーサルサポートを核酸自動合成装置の反応カラムに入れる工程；
（ｂ）ジクロロ酢酸溶液等の酸を反応カラムに流し、ヒドロキシ基の保護基を脱保護し、洗浄する工程；
（ｃ）テトラゾール等により活性化した、３'末端に該当するヌクレオシドホスホロアミダイトを、前記ヒドロキシ基に結合させるカップリング、未反応ヒドロキシ基のキャップ、ホスファイトの酸化の各工程を順次行い、更にこの一連の工程を目的配列になるまで繰り返す工程；
（ｄ）装置での合成工程が終了後、核酸固相合成用担体を上述の本発明による切り出し方法に供することにより、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドを得る工程：
から構成される方法が挙げられる。
【実施例】
【００２５】
以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施例によって限定されるものではない。
【００２６】
［実験１］
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成）
下記（Ａ）〜（Ｄ）のユニバーサルリンカーを結合させたユニバーサルサポート（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製））について、ユニバーサルリンカー１μｍｏｌに相当する量を、それぞれ反応カラムに充填し、核酸合成装置ｎＳ−８ＩＩ（ジーンデザイン社製）を用いて、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’）（配列番号：１）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２７】
（Ａ）下図のＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（登録商標）（ＩＳＩＳファーマシューティカルズ社製）を結合させたユニバーサルサポート
【００２８】
【化１】
2017008038.tif 000002
【００２９】
（Ｂ）下図のユニバーサルサポート
【００３０】
【化２】
2017008038.tif 000003
【００３１】
（Ｃ）下図のユニバーサルサポート
【００３２】
【化３】
2017008038.tif 000004
【００３３】
（Ｄ）下図のユニバーサルサポート
【００３４】
【化４】
2017008038.tif 000005
【００３５】
［実施例１］
（Ａ）のユニバーサルサポートを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成後に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液に４５℃で４時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。この液に、ジメチルスルホキシド及びトリエチルアミン三フッ化水素を順に加え、４５℃で１．５時間加温し、ＲＮＡ２’末端保護基（ターシャリーブチルジメトキシシリル保護基）を脱保護した。この液に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、水で希釈し、ＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液とした。
【００３６】
［実施例２〜４］
実施例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｂ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、実施例２のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
実施例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｃ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、実施例３のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
実施例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｄ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、実施例４のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
【００３７】
［比較例１］
（Ａ）のユニバーサルサポートを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成後に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を２８％アンモニア水／４０％メチルアミン水溶液（１：１）混合溶液に６５℃で１．５時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。この液に、ジメチルスルホキシド及びトリエチルアミン三フッ化水素を順に加え、６５℃で１．５時間加温し、ＲＮＡ２’末端保護基（ターシャリーブチルジメトキシシリル保護基）を脱保護した。この液に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、水で希釈し、ＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液とした。
【００３８】
［比較例２〜４］
比較例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｂ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、比較例２のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
比較例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｃ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、比較例３のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
比較例１において、（Ａ）のユニバーサルサポートを（Ｄ）のユニバーサルサポートに変更した以外は同様の方法にて、比較例４のＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
【００３９】
（ＲＮＡオリゴヌクレオチド純度および副生成物量の測定）
実施例１〜４及び比較例１〜４にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液について、吸光光度計による吸光度（ＯＤ／μｍｏｌ：ユニバーサルリンカー１μｍｏｌ当たりのＯＤ）の測定を行った。
また、実施例１〜４及び比較例１〜４にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ  ＨＦＩＰ／７ｍＭ  ＴＥＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。実施例１および比較例１にて得られたＨＰＬＣチャートを図１に示す。図１において、目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドの保持時間は１４．８分付近、ユニバーサルリンカーとＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した副生成物の保持時間は、１６．２分付近に検出された。
表１に、実験１で得られたデータを示す。実施例では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量の指標であるＯＤ×ＦＬＰ（（ユニバーサルリンカー１μｍｏｌ当たりの吸光度：ＯＤ：Optical Density）×（ＨＰＬＣ測定で算出した目的のＲＮＡオリゴヌクレオチド純度：ＦＬＰ：Full Length Purity））を増加させ、且つ、ユニバーサルリンカーと目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した副生成物の生成を抑制することが確認された。一方、比較例では、実施例と比較してＲＮＡオリゴヌクレオチド純度が低く、且つ、副生成物の生成量が多いことが確認された。
【００４０】
【表１】
2017008038.tif 000006
【００４１】
［実験２］
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成）
（Ａ）のユニバーサルサポートについて、ユニバーサルリンカー１５１μｍｏｌに相当する量を反応カラムに充填し、核酸合成装置ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’）（配列番号：１）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【００４２】
［実施例５〜１１］
以下に示す配合の水溶液（切り出し試薬）を調製した。
実施例５：（Ｅ）２０ｍＭ塩化リチウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例６：（Ｆ）２０ｍＭ塩化カリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例７：（Ｇ）２０ｍＭヨウ化カリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例８：（Ｈ）２０ｍＭ塩化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例９：（Ｉ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例１０：（Ｊ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／エタノール（１：１）混合溶液
実施例１１：（Ｋ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液
【００４３】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を上記（Ｅ）〜（Ｋ）の切り出し試薬に４５℃で２時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。この液に、ジメチルスルホキシド及びトリエチルアミン三フッ化水素を順に加え、６０℃で１時間加温し、ＲＮＡ２’末端保護基（ターシャリーブチルジメトキシシリル保護基）を脱保護した。この液に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、水で希釈し、ＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液とした。
【００４４】
［比較例５〜７］
以下に示す配合の水溶液（切り出し試薬）を調製した以外は、実施例５と同様にしてＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を得た。
比較例５：（Ｌ）４０％メチルアミン水溶液
比較例６：（Ｍ）４０％メチルアミン水溶液／２８％アンモニア水（１：１）混合溶液
比較例７：（Ｎ）４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
【００４５】
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量および副生成物量の測定）
実施例５〜１１及び比較例５〜７にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液について、実施例１〜４及び比較例１〜４と同様の条件にて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った。
表２に、実験２で得られたデータを示す。実施例では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量の指標であるピーク面積／ｎｍｏｌ（ユニバーサルリンカー１ｎｍｏｌ当たりのＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣピーク面積）を増加させ、且つ、ユニバーサルリンカーと目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した副生成物の生成を抑制することが確認された。
【００４６】
【表２】
2017008038.tif 000007
【００４７】
［実験３］
以下に示す配合の水溶液（切り出し試薬）を調製した。
実施例１２：（Ｏ）１０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例１３：（Ｐ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例１４：（Ｑ）３０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（１：１）混合溶液
実施例１５：（Ｒ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（９：１）混合溶液
実施例１６：（Ｓ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（８：２）混合溶液
実施例１７：（Ｔ）２０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（６：４）混合溶液
実施例１８：（Ｕ）６０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（９５：５）混合溶液
実施例１９：（Ｖ）６０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（９：１）混合溶液
実施例２０：（Ｗ）６０ｍＭ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（８：２）混合溶液
【００４８】
実験２にて得たＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、実施例１２〜１７（（Ｏ）〜（Ｔ））の切り出し試薬には４５℃で２時間、実施例１８〜２０（（Ｕ）〜（Ｗ））の切り出し試薬には２３℃で４時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。この液に、ジメチルスルホキシド及びトリエチルアミン三フッ化水素を順に加え、実施例１２〜１４（（Ｏ）〜（Ｑ））は６０℃で１時間、実施例１５〜２０（（Ｒ）〜（Ｗ））は４５℃で１．５時間加温し、ＲＮＡ２’末端保護基及びＴＢＤＭＳ保護基を脱保護した。この液に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、水で希釈し、ＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液とした。
【００４９】
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量および副生成物量の測定）
実施例５〜１１及び比較例５〜７と同様の方法により測定した。
表３に、実験３で得られたデータを示す。実施例では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量の指標であるピーク面積／ｎｍｏｌ（ユニバーサルリンカー１ｎｍｏｌ当たりのＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣピーク面積）を増加させ、且つ、ユニバーサルリンカーと目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した副生成物の生成を抑制することが確認された。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
［実験４］
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成）
（Ａ）のユニバーサルサポートについて、ユニバーサルリンカー８０μｍｏｌに相当する量を反応カラムに充填し、核酸合成装置ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて、１９ｍｅｒ（５’−ｒ（ＣＣＡＵＵＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡ）−３’（配列番号：２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
同様に、（Ａ）のユニバーサルサポートについて、ユニバーサルリンカー８０μｍｏｌに相当する量を反応カラムに充填し、核酸合成装置ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて、１９ｍｅｒ（５’−ｒ（ＵＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＧＵＵＡＡＵＧＧ）−３’（配列番号：３）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【００５２】
（固相担体からのＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出し）
以下に示す配合の水溶液（切り出し試薬）を調製した。
切り出し試薬（Ｘ）：８０Ｍ臭化ナトリウム含有４０％メチルアミン水溶液／イソプロパノール（８：２）混合溶液
実施例２１では、上記の通りにして得た配列番号：２のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、切り出し試薬（Ｘ）に２５℃で１８時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴオチドの切り出しを行った。実施例２２では、上記の通りにして得た配列番号：３のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、切り出し試薬（Ｘ）に２５℃で１４時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。
これらの液に、ジメチルスルホキシド及びトリエチルアミン三フッ化水素を順に加え、６５℃で１．５時間加温し、ＲＮＡ２’末端保護基及びＴＢＤＭＳ保護基を脱保護した。これらの液に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、水で希釈し、ＲＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液とした。
【００５３】
（ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量および副生成物量の測定）
実施例５〜１１及び比較例５〜７と同様の方法により測定した。
表４に、実験４で得られたデータを示す。実施例２１及び２２では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの収量の指標であるピーク面積／ｎｍｏｌ（ユニバーサルリンカー１ｎｍｏｌ当たりのＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣピーク面積）を増加させ、且つ、ユニバーサルリンカーと目的のＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した副生成物の生成を抑制することが確認された。
【００５４】
【表４】
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【図１】
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【配列表】
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