(57)【要約】      （修正有）【課題】多発性嚢胞腎の予防および治療のために有用な医薬組成物の提供。【解決手段】好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を含む、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の予防または治療用の医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を含む多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記多発性嚢胞腎が、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の予防または治療が、
腎嚢胞の成長を遅延させ、
腎臓の嚢胞容積および腎臓重量を減少させ、
腎糸球体線維症および腎間質線維症を減少させ、
腎臓の尿細管間質区画の低酸素状態を低下させ、
腎尿細管の嚢胞性上皮細胞のアポトーシスを増加させ、
腎尿細管の嚢胞性上皮細胞の増殖を減少させ、および、
患者の生存および生存期間を統計学的に有意に改善する、
という病態生理学的メカニズムを同時に改善する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＰＫＤの予防または治療において、前記ＮＧＡＬが、
ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ受容体（ＮＧＡＬ−Ｒ）の発現増加、および、
活性カスパーゼ−３の増加およびプロカスパーゼ３の減少、
の少なくとも１つを誘導する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＰＫＤの予防または治療において、前記ＮＧＡＬが、
α−ＳＭＡ、
コラーゲン、
低酸素誘導因子１−α（ＨＩＦ−１α）、
プロカスパーゼ３、
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、
Ａｋｔ、
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、および、
Ｓ６Ｋ、
の少なくとも１つの発現を阻害する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＫＤの予防または治療が、患者に対するＮＧＡＬを管理することで、
α−ＳＭＡ、低酸素誘導因子１−α（ＨＩＦ−１α）、Ａｋｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、Ｓ６Ｋ、プロカスパーゼ３、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の抑制、および、
ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ受容体（ＮＧＡＬ−Ｒ）、活性カスパーゼ３の発現の増加、
という病態生理学的メカニズムを同時に改善する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＮＧＡＬが用量依存性である、請求項１乃至６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＰＫＤの予防または治療が、有効量のＮＧＡＬの注射投与によるものである、請求項１乃至７の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＰＫＤの予防または治療が、毎日の有効量である５μｇ／体重（ｇ）またはそれ以上のＮＧＡＬを、腹腔内または皮下投与によるものである、請求項１乃至８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照。本出願は、２０１５年１２月２３日出願の台湾特許出願第１０４１４３３２３号、および、２０１６年７月２７日出願の米国特許出願第１５／２２０，６８７号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を含む多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の予防または治療用の医薬組成物に関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）は、最も一般的な遺伝子疾患で、その有症率は１：４００から１：１０００である。ＡＤＰＫＤの症例中、ほぼ８５％が１６番染色体のＰＫＤ１の突然変異を原因としている（Ｔｏｒｒｅｓ  ＶＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６９：１２８７−１３０１，２００７；Ｇｒａｎｔｈａｍ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，７：５５６−５６６，２０１１）。ＰＫＤ１の遺伝子は、ポリシスチン１（ＰＣ１）をコードし、実験マウスでにおいて、ＰＣ１のダウンレギュレーションは、胎生期１５．５日（Ｅ１５．５）の初期嚢胞形成や、重症度に関連する。（Ｐｉｏｎｔｅｋ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１３：１４９０−１４９５，２００７；Ｈｏｐｐ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２２：４２５７−４２７３，２０１２；Ｆｅｄｅｌｅｓ  ＳＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０：２５１−２６０，２０１４；Ｌｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１７：１７９−１８１，１９９７；Ｍａｇｅｎｈｅｉｍｅｒ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１７：３４２４−３４３７，２００６）．
【０００４】
ＡＤＰＫＤ患者は、大抵４０歳になるころには症状が現れ始め、５０歳になるころには腎不全へ進行し、生命を維持するためには、透析（例えば、血液透析や腹膜透析）や、腎移植が必要となる。ＡＤＰＫＤは家族の常染色体優性形質として遺伝する。「常染色体優性」という言葉は、一方の親が罹患している場合、その子供に同じ病気が出る可能性が５０％あるということを意味している。ＡＤＰＫＤは慢性腎不全の第４番目の主因であるが、世界中で約１２００万人、アメリカ合衆国内では、６０万人（約５００人に１人のアメリカ人）が罹患している。ＡＤＰＫＤ患者の約５０％が、５０歳になるころには腎不全となっている。
【０００５】
トルバプタン（Ｔｏｌｖａｐｔａｎ）は、大塚製薬によって、日本で発見・開発されたが、うっ血性心不全による低ナトリウム血症（低レベルの血液ナトリウム）を治療するために使われる、パソプレシンＶ２受容体拮抗薬であった。その薬は、また、ラットおよびマウスを使った動物モデルの成功により、ＡＤＰＫＤの治療に効果があると期待されていた。ＡＤＰＫＤの成人患者１４４５人の臨床試験が国際的に行われ、ＡＤＰＫＤの治療法として支持されている。トルバプタンは、ＰＫＤ患者の腎臓総体積の増加や腎機能の低下を実際に遅らせることが証明されている。しかしながら、ＡＤＰＫＤ患者の臨床試験のデータから、回復不能な、さらには致命的な肝障害のリスクが導き出された。そのため、米国食品医薬品局の心血管・肝臓薬諮問委員会は、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）に対する大塚製薬のトルバプタン使用の承認を控えている。
【０００６】
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）は、２２ｋＤの分泌リポカリンタンパク質ファミリーであり、胚腎臓のネフロンで発現する。ＮＧＡＬは、肝臓発生（Ｙａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，１０：１０４５−１０５６，２００２）や、バクテリアによる感染に対する自然免疫反応（Ｆｌｏ  ＴＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：９１７−９２１，２００４；Ｂｅｒｇｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０３：１８３４−１８３９，２００６）に関与している。ＮＧＡＬレベルの増加は、急性腎虚血（ＡＫＩ）（Ｍｉｓｈｒａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１４：２５３４−２５４３，２００３；Ｍｉｓｈｒａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６５：１２３１−１２３８，２００５；Ｕｒｂｓｃｈａｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，４４：６５２−６５９，２０１４；Ｄｉ  Ｇｒａｎｄｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ，１３：１９７−２００，２００９；Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｍｅｄ，８：２１７−２１９，２０１４）や、慢性腎臓病の進行度（ＣＫＤ）（Ｎｉｃｋｏｌａｓ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，８２：７１８−７２２，２０１２；Ｓｈｅｎ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  （Ｃａｒｌｔｏｎ），１９：１２９−１３５，２０１４）や、ＰＫＤの重症度（Ｐａｒｉｋｈ  ＣＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，８１：７８４−７９０，２０１２；Ｍｅｉｊｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，５６：８８３−８９５，２０１０）に対して、クレアチンや血液尿素窒素（ＢＵＮ）と比較して、より早く、より敏感なバイオメーカーとみなされている。
【０００７】
ＮＧＡＬ受容体（ＮＧＡＬ−Ｒ，Ｓｌｃ２２ａ１７）は、遠位尿細管や集合（尿細）管の頂端膜で発現し、細胞内の鉄供給に関係している（Ｌａｎｇｅｌｕｅｄｄｅｃｋｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８７：１５９−１６９，２０１２）。ＮＧＡＬとＮＧＡＬ−Ｒの結合は、細胞内の鉄の枯渇、アポトーシスの刺激、分裂の減少の原因となる（Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ  ＬＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２３：１２９３−１３０５，２００５；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｏｔｔ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１８：４０７−４１３，２００７；Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，５：４６３−４７０，２００７）。
【０００８】
米国特許出願公開第２０１４／００７９７６９号明細書には、Ｎｇａｌ遺伝子の発現レベルを測定することによって、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の進行を予測することや、Ｎｇａｌ遺伝子の発現を抑制することによって、ＣＫＤを予防したり治療できることが開示されている。加えて、米国特許出願公開第２００９／０１７０１４３号明細書では、被験者の体液サンプル中のＮＧＡＬの濃度を測定することで、腎障害の可能性をモニターしたり、特定する方法を開示している。さらには、高分子量画分中のＮＧＡＬの量を測定することで、ＣＫＤと急性腎障害や急性腎不全（ＡＫＩやＡＫＤ）とを区別するための方法が、米国特許出願公開第２０１１／００９１９１２号明細書には開示されている。
【０００９】
米国特許第８２４７３７６号明細書では、虚血、虚血再灌流障害、又は、毒素による障害で苦しんでいる患者に対するＮＧＡＬの静脈、皮下、腹腔内投与が開示されている。この、特許では、ＮＧＡＬが、腎近位尿細管細胞を直接的にターゲットにし、腎臓の再上皮化や尿細管細胞増殖を高めること、そして、細管細胞のアポトーシスを減らし、虚血再灌流障害後の高レベルな血清又は血漿クレアチンを減少させること、が記載されている。
【００１０】
治療薬としてのＮＧＡＬの使用は、虚血、虚血再灌流障害、又は、毒素誘発性障害で苦しんでいる患者への治療法として開示されているにも関わらず、ＰＫＤへの副作用のない治療薬や治療法にはなっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
肝臓に副作用がなく、有効な抗ＰＫＤ薬が不足している観点から、本発明の発明者らは、肝毒性のない抗ＰＫＤ薬の開発に専念してきた結果、本発明を完成した。本発明では、ＰＫＤマウスモデル（Ｐｋｄ１L3/L3）及びＮＧＡＬマウスモデル（腎臓特異的ＮＧＡＬが過剰発現しているＮｇａｌTg/Tg）を確立させ、異種配合することで、ＰＫＤを有し、且つ、胚腎臓の尿細管及び成獣の腎臓でＮＧＡＬが過剰発現するＰｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスを作り出した。これらのマウスモデルは、ＰＫＤの進行上、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現の効果を研究することにも用いられている。ＰＫＤの予防または治療に対する過剰発現した外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの治療結果に基づいて、ＰＫＤの治療のためのタンパク質医薬品を首尾よく開発することができる。
【００１２】
本発明は、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を含む多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の予防または治療用の医薬組成物に関するものである。
【００１３】
本発明は、ＰＫＤの遺伝子突然変異を有する被検者に有効量の好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を投与する工程を含む、ＰＫＤの治療または予防方法に関する。さらに、本発明は、外因性ＮＧＡＬタンパク質の過剰発現のための外来遺伝子が、ＰＫＤ遺伝子変異を有する被検者に遺伝子形質転換によって導入される、ＰＫＤを遺伝的に治療または予防する方法に関する。ＰＫＤ遺伝子突然変異を有する被験者とは、まだ病気ではないがＰＫＤを発症する可能性、または、ＰＫＤを発症するリスクのある潜在的な患者を含めＰＫＤを発症する可能性を有する対象、及び、ＰＫＤと診断された患者を意味する。ここで、被験者は、人間でも動物でもよい。
【００１４】
加えて、本発明は、低レベルの完全長ＰＣ１を発現し、外因性ＮＧＡＬを過剰発現するＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有するＰｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスモデルを確立する。ここで、外因性Ｎｇａｌ遺伝子は、腎臓管特異的カドヘリン１６（Ｋｓｐ−Ｃｄｈ１６）プロモーターの制御下で、ＮＧＡＬを発現することができる。Ｎｇａｌ遺伝子は、それが改変されているかどうかにかかわらず、完全に機能的なＮＧＡＬを発現することができる既知の生物の任意のＮｇａｌ遺伝子であり得る。外因性ＮＧＡＬの過剰発現は、ＮＧＡＬ／β−アクチン比に基づく。例えば、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/TgマウスのＮＧＡＬの腎臓レベルは、Ｐｋｄ１L3/L3とＮｇａｌTg/Tgマウスのものより、それぞれ１．８倍、３．７倍大きい。ＰＣ１の低レベルとは、野生型のＰＣ１のレベルが２０％以下、特に１５％以下、より具体的には１０％以下であることを意味する。動物モデルは、ＰＫＤに対する、ＮＧＡＬまたは他の酵素、受容体、因子または薬物の効果を調べるために使用することができる。
【００１５】
さらに、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの寿命は、Ｐｋｄ１L3/L3マウスと比較して、１．６−６倍長く、より詳細には２−５倍長い。また、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの体重に対する腎臓の重量比は、１０−１７％、より詳細には１２．２％−１５．５％になり得る。
【００１６】
ＮＧＡＬは、動物の形質転換により、ミルク、ニワトリまたはアヒルの卵において過剰発現され得る。又は、植物の形質転換により、葉、果実、種子、根または茎のような植物の食用成分に過剰発現され得る。あるいは、ＮＧＡＬ薬剤の製造において、ＮＧＡＬ発現ベクターを大腸菌または酵母に形質転換するか、または、ＣＨＯ細胞または他の生物を含む哺乳動物細胞にトランスフェクトして大量にＮＧＡＬを産生し、その後タンパク質精製することができる。
【００１７】
ＮＧＡＬは、その投与様式において汎用性があり、例えば、経口投与、静脈内注射、腹腔内注射または皮下注射によって輸送することができる。静脈内注射により、ＮＧＡＬまたはそれに由来するタンパク質薬剤は、血液循環系に輸送され腎臓に吸収されることで、酵素分解または肝初回通過効果を減少させ、有効性を維持する。さらに、本発明によるＮＧＡＬまたはそれから誘導されるタンパク質薬剤は、その高い特異性、副作用および毒性の低減、および高い生体適合性のために、トルバプタンなどの従来の小分子薬物よりも有利である。
【００１８】
前記ＰＫＤには、常染色体優性多発嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）および常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）が含まれる。本発明の実施形態では、ＰＫＤはＡＤＰＫＤである。
【００１９】
ＰＫＤの予防または治療は、疾患を予防、抑制、緩和、治療または改善することを意味する。本発明の実施形態によれば、嚢胞成長の遅延、間質線維症の減少、嚢胞性上皮細胞のアポトーシスの増加、および腎臓における嚢胞性上皮細胞の増殖の減少によって疾患を治療することで、患者の寿命を延ばすことができる。また、ＰＫＤ遺伝子突然変異を有する被験者については、被験者がまだ病気でない場合、または内因性ＮＧＡＬの発現前の胚期にある場合に、ＰＫＤを発症する可能性のある被験者に外因性ＮＧＡＬを投与することによって、疾患を予防することができる。
【００２０】
ＰＫＤ患者への外因性ＮＧＡＬのデリバリーは、ＮＧＡＬ過剰発現のための遺伝子形質転換によって、または、ＮＧＡＬを含む医薬品を患者に直接投与することによって実現され得る。ＮＧＡＬは、ＰＫＤの予防または治療に有効であるが、その理由は、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−Ｓ６Ｋシグナル伝達（すなわち、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ａｋｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）およびＳ６Ｋ）のダウンレギュレーションと同様に、活性カスパーゼ−３の増加、α−ＳＭＡの減少、および、低酸素誘導性因子１−α（ＨＩＦ−１α）を誘導するためである。
【００２１】
本発明の実施形態に基づいて、ＮＧＡＬは用量依存的に治療効果を示すことが認識され得る。換言すれば、ＰＫＤの予防または治療のためには、全ＮＧＡＬのレベルは、内因性ＮＧＡＬのレベルよりも高いことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、Ｎｇａｌノックアウト（ＫＯ）およびＣｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製を示す：＜図１Ａ＞相同組換えによるＮｇａｌ遺伝子座の標的；＜図１Ｂ＞マウスＣｄｈ１６腎臓特異的プロモーターによって過剰発現が制御されるＮｇａｌ導入遺伝子の概略地図；＜図１Ｃおよび１Ｄ＞Ｎｇａｌ-/-およびＮｇａｌTg/Tgの、ＰＣＲベースの遺伝子型決定。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、ウエスタンブロット解析によって同定されたＰｋｄ１L3/L3および野生型マウスの腎臓におけるＮＧＡＬの一時的発現を示す：＜図２Ａ＞Ｐｋｄ１L3/L3マウスおよび野生型マウスの、腎臓、尿、血清におけるＮＧＡＬ発現のウエスタンブロットの結果；＜図２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄ＞ローディングコントロールとしてβ-アクチンを用いたウエスタンブロットの定量、データは、平均±ＳＥＭ；ｎ＝６；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１）。
【図３】図３は、免疫組織化学分析によって同定されたＰｋｄ１L3/L3マウスおよび野生型マウスの腎臓におけるＮＧＡＬの一時的発現を示しており、野生型およびホモ接合型の異なる年齢のマウスの腎臓切片をＮＧＡＬ抗体で染色した：（Ａ−Ｃ）１日目（１Ｄ）の腎臓切片では、ＮＧＡＬの褐色染色が髄質では見られたが、野生型（ＷＴ）マウス（Ａ）の糸球体および皮質細管、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの腎皮質（Ｂ）および髄質（Ｃ）では見られなかった；（Ｄ−Ｆ）１４日目の腎臓切片では、ＮＧＡＬの発現量は、野生型マウス（Ｄ）では１日目より減少したが、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの腎皮質（Ｅ）および髄質（Ｆ）では１日目より上昇した；（Ｇ−Ｉ）２８日目の腎臓切片では、Ｐｋｄ１L3/L3マウスにおいて嚢胞肥大が１４日目（Ｅ、Ｆ）よりも大きかった。なお、（ｉ）嚢胞肥大間で扁平パターンに変換された立方上皮、および、ＮＧＡＬの発現も見られた（Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ）、（ｉｉ）全ての画像は、２つの独立した実験において遺伝子型当たり少なくとも３匹のマウスを代表するものであり、（ｉｉｉ）図（Ａ−Ｉ）のバーは２００μｍであり、差し込み図（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ）のバーは５０μｍである。
【図４】図４は、ＡＤＰＫＤおよびＡＲＰＫＤ患者の腎組織におけるＮＧＡＬ発現を示す：（Ａ、Ｂ）は正常、（Ｃ、Ｄ）はＡＤＰＫＤ、（Ｅ、Ｆ）はＡＲＰＫＤのヒト腎臓組織におけるＮＧＡＬ発現を示す。なお、（ｉ）ＡＤＰＫＤおよびＡＲＰＫＤ切片の両方において、▲はＮＧＡＬの暗褐色染色を示し、（ｉｉ）矢印は、ＡＤＰＫＤ切片の間質領域における単核細胞中の内因性ＮＧＡＬ発現の染色を示し、（ｉｉｉ）バーの長さは、（Ａ）は２００μｍ、（Ｂ）は５０μｍ、（Ｃ，Ｅ）は５００μｍ、（Ｄ，Ｆ）は１００μｍである。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、Ｎｇａｌの腎臓レベルが、Ｐｋｄ１L3/L3およびＮｇａｌTg/Tgマウスより、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgの方が、大きいことを示す：＜図５Ａ＞生後２１日（２１Ｄ）の異なる遺伝子型のマウスにおける、ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−Ｒ、およびβ−アクチン（コントロール）の代表的なウエスタンブロッティング；。＜図５Ｂ及び５Ｃ＞ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−Ｒのウエスタンブロッティング結果の定量化を示し、バーは、３つの個々のマウスの平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示す；***ｐ＜０．００１。
【図６】図６Ａ−６Ｆは、ＮｇａｌTg/0マウスの腎臓、尿、及び血清におけるＮＧＡＬの発現、異なるマウスの主要臓器におけるＮＧＡＬの発現、野生型マウスと比較したＮｇａｌTg/TgおよびＮｇａｌ-/-マウスの腎臓切片での糸球体の数を示す：＜図６Ａ＞ＮｇａｌTg/0マウスの、腎臓、尿、血清におけるＮＧＡＬ発現のウエスタンブロッティングの結果を示す；＜図６Ｂ，６Ｃ，６Ｄ，及び６Ｅ＞野生型、Ｎｇａｌ-/-、ＮｇａｌTg/Tg、及びＰｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの、主要臓器におけるＮＧＡＬ発現のウエスタンブロッティングの結果を示している。ここで、嚢胞液は陽性ローディリングコントロール（＋）である；＜図６Ｆ＞Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定による、野生型（黒丸）、ＮｇａｌTg/Tg（黒四角）、Ｎｇａｌ-/-（黒三角）マウスにおける２１日齢および同性別の腎糸球体の数を示す。ここで、すべての結果は四分位範囲（２５％−７５％）の中央値を表す。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの生存を延長することを示している：＜図７Ａ＞Ｐｋｄ１L3/L3（白三角），Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg（黒丸），及びＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-（白四角）マウスにおける、生存のカプランマイヤー分析を示す。ここで、ログランク検定は、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/TgマウスとＰｋｄ１L3/L3マウスの間で、そして、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/TgマウスとＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスとの間で、顕著な違いを示した（両者とも、ｐ＜０．００１）；＜図７Ｂ＞生存期間中央値は、Ｐｋｄ１L3/L3（ｎ＝３１，中央値＝２５日）、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg（ｎ＝４５，４６日）、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-（ｎ＝３２，２６日）であった。ここで、全ての結果は、四分位範囲（２５％−７５％）の中央値を表す；***ｐ＜０．００１。
【図８】図８Ａ−８Ｄは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの腎嚢胞を減少させることを示している：＜図８Ａ＞各遺伝子型の腎臓の代表的な画像を示す；＜図８Ｂ＞Ｄｕｎｎの複数比較検定による、２１日のＰｋｄ１L3/L3マウス（ｎ＝１０，中央値＝２３．１％），Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウス（ｎ＝９，１４．１％），及びＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（ｎ＝９，２４．４％）における、体重に対する腎臓重量の中央値の百分率;＜図８Ｃ＞各マウスの腎嚢胞の大きさを示す。Ｐｋｄ１L3/L3（４３０．１μｍ２），Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg（１２４．０μｍ２），及びＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-（３３９．８μｍ２）；＜図８Ｄ＞腎嚢胞の数を示す。ここで、全ての結果は、四分位範囲（２５％−７５％）の中央値を表す；***ｐ＜０．００１。
【図９】図９Ａ−９Ｅは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの間質性線維症を減少させることを示している：＜図９Ａ＞ヘマトキシリンおよびエオシン染色（上）、並びに、マッソントリクローム染色（下、スケールバーは２００μｍ）；＜図９Ｂ＞マッソントリクローム染色した腎臓から判定され、実施形態に記述されている通りに計算された腎線維症スコア。ここで、全ての結果は、四分位範囲（２５％−７５％）の中央値を表す；＜図９Ｃ−９Ｅ＞代表的なウエスタンブロッティング、および、α−ＳＭＡおよびＨＩＦ−１αについての結果の定量化。ここで、棒グラフは、３つの試料の平均±ＳＥＭを示す；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスのＰＣＮＡおよびプロカスパーゼ３の腎臓レベルを低下させることを示す：＜図１０Ａ＞異なる遺伝子型の２１日における、ＰＣＮＡ、カスパーゼ−３、および、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、ローディングコントロール）の代表的なウエスタンブロッティングの結果；＜図１０Ｂ＞ウエスタンブロッティングの結果の定量化（ＰＣＮＡ／ＧＡＰＤＨ）；＜図１０Ｃ＞ウエスタンブロッティングの結果の定量化（プロカスパーゼ−３／ＧＡＰＤＨ）、ここで、棒グラフは、３つの試料の平均±ＳＥＭを示す；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスのリン酸化−ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）およびｍＴＯＲのレベルを低下させることを示す：＜図１１Ａ＞異なる遺伝子型の２１日における、リン酸化−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）、ｍＴＯＲ、βアクチン（ローディングコントロール）の代表的なウエスタンブロッティングの結果；＜図１１Ｂおよび１１Ｃ＞ウエスタンブロッティングの結果の定量化（リン酸化−ｍＴＯＲ／βアクチン、および、ｍＴＯＲ／βアクチン）、ここで、棒グラフは、３つの試料の平均±ＳＥＭを示す；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃは、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、Ｐｋｄ１L3/L3マウスのリン酸化−Ａｋｔ、Ａｋｔ、リン酸化−Ｓ６Ｋ、および、Ｓ６Ｋの腎臓レベルを低下させることを示す：＜図１２Ａ＞異なる遺伝子型の２１日における、リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、Ａｋｔ、リン酸化−Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）、Ｓ６Ｋ、および、βアクチン（ローディングコントロール）の代表的なウエスタンブロッティングの結果；＜図１２Ｂおよび１２Ｃ＞ウエスタンブロッティング結果の定量化（リン酸化−Ａｋｔ／βアクチン、および、リン酸化−Ｓ６Ｋ／βアクチン）、ここで、棒グラフは、３つの試料の平均±ＳＥＭを示す；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃは、リン酸化−ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲの腎臓レベルが、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg、Ｐｋｄ１L3/L3、および、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスにおいて、より大きいことを示す：＜図１３Ａ＞異なる遺伝子型の２１日における、リン酸化−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）の代表的なウエスタンブロッティングの結果；＜図１３Ｂおよび１３Ｃ＞ウエスタンブロッティングの結果の定量化（リン酸化−ＥＧＦＲ／ＧＡＰＤＨ、および、ＥＧＦＲ／ＧＡＰＤＨ）、ここで、棒グラフは、３つの試料の平均±ＳＥＭを示す；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｄは、精製された組換えｍＮＧＡＬ１ΔＮ（マウスＮ末端短縮型ＮＧＡＬＡタンパク質）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、ｍＮＧＡＬ注射の治療効果を示す：＜図１４Ａ＞Ｎｉ2+−ＮＴＡクロマトグラフィーによる、組換えｍＮＧＡＬΔＮの最初の精製；レーンＭ、タンパク質マーカー；レーンＴ、全細胞溶解物；レーンＰ、不溶性ペレット；レーンＳ、可溶画分；レーンＦＴ、フロースルー；レーン３−３９、溶出画分；＜図１４Ｂ＞Ｑアニオン交換クロマトグラフィーによる、組換えｍＮＧＡＬΔＮのさらなる精製；＜図１４Ｃ＞Ｐｋｄ１L3/L3（白三角），Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg（黒丸）、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-（白四角）、ｍＮＧＡＬを注射したＰｋｄ１L3/L3(黒三角)、および、ｍＮＧＡＬを注射したＰｋｄ１L3/L3;Ｎｇａｌ-/-（黒四角）の各マウスにおける、生存のカプランマイヤー分析を示す；＜図１４Ｄ＞（ａ）未処理のＰｋｄ１L3/L3マウス、（ｂ−ｃ）ｍＮＧＡＬ−処理したＰｋｄ１L3/L3マウス、（ｄ）未処理のＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス、（ｅ）ｍＮＧＡＬ処理したＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス、の代表的な腎臓の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜＜実施形態＞＞
臨床的ヒト腎臓標本および患者
すべての腎臓組織は、國立成功（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ）病院のヒトバイオバンクから得た。この研究は國立成功大學（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のメディカルセンターの治験審査委員会によって承認された（Ａ−ＥＲ−１０１−２２８）。ＮＧＡＬタンパク質レベルは、台湾國立成功大學病院の病理学部から得られた３つのヒト腎臓標本（２例のＰＫＤ症例、１例の正常腎臓）における免疫組織化学によって検査した。正常な組織は、非尿生殖器系の病気がないことを検死で確認済みの死亡患者から得た。症例１は、重度の尿細管間質性腎炎による慢性腎不全のＡＤＰＫＤである。一方、症例２は、妊娠３０週で、多発性嚢胞巨大腎がある初期のＡＲＰＫＤと診断され、妊娠は終了している。
【００２４】
免疫組織化学
腎臓を取り出し、４℃の１０％ホルマリン中で一晩固定し、次に脱水およびパラフィン包埋を行い、免疫染色のために４μｍの切片を作製した。ＮＧＡＬを検出するために、腎臓切片は、脱パラフィンおよび再水和後、アビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でブロックし、ウサギ抗ＮＧＡＬ抗体、または、ヤギ抗ヒトＮＧＡＬ抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。他の免疫染色のために、標準免疫ペルオキシダーゼプロトコル（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ヤギ血清でブロックした後、切片を一次抗体と共に室温で一時間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、リンスし、次いでストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、リンスし、次いで色素原として３−アミノ９−エチル−カルバゾールと共にインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡で検査した。
【００２５】
動物実験
全てのマウスは、台湾台南市にある國立実験動物センター（ＮＬＡＣ）において１２時間の明暗周期下で飼育され、全ての実験はＮＬＡＣの動物実験委員会か認可した実験計画書に基づいて行われた。この研究において、本発明者たちは、実験の遂行に先立って、雄マウスと雌マウスに有意差がないことを確認した。いくつかの文献においても、雄雌の両方の動物を使って実験が行われていた。これは、動物の性別がＰＫＤの病理学的および分子的分析にほとんど影響を与えないことを示唆している。従って、マウスの雄雌の両方を使用した。
【００２６】
ＰＫＤマウス
本発明者たちの以前の研究では、ＰＫＤのマウスモデルについて記載した。Ｐｋｄ１L3/L3マウスは、全長ＰＣ１の生成レベルが低く、次第に多発性嚢胞腎を進行した。（Ｊｉａｎｇ  ＳＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１６８：２０５−２２０，２００６）。オリジナルのＰｋｄ１L3/+マウスは、混合Ｃ５７ＢＬ６−１２９バックグランドを有し、均一な遺伝的背景を得るために１０世代以上にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交配された。安定したＣ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景を有するＰｋｄ１L3/+マウスを、ホモ接合突変異体Ｐｋｄ１L3/L3を作製するために用いた。
【００２７】
Ｎｇａｌノックアウトマウス
Ｎｇａｌの従来のノックアウトマウスは、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅバイオテクノロジーを使って作製されていた。マウスのＮｇａｌ遺伝子はＰＧＫ／Ｎｅｏカセットによって破壊され、ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用された。Ｎｇａｌ-/-マウスは、元々、混合Ｃ５７ＢＬ６−１２９バックグランドで繁殖され、Ｎｇａｌ-/-を作製するために、交雑する前に１０世代以上にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交配し、均一的な遺伝的背景を確保した。ＮＧＡＬの従来のノックアウトは、ＰＫＤのＮＧＡＬタンパク質の腎機能を特徴づけるために、腎臓や他の組織からのＮＧＡＬの生成を防ぐことができる。
【００２８】
Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジェニックマウス
Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジェニックマウスは、マウスＣｄｈ１６プロモーターの制御下で、マウスＮＧＡＬを過剰発現する（Ｓｈａｏ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１３：１８２４−１８３６，２００２）。Ｋｓｐ−Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌは、内因性ＮＧＡＬの発現およびＡＤＰＫＤにおける嚢胞形成の前に、外因性ＮＧＡＬの早期発現を確実にした。Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジェニックマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有する。ＤＮＡ組換プロトコルは、ＮＬＡＣのバイオ安全委員会で承認された。ここで、Ｎｇａｌは、ＮＣＢＩ遺伝子Ｎｏ．１６８１９、または、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｎｏ．ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２６８２２である。
【００２９】
遺伝子型決定
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、尾部から抽出したゲノムＤＮＡから全ての変異マウスの遺伝子型決定を行った。各試料は２０μＬのＰＣＲ反応混合物を含み、βアクチンは内部コントロールとして使用された。プライマー配列は、
・マウスＮｇａｌフォワードプライマー、配列番号１（５’−ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＴＧＴＧＴＣ−３’）、
・マウスＮｇａｌリバースプライマー、配列番号２（５’−ＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＴＧ−３’）；
・β−アクチンフォワードプライマー、配列番号３（５’−ＧＧＣＡＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧ−３’）、
・β−アクチンリバースプライマー、配列番号４（５’−ＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＣ−３’）
である。
Ｎｇａｌノックアウト突然変異体を、以下のプライマーを用いて分析した。
・マウスＮｇａｌ  ５’ＵＴＲフォワードプライマー、配列番号５（５’−ＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＣ−３’）、
・ｌａｃＺリバースプライマー、配列番号６（５’−ＧＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＧＧＡＴＴＣＴＣ−３’）、
・マウスＮｇａｌリバースプライマー、配列番号７（５’−ＡＧＧＧＧＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＴＣ−３’）。
【００３０】
ウエスタンブロット解析
マウスの腎臓から抽出した全タンパク質（５０μｇ）は、ウエスタンブロット解析に供した。ｐＱＥタンパク質発現系（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、マウス全長ＮＧＡＬおよび精製ＮＧＡＬタンパク質を６×Ｈｉｓタグで発現させた。そして、精製ＮＧＡＬは、マウスの全長ＮＧＡＬタンパク質を用いてウサギを免疫化することによって、ＮＧＡＬ抗体を生成するために使用された。その他の抗体は、Ｓｌｃ２２Ａ１７に対するウサギポリクローナル抗体（ＧＴＸ８５０３２；ＧｅｎｅＴｅｘ）、ＧＡＰＤＨに対するウサギポリクローナル抗体（６３１４０１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ａ２５４７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、低酸素誘導因子１−α（ＨＩＦ−１α）に対するウサギポリクローナル抗体（ＧＴＸ  １２７３０９；ＧｅｎｅＴｅｘ）、ｍＴＯＲ（リン酸化Ｓｅｒ２４４８）に対するウサギモノクローナル抗体（５５３６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｍＴＯＲに対するウサギモノクローナル抗体（２９８３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、β−アクチン（８Ｈ１０Ｄ１０）に対するマウスモノクローナル抗体（１２２６２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓ６Ｋ１（リン酸化Ｔｈｒ３８９）に対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ２５７１；Ａｂｃａｍ）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼに対するウサギモノクローナル抗体（２７０８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｋｔ（リン酸化Ｓｅｒ４７３）に対するウサギポリクローナル抗体（９２７１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｋｔに対するウサギポリクローナル抗体（９２７２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カスパーゼ−３に対するウサギポリクローナル抗体（９６６２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するマウスモノクローナル抗体（３０７９０２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（リン酸化Ｔｙｒ１０６８）に対するウサギポリクローナル抗体（２２３４；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および、ＥＧＦＲに対するウサギモノクローナル抗体（ＧＴＸ６１５０３；ＧｅｎｅＴｅｘ）を用いた。
【００３１】
組織学および組織形態分析
上記のとおり（Ｗａｎｇ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２２２：２３８−２４８、２０１０）、標本をホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、４μｍ切片に切断し、光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００ニコン、日本）で検査するため、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはマッソントリクローム染色した。マウス遺伝子型を盲検化し、嚢胞数およびサイズ（Ｈ＆Ｅ染色）およびコラーゲン線維（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）の染色を定量化した。平均クイックスコア（ＱＳｓ）の計算には、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｖ．４．５．０．２９ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、２０８５０  ＵＳＡ）を使用した。各スライドについて、ソフトウェアは分析のために５つのフィールド（２００×）をランダムに選択した。適切なホワイトバランスの後で、ソフトウェアは、オペレータがデジタル画像をつかむことによって特別な関心領域をゲートし、それらを別々に検査することを可能にする。各スライドを解析して、標識指数（ＬＩ；全領域に対する陽性染色された領域の比）、および、平均光学密度（ＭＯＤ；陽性ピクセルのカウントに基づく染色濃度）を決定した。ＱＳは、ＬＩとＭＯＤの数学的積として計算された。嚢胞の計数には、皮質、髄質および乳頭を含む、Ｈ＆Ｅ染色された横断腎臓切片の代表的な画像を使用した。画像上にグリッドを配置し、嚢胞性および非嚢胞性領域を二分したグリッド交点の割合を計算した。
【００３２】
統計分析
比較は３つの群：Ｐｋｄ１L3/L3、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg、および、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-で行われた。パラメトリックデータは、すべての群でｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）を用いて行われ、続いて各ペアのターキー多重比較テストが行われた。生存時間は中央値および四分位範囲（２５％〜７５％）として示され、群は非パラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とＤｕｎｎの複数比較検定によって比較された。生存曲線を構築し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定値を用いて、対数ランク検定を用いて異なる群の生存率を比較した。０．０５未満のｐ−値は統計学的に有意であると考えられる。
【００３３】
＜結果＞
Ｎｇａｌ従来型ノックアウトおよびＣｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジェニックマウスの作製
マウスＮｇａｌ標的化ストラテジー、および、Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌトランスジーンは、それぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される。ＰＣＲ分析により、これらのマウスの遺伝子型判定が確認された（図１Ｃ）。ヘテロ接合型ＮｇａｌTg/oマウスの割合は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交配されたＮｇａｌTg/Tgマウスのホモ接合性も確認した。Ｎｇａｌの発現レベルは、ＮｇａｌTg/oとＮｇａｌTg/TgマウスのＮｇａｌのコピー数と正の相関があった（図１Ｄ）。
【００３４】
ＮＧＡＬのレベルは、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの腎臓で増加する
Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスは、Ｐｋｄ１L3/+；ＮｇａｌTg/TgマウスとＰｋｄ１L3/+；ＮｇａｌTg/Tgマウスを交雑することで作製した。ウエスタンブロット解析により、Ｐｋｄ１L3/L3マウスおよび野生型マウスの、尿、血清、腎臓における内因性ＮＧＡＬの発現の差異を検出した（図２Ａ−２Ｄ）。Ｐｋｄ１L3/L3マウスでは、嚢胞拡大過程に沿って徐々にレベルが上昇したのに対し、野生型マウスでは年齢とともにそのレベルが低下した。免疫組織化学的分析により、野生型マウスおよびＰｋｄ１L3/L3マウスの両方において、１日目、１４日目および２８日目の腎臓ＮＧＡＬの一時的発現パターンが明らかになった（図３）。１４日目と２８日目のＰｋｄ１L3/L3マウスにおいて、内因性ＮＧＡＬは、主に嚢胞上皮の頂端膜側に局在し、Ｐｋｄ１L3/L3マウスでは、年齢とともに腎臓髄質の嚢胞は大きくなった。ＡＤＰＫＤまたは常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）患者の腎臓においても、同様のパターンが観察された（図４）。結果は、嚢胞性上皮における内因性ＮＧＡＬのアップレギュレーションは、異常な腎発達を引き起こす可能性があることを示し、この議論はＰＫＤの重症度におけるＮＧＡＬの役割によって支持される。次に、これら３つのＰＫＤマウス（すなわち、Ｐｋｄ１L3/L3マウス、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウス、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス）の２１日目おける、ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−Ｒの腎臓発現を、ウエスタンブロット解析した（図５Ａ）。Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/TgマウスにおけるＮＧＡＬの腎臓レベルは、Ｐｋｄ１L3/L3およびＮｇａｌTg/Tgマウスより、それぞれ、１．８倍および３．７倍高かった（図５Ｂ）。さらに、これら３つのＰＫＤマウスにおけるＮＧＡＬ−Ｒの腎臓発現は、ＰＫＤなしのコントロール同腹子におけるものと比較して、有意に上方制御された（ｐ＜０．００１）（図５Ａおよび５Ｃ）。結果は、外因性ＮＧＡＬは、内因性ＮＧＡＬの発現前にＫｓｐ−Ｃｄｈ１６プロモーターの制御下で胚腎臓において連続的に過剰発現されることを示し、このことは、外因性ＮＧＡＬが胚期のＰｋｄ１L3/L3マウスにおけるＰＫＤの進行を妨げることを示唆している。
【００３５】
ＮｇａｌTg/TgマウスおよびＰｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおける、外因性ＮＧＡＬの腎臓特異的過剰発現
ウエスタンブロット解析で、ＮｇａｌTg/0マウスの、尿、血清、腎臓における外因性ＮＧＡＬの発現を検出した（図６Ａ）。野生型マウスとＮｇａｌ-/-マウスを比べると、野生型（ＷＴ）マウスでは肺および脾臓の組織でＮＧＡＬが発現したが（図６Ｂ）、Ｎｇａｌ-/-マウスでは見られなかった（図６Ｃ）。加えて、外因性ＮＧＡＬの腎臓特異的過剰発現が、ＮｇａｌTg/Tgマウス（図６Ｄ）、および、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウス（図６Ｅ）で検出された。さらに、野生型のマウスと比較して、ＮｇａｌTg/TgマウスおよびＮｇａｌ-/-マウスの腎臓切片における糸球体を計数することによって、ＮＧＡＬの腎臓発達に対する効果を調べた（図６Ｆ）。これらの結果は、腎糸球体の数は、年齢や性別が一致したマウスの間で、有意差がなかったことを示した（ｐ＝０．２９４）。
【００３６】
Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌの過剰発現は、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの生存および寿命を延長する
ＮＧＡＬの差次的発現によって、Ｐｋｄ１L3/L3、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tg、および、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスの生存上のＮＧＡＬの効果が観察された（図７Ａ）。ログランクテストでは、Ｐｋｄ１L3/L3マウス（中央値＝２５日、四分位範囲［ＩＱＲ］２３−２６日）およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（中央値＝２６日，ＩＱＲ２４−３１日）と比較して、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの寿命が著しく伸びた（中央値＝４６日、ＩＱＲ３７−６０日）（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図７Ｂ）。さらに、Ｐｋｄ１L3/L3およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスの間で、寿命に有意差はなかった（ｐ＝０．２９８８）。
【００３７】
Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌの過剰発現は、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの嚢胞肥大を遅らせる
総腎臓体積（ＴＫＶ）は、ＢＵＮの増加およびＰＫＤの疾患進行と正の相関があることが知られていた。多発性嚢胞腎は、Ｐｋｄ１L3/L3およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスにおいて、２１日で終末段階に進行した。Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの腎臓は、Ｐｋｄ１L3/L3およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスの腎臓よりも小さい（図８Ａ）。加えて、２１日目の体重に対する腎臓重量の中央値は、Ｐｋｄ１L3/L3マウス（中央値＝２３．１％、ＩＱＲ２０．９−２７．６％）およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（中央値＝２４．４％、ＩＱＲ２２．７−２７．７％）と比較して、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウス（中央値＝１４．１％、ＩＱＲ１２．２−１５．５％）は明らか低かった（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図８Ｂ）。腎嚢胞サイズも、他の２種類のＰＫＤマウスと比較して、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスは有意に小さかった（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図８Ｃ）、一方、嚢胞数には有意な差はなかった（図８Ｄ）。これらの結果は、外因性腎臓特異的ＮＧＡＬの過剰発現が、嚢胞サイズを減少させることによってＰＫＤの急速な進行を防止するが、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの嚢胞数を減少しないこと実証した。この結果に基づき、Ｎｇａｌの欠失はＰＫＤに影響を与えないことが認められ、このことから、ＮＧＡＬではなくＰＣ１の減少がＰＫＤの進行を決定することが示唆される。さらに、Ｐｋｄ１L3/L3マウスの内因性ＮＧＡＬのアップレギュレーションは、マウスを早期死から保護することができない。
【００３８】
Ｃｄｈ１６−ｍＮｇａｌの過剰発現は、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの間質性線維症を減らす
２１日目の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ、図９Ａ、上部パネル）した腎臓切片、および、マッソントリクローム染色（図９Ａ、下部パネル）した腎臓切片を検査した。次に、腎線維症およびＮＧＡＬ投与の有効性を調べた。具体的には、糸球体線維症の評価のため、マッソントリクローム染色を用いてコラーゲンを染色し、糸球体線維症スコアを統計解析ソフトウェアによりさらに計算した。結果は、野生型マウスは、Ｐｋｄ１L3/L3マウス（ｐ＝０．００２）およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（ｐ＝０．０１５）マウスと比較して、有意に低い腎臓線維症のスコアを示したが、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウス（ｐ＝０．４１７）では有意差はなかった（図９Ｂ）。ＰＫＤの進行性線維症に関連するα−ＳＭＡの腎臓レベル、および、腎臓の尿細管間質区画における低酸素症に関連するＨＩＦ−１αの腎臓レベルをさらに調べた。ウエスタンブロット解析は、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおけるα−ＳＭＡレベルは、野生型マウスのレベルに匹敵することを示した（図９Ｃ）。しかしながら、α−ＳＭＡ、および、ＨＩＦ−１αの発現は、他の２種類のＰＫＤマウスより有意に低かった（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図９Ｄおよび９Ｅ）。上記の評価によれば、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスの外因性ＮＧＡＬのレベルの増加は、腎臓線維症スコア、および、α−ＳＭＡとＨＩＦ−１αの発現を減らすことが証明された。したがって、これらの結果は、ＮＧＡＬが腎糸球体線維症、腎間質性線維症および腎臓の尿細管間質区画における低酸素症を改善することを示唆している。
【００３９】
Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおける、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）およびカスパーゼ３の変化
増殖およびアポトーシスの両方が、多発性嚢胞嚢の早期嚢胞形成において増加した。ウエスタンブロット解析（図１０Ａ）では、他の２種類のＰＫＤマウスと比較して、プロカスパーゼ３およびＰＣＮＡの発現の両方が減少し、活性カスパーゼ３はＰｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおいて増加していることが明らかとなった（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
【００４０】
哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）の腎臓レベルは、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおいて、ＡｋｔおよびＳ６キナーゼシグナル伝達のダウンレギュレーションを伴い減少した
ＰＫＤを有しないそれぞれのコントロール同腹子と比較して、３つのＰＫＤマウスの全てがｍＴＯＲおよびｐ−ｍＴＯＲの発現を示した（図１１Ａ）。さらに、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスは、Ｐｋｄ１L3/L3マウスおよびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウスと比較して、最も低いｍＴＯＲおよびｐ−ｍＴＯＲレベルであった（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図１１Ｂ−１１Ｃ）。ｍＴＯＲの主要上流調節因子（Ａｋｔ）および下流標的［リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）］は、細胞増殖に関与する。その後のウエスタンブロット解析（図１２Ａ）により、他の２種類のＰＫＤマウスと比較して、Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスは、リン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）およびリン酸化Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｓ６Ｋ）の発現が有意に減少したことを確認した（Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgに対して、両方ともｐ＜０．００１）（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。
【００４１】
Ｐｋｄ１L3/L3；ＮｇａｌTg/Tgマウスにおける、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）の腎臓レベル
ＥＧＦＲおよびｐ−ＥＧＦＲの過剰発現および頂端ミスロケーションは、嚢胞成長を促進すること、および、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の阻害はＰＫＤの発達を減弱させうること、が知られている（Ｏｒｅｌｌａｎａ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，４７：４９０−４９９，１９９５；Ｄｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２６９：Ｃ４８７−４９５，１９９５；Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＷＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，５７：３３−４０，２０００；Ｔｏｒｒｅｓ  ＶＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，６４：１５７３−１５７９，２００３）。ウエスタンブロット解析（図１３Ａ）は、ＰＫＤを有しないコントロールの同腹子と比較して、３種類のＰＫＤマウスの何れもが、ＥＧＦＲおよびｐ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）の両方の発現が有意に増加したことを示した（コントロールに対して、ｐ＜０．００１）（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。しかし、ｐ−ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲの比は、３つのＰＫＤマウス間で差異を示さなかった。
【００４２】
組換えマウスＮｇａｌタンパク質（ｍＮＧＡＬ）の準備、および治療ＰＫＤマウス
我々の研究において、私たちは、嚢胞の成長の減少における、分泌Ｎｇａｌの治療効果を強く主張した。我々は、組換えマウスＮｇａｌタンパク質（ｍＮＧＡＬ）をさらに調製し、低内毒素（１００μｇ／ｄａｙ）と高純度（３２ｍｇ／ｍｌ）を持つ機能性組み換えｍＮｇａｌタンパク質を、ＰＫＤマウスの腹腔内に注射した。ｍＮＧＡＬ（２３〜２００残基）のコード配列は、精製を容易にするためのＮ末端Ｈｉｓ６タグを有するｐＥＴ２１ａベクターにサブクローンされた。続いて、配列決定による正しい構築物を、タンパク質発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。単一の形質転換体の６０ｍｌの一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する６リットルの新鮮なＬＢ培地に接種した。細胞をＡ６００ｎｍ＝０．６〜１．０に増殖させ、２０℃で０．５ｍＭイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。１６時間後、細胞を７，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞ペーストを回収した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾールを含むｐＨ８．０の溶解緩衝液中に、細胞ペレットを直ちに再懸濁させた。細胞懸濁液をＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＯＮＳＴＡＮＴ  ＳＹＳＴＥＭ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）により破壊し、１７，０００×ｇで遠心分離して細胞破片を除去した。無細胞抽出物を、予め溶解緩衝液で平衡化しておいたＮｉ2+−ＮＴＡカラムに導入した。カラムを溶解緩衝液で洗浄し、続いてＨｉｓ６タグ付きｍＮＧＡＬを１０ｍＭから５００ｍＭイミダゾールの直線勾配で溶出させた（図１４Ａ）。精製Ｈｉｓ６タグ付きｍＮＧＡＬを４倍の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液で希釈し、続いて、予め２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化したＱアニオンイオン交換カラムに導入した。Ｈｉｓ６タグ付きｍＮＧＡＬを含有する低リポ多糖類（ＬＰＳ）を、Ｑアニオン交換カラムを通過したフローから回収した（図１４Ｂ）。最後に、Ｈｉｓ６タグ付きｍＮＧＡＬを濃縮し、−８０℃で保存するため、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１０ｋＤａカットオフサイズ膜を有するＰＢＳ緩衝液で交換した。皮下（ＳＣ）または腹腔内注射（ＩＰ）により、生後７日目に、Ｐｋｄ１L3/L3マウス（ｎ＝３）、Ｐｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（ｎ＝６）に、ｍＮＧＡＬ（１００μｌ／日）を注射した。我々のデータは、未処置群と比較して、ｍＮＧＡＬを注入したＰｋｄ１L3/L3マウス（ｎ＝３、雄１匹、雌２匹）およびＰｋｄ１L3/L3；Ｎｇａｌ-/-マウス（ｎ＝６、雄３匹、雌３匹）において、生存率および日数が著しく増加したことを示した（図１４Ｃ）。Ｐｋｄ１L3/L3マウスの嚢胞腎も、未処置群と比較して、ｍＮＧＡＬ処理Ｐｋｄ１L3/L3マウスにおいて有意に遅延した（図１４Ｄおよび表１）
【００４３】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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