(57)【要約】【課題】狭窄を抑制することができる新規な狭窄抑制剤を提供すること。【解決手段】間葉系細胞の培養上清を含む狭窄抑制剤、並びにＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞の培養上清を含む、狭窄抑制剤。
【請求項２】
間葉系細胞が、ヒト羊膜由来間葉系細胞である、請求項１に記載の狭窄抑制剤。
【請求項３】
消化管の狭窄抑制剤である、請求項１又は２に記載の狭窄抑制剤。
【請求項４】
食道の狭窄抑制剤である、請求項１から３の何れか一項に記載の狭窄抑制剤。
【請求項５】
ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物。
【請求項６】
間葉系細胞が、ヒト羊膜由来間葉系細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
培養上清が、無血清馴化培地である、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が増粘剤を含むゲル組成物である、請求項５から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
増粘剤が、多糖類である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
増粘剤が、カルボキシメチルセルロースである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬部外品を含む医薬品、飲食品、又は化粧品として使用する、請求項５から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清に増粘剤を懸濁し、得られた懸濁物をゲル化する工程を含む、請求項８から１０の何れか一項に記載の組成物の製造方法。
【請求項１３】
ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清が、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞を血清含有培地で培養した後に、無血清培地で培養することにより得た培養上清である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５から１１の何れか一項に記載の組成物を含む、狭窄抑制剤。
【請求項１５】
消化管の狭窄抑制剤である、請求項１４に記載の狭窄抑制剤。
【請求項１６】
食道の狭窄抑制剤である、請求項１４又は１５に記載の狭窄抑制剤。
【請求項１７】
請求項５から１１の何れか一項に記載の組成物を含む、抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞の培養上清を含む狭窄抑制剤に関する。さらに本発明は、間葉系細胞の培養上清を含み、所定の粘度を有する組成物に関する。さらに本発明は、上記組成物を含む、狭窄抑制剤及び抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系細胞は、骨髄に存在することが指摘された体性幹細胞であり、幹細胞として骨、軟骨及び脂肪に分化する能力を有する。間葉系細胞は、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目され、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが知られている。
【０００３】
特許文献１には、羊膜を、コラゲナーゼと、サーモリシン及び／又はディスパーゼとにより酵素処理する工程；及び酵素処理した羊膜をメッシュに通す工程を含む、間葉系細胞組成物の製造方法；凍結保存された間葉系細胞組成物の製造方法；並びに前記間葉系細胞組成物を有効成分とする移植片対宿主病・炎症性腸疾患・全身性エリテマトーデス・肝硬変・放射線腸炎治療剤が記載されている。しかし、特許文献１には、細胞の培養上清を疾患の予防又は治療に使用することについては記載がない。
【０００４】
間葉系細胞などの細胞の培養上清が、ある種の疾患の治療に有効であることが報告されている。例えば、特許文献２には、間葉系細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤が記載されている。特許文献３には、羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）、又はＡＭＤＡＣによる馴化培養培地の治療有効量を個体に投与することを含む、不適切な又は望ましくない免疫反応に関連した又はこれにより引き起こされた疾患又は障害を有するか又は発症のリスクのある個体を治療する方法が記載されている。特許文献４には、被験体に、ＳＴＲＯ−１+細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれらに由来する可溶性因子を投与するステップを含む膵機能を改善する方法が記載されている。特許文献５には、タンパク質マーカーＣＤ９０およびＣＤ１１７の発現について陰性である、羊膜由来細胞の実質的に精製された集団が記載されている。さらに、非特許文献１には、羊膜由来間葉系幹細胞の培養上清が、肝線維症の改善効果を示すことが記載されている。上記の通り、特許文献２〜４及び非特許文献１には、細胞の培養上清を疾患の治療に使用することが記載されているが、細胞の培養上清を含むゲル化組成物についての記載はない。
【０００５】
他方、食道表在がんに対する内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）は急速に普及し、病変の大きさに制限されない切除技術も進歩している。しかし、広範囲の切除を行なうと、術後に瘢痕狭窄を来たしＱＯＬの低下をひきおこす。臨床では、術後狭窄予防として内視鏡的バルーン拡張術やステロイドの潰瘍面への局注や内服（非特許文献２及び３）、臨床試験として自己口腔粘膜上皮から得られた細胞シートを用いた治療（非特許文献４）が行なわれているが、合併症や細胞採取の侵襲性、コストが問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−６１５２０号公報
【特許文献２】特開２０１３−１８７５６号公報
【特許文献３】特表２０１４−５０１２４９号公報
【特許文献４】特開２０１５−２０５８９４号公報
【特許文献５】特表２００８−５３８１８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  ２０１５：１；ｅ１６
【非特許文献２】Ｈａｎａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ  ２０１２：４４；１００７
【非特許文献３】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｅｎｄｏｓｃ  ２０１１：７３；１１１５
【非特許文献４】Ｏｈｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕｔ  ２００６：５５；１７０４−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の特許文献２には間葉系細胞（ＭＳＣ）の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤が記載されているが、有効成分を疾患部位により長時間滞留させる手法が望まれている。また、術後の狭窄の予防手段については満足できる手段はなく、新しい手段の提供が望まれている。
【０００９】
本発明は、狭窄を抑制することができる新規な狭窄抑制剤を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、狭窄を抑制することができ、また抗炎症作用を有する新規組成物を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記組成物を含む、狭窄抑制剤及び抗炎症剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、ヒト羊膜由来間葉系細胞を血清含有培地(αＭＥＭ)で培養し、細胞がコンフルエントになった時点で無血清培地に置換し、さらに培養した後に、培地を回収し、遠心して培養上清を得た。この培養上清をカルボキシメチルセルロースに懸濁し、ゲル組成物を作製した。ブタ食道ＥＳＤ（内視鏡的粘膜下層剥離術：Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）後に、食道に上記のゲル組成物を塗布したところ、食道狭窄が有意に抑制され、その効果はステロイド局注に匹敵することを実証した。また、ラットＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）腸炎モデルに、上記ゲル組成物を注腸したところ、大腸の炎症所見が有意に改善されることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
すなわち、本明細書によれば以下の発明が提供される。
［１］  間葉系細胞の培養上清を含む、狭窄抑制剤。
［２］  間葉系細胞が、ヒト羊膜由来間葉系細胞である、［１］に記載の狭窄抑制剤。
［３］  消化管の狭窄抑制剤である、［１］又は［２］に記載の狭窄抑制剤。
［４］  食道の狭窄抑制剤である、［１］から［３］の何れか一に記載の狭窄抑制剤。
［５］  ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物。
［６］  間葉系細胞が、ヒト羊膜由来間葉系細胞である、［５］に記載の組成物。
［７］  培養上清が、無血清馴化培地である、［５］又は［６］に記載の組成物。
［８］  組成物が増粘剤を含むゲル組成物である、［５］から［７］の何れか一に記載の組成物。
［９］  増粘剤が、多糖類である、［８］に記載の組成物。
［１０］  増粘剤が、カルボキシメチルセルロースである、［８］又は［９］に記載の組成物。
［１１］  医薬部外品を含む医薬品、飲食品、又は化粧品として使用する、［５］から［１０］の何れか一に記載の組成物。
［１２］  ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清に増粘剤を懸濁し、得られた懸濁物をゲル化する工程を含む、［８］から［１０］の何れか一に記載の組成物の製造方法。
［１３］  ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清が、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞を血清含有培地で培養した後に、無血清培地で培養することにより得た培養上清である、［１２］に記載の方法。
［１４］  ［５］から［１１］の何れか一に記載の組成物を含む、狭窄抑制剤。
［１５］  消化管の狭窄抑制剤である、［１４］に記載の狭窄抑制剤。
［１６］  食道の狭窄抑制剤である、［１４］又は［１５］に記載の狭窄抑制剤。
［１７］  ［５］から［１１］の何れか一に記載の組成物を含む、抗炎症剤。
【００１２】
さらに本発明によれば以下の発明も提供される。
（Ａ）狭窄抑制のために使用される間葉系細胞の培養上清。
（Ｂ）狭窄抑制のために使用される組成物であって、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物。
（Ｃ）抗炎症剤のために使用される組成物であって、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物。
（Ｄ）狭窄抑制を必要とする対象者に、間葉系細胞の培養上清の抑制有効量を投与する工程を含む、狭窄を抑制する方法。
（Ｅ）狭窄抑制を必要とする対象者に、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である組成物の抑制有効量を投与する工程を含む、狭窄を抑制する方法。
（Ｆ）炎症の抑制を必要とする対象者に、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である組成物の抑制有効量を投与する工程を含む、炎症を抑制する方法。
（Ｇ）狭窄抑制剤の製造のための、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清の使用。
（Ｈ）狭窄抑制剤の製造のための、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である組成物の使用。
（Ｉ）抗炎症剤の製造のための、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である組成物の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、狭窄を抑制することができる新規な狭窄抑制剤が提供される。また本発明の所定の粘度を有する組成物によれば、狭窄を抑制することができ、さらに炎症を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、羊膜ＭＳＣにおける表面抗原の発現をフローサイトメーターで確認した結果を示す。
【図２】図２は、狭窄率の測定におけるａ、ｂ１及びｂ２の長さの位置関係を示す。
【図３】図３は、狭窄率の測定結果を示す。ＳＴＤは対照群、ＣＭはゲル群、Ｓｔｅｒｏｉｄはステロイド群を示す。
【図４】図４は、マソン・トリクロム（ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色による狭窄部の繊維の厚さの測定例を示す。
【図５】図５は、肉眼所見（左側）及びｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した結果を示す。
【図６】図６は、狭窄部の線維の厚さの測定結果を示す。ＳＴＤは対照群、ＣＭはゲル群、Ｓｔｅｒｏｉｄはステロイド群を示す。
【図７】図７は、活性化線維芽細胞の数の測定結果を示す。ＳＴＤは対照群、ＣＭはゲル群、Ｓｔｅｒｏｉｄはステロイド群を示す。
【図８】図８は、  病理スコアの測定結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を示し、αＭＥＭｇｅｌは、培養していないαＭＥＭのゲルを示し、ＣＭｇｅｌは、間葉系細胞の培養上清を含むゲルを示す。
【図９】図９は、ＣＤ６８陽性マクロファージの染色結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を示し、αＭＥＭｇｅｌは、培養していないαＭＥＭのゲルを示し、ＣＭｇｅｌは、間葉系細胞の培養上清を含むゲルを示す。
【図１０】図１０は、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）陽性好中球の染色結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を示し、αＭＥＭｇｅｌは、培養していないαＭＥＭのゲルを示し、ＣＭｇｅｌは、間葉系細胞の培養上清を含むゲルを示す。
【図１１】図１１は、ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を示し、αＭＥＭｇｅｌは、培養していないα−ＭＥＭのゲルを示し、ＣＭｇｅｌは、間葉系細胞の培養上清を含むゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
【００１６】
本明細書における「間葉系細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ)」は、間葉系および前駆細胞（１つ又は複数の様々な臓器又は組織を構成する細胞に分化する能力を有する細胞を意味）を指し、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙが提唱する多能性間葉系細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ)の定義を満たす細胞を指す（下記参照）。
なお、「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。
【００１７】
多能性間葉系細胞の定義
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ｉｉ）表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性。
ｉｉｉ）培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。
【００１８】
［２］間葉系細胞の調製
本発明で用いる間葉系細胞の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ブタ、サル、イヌ、ネコなど）であり、より好ましくはヒトである。間葉系細胞を採取する組織は特に限定されず、間葉系細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、卵膜（羊膜を含む）、胎盤、臍帯、歯髄などの組織から取得することができる。好ましくは、本発明で用いる間葉系細胞は、羊膜から採取した間葉系細胞である。
本発明で用いる間葉系細胞は、ＣＤ９０の発現が陽性であり、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０の発現が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲの発現が陰性である。
【００１９】
本発明で用いる間葉系細胞は、上記の組織（例えば、羊膜）を、コラゲナーゼ及び／または金属プロテイナーゼにより酵素処理する工程；及び酵素処理した組織（例えば、羊膜）をメッシュに通す工程を含む方法により調製することができる。
【００２０】
一例においては、ヒト羊膜を、至適濃度に調整したコラゲナーゼと金属プロテイナーゼとを含有する酵素液で一回のみ処理し、酵素処理後の羊膜消化液をメッシュに通すことができる。至適濃度に調整したコラゲナーゼと金属プロテイナーゼでは消化されない基底膜を含む上皮細胞層はメッシュに残り、至適濃度に調整したコラゲナーゼと金属プロテイナーゼでは消化される細胞外基質層に含まれるＭＳＣはメッシュを通過することから、メッシュを通過した細胞を回収することにより、ＭＳＣを回収することができる。
【００２１】
羊膜由来ＭＳＣ分離法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法で行うことができる。ヒト胎児付属物から羊膜を物理的に採取する。羊膜を生理食塩水等の等張液にて洗浄し、至適濃度のコラゲナーゼと金属プロテイナーゼとを含有する酵素を含有する溶液に羊膜を浸して、適温にて震盪攪拌する。上皮細胞層は細胞外基質のみを標的とする酵素処理では個々の細胞に分離されず層構造のままであるため、得られた羊膜消化液をメッシュに通すと、上皮細胞層はメッシュ上に残り、細胞外基質層に含まれるＭＳＣはメッシュを通過し、回収することが可能となる。
【００２２】
羊膜由来ＭＳＣ分離法の一例を詳細に述べる。
１．手術室にて待機的帝王切開例からヒト胎児付属物を無菌的に採取する。
２．胎児付属物から羊膜を無菌的且つ用手的に剥離する。
３．羊膜を滅菌容器（ディスポーザブルカップ）に移し、生理食塩水等の等張液を用いて数回洗浄し、付着した血液等を取り除く。
４．羊膜を、メス・ハサミ等にて大まかに切る（このステップは省略しても良い）。また、羊膜は、培地中で２℃以上８℃以下、２４時間以上４８時間以下保存してから使用してもよい。
５．羊膜を至適濃度に調整したコラゲナーゼと、サーモリシン及び／又はディスパーゼとを含有する溶液に浸し、恒温振盪機を用いて３７℃、６０ｒｐｍで９０分間震盪攪拌する。
６．その結果、上皮細胞層は一層のままとなり、細胞外基質層に含まれるＭＳＣは酵素含有溶液に浮遊する。
７．Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー（１００μｍメッシュ）を滅菌チューブ（Ｆａｌｃｏｎ５０ｍＬチューブ）にセットし、自由落下にて羊膜消化後の細胞含有液をろ過することで、上皮細胞層はメッシュ上に残り、ＭＳＣのみがメッシュを通過する。
８．メッシュを通過したＭＳＣ含有溶液をハンクス平衡塩液で希釈後、４００×ｇ、５分遠心操作にて間葉系細胞をペレットにする。
９．１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加αＭＥＭにて希釈し、プラスチックフラスコに播種し、培養する。
【００２３】
羊膜由来ＭＳＣの分離に用いられる酵素の組み合わせは、好ましくは、コラーゲンのみを消化するコラゲナーゼと、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）である。
上記の通り、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の組合せを用いることが好ましいが、ＭＳＣを遊離し、上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）を使用することもできる。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の好ましい濃度の組合せは、酵素処理後顕微鏡観察やフローサイトメトリーにより決定することができる。上皮細胞層が分解されず、細胞外基質層に含まれるＭＳＣが遊離する濃度条件であることが好ましい。
【００２４】
コラゲナーゼの濃度は、好ましくは５０ＣＤＵ／ｍＬ以上、より好ましくは７５ＣＤＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１００ＣＤＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１２５ＣＤＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ＣＤＵ／ｍＬ以上である。また、コラゲナーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＣＤＵ／ｍＬ以下、９００ＣＤＵ／ｍＬ以下、８００ＣＤＵ／ｍＬ以下、７００ＣＤＵ／ｍＬ以下、６００ＣＤＵ／ｍＬ以下、５００ＣＤＵ／ｍＬ以下、４００ＣＤＵ／ｍＬ以下、３００ＣＤＵ／ｍＬ以下である。ここで、ＣＤＵ（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）は、コラーゲンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５において５時間に１μｍｏｌのロイシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の濃度は、好ましくは１００ＰＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１２５ＰＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ＰＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１７５ＰＵ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍＬ以上である。また、金属プロテイナーゼの濃度は、好ましくは８００ＰＵ／ｍＬ以下、より好ましくは７００ＰＵ／ｍＬ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍＬ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍＬ以下、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍＬ以下である。ここで、ＰＵ（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｕｎｉｔ）は、乳酸カゼインを基質として３５℃、ｐＨ７．２において１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸及びペプチドを生成する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、羊膜の上皮細胞層に含まれる羊膜上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる羊膜ＭＳＣを効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼの濃度を５０ＣＤＵ／ｍＬ未満、又は金属プロテイナーゼの濃度を１００ＣＤＵ／ｍＬ未満とすると、羊膜の細胞外基質層の消化が不十分となり、羊膜ＭＳＣの回収率が著しく低下することがある。金属プロテイナーゼの濃度を８００ＣＤＵ／ｍＬより大きくすると、羊膜の上皮細胞層の分解に伴い羊膜消化液に上皮細胞が混入するため、相対的に羊膜ＭＳＣの回収率が低下することがある。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の羊膜の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
【００２５】
酵素処理は、生理食塩水等で洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、スターラー又はシェーカーで撹拌しながら処理することが好ましいがこれ以外の撹拌手段でもよく、要は効率よくＭＳＣが遊離すればよい。これにより細胞外基質層に含まれるＭＳＣが遊離する。酵素処理は、好ましくはスターラー又はシェーカーを用いて１０ｒｐｍ／分以上１００ｒｐｍ／分以下で３０分以上撹拌することにより行うことができる。なお、酵素処理時間の上限は特に限定されないが、一般的には６時間以内、好ましくは３時間以内、例えば、９０分以内行うことができる。また、酵素処理温度は、本発明の目的が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは３０℃以上４０℃以下であり、より好ましくは３０℃以上３７℃以下である。
【００２６】
この際、上皮細胞層が分解しない濃度の組合せにすることが重要である。上皮細胞が混入すると相対的にＭＳＣの含有率が落ちるためである。
【００２７】
遊離したＭＳＣを含む酵素溶液をメッシュに通してろ過することにより、遊離した細胞のみがメッシュを通過し、分解されなかった上皮細胞層はメッシュを通過できずにメッシュ状に残るため、遊離したＭＳＣを容易に回収することができる。この際、メッシュのポアサイズ（大きさ）は本発明の目的に反しない限り特に限定されないが、好ましくは４０μｍ以上２００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上１５０μｍ以下であり、さらに好ましくは７０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは１００μｍ以上１５０μｍ以下である。メッシュのポアサイズ（大きさ）を上記の範囲とすることにより、圧力を加えず、自然落下により落下させることで細胞の生存率が下がるのを防止することができる。
【００２８】
メッシュの材質としては、ナイロンメッシュが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、１００μｍのナイロンメッシュを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロンおよびポリエステル）が利用できる。更に、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュ、４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュ（金網）等も用いることが可能である。
【００２９】
ＭＳＣをメッシュ通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なメッシュ通過も可能であるが、細胞にダメージを与える事を避けるため、できるだけ弱い圧力が望ましい。
【００３０】
メッシュを通したＭＳＣは、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等の緩衝液を用いることができる。回収した細胞は、所望により、培養により増殖させることができる。培地は、０．０５％より多く５％以下のアルブミンを含有するαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、Ｍ１９９あるいはこれらを基礎とする培地であり、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０あるいはこれらを基礎とする培地は増殖性が低下する。望ましくは１０％以上のウシ血清又はヒト血清を含有するαＭＥＭ培地であり、プラスチックデッシュ・フラスコにて５％ＣＯ2、３７℃環境にて培養を行う。
【００３１】
αＭＥＭは、一般的に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等のアミノ酸類、Ｌ−アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド（ニコチンアミド）、塩酸ピリドキサール、チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ビタミンＢ１２、ミオイノシトール等のビタミン類、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩類を含有する。αＭＥＭは、その他の成分として、例えば、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のリボヌクレオシド、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシグアノシン、チミジン等のデオキシリボヌクレオシド、Ｄ−グルコース、リポ酸、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム等を含有してもよい。好ましいαＭＥＭの組成の一例は、０．６７ｍＭ  グリシン、０．２８ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン、０．３３ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．２３ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸、０．５９ｍＭ  Ｌ−システイン、０．１０ｍＭ  Ｌ−シスチン、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．５１ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、０．２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．４０ｍＭ  Ｌ−イソロイシン、０．４０ｍＭ  Ｌ−ロイシン、０．４０ｍＭ  Ｌ−リジン、０．１０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、０．１９ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．３５ｍＭ  Ｌ−プロリン、０．２４ｍＭ  Ｌ−セリン、０．４０ｍＭ  Ｌ−スレオニン、０．０４９ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、０．２０ｍＭ  Ｌ−チロシン、０．３９ｍＭ  Ｌ−バリン、０．２８ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸、４．１×１０-4ｍＭ  ビオチン、７．１×１０-3ｍＭ  塩化コリン、２．１×１０-3ｍＭ  Ｄ−パントテン酸カルシウム、２．３×１０-3ｍＭ  葉酸、８．２×１０-3ｍＭ  ナイアシンアミド、５．０×１０-3ｍＭ  塩酸ピリドキサール、３．０×１０-3ｍＭ  チアミン塩酸塩、２．７×１０-4ｍＭ  リボフラビン、１．０×１０-3ｍＭ  ビタミンＢ１２、０．０１１ｍＭ  ミオイノシトール、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８１ｍＭ  硫酸マグネシウム、５．３ｍＭ  塩化カリウム、２６．２ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、１１７．２ｍＭ  塩化ナトリウム、１．０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース、９．７×１０-4ｍＭ  リポ酸、０．０２７ｍＭ  フェノールレッド、１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムである。
【００３２】
培養して得られたＭＳＣは、プラスチックデッシュ・フラスコから剥離させた後、新たなプラスチックデッシュ・フラスコに播種し培養してもよく、また、当該技術分野において公知の任意の方法により凍結保存してもよい。好ましい凍結保存方法としては、例えば、特許文献１（特開２０１５−６１５２０号公報）に記載の方法を挙げることができるが、これに限定されない。凍結保存したＭＳＣは、解凍した後にプラスチックデッシュ・フラスコに播種し、培養してもよい。
【００３３】
ＭＳＣの発現マーカーは、当該技術分野において公知の任意の検出方法により確認することができる。発現マーカーとしては、例えば、表面抗原又は細胞内発現タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。表面抗原及び／又は細胞内発現タンパク質を検出する方法としては、例えばフローサイトメトリーが挙げられるが、これに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が、測定した細胞数の５％以上検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
他の例において、本発明で用いる間葉系細胞は、上記の組織（例えば、骨髄）から、幹細胞分離デバイスを用いて調製することができる。
【００３５】
骨髄由来ＭＳＣ分離法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法で行うことができる。穿刺針を用いてヒトの後腸骨稜より骨髄液を採取し、ヘパリンを添加して十分に転倒混和する。骨髄ＭＳＣ分離デバイス（カネカ社製）に付属のカラム（フィルター）に生理食塩液を通液し、カラム内の空気を除去する。シリンジポンプにて骨髄液２ｍＬをカラムに通液し、間葉系細胞をカラムに捕捉する。同方向から生理食塩液２ｍＬを通液し、カラムに残存する骨髄液、赤血球、白血球及び血小板の洗浄除去を行う。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１５％を含む細胞培養液（αＭＥＭ）２ｍＬを、骨髄液を流した方向と逆方向から勢いよく通液し、カラムから間葉系細胞を回収する。得られた細胞懸濁液２ｍＬに、ウシ胎児血清１５％を含む細胞培養液（αＭＥＭ）を５ｍＬ添加し、プラスチックデッシュに移し、５％ＣＯ2、３７℃環境にて培養する。
【００３６】
［３］間葉系細胞の培養上清
本発明では間葉系細胞の培養上清を使用する。間葉系細胞の培養上清としては、間葉系細胞を培養した培養液であれば特に限定されない。上記の培養上清を取得する際に間葉系細胞を培養する培地としては、上記した培地を挙げることができ、血清を含む培地でもよいし、無血清培地でもよいが、好ましくは無血清培地である。即ち、間葉系細胞の培養上清としては、無血清馴化培地であることが好ましい。
【００３７】
本明細書における「無血清培地」は、血清を添加していない培地を意味する。無血清培地は、細胞の増殖及び／又は維持に有用な任意の添加物を含有してもよい。かかる添加物としては、例えば、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、成長因子、血清代替物（例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）など）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
間葉系細胞の培養上清を調製するための手順としては、先ず、血清を含む培地（例えば、１０％以上のウシ・ヒト血清を含有するαＭＥＭ培地など）を用いて間葉系細胞を培養し、細胞が肉眼的にコンフルエントになった時点で、細胞を洗浄液（例えば、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）など）で洗浄し、その後、無血清培地（例えば、αＭＥＭ）にて培養することが好ましい。コンフルエント率の下限は、特に限定されないが、通常、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。また、コンフルエント率の上限は、特に限定されないが、通常、１００％以下、好ましくは９９％以下、より好ましくは９８％以下、さらに好ましくは９７％以下、さらに好ましくは９６％以下、さらに好ましくは９５％以下である。無血清培地での培養時間の下限は、特に限定されないが、通常、１２時間以上、好ましくは１８時間以上、より好ましくは２４時間以上、さらに好ましくは３０時間以上、さらに好ましくは３６時間以上、さらに好ましくは４２時間以上である。また、無血清培地での培養時間の下限は、特に限定されないが、通常、９６時間以下、好ましくは８４時間以下、より好ましくは７２時間以下、さらに好ましくは６６時間以下、さらに好ましくは６０時間以下、さらに好ましくは５４時間以下である。無血清培地での培養後に、培地を回収し、所望により遠心（例えば、３，０００ｒｐｍで５分）し、その上清を回収することにより、間葉系細胞の培養上清を得ることができる。本発明において、間葉系細胞の培養上清は、狭窄抑制剤として使用することができる。狭窄抑制剤については、後記する。
【００３９】
［４］本発明の組成物
本発明の一態様は、ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物に関する。
【００４０】
本発明の組成物の粘度は、２５±１℃において、１００ｃＰ以上であり、好ましくは２００ｃＰ以上であり、より好ましくは３００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは４００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは５００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは６００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは７００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは８００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは９００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは１０００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは２０００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは３０００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは４０００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは５０００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは１００００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは２００００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは５００００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは１０００００ｃＰ以上であり、さらに好ましくは２０００００ｃＰ以上であり、特に好ましくは５０００００ｃＰ以上である。また、本発明の組成物の粘度の上限は、２５±１℃において、１００００００ｃＰ以下であり、より好ましくは９０００００ｃＰ以下であり、さらに好ましくは８０００００ｃＰ以下であり、さらに好ましくは７０００００ｃＰ以下であり、さらに好ましくは６０００００ｃＰ以下である。粘度が１００ｃＰより小さいと、組成物を消化管に塗布した際に液ダレが起こり易く、また、組成物を注射した際に患部に長時間滞留させることが困難となる。また、粘度が１００００００ｃＰより大きいと、消化管への注入が困難となる。ゲル組成物の粘度は、例えばＢ型回転粘度計、コーン・プレート型回転粘度計、毛細管粘度計、落球式粘度計などにより測定することができる。
【００４１】
本発明の組成物の形態は、上記粘度を有する形態であれば特に限定されず、ゲル、クリーム、軟膏などの何れでもよい。
【００４２】
本発明の組成物は、好ましくは、間葉系細胞の培養上清と、増粘剤とを含む、ゲル組成物である。
ゲル組成物において使用する増粘剤としては、培養上清をゲル化してゲル組成物を調製できるものであれば特に限定されない。増粘剤の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロースナトリウム、カチオン化セルロースなどのセルロース系増粘剤（多糖類）、アラビアガム、キサンタンガム、カラギーナン、ジュランガム、グアガム、トラガントガム、カラヤガム、タラガム、サイリウムシードガム、ロカストビーンガム、プルラン、カードラン、ファーセレラン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸、寒天、ペクチン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、グルコマンナン、キトサン、ソルビトール、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、デキストリン、デキストラン、α−シクロデキストリン、グリセリン等が挙げられるが、特に限定されない。増粘剤は１種のみ使用してもよいし、２種以上の増粘剤を組み合わせて使用してもよい。
【００４３】
本発明の組成物が増粘剤を含む場合、本発明の組成物は、増粘剤によるゲル化を誘起及び／又は促進するための任意の因子をさらに含有してもよい。かかる因子としては、例えば、金属イオンを挙げることができるが、これに限定されない。金属イオンとしては、特に２価の金属イオンが好ましく、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の組成物が増粘剤を含む場合、増粘剤の含有量の下限は、特に限定されないが、通常、０．３質量％以上、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは１．５質量％以上、さらに好ましくは２質量％以上である。また、本発明の組成物が増粘剤を含む場合、増粘剤の含有量の上限は、特に限定されないが、通常、１０質量％以下、好ましくは９質量％以下、より好ましくは８質量％以下、さらに好ましくは７質量％以下、さらに好ましくは６質量％以下、さらに好ましくは５質量％以下である。
【００４５】
本発明の組成物は、医薬品（医薬部外品を含む）、飲食品、又は化粧品として使用することができるが、その使用形態は特に限定されない。
【００４６】
［５］組成物の製造方法
本発明の組成物がゲル組成物である場合、ゲル組成物は、上記の［３］で得た間葉系細胞の培養上清に、増粘剤を添加して懸濁することにより製造することができる。増粘剤の添加量は、使用する増粘剤の種類、ゲル組成物で意図する粘度などを考慮して、適宜決定することができる。ゲル組成物とは、ゲル化した状態にある組成物を意味する。ゲル化とは、間葉系細胞の培養上清と増粘剤とを含む組成物の全体又は一部が、溶液の状態から、粘度が上昇して流動性が喪失又は低下した状態になることを指し、例えば、ゼリー状に固化すること、チクソトロピー性を示す固体となること、粘性流体となること等を意味する。
【００４７】
本発明のゲル組成物は、間葉系細胞の培養上清と増粘剤とを含む。本発明のゲル組成物は、間葉系細胞の培養上清と増粘剤のみから構成されていてもよいし、間葉系細胞の培養上清と増粘剤以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、防腐剤、着色料、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤など挙げることができるが特に限定されない。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、クレゾールなどを挙げることができるが、これらに限定されない。着色料としては、例えば、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、赤色１０４号、赤色１０５号、赤色１０６号、黄色４号、黄色５号、青色１号、青色２号、青色３号などを挙げることができるが、これらに限定されない。保湿剤としては、例えば、ワセリンを挙げることができるが、これに限定されない。紫外線吸収剤としては、例えば、サリチル酸オクチル、シノキサート、テトラヒドロキシベンゾフェノンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、α−トコフェロールなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の組成物がクリームである場合、クリーム組成物は、通常の処方により製造することができる。クリーム基剤としては、例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、高級アルコール（例えば、２−ヘキシルデカノール、セタノール等）、乳化剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、脂肪酸エステル類等）、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。
【００４９】
本発明の組成物が軟膏である場合、軟膏組成物は、通常の処方により製造することができる。軟膏基剤としては、例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（例えば、アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステル等）、ロウ類（例えば、ミツロウ、鯨ロウ、セレシン等）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル等）、高級アルコール（例えば、セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）、シリコン油（例えば、ジメチルポリシロキサン等）、炭化水素類（例えば、親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、グリコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール等）、植物油（例えば、ヒマシ油、オリーブ油、ごま油、テレピン油等）、動物油（例えば、ミンク油、卵黄油、スクワラン、スクワレン等）、水、吸収促進剤またはかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。
【００５０】
［６］狭窄抑制剤及び抗炎症剤
本発明はさらに、
・間葉系細胞の培養上清を含む、狭窄抑制剤；
・ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物を含む、狭窄抑制剤；並びに
・ＣＤ９０の発現が陽性である間葉系細胞の培養上清を含み、粘度が１００ｃＰ以上１００００００ｃＰ以下である、組成物を含む、抗炎症剤：
に関する。
【００５１】
本発明によれば、狭窄抑制のために使用される上記した間葉系細胞の培養上清、並びに狭窄抑制のために使用される上記した本発明の組成物が提供される。本発明によれば、炎症抑制のために使用される、上記した本発明の組成物が提供される。
【００５２】
本発明によればさらに、狭窄抑制を必要とする対象者に、上記した間葉系細胞の培養上清の抑制有効量を投与する工程を含む、狭窄を抑制する方法が提供される。本発明によればさらに、炎症抑制を必要とする対象者に、上記した本発明の組成物の抑制有効量を投与する工程を含む、炎症を抑制する方法が提供される。
【００５３】
本発明によればさらに、狭窄抑制剤の製造のための、間葉系細胞の培養上清の使用、並びに狭窄抑制剤の製造のための、上記した本発明の組成物の使用が提供される。本発明によればさらに、抗炎症剤の製造のための、上記した本発明の組成物の使用が提供される。
【００５４】
間葉系細胞の培養上清を投与することにより、投与部位における線維芽細胞の活性化が抑制されることにより線維化が抑制され、これにより狭窄が抑制されることが推察されるが、狭窄抑制の作用メカニズムは上記に限定されるわけではない。また、本発明の組成物を投与することにより、炎症細胞の浸潤が抑制され、これにより炎症を抑制し、腸炎を予防及び／又は治療できることが推察されるが、炎症の抑制、並びに腸炎の予防及び／又は治療の作用メカニズムは上記に限定されるわけではない。
【００５５】
本発明の狭窄抑制剤及び抗炎症剤は、好ましくは組成物の形態において、医薬品（医薬部外品を含む）、飲食品、又は化粧品として使用することができるが、その使用形態は特に限定されない。
【００５６】
本発明で言う狭窄の部位は、狭窄が生じる可能性のある部位であれば特に限定されないが、例えば、消化管、上気道（鼻腔、咽頭、喉頭）、下気道（気管、主気管支）などが挙げられる。消化管とは、消化・吸収を行う管の総称であり、例えば、口腔、食道、胃、及び腸管（十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸）を意味する。
狭窄は、一過性の狭窄でもよいし、慢性の狭窄でもよい。
本発明の狭窄抑制剤は、狭窄の予防及び／又は治療剤として使用することができる。
【００５７】
本発明で言う抗炎症とは、炎症の予防、治療又は症状改善を意味する。炎症とは、感染、物理的刺激、化学的刺激、アレルギー反応等の侵襲に対し、免疫系が応答する種々の反応の総称である。一般に炎症は外来刺激などの外因性要因と生体側の異常、体質的要素などの内因性要因との相互作用によって発症する。
【００５８】
本発明の抗炎症剤は、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤として使用することができる。炎症性疾患としては、腸炎（大腸炎、小腸炎、小腸結腸炎、直腸炎）、喘息、炎症性腸疾患、虫垂炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合織炎、胃炎、胃腸炎、肝炎、化膿性汗腺炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、間質性肺炎、肺炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、及び外陰炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の狭窄抑制剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、狭窄を抑制すべき局所に直接、投与（好ましくは塗布）もしくは経口投与することが挙げられる。経口投与の方法としては、例えば、狭窄抑制剤を直接的に内服したり、シリンジ、チューブ等に充填した狭窄抑制剤を吐出することにより内服したりすることができるが、これらに限定されない。
本発明の抗炎症剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、疾患部位に直接投与することが挙げられる。腸炎の抗炎症剤として使用する場合には、腸（好ましくは、直腸）に直接投与することが挙げられ、注腸投与（直腸内注入）が好ましい。但し、投与方法は上記に限定されない。
【００６０】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の投与量としては、被験者に投与した場合に、投与していない被験者と比較して抑制、予防又は治療効果を得ることができるような量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的および被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。一例として、食道の狭窄を抑制又は予防する場合の投与量の上限は、１回の投与につき投与対象者の体重１ｋｇ当たりのゲルの体積量で０．１ｍＬ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．２ｍＬ／ｋｇ体重以上、より好ましくは０．５ｍＬ／ｋｇ体重以上、さらに好ましくは０．８ｍＬ／ｋｇ体重以上であり、投与量の下限は、１０ｍＬ／ｋｇ体重以下、好ましくは５ｍＬ／ｋｇ体重以下、より好ましくは３ｍＬ／ｋｇ体重以下である。他の例として、腸炎を治療する場合の投与量の上限は、１回の投与につき投与対象者の体重１ｋｇ当たりのゲルの体積量で０．２ｍＬ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．５ｍＬ／ｋｇ体重以上、より好ましくは１ｍＬ／ｋｇ体重以上、さらに好ましくは１．２ｍＬ／ｋｇ体重以上であり、また、投与量の下限は、１０ｍＬ／ｋｇ体重以下、好ましくは５ｍＬ／ｋｇ体重以下、より好ましくは３ｍＬ／ｋｇ体重以下である。食道の狭窄の予防及び腸炎の治療において、上記の投与量を、１日１回以上３回以下、好ましくは１日１回投与することができる。食道の狭窄の予防及び腸炎の治療における投与期間は特に限定されず、例えば１日〜１か月を挙げることができ、１日１回〜１週間に１回など適当な間隔で投与することができる。
【００６１】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の剤型としては、ヒトを含む哺乳動物に対して安全に投与することができるものであれば特に限定されないが、例えば、注射剤、液剤、エキス剤、エアゾール剤、貼付剤、パップ剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤などが挙げられる。これらの製剤は、例えば日本薬局方に記載の方法にて製造することができるが、これに限定されない。
【００６２】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤は、飲食品用に使用することができる。また、本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤は、食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、飲料、飼料に含有させることができ、一般的な食品に添加することもできる。例えば、パン、パスタ、雑炊、米飯、ビスケット、クラッカー、ケーキ、菓子、ガム、キャンディー等に適宜添加して用いることもできる。
【００６３】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤を飲食品用に使用する場合、飲食品中の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の含有量の下限は、特に限定されないが、通常、０．１質量％以上、好ましくは０．３質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは１質量％以上である。また、飲食品中の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の含有量の上限は、特に限定されないが、通常、８０質量％以下である。当該飲食品は、例えば、口から摂取することができるが、これに限定されない。
【００６４】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤は、化粧品用として用いることもできる。化粧品としての最終の製品形態としては、軟膏、ローション、化粧水、クリーム、不敷布含浸化粧料（マスク）、パックなどの形態が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００６５】
本発明の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤を化粧品用に使用する場合、化粧品中の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の含有量の下限は、特に限定されないが、通常、０．１質量％以上、好ましくは０．３質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは１質量％以上である。また、化粧品中の狭窄抑制剤並びに抗炎症剤の含有量の上限は、特に限定されないが、通常、８０質量％以下である。当該化粧品は、例えば、皮膚に塗布又は散布することができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
実施例１：ゲル組成物の調製
ヒト羊膜ＭＳＣは、特許文献１（特開２０１５−６１５２０号公報）の実施例１に記載の方法に準じて（但し、コラゲナーゼ３００ＣＤＵ／ｍＬ、及びサーモリシン２５０ＰＵ／ｍＬの条件）、分離及び培養した。具体的には以下の通りである。
【００６８】
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦由来ヒト胎児付属物から、羊膜を用手的に分離した。ハンクス平衡塩液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて２回洗浄後、得られた羊膜の内１ｇを容器に取り、精製コラゲナーゼ  （ＣＬＳＰＡ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社, 規格＞５００ＣＤＵ／ｍｇ)３００ＣＤＵ／ｍＬ及びサーモリシン（和光純薬、規格＞７０００ＰＵ／ｍｇ）２５０ＰＵ／ｍＬを含有するハンクス平衡塩液（Ｃａ・Ｍｇ含有）計５ｍＬを添加し、３７℃にて９０分間、６０ｒｐｍにてシェーカーにより震盪攪拌を行った。得られた混合物を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ)にて希釈後、ナイロンメッシュフィルター（ポアサイズ：１００μｍ）を用いて濾過し、羊膜ＭＳＣを含む濾液を回収した。羊膜ＭＳＣを含む濾液を４００×ｇにて５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、プラスチックデッシュ上に播種し、羊膜ＭＳＣを接着培養させた。
【００６９】
羊膜ＭＳＣにおける表面抗原の発現をフローサイトメーターで確認した結果を図１に示す。上記で取得された羊膜ＭＳＣにおいて、表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性であった。また、ＣＤ１４及びＣＤ７９ａｌｐｈａも陰性である。さらに、この羊膜ＭＳＣは、培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能である。
【００７０】
コンフルエント率９０％以上９５％以下になるまで接着培養した羊膜ＭＳＣを、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びトリプシンにて処理してプラスチックデッシュから剥離させた。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭにて懸濁し、プラスチックデッシュ上に播種し、羊膜ＭＳＣを接着培養させた。
【００７１】
細胞が肉眼的にコンフルエントになった時点で、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で接着細胞を３回洗浄し、その後、無血清培地（αＭＥＭ）にて４８時間培養した。その後、培地を回収し、３，０００ｒｐｍ×５分遠心し、その上清を回収して培養上清とした。培養上清に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（和光純薬社製カルボキシメチルセルロースナトリウム、又は丸石製薬社製カルメロースナトリウム原末「マルイシ」）を最終濃度が２質量％又は５質量％となるように加え、懸濁してゲル化し、ゲル組成物を調製した。比較例として、培養上清にＣＭＣ（和光純薬社製カルボキシメチルセルロースナトリウム）を最終濃度が１質量％となるように加えた液状組成物を調製した。
【００７２】
ＣＭＣの濃度が１質量％の液状組成物、並びにゲル組成物（ＣＭＣ濃度が２質量％及び５質量％のもの）の粘度を以下の方法で測定した。その結果、ＣＭＣの濃度が１質量％の液状組成物の粘度は８８ｃＰ、ＣＭＣの濃度が２質量％のゲル組成物の粘度は７０４ｃＰ、ＣＭＣの濃度が５質量％のゲル組成物の粘度は１３５６００ｃＰ、カルメロースナトリウムの濃度が２質量％のゲル組成物の粘度は３５４４ｃＰ、カルメロースナトリウムの濃度が５質量％のゲル組成物の粘度は４７６０００ｃＰであった。
【００７３】
（ゲル組成物の粘度の測定方法）
ゲル組成物の粘度の測定は、２５±１℃にて、Ｂ型回転粘度計（英弘精機社製、ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ  ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ  ＤＶ２Ｔ）を用いて行った。
【００７４】
実施例２：食道の狭窄の予防
＜試験方法＞
食道ＥＳＤモデルは２０ｋｇの雌家畜ブタに対し、各ブタにおいて同じ位置において、長径５ｃｍ、３／４周性に粘膜下層を剥離して行った。具体的には、ＥＳＤは、ＥＳＧ１００  ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ及びＩＴナノナイフ（オリンパス社製）を用いて行い、内視鏡は、オリンパス製のＧＩＦ−Ｑ２４０を使用した。ＥＳＤを行った日とＤａｙ１とする。
【００７５】
ＥＳＤ直後に、実施例１で調製した５質量％のカルボキシメチルセルロースを含有する培養上清ゲル（２０ｍＬ）を注入し、潰瘍面に塗布した。培養上清ゲルの塗布はＤａｙ１，８，１５に内視鏡観察時に行った（ゲル群：ｎ＝３）。対照として培養していないαＭＥＭのゲルを用いた（対照群：ｎ＝３）。培養していないαＭＥＭのゲルの塗布は、Ｄａｙ１，８，１５に行った。また、現在日常臨床で用いられているｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ  ８０ｍｇ  ｉｎ  ４ｍＬ生理食塩水を潰瘍面に０．５ｍＬずつ、Ｄａｙ１に局注する方法も行なった（ステロイド群：ｎ＝３）。
Ｄａｙ２２にブタを屠殺し、食道を抜去し、狭窄率を測定して病理組織学的評価を行なった。
【００７６】
＜評価及び結果＞
（食道狭窄率の測定）
食道狭窄率は、以下の式で求めた。
狭窄率（％）＝｛１−ａ／（ｂ１＋ｂ２）×１／２｝×１００
ａは、最大狭窄部位の短軸の長さを示し、ｂ１及びｂ２は、通常粘膜の部位短軸の長さを示す。ａ、ｂ１及びｂ２の長さの位置関係を図２に示す。
【００７７】
対照群、ゲル群、及びステロイド群について食道狭窄率を測定した結果を図３に示す。図３において、＊、＊＊は以下を示す。
＊Ｐ＜０．００１ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較試験
＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較試験
【００７８】
ブタ食道ＥＳＤモデルについては、食道狭窄率は対照群８０．０±２．０％に対し、ゲル群５６．３±７．１％（Ｐ＜０．０１  ｖｓ対照）、ステロイド群４９．３±４．２％（Ｐ＜０．０１  ｖｓ対照）であった。
【００７９】
（狭窄部の線維の厚さ）
狭窄部の線維の厚さは、ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色により測定した。ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色は、膠原線維をアニリン青で染色する方法である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｕｔｏｋａｇａｋｕ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅａｇｅｎｔ／ｐａｔｈｏｌｏｇｙ／ｍａｓｓｏｎ＿ｆｏｒｍａｌｉｎ／）。
ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した様子の一例を図４に示す。図４の右図の矢印で示した部分、すなわち粘膜筋板の両端を結ぶ線から線維組織の最深部までの距離を狭窄部の線維の厚さとした。
【００８０】
対照群、ゲル群、及びステロイド群について、肉眼所見（左側）及びｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した結果を図５に示す。
また、狭窄部の線維の厚さの測定結果を図６に示す。図６おいて、＊、＊＊は以下を示す。
＊Ｐ＜０．０５ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験
＊＊Ｐ＜０．０５ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験
【００８１】
狭窄部の線維の厚さは、対照群が１，６０９±４１８μｍであるのに対し、ゲル群は８３３±２６μｍ（Ｐ＜０．０１ｖｓ対照）であり、ステロイド群は９４４±２５０μｍ（Ｐ＜０．０５ｖｓ対照）であった。
【００８２】
（活性化線維芽細胞の数）
活性化線維芽細胞の数をα−ＳＭＡ染色にて測定した。一次抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製抗α−ＳＭＡ抗体を用い、１０００倍希釈で室温６０分反応させた。４０倍視野で観察し、染色された陽性細胞数をカウントした。
【００８３】
活性化線維芽細胞の数の測定結果を図７に示す。図７において、＊、＊＊は以下を示す。
＊Ｐ＜０．００１ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験
＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ  ＳＴＤ  ＡＮＯＶＡ及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験
【００８４】
活性化線維芽細胞の数は、対照群が６８．３±５．７個／４０倍視野であるのに対し、ゲル群は２６．８±８．６個／４０倍視野（Ｐ＜０．０５ｖｓ対照）であり、ステロイド群は２０．６±２．３個／４０倍視野（Ｐ＜０．０１ｖｓ対照）であった。
【００８５】
（まとめ）
上記の結果より、培養上清を含む本発明のゲル組成物の塗布により、線維芽細胞の活性化が抑制されることにより線維化を抑制し、食道狭窄を予防することが示された。
【００８６】
実施例３：腸炎の治療
＜試験方法＞
腸炎モデルは１０週齢のＳＤラットに対し、１５ｍｇ／ｍＬ  ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）の３０％エタノール溶液を注腸投与して作成した（腸炎群）。実施例１で調製した２質量％のカルボキシメチルセルロースを含有する培養上清ゲル（４００μＬ）をＴＮＢＳ投与３時間後、翌日、翌々日に注腸投与した（腸炎＋ゲル群）（ｎ＝９）。ＴＮＢＳ投与１週間後にラット直腸を内視鏡で観察後に屠殺し、直腸の病理組織学的評価を行なった。
また、対照群はＴＮＢＳの代わりに３０％エタノールを注腸投与し（ｎ＝７）、腸炎群は培養上清ゲルの代わりに培養していないαＭＥＭのゲルを注腸投与した（ｎ＝９）。
【００８７】
＜評価及び結果＞
（病理スコア）
病理スコアは、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２：７；ｅ３３３６０の「Ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」の欄に記載の方法で評価した。即ち、「血管パターンの変化（Ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ)」、「粘膜の粒状性（Ｍｕｃｏｓａｌ  ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）」、「狭窄（Ｓｔｒｉｃｔｕｒｅｓ）」、「出血（Ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」、及び「潰瘍(Ｕｌｃｅｃｒｓ)」の５つのパラメーターについて、それぞれ「あり」の場合を０、「なし」の場合を１としてスコア化し、その合計スコアを求めた（合計スコアは０〜５の間である）。
【００８８】
病理スコアの測定結果を図８に示す。図８において、＊は  ｐ＜０．０１ｖｓ対照、†はｐ＜０．０５ｖｓ．ＴＮＢＳ＋αＭＥＭ  ｇｅｌを示す。ラット腸炎モデルについては、培養上清ゲルの投与により病理スコアが有意に改善した。
【００８９】
（免疫染色）
ＣＤ６８の染色は、以下の通り行った。一次抗体はＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製の抗ＣＤ６８抗体を用い、１００倍希釈で室温６０分反応させた。
ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの染色は、以下の通り行った。一次抗体はＴｈｅｒｍｏ社製の抗ＭＰＯ抗体を用い、３００倍希釈で４℃ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。
細胞は４０倍視野で観察し、染色された陽性細胞数をカウントした。
【００９０】
ＣＤ６８陽性マクロファージの染色結果を図９に示し、ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ陽性好中球の染色結果を図１０に示す。図９及び図１０のグラフの縦軸の単位は細胞数／１視野を示す。図９及び１０において、＊は  ｐ＜０．０５ｖｓ対照、†はｐ＜０．０５ｖｓ．ＴＮＢＳ＋αＭＥＭ  ｇｅｌを示す（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）。
上記の免疫組織染色の結果、培養上清ゲルの投与によってＣＤ６８陽性マクロファージとｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ陽性好中球の浸潤が有意に抑制されることが判明した。
【００９１】
（ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量）
結腸におけるＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量を以下の通り測定した。
ＲＮＡは直腸の組織からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、逆転写はＱｕａｎｔｉＴｅｃ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。得られたｃＤＮＡからＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸを用いて、ＴＮＦαとβａｃｔｉｎに対するプライマーによりＰＣＲを施行した。遺伝子発現量はβａｃｔｉｎに対する相対値として表した。
【００９２】
ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１１に示す。図１１の縦軸の単位は“Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"を示す。図１１において、＊は  ｐ＜０．０５ｖｓ対照、†はｐ＜０．０５ｖｓ．ＴＮＢＳ＋αＭＥＭ  ｇｅｌを示す（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）。培養上清ゲルの投与によって、ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量が抑制されることが判明した。
【００９３】
（まとめ）
上記の結果より、培養上清ゲルの注腸投与は、炎症細胞浸潤を抑制し腸炎モデルの病態を改善することがわかった。
【００９４】
実施例４：培養上清含有飲料
実施例１で調製した５質量％のカルボキシメチルセルロースを含有する培養上清ゲル１．０重量部、果糖ブドウ糖液糖１０．７重量部、クエン酸０．１８重量部、クエン酸三ナトリウム０．０４重量部、水８８．０８重量部からなる培養上清含有飲料を調製した。得られた培養上清含有飲料は、凝集、分離、固化等は認められず、透明な状態を維持していた。
【図１】
2017137268.tif 000002
【図２】
2017137268.tif 000003
【図３】
2017137268.tif 000004
【図４】
2017137268.tif 000005
【図５】
2017137268.tif 000006
【図６】
2017137268.tif 000007
【図７】
2017137268.tif 000008
【図８】
2017137268.tif 000009
【図９】
2017137268.tif 000010
【図１０】
2017137268.tif 000011
【図１１】
2017137268.tif 000012