(57)【要約】【課題】本発明の技術的課題は、微細藻類バイオマスに含まれる脂質を分画する方法であって、そのバイオマスを乾燥させることを必要とせず、溶媒を使用せずに済ませることを可能にし、組成物の様々な成分が次に容易に分離できる組成物を得ることをもたらす方法を利用可能にすることである。【解決手段】本発明は、以下の工程：微細藻類バイオマスであって、前記微細藻類バイオマスの総質量に対して少なくとも１５質量％の脂質を含み、かつ、１ｇ／ｌ〜２００ｇ／ｌの乾燥物質濃度を有する微細藻類バイオマスを準備する工程；前記バイオマスをビーズミルによって粉砕（ミリング）する工程であって、前記ミリングする工程が、ビーズの直径（ｄＧＭ）が０．２〜２．５×１０−３ｍ、好ましくは０．４〜１．０×１０−３ｍ、好ましくはおよそ０．６×１０−３ｍであり；翼端撹拌速度（ブレードチップ撹拌速度）（ν）が４〜５０ｍ／秒、好ましくは５〜２０ｍ／秒であり、好ましくはおよそ８ｍ／秒である条件で操作される工程；及び得られた組成物を取り出す工程を含む、微細藻類バイオマスの処理方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類バイオマスの処理方法であって、以下の工程：
-  微細藻類バイオマスの全質量に対して少なくとも１５質量％の脂質を含み、かつ１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの間の乾燥物質濃度を有する微細藻類バイオマスを準備する工程、
-  前記微細藻類バイオマスを、ビーズミルを使用して粉砕する工程であって、ビーズミルが以下の条件：
-  ビーズの平均直径（ｄＧＭ）が０．２〜２．５×１０−３ｍ、好ましくは０．４〜１．０×１０−３ｍの範囲であり、好ましくは約０．６×１０−３ｍであり；
-  翼端撹拌速度（ν）が４〜５０ｍ・ｓ−１、好ましくは５〜２０ｍ・ｓ−１の範囲であり、好ましくは約８ｍ・秒−１であり；
-  前記ビーズミル内のビーズの充填量が５０％〜８０％の範囲である条件
で操作される工程；
-  得られた組成物を回収する工程、
を含むことを特徴とする、処理方法。
【請求項２】
ビーズミル内での処理が、１〜３０分間、好ましくは２〜２０分間、なおさらに好ましくは４〜１０分間の範囲、有利には約６分間の継続時間のあいだ行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズミル内のビーズの充填量が７０％〜８０％（体積／体積）、有利には約７５％（体積／体積）の範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ビーズミル内での処理工程に続いて以下の工程：
-  ５〜４０℃の温度において、２〜４０分間の範囲の継続時間のあいだ、３５００ｇ〜２００００ｇの範囲の遠心加速度で、得られた組成物を遠心分離する工程であって、前記遠心分離の工程が少なくとも３つの相の生成をもたらす工程；
-  「スーパーペレット」と称する第一の相、第一の相より密度が高い「上清相」と称する第二の相、及び第二の相より密度が高い「ペレット」と称する第三の相を単離することを可能にする、それらの相を回収する工程、
をこの順序で行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
脂質を分離する少なくとも１つの工程を第二の相に対して行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微細藻類バイオマスが、ナンノクロロプシス種（Nannochloropsis sp.）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・オクラータ（Nannochloropsis oculata）、テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Porphyridium cruentum）、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、クロレラ・バルガリス（Chlorella vulgaris）、ネオクロリス・オレオアバンダンス（Neochloris oleoabundans）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）から、好ましくは以下の株：ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）、テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）から選択される少なくとも１種の微細藻類を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類バイオマスの開発の分野に関し、より具体的には、本発明は微細藻類から生じる脂質を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は主に単細胞である真核生物であり、細胞膜と細胞壁によって区切られている。この細胞壁の組成及び構造は、対象にしている微細藻類に応じてさまざまである。
【０００３】
したがって、いくつかの緑色微細藻類、例えばクロレラ（Chlorella）では、細胞壁はセルロースからなり、高い剛性を有し、機械的応力に対する藻類の高い耐性をもたらしている。
【０００４】
珪藻の種類に属する微細藻類については、細胞壁（これは被殻ともいわれる）は、結晶化したシリカからなる。後者はクロレラのものよりも脆い。
【０００５】
最後に、その他の種は、環境からの攻撃から自分を守るためにそれらの細胞の周りに多糖類の鞘を堆積させる。この鞘の厚さは経時的に変化し、その微細藻類の指数関数的成長の間は極めて薄く、静止期にはより厚い。
【０００６】
微細藻類の開発における興味は増大している。したがって、微細藻類は非常に多くの応用、特に、食品、化粧品、医薬品などにおける応用がある。さらに、多くの研究が、それをバイオ燃料として用いることについての観点で、藻類バイオマスにおいて行われている。
【０００７】
全ての微細藻類バイオマスを開発する目的で、バイオ精製の観点から、その微細藻類のさまざまな代謝産物を分画し、単離することが必要である。
【０００８】
微細藻類の主な代謝産物、すなわち、多糖類、タンパク質、及び色素は、通常、培地に溶ける。さらに、微細藻類は、特定の条件下では、「ＴＡＧ」（脂肪酸トリグリセリド）とよばれるトリグリセリドの小球の形態で多量の脂質を蓄積しうる。さらに、それらはまた、「ＰＵＦＡ」とよばれるポリ不飽和脂肪酸を、高い付加価値を有するリン脂質及び糖脂質の形態で生産する。
【０００９】
本発明の目的は、特に、藻類バイオマスからの脂質の回収、さらに特に脂肪酸トリグリセリド及びポリ不飽和脂肪酸の回収である。
【００１０】
これら２つの画分は、慣例的には、予め乾燥させた藻類に対する有機溶媒による抽出と、次に様々な単位操作（選択的抽出、選択的沈殿、蒸留など）による様々な群の脂質の分画によって回収される。脂質はしたがって有機相中に回収され、タンパク質はその有機溶媒に溶けない画分に回収される。この技術は、「Lipid extracted algae as a source for protein and reduced sugar: a step closer to the biorefinery」, Ansari, F. A., A. Shriwastav, S. K, Gupta, I. Rawat, A. Guldhe 及びF. Bux (2015) Bioresour Technol 179: 559-564に特に記載されている。
【００１１】
この方法は、バイオマスを乾燥させることと関連して高いエネルギー消費を含み、これはまた、特定の熱に敏感な化合物、例えば、ビタミン類、色素、又は特定のタンパク質の分解も引き起こす。一連の操作及びまた用いられる多量の溶媒は、その方法を複雑にし、生産コストを増大させる。
【００１２】
本発明の方法の主な利点の一つは、バイオマスを予め乾燥させることなく、バイオマスに対して実施できることである。本発明の方法は、したがって、長い時間がかかり、かつエネルギー及びお金の両方について費用がかかる乾燥工程を行うことを避けることを可能にする。
【００１３】
米国特許出願公開第２０１３／０３３８３８４号明細書は、微細藻類バイオマスから脂質を回収するための方法を開示しており、その方法は、そのバイオマスを１〜５バールの範囲の圧力において８０℃〜１５０℃の範囲の温度に加熱する工程を含む。
【００１４】
バイオディーゼル生産のために適している脂質を回収するという観点でクロレラ・バルガリス（Chlorella vulgaris）の細胞を壊すための方法も、以下の刊行物に特に記載されている：「Disruption of Chlorella vulgaris Cells for the Release of Biodiesel-Producing Lipids: A Comparison of Grinding, Ultrasonication, Bead Milling, Enzymatic Lysis, and Microwaves」, Hongli Zhengら, Appl. Biochem Biotechnol (2011) 164: 1215-1224。
【００１５】
この刊行物は、ビーズミルを使用し、かつ単純な遠心分離によって容易に利用されうる組成物を得ることを可能にする、本発明による方法の条件を記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０３３８３８４号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ansari, F. A., A. Shriwastav, S. K, Gupta, I. Rawat, A. Guldhe 及びF. Bux (2015) Bioresour Technol 179: 559-564
【非特許文献２】Hongli Zhengら, Appl. Biochem Biotechnol (2011) 164: 1215-1224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本出願の基礎である、提示される技術的課題は、微細藻類バイオマスに含まれる脂質を分画する方法であって、そのバイオマスを乾燥させることを必要とせず、溶媒を使用せずに済ませることを可能にし、組成物の様々な成分が次に容易に分離できる組成物を得ることをもたらす方法を利用可能にすることである。
【００１９】
実際に、バイオマスをバイオ精製する枠組みにおいて、成分それぞれの選択的抽出が望まれる。
【００２０】
本発明による方法は、これらの要求に応じている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第一の課題は、微細藻類バイオマスを処理する方法を目的としており、その方法は以下の工程を含む：
-  バイオマスの全質量に対して少なくとも１５質量％の脂質を含み、かつ１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの間の乾燥物質濃度を有する微細藻類バイオマスを準備する工程、
-  そのバイオマスを、ビーズミルを使用して粉砕する工程であって、ビーズミルが以下の条件：
-  ビーズの平均直径（ｄＧＭ）が０．２〜２．５×１０−３ｍ、好ましくは０．４〜１．０×１０−３ｍの範囲であり、好ましくは約０．６×１０−３ｍであり、
-  翼端撹拌速度（blade-tip agitation speed）（ν）が４〜５０ｍ・ｓ−１、好ましくは５〜２０ｍ・ｓ−１の範囲であり、好ましくは約８ｍ・秒−１である、
で操作される工程；
-  得られた組成物を回収する工程。
【００２２】
本発明にしたがう粉砕を実施するための条件は、実質的に全てのトリグリセリドの小滴の放出を確実にすることを可能にし、同時に、リン脂質及び糖脂質のいくらか又は全ての放出をもたらす細胞構造の部分的な破壊を確実にする。
【００２３】
さらに、本発明にしたがう粉砕を実施するための条件は、媒体の過度の均質化を避け、その結果、エマルションの形成を避けることを可能にする。
【００２４】
上記の粉砕の最後に得られる組成物は、次に容易に利用できるという利点を有する。
【００２５】
本発明の第二の主題は、本発明の方法によって得られる組成物を目的としている。
【００２６】
本発明にしたがうビーズミルを使用する工程に、以下の複数の工程（この順序で）を続けることが有利である：
-  ５〜４０℃の温度において、２〜４０分間のあいだ、３５００ｇ〜２００００ｇのあいだの遠心加速度で、得られた組成物を遠心分離し、その遠心分離工程が少なくとも３つの相の生成をもたらす工程；
-  「スーパーペレット」と称する第一の相、第一の相より密度が高い「上清相」と称する第二の相、及び第二の相より密度が高い「ペレット」と称する第三の相を単離することを可能にする、それらの相を回収する工程。
【００２７】
有利には、遠心分離の工程は、ビーズミルを用いる工程の終わりに得られた組成物に対して直接実施される。すなわち、遠心分離の工程は、前述の得られた組成物の回収を目的とする工程以外の中間工程（１以上）なしにビーズミルを使用する工程の後に実施される。
【００２８】
本発明による方法は、したがって、バイオマスを乾燥させることなく（湿式抽出）あるいは溶媒を用いることなく、微細藻類に含まれる脂質及びタンパク質を分画し、それによって化合物の変性を避けるとともに、処理すべき体積を制限することを可能にする。
【００２９】
本発明による方法の別の利点は、培地に対して、特に、微細藻類が残した生産物の懸濁液に直接実施できることであり、これがその方法を実施するために用いられる水の体積を減らすのに寄与する。
【００３０】
したがって、本発明による方法は、培養後に直接得られた濃縮されたバイオマスを用いて作業することを可能にする。
【００３１】
有利には、以下のわずか２工程：粉砕の工程、及び相分離の工程を実施することによって、異なる化合物が選択的に富化された以下の３つの相を直接得ることが可能である：「スーパーペレット」と称する脂質が豊富な第一の相、「上清相」と称するタンパク質が豊富な第二の相、及び不溶性可能物が豊富な「ペレット」と称する第三の相。
【００３２】
スーパーペレット及びペレットはしたがって直接利用することができ、上清相を、溶解した糖類及びＴＡＧからのタンパク質の分離、あるいはタンパク質及びＴＡＧの濃縮のいずれかを可能にするメンブラン濾過操作にかけて、２つの精製された画分を得ることができる。
【００３３】
この場合、バイオマスを乾燥させること及び溶媒を用いることに関連した、分子に対する悪影響は全く観測されない。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［微細藻類バイオマス］
本発明による方法は、充分に脂質が多く、充分に濃縮された微細藻類バイオマスから出発して実施される。したがって、微細藻類バイオマスは、そのバイオマスの全質量に対して、少なくとも１５質量％、好ましくは約１７．５質量％の脂質を含み、それに加えて、微細藻類バイオマスは、処理される微細藻類バイオマスの体積に対して、１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ、なおさらに好ましくは３５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの乾燥物濃度を有する。
【００３５】
微細藻類バイオマスは、好ましくは、ナンノクロロプシス種（Nannochloropsis sp.）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・オクラータ（Nannochloropsis oculata）、テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Porphyridium cruentum）、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、クロレラ・バルガリス（Chlorella vulgaris）、ネオクロリス・オレオアバンダンス（Neochloris oleoabundans）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）から、好ましくは以下の株：ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）、テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）から選択される少なくとも１種の微細藻類を含む
【００３６】
［ビーズミルを用いる方法］
本発明の方法は、ビーズミルを用いる工程を含む。
【００３７】
ビーズミルは、粘性のある製品、例えば、塗料の均質化のために、また、鉱物を粉砕するために慣用されている。ビーズミルは、処理される組成物を受け入れるための室（チャンバー）、例えば、蓋で覆われたボウルを含み、そのチャンバーには、ポンプによって、処理される組成物が供給される。
【００３８】
通常、ミル内のビーズの充填量（これはビーズによって占められているボウルの体積のパーセント割合に対応する）は５０％〜８０％、好ましくは７０％〜８０％（体積／体積）、有利には約７５％（体積／体積）の範囲である。
【００３９】
ビーズは別にして、チャンバーの内容物は、本質的に微細藻類バイオマスを含む。
【００４０】
充填量は、特に、使用するビーズの性質に応じて変えることができる。これは、特定の場合には、撹拌機の複数の翼の間でビーズの凝集が観察されうるからである。
【００４１】
処理される媒体に適した充填量を選択することは、当業者の知識の一部である。
【００４２】
ミルの中への組成物の供給の流速は、一般に、１５０ｍｌ／分〜２００ｍｌ／分の範囲である。処理される媒体に適した供給の流速を選択することも、当業者の知識の一部である。
【００４３】
ビーズミル内での処理は、好ましくは、１〜３０分間、好ましくは２〜２０分間、なおさらに好ましくは４〜１０分間の範囲の、そして有利には約６分間の継続時間（滞留時間）のあいだ行われる。
【００４４】
ビーズミル中での処理は、１８℃〜４０℃の範囲、好ましくは１８℃〜２５℃の範囲に通常は調節された温度で、通常行われる。
【００４５】
既に述べたとおり、本発明による機械的処理法は、ビーズミル、好ましくはガラスビーズミルを使用し、その条件は以下のとおりである：
-  ビーズの平均直径（ｄＧＭ）が０．２〜２．５×１０−３ｍ、好ましくは０．４〜１．０×１０−３ｍの範囲であり、好ましくは約０．６×１０−３ｍであり、
-  翼端撹拌速度（blade-tip agitation speed）（ν）が４〜５０ｍ・ｓ−１、好ましくは５〜２０ｍ・ｓ−１の範囲であり、好ましくは約８ｍ・秒−１である。
【００４６】
ビーズで粉砕する工程（ビーズミル工程）の終わりに、得られた組成物が有利に回収される。
【００４７】
本方法の一つの態様によれば、単一のビーズミル工程が行われる。
【００４８】
本方法の好ましい態様によれば、ビーズミル中での処理は、少なくとも２回、好ましくは２〜１０回、有利には３〜４回のあいだで繰り返される。
【００４９】
この方法は、ある体積のバイオマスを簡単に処理することができるために、バッチ式で実施することが好ましい。
【００５０】
［遠心分離工程］
既に述べたとおり、上記３つのこれまで述べた相を与える遠心分離を可能にする運転条件は、
-  ３５００ｇ〜２００００ｇの間、好ましくは６０００ｇ〜１５０００ｇの間、なおさらに好ましくは約１２０００ｇの遠心加速度、
- ２〜４０分の間、好ましくは５〜３０分の間、なおさらに好ましくは１０〜２０分の間の継続時間、
-  ５〜４０℃の間、好ましくは１０〜３０℃の間、なおさらに好ましくは２０〜２５℃の間の、得られた組成物の温度
である。
【００５１】
既に述べたとおり、この遠心分離工程の終わりに本質的に３つの相が得られ、これらの３つの相は異なる化合物が選択的に富化されている。
【００５２】
第一の相であるスーパーペレットは、通常、３０％より多い、好ましくは６０％より多い脂質を含む。それはまた、１０〜３０％の間の限定された量のタンパク質も含み、そのスーパーペレットの直接使用を可能にしている。
【００５３】
それでもなお、意図した使用に応じて、スーパーペレット中に存在するタンパク質を分離するための操作を行ってもよい。
【００５４】
使用する分離方法を選択することは、当業者の知識の一部である。
【００５５】
さらに、スーパーペレットの精製のための操作は、低減された割合のタンパク質のおかげで、より容易にされる。
【００５６】
第一の相は、本質的には、トリグリセリド（ＴＡＧ）と、リン脂質及び糖脂質の形態にある「ＰＵＦＡ」と称されるポリ不飽和脂肪酸との混合物を含む。
【００５７】
第二の相である上清相は、通常、２０％より多い、好ましくは４０％より多いタンパク質と多量の脂質を含む。
【００５８】
したがって、上清相を、タンパク質と脂質、特にＴＡＧを分離するための１以上の操作にかけて、２つの精製された画分を得てもよく、この／これらの分離操作は、有利には、膜を使用して行うことができる。
【００５９】
有利には、脂質を分離する少なくとも１つの工程が、第二の相に対して行われる。
【００６０】
分離操作の終わりに単離された脂質、特にＴＡＧ、及びスーパーペレット、又はスーパーペレットから単離された脂質は、有利には一緒にまとめられる。
【００６１】
第三の相であるペレットは、不溶性化合物が豊富である。このペレットは直接使用できる。
【００６２】
特に、上記３つの相が、選択的に異なる化合物について富化されているという事実によって、成分の精製のための上記操作はより容易にされている。
【００６３】
本発明による方法は、脂質の目的とする回収および実質的に完全な回収を可能にすると考えられるべきである。
【００６４】
［脂質の特性］
脂質は、化学組成物、化粧品組成物、又は医薬組成物に、栄養補助産業において、かつ食品、特に動物用餌に用いられる。
【００６５】
以下の例は、本発明の範囲を制限することなしに本発明を説明する。
【実施例】
【００６６】
全てのこれらの例について、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）のバイオマスが用いられる。このバイオマスは、１０Ｌの管状の光バイオリアクター中で培養された。
【００６７】
このバイオマスを、各例において特定する条件の下で、ガラスビーズ用いてビーズミル（DynoMill Multilab社, WAB, スイス国）を使用して処理した。
【００６８】
脂質はFolch法によって分析する。
【００６９】
タンパク質は、２８０ｎｍにおける吸光度によって分析し、分光学的分析の正確さを確かめるために、この分析とともに場合によっては任意選択によってＢＣＡプロトコルにしたがって行われるタンパク質分析を追加することができる。
【００７０】
［実施例１（本発明による）］
粉砕（ミリング）工程
-  １７．５％の脂質を含むナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）のバイオマス、
-  供給物の乾燥物質濃度：７５ｇ／Ｌ、
-  ガラスビーズ：直径０．６ｍｍ、
-  撹拌速度:８ｍ・ｓ−１、
-  φ：ミルの充填量：７５％、
-  Ｑ：供給流速、ｍｌ／分単位：２００、
-  温度：２０℃に調節、
-  ６分の平均滞留時間。
【００７１】
遠心分離工程：
-  １０分間、２０℃において、５００ｍｌの容器内で、１７０００ｇでの遠心分離。
【表１】
2017074039.tif 000002
【００７２】
この実施例では、上述した３つのフラクションが実際に回収された。
【００７３】
［例２（比較）］
１２．５％の脂質を含むナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）バイオマス、
-  供給物の乾燥物質濃度：７５ｇ／Ｌ、
-  ガラスビーズ：直径０．６ｍｍ、
-  撹拌速度:８ｍ・ｓ−１、
-  φ：ミルの充填量：７５％、
-  Ｑ：供給流速、ｍｌ／分単位：２００、
-  温度：２０℃に調節、
-  ６分の平均滞留時間。
【００７４】
この例では、より少ない脂質量のバイオマスを用いて、２つの相だけが、遠心分離の後で得られる。
【００７５】
したがって、記載した発明によって、わずか２つの操作において、湿潤バイオマスに対して溶媒なしで全脂質のほぼ７０％の抽出、及びまた、ＴＡＧ及びＰＵＦＡが多い極性脂質の分別を達成することが可能である。
【００７６】
スーパーペレット及びペレットは、したがって直接利用することができ、上清相を、２つの精製された画分をもたらすタンパク質とＴＡＧの分離のための操作（膜）にかけることができる。
【外国語明細書】
2017074039000001.pdf