(57)【要約】【課題】力学的強度に優れ、生体親和性とストロンチウムイオンを徐放する機能を備え、骨再生の効率が高い繊維状人工骨及びその製造方法を与えること。【解決手段】ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する組成物を表面に有する生体吸収性繊維の集合体である繊維状人工骨及びその製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する組成物を表面に有する生体吸収性繊維の集合体である繊維状人工骨。
【請求項２】
生体吸収性繊維がポリ（Ｌ−）乳酸繊維である請求項１に記載の繊維状人工骨。
【請求項３】
請求項１に記載の繊維状人工骨の製造方法であって、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する繊維状人工骨の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の繊維状人工骨の製造方法であって、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する繊維状人工骨の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨折あるいは欠損した骨の修復をするなどの目的に使用される繊維状人工骨及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨折あるいは欠損した骨の修復を目的に人工材料を利用しようとするニーズが高まっている。骨の欠損部を充填する目的で、従来から人工骨として、顆粒状やブロック状などの様々な大きさと形状のリン酸カルシウム系材料が用いられている。あるいは、骨セメントとして利用されているカルシウム系材料以外にも、アクリル系セメントやケイ酸ガラス系セメントなども利用されている。これらの材料は、生体適合性を有し、生体内において骨欠損部を空間的、構造的に補填するのみならず、それ自体が強度と耐久性を有することが望まれ、更に好ましくは生体吸収性であり、体内に吸収される過程と並行して、次第に自己組織と置き換わり、解剖学的にも正しい元の健常な状態に復元できるような材料設計が望まれている。従来からの人工材料は、これらの点で必ずしも満足できる性能を備えているわけではなく、顆粒状やブロック状の人工骨では、欠損部への密なパッキングが不十分で、期待されるレベルでの骨再建が実現できず、あるいはセメントタイプの場合には、欠損部から硬化前の液状セメントが周囲組織に漏出し、重篤な健康被害を引き起こすケースも報告され、大きな問題であった。望ましくは、これら骨充填材が使用される個々のケースにおいて、その大きさや形状がフレキシブルに調整可能で、欠損部にフィットし、かつ施術中のハンドリングに優れ、骨再建過程を促進させるような骨充填材が望まれている。こうした要求に対して、最近、従来にない新たなタイプの人工骨の開発が進められている。例えば特許文献１及び非特許文献１には、綿状人工骨の製法とその利用が示されている。これは、生体親和性の高い生体吸収性ポリマーであるポリ乳酸−グリコール酸共重合体を用いて、これと共に同じく生体吸収性であるリン酸カルシウム系ナノ粒子をブレンドし、両者の混合物からなる溶液から電界紡糸してナノファイバーを作製し、その集合体を形成して用いるものである。このようにして得られたリン酸カルシウムを含有するナノファイバーの集合体は綿状の骨充填材として、動物実験において骨欠損部に充填され、骨組織の再生に有効である実験結果が示されている。
【０００３】
あるいは特許文献２には、同様な生体吸収性ポリマーを含む繊維表面にケイ酸アルミニウムナノ粒子を堆積し、この複合体繊維からなる集合体を形成し、布状または綿状の骨充填材として利用することが示されている。先の例とともに、これらは何れも生体吸収性ポリマーの電界紡糸法により作製したナノファイバーを用いて繊維集合体を形成し、得られたナノファイバー集合体を骨充填材として利用するものであるが、ナノファイバーは一般的に力学的強度に乏しいため、これから構成される繊維集合体も力学的強度が劣ることから、人工骨としての利用には必ずしも適さない問題があった。更には、繊維間間隙が狭く繊維が密に詰まりすぎているため、骨系細胞が繊維集合体内部で増殖するためのスペースが不足することから十分に増殖できず、あるいは新生血管の進入が困難であることから正常な骨再生が進行しないという問題もあった。
【０００４】
上記に示す例以外にも、従来から様々な系で、生体吸収性ポリマーとリン酸カルシウム系微粒子を組み合わせたナノファイバーの利用が検討されており、それらの集合体を各種細胞培養の足場材料として利用する検討が多数報告されている。これらは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣した系として捉えることができ、例えば多分化性幹細胞を繊維集合体上で培養することで分化誘導の促進や、これの増殖、活性、形状、マイグレーションなど様々な特性を制御する試みが成されている。例えば非特許文献２には、生体吸収性ポリマーからなるナノファイバー集合体上で細胞培養を行うことで、フィルムとの比較において細胞の初期接着がより向上することが示されている。先に示した例のように、ナノファイバーにリン酸カルシウム系微粒子を含有させることで、細胞の初期接着の一層の向上や、骨系細胞の関与する系においてはナノファイバーへの骨伝導性の付与など、様々の好ましい効果が期待される。しかしながらこの非特許文献２の例の場合、生体吸収性ポリマーに添加する形でリン酸カルシウム系微粒子を含有したナノファイバーを用いても、その効果が現れていない。このことは、得られたナノファイバーの繊維表面にリン酸カルシウム系微粒子（ヒドロキシアパタイト微粒子）が、その有効性を発揮できるほどには十分露出していないためであると考えられる。その対策として例えばリン酸カルシウム系微粒子を用いて、これを繊維表面に塗工した場合には、繊維表面と微粒子の界面で両者の混ざり合いがないことから両者が接着せず、周囲との摩擦等により容易に該微粒子が繊維表面から脱落する問題があった。
【０００５】
これらの例のように、繊維集合体を骨再生に関わる細胞を培養する担体とした上で、新たなタイプの人工骨としてより有効に利用することが望まれている。そのためには、繊維表面のより有効で持続性のある改質方法を開発することが必要であり、それによって新生骨の形成を更に促進させ、繊維表面と自家骨との界面において両者の接合が促進されると共に、繊維周囲における新生骨の形成が促進されることで、従来にない特徴を有する新たな人工骨としての利用が期待される。更には、現状では力学的強度や生産性などに難点のあるナノファイバーの利用にこだわる必然性はなく、繊維自体の力学的強度を増加させ、繊維密度や繊維径等のよりフレキシブルな制御のためには、従来から広く利用されている様々な不織布の設計と製造技術を利用することが期待される。
【０００６】
一方、骨再生に関わる外科分野への人工材料の利用に関して、上記のようなリン酸カルシウム系材料の骨伝導性を利用する手段に加えて、骨代謝に関連して利用されるストロンチウムイオンの効果を併せて利用することも、その有効性が期待される。即ち、ストロンチウムイオンは生体内において骨芽細胞の働きを活性化し、一方で破骨細胞の活動を抑制する作用を有するとされ、実際にストロンチウムイオンの適切な濃度範囲において骨粗鬆症の予防に有効であることが認められている。すでに欧州において、骨粗鬆症の予防に関し医薬品として認可されているストロンチウムラネレートは、その投与により破骨細胞による過剰な骨吸収を抑制し、同時に骨芽細胞の増殖を促して骨形成を促進する効果のあることが実証されている（例えば、非特許文献３及び非特許文献４等）。ストロンチウムイオンの上記のような作用を利用する観点から、例えば骨折や骨欠損部などの修復を目的とした整形外科、形成外科等の分野における臨床用途においても、ストロンチウムイオンの好ましい効果を利用することが想定される。具体的には、例えば人工骨表面に骨系細胞の増殖と活性を増強しかつ生体親和性と骨伝導性に優れた層を形成することで、生体内においてこれらからストロンチウムイオンが放出されれば、人工骨表面における新生骨の形成を促し、骨伝導性を飛躍的に向上させることが期待される。従って、上記した生体吸収性ポリマーを利用した繊維集合体や、これら以外の繊維系の材料においても、繊維表面と骨との親和性を向上させ、両者の接合を促進する目的に加えて、ストロンチウムイオンの骨形成促進効果を奏することが期待される。しかしながら、従来からの技術では、こうした繊維系材料にストロンチウムイオンの徐放性を付与する具体的な手段が見出されておらず、更に繊維表面の改質方法として、繊維自体へ直接リン酸カルシウム系微粒子を導入するのではなく、繊維表面への選択的な塗工などの方法を開発することが望まれている。また、ナノファイバーに比してより繊維径が大きい従来から利用されてきた不織布の設計と作製方法を利用することも併せて期待されているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０−５０７４１３号公報
【特許文献２】特開２０１２−１９１９８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｏ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，  ５（５），  １７７５−１７８４  （２００９）．
【非特許文献２】Ｉｔｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １００（１），  ４３−４９  （２００５）．
【非特許文献３】Ｐ．Ｊ．Ｍｅｕｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３５０，  ４５９−４６８  （２００４）．
【非特許文献４】Ｍ．Ｅ．Ａｒｌｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，  ２３（２），  ２１５−２２２  （２００８）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、力学的強度に優れ、生体親和性とストロンチウムイオンを徐放する機能を備え、骨再生の効率が高い繊維状人工骨及びその製造方法を与えることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記した本発明の課題は、下記１〜４に示す手段により本質的には解決される。
１．ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する組成物を表面に有する生体吸収性繊維の集合体である繊維状人工骨。
２．生体吸収性繊維がポリ（Ｌ−）乳酸繊維である上記１に記載の繊維状人工骨。
３．上記１に記載の繊維状人工骨の製造方法であって、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する繊維状人工骨の製造方法。
４．上記２に記載の繊維状人工骨の製造方法であって、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する繊維状人工骨の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、力学的強度に優れ、生体親和性とストロンチウムイオンを徐放する機能を備え、骨再生の効率が高い繊維状人工骨及びその製造方法を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を、ポリ（Ｌ−）乳酸不織布に塗工した試料の走査型電子顕微鏡による拡大写真。（ａ）は１００倍、（ｂ）は３０００倍である。
【図２】ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察及びエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）観察することにより得られた、繊維断面におけるストロンチウムイオンの分布。
【図３】ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布から溶出するストロンチウムイオン濃度の、ＨＢＳＳ（−）交換毎の測定値。
【図４】ストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布から溶出するストロンチウムイオン濃度の、ＨＢＳＳ（−）交換毎の測定値。
【図５】実施例３、４及び比較例１、２の細胞培養において、培養開始から１５日目における培地中に分泌されたオステオカルシンの濃度の定量結果。
【図６】実施例５における、ラビットに対して移植した、ストロンチウム炭酸アパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布繊維の周囲に形成された新生骨の様子。
【図７】比較例３における、アパタイト微粒子を塗工しないポリ（Ｌ−）乳酸不織布をラビットに移植した際に形成される新生骨と不織布繊維が互いに無関係に分布する様子。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の繊維状人工骨は、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する組成物（以下、「アパタイトを含有する組成物」とも記載する。）を表面に有する生体吸収性繊維の集合体である。本発明の繊維状人工骨は、アパタイトを含有する組成物を表面に有する生体吸収性繊維が集合体を構成した性状を有する。繊維表面におけるアパタイトを含有する組成物の形状は、粒子状、塊状、層状等どのような形状であっても良いが、層状であることが好ましい。アパタイトを含有する組成物の層を表面に有する生体吸収性繊維の集合体は、本発明の繊維状人工骨として好ましい。例えば、アパタイトを含有する組成物が層状である場合は、繊維状人工骨を構成する生体吸収性繊維は、その表面全体にアパタイトを含有する組成物の層を有してもよく、その表面の一部にアパタイトを含有する組成物の層を有してもよいが、その表面全体にアパタイトを含有する組成物の層を有することが好ましい。以下、本発明の好ましい態様である、繊維表面におけるアパタイトを含有する組成物の形状が層状である場合を例に取り説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００１４】
本発明における生体吸収性繊維から構成される集合体の形状としては、目的、用途に応じて、多数の繊維が集積した塊状、綿状や、繊維の配向方向がランダムで繊維同士が互いに交絡して形成される不織布を利用したシート状、あるいは繊維の長さ方向に束ねた帯状もしくは紐状、これらが織られて形成される布状、袋状など、様々な形状の繊維集合体を自由に設計することができ、本発明に関わる生体吸収性繊維の集合体として用いることができる。
【００１５】
本発明で用いる生体吸収性繊維の性状は、直径が１〜１００μｍの範囲にあり、長さが５ｍｍ以上であることが好ましく、この生体吸収性繊維から、不織布や織布、織紐を形成して使用することが好ましい。不織布の目付（坪量）としては５〜１５０ｇ／ｍ２の範囲が好ましく、概して、低目付とすることで繊維密度が低く柔らかいシートとすることができ、高目付とすることで繊維密度が高く丈夫なシートとすることができる。織布、織紐の場合には、不織布より繊維密度が高くても良い。そして本発明において、このような性状の繊維によって繊維集合体を構成することで、特許文献１や特許文献２、非特許文献１などに記載されるナノファイバーを用いた骨充填材等の人工骨と比べて、繊維状人工骨が格段に力学的強度に優れ、更には、ナノファイバー集合体よりも繊維間間隙が広くて繊維が密に詰まりすぎていないため、骨系細胞が繊維集合体内部で増殖するためのスペースを確保できることから、骨系細胞が十分に増殖でき、加えて、新生血管の進入が容易であることから正常な骨再生の効率が非常に高い繊維状人工骨を得ることができる。
【００１６】
上記の生体吸収性繊維の集合体を形成するための製造方法としては、従来から行われている種々の製造方法によるものを用いることができ、具体的には、例えば不織布の製造の場合、空気流を利用する乾式法、水流を利用する湿式法、溶融した繊維を利用するスパンボンド法、メルトブローン法等が用いられ、また不織布を構成する繊維を結合する方法としては、接着剤を用いるケミカルボンド法、熱融着を利用するサーマルボンド法、ニードルに刻まれる突起を利用して繊維を絡ませるニードルパンチ法、高圧水流を利用するスパンレース法など様々な方法を利用することができる。これらの種々の方法を単独で用いて製造された不織布や、これらを組み合わせて製造された、例えばＳＭＳ不織布と称される、スパンボンド法（Ｓ）により製造された不織布とメルトブローン法（Ｍ）により製造された不織布を組み合わせて製造されるような複合型の不織布を用いることもできる。不織布以外の織布、織紐の場合には、従来から知られているこれらの製造方法を用いることができる。こうした従来から広く用いられてきた繊維集合体の製造方法を利用することで、本発明の目的に最適な繊維密度や力学的強度を有する、様々な繊維から構成される繊維集合体を利用することが可能である。また、この様に製造されたシート状や紐状の繊維集合体から、更に加工を施し、帯状や袋状、組紐状などの様々な形状の繊維集合体を設計することができる。
【００１７】
本発明の繊維状人工骨に使用される生体吸収性繊維は、後述するストロンチウムを含むアパタイト微粒子を含有する塗工液に用いる有機溶媒に溶解しないものが好ましい。
本発明で用いることのできる生体吸収性繊維としては、ポリ（Ｌ−）乳酸繊維が好ましく利用できる。本発明の繊維状人工骨において、生体吸収性繊維の集合体を構成する繊維としてポリ（Ｌ−）乳酸の繊維を用いる場合、良好な生体親和性とストロンチウムイオンを徐放する機能を付与することができるとともに、生体吸収性繊維の集合体が生体環境下において数ヶ月から数年の間に亘り、次第に分解消失する特徴を利用することができる。このような性質を有することが好ましい例として、繊維状人工骨表面であらかじめ骨芽細胞前駆体細胞を培養し、細胞の増殖と骨芽細胞への分化が進んだ時点で、これを付着した細胞と共に生体内に移植することで、骨修復の効果が非常に高い繊維状人工骨として用いることが可能である。このように、組織再生に用いる材料と細胞をあらかじめ組み合わせることで組織再生に有利な効果があることが知られており、例えば、多孔質セラミックスに骨髄細胞を組み合わせたインプラントの例として、Ｏｈｇｕｓｈｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｓｃａｎｄ．，  ６０（３），  ３３４−３３９  （１９８９）等を挙げることができる。本発明の繊維状人工骨を好適に適用できる例として、特に骨が部分的に欠損した部位に移植するケースが考えられ、この場合には、繊維の間隙及びその周辺部において骨芽細胞の増殖と石灰化が亢進し、局所的に骨の再生修復を促進する効果が期待される。更に、従来の人工骨による充填操作と補完的に使用することでも、骨修復過程をシナジー的に加速する効果が期待できる。加えて、骨再生過程の進行と並行して、移植された繊維状人工骨自体の生分解と生体内吸収が進むことで、生来の骨組織と置換し、最終的に完全に元の骨組織を再生できる効果が期待できる。なお、ポリ（Ｌ−）乳酸繊維は、上記の通り好ましく利用できる生体吸収性の特性が維持できることや、後述する通り、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子を含有する塗工液に用いる有機溶媒に溶解しないことなどの、本発明の目的を達成するために好ましい特性を阻害しない範囲において、他の重合成分を含んでいても良い。例えば繰り返し単位中に、１５モル％以下、好ましくは５モル％以下のＤ−乳酸が含まれていてもよい。本発明において生体吸収性繊維として使用されるポリ（Ｌ−）乳酸繊維は、通常、繰り返し単位中のＬ−乳酸の割合が８５モル％以上であるポリ乳酸繊維であり、好ましくは繰り返し単位中のＬ−乳酸の割合が９５モル％以上であるポリ乳酸繊維である。
【００１８】
本発明の繊維状人工骨である生体吸収性繊維の集合体を構成する繊維が、その表面にアパタイトを含有する組成物の層を有するためには、本発明において好ましくは、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子を予め製造しておき、これとポリ乳酸共重合体とを含有する塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する方法が好ましく利用される。ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する塗工液は、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、ポリ乳酸共重合体と、有機溶媒とを含むことが好ましく、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を用いることがより好ましい。ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を用いてアパタイトを含有する組成物の層を形成すると、該層中に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子及びポリ乳酸共重合体の組成が均一となる。従って組成が均一なアパタイトを含有する組成物の層を形成することができる。
ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工する繊維状人工骨の製造方法も本発明に包含される。
ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の製造方法として、最初にストロンチウムを含むアパタイトを合成し、次いでこれを微分散することでストロンチウムを含むアパタイト微粒子を得る方法が挙げられる。例えば、特開平５−３１０４１０号公報には、リン酸水素ストロンチウムと水酸化ストロンチウムまたは炭酸ストロンチウムをポットミルで混合、攪拌しメカノケミカル的な反応によりストロンチウムアパタイトの前駆体を得た後に、これを８００℃程度の温度で仮焼することでストロンチウムアパタイトを合成する方法が開示されている。あるいは、特開平１１−３４３１９８号公報には、任意のリン酸アパタイトを出発原料に用い、これに水熱処理を施すことで、処理中にアパタイト中に含まれる任意のイオンを別のイオンにイオン交換する方法が開示されている。また加藤らによる均一沈殿法（加藤千晴、藤田一美、松田恵三、日本化学会誌、Ｎｏ．３、３２１−３２７、（２００２））には、尿素を用いて、リン酸ストロンチウム塩の前駆体を経てストロンチウムを含むアパタイトを合成する方法が示されている。これらの方法で得られるストロンチウムを含むアパタイトはいずれも本発明において好ましく用いることができる。
【００１９】
あるいは、更に好ましく用いることのできるストロンチウムを含むアパタイトの合成方法として、特開２０１４−１８０４９１号公報及び後述する実施例において示すように、ストロンチウムを含むアパタイトを合成する際に、その前駆体としてリン酸水素ストロンチウム（ＳｒＨＰＯ４）を予め合成し、これをアルカリの存在下で加水分解することで、ストロンチウムを含むアパタイトを得ることができる。あるいは、前駆体としてストロンチウムとともに種々の割合でカルシウムを含むリン酸水素化合物を合成し、これを用いて同様にアルカリの存在下で加水分解を行うことで、カルシウムとストロンチウムを種々の割合で含むアパタイトを高純度で得ることができ、これらは本発明に最も好適に用いることができる。
【００２０】
本発明におけるストロンチウムを含むアパタイトとこれから製造されるストロンチウムを含むアパタイト微粒子において、アパタイト中に含まれるストロンチウムの比率には好ましい範囲が存在し、ストロンチウムは該アパタイト中に２０質量％以上含まれる場合が好ましい。これより少ない比率で該アパタイト中にストロンチウムが含まれる場合、ストロンチウムの好ましい効果が発揮できない場合がある。また、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子におけるストロンチウムの比率は、該アパタイト微粒子中に６５質量％以下であることが好ましい。６５質量％を超えると、該アパタイト微粒子中にアパタイト以外のストロンチウム塩が不純物として含まれる場合があり、好ましくない。
【００２１】
上記のストロンチウムを含むアパタイトにおいて、更にアパタイト中のリン酸基の一部が炭酸イオンに置換した、ストロンチウムを含む炭酸アパタイトも本発明において好適に用いることができる。その具体的な合成方法としては、上記のリン酸水素ストロンチウムを原料に用いて、これと炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行うことでストロンチウムを含む炭酸アパタイトが高純度で得られる。リン酸水素ストロンチウムと、炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行う際、用いる炭酸塩または炭酸水素塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウム等の１０℃の水に対する溶解性が１質量％以上である水溶性の高い炭酸塩または炭酸水素塩が特に好ましい。更に、反応の際の条件として室温（２５℃）もしくは室温以上の温度である場合が好ましく、更に４０℃以上である場合が好ましい。反応の際の温度が室温より低い場合には、リン酸水素ストロンチウムが完全に炭酸ストロンチウムアパタイトに変換されずに生成物中に残存する場合がある。反応温度の上限としては１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは９０℃以下である。
【００２２】
あるいは、ストロンチウムを含むアパタイトの別の合成方法として、ストロンチウムイオンとリン酸イオンを含む水溶液中から一段階の反応でストロンチウムを含むアパタイトを合成することもでき、この場合、ストロンチウムイオンとともに種々の割合でカルシウムイオンを共存させて反応を行うことで、カルシウムイオンとストロンチウムイオンを種々の割合で含むアパタイトを得ることができる。これらのアパタイトも本発明において好ましく用いることができる。
【００２３】
本発明において好ましく用いることのできるストロンチウムを含むアパタイトは、更に種々の割合でマグネシウムや亜鉛、ナトリウム、カリウム等の様々な金属イオンを含んでいてもよく、また、水酸基に換えてアパタイト組成中にフッ素や塩素を含んでいてもよい。あるいは前述したような炭酸イオンを含む炭酸アパタイトであってもよく、あるいはケイ酸イオンを含んでいてもよい。特に、本発明においては、ストロンチウムを含む炭酸アパタイトを用いた場合に、生体内において適度な溶解性を示すことから極めて好ましく用いることができる。更に、これらのアパタイトは生体に対して安全性が懸念される不純物を含んでいないことが重要であり、安全性に優れた繊維状人工骨を提供するためには高純度のストロンチウムを含むアパタイトを用いることが好ましい。
【００２４】
本発明において、ストロンチウムを含むアパタイトは微粒子の性状で用いられる。微粒子の性状としては、走査型電子顕微鏡により観察される該アパタイト微粒子の一次粒子（個々の粒子として観察される最小単位）の大きさが、数平均粒子径で５００ｎｍ未満であることが好ましい。該アパタイト微粒子の中に一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上である粗大粒子が含まれている場合であっても、全体に対する割合が、個数において１０％未満である場合が好ましい。本発明において、平均粒子径として走査型電子顕微鏡を用いて測定する場合には、少なくとも５０個以上の一次粒子の大きさ（粒子形状が等方性ではなく異方性を有する場合には最も長い長軸方向の長さを計測する）を計測し、その数平均粒子径を用いることが好ましい。該アパタイト微粒子の大きさが数平均粒子径で５００ｎｍ以上である場合や、または含まれる一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上である粗大粒子の割合が、個数で１０％以上である場合には、本発明の人工骨を構成する繊維がその表面に有するアパタイトを含有する組成物の層の厚みが不均一になり、該組成物の層と繊維との界面における接着性が不十分となって、該組成物の層が容易に繊維から剥離する場合がある。
【００２５】
本発明で用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト微粒子を製造する方法として、ストロンチウムを含むアパタイトに湿式分散処理を行う方法が好ましい。湿式分散処理の方法としては、メディアミルを利用した湿式分散方式が特に好ましく、具体的には、溶剤中に該アパタイトを導入し、メディアとしてガラスビーズやアルミナビーズ、その他のセラミックビーズ等を加えて振盪や攪拌を行い、該アパタイトとメディアが機械的に衝突し、微粉砕されることで該アパタイトの微粒子化を行うことが好ましい。少量をバッチ方式で処理を行う場合には、メディアミルとしてペイントコンディショナーを使用して数時間に亘る振盪を行うことで湿式分散処理を行うことができる。また、ダイノーミル（ＷＡＢ社製）に代表される横型ビーズミルのような連続方式での湿式分散処理が可能である装置を用いて、これを複数台用いて直列に配置して１パスで湿式分散処理を行っても良く、あるいは１台のメディアミルを用いて複数回処理を繰り返すことも好ましく行うことができる。
【００２６】
上記したメディアを利用して該アパタイト微粒子を製造する場合に、使用するメディアにはセラミックビーズを用いることが好ましい。特に、ビーズが研磨されるなどしてビーズ由来の不純物が分散液中に混入することを防止することが好ましく、仮に、微細に粉砕されたビーズ由来の成分が混入した場合であっても、これが生体内において安全性が確認されていることが好ましい。こうした目的で利用できるセラミックビーズとして、具体的にはＺｒＯ、立方晶ジルコニア、イットリウム安定化ジルコニア、ジルコニア強化アルミナなどのジルコニアを含有するセラミックビーズを最も好ましく用いることができる。また、メディアの平均直径は０．０１〜１０ｍｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。こうしたメディアを使用したメディアミルを用いる湿式分散処理の条件は、通常行われる室温での処理でよく、特に処理時間や温度等に関する制限は無い。また、パス回数については１回で十分である場合もあるが、２〜７回程度のパス回数で処理を行うことで、より均一で微細な該アパタイト微粒子を製造することができる。
【００２７】
上記の方法を用いて該アパタイト微粒子を製造する際に、様々な化合物を添加して湿式分散処理を行うことで、分散の効率が向上し、より短時間で均一に微細化した該アパタイト微粒子を製造することが可能である。使用できる分散剤としては、各種界面活性剤や、有機溶媒に可溶性である様々な合成ポリマー及び天然物由来ポリマーなどを用いることができるが、生体に対する安全性が確認されている素材であって不純物が含まれず高純度であることが好ましい。用いることのできる分散剤の具体的な例としては、ポリ乳酸、ポリ乳酸共重合体、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリトリメチレンカーボネート等の生体吸収性を有するポリマーや、あるいは有機溶媒可溶性の各種合成ポリマーやポリジメチルシロキサン等の生体不活性である合成ポリマーが好ましく用いられる。本発明において最も好ましく用いることのできるポリマーはポリ乳酸共重合体である。特にポリ乳酸共重合体として、繰り返し単位中に乳酸のＤ体とＬ体を任意の割合で含むポリ（Ｄ，Ｌ−）乳酸共重合体（ポリ（Ｄ，Ｌ−）乳酸）を好ましく用いることができ、Ｄ体とＬ体の比率がモル比率で２０：８０〜８０：２０の範囲でともに含まれるポリ（Ｄ，Ｌ−）乳酸共重合体は、有機溶媒への溶解性が良好であり、これを用いた場合に、該アパタイト微粒子の分散安定性が最も良好であるため、本発明において好ましく用いることができる。あるいは、別の好ましいポリ乳酸共重合体の例として、ポリ乳酸共重合体の繰り返し単位中に、乳酸以外に、グリコール酸、ε−カプロラクトン、トリメチレンカーボネート等の繰り返し単位を併せて含むポリ乳酸共重合体であって、これらの乳酸以外の繰り返し単位のモル比率が２０〜８０モル％の範囲である場合が好ましく用いられる。
【００２８】
上記の湿式分散処理で得られるストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体を含む分散液の分散安定性は、分散媒体として用いる有機溶媒の種類に依存することがある。分散液の分散安定性の評価の基準として、分散液を室温に置いて長時間静置した場合、分散液から沈降するストロンチウムを含むアパタイト微粒子の沈殿物の有無と、再分散性の有無を挙げることができる。最も分散安定性が良好である有機溶媒の例としてアセトニトリルを挙げることができる。この場合、室温に置いて１週間静置した後でも該アパタイト微粒子の沈殿は認められず、分散液中に該アパタイト微粒子が均一な状態で分散状態を保つことができる。分散安定性が比較的良好な例としては、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランなどの環状エーテル類や、あるいは、アセトン、メチルエチルケトンなどの各種ケトン類を挙げることができ、これらを用いた場合には、該アパタイト微粒子の沈殿が生じる場合があるものの、再分散性が良好であり、静置後に再分散を行うことで、何れの場合においても後述する塗工に用いる塗工液に好適に用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を得ることができる。
湿式分散処理において、分散媒体として用いる有機溶媒の使用量は、質量比でストロンチウムを含むアパタイト：有機溶媒＝１：１０００〜１：２の範囲が好ましい。有機溶媒を、該アパタイトに対する有機溶媒の比率が質量比で１０００を超えて用いた場合、これを用いて作製される後述する塗工液の固形分濃度が好ましい範囲よりも低下するため好ましくない。また、該アパタイトに対する有機溶媒の比率が質量比で２を下回る場合、湿式分散処理中に分散液の粘度が上昇し、分散処理が進まなくなり、作製した分散液中に粗大粒子が混在する場合がある。
【００２９】
本発明で用いることのできるポリ乳酸共重合体の分子量には好ましい範囲が存在し、重量平均分子量が少なくとも１万以上であり、好ましくは３万〜１００万の範囲にあり、重金属イオンなどの生体に対して有害性のある不純物を実質的に含まない医療グレードとして入手可能である材料を用いることが好ましい。重合体の重量平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィー又は光散乱法により測定される。
【００３０】
上記のポリ乳酸共重合体を添加して該アパタイトの湿式分散処理を行う際の、該アパタイトに対するポリ乳酸共重合体の割合は、本発明の繊維状人工骨を構成する生体吸収性繊維がその表面に有するアパタイトを含有する組成物の層に含まれる両者の比率の好ましい範囲内において用いることが好ましく、具体的には両者の質量比（アパタイト：ポリ乳酸共重合体）が１０：２〜１０：２０の範囲で含まれることが好ましい。この範囲を下回る比率でポリ乳酸共重合体を用いた場合、分散液中における該アパタイト微粒子の分散安定性に劣る場合があり、更にこれを用いて生体吸収性繊維の集合体に塗工した場合、繊維とアパタイト微粒子を含有する組成物の層との接着性が不十分となり、繊維周囲からの摩擦等により該組成物の層が容易に脱落する場合がある。また、ポリ乳酸共重合体が上記の比率を超えて該組成物の層に含まれる場合には、繊維表面が有するアパタイト微粒子を含有する組成物の層からのストロンチウムイオンの放出が妨げられ、本発明の目的とするストロンチウムイオンを徐放する機能が認められない場合がある。
【００３１】
上記の様にポリ乳酸共重合体を加えてアパタイトの湿式分散処理を行い、得られた分散液をそのまま本発明に関わる塗工液として用いることもできるが、湿式分散処理を行って得られた分散液に、更に追加してポリ乳酸共重合体を添加する方法や、各種界面活性剤や有機溶媒等を添加して塗工液を作製し、これを生体吸収性繊維の集合体に塗工することも好ましく行われる。いずれの場合においても塗工液中（及びこれから形成される繊維表面が有するアパタイトを含有する組成物の層中）に含まれる該アパタイト微粒子に対するポリ乳酸共重合体の割合は、質量比でアパタイト微粒子：ポリ乳酸共重合体が１０：２〜１０：２０の範囲であることが好ましい。ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを質量比で１０：２〜１０：２０で含む塗工液を生体吸収性繊維の集合体に塗工することにより、該繊維表面に該アパタイト微粒子：ポリ乳酸共重合体の質量比が上記範囲のアパタイトを含有する組成物の層を形成することができる。
【００３２】
ストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む塗工液に用いることのできる有機溶媒としては、ポリ乳酸共重合体を溶解する有機溶媒であり、更に使用する繊維集合体を溶解しない有機溶媒である場合が好ましく、特にアセトニトリルを最も好ましく用いることができる。種々の繊維集合体に対して、アセトニトリル以外の有機溶媒を用いた場合には、繊維の種類によってはこれが膨潤もしくは溶解する場合がある。アセトニトリルを用いた場合、種々の繊維集合体に対してこれらを膨潤、溶解する作用が弱く、好適に用いることができる。アセトニトリル以外に、本発明において用いることのできる他の有機溶媒の例として、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランなどの環状エーテル類や、あるいは、アセトン、メチルエチルケトンなどの各種ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタンなどの含ハロゲン溶剤を、用いる繊維集合体を溶解しない場合に限って用いることができる。これらは１種のみ用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
上記塗工液の調製において、ポリ乳酸共重合体を溶解する有機溶媒を用いることにより、得られる塗工液は、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含むものとなる。湿式分散処理により得られた分散液をそのまま塗工液として用いる場合には、ポリ乳酸共重合体を溶解する有機溶媒を用いて湿式分散処理を行うことが好ましい。
【００３３】
上記のストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液から作製される塗工液において、塗工液中の全体の固形分濃度には好ましい範囲が存在し、０．１〜２０質量％の範囲であることが好ましい。固形分濃度が０．１質量％未満では繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が形成されない場合がある。また、固形分が２０質量％を上回る濃度では、繊維間の間隙がアパタイトを含有する組成物によって埋められてしまい、生体吸収性繊維の集合体が特徴とする柔軟性や通液性などの特性が損なわれる場合がある。
【００３４】
本発明において生体吸収性繊維表面が有するアパタイトを含有する組成物の層の量には好ましい範囲が存在する。生体吸収性繊維の集合体の単位面積あたりに塗工された固形分質量の総量を以て表した場合、単位平方メートル当たり０．１〜５０ｇの範囲が好ましく、０．５〜２０ｇの範囲がより好ましい。この範囲を超えてアパタイトを含有する組成物の層を形成した場合、生体吸収性繊維の集合体を構成する各繊維の間隙を該組成物が埋めることで通液性が低下し、細胞の増殖に不具合をきたす場合がある。また、上記範囲を下回る場合、該組成物の層からのストロンチウムイオンの放出による効果が発揮されない場合がある。
【００３５】
生体吸収性繊維の集合体に、アパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を用いて塗工を行う方法としては、生体吸収性繊維の集合体の大きさや形状にあわせて種々の好適な方法を用いることができる。例えば、一つの方法として、塗工液中に生体吸収性繊維の集合体を浸漬して引き上げ、余分な塗工液を除いた後、塗工液を乾燥してアパタイトを含有する組成物の層を形成する方法や、あるいは、スプレー噴霧やカーテン塗工などの方法で生体吸収性繊維の集合体に塗工液を満遍なく付着させて、その後に乾燥を行って該組成物の層を形成する方法など、既知の様々なコーティング方法を利用することが可能である。
【００３６】
本発明の繊維状人工骨は、上記した製造方法により製造され、その後に好ましくは滅菌処理されることで安全性の確保された人工骨としての使用が可能である。滅菌方法としては、従来から行われているオートクレーブを用いた加熱滅菌処理や、エチレンオキサイドガスによる化学的滅菌処理、あるいはガンマ線照射や電子線照射による放射線滅菌処理方法など、いずれの方法によっても滅菌処理が可能である。
【００３７】
以下に実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率は断りのない限り質量基準である。
【実施例】
【００３８】
実施例１
（ストロンチウムを含むアパタイトの合成）
特開２０１４−１８０４９１号公報に記載される方法に従ってストロンチウムを含むアパタイトを合成した。即ち、塩化ストロンチウム六水和物２６７ｇ（１モル）とリン酸水素二アンモニウム１３２ｇ（１モル）からリン酸水素ストロンチウム（α−ＳｒＨＰＯ４）を合成し、これに水酸化ナトリウムを３５ｇ添加して７０℃で３時間加熱撹拌を行うことでストロンチウムアパタイト（Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を合成した。生成したストロンチウムアパタイトは濾過により回収し、蒸留水を用いて充分洗浄を行った後、真空乾燥器内において７０℃で２４時間乾燥を行い、以下の湿式分散処理に使用した。
【００３９】
（ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の湿式分散処理）
上記で得られたストロンチウムアパタイト１０ｇを２００ｍｌのポリプロピレン容器に導入し、分散媒体としてアセトニトリル６０ｇにポリ（Ｄ，Ｌ−）乳酸（Ｄ／Ｌ＝１／１：重量平均分子量１２万）２ｇを溶解して、ポリプロピレン容器に加えた。これに粒径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１００ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行った。その後、濾布を使用して分散物からジルコニアビーズを分離し、分散液を得た。得られた分散液の固形分濃度は１６．７質量％であった。得られた分散液に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液を透明ガラス製容器内に入れて１週間室温で静置しておき、静置後の分散液の様子を目視で観察したところ、沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認され、分散液の分散安定性は良好であることが確認された。また、得られた分散液をイオン交換水で希釈し、顕微鏡観察用のカバーグラス表面に薄くキャストして乾燥を行い、カバーグラス上のアパタイト微粒子を、走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０万倍で観察した拡大画像から、一次粒子同士が重ならずに個別に形状が確認できる粒子６０個について、その大きさ（最長の軸方向の長さ）とその個数の分布を計算したところ、数平均粒子径は５００ｎｍ未満であり、一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上である粗大粒子の全体に対する割合は、個数において１０％未満であった。以下に示す実施例や比較例におけるアパタイト微粒子分散液においても、微粒子の性状は同様であった。
【００４０】
生体吸収性繊維の集合体として医療用グレードのポリ（Ｌ−）乳酸（繰り返し単位中に、Ｄ−乳酸を１モル％以下の量で含有する。）から溶融紡糸した繊維径２０μｍのポリ（Ｌ−）乳酸繊維をスパンレース法により不織布化することで、目付が２６ｇ／ｍ２であるポリ（Ｌ−）乳酸不織布（不織布Ａと略す）と、７０ｇ／ｍ２であるポリ（Ｌ−）乳酸不織布（不織布Ｂと略す）をそれぞれ作製した。不織布Ａは繊維密度が比較的小さくてバルキーで柔らかく、引き裂き強度が比較的弱いシート、不織布Ｂは繊維密度が比較的大きく柔軟で丈夫なシートであった。これらを用いて、次に述べる方法でそれぞれの不織布に対してストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む塗工液の塗工を行った。即ち、上記で得られた、アセトニトリル中にストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を用いて、これに更にアセトニトリルを加え、全体の固形分濃度が１質量％、２．５質量％及び５質量％になるように希釈した３種類の塗工液（ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液）を作製した。各々の塗工液を用いて不織布ＡとＢにそれぞれ塗工した。塗工の方法として、各々の不織布に塗工液を含浸させ、余分な塗工液は濾紙を用いて除き、そのまま大気中に室温で静置することで乾燥を行った。ポリ乳酸繊維からなる不織布Ａ及び不織布Ｂは、アセトニトリル中に長時間浸漬しても溶解、膨潤することはなく、元の形状を維持することを確認した。生体吸収性繊維の集合体に塗工して得られた各々の試料は表１に示すように命名した。
【００４１】
【表１】
2017074193.tif 000002
【００４２】
上記の様にして作製した試料は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察及びエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）観察により解析を行い、繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が形成されていることを確認した。図１は、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を、ポリ（Ｌ−）乳酸不織布に塗工した試料の走査型電子顕微鏡による拡大写真を示し、（ａ）１００倍、（ｂ）３０００倍である。繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が均一に形成されている様子が確認された。図２は、上記のストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布をＳＥＭ／ＥＤＳにより観察して得られた、繊維断面におけるストロンチウムイオンの分布を示す（スケールバー：１０μｍ）。図２中の白〜灰色の部分がストロンチウム元素である。繊維を取り囲む形でストロンチウムイオンが分布しており、繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が均一に形成されている様子が確認された。なお、図１（ａ）及び（ｂ）に示す拡大写真、並びに、図２に示すＳＥＭ／ＥＤＳによる像は、いずれも試料Ａ＿ＳＨ＿５のものである。他の試料についても同様な解析を行い、何れの試料についても繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が均一に形成されている様子が確認された。
【００４３】
蛍光Ｘ線測定装置を用いて、各々の試料について、生体吸収性繊維の集合体に塗工して設けたアパタイトを含有する組成物の層中に含まれるストロンチウムの量（Ｓｒ塗布量）を定量した。結果を表２に示した。用いた塗工液に含まれる固形分濃度の増加に比例して、生体吸収性繊維の集合体に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の量が増大する結果が得られた。
【００４４】
【表２】
2017074193.tif 000003
【００４５】
次に、各々の試料を直径１．４ｍｍの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養用プレート内に静置し、疑似体液としてＨＢＳＳ（−）（ハンクス平衡塩溶液）４ｍｌを加えて３７℃の温度で静置した。最初及び２日ごとにＨＢＳＳ（−）を交換し、交換直前のＨＢＳＳ（−）を３０μｌ採取して蛍光Ｘ線測定用点滴濾紙の中央部に滴下した。液交換は通算５回まで行い、毎回採取した溶液を点滴濾紙に滴下し、蛍光Ｘ線測定装置（ＺＳＸ  ｐｒｉｍｕｓ、リガク社製）を用いて、ＨＢＳＳ（−）中に溶出したストロンチウムイオン濃度を定量した。結果を図３に示した。図３は、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布から溶出するストロンチウムイオン濃度の、ＨＢＳＳ（−）交換毎の測定値を示す。この図より、各々の試料からストロンチウムイオンが５〜８ｐｐｍ前後の濃度で定常的に徐放されていることが分かった。更に、用いた繊維集合体の繊維密度が高い不織布Ｂから放出されるストロンチウムイオン濃度が、不織布Ａを用いた場合より若干高くなることが判明した。一方、塗工に用いた塗工液の固形分濃度に対して、繊維表面に形成されたアパタイトを含有する組成物の層の量は表２に示すように増大したが、図３では、これらから溶出するストロンチウムイオン濃度には大差が認められず、ストロンチウムイオンの放出は繊維集合体の表面積には依存するが、アパタイトを含有する組成物の層の量に対しては大きくは左右されない結果であった。
【００４６】
実施例２
（ストロンチウムを含む炭酸アパタイトの合成）
実施例１と同様にして合成したリン酸水素ストロンチウム（０．５モル）を１０００ｍｌ三角フラスコに導入し、イオン交換水６００ｇを加えて攪拌を行いながら、炭酸ナトリウムを２７ｇ（０．２５モル）添加した。反応系のｐＨは９．５であった。これをホットプレート上で攪拌しながら反応系の温度を８０℃に上昇し、この温度で３時間加熱攪拌を行った。その後室温まで冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。イオン交換水により十分に洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行い白色の粉体を得た。得られた粉体は、Ｘ線回折装置（ミニフレックス、リガク社製）を用いて広角Ｘ線回折により解析を行った結果、高純度で結晶性の良好な炭酸ストロンチウムアパタイトが得られていることが明らかとなった。更に、ＦＴ−ＩＲ測定において１４６０ｃｍ−１、１４０５ｃｍ−１及び８７０ｃｍ−１付近に炭酸アパタイトに含まれる炭酸イオンに特徴的な吸収が確認され、生成物は炭酸ストロンチウムアパタイトであることが分かった。更に、得られた炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率（質量％）について、Ｆｅａｔｈｅｒｓｏｔｏｎｅ等の方法（Ｊ．Ｄ．Ｂ．  Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ，  Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．，  １８，  ６３−６６  （１９８４））に従い、１００１ｃｍ−１付近のリン酸基に基づく吸収ピーク強度に対する１４０５ｃｍ−１の炭酸イオンに基づく吸収ピーク強度の比率から定量を行った結果、炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率として２０．０質量％の値が得られた。
【００４７】
上記で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトを用いて、実施例１と同様にポリ乳酸共重合体を同量使用して湿式分散処理を行うことで、アセトニトリル中に固形分濃度１６．７％で炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を製造した。得られた分散液に含まれる炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液を透明ガラス製容器内に入れて１週間室温で静置しておき、静置後の分散液の様子を目視で観察したが、沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認された。
【００４８】
繊維集合体として実施例１で使用した不織布Ａ及び不織布Ｂを用いて、次に述べる方法でそれぞれの不織布に対して炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む塗工液の塗工を行った。即ち、上記で得られた、アセトニトリル中に炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を用いて、これに更にアセトニトリルを加え、全体の固形分濃度が１質量％、２．５質量％及び５質量％になるように希釈した３種類の塗工液（ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液）を作製した。各々の塗工液を用いて不織布Ａと不織布Ｂそれぞれに、実施例１と同様に塗工した。繊維集合体に塗工して得られた各々の試料は表３に示すように命名した。
【００４９】
【表３】
2017074193.tif 000004
【００５０】
上記の様にして作製した試料は、ＳＥＭ観察及びＥＤＳ観察により解析を行い、繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が均一に形成されていることを確認した。
【００５１】
蛍光Ｘ線測定装置を用いて、各々の試料について、生体吸収性繊維の集合体に塗工して設けたアパタイトを含有する組成物の層中に含まれるストロンチウムの量を定量した。結果を表４に示した。用いた塗工液に含まれる固形分濃度の増加に比例して、繊維集合体に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の量が増大する結果が得られた。
【００５２】
【表４】
2017074193.tif 000005
【００５３】
実施例１と同様にして、各々の試料の２日ごと、通算５回のＨＢＳＳ（−）中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量した。図４は、ストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布から溶出するストロンチウムイオン濃度の、ＨＢＳＳ（−）交換毎の測定値を示す。この図より、各々の試料からストロンチウムイオンが１０ｐｐｍ前後の濃度で定常的に徐放されていることが分かった。更に、用いた生体吸収性繊維の集合体の繊維密度が高い不織布Ｂから放出されるストロンチウムイオン濃度が、不織布Ａを用いた場合より若干高くなることが判明した。一方、塗工に用いた塗工液の固形分濃度に対して、繊維表面に形成されたアパタイトを含有する組成物の層の量は、先の表４に示すように増大したが、図４では、これらから溶出するストロンチウムイオン濃度には大差が認められず、ストロンチウムイオンの放出は生体吸収性繊維の集合体の表面積には依存するが、アパタイトを含有する組成物の層の量に対しては大きくは左右されない結果であった。溶出するストロンチウムイオン濃度は、先の実施例１で用いたストロンチウムアパタイトの場合と比べて、実施例２で用いたストロンチウム炭酸アパタイトの場合には１．６倍程度増加する結果が得られた。
【００５４】
実施例３、４及び比較例１、２
上記の実施例１及び２で作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を、ポリ（Ｌ−）乳酸不織布に塗工した試料を用いて、以下のよう細胞培養評価を行った。実施例３として、実施例１で作製した試料Ａ＿ＳＨ＿２．５及びＢ＿ＳＨ＿１を使用した。実施例４として、実施例２で作製した試料Ａ＿ＳＣ＿２．５及びＢ＿ＳＣ＿１を使用した。細胞培養評価は、各々の条件についてｎ＝２で行った。即ち、２４ウェルの細胞培養容器内に各々１枚ずつ試料をセットし、１５％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、ナカライテスク社製）に抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液１ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞密度は１×１０４個／ｃｍ２で播種し、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記試料表面に播種した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、上記抗生剤を添加した１５質量％ウシ胎児血清含有細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Ｓｉｇｍａ社製）とアスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して細胞培養を継続した。光学顕微鏡を用いて細胞の増殖の様子を観察したところ、細胞播種翌日から試料表面に付着した細胞が観察でき、試料表面で盛んに増殖する様子が観察された。
【００５５】
（比較例１の細胞培養評価）
比較例１として、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子と、有機溶媒に溶解したポリ乳酸共重合体とを含む塗工液を塗工しない不織布Ａを試料としてｎ＝２で使用し、上記と同様の細胞培養評価を実施した。この場合においても、上記の場合と同様に、細胞播種翌日から試料表面に付着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察でき、培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００５６】
（比較例２の細胞培養評価）
比較例２として、以下のようにしてストロンチウムを含まない市販のヒドロキシアパタイトを用いて塗工液を作製し、不織布Ａ及び不織布Ｂに塗工した試料を作製した。即ち、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ−１００、太平化学産業社製）を用いて実施例１と同様にポリ乳酸共重合体を同量使用して湿式分散処理を行うことで、アセトニトリル中に固形分濃度１６．７％でヒドロキシアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を製造した。生体吸収性繊維の集合体として実施例１で使用した不織布Ａ及びＢを用いて、次に述べる方法でそれぞれの不織布に対してヒドロキシアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む塗工液の塗工を行った。即ち、上記で得られた、アセトニトリル中にヒドロキシアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含む分散液を用いて、これに更にアセトニトリルを加え、全体の固形分濃度が１質量％、２．５質量％及び５質量％になるように希釈した３種類塗工液を作製した。各々の塗工液を用いて実施例１と同様に塗工した。生体吸収性繊維の集合体に上記塗工液を塗工して得られた各々の試料を表５に示すように命名した。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
上記の様にして作製した試料について、ＳＥＭ観察及びＥＤＳ観察により解析を行い、繊維表面にアパタイトを含有する組成物の層が均一に形成されていることを確認した。
【００５９】
蛍光Ｘ線測定装置を用いて、各々の試料について、生体吸収性繊維の集合体に塗工して設けたアパタイトを含有する組成物の層中に含まれるカルシウムの量を定量した。結果を表６に示した。用いた塗工液に含まれる固形分濃度の増加に比例して、生体吸収性繊維の集合体に含まれるヒドロキシアパタイト微粒子の量が増大する結果が得られた。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
比較例２として上記で作製した試料Ａ＿Ｈ＿２．５及びＢ＿Ｈ＿１を試料として使用して、上記の実施例３及び４と同様にして細胞培養評価を実施した。この場合においても、上記の実施例３及び４の場合と同様に、細胞播種翌日から各々の試料表面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察でき、培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００６２】
各々の試料において、骨芽細胞前駆体細胞からの分化誘導により骨芽細胞へ分化し、骨形成を行う様子を定量的に評価するために、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。
【００６３】
実施例３、４及び比較例１、２において、培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定を行ったところ、培養日数とともにオステオカルシンの分泌量が増大し、培養日数１５日目において測定された培養液中に分泌されたオステオカルシンの分泌量を定量したところ、図５に示す結果が得られた。図５は実施例３、４及び比較例１、２の細胞培養において、培養開始から１５日目における培地中に分泌されたオステオカルシンの濃度の定量結果を示す。なお、各々の条件でオステオカルシンの測定はｎ＝２で行い、測定値は両者の平均値を以て表した。図５に示す結果より、不織布Ａに比べ繊維密度が大きい不織布Ｂを使用した方が、分泌されるオステオカルシンの濃度が高い傾向が認められ、更に、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子を用いた系においてオステオカルシンの分泌量が高く、特にストロンチウム炭酸アパタイトを用いた系において、最もオステオカルシンの分泌量が高くなる結果が得られた。
【００６４】
実施例５及び比較例３
実施例２で作製したＡ＿ＳＣ＿１の試料と、比較例３としてアパタイト微粒子を塗工しないポリ（Ｌ−）乳酸不織布（不織布Ａ）を用いて以下の試験を行った。ラビットの脛骨にドリルで骨孔を作製し、不織布ＡとＡ＿ＳＣ＿１を充填し、試料不織布周囲の骨形成促進試験を実施した（ｎ＝２）。ポリ（Ｌ−）乳酸不織布を移植した骨孔周囲の脛骨を、移植４週間後にブロック状に摘出し、ＨＥ切片を作製して光学顕微鏡により組織像を観察したところ、Ａ＿ＳＣ＿１の試料を充填した群では新生骨形成が著明に認められたうえに、新生骨組織の多くが直接ポリ（Ｌ−）乳酸不織布の繊維に接して形成されている様子が観察された。図６及び図７に、上記ＨＥ切片の光学顕微鏡による拡大写真を示す（スケールバー：２０μｍ）。図６は、実施例５において、ラビットに対して移植した、ストロンチウム炭酸アパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布繊維（試料Ａ＿ＳＣ＿１）の周囲に形成された新生骨の様子を示す。図中、黒矢印は繊維断面を示し、白矢印は形成された新生骨の外周の位置を示す。一方、図７に示すように、不織布Ａを充填した群では、新生骨形成は認められるものの新生骨組織とポリ（Ｌ−）乳酸不織布の繊維の間に軟部組織が介在している様子が見られた。図７は、比較例３において、アパタイト微粒子を塗工しないポリ（Ｌ−）乳酸不織布をラビットに移植した際に形成される新生骨と不織布繊維が互いに無関係に分布する様子を示す。以上の結果より、ストロンチウム炭酸アパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを塗工したポリ（Ｌ−）乳酸不織布は新生骨形成を促進する傾向が強く、材料表面で新生骨形成が起こっていたことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により与えられるストロンチウムを含むアパタイト微粒子とポリ乳酸共重合体とを含有する組成物を表面に有する生体吸収性繊維の集合体は、繊維状人工骨として利用することが可能である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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