(57)【要約】【課題】試料中に含まれるポリソルベートを定量する，新たな方法を提供すること。【解決手段】溶液中に含まれるポリソルベート類を定量する方法であって，（ａ）ポリソルベート類を含む溶液に，チオシアン酸カリウム及び塩化鉄(III)を含む溶液と，非水系有機溶媒とを加えて振とうするステップと，（ｂ）非水系有機溶媒層と水相とを分離するステップと，そして（ｃ）非水系有機溶媒層を分取し，分取した該非水系有機溶媒層の吸光度を測定するステップとをこの順で含んでなるものである，方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に含まれるポリソルベート類を定量する方法であって，
（ａ）ポリソルベート類を含む溶液に，チオシアン酸カリウム及び塩化鉄(III)を含む溶液と，非水系有機溶媒とを加えて振とうするステップと，
（ｂ）非水系有機溶媒層と水相とを分離するステップと，そして
（ｃ）非水系有機溶媒層を分取し，分取した該非水系有機溶媒層の吸光度を測定するステップと
をこの順で含んでなる，方法。
【請求項２】
該ステップ（ａ）において，ポリソルベート類を含む溶液に，チオシアン酸カリウム及び塩化鉄(III)を含む溶液を加えて振とうした後に，非水系有機溶媒を加えて振とうするものである，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該非水系有機溶媒がジクロロメタンである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該吸光度の測定において測定される波長が，240〜260nmの範囲に含まれるいずれかの波長である，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該吸光度の測定において測定される波長が，470〜530nmの範囲に含まれるいずれかの波長である，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該吸光度の測定において測定される波長が503nmである，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該ポリソルベート類が，ポリソルベート20，ポリソルベート60，ポリソルベート65及びポリソルベート80からなる群から選択されるものである，請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ポリソルベート類を含む試料に塩化鉄(III)を添加して，試料中に含まれるポリソルベート類と塩化鉄(III)の錯体を生成させ，生成した錯体の吸光度を測定することにより，簡便にポリソルベート類を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリソルベート類は，ソルビトールと脂肪酸をアルカリ触媒下で加熱反応させることによって生成するソルビタン脂肪酸エステル（アシルソルビタン）に，エチレンオキシドを縮合反応させることによって得られるソルビタン脂肪酸エステルのポリオキシエチレンエーテルである。1分子のソルビタン脂肪酸エステルに縮合して付加するエチレンオキシドは，約20分子である。ポリソルベート類には，ポリソルベート20，ポリソルベート60，ポリソルベート65，ポリソルベート80等のトゥイーン系界面活性剤が含まれる。
【０００３】
ポリソルベート類は，食品添加剤として，例えば，乳化，分散化，可溶化剤として広く使用されている。この他，ポリソルベート類は，エリスロポエチン，成長ホルモン，インスリン等の生理活性蛋白質を有効成分として含有する薬剤において，これら蛋白質の容器への吸着防止剤としても使用されている。蛋白質製剤は，プラスチック又はガラス製の容器中に封入された水性液剤として供給されるものが多い。このような水性液剤においては，水性液剤中の蛋白質の一部が容器の表面に吸着するおそれがある。蛋白質製剤に含まれる蛋白質が容器に吸着すると，患者へ投与したときに体内に注入される蛋白質の量が，吸着した量だけ減少することとなる。従って，蛋白質製剤において，蛋白質の容器への吸着を防止することは極めて重要である。製剤中の吸着防止剤の量が過少であると，蛋白質の容器への吸着を十分に防止できないこととなるが，一方で，製剤中の吸着防止剤の量が過大であると，蛋白質の高次構造が損なわれるおそれがある。従って，製剤中に含まれる吸着防止剤の量を正確に定量することが重要となる。吸着防止剤としてポリソルベート類を使用した場合にあっては，製剤中に含まれるポリソルベート類の量を正確に定量することが重要となる。
【０００４】
ポリソルベート類の定量法は種々開発されている。例えば，ポリソルベート類をチオシアン酸コバルト−アンモニウムと結合させて錯体を生じさせ，吸光度測定によりその錯体の量を測定することによって，ポリソルベート類を定量する方法がある（非特許文献１）。また，蛋白質製剤に含まれるポリソルベート類を定量する方法として，試料中に含まれる蛋白質を予め水系有機溶媒を添加して沈殿させて除去し，次いで，ポリソルベート類をチオシアン酸コバルト−アンモニウムと結合させて錯体を生じさせ，吸光度測定によりその錯体の量を測定することによって，ポリソルベート類を定量する方法がある（特許文献１）。
【０００５】
上記の手法は，ポリソルベート類の定量法として有効なものではあるが，レアメタルであるコバルトを必要とする。レアメタルは，電子材料，磁性材料等の多様な用途に使用されている一方，産出地が偏在しており，産出地の産業政策，政情によって常に安定供給に不安がある金属である。
【０００６】
レアメタルを使用しないポリソルベート類の定量法として，試料を高速液体クロマトグラフィーにより分離し，次いで蒸発光散乱検出器によりポリソルベート類を検出する方法が知られている（特許文献２）。この方法は，レアメタルを必要としない利点があるが，蒸発光散乱検出器等の特殊な装置を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８６４９２
【特許文献２】特開平９−３２９５９１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Greff RA. J Am Oil Chem. 42: 180-5 (1965)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記背景の下で，本発明の目的は，レアメタルを必要とせず，且つ蒸発光散乱検出器等の特殊な装置を必要としない，簡便なポリソルベート類の定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，試料に塩化鉄(III)を添加して，試料中に含まれるポリソルベート類と塩化鉄(III)の錯体を生成させ，生成した錯体の吸光度を測定することにより，簡便にポリソルベート類を定量できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
１．溶液中に含まれるポリソルベート類を定量する方法であって，
（ａ）ポリソルベート類を含む溶液に，チオシアン酸カリウム及び塩化鉄(III)を含む溶液と，非水系有機溶媒とを加えて振とうするステップと，
（ｂ）非水系有機溶媒層と水相とを分離するステップと，そして
（ｃ）非水系有機溶媒層を分取し，分取した該非水系有機溶媒層の吸光度を測定するステップと
をこの順で含んでなる，方法。
２．該ステップ（ａ）において，ポリソルベート類を含む溶液に，チオシアン酸カリウム及び塩化鉄(III)を含む溶液を加えて振とうした後に，非水系有機溶媒を加えて振とうするものである，上記１に記載の方法。
３．該非水系有機溶媒がジクロロメタンである上記１又は２に記載の方法。
４．該吸光度の測定において測定される波長が，240〜260nmの範囲に含まれるいずれかの波長である，上記１乃至３のいずれかに記載の方法。
５．該吸光度の測定において測定される波長が，470〜530nmの範囲に含まれるいずれかの波長である，上記１乃至３のいずれかに記載の方法。
６．該吸光度の測定において測定される波長が503nmである，上記１乃至３のいずれかに記載の方法。
７．該ポリソルベート類が，ポリソルベート20，ポリソルベート60，ポリソルベート65及びポリソルベート80からなる群から選択されるものである，上記１乃至６のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば，レアメタルを使用せず，且つ蒸発光散乱検出器等の特殊な装置を必要とすることなく，試料中に含まれるポリソルベート類を簡便に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ポリソルベート80と塩化鉄(III)との錯体を含む溶液の200〜800nmの範囲における吸光度を示す図。縦軸は吸光度，横軸は波長（nm）を示す。矢印は吸光度のピークを示す。
【図２】ポリソルベート80の検量線を示す図。縦軸は吸光度（503nm），横軸はポリソルベート80の濃度%（w/v）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において，「ポリソルベート類」というときは，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと同義であり，ソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドが縮合したものをいう。ポリソルベート類において，1分子のソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドに縮合して付加しているエチレンオキシドは，好ましくは18〜22分子であり，より好ましくは約20分子である。ポリソルベート20，ポリソルベート60，ポリソルベート65及びポリソルベート80等のトゥイーン系界面活性剤は，ポリソルベート類の一種である。本発明により定量されるポリソルベート類は，好ましくは，ポリソルベート20，ポリソルベート60，ポリソルベート65又はポリソルベート80等のトゥイーン系界面活性剤であり，より好ましくはポリソルベート80である。
【００１４】
本発明において用いることのできる非水系有機溶媒は，ポリソルベート類と塩化鉄(III)の錯体を含む水溶液に添加したときに，該錯体のほとんどを有機溶媒層に移動させることができるものである限り，特に限定はないが，好ましくはジクロロメタン，クロロホルム，1,2-ジクロロエタン，トルエン若しくはベンゼン，又はこれらの2種以上の混合物であり，特に好ましくはジクロロメタンである。
【００１５】
本発明における吸光度の測定において測定される波長は，好ましくは，240〜260nmの範囲に含まれるいずれかの波長，又は470〜530nmの範囲に含まれるいずれかの波長であり，より好ましくは，245〜255nmの範囲に含まれるいずれかの波長，又は480〜520nmの範囲に含まれるいずれかの波長であり，例えば250nm，503nm等である。
【実施例】
【００１６】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００１７】
〔溶液中に含まれるポリソルベート80の定量〕
ポリソルベート80（日油社）を純水で希釈し，0.05〜0.25％(w/v)の濃度のポリソルベート80溶液を調製した。0.78gのチオシアン酸カリウムを1mLの純水に溶解し，チオシアン酸カリウム溶液を調製した。40mgの塩化鉄III・六水和物を1mLの純水に溶解し，塩化鉄III溶液を調製した。150μLのチオシアン酸カリウム溶液，20μLの塩化鉄III溶液及び30μLの純水を混和し，チオシアン酸カリウム−塩化鉄III溶液を調製した。
【００１８】
150μLの0.1％(w/v) ポリソルベート80溶液を1.5mL遠心チューブに分取し，これに60μLのチオシアン酸アンモニウム−塩化鉄III溶液を添加して，十分に撹拌した。次いで，100μLのジクロロメタンを添加して，十分に撹拌した。撹拌後，遠心（6000rpm，約10秒）して，水相（上層）と有機溶媒相（下層）を分離させ，有機溶媒相を採取した。採取した有機溶媒相の吸光度を波長200nm〜800nmの範囲で分光光度計（ベックマン・コールター社）を用いて測定した。その結果，250nm及び503nm付近に吸光度のピークがあることが分かった（図１）。
【００１９】
次いで，0.05〜0.25％(w/v)の濃度のポリソルベート80溶液を，それぞれ150μLずつ分取し，これに60μLのチオシアン酸カリウム−塩化鉄III溶液を添加して，十分に撹拌した。次いで，210μLのジクロロメタンを添加して，十分に撹拌した。撹拌後，遠心（6000rpm，約10秒）して，水相（上層）と有機溶媒相（下層）を分離させ，有機溶媒相を採取した。採取した有機溶媒相の波長503nmにおける吸光度を，分光光度計を用いて測定した。その結果，0.05〜0.25％(w/v)の範囲で，ポリソルベート80の濃度と，波長503nmにおける吸光度に相関が認められた（図２）。これらの結果は，上記の方法により，試料中に含まれるポリソルベート80が簡便且つ正確に定量できることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明によれば，乳化，分散化，可溶化剤，又は吸着防止剤として食品，医薬品等に添加されたポリソルベート類を簡便且つ正確に定量することができる。
【図１】
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【図２】
2017062234.tif 000004