(57)【要約】【課題】  ＨＰＡＨを用いてヒドロキシスチルベンを製造する効率的な方法を提供すること。【解決手段】  一般式（Ｉ）で示される化合物に、シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる。2017074019.tif 000039（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で示される化合物に４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物を製造する反応に添加するための添加剤であって、シクロデキストリンを有効成分として含有する添加剤。
2017074019.tif 000025
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000026
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項２】
一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させて、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を製造する反応における添加剤であって、シクロデキストリンを有効成分として含有する添加剤。
2017074019.tif 000027
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000028
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2017074019.tif 000029
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【請求項３】
Ｒ３は、−Ｈである、請求項１または２に記載の添加剤。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールである、請求項３に記載の添加剤。
【請求項５】
前記ＨＰＡＨが、組換えタンパク質または天然タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項６】
さらに界面活性剤を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項７】
前記シクロデキストリンが、α−、β−、γ−シクロデキストリンのいずれかである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項８】
一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる製造方法。
2017074019.tif 000030
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000031
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項９】
一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、製造方法。
2017074019.tif 000032
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000033
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2017074019.tif 000034
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で示される化合物に、精製ＨＰＡＨ組換えタンパク質、精製ＨＰＡＨ天然タンパク質、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌の抽出物、または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物の抽出物を作用させる、請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）で示される化合物に、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物を作用させる、請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記内在性ＨＰＡＨを発現する細菌がPseudomonas aeruginosaである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、１０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度のβ-およびγ-シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記シクロデキストリンが、α−、β−、γ−シクロデキストリンのいずれかである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物にシクロデキストリン存在下で作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含み、
前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢおよびＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質を有する、測定方法。
2017074019.tif 000035
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000036
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項１６】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素のスクリーニング方法であって、
複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物にシクロデキストリン存在下で作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、
一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出されたＨＰＡＨ類似体を選択する工程を含み、
前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢおよびＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質である、スクリーニング方法。
2017074019.tif 000037
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000038
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシスチルベン製造方法及びそれに用いる添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レスベラトロールの３’位が水酸化された構造を有するピセアタンノール（3',4',3,5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベンまたは3,3',4',5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベン）は、抗酸化活性や抗癌活性等の多様な生理活性を示すことが明らかにされつつある注目すべき化合物である（非特許文献１参照）。このようなピセアタンノールの多様な生理活性に着目し、本化合物を含有するパッションフルーツ種子からの抽出物について、健康、医療への応用を目的として種々の研究開発が進められている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
しかし、ピセアタンノールはパッションフルーツやブドウ等の植物に含まれているものの、含量が少ないために、植物からの抽出は効率的な製造法とは言い難い（特許文献４参照）。また、有機合成法によっても得られるが多数の複雑な反応ステップを要する。
【０００４】
最近、Pseudomonas属細菌および大腸菌由来の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ；ＥＣ  １．１４．１３．３）（別名：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−モノオキシゲナーゼ、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ、４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼ）がレスベラトロールからピセアタンノールへ変換できることが開示された（非特許文献２、非特許文献３、特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０３０９１１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１５１４５７号公報
【特許文献３】特開２０１３−１５１４５８号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０−１１３３１５国際公開公報
【特許文献５】ＷＯ２０１５−１０５１０５国際公開公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mutat Res-Fund Mol M vol.750, p.60-82 (2012).
【非特許文献２】Curr Opin Biotech vol.26 p.71-78 (2014).
【非特許文献３】Tetrahedron Lett vol. 55 p. 2853-2855 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＨＰＡＨを用いてヒドロキシスチルベンを製造する効率的な方法及びそれに用いる添加剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＨＰＡＨが効率よくレスベラトロールをピセアタンノールに変換する系を開発したが、その反応系におけるピセアタンノールの濃度は２５ｍＭ以上増加しなかった。そして、鋭意検討の結果、シクロデキストリンを反応系に添加すると、ピセアタンノールの収量は大幅に増加して２５ｍＭ以上のピセアタンノールを生成することを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明の一実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物に４−ヒドロキシフェニル酢酸３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物を製造する反応に添加するための添加剤であって、シクロデキストリンを有効成分として含有する添加剤である。
2017074019.tif 000002
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000003
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【００１０】
本発明の他の実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させて、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を製造する反応における添加剤であって、シクロデキストリンを有効成分として含有する添加剤である。
2017074019.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000005
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2017074019.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【００１１】
上記いずれの添加剤においても、Ｒ３は、−Ｈであってもよい。また、一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールであってもよい。前記ＨＰＡＨが、組換えタンパク質または天然タンパク質であってよい。さらに界面活性剤を含有してもよい。また、前記シクロデキストリンが、α−、β−、γ−シクロデキストリンのいずれかであってもよい。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる製造方法である。
2017074019.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000008
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、製造方法である。
2017074019.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000010
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2017074019.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【００１４】
上記いずれの製造方法においても、一般式（Ｉ）で示される化合物に、精製ＨＰＡＨ組換えタンパク質、精製ＨＰＡＨ天然タンパク質、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌の抽出物、または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物の抽出物を作用させてもよい。また、一般式（Ｉ）で示される化合物に、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物を作用させてもよい。ここで、前記内在性ＨＰＡＨを発現する細菌がPseudomonas aeruginosaであってもよい。
【００１５】
また、上記いずれの製造方法においても、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、１０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度のβ-およびγ-シクロデキストリン存在下で４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させてもよい。また、前記シクロデキストリンが、α−、β−、γ−シクロデキストリンのいずれかであってもよい。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物にシクロデキストリン存在下で作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含み、前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢおよびＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質を有する、測定方法である。
2017074019.tif 000012
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000013
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素のスクリーニング方法であって、複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物にシクロデキストリン存在下で作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出されたＨＰＡＨ類似体を選択する工程を含み、前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢおよびＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質である、スクリーニング方法である。
2017074019.tif 000014
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000015
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【発明の効果】
【００１８】
本発明によって、ＨＰＡＨを用いてヒドロキシスチルベンを製造する効率的な方法及びそれに用いる添加剤を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例における、HpaBC発現大腸菌によるレスベラトロールを基質にしたピセアタンノールの生産を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例における、HpaBC発現大腸菌によるレスベラトロールを基質にしたピセアタンノール生産に対するピセアタンノール濃度の影響を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例における、HpaBC発現大腸菌によるレスベラトロールを基質にしたピセアタンノール生産に対するシクロデキストリン添加の効果を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例における、HpaBC発現大腸菌によるレスベラトロールを基質にしたピセアタンノール生産に対するシクロデキストリン濃度の影響を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例における、HpaBC発現大腸菌によるレスベラトロールを基質にしたピセアタンノール生産の時間経過による基質及び生産物の濃度変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
＝＝添加剤＝＝
本発明の一実施態様である添加剤は、一般式（Ｉ）で示される化合物に４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物を製造する反応に添加するための添加剤であって、シクロデキストリンを有効成分として含有する添加剤である。
2017074019.tif 000016
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000017
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
さらに、長時間作用させることによって、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）から、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記す）を合成することができる。
2017074019.tif 000018
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
添加剤の剤型は特に限定されず、液状でも固体状で粉体状でもかまわない。添加剤には、界面活性剤やバッファー成分など、シクロデキストリン以外のものを含有してもかまわない。
【００２３】
なお、本明細書で、シクロデキストリンとは、６個、７個または８個のグルコースが環状に結合した環状オリゴ糖のことであり、それぞれα−、β−またはγ−シクロデキストリンと称する。例えば、シクロデキストリンは、以下の構造を有する。
2017074019.tif 000019
（式中、Ｒは独立に、Ｈ，Ｃ１〜６であるアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アセチル基から選択される置換基である。）
【００２４】
＝＝化合物の変換方法＝＝
本発明の一実施態様によると、一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記す）に、シクロデキストリン存在下で酵素ＨＰＡＨを作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と記す）を合成することができる。また、この反応により、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換するＨＰＡＨ酵素活性を測定することができる。
2017074019.tif 000020
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2017074019.tif 000021
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【００２５】
なお、Ｒ3が−Ｈであることが好ましい。さらに、Ｒ1とＲ2が両方とも−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であることが好ましい。なお、Ｒ1とＲ2が両方とも−ＯＨであることが最も好ましく、この場合、化合物（Ｉ）がレスベラトロールであって、化合物（ＩＩ）がピセアンタノールとなる。
2017074019.tif 000022
2017074019.tif 000023
（式中、Ｒ4とＲ5のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【００２６】
さらに、長時間作用させることによって、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）から、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記す）を合成することができる。
2017074019.tif 000024
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【００２７】
シクロデキストリンは、化合物（Ｉ）及び／または（ＩＩ）に、酵素ＨＰＡＨを作用させる反応系に添加する。シクロデキストリンの種類は特に限定されないが、α-シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンであることが好ましく、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンであることがより好ましい。その濃度は特に限定されないが、５ｍＭ以上であることが好ましく、１０ｍＭ以上であることがより好ましく、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭまたは５００ｍＭ以上であることが好ましく、５００ｍＭ以下であってもよく、２００ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭまたは１０ｍＭ以下であってもかまわない。
【００２８】
ここで作用させる二成分型フラビン依存性酸化酵素ＨＰＡＨは、モノキシゲナーゼのサブユニットであるＨｐａＢと、オキシドリダクターゼのサブユニットであるＨｐａＣとから成る。ＨｐａＢ及びＨｐａＣの由来は特に限定されず、Pseudomonas、Escherichia、Enterobacter、Krebsiella、Salmonella、Serratia、Shigella、Yersinia、Rhizobium、Bradyrhizobium、Mesorhizobium、Sinorhizobium、Bacillus、Geobacillus、Saccharothrix、Streptomyces、Rhodococcus、Gordonia、Mycobacterium、Thermus、Acinetbacter、Halomonas、Micrococcusなどの属に分類される細菌が例示できるが、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas ovalisなどのPseudomonas属とEscherichia属に属する細菌が好ましく、特にPseudomonas aeruginosaまたはEscherichia coliが好ましい。Pseudomonas aeruginosaの場合、PAO1株であることがより好ましく、Escherichia coliの場合、Ｗ株およびＢ株系列であることが好ましい。本明細書では、酵素を生物種で特定しない限り、ＨｐａＢ及びＨｐａＣは、相互作用して二成分型フラビン依存性酸化酵素として機能することができる全てのホモログまたは変異体を含むものとし、そのホモログまたは変異体は、天然の配列を有していても人工の配列を有していてもかまわない。また、ＨｐａＢ及びＨｐａＣは、同じ生物種由来であっても、異なる生物種由来であってもかまわないし、少なくとも一方が、人工の配列を有していてもかまわない。ここで、ホモログまたは変異体は、Pseudomonas aeruginosaのＨｐａＢまたはＨｐａＣに対し、７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、８０％以上の相同性を有するものが好ましく、９０％以上の相同性を有するものがより好ましく、９５％以上の相同性を有するものがさらに好ましい。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【００２９】
ＨｐａＢ及びＨｐａＣの形態は、特に限定されず、それぞれ独立に、組換えタンパク質であっても天然タンパク質であってもよい。
【００３０】
ＨＰＡＨが組換えタンパク質の場合、一例として、ＨＰＡＨを構成するＨｐａＢをコードするｈｐａＢ遺伝子とＨｐａＣをコードするｈｐａＣ遺伝子の両方を同じ宿主微生物内に導入して発現させると、組換え微生物内でＨＰＡＨが再構成される。化合物（Ｉ）は細胞膜を透過するので、組換え微生物を培養した培地に化合物（Ｉ）を添加すると、細胞内で化合物（ＩＩ）及び／又は化合物（ＩＩＩ）が合成される。従って、化合物の変換に組換え微生物をそのまま用いてもよい。ここで、宿主微生物は、細菌、酵母などが例示され、特に限定されないが、大腸菌であることが好ましい。酵素が天然タンパク質の場合、上述したような組換え微生物を用いる代わりに、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌を用いればよい。
【００３１】
化合物の変換に微生物を用いる場合、培地にβ-および／またはγ-シクロデキストリンを添加すればよい。また、培地に界面活性剤を添加することで、化合物の変換効率が上昇する。用いる界面活性剤の種類は特に限定されず、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０などを例示できる。界面活性剤の濃度も特に限定されず、当業者が適切な濃度を容易に選択できるが、約０．１％（ｖ／ｖ）以上約１０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、約０．５％（ｖ／ｖ）以上約２％（ｖ／ｖ）以下がより好ましく、約１％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００３２】
また、化合物の変換に、微生物を用いる代わりに、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌や組換え微生物の抽出物、あるいは内在性ＨＰＡＨを発現する細菌や組換え微生物から精製したＨＰＡＨを用いてもよい。精製工程は特に限定されず、粗精製でも高純度精製でもかまわない。抽出物や精製ＨＰＡＨを用いた場合、ＦＡＤ、ＮＡＤなどを添加した再構成系（Biochemistry vol.49, p.372-385 (2010)など）を作ることによって、in vitroでも化合物を変換することができる。
【００３３】
＝＝化合物変換活性の測定方法＝＝
本発明の一実施形態において、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する酵素活性は、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を化合物（Ｉ）にシクロデキストリンの存在下で作用させ、化合物（ＩＩ）を検出することによって、測定できる。ここで、ＨＰＡＨ類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢ（配列番号１）および／またはＨｐａＣ（配列番号２）のホモログであって、アミノ酸レベルで５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上の相同性を有するタンパク質を有する。これによって、ＨＰＡＨ類似体が、化合物変換活性を有するかどうか、判別できる。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【００３４】
＝＝化合物変換活性を有する酵素のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施形態において、複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を化合物（Ｉ）にシクロデキストリンの存在下で作用させて化合物（ＩＩ）を検出し、検出可能であったＨＰＡＨ類似体を選択することによって、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する酵素のスクリーニングを行うことができる。ここで、ＨＰＡＨ類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢおよび／またはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上の相同性を有するタンパク質を有する。これによって、ＨＰＡＨ類似体が、化合物変換活性を有するかどうか、判別できる。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【実施例】
【００３５】
（１）二成分型フラビン依存性酸化酵素HpaBCを発現する組換え大腸菌の作製
まず、Pseudomonas aeruginosa由来の二成分型フラビン依存性酸化酵素HpaBCをコードする遺伝子をpETDuet-1ベクター（Novagen社製）に挿入して、Escherichia coli BL21 Star (DE3)株（Invitrogen社製）に導入した。
【００３６】
具体的には、モノオキシゲナーゼコンポーネントをコードするhpaB遺伝子（ORF no. PA4091）とオキシドレダクターゼコンポーネントをコードするhpaC遺伝子（ORF no. PA4092）を、Pseudomonas aeruginosa PAO1株のゲノム（ATCC 47085D-5、GenBank Accession no. NC#002516）を鋳型としてPCRにより増幅した。hpaB遺伝子の増幅に使用したセンスプライマー（hpaB-s）およびアンチセンスプライマー（hpaB-as）、hpaC遺伝子の増幅に使用したセンスプライマー（hpaC-s）およびアンチセンスプライマー（hpaC-as）を以下に示す。
【００３７】
hpaB-s: TTCTCATGAAACCCGAAGATTTCCGTGCCT  （配列番号３）
hpaB-as: CGCGGATCCTCATTGGCGGATGCGATCGAG  （配列番号４）
hpaC-s: TTCCATATGTCCCAGCTCGAACCCAGGCAG  （配列番号５）
hpaC-as: TTCGGTACCTCAGGCCGCCCGCCGGGGGCA  （配列番号６）
PCRにより増幅後、hpaB遺伝子に関しては両端を制限酵素BspHIおよびBamHIで、hpaC遺伝子に関してはNdeIおよびKpnIで消化し、pETDuet-1のマルチクローニングサイト1、2にそれぞれ挿入した。そして、構築したプラスミド（pETDhpaBC）をエレクトロポレーション法によりE. coli BL21 Star (DE3)株に導入した。
【００３８】
（２）HpaBC発現組換え大腸菌によるレスベラトロール変換産物量の測定
作製した組換え大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、イーストエクストラクト０．５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に植菌し、２５℃で培養した。１２時間後にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド１ｍＭを添加して、さらに１２時間培養し、hpaBC遺伝子の発現を誘導した。集菌後、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）含有リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）で洗菌し、同緩衝液に懸濁してレスベラトロールとの反応に用いた。具体的には、HpaBC発現組換え大腸菌の菌体３２ｇ／ｌ（乾燥重量換算）、レスベラトロール３０ｍＭ、ジメチルスルホキシド４％（ｖ／ｖ）、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ８０  １％（ｖ／ｖ）、リン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液１００μｌを調製後、３０℃で１、２、４、８、１２時間振とうした。反応後、５Ｎ  ＨＣｌ１０μｌ、Ｈ2Ｏ４００μｌ、メタノール５００μｌを添加し、適宜希釈後、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析はアジレント社製の装置（１１００シリーズ）とウォーターズ社製のカラム（ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８  ＩＳ、カラム長４．６×２０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を用いて行なった。展開溶媒はアセトニトリル／メタノール／リン酸カリウム緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ２．７）＝２．５／２．５／９５（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで０分から３分までＢ液０％で流した後、３分から１２分にかけてＢ液を直線勾配により７０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。ピセアタンノール量は標品（東京化成より購入）を用いて作成した検量線から計算した。
【００３９】
図１に示すように、４時間でほぼピーク値の２０ｍＭに達し、それ以上著しく増加することはなかった。レスベラトロールを増量しても、これまで得られた最大量は、２５ｍＭである。このように、本法で得られるピセアタンノールの最終濃度には限界がある。
【００４０】
（３）ピセアタンノールによるレスベラトロール変換反応阻害
（２）と同様の反応系において、レスベラトロールの濃度が１０ｍＭであり、１０、２０、３０ｍＭのピセアタンノールを含有すること以外は同じ初期条件として、６時間振とうした。反応後、各サンプルにおいて、（２）と同様にしてレスベラトロールが変換して生成したピセアタンノール量を測定し、その割合を算出した。
【００４１】
図２に示すように、反応系にピセアタンノールを添加すると、ピセアタンノールの濃度が３０ｍＭで、レスベラトロール変換反応が起こらなくなる。
【００４２】
（４）シクロデキストリンによる、ピセアタンノールによる反応阻害の回復
（２）と同様の反応系において、レスベラトロールの濃度が１０ｍＭであり、３０ｍＭのピセアタンノール、及び１０ｍＭのβ−、またはγ−シクロデキストリンを含有すること以外は同じ初期条件として、６時間振とうした。反応後、各サンプルにおいて、レスベラトロールが変換して生成したピセアタンノール量を測定し、変換した割合を算出した。
【００４３】
図３に示すように、最初から３０ｍＭのピセアタンノールが存在しても、いずれのシクロデキストリンの存在下でも、レスベラトロール変換反応が生じ、β−シクロデキストリンでは約３０％のレスベラトロールが、γ-シクロデキストリンでは約５０％のレスベラトロールがピセアタンノールに変換された。
【００４４】
（５）シクロデキストリンの濃度によるレスベラトロール変換反応の変化
（２）と同様の反応系において、レスベラトロールの濃度が５０ｍＭであり、各濃度のβ−、またはγ−シクロデキストリンを含有すること以外は同じ初期条件として、４８時間振とうし、反応後、（２）と同様にして各サンプルにおいて生成したピセアタンノール量を測定した。
【００４５】
図４に示すように、β−、またはγ−シクロデキストリンの濃度が増加するにつれ、得られたピセアタンノールの最終濃度も増加した。特に、β−シクロデキストリンの場合、濃度が増加するにつれ、顕著に収量も増加した。
【００４６】
（６）最適条件におけるレスベラトロール変換反応
（２）と同様の反応系において、レスベラトロールの濃度が５０ｍＭであり、５０ｍＭのβ−シクロデキストリンを含有すること以外は同じ初期条件として、１、２、４、８、１２、２４時間振とうした。反応後、各サンプルにおいて生成したピセアタンノール量を測定した。
【００４７】
図５に示すように、１２時間でほぼ９５％のレスベラトロールが変換するが、２４時間後にはほぼ１００％変換し、４９ｍＭのピセアタンノールが得られた。
【図１】
2017074019.tif 000040
【図５】
2017074019.tif 000041
【図２】
2017074019.tif 000042
【図３】
2017074019.tif 000043
【図４】
2017074019.tif 000044
【配列表】
2017074019000001.app