(57)【要約】【課題】生体機能性成分を特定し、利用可能にする。非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物の新たな用途を提供する。【解決手段】非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物を含む、メタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物を含む、メタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物。
【請求項２】
一日当たりの摂取量中、10μg〜5,000μgのGluOCを含有する、請求項１に記載の食用組成物。
【請求項３】
GluOC含有骨抽出物が、アミノ酸組成において、グリシン１質量部に対して０．１〜１質量部のグルタミン酸を含む、請求項１または２に記載の食用組成物。
【請求項４】
GluOC含有骨抽出物が、γ−カルボキシル化オステオカルシン（GlaOC）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食用組成物。
【請求項５】
サプリメント、ドリンク食用組成物、または飲料の形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GluOCおよび／または豚骨抽出物を有効成分とするメタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物に関する。本発明は、メタボリックシンドロームに関する医療、保健、健康増進、食品、機能性食品等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨はホルモンを分泌する能動的な内分泌器官であることが明らかになり、注目を集めている。中でもオステオカルシン（OC）は、糖・エネルギー代謝活性化作用をもつことが知られている。OCは骨中に豊富に存在する非コラーゲン性タンパク質の一つであり、ヒトでは49アミノ酸からなる分子量約5,500のタンパク質である。骨形成細胞である骨芽細胞で合成され、ビタミンK-依存性の翻訳後修飾を受けて、分子中に含まれる3つのグルタミン酸残基（17、21、24位）がγ−カルボキシル化される。その後に開口分泌によって細胞外に放出される。この修飾によってCa2+に対する強い親和性を獲得してヒドロキシアパタイトと強固に結合し、大部分は骨マトリックス中に堆積しているが、わずかな部分が、骨のリモデリングにより骨吸収窩から放出されたものも一緒になって血中を循環している。血中OCは、低（非）カルボキシル化状態のもの（GluOC、約5％）と3つのグルタミン酸残基すべてがカルボキシル化されたGlaOC（約95％）の2つの形態で存在しているが、ホルモンとしての活性を持つのはGluOCのみである。
【０００３】
非カルボキシル化OCは、受容体として機能する分子の一つとして同定されたGRPC6Aを介して膵臓β細胞、脂肪細胞、骨格筋、および腸内分泌細胞に直接作用し、グルコースおよびエネルギーの代謝を活性化することが報告されている。非カルボキシル化OCを、野生型および食餌誘導性肥満のマウスに対して浸透圧ポンプを用いて持続的に4週間に渡って投与すると、インスリンの発現・分泌上昇、膵臓b細胞の増殖、耐糖能およびインスリン抵抗性の改善が見られた（非特許文献1）。また、食餌性肥満マウスに非カルボキシル化OCを毎日腹腔内注射すると、4週間で肥満および各種糖代謝指標の改善が見られ、14週間で高脂肪食による脂肪肝が劇的に改善された（非特許文献2）。
【０００４】
一方、活性型オステオカルシンといわれる、3つのグルタミン酸残基がすべてカルボキシル化された、カルボキシル化OCに関しては、豚骨からのオステオカルシンの抽出方法が知られている（特許文献1、2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許5421109号公報
【特許文献２】特開2009-159942号公報
【特許文献３】国際公開WO2008/108395
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ferron, M., Hinoi, E., Karsenty, G., Ducy, P., Osteocalcin differentially regulates β cell and adipocyte gene expression and affects the development of metabolic diseases in wild-type mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105, 5266-5270
【非特許文献２】Ferron, M., McKee, M.D., Levine, R.L., Ducy, P. et al., Intermittent injections of osteocalcin improve glucose metabolism and prevent type 2 diabetes in mice. Bone. 2012, 50, 568-575
【非特許文献３】Mizokami, A., Yasutake, Y., Gao, J., Matsuda M. et al., Osteocalcin Induces Release of Glucagon-Like Peptide-1 and Thereby Stimulates Insulin Secretion in Mice. PLoS ONE. 2013, 8, e57375
【非特許文献４】Mizokami, A., Yasutake, Y., Higashi, S., Kawakubo-Yasukochi, T. et al., Oral administration of osteocalcin improves glucose utilization by stimulating glucagon-like peptide-1 secretion. Bone 2014, 69, 68-79.
【非特許文献５】Engelke, J.A., Hale, J.E., Suttie, J.W., Price, P.A. Vitamin K-dependent carboxylase: utilization of decarboxylated bone Gla protein and matrix Gla protein as substrates. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1991,1078,31-34.
【非特許文献６】Ferron, M., Wei, J., Yoshizawa, T., Fattore, A.D. et al., Insulin signaling in osteoblasts integrates bone remodeling and energy metabolism. Cell. 2010, 142, 296-308
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
経口投与は受け手にとってストレスが少なく、簡便かつ安全な薬物投与方法であるが、消化管における分解を受けるために十分な血中濃度が得にくいという欠点がある。しかし、本発明者らは、経口投与した非カルボキシル化OCの一部が有効な形で小腸へと到達し、腸内分泌細胞からのグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）の分泌を促進することを示した（非特許文献3）。消化管ホルモンであるGLP-1は強力にインスリン分泌を促すホルモンとして知られているが、その作用は血糖値依存的であるため、低血糖発作をおこしにくく糖尿病治療薬のターゲットとなっている。
【０００８】
普通食で飼育したマウスに非カルボキシル化OCを長期間にわたって経口投与すると、空腹時血糖の低下、耐糖能の改善、β細胞の増殖とそれに伴うインスリン分泌の増加、性腺周囲脂肪の減少、脂肪細胞の小型化が認められた。高脂肪高ショ糖食で飼育した肥満モデルマウスでも同様の改善効果が得られた（非特許文献4）。
【０００９】
骨に存在するOCのほぼ全てはGlaOCであるが、GlaOCの一部は酸性pHによって脱カルボキシル化され、GluOCとなることが報告されている（非特許文献5）。つまり、胃内の酸性環境によって脱カルボキシル化されGluOCとなる可能性が高い。実際、GlaOCを経口投与するとGLP-1およびインスリン分泌促進効果が見られたが、腹腔内注射では無効であった（非特許文献3）。
【００１０】
非カルボキシル化OCは経口投与でも糖代謝改善効果を発揮するため、肥満・メタボリックシンドローム予防への応用が期待されるが、49アミノ酸（マウスに関しては46）のペプチドの化学合成による大規模な商業的生産は困難であり高価である。また、それに代わる非カルボキシル化OCの実用的な製造方法は知られていない。
【００１１】
OCは骨中の非コラーゲン性タンパク質の約20％を占めるといわれており、相当な量のOCが畜産動物の骨から得ることができる。日本にはスープをはじめとする豚骨の食文化が根付いており、大量（1日15トン〜）の豚骨が廃棄物として排出される。抽出後の骨の残渣の一部は肥料として使用されるが、それらのほとんどは有効な用途がなく、廃棄物として投棄される。即ち、これらの残渣の有効利用が長い間望まれてきた。また、食品は、第一次機能としての栄養性、第二次機能としての嗜好性に加えて、第三次機能として、生体調節作用を有しており、当該機能性を利用した種々の製品がいわゆる健康食品等として、広く一般に受け入れられ、利用されてきている。食経験の比較的長い食品由来の成分の利用は特に、生活習慣病のような比較的長期にわたり処置を必要とする疾患または状態に対し、繰り返し長期間使用するに際して安心感がある点でも、好ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下を提供する。
[１]  非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を含有する豚骨抽出物を含む、メタボリックシンドロームの予防または改善のための食用組成物。
[２]  一日当たりの摂取量中、10μg〜5,000μgのGluOCを含有する、１に記載の食用組成物。
[３]  GluOC含有骨抽出物が、アミノ酸組成において、グリシン１質量部に対して０．１〜１質量部のグルタミン酸を含む、１または２に記載の食用組成物。
[４]  GluOC含有骨抽出物が、γ−カルボキシル化オステオカルシン（GlaOC）を含む、１〜３のいずれか１項に記載の食用組成物。
[５]  サプリメント、ドリンク食用組成物、または飲料の形態である、１〜４のいずれか１項に記載の食用組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】生の豚骨および煮た豚骨からのオステオカルシンの抽出。1gの材料から抽出された(A)Gluおよび(B)Glaオステオカルシンの量。ミキサーで粉砕した骨を0.2 M炭酸緩衝液（pH 9.5）中で室温において24時間抽出した。スープは、ミキサーで粉砕した生の骨を湯の中で6時間煮ることによって得た。(C)各豚骨抽出物に含まれる全OC中のGluOCのパーセンテージ。*P<0.05, ***P<0.005, ‡‡‡P<0.005対生骨および煮骨の両者。
【図２】豚骨抽出物の経口投与後の小腸のオステオカルシン。(A)豚骨抽出物100μl（17.5μgのGluOCを含有）の経口投与から3、6、および24時間後の小腸内容物中に含まれるGluOCの量。(B)各時間点における全OC中に占めるGluOCの割合（％）。データは4−5匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05, **P<0.01, スチューデントt検定。
【図３】普通食飼育マウスに対する豚骨抽出物長期間投与による各種代謝指標の変化。6−8週齢の雌性マウス1匹あたり、1.2μgのGluOCを含む100μlの豚骨抽出液を4週間に渡って毎日経口投与した。対照マウスは生理食塩水100μlを経口投与した。 (A)投与中の体重変化。投与開始時の体重を100％とし、その後4週間の体重変化を示した。黒丸および白丸はそれぞれ実験マウスおよび対照マウスを表す。以下の図面においても同様ある。（B）摂食時および空腹時（22時間絶食）血糖値。(C)空腹時のおよびグルコース（体重1kgあたり3g）腹腔内投与15分後の血中インスリン濃度。(D)腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT、グルコース注射：2g/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。(E)インスリン負荷試験（ITT、インスリン注射: 0.4U/kg）。全てのデータは5−6匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05対対照マウスに関しての対応する値（スチューデントt検定、二元配置分散分析）。
【図４】HFS飼育雌性マウス（肥満モデルマウス）に対する豚骨抽出物長期間投与による各種代謝指標の変化。6−8週齢の雌性マウスに対して、高脂肪高ショ糖による飼育開始から6週間後より、1匹あたり1.2μgのGluOCを含む100μlの豚骨抽出液を4週間に渡って毎日経口投与した。(A)摂食時および空腹時（22時間絶食）血糖値。*P<0.05, **P<0.01, スチューデントt検定。（B）空腹時血中GLP-1濃度。P<0.05、スチューデントt検定。(C)空腹時血中インスリン濃度。(D)単位面積あたりの膵臓ランゲルハンス島の数および(E)膵臓組織切片におけるβ細胞の占める面積の割合（％）。(F)投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）。曲線下面積を挿入図中に示す。(G)インスリン負荷試験（インスリン注射: 1.5U/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。全てのデータは5−6匹のマウスに関しての平均 ± SEMである。*P<0.05, *P<0.01対対照マウスに関しての対応する値（スチューデントt検定、二元配置分散分析）。
【図５】豚骨抽出物長期間投与による内臓脂肪（性腺周囲脂肪組織）に対する効果。 (A)普通食飼育群の性腺周囲脂肪組織の切片標本をヘマトキシリン-エオシン（HE）染色し、脂肪細胞一つあたりの面積を算出した。（上）HE染色像。（下）脂肪細胞面積の分布。（右）脂肪細胞一つあたりの平均面積。黒棒は豚骨抽出液物を投与したマウス、白棒は対照マウスを表し、以下の図も同様である。(B)高脂肪高ショ糖食飼育群。（上）HE染色像。（下）脂肪細胞面積の分布。(右)脂肪細胞一つあたりの平均面積。一群あたり6匹のマウスからの少なくとも3つの切片を試験し、そしてスライドあたり50の脂肪細胞を測定した。平均の脂肪細胞面積のデータは平均 ± SEMである。*P<0.05, ***P<0.005（スチューデントt検定）。
【図６】HFS飼育雄性マウスに対する豚骨抽出物長期間投与による糖代謝指標の変化。(A)4週間の投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）。 (G)インスリン負荷試験（インスリン注射: 1.5U/kg）。曲線下面積を挿入図中に示す。
【図７】妊娠期間中GluOCを経口投与したことによる、仔への影響。C57BL/6マウスを妊娠期間中普通食あるいはHFSで飼育し、それぞれをさらに2群に分け、一方には妊娠期間中毎日GluOCを経口投与し、他方には生理食塩水を投与した。仔は、離乳後に雌雄とも2群に分けて普通食と高脂肪食を与えて飼育した。それぞれの群の生後34日、69日、95日の体重を示す。*P<0.05, ***P<0.005（スチューデントt検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
％および部は、特に記載した場合を除き、質量を基準としている。数値範囲「X〜Y」は、特に記載した場合を除き、両端の値XおよびYを含む。「Aおよび／またはB」は、特に記載した場合を除き、A、Bのうち少なくとも一方が存在することを指し、AとBの双方が存在する場合も含む。食用組成物は、固形の食品と飲料およびスープのような液状の経口摂取物を含み、また、そのまま摂取される形態のもの（例えば、調理済みの各種の食品、サプリメント、ドリンク食用組成物）のみならず、食品添加物、発酵調味料組成物、飲料濃縮物も含む。さらに、ヒトのみならず、非ヒト動物（ペット、家畜等）のためのものも含む。食用組成物はまた、一般食品（いわゆる健康食品を含む。）のほか、保健機能食品（機能性表示食品、栄養機能食品、および特定保健用食品を含む。）を含む。抽出物というとき、形態は特に限定されず、液状であってもよく、固体状であってもよい。抽出物は、意図した効果を発揮しうる限り、種々の処理を経たもの、例えば抽出液を脱塩、濃縮、殺菌、成分調整および／または乾燥したものであってもよい。
【００１５】
本発明は、非または低カルボキシル化オステオカルシン（GluOC）を有効成分とする、メタボリックシンドロームの予防または改善のため食用組成物に関する。
【００１６】
〔GluOC〕
本発明でいう「GluOC」とは、特に記載した場合を除き、オステオカルシンの3つのグルタミン酸残基のうち、1または2個がカルボキシル化されたもの（低カルボキシル化オステオカルシン）、およびカルボキシル化されていないもの（非カルボキシル化オステオカルシン）を含む。
【００１７】
オステオカルシンのアミノ酸配列を以下に示す。
【００１８】
【化１】
2017039652.tif 000002
順にSEQ ID NO.:1〜7として、配列表に示す。
【００１９】
ヒトオステオカルシンでは、17、21および24位（マウスでは13、17および20位）のグルタミン酸がカルボキシル化を受ける。なお、3つのグルタミン酸残基のうち、17位（マウスでは13位）がカルボキシル化されているが、他の2つのグルタミン酸残基のうち少なくとも1つはカルボキシル化されていない（すなわち、低カルボキシル化OC）は、通常存在しないと考えられている。したがって、低カルボキシル化OCとしては、Glu-Gla-Gla, Glu-Glu-Gla, Glu-Gla-Gluが考えられる。ただし、市販のGluOCを分析するためのキットでは、それらを区別し難いものもある。例えば、本明細書の実施例の項では、GluOCおよびGluOCの測定に関し、EIAキット（タカラバイオ、滋賀、日本）を利用しているが、GluOC測定キットは21および24位にまたがるGlu残基に特異的な抗体を使用したEIAキットであり、低カルボキシル化OCと非カルボキシル化OCの区別はできない。また、GlaOC測定キットは、17位（マウスの13位）のGla残基に特異的な抗体を使用したものであるので、理論的には、17位のグルタミン酸残基がカルボキシル化されていれば、他の2つのグルタミン酸残基がカルボキシル化されていなくても認識する。しかし、実際は、17位がGlaである低カルボキシル化OC (Gla-Gla-Glu、Gla-Glu-Gla、Gla-Glu-Glu)は血中には通常存在しないと考えられている。なお、マウスにおいて、すべてがカルボキシル化されたGlaOCは無効だが、13位のグルタミン酸のみが脱カルボキシル化したGluOCが有効であるという報告がある（非特許文献6）。また、前掲非特許文献1〜4で有効性が証明されているGluOCは、非カルボキシル化OCである。
【００２０】
本発明はまた、以下のいずれかのポリペプチドまたはそのカルボキシル化体である、GluOCを提供する：
(1) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
(2) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり（ただし、配列番号1においては、17、21および24位のアミノ酸は維持され、配列番号2〜7においては、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は維持される。）、かつ対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する、ポリペプチド；または
(3) 配列番号1〜7のいずれか一のアミノ酸配列と少なくとも85％以上（好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり（ただし、配列番号1においては、17、21および24位のアミノ酸は維持され、配列番号2〜7においては、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は維持される。）、かつ対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する、ポリペプチド。
【００２１】
配列番号2における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号3における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、13、17および20位である。
配列番号4における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号5における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号6における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
配列番号7における、配列番号1の17、21および24位に対応するアミノ酸は、17、21および24位である。
【００２２】
上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化体のうち、特に好ましいのは豚または魚由来のものである。
【００２３】
また、本発明でポリペプチドに関し、「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個または1〜5個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドまたはタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
【００２４】
本発明でアミノ酸配列に関し「「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列またはアミノ酸配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合（上記の[化1]参照）に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990)403-410に記載されるNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
【００２５】
上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化体は、対象に経口投与したときに、対象の摂食時および／または空腹時の血糖値を低下させる機能を有する。この機能は、具体的には、対象を例えば6−7週齢のマウスを高脂肪高ショ糖食（HFS）で飼育したものとし、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、適切な量の上記のポリペプチドまたはそのカルボキシル化を毎日数週間にわたり経口投与する群と対象群とを設け、摂食時および／または空腹時の血糖値を測定し、比較することにより判断できる。より詳細な実験条件は本発明の実施例の項の記載を参考にすることができる。低下したか否かは、当業者であれば適宜判断しうるが、対象群の値に対して、例えば5％、好ましくは10％低いときに低下したと判断してもよい。
【００２６】
摂食時および／または空腹時血糖値の変わりに、空腹時血中GLP-1濃度、空腹時血中インスリン濃度、単位面積あたりの膵臓ランゲルハンス島の数、膵臓組織切片におけるβ細胞の占める面積の割合（％）、または(F)投与期間終了後の腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）を比較してもよい。
【００２７】
〔メタボリックシンドロームの処置〕
本発明は、メタボリックシンドロームの予防または改善のために用いうる。
メタボリックシンドロームとは、内臓肥満に高血圧・高血糖・脂質代謝異常が組み合わされ、心臓病や脳卒中などの動脈硬化性疾患をまねきやすい状態をいう。日本では平成20年（2008年）から「特定健診・特定保健指導」の中で、メタボリックシンドロームに関する対策を取り入れた。なお特定健診・特定保健指導では、メタボリックシンドロームといわず、「内臓脂肪症候群」の名称を用いている。
【００２８】
メタボリックシンドロームの診断基準は、日本では、次のとおりである：ウエスト周囲径（臍の高さの腹囲）が男性85cm女性90cmを超え、高血圧、高血糖および脂質代謝異常の3つのうち2つに当てはまること。
【００２９】
高血圧とは、収縮期血圧が130mmHg以上または拡張期血圧が85mmHg以上である状態をいう。脂質代謝異常（高脂血症ということもある。）とは、LDLコレステロールが140mg/dl以上の「高LDLコレステロール血症」、HDLコレステロールが40mg/dl未満の低HDLコレステロール血症、中性脂肪が150mg／dl以上の高トリグリセライド血症（高中性脂肪血症）のいずれかであることをいう。糖尿病は、空腹時高血糖が110mg/dLである場合をいい、1型糖尿病と2型糖尿病が含まれる。
【００３０】
本発明者らの検討によると、GluOCを含む豚骨抽出物は、高脂肪高ショ糖食（HFS）で飼育したマウスにおいて、摂食時および空腹時の血糖値を顕著に低下させ、またインスリン濃度を増加させ、耐糖能およびインスリン感受性を改善した。さらにこのHFS飼育豚骨抽出物投与群においては、単位面積あたりのランゲルハンス島の数が増加しており、β細胞の割合も増加傾向にあった。さらに4週間にわたるGluOCを含む豚骨抽出物の経口投与によって普通食、HFS飼育の両群において脂肪細胞の大きさを減少させた。小さな脂肪細胞の割合が増加し、脂肪細胞の平均面積は減少した。したがって、GluOCは、経口投与により少なくとも内臓肥満および高血糖に対して有効であるということができる。
さらに本発明者らの検討により、妊娠母体がGluOCを摂取することでこの産仔の体重増加は回避されることもわかっている。
【００３１】
本発明で疾患または状態について予防または改善というときは、発症リスクの低減、発症の遅延、予防、治療、進行の停止、遅延を含む。予防または改善には、医師が行う、病気の治療を目的とした行為と、医師以外の者、例えば栄養士（管理栄養士、スポーツ栄養士を含む。）、保健師、助産師、看護師、臨床検査技師、スポーツ指導員、美容部員、エステティシャン、医薬品製造者、医薬品販売者、食品製造者、食品販売者等が行う、非治療的行為とが含まれる。また予防または改善には、獣医師が行う、非ヒト動物の病気の治療を目的としたとした行為と、獣医師以外の者、例えば獣医看護士、愛玩動物飼養管理士、厩務員、飼育員、動物医薬品製造者、動物医薬品販売者、ペット用食品製造者、ペット用食品販売者等が行う、非治療行為が含まれる。さらに予防または改善には、特定の食品の投与または摂取の推奨、食事指導、保健指導、栄養指導（傷病者に対する療養のため必要な栄養の指導、および健康の保持増進のための栄養の指導を含む。）、給食管理、給食に関する栄養改善上必要な指導を含む。
【００３２】
本発明における処置の対象は、ヒト（個体）を含み、好ましくは、上述したいずれかの処置を施すことが望ましいか、または上述したいずれかの処置を施す必要のあるヒトである。
本発明における処置の対象は、ヒト以外の動物であってもよく、この例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、リス等のペット（愛玩動物、コンパニオンアニマルということもある。）、牛、豚等の家畜、マウス、ラット等の実験動物、動物園等で飼育されている動物が挙げられる。対象となる非ヒト動物の成長段階には特に限定がなく、本発明の処置の対象は、例えば、幼犬、成犬、高齢犬、幼猫、成猫、高齢猫であり得る。
本発明による処置の対象は男性および女性を含む。本発明者らの検討によると、マウスを用いた実験では、メスに効果が見られた。したがって、本発明は、女性に対する効果が特に期待できる。
【００３３】
〔製造方法〕
本発明は、GluOC含有骨抽出物またはGluOC（以下、「GluOC等」ということがある。）の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、次の工程を含む：
生の、または加熱処理済の、動物の骨を水系溶媒で抽出処理し、GluOCを含有する骨抽出物を得る工程。
【００３４】
本発明において原料として、動物の骨を使用することができる。OCは骨中の非コラーゲン性タンパク質の約20％を占めるといわれており、相当な量のOCを動物の骨（硬骨）から得ることができる。使用される動物の骨は、GluOCを含むものであれば特に限定はなく、例えば、哺乳類、鳥類、魚類等の脊椎動物の骨、より具体的には豚、牛、鶏、魚の骨が使用できる。使用される骨の部位に特に制限はなく、骨膜、骨質、骨髄または軟骨を含んでいてもよく、頭部の骨、体幹部の骨、上肢の骨、下肢の骨のいずれであってもよい。本発明者らの検討によると、頭部の骨および脊椎は比較的柔らかくて粉砕しやすく、そのためGluOC等収量が高いが、四肢は硬くて粉砕しづらく収量が落ちる傾向がある。したがって、収量が高いという観点からは、頭部の骨および／または体幹部の骨を原料とすることが好ましい。
【００３５】
原料としての骨は、加熱処理していない生のものであってもよく、熱水処理や加圧熱水処理後の骨であってもよい。加熱処理した骨は、通常、余分な脂肪分が比較的少ない点で、GluOCを抽出する原料として適している。加熱処理した骨の例としては、湿式加熱処理、例えば熱水処理、加圧熱水処理および／または加圧水蒸気処理を施された骨が挙げられる。また、加熱処理した骨の例として、骨からスープ等を抽出した残渣が挙げられる。なお、骨の抽出残渣のことを煮骨ということがある。
【００３６】
本発明の原料として加熱処理した骨を用いる場合、加熱条件にもとくに限定はなく、例えば温度は、80℃〜150℃、好ましくは85℃〜140℃、より好ましくは110℃〜130℃であり、時間は、15分〜24時間、好ましくは30分〜10時間、より好ましくは1〜8時間で処理することができる。
【００３７】
GluOC等の製造においては、原料としての骨は、抽出効率を高める観点から、細断または粉砕することができる。抽出に際し、目的の物質が十分に抽出できる限り溶媒に特に制限はないが、水系溶媒を公的に用いることができる。水系溶媒の例としては、各種アルカリ性水溶液、水、塩酸水溶液、酢酸水溶液、燐酸水溶液、乳酸水溶液、クエン酸水溶液、ギ酸水溶液、アスコルビン酸水溶液が挙げられる。好ましくは、後述するpHのアルカリ性水溶液が用いられる。
【００３８】
アルカリ性水溶液は、好ましくは食品または医薬として許容されるpH調整のための成分により調製されていることが好ましい。この例としては、炭酸塩および／または重炭酸塩の水溶液、ホウ酸カリウム、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩の水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、並びに酢酸エタノールアミン緩衝液が挙げられる。炭酸塩の例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、および炭酸バリウムが挙げられ、重炭酸塩の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。
【００３９】
アルカリ性水溶液のpHは、pH7超〜13とすることができ、好ましくはpH8〜12であり、より好ましくはpH9〜pH11である。また、アルカリ性水溶液中の塩濃度は、0.001M以上とすることができ、好ましくは0.1〜3Mであり、より好ましくは0.2〜1Mである。
【００４０】
骨からGluOC等を抽出する際の抽出時間は、目的の物質が十分に抽出できる限り特に制限はないが、例えば1時間以上とすることができ、好ましくは6〜48時間であり、より好ましくは12〜24時間である。また、抽出温度も目的の物質が十分に抽出できる限り特に制限はないが、4〜120℃とすることができる。
【００４１】
抽出に際し、溶媒としてアルカリ性水溶液を用いる場合には、得られた抽出物中のアルカリ成分を、酸により中和する工程を含んでいてもよい。中和に用いる酸としては食品または医薬として許容される成分であることが好ましく、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。特に好ましい例は、クエン酸である。
【００４２】
得られた抽出物は、必要に応じ、脱塩、固形物の分離（濾過、遠心分離等の操作による）、濃縮等の処理を行ってもよい。脱塩方法には特に限定はないが、限外濾過、電気透析、ゲル濾過、イオン交換樹脂を用いることができる。
【００４３】
本発明の製造方法によれば、GluOC等を効率よく抽出することができる。GluOC等の抽出効率は、原料として使用される骨の状態や部位等にも拠るが、例えば豚の煮骨1g（湿重量）から、10〜200μgのGluOCを得ることができる。
【００４４】
本発明の抽出物は、GluOCを多く含む。抽出物中にはGlaOCが含まれていてもよく、また、コラーゲンやその他の骨由来の成分が含まれていてもよい。本発明者らの検討によると、豚骨抽出物を経口投与した際に小腸におけるGlaおよびGluOC量を測定したところ、小腸内容物中においてはGluOCの比率が約4倍増加することが分かっている。すなわち、経口投与されたClaOCは、腸内で脱カルボキシル化され、GluOCとなり、目的の効果を発揮することができる。
【００４５】
〔食用組成物〕
本発明で「食用組成物」というときは、特に記載した場合を除き、動物の骨抽出物そのものである場合と、GluOCまたは骨抽出物と、それら以外の成分とを含む場合とがあるが、GluOCおよび骨抽出物自体は含まず、またGluOCまたは骨抽出物を含有する既存の食品は含まない。
【００４６】
有効成分であるGluOC骨抽出物の摂取量は、目的の効果が発揮される量であればよい。GluOCに関しては、体重1kgあたり1μg/day以上とすることができ、3μg/day以上とすることが好ましく、30μg/day以上とすることがより好ましく、60μg/day以上とすることがより好ましい。いずれの場合であっても、1,000μg/day以下とすることができ、500μg/day以下とすることが好ましく、200μg/day以下とすることがより好ましく、100μg/day以下とすることがさらに好ましい。摂取は、一日に1〜数回に分けて行うことができる。
【００４７】
本発明の食用組成物には、目的の効果を発揮しうる限り、有効成分以外の他の成分を配合することができる。他の成分は、食品として許容される種々の添加食用組成物、または医薬として許容される種々の添加食用組成物であり得る。この例には、賦形食用組成物、酸化防止食用組成物抗（酸化食用組成物）、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定食用組成物、発色食用組成物、漂白食用組成物、防かび食用組成物、ガムベース、苦味料等、酵素、光沢食用組成物、酸味料、乳化食用組成物、強化食用組成物、製造用食用組成物、結合食用組成物、緊張化食用組成物（等張化食用組成物）、緩衝食用組成物、溶解補助食用組成物、防腐食用組成物、安定化食用組成物、凝固食用組成物等である。
【００４８】
他の成分は、GluOC、または豚骨抽出物以外の機能性成分であってもよい。他の機能性成分に例としては、カテキン類、アミノ酸類（例えば、分岐鎖アミノ酸類、オルニチン）、不飽和脂肪酸類（例えば、ARA、EPA、DHA、αリノレン酸、オメリノール酸、オレイン酸）、ビタミン類、微量金属類、ポリフェノール類、卵黄抽出物、はちみつ加工品、黒糖、オリゴ糖、食物繊維、コンドロイチン硫酸類、CoQ10、フコイダン、フコキサンチン、アスタキサンチン、セサミン、プラセンタ、酵母エキス、黒酢濃縮物、ニンニク抽出物、イチョウ葉抽出物、ビルベリー抽出物、ブルーベリー抽出物、各種人参抽出物、マカ抽出物、豆種皮抽出物、セントジョーンズワート抽出物、松樹皮抽出物、アサイー抽出物、ノニ抽出物等が挙げられる。
【００４９】
本発明の食用組成物が有効成分と有効成分以外の他の成分からなる場合、有効成分の含有量は、当業者であれば、製造し安さ、用いやすさ等の点から適宜設計でき、例えば、0.1〜99.9％とすることができ、また1〜95％とすることができ、また10％〜90％とすることができる。
【００５０】
本発明の食用組成物は、上述したように、豚骨抽出物および豚骨抽出物を含有する既存の食品を除き、種々の形態であり得る。例えば、本発明の食用組成物は、それ自体で経口医薬品または食品であり得る。また本発明の食用組成物は、経口医薬品または食品に添加するために用いることができる。本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、固形物のみならず、液状のもの、例えばスープ、飲料およびドリンク食用組成物を含む。また、本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトを対象としたものと、非ヒト動物を対象としたものを含む。さらに本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、健康食品、サプリメント、保健機能食品（栄養機能食品および特定保健用食品を含む。）、一般食品（医薬品（新指定医薬部外品を含む）ではなく、かつ保健機能食品ではない食品）を含み、また治療食（治療の目的を果たすもの。医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、成分調整食、減塩食、介護食、減カロリー食、ダイエット食を含む。非ヒト動物を対象とした食品は、ペットフード、ペット用飲料、ペット用サプリメント、飼料を含む。本発明で「医薬（品）」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト用のものと動物用のものとを含む。
【００５１】
本発明により提供される食用組成物が、経口医薬品、健康食品、サプリメントの形態である場合、その食用組成物形の例としては、カプセル食用組成物（軟カプセル食用組成物、硬カプセル食用組成物）、錠食用組成物（タブレット）、丸食用組成物、粉末食用組成物、顆粒食用組成物、細粒食用組成物、ゼリー食用組成物、チューブ入り食用組成物、ドリンク食用組成物を挙げることができる。
【００５２】
軟カプセル食用組成物、硬カプセル食用組成物、錠食用組成物または丸食用組成物等の形態とする場合、有効成分であるGluOCの一食用組成物当たりの含量は、1μg以上とすることができ、3μg以上とすることが好ましく、30μg以上とすることがより好ましく、60μg以上とすることがより好ましく、200μg以上とすることがより好ましく、300μg以上とすることがより好ましく、600μg以上とすることがより好ましく、800μg以上とすることがより好ましく、1,000μg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、2,000μg以下とすることができ、1,800μg以下とすることが好ましく、1,600μg以下とすることがより好ましく、1,500μg以下とすることがさらに好ましい。
【００５３】
本発明により提供される食用組成物が、ペット用のものである場合、その形態の具体的な例としては、缶詰、ドライフード、レトルトフード食用組成物、豚骨抽出物茶葉製品、缶詰、ドライフード、レトルトフード、またはカプセル食用組成物もしくはタブレットを挙げることができる。
【００５４】
ペット用食品の形態とする場合、有効成分の含量は、一食としての摂取量を勘案して設計することができる。ペット用食品の形態とする場合、GluOCの一食用組成物当たりの含量は、10μg以上とすることができ、20μg以上とすることが好ましく、40μg/g以上とすることがより好ましく、80μg/g以上とすることがより好ましく120μg/g以上とすることがより好ましく、160μg/g以上とすることがより好ましく200μg/g以上とすることがより好ましく、240μg/g以上とすることがより好ましく、300μg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、4000μg以下とすることができ、3000μg/g以下とすることが好ましく、2000μg/g以下とすることがより好ましく、1500μg/g以下とすることがさらに好ましい。
【００５５】
本発明の食用組成物は、食事と共に、例えば、食前、食事中、食後に、摂取することができる。本発明の食用組成物は、メタボリックシンドロームの状態となる前に、メタボリックシンドロームとなるリスクの低減や予防等を目的として、対象に摂取させることができ、またメタボリックシンドロームの状態となる前に、またはそれに起因した疾患の発症後に、諸症状を改善すること等を目的として、対象に摂取させることができる。
【００５６】
本発明の食用組成物には、上述の疾患または状態の処置のために用いることができる旨を表示することができ、また上述の対象に対して摂取を薦める旨を表示することができる。より具体的には、本発明の食用組成物には、メタボリックシンドロームの予防等のために、またはメタボリックシンドロームを改善することを表示することができる。表示は、直接的にまたは間接的にすることができ、直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段よる、広告・宣伝活動を含む。
【００５７】
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明の範囲は実施例に記載したものに限られない。
【実施例】
【００５８】
〔豚骨からのオステオカルシンの抽出〕
1  原料と溶媒の検討
生の豚骨および煮た豚骨（煮骨、スープを熱水抽出した残渣）は株式会社クリーン・エコバランス(福岡市、日本)から提供された。生豚骨および煮骨をミキサーで粉砕したもの3g（湿重量）に対して10mlの0.2 M 炭酸緩衝液（炭酸ナトリウム（和光純薬工業）0.275g、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業）0.62を蒸留水で溶解し50mlとした。pH 9.5）加え、室温で24時間撹拌しながら抽出を行った。抽出液と残渣を12,000xgにて10分間遠心分離した後、抽出液を透析（スペクトラムラボラトリーズ、ランチョ  ドミンゲス、CA; 分子量カットオフ3500）により中和・脱塩し、茶色液体の豚骨抽出物、約10mlを得た。
次に、透析された溶液中のGluオステオカルシンおよびGlaオステオカルシンの含有量をEIAキット（タカラバイオ、滋賀、日本）により測定した。その結果を図1に示す。図1Aに示すように、煮骨からより多くのGlaOCが抽出された。GluOCの抽出効率は生骨と煮骨でほとんど同じであった（図1B）。生骨を熱水で6時間加熱した抽出液（スープ）中に含まれるGlaOCおよびGluOCの量も測定したが、炭酸緩衝液による抽出と比較して効率は極めて低かった（図1AおよびB）。各抽出物のGlu/Gla比に顕著な差異は観察されなかった（図1C）。
【００５９】
2  豚骨抽出物のアミノ酸組成
豚骨抽出物のアミノ酸組成を、HClによる加水分解の後にアミノ酸自動分析法にて測定した（日本食品分析センター）。結果を下表に示した。コラーゲンに特異的なアミノ酸であるヒドロキシプロリンは30 mg/100 gほどが検出された。コラーゲン中のヒドロキシルプロリンの含有量が約10%であること（参考文献）を考慮すると、抽出されたタンパク質の大部分がコラーゲンであると推測される。
【表１】
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3  経口投与された豚骨抽出物の小腸における測定
豚骨の抽出物（一回投与量100μl中に1.1±0.1μgのGluOCを含む。全OCに占めるGluOCの割合4.1±0.7％）を8−10週齢のC57BL-6Jマウスに経口投与した。投与から3、6、および24時間後、動物をセボフルランおよびペントバルビタール(40 mg/kg)により麻酔して、小腸を切除した。小腸の内容物を秤量し、内容物1gにつき1mlの割合でリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、20,000 xgにて30分間4℃にて遠心分離した。得られた上清の部分に含まれるGlaおよびGluOC量をEIAキット（タカラバイオ）にて測定した。その結果を図2に示す。3時間後の小腸内容物からは1.4 ± 0.1 ngのGluOCが検出され、6時間後、24時間後もほぼ同量のGluOCが検出された（図2A）。また、小腸内容物中においてはGluOCの比率が約4倍増加していた（図2B）。
【００６０】
4  通常食飼育マウスに対する豚骨抽出物投与の影響
通常の食事（CRF-1;オリエンタル酵母工業）で飼育した8週齢の雌性C57BL/6Jマウスに対し、一回投与量（100μl）あたり1.2μgのブタGluOCを含む豚骨抽出物または生理食塩水を毎朝8時に4週間経口投与し、その後各種代謝関連試験を行った。血糖値はフリースタイルライト血糖測定電極（アボットラボラトリーズ、アボットパーク、IL）を用いて測定した。血中インスリン濃度はマウスインスリン用ELISAキット（メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて測定した。その結果を図3に示す。豚骨抽出物投与によって体重（図3A）、摂食時・空腹時（22時間絶食）血糖値（図3B）、空腹時血中インスリン濃度（図3C）に変化は見られなかった。グルコース腹腔内注射（3g/kg体重）15分後の血中インスリン濃度は豚骨抽出物投与群で増加傾向にあった（図3C）。22時間絶食後に体重1kgあたり2gのグルコースを腹腔内注射してグルコース負荷試験（IPGTT）を行った結果、豚骨抽出物投与群の耐糖能が改善していた（図3D）。また、4時間絶食後に体重1kgあたり0.4Uのインスリン（ヒューマリンR、イーライリリー）を腹腔内注射してインスリン負荷試験（ITT）を行ったところ、インスリン感受性に変化は見られなかった（図3E）。
【００６１】
6−7週齢の雌性C57BL/6マウスを高脂肪高ショ糖食（HFS）(F2HFHSD; 30 % 脂肪, 20 % ショ糖、オリエンタル酵母工業)で飼育し、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、上記と同様の量の豚骨抽出物または生理食塩水を毎日4週間にわたって経口投与した。その後の各種代謝試験の結果を図4に示す。図4Aに示すように、豚骨抽出物投与群は、摂食時および空腹時ともに血糖値が顕著に低下していた。空腹時の血清GLP-1（シバヤギ社製ELISAキットにて測定）およびインスリン濃度も豚骨抽出物投与群で増加していた（図4C）。また、豚骨抽出物投与群では、耐糖能（IPGTT、22時間絶食後、体重1kgあたりグルコース1g腹腔内注射）およびインスリン感受性（ITT、4時間絶食後、体重1kgあたりインスリン1.5U腹腔内注射）も改善していた（図4E、F）。
【００６２】
5  膵臓の組織形態計測
上記のHFS飼育豚骨抽出物投与群およびコントロール群の膵臓を摘出し、10%中性ホルマリン中にて固定後パラフィン切片（6μm）を作成した。続いて切片をウサギ-抗インスリン（#4590の1:1000希釈;セルシグナリングテクノロジー、ボストン、MA）およびABCエリートキットプラスImmPact DAB（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、CA）を用いて染色し、マイヤーズヘマトキシリン（武藤化学、東京、日本）により対比染色した。インスリン免疫染色陽性の細胞をβ細胞とし、その面積および切片全体の面積をBZ-II アナライザー （キーエンス、大阪、日本）を用いて測定した。その結果、図4Dに示すように、豚骨抽出物投与群において単位面積あたりのランゲルハンス島の数が増加していた。また、切片全体に占めるβ細胞の割合も増加傾向にあった（図4E）。
【００６３】
6  白色脂肪組織の組織形態計測
普通食飼育およびHFS飼育肥満モデルマウスに4週間にわたって毎日豚骨抽出物を経口投与した後、性腺周囲脂肪組織を摘出し、10%中性ホルマリン中で固定して6μm厚のパラフィン切片を作成した。その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）の染色を行い、単位面積あたりの脂肪細胞の数および脂肪細胞の面積を測定した（BZ-II アナライザー、キーエンス）。図5に示すとおり、4週間にわたる豚骨抽出物の経口投与によって普通食、HFS飼育の両群において脂肪細胞の大きさを減少させた。小さな脂肪細胞の割合が増加し、脂肪細胞の平均面積は減少した。
【００６４】
7  雄性マウスに対する豚骨抽出物の効果
6−7週齢の雄性C57BL/6マウスをHFSで飼育し、HFS開始から6週間後、マウスをランダムに2つのグループに分け、上記と同様の量の豚骨抽出物または生理食塩水を毎日4週間にわたって経口投与した。その後の各種代謝試験の結果を図5に示す。雄性マウスにおいては、豚骨抽出物を投与しても耐糖能（IPGTT、22時間絶食後、体重1kgあたりグルコース1g腹腔内注射）およびインスリン感受性（ITT、4時間絶食後、体重1kgあたりインスリン1.5U腹腔内注射）に変化が見られなかった（図6A、B）。
【００６５】
8  妊娠マウスに対するGluOCの効果
C57BL/6マウスを妊娠期間中普通食あるいはHFSで飼育した。それぞれをさらに2群に分け、一方には妊娠期間中毎日GluOCを経口投与し、他方には生理食塩水を投与した。出産と同時にすべての母親の食餌を普通食に変更するとともにGluOCの投与を終了し、21日間の授乳に供した。離乳後に雌雄とも2群に分けて普通食と高脂肪食を与えて約3ヶ月飼育した。普通食で飼育した仔マウスにはGluOC投与群と対照群に雌雄とも相違はなかった。しかし、高脂肪食で飼育した雌性仔マウスでは、妊娠中にHFS摂取した母親の産仔は、通常食を摂取していた母親から生まれた産仔より授乳中から体重が有意に重かった。この傾向は、仔が成獣となった後も引き続き観察された。妊娠母体がGluOCを摂取することでこの産仔の体重増加は回避された。仔の解析結果を図7に示す。
【００６６】
〔食品製造例〕
(1)カプセル食用組成物（1〜3カプセル/dayを推奨）
上述の豚骨抽出物の1/20濃縮物やその乾燥物等を利用し、カプセルあたり0.6mgのGluOCを含む、カプセル食用組成物を調製する。
【００６７】
(2)飲料
上述の豚骨抽出物の1/20濃縮物やその乾燥物等を、飲料原料に加え、必要に応じ無菌的に容器に充填し、または充填後レトルト殺菌する。GluOC濃度が約1.7μg/mL、一食（350 mL）あたり0.6mgのGluOCを含む、食用組成物が得られる。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
SEQ ID NO.:1   human OC
SEQ ID NO.:2   pig OC
SEQ ID NO.:3   mouse OC
SEQ ID NO.:4   rat OC
SEQ ID NO.:5   bovine OC
SEQ ID NO.:6   chicken OC
SEQ ID NO.:7   monkey OC
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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