(57)【要約】【課題】組織工学用担体の製造方法、組織工学用担体、多孔質体の製造方法及び多孔質体の提供。【解決手段】熱可塑性樹脂粉体及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程及び前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を備え、前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える組織工学用担体を製造する組織工学用担体の製造方法。光吸収剤の平均粒子径は、熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であり、露光に用いる光源は、混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、混合粉体層と同等の厚みで形成された、熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下であることを特徴する、組織工学用担体の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程、及び
前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有し、
前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える組織工学用担体を製造する組織工学用担体の製造方法であって、
前記光吸収剤の平均粒子径は、前記熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であり、
前記露光に用いる光源は、前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、前記混合粉体層と同等の厚みで形成された、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下であることを特徴とする、組織工学用担体の製造方法。
【請求項２】
前記熱可塑性樹脂が生分解性を有する樹脂である、請求項１に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項３】
前記熱可塑性樹脂粉体が、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール及びポリグリコール酸から選ばれる１種以上の樹脂、又は、カプロラクトン単位、乳酸単位、ビニルアルコール単位及びグリコール酸単位から選ばれる２種以上の単位を有する樹脂を含有する粉体である、請求項１又は２に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項４】
前記光吸収剤が顔料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項５】
前記露光を、希土類元素ドープドシリカファイバーレーザーの照射により行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項６】
前記露光を、波長が５００ｎｍ以上１０，０００ｎｍ以下のレーザーの照射により行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項７】
得られた組織工学用担体の空隙率が体積割合において５０〜９５％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組織工学用担体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組織工学用担体の製造方法によって得られた組織工学用担体。
【請求項９】
生分解性の熱可塑性樹脂を構造材料として成る組織工学用担体であって、
当該組織工学用担体の内部を貫通する１以上の流路を有し、該流路の内径は２０００μｍ以下であり、
当該組織工学用担体の空隙率が体積割合において４０〜９９％であり、
０．５〜１０ｃＰの粘度を有する培養液を、流速５ｍＬ／分で、内径１０００μｍ、長さ５０ｍｍの当該組織工学用担体内部の流路内に１月間流通させた場合に担体内部構造の破壊が認められない強度を有することを特徴とする、組織工学用担体。
【請求項１０】
熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程、及び
前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有し、
前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える多孔質体を製造する多孔質体の製造方法であって、
前記光吸収剤の平均粒子径は、前記熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であり、
前記露光に用いる光源は、前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、前記混合粉体層と同等の厚みで形成された、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下であることを特徴とする、多孔質体の製造方法。
【請求項１１】
熱可塑性樹脂を構造材料として成る多孔質体であって、
当該多孔質体の内部を貫通する１以上の通路を有し、該通路の内径は２０００μｍ以下であり、
当該多孔質体の空隙率が体積割合において４０〜９９％であることを特徴とする、多孔質体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織工学用担体の製造方法、及び組織工学用担体、並びに、多孔質体の製造方法及び多孔質体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療が世界的に注目されており、幹細胞や万能細胞に関する研究が日々進められている。しかしながら、特定の形態を有する組織や臓器の再生を試みるためには、再生に用いる細胞自体の選定や培養条件の検討のみならず、組織に所望の形態を付与するための組織工学的検討も必要となる。具体的には、細胞を活着させることで組織が所望の３次元形態に配置されるように誘導し、且つ、組織が当該３次元形態を維持した状態で育成や増殖し得るような３次元の組織工学用担体（足場）が求められている。
組織工学用担体を用いて作製した組織は最終的に生体内で用いられるため、組織工学用担体には生体内で分解、吸収され得る材料を用いることが好ましい。かかる材料としては、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生体吸収性ポリマーが広く使用されている。
【０００３】
細胞を用いて組織を形成する際には、通常の細胞培養至適条件よりも細胞を高密度化して３次元形状とする必要がある。しかしながら、細胞が３次元で密集することにより、外表面から離間した細胞が低酸素状態に陥り壊死してしまうという課題がある。そのため、厚みを有する組織の形成や、代謝が速く多量の酸素を必要とする細胞を用いた内臓系組織の形成は非常に困難であった。
この課題の解決を目的として近年では、細胞増殖用の空隙を有するのみならず、３次元的な網目構造の微細流路（内部空洞）を内部に有し、当該流路を介して酸素や培養液を還流可能な組織工学用担体が提案されている。
【０００４】
かかる担体は、粉体材料からなる層を形成した後、該層に対して選択的にＣＯ２レーザー等を照射することで露光された部位の樹脂粉末を溶着させる工程を繰り返し行うことで３次元構造物を造形するレーザー焼結法（いわゆる３Ｄプリンティングの一手法）によって製造することが期待できる。ここで、担体にはその後の培養工程において破壊されない程度の強度が求められ、このような強度を得るためには粉末の各粒子を十分に溶融しなくてはならない。しかしながら、十分に粒子の溶融を行うと、得られる担体において、細胞培養用の空隙が確保できない（空隙率が低下する）という問題が生じる。
この問題に対して例えば特許文献１や非特許文献１に記載の発明では、ポリカプロラクトン粉末に対して、塩化ナトリウム（食塩）粉末をフィラー（副粉末）として添加した粉体材料を用いて、３次元組織工学用担体を製造している。より具体的には、混合粉末を使ってレーザー焼結造形を行った後、未焼結樹脂の除去及び流水によるフィラーの流出を行うことにより、微細な流路構想を有し、かつ高い空隙率を有する３次元組織工学用担体を製造している。
【０００５】
また、非特許文献２〜３に記載の発明では、ポリカプロラクトン粉末に対してポリグリコール酸粉末をフィラーとして添加した粉体材料を用いることにより、３次元組織工学用担体を製造している。ポリグリコール酸は水酸化ナトリウム等のアルカリで洗浄することにより溶出が可能となるため、露光による焼結後にフィラーを溶出させることで、微細な流路構想を有し、かつ高い空隙率を有する３次元組織工学用担体が得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３０１９４５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】新野俊樹ら、「生体組織工学用担体の積層造形技術」、精密工学会誌、第７３巻、第５号、ｐ５２８〜５３２、２００７年
【非特許文献２】板垣裕太郎ら、「アルカリ可溶性樹脂フィラを用いたレーザ焼結造形物の空孔率制御に関する研究」、２０１４年度精密工学会春季大会学術講演会講演論文集、Ｄ３６、２０１４年
【非特許文献３】板垣裕太郎ら、「アルカリ可溶性フィラ混合粉末のレーザ焼結造形における造形精度及び空孔率の評価」、２０１３年度精密工学会秋季大会学術講演会講演論文集、Ｄ４６、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１や非特許文献１に記載の発明では、塩化ナトリウムからなるフィラーを用いて高い空隙率を有する３次元組織工学用担体を得ている。しかしながら、高い熱伝導率を有する塩化ナトリウムを用いた場合、レーザーが照射された部位以外へも熱が伝播してしまう結果、造形の分解能が低くなり、微細な流路を有する組織工学用担体が得られ難いという課題があった。
加えて、特許文献１や非特許文献１に記載の発明では、細胞を増殖し組織を育成するための空隙を、後に溶出する塩化ナトリウムによって確保している。そのため、塩化ナトリウムの添加量は粉体材料全体の１／５程度（質量比）と比較的多い。このように多量の塩化ナトリウムを用いた場合、水による溶出後にも塩化ナトリウムが担体内に残存する可能性を否定することはできず、塩化ナトリウムが残存していた場合には細胞や組織のの増殖や育成に影響を与える虞がある。
【０００９】
また、非特許文献２に記載の発明では、フィラーとして熱伝導率が低いポリグリコール酸が用いられているが、ポリグリコール酸は主材料となるポリカプロラクトンより融点が高く造形時に溶融しない。そのため主材料のみの場合に比べて体積当たりの潜熱発生量が低下し、見かけの熱伝導率が上昇することから造形の分解能が低くなり、微細な流路を有する組織工学用担体が得られ難いという課題が完全にはなくならなかった。
【００１０】
加えて、特許文献１や非特許文献１〜３に記載の発明では、露光後にフィラーを溶出して空隙を確保する必要があるが、フィラーの溶出は、特別な装置が必要となる超音波洗浄や、減圧処理と１２時間以上の時間を伴っていた。したがってレーザー焼結後に微細な流路を有する３次元組織工学担体を得るには設備や時間が更に必要であった。
【００１１】
さらに、引用文献１や非特許文献１〜３に記載の発明では、露光に用いる波長としてポリカプロラクトンが吸収し得る波長を用いる必要がある。そのため、露光波長の制限が大きく、所望の解像度を有する担体を得るために任意の波長を選択し得ないという課題もあった。
【００１２】
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであって、所望の空隙率及び微細な流路を有する、細胞培養や生体内での使用に適した組織工学用担体の製造方法、及び当該製造方法によって得られた組織工学用担体、並びに、多孔質体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、光吸収剤を介して熱可塑性樹脂粉体の溶着を行うことにより、露光に用いる波長に制限を設ける必要がなくなること；流路等の微細性を向上し得ること；必要に応じて、空隙率の高い組織工学用担体を製造し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第一の態様は、熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程、及び前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有し、前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える組織工学用担体を製造する組織工学用担体の製造方法であって、前記光吸収剤の平均粒子径は、前記熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であり、前記露光に用いる光源は、前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、前記混合粉体層と同等の厚みで形成された、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下であことを特徴とする、組織工学用担体の製造方法である。
前記熱可塑性樹脂は、生分解性を有する樹脂であることが好ましい。
前記熱可塑性樹脂粉体は、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール及びポリグリコール酸から選ばれる１種以上の樹脂、又は、カプロラクトン単位、乳酸単位、ビニルアルコール単位及びグリコール酸単位から選ばれる２種以上の単位を有する樹脂を含有する粉体であることが好ましい。
前記光吸収剤は顔料であることが好ましい。
前記露光は、イッテルビウムドープドシリカファイバーレーザーの照射により行うことが好ましい。
前記露光は、波長が５００ｎｍ以上１０，０００ｎｍ以下のレーザーの照射により行うことが好ましい。得られる組織工学用担体の空隙率は、体積割合において５０〜９５％であることが好ましい。
本発明の第二の態様は、前記第一の態様の組織工学用担体の製造方法によって得られた組織工学用担体である。
本発明の第三の態様は、生分解性の熱可塑性樹脂を構造材料として成る組織工学用担体であって、当該組織工学用担体の内部を貫通する１以上の流路を有し、該流路の内径は２０００μｍ以下であり、当該組織工学用担体の空隙率が体積割合において４０〜９９％であり、０．５〜１０ｃＰの粘度を有する培養液を、流速５ｍＬ／分で、内径１０００μｍ、長さ５０ｍｍの当該組織工学用担体内部の流路内に１月間流通させた場合に担体内部構造の破壊が認められない強度を有することを特徴とする、組織工学用担体である。
本発明の第四の態様は、熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程、及び前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有し、前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える多孔質体を製造する多孔質体の製造方法であって、前記光吸収剤の平均粒子径は、前記熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であり、前記露光に用いる光源は、前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、前記混合粉体層と同等の厚みで形成された、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下であことを特徴とする、多孔質体の製造方法である。
本発明の第五の態様は、熱可塑性樹脂を構造材料として成る多孔質体であって、当該多孔質体の内部を貫通する１以上の通路を有し、該通路の内径は２０００μｍ以下であり、当該多孔質体の空隙率が体積割合において４０〜９９％であることを特徴とする、多孔質体である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞が育成及び増殖するために必要な空隙と、内部流路等の所望の３次元構造とを有する、細胞培養や生体内での使用に適した組織工学用担体や、それに類した多孔質体を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明における、熱可塑性樹脂粉体と、光吸収剤との局所の反応を示す模式図である。
【図２】本発明の組織工学用担体の製造方法を示す模式図である。
【図３】実施例１において用いられたポリカプロラクトン粉末の粒子径分布を示す図である。
【図４】実施例１における、粉体組成物の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図５】実施例１において形成された円筒形構造体の設計模式図（図５Ａ）、及び、実施例１において実際に得られた円筒形構造体の光学顕微鏡写真（図５Ｂ：側面視、図５Ｃ：上面視）を示す図である。
【図６】実施例２において形成された直方体構造体の模式図である。
【図７】実施例２において形成された形成する直方体構造体の幅と、空隙率との関係を示すグラフ図である。
【図８】実施例３における、単位面積当たりの供給エネルギー量と、空隙率との関係を示すグラフ図である。
【図９】実施例３における、露光前（図９Ａ）及び露光後（図９Ｂ）のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１０】実施例３における、露光後の光学顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において「組織工学用担体」とは、「組織工学を利用した技術に用い得る担体」、すなわち、「細胞もしくは組織の一部を用いて生体組織や臓器もしくはそれらの機能を人工的に再構築する技術において用いられる担体や、当該技術によって生体組織や臓器を得るために用いられる担体」を意味する。
以下、好適な実施の形態に基づき、本発明を説明する。
【００１７】
［組織工学用担体の製造方法］
本発明の第一の態様である組織工学用担体の製造方法は、熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する粉体層形成工程、及び、前記混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記混合粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有するものであって、前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える組織工学用担体が製造される。
本明細書において、「組織工学用担体の製造方法」を単に「製造方法」ということがある。
【００１８】
本発明の製造方法では、熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下の平均粒径を有する光吸収剤を用いる（図１Ａ）。熱可塑性樹脂及び光吸収剤に対して露光がなされる（図１Ｂ）と、光を吸収した光吸収剤のみが発熱し（図１Ｃ）、その結果、光吸収剤に接触して存在するもしくは光吸収剤近傍の熱可塑性樹脂粒子の一部が溶融し（図１Ｄ）、その結果、熱可塑性樹脂同士が溶着する（図１Ｅ）。
【００１９】
また、本発明の製造方法の一例を図２Ａ〜Ｄに模式図として示す。
まず、粉体層形成工程として、熱可塑性樹脂粉体１Ａ、および光吸収剤２を含有する組成物からなる混合粉体層１０が形成される（図２Ａ）。次に、露光工程として、露光部３に対して選択的に露光がなされる。このとき、未露光部４は露光されない。本例では、上面視円環状に露光を行っている（図２Ｂ）。その結果、図２Ｃに示すように、露光部３における熱可塑性樹脂粉体１Ａの一部は、光吸収剤２の光吸収及び熱変換の影響により溶着し、溶着済熱可塑性樹脂１Ｂとなる。また、露光部３における熱可塑性樹脂粉体１Ａの一部は、光吸収剤２の影響を受けずに熱可塑性樹脂粉体１Ａの状態で溶着せずに存在する。これは、近隣に光吸収剤２が存在していなかった等の影響によるものである。一方、未露光部４の熱可塑性樹脂粉体１Ａは、近隣に存在する光吸収剤２が露光を受けておらず、発熱しないため、溶着しない。その結果、溶着していない部分を除去することにより、図２Ｄに示されるような、組織工学用担体２０が製造される。組織工学用担体２０は、露光によって溶着しなかった露光部３中の熱可塑性樹脂粉体１Ａの脱落により得られた空隙５と；一部の未露光部４から形成される空洞６とを備える。加えて、図２Ａの露光前の状態の粉体が元々有していた、粒子同士の間に存在する空隙７も空隙として存在する。例えば、空隙５、７は細胞が培養される部位として用いることができ、空洞６は微細流路等として用いることができる。
以下、工程ごとに詳細に説明する。
【００２０】
（粉体層形成工程）
粉体層形成工程は、熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる混合粉体層を形成する工程である。
本発明における熱可塑性樹脂粉体とは、熱可塑性樹脂を機械的又は化学的に粉末状としたものである。
熱可塑性樹脂は、生分解性かつ生体適合性のある樹脂であることが好ましく、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール及びポリグリコール酸から選ばれる１種以上の樹脂、又は、カプロラクトン単位、乳酸単位、ビニルアルコール単位及びグリコール酸単位から選ばれる２種以上の単位を有する樹脂を含有する粉体が特に好ましい。これらの樹脂としては市販品を用いてもよく、常法により合成してもよい。熱可塑性樹脂の分子量、分散度等は特に限定されるものではない。
熱可塑性樹脂粉体は、上記のような熱可塑性樹脂を常法により粉体とすることにより得ることができる。熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径は、１００μｍ以下であることが好ましく、２５〜６５μｍがより好ましく、３５〜５５μｍがさらに好ましい。
上記上限値以下の平均粒子径を有する粉体とすることにより、形成される混合粉体層の層厚が厚くなりすぎることがなく、得られる組織工学用担体の形状を微細に制御することが可能となる。また、上記下限値以上とすることにより、粒子の凝集を低減することが可能となる。
【００２１】
ここで、本発明における「平均粒子径」とは、粒子径の累積分布の中央値（５０％値）に対応する粒子径、すなわちメジアン径をいう。粒子径分布は、市販の粒子径分布測定装置を用いて測定することができる。このような装置としては例えば、マイクロトラックＭＴ３０００ＩＩ（マイクロトラック・ベル社製）が挙げられる。
【００２２】
本発明における光吸収剤は、後述する露光工程における露光波長の光を吸収し得る光吸収剤であれば特に限定されるものではないが、例えば、露光に用いる波長が１．０７μｍであれば、当該波長において吸収を有する顔料、染料等を用いることができる。具体的には例えば、黒色顔料、黄色顔料、オレンジ色顔料、褐色顔料、赤色顔料、紫色顔料、青色顔料、緑色顔料、蛍光顔料、金属粉顔料、その他、ポリマー結合色素が挙げられる。アゾ顔料、アゾレーキ顔料、縮合アゾ顔料、キレートアゾ顔料、フタロシアニン系顔料、アントラキノン系顔料、ペリレン系顔料、ペリノン系顔料、チオインジゴ系顔料、キナクリドン系顔料、ジオキサジン系顔料、イソインドリノン系顔料、キノフタロン系顔料、アジン顔料、ニトロソ顔料、ニトロ顔料、天然顔料、蛍光顔料、無機顔料等の顔料；アゾ染料、シアニン染料、フタロシアニン染料、ナフトキノン染料、ピラゾロンアゾ染料、アントラキノン染料、カルボニウム染料、キノンイミン染料、メチン染料、スクワリリウム色素、金属チオレート錯体等の染料等を用いることができる。
一般的に顔料や染料は粉末状であるため、本発明における光吸収剤としては市販の顔料や染料を用いることができる。また、後述する好ましい平均粒子径となるように、市販の顔料や染料をミリング等の常法によりさらに微細化してもよい。
【００２３】
また、本発明では、光吸収剤は最終的に製造された組織工学用担体内に基本的に残存する。そして、当該組織工学用担体を用いて形成された組織や臓器は、組織工学用担体を包含した状態のまま人体内で用いられ得るため、光吸収剤に関しても人体に及ぼす影響の小さい光吸収剤が用いられることが好ましい。
【００２４】
光吸収剤の平均粒子径は、熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であれば特に限定されるものではないが、１００μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以下であることがより好ましく、３０μｍ以下であることがさらに好ましい。
また、光吸収剤の平均粒子径は、熱可塑性樹脂粉体の平均粒子径の１／３以下であって、１／５以下が好ましく、１／１００〜１／１０がより好ましく。１／５０〜１／１０がさらに好ましい。
上記平均粒子径を有する光吸収剤を用いることにより、熱可塑性樹脂粉体中に光吸収剤を均一に分散させることができる。
【００２５】
本発明の組成物において、光吸収剤は、熱可塑性樹脂粉末１００質量部に対して、０．０１〜１０質量部含有されることが好ましく、０．０５〜５質量部がより好ましく、０．１〜１質量部がさらに好ましく、０．３〜０．８質量部が特に好ましい。
上記範囲とすることにより、一定量の光を照射した場合に光吸収剤によって光から変換された熱エネルギーが、適度に近隣の熱可塑性樹脂粉体粒子に伝播し、粒子の一部位のみを溶融および凝固を行う結果、所望の空隙率を有する組織工学用担体を得ることができる。
【００２６】
本発明における組成物は、熱可塑性樹脂及び光吸収剤以外の添加剤等を含有していもよい。添加剤としては、可溶性のフィラーや、積層時の平滑性や均一性を向上させるためのナノシリカ粒子等が挙げられる。組織工学用担体が添加剤を包含した状態のまま人体内で用いられ得ることを鑑みて、人体に及ぼす影響の小さい添加剤を用いることが好ましい。
【００２７】
組成物からなる混合粉体層の形成方法は特に限定されるものではないが、例えば粉末焼結積層造形装置を用いる場合であれば、当該装置内のリコータを用いて、造形用プレート上に混合粉体層を形成することができる。このとき、組成物中の熱可塑性樹脂粉体と光吸収剤とが均一に分散した状態となり、且つ、形成された混合粉体層の表面が平滑となるように混合粉体層を形成することが好ましい。
【００２８】
形成される混合粉体層の厚さは特に限定されるのではないが、熱可塑性樹脂粉体又は光吸収剤の平均粒子径の０．５〜１０倍長であることが好ましく、１〜５倍長であることがより好ましい。上記下限値以上とすることにより、熱可塑性樹脂粉体と光吸収剤とが均一に分散した状態で、均一な混合粉体層を形成することが可能となる。また、上記上限値以下とすることにより、順次積層される混合粉体層の一層一層が薄くなることで、より微細且つ精密な３次元構造を有する組織工学用担体を製造することができる。
【００２９】
（露光工程）
露光工程は、前記粉体層形成工程で得られた混合粉体層に対して選択的に露光を行い、前記層の少なくとも一部を溶着させる工程である。
本発明において露光とは、光、Ｘ線、γ線、α線、電子線等の放射線による照射を意味する。
露光に用いる光源は、前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が５％以上であり、且つ、前記混合粉体層と同等の厚みで形成された、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が４０％以下である光源であれば特に限定されるものではない。前記混合粉体層を通過することによる光の減衰が１０％以上であることが好ましく、１５％以上がより好ましく、２０％以上がさらに好ましい。また、前記熱可塑性樹脂粉体のみからなる単一粉体層を通過することによる光の減衰が２０％以下であることが好ましく、１５％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましく、５％以下が特に好ましい。すなわち、混合粉体層が吸収し得る波長の光であって、熱可塑性樹脂粉体単体からなる層は混合粉体層に比して吸収が小さい波長の光を用いることが好ましい。言い換えれば、本発明では、混合粉体層中の熱可塑性樹脂粉体に比して、光吸収剤がより吸収しやすい波長の光を用いることが好ましい。
なかでも、本発明の製造方法では、光吸収剤を用いることから光を光源とすることが好ましく、レーザー光を用いて選択的に露光を行うことが特に好ましい。
レーザー媒体としては、固体レーザー、液体レーザー、ガスレーザー、半導体レーザー、化学レーザー、結晶レーザー、ファイバーレーザー等のいずれであってもよいが、高出力が可能なファイバーレーザーが好ましい。
【００３０】
レーザー波長も特に限定されるものではないが、本発明では約１μｍの近赤外波長域の波長を有するファイバーレーザーが好ましい。
このような波長を有するファイバーレーザーを用いて混合粉体層に対して露光を行った場合、熱可塑性樹脂粉体自体は光を吸収せず、熱エネルギーを発生しない。そのため、熱可塑性樹脂粉体自体の光吸収を前提とした従来技術（上述の非特許文献１等に記載の従来技術）では、ファイバーレーザーを採用することはできず、従来は波長１０．６μｍ程度のＣＯ２レーザー等が用いられていた。しかしながら、１０μｍ程度の波長の光を用いて露光を行う場合、最低解像寸法は１００μｍ以上となり、微細且つ緻密な構造体の形成は困難であった。
一方、本発明の製造方法では、光吸収剤が光を吸収して熱エネルギーを発生し、光吸収剤周囲の熱可塑性樹脂粉体を溶着させることができる。そのため、熱可塑性樹脂の吸収波長に依らずに露光に用いる波長を選択することができ、高い解像寸法を持つファイバーレーザーを選択可能となる。結果として、所望の３次元構造（例えば微細な流路様の空洞構造等）を有する組織工学用担体の製造が可能となる。
【００３１】
本発明では、混合粉体層中の露光部の熱可塑性樹脂粉体が溶着（溶融・結合）する一方、未露光部の熱可塑性樹脂粉体は溶着せず、後の圧縮空気や水洗等の処理により除去することが可能となる。すなわち、露光部が担体自体の構造を形成する構造体となり、未露光部が担体構造体の外部又は担体構造体中の内部空洞（例えば微細流路等）となる。
【００３２】
また、上述したように、本発明では露光により光吸収剤が吸収された光が熱エネルギーとなり、周囲の熱可塑性樹脂粉体の溶着（溶融・結合）を促進する。そのため、熱可塑性樹脂粉体自体が光を吸収する場合と異なり、露光強度の強弱によって溶着の範囲を制御することが可能となる。
例えば、露光強度が強い場合には、光吸収剤を介した熱が、光吸収剤周囲の広範囲に存在する熱可塑性樹脂粒子に伝播する。熱が伝わった熱可塑性樹脂粒子は、粒子全体が溶融、変形、さらには流動して、固体時にあった粒子間の空隙を埋めることとなる。その結果として熱可塑性樹脂粒子間の空隙の単体全体の体積に占める割合、いわゆる空孔率は小さくなる。
一方、露光強度が弱い場合には、光吸収剤を介した熱が、光吸収剤の極近隣の熱可塑性樹脂粒子のみに伝播する。熱が伝わった熱可塑性樹脂粉体粒子は、接触点又は接着面で互いに結合するが、熱量は少なく、熱の伝播範囲も狭い。よって、熱可塑性樹脂粒子同士は極僅かな接触点同士で結合され、その結果として熱可塑性樹脂粒子間の空隙は大きくなると考えられる。
そのため、所望の空孔率に応じて露光強度を適宜選択することが好ましい。
【００３３】
なお、露光強度が弱すぎる場合には、溶着が一切発生しなくなる虞がある。例えば、ポリカプロラクトンであれば融点は６０℃程度であるため、発生する熱エネルギーがこの温度を下回るようであれば溶着反応は進行しない。
【００３４】
具体的には例えば、波長１．０７μｍのファイバーレーザーを用いて、スポット径５３μｍ、走査速度１．５３ｍ／ｓで、１０ｍｍ×１０ｍｍ×４ｍｍの直方体の製造を試みる場合であれば、単位面積当たりの供給エネルギーを６０ｋＪ／ｍ２以下とすることにより、露光部の空隙率を５０％以上とすることができ、４０ｋＪ／ｍ２以下とすることにより、露光部の空隙率を６０％以上とすることができ、２７ｋＪ／ｍ２以下とすることにより、露光部の空隙率を７０％以上とすることができる。一方、２２ｋＪ／ｍ２以上とすることにより、熱可塑性粉体を溶着させることができる。
【００３５】
なお、エネルギー供給量は担体に十分な強度を与えうる程度に設定されなかればならない。担体強度とエネルギー供給量との関係は、担体の構造設計（外形、内部空洞構造、大きさ等）や、レーザーの照射条件（レーザーのパワー、走査速度、走査間隔等）の他、担体材料の設計（各粉体の流動性、各粉体の溶着性、各粉体の濡れ性等）等の非常に多くの条件に左右される。そのため、エネルギー供給量は適宜設定することが好ましい。実用的には、担体を実際に造形した上で、利用する培養媒体又は同等の流体特性をもつ流体を、同等の液体を用い、培養に利用する流速において所定の期間の灌流を行い、例えば破壊による質量損失が５％以下である等の基準に基づいて強度試験を行うことにより、当業者であればエネルギー供給量を適宜決定することができる。
【００３６】
露光工程は、上述のような放射線を発生し得る放射線源を備える公知の装置を用いて行うことができる。例えばファイバーレーザーの照射を行う場合であれば、半導体レーザー等の励起光源、励起光コンバイナ、イッテルビウム等の希土類元素がコアにドープされた光ファイバー、一対の制御ミラー等を用いて、常法によりファイバーレーザーを発生させ、照射することができる。これらの構成は、粉末焼結積層造形装置に設けられていてもよい。
また、露光は、５００ｎｍ以上、１０，０００ｎｍ以下の波長を有するレーザーの照射により行うことが好ましく、７００ｎｍ以上、２，０００ｎｍ以下の波長であることがより好ましい。
【００３７】
（繰り返し工程）
本発明の製造方法では、上述した粉体層形成工程と、露光工程とをこの順に繰り返す。この繰り返しを便宜上「繰り返し工程」という。
繰り返し工程において、粉体層形成工程と露光工程とを繰り返すことにより、混合粉体層が露光によって溶着した層（以下、「溶着層」という。）が順次積層される。この溶着層の積層体から、未溶着の混合粉体層を除去することにより、本発明の組織工学用担体が得られる。
繰り返し工程における、粉体層形成工程と露光工程との繰り返しの回数は、積層される粉体層の一層毎の厚みと、形成しようとする組織工学用担体の高さ（厚み）とから設定される。
【００３８】
粉末焼結積層造形装置を用いて繰り返し工程を行う場合であれば、一対の粉体層形成工程と露光工程とが終了した後、造形用プレートを降下させ、再度リコータや露光光源を用いて粉体層形成工程と露光工程とを行う。造形用プレートの降下する高さは、直前に形成された一層の厚みに相当する高さであることが好ましい。この作業を繰り返すことにより、溶着済の熱可塑性樹脂が順次積層される。
【００３９】
未溶着の混合粉体層の除去は、ブロワーやエアダスターを用いた気体の吹きかけにより行うことができ、必要に応じて水を用いた洗浄や超音波振動の付与等を行ってもよい。
非特許文献１〜３に記載の発明等では、本段階において担体中の空隙を確保するため塩化ナトリウムやポリグリコール酸の溶出及び洗浄が必要となる結果、さらなる工程、手間、及び時間を要する。具体的には、溶出には超音波洗浄や減圧処理のための特別な装置が必要となる上、レーザー焼結後に空隙や空洞を有する所望の３次元組織工学担体を得るには洗浄及び溶出のための労力と１２時間以上の時間が更に必要である。また、塩化ナトリウムやポリグリコール酸が残存した状態の担体を細胞培養や生体内で用いた場合、高濃度の塩化ナトリウムやポリグリコール酸の加水分解で生じたグリコール酸が細胞や組織の育成を阻害する虞があり、洗浄及び溶出には注意が必要である。
一方本発明の製造方法では、フィラーの洗浄や溶出などの、特別な装置、労力、及び時間を要する工程は不要となる結果、工程完了までの時間やコストを短縮することが可能となる。また、組織工学用担体の内部空洞や内部空隙部分に存在するのは熱可塑性樹脂粉体である。上述したように熱可塑性樹脂粉体としては、生体や細胞に影響を与え難い材料が選択され、生体内で用いられることを前提として設計されているため、除去されるべき部位の熱可塑性樹脂粉体が担体内に若干量残留した場合にも、細胞や組織の育成を阻害する虞がない。
【００４０】
本発明の製造方法により得られる組織工学用担体は、空隙において細胞の培養を行う観点から、空隙率が体積割合において４０〜９９％であることが好ましく、５０〜９８％がより好ましく、７０〜９５％がさらに好ましい。上記下限値以上とすることにより、細胞が培養されるスペースを確保することができ、且つ、細胞を高密度で所望の形状に配置させることができる。また、上記上限値以下とすることにより、組織工学用担体の機械的強度を保つことができる。
本発明において「空隙率」（空孔率；％）は、「空隙率（％）＝｛１−（造形物のかさ密度／材料の真密度）｝×１００」で算出される。
【００４１】
［組織工学用担体］
本発明の第二の態様である組織工学用担体は、前記第一の態様の製造方法によって得られるものであって、高い空隙率、及び、微細な内部空洞等の３次元構造を所望に応じて有し得るものである。また、本発明の組織工学用担体は、細胞培養等に必要な強度を有し得るものである。
このような組織工学用担体は、上述のように再生医療用の細胞培養担体として利用可能であって、例えば、空隙を細胞培養に、空洞を酸素や栄養分の流路として用いることが可能である。
【００４２】
本発明の組織工学用担体の一の態様は、高い空隙率を有する組織工学用担体であって、その空隙率は第一の態様において好ましい空隙率として挙げた割合と同様である。
また、本発明の組織工学用担体の一の態様は、微細な流路を有する組織工学用担体であって、当該担体を貫通する１以上の流路を有し、該流路の内径は２０００μｍ以下であり、１０〜１０００μｍがより好ましく、１０〜２００μｍ以下がさらに好ましい。
さらに、本発明の組織工学用担体の一の態様は、内部で細胞培養を行う際に耐えうる強度を有するものである。具体的には、０．５〜１０ｃＰの粘度を有する培養液を、流速５ｍＬ／分で、内径１０００μｍ、長さ５０ｍｍの内部微細流路内に１月間流通させた場合にも担体内部構造の破壊が認められない強度を有する。担体内部構造の破壊の有無は、溶液流通試験の後に流路断面を顕微鏡等で観察することにより判断することができる。
【００４３】
また、本発明の第三の態様の組織工学用担体は、生分解性の熱可塑性樹脂を構造材料として成る組織工学用担体であって、当該組織工学用担体の内部を貫通する１以上の流路を有し、該流路の内径は２０００μｍ以下であり、該組織工学用担体の空隙率が体積割合において４０〜９９％であり、０．５〜１０ｃＰの粘度を有する培養液を、流速５ｍＬ／分で、内径１０００μｍ、長さ５０ｍｍの当該組織工学用担体内部の流路内に１月間流通させた場合に担体内部構造の破壊が認められない強度を有する。
第三の態様における「熱可塑性樹脂」、「流路」、「空隙率」は、前記第一の態様、第二の態様の説明と同様である。
第三の態様において、「熱可塑性樹脂を構造材料として成る」とは、熱可塑性樹脂を主材料として形成されたことを意味し、例えば、主材料としての熱可塑性樹脂と、光吸収剤と、任意の添加剤とからなる組織工学用担体が挙げられる。任意の添加剤としては、第一の態様の説明において「熱可塑性樹脂及び光吸収剤以外の添加剤」として挙げたものと同様である。
第三の態様の組織工学用担体は、第一の態様の組織工学用担体の製造方法と同様にして得ることができる。
【００４４】
［多孔質体の製造方法］
本発明の第四の態様である多孔質体の製造方法は、熱可塑性樹脂粉体、及び光吸収剤を含有する組成物からなる粉体層を形成する粉体層形成工程、及び前記粉体層に対して選択的に露光を行い、前記粉体層の少なくとも一部を溶着させる露光工程を有するものであって、前記粉体層形成工程及び前記露光工程をこの順に繰り返すことにより３次元構造を備える多孔質体を製造が製造される。
第四の態様における粉体層形成工程、露光工程及びこれら工程を繰り返す繰り返し工程、並びに、これら工程に用いられる材料は、上記第一の態様で説明したものと同様である。本態様により製造された多孔質体の用途は特に限定されるものではない。
【００４５】
［多孔質体］
本発明の第五の態様である多孔質体は、熱可塑性樹脂から成る多孔質体であって、当該多孔質体の内部を貫通する１以上の通路を有し、該通路の内径は２０００μｍ以下であり、当該多孔質体の空隙率が体積割合において４０〜９９％である。
第五の態様における「熱可塑性樹脂」、「空隙率」は、前記第一〜第四の態様の説明と同様である。第五の態様における「通路」は、第一の態様における「流路」と同義である。また、第五の態様における「熱可塑性樹脂を構造材料として成る」は、第三の態様の説明と同様である。
第五の態様の多孔質体は、第四の態様の多孔質体の製造方法と同様にして得ることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００４７】
［実施例１］
ファイバーレーザー焼結造形装置を用いて造形を行い、得られる構造体の特性について検討を行った。
粉体組成物として平均粒子径３９μｍのＰＣＬ（ポリカプロラクトン；ＣＡＰＡ６５００（商品名）、Ｐｅｒｓｔｏｒｐ社製）粉末を熱可塑性樹脂粉体（主材料）とし、光吸収剤として平均粒子径１０μｍの粉末状顔料（ＯＲＩＰＡＣＳ  ＬＳ−１（商品名）、オリヱント化学工業社製）を配合した。光吸収剤は、ＰＣＬに対して０．５質量％配合した。ＰＣＬの粒度分布は、マイクロトラックＭＴ３０００ＩＩ（マイクロトラック・ベル社製）を用いて測定した。用いたＰＣＬの粒度分布を図３に、粉体組成物の光学顕微鏡写真を図４に示す。図４中の黒点が光吸収剤である。
レーザー焼結造形装置の造形サイズは１０ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍであり、熱源は波長１．０７μｍのイッテルビウムドープドシリカファイバーレーザーである。
【００４８】
以下に示すファイバーレーザーの露光条件において、図５Ａに示す円筒形構造体の造形を試みた。
・レーザーパワー：３．６Ｗ
・スポット径：４０μｍ
・走査間隔：４０μｍ
・走査速度：１．５３ｍ／ｓ
・単位面積当たりの供給エネルギー量：５９．２ｋＪ／ｍ２
・積層厚さ：１００μｍ
より具体的には、粉体組成物からなる層を形成した後、当該層に対して選択的にファイバーレーザー露光を行い、この工程を繰り返した後、未焼結組成物を除去した。
得られた構造体の光学顕微鏡写真を図５Ｂ（側面視写真）及び図５Ｃ（上面視写真）に示す。測定を行ったところ、円筒中央を長手方向に貫通する孔の孔径は、呼び寸法３００μｍに対して、１６０μｍであった。また、得られた構造体の空隙率は７０％であった。
【００４９】
［実施例２］
ファイバーレーザー焼結造形装置を用いて造形を行い、空隙率が高くなる条件に関して検討を行った。
実施例１で用いられた粉体組成物、及びレーザー焼結造形装置を用い、下記の条件にて１０ｍｍ×１０ｍｍ×４ｍｍの直方体の製造を試みた。
・レーザーパワー：０．４６Ｗ、１．４Ｗ、２．４Ｗ、又は３．７Ｗ
・スポット径：５３μｍ
・走査間隔：４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍ、又は１５０μｍ
・走査速度：１．５３ｍ／ｓ
【００５０】
レーザー焼結においては、露光面積や造形物の形状が、得られる造形物の空隙率に影響を及ぼす。そのため、１０ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍの直方体造形時に最も高い空隙率が得られた条件を用いて、図６に示す縦及び高さが１０ｍｍであり、幅が４ｍｍ、６ｍｍ、８ｍｍ又は１０ｍｍである直方体を製造し、空隙率を測定した。結果を図７に示す。
【００５１】
図７に示す結果から、直方体幅を変化させた場合にも、空隙率に大きな変化は現れないことが確認できた。
【００５２】
［実施例３］
ファイバーレーザー焼結造形装置を用いて造形を行い、空隙率が高くなる条件に関して引き続き検討を行った。
実施例２と同様の条件において、レーザーパワーと走査間隔を変化させて造形し、空孔率を測定した結果を表１に示す。また、この時の単位面積当たりの供給エネルギー量と造形物の空隙率との関係を図８に示す。
【００５３】
【表１】
2017039253.tif 000003
【００５４】
上記検討の結果、単位面積当たりの供給エネルギー量が低いほど、空隙率が高くなる傾向が認められ、単位面積当たりの供給エネルギー量２６．１ｋＪ／ｍ２において７３％の空隙率を確認した。一方、単位面積当たりの供給エネルギー量が２２．４ｋＪ／ｍ２以下の場合は、粉体組成物が露光後も粉体のままであって溶着せず、造形ができなかった。
また、実施例１で用いられた粉体組成物、及びレーザー焼結造形装置を用い、下記の条件で露光する前後の粉体組成物を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。
・レーザーパワー：２．４Ｗ
・スポット径：５０μｍ
・走査間隔：６０μｍ
・走査速度：１．５３ｍ／ｓ
・単位面積当たりの供給エネルギー量：２６．１ｋＪ／ｍ２
・層厚さ：１００μｍ
図９Ａ（露光前）及び図９Ｂ（露光後）に示すＳＥＭ画像から、露光後のＰＣＬは粒子の形状を保ちつつ、粒子表面が部分的に他の粒子と結合していることが確認できた。加えて、同様の露光後粉体組成物を光学顕微鏡により観察した写真を図１０に示す。
【００５５】
本発明では、粉体内に均一に点在する光吸収剤周辺でのみ露光によって温度が上昇するため、熱可塑性樹脂粒子は完全に溶融せず、光吸収剤と接触する表面のみが部分的に溶融、結合するため、上記のような粒子形状を維持した結合状態が得られると考えられる。そして、このような結合状態によって、溶着後の構造体（担体）は、露光前の粉体と同等の高い空隙率を維持できる上、高い空隙率にも関わらず細胞培養に必要な機械的強度を維持できると考えられる。
また、空隙率が高いにも関わらず、構造を保つ強度が得られるのは、図９Ｂに示されるようなＰＬＣ粒子同士の点による結合の３次元網目が張り巡らされているためであると考えられる。
【００５６】
なお、上記実施例１〜３において、直方体の試料は円筒型モジュールに比べて、単位面積当たり供給エネルギーが低下していた。露光面積が大きいほど造形物周辺の造形床の温度が高くなり、少ない単位面積当たり供給エネルギーでも溶融や結合が生じると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の組織工学用担体の製造方法によって得られた組織工学用担体は、組織工学を利用する再生医療分野において好適に利用可能である。
【符号の説明】
【００５８】
１Ａ  熱可塑性樹脂粉体
１Ｂ  溶着済熱可塑性樹脂
２  光吸収剤
３  露光部
４  未露光部
５  空隙
６  空洞
７  空隙
１０  混合粉体層
２０  組織工学用担体
【図１】
2017039253.tif 000004
【図２】
2017039253.tif 000005
【図３】
2017039253.tif 000006
【図６】
2017039253.tif 000007
【図７】
2017039253.tif 000008
【図８】
2017039253.tif 000009
【図４】
2017039253.tif 000010
【図５】
2017039253.tif 000011
【図９】
2017039253.tif 000012
【図１０】
2017039253.tif 000013