(57)【要約】      （修正有）【課題】新規糖鎖ライブラリー、並びにその製造方法及びその使用の提供。【解決手段】２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む新規糖鎖ライブラリー、並びにその製造方法及びその使用。ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞に、特定の化合物を投与する工程を含む、糖鎖ライブラリー製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させた繊維芽細胞に、下記一般式(Ｉ)で表される化合物を投与する工程を含む、糖鎖ライブラリー製造方法。
式（Ｉ）；Ｘｙｌ−Ａｍ−Ｌ−Ｒ−Ｘ
（式中、Ａｍは、ヒドロキシ基を有するアミノ酸、または、前記アミノ酸中のカルボキシ基が、カルバミル基で置換されているアミノ酸誘導体であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−、または、−ＮＨ−であり；
Ｒは、炭素主鎖の炭素数が６から２０であるアルキル基、または、前記アルキル基中の一部の−ＣＨ2−ＣＨ2−が、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣＯ−、または、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されているアルキル基誘導体であり；
Ｘは、−Ｈ、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ2、および、−ＣＨ＝ＣＨ2からなる群から選択される基であって；
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌのヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合、または、エーテル結合を形成し；
Ａｍ−Ｌ結合は、Ａｍのカルボキシ基とＬの−ＮＨ−との間で、または、Ａｍのアミノ基またはカルバミル基とＬの−Ｃ（Ｏ）−との間で、アミド結合を形成する。）
【請求項２】
前記繊維芽細胞がＮＢ１ＲＧＢ細胞である、請求項１に記載の糖鎖ライブラリー製造方法。
【請求項３】
前記ヒドロキシ基を有するアミノ酸が、SerまたはThrである、請求項１または２に記載の糖鎖ライブラリー製造方法。
【請求項４】
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌの１位のヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合を形成している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー製造方法。
【請求項５】
前記一般式(Ｉ)で表される化合物は、下記化学式（ＩＩ）〜（Ｖ）から選択される化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー製造方法。
【化１】
2017160161.tif 000005
【請求項６】
前記糖鎖ライブラリーが、２位が硫酸化されたイズロン酸および／または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー製造方法によって製造された糖鎖ライブラリー。
【請求項８】
請求項７に記載の糖鎖ライブラリーから部分的にまたは完全に精製された、２位が硫酸化されたイズロン酸および／または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物。
【請求項９】
ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の糖鎖ライブラリーまたは請求項８に記載の糖鎖伸長生成物を含有する、ムコ多糖症の診断基質。
【請求項１１】
前記ムコ多糖症がＩＩ型および／またはＶＩ型である、請求項１０に記載のムコ多糖症の診断基質。
【請求項１２】
糖鎖合成細胞の検定方法であって、
ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させた組換え細胞を製造する工程と、
前記組換え細胞に下記一般式(Ｉ)で表される化合物を投与する工程と、
式（Ｉ）；Ｘｙｌ−Ａｍ−Ｌ−Ｒ−Ｘ
（式中、Ａｍは、ヒドロキシ基を有するアミノ酸、または、前記アミノ酸中のカルボキシ基が、カルバミル基で置換されているアミノ酸誘導体であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−、または、−ＮＨ−であり；
Ｒは、炭素主鎖の炭素数が６から２０であるアルキル基、または、前記アルキル基中の一部の−ＣＨ2−ＣＨ2−が、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣＯ−、または、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されているアルキル基誘導体であり；
Ｘは、−Ｈ、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ2、および、−ＣＨ＝ＣＨ2からなる群から選択される基であって；
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌのヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合、または、エーテル結合を形成し；
Ａｍ−Ｌ結合は、Ａｍのカルボキシ基とＬの−ＮＨ−との間で、または、Ａｍのアミノ基またはカルバミル基とＬの−Ｃ（Ｏ）−との間で、アミド結合を形成する。）
前記化合物が投与された前記組換え細胞が、２位が硫酸化されたイズロン酸または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物を合成したかどうか検定する工程と、を含む検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規糖鎖ライブラリー、並びにその製造方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、ライソゾームに存在する、グリコサミノグリカンを分解する酵素の先天的な欠損により生じる疾患であり、欠損酵素に対応して、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型の６種類が知られている。酵素の欠損によって分解できなくなったムコ多糖が体内に蓄積することにより様々な症状を引き起こすため、新生児のうちに病気が発見できて治療を開始できれば、病気の進行を食い止めることができる。しかしながら、新生児マススクリーニングのような早期診断に使える診断薬の開発は遅れている。
【０００３】
一方、糖鎖プライマー法を用いて動物細胞で糖鎖を合成する方法が開発されている。特に、生体において広く存在しているコンドロイチン硫酸（ＣＳ）型のグリコサミノグリカン鎖（GAG、−[4GlcAβ1−3GalNAc(6S)β1]n−）や、へパラン硫酸（ＨＳ）型の（GAG、−[3GlcAβ1−4 GlcNAc(6S)α1]n−）を得るためのプライマーも開発された（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、これまでのところ、糖鎖プライマー法を用いて、患者の多いムコ多糖症ＩＩ型やＶＩ型の基質となり得る糖鎖、即ち２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を得ることができていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２０９０４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む新規糖鎖ライブラリー、並びにその製造方法及びその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる一実施態様は、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させた繊維芽細胞に、下記一般式(Ｉ)で表される化合物を投与する工程を含む、糖鎖ライブラリー製造方法である。
【０００７】
式（Ｉ）；Ｘｙｌ−Ａｍ−Ｌ−Ｒ−Ｘ
（式中、Ａｍは、ヒドロキシ基を有するアミノ酸、または、前記アミノ酸中のカルボキシ基が、カルバミル基で置換されているアミノ酸誘導体であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−、または、−ＮＨ−であり；
Ｒは、炭素主鎖の炭素数が６から２０であるアルキル基、または、前記アルキル基中の一部の−ＣＨ2−ＣＨ2−が、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣＯ−、または、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されているアルキル基誘導体であり；
Ｘは、−Ｈ、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ2、および、−ＣＨ＝ＣＨ2からなる群から選択される基であって；
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌのヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合、または、エーテル結合を形成し；
Ａｍ−Ｌ結合は、Ａｍのカルボキシ基とＬの−ＮＨ−との間で、または、Ａｍのアミノ基またはカルバミル基とＬの−Ｃ（Ｏ）−との間で、アミド結合を形成する。）
上記方法において、前記繊維芽細胞がＮＢ１ＲＧＢ細胞であってもよい。前記ヒドロキシ基を有するアミノ酸が、SerまたはThrであってもよい。Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌの１位のヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合を形成していてもよい。前記一般式(Ｉ)で表される化合物は、下記化学式（ＩＩ）〜（Ｖ）から選択される化合物であってもよい。
【０００８】
【化１】
2017160161.tif 000002
【０００９】
前記糖鎖ライブラリーが、２位が硫酸化されたイズロン酸および／または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物を含んでもよい。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、上記糖鎖ライブラリー製造方法によって製造された糖鎖ライブラリーである。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、上記糖鎖ライブラリーから部分的にまたは完全に精製された、２位が硫酸化されたイズロン酸および／または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物である。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞である。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、上記糖鎖ライブラリーまたは上記糖鎖伸長生成物を含有する、ムコ多糖症の診断基質である。前記ムコ多糖症がＩＩ型および／またはＶＩ型であってもよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、糖鎖合成細胞の検定方法であって、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）を強制発現させた組換え細胞を製造する工程と、前記組換え細胞に上記一般式(Ｉ)で表される化合物を投与する工程と、前記化合物が投与された前記組換え細胞が、２位が硫酸化されたイズロン酸または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（GAG）を有する糖鎖伸長生成物を合成したかどうか検定する工程と、を含む検定方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む新規糖鎖ライブラリー、並びにその製造方法及びその使用を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る一実施例において、組み換え細胞から得られた糖鎖伸長生成物のＬＣ／ＭＳの結果を示した図である。結果は、＋が多いほど割合が多く、−は検出されなかったことを示す。
【図２】本発明に係る一実施例において、（Ａ）コンドロイチン硫酸ＢをコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した場合の二糖解析の結果、及び（Ｂ）Xyl-Ser-C12をＮＢ１ＲＧＢ細胞に投与して得られた糖鎖伸長生成物をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した場合の二糖解析の結果、を示した図である。図中、ΔＨｅｘＡ、ＨｅｘＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃは、それぞれ不飽和ヘキスロン酸、Ｎ-アセチルヘキソサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミンを表す。また、２Ｓ、４Ｓ、６Ｓは２-Ｏ-硫酸、４-Ｏ-硫酸、６-Ｏ-硫酸を表す。
【図３】（Ａ）ΔＨｅｘＡ２Ｓ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ（ΔＣＳ−２Ｓ４Ｓとも記される）の構造式を示した図である。（Ｂ）本発明に係る一実施例において、組み換え細胞から得られた糖鎖伸長生成物をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した場合の二糖解析の結果を示した図である。
【図４】本発明に係る一実施例において、組み換え細胞から得られた糖鎖伸長生成物をコンドロイチナーゼＢで処理した場合の二糖解析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１８】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾した方法や改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾した方法や改変した方法に加えて、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２０】
＝＝糖鎖プライマーとなる化合物＝＝
本発明に係る糖鎖プライマーは、下記一般式(Ｉ)で表される化合物である。
【００２１】
式（Ｉ）；Ｘｙｌ−Ａｍ−Ｌ−Ｒ−Ｘ
（式中、Ａｍは、ヒドロキシ基を有するアミノ酸、または、前記アミノ酸中のカルボキシ基が、カルバミル基で置換されているアミノ酸誘導体であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−、または、−ＮＨ−であり；
Ｒは、炭素主鎖の炭素数が６から２０であるアルキル基、または、前記アルキル基中の一部の−ＣＨ2−ＣＨ2−が、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣＯ−、または、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されているアルキル基誘導体であり；
Ｘは、−Ｈ、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ2、および、−ＣＨ＝ＣＨ2からなる群から選択される基であって；
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌのヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合（−Ｏ−Ｃ−Ｏ−）、または、エーテル結合（−Ｏ−）を形成し；
Ａｍ−Ｌ結合は、Ａｍのカルボキシ基とＬの−ＮＨ−との間で、または、Ａｍのアミノ基またはカルバミル基とＬの−Ｃ（Ｏ）−との間で、アミド結合（−ＮＨＣＯ−）を形成する。）
Ｘｙｌは、下式のＤ−キシロースである。
【００２２】
【化２】
2017160161.tif 000003
【００２３】
前記ヒドロキシ基を有するアミノ酸の種類は特に限定されないが、入手が容易であることからαアミノ酸であることが好ましく、さらに、生体のタンパク質を構成するアミノ酸である、セリン（Ser）またはスレオニン（Thr）であることがより好ましい。
【００２４】
ヒドロキシ基を有するアミノ酸の立体構造は特に限定されず、Ｌ体であっても、Ｄ体であっても、また、これらエナンチオマーの混合物であっても良いが、Ｌ体であることが好ましい。複数の不斉点を持つ、ヒドロキシ基を有するアミノ酸にあっては、Ｌ体であっても、Ｄ体であっても、ジアステレオマーであっても良く、また、これらエナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、または、エナンチオマーとジアステレオマーとの混合物であっても良いが、Ｌ体であることが好ましい。
【００２５】
例えば、Serの場合には、Ｌ−Serであっても、Ｄ−Serであっても、また、Ｌ−SerとＤ−Serとの混合物（例えば、ラセミ体のSer）であっても良いが、Ｌ−Serであることが好ましい。Thrの場合には、Ｌ−Thr（(2S,3R)-Thr）であっても、Ｄ−Thr（(2R,3S)-Thr）であっても、(2S,3S)-Thrであっても、(2R,3R)-Thrであっても良く、また、Ｌ−ThrとＤ−Thrとの混合物（例えば、ラセミ体のThr）であっても、(2S,3S)-Thrと(2R,3R)-Thrとの混合物であっても、Ｌ−Thrおよび／またはＤ−Thrと(2S,3S)-Thrおよび／または(2R,3R)-Thrとの混合物であっても良いが、Ｌ−Thrであることが好ましい。
【００２６】
前記炭素主鎖の炭素数が６から２０であるアルキル基は特に限定されず、直鎖アルキル基であっても、分岐アルキル基であっても良い。また、前記炭素数は、６から２０であれば特に限定されないが、８から１６であることが好ましく、１０から１４であることが特に好ましい。
【００２７】
Ｘｙｌ−Ａｍ結合は、Ｘｙｌのいずれのヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間で、アセタール結合、または、エーテル結合を形成しても良いが、Ｘｙｌの１位のヒドロキシ基とＡｍのヒドロキシ基との間でアセタール結合を形成していることが好ましい。
【００２８】
一般式(Ｉ)で表される化合物は、下記化学式（ＩＩ）〜（Ｖ）から選択される化合物であっても良い。なお、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物を、以下、Xyl-Ser-C12とも称する。
【００２９】
【化３】
2017160161.tif 000004
【００３０】
＝＝糖鎖プライマーとなる化合物の製造方法＝＝
上述の化合物は、当業者に公知の技術を用いて合成することができる。
【００３１】
例えば、Ｎα−ラウリル−Ｏ−（β−Ｄ−キシロピラノシル）−Ｌ−セリン−アミド（以下、Xyl-Ser-C12と称する）は、Ｄ−キシロースから次の方法で合成することができる。
【００３２】
まず、Ｄ−キシロースに、無水酢酸と酢酸ナトリウムとを作用させることによって、テトラアセチル体へと変換する。テトラアセチル体に、ピペリジンと酢酸とを作用させることによって、１位の水酸基を選択的に遊離の状態にする。
【００３３】
このようにして調製した２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−キシロピラノースにおける遊離の１位の水酸基に、トリクロロアセトニトリルを作用させることによって、トリクロロアセトイミデートへと変換する。トリクロロアセトイミデートに、CbZ-L-Ser-NH2とBF3・Et2Oとを作用させた後、引続き、TMSOTfで処理することによって、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロピラノシル）−Ｌ−セリン−アミドが調製できる。なお、例えば、CbZ-L-Ser-NH2の代わりに、構造または立体構造が異なる、ヒドロキシ基を有するアミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸誘導体を用いることによって、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロピラノシル）−アミノ酸、または、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロピラノシル）−アミノ酸−アミドを調製できる。
【００３４】
得られたＮα−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロピラノシル）−Ｌ−セリン−アミドのＣｂｚ基を、水素添加によって脱保護した後に、遊離の状態となったアミノ基に、ＴＥＡ、ＥＤＣおよびＨＯＢｔの存在下でラウリン酸を作用させる。最後に、ナトリウムメトキシドを作用させ、アセチル基を脱保護することによって、Xyl-Ser-C12を合成することができる。なお、例えば、ラウリン酸の代わりに、炭素数が異なる飽和脂肪酸や、飽和脂肪酸の一部の−ＣＨ2−ＣＨ2−が、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨＣＯ−、または、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されている飽和脂肪酸誘導体、または、これら飽和脂肪酸または飽和脂肪酸誘導体の、カルボキシ基とは反対側の末端の−Ｈが、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ2、および、−ＣＨ＝ＣＨ2からなる群から選択される基で置換されている誘導体を作用させることによって、Xyl-Ser-飽和脂肪酸、Xyl-Ser-飽和脂肪酸誘導体、または、Xyl-Ser-飽和脂肪酸または飽和脂肪酸誘導体の上記誘導体、を合成することができる。
【００３５】
＝＝糖鎖プライマー法で用いる糖鎖合成細胞＝＝
本発明に係る糖鎖プライマー法で用いる糖鎖合成細胞は、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（uronyl 2-O-sulfotransferase；ＵＳＴ）（ＥＣ：２．８．２．−）を強制発現させた繊維芽細胞である。強制発現させる発現レベルは特に限定されず、糖鎖ライブラリーを合成できる有効量であればよい。
【００３６】
繊維芽細胞が由来する動物は、ヒト、サル、ラット、マウスなど、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。繊維芽細胞が由来する組織も、胎児や成体の結合組織など、特に限定されないが、皮膚であることが好ましい。繊維芽細胞は、培養細胞であることが好ましく、初代培養細胞であっても、樹立された株化培養細胞であってもよいが、正常ヒト皮膚繊維芽細胞であるＮＢ１ＲＧＢ細胞であることが好ましい。
【００３７】
ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素は、デルマタン硫酸のイズロン酸の２位に硫酸基を転移する酵素である。この酵素が由来する動物は、ヒト、サル、ラット、マウスなど、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素をコードする遺伝子（ＵＳＴ遺伝子）の繊維芽細胞での強制発現方法は特に限定されず、当業者に周知の方法を用いればよい。ＵＳＴ遺伝子が由来する動物は、ヒト、サル、ラット、マウスなど、特に限定されないが、ヒト（Gene ID: 10090）であることが好ましい。
【００３８】
＝＝糖鎖の合成方法＝＝
糖鎖プライマーとなる上記化合物を、上記糖鎖合成細胞に投与することによって、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたN-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む多種類の糖鎖伸長生成物を効率よく合成することができる。
【００３９】
糖鎖プライマーとなる化合物を糖鎖合成細胞に投与する方法は、特に限定されないが、例えば、少量のＤＭＳＯなどの溶媒に溶解させた糖鎖プライマーとなる化合物を、糖鎖合成細胞を培養するための培地中に添加することによって、投与してもよい。
【００４０】
このようにして添加した糖鎖プライマーは、糖鎖合成細胞を培養している間に、糖鎖合成細胞に取り込まれる。そして、取り込まれた糖鎖プライマーに糖が付加されることによって、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたN-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む多種類の糖鎖が培養液中に産生される。この合成された多種類の糖鎖を糖鎖ライブラリーとして用いることができる。
【００４１】
培養液中に産生された２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたN-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物は、例えば、カラムクロマトグラフィー法や固相抽出法などを用いて、部分的にまたは完全に精製及び／又は単離することができる。
【００４２】
＝＝ムコ多糖症の診断基質＝＝
２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたN-アセチルガラクトサミンは、それぞれ、ムコ多糖症のＩＩ型及びＩＶ型で欠損しているIduronate-2-sulfataseとN-Acetylgalactosamine-4-sulfataseが作用する構造なので、これらの構造を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を含む糖鎖ライブラリーを診断基質として用いることで、ムコ多糖症のＩＩ型及びＩＶ型を検査できる。なお、この糖鎖ライブラリーを部分的にまたは完全に精製及び／又は単離して得られた糖鎖伸長生成物を診断基質として用いることもできる。
【００４３】
具体的には、例えば、診断対象から血液を採取し、糖鎖伸長生成物である診断基質と接触させる。そして、血液中の酵素と診断基質を適切な反応条件の下で反応させ、診断基質の量が減るかどうか、及び／又は分解産物の量が増えるかどうか、調べる。例えば、ＬＣ−ＭＳなどにより、診断基質の量や分解産物の量を調べることができる。
【００４４】
具体的には、例えば、以下のように診断できる。（１）イズロン酸の２位が硫酸化され、N-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されていないＧＡＧを有する糖鎖伸長生成物を診断基質にした場合、イズロン酸の２位が硫酸化され、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されていないＧＡＧを有する糖鎖が（１−１）減少すればムコ多糖症のＩＩ型については健常であり、（１−２）減少しなければムコ多糖症のＩＩ型に罹患している。また、（２）イズロン酸の２位が硫酸化されず、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖伸長生成物を診断基質にした場合、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖が（２−１）減少すればムコ多糖症のＶＩ型については健常であり、（２−２）減少しなければムコ多糖症のＶＩ型に罹患している。また、（３）イズロン酸の２位とＮ-アセチルガラクトサミンの４位の両方が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖伸長生成物を診断基質にした場合、（３−１）イズロン酸の２位とＮ-アセチルガラクトサミンの４位の両方が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖が減少した上に、（３−１−１）イズロン酸の２位が硫酸化され、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されていないＧＡＧを有する糖鎖が増加すれば、ムコ多糖症のＩＩ型に罹患しているが、ＶＩ型については健常であり、（３−１−２）イズロン酸の２位が硫酸化されず、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖が増加すれば、ムコ多糖症のＩＩ型については健常であり、ＶＩ型に罹患しており、（３−１−３）イズロン酸の２位が硫酸化され、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されていないＧＡＧを有する糖鎖も、イズロン酸の２位が硫酸化されず、Ｎ-アセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖も減少すれば、ムコ多糖症のＩＩ型についてもＶＩ型についても健常であり、（３−２）イズロン酸の２位とＮ-アセチルガラクトサミンの４位の両方が硫酸化されているＧＡＧを有する糖鎖が減少しなければ、ムコ多糖症のＩＩ型とＶＩ型の両方に罹患している。
【００４５】
ムコ多糖症は、上記酵素の欠損によって分解できなくなったムコ多糖が体内に蓄積することにより様々な症状を引き起こすため、本発明に係る診断基質に用いることにより、早期のうちに病気が発見できて治療を開始でき、病気の進行を食い止めることが可能となる。
【００４６】
＝＝糖鎖合成細胞の検定方法＝＝
本発明に係る糖鎖合成細胞の検定方法は、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素を強制発現させた組換え培養細胞に上記糖鎖プライマーを投与する工程と、糖鎖プライマーが投与された組換え細胞が、２位が硫酸化されたイズロン酸または４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を合成したかどうか検定する工程と、を含む。組換え培養細胞の製造方法は、繊維芽細胞を用いて糖鎖合成細胞を作製した上記方法と同様であるが、本検定方法では、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素を強制発現させるのに用いる培養細胞として、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を用いてもよく、ＮＢ１ＲＧＢ細胞以外の細胞を用いてもよく、繊維芽細胞以外の細胞を用いてもよい。目的の糖鎖伸長生成物を合成したかどうか検定する方法は特に限定されず、例えば、ＬＣ−ＭＳなどを利用することができる。
【００４７】
この方法によって、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素を強制発現させた組換え培養細胞が、糖鎖プライマー法によって、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を合成することができるかどうかを検定することができる。
【００４８】
また、複数の種類の組換え培養細胞で検定することによって、それらの細胞の中から、２位が硫酸化されたイズロン酸や４位が硫酸化されたＮ-アセチルガラクトサミンを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有する糖鎖伸長生成物を合成することができる細胞をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］レトロウイルスベクターの作製
本実施例では、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素を強制発現させるためのレトロウイルスベクターを作製した。
【００５０】
まず、ＮＢ１ＲＧＢ細胞からtotal RNAをRNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。次に、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社）を用いて１μgのtotal RNAからcDNAを合成した。下記プライマーを用いてＰＣＲを行い、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素をコードするcDNAのフラグメントを増幅した（なお、プライマー中の下線は、NotI（一本下線）とXho I（２本下線）の認識配列を示す。）。ＰＣＲは、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TAKARA社）を用いて９８℃１０秒、 ６２℃５秒、６８℃２分のサイクルを３５サイクル行った。
【００５１】
Forward: ATAAGAATGCGGCCGATGAAGAAGAAGCAGCAGCATCCC（配列番号１）
Reverse: CCGCTCGAGTCACCTCTTATAAATATCTTCCAGCCACTTTTC（配列番号２）
ＰＣＲ産物（１２４５ｂｐ、うちコーディング領域１２２１ｂｐ（配列番号３）の精製は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (#A9282, Promega社) を用いて行った。精製したＰＣＲ産物を、StrataClone Ultra Blunt PCR Cloning Kit （Agilent Technologies社）を用いてpCS-B-amp-kanベクターへクローニングした（以下、作製したベクターをｐＵＳＴと称する）。目的の配列がクローニングされていることは制限酵素EcoRIで処理することでクローニングサイトを切り出して、遺伝子配列の解析を行うことで確認した。そして、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のコーディング領域を、NotI／XhoIで切り出し、レトロウイルスベクターpGCDNsam-IRES/EGFPの同じ制限酵素部位に挿入した（以下、作製した発現ベクターをpGCDNsam-UST-IRES/EGFPと称する）。
【００５２】
［実施例２］レトロウイルスの作製とＮＢ１ＲＧＢ細胞の形質転換
まず、１０μgのpGCDNsam-UST-IRES/EGFPを２９３ｇｐ２細胞にLipofectamine LTX with PLUS Reagent（Life Technologies社）を用いてリポフェクションした。４８時間と７２時間後に培養上清１０ｍＬを回収し、Millex-HV filter（0.45 μm, SLHV033RB, Millipore社）を用いて夾雑物を除去した後、４℃、６０００ｘｇで終夜遠心分離することによってウイルスを沈殿させた。その後、上清を除去し、ペレットに無血清ＤＭＥＭ３００μＬを加えて４℃で振とうし、ペレットを再度溶解した。
【００５３】
次に、１×１０5個／ウエルとなるように６ウエル・プレートにＮＢ１ＲＧＢ細胞を播種してプレート底面に接着させ、そこに、得られたレトロウイルスを４０μＬ加え、さらに０．８ｍｇ／ｍＬポリブレン（SIGMA社）２０μＬ，１ＭＨＥＰＥＳ（Gibco社）４０μＬを加えた。３２℃、１０００ｘｇで６０分間遠心することで、ウイルスを細胞に感染させた。その後、上清を除去し、新しい培地を加え、３日間培養した。ウイルス感染３日後の細胞をＦＡＣＳ（Fluorescence activated cell sorting）で解析し、ソーティングによりＥＧＦＰ陽性細胞のみを回収した。
【００５４】
得られたＥＧＦＰ陽性細胞に対して、ウロニル２−Ｏ−硫酸基転移酵素が発現していることは、Light Cycler 480 （Roche社）を用いたリアルタイムRT-PCRおよびウエスタンブロティングによって確認された。
【００５５】
［実施例３］糖鎖プライマー法による糖鎖合成
Insulin-Transferrin-Selenium-A（ITSA）（51300-044, GIBCO社）を１％添加した無血清培地ＲＰＭＩ１６４０（Phenol Red(-), 11835-030, Gibco社, Lot 1171662）で細胞を洗浄した後、２×１０6個の細胞を、２５μＭのXyl-Ser-C12プライマー含有ＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬに再懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種し、４８時間培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄した後ＰＭＩ１６４０培地で細胞を回収し、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍ，４℃で５分間遠心分離し、糖鎖伸長生成物を含む上清を回収した。この上清からSep-pak C18を用いてメタノール１０ｍＬで糖鎖伸長生成物を単離した後、アミノカラムを用いて中性糖と酸性糖を分離した。
【００５６】
［実施例４］ＬＣ−ＭＳによる構造解析
本実施例では、ＵＳＴを強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞（ＮＢ１−ＵＳＴと称する）、およびコントロール細胞として、Kusabira-Orangeを強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞（ＮＢ１−ＫＯと称する）、緑色蛍光蛋白質ＥＧＦＰだけを強制発現させたＮＢ１ＲＧＢ細胞（ＮＢ１−ＥＧＦＰと称する）を用いた。
【００５７】
得られた糖鎖伸長生成物に対し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中でコンドロイチナーゼＡＢＣ（５００ｍＵ）と３７℃で３ｈ、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）中でヘパリチナーゼ（２ｍＵ）と３７℃で２４ｈ、または５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中でコンドロイチナーゼＢ（２ｍＵ）と３７℃で２４ｈ反応することで、酵素分解を行った。
【００５８】
酵素分解した糖鎖伸長生成物のＬＣ−ＭＳ測定は、Nexera UHPLC System（Shimadzu）を接続した四重極の質量装置（LC-MS8030 and LC-MS8040, Shimadzu）により行った。ＬＣでの分離にはHypercarb（particle size 3 μm, 2.1×150 mm, Thermo）を用いた。移動相には１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）（溶媒Ａ）と１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いた。測定試料は水で平衡化し、次の様なグラディエントで溶出した：溶媒 B: 0 min, 5%; 9 min, 18%; 10.5 min, 18%; 11 min, 70%; 11.5 min, 70%; 12 min, 5%; 23 min, 5%; 溶出速度は 0.15 ml/min; ＤＬ温度は 250℃; nebulizer gasの速度は3L/min; heat block temperatureは400℃; drying gasの速度は15L/ min、測定モードはpositive/negative ion mode。検出はmultiple reaction monitoring（ＭＲＭ）モードで行った。データの解析は Labsolutions（Shimadzu）で行った。図１に、ＬＣ−ＭＳの解析結果を示す。なお、各産物の割合は、ピーク面積の総面積に対する割合で計算した（ｎ＝３）（以降、数値のある場合は、平均値±Ｓ.Ｄ.で表す）。
【００５９】
２種類のコントロール細胞では、得られた糖鎖伸長生成物の傾向にはそれほど違いが見られなかった。しかし、ＮＢ１−ＵＳＴを用いた場合、７−１，９−２，１２ｂ、１４，１５など、硫酸化された糖鎖伸長生成物の種類や量が増加した。
【００６０】
［実施例５］糖鎖伸長生成物の二糖解析
実施例４で得られた糖鎖伸長生成物の構造解析として、二糖解析を行った。
【００６１】
標品としてコンドロイチン硫酸ＢをコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した場合の結果を図２（Ａ）に示した。この解析結果に基づいて、Xyl-Ser-C12をＮＢ１ＲＧＢ細胞に投与して得られた糖鎖伸長生成物の構造解析を行った結果を図２（Ｂ）に示した。表に示されたように、ΔＣＳ−２Ｓ４Ｓの割合は、約０．３％程度であった。なお、ΔＣＳ−２Ｓ４Ｓの構造式を図３（Ａ）に示す。
【００６２】
次に、組み換え細胞から得られた糖鎖伸長生成物の二糖解析を行った。図３（Ｂ）に結果を示すように、ΔＣＳ−２Ｓ４Ｓの割合は、他の細胞が約１％以下であったところ、ＮＢ１−ＵＳＴでは、約６％までに増加していた。
【００６３】
［実施例６］糖鎖伸長生成物の二糖解析
本実施例では、実施例４（糖鎖合成細胞として、ＮＢ１−ＵＳＴ及びＮＢ１−ＥＧＦＰを用いた場合）で得られた糖鎖伸長生成物の二糖解析として、デルマタン硫酸を選択的に切断し、デルマタン硫酸型の二糖を生じさせるコンドロイチナーゼＢで糖鎖伸長生成物を処理したところ、ΔＣＳ−０Ｓ、ΔＣＳ−６Ｓ、ΔＣＳ−２Ｓ４Ｓの３種類の二糖が検出された。
【００６４】
そこで、ＮＢ１−ＥＧＦＰで得られたΔＣＳ−０Ｓ、ΔＣＳ−６Ｓ、およびΔＣＳ−２Ｓ４Ｓの量を１とし、それぞれ得られた二糖の量を相対値で表した。その結果、図４で示すように、ＮＢ１−ＵＳＴではコントロール細胞より、有意に多いΔＣＳ−２Ｓ４Ｓが得られ、デルマタン硫酸型の二糖が合成されていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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