(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＩＲＰ−α（シグナル調節タンパク質α）変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物の組成物と使用方法の提供。【解決手段】ＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物であって、該ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞よりも、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７を選択的に結合する、ＳＩＲＰ−α変異体構築物。前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞にてＣＤ４７を結合するよりも高い親和性で、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物であって、該ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞よりも、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７を選択的に結合する、ＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２】
前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞にてＣＤ４７を結合するよりも高い親和性で、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする請求項１に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３】
前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は少なくとも１つのスペーサーによりブロッキングペプチドに付けられる、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４】
前記ブロッキングペプチドは、前記ＳＩＲＰ−α変異体に結合するよりも高い親和性で、野生型ＳＩＲＰ−αに結合する、ことを特徴とする請求項３に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項５】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、前記ブロッキングペプチドに結合するよりも高い親和性で、野生型ＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする請求項３又は４に記載のＳＩＲＰーα変異体構築物。
【請求項６】
前記ブロッキングペプチドはＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドである、ことを特徴とする請求項３乃至５の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項７】
前記ＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドは、ＣＤ４７の野生型のＩｇＳＦドメインの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）又はそのフラグメントと少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性を有する、ことを特徴とする請求項６に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項８】
前記ＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８又は４０の配列を有する、ことを特徴とする請求項６又は７に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項９】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、切断可能なリンカー及び随意に１以上のスペーサーによりブロッキングペプチドに付けられる、ことを特徴とする請求項３乃至８の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１０】
前記切断可能なリンカーは、酸性のｐＨ及び／又は低酸素の条件下で切断される、ことを特徴とする請求項９に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１１】
前記切断可能なリンカーは腫瘍関連酵素により切断される、ことを特徴とする請求項９又は１０に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１２】
前記腫瘍関連酵素はプロテアーゼである、ことを特徴とする請求項１１に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１３】
前記プロテアーゼは、マトリプターゼ（ＭＴＳＰ１）、尿型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、レグマイン、ＰＳＡ（ＫＬＫ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ−３とも呼ばれる）、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、ＭＭＰ９、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、及びプロテイナーゼ３（Ｐｒ３）から成る群から選択される、ことを特徴とする請求項１２に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１４】
前記プロテアーゼはマトリプターゼである、ことを特徴とする請求項１３に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１５】
前記切断可能なリンカーは、ＬＳＧＲＳＤＮＨの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）又は表７に列挙される配列の何れか１つを有する、ことを特徴とする請求項９乃至１４の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１６】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は抗体結合性ペプチドに付けられる、ことを特徴とする請求項１乃至１５の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１７】
前記抗体結合性ペプチドは、抗体の定常領域に可逆的又は不可逆的に結合する、ことを特徴とする請求項１６に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１８】
前記抗体結合性ペプチドは、抗体のフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）領域に可逆的又は不可逆的に結合する、ことを特徴とする請求項１６に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項１９】
前記抗体結合性ペプチドは、抗体の可変領域に可逆的又は不可逆的に結合する、ことを特徴とする請求項１６に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２０】
前記抗体はセツキシマブである、ことを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２１】
前記抗体結合性ペプチドは、疾患局在化ペプチド（ＤＬＰ）の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４又は６５）又はそのフラグメントと少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有する、ことを特徴とする請求項１６乃至２０の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２２】
前記抗体結合性ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有する、ことを特徴とする請求項２１に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２３】
前記ＳＩＲＰ−α変異体はＦｃドメインモノマーに付けられる、ことを特徴とする請求項１乃至２２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２４】
前記ＳＩＲＰ−α変異体はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付けられる、ことを特徴とする請求項１乃至２２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２５】
前記ＨＳＡは、ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）に相対的な、アミノ酸置換Ｃ３４Ｓ及び／又はＫ５７３Ｐを含む、ことを特徴とする請求項２４に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２６】
前記ＨＳＡは、ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）を有する、ことを特徴とする請求項２５に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２７】
前記ＳＩＲＰ−α変異体はアルブミン結合性ペプチドに付けられる、ことを特徴とする請求項１乃至２２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２８】
前記アルブミン結合性ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有する、ことを特徴とする請求項２７に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項２９】
前記ＳＩＲＰ−α変異体はポリマーに付けられ、該ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又はポリシアル酸鎖である、ことを特徴とする請求項１乃至２２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３０】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は抗体に付けられる、ことを特徴とする請求項１乃至２２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３１】
前記抗体は腫瘍特異的抗体である、ことを特徴とする請求項３０に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３２】
前記抗体は、セツキシマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＥＤＩ６４６９、イピリムマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、バンチクツマブ、バルリルマブ、モガマリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＳ１抗体、ハーセプチン、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び、次の：５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、フィブロネクチン、ＦＲ−アルファ、ＧＣＣ、ＧＤ２、グリピカン−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ  １Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、及び／又はＣＳＦ−１Ｒの１以上に結合することができる抗体から成る群から選択される、ことを特徴とする請求項３０又は３１に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３３】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２及び２４−３４の何れか１つの配列と少なくとも８０％同一の配列を有する、ことを特徴とする請求項１乃至３２の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３４】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３５】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＧＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３６】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＦＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３７】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＰＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３８】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項３９】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４０】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＬＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４１】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＧＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４２】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである、ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４３】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を有し、
ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４４】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＸ１Ｘ２ＱＸ３ＩＱＰＤＫＸ４ＶＸ５ＶＡＡＧＥＸ６Ｘ７Ｘ８ＬＸ９ＣＴＸ１０ＴＳＬＸ１１ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＸ１２ＲＸ１３ＬＩＹＮＱＸ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＦＰＲＶＴＴＶＳＸ１７Ｘ１８ＴＸ１９ＲＸ２０ＮＭＤＦＸ２１ＩＸ２２ＩＸ２３Ｘ２４ＩＴＸ２５ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ２６ＫＸ２７ＲＫＧＳＰＤＸ２８Ｘ２９ＥＸ３０ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＸ３１ＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を有し、
ここで、Ｘ１はＥ又はＧであり；Ｘ２はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ３はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ４はＳ又はＦであり；Ｘ５はＬ又はＳであり；Ｘ６はＳ又はＴであり；Ｘ７はＡ又はＶであり；Ｘ８はＩ又はＴであり；Ｘ９はＨ又はＲであり；Ｘ１０はＡ、Ｖ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ１１はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ１２はＡ又はＧであり；Ｘ１３はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ１４はＫ又はＲであり；Ｘ１５はＥ又はＱであり；Ｘ１６はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１７はＤ又はＥであり；Ｘ１８はＳ、Ｌ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１９はＫ又はＲであり；Ｘ２０はＥ又はＮであり；Ｘ２１はＳ又はＰであり；Ｘ２２はＳ又はＲであり；Ｘ２３はＳ又はＧであり；Ｘ２４は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ２５はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ２６はＶ又はＩであり；Ｘ２７はＦ、Ｌ、Ｖであり；Ｘ２８はＤであるか又は存在せず；Ｘ２９はＴ又はＶであり；Ｘ３０はＦ又はＶであり；及びＸ３１はＡ又はＧである
ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４５】
前記ＳＩＲＰ−α変異体は、アミノ酸残基のヒスチジン残基への１以上の置換を含む、ことを特徴とする請求項１乃至３３の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４６】
アミノ酸残基のヒスチジン残基への１以上の前記置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２の何れか１つの配列に相対的な、次のアミノ酸位置：２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５２、５３、５４、６６、６７、６８、６９、７４、９３、９６、９７、９８、１００、４、６、２７、３６、３９、４７、４８、４９、５０、５７、６０、７２、７４、７６、９２、９４、１０３の１以上において位置付けられる、ことを特徴とする請求項４５に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４７】
前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性で罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする請求項１乃至４６の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４８】
前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、酸性ｐＨの下で、中性ｐＨよりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性でＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする請求項１乃至４７の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項４９】
前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、低酸素条件下で、生理条件よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性でＣＤ４７に結合する、ことを特徴とする請求項１乃至４８の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項５０】
前記罹患した細胞は癌疾患の癌細胞である、ことを特徴とする請求項１、２、又は４７の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項５１】
前記酸性ｐＨは約４乃至約７のｐＨである、ことを特徴とする請求項１０又は４８に記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物。
【請求項５２】
請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子。
【請求項５３】
請求項５２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５４】
請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物を発現する宿主細胞であって、該宿主細胞は請求項５２に記載の核酸分子と請求項５３に記載のベクターとを含み、前記核酸分子又はベクターは前記宿主細胞の中で発現される、ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項５５】
請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物を調製する方法であって、該方法は：
ａ）請求項５２に記載の核酸分子又は請求項５３に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する工程；
ｂ）前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物の形成を可能にする条件下で前記宿主細胞の中で前記核酸分子又はベクターを発現する工程；及び
ｃ）前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物を回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む、医薬組成物。
【請求項５７】
前記医薬組成物は、１以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、ことを特徴とする請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
被験体における標的細胞の食作用を増加させる方法であって、前記被験体に、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５９】
前記標的細胞は癌細胞である、ことを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
被験体における調節性Ｔ細胞を除去する方法であって、前記被験体に、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項６１】
癌細胞を死滅させる方法であって、前記癌細胞を、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項６２】
被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法であって、前記被験体に、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項６３】
被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法であって、該方法は：
（ａ）被験体のＳＩＲＰ−αのアミノ酸配列を判定する工程；
（ｂ）前記被験体に請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を投与する工程
を含み；
ここで、ＳＩＲＰ−α変異体構築物における前記ＳＩＲＰ−α変異体は、前記被験体のＳＩＲＰ−αと同じアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項６４】
被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法であって、該方法は：
（ａ）被験体のＳＩＲＰ−αのアミノ酸配列を判定する工程；及び
（ｂ）前記被験体に請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体の治療上有効な量を投与する工程
を含み；
ここで、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は前記被験体において最小の免疫原性を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項６５】
被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法であって、該方法は、前記被験体に請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物を投与する工程を含み、前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞にてＣＤ４７を結合するよりも、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７を選択的に結合する、ことを特徴とする方法。
【請求項６６】
前記疾患は癌である、ことを特徴と請求項６２乃至６５の何れか１つに記載の方法。
【請求項６７】
前記癌は、固形腫瘍癌、血液癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、肺癌、気管支癌、肝臓癌、卵巣癌、結腸癌及び直腸癌、胃癌、胆嚢癌、胃腸間質性腫瘍癌、甲状腺癌、頭頚部癌、口腔咽頭癌、食道癌、黒色腫、非皮膚メラノーマ癌、メルケル細胞癌、ウイルス誘導性の癌、神経芽腫、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、リンパ腫、肉腫、神経膠腫、脳腫瘍、及び癌腫から選択される、ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
癌は固形腫瘍癌である、ことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
癌は血液癌である、ことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患は免疫疾患である、ことを特徴と請求項６２乃至６５の何れか１つに記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫疾患は自己免疫疾患又は炎症性疾患である、ことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記自己免疫疾患又は炎症性疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節障害、全身性エリトマトーデス、抗体媒介性炎症性疾患又は自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、全身性進行性強皮症、強皮症、急性冠動脈症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、血管炎、又は炎症性自己免疫性筋肉炎である、ことを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
被験体における造血幹細胞の生着を増加させる方法であって、前記被験体に、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物を投与することにより、被験体におけるＳＩＲＰ−αとＣＤ４７の間の相互作用を調節する工程を含む、方法。
【請求項７４】
被験体における免疫反応を変更する方法であって、前記被験体に、請求項１乃至５１の何れか１つに記載のＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、請求項５６或いは５７に記載の医薬組成物を投与する工程であって、それにより被験体の免疫反応を変更する工程を含む、方法。
【請求項７５】
免疫反応を変更する工程は免疫反応を抑える工程を含む、ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記被験体は哺乳動物であり、好ましくは前記哺乳動物はヒトである、ことを特徴とする請求項５８乃至７５の何れか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＲＰ−アルファ変異体構築物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）は、骨髄細胞の膜上に広く発現されるタンパク質である。ＳＩＲＰ−αは、ＣＤ４７、即ち身体中の多くの細胞型の上に広く発現されたタンパク質と相互に作用する。ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７との相互作用は、他には免疫系により認識され得る「自己」細胞の飲み込み（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）を予防する。ＳＩＲＰ−αは、ＳＨＰ−２（チロシンホスファターゼを包含するＳＨ−２ドメイン）のバインダとして最初に発見された。ＣＤ４７は最初に、卵巣癌細胞上に過剰発現された抗原であると特徴付けられる。
【０００３】
２０００年に、Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇらは、マウスモデルにおけるＣＤ４７を欠いた赤血球（ＲＢＣ）の投与の結果、免疫系からＲＢＣが急速に除去されたことを示し、ＣＤ４７は「自己」細胞の幾つかの亜群上の「保護」シグナルであると実証した。後に、ＳＩＲＰ−αと癌との間の潜在的な関係が更に調査された。腫瘍細胞上の高いＣＤ４７の発現が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び様々な固形腫瘍癌において、生存のための負の予後因子として作用したことが見出された。ＣＤ４７又はＳＩＲＰ−αの何れかをマスクする（ｍａｓｋ）薬剤の投与など、ＣＤ４７とＳＩＲＰ−αとの間の相互作用の妨害に向けられた方針は、潜在的な抗癌療法として調査された。
【０００４】
しかし、このような治療方針を考慮する際に、ＳＩＲＰ−αは人体における多くの異なる細胞型にてＣＤ４７に結合することができるという問題が懸念される。故に、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７のみに選択的に結合するように、ＳＩＲＰ−αを設計する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）変異体構築物を特徴とする。ＳＩＲＰ−α変異体構成物はＳＩＲＰ−α変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した部位（例えば、罹患していない部位よりも腫瘍のある部位）において選択的な活性を有する。特定の実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した細胞（例えば腫瘍細胞）上でＣＤ４７に対するより高い結合親和性を有する。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、酸性ｐＨ（例えば約ｐＨ７未満）及び／又は低酸素条件下で、生理条件よりも高い親和性でＣＤ４７に結合する。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患した部位にてＳＩＲＰ−α変異体構築物の選択的な結合を可能にする、アミノ酸のヒスチジン残基又は他のアミノ酸への１以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ブロッキングペプチドにより罹患していない部位においてＣＤ４７に結合するのを妨げられる。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、標的化部分（例えば、腫瘍関連抗体又は抗体結合性ペプチドに向けられた抗体）により罹患した部位（例えば腫瘍）へと標的にされる。本発明はまた、癌、好ましくは固形腫瘍癌及び血液癌などの様々な疾患を処置するための、ＳＩＲＰ−α変異体構築物を含む医薬組成物及び方法を特徴とする。
【０００６】
１つの態様において、本発明はシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）変異体をＳＩＲＰ−α変異体構築物を特徴とし、該ＳＩＲＰ−α構築物は、罹患していない細胞よりも、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７を選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞にてＣＤ４７を結合するよりも高い親和性で、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７に結合する。
【０００７】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物はブロッキングペプチドに付けられるＳＩＲＰ−α変異体を含む。幾つかの実施形態において、ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−αに結合するよりも高い親和性で、野生型ＳＩＲＰ−αに結合する。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、ブロッキングペプチドに結合するよりも高い親和性で、野生型ＣＤ４７に結合する。
【０００８】
幾つかの実施形態において、ブロッキングペプチドはＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドである。幾つかの実施形態において、ＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドは、ＣＤ４７の野生型のＩｇＳＦドメインの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）又はそのフラグメントと少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性を有する部分を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４７をベースとするブロッキングペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８又は４０の配列を有する。
【０００９】
本明細書には、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物が提供され、前記ＳＩＲＰ−α変異体は、少なくとも１つのリンカー（例えば切断可能なリンカー）の使用により本明細書に記載されるブロッキングペプチドに付けられる。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は野生型ＳＩＲＰ−αと同じＣＤ４７結合部位を含む場合がある。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ＳＩＲＰ−αと比較して１以上の変異、又は挿入を含む場合がある。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は野生型ＳＩＲＰ−αの短縮形態でもよい。幾つかの実施形態において、ブロッキングペプチドは、本明細書に記載されるＣＤ４７の模倣体、変異体、又はフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体と比較して、野生型ＳＩＲＰ−αに関するより高い親和性を示す場合がある。幾つかの実施形態において、ブロッキングペプチドは、野生型ＣＤ４７と比較して、ＳＩＲＰ−α変異体に関するより低い親和性を実証する、ＣＤ４７変異体ポリペプチドでもよい。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドとの間のリンカーは、１以上のプロテアーゼにより任意に切断可能な少なくとも１つのリンカーでもよい。幾つかの実施形態において、リンカーはまた、１以上のスペーサーを随意に含む。
【００１０】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、切断可能なリンカー及び随意に１以上のスペーサーによりブロッキングペプチドに付けられる。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーは、酸性ｐＨ及び／又は低酸素条件下で切断される。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーは腫瘍関連酵素により切断される。幾つかの実施形態において、腫瘍関連酵素はプロテアーゼである。幾つかの実施形態において、プロテアーゼは、マトリプターゼ（ＭＴＳＰ１）、尿型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、レグマイン、ＰＳＡ（ＫＬＫ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ−３とも呼ばれる）、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ２）、ＭＭＰ９、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、及びプロテイナーゼ３（Ｐｒ３）から成る群から選択される。幾つかの実施形態において、プロテアーゼはマトリプターゼである。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーは、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）の配列、又は、表７に列挙される配列の何れか１つを有する。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーは、以下の配列の１以上の組み合わせを含む（例えば表７を参照）：ＰＲＦＫＩＩＧＧ、ＰＲＦＲＩＩＧＧ、ＳＳＲＨＲＲＡＬＤ、ＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬ、ＳＳＳＦＤＫＧＫＹＫＫＧＤＤＡ、ＳＳＳＦＤＫＧＫＹＫＲＧＤＤＡ、ＩＥＧＲ、ＩＤＧＲ、ＧＧＳＩＤＧＲ、ＰＬＧＬＷＡ、ＧＰＬＧＩＡＧＩ、ＧＰＥＧＬＲＶＧ、ＹＧＡＧＬＧＶＶ、ＡＧＬＧＶＶＥＲ、ＡＧＬＧＩＳＳＴ、ＤＶＡＱＦＶＬＴ、ＶＡＱＦＶＬＴＥ、ＡＱＦＶＬＴＥＧ、ＰＶＱＰＩＧＰＱ、Ｌ／Ｓ／Ｇ−／Ｒ−−／Ｓ−／Ｄ／Ｎ／Ｈ、−／ｓ／ｇｓ／Ｒｋ−／ｒｖ／−／−／−、ＳＧＲ−ＳＡ、Ｌ／Ｓ／Ｇ−／Ｒ−−／Ｓ−／Ｄ／Ｎ／Ｈ、ｒ／−／−／Ｒｋ−／ｖ−／−／ｇ／−、ＲＱＡＲ−ＶＶ、ｒ／−／−／Ｒｋ／ｖ／−／ｇ、／Ｋｒ／ＲＫＱ／ｇＡＳ／ＲＫ／Ａ、Ｌ／Ｓ／Ｇ−／Ｒ−／Ｓ−／Ｄ／Ｎ／Ｈ、−／−／−／Ｎ／−／−／−、ＡＡＮ−Ｌ、ＡＴＮ−Ｌ、ｓｉ／ｓｑ／−／ｙｑｒｓ／ｓ／−／−、Ｓ／Ｓ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、−／ｐ／−／−／ｌｉ／−／−／−、ｇ／ｐａ／−／ｇｌ／−／ｇ／−、Ｇ／Ｐ／Ｌ／Ｇ／Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｑ、Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｌ／Ｉ／Ｇ、Ｈ／Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｌ／Ｌ／Ａ／Ｒ、−／−／−／ｖｉａｔ−／−／−／−、及び−／ｙ／ｙ／ｖｔａ  −／−／−／−であり、ここで、「−」は任意のアミノ酸（即ち、任意の自然発生のアミノ酸）を意味し、大文字はそのアミノ酸の強力な優先度を示し、小文字はそのアミノ酸の小さな優先度を示し、そして「／」は、「／」に隣接している位置にある１より多くのアミノ酸が可能となる場合にアミノ酸位置を分離する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は抗体結合性ペプチドに付けられる。幾つかの実施形態において、抗体結合性ペプチドは抗体の定常領域に可逆的又は不可逆的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体結合性ペプチドは、抗体のフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）領域に可逆的又は不可逆的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体結合性ペプチドは抗体の可変領域に可逆的又は不可逆的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体はセツキシマブである。幾つかの実施形態において、抗体結合性ペプチドは、疾患局在化ペプチド（ＤＬＰ）（ＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）又はＣＱＹＮＬＳＳＲＡＬＫＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５））或いはそのフラグメントの配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有する。幾つかの実施形態において、抗体結合性ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、Ｆｃドメインモノマーに付けられる。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付けられる。幾つかの実施形態において、ＨＳＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７に相対的な、アミノ酸置換Ｃ３４Ｓ及び／又はＫ５７３Ｐを含む。幾つかの実施形態において、ＨＳＡは、ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）を有する。
【００１３】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、アルブミン結合性ペプチドに付けられる。幾つかの実施形態において、アルブミン結合性ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を有する。幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体はポリマーに付けられ、該ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又はポリシアル酸鎖である。
【００１４】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は抗体に付けられる。幾つかの実施形態において、抗体は腫瘍特異的抗体である。幾つかの実施形態において、抗体（例えば腫瘍特異的抗体）は、セツキシマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＥＤＩ６４６９、イピリムマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、バンチクツマブ、バルリルマブ、モガマリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＳ１抗体、ハーセプチン、トラスツズマブ、及びペルツズマブから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、抗体（例えば腫瘍特異的抗体）は、以下の：５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、フィブロネクチン、ＦＲ−アルファ、ＧＣＣ、ＧＤ２、グリピカン−３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ  １Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＬＩＶ−１、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ−１、及び／又はＣＳＦ−１Ｒの１以上に結合する場合がある。
【００１５】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２及び２４−３４の何れか１つの配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００１７】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＧＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００１８】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＦＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００１９】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＰＩＲＩＧＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２０】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＤＸ１０ＴＸ１１ＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＤＶＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＬ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２１】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２２】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＬＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２３】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＧＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２４】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＸ３ＩＬＨＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＶ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２５】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＥＸ１ＱＸ２ＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＸ３ＴＬＲＣＴＸ４ＴＳＬＸ５ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＸ６ＬＩＹＮＱＸ７Ｘ８ＧＸ９ＦＰＲＶＴＴＶＳＥＸ１０ＴＸ１１ＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＸ１２ＩＴＸ１３ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ１４ＫＸ１５ＲＫＧＳＰＤＴＥＸ１６ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を有し、ここで、Ｘ１はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ２はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ３はＡ又はＶであり；Ｘ４はＡ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ５はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ６はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ７はＫ又はＲであり；Ｘ８はＥ又はＱであり；Ｘ９はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１０はＳ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１１はＫ又はＲであり；Ｘ１２は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１３はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ１４はＶ又はＩであり；Ｘ１５はＦ、Ｌ、又はＶであり；及びＸ１６はＦ又はＶである。
【００２６】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＥＥＸ１Ｘ２ＱＸ３ＩＱＰＤＫＸ４ＶＸ５ＶＡＡＧＥＸ６Ｘ７Ｘ８ＬＸ９ＣＴＸ１０ＴＳＬＸ１１ＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＸ１２ＲＸ１３ＬＩＹＮＱＸ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＦＰＲＶＴＴＶＳＸ１７Ｘ１８ＴＸ１９ＲＸ２０ＮＭＤＦＸ２１ＩＸ２２ＩＸ２３Ｘ２４ＩＴＸ２５ＡＤＡＧＴＹＹＣＸ２６ＫＸ２７ＲＫＧＳＰＤＸ２８Ｘ２９ＥＸ３０ＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＸ３１ＫＰＳの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を有し、ここで、Ｘ１はＥ又はＧであり；Ｘ２はＬ、Ｉ、又はＶであり；Ｘ３はＶ、Ｌ、又はＩであり；Ｘ４はＳ又はＦであり；Ｘ５はＬ又はＳであり；Ｘ６はＳ又はＴであり；Ｘ７はＡ又はＶであり；Ｘ８はＩ又はＴであり；Ｘ９はＨ又はＲであり；Ｘ１０はＡ、Ｖ、Ｉ、又はＬであり；Ｘ１１はＩ、Ｔ、Ｓ、又はＦであり；Ｘ１２はＡ又はＧであり；Ｘ１３はＥ、Ｖ、又はＬであり；Ｘ１４はＫ又はＲであり；Ｘ１５はＥ又はＱであり；Ｘ１６はＨ、Ｐ、又はＲであり；Ｘ１７はＤ又はＥであり；Ｘ１８はＳ、Ｌ、Ｔ、又はＧであり；Ｘ１９はＫ又はＲであり；Ｘ２０はＥ又はＮであり；Ｘ２１はＳ又はＰであり；Ｘ２２はＳ又はＲであり；Ｘ２３はＳ又はＧであり；Ｘ２４は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ２５はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり；Ｘ２６はＶ又はＩであり；Ｘ２７はＦ、Ｌ、Ｖであり；Ｘ２８はＤであるか又は存在せず；Ｘ２９はＴ又はＶであり；Ｘ３０はＦ又はＶであり；及びＸ３１はＡ又はＧである。
【００２７】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３−２３の何れか１つの配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２及び２４−３４の何れか１つの配列を含まない。
【００２９】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、アミノ酸のヒスチジン残基への１以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、アミノ酸残基のヒスチジン残基への１以上の置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２の何れか１つの配列に相対的な、次のアミノ酸位置：２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５２、５３、５４、６６、６７、６８、６９、７４、９３、９６、９７、９８、１００、４、６、２７、３６、３９、４７、４８、４９、５０、５７、６０、７２、７４、７６、９２、９４、１０３の１以上において位置付けられる。
【００３０】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性で罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７に結合する。
【００３１】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、酸性ｐＨの下で、中性ｐＨよりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性でＣＤ４７に結合する。
【００３２】
幾つかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、低酸素条件下で、生理条件よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、又は少なくとも６倍高い親和性でＣＤ４７に結合する。
【００３３】
幾つかの実施形態において、罹患した細胞は癌疾患の癌細胞である。
【００３４】
幾つかの実施形態において、酸性ｐＨは、約４乃至約７の間のｐＨである。
【００３５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子を特徴とする。
【００３６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子を含むベクターを特徴とする。
【００３７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物を発現する宿主細胞を特徴とし、該宿主細胞は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子、又は、該核酸分子を含むベクターを含み、前記核酸分子又はベクターは宿主細胞において発現される。
【００３８】
別の態様において、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物を調製する方法であって、該方法は：ａ）本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子、又は、該核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞を提供する工程；ｂ）ＳＩＲＰ−α変異体構築物の形成を可能にする条件下で、宿主細胞において核酸分子又はベクターを発現する工程；及びｃ）ＳＩＲＰ−α変異体構築物を回収する工程を含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を特徴とする。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、１以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。
【００４０】
別の態様において、本発明は、被験体における標的細胞の食作用を増加させる方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、標的細胞は癌細胞である。
【００４１】
別の態様において、本発明は、被験体における調節性Ｔ細胞を除去する方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、癌細胞を死滅させる方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を、癌細胞に接触させる工程を含む。
【００４３】
別の態様において、本発明は、被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連する疾患を処置する方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。
【００４４】
別の態様において、本発明は、被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法を特徴とし、該方法は：（ａ）被験体のＳＩＲＰ−αのアミノ酸配列を判定する工程；及び（ｂ）被験体に本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を投与する工程を含み；ここで、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は、被験体のＳＩＲＰ−αと同じアミノ酸配列を有する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法を特徴とし、該方法は：（ａ）被験体のＳＩＲＰ−αのアミノ酸配列を判定する工程；及び（ｂ）被験体に本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を投与する工程を含み；ここで、ＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体は被験体において最小の免疫原性を有する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、被験体におけるＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７の活性に関連した疾患を処置する方法を特徴とし、該方法は：被験体に本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物を投与する工程を含み、前記ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞にてＣＤ４７を結合するよりも、罹患した細胞又は罹患した部位にてＣＤ４７を選択的に結合する。
【００４７】
幾つかの実施形態において、疾患は癌である。幾つかの実施形態において、癌は、固形腫瘍癌、血液癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、肺癌、気管支癌、肝臓癌、卵巣癌、結腸癌及び直腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ，  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、胆嚢癌、胃腸間質性腫瘍癌、甲状腺癌、頭頚部癌、口腔咽頭癌、食道癌、黒色腫、非皮膚メラノーマ癌、メルケル細胞癌、ウイルス誘導性の癌、神経芽腫、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、リンパ腫、肉腫、神経膠腫、脳腫瘍、及び癌腫から選択される。幾つかの実施形態において、癌は固形腫瘍癌である。幾つかの実施形態において、癌は血液癌である。
【００４８】
幾つかの実施形態において、疾患は免疫疾患である。幾つかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患又は炎症性疾患である。幾つかの実施形態において、前記自己免疫疾患又は炎症性疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節障害、全身性エリトマトーデス、抗体媒介性炎症性疾患又は自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、全身性進行性強皮症、強皮症、急性冠動脈症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、血管炎、又は炎症性自己免疫性筋肉炎である。
【００４９】
別の態様において、本発明は、被験体における造血幹細胞の生着を増加させる方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体の治療上有効な量を含む医薬組成物を、被験体に投与することにより、被験体におけるＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との間の相互作用を調節する工程を含む。
【００５０】
別の態様において、本発明は、被験体における免疫応答を変更する方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物、又は、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の治療上有効な量を含む医薬組成物を被験体に投与する工程であって、それにより被験体における免疫応答を変更する工程を含む。幾つかの実施形態において、免疫応答は免疫応答を抑えることを含む。
【００５１】
幾つかの実施形態において、被験体は哺乳動物であり、好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００５２】
定義
本明細書で使用されるように、用語「罹患した細胞」および「罹患した組織」は、例えば、癌細胞および癌組織を指す。特に、癌は、固形腫瘍癌または血液癌であり得る。例えば、癌が固形腫瘍癌である場合、罹患した細胞は、固形腫瘍の細胞である。罹患した細胞は、しばしば酸性のｐＨおよび低酸素などの、罹患した部位に特徴的な条件下で生きている。「罹患した細胞」および「罹患した組織」はまた、限定されないが、癌を含む他の疾患に関係し得る。「罹患した細胞」および「罹患した組織」はまた、免疫性の疾患か障害、心臓の疾患または障害、代謝性の疾患または障害、あるいは増殖性の疾患または障害に関係し得る。免疫障害は、炎症性の疾患または障害および自己免疫性の疾患または障害を含む。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「罹患していない細胞」は、身体の正常で、健康な細胞を指す。罹患していない細胞は、しばしば、細胞の正常な代謝および制御的機能を維持する、中性のｐＨおよび適切な酸素濃度などの、生理学的条件下で生存する。
【００５４】
本明細書で使用されるように、用語「罹患した部位」は、身体における疾患の位置に近位の位置または領域を指す。例えば、疾患が、肝臓に位置する固形腫瘍癌である場合、罹患した部位は、肝臓における腫瘍の部位および肝臓における腫瘍に近い領域である。罹患した部位の細胞は、罹患した部位で疾患を支持する細胞の他に、罹患した細胞も含み得る。例えば、罹患した部位が腫瘍の部位である場合、腫瘍の部位の細胞は、罹患した細胞（例えば、腫瘍細胞）および腫瘍の部位で腫瘍成長を支持する細胞の両方を含む。同様に、用語「癌部位」は、身体中の癌の位置を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−αＤ１ドメイン」または「Ｄ１ドメイン」は、ＳＩＲＰ−αの膜遠位の、細胞外ドメインを指す。ＳＩＲＰ−αＤ１ドメインは、全長の、野生型ＳＩＲＰ−αのＮ末端に位置付けられ、ＣＤ４７への結合を媒介する。Ｄ１ドメインのアミノ酸配列は、表１に示される。
【００５６】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−αＤ２ドメイン」または「Ｄ２ドメイン」は、ＳＩＲＰ−αの第２細胞外ドメインを指す。ＳＩＲＰ−αＤ２ドメインは、全長の、野生型ＳＩＲＰ−αのアミノ酸をおよそ１１９乃至２２０含む。
【００５７】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−αＤ３ドメイン」または「Ｄ３ドメイン」は、ＳＩＲＰ−αの第３細胞外ドメインを指す。ＳＩＲＰ−αＤ３ドメインは、全長の、野生型ＳＩＲＰ−αのアミノ酸をおよそ２２１乃至３２０含む。
【００５８】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−αポリペプチド」は、ＳＩＲＰ−α変異体の他に、野生型ＳＩＲＰ−α変異体も指し、各用語は、本明細書で定義され、記載されている。
【００５９】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−α変異体」は、ＳＩＲＰ−αＤ１ドメインを含有しているポリペプチド、または全長ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分を指す。
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−１２と２４−３４のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ＳＩＲＰ−αより高いＣＤ４７に対する親和性を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ヒトＳＩＲＰ−αの一部（好ましくは、野生型ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分）を含み、及び／又は１つ以上のアミノ酸置換を有する。例えば、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ＳＩＲＰ−αに対して１つ以上（例えば、最大２０で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の置換を含み得る。例えば、ＳＩＲＰ−α変異体は、ヒスチジン残基との１つ以上（例えば、最大２０で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の置換を含み得る。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ヒトＳＩＲＰ−αの配列に対して、または本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体のいずれかに対して（例えば、野生型ヒトＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分の配列に対して）、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸配列同一性を有する部分を有する。野生型ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分は、野生型ＳＩＲＰ−αのＤ１ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−１２のいずれか１つの配列）を含む。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−α変異体構築物」は、例えば、ブロッキングペプチド、Ｆｃドメインモノマー、ＨＳＡ、アルブミン結合ペプチド、ポリマー、抗体結合ペプチド、抗体に付けられる、ＳＩＲＰ−α変異体を含有しているポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した部位に選択的活性を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した部位に選択的活性を有し、野生型ヒトＳＩＲＰ−αの配列に対して、または本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体のいずれかに対して（例えば、野生型ヒトＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分の配列に対して）、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸配列同一性を有する部分を有しているＳＩＲＰ−α変異体を含む。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「パーセント（％）同一性」は、必要に応じて、最大のパーセント同一性を達成するための、配列を並べ、間隙を導入した後の、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基、例えば、野生型ヒトＳＩＲＰ−αまたはそのＣＤ４７結合部分と同一である、候補配列のアミノ酸（または核酸）残基、例えば、ＳＩＲＰ−α変異体のパーセンテージを指す（即ち、間隙は、最適なアラインメントのために候補配列および参照配列の１つ又は両方に導入することができ、非相同性の配列は、比較目的のために無視することができる）。パーセント同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該芸術分野内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。幾つかの実施形態では、（与えられた参照配列への、参照配列との、または参照配列に対する特定」のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を有する又は含む、与えられた候補配列として代替的に表わされ得る）与えられた参照配列への、参照配列との、または参照配列に対する、与えられた候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性は、以下のように計算される：
１００ｘ（Ａ／Ｂの割合）
式中、Ａは、候補配列および参照配列のアラインメントにおいて同一なものとしてスコア化されたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは、参照配列におけるアミノ酸（または核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さに等しくない場合の幾つかの実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性と等しくはないだろう。
【００６２】
特定の実施形態では、候補配列との比較のために並べられた参照配列は、候補配列が、候補配列の全長または候補配列の隣接するアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分にわたって５０％乃至１００％の同一性を表わすことを示し得る。比較目的のために並べられた候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％である。候補配列における位置が、参照配列における対応する位置と同じアミノ酸（または核酸）残基によって占められるとき、分子は、その位置で同一である。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「腫瘍関連プロテアーゼ」または「腫瘍酵素」は、癌、例えば固形腫瘍癌において増加したレベルで存在する酵素、例えば、プロテアーゼを指す。幾つかの実施形態では、腫瘍関連プロテアーゼは、切断可能リンカーを切断し得る。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「ブロッキングペプチド」は、ＳＩＲＰ−α変異体に結合することができ、ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分を遮断する又は「マスクする」、ペプチドを指す。ＳＩＲＰ−α変異体構築物において、ブロッキングペプチドは、随意に切断可能であるリンカー、および随意に１つ以上のスペーサーによって、ＳＩＲＰ−α変異体に付けられ得る。ブロッキングペプチドは、非共有結合によってＳＩＲＰ−α変異体に結合され得、罹患した部位または罹患した細胞で切断され得る。幾つかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、罹患した部位または罹患した細胞で野生型ＳＩＲＰ−αに結合され得る。ブロッキングペプチドは、正常な生理学的条件下での、または罹患していない部位での、ＳＩＲＰ−α変異体の野生型ＣＤ４７との結合を減少させるか又は最小限にするために使用され得る。幾つかの実施形態では、ブロッキングペプチドは、野生型ＳＩＲＰ−α変異体に対して、ＳＩＲＰ−α変異体よりも高い結合親和性を有する。ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体から分離して、例えば、罹患した部位で、または非生理学的条件下で、野生型ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。ブロッキングペプチドの一例は、ＣＤ４７またはそのフラグメントに由来するペプチドである、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドである。幾つかの実施形態では、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、ＣＤ４７の細胞外の、ＳＩＲＰ−α結合部分（即ち、ＣＤ４７のＩｇＳＦドメイン）である。幾つかの実施形態では、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、野生型ＣＤ４７に対する、１つ以上のアミノ酸の置換、添加、及び／又は欠失を含む。
【００６５】
本明細書で使用されるように、用語「切断可能リンカー」は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の２つの部分間のリンカーを指す。幾つかの実施形態では、切断可能リンカーは、生理学的条件下でのＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７への結合を遮断するために、ブロッキングペプチドをＳＩＲＰ−α変異体に共有結合的に付け得る。幾つかの実施形態では、切断可能リンカーは、生理学的条件下でのＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７への結合を遮断するために、ＳＩＲＰ−α変異体と非共有結合され得る、ブロッキングペプチド内に導入され得る。切断可能リンカーは、特定の条件下で切断され得る。切断可能リンカーがブロッキングペプチド内にある場合、リンカーの切断は、ブロッキングペプチドを不活性化するだろう。切断可能リンカーは、例えば、固形腫瘍の内部の癌部位などの、罹患した部位に特徴的な条件下で、リンカーを切断する又はその切断か引き起こすように作用する部分を含む。切断可能リンカーは、健全な生理学的条件（例えば、中性のｐＨおよび適切な酸素濃度）下で安定している。該部分は、酸性のｐＨ下で加水分解することができる、ｐＨ感受性の化学官能基（例えば、アセタール、ケタール、チオリンゴ酸（ｔｈｉｏｍａｌｅａｍａｔｅｓ）、ヒドラゾン、ジスルフィド結合）であり得る。該部分はまた、低酸素条件下で減少させることができる、低酸素感受性の化学官能基（例えば、キノン、Ｎ−オキシド、およびヘテロ芳香族ニトロ基）またはアミノ酸であり得る。切断可能リンカー中の該部分はまた、腫瘍関連プロテアーゼ、酵素、またはペプチダーゼによって認識することができ、切断することができる、タンパク質基質であり得る。
【００６６】
本明細書で使用されるように、用語「スペーサー」は、リンカー（例えば、切断可能リンカー）とＳＩＲＰ−α変異体、または抗体結合ペプチドとＳＩＲＰ−α変異体などの、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の２つの部分間の共有結合または非共有結合を指す。好ましくは、スペーサーは、共有結合である。スペーサーは、単一の化学結合、例えば、アミド結合、またはアミノ酸配列（例えば、３−２００のアミノ酸配列であり得る。アミノ酸スペーサーは、（例えば、ポリペプチド骨格を介して間隔を置かれたポリペプチドまたはポリペプチドドメインに接合された）ポリペプチドの一次配列の部分である。スペーサーは、２つの部分間の空間及び／又は柔軟性を提供する。スペーサーは、罹患した部位（例えば酸性のｐＨ、低酸素）に特徴的な条件下に加えて、生理学的条件（例えば、中性のｐＨおよび適切な酸素濃度）下でも安定している。スペーサーは、例えば腫瘍の内部の癌部位などの罹患した部位で安定している。スペーサーの記載は、本明細書でさらに詳細に提供される。
【００６７】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、完全な抗体、所望の生物活性を示す場合の抗体フラグメント、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、および少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を指す。好ましくは、抗体は、罹患した細胞、例えば、腫瘍細胞に特異的である。例えば、抗体は、罹患した細胞、例えば、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合し得る。
【００６８】
本明細書で使用されるように、用語「アルブミン結合ペプチド」は、血清アルブミンに対する親和性を有する及び血清アルブミンを結合するように機能する、１２乃至１６のアミノ酸のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、異なる起原であり得る（例えば、ヒト、マウス、またはラットに由来し得る）。本発明の幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増加させるために、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に融合されるアルブミン結合ペプチドを含み得る。アルブミン結合ペプチドは、直接的に又はスペーサーによって、ＳＩＲＰ−α変異体に融合され得る。
【００６９】
本明細書で使用されるように、用語「ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）」は、ヒト血漿中に存在するアルブミンタンパク質を指す。ヒト血清アルブミンは、血液中で最も豊富なタンパク質である。それは、血清タンパク質のおよそ半分を構成する。幾つかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ ＮＯ：Ｐ０２７６８のアミノ酸２５−６０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）の配列を有する。幾つかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７の配列に対するＣ３４Ｓをさらに含む。
【００７０】
本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃドメインモノマー」は、第２および第３の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含むポリペプチド鎖を指す。幾つかの実施形態では、Ｆｃドメインモノマーはまた、ヒンジドメインを含む。Ｆｃドメインモノマーは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプであり得る。さらに、Ｆｃドメインモノマーは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインモノマーは、抗原認識領域、例えば、可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）として作用することができる免疫グロブリンの部分を含んでいない。Ｆｃドメインモノマーは、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用を変更する、野生型Ｆｃドメインモノマー配列（例えば、１−１０、１−８、１−６、１−４のアミノ酸の置換、添加、または欠失）からの１０もの変化を含むことができる。適切な変化の例は、当該技術分野で知られている。
【００７１】
本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃドメイン」は、２つのＦｃドメインモノマーの二量体を指す。野生型Ｆｃドメインにおいて、２つのＦｃドメインモノマーは、２つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体化し、２つの二量体化するＦｃドメインモノマーのヒンジドメイン間で、１つ以上のジスルフィド結合が形成される。幾つかの実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を欠くように変異され得、これは「死んだ（ｄｅａｄ）Ｆｃドメイン」の典型である。幾つかの実施形態では、ＦｃドメインにおけるＦｃドメインモノマーの各々は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるために、ＣＨ２抗体定常ドメインにおいてアミノ酸置換を含む。
【００７２】
本明細書で使用されるように、用語「親和性」または「結合親和性」は、２つの分子間の結合相互作用の強度を指す。一般に、結合親和性は、分子と、ＳＩＲＰ−α変異体およびＣＤ４７などの、その結合パートナーとの間の非共有結合の相互作用の合計の強度を指す。他に明記のない限り、結合親和性は、結合対のメンバー間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（ＫＤ）または親和定数（ＫＡ）によって一般に記載される。互いに低い結合親和性を有する２つの分子は、一般に、ゆっくり結合し、容易に分離する傾向があり、高いＫＤを示す。互いに高い親和性を有する２つの分子は、一般に、容易に結合し、より長く結合されたままである傾向があり、低いＫＤを示す。２つの相互作用する分子のＫＤは、当該技術分野で周知の方法および技術、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して測定され得る。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として計算される。
【００７３】
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するために必要とされる、必要な細胞成分、例えば、細胞小器官を含むビヒクルを指す。核酸は、典型的に、当該技術分野で既知の従来の技術（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、直接的なマイクロインジェクションなど）によって宿主細胞へと導入され得る核酸ベクターに含まれる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であり得る。本明細書で記載されるように、宿主細胞は、１つ以上のＳＩＲＰ−α変異体構築物を発現するために使用される。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語「医薬組成物」は、有効成分を投与の方法に適したものとする、賦形剤および希釈剤の他に、有効成分を含有する医薬的または薬学的な製剤を指す。本発明の医薬組成物は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物と適合性のある薬学的に許容可能な成分を含む。医薬組成物は、経口投与用の錠剤またはカプセルの形態、あるいは静脈内または皮下の投与用の水性の形態であり得る。
【００７５】
本明細書で使用されるように、用語「ＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７活性に関連する疾患」は、ＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７活性によって引き起こされる及び／又はそれに関連する疾患または障害を指す。例えば、それは、ＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７活性の増加及び／又は減少によって引き起こされる及び／又はそれに関連する疾患または障害を指す。ＳＩＲＰ−α及び／又はＣＤ４７活性に関連する疾患の例には、限定されないが、癌および免疫疾患（例えば、自己免疫性疾患および炎症性疾患）が挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「治療上有効な量」は、癌、例えば、固形腫瘍または血液癌などの疾患を患う患者の処置において所望の治療効果を達成するのに有効な、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物、または本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物を含有している医薬組成物の量を指す。特に、治療上有効な量のＳＩＲＰ−α変異体構築物は、有害な副作用を回避する。
【００７７】
本明細書で使用されるように、用語「最適化された親和性」または「最適化された結合親和性」は、ＳＩＲＰ−α変異体とＣＤ４７との間の結合相互作用の最適化された強度を指す。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した部位の細胞（即ち、癌細胞）上のＣＤ４７に一次的に又はより高い親和性を有して結合し、罹患していない部位の細胞（即ち、非癌細胞）上のＣＤ４７に実質的に結合しないか、またはより低い親和性を有して結合する。ＳＩＲＰ−α変異体とＣＤ４７との間の結合親和性は、相互作用が臨床的に適切な毒性を引き起こさないように最適化される。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体とＣＤ４７との間の最適化された結合親和性を達成するために、ＳＩＲＰ−α変異体は、最大に達成可能である親和性よりも低いＣＤ４７に対する親和性を有するように発達され得る。
【００７８】
本明細書で使用されるように、用語「免疫原性」は、外来抗原であるように宿主中で免疫反応を引き起こすタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の特性を指す。タンパク質の免疫原性は、様々な異なる方法でインビトロにおいて、特に、インビトロのＴ細胞増殖アッセイによって分析され得（例えば、Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９：５３４−５５５， ２０１３を参照）、それらの幾つかは、市販で入手可能である（例えば、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅによって提供される免疫原性アッセイのサービスを参照）。
【００７９】
本明細書で使用されるように、用語「最小の免疫原性」は、修飾された、即ち、アミノ酸置換によって、アミノ酸置換が導入される前よりも低くなるように（例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、または１００％低い）修飾されたタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の免疫原性を指す。タンパク質（例えば、治療用タンパク質）は、最小の免疫原性を有するに修飾され、これは、それが外来抗原であっても宿主免疫反応を全く引き起こさない又はほとんど引き起こさないことを意味する。
【００８０】
本明細書で使用されるように、用語「最適化された薬物動態」は、タンパク質の薬物動態学に一般に関係しているパラメータが、インビトロ及び／又はインビボでの使用のために最適化されたタンパク質を生成するように改善且つ修飾されることを指す。例えば、ＫＤ、原子価、および半減期を含む、タンパク質の薬物動態に関係しているパラメータは、当業者に周知である。本発明において、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物の薬物動態は、治療上の関連で使用するためのＣＤ４７とのその相互作用のために最適化される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ＣＤ４７：ＳＩＲＰ−α（ＰＤＢ：４ＫＪＹ、４ＣＭＭ）の共結晶化構造の一部を示し、ＣＤ４７のＮ末端は、ピログルタミン酸として存在し、ＳＩＲＰ−α変異体のＴｈｒ６６または野生型ＳＩＲＰ−αのＬｅｕ６６との水素結合の相互作用を行う。
【図２】図２は、Ｔ１０２Ｑを有するＣＤ４７とＡ２７を有する野生型ＳＩＲＰ−αとの間の相互作用部位の計算モデル（左）、およびＴ１０２Ｑを有するＣＤ４７とＩ２７を有するＳＩＲＰ−α変異体との間の相互作用部位の計算モデルを示す。
【図３】図３は、ＳＩＲＰ−α変異体構成物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８−５６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｕＰＡおよびマトリプターゼを用いるインビトロでの切断後のＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なる量のマトリプターゼを用いるインビトロでの切断後のＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、マトリプターゼを用いるインビトロでの切断後の様々なＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７−６３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、マトリプターゼを用いるインビトロでの切断の前後の、ＣＤ４７に対する様々なＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８−５５）の異なる結合親和性を例証する棒グラフを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、マトリプターゼを用いるインビトロでの切断の前後の、ＣＤ４７に対する様々なＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２−６３）およびＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）の異なる親和性を例証する棒グラフを示す。
【図６】図６は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）が、セツキシマブおよびＣＤ４７を同時に結合することができることを実証するセンサーグラムを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＥＧＦＲ、セツキシマブ、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、およびＣＤ４７を含む、四成分複合体の概略図を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａで示される四成分複合体の形成を実証するセンサーグラムを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ｂで示されるセンサーグラムの画像である。
【図８】図８は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）およびＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）によって誘発された食作用を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本発明は、罹患した部位で（例えば、罹患していない部位よりも腫瘍の部位で）選択的活性を有している、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）変異体構築物を特徴とする。特定の実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患した細胞（例えば、腫瘍細胞）上のＣＤ４７に対するより高い結合親和性を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。幾つかの実施形態では、アミノ酸は、ヒスチジン残基と置換されてもよい。幾つかの実施形態では、アミノ酸は、他の非ヒスチジンアミノ酸残基と置換されてもよい。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞上よりも、罹患した細胞上または罹患した部位で、および癌部位、例えば、腫瘍の内部の部位などの、罹患した部位に特徴的な条件下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、酸性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７未満）下で、及び／又は生理学的条件よりも低酸素条件下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体およびブロッキングペプチドを含み；ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患した部位に特徴的な条件下でない限り、ブロッキングペプチドによってＣＤ４７への結合が防がれる。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、Ｆｃドメインモノマー、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ペプチド、またはポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）に融合される。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、治療上の関連で使用するために最適化された、その免疫原性、親和性、及び／又は薬物動態を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、標的部分、例えば、標的特異抗体によって、罹患した部位、例えば腫瘍に対して優先的に標的とされる。本発明は、癌細胞を死滅する方法およびＳＩＲＰ−α変異体構築物を製造する方法およびそのようなＳＩＲＰ−α変異体構築物を含有している医薬組成物の他に、癌、好ましくは固形腫瘍または血液癌などの、様々な疾患を処置するための方法およびＳＩＲＰ−α変異体構築物を含有している医薬組成物を特徴とする。
【００８３】
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ブロッキングペプチドに付けられたＳＩＲＰ−α変異体を含む。幾つかの実施形態では、罹患した細胞または罹患した部位上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体の選択的結合は、罹患した細胞または罹患した部位で切断される、切断可能リンカーを使用して、ＳＩＲＰ−α変異体にブロッキングペプチドを付けることにより得られ得る。幾つかの実施形態では、罹患した細胞または罹患した部位上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体の選択的結合は、ＳＩＲＰ−α変異体にブロッキングペプチドを付けることにより得られ得、ここで、ブロッキングペプチドは、罹患した細胞または罹患した部位で、ＳＩＲＰ−α変異体から引き離されるか又は単に分離され得る。
【００８４】
Ｉ．ＳＩＲＰ−α変異体
少なくとも１０の野生型ヒトＳＩＲＰ−αの自然変異体が存在する。１０の野生型ヒトＳＩＲＰ−α変異体のＤ１ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−１２に示される（表１を参照）。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−１２のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する。表２は、各々のＤ１ドメイン変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３−２３）における起こり得るアミノ酸置換を列挙している。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、最適化された親和性を有してＣＤ４７に結合する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物は、一次的に又はより高い親和性を有して癌細胞上のＣＤ４７に結合し、非癌細胞上のＣＤ４７に実質的に結合しないか、またはより低い親和性を有して結合する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物とＣＤ４７との間の結合親和性は、相互作用が臨床的に適切な毒性を引き起こさないように最適化される。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、最小の免疫原性を有する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＩＲＰ−α変異体の親和性を増加させるために導入されたアミノ酸変化を除いて、被験体の生体サンプル中のＳＩＲＰ−αポリペプチドのアミノ酸と同じアミノ酸を有する。ＳＩＲＰ−α変異体を生成する及びＣＤ４７に対するその結合親和性を判定するための技術および方法は、本明細書でさらに詳細に記載されている。
【００８５】
表２は、各々のＤ１ドメイン変異体配列に対する、ＳＩＲＰ−α変異体における特異的なアミノ酸置換を列挙している。ＳＩＲＰ−α変異体は、表２に列挙される置換の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を含み得る。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型Ｄ１ドメインに対して、多くて１０のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型Ｄ１ドメインに対して、多くて７のアミノ酸置換を含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、２つ以上の野生型Ｄ１ドメイン変異体の一部（例えば、１つの野生型Ｄ１ドメイン変異体の一部および別の野生型Ｄ１ドメイン変異体の一部）を含む、キメラＳＩＲＰ−α変異体である。幾つかの実施形態では、キメラＳＩＲＰ−α変異体は、野生型Ｄ１ドメイン変異体の少なくとも２つの部分（例えば、３、４、５など）を含み、ここで、該部分の各々は、異なる野生型Ｄ１ドメイン変異体からのものである。幾つかの実施形態では、キメラＳＩＲＰ−α変異体は、表２に列挙される１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、表３におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−３４のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する。
【００８７】
【表１】
2017060462.tif 000003
【００８８】
【表２−１】
2017060462.tif 000004
【００８９】
【表２−２】
2017060462.tif 000005
【００９０】
【表２−３】
2017060462.tif 000006
【００９１】
【表３】
2017060462.tif 000007
【００９２】
望ましくは、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物は、生理学的条件（例えば、中性のｐＨおよび適切な酸素濃度）下よりも、例えば、腫瘍の内部の癌部位などの、罹患した部位に特徴的な条件下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。例えば、腫瘍の内部の癌部位などの、罹患した部位に特徴的な条件は、例えば、酸性のｐＨおよび低酸素である。幾つかの実施形態では、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物は、優先的に罹患していない細胞よりも罹患した細胞に選択的に結合するように人工的に構築され得る。特に、疾患細胞は、癌疾患、例えば、固形腫瘍または血液癌の癌細胞であり得る。好ましくは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、中性のｐＨ、例えば、ｐＨ７．４下よりも、酸性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７未満）下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。好ましくは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、適切な酸素濃度を有する条件下よりも低酸素条件下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ブロッキングペプチドに付けられたＳＩＲＰ−α変異体を含む。幾つかの実施形態では、罹患した細胞または罹患した部位上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体の選択的結合は、罹患した細胞または罹患した部位で切断される、切断可能リンカーを使用して、ＳＩＲＰ−α変異体にブロッキングペプチドを付けることにより得られ得る。幾つかの実施形態では、罹患した細胞または罹患した部位上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体構築物におけるＳＩＲＰ−α変異体の選択的結合は、ＳＩＲＰ−α変異体にブロッキングペプチドを付けることにより得られ得、ここで、ブロッキングペプチドは、罹患した細胞または罹患した部位で、ＳＩＲＰ−α変異体から引き離されるか又は単に分離され得る。
【００９３】
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体およびブロッキングペプチドを含む。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、リンカー（例えば、切断可能リンカー）によってブロッキングペプチドに付けられ得る。ブロッキングペプチドは、生理学的条件（例えば、中性のｐＨおよび適切な酸素濃度）下でＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体の結合を防ぐために、ＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７結合部位を遮断するように働く。切断可能リンカーは、酸性のｐＨおよび低酸素などの、罹患した部位（例えば、腫瘍の内部の癌部位など）に特徴的な条件下でのみ切断されることが可能なリンカーである。幾つかの実施形態では、切断可能リンカーは、罹患した部位で腫瘍関連プロテアーゼによって切断される。幾つかの実施形態では、リンカーは、切断されず、ブロッキングペプチドは、罹患した部位でＳＩＲＰ−α変異体から単に分離し、その結果、ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患した細胞、例えば、腫瘍細胞上の近くのＣＤ４７に自由に結合する。したがって、ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患した部位にあるときにのみ、ブロッキングペプチドから解放され、罹患した細胞、例えば、腫瘍細胞上の近くのＣＤ４７に自由に結合するだろう。ブロッキングペプチドおよびリンカー（例えば、切断可能リンカー）は、本明細書でさらに詳細に記載されている。
【００９４】
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体および標的部分を含む。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患した細胞に対する結合親和性を示す、抗体、例えば、腫瘍特異性抗体、または別のタンパク質またはペプチド、例えば、抗体結合ペプチドなどの、標的部分に付けられ得る。投与後、腫瘍特異性抗体または抗体結合ペプチドは、例えば、固形腫瘍の内部の癌部位などの、罹患した部位にＳＩＲＰ−α変異体を移動させる標的部分として働き、ここで、ＳＩＲＰ−αは、罹患した細胞上のＣＤ４７と特異的に相互作用することができる。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、抗体（例えば、腫瘍特異性抗体）に結合することができる、即ち、抗体の定常領域または可変領域に結合することができる、タンパク質またはペプチド、例えば、抗体結合ペプチドに融合され得る。１つ以上の抗体に結合することができるＳＩＲＰ−α変異体は、本明細書でさらに詳細に記載されている。他の実施形態では、国際公開番号ＷＯ２０１３１０９７５２（引用によって本明細書に組み込まれる）に記載されるような、他のＳＩＲＰ−α変異体は、腫瘍特異性抗体、または腫瘍特異性抗体に結合することができる、タンパク質またはペプチド、例えば、抗体結合ペプチドに付けられ得る。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、インビトロ（ヒトへの投与前）またはインビボ（投与後）で抗体に付けられ得る。
【００９５】
幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ヒトＳＩＲＰ−αのＤ２及び／又はＤ３ドメインをさらに含み得る。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＩＲＰ−α変異体の薬物動態特性を改善する、例えば、血清半減期を増加させるために、Ｆｃドメインモノマー、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清結合タンパク質またはペプチド、あるいは有機分子、例えば、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に付けられ得る。本発明のＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増加させる働きをする、Ｆｃドメインモノマー、ＨＳＡタンパク質、血清結合タンパク質またはペプチド、およびＰＥＧなどの有機分子は、本明細書でさらに詳細に記載されている。幾つかの実施形態では、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−１２および２４−３４のいずれか１つの配列を含まない。
【００９６】
ＩＩ． ＳＩＲＰ−α変異体におけるヒスチジン残基とのアミノ酸置換
幾つかの実施形態では、表２に列挙されるＳＩＲＰ−α変異体におけるアミノ酸置換に加えて、ＳＩＲＰ−α変異体は、ヒスチジン残基との１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物は、罹患していない細胞よりも罹患した細胞または罹患した部位上で、および生理学的条件下よりも罹患した部位（例えば、酸性のｐＨ、低酸素）に特徴的な条件下で、より高い親和性を有してＣＤ４７に結合する。ヒスチジン残基と置換されるアミノ酸残基は、ヒスチジン系統的変異導入法、タンパク質結晶構造、およびコンピュータによる設計およびモデリングの方法を使用して特定され得る。ＳＩＲＰ−α変異体を生成するために使用され得る技術および方法、および罹患した及び罹患していない細胞上のＣＤ４７に対するそれらの結合親和性を判定する方法は、本明細書でさらに詳細に記載されている。ヒスチジン残基の置換は、ＳＩＲＰ−α変異体およびＣＤ４７の界面に位置付けられ得るか、またはＳＩＲＰ−α変異体の内部領域に存在し得る。優先的に、ヒスチジン残基の置換は、ＳＩＲＰ−α変異体およびＣＤ４７の界面に位置付けられる。表４は、ヒスチジン残基と置換され得る特異的なＳＩＲＰ−αアミノ酸を列挙する。表４において番号付けしているアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列に比例し；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−１２の配列のいずれか１つにおける対応する位置での１つ以上のアミノ酸も、ヒスチジン残基と置換され得る。接触残基は、ＳＩＲＰ−α変異体およびＣＤ４７の界面に位置するアミノ酸である。コア残基は、ＳＩＲＰ−α変異体とＣＤ４７との間の結合に直接関係しない内部アミノ酸である。ＳＩＲＰ−α変異体は、表４に列挙される置換の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、またはすべて）を含み得る。ＳＩＲＰ−α変異体は、最大で２０のヒスチジン置換を含み得る。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
ＩＩＩ．ｐＨ依存性結合
研究は、腫瘍形成性の物質代謝に仲介された腫瘍細胞が、大量の乳酸および陽子を生成し、腫瘍組織内と同じ６程度の低い値まで、細胞外のｐＨ値を低減させることを示した。  （Ｉｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８２６：４２３−４３３，２０１２）。いくつかの実施形態において、１つのＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ‐α変異体構成物は、中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４付近）よりも酸性側ｐＨ下で、ＣＤ４７に対し高い親和性で結合するように設計される。したがって、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構成物は、非罹患細胞上のＣＤ４７ではなく、罹患細胞（例えば腫瘍細胞）または罹患部位の細胞（例えば腫瘍成長を支援する腫瘍微小環境中の細胞）上のＣＤ４７に対し、選択的に結合するように設計される。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明のＳＩＲＰ―α変異体構成物のｐＨ依存性結合を設計するために、ヒスチジン突然変異誘発は、ＳＩＲＰ−α変異体上、特にＣＤ４７と相互作用するＳＩＲＰ−αの領域上で、実行されるかもしれない。ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との複合体の結晶構造（例えばＰＤＢ  ＩＤ  Ｎｏ．２ＪＪＳ参照）およびコンピュータモデリングは、ＳＩＲＰ−αおよびＣＤ４７の三次元の結合部位を視覚化するために使用されてもよい。ｐＨ感受性結合特性を有するタンパク質を設計するのに有用な計算上の設計およびモデリング方法は、文献において知られており、例えばＳｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１１：６７５−８０，２０１４に記載されており、これは参照によってその全体が本明細書に組込まれる。いくつかの実施形態において、コンピュータモデリングは、ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との界面でのキーとなる接触残基を同定するために使用されてもよい。同定されたキーとなる接触残基は、計算された結合エネルギーおよび形状相補性に基づいて、最適化、篩い分け、およびランク付けが可能な様々なタンパク質デザインを生成することができる、入手可能な蛋白質デザインソフトウェア（例えばＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ）を使用して、ヒスチジン残基と置換されてもよい。したがって、あるアミノ酸位置でのエネルギー的に有利なヒスチジン置換が、計算上のデザイン方法を使用して同定され得る。コンピュータモデリングは、ＳＩＲＰ−αの三次元構造の変化を予測するために使用され得る。ＳＩＲＰ−αの三次元構造の重大な変化を生成するヒスチジン置換が回避され得る。
【０１００】
一度、エネルギー的および構造的に最適なアミノ酸置換が同定されると、アミノ酸は、ヒスチジン残基と系統的に置換され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、最大２０）のＳＩＲＰ−αのアミノ酸は、ヒスチジン残基と置換され得る。詳しくは、ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との界面に配置されるアミノ酸、好ましくは、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−αの結合に直接含まれるアミノ酸が、ヒスチジン残基と置換され得る。ＳＩＲＰ−α変異体は、１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、最大２０）のヒスチジン残基置換を含み得る。他の実施形態において、ＳＩＲＰ−αの自然発生するヒスチジン残基は、他のアミノ酸残基と置換され得る。さらに他の実施形態において、ＳＩＲＰ−αの１つ以上のアミノ酸は、自然発生するか又はＣＤ４７と置換されるヒスチジン残基の結合に影響を及ぼすために、非ヒスチジン残基と置換され得る。例えば、自然発生するヒスチジン残基を取り囲むアミノ酸を、他のアミノ酸に置換することは、自然発生するヒスチジン残基を「埋没」させ得るいくつかの実施形態において、ＣＤ４７との結合に直接関与しないアミノ酸、すなわち、内部アミノ酸（例えばＳＩＲＰ−αのコアに配置されるアミノ酸）もヒスチジン残基と置換され得る。表４は、ヒスチジンまたは非ヒスチジン残基と置換され得る特定のＳＩＲＰ−αアミノ酸のリストである。接触残基は、ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との界面に配置されるアミノ酸である。コア残基は、ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との間の結合に直接関与しない内部アミノ酸である。ＳＩＲＰ−α変異体は、表４のリストに掲げた置換のうちの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、または全部）を含み得る。
【０１０１】
１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など、最大値２０）のヒスチジン残基置換を含んでいるＳＩＲＰ−α変異体は、異なるｐＨ条件下（例えばｐＨ５、５．５、６、６．５、７、７．４、８）におけるＣＤ４７へのそれらの結合に関してテストされ得る。いくつかの実施形態において、精製されたＣＤ４７タンパク質が、結合をテストするために使用され得る。異なるｐＨ条件下（例えばｐＨ５、５．５、６、６．５、７、７．４、８）におけるＳＩＲＰ−α変異体／ＣＤ４７複合体の結合定数（ＫＡ）または解離定数（ＫＤ）を測定するために、当業者に公知の様々な技術が、使用されてもよい。好ましい実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７に対する結合親和性が、表面プラズモン共鳴（例えばＢｉａｃｏｒｅ３０００（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）を使用して決定され得る。典型的な実施形態において、ｐＨ７．４よりもｐＨ６で、より高い親和性でＣＤ４７を特に結合するという、ｐＨ依存性結合を有するＳＩＲＰ−α変異体は、ｐＨ７．４におけるよりも、ｐＨ６においてより低いＫＤを示す。
【０１０２】
ＩＶ．低酸素依存性結合
腫瘍低酸素は、腫瘍細胞が酸素を奪われた状態である。腫瘍が成長するにしたがい、その血液供給は腫瘍の最速成長部分へ絶えず転送され、腫瘍の部分が、健常組織におけるよりも著しく低い酸素濃度状態に置かれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、低酸素活性化プロドラッグに取り付けられてもよく、これは、特に低酸素状態下において、関連する罹患細胞に対するＳＩＲＰーα変異体の有効性を増大させるために作用し得る。低酸素活性化プロドラッグは、たとえばＫｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０：３８１，２０１２）によって記述されたような文献において知られており、参照によって本明細書に基見込まれる。
【０１０４】
Ｖ．抗体結合
非罹患部位よりも罹患部位において選択的ＳＩＲＰ−α活性を提供する他の戦略は、抗体の領域と結合可能なタンパク質またはペプチドに、ＳＩＲＰ−αタンパク質を付加することである。好ましくは、抗体は罹患細胞、例えば腫瘍細胞に特異的である。例えば抗体は、罹患細胞、例えば腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質に、特異的に結合し得る。ＳＩＲＰ−αタンパク質は、抗体に可逆的または不可逆的に結合し得る。
【０１０５】
一般的抗体結合
いくつかの実施形態において、抗体特異性にかかわらず異なる抗体に結合可能なＳＩＲＰ−αタンパク質を設計するために、ＳＩＲＰ−αタンパク質は、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３定常ドメインを認識するタンパク質またはペプチドに融合され得る。ＳＩＲＰ−αタンパク質は、ＣＤ４７と結合することができ、野生型ＳＩＲＰ−αの配列（例えば変異体１（下記に示すＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））または野生型ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部分の配列（例えば表１のリストに掲げられたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２のうちの任意の１つの配列）に対し、少なくとも５０％のアミノ酸配列との同一性を有する。
【０１０６】
【化１】
2017060462.tif 000009
【０１０７】
野生型ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７結合部位は、野生型ＳＩＲＰ−αのＤ１ドメインを含む（例えば表１のリストに掲げられたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２のうちの任意の１つの配列）。抗体の定常領域に対する一般的結合を示すタンパク質とペプチドは、この技術分野において知られている。例えば、バクテリアの抗体結合タンパク質、例えばプロテインＡ、ＧおよびＬは、抗体の定常領域に結合する。プロテインＡおよびＧはＦｃドメインに結合するが、その一方、プロテインＬは軽鎖の定常領域に結合する。典型的な実施形態において、プロテインＡ、ＧまたはＬは、ＳＩＲＰ−αタンパク質のＮ−またはＣ末端に融合され得る。選択的に、この実施形態において、プロテインＡ、ＧまたはＬの融合蛋白質およびＳＩＲＰ−αタンパク質は、融合蛋白質が血清中の様々な他の抗体と結合するのを防止するための投与の前に、化学的コンジュゲーションによって、抗体に結合され得る。プロテインＡ、ＧまたはＬは、抗体の定常領域に対するより高い結合親和性のために、この分野における従来技術（すなわち、指向性進化およびディスプレイライブラリ）を使用して、進化され、選別され得る。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−αタンパク質は、この技術分野における従来の遺伝学的または化学的コンジュゲーション技術を使用して、抗体に直接付加され得る。他の実施形態において、ＳＩＲＰ−αタンパク質は、スペーサーを介して抗体に結合され、それによってタンパク質の付加的構造および空間的柔軟性を可能にする。様々なスペーサーが、本明細書でさらに詳しく記載される。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−αタンパク質は、直接的または抗体結合タンパク質またはペプチドを通じて、可逆的にまたは不可逆的に、抗体と結合し得る。さらに、本明細書に記載した本発明の実施形態に従って利用可能な修飾抗体の選別が、例えば米国特許公開公報第２０１００１８９６５１号に記載されるようにして、実行することができる。
【０１０８】
抗体の定常領域に結合可能な他のタンパク質またはペプチド、および、そのようなタンパク質またはペプチドを選別するための方法は、米国特許公開第２０１２０２８３４０８号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
特異的抗体結合
いくつかの実施形態において、罹患部位にＳＩＲＰ−α変異体の選択的な標的を提供するため、および特定抗体、例えば腫瘍特異性抗体に結合可能なＳＩＲＰ−α変異体を設計するために、ＳＩＲＰ−α変異体構成物は、ＳＩＲＰ−α変異体および抗体特異性タンパク質またはペプチドを含み得る。ＳＩＲＰ−α変異体は、抗体特異性タンパク質またはペプチド（例えば抗体結合ペプチド）に融合し得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドは、特に腫瘍特異性抗体に、特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体と抗体結合タンパク質またはペプチドとの融合蛋白質は、併用療法において、腫瘍特異性抗体とともに同時投与されてもよい。他の実施形態において、融合蛋白質および腫瘍特異性抗体は、別々、すなわち互いの数時間以内で投与されてもよく、好ましくは、抗体が最初に投与される。さらに他の実施形態において、投与の前に、融合蛋白質が、この技術分野において公知の遺伝学的または化学的方法を使用して。腫瘍特異性抗体に共有結合されてもよい。
【０１１０】
抗体結合ペプチドの実施例は、疾患局在ペプチド（ＤＬＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４ｏｒ６５）を含み、これはセツキシマブのフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）領域の中心に結合することができる小ペプチドである（例えば、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１０：１７４５６−１７４６１，２０１３参照）。セツキシマブは抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ１の抗体である。ＳＩＲＰ−α変異体に融合することができる抗体結合ペプチドは、限定されるものではないが、ＤＬＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４または６５）の配列に対し少なくとも７５％のアミノ酸配列との同一性を有するペプチドまたはそのフラグメントも含む。いくつかの実施形態において、抗体結合ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有する。
【０１１１】
最近の研究において、ＳＩＲＰ−αが、抗体セツキシマブとの組合せにおいてインビトロでのＤＬＤ−１細胞の食作用を向上させることが示された（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８８−９１，２０１３）。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、特異的な抗体結合ペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有するＤＬＰと融合し得る。これらの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物は、セツキシマブ結合ＥＧＦＲ発現腫瘍におけるその活性を標的としてもよい。これは順に、ＳＩＲＰ−α変異体およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物、およびセツキシマブの、抗ＥＧＦＲ反応性の被処置者に対する送達を、さらに改善し得る。ＳＩＲＰ−α変異体およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物の一例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６において示され、この配列における下線部分がＤＬＰを示し、太字部分がＳＩＲＰ−α変異体を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６におけるＳＩＲＰ−α変異体（太字部分）の配列は、本明細書において記載される任意のＳＩＲＰ−α変異体の配列によって置換されてもよい。他の抗体結合ペプチドも、ＳＩＲＰ−α変異体に融合されてもよい。そのような抗体結合ペプチドは、セツキシマブ、ペルプロリツマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ピジリツマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＥＤＩ６４６９、インプリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バルリルマブ（ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、モガマリツマブ（ｍｏｇａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＳ１抗体、ハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、及び／又はペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のような、抗体に特異的に結合することができるペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
【化２】
2017060462.tif 000010
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物はさらに、切断可能なリンカーが切断され得る罹患部位に構成物が到達する前に、構成物中のＳＩＲＰ−α変異体の結合をブロックするために、本明細書に記載したＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドと結合され得る。これらの実施形態において、治療ウィンドウは拡張可能である。ＳＩＲＰ−α変異体、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドおよびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物は、罹患部位に蓄積して、プロテアーゼ（例えば腫瘍特異性プロテアーゼ）または罹患部位における他の特性（例えば酸性ｐＨ、低酸素）によってリンカー切断が誘発された後に、罹患部位でのみ活性化する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、腫瘍特異性抗体に結合することができるタンパク質またはペプチドは、指向性進化や例えばファージディスプレイライブラリーのようなディスプレイライブラリなどの、この技術分野において一般に使用される技術を使用して、同定され得る。腫瘍特異性抗体に結合することができるタンパク質およびペプチドを同定することに向けられた方法および技術は、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１０：１７４５６−６１、２０１３）によって記載されたもののように、この技術分野で公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージディスプレイライブラリーにおいて、潜在的な抗体特異性タンパク質またはペプチドは、バクテリオファージ外殻蛋白質に対し典型的に共有結合している。結合は、外殻蛋白質に融合したタンパク質またはペプチドをエンコードする核酸の翻訳からもたらされる。ペプチドを表示するバクテリオファージは、例えば培養基からのＰＥＧ沈澱法などの標準ファージ調整方法を用いて、成育し収穫することができる。その後、これらの表示ファージは、表示されたタンパク質と腫瘍特異性抗体との間の相互作用を検出するために、例えば腫瘍特異性抗体などの他のタンパク質からスクリーニングすることができる。一度、腫瘍特異性タンパク質またはペプチドが同定されたならば、選択された腫瘍特異性タンパク質またはペプチドをエンコードする核酸は、増幅後に、選択されたファージが感染した細胞から、またはファージそれ自体から、分離することができる。個々のコロニーまたはプラークは、採取することができ、核酸は分離して配列決定することができる。抗体特異性タンパク質またはペプチドを同定して分離した後、タンパク質またはペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ−またはＣ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、この技術分野において従来の遺伝学的または化学的コンジュゲーション技術を使用して、腫瘍特異性抗体に直接結合され得る。他の実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、スペーサーを介して腫瘍特異性抗体に結合されてもよく、それにより、タンパク質の追加構造や空間的柔軟性を可能にする。様々なスペーサーが、本明細書で、さらに詳しく記載される。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、直接的または抗体結合タンパク質やペプチドを通じて、可逆的にまたは不可逆に、抗体と結合しうる。
【０１１５】
他の実施形態において、野生型のＳＩＲＰ−αまたは野生型のＳＩＲＰ−αの細胞外Ｄ１ドメイン（例えば、表１にリストされたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−１２のうちの任意の１つの配列）は、腫瘍特異性抗体に結合し得る。好ましくは、ＳＩＲＰ−αのＤ１ドメインは腫瘍特異性抗体に結合される。腫瘍特異性抗体は、野生型ＳＩＲＰ−αまたはＤ１ドメインが罹患細胞上のＣＤ４７と相互作用することが可能な、例えば癌部位や固形腫瘍の内部などの罹患部位に、野生型ＳＩＲＰ−αまたはＤ１ドメインをもたらすための標的部分として機能する。いくつかの実施形態において、野生型ＳＩＲＰ−αまたは野生型ＳＩＲＰ−αの細胞外Ｄ１ドメインは、この技術分野における従来の遺伝学的または化学的コンジュゲーション技術を使用して、腫瘍特異性抗体に直接結合され得る。他の実施形態において、野生型ＳＩＲＰ−αまたは野生型ＳＩＲＰ−αの細胞外Ｄ１ドメインは、タンパク質の追加構造や空間的柔軟性を可能にするスペーサーを用いて、腫瘍特異性抗体に結合される得る。様々なスペーサーが本明細書でさらに詳細に記載される。他の実施形態において、野生型ＳＩＲＰ−αまたは野生型ＳＩＲＰ−αの細胞外Ｄ１ドメインは、腫瘍特異性抗体に結合可能な前述のタンパク質またはペプチドに融合され得る。さらに他の実施形態において、国際公開第２０１３／１０９７５２（参照によって本明細書に組込まれる）に記載されるもののような、他のＳＩＲＰーαポリペプチドが、腫瘍特異性抗体または腫瘍特異性抗体に結合可能なタンパク質またはペプチドに結合され得る。いくつかの実施形態において、野生型ＳＩＲＰ−αまたはＤ１ドメインは、直接または抗体結合タンパク質やペプチドを通じて、可逆的にまたは不可逆的に、抗体と結合し得る。
【０１１６】
ＶＩ．ブロッキングペプチド
ブロッキングペプチドは、切断可能リンカーによって、ＳＩＲＰ−α変異体を結合され得る。いくつかの実施形態において、ブロッキングペプチドも、ＳＩＲＰ−α変異体に非共有結合で結合され得る。ブロッキングペプチドは、生理学的条件下（例えば中性ｐＨおよび適切な酸素濃度）で、非罹患細胞の細胞表面上のＣＤ４７にＳＩＲＰ−α変異体が結合することができないように、ＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７結合部位をブロックするように作用する。例えば腫瘍内部のような癌部位などの罹患部位における異常状態下（つまり、酸性状態及び／又は低酸素環境、または増大したプロテアーゼ発現を有する環境）で
切断可能リンカーは、ＳＩＲＰ−α変異体をブロッキングペプチドから解放するために切断され得る。その後、ＳＩＲＰ−α変異体は、近くの腫瘍細胞上のＣＤ４７に自由に結合することになる。切断可能リンカーの実施例は、本明細書でさらに詳細に記載される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ブロッキングペプチドは、設計されたＳＩＲＰ−α変異体よりも、野生型ＳＩＲＰ−αにより高い親和性を有する。一旦リンカーが切断されれば、ブロッキングペプチドはＳＩＲＰ−α変異体から分離し、野生型ＳＩＲＰ−αに結合可能になる。野生型ＳＩＲＰ−αおよびＳＩＲＰ−α変異体に対し異なる結合親和性を有するブロッキングペプチドは、例えば指向性進化およびディスプレイライブラリ（例えばファージまたは酵母ディスプレイ）のような、この技術分野において一般に知られている方法および技術を用いて同定され得る。１つの典型的な実施形態において、ＣＤ４７のＳＩＲＰ−α結合領域をエンコードするヌクレオチドまたは抗ＳＩＲＰ−α抗体の可変領域をエンコードするヌクレオチドは、大きな遺伝子変異体ライブラリを作成するために、例えばエラープローンＰＣＲやＤＮＡシャフリングのような技術を用いて、突然変異及び／又はアトランダムな組み換えがなされ得る。一旦遺伝学的ライブラリが作成されれば、ヌクレオチドによってエンコードされた変異ペプチドが、例えばファージや酵母ディスプレイを使用して、野生型ＳＩＲＰ−αおよびＳＩＲＰ−α変異体への結合能力に対して、スクリーニングされ得る。野生型ＳＩＲＰ−αおよびＳＩＲＰ−α変異体の両方に結合できる同定されたペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体によりも野生型ＳＩＲＰ−αに対し高い親和性で結合するタンパク質が分離され得るような、第２のスクリーニング工程を受けてもよい。同定されたペプチドは、一度、野生型ＳＩＲＰ−αまたはＳＩＲＰ−α変異体に結合されたならば、野生型ＳＩＲＰ−αまたはＳＩＲＰ−α変異体に対するＣＤ４７の結合を阻止することになる。当業者に公知の様々な技術が、ＳＩＲＰ−α変異体／ブロッキングペプチド複合体、または野生型ＳＩＲＰ−α／ブロッキングペプチド複合体の結合定数（ＫＡ）または解離定数（ＫＤ）を測定するために使用され得る。ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体よりも野生型ＳＩＲＰ−αに対し、少なくとも３倍高い親和性で結合され得る。
【０１１８】
ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド
ブロッキングペプチドは、ＣＤ４７ミミックポリペプチド、または、本明細書に記載したＳＩＲＰ−α変異体と結合できるＣＤ４７フラグメントであり得る。いくつかのブロッキングペプチドは、ＣＤ４７結合部位とは異なる部位でＳＩＲＰ−α変異体と結合し得る。いくつかのブロッキングペプチドは、ＣＤ４７とは異なる方法で、ＳＩＲＰ−α変異体と結合し得る。いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、少なくとも１つの安定なジスルフィド結合を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＣＥＲＶＩＧＴＧＷＶＲＣのポリペプチド配列、またはそれらのフラグメント、またはその変異体を含み得る。変異体ブロッキングペプチドは、１つ以上の保存的または非保存的な修飾を含み得る。いくつかの場合において、変異体ブロッキングペプチドは、セリンに対するシステインの修飾、及び／又は、グルタミンに対するアスパラギンの１つ以上の修飾を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＣＥＲＶＩＧＴＧＷＶＲＣのポリペプチド配列を含むペプチド、または、その変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体と結合し得る。ブロッキングペプチドは、ＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫのポリペプチド配列、またはそのフラグメントまたは変異体を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫのポリペプチド配列を含むペプチド、またはその変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、ＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥのポリペプチド配列、またはそのフラグメントまたは変異体を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥのポリペプチド配列を含むペプチド、またはその変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、ＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＣのポリペプチド配列、またはそのフラグメントまたは変異体を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＣのポリペプチド配列を含むペプチド、またはその変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。
【０１１９】
本明細書で、ＳＩＲＰ−α変異体およびブロッキングペプチドを含むＳＩＲＰ−α変異体構成物が提供され、このブロッキングペプチドは、ＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴのポリペプチド配列、またはそのフラグメントまたは変異体を含見得る。ブロッキングペプチドは、ＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴのポリペプチド配列を含むペプチド、またはその変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。
【０１２０】
いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、ＧＱＹＴＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫのポリペプチド配列、またはそのフラグメントまたは変異体を含み得る。ブロッキングペプチドは、ＧＱＹＴＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫのポリペプチド配列を含むペプチド、またはその変異体またはフラグメントと同じ部位で、ＳＩＲＰ−α変異体に結合し得る。いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体と比較して、野生型ＳＩＲＰ−αに対しより高い親和性を示すＣＤ４７変異体ポリペプチドであり得る。野生型ＣＤ４７と比較すると、ブロッキングポリペプチドは、以下の突然変異の少なくとも１つを含み得る：Ｔ１０２Ｑ、Ｔ１０２Ｈ、Ｌ１０１Ｑ、Ｌ１０１ＨおよびＬ１０１Ｙ。野生型ＣＤ４７と比較すると、ブロッキングポリペプチドは、Ｎ末端またはＮ末端の近くで、付加グリシン残基の導入を含み得る。グリシンは、グルタミン及び／又はに隣接している、ＣＤ４７のＮ末端の、またはそのＮ末端の近くのロイシンに導入され得る。いくつかの場合において、ブロッキングペプチドは、野生型ＣＤ４７と比較して、ＳＩＲＰ−α変異体に対しより低い親和性を示すＣＤ４７変異体ポリペプチドであり得る。そのようなＣＤ４７変異体ポリペプチドは、本明細書に記載された方法を使用して、容易に同定および検査され得る。
【０１２１】
本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構成物が本明細書で提供され、前記ＳＩＲＰ−α変異体は、少なくとも１つのリンカーの使用によって、本明細書に記載されたブロッキングペプチドに接続される。ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ＳＩＲＰ−αと同じＣＤ４７結合部位を含み得る。ＳＩＲＰ−α変異体は、１つ以上の突然変異、または野生型ＳＩＲＰ−αに比較して挿入を含み得る。ＳＩＲＰ−α変異体は、野生型ＳＩＲＰ−αのトランケート形態であり得る。ブロッキングペプチドは、本明細書に記載されるＣＤ４７ミミック、変異体またはフラグメントであり得る。ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体構成物中のＳＩＲＰ−α変異体と比較して、野生型ＳＩＲＰ−αに対しより高い親和性を示し得る。ブロッキングペプチドは、野生型ＣＤ４７と比較して、ＳＩＲＰ−α変異体に対しより低い親和性を示すＣＤ４７変異体ポリペプチドであり得る。リンカーは、１つ以上のプロテアーゼによって随意に切断可能な、および１つ以上のスペーサーも随意に含む、少なくとも１つのリンカーであり得る。切断可能リンカーは、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨを含み得る。スペーサーは、グリシン-セリン・スペーサーの１つ以上のユニットを含み、それらの各ユニットは配列ＧＧＧＧＳを含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーによってＳＩＲＰ−α変異体に結合されるブロッキングペプチドは、ＣＤ４７に由来するＳＩＲＰ−α−結合ペプチド（すなわちＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、ＣＤ４７のＳＩＲＰ−α結合部位に由来する。ＣＤ４７のＳＩＲＰ−α結合部位は、ＣＤ４７の免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインとしばしば呼ばれ、この配列は、以下に示される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５；Ｒｅｆ．ＮＰ＿００１７６８１）。
【０１２３】
【化３】
2017060462.tif 000011
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、ＣＤ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）のＩｇＳＦドメインの全長、またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、欠損、及び／又は野生型に対する付加、ＣＤ４７のＩｇＳＦドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、少なくとも８０％（例えば８３％、８６％、９０％、９３％、９６％など）が野生型の配列と同一のアミノ酸配列、ＣＤ４７のＩｇＳＦドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、またはそれらのフラグメントを有する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換、欠損、及び／又はＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド中の付加は、ＳＩＲＰ−α変異体に対し低い結合親和性と、野生型ＳＩＲＰ−αに対し比較的高い結合親和性とを有するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドをもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド中のアミノ酸置換は、ＣＤ４７およびＳＩＲＰ−αの界面に位置付けられる。例えばＣＤ４７ＩｇＳＦドメインにおけるアミノ酸置換Ｔ１０２Ｑは、ＳＩＲＰ−α変異体中のアミノ酸置換Ａ２７Ｉと立体的に衝突するが、Ａ２７を有する野生型ＳＩＲＰ−αは、アミノ酸置換Ｔ１０２Ｑと立体的に衝突することはないであろう（図２参照）。したがって、Ｔ１０２Ｑを有するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、Ａ２７Ｉを有するＳＩＲＰ−α変異体に対するよりも、Ａ２７を有する野生型ＳＩＲＰ−αに対しより高い親和性で結合するであろう。ＳＩＲＰ−α変異体における特定アミノ酸と立体的衝突を生じさせ得る、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド中のアミノ酸置換の例を、表５にリストとして掲げる。ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド中のこれらのアミノ酸置換の各々は、ＳＩＲＰ−α−ＣＤ４７相互作用部位におけるＳＩＲＰ−α変異体中の特定のアミノ酸に依存して、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＳＩＲＰ−α変異体に対する結合親和性を低減させ得る。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドとＳＩＲＰ−α変異体との立体的衝突の発生に加えて、アミノ酸置換、付加、及び／又は欠損が、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドとＳＩＲＰ−α変異体との間の特定の非共有結合の相互作用を破壊するためにも使用することができ、したがって、ＳＩＲＰ−α変異体に対するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドの結合親和性を低減させる。いくつかの実施形態において、Ｎ末端に１つ以上のアミノ酸を直接加えること及び／又はＮ末端において他のアミノ酸間に１つ以上のアミノ酸を挿入することのいずれかにより、１つ以上のアミノ酸（例えば１つのアミノ酸）でＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端を延長することは、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端とＳＩＲＰ−α変異体との間の非共有結合の相互作用（例えば水素結合相互作用）を破壊する。例えばグリシン付加のような、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端でのアミノ酸付加は、Ｎ末端におけるグルタミンのピログルタミン酸への環化を防ぐとともに、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端ピログルタミン酸と、野生型ＳＩＲＰ−α中アミノ酸Ｌ６６またはＳＩＲＰ−α変異体中のアミノ酸置換Ｌ６６Ｔとの間の水素結合相互作用を破壊する可能性がある、不要な接触および相互作用も発生させるであろう（実施例５参照）。いくつかの実施形態において、例えばグリシンのようなアミノ酸残基は、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端に付加され、それによって、ＣＤ４７のＮ末端が、ＱＬＬＦＮＫから、ＧＱＬＬＦＮＫまたはＱＧＬＬＦＮＫに変化する。アミノ酸置換、欠損、及び／又はＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド中の付加の選択は、ＳＩＲＰ−α変異体中の特定のアミノ酸置換に依存するであろう。
【０１２８】
更に、切断可能リンカーおよび随意に１つ以上のスペーサーを通じて、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に対し、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端を融合させることは、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドとＳＩＲＰ−α変異体との間の結合相互作用にも影響し、ＳＩＲＰ−α変異体に対するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドの結合親和性を低減させる。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構成物では、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端が、切断可能リンカーおよび随意に１つ以上のスペーサーによって、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構成物では、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＣ末端が、切断可能リンカーおよび随意に１つ以上のスペーサーによって、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端に融合される。切断可能リンカーおよびスペーサーの実施例は、本明細書でさらに詳細に記載される。
【０１２９】
典型的なＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、表６に示される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、配列ＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を有するか、または含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドは、配列ＧＱＹＴＳＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を有するか、または含む。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
ＶＩＩ．切断可能リンカー
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構成物は、ブロッキングペプチドに結合されたＳＩＲＰ−α変異体を含む。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構成物は、ブロッキングペプチドに結合された野生型ＳＩＲＰ−αを含む。ＳＩＲＰ−α変異体または野生型ＳＩＲＰ−αと、ブロッキングペプチドとの融合に使用されるリンカーは、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、罹患細胞または罹患部位上のＣＤ４７に対する、ＳＩＲＰ−α変異体構成物中のＳＩＲＰ−α変異体の選択的結合は、罹患細胞または罹患部位で切断される切断可能リンカーの使用によって、ＳＩＲＰ−α変異体にブロッキングペプチドを結合することにより得られ得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドとの間で使用される。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは、ブロッキングペプチド内に導入され、これは、生理学的条件下で、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体の結合を阻害するための、ＳＩＲＰ−α変異体と連結される非共有結合であり得る。切断可能リンカーは、ある条件下で、切断され得る。切断可能リンカーがブロッキングペプチド内に有れば、リンカーの切断は、ブロッキングペプチドを不活性化するであろう。例えば腫瘍内部などの癌部位のような罹患部位に特有の条件下で、リンカーは、ＳＩＲＰ−α変異体をブロッキングペプチドから解放するために切断され、それによって、ＳＩＲＰ−α変異体が、例えば腫瘍細胞のような罹患細胞の細胞表面上のＣＤ４７の近くに結合することが可能である。このようにして、ＳＩＲＰ−α変異体およびブロッキングペプチドを含むＳＩＲＰ−α構築物において、ＳＩＲＰ−α変異体は、罹患細胞（例えば腫瘍細胞）上のＣＤ４７または罹患部位（例えば腫瘍成長を支援する腫瘍微小環境中の細胞）の細胞のみに結合することができ、切断可能リンカーは生理学的条件下では安定であり且つＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７結合部位がブロッキングペプチドによってブロックされることになるので、生理学的条件下では非罹患細胞上のＣＤ４７に結合することはできない。切断可能リンカーは、酸性ｐＨ、低酸素および増大したプロテアーゼ発現のような罹患部位に特有の条件下で、リンカーを切断させるか又は切断を誘発する、アミノ酸、有機小分子、またはアミノ酸と有機小分子との組合せを含み得る。切断可能リンカーは、生理学的条件（例えば中性ｐＨおよび適切な酸素濃度）で安定である。いくつかの実施形態において、切断可能リンカーは切断されず、また、ブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体が、例えば腫瘍細胞のような罹患細胞上のＣＤ４７の近くに自由に結合できるように、罹患部位でＳＩＲＰ−α変異体から簡単に分離し得る。これらの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＣＤ４７に対するｐＨ依存性の結合力を有するように設計されてもよく、その詳細は前に記載される。ＳＩＲＰ−α変異体は、ＣＤ４７に対し、非罹患部位の中性ｐＨ下（例えばｐＨ７．４付近）よりも、罹患部位の酸性ｐＨ下において、高親和性で結合するように設計されてもよい。したがって、ブロッキングペプチド（例えばＣＤ−４７ベースのブロッキングペプチドまたはＣＤ４７ＩｇＳＦドメイン・ブロッキング・タンパク質）は、罹患部位の酸性ｐＨ下で、ＳＩＲＰ−α変異体から分離され得る。いくつかの実施形態において、罹患部位でＣＤ４７に対するＳＩＲＰ−α変異体のｐＨ依存性結合力を設計するために、ヒスチジン突然変異生成が、ＳＩＲＰ−α上、特に、ＣＤ４７と相互作用するＳＩＲＰ−αの領域上で実行されてもよい。
【０１３３】
ｐＨ依存性切断可能リンカー
例えば腫瘍内部などの癌部位の特徴のうちの１つは、酸性ｐＨである。いくつかの実施形態において、リンカーは、酸性ｐＨ下（例えばｐＨ７付近未満）で切断され得る。酸感受性リンカーは、生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４付近）で安定である。酸性ｐＨでの切断は、酸加水分解を通じて、または、例えば腫瘍内部などの癌部位のような罹患部位の酸性ｐＨで存在し且つ活性であるタンパク質によるものであり得る。酸感受性リンカーは、化学的官能基または化合物のような、酸性ｐＨ下で加水分解可能な部分を含み得る。酸感受性の化学的な官能基および化合物は、例えばアセタール、ケタール、チオリンゴ酸（ｔｈｉｏｍａｌｅａｍａｔｅｓ）、ヒドラゾン、およびジスルフィド結合などを含むが、これらに限定されない。酸感受性リンカーの構築物に使用され得る酸感受性リンカーは、酸感受性の官能基および化合物と同様に、この技術分野において公知であり、米国特許第８，７４８，３９９号，第５，３０６，８０９号，および第５，５０５，９３１号，Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２１：５ー１３，２０１０），Ｃａｓｔａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４９：８１８７−８１８９，２０１３），およびＤｕｃｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２１：５−１３，２０１０）に記載されており、これらの各々は、参照によって、その全体が本明細書に組込まれる。１つの実施形態において、ジスルフィド結合が、ペプチド合成機及び／又は従来の化学合成技術を使用して、切断可能リンカーに組み込まれ得る。他の実施形態において、チオリンゴ酸（ｔｈｉｏｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ）リンカーが、切断可能リンカーとして使用され得る。この実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドとの間にチオリンゴ酸（ｔｈｉｏｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ）リンカーを挿入するために、チオリンゴ酸リンカー（例えば、Ｓｃｈｅｍｅ  ２，Ｃａｓｔａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．参照）の２つのチオール基のうちの１つは、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に結合され、一方で、チオリンゴ酸リンカーのエステル基は、ブロッキングペプチドのＮ末端に結合され得る。参考文献の内容は、参照によって、その全体が本明細書に組込まれる。
【０１３４】
低酸素依存性切断可能リンカー
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば腫瘍内部などの癌部位におけるもう一つの特徴である、低酸素状態下で切断され、低酸素感受性リンカーによってブロッキングペプチドに結合されるＳＩＲＰ−α変異体は、生理学的条件下（例えば中性ｐＨおよび適切な酸素濃度）でリンカーが安定している間、非罹患細胞上のＣＤ４７と結合することが阻止される。一度、融合タンパク質が、酸素濃度が健常組織内よりも著しく低い、例えば腫瘍内部などの癌の部位に位置すると、リンカーは、ブロッキングペプチドからＳＩＲＰ−α変異体を解放するために切断され、その後、これが、腫瘍細胞上の細胞表面のＣＤ４７に結合することができる。低酸素感受性リンカーは、例えばアミノ酸や化学的官能基などの、低酸素環境下で切断可能な部分を含み得る。低酸素状態下で、切断、すなわち還元により切断され得る化学的部分のいくつかの例は、キノン、Ｎ−オキシド、およびヘテロ芳香族ニトロ基（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ  ｎｉｔｒｏ  ｇｒｏｕｐｓ）を含むが、これらに限定されない。これらの化学的部分は、従来の化学的およびペプチド合成技術を使用して、切断可能リンカーに導入され得る。低酸素感受性アミノ酸の実施例も、たとえばＳｈｉｇｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９６８−９７１，２０１２）に記載されるもののように、この技術分野において公知であり、それらは参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
好ましい実施形態において、Ｓｈｉｇｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ，Ｂｉｏｌ．１３：９６８−９７１，２０１２）に記載される低酸素感受性アミノ酸が、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドのと間に挿入され得る。例えば、低酸素感受性アミノ酸のアミノ基は、ペプチド結合を通じて、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に結合され、同様に、低酸素感受性アミノ酸のカルボン酸基は、ペプチド結合を通じて、ブロッキングペプチドのＮ末端に結合され得る。低酸素状態下において、ニトロ基の還元は、低酸素感受性アミノ酸とブロッキングペプチドのＮ末端との間のペプチド結合の切断を誘発し、したがって、ブロッキングペプチドからＳＩＲＰ−α変異体を首尾よく解放する。その後、ＳＩＲＰ−α変異体は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に結合することができる。
【０１３６】
他の実施形態において、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：２４１２−２４２０，２００８）に記述された低酸素感受性（２ーニトロイミダゾール）基が、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドの間で挿入されるか、またはＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドの間に挿入された切断可能リンカーに導入され得る。低酸素状態下において、ニトロ基の還元は、さらに還元を誘発し、これは結果的に、例えばＳＩＲＰｇ変異体、ブロッキングペプチドまたは切断可能リンカーなどの結合体からの（２ーニトロイミダゾール）基の除去をもたらす。
【０１３７】
腫瘍関連酵素依存性の切断可能リンカー
他の実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構成物は、リンカー（例えば切断可能リンカー）によってブロッキングペプチドに結合されたＳＩＲＰ−α変異体と、随意に１つ以上のスペーサー（スペーサーの実施例は本明細書でさらに詳細に記載される）を含む。いくつかの実施形態において、リンカー（例えば切断可能リンカー）は、腫瘍関連酵素によって切断され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍関連酵素によって切断可能なリンカーは、ＳＩＲＰ−α変異体に対し非共有結合で結合され得るブロッキングペプチド内に含まれ得る。一度、融合蛋白質が、例えば腫瘍内部などの癌の部位に位置すると、ブロッキングペプチドからＳＩＲＰ−α変異体を解放するために、リンカーは、腫瘍関連酵素によって切断され、これは、その後、腫瘍細胞上の細胞表面ＣＤ４７に結合することができる。腫瘍関連酵素感受性リンカーは、例えば腫瘍内部などの癌部位のみに存在する、例えばタンパク性基質のような、例えばプロテアーゼなどの酵素によって特異的に切断され得る部分を含み得る。この部分は、例えば腫瘍内部などの癌部位に存在する、例えばプロテアーゼなどの酵素のタイプに基づいて選択され得る。腫瘍関連酵素によって切断可能なる典型的な切断可能リンカーは、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）であり、これは、例えばマトリプターゼ（ＭＴＳＰ１）、尿プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、レギマイン、ＰＳＡ（ＫＬＫ３とも言う、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−３）、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、ＭＭＰ９、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）およびプロテイナーゼ３（Ｐｒ３）などの複数のプロテアーゼによって切断可能である。例えばプロテアーゼなどの酵素による切断に影響されやすい他の切断可能リンカーも利用可能である。前述のプロテアーゼに加えて、切断可能リンカーを切断することができる他の酵素（例えばプロテアーゼ）は、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、および蛋白質分解活性を有する他の酵素含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＲＰ−α変異体または野生型ＳＩＲＰ−αは、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンまたはトリプシンのような蛋白質分解活性を有する酵素による切断に影響されるリンカー（例えば切断可能リンカー）によって、ブロッキングペプチドに結合される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、切断可能リンカーの配列は、異なる酵素選択性に基づくいくつかの配列を組み合わせることにより、由来し選択することができる。いくつかの潜在的なプロテアーゼおよびそれらに対応するプロテアーゼ部位についての制限がない実施例は、表７に示される。表７において、「−」は任意のアミノ酸（すなわち任意の自然発生のアミノ酸）を意味し、大文字は、そのアミノ酸に対する強い選択性を示し、小文字は、そのアミノ酸に対する弱い選択性を示し、および「／」は、「／」に隣接する位置で１つ以上のアミノ酸が存在可能な場合に、アミノ酸位置を分割する。他の切断可能配列は、ヒト肝臓コラーゲンからの配列（α１（ＩＩＩ）鎖（ｅ．ｇ．，ＧＰＬＧＩＡＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）））、ヒトＰＺＰからの配列（例えばＹＧＡＧＬＧＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、ＡＧＬＧＶＶＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）、またはＡＧＬＧＩＳＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３））、および自己分解性の他の配列（例えばＶＡＱＦＶＬＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０４）、ＡＱＦＶＬＴＥＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、またはＰＶＱＰＩＧＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６））を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
文献には様々なタイプの癌（例えば固形腫瘍）において既知の基質を有する酵素レベルの増加の報告がある。例えば、Ｌａ  Ｒｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１４１４−１４２１  と  Ｄｕｃｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．２１：５−１３，  ２０１０を参照。文献は全体として本明細書で参照されることで組み込まれる。腫瘍に関連する酵素は当該技術分野、例えば腫瘍細胞の免疫組織化学で知られている従来の技術を使用して識別されることもある。１つの典型的な実施形態では、リンカー中の酵素感受性部分は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）基質であってもよく、これは癌部位、例えば腫瘍の内部に存在するＭＭＰによって切断されることもある。別の典型的な実施形態では、リンカー中の酵素感受性部分は、マレイミドを含有するジペプチドリンカー（例えば、Ｄｕｃｒｙらの表１を参照）であってもよく、これは特定の腫瘍中で高いレベルで存在するプロテアーゼ（例えば、カテプシンまたはプラスミン）によるタンパク質分解により切断されることもある。この実施形態では、マレイミドを含有するジペプチドリンカーのマレイミド群は、ＳＩＲＰ−α変異体のシステイン残基に共役することもあり、マレイミドを含有するジペプチドリンカーのＣ末端のカルボン酸基は、ブロッキングペプチドのＮ末端でアミノ基に共役することもある。同様に、マレイミドを含有するジペプチドリンカーのマレイミド群は、ブロッキングペプチドのシステイン残基に共役することもあり、マレイミドを含有するジペプチドリンカーのＣ末端のカルボン酸基は、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端でアミノ基に共役することもある。質量分析法とプロテオミクスの分野の他の利用可能な技術を用いて、腫瘍に関連する酵素依存性の切断可能なリンカーの切断を確認することもある。他の酵素感受性部分は米国特許第８，３９９，２１９号に記載されており、当該文献は全体として本明細書で参照することにより組み込まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍に関連する酵素に感受性のある部分、例えばタンパク質基質は、当該技術分野で周知の従来の分子細胞生物学と化学共役技術を使用して、ＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドとの間に挿入されてもよい。
【０１４１】
ＶＩＩＩ．血清アルブミン
血清アルブミンとの融合は、タンパク質製剤の薬物動態学を改善することができ、とりわけ、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体は血清アルブミンと結合されてもよい。血清アルブミンは哺乳動物で最も豊富な血液タンパク質である球状タンパク質である。血清アルブミンは肝臓で生産され、血清タンパク質のおよそ半分を構成する。血清アルブミンは単量体であり、血液中に溶解可能である。血清アルブミンの最も重大な機能のいくつかは、身体中のホルモン、脂肪酸、および他のタンパク質を輸送すること、ｐＨを緩衝すること、および血管と体組織との間の体液の適切な分布に必要とされる浸透圧を維持することを含む。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は血清アルブミンに融合することもある。好ましい実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＳＡのＮ末端は、ＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増やすためにＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に結合される。ＨＳＡは、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に直接、またはリンカーにより結合可能である。ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端にＨＳＡのＮ末端を結合することで、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端をＣＤ４７と自由に相互作用させ、ＨＳＡのＣ末端の近位端をＦｃＲｎと相互作用させる。記載される方法と組成物で使用できるＨＳＡは一般に当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０２７６８の配列のアミノ酸２５−６０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７に対して１つ以上のアミノ酸置換基（例えば、Ｃ３４Ｓおよび／またはＫ５７３Ｐ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の配列を有する。
【０１４２】
ＩＸ．アルブミン結合ペプチド
血清タンパク質との結合は、タンパク質製剤の薬物動態学を改善することができ、とりわけ、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体は、血清タンパク質結合ペプチドまたはタンパク質で融合されることもある。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＩＲＰ−α変異体の半減期を増やすために、血清アルブミンとの結合活性を示すアルブミン結合ペプチドに融合されることもある。本明細書に記載される方法と組成物で使用可能なアルブミン結合ペプチドは当該技術分野で一般に知られている。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：３５０３５−３５０４３，  ２００２  ａｎｄ  Ｍｉｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  １０２：３１１０−３１１８，  ２０１３を参照。１つの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。アルブミン結合ペプチドは一般にＳＩＲＰ−α変異体に融合可能であり、または、化学的な手段、例えば、化学共役を介してＳＩＲＰ−α変異体に付着させることができる。融合タンパク質のさらなる構造的および空間的な可撓性を可能にするために、ＳＩＲＰ−α変異体とアルブミン結合ペプチドとの間に必要に応じてスペーサーを挿入することができる。特定のスペーサーとそのアミノ酸配列が本明細書でさらに詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、ＳＩＲＰ−α変異体のＮまたはＣ末端に融合されてもよい。一例において、アルブミン結合ペプチドのＣ末端は、ペプチド結合によってＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端に直接融合されてもよい。別の例において、アルブミン結合ペプチドのＮ末端は、ペプチド結合によってＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に直接融合されてもよい。さらに別の例において、アルブミン結合ペプチドのＣ末端のカルボン酸は、従来の化学共役技術を駆使して、内部のアミノ酸残基、つまり、ＳＩＲＰ−α変異体のリジン残基の側鎖アミノ基に融合されてもよい。１つの理論に束縛されることなく、アルブミン結合ペプチドのＳＩＲＰ−α変異体との融合により、血清アルブミンとの結合を介して治療用タンパク質が長期間保持され得ることが予想される。
【０１４３】
Ｘ．Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体とＦｃドメインモノマーを含むこともある。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、免疫グロブリンのＦｃドメインモノマー、またはＦｃドメインモノマーのフラグメントに融合されてもよい。当該技術分野で従来から知られているように、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＣ末端で見られるタンパク質構造である。Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量化される２つのＦｃドメインモノマーを含む。野生型のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶに結合する最小構造を形成する。本発明では、ＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増やすためにＳＩＲＰ−α変異体に融合されたＦｃドメインモノマーまたはＦｃドメインのフラグメントは、２つのＦｃドメインモノマーの二量体、または１つのＦｃドメインモノマーを含んでもよいが、ただし、ＦｃドメインモノマーはＦｃ受容体（例えばＦｃＲｎ受容体）に結合することができる。さらに、ＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増やすためにＳＩＲＰ−α変異体に融合されたＦｃドメインまたはＦｃドメインのフラグメントは、どんな免疫系に関連する反応も引き起こさない。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは変異してエフェクター機能を欠くこともあり、これは「死んだ」Ｆｃドメインに特有である。例えば、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用を最小限に抑えることが知られている特定のアミノ酸置換基を含むこともある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインモノマー、またはＦｃドメインのフラグメントは、従来の遺伝学的または化学的な手段、例えば化学共役を介して、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端またはＣ末端に融合されてもよい。必要に応じて、リンカー（例えばスペーサー）をＳＩＲＰ−α変異体とＦｃドメインモノマーとの間に挿入可能である。
【０１４４】
Ｆｃドメインモノマーのヘテロ二量体化
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン中の２つのＦｃドメインモノマーの各々は、２つのモノマーのヘテロ二量体化を促すアミノ酸置換基を含んでいる。Ｆｃドメインモノマーのヘテロ二量体化は、「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ」残基対や荷電残基対のような、異なるが互換性を有する２つのＦｃドメインモノマー中の置換基を導入することにより促進することが可能である。「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ」残基対の使用については、Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ  （Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９：６１７−６１２，  １９９６；  Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２７０：２６−３５，  １９９７；  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：６７７−６８１，  １９９８）に記載されている。ノブとホールの相互作用はヘテロ二量体の形成に好都合であるが、ノブ−ノブとホール−ホールの相互作用は、立体的な衝突と好ましい相互作用の欠失により、ホモ二量体形成を妨害する。「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ」技術も、米国特許出願第８，２１６，８０５号、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７７−６８１，  １９９８，  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １１０：Ｅ２９８７−Ｅ２９９６，  ２０１３に記載されており、文献は各々全体として参照することにより本明細書に組み込まれる。ホールは、タンパク質中の元々のアミノ酸が少量の側鎖を有する異なるアミノ酸と取り替えられる際に作られる空隙である。ノブは、タンパク質中の元々のアミノ酸が大量の側鎖を有する異なるアミノ酸と取り替えられる際に作成される隆起である。具体的には、交換されるアミノ酸は、ＦｃドメインモノマーのＣＨ３抗体定常ドメインにあり、２つのＦｃドメインモノマーの二量体化に関与する。いくつかの実施形態において、１つのＣＨ３抗体定常ドメイン中のホールは別のＣＨ３抗体定常ドメイン中のノブを収容するために作られ、その結果、ノブとホールのアミノ酸が２つのＦｃドメインモノマーのヘテロ二量体化を促すか、容易にするように作用する。いくつかの実施形態では、１つのＣＨ３抗体定常ドメイン中のホールは、別のＣＨ３抗体定常ドメイン中に元々のアミノ酸をより良く収容するために作られる。いくつかの実施形態では、１つのＣＨ３抗体定常ドメイン中のノブは、別のＣＨ３抗体定常ドメイン中で元々のアミノ酸とさらなる相互作用を形成するために作られる。
【０１４５】
ホールは、チロシンまたはトリプトファンのような大量の側鎖を有するアミノ酸を、アラニン、バリン、またはトレオニンのような少量の側鎖を有するアミノ酸と交換することにより、構築可能である（ＣＨ３抗体定常ドメイン中のＹ４０７Ｖ突然変異など）。同様に、ノブは、少量の側鎖を有するアミノ酸を、大量の側鎖を有するアミノ酸と交換することにより構築可能である（ＣＨ３抗体定常ドメイン中のＴ３６６Ｗ突然変異など）。好ましい実施形態では、１つのＦｃドメインモノマーは、ノブ突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃドメインモノマーはホール突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３５８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。本発明のＳＩＲＰ−αＤ１変異体は、望ましくないノブ−ノブ・ホモ二量体形成を制限するためにノブ突然変異Ｔ３６６Ｗを含むＦｃドメインモノマーに融合されてもよい。ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅアミノ酸対の例は、限定されないが、表８に含まれる。
【０１４６】
【表８】
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【０１４７】
ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ戦略に加えて、静電気操縦戦略を用いてＦｃドメインモノマーの二量体化を制御してもよい。静電気操縦とは、高次タンパク質分子の形成を制御するために、ペプチド、タンパク質ドメイン、およびタンパク質中の逆荷電アミノ酸の間の好ましい静電的相互作用を利用することである。とりわけ、静電気操縦を使用してＦｃドメインモノマーの二量体化を制御するために、ＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つ以上のアミノ酸残基は正荷電または負荷電のアミノ酸配列と交換され、その結果、相互作用は、導入された特定の電荷のアミノ酸に依存して、静電気的に好ましくなるか、または好ましくなくなる。いくつかの実施形態では、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのような界面中の正荷電アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような負荷電アミノ酸と交換される。いくつかの実施形態では、界面中の負荷電アミノ酸は、正荷電アミノ酸と取り替えられる。荷電アミノ酸は、相互作用ＣＨ３抗体定常ドメインの１つ、または両方に導入されることもある。２つのＦｃドメインモノマーの相互作用ＣＨ３抗体定常ドメインへ負荷アミノ酸を導入することで、荷電アミノ酸間の相互作用に起因する静電気操縦効果により制御されるようなＦｃドメインモノマーのヘテロ二量体の選択的な形成が促され得る。静電気操縦技術も、米国特許出願公開第２０１４００２４１１１号、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５：１９６３７−４６，２０１０，ａｎｄ  Ｍａｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：６１４４−５２，  ２００６に開示されており、これらの文献はそれぞれ全体として引用により本明細書に組み込まれる。静電気操縦アミノ酸対の例は限定されないが表９に含まれている。
【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
ＸＩ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー
いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に融合されることもある。タンパク質製剤へのポリマーの付着は宿主の免疫系から製薬のタンパク質を「マスクする」ことができる（Ｍｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  １３：１０５−１１９，  ２０１２）。加えて、特定のポリマー、例えば、親水性ポリマーは、さらに疎水性タンパク質と医薬品に水溶性を与えることができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５７：１９６４−１９６９，  ２０００；  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９：６４３−６５０，  ２００８）。ＰＥＧ、ポリシアル酸鎖（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９：６４３−６５０，  ２００８）、およびＰＡＳ鎖（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  ２６：４８９−５０１，  ２０１３）などの様々なポリマーが当該技術分野で知られており、本発明で使用可能である。いくつかの実施形態では、ポリマー（例えばＰＥＧ）は、従来の化学的手法、例えば、化学共役を用いて、Ｎ末端またはＣ末端か、あるいは内部位置で、ＳＩＲＰ−α変異体に共有結合されることもある。いくつかの実施形態では、ポリマー（例えばＰＥＧ）は、ＳＩＲＰ−α変異体中のシステイン置換または付加に共有結合されることもある。ＳＩＲＰ−α変異体中のシステイン置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３−２３のいずれか１つの配列に対して、Ｉ７Ｃ、Ａ１６Ｃ、Ｓ２０Ｃ、Ｔ２０Ｃ、Ａ４５Ｃ、Ｇ４５Ｃ、Ｇ７９Ｃ、Ｓ７９Ｃ、またはＡ８４Ｃであってもよい。ＳＩＲＰ−α変異体中でのシステイン残基の付加は、当該技術分野の従来の技術、例えば、ペプチド合成、遺伝子修飾、および／または分子クローニングを使用して導入されてもよい。ポリマー（例えばＰＥＧ）は、当業者に周知のシステイン−マレイミド共役を用いて、システイン残基に付けられてもよい。参照する出版物の内容は全体として参照により組み込まれる。
【０１５０】
上に記載された実施形態に加えて、他の半減期を延ばす技術もさらに利用可能であり、ＳＩＲＰ−α変異体の血清半減期を増やすために本発明で使用されてもよい。半減期を延ばす技術は、限定されないが、ＥＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２７：１１８６−１１９２，  ２００９）  ａｎｄ  Ａｌｂｕ  ｔａｇ  （Ｔｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０：２２８６−２２９２，  ２００９）を含む。参照する出版物の内容は全体として参照により組み込まれる。
【０１５１】
ＸＩＩ．スペーサー
いくつかの実施形態では、スペーサーはＳＩＲＰ−α変異体中で使用されてもよい。例えば、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、リンカー（例えば、切断可能なリンカー）によってブロッキングペプチドに付けられたＳＩＲＰ−α変異体を含んでもよい。こうしたＳＩＲＰ−α変異体構築物において、スペーサーは、ＳＩＲＰ−α変異体とリンカー（例えば、切断可能なリンカー）との間に、および／またはリンカー（例えば、切断可能なリンカー）とブロッキングペプチドとの間に挿入されてもよい。ＳＩＲＰ−α変異体とリンカーとの間の間隔、および／または、リンカーとブロッキングペプチドとの間の間隔を最適化するために、以下に記載されるスペーサーの任意の１つ以上が使用されてもよい。
【０１５２】
リンカー（例えば切断可能なリンカー）によりブロッキングペプチドに付けられたＳＩＲＰ−α変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物のいくつかの実施形態において、スペーサーがＳＩＲＰ−α変異体とブロッキングペプチドのコアから遠ざけて切断可能なリンカーの位置を決める役割を果たすことで、切断可能なリンカーは切断の原因となる酵素に近づきやすくなる。ＳＩＲＰ−α変異体構築物中の２つの元素、例えば、ＳＩＲＰ−α変異体、リンカー、および、ブロッキングペプチドを（この順序で）含むＳＩＲＰ−α変異体構築物中のＳＩＲＰ−α変異体とリンカー（例えば切断可能なリンカー）の付着は、特定の付着の方法である必要はなく、または特定の反応によるものである必要もない。適切な安定性と生物学的適合性のＳＩＲＰ−α変異体構築物を与える任意の反応が許容可能である。
【０１５３】
スペーサーとは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物中の２つの元素、例えば、ＳＩＲＰ−α変異体、リンカー、および、ブロッキングペプチドを（この順序で）含むＳＩＲＰ−α変異体構築物中のＳＩＲＰ−α変異体とリンカー（例えば切断可能なリンカー）、ＳＩＲＰ−α変異体、リンカー、および、ブロッキングペプチドを（この順序で）含むＳＩＲＰ−α変異体構築物中のリンカー（例えば切断可能なリンカー）とブロッキングペプチド、ならびに、ＳＩＲＰ−α変異体と血清タンパク質結合ペプチドまたはタンパク質、例えばアルブミン結合ペプチドとの間の結合を指す。スペーサーはさらにＳＩＲＰ−α変異体または野生型のＳＩＲＰ−αと抗体（例えば腫瘍特異的抗体）または抗体結合ペプチドとの間に挿入可能な結合を指すこともある。スペーサーは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の付加的な構造および／または空間的柔軟性を与えることができる。スペーサーは、単純な化学結合、例えば、アミド結合、小さな有機分子（例えば炭化水素鎖）、アミノ酸配列（例えば３−２００のアミノ酸配列）、または小さな有機分子（例えば炭化水素鎖）とアミノ酸配列（例えば３−２００のアミノ酸配列）の組み合わせであり得る。スペーサーは、罹患した部位に特有の条件（例えば酸性のｐＨ、低酸素）下でも生理学的条件（例えば、中性のｐＨと適切な酸素濃度）下でも安定している。スペーサーは、癌部位（例えば腫瘍の内部）のような罹患した部位で安定している。
【０１５４】
スペーサーは３−２００のアミノ酸を含むこともある。適切なペプチドスペーサーは当該技術分野で知られており、例えば、グリシンとセリンのような柔軟なアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含んでいる。ある実施形態では、スペーサーは、ＧＳ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧ、またはＳＧＧＧのモチーフ、例えば、多くのモチーフ、または繰り返しモチーフを含み得る。ある実施形態では、スペーサーは、ＧＳ、例えば、ＧＳ、ＧＳＧＳ、ＧＳＧＳＧＳ、ＧＳＧＳＧＳＧＳ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳのモチーフを含む２〜１２のアミノ酸を含み得る。ある他の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＳ、例えば、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、および、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳのモチーフを含む３〜１２のアミノ酸を含み得る。さらに他の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＳＧ、例えば、ＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧＧＳＧ、または、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧのモチーフを含む４〜１２のアミノ酸を含み得る。他の実施形態では、スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのモチーフを含み得、ｎは１から１０までの整数である。他の実施形態では、スペーサーは、グリシンとセリン以外のアミノ酸、例えば、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ，  ＳＡＣＹＣＥＬＳ、ＲＳＩＡＴ、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ、またはＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳも含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の１２または２０のアミノ酸ペプチドスペーサーは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物中で使用されてもよい。１２および２０のアミノ酸ペプチドスペーサーは、配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳとＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧをそれぞれ含むこともある。いくつかの実施形態では、配列ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳを含む１つ以上の１８のアミノ酸ペプチドスペーサーは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物中で使用されてもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、スペーサーはさらに一般構造
【０１５６】
【化４】
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を有することもあり、ＷはＮＨまたはＣＨ２であり、Ｑはアミノ酸またはペプチドであり、ｎは０から２０までの整数である。
【０１５７】
ＸＩＩＩ．ＳＩＲＰ−α変異体へのブロッキングペプチドの融合
ブロッキングペプチド（例えば、表６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６−４６のいずれか１つの配列を有するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド）は、リンカー、例えば、切断可能なリンカー（例えば、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７））と随意に１つ以上のスペーサー（例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎ、リンカーのＮ末端またはＣ末端のいずれかに遺伝学的に融合し、ｎは１から１０までの整数である）によって、ＳＩＲＰ−α変異体のＮ末端またはＣ末端に融合することもある。切断可能なリンカーと１つ以上のスペーサーによってＳＩＲＰ−α変異体構築物に融合されたＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物の典型的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−６３の配列で示される。スペーサーの長さは、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドとＳＩＲＰ−α変異体との間の最も最適化された結合を実現するために変えられてもよい。
【０１５８】
ＸＩＶ．ＳＩＲＰ−α変異体構築物を産生する方法
本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物は宿主細胞から産生可能である。宿主細胞とは、対応する核酸から本明細書に記載されるポリペプチドと構築物を発現するのに必要とされる細胞成分、例えば細胞小器官を含む媒体を指す。核酸は、当該技術分野で知られている従来の技術（例えば、変換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、感染など）によって宿主細胞へ導入可能な核酸ベクター中に含まれてもよい。核酸ベクターの選択は使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物（例えば細菌性）または真核生物（例えば哺乳動物）起原のものである。
【０１５９】
核酸ベクター構築物と宿主細胞
ＳＩＲＰ−α変異体構築物のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られている様々な方法によって調製されてもよい。こうした方法は、限定されないが、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位指定された）突然変異誘発とＰＣＲ突然変異誘発を含む。本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化するポリヌクレオチド分子は、標準的な技術、例えば、遺伝子合成を使用して得られてもよい。代替的に、野生型のＳＩＲＰ−αをコード化するポリヌクレオチド分子は、当該技術分野の標準的な技術、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発を用いて、特定のヒスチジン置換を含むように変異することもある。ポリヌクレオチドはヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成可能である。
【０１６０】
ＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化するポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物の宿主細胞中のポリヌクレオチドを複製かつ発現することができるベクターに挿入されてもよい。多くのベクターが当該技術分野で入手可能であり、本発明の目的で使用することができる。それぞれのベクターは、特定の宿主細胞との適合性のために調節および最適化され得る様々な成分を含んでもよい。例えば、ベクター成分は、限定されないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化するポリヌクレオチド配列、および転写終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、多くのＳＩＲＰ−α変異体構築物の発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むこともある。細菌の発現ベクターのいくつかの例は、限定されないが、ベクターのｐＧＥＸシリーズ（例えば、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ、ｐＧＥＸ−６Ｐ）、ベクターのｐＥＴシリーズ（例えば、ｐＥＴ−２１、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２１ｂ、ｐＥＴ−２３、ｐＥＴ−２４）、ベクターのｐＡＣＹＣシリーズ（例えば、ｐＡＣＹＤｕｅｔ−１）、ベクターのｐＤＥＳＴシリーズ（例えば、ｐＤＥＳＴ１４、ｐＤＥＳＴ１５、ｐＤＥＳＴ２４、ｐＤＥＳＴ４２）、および、ｐＢＲ３２２、ならびにその誘導体を含む（例えば、米国特許第５，６４８，２３７号を参照）。哺乳動物の発現ベクターのいくつかの例としては、限定されないが、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＤＮＡ４、ｐＮＩＣＥ、ｐＳＥＬＥＣＴ、およびｐＦＬＡＧ−ＣＭＶが挙げられる。他のタイプの核酸ベクターは、細胞（例えば、被験体の細胞）のタンパク質を発現するためのウイルスベクターを含む。こうしたウイルスベクターとしては、限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒａｌ）ベクター（例えば、修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルススベクター、およびアルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒａｌ）ベクターが挙げられる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は本発明の宿主細胞として使用される。大腸菌株の例としては、限定されないが、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられる。他の実施形態では、哺乳動物細胞は本発明の宿主細胞として使用される。哺乳動物の細胞タイプの例としては、限定されないが、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ３細胞、ベロ細胞、およびＭＣ３Ｔ３細胞が挙げられる。様々な宿主細胞は、タンパク質産物の翻訳後プロセシングと修飾のための特性と特定のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現されたタンパク質の適切な修飾とプロセシングを保証するために選択されることもある。上記の発現ベクターは、当該技術分野の従来の技術、例えば、変換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、および直接的なマイクロインジェクションを使用して、適切な宿主細胞へ導入されることもある。いったんベクターがタンパク質産生のために宿主細胞へ導入されると、宿主細胞は、プロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコード化する遺伝子を増幅するのに適切なように修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【０１６２】
タンパク質の産生、回収、および精製
本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物を産生するのに使用される宿主細胞は、当該技術分野で知られている、かつ、選択された宿主細胞の培養に適している培地中で育てられてもよい。細菌の宿主細胞にふさわしい媒体の例としては、選択剤、例えば、アンピシリンなどの必要な添加剤を加えたルリア培地（Ｌｕｒｉａ  ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）が挙げられる。哺乳動物の宿主細胞にふさわしい媒体の例としては、基礎培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を捕捉したＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。
【０１６３】
宿主細胞は、約２０°Ｃ−約３９°Ｃまで、例えば、２５°Ｃから約３７°Ｃまでのような適切な温度で培養される。培地のｐＨは主に宿主生物に依存して、一般に約６．８〜７．４であり、例えば７．０である。誘導可能なプロモーターが本発明の発現ベクター中で使用される場合、タンパク質の発現はプロモーターの活性化に適した条件下で引き起こされる。
【０１６４】
タンパク質の回収は典型的には浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段によって宿主細胞を一般に破壊することを含んでいる。いったん細胞が破壊されると、細胞片は遠心分離または濾過によって取り除かれてもよい。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって精製されてもよい。当該技術分野で知られている標準的なタンパク質精製方法が使用可能である。以下の手順は適切な精製手順の典型的なものである：免疫親和性またはイオン交換カラムの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはカチオン交換樹脂のクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびゲル濾過。
【０１６５】
代替的に、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子を含むベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルススベクター、およびアルファウイルスベクター）を投与することにより、被験体（例えばヒト）の細胞によって、例えば、治療の文脈で、産生可能である。ベクターは、いったん被験体の細胞の内部に（例えば、変換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクション、感染などにより）入ると、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の発現を促し、これはその後細胞から分泌される。
【０１６６】
ＸＶ．医薬組成物と調製
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療用のタンパク質として、本発明の１つ以上のＳＩＲＰ−α変異体構築物を含むこともある。治療量のタンパク質に加えて、医薬組成物は、当業者に知られている方法で処方可能な薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含むこともある。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、（例えば、ウイルスベクターのようなベクター中で）本発明の１つ以上のＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子を含むこともある。ＳＩＲＰ−α変異体構築物をコード化する核酸分子は、適切な発現ベクターへクローン化されてもよく、これは遺伝子療法で周知の方法により送達されることもある。
【０１６７】
医薬組成物中の許容可能な担体と賦形剤は、使用される用量と濃度でレシピエントに対して無毒である。許容可能な担体と賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＴＡＥなどの緩衝液、アスコルビン酸とメチオニンのような抗酸化剤、塩化ヘキサメトニウム、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムのような保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリジンのようなアミノ酸、ならびに、グルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールのような炭水化物を含んでもよい。本発明の医薬組成物は注射可能な製剤の形態で非経口的に投与可能である。注入される医薬組成物は、ビヒクルとして無菌液または任意の薬学的に許容可能な液体を使用して処方可能である。薬学的に許容可能なビヒクルとしては、限定されないが、滅菌水、生理食塩水、および細胞培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−変法イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が挙げられる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物は、ヒドロキシルメチルセルロースまたはゼラチン・マイクロカプセル、およびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルなどのマイクロカプセル中で調製されてもよい。本発明の医薬組成物は、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルのような他の薬物送達系で調製されてもよい。こうした技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０００）に記載されている。インビボ投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは濾過滅菌法膜による濾過によって容易に達成される。
【０１６９】
本発明の医薬組成物は徐放製剤として調製されてもよい。徐放製剤の適切な例は、本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含む。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅｓ）（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）ＴＭなどの分解性の乳酸グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。いくつかの徐放製剤は、数か月、例えば、１〜６か月間の分子の放出を可能にするが、その一方で、他の製剤は短期間、例えば、数日から数週間にわたって本発明の医薬組成物を放出する。
【０１７０】
医薬組成物は必要に応じて単位投与量形態で形成されてもよい。医薬品に含まれる活性な成分、例えば、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の量は、指定された範囲内の適切な投与量が提供される（例えば、体重の０．０１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲内の投与量）ようなものである。
【０１７１】
遺伝子療法用の医薬組成物は、許容可能な希釈剤であり得るか、あるいは遺伝子送達手段が埋め込まれている緩効性マトリックスを含み得る。インビボの遺伝子送達手段として使用され得るベクターとしては、限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルススベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、多くのＳＩＲＰ−α変異体構築物の発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。
【０１７２】
遺伝子送達の他の媒体と方法は、米国特許第５，９７２，７０７号、第５，６９７，９０１号、および第６，２６１，５５４号に記載されており、各文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。医薬組成物を産生する他の方法は、例えば、米国特許第５，４７８，９２５号、第８，６０３，７７８号、第７，６６２，３６７号、および第７，８９２，５５８号に記載されており、各文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
ＸＶＩ．投与の経路、用量、およびタイミング
治療用のタンパク質として１つ以上のＳＩＲＰ−α変異体構築物以上を含有する本発明の医薬組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、脊髄内投与、または腹腔内投与のために処方されてもよい。医薬組成物は、経鼻投与、噴霧投与、エアロゾル投与、直腸投与、または膣投与のために処方されるか、あるいはこうした投与を介して投与されてもよい。治療用のタンパク質を投与する方法は当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第６，１７４，５２９号、第６，６１３，３３２号、第８，５１８，８６９号、第７，４０２，１５５号、および第６，５９１，１２９号、ならびに米国特許出願公開第２０１４００５１６３４号、ＷＯ１９９３００００７７号、および米国特許出願公開第２０１１０１８４１４５号を参照。こうした文献の開示は全体として参照により組み込まれる。こうした方法の１つ以上は、本発明の１つ以上のＳＩＲＰ−α変異体構築物を含有する本発明の医薬組成物を投与するために使用されてもよい。注入可能な製剤については、様々な効果的な医薬担体が当該技術分野で知られている。例えば、ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  ｅｄｓ．，  ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０  （１９８２），  ａｎｄ  ＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｔｏｉｓｓｅｌ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０  （１９８６）を参照。
【０１７４】
本発明の医薬組成物の用量は、投与経路、処置される疾患、および物理的特性、例えば、被験体の年齢、体重、健康状態を含む要因に依存する。典型的には、一回投与量に含まれる本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物の量は、重篤な毒性を引き起こすことなく疾患を効果的に処置する量であってもよい。本発明の医薬組成物は、０．００１−５００ｍｇ（例えば、０．０５、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、０．８、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇ）の、および、具体的な実施形態では、０．１−約１００ｍｇ、より具体的な実施形態では、約０．２−約２０ｍｇの範囲のＳＩＲＰ−α変異体構築物の投与量を含み得る。投与量は、被験体の疾患の程度や様々なパラメータのような従来の要因に従って臨床医により変えられてもよい。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、約０．００１ｍｇから最大で約５００ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、０．０５、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、０．８、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇ／ｋｇ／日）まで量で投与可能である。ＳＩＲＰ−α変異体構築物を含有する本発明の医薬組成物は、例えば、１回以上（例えば、１−１０回以上）毎日、毎週、毎月、半年ごとに、毎年、または医学的な必要に応じて、被験体に投与されてもよい。投与量は単一または複数の投与レジメンで提供されることもある。例えば、いくつかの実施形態では、効果的な量は、約０．１から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、一日当たり約０．２ｍｇから約２０ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物、一日当たり約１ｍｇから約１０ｍｇのＳＩＲＰ−α構築物、一週当たり約０．７  ｍｇから約２１０ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物、一週当たり１．４ｍｇから約１４０ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物、３日ごとの約０．３ｍｇから約３００ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物、一日おきの約０．４ｍｇから約４０ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物、および、一日おきの約２ｍｇから約２０ｍｇのＳＩＲＰ−α変異体構築物まで変動する投与量である。投与間のタイミングは、病状が改善すると減少するか、あるいは被験体の健康が悪化すると増加することがある。
【０１７６】
ＸＶＩＩ．治療法
本発明は、癌や免疫疾患のようなＳＩＲＰ−αおよび／またはＣＤ４７活性に関連する疾患および障害に苦しんでいる患者を処置するために使用され得る医薬組成物と治療法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＳＩＲＰ−α変異体構築物は、被験体中の標的細胞（例えば癌細胞）の食作用を増加させる方法で被験体に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、被験体中の制御性Ｔ細胞を除去する方法で被験体に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、被験体中の癌細胞を殺す方法で被験体に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、被験体中のＳＩＲＰ−αおよび／またはＣＤ４７活性に関連する疾患を処置する方法で被験体に投与されてもよく、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、非疾患細胞上のＣＤ４７よりも疾患細胞および罹患した部位のＣＤ４７と優先的に結合する。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体は、被験体中の造血幹細胞移植を増加させる方法で被験体に投与されてもよく、該方法は被験体中のＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との間の相互作用を調整する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、被験体中の免疫反応を変える（つまり、免疫反応を抑える）方法で被験体に投与されてもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、被験体の疾患（例えば癌）を処置する前に、被験体中のＳＩＲＰ−αのアミノ酸配列は、例えば、ＳＩＲＰ−α遺伝子をコード化する２つの対立遺伝子の各々から決定される。本発明のこの方法では、該方法は、被験体からの生体サンプル中のＳＩＲＰ−αポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、その後、治療上有効な量のＳＩＲＰ−α変異体構築物を被験体に投与する。この方法で、ＳＩＲＰ−α変異体構築物中のＳＩＲＰ−α変異体は、ＳＩＲＰ−α変異体の親和性を増加させるために導入されたアミノ酸変化を除けば、被験体の生体サンプル中のＳＩＲＰ−αポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。ＳＩＲＰ−α変異体構築物は、それが投与された後に被験体中で最小限の免疫原性を有する。
【０１７８】
本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物と医薬組成物は、様々な癌治療で使用されてもよい。本発明による処置を適用できる癌としては、限定されないが、固形腫瘍癌、血液の癌、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肺癌、気管支癌、肝臓癌、卵巣癌、結腸癌と直腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ、ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢癌、消化管間質腫瘍癌、甲状腺癌、頭頸部癌、口腔咽頭癌、食道癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞癌、ウイルスにより誘発される癌、神経芽細胞腫、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、リンパ腫、肉腫、神経膠腫、脳腫瘍、および癌腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明による処置を適用できる癌の疾患は転移癌を含んでいる。いくつかの実施形態では、本発明による処置を適用できる癌は固形腫瘍または血液の癌である。
【０１７９】
本発明のＳＩＲＰ−α変異体構築物と医薬組成物は、免疫疾患を処置するための様々な治療で使用されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリトマトーデス、抗体媒介性の炎症性または自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠動脈症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、脈管炎、または炎症性の自己免疫筋炎などの自己免疫疾患または炎症性疾患である。
【実施例】
【０１８０】
実施例１−方法
ＳＩＲＰ−α変異体構築物の産生
全ての遺伝子構築物は、哺乳動物細胞（ＤＮＡ２．０）中の発現のために最適化された遺伝子合成とコドンを用いて生成される。遺伝子は哺乳動物発現ベクターにクローン化され、ＣＭＶａイントロンプロモーターを用いて発現する。リーダー配列は分泌のために適切なシグナル伝達および処理を保証するために構築物のＮ末端で設計される。ＳＩＲＰ−α融合タンパク質の発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施される。この細胞株は、高密度の、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現媒体中の血清無しの浮遊培養に適しており、高レベルの組み換えタンパク質を製造可能である。製造者のマニュアルに従ってトランスフェクション手順を実施する。典型的に５−７日のトランスフェクション後で上澄みを収集する。タンパク質構築物は、６ｘヒスチジン親和性タグを運ぶように設計され、これは親和性クロマトグラフィーによる精製を可能にする。カラムは最初に５ｍＭイミダゾール、１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化された。様々なＳＩＲＰ−αの変異体を発現する精製された培地は、Ａｖａｎｔ  ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨｉ‐Ｔｒａｐ  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの親和性に優れた樹脂に充填される。別の平衡化段階を実施する。その後、４０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを洗浄し、およびその後２５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。ＳＩＲＰ−α変異体構築物を含んでいる溶出された部分はプールされ、そしてその後、緩衝液が１Ｘ  ＰＢＳへ交換された。
【０１８１】
ＳＩＲＰ−αタンパク質のインビトロにおける切断
組み換えヒトｕＰＡおよびマトリプターゼはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入する。記述されているように、３μＭのＳＩＲＰ−αタンパク質が、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、０．０１％トゥイーン中のｕＰＡおよびマトリプターゼ（０．１〜４４ナノグラム）のそれぞれの量に加えられた。消化反応は典型的に３７度で１８−２４時間インキュベートされる。反応を止めるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填色素（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ）を反応に加えて、３分間９５度で加熱される。切断を評価するために、４−２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で消化されたサンプルを分離する。
【０１８２】
実施例２−腫瘍組織で特異的に活性化されるＳＩＲＰ−α変異体構築物の設計
目標は腫瘍組織中のＣＤ４７に結合するため局所的に活性化されるまで不活性であり続けるＳＩＲＰ−α変異体構築物を設計することである。これは、ＳＩＲＰ−αの、非異常細胞の細胞表面のＣＤ４７への結合を制限し、望まれない「オフターゲット」「組織外」の毒性を防ぐ。そのようなＳＩＲＰ−α変異体構築物を生成するため、ブロッキングペプチド（例えばＣＤ４７ベースのブロッキングペプチド）は切断可能なリンカーとしてＳＩＲＰ−α変異体に遺伝的に融合する。調査されたブロッキングペプチドは、ＳＩＲＰ−αへのＣＤ４７相互作用部位に基づき、以下の式に配列を記述する（セクション（ａ）−（ｃ））。ＧＧＧＧＳの反復するユニットを含んでいるスペーサーは、頻繁にプロテアーゼ認識部位をコード化する切断可能なリンカーの側面に位置するように設計される。いくつかの実施形態において、選ばれたプロテアーゼ切断部位はＬＳＧＲＳＤＮＨであるが他の多くの箇所も可能である。プロテアーゼ切断部位ＬＳＧＲＳＤＮＨは、様々なヒトの癌腫でアップレギュレートされた多数のプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ（ＭＴＳＰ１）、尿型のプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、Ｌｅｇｕｍａｉｎ、ＰＳＡ（ＫＬＫ３、カリクレイン関連のペプチダーゼ−３とも呼ばれる）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、ＭＭＰ９、ヒト好中球エラスターゼ、およびプロテイナーゼ３（Ｐｒ３）へのその感受性について選択される。（Ｕｌｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：３２−７１，  ２００９；  Ｕｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６３：２９６８−２９７８，  ２００６；  ＬｅＢｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１０：９３−９８，  ２０１３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：２９５７−２９６４，  ２００３）
【０１８３】
（ａ）ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを用いたＳＩＲＰ−αのブロッキング
ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドについては前記の通りである。これらのペプチドは異なる親和性を備えたＳＩＲＰ−αに結合し、その機能をブロックする。ＣＤ４７のＮ末端はＳＩＲＰ−αとの相互作用にとって重要であり、したがって、構造分析はＳＩＲＰ−αをＣＤ４７のＣ末端へ融合させて予測される。よりよく結果を理解するために、スペーサーの異なる長さでＮ末端およびＣ末端の融合の両方を調査する。異なるＣＤ−４７ベースのブロッキングペプチド（例えば表６にリストされたペプチド）が切断可能なリンカーおよび１つ以上のスペーサーとしてＳＩＲＰ−α変異体のＮまたはＣ末端と融合させられる。切断可能なリンカーおよび１つ以上のスペーサーとしてＳＩＲＰ−α変異体に融合した、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを含んでいる融合タンパク質の典型的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５６の配列で示され、その中で、一本の下線で強調された部分はＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを示し、二重の下線で強調された部分は切断可能なリンカーを示し、太字の部分はＳＩＲＰ−α変異体を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５１の配列は１２または２１のアミノ酸および、ＧＧＧＧＳの２−３回の繰り返しであるスペーサーを含む、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５６の配列は、Ｃ１５Ｓ置換、およびＧＧＧＧＳの２−５回の繰り返し、またはＧＧＳの３−６回の繰り返しであるスペーサーを有する（ＶＶＳで切断された）ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメインを含む、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを有する。さらに、いくつかの実施形態では、ＨＳＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５６の配列のうちの任意の１つのＣ末端に融合され得る。更に、いくつかの実施形態では、ＦｃドメインモノマーまたはＨＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）は表１０にリストされた融合タンパク質のうちのいずれか１つのＮまたはＣ末端のいずれかに融合され得る。
【０１８４】
【表１０】
2017060462.tif 000018
【０１８５】
（ｂ）伸長したＮ末端を有する低親和性ＣＤ４７突然変異体によるＳＩＲＰ−α変異体のブロッキング
ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７への高い親和性により、リンカーを切断した後、融合プロテインが分離せずＳＴＲＰ−α変異体がブロックされ続ける可能性がある。これを解決するために、我々は、ＳＩＲＰ−α−ＣＤ４７複合体の構造を研究し、野生型ＳＩＲＰ−αへの結合親和性と比べてＳＩＲＰ−α変異体への結合親和性を減少させたＣＤ４７突然変異体を設計した。したがって、リンカーのプロテアーゼ切断の後、ＣＤ４７突然変異体はＳＩＲＰ−α変異体から分離することになる。設計したＣＤ４７突然変異体については以下に記述する。最初の実験はＳＩＲＰ−α変異体を野生型ＣＤ−４７に融合させることで実施される。これらのＳＩＲＰ−α変異体と野生型ＣＤ４７またはＣＤ４７突然変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物はインビトロで切断され、切断を確実にするためにＳＤＳページで分析され、ＣＤ４７への結合能力（換言すると、ＣＤ４７突然変異体がＳＩＲＰ−α変異体から分離した後のＳＩＲＰ−α変異体の野生型ＣＤ４７への結合）を見るためにビアコアによって測定される。もし野生型のＣＤ４７に融合されたＳＩＲＰ−α変異体を含む最初のＳＩＲＰ−α変異体が発現され、プロテアーゼ切断の前にＣＤ４７結合をブロックすることが可能で、プロテアーゼ切断の後にＣＤ４７を結合することが可能であるならば、ＣＤ４７突然変異体は必要無い場合がある。もしこれらの最初のＳＩＲＰ−α変異体構築物が、不活性であるならば（すなわち、切断することが可能であるが分離の不足によりプロテアーゼ切断の後にＣＤ４７に結合しない）、低親和性ＣＤ４７突然変異体に融合されたＳＩＲＰ−α変異体を含む他の融合タンパク質が試験されることになる。
【０１８６】
ＣＤ４７：ＳＩＲＰ−αの共結晶化構造（ＰＤＢ：４ＫＪＹ、４ＣＭＭ）内において、ＣＤ４７のＮ末端はピログルタミン酸として存在し、ＳＩＲＰ−α変異体のＴｈｒ６６および野生型ＳＩＲＰ−αのＬｅｕ６６と水素結合の相互作用を為す（図１）。例えばグリシンなどのアミノ酸を加えることによってＣＤ４７のＮ末端を伸長することが、グルタミンのピログルタミン酸への環化を防ぎ、さらに、Ｔｈｒ６６またはＬｅｕ６６との水素結合の相互作用を阻害すると考えられる他の望まれない接触および相互作用を生み出し、したがってＣＤ４７のＳＩＰＲ−αへの結合を混乱させると仮定される。低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体およびＳＩＲＰ−α変異体を含む融合タンパク質の配列は表１１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７−５９で示され、その中で一本の下線で強調された部分は、表６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６と比較して、アミノ酸１−１１８およびＣ１５Ｓを含む低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体を示し、二重の下線で強調された部分は切断可能なリンカーを示し、太字の部分はＳＩＲＰ−α変異体を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｘ１０−ｘ１２もまたＧＧＧＧＳの３−５回の繰り返しであるスペーサーを含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｘ１０−ｘ１２と同様の配列が設計され、低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体が、切断可能なリンカーおよび１つ以上のスペーサーとしてＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端と融合するように発現させられる場合もある。
【０１８７】
【表１１】
2017060462.tif 000019
【０１８８】
（ｃ）アミノ酸置換物を有する低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体によるＳＩＲＰ−αのブロッキング
ＣＤ４７はＳＩＲＰ−α（ＰＤＢコード：４ＫＪＹ及び４ＣＭＭ）のディープポケットと結合する。コンピュータモデリングは、突然変異する際にＣＤ４７のＳＩＲＰ−α変異体への結合親和性を減少させるが、それでもＣＤ４７の野生型のＳＩＲＰ−αへの結合親和性を維持するＣＤ４７のポケット領域内のアミノ酸残基を同定するために、実施された。同定されたＣＤ４７残基はＬ１０１Ｑ、Ｌ１０１Ｈ、Ｌ１０１Ｙ、Ｔ１０２ＱおよびＴ１０２Ｈである。これらの置換物の１つを含んでいる低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体がＳＩＲＰ−α変異体をテザードモード（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｍｏｄｅ）内で効果的にブロックする事が可能であると仮定されている。しかしながら、腫瘍部位に達して、リンカーでの局所的なプロテアーゼによる切断の際、低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体は、ＳＩＲＰ−αから解離して野生型のＳＩＲＰ−αに結合し、腫瘍細胞の細胞表面のＣＤ４７と結合できるＳＩＲＰ−α変異体を残す。解離した、低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体は、その時野生型のＳＩＲＰ−αの活動をブロックすることが可能である。これは開放された低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体およびＳＩＲＰからの増強された二重のブロッキングの活性を潜在的にもたらす。どのようにアミノ酸残基が選択されているか、およびこれがどう差異的な野生型ＳＩＲＰ−α及びＳＩＲＰ−α変異体のブロッキングをもたらすかを例証するために、野生型ＳＩＲＰ−αのＡｌａ２７を用いた実施例が示される（図２）。例えば、野生型ＳＩＲＰ−αのＡｌａ２７はＳＩＲＰ−α変異体中のＩｌｅ２７よりも小さな残基である。したがって、野生型のＣＤ４７の中のＴｈｒ１０２を、Ｇｌｎ１０２などのより大きなアミノ酸へ変異させることにより、低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体中のＧｌｎ１０２は、結果として対応する相互作用部位でＳＩＲＰ−α変異体の中のＩｌｅ２７と立体的に衝突する場合がある。しかしながら、Ｔｈｒ１０２Ｇｌｎ置換物を有するＣＤ４７突然変異体とＡｌａ２７を有する野生型ＳＩＲＰ−αの間の相互作用は保存されることになる。従って、ＣＤ４７突然変異体はＳＩＲＰ−α変異体に対して低い結合親和性を有し、野生型ＳＩＲＰ−αに対して比較的より高い結合親和性を有することになる。いくつかの典型的な低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体の配列は表６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−４５に示す。アミノ酸置換物を有する低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体を含むＳＩＲＰ−α変異体構築物、およびＳＩＲＰ−α変異体の配列は、表１２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０−６３に示し、その中で一本の下線で強調された部分は、それぞれアミノ酸置換物Ｌ１０１Ｑ、Ｌ１０１Ｙ、Ｔ１０２Ｑ、およびＴ１０２Ｈを含む低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体を示し、二重の下線で強調された部分は切断可能なリンカーを示し、太字の部分はＳＩＲＰ−α変異体を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０−６３はまた、ＧＧＧＧＳの３−５回の繰り返しであるスペーサーを含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０−６３と同様の配列が設計され、低親和性ＣＤ４７  ＩｇＳＦドメイン突然変異体が、切断可能なリンカーおよび��つ以上のスペーサーとしてＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端と融合するように発現させられる場合もある。
【０１８９】
【表１２】
2017060462.tif 000020
【０１９０】
実施例３−インビトロ研究のためのＳＩＲＰ−α変異体の発現と産生
ＳＩＲＰ−変異体およびＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを含む、様々なＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５６）がＥｘｐｉ２９３−Ｆ哺乳動物細胞で発現された。培地の中へ分泌されたタンパク質としての発現を可能にしたリーダー配列を用いて全ての構築物を設計した。全ての構築物は可溶の形態で発現しワンステップＩＭＡＣ単離を用いて、高い水準の純度（図３Ａおよび３Ｂ）に精製された。図３Ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５６のＳＩＲＰ−α変異体構築物の、縮小されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、および図３Ｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５６のＳＩＲＰ−α変異体構築物の縮小されていないＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。サイズ排除データは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物が凝集しないことを示す（データは示されていない）。
【０１９１】
実施例４−ＳＩＲＰ−αおよびＣＤ４７融合タンパク質のインビトロにおける切断
ＳＩＲＰ−α変異体構築物（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−６３）が腫瘍組織で特異的にインビボにおいて切断されるかどうかを判断するために、ＳＩＲＰ−α変異体構築物を切断するために、癌の中でアップレギュレートすることが一般に知られているプロテアーゼｕＰＡおよびマトリプターゼを用いて、インビトロの実験を実施した。プロテアーゼ切断性を判断し、切断条件を最適化するために、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）を用いて、最初の実験を実施した。図４Ａは、ｕＰＡとマトリプターゼにより切断性をテストした結果を示す。３μＭのＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）が１８時間、３７度でｕＰＡおよびマトリプターゼを用いてインキュベートされた。図４Ａのレーン１は、プロテアーゼの追加の無い対照実験を示し、レーン２および３はＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）のそれぞれｕＰＡおよびマトリプターゼを用いるインキュベーションを示す。図４Ａで得られたデータは、ＳＩＲＰ−α変異体構築物を残余ｕＰＡおよびマトリプターゼを用いて１８時間、３７度で消化することにより、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）をインビトロで切断し開放することが可能であることを明確に実証する。切断されたＳＩＲＰ−α変異体構築物は、〜１７  ＫＤａ分子量バンドとして移動する。切断されたＣＤ４７は、おそらくグリコシレーションによって、にじんだバンドとなって３６−４０ｋＤａ周辺に移動する。図４Ａのレーン２および３の切断されていないＳＩＲＰ−α変異体構築物の存在量の比較により、ｕＰＡの使用と比較してマトリプターゼの使用でより多くの完全な切断を達成することが示される。
【０１９２】
したがって、マトリプターゼのみを用いて、切断条件の一層の最適化を実施し、図４Ｂで結果を示す。異なる量のマトリプターゼをテストし、１８時間、３７度で切断を実施した。図４Ｂのレーン１は、マトリプターゼの追加の無い対照実験を示し、レーン２−４はそれぞれ、４４ナノグラム、０．４４ナノグラムおよび０．１６７ナノグラムのマトリプターゼを用いて実施した切断を示す。得られたデータは、０．４４ナノグラムの酵素が現在の条件下の完全な切断のために十分であることを示す。次に、我々は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の最適化された切断条件を使用した切断をテストした。実施例として、および図で４Ｃ示されるように、それぞれのＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５７−６３）は最適化された切断条件を用いて、マトリプターゼによって成功裏にインビトロで切断された。図４Ｃのレーン１−７はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７−６３の切断されていない融合タンパク質に相当する。図４Ｃのレーン８−１４はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７−６３のマトリプターゼで切断した融合タンパク質に相当する。
【０１９３】
実施例５−ＳＩＲＰ−α変異体構築物の結合親和性
ヒトのＣＤ４７−ｈＦｃ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ４６７０−ＣＤ）のＳＩＲＰ−α変異体構築物への結合は、泳動用緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）として０．０１％のトゥイーン−２０を補われたリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ  ７．４）を用いて、ビアコア  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分析された。
【０１９４】
ＣＤ４７−ｈＦｃの３７０共鳴ユニット（ＲＵ）が標準のアミン結合によってＣＭ４センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセル２上で固定された。フローセル１はＥＤＣ／ＮＨＳを用いて活性化され、参考として役立てるために（エタノールアミンを用いて）ブロックされた。全てのＳＩＲＰ−α変異体構築物は、３０μＬ／ｍｉｎの流量で２分間、５０ｎＭまたは１００ｎＭで注入され、その後に１０分間の解離時間が続いた。各注入の後、ピアスＩｇＧ溶離緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ２１００４）および４Ｍ  ＮａＣｌの２：１の混合物を用いて、表面を再生した。実験の開始と終了の際に、ＳＩＲＰ−α変異体の注入により表面の完全な再生を確認した。フローセル１および緩衝液注入を用いて、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）をすべて二重に参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）した。
【０１９５】
すべてのサンプルについて、５０秒の会合の後に１００ｎｍでの結合シグナルが決定され、ＳＩＲＰ−α変異体構築物の分子量によって標準化され、最大の結合反応のパーセントとして発現した。そのＭＷによって標準化された１００ｎＭでのＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）の結合が、最大の結合反応として用いられた。図５Ａ内の結果は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８−５１）がチップ上のＣＤ４７への結合からＳＩＲＰをブロックしない事を示す。リンカーの切断の後、結合活性はやや増加する。ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５４）は、ＳＩＲＰ−α変異体のチップ上のＣＤ４７への結合を効果的にブロックした。しかしながら、リンカーの切断の後に、ＳＩＲＰ−α変異体のチップ上のＣＤ４７への結合はやや増加したのみであり、それによって、ＳＩＲＰ−α変異体とＣＤ４７のＩｇＳＦドメインの相互作用の高い親和性は複合体を繋ぎ止め、したがって、ＣＤ４７のＩｇＳＦドメインはリンカーを切断した後もＳＩＲＰ−α変異体のブロッキングを継続することを示唆する。驚いたことに、ＣＤ４７のＩｇＳＦドメインがＳＩＲＰ−αのＣ末端に融合した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）時、切断されていないＳＩＲＰ−α変異体構築物は、効率的にチップ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５４の融合タンパク質と同じ）上のＣＤ４７への結合からブロックされるが、リンカーの切断はＳＩＲＰ−α変異体のチップ上のＣＤ４７への結合の１００％を回復し、それによって、リンカー切断の後にＣＤ４７のＩｇＳＦドメインはＳＩＲＰ−α変異体から分離され、したがって、ＳＩＲＰ−α変異体はチップ上のＣＤ４７に自由に結合可能である事を示唆する。ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に融合したＣＤ４７を有する別の組成物を用いて後にテストされた（図５Ｂを参照）。より長いスペーサーを含んでいるこの構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）もまた、切断後に活性を回復し、この事は、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端をＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端にリンクする一般的な手法が、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドが効果的にＳＩＲＰ−α変異体をブロックし、切断可能なリンカーを切断した後に分離するＳＩＲＰ−α構築物を含む事を確認する。
【０１９６】
さらにＳＩＲＰ−α変異体構築物の結合親和性を検査するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−６３のＳＩＲＰ−α変異体構築物を、前に記述された同じプロトコルに従ってビアコア機器上で分析した。野生型のＣＤ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）がＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）のＮ末端に切断可能なリンカーＬＳＧＲＳＤＮＨおよび複数の異なる長さのスペーサーを介して融合していることに対して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５４のＳＩＲＰ−α変異体構築物はアミノ酸１−１１７およびＣ１５Ｓを有するＣＤ４７  ＩｇＳＦドメインを含んでいる。野生型のＣＤ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）がＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）のＣ末端に切断可能なリンカーＬＳＧＲＳＤＮＨおよび複数の異なる長さのスペーサーを介して融合していることに対して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５および５６のＳＩＲＰ−α変異体構築物は、アミノ酸１−１１７およびＣ１５Ｓを有するＣＤ４７  ＩｇＳＦドメインを含んでいる。
【０１９７】
図５Ｂは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５および５６のＳＩＲＰ−α変異体構築物が、リンカー切断の前にチップ上のＣＤ４７への結合から効果的にブロックされるが、リンカーの切断は、結合活性の１００％を回復することを示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：の５７−６３のＳＩＲＰ−α変異体構築物において同様の結果が観察された。我々は、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端を１つのグリシン残基で伸長することにより、ＳＩＲＰ−α変異体構築物が生じ、その構築物は、リンカーが切断されプロテアーゼ処置（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７−５９）の後にＣＤ４７の結合活性の１００％近くに回復する前に効率的にブロックされ事を観察し、このことはリンカー切断の後のＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＳＩＲＰ−α変異体からの分離を実証した。
【０１９８】
この結果は切断可能なリンカーおよびスペーサーを介してＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端に融合されたＳＩＲＰ−α変異体が良く機能する事を示唆する。切断可能なリンカーは融合複合体を安定させ、一度切断されると、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドのＮ末端に付けられた切断可能なリンカーのフラグメントを含むＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドの拡張されたＮ末端は、ＳＩＲＰ−α変異体構築物へのＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドの結合を防ぐ。１つのグリシン（例えば、表６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６の配列など）を追加するなど１つ以上のアミノ酸の追加を有するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを、ＣＤ４７ブロッキングペプチドのＮ末端からＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端の間に、切断可能なリンカー及び１つ以上のスペーサーを用いて融合させることにより同様の効果が得られる。１つ以上のアミノ酸置換物、例えばＬ１０１Ｑ、Ｌ１０１Ｙ、Ｌ１０１Ｈ、Ｔ１０２Ｑ、Ｔ１０２Ｈ（例えば表６のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−４５の配列）を有するＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを、ＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に、切断可能なリンカー及び１つ以上のスペーサーを用いて融合させることによりこの同様の効果が観察される。我々は、ＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドがＳＩＲＰ−α変異体のＣ末端に融合可能であり、切断の前にＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７への結合をブロックし、リンカー切断後にＳＩＲＰ−α変異体を解放することを観察した（図５ＡのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ならびに図５ＢのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５および５６を参照）。
【０１９９】
この情報に基づいて、我々はＣＤ４７をブロックしたＳＩＲＰ−α変異体の融合タンパク質を生成すること、換言すれば、生成物の薬物動態、効能、安全性、産生性、安定性においてより優れた結果を与える配位（例えばＮまたはＣ末端の融合）を選ぶことにより、ＦｃドメインモノマーまたはＨＳＡをＳＩＲＰ−α変異体へ融合させることが可能である。
【０２００】
実施例６−抗体結合性ペプチドを介したＳＩＲＰ−α変異体の特異的な標的化
第１に、ＳＩＲＰ−α変異体およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物が境界抗体に集中することが可能かどうかを調べるため、我々はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４の配列を有するＤＬＰのための結合部位を含むと知られているセツキシマブを使用した。我々はＣＭ４  ビアコアチップ（２０００ＲＵ）上でＥＤＣ／ＮＨＳ化学作用を用いてセツキシマブを固定し、チップ（ビアコア  Ｔ１００）において、３０μＬ／ｍｉｎでサンプルおよび泳動用緩衝液としてＰＢＳ  ０．０１％  Ｐ２０を用いて、１００ｎＭおよび５０ｎＭでＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）を流した。図６はＳＩＲＰ−α変異体構築物のチップ上への結合を示すが、ＳＩＲＰ−α変異体単独の結合は示さない。我々はその後、ＣＤ４７−ＥＣＤを注入し、そのＳＩＲＰ−α変異体構築物が使用されたケースにおけるＣＤ４７の結合を調べ、それにより、ＳＩＲＰ−α変異体構築物がＥＧＦＲおよびＣＤ４７を同時に結合することが可能である事を実証した（図６）。したがって、ＳＩＲＰ−α変異体および、癌患者に注入されたＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物は、治療の抗体（例えばセツキシマブ）が蓄積する部位に集中し、それにより効果を高める、および毒性を縮小する。
【０２０１】
第２に、我々はＳＩＲＰ−α変異体、およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物が、ＥＧＦＲに結合するセツキシマブと最初に結合し、次に、ＣＤ４７に結合することが可能である事を実証した。結合する複合体の配列を図７Ａで示す。我々は、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学作用を用いて、ＣＭ４チップに３０００ＲＵのｈｒＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定した。３０μＬ／ｍｉｎ（ビアコア  Ｔ１００）でサンプルおよび泳動用緩衝液としてＰＢＳ  ０．０１％  Ｐ２０使用し、我々は、異なる濃度（４、２０および１００  ｎＭ）のセツキシマブを注入した。固定されたｈｒＥＧＦＲ−Ｆｃへのセツキシマブの結合を観察した。我々はその後、ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６）を１００ｎＭで注入して結合を観察した。ＳＩＲＰ−α変異体単独で注入された時、結合は観察されなかった。我々はその後、ＣＤ４７−ＥＣＤを１００ｎＭで注入して結合を観察した。データは図７Ｂおよび７Ｃで示す。したがって、我々は四次複合体（ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）ＥＧＦＲ−セツキシマブ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６のＳＩＲＰ−α変異体構築物−ＣＤ４７の形成は可能である事を実証した。ＳＩＲＰ−α変異体、およびＤＬＰを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物は、腫瘍特異抗体（例えばセツキシマブ）に特異的に結合する事により、罹患した部位にあらかじめ集中する時に、ＣＤ４７を結合し抑制することが可能である。さらに、同じ概念に従い、ＳＩＲＰ−α変異体、ＤＬＰ、およびＣＤ４７ベースのブロッキングペプチドを含むＳＩＲＰ−α変異体構築物は、腫瘍特異抗体（例えばセツキシマブ）に特異的に結合する事により、罹患した部位にあらかじめ集中する時に、ＣＤ４７に結合し抑制することが可能である。
【０２０２】
実施例７−食作用アッセイ
スペーサーを介してＤＬＰにつけられたＳＩＲＰ−α変異体ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６）、およびＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）は、ＤＬＤ１セル上で食作用アッセイによってテストされた（図８）。食作用アッセイは、例えば、Ｗｅｉｓｋｏｆｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８８−９１，２０１３に記述されているように実施された。実験のプロトコルについて以下に記述する。ＳＩＲＰ−α変異体構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６）は、推測上は罹患した細胞にはより多く蓄積するため、単独のＳＩＲＰ−α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）よりも高い有効性を示した。
【０２０３】
Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから匿名のドナーの軟膜を得て、末梢血単核細胞は密度勾配遠沈によってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃縮した。製造者の指示に従い、Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩを用いて、単球を精製した。これは、ヒトＰＢＭＣからの単球の単離のための間接の磁気ラベル化システムである。単離した単球は、１０％の加熱不活性化したヒトＡＢ漿液、１％のＧｌｕｔａＭａｘ、１％のペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補足した、ＲＰＭＩ  １６４０培地で６−１０日間培養する事により、マクロファージへと分化される。食作用アッセイについては、超低接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７００７）のウェル上で１００，０００個のＧＦＰ＋ＤＬＤ−１細胞を培養した。４μｇ／ｍｌのＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照または４μｇ／ｍｌのセツキシマブ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ００２７９−１０．０）のいずれかの５０μＬ／ウェルをＤＬＤ−１腫瘍細胞に加え、室内温度で３０分間プレインキュベートする。その後に、５０μＬ／ウェルのＳＩＲＰ−α変異体を加え、さらに５０μＬ／ウェルのマクロファージ（１×１０６／ｍｌ）（５０，０００マクロファージ）を各ウェルに加えた。抗体とＳＩＲＰ−α構築物サンプルの最終希釈は、１：４である。セツキシマブの最終濃度は１μｇ／ｍｌである。マクロファージ、腫瘍細胞、抗体、およびＳＩＲＰ−α変異体構築物の共培養を３７度で２時間実施する。分析については、細胞サンプルはＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏによって固定され、着色され、分析された。主要なヒトマクロファージは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４５、または抗ＣＤ２０６の抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いた流動細胞計測法で同定した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で着色することにより分析から死細胞を除外した。ＧＦＰ＋マクロファージのパーセンテージとして食作用を評価し、各細胞株に対するそれぞれの独立したドナーによる最大の反応に標準化した。
【０２０４】
実施例８−ＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７へのｐＨ依存性結合のモデル化
本発明におけるＳＩＲＰ−α変異体のｐＨ依存性の結合を設計するために、ＳＩＲＰ−α上で、とりわけＣＤ４７と相互作用するＳＩＲＰの領域内で、ヒスチジン突然変異誘発を実施し得る。ＳＩＲ−αＰおよびＣＤ４７の三次元の結合部位を視覚化するために、ＳＩＲＰ−αおよびＣＤ４７複合体（例えば、ＰＤＢ  ＩＤ  Ｎｏ．２ＪＪＳを参照）の結晶構造およびコンピュータモデリングを用いる場合がある。ｐＨ感受性の結合特性を備えたタンパク質を設計するために有用なコンピュータの設計およびモデリング方法は文献内において知られており、例えば本明細書の参考文献に全体が組み込まれているＳｔｒａｕｃ  ｅｔ  ａｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１１：６７５−８０、２０１４に記述されている。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ−αおよびＣＤ４７の界面で重要な接触残基を同定するためにコンピュータモデリングを用いる場合がある。計算された結合エネルギーおよび形の相補性に基づいて、最適化され、フィルターされ、ランク付け出来る様々なプロテインデザインを生成することが可能である、利用可能なプロテインデザインソフトウェア（例えばＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ）を用いて、同定された重要な接触残基は、ヒスチジン残基で置換され得る。したがって、コンピュータモデリングを用いて、特定のアミノ酸位置におけるエネルギー的に有利なヒスチジン置換物を同定し得る。コンピュータモデリングはさらに、ＳＩＲＰ−αの三次元構造の変化を予測するために使用され得る。ＳＩＲＰ−αの三次元構造の重要な変化を生成するヒスチジン置換物は回避され得る。
【０２０５】
一度エネルギー的および構造的に最適であるアミノ酸置換物を同定すれば、系統的にアミノ酸をヒスチジン残基と置換され得る。一部の実施形態において１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、その他、最大で２０）のＳＩＲＰ−αのアミノ酸はヒスチジン残基で置換され得る。とりわけ、ＳＩＲＰ−αおよびＣＤ４７の界面に位置するアミノ酸、好ましくは、ＳＩＲＰ−αのＣＤ４７への結合に直接関係するアミノ酸はヒスチジン残基で置換され得る。本発明におけるＳＩＲＰ−α変異体は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、その他、最大で２０）のヒスチジン残留置換物を含み得る。他の実施形態において、ＳＩＲＰ−αの自然発生のヒスチジン残基は他のアミノ酸残基で置換され得る。さらに別の実施形態において、ＳＩＲＰ−αの１つ以上のアミノ酸は、自然発生または置換されたヒスチジン残基のＣＤ４７への結合に作用するために、非ヒスチジン残基で置換され得る。例えば、自然発生のヒスチジン残基を取り囲むアミノ酸を他のアミノ酸で置換することは、自然発生のヒスチジン残基を「埋める」場合がある。いくつかの実施形態で、ＣＤ４７との結合に直接関与しないアミノ酸、換言すれば、内部アミノ酸（例えばＳＩＲＰ−αの核にあるアミノ酸）もまたヒスチジン残基で置換され得る。表４はヒスチジン残基を置換し得るＳＩＲＰ−αアミノ酸をリストする。接触残基はＳＩＲＰ−αとＣＤ４７の界面に位置するアミノ酸である。中核残基は、ＳＩＲＰの間−αとＣＤ４７の結合に直接関与しない内部アミノ酸である。本発明におけるＳＩＲＰ−α変異体は表４にリストされた置換物を１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、その他、または全て）含み得る。
【０２０６】
実施例９−ＣＤ４７とのｐＨ依存性結合を含むＳＩＲＰ−α変異体の生成とスクリーニング
従来の分子クローニングおよびタンパク質発現技術を用いて、ヒスチジン残基を有するアミノ酸を１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、その他、最大で２０）含んでいるＳＩＲＰ−α変異体を生成する場合がある。本発明のＳＩＲＰ−α変異体をコード化している核酸分子は、周知の分子生物学的技術を用いて、バクテリア中の発現のために最適化されたベクターへクローン化される。その後、ベクターをバクテリア細胞（例えば大腸菌細胞）に形質転換することが可能であり、タンパク質発現誘導の前に最適な密度に育て得る。タンパク質発現誘導（換言すれば、ＩＰＴＧの使用）の後、細菌細胞は、さらに２４時間成長させられ得る。細胞は収集することが可能であり、発現されたＳＩＲＰ−α変異体タンパク質を、例えばアフィニティカラムクロマトグラフィーを用いて、細胞培養上澄みから精製する事が可能である。精製されたＳＩＲＰ−α変異体はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析され、その後予期されたサイズのタンパク質バンドの存在を確認するためにＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色で分析される場合がある。
【０２０７】
精製されたＳＩＲＰ−α変異体は、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、表面プラズモン共鳴、シンチレーション接近アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定（ＩＧＥＮ）、螢光消光、および／または螢光転移などの当該分野の技術を用いて、ＣＤ４７へのｐＨ感受性結合のためにスクリーニングされる場合がある。適切な生物検定を用いて、結合をスクリーニングし得る。望ましいＳＩＲＰ−α変異体は、中性のｐＨ（例えばｐＨ７．４）よりも酸性のｐＨ（例えばｐＨ７（例えばｐＨ６）未満）の下でＣＤ４７により高い親和性で結合する。ｐＨ６でのＳＩＲＰ−α／ＣＤ４７複合体のＫＤは、ｐＨ７．４でのＳＩＲＰ−α／ＣＤ４７複合体のＫＤより低くなる。
【０２０８】
実施例１０−マウスにおけるＳＩＲＰ−α変異体のＣＤ４７へのｐＨ感受性結合のテスト
罹患した部位での本発明のＳＩＲＰ−変異体のＣＤ４７へのｐＨ感受性結合をテストするために、様々な癌、例えば固形腫瘍、および血液の癌の遺伝子操作マウスモデルを用いることが可能である。ＳＩＲＰ−α変異体は、マウス中の罹患した部位に直接または間接的に注入され、後に、罹患した部位でのＳＩＲＰ−α変異体およびＣＤ４７の複合体の存在を検知するために解剖され得る。ＳＩＲＰ−α変異体またはＣＤ４７に特異的である抗体を検知に用いる場合がある。
【０２０９】
他の実施形態
上記の明細書で言及された出版物、特許、および特許出願はすべて参考文献に組み込まれている。本発明に記述されている組成物及び方法における多くの変更、および変形が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく当業者にとって明らかになるだろう。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されるが、本発明はその特定の実施形態に極度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者にとって明白である、本発明を実施するための記述されたモードの様々な変更は、本発明の範囲に含むように意図される。他の実施形態は以下の請求項内にある。
【図１】
2017060462.tif 000021
【図２】
2017060462.tif 000022
【図３】
2017060462.tif 000023
【図４Ａ】
2017060462.tif 000024
【図４Ｂ】
2017060462.tif 000025
【図４Ｃ】
2017060462.tif 000026
【図５Ａ】
2017060462.tif 000027
【図５Ｂ】
2017060462.tif 000028
【図６】
2017060462.tif 000029
【図７Ａ】
2017060462.tif 000030
【図７Ｂ】
2017060462.tif 000031
【図７Ｃ】
2017060462.tif 000032
【図８】
2017060462.tif 000033
【配列表】
2017060462000001.app
【外国語明細書】
2017060462000001.pdf