(57)【要約】【課題】試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを簡便且つ効率的に検出する方法を提供すること。【解決手段】試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析して得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とすることを特徴とする、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析して得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とすることを特徴とする、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出する方法。
【請求項２】
（ａ）試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）により得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロキシコレステロールが、２４−ヒドロキシコレステロール、７−ケトコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及び２７−ヒドロキシコレステロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪酸が、炭素原子数１０〜３０の脂肪酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルが、ヒドロキシコレステロールの３位のヒドロキシル基と脂肪酸とのエステル体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料が血液又は尿から調製された試料である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料がクロマトグラフィーにより分画して得られた試料である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試料のイオン化時の放電部内の温度が４５０〜５００℃である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記質量分析が飛行時間型質量分析である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、神経細胞が細胞死により徐々に脱落することによって引き起こされる。代表的な神経変性疾患としては、認知機能が障害されるアルツハイマー病、運動機能が障害されるパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症等が知られている。その患者数は、例えばアルツハイマー病では１００〜２００万人ともいわれており、高齢化と共に増加の一途をたどっている。神経変性疾患は、早期発見が重要である。これにより、適切な治療薬の早期投与が可能となり、症状の進行を遅らせることができ、ひいてはより長い期間に亘りＱＯＬを維持することができる。
【０００３】
一方、本発明者等は、ヒドロキシコレステロールが神経細胞を細胞死へ誘導することを見出しており（非特許文献１）、特にヒドロキシコレステロールの脂肪酸エステルが細胞死を引き起こすキーファクターであること明らかにしている（特許文献１及び非特許文献２）。
【０００４】
そこで、このヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出することができれば、神経変性疾患の早期発見に繋げることができ、また神経変性疾患の新規バイオマーカーとなるヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの発見にも繋がると考えられる。
【０００５】
ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを簡便に検出しようとする場合、例えば試料を質量分析することが考えられる。しかし、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを質量分析で検出しようとする場合、フラグメンテーションが起こる、或いはそもそもイオン化自体が起こらないといった問題がある。このため、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークが検出できず、検出できたとしてもフラグメントイオンのピークであったので、どのような脂肪酸が結合してエステル体を形成しているかについて、容易に判断することができない。
【０００６】
このような事情から、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを質量分析で検出する場合は、けん化処理によりヒドロキシコレステロールと脂肪酸に分解してから、質量分析するのが現状である（特許文献１及び非特許文献２）。しかし、この場合であっても、当然ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークは検出できず、どのような脂肪酸が結合してエステル体を形成しているかについて判断するには、煩雑な工程が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−０９１７０３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL 286, NO.28, pp.24666-24673, July 15, 2011.
【非特許文献２】Cell Death and Disease (2014) 5, e990.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを簡便且つ効率的に検出する方法を提供することを課題とする。より具体的には、質量分析において、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、質量分析における試料のイオン化をＤＡＲＴイオン源で行うことにより、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを検出できることを見出した。本発明はこの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、完成されたものである。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１１】
項１．試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析して得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とすることを特徴とする、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出する方法．
項２．（ａ）試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析する工程、及び（ｂ）工程（ａ）により得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定する工程を含む、項１に記載の方法．
項３．前記ヒドロキシコレステロールが、２４−ヒドロキシコレステロール、７−ケトコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及び２７−ヒドロキシコレステロールからなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の方法．
項４．前記脂肪酸が、炭素原子数１０〜３０の脂肪酸である、項１〜３のいずれかに記載の方法．
項５．前記ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルが、ヒドロキシコレステロールの３位のヒドロキシル基と脂肪酸とのエステル体である、項１〜４のいずれかに記載の方法．
項６．前記試料が血液又は尿から調製された試料である、項１〜５のいずれかに記載の方法．
項７．前記試料がクロマトグラフィーにより分画して得られた試料である、項１〜６のいずれかに記載の方法．
項８．試料のイオン化時の放電部内の温度が４５０〜５００℃である、項１〜７のいずれかに記載の方法．
項９．前記質量分析が飛行時間型質量分析である、項１〜８のいずれかに記載の方法．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを簡便且つ効率的に検出する方法を提供することができる。この方法は、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを検出することができるので、どのような脂肪酸が結合したエステル体であるか、簡便に判断することができる。本発明を利用することにより、神経変性疾患の早期発見に繋げることができ、また神経変性疾患の新規バイオマーカーとなるヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの発見にも繋げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物3（M）の構造式を示し、中段は、化合物3のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【図２】化合物4（24S−ヒドロキシコレステロールのリノール酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物4（M）の構造式を示し、中段は、化合物4のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【図３】化合物5（24S−ヒドロキシコレステロールのアラキドン酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物5（M）の構造式を示し、中段は、化合物5のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【図４】化合物6（24S−ヒドロキシコレステロールのドコサヘキサエン酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物6（M）の構造式を示し、中段は、化合物6のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【図５】化合物7（24S−ヒドロキシコレステロールのステアリン酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物7（M）の構造式を示し、中段は、化合物7のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【図６】化合物8（24S−ヒドロキシコレステロールのパルミチン酸エステル）を含む試料の、DART-TOF-MSによる質量分析（実施例１）結果を示す。上段は、化合物8（M）の構造式を示し、中段は、化合物8のフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析して得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とすることを特徴とする、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを検出する方法（本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００１５】
本発明の検出方法は、（ａ）試料をＤＡＲＴ−ＭＳにより質量分析する工程、及び（ｂ）工程（ａ）により得られたマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定する工程を含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の検出方法の対象となる試料は、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを含み得る試料であれば、特に限定されない。試料としては、例えば、生体組織、或いはこれから調製された試料のみならず、化学合成したヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルも包含される。
【００１７】
生体組織としては、血液；尿等の体液；脳、肝臓等の臓器；脳脊髄液；神経細胞等の細胞等が挙げられる。ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルは神経細胞内に存在しており、またこれは血液脳関門を通過できることから血液中にも存在する（J Lipid Res. 39 (1998) 1594-1600）。この観点から、生体組織としては、血液、尿等が好ましい。
【００１８】
生体組織の由来生物は、特に限定されず、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ等の哺乳類動物を挙げることができる。ヒトの神経細胞変性疾患の早期発見や解析により繋がり易いという観点から、由来生物としては、好ましくはヒト、より好ましくは神経変性疾患患者、又はその疑いがある被検者が挙げられる。
【００１９】
神経変性疾患としては、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、トリプレットリピート病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性、ハンチントン病、網膜変性疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症等）等を挙げることができる。
【００２０】
生体組織から試料を調製する方法は、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルが完全に分解しない方法である限り、特に限定されない。試料の調製は、例えば公知の脂質精製方法に従って又は準じて行うことができる。例えば、生体試料中のタンパク質を酢酸水溶液（濃度は例えば１０％程度）等のタンパク質変性剤（溶媒は、通常、水）で変性させ、さらに有機溶媒（例えばクロロホルム、メタノール、酢酸エチル等、或いはこれらの混合溶媒）中に脂質を溶解させることにより、脂質を精製することができる。より具体的には、例えば生体試料をタンパク質変性剤及び有機溶媒と混合し、激しく撹拌した後、遠心（例えば２０００〜４０００×ｇ、５〜２０分間）し、得られた有機溶媒層を回収することにより、脂質を精製することができる。また、生体組織が血液である場合は、試料の調製は、例えば、血液を静置及び／又は遠心して、上清を回収することにより行ってもよい。なお、本発明の検出方法はヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標としているので、試料の調製の際には該エステルを分解させる処理（例えばけん化処理）が行われないことが好ましい。試料の調製方法は、１種のみを採用してもよいし、２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００２１】
試料は、クロマトグラフィーにより分画して得られた試料であってもよい。クロマトグラフィーによる分画は、例えば、試料を有機溶媒に溶解し、得られた溶液をクロマトグラフィー用担体が充填されたカラムに通液後、適当な溶出液でヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを溶出することによって行うことができる。試料を溶解する有機溶媒、担体、溶出液等については、脂質を分画できる公知のクロマトグラフィー方法に従って又は準じて、適宜選択することができる。一例として、特許文献１や非特許文献２に記載の条件に従って、クロマトグラフィーによる分画を行うことができる。クロマトグラフィーにより分画することによって、試料中の不純物の割合をより低減させることができ、これによりヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの検出がより容易となる。
【００２２】
本発明の検出方法の検出対象であり、且つ試料に含まれ得るヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルは、ヒドロキシコレステロールのヒドロキシル基（好ましくは３位のヒドロキシル基、或いは２４−ヒドロキシコレステロールの場合は３位又は２４位のヒドロキシル基）と、脂肪酸のカルボキシル基とがエステル結合してなるエステル体である限り特に限定されない。
【００２３】
ヒドロキシコレステロールは、特に限定されることはない。ヒドロキシコレステロールとしては、例えば生体内、好ましくはヒト生体内、より好ましくはヒト脳又は血液内に存在するヒドロキシコレステロールが挙げられる。具体的には、例えば２４（好ましくは２４（Ｓ））−ヒドロキシコレステロール、７−ケトコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロール、２２（好ましくは２２（Ｒ））−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール等が挙げられ、これらの中でも好ましくは２４−ヒドロキシコレステロール、７−ケトコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール等が挙げられ、より好ましくは２４−ヒドロキシコレステロールが挙げられる。
【００２４】
脂肪酸は、特に限定されることはない。脂肪酸としては、例えば生体内、好ましくはヒト生体内、より好ましくはヒト脳又は血液内に存在する脂肪酸が挙げられる。具体的には、例えば炭素原子数１０〜３０の脂肪酸（好ましくは直鎖状）が挙げられ、好ましくは炭素原子数１０〜３０の脂肪酸が挙げられ、より好ましくは炭素原子数１３〜２７の脂肪酸が挙げられ、さらに好ましくは炭素原子数１５〜２５の脂肪酸が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸が挙げられる。より具体的には、例えばドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ミリスチン酸、パルミトレイン酸、ドコサペンタエン酸等が挙げられ、これらの中でも好ましくはドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸等が挙げられる。
【００２５】
試料の状態は、固体状であっても、液状であってもよいが、より確実にヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの検出が可能であるという観点から、液状であることが好ましい。液状である場合、その溶媒としては、ＤＡＲＴ−ＭＳによる質量分析が可能である限り特に限定されないが、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン等の、比較的低沸点（好ましくは１００℃以下）の有機溶媒が挙げられる。溶媒が適切な溶媒ではない場合は、公知の方法に従って又は準じた方法（例えば、窒素雰囲気下での乾燥）によって溶媒を除去し、上記した有機溶媒で再溶解すればよい。
【００２６】
ＤＡＲＴ−ＭＳ（Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：）による質量分析は、試料のイオン化方法に特徴を有している。その原理は、大気圧下における励起分子・原子と試料分子・大気に存在する分子の相互作用によるものである。通常、窒素やヘリウム等のガスが放電部（通常、円筒状）に導入され、針状電極に印加された電圧によりイオン或いは励起状態の活性な化学種を生成させ、これを大気中に吹き出し、試料に作用させてイオン化させる。
【００２７】
放電部内のガスは、例えば窒素やヘリウムを用いることができる。より確実にヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの検出が可能であるという観点からは、ガスはヘリウムが好ましい。
【００２８】
放電部内の温度は、特に限定されないが、より確実にヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの検出が可能であるという観点からは、例えば３８０〜５００℃、好ましくは４００〜５００℃、より好ましくは４２０〜５００℃、さらに好ましくは４５０〜５００℃、よりさらに好ましくは４８０〜５００℃である。
【００２９】
試料のイオン化は、例えば市販のＤＡＲＴイオン源（例えばJEOL製DART SVP100等）を用いて行うことができる。より具体的には、例えばイオン源に、試料を付着させたガラス棒をかざすことによって行うことができる。
【００３０】
ＤＡＲＴ−ＭＳによる質量分析は、試料のイオン化方法以外の点については、一般的な質量分析方法における手段、条件等を採用することができる。通常、質量分析においては、イオン化された試料分子を、質量分析部に導入し、ここで分離されたイオン（本発明では、通常、カチオン）を検出部で検出し、得られたデータからマススペクトルが作製される。これら各段階で使用される装置、データ処理ソフト等についても、一般的な質量分析方法で採用されているものを採用することができる。
【００３１】
質量分析部におけるイオン化試料分子の分離方法は、公知の方法、例えば飛行時間型、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型、タンデム型等を採用することができる。これらの中でも、本発明の検出方法により適しているという観点から、飛行時間型が好ましい。
【００３２】
試料のイオン化方法以外の点は、例えば市販の質量分析計（例えば島津製作所製LCMS2020等）を用いて行うことができる。
【００３３】
上記したＤＡＲＴ−ＭＳによる質量分析によって、マススペクトルが得られる。本発明の検出方法は、このマススペクトルにおける、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とする。「指標とする」とは、該エステルの分子イオンピークの有無を判定した結果、該ピークが有る場合は、該エステルを検出できたこと（すなわち試料中に該エステルが有ると判定できること）を意味し、該ピークが無い場合は、該エステルを検出できなかったこと（すなわち試料中に該エステルが有ると判定できないこと）を意味する。また、本発明の検出方法は、該エステルの分子イオンピークを指標としているので、該ピークを検出できた場合は、該エステルの種類（どのような脂肪酸のエステル体であるのか等）についての情報も同時に得ることができる。
【００３４】
ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークは、通常、アンモニウムイオン付加体のピークとして検出できる。アンモニウム付加体の分子イオンピークの質量／電荷比の理論値は、例えば化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）は684.6289であり、化合物4（24S−ヒドロキシコレステロールのリノール酸エステル）は682.6133であり、化合物5（24S−ヒドロキシコレステロールのアラキドン酸エステル）は706.6133であり、化合物6（24S−ヒドロキシコレステロールのドコサヘキサエン酸エステル）は730.6133であり、化合物7（24S−ヒドロキシコレステロールのステアリン酸エステル）は686.6446であり、化合物8（24S−ヒドロキシコレステロールのパルミチン酸エステル）は658.6133である。本発明の検出方法においては、これらの理論値に近いピークの有無によって、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定することができる。特に、高分解能の質量分析計（島津製作所製、LCMS-IT-TOF等）を用いれば、小数点下4桁まで測定することができるので、高精度にヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定することができる。一方、低分解能の質量分析計を用いる場合であって、理論値に近いピークが目的のエステル体のピークであるか否か判定できない場合は、下記のようにヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルのフラグメントイオンのピークをも指標とすることによって、高精度にヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークの有無を判定することができる。
【００３５】
本発明の検出方法は、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを指標とすることに加えて、更に該エステルのフラグメントイオンピークを指標とすることが好ましい。これにより、より高い精度でヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの検出が可能となる。
【００３６】
ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルのフラグメントイオンの代表的なものとしては、下記式（１）で表されるイオン（ピークの質量／電荷比：約385）、及び下記式（２）で表わされるイオン（ピークの質量／電荷比：約367）が挙げられる。
【００３７】
【化１】
2017062135.tif 000002
【００３８】
【化２】
2017062135.tif 000003
【００３９】
斯かる本発明の検出方法によって、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルを簡便且つ効率的に検出することが可能となる。この方法は、質量分析において、試料中のヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの分子イオンピークを検出することができるので、どのような脂肪酸が結合したエステル体であるか、簡便に判断することができる。本発明を利用することにより、神経変性疾患の早期発見に繋げることができ、また神経変性疾患の新規バイオマーカーとなるヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの発見にも繋げることができる。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４１】
製造例１：ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルの合成
以下の合成スキームに従って、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステル（化合物3〜8）を合成した。具体的な合成方法については下記製造例１−１〜１−８に示す。
【００４２】
【化３】
2017062135.tif 000004
【００４３】
【化４】
2017062135.tif 000005
【００４４】
製造例１−１：（3S,6R)-6-((3S,10R,13R)-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)-2-メチルヘプタン-3-イル 2,2,2-トリフルオロアセタート(2)の合成
24(S)-ヒドロキシコレステロール (24S-OHC) (429 mg, 1.06 mmol) を THF (4 mL) に溶解させ、氷冷下、2-(トリフルオロアセトキシ)ピリジン (242 mg, 1.27 mmol) を加え、室温で 17.5 時間攪拌した。TLCで反応終了を確認後、反応液を減圧濃縮し溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物 (73 mg、14 %）を無色アモルファスとして得た。
IR (KBr, cm-1) : 3422, 2937, 2849, 1773, 1466, 1383, 1210, 1166; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.67 (3H, s), 0.93 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.01 (3H, s), 1.01-1.64 (17H, m), 1.65-2.03 (7H, m) , 2.18-2.36 (2H, m) , 3.47-3.58 (1H, m) , 4.84-4.91 (1H, m) , 5.32-5.37 (1H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.8, 17.0, 18.5, 18.6, 19.4, 21.1, 24.2, 27.4, 28.0, 31.1, 31.3, 31.6, 31.9, 31.9, 35.6, 36.5, 37.2, 39.7, 42.3, 42.3, 50.1, 55.7, 57.0, 71.8, 77.2, 84.8, 121.7, 140.7, 157.7;HRMS (DART-OS) m/z 481.3292 [(M-H2O+H)+; calcd for C29H45O3F3 481.3288]
【００４５】
製造例１−２：(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル オレアート (3)の合成
2 (40 mg, 0.08 mmol) を THF (1.5 mL) に溶解させ、氷冷下、トリエチルアミン (20 mg, 0.20 mmol)、DMAP (1 mg, 0.01 mmol) 及び オレイン酸クロライド (48 mg, 0.16 mmol) を順次加え、室温で 17 時間攪拌した。TLCで反応終了を確認後、反応液に水、酢酸エチルを加え、有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し溶媒を留去した。残渣を THF (1.5 mL) に溶解させ、氷冷下、7 N アンモニア/メタノール (1 mL)  を加え、室温で 3 時間攪拌した。TLCで反応終了を確認後、反応液に水、酢酸エチルを加え、有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物 (26 mg、48 %）を無色固体として得た。
m.p 73 - 74 ℃; IR (KBr, cm-1) : 3446, 2927, 2852, 1734, 1465, 1376, 1174, 1009, 800; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s), 0.88 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.90 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.02 (3H, s), 1.02-1.71 (41H, m) , 1.80-1.90 (3H, m) , 1.92-2.07 (6H, m) , 2.24-2.34 (4H, m) , 3.27-3.35 (1H, m) , 4.56-4.65 (1H, m) , 5.31-5.41 (3H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.1, 16.7, 18.8, 19.0, 19.3, 21.0, 22.7, 24.3, 25.0, 27.2, 27.2, 27.8, 28.2, 29.1, 29.2, 29.3, 29.5 (3C), 29.7, 29.8, 30.7, 31.9, 31.9, 31.9,  32.2, 33.2, 34.7, 35.9, 36.6, 37.0, 38.2, 39.7, 42.3, 50.0, 55.9, 56.7, 73.7, 77.4, 122.6, 127.9, 129.8, 130.0, 173.3;HRMS (DART-OS) m/z 684. 6284 [(M+NH4)+; calcd for C45H78O3 684.6289]; [α]20D= -45.2 (c= 0.05, CHCl3)。
【００４６】
製造例１−３：(9Z,12Z)-(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル  ヘプタデカ-9,12-ジエノアート (4)の合成
製造例1−2 と同様な操作、処理を経て、表題化合物を得た。
m.p 56 - 58 ℃; IR (KBr, cm-1) : 3444, 2930, 2853, 1734, 1465, 1375, 1175, 1009, 725; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s), 0.89 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.90 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.02 (3H, s), 1.02-1.70 (35H, m) , 1.79-1.90 (3H, m) , 1.92-2.11 (6H, m) , 2.27 (2H, t, J = 7.8 Hz) , 2.31 (2H, d, J = 7.3 Hz) , 2.77 (2H, dd, J = 6.4, 6.9 Hz), 3.27-3.36 (1H, m) , 4.56-4.68 (1H, m) , 5.28-5.43 (5H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.1, 16.7, 18.8, 19.0, 19.3, 21.0, 22.6, 24.3, 25.0, 25.6, 27.2, 27.8, 28.2, 29.1 (2C), 29.1, 29.2, 29.3, 29.6, 30.7, 31.5, 31.9, 31.9, 32.2, 33.2, 34.7, 35.9, 36.6, 37.0, 38.2, 39.7, 42.3, 50.0, 55.9, 56.7, 73.7, 77.4, 122.6, 127.9, 128.0, 130.1, 130.2, 139.7, 173.3;HRMS (DART-OS) m/z 682.6149 [(M+NH4)+; calcd for C45H76O3682.6133]; [α]20D= -14.3 (c= 0.05, CHCl3)。
【００４７】
製造例１−４：(5Z,8Z,11Z,14Z)-(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル イコサ-5,8,11,14−テトラエノアート (5)の合成
製造例１−2 と同様な操作、処理を経て、表題化合物を得た。
IR (KBr, cm-1) : 3444, 2933, 2868, 1733, 1466, 1376, 1246, 1173, 1007, 668; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s), 0.89 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.90 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.02 (3H, s), 1.02-1.75 (27H, m) , 1.78-1.92 (3H, m) , 1.92-2.15 (6H, m) , 2.25-2.34 (4H, m) , 2.75-2.88 (6H, m) , 3.27-3.34 (1H, m) , 4.55-4.68 (1H, m) , 5.29-5.44 (9H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.2, 16.8, 18.9, 19.1, 19.4, 22.7, 24.3, 24.3, 25.0, 25.7 (3C), 26.7, 27.3, 27.9, 28.3, 29.4, 29.9, 31.6, 31.9, 32.3, 33.2, 34.1, 36.0, 36.7, 37.1, 38.2, 39.8, 39.8, 42.4, 50.1, 56.0, 56.7, 76.8, 77.3, 122.7, 127.6, 127.6, 128.0, 128.3, 128.7, 128.7, 128.9, 129.1, 130.6, 164.8;HRMS (DART-OS) m/z 706.6138 [(M+NH4)+; calcd for C47H76O3 706.6133]; [α]20D= -36.1 (c= 0.05, CHCl3)。
【００４８】
製造例１−５：(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル ドコサ-4,7,10,13,16,19-ヘキサエノアート (6)の合成
製造例1−2 と同様な操作、処理を経て、表題化合物を得た。
IR (KBr, cm-1) : 3445, 2962, 2869, 1732, 1463, 1386, 1262, 1162, 1008, 710; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s), 0.90 (3H, t, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.02 (3H, s), 1.02-1.34 (8H, m) , 1.37-1.71 (11H, m), 1.78-1.90 (3H, m) , 1.92-2.12 (4H, m) , 2.28-2.43 (6H, m) , 2.79-2.90 (10H, m) , 3.27-3.35 (1H, m) , 4.56-4.67 (1H, m) , 5.28-5.43 (13H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.3, 16.7, 18.8, 19.1, 19.3, 20.6, 21.0, 22.9, 24.3, 25.6 (5C), 27.8, 28.2, 30.7, 31.9, 31.9, 32.2, 33.2, 34.6, 36.0, 36.6, 37.0, 38.2, 39.7, 42.3, 50.0, 55.9, 56.7, 73.9, 77.2, 122.6, 127.0, 127.9, 127.9, 128.1, 128.1, 128.2, 128.2, 128.3, 128.5, 128.6, 129.2, 132.1, 139.7, 172.5;HRMS (DART-OS) m/z 730.6124 [(M+NH4)+; calcd for C49H76O3730.6133]; [α]20D= -31.2 (c= 0.05, CHCl3)。
【００４９】
製造例１−６：(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル ステアレート (7)の合成
製造例1−2 と同様な操作、処理を経て、表題化合物を得た。
m.p 98 - 100 ℃; IR (KBr, cm-1) : 3392, 2915, 2849, 1739, 1462, 1377, 1193, 1011, 727; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz), 0.90 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.02 (3H, s), 1.02-1.71 (49H, m) , 1.78-1.90 (3H, m) , 1.92-2.05 (2H, m) , 2.24-2.34 (4H, m) , 3.27-3.36 (1H, m) , 4.54-4.67 (1H, m) , 5.34-5.41 (1H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.1, 16.7, 18.8, 19.0, 19.3, 21.0, 22.7, 24.3, 25.1, 27.8, 28.2, 29.1, 29.2, 29.4, 29.5, 29.6, 29.6, 29.7, 29.7 (5C), 30.7, 31.9, 31.9, 31.9, 32.2, 33.1, 34.7, 35.9, 36.6, 37.0, 38.2, 39.7, 42.3, 50.0, 55.9, 56.7, 73.6, 77.4, 122.5, 139.7, 173.3;HRMS (DART-OS) m/z 686.6432 [(M+NH4)+; calcd for C45H80O3686.6446]; [α]20D= -27.0 (c= 0.05, CHCl3)。
【００５０】
製造例１−７：(3S,10R,13R)-17-((2R,5S)-5-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル パルミタート (8)の合成
製造例1−2 と同様な操作、処理を経て、表題化合物を得た。
IR (KBr, cm-1) : 3390, 2915, 2849, 1739, 1462, 1378, 1220, 1178, 727;1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.67 (3H, s), 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.92 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.01 (3H, s), 1.01-1.70 (45H, m) , 1.76-1.89 (3H, m) , 1.90-2.04 (2H, m) , 2.21-2.33 (4H, m) , 3.25-3.34 (1H, m) , 4.54-4.66 (1H, m) , 5.33-5.39 (1H, m); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.9, 14.2, 16.8, 18.9, 19.2, 19.4, 21.1, 22.8, 24.4, 25.2, 27.9, 28.3, 29.2, 29.3, 29.5, 29.5, 29.7, 29.8 (5C), 30.8, 31.9, 32.0, 32.0, 32.3, 33.2, 34.8, 36.0, 36.7, 37.1, 38.2, 39.8, 42.4, 50.1, 56.0, 56.7, 73.7, 77.3, 122.6, 139.8, 173.5;HRMS (DART-OS) m/z 658.6142 [(M+NH4)+; calcd for C43H76O3 658.6133]。
【００５１】
比較例１：MALDI-TOF MSによる質量分析
化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）、又は化合物4（24S−ヒドロキシコレステロールのリノール酸エステル）を含む試料を、質量分析装置（Bruker Daltonik GmbH製autoflex speed）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）により質量分析した。マトリックスとしては、α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、ジスラノール、又はシナピン酸を用い、また、質量分析は、4種のモード（Liner-Positive、Liner-Negative、Reflector-Positive、及びReflector-Negative）で行った。しかし、化合物3及び化合物4の分子イオンピークは観測できなかった。
【００５２】
比較例２：ESI-TOF MSによる質量分析
化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）、又は化合物4（24S−ヒドロキシコレステロールのリノール酸エステル）を含む試料（10-4 Mのクロロホルム溶液）を、質量分析装置（JEOL製JMS-T100CS）を用いて、エレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析法（ESI-TOF MS）により質量分析した。質量分析は、2種のモード（Positive、及びNegative）で行った。しかし、化合物3及び化合物4の分子イオンピークは観測できなかった。
【００５３】
比較例３：GC/MSによる質量分析（条件1）
化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）を、ガスクロマトグラフ装置（島津製作所製QP2010Plus）及び質量分析装置（島津製作所製QP2010Ultra）を用いて、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（GC/MS）により質量分析した。詳細を以下に示す。
【００５４】
2.7μgの化合物3を含むサンプルを窒素乾燥した。そこへN,O-ビス（ トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（BSTFA） 80μLを加えて混合し、60℃で1時間静置後、さらに25℃で48時間静置した。得られた試料を、GC/MSにより下記測定条件で質量分析した。
【００５５】
＜測定条件＞
(1) Capillary column: DB-5ms (Agilent Technologies) 
Phenyl Arylene polymer virtually equivalent to a (5%-Phenyl)-methylpolysiloxane 
30m (length) x 0.25mm (ID) x 0.25μm (film)  
使用可能温度：325 ℃まで
(2) Flow rate (He gas) 1.41mL/min
(3) Temperature program: 
【００５６】
【表１】
2017062135.tif 000006
【００５７】
(4) Injection temperature: 280℃
(5) Ion source temperature: 200℃
(6) Interface temperature: 280℃
(7) Injection volume: 1μL。
【００５８】
化合物3は24S−ヒドロキシコレステロールより高分子であるため、その溶出は24S−ヒドロキシコレステロールよりも遅いと考えられる。そこで24S−ヒドロキシコレステロールのRetention timeを指標に、これよりも遅い時間に溶出されるピークを検索対象とした。しかし、化合物3は検出されなかった。
【００５９】
比較例４：GC/MSによる質量分析（条件2）
測定条件の「(4) Ion source temperature」を230℃とする以外は、比較例３と同様に行った。しかし、化合物3は検出されなかった。
【００６０】
比較例５：GC/MSによる質量分析（条件3）
測定条件の「(5) Injection temperature」を325℃とし、「(3) Temperature program」を表２の条件とする以外は、比較例３と同様に行った。しかし、化合物3は検出されなかった。
【００６１】
【表２】
2017062135.tif 000007
【００６２】
比較例６：GC/MSによる質量分析（条件4）
測定条件の「(1) Capillary column」をZebron ZB-1 (phenomenex) 100% Dimethylpolysiloxane 60m (length) x 0.32mm (ID) x 3.00μm (film)（使用可能温度：360 ℃まで）とし、「(3) Temperature program」を表３の条件とする以外は、比較例３と同様に行った。しかし、化合物3は検出されなかった。
【００６３】
【表３】
2017062135.tif 000008
【００６４】
実施例１：DART-TOF MSによる質量分析1
化合物3（24S−ヒドロキシコレステロールのオレイン酸エステル）、化合物4（24S−ヒドロキシコレステロールのリノール酸エステル）、化合物5（24S−ヒドロキシコレステロールのアラキドン酸エステル）、化合物6（24S−ヒドロキシコレステロールのドコサヘキサエン酸エステル）、化合物7（24S−ヒドロキシコレステロールのステアリン酸エステル）、又は化合物8（24S−ヒドロキシコレステロールのパルミチン酸エステル）を含む試料（10-4 Mのクロロホルム溶液）を、実時間直接イオン化−飛行時間型質量分析法（DART-TOF MS）により質量分析した。試料のイオン化は、JEOL製DART SVP100を用いて行い（Positiveモード、設定温度：500℃、使用ガス：ヘリウムガス）、検出は島津製作所製LCMS2020を用いて行った。
【００６５】
結果を図１〜６に示す。図１〜６中、上段は、試料が含むヒドロキシコレステロール脂肪酸エステル（M）の構造式を示し、中段は、ヒドロキシコレステロール脂肪酸エステルのフラグメントイオン（[M’] +及び[M’’] +）の構造式を示し、下段は得られたマススペクトルを示す。図１〜６に示されるように、化合物3〜8の分子イオンピークが、[M+NH4]+のピークとして観測できた。
【００６６】
実施例２：DART-TOF MSによる質量分析2
LCMS2020に代えて、より高分解能の質量分析計（LCMS-IT-TOF、島津製作所製）を用いる以外は、実施例１と同様に行った。
【００６７】
その結果、化合物3〜8のアンモニウムイオンの理論値とほぼ同じ位置に、ピークが観測できた。結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2017062135.tif 000009
【図１】
2017062135.tif 000010
【図２】
2017062135.tif 000011
【図３】
2017062135.tif 000012
【図４】
2017062135.tif 000013
【図５】
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【図６】
2017062135.tif 000015