(57)【要約】      （修正有）【課題】人体に安全な新規なポリペプチドの提供。【解決手段】以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のポリペプチド：（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（Ｂ）特定のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；（Ｃ）特定のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。カルボキシペプチダーゼ活性を有し、至適反応ｐＨが８．０〜８．３で、安定ｐＨが５．５〜８．０であり、至適反応温度が４９〜５０℃で、温度安定性が５〜３０℃であり、分子量が約３６ｋＤａであり、機能が金属キレーターにより阻外され、セリプロテアーゼ阻外剤では阻外されない性質を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（１）〜（７）の理化学的性質：
（１）作用：カルボキシペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：８．０〜８．５
（３）安定ｐＨ：５．５〜８．０
（４）至適反応温度：４９〜５０℃
（５）温度安定性：５〜３０℃
（６）分子量：約３６ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
を有するポリペプチド。
【請求項３】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程、および培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシペプチダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質の構成成分として知られているが、アミノ酸単体またはオリゴペプチドとしても、疾病の予防・治療や、食品の品質改良や味の改善に用いられる。これらのアミノ酸やオリゴペプチドは、微生物や植物、動物等に由来するタンパク質を分解することにより製造される。
【０００３】
カルボキシペプチダーゼは、ポリぺプチド鎖のカルボキシ末端から１個〜数個のアミノ酸単位でペプチド結合を切断する活性を有している。切断されたアミノ酸や生成するオリゴペプチドは医薬品や食品として用いられることから、その製造に使用するカルボキシペプチダーゼも、医薬品や食品と同等の人体に対する安全性が求められる。
【０００４】
従来、サーマス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来（特許文献１）、キサントモナス  エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来（特許文献２）のカルボキシペプチダーゼが知られている。しかし、これらの微生物自体の人体への安全性が不明であり、これらの微生物に由来するカルボキシペプチダーゼも医薬品や食品に適用するためには十分に安全とはいえない。
【０００５】
また、ストレプトマイセス  グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のカルボキシペプチダーゼが知られている（非特許文献１）が、活性を維持できるｐＨ範囲がｐＨ７〜８と限定されているので、幅広いｐＨ範囲においてタンパク質からアミノ酸やオリゴペプチドを生産することには適さない。非特許文献２には、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌を培養してペプチダーゼを生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−２１６４８１号公報
【特許文献２】特開平５−２３６９６０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７２；２４７（１３）：４１４４−５４
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００８；６２：２４４-２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
人体に安全な、新規なカルボキシペプチダーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、検討の結果、人体への安全性が確立している微生物から新規なカルボキシペプチダーゼを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１１】
また、本発明は、下記（１）〜（７）の理化学的性質：
（１）作用：カルボキシペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：８．０〜８．５
（３）安定ｐＨ：５．５〜８．０
（４）至適反応温度：４９〜５０℃
（５）温度安定性：５〜３０℃
（６）分子量：約３６ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来することが好ましい。
【００１３】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【００１５】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
【００１６】
また、本発明は、前記ベクターを含む形質転換体に関する。
【００１７】
また、本発明は、前記形質転換体を培養する工程、および培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のカルボキシペプチダーゼは人体に無害である。さらに、至適反応ｐＨの範囲が広いことから、幅広いｐＨ範囲でタンパク質からアミノ酸やオリゴペプチドの生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１の結果を示す。
【図２】実施例２の結果を示す。
【図３】実施例３の結果（作用温度）を示す。
【図４】実施例３の結果（温度安定性）を示す。
【図５】実施例４の結果（作用ｐＨ）を示す。
【図６】実施例４の結果（ｐＨ安定性）を示す。
【図７】実施例５の結果を示す。
【図８】実施例６の結果を示す。
【図９】実施例７の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のポリペプチドは、下記（１）〜（７）の理化学的性質を有する。
（１）作用：カルボキシペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：８．０〜８．５
（３）安定ｐＨ：５．５〜８．０
（４）至適反応温度：４９〜５０℃
（５）温度安定性：５〜３０℃
（６）分子量：約３６ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
【００２１】
以下に、理化学的性質を個別に説明する。
（１）作用
カルボキシペプチダーゼ活性は、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを基質として、４０℃の条件で１分間当たり１μｍｏｌのロイシンを生成する活性をいう。
【００２２】
（２）至適反応ｐＨ
至適反応ｐＨはｐＨ８．０〜８．５である。至適反応ｐＨは、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを基質として、ｐＨ８．０で反応させた場合と比較して９０％の活性を維持するｐＨをいう。
【００２３】
（３）安定ｐＨ
安定ｐＨはｐＨ５．５〜８．０である。安定ｐＨでは、ポリペプチドを一定のｐＨで１６時間置いた後でも、元の活性の９０％以上が保たれる。
【００２４】
（４）至適反応温度
至適反応温度は４９〜５０℃である。至適反応温度は、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを基質として、５１℃で反応させた場合と比較して９０％の活性を維持する温度をいう。
【００２５】
（５）温度安定性
温度安定性は５〜３０℃である。温度安定性は、ポリペプチドを一定の温度で３０分置いた後でも、保温前の活性の９０％以上が保たれる温度をいう。
【００２６】
（６）分子量
本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約３６ｋＤａの分子量を示す。
【００２７】
（７）阻害剤
本発明のポリペプチドは、１，１０−フェナンスロリン、ＥＤＴＡなどの金属キレーターにより阻害され、ＰＭＳＦ、ベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）などのセリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない。ここで、阻害の有無は、試験物質の存在下でベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを基質としてアミノ酸分解反応を行った場合のカルボキシペプチダーゼ活性が、試験物質が存在しない場合のカルボキシペプチダーゼ活性と比較して５０％以下である場合に阻害されていると判断し、これを超える場合に阻害されないと判断する。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、カルボキシペプチダーゼ活性を有する微生物などの生物から単離できる。本発明のポリペプチドの由来生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等が挙げられ、中でもストレプトマイセス属が好ましい。本発明のポリペプチドの由来生物としてはストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）がより好ましく、ストレプトマイセス  シンナモネース  ＴＨ−２株が最も好ましい。ストレプトマイセス  シンナモネース  ＴＨ−２株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）において、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９の寄託番号で寄託されており、当該機関より入手可能である。
【００２９】
また、本発明のポリペプチドは、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００３０】
本発明のポリペプチドと、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、評価対象のアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を総アミノ酸数で除して１００を乗じた値で表される。なお、ストレプトマイセス  アルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）は配列番号１に示すアミノ酸配列と７４．０３％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、当該ポリペプチドがカルボキシペプチダーゼ活性を有するかどうか不明である。
【００３１】
欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列の個数は、６８個以下であることが好ましく、４５個以下であることがより好ましく、２２個以下であることがさらに好ましく、９個以下であることがさらにより好ましい。特に好ましくは５個、４個、３個、または２個以下である。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの成熟ポリペプチドであってもよい。成熟ポリペプチドとしては、配列表の配列番号１の１０５〜４５５番目のアミノ酸からなるポリペプチド、または、配列表の配列番号１の１０５〜４５５番目のアミノ酸からなるポリペプチドと好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００３４】
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法により行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄して得られるＤＮＡをあげることができる。６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることが好ましく、６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがより好ましく、６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明のＤＮＡと、配列番号２に示す塩基配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。なお、ストレプトマイセス  アルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）のゲノムには配列番号２に示す塩基配列と８０．４７％の配列同一性を有する塩基配列が存在するが、当該塩基配列がカルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするかどうか不明である。
【００３７】
塩基配列の配列同一性は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と評価したい塩基配列とを比較し、両方の配列で塩基が一致した位置の数を比較総塩基数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００３８】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、カルボキシペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の遺伝子改変方法に準じて調製することができる。
【００３９】
欠失、挿入、置換および／または付加される塩基の数は、２０５個以下であることが好ましく、１３６個以下であることがより好ましく、６８個以下であることがさらに好ましく、２７個以下であることがさらにより好ましく、特に好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下である。
【００４０】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより、ポリペプチドを発現するベクターを作製できる。また、このベクターで宿主生物を形質転換することにより形質転換体を作製でき、この形質転換体を培養することにより本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００４１】
ベクターは宿主生物内でポリペプチドを発現できるものであればよく、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。
【００４２】
宿主は前記ベクターにより形質転換され、ポリペプチドを発現することができる生物であればよい。宿主としては、ストレプトマイセス属、エッシェリヒア属、バシラス属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属等が挙げられる。中でもストレプトマイセス属が好ましく、ストレプトマイセス  シンナモネース、ストレプトマイセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）がより好ましい。具体的には、ストレプトマイセス  リビダンス１３２６株が挙げられる。ストレプトマイセス  リビダンス１３２６株は、別名がストレプトマイセス  ビオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）１３２６株であり、その培養物や精製物を食品に使用した場合の安全性が確認されている。
【００４３】
また、本発明は、細胞を培養する工程、および、培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。細胞は、本発明のポリペプチドを本来発現する細胞であってもよく、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。培養物としては、細胞若しくは菌体の破砕物、培養上清、培養細胞、培養菌体が挙げられる。
【００４４】
細胞培養のための培地は、細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００４５】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、細胞が増殖し、ポリペプチドを産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、２５〜３５℃、好ましくは２７〜３０℃で２４〜９６時間行われる。ｐＨは、３．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。
【００４６】
タンパク質が宿主菌体内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。発現したタンパク質が細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製することができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドによりタンパク質を分解してアミノ酸やオリゴペプチドを生産することができる。タンパク質としては、カゼイン、コラーゲン、ダイズタンパクなどが挙げられる。本発明のポリペプチドを使用して生産されるアミノ酸としては、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンなどが挙げられる。また、本発明のポリペプチドを使用して生産されるオリゴペプチドとしては、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンなどでないオリゴペプチドが挙げられる。
【００４８】
タンパク質の分解は、例えば、４０℃、ｐＨ７．５の条件により行うことができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドを使用して生産されるアミノ酸およびオリゴペプチドは、疾病の予防・治療や、食品の品質改良や味の改善に用いられる。予防・治療対象の疾病としては、例えば高血圧、糖尿病が挙げられる。食品の品質改良としては、例えば苦味分解、旨味増強が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）カルボキシペプチダーゼの精製、および分子量の検討
配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを放線菌用の発現ベクター（非特許文献２に記載のｐＴＯＮＡ５ａ）に挿入し、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株を宿主として、非特許文献２に記載の方法で培養し、カルボキシペプチダーゼを菌体外に分泌発現させた。この培養上清を、簡易ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア社製、ＰＤ−１０カラム）に供し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むカルボキシペプチダーゼを精製した。
【００５１】
精製したカルボキシペプチダーゼの分子量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検討した。カルボキシペプチダーゼ６．４μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをジェルコード（ライフテクノロジーズ社製）により染色した。結果を図１に示す。約３６ｋＤａの付近にカルボキシペプチダーゼに由来するバンドが確認された。
【００５２】
なお、配列番号１のポリペプチドは４５５アミノ酸からなるが、このポリペプチドは修飾を受け、成熟タンパク質は３５１アミノ酸からなる。成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を解析した結果、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａであった。
【００５３】
（実施例２）基質特異性の検討
基質として以下のジペプチドまたはトリペプチド：Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｈｉｓ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｓｅｒ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｎ−Ａｃ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−ＮＨ２、Ｌｅｕ−ＮＨ２を使用した場合のカルボキシペプチダーゼの活性を測定した。
【００５４】
カルボキシペプチダーゼの活性測定用反応液の組成を表１に示す。
【表１】
2017000107.tif 000002
【００５５】
基質としては、ジペプチドあるいはジペプチドとトリペプチドのベンジルオキシカルボニル派生物を使用した。カルボキシペプチダーゼ酵素液として、ゲルろ過カラムＰＤ−１０でろ過した培養上清液を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。
【００５６】
反応は４０℃で３０分行った。次に反応液を９５℃で５分加熱し、酵素を失活させた。その後、反応液を２０μｌ採取し、１８０μｌのＬＡＡＯ（Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を含む混合物に入れ、４０℃で３０分反応させた後、５０５ｎｍの波長の吸光度を測定した（４ＡＰ−ＬＡＡＯ法、Ａｒｉｍａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７０：５４１−５４７（２００６））。カルボキシペプチダーゼ活性の１単位は、１分間あたり１μｍｏＬのアミノ酸を遊離させる酵素量として定義した。結果を図２に示す。なお、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｎ−Ａｃ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−ＮＨ２、およびＬｅｕ−ＮＨ２はカルボキシペプチダーゼにより加水分解されなかった。
【００５７】
（実施例３）作用温度および温度安定性の検討
カルボキシペプチダーゼによる加水分解反応を４０〜６０℃で行った際の活性を測定した。基質としてベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを使用し、加水分解反応を４０〜６０℃で行った以外は、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定し、５１℃で測定した活性に対する相対活性を算出した。結果を図３に示す。
【００５８】
また、カルボキシペプチダーゼをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で２５〜４５℃で３０分保持した後の活性を測定した。基質としてベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを使用し、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定し、５℃で３０分保持した活性に対する相対活性を算出した。結果を図４に示す。
【００５９】
（実施例４）作用ｐＨおよびｐＨ安定性の検討
カルボキシペプチダーゼによる加水分解反応の反応ｐＨを変動させた際の活性を測定した。基質としてベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを使用し、反応緩衝液を変更した以外は、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定した。反応緩衝液として、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．６）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．５）を使用した。測定結果から、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対する相対活性を算出した。結果を図５に示す。
【００６０】
また、カルボキシペプチダーゼをｐＨ５．５〜８の条件で１６時間保持した後の活性を測定した。基質としてベンジルオキシカルボニル−グリシル−ロイシンを使用し、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定した。測定結果から、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対する相対活性を算出した。結果を図６に示す。
【００６１】
（実施例５）タンパク質分解試験１
プロテアーゼと組み合わせて処理した場合のカルボキシペプチダーゼの活性を測定した。基質としてカゼイン（濃度６ｍｇ／ｍＬ）、大豆タンパク質（濃度６ｍｇ／ｍＬ）、ゼラチン（濃度６ｍｇ／ｍＬ）を使用した。カゼインおよび大豆タンパク質はカルボキシペプチダーゼとビオプラーゼＳＰ（酵素量１０ｍｇ／ｍＬを３３μＬ）を組み合わせて処理した。ゼラチンはカルボキシペプチダーゼとコラゲナーゼ（酵素量１０ｍｇ／ｍＬを３３μＬ）を組み合わせて処理した。カルボキシペプチダーゼの添加量は反応液中に７．１μｇまたは７１．０μｇとし、カルボキシペプチダーゼを添加しないものと比較した。実施例２の組成にて、４０℃、６時間反応を行った。次に８０℃３０分加熱し、酵素を失活させた。遊離したアミノ酸の濃度をニンヒドリン法により測定した。ニンヒドリン呈色による５７０ｎｍの吸光度を測定した。アミノ酸濃度１．０ｍＭは１．０ｍＭのロイシンのニンヒドリン呈色に相当する。結果を図７に示す。
【００６２】
（実施例６）タンパク質分解試験２
基質としてカゼイン（濃度６ｍｇ／ｍＬ）、大豆タンパク質（濃度６ｍｇ／ｍＬ）、ゼラチン（濃度６ｍｇ／ｍＬ）を使用した場合のカルボキシペプチダーゼの活性を測定した。実施例５に記載の反応条件により加水分解反応を行い、反応液をゲルろ過分析により解析した。ゲルろ過分析は下記の条件により行った。カゼインの分解結果を図８Ａに、大豆タンパク質の分解結果を図８Ｂに、ゼラチンの分解結果を図８Ｃに、それぞれ示す。図８Ａ〜Ｃにおいて、実線は各タンパクをプロテアーゼ処理したものを示し、点線はプロテアーゼ処理後にカルボキシペプチダーゼで処理したものを示す。
【００６３】
ゲルろ過分析条件：
検出波長：２１５ｎｍ
流速：０．５ｍｌ／ｍＬ
溶媒：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）
Ｉｎｊ．：０．２ｍＬ
【００６４】
（実施例７）タンパク質分解試験３
基質としてカゼイン、大豆タンパク質、ゼラチンを使用した場合のカルボキシペプチダーゼの活性を測定した。実施例５に記載の反応条件により加水分解反応を行い、遊離したアミノ酸の種類および量を、ＥＺ：ｆａａｓｔ  キット（フェノメネックス社製）およびＦＩＤ付きガスクロマトグラフィーを使用して測定し、酸分解した際の遊離アミノ酸量に対する割合を算出した。結果を図９に示す。検討したアミノ酸の種類の中でも、特にロイシン（Ｌ）、メチオン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）の遊離が多いことが確認された。
【図２】
2017000107.tif 000003
【図３】
2017000107.tif 000004
【図４】
2017000107.tif 000005
【図５】
2017000107.tif 000006
【図６】
2017000107.tif 000007
【図７】
2017000107.tif 000008
【図８】
2017000107.tif 000009
【図９】
2017000107.tif 000010
【図１】
2017000107.tif 000011
【配列表】
2017000107000001.app