(57)【要約】      （修正有）【課題】特に真核細胞内で機能する優れた人工リボスイッチの開発。【解決手段】人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）を含むＲＮＡ分子であって、（ｉ）当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の順に、部位Ａ、Ｂ、Ｃからなり、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列ｃとすると、部位Ａはその３’端に配列ａを含み、部位Ｃはその５’端に配列ｃを含み、部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる、ＲＮＡ分子、あるいは、（ｉｉ）ＲＮＡ分子（ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつリボソームが内部侵入可能なＲＮＡ分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）を含むＲＮＡ分子であって、
（ｉ）
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａは配列ａを含み、部位Ｃは配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又は（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる、
ＲＮＡ分子、あるいは、
（ｉｉ）
ＲＮＡ分子（ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつリボソームが内部侵入可能なＲＮＡ分子。 
【請求項２】
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子であって、
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａはその３’端に配列ａを含み、部位Ｃはその５’端に配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなり、
当該結合構造において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとしたとき、
（１）：部位Ａ及び部位ＢＡを含み、且つ部位ＢＡを部位Ａより３’末端側に含む、ＲＮＡ分子、又は
（２）：部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含む、ＲＮＡ分子
である、
ＲＮＡ分子、あるいは
（１−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＡに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子、又は
（２−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（２）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＣに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（１）の部位ＢＡとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子。 
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＲＮＡ分子であって、
（０−ｇ）：ＲＮＡ分子（ｉ）が、さらに部位Ｃの３’端側に発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子である、請求項１に記載のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）、あるいは、
（２−ｇ）：ＲＮＡ分子（２）が、さらに部位Ｃの３’端側に発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子である、請求項２に記載のＲＮＡ分子（２）又は（２−ｉｉ）。 
【請求項４】
請求項１に記載のＲＮＡ分子が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記結合構造の安定性を変化させる工程を含む、前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を調節する方法。
【請求項５】
前記結合構造の安定性を変化させる工程が、
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（α）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、ステムループ構造をとる配列以外の配列を部分Ｂに含ませる工程である、前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を抑制する、請求項４に記載の方法。 
【請求項６】
前記結合構造の安定性を変化させる工程が、
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（α）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡの、アンチセンスＲＮＡ分子を、系に導入する工程であるか、あるいは
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（β）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち、いずれか１方又は両方のアンチセンスＲＮＡ分子を、系に導入する工程である、
前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を抑制する、請求項４に記載の方法。 
【請求項７】
請求項２に記載のＲＮＡ分子（１）及び（１−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が存在する系において、請求項２に記載のＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を、当該系に導入する工程、又は
請求項２に記載のＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が存在する系において、請求項２に記載のＲＮＡ分子（１）及び（１−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を、当該系に導入する工程
を含む、
ＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が、その部位Ｃ又は部位Ｃ相当部の３’端側に含む遺伝子の、翻訳を開始させる方法。
【請求項８】
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子であって、
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａはその３’端に配列ａを含み、部位Ｃはその５’端に配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ分子、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡ分子からなり、
当該結合構造が、（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとし、ここで、部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含むＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子（２）とし、
当該結合構造が、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ分子
の配列をアンチステムループ配列としたとき、
（１−ａ−ｉ）：アンチステムループ配列、部位Ａ、及び部位ＢＡを含むＲＮＡ分子であるか、又は
（１−ａ−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ、アンチステムループ配列相当部が前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡとハイブリダイズし得、さらに、部位ＢＡ相当部と、ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子。 
【請求項９】
請求項３に記載の、結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）、及びＲＮＡ分子（２−ｇ）が存在する系に、請求項８に記載のＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）及び／又はＲＮＡ分子（１−ａ−ｉｉ）を加える工程を含む、
結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）が含む遺伝子の翻訳を抑制し、かつ、ＲＮＡ分子（２−ｇ）が含む遺伝子の翻訳を開始する、方法。 
【請求項１０】
請求項１に記載のＲＮＡ分子、請求項２に記載のＲＮＡ分子、及び請求項３に記載のＲＮＡ分子からなる群より選択される、少なくとも１種のＲＮＡ分子を含む細胞。 
【請求項１１】
請求項１に記載のＲＮＡ分子、請求項２に記載のＲＮＡ分子、請求項３に記載にＲＮＡ分子、及び請求項８に記載のＲＮＡ分子からなる群より選択される、少なくとも１種のＲＮＡ分子を発現するベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＲＥＳを用いた人工リボスイッチに関する。
【背景技術】
【０００２】
リボスイッチは天然に存在する核酸構造体であり、それ自身が生体内小分子と直接相互作用することでタンパク質翻訳を制御する遺伝子発現レギュレーターである。これまでに報告されているリボスイッチのほとんどは原核細胞から発見されており、真核細胞からの発見例はほとんどない。天然で発見されたリボスイッチはｍＲＮＡ上に存在しており、特異的に結合する代謝物に応答してその構造を変化することで、下流に位置する遺伝子の発現を制御する。このようなリボスイッチの優れた遺伝子制御機構は、核酸工学研究分野での人工リボスイッチが作製に大きな興味を与えた。これまでにも数多くの人工リボスイッチが作製されてきたが、そのほとんどが原核細胞のタンパク質発現システムを制御するものであり、複雑な真核細胞のタンパク質発現システムを制御できるリボスイッチの報告は極めて少ない。
【０００３】
真核細胞内でタンパク質の発現を人工的に誘導することは、細胞生物学において一般的に行われており、これまでにも数多くの細胞機能の解明に役立ってきた。最も有名な方法は、テトラサイクリンによりタンパク質発現誘導・抑制するＴｅｔ  ＯＮ／ＯＦＦシステムであろう。例えばＴｅｔ  ＯＮシステムは、目的タンパク質の発現量を数百倍に誘導することができる優れた方法であり、すでに商品化されている。このＴｅｔシステムは、ｍＲＮＡの発現を誘導・抑制することでタンパク質発現量を制御する“ｍＲＮＡ転写制御システム”である。これに対して、リボスイッチはｍＲＮＡの構造変化を利用してタンパク質発現量を調整する“タンパク質翻訳制御システム”である。真核細胞内で機能する優れた人工リボスイッチが開発されれば、細胞生物学研究分野に新たな視点からの研究方法の提示が期待できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｕｃｈｉｕｍｉ，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３９  （２００９）  １３７-１４７
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ，  Ａ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  ２０１４  Ｎｏｖ  ６；１５９（４）：９２５−３９．
【非特許文献３】Ｐｆｉｎｇｓｔｅｎ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００６  Ｄｅｃ  １；３１４（５８０４）：１４５０−４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、特に真核細胞内で機能する優れた人工リボスイッチを開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の構造と機能をコントロールすることにより、真核細胞の発現システムを制御できる可能性に気づき、さらに検討及び改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）を含むＲＮＡ分子であって、
（ｉ）
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａは配列ａを含み、部位Ｃは配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又は（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる、
ＲＮＡ分子、あるいは、
（ｉｉ）
ＲＮＡ分子（ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつリボソームが内部侵入可能なＲＮＡ分子。
項２．
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子であって、
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａはその３’端に配列ａを含み、部位Ｃはその５’端に配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなり、
当該結合構造において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとしたとき、
（１）：部位Ａ及び部位ＢＡを含み、且つ部位ＢＡを部位Ａより３’末端側に含む、ＲＮＡ分子、又は
（２）：部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含む、ＲＮＡ分子
である、
ＲＮＡ分子、あるいは
（１−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＡに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子、又は
（２−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（２）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＣに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（１）の部位ＢＡとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子。
項３．
項１又は２に記載のＲＮＡ分子であって、
（０−ｇ）：ＲＮＡ分子（ｉ）が、さらに部位Ｃの３’端側に発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子である、項１に記載のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）、あるいは、
（２−ｇ）：ＲＮＡ分子（２）が、さらに部位Ｃの３’端側に発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子である、項２に記載のＲＮＡ分子（２）又は（２−ｉｉ）。
項４．
項１に記載のＲＮＡ分子が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記結合構造の安定性を変化させる工程を含む、前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を調節する方法。
項５．
前記結合構造の安定性を変化させる工程が、
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（α）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、ステムループ構造をとる配列以外の配列を部分Ｂに含ませる工程である、前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を抑制する、項４に記載の方法。
（なお、ステムループ構造をとる配列以外の配列を部分Ｂに含ませる工程は、好ましくは、ステムループ構造をとる配列の片方末端又は両末端にランダムな塩基配列を付加する工程である。）
項６．
前記結合構造の安定性を変化させる工程が、
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（α）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡの、アンチセンスＲＮＡ分子を、系に導入する工程であるか、あるいは
ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（β）である場合のＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）が存在する系において、当該ＲＮＡ分子の前記ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち、いずれか１方又は両方のアンチセンスＲＮＡ分子を、系に導入する工程である、
前記ＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の翻訳を抑制する、項４に記載の方法。
項７．
項２に記載のＲＮＡ分子（１）及び（１−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が存在する系において、項２に記載のＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を、当該系に導入する工程、又は
項２に記載のＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が存在する系において、項２に記載のＲＮＡ分子（１）及び（１−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を、当該系に導入する工程
を含む、
ＲＮＡ分子（２）及び（２−ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子が、その部位Ｃ又は部位Ｃ相当部の３’端側に含む遺伝子の、翻訳を開始させる方法。
項８．
人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子であって、
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａはその３’端に配列ａを含み、部位Ｃはその５’端に配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ分子、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡ分子からなり、
当該結合構造が、（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとし、ここで、部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含むＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子（２）とし、
当該結合構造が、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ分子
の配列をアンチステムループ配列としたとき、
（１−ａ−ｉ）：アンチステムループ配列、部位Ａ、及び部位ＢＡを含み、（好ましくは、且つ部位ＢＡを部位Ａより３’端側に、アンチステムループ配列を部位Ａより５’端側に、それぞれ含み、）ＲＮＡ分子であるか、又は
（１−ａ−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ、アンチステムループ配列相当部が前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡとハイブリダイズし得、さらに、部位ＢＡ相当部と、ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子。
項９．
項３に記載の、結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）、及びＲＮＡ分子（２−ｇ）が存在する系に、項８に記載のＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）及び／又はＲＮＡ分子（１−ａ−ｉｉ）を加える工程を含む、
結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）が含む遺伝子の翻訳を抑制し、かつ、ＲＮＡ分子（２−ｇ）が含む遺伝子の翻訳を開始する、方法。
項１０．
項１に記載のＲＮＡ分子、項２に記載のＲＮＡ分子、及び項３に記載のＲＮＡ分子からなる群より選択される、少なくとも１種のＲＮＡ分子を含む細胞。
項１１．
項１に記載のＲＮＡ分子、項２に記載のＲＮＡ分子、項３に記載にＲＮＡ分子、及び項８に記載のＲＮＡ分子からなる群より選択される、少なくとも１種のＲＮＡ分子を発現するベクター。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るＲＮＡ分子を用いることにより、系内（特に真核細胞内）での翻訳を調節することができる。特に、翻訳を明確に開始又は停止させる（すなわち、翻訳のＯＮ／ＯＦＦを制御する）ことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ネイティブＩＲＥＳユニット−ＦＬ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、及び不安定ループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬのｍＲＮＡの模式図を示す。
【図２】図１における安定ステムループ構造及び不安定ループ構造を具体的に示す。
【図３】図１における３種のｍＲＮＡから翻訳されたルシフェラーゼの活性を評価した結果を示す。
【図４】安定ステムループ構造、安定ステムループ構造の両端に塩基を３塩基ずつ付加した構造を有するステムループ構造、及び安定ステムループ構造の両端に塩基を９塩基ずつ付加した構造を有するステムループ構造、を具体的に示す。
【図５】安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、安定ステムループ構造の両端に塩基を３塩基ずつ付加した構造を有するステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、安定ステムループ構造の両端に塩基を９塩基ずつ付加した構造を有するステムループ構造―ＦＬ、の３種のｍＲＮＡから翻訳されたルシフェラーゼの活性を評価した結果を示す。
【図６】（ａ）ネイティブＩＲＥＳユニット−ＦＬ、（ｂ）５’−ＩＲＥＳユニット及び再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット、（ｃ）再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニット及び３’−ＩＲＥＳユニット、（ｄ）再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニット及び再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット、のＲＮＡからのルシフェラーゼの翻訳を評価した検討において、リボソームが内部侵入してホタルルシフェラーゼ遺伝子を翻訳できるかどうかを模式化した図を示す。
【図７】図６に示した検討における、ルシフェラーゼ活性評価結果を示す。（ａ）のルシフェラーゼ活性を１００％としたとき、（ｂ）の活性は０．２％、（ｃ）の活性は０．３％、（ｄ）の活性は９１％であることが示されている。
【図８】ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡの翻訳終始コドンの後ろに再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬを結合したｍＲＮＡと再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットが共存した場合に、リボソームが内部侵入してホタルルシフェラーゼ遺伝子を翻訳できることを模式化した図を示す。
【図９】ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡの翻訳終始コドンの後ろに再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬを結合したｍＲＮＡと再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットが共存した場合としなかった場合とにおいて、ホタルルシフェラーゼ活性を評価し比較した結果を示す。再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットが共存した場合は、再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットが共存しなかった場合に比べ、２００倍以上のホタルルシフェラーゼ活性が検出されたことが示されている。
【図１０】再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−Ｄｓ−ＲｅｄをクローニングしたｐＣＭＶコンストラクト、及び、再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットをクローニングしたｐＳｕｐｅｒ／ｎｅｏベクターを、ＨＥＫ２９３細胞へコトランスフェクトした際の、Ｄｓ−Ｒｅｄの発現を示す赤色蛍光を観察した結果を（ｂ）に示す。また、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−Ｄｓ−ＲｅｄをクローニングしたｐＣＭＶコンストラクトのみをＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトし際の、Ｄｓ−Ｒｅｄの発現を観察した結果を（ａ）に示す。
【図１１】結合部位にステムループ構造を有するＩＲＥＳ、及び当該ステムループ構造を構成する配列と相補的な配列を有するヌクレオチド（例えばアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いることで、タンパク質発現を抑制する（好ましくは停止：ＯＦＦにする）ことができるかを検討した際の、検討概要図（ａ）、当該検討におけるＩＲＥＳ結合部位のステムループ構造部分とアンチセンスＲＮＡとの構造を示す図（ｂ）、及び遺伝子（ルシフェラーゼ）翻訳の評価結果（ｃ）を示す。
【図１２】、結合構造として安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳと、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニットを含む系においては、前者による遺伝子の翻訳をＯＮからＯＦＦへ、後者による翻訳をＯＦＦからＯＮへ、同時に切り換えることができるＤｕａｌスイッチの構造（ａ）及び当該機構の概要（ｂ）を示す。
【図１３】Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）の７つのステムループ構造を含む範囲の塩基配列を示す。
【図１４】実施例で用いた各合成オリゴヌクレオチド及びプライマーの位置関係を示す。なお、すべてのＩＲＥＳ模式図において「ＰＫ」はｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔサイトを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、特定のＲＮＡ分子、より詳細には、人工内部リボソーム侵入サイト（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）を含むＲＮＡ分子、又は人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子を包含する。
【００１２】
当該人工ＩＲＥＳは、５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなる。
【００１３】
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、部位Ａは配列ａを含み、好ましくは部位Ａは配列ａをその３’端に含む。部位Ａは、配列ａからなるＲＮＡのみからなっていてもよいし、本発明の効果を損なわない範囲で、配列ａの５’側又は３‘側にさらに他の配列が付加された配列からなるＲＮＡからなっていてもよい。また、部位Ｃは配列ｃをみ、好ましくは部位Ｃは配列ｃをその５’端に含む。部位Ｃは、配列ｃからなるＲＮＡのみからなっていてもよいし、本発明の効果を損なわない範囲で、配列ｃの５’側  又は３‘側にさらに他の配列が付加された配列からなるＲＮＡからなっていてもよい。
【００１４】
部位Ｂは、結合構造を有しており、当該結合構造により部位Ａと部位Ｃとが結合される。当該結合構造は、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又は（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる。
【００１５】
天然ＩＲＥＳとは、自然界に存在する生物（多細胞を利用して増殖可能な存在、例えばウイルス等を含む）が有するＲＮＡ分子内に存在する内部リボソーム侵入サイトをいう。公知の天然ＩＲＥＳを適宜選択して利用することができる。例えば、Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）を好ましく用いることができる。ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳは、７個のステム−ループ構造が折り畳まれて複雑な三次元構造を取ることが知られている。当該ＩＲＥＳを含む配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ：  ＡＢ００６５３１．１に登録されている。
【００１６】
天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない配列は、言い換えれば、天然ＩＲＥＳ配列に含まれるが改変（塩基を置換、欠失、又は付加）してもｍＲＮＡの内部にリボソームが侵入して翻訳することを妨げない配列であり、好ましくは、改変しても当該翻訳効率の低下が小さい又は無い配列である。当該配列において改変（塩基の置換、欠失、又は付加）を行い、上記結合構造を人工的に作製する。特に制限はされないが、改変部位の配列長が短い方が翻訳効率に影響を与えるおそれが小さいため、改変対象となる配列としては、天然ＩＲＥＳ配列における任意の１〜３０塩基配列であることが好ましく、１〜２０塩基配列であることがより好ましく、１〜１０塩基配列であることがさらに好ましく１、２、３、４、又は５塩基配列であることがよりさらに好ましい。
【００１７】
本発明に係る人工ＩＲＥＳを含むＲＮＡ分子又はその一部を構成するＲＮＡ分子においては、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分の配列（配列ｂ）において、改変が施されている。
【００１８】
また、天然ＩＲＥＳ配列において、配列ｂより５’端側に存在する配列のうち、内部リボソーム侵入のための配列が配列ａであり、また、配列ｂより３’端側に存在する配列のうち、内部リボソーム侵入のための配列が配列ｃである。内部リボソーム侵入のための配列とは、その配列が存在することで、内部にリボソームが侵入できるようになる配列であり、好ましくは存在しないと内部リボソーム侵入効率が低下（ひいては翻訳効率が低下）する配列であり、より好ましくは存在しないと内部リボソーム侵入がほとんど起こらなくなる（ひいては翻訳がほとんど起こらなくなる）配列である。
【００１９】
配列ａは、配列ｂより５’端側に存在する配列そのものであってもよいし、配列ｂより５’端側に存在する配列のうち、改変（塩基を置換、欠失、又は付加）してもｍＲＮＡの内部にリボソームが侵入して翻訳することを妨げない配列が、改変されていてもよい。同様に、配列ｃは、配列ｂより３’端側に存在する配列そのものであってもよいし、配列ｂより３’端側に存在する配列のうち、改変（塩基を置換、欠失、又は付加）してもｍＲＮＡの内部にリボソームが侵入して翻訳することを妨げない配列が、改変されていてもよい。
【００２０】
また、上記の通り、天然ＩＲＥＳ配列は、複数のステムループ構造を有し、これらのステムループ構造が折りたたまれて複雑な三次元構造を取ることが知られており、リボソームは当該三次元構造を認識してｍＲＮＡの内部に侵入し、翻訳を行うと考えられている。本発明の一実施形態である人工ＩＲＥＳを含むＲＮＡ分子を、リボスイッチとして用いるにあたっては、上記結合構造部位において、当該結合構造を構築したり又は解いたりすることにより、各ステムループ構造による三次元構造の構築を促したり又は阻害したりすることで、リボスイッチのＯＮ又はＯＦＦを制御することが好ましい。よってＩＲＥＳのステムループ構造を崩すことになる部位（すなわち当該ステムループ構造を形成する部位）に配列ｂを設定するのではなく、天然ＩＲＥＳ配列が有する各ステムループ構造を形成する部位と部位の間に配列ｂを設定することが好ましい。また、配列ｂより５’端側又は３’端側に存在する配列のうち、改変してもｍＲＮＡの内部にリボソームが侵入して翻訳することを妨げない配列としても、天然ＩＲＥＳ配列が有する各ステムループ構造を形成する部位と部位の間の配列であることが好ましい。またさらに、配列ａが少なくとも１つの天然ＩＲＥＳ由来のステムループ構造をとる配列を有し、且つ配列ｃが少なくとも１つの天然ＩＲＥＳ由来のステムループ構造をとる配列を有することが好ましい。
【００２１】
例えば、ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳは上記の通り７つのステムループ構造を有しており、これらの構造をとる配列（ステムループ配列：ＳＬ配列）を５’端から３’端の方向の順にＰＳＩＶ−ＩＲＥＳのＳＬ配列１、２、３、４、５、６、及び７とすると、配列ｂは、ＳＬ配列１と２の間、ＳＬ配列２と３の間、ＳＬ配列３と４の間、ＳＬ配列４と５の間、ＳＬ配列５と６の間、又はＳＬ配列６と７の間に存在することが好ましく、特にＳＬ配列３と４の間に存在することがより好ましい。仮に、ＳＬ配列３と４の間に配列ｂを設定した場合、配列ａにはＳＬ配列１，２及び３が含まれ得、配列ｃにはＳＬ配列４〜７が含まれ得る。また、ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳは特に解析が進められているＩＲＥＳであり、ＳＬ配列１及び２は、ｍＲＮＡの内部にリボソームが侵入して翻訳するために必須ではないことが知られている（非特許文献３）。よって、天然ＩＲＥＳとしてＰＳＩＶ−ＩＲＥＳを用いる場合には、ＳＬ配列１及び２も改変されていてもよい。さらには、特に配列ｂがＳＬ配列３と４の間に存在する場合において、部位ＡはＳＬ配列３を含んでいればよく、天然ＩＲＥＳ由来ステムループ構造配列としては、ＳＬ配列３のみを含んでいてもよい。
【００２２】
またさらに、特に部位Ａの５’端には、天然ＩＲＥＳに由来しないステムループ構造（非天然ＩＲＥＳステムループ構造）を有していてもよい。非天然ＩＲＥＳステムループ構造が存在することで、発現漏れの抑制（つまり、プロモーター等の存在のためにＩＲＥＳ三次元構造が構成されない場合においてリボソームが侵入して翻訳が始まってしまうことを抑制）することができる。
【００２３】
なお、天然ＩＲＥＳのうち、既にステムループ構造がどの部位に存在するか公知のものについては、その公知のステムループ構造の配列情報を参照すればよい。また、天然ＩＲＥＳ配列のステムループ構造がどの部位に存在するか未知のものについては、公知のＲＮＡ分子構造予測ソフトを用いて調べることができる。このような公知のソフトとしては、例えば、次の表１に記載のものが例示できる。
【００２４】
【表１】
2017209030.tif 000002
上記の通り、部位Ｂは、結合構造を有しており、当該結合構造は、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又は（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる。
【００２５】
当該（α）１本鎖ＲＮＡのステムループ構造は、ステム部分が完全相補であってもよいし、ステム構造が形成されるのであれば不完全相補であってもよい。つまり、ステム部分を構成する２本鎖部分は一方の鎖の塩基配列ともう一方の塩基配列とが、ステム構造を構成する範囲で相補的であればよい。例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％相補的であり得る。また、通常、相補的割合が低いほど、ステムループ構造は不安定になるが、不安定なステムループ構造であるほど部位Ａと部位Ｃとの結合が不安定となり、ＩＲＥＳのステムループ構造から構成される三次元構造が不安定になるために、内部リボソーム侵入効率が低くなり、結果として翻訳効率が低下する。よって、当該相補的割合を変化させることにより、内部リボソーム侵入効率及び翻訳効率を調節することができる。
【００２６】
なお、本明細書において、相補的割合とは、ステム構造を形成する２本鎖ＲＮＡの全塩基中、各塩基のペアが相補的である割合をいう。ＡとＵのペア、又はＧとＣのペアが相補的ペアである。
【００２７】
また、結合構造が当該（α）１本鎖ＲＮＡのステムループ構造である場合、部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃは連続した１本鎖ＲＮＡを構成し得る。この場合、本発明の一実施形態に係る人工ＩＲＥＳを含むＲＮＡ分子は、連続した１本鎖ＲＮＡ分子であり得る。
【００２８】
（α）１本鎖ＲＮＡの塩基配列長は、本発明の効果が損なわれない限り特に制限はされないが、例えば２０〜３００塩基が挙げられ、下限は例えば３０塩基以上又は４０塩基以上でもよく、上限は２００塩基塩基以下又は１００塩基以下でもよい。また、この中でループ構造をとる塩基配列長も特に制限はされないが、例えば４〜５０塩基が挙げられ、下限は例えば５塩基以上１０塩基以上、１５塩基以上又は２０塩基以上でもよく、上限は４０塩基以下、３５塩基以下、又は３０塩基以下でもよい。
【００２９】
当該ステムループ構造は、特に制限はされないが、ヘアピンループ構造であることが好ましい。
【００３０】
当該（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡは、言いかえれば、上記（α）１本鎖ＲＮＡのステムループ構造において、ループ構造部分が切断された又は欠失した構造を有するＲＮＡである。
【００３１】
ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡは、完全相補であってもよいし、ハイブリダイズされるのであれば不完全相補であってもよい。つまり、ステム部分を構成する２本鎖部分は一方の鎖の塩基配列ともう一方の塩基配列とが、ハイブリダイズし得る範囲で相補的であればよい。例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％相補的であり得る。また、通常、相補的割合が低いほど、２本鎖ＲＮＡは不安定になるが、不安定な２本鎖ＲＮＡであるほど部位Ａと部位Ｃとの結合が不安定となり、ＩＲＥＳのステムループ構造から構成される三次元構造が不安定になるために、内部リボソーム侵入効率が低くなり、結果として翻訳効率が低下する。よって、当該相補的割合を変化させることにより、内部リボソーム侵入効率及び翻訳効率を調節することができる。
【００３２】
また、結合構造が当該（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡである場合、部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃは部位Ｂで途切れた（言いかえれば、非連続の）２本のＲＮＡ分子の複合体（すなわち複合体ＲＮＡ分子）を構成し得る。つまり、部位結合構造において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとしたとき、当該複合体ＲＮＡ分子は、
（１）：部位Ａ及び部位ＢＡを含み、且つ部位ＢＡを部位Ａより３’末端側に含む、ＲＮＡ分子、及び
（２）：部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含む、ＲＮＡ分子
が、部位Ｂにおいて、部位ＢＡと部位ＢＣとに含まれる相補的部位がハイブリダイズして２本鎖を構成することにより結合された、構造を有し得る。この場合、本発明の一実施形態に係る人工ＩＲＥＳを含むＲＮＡ分子は、当該２本のＲＮＡ分子からなる複合体ＲＮＡ分子であり得る。
【００３３】
（β）２本鎖ＲＮＡの塩基配列長は、本発明の効果が損なわれない限り特に制限はされないが、２本鎖ＲＮＡの合計として、例えば２０〜３００塩基が挙げられ、下限は例えば３０塩基以上又は４０塩基以上でもよく、上限は２００塩基以下又は１００塩基以下でもよい。また、２本鎖ＲＮＡの１方の１本鎖ＲＮＡの塩基配列長は、少なくとも５塩基以上が好ましく、１０塩基以上がより好ましく、１５塩基以上がさらに好ましく、２０塩基以上がよりさらに好ましい。
【００３４】
本発明は、人工内部リボソーム侵入サイトを含むＲＮＡ分子であって、当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、部位Ａは配列ａを含み、部位Ｃは配列ｃを含み、部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる、ＲＮＡ（以下「ＲＮＡ（ｉ）」ということがある）を包含する。
【００３５】
また、本発明は、上記人工ＩＲＥＳを含むＲＮＡ（ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつリボソームが内部侵入可能なＲＮＡ（以下「ＲＮＡ（ｉｉ）ということがある」）をも包含する。当該配列同一性は、９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がさらに好ましい。また、本明細書において、配列同一性とは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより２つの塩基配列をアライメントした際に、全塩基ペア中、同一塩基ペアが存在する割合をいう。
【００３６】
なお、ＲＮＡ（ｉｉ）において、ＲＮＡ（ｉ）の部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃに相当する部分を部位Ａ相当部、部位Ｂ相当部、部位Ｃ相当部ということがある。また、ＲＮＡ（ｉｉ）でも部位Ｂ相当部において結合構造も維持されており、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡから成る結合構造を部位Ｂ相当部は有する。
【００３７】
本明細書において、特に断らない限り、ＲＮＡ分子（ｉ）についての説明（特に各部位の説明及び機能の説明）は、ＲＮＡ分子（ｉｉ）の説明として妥当する。
【００３８】
なお、本明細書において、リボソームが内部侵入するとは、ＩＲＥＳを解してリボソームがＲＮＡに結合し（より好ましくはリボソームがＲＮＡ分子の５’端ではない部位に結合し）、その結合部位の下流に遺伝子が存在する場合には当該遺伝子の翻訳を行い得ることをいう。
【００３９】
本発明は、上述の、人工ＩＲＥＳの一部を構成するＲＮＡ分子（１）及び（２）も包含する。さらに、本発明は、以下のＲＮＡ分子（１−ｉｉ）及び（２−ｉｉ）も包含する。
（１−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＡに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる、ＲＮＡ分子、又は
（２−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（２）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ部位ＢＣに相当する部位と上記ＲＮＡ分子（１）の部位ＢＡとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる、ＲＮＡ分子。
【００４０】
ここでの配列同一性は、９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がさらに好ましい。
【００４１】
また、（１−ｉｉ）の「部位ＢＡに相当する部位」とは、ＲＮＡ分子（１）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列において、ＲＮＡ分子（１）の配列における部位ＢＡと最も配列同一性が高い部位をいう。同様に、（２−ｉｉ）の「部位ＢＣに相当する部位」とは、ＲＮＡ分子（２）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列において、ＲＮＡ分子（２）の配列における部位ＢＣと最も配列同一性が高い部位をいう。
【００４２】
なお、上記ＲＮＡ分子（１）、（２）、（１−ｉｉ）、及び（２−ｉｉ）は、人工ＩＲＥＳの一部を構成するＲＮＡ分子であり、それぞれ、部位ＢＣと部位ＢＡ（又はこれらに相当する部位）とがハイブリダイズして構成される複合体ＲＮＡ分子は、ＩＲＥＳの機能を有する。すなわち、当該複合体ＲＮＡ分子の人工ＩＲＥＳ部位にはボソームが結合して内部侵入でき、その結合部位の下流に遺伝子が存在する場合には当該遺伝子の翻訳を行い得る。当該複合体ＲＮＡ分子は、具体的には、ＲＮＡ分子（１）と（２）の複合体分子、ＲＮＡ分子（１）と（２−ｉｉ）の複合体分子、ＲＮＡ分子（１−ｉｉ）と（２）の複合体分子、又はＲＮＡ分子（１−ｉｉ）と（２−ｉｉ）の複合体分子である。これらの複合体ＲＮＡ分子は、部位Ｂの結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（ｉ）、又は部位Ｂ相当部の結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（ｉｉ）の、好ましい例であるといえる。
【００４３】
本明細書において、特に断らない限り、ＲＮＡ分子（１）及び（２）についての説明（特に各部位の説明及び機能の説明）は、ＲＮＡ分子（１−ｉｉ）及び（２−ｉｉ）の説明として妥当する。
【００４４】
なお、本明細書において、ハイブリダイズは、好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイズをいう。ストリンジェントな条件とは、より具体的には例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。ただし、上記結合部位（β）におけるハイブリダイズは、２つの配列の配列同一性が少なくとも９０％以上であることから、通常はハイブリダイズするものであると考えられ、確認的に規定しているに過ぎない。
【００４５】
上記ＲＮＡ分子（ｉ）（ｉｉ）や、上述のＲＮＡ複合体分子は人工ＩＲＥＳを有するため、当該ＩＲＥＳの下流に遺伝子が存在している場合には、ＩＲＥＳを解して侵入したリボソームが当該遺伝子を発現させる。従って、本発明は、以下のＲＮＡ分子をも好ましく包含する。
【００４６】
（０−ｇ）：ＲＮＡ分子（ｉ）が、さらに部位Ｃの３’端側に、発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子であるときの、ＲＮＡ分子（ｉ）又は（ｉｉ）
（２−ｇ）ＲＮＡ分子（２）が、さらに部位Ｃの３’端側に、発現調整のための遺伝子配列を含むＲＮＡ分子であるときの、ＲＮＡ分子（２）又は（２−ｉｉ）
ただし（０−ｇ）において、ＲＮＡ分子（ｉｉ）における遺伝子配列に相当する部分の配列とＲＮＡ分子（ｉ）が含む遺伝子配列の同一性はできるだけ高いことが好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がさらに好ましく、１００％であることがよりさらに好ましい。特に、開始コードＡＵＧは変化していないことが好ましい。
【００４７】
また、同様に、（２−ｇ）において、ＲＮＡ分子（２−ｉｉ）における遺伝子配列に相当する部分の配列とＲＮＡ分子（２）が含む遺伝子配列の同一性はできるだけ高いことが好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がさらに好ましく、１００％であることがよりさらに好ましい。特に、開始コードＡＵＧは変化していないことが好ましい。
【００４８】
なお、部位Ｃの３’端側に遺伝子配列を含むということは、言い換えれば、ＲＮＡ分子（０−ｇ）のＩＲＥＳ、又はＲＮＡ分子（２−ｇ）を含んで構成されたＩＲＥＳの下流に、遺伝子配列を含むということである。
【００４９】
遺伝子配列は、特に制限されず、公知の遺伝子の配列を用いることができる。好ましくは、真核生物由来の遺伝子の配列であり、より好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ハムスター、マウス、ラット等）由来の遺伝子配列である。さらには、人工的に創造された遺伝子配列であってもよい。また、ここでの遺伝子配列としては、プロモーター等の配列も含み得るが、少なくとも開始コドン（ＡＵＧ）と終始コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、又はＵＧＡ）とを同じ読み枠（リーディングフレーム）内に有する配列であればよい。また、本発明に係るＲＮＡ分子を用いた翻訳調節を行う場合には、その翻訳が行われる系（細胞または無細胞系）の翻訳コドンの使用頻度を反映した配列であることが好ましい。つまり、遺伝子の読み枠の各コドンにおいて、その系で用いられる翻訳コドン使用頻度の高いものが多く使用されていることが好ましい。
【００５０】
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子が含まれる細胞も好ましく包含する。このような細胞は、特に制限されないが、真核生物由来の細胞であり、より好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ハムスター、マウス、ラット等）由来の細胞である。
【００５１】
さらにまた、本発明は、上記のＲＮＡ分子を発現するベクターをも包含する。このようなベクターとしては、上記のＲＮＡ分子を発現するＤＮＡ分子が組み込まれたベクターが好ましい。
【００５２】
また、上記人工ＩＲＥＳを有するＲＮＡ分子（複合体ＲＮＡ分子を含む）においては、特に結合構造部位の安定性がＩＲＥＳの３次元構造の安定性に影響するため、結合構造部位の安定性を調節することにより、遺伝子発現量を調節することができる。また、結合構造部位を安定化させることは、遺伝子発現をＯＮにし、結合構造部位を不安定化（特に結合の切断）させることは、遺伝子発現をＯＦＦにすることから、結合構造部位の安定性を調節することで、遺伝子発現のＯＮ・ＯＦＦの切り換えを行うことも可能となる。（すなわち、、上記人工ＩＲＥＳを有するＲＮＡ分子は、リボスイッチとして機能し得る。）
結合構造部位の安定性の調節は、結合構造が（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡである場合には、上述の通り、ステム構造の相補的割合を変化させることで、ステム構造の安定性を変化させ、結果として翻訳効率を変化させる（調節する）ことができる。相補的割合が高いほど安定性は高くなる。
【００５３】
またさらに、ステムループ構造をとる配列以外の配列を部分Ｂが含むことによっても、遺伝子発現量を調節することができる。例えば、部分Ｂが、ステムループ構造をとる配列及び当該配列の片方末端又は両末端にランダムな塩基配列が付加された配列を含むＲＮＡからなる場合、付加されたランダムな塩基配列長が長いほど、遺伝子発現量が低下する。これを利用して、付加するランダムな塩基配列長を調節することで、遺伝子発現量を調節することができる。
【００５４】
当該ランダムな塩基配列は、ステムループ構造をとる配列の５’端、３’端、又は両末端に付加されてよい。付加される合計塩基配列長が２〜１００塩基程度が好ましく、５〜５０塩基程度がより好ましく、１０〜３０塩基程度がさらに好ましい。また、５’端に付加される塩基長と３’端に付加される塩基長とは、できるだけ異ならないことが好ましく、これらの塩基長の異なりは０〜５０塩基程度がより好ましく、０〜２０塩基程度がさらに好ましく、０〜１０塩基程度がよりさらに好ましく、０〜５塩基程度がなかでも好ましく、０塩基（すなわち異ならない）が特に好ましい。
【００５５】
また、当該ランダムな塩基配列は、当該塩基配列内でステムループを形成しないことが好ましい。また、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれかの塩基がランダムに繋がった塩基配列であることが好ましく、特に制限はされないが、Ｕ及びＣのみで形成された塩基配列であることがより好ましい。
【００５６】
また、翻訳のＯＮを徐々にＯＦＦへ明確に切り換えたい場合には、当該ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ分子を系に加えれば、これらがハイブリダイズしてステムループ構造が崩れるために、ＩＲＥＳの３次元構造も崩れてしまい、リボソームが内部侵入できなくなり得る。これを利用して、当該アンチセンスＲＮＡ分子を系に導入する量を徐々に増やすことにより、徐々に部分Ｂの結合構造を不安定化させ、結果として翻訳量を徐々に低下させる（すなわち、徐々に翻訳ＯＦＦにする）ことができる。大過剰の当該アンチセンスＲＮＡ分子を系に導入することで、翻訳をほぼＯＦＦにすることもできる。
【００５７】
結合構造部位の安定性の調節は、結合構造が（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡである場合には、当該２本鎖ＲＮＡの相補的割合を変化させることで、ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡの安定性を変化させ、結果として翻訳効率を変化させる（調節する）ことができる。相補的割合が高いほど安定性は高くなる。
【００５８】
また、翻訳のＯＮを徐々にＯＦＦへと切り換えたい場合には、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち、いずれか１方又は両方のアンチセンスＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を系に導入することで、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡの１方又は両方と、これら導入アンチセンスＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子とが拮抗的にハイブリダイズすることにより、部分Ｂの結合構造を不安定化させることができる。これを利用して、当該アンチセンスＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を系に導入する量を徐々に増やすことにより、徐々に部分Ｂの結合構造を不安定化させ、結果として翻訳量を徐々に低下させる（すなわち、徐々に翻訳ＯＦＦにする）ことができる。大過剰の当該アンチセンスＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を系に導入することで、翻訳をほぼＯＦＦにすることもできる。
【００５９】
また、結合構造が（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡである場合には、上記ＲＮＡ分子（１）及び（２）を利用することで、翻訳をＯＦＦからＯＮへ切り換えることもできる。すなわち、系内に、上記ＲＮＡ分子（１）及び（２）のいずれか一方のみを含ませておき（このときは翻訳ＯＦＦ）、系内に含まれていないもう一方のＲＮＡ分子を系に加えることによって、部位ＢＡ及び部位ＢＣがハイブリダイズすることで、ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる結合構造を有する部位Ｂを含む人工ＩＲＥＳが形成され、その結果リボソームが内部侵入可能となり、翻訳が始まることとなる（すなわち、翻訳がＯＮになる）。系に後から加えるＲＮＡ分子量を徐々に増やすことにより、翻訳ＯＦＦ状態を徐々にＯＮへ切り換えることもできる。なお、ＲＮＡ分子（１）のかわりにＲＮＡ分子（１−ｉｉ）を、ＲＮＡ分子（２）の代わりにＲＮＡ分子（２−ｉｉ）を用いることもできる。
【００６０】
本明細書において、アンチセンスＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、目的のＲＮＡとハイブリダイズし得る範囲で相補的であればよく、特に制限はされないが、目的のＲＮＡ分子との相補的割合が９０％以上が好ましく、９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がさらに好ましく、１００％がよりさらに好ましい。
【００６１】
これら、翻訳を調節する系については、翻訳が起こりえる系であれば特に制限はされず、原核生物又は真核生物の細胞内や、人工細胞合成系などが例示される。中でも、真核生物の細胞内が好ましい。また、ＩＲＥＳを含む又は構成するＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子であることが好ましい。
【００６２】
例えば上述のようにして、翻訳を調節する方法、翻訳を開始させる方法、翻訳を抑制（又は停止）させる方法、を本発明は提供することができ、これらの方法も本発明に好ましく包含される。特に、上記各項に記載の方法が好ましく包含される。
【００６３】
また、本発明は、以下のＲＮＡ分子も好ましく包含する。
『人工内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）の一部を構成するＲＮＡ分子であって、
当該人工ＩＲＥＳは５’端から３’端の方向に順に、部位Ａ、部位Ｂ、及び部位Ｃからなり、
ここで、天然ＩＲＥＳ配列に含まれる内部リボソーム侵入に必須でない１部分配列を配列ｂとし、配列ｂより５’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ａ、３’端側に存在する内部リボソーム侵入のための配列を配列ｃとすると、
部位Ａは配列ａを含み、部位Ｃは配列ｃを含み、
部位Ｂは部位Ａと部位Ｃとを結合する結合構造を有し、当該結合構造は、配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡ分子、又はハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡ分子からなり、
当該結合構造が、（β）ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ａと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＡ、当該ハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡのうち部位Ｃと連続している一本鎖ＲＮＡを含む部位を部位ＢＣとし、ここで、部位Ｃ及び部位ＢＣを含み、且つ部位ＢＣを部位Ｃより５’末端側に含むＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子（２）とし、
当該結合構造が、（α）配列ｂとは異なる配列を有し且つステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡからなる場合において、当該ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ分子
の配列をアンチステムループ配列としたとき、
（１−ａ−ｉ）：アンチステムループ配列、部位Ａ、及び部位ＢＡを含む（好ましくは、且つ部位ＢＡを部位Ａより３’端側に、アンチステムループ配列を部位Ａより５’端側に、それぞれ含む）、ＲＮＡ分子であるか、又は
（１−ａ−ｉｉ）：ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）の配列と配列同一性が９０％以上のＲＮＡ配列からなり、かつ、アンチステムループ配列相当部が前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡとハイブリダイズし得、さらに、部位ＢＡ相当部と、ＲＮＡ分子（２）の部位ＢＣとがハイブリダイズしたときに、リボソームが内部侵入可能となる複合体ＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ分子。』
【００６４】
ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）は、ＲＮＡ分子（ｉ）における前記結合構造が（α）である場合の前記ステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡの、アンチセンスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子（１）の５’端側に付加した構造を有する、ＲＮＡ分子であるということもできる。
【００６５】
ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）及び（１−ａ−ｉｉ）は、特定の系において、特定の遺伝子の発現を開始させるとともに、それ以外の特定の遺伝子の発現を抑制することができる。言い換えれば、これらのＲＮＡ分子は、当該特定の系において、いわゆるデュアルスイッチとして用いることができる。
【００６６】
当該特定の系とは、結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）、及びＲＮＡ分子（２−ｇ）が存在する系である。これらのＲＮＡ分子が同一系内に存在する場合、当該系にＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）又は（１−ａ−ｉｉ）を加えると、結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）が含む遺伝子は翻訳が抑制（好ましくは停止）され、ＲＮＡ分子（２−ｇ）が含む遺伝子は翻訳が開始される。より詳細には、ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）又は（１−ａ−ｉｉ）にはアンチステムループ配列が含まれており、このために、結合構造が（β）であるＲＮＡ分子（０−ｇ）のステムループ構造を有する１本鎖ＲＮＡが当該アンチステムループ配列部分とハイブリダイズして当該ステムループ構造が崩れてしまい、よってＩＲＥＳの３次元構造も崩れてしまい、リボソームが内部侵入できなくなり得る。また、ＲＮＡ分子（１−ａ−ｉ）又は（１−ａ−ｉｉ）には部位ＢＡ又は部位ＢＡ相当部が含まれるため、ＲＮＡ分子（２−ｇ）の部位ＢＣ又は部位ＢＣ相当部とハイブリダイズし、ＩＲＥＳが構成されるため、リボソームが内部侵入できるようになり得る。
【００６７】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００６８】
以下、例を挙げて更に具体的に本発明を説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
＜使用機器＞
細胞イメージは、ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＭＣＣＤ  Ｃ＿９１００  １３  ｃａｍｅｒａ  （５１２  ｘ  ５１２  ｐｉｘｅｌｓ）とＯｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＳＡｐｏ６０ｘＯ  ６０Ｘ  １．３５  ＮＡ  ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（油浸対物レンズ）を備えたＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒＴＭ  ＣＶ１０００  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｂｏｘ  （横河電機株式会社）を用いて得た。
【００６９】
Ｄｓ−Ｒｅｄ蛍光シグナルは、次の励起波長及び蛍光フィルターを用いて検出した。励起波長：  ５６１  ｎｍ、蛍光フィルター：ＢＰ６１７／７３  ｎｍ。得られた画像は、ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒＴＭ  ＣＶ１０００  測定ソフトウェア及びＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪを用いて解析し、最大値投影処理（ｍａｘｉｍｕｍ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ：ＭＩＰ）を施した。
【００７０】
＜使用材料＞
実験細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。ＨＥＫ２９３細胞は、１００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩、及びＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｅｓｔ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で維持（培養）した。
【００７１】
レポーター遺伝子発現プラスミド等のベクターの細胞へのトランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、標準プロトコールに従って行った。Ｄｓ−Ｒｅｄは、ｐＣＭＶ  ３ｔａｇ９  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）にクローン化されているものを用いた。
【００７２】
また、Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）（配列番号１）において、７つのステムループ構造の配列（ＳＬ配列１〜７）のうち、ＳＬ配列３〜７の範囲の配列の５’端に配列ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＣを付加した配列をネイティブＩＲＥＳとして用いた。（ＳＬ配列１及び２がＰＳＩＶ−ＩＲＥＳの機能に影響しないことが知られているため（非特許文献３）、ＳＬ配列１及び２をネイティブＩＲＥＳ配列に含めなかった。）なお、当該付加配列には、５’側から順に、ベクタークローニングサイト、Ｔ７プロモーター、ヘアピンステム構造形成領域、が含まれている。当該ヘアピンステム構造形成領域は、発現漏れの抑制（つまり、プロモーター等の存在のためにＩＲＥＳ三次元構造が構成されない場合においてリボソームが侵入して翻訳が始まってしまうことを抑制）するために含まれている。
【００７３】
＜使用ＲＮＡ分子の準備＞
ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ＦＬ）の２本鎖ＤＮＡは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２  （Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターをテンプレートとして用い、ＰＣＲを行って増幅した。当該ＰＣＲに用いたｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  −３’］であり、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ−３’］である。
【００７４】
ネイティブＩＲＥＳ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ、及び不安定ステムルループ構造を有するＩＲＥＳの２本鎖ＤＮＡを調製するため、合成オリゴヌクレオチドをデザインした（下記表２及び図１４参照）。それぞれの相補ペアオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そしてオーバーラップエクステンションＰＣＲのテンプレートとして使用した。当該ＰＣＲでは、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして［５’−  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧ  −３’］を、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして［５’−  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  Ｃ  −３’］を用いた。当該ＰＣＲ産物を、ｐＵＣ１９（プラスミドベクター）のＢａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩサイトにサブクローンした。
【００７５】
なお、表２及び図１４において、Ｓ３ｓｔｅｍＦ、Ｓ３ｓｔｅｍＲは安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳの２本鎖ＤＮＡ調製のため用いた合成オリゴヌクレオチドであり、Ｓ３ｌｏｏｐＦ、Ｓ３ｌｏｏｐＲは不安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳの２本鎖ＤＮＡ調製のため用いた合成オリゴヌクレオチドである。 
【００７６】
【表２】
2017209030.tif 000003
各ＩＲＥＳ（ネイティブＩＲＥＳ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ、又は不安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ）及び３’−ＩＲＥＳユニットとホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）遺伝子との結合は、次のようにして行った。
【００７７】
まず、各ＩＲＥＳ及び３’−ＩＲＥＳユニットを、次に示すテンプレート及びプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００７８】
各ＩＲＥＳ：
テンプレートは上記で得られた、各ＩＲＥＳのｐＵＣ１９コンストラクト、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧ  −３’］、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣ  −３’］。
【００７９】
３’−ＩＲＥＳユニット（再構成タグ付き）
テンプレートは上記で得られた安定ステムループ構造ＩＲＥＳのｐＵＣ１９コンストラクト、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  Ｃ  −３’］、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣ  −３’］。
【００８０】
３’−ＩＲＥＳユニット（再構成タグ無し）
テンプレートは上記で得られた安定ステムループ構造ＩＲＥＳのｐＵＣ１９コンストラクト、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  Ｃ  −３’］、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣ  −３’］。（再構成タグ付きの場合と、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒのみ異なる）
【００８１】
そして、得られた各ＩＲＥＳ又は各３’−ＩＲＥＳユニットのＰＣＲ産物と、ＦＬとを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにて結合した。当該ＰＣＲでは、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして［５’−  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧ  −３’］を、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして［５’−  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  −３’］を用いた。
【００８２】
また、５’−ＩＲＥＳユニットは、次に示すテンプレート及びプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００８３】
５’−ＩＲＥＳユニット（再構成タグ付き）
テンプレートは上記で得られた安定ステムループ構造ＩＲＥＳのｐＵＣ１９コンストラクト、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧ  −３’］、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  Ｃ  −３’］。
【００８４】
５’−ＩＲＥＳユニット（再構成タグ無し）
テンプレートは上記で得られた安定ステムループ構造ＩＲＥＳのｐＵＣ１９コンストラクト、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧ  −３’］、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  Ｃ  −３’］。（再構成タグ付きの場合と、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒのみ異なる）
【００８５】
得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動にて分離し、ゲル濾過により精製した。当該ＰＣＲ産物を２本鎖ＤＮＡテンプレートとし、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写し、そしてＮＡＰ−５カラムを用いて未反応ＮＴＰｓを除去した。ネイティブＩＲＥＳ−ＦＬ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、不安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、又は３’−ＩＲＥＳユニット（再構成タグ付き若しくはタグ無し）−ＦＬを、ｍＲＮＡテンプレート（１μｇ）として、２０  μＬ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ミックス（ＲＴＳ  １００  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  Ｋｉｔ，  ５  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）中で用いた。当該ミックスにおいては、５’−ＩＲＥＳユニットを添加又は無添加とした。翻訳は２４℃で１時間反応させることで行った。ルシフェラーゼ活性は、  無細胞系タンパク質発現系にて評価した。具体的には、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び、ＡＢ−２２７０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＡＴＴＯ）を用いて評価した。
【００８６】
なお、５’−ＩＲＥＳユニット及び３’−ＩＲＥＳユニットは、次のように説明できる。すなわち、ネイティブＩＲＥＳに存在する配列「ＵＵＡＧＡ」のうち真ん中のＡを欠失させてＰＳＩＶ−ＩＲＥＳを切断した時の、５’のユニットが５’−ＩＲＥＳユニット、３’側のユニットが３’−ＩＲＥＳユニットである。
【００８７】
また、５’−ＩＲＥＳユニットの３’端（「ＵＵ−３’」）にＲＮＡ配列ｂａを付加した構造を有するＲＮＡ分子が再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットであり、３’−ＩＲＥＳユニットの５’端（「５’−ＧＡ」）にＲＮＡ配列ｂｃを付加した構造を有するＲＮＡ分子が再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニットである。ここで、配列ｂａと配列ｂｃは相補的（相補的割合は１００％）である。なお、配列ｂａと配列ｂｃは、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳのステム構造部分の２本鎖と同じ配列であり、配列ｂａは「ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＴ」である。
【００８８】
＜哺乳動物細胞におけるタンパク質合成の誘導＞
Ｄｓ−Ｒｅｄの２本鎖ＤＮＡは、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）をテンプレートとして用いてＰＣＲにより増幅した。当該ＰＣＲに用いたｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  Ｇ  −３’］であり、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ［５’−  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＴ−３’］である。３’−ＩＲＥＳの２本鎖ＤＮＡは、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳがサブクローンされたｐＵＣ１９−コンストラクトをテンプレートとして用いてＰＣＲにより増幅した。当該ＰＣＲに用いたｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＴＡＣ−３’］であり、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ［５’−  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣ−３’］である。３’−ＩＲＥＳユニットのＰＣＲ産物とＤｓ−Ｒｅｄ遺伝子とは、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより結合した。当該ＰＣＲに用いたｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＴＡＣ−３’］であり、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＴ−３’］である。得られたＰＣＲ産物はｐＣＭＶ  ３ｔａｇ９ベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）にクローン化した。
【００８９】
５’−ＩＲＥＳユニットの２本鎖ＤＮＡは、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳがサブクローンされたｐＵＣ１９−コンストラクトをテンプレートとして用いてＰＣＲにより増幅した。当該ＰＣＲに用いたｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは［５’−  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣ−３’］であり、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ［５’−  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＴＡＣ−３’］である。得られたＰＣＲ産物をｐＳｕｐｅｒ／ｎｅｏベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）へサブクローンした。
【００９０】
Ｄｓ−Ｒｅｄの発現は、３’−ＩＲＥＳユニット−Ｄｓ−ＲｅｄをクローニングしたｐＣＭＶコンストラクト、及び、５’−ＩＲＥＳユニットをクローニングしたｐＳｕｐｅｒ／ｎｅｏベクターを、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、コトランスフェクトすることで行った。
【００９１】
＜ＩＲＥＳ経由の翻訳効率の検討（ＩＲＥＳへのステムループ構造の導入の影響）＞
ネイティブＩＲＥＳ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ、及び不安定ステムルループ構造を有するＩＲＥＳの翻訳効率を調べた。具体的には、ネイティブＩＲＥＳユニット−ＦＬ、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬ、及び不安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬのｍＲＮＡをそれぞれｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ミックスのテンプレートとして用い、ルシフェラーゼ活性を評価した。これらの３種のｍＲＮＡの模式図を図１に示す。また、安定ステムループ構造及び不安定ステムループ構造を具体的に図２に示す。ルシフェラーゼ活性評価結果を図３に示す。
【００９２】
また、安定ステムループ構造の両端に塩基を３塩基ずつ又は９塩基ずつ付加した構造を有するステムループ構造（「安定ステムループ＋３」及び「安定ステムループ＋９」と呼ぶことがある）を有するＩＲＥＳについても、同様にして、翻訳効率を調べた。安定ステムループ＋３、及び安定ステムループ＋９の具体的な構造を図４に示す。ルシフェラーゼ活性評価結果を図５に示す。
【００９３】
これらの結果から、安定ステムループ構造を導入しても、ネイティブＩＲＥＳと同等のタンパク質翻訳開始活性を示すこと、及びステムループ構造を不安定にすること、あるいは安定ステムループ構造の両端に余分な塩基を付加すること、でタンパク質翻訳開始活性を低下させることができること、がわかった。
【００９４】
＜ＩＲＥＳ経由の翻訳効率の検討（２本鎖ＲＮＡハイブリダイズによるＩＲＥＳの構築の影響）＞
５’−ＩＲＥＳユニット及び３’−ＩＲＥＳユニットを用いて、ＩＲＥＳを再構築し、リボソームの内部侵入が起こせるかを検討した。
【００９５】
具体的には、（ａ）ネイティブＩＲＥＳユニット−ＦＬ、（ｂ）５’−ＩＲＥＳユニット及び再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬ、（ｃ）再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニット及び３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬ、（ｄ）再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニット及び再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬ、のＲＮＡを用いて、無細胞系タンパク質発現系においてルシフェラーゼ活性を測定することによりタンパク質翻訳能を評価した。（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの検討において、リボソームが内部侵入してホタルルシフェラーゼ遺伝子を翻訳できるかどうかを模式化した図を図６に示す。ルシフェラーゼ活性評価結果を図７に示す。
【００９６】
これらの結果から、再構成タグを欠くＩＲＥＳユニットの組み合わせ（（ｂ）及び（ｃ））では、ＩＲＥＳ再構成ができず、遺伝子翻訳が起こらないのに対して、再構成タグ付を有するＩＲＥＳユニットの組み合わせ（ｄ）では、ネイティブＩＲＥＳとほぼ同等の翻訳開始活性を示すことがわかった。
【００９７】
なお、このタンパク質翻訳制御比（ＯＮ／ＯＦＦ比）は、これまでに報告されている人工リボスイッチのものと比べても最高レベルを示しており、また、再構成タグの有無によりタンパク質翻訳の開始が厳密に制御できていることから、従来よりはるかに優れた人工リボスイッチが得られたといえる。
【００９８】
さらに、当該人工リボスイッチは、ＩＲＥＳの再構成によりｍＲＮＡ内部からのタンパク質発現を制御できる。このことを確認するために、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ミックス（ＲＴＳ  １００  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  Ｋｉｔ，  ５  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）に、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡの翻訳終始コドンの後ろに再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−ＦＬを結合したｍＲＮＡを加え、さらに、同時に再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットも加えた場合と加えなかった場合とにおいて、ホタルルシフェラーゼ活性を評価し比較した。当該検討において、同時に再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットもトランスフェクションした場合に、リボソームが内部侵入してホタルルシフェラーゼ遺伝子を翻訳できることを模式化した図を図８に示す。ルシフェラーゼ活性評価結果を図９に示す。
【００９９】
当該結果から、当該人工リボスイッチは、ＩＲＥＳの再構成によりｍＲＮＡ内部からのタンパク質発現を制御できること、特に目的遺伝子の発現を２００倍以上のＯＮ／ＯＦＦ比で制御できること、が確認できた。
【０１００】
またさらに、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−Ｄｓ−ＲｅｄをクローニングしたｐＣＭＶコンストラクト、及び、再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットをクローニングしたｐＳｕｐｅｒ／ｎｅｏベクターを、それぞれ作製し、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にこれらをコトランスフェクト（同時形質導入）し、レポーター遺伝子として利用した赤色蛍光タンパク質Ｄｓ−Ｒｅｄの発現を蛍光観察することによりタンパク質の発現誘導を評価した。その結果、コトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞ではＤｓ−Ｒｅｄの発現を示す強い赤色蛍光が観察された（図１０（ｂ））一方で、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニット−Ｄｓ−ＲｅｄをクローニングしたｐＣＭＶコンストラクトのみを導入した細胞では、バックグラウンドレベルの弱い蛍光しか観察されなかった（図１０（ａ））。この結果は，ヒトＨＥＫ２９３細胞内で分割型ＩＲＥＳリボスイッチがタンパク質の発現を翻訳レベルで制御したことを強く示唆する。
【０１０１】
＜ＩＲＥＳ経由の翻訳効率の検討（アンチセンスＲＮＡによるＩＲＥＳの分割の影響）＞
結合部位にステムループ構造を有するＩＲＥＳ、及び当該ステムループ構造を構成する配列と相補的な配列を有するヌクレオチド（例えばアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いることで、タンパク質発現を抑制する（好ましくは停止：ＯＦＦにする）ことができるかを検討した。
【０１０２】
具体的には、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳ−ＦＬをｍＲＮＡテンプレート（１μｇ）として、２０  μＬ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ミックス（ＲＴＳ  １００  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  Ｋｉｔ，  ５  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）中に加え、さらにこれに当該安定ステムループ構造を構成する配列のアンチセンスＲＮＡ分子０．１μｇを加えたミックスと加えないミックスを調製し、２４℃で１時間反応させた後のルシフェラーゼ活性を評価した。図１１（ａ）に当該検討の概要を示す。また、図１１に、当該検討における安定ステムループ構造及びそのアンチセンスＲＮＡを示す。結果を図１１（ｃ）に示す。当該結果から、結合部位にステムループ構造を有するＩＲＥＳは、当該ステムループを構成する部分と相補的な配列を有するヌクレオチドが存在することで、その翻訳開始活性が約１／１０に抑制されることがわかった。
【０１０３】
＜一つの誘導シグナルでＯＮとＯＦＦを同時に駆動するＤｕａｌスイッチの検討＞
再構成タグ付き５’−ＩＲＥＳユニットと上記の安定ステムループを構成する部分と相補的な配列を有するヌクレオチド（好ましくはアンチセンスＲＮＡ）を結合した構造を有する分子（好ましくはＲＮＡ分子）は、特定の系において、Ｄｕａｌスイッチとして働き得る。
【０１０４】
つまり、当該分子は、結合構造として安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳと、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニットを含む系においては、前者による遺伝子の翻訳をＯＮからＯＦＦへ、後者による翻訳をＯＦＦからＯＮへ、同時に切り換えることができるＤｕａｌスイッチとして働き得る。
【０１０５】
当該Ｄｕａｌスイッチ分子の概要を図１２（ａ）に示す。また、当該Ｄｕａｌスイッチが、安定ステムループ構造を有するＩＲＥＳの下流に存在する遺伝子の発現をＯＮからＯＦＦにし、かつ、再構成タグ付き３’−ＩＲＥＳユニットの下流に存在する遺伝子の発現をＯＦＦからＯＮにすることを表した概要図を、図１２（ｂ）に示す。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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