(57)【要約】      （修正有）【課題】人体に安全な、新規なアミノペプチダーゼの提供。【解決手段】以下の（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）のポリペプチド。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（Ｂ）特定のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；（Ｃ）特定のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド：以下の（１）〜（７）の理化学的性質を有するポリペプチド。（１）作用：アミノペプチダーゼ活性を有する、（２）至適反応ｐＨ：５．２〜６．５、（３）安定ｐＨ：５．２〜５．６、（４）至適反応温度：５２〜６１℃、（５）温度安定性：５〜４７℃、（６）分子量：約５０ｋＤａ、（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（１）〜（７）の理化学的性質：
（１）作用：アミノペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．２〜６．５
（３）安定ｐＨ：５．２〜５．６
（４）至適反応温度：５２〜６１℃
（５）温度安定性：５〜４７℃
（６）分子量：約５０ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
を有するポリペプチド。
【請求項３】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程、および培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノペプチダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質の構成成分として知られているが、アミノ酸単体またはオリゴペプチドとしても、疾病の予防・治療や、食品の品質改良や味の改善に用いられる。これらのアミノ酸やオリゴペプチドは、微生物や植物、動物等に由来するタンパク質を分解することにより製造される。
【０００３】
アミノペプチダーゼは、ポリぺプチド鎖のアミノ基末端から１個〜数個のアミノ酸単位でペプチド結合を切断する活性を有している。切断されたアミノ酸や生成するオリゴペプチドは医薬品や食品として用いられることから、その製造に使用するアミノペプチダーゼも、医薬品や食品と同等の人体に対する安全性が求められる。
【０００４】
従来、ストレプトマイセス  サーモニトリフィカンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来（特許文献１）、ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）由来（非特許文献１）のアミノペプチダーゼが知られている。しかし、これらの微生物自体の人体への安全性が不明であり、これらの微生物に由来するアミノペプチダーゼも医薬品や食品に適用するためには十分に安全とはいえない。
【０００５】
また、ストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来のアミノペプチダーゼが知られている（特許文献２）。しかし、至適反応ｐＨが７．５〜１０．５と塩基性に偏っており、酸性条件でタンパク質からアミノ酸やオリゴペプチドを生産することには適さない。非特許文献２には、ストレプトマイセス属細菌を培養してペプチダーゼを生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１４７９７９号公報
【特許文献２】特開２００５−２１８３１９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００７）７４：３４７−３５６
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００８；６２：２４４-２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
人体に安全な、新規なアミノペプチダーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、検討の結果、人体への安全性が確立している微生物から新規なアミノペプチダーゼを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
に関する。
【００１１】
また、本発明は、下記（１）〜（７）の理化学的性質：
（１）作用：アミノペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．２〜６．５
（３）安定ｐＨ：５．２〜５．６
（４）至適反応温度：５２〜６１℃
（５）温度安定性：５〜４７℃
（６）分子量：約５０ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来することが好ましい。
【００１３】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
に関する。
【００１５】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
【００１６】
また、本発明は、前記ベクターを含む形質転換体に関する。
【００１７】
また、本発明は、前記形質転換体を培養する工程、および培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアミノペプチダーゼは人体に無害である。さらに、酸性条件でも高い活性を維持し、タンパク質からアミノ酸やオリゴペプチドの生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１の結果を示す。
【図２】実施例２の結果を示す。
【図３】実施例３の結果（作用温度）を示す。
【図４】実施例３の結果（温度安定性）を示す。
【図５】実施例４の結果（作用ｐＨ）を示す。
【図６】実施例４の結果（ｐＨ安定性）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のポリペプチドは、下記（１）〜（７）の理化学的性質を有する。
（１）作用：アミノペプチダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．２〜６．５
（３）安定ｐＨ：５．２〜５．６
（４）至適反応温度：５２〜６１℃
（５）温度安定性：５〜４７℃
（６）分子量：約５０ｋＤａ
（７）阻害剤：金属キレーターにより阻害され、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない
を有するポリペプチド。
【００２１】
以下に、理化学的性質を個別に説明する。
（１）作用
アミノペプチダーゼ活性は、Ｌ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを基質として、４０℃の条件で１分間当たり１μｍｏｌのパラ−ニトロアニリンを生成する活性をいう。
【００２２】
（２）至適反応ｐＨ
至適反応ｐＨはｐＨ５．２〜６．５である。至適反応ｐＨは、Ｌ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを基質として、ｐＨ５．５で反応させた場合と比較して９０％の活性を維持するｐＨをいう。
【００２３】
（３）安定ｐＨ
安定ｐＨはｐＨ５．２〜５．６である。安定ｐＨでは、ポリペプチドを一定のｐＨで１６時間置いた後でも、元の活性の９０％以上が保たれる。
【００２４】
（４）至適反応温度
至適反応温度は５２〜６１℃である。至適反応温度は、Ｌ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを基質として、５６℃で反応させた場合と比較して９０％の活性を維持する温度をいう。
【００２５】
（５）温度安定性
温度安定性は５〜４７℃である。温度安定性とは、ポリペプチドを一定の温度で３０分置いた後でも、保温前の活性の９０％以上が保たれる温度をいう。
【００２６】
（６）分子量
本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約５０ｋＤａの分子量を示す。
【００２７】
（７）阻害剤
本発明のポリペプチドは、ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリンなどの金属キレーターにより阻害され、ＰＭＳＦ、ベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）などのセリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されない。また、本発明のポリペプチドはニッケル、カドミウム、コバルト、マグネシウム、マンガン、亜鉛、カルシウム、鉄などの金属によってもほとんど阻害されない。ここで、阻害の有無は、試験物質の存在下でＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを基質としてアミノ酸分解反応を行った場合のアミノペプチダーゼ活性が、試験物質が存在しない場合のアミノペプチダーゼ活性と比較して５０％以下である場合に阻害されていると判断し、これを超える場合に阻害されないと判断する。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、アミノペプチダーゼ活性を有する微生物などの生物から単離できる。本発明のポリペプチドの由来生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等が挙げられ、中でもストレプトマイセス属が好ましい。本発明のポリペプチドの由来生物としてはストレプトマイセス  シンナモネース（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）がより好ましく、ストレプトマイセス  シンナモネース  ＴＨ−２株が最も好ましい。ストレプトマイセス  シンナモネース  ＴＨ−２株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）において、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９の寄託番号で寄託されており、当該機関より入手可能である。
【００２９】
また、本発明のポリペプチドは、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００３０】
本発明のポリペプチドと、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、評価対象のアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を総アミノ酸数で除して１００を乗じた値で表される。なお、ストレプトマイセス  コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）は、配列番号１に示すアミノ酸配列と６１．１３％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、当該ポリペプチドがアミノペプチダーゼ活性を有するかどうか不明である。
【００３１】
欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列の個数は、７１個以下であることが好ましく、４７個以下であることがより好ましく、２３個以下であることがさらに好ましく、９個以下であることがさらにより好ましい。特に好ましくは５個、４個、３個、または２個以下である。
【００３２】
また、本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００３３】
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法により行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄して得られるＤＮＡをあげることができる。６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることが好ましく、６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがより好ましく、６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがさらに好ましい。
【００３５】
本発明のＤＮＡと、配列番号２に示す塩基配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。なお、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス  サブエスピー  ジンガンゲウシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｊｉｎｇｇａｎｇｅｕｓｉｓ）のゲノムには配列番号２に示す塩基配列と７１．０１％の配列同一性を有する塩基配列が存在するが、当該塩基配列がアミノペプチダーゼ活性を有するかどうか不明である。
【００３６】
塩基配列の配列同一性は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と評価したい塩基配列とを比較し、両方の配列で塩基が一致した位置の数を比較総塩基数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００３７】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の遺伝子改変方法に準じて調製することができる。
【００３８】
欠失、挿入、置換および／または付加される塩基の数は、２１４個以下であることが好ましく、１４２個以下であることがより好ましく、７１個以下であることがさらに好ましく、２８個以下であることがさらにより好ましく、特に好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下である。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより、ポリペプチドを発現するベクターを作製できる。また、このベクターで宿主生物を形質転換することにより形質転換体を作製でき、この形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００４０】
ベクターは宿主生物内でポリペプチドを発現できるものであればよく、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。
【００４１】
宿主は前記ベクターにより形質転換され、ポリペプチドを発現することができる生物であればよい。宿主としては、ストレプトマイセス属、エッシェリヒア属、バシラス属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属等が挙げられる。中でもストレプトマイセス属が好ましく、ストレプトマイセス  シンナモネース、ストレプトマイセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）がより好ましい。具体的には、ストレプトマイセス  リビダンス１３２６株が挙げられる。ストレプトマイセス  リビダンス１３２６株は、別名がストレプトマイセス  ビオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）１３２６株であり、その培養物や精製物を食品に使用した場合の安全性が確認されている。
【００４２】
また、本発明は、細胞を培養する工程、および、培養物からポリペプチドを精製する工程を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。細胞は、本発明のポリペプチドを本来発現する細胞であってもよく、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。培養物としては、細胞若しくは菌体の破砕物、培養上清、培養細胞、培養菌体が挙げられる。
【００４３】
細胞培養のための培地は、細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００４４】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、細胞が増殖し、ポリペプチドを産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、２５〜３５℃、好ましくは２７℃〜３０℃で２４〜９６時間行われる。ｐＨは、３．０〜９．０、好ましくは５．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．０〜７．０に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。
【００４５】
タンパク質が宿主菌体内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。発現したタンパク質が細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製することができる。
【００４６】
本発明のポリペプチドによりタンパク質を分解してアミノ酸やオリゴペプチドを生産することができる。タンパク質としては、カゼイン、コラーゲン、ダイズタンパク等が挙げられる。  本発明のポリペプチドを使用して生産されるアミノ酸としては、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジンなどが挙げられる。また、本発明のポリペプチドを使用して生産されるオリゴペプチドとしては、Ｎ末端のアミノ酸がリジン、ロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジンなどでないオリゴペプチドが挙げられる。
【００４７】
タンパク質の分解は、例えば、４０℃、ｐＨ７．５の条件により行うことができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドを使用して生産されるアミノ酸およびオリゴペプチドは、疾病の予防・治療や、食品の品質改良や味の改善に用いられる。予防・治療対象の疾病としては、例えば、高血圧、糖尿病が挙げられる。食品の品質改良としては、例えば、苦味分解、旨味増強が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）アミノペプチダーゼの精製、および分子量の検討
配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを放線菌用の発現ベクター（非特許文献２に記載のｐＴＯＮＡ５ａ）に挿入し、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株を宿主として、非特許文献２に記載の方法で培養し、アミノペプチダーゼを菌体外に分泌発現させた。この培養上清を、簡易ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア社製、ＰＤ−１０カラム）に供し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むアミノペプチダーゼを精製した。
【００５０】
精製したアミノペプチダーゼの分子量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検討した。アミノペプチダーゼ５μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをジェルコード（ライフテクノロジーズ社製）により染色した。結果を図１に示す。約５０ｋＤａの付近にアミノペプチダーゼに由来するバンドが確認された。
【００５１】
（実施例２）基質特異性の検討
基質として以下のペプチド：
Ｌ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｇｌｙ−ｐＮＡ、Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ、Ｌ−Ａｌａ−ｐＮＡ、Ｄ−Ａｌａ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｇｌｕ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｖａｌ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｈｉｓ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｉｌｅ−ｐＮＡ、Ｌ−Ａｓｐ−ｐＮＡ
を使用した場合のアミノペプチダーゼの活性を測定した。
【００５２】
アミノペプチダーゼの活性測定用反応液の組成を表１に示す。
【表１】
2017000108.tif 000002
【００５３】
基質としては、アミノ酸のｐ−ニトロアニリド派生物を使用した。アミノペプチダーゼ酵素液として、ゲルろ過カラムＰＤ−１０で濾過した培養上清液を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
【００５４】
反応は４０℃で３０分行った。次に反応液を９５℃で５分加熱し、酵素を失活させた。その後、生成物であるｐ−ニトロアニリドの遊離に伴う４０５ｎｍの吸光度を測定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分間あたり１μｍｏＬのｐ−ニトロアニリドを遊離させる酵素量として定義した。結果を図２に示す。
【００５５】
（実施例３）作用温度および温度安定性の検討
アミノペプチダーゼによる加水分解反応を２５〜６５℃で行った際の活性を測定した。基質としてＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを使用し、加水分解反応を２５〜６５℃で行った以外は、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定し、５６℃で測定した活性に対する相対活性を算出した。結果を図３に示す。
【００５６】
また、アミノペプチダーゼをＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で４０〜６０℃で３０分保持した後の活性を測定した。基質としてＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを使用し、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定し、５℃で３０分保持した活性に対する相対活性を算出した。結果を図４に示す。
【００５７】
（実施例４）作用ｐＨおよびｐＨ安定性の検討
反応時のｐＨを変動させた際のアミノペプチダーゼの活性を測定した。基質としてＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを使用し、反応緩衝液を変更した以外は、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定した。反応緩衝液として、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７〜６．１）、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜７．５）を使用した。測定結果から、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対する相対活性を算出した。結果を図５に示す。
【００５８】
また、アミノペプチダーゼをｐＨ４．７〜７．５の条件で１６時間保持した後の活性を測定した。基質としてＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを使用し、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定した。測定結果から、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対する相対活性を算出した。結果を図６に示す。
【００５９】
（実施例５）金属塩の影響の検討
アミノペプチダーゼ活性に対する金属塩の影響を測定した。基質としてＬ−アルギニン−パラ−ニトロアニリドを使用し、表２に記載の金属塩を１ｍＭの濃度で添加した以外は、実施例２に記載の反応液および反応条件により測定した。金属塩を添加しない場合の活性を１００％として、各金属塩を添加した場合の相対活性を算出した。結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【配列表】
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