(57)【要約】      （修正有）【解決手段】培養中の細胞の培養状態を検査するための細胞の培養状態検査方法であって、細胞を培養中の培地１に波長が異なる複数の励起光Ｌ１を照射して、それぞれの励起波長毎に培地から発する蛍光Ｌ２を受光し、受光した蛍光における複数の蛍光波長毎の蛍光強度を計測して、この蛍光強度の値を励起波長と蛍光波長とに相関させた計測励起蛍光マトリクスデータを得て、予め一定の条件を満たすように作成した１種以上の基準励起蛍光マトリクスデータを用意し、これと得られた計測励起蛍光マトリクスデータとを比較する、培養中の細胞の培養状態を分析する方法。前記培地として、細胞培養後の使用済み培地を用いることが望ましい。【効果】簡便に細胞の培養状態を検査することができ、特に使用済み培地を用いれば、正常に培養された細胞を無駄にすることがない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中の細胞の培養状態を検査するための細胞の培養状態検査方法であって、
細胞を培養中の培地に波長が異なる複数の励起光を照射して、それぞれの励起波長毎に培地から発する蛍光を受光し、受光した蛍光における複数の蛍光波長毎の蛍光強度を計測して、この蛍光強度の値を励起波長と蛍光波長とに相関させた計測励起蛍光マトリクスデータとし、該計測励起蛍光マトリクスデータと予め作成した１種以上の基準励起蛍光マトリクスデータとを比較して、上記培養中の細胞の培養状態を評価することを特徴とする細胞の培養状態検査方法。
【請求項２】
上記培地は、培地交換時や継代培養時の使用済み培地であって、細胞が除去された培地であることを特徴とする請求項１に記載の細胞の培養状態検査方法。
【請求項３】
上記基準励起蛍光マトリクスデータは、細胞が正常に培養された際の培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞の培養状態検査方法。
【請求項４】
上記基準励起蛍光マトリクスデータは、所定量の細胞栄養成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータであることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞の培養状態検査方法。
【請求項５】
上記基準励起蛍光マトリクスデータは、所定量の細胞産生成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞の培養状態検査方法。
【請求項６】
上記基準励起蛍光マトリクスデータは、所定量の汚染成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞の培養状態検査方法。
【請求項７】
上記複数の励起波長が、２００ｎｍから５００ｎｍの範囲から選択されることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞の培養状態検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は培養中の細胞の培養状態を検査するための培養状態検査方法に関し、より詳しくは、直接細胞に試薬を作用させることなく、簡便に細胞の培養状態を評価することができるようにした細胞の培養状態検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において組織や臓器を再生するために、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞を培養して目的の組織や臓器となる細胞に分化させている。細胞は分化した後よりも幹細胞の状態の方が活発に増殖するため、分化した後で培養状態の不適が判明すると多くの細胞と培養に要した作業とが無駄になる。したがって効率的に培養を行うためには、培養状態を把握して培養の有効性を判断することが望ましい。
従来、培養状態の検査方法として、細胞に試薬（蛍光色素）を作用させて特定波長の光（励起光）を照射し、試薬が作用した細胞から発する蛍光を受光して培養状態を判断することが行われている（特許文献１）。
また細胞に試薬を作用することなく非侵襲で細胞を検査できるようにしたものも知られている（特許文献２）。この検査方法は、５３０ｎｍの波長の励起光を細胞に照射し、細胞から発せられる自家蛍光を検出し、蛍光強度により培養状態を判断するものである。上記励起光の波長は、細胞に損傷を与える紫外領域及び赤外領域を除いて選択されており、５３０ｎｍの波長において主に細胞の生死状態の判別を行っている。
ところで従来、食品の成分、例えばパン生地のグルテンの分布を分析するために、励起蛍光マトリクスデータ（蛍光指紋）を利用し、得られた励起蛍光マトリクスデータを例えば主成分分析により解析し、主成分分析の結果である主成分得点プロットにおいて成分軸を抽出し、成分軸に色軸を対応させることによって、パン生地中のグルテン分布を可視化することが行われている（特許文献３）。
上記励起蛍光マトリクスデータを利用して成分を判別する際には、試料としてのパン生地に対して励起波長を段階的に変化させながら励起光を照射し、受光した自家蛍光の励起波長毎の蛍光波長および蛍光強度を計測する。そしてこれにより得られた計測励起蛍光マトリクスデータを解析することで、成分軸上でグルテンを判別するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５１００３６１号公報
【特許文献２】特許第４８６８８７９号公報
【特許文献３】特許第５３１１６５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の検査方法においては細胞に直接試薬を作用させるための作業が必要となり、その操作が煩雑となるという欠点がある。また仮に当該細胞が良好な細胞であったことが判明しても、細胞に直接試薬を作用させているためそれ以後の工程において当該細胞を用いることができない。
また特許文献２に記載の検査方法においては、細胞に損傷を与える紫外領域及び赤外領域を除いて選択された５３０ｎｍの波長を用いているが、細胞の生死状態の判別を行なうことができるだけであって、細胞の培養状態の良否を検査することはできなかった。
本発明はそのような事情に鑑み、上記特許文献３に記載された励起蛍光マトリクスデータを利用して、簡便に細胞の培養状態を評価することができるようにした細胞の培養状態検査方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち請求項１の発明は、培養中の細胞の培養状態を検査するための細胞の培養状態検査方法であって、
細胞を培養中の培地に波長が異なる複数の励起光を照射して、それぞれの励起波長毎に培地から発する蛍光を受光し、受光した蛍光における複数の蛍光波長毎の蛍光強度を計測して、この蛍光強度の値を励起波長と蛍光波長とに相関させた計測励起蛍光マトリクスデータとし、該計測励起蛍光マトリクスデータと予め作成した１種以上の基準励起蛍光マトリクスデータとを比較して、上記培養中の細胞の培養状態を評価することを特徴とするものである。
また請求項２の発明においては、上記培地は、培地交換時や継代培養時の使用済み培地であって、細胞が除去された培地であることを特徴とするものである。
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、請求項３の発明のように、細胞が正常に培養された際の培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、請求項４の発明のように、所定量の細胞栄養成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、請求項５の発明のように、所定量の細胞産生成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、請求項６の発明のように、所定量の汚染成分を含有する培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
上記複数の励起波長は、請求項７の発明のように、２００ｎｍから５００ｎｍの範囲から選択されることが望ましい。
【発明の効果】
【０００６】
請求項１の発明によれば、細胞を培養中の培地に波長が異なる複数の励起光を照射して、それぞれの励起波長毎に培地から発する蛍光を受光し、受光した蛍光における複数の蛍光波長毎の蛍光強度を計測して、この蛍光強度の値を励起波長と蛍光波長とに相関させた計測励起蛍光マトリクスデータを得るようにしているので、直接細胞に試薬を作用させるようにした従来技術に比較して、簡便に培養中の細胞の培養状態を評価することができる。
また請求項２の発明においては、上記培地として、培地交換時や継代培養時の使用済み培地であって、細胞が除去された培地を用いているので、培養中の細胞に励起光が照射されることはなく、細胞の安全性を確保することができ、また細胞を無駄にすることがない。
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、請求項３の発明のように、細胞が正常に培養された際の培地から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
すなわち細胞は培地に含まれるグルコースや各種アミノ酸などの栄養を消費し、乳酸や各種サイトカイン（蛋白質）などを細胞外に産生している。そしてアミノ酸、蛋白質などは自家蛍光があるため、これに波長が異なる複数の励起光を照射することにより上述したようにして励起蛍光マトリクスデータを得ることができる。
培養中の細胞の状態が変われば、培地の自家蛍光情報に由来する励起蛍光マトリクスデータに変化が表れるので、予め細胞が正常に培養された培地について基準励起蛍光マトリクスデータを作成しておけば、検査対象となる培地から得られた計測励起蛍光マトリクスデータと基準励起蛍光マトリクスデータとを比較することにより、培地の良否が、したがって細胞の培養状態の良否を判別することができる。
また請求項６の発明のように、上記基準励起蛍光マトリクスデータとして培地の汚染成分を計測して得られたマトリクスデータを用いれば、培地が当該汚染成分によって汚染されているか否かを判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】励起蛍光マトリクスデータ（蛍光指紋）を得るための原理を説明する説明図。
【図２】得られた３次元の励起蛍光マトリクスデータの概念図。
【図３】得られた励起蛍光マトリクスデータとしての複数のサンプルデータについて主成分分析により多変量解析を行った結果を示す解析結果図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下図示実施例について本発明を説明すると、図１は励起蛍光マトリクスデータ（蛍光指紋）を得るための原理を示す図である。
本実施例においては、先ず検査すべき培地として、細胞が除去された培地１を準備する。培地１は容器２内に収容されている。
上記培地１は、例えば細胞を培養中の培地については培地交換や継代培養が行われるので、その際の使用済み培地を用いている。この使用済み培地１については当然に細胞が除去されている。
上記培地交換や継代培養は無菌状態に維持されているアイソレータ３の内部で行われ、使用済み培地１を収容した容器２はアイソレータ３の上面に設けた観察窓３ａに隣接した支持台４上に載置される。
【０００９】
励起光源１１はアイソレータ３の外部で観察窓３ａに隣接した位置に配置されており、該励起光源１１は、光源１２と分光手段１３と照射部１４とから構成されている。光源１２からの光は、分光手段１３により所定の波長を有する励起光Ｌ１に分光され、照射部１４から観察窓３ａを介して上記培地１に照射される。
上記励起光Ｌ１が培地１に照射されることによって、培地に含まれる自家発光成分から発せられた蛍光Ｌ２は、アイソレータ３の外部で観察窓３ａに隣接した位置に配置された検出手段１５によって受光されるようになっている。
該検出手段１５は、受光部１６と分光手段１７と受光素子１８とから構成されており、受光部１６で受光された蛍光は、分光手段１７によって所定の波長を有する光に分光され、当該波長を有する光のみが受光素子１８で受光される。
【００１０】
上記励起光源１１は制御装置２１によって制御され、それによって励起光源１１は上記培地１に波長が異なる複数の励起光Ｌ１を照射するようになる。
上記検出手段１５は、それぞれの励起波長毎に培地１から発する蛍光Ｌ２を受光し、受光した蛍光における複数の蛍光波長毎の蛍光強度を計測する。この蛍光強度の値は制御装置２１に入力されて記録され、該制御装置２１は上記蛍光強度の値を励起波長と蛍光波長とに相関させた３次元の計測励起蛍光マトリクスデータを作成する（図２参照）。
なお良好な蛍光反応を得るために、上記励起光Ｌ１の波長範囲は２００ｎｍから５００ｎｍの範囲であることが望ましい。２００ｎｍは紫外線殺菌の領域であるが、本発明では細胞に直接励起光Ｌ１を照射するのではなく、使用済み培地１に励起光Ｌ１を照射しているので、紫外線殺菌の領域の波長を用いても問題が生じることはない。
【００１１】
他方、上記制御装置２１には上記と同様にして、予め成分が既知の培地から得た基準となる１種以上の基準励起蛍光マトリクスデータが記録されており、蛍光強度を計測した結果得られた計測励起蛍光マトリクスデータと基準励起蛍光マトリクスデータとを比較することにより、培地１の状態が、すなわち培養中の幹細胞の培養状態をリアルタイムに評価することが可能であり、結果に応じて培養を中止することも可能である。
【００１２】
上記基準励起蛍光マトリクスデータとしては、細胞が正常に培養された際の培地に含有される自家蛍光成分から発せられた蛍光強度に基づいて得られたマトリクスデータを用いることができる。
より具体的には、上述したように、細胞は培地１に含まれるグルコースや各種アミノ酸などの栄養を消費し、乳酸や各種サイトカイン（蛋白質）などを細胞外に産生している。そしてアミノ酸、蛋白質は自家蛍光があるため、細胞が正常に培養されことが確認されている培地から上述したようにして自家蛍光Ｌ２を計測することにより、細胞が正常に培養された際の基準励起蛍光マトリクスデータを得ることができる。
すなわち、ある一定期間培養された細胞において、正常に培養された場合と、正常でない場合では、培地における自家蛍光成分の濃度が異なるため、得られる励起蛍光マトリクスデータも異なったものとなる。そこで、正常に培養された培地における励起蛍光マトリクスデータを基準とし、測定された励起蛍光マトリクスデータをこれと比較して、両者の類似性を培養状態を評価するための材料の一つとするものである。
なお、培地１の栄養成分としてはアミノ酸に限定されるものではなく、細胞によって消費される自家蛍光作用がある成分であれば如何なるものであってもよい。また細胞の産生成分としては上述したサイトカインに限定されるものではなく、細胞によって産生される自家蛍光作用がある成分であれば如何なるものであってもよい。
【００１３】
基準励起蛍光マトリクスデータと計測励起蛍光マトリクスデータは、膨大な量の蛍光強度の計測値からなり、そのままでは比較することが困難な場合がある。そこで、これらマトリクスデータを多変量解析による解析手法を用いて解析することにより、比較および評価を行う。
解析手法としては、特許文献３に開示されている主成分分析を用いることができる。主成分分析とは、多変量データの持つばらつきをできるだけ少ない変量によって正確に表現するための情報圧縮方法の１つであり、多変量のデータを少数の主成分に要約するものである。なお、マトリクスデータを主成分分析するための解析方法については、特許文献３に開示されているため、ここでは詳細な説明を省略する。
はじめに、基準励起蛍光マトリクスデータとして正常に培養された場合と、正常に培養されていない場合について、それぞれ複数のサンプルデータを取得する。
そのために、適正な方法で継代培養することにより正常に培養された幹細胞と、過剰な密度で播種するとともに、細胞かい離試薬による酵素処理を３０分間行い、ストレスやダメージを与えながら継代培養した幹細胞（正常に培養されていない幹細胞）とについて、細胞接着面積がセミコンフルエントになる播種後７２時間経過した時の培養上清液をそれぞれ複数サンプル採取した。
【００１４】
それら培養上清液について、励起光２００〜５００ｎｍ、自家蛍光２００〜９００ｎｍの波長でそれぞれ励起蛍光マトリクスデータを取得し、これを基準励起蛍光マトリクスデータとして、これら複数のサンプルデータについて主成分分析により多変量解析を行った結果、図３に示すように、概ね正常に培養された群（○印の群）と正常に培養されていない群（◇印の群）とが分かれて分布されたグラフを得ることができ、正常に培養された場合と正常に培養されていない場合とを判別することが可能となった。
次に、細胞の培養状態を検査する評価対象となる細胞について、同様に培養上清液を採取し、励起光２００〜５００ｎｍ、自家蛍光２００〜９００ｎｍの波長で励起蛍光マトリクスデータを取得し、これを計測励起蛍光マトリクスデータとして主成分分析により多変量解析を行い、基準励起蛍光マトリクスデータからなるグラフにおいて、どの位置にプロットされるかにより培養状態を評価することが可能となる。
すなわち、正常に培養された群の分布に含まれることで、これらと実質的に一致もしくは類似性が高いと判断することができ、正常に培養されていると評価することができ、他方、正常に培養されていない群の分布に含まれることで、これらと実質的に一致もしくは類似性が高いと判断することができ、正常に培養されていないと評価することができる。
【００１５】
上記実施例では、細胞が正常に培養された場合に得られる基準励起蛍光マトリクスデータを用いているが、その他の基準励起蛍光マトリクスデータとして、細胞が正常に培養されなかった場合の基準励起蛍光マトリクスデータを用いることも可能である。
すなわち上述したように、正常に培養された細胞は、自家蛍光を有する細胞栄養成分（アミノ酸）を消費し、かつ自家蛍光を有する細胞産生成分（サイトカイン）を細胞外に産生するので、細胞栄養成分が消費されず所定量の細胞栄養成分が残存する培地から発せられた蛍光強度に基づいて、不良品を示す基準励起蛍光マトリクスデータを作成することができる。
この場合には、当該基準励起蛍光マトリクスデータと計測励起蛍光マトリクスデータとが実質的に一致すれば、当該細胞は正常に培養されていないと判断することができる。
【００１６】
上記不良品を示す基準励起蛍光マトリクスデータは、実際に細胞を培養して、細胞が正常に培養されなかった培地から得ることができるが、より簡便に、実際に細胞を培養する以前の正常な培地から基準励起蛍光マトリクスデータを得てもよい。細胞を培養する以前の正常な培地は、当然に所定量の細胞栄養成分を含有しているので、当該培地から発せられた蛍光強度に基づいて不良品を示す基準励起蛍光マトリクスデータを作成してもよい。
同様に、正常な基準励起蛍光マトリクスデータを簡便に得るために、所定量の細胞産生成分を人工的に添加した培地から発せられた蛍光強度に基づいてマトリクスデータを得ることも可能である。
【００１７】
さらに、細胞・細菌などの微生物は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）トリプトファンに由来する自家蛍光を持っている。したがって、培地が細胞・細菌などによって汚染された際には、汚染源の自家蛍光情報が加わることになる。これにより、培地の励起蛍光マトリクスデータを解析することにより汚染の有無を判別することができる。
つまり、予め基準励起蛍光マトリクスデータとして、培地の汚染成分を計測して得られたマトリクスデータを用意しておけば、どの細胞・細菌などによって培地が汚染されたかを判別することが可能となる。
【００１８】
なお、上記実施例では細胞が除去された培地１を用いているが、例えば上記励起光Ｌ１の波長範囲が細胞を傷つけない場合や作業をより簡素化する必要がある場合などには、細胞を培養中の培地をそのまま用いてもよい。
【符号の説明】
【００１９】
１  培地                          ２  容器
３  アイソレータ                  ３ａ  観察窓
１１  励起光源                    １５  検出手段
２１  制御装置                    Ｌ１  励起光
Ｌ２  蛍光
【図１】
2017131121.tif 000003
【図２】
2017131121.tif 000004
【図３】
2017131121.tif 000005