(57)【要約】      （修正有）【課題】効率の良い、改善された末梢血由来の単球の増殖誘導方法、特に、例えば、ドナー依存性が改善された末梢血由来の単球の増殖誘導方法の提供。【解決手段】ヒト末梢血由来の単球の増殖誘導方法であって、単球に、少なくとも以下の３つの遺伝子：ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及び、ＢＣＬ２又はＬＹＬ１遺伝子を導入して発現させ、増殖能を有する単球を作製することを含む方法。前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球であることが好ましく、がん患者由来の単球であることがより好ましい、単球の増殖誘導方法。単球の増殖誘導方法により増殖能を有する単球を作製する工程と、前記増殖能を有する単球を培養することにより樹状細胞へと分化誘導する工程と、作製した樹状細胞を任意の抗原で負荷（ｌｏａｄ）して抗原提示樹状細胞を作製する工程又は、任意の抗原の遺伝子を導入して抗原提示樹状細胞を作製する工程と、を含む、樹状細胞作製方法。【選択図】図１
2017131136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血由来の単球の増殖誘導方法であって、
単球に、少なくとも以下の３つの遺伝子：ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２又はＬＹＬ１遺伝子を導入して発現させることにより、増殖能を有する単球を作製することを含む方法。
【請求項２】
前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である請求項１に記載の単球の増殖誘導方法。
【請求項３】
前記単球が、がん患者由来の単球である請求項１又は２に記載の単球の増殖誘導方法。
【請求項４】
ヒト末梢血由来の単球から樹状細胞を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により増殖能を有する単球を作製する工程、及び
（ｂ）前記増殖能を有する単球を培養することにより樹状細胞へと分化誘導する工程、
を含む樹状細胞作製方法。
【請求項５】
さらに、前記工程（ｂ）で作製した樹状細胞を任意の抗原で負荷（load）して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、請求項４に記載の樹状細胞作製方法。
【請求項６】
さらに、前記工程（ｂ）で作製した樹状細胞に任意の抗原の遺伝子を導入して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、請求項４に記載の樹状細胞作製方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により作製した増殖能を有する単球を含む医薬。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一つに記載の方法で作製した樹状細胞を含む医薬。
【請求項９】
前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
請求項５又は６で作製した抗原提示樹状細胞を、末梢血由来のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養することにより、該抗原特異的なＣＤ４＋Ｔセルライン又はＣＤ８＋Ｔセルラインを樹立する方法。
【請求項１１】
増殖能を有するヒト末梢血由来の単球であって、
少なくとも以下の３つの外因性（exogeneous）遺伝子：
ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２又はＬＹＬ１遺伝子
を有し、それらが強制的に発現している単球。
【請求項１２】
前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である請求項１１に記載の単球。
【請求項１３】
前記単球が、がん患者由来の単球である請求項１１又は１２に記載の単球。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の単球から分化誘導した樹状細胞。
【請求項１５】
任意の抗原で負荷（load）されて該抗原を提示する、請求項１４に記載の樹状細胞。
【請求項１６】
任意の抗原の遺伝子を有しそれが強制的に発現されることにより該抗原を提示する請求項１４に記載の樹状細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の単球を含む医薬。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか一つに記載の樹状細胞を含む医薬。
【請求項１９】
前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である請求項１８に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液、特には末梢血由来の単球の増殖誘導方法に関する。本発明はまた、該増殖誘導方法を用いた単球の大量作製方法に関する。本発明はさらには、免疫療法に用いることができる単球由来樹状細胞を提供する方法であり、また、それらの樹状細胞を用いた免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球（Monocyte：Mo）は、白血球細胞に分類される単核の細胞であり、血液中を循環している未熟な食細胞である。単球は、感染に対する免疫に重要な役割を果たしており、細菌などの異物を細胞内に取り込み、消化する。断片化した異物を、もともと細胞質内に持っていたＭＨＣ分子と結合させ、細胞表面に提示し、これをヘルパーＴ細胞が認識することにより免疫反応が開始される。また単球は、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞に分化することが知られている。
【０００３】
マクロファージは、生体内における主要な異物処理細胞であり、生体内に侵入した感染性微生物等を貪食してこれを分解することにより、生体を感染症から防御する役割を有している。また、生体内では、日々、大量の細胞が死滅しており、マクロファージは、生体内組織中に存在するその残骸物を貪食し分解する。それ以外にも、マクロファージは、生体内で生じる様々な代謝産物を貪食・分解処理することにより、生体の恒常性維持において必須の役割を担っている。また、マクロファージは、悪性腫瘍の局所においてしばしば浸潤が認められる。腫瘍の局所に存在するマクロファージは、腫瘍細胞を攻撃している場合と腫瘍細胞の増殖を促進している場合の両方があると考えられている。これまでに、マクロファージの腫瘍細胞に対する攻撃能力を活用して悪性腫瘍を治療しようとする試みもなされている。
【０００４】
樹状細胞（Dendritic cell：ＤＣ）は、Ｔリンパ球を強力に刺激し活性化する細胞であり、生体内において免疫応答の制御を司っている細胞である。感染性微生物の生体内侵入に際して、樹状細胞は、微生物を貪食しそれに由来する抗原物質をＴリンパ球に提示し、抗原特異的なＴリンパ球を刺激し活性化することにより、免疫応答を誘導する。樹状細胞が有するＴリンパ球を強力に刺激する能力を生かし、樹状細胞を、がんや感染症に対する免疫療法において細胞ワクチンとして用いる試みがなされている。
【０００５】
抗原性ペプチドを用いたワクチン治療はがん患者を治療するために広く用いられている。これらの抗原性ペプチドは、たとえば、アジュバントで乳化されたり、樹状細胞に付加されたりする。過去２０年間、がん抗原由来ＣＴＬエピトープを同定するためにかなりの努力が払われてきたが、それは、ＨＬＡクラスＩの共通のアレル、例えば、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１に限定されたものであり、結果として、ＨＬＡクラスＩの主要なアレルによって提示されるエピトープに関する膨大な量の情報が累積されている。他方、低頻度のＨＬＡアレルに関しは比較的少ない種類のエピトープが同定されているにすぎない。よって、ＨＬＡクラスＩの共通のタイプに対してネガティブながん患者は、現在行われている殆どのワクチン療法から除外されている。
【０００６】
ＨＬＡ−Ａ*０２：０１は、世界的にみて最も共通のクラスＩアレルであるが、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１の遺伝子頻度は大部分の人種集団で多くても３０％である。従って、かなりの数の患者は、ワクチン療法の恩恵を受けられていない。これに加えて、ＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープは、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座において特に優性なアレルが恐らく存在しないためにほとんど同定されていない。しかし、既知のがん抗原を含む多くの有用なＨＬＡ−Ｂ−拘束性エピトープが存在するはずである。もしＨＬＡ−Ｂ−拘束性ＣＴＬが刺激できれば、抗がんワクチン療法の有効性は実質的に向上すると考えられる。
【０００７】
合成ペプチドベースのワクチン療法に関連した制限を克服するための可能な手段として、遺伝子ベースのワクチン療法、例えば、プラスミドＤＮＡワクチン法や組換えウイルスを用いたワクチン法が考慮されている。しかしながら、プラスミドベースのＤＮＡワクチンは、抗がん免疫を誘導するには十分な効果がない。組換えウイルスを用いた療法は、感染性ウイルスの患者への投与に伴う潜在的リスクが問題となる。がん抗原提示遺伝的改変樹状細胞を用いたワクチン法は、それらに比べて、より効果的でより安全である。
【０００８】
樹状細胞はヒト血液中に極めて少ない数で存在するので、抗がん治療に用いられる樹状細胞は通常は、末梢血中の単球をインビトロで分化させることによって作製する。がん抗原提示樹状細胞を作製するための手段として、ウイルスベクターを用いた単球の遺伝的改変が報告されている（非特許文献１〜３）。しかし、通常、単球は増殖できず、トランスジェニック細胞を選択して増殖されることは実現可能な手段ではない。そこで、樹状細胞又はその前駆体である単球を増殖させる方法が、抗原提示樹状細胞をより効果的に作製するために望まれている。
【０００９】
本発明者は以前、レンチウイルスを用いてＢＭＩ１とともにｃＭＹＣを形質導入することにより、ＣＤ１４+単球の増殖を誘導できることを報告した。この結果は、ヒト単球の増幅法を最初に確立したものであり、本発明者は、単球由来の増殖細胞をＣＤ１４−ＭＬと名付けた（特許文献１、非特許文献４）。増殖したＣＤ１４−ＭＬは、培地へのＩＬ−４の添加により、機能的な樹状細胞（ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ）へと分化した。この方法の一つの欠点は、増殖誘導はドナー依存性が大きく、ＣＤ１４+単球の増殖は、報告では健常者１２人の血液ドナー中３例（約３０％）で成功していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０４３６５１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Su, Z., et al. 2003 Cancer Res. 63: 2127-2133.
【非特許文献２】Kyte, J. A., et al. 2006 Cancer Gene Ther. 13: 905-918.
【非特許文献３】Sundarasetty, B. S., et al. 2015 Gene Ther. doi: 10.1038/gt.2015.43.
【非特許文献４】Haruta, M., et. al. 2013. Hum. Immunol. 74: 1400-1408.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、本発明者らにより報告されている従来の方法の改良方法を提供することである。より具体的には、より効率の良い、改善された末梢血由来の単球の増殖誘導方法を提供することである。そのような方法は、例えば、ドナー依存性が改善された末梢血由来の単球の増殖誘導方法である。
本発明の目的はまた、増殖能を持つ単球より抗原提示が可能な樹状細胞を提供することであり、さらには、そのような樹状細胞を含む医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために、本発明者らの従来の方法の効率化及び改善を試みた結果、単球にｃＭＹＣとＢＭＩ１と共に、ＢＣＬ２又はＬＹＬ１を導入することが非常に有利であることが判り、本発明を完成した。さらに本発明者らは、特定の抗原性ペプチドを用いて、或いは、遺伝子改変技術を用いて、抗原提示樹状細胞の作製にも成功した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の態様を含むものである。
［１］ヒト末梢血由来の単球の増殖誘導方法であって、
単球に、少なくとも以下の３つの遺伝子：ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及び、ＢＣＬ２又はＬＹＬ１遺伝子を導入して発現させることにより、増殖能を有する単球を作製することを含む方法。
［２］前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である前記［１］に記載の単球の増殖誘導方法。
［３］前記単球が、がん患者由来の単球である前記［１］又は［２］に記載の単球の増殖誘導方法。
［４］ヒト末梢血由来の単球から樹状細胞を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により増殖能を有する単球を作製する工程、及び
（ｂ）前記増殖能を有する単球を（分化誘導因子とともに）培養することにより樹状細胞へと分化誘導する工程、
を含む樹状細胞作製方法。
［５］さらに、前記工程（ｂ）で作製した樹状細胞を任意の抗原で負荷（load）して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、前記［４］に記載の樹状細胞作製方法。
［６］さらに、前記工程（ｂ）で作製した樹状細胞に任意の抗原の遺伝子を導入して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、前記［４］に記載の樹状細胞作製方法。
［７］前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により作製した増殖能を有する単球を含む医薬。
［８］前記［４］〜［６］のいずれか一つに記載の方法で作製した樹状細胞を含む医薬。
［９］前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である前記［８］に記載の医薬。
［１０］前記［５］又は［６］で作製した抗原提示樹状細胞を、末梢血由来のＣＤ４+Ｔ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞と共培養することにより、該抗原特異的なＣＤ４+Ｔセルライン又はＣＤ８+Ｔセルラインを樹立する方法。
【００１５】
［１１］増殖能を有するヒト末梢血由来の単球であって、
少なくとも以下の３つの外因性（exogeneous）遺伝子：
ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及び、ＢＣＬ２又はＬＹＬ１遺伝子
を有し、それらが強制的に発現している単球。
［１２］前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である前記［１１］に記載の単球。
［１３］前記単球が、がん患者由来の単球である前記［１１］又は［１２］に記載の単球。
［１４］前記［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載の単球から分化誘導した樹状細胞。
［１５］任意の抗原で負荷（load）されて該抗原を提示する、前記［１４］に記載の樹状細胞。
［１６］任意の抗原の遺伝子を有しそれが強制的に発現されることにより該抗原を提示する前記［１４］に記載の樹状細胞。
［１７］前記［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載の単球を含む医薬。
［１８］前記［１４］〜［１６］のいずれか一つに記載の樹状細胞を含む医薬。
［１９］前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である前記［１８］に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の改良法を用いることにより、細胞ドナーの身体的負荷を伴うことなく、増殖能を有する単球（以下、増殖性単球という場合がある）を大量に、かつ、安定して供給することが可能になる。また本発明によれば、健常者やがん患者を含む様々なサンプルから増殖性単球を得ることができる。さらに、本発明の方法を用いて樹立した増殖性単球胞（本明細書では、ＣＤ１４−ＭＬという）は、機能的に成熟した樹状細胞へと分化できる（ＣＤ１４−ＭＬを分化誘導して作製した樹状細胞を、本明細書では、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣという）。よって、本発明の方法によれば、例えば、ワクチン治療などに必要な十分な数の単球及び／又は樹状細胞を、少量の末梢血から作製できる。
【００１７】
また、本発明の方法に従って作製した増殖性単球（ＣＤ−１４−ＭＬ）や樹状細胞（ＣＤ−１４−ＭＬ−ＤＣ）の一部のものは、その目的に応じ、これに限定されないが、例えば、以下のように利用することができる。例えば、任意の抗原性ペプチドを負荷すれば抗原提示樹状細胞を作製できる。例えば、がん抗原由来ペプチドを負荷すればがん抗原提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを作製でき、さらには、それを用いてインビトロにて末梢血Ｔ細胞を刺激すると、そのペプチドを認識するＣＤ４+セルラインやＣＤ８+ Ｔセルラインが樹立できる。また、ＣＤ１４−ＭＬは１ヵ月以上にわたり増殖するので、遺伝子改変も容易に行うことができる。例えば、抗原をコードする遺伝子を導入して抗原提示樹状細胞を作製することもできる。
さらには、本発明の一部の態様の方法によれば、Ｔ細胞エピトープに関する情報がなくても抗原提示樹状細胞を作製することが可能となる。このことは、Ｔ細胞エピトープに関する情報が、がん抗原提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを用いたワクチン法において不必要となり、従って、ＨＬＡタイプに関係なくすべての患者に対して、本発明を用いた抗がん治療が有用となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例で用いた末梢血単球が由来するドナー（健常者ドナー１０人、がん患者ドナー２人）の年齢、性別、及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）血清型、並びに増殖性ＣＤ１４−ＭＬの作製の結果を示した図である。”ＮＴ”＝Ｎｏｔ Ｔｅｓｔｅｄ。
【図２】本発明の方法により作製したＣＤ１４ＭＬ及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣの形態観察の結果である。位相差顕微鏡画像（Ａ及びＢ，Ｃ：左図）及びＭａｙ-Ｇｒuｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ 染色像（Ｂ，Ｃ：右図）を示している。（Ａ）：本発明の方法（ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＬＹＬ１を導入）で作製したＣＤ１４−ＭＬの形態である。（Ｂ）及び（Ｃ）：本発明の方法（ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２を導入）で作製したＣＤ１４−ＭＬの形態である。（Ｂ）ヒト単球及びヒト単球由来ミエロイドセルライン（ＣＤ１４−ＭＬ）の形態を示している。（Ｃ）ＯＫ４３２で刺激したｍｏ−ＤＣｓ及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの形態を示している。
【図３】ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの細胞表面分子とＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０の生産の結果である。（Ａ）ＯＫ４３２による処置の前後のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣについて、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの発現について分析した結果である。コントロールとして、ＯＫ４３２で刺激したｍｏ−ＤＣ（単球由来ＤＣ）の分析の結果を示した。特定のｍＡｂ（太線で示す）及びアイソタイプがマッチしたコントロールｍＡｂ（影領域）の染色プロファイルを示している。（Ｂ）ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ及びｍｏ−ＤＣｓの６０時間後の培地上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。データは、２回の実験の結果である。
【図４】ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるＴ細胞刺激と抗原提示を示している。（Ａ）ＣＤ１４−ＭＬ（菱形）、ＩＬ−４（正方形）又はＯＫ４３２（三角形）で刺激した結果である。（Ｂ）示した数のＣＤ−１４−ＭＬ−ＤＣｓを、ＧＡＤ６５111-131ペプチド（菱形）で負荷し、或いはそのまま負荷しなかった（正方形）場合の、Ｔ細胞の増殖反応を、最後の１６時間の培養での［3Ｈ］−メチルチミジンの取り込みで測定した結果である。実験は、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４−ＭＬで行った。（Ｃ）ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを、組み換えＧＳＴ融合ＧＡＤ６５タンパク質又はＧＳＴタンパク質で１６時間パルスした場合のＴ細胞の増殖反応を分析した結果である。実験は、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４−ＭＬで行った。
【図５】ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるガン抗原反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導の結果である。（Ａ）ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるガン抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導プロトコルを示している。（Ｂ）２１日目に、ＣＤ８+Ｔ細胞を生産しているＩＦＮ−γの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である（Ｄａｙ ２１）。刺激培養前のＴ細胞の結果もまた示す（Ｄａｙ ０）。（Ｃ）２１日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、及びＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＤＣＡ１56-64又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ177-186 ｔｅｔｒａｍｅｒで染色した結果である。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを示している（Ｄａｙ ２１：右図）。刺激培養前のＴ細胞の結果もまた示す（Ｄａｙ ０：左図）。
【図６】ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるガン抗原反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導の結果である。（Ａ）ＣＤ８+Ｔ細胞を生産しているＩＦＮ−γの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である。（Ｂ）Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１26-35 ｄｅｘｔｒａｍｅｒ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＣＤＣＡ１351-359 ｔｅｔｒａｍｅｒ、又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＩＭＰ３515-523 ｔｅｔｒａｍｅｒで染色した結果である。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｄｅｘｔｒａｍｅｒ又はｔｅｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを示している（右図）。刺激培養前のＴ細胞の結果もまた示す（Ｄａｙ ０：左図）
【図７】ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるがん抗原反応性ＣＤ４+Ｔセルラインの誘導を結果である。（Ａ）ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるガン抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導プロトコルを示している。（Ｂ，Ｃ）刺激後（３回より多く）、各ペプチドに反応するＣＤ４+Ｔ細胞の数をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで分析した結果である（Ｄａｙ ２８）。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０）。ジメチルスルホキシドをコントロールとして用いた。健常者ドナー３（Ｂ）及びドナー２（Ｃ）の結果を示す。
【図８】ＨＮＣ患者から得られたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるがん抗原反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導の結果である。（Ａ、Ｃ）、２１日目に、ペプチドに反応するＣＤ８+Ｔ細胞の数をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である。ＨＩＶペプチドをコントロールペプチドとして用いた。（Ｂ，Ｄ）２１日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、及びＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＤＣＡ１56-64、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＫＩＦ２０Ａ66-75又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ１77-186 ｔｅｔｒａｍｅｒで染色した結果である。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+細胞のパーセンテージを示している。がん患者１（Ａ、Ｂ）とがん患者２（Ｃ、Ｄ）の結果を示す。
【図９】ＨＮＣ患者から得たＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるがん抗原反応性ＣＤ４+Ｔセルラインの誘導の結果である。刺激後（３回より多く）、各ペプチドに反応したＣＤ４+Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果を示す。がん患者１（Ａ）とがん患者２（Ｂ）の結果を示す。
【図１０】抗原性タンパク質を発現するＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるがん抗原反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導の結果である。（Ａ）ＣＭＶｐｐ６５（ＥＦ−ＣＭＶ−ＩＰ）及びＭＡＲＴ１（ＥＦ−ＭＡＲＴ１−ＩＰ）のレンチウイルス構築物を示す。（Ｂ）ＣＤ１４−ＭＬ／ＣＭＶによるＣＭＶｐｐ６５の発現をフローサイトメトリーで分析した結果である。特定のｍＡｂ（太線で示す）とアイソタイプがマッチしたコントロールｍＡｂ（影領域）の染色プロフェイルを示す。（Ｃ）９日目に、ＣＭＶｐｐ６５341-349ペプチドに反応性のＴ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果を示す。ＨＩＶペプチドをコントロールペプチドとして用いた。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０）。（Ｄ）９日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ及びＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＭＶｐｐ６５341-349複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色した結果を示す。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを示している（Ｄａｙ ９：右図）。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０：左図）。（Ｅ）９日目のＣＤ８+Ｔ細胞を生産するＩＦＮ−γの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０）。
【図１１】ＭＡＲＴ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの作製の結果である。（Ａ）ＣＤ１４−ＭＬ／ＭＡＲＴ１によるＭＡＲＴ１の発現をフローサイトメトリー分析した結果である。特定のｍＡｂ（太線で示す）とアイソタイプがマッチしたコントロールｍＡｂ（影領域）の染色プロファイルを示す。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ポジティブな健常者ドナーから得られたＣＤ８+Ｔ細胞を同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ−ＭＡＲＴ１と共培養し、２１日目に、ＭＡＲＴ１26-35に反応するＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である。ＨＩＶペプチドをコントロールペプチドとして用いた。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０）。（Ｃ）２１日目に、抗ＣＤ８ ｍＡｂ及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１26-35 ｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色した結果を示す。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを示している（Ｄａｙ ２１：右図）。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０：左図）。（Ｄ）ＭＡＲＴ１に反応性のＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、刺激物質としてＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した結果である。刺激培養前のＴ細胞の結果も示す（Ｄａｙ ０）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００２０】
（ヒト末梢血からの単球の分離）
本発明において、原料となる単球は末梢血から採取される。ヒトの末梢血中の単球（末梢血中のＣＤ１４分子を発現する細胞）を分離・調製する方法は公知であり、それらの方法を制限なく本発明においても用いることができる。これに限定されないが、例えば、以下の方法が例示できる。
【００２１】
ヒトの末梢血を採血する。抗凝固剤としては、ヘパリンあるいはクエン酸などを用いる。採血した血液を等量の生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、あるいは、ハンクス緩衝溶液などを用いて希釈する。次に、希釈した血液を、あらかじめ遠心チューブ（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ ３５２０７０等）中に分注しておいたフィコール液（ＧＥ ヘルスケア社）の上に重層する。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００ｇで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む）を回収する。
【００２２】
単球は、単核細胞中からＣＤ１４分子の発現を指標として、磁気ビーズ法などにより分離することができる。例えば、ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニー社 １３０−０５０−２０１）等を用いることにより分離することが可能である。あるいは、単核細胞分画を、細胞培養用の表面処理がなされた細胞培養容器を用いて６−１６時間ほど培養し、容器に付着した細胞を回収することにより、単球あるいはそれに由来するマクロファージを得ることも可能である。通常、健康な成人の末梢血１０ｍｌから、２００，０００−５００，０００個の単球を回収することができる。
本発明で用いる末梢血由来の単球は、好ましくは凍結保存されていない新鮮な単球である。
また、ヒト末梢血由来の単球は市販もされておりそれを用いることもできる。
【００２３】
（末梢血由来単球への増殖能力の付与）
本発明の方法は、末梢血単球において、少なくとも以下の３つの遺伝子：ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及び、ＢＣＬ２遺伝子又はＬＹＬ１遺伝子を強制的に発現させることにより、単球に長期増殖能を付与することを特徴とする。前記遺伝子を強制的に発現させるための方法として、例えば、外来の遺伝子を単球に導入することによりこれら遺伝子の強制的な発現を行っても良い。遺伝子の効率的かつ高レベルの発現を達成し、単球に長期増殖能を確実に付与する観点から、遺伝子工学技術を用いて外来遺伝子を単球に導入する方法が好ましい。
本発明において、「増殖能を有する単球」とは、上記の通り、末梢血由来の単球において上記遺伝子を強制的に発現させることにより長期増殖能が付与された単球を意味する。本発明の「増殖能を有する単球」は、上記遺伝子が導入されていない、対照となる単球（つまり、出発材料として用いた末梢血由来単球）と比較して、より長期に渡り増殖することが可能となり、例えば、上記遺伝子を強制的に発現させた時点（上記遺伝子を細胞に導入した時点）から２週間以上、好ましくは１ヶ月以上増殖することが可能である。
【００２４】
ｃＭＹＣ遺伝子の具体例としては、ヒトのｃＭＹＣ遺伝子（ＮＭ＿００２４６７）を挙げることができる。ＢＭＩ１遺伝子の具体例としては、ヒトのＢＭＩ１遺伝子（ＮＭ＿００５１８０）を挙げることができる。ＢＣＬ２遺伝子の具体例としては、ヒトのＢＣＬ２遺伝子（ＮＭ＿０００６３３）を挙げることができる。ＬＹＬ１遺伝子の具体例としては、ヒトのＬＹＬ１遺伝子（ＮＭ＿００５５８３）を挙げることができる。それぞれの括弧内は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を示す。
【００２５】
ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＬＹＬ１遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。また、野生型の遺伝子と同等あるいはそれ以上の機能を有する限りにおいて、該遺伝子の産物が他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として発現されるように人為的に修飾を加えた遺伝子でも良い。
【００２６】
ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＬＹＬ１遺伝子を末梢血由来単球に導入する方法は、導入されたこれら遺伝子が発現して単球に長期増殖能を付与できる限り、特に限定されるものではない。例えば、導入遺伝子を含む発現ベクターを用いて該遺伝子を単球に導入することができる。また、一つの発現ベクターに複数の遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを単球に導入してもよいし、各遺伝子を別々に組み込んだ発現ベクターを用意して、それらを単球に導入してもよい。
【００２７】
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターであり、特に好ましくは導入した遺伝子が単球の染色体に組み込まれるようなウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。
【００２８】
組み換えウイルスベクターを作製するために用いるパッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であれば任意の細胞を用いることができる。例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に基づくパッケージング細胞を用いることができる。
【００２９】
組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。さらに、プラスミドを導入したパッケージング細胞の培養上清から、遠心分離法、あるいはウイルス精製用として市販されているカラムを用いる濃縮する方法などにより遺伝子組換えウイルスを濃縮した溶液を回収することができる。
【００３０】
ヒトから採取した末梢血単球に対して、培養容器の中で、前記のようにして調整した遺伝子組換えウイルスを含む溶液を添加することにより、ウイルスを感染させ、目的とする遺伝子を導入する。
【００３１】
(増殖能を有する単球の増殖方法)
上記のようにして作製した生体外で増殖する能力を有する単球は、Ｍ−ＣＳＦを含む細胞培養液を用いて培養することができる。培養液中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の含有量は、２５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。あるいは、レンチウイルスベクター等を用いてＭ−ＣＳＦ遺伝子を細胞自身に導入することにより単球自身にＭ−ＣＳＦを産生させることも可能である。この場合は、Ｍ−ＣＳＦを添加していない細胞培養液を用いて培養し、増殖させることが可能である。
【００３２】
（単球からの樹状細胞への分化）
本発明の方法により作製した生体外で増殖する能力を有する単球から、樹状細胞を作製することが可能である。例えば、これに限定されないが、本発明の長期増殖能を有する単球を、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキン４（ＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞を作製することができる。培養液中のＭ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの含有量は、これに限定されないが、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲、ＩＬ−４の含有量は、これに限定されないが、例えば、５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。また、さらに成熟誘導物であるＯＫ４３２（ペニシリン殺菌したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の存在下で培養することにより、樹状細胞の成熟を誘導することができる。培養中のＯＫ４３２の含有量は、これに限定されないが、例えば、５〜５０μ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明において、「樹状細胞」とは、形態、細胞表面分子、Ｔ細胞刺激能力という点で、自然の（遺伝子改変が行われていない）単球由来樹状細胞等と類似した性質を有する細胞である。このような樹状細胞の作製方法、及び該方法により作製した樹状細胞もまた本発明の一部である。
【００３３】
（単球からの抗原提示樹状細胞の作製）
本発明の方法により作製した樹状細胞に、抗原となり得る任意の物質、例えばペプチドをパルスすることにより、該抗原を提示する樹状細胞を作製することができる。該抗原としては、抗原として提示出来るものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、これに限定されないが、がん特異的ペプチドあるいはタンパク質をあげることができる。がん特異的ペプチドあるいはタンパク質をパルスして作製されたがん特異的抗原提示樹状細胞は、がんのワクチン療法においての抗がん医薬として有用である。
抗原をパルスする方法は、常法に従って行うことができ、本発明の方法を用いて作製したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを抗原候補物質とともに培養することにより行うことができる。公知の方法として、例えば、Haruta, M., et. al. 2013. Hum. Immunol. 74: 1400-1408 を参照することができ、これらの公知の方法に適宜修正を加えて行うことができる。これに限定されないが、例えば、抗原となるペプチドあるいはタンパク質を１〜２０μＭの濃度になるように添加した培養液中で、３〜２４時間培養する方法をあげることができる。
【００３４】
また、本発明の方法により作製した単球に、特定のタンパク質を発現する遺伝子を導入して培養することにより、該タンパク質を発現する樹状細胞を作製することができる。遺伝子の導入は、公知の遺伝子導入方法を用いることができ、これに限定されないが、例えば、導入遺伝子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。プラスミドベクターを用いる場合には、導入効率の高い方法を用いるべきであり、電気穿孔法による導入が好ましい。
ウイルスベクターの導入方法、及び遺伝子が導入された細胞の選択方法は常法に従って行うことができ、公知の方法を用いることができる。
【００３５】
（抗原特異的なＣＤ４+Ｔセルライン又はＣＤ８+Ｔセルラインの樹立）
さらに、本発明の方法により作製した抗原提示樹状細胞を用いて、同一ドナー由来のＣＤ４+Ｔ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞と共培養することにより、抗原特異的なＣＤ４+Ｔセルライン又はＣＤ８+Ｔセルラインを樹立することができる。
ＣＤ４+Ｔセルライン又はＣＤ８+Ｔセルラインの樹立の手順については、既に多くの報告がなされており、それらの方法を用いて行うことができる。例えば、Harao M., et al., Int J Cancer 2008;123:2616-25に記載の方法やTomita., et al., 2013 Int J Cancer 134:352-66に記載の方法をあげることができ、これら方法に適宜修正を加えて用いることができる。
【００３６】
（細胞医薬）
本発明の方法により作製した単球は、生体内に存在するマクロファージ等と同様の性質をもっており、感染症や悪性腫瘍に対する免疫細胞療法を行うための細胞医薬を提供することができる。また、本発明の単球は、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、或いはある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が蓄積することに起因する疾患の治療に用いるための細胞医薬を提供することもできる。また、本発明の長期増殖能を有する単球に由来する樹状細胞は、悪性腫瘍や感染症の治療に用いるための細胞ワクチンとして使用することができる。さらに、本発明の樹状細胞は、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応等を治療する目的で、免疫応答の抑制的制御に用いるための細胞医薬を提供することができる。
【００３７】
本発明の細胞医薬の製造の際には、本発明の長期増殖能を有する単球、及びそれに由来する樹状細胞を安定に保持しうることを目的として、前記したもの以外の助剤、例えば、培地等を適宜用いてもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（材料及び方法）
１．細胞サンプル及びドナー
本試験は、熊本大学大学院医学教育部の倫理委員会の承認を得て行った。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）サンプルは、インフォームドコンセントを得た健常者ドナー又は頭頸部がん（ＨＮＣ）患者から得た。ＣＤ１４+単球は、タカラバイオから購入して使用した。全体で、１０人の健常者（ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ）及び２人のがん患者（ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ）から得た単球を用いた。それぞれのドナーに関する情報を図１に示す。
【００４０】
２．組み換えレンチウイルスの作製
ヒトｃＭＹＣのｃＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲにより得て、ｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen、米国）中にクローン化した。ＢＭＩ１、ＢＣＬ２及びＬＹＬ１のそれぞれのｃＤＮＡは、理研バイオリソースセンター（筑波、日本）から提供をうけた。ＣＭＶｐｐ６５及びＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡのそれぞれのｃＤＮＡは、遺伝子合成によって作製した（GenScript、米国）。それらのｃＤＮＡは、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて、レンチウイルスベクター、ｐＣＳＩＩ−ＥＦ又はｐＣＳＩＩＥＦ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＲに導入した。ｐＣＳＩＩ−ＥＦ、及びレンチウイルスベクターパッケージのプラスミド、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−ＲｅｖとｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐは、三好博士（理研バイオリソースセンター）から提供を受けた。プラスミッド構築物は、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Invitrogen）を用いて２９３Ｔ細胞に導入し、３日後に、組み換えレンチウイルスを、遠心分離（５０，０００×ｇ、２ｈ）した培養上清から回収した。
【００４１】
３．単球からの増殖性ミエロイド系統細胞の作製
単球は、抗ヒトＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec、ドイツ）を用いたポジティブ選択により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（GE Healthcare UK、英国）を使って健常者のドナーから単離したＰＢＭＣから精製し、ポリブレン（８ｎｇ／ｍｌ）存在下で、レンチウイルスを用いて形質導入した。細胞は、２０％ ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、及び５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有したα−ＭＥＭで培養した。培養４−５週後に、増殖性細胞（ＣＤ１４−ＭＬ）が出現した。ＣＤ１４−ＭＬのＤＣへの分化を誘導するために、細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。成熟を誘導するために、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを、ペニシリンで殺菌したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（１０μｇ／ｍｌ）で２日間刺激した。
【００４２】
４．フローサイトメトリー分析 
以下のＦＩＴＣ又はＰＥコンジュゲートｍＡｂは、BD Pharmingen（米国）、eBioscience（米国）、R&D Systems（米国）、Abcam（英国）又はMiltenyi Biotec（ドイツ）から購入した：抗ＨＬＡクラスＩＩ（クローンＴＵ３９、マウスＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩ（クローンＧ４６−２．６、マウスＩｇＧ１）、抗ＣＤ８０（クローンＬ３０７．４、マウスＩｇＧ１）、抗ＣＤ８３（クローンＨＢ１５ｅ、マウスＩｇＧ１）、抗ＣＤ８６（クローンＦＵＮ−１、マウスＩｇＧ１）、抗ＣＤ４０（クローン５Ｃ３、マウスＩｇＧ１）、及び抗ＣＤ８（クローンＴ８、マウスＩｇＧ１）。マウスＩｇＧ２ａ（クローンＧ１５５−１７８）、マウスＩｇＧ２ｂ（クローン２７−３５）、マウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ−２１）、アフィニティ精製マウスＩｇＭ（eBioscience）、及びラットＩｇＧ２ａ（クローンｅＢＲ２ａ）は、アイソタイプがマッチした対照として使用した。細胞サンプルは、Ｆｃレセプタブロッキング試薬（Miltenyi Biotec）で１０分間処理し、蛍光色素コンジュゲートｍＡｂで３０分間染色し、次いで、２％ ＦＣＳを含んだＰＢＳで３回洗浄した。染色された細胞サンプルは、ＦＡＣＳｃａｎ（BD Biosciences、米国）フローサイトメトリーで分析した。
【００４３】
５．ＩＬ−１２ｐ７０生産の定量
ｍｏ−ＤＣｓ、及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるＩＬ−１２ｐ７０の生産を分析するために、細胞をＯＫ４３２（１０μｇ／ｍｌ）存在下、９６ウェル平底培養プレートで培養した（１×１０5細胞／２００μｌ培養液／ウェル）。培養６０時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（eBioscience）を用いてＩＬ−１２ｐ７０の濃度を測定した。
【００４４】
６．Ｔ細胞増殖分析。
Ｔ細胞は、Ｐａｎ Ｔ細胞分離キットＩＩ（Miltenyi Biotec）を用いてネガティブ選択でＰＢＭＣから精製し、９６ウェル丸底培養プレートで、５％の非動化（decomplemented）ヒト血漿を添加した２００μｌのＡＩＭ−Ｖ（Life Technologies、米国）中で、段階的な数の、Ｘ線照射（４５ Ｇｙ）した同種異系刺激細胞（ｍｏ−ＤＣ，ＣＤ１４−ＭＬ又はＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ）とともに５日間培養した。培養液に［3Ｈ］−メチルチミジン（２４７．９ Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ）を加え０．０３７Ｍｂｑ／ウェルとし、１６時間培養した。［3Ｈ］−メチルチミジンの取り込みは、シンチレーションカウンターで測定した。段階的な数のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣは、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）111-131ペプチド（ＬＱＤＶＭＮＩＬＬＱＹＶＶＫＳＦＤＲＳＴＫ（配列番号１）、１０μＭ）で３時間パルスし、Ｘ線照射し（４５ Ｇｙ）、次いで、９６ウェル平底培養プレートで、３日間、５％の非動化ヒト血漿を添加した２００μｌのＡＩＭ−Ｖ中で、ＧＡＤ６５特異的ＨＬＡ−ＤＲ５３拘束性ヒトＣＤ４+Ｔ細胞（３×１０4細胞／ウェル）とともに培養した。Ｔ細胞の増殖反応は、［3Ｈ］−メチルチミジンの取り込みで測定した。タンパク質抗原の自然なプロセッシングを調べるために、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（２×１０4ｃｅｌｌ／ウェル）を、９６ウェル平底培養プレートで、１６時間、組み換え型グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）を融合したＧＡＤ６５タンパク質又はＧＳＴタンパク質でパルスし、Ｘ線照射し、次いで、５％のヒト補完的血漿が添加された２００μｌのＡＩＭ−Ｖ中のＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞（３×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルズ）に加えた。Ｔ細胞の増殖反応は、［3Ｈ］−メチルチミジンの取り込みで測定した。
【００４５】
７．がん抗原反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの作製
血液サンプルのＨＬＡ−Ａ、ＤＲＢ１、及びＤＰＢ１遺伝子タイピングは、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法に基づいてHLA Laboratory（日本）で行った。抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導は、以前の報告（Harao M., et al., Int J Cancer 2008;123:2616-25）に若干の変更を加えて行った。要約すると、ＣＤ８+Ｔ細胞は、磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec、米国）を用いてポジティブ選択によりＰＢＭＣｓから精製した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを刺激細胞として用いて、抗原特異的ＣＤ８+Ｔセルラインを誘導した。ＣＤＣＡ１351-359（ＫＬＡＴＡＱＦＫＩ）（配列番号２）、ＫＩＦ２０Ａ809-817（ＣＩＡＥＱＹＨＴＶ）（配列番号３）、ＭＡＲＴ１26-35（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号４）及びＩＭＰ３515-523（ＮＬＳＳＡＥＶＶＶ）（配列番号５）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性エピトープと同定された。ＣＤＣＡ１56-64（ＶＹＧＩＲＬＥＨＦ）（配列番号６）、ＫＩＦ２０Ａ66-75（ＫＶＹＬＲＶＲＰＬＬ）（配列番号７）、ＬＹ６Ｋ177-186（ＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩ）（配列番号８）とＩＭＰ−３508-516（ＫＴＶＮＥＬＱＮＬ）（配列番号９）は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性エピトープと同定された。Ｔ細胞−刺激培養の開始（０日目）に、ＯＫ４３２で前処理したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（１×１０5／ウェル）を、これらの９−ｍｅｒ又は１０−ｍｅｒペプチド１０μｇで３時間パルスし、Ｘ線照射し（４５ Ｇｙ）、次いで、２４ウェル培養プレートにて、５％の非動化ヒト血漿と１０ｎｇ／ｍｌの組み換え型ヒトＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７）が添加された２ｍｌのＡＩＭ−Ｖ中で、ＣＤ８+Ｔ細胞（２×１０6／ウェル）をともに培養した。７日目と１４日目に、各培養から培地の半分を除去し、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−７で前もって負荷した、照射（４５ Ｇｙ）を受けたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（ＯＫ４３２で刺激していない、１×１０4／ウェル）を含む新鮮な培地（１ｍｌ／ウェル）を加えた。９日目に、ｒｈＩＬ−２を各ウェルに、２０ＩＵ／ｍｌとなるように添加した。培養の終わりに、刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析にて特異性を分析し、ＰＥラベルしたＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＣＤＣＡ１351-359、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＩＭＰ３515-523、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＤＣＡ１56-64又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ177-186ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒ（ＭＢＬ、日本）、又はＰＥラベルしたＨＬＡ−Ａ＊２４：０１／ＭＡＲＴ１26-35ペプチド複合体のｄｅｘｔｒａｍｅｒ（Immunodex、デンマーク）で染色し、ＦＩＴＣラベルした抗ヒトＣＤ８ ｍＡｂ（クローンＴ８；Beckman Coulter、米国）との組合せで、フローサイトメトリーで分析した
【００４６】
８．抗原反応性ＣＤ４+Ｔセルラインの作製
抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導は、Tomitay., et al., 2013 Int J Cancer 134:352-66に記載の方法にいくつかの変更を加えて行った。ＣＤ４+Ｔ細胞は、磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec、米国）を用いたポジティブ選択によって得たＰＢＭＣｓから精製した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓは、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を誘導するためのＡＰＣｓとして用いた。ＣＤＣＡ１39-64（ＮＰＫＰＥＶＬＨＭＩＹＭＲＡＬＱＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦ）（配列番号１０）、ＣＤＣＡ１55-78（ＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦＹＭＭＰＶＮＳＥＶＭＹＰＨＬ）（配列番号１１）、ＫＩＦ２０Ａ60-84（ＤＳＭＥＫＶＫＶＹＬＲＶＲＰＬＬＰＳＥＬＥＲＱＥＤ）（配列番号１２）、ＫＩＦ２０Ａ809-833（ＣＩＡＥＱＹＨＴＶＬＫＬＱＧＱＶＳＡＫＫＲＬＧＴＮ）（配列番号１３）、ＬＹ６Ｋ119-142（ＫＷＴＥＰＹＣＶＩＡＡＶＫＩＦＰＲＦＦＭＶＡＫＱ）（配列番号１４）及びＬＹ６Ｋ172-191（ＫＣＣＫＩＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩＮＳＳＶＦ）（配列番号１５）は、以前の研究で、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞のエピトープとして同定されている。０日目に、ＯＫ４３２で前処理したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（１×１０4細胞／ウェル）を、ペプチドの混合物（各々１０μｇ／ｍｌ）で３時間パルスし、Ｘ線照射し（４５ Ｇｙ）、次いで、９６ウェル平底培養プレートで、５％の非動化ヒト血漿を添加した２００μｌのＡＩＭ−Ｖ中で、ＣＤ４+Ｔ細胞（３×１０4細胞／ウェル）と共培養した。７日目に、培地の半分を除き、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）及びｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）で前もって負荷した、照射（４５ Ｇｙ）を受けたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（ＯＫ４３２で刺激していない、１×１０4細胞／ウェル）を含む新鮮な培地（１００μｌ／ウェル）を加えた。９日目に、ｒｈＩＬ−２を各ウェルに添加した（１０ ＩＵ／ｍｌ）。１４日目に、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析に基づいてペプチド特異的反応性について、各ウェルのＣＤ４+Ｔ細胞を分析した。同族のペプチドに特異的な反応を示すＴ細胞を、２４ウェルプレートに移し、ペプチドで負荷した照射を受けたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（ＯＫ４３２で刺激されていない、１×１０5細胞／ウェル）で一週間おきに再刺激した。次いで、ｒｈＩＬ−２（２０ ＩＵ／ｍｌ）とｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）が添加された培地を加えた。２８日目に、刺激されたＣＤ４+Ｔ細胞を集めて洗浄して、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によってＩＦＮ−γのペプチド特異的産生を分析した。拘束性ＨＬＡ分子を決定するために、抗ＨＬＡ−ＤＰ ｍＡｂ（Ｂ７／２１、Abcam）、抗ＨＬＡ−ＤＱ ｍＡｂ（ＳＰＶ−Ｌ３、Abcam）又は抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ（Ｌ２４３、BioLegend）を、ＥＬＩＳＰＯＰＴプレート中の刺激細胞（同一ドナー由来のＰＢＭＣ）に加えた（すべてのｍＡｂの濃度は５μｇ／ｍＬとした）。１時間のインキュベーション後、ペプチド及びＴ細胞を加えた。スポット数は、１６時間の共培養後に計測した。
【００４７】
９．抗原性タンパク質提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣの作製
ＣＤ１４−ＭＬは、ポリブレン（８ｎｇ／ｍｌ）存在下、ＣＭＶｐｐ６５又はＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡをエンコードするレンチウイルスベクターを用いて形質転換した。細胞を、２０％ ＦＣＳ、Ｍ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ中で培養した。レンチウィルス導入２日後から、細胞をピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）存在下で２週間培養した。改変したＣＤ１４−ＭＬ中の抗原性タンパク質の提示は、フローサイトメトリー分析により確認した。次いで、抗原提示ＣＤ−１４−ＭＬ（ＣＤ１４−ＭＬ／ＣＭＶ又はＣＤ１４−ＭＬ／ＭＡＲＴ１）にＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を加え、ＤＣ（ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶ又はＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１）へと分化させた。
【００４８】
１０．ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶを用いたＣＤ８+Ｔ細胞の刺激
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶは、２日間ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、照射をし、そして２４ウェル培養プレートに播いた（１×１０5細胞／ウェル）。同一ドナー由来末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞をウェルに添加した（２×１０6細胞／ウェル）。細胞を、５％のヒト非動化血漿とｒｈＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）を含んだＡＩＭ−Ｖ培地で培養した。ｒｈＩＬ−２（２０ Ｕ／ｍｌ）を２日目に加えた。９日目に、細胞を集め、ＦＩＴＣラベルした抗ヒトＣＤ８ｍＡｂを組み合わせて、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＭＶｐｐ６５341-349（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ）（配列番号１６）複合体のＰＥラベルしたｔｅｔｒａｍｅｒ（ＭＢＬ、日本）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＭＶ特異的なＴ細胞によるＩＦＮ−γ生産を分析するために、ＣＤ８+Ｔ細胞（１×１０4細胞／ウェル）を、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性ＣＭＶ ｐｐ６５341-349ペプチドで前もってパルスしたＣＤ１４−ＭＬ／ＣＭＶ又はＣ１Ｒ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２提示Ｃ１Ｒ細胞（１×１０4細胞／ウェル）と共培養した。１６時間後、培養を終了し、ＩＦＮ−γ産生細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を用い計数した。
【００４９】
１１．ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１を用いたＣＤ８+Ｔ細胞の刺激
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１を、ＯＫ４３２で刺激し、照射し、次いで、２４ウェル培養プレートで、５％のヒト非動化血漿とｒｈＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した２ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中で、同一ドナー由来ＣＤ８+Ｔ細胞（２×１０6細胞／ウェル）と共培養した。７日目及び１４日目に、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ−ＭＡＲＴ１とｒｈＩＬ−７を加え、９日目及び１６日目にｒｈＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を加えた。２１日目に、ＣＤ８+Ｔ細胞を集め、ＦＩＴＣラベルした抗ヒトＣＤ８ ｍＡｂと組み合わせて、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１ペプチド複合体のＰＥラベルされたｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色し、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析によってＩＦＮ−γ生産を分析するために、ＣＤ８+Ｔ細胞（１×１０4細胞／ウェル）を、ＭＡＲＴ１26-35ペプチドで前もってパルスした同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ−ＭＡＲＴ１又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞（１×１０4細胞／ウェル）とともに１６時間共培養した。
【００５０】
（実施例１）
ＣＤ１４−ＭＬの改良作製法
発明者らは、以前に、レンチウイルスによってｃＭＹＣとＢＭＩ１を導入することによりＣＤ１４+単球の増殖を誘導出来ることを報告し、ＣＤ１４−ＭＬを作製した。それにもかかわらず、献血ドナー間において増殖効率にはばらつきがあり、１２人の血液ドナー中の３人に由来する単球の増殖は誘導できなかった。そこで、ＣＤ１４−ＭＬの作製効率の改善を試みた。この目的のため、２つの遺伝要因に加えて、他の要因を研究した。細胞増殖を助ける又は促進するかもしれない要因として、例えば、ＢＣＬ２，ＬＹＬ１，ＢＣＬ−ＸＬ，ＭＬＬＴ１，ＭＥＩＳ１，ＨＯＸＡ９，Ｅ２Ｆ２，Ｅ４Ｆ１，ＰＨＣ１，ＰＢＸ１，ＣＤＴ１，ＭＬＦ１，Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ２，ＭＹＢ，ＳＯＸ２，ＣＢＸ５，ＡＵＲＫＢ，及びＢＵＢ１を試した。その結果、以前報告した２つの因子ｃＭＹＣとＢＭＩ１に加えて、ＢＣＬ２又はＬＹＬ１を導入すると、増殖誘導効率を著しく改善した。
【００５１】
ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２を導入してから３〜５週間後に、細胞の増殖が観察された。すべての提供者からの単球サンプルが顕著な増殖を示した。単球は、凍結融解した単球ではなく、新たに調製した単球を用いた。本実施例で用いたサンプルは、以前の報告でｃＭＹＣ及びＢＭＩ１のみの導入によっては増殖誘導できなかったドナーからのサンプルを含む。増殖の期間、速度、及び程度は、ドナー間でまだばらついているが、本発明の方法では、細胞数は少なくとも１００倍に増加した。結果を図１に示す。同様にして、ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＬＹＬ１を用いた場合も細胞数は著しく増加した。
以前の方法（ｃＭＹＣ及びＢＭＩ１を導入）で作製されたＣＤ−１４−ＭＬと同様に、本発明の方法（ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２又はＬＹＬ１を導入）によるＣＤ１４−ＭＬの増殖は、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの両者の存在に依存した。本発明の方法により作製したＣＤ１４−ＭＬの形態観察をした結果を図２に示す。図２Ｂに示されるように、ＣＤ１４−ＭＬは、単球より大きく、単球様の不規則な核の代わりに丸い核を持っている。
【００５２】
（実施例２）
改良法（ｃＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ２を導入）によって作製されたＣＤ１４−ＭＬのＤＣへの分化
ＣＤ１４−ＭＬをＤＣｓに分化させるために、ＩＬ−４を加えた。３日後に、ヒト単球由来ＤＣ（ｍｏ−ＤＣ）の強力な成熟誘導物であるＯＫ４３２（ペニシリン殺菌したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を加えた。ｍｏ−ＤＣ及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣは２日間ＯＫ４３２で刺激した後、顕微鏡分析をした。結果を図２Ｃに示す。データは、２回の実験の結果である。以前の方法で作製されたＣＤ１４−ＭＬと同様に、本発明の方法により作製されたＣＤ１４−ＭＬもまた、典型的なＤＣ様の形態と突起をもったＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣへと分化した（図２Ｃ）。
【００５３】
次に、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの細胞表面分子、とＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０の生産を確認した。ＯＫ４３２による処置の前後のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣについて、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの発現について分析した。コントロールとして、ＯＫ４３２で刺激したｍｏ−ＤＣ（単球由来ＤＣ）を用いた。結果を図３Ａに示す。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの発現は、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣで検出され、それらの発現はＯＫ４３２による刺激で増幅された。これらの分子の発現レベルは、ｍｏ−ＤＣのそれと殆ど同じであった。
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ及びｍｏ−ＤＣｓを、ＯＫ４３２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、９６穴平底培養プレート（１×１０5細胞／２００μｌ培地／ウェル）で培養した。６０時間後に、培地上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図３Ｂに示す。データは、２回の実験の結果である。ＯＫ４３２による刺激によって、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣは、ｍｏ−ＤＣより多くの量のＩＬ−１２ｐ７０を産生した。全体としては、本発明の方法により作製したＣＤ１４−ＭＬは、完全に成熟したＤＣの表現形を持ったＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣへと分化した。
【００５４】
（実際例３）
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣによるＴ細胞刺激と抗原提示
一次同種異系（ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）Ｔ細胞刺激アッセイを用い、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣについて、ネイティブなＴ細胞を刺激する能力を確認した。ＣＤ１４−ＭＬ（菱形）、ＩＬ−４（正方形）又はＯＫ４３２（三角形）で刺激したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ、或いはｍｏ−ＤＣ（円）を、照射し、同一ドナー由来の末梢血Ｔ細胞（４×１０4細胞／ウェル）と共培養した。或いは、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（円）のみを照射し培養した。培養は、９６穴丸底培養プレートで、５日間行った。Ｔ細胞の増殖は、最後の１６時間の培養での［3Ｈ］−メチルチミジン取り込みによって測定した。実験は、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４−ＭＬで行った。結果を図４Ａに示す。ＣＤ１４−ＭＬ及びｍｏ−ＤＣに比べて、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣは、同種異系Ｔ細胞の増殖をより顕著に誘導した。ＯＫ４３２による処理は、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣのＴ細胞刺激能力をさらに強化した。
【００５５】
次に、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓが、ＨＬＡクラスＩＩとの関係で抗原性ペプチドを提示することができるかどうかを確認した。発明者らは以前、レスポンダーとして、ＧＡＤ６５111-131特異的ＤＲ５３（ＤＲＢ４＊０１：０３）拘束性ヒトＣＤ４+Ｔ細胞のクローンを確立した。ＤＲ５３ポジティブドナーからのＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを、ＧＡＤ６５ペプチドでパルスし、そのＴ細胞クローンと共に培養した。図中に示した数のＣＤ−１４−ＭＬ−ＤＣｓを、ＧＡＤ６５111-131ペプチド（菱形）で負荷し、或いはそのまま負荷せず（正方形）、Ｘ線照射し、次いで、ＧＡＤ６５特異的ＨＬＡ−ＤＲ５３拘束性クローンのヒトＣＤ４+Ｔ細胞（３×１０4細胞／ウェル）と３日間、共培養した。Ｔ細胞の増殖反応は、最後の１６時間の培養での［3Ｈ］−メチルチミジンの取り込みで測定した。実験は、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４−ＭＬで行った。結果を図４Ｂに示す。Ｔ細胞は、特異的な増殖反応を示し、このことは、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓが、ＨＬＡクラスＩＩとの関係で抗原性ペプチドを提示し、Ｔ細胞を刺激できることを示している。
【００５６】
次に、タンパク質抗原のプロセッシング能力を調べた。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを、組み換え型ＧＳＴ融合ＧＡＤ６５タンパク質又はＧＳＴタンパク質の存在下で、１６時間培養（パルス）し、Ｘ線照射し、次いで、ＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞を加えた。Ｔ細胞の増殖反応を分析した。実験は、２人の異なるドナー由来のＣＤ１４−ＭＬで行った。結果を図４Ｃに示す。ＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞は、用量依存的に増殖し、このことは、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣが、タンパク質抗原をプロセッシングし、抗原性ペプチドを提示できることを示している。
【００５７】
（実施例４）
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによる健常者ドナーからの抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導。
図５Ａに示される培養プロトコルに従って、抗原性ペプチドを負荷したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを用いたインビトロ刺激によって、がん抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞をプライム（ｐｒｉｍｅ）した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを作製するために、ＣＤ１４−ＭＬにＩＬ−４を添加した。３日後、ＯＫ４３２を添加した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓをペプチドで３時間パルスし、Ｘ線照射し（４５ Ｇｙ）、次いで同一ドナー由来のＣＤ８+Ｔ細胞を混合した。細胞を、５％の非動化ヒト血漿を含むＡＩＭ−Ｖ中で、ｒＩＬ−７（１０ ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。７日目と１４日目に、ペプチドでパルスした同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで刺激し、９日目と１６日目に、ｒＩＬ−２（２０ ＩＵ／ｍｌ）を添加した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓは、毎回調製し、ＩＬ−４のみ添加した（ＯＫ４３２は添加しない）。ペプチド刺激を３サイクル繰り返した後の６日目又は７日目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析及びフローサイトメトリー分析を行った。
【００５８】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ポジティブの健常者ドナー由来の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞を、４種類の既に同定されたがん抗原由来ペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＣＤＣＡ１56-64、ＫＩＦ２０Ａ66-75、ＬＹ６Ｋ177-186及びＩＭＰ−３508-516；ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＣＤＣＡ１351-359、ＫＩＦ２０Ａ809-817、ＭＡＲＴ１26-35及びＩＭＰ３515-523）の混合物で前もって負荷した同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓと共培養した。ペプチド負荷したＤＣｓを用いたＴ細胞刺激を週に一度繰り返し、３週間続けた。ＨＩＶペプチドをコントロールペプチドとして用いた。２１日目に、Ｔ細胞を集め、刺激物質としてＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ポジティブＣＩＲ細胞又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ポジティブＴ２細胞を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって個々のペプチドに対する反応性を分析した。結果を図５Ｂ及びＣに示す。
健常者ドナー（一人がＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ポジティブ）からのＴ細胞から、３週間の誘導培養によりＣＤＣＡ１56-64及びＬＹ６Ｋ177-186に反応性のＴ細胞が誘導された（図５Ｂ、Ｃ）。ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒによる染色により、３週間の刺激培養の間の特定のＴ細胞の増幅を確認した。
【００５９】
同様にして、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ポジティブドナー（ドナー２）から得られた細胞について実験を行った。Ｔ細胞刺激のために、４つのペプチド（ＣＤＣＡ１351-359、ＫＩＦ２０Ａ809-817、ＭＡＲＴ１26-35、及びＩＭＰ３515-523）を用いた。結果を図６に示す。上記と同様に、ＣＤＣＡ１351-359、ＭＡＲＴ１26-35、及びＩＭＰ３515-523に反応性のＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がポジティブな健常者ドナー２の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞から誘導された。
これらの結果は、ＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチドを負荷したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓが、同一ドナー由来のＣＤ８+Ｔ細胞集団中の特定のＣＤ８+Ｔ細胞を刺激でき、ｍｏ−ＤＣと同じようにして、それらの増幅を誘導できることを示唆している。
【００６０】
（実施例５）
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるがん抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の刺激
次に、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣの抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を誘導する能力を検討した。図７Ａに培養スケジュールを示す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性エピトープとして既に同定されている６種類のがん抗原由来ペプチド（ＣＤＣＡ１39-64、ＣＤＣＡ１55-78、ＫＩＦ２０Ａ60-84、ＫＩＦ２０Ａ809-833、ＬＹ６Ｋ119-142及びＬＹ６Ｋ172-191）を用いた。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを作製するために、ＣＤ１４−ＭＬにＩＬ−４を添加した。３日後、ＯＫ４３２を添加した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを、６つのペプチド（ＣＤＣＡ１39-64、ＣＤＣＡ１55-78、ＫＩＦ２０Ａ60-84、ＫＩＦ２０Ａ809-833、ＬＹ６Ｋ119-142、及びＬＹ６Ｋ172-191）の混合物で３時間パルスし、Ｘ線照射し（４５ Ｇｙ）、次いで５％の非動化ヒト血漿を含むＡＩＭ−Ｖ中の同一ドナー由来のＣＤ４+Ｔ細胞と混合した。７日目に、ペプチドでパルスした同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで刺激し、ｒＩＬ−７（５ ｎｇ／ｍｌ）を添加した。２日後に、培地にｒＩＬ−２（１０ ＩＵ／ｍｌ）を添加した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓは、ＩＬ−４のみ添加した（ＯＫ４３２は添加しない）。１４日目に、各ウェルの刺激したＣＤ４+細胞の特性をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで分析した。同族のペプチドに対する特異的反応性を示すＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、ペプチドでパルスした同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで再刺激し、次いで、ｒＩＬ−７（５ ｎｇ／ｍｌ）及びｒＩＬ−２（２０ ＩＵ／ｍｌ）を添加した。２１日目に、ペプチドでパルスした同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで再刺激し、ｒＩＬ−７及びｒＩＬ−２を添加した。ペプチド刺激を４サイクル繰り返した後の６日目又は７日目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。
【００６１】
結果を図７Ｂ及びＣに示す。図７Ｂは、健常者ドナー３から得られたＣＤ４+Ｔセルラインを、ＨＬＡ−ＤＲ依存的な方法で、ＣＤＣＡ１39-64、ＣＤＣＡ１55-78、及びＬＹ６Ｋ172-191と反応させた結果であり、健常者ドナー２（図７Ｃ）と同様の結果が得られた。これらの結果は、ペプチド負荷したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓが、インビトロ刺激培養で、抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を誘導できたことを示唆している。
【００６２】
（実施例６）
がん患者から確立したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓによるＴ細胞刺激
がん患者から得た単球は、健常者ドナーからの単球に比べてしばしば生存しづらい。そのような場合、報告されているように、単球からの樹状細胞の作製は非常に困難である。従って、健康なドナーからだけでなくがん患者からもＣＤ１４−ＭＬが確立できるのは非常に有用である。そこで、ＨＮＣ患者から得られた単球からのＣＤ１４ＭＬの確立を試みた。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの、抗原特異的ＣＤ８+Ｔセルラインを誘導する能力を試験した。
図５Ａに示したのと同様のスケジュールにて、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ポジティブなＨＮＣ患者から得られた末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞を、ペプチド混合物（ＣＤＣＡ１56-64、ＫＩＦ２０Ａ66-75、ＬＹ６Ｋ177-186及びＩＭＰ−３508-516）で前もって負荷した同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓと共培養し、それらのペプチドに反応性のＴ細胞を誘導した。７日目と１４日目に、ＣＤ８+Ｔ細胞を、ペプチドを負荷したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで再刺激した。２１日目に、ペプチドに反応するＣＤ８+Ｔ細胞の数をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。ＨＩＶペプチドをコントロールペプチドとして用いた。結果を図８Ａ（がん患者１）及び図８Ｂ（がん患者２）に示す。
２１日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、及びＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＤＣＡ１56-64、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＫＩＦ２０Ａ66-75又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＬＹ６Ｋ１77-186 ｔｅｔｒａｍｅｒで染色した。結果を図８Ｂ（がん患者１）及び図８Ｄ（がん患者２）に示す。図中の数は、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを示している。
ＣＤ８+Ｔ細胞のＣＤＣＡ１56-64、ＬＹ６Ｋ177-186、及びＫＩＦ２０Ａ66-75に対する反応性ががん患者で観察された。結果として、２人の患者（がん患者１及び２）から得られた単球から、ＣＤ１４ＭＬの確立に成功した。そして、得られたＣＤ１４ＭＬは、ＩＬ−４の刺激によりＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣに分化できた。
【００６３】
同様に、がん患者由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを用いてがん抗原特異的ＣＤ４+Ｔセルラインの誘導を試みた。
ＨＮＣ患者のＰＢＭＣｓから単離されたＣＤ４+Ｔ細胞を、６種類のペプチド（ＣＤＣＡ１39-64、ＣＤＣＡ１55-78、ＫＩＦ２０Ａ60-84、ＫＩＦ２０Ａ809-833、ＬＹ６Ｋ119-142、及びＬＹ６Ｋ172-191）の混合物でパルスしたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓで刺激した。３回サイクルを越える刺激をした後、各ペプチドに反応したＣＤ４+Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。がん患者からの血液サンプルは少量しか得られないので、アッセイにおいてＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを刺激物質として用いた。結果を図９に示す。誘導培養から集めたがん患者１由来のＣＤ４+Ｔセルラインは、ＨＬＡ−ＤＱ又はＨＬＡ−ＤＲ拘束性で、ＣＤＣＡ１55-78及びＬＹ６Ｋ172-191ペプチドに反応した（図９Ａ）。誘導培養から集めたがん患者２由来のＣＤ４+Ｔセルラインは、ＨＬＡ−ＤＱ又はＨＬＡ−ＤＲ拘束性で、ＣＤＣＡ１39-764、ＣＤＣＡ１55-78、及びＬＹ６Ｋ172-191ペプチドと反応した（図９Ｂ）。
上記より、がん患者の単球からのＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの作製は実行可能であった。そして、がん患者由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓは、抗原特異的Ｔ細胞反応を誘導するために十分な能力を有していた。
【００６４】
（実施例７）
ＣＤ１４−ＭＬの遺伝子組換えによるＣＭＶｐｐ６５提示ＣＤ１４ＭＬ−ＤＣの作製
合成ペプチドで前もって負荷したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓを用いたインビトロ刺激により抗原特異的ＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔセルラインが確立できたので、次に、ＣＤ１４−ＭＬの増殖能を利用することにより、抗原性タンパク質を提示する遺伝子改変ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの作製を試みた。
図１０Ａに、ＣＭＶｐｐ６５（ＥＦ−ＣＭＶ−ＩＰ）及びＭＡＲＴ１（ＥＦ−ＭＡＲＴ１−ＩＰ）のレンチウイルス構築物を示す。ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ポジティブドナー由来のＣＤ１４−ＭＬを、ＩＲＥＳ（内部リボソームエントリーサイト）−ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼカセットを持つＣＭＶｐｐ６５のレンチウィルスベクターを用いて形質転換した。細胞を、ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）の存在下で２週間培養して、導入遺伝子をもつ細胞集団を選択して増殖させ、ＣＤ１４−ＭＬ／ＣＭＶ及びＣＤ１４−ＭＬ／ＭＡＲＴ１を作製した。その後、得られたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶ）のＣＭＶｐｐ６５発現を、フローサイトメトリー分析により確認した（図１０Ｂ）。
【００６５】
ＣＤ１４−ＭＬ培養にＩＬ−４を添加し、そして、刺激物質として得られたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２がポジティブな健常者ドナーに由来するＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶを用いて、同一ドナー由来の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞からのＣＭＶ特異的ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導を行った。ＣＭＶ特異的反応を調べるために、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性ＣＭＶｐｐ６５由来エピトープ（ＣＭＶｐｐ６５341-349）でパルスしたＣ１Ｒ細胞と一晩共培養したのち、ＩＦＮ−γ生成細胞を調べた。９日目に、ＣＭＶｐｐ６５341-349ペプチドに反応性のＴ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。図１０Ｃに示される結果は、ＣＭＶｐｐ６５341-349反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの誘導が成功したことを示している。
【００６６】
また、９日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ及びＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＣＭＶｐｐ６５341-349複合体のｔｅｔｒａｍｅｒで染色した。図１０Ｄに示されるように、ＣＭＶｐｐ６５341-349反応性ＣＤ８+Ｔ細胞はまた、ｔｅｔｒａｍｅｒで染色することにより検出された。
【００６７】
次に、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０１にホモである他の血液ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ネガティブな健常者ドナー）からのＣＭＶ−ｐｐ６５反応性ＣＤ８+Ｔセルラインの作成を試みた。このＨＬＡ−ＡアレルについてのＣＭＶ由来エピトープに関する情報はなかった。ＣＭＶｐｐ６５提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの作製と同一ドナー由来のＣＤ８+Ｔ細胞との共培養は、上記と同じ手順によって行った。ＣＭＶｐｐ６５に対する反応性を検出するために、得られたＴ細胞を、ＣＭＶｐｐ６５の導入遺伝子の有無の条件で、同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬと共培養した。９日目に、ＣＤ８+Ｔ細胞を生産するＩＦＮ−γの数を、刺激物質としてＣＤ１４−ＭＬとＣＤ１４−ＭＬ／ＣＭＶを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。図１０Ｅに示されるように、ｐｐ６５タンパク質への反応がこの分析において観察された。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＣＭＶｐｐ６５で刺激したＴ細胞をさらに活性化し、刺激培養前のＴ細胞を比較した。この反応は、抗ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体の添加でブロックされ、このことは、この反応がＨＬＡクラスＩによって制限されていたことを示している。このドナーのエピトープは同定していないが、エピトープに関する情報が利用可能か否かにかかわらず、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の刺激が可能であることが証明された。
【００６８】
（実施例８）
ＭＡＲＴ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓの作製
次いで、上記と同様の方法により、ＭＡＲＴ１／Ｍｅｌａｎ−Ａ提示ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣを作製した。ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１は、２人の血液ドナーから作製した。一人（健常者ドナー２）はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がポジティブであり、他の一人（健常者ドナー４）はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がネガティブであった。得られたＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓ（ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１）におけるＭＡＲＴ１タンパク質の発現は、特異的抗体による染色とそれに続くフローサイトメトリー分析によって確認した。結果を図１１Ａに示す。
【００６９】
ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ−ＭＡＲＴ１を、同一ドナー由来の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞と共培養した。ＣＤ８+Ｔ細胞は、一週間に一度、ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１で刺激し、３週間培養を続けた。２１日目に、培養Ｔ細胞のＭＡＲＴ１に対する反応性を分析した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ポジティブドナーからの培養Ｔ細胞を、既知のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性エピトープ（ＭＡＲＴ１26-35）で負荷したＨＬＡ−Ａ０２＊：０１提示Ｔ２細胞と共培養した。図１１Ｂに示される結果は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性エピトープに反応性のＴ細胞の誘導を示している。
【００７０】
２１日目に、Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ８ ｍＡｂ及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１26-35 ｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色し、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色されたＣＤ８+Ｔ細胞の割合を調べた。結果を図１１Ｃで示されるように、Ｔ細胞の３８．１％が、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１26-35複合体のｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色された。
【００７１】
次いで、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ネガティブドナーから誘導された回収されたＣＤ８+Ｔ細胞を、同一ドナー由来のＣＤ１４ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１又は同一ドナー由来のＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣｓと共培養した。２１日目に、ＭＡＲＴ１に反応性のＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、刺激物質としてＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ及びＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣ／ＭＡＲＴ１を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。図１１Ｄに示された結果は、Ｔ細胞がＭＡＲＴ１に反応したこと、及びその反応がＨＬＡ−クラスＩ拘束性であったことを示している。
【００７２】
以上の結果より、従来方法を改善した本発明の方法により、全ての健康な人及びがん患者からの単球の増殖を誘導できた。この方法によって調製したＣＤ１４−ＭＬは、本発明者らの従来の方法によって調製したＣＤ１４−ＭＬに比べてより活発に増殖した。この方法により作製したＣＤ１４−ＭＬの性質は、形態、細胞表面分子、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦへの依存性、樹状細胞への分化能力という点においては、本発明者らの従来の方法によって作成されたＣＤ１４−ＭＬと区別がなかった。
また、本発明の方法を用いて、抗原性タンパク質を発現する遺伝子改変したＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣが作製できることが判った。そして、本発明の方法で作製した抗原発現ＣＤ１４−ＭＬ−ＤＣは、それを用いた末梢血Ｔ細胞のインビトロ刺激によりＣＭＶｐｐ６５又はＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡに反応性のＣＤ８+Ｔセルラインの誘導に成功したことより、抗原特異的Ｔ細胞を誘導する能力を有していることが示された。これらの結果は、ワクチン治療への適用を示唆している。
そして、本発明のＣＤ１４−ＭＬ技術に基づいて、抗原性タンパク質を発現している機能的ＤＣを容易に作製でき、より重要なことは、抗原提示ＤＣｓを用いて、ＨＬＡ−拘束性エピトープの情報が入手できない場合でも、抗原特異的なＴ細胞を誘導することができることである。
【００７３】
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の方法によれば、ドナーに依存することがなく、増殖能を有する末梢血単球を大量に効率良く提供できる。また、本発明の方法により提供される単球は、機能的な樹状細胞へと分化できる。単球は、感染症や悪性腫瘍に対する細胞療法、アルツハイマー病、アミロイドーシス、あるいは、ある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が蓄積することに起因する疾患に対する細胞医薬として用いることができ、本発明の方法により提供される単球はそれらの用途に用いることができる。さらに、樹状細胞は、悪性腫瘍、感染症などに対する細胞ワクチンとして用いられており、本発明の方法により提供される樹状細胞は、それらの用途に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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