(57)【要約】【課題】タンパク質の発現効率の高い無細胞タンパク質合成技術を提供する。【解決手段】転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系においてタンパク質の発現量を増大させるためのABPV(Acute bee paralysis virus) IGR(intergenic region)-IRES(internal ribosome entry sites)核酸配列の使用。【選択図】図１
2017131171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系においてタンパク質の発現量を増大させるためのABPV(Acute bee paralysis virus) IGR(intergenic region)-IRES(internal ribosome entry sites)核酸配列の使用。
【請求項２】
タンパク質をコードする構造遺伝子がABPV IGR-IRESの制御下に組み込まれた転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成用鋳型ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の鋳型ＤＮＡ及びリボソームを含有する転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成用反応液。
【請求項４】
カイコガ抽出液をさらに含む、請求項３に記載の反応液。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の反応液を用いて構造遺伝子の転写と翻訳を１つの容器内で行い目的とするタンパク質を得ることを特徴とする、転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写・翻訳共役型無細胞系タンパク質合成に使用するDNA断片、反応液、鋳型DNA、タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞（昆虫培養細胞）などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。
【０００５】
特許文献１〜４は、転写と翻訳を別々の容器で独立して行う無細胞系タンパク質合成系の発現効率を向上させるDNA断片等を開示する。
【０００６】
無細胞系タンパク質合成において、転写と翻訳で好ましい反応条件、特にMg濃度が異なるため転写と翻訳を別の反応容器で行う転写・翻訳独立型の反応が行われていたが、この方法は操作が煩雑であり、改善が求められていた。
【０００７】
無細胞タンパク質合成系において、転写と翻訳を１つの容器内で共役して行うことは可能であるが、転写と翻訳に適した反応条件は異なるため、タンパク質の発現効率が低下するため、現在はほとんど採用されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004-350579
【特許文献２】特開2006-187275
【特許文献３】特開2009-72207
【特許文献４】特開2013-158342
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
大腸菌、酵母、真核生物細胞などを用いたタンパク質合成系は、１つのタンパク質を大量に合成するのには都合がよいが、多数のタンパク質を少量ずつ合成する場合には無細胞タンパク質合成系が適している。
【００１０】
本発明は、タンパク質の発現効率の高い無細胞タンパク質合成技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は  ABPV(Acute bee paralysis virus) IGR(intergenic region)-IRES(internal ribosome entry sites)は転写・翻訳独立型の無細胞系では公知のAcNPV 5’UTRよりも効率が劣るが、転写・翻訳共役型の無細胞系では飛躍的に発現効率が高くなることを見出した。
【００１２】
本発明は、転写・翻訳共役型無細胞系タンパク質合成系におけるABPV IGR-IRESの使用、鋳型ＤＮＡ、反応液及びタンパク質の製造方法を提供するものである。
項１．  転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系においてタンパク質の発現量を増大させるためのABPV(Acute bee paralysis virus) IGR(intergenic region)-IRES(internal ribosome entry sites)核酸配列の使用。
項２．  タンパク質をコードする構造遺伝子がABPV IGR-IRESの制御下に組み込まれた転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成用鋳型ＤＮＡ。
項３．  項２に記載の鋳型ＤＮＡ及びリボソームを含有する転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成用反応液。
項４．  カイコガ抽出液をさらに含む、項３に記載の反応液。
項５．  項３又は４に記載の反応液を用いて構造遺伝子の転写と翻訳を１つの容器内で行い目的とするタンパク質を得ることを特徴とする、転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、１つの反応容器で転写と翻訳を同時に進行させる転写・翻訳共役型の無細胞タンパク質合成系を用いて高効率で目的タンパク質を合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】転写・翻訳独立型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図２】転写・翻訳独立型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図３】転写・翻訳共役型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図４】転写・翻訳共役型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図５】ABPV IGR-IRESの配列の一部を削除した転写・翻訳共役型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図６】ABPV IGR-IRESの配列の一部を削除した転写・翻訳共役型の無細胞系タンパク質合成の結果を示す。
【図７】実施例で使用したIGR-IRESの塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、構造遺伝子をABPV IGR-IRESの制御下に置いたDNA断片を転写・翻訳共役型の無細胞系において発現させる。好ましいDNA断片は構造遺伝子の発現ベクターであり、例えばプラスミドを使用することができる。
【００１６】
ABPV IGR-IRESは、GenBankのアクセッション番号がAF150629の6301-6569のDNA配列であり、その配列を配列番号1及び図７に示す。
【００１７】
ABPV IGR-IRESは、構造遺伝子を発現させる機能を有する限り、1又は複数個、例えば１〜40個、好ましくは１〜30個、より好ましくは１〜25個、さらに好ましくは1〜20個、特に1〜15個の塩基が置換、付加、欠失又は挿入されていてもよい。また、構造遺伝子は、構造遺伝子を発現させる機能を有する限り、80%以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に98％以上の同一性を有する塩基配列であってもよい。ABPV IGR-IRESの制御下に構造遺伝子を挿入し、転写・翻訳共役型の無細胞系で発現させることにより、構造遺伝子の発現産物であるタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、透析などの常法の精製手段に従い精製することができる。
【００１８】
ABPV IGR-IRESの5’側から、25個以下、好ましくは、20個以下、より好ましくは15個以下、さらに好ましくは10個以下、特に5個以下の塩基を欠失させることができる。また、ABPV IGR-IRESの3’側から、30個以下、好ましくは25個以下、より好ましくは、20個以下、さらに好ましくは15個以下、特に好ましくは10個以下、最も好ましくは5個以下の塩基を欠失させることができる。
【００１９】
本発明のDNA断片は、ABPV IGR-IRESの5’上流側にプロモーターを有することが好ましい。プロモーターとしては、通常のものが制限なく使用することができ、例えばT7プロモーター、SP6プロモーター、T3プロモーターなどが挙げられる。また、DNA断片の構造遺伝子の下流側に3’非翻訳領域及びポリＡ配列、ターミネーター配列を有していてもよい。
【００２０】
構造遺伝子は、精製を容易にするためにHisタグ、GSTタグなどを連結してもよい。構造遺伝子がコードするタンパク質は特に限定されないが、各種の酵素、ホルモン、サイトカイン、医薬、抗原、抗体、受容体などの有用タンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が少し異なる多数のタンパク質を各々の転写・翻訳共役型の無細胞発現系で発現させてもよい。
【００２１】
転写・翻訳共役型の無細胞系タンパク質合成に使用する抽出物としては、小麦胚芽などの植物由来抽出物、ウサギ網状赤血球などの哺乳動物由来の抽出物、大腸菌などの細菌由来の抽出物、カイコガなどの昆虫培養細胞由来の抽出物のいずれを用いてもよいが、昆虫由来の抽出物が好ましく、カイコガ由来の抽出物が最も好ましい。
【００２２】
転写・翻訳共役型の無細胞系の反応液には、ABPV IGR-IRESの制御下に構造遺伝子を含むDNA断片（例えばプラスミド）、マグネシウムイオン、カリウムイオン、NTP、DTT（ジチオスレイトール、任意成分）、アミノ酸(任意成分)、スペルミジン、RNAポリメラーゼ、転写・翻訳を可能にする細胞由来の抽出物(lysate)などが含まれる。構造遺伝子のコドンユーセージは、これらの抽出物に適したものに改変することが好ましい。
【００２３】
マグネシウムイオンは、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩として反応液に添加することができる。好ましくは酢酸マグネシウムが挙げられる。マグネシウムイオンの濃度としては、無細胞系でタンパク質が生産できる限り特に限定されないが、好ましくは1.6mM〜1.8mM程度が挙げられる。
【００２４】
カリウムイオンは、酢酸カリウム、塩化カリウムなどのカリウム塩として反応液に添加することができる。好ましくは酢酸カリウムが挙げられる。カリウムイオンの濃度としては、無細胞系でタンパク質が生産できる限り特に限定されないが、好ましくは100mM〜150mM程度が挙げられる。
【００２５】
NTP（ATP, GTP, UTP, CTP）の濃度としては、0.2mM〜0.6mM程度が挙げられる。
【００２６】
DTTはなくても問題ないが、例えば0〜0.05mM程度で使用してもよい。
【００２７】
カイコガなどの抽出液(lysate)としては、例えば10〜20%(v/v)程度が挙げられる。
【００２８】
アミノ酸は、添加しなくてもよいが、反応液1ml当たり0〜60μM程度添加してもよい。
【００２９】
スペルミジンは、例えば0.1〜1mM程度、好ましくは0.2〜0.3mM程度添加する。
【００３０】
転写・翻訳共役型無細胞系タンパク質合成系の反応温度は、15〜32℃程度、好ましくは25〜30℃程度、最も好ましくは28℃程度である。このような反応温度で合成されるタンパク質量が多くなる。
【００３１】
転写・翻訳共役型無細胞系タンパク質合成系のpHは、6〜8程度、好ましくは7〜7.8程度である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例及び比較例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実施例及び比較例
1.  カイコガの飼育と後部絹糸腺の摘出
1-1.  カイコガの飼育
実験には錦秋×鐘和（上田蚕種）を用い，飼育は松原ら（1988）の方法に従い, 人工飼料はKIT-512 （無菌養蚕研究所）を用い，26±1°Cに設定されたクリーンルーム内での完全無菌人工飼料飼育を行った。
【００３４】
実験に供試したカイコは発達段階を同調させるために，4齢0日でいったん整え，5齢0日においては6時間以内に5齢脱皮を完了した個体を集めた。
【００３５】
1-2. 後部絹糸腺の摘出
5齢4日の幼虫を氷冷した 0.75% NaCl 溶液中で背側から切開し, 中腸を除いた後, 絹糸腺のうち, 後部絹糸腺のみを摘出した。 摘出された器官は, 別の容器に準備しておいた氷冷0.75% NaCl溶液中で, 器官などの付着物を取り除いたのち, ろ紙で充分に水分を取り除き, 1.5 g ずつアルミホイルで包み, 液体窒素で凍結した後, 実験に使用するまで-80°C下で保存した。
【００３６】
2. プラスミド
2-1. プラスミドの構築
2-1-1. pGEM-LA （IRESを含まないプラスミド）
pGL3-Control Vector (Promega)を鋳型とし，ホタルルシフェラーゼ遺伝子をpolymerase chain reaction (PCR) により増幅した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子はpGL3-Control Vector の88 ‐1737領域にコードされている。そこで，88 以降に相当する配列にEcoR Iサイトを付加した TNT-Luc#1 (5’ -GGAATTCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG- 3’ ) と，1737までに相当する配列にSal Iサイトを付加した TNT-Luc#2 (5’ -ACGCGTCGACTTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC- 3’ ) をプライマーとして，Pyrobest DNA polymerase (TAKARA Bio) を用い，98℃, 10秒，61℃, 30秒，72℃, 60秒 を1サイクルとして25回の反応を行い，増幅されたDNAはNucleoSpin Extract II (MACHEREY-NAGEL) で精製した。精製DNAとpTNT Vector (Promega) は制限酵素, EcoR I,とSal Iでそれぞれ消化し，ライゲーション反応により生成されたプラスミドをpTNT-Lucと名づけた。
【００３７】
次に，pTNT-Lucを制限酵素 ，EcoR IとBamH Iで消化し，これをTAE [0.04M Tris，0.04M Acetic acid，0.5M EDTA (pH 8.0)] を含む1 % Agarose ゲル (Seakem GTG：BMA) をTAE緩衝液，50V定電圧で電気泳動した．EtBr (エチレンブロマイド) で染色後，UVイルミネーター上で 1,744 bpのDNA断片をゲルから切り出した．切り出したゲルはNucleoSpin Extract II (MACHEREY-NAGEL)を用い， DNAの精製，回収を行った．これを，制限酵素 ，EcoR I,とBamH Iで消化したpGEM-3Zf (+) Vector (Promega)とライゲーション反応をおこない，生成されたプラスミドベクターをpGEM-LAと名づけた。
【００３８】
2-1-2. pAc-LA(比較例で使用する公知のプラスミド)
pTNT-Lucを制限酵素Bgl IIとXho Iで消化し，この間に，T7 RNA polymarase promotor (TAATACGACTCACTATAGG) と夜盗蛾の一種 (Autographa californica)の 核多核体病ウイルス (nuclear polyhdrosis virus) のポリヘドリン遺伝子の5’ UTR配列(5’-AAGTATTTTACTGTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT-3’; Possee et al., 1991) を挿入した。
【００３９】
2-1-3. pPSIV-LA
Plautia stali intestine virus (PSIV; GenBank Accession No. AB006531) の複製酵素前駆体遺伝子と外皮タンパク質前駆体遺伝子の間にあるIGR-IRES配列およびその前後の配列がクローニングされたpT7CAT5373 (平塚和之 教授, 横浜国立大学より分与された) を鋳型として，5,955以降に相当する配列にBgl IIサイト(AGATCT)，RNA polymarase promotor配列を付加した PSIV2-1 (5’ -GAAGATCTAATACGACTCACTATAGGACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAG- 3’ ) と，6,223までに相当する配列にXho Iサイトを付加した PSIV2-2 (5’ -CCGCTCGAGCCTGCCTGCGCTCCTGGTATACGC- 3’ ) をプライマーとして，Pyrobest DNA polymerase (TAKARA Bio) を用い，98℃ 10秒，63℃ 30秒，72℃ 60秒 を1サイクルとして30回の反応を行った。この増幅されたDNAを精製した後，pTNT-LucのBgl II, Xho Iサイトに挿入した。 
【００４０】
2-1-4. pCrPV-LA, pDCV-LA, pRhPV-LA, pABPV-LA
Cricket paralysis virus isolate CrPV-3 (CrPV; GenBank Accession No. KP974707), Drosophila C virus strain EB (DCV; GenBank Accession No. AF014388), Rhopalosiphum padi virus (RhPV ; GenBank Accession No. AF022937), Acute bee paralysis virus (ABPV; GenBank Accession No. AF150629),のそれぞれIGR-IRES配列およびその前後の配列(Nakajima and Uchiumi, 2009 ; 5,980-6,248, 6,026-6,296, 6,885-7,141, 6,301-6,569) に，5’端にはBgl II, T7 promoter配列 (AGATCTAATACGACTCACTATAGG) を, 3’端にはXho I配列 (CTCGAG) を附加した配列を化学合成し, pUC119に由来するBlue Heron pUC; BLUEHERON Biotechnology) にクローニングしたpUC-CrPV, pUC-DCV, pUC-RhPV, pUC-ABPV,をLife Technologiesに依頼して作成した。各配列を図7に示す。
【００４１】
すべてのプラスミドは，全て大腸菌DH5αに形質転換し, 50 ppm Ampicilinを含む Luria-Bertanis broth (LB) 50 ml で37°C, 18 時間培養した。 このプラスミドを精製した後, Bgl II, Xho Iで消化した。 これをTAE [0.04 M Tris，0.04 M Acetic acid，0.5 M EDTA (pH 8.0)] を含む1 % Agarose ゲル (Seakem GTG：BMA) を用いてTAE緩衝液，50V定電圧で電気泳動した。 EtBr (エチジウムブロマイド) で染色後，化学合成により作製したDNA部分に相当する300 bp付近のDNA断片をゲルから切り出した。切り出したゲルからキットの説明書に従いNucleoSpin Extract II (MACHEREY-NAGEL) を用いて，DNAの精製，回収を行った。次に，それぞれのIGR-IRESをpTNT-LucのBgl II, Xho Iサイトに挿入した。結果，生成されたCrPV, DCV, RhPV, ABPVのIGR-IRESを含むプラスミドを, それぞれpCrPV-LA, pDCV-LA, pRhPV-LA, pABPV-LAと名付けた。
【００４２】
2-1-5. pABPV-LAの短縮化および改変
第2-1-4項で構築したpABPV-LAを鋳型に，表１に表すプライマーを用い，KOD -plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO) を使用して，配列の短縮化および改変をおこなった。なお，PCR条件は94 °C 2分, (98 °C 10秒, 68 °C 7分10秒)×5回, または10回の条件でPCRを行った。なお，配列の短縮化および改変をシークエンスにより確認した。
【００４３】
【表１】
2017131171.tif 000003
【００４４】
2-2. プラスミドDNAの調製
上記すべてのプラスミドは大腸菌DH5αに形質転換し, 50 ppm Ampicilinを含む Luria-Bertanis broth (LB) 50 ml で37°C, 18時間培養した。これをPure Yield Midiprep System (Promega) を用い, キットの説明に従って, プラスミドを精製した。なお，精製したプラスミドは適当に希釈し，Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies) を用いて，添付された説明書に従ってプラスミドDNAの純度及び濃度を求めた。
【００４５】
3. 無細胞翻訳反応系
3-1.  in vitro transcriptionによるRNA合成
前項で構築・精製したプラスミドDNAを BamH I で切断して直鎖化したのち, フェノール/クロロホルム処理を2回, クロロホルム処理を1回行い, エタノール沈殿によりDNA を沈殿させ, 蒸留水に再溶解した。
【００４６】
この直鎖化したDNAを鋳型として， Ribomax Large Scale RNA Production System - T7 (Promega) を用い, キットに添付されている説明書に従って, in vitro transcription によりRNA を合成した。 反応時間は4時間とし, 反応終了後, RNase-free DNaseで処理し, フェノール/クロロホルム処理を2回, クロロホルム処理を1回行い, エタノール沈殿法により, RNAを沈殿させた。 その後, 全量を100 μlのD.W. に溶解し, NICK columns (GE helthcare) に供してヌクレオチドの排除を目的とした精製を行った。精製したRNAは適当に希釈し，添付された説明書に従い，Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies)を用いて濃度を求め，最終的に全て2.0 μg/μlになるように蒸留水で調整した。なお，以降の無細胞翻訳反応系には，-80°Cに少量ずつ分注・保存したものを使用した。
【００４７】
3-2. 器官抽出液の作製
凍結状態の後部絹糸腺を, 氷冷した0.75% NaCl 溶液に移し, 穏やかに解凍した。完全に解凍が確認された後, 器官に付着する余分な水分をろ紙で取り除き, これを, あらかじめ氷冷したLoose タイプのガラス製ダウンス型ホモジナイザー （直径 13 mm, 長さ 82 mm, 筒長175 mm, Wheaton）に移した。 後部絹糸腺 1.5 g に対して氷冷した抽出緩衝液 [20 mM HEPES-KOH pH7.0 (Nacalai tesque), 150 mM Potasium acetate (KOAc; Nacalai tesque), 2 mM Magnesium acetate (MgOAc; Nacalai tesque), 2 μM Leupeptin (Peptide institute), 20% (W/V) Glycerol (Nacalai tesque), 50 μg/ml Bentonite (Nacalai tesque)] を, 1.5 ml 加え, 氷冷下でペッスルを5回上下させた。 これを, 20,000×g, 4°C, 30分遠心し, その上清を丁寧に回収した。上清に組織片が浮遊している場合は，さらに，20,000×g, 4°C,15分遠心した。 これを以降，翻訳系Lysateと呼ぶ。
【００４８】
3-3. 反応
無細胞翻訳反応液 [20 mM HEPES-KOH, pH 7.0, 125 mM KOAc, 1.75 mM MgOAc, 0.75 mM ATP, 1 mM GTP, 25 mM Creatin phosphate (CP), 200 μg/ml Creatin kinase (CK), 6% (w/v) Glycerol, 1 mM DTT, 40 μM Amino Acid Mixture, 250 μM EGTA, 1.5 U/μl RNase Inhibitor, 100 μg/ml tRNA, 160 μg/ml 前項において調製したさまざま構造をもつルシフェラーゼmRNA, 7.5 μl Lysate] は総量25 μlとして25°C下で反応させた。結果を図1及び図2に示す。図1は，ルシフェラーゼの発光量から測定した相対量を，図2はそれをウエスタンブロットで検討した結果である。
【００４９】
4. 無細胞転写-翻訳共役反応系
4-1. 器官抽出液の作製
凍結状態の後部絹糸腺を, 氷冷した0.75% NaCl 溶液に移し, 穏やかに解凍した。完全に解凍が確認された後, 器官に付着する余分な水分をろ紙で取り除き, これを, あらかじめ氷冷したLoose タイプのガラス製ダウンス型ホモジナイザー （直径 13 mm, 長さ 82 mm, 筒長175 mm, Wheaton）に移した。後部絹糸腺 1.5 g に対して氷冷した抽出緩衝液[10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)-KOH pH 7.8 (Nacalai tesque), 2 μM Leupeptin (ペプチド研究所), 20% (W/V) Glycerol (Nacalai tesque), 50 μg/ml Bentonite (Nacalai tesque)] を, 1.5 ml 加え, 氷冷下でペッスルを4回上下させた。これを, 20,000×g, 4°C, 30分遠心し, その上清を丁寧に回収した。上清に組織片が浮遊している場合は，さらに，20,000×g, 4°C,15分遠心した。これを以降，ライセート (Lysate) と呼ぶ。
【００５０】
4-2. 反応
反応系は [2 M potassium acetate (KOAc; Nacalai tesque) 1.4 μl , 100 mM magnesium acetate (MgOAc ; Nacalai tesque) 0.4 μl , 10 mM adenosine triphosphate (ATP; Promega) 1.0 μl, 10 mM uridine triphosphate (UTP; Promega) 1.0 μl, 10 mM cytidine triphosphate (CTP; Promega) 1.0 μl, 10 mM guanosine triphosphate (GTP; Promega) 1.0 μl, 2.5 mM dithiothreitol (DTT) 0.5 μl , 10 mM spermidine 0.5 μl , 19 U/μl T7 RNA polymerase (Promega) 2.0 μl, Lysate 2.5 μl] に，第2-2.項で精製したプラスミドを適当量添加し，これに精製水を加えることで，反応液25 μl とした。反応は28°Cで行った。結果を図3〜図6に示す。図3は，ルシフェラーゼの発光量から測定した相対量を，図4はそれをウエスタンブロットで検討した結果である。また，配列の特定化（deletion）プラスミドを使っての，転写・翻訳共役型の合成の結果を図5，図6に示す。図5は，ルシフェラーゼの発光量から測定した相対量を，図6はそれをウエスタンブロットで検討した結果である。
【００５１】
5. ルシフェラーゼの定量
ルシフェラーゼ活性の測定は，反応系から2.5 μl を取り出し，あらかじめ28℃に保温したLuciferase Assay System (Promega) 50 μl と混合し，これを速やかに96穴タイタープレート (Nalge Nunc) に移して，ルミノメーター(Luminescencer-JNRAB2100; ATTO) で発光量を測定した．測定は25℃下で，Delay 3 秒，Integrate 5 秒の計測条件でおこない，発光積算量は機械に付属するソフトで処理することにより，求めた。
【００５２】
得られた発光積算量からは，あらかじめQuantium Reconbinant Luciferase (Promega) を用いて作成した検量線を元に，ルシフェラーゼタンパク質量を決定した。
【００５３】
6. Western blot解析
Western blotting法は，Towbin et al. (1979) とKyhse and Audenseu (1984) の方法に従った。
【００５４】
6-1. サンプルの調製
反応開始5時間後の翻訳反応液および，転写‐翻訳反応液から取り出した溶液10 μlに対して，サンプル緩衝液 [4% SDS，5% Mercaptoethanol，10% Glycerol，0.002% Bromophenol blue，125mM Tris-HCl (pH 6.8) ] を等量加え，100℃で5分間処理した。
【００５５】
6-2. 電気泳動(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;SDS-PAGE)
電気泳動はLaemmli (1970) の方法に従った。8×10，厚さ1 mmのミニスラブゲルに12.5% 分離ゲル [30% (w/v) Acrylamide-0.8% (w/v) Bisacrylamide混合液4 ml，1.5M Tris-HCl (pH8.8) 緩衝液 2.5 ml，10% SDS溶液 100 μl，H2O 3 ml，N,N,N’,N’,- Tetrametylethylenediamine (TEMED) 10 μl，10% Ammonium peroxodisulfate (APS) 溶液 100 μlを混合した] を流し込み，ゲルが固まるまで放置した。分離ゲルが固化した後，濃縮ゲル溶液 [30% (w/v) Acrylamide-0.8% (w/v) Bisacrylamide混合液0.79 ml，0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 緩衝液 1.25 ml，10% SDS溶液 50 μl，H2O 2.8 ml，TEMED 10 μl，10% APS溶液 50 μlを混合した] をさらに流し込んだ。各レーンには，第8-1項で調整したサンプルをシリンジで 10 μlずつ添加した後，泳動緩衝液 (0.025M Tris，0.192M Glycine，0.1% SDS)を用いて室温，150 V 定電圧で泳動した。
【００５６】
6-3. ポリアクリルアミドゲルから膜への転写法
SDS-PAGEによって分離されたタンパク質は，Polyvinilden difluoride膜 (PVDF膜) を用いて電気的に転写した。PVDF膜の陽極側の電極に，分離ゲルの大きさに合わせて切断したろ紙を転写用緩衝液 (20mM Glycine, 25mM Tris, 20% Methanol) に浸したものを3枚置き，その上にMethanolで1分振盪した後転写用緩衝液に浸したPVDF膜，次にポリアクリルアミドゲルを重ね，さらにその上に前述の転写用緩衝液を染み込ませたろ紙を3枚重ね，100mA 定電流，室温で1時間通電した。
【００５７】
6-4. 免疫学的検出法
転写後のPVDF膜をD.W.で三回洗浄した後，ブロッキング溶液 (0.1% スキムミルクを含むT-PBS[137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8.1 mM NaHPO4・12H2O，1.5 mM KH2PO，0.1% Polyoxyetylene Sorbitan (Tween 20)] ) 中で2時間，室温で振盪した。反応後，PVDF膜をT-PBSで1分間，室温で振盪し，この操作を3回繰り返した。一次抗体として，Anti-Luciferase pAb (Promega) をT-PBSで1,000倍希釈したものを用い，1時間，室温で振盪した後，さらに一晩，4℃でPVDF膜を反応させた。反応後，PVDF膜はT-PBSで10分間，室温で振盪し，この操作を3回繰り返した。二次抗体として，Peroxidase-conjugated Donkey Anti-Goat IgG (Promega) をT-PBSで50,000倍希釈したものを用い，1時間，室温で振盪した。反応後，PVDF膜をT-PBSで10分間，室温で振盪し，この操作を3回繰り返した。ブロットの発色はイムノスターLD (和光純薬工業) を用い，キットに添付された方法に従い，X線フィルムに感光させて，可視化した。
【００５８】
なお、ABPVの汎用優位性については，TnT T7 Insect Cell Extract Protein Expression System (Promega)  -昆虫細胞Sf21エクストラクトで確認している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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