(57)【要約】【課題】本発明は、透過性膜中空糸モジュールを細胞培養容器として使用し細胞を培養する際に、モジュール内に入り込んだ、あるいはモジュール内で発生した気泡を移動または除去することにより液流を回復する方法を提供することを課題とする。【解決手段】複数の透過性膜中空糸を内挿し、前記透過性膜中空糸の内腔に連通する液出入口および前記透過性膜中空糸の外腔に連通する液出入口を有する中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる細胞の培養方法であって、前記中空糸モジュールのプライミング処理乃至細胞培養終了までの間、前記中空糸モジュールに連続的または断続的に振動を与えることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の透過性膜中空糸を内挿し、前記透過性膜中空糸の内腔に連通する液出入口および前記透過性膜中空糸の外腔に連通する液出入口を有する中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる細胞の培養方法であって、前記中空糸モジュールのプライミング処理乃至細胞培養終了までの間、前記中空糸モジュールに連続的または断続的に振動を与えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記透過性膜中空糸の内径が１００〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記透過性膜中空糸の長さが１０〜３０ｃｍであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記振動が振動発生装置によるものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記振動の大きさが１０〜８０ｍ／ｓ２であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透過性膜中空糸を内挿した中空糸モジュールを細胞培養容器として用いて、効率よく細胞を培養するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は万能細胞であり、全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は、全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は、患者自身から採取でき、拒絶反応の恐れがないため細胞移植治療に用いる移植用細胞として注目されている。
【０００３】
ヒトにおける体性幹細胞は、現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、これら体性幹細胞は組織中には極めて少数しか存在しない。
【０００４】
そこで、生体組織から得られた体性幹細胞を生体外で培養し、治療に必要な細胞数まで増幅した後、同一人又は他人の治療に使用するという細胞移植治療の研究が進展し、実用化され始めている。
【０００５】
しかしながら、一般に実施されている細胞培養の作業では、生物学的な汚染のリスクが高いことや、人件費によるコスト高などが課題となるため、細胞移植治療の更なる発展には安全かつ低コストで幹細胞を培養することが求められる。
【０００６】
幹細胞を効率よく、かつ低コストで培養する手段の一つとして、透過性膜中空糸を培養基材とする培養方法が挙げられる。透過性膜中空糸を培養基材として用いるメリットは、通常のシャーレやフラスコ培養では実現できない接着細胞の接着面からの物質交換ができることであり、栄養分や酸素の供給と老廃物除去が効率的に実施される。中空糸内側あるいは中空糸外側の何れにおいて細胞を培養しても、こうした効果が期待できる。
【０００７】
透過性膜中空糸を用いて例えば、筒状容器の大きさに応じ、数十本〜数万本の中空糸を筒状容器内に格納することによりモジュールを作製することができる。このような中空糸モジュールは、中空糸内側および中空糸外側の何れも、モジュール容積あたりの細胞培養面積が非常に大きくなり、効率よく細胞培養を実施することが可能となる。また、透過性膜中空糸の性質やモジュールの構造上の特性を活かし、中空糸モジュールを装置に組み込んで自動細胞培養装置とすることも既に行われている。
【０００８】
一方、細胞培養に用いられる透過性膜中空糸は、内径が１００〜１０００μｍと細く、かつ培養液の流速が遅いため、中空部に気泡が残り易く、こうした気泡は培養液の流れを阻害し、ひいては細胞の増殖を妨げる等の問題の原因となる。このため、細胞培養を行う際には、中空糸内の気泡を除去する等の処理が必要である。
【０００９】
特許文献１には、細胞の増殖及び成長用の中空糸型バイオリアクターであって、細胞空間（中空糸中空部）および無細胞空間（中空糸外側）にそれぞれ異なる培地を循環するための液流回路を有するバイオリアクタシステムが開示されている。該システムにおいては、バイオリアクタシステム内の流体を１００ｍｍＨｇに加圧し、モジュールおよびチューブ内のガスバブルの形成を防ぐことが開示されている。
【００１０】
通常、気泡を除去するためには培養操作者が手で叩くなどして中空糸モジュールに衝撃を与え気泡を除去しているが、自動細胞培養装置に組み込まれた中空糸モジュールに対し、こういった操作を加えることは難しく、有効な手段が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００３−５１００６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、透過性膜中空糸モジュールを細胞培養容器として使用し細胞を培養する際に、モジュール内に入り込んだ、あるいはモジュール内で発生した気泡を移動させる、または除去することにより液流を回復させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．複数の透過性膜中空糸を内挿し、前記透過性膜中空糸の内腔に連通する液出入口および前記透過性膜中空糸の外腔に連通する液出入口を有する中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる細胞の培養方法であって、前記中空糸モジュールのプライミング処理乃至細胞培養終了までの間、前記中空糸モジュールに連続的または断続的に振動を与えることを特徴とする方法。
２．前記透過性膜中空糸の内径が１００〜１０００μｍであることを特徴とする１に記載の方法。
３．前記透過性膜中空糸の長さが１０〜４０ｃｍであることを特徴とする１または２に記載の方法。
４．前記振動が振動発生装置によるものであることを特徴とする１〜３のいずれかに記載の方法。
５．前記振動の大きさが１０〜８０ｍ／ｓ２であることを特徴とする１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、透過性膜中空糸モジュールを細胞培養容器として使用し細胞を培養する際に、前記モジュールに振動を与えることにより、特に中空糸内腔に停滞した気泡を破砕する、移動させる、乃至は除去することができるため、各中空糸内を流れる培養液の滞留を抑制することができ、高効率に細胞を培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞培養容器の一例を示す模式図である。
【図２】細胞培養容器を用いた細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【図３】本発明に使用する振動モーターの例を示す模式図である。
【図４】細胞培養容器と振動モーターの関連を示す模式図である。
【図５】細胞培養容器と振動モーターの関連を示す模式図である。
【図６】本発明の実施例および比較例における細胞増殖率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（透過性膜中空糸）
本発明において、透過性膜中空糸の素材については、細胞を中空糸表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過できる構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロースなどのセルロース系材料、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等のポリスルホン系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等の水不溶性担体が好適に利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、透過性膜中空糸はこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されていてもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をポリビニルピロリドンやエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。また、使用する細胞に応じて、中空糸への接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコーティングしたものでも良い。
【００１８】
本発明において、透過性膜中空糸の内径は、好ましくは１００〜１０００μｍ、より好ましくは１５０〜５００μｍ程度のものが利用される。膜厚は、中空糸が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲で設定すればよく、例えば１０〜１５０μｍ程度が好ましい。中空糸の内側に細胞を播種し、培地を還流する培養を行う場合は、中空糸の内径は、二次元的な効果として、細胞の播種、増殖する面積、細胞密度だけでなく、三次元的な効果である、コンパクト性のみならず、培地との接触容積、培地の流れ、線速度、せん断力などに影響する設計や操作条件と関わる事項となることから、中空糸培養のメリットを活かす要件となる。
【００１９】
本発明において、透過性膜中空糸の孔径は、細胞は通過させないが、水、塩類、タンパク質などの培養液成分は通過させる通孔であれば、特に限定されるものではないが、細胞の培養を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が望ましく、例えば、平均孔径が０．００１〜０．５μｍ程度であることが好ましく、０．０１〜０．１μｍ程度の通孔を有するものであればさらに好ましい。また、分画分子量（篩係数が０．１未満となる分子量）は、１〜１００万程度であることが好ましく、２〜２０万程度であれば、より好ましい。さらに、膜の孔径は、培養に伴う各種生体成分の吸着や目詰まりの影響も受けることになる。すなわち、最適な設計は、これらの物質との相互作用を鑑みて実施されるべきものである。
【００２０】
本発明において、透過性膜中空糸の透水性についても、特に制限はないが、好ましくは１０〜１０００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇ、より好ましくは２０〜５００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇが適している。透水性が、小さいと十分な物資移動を発現できない。また、透水性が大きすぎると、中空糸の内部や外部流路に培地などを流した場合に、膜間の圧力差が生じ、勝手にろ過が発生し、流れが偏ってしまったり、中空糸の長さ方向で分布ができてしまうため好ましくない。
【００２１】
（透過性膜中空糸モジュール）
本発明において、透過性膜中空糸モジュールは、例えば、筒状容器に数十本〜数万本の中空糸を格納することにより作製することができる。このような中空糸モジュールは、容積あたりの培養面積を大きくすることができるため細胞培養容器として適している。また、培養操作も簡便化することが出来、効率よく細胞培養を実施することが出来る。
【００２２】
このような透過性膜中空糸を用いたモジュールの構成は特に限定されないが、例えば図１に示すように、４つの出入口を有するモジュールケース３に透過性膜中空糸４が適宜必要な本数束ねられて内挿された形態が挙げられる。より具体的には、中空糸の両端において各中空糸の内腔と外腔を分離した状態かつ中空糸の中空部が開口した状態で、適当なシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤やエポキシ系ポッティング剤など）によりモジュールケース端部に接着固定されており、前記出入口１ａまたは１ｂの一方から導入された培養液などが中空糸内腔を通ってもう一方の出入口１ｂまたは１ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記出入口のうち、残りの２つの出入口２ａまたは２ｂは、前記モジュールケース３の内側かつ前記中空糸の外腔である空間（以下、単に「外腔側」とも呼ぶ。）と連通しており、前記出入口２ａまたは２ｂの一方から導入された培養液などがモジュールの外腔側を通ってもう一方の出入口２ｂまたは２ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。
【００２３】
前記中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる場合、細胞培養は、中空糸の内腔側または外腔側のいずれにおいて行っても良いが、内腔側で培養を行うことが好ましい。たとえば、内腔側にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を出入口１ａまたは１ｂより注入することにより播種し、播種終了後、細胞懸濁液を培地に切り換えて灌流させ、内腔側にて一定期間培養を行う。この間、同時に、外腔側へも培地を側部導管より注入し灌流させることが好ましい。
【００２４】
細胞培養容器として中空糸モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地および酸素ガス等を連続的または断続的に供給することができ、細胞培養容器としてシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な交換作業は不要となり、作業者の手間や拘束時間を減らすことができる。
【００２５】
（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる細胞としては、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
【００２６】
（中空糸モジュールにおける細胞の培養）
本発明において、中空糸内腔において細胞を培養する場合には、前述の中空糸モジュールを用い、出入口の一方から細胞を懸濁した液を中空糸内腔に流入させることにより、細胞を播種することが出来る。一定時間静置し、細胞を中空糸表面に接着させた後に、インキュベーター内に設置した細胞培養容器（中空糸モジュール）に、連続的あるいは断続的に培養液を送液することにより細胞を培養、増殖させることが出来る。培養液は、細胞に必要な養分や酸素・二酸化炭素などのガスを供給する役割を有する。培養に用いられる培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。
【００２７】
（培養液が流れる速度）
本発明において、細胞培養における培養液、特に中空糸内腔を流れる培養液の流速については、流速を厳密に制御することが好ましい。流速が遅すぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流速が速すぎても、細胞周囲の環境変化が激しく、細胞が周りの環境に馴染めず、細胞が増殖しにくくなる。このように、培養液、特に中空糸内腔を流れる培養液の流速は、細胞増殖度合いや環境に応じて、調整することが好ましい。細胞増殖度合いを調べる方法は、特に限定されないが、培養液中のグルコースや乳酸塩の濃度等の測定結果をもとに行うことが出来る。細胞が播種された側に流す培養液の好ましい流速は、０．０１〜１ｍｍ／ｍｉｎである。一方、細胞が播種されていない側に流す培養液の好ましい流速は、０．０２〜５ｍｍ／ｍｉｎである。このように、細胞培養においては、中空糸内径が小さいことと培養液の流速が非常に遅いため、中空糸内腔の気泡が自然に系外に排出されることや移動することはほぼない。
【００２８】
（振動処理）
本発明において、振動発生装置は、自ら振動を発生する装置であれば、特に限定されない。例えば、モーター軸に偏芯したおもりを付けて回転させることにより振動を発生させるタイプ、磁界中でコイルに電流を流すことにより起こる力を利用して振動を発生させるタイプ（スピーカータイプ）、ピストンを油圧や空気圧によって駆動して振動を発生させるタイプ等の振動発生装置を使用することが出来る。中でも、モーター軸に偏芯したおもりを付けて回転させることにより振動を発生させるタイプ（以降、振動モーターともいう）が、小型化や費用面を考慮すると好ましい。振動モーターは、携帯電話機、ゲーム機などに幅広く用いられている。内部の回転方式の違いから、円筒型（シリンダー型）、円盤型のものなどがあるが、本発明に使用するものは、何れの形態をとるものでも構わない。
【００２９】
使用する振動モーターの振動の大きさ（振動量）は、透過性膜中空糸モジュールに対し、細胞剥離に適した振動を伝えることが出来れば特に限定されないが、振動量（加速度）が１０〜８０ｍ／ｓ２のものが適している。また、振動モーターは、所望の振動量のものを一つだけ使用しても良いし、複数個を同時に使用することで振動量を確保しても良い。但し、複数個の振動モーターを同時に使用する場合は、互いに振動を打ち消し合わないよう、空間的配置やモーターの振動数などを考慮する必要がある。
【００３０】
本発明において、気泡の処理（除去）は、細胞培養容器（中空糸モジュール）に細胞を播種する前段階だけでなく、細胞培養に係る多くの場面で利用することができる。具体的には、中空糸モジュールを細胞培養容器として使用する準備段階であるプライミング処理や細胞接着因子を中空糸表面に固定化するため処理液を充填する段階、細胞懸濁液を中空糸内腔に充填する段階、細胞懸濁液を細胞培養液に置換する段階だけでなく、細胞培養中にも本発明の気泡除去処理を施すことができる。なお、振動処理は、細胞培養中連続して行ってよいが、適当な間隔を設けて断続的に実施してもよい。
【００３１】
（細胞の回収）
透過性膜中空糸を用いて培養した細胞を回収するための手段を例を挙げて説明する。例えば、中空糸モジュールを用い中空糸内腔（内表面）において細胞を培養した場合には、培養液の灌流を停止した後、中空糸内側および外側に存在する培養液を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間灌流させ、培養液を充分ＰＢＳに置換する。次に、ＰＢＳを除去し、トリプシン等のプロテアーゼを中空糸内腔と外腔へ充填し、一定時間インキュベートする。また、このような処理の後、中空糸モジュールに接触させた振動モーターを駆動させ、中空糸モジュールに振動を与えることにより、培養細胞を中空糸膜面から剥離させる処理を併用してもよい。その後、培養液などを中空糸内腔へ流入することにより、中空糸内腔から流し出した細胞を回収することが出来る。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下に代表的な透過性膜中空糸モジュールからの細胞回収方法を記載する。
【００３３】
（細胞回収数の測定）
中空糸モジュールからの細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算法：
Ｃ＝Ｎ×１０４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０４：１ｍｍ２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量
【００３４】
（細胞増殖率の測定）
培養終了後の細胞培養容器（中空糸モジュール）より回収した生細胞数と初期の播種細胞数（１．０５×１０５）を用いて以下の式により細胞増殖率を算出した。
細胞増殖率（％）＝（回収した生細胞数−播種細胞数）／播種細胞数×１００
【００３５】
［実施例１］
（透過性膜中空糸の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０質量％、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）３６質量％、トリエチレングリコール（三井化学社製）４４質量％を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン１３．５質量％、トリエチレングリコール１６．５質量％、水７０質量％の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に、束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰なグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。乾燥後の中空糸が、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量等を調整した。
【００３６】
（細胞培養容器の作製）
試験用の中空糸モジュールを以下のように作製した。直径１ｃｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に、得られた透過性膜中空糸を１００本内挿し、ポリウレタン系ポッティング剤で中空糸両末端をモジュールケースに固定した後、ポッティング部の一部を切削し、中空糸中空部を開口させた。このようにして、図１に示すような形状の細胞培養容器（中空糸モジュール）を作製し、滅菌処理を行った。中空糸内径基準の膜面積は、およそ５５ｃｍ２であった。
【００３７】
得られた中空糸モジュールを細胞培養容器として用い、図２に示すような細胞培養装置を構成した。まず、中空糸に付着しているグリセリンを除去するために、培養液貯留容器５、６に注射用蒸留水容器に交換した後、ポンプ８、９を起動してプライミング処理を行った。注射用蒸留水をおよそ５００ｍＬ流す間、振動モーターによる振動処理を併用した。なお、振動処理は、中空糸モジュールに接触させた円盤型振動モーター（東京パーツ工業製、FM34F）１台を振動量（加速度）１７ｍ／ｓ２で駆動させ、中空糸モジュールに振動を与えた。プライミング処理を終了した後、注射用蒸留水容器をウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地を入れた培養液貯留容器に交換し、中空糸モジュール内の水を培養液に置換した。
【００３８】
（細胞培養実験）
前記培養液貯留容器５内の培養液に、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を懸濁し、中空糸内腔に充填して１晩放置し、中空糸表面に細胞を接着させた。細胞播種密度が１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように調整した。培養液貯留容器５を培養液のみの容器に交換した後、中空糸内腔側の流速０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側の流速３．４６ｍｍ／ｍｉｎで送液を開始した。培養液の送液を開始して２日後、中空糸モジュールに接触させた円盤型振動モーター（東京パーツ工業製、FM34F）１台を振動量（加速度）１７ｍ／ｓ２で１５秒間駆動させ、中空糸モジュールに振動を与えた。即ち、図４および図５に示すように、振動モーターを含む支持体で中空糸モジュールを挟んで固定した後、振動モーターを駆動させ振動を与えた。前記操作を数時間おきに実施し、気泡除去を実施した。なお、本細胞培養実験は、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間行った。
【００３９】
（中空糸モジュールからの細胞回収）
７日間培養後、培養液灌流を停止し、中空糸モジュール内にて増殖した細胞を回収した。
即ち、培養液の灌流を停止した後、中空糸内腔側および外腔側に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間灌流させ、培養液を充分ＰＢＳに置換した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を中空糸内腔側と外腔側へ静かに充填し、室温で１５分間インキュベートした。
この後、培養液を図１の１ａより中空糸内側へ流し入れ、反対側（図１の１ｂ）より流し出した細胞を回収した。回収した細胞について、生細胞数および細胞増殖率を計測した。
【００４０】
［実施例２］
培養液の送液を開始して２日後より、振動モーターとして、円筒型の振動モーター（シーアイ化成製、A4A-05-WTB-3）１台を用いて数時間おきに振動量（加速度）７ｍ／ｓ２、５分間駆動させた以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行った後、細胞を回収した。
【００４１】
［実施例３］
培養液の送液を開始して２日後より、実施例２と同様の振動モーター１台を用いて数時間おきに振動量（加速度）３ｍ／ｓ２、２５分間駆動させた以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行った後、細胞を回収した。
【００４２】
［実施例４］
培養液の送液を開始して２日後より、実施例３と同様の振動モーター１台を用いて培養全期間中、細胞培養容器に連続して振動量（加速度）３ｍ／ｓ２の振動を与えた以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行った後、細胞を回収した。
【００４３】
［比較例１］
細胞培養中の振動処理を行わなかった以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行った後、細胞を回収した。
【００４４】
［比較例２］
プライミング処理において、振動処理を行わなかった以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行った後、細胞を回収した。
【００４５】
実施例１〜３、比較例１の細胞培養実験をそれぞれ８回行った。その生細胞回収数の測定結果を表１に示した。また、細胞増殖率を表２に示した。実施例１〜３においては、生細胞回収数および細胞増殖率について良好な結果を得ることができた。一方、比較例１、２においては、実施例に比べ、生細胞回収数および細胞増殖率が見劣りする結果となった。比較例１では、細胞培養中の振動処理を省略したため、細胞培養中に発生した気泡の影響で培養液の流れが阻害されたため、細胞の生育または増殖に影響があったものと思われる。また、比較例２では、プライミング処理における気泡の除去が不十分であったため、その後の細胞播種時または細胞培養液の送液時に全中空糸に満遍なく細胞懸濁液または細胞培養液が入り込まなかったことが考えられる。すなわち、全ての中空糸を有効に活用できていなかったと考えられる。
【００４６】
【表１】
2017176043.tif 000002
【００４７】
【表２】
2017176043.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、透過性膜中空糸モジュール内を流れる培養液等の流れを滞留させる原因を取り除くことができるため、細胞を効率よく増殖させることが可能となる。
【符号の説明】
【００４９】
１        出入口（内腔側）
２        出入口（外腔側）
３        モジュールケース
４        透過性膜中空糸
５、６    培養液貯留容器
７        細胞培養容器（中空糸モジュール）
８、９    送液ポンプ
１０      廃液回収容器
１１      振動モーターのおもり
１２      振動モーター軸
１３      振動モーター本体
１４      振動モーターハウジング
１５      支持体
１６      接続バネ
【図１】
2017176043.tif 000004
【図２】
2017176043.tif 000005
【図３】
2017176043.tif 000006
【図４】
2017176043.tif 000007
【図５】
2017176043.tif 000008
【図６】
2017176043.tif 000009