(57)【要約】【課題】癌細胞における炭素線感受性のバイオマーカーおよび増感剤を提供すること。【解決手段】ｍｉＲ−３７４を含む癌細胞の炭素線感受性を評価するためのバイオマーカーが開示される。また、癌細胞の炭素線感受性を評価する方法が開示され、この方法は、癌患者から採取された生体試料から抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−３７４の発現量を測定する工程、および該発現量に基づいて該炭素線感受性を評価する工程を含む。上記方法に用いるためのキットもまた開示される。さらに、ｍｉＲ−３７４を含む炭素線増感剤も開示される。【選択図】図４
2017176056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−３７４を含む、癌細胞の炭素線感受性を評価するためのバイオマーカー。
【請求項２】
癌細胞の炭素線感受性を評価する方法であって、
癌患者から採取された生体試料から抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−３７４の発現量を測定する工程、および
該発現量に基づいて該炭素線感受性を評価する工程
を含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法に用いるための、炭素線感受性評価キット。
【請求項４】
ｍｉＲ−３７４またはその関連物質を含む、炭素線増感剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素線感受性バイオマーカー、炭素線感受性の評価方法およびキット、ならびに炭素線増感剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の放射線治療は、手術療法および薬物療法とともに重要な位置を占める。放射線治療において、特に粒子線（陽子線、重粒子線など）の治療効果には大きな期待がかかっており、世界的にも我が国は粒子線先進国として複数の粒子線による癌治療施設の設立が進められている。
【０００３】
炭素線治療を含む重粒子線治療は、種々のタイプのヒト癌にとって有望な治療法であると考えられている。重粒子線治療は、現在の４施設に加えて今後大阪地区に新設される予定であり、国全体・地域での高い注目度を有している。そして我が国は、重粒子線治療の患者数も世界一である。重粒子線治療の対象疾患は１４疾患（頭頸部腫瘍、中枢神経腫瘍、頭蓋底・傍頸髄腫瘍、非小細胞肺癌、肝細胞癌、前立腺癌、子宮癌、膵癌、骨・軟部腫瘍、直腸癌術後再発、脈絡膜悪性黒色腫、食道癌、涙腺癌、大腸癌肝転移）であるが、高度先進医療として保険診療対象外であるため患者の自己負担は重い。よって、治療前または治療初期段階において治療効果を高精度に予測する技術の開発が所望されている。
【０００４】
粒子線においても、陽子線の粒子質量に比較して、例えば、放射線医学総合研究所重粒子医科学センター病院（ＨＩＭＡＣ）の重粒子として加速および照射される炭素線の場合はその粒子質量は約１２倍であり、生物学的効果が陽子線と重粒子線とでは異なることが示唆されている。すなわち、飛程粒子のエネルギーはｍｖ２／２（ｍ＝質量、ｖ＝速度）で決まるため、エネルギーは粒子質量に比例し、炭素線では、ＤＮＡの二本鎖断裂（発生すると細胞は致死であり、癌の殺細胞効果は最も高い）を誘導するが、陽子線では二本鎖断裂までは惹起せずに、ヌクレオチドの塩基障害（変異）などを誘導して複製阻害または遅延、結果的にＤＮＡの一本鎖損傷を優先的に発生するとされる。一方で、Ｘ線は粒子質量がなく、主に活性酸素の誘導を惹起することにより、周辺に二本鎖断裂および一本鎖損傷を含む種々の変化が誘導される。このように、ゲノムに与える生化学的効果と生物学的効果とを応用可能なレベルにまで掘り下げて研究し、例えば、初回照射で治療効果と密接に関係するゲノム関係産物を鋭敏に同定する技術は、利用価値が極めて高い。
【０００５】
腫瘍多様性の根源は癌幹細胞である。放射線治療後にも癌幹細胞が残存し、難治性の根源となる。現在、粒子線治療の前後での残存する癌細胞を癌幹細胞の視点で研究した報告はほとんどなく、開発研究が残されている重要な領域である。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）は、細胞内に存在する２０〜２５塩基ほどの一本鎖ＲＮＡであり、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡが腫瘍の開始および進行の制御に関与することが示されてきている。ｍｉＲＮＡの中には、癌治療の予後因子となるもの、および臨床標的となるものが見出されている。非特許文献１は、放射線耐性癌細胞においてダウンレギュレートされるｍｉＲ−２０５が、前臨床モデルにおいて放射線増感剤として用いることができることを示している。非特許文献２には、ｍｉＲ−１８５が放射線に応じてダウンレギュレートされ、ｍｉＲ−１８５の増大が腎臓癌細胞をＸ線照射に対して感受性とすることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zhang, P.ら, miR-205 acts as a tumor radiosensitizer by targeting ZEB1 and Ubc13. Nat. Commun. 5, 5671 (2014)
【非特許文献２】Wang, J. ら, Repression of ATR pathway by miR-185 enhances radiation-induced apoptosis and proliferation inhibition. Cell Death Dis. 4, e699 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、癌細胞における炭素線に対する感受性のバイオマーカーおよび増感剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｍｉＲ−３７４を含む、癌細胞の炭素線感受性を評価するためのバイオマーカーを提供する。
【００１０】
本発明は、癌細胞の炭素線感受性を評価する方法であって、
癌患者から採取された癌細胞を含む生体試料から抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−３７４の発現量を測定する工程を含み、
該発現量に基づいて該炭素線感受性を評価する工程
を含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、上記方法に用いるための、炭素線感受性評価キットを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、ｍｉＲ−３７４またはその関連物質を含む、炭素線増感剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、癌患者に対する炭素線治療の有効性の予測の一助となり得る。また、本発明によれば、炭素線治療の効率性を高めるのに有用となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウス扁平上皮癌細胞、同Ｘ線耐性細胞および同炭素線耐性細胞のｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析からのクラスターマップである。
【図２】ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した、ｍｉＲ−３７４のマウス扁平上皮癌細胞、同Ｘ線耐性細胞および同炭素線耐性細胞における相対的発現を示すグラフである。
【図３】強制発現させたヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２におけるｍｉＲ−３７４の発現量を示すグラフである。
【図４】ｍｉＲ−３７４のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において過剰発現させた場合のγ線および炭素線の照射量に対する細胞生存割合の変化を示すグラフである。
【図５】ｍｉＲ−１９６のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において過剰発現させた場合のγ線および炭素線の照射量に対する細胞生存割合の変化を示すグラフである。
【図６】ｍｉＲ−３７４およびｍｉＲ−１９６のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において過剰発現させた場合の形成されたスフィア数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（炭素線感受性バイオマーカー）
本発明によれば、炭素線に対する感受性を評価するためのバイオマーカーとして、ｍｉＲ−３７４を使用することができる。
【００１６】
当該技術分野において、ｍｉＲ−３７４はｍｉＲＮＡ−３７４とも表記される。ｍｉＲ−３７４の塩基配列自体は公知であり、例えば、ｍｉＲＢａｓｅ（マイクロＲＮＡデータベース、http://microrna.sanger.ac.uk/）、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などの公知のデータベースから入手可能である。ｍｉＲ−３７４の塩基配列について、例えば、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ（マウス由来、miRBase Accession No. MIMAT0014953；配列番号１）およびｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ（ヒト由来、miRBase Accession No. MIMAT0018443；配列番号２）を配列表に示す。
【００１７】
下記実施例に示されるように、ｍｉＲ−３７４は、炭素線耐性癌細胞においてその発現がダウンレギュレートされ、癌細胞での過剰発現により炭素線感受性が増大する。したがって、癌患者から採取した生体試料中のｍｉＲ−３７４を、それ自体公知の方法に従って測定することにより、患者の癌細胞が炭素線に対して耐性または感受性かを評価し得る。また、ｍｉＲ−３７４は、炭素線増感剤として使用され得る。ｍｉＲ−３７４を用いて、癌細胞の炭素線に対する感受性を増大させ得、よって、炭素線照射による癌の治療効果を高め得る。
【００１８】
（癌細胞の炭素線感受性を評価する方法およびキット）
本発明は、癌細胞の炭素線感受性を評価する方法を提供し、この方法は、癌患者から採取された生体試料から抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−３７４の発現量を測定する工程、および該発現量に基づいて該炭素線感受性を評価する工程を含む。
【００１９】
癌患者としては、癌と診断された後、癌の治療を開始する前、または癌の治療初期段階の患者が好ましいが、患者の年齢、性別、癌の種類、発生部位および病期（ステージ）などは特に限定されない。癌細胞についても、細胞の形態、増殖速度、悪性度などは特に限定されない。生体試料は、癌患者から採取した癌細胞を含む限り特に限定されない。例えば、癌患者から採取した臨床検体である。
【００２０】
採取した臨床検体としては、例えば、手術や生検により癌の発生部位から採取した癌細胞および癌細胞を含む組織、ならびに血液、血清、血漿およびリンパ液などが挙げられる。また、上記患者から採取した癌細胞または組織を培養して得られた培養物もまた、生体試料として用いられ得る。
【００２１】
生体試料からのＲＮＡの抽出は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、生体試料と、チオシアン酸グアニジンおよび界面活性剤を含む可溶化液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるＲＮＡを該混合液中に遊離させることによって、トータルＲＮＡを抽出することができる。生体試料からのＲＮＡの抽出および精製には、Trizol（登録商標）Reagent（Invitrogen社）、miRNeasy kit（QIAGEN社）やHigh Pure miRNA Isolation Kit（Roche社）などのトータルＲＮＡを抽出するための市販の試薬キットを用いてもよい。
【００２２】
抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲ−３７４の発現量の測定については、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法（例えば、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ）または、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法（例えば、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法）により、測定することができる。ｍｉＲＮＡの発現量の測定は、TaqMan（登録商標）MicroRNA Assayなどの市販のｍｉＲＮＡ定量用試薬キットを用いて行ってもよい。核酸プローブまたはプライマーは、ｍｉＲ−３７４の塩基配列に基づいて適宜設計され得る。核酸プローブまたはプライマーは、当業者が通常用いる核酸合成方法により製造することができる。
【００２３】
ｍｉＲ−３７４発現量に基づいて炭素線感受性が評価される。例えば、癌患者より摘出された癌組織について、炭素線照射前の細胞と照射後の細胞との発現量の変化量が調べられ、当該変化量に基づき、その患者の癌細胞が炭素線に対して耐性かまたは感受性かが予測され得る。この場合、照射後細胞の発現量が照射前細胞の発現量よりも低下している場合、当該癌組織細胞は炭素線耐性であると予測し得る。あるいは、ｍｉＲ−３７４発現量に関して所定の閾値を定め、測定された発現量が当該閾値以上であると、その癌細胞は炭素線感受性であり、閾値未満であると耐性であると予測し得る。
【００２４】
上記のようなｍｉＲ−３７４発現量に基づく癌細胞の炭素線感受性の評価は、以下に示すような癌の評価方法と併用してもよい：癌増殖法、スフェア形成法、コロニー形成法、浸潤能評価法、運動能評価法、細胞死評価法、アポトーシス評価法、マウス移植法および治療実験、遺伝子組換えマウス発癌法および治療実験など。
【００２５】
バイオマーカーは、上記評価方法に必要な構成要素を備えるようにキット化されてもよい。よって、本発明は、上記評価方法で用いられる、炭素線感受性評価キットもまた提供する。例えば、当該キットは、核酸プローブによるハイブリダイゼーション用には、ｍｉＲ−３７４の発現量を測定するために必要な核酸プローブ（例えばｍｉＲ−３７４ハイブリダイズする核酸プローブ）、ならびに必要に応じてハイブリダイゼーション法に通常用いられ得る他の試薬、および指示書を備え得る。あるいはＰＣＲ用には、ｍｉＲ−３７４の発現量を測定するために必要なプライマー対（例えばｍｉＲ−３７４を増幅可能なプライマー対）、ならびに必要に応じてＰＣＲ法に通常用いられ得る他の試薬、および指示書を備え得る。
【００２６】
（炭素線増感剤）
本発明は、ｍｉＲ−３７４を含有する炭素線増感剤を提供する。本発明の炭素線増感剤は、炭素線に対する増感作用を奏する限り、その有効成分として、ｍｉＲ−３７４の関連物質を含有してもよい。「ｍｉＲ−３７４の関連物質」は、ｍｉＲ−３７４に基づく下記のような改変物であり得るが、炭素線に対する増感作用を奏するものである限り限定されない。例えば、ｍｉＲ−３７４の関連物質としては、ｍｉＲ−３７４を参照して変更、置換、欠失、順序変更などが施された塩基配列からなるＲＮＡ（以下、単に「ＲＮＡ配列改変体」ともいう）が挙げられる。例えば、このＲＮＡ配列改変体は、ｍｉＲ−３７４の塩基配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、よりさらに好ましくは少なくとも９５％、なお好ましくは少なくとも９７％の相同性を有する塩基配列からなるものであり得る。本明細書においては、配列の相同性は、配列同士をアライメントする際に７塩基で設定して比較され得る（これは、マイクロＲＮＡのシード配列が平均７塩基であることと、ゲノム参照プログラムの相同性検索が８０％を標準として実施されていることに基づく。なお、配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ検索（Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448）やＢＬＡＳＴ検索により決定され得る。さらに、ｍｉＲ−３７４関連物質としては、ｍｉＲ−３７４のプロトタイプに化学的な分子内架橋および／または分子間架橋が施されたもの、ｍｉＲ−３７４のプロトタイプに炭素、リン、または窒素の原子置換が施されたものなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の増感剤は、炭素線に対する増感作用を奏する限り、ｍｉＲ−３７４とその関連物質との混合物、ｍｉＲ−３７４とその関連物質との融合物（例えば、ｍｉＲ−３７４とＲＮＡ配列改変体との配列を連結した融合物）を、その製剤の有効成分として含むものでもよい。さらに、その製剤の有効成分として、ｍｉＲ−３７４とＲＮＡ配列改変体との配列を連結した融合物のうちの一部の配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、よりさらに好ましくは少なくとも９５％、なお好ましくは少なくとも９７％の相同性を有する塩基配列からなるものであってもよい。
【００２８】
本発明の増感剤は、医薬上許容可能な担体をさらに含んでいてもよい。また、本発明の増感剤は、特異的に標的組織へ送達させることを可能にする標識やナノカプセルなどを含有するものであり得る。また、本発明の増感剤は、癌の治療に有効な公知の抗癌剤等の他の薬効成分をさらに含んでもよく、また、投薬時にこれらの抗癌剤と併用されてもよい。増感剤の投与経路および投与のタイミング等は、当業者により適宜決定され得る。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００３０】
下記の実施例においては、下記の材料および手順を用いた。
【００３１】
（細胞株の調製）
ＮＲ−Ｓ１（マウス扁平上皮癌、対照）、Ｘ６０（Ｘ線耐性）およびＣ３０（炭素線耐性）の細胞株を用いた。ＮＲ−Ｓ１株は、国立大学法人群馬大学  重粒子線医学研究センター医学生物学部門安藤興一教授により提供された。Ｘ６０およびＣ３０の細胞株は、国立研究開発法人  放射線医学総合研究所重粒子医科学センターの先端粒子線生物研究プログラムの佐藤克俊氏により提供された。これらの細胞を１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma社製）中で培養し、５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にて維持した。
【００３２】
（Ｘ線耐性細胞の調製）
Ｘ６０細胞を、２週ごとに１回１０ＧｙのＸ線をＮＲ−Ｓ１細胞に照射することにより樹立した。合計で６０ＧｙのＸ線放射線を細胞に照射し、最終照射後それらを４週間培養した。
【００３３】
（炭素線耐性細胞の調製）
Ｃ３０細胞を、週ごとに１回５Ｇｙの炭素線をＮＲ−Ｓ１細胞に照射することにより樹立した。合計で３０Ｇｙの炭素線放射線を細胞に照射し、最終照射後それらを４週間培養した。
【００３４】
（ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析）
細胞株から単離したヌクレオチドを3D-Geneマイクロアレイ（東レ株式会社）によって解析した。
【００３５】
（マイクロＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ）
培養細胞からTrizol（登録商標）Reagent（Invitrogen社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ｍｉＲ−３７４等のマイクロＲＮＡの逆転写をTaqman（登録商標）MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社）を用いて行った。定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をTaqman（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いることにより行った。内部標準には、ｓｎｏＲＮＡ２０２、ｓｎｏＲＮＡ２３４およびＵ６を含んだ。
【００３６】
（ｍｉＲＮＡトランスフェクション）
７０〜８０％コンフルエントの細胞のトランスフェクションを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を製造者のプロトコルに従って用いることによって行った。培地をトランスフェクションの２４時間後に新たな培地と交換した。
【００３７】
（コロニー形成アッセイ）
ヒト膵臓癌細胞株のＰＡＮＣ−１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株（共に理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）より入手）のそれぞれを、陰性対照（Pre-miRTM miRNA Precursor Negative Control #1、Ambion社）、ｍｉＲ−１９６およびｍｉＲ−３７４のいずれかでトランスフェクトした。炭素線照射を放射線医学総合研究所の重粒子線がん治療装置（ＨＩＭＡＣ）で、そしてγ線照射を大阪大学のガンマセルで行った。トランスフェクトを行った１日後に、これらのトランスフェクトした細胞に対し、炭素線を０、１、２、３、４、５、６Ｇにて、またはγ線を０、２、４、６、８、１０、１２Ｇｙにて照射した。照射後の細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中で３７℃にて１２日間インキュベートした。クリスタルバイオレット染色を用いて細胞５０個以上をコロニーと定義して生存細胞数を計数し、生存細胞割合を求めた。
【００３８】
（スフィア形成アッセイ）
ＰＡＮＣ−１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株のそれぞれを陰性対照、ｍｉＲ−１９６およびｍｉＲ−３７４のいずれかでトランスフェクトした後、細胞（１０００、５００、および１００細胞／ウェルの細胞）を、Ｎ２補体（Invitrogen社）、上皮成長因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ、R & D Systems社）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ、R & D Systems社）を補充した無血清培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れた９６ウェルプレート中に播種した。１４日のインキュベーション後、直径が１００μｍより大きいスフィアを計数した。
【００３９】
（統計学的解析）
各実験を３回以上繰り返した。データは平均±ＳＤとして表す。統計学的有意性は、Microsoft Excelソフトウェア（Microsoft Campus社）を用いてスチューデントのｔ検定で求めた。なお、各図面中の「＊」はｐ＜０．０５での有意差を示す。
【００４０】
（実施例１：Ｘ線耐性細胞および炭素線耐性細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の検討および放射線耐性に関与するｍｉＲＮＡのスクリーニング）
炭素線耐性に関与するｍｉＲＮＡを同定するために、上記のようにマウス扁平上皮癌細胞株からＸ線耐性細胞株および炭素線耐性細胞株を調製し、次いでｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析を用いてこれらの耐性細胞のｍｉＲＮＡプロフィールを得た。
【００４１】
図１は、マウス扁平上皮癌細胞、同Ｘ線耐性細胞および同炭素線耐性細胞のｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析からのクラスターマップである。合計１２６５のマイクロＲＮＡを、マイクロアレイ解析を用いて解析した。ＮＲ−Ｓ１−ａは対照細胞株（未処理のマウス扁平上皮癌細胞）である。ＮＲ−Ｓ１−Ｘ６０はＸ線耐性細胞株であり、ＮＲ−Ｓ１−Ｘ６０−Ａ３およびＮＲ−Ｓ１−Ｘ６０−Ｈ２はＮＲ−Ｓ１−Ｘ６０に由来する単クローンである。ＮＲ−Ｓ１−Ｃ３０は炭素線耐性細胞株であり、ＮＲ−Ｓ１−Ｃ３０−２およびＮＲ−Ｓ１−Ｃ３０−１０はＮＲ−Ｓ１−Ｃ３０に由来する単クローンである。図１に示されるように、Ｘ線照射で生じた放射線耐性細胞株（Ｘ線耐性細胞株）と炭素線照射で生じた放射線耐性細胞株（炭素線耐性細胞株）との間でｍｉＲＮＡ発現パターンは異なっていた。
【００４２】
これらのｍｉＲＮＡのどれが炭素線耐性に関するものであるかを調べるために、ｍｉＲＮＡを、ＮＣＢＩ遺伝子データベースおよびｍｉＲＢａｓｅ（マイクロＲＮＡデータベース）を用いてスクリーニングした。
【００４３】
解析した１２６５のｍｉＲＮＡのうち、Ｃ３０細胞株（炭素線耐性細胞株）において４つがアップレギュレートされ、１１がダウンレギュレートされていた。これらのｍｉＲＮＡの発現結果を表１に示す。表１中の数値は、マイクロアレイ解析からのｌｏｇ２表記の平均値である。
【００４４】
【表１】
2017176056.tif 000003
【００４５】
各ｍｉＲＮＡを調べてその機能を同定し、その配列がヒトｍｉＲＮＡのものと適合するかを決定した。ｍｉＲＮＡ  ｍｍｕ−ｍｉＲ−３０６８−３ｐは、ヒトに存在しないため採用しなかった。
【００４６】
マイクロアレイ解析からの平均ｌｏｇ２比率値に基づいて、３つのアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９４−３ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１４９−３ｐおよびｍｍｕ−ｍｉＲ−２８６１）と、２つのダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ）とをさらなる研究のために選択した。
【００４７】
選択したｍｉＲＮＡの細胞発現がマイクロアレイ結果と一致することを確かめるために、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。このうち、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ（ｍｉＲ−３７４）のマウス扁平上皮癌細胞（ＮＲ−１）、同Ｘ線耐性細胞（Ｘ３０）および同炭素線耐性細胞（Ｃ３０）の発現結果を図２に示す。図２においては、対照のマウス扁平上皮癌細胞（左）の発現量を１として、同Ｘ線耐性細胞（中央）および同炭素線耐性細胞（右）の発現量を相対的値として示す。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果、ｍｉＲ−５３２については、実際の発現とマイクロアレイの結果とが一致していなかったので採用しなかった。
【００４８】
さらに、放射線増感剤としてのｍｉＲＮＡの使用に関する以前の研究は、ダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡに集中していた（例えば、ｍｉＲ−２０５（非特許文献１）およびｍｉＲ−１８５（非特許文献２））。
【００４９】
以上の検討の結果、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ（ｍｉＲ−１９６）およびｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ（ｍｉＲ−３７４）を続く実施例２のために採用した。
【００５０】
（実施例２：炭素線照射に対するｍｉＲＮＡの放射線増感作用）
炭素線治療は、治療法に耐性である癌である膵臓細胞癌において臨床試験では良好な治療結果が出ており、よって膵臓細胞癌は、この治療が有望な癌である。そこで、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において、ｍｉＲ−１９６およびｍｉＲ−３７４をリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸで過剰発現させた。ｍｉＲ−１９６は、マウス（ｍｍｕ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、miRBase Accession No. MIMAT0000518：配列番号３）とヒト（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、miRBase Accession No. MIMAT0000226：配列番号４）とで配列が同じであるため、そのままマウスの配列に基づくＲＮＡを用いた。ｍｉＲ−３７４は、マウスの配列（ｍｍｕ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、miRBase Accession No. MIMAT0014953：配列番号１）の３’末端にＣＵの２塩基が追加されたヒトの配列（ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、miRBase Accession No. MIMAT0018443：配列番号２）に基づくＲＮＡを用いた。実際の発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにて確認した。
【００５１】
トランスフェクト後のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２におけるｍｉＲ−３７４発現量を図３に示す。図３においては、ＰＡＮＣ１（右）およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２（左）ともに、陰性対照（未発現の対照：ＮＣ、左の棒）を０として、トランスフェクト後の発現量（ｍｉＲ−３７４、右の棒）を相対的値として示す。どちらの細胞においても、トランスフェクト後のｍｉＲ−３７４の発現増大が確認された。
【００５２】
これらの過剰発現細胞に対してγ線照射または炭素線照射のいずれかで処理した後、コロニー形成アッセイを行い、ｍｉＲＮＡの発現が放射線感受性を変化したかを調べた。
【００５３】
図４および図５は、それぞれｍｉＲ−３７４（図４）およびｍｉＲ−１９６（図５）のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において過剰発現させた場合のγ線および炭素線の照射量に対する細胞生存割合の変化を示すグラフである。
【００５４】
図４および図５のいずれとも、上段の２つのグラフはγ線照射に対する生存割合を示し、下段の２つのグラフは、炭素線照射に対する生存割合を示し、左側の上下段２つのグラフはヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１の結果を示し、右側の上下段の２つのグラフはヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ−２の結果を示す。さらにいずれの図とも、横軸は放射線照射量（Ｇｙ）、縦軸は生存割合（％）を示す。白四角は陰性対照細胞（ＮＣ：いずれのｍｉＲＮＡも過剰発現させていない細胞）、白三角はｍｉＲ−３７４過剰発現細胞（ｍｉＲ−３７４）、そして白菱形はｍｉＲ−１９６過剰発現細胞（ｍｉＲ−１９６）の結果を表し、実線は対照細胞、破線はｍｉＲＮＡ過剰発現細胞の結果を表す。生存割合の％値が低いほど細胞が死滅したことを示す。よって、破線が実線よりも低い位置にあると、ｍｉＲＮＡの発現により放射線感受性が増大したことが示される。
【００５５】
ｍｉＲ−３７４の過剰発現は、ＰＡＮＣ−１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２両細胞とも炭素線照射に対する感受性を増大したが、γ線感受性には変化はなかった（図４）。これに対し、ｍｉＲ−１９６を過剰発現する細胞株は、γ線照射に対しては未発現の陰性対照よりもより耐性であった。炭素線照射に対して、ｍｉＲ−１９６を過剰発現するＰＡＮＣ−１細胞は未発現の陰性対照よりもやや感受性であったが、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株においては炭素線感受性に変化はなかった（図５）。
【００５６】
さらに、これらの過剰発現細胞に対してスフィア形成アッセイを行い、腫瘍形成能を調べ、これらのｍｉＲＮＡの癌幹細胞に対する作用を検討した。
【００５７】
図６は、ｍｉＲ−３７４およびｍｉＲ−１９６のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２において過剰発現させた場合の形成されたスフィア数を示すグラフである。横軸の左側はＰＡＮＣ１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株の結果を示し、縦軸は１００μｍより大きいスフィアの数（％）を示す。左の棒は陰性対照細胞（ＮＣ：いずれのｍｉＲＮＡも過剰発現させていない細胞）、中央の棒はｍｉＲ−１９６過剰発現細胞（ｍｉＲ−１９６）、および右棒はｍｉＲ−３７４過剰発現細胞（ｍｉＲ−３７４）の結果を表す。
【００５８】
その結果、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞について、ｍｉＲ−１９６過剰発現はスフィア形成数を増大したのに対し、ｍｉＲ−３７４過剰発現はスフィア形成を抑制した（図６）。ＰＡＮＣ１においては、有意差は見られなかった。
【００５９】
以上の結果は、ｍｉＲ−３７４が新規な炭素線増感剤として用いられ得ることを示唆している。また、ｍｉＲ−３７４が、癌細胞の炭素線感受性に対するバイオマーカーとして用いられ得ることも示唆している。さらに、癌幹細胞特性と放射線感受性との間の関連を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、炭素線治療前の癌細胞の炭素線感受性の予測、および治療初期における炭素線治療効果の予測のための手法の開発に有用である。また、本発明は、炭素線治療への癌細胞の増感用のツールとしての利用が期待される。
【図１】
2017176056.tif 000004
【図２】
2017176056.tif 000005
【図３】
2017176056.tif 000006
【図４】
2017176056.tif 000007
【図５】
2017176056.tif 000008
【図６】
2017176056.tif 000009
【配列表】
2017176056000001.app