(57)【要約】【課題】高分子ヒアルロン酸の製造方法を提供する。【解決手段】ヒアルロン酸生産能を有する微生物を、塩濃度２ｗ／ｖ％以上５ｗ／ｖ％以下または０．２ｍｏｌ／Ｌ以上０．９ｍｏｌ／Ｌ以下の培地で培養する工程を含む、ヒアルロン酸の製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物を、塩濃度２ｗ／ｖ％以上５ｗ／ｖ％以下の培地で培養する工程を含む、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
培地の塩濃度が２ｗ／ｖ％以上４ｗ／ｖ％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物を、塩濃度０．２ｍｏｌ／Ｌ以上０．９ｍｏｌ／Ｌ以下の培地で培養する工程を含む、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項４】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカス、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・エキおよびストレプトコッカス・ピオゲネスから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
塩が、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
製造されるヒアルロン酸の分子量が７００万以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子ヒアルロン酸の製造方法ならびにそのような製造方法で得られる高分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸を含有する医薬品、飲食品および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸の２糖による繰り返し構造からなる直鎖の多糖であり、高保湿性、高粘弾性、高潤滑性等を示す素材である。それらの特徴を生かして、保湿剤として化粧品に配合するのみならず、関節症治療剤や眼科手術補助剤等の医療分野への利用も広がっている。また、近年は、ヒアルロン酸の機能への関心の高まりから、ヒアルロン酸が配合されたサプリメントや嗜好食品が多数販売されている。ヒアルロン酸は、分子量に違いにより異なる生理作用を有することが知られているため、各用途に応じて様々な平均分子量のヒアルロン酸が求められている。
【０００３】
食品や化粧品に利用されるヒアルロン酸として、鶏冠からの抽出物や、ストレプトコッカス属等のヒアルロン酸を生産する微生物を培地で培養し、精製して得たものが一般的に用いられている。特定の分子量のヒアルロン酸の生産方法としては、例えば、ストレプトコッカス・エキの変異株を培養して６ｘ１０6Ｄａを超える分子量のヒアルロン酸を生産する方法等が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３７２０３６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主な目的は、高分子量のヒアルロン酸を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸を生産する微生物を培養する際の培地の塩濃度を制御することにより上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］
ヒアルロン酸生産能を有する微生物を、塩濃度２ｗ／ｖ％以上５ｗ／ｖ％以下の培地で培養する工程を含む、ヒアルロン酸の製造方法。
［２］
培地の塩濃度が２％以上４％以下である、［１］に記載の方法。
［３］
ヒアルロン酸生産能を有する微生物を、塩濃度０．２ｍｏｌ／Ｌ以上０．９ｍｏｌ／Ｌ以下の培地で培養する工程を含む、ヒアルロン酸の製造方法。
［４］
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカス、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・エキおよびストレプトコッカス・ピオゲネスから成る群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカスである、［４］に記載の方法。
［６］
塩が、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムから選択される、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
製造されるヒアルロン酸の分子量が７００万以上である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便に高分子量のヒアルロン酸を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（１）ヒアルロン酸生産能を有する微生物
本発明において、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、ヒアルロン酸を生産する微生物である限り特に限定されず、天然に存在する微生物のみならず、ヒアルロン酸生産能を有するよう遺伝子改変された微生物を用いることもできる。
本発明の一態様において、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、ストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する微生物が好ましい。ストレプトコッカス属に属する微生物としては、例えば、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカス(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・エキ(Streptococcus equi subsp. equi)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)等が挙げられる。その中でも、ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカスがより好ましい。
【００１０】
（２）培地の塩濃度
本発明では、上記のヒアルロン酸生産能を有する微生物を培養してヒアルロン酸を製造する際に、培地の塩濃度を調整する。
【００１１】
本発明の一態様において、培地の塩濃度は、微生物の種類にもよるが、高分子ヒアルロン酸の生産能の観点から、１ｗ／ｖ％超であり、２ｗ／ｖ％以上が好ましく、３ｗ／ｖ％以上がより好ましい。また、微生物の生育のし易さの観点から、６ｗ／ｖ％以下であり、５ｗ／ｖ％以下が好ましく、４ｗ／ｖ％以下がより好ましい。例えば、１ｗ／ｖ％超６ｗ／ｖ％以下、好ましくは２ｗ／ｖ％以上５ｗ／ｖ％以下、より好ましくは２ｗ／ｖ％以上４ｗ／ｖ％以下、特に好ましくは３ｗ／ｖ％以上４ｗ／ｖ％以下の塩濃度の培地で微生物を培養することができる。
【００１２】
また、本発明の一態様において、培地の塩濃度は、微生物の種類にもよるが、高分子ヒアルロン酸の生産能の観点から、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上であり、０．３ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．４ｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましい。また、微生物の生育のし易さの観点から、１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、０．９ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．８ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、０．７ｍｏｌ／Ｌ以下が特に好ましい。例えば、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以上０．９ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ以上０．８ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．４ｍｏｌ／Ｌ以上０．８ｍｏｌ／Ｌ以下、特に好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上０．７ｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度の培地で微生物を培養することができる。
【００１３】
上記の塩濃度で微生物を培養することにより、より高分子量のヒアルロン酸を得ることができる。これは、理論に束縛されるものではないが、高塩濃度下での塩ストレス応答として、微生物が、より高分子量のヒアルロン酸を生産するようになることに起因すると考えられる。
【００１４】
塩濃度の調整に用いる塩としては、微生物が生育可能な限り特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、好ましくは塩化ナトリウムである。
【００１５】
（３）培地
塩濃度以外の点については、培地は、微生物の種類に応じた公知の培地を用いることができる。例えば：炭素源として、グルコース、フルクトース等の単糖類、乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等；窒素源としてポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素源を添加した培地を使用することができる。必要に応じて、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸；ビタミン等を添加してもよい。培地のｐＨも、微生物の種類に応じて適宜設定すればよく、例えばｐＨ５．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲とすることができる。
【００１６】
（４）培養条件
培養条件は、微生物の種類に応じて適宜選択することができ、振盪培養、通気撹拌培養等、公知の手法を用いて行うことができる。培地の温度は、２５〜４２℃程度、好ましくは３０〜４０℃程度、より好ましくは３２〜３８℃程度に制御すればよい。また、必要に応じて、好気的に培養することも可能である。培養時間も限定されず、培地の量、所望のヒアルロン酸の量に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
（５）ヒアルロン酸の単離・精製
微生物が生産した培地中のヒアルロン酸は、用途に応じて公知の方法により単離・精製することができる。例えば、加熱殺菌、各種ろ過処理、遠心分離等を実施して、菌体や培地由来の不溶性成分を除去してヒアルロン酸の粗精製物を得て、これを飲食品に添加したり化粧品等に配合したりすることもできる。また、エタノール等を用いた溶媒沈殿等、ヒアルロン酸の精製法として一般的に行われる処理によって、純度を高めたヒアルロン酸を得て、飲食品、化粧品、医薬品等に用いることもできる。公知の手法により、ナトリウム塩等のヒアルロン酸の塩として単離・精製することもできる。
【００１８】
本発明の方法で製造されるヒアルロン酸は、同一の微生物から、本発明の方法を用いずに得られるヒアルロン酸と比較して、平均分子量が大きく、例えば、６５０万以上、好ましくは、７００万以上の平均分子量を有する。平均分子量は、極限粘度法、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ法等、当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、後述の実施例に記載の方法を参照して測定することができる。
【実施例】
【００１９】
［ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカスＡＴＣＣ４３０７９の培養］
グルコース１．０％、酵母エキス１．５％および大豆ペプトン０．５％を含む培地に、塩化ナトリウムをそれぞれ０、１、２、３または４％（すなわち、０、０．１７、０．３４、０．５１または０．６８ｍｏｌ／Ｌ）となるように加えた。なお、特筆しない限り、実施例および比較例における「％」は「ｗ／ｖ％」を意味する。３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．９〜７．０に調整したのち、それぞれの培養液５０ｍＬを、炭酸カルシウム０．２５ｇを秤取った２００ｍＬバッフル付き三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）ＡＴＣＣ４３０７９を植菌し、３３℃、１２０ＲＰＭで振盪培養した。培養時間は表１に示す。塩濃度が高くなるにつれて、微生物の増殖速度が低下することを加味して、培養時間を設定した。
【００２０】
［ヒアルロン酸の平均分子量および濃度の測定］
培養液中に生産されたヒアルロン酸の分子量および濃度の測定は以下のように行った。
培養液をヒアルロン酸濃度が０．０２％以下となるように、０．２ｍｏｌ／Ｌ硝酸ナトリウム水溶液で適宜希釈し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過して検液とした。
この液を以下の条件でＳＥＣ(サイズ排除クロマトグラフィー)とＭＡＬＳ(多角度光散乱)を組み合わせたシステムで分析した。尚、解析ソフトは、ＡＳＴＲＡ Ｖ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した。結果を表１に示す。培養液中の塩濃度が高くなるにつれて、より高分子量のヒアルロン酸が得られた。
【００２１】
（ｉ）使用機器
ＳＥＣシステム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１(昭和電工社製)
（ｉｉ）分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０７ＨＱ
カラム槽温度:４０℃
溶離液:０．２ｍｏｌ／Ｌ硝酸ナトリウム水溶液
流速:０．４ｍＬ／分
試料注入量:１００μＬ
光散乱計:ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ−II（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
分析時間:４０分
【表１】
2017112901.tif 000002
【００２２】
＜比較例＞
グルコース１．０％、酵母エキス１．５％、大豆ペプトン０．５％および塩化ナトリウム０．２％（すなわち、０．０３４ｍｏｌ／Ｌ）を含む培地を、３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．９〜７．０に調整した。この培養液５０ｍＬを、炭酸カルシウム０．２５ｇを秤取った２００ｍＬバッフル付き三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。ストレプトコッカス・エキ・サブスピーシズ・ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）ＡＴＣＣ４３０７９を植菌し、３３℃、１２０ＲＰＭで振盪培養した。培養液中に生産されたヒアルロン酸の分子量測定および濃度測定は実施例と同様に行った。培養時間および測定結果を表２に示す。培養液の塩濃度が低い場合、培養を継続しても高分子量のヒアルロン酸は得られなかった。
【表２】
2017112901.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、簡便に高分子量のヒアルロン酸を製造する方法を提供するという産業上の利用可能性を有する。本発明は、医療、化粧品、食品等の分野において有用である。