(57)【要約】      （修正有）【課題】骨芽細胞の活性を阻害した骨粗鬆症モデル動物の作成方法、及び被検物質の骨粗鬆症の治療効果を評価する方法の提供。【解決手段】担体と，有効成分としての非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害するシノビオリン阻害剤を含む，骨芽細胞の活性阻害組成物を用いる非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程を含む，非ヒト骨粗鬆症モデル動物の作成方法。その非ヒト骨粗鬆症モデル動物を用いて被検物質の骨粗鬆症の治療効果を評価する。【選択図】図１
2017112836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程を含む，非ヒト骨粗鬆症モデル動物の作成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって，
前記非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程が，シノビオリン遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程を含む，  
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって，
前記非ヒト骨粗鬆症モデル動物は，骨芽細胞の活性が阻害された非ヒト骨粗鬆症モデル動物である，
方法。
【請求項４】
被検物質の骨粗鬆症の治療効果を評価する方法であって，
請求項１に記載の方法に従って，非ヒト骨粗鬆症モデル動物を作成する工程と，
前記非ヒト骨粗鬆症モデル動物に前記被検物質を投与する工程と，
前記被検物質が投与された前記非ヒト骨粗鬆症モデル動物を分析する工程とを含む，
方法。
【請求項５】
担体と，有効成分としての非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害するシノビオリン阻害剤を含み，
前記シノビオリン阻害剤が，
シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸；
配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有する，シノビオリンのｓｉＲＮＡ；及び
配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸
のいずれか又は２種以上を含む，
骨芽細胞の活性阻害組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の骨芽細胞の活性阻害組成物を含む，骨粗鬆症モデル動物を作成するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，骨粗鬆症モデル動物の作成方法に関する。より詳しく説明すると，本発明は，シノビオリンの活性を阻害することにより，骨芽細胞の活性を阻害した骨粗鬆症モデル動物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症の治療剤を開発する上で，骨粗鬆症のモデル動物（特に非ヒト哺乳動物）を作成することは重要である。
【０００３】
また，例えば，特許第４９９８８８０号には，卵巣を摘出した骨粗鬆症モデル動物が開示されている。この卵巣を除去して得られる骨粗鬆症モデル動物は，破骨細胞の活性が高まり，その結果，骨が脆弱化するとともに，骨密度が低下する。
【０００４】
特開２０１０−５１２３８号公報には，ホモシスチンを含む飼料を投与することによる骨粗鬆症モデル動物の作成方法が開示されている。この公報に開示された方法で作成された骨粗鬆症モデル動物は，骨密度が低下せずに骨折頻度が高まる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４９９８８８０号
【特許文献２】特開２０１０−５１２３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
破骨細胞を活性化させることにより得られた骨粗鬆症モデル動物は，骨以外も障害を有している場合が多く，その結果，骨粗鬆症モデルとしてふさわしくない場合がある。
【０００７】
そこで，本発明は，骨芽細胞の活性を阻害した骨粗鬆症モデル動物の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，シノビオリンの活性を阻害することにより，骨芽細胞の活性を阻害することができ，その結果，生体機能が維持された骨粗鬆症モデル動物を作成できるという実施例による知見に基づく。すなわち，本明細書の実施例において，非ヒトシノビオリンノックアウト動物を作成し，その骨密度や骨芽細胞を検出したところ，骨芽細胞が有意に減少し，骨粗鬆症のモデル動物を得ることができた。本発明は，その実施例や関連する技術に基づくものである。
【０００９】
本発明の第１の側面は，非ヒト骨粗鬆症モデル動物の作成方法に関する。この方法は，非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程を含む。
非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程の例は，シノビオリン遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程を含む工程である。非ヒト骨粗鬆症モデル動物の例は，骨芽細胞の活性が阻害された非ヒト骨粗鬆症モデル動物である。
【００１０】
本発明の第２の側面は，被検物質の骨粗鬆症の治療効果を評価する方法に関する。
この方法は，まず，先に説明した方法に従って，非ヒト骨粗鬆症モデル動物を作成する。
次に，非ヒト骨粗鬆症モデル動物に被検物質を投与する。
その後，被検物質が投与された非ヒト骨粗鬆症モデル動物を分析する。このようにすることで，被検物質に骨粗鬆症の治療効果があるか否か（又は重篤な副作用があるか否か）を評価することができる。
【００１１】
本発明の第３の側面は，骨芽細胞の活性阻害組成物に関する。骨芽細胞の活性阻害組成物は，骨芽細胞の活性を阻害するために用いられる組成物である。この組成物は，担体の他に骨芽細胞の活性を阻害することに関する有効成分であるシノビオリン阻害剤を含む。
シノビオリン阻害剤の例は，
シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸；
配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有する，シノビオリンのｓｉＲＮＡ；及び
配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸
のいずれか又は２種以上を含むものである。
【００１２】
配列番号２〜４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Ｉｚｕｍｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．,  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．  ２００９；６０（１）：６３−７２，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００７；  ２６（１）:１１３−２２．に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５／０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
【００１３】
配列番号２：５’−ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ−３’
配列番号３：５’−ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ−３’
配列番号５：５’−ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ−３’
【００１４】
「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
【００１５】
本発明の第３の側面のある態様は，有効成分が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Ｔｓｕｃｈｉｍｏｃｈｉ  Ｋ,  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；２５（１６）：７３４４−５６．に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ−３’
【００１６】
本発明の第４の側面は，第３の側面の骨芽細胞の活性阻害組成物を含む，骨粗鬆症モデル動物を作成するための組成物に関する。
【発明の効果】
【００１７】
この骨粗鬆症モデル動物は，骨芽細胞の活性を阻害する結果，破骨細胞の活性が高まっている場合もあるものの，従来の骨粗鬆症モデル動物に比べると，生態が維持されており，骨粗鬆症モデル動物としてふさわしいものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いたｐＱＣＴ法による，全骨密度，海綿骨密度，皮質骨密度および皮質骨厚の計測結果を示すグラフである。
【図２】図２は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いたｐＱＣＴ法による，皮質骨外膜周囲長，皮質内膜周囲長，Ｘ軸骨強度指標（三点曲げ方向の強度）および極座標骨強度指標（ねじり曲げ方向の強度）の計測結果を示すグラフである。
【図３】図３は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いた二次元マイクロＣＴ法による，組織量あたりの骨量の割合（ＢＤ／ＴＶ），骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ），骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）および骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）の計測結果を示すグラフである。
【図４】図４は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いた二次元マイクロＣＴ法による，骨髄腔内の点からすべての方向について骨梁に遮られることなく見渡せる範囲の骨髄腔の体積の平均であるＭａｒｒｏｕ  Ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｍ．ｓｐａｃｅ），骨梁の中の点から全ての方向の骨量の端にいたる範囲の体積の平均であるＴｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｔｒ），骨梁の結合点を結節（Ｎｄ）と定義し，他の骨量と結合していない自由端を終末と定義した場合の組織量あたりのＮｄ数，および組織量あたりの骨格線の総長（Ｔｏｔａｌ  ｓｔｒｕｔ  ｌｅｎｇｔｈ）の計測結果を示すグラフである。
【図５】図５は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を二次元マイクロＣＴ法で撮影した画像である。
【図６】図６は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，関節軟骨幅の計測結果を示すグラフである。
【図７】図７は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，軟骨下骨幅の計測結果を示すグラフである。
【図８】図８は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，関節間隙の計測結果を示すグラフである。
【図９】図９は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を顕微鏡で観察した画像である。
【図１０】図１０は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，成長速度測定，成長軟骨幅および肥大軟骨細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を顕微鏡で観察した画像である。
【図１２】図１２は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本の成長板軟骨付近の領域を顕微鏡で観察した画像である。
【図１３】図１３は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，破軟骨細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，全円柱，骨髄量および皮質骨幅の計測結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，皮質骨開幕面および内膜面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ）および静止面（ＱＳ）の割合と，皮質骨面あたりの粗鬆化面の計測結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，骨石灰化速度，骨形成速度および骨表面あたりの石灰化面の計測結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を顕微鏡で観察した画像である。
【図１８】図１８は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，二次海綿骨表面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ）および静止面（ＱＳ）の割合と，破骨細胞数，類骨幅および骨芽細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，骨石灰化速度，骨形成速度および骨表面あたりの石灰化面の計測結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，二次海綿骨表面における骨量および骨量幅の計測結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いて，二次海綿骨表面を顕微鏡観察した画像である。
【図２２】図２２は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いたｐＱＣＴ法による，全骨密度，海綿骨密度，皮質骨密度および皮質骨厚の計測結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いたｐＱＣＴ法による，皮質骨外膜周囲長，皮質内膜周囲長，Ｘ軸骨強度指標（三点曲げ方向の強度）および極座標骨強度指標（ねじり曲げ方向の強度）の計測結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を用いた二次元マイクロＣＴ法による，組織量あたりの骨量の割合（ＢＤ／ＴＶ），骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ），骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）および骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）の計測結果を示すグラフである。
【図２５】図２５は，全身性シノビオリンノックアウトマウスの摘出大腿骨を用いた二次元マイクロＣＴ法による，骨髄腔内の点からすべての方向について骨梁に遮られることなく見渡せる範囲の骨髄腔の体積の平均であるＭａｒｒｏｕ  Ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｍ．ｓｐａｃｅ），骨梁の中の点から全ての方向の骨量の端にいたる範囲の体積の平均であるＴｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｔｒ），骨梁の結合点を結節（Ｎｄ）と定義し，他の骨量と結合していない自由端を終末と定義した場合の組織量あたりのＮｄ数，および組織量あたりの骨格線の総長（Ｔｏｔａｌ  ｓｔｒｕｔ  ｌｅｎｇｔｈ）の計測結果を示すグラフである。
【図２６】図２６は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨を二次元マイクロＣＴ法で撮影した画像である。
【図２７】図２７は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，関節軟骨幅の計測結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，成長速度測定，成長軟骨幅および肥大軟骨細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を顕微鏡で観察した画像である。
【図３０】図３０は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いた，破軟骨細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図３１】図３１は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，全円柱，骨髄量および皮質骨幅の計測結果を示すグラフである。
【図３２】図３２は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，皮質骨開幕面および内膜面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ）および静止面（ＱＳ）の割合と，皮質骨面あたりの粗鬆化面の計測結果を示すグラフである。
【図３３】図３３は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を用いた，骨石灰化速度，骨形成速度および骨表面あたりの石灰化面の計測結果を示すグラフである。
【図３４】図３４は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の大腿骨骨幹部研磨標本を顕微鏡で観察した画像である。
【図３５】図３５は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，二次海綿骨表面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ）および静止面（ＱＳ）の割合と，破骨細胞数，類骨幅および骨芽細胞数の計測結果を示すグラフである。
【図３６】図３６は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，骨石灰化速度，骨形成速度および骨表面あたりの石灰化面の計測結果を示すグラフである。
【図３７】図３７は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いた，二次海綿骨表面における骨量および骨量幅の計測結果を示すグラフである。
【図３８】図３８は，全身性コンディショナルＫＯマウスの摘出大腿骨の膝関節温存薄切標本を用いて，二次海綿骨表面を顕微鏡観察した画像である。
【図３９】図３９は，全身性コンディショナルノックアウト（ＫＯ）マウス（シノビオリンノックアウトマウス（ｓｙｖｎ１ ｃＫＯマウス））の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００２０】
本発明の第１の側面は，非ヒト骨粗鬆症モデル動物の作成方法に関する。非ヒト骨粗鬆症モデル動物は，骨粗鬆症のモデルとなるヒト以外の哺乳動物である。非ヒト骨粗鬆症モデル動物を用いることで，骨粗鬆症の治療剤の開発や治療方法の開発を行うことができる。
【００２１】
このモデル動物の作成方法は，非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程を含む。後述するとおり，シノビオリン，シノビオリンタンパク質及びシノビオリン遺伝子は公知である。また，ある遺伝子の発現や機能を阻害する方法も公知である。本発明は，公知の方法を適宜利用して，非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害すればよい。非ヒト哺乳動物におけるシノビオリンタンパク質の発現又は機能を阻害する工程の例は，シノビオリン遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程を含む工程である。非ヒト骨粗鬆症モデル動物の例は，骨芽細胞の活性が阻害された非ヒト骨粗鬆症モデル動物である。
【００２２】
本発明の第２の側面は，被検物質の骨粗鬆症の治療効果を評価する方法に関する。
この方法は，まず，先に説明した方法に従って，非ヒト骨粗鬆症モデル動物を作成する。
次に，非ヒト骨粗鬆症モデル動物に被検物質を投与する。被検物質は，公知の担体と共に，経口投与されても良いし，注射剤として関節など骨組織又は骨組織の周囲に投与されてもよい。その後，被検物質が投与された非ヒト骨粗鬆症モデル動物を分析する。非ヒト骨粗鬆症モデル動物を分析する方法は，公知である。非ヒト骨粗鬆症モデル動物を分析する方法の例は，骨密度を測定する方法，骨強度を測定する方法，骨に含まれる塩などの成分を測定する方法，コラーゲン量やコラーゲンの架橋状態を測定する方法，軟骨密度を測定する方法，及び骨や軟骨の状態を画像分析する方法である。このようにすることで，被検物質に骨粗鬆症の治療効果があるか否か（又は重篤な副作用があるか否か）を評価できる。
【００２３】
本発明の第３の側面は，骨芽細胞の活性阻害組成物に関する。骨芽細胞の活性阻害組成物は，骨芽細胞の活性を阻害するために用いられる組成物である。この組成物は，担体の他に骨芽細胞の活性を阻害することに関する有効成分であるシノビオリン阻害剤を含む。担体は，薬学的に許容される担体である。
シノビオリン阻害剤の例は，
シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸；
配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有する，シノビオリンのｓｉＲＮＡ；及び
配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸
のいずれか又は２種以上を含むものである。
【００２４】
本発明の第４の側面は，第３の側面の骨芽細胞の活性阻害組成物を含む，骨粗鬆症モデル動物を作成するための組成物に関する。上記した骨芽細胞の活性阻害組成物を対象となる非ヒト哺乳動物に投与することで，非ヒト骨粗鬆症モデル動物を作成できる。
【００２５】
ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号は，ＡＢ０２４６９０（配列番号１）である。
【００２６】
ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質以外のタンパク質であっても，これと高い相同性（通常７０％以上，好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上，最も好ましくは９５％以上）を有し，かつ，シノビオリンタンパク質が有する機能を持つタンパク質は，本発明のシノビオリンに含まれる。
【００２７】
本発明における「シノビオリン遺伝子」には，例えば，配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトのシノビオリン遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００２８】
また，配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対応する他の生物の内在性のＤＮＡは，一般的に，配列番号１に記載のＤＮＡと高い相同性を有する。高い相同性とは，50％以上，好ましくは７０％以上，さらに好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上(例えば，９５％以上，さらには９６％，９７％，９８％又は９９％以上)の相同性を意味する。この相同性は，ｍＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ。（１９９０）  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄｓｃｉ.  ＵＳＡ ８７:  ２２６４−８;Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−７）によって決定することができる。また，該ＤＮＡは，生体内から単離した場合，配列番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては，例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃」，「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」，「１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」であり，よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」，「０．５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」および「０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」の条件を挙げることができる。当業者においては，他の生物におけるシノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を，シノビオリン遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお，本明細書においては，ヒト以外の生物におけるシノビオリンタンパク質（遺伝子）に相当するタンパク質（遺伝子），あるいは，上述のシノビオリンと機能的に同等なタンパク質（遺伝子）を，単に「シノビオリンタンパク質（遺伝子）」と記載する場合がある。
【００２９】
本発明の「シノビオリン」は，天然のタンパク質のほか，遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は，例えばシノビオリンタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方，組換えタンパク質は，シノビオリンタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は，例えば，後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００３０】
本発明において「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」とは，シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること，またはこれらの転写・翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。
【００３１】
上述の各種機能は，当業者においては，一般的な技術を用いて，適宜，評価（測定）することが可能である。具体的には，後述の実施例に記載の方法，あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００３２】
従って，「シノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する」とは，野生型シノビオリン遺伝子またはタンパク質の量，機能または活性と比較して，その量，機能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には，機能と発現の両者を阻害すること，およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。
【００３３】
ユビキチン化は，具体的には，ユビキチン活性化酵素（Ｅ１），ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返すことにより，基質となるタンパク質にユビキチン分子を枝状に結合させてポリユビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリユビキチン鎖は，ユビキチン分子内の４８番目のリシン残基のε‐アミノ基を介して形成され，２６Ｓプロテアソームへの分解シグナルとなり，標的タンパク質を分解に導く。
【００３４】
被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する方法は，例えば国際公開ＷＯ２００６−１３７５１４号パンフレットに開示されている方法を適宜用いればよい。
【００３５】
被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響
【００３６】
シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる。この際に用いられる「細胞」の例は，ヒト，マウス，又はラットに由来する細胞である。シノビオリンを発現するように形質転換された大腸菌，酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノビオリン遺伝子を発現する細胞」の例は，内在性のシノビオリン遺伝子を発現している細胞，または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され，該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は，通常シノビオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは，一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００３７】
本方法に用いる被検化合物としては，特に制限されないが，例えば，天然化合物，有機化合物，無機化合物，タンパク質，ペプチドなどの単一化合物，並びに，化合物ライブラリー，遺伝子ライブラリーの発現産物，細胞抽出物，細胞培養上清，発酵微生物産生物，海洋生物抽出物，植物抽出物等が挙げられる。
【００３８】
シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は，通常シノビオリン遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが，この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には，該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを，該細胞へ導入することにより，上記「接触」を行うことができる。
【００３９】
本方法においては次いで，シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には，転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は，当業者に公知の方法によって行うことができる。
【００４０】
例えば，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し，このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法，ＲＴ−ＰＣＲ法，ＤＮＡアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し，シノビオリンタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて，ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用いる抗体としては，検出可能な抗体であれば特に制限はないが，例えばモノクローナル抗体，またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【００４１】
本方法においては，次いで，被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は骨芽細胞の活性を阻害した骨粗鬆症モデル動物の作成方法のための剤となる。
【００４２】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該タンパク質の活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。シノビオリン蛋白質の活性への影響の例は，シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響である。
【００４３】
シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響
例えば，特開２００８−７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）には，プルムバギン（２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）及びケルセチン（２−(３,４−ジヒドロキシフェニル)−３,５,７−トリヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラノ−４−オン）がシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を阻害することが開示されている。シノビオリンの自己ユビキチン化とは，特開２００８−７４７５３号公報に開示されるように，シノビオリン同士の相互作用により生じるタンパク質のユビキチン化を意味する。タンパク質のユビキチン化は，タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じる。
【００４４】
シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響は，特開２００８−７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）に開示された方法を用いて確認すればよい。例えば，被験物質をＭＢＰ−Ｓｙｖｎ１  ΔＴＭ−Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ自己ユビキチン化反応液に添加し，３７℃で３０分間反応を行う。反応後，抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット法によりユビキチン化タンパク質を検出する。ＭＢＰ−Ｓｙｖｎ１  ΔＴＭ−Ｈｉｓは，Ｎ末端側にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ），Ｃ末端側にＨｉｓタグを融合させた膜貫通領域欠損させたシノビオリンを意味する。
【００４５】
本発明の態様は，シノビオリン阻害剤がシノビオリンのｓｉＲＮＡのものである。ＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸は，一般的にｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡとも呼ばれる。ＲＮＡｉは，標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる短鎖二本鎖ＲＮＡ（以下，「ｄｓＲＮＡ」と略称する）を細胞等に導入することにより，標的遺伝子ｍＲＮＡに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し，当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば，ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると，そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにＲＮＡｉは，標的遺伝子の発現を抑制し得ることから，従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として，または，遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。ＲＮＡｉに用いるＲＮＡは，シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが，完全な相同性を有することが好ましい。
【００４６】
ｓｉＲＮＡの設計は，以下の通り行うことができる。
（ａ） シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく，任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば，ヒトの場合では，ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号 ＡＢ０２４６９０（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
（ｂ） 選択した領域から，ＡＡで始まる配列を選択し，その配列の長さは１９〜２５塩基，好ましくは１９〜２１塩基である。その配列のＧＣ含量は，例えば４０〜６０％となるものを選択するとよい。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して，発現量を低下させる化合物を選択する工程
【００４７】
シノビオリンのｓｉＲＮＡの例は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。配列番号２〜４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Ｉｚｕｍｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ.  ２００９;６０(１):６３−７２.，  ＥＭＢＯ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００７;  ２６（１）：１１３−２２.に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
【００４８】
配列番号２：５’−ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ−３’   
配列番号３：５’−ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ−３’
配列番号５：５’−ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ−３’
【００４９】
「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
【００５０】
例えば，国際公開ＷＯ２００５−０１８６７５号パンフレット，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットには，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及び，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡのスクリーニング方法及び評価方法が開示されている。本発明においても，この公報に開示された方法を適宜用いて，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡを評価することができる。
【００５１】
本発明のある態様は，シノビオリン阻害剤が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Ｔｓｕｃｈｉｍｏｃｈｉ  Ｋ,  ｅｔ  ａｌ．,  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.２００５;２５(１６):７３４４−５６.に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ−３’
【００５２】
また，シノビオリンのデコイ核酸及びその確認方法は，例えば国際公開ＷＯ２００５−０９３０６７号パンフレット，及び国際公開ＷＯ２００５−０７４９８８号パンフレットに開示されるとおり公知である。
【００５３】
本発明のある態様は，シノビオリン阻害剤が，シノビオリンのアンチセンス核酸である。シノビオリンのアンチセンス核酸及びシノビオリンのアンチセンス核酸をスクリーニングする方法は，例えば，特開２００９−１５５２０４号公報，再表２００６−１３７５１４号及び再表２００５−０７４９８８号に開示されている。シノビオリンのアンチセンス核酸とは，シノビオリン遺伝子に相補的な配列を有し，当該遺伝子にハイブリダイズすることにより，シノビオリン遺伝子の発現を阻害することができる核酸を意味する。アンチセンス核酸は，シノビオリンをコードする遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学的手法などにより調製することができる。当該核酸化合物がシノビオリンの産生を効率的に阻害するかどうかを評価するためには，遺伝子の発現量を指標としたスクリーニング試験を行えばよい。上記アンチセンス核酸化合物としては，例えばシノビオリンの発現を，コントロールと比較して少なくとも５０％以下に抑えることができるものである。
【００５４】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては，アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては，以下のような複数の要因が存在する。即ち，三重鎖形成による転写開始阻害，ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害，合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害，イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害，スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害，キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害，開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害，ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害，および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は，転写，スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで，標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座２ 核酸ＩV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, １９９３, ３１９−３４７.）。
【００５５】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は，上記のいずれの作用によりシノビオリン遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては，シノビオリン遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば，遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また，コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように，シノビオリン遺伝子の翻訳領域だけでなく，非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も，本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は，適当なプロモーターの下流に連結され，好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は，公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は，形質転換される動物（細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが，遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて，完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上，最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス拡散を用いて標的遺伝子（しのび折ン）の発現を効果的に阻害するには，アンチセンス核酸の長さは少なくとも１５塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが，本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず，例えば１００塩基以上，または５００塩基以上であってもよい。
【００５６】
また，シノビオリン遺伝子の発現の阻害は，リボザイム，またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが，中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により，ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには，グループＩイントロン型やＲＮＡse Pに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが，ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, １９９０, ３５, ２１９１.）。
【００５７】
例えば，ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは，Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが，その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ，Ｃ１５の代わりにＡ１５又はＵ１５でも切断され得ることが示されている（ＫＯｉｚｕｍｉ, Ｍ，ｅｔ ａｌ．, ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ, １９８８, ２２８, ２２８.）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば，標的ＲＮＡ中のＵＣ，ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫＯｉｚｕｍｉ, Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ, １９８８, ２３９, ２８５.，小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, １９９０, ３５, ２１９１.，ＫＯｉｚｕｍｉ, Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓｅｓ, １９８９, １７, ７０５９.）。
【００５８】
また，ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは，例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ, ＪＭ．, Ｎａｔｕｒｅ, １９８６, ３２３, ３４９.）。ヘアピン型リボザイムからも，標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ,  Ｙ.＆  Ｓａｓａｋｉ,  Ｎ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ,  １９９１,  １９,  ６７５１．，菊池洋,  化学と生物,  １９９２,  ３０,  １１２.）。このように，リボザイムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで，該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５９】
内在性遺伝子の発現の抑制は，さらに，標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。
【００６０】
上述した本発明の剤は，経口，非経口投与のいずれでも可能である。非経口投与の場合は，経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの），経鼻投与剤型，経皮投与剤型（例えば軟膏，クリーム剤），注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は，例えば点滴等の静脈内注射，筋肉内注射，腹腔内注射，皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００６１】
投与方法は，患者の年齢，症状により適宜選択する。有効投与量は，一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ，好ましくは１〜１０μｇである。但し，上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。ｓｉＲＮＡ等の核酸を混合する場合，当該核酸の用量の例は，０．０１〜１０μｇ／ｍｌ，好ましくは０．１〜１μｇ／ｍｌである。
【００６２】
本発明の剤は，常法にしたがって製剤化することができ，医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として，水，医薬的に許容される有機溶剤，コラーゲン，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，カルボキシビニルポリマー，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリアクリル酸ナトリウム，アルギン酸ナトリウム，水溶性デキストラン，カルボキシメチルスターチナトリウム，ペクチン，メチルセルロース，エチルセルロース，キサンタンガム，アラビアゴム，カゼイン，寒天，ポリエチレングリコール，ジグリセリン，グリセリン，プロピレングリコール，ワセリン，パラフィン，ステアリルアルコール，ステアリン酸，ヒト血清アルブミン，マンニトール，ソルビトール，ラクトース，医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００６３】
上記添加物は，本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば，注射用製剤として使用する場合，精製されたＥＲストレス誘導物質を溶剤（例えば生理食塩水，緩衝液，ブドウ糖溶液等）に溶解し，これにＴｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０，ゼラチン，ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは，使用前に溶解する剤型とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては，例えば，マンニトール，ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００６４】
本発明は，シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスを産生し，それによりシノビオリンの発現を阻害するかシノビオリンの活性を阻害することで，骨芽細胞の活性を阻害した骨粗鬆症モデル動物の作成に有効であることを見出した。シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスとは，シノビオリン遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって，その正常な発現が阻害されていること，その結果，生体においてシノビオリンが正常に機能していないことを意味する。
【００６５】
また，シノビオリン遺伝子は，一部又は全部を改変又は欠損することができる。ここで，「全部」とは，シノビオリンゲノムＤＮＡのエクソン１の５'端から最後のエクソンの３'端までの領域をいう。また，「一部」とは，この領域の一部であって，シノビオリン遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。さらに，「改変」とは，単一または複数のヌクレオチドを置換，欠失，挿入，及び／又は転位させることにより，ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【００６６】
シノビオリン遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損しているノックアウト動物は，公知の方法で作製することができる。例えば，下記実施例の記載のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において，シノビオリン遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより，シノビオリンの正常な発現を阻害できる。また，本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は，同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず，さらにその子孫をも含む。
【００６７】
本発明のノックアウト動物の対象となる動物は，非ヒト動物であり，特に限定されない。例えば，ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち，実験動物として用いるには，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットが好ましく，なかでも齧歯目がさらに好ましく，近交系が多数作出されており，受精卵の培養，体外受精等の技術を考慮するとマウス及びラットが，特に好ましい。
【００６８】
ターゲッティングベクター構築のため，対象となる動物のシノビオリン遺伝子の一部を単離する。例えば，ノックアウトマウスを作製する場合は，マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからシノビオリン遺伝子をスクリーニングする。得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて，相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく，シノビオリン遺伝子を破壊し，そしてシノビオリンの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。また，ターゲッティングベクターは，公知の方法により作製することができ，例えば市販のプラスミドをバックボーンとして，上記ゲノムＤＮＡクローン，ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカーなどの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。
【００６９】
上記方法により作製したターゲッティングベクターを，受精卵，初期胚，又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し，その後，目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は，ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。選択後，目的とする相同組換えが起こった細胞を，サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を，妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。
【００７０】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と，野生型ｓｙｎｖ１遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより，第１世代（Ｆ１）として，相同染色体上の一方のｓｙｎｖ１遺伝子が相同組換えにより破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るヘテロ接合体を得ることができる。さらに，これらヘテロ接合体同士を交配させることにより，第２世代（Ｆ２）として，相同染色体上の双方のｓｙｎｖ１遺伝子が破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るホモ接合体，即ち本発明のｓｙｎｖ１ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は，体の一部（例えば尻尾）を切断し，ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。
【００７１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
＜作製例１：シノビオリンノックアウトマウスの作製＞
本実施例の全身性コンディショナルノックアウト（ＫＯ）マウス（シノビオリンノックアウトマウス（ｓｙｖｎ１ ｃＫＯマウス））の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図を図３９に示した。図中，上から順に，正常のシノビオリン遺伝子（Ｗｉｌｄ ａｌｌｅｌｅ），シノビオリンノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＶｅＣＴｏｒ），相同組換えを起こしたアレル（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｌｌｅｌｅ），ｌｏｘＰ配列が導入されたアレル（Ｆｌｏｘ Ａｌｌｅｌｅ），ｌｏｘＰ−Ｅｘｏｎ２〜１４−ｌｏｘＰが除去されたアレル（Ｄｅｌｅｔｅｄ Ａｌｌｅｌｅ）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００７３】
マウスシノビオリン遺伝子のエクソン１の上流からエクソン１６の下流の領域である１４．８ｋｂの遺伝子領域をターゲッティングベクター構築のために使用した。ＦＲＴ配列で挟んだＮｅｏ耐性遺伝子をエクソン１とエクソン２との間に挿入した。また，エクソン２の上流及びエクソン１４の下流にｌｏｘＰ配列を導入した。
【００７４】
上記ターゲッティングベクターを，ＥＳ細胞に導入した。目的の相同組換えが起こったアレルを有するクローンを，Ｃｒｅ処理によるｌｏｘＰ−エクソン−ｌｏｘＰ配列の除去及びＦＬＰ処理によるＦＲＴ−ネオマイシン−ＦＲＴの除去をＰＣＲ産物の長さで確認することによって，選抜した。
【００７５】
相同組換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを，公知の方法（たとえば，ＥＭＢＯ Ｊ １６:１８５０−１８５７）のとおりに，マウス胚に導入することにより，キメラマウスを得た。さらに，このキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させ，ネオマイシン配列が除去されたマウスを獲得した。また，ターゲッティングベクターに組み込まれているエクソン−Ｌｏｎｇ ａｒｍ間のｌｏｘＰ配列は，相同組換え時に欠損している可能性があるため，その存在をＰＣＲで確認した。
【００７６】
得られたネオマイシン除去マウスをＣＡＧ−Ｃｒｅ-ＥＲマウスと掛け合わせ，ＣＡＧ−Ｃｒｅ−ＥＲ；ｓｙｖｎ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを得た。
【００７７】
（実施例１：骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスのｐＱＣＴ法による解析）
シノビオリンと骨量に相関がある可能性を検討するため，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスを用いて，骨密度の測定を行った。測定には雌雄のＫＯマウスを用い，形態測定のための骨標識剤（蛍光Ｃａキレート剤）として，２ｍｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを０．０２  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，１  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ０１−０１−０１−０１のラベルスケジュールで皮下投与し（テトラサイクリン投与後１日あけてカルセイン投与し、さらに一日あけて骨採取），各マウスから大腿骨を摘出した。雌雄のコントロールマウスからも同様にして大腿骨を摘出した。摘出した各大腿骨を測定試料とし，ＸＣＴ  Ｒｅｓａｒｃｈ  ＳＡ＋（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ社）により，遠位成長板軟骨から１．２ｍｍの骨幹端部と骨長の約１／２の骨幹部の２スライスについて，ｐＱＣＴ法（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｇｈｙ法）による骨密度の計測を行った。結果を図１に示す。
【００７８】
全骨密度（図１ａ），海綿骨密度（図１ｂ）および皮質骨密度（図１ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで低下していた。また，皮質骨厚（図１ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで減少していた。また，皮質骨外膜周囲長（図２ａ），皮質骨内膜周囲長（図２ｂ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで低下していることが認められた。さらに，Ｘ軸骨強度指標（三点曲げ方向の強度）（図２ｃ），極座標骨強度指標（ねじり曲げ方向の強度）（図２ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで低下していることが認められた。
【００７９】
これらの結果から，ＫＯマウスの骨では粗鬆化が進んでいることが明らかとなった。
【００８０】
（実施例２：骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの二次元マイクロＣＴによる解析）
シノビオリンと骨量に相関がある可能性を検討するため，骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスを用いて，骨微細構造の定量化を行った。
【００８１】
まず，実施例１に記載したのと同様の手順でＫＯマウス，コントロールマウスを処理し，各マウスより大腿骨を摘出した。摘出した各大腿骨を測定試料とし，Ｓｃａｎ  Ｘｍａｔｅ−Ｌ０９０（コムスキャンテクノ社）により，成長板０．５０７ｍｍ下〜２．６０９ｍｍのエリアについてマイクロＣＴ法（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ法）による骨微細構造の定量化を行った。解析ソフトには，ＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ（ラトックシステムエンジニアリング社）を用いた。また，電圧７５ｋＶ，電流１００μＡ，拡大率９．６６０倍，解像度  １０．３５２μｍ／ｐｉｘｃｅｌ，スライス厚  １０．３５２μｍの条件を用いた。結果を図３〜図５に示す
【００８２】
組織量あたりの骨量の割合（ＢＤ／ＴＶ）（図３ａ），骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）（図３ｂ）および骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）（図３ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで減少し，骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）（図３ｄ）は増加していた。これらのことから，ＫＯマウスの骨では粗鬆化が進んでいることが明らかとなった。
【００８３】
また，骨髄腔内の点からすべての方向について骨梁に遮られることなく見渡せる範囲の骨髄腔の体積の平均であるＭａｒｒｏｕ  Ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｍ．ｓｐａｃｅ）（図４ａ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで増加していた。逆に，骨梁の中の点から全ての方向の骨量の端にいたる範囲の体積の平均であるＴｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｔｒ）（図４ｂ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。また，骨梁の結合点を結節（Ｎｄ）と定義し，他の骨量と結合していない自由端を終末と定義した場合の組織量あたりのＮｄ数（図４ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。さらに，組織量あたりの骨格線の総長（Ｔｏｔａｌ  ｓｔｒｕｔ  ｌｅｎｇｔｈ）（図４ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。実際に，マイクロＣＴで撮影した画像を図５に示す。
【００８４】
これらの結果からも，ＫＯマウスの骨では粗鬆化が進んでいることが明らかとなった。
【００８５】
（実施例３：骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの膝関節温存薄切標本を用いた骨形態計測）
シノビオリンＫＯによる骨形態への影響を詳細に調べるため，マウス大腿骨・脛骨の標本を作製し骨形態計測を行った。骨形態計測のための標本は，以下の方法で作成した。
【００８６】
雌雄のＫＯマウスを用い，骨標識剤として，２ｍｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを０．０２  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，１  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ０１−０１−０１−０１のラベルスケジュールで皮下投与し（テトラサイクリン投与後1日あけてカルセイン投与し、さらに一日あけて骨採取），各マウスから脛骨・大腿骨を摘出し，
７０％エタノールで固定した。不要な軟部組織を除去し、技工用マイクロモーター（ハイパーテックＩＩ、ＴＹＰＥ: ♯９３７０６Ｊ）で切断（トリミング）した後、Ｖｉｌｌａｎｅｕｖａ  Ｂｏｎｅ  Ｓｔａｉｎ溶液に６〜７日間浸し、ブロック染色を行った。
【００８７】
薄切標本作成のために，ブロック染色後の試料を７０％エタノール〜１００％エタノールで段階的に脱水し、アセトン、アセトン・メチルメタクリレートモノマー混合液、メチルメタクリレートモノマーに置換した後、メチルメタクリレート樹脂（ＭＭＡ樹脂）で包埋した。これを３０℃から４３℃まで温度を上げながら約１０日間かけて重合させた。重合後、不要な部分はダイヤモンドソーで切断してブロック成形し、ミクロトーム（ロータリーミクロトーム、ライカＲＭ２２５５）で５μｍ厚で薄切した。切片は光硬化封入剤を用いて封入し，薄切標本とした。
【００８８】
骨形態の計測には，骨形態計測システムとしてＨｉｓｔｏｍｅｔｒｙ  ＲＴデジタイザ（株式会社システムサプライ社）を用い，計測ソフトにはＣＳＳ−８４０  海綿骨計測バージョンを用いた。計測は，関節軟骨幅計測，海綿骨形態計測，成長速度計測，肥大軟骨細胞計測，破軟骨細胞数，関節軟骨下骨幅計測の項目について行った。
【００８９】
また，顕微鏡を用いて膝関節温存薄切標本の観察を行った。観察には，落射型蛍光偏光顕微鏡ＯＬＹＭＰＵＳ  ＢＸ−５３を用いた。
【００９０】
上記の手順に従って膝関節温存薄切標本を作製し，マウス摘出大腿骨・脛骨の関節軟骨幅，軟骨下骨幅および関節間隙の計測を行った。結果を図６〜図８に示す。また，これら膝関節温存薄切標本を顕微鏡で観察した画像を図９に示す。
【００９１】
雄では，脛骨外側の関節軟骨幅および脛骨内側の関節軟骨幅は，コントロールマウスに比べＫＯマウスで狭くなっていることが認められた（図６ａ，図６ｂ）。 一方，雌では，コントロールマウスに比べＫＯマウスで脛骨内側の関節軟骨幅が広くなっていた（図６ｂ）。また，雌雄ともに大腿骨外側の軟骨幅および大腿骨内側の軟骨幅は，コントロールマウスとＫＯマウスで差が見られなかった（図６ｃ，図６ｄ）。
【００９２】
雌雄ともに軟骨下骨幅は，計測した全ての部位において，コントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していることが認められた（図７）。また，雌では軟骨下骨の部分に標識がみられ，異所性に石灰化している様子が観察された（図９）。
【００９３】
雄では，内側の関節間隙が，コントロールマウスに比べてＫＯマウスで狭くなっていることが認められた（図８ｂ）。雌雄ともに外側の関節間隙は，コントロールマウスとＫＯマウスで差が見られなかった（図８ａ）。
【００９４】
次に，マウス摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いて，成長速度測定，成長軟骨幅，肥大軟骨細胞計測および破軟骨細胞数を計測した。結果を図１０〜１３に示す。
【００９５】
雌雄ともに長軸骨形成速度は，コントロールマウスに比べＫＯマウスにおいて増加していた（図１０ａ）。雌では，成長板軟骨幅が広くなっていることが認められた（図１０ｂ）。顕微鏡観察の画像より，ＫＯマウスでは，一度目に投与したテトラサイクリン由来の蛍光（黄色）と，二回目に投与したカルセイン由来の蛍光（緑色）の標識の幅がコントロールマウスのものと比較して広く，長軸骨形成速度が増加していることがわかる（図１１）。また，雌雄ともに成長板軟骨を構成する細胞のうち，最終分化した肥大軟骨細胞は，コントロールマウスに比べＫＯマウスにおいて減少していた（図１０ｃ，図１０ｄ）。さらに，雌のＫＯマウスでは，肥大軟骨細胞が不均一となっており，コントロールマウスでみられる成長板軟骨から一次海綿骨にかけての規則的な配列が失われていた（図１２）。雌では，破軟骨細胞数は，コントロールマウスに比べＫＯマウスで減少していることが明らかとなった（図１３）。
【００９６】
（実施例４：骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの大腿骨骨幹部研磨標本を用いた骨形態計測）
実施例３に記載したのと同様の手順で，ブロック染色した試料を作成した。研磨標本作成のために，ダイヤモンドソーを用いてブロック染色後の試料より不要な樹脂を切断した後、切断面を研磨シートを用いて成形した。さらにマイクロカッターでブロックを切断し、貼り付け面を研磨シートを用いて研磨した。吸着プレートの成形したブロックを光硬化封入剤で貼り付け、スピードラップ（マルトー  ＭＬ−５２１−ｄ）を用いて荒研磨し（吸着プレート＋２５μｍ程度）、顕微鏡で標本の状態を確認しながら仕上げ研磨を行った（吸着プレート＋１５μｍ程度）。その後，光封入剤を用いて切片の封入を行い，研磨標本とした。
【００９７】
骨形態の計測には，骨形態計測システムとしてＨｉｓｔｏｍｅｔｒｙ  ＲＴデジタイザ（株式会社システムサプライ社）を用い，計測ソフトにはＣＳＳ−８４０  皮質骨計測バージョンを用いた。
【００９８】
また，顕微鏡を用いて大腿骨骨幹部研磨標本の観察を行った。観察には，落射型蛍光偏光顕微鏡ＯＬＹＭＰＵＳ  ＢＸ−５３を用いた。
【００９９】
上記の手順に従った作成したマウス大腿骨骨幹部研磨標本を用いて，形態計測を行った。結果を図１４〜図１７に示す。
【０１００】
雌雄ともに全円柱（図１４ａ），骨髄量（図１４ｂ），皮質骨幅（図１４ｃ）は，コントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。また，皮質骨外膜面および皮質骨内膜面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ），静止面（ＱＳ）の割合を比較すると，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは，皮質外膜面においても皮質骨内膜面においても吸収面が減少していた（図１５ａ，図１５ｂ）。さらに，ＫＯマウスでは，多孔エリアの増加が認められた（図１５ｃ）。
【０１０１】
次に，骨石灰化速度（図１６ａ），骨形成速度（図１６ｂ），骨表面あたりの石灰化面の割合（図１６ｃ）について比較した。雄では，皮質骨外膜面（Ｐｓ），皮質骨内膜面（Ｅｓ）の両者において，コントロールマウスに比べてＫＯマウスでは，いずれの項目も増加していた。一方，雌では，皮質骨外膜面（Ｐｓ）では雄と同様にいずれの項目も増加が認められたが，皮質骨内膜面（Ｅｓ）ではいずれの項目も低下していた。
【０１０２】
次に，大腿骨骨幹部研磨標本の顕微鏡観察の結果を図１７に示す。
【０１０３】
コントロールマウスでは楕円状である横断面が，ＫＯマウスでは円状になり，径が小さくなっているのが認められた。また，ＫＯマウスでは皮質骨内膜面がＶｉｌｌａｎｕｅｖａ Ｂｏｎｅ染色で濃く染色されていることから，骨リモデリングが正常に行われておらず，古い骨が残存していることが考えられた。さらに，ＫＯマウスでは，骨細胞が肥大しており，骨細管が太く，途切れている様子が観察された。
【０１０４】
（実施例５：骨芽細胞特異的コンディショナルＫＯマウスの大腿骨骨幹部研磨標本を用いた海綿骨形態計測）
実施例３と同様の手順で，マウス摘出大腿骨を用いて，膝関節温存薄切標本を作製し，海綿骨の形態計測を行った。結果を図１８〜図２１に示す。
【０１０５】
二次海綿骨表面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ），静止面（ＱＳ）の割合を比較すると，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは吸収面（ＥＳ）の割合がやや増加し，類骨面の割合が減少していた（図１８ａ）。また，雌雄ともにＫＯマウスでは破骨細胞数が増加し（図１８ｂ），類骨幅が減少していた（図１８ｃ）。雌のＫＯマウスでは，骨芽細胞数は，減少していた（図１８ｄ）。
【０１０６】
次に，二次海綿骨表面における骨石灰化速度（図１９ａ），骨形成速度（図１９ｂ，図１９ｃ）を比較した。雄では，骨石灰化速度，骨形成速度ともにコントロールマウスとＫＯマウスの間で差は認められなかった。一方，雌では，骨石灰化速度，骨形成速度ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで低下していた。また，骨表面あたりの石灰化面（図１９ｄ）については，雄ではコントロールマウスに比べてＫＯマウスで増加していたが，雌では減少していた。
【０１０７】
次に，二次海綿骨表面における骨量と骨梁幅を測定した。結果を図２０に示す。
【０１０８】
二次海綿骨表面における骨量を比較すると，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは低下していた（図２０ａ）。骨梁幅を比較すると，雄ではコントロールマウスとＫＯマウスの間で差は認められなかったが，雌ではＫＯマウスにおいて薄くなっているのが認められた（図２０ｂ）。
【０１０９】
次に，膝関節温存薄切標本の顕微鏡観察の結果を図２１に示す。
【０１１０】
ＫＯマウスの二次海綿骨表面では，類骨の減少が認められた。また，コントロールマウスでみられる骨芽細胞の規則的な配列が失われていた。
【０１１１】
（実施例６：全身性コンディショナルＫＯマウスのｐＱＣＴ法による解析）
シノビオリンと骨量に相関がある可能性を検討するため，全身性コンディショナルＫＯマウスを用いて，骨密度の測定を行った。測定には雌雄のＫＯマウスを用い，形態測定のための骨標識剤として，２ｍｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを０．０２  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，１  ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ０１−０１−０１−０１のラベルスケジュールで皮下投与し（テトラサイクリン投与後１日あけてカルセイン投与し、さらに一日あけて骨採取），各マウスから大腿骨を摘出した。雌雄のコントロールマウスからも同様にして大腿骨を摘出した。摘出した各大腿骨を測定試料とし，ＸＣＴ  Ｒｅｓａｒｃｈ  ＳＡ＋（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ社）により，遠位成長板軟骨から１．２ｍｍの骨幹端部と骨長の約１／２の骨幹部の２スライスについて，ｐＱＣＴ法（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｇｈｙ法）による骨密度の計測を行った。結果を図２２に示す。
【０１１２】
全骨密度（図２２ａ）および皮質骨密度（図２２ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで低下していた。また海綿骨密度（図２２ｂ）は，雄において，コントロールマウスに比べＫＯマウスで低下が認められた。また，皮質骨厚（図２２ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで減少していた。また，皮質骨外膜周囲長（図２３ａ），皮質骨内膜周囲長（図２３ｂ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで低下していた。さらに，Ｘ軸骨強度指標（三点曲げ方向の強度）（図２３ｃ），極座標骨強度指標（ねじり曲げ方向の強度）（図２３ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで低下していた。
【０１１３】
（実施例７：全身性コンディショナルＫＯマウスの二次元マイクロＣＴによる解析）
シノビオリンと骨量に相関がある可能性を検討するため，全身性コンディショナルＫＯマウスを用いて，骨微細構造の定量化を行った。まず，実施例１に記載したのと同様の手順でＫＯマウス，コントロールマウスを処理し，各マウスより大腿骨を摘出した。摘出した各大腿骨を測定試料とし，Ｓｃａｎ  Ｘｍａｔｅ−Ｌ０９０（コムスキャンテクノ社）により，成長板０．５０７ｍｍ下〜２．６０９ｍｍのエリアについてマイクロＣＴ法（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ法）による骨微細構造の定量化を行った。解析ソフトには，ＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ（ラトックシステムエンジニアリング社）を用いた。また，電圧７５ｋＶ，電流１００μＡ，拡大率９．６６０倍，解像度  １０．３５２μｍ／ｐｉｘｃｅｌ，スライス厚  １０．３５２μｍの条件を用いた。結果を図２４〜図２６に示す。
【０１１４】
組織量あたりの骨量の割合（ＢＤ／ＴＶ）（図２４ａ），骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）（図２４ｂ）および骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）（図２４ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べ，ＫＯマウスで減少し，骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）（図２４ｄ）は増加していた。これらの結果から，ＫＯマウスの骨では粗鬆化が進んでいることが明らかとなった。
【０１１５】
また，骨髄腔内の点からすべての方向について骨梁に遮られることなく見渡せる範囲の骨髄腔の体積の平均であるＭａｒｒｏｕ  Ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｍ．ｓｐａｃｅ）（図２５ａ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで増加していた。逆に，骨梁の中の点から全ての方向の骨量の端にいたる範囲の体積の平均であるＴｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｒ  ｖｏｌｕｍｅ（Ｖ＊ｔｒ）（図２５ｂ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。また，骨梁の結合点を結節（Ｎｄ）と定義し，他の骨量と結合していない自由端を終末と定義した場合，組織量あたりのＮｄ数（図２５ｃ）は，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。さらに，組織量あたりの骨格線の総長（Ｔｏｔａｌ  ｓｔｒｕｔ  ｌｅｎｇｔｈ）（図２５ｄ）も，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスで減少していた。実際に，マイクロＣＴで撮影した画像を図２６に示す。
【０１１６】
これらのこと結果からも，ＫＯマウスの骨では粗鬆化が進んでいることが明らかとなった。
【０１１７】
（実施例８：全身性コンディショナルＫＯマウスの膝関節温存薄切標本を用いた骨形態計測）
シノビオリンＫＯによる骨形態への影響を詳細に調べるため，マウス大腿骨・脛骨の標本を作製し骨形態計測を行った。骨形態計測のための標本は，実施例３に記載したものと同様の手順で作成し，同様の方法で骨形態計測，顕微鏡観察を行った。
【０１１８】
作成したマウス摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いて，関節軟骨幅の計測を行った。結果を図２７に示す。また，これら膝関節温存薄切標本を顕微鏡で観察した画像を図２９に示す。
【０１１９】
雄では，脛骨外側の関節軟骨幅と大腿骨外側の関節軟骨幅は，コントロールマウスに比べＫＯマウスで狭くなっていることが認められた（図２７ａ，図２７ｃ）。また，雄では，脛骨内側の軟骨幅が広くなっていた（図２７ｂ）。雌雄ともに大腿骨内側の軟骨幅には差が見られなかった（図２７ｄ）。
【０１２０】
次に，マウス摘出大腿骨・脛骨の膝関節温存薄切標本を用いて，成長速度測定，成長軟骨幅，肥大軟骨細胞計測および破軟骨細胞数を計測した。結果を図２８〜図３０に示す。
【０１２１】
雌雄ともにコントロールマウスに比べＫＯマウスにおいて，長軸骨形成速度が増加し（図２８ａ），成長板軟骨幅が短縮していた（図２８ｂ）。さらに，雌雄ともに成長板軟骨を構成する細胞のうち，最終分化した肥大軟骨細胞は，コントロールマウスに比べＫＯマウスにおいて顕著に減少していた（図２８ｃ，図２８ｄ）。
【０１２２】
また，顕微鏡観察の結果，ＫＯマウスでは，成長板軟骨幅が短く，肥大軟骨細胞が減少していた（図２９）。さらに，成長板軟骨直下に標識剤の沈着が見られ，内軟骨性骨化が正常に進行していない様子（長軸骨成長速度の遅延）が観察された。雌雄ともに破軟骨細胞数は，コントロールマウスに比べＫＯマウスで増加していた（図３０）。
【０１２３】
（実施例９：全身性コンディショナルＫＯマウスの大腿骨骨幹部研磨標本を用いた骨形態計測）
マウス摘出大腿骨を用いて，大腿骨骨幹部研磨標本を作製し，形態計測を行った。結果を図３１〜図３４に示す。
【０１２４】
雌雄ともに全円柱は，コントロールマウスとＫＯマウスの間では差が認められなかった（図３１ａ）。一方，骨髄量は，雌雄ともにコントロールマウスに比べＫＯマウスでやや増加していた（図３１ｂ）。また，皮質骨幅はコントロールマウスに比べＫＯマウスでやや減少していた（図３１ｃ）。
【０１２５】
これらのことから，ＫＯマウスの骨では，ｐＱＣＴで得られた結果と同様，骨髄腔側からの骨リモデリングが正常に機能していない可能性がある。
【０１２６】
また，皮質骨外膜面および皮質骨内膜面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ），静止面（ＱＳ）の割合を比較すると，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは，皮質外膜面においても皮質骨内膜面においても類骨面が減少していた（図３２ａ，図３２ｂ）。また，皮質骨内膜面では，吸収面が増加していた。さらに，コントロールマウスに比べてＫＯマウスでは，多孔エリアの増加が認められた（図３２ｃ）。
【０１２７】
次に，骨石灰化速度（図３３ａ），骨形成速度（図３３ｂ），骨表面あたりの石灰化面の割合（図３３ｃ）について比較した。雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは，皮質骨外膜面（Ｐｓ），皮質骨内膜面（Ｅｓ）の両者において，いずれの項目も低下していた。
【０１２８】
次に，大腿骨骨幹部研磨標本の顕微鏡観察の結果を図３４に示す。
【０１２９】
コントロールマウスでは楕円状である横断面が，ＫＯマウスでは円状になっていた。また，ＫＯマウスでは，骨細胞が肥大しており，骨細管が太く，途切れている様子が観察された。
【０１３０】
（実施例１０：全身性コンディショナルＫＯマウスの大腿骨骨幹部研磨標本を用いた海綿骨形態計測）
マウス摘出大腿骨を用いて，膝関節温存薄切標本を作製し，海綿骨の形態計測を行った。結果を図３５〜図３８に示す。
【０１３１】
二次海綿骨表面における吸収面（ＥＳ），類骨面（ＯＳ），静止面（ＱＳ）の割合を比較すると，雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスでは吸収面，静止面の割合が増加し，類骨面の割合が減少していた（図３５ａ）。また，雄では，コントロールマウスに比べＫＯマウスで破骨細胞数が増加していた（図３５ｂ）。さらに，雌雄ともにコントロールマウスに比べＫＯマウスにおいて，類骨幅と骨芽細胞数が減少していた（図３５ｃ，図３５ｄ）。
【０１３２】
次に，二次海綿骨表面における骨石灰化速度（図３６ａ），骨形成速度（図３６ｂ，図３６ｃ），骨表面あたりの石灰化面の割合（図３６ｄ）を比較した。雌雄ともにコントロールマウスに比べＫＯマウスで，すべての項目が低下していた。
【０１３３】
次に，二次海綿骨表面における骨量および骨梁幅を測定した。雌雄ともにコントロールマウスに比べてＫＯマウスにおいて，二次海綿骨表面における骨量（図３７ａ）および骨梁幅（図３７ｂ）は低下していた。
【０１３４】
次に，膝関節温存薄切標本の顕微鏡観察の結果を図３８に示す。
【０１３５】
ＫＯマウスの二次海綿骨表面では，類骨の減少が認められた。また，コントロールマウスでみられる骨芽細胞の規則的な配列が失われていた。また，破骨細胞は多核で巨大化しており，骨吸収が盛んに行われている様子が観察された。骨細胞の肥大化も観察された。さらに，ＫＯマウスでは静脈洞が観察され，個体が瀕死の状態であることが推察された。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は，骨粗鬆症のモデル動物の作成方法などに関するため，例えば，医薬産業や実験機材産業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号２：合成ＲＮＡ
配列番号３：合成ＲＮＡ
配列番号４：合成ＲＮＡ
配列番号５：合成ＲＮＡ
配列番号６：合成ＲＮＡ
配列番号７：合成ＲＮＡ
【図１】
2017112836.tif 000003
【図２】
2017112836.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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