(57)【要約】【課題】過剰な標識試薬を除去する場合とは異なる状況で標識糖を精製する場合に、良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる方法を提供する。【解決手段】本発明の標識糖の精製物を調製する方法は、前調製工程と、アプライ工程と、洗浄工程と、溶出工程と、を含む。前調製工程では、標識基と糖基とを含む標識糖を含みかつ酸性成分を実質的に含まない標識糖試料と、酸性成分を含む酸性溶液とを混合し、アプライ用試料を調製する。アプライ工程では、アプライ用試料をシリカゲルの固相にアプライする。洗浄工程では、固相を洗浄液で洗浄する。溶出工程では、固相から、溶出用液で標識糖を溶出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識基と糖基とを含む標識糖を含みかつ酸性成分を実質的に含まない標識糖試料と、酸性成分を含む酸性溶液とを混合し、アプライ用試料を調製する前調整工程と、
前記アプライ用試料をシリカゲルの固相にアプライするアプライ工程と、
前記固相を洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
前記固相から、溶出用液で前記標識糖を溶出する溶出工程と、
を含む、標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項２】
前記前調製工程において、前記アプライ試料中における酸性成分の濃度が０．００５体積％以上となるように前記酸性成分を含む酸性溶液を混合する、請求項１に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項３】
前記前調製工程において、前記アプライ試料中における酸性成分の濃度が５体積％未満となるように前記酸性成分を含む酸性溶液を混合する、請求項１または２に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項４】
前記糖基がＮ型糖鎖基である、請求項１から３のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項５】
前記糖基が分子量１０００以上の糖鎖基である、請求項１から４のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項６】
前記標識基が、前記固相の表面と前記糖基との間の分子間力よりも小さい分子間力で前記固相の表面と相互作用するものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項７】
前記標識基が中性基である、請求項１から６のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項８】
前記中性基が、２−アミノベンズアミドの誘導基である、請求項７に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項９】
前記酸性成分が有機酸である、請求項１から８のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項１０】
前記有機酸が酢酸である、請求項９に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖を精製する技術に関する。より具体的には、標識糖を良好な回収率で精製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【０００３】
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
【０００４】
病気を早期発見して生活の質（ＱＯＬ）を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている（非特許文献１，２）。また、糖鎖修飾に異常がみられるとさまざまな疾病が引き起こされることも知られている（非特許文献３）。糖鎖の構造は細胞の癌化やさまざまな疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
【０００５】
糖鎖自体は蛍光性、紫外吸収性をもたないため、糖鎖を分析する際には予め修飾（ラベル化）を施すことが多い。糖鎖をＨＰＬＣあるいはＨＰＬＣ−ＭＳで分析する場合は、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ誘導体化（２ＡＢ化）、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ誘導体化（ＰＡ化）などの蛍光ラベル化が一般的である（非特許文献４）。また、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析する場合にも、ラベル化を施すことにより測定感度の向上を図ることが行われる（非特許文献５、６）。
【０００６】
糖鎖をラベル化する際には、ラベル化効率を高めるため糖鎖に対して過剰量のラベル化試薬を作用させる場合が多い。試料溶液中に過剰のラベル化試薬が存在すると、ＨＰＬＣ測定や質量分析に支障をきたすため、あらかじめ除去する必要がある。このような過剰量のラベル化試薬を簡単に除去可能とするために、ラベル化糖鎖を含む試料溶液をモノリスシリカと接触させることにより、モノリスシリカに糖鎖成分を吸着させる工程と、モノリスシリカを洗浄液で洗浄する工程と、モノリスシリカに溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程と、を含む糖鎖試料調製方法が知られている（特許文献１）。この方法は、２ＡＢ化およびＰＡ化のように一般的な標識糖鎖に適用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５０８３４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ioffe E., Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp.728-732 (1994)
【非特許文献２】Metzler M., Gertz A., Sarker M., Schachter H., Schrader J.W., Marth J.D., EMBO J., 13, pp.2056-2065 (1994)
【非特許文献３】Powell L.D., Paneerselvam K., Vij R., Diaz S., Manzi A., Buist N., Freeze H., Varki A., J. Clin. Invest., 94, pp.1901-1909 (1994)
【非特許文献４】Shilova N.V., Bovin N.V., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29, pp.309-324 (2003)
【非特許文献５】Shinohara Y., Furukawa J.-i., Niikura K., Miura Y., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 76, pp.6989-6997 (2004)
【非特許文献６】Furukawa J.-i., Shinohara Y., Kuramoto H., Miura Y., Shimaoka H., Kurogochi M., Nakano M., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 80, pp.1094-1101 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１の方法は、過剰な標識試薬を除去する目的で行われる精製法であり、特に２ＡＢ化糖鎖に関しては良好な回収率で得ることができる。しかしながら、上記とは異なる状況で２ＡＢ化糖鎖の精製を行う場合にあっては、同様にモノリスシリカを用いて精製しようとしても、良好な回収率で得ることはできない。
【００１０】
そこで本発明の目的は、過剰な標識試薬を除去する場合とは異なる状況で標識糖を精製する場合に、良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意検討の結果、上述の異なる状況で精製を行う場合では精製すべき標識糖を得た系には酢酸が含まれていないことから、特許文献１の方法で良好な回収率を達成できている要因が、糖鎖を標識する反応系において使用した酢酸とジメチルスルホキシドとの混合溶媒に由来して精製時まで残存した酢酸にあることを発見した。これによって、本発明者は、精製対象となる標識糖試料を得た系に酸性成分が実質的に含まれない場合は、当該標識糖試料に酸性成分を混合することで上記の本発明の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下の発明を含む。
【００１２】
（１）
本発明の標識糖の精製物を調製する方法は、前調製工程と、アプライ工程と、洗浄工程と、溶出工程と、を含む。
前調製工程では、標識基と糖基とを含む標識糖を含みかつ酸性成分を実質的に含まない標識糖試料と、酸性成分を含む酸性溶液とを混合し、アプライ用試料を調製する。
アプライ工程では、アプライ用試料をシリカゲルの固相にアプライする。
洗浄工程では、固相を洗浄液で洗浄する。
溶出工程では、固相から、溶出用液で標識糖を溶出する。
【００１３】
このように、アプライ用試料に酸性成分を含ませることによって標識糖をシリカゲル固相へ吸着させやすくするため、過剰な標識試薬を除去する場合とは異なる場合、つまり精製対象となる標識糖試料に酸性成分が実質的に含まれない場合に、良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
なお、前調製工程では、標識糖試料と酸性溶液とを混合した後、遠心分離などの前精製工程を経た後にアプライ試料を得てよい。
【００１４】
（２）
上記（１）に記載の標識糖の精製物を調製する方法では、前調製工程において、アプライ試料中における酸性成分の濃度が０．００５体積％以上となるように酸性成分を含む酸性溶液を混合してよい。
【００１５】
この場合、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００１６】
なお、アプライ試料中において０．００５体積％以上となるように調整される酸性成分は、精製対象の標識糖試料中に酸性成分が全く含まれない場合にあっては混合された酸性溶液に由来し、精製対象の標識糖試料中に酸性成分をわずかに含む場合にあっては、当該標識糖試料中のわずかな酸性成分と、混合された酸性溶液中の酸性成分とに由来する。
【００１７】
（３）
上記（１）または（２）における標識糖の精製物を調製する方法では、前調製工程において、アプライ試料中における酸性成分の濃度が５体積％未満となるように酸性成分を含む酸性溶液を混合してよい。
【００１８】
この場合、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００１９】
なお、アプライ試料中において５体積％未満となるように調整される酸性成分は、精製対象の標識糖試料中に酸性成分が全く含まれない場合にあっては混合された酸性溶液に由来し、精製対象の標識糖試料中に酸性成分をわずかに含む場合にあっては、当該標識糖試料中のわずかな酸性成分と、混合された酸性溶液中の酸性成分とに由来する。
【００２０】
（４）
上記（１）から（３）のいずれかに記載の標識糖の精製物を調製する方法では、糖基がＮ型糖鎖基であってよい。
【００２１】
この場合、本発明による良好な回収率で標識糖の精製物を得る効果をより好ましく享受するため、特に本発明の有用性が高い。
【００２２】
（５）
上記（１）から（４）のいずれかに記載の標識糖の精製物を調製する方法では、糖基が分子量１０００以上の糖鎖基であってよい。
【００２３】
この場合、本発明による良好な回収率で標識糖の精製物を得る効果をより好ましく享受するため、特に本発明の有用性が高い。
（６）
上記（１）から（５）のいずれかに記載の標識糖の精製物を調製する方法では、標識基が、固相の表面と糖基との間の分子間力よりも小さい分子間力で固相の表面と相互作用するものであってよい。
【００２４】
この場合、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００２５】
（７）
上記（１）から（６）のいずれかに記載の標識糖の精製物を調製する方法では、標識基が、中性基であってよい。
【００２６】
この場合、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００２７】
（８）
上記（７）の標識糖の精製物を調製する方法では、中性基が、２−アミノベンズアミドの誘導基であってよい。
【００２８】
このように、本発明の調製方法は汎用性に優れる。
【００２９】
（９）
上記（１）から（８）のいずれかに記載の標識糖の精製物を調製する方法では、酸性成分が有機酸であってよい。
【００３０】
この場合、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００３１】
（１０）
上記（９）に記載の標識糖の精製物を調製する方法では、有機酸が酢酸であってよい。
【００３２】
この場合、汎用性に優れるため、本発明の有用性が高い。さらに酢酸自体が揮発性であるため、精製物を濃縮または乾燥する場合など、溶媒を除去する場合に好都合である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖（ａ）およびカラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖の原液（ｂ）のＨＰＬＣチャートである。
【図２】比較例１でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖（ａ）およびカラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖の原液（ｂ）のＨＰＬＣチャートである。
【図３】比較例２でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖（ａ）およびカラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖の原液（ｂ）のＨＰＬＣチャートである。
【図４】実施例２から実施例５でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［１．前調製工程］
本発明の方法に供される試料は、前調製工程でアプライ用試料に調製される。アプライ用試料は、標識糖試料と酸性溶液とを混合することによって得られる。標識糖試料は、標識糖を含みかつ酸性成分を実質的に含まない。
【００３５】
［１−１．酸性溶液］
標識糖試料と混合される酸性溶液は、溶媒中に少なくとも酸性成分が含まれていればよい。具体的には、実質的に酸性成分のみを溶質として含む溶液であってもよいし、酸性成分とその共役塩基とを含んで酸性に調製された緩衝液であってもよい。
【００３６】
酸性成分は、揮発性であることが好ましい。本明細書において揮発性とは、１atmでの沸点が５０℃以上２６０℃以下、好ましくは１５０℃以下である性質をいう。これによって、精製後の標識糖の濃縮または乾燥が容易となり、酸性成分が残存して分析へ悪影響を及ぼす可能性を防止することができる。
【００３７】
酸性溶液のｐＫａは、たとえば３．５以上５．０以下、好ましくは４．０以上５．０以下の弱酸性であることが好ましい。酸性溶液のｐＫａが上記下限値以上であることは、溶出条件が穏和である点で好ましい。酸性溶液のｐＫａが上記上限値以下であることは、標識糖の精製効率が良好である点で好ましい。
【００３８】
このような弱酸性を示す酸性成分は、好ましくは有機酸であり、より好ましくはカルボン酸である。より具体的には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、シクロヘキサンカルボン酸などが挙げられる。この中でも、溶出条件の穏和性、揮発性および入手容易性を考慮すると、酢酸が最も好ましい。
【００３９】
本発明では、酸性溶液が上述のような弱酸性であることが好ましいが、標識糖の標識基の種類によっては（たとえば極性が比較的小さい場合など）、溶出効率を上げる目的で上記の弱酸性よりも強い酸性であることを除外するものではない。このような場合の酸性成分としては、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；トリフルオロ酢酸などの含フッ素カルボン酸；有機スルホン酸などが挙げられる。
【００４０】
溶媒は、水および有機溶媒から１種または複数種の組み合わせで用いられる。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミドなどが挙げられるが、この中でも、極性かつ非プロトン性、さらには表面張力が低く粘度も低いという点でアセトニトリルが好ましい。溶媒として有機溶媒と水との両方が含まれる場合、有機溶媒の量は、水と混和する量であればよいが、たとえば９０体積％以上、好ましくは９５体積％以上であってよい。これによって、標識糖を良好に溶解させることができる。
【００４１】
アプライ用試料中の酸性成分の濃度は、たとえば０．００５体積％以上、好ましくは０．５体積％以上、より好ましくは０．２体積％以上であってよい。これによって、精製物をより良好な回収率で得ることができる。また、アプライ用試料中の酸性成分の濃度は、たとえば５．０体積％未満であってよい。これによって、精製物をより良好な回収率で得ることができる。より具体的には、たとえば糖基がＮ型糖鎖の場合は５．０体積％未満、Ｏ型糖鎖の場合は１．０体積％未満であってよい。精製物の回収率向上効果をより良好に得る点で、たとえば糖基がＮ型糖鎖の場合は１．５体積％未満、好ましくは１．０体積％未満、糖基がＯ型糖鎖の場合は０．３体積％未満、好ましくは０．２体積％未満であってもよい。上記の濃度は、酸性成分が１価酸である場合の濃度である。
なお、アプライ用試料中の酸性成分の濃度は、標識糖試料にわずかに酸性成分が混在していた場合は、厳密には混在していた酸性成分と混合させた酸性溶液中の酸性成分との合計濃度である。
【００４２】
［１−２．標識糖−標識基］
本発明の精製対象である標識糖が有する標識基は、糖の標識試薬の誘導体基である。標識基は、固相の表面と糖基との間の分子間力よりも小さい分子間力で固相の表面と相互作用するものであってよい。これによって、標識糖が糖基を介して固相表面に保持され、精製物の回収率向上効果を良好に得ることができる。
【００４３】
標識基を与える標識試薬の例としては、たとえば、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，  ７−ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、３−（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ  ７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、  ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ２−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ；  ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ；２−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃａｒｂａｚａｔｅ、  ４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｏｃ  ａｃｉｄ，  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ２−（６，８−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）ａｃｅｔｏｈｙｄｒａｚｉｄｅ、ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ；１−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、２−Ａｍｉｎｏ  Ｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄなどが挙げられる。
【００４４】
標識基は中性基であることが好ましい。中性基は、電気的に中性である基であり、正電荷を有する基および負電荷を有する基を除外する。これによって、糖基を介して固相に保持され易く、精製物の回収率向上効果を容易に得ることができる。上述の標識試薬の中では、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，７−ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ、ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅが中性基を有する点で好ましい。
【００４５】
［１−３．標識糖−糖基］
本発明において、糖とは、単糖および糖鎖の両方を含む。さらに、その構造が未知であっても既知であってもよい。標識糖が有する糖基はＮ型糖鎖であってもよいし、Ｏ型糖鎖であってもよいが、酸性成分をアプライ用試料に含ませることによる回収率向上効果を良好に得やすい点で、Ｎ型糖鎖であることが好ましい。また、糖基の分子量は特に限定されないが、酸性成分をアプライ用試料に含ませることによる精製物の回収率向上効果をより良好に得る点で、１０００以上であることが好ましい。
【００４６】
［１−４．標識糖試料］
酸性溶液と混合させられる標識糖試料は、標識糖を含みかつ酸性成分を実質的に含まない。酸性成分を実質的に含まないとは、酸性成分が全く含まれない（０体積％）場合だけでなく、酸性成分をわずかに混在させている場合も許容する。酸性成分をわずかに混在させている場合とは、本工程で混合されるべき所定量の酸性溶液と混合させずに固相にアプライしたとしても本発明の効果（つまり良好な回収率で標識糖の精製物を得る効果）が得られないわずかな量しか酸性成分を含んでいない場合をいう。当該わずかな量としては、酸性成分が一価の酸の場合であれば、たとえば０．００５体積％未満、好ましくは０．００１体積％以下、より好ましくは０．０００２５体積％以下、さらに好ましくは０．００００５体積％以下、より一層好ましくは０．００００１体積％以下である。
【００４７】
標識糖試料は、たとえば、精製された標識糖が生化学反応系に供されて得られる反応生成物、当該反応生成物に対して行われてよい後処理により得られる後処理物、その他、酸性条件を経ずに調製された標識糖混合物であればどのようなものでもよい。
【００４８】
生化学反応系としては、糖転移酵素反応系および糖分解酵素反応系などの酵素反応系、ならびに、糖−タンパク質特異的結合系および糖−細胞特異的結合系などの特異的結合系が挙げられる。
後処理としては、上記の特異的結合の後、特異的結合体を分離し、分離された特異的結合体における特異結合を乖離させる処理が挙げられる。
【００４９】
［１−５．アプライ用試料の調製］
アプライ用試料は、少なくとも、上述の酸性溶液と上述の標識糖試料を混合する過程を経て得られる。
たとえば、上述の標識糖試料の具体例（生化学反応系の反応直後の反応生成物または後処理の直後の後処理物）の場合、標識糖試料には、本発明の精製対象となる標識糖とともに、夾雑物がたいてい含まれる。夾雑物としては、タンパク質、固相、および細胞など、上述の酸性溶液に不溶の成分が挙げられる。このため、当該反応生成物または後処理物から夾雑物を除去して標識糖を分離する粗精製がさらに行われてよい。この場合、粗精製用の溶媒として酸性溶液を含ませることができる。より具体的には、これらの標識糖試料（反応生成物または後処理物）を一旦蒸発乾固させ、本工程における酸性溶液を加えて懸濁液とし、遠心分離などで夾雑物を沈殿させることができる。これによって得られる上清は、標識糖および酸性溶液を含んでおり、アプライ用試料として得られる。
【００５０】
なお、糖転移酵素反応系は、糖転移酵素の基質特異性を明らかにするために用いられることができる。具体例として、転移候補物となる単糖の標識体を用意し、糖転移酵素存在下でオリゴ糖への糖転移酵素反応系を構築し、反応生成物として、オリゴ糖に当該単糖の標識体が伸長しているかどうかを調べることができる。この例の場合、本発明の精製によって、オリゴ糖に当該単糖の標識体が伸長した生成物が「標識糖」の精製物の主成分として得られた場合は基質特異性有りと判断することができ、本発明による精製によって、未反応の単糖の標識体が「標識糖」の精製物の主成分として得られた場合は基質特異性無しと判断することができる。
【００５１】
糖分解酵素反応系は、糖分解酵素の基質特異性を明らかにするために用いることができる。具体例として、分解候補物となるオリゴ糖の標識体を用意し、糖分解酵素存在下で糖転移酵素反応系を構築し、反応生成物として、オリゴ糖の標識体が分解されているかどうかを調べることができる。この例の場合、本発明の精製によって、オリゴ糖の標識体の糖鎖部分が分解された生成物が「標識糖」の精製物の主成分として得られた場合は基質特異性有りと判断することができ、本発明による精製によって、未反応のオリゴ糖の標識体が「標識糖」の精製物の主成分として得られた場合は基質特異性無しと判断することができる。
【００５２】
糖−タンパク質特異的結合系は、糖とタンパク質との相互作用性を明らかにするために用いることができる。具体例として、相互作用候補となる糖の標識体を用意し、レクチンが固相（たとえばビーズ）に担持されたレクチンビーズの存在下で特異的結合系を構築し、レクチンビーズに糖の標識体が結合したかどうかを調べることができる。この例の場合、レクチンビーズと糖との特異的結合体が生じていれば、タンパク質変性条件（たとえば加熱。酸変性は除く。）に供して特異的結合を乖離させることで標識糖が遊離する。本発明の精製によって、遊離した標識糖が得られた場合は相互作用有りと判断することができ、本発明による精製によって標識糖が得られなかった場合は相互作用無しと判断することができる。
【００５３】
糖−細胞特異的結合系は、糖と細胞表面の受容体との相互作用性を明らかにするために用いることができる。具体例として、相互作用候補となる糖の標識体を用意し、細胞存在下で特異的結合系を構築し、細胞に糖が結合したかどうかを調べることができる。この例の場合、細胞と糖との特異的結合体が生じていれば、タンパク質変性条件（たとえば加熱。酸変性は除く。）に供して特異的結合を乖離させることで標識糖を遊離する。本発明の精製によって、遊離した標識糖が得られた場合は相互作用有りと判断することができ、本発明による精製によって標識糖が得られなかった場合は相互作用無しと判断することができる。
【００５４】
［２．アプライ工程］
［２−１．アプライ用試料］
上記の前調製工程によって得られたアプライ用試料は、溶媒（酸性成分を含む酸性溶液の溶媒）中に、精製すべき標識糖を、分離除去されるべき不純物とともに含む。
【００５５】
分離除去されるべき不純物は、前調製工程で用いた酸性溶液に可溶であるかおよび不溶であるかを問わないが、前調製工程で推奨される粗精製が行われることで可能であるものであることが好ましい。これによって、通液性が良好になり、精製物を良好な回収率で得ることができる。具体的には、分離除去される不純物としては、残存試薬および塩などが挙げられる。
【００５６】
［２−２．シリカゲルの固相］
本発明で用いられる固相は、シリカゲルである。シリカゲルは、表面にシラノール基を有する。本発明は、表面のシラノール基のうち一部に修飾基が付されている場合を特段除外するものではないが、非修飾シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）が多いほど好ましい。これによって、精製すべき標識糖を好ましく捕捉することができる。
【００５７】
好ましい量の非修飾シラノール基を有する例として、たとえば、表面全体のシラノール基のうち５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％が非修飾シラノール基であってよい。
【００５８】
固相の形状として特に限定されず、たとえば、ビーズタイプであってもよいし、モノリスタイプであってもよい。
ビーズタイプの場合、粒子径はたとえば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、さらに好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下、たとえば５μｍであってよい。粒子径が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。
【００５９】
モノリスタイプのシリカゲルは、マイクロメートルサイズの三次元網目状細孔（マクロ孔）と、ナノメートルサイズの細孔（メソ孔）とを有する、シリカゲルのバルク体である。マクロ孔の径はたとえば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは１μｍ以上３０μｍ以下、さらに一層好ましくは１μｍ以上２０μｍ以下であってよい。マクロ孔が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。メソ孔の径はたとえば１ｎｍ以上１００ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ以上７０ｎｍ以下であってよい。これによって、精製すべき標識糖を好ましく捕捉することができる。
【００６０】
モノリスタイプのシリカゲルの体積（マクロ孔およびメソ孔の体積を含む）は、たとえば０．０１ｃｍ３以上１ｃｍ３以下、好ましくは０．０１ｃｍ３以上０．１ｃｍ３以下であってよい。この体積であることにより、溶出後の溶離液を、HPLC分析に適した濃度で得ることが容易となる。
【００６１】
シリカゲル固相は、適当な容器に収容されて使用される。容器は、固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、たとえば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブなどが挙げられる。
【００６２】
［２−３．アプライ］
アプライ用試料は、上述の固相にアプライされる。これによって、固相に標識糖が吸着する。標識糖は、糖基を介して、シリカゲル固相のシラノール基に可逆的に捕捉される。
【００６３】
［３．洗浄工程］
［３−１．洗浄液］
試料をアプライした後、洗浄液で固相を洗浄する。洗浄液は、たとえば９０体積％以上１００体積％以下の有機溶媒および０体積％以上１０体積％以下の水、好ましくは９５体積％以上１００体積％以下の有機溶媒および０体積％以上５体積％以下の水を含んでよい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミドなどが挙げられるが、この中でも、非プロトン性であるという点でアセトニトリルが好ましい。
【００６４】
［３−２．洗浄］
洗浄液を通液することによって、標識糖を固相に吸着させたまま、不純物を溶出させる。通液の方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心などの方法が挙げられる（後述の溶出工程においても同様）。洗浄においては、組成の異なる洗浄液を用いて段階的に洗浄してもよい。たとえば、実質的に１００％のアセトニトリルを通液した後に、水を含むアセトニトリルを通液することもできる。なお、実質的に１００％のアセトニトリルとは、完全に１００％のアセトニトリルと、段階的洗浄に悪影響を与えない程度の少量の他の溶媒が混入したアセトニトリルとの両方を含む。上述の少量とは、たとえば、洗浄液の０体積％超２体積％以下の量であってよい。上述の他の溶媒としては、水などが挙げられる。
【００６５】
［４．溶出工程］
［４−１．溶出液］
固相を洗浄した後、溶出液を通液して固相から標識糖を溶離液中に溶出させる。溶出液としては、水または水溶液であってよい。
【００６６】
水または水溶液は、上記の前調製工程で用いられた酸性溶液よりもｐＨが大きければ特に限定されない。たとえば、本工程で溶出液として用いる水または水溶液のｐＨと、上記の前調製工程における酸性溶液のｐＨとは、１．５以上、好ましくは２．０以上の差があることが好ましい。これによって、標識糖を良好に溶出することができる。当該ｐＨ差の範囲内の上限値は特に限定されないが、たとえば５．０、好ましくは４．０であってよい。これによって、シリカの分解を抑制することが可能となる。
【００６７】
あるいは、本工程で用いる水または水溶液のｐＨは、５．８以上８．６以下、好ましくは６．０以上７．５以下であってもよい。当該ｐＨが上記下限値以上であることは、標識糖を良好に溶出する点で好ましく、上記上限値以下であることは、シリカの分解を抑制する点で好ましい。
【００６８】
溶出液としての水溶液に含まれてよい溶質としては特に限定されないが、たとえば、二酸化炭素、界面活性剤、有機溶媒、塩基性成分、およびｐＨの条件を満たす限りにおいて酸性成分が挙げられる。なお、有機溶媒を含む場合は、水の方が主成分であり、有機溶媒が大部分を占める上述の洗浄液とは明確に区別される。
【００６９】
酸性溶液の通液量は、たとえば担体の見かけ体積（粒状タイプのシリカゲルである場合は充填状態における粒子間の空隙の体積も含み、モノリスタイプのシリカゲルである場合はマクロ孔およびメソ孔の体積も含む。）のたとえば０．１倍以上、好ましくは０．２倍以上であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば０．１倍以上、好ましくは１倍以上であてよい。たとえば１０μｌ以上、好ましくは１５μｌ以上、さらに好ましくは２０μｌ以上であってよい。これによって、標識糖をより回収率良く得ることができる。
【００７０】
通液量の範囲内の上限値は特に限定されないが、担体の見かけ体積のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。たとえば３０μｌ、好ましくは２５μｌであってよい。これによって、溶出液の使用量に対する溶出能をより効率的に得ることができる。
【００７１】
［４−２．溶離液］
溶出工程で固相から溶出された溶離液は、精製された標識糖を含んでおり、分析工程に供する前に、適宜、濃縮、乾燥、希釈などの処理を行うことができる。
【００７２】
なお、溶出工程で用いた溶出液を構成する物質が水および酸性成分以外の他の成分を含む場合は、酸性成分のみならず、当該他の成分も揮発性であることが好ましい。これによって、溶離液中の標識糖を濃縮または乾燥が容易となり、当該他の成分が残存して分析へ悪影響を及ぼす可能性を防止することができる。
【００７３】
［５．分析］
本発明によって調製された標識糖は、クロマトグラフィ（例えば、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィ）、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳ）、それらの組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）、などの公知の方法により、定性的および／または定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、GlycoMod、Glycosuite、SimGlycan(登録商標)など）を利用することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７５】
［実施例１］
グルコースオリゴマー混合物（重合度が２から２０までの異なる重合度を有する複数種のグルコースオリゴマーの混合物であって、重合度が７のグルコースオリゴマーの量が１０pmolとなる量で調製された混合物）を２−アミノベンズアミドで標識（２ＡＢ標識と記載する）した２ＡＢ標識糖鎖混合物を用意した。
固相としてモノリスシリカが保持されたカラムを用意した。このカラムは、スルーポア径（マクロ径）６−１２μｍ、メソ径１０−６０ｎｍのディスク状モノリスシリカフィルターが、容量約１ｍＬのチューブの底部に固定されたものである。このカラムは、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。以下、この固相のカラムをモノリスシリカスピンカラムと記載する。
【００７６】
２ＡＢ標識糖鎖混合物を、アセトニトリルに溶解させるとともに、２０％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液を１０μＬ加えて１０００μＬのアプライ用試料を調製した。アプライ用試料中の酢酸濃度は０．２％（ｖ／ｖ）である。
【００７７】
得られたアプライ用試料の全量を、モノリスシリカスピンカラムにアプライし、卓上遠心機で遠心して通液させることにより標識糖鎖混合物を吸着させた。
洗浄液として、アセトニトリル、およびアセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）を用いてカラムを順次洗浄したのち、溶出液として純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、溶離液を回収した。回収した溶離液１μＬをＬＣに供した。
【００７８】
（ＨＰＬＣ測定）
得られた溶離液について、下記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整した。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ2−Ｔ1）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1，Ｔ2，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積を基準とした百分率を表わす。
【００８１】
図１（ａ）に、実施例１でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖混合物のＨＰＬＣチャートを示す。図１（ｂ）には、比較用として、カラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖混合物の原液のＨＰＬＣチャートを併せて示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は蛍光強度（ｍＶ）である（以下、すべてのＨＰＬＣチャートにおいて同じ）。
【００８２】
図１に示すように、実施例１によって、２ＡＢ標識糖鎖混合物が良好な回収率で溶出されたことを確認した。
【００８３】
［比較例１］
アプライ用試料の調製において、２０％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液の代わりに純水を用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。
【００８４】
図２（ａ）に、比較例１でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖混合物のＨＰＬＣチャートを示す。図２（ｂ）には、比較用として、カラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖混合物の原液のＨＰＬＣチャートを併せて示す。
【００８５】
図２に示すように、アプライ用試料に酢酸を含まない場合、２ＡＢ標識糖鎖混合物の回収率が極端に下がった。
【００８６】
［比較例２］
アプライ用試料の調製において、２００％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液の代わりに純水を用い、かつ、カラムの溶出液として純水５０μＬ中に０．２％（ｖ／ｖ）となるように酢酸を含む酢酸水溶液を用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。
【００８７】
図３（ａ）に、比較例２でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖混合物のＨＰＬＣチャートを示す。図３（ｂ）には、比較用として、カラム精製を行っていない２ＡＢ標識糖鎖混合物の原液のＨＰＬＣチャートを併せて示す。
【００８８】
図３に示すように、アプライ用試料に酢酸を含まない場合、溶出液に酢酸を用いても、２ＡＢ標識糖鎖混合物の回収率が極端に下がった。
【００８９】
［実施例２］
アプライ用試料の調製時に０．５％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液を１０μＬ加えたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。なお、アプライ用試料中の酢酸濃度は０．００５％（ｖ／ｖ）である。
【００９０】
［実施例３］
アプライ用試料の調製時に２．５％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液を１０μＬ加えたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。なお、アプライ用試料中の酢酸濃度は０．０２５％（ｖ／ｖ）である。
【００９１】
［実施例４］
アプライ用試料の調製時に１０％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液を１０μＬ加えたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。なお、アプライ用試料中の酢酸濃度は０．１％（ｖ／ｖ）である。
【００９２】
［実施例５］
アプライ用試料の調製時に５０％の酢酸を１０μＬ加えたことを除いて、実施例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣ測定を行った。なお、アプライ用試料中の酢酸濃度は０．５％（ｖ／ｖ）である。
【００９３】
図４に、実施例２から実施例５でカラム精製した２ＡＢ標識糖鎖混合物のＨＰＬＣチャートを示す。図４に示すように、アプライ用試料に酢酸を用いることによって、２ＡＢ標識糖鎖混合物が良好な回収率で溶出された。
【００９４】
本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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