(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルス及びタンパク質を含む溶液からウイルスを好適に濃縮精製する手段の提供。【解決手段】ウイルス及びタンパク質を含む第１の溶液に、金属多価イオンを添加して、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液を調製する工程（１）と、前記第２の溶液をフィルターに接触させて、前記ウイルス−金属複合体及びタンパク質を分離する工程（２）と、キレート剤により前記ウイルス−金属複合体からウイルスを解離させる工程（３）と、を含み、前記金属多価イオンが、第２族元素のイオン及び／又は遷移元素のイオンである、精製ウイルス液の製造方法。【選択図】図１
2017112851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスおよびタンパク質を含む第１の溶液に、金属多価イオンを添加して、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液を調製する工程（１）と、
前記第２の溶液をフィルターに接触させて、前記ウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離する工程（２）と、
キレート剤により前記ウイルス−金属複合体からウイルスを解離させる工程（３）と、
を含み、
前記金属多価イオンが、第２族元素のイオンおよび／または遷移元素のイオンである、精製ウイルス液の製造方法。
【請求項２】
前記ウイルス径に対する前記フィルター孔径の比（フィルター孔径／ウイルス径）が、３以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記金属多価イオンが、マグネシウムイオンおよび／またはカルシウムイオンである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記キレート剤が、ヒドロキシ酸系キレート剤および／またはアミノカルボン酸系キレート剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製ウイルス液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、数多くのウイルス感染症が世界各地で報告されており、ウイルス治療薬やワクチンの開発が切望されている。ウイルス治療薬の開発にあたっては、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの解析やスクリーニング等のために、精製されたウイルスが必要となる。
【０００３】
精製されたウイルスを取得する方法として、培養中の細胞にウイルスを感染させて増殖させ、得られた培養液からウイルスを分離することで、精製されたウイルスを取得する方法が挙げられる。しかしながら、培養液中のタンパク質や夾雑物からウイルスを分離することは容易でないことが知られている。
【０００４】
これに対し、従来、ウイルスを精製するいくつかの方法が知られている。例えば、限外ろ過膜（ＵＦ膜）を用いることで、培養液中の水、イオン成分、低分子化合物とウイルスとを分離できることが知られている。また、特許文献１には、一連の少なくとも２つのカラム分離を含む方法に係る発明が記載されている。この際、各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、各分離が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とアデノウイルスたんぱく質とを含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にＡＡＶ含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつＡＡＶが、該アデノウイルスたんぱく質から、該一連のカラム分離により分離されて感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収されることを特徴とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−８２５５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ウイルスを分離する場合において、特にウイルスとタンパク質とを分離してウイルスのみを濃縮精製することは容易でないことが判明した。
【０００７】
具体的には、限外ろ過膜（ＵＦ膜）を用いると、タンパク質を除去することができない、またはほとんどできないため、続く超遠心分離によるタンパク質の分離等の処理がさらに必要となる。
【０００８】
また、特許文献１に記載の方法では、細胞溶解産物組成物に含まれる不純物（タンパク質およびアデノウイルス）について、それぞれの不純物に適したクロマトグラフィ材料を用いて精製するため、多段階のクロマトグラフィが必須となる。そうすると、クロマトグラフィにより一度濃縮したウイルス液を、続くクロマトグラフィを行うために希釈、再濃縮する必要が生じるため非効率な結果となる。
【０００９】
そこで、本発明は、ウイルスおよびタンパク質を含む溶液からウイルスを好適に濃縮精製する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、多価金属イオンを用いてウイルスの精製を行うことで上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ウイルスおよびタンパク質を含む第１の溶液に、金属多価イオンを添加して、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液を調製する工程（１）と、前記第２の溶液をフィルターに接触させて、前記ウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離する工程（２）と、キレート剤により前記ウイルス−金属複合体からウイルスを解離させる工程（３）と、を含む、精製ウイルス液の製造方法に関する。この際、前記金属多価イオンが、第２族元素のイオンおよび／または遷移元素のイオンであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ウイルスおよびタンパク質を含む溶液からウイルスを好適に濃縮精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係るウイルスを濃縮精製する装置である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１５】
＜精製ウイルス液の製造方法＞
本形態に係る精製ウイルス液の製造方法は、ウイルスおよびタンパク質を含む第１の溶液に、金属多価イオンを添加して、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液を調製する工程（１）と、前記第２の溶液をフィルターに接触させて、前記ウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離する工程（２）と、キレート剤により前記ウイルス−金属複合体からウイルスを解離させる工程（３）と、を含む。この際、前記金属多価イオンは、第２族元素のイオンおよび／または遷移元素のイオンである。
【００１６】
以下、図面を参照しながら、本発明の一実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態に係るウイルス濃縮精製装置である。図１によると、ウイルス濃縮精製装置１は、ポリエチレン製の中空糸にメトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）およびメタクリル酸（ＭＡＡ）の共重合体（ＭＥＡ−ＭＡＡ共重合体）を塗工してなる樹脂塗工中空糸（フィルター）２を有し、当該フィルター２が６１本束ねられている。ウイルス濃縮装置１は、両端部に注入口３および回収口４を有し、側壁部には２つのろ過液取出し口５を有している。
【００１８】
Ｑβファージおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）由来タンパク質を含む第１の溶液に、塩化マグネシウムを添加して調製された第２の溶液においては、後述するようにＱβファージおよびマグネシウムイオンが複合体を形成すると考えられる。
【００１９】
この第２の溶液をウイルス濃縮精製装置１の注入口３より注入すると、第２の溶液はフィルター２の内部から外部にろ過される。この際、Ｑβファージ−マグネシウムの複合体はサイズが大きく中空糸内部に残存するが、タンパク質は中空糸外部にろ過される。これにより、Ｑβファージ−マグネシウムの複合体とタンパク質とは分離される。ろ過されたタンパク質を含む溶液（ろ過液）は、ウイルス濃縮精製装置１のろ過液取出し口５より除かれる。次いで、ろ過液取出し口５からクエン酸水溶液をウイルス濃縮精製装置１中に充填する。これにより、Ｑβファージ−マグネシウムの複合体が解離する。そして、これを回収口４から回収することで、ＦＢＳ由来タンパク質が分離された精製ウイルス液（Ｑβファージ溶液）を得ることができる。この際、最後に注入するクエン酸水溶液の量が、初めに注入する第２の溶液の量よりも少ない場合には、結果としてＱβファージが濃縮されて得られることとなる。
【００２０】
なお、上記ウイルス精製のメカニズムは、あくまで推定のものであり、上記メカニズム以外のメカニズムによって本発明の効果が得られる場合であっても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２１】
以下、本発明に係る精製ウイルス液の製造方法の各構成ついて、詳細に説明する。
【００２２】
［工程（１）］
工程（１）は、ウイルスおよびタンパク質を含む第１の溶液に、金属多価イオンを添加して、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液を調製する工程である。
【００２３】
（第１の溶液）
第１の溶液は、ウイルスおよびタンパク質を含む。その他、必要に応じて、溶媒、添加物等を含んでいてもよい。
【００２４】
第１の溶液は、通常、ウイルスとウイルス感染により破壊された細胞分解物、および細胞を溶解させて得られる細胞溶解組成物である。また、第１の溶液は、前記細胞溶解組成物の少なくとも一部を精製して得られたものであってもよいし、研究、スクリーニング等の目的でウイルス、タンパク質、および必要に応じて添加される添加剤を混合して得られるものであってもよい。
【００２５】
この際、前記少なくとも一部を精製する方法としては、公知の前処理が行われる。具体的には、ろ過、クロマトグラフィ、抽出、遠心分離等が挙げられる。
【００２６】
第１の溶液のｐＨは、２〜１３であることが好ましく、２〜１２であることがより好ましい。第１の溶液のｐＨが２以上であると、多価金属イオンとウイルスが好適に複合体を形成できることから好ましい。一方、第１の溶液のｐＨが１３以下であると、ウイルスの感染性を維持したまま回収できることから好ましい。
【００２７】
第１の溶液の温度は、１〜６０℃であることが好ましく、１〜５０℃であることがより好ましい。第１の溶液の温度が１℃以上であると、液状であることから好ましい。一方、第１の溶液の温度が６０℃以下であると、ウイルスの感染性が維持されるとともに、タンパク変性が抑制されることによりフィルターの目詰まりを防止できることから好ましい。
【００２８】
ウイルス
ウイルスとしては、特に制限されず、公知のウイルスが適用されうる。なお、本明細書において、「ウイルス」には、動植物に感染するウイルスだけでなく、細菌に感染するバクテリオファージを含むものとする。
【００２９】
ウイルスの具体例としては、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡファージ、１本鎖ＤＮＡファージ、１本鎖ＲＮＡファージ、並びにこれらの改変体および変異体等が挙げられる。
【００３０】
前記２本鎖ＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス、ポドウイルス等が挙げられる。
【００３１】
前記１本鎖ＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス等が挙げられる。
【００３２】
前記２本鎖ＲＮＡウイルスとしては、ロタウイルス、レオウイルス等が挙げられる。
【００３３】
前記１本鎖ＲＮＡウイルスとしては、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ノロウイルス、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）等のｍＲＮＡとして作用する１本鎖ＲＮＡウイルス；麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス等のｍＲＮＡの相補鎖として作用する１本鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。
【００３４】
前記１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、泡沫状ウイルス等が挙げられる。
【００３５】
前記２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス等が挙げられる。
【００３６】
前記２本鎖ＤＮＡファージとしては、Ｔ２ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ６ファージ等が挙げられる。
【００３７】
前記１本鎖ＤＮＡファージとしては、φ１７４、Ｍ１３ファージなどが挙げられる。
【００３８】
前記１本鎖ＲＮＡファージとしては、Ｑβファージ、ｆ２ファージ、ＭＳ２ファージ等が挙げられる。
【００３９】
また、ウイルスまたはファージの改変体または変異体とは、上記ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の少なくとも１つについて、意図的または非意図的に欠失、置換、挿入、および付加の少なくとも１つが生じているものを意味する。この際、改変体または変異体は、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相当性を保持する。なお、改変体または変異体を意図的に作製する場合、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）突然誘発法、トランスポゾン挿入突然変異誘発法等の方法により行うことができる。
【００４０】
上述のウイルスは第１の溶液に単独で含まれていても、２種以上が混合されて含まれていてもよい。
【００４１】
ウイルスの粒径は、特に制限されないが、５〜２０００ｎｍであることが好ましく、１０〜１５００ｎｍであることがより好ましく、２０〜５００ｎｍであることがさらに好ましい。ウイルスの粒径が５ｎｍ以上であると、ウイルスおよび多価金属イオンの複合体の大きさが大きくなりフィルターで捕捉しやすくなることから好ましい。一方、ウイルスの粒径が２０００ｎｍ以下であると、フィルターの目詰まりを抑制できることから好ましい。なお、本明細書において、「粒径」とは、粒子の輪郭線上の２点間の距離のうち、最大の長さを意味する。また、「粒径」の値は、任意の２０個のウイルスの粒径を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により得られたイメージから測定、算出された値を意味する。
【００４２】
第１の溶液中のウイルス濃度は、１０〜１０１１ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであることが好ましく、１０２〜１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであることがより好ましい。第１の溶液中のウイルス濃度が１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上であると、ウイルスおよび多価金属イオンの複合体の大きさが大きくなりフィルターで捕捉しやすくなることから好ましい。一方、第１の溶液中のウイルス濃度が１０１１ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以下であると、フィルターの目詰まりを抑制できることから好ましい。
【００４３】
タンパク質
タンパク質としては、公知のものであれば特に制限されない。
【００４４】
具体的には、アルブミン、成長因子、細胞増殖阻害因子等の培養液由来タンパク質；膜タンパク質等の感染細胞由来タンパク質等が挙げられる。
【００４５】
これらのタンパク質は単独で含まれていても、２種以上が混合して含まれていてもよい。
【００４６】
第１の溶液中のタンパク質濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ未満であること好ましく、０．０５〜１５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。第１の溶液中のタンパク質濃度が２０ｍｇ／ｍＬ未満であると、フィルターの目詰まりを抑制できることから好ましい。
【００４７】
溶媒
溶媒としては、特に制限されないが、水および有機溶媒が挙げられる。
【００４８】
前記有機溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ジエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類などが挙げられる。
【００４９】
これらのうち、ウイルスの感染性を保持する観点から、用いられる溶媒成分は水であることが好ましい。
【００５０】
上述の溶媒は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５１】
添加物
第１の溶液には添加物が含まれていてもよい。なお、添加物は、第１の溶液に意図的に添加したものの他、第１の溶液を得る過程で混入しうる不純物も含まれる。
【００５２】
前記添加物としては、特に制限されないが、塩、並びに細菌類、原虫類、真菌類、およびこれらに由来するＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が挙げられる。
【００５３】
前記塩としては、無機塩および有機塩が挙げられる。前記無機塩としては、特に制限されないが、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等の無機酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。より詳細には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等の塩化物；硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム等の硫化物；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸化物；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸化物が挙げられる。また、前記有機塩としては、特に制限されないが、有機酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。より詳細には、酢酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５４】
前記細菌類としては、特に制限されないが、大腸菌、ブドウ球菌等が挙げられる。
【００５５】
前記原虫類としては、特に制限されないが、クリプトスポリジウム、ジアルジア等が挙げられる。
【００５６】
前記真菌類としては、特に制限されないが、カビ、酵母等が挙げられる。
【００５７】
上述の添加物は単独で含まれていても、２種以上が混合されて含まれていてもよい。
【００５８】
（金属多価イオン）
金属多価イオンは、ウイルスと相互作用をすることで、ウイルス−金属複合体を形成する機能を有する。
【００５９】
金属多価イオンは、第２族元素のイオンおよび／または遷移元素のイオンである。なお、本明細書において、「遷移元素」とは、第３族元素から第１２族元素の間に存在する元素を意味する。
【００６０】
前記第２族元素としては、ベリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｔ）、バリウム（Ｂａ）、ラジウムイオン（Ｒａ）が挙げられる。
【００６１】
前記遷移元素としては、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）等の３ｄ遷移元素；イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）等の４ｄ遷移元素；ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）等の４ｆ遷移元素が挙げられる。これらのうち、金属多価イオンは、第２族元素のイオンおよび３ｄ遷移元素のイオンであることが好ましく、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄（ＩＩ）イオン、鉄（ＩＩＩ）イオン、亜鉛イオンであることがより好ましく、ウイルス感染性の低下を防止できる観点から、マグネシウムイオン、カルシウムイオンであることがさらに好ましい。
【００６２】
上述の金属多価イオンは単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６３】
金属多価イオンの価数は、通常、２価以上であり、２〜４価であることが好ましく、２〜３価であることがより好ましく、２価であることがさらに好ましい。金属多価イオンの価数が２価以上であることにより、ウイルスと好適に複合体を形成することができる。
【００６４】
金属多価イオンの添加量は、特に制限されないが、１０００ｍＭ以下であることが好ましく、０．０１〜５００ｍＭであることがより好ましく、０．１〜１００ｍＭであることがさらに好ましい。
【００６５】
（第２の溶液）
第２の溶液は、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む。
【００６６】
ウイルス−金属複合体
ウイルス−金属複合体は、ウイルスおよび多価金属イオンが複合体を形成したものである。具体的な構造は明らかではないが、例えば、ウイルスが多価金属イオンと静電的相互作用により複合体を形成していると推察される。このような場合、通常、複合体は２以上のウイルスが多価金属イオンと複合体を形成することになるため、ウイルス単独で存在する場合と比べて粒径が大きくなる。そうすると、ウイルス−金属複合体の大きさと、タンパク質の大きさにおいて差異が生じることとなるため、タンパク質を分離することができる。
【００６７】
ウイルス−金属複合体の粒径は、適用されるウイルス、使用する多価金属イオン、分離されるタンパク質によっても異なるが、１０ｎｍ以上であることが好ましく、１５〜１００００ｎｍであることがより好ましい。ウイルス−金属複合体の粒径が１０ｎｍ以上であると、タンパク質と好適に分離できることから好ましい。
【００６８】
タンパク質
タンパク質は上述したものが用いられうることから、ここでは説明を省略する。
【００６９】
［工程（２）］
工程（２）は、前記第２の溶液をフィルターに接触させて、前記ウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離する工程である。
【００７０】
（第２の溶液）
第２の溶液は上述した通りであるから、ここでは説明を省略する。
【００７１】
（フィルター）
フィルターは、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離する機能を有する。より詳細には、フィルターはウイルス−金属複合体は通過させず、かつ、タンパク質を通過させることによって、両者を分離する機能を有する。
【００７２】
フィルターの基材としては、特に制限されないが、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、スルホン系樹脂、ポリイミド系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂、フッ素系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリカーボネート樹脂が挙げられる。
【００７３】
前記オレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリブチレン、ポリブタジエン、ポリ４−メチルペンテン−１等が挙げられる。
【００７４】
前記スチレン系樹脂としては、ポリスチレン等が挙げられる。
【００７５】
前記アクリル系樹脂としては、ポリアクリレート；ポリメタクリレート；ポリアクリル酸メチル、ポリアクリル酸エチル等のポリアクリル酸エステル；ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エチル等のポリメタクリル酸エステル等が挙げられる。
【００７６】
前記スルホン系樹脂としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン等が挙げられる。
【００７７】
前記ポリイミド系樹脂としては、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリベンズイミダゾール等が挙げられる。
【００７８】
前記ウレタン系樹脂としては、ジイソシアネートと、ポリオールとを反応させて得られるウレタン樹脂が挙げられる。この際、前記ジイソシアネートとしては、ヘキサメチレンジイソシアネート等の脂肪族ジイソシアネート類；１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等の脂環族ジイソシアネート類；トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネート等の芳香族ジイソシアネート類が挙げられる。また、前記ポリオールとしては、ポリエステルポリオール；ポリテトラメチレンエーテルグリコール等のポリエーテルポリオール；ポリカーボネートポリオール等が挙げられる。
【００７９】
前記エステル系樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の脂肪族ポリエステル；ポリエチレンナフタレート等の芳香族ポリエステル；ジオールとジカルボン酸とを反応させて得られるポリエステルなどが挙げられる。
【００８０】
前記エーテル系樹脂としては、ポリオキシアルキレン系樹脂、ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリフェニレンエーテルケトン系樹脂、ポリスルフィド系樹脂、ポリエーテルケトン系樹脂、ポリエーテルエーテルケトン系樹脂等が挙げられる。
【００８１】
前記フッ素系樹脂としては、ポリテトラフルオロエチレン、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＥＰＡ）、テトラフルオロエチレン−エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン等が挙げられる。
【００８２】
前記ポリアミド系樹脂としては、ナイロン６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６Ｔ、ナイロン６Ｉ、ナイロン９Ｔ、ナイロンＭ５Ｔ、ナイロン６１２等が挙げられる。
【００８３】
また、フィルターの基材は、上述の樹脂のモノマー単位を２以上用いて得られるポリマーであってもよい。
【００８４】
さらに、フィルターの基材は単層でも積層されたものであってもよい。
【００８５】
上述の樹脂は強度の向上、透過性の向上等の観点から、被覆層を有していてもよい。
【００８６】
前記被覆層の材料は、特に制限されないが、親水性樹脂または親水性樹脂用モノマーが挙げられる。
【００８７】
当該親水性樹脂としては、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、アクリル酸とアクリル酸エステルとの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸エステルとの共重合体、メタクリル酸とアクリル酸エステルとの共重合体、メタクリル酸とメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００８８】
この際、アクリル酸エステルとしては、特に制限されないが、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、イソブチルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート等のアルキルアクリレート；１−メトキシエチルアクリレート、１−エトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−エトキシエチルアクリレート、１−メトキシプロピルアクリレート、１−エトキシプロピルアクリレート、２−メトキシプロピルアクリレート、２−エトキシプロピルアクリレート、等のアルコキシアルキルアクリレート；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート等のヒドロキシアルキレンアクリレート等が挙げられる。
【００８９】
また、前記メタクリル酸エステルとしては、特に制限されないが、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート等のアルキルメタクリレート；１−メトキシエチルメタクリレート、１−エトキシエチルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、２−エトキシエチルメタクリレート、１−メトキシプロピルメタクリレート、１−エトキシプロピルメタクリレート、２−メトキシプロピルメタクリレート、２−エトキシプロピルメタクリレート、等のアルコキシアルキルメタクリレート；ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート等のヒドロキシアルキレンメタクリレート等が挙げられる。
【００９０】
また、前記被覆層のうち、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体等の水酸基を有するものは、さらに表面修飾されていてもよい。当該表面修飾は、特に制限されないが、活性化剤により水酸基を活性化し、次いで官能基含有化合物を反応させることにより行うことができる。
【００９１】
前記活性化剤としては、特に制限されないが、エピクロロヒドリン等のハロヒドリン；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド；グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル等のポリエポキシド等が挙げられる。これらの活性化剤は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９２】
また、前記官能基含有化合物としては、特に制限されないが、アンモニア、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ヒドロキシルアミン、スルホン酸、リン酸等が挙げられる。これらの官能基含有化合物は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
例えば、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）にエピハロヒドリンを反応させることで、ビニルアルコール由来の水酸基の少なくとも１つが、グリシジルエーテル基に変換される。次いで、アミンをグリシジル基と反応させると、アミノアルコールが得られる。
【００９４】
被覆層の形成方法は、特に制限されないが、塗布法、浸漬法、放射線（α線、β線、γ線、電子線等）グラフト法等が挙げられる。
【００９５】
この際に使用されうる溶液（塗布液等）中の被覆層の材料の濃度についても特に制限されないが、溶液の質量に対して、２０質量％未満であることが好ましく、０．１〜１５質量％であることがより好ましい。被覆層の材料の濃度が上記範囲にあると、均質な膜が形成されうることから好ましい。
【００９６】
フィルターの形状は、特に制限されず、多孔質膜状、中空糸状、平膜状、ビーズ状のいずれであってもよい。このうち、接触効率および濃縮の容易性の観点から中空糸状であることが好ましい。
【００９７】
フィルターの使用形態についても特に制限されず、単一フィルターを用いてもよいし、２以上のフィルターを積層して用いてもよいし、モジュールの形態にして用いてもよい。
【００９８】
フィルターの平均孔径は、特に制限されないが、５ｎｍ以上であることが好ましく、１０〜５０００ｎｍであることがより好ましい。フィルターの平均孔径が５ｎｍ以上であると、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を好適に分離することができることから好ましい。
【００９９】
前記フィルターの平均孔径は、Automated Perm Porometer（Porous Materials, Inc.製）でＧＡＬＷＩＣＫ液（Porous Materials, Inc.製）を用いて測定した値を採用するものとする。
【０１００】
なお、フィルターの平均孔径は、フィルターの製造条件を適宜調整することで、制御することができる。例えば、フィルターが中空糸状である場合には、製造過程における引っ張り速度等を変更することで、平均孔径を制御することができる。
【０１０１】
また、ウイルス粒径に対するフィルターの平均孔径の比（フィルター平均孔径／ウイルス粒径；Ｆ／Ｖ比）は、３以下であることが好ましく、０．００１〜２．５であることがより好ましく、０．００５〜２．０であることがさらに好ましく、０．０１〜１．５であることが特に好ましい。前記比が３以下であると、ウイルスの回収率が高くなりうることから好ましい。
【０１０２】
さらに、フィルターのろ過面積（モジュールを形成している場合にはモジュールのろ過面積）は、１ｃｍ２以上であることが好ましく、２〜１０００００００ｃｍ２であることがより好ましい。ろ過面積が１ｃｍ２以上であると、ろ過操作が容易になることから好ましい。
【０１０３】
（分離）
ウイルス−金属複合体およびタンパク質の分離は、通常、フィルターに接触させることにより行われる。この際、フィルターの形状により分離の態様が異なりうる。
【０１０４】
例えば、フィルターが平膜の場合、ウイルス−金属複合体およびタンパク質を含む第２の溶液をフィルターに通液により接触させると、フィルター上にウイルス−金属複合体が残存し、ろ過液中にタンパク質が存在しうる。すなわち、フィルターの接触によりウイルス−金属複合体およびタンパク質が分離されたといえる。
【０１０５】
また、フィルターが中空糸状であり、かつ、モジュールの形態とした場合、第２の溶液を中空糸に接触させると、中空糸内部にウイルス−金属複合体が残存し、タンパク質は中空糸外部にろ過されることから、フィルターとの接触によりウイルス−金属複合体およびタンパク質が分離されたといえる。
【０１０６】
第２の溶液を接触させる場合、全液量を一度に通液させる全ろ過方式であっても、一部を通液させる十字流ろ過（タンジェンシャルフロー、クロスフロー）方式であってもよい。
【０１０７】
フィルターへの接触は、大気圧下で行っても、加圧して行っても、吸引して行ってもよい。これらのうち、目詰まりを抑制し、また、効率的な分離を行う観点から、加圧または吸引して行うことが好ましく、加圧または真空吸引して行うことがより好ましい。
【０１０８】
［タンパク質除去工程］
工程（２）の後に、必要に応じて、タンパク質除去工程を行ってもよい。当該タンパク質除去工程は、ろ過液を除去することによりタンパク質を除去する工程を含む。
【０１０９】
具体的には、上述のフィルターが中空糸状であり、かつ、モジュールの形態とした場合には、分離後もろ過液がモジュール内に残存しうる。タンパク質除去工程では、このような残存したろ過液を除去する。より詳細には、上記形態の場合、中空糸内部にはウイルス−金属複合体が、中空糸外部のろ過液中にはタンパク質が、それぞれ含まれうる。この場合、中空糸外部からろ過液をモジュールから除去すると、タンパク質のみを除去することができる。
【０１１０】
［洗浄工程］
工程（２）またはタンパク質除去工程の後に、必要に応じて洗浄工程を行ってもよい。当該洗浄工程は、溶媒をフィルターに接触させて残存しうるタンパク質を洗浄する工程を含む。
【０１１１】
洗浄工程は２度以上行うことができる。
【０１１２】
［工程（３）］
工程（３）は、キレート剤により前記ウイルス−金属複合体からウイルスを解離させる工程である。
【０１１３】
（キレート剤）
キレート剤としては、特に制限されず、公知のものが使用されうる。キレート剤の具体例としては、ヒドロキシ酸系キレート剤、アミノカルボン酸系キレート剤、エーテルカルボン酸系キレート剤が挙げられる。
【０１１４】
前記ヒドロキシ酸系キレート剤としては、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸、アスコルビン酸、エチドロン酸、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）等が挙げられる。
【０１１５】
前記アミノカルボン酸系キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グルタミン酸二酢酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）等が挙げられる。
【０１１６】
前記エーテルカルボン酸系キレート剤としては、カルボキシメチルタルトロン酸（ＣＭＴ）、カルボキシメチルオキシコハク酸（ＣＭＯＳ）等が挙げられる。
【０１１７】
これらのうち、キレート剤は、ヒドロキシ酸系キレート剤、アミノカルボン酸系キレート剤であることが好ましく、精製するウイルスの感染性の低下を防止する観点から、アミノカルボン酸系キレート剤であることがより好ましく、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）であることがより好ましい。
【０１１８】
上述のキレート剤は単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１１９】
キレート剤は溶媒に溶解または分散させて、キレート剤溶液として添加することが好ましい。
【０１２０】
この際、使用される溶媒は、特に制限されないが、上述の溶媒、および緩衝液が挙げられる。
【０１２１】
前記緩衝液としては、特に制限されないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液が挙げられる。また、キレート剤として、クエン酸、酒石酸を用いる場合には、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液等を使用することができる。
【０１２２】
また、キレート剤溶液中のキレート剤の濃度は、使用する多価金属イオンによっても異なるが、１０００ｍＭ以下であることが好ましく、０．０１〜５００ｍＭであることがより好ましい。キレート剤の濃度が１０００ｍＭ以下であると、精製するウイルスの感染性の低下を防止できることから好ましい。
【０１２３】
（解離）
ウイルス−金属複合体にキレート剤を接触させるとウイルスと多価金属イオンとが解離される。この際、多価金属イオンは、キレート剤と複合体を形成すると考えられる。これにより、タンパク質を精製したウイルス液を得ることができる。
【０１２４】
［多価金属イオン分離工程］
工程（３）の後に、必要に応じて、多価金属イオン分離工程を行ってもよい。当該多価金属イオン分離工程は、ウイルスと、多価金属イオンとを分離することを含む。
【０１２５】
多価金属イオンを分離する方法としては、特に制限されず、イオン交換性の担体（ビーズ、ゲル、膜等）による吸着等が挙げられる。
【０１２６】
＜精製ウイルス液＞
精製ウイルス液は、ウイルスを含む。
【０１２７】
当該精製ウイルス液は、ウイルス−金属複合体とタンパク質とを分離する過程で濃縮されうる。すなわち、本発明の一実施形態によれば、タンパク質の分離と濃縮を一挙に行うことができるウイルスの精製方法であるといえる。例えば、平膜状のフィルターを用いた場合には、フィルター状に残存したウイルス−金属複合体を溶媒等で回収する際、使用する溶媒が第２の溶液中の溶媒量（ろ過液の量）よりも少ない場合、精製ウイルス液は濃縮されていることとなる。
【０１２８】
前記ウイルスが感染性を有する場合には、抗原性に関する試験、ウイルス治療薬の開発・製造、生ワクチンの開発・製造、不活化ワクチンの開発・製造、ウイルス感染症の診断（検査）試薬の開発・製造等に適用されうる。
【０１２９】
また、前記ウイルスが感染性を有さない場合には、抗原性に関する試験、ウイルス治療薬の開発・製造、不活化ワクチンの開発・製造、ウイルス感染症の診断（検査）試薬の開発・製造等に適用されうる。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１３１】
＜フィルターの作製＞
［合成例１］
メトキシエチルアクリレートおよびメタクリル酸の共重合体（塗工樹脂）を合成し、前記塗工樹脂を中空糸に塗工して樹脂塗工中空糸（フィルター）を作製し、これを用いて中空糸モジュールを作製した。
【０１３２】
（共重合体（塗工樹脂）の合成）
メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）２２５ｇと、メタクリル酸（ＭＡＡ）２５ｇと、重合開始剤である２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）２．５ｇと、溶媒であるメチルエチルケトン２２．５ｇと、を混合し、反応溶液を調製した。
【０１３３】
１Ｌの３口フラスコに溶媒であるメチルエチルケトン２２５ｍＬを投入し、窒素雰囲気下、スリーワンモーターで撹拌しながら８０℃に加温した。次いで、上記で調製した８０℃を維持しながら反応溶液を４時間かけて滴下した。８０℃で１０時間撹拌することで、ＭＥＡ−ＭＡＡの共重合体（塗工樹脂）を含む樹脂組成物を得た。なお、得られた樹脂組成物の分子量をゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー株式会社製）で測定したところ、重量平均分子量（Ｍｗ）は７７０００であり、Ｍｗ／Ｍｎは３．１６であった。この際、ＧＰＣはポリメチルメタクリレートを標準物質として用いた。
【０１３４】
（樹脂塗工中空糸の作製）
上記で合成した塗工樹脂組成物をメチルエチルケトンで希釈し、塗布液（樹脂濃度：１質量％）を調製した。得られた溶液に中空糸（ポリエチレン、中空糸の長さ：１０ｃｍ、中空糸の平均孔径：５０ｎｍ、ＤＩＣ株式会社製）を３０秒浸漬させた後、５０℃で９０秒間乾燥させることで、樹脂塗工中空糸を作製した。
【０１３５】
（中空糸モジュールの作製）
上記で作製した樹脂塗工中空糸を６１本束ね、アクリル樹脂製パイプ（外径：８ｍｍ、内径：５ｍｍ、長さ：８ｃｍ）に挿入し、両端をエポキシ系接着剤であるセメダインハイスーパー５（セメダイン株式会社製）で封止した。次いで、アクリル樹脂製パイプの両端部にメスルアーフィッティングＶＲＦ２０６（株式会社アイシス製）を取り付け、側面にろ過液取出し用の２条ねじプラスチックニードル（武蔵エンジニアリング株式会社製）を２箇所取り付けることで、中空糸モジュール（ろ過面積：２０ｃｍ２）を作製した。
【０１３６】
［合成例２］
塗布液の樹脂濃度を５質量％に変更したことを除いては、合成例１と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：２０ｃｍ２）を作製した。
【０１３７】
［合成例３］
中空糸（ポリエチレン、中空糸の長さ：１０ｃｍ、中空糸の平均孔径：１００ｎｍ、ＤＩＣ株式会社製）を用いたことを除いては合成例１と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：２０ｃｍ２）を作製した。
【０１３８】
［合成例４］
中空糸（ポリエチレン、中空糸の長さ：１０ｃｍ、中空糸の平均孔径：１５０ｎｍ、ＤＩＣ株式会社製）を用いたことを除いては合成例１と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：２０ｃｍ２）を作製した。
【０１３９】
［合成例５］
エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）を中空糸に塗工して樹脂塗工中空糸を作製し、これを用いて中空糸モジュールのフィルターを作製した。
【０１４０】
ＥＶＯＨ（重量平均分子量：９００００、エチレン含量：４４ｍｏｌ％、日本合成化学工業株式会社製）を、エタノールおよび水の混合液（エタノール：水＝７５：２５）に添加して、２．５質量％のＥＶＯＨ溶液を作製した。得られた溶液を５０℃にまで昇温し、中空糸（ポリエチレン、中空糸の長さ：１０ｃｍ、中空糸の平均孔径：５０ｎｍ、ＤＩＣ株式会社製）を１００秒浸漬させた後、５０℃で８０秒間乾燥させることで、樹脂塗工中空糸を作製した。
【０１４１】
（中空糸モジュールの作製）
合成例１と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：２０ｃｍ２）を作製した。
【０１４２】
［合成例６］
合成例１と同様の方法で、樹脂塗工中空糸を作製した。
【０１４３】
作製した樹脂塗工中空糸を１２本束ねたことを除いては、合成例１と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：４ｃｍ２）を作製した。
【０１４４】
［合成例７］
合成例４と同様の方法で、樹脂塗工中空糸を作製した。
【０１４５】
合成例６と同様の方法で中空糸モジュール（ろ過面積：４ｃｍ２）を作製した。
【０１４６】
合成例１〜７で作製した中空糸モジュールを下記表１に示す。
【０１４７】
【表１】
2017112851.tif 000003
【０１４８】
＜精製ウイルス液の製造−濃縮精製−＞
［実施例１］
（第１の溶液の調製工程）
ウイルスおよびタンパク質を含む溶液を調製した。
【０１４９】
具体的には、１０１１ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＱβファージ（ＮＢＲＣ２００１２、球状、粒径：２５ｎｍ）を、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養液に添加し、１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＱβファージを含む第１の溶液を得た。
【０１５０】
（工程（１））
上記で調製した第１の溶液に、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を終濃度が２５ｍＭとなるように添加し、第２の溶液を調製した。
【０１５１】
（工程（２））
合成例１で作製した中空糸モジュールを用いてウイルス−金属複合体およびタンパク質を分離した。
【０１５２】
より詳細には、中空糸モジュールの回収口を閉口した状態で、第２の溶液１０ｍＬを注入口より注入してろ過した。この際、ウイルス−金属複合体はろ過されずに中空糸内部に残存し、タンパク質がろ過された。次いで、ろ過液取出し口よりタンパク質を含むろ過液をシリンジにより除去することでタンパク質を分離した。
【０１５３】
（工程（３））
キレート剤を用いてウイルス−金属複合体からウイルスを解離させた。
【０１５４】
より詳細には、中空糸モジュールの注入口および回収口を閉口し、クエン酸水溶液（５０ｍＭ、ｐＨ６．２）をろ過液取出し口から注入した。次いで、前記クエン酸水溶液をろ過液取出し口からさらに注入した。この際、注入したクエン酸水溶液は計１ｍＬである。そして、ろ過液取出し口から空気を注入し、中空糸モジュール内の中空糸すべてにクエン酸水溶液を透過させた。最後に、注入口から空気を送り、回収口から精製ウイルス液を回収した。なお、中空糸モジュールに注入した第２の溶液は１０ｍＬであり、回収した溶液は１ｍＬ（クエン酸水溶液の注入量）であることから、得られる精製ウイルス液は１０倍に濃縮されていることとなる。
【０１５５】
［実施例２］
合成例２で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１５６】
［実施例３］
合成例３で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１５７】
［実施例４］
合成例４で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１５８】
［実施例５］
クエン酸水溶液（１０ｍＭ、ｐＨ６．２）を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１５９】
［実施例６］
クエン酸水溶液（５０ｍＭ、ｐＨ６．２）に代えて、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびトリス塩酸を含むＴＥ緩衝液（ＥＤＴＡ  １ｍＭ、トリス塩酸１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６０】
［実施例７］
Ｑβファージに代えて、Ｍ１３ｍｐ１８（Ｔａｋａｒａ３１１８、６×１０００ｎｍの棒状、粒径：１０００ｎｍ）を用いたことを除いては、実施例７と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６１】
［実施例８］
合成例３で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例７と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１６２】
［実施例９］
合成例４で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例７と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１６３】
［実施例１０］
Ｑβファージに代えて、ＭＳ２（ＮＢＲＣ１０２６１９、球状、粒径：２７ｎｍ）を用いたことを除いては、実施例７と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６４】
［実施例１１］
合成例２で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例１０と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１６５】
［実施例１２］
Ｑβファージに代えてネコカリシウイルス（ＶＲ−７８２、球状、粒径：３５ｎｍ、以下ＦＣＶと略）を用い、培養液中のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の添加量を２％に変更したことを除いては、実施例６と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１６６】
［比較例１］
第１の溶液に塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を添加せず、工程（３）においてクエン酸水溶液に代えてリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６７】
［比較例２］
第１の溶液に塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を添加せず、工程（３）においてクエン酸水溶液に代えてＰＢＳを用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６８】
［比較例３］
合成例５で作製した中空糸モジュールを用い、第１の溶液に塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を添加せず、工程（３）においてクエン酸水溶液に代えてＰＢＳを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１６９】
［比較例４］
実施例１と同様の方法で第１の溶液を調製した。
【０１７０】
前記第１の溶液を、限外ろ過（ＵＦ）膜アミコンウルトラ−１５（５０ｋＤａ、メルク社製）を用いてろ過することで、精製ウイルス液を製造した。
【０１７１】
［比較例５］
限外ろ過（ＵＦ）膜アミコンウルトラ−１５（１００ｋＤａ、メルク社製）を用いたことを除いては、比較例４と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１７２】
［比較例６］
Ｑβファージに代えて、Ｍ１３ｍｐ１８（Ｔａｋａｒａ３１１８、６×１０００ｎｍの棒状、粒径：１０００ｎｍ）を用いたことを除いては、比較例５と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１７３】
［比較例７］
Ｑβファージに代えて、ＭＳ２（ＮＢＲＣ１０２６１９、球状、粒径：２７ｎｍ）を用いたことを除いては、比較例５と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０１７４】
［比較例８］
Ｑβファージに代えてＦＣＶ（ＶＲ−７８２、球状、粒径：３５ｎｍ）を用い、培養液中のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の添加量を２％に変更したことを除いては、比較例５と同様の方法で、精製ウイルス液を製造した。
【０１７５】
＜精製ウイルス液の評価＞
実施例１〜１２および比較例１〜８の精製方法および得られた精製ウイルス液についての評価を行った。
【０１７６】
［回収率］
第１の溶液および得られた精製ウイルス液のそれぞれについて、QIAGEN MinElute Virus Spinキット（株式会社キアゲン製）を用いてバクテリオファージまたはウイルスから核酸を抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＲＮＡまたはＤＮＡの定量を行った。
【０１７７】
測定装置にStep One Plus Real-Time PCR System（ライフテクノロジーズジャパン製）を使用した。また、プローブおよびプライマーは以下の配列のものを使用した。
【０１７８】
Ｑβ
Forward Primer  GYGGTGCYACAACRACGAAT
Reverse Primer  GWGGSGTACACKCTTGCG
Probe           FAM-TACGGCCATCCGTCCT-MGB
Ｍ１３ｍｐ１８
Forward Primer  GCGTTGGCCGATTCATTAA 
Reverse Primer  TCACTGCCCGCTTTCCA
Probe           FAM-CAGCTGGCACGACAG-MGB
ＭＳ２
Forward Primer  GTCCTGCTCRACTTCCTGT
Reverse Primer  CGGCTACCTACAGCGCATAG
Probe           FAM-CAWGGTAGCGTCTCGCTAAAGACATTA-MGB
ＦＣＶ
Forward Primer  TGCGGTCGATTATTCCAAATG
Reverse Primer  CGATCGGAAAAGTAACGAAGGA 
Probe           FAM-TTCGACCCAATCGCCTCGTGTCAG-TAMRA
【０１７９】
回収率は下記一般式（１）により算出した。
【０１８０】
【数１】
2017112851.tif 000004
【０１８１】
［タンパク質濃度比］
第１の溶液および得られた精製ウイルス液のそれぞれについて、Protein Assay Rapid Kit Wako（和光純薬工業株式会社製）を用い、付属のプロトコルに準拠して６００ｎｍの吸光度に基づきタンパク質量を測定した。
【０１８２】
タンパク質濃度比は下記一般式（２）により算出した。
【０１８３】
【数２】
2017112851.tif 000005
【０１８４】
［感染性］
バクテリオファージ（Ｑβ、Ｍ１３ｍｐ１８、ＭＳ２）に係る感染性は、以下のように評価した。
【０１８５】
精製ウイルス液を所定の液体培地で１０倍に希釈した希釈液１００μＬと、所定の液体培地で懸濁した宿主菌懸濁液（濃度：８×１０８cells/mL）ｍＬと、を５５℃に加温した所定の軟寒天培地（トップアガー）３ｍＬに混合し、所定の下層寒天培地（ボトムプレート）の上に素早く重層した。軟寒天培地が固化した後、所定の温度で一晩インキュベーションしてプラーク数を目視で測定した。
【０１８６】
なお、バクテリオファージの宿主菌、使用する液体培地、軟寒天培地、下層寒天培地、およびインキュベーション温度は以下の通りである。
【０１８７】
Ｑβ
宿主菌：大腸菌（ＮＢＲＣ１３９６５）
液体培地：７０２
軟寒天培地：０．６％のアガーを添加した７０２
下層寒天培地：８０２
インキュベーション温度：３０℃
Ｍ１３ｍｐ１８
宿主菌：大腸菌（ＮＢＲＣ１０６３７３）
液体培地：ＬＢ
軟寒天培地：ＹＴ  ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ
下層寒天培地：Ｌプレート
インキュベーション温度：３７℃
ＭＳ２
宿主菌：大腸菌（ＪＭ１０９  Competent Cell）
液体培地：８９２
軟寒天培地：０．６％のアガーを添加した８９２
下層寒天培地：８９１
インキュベーション温度：３７℃
【０１８８】
バクテリオファージの感染性は、以下の基準に準拠して評価した。
【０１８９】
○：プラーク数が濃縮精製前のプラーク数に対して２倍以上
△：プラーク数が濃縮精製前のプラーク数に対して１倍以上２倍未満
×：プラーク数が濃縮精製前のプラーク数に対して１倍未満
【０１９０】
また、ウイルス（ＦＣＶ）に係る感染性は、以下のように評価した。
【０１９１】
２４ウェルプレート上にネコ腎由来株化細胞ＣＬＬ−９４、ＡＴＣＣ（ＣＲＦＫ細胞）を播種し、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養液を用いて３７℃で８０％コンフルエント、すなわち培養容器底面の８０％を増殖した細胞が占める状態まで培養した。次いで、培養液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業株式会社製）で各ウェルを洗浄した。
【０１９２】
精製ウイルス液をＥＭＥＭにＦＢＳを２％添加した培養液で１０倍まで段階希釈し希釈した精製ウイルス希釈液を調製した。
【０１９３】
調製した精製ウイルス希釈液２００μＬを、上記の各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、精製ウイルス希釈液を除去し、ＥＭＥＭにＦＢＳを２％添加した培養液を各ウェルに添加して３７℃でインキュベーションした。３日後、感染した細胞をＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法により５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を測定し、以下の基準に準拠してウイルスの感染性を評価した。
【０１９４】
○：log TCID50/mLが濃縮精製前のＴＣＩ５０に対して２倍以上である
△：log TCID50/mLが濃縮精製前のＴＣＩ５０に対して１倍以上２倍未満である
×：log TCID50/mLが濃縮精製前のＴＣＩ５０に対して１倍未満である
【０１９５】
得られた結果を下記表２に示す。
【０１９６】
【表２】
2017112851.tif 000006
【０１９７】
比較例４〜８の結果を参照すると、限外ろ過（ＵＦ）膜では、ウイルスを濃縮することができるが、タンパク質も同時に濃縮されていることが分かる。
【０１９８】
また、比較例１〜３を参照すると、中空糸に樹脂を塗工したフィルターでは、タンパク質濃度比が低いことからタンパク質を除去できていることが分かる。しかしながら、回収率の値も低く、タンパク質とともにウイルスも除去されてしまっていることが分かる。
【０１９９】
他方、実施例１〜１２を参照すると、回収率が高く、かつ、タンパク質濃度比が低いことから、タンパク質を分離しつつ、ウイルスは好適に精製されていることが分かる。
【０２００】
＜精製ウイルス液の製造−精製−＞
［実施例１３］
実施例１と同様の方法で、第１の溶液の調製工程および工程（１）を行い、第２の水溶液を調製した。
【０２０１】
合成例６で作製した中空糸モジュール（ろ過面積：４ｃｍ２）を用い、注入する第２の溶液を１０ｍＬから１ｍＬに変更したことを除いては、実施例１と同様の方法で工程（２）および（３）を行い、精製ウイルス液を製造した。なお、中空糸モジュールに注入した第２の溶液は１ｍＬであり、回収した溶液は１ｍＬ（クエン酸水溶液の注入量）であることから、得られる精製ウイルス液は濃縮されていないこととなる。
【０２０２】
［実施例１４］
工程（１）において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）に代えて、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０３】
［実施例１５］
工程（１）において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）に代えて、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０４】
［実施例１６］
工程（１）において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）に代えて、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２）を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０５】
［比較例９］
工程（１）において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）に代えて、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０６】
［比較例１０］
工程（３）においてクエン酸水溶液に代えて水を用いたことを除いては、実施例１３と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０７】
［実施例１７］
合成例５で作製した中空糸モジュールを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で精製ウイルス液を製造した。
【０２０８】
＜精製ウイルス液の評価＞
実施例１３〜１７および比較例９〜１０の精製方法および得られた精製ウイルス液について、上記と同様の方法で評価を行った。
【０２０９】
ただし、バクテリオファージの感染性については、以下の基準に準拠して評価した。
【０２１０】
○：プラーク数が精製前のプラーク数に対して０．５倍以上
△：プラーク数が精製前のプラーク数に対して０．２倍以上０．５倍未満
×：プラーク数が精製前のプラーク数に対して０．２倍未満
【０２１１】
得られた結果を下記表３に示す。
【０２１２】
【表３】
2017112851.tif 000007
【０２１３】
実施例１３〜１６の結果から、金属多価イオンとして、アルカリ土類金属または遷移元素のイオンを用いた場合には、回収率が高く、かつ、タンパク質濃度比が低いことから、タンパク質を分離しつつ、ウイルスは好適に精製されていることが分かる。
【０２１４】
他方、比較例９の結果から、アルミニウムイオンを用いた場合には、ウイルスの回収ができなかったことが分かる。
【０２１５】
また、比較例１０の結果から、キレート剤を使用しない場合にも、ウイルスの回収ができなかったことが分かる。
【０２１６】
実施例１７の結果を参照すると、塗工樹脂として、ＥＶＯＨ樹脂を用いた場合、タンパク質を分離しつつ、ウイルスは好適に精製できることが分かる。
【符号の説明】
【０２１７】
１  ウイルス濃縮装置、
２樹脂塗工中空糸（フィルター）、
３  注入口、
４  回収口、
５  ろ過液取出し口。
【図１】
2017112851.tif 000008