(57)【要約】【課題】  正常細胞共存下、癌細胞を検出する蛍光プローブを提供すること。【解決手段】  一般式（１）【化１】2017222609.tif 000080で表されるキサンテン誘導体により前記課題を解決する。【選択図】  図４
2017222609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2017222609.tif 000074
（式中、Ｒ１は炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【化２】
2017222609.tif 000075
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表される基を表す。）で表されるキサンテン誘導体。
【請求項２】
Ｒ１が炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基である請求項１に記載のキサンテン誘導体。
【請求項３】
Ｒ１が２−メトキシエチル基である請求項１に記載のキサンテン誘導体。
【請求項４】
Ｒ２がオクチルアミノ基または２−［［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノ基である請求項１から３のいずれか一項に記載のキサンテン誘導体。
【請求項５】
一般式（２）
【化３】
2017222609.tif 000076
（式中、Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【化４】
2017222609.tif 000077
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表される基を表す。）で表されるローダミン誘導体を、塩基存在下ホスゲンまたはホスゲン等価体と反応させ、次いで、一般式（３）
【化５】
2017222609.tif 000078
（式中、Ｒ１ａは炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基もしくはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基もしくはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。）で表されるアルコール誘導体と反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
【化６】
2017222609.tif 000079
（式中、Ｒ１ａおよびＲ２は前記と同じ意味を表す。）で表されるキサンテン誘導体の製造方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のキサンテン誘導体を用いたチオールの検出方法。
【請求項７】
チオールが生体チオールであることを特徴とする請求項６に記載のチオールの検出方法。
【請求項８】
生体チオールがグルタチオンであることを特徴とする請求項７に記載のチオールの検出方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項に記載のキサンテン誘導体を用いたことを特徴とする癌細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞を検出する蛍光プローブとして有用なキサンテン誘導体、その製造方法および当該誘導体を用いた癌細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞または正常組織中に混在する癌細胞の検出は、癌の早期発見や治療において重要な技術である。これまでに様々な癌細胞の検出方法が開発されているが、特定の生体物質、細胞、または組織などに特異的に結合または分布し、蛍光を発する物質である蛍光プローブを用いた検出方法は、高感度な検出方法の一つである。
【０００３】
正常細胞存在下選択的に癌細胞を検出するには、癌細胞で過剰発現するがんマーカーを検出する蛍光プローブを用いることが有効である。還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと称する。）は、癌細胞内では正常細胞内に比べてその濃度が高くなっていることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。細胞内ＧＳＨを検出する蛍光プローブを用いて、正常細胞または正常組織中に混在する癌細胞を検出する方法が開示されている。特許文献１および非特許文献４で開示されている方法は、蛍光プローブにＧＳＨが付加することで蛍光波長が変化し、その比率を測定することで癌細胞を検出する方法である。しかしながら、これらの方法では、細胞内で生成した蛍光プローブ−ＧＳＨ付加体が、薬物排出ポンプによって細胞外へ排出されてしまう課題があった。非特許文献５で開示されている方法は、蛍光プローブとＧＳＨが反応し、アリールスルホニル保護基が脱離することで蛍光色素が放出され、その蛍光強度を測定することで癌細胞を検出する方法である。しかしながら、選択性という点で課題があった。正常細胞存在下、癌細胞を選択的に検出する新規な蛍光プローブの開発が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０８８５１２号
【特許文献２】国際公開第２００９／１０７４４８号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１４９０３２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，２８４５−２８４８（１９８６）
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ，７２，７８３−７８７（１９９３）
【非特許文献３】Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４３，１４３−１８１（２００６）
【非特許文献４】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５，４１５７−４１６７（２０１４）
【非特許文献５】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４，４３６３−４３６６（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、癌細胞を検出するための蛍光プローブを提供することにある。特に、正常細胞共存下、癌細胞を検出するための蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明のキサンテン誘導体が正常細胞共存下、癌細胞を蛍光検出する蛍光プローブとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、一般式（１）
【０００９】
【化１】
2017222609.tif 000003
（式中、Ｒ１は炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【００１０】
【化２】
2017222609.tif 000004
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表される基を表す。）で表されるキサンテン誘導体に関する。
【００１１】
また本発明は、一般式（２）
【００１２】
【化３】
2017222609.tif 000005
（式中、Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【００１３】
【化４】
2017222609.tif 000006
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表される基を表す。）で表されるローダミン誘導体を、塩基存在下ホスゲンまたはホスゲン等価体と反応させ、次いで、一般式（３）
【００１４】
【化５】
2017222609.tif 000007
（式中、Ｒ１ａは炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基もしくはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基もしくはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。）で表されるアルコール誘導体と反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
【００１５】
【化６】
2017222609.tif 000008
（式中、Ｒ１ａおよびＲ２は前記と同じ意味を表す。）で表されるキサンテン誘導体の製造方法に関する。
【００１６】
また本発明は、一般式（１）
【００１７】
【化７】
2017222609.tif 000009
（式中、Ｒ１は炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【００１８】
【化８】
2017222609.tif 000010
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表される基を表す。）で表されるキサンテン誘導体を用いることを特徴とする、チオールの検出方法に関する。
【００１９】
また本発明は、一般式（１）
【００２０】
【化９】
2017222609.tif 000011
（式中、Ｒ１は炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基；炭素数２から４のアルケニル基；炭素数２から４のアルキニル基；ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシ）カルボニル基もしくは炭素数１から４のアルキルオキシ基で置換されていてもよいフェニル基；炭素数１から４のアルキルオキシ基、トリオルガノシロキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい炭素数７もしくは８のアラルキル基；（チオフェン−２−イル）メチル基；（フラン−２−イル）メチル基；２−（フラン−２−イル）エチル基；（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基；または２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基を表す。Ｒ２は炭素数１から１６のアルキルオキシ基；炭素数１から１６のアルキルアミノ基；または一般式（６）
【００２１】
【化１０】
2017222609.tif 000012
（式中、Ｒ３は炭素数１から４のアルキル基を表す。Ｘは炭素数１から４のアルカンジイル基を表す。ｎは１から４の整数を表す。ｎが２以上の場合、複数のＸは同一または相異なっていてもよい）で表されるアミノ基を表す。Ｙは酸素原子またはＮＨ基を表す。）で表されるキサンテン誘導体を用いることを特徴とする、癌細胞の検出方法に関するものである。
【００２２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本明細書におけるＲ１、Ｒ１ａ、Ｒ２、Ｒ３およびＸの定義について説明する。
【００２４】
Ｒ１で表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基を例示することができる。該アルキル基は、炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基、トリオルガノシロキシ基または水酸基で置換されていてもよく、２−メトキシエチル基、３−メトキシプロピル基、４−メトキシブチル基、２−エトキシエチル基、２−イソプロポキシエチル基、２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチル基、２−フェノキシエチル基、２−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル基、２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）エチル基、２−（トリイソプロピルシリルオキシ）エチル基、２−ヒドロキシエチル基を例示することができる。
【００２５】
Ｒ１ａで表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基を例示することができる。該アルキル基は、炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基またはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよく、２−メトキシエチル基、３−メトキシプロピル基、４−メトキシブチル基、２−エトキシエチル基、２−イソプロポキシエチル基、２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチル基、２−フェノキシエチル基、２−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル基、２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）エチル基、２−（トリイソプロピルシリルオキシ）エチル基を例示することができる。
【００２６】
Ｒ１およびＲ１ａで表される炭素数２から４のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基を例示することができる。
【００２７】
Ｒ１およびＲ１ａで表される炭素数２から４のアルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基を例示することができる。
【００２８】
Ｒ１およびＲ１ａで表される（ニトロ基、フェニル基、（炭素数１から４のアルキルオキシカルボニル基）または炭素数１から４のアルキルオキシ基）で置換されていてもよいフェニル基としては、フェニル基、３−ニトロフェニル基、ビフェニル−２−イル基、ビフェニル−３−イル基、ビフェニル−４−イル基、３−（メトキシカルボニル）フェニル基、３−メトキシフェニル基を例示することができる。
【００２９】
Ｒ１で表される炭素数７もしくは８のアラルキル基としては、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基を例示することができる。該アラルキル基は、炭素数１から４のアルキルオキシ基、トリオルガノシロキシ基または水酸基で置換されていてもよく、（Ｓ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル基、（Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基を例示することができる。
【００３０】
Ｒ１ａで表される炭素数７もしくは８のアラルキル基としては、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基を例示することができる。該アラルキル基は、炭素数１から４のアルキルオキシ基またはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよく、（Ｓ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基を例示することができる。
【００３１】
Ｒ１ｂで表されるトリオルガノシロキシ基で置換されている炭素数１から６のアルキル基としては、２−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル基、２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）エチル基、２−（トリイソプロピルシリルオキシ）エチル基を例示することができる。
【００３２】
Ｒ１ｂで表されるトリオルガノシロキシ基で置換されている炭素数７から８のアラルキル基としては、（Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１−フェニルエチル基を例示することができる。
【００３３】
Ｒ１ｃで表される水酸基で置換されている炭素数１から６のアルキル基としては、２−ヒドロキシエチル基を例示することができる。
【００３４】
Ｒ１ｃで表される水酸基で置換されている炭素数７から８のアラルキル基としては、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル基、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル基を例示することができる。
【００３５】
Ｒ２で表される炭素数１から１６のアルキルオキシ基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デカニルオキシ基、ウンデカニルオキシ基、ドデカニルオキシ基、トリデカニルオキシ基、テトラデカニルオキシ基、ペンタデカニルオキシ基、ヘキサデカニルオキシ基を例示することができる。
【００３６】
Ｒ２で表される炭素数１から１６のアルキルアミノ基としては、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基または環状アルキルアミノ基のいずれであってもよく、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、シクロプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ヘプチルアミノ基、オクチルアミノ基、ノニルアミノ基、デカニルアミノ基、ウンデカニルアミノ基、ドデカニルアミノ基、トリデカニルアミノ基、テトラデカニルアミノ基、ペンタデカニルオキシ基、ヘキサデカニルオキシ基、ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−プロピルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジペンチルアミノ基、ジヘキシルアミノ基、ジシクロヘキシルアミノ基、ジヘプチルアミノ基、ジオクチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ヘキサメチレンイミノ基、ヘプタメチレンイミノ基を例示することができる。
【００３７】
Ｒ３で表される炭素数１から４のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができる。
【００３８】
Ｘで表される炭素数１から４のアルカンジイル基としては、メチレン基、ジメチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基を例示することができる。
【００３９】
Ｒ１としては、蛍光強度が強い点で、（炭素数１から４のアルキルオキシ基、フェノキシ基または水酸基）で置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基、２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基が好ましく、２−メトキシエチル基、３−メトキシプロピル基、（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル基、２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル基がさらに好ましく、２−メトキシエチル基がより好ましい。
【００４０】
Ｒ１ａで表される炭素数７から８のアラルキル基としては、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基を例示することができる。該アラルキル基は、炭素数１から４のアルキルオキシ基またはトリオルガノシロキシ基で置換されていてもよく、（１Ｓ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（１Ｒ）−２−メトキシ−１−フェニルエチル基、（１Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）−１−フェニルエチル基、（１Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）−１−フェニルエチル基を例示することができる。
【００４１】
Ｒ２としては、蛍光強度が強い点で、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、オクチルオキシ基、オクチルアミノ基、［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノ基が好ましく、オクチルアミノ基、［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル］アミノ基がさらに好ましい。
【００４２】
更に、本発明のキサンテン誘導体（１）の好ましい例として、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（フェニルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（３−ニトロフェニル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（３−メトキシカルボニル）フェニル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［［２−［（ビフェニル−３−イル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（３−メトキシフェニル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（フラン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［［２−（ベンジルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（チオフェン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（２−テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（フェネチルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［２−（フラン−２−イル）エチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（３−メトキシプロピル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（ブチルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−フェノキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、（Ｒ）−３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、（Ｓ）−３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、６’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３’−［２−（プロパルギルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［２−（アリルアミノカルボニル）−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ−６’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、６’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３’−［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ−６’−（１−オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ−６’−（１−オクチルアミノカルボニル）アミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン、３’−［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ−６’−［２−［［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニル］アミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンを例示することができる。
【００４３】
次に、本発明のキサンテン誘導体（１）の製造方法について詳細に説明する。本発明のキサンテン誘導体（１）は、工程−１から工程−５によって製造することができる。
【００４４】
工程−１は、アクリルアミド誘導体（７）を第三級アミン存在下、パラホルムアルデヒドと反応させ、アルコール誘導体（３）を製造する工程である。
【００４５】
【化１１】
2017222609.tif 000013
（式中、Ｒ１ａは前記と同じ意味を表す。）
工程−１の原料として用いるアクリルアミド誘導体（７）は、一部は市販されているが、文献記載の方法（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７，４５８−４６０（２０１５）やＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７，７５９０−７５９９（２０１４））等を参考に、容易に製造することができる。
工程−１の反応は、第三級アミンの存在下に行なうことが必須である。第三級アミンとしては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを例示することができる。収率が良い点で、ＤＡＢＣＯが第三級アミンとして好ましい。
【００４６】
工程−１の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド等スルホン系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、水を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。収率が良い点で、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、水が好ましい。
【００４７】
アクリルアミド誘導体（７）とパラホルムアルデヒドとのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１００の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：１０がさらに好ましい。
【００４８】
アクリルアミド誘導体（７）と第三級アミンとのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。
【００４９】
工程−１の反応温度は、０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。収率が良い点で室温から７０℃の範囲が好ましい。
【００５０】
工程−１の反応で得られるアルコール誘導体（３）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００５１】
工程−２は、ローダミン誘導体（２ａ）を、塩基存在下ホスゲンまたはホスゲン等価体と反応させ、次いで、求核剤（５）と反応させローダミン誘導体（４）を製造する工程である。
【００５２】
【化１２】
2017222609.tif 000014
（式中、Ｒ２は前記と同じ意味を表す。）
工程−２の原料として用いるローダミン誘導体（２ａ）は、文献記載の方法（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２５２−２６０（２００６））を参考に調製することができる。
【００５３】
工程−２の原料として用いる求核剤（５）は、市販されているものを利用することができる。求核剤（５）としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ヘキサノール、オクタノール、デカノール、ドデカノール、ヘキサデカノール、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、へキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノール、（２−メトキシエトキシ）エタノール、（２−エトキシエトキシ）エタノール、（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エタノール、（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エタノール、（２−メトキシエチル）アミン、（２−エトキシエチル）アミン、（（２−メトキシエトキシ）エチル）アミン、（（２−エトキシエトキシ）エチル）アミン、（（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）アミン、（（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エチル）アミンを例示することができる。
【００５４】
工程−２の反応は、ホスゲンまたはホスゲン等価体を用いることが必須である。ホスゲンまたはホスゲン等価体としては、ホスゲン、ホスゲンダイマー、トリホスゲンを例示することができる。収率が良い点で、トリホスゲンが好ましい。
【００５５】
工程−２の反応は、塩基を用いることが必須である。塩基としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等の第３級アミン、ピリジン、２，６−ルチジン等の複素環芳香族塩基を例示することができる。収率が良い点で、２，６−ルチジンが塩基として好ましい。
【００５６】
工程−２の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。収率が良い点で、ジクロロメタンが好ましい。
【００５７】
ローダミン誘導体（２ａ）と求核剤（５）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。
【００５８】
ローダミン誘導体（２ａ）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：５がさらに好ましい。
【００５９】
ローダミン誘導体（２ａ）とホスゲンもしくはホスゲン等価体とのモル比も特に制限はないが、１：５の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：２がさらに好ましい。
【００６０】
工程−２の反応温度は、０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。収率が良い点で室温から５０℃の範囲が好ましい。
【００６１】
工程−２の反応で得られるローダミン誘導体（４）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００６２】
工程−３は、ローダミン誘導体（４）を酸処理することにより、ローダミン誘導体（２）を製造する工程である。
【００６３】
【化１３】
2017222609.tif 000015
（式中、Ｒ２は前記と同じ意味を表す。）
工程−３の反応で用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびメタンスルホン酸等のブレンステッド酸を例示することができる。
【００６４】
工程−３の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド等スルホン系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、水を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。収率が良い点で、ジクロロメタンが好ましい。
【００６５】
ローダミン誘導体（４）と酸とのモル比は特に制限はないが、１：１０から１：１００の範囲が好ましく、収率が良い点で１：２０から１：５０がさらに好ましい。
【００６６】
工程−３の反応温度は、０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。収率が良い点で０℃から５０℃の範囲が好ましい。
【００６７】
工程−３の反応で得られるローダミン誘導体（２）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００６８】
工程−４は、ローダミン誘導体（２）を塩基存在下ホスゲンまたはホスゲン等価体と反応させ、次いで、アルコール誘導体（３）と反応させキサンテン誘導体（１ａ）を製造する工程である。
【００６９】
【化１４】
2017222609.tif 000016
（式中、Ｒ２およびＲ１ａは前記と同じ意味を表す。）
工程−４の反応は、ホスゲンまたはホスゲン等価体を用いることが必須である。ホスゲンまたはホスゲン等価体としては、ホスゲン、ホスゲンダイマー、トリホスゲンを例示することができる。収率が良い点で、トリホスゲンが好ましい。
【００７０】
工程−４の反応は、塩基を用いることが必須である。塩基としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等の第３級アミン、ピリジン、２，６−ルチジン等の複素環芳香族塩基を例示することができる。収率が良い点で、２，６−ルチジンが塩基として好ましい。
【００７１】
工程−４の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。収率が良い点で、ジクロロメタンが好ましい。
【００７２】
ローダミン誘導体（２）とアルコール誘導体（３）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。
【００７３】
ローダミン誘導体（２）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：５がさらに好ましい。
【００７４】
ローダミン誘導体（２）とホスゲンまたはホスゲン等価体とのモル比も特に制限はないが、１：５の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：２がさらに好ましい。
【００７５】
工程−４の反応温度は、０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。収率が良い点で室温から５０℃の範囲が好ましい。
【００７６】
工程−４の反応で得られるキサンテン誘導体（１ａ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００７７】
工程−５は、キサンテン誘導体（１ｂ）に脱保護化剤を反応させ、トリオルガノシリル基を除去し、キサンテン誘導体（１ｃ）を製造する工程である。
【００７８】
【化１５】
2017222609.tif 000017
（式中、Ｒ２は前記と同じ意味を表す。Ｒ１ｂは、トリオルガノシロキシ基で置換されている炭素数１から６のアルキル基またはトリオルガノシロキシ基で置換されている炭素数７から８のアラルキル基を表す。Ｒ１ｃは、水酸基で置換されている炭素数１から６のアルキル基または水酸基で置換されている炭素数７から８のアラルキル基を表す。）
工程−５の反応は、脱保護化剤を用いることが必須である。用いることのできる脱保護化剤としては、フッ化カリウム、フッ化ナトリウム等のフッ化アルカリ金属類、フッ化カルシウム等のフッ化アルカリ土類金属類、フッ化テトラブチルアンモニウム等の四級アンモニウム塩を例示することができる。収率が良い点で、フッ化テトラブチルアンモニウムが好ましい。
【００７９】
工程−５の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド等スルホン系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、水を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。収率が良い点で、テトラヒドロフランが好ましい。
【００８０】
キサンテン誘導体（１ｂ）と脱保護化剤とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。
【００８１】
工程−５の反応温度は、０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。収率が良い点で室温から５０℃の範囲が好ましい。
【００８２】
工程−５の反応で得られるキサンテン誘導体（１ｃ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００８３】
本発明のキサンテン誘導体（１）はチオールおよび癌細胞を検出する蛍光プローブとして有用である。蛍光プローブは、特定の生体物質、細胞、または組織などに特異的に結合または分布し、蛍光を発する物質であり、それにより特定の生体物質、細胞、または組織の観察を容易にする。通常、蛍光プローブといった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質を指すが、本明細書中では、それ自体蛍光を発しないが、変換反応などにより蛍光を発するようになる前駆物質も蛍光プローブに含まれるものとする。
【００８４】
本発明のキサンテン誘導体（１）は、それ自体では蛍光を発しないものの、チオールと特異的に反応して（２−カルバモイルアリル）オキシ基が脱離しローダミン誘導体（２）に変換される。ローダミン誘導体（２）は、開環型（２’）と平衡状態となり蛍光を発する。
【００８５】
【化１６】
2017222609.tif 000018
（式中、Ｒ１およびＲ２は、前記と同じ意味を表す。）
ローダミン誘導体の開環型（２’）は、所定の励起光、例えば４００から５００ｎｍ程度の励起光を照射した場合に、極めて強い蛍光（例えば５２０ｎｍでの蛍光）を発する性質を有する一方で、本発明のキサンテン誘導体（１）は、同程度の励起光を照射した場合であっても、ほとんど蛍光を発しない。ローダミン誘導体の開環型（２’）に対する励起光の範囲の上限は、蛍光波長とのオーバーラップを避ける観点から、５００ｎｍ以下が好ましく、４９５ｎｍ以下が特に好ましく、励起光の範囲の下限は、励起能力の観点から４００ｎｍ以上が好ましい。蛍光観測の観点から、励起光は、所望される波長のみを透過する励起フィルターを通して得た単一波長の光であることが好ましいが、４００から４９５ｎｍにピークを有するスペクトルを有する光源を使用することもできる。
【００８６】
本発明のキサンテン誘導体（１）は、それ自体蛍光を発しないが、チオールと反応して強い蛍光を発するローダミン誘導体の開環型（２’）に変換されるため、蛍光強度の変化を測定することでチオールを検出することができる。
【００８７】
本発明のキサンテン誘導体（１）が検出できるチオールとしては、メチルメルカプタン、エチルメルカプタン、プロピルメルカプタン等のアルキルチオール、システイン、ホモシステイン、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルシステイン、システイニルグリシン、γ−グルタミルシステイン、フィトケラチン、ジヒドロリポ酸等の生体チオールを例示することができ、生体チオールの検出に用いることが好ましい。
【００８８】
次に、本発明のキサンテン誘導体（１）を用いたチオールの検出方法について説明する。本発明のキサンテン誘導体（１）を用いたチオール検出方法は、（ａ）キサンテン誘導体（１）をチオールと反応させる工程；および（ｂ）発光強度を測定する工程を含む。
【００８９】
本発明のキサンテン誘導体（１）をチオールと反応させる工程に用いる溶媒は、特に制限はないものの、緩衝液を用いることが好ましい。用いることのできる緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液を例示することができる。さらに、緩衝液に混和可能な有機溶媒を添加してもよい。該有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリンを例示することができ、これらの有機溶媒のうち２種類以上を混合して用いてもよい。有機溶媒の割合は、反応効率が良い点で、０％から１０％の範囲が好ましい。
【００９０】
本発明のキサンテン誘導体（１）をチオールと反応させる工程の温度は、特に制限はないものの、反応効率が良い点で、５℃から４０℃の範囲であることが好ましく、より好ましくは２０℃から３７℃の範囲である。また、本発明のキサンテン誘導体（１）とチオールを加える順番は特に限定されるものではない。
【００９１】
発光強度を測定する工程は、それぞれの測定方法に応じて、当業者であればその条件を適宜設定でき、特に制限はされず、蛍光の検出装置として従来公知のものを用いればよい。当該装置としては、例えばプレートリーダー、蛍光分光装置、蛍光顕微鏡等が好ましく挙げられる。
【００９２】
次に、本発明のキサンテン誘導体（１）を用いた癌細胞の検出方法について説明する。
【００９３】
本発明のキサンテン誘導体（１）は、癌細胞検出用のプローブであり、癌の検出、判定、または診断方法においても使用することができる。癌の検出、判定、または診断方法は体外で行われる方法であってもよいし、体内で行われる方法であってもよい。生体チオールの一つであるグルタチオン（ＧＳＨ）は、抗酸化物質として細胞内に豊富に存在しているが、癌細胞内では正常細胞に比べてＧＳＨの濃度が高くなっていることが知られている。したがって、本発明のキサンテン誘導体（１）を用いることで、正常細胞共存下、癌細胞を蛍光検出することができる。
【００９４】
本発明のキサンテン誘導体（１）は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、特許文献３に記載の、生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。
【００９５】
前述のような生体試料固定装置として、例えば、図１および２に示すように上部電極基板と下部電極基板の間に、スペーサーを配置し、複数の微細孔をアレイ状に配置した平板状の絶縁体および絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光部材からなる保持部をスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造を有する、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）を、生体試料を保持するための容器として用いることができる。図１および２の例では、保持部に生体試料懸濁液を導入するための導入口と、保持部から溶液を排出するための排出口とを、前記スペーサーに設け、保持部への生体試料懸濁液の供給と排出が迅速に実施可能となるようにしてある。また、前記遮光部材は、前記下部電極基板の、前記微細孔の底部以外の全面を覆うように配置され、微細孔周辺の光ノイズを低減することができる。これにより、微細孔内において生体試料から発する微弱な蛍光などの情報をより高感度に検出することが可能となる。本発明により提供されるキサンテン誘導体（１）を用いると、白血球細胞と、癌細胞とが混合された状態の細胞群の中から、癌細胞のみを、生きたまま蛍光標識し、生体イメージング手法により、癌細胞と白血球細胞とを精度よく識別することが可能になる。
【００９６】
前述のような構成の細胞診断チップの保持部に細胞などの生体試料懸濁液を導入し、信号発生器と前記２つの電極を導線でそれぞれ接続し、２つの電極の間に所定の波形を有する交流電圧を前記信号発生器により印加することで、電気力線が微細孔へ集中し、懸濁液中の生体試料が、電気力線の集中する方向に力を受け、保持部分の微細孔内へ移動して容易に固定される。この時に発生する力を誘電泳動力という。
【００９７】
観察容器に保持された生体試料に対し、本発明のキサンテン誘導体（１）またはその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーにより励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができる。その後、より蛍光を発する細胞を癌細胞と判定することができる。
【００９８】
本発明では、例えば癌の転移を判定する観点から、生体試料は組織であっても血液であってもよく、さらに組織または血液から得られた細胞群であってもよい。例えば転移性の癌を患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞と少数の癌細胞が含まれているが、本発明のキサンテン誘導体（１）を用いることにより、大量の細胞のなかから、癌細胞を精度よく検出することが可能になる。被験者の血液細胞中に癌細胞が存在した場合、原発巣から癌細胞が血中に循環していることが想定されることから、被験者が転移性の癌を患っていると判定または診断することができる。
【００９９】
また、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、癌細胞数の計測および癌細胞の取得を行なうこともできる。被験者の血液細胞中の癌細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像検出では発見不可能な微小な固形癌の存在を検出することが可能となる。さらに、被験者の血液細胞中の癌細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中の癌細胞を取得することにより、癌細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。
【０１００】
本発明の別の態様では、本発明のキサンテン誘導体（１）を用いた癌細胞または癌組織の検出方法に関する。当該検出方法では、本発明のキサンテン誘導体（１）を、細胞または組織に適用し、適用後の細胞または組織に対し所定の励起光を照射することにより、細胞または組織における蛍光を検出することを含む。例えばかかる方法は、血液中における癌細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、係る検出方法を、生体の組織に適用して、手術時における癌組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞または組織に対する噴霧または塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用してもよい。
【０１０１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の癌細胞または癌組織の検出方法を用いて、癌の切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。
【０１０２】
本発明の癌細胞の検出方法は、転移癌の判定に用いることができる。すなわち、本発明の癌細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、転移癌が存在すると判定することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象が癌を有すると決定することができる。別の態様では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、転移癌の重篤度を判定することもできる。
【０１０３】
具体的には、本発明のキサンテン誘導体（１）は、それ自体蛍光を発しないが、細胞内に含まれる生体チオールと反応する。更に具体的には、生体チオールはＧＳＨのことを指す。
【０１０４】
その際に、蛍光強度の変化を測定することでチオールを検出し、正常細胞との蛍光強度を比較することで、癌細胞と正常細胞（白血球を含む）とを識別することができることがわかる。つまり、癌細胞には正常細胞と比較して細胞内にチオールが多く含まれており、本発明の化合物が細胞由来のチオールを検出することによって、癌細胞かどうかを判定することに用いることができる。応用例として、生体由来の組織や血液から得られたタンパク質抽出液に、本発明のキサンテン誘導体（１）を反応させることによって癌細胞と正常細胞（白血球を含む）とを識別することができる。
【０１０５】
本明細書において、「癌組織」の用語は癌細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部または全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明のキサンテン誘導体（１）は、癌組織において特異的に強発現しているＧＳＴを検出する作用を有していることから、癌組織の中でも、ＧＳＴを高発現している組織が好ましく、このような癌組織は、例えばＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８，ｐｐ．５２７−５３７，１９８８に説明されている。癌の例として、頭頚部癌、咽頭癌、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、子宮体癌、卵巣癌、中皮腫、皮膚癌、メラノーマ、骨癌などの典型的な原発癌の他に、リンパ節などのリンパ組織や周囲組織への転移癌の組織も挙げられるが、これらの癌種に限定されるものではない。
【発明の効果】
【０１０６】
本発明のキサンテン誘導体は、正常細胞共存下、癌細胞を蛍光染色し、癌細胞が強い発光を示すので、癌細胞を検出する蛍光プローブとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】生体試料固定装置（細胞診断チップ）の模式鳥瞰図。
【図２】生体試料固定装置（細胞診断チップ）の模式断面図。
【図３】実施例２６で測定した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）のＧＳＨ存在下の蛍光スペクトルを示した図。
【図４】実施例２７で測定した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）の生物学的チオール存在下での蛍光強度の経時変化を示した図。
【図５】実施例２８で測定した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）の癌細胞内タンパク質抽出液存在下での蛍光強度の時間変化を示した図。
【図６】実施例２９で測定した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）の癌細胞内タンパク質抽出液存在下での発光強度の時間変化を示した図。
【図７】実施例２９および比較例１で測定した、化合物４１の濃度と蛍光強度との相関を表す検量線を示す図。
【図８】実施例３０および比較例２で取得した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を癌細胞または白血球に接触させ撮影した蛍光顕微鏡像の、細胞の蛍光像の時間変化を示す図。
【図９】実施例３１で取得した、Ｎ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）の存在下または非存在下で本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を癌細胞に接触させ撮影した蛍光顕微鏡像の、癌細胞の蛍光像の時間変化を示す図。
【図１０】実施例３２および比較例３で実施した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を癌細胞または白血球に接触させ、フローサイトメトリーにより得られたヒストグラムを示す図。
【図１１】実施例３３で取得した、本発明のキサンテン誘導体（１）（化合物２３）を癌細胞および白血球細胞の混合体に接触させ撮影した蛍光顕微鏡像を示す図。
【図１２】実施例３４で取得した、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を細胞診断チップ上に固定化した癌細胞および白血球細胞の混合体に接触させ撮影した蛍光顕微鏡像を示す図。
【実施例】
【０１０８】
次に本発明を実施例および参考例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【０１０９】
実施例１
【０１１０】
【化１７】
2017222609.tif 000019
３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（１６μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（６．３ｍｇ，２３．２μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−フェニルアクリルアミド（１６ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）を加えて、そのまま２０時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に２％メタノール／クロロホルム）で精製し、更に分取薄層クロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（フェニルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１５ｍｇ，収率５１％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），１０．０６（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例２
【０１１１】
【化１８】
2017222609.tif 000020
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−ヒドロキシメチル−Ｎ−（３−ニトロフェニル）アクリルアミド（２１ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（３−ニトロフェニル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１９ｍｇ，収率６０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．５３（ｓ，１Ｈ），１０．１３（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．７１（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，２．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，２．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ．Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．１９（ｓ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），４．９４（ｓ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例３
【０１１２】
【化１９】
2017222609.tif 000021
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［（３−メトキシカルボニル）フェニル］アクリルアミド（２２ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（３−メトキシカルボニル）フェニル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１８ｍｇ，収率５６％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．２８（ｓ，１Ｈ），１０．１３（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１，１．８，７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６６−７．７０（ｍ，１Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．１６（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例４
【０１１３】
【化２０】
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実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）とＮ−（ビフェニル−３−イル）−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（１８ｍｇ，７０．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−［［２−［（ビフェニル−３−イル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（７．７ｍｇ，収率２３％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１５（ｓ，１Ｈ），１０．１４（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），７．９９−８．０３（ｍ，２Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６９−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），４．９４（ｓ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例５
【０１１４】
【化２１】
2017222609.tif 000023
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−ヒドロキシメチル−Ｎ−（３−メトキシフェニル）アクリルアミド（１９ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［２−［（３−メトキシフェニル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１５ｍｇ，収率４９％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１３（ｓ，１Ｈ），１０．０３（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６４−６．６８（ｍ，１Ｈ），６．０９（ｓ，１Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例６
【０１１５】
【化２２】
2017222609.tif 000024
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１９ｍｇ，４４．１μｍｏｌ）とＮ−［（フラン−２−イル）メチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（１６ｍｇ，８８．２μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（フラン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１５ｍｇ，収率５３％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．７０（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，３Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝１．９，３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｄｄ，Ｊ＝０．７，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），５．７２（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例７
【０１１６】
【化２３】
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実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）とＮ−ベンジル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（１８ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−［［２−（ベンジルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２５ｍｇ，収率８３％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１３（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．７７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５３−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．３４（ｍ，６Ｈ），７．１１−７．１９（ｍ，２Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．７２（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例８
【０１１７】
【化２４】
2017222609.tif 000026
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［（チオフェン−２−イル）メチル］アクリルアミド（１８ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（チオフェン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１５ｍｇ，収率４９％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．８７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝１．２，５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄｄ，Ｊ＝１．２，３．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝３．０，５．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．７２（ｓ，１Ｈ），４．８４（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例９
【０１１８】
【化２５】
2017222609.tif 000027
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アクリルアミド（１７ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［（２−テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１４ｍｇ，収率４７％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１０（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），３．８４−３．９３（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６４（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．２２（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．９２（ｍ，３Ｈ），１．４８−１．５９（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１０
【０１１９】
【化２６】
2017222609.tif 000028
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−フェニルエチル）アクリルアミド（１９ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（フェネチルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１８ｍｇ，収率５９％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２４−７．３１（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．２３（ｍ，５Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｓ，１Ｈ），５．６６（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．２９−３．３９（ｍ，２Ｈ），２．７４−２．８０（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１１
【０１２０】
【化２７】
2017222609.tif 000029
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１９ｍｇ，４４．１μｍｏｌ）とＮ−［２−（フラン−２−イル）エチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（１８ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［２−（フラン−２−イル）エチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２２ｍｇ，収率７３％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄｄ，Ｊ＝０．８，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄｄ，Ｊ＝１．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１５（ｄｄ，Ｊ＝０．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．３４−３．４２（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１２
【０１２１】
【化２８】
2017222609.tif 000030
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（１５ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１４ｍｇ，収率４９％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２９（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１３
【０１２２】
【化２９】
2017222609.tif 000031
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル］アクリルアミド（１９ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［［２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル］アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，収率６６％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１０（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｓ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），５．６６（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｄｔ，Ｊ＝６．４，７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０９−３．２８（ｍ，２Ｈ），１．８９−２．０１（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．８３（ｍ，２Ｈ），１．５９−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．３１−１．４３（ｍ，１Ｈ）．
実施例１４
【０１２３】
【化３０】
2017222609.tif 000032
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（３−メトキシプロピル）アクリルアミド（１６ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（３−メトキシプロピル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２５ｍｇ，収率８５％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．６６（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．３０−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．１３−３．２０（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．７３（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１５
【０１２４】
【化３１】
2017222609.tif 000033
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（３０ｍｇ，６９．７μｍｏｌ）とＮ−ブチル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（２２ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（ブチルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１２ｍｇ，収率２８％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１０（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），５．６５（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．０９−３．１６（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．４３（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．２８（ｓｅｘｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）．
実施例１６
【０１２５】
【化３２】
2017222609.tif 000034
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）アクリルアミド（２１ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−フェノキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２７ｍｇ，収率８６％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．２９（ｍ，３Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．９６（ｍ，３Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．７１（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５１（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１７
【０１２６】
【化３３】
2017222609.tif 000035
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１００ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と（Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（１０９ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）とを反応させて、（Ｒ）−３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３’−［［２−［（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１２９ｍｇ，収率８０％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１−７．３９（ｍ，６Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０６（ｓ，１Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），５．１２（ｄｔ，Ｊ＝５．３，８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７８−４．８８（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝５．３，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１８
【０１２７】
【化３４】
2017222609.tif 000036
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１００ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（１０９ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）とを反応させて、（Ｓ）−３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１３２ｍｇ，収率８２％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１−７．３９（ｍ，６Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０６（ｓ，１Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），５．１２（ｄｔ，Ｊ＝５．３，８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７８−４．８８（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝５．３，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例１９
【０１２８】
【化３５】
2017222609.tif 000037
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）と２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−プロパルギルアクリルアミド（１３ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−（プロパルギルアミノカルボニル）−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（７．０ｍｇ，収率２５％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１２（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），５．７４（ｓ，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝２．５，５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１１（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
実施例２０
【０１２９】
【化３６】
2017222609.tif 000038
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２０ｍｇ，４６．５μｍｏｌ）とＮ−アリル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（１３ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）とを反応させて、３’  −［［２−（アリルアミノカルボニル）−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１８ｍｇ，収率６４％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４８−７．５２（ｍ，１Ｈ），７．４２−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６，８９（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８５−６．９１（ｍ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），６．２２−６．３１（ｍ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．８６（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．１，１７．１，５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７０（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｄｄ，Ｊ＝１．３，１７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄｄ，Ｊ＝１．３，１０．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｓ，２Ｈ），３．９７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ）．
実施例２１
【０１３０】
【化３７】
2017222609.tif 000039
実施例１と同様に、３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（４７ｍｇ，０・１１ｍｍｏｌ）とＮ−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）エチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（８４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）とを反応させて、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）エチルアミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（８２ｍｇ，収率９０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１０（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．２７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５９−７．６０（ｍ，４Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３９−７．４９（ｍ，６Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），５．７８（ｓ，１Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），３．６９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３３−３．３８（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），０．９８（ｓ，９Ｈ）．
実施例２２
【０１３１】
【化３８】
2017222609.tif 000040
３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（８２ｍｇ，９７．６μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した後、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムの１Ｍテトラヒドロフラン溶液（０．１２ｍＬ，０．１２ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま３０分間反応させた。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（５．０ｍＬ）を加えて反応を停止させ、酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次いで３％メタノール／クロロホルム）で精製して、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−［［２−［（２−ヒドロキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（４６ｍｇ，収率７８％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），４．６８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２０（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
参考例１
【０１３２】
【化３９】
2017222609.tif 000041
３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（４１μＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（１６ｍｇ，５８．０μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、１−オクタノール（３７μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１４時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン、次に２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−（オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（６０ｍｇ，収率８８％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．０２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４９−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．４９（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６８（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），  １．５３（ｓ，９Ｈ），１．２２−１．４５（ｍ，１０Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
参考例２
【０１３３】
【化４０】
2017222609.tif 000042
３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−（オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（７０ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．３ｍＬ）を加えて室温で２時間反応させた。反応液を０℃に冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、溶液のｐＨを約９とした。反応混合液を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体を減圧下乾燥して、３’−アミノ−６’−（オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（５１ｍｇ，収率８６％）を橙色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｓ，２Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６２（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．２０−１．４２（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．
実施例２３
【０１３４】
【化４１】
2017222609.tif 000043
３’−アミノ−６’−（オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２５ｍｇ，５１．０μｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（１８μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（６．９ｍｇ，２６．７μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（１６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１２時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に２５％酢酸エチル／クロロホルム）で精製して、３’−［［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−（オクチルオキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１２ｍｇ，収率３５％）を淡桃色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），９．９５（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２９（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．６２（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．２０−１．４２（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
参考例３
【０１３５】
【化４２】
2017222609.tif 000044
３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（４１μＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（１６ｍｇ，５８．０μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、オクチルアミン（７７μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１．５時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に３％メタノール／クロロホルム）で精製して、３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６’−（オクチルアミノカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（６５ｍｇ，収率９６％）を黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．６９（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０３−３．１２（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．３６−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．１８−１．３３（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
参考例４
【０１３６】
【化４３】
2017222609.tif 000045
３’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３’−（オクチルアミノカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（７２ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．３ｍＬ）を加えて室温で１．５時間反応させた。反応液を０℃に冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、溶液のｐＨを約９とした。反応混合液を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体を減圧下乾燥して、３’−アミノ−６’−（オクチルアミノカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（５４ｍｇ，収率９０％）を赤色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．７１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｓ，２Ｈ），３．０２−３．１２（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．１８−１．３４（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
実施例２４
【０１３７】
【化４４】
2017222609.tif 000046
３’−アミノ−６’−（オクチルアミノカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（２５ｍｇ，５１．５μｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（１８μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（６．９ｍｇ，２６．７μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（１６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１３時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に５０％酢酸エチル／クロロホルム）で精製し、得られた化合物を更にシリカゲルクロマトグラフィー（４％メタノール／クロロホルム）で精製して、３’−［［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ）−６’−（オクチルアミノカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（５．３ｍｇ，収率１５％）を淡桃色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．８１（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．２９（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．０３−３．１１（ｍ，２Ｈ），１．３４−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．１７−１．３４（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．
参考例５
【０１３８】
【化４５】
2017222609.tif 000047
３’−アミノ−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１００ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（０．１１ｍＬ，０．９３ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（３１ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミン（１０５ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１時間反応させた。反応液を酢酸エチル（１００ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に５０％酢酸エチル／クロロホルム）で精製して、３’−［［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１３０ｍｇ，収率９０％）を黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．６７（ｓ，１Ｈ），８．９２（ｓ．１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３７−３．６０（ｍ，８Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２６（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
参考例６
【０１３９】
【化４６】
2017222609.tif 000048
３’−［［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニルアミノ］−６’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１４９ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加えて室温で２時間反応させた。反応液を０℃に冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、溶液のｐＨを約９とした。反応混合液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体を減圧下乾燥して、３’−アミノ−６’−［［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１０５ｍｇ，収率８４％）を赤色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．８２（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｓ，２Ｈ），３．４０−３．６０（ｍ，８Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ）．
実施例２５
【０１４０】
【化４７】
2017222609.tif 000049
３’−アミノ−６’−［［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（３５ｍｇ，５７．７μｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、２，６−ルチジン（２０μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加えて０℃に冷却した。トリホスゲン（７．８ｍｇ，２８．９μｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間、更に室温で１時間反応させた後、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（１８ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加えて、そのまま１２時間反応させた。反応液を酢酸エチル（３０ｍＬ）希釈した後、有機層を１Ｍ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム、次に４％メタノール／クロロホルム）で精製し、得られた化合物を更にシリカゲルクロマトグラフィー（３％メタノール／酢酸エチル）で精製して３’−［［２−［（２−メトキシエチル）アミノカルボニル］−２−プロペン−１−イル］オキシカルボニルアミノ］−６’−［［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル］アミノカルボニルアミノ］スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１１ｍｇ，収率２７％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．９３（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），３．３６−３．５５（ｍ，１２Ｈ），３．３１−３．２５（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ）．  参考例７
【０１４１】
【化４８】
2017222609.tif 000050
Ｎ−フェニルアクリルアミド（１．２ｇ，８．１５ｍｍｏｌ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（９１４ｍｇ，８．１５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（１．２ｇ，４０．８ｍｍｏｌ）、フェノール（１９２ｍｇ，２．０４ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール：水（体積比３：７）の混合溶媒（４．０ｍＬ）に懸濁させ、５５℃で７２時間反応させた。反応液に水（５０ｍＬ）を加えた後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−フェニルアクリルアミド（１４６ｍｇ，収率１０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５２（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），５．６５（ｓ，１Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例８
【０１４２】
【化４９】
2017222609.tif 000051
参考例７を参照し、Ｎ−（３−ニトロフェニル）アクリルアミド（１．３５ｇ，７．０３ｍｍｏｌ）から２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（３−ニトロフェニル）アクリルアミド（６１ｍｇ，収率４％）を黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ９．０１（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，２．１，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄｄｄ，Ｊ＝０．９，２．１，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），５．７２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例９
【０１４３】
【化５０】
2017222609.tif 000052
参考例７を参照し、Ｎ−［（３−メトキシカルボニル）フェニル］アクリルアミド（１．２９ｇ，６．２９ｍｍｏｌ）から２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［（３−メトキシカルボニル）フェニル］アクリルアミド（７１ｍｇ，収率５％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．７７（ｓ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，２．０，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝１．０，２．０，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝０．８，６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１０
【０１４４】
【化５１】
2017222609.tif 000053
参考例７を参照し、Ｎ−（ビフェニル−３−イル）アクリルアミド（１．１８ｇ，５．２９ｍｍｏｌ）から、Ｎ−（ビフェニル−３−イル）−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（２６５ｍｇ，収率２０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６４，（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９−７．６２（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝１．７，２．０，７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．４７（ｍ，５Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），５．６６（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１１
【０１４５】
【化５２】
2017222609.tif 000054
参考例７を参照し、Ｎ−（３−メトキシフェニル）アクリルアミド（１．４８ｇ，８．３５ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（３−メトキシフェニル）アクリルアミド（１７３ｍｇ，収率１０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５５，（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄｄｄ，Ｊ＝０．８，２．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄｄ，Ｊ＝０．８，２．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１２
【０１４６】
【化５３】
2017222609.tif 000055
参考例７を参照し、Ｎ−［（フラン−２−イル）メチル］アクリルアミド（１．９２ｇ，１２．７ｍｍｏｌ）から、Ｎ−［（フラン−２−イル）メチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（７００ｍｇ，収率３０％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６，（ｄｄ，Ｊ＝０．８，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），６．３３（ｄｄ，Ｊ＝１．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｄｄ，Ｊ＝０．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），５，９２（ｓ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｄｄ，Ｊ＝０．８，６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１３
【０１４７】
【化５４】
2017222609.tif 000056
参考例７を参照し、Ｎ−ベンジルアクリルアミド（１．１２ｇ，６．９５ｍｍｏｌ）から、Ｎ−ベンジル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（３３２ｍｇ，収率２５％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２８−７．３９（ｍ，５Ｈ），６．２８（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．５６（ｓ，１Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．３８（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６５−２．６８（ｍ，１Ｈ）．
参考例１４
【０１４８】
【化５５】
2017222609.tif 000057
参考例７を参照し、Ｎ−［（チオフェン−２−イル）メチル］アクリルアミド（１．１６ｇ，６．９４ｍｍｏｌ）から、２−ヒドロキシメチル−Ｎ−［（チオフェン−２−イル）メチル］アクリルアミド（６４０ｍｇ，収率４７％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２４（ｄｄ，Ｊ＝１．３，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９９−７．０２（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝３．５，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），５．５７（ｄ，Ｊ＝０．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｄｄ，Ｊ＝０．７，５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３８（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例１５
【０１４９】
【化５６】
2017222609.tif 000058
参考例７を参照し、Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アクリルアミド（１．４１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アクリルアミド（５３０ｍｇ，収率２９％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７４（ｓ、１Ｈ），５．８５（ｓ、１Ｈ），５．５５（ｓ、１Ｈ），４．３６（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０２（ｄｑ、Ｊ＝３．４，７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄｔ，Ｊ＝６．７，８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｄｔ，Ｊ＝６．７，８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｄｄｄ，Ｊ＝３．４，６．５，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝５．１，７．３，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６２−２．７３（ｍ，１Ｈ），１．８６−２．０６（ｍ，３Ｈ），１．５０−１．６２（ｍ，１Ｈ）．
参考例１６
【０１５０】
【化５７】
2017222609.tif 000059
参考例７を参照し、Ｎ−フェネチルアクリルアミド（２．０ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−フェネチルアクリルアミド（１．１ｇ，収率４６％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２９−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１８−７．２６（ｍ，３Ｈ），６．４６（ｓ，１Ｈ），５．７７（ｓ，１Ｈ），５．４９（ｄ，Ｊ＝０．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．５９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４３−２．５５（ｍ，１Ｈ）．
参考例１７
【０１５１】
【化５８】
2017222609.tif 000060
参考例７を参照し、Ｎ−［２−（フラン−２−イル）エチル］アクリルアミド（１．１７ｇ，７．０８ｍｍｏｌ）から、Ｎ−［２−（フラン−２−イル）エチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（７３０ｍｇ，収率５３％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（ｄｄ，Ｊ＝０．８，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．９，３．２Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｄｄ，Ｊ＝０．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．４５−２．５８（ｍ，１Ｈ）．  実施例１８
【０１５２】
【化５９】
2017222609.tif 000061
参考例７を参照し、Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（１．０５ｇ，８．０９ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド（２１０ｍｇ，収率１６％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．８１（ｓ，１Ｈ），５．８６（ｓ，１Ｈ），５．５５（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４７−３．５８（ｍ，４Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｓ，１Ｈ）．
実施例１９
【０１５３】
【化６０】
2017222609.tif 000062
参考例７を参照し、Ｎ−［２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル］アクリルアミド（６１７ｇ，３．６５ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−［２−（テトラヒドロフラン−２−イル）エチル］アクリルアミド（２３６ｍｇ，収率３２％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１７（ｓ，１Ｈ），５．７６（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８４−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．５７−３．６８（ｍ，１Ｈ），３．２６−３．３６（ｍ，１Ｈ），２．８１−２．９０（ｍ，１Ｈ），１．９８−２．０９（ｍ，１Ｈ），１．８０−１．９６（ｍ，３Ｈ），１．６２−１．７２（ｍ，１Ｈ），１．４７−１．５７（ｍ，１Ｈ）．
参考例２０
【０１５４】
【化６１】
2017222609.tif 000063
参考例７を参照し、Ｎ−（３−メトキシプロピル）アクリルアミド（８２７ｍｇ，５．７８ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（３−メトキシプロピル）アクリルアミド（１５０ｍｇ，収率１５％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．９５（ｓ，１Ｈ），５．７７（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），１．８２（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）．
参考例２１
【０１５５】
【化６２】
2017222609.tif 000064
参考例７を参照し、Ｎ−ブチルアクリルアミド（２．０ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）から、Ｎ−ブチル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（２０８ｍｇ，収率８．４％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．４６（ｓ，１Ｈ），５．８５（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｄｄ，Ｊ＝０．９，６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｄｔ，Ｊ＝５．６，７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５４（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓｅｘｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），０．９４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
参考例２２
【０１５６】
【化６３】
2017222609.tif 000065
参考例７を参照し、Ｎ−（２−フェノキシエチル）アクリルアミド（２．０ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）アクリルアミド（２０８ｍｇ，収率８．４％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２７−７．３３（ｍ、２Ｈ），６．９５−７．００（ｍ、１Ｈ），６．８７−６．９４（ｍ、３Ｈ），５．８９（ｓ、１Ｈ），５．５６（ｓ、１Ｈ），４．３６（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１０（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），３．７５（ｑ、Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３６−２．５０（ｍ、１Ｈ）．
参考例２３
【０１５７】
【化６４】
2017222609.tif 000066
参考例７を参照し、（Ｒ）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（１．１３ｇ，５．５１ｍｍｏｌ）から、（Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（７９３ｍｇ，収率６１％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２５−７．３７（ｍ、５Ｈ），７．０５−７．１７（ｍ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．５８（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｔｄ，Ｊ＝５．０，７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例２４
【０１５８】
【化６５】
2017222609.tif 000067
参考例７を参照し、（Ｓ）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（９１０ｇ，４．４４ｍｍｏｌ）から、（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−（２−メトキシ−１−フェニルエチル）アクリルアミド（８０４ｍｇ，収率７７％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２５−７．３７（ｍ、５Ｈ），７．０５−７．１７（ｍ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．５８（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｔｄ，Ｊ＝５．０，７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例２５
【０１５９】
【化６６】
2017222609.tif 000068
参考例７を参照し、Ｎ−プロパルギルアクリルアミド（１．１６ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）から、２−（ヒドロキシメチル）−Ｎ−プロパルギルアクリルアミド（４８８ｍｇ，収率３３％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７４（ｓ，１Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．５９（ｓ，１Ｈ），４．３８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．５，５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３０−２．４０（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）．
参考例２６
【０１６０】
【化６７】
2017222609.tif 000069
参考例７を参照し、Ｎ−アリルアクリルアミド（１．２２ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）から、Ｎ−アリル−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（６６６ｍｇ，収率４７％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．５７（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），５．８８（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．２，１７．１，５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５５（ｓ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，Ｊ＝１７．１，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄｑ，Ｊ＝１０．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｔｔ，Ｊ＝１．６，５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４７−２．５７（ｍ，１Ｈ）．
参考例２７
【０１６１】
【化６８】
2017222609.tif 000070
参考例７を参照し、Ｎ−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）エチル］アクリルアミド（２．２３ｇ，６．６２ｍｍｏｌ）から、Ｎ−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ）エチル］−２−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（２８８ｍｇ，収率１１％）を無色油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．６２−７．６７（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４７（ｍ，６Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ），５．５３（ｓ，１Ｈ），４．３４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），
３．４９（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．０７（ｓ，９Ｈ）．
以上、実施例および参考例に例示した方法により製造することのできる本発明のキサンテン誘導体（１）を表１に例示した。ただし、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【０１６２】
【表１】
2017222609.tif 000071
実施例２６
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）にＧＳＨを添加して、発光強度を測定した。また同様に、ＧＳＨを添加しない場合の発光強度も測定し、その発光強度と比較することでＧＳＨの検出を評価した。
【０１６３】
（ａ）方法
反応溶液：リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）
化合物２４の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１．５ｍＭ
反応温度：３７℃
ＧＳＨを添加しない場合は、ＧＳＨ溶液の代わりに、同量のリン酸緩衝溶液を反応溶液に加えた。
【０１６４】
６０分後に上記の反応溶液を抜き取り、リン酸緩衝溶液で１０倍希釈した後、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。４９０ｎｍの励起による蛍光を、５００から７００ｎｍの範囲で測定した。
【０１６５】
（ｂ）結果
化合物２４のＧＳＨ存在下および非存在下での、反応開始６０分後の蛍光スペクトルを図３に示す。なお、図３において、実線はＧＳＨ存在下での、破線はＧＳＨ非存在下での蛍光スペクトルを表している。ＧＳＨ存在下では、５２０ｎｍ付近に強い蛍光を示したのに対して、ＧＳＨ非存在下では、ほとんど蛍光は認められなかった。ＧＳＨ存在下では、非存在下に対して最大蛍光波長５２２ｎｍでの蛍光強度は約２４倍に増加した。このことから、本発明のキサンテン誘導体（１）はチオールを検出できることがわかる。
【０１６６】
実施例２７
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）にアミノ酸などの生物学的物質を添加して、発光強度を測定した。そして、発光強度を比較することでチオール選択性を評価した。
【０１６７】
（ａ）方法
反応溶液：リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）
化合物２４の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
生物学的物質：グルタチオン（ＧＳＨ）、システイン（Ｃｙｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
生物学的物質の当量：化合物２４に対して１００当量
反応温度：３７℃（過酸化水素を用いた場合は２５℃）
生物学的物質を添加しない場合は、生物学的物質溶液の代わりに、同量のリン酸緩衝溶液を反応溶液に加えた。
【０１６８】
各時間に上記の反応溶液を抜き取り、リン酸緩衝溶液で１０倍希釈した後、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。４９０ｎｍの励起光による５２２ｎｍの蛍光強度を比較した。
【０１６９】
（ｂ）結果
化合物２４の生物学的物質存在下および非存在下での蛍光強度の経時変化を図４に示す。生物学的チオールであるグルタチオンおよびシステイン存在下では、時間経過共に蛍光強度が増加した。一方で、その他の生物学的物質であるリジン、グルタミン酸、メチオニン、過酸化水素、ウシ血清アルブミン存在下では、ほとんど蛍光強度は増加しなかった。同様に、生物学的物質非存在下でも、ほとんど蛍光強度は増加しなかった。このことから、本発明のキサンテン誘導体（１）はチオールを選択的に検出できることがわかる。
【０１７０】
実施例２８
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）に、癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、発光強度を測定した。また、化合物２３に、癌細胞内タンパク質抽出液および２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＣＤＮＢ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４９，７１３０−７１３９（１９７４））を添加した場合の発光強度も測定し、それぞれの場合の発光強度を比較することで化合物２３のチオール特異性を評価した。なおＣＤＮＢはＧＳＴの基質であり、他のＧＳＴの基質に対して競合阻害的に作用する。
【０１７１】
（ａ）方法
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、接着培養用シャーレ９０φ（深型）（住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。剥がした細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、細胞内タンパク質の抽出を行ない、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の癌細胞内タンパク質抽出液を得た。得られた癌細胞内タンパク質抽出液は、使用するまでは超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保存した。
【０１７２】
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）に癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、蛍光強度を測定した。また同様に、癌細胞内タンパク質抽出液および２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＣＤＮＢ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４９，７１３０−７１３９（１９７４））を添加した場合、並びに癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度も測定し、それらの蛍光強度と比較することで癌細胞内タンパク質抽出液に含まれるＧＳＴの検出能を評価した。
【０１７３】
反応溶液
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物２３：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
癌細胞内タンパク質抽出液：反応溶液量の１０分の１量
ＣＤＮＢの濃度：４ｍＭ（４％エタノール）
反応温度：３７℃
ＣＤＮＢを添加しない場合は、ＣＤＮＢエタノール溶液の代わりに、同量のエタノールを加えた。０分、３０分、６０分、および１２０分経過時に上記の反応溶液を抜き取り、測定まで超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保持した。解凍した反応溶液を、牛血清アルブミン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１０倍希釈した後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起光：４８５ｎｍ、検出光：５３５ｎｍ）。
【０１７４】
（ｂ）結果
結果を図５に示す。ＣＤＮＢを添加しなかった場合は、反応時間経過に伴い、化合物２３を含む溶液の蛍光強度（図５、実線黒四角）が増大した。一方、ＣＤＮＢを添加した場合（図５、点線黒丸）は、反応時間経過に伴い溶液の蛍光強度が変化しなった。なお、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しなかった場合は、反応時間経過に伴い溶液の蛍光強度は変化しなかった（図５、破線黒ひし形）。
【０１７５】
実施例２８の結果から、本発明の化合物２３が細胞内タンパク質抽出液に含まれるＧＳＴを検出できることが分かる。
【０１７６】
実施例２９（癌細胞ライセート評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）に癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、発光強度を測定した。また、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合、および白血球細胞内タンパク抽出液を添加した場合（比較例１）の発光強度も測定し、それらの発光強度と比較することでＧＳＴおよび癌細胞検出能を評価した。
【０１７７】
（ａ）方法
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、またヒト肺腺がん由来のＰＣ−１４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、接着培養用シャーレ９０φ（深型）（住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。剥がした細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、細胞内タンパク質の抽出を行ない、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞のそれぞれの癌細胞について、癌細胞内タンパク質抽出液を得た。得られた癌細胞内タンパク質抽出液の一部を、ＰＩＥＲＣＥ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて着色し、プレートリーダーを用いて吸光度を測定することで、癌細胞内タンパク質抽出液の中のタンパク質濃度を決定した。得られた癌細胞内タンパク質抽出液は、使用するまでは超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保存した。
【０１７８】
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２４）に癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、蛍光強度を測定した。また同様に、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度も測定し、その蛍光強度と比較することで癌細胞内タンパク質抽出液に含まれるＧＳＴの検出を評価した。
【０１７９】
反応溶液組成
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物２４：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
癌細胞内タンパク質抽出液のタンパク質濃度：１００μｇ／ｍＬ
反応温度：３７℃
なお癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合は、癌細胞内タンパク質抽出液の代わりに、同量のＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを反応溶液に加えた。０分、３０分、６０分、および１２０分経過時に上記の反応溶液を抜き取り、測定まで超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保持した。解凍した反応溶液を、牛血清アルブミン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１０倍希釈した後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起光：４８５ｎｍ、検出光：５３５ｎｍ）。
【０１８０】
またＧＳＴの活性による化合物２４の分解産物と同等の化合物である化合物４１を用いて、以下の条件で化合物４１の濃度と蛍光強度との相関を表す検量線を作成した。
【０１８１】
反応溶液組成
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物４１：０μＭ、３．７５μＭ、７．５μＭ、１５μＭ
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
上記と同量のＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ
励起光：４８５ｎｍ、検出光：５３５ｎｍ
（ｂ）結果
結果を図６および７に示す。癌細胞内タンパク質抽出液を添加した場合の蛍光強度から癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度を差し引いた値の時間変化を図６に示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞のいずれについても、癌細胞内タンパク質抽出液を添加した場合は、反応時間経過に伴い、化合物２４を含む溶液の蛍光強度が増大した。一方、化合物４１の濃度と蛍光強度との相関を表す検量線を図７に示す。これらの結果から算出した、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞それぞれ由来の癌細胞タンパク質抽出液に含まれるタンパク質濃度あたりの化合物２４の分解速度を表２に示す。
【０１８２】
比較例１（白血球ライセートの比較例）
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前記希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行ない、白血球細胞を得た。
【０１８３】
白血球細胞を遠心し、上澄みを捨てた後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、細胞内タンパク質の抽出を行ない、白血球細胞内タンパク質抽出液を得た。得られた白血球細胞内タンパク質抽出液の一部を、ＰＩＥＲＣＥ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて着色し、プレートリーダーを用いて吸光度を測定することで、白血球細胞内タンパク質抽出液の中のタンパク質濃度を決定した。得られた白血球細胞内タンパク質抽出液は、使用するまでは超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保存した。
【０１８４】
実施例２９と同様に以下の条件で、本発明の化合物２４に白血球細胞内タンパク質抽出液を添加して、蛍光強度を測定した。また白血球細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度も、実施例２９と同様に測定した。
【０１８５】
反応溶液組成
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物２４：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
癌細胞内タンパク質抽出液のタンパク質濃度：１００μｇ／ｍＬ
反応温度：３７℃
励起光：４８５ｎｍ、検出光：５３５ｎｍ
（ｂ）結果
白血球細胞内タンパク質抽出液を添加した場合の蛍光強度から白血球細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度を差し引いた値の時間変化を図６に示す。白血球細胞内タンパク質抽出液を添加した場合は、癌細胞内タンパク質抽出液を添加した場合と比較して、反応時間経過に伴う蛍光強度の増大は小さかった。一方、化合物４１の濃度と蛍光強度との相関を表す検量線を図７に示す。これらの結果から算出した、白血球細胞タンパク質抽出液に含まれるタンパク質濃度あたりの化合物２４の分解速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を表２に示す。
【０１８６】
【表２】
2017222609.tif 000072
実施例２９、および比較例１の結果から、本発明の化合物２４が細胞内タンパク質抽出液に含まれるチオールを検出し、蛍光強度を比較することで癌細胞と正常細胞である白血球とを識別することができることがわかる。
【０１８７】
実施例３０（セルベース蛍光画像評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０のいずれか）を癌細胞に接触させ、蛍光顕微鏡観察により癌細胞の蛍光染色能を評価した。また、同様に白血球細胞に接触させて、蛍光顕微鏡観察により白血球細胞の蛍光染色能を評価した（比較例２）。
【０１８８】
（ａ）方法
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、またヒト肺腺がん由来のＰＣ−１４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、マルチウェルプレート１２Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。
【０１８９】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、およびＰＣ−１４細胞がいずれも底面の半分程度を覆うような細胞密度になってから、上澄みの培地を捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し、１．５μＭの化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０のいずれかを含む前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を４００μＬ加えた。
【０１９０】
細胞の蛍光画像を、励起波長４７０から４９５ｎｍ、蛍光波長５１０から５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＣＣＤカメラで１０分、３０分、および６０分経過時に撮像した。
【０１９１】
（ｂ）結果
化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０のいずれを用いた場合も、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞のいずれも、細胞質が蛍光染色された。また、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した。なお化合物２３を用いた場合の結果を図８に示す。
【０１９２】
比較例２
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前記希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行ない、白血球細胞を得た。
【０１９３】
前記白血球細胞を、１．５μＭの化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０のいずれかを含む前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し（細胞濃度２．０×１０６個／ｍＬ）、マルチウェルプレート１２Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）に４００μＬ播種した。
【０１９４】
前記白血球細胞の蛍光画像を、励起波長４７０から４９５ｎｍ、蛍光波長５１０から５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１０分、３０分、および６０分経過時に撮像した。
【０１９５】
（ｂ）結果
化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０のいずれを用いた場合も、時間経過に伴う、白血球細胞の蛍光強度増大は僅かであった。なお化合物２３を用いた場合の結果を図８に示す。
【０１９６】
実施例３０、および比較例２の結果から、本発明のキサンテン誘導体（化合物１から１６、２１から２３、および２５から３０）は、癌細胞を蛍光染色し、一方で正常細胞である白血球細胞はほとんど蛍光染色せず、従って蛍光強度を比較することで、癌細胞と正常細胞とを識別することができることがわかる。
【０１９７】
実施例３１（セルベース阻害剤競合評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）、およびＮ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）を癌細胞に接触させ、蛍光顕微鏡観察により癌細胞の蛍光染色能を評価した。なお、ＮＥＭはチオールと反応するチオールスカベンジャーの一種であって、システイン残基を持つタンパク質等の不活性化に用いられ、ＧＳＨと結合する。
【０１９８】
（ａ）方法
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、マルチウェルプレート１２Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。
【０１９９】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がどちらも底面の半分程度を覆うような細胞密度になってから、上澄みの培地を捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し、１．５μＭの化合物２３、０．２ｍＭのＮＥＭを含み前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を４００μＬ加えた。
【０２００】
細胞の蛍光画像を、励起波長４７０から４９５ｎｍ、蛍光波長５１０から５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＣＣＤカメラで１０分、３０分、および６０分経過時に撮像した。
【０２０１】
（ｂ）結果
結果を図９に示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のいずれも、ＮＥＭ非存在下と比較して、０．２ｍＭのＮＥＭ存在下では、細胞質が蛍光染色される程度が低く、特に６０分経過時は蛍光強度の有意な差が見られた。以上の結果から、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）は、細胞内のチオールと反応していることが分かる。
【０２０２】
実施例３２（フローサイトメトリー評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を癌細胞に接触させ、フローサイトメトリーにより癌細胞の蛍光染色能を評価した。また、同様に白血球細胞に接触させて、フローサイトメトリーにより白血球細胞の蛍光染色能を評価した（比較例３）。
【０２０３】
（ａ）方法
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、またヒト肺腺癌由来のＰＣ−１４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を各々遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で懸濁し、癌細胞懸濁液をそれぞれの細胞株について得た。
【０２０４】
前記癌細胞懸濁液を細胞濃度５．０×１０５個／ｍＬとなるよう希釈し、そこに化合物２３の１．５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を終濃度１．５μＭとなるよう添加し、３７℃で３０分間静置し反応させた後、それぞれ氷上に置くことで反応を停止した。
【０２０５】
前記の化合物２３と反応させた癌細胞懸濁液を、フローサイトメトリー装置（ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭシングルシステム、メルクミリポア社）に供し、蛍光強度分布を測定した。また対照として、化合物２３を添加していない癌細胞懸濁液についても同様にフローサイトメトリー装置を用いて蛍光強度分布を測定した。なお各癌細胞株の細胞懸濁液の蛍光強度分布測定時の蛍光に対する感度は同一に設定した。
【０２０６】
（ｂ）結果
フローサイトメトリーの結果のヒストグラムを図１０に示す。また各癌細胞の蛍光強度の平均値を表３に示す。ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−１４の各癌細胞は化合物２３により蛍光標識され、化合物２３を添加しない場合と比較して蛍光強度が増大した。
【０２０７】
比較例３  （白血球のフローサイトメトリーの比較例）
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前記希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行ない、白血球細胞を得た。得られた白血球細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で懸濁し、白血球細胞懸濁液を得た。
【０２０８】
前記白血球細胞懸濁液を細胞濃度５．０×１０５個／ｍＬとなるよう希釈し、そこに化合物２３の１．５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を終濃度１．５μＭとなるよう添加し、３７℃で３０分間静置し反応させた後、氷上に置くことで反応を停止した。
【０２０９】
前記の化合物２３と反応させた白血球細胞懸濁液を、フローサイトメトリー装置（Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭシングルシステム、メルクミリポア社）に供し、蛍光強度分布を測定した。なお白血球懸濁液の蛍光強度分布測定時の蛍光に対する感度は実施例３０の各癌細胞懸濁液と同一に設定した。また対照として、化合物２３を添加していない白血球細胞懸濁液についても同様にフローサイトメトリー装置を用いて蛍光強度分布を測定した。
【０２１０】
（ｂ）結果
フローサイトメトリーの結果のヒストグラムを図１０に示す。また白血球細胞の蛍光強度の平均値を表３に示す。白血球細胞は化合物２３により蛍光標識され、化合物２３を添加しない場合と比較して蛍光強度が増大したものの、その平均輝度は各癌細胞株と比較して有意に低かった。
【０２１１】
【表３】
2017222609.tif 000073
実施例３２、および比較例３の結果から、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）は、癌細胞の蛍光染色能が高く、一方で正常細胞である白血球細胞の蛍光染色能は低く、従って蛍光強度を比較することで、癌細胞と正常細胞とを識別することができることがわかる。
【０２１２】
実施例３３  （白血球と癌細胞混在下での検出評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を癌細胞および白血球細胞の混合体に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。
【０２１３】
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前記希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行なった。次に、得られた白血球細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて細胞核染色し、同時に抗ＣＤ−４５抗体（ＡＰＣ標識）（ミルテニーバイオテク社製）を加えて細胞表面染色を行なった。次に遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し上澄みを捨て、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で白血球細胞を洗浄して抗原に結合しなかった抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）を除去した。次に遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し上澄みを捨て、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し、白血球細胞懸濁液を得た。
【０２１４】
ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、またヒト肺腺癌由来のＰＣ−１４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を各々遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し、癌細胞懸濁液をそれぞれの細胞株について得た。次に、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて各癌細胞の細胞核を染色した。
【０２１５】
続いて、癌細胞の細胞密度が１．０×１０５個／ｍＬ、白血球細胞の細胞密度が１．０×１０６個／ｍＬにそれぞれなるよう、前記癌細胞懸濁液と前記白血球細胞懸濁液とを混合し、癌細胞および白血球細胞の混合体をそれぞれの細胞株について作製した。
【０２１６】
前記癌細胞および白血球細胞の混合体に、１．５μＭの化合物２３を加え、マルチウェルプレート２４Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）に４００μＬ播種した。
【０２１７】
前記癌細胞および白血球細胞の混合体の蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＣＣＤカメラで１０分経過時に撮像した。なお、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）由来の蛍光像は励起波長６００から６５０ｎｍ、蛍光波長６７０から７２０ｎｍの条件で撮像し、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２由来の蛍光像は励起波長３６０から３７０ｎｍ、蛍光波長４２０から４６０ｎｍの条件で撮像し、また化合物２３由来の蛍光像は励起波長４７０から４９５ｎｍ、蛍光波長５１０から５５０ｎｍの条件で撮像した。
【０２１８】
（ｂ）結果
以上の条件で撮像すると、全ての有核細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２によりその細胞核が蛍光染色され、また白血球細胞は抗ＣＤ４５（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されることが分かる。従って、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色される細胞が白血球細胞であり、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、かつ抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されない細胞は癌細胞であることが分かる。撮像結果を図１１に示す。その結果、各癌細胞が化合物２３由来の蛍光を発した。一方、白血球細胞の中にも化合物２３由来の蛍光を発するものがあったが、癌細胞と比較してその蛍光強度は小さかった。従って、癌細胞と白血球細胞との蛍光強度の違いから、白血球細胞の集団の中から癌細胞を検出することが可能であることが分かった。
【０２１９】
実施例３４（細胞診断チップ評価）
以下の条件で、本発明のキサンテン誘導体（化合物２３）を細胞診断チップ上に固定化した癌細胞および白血球細胞の混合体に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。
【０２２０】
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前記希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行なった。次に、得られた白血球細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて細胞核染色し、同時に抗ＣＤ−４５抗体（ＡＰＣ標識）（ミルテニーバイオテク社製）を加えて細胞表面染色を行なった。続いて、染色を行なった白血球細胞を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し白血球細胞懸濁液を得た。
【０２２１】
続いて、ヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＭｃＣｏｙ‘ｓ  ５ａ培地中で、またヒト乳腺癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  Ｌ−１５培地中で、またヒト肺腺癌由来のＰＣ−１４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、それぞれ５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞に１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、細胞核染色した。細胞核染色した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、１×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように０．１％ＢＳＡを含む３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞の各癌細胞懸濁液を調製した。
【０２２２】
続いて、癌細胞の細胞密度が２．４×１０２個／ｍＬ、白血球細胞の細胞密度が４．０×１０５個／ｍＬにそれぞれなるよう、前記癌細胞懸濁液と前記白血球細胞懸濁液とを混合し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞の各癌細胞について、癌細胞および白血球細胞の混合体を作製した。
【０２２３】
続いて、前記癌細胞および白血球細胞の混合体に化合物２３を終濃度１．５μＭになるよう添加し、すぐさま細胞診断チップに導入し、交流電圧として電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、細胞に誘電泳動力が作用し、１分程度の時間でアレイ状に配置した複数の微細孔に白血球細胞、および癌細胞を固定することができた。なお、細胞診断チップに導入した白血球細胞と癌細胞のそれぞれの細胞密度の合計が、微細孔の密度（４．０×１０５個／ｍＬ）とほぼ等しいため、１個の微細孔に概ね１個の白血球細胞もしくは癌細胞が固定された。
【０２２４】
細胞が固定された細胞診断チップの蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで３０分、６０分、１８０分経過時に撮像した（図１２）。なお、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）由来の蛍光像は励起波長６００から６５０ｎｍ、蛍光波長６７０から７２０ｎｍの条件で撮像し、また化合物２３由来の蛍光像は励起波長４７０から４９５ｎｍ、蛍光波長５１０から５５０ｎｍの条件で撮像した。以上の条件で撮像すると、全ての有核細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２によりその細胞核が蛍光染色され、また白血球細胞は抗ＣＤ４５（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されることが分かる。従って、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色される細胞が白血球細胞であり、また抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されない細胞は癌細胞であることが分かる。
【０２２５】
（ｂ）結果
結果を図１２に示す。時間経過に伴い、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−１４細胞のいずれの癌細胞の場合も、癌細胞が発する化合物２３由来の蛍光強度が増大した。一方、白血球細胞が発する化合物２３由来の蛍光強度は僅かであり、癌細胞と白血球細胞との蛍光強度の違いから、細胞診断チップに固定した白血球細胞の集団の中から癌細胞を特異的に検出することが可能であることが分かった。
【符号の説明】
【０２２６】
１：下部電極基板
２：上部電極基板
３：微細孔
４：絶縁体
５：遮光部材
６：スペーサー
７：導入口
８：排出口
９：保持部
１０：信号発生器
１１：導線
１２：生体試料固定装置（細胞診断チップ）
１３：電気力線
１４：誘電泳動力
１５：生体試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2017222609.tif 000084
【図５】
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【図６】
2017222609.tif 000086
【図７】
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【図８】
2017222609.tif 000088
【図９】
2017222609.tif 000089
【図１０】
2017222609.tif 000090
【図１１】
2017222609.tif 000091
【図１２】
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