(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子組み換え手法を用いず、難消化性澱粉含量が高い新規イネ変異体を提供する。【解決手段】イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、インディカ米由来のＳＳＩＩａ遺伝子及びＧＢＳＳＩ遺伝子を交配により導入した非遺伝子組み換え体のイネ変異体を得る。当該イネ変異体は、野生型と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている。さらに、このイネ変異体のイネ種子は、イネでは類い希な難消化性澱粉含量を含んでおり、炊飯米の難消化性澱粉の含有量が１０％〜３０％となり、アミロースの割合が３５％以上となる。【選択図】図１
2017038588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、
インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子が遺伝的に固定されており、
非遺伝子組み換え体である
ことを特徴とするイネ変異体。
【請求項２】
精米後のイネ種子を炊飯した炊飯米の難消化性澱粉の含有量が１０％〜３０％である
ことを特徴とする請求項１に記載のイネ変異体。
【請求項３】
野生型に比べて、前記ＢＥＩＩｂの活性が低下し、前記ＳＳＩＩａ及び前記ＧＢＳＳＩの遺伝子発現が増加し両酵素の活性が高い
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のイネ変異体。
【請求項４】
前記イネ種子は、難消化性澱粉の含有量が、親系統である前記インディカ米又はＢＥＩＩｂ変異体よりも多い
ことを特徴とする請求項２又は３に記載のイネ変異体。
【請求項５】
前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、
前記インディカ米の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１２以下が減少され、ＤＰ１３〜２４が増加される
ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項６】
前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、
前記インディカ米の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉よりも１℃以上高い糊化温度である
ことを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項７】
前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、
アミロースの割合が３５％以上である
ことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項８】
前記イネ種子は、粉末化することで米粉としても利用可能である
ことを特徴とする請求項２乃至７のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項９】
請求項２乃至７のいずれか１項に記載のイネ変異体の前記イネ種子の胚乳を粉末化することで製造された
ことを特徴とする米粉。
【請求項１０】
請求項９に記載の米粉より抽出される
ことを特徴とする難消化性澱粉。
【請求項１１】
請求項２乃至８のいずれか１項に記載のイネ変異体の前記イネ種子、請求項９に記載の米粉、及び／又は請求項１０に記載の難消化性澱粉を含んで製造された
ことを特徴とする食品。
【請求項１２】
非遺伝子組み換えの方式により、
ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の二重劣性ホモ変異体を作出させ、
インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子を遺伝的に固定させる
ことを特徴とするイネ変異体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ変異体、米粉、難消化性澱粉、食品、及びイネ変異体の作出方法に係り、特にイネスターチシンターゼに変異を備えるイネ変異体、米粉、難消化性澱粉、食品、及びイネ変異体の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖及びα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。
【０００３】
澱粉の生合成には、少なくとも４種類の酵素が関与していることが分かっている。この４種類の酵素は、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付加した余分な枝分かれ構造をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）である。なお、澱粉生合成に関与する酵素は、他にもあると考えられている（非特許文献１参照）。
【０００４】
このように、植物の澱粉生合成には少なくとも４種類の酵素が関与している。
加えて、高等植物の場合、これらの酵素には多数のアイソザイムが存在し、澱粉生合成に関与している。アイソザイムは、同様の酵素反応を触媒するアミノ酸配列の異なる酵素群のことである。たとえば、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）には、１１種類ものＳＳ、３種類ものＢＥ、４種類ものＤＢＥが存在する。
近年、これらのアイソザイムは、組織特異性や、微妙な基質特異性によって、役割分担をしていることが分かってきた。
このようなアイソザイムの働きや役割を解明することは、アイソザイムの機能解明につながる。そして、アイソザイムの機能解明は、植物の澱粉生合成メカニズムの全体像の解明には欠かせない。
このため、従来から各アイソザイムの変異体が開発されてきた。特定のアイソザイムが欠失した変異体の表現型を調べることで、そのアイソザイムの働きや役割を知ることができる。
【０００５】
たとえば、各アイソザイムの機能を明確にするために、イネにおいて既に単離され、分析されている変異体には、ＳＳＩ（非特許文献２、特許文献１）、ＳＳＩＩａ（非特許文献３、特許文献２）、ＳＳＩＩＩａ（非特許文献４、特許文献３）、ＧＢＳＳＩ（非特許文献５）、ＢＥＩ（非特許文献６）、ＢＥＩＩｂ（非特許文献７）、ＩＳＡ１（非特許文献８）、ＰＵＬ（非特許文献９、特許文献４）、ＰＨＯ１（非特許文献１０）等の変異体がある。
これらの変異体は、胚乳に蓄積する澱粉の構造が野生型とは異なることがある。その構造の違いに伴い、澱粉粒の大きさや熱糊化温度、熱糊化粘度が異なる等の物性を示すことがある。
【０００６】
ここで、イネ品種は大きく、インディカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｄｉｃａ）品種と、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａ）品種とに分類される。インディカ米とジャポニカ米の澱粉は、その性質が明らかに異なっている。タイ米に代表されるインディカ米は、食感がパサパサしており、糊化温度がジャポニカ米と比べて高い。この原因は、主として２種類のスターチシンターゼの配列の塩基置換によるものである。そのスターチシンターゼの一つは、ＳＳＩＩａ遺伝子であり、もう一つはＧＢＳＳＩ遺伝子である。インディカ米は両遺伝子の野生型であり、ジャポニカ米は、塩基置換により変異型である。
ジャポニカ米のＳＳＩＩａ遺伝子は、野生型（インディカ米）の配列と比べて４か所の塩基置換が生じており、そのうちの２か所の塩基置換が原因で、その活性が野生型の１０％にまで低下している（非特許文献３）。ＳＳＩＩａの活性の大幅な低下により、ジャポニカ米の澱粉は、インディカ米の澱粉と比べて糊化温度が低い（非特許文献３）。
また、ジャポニカ米のＧＢＳＳＩ遺伝子は、野生型（インディカ米）の配列と比べて１か所の塩基置換が生じており、それが原因で正常なＧＢＳＳＩ遺伝子の発現量が野生型の１０％にまで低下している（非特許文献５及び非特許文献１１）。ＧＢＳＳＩ遺伝子の発現量の低下により、ジャポニカ米の澱粉は、インディカ米の澱粉と比べてアミロース含量が低い（非特許文献５）。
なお、上述の非特許文献のイネの澱粉生合成を分析するための各アイソザイムに関する変異体は、全て、ジャポニカ米に分類される「日本晴」、「台中６５号」、「金南風」のいずれかの品種に由来する。
【０００７】
一方、澱粉には、αアミラーゼ等で容易に消化される成分の澱粉と、消化されにくい難消化性澱粉が存在する。難消化性澱粉は、消化液では分解されにくく、高分子のまま小腸を通過して大腸に到達する澱粉のことである。難消化性澱粉は、小腸でグルコースにまで分解されないため、カロリーオフ効果がある。難消化性澱粉は、アミロース含量が高い澱粉に多く含まれることがある。このため、高アミローストウモロコシが、ダイエット素材として、利用されている。
また、難消化性澱粉は、高分子で大腸に到達し、大腸菌による発酵を通して短鎖脂肪酸を分泌し、大腸環境を整え、大腸癌予防、便秘予防効果があることが大麦（非特許文献１２）や小麦（非特許文献１３）で知られている。このため、難消化性澱粉を多く含む大麦グリッツ等は、オーストラリアで既に商品化されている。
一方で、イネにおいては、通常の炊飯米にも難消化性澱粉は含まれるものの、その割合は、わずか１％以下であることが多い。これに対して、難消化性澱粉を増加させるため、枝作り酵素の発現量を減らした遺伝子組換えイネが開示されている（非特許文献１４及び非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−０７９２６０号公報
【特許文献２】特開２００５−２６９９２８号公報
【特許文献３】特開２００６−０５１０２３号公報
【特許文献４】特開２００７−０２０４７５号公報
【特許文献５】特開２０１１−０５５７６４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、ｐ．７１８−７２５
【非特許文献２】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｉ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００６年、１４０、ｐ．１０７０−１０８４
【非特許文献３】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｒｃｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．  、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００５年、５８、ｐ．２１３−２２７
【非特許文献４】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＳＩＩＩａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）；  ｔｈｅ  ｆｕｃｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＳＩＩＩａ  ａｎｄ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ＳＳＩＩＩａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００７年４月、１４４、４、ｐ．２００９−２０２３
【非特許文献５】Ｙ．  Ｓａｎｏ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｘｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ、１９８４年、６８、ｐ．４６７−４７３
【非特許文献６】Ｈ．  Ｓａｔｏｈ他、Ｓｔａｒｃｈ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｉ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、１３３、ｐ．１１１１−１１２１
【非特許文献７】Ａ．  Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、ｐ．４５９−４７２
【非特許文献８】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  α−ｐｏｌｙｇｌｕｃａｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｙ−１  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、イギリス、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９９７年、１２、ｐ．１４３−１５３
【非特許文献９】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＵＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＵＬ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年３月、６０、３、ｐ．１００９−１０２３
【非特許文献１０】Ｈ．  Ｓａｔｏｈ他、Ｐｌａｓｔｉｄｉｃ  α−ｇｌｕｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、２０、ｐ．１８３３−１８４９
【非特許文献１１】Ｍ．Ｉｓｓｈｉｋｉ  他、Ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｗａｘｙ  ｌｏｃｕｓ  ｈａｓ  ａ  ＧＴ  ｔｏ  ＴＴ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ５'  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｔｒｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９８年、１５、ｐ．１３３−１３８
【非特許文献１２】Ｂｉｒｄ  ＡＲ他、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｒｌｅｙ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  （Ｈｉｍａｌａｙａ  ２９２）  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩａ  ｒａｉｓｅｓ  ｌａｒｇｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２００４年、１３４、ｐ．８３１−８３５
【非特許文献１３】Ｒｅｇｉｎａ  Ａ他、Ｈｉｇｈ−ａｍｙｌｏｓｅ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｂｏｗｅｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｉｎ  ｒａｔｓ、Ｐｒｏｃｃｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、１０３、ｐ．３５４６−３５５１
【非特許文献１４】Ｂｕｔａｒｄｏ  ＶＭ他、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩｂ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−  ａｎｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、６２、ｐ．４９２７−４９４１
【非特許文献１５】Ｚｈｕ  Ｌ他、Ｈｉｇｈ−ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｉｃｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１２年、１０、ｐ．３５３−３６２
【非特許文献１６】Ｗａｎｇ  ＺＹ他、Ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｘｙ  ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９５年、７（４）、ｐ．３１６−６２２
【非特許文献１７】Ｈｉｒａｔｓｕｋａ  Ｍ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＳＮＰ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩａ（ａｌｋ）  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、２０１０年、２５、ｐ．８０−８２
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎｇ  Ａ他、Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、１３、ｐ．６１５６−６１６６
【非特許文献１９】Ａｓａｉ  Ｈ他、Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  （ＳＳ）  ＩＩＩａ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩｂ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｓｅ  ｉｎ  ＳＳＩＩａ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、２０１４年、６５、ｐ．５４９７−５５０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、従来の通常の栽培用のイネの種子は、そもそも難消化性澱粉の含有率が低かった。しかしながら、非特許文献１４及び１５に記載された米の難消化性澱粉の含有率を高める方式では、遺伝子組み換えの手法を用いているため、実用化が困難であった。一方、従来の難消化性澱粉の含有率が高い非遺伝子組み換え体の米は、種子が小さかったり、調理性が良くないという問題があり、実用性が低かった。実際に、難消化性澱粉を含むイネの具体的な実用化、商品化は皆無であった。
このため、難消化性澱粉の含有率（難消化性澱粉含率）が高く、実用性を高めた非遺伝子組み換え体のイネ変異体が求められていた。
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のイネ変異体は、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子が遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、精米後のイネ種子を炊飯した炊飯米の難消化性澱粉の含有量が１０％〜３０％であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、野生型に比べて、前記ＢＥＩＩｂの活性が低下し、前記ＳＳＩＩａ及び前記ＧＢＳＳＩの遺伝子発現が増加し両酵素の活性が高いことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、難消化性澱粉の含有量が、親系統である前記インディカ米又はＢＥＩＩｂ変異体よりも多いことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、前記インディカ米の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１２以下が減少され、ＤＰ１３〜２４が増加されることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、前記インディカ米の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉よりも１℃以上高い糊化温度であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、アミロースの割合が３５％以上であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子は、粉末化することで米粉としても利用可能であることを特徴とする。
本発明の米粉は、前記イネ変異体の前記イネ種子の胚乳を粉末化することで製造されたことを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉は、前記米粉より抽出されることを特徴とする。
本発明の食品は、前記イネ変異体の前記イネ種子、前記米粉、及び／又は前記難消化性澱粉を含んで製造されたことを特徴とする。
本発明のイネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の二重劣性ホモ変異体を作出させ、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子を遺伝的に固定させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来よりもイネ種子の難消化性澱粉含率が高く、実用性が高いイネ変異体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、それらの親変異体（ＥＭ１０）、及び野生型（日本晴、カサラス）の完熟玄米の形態を示す写真である。
【図２】本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、それらの親変異体（ＥＭ１０）、及び野生型（日本晴、カサラス）の完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、それらの親変異体（ＥＭ１０）、及び野生型（日本晴、カサラス）の完熟胚乳の（ａ）アミロペクチンの鎖長分布（Ｍｏｌａｒ％）と、（ｂ）それぞれから野生型（日本晴）のパターンを引いた差分（ΔＭｏｌａｒ％）を示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、それらの親変異体（ＥＭ１０）、及び野生型（日本晴、カサラス）の澱粉のゲル濾過パターンを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜実施の形態＞
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
上述したように、従来から、いくつかの澱粉生合成に係るアイソザイムの変異体については、研究が進んでいた。たとえば、澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、ΔＢＥＩＩｂにおいては、澱粉の構造、物性が明らかになっており、各酵素の機能もある程度明確になっている。さらに、インディカ米とジャポニカ米の澱粉構造や物性の違いも明らかになってきている。
しかしながら、インディカ米を基にしたＢＥＩＩｂ欠損変異体の報告はなかった。この理由として、澱粉変異体技術は、ジャポニカ米で目覚ましい発展があったが、インディカ米では本格的には行われてこなかったからである。すなわち、従来、インディカ米とΔＢＥＩＩｂを組み合わせた変異体は存在しなかった。
これに着目した本発明の発明者らは、鋭意実験を行い、イネの澱粉の代謝系を網羅的に研究して有益な表現型をもつ新規変異体を探索した。具体的には、インディカ米のＳＳＩＩａ遺伝子とＧＢＳＳＩ遺伝子を導入した新規変異体を導出し、澱粉性質に対する影響を調べた。結果として、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子を導入したＢＥＩＩｂの新規変異体ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ；上付きのＩは、インディカ米由来を示す）に、予想できない効果が得られることを見いだした。具体的には、本発明の発明者が作出したΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）は、両親変異体及び野生型と比べると、アミロース含量及び難消化性澱粉含量が著しく高くなった。
具体的には、本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）は、両親変異体及び野生型と比べて、以下のような性質、効果を得ることができる。
【００１６】
上述のように、従来、インディカ米において、ＢＥＩＩｂが欠損した変異体は見つかっていないため、ＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子が優性であり、且つＢＥＩＩｂが欠損したイネがどのような澱粉を蓄積するかは、不明であった。また、インディカ米とΔＢＥＩＩｂを組み合わせた変異体は存在せず、インディカ米のＳＳＩＩａ遺伝子とＧＢＳＳＩ遺伝子を導入した変異体への影響については、不明であった。実際、従来の親系統のＢＥＩＩｂ欠損変異体はジャポニカ米由来であった。
ここで、通常の場合、新規変異体を作成しても、各変異体の形質に導入した遺伝子の表現型が、そのまま現われるだけである。一方で、別品種からの特定の遺伝子の交配による導入については、かなりの手間を要する。また、遺伝子型をホモに固定させるために、交配後代の多数の種子の中から、抗体や分子マーカー等を用いて選抜し、澱粉構造決定するため、大変な時間、手間が必要であった。このような理由から、通常、当業者は、このような変異体を交配により作成することは、ほとんど不可能であった。
一方、従来の澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、上述のように、それぞれの単一の変異体の効果については、明らかになりつつあった。しかし、どのような遺伝子の変異を組み合わせのイネ変異体に難消化性澱粉含量が高いのかは不明であった。
【００１７】
これに対して、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の劣性ホモ変異体を作出し、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子を遺伝的に固定させたことを特徴とする。つまり、本発明者らは、本実施形態のイネ変異体として、イネ種子の難消化性澱粉含量が通常の野生型よりは高いＢＥＩＩｂが欠損したジャポニカ米由来のＢＥＩＩｂ欠損変異体（ＥＭ１０）に、インディカ米由来のＳＳＩＩａとＧＢＳＳＩの二つのスターチシンターゼ遺伝子を交配によって導入して系統化した。
具体的に説明すると、本実施形態のイネ変異体は、従来の難消化性澱粉含量が高い変異体米（ＥＭ１０）を親に用いて、インディカ米の遺伝子を交配により導入した。本実施形態のイネ変異体は、この際、特定の酵素に対する抗体、分子マーカー、澱粉形質の特定等の技術を用いて、非組み換え（非遺伝子組み換え）の手法で、ＢＥＩＩｂ欠損変異体にインディカ米を交配し、インディカ米由来の２種類のスターチシンターゼ遺伝子の導入を確認した。
これにより作成された本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子が遺伝的に固定されている。結果として、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、ＢＥＩＩｂ活性が野生型に比べて低下し、ＳＳＩＩａとＧＢＳＳＩの遺伝子発現が増加し、両酵素の活性が高くなり、親系統のイネ変異体の種子よりアミロース含量及び難消化性澱粉含量を高めることができる。
【００１８】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の精米後のイネ種子を加水量１．８倍で炊飯した炊飯米の難消化性澱粉の含有量（難消化性澱粉含量）が１０％〜３０％であることを特徴とする。
本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの変異体からは、特に通常のイネの澱粉とは異なった性質と形状をもつ特性の澱粉を得られる。これらの特性の中で、特にユニークであるのは、難消化性澱粉含量であり、これまで報告されたイネの中では類をみないほどである。具体的には、本実施形態の変異体米（イネ種子）は、炊飯した場合、従来のイネ変異体より遙かに多い難消化性澱粉が含まれる。より具体的には、ＥＭ１０が十分に糊化する加水量である加水量１．８倍で炊飯した場合、ＥＭ１０のさらに約１．１倍程度高い値を示し、平均で約２５％前後、少なくとも１０％〜３０％の難消化性澱粉含量となる。
すなわち、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、ジャポニカ米とは異なる性質があるインディカ米の遺伝子を変異体に導入することで、両親変異体及び野生型と比べると、難消化性澱粉含量を著しく高めることができる。
【００１９】
本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのイネ変異体の変異体米は、このように難消化性澱粉含量が高いため、食品に少量でも用いるだけで低カロリー化が可能であり、ダイエット食品を製造する際、低コスト化につながる。具体的に、難消化性澱粉は、通常の炭水化物が４ｋｃａｌ／１ｇに対して、２ｋｃａｌ／ｇであるため、本実施形態の変異体米を食品に含有させることで、確実に摂取カロリー少なくすることができる。
なお、炊飯米の難消化性澱粉含量は、調理方法によって大きく異なる。たとえば、従来のＢＥＩＩｂ変異体（ＥＭ１０）の場合、加水量１．５倍で炊飯した炊飯米の難消化性澱粉含量は、炊飯が完全ではなく少し生米が混じるため、２２〜２７％程度となる。これに対して、本実施形態の変異体米においては、例えば、加水量１．５倍で炊飯した炊飯米の難消化性澱粉含量は、３０〜５０％となる。また、本実施形態の変異体米を米粉又は精製澱粉として添加して食品を製造した場合、その食品中の難消化性澱粉含量も調理方法により変化するものの、従来のイネよりも添加量を抑えることができる。
【００２０】
また、従来のＢＥＩＩｂ変異体（ＥＭ１０）は、種子が小さいため、精米上の困難があり、又、相対的に収量が低いため、実用的に使用できなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子は、親系統であるカサラス等のインディカ米又はＢＥＩＩｂ変異体（ＥＭ１０）よりも難消化性澱粉含量が多くなり、更に、種子が大きいことを特徴とする。
このように、本実施形態のイネ変異体は、従来の難消化性澱粉含量が高いイネ変異体よりも難消化性澱粉含量が多くなることに加え、種子が大きいため、精米する上で大きなメリットとなる。また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、種子が大きくなることから収量が高くなり、この生産性の高さが経済性にも貢献する。すなわち、難消化性澱粉を取得したり食品を製造したりする際に低コスト化につながる。このため、実際に食品等を製造する際、又は、炊飯米として提供する際の実用性を高めることができる。
【００２１】
さらに、本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのイネ変異体は、既に遺伝的に固定された系統であり、この種子を植えて自殖によって稔った種子は、全て同型質になる。このため、安定して生産が可能である。
また、片親であるΔＢＥＩＩｂの種子が野生型に比べて６割程度であるのに対し、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのイネ変異体は、種子重量は８割程度を維持しており、稔性、生育も激しくは低下しない。将来的に優良品種と戻し交配することで農業的形質を向上させることも可能である。
さらに、本実施形態のイネ変異体は、非遺伝子組み換え体（非組換え体）であるため、一般の水田での栽培も可能となり、大規模栽培も可能である。
結果として、栽培用作物として実用性が高い難消化性澱粉含量を含むイネ変異体を提供することができる。
【００２２】
一方、従来、ＥＭ１０を親系統として、アミロース含量が０％のモチ米の変異体と交配により作成した二重変異体も存在し（例えば、特開２００９−２５４２６５を参照）、このモチ米と交配した二重変異体は、アミロースが無いにもかかわらず、ＥＭ１０のアミロペクチンの平均鎖長が極端に長いという性質に由来する難消化性澱粉を備えていた。
この従来のＥＭ１０を親系統としてモチ米の変異体との交配により作成した二重変異体は、アミロースが含まれていないため、難消化性澱粉含量が比較的少なかった。このため、従来の難消化性澱粉を含むイネ変異体は、実用性が低かった。
【００２３】
また、従来から、アミロース含量が高い澱粉には、難消化性澱粉が多いと推測されていた。しかしながら、どのような構造、あるいは澱粉が難消化性を示すのかは、詳細については、不明であった。
これに対して、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、アミロースの割合が３５％以上であることを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、インディカ米品種の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１２以下が減少され、ＤＰ１３〜２４が増加されることを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、インディカ米品種の野生型イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネ（ＥＭ１０）を用いて製造される澱粉よりも１℃以上高い糊化温度であることを特徴とする。
【００２４】
つまり、本発明の実施の形態に係るイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及び澱粉は、親系統のＥＭ１０よりアミロース含量が増加していることで、ＥＭ１０とは違った物性を示す。ここで、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及び澱粉は、高アミロース含量及びアミロペクチンの長鎖が多いことに起因する老化性の高さから、老化性が有利に働く調理法において、調理性を高めることができる。
具体的には、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及び澱粉は、老化性が有利に働く調理法である、麺や米菓に適している。さらに具体的には、本実施形態のイネ種子、米粉、及び澱粉は、ピラフ若しくはリゾット、米菓、グラノーラ等の食品に好適に用いることができ、従来とは、味わい、口触り、食感、風味等が異なる特徴ある食品を製造することができる。また、これらを用いた各種健康食品やダイエット食品等に利用可能である。
【００２５】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子は、粉末化することで米粉としても利用可能であることを特徴とする。
すなわち、本実施形態の変異体米は、粉砕機等で粉砕して、米粉として使用することができる。また、本実施形態の変異体米から抽出した澱粉自体を、難消化性澱粉が多く含まれる澱粉として使用することも可能である。
本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの変異体米を粉砕した粉砕物である米粉は、パンや麺等に混合させて利用することができる。また、本実施形態の変異体米自体も、玄米のまま又は精米してダイエット米として提供することが可能である。
また、このような本実施形態の変異体米及びこの粉末等を用いた食品は、麺、パン、ピラフ、かゆ、米菓等の米由来のダイエット素材として用いることが可能である。また、これらの食品は、習慣的に摂取することにより、低カロリー性を備え、大腸環境を整えるため糖尿病、大腸癌、便秘の予防等の効果が期待される。
【００２６】
また、本実施形態のΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの変異体の米粉や澱粉は、アミロースの含量が高いことにより、工業的な用途にて使用可能である。これは、生分解性プラスチックなど、成形が必要な場合は、老化性が高い方が有利であるためである。たとえば、アミロースは温水に溶けるため、フィルム状に成形して、生分解性フィルム、医療用材料、縫合糸のような用途に用いることができる。また、体内で吸収分解される性質を用いて、再生医療の「足場」用の部材として用いることが可能である。
さらに、グラスファイバー作成時の資材、工業用糊、建築材料の配合剤、植物栽培用の資材等、様々な工業用途に利用可能である。
このように、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIである変異体は産業上利用することができる。
【００２７】
以上のように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法においては、類い希な難消化性澱粉含量をもつイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法を得ることができる。さらに、本発明は、当該澱粉を利用する飲食品及び工業製品に用いることができる。
【実施例１】
【００２８】
以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００２９】
〔実験方法と材料〕
（ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI変異体の単離）
インディカ米であるカサラスとＢＥＩＩｂ変異体を交配することで、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIを作出し、その性質を調べた。
【００３０】
以下で、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI変異体の作出法について説明する。本発明の発明者らは、ジャポニカ米のＢＥＩＩｂ変異体であるＥＭ１０（白濁種子）に、インディカ米であるカサラスを交配し、交配当代のＦ１種子を次年度に播種し、Ｆ２種子を得た。この中には、白濁種子が約２５％含まれていた。白濁種子の胚と反対側の胚乳１／４を使って、タンパク質を抽出し、ＢＥＩＩｂ抗体でウエスタンブロッティングを行い、ＢＥＩＩｂが欠損している種子の胚側の残りの３／４を滅菌し、寒天培地に移植した。これらの幼植物の葉身からＰＣＲ法によって、ＳＳＩＩａ遺伝子及びＧＢＳＳＩ遺伝子がインディカ米由来のパターンを示す個体を選抜し、栽培を続け、Ｆ３種子を取得した（図２）。このように、ＢＥＩＩｂが欠失し、ＳＳＩＩａがインディカ型、ＧＢＳＳＩがインディカ型の個体を「＃１２０３Ｃ」クローンと名付けた。なお、ＢＥＩＩｂタンパク質の欠損は、即ちＢＥＩＩｂ活性の欠損を意味する。
【００３１】
ウエスタンブロッティングのためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法について述べる。電気泳動槽にアクリルアミドゲルをセットして泳動バッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％  ＳＤＳ）を注ぎ、ゲルのウェルに分子量マーカー（Ｃａｔ＃１６１−０３７３、Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を５μＬ、調製したサンプルを１０μＬずつアプライして、室温で電気泳動を行った。ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）フロントダイが濃縮ゲルを通過するまではゲル１枚あたり１０ｍＡの定常電流を流し、分離ゲルに到達した後ゲル１枚あたり２０ｍＡの電流を流して電気泳動を行い、ＢＰＢフロントダイがゲルの下から１ｃｍ程度になるまで電流を流し停止した。
【００３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に分離されたタンパク質を転写するためのメンブレン（ＰＶＤＦ膜、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＩＰＶＨ００１０）１枚と、ろ紙６枚をゲルと同じ程度の大きさに切り、メンブレンは１００％  ｍｅｔｈａｎｏｌに２０秒浸してから、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ、０．１％  ＳＤＳ）に浸した。ろ紙はそのまま、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒが湿るぐらい浸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒの入ったプラスチックケースに移して１５分間浸とうした。ブロッティング用電極の陽極側にｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙３枚を泡が入らないように重ね、その上にメンブレンを泡が入らないように重ね、次にゲルを泡が入らないように重ね、更にろ紙３枚を泡が入らないように重ねた。上部電極板（陰極）をセットし、メンブレン１枚当たり８０ｍＡの電流で１時間流した。１時間後、通電を止めてメンブレンをプラスチック容器に移し、ブロッキング液（４％スキムミルク／ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ））１５ｍＬを入れ、３０分間浸とうした（ブロッキング）。３０分後、１次抗体（本実験では４％スキムミルク／ＴＢＳで抗ＢＥＩＩｂ血清（非特許文献７）を１５００倍希釈したもの、抗ＳＳＩＩａ血清（非特許文献３）を２５０倍希釈したもの、抗ＧＢＳＳＩ血清（非特許文献２）を２５００倍希釈したものを添加して４℃で一晩ゆっくり浸とうさせた。
翌日、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、洗浄した。その後、４％スキムミルク／ＴＢＳ１０ｍＬと共に、抗ウサギヤギ血清パーオキシダーゼ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を５０００倍希釈した２次抗体を添加して約２時間ゆっくり浸とうさせた。その後、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２で１回洗い、ＴＢＳで１回洗った後、新しいＴＢＳに浸し、検出に用いた。
ウエスタンブロッティングを行ったメンブレンにＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｅｃｅ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｒｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１ｍＬかけることで発色させ、Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）で発色したバンドを写真に撮り、その画像データをソフトウェア：ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅを用いて、検出したバンドの明るさやコントラストを編集した。写真撮影後、メンブレンを蒸留水で十分に洗浄した後乾燥させ保存した。
【００３３】
次にＰＣＲ選抜のための幼植物からのＤＮＡ抽出方法について述べる。培地からセルトレイに移植した幼植物の葉身２ｃｍ程度をマルチビーズショッカー用のチューブに移し、液体窒素に入れ凍らせてマルチビーズショッカーで粉砕した（ＳＰＥＥＤ  ＭＥＴＥＲ：２０００ｒｐｍ、ＯＮ  ＴＩＭＥ：５秒、ＯＦＦ  ＴＩＭＥ：０秒、ＣＹＣＬＥ：１回）。４００μＬのＤＮＡ抽出ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）を加えてボルテックスし、１５，０００ｒｐｍ、２０℃で５分間、遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、３００μＬのイソプロピルアルコールを加えよく混合し、１５分間静置した。その後、上述のものと同じ条件で遠心分離し、チューブの底に半透明な沈殿があるか確認した後、７０％エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を除去した。残った沈殿を減圧乾燥し、氷上で２５μＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を加え懸濁した。その後、実験に用いるまで−３０℃で冷凍保存した。
【００３４】
ここで、ＳＳＩＩａの遺伝子中には、４カ所の塩基が置換された部分（ＳＮＰ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、１塩基置換）があり、これらがインディカ型ＳＳＩＩａ（活性型）又はジャポニカ型ＳＳＩＩａ（不活性型）を決めている（非特許文献３）。一方、ＧＢＳＳＩ遺伝子中には、１カ所の塩基が置換された部分があり、これらがインディカ型ＧＢＳＳＩ（活性型）とジャポニカ型ＧＢＳＳＩ（リーキー）を決めている（非特許文献１６）。
ＳＳＩＩａ、ＧＢＳＳＩ遺伝子中の塩基置換された部分を３'末端に含むプライマーを作成することでインディカ型かジャポニカ型かを判別することができる。ＳＳＩＩａ選抜プライマーは非特許文献１７を参考にし、ＧＢＳＳＩ選抜プライマー非特許文献１８を参考にして作成したものを使用した。
以上のようにして、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの系統を確立できた。
【００３５】
（澱粉の精製方法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ  ２８：２４１−２４４（１９８１））を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍＬ加えて一晩４℃で放置した。
翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍＬ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
【００３６】
（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉及びアミロペクチン２２．５ｍｇに蒸留水０．２５ｍＬを加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えて、３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．２６ｍＬを加え、５ＮのＨＣｌを９０μＬ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を５ｍＬ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μＬ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、４０℃で２４時間揺らしながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍＬ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍＬ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍＬ加えて、５℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
【００３７】
使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５Ｓ（３００×２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５０Ｓ（３００×２０ｍｍ）３本（両カラムとも、ＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍＬずつ分取し、６８本に分画し、各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘを求めた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＲＩ８０２０、ＴＯＳＯＨ社製）で検出した。
【００３８】
（鎖長分布解析）
鎖長分布解析について、図２を参照して説明する。
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末を用いた。
各々に５ｍＬのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍＬ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μＬ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸９．６μＬで中和した後、蒸留水を１０８９μＬ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μＬ、２％のアジ化ナトリウムを１５μＬ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を２μＬ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。
次に、イソアミラーゼを２μＬ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で濾過した。
次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９４、２０５−２１３（１９８１）参照）の方法により、試料中の糖含量を定量し５〜１０ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸）を２μＬ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン）を２μＬ添加し、５５℃で９０分間反応させた。
分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌｅ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌｅ％）のグラフを作成した。
【００３９】
（示差走査熱量測定器ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）による糊化温度の測定）
１０５℃で２時間乾燥させた澱粉、約３ｍｇに蒸留水９μＬを加えて混合し、昇温速度３℃／分で５℃から２００℃までの温度変化させたときの示差走査熱量をＤＳＣ６１００（セイコーインスツル株式会社製）で測定した。
その後、同機種のアプリケーションソフトを用いて、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量を算出した。
【００４０】
（難消化性澱粉含量の測定）
まず、炊飯方法について述べる。１５ｍＬフタ付き遠沈管に約１００ｍｇの精米（５〜８粒）を秤量し、パスツールピペットを用いて遠沈管内でサンプルを２回水洗した。遠沈管内の水分が精米重量の１．８倍±０．３ｍｇの水量になるように蒸留水を加えた（即ち、遠沈管内の全重量が精米の２．８倍になるようにした）。遠沈管側面に付いた水を遠心分離機にかけて落とした。５合炊き炊飯器の炊飯釜に約２５０ｍＬの水道水を入れ、マイクロチューブスタンドとガラスシャーレ（直径１２ｃｍ）を置き、その上にサンプルの入った１５ｍＬ遠沈管をななめに置いて５合炊き炊飯器で炊飯した。
次に、難消化性澱粉含量は、メガザイム社が販売しているＲＳ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（以下、「ＲＳ測定キット」という。）により測定した。
【００４１】
ＲＳ測定キットの測定用のパンクレアチンα−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋アミログルコシターゼ（３Ｕ／ｍＬ）の作成方法は以下の通りである。
５０ｍＬ遠沈管に０．１Ｍマレート・ナトリウム・バッファー（ｐＨ  ６．０）５０ｍＬとＲＳ測定キットに付属のブタ膵臓α−アミラーゼ０．５ｇを溶かし、氷上で５分間振とう機で撹拌した。３００Ｕ／ｍＬに希釈したアミログルコシターゼ（ＡＭＧ）溶液０．５ｍＬを加え撹拌し３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分遠心分離し、上清を新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。この試薬は必要分等倍に変化させ、その都度作成した。
【００４２】
このように準備したパンクレアチンα−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ＡＭＧ（３Ｕ／ｍＬ）４ｍＬを各炊飯米に加え、恒温振とう機（ＭＨ−１０，ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて１６４ｒｐｍ、３７℃で１６時間、激しく振とうさせた。１００％エタノール４ｍＬを加えて撹拌し、３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離し、５０ｍＬ遠沈管に、すばやく上清を回収した。沈殿物に５０％エタノールを２ｍＬ入れて撹拌した後、再度５０％エタノールを８ｍＬ加え、全体量を１０ｍＬにし、撹拌した。３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離して、上記の５０ｍＬ遠沈管にすばやく上清を移した。この作業をもう一度行い、沈殿（この中に含まれる難消化性澱粉をｒｓとする）と上清（この中に含まれる可溶化した澱粉量をｎｏｎ−ｒｓとする）を分離した。なお、この一連の操作の際に用いた遠心分離機は（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−３０Ｒ、ＢＥＣＫＭＡＮ社製）であり、スイングローター（ＳＸ４４００）のバケットを用いた。
【００４３】
沈殿に残っている上清をピペットでできるだけ取り除き、１５ｍＬ遠沈管に入っているｒｓをプラスチックペッスルで潰しながら、２ｍＬの２Ｍ  ＫＯＨ加えた。スターラーバーを入れ、氷中で２０分撹拌した。１．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３．８）を８ｍＬ、ＡＭＧ（３３００Ｕ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加えて、ｒｓをグルコースまで分解させた。５分に１回ボルテックスで撹拌しながら、５０℃で３０分加熱し、４，５００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離した。
グルコースまで分解されたｒｓは遠沈管の目盛１１ｍＬ、ｎｏｎ−ｒｓは目盛３０ｍＬまで、蒸留水でメスアップした。ｒｓは難消化性澱粉が高いサンプル（難消化性澱粉が１５％を超えるもの）及び、ｎｏｎ−ｒｓは０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で１０倍希釈した。各溶解液及び希釈液１０μＬとグルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）１５０μＬとをそれぞれ２ホールずつ９６穴のマイクロプレートの各穴にアプライした。また、別の穴に、検量線作成のためのグルコース溶液標準液（ｍｇ／ｍＬ）、その上から、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）、グルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）をアプライした。マイクロプレートシートでふたをし、ハイブリオーブン（ＴＡＩＴＥＣ  ＨＢ−８０）で５０℃、２０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍの吸光度を測定した。
グルコース溶液の測定値から検量線を引き、各サンプルのグルコース濃度（μｇ／μＬ）を求め、１００ｍｇ精米中のｒｓ及びｎｏｎ−ｒｓ量を算出した。難消化性澱粉含量を示すＲＳ値（％）は以下の式（１）により算出した。
ＲＳ値（％）＝ｒｓ（ｍｇ）／［ｒｓ（ｍｇ）＋ｎｏｎ−ｒｓ（ｍｇ）］……式（１）
【００４４】
〔結果〕
まず、図１を参照して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）及び、それらの親変異体（ＥＭ１０）と野生型（日本晴とカサラス）の各クローンの完熟玄米の形態について説明する。
各クローンにおいて、上図は完熟玄米の上から光を当てて撮影した写真、下図は完熟玄米の下から光を当てて撮影した写真である。
なお、ＥＭ１０は、胚の突然変異源であるＭＮＵ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ、メタンニトロソウレア）処理を用いて選抜した。ＭＮＵ処理は、文献（Ｙａｎｏ，Ｍ．，  Ｏｋｕｎｏ，  Ｋ．，  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｊ．，  Ｓａｔｏｈ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，  Ｔ．  （１９８５）  Ｈｉｇｈ  ａｍｙｌｏｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ，  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：  ２５３−２５７．）に記載された方法に従って行った。
また、ＥＭ１０の親系統は金南風であるが、ここでは、同じジャポニカ米品種で金南風とすべての表現型がほぼ同一の日本晴を野生型として用いた。また、インディカ米品種の親系統としては、交配親に用いたカサラスを用いた。
【００４５】
図１において、ＢＥＩＩｂ単一変異体（ΔＢＥＩＩｂ）のクローンであるＥＭ１０の種子は白濁し、野生型（日本晴）より小さかった。
これに対して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのクローンである＃１２０３Ｃの種子は、ＢＥＩＩｂ単一変異体のＥＭ１０と同様、玄米全体が白く濁る「白濁」の形態を示したが、種子の大きさはＥＭ１０と比べて大きかった。
【００４６】
次に、本発明の実施の形態に係るΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、それらの親変異体（ＥＭ１０）。及び野生型（日本晴、カサラス）の玄米１粒重（ｍｇ）を測定した。
この結果を下記の表１に示す。
【００４７】
【表１】
2017038588.tif 000003
【００４８】
表１は、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのクローンである＃１２０３Ｃ、それらの親変異体のクローンであるＥＭ１０（ΔＢＥＩＩｂ）、野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）のカサラスと日本晴の玄米重量（ｍｇ）について測定したデータを示している。表１において、測定のｎ＝２０であり、玄米重量（ｍｇ）は平均±標準誤差、相対値は日本晴を１００としたときの値を、それぞれ示す。
このように、ＢＥＩＩｂ単一変異体のクローンであるＥＭ１０は、野生型の６割程度の種子重量であった。
また、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのクローンである＃１２０３Ｃの玄米重量は野生型（日本晴）の７９％と、やや小さかったものの、親系統のＥＭ１０やカサラスよりは大きく、玄米重量のさらなる減少は見られなかった。
【００４９】
次に、図２を参照して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）及びそれらの親変異体（ＥＭ１０）と野生型（日本晴、カサラス）の完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果について説明する。
具体的には、本実施例のイネ変異体は、ＢＥＩＩｂ欠損変異体であるＥＭ１０とインディカ米であるカサラスの交配後代から選抜されたものである。選抜により得られたＦ３種子が、望みの遺伝子型をホモに持つかを確認するため、ウエスタンブロッティングでＢＥＩＩｂ、ＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩのタンパク質バンドを検出した。
【００５０】
図２（ａ）は、Ｆ３種子を４粒の可溶性及び澱粉にゆるく結合したタンパク質を抽出した画分（フラクション）であるＳＰ＋ＬＢＰ画分を用いてＢＥＩＩｂの抗体で検出を行ったウエスタンブロッティングの検出結果を示す。図２（ａ）の各レーンは、左から、Ｍはマーカー、カサラスはインディカ米の野生型、日本晴はジャポニカ米の野生型、ＥＭ１０は親変異体（親系統）、＃１２０３Ｃの（１）〜（４）は各種子を示す。
＃１２０３Ｃのタンパク質を抽出したウエスタンブロッティングにおいては、いずれの種子でもＥＭ１０と同様、ＢＥＩＩｂバンドが欠損していた。
【００５１】
次に、図２（ｂ）は、澱粉に強固に結合したタンパク質を抽出した画分であるＴＢＰ画分を用いてＳＳＩＩａとＧＢＳＳＩの抗体で検出を行ったウエスタンブロッティングの検出結果を示す。
インディカ米由来のＳＳＩＩａは、澱粉結合タンパク質画分でバンドが検出される特徴がある（非特許文献３）。ここで、本実施例のウエスタンブロッティングの結果においては、ジャポニカ米である日本晴では、ほとんどバンドが検出されないにもかかわらず、＃１２０３Ｃでは検出された。ただし、ジャポニカ米由来のＥＭ１０でも検出されており、これは、ＢＥＩＩｂが欠損することによるＳＳＩＩａの澱粉結合性の変化による。従って、＃１２０３ＣでＳＳＩＩａバンドが検出された原因がＢＥＩＩｂ欠損か、インディカ米由来のＳＳＩＩａの導入かは、この結果からは、限定できない。しかしながら、下記で示すアミロペクチンの鎖長分布解析の結果から、インディカ米のＳＳＩＩａが導入されたことが明らかであった。
また、インディカ米のＧＢＳＳＩバンドは、ジャポニカ米のＧＢＳＳＩバンドと比べて濃く太くなることが知られている。＃１２０３Ｃの４粒の種子のバンドは、いずれも濃く太かったために、インディカ米由来のＧＢＳＳＩが確かに導入されていることが確認された。
【００５２】
次に、図３を参照して、アミロペクチンの鎖長分布について説明する。
図３（ａ）は、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）の各種子（１）〜（４）、それらの親変異体であるΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、コントロールの日本晴（野生型）及びカサラスの完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布を示すグラフである。図３（ａ）において、横軸は、ＤＰ（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、グルコースの重合度を示す値である。縦軸は、Ｍｏｌａｒ（％）を示す。
図３（ｂ）は、それぞれから野生型である日本晴のＭｏｌａｒ％を引いた差分をモル比（ΔＭｏｌａｒ％）にて示すグラフである。
ＢＥＩＩｂの単一変異体のクローンであるＥＭ１０は、ＤＰ≦１４の短鎖が野生型と比べて激減し、その代わりＤＰ≧１５の長鎖が増加していた。
また、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのクローン＃１２０３Ｃは、ＥＭ１０のパターンに類似してＤＰ６〜１４の短鎖の減少が大きいのが特徴であった。しかしながら、ＤＰ６〜１２の減少の程度はＥＭ１０より増加しており、ＤＰ１３〜２４の中鎖は、ＥＭ１０より増加していた。一方、ＤＰ２５〜４５の長鎖の量は、ＥＭ１０よりは減少しており、ＤＰ４６以上の長鎖はＥＭ１０と同様に増加していた。
図３（ｃ）は、＃１２０３Ｃの鎖長分布からＥＭ１０の鎖長分布を引いた差分グラフを示す。この差分グラフでは、＃１２０３Ｃ種子の４粒すべてでＤＰ１２以下が減少し、ＤＰ１３〜２４が増加するという、インディカ米由来のＳＳＩＩａの特徴が表れていた。このため、＃１２０３Ｃにはインディカ米のＳＳＩＩａがホモで導入されていることが確認できた。
以上のように、＃１２０３Ｃのアミロペクチンの鎖長分布パターンは、ＥＭ１０の特徴を示すものの、これとは同一ではなく、独特のアミロペクチン構造をしていることが分かった。
【００５３】
次に、図４を参照して、ゲル濾過パターンについて説明する。
図４は、それぞれΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、親変異体であるΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、野生型である日本晴及びカサラスの各クローンのゲル濾過パターンである。横軸はカラムの通過時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ、分）、縦軸は相対炭素量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ（％））を示す。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。
これらを数値化したものを、以下の表２に示す。この表２では、各フラクションの割合と、アミロペクチンの長鎖に対する短鎖の割合（ＩＩＩ／ＩＩ）を示す。表２において、測定のｎ＝３、エラーバーは標準誤差を示す。
【００５４】
【表２】
2017038588.tif 000004
【００５５】
ＢＥＩＩｂ単一変異体（ΔＢＥＩＩｂ）は、枝切りした澱粉のゲル濾過の結果、見かけのアミロース含量が日本晴に比べて約１．３倍高い（非特許文献１９）。本実施例の実験結果においても、日本晴の見かけのアミロース含量は１９．７％であるのに対し、ΔＢＥＩＩｂのクローンＥＭ１０は２８．９％と約１．５倍の値を示した。
これに対して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのアミロース含量は３７．５％と、ΔＢＥＩＩｂのクローンＥＭ１０よりも更に約１．３倍高かった。また、ΔＢＥＩＩｂでは、短鎖の割合であるＩＩＩ／ＩＩ値が１．０と非常に小さいことから、アミロペクチンの長鎖の割合が非常に大きかった。ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIはΔＢＥＩＩｂと同等にアミロペクチンの長鎖の割合が大きかった。
以上のことから、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIは、ΔＢＥＩＩｂと同等にアミロペクチンの長鎖の割合が非常に高いうえ、アミロース含量がΔＢＥＩＩｂより高い値を示す、ということが明らかとなった。他の予備実験により、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIのアミロース含量は、少なくとも３５％以上となっていた。
これにより、アミロース含量が高い澱粉においては難消化性澱粉の割合が多い傾向があり、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIにおいても、澱粉の難消化性澱粉は非常に高くなることが分かる。このため、ダイエット素材を中心とした食品加工分野や添加剤及び工業資材として特徴的な製品を製造できると考えられる。
【００５６】
次に、下記の表３を参照して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの澱粉の糊化温度について説明する。
【００５７】
【表３】
2017038588.tif 000005
【００５８】
表３は、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）及びそれらの親変異体（ＥＭ１０）と野生型（日本晴、カサラス）の糊化温度及び糊化熱量を示す表である。
具体的には、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、これらの親変異体ΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、野生型である日本晴、カサラスの各澱粉糊試料の糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化熱量を示差走査熱量分析器（ＤＳＣ）で測定した結果を示す。
インディカ米であるカサラスやＥＭ１０の糊化ピーク温度はジャポニカ米の日本晴より約１２℃高かった。＃１２０３Ｃは、ＥＭ１０よりさらに１．５℃高く、測定した澱粉の中では最も高い糊化温度を示した。
【００５９】
次に、表４を参照して、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩIの澱粉の難消化性澱粉含量について説明する。
【００６０】
【表４】
2017038588.tif 000006
【００６１】
表４は、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）及びそれらの親変異体（ＥＭ１０）と野生型（日本晴、カサラス）の精米の炊飯米の難消化性澱粉量を示す表である。表４において、測定のｎ＝６、エラーバーは標準偏差を示す。
具体的には、ΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）、これらの親変異体ΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、野生型である日本晴、カサラスの精米を１．８倍の加水量で炊飯した炊飯米の難消化性澱粉含量をＲＳ測定キットで測定した結果を示す。
このキットで測定される難消化性澱粉含量は、誤差が大きい。
ＥＭ１０の難消化性澱粉含量は、日本晴の約１２．２倍、カサラスの約４．２倍高い値を示した。これに対して、＃１２０３Ｃの難消化性澱粉含量は、ＥＭ１０のさらに約１．２倍高い値を示した。
【実施例２】
【００６２】
次に、本発明の実施例２では、上述の実施例１と同様の方法で、異なる年に収穫したΔＢＥＩＩｂ／ＳＳＩＩａI／ＧＢＳＳＩI（＃１２０３Ｃ）及びそれらの親変異体（ＥＭ１０）と野生型（日本晴、カサラス）の精米の炊飯米の難消化性澱粉量を更に測定した。これは、上述のようにＲＳ測定キットは、誤差が大きく、ハンドリングに不慣れであると、測定結果が実際の値よりも低い値となり、結果が安定しないためである。また、収穫年によっても異なる値を示すことがある。この本発明者らによる、上述の実施例１と同様のＲＳ測定キットによる試行の結果を、下記の表５に示す。
【００６３】
【表５】
2017038588.tif 000007
【００６４】
表５では、測定のｎ＝４、エラーバーは標準誤差を示す。表５に示す結果では、ＥＭ１０の難消化性澱粉含量は、日本晴の約１７．９倍、カサラスの約８．０倍高い値を示した。
これに対して、＃１２０３Ｃの難消化性澱粉含量は、ＥＭ１０のさらに約１．１倍高い値を示した。具体的に、１．５倍加水量で炊飯した炊飯米を使用した場合に、＃１２０３Ｃの難消化性澱粉の含有量が４０％前後、より具体的には３５％〜５５％となると予想される。
【００６５】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の活性が低下し、インディカ米由来のＳＳＩＩａ及びＧＢＳＳＩ遺伝子を備えるイネ変異体を提供でき、当該イネ変異体のイネ種子は、イネでは類い希な難消化性澱粉含量となるため、産業上利用可能である。
【図１】
2017038588.tif 000008
【図２】
2017038588.tif 000009
【図３】
2017038588.tif 000010
【図４】
2017038588.tif 000011