(57)【要約】【課題】試料から非エンベロープウイルスのＲＮＡの単離や試料の事前の加熱処理を行うことなく、反応液に加え、１ステップＲＴ−ＰＣＲによりウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とする方法およびキットを提供する。【解決手段】試料中のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査方法であって、試料からのＲＮＡ精製、または試料の事前の熱処理のない、以下の工程からなるウイルスの存在の有無を検査するための方法。（１）試料とカオトロピック剤を含む試薬を混合する工程、（２）前記混合液に逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する工程、（３）反応容器を密閉後、1ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査方法であって、試料からのＲＮＡ精製、または試料の事前の熱処理のない、以下の工程からなるウイルスの存在の有無を検査するための方法。
（１）試料とカオトロピック剤を含む試薬を混合する工程、
（２）前記混合液に逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する工程、
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する工程。
【請求項２】
前記工程（１）、（２）が同一容器で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が糞便である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料が前記懸濁液の遠心上清である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
エンベロープを持たないウイルスがノロウイルスである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カオトロピック剤が、尿素、チオ尿素、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、アルギニンからなる群から選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはこれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
カオトロピック剤を含む試薬、及び逆転写酵素、耐熱性ポリメラーゼ、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とするエンベロープを持たないウイルスの検査用キット。
【請求項１５】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
検出対象のウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
検出対象のウイルスの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする請求項１４から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
エンべロープを持たないウイルスがノロウイルスである請求項１４から１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅によるウイルスの検出法に関する。より具体的には、試料から核酸の単離や加熱処理をすることなく、試料をカオトロピック剤と混合後、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の反応液を加えることによる、糞便試料または環境拭き取り試料中のエンベロープを持たないウイルスの検出に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ−ＰＣＲという。このＲＴ−ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ−ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲの３つに大別される。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲのうち、遺伝子検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ−ＰＣＲが好まれる。一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。一方、二酵素１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。
【０００４】
逆転写酵素としては、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；モロニーマウス白血病ウイルス）−ＲＴ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；トリ骨髄芽球症ウイルス）−ＲＴ、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）２−ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｎｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やこれらの変異体が利用される。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては。Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体などが利用される。
【０００５】
一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が低いことが知られる（非特許文献１）。これに対し、二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いとされる（非特許文献２）。しかし、二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲは、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いが、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、反応効率を低下させることが報告されている（非特許文献３）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、あるいは逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加などの使用が行われてきた。
【０００６】
病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（Ｇ１）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（Ｇ２）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ−ＰＣＲ法が公定法として普及している。
【０００７】
ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、必要に応じてノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。
【０００８】
ノロウイルスは、エンベロープを持たない、約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体構造を持ったウイルスである。このキャプシド構造にウイルスＲＮＡゲノムが封入される。そこで、従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％乳剤を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた（食安監１１０５００１号）。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。そこで、近年、糞便試料から熱処理でキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ−ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法がとられるようになった（非特許文献４）。この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。そこで、これらの影響を低減するような工夫が前処理剤やＰＣＲ反応液になされている（特許文献１）。便によるＰＣＲ阻害は、ベタイン、ＢＳＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、タンパク質分解酵素阻害剤の添加により改善されることが報告されているが、便試料にスパイクされたＤＮＡを検出したものでＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出を改善できるか不明であった（非特許文献５）。本発明者は、既にアミノ酸における３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（ベタイン、Ｌ−カルニチン、など）、１ｍｇ／ｍｇ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、及びゼラチンの全部または一部を組み合わせることによって、便によるＰＣＲ阻害を解消できることを見出している。
【０００９】
一方で、前記糞便試料の熱処理は、逆転写酵素を失活させてしまうことから、熱処理後にＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する必要がある。ここで反応容器の開閉や試薬の添加が非常に手間と労力を要する。さらに、サンプル間のコンタミネーションのリスクもある。Ｋ．Ｋａｎｇらは、高病原性北米産豚生殖器呼吸器症候群ウイルスＲＮＡを豚血清サンプルから直接ＲＴ−ＰＣＲにより検出できることを報告している（非特許文献６）。この報告では、試料を直接ＲＴ−ＰＣＲ反応液と混合して反応するだけで、ウイルスのエンベロープ構造が破壊され、ウイルスＲＮＡが検出される。しかし、ノロウイルスのような消化管に感染しうるエンベロープを持たないウイルスは、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。そのため、未処理の試料を直接ＲＴ−ＰＣＲに供するだけではこのキャプシド構造が保持され、ＲＮＡの検出を十分に行えないケースがあった。そこで、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離や熱処理をせずに、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に加え、効率よくウイルスＲＮＡの有無を検出する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５―１１９６５６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１７巻，１９９４年、第１０３４−１０３６頁
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０−２３４頁
【非特許文献３】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，第２０巻，１９９２年、第１４８７−１４９０頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１６３巻，２０１０年、第２８２−２８６頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３−４４７０頁
【非特許文献６】Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻、２０１４年、第４５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、試料から非エンベロープウイルスのＲＮＡの単離や試料の事前の加熱処理を行うことなく、反応液に加え、１ステップＲＴ−ＰＣＲによりウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、ウイルスＲＮＡの精製や事前の熱処理を行っていない試料をカオトロピック剤と混合後、１ステップＲＴ−ＰＣＲに供することで、非エンベロープウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
さらに本発明者らは、ウイルスキャプシド構造の変性に必要な濃度のカオトロピック剤と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応に許容されるカオトロピック剤濃度を見極め、同一反応容器にカオトロピック剤、試料、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を順次添加して反応容器を密閉後、ＲＴ−ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけでウイルスＲＮＡを検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
項１．試料中のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査方法であって、試料からのＲＮＡ精製、または試料の事前の熱処理のない、以下の工程からなるウイルスの存在の有無を検査するための方法。
（１）試料とカオトロピック剤を含む試薬を混合する工程、
（２）前記混合液に逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する工程、
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する工程。
項２．前記工程（１）、（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１に記載の方法。
項３．試料が糞便である項１または２のいずれかに記載の方法。
項４．試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から３のいずれかに記載の方法。
項５．試料が項４に記載の懸濁液の遠心上清である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
項６．試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする項１または２に記載の方法。
項７．エンベロープを持たないウイルスがノロウイルスである項１から６のいずれかに記載の方法。
項８．ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項７に記載の方法。
項９．カオトロピック剤は尿素、チオ尿素、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、アルギニンからなる群から選択された少なくとも１つであることを特徴とする項１から８のいずれかに記載の方法。
項１０．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体から選択されることを特徴とする項１から９のいずれかに記載の方法。
項１１．逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはこれらの変異体から選択されることを特徴とする項１から１０のいずれかに記載の方法。
項１２．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする項１から１１のいずれかに記載の方法。
項１３．ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである項１２に記載の方法。
項１４．カオトロピック剤を含む試薬、及び逆転写酵素、耐熱性ポリメラーゼ、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とするエンベロープを持たないウイルスの検査用キット。
項１５．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含む項１４記載のキット。
項１６．検出対象のウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする項１４または１５に記載のキット。
項１７．検出対象のウイルスの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする請求項１４から１６のいずれかに記載のキット。
項１８．エンべロープを持たないウイルスがノロウイルスである項１４から１７のいずれかに記載のキット。
項１９．ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項２０に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、試料からウイルスＲＮＡの単離や事前の試料の熱処理を必要とせず、試料をカオトロピック剤と混合後、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に添加するだけで、試料中のノロウイルスのような非エンベロープウイルスの有無を検出することが可能になる。この結果、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも寄与する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１７】
本発明の一態様は、ノロウイルスなどの試料中の非エンベロープＲＮＡウイルスの検査であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、試料とカオトロピック剤を含む試薬を混合し、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ試薬を添加することからなるウイルスの存在の有無を検査するための方法である。
【００１８】
本発明のウイルスの存在の有無を検査するための方法は、以下の工程からなるウイルスの存在の有無を検査するための方法。
（１）試料とカオトロピック剤を含む試薬を混合する工程、
（２）前記混合液に逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する工程、
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施する工程。
前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。すなわち、工程（１）により混合液の全量を工程（２）に供してもよいし、その一部を別の容器に移し替えて工程（２）を実施しても良い。
【００１９】
本発明において検査対象となるＲＮＡウイルスは、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科アストロウイルス、カリシウイルス科サポウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス科Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキ―ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、へぺウイルス科Ｅ型肝炎ウイルス、レオウイルス科ロタウイルスなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。非エンベロープウイルスの多くが糞口感染などによって消化管に感染可能で、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。
【００２０】
本発明の試料として、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明におけるこれら試料は、市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離したり、あるいは熱処理でＲＮＡをウイルス構造から露出させるための事前の熱処理を行う必要がないことを特徴とするものである。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。さらに、糞便など夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。
【００２１】
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。
【００２２】
本発明において、カオトロピック剤とは、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水結合などに影響を与えることで分子構造を不安定化する性質のある物質をいうものである。カオトロピック剤を用いることにより、核酸やタンパク質のような生体分子の高次構造が不安定化できる。この性質を利用することで、ウイルスのキャプシドタンパク質の疎水結合などを弱め、キャプシド構造を不安定化するような効果を奏するものである。
【００２３】
前記カオトロピック剤としては、具体的にはチオシアン酸グアニジン、イソチアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素、チオ尿素、アルギニン、ヨウ化ナトリウム等が挙げられるが、これに限られるものではない。該カオトロピック剤のキャプシドタンパク質の変性剤としての下限の濃度としては、カオトロピック剤や他の添加剤の種類にもよるが、キャプシドタンパク質が変性される濃度であれば特に限定されるものではなく、０．３Ｍ以上８Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以上８Ｍ以下、さらに好ましくは１Ｍ以上８Ｍ以下である。
【００２４】
前記カオトロピック剤は、１つ以上の界面活性剤、還元剤、キレート剤と組み合わせてもよい、
【００２５】
前記カオトロピック剤は、ＰＣＲの阻害剤としても知られる。そのため、前記カオトロピック剤の中でも、タンパク質の変性に必要な濃度とＰＣＲへの持込み許容濃度の相違が小さいものが選択することで、カオトロピック剤、試料、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液と順次添加することで、キャプシドタンパク質の変性から１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応まで同一容器で、途中で容器を開閉することなく簡便に検出操作が進められる。このようなカオトロピック剤の例としては尿素が挙げられる。例えば、８Ｍの尿素２．５μｌと試料１μｌを混合し、１ステップＲＴ−ＰＣＲ液４６．５ｕＬを加えた場合、反応液中に持ち込まれる尿素は０．４Ｍである。０．４Ｍ尿素はＲＴ−ＰＣＲ液の持ち込まれても許容される濃度である。一方、同様の操作液量で１Ｍグアニジンチオシアン酸塩を使用した場合、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応に５０ｍＭのグアニジンチオシアン酸塩が持ち込まれる。この結果、ＲＴ−ＰＣＲ反応を阻害してしまうため、グアニジンチオシアン酸塩と試料の混合液の一部移し替えが必要となり、操作性が低下する。
【００２６】
前記混合液に添加される１ステップＲＴ−ＰＣＲ溶液は、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。逆転写酵素活性を合わせ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどを使用してもよいが、より好ましくは、二酵素、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素の使用である。
【００２７】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。
【００２８】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。より好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。さらに、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
【００２９】
本発明に用いられる１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０〜２００ｍＭ，より好ましくは２０〜１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが加えられる。
【００３１】
本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１〜１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。
【００３２】
さらに１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤としては、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことが望ましい。
【００３３】
前記ベタイン様４級アンモニウム塩としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、Ｌ−カルニチンなどが挙げられるが、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩であれば、特に限定されるものではない。ベタイン様４級アンモニウム塩が有する構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすものと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム塩濃度は０．１Ｍ〜２Ｍであり、より好ましくは０．２Ｍ〜１．２Ｍである。
【００３４】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンとしては、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｇ以上で、良好な検出が可能となる。
【００３５】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるゼラチンは、ウシや豚などの動物の皮膚や骨、腱、あるいは魚の鱗や皮に由来し、ＰＣＲ酵素の安定化に寄与すると考えられている。使用濃度としては、ＰＣＲ増幅を安定化する一方で、蛍光検出を妨げない程度が好ましい。好ましくは１〜５％、さらに好ましくは１〜２％である。特にゼラチンの由来については限定されるものではないが、ウシや豚由来よりも魚由来のものの方が、ゼリー強度が低く、反応液のハンドリングがよい点で好ましい。
【００３６】
さらには、当該分野で知られるＲＴ−ＰＣＲを促進するような物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、トリトンＸ−１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでもよい。
【００３７】
本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明でエンベロープを持たないウイルスの１種であるノロウイルスを検出する場合、プライマー対の例としてはノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマーが挙げられるが、これに限るものではない。
【００３８】
本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。
【００３９】
２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。
【００４０】
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列が挙げられるが、これに限るものではない。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。
【００４１】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットであって、カオトロピック剤、及び逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液、を含むことを特徴とするエンベロープを持たないウイルスの検査用キットである。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応におけるカオトロピック剤持込み許容量の検討
（１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２）に示すグアニジンチオシアン酸塩、尿素の影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
１％  ゼラチン
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２）カオトロピック剤
条件１  カオトロピック剤なし
条件２  １６０ｍＭグアニジンチオシアン酸塩
条件３  ８０ｍＭグアニジンチオシアン酸塩
条件４  ４０ｍＭグアニジンチオシアン酸塩
条件５  ２０ｍＭグアニジンチオシアン酸塩
条件６  １０ｍＭグアニジンチオシアン酸塩
条件７  カオトロピック剤なし
条件８  １６０ｍＭ尿素
条件９  ３２０ｍＭ尿素
条件１０  ４８０ｍＭ尿素
条件１１  ６４０ｍＭ尿素
条件１２  ８００ｍＭ尿素
条件１３  ９６０ｍＭ尿素
条件１４  １１２０ｍＭ尿素
条件１５  １２８０ｍＭ尿素
（３）反応
前記反応液４９μlにノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡを１２５０コピー、２５０コピー、５０コピー（Ｎ＝２）、２５コピー（Ｎ＝２）を添加した。これをＢｉｏＲａｄ社ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ  ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの６０℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。
４２℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  ２０秒、
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ１、Ｇ２  ＲＮＡのＣｑ値を表１、２に示す。この結果、グアニジンチオシアン酸塩は８０ｍＭ以上ではＲＴ−ＰＣＲ反応を完全に阻害してしまう。グアニジンチオシアン酸塩の持込み許容量としては４０ｍＭまで、より好ましくは２０ｍＭ程度であった。尿素については９６０ｍＭ以上でＲＮＡ２５コピーが検出できなかった。尿素の持込み許容量としては８００ｍＭ、より好ましくは６４０ｍＭ、さらに好ましくは４８０ｍＭであった。
【００４４】
【表１】
2017209036.tif 000002
【００４５】
【表２】
2017209036.tif 000003
【００４６】
実施例２．試料をグアニジンチオシアン酸塩とを混合する効果
（１）試料の調製方法
ノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便４検体ａ８、ｂ５、ｄ６、ｄ７を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）グアニジンチオシアン酸塩との混合方法
条件１  試料ａ８、ｂ５０．５μＬ
条件２  ２Ｍグアニジンチオシアン酸塩０．５μＬと試料ａ８、ｂ５  ０．５μＬ
条件３  ０．４Ｍグアニジンチオシアン酸塩２．５μＬと試料ａ８、ｂ５  ０．５μＬ
条件４  ０．２８５Ｍグアニジンチオシアン酸塩３．５μＬと試料ａ８、ｂ５  ０．５μＬ
条件５  ０．２２２Ｍグアニジンチオシアン酸塩４．５μＬと試料ａ８、ｂ５  ０．５μＬ
条件６  ０．１０５Ｍグアニジンチオシアン酸塩９．５μＬと試料ａ８、ｂ５  ０．５μＬ
条件７  試料ｄ６、ｄ７  １μＬ
条件８  ０．６２５Ｍグアニジンチオシアン酸塩２μＬと試料ｄ６、ｄ７  １μＬ
条件９  ０．５Ｍグアニジンチオシアン酸塩２μＬと試料ｄ６、ｄ７  １μＬ
条件１０  ０．５Ｍグアニジンチオシアン酸塩２．５μＬと試料ｄ６、ｄ７  １μＬ
条件１１  ２Ｍグアニジンチオシアン酸塩０．５μＬと試料ｄ６、ｄ７  １μＬ
（３）反応液
前記混合液に下記反応液５０μｌを加えた。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
１％  ゼラチン
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（４）反応
ＢｉｏＲａｄ社ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ  ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの６０℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。
４２℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  ２０秒、
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
（５）結果
この結果、各試料のＧ２シグナルのＣｑ値を表３に示す。試料によって有効濃度は異なるが、試料とグアニジンチオシアン酸塩混合液のグアニジンチオシアン酸塩濃度が０．３３Ｍ以上、さらに好ましくは０．６Ｍ以上で、混合しなかった条件に比べ、有意な検出感度の改善が認められた。この際、ＲＴ−ＰＣＲ反応液中へのグアニジンチオシアン酸塩含有濃度は２０〜２５ｍＭである。
【００４７】
【表３】
2017209036.tif 000004
【００４８】
実施例３．試料を尿素とを混合する効果
（１）試料の調製方法
ノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便各４検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）尿素との混合方法
条件１  ２Ｍグアニジンチオシアン酸塩０．５μＬと試料０．５μＬ
条件２  ８Ｍ尿素２．５μＬと試料０．５μＬ
条件３  ３．１２５Ｍ尿素２μＬと試料０．５μＬ
条件４  １Ｍ尿素２μＬと試料０．５μＬ
条件５  ０．７５Ｍ尿素２μＬと試料０．５μＬ
条件６  ０．５Ｍ尿素２μＬと試料０．５μＬ
条件７  試料０．５μｌ
条件８  ８Ｍ尿素２．５μＬと試料１μＬ
条件９  ７Ｍ尿素２．５μＬと試料１μＬ
条件１０  ６．４Ｍ尿素２．５μＬと試料１μＬ
条件１１  ６Ｍ尿素２．５μＬと試料１μＬ
条件１２  試料１μＬ
（３）反応液
前記混合液に下記反応液５０μｌを加えた。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
１％  ゼラチン
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（４）反応
ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ  ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの６０℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。
４２℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  ２０秒、
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
（５）結果
この結果、各試料のＧ２シグナルのＣｑ値を表４に示す。試料によって有効濃度は異なるが、試料と尿素混合液の尿素濃度が２．５Ｍ以上、より好ましくは４．３Ｍ以上で、混合しなかった条件に比べ、有意な検出感度の改善が認められた。この際、ＲＴ−ＰＣＲ反応液中への尿素含有濃度は０．４Ｍ以下である。
【００４９】
【表４】
2017209036.tif 000005
【００５０】
実施例４．カオロトピック法と従来型熱処理法の比較
（１）試料
ノロウイルス陽性のヒト糞便８検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）カオトロピック法による検出
８Ｍ尿素と各試料上清１μＬを混合後、下記反応液５０μｌを加え、ＢｉｏＲａｄ社ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ  ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（２）−１  反応液
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
１％  ゼラチン
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２）−２  反応サイクル
後半３０サイクルの６０℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。
４２℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  ２０秒、
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃  １秒−５６℃  ３０秒−６０℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
（３）熱処理法による検出
検出試薬として、ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）を使用した。各試料１μＬにキット添付の前処理液を添加し、８５℃、１分間の熱処理を実施した。キット添付の反応液、酵素液、プライマー液、プローブ液を混合後、各サンプルに４５μＬずつ添加し、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
反応サイクル
後半３０サイクルの６０℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。
４２℃  ５分（逆転写反応）、
９５℃  ３０秒、
９５℃  ５秒−５６℃  ６０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃  ５秒−５６℃  ６０秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、蛍光シグナルの上昇が認められた蛍光色素とＣｑ値、型別判定結果を表５に示す。熱処理を実施しない本発明の方法で、熱処理を行う従来方法と同様の結果が得られた。
【００５１】
【表５】
2017209036.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。