(57)【要約】【課題】デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で精度よく解析することができるアミノ酸配列解析方法及びアミノ酸配列解析システムを提供する。【解決手段】組成分析部２が、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う。質量分析部３が、組成分析部２における組成分析の対象と同一のペプチド試料に対して質量分析を行う。配列決定部４が、組成分析部２により得られたアミノ酸の組成情報と、質量分析部３により得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う組成分析ステップと、
前記組成分析ステップにおける組成分析の対象と同一のペプチド試料に対して質量分析を行う質量分析ステップと、
前記組成分析ステップにより得られたアミノ酸の組成情報と、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する配列決定ステップとを含むことを特徴とするアミノ酸配列解析方法。
【請求項２】
前記質量分析ステップでは、前記組成分析ステップにより組成分析が行われた後のペプチド試料に対して質量分析を行うことを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項３】
前記質量分析ステップでは、ペプチド試料をイオン化することにより得られるイオンを開裂させてＭＳｎ分析（ｎは１以上の整数）を行うことにより、ペプチド試料に対する質量分析を行うことを特徴とする請求項２に記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項４】
消化酵素を用いてタンパク質試料を消化することにより複数のペプチド試料に断片化するペプチド断片化ステップと、
前記ペプチド断片化ステップにより断片化された複数のペプチド試料を分離するペプチド分離ステップとをさらに含み、
前記組成分析ステップでは、前記ペプチド分離ステップにより分離されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行い、
前記質量分析ステップでは、前記ペプチド分離ステップにより分離されたペプチド試料に対して質量分析を行うことを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項５】
前記配列決定ステップは、
前記組成分析ステップにより得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルに基づいて、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節として各階層の節を枝で対応付けた木構造を作成する分枝ステップと、
前記分枝ステップにより決定された各節について、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルから求められるピーク強度スコアに基づいて、アミノ酸の組成情報を考慮することなくピーク強度スコアが最大値となる節の組み合わせを算出することにより、アミノ酸配列の候補を選定する配列候補選定ステップとを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項６】
前記配列決定ステップは、
前記組成分析ステップにより得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルに基づいて、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節として、質量スペクトルから求められる各節のピーク強度スコアに応じて各階層の節を枝で対応付けた木構造を作成する分枝ステップと、
アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のピーク強度スコアのスコア最大値の和を上界値として算出することにより、当該上界値と暫定解のスコアとの比較に基づいてアミノ酸配列の候補を選定する配列候補選定ステップとを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項７】
各階層のピーク強度スコアのスコア最大値は、特定のアミノ酸に対応する節のピーク強度スコアにボーナススコアを加算することにより求められることを特徴とする請求項６に記載のアミノ酸配列解析方法。
【請求項８】
ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う組成分析部と、
前記組成分析部における組成分析の対象と同一のペプチド試料に対して質量分析を行う質量分析部と、
前記組成分析部により得られたアミノ酸の組成情報と、前記質量分析部により得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する配列決定部とを備えたことを特徴とするアミノ酸配列解析システム。
【請求項９】
前記質量分析部は、前記組成分析部により組成分析が行われた後のペプチド試料に対して質量分析を行うことを特徴とする請求項８に記載のアミノ酸配列解析システム。
【請求項１０】
前記質量分析部は、ペプチド試料をイオン化することにより得られるイオンを開裂させてＭＳｎ分析（ｎは１以上の整数）を行うことにより、ペプチド試料に対する質量分析を行うことを特徴とする請求項９に記載のアミノ酸配列解析システム。
【請求項１１】
消化酵素を用いてタンパク質試料を消化することにより複数のペプチド試料に断片化するペプチド断片化部と、
前記ペプチド断片化部により断片化された複数のペプチド試料を分離するペプチド分離部とをさらに備え、
前記組成分析部は、前記ペプチド分離部により分離されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行い、
前記質量分析部は、前記ペプチド分離部により分離されたペプチド試料に対して質量分析を行うことを特徴とする請求項８に記載のアミノ酸配列解析システム。
【請求項１２】
前記配列決定部は、
前記組成分析部により得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析部により得られた質量スペクトルに基づいて、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節として各階層の節を枝で対応付けた木構造を作成する分枝処理部と、
前記分枝処理部により決定された各節について、前記質量分析部により得られた質量スペクトルから求められるピーク強度スコアに基づいて、アミノ酸の組成情報を考慮することなくピーク強度スコアが最大値となる節の組み合わせを算出することにより、アミノ酸配列の候補を選定する配列候補選定部とを含むことを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列解析システム。
【請求項１３】
前記配列決定部は、
前記組成分析部により得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析部により得られた質量スペクトルに基づいて、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節として、質量スペクトルから求められる各節のピーク強度スコアに応じて各階層の節を枝で対応付けた木構造を作成する分枝処理部と、
アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のピーク強度スコアのスコア最大値の和を上界値として算出することにより、当該上界値と暫定解のスコアとの比較に基づいてアミノ酸配列の候補を選定する配列候補選定部とを含むことを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列解析システム。
【請求項１４】
各階層のピーク強度スコアのスコア最大値は、特定のアミノ酸に対応する節のピーク強度スコアにボーナススコアを加算することにより求められることを特徴とする請求項１３に記載のアミノ酸配列解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を解析するアミノ酸配列解析方法及びアミノ酸配列解析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質やペプチドの構造及び機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質やペプチドの解析方法として、質量分析を用いた方法が広く用いられるようになってきている。質量分析を用いてタンパク質やペプチドのアミノ酸配列を解析する場合には、データベース検索法を用いるのが一般的である。
【０００３】
しかしながら、データベース検索法では、データベースに格納されていないアミノ酸配列を決定することができない。したがって、例えば抗体の可変領域などのように一般的な配列とは異なるアミノ酸配列は、データベース検索法を用いて決定することができないという問題がある。
【０００４】
このような場合には、例えばデノボシーケンシング法（de novo sequencing）と呼ばれる方法が用いられる。デノボシーケンシング法は、核酸の配列決定に用いられるサンガー法と同様、長さが１残基違いの配列を多種類生成し、当該配列のイオンピーク間の質量電荷比（ｍ／ｚ）の差がアミノ酸残基の質量電荷比（ｍ／ｚ）に相当することを利用して、アミノ酸配列を推定する方法である。
【０００５】
デノボシーケンシング法は、通常、人間が経験に基づいてアミノ酸配列を推定することにより行われる。このデノボシーケンシング法を自動で行う場合には、可能性のあるアミノ酸配列を総当りで確認するアルゴリズムが必要となる。
【０００６】
図６は、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を推定する方法について説明するための質量スペクトルの一例を示した図である。この図６には、あるペプチド試料のアミノ酸配列をデノボシーケンシング法により推定した結果が質量スペクトルに重ねて示されている。
【０００７】
この例は、Ｃ末端側が同一のアミノ酸で終了した複数のイオンを基に推定した結果である。そのため、より長くて重いペプチド断片、すなわちアミノ酸残基の数がより多いペプチド断片は、質量電荷比（ｍ／ｚ）が大きく、質量スペクトルの右側に現れる。この例では、右側から Ｈ（ヒスチジン）、Ｅ（グルタミン酸）というアミノ酸が推定されている。これは、ピーク間の質量電荷比（ｍ／ｚ）の差がＮ末端側についたアミノ酸の質量電荷比（ｍ／ｚ）の差であるため、このペプチド試料はＨＥで始まっていると推定されたことになる。それよりもＣ末端側、すなわち質量スペクトル上の左側については、図中に示したように、 Ｓ（セリン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｔ（トレオニン）、Ｇ（グリシン）、Ｖ（バリン）、Ｃ（システイン）、Ａ（アラニン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｐ（フェニルアラニン）、Ｑ（グルタミン）、Ｋ（リシン）などのアミノ酸を組み合わせた６つのアミノ酸配列のバリエーションが考えられる。デノボシーケンシング法を自動で行う場合には、このような複数のバリエーションについて、どのアミノ酸配列が最も妥当な結果であるかを総当りで確認する必要がある。
【０００８】
上記のようなアミノ酸配列の総当りの確認方法としては、例えばプロダクトイオンの質量から可能性のあるアミノ酸配列を全て生成する方法や、配列タグを決定した上で、それを延長していく方法など、シンプルなアイデアに基づく方法が知られている。また、機械学習又は確率モデルを用いた方法としては、例えばトレーニングデータを用いて質量スペクトルの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を構築しておき、これを用いて質量スペクトルのスコア付けを行う方法や、ベイズ推定によってアミノ酸配列の候補を生成する方法などがある。
【０００９】
比較的多用される方法としては、グラフ理論を用いた手法がある。このカテゴリの手法では、アミノ酸配列の決定が有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）上での最長経路問題として定式化される。この場合の最長経路の決定には、通常、動的計画法（dynamic programing）が用いられる（例えば下記特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１４５２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような方法でアミノ酸配列を総当りで確認する場合、いくつかの問題が存在することが知られており、これらは例えば以下の３つのように大別できる。
【００１２】
１つ目の問題は、質量スペクトル中のどのピークがペプチド試料由来のもので、どのピークが夾雑物由来などによるノイズであるかの判定が難しいということである。図６の例では、最も大きい１価イオンピーク（ｍ／ｚ＝１１０９．５）は非常に大きく明確であるため、問題なく認識されている。また、ｍ／ｚ＝８４３．４の１価イオンピークも同様に大きいため、問題なく認識されている。これらのピーク間の差分ｍ／ｚ＝２６６．１に該当するアミノ酸として判定されたのがＥ（グルタミン酸）及びＨ（ヒスチジン）の組み合わせであり、図示された順番に該当するピークが見つかっているため、当該差分に該当するアミノ酸配列が質量スペクトル上の左側から順にＥ（グルタミン酸）、Ｈ（ヒスチジン）とアサインされている。この部分については、ピークが充分に大きく、紛らわしいピークも測定されていないため、他の配列候補は挙がっていない。
【００１３】
しかしながら、図６の質量スペクトルにおけるさらに左側、すなわちペプチド試料のさらにＣ末端側の部分については、ピークが小さいため、上述したピークほど明確にアミノ酸配列を判定することは不可能である。そのため、複数種類のアミノ酸を組み合わせた複数（図６の例では６つ）のアミノ酸配列のバリエーションが挙げられている。この部分には、充分に大きいピークが存在しておらず、該当するアミノ酸が見つけられないために採用されなかったｍ／ｚ＝１０９１．５のピークよりも小さいピークしか存在していない。そのため、どのピークを用いてアミノ酸配列を判定するべきか明確な基準が得られず、アミノ酸に対応するピークの組み合わせが複数考えられる結果、推定されるアミノ酸配列を一意的に絞り込むことができない。
【００１４】
２つ目の問題は、質量分析計の分解能以下の僅差しか質量差を持たないような、数個程度のアミノ酸からなるペプチド（オリゴペプチド）の組み合わせが多数推定されるということである。すなわち、質量分析計によって質量スペクトルを測定しても、その質量スペクトルのピーク間の差分ｍ／ｚに該当する短いペプチドには、アミノ酸配列の候補が複数存在する。
【００１５】
図６の例では、６つのアミノ酸配列のバリエーションが挙げられている部分において、上から３番目のアミノ酸配列と最も下のアミノ酸配列とを比較すると、同じ２つのピーク間にアサイン可能なアミノ酸の候補として、Ｑ（グルタミン）、Ｋ（リシン）、又は、Ａ（アラニン）及びＧ（グリシン）の組み合わせが考えられる。これらのアミノ酸の質量は非常に近接しているため、翻訳後修飾を考慮するとさらに区別しにくくなることが予想される。
【００１６】
このように、計算機に自動でデノボシーケンシング法を行わせようとすると、アミノ酸配列の候補が複数挙げられることが多く、それらの候補の中からいずれが最適であるかを確認する必要がある。そのために、上述したような動的計画法を用いることが考えられるが、ここに３つ目の問題がある。
【００１７】
すなわち、例えばＢＬＡＳＴのような相同性検索で用いられるＢＬＯＳＵＭ又はＰＡＭなどの置換マトリックスに相当する評価関数、すなわち推定解が適切であるか否かを判断するための最適な評価関数が、質量分析の分野ではまだ存在していないという問題がある。そのため、アルゴリズムを実行することにより得られた最適解が正解となる保証がない。この結果、例えば最適解のみを求める動的計画法では、本来ならば正解であるはずのアミノ酸配列が、アルゴリズムの実行途中で候補から外されてしまう可能性がある。
【００１８】
このような問題を避けるためには、例えばアミノ酸配列の全ての候補を保存して順位付けし、最後に検討を加えることが望ましい。しかしながら、候補となるアミノ酸配列の数は実用的な時間で適切な結果を得られないほど膨大となるため、デノボシーケンシング法では、高い正答率でアミノ酸配列を解析できないのが実情である。
【００１９】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で精度よく解析することができるアミノ酸配列解析方法及びアミノ酸配列解析システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（１）本発明に係るアミノ酸配列解析方法は、組成分析ステップと、質量分析ステップと、配列決定ステップとを含む。前記組成分析ステップでは、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う。前記質量分析ステップでは、前記組成分析ステップにおける組成分析の対象と同一のペプチド試料に対して質量分析を行う。前記配列決定ステップでは、前記組成分析ステップにより得られたアミノ酸の組成情報と、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する。
【００２１】
このような構成によれば、同一のペプチド試料に対してアミノ酸の組成分析及び質量分析が行われ、それにより得られたアミノ酸の組成情報及び質量スペクトルに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列が決定される。従来の方法では、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の種類及び数が判らない状態でアミノ酸配列を解析していたが、本発明によれば、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の種類及び数は判った状態で、それらのアミノ酸の並び方だけをデノボシーケンシング法により決定すればよい。
【００２２】
これにより、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で解析する場合であっても、アミノ酸配列の候補の数を飛躍的に減少させることができる。その結果、本来ならば正解であるはずのアミノ酸配列が、アルゴリズムの実行途中で候補から外されてしまうのを効果的に防止することができるため、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で精度よく解析することができる。
【００２３】
（２）前記質量分析ステップでは、前記組成分析ステップにより組成分析が行われた後のペプチド試料に対して質量分析を行ってもよい。
【００２４】
このような構成によれば、組成分析に用いられたペプチド試料が、そのまま質量分析に用いられるため、ペプチド試料を組成分析用と質量分析用とに分ける必要がない。例えば、ペプチド試料に対する組成分析を行う際に、配列非特異的な消化酵素を用いるなどしてペプチド試料のペプチド結合を切断した場合には、組成分析により得られたペプチド断片を用いて質量分析が行われるため、質量分析においてペプチド試料のペプチド結合を切断する工程を簡略化することができる。
【００２５】
（３）前記質量分析ステップでは、ペプチド試料をイオン化することにより得られるイオンを開裂させてＭＳｎ分析（ｎは１以上の整数）を行うことにより、ペプチド試料に対する質量分析を行ってもよい。
【００２６】
このような構成によれば、組成分析により得られたペプチド断片をイオン化し、そのイオンを開裂させてＭＳｎ分析を行うことにより、ペプチド試料に対する質量分析を行うことができる。ＭＳｎ分析の開始時に既にペプチド試料からペプチド断片が得られているため、ＭＳ１分析を実質的にＭＳ２分析として機能させることができ、ＭＳｎ分析を簡略化することができる。
【００２７】
（４）前記アミノ酸配列解析方法は、ペプチド断片化ステップと、ペプチド分離ステップとをさらに含んでいてもよい。前記ペプチド断片化ステップでは、消化酵素を用いてタンパク質試料を消化することにより複数のペプチド試料に断片化する。前記ペプチド分離ステップでは、前記ペプチド断片化ステップにより断片化された複数のペプチド試料を分離する。この場合、前記組成分析ステップでは、前記ペプチド分離ステップにより分離されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行ってもよい。また、前記質量分析ステップでは、前記ペプチド分離ステップにより分離されたペプチド試料に対して質量分析を行ってもよい。
【００２８】
このような構成によれば、タンパク質試料から断片化されて分離されたペプチド試料に対して、アミノ酸の組成分析及び質量分析が行われ、それにより得られたアミノ酸の組成情報及び質量スペクトルに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列が決定される。これにより、例えば抗体医薬として用いる予定の抗体などのタンパク質試料に対して本発明を応用することができる。
【００２９】
（５）前記配列決定ステップは、分枝ステップと、配列候補選定ステップとを含んでいてもよい。前記分枝ステップでは、まず、前記組成分析ステップにより得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルに基づいて、Ｎ末端を持つ部分的なアミノ酸組成又は配列を節として作成する。次に、各節をアミノ酸残基数に応じて階層化し、隣接する階層上の節の間を枝で対応付けた木構造を作成する。節（部分配列）から算出されるプロダクトイオン質量に相当するイオンピークを、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルより検出し、検出されたイオンピーク強度の和を節の値とする。ここで、各節はＮ末端を持つとしたが、Ｃ末端を持つものとしても良い。このように前記分枝ステップにおいて木構造を作成した場合、前記配列候補選定ステップでは、木構造を深さ方向優先により探索し、探索経路上の節の値をもとに算出したピーク強度スコアが最大値となる節の組み合わせを算出することにより、アミノ酸配列の候補を選定してもよい。
【００３０】
このような構成によれば、アミノ酸の組成情報を考慮することなく、例えば線形計画問題としてペプチド試料のアミノ酸配列の候補を選定することができる。これにより、アミノ酸の組成情報を考慮しながらアミノ酸配列の候補を選定する場合と比べて、極めて短時間でアミノ酸配列を解析することができる。
【００３１】
（６）あるいは、前記分枝ステップにおいて各階層のピーク強度スコアのスコア最大値を求め、前記スコア最大値の高い階層から順に上から下へと階層を並べ、さらに各階層において節をピーク強度スコアの大きい順に左から右へと並べて木構造を作成してもよい。この場合、前記配列候補選定ステップでは、アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のスコア最大値の和を上界値として算出することにより、当該上界値と暫定解のスコアとの比較に基づいて探索経路を限定し、アミノ酸配列の候補を選定してもよい。
【００３２】
このような構成によれば、アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のスコア最大値の和を上界値として算出することによって、ペプチド試料のアミノ酸配列の候補を選定することができる。この場合、アミノ酸の組成情報を考慮しながらアミノ酸配列の候補を選定する場合と比べて、極めて短時間でアミノ酸配列を解析することができるとともに、線形計画問題としてアミノ酸配列の候補を選定する場合よりも精度よくアミノ酸配列を解析することができる。
【００３３】
（７）この場合、各階層のピーク強度スコアのスコア最大値は、特定のアミノ酸に対応する節のピーク強度スコアにボーナススコアを加算することにより求められてもよい。
【００３４】
このような構成によれば、各階層のピーク強度スコアのスコア最大値を求める際に、より適正な値を算出することができるため、より精度よくアミノ酸配列を解析することができる。
【００３５】
（８）本発明に係るアミノ酸配列解析システムは、組成分析部と、質量分析部と、配列決定部とを備える。前記組成分析部は、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う。前記質量分析部は、前記組成分析部における組成分析の対象と同一のペプチド試料に対して質量分析を行う。前記配列決定部は、前記組成分析部により得られたアミノ酸の組成情報と、前記質量分析部により得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する。
【００３６】
（９）前記質量分析部は、前記組成分析部により組成分析が行われた後のペプチド試料に対して質量分析を行ってもよい。
【００３７】
（１０）前記質量分析部は、ペプチド試料をイオン化することにより得られるイオンを開裂させてＭＳｎ分析（ｎは１以上の整数）を行うことにより、ペプチド試料に対する質量分析を行ってもよい。
【００３８】
（１１）前記アミノ酸配列解析システムは、ペプチド断片化部と、ペプチド分離部とをさらに備えていてもよい。前記ペプチド断片化部は、消化酵素を用いてタンパク質試料を消化することにより複数のペプチド試料に断片化する。前記ペプチド分離部は、前記ペプチド断片化部により断片化された複数のペプチド試料を分離する。この場合、前記組成分析部は、前記ペプチド分離部により分離されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行ってもよい。また、前記質量分析部は、前記ペプチド分離部により分離されたペプチド試料に対して質量分析を行ってもよい。
【００３９】
（１２）前記配列決定部は、分枝処理部と、配列候補選定部とを含んでいてもよい。前記分枝処理部は、前記組成分析部により得られたアミノ酸の組成情報、及び、前記質量分析部により得られた質量スペクトルに基づいて、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節として各階層の節を枝で対応付けた木構造を作成する。この場合、前記配列候補選定部は、前記分枝処理部により決定された各節について、前記質量分析部により得られた質量スペクトルから求められるピーク強度スコアに基づいて、アミノ酸の組成情報を考慮することなくピーク強度スコアが最大値となる節の組み合わせを算出することにより、アミノ酸配列の候補を選定してもよい。
【００４０】
（１３）あるいは、前記分枝処理部において各階層のピーク強度スコアのスコア最大値を求め、前記スコア最大値の高い階層から順に上から下へと階層を並べ、さらに各階層において節をスコアの大きい順に左から右へと並べて木構造を作成してもよい。この場合、前記配列候補選定部では、アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のスコア最大値の和を上界値として算出することにより、当該上界値と暫定解のスコアとの比較に基づいて探索経路を限定し、アミノ酸配列の候補を選定してもよい。
【００４１】
（１４）この場合、各階層のピーク強度スコアのスコア最大値は、特定のアミノ酸に対応する節のピーク強度スコアにボーナススコアを加算することにより求められてもよい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、アミノ酸配列の候補の数を飛躍的に減少させることができる結果、本来ならば正解であるはずのアミノ酸配列が、アルゴリズムの実行途中で候補から外されてしまうのを効果的に防止することができるため、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で精度よく解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の第１実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。
【図２】配列決定部の構成例を示したブロック図である。
【図３】木構造の探索経路の一例を示す図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。
【図５】本発明の第３実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。
【図６】デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を推定する方法について説明するための質量スペクトルの一例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
＜第１実施形態＞
１．第１実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成
図１は、本発明の第１実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。このアミノ酸配列解析システムは、分析対象となる試料（ペプチド試料）のアミノ酸配列を自動で解析するためのものであり、試料投入部１、組成分析部２、質量分析部３、配列決定部４及び出力部５などを備えている。図１では、試料の流れを破線、電気信号の流れを実線で示している。
【００４５】
試料投入部１は、ペプチド試料を分割し、その一部を組成分析部２に投入するとともに、他の一部を質量分析部３に投入する。すなわち、組成分析部２及び質量分析部３には、それぞれ同一のペプチド試料が投入される。
【００４６】
組成分析部２は、試料投入部１から投入されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う（組成分析ステップ）。組成分析部２によるアミノ酸の組成分析の方法としては、特に限定されるものではなく、公知のアルゴリズムを用いた任意の方法を採用することができる。
【００４７】
質量分析部３は、試料投入部１から投入されたペプチド試料に対して質量分析を行う（質量分析ステップ）。質量分析部３による質量分析の方法としては、特に限定されるものではないが、例えばイオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＩＴ−ＴＯＦＭＳ）を用いた方法を採用することができる。この方法を用いた場合には、例えばイオン化部、イオントラップ及びＴＯＦＭＳ（いずれも図示せず）を備えたＩＴ−ＴＯＦＭＳを用いてペプチド試料に対する質量分析が行われる。
【００４８】
具体的には、ペプチド試料はイオン化部においてイオン化され、そのイオンがイオントラップにより捕捉される。イオントラップとしては、例えば三次元四重極型のものを用いることができるが、これに限られるものではない。イオントラップ内には、捕捉したイオンの一部が選択的に残され、そのイオンがＣＩＤ（衝突誘起解離）により開裂される。開裂されたイオンは、イオントラップからＴＯＦＭＳ（飛行時間型質量分析器）に送られる。
【００４９】
ＴＯＦＭＳでは、飛行空間を飛行したイオンが検出器により検出される。具体的には、飛行空間に形成された電場により加速されたイオンが、当該飛行空間を飛行する間に質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて時間的に分離され、検出器により順次検出される。これにより、質量電荷比（ｍ／ｚ）と検出器における検出強度との関係が質量スペクトルとして測定され、質量分析が実現される。
【００５０】
ＩＴ−ＴＯＦＭＳを用いた質量分析では、イオントラップにおいてイオンを開裂させてＴＯＦＭＳで質量分析を行うという一連の動作を繰り返し行うことにより、ＭＳｎ分析（ｎは２以上の整数）を行い、質量スペクトルとしてのＭＳｎスペクトルを測定することができる。
【００５１】
配列決定部４には、組成分析部２により得られたアミノ酸の組成情報と、質量分析部３により得られた質量スペクトルとが入力される。配列決定部４は、これらの情報に基づいて、デノボシーケンシング法（de novo sequencing）によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する（配列決定ステップ）。
【００５２】
配列決定部４により決定されたペプチド試料のアミノ酸配列の情報は、出力部５から出力される。出力部５は、例えば表示装置にアミノ酸配列の情報を出力して、当該情報を表示装置に表示させるような構成であってもよいし、他の装置にアミノ酸配列の情報を出力するような構成であってもよい。
【００５３】
２．配列決定部の構成
図２は、配列決定部４の構成例を示したブロック図である。配列決定部４には、分枝処理部４１及び配列候補選定部４２などが含まれる。
【００５４】
分枝処理部４１は、組成分析部２により得られたアミノ酸組成情報、及び、質量分析部３により得られた質量スペクトルに基づいて、木構造を作成する（分枝ステップ）。具体的には、それぞれ異なる部分的なアミノ酸組成又は配列を節（ノード）として、各節から分岐する複数本の枝を下層に伸ばして多層化することにより、各階層の節が枝で対応付けられた木構造の探索経路が決定される。各節はＮ末端又はＣ末端を持っており、各節をアミノ酸残基数に応じて階層化し、隣接する階層上の節の間を枝で対応付けることにより、木構造が作成される。
【００５５】
このとき、木構造の各節は、少なくとも一部にアミノ酸（残基）が配置され残りが未定であるようなアミノ酸配列とされる。また、木構造の枝には、質量スペクトルから得られるピークリストにおいてアミノ酸の質量電荷比と一致するｂ／ｙ系列イオンのピーク強度の値（ピーク強度スコア）が割り当てられる。
【００５６】
配列候補選定部４２は、分枝処理部４１により決定された木構造の探索経路に基づいて、分析対象であるペプチド試料のアミノ酸配列の候補を選定する（配列候補選定ステップ）。このようにして選定された複数のアミノ酸配列の候補の中から最適なアミノ酸配列が決定される。アミノ酸配列の候補を選定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば特許第５８２１６７０号公報に開示されているような従来法を採用することができる。
【００５７】
ただし、上記のような従来法では、アミノ酸の組成情報を考慮しながら、Ｃ末端側及びＮ末端側から内側に向かってアミノ酸を配置していくことでアミノ酸配列の候補を選定するため、アミノ酸配列の解析に時間がかかるという問題がある。そこで、以下の第１〜第３実施例に示すようなアルゴリズムでアミノ酸配列の候補を選定してもよい。
【００５８】
３．配列候補選定部によるアルゴリズム
（１）実施例１
実施例１では、線形計画問題（0-1線形計画問題）としてペプチド試料のアミノ酸配列の候補を選定する。線形計画問題では、変数が整数であるという制約を外した緩和問題を設定する。一般の線形計画問題には、優れた整数計画ソルバーが開発されているため、それらの整数計画ソルバーを利用することで高速化が期待できる。整数計画ソルバーとしては、例えばｌｐ＿ｓｏｌｖｅ５．５（http://lpsolve.sourceforge.net/5.5/）を利用することができる。
【００５９】
具体的には、木構造の探索経路におけるｉ番目の階層のｊ番目の節をｘｉｊとし、その節を選択するときはｘｉｊ＝１、選択しないときはｘｉｊ＝０として、以下の最適化問題を解く。
【数１】
2017129368.tif 000003
【００６０】
ここで、ｆｉｊはアミノ酸数がｉ個のｊ番目の節のピーク強度スコアである。１番目の制約式は、各階層において１つの節を選択することを示している。２番目の制約式は、実行不可能を表す制約であり、ｘｋｌとｘｍｎは実行不可能な節のペアである。上記実行不可能な場合としては、例えば先祖の経路上のアミノ酸数が少ない節に存在したアミノ酸が存在していない場合、先祖の経路上のアミノ酸数が多い節に存在していないアミノ酸が存在している場合、又は、先祖の経路上の節に帰属されたピークと同一のピークを使用する場合などを例示することができる。
【００６１】
整数計画ソルバーでは、最適解が１つ求まるだけである。したがって、ユーザが指定した数のアミノ酸配列の候補を求める場合には、既に求めた解を制約条件として追加し、整数計画ソルバーによる解を繰り返し求める。すなわち、ｉ番目の階層においてｘ*ｉが１になったとして、以下の制約式を追加する。
【数２】
2017129368.tif 000004
【００６２】
一般の整数計画ソルバーには、特定のアミノ酸に対応する節のピーク強度スコアにボーナススコアを加算したり（条件Ａ）、先祖の枝のピーク番号を参考にして、同じピークの強度を二重に加算しないようにする（条件Ｂ）といった条件を実装することができない。そのため、整数計画ソルバーの解を複数（例えば１００個）求めた後、このような条件に基づくスコアの再計算を行う。
【００６３】
すなわち、上記の通り複数の解を求めるために計算を繰り返し行うが、予め上記条件Ａに対して期待される最大ボーナススコアｓｂｏｎｕｓを求め、整数計画ソルバーの解ｘ*ｋｉｊによるスコアに最大ボーナススコアを加えたスコアが、暫定解の最小スコアＳｍｉｎよりも小さい場合には、繰り返し計算を終了する。すなわち、下記式を満たす場合には、計算が終了する。
【数３】
2017129368.tif 000005
【００６４】
このように、実施例１では、分枝処理部４１により決定された各節について、質量分析部３により得られた質量スペクトルから求められるピーク強度スコアに基づいて、アミノ酸の組成情報を考慮することなくピーク強度スコアが最大値となる節の組み合わせを算出することにより、アミノ酸配列の候補が選定される。このように、アミノ酸の組成情報を考慮することなくペプチド試料のアミノ酸配列の候補を選定することにより、アミノ酸の組成情報を考慮しながらアミノ酸配列の候補を選定する場合（従来法）と比べて、極めて短時間でアミノ酸配列を解析することができる。
【００６５】
（２）実施例２
実施例２では、分岐ステップにおいて各階層のピーク強度スコアの最大値（スコア最大値）を求め、そのスコア最大値が大きい順に最上階層（root）から最下階層（leaf）へ階層を配置する。また、同じ階層では、ピーク強度スコアが大きい順に左から右へ配置する。図３に、木構造の探索経路（探索木）の一例を示す。
【００６６】
このような探索木を、深さ優先で上から下へ探索し、同じ階層では左から右へ探索する。これにより、早い段階で最適解が求まる可能性が高く、さらに緩和問題の上界値が小さくなるため、早い段階で限定操作を行えることが期待できる。
【００６７】
緩和問題としては、アミノ酸の組成情報を考慮することなく、子孫のスコアの上界値を求める。子孫のスコアの上界値は、子孫の各階層のスコア最大値の和とする。緩和問題の上界値が暫定解のスコアより小さい場合には、それ以降の分枝操作を行わない。また、同じ階層の右側の節を全てカットする。
【００６８】
複数（例えば１００個）の解を求めた後は、上記条件Ａのようなボーナススコアを考慮したスコアを再計算する。具体的には、Ｄ（アスパラギン酸）又はＥ（グルタミン酸）のＣ末端側で切断され、かつ、Ｒ（アルギニン）又はＨ（ヒスチジン）を含むｙイオンは、ボーナススコアとして、対応するピーク強度スコアを２回加算する。
【００６９】
このように、実施例２では、アミノ酸の組成情報を考慮することなく各階層のスコア最大値の和を上界値として算出することにより、当該上界値と暫定解のスコアとの比較に基づいて探索経路を限定し、アミノ酸配列の候補が選定される。この場合、アミノ酸の組成情報を考慮しながらアミノ酸配列の候補を選定する場合（従来法）と比べて、極めて短時間でアミノ酸配列を解析することができるとともに、線形計画問題としてアミノ酸配列の候補を選定する場合（実施例１）よりも精度よくアミノ酸配列を解析することができる。
【００７０】
（３）実施例３
実施例３では、実施例２のアルゴリズムに加えて、各階層のピーク強度スコアのスコア最大値を求める際に、ピーク強度スコアに対するボーナススコアが考慮される。すなわち、緩和問題の上界値の計算時に、上記条件Ａのようなボーナススコアが加算される。
【００７１】
これにより、実施例３では、各階層のピーク強度スコアのスコア最大値を求める際に、より適正な値を算出することができるため、より精度よくアミノ酸配列を解析することができる。
【００７２】
（４）解析結果の比較
特許第５８２１６７０号公報に開示されているような従来法、上記の各実施例１〜３に対応する方法、及び、デノボシーケンシグにより解析を行うソフトウェアとして代表的なＰＥＡＫＳをそれぞれ用いて、実際に解析を行った。具体的には、１４個のＡＸＩＭＡ−ＱＩＴデータを使用し、ＭＡＳＣＯＴ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒにより生成したピークリストに対してデノボシーケンシング法を行うことにより、ランク１位の候補配列に含まれる正しい部分配列のアミノ酸数（Ｔｏｐ）と、ランク１０位までで最も長い正しい部分配列のアミノ酸数（Ｂｅｓｔ）を求めた。なお、分析対象であるペプチド試料に含まれるアミノ酸の合計数は１８１個である。
【００７３】
下記表１は、各方法により解析を行った結果を比較するための表であり、各方法により解析した正しい部分配列のアミノ酸数（ＴｏｐとＢｅｓｔ）及び各方法による解析時間（Ｔｉｍｅ）を示している。
【表１】
2017129368.tif 000006
【００７４】
この表１から、実施例１〜３の方法であれば、従来法よりも極めて短時間でアミノ酸配列を解析することができることが分かる。また、実施例１の方法であっても、従来法又はＰＥＡＫＳを用いた場合と同程度の精度でアミノ酸配列を解析できることが分かる。また、実施例２の方法であれば、従来法又はＰＥＡＫＳを用いた場合や実施例１の方法よりも精度よく解析でき、実施例３の方法であれば、さらに精度よく解析できることが分かる。実施例２の方法によれば、最も短時間で解析することができるが、解析の精度も考慮すると実施例３の方法が最も好ましい。
【００７５】
４．第１実施形態の作用効果
本実施形態では、同一のペプチド試料に対して、組成分析部２によるアミノ酸の組成分析及び質量分析部３による質量分析が行われ、それにより得られたアミノ酸の組成情報及び質量スペクトルに基づいて、配列決定部４によりデノボシーケンシング法を用いてペプチド試料のアミノ酸配列が決定される。従来の方法では、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の種類及び数が判らない状態でアミノ酸配列を解析していたが、本実施形態では、組成分析部２においてペプチド試料に含まれるアミノ酸の種類及び数は判った状態で、それらのアミノ酸の並び方だけをデノボシーケンシング法により決定すればよい。
【００７６】
これにより、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で解析する場合であっても、アミノ酸配列の候補の数を飛躍的に減少させることができる。その結果、候補配列数が多すぎるという問題を回避することができ、動的計算法などではなく全ての結果を保持したまま計算を完了させることが可能になる。このため、デノボシーケンシング法を用いてアミノ酸配列を自動で精度よく解析することができる。
【００７７】
＜第２実施形態＞
１．第２実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成
図４は、本発明の第２実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。このアミノ酸配列解析システムは、第１実施形態と同様、分析対象となる試料（ペプチド試料）のアミノ酸配列を自動で解析するためのものであり、試料投入部１、組成分析部２、質量分析部３、配列決定部４及び出力部５などを備えている。図４では、試料の流れを破線、電気信号の流れを実線で示している。
【００７８】
試料投入部１は、組成分析部２にペプチド試料を投入する。組成分析部２は、試料投入部１から投入されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う（組成分析ステップ）。このとき、組成分析部２は、例えば消化酵素を用いてペプチド試料のペプチド結合を切断し、得られたペプチド断片を用いて組成分析を行う。
【００７９】
具体的には、組成分析部２は、特開２０１４−２３０５１６号公報に開示されているような方法を用いて、ペプチド試料の組成分析を行うことができる。すなわち、配列非特異的な消化酵素として、例えばプロテイナーゼＫなどの配列非特異的エンドペプチダーゼを用いてペプチド試料のペプチド結合が切断される。この場合、消化酵素としてトリプシンを用いた場合のように特定のアミノ酸で切断されるのではなく、様々な部位で切断された様々な長さのペプチド断片が生成される。したがって、充分な量のペプチド試料がある場合には、ペプチド試料から生成される多数のペプチド断片には、１残基違いの様々な長さのペプチド断片が含まれていることが期待される。
【００８０】
ペプチド試料から生成された様々な種類のペプチド断片は、例えば液体クロマトグラフなどを用いて分離され、各ペプチド断片に対して質量分析が行われる。これにより得られた各ペプチド断片の質量に基づいて、ペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成が求められる。
【００８１】
質量分析部３は、組成分析部２により組成分析が行われた後のペプチド試料（ペプチド断片）に対して質量分析を行う（質量分析ステップ）。すなわち、組成分析部２における組成分析の対象と同一のペプチド試料が、質量分析部３に導入される。質量分析部３による質量分析の方法としては、特に限定されるものではないが、第１実施形態と同様にＩＴ−ＴＯＦＭＳを用いた方法を採用することができる。
【００８２】
ペプチド試料は、組成分析部２においてペプチド断片に断片化されているため、当該ペプチド断片に対してそのままＭＳ１分析を行えば、ＭＳｎ分析の回数を１回減らしたとしても、核酸の場合のサンガー法と同様のラダー状の配列整列が可能になることが期待される。この場合、質量分析部３は、少なくともＭＳ１分析を行うだけで充分となる可能性がある。すなわち、質量分析部３は、ＭＳｎ分析（ｎは１以上の整数）を行うことにより、質量スペクトルとしてのＭＳｎスペクトルを測定する。
【００８３】
配列決定部４は、組成分析部２により得られたアミノ酸の組成情報と、質量分析部３により得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法（de novo sequencing）によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する（配列決定ステップ）。配列決定部４により決定されたペプチド試料のアミノ酸配列の情報は、出力部５から出力される。配列決定部４及び出力部５については、第１実施形態と同様の構成を採用することができるため、詳細な説明を省略する。
【００８４】
２．第２実施形態の作用効果
本実施形態では、第１実施形態と同様の作用効果に加えて、以下のような作用効果を奏することができる。
【００８５】
すなわち、本実施形態では、組成分析部２による組成分析に用いられたペプチド試料が、そのまま質量分析部３の質量分析に用いられるため、ペプチド試料を組成分析用と質量分析用とに分ける必要がない。上述のように、組成分析部２でペプチド試料に対する組成分析を行う際に、配列非特異的な消化酵素を用いてペプチド試料のペプチド結合を切断した場合には、組成分析により得られたペプチド断片を用いて質量分析部３で質量分析が行われるため、質量分析においてペプチド試料のペプチド結合を切断する工程を簡略化することができる。
【００８６】
特に、本実施形態のように、質量分析部３が、ペプチド試料をイオン化することにより得られるイオンを開裂させてＭＳｎ分析を行うような構成の場合には、ＭＳｎ分析の開始時に既にペプチド試料からペプチド断片が得られている。そのため、ＭＳ１分析を実質的にＭＳ２分析として機能させることができるため、ＭＳｎ分析を簡略化することができる。
【００８７】
＜第３実施形態＞
１．第３実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成
図５は、本発明の第３実施形態に係るアミノ酸配列解析システムの構成例を示したブロック図である。このアミノ酸配列解析システムは、第１実施形態と同様、試料投入部１、組成分析部２、質量分析部３、配列決定部４及び出力部５などを備えているが、これら以外に、ペプチド断片化部６、ペプチド分離部７及びペプチド結合処理部８を備えている。分析対象となる試料はタンパク質試料であり、試料投入部１からはタンパク質試料が投入される。図５では、試料の流れを破線、電気信号の流れを実線で示している。
【００８８】
試料投入部１は、ペプチド断片化部６にタンパク質試料を投入する。ペプチド断片化部６は、例えばタンパク質試料をトリプシン、ＡｓｐＮなどの一種類以上の消化酵素を用いてそれぞれ消化することにより、複数のペプチド試料に断片化する（ペプチド断片化ステップ）。このとき使用される消化酵素は、プロテイナーゼＫなどの配列非特異的エンドペプチダーゼではないため、切断部位のアミノ酸は既知である。
【００８９】
ペプチド分離部７は、ペプチド断片化部６により断片化された複数のペプチド試料を分離する（ペプチド分離ステップ）。具体的には、液体クロマトグラフなどを用いて個々のペプチド試料を分離することができるが、これに限らず、他の方法でペプチド試料を分離するような構成であってもよい。
【００９０】
ペプチド分離部７において分離されたペプチド試料は、その一部が組成分析部２に投入されるとともに、他の一部が質量分析部３に投入される。すなわち、組成分析部２及び質量分析部３には、それぞれ同一のペプチド試料が投入される。
【００９１】
組成分析部２は、ペプチド分離部７により分離されたペプチド試料に含まれるアミノ酸の組成分析を行う（組成分析ステップ）。また、質量分析部３は、ペプチド分離部７により分離されたペプチド試料に対して質量分析を行う（質量分析ステップ）。そして、配列決定部４は、組成分析部２により得られたアミノ酸の組成情報と、質量分析部３により得られた質量スペクトルとに基づいて、デノボシーケンシング法（de novo sequencing）によりペプチド試料のアミノ酸配列を決定する（配列決定ステップ）。これらの組成分析部２、質量分析部３及び配列決定部４については、第１実施形態と同様の構成を採用することができるため、詳細な説明を省略する。
【００９２】
ペプチド結合処理部８は、配列決定部４により決定されたペプチド試料のアミノ酸配列と、上述した既知の切断部位のアミノ酸の情報とに基づいて、ペプチド分離部７により分離された個々のペプチド試料のアミノ酸配列を結合する。これにより、タンパク質試料のアミノ酸配列が決定され、決定されたタンパク質試料のアミノ酸配列の情報が出力部５から出力される。このようなペプチド結合処理部８による処理は、例えば特開２０１４−５２３３１号公報に開示されているような方法を用いて行うことができるが、これに限られるものではない。
【００９３】
２．第３実施形態の作用効果
本実施形態では、第１実施形態と同様の作用効果に加えて、以下のような作用効果を奏することができる。
【００９４】
すなわち、本実施形態では、ペプチド断片化部６によりタンパク質試料から断片化され、ペプチド分離部７により分離されたペプチド試料に対して、組成分析部２によるアミノ酸の組成分析及び質量分析部３による質量分析が行われる。そして、得られたアミノ酸の組成情報及び質量スペクトルに基づいて、配列決定部４によりデノボシーケンシング法を用いてペプチド試料のアミノ酸配列が決定される。これにより、例えば抗体医薬として用いる予定の抗体などのタンパク質試料に対して本発明を応用することができる。
【符号の説明】
【００９５】
１    試料投入部
２    組成分析部
３    質量分析部
４    配列決定部
５    出力部
６    ペプチド断片化部
７    ペプチド分離部
８    ペプチド結合処理部
４１    分枝処理部
４２    配列候補選定部
【図１】
2017129368.tif 000007
【図２】
2017129368.tif 000008
【図３】
2017129368.tif 000009
【図４】
2017129368.tif 000010
【図５】
2017129368.tif 000011
【図６】
2017129368.tif 000012