(57)【要約】【課題】本発明は、体液等の細胞含有試料から表面にＣａＳＲを有する細胞を選択的に分離する細胞分離材を提供することを解決すべき課題とする。【解決手段】本発明が提供する細胞分離材は、基材と前記基材に連結されたアミノグリコシド系抗生物質とを含み、より好ましくは、前記基材と前記抗生物質とはリンカーを介して連結している。本発明はまた前記細胞分離材を用いて細胞を分離する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材に連結されたアミノグリコシド系抗生物質とを含むことを特徴とする細胞分離材。
【請求項２】
前記基材と前記アミノグリコシド系抗生物質とがリンカーを介して連結している、請求項１に記載の細胞分離材。
【請求項３】
前記基材と前記リンカーとが共有結合により連結しており、且つ
前記リンカーと前記アミノグリコシド系抗生物質とが共有結合により連結している、請求項２に記載の細胞分離材。
【請求項４】
前記リンカーが重合体であり、
前記基材が前記重合体の側鎖に連結しており、且つ、
前記アミノグリコシド系抗生物質が前記重合体の側鎖に連結している、請求項２又は３に記載の細胞分離材。
【請求項５】
前記リンカーが、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の細胞分離材。
【請求項６】
前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含み、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２とがランダム共重合している重合体である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の細胞分離材。
【請求項７】
前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位１が式Ｉ：
【化１】
2017112910.tif 000022
（式Ｉ中
Ｒ１１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数であり、
Ｒ１５は、基材に連結した連結基である）
で表される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の細胞分離材。
【請求項８】
前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位２が式ＩＩ：
【化２】
2017112910.tif 000023
（式ＩＩ中
Ｒ２１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２２は、水素、アルキル基、芳香族基、芳香族アルキル基又はカルボキシ基であり、
Ｒ２３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上４以下の整数であり、
Ｒ２５は、アミノグリコシド系抗生物質を含む基である）
で表される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の細胞分離材。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれか１項に記載の細胞分離材の製造方法であって、
基材と、
前記基材に連結可能な連結性基、及び、前記アミノグリコシド系抗生物質と結合を形成可能な反応性基を含むリンカーとを、
前記連結性基を介して連結して基材−リンカー結合体を形成する、リンカー連結工程と、
基材−リンカー結合体における前記反応性基とアミノグリコシド系抗生物質とを反応させ、前記リンカーにアミノグリコシド系抗生物質を結合させて、請求項２〜８のいずれか１項に記載の細胞分離材を形成する、抗生物質結合工程と
を含む方法。
【請求項１０】
前記リンカー連結工程において、前記連結性基と前記基材とが共有結合により連結され、
前記抗生物質結合工程において、前記反応性基と前記アミノグリコシド系抗生物質とが共有結合により連結される
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基材と連結する前の前記リンカーが、前記連結性基及び前記反応性基を側鎖に含む重合体である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材と連結する前の前記リンカーが、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含み、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２とがランダム共重合している重合体である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位１が式Ｉ’：
【化３】
2017112910.tif 000024
（式Ｉ’中
Ｒ１１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数であり、
Ｒ１６は、基材に連結可能な連結性基である）
で表される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位２が式ＩＩ’：
【化４】
2017112910.tif 000025
（式ＩＩ’中
Ｒ２１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２６は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２７は、式ＩＩＩ
【化５】
2017112910.tif 000026
（式ＩＩＩ中、
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上、４以下の整数であり、
Ｒ２８は、前記アミノグリコシド系抗生物質により置換可能な脱離基又は前記アミノグリコシド系抗生物質が有する官能基と結合を形成可能な反応性基であり、
＊は結合を示す）
で表される基であり、
或いは、
Ｒ２６とＲ２７とは一体となって式ＩＶ
【化６】
2017112910.tif 000027
（式ＩＶ中、＊は、結合を示す）
で表される二価の基を形成している）
で表される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の細胞を分離する方法であって、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞分離材と、試料とを接触させて、前記試料中の細胞を前記細胞分離材により捕捉する細胞捕捉工程
を含む方法。
【請求項１７】
分化能を有する細胞を分化誘導する方法であって、
請求項１６に記載の方法より分化能を有する細胞を分離する細胞分離工程と、
前記細胞分離工程で分離された前記細胞を分化誘導する分化誘導工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液等の細胞含有試料から細胞を選択的に分離できる細胞分離材、該細胞分離材の製造方法、並びに、該細胞分離材を使用した細胞の分離方法及び分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液、骨髄等の体液に含まれる細胞を分離し、血管などの組織再生ならびにがん患者の免疫賦活を目的として移植する細胞治療が実用化されるともに治療に有用な細胞を選択的に分離する材料、デバイスが種々開発されている。
【０００３】
細胞を分画する方法として細胞の比重差を利用して分離する比重密度勾配遠心法が知られている。
【０００４】
目的とする細胞の表面に存在するタンパク質に対する抗体を利用して細胞を分離する方法も開発されている。例えば、目的とする細胞の表面タンパク質に特異的な抗体を連結した磁気ビーズを細胞含有試料と接触させ、磁性を利用して磁気ビーズを回収する方法が知られている。
【０００５】
また、細胞分離フィルターを使用して細胞を分離する方法も報告されている（特許文献１〜３）。例えば特許文献３には、不織布フィルターを用いた細胞の分離回収方法において、不織布フィルターの充填密度及び繊維径を規定することにより目的細胞（単球）の捕捉性が向上することが開示されている。
【０００６】
更に、物理的な細胞分離フィルターに化学的な特性を付与する技術も開発されている（特許文献４〜８）。例えば特許文献４には、表面にアミノ基を配置した特定構造の繊維を含む吸着担体により、血液に存在する細胞（特に顆粒球や単球等の活性化した白血球）、がん細胞等を除去することが開示されている。
【０００７】
一方、ヒト単球の表面にはカルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）が発現していることが知られている（非特許文献１）。また、ヒト間葉系幹細胞の表面にもＣａＳＲが発現していることが従来知られている。非特許文献２では、ＣａＳＲのリガンドとして、二価金属イオン、ポリアミン、アミノグリコシド系抗生物質等が報告されており、アミノグリコシド系抗生物質の具体例としてネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン等が挙げられている。
【０００８】
特許文献９では、ポリペプチド系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質等のアミノ基を有する生理活性物質を成形品担体に固定化した、生理活性物質固定化成形品の製造方法が開示されている。ポリペプチド系抗生物質としてはポリミキシンＢが開示されている。特許文献９では抗生物質固定のための基材となる成形品担体として、アミノ基を有する生理活性物質を化学的に固定できる官能基を有するものを用い、該官能基とアミノ基を有する生理活性物質との反応により成形品担体に生理活性物質を固定化することが開示されている。この生理活性物質固定化成形品は、治療用血液浄化剤、抗菌剤、治療用イミノモジュレータ、アフィニティークロマトグラフ用吸着剤等の用途に使用されると記載されている。
【０００９】
特許文献９の出願人はまた、特許文献１０において、特許文献９と同様に、グラム陰性菌に由来する毒素を除去或いは解毒する材料と、グラム陽性菌に由来する毒素を除去或いは解毒する材料とを含む液体処理用カラムを開示している。グラム陰性菌に由来する毒素を除去或いは解毒する材料がポリミキシンＢ或いはポリアミノ化合物を含むこと、グラム陽性菌に由来する毒素を除去或いは解毒する材料が尿素結合を含むことが記載されている。
【００１０】
特許文献１１では、アミノグリコシド系抗生物質等のタンパク質合成を阻害する化学療法剤を固定化した不溶性担体が記載されている。特許文献１１では、化学療法剤（リガンド）と担体との結合方式として、担体結合法等を用いること、担体とリガンドとは直接結合してもよいし、スペーサーを介して結合してもよいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ９８／３２８４０
【特許文献２】特開平９−７５０７６号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９５５０号公報
【特許文献４】特開２００８−８０１１４号公報
【特許文献５】特開昭５８−７４６１１号公報
【特許文献６】特開２００７−５３９５０号公報
【特許文献７】特開２００６−３１２８０４号公報
【特許文献８】特開２００７−３１２７３７号公報
【特許文献９】特開平５−３０５１３９号公報
【特許文献１０】特開平１０−２２５５１５号公報
【特許文献１１】特開平７−１２４２５２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  ｖｏｌ．  ８，  Ｉｓｓｕｅ  １０，  ｅ７４８００，  ２０１３
【非特許文献２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．７６：１１３１−１１４４，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
背景技術の欄で挙げた既存の細胞分離手段は以下の理由から必ずしも満足できるものではない。
【００１４】
比重密度勾配遠心法は、比重が近似した複数種の細胞を分離することはできず、必要に応じて他の細胞分離手段と併用する必要がある。
【００１５】
抗体と磁気ビーズとの複合体を用いた細胞の分離法は、目的細胞を選択的に取得できる点で優れた方法であるが、細胞と抗体との結合力が非常に強いために細胞の回収が容易ではないという問題がある。また、細胞の処理に長時間を要すること、高コストであること、回収した細胞を治療に用いる場合には磁気ビーズが残存するリスクを解消する必要があることなどから十分に満足できるものではない。
【００１６】
特許文献１〜３に記載されている細胞分離フィルターは物理的な濾過フィルターであり、目的細胞を選択的に回収するには適しているとは言えない。
【００１７】
特許文献４〜８では化学的な特性が付加された細胞分離材が各種開示されているが、それぞれ分離対象細胞は限られており、分離対象細胞に応じてなお開発の必要性がある。
【００１８】
単球、間葉系幹細胞等の分化能を有する細胞は再生医療等に応用が期待されている。このため単球、間葉系幹細胞等の分化能を有する細胞を選択的に分離する技術が求められている。単球、間葉系幹細胞等はカルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）を表面に発現していることが知られているが、ＣａＳＲを表面に有する細胞をＣａＳＲ特異的リガンドを用いて選択的に分離する試みは従来なされておらず、細胞の選択的な分離に成功するか否かは不明である。当然ながら、どのようなリガンドがこれらの細胞の選択的な分離に好適であるかも不明であった。
【００１９】
非特許文献２にはＣａＳＲを活性化するアゴニストとしてアミノグリコシド系抗生物質が挙げられているが、アミノグリコシド系抗生物質を、細胞表面にＣａＳＲが発現している細胞の特異的な捕捉に利用することは従来検討されていない。アミノグリコシド系抗生物質がＣａＳＲに対するアゴニストとしての作用するということは、アミノグリコシド系抗生物質とＣａＳＲとの結合能が細胞の捕捉に利用可能であるか否かとは無関係である。また、アミノグリコシド系抗生物質は、細胞膜から細菌細胞内に取り込まれてタンパク質合成系を阻害することが知られており、且つ、非特許文献２に記載されているようにアミノグリコシド系抗生物質は腎毒性(ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)を有することが知られていることから、再生医療等での利用を目的として細胞を分離する目的で抗生物質を利用することは、当業者が容易には着想し得ない。
【００２０】
一方、特許文献９〜１１に記載には抗生物質を固定化した担体が開示されているが、これらの担体は下記の通り細胞の吸着を目的とするものではない。
【００２１】
特許文献９では上記の通りアミノグリコシド系抗生物質等のアミノ基を有する生理活性物質を成形品担体に固定化した、生理活性物質固定化成形品を治療用血液浄化剤として用いることが記載されている。特許文献９における治療用血液浄化剤とは、生理活性物質固定化成形品が有する抗生物質により、治療用血液に含まれ得るエンドトキシンを中和解毒するためのものであり、血液中の細胞を吸着させるものではない。また特許文献９における抗菌剤としての用途もまた、細胞の吸着とは無関係である。特許文献９では、アミノグリコシド系抗生物質を有する生理活性物質固定化成形品により血液を処理した実験例は記載されていない。
【００２２】
特許文献９及び１０の出願人は、自身による上記特許文献４において、特許文献１０の液体処理用カラムを背景技術として引用して、特許文献１０の液体処理用カラムは毒素やサイトカインを吸着するものであり、細胞の吸着は意図していないと記載している。このことから、特許文献１０に記載の液体処理用カラムを、細胞を吸着するために利用することは当業者が容易に想到できることではない。
【００２３】
特許文献１１に開示されているアミノグリコシド系抗生物質等のタンパク質合成を阻害する化学療法剤を固定化した不溶性担体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の負に帯電した生理活性物質を吸着することができると記載されているが、細胞を吸着させることについては一切記載されていない。特許文献１１では、化学療法剤（リガンド）と不溶性担体とをスペーサーを介して結合してもよいと記載されているが、スペーサーの具体的な構造については開示されていない。
【００２４】
上記の通り、単球、間葉系幹細胞等の表面にＣａＳＲを有する細胞を選択的に分離するための細胞分離材は従来提供されていない。細胞分離材により細胞を捕捉し分離し回収しようとする場合、細胞と細胞分離材との適度な結合性（親和性）が必要である。細胞と細胞分離材との結合性が弱すぎる場合は細胞の分離吸着が不十分となり、結合性が強すぎる場合は細胞分離材に捕捉された細胞の回収、脱着が難しくなる。細胞と細胞分離材とが適度な結合性を有する場合には、細胞の回収率を高めることができる。また、細胞分離材による細胞の捕捉及び回収の工程において細胞に対してダメージ（例えば細胞生存率、細胞を用いた治療効果等への悪影響）を与えないことが重要である。表面にＣａＳＲを有する細胞に対しこの要求を満たす細胞分離材は従来提供されていない。
【００２５】
そこで本発明は、細胞含有試料から、表面にＣａＳＲを有する細胞を選択的に分離することができる細胞分離材を提供すること、並びに、該細胞分離材を使用した細胞の分離方法並びに分化誘導方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明者らは、鋭意検討した結果、基材と前記基材に連結されたアミノグリコシド系抗生物質とを含む細胞分離材により、細胞、特に該抗生物質と親和性を示す構造を表面に含む細胞を選択的に分離できること、また、分離された細胞が分化能を有する細胞である場合には分化能が保持されており分化誘導可能であることを見出し、本発明に至った。上記の通りアミノグリコシド系抗生物質を、表面にＣａＳＲを有する細胞の選択的分離に利用可能であることを示唆する従来技術は存在せず、むしろその毒性ゆえにアミノグリコシド系抗生物質を細胞分離のために利用することに阻害要因が存在したことに鑑みれば、本発明は、当業者の予想を超えた格別顕著な発明というべきである。
【００２７】
具体的には、本発明は以下の発明を提供する。
（１）基材と、前記基材に連結されたアミノグリコシド系抗生物質とを含むことを特徴とする細胞分離材。
（２）前記基材と前記アミノグリコシド系抗生物質とがリンカーを介して連結している、（１）に記載の細胞分離材。
（３）前記基材と前記リンカーとが共有結合により連結しており、且つ
前記リンカーと前記アミノグリコシド系抗生物質とが共有結合により連結している、（２）に記載の細胞分離材。
（４）前記リンカーが重合体であり、
前記基材が前記重合体の側鎖に連結しており、且つ、
前記アミノグリコシド系抗生物質が前記重合体の側鎖に連結している、（２）又は（３）に記載の細胞分離材。
（５）前記リンカーが、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体である、（２）〜（４）のいずれかに記載の細胞分離材。
（６）前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含み、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２とがランダム共重合している重合体である、（２）〜（５）のいずれかに記載の細胞分離材。
【００２８】
（７）前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位１が式Ｉ：
【化１】
2017112910.tif 000002
（式Ｉ中
Ｒ１１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数であり、
Ｒ１５は、基材に連結した連結基である）
で表される、（２）〜（６）のいずれかに記載の細胞分離材。
【００２９】
（８）前記リンカーが、
前記基材に連結した連結基を含む繰り返し単位１と、
前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位２が式ＩＩ：
【化２】
2017112910.tif 000003
（式ＩＩ中
Ｒ２１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２２は、水素、アルキル基、芳香族基、芳香族アルキル基又はカルボキシ基であり、
Ｒ２３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上４以下の整数であり、
Ｒ２５は、アミノグリコシド系抗生物質を含む基である）
で表される、（２）〜（７）のいずれかに記載の細胞分離材。
【００３０】
（９）（２）〜（８）のいずれかに記載の細胞分離材の製造方法であって、
基材と、
前記基材に連結可能な連結性基、及び、前記アミノグリコシド系抗生物質と結合を形成可能な反応性基を含むリンカーとを、
前記連結性基を介して連結して基材−リンカー結合体を形成する、リンカー連結工程と、
基材−リンカー結合体における前記反応性基とアミノグリコシド系抗生物質とを反応させ、前記リンカーにアミノグリコシド系抗生物質を結合させて、（２）〜（８）のいずれかに記載の細胞分離材を形成する、抗生物質結合工程と
を含む方法。
（１０）前記リンカー連結工程において、前記連結性基と前記基材とが共有結合により連結され、
前記抗生物質結合工程において、前記反応性基と前記アミノグリコシド系抗生物質とが共有結合により連結される
（９）に記載の方法。
（１１）前記基材と連結する前の前記リンカーが、前記連結性基及び前記反応性基を側鎖に含む重合体である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）前記基材と連結する前の前記リンカーが、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体である、（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含み、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２とがランダム共重合している重合体である、（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００３１】
（１４）前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位１が式Ｉ’：
【化３】
2017112910.tif 000004
（式Ｉ’中
Ｒ１１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数であり、
Ｒ１６は、基材に連結可能な連結性基である）
で表される、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００３２】
（１５）前記基材と連結する前の前記リンカーが、
前記連結性基を含む繰り返し単位１と、
前記反応性基を含む繰り返し単位２と
を含む重合体であり、
前記繰り返し単位２が式ＩＩ’：
【化４】
2017112910.tif 000005
（式ＩＩ’中
Ｒ２１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２６は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２７は、式ＩＩＩ
【化５】
2017112910.tif 000006
（式ＩＩＩ中、
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上、４以下の整数であり、
Ｒ２８は、前記アミノグリコシド系抗生物質により置換可能な脱離基又は前記アミノグリコシド系抗生物質が有する官能基と結合を形成可能な反応性基であり、
＊は結合を示す）
で表される基であり、
或いは、
Ｒ２６とＲ２７とは一体となって式ＩＶ
【化６】
2017112910.tif 000007
（式ＩＶ中、＊は、結合を示す）
で表される二価の基を形成している）
で表される、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
【００３３】
（１６）試料中の細胞を分離する方法であって、
（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞分離材と、試料とを接触させて、前記試料中の細胞を前記細胞分離材により捕捉する細胞捕捉工程
を含む方法。
（１７）分化能を有する細胞を分化誘導する方法であって、
（１６）に記載の方法より分化能を有する細胞を分離する細胞分離工程と、
前記細胞分離工程で分離された前記細胞を分化誘導する分化誘導工程と
を含む方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の細胞分離材は、表面にＣａＳＲを有する細胞を選択的に捕捉することができ、且つ捕捉された細胞の回収が可能であることから、表面にＣａＳＲを有する細胞の選択的な分離が可能である。
【００３５】
本発明の細胞分離材の製造方法によれば、リンカーを介して基材とアミノグリコシド系抗生物質とが連結している構造の細胞分離材を簡易な工程で製造することが可能である。
【００３６】
本発明の細胞分離方法によれば、細胞含有試料から、表面にＣａＳＲを有する細胞を簡便且つ選択的に分離することが可能である。
【００３７】
本発明の、分化能を有する細胞の分化誘導方法では、細胞分離工程での細胞に与えるダメージを小さくすることができるため、効率的に細胞の分化誘導が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実験２において、重合体を固定化した細胞培養ディッシュについて、ＸＰＳ（Ｋｒａｔｏｓ  ＡＸＩＳ−ＵＬＴＲＡ  ＤＬＤ）を測定して、ネオマイシンの固定化を確認した結果を示す。図１（Ａ）は、高分子を固定化したが該高分子をネオマイシンで修飾していない細胞培養ディッシュのＮ（１ｓ）のピーク強度を示し、図１（Ｂ）は、高分子を固定化し且つ該高分子をネオマイシンで修飾した細胞培養ディッシュのＮ（１ｓ）のピーク強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜アミノグリコシド系抗生物質＞
アミノグリコシド系抗生物質はアミノ糖又はアミノシクリトールを含む配糖体抗生物質の総称であり、マクロライド、ヌクレオシド及びアントラサイクリン等の抗生物質群は含まない。本発明者らは、驚くべきことにアミノグリコシド系抗生物質を基材上に連結することにより特異的に細胞を捕捉できること、並びに捕捉された細胞は抗生物質による害を受けることなく高効率で分化誘導可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００４０】
アミノグリコシド系抗生物質としては、ネオマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン及びトブラマイシンからなる群より選択される１種以上が好ましく、ネオマイシン、ゲンタマイシン及びトブラマイシンからなる群から選択される１種以上がより好ましく、ネオマイシンから選択される１種以上が特に好ましい。これらの抗生物質は、ＣａＳＲを表面に有する細胞との親和性が適度であり、該抗生物質を含む細胞分離材を用いて前記細胞を捕捉することができ、且つ捕捉された細胞を容易に回収することが可能である観点から好ましく、この観点から以下の抗生物質がより好ましい。
【００４１】
ネオマイシンとしてはネオマイシンＡ（＝ネアミン）、ネオマイシンＢ（＝フラジオマイシンＢ、ストレプトスリシンＢ）及びネオマイシンＣ（＝フラジオマイシンＣ）のいずれであってもよくこれらのうち２種以上の混合物であってもよいが、ネオマイシンＢ及びネオマイシンＣの少なくとも１種を用いることが好ましく、特にネオマイシンＢを用いることが特に好ましい。
【００４２】
ゲンタマイシンとしてはゲンタマイシンＣが特に好ましい。ゲンタマイシンＣはゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ２及びゲンタマイシンＣ１ａからなる群から選択される少なくとも１を含み、２以上の混合物であってもよい。
【００４３】
カナマイシンとしてはカナマイシンＡを用いることが特に好ましい。
アミノグリコシド系抗生物質はイオン、塩、エステル化物、アミド化物等のどのような形態で基材に連結されていてもよい。
【００４４】
アミノグリコシド系抗生物質は、アミノ基又は水酸基のうち１つにおいて１つの水素原子が結合に置き換えられた一価の基の形態で基材に連結されていることが好ましい。アミノグリコシド系抗生物質は基材に直接連結されていてもよいが、より好ましくは、後述するリンカーを介して基材に連結される。
【００４５】
本発明において、基材とアミノグリコシド系抗生物質との連結は、化学的な結合による基材とアミノグリコシド系抗生物質との連結を指す。前記化学的な結合としては共有結合、イオン結合、水素結合、疏水結合及び配位結合からなる群から選択される１種以上が例示でき、複数種の結合が組み合わされてもよいが、アミノグリコシド系抗生物質の基材からの脱離を抑制するためには結合安定性が特に高い共有結合が好ましい。
【００４６】
本発明の細胞分離材において、アミノグリコシド系抗生物質の基材上での存在密度は特に限定されず目的に応じて適宜調節することができる。本発明の細胞分離材の好ましい実施形態では、基材の表面のうち、アミノグリコシド系抗生物質が連結されている領域において、アミノグリコシド系抗生物質が好ましくは０．０２μｍｏｌ／ｃｍ２以上、２００μｍｏｌ／ｃｍ２以下、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１０μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１１μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１２μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１３μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１４μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１５μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１６μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１７μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１８μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．１９μｍｏｌ／ｃｍ２以上、０．２０μｍｏｌ／ｃｍ２以上であり、また１９０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１８０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１７０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１６０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１５０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１４０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１３０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１２０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１１０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１００μｍｏｌ／ｃｍ２以下、９０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、８０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、７０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、６０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、５０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、４０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、３０μｍｏｌ／ｃｍ２以下、２０μｍｏｌ／ｃｍ２以下の密度で連結されている。本発明の細胞分離材は、上記数値範囲において、特に効率的に細胞を捕捉することが可能である。
【００４７】
＜基材＞
本発明の細胞分離材に用いる基材は、好ましくは、アミノグリコシド系抗生物質が有する基又はリンカーが有する連結性基と反応して化学結合を形成することができる表面性状を有する。具体的には、基材の表面には水酸基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、第１〜４級アミノ基、−ＳｉＨ基、ビニル基、Ａｕ等の金属元素、アビジン含有基、ストレプトアビジン含有基等の官能基が存在するとリンカーが有する連結性基との間で化学結合の形成が容易であるため好ましく、特に、後述するケイ素含有基と−Ｓｉ−Ｏ−結合等の共有結合を形成することが容易であることから、基材表面に水酸基、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基が存在することが好ましい。
【００４８】
基材の表面に水酸基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、第１〜４級アミノ基、ビニル基等の親水性基を導入するには、例えば、オゾン雰囲気下での紫外線照射処理、プラズマ処理（例えば、酸素プラズマ、窒素プラズマ、これらの混合物のプラズマによる処理）、高エネルギー線照射処理（例えばガンマ線、電子ビームの照射処理）、酸化剤を用いた化学酸化処理等などを用いることができる。またＳｉＨ基は、ガラス、シリコンコートされた各種基材等のケイ素を含有する基材の表面を水素プラズマ処理することにより基材表面に導入することができる。またＡｕ等の金属元素、アビジン含有基、ストレプトアビジン含有基については当業者に知られた方法により基材表面に導入することができる。これらの官能基は、ラジカルを導入した基材表面に、該官能基を含む分子をグラフト化して結合させて導入することもできる。基材表面にラジカルを導入する方法としては、基材表面を電子線等の高エネルギー線で照射処理する方法が挙げられる。例えば、繊維素材に電子線を照射した後、溶媒にラジカル重合性化合物を溶解したラジカル重合性化合物溶液に浸漬して繊維素材にラジカル重合性化合物を付与した後、前記繊維素材の両面にフィルムを密着し、重合する方法が挙げられる。前記官能基を含む分子としては、ビニル基等のラジカル反応性の基を含む分子が挙げられる。該分子は、基材表面と結合させる前から前記官能基を含むものであってもよいし、基材表面と結合させてから前記官能基を更に結合させたものであってもよい。
【００４９】
基材としてポリオレフィン、ポリエステル等の合成樹脂を表面に含む基材を用いる場合、基材表面に導入する官能基としてはカルボニル基、カルボキシ基、水酸基等が挙げられ、これらの官能基は上記の方法により導入することができる。ポリオレフィンを含む基材に対しては、高エネルギー線照射によりラジカルを導入した後に、官能基を含む分子をグラフト化して結合させて導入することが比較的容易である。
【００５０】
基材としてセルロース等の多糖類を表面に含む基材を用いる場合、多糖類に多く含まれる水酸基を前記抗生物質又はリンカーとの反応に用いることができる。また、多糖類を含む基材に官能基を導入する方法としては、導入しようとする官能基を含み、且つ、エステル結合、シリルエーテル結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｃ）結合等の共有結合を介して多糖類が有する水酸基と結合可能な官能基を更に含む分子を、多糖類が有する水酸基に結合させる方法が挙げられる。
【００５１】
本発明の細胞分離材の基材の形態としては、ディッシュ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどの面部分を少なくとも一部に含む基材、あるいは連通孔を有する構造体などが挙げられるが、特に形態は限定されない。例えば、分化能を有する細胞を捕捉した状態で、分化誘導する場合においては、面部分を少なくとも一部に含む基材を好適に用いることができ、また、細胞含有試料から目的の細胞を濃縮する際には、連通孔を有する構造体を好適に用いることができ、当業者の目的に応じて、細胞分離材の基材の形態を、適宜設計すればよい。
【００５２】
面部分を少なくとも一部に含む基材とは、二次元的な広がりを有する表面を備える部分（面部分）を少なくとも一部に含む基材である。二次元的な広がりを有する表面は平面であってもよいし、曲面であってもよいし、平面と曲面との組み合わせであってもよいが、好ましくは平面である。ここで平面は実質的に平面とみなせるものであればよい。二次元的な広がりを有する表面は、好ましくは、該表面に対して垂直な方向から見て一辺１ｃｍ以上、例えば２ｃｍ以上の正方形を内包するように広がった表面である。例えば基材が容器形状（板状容器も含む）である場合は細胞含有試料と接触する容器内面、具体的には、ディッシュ、フラスコ等の細胞処理用容器における容器内面（底面、側壁面等）、プレートにおける細胞含有試料の載置面、バッグ、カートリッジ又はカセットにおける内面の少なくとも一部が、前記の二次元的な広がりを有する表面の例である。本発明の細胞分離材の基材として、面部分を少なくとも一部に含む基材を用いる場合、少なくとも、該面部分の、前記の二次元的な広がりを有する表面にアミノグリコシド系抗生物質が連結されることが好ましい。
【００５３】
本発明の細胞分離材の基材が面部分を少なくとも一部に含む基材の場合には、その面部分の形態、大きさは特に限定されない。材質としても特に限定されないが、非反応性ポリマー、金属、ガラスなどが好ましく使用される。または、これら非反応性ポリマー、金属又はガラスでコートあるいはメッキされた材料でも良い。具体的には、該ポリマーとして、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレンまたはヘキサフルオロプロピレン等のハロゲン化ポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、スチレンブタジエンコポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。金属としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、またはそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、または窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられ、生物親和性金属あるいはその合金が好ましい。ガラスとしては、シリコンコートされたガラスであってもよい。特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。
【００５４】
また、本発明の細胞分離材の基材が面部分を少なくとも一部に含む基材の場合に、少なくとも面部分にガス透過性構造を有する材料を使用したものも好ましく使用できる。ガス透過性構造を有する材料としては、コンタミネーションの抑制が可能な程度の微細な孔構造やスリット構造を有するものや、材質的にガス透過性が高い素材が挙げられる。ガス透過性が高い素材としては、例えばポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、オレフィン系熱可塑性エラストマー、スチレン系熱可塑性エラストマー、ポリアミド系熱可塑性エラストマーなどが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
基材として用いることができる「連通孔を有する構造体」とは、水等の液体が透過可能な連通孔を有する構造体であればよく、例えば繊維の集合体、粒体の集合体、多孔体等が挙げられ、繊維の集合体としては不織布、織布、繊維が集合して形成されるフエルト状構造体、綿状構造体等が挙げられる。繊維の集合体では繊維間に連通孔が形成される。粒体の集合体では、少なくとも粒体間に連通孔が形成され、更に、個々の粒体の内部が多孔質であって内部に連通孔が形成されたものであってもよい。多孔体としては、後に例示する素材により形成される組織中に多数の連通孔が形成されたもの（例えばスポンジ状構造体）が挙げられる。連通孔を有する構造体において、連通孔の孔径は特に限定されないが、捕捉し分離しようとする目的細胞及び試料中に含まれる他の細胞が通過できる孔径を有する実施形態とすると、前記抗生物質と前記目的細胞との親和性による細胞の選択的な捕捉分離が可能となるため好ましい。連通孔の孔径としては例えば９μｍ以上、８０μｍ以下とすることができる。ここで連通孔の「孔径」とは、構造体の断面を走査型電子顕微鏡等の拡大観察手段を用いて観察することができる、連通孔の長さ方向に略垂直な方向に沿った、該連通孔の横断面の径（該横断面の周縁上の、該横断面の重心を通る直線上の対向する一対の点の間の距離のうち最も短い距離、すなわち短径）を指す。前記拡大観察手段により適当な数、例えば１０以上、２０以上又は３０以上の前記横断面を観察し、適当なスケール（例えば観察画像上のスケール）と対比して求めた上記の孔径の平均値（すなわち平均孔径）を、連通孔の孔径とみなすことができる。連通孔を有する構造体は各種形状に成形することができその全体形状は特に限定されないが、例えば円盤状等のシート状、筒状、パイプ状等の形状とすることができる。
【００５６】
本発明の細胞分離材料の基材が連通孔を有する構造体である場合には、その素材としては、特に限定されないが、例えば、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリオレフィン（例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン等のαオレフィンの単独重合体又は２種以上の共重合体）、ポリアクリルアミド、ポリエステル（例えばポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、アクリル樹脂等に代表される合成高分子、キチン、キトサン、酢酸セルロース、セルロース、レーヨン、アガロース、アルギン酸等に代表される天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ等に代表される無機材料、ステンレス、チタン等に代表される金属等が挙げられる。
【００５７】
連通孔を有する前記構造体が繊維の集合体である実施形態では、平均繊維径が例えば５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μ以下、例えば１μｍ以上、好ましくは３μｍ以上とすることができる。平均繊維径がこの範囲であるとき細胞の捕捉が容易となる。平均繊維径は、例えば走査型電子顕微鏡等の拡大観察手段により繊維又は繊維の集合体を観察し、観察像中の適当な数、例えば１０以上、２０以上又は３０以上の箇所（繊維の端部を除く）において、適当なスケール（例えば観察画像上のスケール）と対比して繊維の幅を求め、その平均値を求めたものとすることができる。繊維の集合体の密度は特に限定されないが、細胞の効率的な捕捉のためには、例えば１×１０４ｇ／ｍ３以上、２×１０４ｇ／ｍ３以上、３×１０４ｇ／ｍ３以上、４×１０４ｇ／ｍ３以上、５×１０４ｇ／ｍ３以上、６×１０４ｇ／ｍ３以上、７×１０４ｇ／ｍ３以上、８×１０４ｇ／ｍ３以上、９×１０４ｇ／ｍ３以上、例えば１×１０６ｇ／ｍ３以下、９×１０５ｇ／ｍ３以下、８×１０５ｇ／ｍ３以下、７×１０５ｇ／ｍ３以下、６×１０５ｇ／ｍ３以下、５×１０５ｇ／ｍ３以下、４×１０５ｇ／ｍ３以下、３×１０５ｇ／ｍ３以下、２×１０５ｇ／ｍ３以下、１×１０５ｇ／ｍ３以下とすることができる。繊維を構成する素材としては、連通孔を有する前記構造体の素材として上記で例示したものが使用できるが、特にポリオレフィン、ポリエステル、ポリブチレンテレフタラート、ポリアミドが既存の細胞分離フィルターとして使用実績が多いため安全性の観点から好ましい。また、基材として用いる繊維の集合体としては、特に不織布が、既存の細胞分離フィルターとして使用実績が多いため安全性の観点から好ましい。
【００５８】
連通孔を有する前記構造体が、粒体の集合体である実施形態では、該粒体の粒径は１０μｍ以上、２０００μｍ以下が好ましく、処理効率からより好ましくは７０μｍ以上、１０００μｍ以下である。ここで粒体の「粒径」とは、個々の粒体を走査型電子顕微鏡等の拡大観察手段で観察したときに観察される観察像の径（該観察像の周縁上の、該観察像の重心を通る直線上の対向する一対の点の間の距離のうち最も短い距離、すなわち短径）を指す。前記拡大観察手段により適当な数、例えば１０以上、２０以上又は３０以上の前記粒体を観察し、適当なスケール（例えば観察画像上のスケール）と対比して求めた上記の粒径の平均値（すなわち平均粒径）を、粒体の粒径とみなすことができる。前記粒体の素材としては、連通孔を有する前記構造体の素材として例示したものに加えて、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機材料、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物、架橋ポリアクリル酸、架橋ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレンなどの合成樹脂材料、結晶性セルロース、架橋セルロース、セルロース誘導体、架橋アガロース、架橋デキストリン、キチン、キトサンなどの多糖類、さらにはこれらの組合せによって得られる、有機−有機、有機−無機などの複合材料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
＜リンカー＞
前記基材と前記アミノグリコシド系抗生物質とは好ましくはリンカーを介して連結している。リンカーを介することにより、細胞が捕捉される捕捉点となる前記抗生物質の基材表面からの距離が大きくなり、且つ、細胞を捕捉した前記抗生物質が移動できる範囲が広がるため、細胞が基材と結合する際の立体障害が低減され、前記抗生物質により細胞を効率的に捕捉することができると考えられる。
【００６０】
リンカーの構造は特に限定されないが、好ましくは、リンカー１分子中に、前記基材への結合を少なくとも１つ有し、且つ前記アミノグリコシド系抗生物質が少なくとも１つ結合した構造を有し、より好ましくは、リンカー１分子中に、前記基材への結合を複数有し、且つ前記アミノグリコシド系抗生物質が複数結合した構造を有する。リンカー１分子が複数個所で基材と結合することによりリンカー及び前記抗生物質が基材に強固に結合するため、それらが基材から分離して分離対象細胞に混入するリスクを低減することができる。また、リンカー１分子に複数の前記抗生物質を結合する構成とすることで適度な密度で抗生物質を基材表面に配置することが可能である。
【００６１】
リンカーと基材との結合の種類は上述の化学結合の１つであればよく特に限定されないが、結合の安定性が高いことから共有結合であることが好ましい。同様に、リンカーと前記抗生物質との結合は上述の化学結合の１つであればよく特に限定されないが、結合の安定性が高いことから共有結合であることが好ましい。
【００６２】
リンカーは、基材の表面上での反応により形成された化学構造であってもよいし、別途用意した化合物を基材及び抗生物質と結合させたものであってもよいが、より好ましくは後者であり、前記別途用意した化合物を便宜上「リンカー化合物」又は「リンカー前駆体」と呼ぶ場合がある。
【００６３】
リンカー化合物は通常、基材及び抗生物質と結合させる前の状態においては、前記基材に連結可能な連結性基と、前記抗生物質と結合を形成可能な反応性基とを、それぞれ少なくもと１つ含む化合物である。リンカー化合物には連結性基が含まれ、該リンカー化合物が基材とともに基材−リンカー結合体を形成する際に、前記連結性基が基材表面の官能基と連結し結合を形成する。本発明では連結性基が基材と連結して構造が変化したものを「連結基」と呼び区別する。同様に、前記抗生物質と結合する前のリンカー化合物には反応性基が含まれ、該反応性基は前記抗生物質が有する基と結合を形成する際に構造が変化する。
【００６４】
リンカー化合物が有する前記連結性基は、基材に連結可能なものであれば特に限定されないが、リンカーと基材との結合を十分に安定なものとするためには、下記において詳述するＲ１６の範囲から選択される基であることが特に好ましい。同様の理由から、基材との結合後のリンカーが有する連結基は、下記において詳述するＲ１５の範囲から選択される基であることが特に好ましい。
【００６５】
基材と結合する前のリンカー化合物が有する前記反応性基は、前記アミノグリコシド系抗生物質と結合を形成可能な基であれば特に限定されず、前記アミノグリコシド系抗生物質が有する官能基（第一級アミノ基、第二級アミノ基、水酸基、アルデヒド基等）のいずれと結合を形成するものであってもよいが、好ましくは第一級アミノ基と結合を形成するものである。前記抗生物質がその第一級アミノ基を介してリンカーに結合することができれば、結合した前記抗生物質の細胞との適度な結合性を実現することができると推測される。前記反応性基は、リンカーと前記抗生物質との結合を十分に強固なものとするためには、下記において詳述する式ＩＩＩ又は式ＩＶで表される基の範囲から選択される基であることがより好ましい。
【００６６】
リンカーの大きさは特に限定されず、水素を除く構成原子数が２０未満、或いは１０未満の低分子量の構造であってもよいし、構成原子数が前記範囲を超える高分子量の構造であってもよい。
【００６７】
リンカーは直鎖、分岐鎖、環状鎖、これらの２つ以上の組み合わせなどの任意の形状であることができ、側鎖を有していてもよい。
【００６８】
リンカーは、特に好ましくは、１種以上の繰り返し単位を含む重合体である。重合体は直鎖状の構造であってもよいし、３つ以上の末端を有する分岐鎖の構造であってもよい。重合体であるリンカーは、主鎖同士が架橋されたものであってもよい。
【００６９】
リンカーを構成する重合体は特に限定されず、付加重合系ポリマーであっても、縮合重合系ポリマーであってもよい。具体的には、ラジカル重合性二重結合を有するモノマーが付加重合したポリマー、エポキシ系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、ポリウレタン系ポリマー、ポリアミド系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、ポリウレア系ポリマー、ポリエーテル系ポリマー、ポリイミド系ポリマー等を挙げることができ、特に好ましくはラジカル重合性二重結合を有するモノマーが付加重合したポリマーである。また、キチン、キトサン、セルロース等の天然にも存在する多糖類又はその誘導体もリンカーを構成する重合体として利用することができる。ラジカル重合性二重結合を有するモノマーが付加重合したポリマーは、具体的にはポリアクリレート、ポリメタクリレートなどを包含する。
【００７０】
リンカーを構成する重合体は、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体であることが特に好ましい。このような構造の主鎖は安定性が高く、熱や化学処理による影響下においても切断しにくく、前記抗生物質を基材に安定して保持することができる。このような主鎖構造を有する重合体としてはラジカル重合性二重結合を有するモノマーが付加重合したポリマーが挙げられる。このポリマーでは各繰り返し単位が主鎖を構成する炭素を２つ有する。なお、「炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体」とは主鎖の少なくとも一部が該構成を有していればよいが、重合体の化学的安定性の観点から、両末端部を除いて、主鎖を構成する隣接原子を繋ぐ結合の好ましくは７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、より好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９８モル％以上、より好ましくは１００モル％が炭素−炭素単結合である。
【００７１】
リンカーを構成する重合体は、好ましくは、側鎖にアミノグリコシド系抗生物質が連結している、又は連結前の状態にあっては側鎖に前記反応性基を有する。この場合、多量のアミノグリコシド系抗生物質を効率的に基材に配置することができる。
【００７２】
リンカーを構成する重合体は、好ましくは、側鎖が基材と連結している、又は連結前の状態にあっては側鎖に前記連結性基を有する。この場合、重合体の鎖は、主鎖の一端又は両端でのみ結合する場合と比較して強固に基材表面と結合することができる。
【００７３】
リンカーを構成する重合体のより好ましい実施形態は、基材及び抗生物質との連結後においては、前記基材が前記重合体の側鎖に連結しており、且つ、前記アミノグリコシド系抗生物質が前記重合体の側鎖に連結している重合体である、或いは、基材及び抗生物質との連結前においては、前記連結性基及び前記反応性基を側鎖に含む重合体である。この実施形態では、リンカーは基材表面に沿った状態で固定され、且つ、重合体の鎖に沿って前記抗生物質が配置されるため、多量のアミノグリコシド系抗生物質を基材表面上の異なる位置に効率的に配置することができ、且つ、リンカーの基材への結合安定性が高まるため好ましい。
【００７４】
リンカーは好ましくは、繰り返し単位１と繰り返し単位２とを少なくもとも含む重合体であり、少なくとも繰り返し単位２が、前記アミノグリコシド系抗生物質を含む基を含む。このとき繰り返し単位１が前記基材に連結した連結基を含む実施形態は、重合体の合成が容易であるとともに基材表面への重合体の結合が十分に強いものとなるため好適である。特に、繰り返し単位１が前記基材に連結した連結基を含み且つ繰り返し単位１と繰り返し単位２とがランダム共重合した実施形態では、重合体の鎖の長さ方向に沿って分散した位置に基材への連結部位が存在することができるため好ましい。
【００７５】
他の好ましい実施形態では、前記繰り返し単位１に前記抗生物質が結合しておらず、前記繰り返し単位２に前記抗生物質が結合している構造を有する。前記抗生物質を含まない繰り返し単位１を含むことにより、細胞の捕捉点となる前記抗生物質をまばらに配置することができ、前記抗生物質及び結合した細胞の干渉を軽減して効率的に細胞を捕捉することが可能となる。この効果を高めるためには、繰り返し単位１と繰り返し単位２とがランダム共重合により重合されていることが特に好適である。
【００７６】
繰り返し単位１は１種類の構造のみを含んでいる必要はなく、構造の異なる複数種の単位を含んでいてもよい。同様に繰り返し単位２は１種類の構造のみを含んでいる必要はなく、構造の異なる複数種の単位を含んでいてもよい。
【００７７】
前記重合体中での前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２との量比は特に限定されないが、好ましくは、前記繰り返し単位１が１００モルに対して前記繰り返し単位２が５０モル以上、９９０モル以下であり、より好ましくは１００モル以上、１５０モル以上、２００モル以上であり、より好ましくは９００モル以下、５００モル以下である。この数値範囲の場合に細胞分離材への細胞吸着率が特に高い。
【００７８】
前記重合体は、基材表面へ、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２の一方又は両方の側鎖を介して結合していることが好ましく、少なくとも前記繰り返し単位１の側鎖を介して結合していることがより好ましい。この場合、前記重合体は基材表面に強固に結合することができるとともに、多量のアミノグリコシド系抗生物質を効率的に基材表面に配置することができるため好適である。
【００７９】
＜重合体の好適な実施形態＞
リンカーを構成する重合体の好ましい実施形態は、前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２とを少なくもとも含む重合体である。そこでこの重合体の更に好ましい実施形態について以下に説明する。
【００８０】
以下の説明では、繰り返し単位１を形成する単量体化合物をモノマー１とし、繰り返し単位２を形成する単量体化合物をモノマー２とする。
【００８１】
モノマー１とモノマー２はそれぞれ、重合により炭素−炭素単結合からなる主鎖を形成することができることからラジカル重合性二重結合を各分子中に少なくとも１つ含むことが好ましいが、これには限定されず、上記のような各種重合体を形成し得る構造のモノマーであればよい。
【００８２】
繰り返し単位１及びモノマー１は、基材と結合する前の状態では前記連結性基を有するものであってもよい。
【００８３】
繰り返し単位２及びモノマー２は、アミノグリコシド系抗生物質と結合する前の状態では、前記反応性基を有するものであれば特に限定されない。
【００８４】
繰り返し単位２及びモノマー２は、基材と結合する前の状態では前記連結性基を有するものであってもよい。
【００８５】
前記重合体に含まれる繰り返し単位１の一部は、前記重合体と基材とを連結した後でも、前記連結性基が基材と未反応のまま残存していてもよい。同様に、前記重合体に含まれる繰り返し単位２の一部は、前記重合体とアミノグリコシド系抗生物質とを連結した後でも、前記反応性基がアミノグリコシド系抗生物質と未反応のまま残存していてもよい。また、繰り返し単位２がアミノグリコシド系抗生物質と未反応の前記反応性基を含む場合には、該反応性基と結合を形成し得る官能基を有する他の化合物と反応させて、当該他の化合物を含有する基をアミノグリコシド系抗生物質を含有する基の代わりに導入してもよく、この場合の繰り返し単位２は後述する式ＩＩにおいてＲ２５は前記他の化合物を含む基となる。前記他の化合物としては、アミノグリコシド系抗生物質と同様の官能基（例えば第一級アミノ基、水酸基）を有し分離対象細胞との特異的な吸着性を有さない化合物が使用でき、例えばエタノールアミンが使用できる。前記重合体中での前記繰り返し単位１と前記繰り返し単位２との量比についての上記の好適な範囲は、基材と連結した前記連結基を有する繰り返し単位１に加えて、未反応の前記連結性基を有する繰り返し単位１等の全てのモノマー１由来繰り返し単位と、アミノグリコシド系抗生物質と連結した繰り返し単位２に加えて、未反応の前記反応性基や前記反応性基と前記他の化合物とが反応して形成される前記他の化合物を含有する基を有する繰り返し単位２等の全てのモノマー２由来繰り返し単位との量比の好適な範囲でもある。
【００８６】
以下、各単位及びモノマーの特に好適な実施形態について説明する。
＜繰り返し単位１及びモノマー１の特に好適な実施形態＞
前記繰り返し単位１は、好ましくは、基材に連結した重合体中においては前記式Ｉで表される構造を有し、基材と結合する前の重合体中では前記式Ｉ’で表される構造を有する。
【００８７】
前記式Ｉ’で表される構造の前記繰り返し単位１は、下記の式Ｉ’’で表されるラジカル重合性二重結合を有するモノマー１を、後述するモノマー２等の他のラジカル重合性のモノマー成分とともにラジカル重合して形成することができる。
式Ｉ’’：
【化７】
2017112910.tif 000008
式Ｉ’’及び式Ｉ’において、並びに、該当する基が含まれる場合は式Ｉにおいても、
Ｒ１１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数であり、
Ｒ１６は、基材に連結可能な連結性基である。
【００８８】
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３において「アルキル基」の炭素数は特に限定されないが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくできることから炭素数が小さいほうが好ましく、炭素数は好ましくは１以上、６以下であり、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、更に好ましくは１又は２、最も好ましくは１である。該アルキル基は直鎖又は分岐鎖であってよいが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくする観点から好ましくは直鎖のアルキル基である。
【００８９】
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３において「芳香族基」の原子数は特に限定されないが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくするためには水素以外の原子数が好ましくは５以上、１５以下であり、より好ましくは１０以下であり、より好ましくは５又は６の芳香族基を指す。水素以外の原子の種類は特に限定されないが、典型的には少なくとも炭素を含み、更に窒素、酸素、硫黄を含んでもよい。水素以外の原子数の総数が前記範囲である限り芳香族基は１つ以上の置換基を有していてもよく、該置換基としては例えばアルキル基が挙げられ、アルキル基としてはＲ１１、Ｒ１２及びＲ１３に関して上記したものと同様なものが使用できる。芳香族基としては立体障害が小さいことからフェニル基が特に好ましい。
【００９０】
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３において「芳香族アルキル基」は、アルキル基の１つ以上、好ましくは１つの水素原子が芳香族基に置換された基であり、芳香族アルキル基のアルキル基部分は好ましくは上記で定義したアルキル基の範囲から選択され、芳香族アルキル基の芳香族基部分は好ましくは上記で定義した芳香族基の範囲から選択される。芳香族アルキル基としては最も好ましくはベンジル基である。芳香族アルキル基がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【００９１】
Ｒ１１はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ１１でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ１１がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【００９２】
Ｒ１２はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ１２でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ１２がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【００９３】
リンカー化合物の重合時の反応性の観点から、Ｒ１１とＲ１２の少なくとも一方は水素であることが好ましく、共に水素であることが特に好ましい。
【００９４】
Ｒ１３はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ１３でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ１３がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【００９５】
Ｌ１４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｐの基であり、ここでｐは２以上４以下の整数である。Ｌ１４はリンカー主鎖と基材との距離を大きくして細胞が基材表面と抵触する可能性を低減するスペーサーとしての役割があり、水素以外の原子の数が２以上であることでこの役割がより顕著に奏される。Ｌ１４の水素以外の原子の数は１以上であり、例えば２以上或いは３以上の場合にスペーサーとして好ましく、上限は特に限定されないが、取扱いの容易性の観点から好ましくは１２以下、１０以下又は８以下である。特に、Ｌ１４を構成する水素以外の原子のうち、Ｒ１３が結合する炭素が結合する原子からＲ１６（又は式ＩでのＲ１５）が結合する原子までの結合を最小原子数となるように辿ったときの原子数（すなわち鎖長）が１以上又は２以上であり、１２以下、１０以下、８以下又は６以下であることが上記と同様の観点から好ましい。Ｌ１４の結合価数ｐは２以上４以下であればよいが、製造の容易性からｐは好ましくは２又は３、より好ましくは２である。Ｌ１４としては例えば次式で表されるものが例示できる。
【００９６】
【化８】
2017112910.tif 000009
（式中、Ｘ１は酸素又は硫黄を表し、好ましくは酸素であり、Ｘ２は酸素、硫黄又はＮＨを表し、ｍ１は０以上、８以下、好ましくは１以上、６以下の整数を表し、＊１はＲ１３が結合しているのと同一の炭素への結合を示し、＊２はＲ１６への結合を示す。炭素鎖の部分は１つ以上の水素原子が水酸基、ハロゲン原子、アルキル基等により置換されていてもよい。或いは、Ｌ１４全体で上記の原子数となる範囲内及び／又は鎖長が上記の原子数となる範囲内で＊１とＲ１３が結合しているのと同一の炭素との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよく、＊２とＲ１６との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよい。）
【００９７】
Ｒ１６は、基材に連結可能な連結性基であればよく、基材の表面に存在する基に応じて適宜選択することができ、特定の構造には限定されない。
【００９８】
基材の表面に存在する基としては、例えば、水酸基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、第１〜４級アミノ基、−ＳｉＨ基、ビニル基、Ａｕ等の金属元素、アビジン含有基、ストレプトアビジン含有基等が挙げられる。これらの基は基材が予め有している基であってもよいし、既述のような方法により基材表面に導入された基であってもよい。
【００９９】
前記連結性基としては、基材表面上の基と連結可能な基であればよく、基材表面上の基との間で共有結合、イオン結合、水素結合、疏水結合及び配位結合からなる群から選択される１種以上を形成可能なものであることが好ましく、特に結合の安定性の観点から共有結合を形成可能なものであることが好ましい。例えば基材表面に水酸基が存在する場合、前記連結性基としては、水酸基との反応により−Ｓｉ−Ｏ−結合、エステル結合、エーテル結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。基材表面にカルボキシ基が存在する場合、前記連結性基としては、カルボキシ基との反応によりエステル結合、アミド結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。基材表面にカルボニル基が存在する場合、前記連結性基としては、カルボニル基との反応により共有結合を形成可能な基が好ましい。カルボニル基との反応により共有結合を形成可能な基の例としては、カルボニル基との反応によりイミンを形成可能な基が挙げられる。基材表面にアルデヒド基が存在する場合、前記連結性基としては、アルデヒド基との反応によりアミド結合、エステル結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。アルデヒド基との反応により共有結合を形成可能な基の他の例としては、アルデヒド基との反応によりシッフ塩基を形成可能な基が挙げられる。基材表面にチオール基が存在する場合、前記連結性基としては、チオール基との反応によりチオエステル結合、−Ｓ−Ｓ−結合、硫黄−金属結合、Ｓ−Ｃ結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。チオール基とのＳ−Ｃ結合は、前記連結性基がビニル基等のアルケニル基である場合にチオール−エン反応により、前記連結性基がマレイミジル基である場合にチオール基とマレイミジル基との反応により、それぞれ形成され得る。基材表面にエポキシ基が存在する場合、前記連結性基としては、エポキシ基との反応により共有結合を形成可能な基が好ましく、具体的にはアミノ基、チオール基等が例示できる。基材表面に第１〜４級アミノ基が存在する場合、前記連結性基としては、第１〜４級アミノ基との反応によりアミド結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。基材表面に−ＳｉＨ基が存在する場合、前記連結性基としては、−ＳｉＨ基との反応によりＳｉ−Ｃ結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。−ＳｉＨ基との反応によりＳｉ−Ｃ結合を形成可能な前記連結性基としては、−ＳｉＨ基とのラジカル反応によりＳｉ−Ｃ結合を形成することができるビニル基が挙げられる。基材表面にビニル基が存在する場合、前記連結性基としては、ビニル基との反応により共有結合を形成可能な基が好ましい。ビニル基との反応により共有結合を形成可能な前記連結性基としては、ビニル基とのチオール−エン反応によりＳ−Ｃ結合を形成することができるチオール基が挙げられる。基材表面にＡｕ等の金属元素が存在する場合、前記連結性基としては、金属元素との反応により硫黄−金属結合等の共有結合を形成可能な基が好ましい。基材表面にアビジン含有基又はストレプトアビジン含有基が存在する場合、前記連結性基としてはビオチン又はその誘導体を含有する基が好ましい。
【０１００】
表面に水酸基、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基等の基が存在する基材を用いる場合、Ｒ１６及び基材と連結する前の状態のリンカー化合物に含まれる連結性基としては、特に好ましくは、合計１〜３個の−ＯＲ１７及び／又はハロゲン原子と結合したケイ素原子を有する基であり、ここでＲ１７はアルキル基である。ハロゲン原子としては好ましくは塩素、フッ素、ヨウ素又は臭素、より好ましくは塩素である。このような基は加水分解を受けて前記ケイ素原子とともにシラノールを形成することができ、基材上の前記基と反応して共有結合（−Ｓｉ−Ｏ−結合等）を形成することができる。また加熱条件下などではシラノールを経由することなく直接に基材上の前記と反応して共有結合（−Ｓｉ−Ｏ−結合等）を形成することができる。
【０１０１】
合計１〜３個の−ＯＲ１７及び／又はハロゲン原子と結合したケイ素原子を有する前記の連結性基としては次式Ｖで表されるものが好ましい。
式Ｖ：
【化９】
2017112910.tif 000010
（式中
Ｘ３は−ＯＲ１７及び／又はハロゲン原子であり、
Ｒ１７はアルキル基であり、
Ｙは水素又はアルキル基であり、
ｎは１以上、３以下の整数であり、
＊３は結合を表す）
【０１０２】
Ｒ１７及びＹにおけるアルキル基としては、それぞれ独立に、炭素数が好ましくは１以上、６以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２以下、最も好ましくは１の、直鎖又は分岐鎖、好ましくは直鎖のアルキル基であり、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ１７及びＹにおけるアルキル基がこの範囲である場合、基材表面の水酸基等の基と前記連結性基との反応の際の反応性が高く好ましい。
【０１０３】
Ｒ１６及び基材と連結する前の状態のリンカー化合物に含まれる連結性基の他の好適な例としては、ビニル基、チオール基、ビオチン等が例示できる。繰り返し単位１中の連結性基がビニル基である場合、基材上に−ＳＨ基、−ＳｉＨ基が存在する場合に反応して共有結合を形成することができる。前記連結性基がチオール基である場合、基材上にチオール基が存在すれば−Ｓ−Ｓ−結合を形成することができ、基材上に金（Ａｕ）が存在すれば−Ａｕ−Ｓ−結合を形成することができる。前記連結性基がビオチンである場合、基材上にアビジン又はストレプトアビジンが存在すれば特異的結合を形成することができる。
【０１０４】
基材へ連結する前のリンカー化合物には前記連結性基（Ｒ１６等）が含まれ、該リンカー化合物が基材とともに基材−リンカー結合体を形成する際に、前記連結性基が基材と連結を形成する。
【０１０５】
連結基は、典型的には式Ｉで表される繰り返し単位１の実施形態においてはＲ１５で表される基である。連結基は、前記連結性基が基材表面の基と反応した結果形成される基であり、その構造は連結性基と基材表面の基との組み合わせに応じて定まる。例えば、連結性基が合計１〜３個の−ＯＲ１７及び／又はハロゲン原子と結合したケイ素原子を有する基、例えば式Ｖで表される基であり、基材表面に該基と反応する水酸基、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基等の前記基が存在する場合、連結基は好ましくは基材の表面への結合を少なくとも１つ有するケイ素原子を含む基であり、典型的には、上記式Ｖで表される基において、Ｘ３のうち少なくとも１つが基材の表面への結合（例えば−Ｏ−の酸素への単結合等）に置換された基である。
【０１０６】
＜繰り返し単位２及びモノマー２の特に好適な実施形態＞
前記繰り返し単位２は、好ましくは、アミノグリコシド系抗生物質が結合した重合体中においては前記式ＩＩで表される構造を有し、アミノグリコシド系抗生物質と結合する前の重合体中では好ましくは前記式ＩＩ’で表される構造を有する。
【０１０７】
前記式ＩＩ’で表される構造の前記繰り返し単位２は、下記の式ＩＩ’’で表されるラジカル重合性二重結合を有するモノマー２を、前記のモノマー１等の他のラジカル重合性のモノマー成分とともにラジカル重合して形成することができる。
式ＩＩ’’：
【化１０】
2017112910.tif 000011
式ＩＩ’’及び式ＩＩ’において、並びに、該当する基が含まれる場合は式ＩＩにおいても、
Ｒ２１は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２３は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２６は、水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基であり、
Ｒ２７は、式ＩＩＩ
【化１１】
2017112910.tif 000012
（式ＩＩＩ中、
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上、４以下の整数であり、
Ｒ２８は、アミノグリコシド系抗生物質により置換可能な脱離基又はアミノグリコシド系抗生物質が有する官能基（例えば第一級アミノ基、水酸基）と結合を形成可能な反応性基であり、
＊は結合を示す）
で表される基であり、
或いは、
Ｒ２６とＲ２７とは一体となって式ＩＶ
【化１２】
2017112910.tif 000013
（式ＩＶ中、＊は、結合を示す）
で表される二価の基を形成している。
【０１０８】
Ｒ２１、Ｒ２６及びＲ２３において「アルキル基」の炭素数は特に限定されないが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくできることから炭素数が小さいほうが好ましく、炭素数は好ましくは１以上、６以下であり、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、更に好ましくは１又は２、最も好ましくは１である。該アルキル基は直鎖又は分岐鎖であってよいが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくする観点から好ましくは直鎖のアルキル基である。
【０１０９】
Ｒ２１、Ｒ２６及びＲ２３において「芳香族基」の原子数は特に限定されないが、重合時及び細胞捕捉時の立体障害を小さくするためには水素以外の原子数が好ましくは５以上、１５以下であり、より好ましくは１０以下であり、より好ましくは５又は６の芳香族基を指す。水素以外の原子の種類は特に限定されないが、典型的には少なくとも炭素を含み、更に窒素、酸素、硫黄を含んでもよい。水素以外の原子数の総数が前記範囲である限り芳香族基は１つ以上の置換基を有していてもよく、該置換基としては例えばアルキル基が挙げられ、アルキル基としてはＲ２１、Ｒ２６及びＲ２３に関して上記したものと同様なものが使用できる。芳香族基としては立体障害が小さいことからフェニル基が特に好ましい。
【０１１０】
Ｒ２１、Ｒ２６及びＲ２３において「芳香族アルキル基」は、アルキル基の１つ以上、好ましくは１つの水素原子が芳香族基に置換された基であり、芳香族アルキル基のアルキル基部分は好ましくは上記で定義したアルキル基の範囲から選択され、芳香族アルキル基の芳香族基部分は好ましくは上記で定義した芳香族基の範囲から選択される。芳香族アルキル基としては最も好ましくはベンジル基である。芳香族アルキル基がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【０１１１】
Ｒ２１はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ２１でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ２１がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【０１１２】
Ｒ２６はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ２６でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ２６がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【０１１３】
リンカー化合物の重合時の反応性の観点から、Ｒ２１とＲ２６の少なくとも一方は水素であることが好ましく、共に水素であることが特に好ましい。
【０１１４】
Ｒ２３はより好ましくは、水素、アルキル基、又はフェニル基であり、特に好ましくは水素又はアルキル基である。Ｒ２３でのアルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましく、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。Ｒ２３がここで例示した範囲から選択されるとき、リンカー化合物の重合時及び細胞捕捉時の立体障害を低減することができる。
【０１１５】
ここでＲ２７が上記式ＩＩＩで表される基である実施形態について説明する。
Ｌ２４は、水素以外の原子の数が１以上で価数ｑの基であり、ここでｑは２以上４以下の整数である。Ｌ２４はリンカー主鎖と前記抗生物質との距離及び基材表面と前記抗生物質との距離を大きくして細胞が基材表面と抵触する可能性を低減するスペーサーとしての役割があり、水素以外の原子の数が１以上であり、２以上である場合にスペーサーとしてより好ましい。Ｌ２４の水素以外の原子の数の上限は特に限定されないが、取扱いの容易性の観点から好ましくは１２以下、１０以下、８以下又は５以下である。特に、Ｌ２４を構成する水素以外の原子のうち、Ｒ２３が結合する炭素が結合する原子からＲ２８（又は式ＩＩでのＲ２５）が結合する原子までの結合を最小原子数となるように辿ったときの原子数（すなわち鎖長）が１以上であり、１２以下、１０以下、８以下又は５以下であることが上記と同様の観点から好ましい。Ｌ２４の結合価数ｑは２以上４以下であればよいが、製造の容易性からｑは好ましくは２又は３、より好ましくは２である。Ｌ２４としては例えば次式で表されるものが例示できる。
【０１１６】
【化１３】
2017112910.tif 000014
（式中、Ｘ４は酸素又は硫黄を表し、好ましくは酸素であり、＊４はＲ２３が結合しているのと同一の炭素への結合を示し、＊５はＲ２８への結合を示す。或いは、Ｌ２４全体で上記の原子数となる範囲内で＊４とＲ２３が結合しているのと同一の炭素との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよく、＊５とＲ２８との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよい。）
【０１１７】
【化１４】
2017112910.tif 000015
（式中、＊４はＲ２３が結合しているのと同一の炭素への結合を示し、＊５はＲ２８への結合を示す。或いは、Ｌ２４全体で上記の原子数となる範囲内で＊４とＲ２３が結合しているのと同一の炭素との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよく、＊５とＲ２８との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよい。）
【０１１８】
【化１５】
2017112910.tif 000016
（式中、＊４はＲ２３が結合しているのと同一の炭素への結合を示し、＊５はＲ２８への結合を示す。或いは、Ｌ２４全体で上記の原子数となる範囲内で＊４とＲ２３が結合しているのと同一の炭素との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよく、＊５とＲ２８との間に更に２価以上４価以下の基が介在していてもよい。）
【０１１９】
式ＩＩＩにおいてＲ２８は、アミノグリコシド系抗生物質により置換可能な脱離基又はアミノグリコシド系抗生物質が有する官能基（例えば第一級アミノ基、水酸基）と結合を形成可能な反応性基である。Ｒ２８における「反応性基」とは、脱離基以外の基であって、アミノグリコシド系抗生物質が有する官能基と結合を形成可能な基である。
【０１２０】
Ｒ２８として可能な、アミノグリコシド系抗生物質により置換可能な脱離基としては、アミノグリコシド系抗生物質に限らず第一級アミン化合物により置換可能な脱離基であればよく、反応性が高く且つ入手が容易な基として、次式で表される基又はハロゲン原子が例示できる。このとき、Ｒ２８が結合するＬ２４の末端の原子が、前記抗生物質が有するアミノ基又は水酸基による求核反応を受けて前記脱離基が前記抗生物質により置換され得る原子であるとき前記抗生物質の結合が更に容易となるため好ましい。このようなＬ２４の末端の原子としては、−Ｃ（＝Ｏ）−基の炭素原子、−Ｃ（＝Ｓ）−基の炭素原子、−Ｓ（＝Ｏ）−基の硫黄原子、−Ｓ（＝Ｏ）２−基の硫黄原子等が挙げられる。ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であることができ、好ましくは臭素又は塩素である。
【０１２１】
【化１６】
2017112910.tif 000017
（式中、Ａ１〜Ａ５はそれぞれ独立に同一又は異なるハロゲン原子であることができ、好ましくは全てフッ素であり、＊はＬ２４への結合を示す）
【０１２２】
Ｒ２８として可能な、アミノグリコシド系抗生物質が有する官能基（例えば第一級アミノ基、水酸基）と結合を形成可能な反応性基としては、反応性が高く且つ入手が容易であることから、エポキシ基を含む反応性基が例示できる。エポキシ基を含む反応性基としては次式で表される構造の基が例示できる。
【０１２３】
【化１７】
2017112910.tif 000018
（式中、Ｌ２９は水素以外の原子数が１〜１０個、好ましくは１〜４個の二価の基又は結合を表し、＊はＬ２４への結合を表す）
【０１２４】
上記式において、Ｌ２９の構造は特に限定されないが、例えばＬ２９はＬ２４と結合する位置に酸素、硫黄又はＮＨを有し、残部は結合又は炭素数１〜９の炭化水素鎖を表す。
【０１２５】
式ＩＩ’’において、Ｒ２６とＲ２７とが一体となって前記式ＩＶで表される基を形成する場合、式ＩＩ’’で表されるモノマー２は無水マレイン酸誘導体である。この実施形態では、モノマー間の重合反応の反応性を良好にするために、好ましくはＲ２１とＲ２３の少なくとも一方が水素であり、より好ましくは両方が水素である。
【０１２６】
式ＩＩ’’で表されるモノマー２を、式Ｉ’’のモノマー１などの他のラジカル重合性二重結合を有するモノマーとともにラジカル共重合させて形成される重合体では、式ＩＩ’’で表されるモノマー２に由来する繰り返し単位は、式ＩＩ’で表される構造を有する繰り返し単位２となる。式ＩＩ’で表される繰り返し単位２における各基については式ＩＩ’’で表されるモノマー２について上記した通りである。
【０１２７】
式ＩＩ’で表される繰り返し単位２を有する重合体に、アミノグリコシド系抗生物質を反応させると、繰り返し単位２は、式ＩＩで表される構造に変化する。
【０１２８】
上記式ＩＩにおいてＲ２５は、式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるＲ２８がアミノグリコシド系抗生物質と置換可能な脱離基である実施形態では、アミノグリコシド系抗生物質を含む一価の基である。例えば、Ｒ２８が第一級アミノ基又は水酸基により置換可能な脱離基である場合、上記式ＩＩにおいてＲ２５は、アミノグリコシド系抗生物質のアミノ基又は水酸基の一つの水素原子が脱落して形成される１価の基である。この場合式ＩＩにおけるＬ２４は、式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるＬ２４と同一である。
【０１２９】
また、上記式ＩＩにおいてＲ２５は、式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるＲ２８が前記反応性基である実施形態では、前記反応性基とアミノグリコシド系抗生物質の官能基の一つとが反応して形成される１価の基である。この１価の基は、通常、その部分構造として、アミノグリコシド系抗生物質を含む１価の基を含む。この場合もまた式ＩＩにおけるＬ２４は、式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるＬ２４と同一である。
【０１３０】
また、上記式ＩＩにおいてＲ２５は、式ＩＩ’及び式ＩＩ’’においてＲ２６とＲ２７とが一体となって式ＩＶで表される基を形成している実施形態では、アミノグリコシド系抗生物質を含む１価の基（典型的には、アミノグリコシド系抗生物質のアミノ基又は水酸基から１つの水素原子が脱落して形成される１価の基）である。この場合式ＩＩにおけるＬ２４は、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）である。また、この場合、式ＩＩにおけるＲ２２はカルボキシ基である。
【０１３１】
式ＩＩ’及び式ＩＩ’’においてＲ２１が水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基である場合には、式ＩＩにおいてもＲ２１は式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるのと同一である。
【０１３２】
式ＩＩ’及び式ＩＩ’’においてＲ２６が水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基である場合には、式ＩＩにおけるＲ２２は式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるＲ２６と同一である。
【０１３３】
式ＩＩ’及び式ＩＩ’’においてＲ２３が水素、アルキル基、芳香族基又は芳香族アルキル基である場合には、式ＩＩにおいてもＲ２３は式ＩＩ’及び式ＩＩ’’におけるのと同一である。
【０１３４】
＜重合＞
上記で例示したようなモノマー１とモノマー２とを共重合させて重合体を形成することができる。
【０１３５】
モノマー１とモノマー２とを適当な溶媒中でラジカル重合開始剤の存在下で反応させることによりランダム共重合体として基材及び抗生物質を連結する前の重合体を得ることができる。溶媒、ラジカル重合開始剤、反応温度、反応時間などの諸条件は当業者であれば適宜設定することができるが、好ましくは溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、水／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）混合溶媒等を用いることができ、特にＤＭＦ又はＤＭＳＯが好ましい。ただしモノマー１における前記連結性基が前記ケイ素含有基である場合には水を含まない溶媒が好ましい。ラジカル重合開始剤としてはアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＡＰＤ）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等を用いることができ、特にＡＩＢＮが好ましい。反応温度は例えば４０℃以上、１２０℃以下の範囲内、より好ましくは５０℃以上、より好ましくは１００℃以下、更に好ましくは６０℃以上、更に好ましくは８０℃以下とすることができる。反応時間は例えば０．５時間以上、５０時間以下とすることができ、より好ましくは１．０時間以上、２５時間以下、更に好ましくは６時間以上、１２時間以下、更に好ましくは１０時間以上とすることができる。重合反応は窒素雰囲気下において行うことが好ましい。反応条件をこの範囲とすることによりリンカー化合物として使用できる分子量の重合体を効率的に製造することができる。
【０１３６】
共重合の際には、モノマー１とモノマー２以外に更なる１種以上の他のモノマーを加えてもよい。他のモノマーとしてはラジカル重合性二重結合を少なくとも１つ有するものであれば特に限定されず、ビニル系モノマー、例えばアクリレート系モノマー、メタクリレート系モノマー、アクリルアミド系モノマー、メタクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー等を使用することができる。例えば重合体に親水性を付与する目的では２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等の親水性モノマーを他のモノマーとして加えることができる。より好ましくは、基材及び抗生物質を連結する前の重合体の１分子に含まれる全繰り返し単位における、繰り返し単位１（モノマー１由来繰り返し単位）と繰り返し単位２（モノマー２由来繰り返し単位）との合計は、基材へのリンカーの連結箇所とリンカーに連結した前記抗生物質の量を十分に確保する観点から、好ましくは５０モル％以上、より好ましくは６０モル％以上、より好ましくは７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、より好ましくは９５モル％以上、最も好ましくは１００モル％である。
【０１３７】
重合の際に原料として用いるモノマー１とモノマー２と他のモノマーとの比は、上述したような所望の繰り返し単位のモル比に応じたモル比とすることができる。
【０１３８】
基材及び抗生物質を連結する前の重合体の分子量は特に限定されないが、好ましくは重量平均分子量（Ｍｗ）として１，０００以上、１，０００，０００以下であり、より好ましくは２，０００以上であり、より好ましくは５００，０００以下、２００，０００以下、１００，０００以下である。ここで、重量平均分子量は、標準ポリエチレングリコールとして換算した重量平均分子量を採用することができ、分子量の測定方法は特に限定されないが、動的光散乱法、静的光散乱法、粘度測定に基づく方法が挙げられ、粘度測定に基づく方法が、炭素−炭素単結合により連結した炭素原子により構成された主鎖を含む重合体の分子量測定に特に適している。Ｍｗがこの範囲内であるとき、基材へ連結する際及び／又は抗生物質の連結の際の重合体の取り扱いが容易であり、基材表面に重合体及び／又は抗生物質を効率的に配置することができる。また、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は分子量分布であり、分子量分布の範囲は特に限定されないが、望ましくは２以下である。
【０１３９】
前記重合体の末端の構造は特に限定されず、前記のような重合開始剤に由来する基が結合していてもよいし、他の適当な基により末端が封止されていてもよい。
【０１４０】
＜細胞分離材の製造方法＞
本発明の細胞分離材の製造方法は特に限定されないが、好ましい実施形態としては、
基材と、
前記基材に連結可能な連結性基、及び、前記アミノグリコシド系抗生物質と結合を形成可能な反応性基を含むリンカー（「リンカー化合物」または「リンカー前駆体」）とを、
前記連結性基を介して連結して基材−リンカー結合体を形成する、リンカー連結工程と、
基材−リンカー結合体における前記反応性基とアミノグリコシド系抗生物質とを反応させて、前記リンカーにアミノグリコシド系抗生物質を結合させる、抗生物質結合工程と
を行うことが挙げられる。
【０１４１】
リンカー化合物が前記で挙げたような重合体である場合、上記の＜重合＞の欄で例示したようにモノマー分子の重合により合成することができる。
【０１４２】
リンカー連結工程は、リンカーが有する少なくとも１つの連結性基と、基材表面上の基との組み合わせに応じて適宜条件を設定することができる。前記連結性基と前記基材表面上の基との組み合わせと形成される結合の具体例は既述の通りである。また前記連結性基と前記基材表面上の基とを反応させる際に、一方又は両方を反応性の高い官能基に誘導体化してから反応させてもよい。例えば、リンカーの連結性基が、合計１〜３個の−ＯＲ１７及び／又はハロゲン原子と結合したケイ素原子を有する基であり、基材表面上の基が水酸基である場合、重合体をＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒中で溶解した溶液を基材に接触させてインキュベートしてＳｉ−Ｏ結合を形成させることができ、インキュベート中に又はインキュベート後に６０℃以上、例えば１００℃程度、の温度での加熱、及び／又はマイクロ波の照射により、前記ケイ素原子に結合した−ＯＲ１７又はハロゲン原子をＲ１７ＯＨ又はハロゲンイオンとして脱離させてＳｉ−Ｏ結合の形成を促進することができる。
【０１４３】
最終的な基材が繊維の集合体、又は、粒体の集合体である実施形態では、繊維又は粒体を基材として上記のリンカー連結工程及び抗生物質結合工程を行った後に、リンカー及び抗生物質が連結された繊維又は粒体を用いて繊維の集合体又は粒体の集合体を形成して本発明の細胞分離材を製造する方法（態様１）、繊維又は粒体を基材として上記のリンカー連結工程を行い、その後に、リンカーが連結された繊維又は粒体を用いて繊維の集合体又は粒体の集合体を形成し、その後に上記の抗生物質結合工程を行って本発明の細胞分離材を製造する方法（態様２）、繊維の集合体又は粒体の集合体を基材として上記のリンカー連結工程及び抗生物質結合工程を行って本発明の細胞分離材を製造する方法（態様３）等の各種態様とすることができる。上記の本発明の細胞分離材の製造方法は、これらのいずれの態様も包含する。
【０１４４】
抗生物質結合工程において、基材−リンカー結合体とアミノグリコシド系抗生物質とを反応させる際の反応条件もまたリンカーの反応性基とアミノグリコシド系抗生物質との組み合わせに応じて適宜決定することができる。アミノグリコシド系抗生物質には複数の第一級アミノ基が存在し、それぞれｐＫａ値が異なる。そこでリンカーの反応性基とアミノグリコシド系抗生物質の第一級アミノ基とを反応させる場合には、抗生物質結合工程では、使用するアミノグリコシド系抗生物質に含まれる第一級アミノ基のうち最も低いｐＫａ値よりも高いｐＨ値条件において基材−リンカー結合体とアミノグリコシド系抗生物質とを反応させることが好ましい。
【０１４５】
リンカー連結工程と抗生物質結合工程の後にはそれぞれ適宜洗浄工程を行ってもよい。
抗生物質結合工程において、基材−リンカー結合体での前記反応性基の一部がアミノグリコシド系抗生物質と反応せず残存する場合は、抗生物質結合工程後に更に、残存した前記反応性基と結合を形成し得る官能基を有する他の化合物と基材−リンカー結合体とを反応させて、前記他の化合物を含有する基を導入する残存反応性基処理工程行ってもよい。前記他の化合物の具体例は既述の通りである。
【０１４６】
本発明の細胞分離材において、基材上への前記リンカーの結合量は特に限定されず目的に応じて適宜調節することができる。本発明の細胞分離材がリンカーとして前記重合体を備える実施形態では、基材の表面のうち、アミノグリコシド系抗生物質が連結されている領域において、前記重合体が構成モノマー換算で好ましくは０．２μｍｏｌ／ｃｍ２以上の密度で連結され、該密度はより好ましくは２μｍｏｌ／ｃｍ２以上、５μｍｏｌ／ｃｍ２以上、１０μｍｏｌ／ｃｍ２以上であり、上限は特に限定されないが例えば２，０００μｍｏｌ／ｃｍ２以下、好ましくは２００μｍｏｌ／ｃｍ２以下、１００μｍｏｌ／ｃｍ２以下、５０μｍｏｌ／ｃｍ２以下である。本発明の細胞分離材は、基材表面上での前記重合体の結合密度が前記範囲である場合に特に効率的に細胞を捕捉することが可能である。
【０１４７】
＜細胞分離材の形態＞
本発明の細胞分離材はそのまま細胞の分離に用いることができる。特に、細胞分離材の基材の形態が、ディッシュ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどの面部分を少なくとも一部に含む基材である場合、細胞分離材はそのまま細胞の分離に使用するのに適している。
【０１４８】
本発明の細胞分離材はまた、液体入口および／または液体出口を有する容器に充填して用いてもよい。容器と、該容器に充填された本発明の細胞分離材との組み合わせを特に細胞分離デバイスという場合がある。
【０１４９】
細胞分離材の基材が、繊維の集合体、粒体の集合体、多孔体等の、連通孔を有する構造体である場合に、細胞分離材を容器に充填して用いることが好ましい。
【０１５０】
該容器の形態、材質、大きさにはとくに限定されず、コンテナ、バッグ、チューブ、カラム、カセット、フラスコなど任意の形態であってよい。細胞分離デバイスの一例を挙げると、容量約０．１ｍｌ以上、約５００ｍｌ以下の程度、直径約０．１ｃｍ以上、約１０ｃｍ以下の程度の透明または半透明の筒状容器に、球状担体などの連通孔を有する構造体を充填し、カラム形状としたものが挙げられ、該カラムは細胞分離デバイスとして有用である。該デバイスは、体液流入口および体液流出口のある容器に液体流入口と液体流出口を仕切るように装着・充填し、フィルターまたはクロスフロー型モジュールとすることが好ましく、該フィルターおよびクロスフロー型モジュールも細胞分離デバイスの一形態である。また容器に、基材が連通孔を有する構造体により構成される細胞分離材を装着・充填する場合は、細胞分離材を容器内に単層もしくは複数層となるように積層することができ、また表面にアミノグリコシド系抗生物質が連結されていない材料と組み合わせて装着・充填することもできる。
【０１５１】
細胞分離デバイスを構成する容器の素材としては、特に限定されるものではないが、非反応性ポリマー、生物親和性金属あるいはその合金、ガラス等が使用される。または、これら非反応性ポリマーや生物親和性金属でコートあるいはメッキされた材料でも良い。具体的には、該ポリマーとして、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレンまたはヘキサフルオロプロピレン等のハロゲン化ポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン等が挙げられる。金属材料としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、および窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられる。ガラスとしては、シリコンコートされたガラスであっても良い。特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。
【０１５２】
＜捕捉対象細胞＞
本発明の細胞分離材により捕捉され分離される細胞は、アミノグリコシド系抗生物質と結合し得る構造を表面に有する細胞であれば特に限定されないが、好ましくは、表面にカルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）が存在する細胞である。ＣａＳＲとアミノグリコシド系抗生物質との親和性は細胞を捕捉するには十分に高いが容易に脱離可能な程度に低いため、本発明の細胞分離材により捕捉された、表面にＣａＳＲを含む細胞は、細胞にダメージを与えることなく回収することが可能であり、回収された細胞を利用するのに適している。
【０１５３】
表面にＣａＳＲが存在する細胞としては単球、間葉系幹細胞、副甲状腺細胞、卵巣上皮細胞等が挙げられる。また、膵臓又は腎臓から分離された細胞も、多くの場合は、表面にＣａＳＲが存在する細胞である。単球とは、造血幹細胞由来の単球系細胞である。細胞の起源としてはヒト等の哺乳動物が好ましいが特に限定されない。
【０１５４】
＜細胞を含有する試料＞
本発明の細胞分離材により処理する試料としては細胞を含有する試料であれば特に限定されず、血液、リンパ液、骨髄液等の体液、細胞を含む生体試料や、これらから調製された細胞懸濁液が挙げられる。細胞を含有する試料は、好ましくはカルシウムイオンを実質的に含まず、例えばカルシウムイオンが含むとしてもその濃度は１ｍＭ未満、特に０．５ｍＭ未満であり、好ましくはカルシウムイオンを含まない。
【０１５５】
単球を含有する試料としては、少なくとも単球を含有する細胞浮遊液を指し、通常は単球に加えてリンパ球を含有する、すなわち単核球を含有する細胞浮遊液を指す。単球を含有する試料としては、典型的には、末梢血液、骨髄液、臍帯血液等の単球含有体液或いは、これらの体液に遠心分離処理、または所望によりフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）等を使用し、比重密度遠心分離処理を施した細胞懸濁液が挙げられる。単球含有体液から単球含有試料を採取する際、一般的に使用されている抗凝固剤として、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバンや、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）などのクエン酸含有抗凝固剤などを使用してもよい。なかでもクエン酸含有抗凝固剤、又はヘパリンは、一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げることができる。
【０１５６】
間葉系幹細胞を含有する試料としては、少なくとも間葉系幹細胞を含有する細胞浮遊液が例示できる。該細胞浮遊液の具体例としては、白血球に加えて赤血球を含有する、すなわち血球を含有する細胞浮遊液が例示できる。間葉系幹細胞を含有する試料としては、典型的には、末梢血液、骨髄液、臍帯血液、胎盤、羊膜等の間葉系幹細胞含有生体試料或いは、これらの生体試料を処理して調製した細胞懸濁液が挙げられる。前記細胞懸濁液としては遠心分離処理、または所望によりフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）等を使用し、比重密度遠心分離処理を施した細胞懸濁液が挙げられる。間葉系幹細胞含有生体試料から間葉系幹細胞を含有する試料を採取する際、一般的に使用されている抗凝固剤として、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバンや、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）などのクエン酸含有抗凝固剤などを使用してもよい。なかでもクエン酸含有抗凝固剤、又はヘパリンは、一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げることができる。また、間葉系幹細胞含有生体試料から間葉系幹細胞を含有する試料を採取する際、一般的に使用されている酵素として、コラゲナーゼ、金属プロテアーゼであるサーモリシン及びディスパーゼを使用してもよい。
【０１５７】
＜細胞の分離方法＞
本発明はまた、
試料中の細胞を分離する方法であって、
本発明の細胞分離材と、試料とを接触させて、前記試料中の細胞を前記細胞分離材により捕捉する細胞捕捉工程、
を含む方法に関する。
【０１５８】
本方法は更に、細胞捕捉工程後に、細胞分離材から非捕捉細胞を洗浄液で洗浄除去する洗浄工程を含むことができる。
本方法は更に、捕捉された細胞を細胞分離材から回収する回収工程を含むことができる。
【０１５９】
細胞捕捉工程において、細胞分離材と、捕捉対象細胞を含有する試料とを接触させる条件は特に限定されない。接触時間としては例えば５分間以上、１２０分間以下が例示でき、細胞の安定した捕捉及び細胞に対するダメージを少なくするという観点から、３０分間以上、９０分間以下が好ましい。接触させる試料のｐＨ、接触温度は特に限定されないが、体内環境と同等のｐＨ（例えば７以上、８以下）及び温度（例えば３２℃以上、４０℃以下、より好ましくは３６以上、３８℃以下、最も好ましくは３７．０±０．５℃）が望ましい。細胞捕捉工程はカルシウムイオンが実質的に存在しない条件下（例えばカルシウムイオンが存在したとしても１ｍＭ未満又は０．５ｍＭ未満である条件下）で行われることが好ましい。細胞分離材が、面部分を少なくとも一部に含む基材と、該面部分に連結したアミノグリコシド系抗生物質とを含む実施形態では、それを用いた細胞捕捉工程としては、該面部分の表面が底となるように配置し細胞含有試料を載せた状態で静置して接触させることが好ましい。細胞分離材が、連通孔を有する構造体を基材とする細胞分離材である実施形態では、前記試料を細胞分離材に透過させる又は含浸させることにより、前記試料を細胞分離材に接触させることができる。
【０１６０】
細胞捕捉工程後に洗浄工程を行う場合、まず細胞捕捉工程で接触させた試料を細胞分離材から除去する。試料を除去後、適当な洗浄液を用いて細胞分離材に残存する非捕捉細胞を洗浄除去することができる。洗浄液としては生理食塩液、リンゲル液、リン酸緩衝液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用液体培地が挙げられるがこの限りではない。接触させる洗浄液のｐＨ、接触温度は特に限定されないが、体内環境と同等のｐＨ（例えば７以上、８以下）及び温度（例えば３２℃以上、４０℃以下、より好ましくは３６度以上、３８℃以下、最も好ましくは３７．０±０．５℃）が望ましい。
【０１６１】
前記細胞捕捉工程において捕捉された細胞を、細胞分離材から回収する回収工程は、好ましくは前記洗浄工程の後に行う。回収工程は、細胞を捕捉した細胞分離材に適当な細胞回収溶液を接触させることで行う。細胞回収溶液としては生理食塩液；液体培地；細胞保存液；アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）等の２価カチオンキレート剤を含む溶液が挙げられる。細胞の回収操作は、細胞回収溶液を、細胞を捕捉した細胞分離材に接触させて、静置、振とう、或いは循環させながら行い、その後、ピペッティング、振動の付加、捕捉された細胞に損傷を与えない程度に細胞回収溶液を勢いよく押し出す方法（例えばフラッシングなど）などにより細胞を回収することができる。押し出す手段としては、空気あるいは不活性ガス、生理食塩液などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。この際、回収効率を上げるために、４℃まで冷却、あるいは３７℃までの加温操作を併用してもよい。また単球の回収が不十分な場合は、上記回収操作を繰り返し行ってもよい。
【０１６２】
＜分化能を有する細胞を分化誘導する方法＞
本発明はまた、
分化能を有する細胞を分化誘導する方法であって、
本発明の細胞分離材を用いた前記方法より細胞含有試料から分化能を有する細胞を分離する細胞分離工程と、
前記細胞分離工程で分離された前記細胞を分化誘導する分化誘導工程と
を含む方法に関する。
【０１６３】
ここで「分化能を有する細胞」とは、多分化能を有する細胞と、単分化能を有する細胞とを包含し、未分化の細胞には限らず分化の途上にある細胞も包含する。例えば間葉系細胞に分化し得る間葉系幹細胞；樹状細胞、破骨細胞、マクロファージ等に分化し得る単球；これらの細胞のうち１種から成熟細胞へと分化する途上にあり、成熟細胞に至っていない細胞等が典型的な例である。
【０１６４】
「分化誘導」とは、分化能を有する細胞に対して分化を進行させることを指し、分化の途上の状態まで分化させることや、成熟細胞まで分化させることを包含する。分化能を有する細胞を成熟細胞にまで分化誘導させる場合、成熟細胞に特異的な分化マーカーが検出される状態にまで前記細胞の分化を進行させることができる。
【０１６５】
前記細胞分離工程は、本発明の細胞分離材を用いた上記の方法により、分化能を有する細胞を含有する試料から該細胞を本発明の細胞分離材により捕捉して分離する工程である。前記細胞分離工程は、少なくとも前記細胞捕捉工程を含み、前記洗浄工程及び前記回収工程のうち一方又は両方を更に含んでよい。
【０１６６】
前記分化誘導工程における「前記細胞分離工程で分離された前記細胞」とは、前記細胞分離工程で試料から分離された分化能を有する細胞であればよく、前記細胞捕捉工程の後の（好ましくは更に前記洗浄工程を経た後の）細胞分離材に捕捉されたままの細胞であってもよいし、前記細胞捕捉工程の後の（好ましくは更に前記洗浄工程を経た後の）細胞分離材から前記回収工程により回収された細胞であってもよい。
【０１６７】
分化誘導工程が細胞分離材に捕捉された状態の細胞を分化誘導する工程である場合は、分化誘導後に細胞分離材から細胞を回収する細胞回収工程を更に行うことができる。
【０１６８】
例えば本発明の細胞分離材を用いて単球を分離する場合には、分離した単球を更に分化誘導して樹状細胞を製造することが好ましい。ここで樹状細胞とは、単球をインターロイキン−４（ＩＬ−４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカイン類により分化誘導した未熟樹状細胞、さらに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１−β（ＩＬ１−β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などのサイトカイン類を添加して分化誘導した成熟樹状細胞、癌抗原の添加に代表される抗原提示能を獲得させる工程を経て、癌抗原を提示させた樹状細胞等を意味する。
【０１６９】
細胞分離材に捕捉された状態の単球を分化誘導して樹状細胞にする場合、単球を捕捉したままの細胞分離材をＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン類を含有する液体培地に接触させておよそ３日間以上、７日間以下の期間培養し未熟樹状細胞に分化誘導させることができる。その後、前記液体培地を、ＴＮＦα、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２などのサイトカイン類を含有する液体培地に交換し、該培地中で更におよそ１日以上、３日間以下の期間培養して成熟樹状細胞に分化誘導させることができる。また必要に応じて、癌抗原の添加に代表される抗原提示能を獲得させる工程を経て、癌抗原を提示させた樹状細胞に分化誘導することもできる。分化誘導後の樹状細胞を細胞分離材から回収する方法としては、単球を細胞分離材から回収する方法として上記したのと同様の方法を用いることができる。
【０１７０】
細胞分離材から前記回収工程を経て回収された単球を分化誘導して樹状細胞にする場合、回収された単球を適当な容器、例えば細胞培養用のディッシュやフラスコに移動させ、該容器にＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン類を含有する液体培地を加えておよそ３日間以上、７日間以下の期間培養し未熟樹状細胞に分化誘導させることができる。その後、前記液体培地を、ＴＮＦα、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２などのサイトカイン類を含有する液体培地に交換し、該培地中で更におよそ１日以上、３日間以下の期間培養して成熟樹状細胞に分化誘導させることができる。また必要に応じて、癌抗原の添加に代表される抗原提示能を獲得させる工程を経て、癌抗原を提示させた樹状細胞に分化誘導することもできる。分化誘導後の樹状細胞を前記容器から回収する方法としては、ピペッティング等により回収する方法や、単球を細胞分離材から回収する方法として上記したのと同様の方法を用いることができる。
【実施例】
【０１７１】
実験１：重合体の合成
【化１８】
2017112910.tif 000019
（式中、ｍはＴＭＳＭＡの重合度を表し、ｎはＮＡＳの重合度を表す）
【０１７２】
下記の手順により、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）（以下「ＴＭＳＭＡ」と称する場合がある）と、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（東京化成工業株式会社（ＴＣＩ））（以下「ＮＡＳ」と称する場合がある）とをランダム共重合させて重合体（以下「ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）」と称する場合がある）を合成した。
【０１７３】
ＴＭＳＭＡとＮＡＳとのモル比として、５：５、３：７、１：９の３種類のｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を調製した。
【０１７４】
まず、ダイヤグラムポンプで吸引しながら熱をかけ乾燥させたシュレンク管内を窒素置換したものを用意した。
【０１７５】
ＴＭＳＭＡとしては、予めアルミナカラムに通して重合禁止剤を除いたＴＭＳＭＡを用いた。
【０１７６】
ＴＭＳＭＡとＮＡＳとのモル比を５：５とする場合、２３８０μＬ（１０ｍｍｏｌ）のＴＭＳＭＡと、１６９０ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮＡＳとを、２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、前記シュレンク管に入れた。この溶液中のモノマー濃度は１９８ｇ／Ｌであった。
【０１７７】
ＴＭＳＭＡとＮＡＳとのモル比を３：７とする場合、１４３０μＬ（６ｍｍｏｌ）のＴＭＳＭＡと、２３７０ｍｇ（１４ｍｍｏｌ）のＮＡＳとを、２０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、前記シュレンク管に入れた。この溶液中のモノマー濃度は１８５ｇ／Ｌであった。
【０１７８】
ＴＭＳＭＡとＮＡＳとのモル比を１：９とする場合、４７５μＬ（２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＭＡと、３０４０ｍｇ（１８ｍｍｏｌ）のＮＡＳとを、２０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、前記シュレンク管に入れた。この溶液中のモノマー濃度は１７２ｇ／Ｌであった。
【０１７９】
前記シュレンク管内において前記各溶液に３０分間窒素バブリングし窒素雰囲気下にしたのち、０．２ｍｍｏｌのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を０．５ｍＬのＤＭＦで溶解させたものをそれぞれ加え、重合を開始した。
【０１８０】
その後、再びダイヤグラムポンプを使い、シュレンク管内の空気を吸引後、窒素を充填し、反応混合液を７０℃の油槽中で反応させた。２０時間後に開封して反応を終了させた。
【０１８１】
合成された３種類のｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）の分子量を、動的光散乱測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー）を用いて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のスタンダード試料と比較して推定したところ、いずれも重量平均分子量が約１０，０００であった。
【０１８２】
実験２：基材−重合体結合体、及び、細胞分離材の製造
基材として用いたプラスチック容器は、直径３５ｍｍ、高さ１０ｍｍの円形皿状のＦａｌｃｏｎ社製イージーグリップ細胞培養ディッシュ（素材：ポリスチレン）である。
【０１８３】
前記プラスチック容器にオゾン雰囲気下でＵＶを３０分間照射し、表面を親水性にした。このとき容器表面には水酸基、カルボニル基及びカルボン酸基のうち少なくとも１種の基が導入されたと考えられ、特に、少なくとも水酸基が導入されたと考えられる。
【０１８４】
実験１で得られた各ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を含む反応混合液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により希釈して、原料モノマー重量換算で２０ｇ／Ｌの濃度の溶液を調製した。この溶液約２ｍＬを、ＵＶ／オゾン処理後の前記容器に加えた。
【０１８５】
常温（約２５℃）で一晩静置し、前記容器内の表面にｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を結合させた。
その後、前記容器内の溶液を廃棄し、前記容器をＤＭＳＯ、蒸留水の順番で濯いだ。
【０１８６】
容器に残った水気を空気流により除去し５００Ｗ強のレンジで１分加熱し、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を固定化した。
【０１８７】
こうして、３種類のｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）がそれぞれ固定化されたプラスチック容器（基材−重合体結合体）を作製した。ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）の全量が前記培養ディッシュの内底面に結合していると仮定すると、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）のＴＭＳＭＡ：ＮＡＳのモル比が１：９である場合は前記内底面にＮＡＳ単位が約２１μｍｏｌ／ｃｍ２含まれ、前記比が３：７である場合は前記内底面にＮＡＳ単位が約１５μｍｏｌ／ｃｍ２含まれ、前記比が５：５である場合は前記内底面にＮＡＳ単位が約１０μｍｏｌ／ｃｍ２含まれると算出できる。
【０１８８】
次にネオマイシンをｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）に結合した。
ネオマイシンとして、ナカライテスク株式会社から市販されているネオマイシン硫酸塩（Ｃ２３Ｈ４６Ｎ６Ｏ１３・３Ｈ２ＳＯ４＝９０８．８８）を用いた。このネオマイシン硫酸塩は、実質的に、ネオマイシンＢの硫酸塩のみからなると考えられる。
【０１８９】
ネオマイシンをｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０ｍＭの濃度となるように調整して、ネオマイシン溶液を調製した。このネオマイシン溶液を約２ｍＬ、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）が固定化されたプラスチック容器に入れ、３７℃に調整したインキュベーター内にて一晩静置した。
その後、容器内の溶液をすて容器を蒸留水で洗い、空気流を当てて水気を除去した。
【０１９０】
次に、未反応のスクシンイミド基を除去するために、約２ｍＬの１体積％エタノールアミン水溶液を容器に入れ、２時間静置した。
２時間静置後に、容器内の液を廃棄し、蒸留水で洗い、空気流で水気を除去した。
【０１９１】
こうしてネオマイシンが重合体を介して結合したプラスチック容器（細胞分離材）を調製した。上記処理において、ネオマイシンの全量がプラスチック容器の内底面に結合したとすると、該面にはネオマイシンが約２μｍｏｌ／ｃｍ２の密度で存在することになる。
【０１９２】
高分子を固定化した細胞培養ディッシュについて、ＸＰＳ（Ｋｒａｔｏｓ  ＡＸＩＳ−ＵＬＴＲＡ  ＤＬＤ）を測定して、ネオマイシンの固定化を確認した。図１において（Ａ）は、高分子を固定化したが該高分子をネオマイシンで修飾していない細胞培養ディッシュのＮ（１ｓ）のピーク強度を示し、（Ｂ）は、高分子を固定化し且つ該高分子をネオマイシンで修飾した細胞培養ディッシュのＮ（１ｓ）のピーク強度を示す。Ｎ（１ｓ）のピーク強度がネオマイシンによる修飾前後で、有意に増加したことから、ネオマイシンが固定されていることが確認された（図１）。
【０１９３】
実験３：細胞分離材を用いた単球の分離と樹状細胞への分化
（実施例１）
ヒト末梢血（ここで用いた、特定のヒトに由来するヒト末梢血を「ヒト末梢血Ａ」とする）から単核球をフィコール法で回収した。ＰＢＳを用いて単核球の洗浄を行った後、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、ＳＹＳＭＥＸの血球カウンターで単核球の数及び組成を測定した。
【０１９４】
次に、調製した単核球懸濁液を、実験２で製造した、ネオマイシン修飾済ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）（ＴＭＳＭＡ：ＮＡＳ＝３：７（モル比））を固定したポリスチレン製細胞培養ディッシュに６×１０５個ＰＢＭＣ（末梢血単核球）／ｃｍ２の密度で添加した後に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて６０分間静置した。６０分間静置後、上清の回収を行い、また細胞培養ディッシュは生理食塩液２ｍＬにて２回洗浄を行った。回収液を濃縮し、血球カウンターで細胞数及び組成を測定した。
【０１９５】
単球の吸着率は下記の式（１）にて求めた。
単球吸着率（％）
＝（１−（容器から回収した単球数／播種前の単球数））×１００・・・・・式（１）
その結果、単球吸着率は７３．９５％であることがわかった。
【０１９６】
（実施例２）
基材としてポリスチレン製細胞培養ディッシュに代えてスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を使用した以外は前記実験２と同様の手順により、ネオマイシン修飾済ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）（ＴＭＳＭＡ：ＮＡＳ＝３：７（モル比））を固定したスライドガラスを製造した。
【０１９７】
実施例１で用いたヒト末梢血Ａとは異なるヒトに由来するヒト末梢血（「ヒト末梢血Ｂ」とする）から、実施例１で説明したのと同様の手順で単核球懸濁液を調製した。
【０１９８】
前記スライドガラスを用いて前記単核球懸濁液から単球を分離し、単球の吸着率を求めた。その結果、単球吸着率は７３．１０％であることがわかった。
【０１９９】
（実施例３）
基材としてポリスチレン製細胞培養ディッシュに代えてスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を使用した以外は前記実験２と同様の手順により、ＴＭＳＭＡ：ＮＡＳのモル比が１：９、３：７、５：５の３種類のネオマイシン修飾済ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を固定したスライドガラスを製造した。
【０２００】
前記スライドガラスを用いて上記実施例１と同様の手順で上記のヒト末梢血とは異なるヒトに由来するヒト末梢血（「ヒト末梢血Ｃ」とする）から調製したヒト末梢血由来単核球懸濁液から単球を分離し、単球の吸着率を求めた。その結果、前記比が１：９の場合、単球吸着率は８０．４７％、３：７の場合、単球吸着率は８５．５１％、５：５の場合、単球吸着率は７３．３９％であることがわかった。
【０２０１】
（比較例１）
実験２で基材として用いたポリスチレン製細胞培養ディッシュを、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を固定せずに用いた以外は実施例１と同様の手順でヒト末梢血Ａ由来単核球懸濁液から単球を分離し、単球の吸着率を求めた。その結果、単球の吸着率は５５．２７％であった。
【０２０２】
（比較例２）
実施例２で基材として用いたスライドガラスを、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を固定せずに用いた以外は実施例２と同様の手順でヒト末梢血Ｂ由来単核球懸濁液から単球を分離し、単球の吸着率を求めた。その結果、単球の吸着率は２４．３９％であった。
【０２０３】
（実施例４）
（１）細胞分離材及び単球の調製
基材としてポリスチレン製細胞培養ディッシュに代えてガラス製ディッシュ（ＴＯＰ）を使用した以外は前記実験２と同様の手順により、ネオマイシン修飾済ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）（ＴＭＳＭＡ：ＮＡＳ＝３：７（モル比））を固定したガラス製ディッシュを製造した。
【０２０４】
実施例１記載の方法に準じ上記のヒト末梢血とは異なるヒトに由来するヒト末梢血（「ヒト末梢血Ｄ」とする）から調製した単核球懸濁液を、前記のネオマイシン修飾済ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）（ＴＭＳＭＡ：ＮＡＳ＝３：７（モル比））固定ガラス製ディッシュ（ＴＯＰ）に６×１０５個ＰＢＭＣ／ｃｍ２の密度で添加した後に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて６０分間静置した。６０分間静置後、上清を除去しリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２ｍＬ添加後、ゆっくりと細胞培養ディッシュ内を攪拌し、上清を除去する洗浄操作を行った。該洗浄操作を２回繰り返すことにより、非捕捉細胞の洗浄除去を行った。単球の吸着率は７３．８８％であった。
【０２０５】
その後、インターロイキン４（ＩＬ−４）：５００ＩＵ／ｍＬ，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）：５００ＩＵ／ｍＬになるように調製したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ製、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％添加済み）培地を２ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて５日間培養を行った。この培養により単球の樹状細胞への分化を促進した。
【０２０６】
その後、樹状細胞を成熟させるため、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦを添加した培地にさらに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）：１０ｎｇ／ｍＬ，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）：１μｇ／ｍＬになるように試薬を添加し、培地交換を行い、更に２日間（合計で７日間）培養を行った。
【０２０７】
（２）樹状細胞の回収
合計で培養７日後、ピペッティング操作にて細胞培養ディッシュにある細胞を回収し、細胞数を血球計算盤にて求めた。
【０２０８】
（３）樹状細胞の同定
樹状細胞の回収操作で得られた細胞懸濁液をポリプロピレン製試験管に１００μＬ分取し、抗ＣＤ８３抗体（ＦＩＴＣ標識）溶液、及び抗ＣＤ８６抗体（ＰＥ標識）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）溶液をそれぞれ５μＬずつ添加し、冷暗所にて３０分間静置した。３０分間静置後、１５００ｒｐｍ，５分間遠心分離を行い、上清を除去した後にＰＢＳを０．５ｍＬ添加し、フローサイトメーターにて測定を行った。測定の結果、表面抗原ＣＤ８３＋かつＣＤ８６＋を成熟樹状細胞とし陽性率を求めた。陽性率は、蛍光染色された細胞が全細胞に占めるパーセンテージを意味する。
【０２０９】
成熟樹状細胞数は、下式（２）より求めた。
（シャーレから回収した成熟樹状細胞数）
＝（シャーレから回収した総細胞数）×（樹状細胞陽性率）・・・式（２）
その結果、回収した樹状細胞数は４．３×１０５個であった。
樹状細胞陽性率は７６．５％であった。
【０２１０】
（比較例３）
実施例４においてガラス製ディッシュを、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を固定せずに用いた以外は実施例４と同様の手順にてヒト末梢血Ｄ由来単核球懸濁液から成熟細胞を調製し成熟樹状細胞数を求めた。その結果、単球の吸着率は６０．７５％であった。回収した樹状細胞数は３．０×１０５個であった。
樹状細胞陽性率は７６．２％であった。
【０２１１】
【表１】
2017112910.tif 000020
【０２１２】
実験４：ＮＡＳとラジカル重合性二重結合を有する化合物とからの重合体の調製
Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＮＡＳ）は、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＭＳＭＡ）だけでなくラジカル重合性二重結合を有する他の化合物とも重合して重合体を形成することができる。そこでラジカル重合性二重結合を有する化合物の一例として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を用いて、ＮＡＳとＭＰＣとをランダム共重合させて重合体（以下「ｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）」と称する場合がある）を合成し、ＮＡＳ単位をネオマイシンにより修飾した実験結果を示す。この実験結果と、上記の実験１、２においてｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を合成しＮＡＳ単位をネオマイシンにより修飾した実験結果とから、ＮＡＳとＴＭＳＭＡとＭＰＣとをランダム共重合させた重合体であるｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ−ＭＰＣ）を合成しＮＡＳ単位をネオマイシンにより修飾することが可能であることが示される。
以下の試験で用いたＮＡＳ及びネオマイシンは実験１及び２で用いたものと同一である。
【０２１３】
【化１９】
2017112910.tif 000021
（式中、ｎはＮＡＳの重合度を表し、ｐはＭＰＣの重合度を表す）
【０２１４】
ＮＡＳ  ５ｍｍｏｌ（８４６ｍｇ）、ＭＰＣ（シグマアルドリッチ）５ｍｍｏｌ（１４８０ｍｇ）及び２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＡＰＤ）  ２７ｍｇを水／ＤＭＳＯ  １０ｍＬ中に溶解させ、窒素雰囲気下、７０度で１．５時間重合したところ、ｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）が得られた。得られた重合体を透析して、精製した。
【０２１５】
ｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）２３ｍｇ中に、ネオマイシン１０ｍＭ水溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２）を加えて、１２時間攪拌した。その後、精製水で透析を１日行い、未反応のネオマイシン、バッファーに含まれる塩を取り除いた。ＮＭＲによって解析し、ＮＡＳ単位に含まれるスクシンイミド基が全てネオマイシンに置換されていることを確認した。
【０２１６】
実験５：各種ｐＨ条件でのネオマイシンの結合
ネオマシンＢは６つのアミノ基を有しそれぞれｐＫａ値が異なることが知られている。Ｏｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１５２４８−１５２５４によれば遊離体のネオマイシンＢでの各アミノ基のｐＫａ値は１位：７．９、３位：５．７、２’位：７．４、６’位：８．１、２’’’’位：７．７、６’’’’位：８．７である。そこで重合体中のＮＡＳ単位のネオマイシンによる修飾反応のｐＨ依存性を確認するために、上記実験４で製造したｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）を用いて異なるｐＨ値条件下でネオマイシンとの反応性を確認した。本実験の結果は、基材上に固定されたｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）のＮＡＳ単位のネオマイシンによる修飾反応でのｐＨ依存性にも同様に妥当する。なおこの実験でｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を用いなかった理由は、ｐｏｌｙ（ＴＭＳＭＡ−ＮＡＳ）を、トリメチルシリル基を介して基材に固定した状態ではネオマイシンがＮＡＳ単位に結合しているか否かをＮＭＲで確認することができないためである。
【０２１７】
以下の試験で用いたネオマイシンは実験１及び２で用いたものと同一である。
（ｐＨ３での反応）
精製水にｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）２３ｍｇを溶解させて、ネオマイシン１０ｍＭ溶液１０ｍＬを加えた（精製水）、ｐＨは調整せず、出来た溶液のｐＨを調べたところ３−４の酸性となった。１２時間反応させた後に精製水によって透析を行い、凍結乾燥した後に、ＮＭＲによってネオマイシンの導入を確認したが、ネオマイシンは導入されていなかった。
【０２１８】
（ｐＨ５での反応）
酢酸バッファー（ｐＨ  ５．０  前後）にｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）２３ｍｇを溶解させて、ネオマイシン  １０ｍＭ溶液  １０ｍＬを加えた（酢酸バッファー）。１２時間反応させた後に精製水によって透析を行い、凍結乾燥した後に、ＮＭＲによってネオマイシンの導入を確認したが、ネオマイシンは導入されていなかった。
【０２１９】
（ｐＨ７．２での反応）
実験４に記載の通り、ＮＡＳ単位に含まれるスクシンイミド基が全てネオマイシンに置換された。
【０２２０】
（ｐＨ８．０での反応）
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０前後）にｐｏｌｙ（ＮＡＳ−ＭＰＣ）２３ｍｇを溶解させて、ネオマイシン１０ｍＭ溶液１０ｍＬを加えた（炭酸ナトリウムバッファー）。１２時間反応させた後に精製水によって透析を行い、凍結乾燥した後に、ＮＭＲによってネオマイシンの導入を確認した。ネオマイシンはＮＡＳの量だけ定量的に導入されていた。
【図１】
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