(57)【要約】      （修正有）【課題】１０ｍＭ以下のＤ−グルコース量を正確に測定すること。【解決手段】（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、（ｉｉ）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い、（ｉｉｉ）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、（ｉｖ）フラビン化合物を補酵素とする、（ｖ）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度におけるＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である、を備えるフラビン結合型ＧＤＨをＤ−グルコースと２０〜４０℃で接触させてＤ−グルコースを測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）から（ｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、
（ｉｉ）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｉｉ）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、
（ｉｖ）フラビン化合物を補酵素とする、
（ｖ）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度におけるＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である、かつ２０℃における活性値が７０％以上である、
を備えるフラビン結合型ＧＤＨをＤ−グルコースと２０〜４０℃で接触させることを含む、Ｄ−グルコースの測定方法。
【請求項２】
Ｄ−グルコースの濃度が、１０ｍＭ以下である、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
フラビン結合型ＧＤＨが、ケカビ亜門に分類される微生物に由来する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
フラビン結合型ＧＤＨが、Ｍｕｃｏｒ属またはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物に由来する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
以下の（ｉ）から（ｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、
（ｉｉ）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｉｉ）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、
（ｉｖ）フラビン化合物を補酵素とする、
（ｖ）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度におけるＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である、かつ２０℃における活性値が７０％以上である、
を備えるフラビン結合型ＧＤＨを含む、２０〜４０℃おける、温度補正を含まないグルコース測定方法のための、グルコース測定剤又はセンサ。
【請求項６】
測定試料中のＤ−グルコースの濃度が、１０ｍＭ以下である、請求項５に記載のグルコース測定剤又はセンサ。
【請求項７】
フラビン結合型ＧＤＨが、ケカビ亜門に分類される微生物に由来する、請求項５に記載のグルコース測定剤又はセンサ。
【請求項８】
フラビン結合型ＧＤＨが、Ｍｕｃｏｒ属またはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物に由来する、請求項５に記載のグルコース測定剤又はセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビン化合物を補酵素とするケカビ亜門由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いた、温度補正が不要な簡便かつ正確なグルコース測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
【０００４】
約１０年前、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきており、例えば、特許文献１〜３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示され、特許文献４にはＤ−キシロースに対する作用性を低減させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨが開示されている。特許文献１〜４には、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有するとまではいえないものの、Ｄ−グルコースではない１種または数種の糖化合物に対し反応性が低いＦＡＤ−ＧＤＨが開示されている。
【０００６】
その後、近年では、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下において、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能なフラビン結合型ＧＤＨとして、ケカビ亜門に属する微生物由来のＦＡＤ−ＧＤＨが見出されている（例えば、特許文献５参照）。さらに、ブルクホルデリア・セパシア由来、シルシネラ由来のＦＡＤ−ＧＤＨや、それら開示すみの各種ＦＡＤ−ＧＤＨに変異を導入して基質特異性を向上させた変異酵素や、耐熱性を向上させた変異酵素等が精力的に探索、開発されるようになった（例えば、特許文献６〜１０参照）。
【０００７】
このような背景を受けて、これまでに種々見出されてきたＦＡＤ−ＧＤＨは、血糖値測定を目的として、液状試薬の成分として、あるいは、センサやストリップ状に固定化された成分として利用されることが想定されているが、こうした測定用試薬や測定用センサの設計においては、上述の「測定サンプル中の溶存酸素をノイズとして測り込みたくない」「補酵素を添加したくない」「測定サンプル中に混在していることが想定されるＤ−グルコース以外の糖をノイズとして測り込みたくない」という点以外にも、もう１点、重要なニーズが存在している。それは、「測定する際の温度により測定値が変動することを極力回避したい」というニーズである。
【０００８】
一般的に、酵素法の原理を利用して測定を行う場合、測定する際の温度により測定値が変動するという現象は、酵素を利用する以上不可避な普遍的課題として当業者に認識されている。酵素には反応至適温度が存在し、反応に最適な温度条件からかけ離れた温度で反応させる時には、酵素反応が十分に発揮できない。したがって、同じ性能で同じ測定値を得たいと思えば、測定時の温度を一定に保ち、かつ、好ましくは反応至適温度付近に設定するべきであることが当業者の技術的常識である。もし、その温度から乖離した温度下で測定された場合には、測定値が大きく変動して、測定誤差や誤った診断につながる恐れがある。
【０００９】
測定時の温度設定は、サンプルを恒温槽等の装置の中で予め温度調整するなどの操作を行わせることによって測定時の温度を一定にすることが容易なラボレベルでの測定や、測定機器に保温機能等の温度調整機能が備えられている装置を使って測定を行う場合であれば、容易に設定・管理することができるため、現実的には誤差発生のリスクが生じにくい場合も多い。
一方で、個別事情により、上記のような温度調整を十分に行えないことが見込まれる測定においては、この問題が深刻な誤差発生のリスクを生じることとなる。
【００１０】
糖尿病患者が血糖を自己測定する、いわゆるＳＭＢＧの場面は、日常生活である。すなわち、このような場面では、患者は、小型で簡便型の測定装置を自宅に保有しており、毎日数回、自分で血液を少量採取して、これをテスト用の紙片（テストストリップ）にしみこませ、直ちに測定装置に挿入して測定を行っている。採取する血液は少量であることから、予め温度調整することはできない。測定装置には温度調整機能は付いていない機種が多く、したがって、真夏の測定時と真冬の寒冷地での測定では、測定温度は数十度も変動することが想定される。さらに、温度調整機能が付いている場合においても、ＳＭＢＧ機器とセンサの温度が異なる場合に、温度補正が適正に行われない可能性が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【００１１】
実際に、簡易型の血糖測定装置による血糖自己測定に与える温度の影響に関しては、測定較差が生じることが確認されており（例えば、非特許文献３参照）、医療関係者からは、値が不正確となることにより患者が間違った判断につながる恐れを懸念して、ＳＭＢＧ機器とテストストリップは共に室温に保管するよう、または測定時には室温に十分戻してから使用するよう、あるいは携帯型の保温ケースを使用する等の工夫が好ましいのではないかとの提言もなされている。これらの工夫は現場から出る対処策として有効であると考えられるが、裏を返せば、簡易型の血糖測定装置による血糖自己測定において、このような誤差の課題が深刻であることを示している。
【００１２】
室温で測定させる、保温ケースを用いる、という、使用時の温度を一定に保たせる指導と併せて、測定装置側に講じることができる従来の対応としては、温度補正がある。すなわち、予め、温度変化による測定値を得ておき、両者の関係式を作成する。そして、測定時の周辺温度を測定し、関係式を用いて実際の測定値から、(たとえば)最適温度で測定した場合の値を算出する、という方法である。この方法を用いれば、測定温度が多少変動しても、補正によって正確な値に近付けることは、理論的には可能である。しかしながら、補正にも限界があり、温度の変動で活性の低下が著しいタイプの酵素では、補正しきれないこと、また、温度補正機能を盛り込むことで、測定装置の大型化や高額化につながってしまうという事情から、全ての測定装置にこの方法を講じることは困難であるという問題がある。
【００１３】
上述のような事情から、血糖値測定においては、可能な限り、測定時の温度の変動の影響を受けにくい形で測定が行える測定方法、あるいは、手間のかかる保温の作業や温度補正機構の導入を行う必要性を低減できる測定方法に対するニーズは極めて大きいといえる。
しかし、現実には、そのような測定を達成できる測定試薬や測定装置は今日まで知られておらず、現状で確認されている誤差を元に、使用方法を工夫し、温度補正である程度の対処を行うこと以外に、対応方法がなかったことが実情であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開第０４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号パンフレット
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献５】特許第４６４８９９３号
【特許文献６】特開２０１２−９０５６３号公報
【特許文献７】国際公開第１２／１６９５１２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０９／０８４６１６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第１３／０５１６８２号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第１３／０６５６２３号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】佐瀬正次郎，高木正義，”血糖自己測定機器の低温環境下における血糖値への影響”，日本臨床検査自動化学会会誌，  ３４（４），  ７７０  （２００９）．
【非特許文献３】松崎純子，岡本敏哉，小野百合，”簡易血糖測定器による血糖自己測定に与える温度の影響” ，糖尿病，  ４５（１１），  ８２１−８２４  （２００２）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明では、１０ｍＭ以下のＤ−グルコースを測定する際に、幅広い温度範囲で、Ｄ−グルコースに特異性が高く、Ｄ−グルコース以外の糖化合物の共存条件下においてもＤ−グルコース量を正確に測定できるＧＤＨを用いたＤ−グルコース量の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ね、種々のＧＤＨのスクリーニングを実施した結果、ケカビ亜門に属する菌株由来ＧＤＨは、基質濃度が１０ｍＭ以下である場合、幅広い温度条件下で測定を行った場合でもグルコースを正確に測定できることを新たに見出し、日本糖尿病学会の血糖コントロール指標である食後２時間血糖値１０ｍＭ以下のＤ−グルコース量の新規な測定方法を構築して、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ｉ）から（ｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、
（ｉｉ）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｉｉ）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、
（ｉｖ）フラビン化合物を補酵素とする、
（ｖ）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度におけるＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である、かつ２０℃における活性値が７０％以上である、
を備えるフラビン結合型ＧＤＨをＤ−グルコースと２０〜４０℃で接触させることを含む、Ｄ−グルコースの測定方法。
（２）Ｄ−グルコースの濃度が１０ｍＭ以下である上記（１）記載の測定方法。
（３）フラビン結合型ＧＤＨが、ケカビ亜門に分類される微生物に由来する、上記（１）記載の測定方法。
（４）フラビン結合型ＧＤＨが、Ｍｕｃｏｒ属またはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物に由来する、上記（１）に記載の測定方法。
（５）以下の（ｉ）から（ｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、
（ｉｉ）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｉｉ）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、
（ｉｖ）フラビン化合物を補酵素とする、
（ｖ）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度におけるＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である、かつ２０℃における活性値が７０％以上である、
を備えるフラビン結合型ＧＤＨを含む、２０〜４０℃おける、温度補正を含まないグルコース測定方法のための、グルコース測定剤又はセンサ。
（６）測定試料中のＤ−グルコースの濃度が、１０ｍＭ以下である、上記（５）記載のグルコース測定剤又はセンサ。
（７）フラビン結合型ＧＤＨが、ケカビ亜門に分類される微生物に由来する、上記（５）に記載のグルコース測定剤又はセンサ。
（８）フラビン結合型ＧＤＨが、Ｍｕｃｏｒ属またはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物に由来する、上記（５）に記載のグルコース測定剤又はセンサ。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いた測定方法により、２０〜４０℃において温度補正機能を備えなくとも、正確な血糖測定が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（フラビン結合型ＧＤＨの温度特性）
Ｍｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨは、基質濃度が低くなるにつれ、幅広い測定温度領域において活性の変動が小さくなることを特徴とする。具体的には、本発明の測定方法に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度における１０ｍM以下の Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である。本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いる測定方法は、このような優れた温度特性を有するため、測定する温度環境の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能である。
【００２１】
（本発明のフラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的特徴）
本発明のフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、以下の酵素化学的特徴を有するものが挙げられる。
（１）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す
（２）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い
（３）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する
（４）フラビン化合物を補酵素とする
（５）温度特性：２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度における１０ｍＭ以下の Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％である。
上記のような酵素化学的特徴を有するＧＤＨであれば、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、さらに、測定温度が２０〜４０℃において温度補正機能を有することなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。また、血糖値の測定等の臨床診断に応用するために好適なｐＨ範囲、温度範囲で良好に作用するので、診断用測定試薬（測定剤）等の用途に好適に使用することができる。
Ｋｍ値は一般的には小さくなるほど基質特異性が良いとされるが、本発明の酵素としては、所定の測定条件において実質的に十分な基質の選択が実現される範囲の値を有していればよい。
分子量は、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）やＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）等のプログラムを用いて、一次配列情報から算出する、あるいはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定することができる。例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１を用いて算出する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、７０ｋＤａであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、６９ｋＤａである。また、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、約８０ｋＤａであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、約８８ｋＤａである。
【００２２】
（フラビン結合型ＧＤＨの基質特異性）
本発明に用いることができるフラビン結合型ＧＤＨは、基質特異性に優れ、Ｄ−グルコースに対する選択性が極めて高いことを特徴とする。具体的には、本発明に用いることができるフラビン結合型ＧＤＨは、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が極めて低い。具体的には、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースに対する反応性がいずれも５％以下、好ましくは４％以下、さらに好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下であることを特徴とする。本発明に用いることができるフラビン結合型ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。
【００２３】
上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素をいう。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。なお、本明細書中に後述する「ＭｐＧＤＨ」は、特に断りの無い限り、精製酵素をいう。
【００２４】
本発明における、Ｄ−グルコース測定実施時のＤ−グルコース濃度は、１０ｍＭ以下である。この濃度は、食後２時間血糖値のＤ−グルコースを測定することを想定したときに該当する温度範囲に該当する。また、こうした測定の際には、場合により、より低濃度のＤ−グルコースを測定する場合となることがある。例えば、６ｍＭ以下、４ｍＭ以下、あるいは３ｍＭ以下となることがある。
【００２５】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨが利用する電子受容体は、特に限定されず、例えば、血糖値測定に用いるために好適な試薬成分として公知の任意の電子受容体を用いることができる。
【００２６】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨが利用する補酵素は、フラビン化合物であることを特徴とする。フラビン化合物には、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）等が挙げられる。
【００２７】
本発明の測定方法に用いることができるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度における１０ｍＭ Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％であるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。さらに好ましくは、２０〜４０℃の範囲で最も活性が高い測定温度における１０ｍＭ Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、２０〜４０℃における活性値が７４％〜１００％であり、かつ２０℃における活性値が７０％以上であるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。
【００２８】
（フラビン結合型ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
したがって、この原理を利用して、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系により、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
→ ＰＭＳ ＋ ＤＣＩＰ（還元型）
【００２９】
まず、（反応１）において、グルコースの酸化に伴いＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳの酸化と共にＤＣＩＰが還元されるため、酸化型ＤＣＩＰの消失を６００ｎｍの波長の吸光度変化量から測定することができる。
具体的には、本発明において、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、５．０Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【００３０】
【数１】
2017000137.tif 000002
【００３１】
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００３２】
（フラビン結合型ＧＤＨの由来）
上記の特徴を有する本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、ケカビ亜門に分類される微生物から得ることができる。ケカビ亜門に分類される微生物としては、例えば、Ｍｕｃｏｒ属、Ａｂｓｉｄｉａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  （Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属等が挙げられる。Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉもしくはＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓが挙げられる。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ  ＮＩＳＬ０１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ  ＮＩＳＬ０１１１もしくはＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＮＩＳＬ０１１７が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ  ＮＩＳＬ０２１１、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ  ＮＩＳＬ０２１８を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  （Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ  もしくはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘを挙げることができる。より具体的には、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＮＩＳＬ９０８２を挙げることができる。
【００３３】
本発明の測定方法に用いることができるフラビン結合型ＧＤＨは、上述の通り、「ケカビ亜門に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」である。さらにまた、それらのフラビン結合型ＧＤＨ生産微生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用し、必要によりそれを一部改変して、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えフラビン結合型ＧＤＨもまた、本発明の「ケカビ亜門に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」に含まれる。同様に、「Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物」もしくは「Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  （Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物」、あるいは、特定の生産微生物菌株名を記載したフラビン結合型ＧＤＨについても、各々に由来する遺伝子情報を元に取得される、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨをも本発明に包含する。
【００３４】
（フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列）
本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、配列番号１又は配列番号５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と７０％以上相同なアミノ酸配列を有することを特徴とする。配列番号１又は配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨは、上述の各種の性質を有する。また、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１又は配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨと同様な諸性質を有するＧＤＨも、本発明の測定方法に用いるフラビン結合型ＧＤＨに含まれる。
【００３５】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列）
本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号１又は配列番号５で示されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列と７０％以上相同なアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨをコードするＤＮＡをいう。または、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡをいう。あるいは、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号６で示される塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは、７５％以上の同一性、より好ましくは、８０％以上の同一性、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つフラビン結合型ＧＤＨ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡをいう。
【００３６】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列を含むベクター、形質転換体）
本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体を作製することができる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。
【００３７】
フラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物からフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００３８】
次いで、フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００３９】
このようにして得られたフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子の好ましい一例として、Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したＭｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを作製し、そこから例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得ることができる。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
【００４０】
上記方法により得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行い得る。
上述のように得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により形質転換または形質導入することができる。宿主としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（ともにタカラバイオ社製）等が挙げられ、これらの宿主を形質転換して、またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。こうして得られた上記形質転換体を培養することによって、フラビン結合型ＧＤＨを大量に生産することができる。
【実施例１】
【００４１】
（ＭｐＧＤＨの製造と精製）
ＭｐＧＤＨ遺伝子（配列番号２）を含むカセットを用いて形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ株（特許第４６４８９９３号公報参照）を培養し、粗酵素液のＧＤＨ活性を確認した。得られた粗酵素を用いて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス−７０（ミリポア社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２００ｍＭ 塩化カリウム、ｐＨ４．５）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
【実施例２】
【００４２】
（ＭｐＧＤＨの温度特性評価）
実施例１により得られたＭｐＧＤＨ精製標品の温度特性を調べた。
上記に示したＧＤＨ活性測定法において、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコース、０．２５Ｍ、０．１Ｍもしくは０．０７５Ｍで行った。
【００４３】
【表１】
2017000137.tif 000003
【００４４】
表１中のかっこ内に示す割合は、最も活性が高かった測定温度における活性値を基準とした相対値である。表１に示す通り、基質の終濃度が２００ｍＭの場合、ＭｐＧＤＨが最大活性を示す測定温度における活性値を１００％とした際に、２０℃における相対活性は５７％であった。一方で、基質の終濃度が１０ｍＭの場合、ＭｐＧＤＨが最大活性を示す測定温度における活性値を１００％とした際に、２０℃における相対活性は７８％であり、非常に変動が小さいことが明らかとなった。
【００４５】
続いて、低血糖患者を想定し、３ｍＭおよび４ｍＭのグルコースを基質として上記と同様の温度特性評価を行い、最大活性を示す測定温度における活性値を１００％とした際の相対活性を算出した（表２）。
【００４６】
【表２】
2017000137.tif 000004
【００４７】
表２に示す通り、３ｍＭおよび４ｍＭのグルコースを基質とした際には、１０ｍＭの時と比べて、さらに測定温度による活性変動が小さくなった。特に、２５℃〜３５℃間においては、ほぼ一定の活性値を示すことが分かり、このように良好な活性値が維持されている状態であれば、温度補正機能を有しない測定装置を用いた場合でも正確なグルコース量を測定できることが示された。
【００４８】
このように、基質濃度が低くなるほど、測定温度による活性の変動が小さくなるという傾向を示す酵素が存在することは、当業者にとっては技術的常識とはいえない。一般的には、測定温度による活性の変動が、測定時の基質濃度の多少の変動によって大きく変化を生じるとは考えがたく、そのような報告も知られていない。それゆえに、いわゆる酵素製品の販売カタログや酵素の諸性質を示す学術文献中の記載を参照しても、温度と活性の関係を示すグラフにおいて、基質の濃度条件は１点に固定されていることがほとんどである。そして、ほとんどの場合、酵素の諸性質を確認するための活性測定法における基質濃度は、酵素の活性測定法の原則に則して、反応初速度を算出する場合は十分に過剰な濃度に設定されていることが多い（生化学実験化学講座５，酵素研究法（上），１９７５参照）。
【００４９】
フラビン結合型ＧＤＨ公知の文献においても、この当業者の認識は同様であり、測定温度と活性を確認する際のグルコース濃度は十分に高いものに固定されており、その濃度範囲は、実際に血糖値を測定するために想定されるグルコース濃度からは、大きくかけ離れたものであった（例えば、特許第４４９４９７８号、特開２０１１−１５２１２９号公報、特開２０１１−１１５１５６号公報、国際公開第１３／０５１６８２号パンフレット、国際公開第１３／０６５６２３号パンフレット、国際公開第１３／１１８７９８号パンフレット参照）。
【００５０】
ＭｐＧＤＨは、２００ｍＭという高いグルコース濃度条件下においては、３０℃以下、２５℃、２０℃と低温にするに従って、大きく活性が低下することが確認された。しかし、同じ温度条件下で測定を行った場合でも、１０ｍＭという低いグルコース濃度条件下で測定を行った時には、活性の低下は著しく改善され、３０℃ではほぼ１００％の活性が維持され、２５℃でも９０％を超える活性が維持され、２０℃においても、約８０％の活性が維持されることが見出された。
【００５１】
比較例１
アスペルギルスオリゼ由来グルコース脱水素酵素（以下、ＡｏＧＤＨと表記）（特開２００８−２２８７４０参照）を用いて、実施例２と同様の温度特性評価を試みた。
ＡｏＧＤＨのアミノ酸配列であり、配列番号３で示される５９３アミノ酸をコードし、且つ、特開２００８−２２８７４０で示される塩基配列と全く同様である、配列番号４で示す１７８２ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡを取得した。このとき、配列番号４の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。
【００５２】
続いて、取得した配列番号４に示される遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）− Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＡｏＧＤＨを取得し、実施例１と同様の条件で、用いる大腸菌をＪＭ１０９株の代わりにＢＬ２１（ＤＥ３）株として形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＡｏＧＤＨ）株を得た。
【００５３】
上記のようにして得られたＡｏＧＤＨ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＡｏＧＤＨ）株をＬＢ−ａｍｐ培地に０．５％  グリセロール、０．０５％  グルコース、０．２％  α−ラクトース、２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、１  ｍＭ  ＭｇＳＯ４を添加した培地１００ｍｌにおいて、３０℃で２４時間培養した（Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （２００５）を改変）。その後、菌体をｐＨ６．０の０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液で洗浄、超音波破砕、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＡｏＧＤＨ粗酵素液２０ｍｌを調製した。得られた粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた活性測定方法に従ってＧＤＨの活性を確認した。
【００５４】
得られた粗酵素を用いて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラムにかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ６．５）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス−７０（ミリポア社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＣａｐｔｏＱ（ＧＥヘルスケア社製）カラムにかけ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１Ｍ 塩化カリウム、ｐＨ６．５）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
【００５５】
得られたＡｏＧＤＨ精製酵素を用いて、実施例２と同様に、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．２５Ｍで行った。
【００５６】
【表３】
2017000137.tif 000005
【００５７】
表３に示す通り、ＡｏＧＤＨの温度特性、すなわち、測定温度と活性の関係は、基質であるグルコース濃度には全く影響されなかった。このような傾向は、測定温度による活性の変動が、測定時の基質濃度の多少の変動によって大きく変化を生じるとは考えがたいという、当業者の一般的認識と合致している。
【００５８】
比較例２
アスペルギルステレウス由来グルコース脱水素酵素（以下、ＡｔＧＤＨと表記）（
特許第５０２００７０号参照）を用いて、実施例２と同様の温度特性評価を試みた。
特許第５０２００７０号で示されるＡｔＧＤＨのアミノ酸配列である配列番号５で示される５９２アミノ酸をコードする、配列番号６で示す１７７９ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡを取得した。
【００５９】
実施例１と同様の手法により、ＡｔＧＤＨ遺伝子を含むカセットを用いて形質転換することでＡｔＧＤＨ発現麹菌株を取得し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素を用いて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラムにかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ６．５）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（メルク社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）カラムにかけ、溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
得られた粗酵素液を用いて、実施例２と同様に温度特性評価を行った。ただし、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．２５Ｍで行った。
【００６０】
【表４】
2017000137.tif 000006
【００６１】
表４に示す通り、ＡｔＧＤＨの温度特性、すなわち、測定温度と活性の関係は、基質であるグルコース濃度には全く影響されなかった。このような傾向は、測定温度による活性の変動が、測定時の基質濃度の多少の変動によって大きく変化を生じるとは考えがたいという、当業者の一般的認識と合致している。
【００６２】
比較例３
アスペルギルスニガー由来グルコース酸化酵素（以下、ＡｎＧＯＤと表記）（ＢＢＩ社製、ＧＯ３Ｂ２）を用いて、実施例２と同様に温度特性評価を行った。ただし、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．０５Ｍで行った。
【００６３】
【表５】
2017000137.tif 000007
【００６４】
表５に示す通り、ＡｎＧＯＤの温度特性、すなわち、測定温度と活性の関係は、基質であるグルコース濃度には全く影響されなかった。このような傾向は、測定温度による活性の変動が、測定時の基質濃度の多少の変動によって大きく変化を生じるとは考えがたいという、当業者の一般的認識と合致している。
【００６５】
実施例３
Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来グルコース脱水素酵素（以下、ＭｇＧＤＨと表記）を用いて、実施例２と同様の温度特性評価を試みた。まず、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＮＢＲＣ９４０３株をＤＰＹ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物）で、３０℃で２４時間培養した。培養後、菌体を回収し、菌体の水分を除いた後、液体窒素中で菌体を破砕し、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて添付のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを取得した。次に、取得したゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号７、８の縮重プライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により約１．９ｋｂのＤＮＡが増幅されていることを確認した。この増幅されたＤＮＡ断片を精製し、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて塩基配列を解析した。その配列情報を基に下記で用いるインバースＰＣＲ用のプライマー（配列番号９、１０）を設計した。
次に、上記で回収したゲノムＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩで処理し、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿を行った後に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（東洋紡社製）を用いてライゲーション反応を１６℃で８時間行った。エタノール沈殿を行った該反応液を鋳型にし、上記で設計した配列番号９、１０のプライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）により、インバースＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片の配列解析を上記と同様に行い、上流と下流の塩基配列を解析し、ＭｇＧＤＨの塩基配列全長（配列番号１１）が明らかとなった。さらに、ＭｐＧＤＨの配列情報を基に、イントロン配列を除いたエキソン配列（配列番号１２）を予測し、ＭｇＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１３）を決定した。なお、ＭｇＧＤＨとＭｐＧＤＨのアミノ酸配列の同一性は７８％であった。
【００６６】
実施例１と同様の手法により、ＭｇＧＤＨ遺伝子（配列番号１２）を含むカセットを用いて形質転換することでＭｇＧＤＨ発現麹菌株を取得し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を用いて、実施例２と同様に温度特性評価を行った。ただし、加温温度および測定温度を２５℃もしくは３７℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．２５Ｍで行った。
【００６７】
【表６】
2017000137.tif 000008
【００６８】
表６に示す通り、ＭｇＧＤＨについても、基質濃度が低くなるほど、測定温度による活性変動が小さくなることが明らかとなった。このような傾向は、測定温度による活性の変動が、測定時の基質濃度の多少の変動によって大きく変化を生じるとは考えがたいという、当業者の一般的認識と合致しない。
【００６９】
ＭｇＧＤＨは、２００ｍＭという高いグルコース濃度条件下においては、３７℃で測定した場合と２５℃で測定した場合で、４０％近くも活性に差を生ずる。しかし、同じ温度条件下で測定を行った場合でも、１０ｍＭという低いグルコース濃度条件下で測定を行った時には、活性の低下は著しく改善され、その差は約２０％にとどまった。すなわち、ＭｇＧＤＨを用いて、１０ｍＭ程度やそれより低濃度のグルコース濃度条件下で測定を行う場合には、温度補正機能を有しない測定装置を用いた場合でも、正確なグルコース量を測定できることが示された。
【００７０】
配列番号１４で示されるアミノ酸配列であるＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来グルコース脱水素酵素（以下、ＭｒｄＧＤＨと表記）（国際公開２０１３／１１８７９８号参照）を用いて、実施例２と同様の温度特性評価を試みた。
【００７１】
実施例１と同様の手法により、ＭｒｄＧＤＨ遺伝子（配列番号１５）を含むカセットを用いて形質転換することでＭｒｄＧＤＨ発現麹菌株を取得し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を用いて、実施例１と同様の手法により精製し、実施例２と同様に温度特性評価を行った。ただし、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．０５Ｍで行った。
【００７２】
【表７】
2017000137.tif 000009
【００７３】
表７に示す通り、ＭｒｄＧＤＨについても、基質濃度が低いほど、測定温度による活性変動が小さくなることが明らかとなった。
【００７４】
配列番号１６で示されるアミノ酸配列であるＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  f.  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ６７５４由来グルコース脱水素酵素（以下、ＭｈＧＤＨと表記）（国際公開２０１３／０６５６２３号参照）を用いて、実施例２と同様の温度特性評価を試みた。
【００７５】
実施例１と同様の手法により、ＭｈＧＤＨ遺伝子（配列番号１７）を含むカセットを用いて形質転換することでＭｈＧＤＨ発現麹菌株を取得し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を用いて、実施例１と同様の手法により精製し、実施例２と同様に温度特性評価を行った。ただし、加温温度および測定温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃で活性測定を行った。また、添加する基質は５Ｍグルコースもしくは０．０５Ｍで行った。
【００７６】
【表８】
2017000137.tif 000010
【００７７】
表８に示す通り、ＭｈＧＤＨについても、基質濃度が低いほど、測定温度による活性変動が小さくなることが明らかとなった。
【００７８】
これまで、ケカビ亜門由来ＧＤＨが、基質濃度が低くなるほど、測定温度による活性変動を受けにくい酵素であることは知られていなかった。今回得られた知見により、ケカビ亜門由来ＧＤＨのＭｐＧＤＨ、ＭｇＧＤＨ、ＭｄｒＧＤＨとＭｈＧＤＨが血糖値の日常的簡易的測定という特定実用用途において非常に有利である特筆すべき性質を有し、それを活用することにより、温度補正機能を有しない測定装置の実現が可能になりうるという新たな着想が導かれることとなった。
【００７９】
ＭｐＧＤＨ、ＭｇＧＤＨ、ＭｄｒＧＤＨとＭｈＧＤＨは同じケカビ亜門に則し、これらのアミノ酸配列同一性は７３〜７９％であるから、同様のケカビ亜門由来の各種ＧＤＨ、特にはＭｐＧＤＨもしくはＭｇＧＤＨと配列同一性が７３％以上であるＧＤＨは、その近縁性、酵素としての構造同一性の高さから推測して、グルコース濃度が低いほど、測定温度による活性変動が小さくなるという良好な性質を有している蓋然性が高い。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いた、Ｄ−グルコースの測定方法は、幅広い温度範囲において、Ｄ−グルコース濃度を精度良く定量することができるので、血糖値の測定や食品中のグルコース濃度の定量等の分野において有用である。
【配列表】
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