(57)【要約】      （修正有）【課題】高圧に耐える機械的強度を有し、さらに分析対象試料であるタンパク質や核酸が非特異的吸着し難い、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターの製造方法を提供する。【解決手段】多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィー用カラムに、分子量１００、０００以上のポリリジンを注入してコンディショニングを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィー用カラムをポリリジンでコンディショニングすることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項２】
多孔質金属フィルターがステンレス焼結またはチタンであることを特徴とする請求項
１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項３】
ポリリジンの分子量が１００、０００以上である請求項１記載の液体クロマトグラフィ
ー用カラムの製造方法。
【請求項４】
ポリリジンの使用量がカラム断面積当たり、０．５  ｍｇ  ／  ｃｍ２以上であること
を特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、医化学等の分野で分析手段として用いられる液体クロマトグラフィーカラムの吸着防止法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学、医化学等の分野では、タンパク質や核酸等を分析対象試料とする分析法として、液体クロマトグラフィーが利用されている。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、種々の手法があり、各手法を実施するのに好適な充填材を充填したカラムを使用して分析を実施する。
【０００３】
液体クロマトグラフィーに使用するカラムは、その内部に充填材を充填したカラムハウジングの両端を、フィルターを具備するカラムエンドで密閉したものであり、かかる液体クロマトグラフィーカラム用フィルターとしては、従来、多孔質金属（ステンレス焼結体、チタン）製のもの、ガラス製のもの、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製のもの、四フッ化ポリエチレン（テフロン：登録商標）製のもの、ポリエチレン製のもの等が知られている（例えば特許文献１から８参照）。
【０００４】
また、特許文献９には種々のシラン化合物で修飾した多孔質ガラスフィルターが示されており、さらに特許文献１０及び１１にはシリコーン被膜をフィルターに導入する手法がしめされている。また非特許文献４及び５にはステンレスへのタンパク質吸着防止として、シラン処理剤である３−Ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅを金属表面に導入し、導入されたエポキシ基に種々の官能基を導入する手法が開示されている。
【０００５】
一方金属、樹脂等へのタンパク質等の非特異的吸着防止法として、非特許文献１にはアルブミン、カゼイン等のタンパク質や、デキストラン等の多糖類を用いて予めコンディショニングする方法が記載されている。また非特許文献２には水溶性合成高分子を用いる方法が記載されている。さらに近年では非特許文献３に記載されているベタイン構造を有する手法が使用されている。
【０００６】
液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターは、カラム内部に充填材を密封、つまり充填した充填剤が流失しないようにしつつも、目詰まりを起こし難い、試料や溶離液中の固形分等がカラムに流入することを防止して充填材を保護する目的で使用される多孔質体である。近年では、２ミクロン以下の粒子径を有する充填剤が実用化され、充填剤をカラムに充填する際の圧力や、分析の際の操作圧（分析対象となる液体を送液する圧力）が１００ＭＰａに近くまで達している。このためカラム用フィルターには高い耐圧性が求められ、使用されるフィルター部材にも耐圧性の面で制限が生じており、ガラス製のもの、四フッ化ポリエチレン製のもの、ポリエチレン製のもの等は１００ＭＰａに耐えうる耐圧性を有するものがない。ポリエーテルエーテルケトン製のフィルターでは１００ＭＰａに耐えうる商品も実用化されているが、疎水性が高いという欠点を有している。
【０００７】
ステンレス焼結体や多孔質チタンを用いたカラムフィルターは金属が融着されたフィルターであるため、高い耐圧性を有している。しかしこれらのフィルターは金属であるために、塩基性のタンパク質や金属配位性のタンパク質が吸着することが知られており、さらに抗体の凝集体等の高分子量タンパク質が注入初期にカラムに吸着する現象（以下「初期吸着」と記載する）が知られている。初期吸着は大量の試料をカラムに注入することにより改善（以下この手法を「コンディショニング」と記載する）することは可能であるものの、カラムを保管すると初期吸着が再度発生する場合があるなど、試料の分析前に初期吸着の有無を確認する必要が生じている。
【０００８】
これらの要求を満足するため、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターには、高圧に耐える機械的強度を有していることが求められ、さらに分析対象試料であるタンパク質や核酸が吸着し難くい性質が求められていた。
【０００９】
上記の様に、特に生体高分子であるタンパク質や核酸等の分析に用いる液体クロマトグラフィーカラムに用いられるフィルターとしては１）高い耐圧性、２）低い非特異的吸着が求められている。
【００１０】
液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターの非特異的吸着防止に、タンパク質等の生体高分子を用いるとカラムの保管条件によっては菌体などの発生が懸念される。また分画された試料中にフィルター吸着防止に用いたタンパク質等の生体高分子が混入する懸念があり、分画された試料をさらに検討に用いるには懸念が生じる。合成高分子を用いた場合、生体高分子の様な懸念は生じないが、合成高分子はポリマー主鎖に疎水性部を有している場合が多いため、測定試料との相互作用の懸念が生じる。さらに分画された試料中に合成高分子が溶出した場合には、その毒性の影響が懸念される。
【００１１】
フィルターをシリコーン被膜で被覆する方法はそのベースポリマーが疎水性であるために、タンパク質等が疎水的に吸着するため適さない。また非特許文献４及び５に示されているシラン処理剤により金属表面修飾する方法では事前に金属表面の処理が必要であること、シラン処理剤導入がトルエンなどの非水溶性有機溶剤中で行う必要があること、導入されたエポキシ基にさらに官能基を導入する必要があることなどから煩雑な手順が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０００−０８１４２４号公報
【特許文献２】特開２０００−１３１３０２号公報
【特許文献３】特開２００１−２４９１２０号公報
【特許文献４】特表２００５−５０８３９８号公報
【特許文献５】特開２００６−１３８７２４号公報
【特許文献６】特開２００６−２２７０２２号公報
【特許文献７】特開平０６−２４２０９４号公報
【特許文献８】特開平０７−２６０７６３号公報
【特許文献９】特開１９９８−２８２０７８号公報
【特許文献１０】特許３９９０５０３号公報
【特許文献１１】特許３８５７４３９号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ  １９９９
【非特許文献２】Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ，Ｐｌｅｎｕｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅ，  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｔｒｉｘ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ
【非特許文献４】Ｋａｎｇ  ＣＫ１，  Ｌｅｅ  ＹＳ．，  Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄ．２００７  Ｊｕｌ；１８（７）：１３８９−９８  Ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
【非特許文献５】Ｈａｉｒｅｎ  Ｗａｎｇ，  Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ    Ｖｏｌ．  ６１  Ｉｓｓ：  ５，  ｐｐ．３０７  −  ３１３  ２０１４，  Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ  ｂｙ  ａ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｅ  ｂｉｌａｙｅｒ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、液体クロマトグラフィーカラム用のフィルターは、高圧に耐える機械的強度を有し、さらに分析対象試料であるタンパク質や核酸が非特異的吸着し難いフィルターの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、従来から使用されている１）高い耐圧性を有する多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィーカラムの２）非特異的吸着に関する課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムを事前にポリリジンを用いてコンディショニングすることにより、多孔質金属フィルターの欠点であった、塩基性タンパク質や金属配位性タンパク質の吸着を低減し、高分子量タンパク質の初期吸着も低減する、多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィー用カラムの吸着防止法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィーカラムの塩基性タンパク質、金属配位性タンパク質吸着および、特に高分子タンパク質の初期吸着の低減法に関するものであり、ポリリジンを使用したコンディショニングを行う方法である。本発明のポリリジンを使用してコンディショニングした液体クロマトグラフィー用カラムは、塩基性タンパク質や金属配位性タンパク質の溶出ピーク形状が改善し、タンパク質の初期吸着が低減することから、試料大量注入などの必要が無く、分析開始直後から使用できるため、タンパク質や核酸などの生体高分子分析に特に好適である。
【００１７】
コンディショニングに使用するポリリジンとしては、種々の分子量のものが使用可能であるが、分子量が低いと使用中に効果が低下する場合があるため、分子量が大きいことが好ましく、分子量１００，０００以上が好ましい。
【００１８】
コンディショニング方法としては、液体クロマトグラフィー分析と同様な手法、装置で、液体クロマトグラフィー用カラムに溶媒を通液しながら、所定量のポリリジンをカラムに注入することで容易にコンディショニング可能である。用いる溶媒としては、多孔質金属フィルターとポリリジンの結合を阻害せず、かつカチオン交換体充填剤等の様に、ポリリジンの相互作用が予想される場合は、充填剤に吸着しない溶媒を使用する。多孔質金属フィルターとポリリジンの結合を阻害する溶媒例としては、イミダゾール、エチレンジアミン４酢酸等の金属配位性低分子化合物を含む溶媒である。また充填剤にポリリジンが吸着する例としては、充填剤としてシリカ充填剤を使用する場合には、例えば１００  ｍｍｏｌ  ／  Ｌ  濃度以上のリン酸ナトリウム緩衝液を使用することにより、充填剤へのポリリジンの吸着が抑制できる。またカルボン酸、スルホン酸等のイオン交換基を有する充填剤を使用する場合には、例えば０．５  ｍｏｌ／Ｌ  以上の塩化ナトリウムを含む溶媒を使用する。
【００１９】
ポリリジンの使用量としては、カラム断面積当たり、０．５  ｍｇ  ／  ｃｍ２以上が好ましく１．０  ｍｇ  ／  ｃｍ２以上であれば特に好ましい。使用量は一定以上であれば効果に差が無い。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の液体クロマトグラフィーカラムの吸着防止法は１）高い耐圧性を有する多孔質金属製のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーカラムに用い、さらに、ポリリジンを用いてコンディショニングすることにより、高分子生体試料であるタンパク質、核酸等の２）  非特異的吸着を低減する手法である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により液体クロマトグラフィーカラムの吸着防止法を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＵＰ−ＳＷ３０００から充てん剤を抜出し、市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムに充填した。充てんしたカラムを液体クロマトグラフィー装置に接続し、下記に記載した条件でポリ−Ｌ−リシン溶液（シグマ社  Ｐ４８３２  ｍｏｌ  ｗｔ  １５０，０００−３００，０００  ０．０１％  ）を注入することによりカラムのゴンディショニングを行った。
【００２３】
〈コンディショニング条件〉
溶離液：１００  ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸ナトリウム  ｉｎ  １００  ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ６．７）
流速：０．３５  ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
注入量：１５０  ｕＬ
コンディショニングしたカラムに下記の条件で試料を順に注入し、ピーク形状を計測し吸着程度を観察した。
【００２４】
〈測定条件〉
溶離液：１００  ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸ナトリウム  ｉｎ  １００  ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ６．７）
流速：０．３５  ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
試料：１．  ０．０１  ｇ／Ｌ  ４−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ
２．  １．５  ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  （和光純薬  １２０−０２６７４）
３．  １．５  ｇ／Ｌ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  （和光純薬  ０３３−２２４１４）
４．  １．５  ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ  （和光純薬  ２０８−０９２２３）
５．  １．５  ｇ／Ｌ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇ  （和光純薬  ０１６−１７０７３）
６．  １．５  ｇ／Ｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ１各  ５ｕＬ
表１に各試料の溶出時間、ピーク段数および非対称係数を記載した。塩基性であり疎水性の強いＬｙｓｏｚｙｍｅ（ｐＩ  １１．２）、塩基性であり金属に配位するＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ（ｐＩ１０．２）、酸性タンパク質であるＴｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｐＩ  ４．６）  及びＡｌｂｕｍｉｎ（ｐＩ４．７）のいずれの溶出ピークもテーリングすることなく溶出されており吸着現象は見られなかった。また２０％程度の凝集体を含むマウス抗体の凝集体成分も吸着されることが無く溶出された。
【００２５】
比較例１
実施例１と同様に市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムを調整した。コンディショニングをせずに実施例１と同様にピーク形状を計測し吸着程度を観察した。結果を表１に記載した。酸性タンパク質は吸着なく溶出されたが、塩基性タンパク質はテーリングが見られ、非対称係数が実施例１と比較し大きな値となった。また抗体の凝集体はまったく溶出されなかった。
【００２６】
比較例２
実施例１と同様に市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムを調整した。コンディショニングとして０．１％濃度のＡｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  （広島和光  ０１６−１５０９１）を１５０ｕＬ注入した。続いて実施例１と同様にピーク形状を計測し吸着程度を観察した。結果を表１に記載した。酸性タンパク質は吸着なく溶出されたが、塩基性タンパク質は若干のテーリングが見られ非対称係数が実施例１と比較し大きな値となった。抗体凝集体は溶出されるものの、ピーク面積は実施例１と比較し小さい値となった。
【００２７】
比較例３
実施例１と同様に市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムを調整した。コンディショニングとして０．１％濃度Ｃａｓｅｉｎ  （Ｓｉｇｍａ  Ｃ７０７８）を１５０ｕＬ注入した。続いて実施例１と同様にピーク形状を計測し吸着程度を観察した。結果を表１に記載した。酸性タンパク質は吸着なく溶出されたが、塩基性タンパク質は若干のテーリングが見られ非対称係数が実施例１と比較し大きな値となった。抗体凝集体はほとんど溶出されなかった。
【００２８】
比較例４
実施例１と同様に市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムを調整した。コンディショニングとして０．１％濃度Ｄｅｘｔｒａｎ７０  （Ｓｉｇｍａ  ３１２９０）を１５０ｕＬ注入した。続いて実施例１と同様にピーク形状を計測し吸着程度を観察した。結果を表１に記載した。酸性タンパク質は吸着なく溶出されたが、塩基性タンパク質は若干のテーリングが見られ非対称係数が実施例１と比較し大きな値となった。抗体凝集体はほとんど溶出されなかった。
【００２９】
比較例５
実施例１と同様に市販の焼結ステンレス製フィルターを使用した４．６ｍｍ内径  Ｘ  １５ｃｍ長さの液体クロマトグラフィーカラムを調整した。コンディショニングとして０．１％濃度Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  （Ｓｉｇｍａ  ４３４９４−９）を１５０ｕＬ注入した。続いて実施例１と同様にピーク形状を計測し吸着程度を観察した。結果を表１に記載した。酸性タンパク質は吸着なく溶出されたが、塩基性タンパク質は若干のテーリングが見られ非対称係数が実施例１と比較し大きな値となった。抗体凝集体は全く溶出されなかった。
【００３０】
【表１】
2017227461.tif 000002