(57)【要約】【課題】カルスを経由して健全なイチゴ苗を比較的大量かつ安定的に提供できる方法を提供する。【解決手段】イチゴのカルスからイチゴ苗を生産する方法であって、（１）原材料となるイチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を４０〜６０℃に加熱処理する第１工程、（２）第１工程で加熱処理された構成部分を第１培地で培養することによって、前記構成部分からカルスを生成させる第２工程、（３）前記カルスを第２培地で培養することによりシュートを形成させる第３工程、（４）形成されたシュートを採取し、これを挿し木法により育成することによってイチゴ苗を得る第４工程を含むことを特徴とするイチゴ苗の生産方法に係る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴのカルスからイチゴ苗を生産する方法であって、
（１）原材料となるイチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を４０〜６０℃に加熱処理する第１工程、
（２）第１工程で加熱処理された構成部分を第１培地で培養することによって、前記構成部分からカルスを生成させる第２工程、
（３）前記カルスを第２培地で培養することによりシュートを形成させる第３工程、
（４）形成されたシュートを採取し、これを挿し木法により育成することによってイチゴ苗を得る第４工程
を含むことを特徴とするイチゴ苗の生産方法。
【請求項２】
前記構成部分が葉柄である、請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
第２工程に先立って、加熱処理された構成部分を消毒液により消毒する工程をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項４】
前記第１培地が、ナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸及び塩酸チアミンの少なくとも１種の生長促進成分とベンジルアデニンとを含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項５】
前記第２培地が、ナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸及び塩酸チアミンの少なくとも１種の生長促進成分とベンジルアデニンとを含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項６】
前記第２培地における生長促進成分の濃度が、第１培地における生長促進成分の濃度の５〜１５％である、請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
前記第１培地における生長促進成分の合計含有量が５〜２０ｍｇ／Ｌである、請求項４に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健全なイチゴ苗を葉柄等から生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イチゴは、代表的な野菜ないしはフルーツの一つとして知られており、例えば果物店、スーパーマーケット、百貨店等で販売され、家庭用、飲食店用、食品工業製品用等として大量に消費されている。最近では、消費者の嗜好の多様化等に伴って、さまざまな品種のイチゴが商品開発され、人気のある品種の安定的な供給を確保すべく、生産業者においてもその栽培方法等について種々の方法が開発されている。
【０００３】
イチゴの一般的な栽培方法は、ランナーの採取による育苗法が知られている。この方法は、１つの株から多数の株を発生させ、これらを個別に育苗することによって、イチゴを生産する方法である。このようなランナーを用いる方法としては、例えばランナーにより繁殖する植物の親株の周囲に特定の樹皮培地の成形体を設置し、前記親株のランナーが前記培地に根付いて生じる子株を、前記樹皮培地の成形体とともに、別途に調製した定植用の培地に定植する工程を有することを特徴とする栽培方法が知られている（特許文献１）。
【０００４】
しかし、ランナーを利用する育苗方法は、例えば炭疽病、萎黄病等のような病原菌による大量枯死という致命的な問題がある。この方法は、通常は無病の親株を入手し、１年かけて数１０倍に増殖して使用するか、あるいはさらに１年かけて数百倍に増殖したものを定植苗として用いる。この場合、育苗中に感染した場合、圃場での潜在感染がひどくなり、株に負担がかかる果実生産時期又は病原菌の活動が盛んになる夏場に発病することになる。潜在感染株が大量に増殖して全滅した事例もかなり存在する。これらの問題は、栽培が大規模化すればそれだけ深刻な問題となり、生産者の経済的なダメージも多大になる。
【０００５】
これに対し、無病苗を作成するため、ランナーに存在する芽を茎頂培養（メリクロン）によって増殖する方法もある。例えば、イチゴの茎頂を培養して得たメリクロン苗を一定期間低温処理する低温処理工程と、親株として高温長日条件で養液栽培してランナーを発生させる養液栽培工程と、発生したランナーに着生した子株を展開葉が２枚くらいで根の原基が見えかけた早期の状態で切り離して採苗する子株の採苗工程とを、有することを特徴とするイチゴ苗の増殖方法がある（特許文献２）。
【０００６】
しかし、このような方法では、無病化されたイチゴ苗を提供することは可能であるものの、増殖率が低く、また比較的高価であるため、少量の自家栽培で使用されている程度であり、商業的な規模での育成方法としては不向きといえる。
【０００７】
一方において、イチゴのカルス（未分化の細胞塊）を用いる組織培養等の研究も進められている（非特許文献１）。この方法によれば、無病化されたイチゴ苗をより確実に作成できるため、イチゴの大量生産を大いに期待できる方法である。
【０００８】
ところが、この方法では、カルスを分化するに際し、培養中に変異が誘発されることが多く、無病化されたイチゴ苗を大量に確保することが困難であることから、現時点ではその実用化が阻まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１４−７９２３２
【特許文献２】特開平６−２３７６４２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】イチゴ品種「とちおとめ」のカルス誘導および再分化条件（栃木県農業試験場報告書第６３号  ９〜１６頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特に、イチゴのカルスから健全なイチゴ苗を比較的大量かつ安定に生産することができれば、イチゴの大量生産を実現できるものの、上記のような問題を有するため、未だそのような技術は開発されていないのが実情である。
【００１２】
従って、本発明の主な目的は、カルスを経由して健全なイチゴ苗を比較的大量かつ安定的に提供できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の工程からなる培養方法を採用することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、下記のイチゴ無病苗の生産方法に係る。
１．  イチゴのカルスからイチゴ苗を生産する方法であって、
（１）原材料となるイチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を４０〜６０℃に加熱処理する第１工程、
（２）第１工程で加熱処理された構成部分を第１培地で培養することによって、前記構成部分からカルスを生成させる第２工程、
（３）前記カルスを第２培地で培養することによりシュートを形成させる第３工程、
（４）形成されたシュートを採取し、これを挿し木法により育成することによってイチゴ苗を得る第４工程
を含むことを特徴とするイチゴ苗の生産方法。
２．  前記構成部分が葉柄である、前記項１に記載の生産方法。
３．  第２工程に先立って、加熱処理された構成部分を消毒液により消毒する工程をさらに含む、前記項１に記載の生産方法。
４．  前記第１培地が、ナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸及び塩酸チアミンの少なくとも１種の生長促進成分とベンジルアデニンとを含む、前記項１に記載の生産方法。
５．  前記第２培地が、ナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸及び塩酸チアミンの少なくとも１種の生長促進成分とベンジルアデニンとを含む、前記項１に記載の生産方法。
６．  前記第２培地における生長促進成分の濃度が、第１培地における生長促進成分の濃度の５〜１５％である、前記項５に記載の生産方法。
７．  前記第１培地における生長促進成分の合計含有量が５〜２０ｍｇ／Ｌである、前記項４に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、予め無病化処理されたイチゴ構成部分を出発材料として用い、これから所定の培地においてカルス及びシュートを生成させる工程を経てイチゴ苗を生産するので、健全なイチゴ苗を比較的大量かつ安定的に提供することが可能となる。
【００１６】
しかも、カルスを培養する場合に配合する生長促進成分よりも少量の生長促進成分を含む培地を用いてシュートを生成させる場合には、より変異の少ないイチゴ小苗を効率良く生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の生産方法は、イチゴのカルスからイチゴ苗を生産する方法であって、
（１）原材料となるイチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を４０〜６０℃に加熱処理する第１工程、
（２）第１工程で加熱処理された構成部分を第１培地で培養することによって、前記構成部分からカルスを生成させる第２工程、
（３）前記カルスを第２培地で培養することによりシュートを形成させる第３工程、
（４）形成されたシュートを採取し、これを挿し木法により育成することによってイチゴ苗を得る第４工程
を含むことを特徴とする
【００１８】
第１工程
第１工程では、原材料となるイチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を４０〜６０℃  に加熱処理する。
【００１９】
イチゴ親苗としては、その品種、育成方法等は限定されず、例えば市販の無病苗を使用することも可能である。なお、炭疽病菌等の検出は、公知の方法により実施できるので、事前にそのような検出方法に従って病原菌の存在を確認することもできる。なお、第２工程以降においても、異変のあった場合は培養容器（フラスコ）ごと廃棄するか、健全な部分を新しい培地のフラスコに移植することにより健全生育種苗や組織を選別することができる。この過程で培養期間中に外見上変化のないものは無菌化されているとみなせる。
【００２０】
イチゴ親苗の一部を採取して得られた構成部分を原材料として用いるが、その構成部分としては特に限定されない。例えば、葉片、葉柄、ランナー茎部、ランナーの芽等のいずれも使用することができる。
【００２１】
本発明では、前記構成部分として、確実に加熱処理に耐えられるという点で葉柄を用いることが好ましい。葉柄は、葉片等に比して耐熱性があり、加熱耐性がより強いため、加熱滅菌することが可能になる。例えばうどんこ病、炭疽病、ウィルス病等の病原菌は熱に弱いため、たとえイチゴ親苗が罹病していたとしても、加熱処理により滅菌したり、あるいは大幅に減少させることができる。しかも、葉柄は、ランナーと異なり、周年得られること及び大量に得られることから出発材料として適している。
【００２２】
葉柄を構成部分として用いる場合、葉が展開した状態の若いものが好ましい。幼若葉の場合は、組織が軟らかく、耐熱性に劣るため、活着率が低くなる。また、成熟しきった葉柄は、カルス形成が遅い。
【００２３】
本発明では、構成部分を４０〜６０℃程度、好ましくは４５〜５５℃で加熱処理する。加熱時間は、品種により耐熱性の差異があるので、通常は５〜３０分程度の範囲内において、その耐熱性等を考慮しながら決定すれば良い。従って、例えば４８〜５２℃で５〜１５分程度の加熱滅菌処理を行うことができる。例えば、５０℃で１０分程度の加熱処理によって、雑菌の混入率を加熱処理前の概ね１割以下に減少させることができる。
【００２４】
本発明では、加熱処理後に必要に応じて消毒液による消毒（消毒工程）を実施することもできる。これにより、耐熱性のある細菌もほぼ完全に除去することができる。細菌の耐熱性は、組織内部に存在する菌糸状のもの等は低いが、胞子等の硬い殻につつまれたものは高い。このような耐熱性を有する細菌は、加熱処理でも十分に取り除くことができない場合がある。このため、消毒工程を実施することにより、耐熱性の高い細菌もほぼ完全に除去することが可能となる。
【００２５】
消毒工程は、殺菌性のある消毒液により構成部分を接触させることにより実施することができる。前記消毒液としては、例えばエタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウム等を好適に用いることができる。これらは水溶液の形態で好適に使用することができる。接触させる方法は、特に限定されず、例えばスプレー、浸漬等の手段を採用すれば良い。構成部分として葉柄を用いる場合を一例とすると、葉柄を１〜５ｃｍ程度に切断し、水洗した後、消毒用アルコールで２０〜６０秒程度、５〜１５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液で５〜１５分程度滅菌した後、滅菌水に１〜５回程度洗浄することが好ましい。これらの操作で培養中に雑菌が発生・繁殖する可能性はほとんどなくなる。
【００２６】
第２工程
第２工程では、第１工程で加熱処理された構成部分を第１培地で培養することによって、前記構成部分からカルスを生成させる。
【００２７】
第１培地は、基本培地に対して生長促進成分を添加してなる改変培地を好適に用いることができる。
【００２８】
基本培地としては、植物組織培養で一般的に使用されている培地を用いることができる。例えば、ハイポネックス（登録商標）培地等を用いることができる。特に、本発明では、基本培地として、ハイポネックス（登録商標）培地に有機成分を配合した培地を好適に用いることができる。例えば、水、ハイポネックス（登録商標）、糖類（二糖類）、ゲル化剤、果実類及び活性炭を含む培地を採用することができる。各成分の含有量は、イチゴの品種、構成部分の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば葉柄を用いる場合等は、水１Ｌにハイポネックス（登録商標）３〜１０ｇ、砂糖１５〜３０ｇ、ジュランガム１〜５ｇ、果実類５０〜２００ｇ及び活性炭０．１〜５ｇを配合した組成を基本培地として好適に採用することができる。なお、これらの成分のうち水溶性成分は、すべて水に溶解していることが好ましいが、本発明の効果を大きく損なわない範囲内で一部が未溶解となっていても良い。また、上記の果実類は特に限定されないが、例えばバナナ、リンゴ等を好適に用いることができる。
【００２９】
切断材料（構成部分）からカルスを生成するためには微量のベンジルアデニン（ＢＡ）等のサイトカイニンよばれる生長促進成分（ホルモン）も添加することが望ましい。このため、本発明では、基本培地に対して一定量の生長促進成分を配合した改変培地を第１培地とすることが好ましい。
【００３０】
生長促進成分としては、カルスの生成を促進するものであれば限定的ではないが、特に本発明ではナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸及び塩酸チアミンの少なくとも１種とベンジルアデニンとを好適に用いることができる。好ましくは、ナフチル酢酸、ミオイノシトール、アデニン、ニコチン酸、塩酸チアミン及びベンジルアデニンをすべて含む組成である。例えば、基本培地中において、生長促進成分としてナフチル酢酸０．０５〜０．５ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール５〜５０ｍｇ／Ｌ、アデニン０．５〜５ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０５〜０．５ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン０．０５〜０．５ｍｇ／Ｌ及びベンジルアデニン０．５〜５ｍｇ／Ｌを含むことが好ましい。これらの生長促進成分は、水等の溶媒に予め溶解させて水溶液として用いることが好ましい。生長促進成分の濃度が高すぎるとカルス化は容易になり、増殖速度も早くなるが、外観的に変異した状態ができやすくなる。例えば、軟らかいゼリー状のカルスになり、シュートを形成しなくなる。他方、生長促進成分の存在しない又は少なすぎる培地では、カルスは効果的に形成されず、枯死するおそれがある。
【００３１】
また、第１培地のｐＨは健全なカルスが形成される限りは特に制限されないが、通常はｐＨ５〜７程度の範囲内となるように適宜調節すれば良い。
【００３２】
培養方法は、一般的な方法に従って実施すれば良い。特に、葉柄を用いる場合は、長さ０．５〜５ｍｍ程度に切断し、培地（好ましくは固体培地）上に移植することが好ましい。この場合、切断面を横にして移植（配置）することが好ましい。これにより、切断両面からカルスが発生し、高い肥大速度を得ることができる。また、フラスコ等のような培養容器中で培養することもできる。
【００３３】
なお、ランナーを出発材料として使用する場合も同様条件であり、ランナー先端１０ｃｍ程度の比較的軟らかい部分が材料として適する。ランナーの先端又は節の部分に存在する芽を切り出して使用しても良い。
【００３４】
培養条件は特に限定的ではないが、次のように設定することが望ましい。温度は、通常２０〜３０℃の範囲内とすることが好ましい。光強度は、通常１０００〜３０００ルクスの電照を１０〜１５時間／日とすることが好ましい。このような条件下で培養することにより、一般的に１５〜２０日程度でカルスを発生させることができる。
【００３５】
第３工程
第３工程では、前記カルスを第２培地で培養することによりシュートを形成させる。
【００３６】
前記カルスは、数ｍｍ程度の粒状のカルスが集まった集合体となっている場合があるが、その場合は集合体を解してから個々の粒状のカルスを第２培地で培養することが好ましい。この場合、破砕と培養を繰り返せば３回程度で１０００倍に増殖することは可能であるが、変異の危険性が高くなるおそれがあるので、葉柄から発生したカルスはそのまま直ちにシュートを形成させるために用いることが好ましい。特に、前記のような集合体を形成する前の段階のカルス（直径１〜５ｍｍ程度）を用いて第２培地で培養することがより好ましい。これにより、より確実に変異していないカルスを用いることができる結果、健全なシュートを効果的に形成させることができる。
【００３７】
第２培地は、基本培地の単独、あるいは基本培地に生長促進成分を添加した改変培地を採用することができる。基本培地としては、第１培地で使用する基本培地と同様の組成の培地を採用することができる。また、改変培地は、基本培地に対して、第１培地で使用する生長促進成分を配合した培地を用いることができる。この場合、生長促進成分の種類も、第１培地の場合と同様の成分を用いることができるが、その濃度は第１培地よりも低くすることが好ましい。より具体的には、第１培地における生長促進成分の濃度（合計重量）の５〜１５％程度の濃度であることが好ましい。このような低い濃度に設定することによって、より確実に変異を回避しつつ、健全なシュートを効率的に発生させることができる。
【００３８】
また、第２培地のｐＨは健全なシュートが形成される限りは特に制限されないが、通常はｐＨ５〜７程度の範囲内となるように適宜調節すれば良い。
【００３９】
培養方法は、生成したカルスを必要に応じて細かく解した後、個々のカルスを培地に移植すれば良い。培養は、フラスコ等のような培養容器中で実施することもできる。
【００４０】
培養条件は限定的ではないが、次のように設定することが望ましい。温度は、通常２０〜３０℃の範囲内とすることが好ましい。光強度は、通常１０００〜３０００ルクスの電照を１０〜１５時間／日とすることが好ましい。このような条件下で培養することにより、一般的に約１ヶ月程度でシュートを発生させることができる。
【００４１】
第３工程で発生したシュートは、節間に茎とともに葉柄が出現し、その葉柄と茎の接続部に芽が発生するまで第２培地で育成することが好ましい。すなわち、節間に茎が現れ、切断増殖できる形態を有するようになるまで育成することが好ましい。発生したシュートをそのまま成長させると通常は約２〜５ｍｍ程度の茎を有して葉柄が出現し、この葉柄と茎の接続部には芽が発生する。このような芽が存在する部分を切断して第４工程で育成することによって小苗を得ることができる。
【００４２】
第４工程
第４工程では、形成されたシュート（好ましくは、形成したシュートの葉柄と茎の接続部に発生した芽を含む部分）を採取し、これを挿し木法により育成することによってイチゴ苗を得る。
【００４３】
第３工程で発生したシュートは、節間に茎が現れて切断増殖できる形態を有するようになる。成長すると２〜５ｍｍ程度の茎を有して葉柄が出現する。この葉柄と茎の接続部には芽が存在する。この芽とその周辺を含む部分を切断し、これを培養すると短時間で芽は成長し、小苗が育成される。また、この小苗を再度切断し、培養することにより新たな小苗を育苗できる。このようにして繰り返して増殖することにより、２倍／月以上の速度で増殖することができる。この挿し木法による増殖段階では、通常の花木、花類の挿し木増殖と同様、ほとんど変異のない繁殖苗が得られる。
【００４４】
また、挿し木法は、１つの培地で実施する方法でも良いし、経時的に２段階又はそれ以上に分けての培地を変えながら育成する方法であっても良い。例えば、第１段階では合成培地又は半合成培地で育成した後、第２段階では培養土等のような天然培地ないしは土壌での育成を行うことができる。
【００４５】
挿し木を行う場合に用いる培地は特に限定されず、一般的な培地を使用することもできる。この場合、培地には、生長促進成分を含まないことが好ましい。従って、例えば前記第１培地と同様の培地で好適に培養することができる。また、寒天培地のような合成培地のほか、培養土等の天然培地であっても良い。
【００４６】
このようにして育苗されたイチゴ苗は活性が高い。例えば、最終的に数枚の葉が存在する茎頂部を切り取り、フラスコ外の圃場の培地に移植すると、１週間程度で発根し、１ヶ月程度で鉢上げできる数ｃｍの苗に成長する。フラスコ内に残った残部は１ヶ月程度で再生し、新たに苗を切り出すことができる。このように無病で大量にイチゴ苗が生産できることから、安価に健全なイチゴ苗を安定的に供給することが可能になる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を示し、本発明の特徴をより具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
【００４８】
実施例１
（１）葉柄の無病化
品種名「おいＣベリー」（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構（通称：農研機構））の葉柄を採取し、約５ｃｍに切断した。この葉柄を５０℃に調整した恒温槽中で１０分間加熱処理を行った。次いで、消毒用の市販７８％エタノール中に３０秒間浸した後、試薬次亜塩素酸ナトリウム溶液（アンチホルミン）を１０倍希釈した水溶液に１０分間浸すことにより、消毒液による滅菌を実施した。滅菌水で３回洗浄した後、葉柄をさらに１〜２ｍｍ程度に切断して得られた葉柄切片を寒天培地（第１培地）に置いた。葉柄を培養し始めて１８日経過後に全個数の１割の葉柄から薄緑色のカルスが発生しているのを確認した。葉柄を培養し始めて２６日経過後に２個の緑色カルスを１０個以上に破砕した。
第１培地としては、水１０００ｍＬにハイポネックス（登録商標）６ｇ、砂糖２５ｇ、ジェランガム２．６５ｇ（寒天に代用可能）、バナナ１００ｇ、活性炭０．５ｇ溶解した培地を基本培地とし、この基本培地に対して１０重量％の生長促進成分（ホルモン）培地を添加した組成からなる改変培地を採用した。前記ホルモン培地として、ナフチル酢酸０．００１ｇ、ミオイノシトール０．１ｇ、アデニン０．０１ｇ、ニコチン酸０．００１ｇ、塩酸チアミン０．００１ｇ、ベンジルアデニン０．０１ｇを水１０００ｍＬに加えて得られる混合物を用い、この混合物をホルモン１００重量％培地とした。なお、本実施例では基本培地に対して１０重量の上記ホルモン培地を添加したが、通常は０．５〜１５重量％（特に５〜１５重量％）の範囲で適宜調整することができる。
【００４９】
（２）カルスの増殖
固体培地に置かれた葉柄切片は２５℃の培養室で２５００ルクスの電照を１２時間／日行うことにより、約１ヶ月で両端から緑色のカルスが発生した。発生したカルスは１ヶ月程度で１ｃｍ程度に肥大した（大きさ約数ｍｍ程度の粒状のカルスが集合した状態）。ちなみに、カルスを同じ組成の新培地に移してピンセットで強く挟むことにより１０〜２０片程度に破砕した。上記条件で管理すると約１ヶ月で元の大きさに肥大した。
【００５０】
（３）シュートの発生
上記で得られたカルスの１個を第２培地に移し、５個に破砕した。約１ヶ月経過後に２ｍｍ程度のシュートを確認した。その約２週間後には７か所からシュートを発生し、７ｍｍ程度に成長した。第２培地としては、ホルモン培地の添加量を１０重量％から１重量％に変更したほかは、第１培地と同様にした培地を用いた。
【００５１】
（４）挿し木の実施
数ｃｍ、５〜１０枚程度の葉が存在する小苗を切断した。葉と茎の結合部には芽が存在するのでこの部分を含む部分を寒天培地に挿し木する。培地上に乗せただけでもほぼ同様に成長する。１ヶ月で４〜５枚の新葉が発生するので、再度同様に切断しても良い。培地はホルモンを含まないものを用いる。バナナ、リンゴ等の果実類（有機成分）を添加した培地のほうが成長が良い。ここで使用した寒天培地としては、ハイポネックス（登録商標）（窒素／リン／カリ比率＝６．５／６．０／１９）３ｇ、ショ糖２５ｇ、寒天１．７５ｇ、活性炭０．５ｇ及びバナナ１００ｇを１０００ｍＬの水に混合し、ｐＨ５．７に調整した培地を使用した。
【００５２】
（５）第２の挿し木の実施（苗の作成）
挿し木法によって増殖した小苗（フラスコ中）の先端に３〜５枚程度の葉を付けた状態で先端部を切り取った。切り取った基部は１ヶ月ほどの放置で元のような小苗に回復した。切り取った先部を赤玉土（微細）等の雑菌の少ない培養土に挿し木を行った。２５℃の温度下で培養して１週間程度で発根が始まり、１ヶ月程度で育苗用の数ｃｍ径のポリポット等に植え込むことができた。その後は、通常のイチゴ苗の栽培法に準じて栽培し、葉柄の採取日から約３００日目にイチゴを収穫することができた。
【００５３】
（６）変異の有無の確認
上記実施例による種苗について、栽培農家による委託栽培を実施した（委託先：（株）小豆島ふるさと村、（株）スカイファーム及び（株）森のいちごの合計３ヶ所）。これら３か所の外部委託分（各１００株）、自社栽培株２００株は、いずれも変異は認められなかった。