(57)【要約】【課題】カイコガ科に属するカイコでは、後部絹糸腺は細く摘出が難しく、中部絹糸腺では合成量が低いという欠点があった。【解決手段】カイコとは異なりヤママユガ科に属するエリ蚕の絹糸腺に着目した。このエリ蚕の絹糸腺は、５齢期に急激に発達し、さらに、中部、後部絹糸腺の区別がほとんどなく全体を容易に摘出できることがわかった。その容易に摘出した絹糸腺を用い、合成量を実用化レベルにまで向上するために、抽出液製造条件を検討した。その結果、５齢２，３日のエリ蚕幼虫から摘出した絹糸腺を用い、さらに絹糸腺重量に対して１．２５倍の抽出用液を添加して作製した抽出液を用いて、４．２μｇ／ｍｌの合成量を有する無細胞タンパク質合成系の構築に成功した。これにより、作業性の向上を保ちつつ、高い合成能を有する絹糸腺抽出液の製造が可能となり、実用化可能な技術とすることができた。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹糸腺を用いる無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法において、ヤママユガ科に属する蛾の幼虫を用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項２】
ヤママユガ科に属する蛾の幼虫が、エリ蚕の幼虫である請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項３】
絹糸腺重量に対して０．２５〜２倍の抽出用液を添加して作製した抽出液を用いる請求項１〜２に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項４】
５齢期のエリ蚕幼虫から摘出した絹糸線を用いる請求項１〜３に記載の無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造した無細胞タンパク質合成用抽出液を用いた無細胞タンパク質合成試薬キットの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法で製造した無細胞タンパク質合成用抽出液を用いたタンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成系に使用できる抽出液の製造方法、ならびに当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムをはじめとし多くの生物の遺伝情報が解読されている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品開発研究などに利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡便に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって大腸菌、酵母、昆虫培養細胞、哺乳動物培養細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系または遺伝情報転写／翻訳系を試験管内に取り揃え、反応鋳型として目的タンパク質をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡ（転写鋳型）またはｍＲＮＡ（翻訳鋳型）を用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞タンパク質合成系（以下、「無細胞系」）が知られている。このような無細胞タンパク質合成系では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を絶つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系に供する抽出液（無細胞タンパク質合成用抽出液）として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。
【０００５】
無細胞タンパク質合成用抽出液としては、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球の他、昆虫培養細胞など由来のものが以前から知られている。出願人は、これまでカイコ組織由来の抽出液（カイコ抽出液）を使用した無細胞系タンパク質合成方法を提案して来ている（特許文献１〜３）。我々が提案するカイコ抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法では、従来の方法と比較して、カイコという安価な材料を用いて抽出液が作製でき、動物細胞由来の抽出液の中では高いタンパク質合成能力を有し、糖タンパク質の合成も可能であるという利点があり、非常に有用である。しかしながら、抽出液作製に適しているカイコ器官である後部絹糸腺や脂肪体は、細く脆弱であるため、ローラー状の物で蚕の頭部から尾部に向けて押し出す方法にて絹糸線を分離する方法や絹糸線を細かく切って絹糸線細胞を除去する等の従来方法では傷つけることなく、摘出することができない。その結果として抽出液の製造が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合があり、その改善方法を見出すことが重要な課題であった。
【０００６】
一方出願人は、カイコ抽出液を得るために、フィブロインを特異的に産生しない突然変異蚕系統から作製した交雑種の中部絹糸腺を採取することにより、後部絹糸腺に比べて太いため摘出が容易な中部絹糸腺を用いることにより作業が効率的であり、フィブロインの蓄積を伴わないため一般的なカイコ品種より粘弾性が低く取り扱いに適した、無細胞系タンパク質合成用抽出液が得られることを見出したが、合成量が少なく実用化までには至っていない。（特許文献４）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４２４４６２５号公報
【特許文献２】特許第４２４４６２８号公報
【特許文献３】特許第４２４３７６２号公報
【特許文献４】特開２０１４−９７０５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまで研究材料としてきたカイコガ科に属するカイコでは、後部絹糸腺は細く摘出が難しく、中部絹糸腺では合成量が低いという欠点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
欠点を改善するために、カイコとは異なりヤママユガ科に属する蛾、特にエリ蚕の絹糸腺に着目した。このエリ蚕の絹糸腺は、５齢期に急激に発達し、さらに、中部、後部絹糸腺の区別がほとんどなく全体を容易に摘出できることがわかった。その容易に摘出した絹糸腺を用い、合成量を実用化レベルにまで向上するために、抽出液製造条件を検討した。その結果、５齢２，３日のエリ蚕幼虫から摘出した絹糸腺を用い、さらに絹糸腺重量に対して１．２５倍の抽出用液を添加して作製した抽出液を用いて、４．２μｇ／ｍｌの合成量を有する無細胞タンパク質合成系の構築に成功した。
【発明の効果】
【００１０】
これにより、作業性の向上を保ちつつ、高い合成能を有する絹糸腺抽出液の製造が可能となり、実用化可能な技術とすることができた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はエリ蚕の幼虫である。
【図２】図２は５齢エリ蚕幼虫より摘出した絹糸腺である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「エリ蚕」は、通常用いられるカイコガ科に属する蚕系統とは異なり、野蚕の一つであるヤママユガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）に含まれ、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。
【００１３】
エリ蚕は、卵より孵化した後の幼虫の状態では、ヒマを食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期が終齢である。その後１週間程度でカイコの幼虫は、体が半透明になり絹糸を吐いて繭を形成し始め（この状態は「熟蚕」とも呼ばれる）、繭中で蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００１４】
本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であるが、通常用いられるカイコガ科に属する蚕系統とは異なり、摘出に適する発達した５齢期には、中部、後部絹糸腺の区別がほとんど無いという特徴を有する。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
【００１５】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成（翻訳系）、ならびに、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成（転写／翻訳系）のいずれであってもよい。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、ヤママユガ科に属する蚕系統の幼虫の絹糸腺を材料として用いることを特徴とする、無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法である。従来のカイコガ科に属するカイコでは、後部絹糸腺は細く摘出が難しく、中部絹糸腺では合成量が低いという欠点を有しているが、ヤママユガ科に属するエリ蚕の絹糸腺は、５齢期に急激に発達し、さらに、中部、後部絹糸腺の区別がほとんどなく全体を容易に摘出できること、抽出液製造条件の検討及び抽出液の添加により、高い合成量を有する無細胞タンパク質合成系の構築に成功した。これにより、作業性の向上を保ちつつ、高い合成能を有する絹糸腺抽出液の製造が可能となり、実用化可能な技術とすることができた。
【００１７】
本発明に用いるヤママユガ科に属する蚕系統として、特に好ましいのはエリ蚕であるが、これに限定されるものでは無い。
本発明の実現に先だって、通常用いられるカイコガ科の蚕系統とは異なり、エリ蚕特有の飼育方法が必要とされる。
【００１８】
エリ蚕の飼育には、新鮮なヒマを給餌する必要がある。しかしながらヒマの栽培、葉の収穫、給餌、幼虫の飼育を毎日行うには多大な労力と時間がかかる。そのため、生葉の保存が数日間でも可能になれば作業の効率化が図れる。
【００１９】
葉の収穫方法として、茎の有無については、茎を付けたまま収穫することが望ましい。また保存温度と湿度については、１５℃前後で保存し、ポリ袋を密封し湿度を保つ方法が適している。生葉は、収穫後１週間程度の保存が可能であり、生葉飼料に関する作業の効率化が図れる。
【００２０】
ヒマ（トウゴマ）は沖縄から東南アジアにかけて高温多湿な地方において生育するため、カイコガ科の蚕系統の飼料であるクワとは異なる地域での生産が期待出来る。さらにエリ蚕はキャッサバをも飼料とするので、飼育可能地域は熱帯にまで広がり、従来のカイコの飼育及び無細胞タンパク質合成の研究、実施では考えられていなかった環境条件での運用が可能である。
【００２１】
生葉飼料と併用又は人工飼料による飼育が可能である。用いる人工飼料としては、市販のシルクメイトＬ４Ｍ交雑種４齢用やシルクメイト原種１〜３齢用Ｓ（日本農産工業）が使用出来る。生育の速度としては、人工飼料に比べ生葉飼料で飼育した方が好ましいが、飼料植物の栽培事情や、葉の収穫、保存等の労力を勘案し、適宜選択可能である。なお、人工飼料で飼育する場合は、比較的高温環境下（たとえば２５℃より２７℃）で飼育することが好ましい。このことから、比較的高温の地域において、エリ蚕の人工飼料による飼育が適していることが判る。
ヒマの生葉３０ｇから５０ｇと水１５０ｃｃをミキサー内に投入し、粉砕撹拌し得られた液（青汁）を市販のシルクメイトＬ４Ｍ交配種４齢用に混ぜ与えると、市販のシルクメイトＬ４Ｍ交配種４齢用のみで与えた場合より好んで食し、成長についても良好となる。
【００２２】
エリ蚕は野蚕に分類され、通常屋外で飼育される。そのため屋内飼育の場合、エリ蚕に適した飼育環境を整える必要がある。室内飼育は、飼育施設の整備や飼育葉の収穫、糞や脱皮殼の除去などに多くの労力がかかるが、鳥虫獣などの危険に曝されることなく安定した幼虫飼育ができる。この時、野蚕であるエリ蚕の生態的特徴を把握したうえで、飼育を行う環境をエリ蚕に合わせていく必要がある。
【００２３】
エリ蚕の屋内飼育に適した環境条件として注意すべきことは、エリ蚕の飼育には、蚕沙（飼料の食べ残し、糞、脱皮殼）により発育不良が起こることであり、飼料と蚕沙との分別について適切な方法を採る必要がある。
【００２４】
最も好ましい方法は、飼育棚にハンモック状にネットを吊す方法であり、蚕がネット下側への移動も可能となり給餌効率が向上する。さらに、通気性が改善され、糸状腐食の発生がなくなり、清掃作業回数が少なくて済む。５齢幼虫までの成長過程においての減蚕歩合が最も低くなる。
その他に使用可能な方法としては、蚕座に新聞紙を敷いた場合やプラスチックカゴを使用した場合、人工飼料飼育では、蚕糞、人工飼料の水分により糸状腐食が起こらないよう、設定環境が高温多湿環境にならないように注意する必要がある。清掃作業も頻繁に行うことが望ましい。
【００２５】
その他細かい飼育条件として好ましい一例を示す。ただしこの条件に限定されるものでは無い。
・  温度・湿度  ：２６℃、６０％
・  給餌量      ：４齢約１／２枚、５齢約４枚（１日１頭あたりに与える餌）
・  飼育密度    ：１００頭／ｍ２
・  エリ蚕の餌となるヒマは野外で栽培されており、虫やウイルス等が付着している場合がある。そのため、飼育部屋と餌を保存している部屋とを別けている。
・  家蚕とエリ蚕への給餌や飼育箱の掃除は同時に行わない。
・  洗浄できる飼育用具・器具は、給餌や飼育箱の掃除を行った後、家庭用洗剤を用いて洗浄する。洗浄できない器具に関しては、７０％エタノールを用いて消毒する。
・  野蚕の一種であるエリ蚕は、良く歩き回り集団生活を嫌う。さらに飼育密度が高いと他の幼虫を傷つけることがあるため、１頭あたりの飼育環境を広く確保した（５齢幼虫５頭／飼育用弁当箱）。
【００２６】
エリ蚕無細胞タンパク質合成系において、５齢日齢に伴う絹糸腺の状態が大きく影響する。エリ蚕幼虫の絹糸腺は、５齢中期以降に後部絹糸腺の肥大が著しいため、エリ蚕無細胞タンパク質合成の成功にとって、５齢期後の日齢を的確に把握することが重要である一方、エリ蚕は、胸肢・腹肢・尾肢の把握力が強く体をしっかり餌や網に固定しているため、無理にそれらから離すと幼虫を傷つける原因になる。そのため、幼虫に触れず迅速に５齢期幼虫を判別することが望ましい。
【００２７】
この判別方法としては、５齢幼虫の頭部幅は４齢幼虫のそれに比べ平均０．１９ｃｍ長いことから、エリ蚕幼虫の頭部幅を目視することにより５齢期エリ蚕を確認することが出来る。
【００２８】
エリ蚕をはじめ、ヤママユガ科の野蚕のみが多孔性繭糸を吐く（赤＃２００７）。その糸は、明確なセリシン層を有しないため絹糸腺全体を用いた簡便な抽出液の製造が可能である。
【００２９】
エリ蚕５齢幼虫を切開して絹糸腺摘出を取り出す場合、切開器具には、ハサミ、バット、ピンセット等が用いられ、エリ蚕は５分から１０分の氷冷で仮死状態にし、その後切開される。５齢４日以降の幼虫を切開する場合、絹糸腺は目視で容易に確認が可能な程肥大しているため、腹側・背側どちらの切開方法で摘出しても差はなく容易であるが、５齢初期の幼虫を切開した場合、絹糸腺が細く目視での確認が困難であるため、以前からカイコの解剖等で幅広く行われている腹面、尾部から頭部にかけて切開する方法が背面からの切開に比べ容易である。このことから、エリ蚕５齢幼虫の絹糸腺全体を摘出するには、腹側を尾部から頭部にかけてハサミを用いて切開する方法が有効である。さらにはスライサー・アスピレーター器具等の機器が、機械化、効率化のために使用され得る
【００３０】
本発明における抽出対象である絹糸腺は、カイコ幼虫のどの状態（１齢期〜５齢期）由来であってよい。また、単一の状態（たとえば、５齢期のカイコ幼虫）に限らず、複数の状態（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫）であってもよい。また、中部絹糸腺及び後部絹糸腺を区別なく摘出するのが作業効率上好ましいが、中部絹糸腺や後部絹糸腺のみである場合や、他の組織（たとえば、脂肪体）を含んでいる場合でも構わない。無論、複数の状態の絹糸腺と他の組織を含んでいてもよい。なお、絹糸腺は、その組織全体である必要はない。
【００３１】
絹糸腺抽出液製造に用いるカイコ幼虫は、１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明の方法にて製造できるが、特に、５齢期のカイコ幼虫が適している。中でも絹糸腺長が著しく伸長している点から５齢２、３日が特に好ましく、組織抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行った結果の合成量の点から、５齢１から３日が好ましい。
【００３２】
所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００３３】
本発明の洗浄液としては、塩化ナトリウム水溶液が使用される。塩化ナトリウム水溶液の濃度としては特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜５％、より好ましくは０．５〜２％、特に好ましくは０．７５％である。洗浄は通常、絹糸腺を洗浄液内で攪拌し、濁った溶液の上清を捨て、新鮮な洗浄液で置換することによって行う。以下特に断りが無ければ、本明細書中では洗浄液として塩化ナトリウム水溶液を用いる。
【００３４】
本発明で使用する洗浄液としては、塩を含む水溶液（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムなど）や緩衝液（リン酸バッファー、クエン酸バッファー、トリスバッファーなど）が挙げられる。例えば、塩化ナトリウム水溶液の場合、塩化ナトリウム水溶液の濃度としては特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜５％、より好ましくは０．５〜２％、特に好ましくは０．７５〜０．８％である。この範囲より大きく離れると細胞内外の塩濃度の違いから細胞損傷を起こす恐れがある。
洗浄は通常、中部絹糸腺を洗浄液内で攪拌し、濁った溶液の上清を捨て、新鮮な洗浄液で置換することによって行う。以下特に断りが無ければ、本明細書中では洗浄液として塩化ナトリウム水溶液を用いる。
【００３５】
摘出した組織を、液体窒素で凍結させた後、予め液体窒素で冷却させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、グリセロールおよび緩衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５〜４０％（ｖ／ｖ）グリセロール、および、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有する抽出用液を使用する。このようにして、まず、カイコ中部絹糸腺からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００３６】
組織抽出液を最適化するために抽出液を希釈することが好ましい。添加する抽出液は、摘出し凍結粉砕した絹糸腺重量に対して、好ましくは０．２５〜２倍量であり、より好ましくは１．０から１．２５倍量である。
【００３７】
遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。抽出液の製造方法としては、該遠心分離を１回行った後、得られた上清を抽出液とする。また、タンパク質合成に不要な不溶成分を除去するという観点より、該上清に上記の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清を抽出液としてもよい。
【００３８】
さらに、本発明の抽出液の製造方法としては、上記１回あるいは２回の遠心分離で得られた抽出液をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行うことで抽出液を製造してもよい。具体的には以下の手順にて行う。まず、遠心分離後の上清についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。次に、ゲル慮過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＤＵ８００（ベックマンコールター社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにして得られる画分を抽出液としてもよい。
【００３９】
上記のように本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるエリ蚕の絹糸腺由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお上記タンパク質合成反応は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみによるタンパク質合成反応（翻訳系合成反応）、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含むタンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）のいずれであってもよい。さらに、このような抽出液は、後述するように従来のカイコ後部絹糸腺を用いた抽出液の製造と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に製造することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
【００４０】
本発明の方法で得られた抽出液中におけるエリ蚕絹糸腺由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを超えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００４１】
なお上記範囲の量のエリ蚕絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、製造できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００４２】
本発明の方法で得られる抽出液を用いて、上記翻訳系合成反応、転写／翻訳系合成反応を行うために製造する反応液（それぞれ、「翻訳系用反応液」、「転写／翻訳系用反応液」と呼ぶ。）の組成に特に制限はなく、それぞれ従来公知の組成を適宜選択すればよい。翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液のいずれの場合であっても、本発明の方法で得られた抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するように製造されたものであるのが好ましい。すなわち、反応液の全体において、エリ蚕絹糸腺由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように製造されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように製造されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。  以下、（１）翻訳系用反応液、（２）転写／翻訳系用反応液について、それぞれ説明する。
【００４３】
（１）翻訳系用反応液  翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来ｍＲＮＡ、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。かかる翻訳系用反応液を使用して翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００４４】
上記翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡとは、エリ蚕絹糸腺に由来しないｍＲＮＡを指し、エリ蚕絹糸腺に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、翻訳系用反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるかエリ蚕絹糸腺に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、翻訳系用反応液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００４５】
なお翻訳系用反応液に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００４６】
翻訳系用反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４７】
翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４８】
翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４９】
翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５０】
翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５１】
翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５２】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５３】
翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５４】
翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００５５】
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するエリ蚕絹糸腺由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００５７】
翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５８】
翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５９】
また翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。また、グリセロールの代わりに、同様の効果を有する種々の多価アルコールを好適に添加してもよい。
【００６０】
さらに、翻訳系用反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを超えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６１】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００６２】
上記翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（翻訳系合成反応）は、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を超えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００６３】
（２）転写／翻訳系用反応液  転写／翻訳系用反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分として、外来鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５’−三リン酸、ウリジン５’−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも含有するのが好ましい。かかる転写／翻訳系用反応液を使用して転写／翻訳系合成反応を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。
【００６４】
上記転写／翻訳系用反応液に用いる外来鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記外来鋳型ＤＮＡは、エリ蚕組織に由来しない鋳型ＤＮＡを指し、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５’上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、エリ蚕絹糸腺に由来しない鋳型ＤＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。また本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
【００６５】
なお本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば鋳型ＤＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型ＤＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。なお、抽出液において、含有される鋳型ＤＮＡが外来鋳型ＤＮＡであるかエリ蚕絹糸腺に由来する鋳型ＤＮＡであるかは、抽出液中より、フェノール−クロロホルム抽出を行ってその鋳型ＤＮＡを抽出し、その塩基配列を解析することによって判別することができる。
【００６６】
また、本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
【００６７】
外来鋳型ＤＮＡは、転写／翻訳系用反応液中において、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６８】
転写／翻訳系用反応液に用いるＲＮＡポリメラーゼは、外来鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、外来鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００６９】
ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中に０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７０】
転写／翻訳系用反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７１】
転写／翻訳系用反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７２】
転写／翻訳系用反応液中におけるシチジン５’−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７３】
転写／翻訳系用反応液中におけるウリジン５’−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７４】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７５】
転写／翻訳系用反応液中におけるクレアチンキナーセは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを超えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７６】
転写／翻訳系用反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
【００７７】
タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを超えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００７８】
転写／翻訳系用反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。ｔＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点からは、転写／翻訳系用反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００７９】
転写／翻訳系用反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００８０】
転写／翻訳系用反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８１】
転写／翻訳系用反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出用液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該転写／翻訳系用反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８２】
転写／翻訳系用反応液中におけるＤＴＴは、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを超えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００８３】
転写／翻訳系用反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するエリ蚕由来のＲＮａｓｅによって、転写／翻訳系合成反応の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８４】
上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、転写／翻訳系用反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ末満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを超えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００８５】
転写／翻訳系用反応液に含有される緩衝剤としては、上述した抽出用液に用いたものと同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出用液における緩衝剤の場合と同様の観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００８６】
また転写／翻訳系用反応液は、さらにグリセロールを添加されたものであるのがより好ましい。グリセロールを添加すると、転写／翻訳系合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるという利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。また、グリセロールの代わりに、同様の効果を有する種々の多価アルコールを好適に添加してもよい。
【００８７】
すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した転写／翻訳系用反応液としては、当該抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００８８】
上記転写／翻訳系用反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応（転写／翻訳系合成反応）についても、上記翻訳系合成反応の場合と同様、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行えばよい。転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃末満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
【００８９】
転写／翻訳系合成反応では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００９０】
上記翻訳系用反応液、転写／翻訳系用反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【実施例１】
【００９１】
実施例１：エリ蚕幼虫中部絹糸腺の摘出
５齢期１〜５日に達したエリ蚕幼虫を用いて、絹糸腺の摘出を行った。まず、エリ蚕を氷冷し、仮死状態にした後、切開し絹糸腺全体摘出した。摘出した絹糸腺は、滅菌した０．７５％ＮａＣｌ溶液を入れた滅菌済みプラスチックシャーレに移し洗浄した。その後、ピンセットを用いて絹糸腺をろ紙上に移し、余分な水分を取り除いた。−８０℃にて保冷した乳鉢に絹糸腺を薄く広げた後、液体窒素を用いて凍結させ、乳棒で粉砕した。粉砕した絹糸腺は、１．５  ｍｌのマイクロチューブに分注し、絹糸腺の重量を電子天秤にて測定した後、抽出液作製時まで−８０℃で冷却保存した。
【実施例２】
【００９２】
実施例２：エリ蚕幼虫絹糸腺抽出液の製造
抽出液の製造は以下のように行った。粉状となった中部絹糸腺に等量の下記組成の抽出用液を加え良く攪拌することで抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ        ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ      酢酸カリウム
・２ｍＭ          酢酸マグネシウム
・１ｍＭ          ＤＴＴ
・０．５ｍＭ      ＰＭＳＦ
・１０％          グリセロール
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２２Ｇ２（日立工機社製））にて、２１，５００×ｇ，  １５分間，  ４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、これをエリ蚕絹糸腺抽出液とした。この間、材料や試薬は氷上で冷やしながら操作を行い、不純物が混入しないように手袋を着用した。また、器具や試薬は滅菌したものを使用した。
【００９３】
参考例１：鋳型ｍＲＮＡの調製
無細胞タンパク質合成に用いる鋳型ＤＮＡは、ｐＴＤ１−βｇａｌを用いた。ｐＴＤ１は、昆虫無細胞タンパク質合成用発現ベクター（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｎｅｒ：ＡＢ１９４７４２）であり、ｐＴＤ１−βｇａｌは、翻訳促進配列の直下とＢａｍＨＩサイトの間にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子コードする遺伝子配列が挿入されている。この発現プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、直鎖状ＤＮＡとした。直鎖状ＤＮＡを精製し、フェノール／クロロホルム抽出処理を行った後、エタノール沈澱で濃縮し、滅菌蒸留水に再溶解することで鋳型ＤＮＡを調製した。次にＲｉｂｏＭＡＸ（登録商標）  Ｔ７  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応により、鋳型ＤＮＡから鋳型ｍＲＮＡを合成した。合成した鋳型ｍＲＮＡを含む反応液をゲル濾過カラム（ｉｌｌｕｓｔｒａ（登録商標）  ＮＩＣＫ  Ｃｏｌｕｍｎｓ，  ＧＥヘルスケア社製）に供して未反応の核酸を取り除いたのち、エタノール沈殿を行い、滅菌蒸留水に再溶解して精製ｍＲＮＡ溶液を得た。
【００９４】
実験例１：エリ蚕絹糸腺抽出液を用いた無細胞タンパク質合成
実施例２で製造された抽出液、昆虫培養細胞無細胞タンパク質合成試薬キットＴｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ（島津製作所社製）の反応用試薬（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ４ｍＭメチオニン）、β−ガラクトシダーゼをコードしたｍＲＮＡ（参考例１）を用いて、以下の組成となるように各試薬を混合し、β−ガラクトシダーゼの無細胞合成を行った。合成反応条件は、最終液量を２５μｌ、反応温度を２５℃、そして反応時間を５時間とした。
〔反応液の組成〕
５０（ｖ／ｖ）％  エリ蚕絹糸腺抽出液
３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ７．４）
１００ｍＭ        酢酸カリウム
１．５ｍＭ        酢酸マグネシウム
２ｍＭ            ＤＴＴ
５（ｖ／ｖ）％    グリセロール
０．２５ｍＭ      ＡＴＰ
０．１ｍＭ        ＧＴＰ
２０ｍＭ          クレアチンリン酸
２００μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ
８０μＭ          アミノ酸（２０種）
０．１ｍＭ        ＥＧＴＡ
２００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ
３２０μｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ
合成されたβ−ガラクトシダーゼは、β−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて定量した。具体的な測定方法は、合成液を希釈し、希釈液１０μｌとβ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍの基質溶液１０μｌに加えよく混合した。混合液を発光測定用９６穴マイクロプレート（ｈａｌｆ−ａｒｅａ  ９６ｗｅｌｌ  ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ，グライナー社製）に移し、低温アルミブロック恒温槽ＣＴＵ−Ｍｉｎｉ  を用い、２５℃、３０分間インキュベートしたのち、フレキシブルマイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００，テカン社製）で発光強度を測定した。合成量は、精製β−ガラクトシダーゼ標準品を用いて作成した検量線をもとに、その発光強度より算出した。
【００９５】
表１に日数別に製造した抽出液のβ−ガラクトシダーゼ合成量を示す。５齢期１〜３日の抽出液において合成が確認できた。
【表１】
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【００９６】
実験例２：抽出用液添加量の影響
実験例１では、絹糸腺と同等量の抽出用液を用いて抽出した。さらに合成量を向上させるために、抽出用液添加量の影響を調べた。５齢２，３日のエリ蚕幼虫の絹糸腺を用い、０．２５〜２倍量の抽出液用液を加え、実施例２に従って抽出液を製造した。得られた各抽出液を、実験例１に従って無細胞タンパク質合成および合成量の算出を行った。表４に各抽出液のβ−ガラクトシダーゼ合成量を示す。１倍および１．２５倍の抽出用液を加えて製造した抽出液で４μｇ／ｍｌ以上の高い合成量が得られた。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００９７】
カイコ抽出液を使用した無細胞タンパク質合成系において、ヤママユガ科に属するエリ蚕を用いることにより、５齢期に急激に発達し、さらに中部、後部の区別がほとんどなく全体を容易に摘出できる絹糸腺を材料とした抽出液の製造方法およびその抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法が提供される。
さらに、高温多湿な地方で生育するヒマ、キャッサバ等を飼料とするので、従来のカイコの飼育及び無細胞タンパク質合成の研究、実施では考えられていなかった環境条件での実用的運用も可能である。
【図１】
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【図２】
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