(57)【要約】      （修正有）【課題】環境に有害な芳香族化合物、又はこれを含有する産業廃水を利用してポリヒドロキシブチレートを製造する方法の提供。【解決手段】下記１）及び／又は２）の微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程を含む、芳香族化合物からポリヒドロキシブチレートを製造する方法。１）特定の塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するバチルス属微生物。２）特定の塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するカプリアビダス属微生物。【効果】有害な芳香族化合物の分解除去と有用物質の製造という２つの課題を解決することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１）及び／又は２）の微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程を含む、芳香族化合物からポリヒドロキシブチレートを製造する方法。
１）配列番号１に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物
２）配列番号２に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物
【請求項２】
微生物がさらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有する微生物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程が、芳香族化合物を含有する産業廃水を含む培地中で前記微生物を培養する工程である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
芳香族化合物がフェノール類及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５０として寄託されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株及び／又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５１として寄託されているカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属株である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物。
【請求項７】
さらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有する、請求項６に記載のバチルス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ）属微生物。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５０として寄託されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株である、請求項６又は７に記載のバチルス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ）属微生物。
【請求項９】
配列番号２に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有するカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物。
【請求項１０】
さらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からポリヒドロキシブチレートを生産する能力を有する、請求項９に記載のカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物。
【請求項１１】
独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５１として寄託されているカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属株である、請求項９又は１０に記載のカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の製造方法及び該方法に利用可能な新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性プラスチックは、微生物などの作用により例えば土壌中に埋めた状態で分解されるため、環境破壊を防止する観点から注目されている。その実用化に向けて、生分解性プラスチックの安価な量産技術が求められている。中でも、生分解性プラスチックの一種であるＰＨＢ（Ｐ３ＨＢとも表される）は、硬度等の点でポリ乳酸などの他の生分解性プラスチックよりも優れており、その安価な製造方法に対するニーズは高い。
【０００３】
生分解性プラスチックは、メタン若しくはメタノールなどの炭化水素若しくはアルコール、又はトウモロコシ、ビートその他の植物体若しくはこれらを加工して得られるいわゆるバイオマスなどを炭素源とし、生分解性プラスチックを生合成することのできる微生物を培養することで製造されることが多い。しかし、上記の方法における各種原料のコストは、通常のプラスチック原料となる石油等と比較して高く、このことが生分解性プラスチックの量産化を妨げる経済的原因の一つとなっている。
【０００４】
一方、生分解性プラスチックの利用とは別に、環境破壊を防止する観点において、産業廃水に多く含まれる有害な芳香族化合物の分解除去も、重要な課題の一つである。特に産業廃水に広く含有されているフェノール類は、いわゆる環境ホルモンとして知られており、生態系に対して有害な芳香族化合物の代表例である。
【０００５】
このような芳香族化合物を原料として生分解性プラスチックのような有用物質を製造することができれば、有害な芳香族化合物を分解除去することができると同時に、生分解性プラスチックの原料コストを大幅に抑制することができる点で、有益である。しかし、芳香族化合物は生分解性プラスチックを製造することができる多くの微生物に対しても有害であることが多く、ＰＨＢ生産能を有する既知の微生物の全てに直ちに適用することは困難である。
【０００６】
芳香族化合物を分解することができる微生物、例えば幾つかのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物はこれまでにも見いだされているが、これらは芳香族化合物を原料とした生分解性プラスチックを生産する能力を有しない。また、ＰＨＢを生産することのできる微生物も多数報告されているが、その多くは前記炭化水素や糖類を原料とするものであり、原料コストの問題は解消されていない。
【０００７】
芳香族化合物例えばフェノール又は安息香酸ナトリウムを炭素源としてＰＨＢを製造することができる微生物としては、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）及びバリオボラックス・パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）などが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５１３５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、環境に有害な芳香族化合物、又はこれを含有する産業廃水を利用してＰＨＢを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、フェノール類を資化することのできる微生物を探索する過程において、特定の１６ＳリボソームＤＮＡ（以下、１６Ｓ  ｒＤＮＡと表す）を有するバチルス属微生物及びカプリアビダス属微生物が、種々のフェノール類からＰＨＢを製造する能力を有することを見出し、以下の各発明を完成させた。
【００１１】
（１）下記１）及び／又は２）の微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程を含む、芳香族化合物からＰＨＢを製造する方法。
１）配列番号１に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物
２）配列番号２に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物
（２）微生物がさらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からＰＨＢを生産する能力を有する微生物である、（１）に記載の製造方法。
（３）微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程が、芳香族化合物又はこれを含有する産業廃水を含む培地中で前記微生物を培養する工程である、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）芳香族化合物がフェノール類及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物である、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５０として寄託されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株及び／又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５１として寄託されているカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属株である、（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）配列番号１に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物。
（７）さらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からＰＨＢを生産する能力を有する、（６）に記載のバチルス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ）属微生物。
（８）微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５０として寄託されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属株である、（６）又は（７）に記載の微生物。
（９）配列番号２に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物。
（１０）さらにハロゲン化フェノール及び／又は２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物からＰＨＢを生産する能力を有する、（９）に記載のカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物。
（１１）微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５１として寄託されているカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属株である、（９）又は（１０）に記載の微生物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、産業廃水に含有される芳香族化合物から有用な生分解性プラスチックを製造することができ、有害な芳香族化合物の分解除去と有用物質の製造という２つの課題を解決することができる。また、本発明で製造される生分解性プラスチックは、ＰＨＢ以外のポリヒドロキシアルカン酸を実質的に含まず、硬度等の点で優れたＰＨＢを高純度でかつ簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】種々の芳香族化合物を含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養したときの増殖曲線である。
【図２】種々の芳香族化合物を含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養したときの乾燥菌体重量を示すグラフである。
【図３】幾つかの芳香族化合物を含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養したときに製造される培養生産物の、乾燥菌体重量当たりの含有率（％／ＤＣＷ）を示すグラフである。
【図４】フェノールを含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養して得られる培養生産物についての、ＦＴ−ＩＲ解析チャート図である。
【図５】フェノールを含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養して得られる培養生産物についての１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのチャート図である。
【図６】フェノールを含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養して得られる培養生産物についての１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのチャート図である。
【図７】フェノールを含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養して得られる培養生産物及び標準ＰＨＢについての、ＤＳＣ曲線である。
【図８】フェノールを含む培地でバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株を培養して得られる培養生産物についてＸ線回折分析を行ったときの回折パターンである。
【図９】フェノールを含む培地で培養したバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株の透過型電子顕微鏡写真である。図中Ａ〜Ｄは、同条件で培養した異なる菌体の写真である。
【図１０】ナフタレンを含む培地で培養したバチルス属ｓｐ．ＣＹＲ−１株の透過型電子顕微鏡写真である。図中Ａ〜Ｄは、同条件で培養した異なる菌体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、下記１）及び／又は２）の微生物と芳香族化合物とをインキュベートする工程を含む、芳香族化合物からＰＨＢを製造する方法に関する。
１）配列番号１に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するバチルス属微生物
２）配列番号２に示される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡ、及びアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するカプリアビダス属微生物。
【００１５】
本発明の方法において利用可能な前記１）の微生物の代表的な例は、以下の表１に示される形態的性質、培養的性質及び生理学的性質を有する微生物である。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
この微生物は、後の実施例に示すように、フェノール、アルキルフェノール、ハロゲン化フェノール又は例えばアントラセンなどの２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物を含む芳香族化合物を炭素源とした合成培地上で増殖することができ、ＰＨＢを生産して菌体内に蓄積する能力を有することが確認された。
【００１８】
この微生物について、アクロモペプチダーゼで溶菌した後にＤＮＡを回収し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析用のプライマーである９ｆ＿ｄｅｇ及び１５１０ｒ＿ｄｅｇを用いたコロニーＰＣＲによって１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子領域を増幅し、その塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。決定された株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
【００１９】
配列番号１に示される塩基配列について、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して、既知の微生物の１６ｓ  ｒＤＮＡとの相同性検索を行った。その結果、アクセッションナンバーＣＰ００９３５１として登録されているバチルス  チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）その他幾つかのバチルス属微生物の１６ｓ  ｒＤＮＡとの相同性が１００％であることが確認された。
【００２０】
以上の特徴を有する微生物について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  第３巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、２０１１年）を参考にして分類・同定した結果、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属すると同定された。しかしながら、株レベルでは芳香族化合物資化性、特にアルキルフェノール資化性及びＰＨＢの産生能等の点がバチルス属に含まれる既知の株と異なるため、新規なバチルス属株と同定し、平成２７年５月１８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５０として、識別の表示ＣＲ−１で寄託した。以下、この寄託株をＣＹＲ−１株と表す。
【００２１】
ＣＹＲ−１株は、バチルス属細菌の培養に通常用いられる培地、例えばニュートリエントブロス（ＮＢ）培地又はルリアブロス（ＬＢ）培地などを利用して培養することができる他、前記表１の各種特性を考慮して設計した合成培地で培養することもできる。
【００２２】
本発明は、上記の寄託されたＣＹＲ−１株のみならず、これと実質的に同種のバチルス属微生物、例えば配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するバチルス属微生物、より具体的には、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、かつアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するバチルス属微生物を利用した、芳香族化合物からＰＨＢを製造する方法も提供する。
【００２３】
また、上記のバチルス属微生物に対して突然変異処理を施すことによって誘導され得る、上記微生物の変異株も、ＣＹＲ−１株と同等の性質を保持する限り、本発明において利用することができる。突然変異処理としては、例えばＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、メタンスルホン酸メチル、ニトロソグアニジンなどの化学変異原を用いた処理、例えば紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線照射処理などを挙げることができる。
【００２４】
本発明の方法において利用可能な前記２）の微生物の代表的な例は、以下の表２に示される形態的性質、培養的性質及び生理学的性質を有する微生物である。
【００２５】
【表２】
2017000075.tif 000004
【００２６】
この微生物は、後の実施例に示すように、フェノール、アルキルフェノール、ハロゲン化フェノール又は例えばアントラセンなどの２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物を含む芳香族化合物を炭素源とした合成培地上で増殖することができ、ＰＨＢを生産して菌体内に蓄積する能力を有することが確認された。
【００２７】
この微生物について、ＤＮＡを回収し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析用のプライマーである２７ｆ＿ｄｅｇ及び１３９２ｒ＿ｄｅｇを用いたコロニーＰＣＲによって１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子領域を増幅し、その塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。決定された株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
【００２８】
配列番号２に示される塩基配列について、国際塩基配列データベース （ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して、既知の菌種との相同性検索を行った。その結果、アクセッションナンバーＡＢ２６６６０８として登録されているカプリアビダス  ｓｐ．その他幾つかのカプリアビダス属微生物の１６ｓ  ｒＤＮＡとの相同性が９８％以上であることが確認された。
【００２９】
以上の特徴を有する微生物について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  第１巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、１９８４年）を参考にして分類・同定した結果、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属に属すると同定された。しかしながら、株レベルでは芳香族化合物資化性、特にアルキルフェノール資化性及びＰＨＢの産生能等の点がカプリアビダス属に含まれる既知の株と異なるため、新規なカプリアビダス属株と同定し、平成２７年５月１８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０５１として、識別の表示ＣＲ−２で寄託した。以下、この寄託株をＣＹ−１株と表す。
【００３０】
ＣＹ−１株は、カプリアビダス属細菌の培養に通常用いられる培地、例えばニュートリエントブロス（ＮＢ）培地又はルリアブロス（ＬＢ）培地などを利用して培養することができる他、前記表２の各種特性を考慮して設計した合成培地で培養することもできる。
【００３１】
本発明は、上記のＣＹ−１株だけでなく、これと実質的に同種のカプリアビダス属微生物、例えば配列番号２に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するカプリアビダス属微生物、より具体的には、配列番号２に示される塩基配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、かつアルキルフェノールからＰＨＢを生産する能力を有するカプリアビダス属微生物を利用した、芳香族化合物からＰＨＢを製造する方法も提供する。
【００３２】
また、上記のカプリアビダス属微生物に対して突然変異処理を施すことによって誘導され得る、上記微生物の変異株も、ＣＹ−１株と同等の性質を保持する限り、本発明において利用することができる。突然変異処理としては、例えばＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、メタンスルホン酸メチル、ニトロソグアニジンなどの化学変異原を用いた処理、例えば紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線照射処理などを挙げることができる。
【００３３】
本発明の製造方法は、前記１）及び／又は２）の微生物と芳香族化合物をインキュベートする工程を含む。
【００３４】
本発明で使用可能な芳香族化合物は、産業廃水特に工業廃水に多く含まれる有毒性の芳香族化合物、特にフェノール類及び２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物である。
【００３５】
フェノール類としては、フェノール、例えばメチルフェノール、ブチルフェノール、オクチルフェノール又はノニルフェノールなどのアルキルフェノール、モノクロロフェノール、ジクロロフェノール、トリクロロフェノール、ペンタクロロフェノール又はブロモフェノールなどのハロゲン化フェノールなどを挙げることができる。
【００３６】
２以上のベンゼン環が縮合してなる多環式芳香族化合物としては、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン又はそれらの誘導体を挙げることができる。
【００３７】
本発明では、各種の化学工業における反応工程で生じる不要の芳香族化合物、産業廃水例えば皮革加工、衣服染色、医薬品製造、石油精製などの工場からの工業廃水に含有されている芳香族化合物、そのような産業廃水から部分精製された芳香族化合物などを利用することができる。特に、産業廃水を直接利用するか、又は必要に応じて産業廃水から部分精製された芳香族化合物の利用が好ましい。部分精製は、微生物の生存又は増殖に影響を与えるおそれのある重金属の除去、又は芳香族化合物以外の不要な化学成分の除去等を含む。また、芳香族化合物が含有されている限り、上記のような工業廃水の他に、農林水産物の加工処理によって生じる廃水、畜産業からの廃水若しくは生活廃水又はそれらの混合廃水も利用可能である。これら産業廃水は、使用される微生物にとって好適な緩衝液又は培地と混合され使用されることが好ましい。
【００３８】
本発明における微生物と芳香族化合物とのインキュベートとは、前記微生物が芳香族化合物を菌体内に取り込むことができる環境下に前記微生物と芳香族化合物とを置くことを意味する。インキュベートは、好ましくは適当な緩衝液又は液体培地中に前記微生物と芳香族化合物とを置くことで行われる。より好ましくは芳香族化合物を含有する産業廃水を含む適当な液体培地中で前記微生物を培養することにより行われる。かかるインキュベートにより、芳香族化合物が炭素源として前記微生物に利用され、ＰＨＢに変換される。
【００３９】
微生物は、いずれか一種の微生物を単独で用いて芳香族化合物とインキュベートしてもよく、前記１）及び／又は前記２）の複数種類の微生物を用いて芳香族化合物とインキュベートしてもよい。複数の微生物を用いることによって、芳香族化合物の分解、ひいては芳香族化合物からＰＨＢへの変換効率を高めることができることが期待される。
【００４０】
インキュベートは、微生物が生存又は増殖可能な環境条件下で行うことが好ましい。例えば温度は２０℃〜４２℃好ましくは３０℃〜３７℃の範囲、ｐＨは４．５〜８．５好ましくは６．０〜８．０の範囲で、それぞれ適宜設定して行うことができる。また、培地中で微生物とインキュベートするときの芳香族化合物の量は、培地１Ｌあたり５０〜２００ｍｇ、好ましくは７０〜１５０ｍｇ、より好ましくは８０〜１２５ｍｇの範囲内で調節することが可能であり、ナフタレンの場合は、５０〜１０００ｍｇ、好ましくは８０〜５００ｍｇの範囲で調節することが可能である。なお、緩衝液又は培地の種類ないし組成には特に制限はないが、培地中でインキュベートするときは、炭素源を芳香族化合物のみとし、さらに微生物が増殖するための好適な培地組成における窒素及び／又はリンの含有量を低減させた、いわゆる制限培地を用いることが好ましい。窒素及び／又はリンの含有量は培地１Ｌあたり５０〜５００ｍｇ、好ましくは５０〜２００ｍｇ、さらに好ましくは５０〜１００ｍｇの範囲で調節すればよい。
【００４１】
インキュベートは、芳香族化合物の種類に応じて、界面活性剤特に脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンを加えて行うことが好ましい。脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンを加えることで、微生物の芳香族化合物の分解能が向上する場合がある。脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンはツィーン（登録商標）又はポリソルベート（登録商標）として市販されているものを利用することができる。好ましい脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンはオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ツィーン（登録商標）８０、ポリソルベート（登録商標）８０）であり、培地中で微生物と芳香族化合物とをインキュベートするときの添加量は、０．０１〜０．０２重量％であればよい。
【００４２】
またインキュベートは、適当な担体に前記微生物を固定化した、いわゆる固定化微生物を用い、適当な緩衝液又は液体培地中に前記固定化微生物と芳香族化合物とを置くことで行なってもよい。あるいは、前記固定化微生物を充填等したカラムに芳香族化合物を含む緩衝液又は液体培地を流通させることで行なってもよい。かかる微生物の固定化及びその利用は、公知の方法により行うことができる。
【００４３】
本発明におけるインキュベートにより、ＰＨＢは菌体内に蓄積して製造される。菌体内に蓄積したＰＨＢは、微生物を用いたＰＨＢの製造方法において一般的に行われる抽出方法によって回収し、精製することができる。例えば、インキュベート後の緩衝液又は培地から菌体を遠心分離によって沈殿させ、必要に応じて乾燥させた後、クロロホルム、アセトン及び／又はエタノールなどの適当な有機溶媒を適宜組み合わせて使用した有機溶媒抽出を行い、有機相にメタノール又はヘキサン等の溶媒を加えてＰＨＢを沈殿させ、回収すればよい。
【００４４】
以下、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４５】
＜実験材料＞
１）芳香族化合物
表３に示される芳香族化合物を使用した。
【００４６】
【表３】
2017000075.tif 000005
２）培地
窒素及びリンの含有量が制限された、表４に示す組成からなるＭＳＭ培地（ｐＨ７．０）を培地として使用した。
【００４７】
【表４】
2017000075.tif 000006
【００４８】
芳香族化合物は、ナフタレン及びフェナントレンはｎ−ヘキサン溶液（１０ｇ／Ｌ）を、その他の化合物はメタノール溶液（１０ｇ／Ｌ）をストック溶液として用意し、培地調製に用いた。
【００４９】
＜試験例＞
１）ＣＹＲ−１株の増殖曲線
ＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）液体培地で一晩前培養したＣＹＲ−１培養液２ｍＬを、表３に示す各芳香族化合物（１００ｍｇ／Ｌ）を含む１００ｍＬのＭＳＭ培地に接種し、好気条件下で３０℃、３日間培養し、経時的に６６０ｎｍの吸光度を測定することで増殖曲線（図１）を作成した。また、３日間培養後の培地から菌体を遠心分離で回収、乾燥し、乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）を測定した（図２）。これらの結果から、ＣＹＲ−１株は、表３の芳香族化合物のいずれの存在下でも増殖できることが明らかとなった。
【００５０】
２）ＣＹＲ−１株及びＣＹ−１株の芳香族化合物に対する分解能
１）の培養において経時的にサンプリングした培地に１０％リン酸を加え、さらに等量の酢酸エチルを加えて３分間攪拌し、８０００×ｇで１０分間遠心分離した後に得られる有機相を濾過して、ＨＰＬＣ分析用の試料を調製した。各試料中に残存する芳香族化合物について、以下の条件を用いてＨＰＬＣで定量し、芳香族化合物に対する分解率を算出した。
【００５１】
カラム：  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＶＰ−ＯＤＳカラム（４．５×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
移動相：  アセトニトリル：水＝４：１
流速：  １．０ｍＬ／分
温度：  ４０℃
検出：  ＵＶ  ２７７ｎｍ
また、同様にしてＣＹ−１株を培養（培養日数は６日）して、さらにＣＹＲ−１株とＣＹ−１株を混合培養して（培養日数は６日）、ＣＹ−１株単独及び混合培養における各芳香族化合物に対する分解率を測定した。その結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
ＣＹＲ−１株は全ての芳香族化合物に対して、またＣＹ−１株はほとんどの芳香族化合物に対して分解能を示すことが確認された。
【００５４】
＜実施例１＞ＣＹＲ−１株によるＰＨＢの生産
１）培養及び培養生産物の回収
一晩前培養したＣＹＲ−１株の培養液２ｍＬを、Ｐ−ｔ−ＯＰ、４−ＮＰ、フェノール、４−ＣＰ又はナフタレンをそれぞれ含むＭＳＭ培地１００ｍＬ／５００ｍＬ容フラスコに接種し、好気条件下で３０℃、２日間培養した。１０℃で６０００×ｇ、１０分間遠心分離して菌体を回収し、アセトン及びエタノールでそれぞれ洗浄後、４％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁して室温で３時間インキュベートした。１０℃で６０００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物をアセトン及びエタノールでそれぞれ洗浄後、熱したクロロホルムに溶解し、フィルター（０．４５μｍポアサイズ）で濾過した濾液を回収し、冷エタノールを加えて得られる沈殿物を培養生産物として回収した。
【００５５】
２）培養生産物の定量
１）で回収された培養生産物の一部を硫酸（３６Ｎ）１０ｍＬに溶解し、１００℃で１０分間加熱後冷却した溶液の２３５ｎｍの吸光度を測定し、ＰＨＢ（純品、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた検量線から、培養生産物の含有量を測定した。また、１）で回収された培養生産物の一部を濾過し、乾燥した後の乾燥菌体重量を測定した。各芳香族化合物における最終的な培養生産物の生産量を細胞内含有量（％Ｄｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｉｇｈｔ）で表示したグラフを、図３に示す。ＣＹＲ−１株は使用したいずれの芳香族化合物からもＰＨＢを産生することが確認され、特に４−ＮＰ、フェノール、４−ＣＰ、ナフタレンを使用した場合にＰＨＢ産生は良好であった。
【００５６】
３）ＦＴ−ＩＲ分析
１）で回収された培養生産物の一部をクロロホルムに溶解後、ＫＲＳ−５  Ｗｉｎｄｏｗ上に拡げた後にクロロホルムを蒸発させた。形成されたフィルムについて、ＦＴ／ＩＲ−４１００（Ｊａｓｃｏ）を用いてＦＴ−ＩＲ分析を行った。また、試薬として市販されているＰＨＢ（以下、標準ＰＨＢとする）についても同様にＦＴ−ＩＲ分析を行った。フェノールを含む培地での培養生産物に関する分析チャートを図４に示す。この実験により、サンプルの分析チャートにおける全てのバンドが、標準ＰＨＢのそれと同一であることが確認された。また、他の芳香族化合物に関する培養生産物についても同様の結果が得られた。
【００５７】
４）ＮＭＲ分析
重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解した１）で回収された培養生産物の一部について、ＪＮＭ−ＥＣＡ４００  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（４００ＭＨｚ、プローブ温度２７℃、ＪＥＯＬ）を用いて、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを測定した。また、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを１２５．７５９ＭＨｚ、３７℃で測定した。フェノールを含む培地での培養生産物に関する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５に、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図６に示す。
【００５８】
フェノールを使用した培養生産物に関する１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲいずれの分析チャートも、標準ＰＨＢに関する分析チャートにおいて検出されるシグナルと同じシグナルを示すことが確認された（１Ｈ  ＮＭＲ：１．５８ｐｐｍのメチル、２．４８ｐｐｍ及び２．５９ｐｐｍのメチレン、５．２５ｐｐｍのメチン、１３Ｃ  ＮＭＲ：１９．７５ｐｐｍのメチル、４０．７６ｐｐｍのメチレン、６７．５９ｐｐｍのメチン、１６９．１３ｐｐｍのカルボニル）。また、他の芳香族化合物に関する培養生産物についても同様の結果が得られた。
【００５９】
５）示差走査熱量分析
１）で回収した培養生産物の一部について、ＤＳＣ  ｍｏｄｅｌ  ２９２０（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、１０℃／分の昇温速度及び５℃／分の冷却速度、温度範囲−５０℃〜２５０℃で、溶融温度（Ｔｍ）を測定した。また、標準ＰＨＢについても同様に示差走査熱量分析を行った。フェノールを含む培地での培養生産物及び標準ＰＨＢに関して測定されたＤＳＣ曲線を図７に示す。
【００６０】
ＤＳＣ分析の結果、Ｔｍは１７１℃で、標準ＰＨＢのそれと実質的に同一であることが、それぞれ確認された。また、他の芳香族化合物に関する培養生産物についても同様の結果が得られた。
【００６１】
６）分子量分析
１）で回収した培養生産物の一部について、ＬＣ−２０ＡＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いたゲル濾過法（移動相：クロロホルム、流速：１ｍＬ／分）で数平均分子量及び量平均分子量を測定した。また、標準ＰＨＢについても同様にして数平均分子量及び量平均分子量を測定した。
【００６２】
培養生産物の数平均分子量及び量平均分子量は、それぞれ３１４２９６ダルトン及び７０９３８３ダルトン、また多分散度（ｐｏｌｙ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）は２．２５であった。一方、標準ＰＨＢの数平均分子量、量平均分子量及び多分散度はそれぞれ１６９００１、７２４９０２及び４．２８であった。また、他の芳香族化合物に関する培養生産物についても同様の結果が得られた。
【００６３】
７）Ｘ線回折分析
１）で回収した培養生産物の一部について、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用い、製造者のマニュアルにしたがってＸ線回折像を測定した。フェノールを含む培地での培養生産物に関する回折パターンを図８に示す。
【００６４】
解析の結果、培養生産物において特徴的な２θピーク値として１３、１７、２０、２１、２２、２５及び２７が観察された。また、他の芳香族化合物に関する培養生産物についても同様の結果が得られた。
【００６５】
以上の分析結果から、Ｐ−ｔ−ＯＰ、４−ＮＰ、フェノール、４−ＣＰ又はナフタレンを含む培地で培養したときのＣＹＲ−１株が産生する培養生産物は、いずれもＰＨＢであると結論された。また、ＰＨＢ以外のポリヒドロキシアルカン酸は検出されなかった。
【００６６】
＜実施例２＞
実施例１の１）においてフェノール又はナフタレンを含む培地で培養した培養液５０μＬを１．５ｍＬ容チューブに取り、製造者のマニュアルにしたがってｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ）に包埋した後、電子顕微鏡観察用の試料を作製して、透過型電子顕微鏡Ｈ−７６５０（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて試料を撮影した（図９はフェノール、図１０はナフタレン）。図９及び１０に示す画像のとおり、菌体中に培養生産物すなわちＰＨＢの蓄積が観察された。
【００６７】
＜実施例３＞
工業廃水を模した下記の組成からなる人工廃水（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｗａｔｅｗａｔｅｒ、ＳＷ、ｐＨ７）を調製した。
【００６８】
【表６】
2017000075.tif 000008
【００６９】
上記ＳＷで３０℃、ｐＨ７の条件で一晩前培養したＣＹＲ−１株及びＣＹ−１株の各培養液、並びにＣＹＲ−１株及びＣＹ−１株を同時に培養した混合培養液各２ｍＬを、フェノール（１００ｍｇ/Ｌ）を含むＳＷ１００ｍＬ／５００ｍＬ容フラスコに接種し、好気条件下で３０℃、３日間培養した。１０℃で６０００×ｇ、１０分間遠心分離して菌体を回収し、一部を乾燥させて乾燥菌体重量を測定した。また他の一部はアセトン及びエタノールでそれぞれ洗浄後、４％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁して室温で３時間インキュベートした。１０℃で６０００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物をアセトン及びエタノールでそれぞれ洗浄後、熱したクロロホルムに溶解し、フィルター（０．４５μｍポアサイズ）で濾過した濾液を回収し、冷エタノールを加えて得られる沈殿物を培養生産物として回収した。
【００７０】
回収された培養生産物の一部を硫酸（３６Ｎ）１０ｍＬに溶解し、１００℃で１０分間加熱後冷却した溶液の２３５ｎｍの吸光度を測定し、ＰＨＢ（純品、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた検量線から、培養生産物の含有量を測定した。また、培養生産物の一部を濾過し、乾燥した後の乾燥菌体重量を測定した。フェノールから生産される最終的な培養生産物の量を細胞内含有量（％Ｄｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｉｇｈｔ）で表示した（表７）。
【００７１】
【表７】
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【００７２】
フェノールを加えたいずれの条件（ＣＹＲ−１株単独、ＣＹ−１株単独、またはＣＹＲ−１株とＣＹ−１株の混合培養）においてもＰＨＢの生産が確認された。特にＣＹＲ−１株とＣＹ−１株の混合培養の条件下でＰＨＢ生産量が最も高かった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、環境に有害な芳香族化合物を原料にして生分解性プラスチックを製造する方法に関する発明であり、有害な芳香族化合物を分解することによる環境保全に関しての利用可能性、及び生分解性プラスチックの製造に関しての利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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