(57)【要約】【課題】本開示は、腫瘍の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基を合成および利用する方法を提供すること。【解決手段】本開示は、ｉ）標的受容体タンパク質に結合するプテロイルリガンド、ｉｉ）色素分子、およびｉｉｉ）アミノ酸またはその誘導体を含むリンカー分子を含む、近赤外蛍光プローブとして有用である化合物に関する。本開示にはさらに、化合物を作製および使用するための方法および組成物、化合物を組み込む方法、ならびに化合物を組み込むキットが記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，９２１号に関連し、その優先権の利益を請求し、その内容は、その全体が本明細書により参照によって本開示に組み込まれる。
【０００２】
分野の開示
本開示は、診断法の分野にある。本開示は、腫瘍の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基を合成および利用する方法を提供する。アミノ酸連結基のコンジュゲーションは、化合物の特異性および検出を増大させる。診断画像化におけるその使用のための方法および組成物が企図される。
【背景技術】
【０００３】
悪性疾患の外科的除去は、がんの一次処置のための最も一般的で、かつ有効な治療法の一つを構成する。検出可能な悪性病変のすべての切除は、すべてのがん患者のおよそ５０％で疾患の検出可能な逆戻りをもたらさず１、がんの再発が見られる患者について平均余命を延ばし、または羅患率を減少させ得る。驚くことではないが、より定量的な腫瘍縮小を達成するための手術方法は、いまやより大きな安全性を与えられている。
【０００４】
検出可能な悪性病変のすべての切除は、すべてのがん患者のおよそ５０％で疾患の検出可能な逆戻りをもたらさず、がんの再発が見られる患者について平均余命を延ばし、または羅患率を減少させ得る。悪性病変の全切除の重要性を前提として、悪性病変が、正確かつ完全に特定されることを確実にすることは有益である。手術中の悪性組織の特定は、現在３つの方法で行われている。第１に、腫瘍塊および結節の多くは、異常な色、テクスチャ、および／または形態に基づいて視覚的に検出することができる。したがって、腫瘍塊は、斑紋状の色を示し、不規則な境界を有して非対称に見え、または健康臓器の輪郭から突き出し得る。悪性塊はまた、隣接する健康組織から可塑性、弾性または固体性の差によって触覚的に認識されてもよい。最後に、少数のがん病巣は、原発腫瘍から流入領域リンパ節中に受動的に流れる蛍光色素を使用して術中で位置付けるができる。この後者の方法論では、蛍光（センチネル）リンパ節は、これらのリンパ節にがん細胞が転移したかどうかを決定するために、視覚的に特定し、切除し、および調べることができる。
【０００５】
腫瘍の除去の重要性の認識および腫瘍塊を可視化するためのある種の特定技術の利用性にもかかわらず、多くの悪性結節は依然として検出を逃れ、疾患再発およびしばしば死をもたらす。したがって、改善された腫瘍特定の必要性がある。この動機付けは、悪性疾患の手術内可視化に対する２つの新手法の導入をもたらした。第１に、クエンチされた蛍光色素が担腫瘍動物に全身的に注射され、腫瘍特異的酵素、ｐＨ変化、または酸化還元電位の変化によるクエンチング部分の放出が引き出されて、悪性塊内の蛍光を選択的に活性化する。第２の手法では、リガンドの受容体を過剰発現するがんに付着色素を蓄積させる腫瘍特異的標的化リガンドに、蛍光色素をコンジュゲートする。この後者の目的のために使用される腫瘍標的化リガンドの例としては、卵巣、腎臓、肺、子宮内膜、乳房、および結腸の葉酸受容体（ＦＲ）陽性がんに特異性を示す葉酸、ならびに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する細胞、すなわち、前立腺がんおよび他の固形腫瘍の新生脈管系に選択的に付着蛍光色素を送達し得るＤＵＰＡが挙げられる。有利には、葉酸標的蛍光色素（葉酸フルオレセインまたはＥＣ１７）の一つが、最近ヒト卵巣がん患者で術中に試験された。この研究では、腫瘍標的蛍光色素の補助により、それなしに比べて、約５×超の悪性病変が除去され、切除された蛍光病変のすべてが、悪性であると病理学により確認された。
【０００６】
慣用蛍光技術は、可視光スペクトル（約４００〜６００ｎｍ）でプローブを使用し、これは、組織中のコラーゲンによる比較的高いレベルの非特異的バックグラウンド光を伴うので、術中画像誘導手術に最適でない。したがって、これらの慣用化合物からの信号とノイズの比は低い。さらに、生物発色団、特にヘモグロビンによる可視光の吸収は、数ミリメートルに侵入深さを制限する。したがって、組織中に数ミリメートルより深く埋められている腫瘍は、検出されないままであり得る。さらに、フルオレセインのイオン化平衡（ｐＫａ＝６．４）は、５〜９の範囲にわたってｐＨ依存性の吸収および発光をもたらす。したがって、フルオレセイン系色素の蛍光は、低いｐＨ（ｐＨ５未満）でクエンチされる。
【０００７】
例えば、臨床設定における疾患組織の特徴付けおよび測定のための光学的画像化におけるより普及した使用のための、ＥＣ１７色素の潜在的使用は、付着色素（フルオレセイン）が可視範囲で蛍光を発するという主たる欠点によって妨げられてきた。これは、ＥＣ１７および関連色素を組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏ使用に不良とするが、組織が典型的には可視範囲で強力に自己蛍光を発し、光が組織を不十分に侵入するからである。さらに、ＥＣ１７（葉酸−エチレンジアミン−フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein  isothiocynate））は、チオ尿素リンカーからなる。チオ尿素化合物が、チオ尿素連結の不安定性のために保存寿命が低いことは周知である。したがって、ＥＣ１７などの化合物は、この不安定性および関連したチオ尿素架橋の分解のために、光学的画像化における使用に最適ではない。
【０００８】
可視光（＜６００ｎｍ）におけるヘモグロビンと、ＩＲ範囲（＞９００ｎｍ）における水および脂質とによる光吸収の組合せは、組織の吸収係数が最小である、およそ６５０〜９００ｎｍの光学的画像化枠を与える。可視範囲で発光する色素に対する好適な代替は、近赤外（ＮＩＲ）で使用され得る色素を開発することであり、その理由は、近赤外領域の光は、ほとんど自己蛍光を誘発せず、組織をはるかにより効率的に透過するからである。近ＩＲ蛍光技術の別の利点は、散乱強度は波長の逆４乗に比例するので、励起光源からの散乱光からのバックグラウンドが、非常に減少することである。低いバックグラウンドの蛍光は、高感度検出に必要である。さらに、生物組織における近−ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）の光学的に透明な枠は、生物学的構成要素を通る光の透過を必要とするｉｎ  ｖｉｖｏ画像化および細胞下検出の利用にとってＮＩＲ蛍光を貴重な技術とする。
【０００９】
より深い組織の画像化のためのＮＩＲ範囲の光の使用が可視スペクトルの光に対して好ましい一方で、当技術分野で現在使用されるＮＩＲ画像化色素は、光退色に対する感受性、不十分な化学安定性、多くの生理的分子と同じ範囲内に入る吸収および発光スペクトル（高いバックグラウンド信号および自己蛍光をもたらす）などの多くの課題および不利点を欠点としてもつ。さらに、大部分のＮＩＲ色素は、合成の間、とりわけ、アミンリンカーによってリガンドへコンジュゲートする間に安定でなく、複数の不要な副生成物を生成する。したがって、臨床用にリガンド標的ＮＩＲ画像化剤を取得することは、高価であり得る。したがって、ＮＩＲ蛍光プローブを利用する現在の画像化方法は、深い組織の画像化（表面から＞５ｍｍ）、哺乳動物組織における蛍光信号の定量化、または前臨床から臨床への翻訳時間を増大させる生産コストにおいて有効でない。
【００１０】
蛍光誘導手術への２つの有望な手法が、臨床における使用のために現在熱心に開発中である。一方の方法では、付着消光剤へのその近接のために定常状態で最小限に蛍光性である活性化可能なＮＩＲ蛍光プローブが、悪性組織での消光剤の放出後に高度に蛍光性になる。最も一般的に使用される放出メカニズムの一つは、腫瘍−濃縮プロテアーゼ（すなわち、カテプシン、カスパーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ）により特異的に開裂され得る、色素と消光剤の間のペプチド配列の組み込みを伴う。この戦略の主な利点は、活性化酵素を欠く組織における蛍光の非存在にあり、排泄経路に沿った組織（例えば、腎臓、膀胱、肝臓）を、それらが開裂酵素を偶然に発現しない限り、非蛍光性のままにさせる。このような腫瘍−活性ＮＩＲ色素はまた、悪性病変に開裂プロテアーゼが濃縮されており、かつ放出色素が腫瘍中に保持されている限り、腫瘍塊においてかなりの蛍光を発生させることができる。この方法論の主な不利点は、関連ヒドロラーゼ（これらの大部分は、自然のリモデリングを受けるか、または炎症を起こす健康組織においても発現される）の多くの腫瘍特異性不足から生じる。さらに、所望のプロテアーゼの存在量は、腫瘍塊の間で変わり、一部の悪性病変で蛍光の緩徐または無活性化、および他で蛍光の急速な発生をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、羅患組織を特異的に標的にするために使用することができ、かつ組織画像化のためのｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために安定性および輝度の増大を有する色素物質に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、腫瘍およびリンパ節の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基を合成する方法を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、葉酸またはプテロイルリガンド、連結基、および蛍光色素を含む、化合物またはその塩誘導体に関する。ある特定の実施形態において、連結基は、アミノ酸、その異性体、誘導体、またはラセミ混合物であり得る。他の態様において、蛍光色素は、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、ＳＰ０５４、Ｓ０１２１、ＫＯＤＡＫ、Ｓ２０７６およびＳ０４５６からなる群から選択される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
式：
【化２８】
2017149776.tif 000002
（式中：
Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、
Ｙは、近赤外範囲に蛍光励起および発光スペクトルを有する色素である）
を有し、前記色素の蛍光を維持または増強する化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの同位体。
（項目２）
前記アミノ酸が、チロシン、システイン、またはチロシンもしくはシステインの誘導体からなる群から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目３）
前記アミノ酸がチロシンである、項目１に記載の化合物。
（項目４）
炭素同位体が、チロシンの芳香族環上にある、項目３に記載の化合物。
（項目５）
水素同位体が、チロシンの芳香族環の置換基である、項目４に記載の化合物。
（項目６）
前記アミノ酸誘導体が、
【化２９】
2017149776.tif 000003
からなる群から選択されるチロシンの誘導体またはそれらのラセミ混合物である、項目１に記載の化合物。
（項目７）
Ｙが、式：
【化３０】
2017149776.tif 000004
（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＣからなる群から独立して選択され、
Ｒは、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される）
を有する、項目１に記載の化合物。
（項目８）
前記アミノ酸が、硫黄含有側鎖基を含む、項目１に記載の化合物。
（項目９）
硫黄含有側鎖基を含む前記アミノ酸が、システインである、項目８に記載の化合物。
（項目１０）
硫黄含有側鎖基を含む前記アミノ酸が、メチオニンである、項目８に記載の化合物。
（項目１１）
カルコゲン含有側鎖基を含む前記アミノ酸が、セレノシステインである、項目１に記載の化合物。
（項目１２）
式：
【化３１】
2017149776.tif 000005
を有するか、またはそのカリウム塩、ナトリウム塩、もしくはアンモニウム塩である、項目１に記載の化合物。
（項目１３）
式：
【化３２】
2017149776.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩を有する、項目１に記載の化合物。
（項目１４）
式：
【化３３】
2017149776.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩を有する、項目１に記載の化合物。
（項目１５）
約５００ｎｍから約９００ｎｍの間に吸収および発光極大を有する、項目１に記載の化合物。
（項目１６）
約６００ｎｍから約８００ｎｍの間に吸収および発光極大を有する、項目１５に記載の化合物。
（項目１７）
組織細胞中での前記化合物の分布後に蛍光を発するように作製されている、項目１に記載の化合物。
（項目１８）
前記化合物を近赤外波長の励起光に供することによって、蛍光を発するように作製されている、項目１に記載の化合物。
（項目１９）
葉酸受容体に対する葉酸の結合親和性と類似している、葉酸受容体標的に対する結合親和性を有する、項目１に記載の化合物。
（項目２０）
【化３４】
2017149776.tif 000008
【化３５】
2017149776.tif 000009
からなる群から選択される化合物の葉酸コンジュゲートよりも大きい近赤外輝度を有する、項目１に記載の化合物。
（項目２１）
腫瘍細胞への標的化に対して高度に選択的である、項目１に記載の化合物。
（項目２２）
項目１に記載の化合物、および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、組成物。
（項目２３）
葉酸受容体を発現する生物組織を光学的に画像化する方法であって、
（ａ）前記生物組織を項目２２に記載の組成物と接触させるステップ、
（ｂ）前記組成物中の前記化合物が生物学的標的内に分布するための時間を与えるステップ、
（ｃ）前記組織を、前記化合物により吸収可能な波長の励起光で照射するステップ、および
（ｄ）前記化合物により発せられた光学信号を検出するステップ
を含む方法。
（項目２４）
前記化合物により発せられた前記信号が、画像を構築するために使用される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記組織が、対象中にあり、且つ前記対象が動物またはヒトである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ａ）で、信号特性が区別可能である２種またはそれ超の蛍光化合物が、前記組織と接触しており、必要に応じて前記組織が対象中にある、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記照射するステップおよび検出するステップが、内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、手持ち式光学的画像化システム、外科用ゴーグル、または術中顕微鏡を使用して行われる、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記葉酸受容体を発現する生物組織が、前記受容体を過剰発現する疾患を有する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記疾患が、がん、心血管疾患、神経変性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、感染症、骨疾患、および環境性疾患からなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
生物試料中の標的細胞型を同定する方法であって、
ａ）前記生物試料を項目１に記載の化合物と、前記化合物の前記標的細胞型の少なくとも１個の細胞への結合を可能にする時間および条件下で接触させるステップ、および
ｂ）前記生物試料中の前記化合物の存在または非存在を光学的に検出するステップ
を含み、検出するステップｂ）における前記化合物の存在は、前記標的細胞型が前記生物試料に存在することを示す方法。
（項目３１）
前記標的細胞型が、診断目的のために画像化される組織である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記組織が、腫瘍またはリンパ節である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記光学的に検出するステップが、前記化合物を励起光源に供するステップおよび前記化合物からの蛍光を検出するステップを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記励起光が近赤外波長光である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記励起光の波長が、約６００から１０００ナノメートルの範囲内にある、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記励起光の波長が、約６７０から８５０ナノメートルの範囲内にある、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
対象に対して画像誘導手術を行う方法であって、
ａ）項目１に記載の化合物を含む組成物を、前記化合物が所与の手術部位で蓄積するために十分な条件下および時間で投与するステップ、
ｂ）赤外光を使用して前記化合物を視覚化するために前記化合物を照射するステップ、
ならびに
ｃ）前記赤外光による励起の際に蛍光を発する領域の外科的切除を行うステップ
を含む方法。
（項目３８）
前記赤外光が、近赤外波長光である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記赤外光の波長が、約６００から１０００ナノメートルの範囲内である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記赤外光の波長が、約６７０から８５０ナノメートルの範囲内である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
対象における疾患を診断する方法であって、
ａ）診断を必要としている対象に、ある量の項目１に記載の化合物を、前記化合物の標的細胞型の少なくとも１個の細胞への結合を可能にする時間および条件下で投与するステップ、
ｂ）生物試料中に存在する前記項目１に記載の化合物からの信号を測定するステップ、
ｃ）ｂ）で測定された前記信号を少なくとも１つの対照データセットと比較するステップであって、前記少なくとも１つの対照データセットは、前記標的細胞型を含まない生物試料と接触した前記項目１に記載の化合物からの信号を含むステップ、および
ｄ）ステップｃ）における前記比較が前記疾患の存在を示す、疾患の診断を提供するステップ
を含む方法。
（項目４２）
項目１に記載の化合物を含むキット。
（項目４３）
項目１に記載の化合物が、
【化３６】
2017149776.tif 000010
【化３７】
2017149776.tif 000011
【化３８】
2017149776.tif 000012
からなる群から選択される化合物の葉酸コンジュゲートを含む化合物よりも明るい蛍光信号を生じさせる、項目４２に記載のキット。
（項目４４）
項目１に記載の化合物の誘導体をさらに含む、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
前記Ｙが、式：
【化３９】
2017149776.tif 000013
【化４０】
2017149776.tif 000014
（式中、各Ｒｘは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネート、アンモニウム、およびヒドロキシル、糖、アミノ酸、スルホンアミドまたはカルボキシル基からなる群から独立して選択される）
を有する化合物である、項目４４に記載の化合物。
（項目４６）
Ｙが、式：
【化４１】
2017149776.tif 000015
（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＣからなる群から独立して選択され、
Ｒは、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される）
を有する、項目４３に記載の化合物。
（項目４７）
【化４２】
2017149776.tif 000016
【化４３】
2017149776.tif 000017
【化４４】
2017149776.tif 000018
【化４５】
2017149776.tif 000019
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化４６】
2017149776.tif 000020
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化４７】
2017149776.tif 000021
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化４８】
2017149776.tif 000022
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化４９】
2017149776.tif 000023
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化５０】
2017149776.tif 000024
【化５１】
2017149776.tif 000025
【化５２】
2017149776.tif 000026
（式中、チロシンはベータホモである）、
【化５３】
2017149776.tif 000027
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化５４】
2017149776.tif 000028
【化５５】
2017149776.tif 000029
【化５６】
2017149776.tif 000030
【化５７】
2017149776.tif 000031
およびその薬学的に許容される塩からなる群から選択される式を有する、項目１に記載の化合物。
（項目４８）
式：
【化５８】
2017149776.tif 000032
（式中、
Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、
Ｙは、可視スペクトルに蛍光励起および近赤外範囲に発光スペクトルを有する色素であり、Ｘは、Ｙに直接結合した第２級アミンを生成するＹに連結している）
を有し、前記色素の蛍光を維持または増強する化合物もしくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの同位体。
（項目４９）
前記アミノ酸が、天然に存在するアミノ酸である、項目４８に記載の化合物。
（項目５０）
前記アミノ酸が、アルファアミノ酸である、項目４８に記載の化合物。
（項目５１）
前記アミノ酸が、ホモアミノ酸である、項目５０に記載の化合物。
（項目５２）
前記アミノ酸が、ベータアミノ酸である、項目４８に記載の化合物。
（項目５３）
前記アミノ酸が、ヒドロキシ含有側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目５４）
前記アミノ酸が、セリン、チロシン、トレオニン、それらの異性体およびそれらの誘導体からなる群から選択される、項目５３に記載の化合物。
（項目５５）
前記アミノ酸が、酸素含有側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目５６）
前記アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、グルタメート、アスパラギン、それらの異性体およびそれらの誘導体からなる群から選択される、項目５５に記載の化合物。
（項目５７）
前記アミノ酸が、芳香族側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目５８）
芳香族側鎖基を含む前記アミノ酸が、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択される、項目５７に記載の化合物。
（項目５９）
前記アミノ酸が、硫黄含有側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目６０）
硫黄含有側鎖基を含む前記アミノ酸が、システインである、項目５９に記載の化合物。
（項目６１）
カルコゲン含有側鎖基を含む前記アミノ酸が、セレノシステインである、項目４８に記載の化合物。
（項目６２）
前記アミノ酸が、中性極性アミノ酸である、項目４８に記載の化合物。
（項目６３）
前記アミノ酸が、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アルパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される、項目６２に記載の化合物。
（項目６４）
前記アミノ酸が、アミン含有側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目６５）
前記アミノ酸が、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、それらの異性体、および誘導体からなる群から選択される、項目６４に記載の化合物。
（項目６６）
前記アミノ酸誘導体が、塩基性側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目６７）
前記アミノ酸が、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択される、項目６６に記載の化合物。
（項目６８）
前記アミノ酸誘導体が、カルコゲン含有側鎖基を含む、項目４８に記載の化合物。
（項目６９）
前記カルコゲンが、酸素、硫黄およびセレンからなる群から選択される、項目６８に記載の化合物。
【００１３】
一部の態様において、本開示は、アミノ酸連結基を蛍光色素にコンジュゲートさせる方法であって、アミノ酸は、チロシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、それらの異性体、および誘導体であり得る。ある特定の実施形態において、アミノ酸、その異性体、または誘導体は、わずかのモル過剰で蛍光色素を添加後に、蛍光基とアミノ酸、その異性体、または誘導体とのコンジュゲーションを生じる−ＯＨ、−ＮＨ２、または−ＳＨ官能基を含有する。他の実施形態において、アミノ酸、その異性体、または誘導体は、合成後に、化合物の輝度および検出を増大させる蛍光色素とのエーテル結合を生成する−ＯＨ官能基を含有する。一部の実施形態において、本開示は、アミノ酸連結基と蛍光色素とのコンジュゲーションであって、アミノ酸、その異性体、または誘導体は、合成後に、蛍光色素とＣ−Ｓ、Ｃ−Ｓｅ、Ｃ−Ｐｏ、またはＣ−Ｔｅ結合を生成する−ＳＨ、−ＳｅＨ、−ＰｏＨ、または−ＴｅＨ官能基を含有するコンジュゲーションに関する。一部の態様において、本開示は、約５００ｎｍから約９００ｎｍの間に吸収および発光極大を有する蛍光色素へのアミノ酸連結基のコンジュゲーションに関する。他の態様において、アミノ酸連結基は、約６００から約８００ｎｍの間に吸収および発光極大を有する蛍光色素にコンジュゲートしている。
【００１４】
さらなる実施形態において、本開示は、アミノ酸連結基を葉酸リガンドにコンジュゲートさせる方法であって、アミノ酸連結基は、チロシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、それらの異性体または誘導体であり、かつジペプチド結合を介して葉酸塩にコンジュゲートしている方法を提供する。さらなる態様において、本開示は、連結基を葉酸リガンドとコンジュゲートさせる方法であって、連結基は、チロシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、それらの異性体または誘導体であり、かつホモオリゴペプチド結合を介して葉酸塩にコンジュゲートしている方法を提供する。他の実施形態において、本開示は、プテロイルリガンドをアミノ酸連結基にコンジュゲートさせる方法であって、連結基は、チロシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、それらの異性体または誘導体である方法に関する。ある特定の態様において、連結基のカルボン酸は、任意のアミノ酸のアルファ炭素に結合しており、したがって、標的受容体に対する化合物の特異性を増大させる。一部の実施形態において、アミノ酸連結基は、化合物に特異性を与え、ここで、化合物の標的受容外への観察された結合親和性は、葉酸受容体である。
【００１５】
さらなる態様において、化合物は、標的受容体を発現する腫瘍細胞に対する標的化に高度に選択的である。
【００１６】
他の実施形態において、本開示は、画像誘導手術、腫瘍画像化、リンパ節画像化、炎症疾患、アテローム性動脈硬化症、感染疾患、法医学的応用、ミネラル適用、歯科、ゲル染色、ＤＮＡ塩基配列決定法、神経染色、または形成外科のための、指定された化合物、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の使用に関する。他の態様において、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６誘導体は、Ｐｔｅ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−ホモＴｙｒ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−ベータ−ホモ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−（ＮＭｅ）−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−ＮＨＮＨ−Ｔｙｒ−ＯＡｃ−Ｓ０４５６、それらの塩、または誘導体であり得る。
【００１７】
他の態様において、本開示は、化合物を合成する方法であって、不要な化合物を生成し得る、アミノ基以外の基との望ましくない反応性を回避するために、保護基が使用される方法を提供する。本開示で提供される方法は、９８％超の純度の収率で最終化合物を生成する。
【００１８】
ある特定の態様において、本開示は、腫瘍の標的画像化のために使用される化合物であって、研究、診断、または治療目的に使用され得る化合物に関する。他の実施形態において、本開示は、画像化化合物、および薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、または塩を含む、組成物を提供する。
【００１９】
他の態様において、本開示は、
【化１】
2017149776.tif 000033
【化２】
2017149776.tif 000034
【化３】
2017149776.tif 000035
【化４】
2017149776.tif 000036
【化５】
2017149776.tif 000037
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化６】
2017149776.tif 000038
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化７】
2017149776.tif 000039
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化８】
2017149776.tif 000040
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化９】
2017149776.tif 000041
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化１０】
2017149776.tif 000042
【化１１】
2017149776.tif 000043
（式中、チロシンは、ベータホモである）
【化１２】
2017149776.tif 000044
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、またはＺは、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋である）、
【化１３】
2017149776.tif 000045
【化１４】
2017149776.tif 000046
【化１５】
2017149776.tif 000047
からなる群から選択される式を有する化合物、およびその薬学的に許容される塩に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、葉酸受容体−標的第一世代葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートを示す図である。
【００２１】
【図２】図２は、第一世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの結合等温線を示す図である。葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの葉酸受容体発現ＫＢ細胞への結合曲線。標的コンジュゲートは、ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（三角）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０（ひし形）、およびＩＲ８００ＣＷ（円）。
【００２２】
【図３】図３は、第一世代葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの静脈内注射４時間後の、転移性疾患を有するマウス（実験モデル）の蛍光画像を示す図である。無傷（Ａ〜Ｄ）および外科的切開（ａ〜ｄ）担腫瘍マウスの蛍光および白色光画像のオーバーレイ。ＦＲ発現転移性Ｌ１２１０Ａ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスに、１０ｎｍｏｌの葉酸−ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（Ａ／ａ）または葉酸−ＤｙＬｉｇｈｔ７５０（Ｂ／ｂ）を静脈内に注射し、４時間後に画像化した。
【００２３】
【図４】図４は、連続的腫瘍減量手術中に切除された組織のＨ＆Ｅ分析を示す図である。Ａ〜Ｄ：１０ｎｍｏｌの葉酸−ＩＲ８００ＣＷによる尾静脈注射４時間後の、Ｌ１２１０Ａ担転移性腫瘍マウスの蛍光および白色光画像のオーバーレイ。Ａ：全身画像。Ｂ：切開胸腔。Ｃ：原発腫瘍の除去後。Ｄ：すべての二次小節の除去後。ａ〜ｄ：ａ：健康対照肺、ｂ：原発腫瘍、ｃ：二次腫瘍小節、ｄ：残存組織の、Ｈ＆Ｅ染色。
【００２４】
【図５】図５は、葉酸受容体−標的第二世代葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートを示す図である。
【００２５】
【図６】図６は、培養がん細胞への葉酸−リンカーおよび第二世代葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの結合等温線（放射性標識葉酸による競争研究を示す図である。このアッセイは、葉酸受容体に対する結合親和性および特異性を同時に与える）。葉酸受容体発現ＫＢ細胞への、Ａ：葉酸−ＥＤＡ−およびＢ：葉酸−Ｌｙｓ−ＮＩＲ色素コンジュゲートの、結合曲線。
【００２６】
【図７−１】図７は、第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの蛍光画像およびｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布を示す図である。Ａ：１０ｎｍｏｌの葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの静脈内注射２時間後の、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの蛍光画像。（ａ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した、（ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウスの直接比較、および（ｃ）葉酸−Ｌｙｓ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した。Ｂ：葉酸−ＮＩＲコンジュゲートを投与された動物のｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布。
【図７−２】図７は、第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの蛍光画像およびｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布を示す図である。Ａ：１０ｎｍｏｌの葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの静脈内注射２時間後の、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの蛍光画像。（ａ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した、（ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウスの直接比較、および（ｃ）葉酸−Ｌｙｓ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した。Ｂ：葉酸−ＮＩＲコンジュゲートを投与された動物のｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布。
【図７−３】図７は、第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの蛍光画像およびｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布を示す図である。Ａ：１０ｎｍｏｌの葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの静脈内注射２時間後の、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの蛍光画像。（ａ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した、（ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウスの直接比較、および（ｃ）葉酸−Ｌｙｓ−ＮＩＲコンジュゲート投与マウス群を個別に画像化した。Ｂ：葉酸−ＮＩＲコンジュゲートを投与された動物のｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布。
【００２７】
【図８】図８は、葉酸受容体−標的第三世代ＮＩＲ色素コンジュゲートを示す図である。
【００２８】
【図９】図９は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６ＮＩＲ色素コンジュゲートの理論的根拠を示す図である。４個の有利な官能基を有するプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の化学構造。ａ＝標的化分子としてのプテロイン酸；ｂ＝腫瘍特異性のためのチロシンからのα−カルボン酸、および葉酸受容体に対する結合親和性を改善する；ｃ＝（明）蛍光強度を増強するためのチロシンからのフェノール性部分；ｄ＝近ＩＲ蛍光プローブ。したがって、チロシンは、リガンド、リンカー、および近ＩＲ色素の一部として作用する。言い換えれば、チロシンは、リガンド（プテロイン酸）の結合親和性および特異性を改善するリンカーである。それは、ＮＩＲ色素の輝度も増強する。
【００２９】
【図１０】図１０は、ＬＣ／ＭＳによる（Ａ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）および（Ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００ＣＷの反応進行のモニタリングを示す図である。Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６は、９８％超の収率で９９％純粋の所望の生成物を与えた一方で、葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００ＣＷは、３０〜４０％の所望の生成物とともに複数の副生成物を与えた。
【００３０】
【図１１】図１１は、１０ｎｍｏｌのＰｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を注射したマウスの全身蛍光画像およびｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布を示す図である。（１）１０ｎｍｏｌの葉酸受容体標的−ＮＩＲコンジュゲートの静脈内注射２時間後の、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの蛍光画像（蛍光および白色光画像のオーバーレイ）。（２）前に画像化したマウスの組織の収集後の、コンジュゲートのｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布。
【００３１】
【図１２−１】図１２は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの直接比較を示す図である。（Ａ）全身蛍光画像、（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布、ならびに（Ｃ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６および第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）をヌードマウスに投与２時間後の、腫瘍および腎臓の画像。解剖（薄片化）腫瘍は、腫瘍における標的画像化剤の均一な取り込みを示した。
【図１２−２】図１２は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの直接比較を示す図である。（Ａ）全身蛍光画像、（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布、ならびに（Ｃ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６および第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）をヌードマウスに投与２時間後の、腫瘍および腎臓の画像。解剖（薄片化）腫瘍は、腫瘍における標的画像化剤の均一な取り込みを示した。
【図１２−３】図１２は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの直接比較を示す図である。（Ａ）全身蛍光画像、（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体内分布、ならびに（Ｃ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６および第二世代葉酸−ＮＩＲコンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）をヌードマウスに投与２時間後の、腫瘍および腎臓の画像。解剖（薄片化）腫瘍は、腫瘍における標的画像化剤の均一な取り込みを示した。
【００３２】
【図１３】図１３は、葉酸受容体陽性腫瘍異種移植片を有するマウスに、それぞれ１０ｎｍｏｌのコンジュゲートを投与後の、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６と他のプテロイル−ＮＩＲー色素コンジュゲートとの腫瘍蓄積および腫瘍特異性の比較を示す図である。
【００３３】
【図１４】図１４は、Ｐｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６、プテロイル−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−Ｓｅｒ−Ｓ０４５６、およびＰｔｅ−４−アミノ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｓ０４５６を含めたアミノ酸連結基とコンジュゲートした４種の化合物の構造を示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、葉酸受容体に対するＯＴＬ−００３８、ＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）、および葉酸の相対結合親和性を示す。図１５Ａは、葉酸受容体に対する各化合物の結合曲線を示すプロットである。図１５Ｂは、３種の化合物すべての結合親和性および相対結合親和性を例証する表である。
【００３５】
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＯＴＬ−００３９を注射した、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの全身蛍光画像を示す。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３９を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、全身画像化実験を行った。
【００３６】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、化合物の注射２．５時間後の、図５Ａ中ＯＴＬ−００３９を注射されたマウスの組織生体内分布を例証する。全身画像化に続いて、動物を解剖し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を使用して、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、および腫瘍）を蛍光活性について分析した。
【００３７】
【図１７】図１７は、ＯＴＬ−００３８の腫瘍取り込みを要約する表を示す。組織生体内分布は、０．３〜９０ｎｍｏｌの範囲の増加する量のＯＴＬ−００３８を注射したマウスで分析した。生体内分布のデータ分析は、注射２．５時間後に調べた。
【００３８】
【図１８】図１８は、増加する量のＯＴＬ−００３８を注射したマウスの組織生体内分布を例証する。０．３〜９０ｎｍｏｌの範囲の化合物濃度を、マウスに静脈内に投与した。生体内分布のデータ分析は、注射２．５時間後に調べた。
【００３９】
【図１９】図１９は、１ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８を注射した、ＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの全身蛍光画像化を例証する。これは、本発明者らが、ＦＲに対するその高い親和性および色素の比較的高い輝度によって、腫瘍を画像化するために非常に低い濃度のＯＴＬ−００３８を必要とすることを実証する。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、全身画像化実験を行った。
【００４０】
【図２０Ａ】図２０Ａは、葉酸受容体に対して陰性の腫瘍異種移植片を有するマウスの全身蛍光画像を示す。全身画像化は、１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８の投与２．５時間後に行った。
【００４１】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、葉酸受容体−陰性腫瘍異種移植片および葉酸受容体−陽性腎臓による、ＯＴＬ−００３８の侵襲性腫瘍および腎臓の取り込みを例証する。データ分析は、注射２．５時間後に行った。
【００４２】
【図２１】図２１は、画像化化合物の溶液相合成のための３ステップ反応の概略図を示す。
【００４３】
【図２２】図２２は、画像化化合物の固相合成のための２ステップ反応の概略図を示す。
【００４４】
【図２３Ａ】図２３Ａは、注射２時間後の、１０ｎｍｏｌのＰｔｅ−チロシンアナログ−Ｓ０４５６を注射したマウスの全身蛍光画像を提示する。
【００４５】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、注射２時間後の、Ｐｔｅ−チロシンアナログ−Ｓ０４５６の組織生体内分布を提示する。
【００４６】
【図２４】図２４は、注射２時間後の、１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５３（プテロイル−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６）、およびＯＴＬ−００５４（プテロイル−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６）を注射したマウスの全身蛍光画像を実証する。励起：７４５ｎｍ。発光：８３０ｎｍ。
【００４７】
【図２５】図２５は、注射２時間後の、ＯＴＬ−００３８（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５３（プテロイル−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６）、およびＯＴＬ−００５４（プテロイル−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６）の組織生体内分布を実証する。励起：７４５ｎｍ。発光：８３０ｎｍ。
【００４８】
【図２６】図２６は、注射２時間後の、１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００５１（Ｐｔｅｒｏｙｌ−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）を注射したマウスの全身および半身蛍光画像を示す。
【００４９】
【図２７】図２７は、注射２時間後の、ＯＴＬ−００５１（Ｐｔｅｒｏｙｌ−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）の組織生体内分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
手術は、すべての固形腫瘍、例えば、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がんのための最良の療法の一つである。手術は、米国で固形腫瘍を有する患者の５０％で有効である一方で、化学および放射線療法単独は、すべてのがん患者の５％未満で有効である。７００，０００超の患者が、米国で毎年がん手術を受け、手術患者の４０％は、５年以内に局所領域疾患の再発を有する。この１０年間にわたる腫瘍学分野での大きな進歩にもかかわらず、この分野で克服すべきかなりの難関が依然として残っている。例えば、陰性断端の原発腫瘍の完全切除、転移性がん細胞を持つリンパ節の除去、およびサテライト疾患の特定を達成することが困難なままである。これらの３つの場合における改善の達成は、疾患クリアランスを改善するだけでなく、術後化学療法および放射線療法に関する決定も誘導する。非標的蛍光色素は、一部の腫瘍に受動的に蓄積することが示されているが、得られた腫瘍対バックグラウンド比は、しばしば不十分であり、悪性組織と健康組織との間の境界は、明確にするのが困難であり得る。リガンド標的蛍光色素（例えば、ＥＣ１７：葉酸−ＥＤＡ−ＦＩＴＣ）は、組織を画像化するために使用されてきたが、それらの色素は、それらが組織深く侵入しないので、有効でなく、したがって、組織試料内のより深くよりはむしろ、組織の表面で特定の細胞を特定しただけである。さらに、これらの従来の蛍光色素の励起および発光スペクトルは、それがかなりのバックグラウンドノイズを発生し、その結果、標的組織が容易に検出されないようであることが示されている。さらに、上記背景技術で検討されたように、フルオレセイン系色素は、保存寿命安定性が低いという不利点を有する。ＥＣ１７は、その化合物中のチオ尿素架橋の不安定性の結果として容易に分解する。さらに、ＥＣ１７はフルオレセインを使用するので、画像化部位の周囲の組織でコラーゲンからの比較的高いレベルの非特異的バックグラウンドノイズの欠点を有する。さらに、生物発色団、特にヘモグロビンによる可視光の吸収は、フルオレセインを組み込む色素の有用性をさらに制限する。これは、慣用色素が、組織中に数ミリメートルより深く埋められ得る腫瘍を容易には検出できないことを意味する。さらに、フルオレセインからの蛍光は、低いｐＨ（ｐＨ５未満）でクエンチされる。
【００５１】
色素材料が、検出および誘導手術、または他の組織画像化の提供に有用であるために、これらの欠点を克服することが重要である。
【００５２】
いくつかの基準が、近赤外色素を含むコンジュゲートの調製で考慮された。合成の容易さおよび化学的安定性は、主要な化学的特質である。スペクトル特性、例えば、吸収および発光スペクトルならびに量子収率が考慮された。いくつかの生物学的特性、たとえば、細胞研究における結合親和性、腫瘍を有するマウスを使用する全身動物画像化、および生体内分布が評価された。具体的には生体内分布の場合、口腔内分布につき２時間後の死亡マウス、ライブのマウス画像化および用量増加を含めた、いくつかの態様が考慮された。最後に、最大耐量（ＭＴＤ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、および一般臨床病理学分析を含めた、安全上の考慮が取り上げられた。
【００５３】
本開示は、安定であり、赤外範囲で蛍光を発光し、標的組織内に深く侵入して、葉酸受容体を発現する組織の領域の特異的で明るい特定をもたらす近赤外色素のプテロイルコンジュゲートを提供する。より具体的には、プテロイルコンジュゲートは、アミノ酸リンカーを介して近赤外色素に連結されている。さらにより具体的には、アミノ酸リンカーがチロシンまたはチロシンの誘導体である場合に、色素の蛍光の強度は維持され、またはさらには増強されることが見出された。
【００５４】
アミノ酸は、カルボン酸官能基に連結されたアミン官能基、および各アミノ酸に特異的な側鎖を含むと定義される。アルファアミノ酸は、一般式Ｒ５ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（α−アミノ酸）の任意の化合物であり、式中、Ｒ５は、Ｈまたは任意の公知のアミノ酸側鎖からなる群から選択される。
【００５５】
ベータアミノ酸は、ベータ炭素で連結されたアミン官能基およびアルファ炭素で連結されたカルボン酸官能基を含むと定義される。ベータホモアミノ酸は、ベータ炭素で連結されたアミン官能基、アルファ炭素で連結されたカルボン酸官能基、およびアルファ炭素またはベータ炭素のいずれかで開始する、別のアミノ酸に結合している側鎖を含むと定義される。
【００５６】
天然に存在するアミノ酸は、以下の４つの群：（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、および（４）中性非極性アミノ酸に分けることができる。これらの様々な群内の代表的アミノ酸としては、限定されないが、（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性（陰性に荷電した）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン、およびリシンなどの塩基性（陽性に荷電した）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンなどの中性極性アミノ酸；ならびに（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンなどの中性非極性（疎水性）アミノ酸が挙げられる。
【００５７】
天然に存在するアミノ酸配列内の、アミノ酸の保存された置換は、天然に存在するアミノ酸が属する群の他のメンバーから選択され得る。例えば、アミノ酸の脂肪族側鎖基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。天然に存在するアミノ酸であるバリンの保存された置換には、グリシン、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンの使用が含まれる。
【００５８】
アミノ酸の脂肪族ヒドロキシル側鎖基は、セリンおよびトレオニンである。アミノ酸のアミド含有側鎖基は、アスパラギンおよびグルタミンである。アミノ酸の芳香族側鎖基は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。アミノ酸の塩基性側鎖基は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンである。アミノ酸の硫黄含有側鎖基は、システインおよびメチオニンである。天然に保存性のアミノ酸置換の例は、ロイシンの代わりにバリン、トレオニンの代わりにセリン、チロシンの代わりにフェニルアラニン、アルギニンの代わりにリシン、メチオニンの代わりにシステイン、およびグルタミンの代わりにアスパラギンである。
【００５９】
好ましい実施形態において、このようなプテロイルコンジュゲートは、組織内の腫瘍細胞に特異的に標的化することが本明細書で示される。さらに、蛍光の強度は、葉酸受容体陽性腫瘍に対して葉酸塩によって標的化される他の近赤外色素で以前に観察された強度よりも大きい。この強度の増加は、モニターされる組織からの生物試料の比較的小さい領域（例えば、比較的小さい腫瘍）の標的化するおよび明瞭な特定を可能にする。さらに、本開示の化合物の強度の増加は、色素のより低い用量／量が投与され得、なお意味ある結果をもたらすという追加された利点を与える。したがって、本開示の化合物は、より経済的な画像化技術をもたらす。さらに、慣用の画像化化合物と比較してより低い用量の本開示の化合物は、身体への異物の投与に伴う毒性および他の副作用を最小限にするという追加された利点がある。
【００６０】
さらに、小さい腫瘍の特定は、原発腫瘍のより正確で、より有効な切除をもたらし、陰性断端、ならびに転移性がん細胞を持つリンパ節の正確な特定および除去、ならびにサテライト疾患の特定を生じさせる。これらの利点のそれぞれは、処置される患者にとってのより良い臨床転帰と正に相関する。
【００６１】
具体的な実験において、リンカーとしてチロシン以外のアミノ酸の使用は、近赤外蛍光の消失を生じることがわかった。例えば、スキームＩの検討を参照されたい。具体的には、合成経路が、ＮＩＲ特性を有さない主な生成物として望ましくない副生成物４をもたらすことに留意されたい。
【００６２】
しかしながら、チロシンおよびチロシン誘導体に加えて、近赤外色素とシステインまたはシステイン誘導体とのプテロイルコンジュゲートも有用であり得ることが企図される。さらに、アミンリンカーを介した、プテロイルもしくは葉酸部分の色素への直接連結、または色素のプテロイン酸もしくは葉酸への連結も、コンジュゲートからの蛍光の強度の消失を生じさせる一方で、プテロイル（標的化部分）と近赤外色素（蛍光性部分）との間の連結部分としてのチロシンまたはチロシン誘導体の存在は、コンジュゲーテッド化合物の蛍光を維持または増強するために有利であることが企図される。本開示のチロシンベース化合物は、Ｓ０４５６をコンジュゲートさせる余分なアミンリンカーを必要とせず、チロシンのフェノール部分を介したコンジュゲーションのために蛍光の増強をもたらす。
【００６３】
本化合物は、蛍光媒介分子断層撮影画像化システム、例えば、深部組織における近赤外蛍光活性化を検出するように設計されたものによって使用され得る。本化合物は、分子および組織特異性を与え、高い蛍光コントラスト、より明るい蛍光信号を生じさせ、バックグラウンドの自己蛍光を減少させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ疾患組織（例えば、がん）の改善された早期検出および分子標的評価を可能にする。本化合物は、深部組織三次元画像化標的手術、および生物試料中の標的細胞型の量を定量化する方法に使用され得る。
【００６４】
化合物
【００６５】
一態様において、本開示は、式、すなわち、式（Ｉ）：
【化１６】
2017149776.tif 000048
【００６６】
（式中：
【００６７】
Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、
【００６８】
Ｙは、近赤外範囲に蛍光励起および発光スペクトルを有する色素である）
を含み、Ｙの蛍光を維持または増強する化合物に関する。
【００６９】
一部の実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸誘導体は、未修飾色素分子の電子スペクトルに対して、電子発光スペクトル、電子吸収スペクトル、または電子発光と吸収の両方のスペクトルでシフトを誘発する。好適には、電子スペクトルでのシフトは、深色シフト（すなわち、より長い波長／より低い周波数へのシフト）であり、これは、近赤外（ＮＩＲ）スペクトル枠における化合物の検出を改善し、および／またはバックグラウンド信号の量、自己蛍光、可視化される領域の周りの組織からの干渉を減少させるのを助ける。より具体的には、電子スペクトルにおけるこのシフトは、６員環に組み込まれている電気陰性原子を含むＮＩＲ色素で特に観察される。したがって、ある特定の実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸（Ｘ）誘導体は、例えば、酸素、硫黄、または窒素などの電子豊富部分を含む。このようなアミノ酸の非限定的な例としては、システイン、メチオニン、トレオニン、セリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン、またはそれらの誘導体を挙げることができる。
【００７０】
この態様の実施形態において、本開示は、式（Ｉ）ａ、式（Ｉ）ｂ、式（Ｉ）ｃ、および式（Ｉ）ｄ：
【化１７】
2017149776.tif 000049
【化１８】
2017149776.tif 000050
【００７１】
（式中、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓ基は、それぞれ、チロシン、システイン、セリン、およびリシンアミノ酸残基、またはそれらの誘導体を示し、Ｌは、好ましくはプテロイルまたは葉酸塩であり、Ｒｘはそれぞれ、必要に応じて非存在である独立して選択された可溶化基を含む）
の化合物を提供する。
【化１９】
2017149776.tif 000051
【化２０】
2017149776.tif 000052
【００７２】
（式中、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓ基は、それぞれ、チロシン、システイン、セリン、およびリシンアミノ酸残基、またはそれらの誘導体を示し、Ｌは、好ましくはプテロイルまたは葉酸塩である）。好ましくはＬは、プテロイルである。
【００７３】
具体的な好ましい実施形態において、本開示は、Ｔｙｒが、
【化２１】
2017149776.tif 000053
からなる群から選択される、式Ｉ（ａ）の化合物を提供する。
【００７４】
好適には、本明細書で開示される化合物は、約６５０ｎｍから１０００ｎｍの間の近赤外領域に、例えば、好ましくはおよそ８００ｎｍに最大光吸収波長を有する。
【００７５】
具体的な好ましい実施形態において、本明細書で開示される化合物は、特定の細胞または組織型に対して化合物を標的化するのに有効であるリガンド（Ｌ）を含み、その標的細胞または組織の画像化を可能にする。Ｌが、プテロイル部分または葉酸塩部分のいずれかであることが好ましく、Ｌがプテロイル部分であることがより好ましい。しかしながら、当業者は、特定の細胞表面タンパク質または目的の受容体タンパク質に対して化合物を標的化する何らかの他のリガンドＬを使用し得ることが企図される。具体的で、好ましい実施形態において、リガンドは、プテロイル：
【化２２】
2017149776.tif 000054
を含む。
【００７６】
化合物の合成
【００７７】
本明細書で開示される化合物は、文献で公知の慣用方法を使用して作製され得る。例えば、色素化合物は、以前に報告されたとおりに合成されたことを理解されたい。
【００７８】
しかしながら、具体的な好ましい実施形態において、本開示は、本明細書で開示される化合物（すなわち、式Ｉの化合物）を生成するためのより効率的な合成方法を提供する。例えば、式Ｉ（ａ）〜式Ｉ（ｄ）を有する化合物は、以下のスキームＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれで概略された一般スキームに従って調製され得る。
【００７９】
スキームＩは、標的リガンドが色素分子にアミノ酸（リシン）を介して連結された葉酸塩を含む、式Ｉの化合物を生成させるために以前に使用された合成スキームを例証する。簡潔には、アミノ酸のアミノ基への付着によって修飾された葉酸リガンドは、生成物（３）および（４）を生成する条件下で色素の架橋エーテル誘導体と反応させる。しかしながら、化合物３は好ましく、望ましい化合物であるが、その合成経路は、ＮＩＲ特性を有さない、主要生成物として望ましくない副生成物４の存在をもたらすことが注目に値する。さらに、そのスペクトル特性は、ｐＨ依存性である。したがって、このスキームは、エーテル架橋色素の主たる欠点を実証する。これらの色素の慣用の生産では、収量の３０〜６０％は望ましい生成物のものであるが、一方で収量の４０〜７０％は望ましくない副生成物のものである。
【化２３】
2017149776.tif 000055
【００８０】
スキームＩＩは、単に３つの反応ステップを含み、高収率（９８％超）で生成物化合物（５）を与える合成経路を提供する。簡潔には、標的化リガンド（１）（プテロイル基とともにスキームＩＩで例証される）と、アミノ酸のアミノ基以外の基との望ましくない反応性を回避するために保護基を必要に応じて含むアミノ酸またはアミノ酸誘導体（２）とは、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）］／ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒系中で混合され、室温で、リガンド（１）へのアミノ官能基を介した（２）のカップリングを可能にするのに十分な時間（５分間）反応させて、（３）を得る。化合物（３）は、有利には、反応混合物に希酸を添加することによって沈殿させる。より具体的には、化合物３は、１Ｎ  ＨＣｌ（塩酸）中で沈殿させて、９８％超の純度の最終化合物を得、これらの実施形態において、費用のかかるＨＰＬＣまたはカラムクロマトグラフィーのステップは回避される。化合物をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：水：ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）溶媒系中室温で反応させることによって、化合物のアミノ酸部分で保護基を除去するために化合物（３）を反応させて、化合物（４）を得る。化合物４を、ジエチルエーテルまたはメチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させることによって精製して、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）またはカラムクロマトグラフィーなしに９８％超の純度を得た。保護基官能性を除去するために化合物（４）を塩基性水系（例えば、ＮａＯＨ、水酸化ナトリウム）中で反応させ、その後、水中わずかにモル過剰で色素（Ｓ０４５６）と、８０〜１００℃の温度で１５分間反応させて、色素と（４）との間のカップリングを可能にして、最終化合物（５）を得る。化合物５をアセトンで沈殿させて、９８％超の純粋なＰｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を得た。ＮａＯＨが使用される場合、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６のナトリウム塩が生成される。
スキームＩＩ：
【化２４】
2017149776.tif 000056
【００８１】
スキームＩＩＩは、本明細書で開示される化合物を生成するための代替の固相合成経路を提供し、スキームＩＩに記載されたものと同様の収率を与える。簡潔には、基質（１）に結合したアミノ酸（樹脂ビーズに付着した保護チロシンとして以下のスキームＩＩＩで例証される）を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン中反応させて、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を除去し、その後、アミノ酸のアミン官能基にリガンドをカップリングさせるために十分な時間および温度でＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ中標的化リガンド（以下のプテロイルによりやはり例証される）と反応させて、（２）を与える。化合物（２）を、ＴＦＡ：水：ＴＩＰＳ溶媒系中一連の反応で基質およびアミノ酸上の任意の保護基を除去するために反応させて、（３）を与える。スキームＩＩに記載されたのと同様の最終ステップに続いて、化合物（３）を、保護基官能基を除去するために塩基性水溶液系で反応させ、その後、色素と（３）の間のカップリングを可能にする時間および温度で水中わずかにモル過剰で色素（Ｓ０４５６）と反応させて、最終化合物（４）を生成する。
スキームＩＩＩ：
【化２５】
2017149776.tif 000057
【００８２】
上記スキームは、本明細書で開示される化合物が調製され得るいくつかの非限定的な合成手法を単に例証する。当業者は、上記スキームに、本開示の範囲内である物理的特性を有する他の化合物を与える変更を特定し、組み込むことができることが理解される。例えば、上記スキームは、本明細書で開示される化合物の標的化リガンドとして葉酸およびプテロイル基を例証するが、当業者は、他の標的化リガンドが合成スキーム中に容易に組み込まれ、代替の式Ｉの化合物を生成し得ることを理解する。別の例として、当業者は、ポリメチン鎖の長さを調整すること、および適当なアリールまたはヘテロアリール基（例えば、インドール対ベンゾインドール）を選択すること、ならびにアミノ酸基を連結することによって、化合物の色素部分の吸収／発光波長が調節され得ることを理解する。さらなる例において、当業者は、当技術分野で一般に公知のようにポリメチン鎖の剛直を調整することによって（例えば、とりわけ、シクロヘキセン、シクロブテノンなどの環系をポリメチン鎖中に導入することによって）、色素の吸光係数および蛍光強度を変え得ることを理解する。したがって、当業者は、本明細書で開示される化合物のいずれかを作製するために適当な試薬を選択することによって、合成を変更することができ、および必要に応じて化合物の特定の物理的特性を変えることができる。
【００８３】
使用の方法
【００８４】
本明細書で上に述べたように、組織内の領域に特異的に標的化する近赤外色素化合物に対する必要性がある。これは、その結果、本化合物が、画像化技術で、ならびに疾患の診断および治療的介入に役立つために使用され得る。上で詳細に検討したように、本明細書で提供される化合物は、光スペクトルのＮＩＲ領域の色素および画像化剤として有用である。したがって、本化合物は、いくらでも画像化、診断、および標的治療の方法に広範な適用性を有する。
【００８５】
具体的な実施形態において、本開示は、組織内の腫瘍を特異的および選択的に特定するために使用され得る、少なくとも１種の本明細書で開示される化合物（例えば、式Ｉ、式Ｉ（ａ）、式Ｉ（ｂ）、式Ｉ（ｃ）、および／または式Ｉ（ｄ）の）を組み込む方法に関する。より具体的には、特定された腫瘍は、次いで、手術方法を介して治療的に切除され得る。このように、本開示の化合物は、腫瘍、リンパ節などの蛍光誘導手術による切除において有用である。あるいは、本開示の化合物は、本化合物が対象に投与され、蛍光の定位が腫瘍部位の特定を容易にする全身画像化において容易に使用され得る。
【００８６】
このように、本開示の化合物は、それを必要とする対象における羅患組織のｉｎ  ｖｉｖｏ特定のために使用され得る。本開示方法は、約６００ｎｍから約１０００ｎｍの近赤外範囲に少なくとも１つの励起波長を有する光で、羅患組織を含有する対象のｉｎ  ｖｉｖｏ身体部分を照射するステップを含む。対象に投与され、そして身体部分の羅患組織に特異的に結合し、および／またはそれにより取り込まれた本開示の化合物から、少なくとも１つの励起波長に反応して発する蛍光は、対象における解剖組織の位置および／または表面積を決定するために直接目視される。
【００８７】
６００ｎｍから８５０ｎｍの波長範囲を有する光は、約４０１ｎｍから５００ｎｍの範囲内にある可視光と対照的に、スペクトルの近赤外範囲内にある。したがって、本開示診断方法の実施で使用される励起光は、化合物を励起するために赤外波長で組織を照射する少なくとも１つの光の波長を含有し、その結果、本開示の化合物の取り込みを有するエリアから得られた蛍光は、明瞭に目に見え、周囲組織の自己蛍光と区別される。励起光は、単色または多色であってもよい。このように、本開示の化合物は、蛍光プローブが６００ｎｍ未満の波長で蛍光を発するものである場合に所望の診断画像を得るために使用されるフィルタリング機構の使用の必要性をなくすので有利である。このように、本開示の化合物は、健康組織から反射され、蛍光画像の分解能の損失を引き起こす波長の励起光の結果として作成される不明瞭な診断画像を回避する。
【００８８】
外科的手順のための手術室は、本開示診断方法の実施に有用な光学発光スペクトルにおける光の波長を生じさせるオーバーヘッドライト、例えば、適当な波長の光を生じさせるランプを備えている。このような光は、単に、手術室の他の光を消し（調査中の身体部分の組織から可視的に反射される外部光を排除するために）、観察者（例えば、外科医）の目により直接受け取られる蛍光画像が主として視野においてフルオロフォア（複数可）から発する蛍光画像であるように、体腔または外科的に作られた開口中に近赤外波長の励起光を照射することによって、本開示診断方法の実施に利用され得る。６００ｎｍから８５０ｎｍの範囲、好ましくは７５０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲で光源から発する光は、蛍光性部分からのもの以外の、身体部分から反射する光が最小限化または排除されるように、観察者による直接可視化の目標を達成する際に使用される。
【００８９】
したがって、本開示診断方法において、羅患組織（および結合または取り込まれた標的化構築物）は、励起光に「曝露される」（例えば、外科的に作られた開口、または内部位置への光の内視鏡的送達によって）。本開示方法は、生まれつきの体腔、または外科的に作られた開口内などの、対象の内部部位に位置する羅患組織のｉｎ  ｖｉｖｏ検出に特に適しており、ここでは、羅患組織は、「よく見える場所に」あって（すなわち、ヒトの目に曝されていて）、本開示の化合物の取り込みにより強調されたエリアの生検または外科的切除の手順を容易にする。腫瘍組織の正確な位置および／または表面積が本開示の化合物の取り込みによって容易に決定されるので、本開示の化合物を用いる方法は、手術が進行するにつれて切除されるべき塊の正確な輪郭、サイズなどを実時間で「見る」必要がある外科医にとって貴重な誘導を与える。
【００９０】
したがって、具体的な実施形態において、本開示は、組織を、本開示の化合物（例えば、式Ｉの化合物）を含む組成物と接触させて、組成物中の化合物が組織内に分布し、葉酸受容体の部位と相互作用する時間を考慮することによる、葉酸受容体を発現する生物組織の光学的画像化を伴う。このような相互作用のための十分な時間後、組織は励起光で照射されて、組成物中の化合物に蛍光を発するようにさせる。次いで、蛍光は、そのままで検出され、このような蛍光が観察される場所は、葉酸受容体を含有する領域である。
【００９１】
同様に、本開示の化合物は、標的細胞型の少なくとも１個の細胞に本化合物を結合させることを可能にする時間および条件下で生物試料をこのような化合物と接触させることによって、生物試料中の標的細胞型を特定するために使用される。次いで、結合した化合物は、光学的に検出され、その結果、本開示の、結合して、標的化された化合物から発する近赤外波長の蛍光の存在が、標的細胞型が生物試料中に存在することを示す。したがって、この方法は、評価される組織中の標的細胞型の画像を与える。最も好ましくは、標的細胞型は、腫瘍細胞が広まった腫瘍細胞またはリンパ節である。
【００９２】
これらの方法は、本開示の化合物を含む組成物の、前記化合物が所与の手術部位で蓄積するために十分な条件下および時間での投与は、除去される組織を可視化する際に外科医を補助するので、対象に対して画像誘導手術を行う改善された方法を提供する。好ましくは、組織は腫瘍組織であり、組織により取り込まれた化合物の照明は、赤外光を使用する化合物の近赤外蛍光によって腫瘍の可視化を容易にする。腫瘍部位に対する本開示の化合物の標的化によって容易化される可視化の補助によって、赤外光による励起後に蛍光を発するエリアの外科的切除は、小さい腫瘍でさえもその改善されてかつ正確な除去を可能にする。
【００９３】
本開示の手術方法のいずれにおいても、本開示の化合物は、外科的切開が行われる前、またはさらには腫瘍の外科的空洞および部位が手術により明らかにされた後で投与されてもよいことが理解される。
【００９４】
推定羅患部位が生まれつきの体腔または外科的に作られた内部部位である場合、励起光を部位に送達し、体腔内の部位から発する蛍光を受け取り、羅患組織からの蛍光の直接画像の形成を補助するために、内視鏡装置が必要に応じて使用され得る。例えば、内視鏡装置におけるレンズは、画像の形成の補助として検出された蛍光を焦点に合わせるために使用され得る。本明細書で使用される場合、このような内視鏡送達蛍光は、医療従事者により「直接目視される」と言われ、標的化構築物が結合する、またはそれが取り込まれる組織は、内視鏡に対して「よく見える場所に」なければならないが、本開示診断手順において使用される光は、近赤外範囲の波長などの、組織に侵入する光の波長を含有しないからである。代わりに、励起光は、体腔、または本明細書で記載される通りに投与される標的化構築物を含有する外科的開口中に任意の慣用手段によって向けられてもよく、そのように作成された蛍光画像は、内視鏡からの補助なしに観察者の目によって直接目視され得る。いずれかのタイプの内視鏡装置の補助によって、またはそれなしで、本開示方法によって作成された蛍光画像は、結果として、画像処理装置、例えば、ＣＣＤカメラ、ＴＶモニター、フォトン収集装置などの補助なしに可視化され得る。
【００９５】
本開示の診断または画像化方法は、外科医／医療従事者が生検または外科的切除の手順を容易にするために外科的開口を通して羅患組織または異常組織を同時に見る／目視する／可視化することを可能にする。羅患組織の位置および／または表面積は、本明細書に記載される化合物を用いる本開示の診断手順によって容易に決定されるので、本開示方法は、例えば、手術が進行するにつれての切除のための、塊の正確な輪郭、サイズなどを知ることを必要とする外科医にとって貴重な誘導である。特に、本開示の化合物は、以前に記載されたものよりも大きい強度に近赤外範囲で蛍光を発することが留意される。したがって、有利には、より少ない化合物が診断画像化を達成するために必要とされることが企図される。さらに、本開示の化合物は、腫瘍中に深く侵入し、したがって、本開示は、腫瘍が除去されたことをより大きな正確さで可能にする。
【００９６】
本開示は、対象に本開示の化合物を含む組成物を投与するステップ、羅患組織を含有する対象のｉｎ  ｖｉｖｏ身体部分を約６００ｎｍから約８５０ｎｍの範囲の少なくとも１つの励起波長を有する光で照射するステップ、身体部分の羅患組織に特異的に結合した、および／またはそれにより取り込まれた、対象に投与された標的化構築物から発する蛍光を直接目視するステップであって、標的化構築物は、少なくとも１つの励起波長に反応して蛍光を発するステップ、対象における羅患組織の位置および／または表面積を決定するステップ、ならびに腫瘍組織の少なくとも一部を除去するステップによって、それを必要とする対象において手術中に診断手順を利用する方法を提供する。
【００９７】
さらに別の実施形態において、本開示は、それを必要とする対象における腫瘍組織のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための方法を提供する。この実施形態において、本開示方法は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで対象から得られた腫瘍細胞の試料を複数の検出可能に標識された化合物と接触させるステップであって、これらのそれぞれは、区別できる腫瘍タイプに結合するか、またはそれにより選択的に取り込まれるステップ、化合物のどれが試料腫瘍細胞に結合するか、またはそれにより選択的に取り込まれるかを決定するステップ、試料腫瘍細胞に結合し、および／またはそれにより取り込まれると決定された本開示の化合物、ならびに約６００ｎｍから約８５０ｎｍの範囲の光の少なくとも１つの波長に反応性であるフルオロフォアを含有する、診断的に有効量の少なくとも１種の生物学的に適合する蛍光性標的化構築物を投与するステップ、ならびに蛍光性標的化構築物のための少なくとも１つの励起波長を与える光によって、その照射後に腫瘍組織に結合するか、またはそれに取り込まれた標的化構築物から発する蛍光を直接目視することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ身体部分において腫瘍組織の位置および／または表面積を診断するステップを含む。
【００９８】
一部の実施形態において、蛍光部分の１つのタイプは、照射身体部分から（すなわち、羅患組織に結合し、またはそれに取り込まれる蛍光性標的化構築物から）発する蛍光を発生させること、および標的化構築物に近赤外スペクトルからの光源を受けさせることについて信頼される。
【００９９】
他の実施形態において、複数（すなわち、２つ、３つ、４つ、またはそれ超の）標的化構築物が、診断画像を得るために使用されることが企図される。このような追加の標的化構築物は、最初のこのような化合物から区別される本開示の追加の化合物であり得る。代わりに、追加の標的化構築物は、本明細書で記載される色素を含んでもよいが、プテロイル部分は、葉酸受容体以外の別の受容体のためのリガンドによって置き換えられている。さらに他の実施形態において、追加の標的化部分は、画像化される腫瘍または組織（例えば、アテローム性動脈硬化症、感染、心血管疾患、神経変性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、呼吸器系疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、感染性疾患、骨疾患、および環境性疾患（ｅｍｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）など）上の他の受容体または抗原に結合する他の蛍光性標的化構築物（例えば、付着フルオロフォアを有する、抗体、またはその生物学的に活性な断片）であってもよい。腫瘍または組織上の特異的部位を特異的に標的化するいずれの追加の標的化部分も使用されてよいが、但し、それが、モニターされる部位に特異的であることを条件とする。追加の蛍光性標的化構築物の目的は、モニターされる部位で蛍光の強度を増加させ、それにより、身体部分の羅患組織または異常組織を検出するのを補助することである。例えば、所与の腫瘍は、多数のマーカーを有してもよく、本開示の化合物に加えて、その所与の腫瘍に特異的である蛍光部分のカクテルが提供され、その結果、腫瘍から発する信号は、目的の腫瘍部位を標的化し、およびそれに局在された２種以上の化合物または蛍光部分によって発生する。
【０１００】
実際には、当業者は、本開示の化合物を単独でまたは標的化検出可能部分のカクテルの一部として投与し、これらの化合物および標的化部分を調査中の部位に存在し得る任意の標的化組織に結合させ、および／またはそれにより取り込ませ、次いで、光源の供給を行う。典型的には、本開示の化合物および任意の追加の標的化部分は、本開示の蛍光性化合物および任意の追加の蛍光構築物が標的組織により取り込まれることを可能にするある時間および組成物中で手術前に投与される。
【０１０１】
当業者は、それらのそれぞれが、標的部位に特異的に結合する、連続的に投与された蛍光性標的化構築物の組合せを考え出すことができる。標的組織を特定するためにこのようなカクテル中で使用される蛍光性標的化構築物のすべてが、本開示方法の実施において使用される異なる標的化構築物のすべてからの同時の蛍光を励起するために用いられることを必要とする異なる光源の数を最小限にするために、本開示の化合物がそうである（例えば、本開示の化合物における光の近赤外波長に感受性のある蛍光）のと同じ波長帯域内または同じ波長で蛍光を発するフルオロフォア含むことが好ましい。しかしながら、本開示の化合物以外の追加の標的化部分は、本開示の蛍光性化合物からのものと異なる色で（すなわち、異なる波長を有する）照射光に反応して蛍光を発してもよいことが企図される。本開示の化合物から発する蛍光の色と、追加の標的化化合物のものとの差は、羅患組織の位置およびサイズを決定する際に観察者を補助し得る。一部の例では、正常組織を標的化するように標的化された標的化構築物中のフルオロフォアおよび羅患組織を標的化する本開示の化合物を含み、その結果、羅患組織と正常組織の間のコントラストは、標的組織の位置およびサイズを決定する際に観察者をさらに補助するようにさらに増強される。本開示の化合物に加えて、このような追加のフルオロフォアおよび標的化剤の使用は、正常組織から発するいずれの自然蛍光も、身体部分の正常組織に標的化された補足的標的化構築物中のフルオロフォア（複数可）から発する蛍光によって不明瞭にされるという利点を与える。正常組織と標的組織とから発する蛍光の間の色の差が大きければ大きいほど、観察者にとって標的組織の輪郭およびサイズを可視化することがより容易になる。例えば、標的組織（すなわち、異常組織）に対して本開示の化合物からの赤外光を生じさせるフルオロフォアと、健康組織に対して緑色光を生じさせるフルオロフォアとを含む蛍光性標的化構築物の標的化は、標的組織を正常組織と区別する際に観察者を補助する。当業者は、区別できる視覚的な色コントラストを提示するフルオロフォアの組合せを容易に選択することができる。
【０１０２】
本開示方法の実施で使用される光のスペクトルは、標的化構築物、または標的化構築物内に含有される生物学的に適合する蛍光性部分の主要な励起波長に相当する少なくとも１つの波長を含有するように選択される。一般に、本開示方法の実施で使用される励起光は、約６００ｎｍから約８５０ｎｍの近赤外波長範囲の光の少なくとも１つの励起波長を含む。
【０１０３】
しかしながら、異なる波長で蛍光を発する標的化リガンドの組合せが本開示の実施で使用される場合、励起光のスペクトルは、使用されるフルオロフォアのそれぞれに対して少なくとも１つの励起波長を与えるのに十分に広くなければならない。例えば、異なる色のフルオロフォアが羅患組織と正常組織を区別するように選択される場合、光（複数可）の励起スペクトルが、正常組織および標的組織に標的化されたフルオロフォアのための励起波長を含むことが特に有利である。
【０１０４】
本明細書で述べたように、本開示の化合物は、本開示の化合物の一部であるプテロイルまたは葉酸リガンドによって葉酸受容体に特異的に標的化される。追加の標的化部分が使用される実施形態において、このような追加の標的化部分の標的化構築物は、目的の標的組織、例えば、標的組織の疾患状態または異常状態を特徴付ける細胞上またはそれの内に含有される抗原または他の表面特徴に特異的に結合し、および／またはそれによって取り込まれるように選択される。他の診断アッセイにおけるように、標的化構築物が標的組織に選択的に、または疾患状態もしくは異常状態を伴う抗原に結合し、またはそれにより取り込まれることが望ましく；しかしながら、健康組織または細胞構造にやはり結合し、またはそれにより取り込まれるリガンド部分を含有する標的化構築物が、標的組織を表す蛍光画像が、視野における健康組織または構造からもたらされるいずれの蛍光からも区別できるように明瞭に可視化され得るように、標的組織中の抗原の濃度または標的組織に対する標的化構築物の親和性が視野において健康組織に対するよりも十分大きい限り、本開示方法の実施で使用され得る。
【０１０５】
例えば、結腸がんは、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）の存在によってしばしば特徴付けられるが、この抗原はまた、健康個体のある種の組織とも関連する。しかしながら、がん性結腸組織中のＣＥＡの濃度は、健康組織で見られるよりもしばしば大きく、したがって、抗ＣＥＡ抗体は、本開示の実施においてリガンド部分として使用され得る。別の例において、デオキシグルコースは、種々の程度に健康組織によって取り込まれ、利用されるが、ある種の知られている臓器、例えば、心臓を除いて、健康組織におけるその代謝は、腫瘍におけるよりも実質的により低い。したがって、身体におけるデオキシグルコース消費の公知のパターンは、デオキシグルコースの予想外に高い取り込みが腫瘍細胞の存在を伝えるエリアの決定において補助するために使用され得る。
【０１０６】
本開示方法により検出される疾患状態または異常状態は、特異的結合リガンドが公知である公知の標的組織の存在によって特徴付けられるいずれのタイプであることもできる。例えば、様々な心臓状態は、特異的結合リガンドが公知である、壊死もしくは虚血組織の産生、またはアテローム性動脈硬化組織の産生により特徴付けられる。別の例証的な例として、乳がんは、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、またはＨＥＲ２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体により特定されるがん性組織の産生によって特徴付けられる。多くの標的化構築物が細胞膜に侵入するので、標的組織は、結合リガンドが公知である表面抗原、または細胞内マーカー（すなわち、抗原）のいずれかを産生する細胞によって特徴付けられてもよいことが企図される。本開示方法を使用して特定され得る代表的な疾患状態としては、腫瘍、細菌感染、真菌感染およびウイルス感染などの異なるタイプのそのような様々な状態が挙げられる。本明細書で使用される場合、「異常」組織としては、前がん状態、壊死または虚血組織、および結合組織疾患を伴う組織、ならびに自己免疫障害などが挙げられる。さらに、本開示方法を使用する診断または検査に適した標的組織のタイプの例としては、心臓、乳房、卵巣、子宮、肺、内皮、血管、胃腸、結腸直腸、前立腺の組織、内分泌組織など、およびそれらの任意の２つまたはそれ超の組合せが挙げられる。
【０１０７】
単に例として、一部の一般的な悪性腫瘍に対する抗原およびそれらが一般に見られる身体位置は、当業者に公知であり、抗体などの、もしくはこれらの抗原に対する標的化リガンド、または実に抗原が受容体である場合のリガンドは、当技術分野で公知である。例えば、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）は、結腸、乳房および肺からの腫瘍で一般に見られ；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原、または時に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と称される）は、前立腺がんに特異的であり；ＣＡ−１２５は、卵巣がん起源の腫瘍で一般に見られ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ−１、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕは、乳がん腫瘍に一般に見られ、アルファフェトプロテインは、精巣がんおよび肝がん腫瘍の両方に見られ、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、精巣がんおよび絨毛癌に見られ、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の両方はまた、子宮がん腫瘍に見られ、上皮増殖因子受容体は、膀胱がんからの腫瘍に通常見られる。他の腫瘍特異的リガンドおよびマーカーは、当業者に周知である。好ましい実施形態において、本開示は、前立腺がん細胞に対して葉酸受容体を標的化するために葉酸またはプテロイル部分、および色素を標的化するためにＰＭＳＡ標的部分を用いる。
【０１０８】
これらの腫瘍の一般的に公知のマーカーのいずれも、本明細書に記載される色素を使用して（プテロイル部分を、これらのマーカーを特異的に標的化する部分に切り替えることによって）標的化され得るか、または代わりに、これらのマーカーは、本開示の化合物を使用して標的化されている葉酸受容体に加えて、およびそれと組み合わせて標的化され得る。以前に検討されたように、所与の腫瘍上のいくつかの異なるマーカーに対して標的化部分を有して、いくつかのマーカーが腫瘍をより明るくかつ明瞭に可視化するために標的化される診断カクテルとして役立つことが特に有利であり得る。
【０１０９】
化学化合物に加えて、このようなカクテル中の標的化部分としては、タンパク質もしくはポリペプチド、例えば、抗体、またはその生物学的に活性な断片、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられてもよい。本開示方法の実施で使用される補足的蛍光性標的化構築物も、フルオロフォアで標識されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体であっても、またはそれらを含んでもよい。本開示で使用される場合の「抗体」という用語は、無傷分子およびその機能性断片、例えば、エピトープ決定基に結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む。これらの断片を作製する方法は、当技術分野で公知である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Harlow  &  Lane、Antibodies:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York、１９８８年を参照のこと）。本開示で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常はアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特異的三次元構造特性、および特異的電荷特性を有する。
【０１１０】
抗体に加えて、カクテルは、蛍光性標的化構築物に付着したリガンド部分が、受容体に特異的に結合し、および／または腫瘍細胞に優先的に取り込まれ、ならびに本開示標的化構築物中のリガンド部分として使用され得る、多くの生物学的に適合する化合物の中から選択される化合物を含み得る。腫瘍細胞により優先的に「取り込まれる」化合物は、表面または核内受容体（例えば、ホルモン受容体）、孔、細胞脂質二重層中の親水性「枠」などを介して細胞に入り得る。
【０１１１】
腫瘍を標的化するこのクラスの化合物の例証となるものは、ソマトスタチン、ソマトスタチン受容体結合性ペプチド、デオキシグルコース、メチオニンなどである。特に有用なソマトスタチン受容体結合性ペプチドは、オクトレオチド（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−トリプトフィル−Ｌ−リシル−Ｌ−トレオニル−Ｎ［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）プロピル］−−Ｌ−システインアミド環状（２→７）−ジスルフィド）、ランレオチド、オクトレオチドの経口製剤、Ｐ８２９、Ｐ５８７などとして公知である、ソマトスタチンの長時間作用型のオクタペプチドアナログである。ソマトスタチン結合性ペプチドは、米国特許第５，８７１，７１１号に開示されており、このようなペプチドを還元条件下でそれらのカルボキシル末端アミノ酸を介して放射性同位体に共有結合的に連結する方法は、米国特許第５，８４３，４０１号に開示されており、これらは両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、放射性同位体の代わりに本開示の蛍光性部分を置換することによって、このような教示を蛍光感受性ソマトスタチン受容体結合性ペプチドに容易に適合させ得る。
【０１１２】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン受容体結合性ペプチドは、疾患状態が神経内分泌腫または内分泌腫瘍である場合に、標的化構築物中の腫瘍標的化リガンド部分としての使用に特に有効である。本開示方法を使用して診断され得る神経内分泌腫瘍の例としては、腺腫（ＧＨ産生性およびＴＳＨ産生性）、島細胞腫、カルチノイド、未分化神経内分泌癌腫、小細胞および非小細胞肺がん、神経内分泌および／または中間細胞癌腫、（卵巣、頸部、子宮内膜、乳房、腎臓、咽頭、副鼻腔、および唾液腺の）神経内分泌腫瘍、髄膜腫、高分化神経膠由来腫瘍、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、神経節芽細胞腫、傍神経節腫、甲状腺細胞中の乳頭、濾胞および髄様癌腫、メルケル細胞癌腫、および黒色腫、ならびに肉芽腫およびリンパ腫が挙げられる。これらの腫瘍細胞は、ソマトスタチン受容体を有することが公知であり、本開示の蛍光性標的化構築物中の腫瘍標的化リガンドとしてソマトスタチンまたはソマトスタチン受容体結合性ペプチドを使用して標的化され得る。
【０１１３】
血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）受容体シンチグラフィーで使用されるＶＩＰ（I.  Virgolini、Eur  J.  Clin.  Invest.  ２７巻（１０号）：７９３〜８００頁、１９９７年）も、小原発性腺癌、肝転移、および胃腸管のある種の内分泌腫瘍の診断のために本開示方法で有用である。
【０１１４】
腫瘍により優先的に取り込まれる腫瘍標的化リガンドの別の分子の例証となるものは、デオキシグルコースであり、これは、多種多様なタイプの腫瘍に優先的に取り込まれることが公知である。腫瘍標的化リガンドとしてデオキシグルコースを使用して検出され得る腫瘍のタイプの例証となるものとしては、黒色腫、結腸直腸および膵臓腫瘍、リンパ腫（ＨＤおよびＮＨＬの両方）、頭頸部腫瘍、骨髄腫、（卵巣、乳房、および脳の）がん（高悪性度および下垂体腺腫）、肉腫（悪性度依存性）、肝がん、精巣がん、甲状腺（悪性度依存性）小細胞肺がん、膀胱および子宮がんなどが挙げられる。
【０１１５】
本開示のカクテル中で使用され得るさらに他の腫瘍標的化化合物としては、１−アミノ−シクロブタン−１−カルボン酸およびＬ−メチオニンが挙げられる。Ｌ−メチオニンは、タンパク質合成に必要な必須アミノ酸である。悪性細胞がメチオニン代謝の変化を有し、メチオニンの外部源を必要とすることは公知である。
【０１１６】
腫瘍受容体に特異的に結合し、および／または腫瘍細胞により優先的に取り込まれる、生物学的に適合する腫瘍標的化化合物のさらなる例としては、哺乳動物ホルモン、特に性ホルモン、神経伝達物質、および腫瘍細胞により優先的に取り込まれる互いに連絡する腫瘍細胞により発現される化合物、例えば、クローン内の移動または反転などの染色体異常から生じる新規な分泌タンパク質構築物が挙げられる。
【０１１７】
性ホルモン、細胞成長ホルモン、サイトカイン、内分泌ホルモン、エリトロポエチンなどを含めたホルモンも、腫瘍標的化部分として十分に役立つ。当技術分野で公知であるように、多くの腫瘍タイプは、ホルモン、例えば、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、例えば、テストステロン、などに対して受容体を発現する。このようなホルモンは、腫瘍細胞によって、例えば、特異的受容体を介して、優先的に取り込まれる。
【０１１８】
本開示方法の実施で使用される標的化構築物および補足的標的化構築物は、当業者に公知の任意の経路によって、例えば、局所的、血管内、嚢内、眼内、脳室内、髄腔内、静脈内、筋内、腹腔内、皮内、気管内、腔内などに、およびそれらの任意の２つまたはそれ超の任意の組合せによって投与され得る。
【０１１９】
投与のための最も適した経路は、処置される疾患状態、または診断される、疑いのある状態もしくは腫瘍の位置に依存して変わる。例えば、炎症状態および種々の腫瘍の処置のために、励起光により（例えば、腔内に）照射される身体部分の中への直接注射による投与を含めた局所投与は、標的化構築物（例えば、蛍光標識抗体）が、その全身投与を伴い得る合併症の危険なしに高濃度で投与され得る利点を与える。
【０１２０】
本開示の化合物を含む診断カクテル中で使用される本開示の化合物および任意の追加の標的化構築物は、診断のための「有効量」で投与される。有効量は、対象において調査中の身体部分に位置する任意の標的組織の直接可視化において補助するために必要な標的化構築物の量である。その用語が本明細書で使用される場合の「対象」は、任意の哺乳動物、例えば、飼いならされたペット、農場動物、または動物園動物を含むことが企図されるが、好ましくはヒトである。診断使用に有効な量は、当然に、調査される身体部分のサイズおよび位置、標的組織に対する標的化構築物の親和性、標的組織のタイプ、ならびに投与の経路に依存する。標的化構築物の局所投与は、典型的には全身投与の任意の様式よりも小さい投与量を必要とするが、標的化構築物の局所濃度は、場合によっては、全身投与後に安全に達成され得るよりも、局所投与後により高くでもよい。
【０１２１】
個々の対象は、症状の重症度で幅広い変化を提示し得、かつ各標的化構築物は、標的に対する標的化構築物の親和性、身体過程による標的化構築物のクリアランス率、その中に含有されるフルオロフォアの特性などを含めたその独特の診断上の特性を有するので、熟練の医療従事者は、要因を比較検討し、それに基づいて投与量を変える。
【０１２２】
本開示の化合物、およびこれらの化合物を含むカクテルは、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して公知の方法によって滅菌の注射可能な懸濁剤として製剤化され得る。滅菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌の注射可能な溶液剤または懸濁剤で、例えば、１，４−ブタンジオール（1-4,  butanediol）中の溶液剤としてあってもよい。滅菌の固定油は、溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。このために、合成モノ−もしくはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、（ゴマ油、ココナツ油、ピーナッツ油、綿実油などのような）天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクルなどを含めた、任意の無菌性固定油が用いられてもよい。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤などが、必要に応じて組み込まれ得、または代わりに、製剤を構成し得る。
【０１２３】
様々な変化が、本開示において、その精神および範囲から逸脱することなしになされてもよく、したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲に示されたものだけでなく、本明細書に具体的に開示されたものに加えて実施形態を包含することが、当業者に明らかである。
【０１２４】
以下に続く実施例は、本開示の特定の実施形態の例証のためだけに与えられ、添付の特許請求の範囲に対して限定的であることは意図されない。本明細書で検討されたように、本開示化合物および方法の特定の特徴は、操作性またはそれらが与える利点に必要でない様々な仕方で変更することができる。例えば、本化合物は、本化合物が用いられる特定の用途に応じて種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体ならびに標的化リガンドを組み込むことができる。当業者は、このような変更が添付の特許請求の範囲内に包含されることを理解する。
【実施例】
【０１２５】
（実施例）
【０１２６】
（実施例１）：蛍光誘導手術のための腫瘍標的近赤外色素の開発
【０１２７】
悪性疾患の完全な外科的切除は、がんに治療介入する唯一の信頼できる方法である。残念なことに、定量的腫瘍切除は、すべての悪性疾患を探し出し、それを健康組織と区別する外科医の能力によりしばしば制限される。蛍光誘導手術は、悪性病変の特定および除去において外科医を補助する手段として出現してきた。非標的蛍光色素が一部の腫瘍に受動的に蓄積することが示されている一方で、得られた腫瘍対バックグラウンド比は、しばしば不十分であり、悪性組織と健康組織の間の境界を明確にすることは困難であり得る。これらの問題を回避するために、本開示により、がん細胞で過剰発現されている受容体に結合し、これらの細胞に付着分子を選択的に送達する高親和性腫瘍標的化リガンドの開発が示される。
【０１２８】
本実施例において、２種の腫瘍特異的標的化リガンド（すなわち、葉酸受容体（ＦＲ）を標的にする葉酸）をＦＲ発現がんに特異的に近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素を送達するために使用し、それにより、悪性細胞のみを高度に蛍光性にさせる。本実施例は、調べたすべてのＦＲ標的色素が低いナノモル範囲で培養がん細胞に結合することを示す。さらに、転移性疾患を有する担腫瘍マウスへの静脈内注射後、これらの同じリガンド−ＮＩＲ色素コンジュゲートは、受容体発現腫瘍組織を蛍光性にさせ、健康組織からの最小汚染でそれらの容易な切除を可能にする。
【０１２９】
１Ａ：材料および方法
【０１３０】
本実施例で示した結果は、本明細書で記載する特定の材料および方法を使用して得た。当業者は、これらの方法、反応条件、および試験条件を変更し、なお本開示のＦＲ標的ＮＩＲ色素の効力を実証する結果をもたらすことができ得ることが企図される。
【０１３１】
ａ．葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの合成および特徴付け。リガンドおよびリンカーのすべてを文献に以前に報告されたとおりに合成した。精製後、葉酸標的化リガンドは、図１、図５、および図８に示すとおりの選択ＮＩＲ色素にコンジュゲートした。色素コンジュゲートは、逆相分取ＨＰＬＣ［Ｗａｔｅｒｓ、ｘＴｅｒｒａ  Ｃ１８  １０μｍ；１９×２５０ｍｍ；λ＝２８０ｎｍ；溶媒勾配：３０分間の実行で０〜３０％または８０％Ｂ、Ａ＝水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液（ｐＨ＝７．０）、Ｂ＝アセトニトリル（ＡＣＮ）］を使用して精製した。精製化合物は、ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）質量分光分析（Ｗａｔｅｒｓ、Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ；３．０×１５ｍｍ）を使用して分析した。
【０１３２】
ｂ．葉酸受容体発現細胞株の培養。Ｌ１２１０Ａ細胞をＤｒ．Ｍａｎｏｈａｒ  Ｒａｔｎａｍから入手し、ＫＢ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した葉酸塩欠乏１６４０ＲＰＭＩ培地で、細胞を培養した。すべての細胞株を、５％二酸化炭素、９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で培養した。
【０１３３】
ｃ．蛍光光度法による葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの結合親和性および特異性の分析。ＫＢ（５００μＬ中２００，０００細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、４８時間にわたって単層を形成させた。各ウェル中の使用済み培地を、１００倍過剰の競合リガンド；すなわち、葉酸の存在下または非存在下で増加する濃度の葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートを含有する新鮮培地（０．５ｍＬ）と置き換えた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を新鮮培地（３×０．５ｍＬ）ですすぎ、１％ＳＤＳ水溶液（０．６００ｍＬ）に溶解させ、石英キュベットに移し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を使用して各色素の励起および発光極大で蛍光発光強度を分析することにより、蛍光についてアッセイした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０３を使用して、添加した標的近赤外色素の濃度に対して蛍光発光単位をプロットすることによって、コンジュゲートの解離定数（Ｋｄ）を計算した。
【０１３４】
ｄ．転移のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル。動物手順のすべてを、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｉｔｔｅｅの承認を得て行った。ＦＲ発現腫瘍に関係する試験の場合、５〜６週齢の雌ＤＢＡ／２マウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、各試験の前および間に２週間葉酸欠乏食をさせた。腫瘍転移は、３０ゲージ注射針を使用して心臓の左心室に１×１０６個のＬ１２１０Ａ（ＦＲ発現）細胞に注射することによって誘発させた。腫瘍を４週間発症させ、その後、動物に、１００μｌの生理食塩水に溶解させた所望のＦＲ標的ＮＩＲ色素１０ｎｍｏｌを静脈内注射した。４時間後、動物をＣＯ２窒息により屠殺し、以下に記載されるとおりに画像化した。
【０１３５】
ｅ．転移性疾患を有するマウスの蛍光画像化。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  Ｉｖｉｓ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、動物画像化実験を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７およびＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０コンジュゲートを画像化するための設定：ランプレベル：高；励起：６０５；発光：Ｃｙ５．５；ｅｐｉ照射；ビニング：（Ｍ）４；ＦＯＶ＝７．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝４；捕捉時間＝１秒。ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０およびＩＲ８００ＣＷコンジュゲートを画像化するための設定：ランプレベル：高；励起：７４５；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：（Ｍ）４、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝４；捕捉時間＝１秒。
【０１３６】
ｆ．正常および疾患組織のＨ＆Ｅ染色。画像化後、臓器を解剖し、５ｍｌのホルマリンに保存し、Ｈ＆Ｅ染色のためのＰｕｒｄｕｅ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｐｈｅｎｏｔｙｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに供した。簡潔には、組織試料をＳａｋｕｒａ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＶＩＰ  ６を使用して加工し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｅｓｓｅ  ＭＥミクロトームを使用して切片にし、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｖａｒｉ−Ｓｔａｉｎ  ２４−２自動染色装置を使用してＨ＆Ｅ試薬で染色した。次いで、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０カメラを有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２研究用顕微鏡を使用して、Ｈ＆Ｅ染色スライドを画像化した。
【０１３７】
Ｂ．結果
【０１３８】
ａ．腫瘍標的ＮＩＲ色素の合成。選択的腫瘍標的化の場合、本発明者らは市販のＮＩＲ色素を葉酸塩にコンジュゲートした。大部分の葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートを高収率で合成し、その後、ＨＰＬＣを使用して均一になるまで精製した。
【０１３９】
ｂ．標的ＮＩＲ色素の結合親和性および特異性。リガンドに付着したカーゴは、リガンド結合をしばしば妨害し得るので、ＦＲ発現がん細胞への葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの結合親和性の試験に有益である。コンジュゲートすべての結合親和性は、いくらかの変動は付着色素に依存して、低いナノモル範囲にあることが見出され（図２）、連結カーゴのみがリガンド結合に軽度に影響することを示唆する。それらの受容体に対する葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの特異性も、過剰の葉酸を加えることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定された。図２に見られるように、１００倍モル過剰の葉酸との共インキュベーションにより、結合はほとんど定量的に阻害された。
【０１４０】
ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍標的ＮＩＲ色素の画像化。ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍標的色素の腫瘍特異性の評価の前に、組織を通して励起の際に選択色素の強度を比較することは有益であった。このために、それぞれ１００ｎＭの色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、ＩＲ８００ＣＷ）を含有する１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を、エッペンドルフチューブに入れ、これを、順に、新鮮なブタ筋肉の１ｃｍ厚切片の下に置き、Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  ＳｔａｔｉｏｎとＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｅｒの両方で同じ条件下に、得られた組織を画像化し、最適励起および発光波長のみを各装置で各色素について常に選択した。ＩＲ８００ＣＷは最も明るい蛍光信号を生じ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０は中間強度の信号を生じ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７およびＤｙＬｉｇｈｔ６８０は、最も弱い蛍光を示した。
【０１４１】
転移性腫瘍結節をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する上記葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの能力を比較するために、腫瘍転移のマウスモデルを開発し、これは、１０６個のＬ１２１０Ａ細胞（ＦＲ発現細胞）を心腔内注射し、続いて、マウスを４週間通常に飼育して、初期腫瘍を増殖させた。次いで、尾静脈注射を介して担腫瘍マウスを１０ｎｍｏｌの選択葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートで処置し、マウスを蛍光画像化のために４時間後に安楽死させた。図３に見られるように、腫瘍位置を容易に区別することができ、蛍光がん結節と隣接する健康組織との間の強いコントラストを生じた。場合によっては、蛍光腫瘍は、無傷マウスの画像で見ることさえできたが（図３、上部パネル）、しかしながら、腫瘍サイズ、位置、および深さの差のために、無傷動物でどのＮＩＲ色素が最良の画像を生成したかを明白に確立することは可能でなかった。
【０１４２】
最後に、ライブの手術環境を模倣するために、蛍光腫瘍組織の切除を段階的に行い、最大の塊を最初に除去し、より目立つ蛍光塊を取り除いた後でより小さい悪性位置を摘出した（図４）。有利には、原発性塊の除去は、手術の初期ラウンドの前に目に見えず、腫瘍特異的蛍光の補助なしでは見逃されてしまったように思われる二次性転移をしばしば明らかにした。これらの複数の切除のラウンドに続いて、目に見える蛍光のすべてを除去してしまった場合に、摘出組織を組織学的分析に供し、これらの研究により、すべての蛍光結節が事実悪性であること明らかにされた。有利には、残存組織の無作為サンプリングは、非蛍光領域が非悪性であることを実証し（図４ｄ）、腫瘍標的蛍光色素の補助によるがん性病変の明らかな定量的除去を示唆した。
【０１４３】
Ｃ．検討
【０１４４】
蛍光誘導手術の第２の手法は、がん細胞に貪欲に結合し、大部分の健康組織から定量的に消える腫瘍特異的標的化リガンドへのＮＩＲ色素のコンジュゲーションを伴う。この手法の利点としては、以下が挙げられる：ｉ）色素の腫瘍取り込みおよび正常組織クリアランスが静脈内注射の数分以内に起こり得ることによる、急速な腫瘍可視化率、ｉｉ）リガンド−色素コンジュゲートが受容体媒介エンドサイトーシスを介してがん細胞により一般に内在化されることから生じる、腫瘍コントラストの安定性、ｉｉｉ）標的受容体が、非存在であり、弱く発現されており、または正常組織で隔絶される場合にいつでも、蛍光が特異的であること、およびｉｖ）その受容体上でのリガンド−色素コンジュゲートの高い親和性保持のための、蛍光の悪性組織から非悪性組織への「ブリージング」の非存在（明瞭にがんを区別する非常に明確な境界を生じる）。この戦略の不利点は、リガンド標的色素が、排泄の間でさえも、常に蛍光性であり、色素の排泄が完了するまで腎腫瘍および膀胱腫瘍の画像化を妨げることに由来する。
【０１４５】
これらの研究からの驚くべき結果の一つは、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に検出され得る悪性病変のサイズがより小さいことである。したがって、点状転移性疾患を有するいくつかの部位のより詳細な分析は、５０μｍ程度に小さいがん細胞クラスターが、より高い分解能の光学部品の使用によって可視化され得ることを明らかにした。数個の細胞でさえもそれらのクラスターは、最終的にはがんの再発に至ることができるので、適当なカメラを設計することができるのを仮定して、最小の転移性病変さえも検出および除去する能力は、結果として、患者死亡率の減少をもたらすことができる。
【０１４６】
蛍光誘導手術の適用の大部分は、発見されているようであるが、その技術のいくつかの使用を既に想定することができる。第１に、腫瘍塊のより良好な可視化のために、より悪性の病変が、潜在的に特定および切除される。第２に、正常細胞の最大保存が不可欠である場合（すなわち、脳、乳房、膵臓、頭頸部など）、蛍光がまったく残存しなくなるまで蛍光病変を注意深く削ることは、健康組織のより効率的な保護を可能にする。第３に、がん患者の手術前の病期診断が、蛍光病変に対する近位リンパ節の腹腔鏡下尋問を介して最終的に可能であり、重大な転移が明らかに観察される場合には手術の必要性を未然に防ぎ、単一の腫瘍塊のみが検出される場合にはセンチネルリンパ節のその後の外科的サンプリングの要求をなくす。
【０１４７】
結論として、本実施例は、腫瘍標的ＮＩＲ色素が、悪性組織の可視化を改善し、より完全で正確な羅患組織の除去および患者転帰の改善をもたらすことによって、標準的な外科手順を形成し直す可能性を有する。
【０１４８】
（実施例２）：蛍光誘導がん手術のための高い標的化親和性および感受性を有する最適葉酸コンジュゲーテッド近赤外プローブの設計および合成
【０１４９】
腫瘍特定のための精微な用具によってさえも、多くの悪性結節は依然として検出を逃れ、疾患再発およびしばしば、死をもたらす。腫瘍特定の改善に対する必要性によって動機付けされて、悪性疾患の手術内可視化に対する２つの新手法が導入された。第１に、クエンチされた蛍光色素が担腫瘍動物に全身的に注入され、腫瘍特異的酵素、ｐＨ変化、または酸化還元電位の変化によるクエンチング部分の放出が引き出されて、悪性塊内の蛍光を選択的に活性化する。第２に、リガンドの受容体を過剰発現するがんに付着色素を蓄積させる腫瘍特異的標的化リガンドに、蛍光色素がコンジュゲートする。この後者の目的のために使用される腫瘍標的化リガンドの例としては、葉酸が挙げられ、これは、卵巣、腎臓、肺、子宮内膜、乳房、および結腸の葉酸受容体（ＦＲ）陽性がんに特異性を示す。有利には、葉酸標的蛍光色素（葉酸−フルオレセインまたはＥＣ１７）は、最近になってヒト卵巣がん患者で手術内的に試験された。この試験では、腫瘍標的蛍光色素の補助によって、それなしと比べて、約５×を超える悪性病変が除去され、切除された蛍光病変のすべてが、悪性であると病理学で確認された。
【０１５０】
残念なことに、上記臨床試験に関する主要な不足は、付着色素（フルオレセイン）が可視範囲で蛍光を発光するということ、すなわち、ここで、自己発光が強く、光が不十分にしか組織に侵入しないことに由来した。近赤外（ＮＩＲ）領域の光は、自己発光をあまり誘発せず、組織をさらにより効率的に透過するので、本発明者らは、ＮＩＲ色素が手術を誘導するために使用される場合、より完全な腫瘍切除が可能になることを仮定した。しかし、市販のＮＩＲフルオロフォアの数は限られており、大部分は各製造業者による特定の修飾を有するシアニン化学構造に基づいている（図６）。幸いにも、それらのフルオロフォア系列のそれぞれは、コンジュゲーション化学によって特異的ｉｎ  ｖｉｖｏ標的化のための目的のタンパク質またはリガンドに容易にコンジュゲートすることができる反応性フルオロフォアとして出てきている。大部分の市販の実験的ＮＩＲフルオロフォアは、Ｎ末端アミンでのフルオロフォアコンジュゲーションに使用され得るＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとして入手可能である。画像誘導がん手術のための最良の葉酸コンジュゲーテッドＮＩＲプローブを評価および特定するために、本発明者らは、光安定性ＮＨＳエステルＮＩＲ色素（以下の化合物ａ〜ｃ）をＮ末端アミン官能基化葉酸塩（Ｆｏｌ−ＥＤＡおよびＦｏｌ−Ｌｙｓ）とコンジュゲートさせ、副生成物の大幅な除去（１ｅ〜１ｇおよび２ｅ〜２ｇ）とともに、予期ＮＩＲプローブを生成した（１ａ〜１ｃおよび２ａ〜２ｃ）。収率増大を得るために、より安定なＮＩＲ色素ＬＳ２８８  ＮＨＳエステル（ｄ）を利用して、良好な収率で葉酸コンジュゲーテッドＮＩＲ色素１ｄおよび２ｄを単離した。合成された葉酸−ＮＩＲプローブ１ａ〜１ｄおよび２ａ〜２ｄの光学特性および光安定性を特徴付けした。
【化２６】
2017149776.tif 000058
【０１５１】
同じ濃度の葉酸−ＮＩＲプローブ１ａ〜１ｄおよび２ａ〜２ｄ（５００Ｌ；ＰＢＳ中５Ｍ）のすべての蛍光励起および発光スペクトルは、ほとんど同様の強度を示した。プローブの細胞毒性および葉酸受容体親和性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞実験により調査し、腫瘍標的化能力は、ＦＲ＋ＫＢ腫瘍異種移植片を有する５群のヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで調査し、また生体内分布は、Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ近赤外蛍光画像化システムを使用することによって調べた。残念なことに、生体内分布は、図６の化合物１ｄおよび図７の化合物２ｄの合成的に好都合な高収率の葉酸−ＮＩＲプローブは、他の図６の化合物１ａ〜１ｃおよび図７の化合物２ａ〜２ｃの葉酸−ＮＩＲプローブと比較して、腫瘍上の蛍光強度の２倍少ない輝度を有することを示した。
【化２７】
2017149776.tif 000059
【０１５２】
構造を考慮すると、有利な変化は、ＮＩＲ色素ａ〜ｃのフェノール部分およびＮＩＲ色素ｄのフェニル部分（またそれらの対応する最終的な葉酸−ＮＩＲプローブとともに）による中心のビニル性シクロヘキセン（cyclohexe）炭素（Ｃ（ｓｐ２））での置換（ＳＮ
Ｒ１）であった。これらの上記理由により、本発明者らは、生理学的ｐＨにおいて光安定性、選択性、感受性および高い蛍光強度を有する新たな修飾された葉酸−ＮＩＲプローブを開発するように動機付けされた。
【０１５３】
問題の解決のために、全般的な戦略は、市販の前駆体ＮＩＲフルオロフォアが、溶解性のための４個のＳＯ３Ｈ基および光安定性のためにフルオロフォアの中央の剛直なシクロヘキセニル環、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍画像化のための高い感受性および明るい蛍光に有利なフェノール性酸素と結合するビニル性シクロヘキセンクロリド（Ｃ（ｓｐ２）Ｃｌ）を含有すべきなので、Ｓ０４５６を選択することであった。さらに、受容体に対するリガンドの結合親和性および選択性を改善するために、葉酸結合ポケットを有する葉酸受容体リガンドの構造的要件を調査した。葉酸受容体の結晶構造は、確立されておらず、遠位グルタミル残基を欠く葉酸の断片であるプテロイン酸は、高親和性葉酸受容体に結合するために十分に良好であるという議論がある。グルタミル残基の−カルボン酸が葉酸受容体との結合に有利であるかどうか決定するために、本発明者らは、種々のアミノ酸および非アミノ酸プテロイルコンジュゲートならびにそのＮＩＲプローブを合成した。次ぎに、本発明者らは、葉酸受容体陽性がん細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性および葉酸受容体陽性ＫＢ腫瘍によるｉｎ  ｖｉｖｏ画像化について、これらの新たな修飾された葉酸−ＮＩＲプローブのすべてを比較した。興味深いことに、本発明者らは、結合親和性において大きな変化を認めなかったが、腫瘍特異性および蛍光強度には顕著な変化があった。この試験は、葉酸−ＮＩＲコンジュゲートのすべてと一致しており、グルタミル残基の−カルボン酸が、特異的腫瘍標的化、取り込みに有利であり、ＮＩＲ色素の中央のビニル性シクロヘキセン炭素（Ｃ（ｓｐ２））上でのフェノール性酸素の置換が、腫瘍組織の高い蛍光強度に有利であることを示唆した。したがって、画像誘導がん手術のための最適な新たな修飾された葉酸−ＮＩＲ蛍光プローブを得るためのより簡単でより直接的な戦略を開発することが早急に必要とされている。本発明者らは、臨床応用のための、高い蛍光強度を有する、感受性、光安定性および腫瘍選択性の新たな修飾された葉酸−ＮＩＲ蛍光プローブ（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６；図６）を設計および合成した。
【０１５４】
本実施例において、本発明者らは、蛍光強度および光安定性を強化した、葉酸受容体標的近赤外蛍光プローブ（プテロイル＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６）を設計した。明るい蛍光強度を有する葉酸受容体過剰発現腫瘍に対する高い標的化能力を実証した。この新たなプテロイル＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６コンジュゲーションは、マウス対象におけるプローブの動力学を改善し、ＦＲ過剰発現腫瘍に対する標的化能および感受性を増強した。この実施例の結果により、この新たなＮＩＲプローブが、早期腫瘍の診断に大きな可能性を有することが実証される。
【０１５５】
（実施例３）
【０１５６】
ＯＴＬ−０００１（ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８）、ＯＴＬ−０００２（ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００）、ＯＴＬ−０００３（ＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００）、およびＯＴＬ−０００４（ＦＡ−ＥＤＡ−Ｋｏｄａｋ２）の比較分析
【０１５７】
材料および方法
【０１５８】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を使用して単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１５９】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ（ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ，ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、試験を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を収容した。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。試験の期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を収容した。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０１６０】
全身画像化：
【０１６１】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを使用して２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００から５００ｍｍ３の間に達すると直ちに、動物（２匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品（ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８、ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００、ＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００およびＦＡ−ＥＤＡ−Ｋｏｄａｋ２）を静脈内注射した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ，ＭＡ）を使用して、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：８３０ｎｍ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０１６２】
組織生体内分布
【０１６３】
全身画像化に続いて、動物を解剖し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を使用して蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：８３０ｎｍ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０１６４】
結果
【０１６５】
全身画像化：図７ａに見られるように、ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８、ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００、およびＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。しかしながら、ＦＡ−ＥＤＡ−Ｋｏｄａｋ２は、腫瘍に蓄積しなかった。さらに、直接の比較は、ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００注射マウスの腫瘍蛍光強度が、他の葉酸コンジュゲーテッド近ＩＲ色素で処置したマウスよりも明るい（蛍光強度がより高い）ことを実証した（図７ｂ）。
【０１６６】
結論
【０１６７】
最良から最悪に列挙したコンジュゲートの輝度および特異性は以下の通りである：ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００、ＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００、ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８、ＦＡ−ＥＤＡ−Ｋｏｄａｋ２。ＩＲ８００およびＺＷ８００を含有するコンジュゲートは、最大の腫瘍蓄積蛍光を示した一方で、Ｋｏｄａｋを含有するコンジュゲートは、腫瘍に対して非常に低い特異性を示した。Ｋｏｄａｋコンジュゲートで見られる低い蛍光は、色素が８００ｎｍで励起するということによるためであり得る。ＩＶＩＳ画像システムは、８００ｎｍで励起させるフィルターを有しておらず、したがって、腫瘍における低い蛍光は、不十分な励起波長の使用のためであり得る。
【０１６８】
（実施例４）：葉酸受容体−標的近赤外色素の全身画像化および生体内分布
【０１６９】
材料および方法：
【０１７０】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を使用して単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１７１】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ，ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、試験を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を収容した。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。試験の期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を収容した。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０１７２】
全身画像化：
【０１７３】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを使用して２日毎に垂直方向に腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００から５００ｍｍ３の間に達すると直ちに、動物（２〜３匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品を静脈内注射した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ，ＭＡ）を使用して、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０１７４】
組織生体内分布：
【０１７５】
全身画像化に続いて、動物を解剖し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を使用して蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０１７６】
結果
【０１７７】
全身画像化：
【０１７８】
図１に見られるように、ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８、ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００、およびＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。さらに、直接の比較は、ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００注射マウスの腫瘍蛍光強度が、他の葉酸コンジュゲーテッド近ＩＲ色素で処置したマウスよりも明るい（より高い）ことを実証した（図２）。
【０１７９】
組織生体内分布：
【０１８０】
組織生体内分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出し、ＩＶＩＳ撮像装置を使用してそれらを画像化することによって、同じ条件下で動物に行った。図２に見られるように、最大の蛍光強度は、ＦＲ陽性腫瘍および腎臓で認められた。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは、３０分未満の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０１８１】
結論：
【０１８２】
最良から最悪に列挙したコンジュゲートの輝度および特異性は以下の通りである：ＦＡ−ＥＤＡ−ＩＲ８００、ＦＡ−ＥＤＡ−ＺＷ８００、ＦＡ−ＥＤＡ−ＬＳ２８８、ＦＡ−ＥＤＡ−Ｋｏｄａｋ２。ＩＲ８００およびＺＷ８００を含有するコンジュゲートは、最大の腫瘍蓄積蛍光を示した一方で、Ｋｏｄａｋを含有するコンジュゲートは、その他と比較して、腫瘍に対して非常に低い特異性および低い蛍光を示した。
【０１８３】
Ａ．材料および方法
【０１８４】
本実施例で示した結果は、本明細書で記載する特定の材料および方法を使用して得た。当業者は、これらの方法、反応条件、および試験条件を変更し、なお本開示のＦＲ標的ＮＩＲ色素の効力を実証する結果をもたらすことができ得ることが企図される。
【０１８５】
ａ．葉酸−ＮＩＲコンジュゲートの合成および特徴付け
葉酸ＮＩＲコンジュゲートの合成および特徴付けは、実質的に実施例１に記載したとおりに行った。
【０１８６】
ｂ．ＦＲに対する葉酸−ＮＩＲコンジュゲート（４）の相対結合親和性。ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、２４時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸の存在下１０ｎＭ［３Ｈ]−葉酸塩で置き換えた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（２×０．５ｍＬ）および１Ｍトリクロロ酢酸（１×０．５ｍＬ）ですすぎ、未結合放射性物質のすべてを除去した。ＰＢＳ（０．５ｍＬ）中１％ドデシル硫酸ナトリウムを添加後、細胞をＥｃｏｌｕｍｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を使用して、細胞結合放射能を試験品の濃度に対してプロットして、相対結合親和性を計算した。
【０１８７】
ｃ．皮下腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル。５週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、それらの肩上にＫＢ細胞（ＲＰＭＩ培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下に接種した。キャリパを使用して２日毎に２つの垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ）最長軸であり、Ｗ）Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００から５００ｍｍ３の間に達すると直ちに、動物を、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中葉酸受容体標的ＮＩＲ色素コンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）で処置した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により屠殺し、以下に記載するとおりに画像化した。
【０１８８】
ｄ．ＦＲ＋ＫＢ腫瘍を有するマウスの蛍光画像化。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを有するＣａｌｉｐｅｒ  Ｉｖｉｓ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、動物画像化実験を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７およびＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０コンジュゲートを画像化するための設定：ランプレベル：高；励起：６０５；発光：Ｃｙ５．５；ｅｐｉ照射；ビニング：（Ｍ）４；ＦＯＶ＝７．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝４；捕捉時間＝１秒。Ｄｙｌｉｇｈｔ  ７５０およびＩＲ８００ＣＷコンジュゲートを画像化するための設定：ランプレベル：高；励起：７４５；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：（Ｍ）４、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝４；捕捉時間＝１秒。
【０１８９】
Ｂ．結果
【０１９０】
ａ．腫瘍標的ＮＩＲ色素の合成。選択的腫瘍標的化のために、本発明者らは、ＮＨＳ活性化色素使用するアミド結合形成、またはＮＩＲ色素のクロロ誘導体を使用するＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成反応を介して、市販のＮＩＲ色素を、葉酸塩またはプテロエートのいずれかにコンジュゲートさせた。Ｐｔｅ−アミノ酸−ＮＩＲ、とりわけチロシンは、ＨＰＬＣまたは特別の精製技術（沈殿による）なしに非常に高い純度（９８％超）で、非常に高い収率（９８％超）で合成された。ここで言及するアミノ酸はチロシンおよびその類似体、シスチン、セリン、リシンなどである。本発明者らが使用したＮＩＲ色素は、Ｓ０４５６、Ｋｏｄａｋ、Ｓ０１２１、およびＳ２０７６（これらに限定されない）である。しかしながら、葉酸−ＩＲ８００ＣＷ（３）および葉酸−ＺＷ８００（５）などの、葉酸塩のエーテル架橋ＮＩＲコンジュゲートの合成は、ＨＰＬＣなどの特別の精製技術を必要とする顕著な副生成物の生成をもたらし（図１０Ｂ）、それにより、より高い生産コストおよび前臨床から臨床への時間の長さの増加をもたらした。これは、外科腫瘍学の進歩だけでなく、新しい治療剤を待っている患者にとっても望ましい結果をもたらさない。さらに、より高い生産コストは、薬物の費用の増加によって患者およびそれらの保険会社に間接的に影響を与え得る。重要なことに、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６反応は、望ましくない副生成物を何ら生成せず、反応は、高収率および高純度で１５分以内に完了した（図１０Ａ）。
【０１９１】
ｂ．葉酸受容体標的ＮＩＲ色素の結合親和性および特異性。最初に、葉酸受容体を過剰発現したがん（ＫＢ）細胞を使用して、葉酸−およびプテロエート−ＮＩＲコンジュゲートの親和性および特異性を評価した。トリチウム標識した葉酸（放射性標識葉酸）による競合研究は、葉酸−またはプテロエート−ＮＩＲコンジュゲートが、高い親和性（低いナノモル値）でだけでなく、高い特異性でも葉酸受容体に結合することを実証した（図６）。トリチウム標識した葉酸（放射性標識葉酸）による競合研究は、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６が、高い親和性および特異性で葉酸受容体に結合することを実証し、フェノール性酸素を介したバルキーＳ０４５６部分のコンジュゲーションが、Ｐｔｅ−Ｔｙｒの葉酸（flote）受容体への結合を損なわなかったことを示唆する。
【０１９２】
ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍標的ＮＩＲ色素の画像化。上記葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートが腫瘍を検出する能力を比較するために、異種移植片モデルを開発し、これは、ＫＢ細胞（ＦＲ発現細胞）を皮下に移植すること、続いて、マウスを４週間通常に飼育して、初期腫瘍を増殖させた。次いで、尾静脈注射を介して担腫瘍マウスを１０ｎｍｏｌの選択葉酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートで処置し、マウスを蛍光画像化のために２時間後に安楽死させた。図７Ａに見られるように、腫瘍位置を容易に区別することができ、蛍光がん結節と隣接する健康組織との間の強いコントラストを生じた。最も重要なことに、無傷蛍光腫瘍は、腫瘍の切開または収集なしに無傷マウスの画像でも見られた（図７Ａ）。第二世代の葉酸受容体標的ＮＩＲ作用物質についての直接の全身蛍光画像化の試験は、葉酸−ＩＲ８００ＣＷ（３）が、他のすべての色素に対して優位性（蛍光輝度の点で）があった（図７Ａ、第２行）。しかしながら、残念なことに、葉酸−ＩＲ８００ＣＷ（３）は、合成中に安定でなく、６０％を超える望ましくない副生成物の形成をもたらした。前述のとおりに、これは、特別の精製技術を探し出すための原因となり、より高い生産コスト、臨床説明のためのより長い待ち時間への道筋を示し、外科医および患者は、その薬物を入手できない。
【０１９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ特異性を確立するために、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を、葉酸受容体陽性腫瘍異種移植片を担うマウスに、それらの肩上に投与した。ｉｎ  ｖｉｖｏ全身画像化研究は、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６が、主に葉酸受容体陽性腫瘍に蓄積しており、蛍光が他の組織ではまったく認められなかったことを実証した（図１１Ａ）。ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織生体内分布研究は、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６が、葉酸受容体陽性腫瘍に主に蓄積し、腎臓を除いて他の臓器で実質的な蛍光活性はなかった（図１１Ｂ、および図１２Ｂ）。腎臓でのかなりの取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルのＦＲを発現することが公知であったので、予期された。Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６と、葉酸−ＩＲ８００ＣＷ、葉酸−ＬＳ２８８、および葉酸−ＺＷ８００との直接の比較試験は、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６が、葉酸−ＮＩＲコンジュゲートのすべてに対して蛍光輝度の点で優位性があることを実証した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。さらに、薄片化（解剖した）腫瘍の画像化された蛍光は、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６および葉酸−ＮＩＲコンジュゲートのすべての両方ともが、腫瘍内に埋められていてさえも、すべての腫瘍細胞で均一に蓄積していることを示唆した（図１２Ｃ）。
【０１９４】
（実施例５）葉酸−およびプテロイル−ＮＩＲ色素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬品作用研究
【０１９５】
材料および方法：
【０１９６】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１９７】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭ［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０１９８】
結果：
【０１９９】
化合物ＯＴＬ−００１〜ＯＴＬ−００１０および葉酸に対して、研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ３０．７ｎＭ、１９．３Ｎｍ、２３．３ｎＭ、３０．６ｎＭ、５０．１ｎＭ、２２．８ｎＭ、３０．５ｎＭ、３９．７ｎＭ、４９．６ｎＭ、３０．５ｎＭ、および８ｎＭであった。ＯＴＬ−０００１〜ＯＴＬ−００１０および葉酸に対して計算した相対結合親和性は、それぞれ０．２７０、０．４３０、０．３５６、０．２７１、０．１６６、０．３６４、０．２７２、０．２０９、０．１６７、０．２７２および１であった。すべての試験品は［３Ｈ］−葉酸に定量的に匹敵した。相対結合親和性とは、細胞上の葉酸受容体に結合している［３Ｈ］−葉酸の５０％を置き換えるのに必要とされる化合物のモル比と定義される；葉酸の相対親和性＝１；相対親和性＜１は、葉酸受容体に対してより弱い親和性を示す；相対親和性＞１は、葉酸受容体に対してより強い結合を示す。
【０２００】
結論：
【０２０１】
すべての化合物は葉酸受容体に対して親和性を有し、それらは葉酸の結合親和性とほとんど十分同程度の親和性を有する。すべての化合物は［３Ｈ］−葉酸に十分匹敵し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一の結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２０２】
（実施例６）：ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬品作用研究
【０２０３】
２種のリガンド−ＮＩＲコンジュゲートを開発し、ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９と命名した。ＯＴＬ−００３８化合物は、リガンドであるプテロイルがＬ−チロシンにコンジュゲートしており、これがＳ０４５６に連結しているＰＴＥ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を指す。ＯＴＬ−００３９はＯＴＬ−００３８のＤ−異性体である。葉酸受容体に対する両化合物の結合親和性および結合特異性を、葉酸受容体に対するコンジュゲートリガンドである葉酸と比較して調べた。
【０２０４】
Ａ．材料および方法
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２０５】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）のＯＴＬ−００３９（Ｄ−異性体）およびＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）、または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭ［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０２０６】
Ｂ．結果
ＯＴＬ−００３９、ＯＴＬ−００３８、または葉酸に対して、研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ８１．８ｎＭ、１０．４ｎＭ、および７．４ｎＭであった。ＯＴＬ−００３９、ＯＴＬ−００３８、および葉酸に対して計算した相対結合親和性はそれぞれ０．０９、０．７１、および１であった。すべての３種の試験品は、［３Ｈ］−葉酸と定量的に匹敵した。
【０２０７】
相対結合親和性とは、細胞上の葉酸受容体に結合している［３Ｈ］−葉酸の５０％を置き換えるのに必要とされる化合物のモル比と定義される；葉酸の相対親和性＝１；相対親和性＜１は、葉酸受容体に対してより弱い親和性を示す；相対親和性＞１は葉酸受容体に対してより強い結合を示す。
【０２０８】
Ｃ．結論
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体に対して親和性を有し、これは、葉酸の結合親和性と十分同じ程度の親和性を有する（１０．４ｎＭ対７．４ｎＭ）。他方では、ＯＴＬ−００３９は、葉酸およびＯＴＬ−００３８と比較した場合、葉酸受容体に対してより低い親和性を有する。ＯＴＬ−００３８は、［３Ｈ］−葉酸に十分匹敵し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一のＯＴＬ−００３８結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２０９】
（実施例７）：葉酸受容体−陽性腫瘍異種移植片を担うマウスにおけるＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）の全身画像化および生体分布
【０２１０】
ＯＴＬ−００３８（ＰＴＥ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）およびＯＴＬ−００３９（ＰＴＥ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）の葉酸受容体陽性腫瘍取り込みを調べることによって、腫瘍上の標的受容体により両化合物がいかにうまく取り込まれるか判定した。化合物の組織生体分布もまた調べた。化合物の静脈内投与後、マウスにおいて両特性を２時間半調べた。
【０２１１】
Ａ．材料および方法
細胞培養および動物の準備
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２１２】
雌の無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２１３】
全身画像化
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容量を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（５匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８またはＯＴＬ−００３９を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２１４】
組織生体分布
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２１５】
Ｂ．結果
全身画像化
図１４に見られるように、ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。
【０２１６】
組織生体分布
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出して、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、全身画像化を施した同じ動物に対して行った。図１５に見られるように，最大の蛍光強度が、ＦＲ陽性腫瘍で認められ、腎臓を除く他の組織には蓄積されていなかった。ＯＴＬ−００３８の腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０２１７】
Ｃ．結論
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体陽腫瘍異種移植および腎臓に主に蓄積した。他のすべての正常な組織は、最小レベルまたは取り込みなしを示し、結果として優れた腫瘍と正常な組織との蛍光比をもたらした。
【０２１８】
（実施例８）：ＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）と、葉酸由来の近ＩＲ薬剤との比較分析
【０２１９】
ＯＴＬ−００３８の全身画像化および組織生体分布を、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、および葉酸−ＺＷ８００と比較した。それらの化合物を、葉酸および市販の近赤外線色素、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、およびＺＷ８００とコンジュゲートした。
【０２２０】
Ａ．材料および方法
細胞培地およびマウスの準備
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２２１】
雌の無胸腺ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２２２】
全身画像化
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（２匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品（ＯＴＬ−００３８、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、葉酸−ＺＷ８００）を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２２３】
組織生体分布
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２２４】
Ｂ．結果
全身画像化
図１４に見られるように、ＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、葉酸−ＺＷ８００は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。さらに、直接の比較は、ＯＴＬ−００３８注射マウスの腫瘍蛍光強度が、他の葉酸コンジュゲーテッド近ＩＲ色素で処置したマウスよりも明るい（蛍光強度がより高い）ことを実証した（図１５）。
【０２２５】
組織生体分布
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出して、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、全身画像化を施した同じ動物に対して行った。図１６に見られるように、最大の蛍光強度は、ＦＲ−陽性腫瘍および腎臓において認められた。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０２２６】
Ｃ．結論
腫瘍蓄積蛍光強度において、ＯＴＬ−００３８は、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、および葉酸−ＺＷ８００と比べて有利な態様を有する。ＯＴＬ−００３８は、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、およびＺＷ８００などの他の市販の近ＩＲ色素よりも明るくなり得る。
【０２２７】
（実施例９）：葉酸受容体陽腫瘍異種移植を担うマウスにおけるＯＴＬ−００３８の用量増加研究
【０２２８】
腫瘍とバックグラウンドとの最良の比を得るために投与することができるＯＴＬ−００３８の最低用量を決定するために用量範囲実験を行った。加えて、腫瘍（標的）と非標的組織との最良の比を得るために投与することができるＯＴＬ−００３８の最高用量を決定するために実験を行った。
【０２２９】
Ａ．材料および方法
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２３０】
無胸腺雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２３１】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（３匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中、増加する濃度のＯＴＬ−００３８（０．３ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、３ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、３０ｎｍｏｌ、６０ｎｍｏｌ、９０ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、組織生体分布研究を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２３２】
Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、１ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８を注入後２．５時間で全身画像（無傷腫瘍）を撮った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２３３】
Ｂ．結果
表１および図１４に示されているように、０．３ｎｍｏｌ用量を除くすべての用量が、葉酸受容体陽性腫瘍においてより高い腫瘍の取り込みを有した。他方では、より高い腎臓取り込みも用量範囲０．３〜１０ｎｍｏｌに対して認められ、より低い腎臓取り込み（腫瘍取り込みと比べて）が用量範囲３０〜９０ｎｍｏｌに対して認められた。さらに、より高い非特異的取り込みが６０および９０ｎｍｏｌ用量において認められた。
【０２３４】
Ｃ．結論
０．３ｎｍｏｌ用量において認められた、葉酸受容体陽性腫瘍におけるより低い取り込み（弱い蛍光強度）は、腫瘍細胞上の葉酸受容体の不完全な飽和に起因し得る。他方では、腎臓において認められたより高い蛍光強度は、腎臓を通ったプローブの排除に起因し得る。さらに、腎臓の近位尿細管の頂端膜は、高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知である。１．０〜３０．０ｎｍｏｌの間の用量範囲は、腫瘍取り込みおよび腫瘍と正常な組織との優れた比（信号対バックグラウンド比）を示していた。より高い腎臓取り込みは、腎臓を通ったプローブの排除（３０ｎｍｏｌ用量を除く）および腎臓上での葉酸受容体の発現に起因し得る。用量レベル６０．０ｎｍｏｌおよびそれ超は、より高い非特異的取り込みを示している。しかし、それらは高い腫瘍取り込みおよびより少ない腎臓取り込み（３０ｎｍｏｌ用量を含む）を依然として有する。より少ない腎臓取り込みは、肝臓および腸を通ったプローブの代替の排除に起因し得る。したがって、ＯＴＬ−００３８は、このより高い濃度で凝集を形成し得る。１．０ｎｍｏｌが、腫瘍の画像化に対して非侵襲性態様を維持しながら（図２２）、腫瘍とバックグラウンドとの良好な比を得るために投与される最も低い用量であり、３０ｎｍｏｌが、腫瘍とバックグラウンドとの最も良い比を得るために投与される最大の用量であると結論づけることができる。
【０２３５】
（実施例１０）：葉酸受容体陰性腫瘍異種移植片を担うマウスにおけるＯＴＬ−００３８の全身画像化および生体分布
【０２３６】
ＯＴＬ−００３８のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異性を決定するために、葉酸受容体に対して全身画像化および組織生体分布を行った。実験では、葉酸受容体に対して陰性である腫瘍を抱えるマウスを使用して、葉酸受容体に対するＯＴＬ−０３８化合物の特異性を特徴づけた。
【０２３７】
Ａ．材料および方法
細胞培養物およびマウスの準備
Ａ５４９細胞（肺胞の基底上皮癌細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２３８】
無胸腺雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（６週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、正常な食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で維持した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２３９】
全身画像化
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＡ５４９細胞（ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（６匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により屠殺した。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を実施した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２４０】
組織生体分布
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２４１】
Ｂ．結果
全身画像化
図１４に見られるように、ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体陰性腫瘍において蓄積せず、腎臓を除く他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。
侵襲性腫瘍および腎臓取り込み
【０２４２】
腫瘍および腎臓蓄積の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出して、ＩＶＩＳ撮像装置を用いて画像化することによって全身画像化を施した同じ動物に対して行った。発明者らが予期したように、葉酸受容体陰性腫瘍中に蛍光は認められず、高い腎臓取り込みが存在した。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルのＦＲを発現することが公知であったので、予想された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０２４３】
Ｃ．結論
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体に対して極めて特異的である。
【０２４４】
（実施例１１）：健常なヌードマウスにおける毒性ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）の評価
【０２４５】
健常なマウスにおいて、ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を特徴づけた。マウスに各化合物の１ｎｍｏｌまたは１０００×の臨床用量を投与して、化合物の毒性を調べた。
【０２４６】
Ａ．材料および方法
無胸腺雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（６週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、正常な食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で維持した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２４７】
７週齢の健常な雌ヌードマウス（５マウス匹／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）に溶解した、１μｍｏｌの、調製したばかりのＯＴＬ−００３８またはＯＴＬ−００３９を、ゼロ日目に尾静脈注射を介して投与した。体重および臨床的観察を、投薬前およびその後ゼロ日目から７日目まで毎日モニターした。２日間にわたり連続して２０％またはそれ超の体重減のあった動物はすべて安楽死させた。ただし、これは必須ではなかった。７日目に動物をＣＯ２窒息により安楽死させ、選択した組織（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚）を４％ホルマリンを含有するバイアルに採取した。ホルマリン固定した組織を１０μｍ厚の切片へと切開し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（商標）スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）上に固定した。スライドをＨ＆Ｅで染色後、組織の免疫組織化学法（ＩＨＣ）分析を行って、ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９の毒性を決定した。
【０２４８】
Ｂ．結果
ＯＴＬ−００３８またはＯＴＬ−００３９の注入直後、動物の皮膚は緑色になった。しかし、この緑色は２４時間以内に消えた。試験品の投与後動物は活動的であり、研究を通して正常に挙動した。図１４に見られるように、研究を通して体重は安定したままであった。ＩＨＣデータに従い（図１５）、いかなる組織にも病変は識別されなかった。
【０２４９】
Ｃ．結論
１μｍｏｌ（１０００×臨床的用量）のＯＴＬ−００３８またはＯＴＬ−００３９は、動物に対して毒性を持たず、これは、ＯＴＬ−００３８（１ｎｍｏｌ）およびＯＴＬ−００３９（１ｎｍｏｌ）が、病院でヒトに対して毒性を持たないことを示唆している。
【０２５０】
（実施例１２）：
【０２５１】
Ｐｔｅ−チロシン類似体−Ｓ０４５６（修飾ＯＴＬ−００３８類似体）試験品：ＯＴＬ−００４０（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−１３Ｃ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４２（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−２Ｈ（重水素化）−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４３［Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−（ＯＢｎ）−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４４［Ｐｔｅ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４５［Ｐｔｅ−ＮＨＮＨ−Ｔｙｒ−（ＯＡｃ）−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４６（Ｐｔｅ−ホモ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４７（Ｐｔｅ−β−ホモ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４９（Ｐｔｅ−チラミン−Ｓ０４５６）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学的研究
【０２５２】
材料および方法：ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２５３】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭの［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０２５４】
結果：
【０２５５】
研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、化合物ＯＴＬ−００４０、ＯＴＬ−００４２−ＯＴＬ−００４７、ＯＴＬ−００４９および葉酸に対してそれぞれ、２７．６ｎＭ、６１．７ｎＭ、１４．８ｎＭ、１３．８ｎＭ、１２．８ｎＭ、３０．２および８ｎＭであった。ＯＴＬ−００４０、ＯＴＬ−００４２−ＯＴＬ−００４７、ＯＴＬ−００４９および葉酸に対して計算した相対結合親和性は、それぞれ０．２９０、０．１３０、０．１７７、０．５８０、０．６２５、０．２６５および１であった。すべての試験品は、［３Ｈ］−葉酸に定量的に匹敵した。
【０２５６】
結論：
【０２５７】
ＯＴＬ−００４４およびＯＴＬ−００４５を除くすべての化合物は、葉酸受容体に対して親和性を有し、それらは葉酸の結合親和性とほとんど十分同程度の親和性を有する。すべての化合物は、［３Ｈ］−葉酸に十分匹敵し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一の結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２５８】
（実施例１３）：
【０２５９】
Ｐｔｅ−チロシン類似体−Ｓ０４５６の全身画像化および生体分布
【０２６０】
試験品：ＯＴＬ−００４３［Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−（ＯＢｎ）−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４４［Ｐｔｅ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４５［Ｐｔｅ−ＮＨＮＨ−Ｔｙｒ−（ＯＡｃ）−Ｓ０４５６］、ＯＴＬ−００４６（Ｐｔｅ−ｈｏｍｏ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４７（Ｐｔｅ−β−ホモ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００４９（Ｐｔｅ−チラミン−Ｓ０４５６）
【０２６１】
材料および方法：
【０２６２】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２６３】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ（ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０２６４】
全身画像化：
【０２６５】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（２〜３匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品を静脈内注射した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った実施した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２６６】
組織生体分布：
【０２６７】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、および腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０２６８】
結果：
【０２６９】
全身画像化：
【０２７０】
図２８Ａに見られるように、ＯＴＬ−００４４、ＯＴＬ−００４６、およびＯＴＬ−００４７は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。
【０２７１】
組織生体分布：
【０２７２】
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出し、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、同じ条件下で動物に行った。図２８Ｂに見られるように、最大の蛍光強度は、ＦＲ−陽性腫瘍および腎臓において認められた。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０２７３】
結論：
【０２７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏの生体分布は、すべての化合物が腫瘍および腎臓内に蓄積されたことを実証した一方、全身分布は、ＯＴＬ−００４４、ＯＴＬ−００４６、およびＯＴＬ−００４７が腫瘍内に主に蓄積したことを実証し、これは、特異性および親和性についてのアルファカルボン酸の必要条件を示している。
【０２７５】
（実施例１４）：ＯＴＬ−００５０（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０１２２）、ＯＴＬ−００５１（プテロイル−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬品作用研究
【０２７６】
材料および方法：
【０２７７】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２７８】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭの［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０２７９】
結果：
【０２８０】
化合物ＯＴＬ−０５０−ＯＴＬ−００５２および葉酸に対して、研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ２９．３ｎＭ、１３．８ｎＭ、１５．３ｎＭ、および７．４ｎＭであった。ＯＴＬ−００５０−ＯＴＬ−００５２および葉酸に対して計算した相対結合親和性は、それぞれ０．２５、０．５４、０．４８および１であった。すべての試験品は、［３Ｈ］−葉酸に定量的に匹敵した。
【０２８１】
結論：
【０２８２】
ＯＴＬ−００５０、ＯＴＬ−００５１、およびＯＴＬ−００５２はそれぞれ葉酸受容体に対して親和性を有し、化合物は葉酸の結合親和性とほとんど十分同程度の親和性を有する。すべての化合物は、［３Ｈ］−葉酸に十分匹敵し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一の結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２８３】
（実施例１５）：プテロイル−非アミノ酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬品作用研究
【０２８４】
材料および方法：
【０２８５】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２８６】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭの［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０２８７】
結果：
【０２８８】
化合物ＯＴＬ−００５６（プテロイル−ＤＡＰ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５７（プテロイル−ＢＡＭＢ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５８（プテロイル−ＡＭＨＭＢ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５９（プテロイル−ＤＨＤＡＤＳ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００６０（プテロイル−ＤＡＤＳ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００６１（プテロイル−４ＡＰＥＰ−Ｓ０４５６）および葉酸に対して研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ９５．２ｎＭ、１２１．３ｎＭ、９０．２ｎＭ、２５０．５ｎＭ、２２５．８ｎＭ、４１．７ｎＭであった。ＯＴＬ−００５６〜ＯＴＬ−００６１および葉酸に対して計算した相対結合親和性は、それぞれ０．０７８、０．０６１、０．０８２、０．０２９、０．０３３、０．１７１および１であった。すべての試験品は［３Ｈ］−葉酸に定量的に匹敵した。
【０２８９】
結論：
【０２９０】
化合物ＯＴＬ−００５６−ＯＴＬ−００６１はそれぞれ葉酸受容体に対して親和性を有し、それらは、葉酸の結合親和性とほとんど十分同程度の親和性を有する。すべての化合物は、［３Ｈ］−葉酸に十分匹敵し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一の結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２９１】
（実施例１６）：
【０２９２】
プテロイル−非アミノ酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学的研究
【０２９３】
材料および方法：
【０２９４】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０２９５】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済み培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μＭ）の試験品または葉酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭの［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞を、Ｅｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品のログ濃度に対してプロットし、相対結合親和性を計算した。
【０２９６】
結果：
【０２９７】
化合物ＯＴＬ−００５６−ＯＴＬ−００６１および葉酸に対して研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ９５．２ｎＭ、１２１．３ｎＭ、９０．２ｎＭ、２５０．５ｎＭ、２２５．８ｎＭ、４１．７ｎＭおよび７．４ｎＭであることが判明した。ＯＴＬ−００５６（Ｐｔｅ−ＤＡＰ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５７（Ｐｔｅ−ＢＡＭＢ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５８（プテロイル−ＡＭＨＭＢ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５９（Ｐｔｅ−ＤＨＤＡＤＳ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００６０（Ｐｔｅ−ＤＡＤＳ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００６１（Ｐｔｅ−４ＡＰＥＰ−Ｓ０４５６）および葉酸に対して相対結合親和性を計算すると、それぞれ０．０７８、０．０６１、０．０８２、０．０２９、０．０３３、０．１７１および１であることが判明した。すべての試験品は［３Ｈ］−葉酸に定量的に匹敵した。
【０２９８】
結論：すべての化合物は、葉酸受容体に対して弱い親和性を有する。［３Ｈ］−葉酸に匹敵したすべての化合物は、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一の結合部位を構成し、それらが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０２９９】
（実施例１７）：
【０３００】
プテロイル−アミノ酸−ＮＩＲ色素コンジュゲートの全身画像化および生体分布
【０３０１】
試験品：ＯＴＬ−００３８（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）、ＯＴＬ−００５３（プテロイル−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６）、およびＯＴＬ−００５４（プテロイル−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６）
【０３０２】
材料および方法：
【０３０３】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０３０４】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ（ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０３０５】
全身画像化：
【０３０６】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（２〜３匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品を静脈内注射した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身（無傷腫瘍）画像を撮った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。Ｐｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６の場合、励起：７４５ｎｍ、７１０ｎｍ、６７５ｎｍ、６４０ｎｍ、６０５ｎｍ；発光：ＩＣＧおよび残りのパラメーターは同じである。
【０３０７】
組織生体分布：
【０３０８】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、および腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０３０９】
結果：
【０３１０】
全身画像化：
【０３１１】
図２９に見られるように、ＯＴＬ−００３８（Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）およびＯＴＬ−００５４（Ｐｔｅ−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６）は、葉酸受容体−陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。さらに、直接比較は、ＯＴＬ−００３８を注射されたマウスの腫瘍蛍光強度は、他のコンジュゲートで処置したマウスよりも明るいことを実証した。他方では、Ｐｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６は、６０５〜６７５ｎｍ波長で励起した場合、明るい腫瘍蛍光を有し、７１０〜７４５ｎｍで励起した場合、ＩＣＧ（８３０ｎｍ）で中程度の輝度の発光しか生じず、図３０に見られるようにＩＣＧで発光した（他のコンジュゲートで使用した同じパラメーター）。
【０３１２】
組織生体分布：
【０３１３】
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出し、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、同じ条件下で動物に行った。図３１に見られるように、最大の蛍光強度は、ＦＲ−陽性腫瘍および腎臓で認められた。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸コンジュゲートは＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
【０３１４】
結論：
【０３１５】
最良から最悪に列挙したコンジュゲートの輝度および特異性は、Ｅｘ＝７４５ｎｍおよびＥｍ＝ＩＣＧにおいて以下の通りである：Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６、Ｐｔｅ−Ｃｙｓ−Ｓ０４５６、およびＰｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６。Ｐｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６はすべてより長いストークシフトを示し、これは、６０５ｎｍで励起させ、ＩＣＧ（８３０ｎｍ）で発光させることによって、明るい腫瘍蛍光を認めることができることを示している。
【０３１６】
（実施例１８）：
【０３１７】
Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ誘導体［ＯＴＬ−００５１（プテロイル−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）］の全身画像化および生体分布
【０３１８】
試験品：ＯＴＬ−００５１（プテロイル−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）
【０３１９】
材料および方法：
【０３２０】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸不含１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０３２１】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）はＨａｒｌａｎ（ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間の明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
【０３２２】
全身画像化：
【０３２３】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向で腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の容積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が容積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（２〜３匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品を静脈内注射した。２時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。Ｐｔｅ−Ｌｙｓ−Ｓ０４５６の場合、励起：７４５ｎｍ、７１０ｎｍ、６７５ｎｍ、６４０ｎｍ、６０５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）および残りのパラメーターは同じである。
【０３２４】
組織生体分布：
【０３２５】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、および腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（８３０ｎｍ）；ｅｐｉ照射；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
【０３２６】
結果：
【０３２７】
全身画像化：
【０３２８】
図３２に見られるように、ＯＴＬ−００５１（プテロイル−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）は、葉酸受容体陽性腫瘍においてほとんど十分に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。Ｋｏｄａｋ色素は８００ｎＭで励起したが、ＩＶＩＳ画像システムは、８００ｎＭで励起させるフィルターを有していない。したがって、腫瘍において認められた低い蛍光の取り込みは、乏しい励起波長の使用に起因し得る。
【０３２９】
組織生体分布：
【０３３０】
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出し、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、同じ条件下で動物に行った。図３３に見られるように、最大の蛍光強度は、ＦＲ−陽性腫瘍に認められた。肺における取り込みも認められた。腎臓取り込みを有することが予期されたが（腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であった）、腎臓取り込みは低かった。
【０３３１】
結論：
【０３３２】
組織生体分布研究は、ＯＴＬ−００５１（プテロイル−Ｔｙｒ−ＩＲＤ２８）、およびＯＴＬ−００５２（プテロイル−Ｔｙｒ−Ｋｏｄａｋ）コンジュゲートは、葉酸受容体陽性腫瘍における取り込みがあることを実証した。
【図１】
2017149776.tif 000060
【図２】
2017149776.tif 000061
【図３】
2017149776.tif 000062
【図４】
2017149776.tif 000063
【図５】
2017149776.tif 000064
【図６】
2017149776.tif 000065
【図７−１】
2017149776.tif 000066
【図７−２】
2017149776.tif 000067
【図７−３】
2017149776.tif 000068
【図８】
2017149776.tif 000069
【図９】
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【図１０】
2017149776.tif 000071
【図１１】
2017149776.tif 000072
【図１２−１】
2017149776.tif 000073
【図１２−２】
2017149776.tif 000074
【図１２−３】
2017149776.tif 000075
【図１３】
2017149776.tif 000076
【図１４】
2017149776.tif 000077
【図１５】
2017149776.tif 000078
【図１６Ａ】
2017149776.tif 000079
【図１６Ｂ】
2017149776.tif 000080
【図１７】
2017149776.tif 000081
【図１８】
2017149776.tif 000082
【図１９】
2017149776.tif 000083
【図２０Ａ】
2017149776.tif 000084
【図２０Ｂ】
2017149776.tif 000085
【図２１】
2017149776.tif 000086
【図２２】
2017149776.tif 000087
【図２３Ａ】
2017149776.tif 000088
【図２３Ｂ】
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【図２４】
2017149776.tif 000090
【図２５】
2017149776.tif 000091
【図２６】
2017149776.tif 000092
【図２７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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