(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡ干渉（RNAi）農薬の標的とできる有害動物の遺伝子の塩基配列を含む核酸、及び該遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNAの提供。当該二本鎖RNAを利用した有害動物防除剤及び有害動物の防除方法の提供。【解決手段】特定な配列からなる塩基配列、又は当該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、該核酸からなる遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA、該二本鎖RNAを有効成分として含む有害動物防除剤、及び該二本鎖RNAを施用する工程を備えた、有害動物の防除方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
配列番号２９、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列の一部である67塩基以上の核酸。
【請求項３】
配列番号２５、２７若しくは２８の塩基配列、又は配列番号２５、２７若しくは２８の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１、３若しくは４の塩基配列、又は配列番号１、３若しくは４の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸からなる遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸からなる遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるセンス鎖、及び該センス鎖と相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む、請求項５に記載の二本鎖RNA。
【請求項７】
前記二本鎖RNAの少なくとも一方の鎖が17塩基以上の長さを有する、請求項５又は６に記載の二本鎖RNA。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の二本鎖RNAを有効成分として含む有害動物防除剤。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の二本鎖RNAを施用する工程を備えた、有害動物の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害動物の遺伝子の塩基配列を含む核酸、及び該遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNAに関する。さらに、本発明は、当該二本鎖RNAを利用した有害動物防除剤及び有害動物の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有害動物の防除に対しては、化学農薬による防除が行われてきた。しかし、有機リン・カーバメート・合成ピレスロイド・ネオニコチノイド等の化学農薬に対する抵抗性が世界的に発達してきており、有害動物を防除できる化学農薬が不足している。したがって、既存の化学農薬に代わる有害動物を防除する新しい方法の開発が重要である。
【０００３】
近年、二本鎖RNA (dsRNA)によって配列特異的にmRNAが分解され、遺伝子発現が抑制される現象、すなわちRNA干渉(RNAi)を利用した有害動物の防除方法が報告されている(特許文献１、非特許文献１)。例えば、飼料用トウモロコシの分野ではウエスタン コーン ルートワーム(Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera)に対してsnf7遺伝子を標的としたdsRNAを投与することでRNAi現象を誘導し、致死効果を発現させ防除している。このようなdsRNAを利用して植物害虫を防除する方法は、特許文献２〜６において報告されている。
【０００４】
非特許文献２では、ミカンキイロアザミウマに対してV-ATPase-B (vascuolar ATP synthase subunit B)遺伝子を標的としたdsRNAを注射により注入することで死虫率が増加したことが報告されている。
【０００５】
dsRNAを実際に圃場で使用する場合、注射により害虫にdsRNAを注入することは手間がかかりあまり現実的ではない。そのため、害虫にdsRNAを経口投与することで害虫を防除できれば効率性が高く、圃場での使用も可能となる。しかしながら、アザミウマ類では、経口投与によるRNAi現象が確認されておらず、RNAi農薬を開発することは不可能だと考えられていた(非特許文献３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第99/032619号
【特許文献２】米国特許出願公開第2007/0124836号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第2008/0214443号明細書
【特許文献４】国際公開第2006/129204号
【特許文献５】国際公開第2007/080127号
【特許文献６】国際公開第2010/140675号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998)
【非特許文献２】I.E. Badillo-Vargas et al., Journal of Insect Physilolgy, 76, 36-46 (2015)
【非特許文献３】C. Minakuchi et al., The IX International Symposium on Thysanoptera and Tospoviruses Program & Abstracts, 97 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、RNAi農薬の標的とできる有害動物の遺伝子の塩基配列を含む核酸、及び該遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNAを提供することを目的とする。さらに、本発明は、当該二本鎖RNAを利用した有害動物防除剤及び有害動物の防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ショウジョウバエ由来のアミノ酸配列GenBank: AAO74886.1、及びNCBI Reference Sequence: NP_651057.1と相同と考えられるミカンキイロアザミウマの遺伝子Fo_AAO74886.1、及びFo_NP_651057.1に対するdsRNAが、ミカンキイロアザミウマに対して経口投与で高い致死効果を示すという知見を得た。同様にトビイロウンカの遺伝子Nl_AAO74886.1、及びNl_NP_651057.1に対するdsRNAもトビイロウンカに対して体腔注射投与で高い致死効果を示すという知見を得た。
【００１０】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の核酸、二本鎖RNA、有害動物防除剤、及び有害動物の防除方法を提供するものである。
【００１１】
項１．配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
項２．配列番号２９、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列の一部である67塩基以上の核酸。
項３．配列番号２５、２７若しくは２８の塩基配列、又は配列番号２５、２７若しくは２８の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる項２に記載の核酸。
項４．配列番号１、３若しくは４の塩基配列、又は配列番号１、３若しくは４の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる項２に記載の核酸。
項５．項１に記載の核酸からなる遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA。
項６．項１に記載の核酸からなる遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるセンス鎖、及び該センス鎖と相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む、項５に記載の二本鎖RNA。
項７．前記二本鎖RNAの少なくとも一方の鎖が17塩基以上の長さを有する、項５又は６に記載の二本鎖RNA。
項８．項５〜７のいずれか一項に記載の二本鎖RNAを有効成分として含む有害動物防除剤。
項９．項５〜７のいずれか一項に記載の二本鎖RNAを施用する工程を備えた、有害動物の防除方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸の塩基配列をRNAi農薬の標的とすることで、有害動物(特に、アザミウマ及びウンカ)に対する高い致死効果を得ることが可能である。また、本発明の二本鎖RNAは、有害動物(特に、アザミウマ及びウンカ)に対する高い致死効果を有しており、RNAi農薬として使用することが可能である。
【００１３】
さらには、本発明の二本鎖RNAは、アザミウマに対して経口投与で高い致死効果を得ることができるため、RNAi農薬として有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】dsRNA-Fo_AAO74886.1又はdsRNA-EGFPのミカンキイロアザミウマへの投与7日後の死虫率を示すグラフである。
【図２】dsRNA-Fo_NP_651057.1又はdsRNA-EGFPのミカンキイロアザミウマへの投与7日後の死虫率を示すグラフである。
【図３】dsRNA-Fo_AAO74886.1、dsRNA-EGFP又は水のミカンキイロアザミウマへの投与3日後のFo_AAO74886.1の相対遺伝子発現量を示すグラフである。
【図４】dsRNA-Fo_NP_651057.1、dsRNA-EGFP又は水のミカンキイロアザミウマへの投与3日後のFo_NP_651057.1の相対遺伝子発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「からなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００１７】
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、2本鎖DNA、1本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００１８】
また、本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはDNA及びRNAの両方を含み、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。
【００１９】
核酸
本発明の核酸は、配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の核酸は、配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列の一部であることを特徴とする。
【００２１】
ここで、「一部」とは、少なくとも67塩基以上、好ましくは93塩基以上、更に好ましくは316塩基以上であり、好ましくは7,247塩基以下、より好ましくは5,221塩基以下、更に好ましくは4,524塩基以下、特に好ましくは1,000塩基以下であることを意味する。
【００２２】
上記一部の核酸としては、例えば、配列番号２５、２６、２７若しくは２８の塩基配列、又は配列番号２５、２６、２７若しくは２８の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、配列番号１、２、３若しくは４の塩基配列、又は配列番号１、２、３若しくは４の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸などが挙げられる。
【００２３】
配列番号２５(又は２９)、２６(又は３０)、２７(又は３１)、２８(又は３２)の遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０に示されるものである。また、配列番号１、２、３、４の遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６に示されるものである。
【００２４】
上記の配列番号２９、３０、３１、３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸は、それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードすることが好ましい。上記の配列番号２５、２６、２７、２８の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸は、それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードすることが好ましい。
【００２５】
上記塩基配列の同一性は、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上である。塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。塩基配列の同一性(%)は、当該分野で慣用のプログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初期設定で用いて決定することができる。
【００２６】
本発明の核酸は、上記核酸を含む遺伝子を有する生物から常法に従って調製した全mRNAを鋳型として、本発明の核酸を増幅可能なように設計したプライマーを用いて、RT-PCR法により取得することができる。また、本発明の核酸は、当該核酸を含む遺伝子を有する生物からcDNAライブラリーを鋳型として、本発明の核酸を増幅可能なように設計したプライマーを用いてPCR法により取得することもできる。また、本発明の核酸は、公知の固相合成法、液相合成法等や、公知のDNA合成装置等を用いて化学的に合成することができる。
【００２７】
本発明の核酸は、適当なベクター中に導入ことができる。そのようなベクターとしては、自立的に複製するベクター(例えば、プラスミドなど)、又は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものを挙げることができる。当該ベクターとして、具体的には、細菌プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、ウイルス(例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなど)などに由来するベクター；プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター(例えば、コスミド、ファージミドなど)などが挙げられる。
【００２８】
上記ベクターは、本発明の核酸に加えて、必要により複製及び制御に関する情報を担う配列(例えば、プロモーター、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、リボソーム結合部位など)、選択マーカー遺伝子の配列などを構成要素としている。
【００２９】
本発明の核酸は、公知の方法によりベクターに挿入することができる。例えば、適当な制限酵素を用いて本発明の核酸の両末端に付加された配列及びベクターの特定部位を切断し、混合してリガーゼを用いて結合させることができる。
【００３０】
本発明の核酸が組み込まれた組換えベクターを、大腸菌、バチルス属細菌などの細菌；酵母；昆虫細胞；動物細胞；植物細胞などの公知の宿主細胞に対して、公知の方法で導入することによって、本発明の核酸が導入された形質転換体を得ることができる。組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションなどを挙げることができる。
【００３１】
本発明の核酸の塩基配列をRNAi農薬の標的とすることで、有害動物(特に、アザミウマ及びウンカ)に対する高い致死効果を得ること可能である。なお、本明細書において、「RNAi農薬」とはRNAiによる標的遺伝子の発現阻害を利用して有害動物の防除を行う農薬を意味する。
【００３２】
二本鎖RNA
本発明の二本鎖RNAは、前述する配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸からなる遺伝子に対してRNAi効果を有することを特徴とする。
【００３３】
RNAi (RNA interference、RNA干渉)とは、標的遺伝子のmRNA配列と同一の配列からなるセンスRNA及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAからなる二本鎖RNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子のmRNAの破壊、タンパク質への翻訳阻害を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象をいう。RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素(RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種)が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNA (siRNA)と呼ばれる小さな断片に分解されるのが主な機構と考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、当該siRNAも含まれる。
【００３４】
なお、本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、二本鎖RNAの一方の端が閉じられた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA (shRNA)も含まれる。すなわち、上記RNAには、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子も含まれる。
【００３５】
本発明においてRNAiのために使用されるRNAは、上記遺伝子の全部又は一部と完全に同一である必要はないが、完全な同一性を有することが望ましい。
【００３６】
本発明のRNAi効果を有する二本鎖RNAは、通常、遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるセンス鎖、及び該センス鎖と相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む。本発明の二本鎖RNAの少なくとも一方の鎖の長さは、好ましくは17塩基以上、より好ましくは21塩基以上、更に好ましくは25塩基以上であり、好ましくは1,000塩基以下、より好ましくは721塩基以下、更に好ましくは404塩基以下、特に好ましくは160塩基以下である。しかしながら、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞内でRNAi効果を有するsiRNAへ分解され得るので、本発明における二本鎖RNAの長さは特に限定されない。また、昆虫等の害虫を対象とする場合はむしろ数百塩基以上の長いdsRNAがより有効であり得る。上記遺伝子のmRNAの全長又はほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の二本鎖RNAとして利用してもよい。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれ得る。
【００３７】
また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAは、RNAi効果が高いことが知られているので、本発明の二本鎖RNAは、末端に数塩基のオーバーハングを有することが好ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さは特に限定されないが、好ましくは2塩基のオーバーハングである。本発明において、例えば、TT(チミン×2)、UU(ウラシル×2)等のオーバーハングを有する二本鎖RNAを用いることができる。本発明の二本鎖RNAには、オーバーハングを形成する塩基がDNAである分子も含まれる。
【００３８】
また、天然型のヌクレオチドを持つsiRNAはリボヌクレアーゼに対して感受性であるため分解を受け易い。本発明において、この欠点を補うため、siRNA中のウリジンやシチジンの2'OH基をメチル化した2'-O-メチル化siRNAを合成して使用することもできる。
【００３９】
また、本発明の二本鎖RNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくてもよい。すなわち、本発明において、二本鎖RNAを構成する1又は2個以上のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
本発明の二本鎖RNAを構成する核酸は、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)等の核酸アナログであってもよい。該LNPは、ヌクレアーゼに耐性の物質であるため、より長時間RNAi効果を持続させることができる。
【００４１】
本発明の二本鎖RNAは、有害動物以外の生物に対してはRNAi作用を生じさせないことが望ましく、そのため、上記遺伝子以外の遺伝子の塩基配列とは同一性が低いことが望ましい。
【００４２】
本発明の二本鎖RNAは、該二本鎖RNAの標的となる上記遺伝子の塩基配列の情報を基に作製することが可能である。例えば、配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列、又は配列番号２９、３０、３１若しくは３２の塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列を基に、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製する。
【００４３】
本発明の二本鎖RNAは、化学合成、又は本発明の二本鎖RNAをコードするDNAを使用してin vitro若しくはin vivoで合成することが可能である。例えば、本発明の二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、及び該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAを、それぞれ独立又は連続して発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAをベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体により製造することができる。この場合、本発明の二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、及び該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAは、同一又は別々のベクターに組み込むことができる。ここにおけるベクター、宿主細胞、組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法などは、前述するものと同様である。
【００４４】
本発明の二本鎖RNAは、有害動物(特に、アザミウマ及びウンカ)に対する高い致死効果を有しており、RNAi農薬として使用することが可能である。特に、本発明の二本鎖RNAは、アザミウマに対して経口投与で高い致死効果を得ることができるという優れた効果を有している。
【００４５】
有害動物防除剤、有害動物の防除方法
本発明の有害動物防除剤は、上記二本鎖RNAを有効成分として含むことを特徴とする。また、本発明の有害動物の防除方法は、上記二本鎖RNAを施用する工程を備えていることを特徴とする。
【００４６】
本発明における「防除」には、有害動物を殺虫すること、有害動物の繁殖又は生長を抑制すること、有害動物を無害化又は低害化すること、及び有害動物により媒介される病気を抑制することが包含される。
【００４７】
上記有害動物としては、植物寄生性ダニ類、農業害虫類、衛生害虫類、貯殺害虫類、衣類又は家屋害虫類、家畜などに寄生するノミ類、シラミ類又はハエ類、植物寄生性線虫類、土壌害虫類などが挙げられる。中でも、本発明の有害動物防除剤は、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシなどのアブラムシ類、コナガ、ヨトウムシ、ハスモンヨトウ、コドリンガ、ボールワーム、タバコバッドワーム、マイマイガ、コロラドハムシ、ウリハムシ、ボールウィービル、ウンカ類、ヨコバイ類、カイガラムシ類、カメムシ類、コナジラミ類、アザミウマ類、バッタ類、ハナバエ類、コガネムシ類、タマナヤガ、カブラヤガ、アリ類などのような農業害虫類に対して好適に使用される。
【００４８】
本発明の二本鎖RNAを有害動物防除剤の有効成分として使用するに際しては、従来の農薬の製剤の場合と同様に農薬補助剤と共に乳剤、懸濁剤、粉剤、粒剤、水和剤、水溶剤、液剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、エアゾール剤、ペースト剤、微量散布剤などの種々の形態に製剤することができる。本発明の二本鎖RNAの配合割合は、通常0.1〜500,000 ppm、好ましくは1〜100,000 ppm、更に好ましくは1〜1,000 ppmである(希釈して使用する場合は最終濃度を示す)。これらの製剤の実際の使用に際しては、そのまま使用するか、又は水等の希釈剤で所定濃度に希釈して使用することができる。本発明の二本鎖RNAの配合割合は、製剤の形態及び施用する目的、時期、場所、害虫の発生状況などによって適宜変更するが可能である。
【００４９】
農薬補助剤としては、担体、乳化剤、懸濁剤、分散剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、増粘剤、安定剤などが挙げられる。
【００５０】
また、必要に応じて他の農薬、例えば、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺菌剤、抗ウイルス剤、誘引剤、除草剤、植物生長調整剤などと混用又は併用することができ、この場合に一層優れた効果を示すこともある。
【００５１】
本発明の有害動物防除剤の施用量は、二本鎖RNAの量として、1 ha当たり通常0.000015〜150,000 g、好ましくは0.0015〜1,500 gである。しかしながら、特別な場合には、当該範囲を逸脱することも可能である。
【００５２】
本発明の有害動物防除剤の施用方法は、通常一般的に行われている施用方法、例えば、散布(散布、噴霧、ミスティング、アトマイジング、散粒、水面施用など)、土壌施用(混入、灌注など)、表面施用(塗布、粉衣、被覆など)、浸潰毒餌などにより行うことができる。また、いわゆる超高濃度少量散布法(ultra low volume)により施用することもできる。この方法では本発明の二本鎖RNAを100%含有させることが可能である。
【００５３】
有害動物を防除するためには、本発明の二本鎖RNAを有害動物の体内に取り込ませる必要がある。そのような有害動物体内への二本鎖RNAの取り込ませ方は、特に限定されず、例えば、有害動物が食害する植物上に二本鎖RNAを散布等により付着させておくことで、又は有害動物が食害する植物体内に二本鎖RNAを散布等により浸透させておくことで、有害動物に摂食させることで取り込ませることができる。また、注射などにより、有害動物に直接、二本鎖RNAを注入することもできる。
【００５４】
本発明の有害動物防除剤は、有害動物(特に、アザミウマ及びウンカ)に対する高い致死効果を有している上、アザミウマに対して経口投与で高い致死効果を得ることができるため、RNAi農薬として高い有用性を有している。また、本発明の有害動物防除剤は、従来の化学農薬に抵抗性を有する有害動物に対しても優れた防除効果が期待される。
【実施例】
【００５５】
本発明をより詳しく述べるために、以下に実施例を記載するが、本発明はこれらに限定して解釈されるものではない。
【００５６】
試験例
ショウジョウバエ由来のアミノ酸配列GenBank: AAO74886.1、及びNCBI Reference Sequence: NP_651057.1と相同と考えられる遺伝子に注目し、各々の遺伝子発現を特異的に阻害可能な二本鎖RNA (dsRNA)による致死効果を検討した。
【００５７】
＜材料と方法＞
１．AAO74886.1、及びNP_651057.1相同遺伝子cDNAのクローニング並びに塩基配列の決定
（１）供試昆虫
ミカンキイロアザミウマ(学名Frankliniella occidentalis、英名western flower thrips)については2008年5月に栃木県宇都宮市圃場のイチゴ葉上より採集して石原産業(株)中央研究所にて継代飼育した個体、トビイロウンカ(学名Nilaparvata lugens、英名Brown rice planthopper)については島根県出雲市イネ圃場より採集して、国立研究開発法人農業生物資源研究所にて継代飼育した個体を用いた。
【００５８】
（２）cDNAの調製
ミカンキイロアザミウマ(Fo)については1齢幼虫から成虫まで全ステージを含む昆虫より、トビイロウンカ(Nl)については1齢幼虫から成虫まで全ステージを含む昆虫より、全RNAをRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いた塩酸グアニジン法により抽出した。このRNAを鋳型として、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific)に基づき、MultiScribeTM Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)を用いて一本鎖cDNAを合成した。
【００５９】
（３）発現遺伝子データベースの構築
ミカンキイロアザミウマcDNA、及びトビイロウンカcDNAを用いて、ハイスループットシーケンサーHiSeq2000 (illumina)を用いて発現遺伝子データの取得を行った。取得したデータを用いてde novo assemblyを実施して発現遺伝子データベースの構築を行った。
【００６０】
（４）相同遺伝子検索
ショウジョウバエGenBank: AAO74886.1、及びNCBI Reference Sequence: NP_651057.1のアミノ酸配列を検索配列としてトビイロウンカ発現遺伝子データベースよりGENETYX ver.12 (GENETYX)を用いて、TBLASTNによる相同遺伝子検索により相同遺伝子配列を得た。または、ショウジョウバエGenBank: AAO74886.1、NCBI Reference Sequence: NP_651057.1、及びショウジョウバエGenBank: CAA29993.1のアミノ酸配列を検索配列としてミカンキイロアザミウマ発現遺伝子データベースよりGENETYX ver.12 (GENETYX)を用いて、TBLASTNによる相同遺伝子検索により相同遺伝子配列を得た。
【００６１】
（５）クローニング用プライマー設計
相同遺伝子配列より、クローニング用のプライマーを設計した。それぞれの種に対応したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組み合わせは下記に示した。陰性対照dsRNA作製用の高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP; enhanced green fluorescent protein)部分断片のサブクローニングに用いたプライマーも下記に示した。なお、ここでクローニングした配列は、それぞれFo_AAO74886.1：配列番号１、Nl_AAO74886.1：配列番号２、Fo_NP_651057.1：配列番号３、Nl_NP_651057.1：配列番号４である。
・ミカンキイロアザミウマ
(Fo_AAO74886.1フォワードプライマー)
Fo_AAO74886.1-F01: 5'-CCAACAACTCGCACAGCAAT-3'(20mer)(配列番号５)
(Fo_AAO74886.1リバースプライマー)
Fo_AAO74886.1-R01: 5'-ATCAGAGTGTACAGGACCAG-3'(20mer)(配列番号６)
(Fo_NP_651057.1フォワードプライマー)
Fo_NP_651057.1-F03: 5'-CTGTGCGCCATGACGTTCAA-3'(20mer)(配列番号７)
(Fo_NP_651057.1リバースプライマー)
Fo_NP_651057.1-R06: 5'-CGATGGCGTAGTACCGGTCC-3'(20mer)(配列番号８)
・トビイロウンカ
(Nl_AAO74886.1フォワードプライマー)
Nl_AAO74886.1-F01: 5'-AGTCATCCTGGGCATAGGG-3'(19mer)(配列番号９)
(Nl_AAO74886.1リバースプライマー)
Nl_AAO74886.1-R01: 5'-TGAGTCAGGCACACGTCAA-3'(19mer)(配列番号１０)
(Nl_NP_651057.1フォワードプライマー)
Nl_NP_651057.1-F01: 5'-ATGTGCGACGTGTGGAAT-3'(18mer)(配列番号１１)
(Nl_NP_651057.1リバースプライマー)
Nl_NP_651057.1-R01: 5'-GTTGCCACTTTGCTCCTGT-3'(19mer)(配列番号１２)
・EGFP
(EGFPフォワードプライマー)
EGFP-F01: 5'-GGCTACGGCTTCTACCACTT-3'(20mer)(配列番号１３)
(EGFPリバースプライマー)
EGFP-R01: 5'-TTGAAGGCGTGCTGGTACTC-3'(20mer)(配列番号１４)
【００６２】
（６）PCR
上記の通り調製した一本鎖cDNAを鋳型として、上記プライマーを用いてポリメラーゼチェーン反応(PCR)を行った。PCRのTaq DNAポリメラーゼにはEx Taq (Takara Bio)を用いた。PCR産物はNucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel)を用いて精製した。
【００６３】
（７）PCR産物のpMD20-T vectorへのクローニング
上記のように調製したインサートをMighty TA-cloning Kit (Takara Bio)に基づき、pMD20-T vectorにTAライゲーションし、大腸菌(HST08 Premium Competent Cells)に形質転換を行った。ライゲーション反応は、DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Bio)を用いて行った。形質転換した大腸菌培養液をLBプレートに展開し、37℃で一晩培養の後、コロニーを選出してクローニングした。選出したクローンはLB培地中で37℃で一晩振とう培養し、Wizard R Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)によりプラスミドDNAを調製した。
【００６４】
（８）塩基配列の決定
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて、プロトコルに従ってプラスミドDNAにクローニングされたインサートの塩基配列を決定した。得られた塩基配列はGENETYX ver.12 (GENETYX)で解析した。
【００６５】
２．RNAi法
（１）RNA合成用の鋳型の増幅
ミカンキイロアザミウマのAAO74886.1、及びNP_651057.1相同遺伝子については、上記のベクターにPCR産物がクローニングされたものを用いた。トビイルウンカのAAO74886.1、及びNP_651057.1相同遺伝子についても、上記のベクターにPCR産物がクローニングされたものを用いた。
【００６６】
dsRNAを合成するための鋳型として使用するPCR産物(dsRNA合成鋳型DNA)を得るため、T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加した下記のPCRプライマーを設計した。RNA合成は、センス鎖、アンチセンス鎖別々に行うため、PCR反応のプライマーは下記の組合せで用いた。PCRのポリメラーゼにはKOD FX Neo (TOYOBO)を用いた。上記の反応で得られたPCR産物はエタノール沈殿を行って濃縮した後、アガロース電気泳動を行い、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel)を用いて精製した。
・センス鎖ssRNA合成鋳型DNAのPCR反応に用いたプライマー
T7-M13 primer RV：
5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCAGGAAACAGCTATGAC-3'(配列番号１５)
M13 primer M4 EXT：
5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCA-3'(配列番号１６)
・アンチセンス鎖ssRNA合成鋳型DNAのPCR反応に用いたプライマー
M13 primer RV EXT：
5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTA-3'(配列番号１７)
T7-M13 primer M4：
5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(配列番号１８)
【００６７】
（２）dsRNAの合成
上記鋳型DNAを1μg用い、T7 RiboMAXTM Express RNAi System (Promega)に従ってRNAを合成し、適量のヌクレアーゼ・フリーの超純水に溶解した。dsRNAのアニーリングを行うため、得られたRNA溶液はヒートブロックを用い65℃で30分間インキュベートした後、1〜2時間かけて室温に戻した。このdsRNAを少量用い、NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)を用いた濃度測定及びアガロース電気泳動による確認を行った。合成が確認されたdsRNAは、4μg/μlの濃度に調整し、一回分ずつに小分けして-80℃で保存した。 
【００６８】
（３）dsRNA-Fo_AAO74886.1の投与(ミカンキイロアザミウマ)
ミカンキイロアザミウマ2齢幼虫を、蓋部分を切り取ったマイクロテストチューブに20頭導入して、パラフィルムを被せて覆い、その上にショ糖(最終濃度20%(w/v))+dsRNA (最終濃度2,000 ng/μl)を10μl滴下した。そこにdsRNA溶液を挟み込むようにもう１枚のパラフィルムを被せて張り付けた。キムタオルで遮光して25℃で24時間静置した。試験群は2群準備し、dsRNA-Fo_AAO74886.1及びdsRNA-EGFP(陰性対照群)をそれぞれ投与した。24時間パラフィルムを介して経口投与した後に、インゲン葉で飼育し、7日後の死虫数を観察した。
【００６９】
（４）dsRNA-Fo_NP_651057.1の投与(ミカンキイロアザミウマ)
ミカンキイロアザミウマ2齢幼虫を、蓋部分を切り取ったマイクロテストチューブに20頭導入して、パラフィルムを被せて覆い、その上にショ糖(最終濃度20%(w/v))+dsRNA (最終濃度2,000 ng/μl)を10μl滴下した。そこにdsRNA溶液を挟み込むようにもう１枚のパラフィルムを被せて張り付けた。キムタオルで遮光して25℃で24時間静置した。試験群は2群準備し、dsRNA-Fo_NP_651057.1及びdsRNA-EGFP(陰性対照群)をそれぞれ投与した。24時間パラフィルムを介して経口投与した後に、インゲン葉で飼育し、7日後の死虫数を観察した。
【００７０】
（５）定量リアルタイムPCR (ミカンキイロアザミウマ)
dsRNA投与を24時間投与した後、2日後の幼虫10頭を採取し、全RNAをRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いた塩酸グアニジン法により抽出した。このRNAを鋳型として、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific)に基づき、MultiScribeTM Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)を用いて一本鎖cDNAを合成した。定量リアルタイムPCRは一本鎖cDNAを鋳型としてリアルタイムPCRシステムStep One Plus (Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。検出用の反応試薬はPower SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)を用いた。内部標準遺伝子にはショウジョウバエGenBank: CAA29993.1と相同な遺伝子、Fo_CAA29993.1の発現量を用いて、標準化を行った。dsRNAを投与せず水のみ添加したショ糖溶液投与区を100%としてEGFPと標的遺伝子のdsRNA投与区の発現量を示した。遺伝子特異的プライマーの配列を下記に記載する。
(Fo_CAA29993.1)
Fo_CAA29993.1_qPCR-F：5'-TCAAGGAACTGCGTCGTGGAT-3'(配列番号１９)
Fo_CAA29993.1_qPCR-R：5'-ACAGGGGTGTAGCCGTTGGAG-3'(配列番号２０)
(Fo_AAO74886.1)
Fo_AAO74886.1_qPCR-F：5'-AGGCCTTACTTCTGGTCTTG-3'(配列番号２１)
Fo_AAO74886.1_qPCR-R：5'-CCCACAGTCCACACACAATA-3'(配列番号２２)
(Fo_NP_651057.1)
Fo_NP_651057.1_qPCR-F：5'-TCGCCTCCAGCAAGATGAAG-3'(配列番号２３)
Fo_NP_651057.1_qPCR-R：5'-CGTGATGATGTACCAGAGGA-3'(配列番号２４)
【００７１】
（６）dsRNA-Nl_AAO74886.1及びdsRNA-Nl_NP_651057.1の投与(トビイロウンカ)
ウンカ類3齢幼虫にCO2麻酔の後、容量可変式オートインジェクターNANOJECT II (Drummond Scientific Company)を用いて、１頭当たり75-100 ng/15-20 nlの溶液を体腔に注射した。試験群は3群準備しdsRNA-Nl_AAO74886.1、dsRNA-Nl_NP_651057.1、及びdsRNA-EGFP(陰性対照群)をそれぞれ投与した。麻酔状態からの復活を確認した後、芽出しのイネを入れた試験管内で個別飼育し、全ての個体が成虫化する10日後までの死亡率を観察した。生死判定は、イネ下の脱脂綿に死虫が落下するのを目視で観察した。
【００７２】
＜結果＞
（１）dsRNA-Fo_AAO74886.1の投与(ミカンキイロアザミウマ)
dsRNA-Fo_AAO74886.1を経口投与したアザミウマ幼虫(試験区)の投与7日後死虫率を図１に示した。対照区と比較して、7日後の死虫率に顕著な差を認めた。
【００７３】
（２）dsRNA-Fo_NP_651057.1の投与(ミカンキイロアザミウマ)
dsRNA-Fo_NP_651057.1を経口投与したアザミウマ幼虫(試験区)の投与7日後死虫率を図２に示した。対照区と比較して、7日後の死虫率に顕著な差を認めた。
【００７４】
（３）定量リアルタイムPCR (ミカンキイロアザミウマ)
dsRNA-Fo_AAO74886.1を経口投与したアザミウマ幼虫(試験区)では、対照区(dsRNA-EGFP)と比較して、投与3日後のFo_AAO74886.1遺伝子発現量において顕著な遺伝子発現抑制が認められた(図３)。
【００７５】
dsRNA-Fo_NP_651057.1を経口投与したアザミウマ幼虫(試験区)でも、対照区(dsRNA-EGFP)と比較して、投与3日後のFo_NP_651057.1遺伝子発現量において顕著な遺伝子発現抑制が認められた(図４)。
【００７６】
（４）dsRNA-Nl_AAO74886.1及びdsRNA-Nl_NP_651057.1の投与(トビイロウンカ)
dsRNA-Nl_AAO74886.1及びdsRNA-Nl_NP_651057.1を注射投与したトビイロウンカ幼虫(試験区)の投与10日後死虫率を表１に示した。陰性対照区と比較して、10日後までの死虫率に顕著な差を認めた。
【００７７】
【表１】
2017131201.tif 000002
【００７８】
Fo_AAO74886.1、Nl_AAO74886.1、Fo_NP_651057.1及びNl_NP_651057.1のCDS、全長cDNA配列、配列番号１〜４及び２５〜２８にコードされるアミノ酸配列、並びにFo_CAA29993.1のCDSは以下の通りである。
Fo_AAO74886.1のCDS：配列番号２５
Nl_AAO74886.1のCDS：配列番号２６
Fo_NP_651057.1のCDS：配列番号２７
Nl_NP_651057.1のCDS：配列番号２８
Fo_AAO74886.1の全長cDNA配列：配列番号２９
Nl_AAO74886.1の全長cDNA配列：配列番号３０
Fo_NP_651057.1の全長cDNA配列：配列番号３１
Nl_NP_651057.1の全長cDNA配列：配列番号３２
配列番号１にコードされるアミノ酸配列：配列番号３３
配列番号２にコードされるアミノ酸配列：配列番号３４
配列番号３にコードされるアミノ酸配列：配列番号３５
配列番号４にコードされるアミノ酸配列：配列番号３６
配列番号２５にコードされるアミノ酸配列：配列番号３７
配列番号２６にコードされるアミノ酸配列：配列番号３８
配列番号２７にコードされるアミノ酸配列：配列番号３９
配列番号２８にコードされるアミノ酸配列：配列番号４０
Fo_CAA29993.1のCDS：配列番号４１
【図１】
2017131201.tif 000003
【図２】
2017131201.tif 000004
【図３】
2017131201.tif 000005
【図４】
2017131201.tif 000006
【配列表】
2017131201000001.app