(57)【要約】【課題】  オーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供し、特に、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供する。【解決手段】  五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物、当該新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物、ならびに当該新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程と、脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程と、回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程とを有する、液体燃料を製造する方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物。
【請求項２】
五炭糖が、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）およびリボース（ｒｉｂｏｓｅ）からなる群から選択される１または２以上の単糖である、請求項１に記載の新規微生物。
【請求項３】
キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、請求項２に記載の新規微生物。
【請求項４】
ｍｈ１８８２（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７０）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項５】
ｍｈ１９１１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項６】
ｍｈ１９１２（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項７】
ｍｈ１９１３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７３）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物。
【請求項９】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程と、
脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程と、
回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程と
を有する、液体燃料を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物に関し、特に、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム属に属する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ） は、鞭毛に中空の小毛を持つ真核生物の一群であるストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）亜界に属する、アメーバ様生物群であって光合成を行わない従属栄養性の生物群である。細菌類、真菌類、水棲多細胞植物などを栄養源として捕食するが、食作用は行わず、これらを細胞表面で消化し、栄養分として吸収する細胞外消化吸収を行う。また、吸収した栄養分は細胞内に油滴として蓄積されるのが特徴である。油滴は無色のものから、色素を含んで橙色〜赤色を呈するものまで様々であるが、この油滴には、ｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸であるｎ−６（ω−６）ドコサペンタエン酸（ｎ−６ Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ｎ−６（ω−６）ＤＰＡ）やｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＡ）などの高度不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）やアスタキサンチンなどの有用物質を高濃度に含まれることが知られており、バイオ燃料や医薬品などへの活用が期待されている。
【０００３】
近年、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）について、分類上の再編成がなされ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびオブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の、３つの属に分割された（Ｒ．Ｙｏｋｏｙａｍａ ａｎｄ Ｄ．Ｈｏｎｄａ，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ４８：１９９〜２１１，２００７）が、中でもオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物は、炭化水素を高効率で生成・蓄積するＰＵＦＡの他、スクアレンなどの炭化水素を高効率で生成・蓄積することが見出され、例えば、産生する全脂質中、スクワレンが１０質量％以上であり、かつオレンジ色〜赤色を呈するコロニーを形成する分離株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｔｓｕｋｕｂａ−３（特許文献１）が単離されている。また、本発明者らは、高い増殖性と著量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を細胞内に蓄積することを特徴とする分離株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６の単離に成功している（非特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７７７９９号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｎａｇａｎｏ ｅｔ． ａｌ．，Ｊ．Ｏｌｅｏ Ｓｃｉ．，５８（１２）：６２３〜６２８、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に開示されているＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｔｓｕｋｕｂａ−３株は、炭水化物由来の炭素源としてグルコース、フルクトース、サッカロースまたはデンプンが挙げられており（特許文献１の明細書段落［００１８］）、非特許文献に開示されているＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株もまた、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースまたはショ糖を炭水化物由来の炭素源としている（非特許文献１の図２）ように、キシロース、アラビノースまたはリボースなどの五炭糖を炭水化物由来の炭素源とするオーランチオキトリウムの分離株は見出されていなかった。
【０００７】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、オーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供することを目的とし、特に、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、新規に単離したオーランチオキトリウムの分離株が、キシロース、アラビノースまたはリボースなどの五炭糖を炭水化物由来の炭素源として脂肪酸生成能を有する、すなわち、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物。
【００１０】
（２）五炭糖が、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）およびリボース（ｒｉｂｏｓｅ）からなる群から選択される１または２以上の単糖である、（１）に記載の新規微生物。
【００１１】
（３）キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、（２）に記載の新規微生物。
【００１２】
（４）キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、（２）に記載の新規微生物。
【００１３】
（５）ｍｈ１８８２（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７０）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１４】
（６）ｍｈ１９１１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１５】
（７）ｍｈ１９１２（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１６】
（８）ｍｈ１９１３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７３）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１７】
（９）（１）から（８）のいずれか一項に記載の新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物。
【００１８】
（１０）（１）から（８）のいずれか一項に記載の新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程と、脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程と、回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程とを有する、液体燃料を製造する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物によれば、例えば、稲わらやバガスなどのリグノセルロース系バイオマスは多量のキシロースを含むゆえ、現状は利用価値が乏しいが、このようなリグノセルロース系バイオマスや五炭糖から、有益なＰＵＦＡなどの脂質やアスタキサンチンなどを産生することができ、新しいバイオ燃料や医薬品などの開発に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】単離した４つの微生物株について決定された１８Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて作成した系統樹を示す図である。
【図２】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についての糖資化性を示す図である。
【図３】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についての人工海水濃度条件を示す図である。数値は濁度（ＯＤ６６０）を示す。
【図４】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についてのｐＨ条件を示す図である。数値は濁度（ＯＤ６６０）を示す。
【図５】ｍｈ１８８２株の体内において生成される脂肪酸組成（ガスクロマトグラフィーのチャート）を示す図である。
【図６】ｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸組成（ガスクロマトグラフィーのチャート）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物について詳細に説明する。本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物は、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有する。
【００２２】
本明細書において「オーランチオキトリウム属に属する新規微生物」とは、「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」であることと同義である。「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」であるか否かは、新規微生物の系統を解析することにより確認することができる。
【００２３】
新規微生物の系統を解析するには、１８Ｓ リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いる方法が広く知られており、当業者であれば、適当にプライマーを設計して微生物の１８Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるし、増幅されたＰＣＲ断片の塩基配列を決定することも当業者において周知技術である。さらに、決定された塩基配列は、ＢＬＡＳＴ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ＪＰ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）に掲載のプログラム）であるＣｌｕｓｔａｌＷなどのソフトウェアを使用して、他の系統の１８Ｓ ｒＤＮＡとの配列相同性を比較することができる。
【００２４】
ここで核酸配列の「相同性」とは、比較すべき２つの核酸配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率で表したものである。本発明において、「配列間の相同性」は、「配列間の類似性」または「配列間の同一性」と置換可能に用いられ得る。また、当業者であれば、ＢＬＡＳＴやＣｌｕｓｔａｌＷといったソフトウェアのパラメーターを適当に設定し、核酸配列の相同性を決定することができる。
【００２５】
ここで、国際細菌分類命名委員会特別委員会報告（Ｌ．Ｇ．Ｗａｙｎｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｄ−ｈｏｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｒｅｃｏｎｃｉｌｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３７：４６３−４６４，１９８７）によれば、「細菌の種は系統的にほぼ７０％またはそれ以上のＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性を示す菌株である」と定義されているが、Ｓｔａｃｋｅｒｂｒａｎｄｔらは、上記定義におけるＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性との関係について、ＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性の比較からＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性７０％以上のものと１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性９７％以上のものは対応するとし、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性９７％以上のものを同一の種とみなされると述べている（Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｎｏｔｅ；ａ ｐｌａｃｅ ｆｏｒ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４４：８４６−８４９，１９９４）。
【００２６】
従って、オーランチオキトリウム属に属する微生物株のうち、分子系統的に近縁な公知の微生物株との１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性が９７％未満であれば、「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」といえ、また、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性と種の関係からみれば、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であれば同一種とみなされる。ただし、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であっても、塩基配列が一致しない場合や、分子系統樹において対象となる公知の微生物株との間に距離が認められる場合は、新種の微生物とみなされる場合がある。さらに、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であっても、増殖能力、形態学的性質や生理学的性質などの性状、物質生成能あるいは物質分解能において公知の微生物株と明確に区別することができる場合などにおいても、新種の微生物とみなされる場合がある。
【００２７】
次に、本発明において、「五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有する」とは、五炭糖を資化することにより脂肪酸生成が可能なこと、より詳細には、五炭糖を炭水化物由来の炭素源として導入して脂肪酸生成が可能なことをいう。すなわち、本発明において、「基質として導入」は「資化」と交換可能に用いられる場合がある。
【００２８】
本発明において、「五炭糖（ペントース；Ｐｅｎｔｏｓｅ）」は特に限定されず、アルドペントースでもケトペントースでもよく、アルドペントースとしては、例えば、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースを挙げることができ、ケトペントースとしては、例えば、リブロース、キシルロースを挙げることができるが、バイオマスの活用という観点からはリボース、アラビノース、キシロースが好適である。また、ペントースのアルデヒド基とケトン基が４位または５位のヒドロキシル基と反応して形成する分子内ヘミアセタールまたはヘミケタールも、本発明における「五炭糖」に包含される。
【００２９】
本発明において、「脂肪酸」は特に限定されず、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。飽和脂肪酸としては、炭素数が１４〜２４、さらには炭素数が１５〜２２のものが好ましく、そのような飽和脂肪酸としてはパルミチン酸やステアリン酸などを挙げることができる。また、不飽和脂肪酸としては、炭素数が１４〜２４、さらには１６〜２２のものが好ましく、いわゆる高度不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ：ＰＵＦＡ）が好適である。そのような高度不飽和脂肪酸としては、ｎ−３（ω−３）系高度不飽和脂肪酸、ｎ−６（ω−６）系高度不飽和脂肪酸、あるいはｎ−９（ω−９）系高度不飽和脂肪酸が好適である。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４）、ｎ−３（ω−３）８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４）、ＥＰＡ（５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）、ｎ−３（ω−３）ＤＰＡ（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）などを挙げることができ、ｎ−６（ω−６）系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカトリエン酸）、ジホモ−γ−リノレン酸（８，１１，１４−エイコサトリエン酸）、アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４）、ｎ−６（ω−６）ドコサペンタエン酸（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）などを挙げることができ、ｎ−９（ω−９）系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、ミード酸（５，８，１１−エイコサトリエン酸）などを挙げることができる。
【００３０】
なお、本発明において、「生成」は「生産」、「産生」、「製造」などと交換可能に用いられる場合がある。
【００３１】
また、本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物は、五炭糖を基質として導入することにより、脂肪酸の他、例えば、１−アシルグリセロリゾリン脂質または２−アシルグリセロリゾリン脂質に分類されるリン脂質、ガラクト脂質、スルホ脂質、スフィンゴ糖脂質または糖スフィンゴリン脂質などの糖脂質、グリセリン脂肪酸エステルなどの中性脂質、ならびにスクアレンなどの脂質；フィトステロールまたはコレステロールなどのステロールやステロールエステルなどのステロール類；アスタキサンチンなどのカロテノイド；などについての生成能を有していてもよい。
【００３２】
次に、本発明に係るオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物は、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である。
【００３３】
本発明において、「唯一の炭素源として添加した所定の培地」は、唯一の炭素源として添加する限り、例えば、寒天や酵母エキスなどのような炭素源となり得る組成物が当該所定の培地に含まれていてもよい。本発明においては、炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した所定の培地であることが好適である。
【００３４】
また成長率の測定は、当業者により適宜選択可能な手法に基づいて行うことができ、そのような手法としては、例えば、液体培地を用いて濁度を測定する方法に基づく手法や、培地において形成されるコロニーの大きさを測定する方法に基づく手法などを挙げることができる。
【００３５】
上述した本発明に係る五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物としては、例えば、２０１４年５月２７日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託して受領番号が付与されたｍｈ１８８２株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７０）、ｍｈ１９１１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７１）、ｍｈ１９１２株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７２）およびｍｈ１９１３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７３）を挙げることができる。
【００３６】
また、上述した本発明に係る五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物もまた、本発明に包含される。「微生物体処理物」とは、微生物体破砕物、微生物体抽出物、それらの分画物粗精製画分など、もしくは培養物（微生物体、培養上清を含む）から抽出した酵素などをいう。そのような微生物体処理物としては、例えば、培養して得られた微生物体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの、もしくはアルカリ処理したもの、微生物体を物理的もしくは酵素的に破砕したもの、またはこれらのものから分離・抽出された粗酵素などを挙げることができる。
【００３７】
次に、本発明に係る液体燃料を製造する方法は下記の（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の工程を有している。
（Ｉ）本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程（培養蓄積工程）、
（ＩＩ）脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程（回収工程）、
（ＩＩＩ）回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程（臨機酸化工程）。
【００３８】
培養蓄積工程（Ｉ）における本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を培養する方法、回収工程（ＩＩ）における本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物の微生物体から脂肪酸を回収する方法、および臨機酸化工程（ＩＩＩ）における脂肪酸を酸化する方法は特に限定されず、当業者において適宜選択可能な手法に基づいて行うことができる。
【００３９】
さらに、本発明に係る液体燃料を製造する方法には、本発明に係る液体燃料を製造する方法の特徴を損なわない限り、上述した（Ｉ）〜（ＩＩＩ）以外の工程を有してもよく、そのような工程としては、例えば、各種保存工程、攪拌工程、精製工程などを挙げることができる。
【００４０】
以下、本発明に係るオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞オーランチオキトリウム属に属する新規微生物の単離および同定
日本各地の天然海より採取したサンプルから、ラビリンチュラ類に属する微生物を単離し、その同定を試みた。
（１）松花粉釣餌法による遊走子の濃縮
日本各地の天然海より海水、海砂、サンゴ片、海藻片、海草片または落葉などを分離源として採集し、松花粉釣餌法で遊走子の濃縮を試みた。より詳細には、各地の海水、または海水とともに海砂などの分離源を５０ｍＬのプラスチック製遠沈管に収容し、それら分離源を収容した遠沈管の水面に少量の松花粉を添加した後、室温で１週間静置することにより遊走子の濃縮を試みた。
【００４２】
（２）ラビリンチュラ類に属する微生物のコロニーの純化および保存
室温で１週間静置した後に、それぞれの遠沈管における水面から花粉を含む海水を１００μＬずつ採取し、アラビノースまたはキシロースを唯一の炭素源とする分離用寒天プレートに播種した後、２８℃において１週間程度培養した。続いて、寒天プレート上に出現したコロニーを肉眼および実体顕微鏡で観察し、ラビリンチュラ類に属する微生物のコロニーと判断できるものについて新たな寒天プレートに画線を繰り返すことにより純化した後、検鏡にて形態的にラビリンチュラ類に属する微生物と判断した４つの微生物株を単離し、それぞれ斜面培地に保存した。
【００４３】
使用した分離用寒天プレートは２種類であり、それぞれの組成を下記に示す。
（Ｉ）分離用寒天プレート（Ａ）
炭素源（アラビノースまたはキシロース）  ２０ｇ
ＫＮＯ３                                  ５．７８ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                              ０．１６ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．１６ｇ／Ｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ                    １ｍＬ／Ｌ
Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ                        ２ｍＬ／Ｌ
寒天                                    １５ｇ
５０％濃度の人工海水（ｐＨ７．０）  １０００ｍＬ
（ＩＩ）分離用寒天プレート（Ｂ）
炭素源（アラビノースまたはキシロース）  ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス                              １０ｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ                    １ｍＬ／Ｌ
Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ                        ２ｍＬ／Ｌ
寒天                                    １５ｇ
５０％濃度の人工海水（ｐＨ７．０）  １０００ｍＬ
【００４４】
なお、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ、Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘおよび５０％濃度の人工海水の組成を下記に示す。
（ＩＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１                  ２００．０ｍｇ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ２                      １．０ｍｇ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２                    １．０ｍｇ
蒸留水                                １００ｍＬ
（ＩＶ）Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ
ＥＤＴＡ  ｄｉ−ｓｏｄｉｕｍ            ３０ｇ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      １．４５ｇ
Ｈ３ＢＯ３                              ３４．２ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                      ４．３ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      １．３３５ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ０．１３ｇ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ                      ０．２６ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ０．０１ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ                  ０．０２５ｇ
蒸留水                              １０００ｍＬ
（Ｖ）５０％濃度の人工海水
ＮａＣｌ                                １５．０ｇ
ＫＣｌ                                    ０．３５ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ５．４ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ２．７ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                      ０．５ｇ
蒸留水                              １０００ｍＬ
【００４５】
また、斜面培地としては、
グルコース                              ２０ｇ
ＫＮＯ３                                  ５．７８ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                              ０．１６ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．１６ｇ
寒天                                    １５ｇ
以上を終濃度が１／２となるように人工海水に溶解し、ｐＨ６．８に調整した後、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップし、これに１ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｍｉｘと２ｍＬのＭｅｔａｌ Ｍｉｘを添加することにより調製したものを使用した。
【００４６】
（３）１８Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の解析
本実施例１（２）において斜面培地に保存した４つの微生物株について、下記に示す手順により、１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列を決定し、解析を行った。
【００４７】
ＤＮＡ抽出キット（商品名：ＩＳＯＰＬＡＮＴ、ニッポン・ジーン社）を用いて、添付の仕様書に従って斜面培地に保存した４つの微生物株それぞれのゲノムＤＮＡを抽出し、既報（Ｄ．Ｈｏｎｄａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６：６３７〜６４７，１９９９）に従って１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を精製した。使用したプライマー、ＰＣＲ法の条件およびＰＣＲ産物の精製の方法などについて下記に示す。
（ｉ）使用したプライマー
１８Ｓ００１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＡＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＧＴ Ａ−３’（配列番号１）
１８Ｓ１３（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ Ｔ−３’（配列番号２）
（ｉｉ）ＰＣＲ法の条件
９４℃にて１分間変性させた後、９４℃にて３０秒間、続いて５５℃にて３０秒間、さらに７２℃にて１分３０秒間、それぞれ３０サイクル行い、７２℃にて７分間、最後の伸長反応を行った。
（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の精製
得られたＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動法により視覚化した後、バンドを切除し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製した。
【００４８】
続いて、既報（Ｃ．Ｑ．Ｍｏ，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１４０：８８３〜８８９，２００２；Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４８：３２９〜３４１，２００７；Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０；Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：１１１〜１２０，１９８０；Ｎ．Ｓａｉｔｏｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５，１９８７；Ｓ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ ５：１５０〜１６３，２００４）に従い、精製したＰＣＲ産物から１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列を決定し、決定した１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて系統解析を行った。使用したプライマー、ｒＲＮＡ塩基配列の決定および系統解析に使用したキット、ならびにプログラムについて下記に示す。
（ｉｖ）使用したプライマー
ＦＡ１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴ−３’（配列番号７）
ＲＡ１（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＣ−３’（配列番号８）
ＦＡ２（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＧ−３’（配列番号９）
ＲＡ２（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＣＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＧ−３’（配列番号１０）
ＦＡ３（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＧ−３’（配列番号１１）
ＲＡ３（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＡＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＧＧ−３’（配列番号１２）
（ｖ）ｒＲＮＡ塩基配列の決定に使用したキット
Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）
（ｖｉ）系統解析に使用したプログラム
ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）
【００４９】
単離した４つの微生物株について決定された１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて作成した系統樹を図１に示す。図１に示すように、形態的にラビリンチュラ類に属する微生物と判断した４つの微生物株は、いずれもオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する分離株であることが明らかになった。
【００５０】
なお、前記４つの微生物株をそれぞれ、「ｍｈ１８８２」、「ｍｈ１９１１」、「ｍｈ１９１２」および「ｍｈ１９１３」と命名し、２０１４年５月２７日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託して、それぞれの微生物株に受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７０、ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７１、ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７２およびＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７３が付与された。なお、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株における１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列は、順に、配列番号３〜６である。
【００５１】
＜実施例２＞従来株であるｍｈ０１８６株との糖資化性における比較
糖資化性について、前記単離したｍｈ１８８２株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７０）、ｍｈ１９１１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７１）、ｍｈ１９１２株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７２）およびｍｈ１９１３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２２７３）と、系統上これら４つの微生物株と近隣に位置する、従来株であるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株（非特許文献１）との比較を行った。
【００５２】
実施例１（２）で使用した分離用寒天プレート（Ｂ）の炭素源について、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラクトース、ショ糖、マルトースまたはデンプンとした培地をそれぞれ調製し、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株をそれぞれ植菌して、２８℃にて３日間培養した。一方、実施例１（２）で使用した分離用寒天プレート（Ｂ）において炭素源を添加しない、炭素源を含まない培地を調製して、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株をそれぞれ植菌し、同様に２８℃にて３日間培養した。炭素源をグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラクトース、ショ糖、マルトースまたはデンプンとした培地において、炭素源を含まない培地のコロニーと比較して明らかに大きなコロニーを形成した場合を資化性ありと判断した。その結果を図２に示す。
【００５３】
図２に示すように、従来株であるｍｈ０１８６株がキシロースおよびアラビノース、すなわち五炭糖を資化しないのに対し、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株は五炭糖であるキシロースおよびアラビノースを資化することが明らかとなった。前記系統樹（図１）および当該資化性の結果（図２）から、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株はオーランチオキトリウム属に属する新規微生物株であることが示された。
【００５４】
＜実施例３＞従来株ｍｈ０１８６株との形態学的性質の比較試験
ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株の形態学的性質を、実体顕微鏡で観察することにより確認し、比較した。その結果を下記に示す。
（ｉ）ｍｈ１８８２株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では凝集して細胞塊を形成することがある。
（ｉｉ）ｍｈ１９１１株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｉｉｉ）ｍｈ１９１２株
栄養細胞は直径２〜１５μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｉｖ）ｍｈ１９１３株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｖ）従来株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
【００５５】
以上の結果より、形態学的性質上、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株は、オーランチオキトリウム属に属する微生物の特徴を有していることが示された。
【００５６】
＜実施例４＞従来株ｍｈ０１８６株との人工海水濃度条件およびｐＨ条件についての比較試験
続いて、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株において、生理学的性質でありかつ基本的な培養条件である人工海水濃度条件およびｐＨ条件についての比較試験を行った。
【００５７】
（１）人工海水濃度条件についての比較試験
実施例１（２）で使用した人工海水の濃度を、それぞれ２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）としたものを調製した。蒸留水（人工海水濃度０％）、ならびに調製した濃度２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の人工海水にそれぞれグルコースを３％（ｗ／ｖ）および酵母エキスを１％（ｗ／ｖ）加えることにより、濃度が０％、２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の試験用人工海水を調製した。これら濃度が０％、２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の試験用人工海水を使用してｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株を室温にて７２時間培養し、濁度（ＯＤ６６０）を測定することにより繁殖度合いの比較を行った。その結果を図３に示す。
【００５８】
図３に示すように、ｍｈ１８８２株については試験用人工海水濃度が５０〜１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１１株およびｍｈ１９１２株については試験用人工海水濃度が１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１３株については試験用人工海水濃度が１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖することが確認された。これらに対し、従来株であるｍｈ０１８６株については試験用人工海水濃度が２５〜５０％（ｗ／ｖ）と、比較的低濃度の場合に最も繁殖することが確認された。
【００５９】
（２）ｐＨ条件についての比較試験
本実施例４（２）で使用した５０％（ｗ／ｖ）濃度の試験用人工海水について、ｐＨをそれぞれ３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０および９．０に調整した試験用人工海水をそれぞれ調製し、それぞれの試験用人工海水において、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株を室温にて７２時間培養し、濁度（ＯＤ６６０）を測定することにより繁殖度合いの比較を行った。その結果を図４に示す。
【００６０】
図４に示すように、ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株については試験用人工海水濃度のｐＨが６．０〜７．０の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１２株については試験用人工海水濃度のｐＨが６．０〜８．０の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１３株については試験用人工海水濃度のｐＨが７．０〜８．０の場合に最も繁殖することが確認された。これらに対し、従来株であるｍｈ０１８６株については試験用人工海水濃度のｐＨが４．０〜７．０の場合に最も繁殖し、特に、ｐＨ４．０という比較的低ｐＨの場合にも十分に繁殖することが確認された。
【００６１】
＜実施例５＞オーランチオキトリウム属に属する新規微生物株の体内において生成される脂肪酸組成の解析
オーランチオキトリウム属に属する新規微生物株であるｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸の組成解析を行った。具体的には、これら微生物体を凍結乾燥し、Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２６：４９７〜５０９，１９５７）に従って凍結乾燥した微生物体から脂質を抽出した後、１０％（ｗ／ｖ）ＨＣｌ−メタノール溶液を用いてメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィーにて解析した。ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株についてのガスクロマトグラフィーチャートの内容を図５および図６に示し、ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸の組成を下記に示す。
【００６２】
（ｉ）ｍｈ１８８２における体内生成脂肪酸組成（ＧＣ％）
Ｃ１５：０                                ４．００
Ｃ１６：０                              ２０．２１
Ｃ１７：０                                ８．４７
Ｃ１８：０                                ６．９５
Ｃ２０：４（ｎ−６）                      １．５０
Ｃ２０：５（ｎ−３）                      １．７６
Ｃ２２：５（ｎ−６）                    １０．７３
Ｃ２２：６（ｎ−３）                    ４０．３１
（ｉ）ｍｈ１９１１における体内生成脂肪酸の組成（ＧＣ％）
Ｃ１４：０                                １．８９
Ｃ１５：０                                ４．１５
Ｃ１６：０                              ４０．２２
Ｃ１７：０                                １．９２
Ｃ１８：０                                ２．９１
Ｃ２０：４（ｎ−６）                      ０．６０
Ｃ２０：５（ｎ−３）                      １．９０
Ｃ２２：５（ｎ−６）                      ７．４８
Ｃ２２：６（ｎ−３）                    ３１．８２
【００６３】
図５、図６および上記ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株における体内生成脂肪酸組成に示すように、ｍｈ１８８２株の体内において最も多く生成される脂肪酸はｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、次いで多く生成される脂肪酸は飽和脂肪酸であるパルミチン酸（Ｃ１６：０）、さらに次いで多く生成される脂肪酸はｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））であり、ｍｈ１９１１株の体内において最も多く生成される脂肪酸は飽和脂肪酸であるパルミチン酸（Ｃ１６：０）、次いで多く生成される脂肪酸はｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、さらに次いで多く生成される脂肪酸はｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：５（ｎ−６）））であることが明らかになった。
【図１】
2017131110.tif 000003
【図２】
2017131110.tif 000004
【図３】
2017131110.tif 000005
【図４】
2017131110.tif 000006
【図５】
2017131110.tif 000007
【図６】
2017131110.tif 000008
【配列表】
2017131110000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月4日(2014.12.4)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物。
【請求項２】
五炭糖が、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）およびリボース（ｒｉｂｏｓｅ）からなる群から選択される１または２以上の単糖である、請求項１に記載の新規微生物。
【請求項３】
キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、請求項２に記載の新規微生物。
【請求項４】
ｍｈ１８８２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７０）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項５】
ｍｈ１９１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項６】
ｍｈ１９１２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項７】
ｍｈ１９１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７３）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の新規微生物。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物。
【請求項９】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程と、
脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程と、
回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程と
を有する、液体燃料を製造する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物に関し、特に、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム属に属する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ） は、鞭毛に中空の小毛を持つ真核生物の一群であるストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）亜界に属する、アメーバ様生物群であって光合成を行わない従属栄養性の生物群である。細菌類、真菌類、水棲多細胞植物などを栄養源として捕食するが、食作用は行わず、これらを細胞表面で消化し、栄養分として吸収する細胞外消化吸収を行う。また、吸収した栄養分は細胞内に油滴として蓄積されるのが特徴である。油滴は無色のものから、色素を含んで橙色〜赤色を呈するものまで様々であるが、この油滴には、ｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸であるｎ−６（ω−６）ドコサペンタエン酸（ｎ−６ Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ｎ−６（ω−６）ＤＰＡ）やｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＡ）などの高度不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＰＵＦＡ）やアスタキサンチンなどの有用物質を高濃度に含まれることが知られており、バイオ燃料や医薬品などへの活用が期待されている。
【０００３】
近年、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）について、分類上の再編成がなされ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびオブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の、３つの属に分割された（Ｒ．Ｙｏｋｏｙａｍａ ａｎｄ Ｄ．Ｈｏｎｄａ，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ４８：１９９〜２１１，２００７）が、中でもオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物は、炭化水素を高効率で生成・蓄積するＰＵＦＡの他、スクアレンなどの炭化水素を高効率で生成・蓄積することが見出され、例えば、産生する全脂質中、スクワレンが１０質量％以上であり、かつオレンジ色〜赤色を呈するコロニーを形成する分離株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｔｓｕｋｕｂａ−３（特許文献１）が単離されている。また、本発明者らは、高い増殖性と著量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を細胞内に蓄積することを特徴とする分離株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６の単離に成功している（非特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７７７９９号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｎａｇａｎｏ ｅｔ． ａｌ．，Ｊ．Ｏｌｅｏ Ｓｃｉ．，５８（１２）：６２３〜６２８、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に開示されているＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｔｓｕｋｕｂａ−３株は、炭水化物由来の炭素源としてグルコース、フルクトース、サッカロースまたはデンプンが挙げられており（特許文献１の明細書段落［００１８］）、非特許文献に開示されているＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株もまた、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースまたはショ糖を炭水化物由来の炭素源としている（非特許文献１の図２）ように、キシロース、アラビノースまたはリボースなどの五炭糖を炭水化物由来の炭素源とするオーランチオキトリウムの分離株は見出されていなかった。
【０００７】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、オーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供することを目的とし、特に、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、新規に単離したオーランチオキトリウムの分離株が、キシロース、アラビノースまたはリボースなどの五炭糖を炭水化物由来の炭素源として脂肪酸生成能を有する、すなわち、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物。
【００１０】
（２）五炭糖が、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）およびリボース（ｒｉｂｏｓｅ）からなる群から選択される１または２以上の単糖である、（１）に記載の新規微生物。
【００１１】
（３）キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、（２）に記載の新規微生物。
【００１２】
（４）キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である、（２）に記載の新規微生物。
【００１３】
（５）ｍｈ１８８２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７０）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１４】
（６）ｍｈ１９１１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１５】
（７）ｍｈ１９１２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７２）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１６】
（８）ｍｈ１９１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７３）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている新規微生物である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の新規微生物。
【００１７】
（９）（１）から（８）のいずれか一項に記載の新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物。
【００１８】
（１０）（１）から（８）のいずれか一項に記載の新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程と、脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程と、回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程とを有する、液体燃料を製造する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物によれば、例えば、稲わらやバガスなどのリグノセルロース系バイオマスは多量のキシロースを含むゆえ、現状は利用価値が乏しいが、このようなリグノセルロース系バイオマスや五炭糖から、有益なＰＵＦＡなどの脂質やアスタキサンチンなどを産生することができ、新しいバイオ燃料や医薬品などの開発に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】単離した４つの微生物株について決定された１８Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて作成した系統樹を示す図である。
【図２】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についての糖資化性を示す図である。
【図３】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についての人工海水濃度条件を示す図である。数値は濁度（ＯＤ６６０）を示す。
【図４】ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株についてのｐＨ条件を示す図である。数値は濁度（ＯＤ６６０）を示す。
【図５】ｍｈ１８８２株の体内において生成される脂肪酸組成（ガスクロマトグラフィーのチャート）を示す図である。
【図６】ｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸組成（ガスクロマトグラフィーのチャート）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物について詳細に説明する。本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物は、五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有する。
【００２２】
本明細書において「オーランチオキトリウム属に属する新規微生物」とは、「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」であることと同義である。「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」であるか否かは、新規微生物の系統を解析することにより確認することができる。
【００２３】
新規微生物の系統を解析するには、１８Ｓ リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いる方法が広く知られており、当業者であれば、適当にプライマーを設計して微生物の１８Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるし、増幅されたＰＣＲ断片の塩基配列を決定することも当業者において周知技術である。さらに、決定された塩基配列は、ＢＬＡＳＴ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ＪＰ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）に掲載のプログラム）であるＣｌｕｓｔａｌＷなどのソフトウェアを使用して、他の系統の１８Ｓ ｒＤＮＡとの配列相同性を比較することができる。
【００２４】
ここで核酸配列の「相同性」とは、比較すべき２つの核酸配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率で表したものである。本発明において、「配列間の相同性」は、「配列間の類似性」または「配列間の同一性」と置換可能に用いられ得る。また、当業者であれば、ＢＬＡＳＴやＣｌｕｓｔａｌＷといったソフトウェアのパラメーターを適当に設定し、核酸配列の相同性を決定することができる。
【００２５】
ここで、国際細菌分類命名委員会特別委員会報告（Ｌ．Ｇ．Ｗａｙｎｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｄ−ｈｏｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｒｅｃｏｎｃｉｌｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３７：４６３−４６４，１９８７）によれば、「細菌の種は系統的にほぼ７０％またはそれ以上のＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性を示す菌株である」と定義されているが、Ｓｔａｃｋｅｒｂｒａｎｄｔらは、上記定義におけるＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性との関係について、ＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性と１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性の比較からＤＮＡ−ＤＮＡ配列相同性７０％以上のものと１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性９７％以上のものは対応するとし、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の相同性９７％以上のものを同一の種とみなされると述べている（Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｎｏｔｅ；ａ ｐｌａｃｅ ｆｏｒ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４４：８４６−８４９，１９９４）。
【００２６】
従って、オーランチオキトリウム属に属する微生物株のうち、分子系統的に近縁な公知の微生物株との１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性が９７％未満であれば、「オーランチオキトリウム属に属する新種の微生物」といえ、また、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性と種の関係からみれば、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であれば同一種とみなされる。ただし、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であっても、塩基配列が一致しない場合や、分子系統樹において対象となる公知の微生物株との間に距離が認められる場合は、新種の微生物とみなされる場合がある。さらに、１８Ｓ ｒＲＮＡ（ＤＮＡ）配列の相同性において９７％以上の微生物株であっても、増殖能力、形態学的性質や生理学的性質などの性状、物質生成能あるいは物質分解能において公知の微生物株と明確に区別することができる場合などにおいても、新種の微生物とみなされる場合がある。
【００２７】
次に、本発明において、「五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有する」とは、五炭糖を資化することにより脂肪酸生成が可能なこと、より詳細には、五炭糖を炭水化物由来の炭素源として導入して脂肪酸生成が可能なことをいう。すなわち、本発明において、「基質として導入」は「資化」と交換可能に用いられる場合がある。
【００２８】
本発明において、「五炭糖（ペントース；Ｐｅｎｔｏｓｅ）」は特に限定されず、アルドペントースでもケトペントースでもよく、アルドペントースとしては、例えば、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースを挙げることができ、ケトペントースとしては、例えば、リブロース、キシルロースを挙げることができるが、バイオマスの活用という観点からはリボース、アラビノース、キシロースが好適である。また、ペントースのアルデヒド基とケトン基が４位または５位のヒドロキシル基と反応して形成する分子内ヘミアセタールまたはヘミケタールも、本発明における「五炭糖」に包含される。
【００２９】
本発明において、「脂肪酸」は特に限定されず、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。飽和脂肪酸としては、炭素数が１４〜２４、さらには炭素数が１５〜２２のものが好ましく、そのような飽和脂肪酸としてはパルミチン酸やステアリン酸などを挙げることができる。また、不飽和脂肪酸としては、炭素数が１４〜２４、さらには１６〜２２のものが好ましく、いわゆる高度不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ：ＰＵＦＡ）が好適である。そのような高度不飽和脂肪酸としては、ｎ−３（ω−３）系高度不飽和脂肪酸、ｎ−６（ω−６）系高度不飽和脂肪酸、あるいはｎ−９（ω−９）系高度不飽和脂肪酸が好適である。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４）、ｎ−３（ω−３）８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４）、ＥＰＡ（５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）、ｎ−３（ω−３）ＤＰＡ（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）などを挙げることができ、ｎ−６（ω−６）系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカトリエン酸）、ジホモ−γ−リノレン酸（８，１１，１４−エイコサトリエン酸）、アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４）、ｎ−６（ω−６）ドコサペンタエン酸（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）などを挙げることができ、ｎ−９（ω−９）系高度不飽和脂肪酸としては、例えば、６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、ミード酸（５，８，１１−エイコサトリエン酸）などを挙げることができる。
【００３０】
なお、本発明において、「生成」は「生産」、「産生」、「製造」などと交換可能に用いられる場合がある。
【００３１】
また、本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物は、五炭糖を基質として導入することにより、脂肪酸の他、例えば、１−アシルグリセロリゾリン脂質または２−アシルグリセロリゾリン脂質に分類されるリン脂質、ガラクト脂質、スルホ脂質、スフィンゴ糖脂質または糖スフィンゴリン脂質などの糖脂質、グリセリン脂肪酸エステルなどの中性脂質、ならびにスクアレンなどの脂質；フィトステロールまたはコレステロールなどのステロールやステロールエステルなどのステロール類；アスタキサンチンなどのカロテノイド；などについての生成能を有していてもよい。
【００３２】
次に、本発明に係るオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物は、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）またはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した所定の培地および所定の時間における成長率が、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）および／またはマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を唯一の炭素源として添加した前記所定の培地ならびに前記所定の時間における成長率よりも大である。
【００３３】
本発明において、「唯一の炭素源として添加した所定の培地」は、唯一の炭素源として添加する限り、例えば、寒天や酵母エキスなどのような炭素源となり得る組成物が当該所定の培地に含まれていてもよい。本発明においては、炭水化物由来の唯一の炭素源として添加した所定の培地であることが好適である。
【００３４】
また成長率の測定は、当業者により適宜選択可能な手法に基づいて行うことができ、そのような手法としては、例えば、液体培地を用いて濁度を測定する方法に基づく手法や、培地において形成されるコロニーの大きさを測定する方法に基づく手法などを挙げることができる。
【００３５】
上述した本発明に係る五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物としては、例えば、２０１４年５月２７日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託して受託番号が付与されたｍｈ１８８２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７０）、ｍｈ１９１１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７１）、ｍｈ１９１２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７２）およびｍｈ１９１３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７３）を挙げることができる。
【００３６】
また、上述した本発明に係る五炭糖を基質として導入することによる脂肪酸生成能を有するオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物の培養物、微生物体または微生物体処理物もまた、本発明に包含される。「微生物体処理物」とは、微生物体破砕物、微生物体抽出物、それらの分画物粗精製画分など、もしくは培養物（微生物体、培養上清を含む）から抽出した酵素などをいう。そのような微生物体処理物としては、例えば、培養して得られた微生物体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの、もしくはアルカリ処理したもの、微生物体を物理的もしくは酵素的に破砕したもの、またはこれらのものから分離・抽出された粗酵素などを挙げることができる。
【００３７】
次に、本発明に係る液体燃料を製造する方法は下記の（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の工程を有している。
（Ｉ）本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を培養して前記微生物体中に脂肪酸を蓄積させる工程（培養蓄積工程）、
（ＩＩ）脂肪酸を蓄積した微生物体を分離し、分離した前記微生物体から脂肪酸を回収する工程（回収工程）、
（ＩＩＩ）回収した脂肪酸に不飽和脂肪酸が含まれる場合において、回収した脂肪酸を酸化する工程（臨機酸化工程）。
【００３８】
培養蓄積工程（Ｉ）における本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物を培養する方法、回収工程（ＩＩ）における本発明に係るオーランチオキトリウム属に属する新規微生物の微生物体から脂肪酸を回収する方法、および臨機酸化工程（ＩＩＩ）における脂肪酸を酸化する方法は特に限定されず、当業者において適宜選択可能な手法に基づいて行うことができる。
【００３９】
さらに、本発明に係る液体燃料を製造する方法には、本発明に係る液体燃料を製造する方法の特徴を損なわない限り、上述した（Ｉ）〜（ＩＩＩ）以外の工程を有してもよく、そのような工程としては、例えば、各種保存工程、攪拌工程、精製工程などを挙げることができる。
【００４０】
以下、本発明に係るオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する新規微生物について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞オーランチオキトリウム属に属する新規微生物の単離および同定
日本各地の天然海より採取したサンプルから、ラビリンチュラ類に属する微生物を単離し、その同定を試みた。
（１）松花粉釣餌法による遊走子の濃縮
日本各地の天然海より海水、海砂、サンゴ片、海藻片、海草片または落葉などを分離源として採集し、松花粉釣餌法で遊走子の濃縮を試みた。より詳細には、各地の海水、または海水とともに海砂などの分離源を５０ｍＬのプラスチック製遠沈管に収容し、それら分離源を収容した遠沈管の水面に少量の松花粉を添加した後、室温で１週間静置することにより遊走子の濃縮を試みた。
【００４２】
（２）ラビリンチュラ類に属する微生物のコロニーの純化および保存
室温で１週間静置した後に、それぞれの遠沈管における水面から花粉を含む海水を１００μＬずつ採取し、アラビノースまたはキシロースを唯一の炭素源とする分離用寒天プレートに播種した後、２８℃において１週間程度培養した。続いて、寒天プレート上に出現したコロニーを肉眼および実体顕微鏡で観察し、ラビリンチュラ類に属する微生物のコロニーと判断できるものについて新たな寒天プレートに画線を繰り返すことにより純化した後、検鏡にて形態的にラビリンチュラ類に属する微生物と判断した４つの微生物株を単離し、それぞれ斜面培地に保存した。
【００４３】
使用した分離用寒天プレートは２種類であり、それぞれの組成を下記に示す。
（Ｉ）分離用寒天プレート（Ａ）
炭素源（アラビノースまたはキシロース）  ２０ｇ
ＫＮＯ３                                  ５．７８ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                              ０．１６ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．１６ｇ／Ｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ                    １ｍＬ／Ｌ
Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ                        ２ｍＬ／Ｌ
寒天                                    １５ｇ
５０％濃度の人工海水（ｐＨ７．０）  １０００ｍＬ
（ＩＩ）分離用寒天プレート（Ｂ）
炭素源（アラビノースまたはキシロース）  ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス                              １０ｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ                    １ｍＬ／Ｌ
Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ                        ２ｍＬ／Ｌ
寒天                                    １５ｇ
５０％濃度の人工海水（ｐＨ７．０）  １０００ｍＬ
【００４４】
なお、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ、Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘおよび５０％濃度の人工海水の組成を下記に示す。
（ＩＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１                  ２００．０ｍｇ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ２                      １．０ｍｇ
ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２                    １．０ｍｇ
蒸留水                                １００ｍＬ
（ＩＶ）Ｍｅｔａｌ  Ｍｉｘ
ＥＤＴＡ  ｄｉ−ｓｏｄｉｕｍ            ３０ｇ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      １．４５ｇ
Ｈ３ＢＯ３                              ３４．２ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                      ４．３ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      １．３３５ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ０．１３ｇ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ                      ０．２６ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ０．０１ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ                  ０．０２５ｇ
蒸留水                              １０００ｍＬ
（Ｖ）５０％濃度の人工海水
ＮａＣｌ                                １５．０ｇ
ＫＣｌ                                    ０．３５ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ５．４ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ２．７ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                      ０．５ｇ
蒸留水                              １０００ｍＬ
【００４５】
また、斜面培地としては、
グルコース                              ２０ｇ
ＫＮＯ３                                  ５．７８ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                              ０．１６ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．１６ｇ
寒天                                    １５ｇ
以上を終濃度が１／２となるように人工海水に溶解し、ｐＨ６．８に調整した後、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップし、これに１ｍＬのＶｉｔａｍｉｎ Ｍｉｘと２ｍＬのＭｅｔａｌ Ｍｉｘを添加することにより調製したものを使用した。
【００４６】
（３）１８Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の解析
本実施例１（２）において斜面培地に保存した４つの微生物株について、下記に示す手順により、１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列を決定し、解析を行った。
【００４７】
ＤＮＡ抽出キット（商品名：ＩＳＯＰＬＡＮＴ、ニッポン・ジーン社）を用いて、添付の仕様書に従って斜面培地に保存した４つの微生物株それぞれのゲノムＤＮＡを抽出し、既報（Ｄ．Ｈｏｎｄａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６：６３７〜６４７，１９９９）に従って１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を精製した。使用したプライマー、ＰＣＲ法の条件およびＰＣＲ産物の精製の方法などについて下記に示す。
（ｉ）使用したプライマー
１８Ｓ００１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＡＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＧＴ Ａ−３’（配列番号１）
１８Ｓ１３（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ Ｔ−３’（配列番号２）
（ｉｉ）ＰＣＲ法の条件
９４℃にて１分間変性させた後、９４℃にて３０秒間、続いて５５℃にて３０秒間、さらに７２℃にて１分３０秒間、それぞれ３０サイクル行い、７２℃にて７分間、最後の伸長反応を行った。
（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の精製
得られたＰＣＲ産物は、アガロース電気泳動法により視覚化した後、バンドを切除し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製した。
【００４８】
続いて、既報（Ｃ．Ｑ．Ｍｏ，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１４０：８８３〜８８９，２００２；Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４８：３２９〜３４１，２００７；Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０；Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６：１１１〜１２０，１９８０；Ｎ．Ｓａｉｔｏｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５，１９８７；Ｓ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ ５：１５０〜１６３，２００４）に従い、精製したＰＣＲ産物から１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列を決定し、決定した１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて系統解析を行った。使用したプライマー、ｒＲＮＡ塩基配列の決定および系統解析に使用したキット、ならびにプログラムについて下記に示す。
（ｉｖ）使用したプライマー
ＦＡ１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴ−３’（配列番号７）
ＲＡ１（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＣ−３’（配列番号８）
ＦＡ２（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＧ−３’（配列番号９）
ＲＡ２（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＣＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＧ−３’（配列番号１０）
ＦＡ３（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＧ−３’（配列番号１１）
ＲＡ３（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ＣＡＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＧＧ−３’（配列番号１２）
（ｖ）ｒＲＮＡ塩基配列の決定に使用したキット
Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）
（ｖｉ）系統解析に使用したプログラム
ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）
【００４９】
単離した４つの微生物株について決定された１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列（配列番号３〜６）に基づいて作成した系統樹を図１に示す。図１に示すように、形態的にラビリンチュラ類に属する微生物と判断した４つの微生物株は、いずれもオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する分離株であることが明らかになった。
【００５０】
なお、前記４つの微生物株をそれぞれ、「ｍｈ１８８２」、「ｍｈ１９１１」、「ｍｈ１９１２」および「ｍｈ１９１３」と命名し、２０１４年５月２７日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託して、それぞれの微生物株に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７０、ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７１、ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７２およびＦＥＲＭ Ｐ−２２２７３が付与された。なお、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株における１８Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から約５００〜１０００ｂｐの塩基配列は、順に、配列番号３〜６である。
【００５１】
＜実施例２＞従来株であるｍｈ０１８６株との糖資化性における比較
糖資化性について、前記単離したｍｈ１８８２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７０）、ｍｈ１９１１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７１）、ｍｈ１９１２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７２）およびｍｈ１９１３株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２２７３）と、系統上これら４つの微生物株と近隣に位置する、従来株であるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株（非特許文献１）との比較を行った。
【００５２】
実施例１（２）で使用した分離用寒天プレート（Ｂ）の炭素源について、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラクトース、ショ糖、マルトースまたはデンプンとした培地をそれぞれ調製し、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株をそれぞれ植菌して、２８℃にて３日間培養した。一方、実施例１（２）で使用した分離用寒天プレート（Ｂ）において炭素源を添加しない、炭素源を含まない培地を調製して、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株をそれぞれ植菌し、同様に２８℃にて３日間培養した。炭素源をグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラクトース、ショ糖、マルトースまたはデンプンとした培地において、炭素源を含まない培地のコロニーと比較して明らかに大きなコロニーを形成した場合を資化性ありと判断した。その結果を図２に示す。
【００５３】
図２に示すように、従来株であるｍｈ０１８６株がキシロースおよびアラビノース、すなわち五炭糖を資化しないのに対し、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株は五炭糖であるキシロースおよびアラビノースを資化することが明らかとなった。前記系統樹（図１）および当該資化性の結果（図２）から、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株はオーランチオキトリウム属に属する新規微生物株であることが示された。
【００５４】
＜実施例３＞従来株ｍｈ０１８６株との形態学的性質の比較試験
ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株の形態学的性質を、実体顕微鏡で観察することにより確認し、比較した。その結果を下記に示す。
（ｉ）ｍｈ１８８２株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では凝集して細胞塊を形成することがある。
（ｉｉ）ｍｈ１９１１株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｉｉｉ）ｍｈ１９１２株
栄養細胞は直径２〜１５μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｉｖ）ｍｈ１９１３株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
（ｖ）従来株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ｍｈ０１８６株
栄養細胞は直径３〜２０μｍの球形で、運動性があり１〜３μｍの遊走細胞を放出することがある。培養液中では単分散してあまり細胞塊は形成しない。
【００５５】
以上の結果より、形態学的性質上、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株は、オーランチオキトリウム属に属する微生物の特徴を有していることが示された。
【００５６】
＜実施例４＞従来株ｍｈ０１８６株との人工海水濃度条件およびｐＨ条件についての比較試験
続いて、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株において、生理学的性質でありかつ基本的な培養条件である人工海水濃度条件およびｐＨ条件についての比較試験を行った。
【００５７】
（１）人工海水濃度条件についての比較試験
実施例１（２）で使用した人工海水の濃度を、それぞれ２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）としたものを調製した。蒸留水（人工海水濃度０％）、ならびに調製した濃度２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の人工海水にそれぞれグルコースを３％（ｗ／ｖ）および酵母エキスを１％（ｗ／ｖ）加えることにより、濃度が０％、２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の試験用人工海水を調製した。これら濃度が０％、２５％（ｗ／ｖ）、５０％（ｗ／ｖ）、１００％（ｗ／ｖ）および２００％（ｗ／ｖ）の試験用人工海水を使用してｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株を室温にて７２時間培養し、濁度（ＯＤ６６０）を測定することにより繁殖度合いの比較を行った。その結果を図３に示す。
【００５８】
図３に示すように、ｍｈ１８８２株については試験用人工海水濃度が５０〜１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１１株およびｍｈ１９１２株については試験用人工海水濃度が１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１３株については試験用人工海水濃度が１００％（ｗ／ｖ）の場合に最も繁殖することが確認された。これらに対し、従来株であるｍｈ０１８６株については試験用人工海水濃度が２５〜５０％（ｗ／ｖ）と、比較的低濃度の場合に最も繁殖することが確認された。
【００５９】
（２）ｐＨ条件についての比較試験
本実施例４（２）で使用した５０％（ｗ／ｖ）濃度の試験用人工海水について、ｐＨをそれぞれ３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０および９．０に調整した試験用人工海水をそれぞれ調製し、それぞれの試験用人工海水において、ｍｈ１８８２株、ｍｈ１９１１株、ｍｈ１９１２株およびｍｈ１９１３株、ならびに従来株であるｍｈ０１８６株を室温にて７２時間培養し、濁度（ＯＤ６６０）を測定することにより繁殖度合いの比較を行った。その結果を図４に示す。
【００６０】
図４に示すように、ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株については試験用人工海水濃度のｐＨが６．０〜７．０の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１２株については試験用人工海水濃度のｐＨが６．０〜８．０の場合に最も繁殖し、ｍｈ１９１３株については試験用人工海水濃度のｐＨが７．０〜８．０の場合に最も繁殖することが確認された。これらに対し、従来株であるｍｈ０１８６株については試験用人工海水濃度のｐＨが４．０〜７．０の場合に最も繁殖し、特に、ｐＨ４．０という比較的低ｐＨの場合にも十分に繁殖することが確認された。
【００６１】
＜実施例５＞オーランチオキトリウム属に属する新規微生物株の体内において生成される脂肪酸組成の解析
オーランチオキトリウム属に属する新規微生物株であるｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸の組成解析を行った。具体的には、これら微生物体を凍結乾燥し、Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２６：４９７〜５０９，１９５７）に従って凍結乾燥した微生物体から脂質を抽出した後、１０％（ｗ／ｖ）ＨＣｌ−メタノール溶液を用いてメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィーにて解析した。ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株についてのガスクロマトグラフィーチャートの内容を図５および図６に示し、ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株の体内において生成される脂肪酸の組成を下記に示す。
【００６２】
（ｉ）ｍｈ１８８２における体内生成脂肪酸組成（ＧＣ％）
Ｃ１５：０                                ４．００
Ｃ１６：０                              ２０．２１
Ｃ１７：０                                ８．４７
Ｃ１８：０                                ６．９５
Ｃ２０：４（ｎ−６）                      １．５０
Ｃ２０：５（ｎ−３）                      １．７６
Ｃ２２：５（ｎ−６）                    １０．７３
Ｃ２２：６（ｎ−３）                    ４０．３１
（ｉ）ｍｈ１９１１における体内生成脂肪酸の組成（ＧＣ％）
Ｃ１４：０                                １．８９
Ｃ１５：０                                ４．１５
Ｃ１６：０                              ４０．２２
Ｃ１７：０                                １．９２
Ｃ１８：０                                ２．９１
Ｃ２０：４（ｎ−６）                      ０．６０
Ｃ２０：５（ｎ−３）                      １．９０
Ｃ２２：５（ｎ−６）                      ７．４８
Ｃ２２：６（ｎ−３）                    ３１．８２
【００６３】
図５、図６および上記ｍｈ１８８２株およびｍｈ１９１１株における体内生成脂肪酸組成に示すように、ｍｈ１８８２株の体内において最も多く生成される脂肪酸はｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、次いで多く生成される脂肪酸は飽和脂肪酸であるパルミチン酸（Ｃ１６：０）、さらに次いで多く生成される脂肪酸はｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））であり、ｍｈ１９１１株の体内において最も多く生成される脂肪酸は飽和脂肪酸であるパルミチン酸（Ｃ１６：０）、次いで多く生成される脂肪酸はｎ−３（ω−３）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、さらに次いで多く生成される脂肪酸はｎ−６（ω−６）系不飽和脂肪酸（Ｃ２２：５（ｎ−６）））であることが明らかになった。