(57)【要約】【課題】アフィニティークロマトグラフィー用担体の動的結合容量の低下を抑制する手段を提供すること。【解決手段】アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに、抗体を含む液体を添加する工程と、前記抗体を含む液体に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、前記抗体を前記カラムから溶出させる工程と、前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程とを含む、抗体の精製方法であって、前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、
前記平衡化したカラムに、抗体を含む液体を添加する工程と、
前記抗体を含む液体に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、
前記抗体を前記カラムから溶出させる工程と、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程とを含む、抗体の精製方法であって、
前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、
精製方法。
【請求項２】
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体が、抗体吸着性リガンドが固定された担体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程を含む、担体の洗浄方法であって、
前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、
洗浄方法。
【請求項４】
抗体吸着性リガンドが固定されたアフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程を含む、担体の洗浄方法であって、
前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、
洗浄方法。
【請求項５】
前記抗体吸着性リガンドが、タンパク質リガンドである、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質リガンドが、プロテインＡ又はＦｃ結合性タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を精製する方法及び担体を洗浄する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた抗体発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞等）を培養した後、アフィニティークロマトグラフィー等で精製することで得られている。
また、上記アフィニティークロマトグラフィーには、抗体を特異的に吸着可能な物質（リガンド）を固定した担体が一般に用いられている。リガンドは、イオン相互作用、疎水相互作用、水素結合、弱い共有結合、キレート結合等を抗体との間に複合的かつ立体的に形成する。
アフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、抗体を含む液体試料に含まれる夾雑物（例えば、培養細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ(Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））や核酸、膜成分、代謝物質、培養液由来の成分の他、リガンドや担体が剥離したもの等）が除去され、抗体を高純度に精製できるとされているが、液体試料に含まれる夾雑物も、弱い結合力ながら担体に吸着し残存してしまい、このことが、抗体の精製純度が低下する要因や担体の再利用を困難にする要因となっていた（特許文献１、並びに非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−２０６０４６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ，１１０２，２２４−２３１，２００６
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．２４，１１１５−１１２１，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのため、担体に吸着したＨＣＰ等の夾雑物の持ち越しをなくすために、抗体を溶出させた後に塩基性液体を用いた担体の洗浄が実施されるが、プロテインＡ等のリガンドは塩基性液体により劣化し、動的結合容量が洗浄するたびに徐々に低下していくという問題があった。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、アフィニティークロマトグラフィー用担体の動的結合容量の低下を抑制する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、下記の手段により解決された。
＜１＞  アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに、抗体を含む液体を添加する工程と、前記抗体を含む液体に含まれる夾雑物を洗浄する工程と、前記抗体を前記カラムから溶出させる工程と、前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程とを含む、抗体の精製方法であって、前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、精製方法（以下、本発明の精製方法とも称する）。
＜２＞  前記アフィニティークロマトグラフィー用担体が、抗体吸着性リガンドが固定された担体である、＜１＞に記載の精製方法。
＜３＞  アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程を含む、担体の洗浄方法であって、前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、洗浄方法（以下、本発明の洗浄方法とも称する）。
＜４＞  抗体吸着性リガンドが固定されたアフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程を含む、担体の洗浄方法であって、前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とする、洗浄方法。
＜５＞  前記抗体吸着性リガンドが、タンパク質リガンドである、＜２＞又は＜４＞に記載の方法。
＜６＞  前記タンパク質リガンドが、プロテインＡ又はＦｃ結合性タンパク質である、＜５＞に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の精製方法及び洗浄方法により、アフィニティークロマトグラフィー用担体の動的結合容量の低下を抑制することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜精製方法＞
本発明の精製方法は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程（以下、工程Ａとも称する）と、前記平衡化したカラムに、抗体を含む液体を添加する工程（以下、工程Ｂとも称する）と、前記抗体を含む液体に含まれる夾雑物を洗浄する工程（以下、工程Ｃとも称する）と、前記抗体を前記カラムから溶出させる工程（以下、工程Ｄとも称する）と、前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程（以下、工程Ｅとも称する）とを含む、抗体の精製方法であって、工程Ｅを、２０℃以下で行うことを特徴とするものである。なお、数値範囲等を表す「ａ〜ｂ」等の表記は、特に断りのない限りａ及びｂをその数値範囲に含むものであり、「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
以下、本発明の精製方法について説明する。
【００１０】
（アフィニティークロマトグラフィー用担体）
本発明の精製方法で使用するアフィニティークロマトグラフィー用担体は、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、抗体吸着性リガンドが固定された担体が挙げられる。
上記抗体吸着性リガンドとしては、タンパク質リガンドが好ましい。具体的には、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合性タンパク質、（ストレプト）アビジン、レクチン、それらの機能性変異体等が挙げられる。なお、抗体吸着性リガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるフラグメントを用いてもよい。
これらの中でも、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合性タンパク質及びそれらの機能性変異体から選ばれる１種以上が好ましく、プロテインＡ、Ｆｃ結合性タンパク質が特に好ましい。Ｆｃ結合性タンパク質は特に限定されないが、例えば、特開２０１１−２０６０４６号公報に記載のＦｃ結合性タンパク質等が挙げられる。
【００１１】
担体の材質としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の天然高分子；ポリスチレン系樹脂、メタクリレート系樹脂等の合成高分子；シリカ；ガラス等が挙げられ、これらのうち１種が単独で用いられていてもよく、２種以上が用いられていてもよい。
また、担体の形状としては、粒子状、中空繊維状、不織布状、フィルター状、モノリス状が挙げられる。これらの中でも、粒子状が好ましい。
【００１２】
（工程Ａ）
工程Ａは、上記アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラムを平衡化する工程である。
【００１３】
ここで、工程Ａ及び工程Ｃにおいて、系中のｐＨは、リガンドの変性を抑える点や工程Ｃにおける抗体の溶出を抑える点から、好ましくは５以上であり、より好ましくは５〜１２の範囲であり、更に好ましくは５〜１０の範囲であり、特に好ましくは６〜８の範囲（中性付近）である。また、ｐＨをこのような範囲とするために、工程Ａ、Ｃは緩衝液を用いて行うのが好ましい。
上記緩衝液に使用する緩衝剤は特に限定されないが、リン酸ナトリウム等のリン酸塩、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシアミノメタン）、ホウ酸、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等が挙げられる。また、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）やＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）といったグッドバッファー系緩衝剤を用いてもよい。また、緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてもよい。また、緩衝剤の濃度は、最終濃度で、好ましくは１０〜１００ｍＭ（１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ）程度である。
また、上記緩衝液としては、塩類を含むものが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウム等のアルカリ金属塩化物が挙げられる。塩類の濃度は、最終濃度で、好ましくは２０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上であり、また、最終濃度で、好ましくは１２００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。
【００１４】
工程Ａ及び工程Ｃにおける緩衝液の使用量は、通常、カラム容量の１〜１０倍であり、好ましくはカラム容量の３〜５倍である。
【００１５】
（工程Ｂ）
工程Ｂは、平衡化したカラムに、抗体を含む液体を添加する工程である。工程Ｂにより、液体試料中の抗体が担体に接触し吸着される。
抗体を含む液体としては、例えば、ハイブリドーマを培養した際の培養液と抗体との混合液が挙げられる。この場合、培養液に含まれる抗体以外の成分が夾雑物として挙げられる。
本発明における抗体としては、例えば、ＩｇＧ抗体のＣＨ２／ＣＨ３領域（ＣＨ２領域及びＣＨ３領域）を含むタンパク質を有する抗体、Ｆｃ融合タンパク質、組換えタンパク質等が挙げられる。
なお、工程Ｂにおいては、液体試料を緩衝液で希釈して用いてもよい。緩衝液としては、工程Ａで使用されるものと同様のものが挙げられる。
【００１６】
工程Ｂにおける抗体を含む液体の使用量は、通常、当該液体に含まれる抗体の使用量が、カラムに充填されたアフィニティークロマトグラフィー用担体の吸着容量の５０〜１００質量％の範囲となる量であり、好ましくは吸着容量の６０〜９０質量％の範囲となる量、より好ましくは７５〜８５質量％である。吸着容量は抗体を吸着させる際のカラムの流速等の条件により変化するが、例えば実施例に記載の手法により動的結合容量（抗体量ｍｇ／カラム粒子体積ｍＬ）として算出できる。使用するカラム粒子の量、流速、抗体の濃度等に応じて、上記の使用量を選定すればよい。
なお、工程Ｂにおいては、アフィニティークロマトグラフィー用担体と抗体が接触した状態を保持させてもよく、この場合、保持時間は、特に限定はされないが、通常１〜６０分間であり、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは２〜８分間である。
【００１７】
（工程Ｃ）
工程Ｃは、抗体を含む液体に含まれる夾雑物を洗浄する中間洗浄工程である。
工程Ｃにおいては、中間洗浄に使用する洗浄液に上記緩衝液、上記塩類、水溶性有機溶媒、非イオン系界面活性剤及び疎水性アミノ酸から選ばれる１種以上を含有せしめて用いてもよい。これにより、抗体とアフィニティークロマトグラフィー用担体との疎水的な相互作用がコントロールしやすくなる。
【００１８】
水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、ブタノール等の炭素数１〜６程度の直鎖状又は分岐状のアルコールの他、アセトニトリル、アセトン、ベンジルアルコール等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で用いてもよく２種以上を組み合わせて用いてもよい。
水溶性有機溶媒を使用する場合、その使用量は、通常０．１〜２５％（ｖ／ｖ）の範囲であり、好ましくは５〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。
非イオン系界面活性剤としては、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０（以上商品名）等）やＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で用いてもよく２種以上を組み合わせて用いてもよい。
非イオン系界面活性剤を使用する場合、その使用量は、臨界ミセル濃度以上の常用濃度となるように添加すればよく、好ましくは０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の範囲である。
疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリンが挙げられる。
疎水性アミノ酸を使用する場合、その使用量は、溶解可能な濃度域であればよく、好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍの範囲、より好ましくは２００ｍＭ〜４００ｍＭの範囲である。
【００１９】
また、工程Ｃで用いる洗浄液には、水素結合の形成を阻害する物質を含有せしめてもよい。これにより、抗体とアフィニティークロマトグラフィー用担体との水素結合の強さをコントロールしやすくなる。
水素結合の形成を阻害する物質としては尿素が挙げられ、グアニジン塩酸塩等のグアニジウム塩を用いてもよい。
水素結合の形成を阻害する物質を使用する場合、その使用量は、最終濃度で、通常０．３Ｍ以上であり、好ましくは０．５Ｍ以上であり、より好ましくは０．５〜３Ｍの範囲である。
なお、工程Ｃで用いる洗浄液には、上記水溶性有機溶媒や非イオン系界面活性剤、疎水性アミノ酸と、上記水素結合の形成を阻害する物質とを組み合わせて含有せしめてもよい。これにより、工程Ｃによる夾雑物の洗浄効果をさらに高めることができる。
【００２０】
なお、工程Ｃで用いる洗浄液は、上記のとおり、塩類を含むものが好ましい。また、塩類の濃度は上記のとおりである。
【００２１】
（工程Ｄ）
工程Ｄは、抗体をカラムから溶出させる工程である。
工程Ｄは、溶出バッファーを用いて行うのが好ましい。溶出バッファーは担体の種類に応じて選択すればよいが、プロテインＡ等のタンパク質リガンドの場合は、酸性緩衝液が好ましい。酸性緩衝液のｐＨは、好ましくは２〜６の範囲であり、より好ましくは３〜６の範囲であり、特に好ましくは３〜５の範囲である。また、酸性緩衝液としては、クエン酸や酢酸等の有機酸の塩を用いた酸性緩衝液が挙げられる。有機酸の塩の濃度は、最終濃度で、好ましくは１０〜１００ｍＭ程度である。
【００２２】
工程Ｄにおける溶出バッファーの使用量は、通常、カラム容量の０．２〜１０倍であり、好ましくはカラム容量の１〜５倍である。
【００２３】
なお、工程Ｅに先立ち、工程Ｄで抗体を溶出させたカラムを平衡化してもよい。当該平衡化は、工程Ａと同様にして行えばよい。
また、工程Ｄにより溶出した抗体をカラムから回収することができる。抗体を回収する方法としては、例えば、クロマトグラフィーシステムのフラクションコレクターを用いる方法が挙げられる。
【００２４】
なお、上記工程Ａ〜Ｄを実施する温度は特に限定されないが、好ましくは１〜４０℃であり、より好ましくは１〜３０℃である。
【００２５】
（工程Ｅ）
工程Ｅは、アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体を用いて２０℃以下で洗浄する工程である。工程Ｅにおける洗浄はアルカリ洗浄であり、動的結合容量の低下を抑制する点や操作の容易性の点から、定置洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）が好ましい。
【００２６】
工程Ｅで用いる塩基性の液体としては、塩基性化合物の水溶液が好ましい。塩基性化合物は、塩基性無機化合物と塩基性有機化合物とに大別されるが、本発明の所望の効果を高める点から、塩基性無機化合物が好ましい。
塩基性無機化合物としては、金属の水酸化物、アンモニア等が挙げられる。この中でも、本発明の所望の効果を高める点から、金属の水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物がより好ましく、アルカリ金属の水酸化物が更に好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
塩基性の液体としては、水酸化ナトリウム水溶液が特に好ましい。
【００２７】
塩基性化合物の濃度は、本発明の所望の効果を高める点から、最終濃度で、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上、更に好ましくは５０ｍＭ以上、特に好ましくは１００ｍＭ以上であり、また、本発明の所望の効果を高める点から、最終濃度で、好ましくは２Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下、更に好ましくは１Ｍ以下、特に好ましくは０．５Ｍ以下である。
【００２８】
工程Ｅにおける洗浄温度は２０℃以下である。この構成によって、アフィニティークロマトグラフィー用担体の動的結合容量の低下を抑制することができる。
工程Ｅにおける洗浄温度は、本発明の所望の効果を高める点から、１７．５℃以下が好ましく、１５℃以下がより好ましく、１２．５℃以下が更に好ましく、１０℃以下が更に好ましく、８℃以下が特に好ましい。また、洗浄温度は、塩基性液体の凝固点を超えていればよいが、好ましくは１℃以上である。
また、洗浄温度を２０℃以下にするにあたっては、カラム容器ごと２０℃以下に冷却してもよく、洗浄液の温度を直接２０℃以下に制御してもよい。また、精製方法の全工程を２０℃以下で実施しても、工程Ｅのみを２０℃以下で実施してもよい。
【００２９】
工程Ｅにおける塩基性液体の使用量は、通常、カラム容量の１〜１０倍であり、好ましくはカラム容量の３〜５倍である。
工程Ｅにおける洗浄時間は、工程１回あたり、好ましくは１分間〜６０分間であり、より好ましくは５分間〜４０分間であり、特に好ましくは１５分間〜３０分間である。なお、工程Ｅを行う回数は、１回でも複数回でもよい。
【００３０】
＜洗浄方法＞
本発明の洗浄方法は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を塩基性の液体で洗浄する工程を含む、担体の洗浄方法であって、前記塩基性の液体で洗浄する工程を、２０℃以下で行うことを特徴とするものである。
本発明の洗浄方法における洗浄工程は、本発明の精製方法における工程Ｅと同様である。アフィニティークロマトグラフィー用担体についても、本発明の精製方法で用いるものとして挙げたものを使用できる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
〔試験例（塩基性液体による動的結合容量低下の比較）〕
カラムに充填したアフィニティークロマトグラフィー用担体の動的結合容量（ＤＢＣ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ）を測定したのち、塩基性液体（０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）でカラム内を置換して、所定の温度（実施例１：２０℃、実施例２：１５℃、実施例３：１０℃、実施例４及び５：６℃、比較例：２５℃）にて１５時間静置し、動的結合容量を再度測定することで、塩基性液体による動的結合量低下を比較した。具体的な手順は以下のとおりである。なお、複数回（複数サイクル）の使用を経た場合を想定し、塩基性液体浸漬後に長時間の静置を行った。
【００３３】
（初期ＤＢＣ測定）
ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５０／２００カラムに、プロテインＡが固定された担体（ＪＳＲライフサイエンス社製  ＡｍｓｐｈｅｒｅTM  Ａ３）４ｍＬを充填し、このカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓに接続した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）５ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｖｏｌｕｍｅ：カラム充填体積）を、２３℃環境下流速１ｍＬ／分で送液することで、カラムを平衡化した。
その後、保持時間４分における抗体（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対するＤＢＣを測定した。抗体は、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用して２３℃環境下流速１ｍＬ／分で送液し、溶出先端１０％ブレークスルーのときの抗体捕捉量とカラム充填体積から初期ＤＢＣを求めた。
【００３４】
（実施例１）
初期ＤＢＣ測定後、２３℃環境下にて、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）５ＣＶを流速２．０ｍＬ／分で送液することで未吸着の抗体を洗浄し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ３．２）５ＣＶを流速１．０ｍＬ／分で送液することで抗体の溶出を実施した。次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）５ＣＶを流速２．０ｍＬ／分で送液することで、カラムを再度平衡化した。
その後、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を流速１．０ｍＬ／分にて１０分間通液することでカラム内を置換し、２０℃の環境下で１５時間静置したのち、上記初期ＤＢＣの測定に則り、塩基性液体浸漬後のＤＢＣを測定し、初期ＤＢＣからの維持率を算出した。
【００３５】
（実施例２〜４）
塩基性液体浸漬後の静置温度を、１５℃（実施例２）、１０℃（実施例３）、６℃（実施例４）に変更する以外は実施例１と同様の操作を行い、初期ＤＢＣと静置後のＤＢＣの比較を実施した。
【００３６】
（比較例）
塩基性液体浸漬後の静置温度を２５℃に変更する以外は実施例１と同様の操作を行い、初期ＤＢＣと静置後のＤＢＣの比較を実施した。
【００３７】
（測定結果）
各実施例、比較例の測定結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2017222613.tif 000002
【００３９】
（実施例５）
工程Ａ〜工程Ｅに該当する手順（初期ＤＢＣ測定前の平衡化から塩基性液体浸漬後の静置まで）をすべて６℃の冷蔵庫内にて実施する以外は、実施例４と同様の操作を行い、初期ＤＢＣと静置後のＤＢＣの比較を実施した。その結果、実施例４とほぼ同様の結果が得られた。