(57)【要約】      （修正有）【課題】神経突起の形成を促進し、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の予防又は治療に有効な手段の提供。【解決手段】八朔の植物乳酸菌発酵物、又は田七人参、杜仲、甘草及び黄精から選ばれる１種以上を含有する生薬組成物の植物乳酸菌発酵物を有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。植物乳酸菌が、ラクトバチルスプランタラム、ラクトバチルスブレビス、ペディオコッカスペントサセウス、及びラクトバチルスロイテリから選ばれる１種以上である上記の神経変性疾患の予防、改善又は治療剤。生薬組成物が、田七人参、杜仲、甘草及び黄精の全てを含む神経変性疾患の予防又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
八朔の植物乳酸菌発酵物、又は田七人参、杜仲、甘草及び黄精から選ばれる１種以上を含有する生薬組成物の植物乳酸菌発酵物を有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
植物乳酸菌が、ラクトバチルス  プランタラム、ラクトバチルス  ブレビス、ペディオコッカス  ペントサセウス及びラクトバチルス  ロイテリから選ばれる１種以上である請求項１に記載の神経変性疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
植物乳酸菌が、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株、ディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株、ラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株及びラクトバチルス  ロイテリＢＭ５３−１株から選ばれる１種以上である請求項１に記載の神経変性疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
生薬組成物が、田七人参、杜仲、甘草及び黄精の全てを含む請求項１〜３のいずれか１項記載の神経変性疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経変性疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、系統的な神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態である。代表的な疾患として、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、緑内障が知られているほか、自閉症との関連性も議論されている。
このうち、アルツハイマー型認知症は初老期に発病する進行性の神経変性疾患であり、認知症の５０％を占めるとされ、近年、その患者数は高齢者人口の増加とともに増え、わが国の６５歳の高齢者の１４％ほどが現在認知症を患っており、社会的に重要な疾患となっている。
【０００３】
神経変性疾患の原因である神経変性死のメカニズムには多くの分子群が複雑に関与し、それらの発現、機能異常が生じているものと予想される。しかしながら、その分子病態については解明されたものはほとんどなく、有効な神経変性の抑制方法も確立されていない。アルツハイマー病の発症機序として現在最も有力な説は、ベータアミロイドタンパク質が脳内に異常沈着することにより神経変性が誘導され、その結果認知障害を発症するというものである。
【０００４】
アルツハイマー病治療薬の代表的なものとして現在コリンエステラーゼ阻害を主作用に持つドネペジル等が上市されているが、当該薬剤は記憶学習機能に関連するコリン作動性神経を賦活することにより一過的に症状を緩和するいわば対処療法的な位置づけにあり、神経の変性の進行抑制ないしは神経再生を誘導する機序やアルツハイマー病発症原因自体を取り除く原因療法的治療薬は未だ存在していないのが現状である。
【０００５】
したがって、中枢神経系の神経細胞に作用し、神経細胞を活性化し、神経突起の萎縮を抑制或いは神経突起の形成を促進させて神経変性を抑制し、それに伴う病態や臨床症状を予防もしくは治療することができる神経変性疾患剤の開発が切望されている。
【０００６】
例えば、特許文献１では、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の治療、予防のために、海馬BDNF発現を増加させる目的で、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC  BAA-９９９を含む食用組成物、健康補助食品、医療用組成物が提案されている。
また、特許文献２では、乳酸菌の表面にワクチン抗原たるＡβ（アミロイドβ）分子種を発現する乳酸菌を固体に投与することにより抗アミロイドβ抗体を誘導し、アミロイドβに対する免疫を固体に誘導してアルツハイマー病の予防、治療方法が提案されている。
また、特許文献３では、抗アルツハイマー用組成物及び食品として、大豆を納豆菌等で発酵させた発酵物の抽出物を含む組成物が提案されている。
また、特許文献４では、酸化及び抗老化機能及び認知症改善効果を有する新規の乳酸菌として、キムチから分離したラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルム（Lactobacillus pentosus var. plantarum）Ｃ２９  ＫＣＣＭ１１２９１Ｐ及びラクトバチルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）Ｃ３  ＫＣＣＭ４３０００９を有効成分として含む抗酸化及び抗老化薬学組成物及び健康機能食品、認知症予防または治療用組成物及び認知症予防または改善用健康機能食品、Ｃ２９またはＣ３菌株で発酵した発酵組成物を有効成分として含む認知症の予防または治療用組成物が提案されている。
また、非特許文献１では、柑橘類の成分ノビレチンや生薬エキスにNGF（nerve growth factor）神経突起伸展作用を増強する効果のあることが報告されている。
【０００７】
一方、八朔（学名：Citrus hassaku Hort．）は、元々は広島が原産のミカン科の常緑高木で、柑橘類の一つである。また、その果皮は、芳香性の健胃薬として腹痛、膨満感、便秘等の治療又は予防に使用され、また咳又は痰を鎮めるためにも使用される。さらに、八朔中に含まれるノビレチンにはアンドロゲン受容体結合阻害作用があり、男性型禿頭、多毛症、脂漏症等に有効であることが報告されている（特許文献５）。
また、田七人参、杜仲、甘草及び黄精を含む生薬組成物（例えば、「養生片仔廣」（登録商標）」）は、血中ＧＰＴ（ＡＬＴとも呼ぶ）及びＧＯＴ（ＡＳＴ）を正常化し、肝機能改善作用を有するサプリメントとして知られ、肝癌に対する抑制作用を有すること（特許文献６）や、コレステロール血症、高血圧症等の生活習慣病の改善に（特許文献７）に有効であることも報告されている。
【０００８】
しかしながら、八朔や田七人参、杜仲、甘草及び黄精を含む生薬組成物を含む培地で乳酸菌培養して得られた発酵物が、神経変性疾患に有効であることは、これまで全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１５−７７１３３号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１２６６８２号
【特許文献３】特開２０１３−１０７８７２号公報
【特許文献４】特表２０１５−５２６０８５号公報
【特許文献５】特開２００５−２０６５４６号公報
【特許文献６】特開２００６−１１７５８８号公報
【特許文献７】特開２０００−１３９４０５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Yasushi Ohizumia,YAKUGAKU ZASSHI 135(3) 449-464(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、神経突起の形成を促進し、アルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障等の神経変性疾患の予防又は治療に有効な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、酒粕を含む八朔果汁を培地とした植物乳酸菌発酵物又は田七人参、杜仲、甘草及び黄精を含む生薬組成物の植物乳酸菌発酵物に、神経突起形成促進作用があり、これらが神経変性疾患の予防又は治療に有用であることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）八朔の植物乳酸菌発酵物、又は田七人参、杜仲、甘草及び黄精から選ばれる１種以上を含有する生薬組成物の植物乳酸菌発酵物を有効成分とする神経変性疾患の予防又は治療剤。
２）植物乳酸菌が、ラクトバチルス  プランタラム、ラクトバチルス  ブレビス、ペディオコッカス  ペントサセウス、及びラクトバチルス  ロイテリから選ばれる１種以上である１）に記載の神経変性疾患の予防、改善又は治療剤。
３）植物乳酸菌が、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株、ぺディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株及びラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株及びラクトバチルス  ロイテリＢＭ５３−１株から選ばれる１種以上である１）に記載の神経変性疾患の予防、改善又は治療剤。
４）生薬組成物が、田七人参、杜仲、甘草及び黄精の全てを含む１）〜３）のいずれかの神経変性疾患の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の神経変性疾患の予防又は治療剤によれば、特定の神経細胞の変性、脱落を伴うアルツハイマー病、パーキンソン病等の予防、改善又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＣ−１２細胞における神経突起形成促進作用。（１）ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株のＭＲＳ培地での培養物、（２）ＹＨＫを含むＭＲＳ培地（乳酸菌発酵無し）、（３）ＹＨＫの植物乳酸菌（ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株）発酵物、（４）八朔果汁（乳酸菌発酵無し）、（５）八朔果汁の植物乳酸菌（ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株）発酵物。
【図２】ＹＨＫの植物発酵物のｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−１転写活性。１７４Ａ：ラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株、ＳＮ３５Ｎ：ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株、ＬＰ２８：ぺディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の植物乳酸菌発酵物は、「八朔（ハッサク）」又は「田七、杜仲、甘草及び黄精を含む生薬組成物」を植物乳酸菌で発酵させた発酵物である。
【００１７】
「八朔」は、広島県が原産で、和歌山県等で盛んに栽培されているミカン科の常緑高木であり、その学名は「Citrus hassaku Hort．」である。
乳酸菌発酵に供する部位は、果実、果皮等が挙げられるが、果実が好ましい。
【００１８】
本発明において、八朔は、ミキサー等を用いて摩砕し、必要に応じて発酵に適した形状、例えばピューレ状（果皮を含む）、搾汁、八朔抽出液（八朔を水等の抽出溶媒で抽出した液）、若しくはこれらの濃縮液、又は八朔の果皮を粉末化したものをそのまま、或いはこれらを蒸留水等で適当な濃度に希釈して発酵原料とすることができる。
【００１９】
本発明において、田七人参、杜仲、甘草及び黄精から選ばれる１種以上を含有する生薬組成物（以下、「生薬組成物」とも称する）としては、田七人参、杜仲、甘草及び黄精の一種以上を組み合わせて用いることができるが、田七人参、杜仲、甘草及び黄精の４種を含むものが好ましい。田七人参、杜仲、甘草及び黄精を含む生薬組成物としては、好適には、組成物中に、田七を１０〜９０質量％、好ましくは３０〜９０質量％、杜仲を１０〜９０質量％、好ましくは１０〜７０質量％、より好ましくは４０〜９０質量％、甘草を４〜１５質量％、より好ましくは６〜１１重量％、黄精を４〜２０質量％、好ましくは６〜１２質量％を含有する組成物が挙げられ、さらに高麗人参（朝鮮人参）を５〜２０質量％含有するもの、さらには、蜂蜜を３０質量％以下で含むものが好適に例示される。より具体的には、田七５５質量％、杜仲２５質量％、黄精１０質量％、甘草５質量％、高麗人参３質量％、及び蜂蜜２質量％を含有する組成物が例示できる。
【００２０】
ここで、「田七人参」は、三七人参とも呼ばれ、中国原産のサンシチニンジン Panax pseudo-ginseng Wall.の根を、「杜仲」は、トチュウ科のトチュウ Eucommiae ulmoidesの樹皮の乾燥物を、「黄精」は、Polygonati Rhizoma又はSiberian Solomonseal Rhizomeとも称され、Polygonatum属の起源植物の根茎の乾燥物を、「甘草」は、マメ科のGlycyrrhiza属植物であるGlycyrrhiza glabra Linnの根及び走茎の乾燥物を、それぞれ意味する。
【００２１】
上記生薬組成物は、田七人参、杜仲、黄精及び甘草の各熱水抽出物を乾燥させたエキスに、適宜高麗人蔘エキスや蜂蜜を加えて混合し、粉末状又は粉末顆粒状とすることにより調製することができる。
本発明の生薬組成物としては、田七人参、杜仲、黄精及び甘草を含有する市販の「養生片仔廣（登録商標）」（株式会社 協通事業）を用いることもできる。
【００２２】
本発明において、植物乳酸菌とは植物由来の乳酸菌をいい、例えば穀物、野菜、果物、あるいはこれらを原材料に含む発酵食品から分離されたものを使用することができる。具体的には、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株（分離源：ソーセージ）、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ２６Ｔ株（分離源：ソーセージ）、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株（分離源：ナシ）、ラクトバチルス  プランタラムＪＣＭ  １１４９株（分離源：塩漬キャベツ）、ラクトバチルス  プランタラムＪＣＭ  ８３４８株（分離源：コメ）、ラクトバチルス  プランタラムＩＦＯ３０７０株（ＪＣＭ  １０５７株）、ラクトバチルス  カゼイＫ−１株（分離源：亀田  植物乳酸菌ヨーグルト）、ラクトバチルス  カゼイＪＣＭ  ８１３６株（分離源：不明）、ペディオコッカス  ペントサセウス（分離源：大塚  野菜の戦士）、ペディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株（分離源：ロンガン）、ペディオコッカスＪＣＭ  ５８８５株（分離源：酒もろみ）、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｍ株（分離源：メロン）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスペシース  ラクティス  ＳＮ２６Ｎ株（分離源：ナシ）、エンテロコッカス  スペシースＳＮ２１Ｉ株（分離源：イチジク）及びエンテロコッカス  ムンヅティＳＮ２９Ｎ株（分離源：ナシ）ラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株（分離源：伊予柑  ＮＩＴＥ  ＡＰ−００２２４７）のほか、ラクトバチルス  ヒルガルディＮＢＲＣ１５８８６（分離源：ワイン）等が挙げられ、このうち、ラクトバチルス  プランタラム、ラクトバチルス  ブレビス、ペディオコッカス  ペントサセウス、ラクトバチルス  ロイテリＢＭ５３−１（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１２８）が好ましい。
中でも、本発明者により分離され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託されている、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株(ＮＩＴＥ  Ｐ−７)、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株(ＮＩＴＥ  Ｐ−６)、ディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株（ＮＩＴＥ ＢＰ−７００）及びラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株 （ＮＩＴＥ  ＡＰ−００２２４７）、ラクトバチルス  ロイテリＢＭ５３−１（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１２６）がより好ましい。
【００２３】
八朔や生薬組成物に植物乳酸菌を接種する方法は特に制限されず、例えば上記の発酵に適した形状にした八朔や生薬組成物に菌体を混合する方法、発酵に適した形状の八朔や生薬組成物を溶解又は懸濁した水に菌体を混合する方法、菌体を適当な液体培地（例えば、ＭＲＳ培地）で培養した培養液を、発酵に適した形状の八朔や生薬組成物に接触させる方法、発酵に適した形状の八朔や生薬組成物を溶解又は懸濁した上記液体培地で植物乳酸菌を培養する方法などである。ここで、培養に際しては、酒粕を添加するのが当該植物乳酸菌の増殖を促進させる点から好ましい。特に八朔の植物乳酸菌発酵物を製造する場合には、酒粕の存在下で培養することが必要である。酒粕の添加量は、培地中に好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．０５〜１質量％である。
【００２４】
発酵に際しては、植物乳酸菌の一白金耳を種培養培地に接種することにより所定時間培養して種培養液とするが、本培養では本培養培地容量に対して１％〜２％程度の種培養液を接種後、３０〜４５℃の温度で１２〜７２時間、好ましくは１０時間〜３６時間培養することで乳酸菌発酵液を得る。発酵過程では発酵液のｐＨが徐々に低下するが、ｐＨが４．５以下になるまで発酵させることが好ましく、４．２以下がより好ましい。また、発酵は、好気発酵、嫌気発酵のいずれでも可能であり、好ましくは嫌気発酵である。好気発酵の場合には撹拌発酵よりも静置発酵が好ましい。
得られた発酵物は、必要に応じて加熱殺菌（通常、６０〜８５℃で２〜６０分間）した後、そのまま用いることができるが、遠心分離等の手段により、該発酵物から不溶物を除去して、その上清を用いることもできる。さらに、ろ過により菌体等を除いた上清を用いることもできる。
【００２５】
斯くして得られる本発明の植物乳酸菌発酵物は、後記実施例に示すように、ラット由来のＰＣ−１２細胞における神経突起の形成を促進することから、神経新生促進作用及び／又は神経再生促進作用を有すると考えられる。したがって、本発明の植物乳酸菌発酵物は、神経変性疾患の予防又は治療剤となり得、神経変性疾患の予防又は治療のために使用することができる。神経変性疾患の予防又は治療剤は、神経変性疾患の予防又は治療に有効な医薬品又は食品として、又は医薬品又は食品に配合する素材として使用可能である。
ここで、食品は、神経変性疾患の予防又は改善をコンセプトとし、その旨を表示した保険機能食品、例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等とすることが可能である。
【００２６】
本発明において、「神経変性疾患」としては、特定の神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態をいい、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳性運動失調症、脊髄性筋萎縮症、進行性核上麻痺、ハンチントン病等を挙げることができる。
【００２７】
本発明の植物乳酸菌発酵物を含む医薬品として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明の植物乳酸菌発酵物の作用を妨げない範囲で、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせることにより調製できる。
【００２８】
また、本発明の植物乳酸菌発酵物を含む食品の形態としては、果汁又は野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料や、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、佃煮などの各種食品組成物の他、サプリメントの如く上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
【００２９】
上記医薬品や食品における本発明の植物乳酸菌発酵物の含有量は、特に限定されず一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良い。一例として、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の含有量は、乾燥固形分として０．０１〜５０重量％、好ましくは０．０５〜１０重量％が良い。
【００３０】
上記医薬品や食品の摂取又は投与対象者としては、神経機能の低下した者、神経機能低下のリスクが高い者、例えばアルツハイマー病の患者、アルツハイマー病の疑いがある患者等が挙げられる。
【００３１】
本発明の神経変性疾患の予防又は改善剤は、１日１回又は数回に分けて投与することができ、投与量は特に制限されない。
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
製造例１  八朔の植物乳酸菌発酵物の調製
八朔濃縮果汁（株式会社ヒロシマ・コープ、広島県三原市）をBrix 17.0に合わせ、炭酸水素ナトリウムでpH5.2に調整した。その後、1% になるよう酒粕粉末を加え、100℃で10分間の熱処理により殺菌した。 準備した本培養培地に以下に示す植物乳酸菌株の前培養液を1%になるように加え、37℃で48時間の静置培養を行った。培養終了後、培養液を遠心し、その培養液上清を5N NaOHでpH5.5に調整後、フィルター殺菌したものを、八朔の植物乳酸菌発酵物として得た。
【００３３】
植物乳酸菌：ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株、ぺディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株及びラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株、ラクトバチルス  ロイテリ  ＢＭ５３−１株
【００３４】
製造例２  田七人参、杜仲、甘草及び黄精の４種を含む生薬組成物「養生片仔廣（登録商標）の植物乳酸菌発酵物の調製
「養生片仔廣（登録商標）」（株式会社 協通事業製；「ＹＨＫ」と略す」）のタブレット錠剤（0.25g重量/ 錠）を乳鉢ですり潰し、得られた粉末を20 (w/v) % となるよう蒸留水に懸濁し、60℃で, 4時間, 撹拌した。得られた懸濁液を遠心し、その上清を5% になるようMRS培地に加え, 121℃, 15分間の熱処理により殺菌した。これを培地として以下に示す植物乳酸菌株の前培養液（スターター）を1%になるように加え, 37℃, 48時間の静置培養を行った。培養終了後、培養液を遠心し、その培養液上清を5N NaOHでpH5.5に調整後、フィルター（0.22 μｍ 直径, アドバンテック）で濾過滅菌したものを生薬組成物の植物乳酸菌発酵物として得た。
【００３５】
植物乳酸菌：ラクトバチルス  プランタラムＳＮ１３Ｔ株、ラクトバチルス  プランタラムＳＮ３５Ｎ株、ディオコッカス  ペントサセウスＬＰ２８株及びラクトバチルス  ブレビス１７４Ａ株、ラクトバチルス  ロイテリ  ＢＭ５３−１株
【００３６】
試験例１  神経突起形成促進作用
１．方法
ラット副腎髄質褐色腫由来細胞（ＰＣ−１２細胞）の培養には、10%FBS及び抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するDMEMを用いた。100 mm 組織培養皿 (Falcon) に PC-12 細胞を播種した後，CO2 インキュベーターを用い、 37℃，5% CO2条件下で培養した． なお、3日に一度、 Trypsin-EDTA 処理して継代した。さらに、神経突起形成実験には、PC12細胞を、6ｘ105 cells/well になるように24-ウェルプレートへ播種し、24 時間培養した。培養終了後、培養液を除去し、1% FBS/ DMEM を加え6−8時間スタベーションを行った。そのあと、製造例１で調製した八朔の植物乳酸菌発酵物及び未発酵のサンプル（乳酸菌を接種しない八朔果汁）、製造例２で調製した生薬組成物の植物乳酸菌発酵物及び未発酵のサンプル（乳酸菌を接種しなかった培地のみ）を最終濃度5%になるよう加え、さらに4-5日間培養した。 
【００３７】
２．結果
図１（１）の写真のように, ラクトバチルス  プランタルム ＳＮ３５Ｎ株をＭＲＳ培地で培養し, 得られた培養液上清は, PC-12細胞の突起形成を引き起こさない。また、図１（２）のようにＹＨＫを含むMRS培地（乳酸菌培養なし）、及び図１（４）のように八朔果汁（乳酸菌培養なし）にはPC-12細胞の突起形成能は存在しない。
しかしながら、ＹＨＫの植物乳酸菌（ＳＮ３５Ｎ株）発酵物（図１（３））や、八朔果汁の植物乳酸菌（ＳＮ３５Ｎ株）発酵物（図１（５））ではＰＣ−１２細胞の突起形成を著しい促進が認められた。
尚、図１には、ラクトバチルス  プランタルム  ＳＮ３５Ｎ株を用いて発酵した発酵物の結果を示したが、製造例１及び２で示した植物乳酸菌株を用いた発酵物にはいずれも突起形成促進効果が認められ、そのうち、ラクトバチルス  プランタルム  ＳＮ３５Ｎ株とペディオコッカス  ペントサセウス  ＬＰ２８株はより効果が高かった。
【００３８】
実施例２  神経突起誘導能促進作用
１．方法
neurogenin-1は転写調節因子の１つであり、この発現量が多ければ神経突起誘導能が高いと判断できる。そこで、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて、neurogenin-1の発現量を測定した。すなわち、製造例２と同様に、ＹＨＫを添加したＭＲＳ培地で３種類の植物乳酸菌（Lb. brevis 174A; Lb. plantarum SN35N; P. pentosaceus LP28)を培養し、得られた各培養液上清（YHKの植物乳酸菌発酵物）をＰＣ−１２培養細胞に添加し、その神経細胞で発現するneurogenin-1をQ-PCRで定量した。
【００３９】
２．結果
未醗酵のＹＨＫ含有培地のみを添加した場合におけるＰＣ−１２細胞のneurogenin-1転写量を１としたときの、３種の各乳酸菌によるＹＨＫの発酵物を添加した際に誘導されるneurogenin-1転写量を図２に示した。
その結果、何れの植物乳酸菌発酵物においてもneurogenin-1の発現量が増加したが、特にＬＰ２８による発酵物においてneurogenin-1の発現量が高かった。
【図１】
2017222601.tif 000002
【図２】
2017222601.tif 000003