(57)【要約】【課題】タデアイの葉から得られたフラボノイド化合物の新たな用途を提供する。【解決手段】タデアイの葉から得られたフラボノイド化合物は、（成分１）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]、（成分２）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-Dグルコピラノシド]、（成分３）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]である。既知物質は、（成分４）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシドと、（成分５）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンを有する。これらのフラボノイド化合物は、抗炎症剤として有用である。【選択図】図３
2017149688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（一般式１）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物を有する抗炎症剤。
【化６】
2017149688.tif 000022
【請求項２】
（化学式１）、（化学式２）、（化学式３）、（化学式４）および（化学式５）のいずれかに示す化学構造体を有する抗炎症剤。
【化１】
2017149688.tif 000023
【化２】
2017149688.tif 000024
【化３】
2017149688.tif 000025
【化４】
2017149688.tif 000026
【化５】
2017149688.tif 000027
【請求項３】
（ａ）タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の葉を、水、アルコール、または、アセトンで抽出する抽出工程を、有し、
前記（ａ）工程で得られた抽出液は、（一般式１）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物を有する、抗炎症剤の製造方法。
【化６】
2017149688.tif 000028
【請求項４】
請求項３に記載の抗炎症剤の製造方法において、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた抽出液を、溶出し、精製する工程を有し、
前記溶出は、カラムを用いた溶出であり、
前記精製は、合成吸着剤を充填したカラムあるいは逆相カラムを用いて行われる、抗炎症剤の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の抗炎症剤の製造方法において、
前記（ｂ）工程は、前記（ａ）工程で得られた水抽出液から糖類およびタンパク質を取り除く工程を有する、抗炎症剤の製造方法。
【請求項６】
請求項３記載の抗炎症剤の製造方法において、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた抽出液を加水分解する工程を有する、抗炎症剤の製造方法。
【請求項７】
請求項３記載の抗炎症剤の製造方法において、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた抽出液を酵素分解する工程を有する、抗炎症剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タデアイから得られたフラボノイド化合物を利用した抗炎症剤およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タデアイは、東南アジア原産の一年生植物で、古くから藍染めの染料原料として用いられてきた。また、タデアイは古くから薬用植物として、解毒、解熱、消炎などの目的で利用されていた（非特許文献２参照）。また、日本の一部の地方では、タデアイはタデ酢などの食品原料としても利用されている。タデアイの成分の機能性については、抗癌作用（非特許文献２〜４参照）、抗炎症作用（非特許文献５参照）、抗酸化作用（非特許文献４、６参照）、抗アレルギー作用（非特許文献７参照）、抗菌作用（非特許文献８参照）、抗血液凝固作用（非特許文献１参照）などの様々な報告がある。
【０００３】
また、タデアイの機能性を示すポリフェノール成分として、没食子酸〔gallic acid〕、ケンペロール〔kaempferol〕、カフェイン酸〔caffeic acid〕、6-メトキシケンペロール〔6-methoxykaempferol〕、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシド〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-β-D-glucopyranoside〕などが確認されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
なお、非特許文献９は、タデアイの葉茎からポリフェノール類を抽出し、精製した本発明者の報告である。また、非特許文献１０は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕が結合している炭素原子のシグナルについての報告である。また、非特許文献１１は、ルチンの性質についての報告である。また、非特許文献１２〜１４は、フラボノイド配糖体の作用についての報告である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kohda, H., Niwa, A., Nakamoto, Y. and Takeda, O., Flavonoid glucosides from Polygonum tintorium. Chem. Pharm. Bull. 38, 523-524（1990）.
【非特許文献２】Iwaki,K. and Kurimoto, M., Cancer preventive effects of the indigo plant, Polygonum tinctorium. Recent Res. Devel. Cancer, 4, 429-437 （2002）.
【非特許文献３】Koya-Miyata, S., Kimoto, T., Micallef MJ., Hino, K., Taniguchi, M., Ushio, S., Iwaki, K., Ikeda, M. and Kurimoto, M., Preventioon of azoxymethane-induced intestianal tumors by a crude ethyl acetate-extract and tryptanthrin extracted from Polygonum tinctorium Lour., Anticancer Res.,21, 3295-3300 （2001）.
【非特許文献４】Jang, H.G., Heo, B.G., Park, Y.S., Namiesnik ,J., Barasch, D., Katrich, E., Vearasilp, K., Trakhtenberg, S. and Gorinstein S., Chemical composition, antioxidant and anticancer effects of the seeds and leaves of indigo （Polygonum tinctorium Ait.） plant. Appl Biochem Biotechnol. 167,1986-2004（2012）.
【非特許文献５】Micallef, M.J., Iwaki, K., Ishihara, T., Ushio, S., Aga, M., Kunikata, T., Koya-Miyata, S., Kimoto, T., Ikeda, M., Hino, K. and Kurimoto, M., The natural plant product tryptanthrin ameliorates dextran sodium sulfate- induced colitis in mice. Int.Immunopharmacol. 2, 565- 578 （2002）.
【非特許文献６】Kimoto, T., Koya, S., Hino, K., Yamamoto, Y., Aga, H.,Hashimoto, T., Masaki, N., Hanaya, T., Micallef, MJ., Iwaki, K., Ishihara, T., Ushio, S., Aga, M., Kunikata, T.,Arai, S., Ikeda, M., Fukuda, S. and Kurimoto, M., Protection by Indigo plant （Polygonum tinctorium Lour.） ageinst renal oxidative damage in mice treated with ferric nitrilotriacetate., Natural Medicines., 53, 291-296 （1999）.
【非特許文献７】Kunikata, T., Takefuji, T., Aga, H., Iwaki, K., Ikeda, M. and Kurimoto, M., Indirbin inhibits inflammatory reactions in delayed-type hypersensitivity. Eur. J. Pharmacol. 410, 93-100 （2000）.
【非特許文献８】Hashimoto, T., Aga, H., Chaen, H.: Fukuda, S. and Kurimoto, M., Isolation and identification of anti- helicobacter pyrori compounds from Polygonum tinctorium Lour. Natural Medicines., 53, 27-31 (1999).
【非特許文献９】Kimura, H., Ishihara, T., Michida, M., Ogawa, S., Akihiro, T. and Yokota, K., Identification and quantitative analysis of polyphenolic compounds from indigo plant （Polygonum tinctorium Lour）., Nat. prod. Res. 7, 492-495 （2014）.
【非特許文献１０】Wang, S-S., Zhang, X-J., Que, S., Tu, G-Z., Wan, D., Cheng, W., Liang, H., Ye, J., and Zang, Q-Y., 3-hydroxy-3-methylglutaryl flavonol glycosides from Oxytropis falcata. J. Nat. Prod., 75, 1359-1364（2012）.
【非特許文献１１】Fale, P.L., Ferreira, C., Maruzzella, F., Helena Florencio, M., Frazao, F.N., and Serralheiro, M.L., Evaluation of cholesterol absorption and biosynthesis by decoctions of Annona cherimola leaves. J. Ethnopharmacol., 150, 718-723 （2013）.
【非特許文献１２】Ishisaka, A., Kawabata, K., Miki, S., Shiba, Y., Minekawa, S., Nishikawa,T., Mukai, R., Terao, and J., Kawai, Y., Mitochondrial dysfunction leads to deconjugation of quercetin glucuronides in inflammatory macrophages, PLoS One,  8, e80843 (2013).
【非特許文献１３】Mullen, W., Edwards, C.A.  and Crozier, A., Absorption, excretion and metabolite profiling of methyl-, glucuronyl-,glucosyl- and sulpho-conjugates of quercetin in human plasma and urine after ingestion of onions, Br J Nutr. 96, 107-116 (2006).
【非特許文献１４】Perez-Vizcaino, F., Duarte, J. and Santos-Buelga, C., The flavonoid paradox: conjugation and deconjugation as key steps for the biological activity of flavonoids., J Sci Food Agric, 92, 1822-5(2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、上記のタデアイの有効成分に関する研究開発に従事しており、例えば、タデアイの葉茎からポリフェノール類を抽出、精製し、カフェイン酸〔caffeic acid〕、クロロゲン酸〔chlorogenic acid〕、ケンペロール〔keampferol〕、ケルセチン〔quercetin〕、ケルセチン-3-O-グルクロニド〔quercetin-3-O-glucronide〕などの検出に成功している（非特許文献９参照）。なお、成分分析には、超高速液体クロマトグラフ質量分析計およびガスクロマトグラフ質量分析計を用いた。
【０００７】
さらに、タデアイ抽出物には、多くの有機化合物が含まれており、未だ化学構造が不明の物質が数多くある。このような物質は、薬用植物として利用されてきたタデアイの機能と深く関係するものであり、その解明が望まれる。
【０００８】
そこで、本発明者は、上記のタデアイの有効成分に関し、鋭意研究を重ね、タデアイ中に含まれているフラボノイド化合物を確認し、その機能や有効性の検証を重ねた。
【０００９】
本発明の目的は、タデアイから得られたフラボノイド化合物の抗炎症剤としての新たな用途を提供することにある。
【００１０】
その他の課題と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願において開示される実施の形態のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。
【００１２】
本願において開示される一実施の形態に示されるフラボノイド化合物は、以下の（化学式１）〜（化学式５）に示す化学構造体を有する。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
【化２】
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【００１５】
【化３】
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【００１６】
【化４】
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【００１７】
【化５】
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【００１８】
本願において開示される一実施の形態に示される抗炎症剤は、（一般式１）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物を有する。
【００１９】
【化６】
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【００２０】
本願において開示される一実施の形態に示される抗炎症剤は、上記（化学式１）、（化学式２）、（化学式３）、（化学式４）および（化学式５）のいずれかに示す化学構造体を有する。
【００２１】
本願において開示される一実施の形態に示される抗炎症剤の製造方法は、（ａ）タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の葉を、水、アルコール、または、アセトンで抽出する抽出工程を、有し、上記（ａ）工程で得られた抽出液は、上記（一般式１）に示す化学構造体を有するフラボノイド化合物を有する。
【００２２】
上記抗炎症剤の製造方法において、（ｂ）上記（ａ）工程で得られた抽出液を、溶出し、精製する工程を有し、上記溶出は、カラムを用いた溶出であり、上記精製は、合成吸着剤を充填したカラムあるいは逆相カラムを用いて行われる。
【００２３】
上記（ｂ）工程は、上記（ａ）工程で得られた抽出液から糖類およびタンパク質を取り除く工程を有する。
【００２４】
上記抗炎症剤の製造方法において、（ｂ）上記（ａ）工程で得られた抽出液を加水分解する工程を有する。
【００２５】
上記抗炎症剤の製造方法において、（ｂ）上記（ａ）工程で得られた抽出液を酵素分解する工程を有する。
【発明の効果】
【００２６】
タデアイから得られたフラボノイド化合物（例えば、上記（化学式１）〜（化学式５））は、抗炎症剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】タデアイのダイヤイオンＨＰ−２０カラムでのメタノール溶出フラクションを超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した結果を示すチャートである。
【図１Ｂ】タデアイのダイヤイオンＨＰ−２０カラムでのメタノール溶出フラクションの酸加水分解物を超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した結果を示すチャートである。
【図２Ａ】成分１のハイレゾリューションモードでの超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す図である。
【図２Ｂ】成分１のハイレゾリューションモードでの超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す図である。
【図３】タデアイ葉およびタデアイ茎の水抽出物の超高速液体クロマトグラフ−質量分析計で分析した結果を示すチャートであり、（Ａ）は、タデアイ葉の水抽出物、（Ｂ）は、タデアイ茎の水抽出物の分析結果である。
【図４】タデアイ葉および茎の抽出物についてのＮＯ産生抑制能を示す図であり、（Ａ）は、タデアイ葉の抽出物、（Ｂ）はタデアイ茎の抽出物の測定結果である。
【図５】食餌に混合したタデアイ葉の成分１〜４の混合物および糞便抽出物のクロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
まず、タデアイに含まれているフラボノイド化合物について説明する。
【００２９】
（１．実験材料）
タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の種子は、タキイ種苗（株）（京都）から購入し、栽培したものを用いた（標本番号14001）。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用のアセトニトリルは、シグマ社（Sigma，セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）から得た。N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C〕は、ジーエルサイエンス（東京）のものを使用した。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸〔3-hydroxy-3-methylglutaric acid〕およびその他の試薬は和光純薬（大阪）から購入した。
【００３０】
（２．実験機器）
ＮＭＲ（核磁気共鳴；Nuclear Magnetic Resonance）スペクトルは、ＪＥＯＬ社（東京）のＪＮＭ  Ａ４００  ＦＴ−４００ＦＴ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）を使用した。２次元ＮＭＲのＨＭＢＣ〔Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy〕分析は、日立化成テクノサービス（株）に依頼し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ社（神奈川）のＡＶ４００Ｍ（４００ＭＨｚ）を用いて測定した。赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ〔Attenuated Total Reflection-Fourier Transform-Infrared Spectorophotometer〕）の分析には、島津製作所（京都）の  ＭＩＲａｃｌｅ１０  （ＡＴＲ）を接続したＩＲ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ−１を使用した。紫外吸収スペクトルの分析には、日本分光（東京）のＶ−５３０を使用した。融点測定には、（株）ヤナコ機器開発研究所（京都）のモデルＭＰ−Ｓ３を使用した。超高速液体クロマトグラフ-質量分析計（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳE）には、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ）のＡＣＱＵＩＴＹ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）システムとＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２  ＨＤＭＳシステムを使用した。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー）による分析には、島津製作所（京都）のＬＣ−２０１０ＡとクロマトパックＣ−Ｒ８Ａを使用した。ここで、逆相クロマトグラフィーはＨＰＬＣの一般的な方法である。ＨＰＬＣでの分離（精製）は、移動相と固定相の極性に差が必要である。移動相の極性が低く、固定相の極性が高い場合は順相クロマトグラフィーと呼ばれ、逆に移動相の極性が高く、固定相の極性が低い場合を逆相クロマトグラフィーと呼ばれる。
【００３１】
ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）には、島津製作所（京都）製の２００８年版のＮＩＳＴライブラリがインストールされたガスクロマトグラフ質量分析計用ワークステーションであるＧＣＭＳｓｏｌｕｔｉｏｎを接続した質量分析計ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０を使用した。ＧＣキャピラリーカラムは、ＲＥＳＴＥＫ（ベルフォント〔Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ〕、ペンシルベニア州、アメリカ）製のＲｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，膜厚０．２５μｍ）を使用した。マイクロプレートリーダーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．（神奈川）〕のＭｕｌｔｉｓｋａｎ  ＧＯである。
【００３２】
（３．抽出と精製）
タデアイの葉を、８０％のメタノールで抽出した。具体的には、タデアイの葉を細かく刻み、８０％のメタノールを加え攪拌した後、濾過し、溶媒を減圧留去し、抽出物を得た。抽出物を３０％メタノールに溶解してカラムに供した。具体的には、抽出物に３０％のメタノールを添加し、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（三菱化学製，東京、合成吸着剤充填カラム）に通して溶出した。この後、５０％のメタノール、７０％のメタノール、１００％のメタノールを用いて、同様に溶出したところ、本実施例に係る物質は、主に１００％のメタノールを用いた溶出フラクションに回収されることが判明した。
【００３３】
次いで、１００％のメタノールを用いた溶出フラクションを、クロマトレックスＯＤＳ１０２４Ｔカラム（富士シリシア化学、春日井、逆相カラム）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、個々の成分を精製した。
【００３４】
ＨＰＬＣは、島津製作所（京都）のＬＣ−２０１０ＡとクロマトパックＣ−Ｒ８Ａを用いた。カラム（逆相カラム、逆相のオクタデシルシリカ（ODS）カラム）は、ワイエムシィ（ＹＭＣ（京都））のＯＤＳ−ＡＭ（１５０×６．０ｍｍｉ．ｄ．，粒径３μｍ）を用いた。カラム温度は４０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。移動相は、０．１％のギ酸とアセトニトリルとの７５：２５（ｖ／ｖ）の混合溶液を用いて溶出した。検出は、３４０ｎｍの吸収をモニターした。
【００３５】
（４．目的物質の構造決定）
（４．１）超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析カラムは、ウォーターズのＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１００×２．１ｍｍｉ．ｄ．，粒径１．７μｍ）を使用した。カラム温度は４０℃、流速は０．３ｍｌ／分、検出は、フォトダイオードアレイ検出器〔ＰＤＡ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ〕を用いて３４０ｎｍで行った。移動相は、０．１％のギ酸とアセトニトリルとの混合溶液を用い、１０分で、ギ酸：アセトニトリル比を、９０：１０（ｖ／ｖ）から５０：５０（ｖ／ｖ）まで直線的に変化させた状態で溶出した。即ち、直線的濃度勾配法を用いて溶出した。質量分析（ＭＳE）は、負イオンモード〔negative mode〕で測定し、以下の条件で行った。測定感度は、センシティブモード〔sensitive mode〕あるいはハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕で測定した。
電圧：キャピラリー…２．５ｋＶ、サンプリングコーン…５０Ｖ、エクストラクションコーン…４．０Ｖ
温度：ソース…１５０℃、デソルベイション…５００℃
ガス流速：コーンガス…５０Ｌ／時、デソルベイションガス…１０００Ｌ／時
スキャンタイム：０．５秒
コリジョンエネルギー：
ファンクション１、［低エネルギー］
トラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
ファンクション２、［高エネルギー］
ランプトラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６−４５Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
（４．２）アルカリ分解
各成分（成分１、成分２、成分３）の各１．０ｍｇを、５０％メタノール（１ｍｌ）に溶解し、２０％の水酸化カリウム水溶液（１ｍｌ）を加え、１晩、室温にて反応させた。塩酸で中和後、Ｇｒａｃｅ（コロンビア、メリーランド州、アメリカ）製のオルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕に注入後、２０％メタノール５ｍｌで溶出後（２０％メタノール溶出フラクション）、１００％のメタノール５ｍｌで溶出した。このメタノール溶出フラクションを、前述の（４．１）の欄で説明した超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析した。また、２０％メタノール溶出フラクションは、減圧乾固した後、１晩、真空デシケーターで乾燥させた。このサンプルをジメチルスルホキシド０．３ｍｌに溶解し、N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C）〕とを各１００μｌ加えて、７０℃で、１時間反応させた後、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した。分析条件は、以下の通りである。
カラム：Ｒｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
カラム温度：１５０℃から２５０℃まで（５℃／分）
キャリアガス：ヘリウム、全流量５８．１ｍｌ／分、カラム流量１．０８ｍｌ／分
インジェクター温度：２５０℃
イオン源温度：２００℃
インターフェイス温度：２５０℃
スプリット比１：５０
（４．３）酸分解
タデアイの８０％メタノール抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムにかけ１００％メタノールで溶出したフラクション１．０ｍｇを、１００％のメタノール（１ｍｌ）に溶解し、２．４Ｍの塩酸水溶液（１ｍｌ）を加え、９０℃で２時間、加熱還流を行った。反応後、５ｍｌの蒸留水を加えた後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラムに注入し、２０％メタノール５ｍｌで洗浄後、メタノール５ｍｌで溶出した。このサンプルを前述の（４．１）の欄で説明した超高速液体クロマトグラフ-質量分析計（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳE）により分析した。
【００３６】
成分３の糖部を分析するために、同様に酸分解を行った。成分３（１．０ｍｇ）を、１００％のメタノール（１ｍｌ）に溶解し、２．４Ｍの塩酸水溶液（１ｍｌ）を加え、９０℃で２時間、加熱還流を行った。反応後、５ｍｌの蒸留水を加えた後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラムに注入し、２０％メタノール５ｍｌで溶出し、メタノール５ｍｌで溶出した。注入液と、２０％メタノールで溶出した液を、炭酸カリウムで中和後、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し、１晩、真空デシケーターで乾燥させた。このサンプルをジメチルスルホキシド０．３ｍｌに溶解し、N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド〔N,O-Bis（trimethylsilyl） acetamide〕と、N-トリメチルシリルイミダゾール（TMSI）-C〔N-trimethylsilylimidazole（TMSI）-C）〕とを各１００μｌ加えて、７０℃で、１時間反応させた後、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した。分析条件は、以下の通りである。
カラム：Ｒｔｘ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
カラム温度：１５０℃から３００℃まで（５℃／分）
キャリアガス：ヘリウム、全流量５８．１ｍｌ／分、カラム流量１．０８ｍｌ／分
インジェクター温度：２５０℃
イオン源温度：２００℃
インターフェイス温度：２５０℃
スプリット比１：５０
（４．４）構造決定
タデアイの８０％メタノール抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムにかけて１００％メタノール溶出フラクションを回収し、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した。その結果を、表１および図１Ａ、図１Ｂに示す。図１Ａおよび図１Ｂの横軸は、保持時間（分）であり、縦軸は、ＡＵ（任意単位）である。図１Ａは、上記フラクションの分析結果であり、図１Ｂは、上記フラクションを加水分解したものの分析結果である。
【００３７】
図１Ａに示すように、５つのピーク（成分１−成分５）が確認され、これらの成分（化合物）が、このフラクションに回収されたことが分かった。このフラクションを、塩酸を用いて酸加水分解し、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計にかけたところ、図１Ｂに示すように、成分１−成分４のピーク位置は成分５のピーク位置にシフトした。この結果から、成分１−成分４は、成分５をアグリコンとして有することが明らかとなった。表１に、成分１−成分５の保持時間（分）と、同定した物質名と、分子イオンおよびフラグメントイオンのｍ／ｚ（ｍ／ｚ値ともいう）とをまとめた。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
成分５の融点は、３００℃以上（＞３００℃）であり、カーボン核磁気共鳴スペクトル（13Ｃ−ＮＭＲ）、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ）、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）、質量分析（ＭＳ）の結果が、前記の非特許文献１と一致した。これにより、成分５は、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕と同定した。
【００４０】
成分４の融点は、２９７℃であり、カーボン核磁気共鳴スペクトル（13Ｃ−ＮＭＲ）、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ）、紫外吸収スペクトル（ＵＶ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）、質量分析（ＭＳ）の結果が、前述の非特許文献１と一致した。これにより、成分４は、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシド〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-β-D-glucopyranoside〕と同定した。
【００４１】
成分１は、ハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、６１９．１２７３［Ｍ−Ｈ］-（計算値６１９．１２９９）であった。赤外吸収スペクトルの分析結果は、成分４と酷似していた。
【００４２】
図２Ａおよび図２Ｂに、成分１のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析結果を示す。図２Ａは、低エネルギー（６Ｖ）の場合の結果であり、図２Ｂは、高エネルギー（４５Ｖ）の場合の結果である。横軸は、ｍ／ｚ、縦軸は、相対強度である。図２Ａに示すように、低エネルギー（６Ｖ）で測定することにより、分子をなるべく壊さず、分子イオンピークが明確に判別できる。この結果、分子イオンピークｍ／ｚは、６１９．１２７３［Ｍ−Ｈ］-（計算値６１９．１２９９）であった。図２Ｂに示すように、フラグメントイオンとして、ｍ／ｚが４７５．０８５２の[（Ｍ−Ｈ）-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル]-〔［(M-H)-3-hydroxy-3-methylglutaryl］-〕を検出した。3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルを以下にＨＭＧとして示す。また、ｍ／ｚが３１３．０３６１の[（Ｍ−Ｈ）−ＨＭＧ−グルコース]-〔[（Ｍ−Ｈ）−ＨＭＧ−glucose]-〕を検出した。
【００４３】
また、グルコースに結合しているアシル基を分析する目的で、成分１を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕での２０％メタノール溶出フラクションを、トリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析したところ、試薬の3-ヒドロキシ-3-メチルグルタル酸〔3-hydroxy-3-methylglutaric acid〕とリテンションタイム（７．９分）およびＭＳスペクトルが一致した。
【００４４】
さらに、オルテックＣ１８マキシクリーンカートリッジカラム〔Alltec C18 Maxiclean cartridgeカラム〕での１００％メタノール溶出区を、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析したところ、成分４と同じリテンションタイムを示し、分子イオンピークｍ／ｚが、４７５．０８［Ｍ−Ｈ］-となり、アグリコンのｍ／ｚである３１３．０３を検出した。この結果から、成分１は、成分４に3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕が結合した物質であることが明らかとなった。13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲの結果は、表２、表３に示すとおりである。
【００４５】
【表２】
2017149688.tif 000010
【００４６】
【表３】
2017149688.tif 000011
【００４７】
13Ｃ−ＮＭＲのＤＥＰＴ〔Distortionless Enhancement by Polarization Transfer〕１３５による分析で、アグリコンのメチレン基（−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−）を示す「δ１０２．８」、グルコースのＣ６’’位のメチレン基を示す「δ６３．１」、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕のＣ２’’’とＣ４’’’のメチレン基を示す「δ４５．１と４５．２」のシグナルが検出された。
【００４８】
２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析でグルコースのＣ６’’のプロトンと3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基〔3-hydroxy-3-methylglutaryl基〕のＣ１’’’とに相関が見られることから、グルコースの６位に3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合していることが明らかとなった。
【００４９】
また、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合している炭素原子のシグナルは、２−３ｐｐｍ低磁場側にシフトするとの報告がある（非特許文献１０参照）。今回の分析結果でも、成分４のグルコースのＣ６’’の「δ６０．８」が、成分１では3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル基が結合したことにより、「δ６３．１」にシフトした。このことから、成分１は、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[6''-（3-hydroxy-3-methylglutaryl）-β-D-glucopyranodside〕と同定した。
【００５０】
成分２のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、５１７．０９９４［Ｍ−Ｈ］-（計算値５１７．０９８０）であった。フラグメントイオンとして、アセチル基が脱離したｍ／ｚが４７５．０８の［（Ｍ−Ｈ）-アセチル］-（［(M-H)-acetyl］-）、アグリコンのｍ／ｚが３１３．０の［（Ｍ−Ｈ）-アセチル-グルコース］-〔［(M-H)-acetyl-glucose］-〕を検出した。
【００５１】
成分２を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析したところ、このアルカリ分解物は、成分４であることが確認された。
【００５２】
13Ｃ−ＮＭＲによる分析で、アセチル基を示すシグナル（Ｃ１’’’「δ１７０．０」、Ｃ２’’’「δ２０．０」）と、1Ｈ−ＮＭＲによる分析でのシグナル（Ｃ２’’’−Ｈ「δ１．７５ｓ」）が検出された。
【００５３】
２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析でグルコースのＣ６’’のプロトンとアセチル基のＣ１’’’に相関が見られることから、グルコースの６位にアセチル基が結合していることが明らかとなった。以上の結果から、成分２は、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[6''-（acetyl）-β-D-glucopyranoside〕と同定した。
【００５４】
成分３のハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕での超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析で、分子イオンピークｍ／ｚは、５３１．０７７４［Ｍ−Ｈ］-（計算値５３１．０７７５）であった。
【００５５】
成分３を前述の（４．２）の欄で説明したアルカリ分解して中和した後、超高速液体クロマトグラフ-質量分析計により分析したところ、分子イオンピークはｍ／ｚが４８９．０７［Ｍ−Ｈ］-となり、ｍ／ｚが３１３．０３の[Ｍ-グルクロン酸］-〔［M-glucuronic acid]-〕を検出した。
【００５６】
また、成分３を、前述の（４．３）の欄で説明した酸分解して、トリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析したところ、リテンションタイム１５．９のピークが確認された。ＮＩＳＴライブラリとの照合により、酸分解物は、グルクロン酸と推定された。さらに、試薬のグルクロン酸をトリメチルシリル化〔trimethylsilyl化〕して、同様の条件で分析したところ、リテンションタイムは１５．９であった。これにより、成分３のアグリコンにグルクロン酸が結合していることが明らかとなった。
【００５７】
13Ｃ−ＮＭＲによる分析で、アセチル基を示すシグナル（Ｃ１’’’「δ１６９．９」、Ｃ２’’’「δ２０．９」）と、1Ｈ−ＮＭＲによる分析でのシグナル（Ｃ２’’’−Ｈ「δ２．００ｓ」）が検出された。
【００５８】
２次元ＮＭＲのＨＭＢＣによる分析で、Ｃ１’’のアノメリックプロトン（δ５．５６）とＣ３（δ１３３．０）に相関が見られたことにより、グルクロン酸はＣ１’’位でアグリコンのＣ３位に結合していることが明らかとなった。また、アセチル基は、グルクロン酸のＣ２’’のプロトン（δ４．７６）とアセチル基のＣ１’’’（δ１６９．９）に相関が見られ、アセチル基のＣ２’’’のプロトン（δ２．００）とＣ２’’のカーボン（δ７４．０）に相関が見られたことにより、グルクロン酸のＣ２’’に結合していることが明らかとなった。以上の結果より、成分３は3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone-3-O-[2''-（acetyl）-β-D-glucuronide]〕と同定した。
【００５９】
（機器分析データ）
以下に、成分１−成分５の機器分析データを示す。
【００６０】
（成分１）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]について
結晶：黄色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２０８−２１０℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３３９，２７９，２４０ｓｈ，２１８ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３００，２９２４，１７１７，１６８０，１６１０，１５５６，１４８１，１３４４，１２７１，１２２４，１１８２，１０６２，１０１４ｃｍ-1、
13Ｃ−ＮＭＲと1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分１の構造：以下の（化学式１）で示すとおり。
【００６１】
【化１】
2017149688.tif 000012
【００６２】
（成分２）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]について
結晶：淡黄色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２１８−２２０℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４０，２７８，２４０ｓｈ ｎｍ
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３１２，２９０８，１７２８，１６８１，１６１０，１５５３，１４７２，１３４４，１２６９，１２２７，１１７９，１０５８，１００９ｃｍ-1、
13Ｃ−ＮＭＲと1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分２の構造：以下の（化学式２）で示すとおり。
【００６３】
【化２】
2017149688.tif 000013
【００６４】
（成分３）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]について
結晶：黄色アルモファス結晶、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４３，２７４，２４０ｓｈ ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３５６，２９２０，１７３２，１６８２，１６１１，１５６２，１４７１，１３４８，１２２３，１１８０，１０２８ｃｍ-1、
13Ｃ−ＮＭＲと1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分３の構造：以下の（化学式３）で示すとおり。
【００６５】
【化３】
2017149688.tif 000014
【００６６】
（成分４）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシドについて
結晶：白色アルモファス結晶、
融点（ｍｐ）：２９７℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３４０，２７８，２３９ｓｈ ｎｍ、
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３３９３，３２３６，２８９１，１６７８，１６１０，１５５０，１４６８，１３３５，１２７５，１１７３，１０５１，１０１０ｃｍ-1、
13Ｃ−ＮＭＲと1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分４の構造：以下の（化学式４）で示すとおり。
【００６７】
【化４】
2017149688.tif 000015
【００６８】
（成分５）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンについて
結晶：淡緑色針状結晶、
融点（ｍｐ）：＞３００℃、
紫外吸収スペクトル（ＵＶ）λｍａｘ（メタノール溶媒）：３５４，２７３，２４１ｓｈ ｎｍ
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）νｍａｘ：３２９２，１６８１，１６２４，１６０７，１５５３，１４９５，１３６２，１２６９，１２３８，１１５７，１０９９，１０７４，１０１２ｃｍ-1、
13Ｃ−ＮＭＲと1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシドｄ６溶液）のデータ：表２、表３に示すとおり。
超高速液体クロマトグラフ-質量分析計での分析データ：表１に示すとおり。
成分５の構造：以下の（化学式５）で示すとおり。
【００６９】
【化５】
2017149688.tif 000016
【００７０】
（実施の形態１）
タデアイは、古くから、消炎目的で利用されていた。タデアイの抗炎症物質として、トリプタンスリンが報告されている。そこで、タデアイの抗炎症作用に寄与している物質を明らかにすることを試みた。具体的には、タデアイに主要に含まれている3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxy-flavone〕およびその配糖体の抗炎症作用を確認し、さらに、トリプタンスリン〔tryptanthrin〕や主要なフラボノイドを定量するとともに、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用およびプロスタグランジンＥ2産生抑制作用を指標としてタデアイの抗炎症作用に寄与している物質を明らかにした。
（実施例）
（１．実験材料）
タデアイ（Polygonum tinctorium Lour.）の種子は、タキイ種苗（株）（京都）から購入し、鳥取県境港市で栽培したものを用いた（標本番号15001）。ケルセチン3-O-β-D-グルクロニド〔Quercetin3-O-β-D-glucuronide〕、トリプタンスリン〔tryptanthrin〕、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸(Trolox（登録商標）)、フルオレセインナトリウムおよびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用のアセトニトリルは、シグマ社（Sigma，セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）から得た。ケンペロール-3-O-D-グルコピラノシド（アストラガリン）〔Kaempferol-3-O-D-glucopyranoside(astragalin)〕、イソラムネチン〔isorhamnetin〕、イソラムネチン-3-O-D-グルコピラノシド〔isorhamnetin-3-O-D-glucopyranoside〕は、EXTRASYNTHESE（リヨン、フランス）製のものを用いた。ケルセチン〔Quercetin〕、ケンペロール〔kaempferol〕、2,2'-アゾビス（2-アミジノ-プロパン）ジヒドロクロリド〔2,2'-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH)〕およびその他の試薬は和光純薬工業（大阪）から得た。
【００７１】
（２．実験機器）
高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー）による分析には、島津製作所（京都）のＬＣ−２０１０ＡとクロマトパックＣ−Ｒ８Ａを使用した。マイクロプレートリーダーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific K.K.(神奈川)）のMultiskan GOを用いた。超高速液体クロマトグラフ-質量分析計（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳE）には、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ）のＡＣＱＵＩＴＹ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）システムとＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２  ＨＤＭＳ  システムを使用した。
【００７２】
（３．タデアイ葉、茎の抗炎症活性測定用抽出物の調製）
タデアイは、収穫後、すぐに葉と茎に分割し、凍結乾燥を行った後、ミルで粉末化した。この粉末各１ｇを三角フラスコにとり、メタノール、酢酸エチルを各５００ｍＬ加えて、室温にてマグネチックスターラーで３時間撹拌し、抽出した。
【００７３】
水抽出用のサンプルは、フラボノイド配糖体を分解する可能性があるβ−グルコシダーゼを失活させるため、８０℃の熱水を加えて、８０℃を５分保持後、室温で放冷しながらマグネチックスターラーで３時間撹拌し、抽出した。水抽出物は、アドバンテックNo.2の濾紙で、吸引ろ過後、糖類、タンパク質を取り除くため、ダイヤイオン  ＨＰ−２０カラム（長さ２１０×内径３０ｍｍ）に通し、蒸留水２５０ｍＬで洗浄後、メタノール３００ｍｌで溶出した。この溶出物を、ロータリーエバポレーターを用いて４０℃で減圧乾固した。メタノール抽出物と酢酸エチル抽出物は、それぞれアドバンテックNo.2の濾紙で、吸引ろ過後、ロータリーエバポレーターを用い４０℃で減圧乾固した。
【００７４】
（４．ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳEによる分析）
ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳE  はＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）のＡＣＱＵＩＴＹ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）システムとＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２  ＨＤＭＳ  システムを使用した。分析条件は、「（４．１）超高速液体クロマトグラフ-質量分析計による分析」の欄で説明した条件と同じ条件で行った。ＵＰＬＣカラムはＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１００×２．１ｍｍｉ．ｄ．，粒径１．７μｍ）を使用した。カラム温度は４０℃、流速は０．３ｍｌ／分、検出は、フォトダイオードアレイ検出器〔ＰＤＡ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ〕を用いて３４０ｎｍで行った。移動相は、０．１％のギ酸とアセトニトリルとの混合溶液を用い、１０分で、ギ酸：アセトニトリル比を、９０：１０（ｖ／ｖ）から５０：５０（ｖ／ｖ）まで直線的に変化させた状態で溶出した。即ち、直線的濃度勾配法を用いて溶出した。質量分析（ＭＳE）は、負イオンモード〔negative mode〕で測定し、以下の条件で行った。
電圧：キャピラリー…２．５ｋＶ、サンプリングコーン…５０Ｖ、エクストラクションコーン…４．０Ｖ
温度：ソース…１５０℃、デソルベイション…５００℃
ガス流速：コーンガス…５０Ｌ／時、デソルベイションガス…１０００Ｌ／時
スキャンタイム：０．５秒
コリジョンエネルギー：
ファンクション１、［低エネルギー］
トラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
ファンクション２、［高エネルギー］
ランプトラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６−４５Ｖ
（５．トリプタンスリン〔tryptanthrin〕の定量）
「３．タデアイ葉、茎の抗炎症活性測定用抽出物の調製」で調製した各抽出物を５０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、トリプタンスリンをＨＰＬＣで定量した。カラムは、東ソー(東京）のＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｏｃｔｙｌ−８０Ｔｓ（１５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．）を使用した。溶出は５０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）で、イソクラティックで溶出した。カラム温度は４０℃、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎに設定した。検出は、２５０ｎｍで行った。
【００７５】
（６．総ポリフェノール量の測定）
総ポリフェノール量は、フォーリン・チオカルト法（Folin-ciocalteu法）にて測定し、タデアイ葉あるいは茎の凍結乾燥物重量１ｇあたりの没食子酸相当量（ｍｇＧＡＥ／ｇＤＷ）で表した。
【００７６】
（７．逆相ＨＰＬＣによる3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン配糖体〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone配糖体〕の定量）
タデアイ葉の水およびメタノール抽出物に含まれる3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン配糖体の定量を逆相ＨＰＬＣにて行った。カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ，粒径５μｍ）を用いた。
【００７７】
流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は３４０ｎｍに設定した。移動相は、４０分で０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル９５：５（ｖ／ｖ）から６０：４０（ｖ／ｖ）まで直線的に変化させた状態で溶出した。即ち、直線的濃度勾配法を用いて溶出した。
【００７８】
（８．タデアイ葉由来フラボノイド配糖体の単離および3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕の調製法）
実施の形態１の場合と同様にして、タデアイ葉由来のフラボノイド配糖体（以下の成分Ａ、成分Ｂ、成分４、成分１〜３）を精製（単離）した。また、実施の形態１の場合と同様にして、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）を調製した。
【００７９】
（成分Ａ）
ケルセチン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]〔quercetin-3-O-[6"-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-β-D-glucopyranoside]〕
（成分Ｂ）
ケンペロール-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]〔kaempferol-3-O-[6"-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-β-D-glucopyranoside]〕
（成分４）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-β-D-グルコピラノシド
（成分１）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシド]
（成分２）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシド]
（成分３）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]
（成分５）3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン
（９．細胞培養条件）
理化学研究所よりマウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ  ２６４）を購入した。ＲＡＷ２６４は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリンストレプトマイシン溶液、１％非必須アミノ酸溶液培地を加えたイーグル最小必須培地を使用し、９５％空気、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で培養した。細胞解凍後２週間の予備培養を経て、ＲＡＷ２６４をトリプシン溶液にて剥離し、９６穴マイクロプレートに、１ｍｌあたり５×１０5の細胞数の濃度で播種した。細胞を播種して１時間後に、リポポリサッカライド（ＬＰＳともいう）（１μｇ／ｍＬ）およびタデアイ抽出物、精製物を単独または組み合わせて添加後、９５％空気、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で２４時間インキュベートした。培養後、培養上清を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄後、１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル５０μＬを各ウェルに添加して１０分間振盪させ細胞溶解液を得た。細胞溶解液中のタンパク質量をＰｒｅｉｃｅ（登録商標）  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．（神奈川）〕）にて測定した。
【００８０】
（１０．一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制能の測定）
培養終了後の培養上清を５０μＬ回収し、ＮＯ濃度測定に使用した。ＮＯ濃度はグリース法により求めた。測定したＮＯ濃度は単位タンパク質量あたりに換算した。
【００８１】
（１１．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ2（ＰＧＥ2）産生抑制能の測定）
培養終了後の培養上清を２０μＬ回収し、ＰＧＥ2濃度測定に使用した。ＰＧＥ2濃度はＰＧＥ2エンザイムイムノアッセイキット（キーマンケミカルカンパニー、ミシガン州、アメリカ）にて測定した。測定したＰＧＥ2濃度は単位タンパク質量に換算した。
【００８２】
（１．タデアイ葉および茎のフラボノイド配糖体の分析および定量）
タデアイ葉および茎の抽出物についてＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳEにより分析した。水抽出物とメタノール抽出物は、同様の溶出パターンを示した。また、アセトン抽出物も、同様の溶出パターンを示した。図３は、その分析結果、即ち、タデアイ葉およびタデアイ茎の水抽出物の超高速液体クロマトグラフ-質量分析計で分析した結果を示すチャートである。図３のうち、（Ａ）は、タデアイ葉の水抽出物の、（Ｂ）は、タデアイ茎の水抽出物の分析結果である。各図について、横軸は、時間（Time）で、縦軸は、Relative intensity（相対強度、（％））である。表４にタデアイ葉およびタデアイ茎の水抽出物の各ピーク位置に対応する物質名を示す。
【００８３】
【表４】
2017149688.tif 000017
【００８４】
3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン〔3,5,4'-trihydroxy-6,7-methylenedioxyflavone〕をアグリコンとする配糖体は、以下の（一般式１）で示すことができる。
【００８５】
【化６】
2017149688.tif 000018
【００８６】
上記（一般式１）中のＲと、前述の成分とピーク位置の関係は次のとおりである。
【００８７】
Ｒ：β-D-グルコピラノシル〔β-D- glucopyranosyl〕…成分４、ピーク位置Ｐ７
Ｒ：6''-(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル)-β-D-グルコピラノシル〔6''-（3-hydroxy-3-methylglutaryl）-β-D-glucopyranosyl〕…成分１、ピーク位置Ｐ８
Ｒ：6''-(アセチル)-β-D-グルコピラノシル〔6''-（acetyl）-β-D-glucopyranosyl〕…成分２、ピーク位置Ｐ９
Ｒ：2''-(アセチル)-β-D-グルクロニル〔2''-（acetyl）-β-D-glucuronyl〕…成分３、ピーク位置Ｐ１０
Ｒ：Ｈ…成分１、ピーク位置Ｐ１１
なお、本明細書では、上記（一般式１）で示される、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）とその配糖体（成分１〜４）を、総じて、“3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン配糖体”や“3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体”と言うことがある。
【００８８】
図３の（Ａ）および表４に示すように、ピーク位置Ｐ１〜Ｐ１１に示す成分を確認することができた。ピーク位置Ｐ１〜Ｐ１１のうち、ピーク位置Ｐ７が成分４に、ピーク位置Ｐ８が成分１に、ピーク位置Ｐ９が成分２に、ピーク位置Ｐ１０が成分３に、ピーク位置Ｐ１１が成分５に対応する。
【００８９】
一方、図３の（Ｂ）では、ピーク位置Ｐ７〜Ｐ１１（成分４、１〜３、５）を確認することができず、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体は、葉に局在することが分かる。
【００９０】
表５に、タデアイ葉および茎の抽出物の乾燥重量、総ポリフェノール量およびトリプタンスリン〔tryptanthrin〕量を示す。なお、“Ｎ．Ｄ．”は、不検出を示す。また、水抽出物については、ダイヤイオン  ＨＰ−２０を用いて糖質やタンパクを取り除いてある。
【００９１】
【表５】
2017149688.tif 000019
【００９２】
例えば、葉（Leaves）の水抽出物（Water）の乾燥重量（Weight、（ｍｇ／ｇＤＷ））は、タデアイ葉の乾燥重量１ｇあたり、９１．０ｍｇ、即ち９１．０ｍｇ／ｇＤＷである。総ポリフェノール量（没食子酸相当量として）は、２５．０ｍｇＧＡＥ／ｇＤＷであり、水抽出物の乾燥重量に占める割合（％in each extract)は、２７．５％である。トリプタンスリン量は、６７．２μｇ／ｇＤＷであり、水抽出物の乾燥重量に占める割合（％in each extract)は、０．０７％である。同様に、葉（Leaves）のメタノール抽出物（Methanol）、酢酸エチル抽出物（Ethyl acetate）についても、表５に示すとおりである。
【００９３】
また、茎（Stems）の水抽出物（Water）、メタノール抽出物（Methanol）、酢酸エチル抽出物（Ethyl acetate）についても、表５に示すとおりである。
【００９４】
タデアイ葉の抽出物に含まれる3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体の定量を逆相ＨＰＬＣにて行った。カラムはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（トーランス、カリフォルニア州、アメリカ）製のＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ，粒径５μｍ）を用いた。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は３４０ｎｍに設定した。移動相は、４０分で０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル９５：５（ｖ／ｖ）から６０：４０（ｖ／ｖ）の直線濃度勾配で溶出した。各3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体の単離物で作成した検量線より定量した。
【００９５】
表６に、タデアイ葉の抽出物に含まれる3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体の量を示す。なお、水抽出物については、ダイヤイオン  ＨＰ−２０を用いて糖質やタンパクを取り除いてある。
【００９６】
【表６】
2017149688.tif 000020
【００９７】
表６に示すように、水抽出物（Water extracts）およびメタノール抽出物（Methanol extracts）中の、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜５）の占める割合は、水抽出物では約４１％、メタノール抽出物では約１９％である。
【００９８】
（２．タデアイ葉のフラボノイド配糖体およびトリプタンスリン等のＮＯおよびＰＧＥ2産生抑制能）
前述したとおり、タデアイ葉には、上記ピーク位置Ｐ１〜Ｐ１１のフラボノイド配糖体が含まれており、これらは同定されている。また、タデアイ葉には、カフェイン酸、クロロゲン酸が含まれていることを確認している。これらのフラボノイド配糖体およびその他の物質（ケルセチン〔quercetin〕、ケンペロール〔keampferol〕、イソラムネチン〔isorhamnetin〕、カフェイン酸〔caffeic acid〕、クロロゲン酸〔chlorogenic acid〕、
トリプタンスリン〔tryptanthrin〕）ついて、ＮＯ産生抑制能とＰＧＥ2産生抑制能を測定した。
【００９９】
まず、細胞培養条件について説明する。理化学研究所よりマウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ  ２６４）を購入した。ＲＡＷ２６４は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリンストレプトマイシン溶液、１％非必須アミノ酸溶液培地を加えたイーグル最小必須培地を使用し、９５％空気、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で培養した。細胞解凍後２週間の予備培養を経て、ＲＡＷ２６４をトリプシン溶液にて剥離し、９６穴マイクロプレートに、１ｍｌあたり５×１０5の細胞数の濃度で播種した。細胞を播種して１時間後に、リポポリサッカライド（１μｇ／ｍＬ）およびタデアイ抽出物、精製物を単独または組み合わせて添加後、９５％空気、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で２４時間インキュベートした。培養後、培養上清を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄後、１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル５０μＬを各ウェルに添加して１０分間振盪させ細胞溶解液を得た。細胞溶解液中のタンパク質量をＰｒｅｉｃｅ（登録商標）  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．（神奈川）〕）にて測定した。
【０１００】
培養終了後の培養上清を５０μＬ回収し、ＮＯ濃度測定に使用した。ＮＯ濃度はグリース法により求めた。測定したＮＯ濃度は単位タンパク質量あたりに換算した。
【０１０１】
培養終了後の培養上清を２０μＬ回収し、ＰＧＥ2濃度測定に使用した。ＰＧＥ2濃度はＰＧＥ2エンザイムイムノアッセイキット（キーマンケミカルカンパニー、ミシガン州、アメリカ）にて測定した。測定したＰＧＥ2濃度は単位タンパク質量に換算した。
【０１０２】
表７に、タデアイ葉のフラボノイド配糖体およびトリプタンスリン等のＮＯおよびＰＧＥ2産生抑制能を示す。具体的に、表７においては、タデアイ葉由来の各物質の、ＮＯ産生の５０％阻害濃度（ＩＣ50（μＭ））およびＰＧＥ2産生５０％阻害濃度（ＩＣ50（μＭ））を示す。各データは平均±標準偏差で示した（ｎ＝３）。
【０１０３】
【表７】
2017149688.tif 000021
【０１０４】
表７に示すように、ＮＯ産生抑制能およびＰＧＥ2産生抑制能について、フラボノイド配糖体は、いずれもアグリコンより低い。フラボノイド配糖体の中で、ＮＯ産生抑制能が確認できたものは、糖部がグルクロン酸である、ケルセチン-3-O-β-D-グルクロニド（ピーク位置Ｐ１）と、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]（ピーク位置Ｐ１０、成分３）であった。
【０１０５】
一方、マクロファージ細胞であるＲＡＷ２６４はＬＰＳで刺激すると、グルクロニダーゼを分泌し、その結果、ケルセチン-3-O-β-D-グルクロニド〔quercetin 3-O-β-D-glucuronide〕は脱抱合されケルセチン〔quercetin〕の状態で細胞に取り込まれる。このことから、ケルセチン-3-O-β-D-グルクロニド（ピーク位置Ｐ１）と、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]（ピーク位置Ｐ１０、成分３）はＬＰＳ刺激を受けたＲＡＷ２６４細胞が分泌したグルクロニダーゼによって分解され、細胞内にアグリコンが取り込まれたため抗炎症作用を示したものと考察される。
【０１０６】
また、フラボノイド配糖体は、通常、腸でアグリコンと糖に分解されてから吸収され、グルクロン酸抱合体や硫酸抱合体として、生体内の様々な臓器に運ばれてから、再度脱抱合され抗炎症作用などの機能を果たすと考えられる。
【０１０７】
したがって、フラボノイドアグリコンの抗炎症活性を把握することが重要である。タデアイ葉の主要なフラボノイド配糖体のアグリコンである3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（ピーク位置Ｐ１１、成分５）のＮＯ産生抑制能は、ケルセチン〔quercetin〕よりやや弱いが、ケンペロール〔keampferol〕やイソラムネチン〔isorhamnetin〕よりも強い（表７参照）。
【０１０８】
一方、タデアイ葉の主要なフラボノイド配糖体のアグリコンである3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（ピーク位置Ｐ１１、成分５）のＰＧＥ2産生抑制能は、ケルセチン〔quercetin〕、ケンペロール〔keampferol〕やイソラムネチン〔isorhamnetin〕よりも低い。
【０１０９】
また、トリプタンスリン〔tryptanthrin〕と比較すると、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（ピーク位置Ｐ１１、成分５）のＮＯ産生の５０％阻害濃度は、約５倍、ＰＧＥ2産生５０％阻害濃度は、約１７倍である。
【０１１０】
しかしながら、前述したように、タデアイ葉に含まれている3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜５）の占める割合は、水抽出物中では約４１％、メタノール抽出物中では約１９％である（表６参照）。これに対し、トリプタンスリンの占める割合は、水抽出物中では０．０７％程度、メタノール抽出物中では０．１２％程度であり（表５参照）、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜５）は、トリプタンスリンの１００倍以上、タデアイ葉に含まれている。
【０１１１】
したがって、トリプタンスリンに比べて、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜５）は、トリプタンスリンよりも格段に多いことから、タデアイ葉の実質的な抗炎症作用は、タデアイ葉に特徴的に含まれている3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜５）によるものと考えられる。
【０１１２】
また、タデアイ葉および茎の抽出物について、ＮＯ産生抑制能を測定した。図４に、タデアイ葉および茎の抽出物についてのＮＯ産生抑制能を示す。（Ａ）は、タデアイ葉の抽出物、（Ｂ）は、タデアイ茎の抽出物の結果である。各図について、横軸は、濃度（Concentration、（μｇ／ｍｌ）で、縦軸は、ＬＰＳ刺激後のＮＯ産生の阻害濃度（％）である。水抽出物、メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物について、ＮＯ産生抑制能を示す。（Ａ）のタデアイ葉の抽出物については、ＮＯ産生の阻害濃度（％）が１００％以下であり、ＮＯ産生抑制能を確認できる。（Ｂ）のタデアイ茎の抽出物については、ＮＯ産生の阻害濃度（％）が１００％近傍か１００％以上であり、ＮＯ産生抑制能を確認できない。
【０１１３】
（まとめ）
タデアイ（Polygonum tinctorium）葉から水、メタノール、エタノール、アセトンで抽出した抽出物に3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンの配糖体（成分１〜５）が含まれており、これらについて、抗炎症剤としての用途を見出すことができた。
【０１１４】
タデアイの葉と茎について水、メタノール、酢酸エチル抽出物のＮＯ産生抑制能を測定したところ、ＮＯ産生抑制能は葉の抽出物のみ確認されたが、抽出溶媒による活性の差異は小さかった。各抽出物の総ポリフェノール量およびトリプタンスリン量を測定したところ、メタノール抽出物及び酢酸エチル抽出物には、同様の含有率でトリプタンスリンが含まれていた。水抽出物は、ポリフェノール含有量が一番高かったが、トリプタンスリンの量はメタノール抽出物および酢酸エチル抽出物の５８％であった（表５参照）。また、ＮＯ産生抑制能は、抽出溶媒による活性の差異は小さく、同程度だった（図４参照）。これにより、ポリフェノールもＮＯ産生抑制に寄与している可能性が示唆された。タデアイ葉の主要なフラボノイド配糖体の単離物の抗炎症作用を、ＮＯ産生抑制能およびＰＧＥ2産生抑制能で評価したところケルセチン-3-O-β-D-グルクロニドと、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン-3-O-[2''-(アセチル)-β-D-グルクロニド]（成分３）、ＮＯ産生抑制能が確認された。また、タデアイ葉の主要なフラボノイド配糖体のアグリコンである3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）は、ＮＯ産生抑制のＩＣ50が、１８．８±１．６μＭ、ＰＧＥ2産生抑制のＩＣ50が、１６．７±１．９μＭであった（表７参照）。トリプタンスリンのＮＯ産生抑制のＩＣ50が、３．９±０．３μＭ、ＰＧＥ2産生抑制のＩＣ50が、１．１±０．５μＭであり、トリプタンスリンは、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）よりも高い抗炎症活性を示したが、タデアイ葉においては3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとするフラボノイド配糖体の含有量が多いため、これらの配糖体の実質的な抗炎症物質としての作用が大きいことが考えられる。
【０１１５】
また、フラボノイド配糖体は、通常、腸でアグリコンと糖に分解されてから吸収されるため（実施の形態２の（２−１）参照）、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとするフラボノイド配糖体（成分１〜５）について、抗炎症剤として用いて有用であることが、判明した。
【０１１６】
（実施の形態２）
（１．酸分解による3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンの調製法）
タデアイ葉４ｋｇを水２０Ｌで、１時間、９３〜９８℃で熱水抽出した。４０メッシュの網で固形物を除去後、２Ｌまで濃縮し、１５，０００×ｇ、２０分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後の上清をアドバンテックＮｏ．２濾紙で濾過し、濾液を凍結乾燥して４６．６ｇの抽出物を得た。この抽出物のトリプタンスリン量を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で定量したところ、タデアイ生葉１ｋｇあたり７．８ｍｇであった。
【０１１７】
一方、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン配糖体は、８４５ｍｇ含まれていた。
【０１１８】
この抽出物１０ｇを水に溶解して、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（樹脂量５００ｇ）に供した。水２Ｌで洗浄後、５０％エタノール２Ｌ、エタノール２Ｌの順で溶出した。エタノールで溶出した画分を減圧濃縮し、２．０ｇの抽出物（以下ＭＦ画分）を得た。この抽出物に２．４Ｎの塩酸水溶液２００ｍｌとメタノール２００ｍｌを加え、９０℃で２時間加熱還流を行った（酸分解、加水分解、酸加水分解）。２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、中和後、メタノールを減圧留去した。この溶液を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（樹脂量５００ｇ）に供し、水２Ｌで洗浄後、エタノールで溶出した。この溶出液を減圧乾固した後、メタノールで再結晶し、０．３ｇの3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）を得た。
（２．酵素分解による3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンの調製法）
（２−１）マウス体内での3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）の分解の確認
3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）を含む混合物のサンプルをマウスの食餌に０．２％混合し、４日間摂食させた。４日目のマウスの糞便を回収し、マウスの糞便１．０ｇに８０％メタノール１０ｍｌを加え、乳鉢で磨り潰した。
【０１１９】
この懸濁液を超音波で３０分破砕した後、４０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離機にかけた。この遠心上清を回収し、桐山No.4濾紙で濾過後、得られたサンプルを０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。カラムはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（トーランス、カリフォルニア州、アメリカ）製のＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ，粒径５μｍ）を用いた。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は３４０ｎｍに設定した。移動相は、４０分で０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル９５：５（ｖ／ｖ）から６０：４０（ｖ／ｖ）の直線濃度勾配で溶出した。この結果を図５に示す。図５は、食餌および糞便抽出物のクロマトグラフである。図５のうち、上段は、食餌に使用した成分１〜４を含む混合物のクロマトグラフであり、下段は、マウスの糞便抽出物中の成分１〜５のクロマトグラフである。図５に示すように、上段と比較し、下段のクロマトグラフでは、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）の大幅な生成が確認された。これは、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）がマウスの体内の腸内細菌で分解されたことにより3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）が生成したと考えられる。
【０１２０】
例えば、青果物に含まれているフラボノイドは主に配糖体の形で存在し、腸内細菌により分解されアグリコンを生成することが知られている。上記成分１〜４についても類似する現象が認められる。このことより、成分１〜４のＮＯ産生抑制能およびＰＧＥ2産生抑制能については、成分４を除き、２００μＭ以上の濃度となり、その抑制能が確認されていない（表７参照）。しかしながら、成分１〜４は、生体内に入った場合、成分５に分解され、抗炎症作用を示すと考えられる。
（２−２）酵素分解
上記（２−１）の現象から、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）から、酵素分解により3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）を調製することが可能であると考えられる。以下に、調製法の一例を説明する。
【０１２１】
例えば、タデアイ葉の抽出液を３７℃で数分間加温し、加温後の液に、酵素を加えて混合し、酵素反応させる。反応後の液をＨＰＬＣで精製し、3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチエレンジオキシフラボンを調製する。
【０１２２】
酵素としては、例えば、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、マウスやラットの腸のホモジネートから調製した粗酵素などを用いることができる。
【０１２３】
また、タデアイ葉の抽出液を３７℃で数分間加温し、加温後の液に、腸内細菌を添加し、腸内細菌が出す酵素により、抽出液中の3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）を分解してもよい。腸内細菌としては、ラクトバシラス属 Lactobacillus、ストレプトコッカスStreptococcus属、バクテロイデス属 Bacteroides やユーバクテリウム属 Eubacteriumなどを用いることができる。
（まとめ）
このように、タデアイ（Polygonum tinctorium）葉から水、メタノール、エタノール、アセトンで抽出した3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）を酸で加水分解することにより、抗炎症作用の大きい3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）を得ることができる。
【０１２４】
具体的には、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）に酸（例えば、塩酸水溶液）を混合し、加水分解させる。
【０１２５】
また、タデアイ（Polygonum tinctorium）葉から水、メタノール、エタノール、アセトンで抽出物した3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）を酵素分解することにより、抗炎症作用の大きい3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）を得ることができる。
【０１２６】
具体的には、3,5,4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボンをアグリコンとする配糖体（成分１〜４）に酵素（例えば、β−グルコシダーゼやβ−グルクロニダーゼなど）を混合し、酵素反応させる。
（応用例）
抗炎症物質として有用な上記3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）とその配糖体（成分１〜４）の抗炎症剤として用途例に制限はないが、例えば、口腔への抗炎症剤として、はみがき粉、液体はみがき、錠剤、飴、口腔スプレーに配合して使用できる。この際の添加量は、１使用量あたり上記3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）やその配糖体（成分１〜４）の物質量として例えば１０μｇ以上添加する。なお、錠剤や飴など、飲食物として利用する場合には、上記成分１〜５を上記添加量で使用することが好ましいが、はみがき粉、液体はみがきや口腔スプレーとして使用する場合には、上記成分１〜５のうち、成分３や成分５などを上記添加量で使用することがより好ましい。
【０１２７】
また、皮膚への抗炎症剤として化粧用クリーム、化粧水、石けん、ボディシャンプー、シャンプー、リンス、整髪料にに配合して使用できる。この際の添加量は、１使用量あたり上記3, 5, 4'-トリヒドロキシ-6,7-メチレンジオキシフラボン（成分５）やその配糖体（成分１〜４）を、例えば塗布面積１ｃｍ2に対し０．０１μｇ以上となるように配合する。なお、皮膚へ塗布する場合には、上記成分１〜５のうち、成分３や成分５などを上記配合量で使用することがより好ましい。
【０１２８】
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【図１Ａ】
2017149688.tif 000029
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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