(57)【要約】【課題】Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。【解決手段】アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変されたＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、アコニターゼ活性が増大するように改変されていることを特徴とし、
前記アコニターゼが、ＡｃｎＢタンパク質である、方法。
【請求項２】
前記ＡｃｎＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
【請求項４】
前記アコニターゼが、ＡｃｎＡタンパク質またはＡｃｎＢタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡｃｎＡタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項４に記載の方法：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記ＡｃｎＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項４に記載の方法：
（ａ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが、ＡｌｄＢタンパク質である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡｌｄＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項７に記載の方法：
（ａ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
前記細菌が、さらに、エタノール代謝酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌が、好気的にエタノールを資化できる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、変異型ａｄｈＥ遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型ａｄｈＥ遺伝子は、好気条件での不活化に対する耐性が向上する変異を有する変異型AdhEタンパク質をコードするａｄｈＥ遺伝子である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異が、野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における568位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、グルタミン酸お
よびアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記置換後のアミノ酸残基が、リジン残基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異型AdhEタンパク質が、さらに、下記の追加的変異を有する、請求項１２または１３に記載の方法。：
（Ａ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における560位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換
される変異；
（Ｂ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における566位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に
置換される変異；
（Ｃ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554
位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミ
ノ酸残基に置換される変異；
（Ｄ）上記変異の組み合わせ。
【請求項１５】
前記細菌が、エシェリヒア属細菌である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、さらに、下記の性質を有する、請求項１７に記載の方法：
（Ａ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている；
（Ｂ）リジンデカルボキシラーゼの活性が低下するように改変されている；
（Ｃ）上記性質の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、調味料や飲食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する各種微生物を用いた発酵法により工業生産されている。発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法としては、例えば、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法が挙げられる。
【０００３】
また、近年は、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸生産能を向上させた微生物がＬ−アミノ酸の製造に利用されている。微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる方法としては、例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、特許文献２）やＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）が挙げられる。
【０００４】
従来、発酵法によるＬ−アミノ酸等の目的物質の工業生産においては、炭素源として、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されてきた。
【０００５】
一方、エタノール等のアルコール類を炭素源として使用することも可能である。エタノールを炭素源とする発酵によるＬ−アミノ酸の製造法としては、例えば、好気条件下でアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献４）、ピルビン酸シンターゼまたはピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクタ
ーゼの活性が増大するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献５）、リボヌクレアーゼＧの活性が低下するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献６）、変異型リボソームＳ１タンパク質を有するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献７）、ＡｌｄＢタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献８）、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変された腸内細菌科の細菌を利用する方法（特許文献９）が知られている。
【０００６】
アコニターゼ（aconitase）は、ＴＣＡ回路やグリオキシル酸回路において、クエン酸
とイソクエン酸間の異性化反応を可逆的に触媒するデヒドラターゼ／ヒドラターゼ（EC 4.2.1.3）である。エシェリヒア・コリは、少なくとも２つのアコニターゼのアイソザイム、ＡｃｎＡとＡｃｎＢ、を有する。ＡｃｎＡとＡｃｎＢ間のアミノ酸配列の同一性は１７％程度である。ＡｃｎＢは、エシェリヒア・コリにおける主要なアコニターゼであり、特に対数増殖期に発現する（非特許文献１）。一方、ＡｃｎＡは、鉄や酸化ストレスにより誘導され、特に静止期に発現する（非特許文献１）。
【０００７】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）は、ＮＡＤ+また
はＮＡＤＰ+を電子受容体として、アセトアルデヒドから酢酸を生成する反応を可逆的に
触媒する酵素（EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4、EC 1.2.1.5、EC 1.2.1.22等）である。例えば
、エシェリヒア・コリのＡｌｄＢタンパク質は、ＮＡＤＰ+を電子受容体とするアセトア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する。上述のとおり、ＡｌｄＢタンパク質の活性低下がエタノールを炭素源とするＬ−アミノ酸の生産に有効であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,168,056号明細書
【特許文献２】米国特許第5,776,736号明細書
【特許文献３】米国特許第5,906,925号明細書
【特許文献４】WO2008/010565
【特許文献５】WO2009/031565
【特許文献６】WO2010/101053
【特許文献７】WO2011/096554
【特許文献８】WO2012/002486
【特許文献９】特開2014-036576
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cunningham L1, Gruer MJ, Guest JR., Microbiology., 1997, Dec;143(12):3795-805.
【非特許文献２】Ho KK, Weiner H., J. Bacteriol., 2005, Feb;187(3):1067-73.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように細菌を改変することによって、エタノールを炭素源として用いる場合の同細菌によるＬ−アミノ酸生産を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、アコニターゼ活性が増大するように改変されていることを特徴とし、
前記アコニターゼが、ＡｃｎＢタンパク質である、方法。
［２］
前記ＡｃｎＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
［３］
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大す
るように改変されていることを特徴とする、方法。
［４］
前記アコニターゼが、ＡｃｎＡタンパク質またはＡｃｎＢタンパク質である、前記方法。
［５］
前記ＡｃｎＡタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２２、２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
［６］
前記ＡｃｎＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アコニターゼ活性を有するタンパク質。
［７］
前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが、ＡｌｄＢタンパク質である、前記方法。
［８］
前記ＡｌｄＢタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［９］
前記細菌が、さらに、エタノール代謝酵素の活性が増大するように改変されている、前記方法。
［１０］
前記細菌が、好気的にエタノールを資化できる、前記方法。
［１１］
前記細菌が、変異型ａｄｈＥ遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型ａｄｈＥ遺伝子は、好気条件での不活化に対する耐性が向上する変異を有する変異型AdhEタンパク質をコードするａｄｈＥ遺伝子である、前記方法。
［１２］
前記変異が、野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における568位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、グルタミン酸お
よびアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
［１３］
前記置換後のアミノ酸残基が、リジン残基である、前記方法。
［１４］
前記変異型AdhEタンパク質が、さらに、下記の追加的変異を有する、前記方法。：
（Ａ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における560位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換
される変異；
（Ｂ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における566位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に
置換される変異；
（Ｃ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554
位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミ
ノ酸残基に置換される変異；
（Ｄ）上記変異の組み合わせ。
［１５］
前記細菌が、エシェリヒア属細菌である、前記方法。
［１６］
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
［１７］
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、前記方法。
［１８］
前記細菌が、さらに、下記の性質を有する、前記方法：
（Ａ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている；
（Ｂ）リジンデカルボキシラーゼの活性が低下するように改変されている；
（Ｃ）上記性質の組み合わせ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができ、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種AldBタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図。
【図２】各種AldBタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図３】各種AdhEタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図。
【図４】各種AdhEタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図５】各種AdhEタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌をエタノールを含有する培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変されていることを特徴とする、方法である。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。
【００１７】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、且つ、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変された細菌である。
【００１８】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするＬ−アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００１９】
Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は、１種のＬ−アミノ酸の生産能のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸の生産能を有していてもよい。
【００２０】
本発明において、アミノ酸は、特記しない限り、いずれもＬ−アミノ酸であってよい。
【００２１】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００２２】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K12由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）が挙げられる。
【００２３】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エ
ンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００２４】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091
）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２５】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２６】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２７】
本発明の細菌は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよく、Ｌ−アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。
【００２８】
Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのよ
うな方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００２９】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株
は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００３０】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する
。
【００３１】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
【００３２】
以下、Ｌ−アミノ酸生産菌、およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなＬ−アミノ酸生産菌が有する性質およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタミン酸シンテターゼ（gltBD）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ
（acnA, acnB）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、ホスホエノールピルビン酸カルボシラーゼ（ppc）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルベートキナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセリン
酸キナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、トリ
オースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（fbp）、ホ
スホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）、６−ホ
スホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン
酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、カッコ内は、そ
の酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。
【００３４】
クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。また、エントナー・ドゥドロフ経路の遺伝子（edd, eda）の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1352966Bに開示されたものが挙げら
れる。
【００３５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、酢酸キナーゼ（ack）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvG）、アセト乳酸シンターゼ（ilvI）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（ldh）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（gadAB）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）が挙げられる。
【００３６】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。また、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、エルビニア属細菌等の腸内細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下または欠損させる方法は、米国特許6,197,559号公報、米国特許6,682,912号公報、米国特許6,331,419
号公報、米国特許8,129,151号公報、およびWO2008/075483に開示されている。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００３７】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードするsucA遺伝子を破壊することにより得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。
【００３８】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）、Pantoea ananatis SC17株（FERM BP-11091）、Pantoea ananatis SC17(0)株（VKPM B-9246）等のパントエア属細菌も挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選
択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17株は、2009年2月4日に、独立行政法
人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構
特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。AJ13355株は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。
【００３９】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したパントエア属細菌も挙げられる。そのような株としては、AJ13355株のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット
遺伝子（sucA）欠損株であるAJ13356株（米国特許第6,331,419号）、及びSC17株のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA株（米国特許第6,596,517号）が挙げられる。AJ13356株は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基
盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-8646として寄託されている。
【００４０】
尚、AJ13355株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransと同定されたが、近年
、16S rRNAの塩基配列解析などにより、Pantoea ananatisに再分類されている。よって、AJ13355株及びAJ13356株は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書ではPantoea ananatisとして記載する。
【００４１】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、Pantoea ananatis AJ13601株、Pantoea ananatis NP106株、及びPantoea ananatis NA1株等のパントエア属細菌も挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得られた株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下
で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株
は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999
年8月18日に、工業技術院生命工学研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特
許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に
基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００４２】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）活性およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（sdh）活性の両
方が低下または欠損した株も挙げられる（特開2010-041920号）。そのような株として、
具体的には、例えば、Pantoea ananatis NA1のsucAsdhA二重欠損株が挙げられる（特開2010-041920号）。
【００４３】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、栄養要求性変異株も挙げられる。栄養要求性変異株として、具体的には、例えば、E. coli VL334thrC+
(VKPM B-8961) (EP 1172433) が挙げられる。E. coli VL334 (VKPM B-1641) は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である
(米国特許第4,278,765号)。E. coli VL334thrC+は、thrC遺伝子の野生型アレルをVL334
に導入することにより得られた、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌である。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7) の細胞で増殖した
バクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。
【００４４】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アスパラギン酸アナログに耐性を有する株も挙げられる。これらの株は、例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損していてもよい。アスパラギン酸アナログに耐性を有し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損した株として、具体的には、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したE. coli FFRM P-12379 (米国特許第5,393,671号)、E. coli AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号) が挙げられる。
【００４５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｄ−キシロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように細菌を改変する方法も挙げられる（特表2008-509661
）。Ｄ−キシロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を増強してもよいし、両方を増強してもよい。なお、本明細書ではＤ−キシロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。
【００４６】
Ｄ−キシロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−５−リン酸をグリセルアルデヒド−３−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (Methods Enzymol., 9,515-520 (1966)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。
【００４７】
また、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース６−リン酸をエリスロース−４−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。
【００４８】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子（WO2005/085419）やybjL遺伝子（WO2008/133161）の発現を増強することも挙げられる。
【００４９】
＜Ｌ−グルタミン生産菌＞
Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）やグルタミンシンセターゼ（glnA）が挙げられる。なお、グルタミンシンセターゼの活性は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊やPII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によって増強してもよい（EP1229121）。
【００５０】
また、Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミンの生合成経路から分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミナーゼが挙げられる。
【００５１】
Ｌ−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセター
ゼを有するエシェリヒア属に属する株が挙げられる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００５２】
＜Ｌ−プロリン生産菌＞
Ｌ−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−プロリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、グルタミン酸−５−キナーゼ（proB）、γ‐グルタミル−リン酸レダクターゼ、ピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ（
putA）が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸−５−キナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が好適に利用できる。
【００５３】
また、Ｌ−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−プロリン分解に関与する酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、プロリンデヒドロゲナーゼやオルニチンアミノトランスフェラーゼが挙げられる。
【００５４】
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、E. coli VKPM B-8012 (ロ
シア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のE. coliプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のE. coliプラスミド変異体、３，４−デヒドロキシプロリンおよびアザチジン−２−カルボキシレートに耐性のE. coli 702株（VKPMB-8011）、702株のilvA遺伝子欠損株であるE. coli 702ilvA株(VKPM B-8012) (EP 1172433) が挙げられる。
【００５５】
＜Ｌ−スレオニン生産菌＞
Ｌ−スレオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−スレオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）（thrB）、スレオニンシンターゼ（threonine synthase）（thrC）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）（aspC）が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルト
キナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレ
オニンシンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。スレオニン分解が抑制された株としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したE. coli TDH6株（特開2001-346578号）が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素の活性は、最終産物のＬ−スレオニンによって阻害される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変するのが好ましい。上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しており、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成している。スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより抑制される。スレオニンオペロンの発現の増強は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいはアテニュエーターを除去することにより達成できる（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
WO02/26993; WO2005/049808; WO2005/049808; WO2003/097839参照）。
【００５７】
スレオニンオペロンの上流には固有のプロモーターが存在するが、同プロモーターを非天然のプロモーターに置換してもよい（WO98/04715号パンフレット参照）。また、スレオニン生合成関与遺伝子がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターの制御下で発現するようにスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）
。また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変された細菌は、Ｌ−スレオニンアナログであるα-amino-β-hydroxyvaleric acid（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても取得できる。
【００５８】
このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、コピー数の上昇により、あるいは強力なプロモーターに連結されることにより、宿主内での発現量が向上しているのが好ましい。コピー数の上昇は、スレオニンオペロンを含むプラスミドを宿主に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Muファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成できる。
【００５９】
また、Ｌ−スレオニン生産能を付与または増強する方法としては、宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法やＬ−ホモセリン耐性を付与する方法も挙げられる。耐性の付与は、例えば、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することにより達成できる。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK遺伝子、yeaS遺伝
子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また、宿主にＬ−スレオニン
耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や国際公開第90/04636号パ
ンフレットに記載の方法を参照出来る。
【００６０】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)
、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRＬ−21593
(米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)、ならびにE. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) が挙げられる。
【００６１】
VKPM B-3996株は、TDH-6株に、プラスミドpVIC40を導入した株である。TDH-6株は、ス
クロース資化性であり、thrC遺伝子を欠損し、ilvA遺伝子にリーキー（leaky）変異を有
する。また、VKPM B-3996株は、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに
対する耐性を付与する変異を有する。プラスミドpVIC40は、RSF1010由来ベクターに、ス
レオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンが挿入されたプラスミドである（米国特許第5,705,371号）。この変異型thrA遺伝子は、スレオ
ニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス（Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia）に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4
月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオル
ガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM
B-3996で寄託されている。
【００６２】
VKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオ
ペロンの制御領域を温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換したプラスミドpPRT614を保持する。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託され
ている。
【００６３】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子
は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, g
i: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子と
の間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにさ
れている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディ
ングフレームとの間に位置する。また、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンは、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在す
る周知のプラスミドpVIC40（米国特許第5,705,371号）から取得できる。
【００６４】
E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: resistant to homoserine and threonine（ホモセ
リン及びスレオニンに耐性）)。また、高濃度のスレオニン又はホモセリンへの耐性を付
与するrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.
457, EP 1013765 A)。
【００６５】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより取得できる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００６６】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、その遺伝子の塩基配列に基づいて
作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も
同様に得ることができる。
【００６７】
＜Ｌ−リジン生産菌＞
Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase）（dapA）、アスパルトキナーゼIII（aspartokinase III）（lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase）（dapB）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）（lysA）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（diaminopimelate dehydrogenase）（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（phosphoenolpyrvate carboxylase）（ppc）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenease）（asd）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase））（aspC）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（diaminopimelate epimerase）（dapF）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ（tetrahydrodipicolinate succinylase）（dapD）、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ（succinyl-diaminopimelate deacylase）（dapE）、及びアスパルターゼ（aspartase）（aspA）
（EP 1253195 A）が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）をコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII（lysC）はＬ−リジンによるフィードバ
ック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利用してもよ
い（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（dapA）Ｌ−
リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。
【００６８】
また、Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、リジンデカルボキシラーゼ（lysine decarboxylase）（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。
【００６９】
また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログは腸内細菌科の細菌やコリネ型細菌等の細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログとしては、特に制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムが挙げられる。これらのリジンアナ
ログに対して耐性を有する変異株は、細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。
【００７０】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバ
ック阻害が解除されている。
【００７１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、E. coli WC196
株も挙げられる。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与すること
により育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され
、1994年12月6日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技
術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００７２】
好ましいＬ−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldcやE. coli WC196ΔcadA
Δldc/pCABD2が挙げられる（WO2010/061890）。WC196ΔcadAΔldcは、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2は、WC196ΔcadAΔldcに、リジン生合成系遺伝子を含
むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である
。WC196ΔcadAΔldcは、AJ110692と命名され、2008年10月7日に、独立行政法人産業技術
総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120
号室）に受託番号FERM BP-11027として寄託された。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコード
する変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
【００７３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、E. coli AJIK01株（NITE BP-01520）も挙げられる
。AJIK01株は、E. coli AJ111046と命名され、2013年1月29日に、独立行政法人製品評価
技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、2014年5月15日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01520が付与されている。
【００７４】
＜Ｌ−アルギニン生産菌＞
Ｌ−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子と
しては、例えば、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸残基が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００７５】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株 (ロシア特許出願第2001112869号)、237株由来の酢酸資化能が向上した株であるE. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、及び
Ｎ−アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたE. coliア
ルギニン生産株 (EP1170361A1) が挙げられる。E. coli 237株は、2000年4月10日にルシ
アン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7925の受託番号で寄
託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。E. coli 382株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００７６】
また、Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログ等への耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、α−メチルメチ
オニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）が挙げられる。
【００７７】
＜Ｌ−シトルリン生産菌およびＬ−オルニチン生産菌＞
Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンは、Ｌ−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、および／またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、Ｌ−シトルリンおよび／またはＬ−オルニチンの生産能を付与または増強することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。
【００７８】
＜Ｌ−ヒスチジン生産菌＞
Ｌ−ヒスチジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル−ＡＭＰサイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシルフォルミミノ−５−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）が挙げられる。
【００７９】
これらの内、hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素は、Ｌ−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、例えば、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（hisG）にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより、 付与または増強させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００８０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116〜B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)
及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674)
(EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)、Ｌ−ヒスチジン生合成
系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファ
グアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。
【００８１】
＜Ｌ−システイン生産菌＞
Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システイン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、セリンアセチルトランスフェラーゼや３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。セリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、システインによるフィードバック阻害に耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、特
開平11-155571や米国特許公開第20050112731に開示されている。また、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、セリンによるフィードバック阻害に耐性の変異型３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、例えば、米国特許第6,180,373号に開示されている。
【００８２】
また、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システインの生合成経路から分岐してＬ−システイン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、例えば、Ｌ−システインの分解に関与する酵素が挙げられる。Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、特に制限されないが、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC）（特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、トリプトファナーゼ（tnaA）（特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（cysM）（特開2005-245311）、malY遺伝子産物（特開2005-245311）、Pantoea ananatisのd0191遺伝子産物（特開2009-232844）が挙げられる。
【００８３】
また、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システイン排出系を増強することや硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系を増強することも挙げられる。Ｌ−システイン排出系のタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質（特開2002-233384）、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質（特開2004-49237）、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusAの各遺伝子にコードされる各タンパク質（特開2005-287333）、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質（特開2010-187552）が挙げられる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系のタンパク質としては、cysPTWAM遺伝子クラスターにコードされるタンパク質が挙げられる。
【００８４】
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15 (米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ
活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307A1)が挙げられる。
【００８５】
＜Ｌ−メチオニン生産菌＞
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−スレオニン要求株や、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられる(特開2000-139471)。また、Ｌ−メ
チオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを保持する株も挙げられる（特開2000-139471、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471、US20080311632）。
【００８６】
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli AJ11539 (NRRL B-12399)、E. coli AJ11540 (NRRL B-12400)、E. coli AJ11541 (NRRL B-12401)、E. coli AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有するE. coli 218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)、E. coli AJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471）が挙げられる。AJ13425株は、メチオニンリプレッサーを欠
損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された、E. coli W3110由来のＬ−ス
レオニン要求株である。
【００８７】
＜Ｌ−ロイシン生産菌＞
Ｌ−ロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−ロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロン
の遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。また、酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。
【００８８】
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))、β−２
−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。
【００８９】
＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−イソロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる（特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号）。
【００９０】
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、例えば、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、イソロイシンアナログに加えてＤＬ−エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号) 等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。
【００９１】
＜Ｌ−バリン生産菌＞
Ｌ−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−バリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンやilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼを、ilvCはイソメロリダクターゼ（国際公開00/50624号）を、それぞれコードする。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、および／またはＬ−ロイシンによる発現抑制（アテニュエーション）を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、Ｌ−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。
【００９２】
また、Ｌ−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−バリンの生合成経路から分岐してＬ−バリン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選
択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやＤ−パントテン酸合成に関与する酵素が挙げられる（国際公開00/50624号）。
【００９３】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変されたE. coli株(米国特許第5,998,178号) が挙げ
られる。
【００９４】
また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノアシルt-RNA
シンテターゼに変異を有する株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。そのような株と
しては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が挙げられる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。ま
た、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、生育にリポ酸を要求する、および／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)も挙げられる。
【００９５】
＜Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌、Ｌ−チロシン生産菌＞
Ｌ−トリプトファン生産能、Ｌ−フェニルアラニン生産能、および／またはＬ−チロシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。
【００９６】
これらの芳香族アミノ酸に共通する生合成系酵素としては、特に制限されないが、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroG）、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ（aroC）が挙げられる（欧州特許763127号）。これらの酵素をコードする遺伝子の発現はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、これらの酵素の活性を増強してもよい（欧州特許763127号）。
【００９７】
Ｌ−トリプトファン生合成系酵素としては、特に制限されないが、アントラニル酸シンターゼ（trpE）、トリプトファンシンターゼ（trpAB）、及びホスホグリセリン酸デヒド
ロゲナーゼ（serA）が挙げられる。例えば、トリプトファンオペロンを含むＤＮＡを導入することにより、Ｌ−トリプトファン生産能を付与又は増強できる。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。アントラニル酸シンターゼはＬ−トリプトファンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼはＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。さらに、マレートシンターゼ（aceB）、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）からなるオペロン（aceオペロン）
の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与または増強してもよい(WO2005/103275)。
【００９８】
Ｌ−フェニルアラニン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼは、２機能酵素としてpheA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸
ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼはＬ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。
【００９９】
Ｌ−チロシン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、２機能酵素としてtyrA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼはＬ−チロシンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。
【０１００】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸の生合成が低下するように改変されていてもよい。また、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、副生物の取り込み系が増強されるように改変されていてもよい。副生物としては、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸が挙げられる。副生物の取り込み系をコードする遺伝子としては、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み系をコードする遺伝子であるtnaBやmtr、Ｌ−フェニルアラニンの取り込み系をコードする遺伝子であるpheP、Ｌ−チロシンの取り込み系をコードする遺伝子であるtyrPが挙げられる（EP1484410）。
【０１０１】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、部分的に不活化されたトリプトファニル-tRNAシンテターゼをコードする変異型trpS遺
伝子を保持するE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164、セリンによるフィードバ
ック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを含むトリプトファンオペロンが導入された株 (特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号,
米国特許第4,371,614号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL
B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノ
ールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特
許第6,319,696号)、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株 (米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1) が挙げられる。
【０１０２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバ
ック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146
、NRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)が挙げられる。また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHAB＞ (FERM BP-3566)、E. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHAD＞ (FERM BP-12659)、E. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHATerm＞ (FERM BP-12662)、E. coli K-12 AJ 12604 ＜W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB＞ (FERM BP-3579)も挙
げられる(EP 488424 B1)。また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株も挙げられる(US2003/0148473、US2003/0157667、WO03/044192)。
【０１０３】
また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。Ｌ−アミノ酸を排出する活性は、例えば、Ｌ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子（ygaZ）、b2683遺伝子（ygaH）、b1242遺伝子（ychE）、b3434遺伝子（yhgN）が挙げられる（特開2002-300874号
公報）。
【０１０４】
また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。
【０１０５】
糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエ
ノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps；欧州出願公開877090号明細書）、ホスホエノ
−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（ppc；国際公開95/06114号パンフレット)、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc；国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレッ
ト）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB, fbp；国際公開03/04664号パン
フレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF；国際公開03/008609号パンフレット）、
トランスアルドラーゼ遺伝子（talB；国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ
遺伝子（fum；国際公開01/02545号パンフレット）、non-PTSスクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc；欧州出願公開149911号パンフレット）、スクロース資化性（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【０１０６】
エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB；米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB；欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げ
られる。
【０１０７】
なお、上記のＬ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するアコニターゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼならびにそれらをコードする遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０１０８】
＜１−２＞アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の増強
本発明の細菌は、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変されている。アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように細菌を改変することによって、エタノールを炭素源として用
いる場合の同細菌によるＬ−アミノ酸生産を向上させることができる。
【０１０９】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように細菌を改変した後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、アコニターゼ活性が増大するように、または、アコニターゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増大するように改変されたことにより、Ｌ−アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【０１１０】
「アコニターゼ（aconitase）」とは、クエン酸とイソクエン酸間の異性化反応を可逆
的に触媒する活性を有するタンパク質（EC 4.2.1.3）をいう。同活性を「アコニターゼ活性」ともいう。また、アコニターゼをコードする遺伝子を「アコニターゼ遺伝子」ともいう。アコニターゼ活性は、例えば、イソクエン酸からのcis-アコニット酸の生成を測定することにより、測定できる（Gruer MJ, Guest JR., Microbiology., 1994, Oct;140(10):2531-41.）。
【０１１１】
アコニターゼとしては、acnA遺伝子にコードされるAcnAタンパク質やacnB遺伝子にコードされるAcnBタンパク質が挙げられる。本発明においては、例えば、AcnAタンパク質の活性を増強してもよく、AcnBタンパク質の活性を増強してもよく、AcnAタンパク質とAcnBタンパク質の両方の活性を増強してもよい。なお、本発明の細菌がアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が増大するように改変されていない場合は、少なくともAcnBタンパク質の活性を増強する。
【０１１２】
AcnAタンパク質およびAcnBタンパク質としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（旧名、エルビニア・カロトボー
ラ（Erwinia carotovora））、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）等の腸
内細菌科に属する細菌のAcnAタンパク質およびAcnBタンパク質が挙げられる。
【０１１３】
Escherichia coli K12 MG1655株のacnA遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列
中、1335831〜1338506位の配列に相当する。また、MG1655株のAcnAタンパク質は、GenBank accession NP_415792 (version NP_415792.1 GI:16129237)として登録されている。MG1655株のacnA遺伝子の塩基配列およびAcnAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番
号２１および２２に示す。
【０１１４】
Pantoea ananatis AJ13355株のacnA遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、1665681〜1668362位の配列の相補配列に相当する。また、AJ13355株のAcnAタンパク質は
、GenBank accession YP_005934253 (version YP_005934253.1 GI:386015968)として登録されている。AJ13355株のacnA遺伝子の塩基配列およびAcnAタンパク質のアミノ酸配列を
、それぞれ配列番号２３および２４に示す。
【０１１５】
Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のacnA遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_004547 (VERSION NC_004547.2 GI:50119055)として登録されているゲ
ノム配列中、2198282〜2200954位の配列に相当する。また、SCRI1043株のAcnAタンパク質は、GenBank accession YP_050038 (version YP_050038.1 GI:50120871)として登録され
ている。SCRI1043株のacnA遺伝子の塩基配列およびAcnAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５および２６に示す。
【０１１６】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のacnA遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)として登録されている
ゲノム配列中、1298278〜1300953位の配列に相当する。また、CT18株のAcnAタンパク質は、GenBank accession NP_455785 (version NP_455785.1 GI:16760168)として登録されて
いる。CT18株のacnA遺伝子の塩基配列およびAcnAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２７および２８に示す。
【０１１７】
Escherichia coli K12 MG1655株のacnB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列
中、131615〜134212位の配列に相当する。また、MG1655株のAcnBタンパク質は、GenBank accession NP_414660 (version NP_414660.1 GI:16128111)として登録されている。MG1655株のacnB遺伝子の塩基配列およびAcnBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号
２９および３０に示す。
【０１１８】
Pantoea ananatis AJ13355株のacnB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、116856〜119552位の配列に相当する。また、AJ13355株のAcnBタンパク質は、GenBank accession YP_005932972 (version YP_005932972.1 GI:386014695)として登録されている。AJ13355株のacnB遺伝子の塩基配列およびAcnBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３１および３２に示す。
【０１１９】
Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のacnB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_004547 (VERSION NC_004547.2 GI:50119055)として登録されているゲ
ノム配列中、4218908〜4221505位の配列の相補配列に相当する。また、SCRI1043株のAcnBタンパク質は、GenBank accession YP_051867 (version YP_051867.1 GI:50122700)とし
て登録されている。SCRI1043株のacnB遺伝子の塩基配列およびAcnBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３３および３４に示す。
【０１２０】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のacnB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)として登録されている
ゲノム配列中、189006〜191603位の配列に相当する。また、CT18株のAcnBタンパク質は、GenBank accession NP_454772 (version NP_454772.1 GI:16759155)として登録されてい
る。CT18株のacnB遺伝子の塩基配列およびAcnBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３５および３６に示す。
【０１２１】
「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）」とは、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を電子受容体として、アセトアルデヒドから酢酸を生成する反応を可逆的に触媒するタンパク質（EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4、EC 1.2.1.5、EC 1.2.1.22等）をい
う。同活性を「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性」ともいう。また、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子」ともいう。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、アセトアルデヒドデヒド依存的なＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+の還元を測定することにより、測定できる（Ho KK, Weiner H., J. Bacteriol., 2005, Feb;187(3):1067-73.）。
【０１２２】
なお、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、「ＣｏＡ非依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（CoA-independent acetaldehyde dehydrogenase）」ともいい、ＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（CoA-dependent acetaldehyde dehydrogenase）（
後述）とは区別される。また、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」や「ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ」等と呼ばれている場合もある。
【０１２３】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、aldB遺伝子にコードされるAldBタンパク質が挙げられる。AldBタンパク質としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（旧名、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora））、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）等の腸内細菌科に属する細菌のAldBタンパク質が挙げられる。
【０１２４】
Escherichia coli K12 MG1655株のaldB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列
中、3754973〜3756511位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のAldBタンパク質は、GenBank accession NP_418045 (version NP_418045.4 GI:90111619)として登録され
ている。MG1655株のaldB遺伝子の塩基配列およびAldBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３７および３８に示す。
【０１２５】
Pantoea ananatis LMG 20103株のaldB遺伝子ホモログは、データベース上ではaldA遺伝子の１つとして登録されている。本発明においては、当該aldB遺伝子ホモログをaldB遺伝子として扱う。Pantoea ananatis LMG 20103株のaldB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、2168098〜2169570位の配列の相補配列に相当する。また、LMG 20103株のAldBタンパク質は、GenBank accession YP_003520235 (version YP_003520235.1 GI:291617493)として登録されている。LMG 20103株のaldB遺伝子の塩基配列およびAldBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３９および４０に示す。
【０１２６】
Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のaldB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_004547 (VERSION NC_004547.2 GI:50119055)として登録されているゲ
ノム配列中、111626〜113161位の配列に相当する。また、SCRI1043株のAldBタンパク質は、GenBank accession YP_048222 (version YP_048222.1 GI:50119055)として登録されて
いる。SCRI1043株のaldB遺伝子の塩基配列およびAldBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４１および４２に示す。
【０１２７】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のaldB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)として登録されている
ゲノム配列中、3978586〜3980124位の配列に相当する。また、CT18株のAldBタンパク質は、GenBank accession NP_458246 (version NP_458246.1 GI:16762629)として登録されて
いる。CT18株のaldB遺伝子の塩基配列およびAldBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４３および４４に示す。
【０１２８】
これらAldBタンパク質のアラインメントの結果を図１および２に示す。Escherichia coli K12 MG1655株のAldBタンパク質と、Pantoea ananatis LMG 20103株、Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株、およびSalmonella enterica serovar Typhi CT18株のAldBタ
ンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ、64.7%、81.4%、および95.8%である。
【０１２９】
アコニターゼは、元の機能が維持されている限り、上記例示したアコニターゼ、例えば上記例示したAcnAタンパク質やAcnBタンパク質、のバリアントであってもよい。同様に、アコニターゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、すなわち元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したアコニターゼ遺伝子、例えば上記例示したacnA遺伝子やacnB遺伝子、のバリアントであってもよい。また、アセトアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼは、元の機能が維持されている限り、上記例示したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば上記例示したAldBタンパク質、のバリアントであってもよい。同様に、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、すなわち元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、例えば上記例示したaldB遺伝子、のバリアントであってもよい。このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したアコニターゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、並びにそれらをコードする遺伝子の、ホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【０１３０】
なお、「AcnAタンパク質」、「AcnBタンパク質」、および「AldBタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したAcnAタンパク質、AcnBタンパク質、およびAldBタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「acnA遺伝子」、「acnB遺伝子」、および「aldB遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したacnA遺伝子、acnB遺伝子、およびaldB遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。
【０１３１】
「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性（または性質）に対応する活性（または性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、アコニターゼにあっては、タンパク質のバリアントがアコニターゼ活性を有することをいい、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにあっては、タンパク質のバリアントがアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することをいう。
【０１３２】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【０１３３】
アコニターゼまたはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログとしては、例えば、上記アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、アコニターゼ遺伝子またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のホモログは、例えば、各種微生物の染色体を鋳型にして、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【０１３４】
アコニターゼまたはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、アコニターゼについて配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６に示すアミノ酸配列、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼについて配列番号３８、４０、４２、または４４に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【０１３５】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln
、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０１３６】
また、アコニターゼまたはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１３７】
また、アコニターゼまたはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、アコニターゼについて配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、または３５に示す塩基配列、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼについて配列番号３７、３９、４１、または４３に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質であってもよい。そのような
プローブは、例えば、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80
％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が
低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーショ
ンの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好
ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件と
しては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
【０１３８】
アコニターゼ遺伝子またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、アコニターゼ遺伝子またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【０１３９】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素やエタノール代謝酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【０１４０】
＜１−３＞エタノール資化性
本発明の細菌は、エタノール資化性を有する。「エタノール資化性を有する」とは、エタノールを唯一炭素源とする最少培地において生育可能であることをいう。本発明の細菌は、本来的にエタノール資化性を有するものであってもよく、エタノール資化性を有するように改変されたものであってもよい。エタノール資化性を有する細菌は、例えば、上記
のような細菌にエタノール資化性を付与することにより、または、上記のような細菌のエタノール資化性を増強することにより、取得できる。
【０１４１】
エタノール資化性は、エタノール代謝酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変することにより、付与または増強できる。すなわち、本発明の細菌は、エタノール代謝酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するよう改変されていてよい。
【０１４２】
エタノール代謝酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼやＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【０１４３】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を電子受容体として、エタノールからアセトアルデヒドを生成する反応を可逆的に触媒するタンパク質（EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.71等）をいう。同活性を「アルコールデヒドロゲナーゼ活
性」ともいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、エタノール依存的なＮＡＤ+の還元を測定することにより、測定できる（Clark D, Cronan JE Jr., J Bacteriol., 1980, Jan;141(1):177-83.）。
【０１４４】
「ＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を電子受容体として、アセトアルデヒドからアセチルＣｏＡを生成する反応を可逆的に触媒するタンパク質（EC 1.2.1.10）をいう。同活性を「ＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ活性」ともいう。ＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、アセトアルデヒドデヒドおよびＣｏＡ依存的なＮＡＤ+の還元を測定することに
より、測定できる（Rudolph FB, Purich DL, Fromm HJ., J Biol Chem., 1968, Nov 10;243(21):5539-45.）。
【０１４５】
エタノール代謝酵素としては、adhE遺伝子にコードされるAdhEタンパク質が挙げられる。AdhEタンパク質は２機能酵素であり、アルコールデヒドロゲナーゼ活性とＣｏＡ依存的アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する。AdhEタンパク質としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）
（旧名、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora））、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）等の腸内細菌科に属する細菌のAdhEタンパク質が挙げられる。
【０１４６】
Escherichia coli K12 MG1655株のadhE遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列
中、1295446〜1298121位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のAdhEタンパク質は、GenBank accession NP_415757 (version NP_415757.1 GI:16129202)として登録され
ている。MG1655株のadhE遺伝子の塩基配列およびAdhEタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４５および４６に示す。
【０１４７】
Pantoea ananatis LMG 20103株のadhE遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、2335387〜2338071位の配列に相当する。また、LMG 20103株のAdhEタンパク質は、GenBank accession YP_003520384 (version YP_003520384.1 GI:291617642)として登録されて
いる。LMG 20103株のadhE遺伝子の塩基配列およびAdhEタンパク質のアミノ酸配列を、そ
れぞれ配列番号４７および４８に示す。
【０１４８】
Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のadhE遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_004547 (VERSION NC_004547.2 GI:50119055)として登録されているゲ
ノム配列中、2634501〜2637176位の配列に相当する。また、SCRI1043株のAdhEタンパク質は、GenBank accession YP_050421 (version YP_050421.1 GI:50121254)として登録され
ている。SCRI1043株のadhE遺伝子の塩基配列およびAdhEタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４９および５０に示す。
【０１４９】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のadhE遺伝子ホモログは、データベース上ではadh遺伝子として登録されている。本発明においては、当該adhE遺伝子ホモログをadhE遺伝子として扱う。Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のadhE遺伝子は、NCBI
データベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)と
して登録されているゲノム配列中、1259893〜1262571位の配列の相補配列に相当する。また、CT18株のAdhEタンパク質は、GenBank accession NP_455751 (version NP_455751.1 GI:16760134)として登録されている。CT18株のadhE遺伝子の塩基配列およびAdhEタンパク
質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５１および５２に示す。
【０１５０】
これらAdhEタンパク質のアラインメントの結果を図３〜５に示す。Escherichia coli K12 MG1655株のAdhEタンパク質と、Pantoea ananatis LMG 20103株、Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株、およびSalmonella enterica serovar Typhi CT18株のAdhEタンパ
ク質とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ、89.0%、89.1%、および97.2%である。
【０１５１】
エタノール代謝酵素は、上記例示したエタノール代謝酵素、例えば上記例示した腸内細菌科に属する細菌のAdhEタンパク質、の保存的バリアントであってもよい。例えば、AdhEタンパク質は、４６、４８、５０、または５２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、上述したアコニターゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼならびにそれらをコードする遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０１５２】
本発明の細菌は、特に、好気条件でエタノール資化性を有する（好気的にエタノールを資化できる）のが好ましい。「好気条件でエタノール資化性を有する」とは、エタノールを唯一炭素源とする最少培地において好気条件で生育可能であることをいう。また、「好気条件でエタノール資化性を有する」とは、例えば、本発明の細菌を好気的に培養して得られた菌体から調製した無細胞抽出液におけるアルコールデヒドロゲナーゼの比活性が、例えば、1.5 U/mg protein以上、好ましくは5 U/mg protein以上、より好ましくは10 U/mg protein以上であることであってよい。なお、1 Uのアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、上記活性測定条件（Clark D, Cronan JE Jr., J Bacteriol., 1980, Jan;141(1):177-83.）において、1分間に1 nmolのＮＡＤＨを生じる活性として定義される。「好気条件」
とは、通気、振盪、および撹拌等の酸素供給手段によって酸素が培養系に供給される培養条件をいう。本発明の細菌は、本来的に好気条件でエタノール資化性を有するものであってもよく、好気条件でエタノール資化性を有するように改変されたものであってもよい。例えば、エシェリヒア・コリは一般的に好気的にエタノールを資化できないが、好気的にエタノールを資化できるようにエシェリヒア・コリを改変して本発明の細菌として用いてもよい。
【０１５３】
好気条件でのエタノール資化性は、エタノール代謝酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の好気条件での活性が増大するように細菌を改変することにより、付与または増強できる。すなわち、本発明の細菌は、エタノール代謝酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の好気条件での活性が増大するよう改変されていてよい。
【０１５４】
好気条件でのエタノール資化性は、例えば、好気条件で機能するプロモーターの制御下で発現するadhE遺伝子を保持するように細菌を改変することにより、付与又は増強できる
。
【０１５５】
そのような改変は、例えば、細菌のゲノム上のadhE遺伝子の本来のプロモーターを、好気条件で機能するプロモーターに置換することにより、達成できる。また、好気条件で機能するプロモーターの下流にadhE遺伝子を結合して細菌に導入してもよく、細菌のゲノム上の好気条件で機能するプロモーターの下流にadhE遺伝子を導入してもよい。プロモーターの置換や遺伝子の導入については、後述する「タンパク質の活性を増大させる手法」の記載を参照できる。
【０１５６】
好気条件で機能するプロモーターは、本発明の細菌がエタノールを資化できる程度に好気条件でadhE遺伝子を発現できる限り、特に制限されない。好気条件で機能するプロモーターとしては、例えば、解糖系、ペントースリン酸経路、ＴＣＡ回路、アミノ酸生合成系の遺伝子のプロモーターや実施例で用いたＰ14プロモーター（配列番号１）が挙げられる。また、好気条件で機能するプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロ
モーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプ
ロモーター等の強力なプロモーターも挙げられる。
【０１５７】
好気条件でのエタノール資化性は、例えば、好気条件での不活化に対する耐性が向上する変異を有するAdhEタンパク質をコードするadhE遺伝子を保持するように細菌を改変することにより、付与又は増強できる。「好気条件での不活化に対する耐性が向上する変異」を、「好気耐性変異」ともいう。
【０１５８】
好気耐性変異を有するAdhEタンパク質を「変異型AdhEタンパク質」ともいう。また、変異型AdhEタンパク質をコードする遺伝子を、「変異型adhE遺伝子」ともいう。
【０１５９】
好気耐性変異を有さないAdhEタンパク質を「野生型AdhEタンパク質」ともいう。また、野生型AdhEタンパク質をコードする遺伝子を、「野生型adhE遺伝子」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、好気耐性変異を有さない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型AdhEタンパク質としては、例えば、上記例示した腸内細菌科に属する細菌のAdhEタンパク質が挙げられる。また、上記例示した腸内細菌科に属する細菌のAdhEタンパク質の保存的バリアントは、好気耐性変異を有さない限り、いずれも野生型AdhEタンパク質である。
【０１６０】
好気耐性変異としては、野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列（Escherichia coli K12 MG1655株の野生型AdhEタンパク質のアミノ
酸配列）における568位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、グルタミン酸お
よびアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に置換される変異が挙げられる（WO2008/010565
）。置換後のアミノ酸残基としては、L（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、N（Asn）、Q（Gln）が挙げられる。置換後のアミノ酸残基は、例えば、リジン残基であってよい。置換後のアミノ酸残基がリジン残基である場合の同変異を、「Glu568Lys」または「E568K」ともいう。
【０１６１】
変異型AdhEタンパク質は、さらに、下記の追加的変異を有していてもよい：
（Ａ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における560位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換
される変異；
（Ｂ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における566位のフェニルアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に
置換される変異；
（Ｃ）野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号４６に示すアミノ酸配列における22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554
位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基に相当するアミノ酸残基が、他のアミ
ノ酸残基に置換される変異；
（Ｄ）上記変異の組み合わせ。
【０１６２】
上記の追加的変異において、置換後のアミノ酸残基としては、L（Lys）、R（Arg）、H
（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。上記変異（Ａ）にお
いて、置換後のアミノ酸残基は、例えば、リジン残基であってよい。上記変異（Ｂ）において、置換後のアミノ酸残基は、例えば、バリン残基であってよい。上記変異（Ｃ）において、置換後のアミノ酸残基は、例えば、22位についてグリシン残基（Glu22Gly）、236
位についてバリン残基（Met236Val）、461位についてシステイン残基（Tyr461Cys）、554位についてセリン残基（Ile554Ser）、及び786位についてバリン残基（Ala786Val）であ
ってよい。
【０１６３】
任意の野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列において、「配列番号４６に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象の野生型AdhEタン
パク質のアミノ酸配列と配列番号４６のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号４６に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味す
る。すなわち、上記変異において、アミノ酸残基の位置は、必ずしも野生型AdhEタンパク質のアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号４６に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号４６に示すアミノ酸配列からなる野生型AdhEタンパク質において、n位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残
基が欠失した場合、元のn位のアミノ酸残基はN末端から数えてn-1番目のアミノ酸残基と
なるが、「配列番号４６に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミ
ノ酸残基」とみなされる。同様に、例えば、ある微生物のAdhEタンパク質ホモログのアミノ酸配列中の567位のアミノ酸残基が、配列番号４６に示すアミノ酸配列中の568位に相当するときは、当該アミノ酸残基は、当該AdhEタンパク質ホモログにおける「配列番号４６に示すアミノ酸配列における568位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」である。
【０１６４】
アラインメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているClustalWなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al.,
Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987；Thompson JD et al., Nucleic
acid Reseach, 22(22), 4673-80. 1994）。
【０１６５】
変異型adhE遺伝子は、例えば、野生型adhE遺伝子を、コードされるAdhEタンパク質が好気耐性変異を有するよう改変することにより取得できる。改変のもとになる野生型adhE遺伝子は、例えば、野生型adhE遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型adhE遺伝子は、例えば、化学合成等により直接取得してもよい。
【０１６６】
遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用い
る方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【０１６７】
変異型adhE遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に導入される。具体的には、遺伝子は、好気条件で機能するプロモーターの制御下で発現するように本発明の細菌に導入することができる。遺伝子の導入については、後述する「タンパク質の活性を増大させる手法」の記載を参照できる。
【０１６８】
＜１−４＞その他の改変
本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ（「ＰＳ」ともいう）、および／または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ（「ＰＮＯ」ともいう）の活性が増大するよう
に改変されていてもよい（WO2009/031565）。
【０１６９】
「ピルビン酸シンターゼ」とは、還元型フェレドキシンまたは還元型フラボドキシンを電子供与体として、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する反応を可逆的に触媒す
る酵素（EC 1.2.7.1）をいう。ＰＳは、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、またはピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼともいう。ＰＳの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch.
Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。
【０１７０】
ＰＳをコードする遺伝子（ＰＳ遺伝子）としては、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、ハイドロジェノバクター・サーモフィラス（Hydrogenobacter thermophilus）等の還元的ＴＣＡサイクルを有する細菌のＰＳ遺伝子、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科に属する細菌のＰＳ遺伝子、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）等の独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のＰＳ遺伝子が
挙げられる。
【０１７１】
「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ
を電子供与体として、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する反応を可逆的に触媒
する酵素（EC 1.2.1.15）をいう。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼともいう。ＰＮＯの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。
【０１７２】
ＰＮＯをコードする遺伝子（ＰＮＯ遺伝子）としては、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のＰＮＯ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479: 155-156；GenBank Accession No. AB021127）、原生
動物クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のＰＮＯ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）、珪藻タラシオシラ・シュードナ
ナ（Tharassiosira pseudonana）のＰＮＯ相同遺伝子（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）が挙げられる。
【０１７３】
ＰＳ活性の増強は、後述するようなタンパク質の活性を増大する手法に加えて、ＰＳ活性に要求される電子供与体の供給を向上させることによっても達成できる。例えば、フェレドキシンまたはフラボドキシンの酸化型を還元型にリサイクルする活性を増強すること、フェレドキシンまたはフラボドキシンの生合成能を増強すること、またはそれらの組み合わせにより、ＰＳ活性を増強することができる（WO2009/031565）。
【０１７４】
フェレドキシンまたはフラボドキシンの酸化型を還元型にリサイクルする活性を有する
タンパク質としては、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼが挙げられる。「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、ＮＡＤＰＨを電子供与体として、フェレドキシンまたはフラボドキシンの酸化型を還元型に変換する反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+
レダクターゼともいう。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。
【０１７５】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子（フェレドキシン-ＮＡＤ
Ｐ+レダクターゼ遺伝子）としては、エシェリヒア・コリのfpr遺伝子、コリネバクテリウム・グルタミカムのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子、シュードモナス・プチダ（Psuedomonas putida）のＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子（Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）が挙げられる。
【０１７６】
フェレドキシンまたはフラボドキシンの生合成能は、フェレドキシンをコードする遺伝子（フェレドキシン遺伝子）またはフラボドキシンをコードする遺伝子（フラボドキシン遺伝子）の発現を増強することにより、増強することができる。フェレドキシン遺伝子またはフラボドキシン遺伝子としては、ＰＳおよび電子供与体再生系が利用可能なフェレドキシンまたはフラボドキシンをコードするものであれば、特に制限されない。
【０１７７】
フェレドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリのfdx遺伝子やyfhL遺伝子、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムのfer遺伝子、クロロビウム・テピダムやハイドロジェノ
バクター・サーモフィラス等の還元的ＴＣＡサイクルを有する細菌のフェレドキシン遺伝子が挙げられる。フラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリのfldA遺伝子やfldB遺伝子、還元的ＴＣＡサイクルを有する細菌のフラボドキシン遺伝子が挙げられる。
【０１７８】
また、本発明の細菌は、リボヌクレアーゼＧの活性が低下するように改変されていてもよい（特開2012-100537）。
【０１７９】
また、本発明の細菌は、変異型リボソームＳ１タンパク質を有するように改変されていてもよい（特開2013-074795）。
【０１８０】
また、本発明の細菌は、細胞内の過酸化水素濃度が低下するように改変されていてもよい（特開2014-036576）。
【０１８１】
なお、上記の遺伝子、例えば、ＰＳ遺伝子、ＰＮＯ遺伝子、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子、フラボドキシン遺伝子は、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、同遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、上述したアコニターゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼならびにそれらをコードする遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０１８２】
＜１−５＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、アコニターゼやアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【０１８３】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【０１８４】
タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０１８５】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【０１８６】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０１８７】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、ト
ランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する
こともできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【０１８８】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な
配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０１８９】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）
、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロ
ンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。
【０１９０】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、解糖系、ペントースリン酸経路、ＴＣＡ回路、アミノ酸生合成系の遺伝子のプロモーターや実施例で用いたＰ14プロモーター（配列番号１）が挙げられる。また、プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【０１９１】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、
およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【０１９２】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【０１９３】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成
する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１９４】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【０１９５】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０１９６】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinら
の論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１９７】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０１９８】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペ
ーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことが
できる。
【０１９９】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じ
うる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０２００】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０２０１】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０２０２】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エ
チルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処
理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０２０３】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組
換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パ
ルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
【０２０４】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０２０５】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０２０６】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して
、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２０７】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２０８】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、アコニターゼやアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性増強に加えて、任意のタンパク質、例えばＬ−アミノ酸生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０２０９】
＜１−６＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０２１０】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変
株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２１１】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２１２】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、
遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０２１３】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０２１４】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０２１５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０２１６】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失
型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切
り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用
いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０２１７】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０２１８】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０２１９】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０２２０】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０２２１】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株
と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２２２】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２２３】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の
塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０２２４】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えば目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０２２５】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の方法は、本発明の細菌をエタノールを含有する培地で培養してＬ−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法である。本発明においては、１種のＬ−アミノ酸が製造されてもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸が製造されてもよい。
【０２２６】
使用する培地は、エタノールを含有し、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、エタノールに加えて、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するＬ−アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０２２７】
本発明の方法において、エタノールは、唯一炭素源（sole carbon source）として利用されてもよく、そうでなくてもよい。すなわち、本発明の方法においては、エタノールに加えて、他の炭素源を併用してもよい。他の炭素源は、本発明の細菌が資化してＬ−アミノ酸を生成し得るものであれば、特に限定されない。他の炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。他の炭素源を用いる場合には、総炭素源中のエタノールの比率は、例えば、５重量％以上、１０重量％以上、２０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であってよい。他の炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２２８】
培地中での炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地中での炭素源の濃度は、Ｌ−アミノ酸の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くするのが好ましい。培地中での炭素源の初発濃度は、例えば、通常1
〜30 %(w/v)、好ましくは3〜10 %(w/v)であってよい。また、発酵の進行に伴う炭素源の
消費に応じて、炭素源を追加で添加してもよい。
【０２２９】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２３０】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０２３１】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源として
は、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０２３２】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０２３３】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−リジン生合成経路が強化され、Ｌ−リジン分解能が弱化されている場合が多い。よって、そのようなＬ−リジン生産菌を培養する場合には、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸を培地に補添するのが好ましい。
【０２３４】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、エシェリヒア・コリ等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するＬ−アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０２３５】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。
【０２３６】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０２３７】
本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
【０２３８】
培地中のエタノール濃度は、本発明の細菌がエタノールを炭素源として利用できる限り
、特に制限されない。エタノールは、例えば、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、より好ましくは２w/v%以下の濃度で培地に含有されてよい。また、エタノールは、例えば、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、より好ましくは１．０w/v%以上の濃度で培地に含有されてよい。エタノールは、初発培地、流加培地、またはその両方に、上記例示した濃度範囲で含有されていてよい。
【０２３９】
また、エタノールが流加培地に含有される場合、エタノールは、例えば、流加後の培地中のエタノール濃度が、５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、より好ましくは１w/v%以下となるように、流加培地に含有されてもよい。また、エタノールが流加培地に含有される場合、エタノールは、例えば、流加後の培地中のエタノール濃度が、０．０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、より好ましくは０．０５w/v%以上となるように、流加培地に含有されてもよい。
【０２４０】
エタノールは、唯一炭素源として利用される場合に、上記例示した濃度範囲で含有されていてよい。また、エタノールは、他の炭素源を併用する場合に、上記例示した濃度範囲で含有されてもよい。また、エタノールは、他の炭素源を併用する場合に、例えば、総炭素源中のエタノールの比率等に応じて、上記例示した濃度範囲を適宜修正した濃度範囲で含有されてもよい。
【０２４１】
エタノールは、培養の全期間において一定の濃度範囲で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。例えば、一部の期間、エタノールが不足していてもよい。「不足する」とは、要求量を満たさないことをいい、例えば、培地中の濃度がゼロとなることであってよい。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の内の、１％以下の期間、５％以下の期間、１０％以下の期間、２０％以下の期間、３０％以下の期間、または５０％以下の期間であってよい。なお、「培養の全期間」とは、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合には、本培養の全期間を意味してよい。エタノールが不足する期間には、他の炭素源が充足されているのが好ましい。このように、一部の期間、エタノールが不足していても、エタノールを含有する培地での培養期間が存在する限り、「エタノールを含有する培地中で細菌を培養する」ことに含まれる。
【０２４２】
エタノール等の各種成分の濃度は、ガスクロマトグラフィー（Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:22-30）やHPLC（Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）により測定することができる。
【０２４３】
培養は、例えば、好気的に行うことができる。例えば、培養は、通気培養または振盪培養で行うことができる。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％
程度に制御されてよい。培地のpHは、例えば、pH 3〜10、好ましくはpH 4.0〜9.5であっ
てよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20〜45℃、好ましくは25℃〜37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間〜120時間
であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、菌体内および／または培地中にＬ−アミノ酸が蓄積する。
【０２４４】
流加培養または連続培養においては、流加は、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、流加培養または連続培養においては、複数回の流加が間欠的に行われてもよい。
【０２４５】
複数回の流加が間欠的に行われる場合、１回当たりの流加の継続時間が、複数回の流加の合計時間の、例えば30％以下、好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下となるように、流加の開始と停止を繰り返してもよい。
【０２４６】
また、複数回の流加が間欠的に行われる場合、２回目以降の流加を、その直前の流加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇したときに開始されるように制御することにより、発酵培地中の炭素源濃度を自動的に低レベルに維持することもできる（米国特許5,912,113号明細書）。炭素源の枯渇は、例えば、pHの上昇または溶存酸素濃度の上昇により検
出できる。
【０２４７】
連続培養においては、培養液の引き抜きは、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、連続培養においては、複数回の培養液の引き抜きが間欠的に行われてもよい。培養液の引き抜きと流加は、同時に行われてもよく、そうでなくてもよい。例えば、培養液の引き抜きを行った後で流加を行ってもよく、流加を行った後で培養液の引き抜きを行ってもよい。引き抜く培養液量は、流加させる培地量と同量であるのが好ましい。ここで、「同量」とは、例えば、流加させる培地量に対して９３〜１０７％の量であってよい。
【０２４８】
培養液を連続的に引き抜く場合には、流加と同時に、または流加の開始後に、引き抜きを開始するのが好ましい。例えば、流加の開始後５時間以内、好ましくは３時間以内、より好ましくは１時間以内に、引き抜きを開始してよい。
【０２４９】
培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、培養液を一部引き抜いてＬ−アミノ酸を回収し、新たに培地を流加して培養を継続するのが好ましい。
【０２５０】
また、引き抜かれた培養液から、Ｌ−アミノ酸を回収し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させることにより、菌体を再利用することもできる（フランス特許2669935
号明細書）。
【０２５１】
また、Ｌ−グルタミン酸を製造する場合、Ｌ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜３．０、好ましくはｐＨ４．９〜３．５、さらに好ましくはｐＨ４．９〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．７付近の条件が挙げられる（欧州特許出願公開第1078989号明細書）。尚、培養は、その
全期間において上記ｐＨで行われてもよく、一部の期間のみ上記ｐＨで行われてもよい。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。
【０２５２】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する場合、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用して塩基性アミノ酸を発酵生産する方法を利用してもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。これらの
方法によれば、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして従来利用されていた硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減しつつ、塩基性アミノ酸を製造することができる。
【０２５３】
同方法においては、培養中の培地のｐＨを６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨを７．２〜９．０となるように制御し、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが培地中に２０ｍＭ以上、好ましくは３０ｍＭ以上、より好ましくは４０ｍＭ以上存在する培養期があるようにする。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるためには、発酵中の発酵槽
内圧力を正となるように制御すること、炭酸ガスを培養液に供給すること、またはその両方を行うのが好ましい。
【０２５４】
発酵中の発酵槽内圧力を正となるように制御するには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解して重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを生じ、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として、具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、より好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、炭酸ガスを培養液に供給する場合は、例えば、純炭酸ガス又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを培養液に吹き込めばよい。発酵槽内圧力、炭酸ガスの供給量、および制限された給気量は、例えば、培地のｐＨ、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン濃度、または培地中のアンモニア濃度を測定することにより決定できる。
【０２５５】
従来の塩基性アミノ酸の製造方法においては、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを塩基牲アミノ酸のカウンタイオンとして利用するため、十分量の硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウム、あるいは、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物及び／又は塩酸分解物が培地に添加されていた。そのため、培地中には、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが多量に存在し、弱酸性である炭酸イオン濃度はppmオーダーと極めて低かった。
【０２５６】
一方、上記方法（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）は、これら硫酸イ
オンおよび塩化物イオンの使用量を減じ、微生物が発酵時に放出する炭酸ガスを培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとして利用することに特徴がある。
【０２５７】
すなわち、同方法においては、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであるため、培地に含まれる硫酸イオンおよび塩化物イオンのモル濃度の合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。硫酸イオン及び／又は塩化物イオン濃度を低減することで、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンをより容易に培地中に存在させることができる。すなわち、同方法においては、従来法に比べて、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。
【０２５８】
また、同方法においては、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外のアニオン（他のアニオンともいう）の濃度は、塩基性アミノ酸生産菌の生育に必要な量が含まれてさえいれば、低いことが好ましい。他のアニオンとしては、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、水酸化物イオンが挙げられる。培地に含まれる他のアニオンのモル濃度の合計は、通常９００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３００ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。
【０２５９】
同方法においては、硫酸イオンや塩化物イオンを塩基性アミノ酸生産菌の生育に必要な量以上に培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。例えば、アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるために供給されたアンモニアが、塩基性アミノ酸の窒素源として利用され得る。アンモニアは、単独で、又は他の気体とともに培地に供給することができる。
【０２６０】
また、同方法においては、培地中の総アンモニア濃度を、塩基性アミノ酸の生産を阻害しない濃度に制御するのが好ましい。「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の収率及び／又は生産性が得られる総アンモニア濃度が挙げられる。培地中の総アンモニア濃度として、具体的には、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２５０ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度範囲として用いてもよい。
【０２６１】
一方、塩基性アミノ酸生産菌の生育及び塩基性アミノ酸の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度は、培養中にアンモニアが枯渇した状態が継続せず、且つ、窒素源が不足することによる微生物による目的物質の生産性の低下が起こらない限り、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときのアンモニア濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。
【０２６２】
また、同方法において、培地には、塩基性アミノ酸以外のカチオンが含まれ得る。塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａが挙げられる。塩基性アミノ酸以外のカチオンのモル濃度の合計は、好ましくは、総カチオンのモル濃度の５０％以下である。
【０２６３】
Ｌ−アミノ酸が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０２６４】
生成したＬ−アミノ酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってＬ−アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ−アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【０２６５】
また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０２６６】
尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたＬ−アミノ酸の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０２６７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０２６８】
〔実施例１〕Ｌ−リジン生産菌AJIK01株（NITE BP-01520）へのエタノール資化性の付与
Ｌ−リジン生産菌Escherichia coli AJIK01株（NITE BP-01520）を親株として、以下の手順により、エタノール資化性を付与されたＬ−リジン生産菌AJIK01m2株を構築した。
【０２６９】
まず、Escherichia coli MG1655-att-tet-PL-tacadhE*株（WO2011/096554）から常法に従いP1ライセートを取得し、AJIK01株（NITE BP-01520）を宿主としてP1形質導入を行い
、adhE*遺伝子を含むカセットが導入されたAJIK01 att-tet-PL-tacadhE*株を得た。adhE*遺伝子は、配列番号４６に示すEscherichia coli K12 MG1655株の野生型AdhEタンパク質
にGlu568Lys、Glu22Gly、Met236Val、Tyr461Cys、Ile554Ser、及びAla786Valの６変異が
導入された変異型AdhEタンパク質をコードする変異型adhE遺伝子である（WO2008/010565
）。
【０２７０】
次に、PL-tacプロモーター上流に導入されたatt-tet配列を除去するために、ヘルパー
プラスミドpMW-intxis-ts（米国特許出願公開20060141586参照）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子及びエクシジョナーゼ（Xis）をコードする遺伝子を搭載した、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
上記で得られたAJIK01 att-tet-PL-tacadhE*株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/Lのアンピシリンを
含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。pMW-intxis-tsプラ
スミドを除去するために、形質転換株をLB寒天培地上、42℃で培養した。得られたコロニーのアンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性を試験し、アンピシリン及びテトラサイクリンに感受性の株を取得した。得られた株は、染色体ゲノム中からatt-tet配列が除去
され、且つ、pMW-intxis-tsが脱落したPL-tacadhE*導入株である。同株をAJIK01m2株と名づけた。
【０２７１】
〔実施例２〕acnB遺伝子の発現を増強したＬ−リジン生産菌の構築
（１）プロモーターP14を備えた発現プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14の構築
配列番号２及び配列番号３に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、配列番号１に示
したプロモーターP14を含むgdhA遺伝子の配列を増幅した。PCR産物を精製してTakara BKL
Kit（タカラバイオ社製）で処理し、SmaIで消化してTakara BKL Kitで処理したpMW219（ニッポンジーン社製）に連結して、プラスミドpMW219-P14-gdhAを得た。
【０２７２】
配列番号４及び配列番号５に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、pMW219-P14-gdhAを鋳型としてPCRを行い、プロモーターP14部分の配列（P14配列）を増幅した。
【０２７３】
配列番号６及び配列番号７に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO2005/010175）を鋳型としてPCRを行い、λファー
ジのアタッチメントサイトの配列attRとattLの間にクロラムフェニコール耐性遺伝子cat
を持つattR-cat-attL配列を増幅した。
【０２７４】
HindIIIおよびSalIで消化したpMW119（ニッポンジーン社製）に、In-Fusion HD Cloning kit（タカラバイオ社製）を用いてattR-cat-attL配列とP14配列を連結して、プロモー
ターP14を備えた発現プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14を構築した。
【０２７５】
（２）acnB遺伝子の発現増強用プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnBの構築
配列番号８及び配列番号９に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、acnB遺伝子を含
む配列を増幅した。配列番号１０及び配列番号１１に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14を鋳型としてPCRを行い、
直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を増幅した。In-Fusion HD Cloning kit（タカラバイオ社製）を用いてacnB遺伝子を含む配列と直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を連結して、プロモーターP14の制御下でacnB遺伝子を発現するプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnBを構築した。
【０２７６】
構築したプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnBをAJIK01m2株に常法に従い導入し
、AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB株を得た。得られた株を100mg/Lのアンピシ
リンを含むLB培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをAJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB株のグリセロールストックと呼ぶ。
【０２７７】
〔実施例３〕acnBおよびaldBの両遺伝子の発現を増強したＬ−リジン生産菌の構築
（１）aldB遺伝子の発現増強用プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-aldBの構築
配列番号１２及び配列番号１３に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、aldB遺伝子
を含む配列を増幅した。配列番号１０及び配列番号１１に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14を鋳型としてPCRを行
い、直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を増幅した。In-Fusion HD Cloning kit（タカラバイオ社製）を用いてaldB遺伝子を含む配列と直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を連結して、プロモーターP14の制御下でaldB遺伝子を発現するプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを構築した。
【０２７８】
（２）acnB遺伝子及びaldB遺伝子の発現増強用プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldBの構築
配列番号１４及び配列番号１５に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnBを鋳型としてPCRを行い、P14-acnBを含む配列を増幅した。配列番号１６及び配列番号１７に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを鋳型としてPCRを行い、直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを増幅した。In-Fusion HD Cloning kit（タカ
ラバイオ社製）を用いてP14-acnBを含む配列と直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを連
結して、プロモーターP14の制御下でacnB遺伝子とaldB遺伝子を発現するプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldBを構築した。
【０２７９】
構築したプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldBをAJIK01m2株に常法に従い導入し、AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldB株を得た。得られた株を100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保
存した。これをAJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldB株のグリセロールス
トックと呼ぶ。
【０２８０】
〔実施例４〕acnAおよびaldBの両遺伝子の発現を増強したＬ−リジン生産菌の構築
（１）acnA遺伝子の発現増強用プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnAの構築
配列番号１８及び配列番号１９に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、acnA遺伝子
を含む配列を増幅した。配列番号１０及び配列番号１１に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14を鋳型としてPCRを行
い、直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を増幅した。In-Fusion HD Cloning kit（タカラバイオ社製）を用いてacnA遺伝子を含む配列と直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14を連結して、プロモーターP14の制御下でacnA遺伝子を発現するプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnAを構築した。
【０２８１】
（２）acnA遺伝子及びaldB遺伝子の発現増強用プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldBの構築
配列番号１４及び配列番号２０に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnAを鋳型としてPCRを行い、P14-acnAを含む配列を増幅した。配列番号１６及び配列番号１７に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、プラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを鋳型としてPCRを行い、直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを増幅した。In-Fusion HD Cloning kit（タカ
ラバイオ社製）を用いてP14-acnAを含む配列と直鎖pMW119-attR-cat-attL-P14-aldBを連
結して、プロモーターP14の制御下でacnA遺伝子とaldB遺伝子を発現するプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldBを構築した。
【０２８２】
構築したプラスミドpMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldBをAJIK01m2株に常法に従い導入し、AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldB株を得た。得られた株を100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保
存した。これをAJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldB株のグリセロールス
トックと呼ぶ。
【０２８３】
〔実施例５〕Ｌ−リジン生産菌のＬ−リジン生産能の評価
実施例２、実施例３、および実施例４で得られた各グリセロールストックを融解し、約100μLを、100mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間静置培養した。静置培養後、得られた菌体を0.85%の食塩水に懸濁し、波長600nmの濁度（OD600）が0.2となるように、500mL容の坂口フラスコに入れた100mg/Lのアンピシリンを含む25
mLの発酵培地（下記）に接種し、往復振とう培養装置で攪拌120rpmの条件の下、37℃で24時間培養した。24時間の振とう培養後、各フラスコに125μLのエタノールを添加し、さ
らに同様の条件で17時間振とう培養した。
【０２８４】
発酵培地の組成を下記に示す。
エタノール                          10 ml/L
（NH4）2SO4                           24 g/L
KH2PO4                               1.0 g/L
MgSO4・7H2O                           1.0 g/L
FeSO4・7H2O                           0.01 g/L
MnSO4・5H2O                           0.082 g/L
Yeast Extract（Difco社製）           2.0 g/L
CaCO3（日本薬局方）                 40 g/L
蒸留水                        最終量 1 L
【０２８５】
培養終了後に、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS310（
サクラ精機社製）を用いて測定した。また、培地中に添加した炭素源を全て消費したことを、エタノールについてバイオテックアナライザーBF-5（王子計測機器）を用いて確認した。さらに、培養終了直後に培養液を0.2N希塩酸で適宜希釈して分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度（OD600）を測定することにより、培養終了時の菌体量を測定した。
【０２８６】
結果を表１に示す。表１において、「Strain」は菌株の名前を示す。また、表1におい
て、「Lys (g/L)」は培地中に蓄積したＬ−リジン量を示す。acnB遺伝子の発現増強株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB株）は、対照株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14株）と比較して、有意に高いＬ−リジン生産を示した。すなわち、acnB遺伝子の発現増強により、Ｌ−リジン生産能が向上することが示された。また、acnBおよびaldBの両遺伝子の発現増強株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnB-P14-aldB株）は、対照
株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14株）と比較して、有意に高いＬ−リジン生産を
示した。すなわち、acnB遺伝子およびaldB遺伝子の同時発現増強により、Ｌ−リジン生産能が向上することが示された。また、acnAおよびaldBの両遺伝子の発現増強株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14-acnA-P14-aldB株）は、対照株（AJIK01m2/pMW119-attR-cat-attL-P14株）と比較して、有意に高いＬ−リジン生産を示した。すなわち、acnA遺伝子およびaldB遺伝子の同時発現増強により、Ｌ−リジン生産能が向上することが示された。
【０２８７】
【表１】
2017131111.tif 000002
【０２８８】
＜配列表の説明＞
配列番号１：プロモーターP14の塩基配列
配列番号２〜２０：プライマー
配列番号２１：Escherichia coli K12 MG1655株のacnA遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Escherichia coli K12 MG1655株のAcnAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Pantoea ananatis AJ13355株のacnA遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Pantoea ananatis AJ13355株のAcnAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のacnA遺伝子の塩基配列
配列番号２６：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のAcnAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のacnA遺伝子の塩基配列
配列番号２８：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のAcnAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：Escherichia coli K12 MG1655株のacnB遺伝子の塩基配列
配列番号３０：Escherichia coli K12 MG1655株のAcnBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：Pantoea ananatis AJ13355株のacnB遺伝子の塩基配列
配列番号３２：Pantoea ananatis AJ13355株のAcnBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のacnB遺伝子の塩基配列
配列番号３４：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のAcnBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のacnB遺伝子の塩基配列
配列番号３６：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のAcnBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：Escherichia coli K12 MG1655株のaldB遺伝子の塩基配列
配列番号３８：Escherichia coli K12 MG1655株のAldBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：Pantoea ananatis LMG 20103株のaldB遺伝子の塩基配列
配列番号４０：Pantoea ananatis LMG 20103株のAldBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のaldB遺伝子の塩基配列
配列番号４２：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のAldBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のaldB遺伝子の塩基配列
配列番号４４：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のAldBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：Escherichia coli K12 MG1655株のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号４６：Escherichia coli K12 MG1655株のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７：Pantoea ananatis LMG 20103株のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号４８：Pantoea ananatis LMG 20103株のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４９：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号５０：Pectobacterium atrosepticum SCRI1043株のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５１：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号５２：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2017131111.tif 000003
【図２】
2017131111.tif 000004
【図３】
2017131111.tif 000005
【図４】
2017131111.tif 000006
【図５】
2017131111.tif 000007
【配列表】
2017131111000001.app