(57)【要約】【課題】ＰＣＲで増幅した遺伝子のコード領域を正確に組み込み、かつ、サブクローニング等のステップを踏まずに真核細胞において遺伝子発現を可能とする利便性の高いクローニング兼発現ベクター、ならびにこれを用いたクローニング法を提供すること。【解決手段】遺伝子のコード領域を標的核酸として、ベクター宿主の原核細胞においてペプチドタグが付加された融合タンパク質として産生させ、ペプチドタグに依存的な酵素反応で検出することによって、正しく組み込まれたクローンを効率的に獲得することができるようにし、かつ、これらを真核生物の遺伝子発現システムとうまく組み合わせることによって、サブクローニング等のステップを踏むことなく、利用する真核細胞においてベクターに組み込まれた標的核酸を直接発現できるようにした利便性の高いベクター、ならびにこれを用いたクローニング法を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をクローニングするためのベクターであって、遺伝子のコード領域を標的核酸とし、ベクター宿主の原核細胞においてペプチドタグが付加された遺伝子産物を産生することを可能とし、ペプチドタグに依存した酵素反応を用いることで適正に組み込まれた標的核酸を有するクローンを選別することができ、かつ、組み込まれた標的核酸を他のベクターに移し替えることなく利用する真核細胞においてその遺伝子産物を直接産生することができることを特徴とする。
【請求項２】
請求項１に記載されたベクターを利用するクローニング法。
【請求項３】
請求項１〜２を利用したキット等の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、遺伝子のコード領域を効率的にクローニングし、かつ、真核細胞でその遺伝子産物を発現させることを可能とする、ベクターならびにクローニング法である。
【背景技術】
【０００２】    遺伝子は生物の設計図である。遺伝子および遺伝子産物を解析することは、さまざまな生物現象を分子レベルから理解するために重要である。
そこから得られる知見は、生物学、医学、薬学、農学、工学などの各分野に応用することが可能である。例えば、医学系では、製薬、遺伝子診断、遺伝子治療、再生医療など病気の予防や治療に寄与し、農学系では動植物の品種改良や生産性の向上に寄与する。これらは現代社会に広く浸透し、日常生活を支える重要な技術基盤を形成している。【０００３】  遺伝子は、生物の遺伝情報を担う基本単位であり、相補的な２本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を担体とした染色体に存在する。多くの遺伝子はタンパク質の情報をコードする。タンパク質は、様々な細胞機能を発揮する上で中心的な役割を担う生体分子であり、例えば酵素は、数千もの生化学反応を触媒することによって生体物質の合成や分解を行う。【０００４】  遺伝子の発現は、転写と翻訳の過程を経る。転写では、ＤＮＡを鋳型として伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）が合成され、翻訳では、ｍＲＮＡの情報を基づいてタンパク質の合成がなされる。遺伝子は全ての細胞が等しく保有するが、ｍＲＮＡは細胞のタイプや発生の時期等によって種類や存在量が異なる。これが、発生や細胞応答などの細胞現象を可能とする。【０００５】  真核生物の遺伝情報は、イントロン−エキソン構造により染色体に断片化されている。しかし、ｍＲＮＡでは、タンパク質をコードする領域（翻訳領域）が一繋がりになる。ヒトの場合、染色体で遺伝子が占める割合は２割程度で、翻訳領域は遺伝子の１０分の１程度であることから、染色体全体からすれば約２％に過ぎない。すなわち、ｍＲＮＡは遺伝子産物の情報を有する最もコンパクトな核酸である。【０００６】  コード領域は、ｍＲＮＡの翻訳領域に相当し、遺伝子産物であるタンパク質の開始アミノ酸（メチオニン）から最終アミノ酸までの情報を担う一続きの塩基配列である。具体的には、メチオニンをコードするＡＵＧ（ＤＮＡではＡＴＧに相当する）に始まり、それに続く各アミノ酸が３塩基毎にコードされ、終止コドン（ＵＡＡ，ＵＡＧ，ＵＧＡ：ＤＮＡではＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡに相当する）は含まない。【０００７】  ｍＲＮＡは、組織から微量しか得られず、しかも分解され易いため、汎用的な用途には不向きである。そのため、人為的にｍＲＮＡの情報をＤＮＡに移し替えた相補的ＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと呼ぶ）を用いる。ｃＤＮＡの合成にはｍＲＮＡが必要であるが、ｍＲＮＡの精製は煩雑であるため、しばしば全ＲＮＡ（ｍＲＮＡは全体の１−２％）が使われる。【０００８】  このようにして得られたｃＤＮＡも、通常微量であるため、それをベクターに組み込んで増やす必要がある。組み換えベクターを宿主細胞に導入すると、宿主細胞の増殖およびベクターの自己複製により、ベクターに組み込まれた核酸も指数関数的に増える。【０００９】  従来、真核生物由来のｍＲＮＡに始まって実際的な利用に至るまで、複数の工程が必要であった。まず、ｃＤＮＡをベクターに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、次に、ライブラリーから標的核酸を含むベクターを探索する工程、さらに、標的核酸をクローニング用のベクターから用途に適した別のベクターに移し替える工程、を必要としていた。しかし、手順が複雑で時間がかり、しかも熟練した技術を必要とした。【００１０���  近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が開発されたこと（非特許文献１）、また、ヒトを含む主だった種の全ゲノムが解析されたことで（非特許文献２）、従来のクローニングの手法が一変した。例えば、ゲノム情報を利用して、標的核酸に対する特異的なプライマーを作製し、それを用いたＲＴ−ＰＣＲ（逆転写反応ののちＰＣＲを行う方法）によって、ｍＲＮＡから目的とする核酸を比較的簡単にしかも短時間で増幅できるようになった。そのため、ｃＤＮＡライブラリーの作製および標的核酸の探索を経ることなく、ＰＣＲで増幅された標的核酸を直接ベクターに組み込む方法が主流になってきた。【００１１】  当初、ＰＣＲで増幅した核酸をクローニングするとき、制限酵素で消化したＰＣＲ産物を、末端構造が合うように同様に調製したベクターに加え、ＤＮＡリガーゼを用いて両者を連結させていた。しかし、この方法は、標的核酸やベクターに含まれる制限酵素の認識部位に応じた設計が必要であるうえ、遺伝子組み換えの作業に時間がかかっていた。そのため、ＰＣＲを用いたクローニング法に改良がなされ、制限酵素処理を行うことなく、比較的簡単にＰＣＲ産物をベクターに組み込めるようになった。【００１２】  初期の例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が製品化したＴＡクローニング法（非特許文献３）がある。これは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲで最もよく用いられる酵素）が複製したＤＮＡの３’末端に１塩基分のアデニンを余計に付加することから、ベクターの３’末端に１塩基分のチミンを付加することで、ＰＣＲ産物と相補的な末端構造をとるようにしたものである（ＴＡベクター）。使用者は、制限酵素処理を行うことなく、ＤＮＡリガーゼを用いてＴＡベクターとＰＣＲ産物を連結するだけでよい。【００１３】  また、同社が製品化したＴＯＰＯクローニング法（非特許文献４、特許文献１）がある。これは、ワクシニアウイルス由来トポイソメラーゼＩを利用した遺伝子組み換え技術で、使用者は、酵素が付加されたベクター（ＴＯＰＯベクター）にＰＣＲ産物を加えるだけで、制限酵素もＤＮＡリガーゼも使わずに、短時間に両者を連結することができる。【００１４】  別の手法としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が製品化したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法（非特許文献５）がある。これは、まず、１５塩基長の配列（クローニング部位の一部の配列）が余分に付加されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をベクターに加えて、短時間反応させることで、ベクターに組み込むことができる。【００１５】  しかし、ＰＣＲを用いた核酸のクローニング法には課題があった。〔ａ〕混入したＰＣＲ副産物もクローニングされること、〔ｂ〕ＰＣＲによる変異を含む標的核酸を識別できないこと、〔ｃ〕不完全な末端を有するＤＮＡ断片も組み込まれてしまうこと、〔ｄ〕ＰＣＲ産物がベクターに逆方向に挿入される可能性があること、である。これらは全て、クローニング効率の低下につながる。以下に記述する。【００１６】  〔ａ〕混入したＰＣＲ副産物もクローニングされること：  理論的に、ＰＣＲでは標的核酸のみが増幅されるはずであるが、実際には、標的以外の核酸（以下、ＰＣＲ副産物と呼ぶ）が同時に生成することが多い。これらは主に、ＰＣＲに用いるプライマーが標的以外の部位にも非特異的に結合することにより得られるもので、反応に用いたあらゆる核酸に由来しうる。ＰＣＲ副産物は、概して、反応に用いた核酸に含まれる標的の割合が少ないほど生成され易く、例えば、ＲＴ−ＰＣＲや染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにおいては頻繁に見られる。上記記載のＴＡクローニング法、ＴＯＰＯクローニング法、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法では、ＰＣＲ副産物が標的核酸と区別されることなくベクターに組み込まれるため、結果としてクローニング効率が下がる。増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動等で分離・精製しても、ＰＣＲ副産物を完全に除くことは難しい。【００１７】  〔ｂ〕ＰＣＲによる変異を含む標的核酸を識別できないこと：  ＰＣＲで核酸を増幅する場合、変異が導入され易い。これは主に、耐熱性ＤＮＡ合成酵素のエラー率による。特に、ＰＣＲのサイクル数が多く標的核酸のサイズが大きい場合は、変異を有するＰＣＲ産物の割合が多くなる。ＰＣＲに最もよく用いられるＴａｑＤＮＡポリメラーゼの場合、条件によっては、変異を有するＰＣＲ産物が大半を占めることもある。校正を有する他の酵素（ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなど、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するもの）では、エラー率がＴａｑＤＮＡポリメラーゼの数分の一から数十分の一程度に抑えられるものの、完全に変異を防ぐことは難しい。従来のクローニング法では、ＰＣＲ産物に変異があっても、全く区別されることなくベクターに組み込まれる。サイレント変異以外の変異は、アミノ酸置換や翻訳エラーが発生するため、遺伝子発現には使用できない。つまり、変異を有する核酸がベクターに組み込まれたとしても、厳密な意味でクローニングが成功したとは言えない。変異の発生は、通常、塩基配列解析によって初めて明らかになるが、クローニング後に変異を修正したり、再度クローニングしたりすることは、時間、労力、コストの点で不利である。【００１８】  〔ｃ〕不完全な末端を有するＤＮＡ断片も組み込まれてしまうこと：  不完全なＤＮＡ末端が生じる原因には幾つかあり、ＰＣＲ産物の末端が十分に伸長されていない場合、混入したＤＮＡ分解酵素によって末端が削られた場合、ベクターと外来ＤＮＡの連結時にエラーが発生する場合、等が含まれる。コード領域の５’あるいは３’末端側が影響を受けると、翻訳の効率が低下したり、翻訳のフレームシフトが起きたり、または翻訳自体が不能になる。遺伝子発現を目的とする場合、このようなクローンは適していない。【００１９】  〔ｄ〕ＰＣＲ産物がベクターに逆方向に挿入される可能性があること：  遺伝子発現の目的で核酸をクローニングする場合、プロモーターに合った向きでコード領域をベクターに挿入する必要がある。反対方向に挿入された場合、遺伝子発現は起こらない。例えば、先に記載したＴＡクローニングやＴＯＰＯクローニング法では、一般にＤＮＡ断片はどちらの方向にも挿入される。それを改善するために、例えば、ベクターおよびプライマーに４塩基ＣＡＣＣを付加することで順方向に核酸が挿入され易くする方法もあるが、それでもなお反対方向に挿入され得る（後述の実施例で示す通り）。【００２０】  その他、ＰＣＲに直接関連���るものではないが、核酸のクローニングにおいて共通してみられる課題がある。これには、〔ｅ〕組み換えがなされていないクローンが得られること、〔ｆ〕クローニング後、用途に合った別のベクターに移し替える必要があること、が含まれる。〔ｅ〕はクローニング効率を低下させ、〔ｆ〕は利便性を悪くしている。【００２１】  〔ｅ〕組み換えがなされていないクローンが得られること：  ベクターと外来ＤＮＡを連結する際、ベクターが自己連結することで、外来ＤＮＡを含まないクローンが得られることがある。これは、クローニング効率を低下させる大きな原因でもある。改善策の１つとして、ベクター断片を脱リン酸化することで自己連結を防ぐ方法がある。しかし、ＰＣＲ産物のクローニングには適していない（ＰＣＲ産物の５’末端にリン酸基がないため）。また、別の方法として、βガラクトシダーゼのα相補性に基づく青白選択法で例示されるように、酵素活性を指標として組換えがなされたクローンを選択する方法がある（非特許文献６）。この方法はクローニング用のベクターには広く導入されているが、発現ベクターにはほとんど導入されていない（機能的な互換性がないため）。【００２２】  〔ｆ〕クローニング後、用途に合った別のベクターに移し替える必要があること：  一般的な過程は、まず、クローニング用のベクターに標的核酸を組み込み、それを制限酵素解析や塩基配列解析等で確認したあと、用途に合ったベクター（例えば、発現ベクター）に移し替えて、遺伝子を利用するものである（例えば、真核細胞での遺伝子発現）。しかし、これにはコスト・時間・労力を必要とするうえ、とりわけ多種類の遺伝子を扱う場合は不便である。そのため、近年、ＧＡＴＥＷＡＹクローニング法等の開発により（非特許文献７）、クローニングベクターに組み込まれた標的核酸を、発現ベクター等にサブクローニングすることが比較的容易になってきた。しかし、時間と労力が若干削減されたものの、コストがかかる。一般に、用途として最も多いのは、真核細胞における遺伝子発現である。そのため、標的核酸のクローニング後に直ぐに利用できるベクターがあれば便利である。【００２３】  ＰＣＲで増幅したコード領域をクローニングし、かつ、真核細胞で遺伝子発現を可能とするベクターは非常に少ないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が製品化しているｐｃＤＮＡ３．１ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯクローニングベクターがある。これは、上述の〔ｄ〕の課題を改善する目的で、コード領域の５’末端側にＣＡＣＣの４塩基を付加することによって、ＰＣＲ産物がベクターに順方向に挿入され易くしたものである。しかし、実際は少なからず逆方向に挿入される。さらに、上述の〔ａ〕，〔ｂ〕，〔ｃ〕，〔ｅ〕の課題が解決されておらず、結果としてクローニング効率が低下する（後述の実証例で比較された）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特表平１０−５１０７１６号公報
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｓ  ＫＢ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７  Ｊａｎ  １；１５５：３３５−５０．
【非特許文献２】Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１  Ｆｅｂ．１５；４０９（６８２２）：８６０−９２１．
【非特許文献３】Ｈｏｌｔｏｎ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｍａｒ．１１；１９（５）：１１５６．
【非特許文献４】Ｓｈｕｍａｎ  Ｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  Ａｐｒ．２５；２６７（１２）：８６２０−７．
【非特許文献５】Ｉｒｗｉｎ  ＣＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ；８９０：２３−３５．
【非特許文献６】Ｕｌｌｍａｎｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６７  Ｍａｒ．１４；２４（２）：３３９−４３．
【非特許文献７】Ｗａｌｈｏｕｔ，ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００  Ｎｏｖ．１５；３２８：５７５−９２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】  従来、真核細胞における遺伝子発現を目的としたコード領域のクローニングでは、次のような欠点があった。
〔ａ〕混入したＰＣＲ副産物もクローニングされること：  ＰＣＲを用いたクローニングにおいて、目的とするＤＮＡに加えて、非特異的に増幅されたＤＮＡもベクターに組み込まれるため、クローニング効率が低下していた。
〔ｂ〕ＰＣＲによる変異を含む標的核酸を識別できないこと：  ＰＣＲで増幅した核酸には変異が含まれていることもあるが、従来の方法では区別されることなくクローニングされてしまうため、利用不可能なクローンが得られていた。
〔ｃ〕不完全な末端を有するＤＮＡ断片も組み込まれてしまうこと：  遺伝子組み換え操作において、ベクターＤＮＡと外来ＤＮＡの不完全な連結を原因とした欠陥を有するクローンが得られていた。
〔ｄ〕ＰＣＲ産物がベクターに逆方向に挿入される可能性があること：  ベクターにコード領域が反対方向に組み込まれると、遺伝子発現に利用することができなかった。
〔ｅ〕組み換えがなされていないクローンが得られること：  特に、発現ベクターを利用する場合、外来ＤＮＡの有無の判定が難しかった。
〔ｆ〕クローニング後、用途に合った別のベクターに移し替える必要があること：  標的核酸をクローニングできても、直ぐに真核細胞での遺伝子発現に利用できなかった。
本発明は、かかる欠点を克服するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】  本発明者は、上記の課題を解決するために検討を重ねた。その結果、コード領域のクローニングの精度が改善され、しかも遺伝子発現における利便性が向上した。本発明はかかる知見に基づいて開発されたものである。【００２８】  最も重要な特徴は、遺伝子のコード領域を、ベクター宿主である原核細胞および利用する真核細胞において、小分子のペプチドタグが付加された融合タンパク質として発現させ、より精度の高いクローンの選択ならびに真核細胞での遺伝子発現を両立させたことである。
これによって、上述の〔ａ〕〜〔ｆ〕の課題が大幅に改善された。【００２９】  すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕核酸をクローニングするためのベクターであって、遺伝子のコード領域を標的核酸とし、ベクター宿主の原核細胞においてペプチドタグが付加された遺伝子産物を産生することを可能とし、ペプチドタグに依存した酵素反応を用いることで適正に組み込まれた標的核酸を有するクローンを選別することができ、かつ、組み込まれた標的核酸を他のベクターに移し替えることなく利用する真核細胞においてその遺伝子産物を直接産生することができることを特徴とする。
〔２〕前述〔１〕記載のベクターを用いるクローニング法。
〔３〕前述〔１〕、〔２〕を利用した試薬やキット等の製品。
【発明の効果】
【００３０】  本発明により、目的とする遺伝子のコード領域を正確にクローニングすることができ、かつ、サブクローニング等の余計な工程を踏むことなく、真核細胞における遺伝子発現を実現することができた。具体的には、以下に示す通りである。【００３１】  クローニングに際し、ＰＣＲで非特異的に増幅されたＤＮＡ断片（ＰＣＲ副産物）を含むクローンを排除することができる：  ＰＣＲ副産物のほとんどは非翻訳領域の核酸であり、その塩基配列中には多数のＡＴＧ（翻訳時は開始コドンとして機能する）やＴＡＡ，ＴＧＡ，ＴＡＧ（翻訳時は終止コドンとして機能する）が含まれる。そのため、プロモーター下流のクローニング部位に非翻訳領域の核酸が組み込まれると、翻訳が正常に起こらず、その下流にインフレームで配置した酵素検出用のペプチドタグが融合タンパク質として発現されない。その結果、ペプチドタグに依存した酵素反応がみられず、これらのクローンを排除することができる。【００３２】  クローニングに際し、変異したコード領域を含むクローンを効果的に排除することができる：  ＰＣＲで核酸を増幅すると、しばしば変異が導入される。ベクターに組み込まれたコード領域に、ナンセンス変異やフレームシフト変異など、翻訳の終了や読み枠のずれを生じさせる変異が含まれると、酵素検出用のペプチドタグが融合タンパク質として発現されない。そのため、これらのクローンを選択時に排除することができる。【００３３】  クローニングに際し、不完全な連結末端を含むクローンを排除することができる：  コード領域の組み換えで不完全な連結末端が生じると、翻訳が不能になったり読み枠がずれたりすることから、酵素検出用のペプチドタグを有する融合タンパク質が産生されない。そのため、これらのクローンを選択時に排除することができる。【００３４】  クローニングに際し、コード領域が逆向きに組み込まれたクローンを排除することができる：  目的とするコード領域の核酸がベクターに組み込まれたとしても、それが反対方向（アンチセンス）であれば、開始コドンや終止コドンがランダムに発生し、不適切な翻訳が起こる。上記の理由から、これらのクローンを選択時に排除することができる。【００３５】  クローニングに際し、組み換えがなされていないクローンを排除することができる：外来核酸が組み込まれていないベクターもしくは自己連結したベクターでは、酵素検出用のペプチドタグがそもそも発現しない。従って、これらのクローンは識別可能である。【００３６】  核酸の利用に際し、組み込んだ標的核酸をサブクローニングすることなく、直接、真核細胞を用いた遺伝子発現に応用することができる：  原核細胞用のプロモーターと真核細胞用のプロモーターを上手く組み合わせることによって、組み込んだ標的核酸を真核細胞で発現可能なシステムを構築した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の実証例として構築したベクターの概略図である。
【図２】図２は、図１のＮｈｅＩ−ＸｂａＩ領域にあたる塩基配列である。
【図３】図３は、ＰＣＲで得られたｍＫＯ遺伝子を、電気泳動で解析した写真である。
【図４】図４は、ｍＫＯ遺伝子を用いたクローニングの試験において、Ｘ−ｇａｌ寒天培地に形成された大腸菌コロニーの写真である。
【図５】図５は、ｍＫＯ遺伝子をベクターに組み込んで得られたクローンを、制限酵素で処理した後、電気泳動で解析した画像である。
【図６】図６は、ｍＫＯ含有ベクターを保持する大腸菌を画線培養したのち、蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図７】図７は、ｍＫＯ遺伝子を用いたクローニングの試験における、クローニングの効率および核酸の挿入方向を比較したグラフである。
【図８】図８は、ＲＴ−ＰＣＲで得られた核酸を、電気泳動で解析した写真である。
【図９】図９は、ＲＴ−ＰＣＲで得られた核酸のクローニングにおける、クローニングの効率および核酸の挿入方向を比較したグラフである。
【図１０】図１０は、真核細胞で産生された遺伝子産物を、蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図１１】図１１は、真核細胞で産生された遺伝子産物を、ウェスタンブロッティング法で検出した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】  本発明のベクターは、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現を可能とするクローニング兼発現ベクターであって、ＰＣＲで増幅した遺伝子のコード領域を標的核酸とし、その遺伝子産物をベクター宿主の原核細胞で酵素検出用のペプチドタグを付加した融合タンパク質として産生させ、それを酵素反応で検出することによって標的核酸が正しく組み込まれたクローンを効率的に獲得することができ、かつ、サブクローニングすることなく利用する真核細胞で遺伝子発現を行うことができるものである。
【００３９】  すなわち、本発明のベクターの要素には、〔Ａ〕真核細胞で活性を有するプロモーター、〔Ｂ〕原核細胞で活性を有するプロモーター、〔Ｃ〕クローニング部位、〔Ｄ〕酵素検出用のペプチドタグ配列、〔Ｅ〕ポリＡ付加シグナル、〔Ｆ〕プラスミドの複製開始領域、〔Ｇ〕薬剤耐性遺伝子、が含まれる。この中で、〔Ｆ〕と〔Ｇ〕は、一般のプラスミドベクターに共通する要素であり、本発明に直接関係するのは、〔Ａ〕〜〔Ｅ〕の要素である。役割で分類すれば、真核細胞での遺伝子発現に必要なユニット（〔Ａ〕、〔Ｃ〕、〔Ｅ〕）、および原核細胞での遺伝子発現に必要なユニット（〔Ｂ〕、〔Ｃ〕、〔Ｄ〕）、から構成される。
また、これらの要素は、後述の例外を除き〔Ａ〕〜〔Ｅ〕の順番になるように配置される必要がある。
ただし、これらは本発明を実施するうえで最低必要な構成要素であって、更に利便性を高める目的で、ベクターに新たな要素を付加しても構わない。例えば、抗体検出用のペプチドタグ配列、蛍光タンパク質やルシフェラーゼなどのレポーター、組換えウイルスの作製や増殖に必要な配列、などを加えることができる。
【００４０】  以下に、それぞれの要素の性質を示す。
〔Ａ〕真核細胞で活性を有するプロモーター：  これは、クローニングした遺伝子のコード領域を、真核細胞で発現させるために必要な要素である。遺伝子発現に利用する真核細胞において、活性を有するプロモーターであれば何でもよい。例えば、真核細胞に固有な遺伝子のプロモーターやその変異体、真核細胞に感染するウイルス由来のプロモーターやその変異体、真核細胞で機能しうる人工的に作製されたプロモーターやその変異体、が含まれる。細胞の種類や発生の時期等に左右されず高い活性を示すプロモーターは、汎用性が高い。また、ベクターに組み込むために、プロモーターのサイズは小さいほうがよい。
【００４１】  〔Ｂ〕原核細胞で活性を有するプロモーター：  これは、クローニングした遺伝子のコード領域を、原核細胞で発現させるために必要な要素である。真核細胞で活性を有するプロモーターの下流に配置する。ベクターの宿主として用いる原核細胞において、活性を有するプロモーターであれば何でも良い。例えば、原核細胞に固有な遺伝子のプロモーターやその変異体、原核細胞に感染するファージ由来のプロモーターやその変異体、原核細胞で機能しうる人工的に作製されたプロモーターやその変異体、が含まれる。一般に、原核細胞のプロモーターはサイズが小さく、４０−６０塩基対程度である。また、プロモーターの活性の程度は、宿主内で産生されたペプチドタグ付きの遺伝子産物がクローン選択の際に検出できれば十分であることから、弱くても構わない。
ただし、このプロモーターが、真核細胞における遺伝子発現を妨げるものであってはならない。例えば、開始コドンとして機能し得るＡＴＧ、ターミネーター配列、リプレッサー配列、ＧＣリッチ配列などは、発現を抑制する可能性がある。
また、宿主原核細胞の生育を阻害するものであってはならない。例えば、プロモーターの活性が高すぎると、遺伝子産物が過剰産生され、宿主の生育が悪くなる可能性がある。
例外として、原核細胞で活性を有するプロモーターを導入しなくても、ベクター宿主の原核細胞において挿入核酸の遺伝子発現が見られる場合、ベクターの要素として〔Ｂ〕を付加する必要はない。このような例外には、ベクター要素としての真核細胞で活性を有するプロモーターが原核細胞でもプロモーター活性を示す場合、ベクター自体に挿入核酸の遺伝子発現を可能とするプロモーター活性がみられる場合、が含まれる。
【００４２】  〔Ｃ〕クローニング部位：  これは、遺伝子のコード領域をベクターに組み込むために必要な要素である。原核細胞で活性を有するプロモーターの下流に配置する。この部位は、用いる遺伝子組み換えの方法に適した塩基配列にする必要がある。例えば、制限酵素とリガーゼを用いる方法であれば、クローニング部位に制限酵素の認識配列を必要とする。
別の要件として、ベクターのみを宿主原核細胞に導入した場合、ペプチドタグが自然に産生されないようにする必要がある。その目的で、ペプチドタグの塩基配列とコドンの読み枠が合う（インフレームの）ＡＴＧは開始コドンとして機能しうるため、除外しなければならない。反対に、組換え操作によって取り除かれるクローニング部位の配列において、ペプチドタグの塩基配列とコドンの読み枠が合わない（アウトオブフレームの）ＡＴＧを含めたり、インフレームもしくはアウトオブフレームの終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を含めたりすることが望ましい。
また、原核細胞で活性を有するプロモーターとクローニング部位の間に挟まれる塩基配列については、インフレームのＡＴＧを含めてはならない。一方、翻訳を効率化する目的で、この部分にシャイン−ダルガノ配列やコザック配列等を含めてもよい。
一方、クローニング部位とペプチドタグ配列の間に挟まれる塩基配列は、コード領域の遺伝子産物をペプチドタグと連結させる領域である。従って、インフレームの終止コドン（翻訳が中途で終了するため）や、インフレームの開始コドン（ベクターのみでペプチドタグが発現するため）があってはならない。反対に、ペプチドタグが自然に発現しないようにする目的で、アウトオブフレームの開始コドンや終止コドンを含めても構わない。
【００４３】  〔Ｄ〕酵素検出用のペプチドタグ配列：  これは、クローンを選択するための酵素検出に必要な要素である。クローニング部位の下流に配置する。コード領域が正しくベクターに挿入された場合に限り、コード領域の遺伝子産物がペプチドタグの付加された融合タンパク質として産生されるようにする。ペプチドタグとしては、クローン選択の際に、容易にしかも感度良く検出できるものであれば何でもよい。
ペプチドタグの検出には、酵素反応、蛍光観察、抗原抗体反応、分子間アフィニティなど何でもよいが、コスト・時間・労力がかからず、容易でしかも高感度である必要がある。この点を考慮すると、酵素反応による検出法が利用し易いと考えられる。
【００４４】  〔Ｅ〕ポリＡ付加シグナル：  これは、クローニングした核酸を、真核細胞で発現させるために必要な要素である。遺伝子発現により産生されるｍＲＮＡが正常に機能するためには、ｍＲＮＡの３‘末端側にポリアデニル基が無くてはならない。ポリＡ付加シグナルは、ポリアデニル基の形成を促すシグナル配列である。本発明に必要なポリＡ付加シグナルは、ｍＲＮＡの安定性や翻訳の効率を損なうものでない限り何でもよい。例えば、真核細胞に固有な遺伝子のポリＡ付加シグナルやその変異体、真核細胞を宿主とするウイルス由来のポリＡ付加シグナルやその変異体、または人工的に作製されたポリＡ付加シグナル、が含まれる。細胞の種類や発生の時期に関わらず高い活性を示すポリＡ付加シグナルは、汎用性が高い。
【００４５】  その他、本発明に関わるものとして、以下のものがある
遺伝子組み換えの方法：  外来遺伝子をベクターに組み込むにあたり、従来の制限酵素を用いた方法のほか、ＴＡクローニング法、ＴＯＰＯクローニング法、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法など、いずれの遺伝子組み換え技術を適用することができる。ただし、上記の〔Ｃ〕クローニング部位の項で記載した通り、クローニング部位の塩基配列は、用いる遺伝子組み換えの手法と上記記載の条件に合ったものでなくてはならない。
【００４６】  クローニング用の原核細胞：  これは、ベクターの宿主となる原核細胞であり、クローニングに利便性が良いものであれば何でもよい。一般に、非病原性大腸菌Ｋ−１２系株が使われるが、これに限られることは無い。
ただし、クローンの選択方法として、酵素機能の相補性に基づいた検出法を用いる場合、ベクター宿主である原核細胞の染色体上に相補的なペプチドを発現させるための配列を必要とする。例えば、βガラクトシダーゼのα相補性を利用する場合は、ベクター宿主である原核細胞の染色体上にｌａｃＺΔＭ１５等を有する必要がある。
【００４７】  遺伝子発現に利用する真核細胞：  これは、最終的に遺伝子発現を行う利用目的としての真核細胞である。これには、細胞そのもののほかに、生物組織や生物個体が含まれる。ベクター要素としてのプロモーターが機能する真核細胞であれば何でもよい。これらの細胞に組換えベクターを導入する方法については、利用する真核細胞とその他の条件を考慮したうえで適したものを選択する必要がある。
【実施例】
【００４８】  以下、実施例により本発明を具体的に説明する（これらは、Ｕｄｏ  Ｈ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ｓｅｐ．３０；１０（９）：ｅ０１３９３４９．に基づく）。ただし、本発明は記載された実施例にその技術が限定されるものではない。【００４９】  実施例１：  ベクターの作製
本発明者は、ベクターを以下の手順で構築した。この実施例では、遺伝子組換えにはＴＯＰＯクローニング法を、酵素検出法にはβガラクトシダーゼのα相補性による青白選択法を利用しているが、これらの手法に限定されない。【００５０】  ベクターの必須要素は、先に示した通り〔Ａ〕真核細胞で活性を有するプロモーター、〔Ｂ〕原核細胞で活性を有するプロモーター、〔Ｃ〕クローニング部位、〔Ｄ〕酵素検出用のペプチドタグ配列、〔Ｅ〕ポリＡ付加シグナル、である。実施例では、〔Ａ〕としてはＣＭＶプロモーターを用い、〔Ｂ〕としては改変した大腸菌ラクトースプロモーターを用い、〔Ｃ〕はＴＯＰＯクローニング用に合うようにし、〔Ｄ〕としては改変したβガラクトシダーゼ由来のαペプチドを用い、〔Ｅ〕としてはＳＶ４０由来の配列を用いた。【００５１】  ベクターを構築する上で必要な遺伝子工学的な技術は、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１）に記載の方法等、に従った。【００５２】  作製したベクターは、ｐＣＭＶｌａｃ−ｄｉｒＴｏｐｏ−ＡＵ１−αＧＦＰ（４．８５ｋｂｐ、ｂｐは塩基対の数）とｐＣＭＶｌａｃ−ｄｉｒＴｏｐｏ−Ｐ２Ａ−αＧＦＰ（４．８９ｋｂｐ）であり、その概略図を図１に示した。これらは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）を改変したものであるが、それに限られるものではなく、用途に適した真核細胞用の発現ベクターであれば何でも構わない。
ｐＥＧＦＰ−Ｃ２のＣＭＶプロモーター（約５９０ｂｐ）の下流に位置するＮｈｅＩ−ＸｂａＩ領域（８１５ｂｐ）を、次の要素を含むＤＮＡ断片（約１．０ｋｂｐ）で置き換えた：  改変した大腸菌ラクトースプロモーター／オペレーター（ＮｈｅＩ−ＢｓｐＥＩ間の５７ｂｐ）、クローニング部位（ＡｃｃＩＩＩ−ＢａｍＨＩ間の６５ｂｐ）、ＡＵ１／Ｐ２Ａ配列（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間の１８ｂｐ／５７ｂｐ）、改変したｌａｃＺα（ＳａＩＩ−ＥｃｏＲＩ間の１３２ｂｐ）、ＧＦＰ（ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間の７１４ｂｐ）。図２は、その領域の塩基配列を示したものである。
改変した大腸菌ラクトースプロモーター／オペレーター（ｌａｃＰＯｍ）は、大腸菌の染色体ＤＮＡに由来するもので、その調製過程で２箇所に点突然変異を導入し、配列に含まれるＡＴＧを除去するとともに（真核生物での遺伝子発現を妨げないようにするため）、プロモーター活性を低減させた（宿主原核細胞の生育に支障が出ないようにするため）。
クローニング部位については、ＴＯＰＯクローニング法と整合性が取れるようにするため、ワクシニアウイルス由来トポイソメラーゼＩの認識部位であるＣＣＣＴＴを２箇所挿入した。また、インフレームの終止コドンを２箇所含ませた。クローニング部位より下流の配列（ＡＵ１／Ｐ２Ａ配列、ｌａｃＺα、ＧＦＰ）については、標的とするコード領域がクローニング部位に正しく組み込まれた場合にインフレームになるように（コドン枠が一致するように）配置した。
ＡＵ１／Ｐ２Ａ配列については、本発明に必要な要素ではないが、産生された遺伝子産物を抗体反応で検出したり、融合タンパク質を非酵素的に切り離したりする利便性の目的で導入した。これらの配列の５’末端側にアウトオブフレームのＡＴＧを挿入し、ベクターのみで下流に位置するαペプチドが産生されるのを抑えた。
改変したｌａｃＺαは、大腸菌の染色体ＤＮＡに由来するもので、大腸菌βガラクトシダーゼのＩｌｅ４からＡｒｇ４７までの４４アミノ酸残基からなるαペプチドをコードしており、その調製過程で複数のサイレント変異（翻訳に影響しない変異）を導入して制限酵素の認識部位を除去するともに、哺乳動物のコドン使用頻度に適合するようにした。
ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質の遺伝子であり、本発明に必要な要素ではないが、真核細胞における遺伝子発現を容易に観察できるようにする利便性の目的で導入した。
その他、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２ベクターのＳｓｐＩ−ＥａｇＩ間の領域（カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域、４４７ｂｐ）も改変したが、本発明に関わるものではない。
得られたベクターは、ＤＮＡの塩基配列解析によって、その妥当性を確認した。【００５３】  ワクシニアウイルス由来トポイソメラーゼＩを結合したベクターの調製：  ワクシニアウイルス由来トポイソメラーゼＩは、Ｙａｋｏｖｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）の方法に従って調製した。また、ワクシニアウイルス由来トポイソメラーゼＩを結合させたベクターの調製については、Ｕｄｏ．（２０１５）に記載した手順で行った。【００５４】  実施例２：  ＰＣＲで増幅されたコード領域を用いたクローニングの試験
本発明者は、作製したベクターの有効性を確かめるため、通常のＰＣＲで増幅された核酸を用いて、以下の手順でクローニングの試験を行った。【００５５】  試験用の核酸として、ｍＫＯ（サンゴ由来の橙色蛍光タンパク質の遺伝子、６５４ｂｐ）の遺伝子を使用した。プラスミドｐｈｍＫＯ２−ＭＣ１（医学生物学研究所）を鋳型として、ｍＫＯのコード領域を通常のＰＣＲで増幅したのち精製した。ｍＫＯのＰＣＲに用いたプライマーの配列は、フォワードが５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧ−３’で、リバースが５‘−ＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣ−３’であった【００５６】  図３は、通常のＰＣＲで得たｍＫＯのコード領域をアガロース電気泳動で確認した画像である。ＤＮＡのサイズマーカーはλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた（バンドの大きさ順に、２３１３０，９４１６，６５５７，４３６１，２３２２，２０２７，５６４ｂｐ）。ｍＫＯの核酸（６５７ｂｐ、星印）が主要なＰＣＲ産物として確認され、非特異的に増幅された副産物は見られなかった。一般に、鋳型として用いるＤＮＡが単一分子種の場合、標的核酸が主要産物として得られることが多く、副産物の生成は少ない。【００５７】  ＰＣＲ産物の組換え操作や得られたクローンの解析は、Ｕｄｏ．（２０１５）に記載された要領で行った。簡単には、ベクターとＰＣＲ産物を連結させた後、大腸菌ＤＨ５α株（染色体にｌａｃＺΔＭ１５を有する）に導入した。その後、抗生物質とβガラクトシダーゼの基質であるＸ−ｇａｌを含む寒天培地に大腸菌を塗布し、３７℃で１８−２２時間培養した。Ｘ−ｇａｌプレートに形成されたコロニーからプラスミドを調製し、挿入核酸の有無については制限酵素処理で確認し、さらに挿入核酸の塩基配列を解析した。【００５８】    この方法で、得られた大腸菌のコロニーを図４に示した。ベクターのみ（ｐＣＭＶｌａｃ−ｄｉｒＴｏｐｏ−ＡＵ１−αＧＦＰ）を、大腸菌ＤＨ５α株に導入すると、白色コロニーのみがＸ−ｇａｌプレート上に形成された（図４右）。ベクターだけでは、αペプチドを含む融合タンパク質が産生されないため、βガラクトシダーゼの相補的な活性の発現が見られず、結果としてＸ−ｇａｌの呈色反応（青色に呈色）が起こらない。一方、ｍＫＯを組み込んだベクターでは、Ｘ−ｇａｌプレート上に青色と白色のコロニーが形成された（図４左）。青色コロニーの割合は、コロニー全体の７６．４±２．８％（Ｎ＝１２試験）であった。
図５の上の写真は、得られた青色または白色コロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素処理を施した後、挿入核酸の有無をアガロース電気泳動で調べたものである。その結果、青色コロニーの全てがｍＫＯのＤＮＡを有していることが分った。さらに、塩基配列解析で青色の３２クローンを調べたところ、全てクローンについて、ｍＫＯのコード領域がインフレームで正しい方向に挿入されていた（１００％、３２／３２コロニー）。一方、白色コロニーについては、その大半がｍＫＯを含んでいなかった（ベクターのみ）。一部の白色コロニー（約１〜２割）はｍＫＯを有していたが、塩基配列解析の結果、反対方向に挿入されていることが分った（図中の白色コロニー＃３は、ｍＫＯが逆向きであった）。【００５９】  理論的には、ｍＫＯの翻訳領域ＤＮＡが反対方向に挿入されると、プロモーターの下流に１０箇所もの開始コドン（ＡＴＧ）が生じ、その２箇所についてはｌａｃＺαとアウトオブフレームだが、８箇所についてはインフレームであることが判明した。また同時に、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）が２０箇所生じることになり、そのほとんどがランダムに生じた開始コドンからの翻訳を途中で終了させるが、１つの開始コドンについては途中で終止コドンにさえぎられることなくαペプチドを産生する可能性があった。しかし、実際には、計４８個の青色コロニーを調査しても、反対方向に挿入されたｍＫＯは一つも得られなかった（０％、０／４８コロニー）。つまり、目的とするコード領域が反対方向に挿入されると、多数の開始コドンや終止コドンが生じ、ｌａｃＺαの翻訳（αペプチドの合成）が阻害されると考えられる。また、この結果は、非翻訳領域の核酸（通常、多数のＡＴＧ、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡを含む）がベクターに組み込まれた場合でも、αペプチドの産生が阻害されることを意味し、その場合、白色コロニーが生じると予想される。【００６０】  このベクターを用いると、遺伝子産物はＧＦＰの融合タンパク質として発現されるはずであるが、青色と白色コロニーから発せられる緑色蛍光を区別することができなかった。図６は、大腸菌を画線培養して、組み込まれたｍＫＯの橙色蛍光を観察したものである。ベクターのみでは蛍光が弱く（バックグラウンド）、ｍＫＯを挿入したベクターでも同様に弱かった（補正した平均蛍光強度の比較、ベクターのみ：１．７±１．０、ｍＫＯを有するベクター：１．４±１．０、Ｎ＝４、有意差無し、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）。しかし、野生型のｌａｃＰＯを用いると、ｍＫＯの蛍光が明瞭に観察された（２５．８±６．０、Ｎ＝４、Ｆ［２，９］＝１５．４２；Ｐ＜０．０１、一要因の分散分析；Ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）。つまり、このベクター（改変したｌａｃＰＯを有する）を用いると、大腸菌での遺伝子発現が十分に弱い。しかし、それでもなお、Ｘ−ｇａｌの呈色は明瞭に観察されることから、検出感度において蛍光観察よりも酵素反応のほうが優れていると言える。【００６１】  従来のベクターとの効率を比較するため、ｐｃＤＮＡ３．１ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて同様な実験を行った。その結果、解析したコロニーのう��約７割がｍＫＯを含んでいたが、その内の約１５％がｍＫＯを反対方向に組み込んでおり、結局、正しいクローンが得られたのは全体の約６割であった。図５の下の写真では、解析した１６クローンのうち１０クローンがｍＫＯを含んでいたが、塩基配列の解析から、そのうちの２つは逆向きであることが判明した。【００６２】  図７は、ｍＫＯのコード領域を用いたクローニング試験で、本発明のベクター（ｐＣＭＶｌａｃ−ｄｉｒＴｏｐｏ−ＡＵ１−αＧＦＰ，図ではｐＣＭＶｌａｃと略記）と従来のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯクローニングベクター、図ではｐｃＤＮＡ３．１と略記）を比較したものである。クローニング効率でみると、ｐＣＭＶｌａｃでは９３．８±３．６％であったのに対し、ｐｃＤＮＡ３．１では５８．３±４．２％であり、本発明のベクターにおいて効率が有意に改善されていた（各ベクターにつきＮ＝３試験、Ｔ［４］＝６．４３、Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。一方、挿入されたコード領域の方向を比較したところ、ｐＣＭＶｌａｃでは１００±０．０％であったのに対し、ｐｃＤＮＡ３．１では８４．７±３．２％であり、本発明のベクターが有意に優れていた（各ベクターにつきＮ＝３試験、Ｕ＝０、Ｚ＝−１．９６、Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。【００６３】  実施例３：  ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたコード領域のクローニング
本発明者は、作製したベクターが、ＲＴ−ＰＣＲで得られた遺伝子のコード領域についても有効であるのかを確かめるために、以下の手順で試験を行った。【００６４】  Ｕｄｏ．（２０１５）に記載された方法で、ｃＤＮＡを調製した。要点として、クローニング用の標的核酸は、マウスの増殖因子や転写因子のコード領域（０．２４〜４．６７ｋｂｐ、平均サイズ：１．２５ｋｂｐ）であり、マウスの組織より得た全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲにより調製された。予想した位置に核酸のバンドが確認された場合、バンドを含むゲル片を切り出して精製した。【００６５】  図８は、ＲＴ−ＰＣＲで得られた核酸を電気泳動で解析した典型的な画像である。特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行っても、目的とする核酸（星印）が主産物として得られる場合とそうでない場合がある。このように、ＲＴ−ＰＣＲでは、非特異的に増幅された副産物が混在していることが多い。目的の核酸をゲルから回収しても、副産物を完全に除くのは難しく、クローニング効率の低下につながる。【００６６】  アガロースゲルから回収・精製したＤＮＡ断片を、Ｕｄｏ．（２０１５）に記載された方法で、本発明のベクターに組み込んだ（図ではｐＣＭＶｌａｃと略記）。この実施例では、Ｘ−ｇａｌプレートに青色のコロニーを形成した１２６遺伝子のコード領域について解析を行い、その内の１０６遺伝子が正常にクローニングされた（８４％、１０８／１２６遺伝子）。平均して、Ｘ−ｇａｌプレート上の青色のコロニーの割合は２９．８±２．３％であった（薄く呈色したコロニーは除いた）。この割合は、ｍＫＯを用いたクローニングの試験の場合（７６％）と比べると、随分低くなった。これは、ゲルから回収した核酸に標的以外の核酸が混入しているためと考えられた。
図９に示すように、本発明の実施例として用いたベクターでは（図ではｐＣＭＶｌａｃと略記）、クローニング効率が７５．１±３．５％であり、ｍＫＯを用いたクローニングの試験の場合（９４％）に比べて若干減少したが、依然高い効率を保っていた。また、コード領域の挿入方向を調べると、ほとんどが正しくベクターに挿入されており、９９．５±０．５％であった。青色コロニーを一つ分析した場合、平均して７８．１％が正しいクローンであったことから、目的のクローンを得るためには、多くの場合、一つもしくは二つのコロニーを調べるだけで十分であった。
比較として、ｐｃＤＮＡ３．１ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯクローニングベクター（図ではｐｃＤＮＡ３．１と略記）を用いて、同様なクローニングを実施した。コロニーが得られた１８遺伝子のコード領域について解析を行い、その内の１５遺伝子を得る事ができた（８３％、１５／１８遺伝子）。しかしながら、正しいクローンを得るには、多数のコロニーを解析する必要があった。図９に示すように、クローニング効率は、ｍＫＯを用いたクローニング試験の場合（５８％）と比べると、ｃＤＮＡの場合では２５．１±４．３％と大幅に減少した。この数値は、本発明のｐＣＭＶｌａｃの場合（７５％）と比較して有意に低かった（Ｕ＝４４０．５、Ｚ＝−５．０９、Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。これとは対照的に、ｐｃＤＮＡ３．１における挿入核酸の方向について調べると、ｍＫＯを用いたクローニングの試験の場合（８４％）と同程度の７７．８±９．２％であった。つまり、ｐｃＤＮＡ３．１におけるクローニング効率の低下は、核酸の挿入方向によるものでは無く、目的以外の核酸が組み込まれたためであった。この結果は、塩基配列の解析からも確かめられた。コード領域の挿入方向についてみても、本発明のベクター（９９％）のほうがｐｃＤＮＡ３．１（７８％）に比べて優れていた（Ｕ＝７１１、Ｚ＝−２．１８、Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。【００６７】  実施例４：  真核細胞における遺伝子発現
本発明者は、原核細胞を用いてクローニングされた遺伝子のコード領域が、真核細胞でも発現することを、以下の手順で確認した。【００６８】  細胞培養および遺伝子導入は、Ｕｄｏ．（２０１５）に記載された方法で行った。遺伝子発現用の真核細胞としては、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、遺伝子導入用のＤＮＡとしては、ベクターのみ（ｐＣＭＶｌａｃ−ｄｉｒＴｏｐｏ−ＡＵ１またはＰ２Ａ−αＧＦＰ）、転写因子Ｐａｘ６を組み込んだベクター（ｐＣＭＶｌａｃ−Ｐａｘ６−ＡＵ１またはＰ２Ａ−αＧＦＰ）、および緑色蛍光タンパク質の発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｃ２）を用いた。遺伝子導入から４８時間後、培養細胞を固定し、Ｐａｘ６は免疫蛍光染色により、細胞核はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により、ＧＦＰは蛍光観察により、検出した。【００６９】  同様に、タンパク質の検出も、Ｕｄｏ．（２０１５）に記載された方法で行った。簡単には、上記記載のベククーを用いて遺伝子導入を行い、細胞抽出液および細胞画分（細胞質画分、細胞核画分）を調製したのち、真核細胞において産生された遺伝子産物をウエスタンブロット法で検出した。コントロールには、β−ｔｕｂｕｌｉｎを用いた。用いたサイズマーカーの大きさは、順に、１７５、８０、５８，４６ｋＤａであった。【００７０】  図１０は、遺伝子導入がなされたＨＥＫ２９３細胞を蛍光観察して得られた画像である。Ｐａｘ６は転写因子であり、細胞核に局在することが知られている。Ｐａｘ６をＡＵ１含有ベクターで発現させた場合、Ｐａｘ６はＧＦＰとの融合タンパク質として産生され、ＧＦＰの蛍光およびＰａｘ６の免疫反応は、細胞核のみで検出された。一方、Ｐａｘ６をＰ２Ａ含有ベクターで発現させた場合、Ｐａｘ６の免疫反応は細胞核で観察されたが、ＧＦＰの蛍光は細胞質全体に見られた。これは、Ｐ２Ａの自己切断によりＰａｘ６−ＧＦＰ融合タンパク質が、Ｐａｘ６とＧＦＰに分離されたためである。ＧＦＰのみを発現させると、細胞質全体にＧＦＰの蛍光が見られた。ベクターのみを細胞に導入した場合は、ＧＦＰの蛍光およびＰａｘ６の免疫反応はともに見られなかった。【００７１】  図１１に示すように、ＨＥＫ２９３細胞で産生された遺伝子産物を、ウエスタンブロット法により検出した。その結果、ＡＵ１含有ベクターでは、Ｐａｘ６−ＧＦＰ融合タンパク質（８１ｋＤａ）が産生されていることが確認でき、細胞核に局在していた。細胞質のタンパク質であるβ−ｔｕｂｕｌｉｎが核画分に見られないことから、細胞分画は上手くなされていることが分る。一方、Ｐ２Ａ含有ベクターを用いた場合、Ｐａｘ６−ＧＦＰ融合タンパク質（８１ｋＤａ）およびＰａｘ６（４９  ｋＤａ）の２つのバンドが確認され、全体の５５．２±３．６％（Ｎ＝３試験）がＰ２Ａの自己切断を受けていることが分った。この結果は、本発明の実施例として用いたベクターが、真核細胞における遺伝子発現に利用できることを示している。また、この結果は、本発明のベクターに新たな要素を付加して（実証例では、ＧＦＰやＰ２Ａ）、利便性を高める事ができることを意味する。【００７２】  実施例５：  ペプチドタグの細胞毒性の確認
本発明者は、用いたペプチドタグに細胞毒性がないことを、以下の手順で確認した。【００７３】  遺伝子導入２４時間後、ＨＥＫ２９３細胞の生存率をＰＩ染色で調べた。ＰＩ陽性であった死細胞の割合は、ＡＵ１含有ベクターでは１．５±０．３％、Ｐ２Ａ含有ベクターでは１．０±０．３％、無処理の細胞では０．７±０．３％であった。全てについて有意差は見られず、ペプチドタグとして用いたαペプチドに細胞毒性は見られなかった（Ｎ＝８視野、５２〜２２３細胞、Ｆ［２，２１］＝１．７１、Ｐ＝０．２１、一要因分散分析）。実際、βガラクトシダーゼ（αペプチドはその一部）は、遺伝子発現のレポーターとして広範に利用されており、細胞毒性は報告されていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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