(57)【要約】【課題】汎用性が高く操作が簡便である標的核酸の検出方法を提供する。【解決手段】標的配列を含む標的核酸として、前記標的核酸を含む可能性のある試料に対して、核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、前記標的核酸を検出する工程と、を実施する。検出工程は、前記標的配列を識別する識別プローブと前記標的配列を含む一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を前記標的配列に関連付けられる捕捉プローブを用いて検出し、識別プローブは、前記標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列と、を有し、前記ハイブリダイズ産物は、前記第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列を含む標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸を含む可能性のある試料に対して、核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、
前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
前記検出工程は、前記標的配列を識別する識別プローブと前記標的配列を含む一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を前記標的配列に関連付けられる捕捉プローブを用いて検出する工程であり、
前記識別プローブは、前記標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列と、を有し、
前記ハイブリダイズ産物は、前記第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する、方法。
【請求項２】
前記増幅工程は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下で実施する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程は、前記標的配列を含む前記一本鎖核酸を他方の一本鎖核酸よりも多く増幅する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程は、前記ハイブリダイズ産物を、前記捕捉プローブを備える固相担体を用いてクロマトグラフィーによって分離することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下、前記標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行い、
前記識別プローブは、前記標的核酸に関連付けられた前記クロマトグラフィー用の固相担体上の捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記標的配列は、１又は２以上の一塩基多型を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１の識別配列は、少なくとも１つの前記一塩基多型を識別する塩基を前記識別配列のほぼ中央に備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅工程は、増幅サイクルを前記識別プローブの存在下で実施し、前記ハイブリダイズ産物を取得する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイズ産物を、前記増幅産物を加熱変性し、前記識別プローブの存在下で冷却することにより取得する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで５分以内に冷却する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで３分以内に冷却する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡおよびＲＰＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸を検出するためのキットであって、
標的核酸を増幅するための核酸増幅反応のための試薬と、
前記標的配列を含む一本鎖核酸と前記標的配列を識別可能な識別プローブと、
前記識別プローブを捕捉可能な捕捉プローブを備えるクロマトグラフィー用の固相担体と、
を備え、
前記識別プローブは、前記標的配列と特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記固相担体上の前記捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列と、を有する、キット。
【請求項１６】
前記試薬は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを含む、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示する技術は、試料中に存在する標的核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中などに存在する特定の核酸（以下、標的核酸ともいう。）を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。
【０００３】
近年注目されている操作性に優れ、迅速、簡便な標的核酸の検出方法として、クロマトグラフィーに基づいた遺伝子検出方法がある（特許文献１〜３）。これらの方法は、核酸増幅法により、標識化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸を含むＤＮＡを増幅すると共に標識を導入し、この増幅産物からなる試料をクロマトグラフ用のテストストリップにアプライし、毛細管現象を利用してテストストリップ中を展開させ、当該テストストリップに予め固定化したプローブで増幅産物を捕捉して標識に基づくシグナルの有無で標的核酸を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１５４０７５号公報
【特許文献２】特開２００３−１９４８１７号公報
【特許文献３】特許第３００１９０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、この方法ではプライマーの塩基配列に基づき識別能によってのみ標的核酸を検出するものであるため、増幅産物中に存在する、例えば、一塩基多型を含む遺伝子型や変異を検出するなどの精密な配列の検出はできない。また、標識プライマーの利用は、検出には便宜であるが、プライマー同士でアニールして増幅したいわゆるプライマーダイマーも検出する危険が伴う。
【０００６】
本明細書は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、従来の標的核酸の検出方法に比べて、汎用性が高く操作が簡便である標的核酸の検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、増幅産物中に含まれる標的核酸と当該標的核酸中の標的配列を識別するタグ付きプローブとのハイブリダイズ産物を調製し、当該ハイブリダイズ産物を、前記タグとハイブリダイズ可能な捕捉プローブで検出する方法を見出した。そして、この方法によれば、従来、プライマーの識別能のみでは検出不可能であったＳＮＰなどの微小な標的配列もＰＣＲ等の核酸増幅反応を経由して簡易にかつ高い特異性で検出することができる。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【０００８】
（１）  標的配列を含む標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸を含む可能性のある試料に対して、核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、
前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
前記検出工程は、前記標的配列を識別する識別プローブと前記標的配列を含む一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を前記標的配列に関連付けられる捕捉プローブを用いて検出する工程であり、
前記識別プローブは、前記標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列と、を有し、
前記ハイブリダイズ産物は、前記第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する、方法。
（２）  前記増幅工程は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行う、（１）に記載の方法。
（３）  前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、（２）に記載の方法。
（４）  前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下で実施する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  前記増幅工程は、前記標的配列を含む前記一本鎖核酸を他方の一本鎖核酸よりも多く増幅する、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  前記検出工程は、前記ハイブリダイズ産物を、前記捕捉プローブを備える固相担体を用いてクロマトグラフィーによって分離することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下、前記標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行い、
前記識別プローブは、前記標的核酸に関連付けられた前記クロマトグラフィー用の固相担体上の捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  前記標的配列は、１又は２以上の一塩基多型を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  前記第１の識別配列は、少なくとも１つの前記一塩基多型を識別する塩基を前記識別配列のほぼ中央に備える、（８）に記載の方法。
（１０）  前記増幅工程は、増幅サイクルを前記識別プローブの存在下で実施し、前記ハイブリダイズ産物を取得する、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  前記ハイブリダイズ産物を、前記増幅産物を加熱変性し、前記識別プローブの存在下で冷却することにより取得する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで５分以内に冷却する、（１１）に記載の方法。
（１３）  前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで３分以内に冷却する、（１２）に記載の方法。
（１４）  前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡおよびＲＰＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  標的核酸を検出するためのキットであって、
標的核酸を増幅するための核酸増幅反応のための試薬と、
前記標的配列を含む一本鎖核酸と前記標的配列を識別可能な識別プローブと、
前記識別プローブを捕捉可能な捕捉プローブを備えるクロマトグラフィー用の固相担体と、
を備え、
前記識別プローブは、前記標的配列と特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記固相担体上の前記捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列と、を有する、キット。
（１６）  前記試薬は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを含む、（１５）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の概要を示す図である。
【図２】実施例１で用いるクロマトグラフィーデバイスを示す図である。
【図３】実施例１で用いる２段階クロマトグラフィーを示す図である。
【図４】実施例１のクロマトグラフィーデバイスによる検出結果を示す図である。
【図５】実施例２のクロマトグラフィーデバイスによる検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、標的核酸の検出方法及びそのためのキット等に関する。本明細書に開示の標的核酸の検出方法（以下、単に本検出方法ともいう。）の概要を図１に例示する。
【００１１】
図１に示すように、本検出方法は、標的核酸を増幅工程において増幅して増幅産物を得る。識別プローブは、この増幅産物中の標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、標的核酸に関連付けられる捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列とを有している。
【００１２】
増幅産物と識別プローブとを接触させ、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物を取得する。このハイブリダイズ産物は、第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する部分二本鎖となっている。
【００１３】
本検出方法におけるハイブリダイズ産物、すなわち、第１の識別配列と標的配列とのハイブリダイズを達成させて得られるハイブリダイズ産物は、そのまま、確実に捕捉プローブによって捕捉させるための捕捉要素である第２の識別配列を有することができる。このため、本検出方法によれば、核酸増幅反応の増幅産物を用いて高い検出感度及び精度を発揮できる。さらに、本検出方法によれば、確実にかつ容易に標的核酸を検出できる。
【００１４】
また、標的配列を含む一本鎖核酸が標識要素を備える場合には、得られるハイブリダイズ産物は、そのまま捕捉要素と標識要素とを備えることになるため、一層容易に標的核酸を検出できる。
【００１５】
本検出方法によれば、一塩基多型などの一塩基の相違を含む標的配列も、識別プローブにより識別可能であり、ハイブリダイズ産物として取得することができ、その後の検出工程に供することができる。
【００１６】
ハイブリダイズ産物は、例えば、核酸増幅反応による増幅産物を加熱して一旦融解し、識別プローブの存在下で冷却することで、識別プローブと増幅産物中の標的核酸とをハイブリダイズさせることで得ることができる。
【００１７】
増幅工程におけるいわゆる核酸増幅反応の熱変性−アニール−伸長反応のサイクル後に、熱変性させ、さらに冷却するサブステップにおいて、本発明者らは、意外にも、標的核酸の増幅産物のうち一本鎖核酸と識別プローブとが十分に特異的にハイブリダイズし得て、後段の検出工程で検出可能な程度にハイブリダイズ産物が得られることを見出した。本発明者らによれば、このようなハイブリダイズ産物を得るためには、例えば、核酸増幅反応に用いるプライマーとその相補鎖との融解温度よりも、識別プローブとその相補鎖との融解温度を低く設定することができる。
【００１８】
こうして得られる、標的核酸と識別プローブとの特異的ハイブリダイズ産物は、例えば、固相担体に固定された捕捉プローブ等で捕捉されることで、固相担体上で検出されるようになる。こうしたハイブリダイズ産物は、捕捉プローブを固相担体を用いてクロマトグラフィーによって分離し捕捉するのに都合がよい。
【００１９】
識別プローブによる標的配列の識別能は十分に高いため、ＳＮＰなどの一塩基の相違でも、十分に識別し、また、ホモ又はヘテロなどの変異の割合等に応じて定量的に標的配列にハイブリダイズし、検出することができる。
【００２０】
本明細書において、「標的核酸」とは、検出しようとする標的配列を含む核酸を意味している。標的核酸の由来は、特に限定しないで、各種生物材料（個体またはその組織、器官等の個体の一部のほか、排せつ物、体液等）ほか、人工的な核酸を含む人工材料が挙げられる。
【００２１】
本検出方法には、標的核酸を含む可能性のある生物材料又は人工材料自体又は必要に応じてこうした各種材料から核酸以外の構成成分の一部又は全部が除去されて核酸抽出試料を、試料として供給することができる。
【００２２】
「標的配列」は、２以上の塩基で表され、１又は２以上の塩基からなる欠失、挿入及び置換又はその組合せからなる変異、多型、属、種若しくは株の配列上の特徴を含んでいる「標的配列」は、典型的には、一塩基多型などの各種多型、変異、微生物の同定のための配列を含むことができる。
【００２３】
以下、本明細書に開示される検出方法及びキット等について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。ここで図１は、本検出方法の一例の概要を示す図である。
【００２４】
（標的核酸の検出方法）
本検出方法は、標的核酸を増幅するための核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、前記標的核酸を検出する工程と、を備えることができる。
【００２５】
（増幅工程）
増幅工程は、標的核酸を含む可能性のある試料に対して標的核酸を増幅可能に設計したプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する工程である。プライマーセットを、例えば、図１に示すように、標的配列を含む可能性のある標的核酸を増幅できるように設計することができる。本検出方法においては、標的配列の有無にかかわらず、標的配列を含む可能性のある領域を増幅産物として取得すれば足りる。
【００２６】
本検出方法においては、１又は２以上の標的核酸を対象とすることができる。本検出方法は、標的核酸の検出を核酸増幅反応に関与しない識別プローブで行うため、複数の標的核酸を検出対象としても高い正確性と精度を確保することができる。２以上の標的核酸を検出対象とするときには、各標的核酸の増幅及び検出のために、複数のプライマーセット、識別プローブ及び捕捉プローブを用いる。
【００２７】
プライマーセットを構成するプライマー対は、以下の特徴を備えることができる。まず、プライマーセットによって増幅産物として取得する標的核酸の塩基長は特に限定しないで８０〜３００ｂｐとすることができるが、例えば、１００塩基以上２５０塩基以下とすることができる。この範囲であると、増幅産物の一本鎖核酸である一本鎖ＤＮＡ鎖と識別プローブとのハイブリダイズ産物を得られやすいからである。特に限定するものではないが、より好ましくは１５０塩基以上２２０塩基以下である。
【００２８】
プライマーセットを構成する各プライマーの長さも特に限定しないで、１５〜５０ヌクレオチド等とすることができる。より典型的には２０〜３０ヌクレオチドであり、例えば、１７ヌクレオチドから２５ヌクレオチド程度することができる。
【００２９】
プライマーセットの各プライマーの融解温度（Ｔｍ、℃）も、特に限定しないが、例えば、４５℃以上６５℃以下とすることができる。後述する識別プローブとの融解温度差を考慮すると、好ましくは５０℃以上６０℃以下である。
【００３０】
プライマーセットの各プライマーのいずれか一方には、標識要素を備えることが好ましい。こうしたプライマーセットによる増幅産物は、標識要素を備えることとなる。こうすることで、ハイブリダイズ産物は、検出のための操作を簡略化でき、検出工程における検出に都合がよい。
【００３１】
ハイブリダイズ産物に標識要素を付与する観点からは、識別プローブとハイブリダイズすることとなる一本鎖核酸が標識要素を備えるようにプライマーを設計することが好ましい。すなわち、識別プローブがアンチセンス鎖にハイブリダイズする場合には、アンチセンス鎖が標識要素を備えるように構成し、識別プローブがセンス鎖とハイブリダイズするとき場合には、センス鎖が標識要素を備えるように構成する。
【００３２】
ここで標識要素とは、例えば、標識物質及び標識物質結合物質が挙げられる。本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
【００３３】
標識物質は、目視（肉眼）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質若しくは着色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、より好適である。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
【００３４】
この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００３５】
標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
【００３６】
好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００３７】
標識物質結合物質は、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用、核酸−核酸相互作用等を利用して、最終的に標識物質を結合できる物質が挙げられる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類及び互いにハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ、オリゴヌクレオチドなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように構成される。
【００３８】
こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
【００３９】
増幅工程は、標的核酸を含む可能性のある試料に対して、こうしたプライマーセットのほか、ＤＮＡポリメラーゼ、各種塩基を備えるヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）とともに核酸増幅反応を実施する。核酸増幅反応は、概して、以下の（１）〜（４）のステップを備えている。通常、（２）〜（４）を１５回〜１００回以下程度、典型的には、２０回〜５０回程度繰り返すことにより、増幅産物を取得できる。増幅工程は、例えば、さらに、後述するハイブリダイズ産物を得るための（５）熱変性ステップ及び（６）の冷却ステップを備えていてもよい。
【００４０】
（１）サイクル前の熱変性ステップ
（２）熱変性ステップ
（３）アニーリングステップ
（４）伸長反応ステップ
（５）熱変性ステップ
（６）冷却ステップ
【００４１】
上記（１）〜（４）の各ステップは、それぞれ、一般的な条件が周知であり、当業者であれば、適宜公知の条件に基づいて設定することができる。例えば、（１）サイクル前の冷却ステップは、例えば、９０℃以上９９℃以下程度であり、（２）熱変性ステップも９０℃以上９９℃以下であり、（３）アニーリングステップは、例えば、プライマーの溶解温度に対して±６℃程度とすることができる。また、（４）伸長反応ステップは、用いるＤＮＡポリメラーゼの温度特性にもよるが、概して７２℃とすることができる。
【００４２】
例えば、（５）熱変性ステップは、他の熱変性ステップと同様９０℃以上９９℃以下程度で実施することができる。また、熱変性ステップは、こうした温度で好ましくは１０秒以上、より好ましく２０秒以上６０秒以下程度維持することが好ましい。さらに、例えば、（６）冷却ステップは、識別プローブの融解温度以下に冷却するステップである。冷却ステップの到達温度（冷却温度）としては、例えば、２５℃以下であり、好ましくは２０℃以下であり、より好ましくは１８℃以下であり、さらに好ましくは１５℃以下である。また、冷却温度に到達するまでの時間（冷却時間）としては、例えば、１５分以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは７分以下、さらに好ましくは５分以下、なお好ましくは３分以下、一層好ましくは１分以下程度で冷却するステップである。冷却時間が短いほど、検出に要する時間を短縮化することができる。なお、熱変性時間及び冷却時間がともに極めて短時間でよいため、検査時間の短縮化に有効である。
【００４３】
増幅工程における核酸増幅反応は、ＰＣＲのほか、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡおよびＲＰＡなどから適宜選択して用いることができる。
【００４４】
核酸増幅反応は、また、増幅産物のうち、標的配列を含む一本鎖核酸を他方の一本鎖核酸よりも多く増幅するように実施することが好ましい。いわゆる非対称ＰＣＲなどの非対称核酸増幅反応とすることが好ましい。こうすることで、ハイブリダイズ産物をより効率的及び高濃度で得ることができるようになる。こうした非対称核酸増幅反応は、より多く増幅しようとする一本鎖核酸を増幅するためのプライマーを他方のプライマーよりも多く存在するようにする。例えば、非対称ＰＣＲの場合、標的配列を含む一本鎖核酸用プライマー（Ａ）と他方の一本鎖核酸用プライマ−（Ｂ）との濃度比を、Ａ：Ｂ＝２：１〜５０：１とすることができる。
【００４５】
（標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物）
本検出方法では、標的核酸又はその増幅産物の標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブと、前記標的配列を含む一本鎖核酸とのハイブリダイズ産物を、検出工程において供する。本検出方法では、こうしたハイブリダイズ産物は、増幅工程内又は増幅工程後において取得することができる。以下、ハイブリダイズ産物及びその取得について説明する。
【００４６】
（識別プローブ）
識別プローブは、１又は２以上の標的核酸に対して、それぞれ設計して、１又は２以上を準備することができる。例えば、Ｔ／Ａの１塩基多型のとき、標的配列としては、Ｔ型（例えば、野生型）とＡ型（変異型）の２種類があり、標的核酸も２種類となる。この場合、識別プローブは、標的配列、すなわち、標的核酸に応じて、野生型標的配列向け及び変異型標的配列向けに、合計２種類準備される。このほか、識別プローブは、異なる変異や多型に対応して複数種類を一つの検出方法に供されてもよい。
【００４７】
ここで、識別プローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列を有することができる。識別プローブが第１の識別配列を有することで、標的配列を有する一本鎖核酸とハイブリダイズすることができる。
【００４８】
例えば、標的配列が一塩基多型の場合、１又は２以上の一塩基多型のうち少なくとも１つの一塩基多型を検出するための塩基は、第１の識別配列の塩基長の範囲のいずれの位置にあってもよい。任意の位置に設定しても、精度よく標的配列を検出することができる。すなわち、識別のための塩基は、中央側に存在するようにしてもよいし、３’末端又は５’末端にあってもよいし、末端よりも内側にあってもよい。
【００４９】
識別プローブにおける第１の識別配列の長さは特に限定しないが、プライマーセットによる標的核酸の増幅を確保できるように設計される。すなわち、（３）アニーリングステップではプライマーのみが標的核酸にアニールするが、このとき、識別プローブが標的核酸やプライマーにアニールしないことが好ましい。より具体的には、第１の識別配列の長さが長すぎる場合には、（３）アニーリングステップで標的核酸等にアニールする傾向が生じる。
【００５０】
また、第１の識別配列の長さは、特異的に標的配列とハイブリダイズするのに好適な長さであることが好ましい。すなわち、（６）冷却ステップで、非特異的に標的配列以外にハイブリダイズしないことが好ましい。より具体的には、第１の識別配列が長すぎると非特異的なハイブリダイズが生じ、第１の識別配列が短すぎるとハイブリダイズ自体が抑制される。
【００５１】
第１の識別配列の好適な長さは、標的配列の種類や、（３）アニーリングステップ及び（６）冷却ステップの条件に応じて適宜設定することができる。典型的には、１０〜２５ヌクレオチドとすることができる。例えば、一例であって限定されるものではないが、第１の識別配列は、１３塩基以上１５塩基以下程度としてもよい。
【００５２】
識別プローブは、その第１の識別配列と標的配列との融解温度が、標的核酸を増幅するためのプライマーセットの各プライマーの融解温度よりも低いことが好ましい。プライマーセットに比較して識別プローブの融解温度を十分低く設計することで、（５）熱変性ステップ後の（６）冷却ステップにおいて、標的配列と識別プローブとのハイブリダイズ産物とを取得することができる。どの程度、プライマーセットの融解温度から低ければよいかは、増幅反応に用いる熱変性温度、アニーリング温度等にもよるが、識別プローブの融解温度は、好ましくはプライマーセットの各プライマーの融解温度の平均温度よりも、１０℃以上低いことが好ましく、より好ましくは１５℃以上であり、さらに好ましくは１６℃以上であり、なお好ましくは１７℃以上であり、一層好ましくは１８℃以上低いことが好ましい。また、プライマーセットの平均融解温度から２０℃程度低くてもよい。
【００５３】
また、識別プローブは、その３’末端が、伸張反応が起こらないように公知のブロック剤によりブロックされていてもよい。例えば、３’末端をヒドロキシル基で修飾してもよい。例えば、米国特許第5,516,663号は、プローブを伸長不能にするために用いることができる修飾を記載している。
【００５４】
なお、識別プローブは、第１の識別配列に加えて、標的配列に関連付けられる捕捉プローブと特異的にハイブリダイズ可能な第２の識別配列を備えることができる。第２の識別配列を備えることで、捕捉プローブとのハイブリダイズ特異性を十分に確保できて確度の高い検出が可能となる。
【００５５】
第２の識別配列は、標的配列を含む一本鎖核酸（すなわち、増幅産物を構成する一方のＤＮＡ鎖）とは、特異的にハイブリダイズしない配列とする。こうすることで、図１に示すように、識別プローブが標的配列を有する一本鎖核酸と第１の識別配列を介してハイブリダイズしたとき、第２の識別配列は、一本鎖核酸とはハイブリダイズしない一本鎖領域の一部を構成することができる。第２の識別配列が一本鎖領域に含まれることで、捕捉プローブとのハイブリダイズを容易かつ確実となる。また、第２の識別配列は、例えば、人工的にクロスハイブリダイゼーションしないように設計された配列などとすることができる。
【００５６】
（ハイブリダイズ産物）
ハイブリダイズ産物は、増幅産物を構成する、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物は、図１に示すように、第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する部分二本鎖核酸となっている。また、ハイブリダイズ産物は、標的配列を含む一本鎖核酸の長さに対して十分に短い識別プローブがハイブリダイズするものであるため、一本鎖核酸が５’末端等において標識要素を備える場合においても、標識要素が標識物質結合物質であるときなど、標識物質を容易に結合させることができる。
【００５７】
（増幅工程におけるハイブリダイズ産物の取得）
識別プローブと標的配列とのハイブリダイズ産物は、例えば、増殖工程内の少なくとも（６）冷却ステップにおいて、標的核酸ないしはその増幅産物の標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブを併存させることにより、取得することができる。本発明者らによれば、増幅産物や残存プライマー等が存在している中でさえも、冷却ステップにおいて識別プローブを併存させることにより、識別プローブと標的配列との特異的ハイブリダイズに基づくハイブリダイズ産物を取得することができる。増幅工程内においてハイブリダイズ産物を取得することで、追加の工程を実施することがなく、効率的である。
【００５８】
かかる増幅工程においては、（５）熱変性ステップは、標的配列を含む標的核酸を含む可能性のある増幅産物を含む液体（核酸増幅反応液）を、増幅産物を融解可能に加熱する。具体的には、既に説明した温度に加熱することができる。また、（６）冷却ステップは、前記液体を、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物が得られるように冷却する。具体的には、既に説明した温度及び時間で冷却することができる。
【００５９】
さらに、識別プローブは、（６）冷却ステップの前段階の（５）熱変性ステップ又は段階の（２）〜（４）の増幅サイクルステップの段階においてプライマー等と併存されてもよいし、さらに（１）サイクル前の加熱変性ステップからプライマー等と併存されていてもよい。上記した識別プローブとしての１又は２以上の適性を備えている場合には、冷却ステップのみならず増幅ステップにおいても識別プローブを併存させうるからである。特に、増幅工程の当初から、すなわち、サイクル前の熱変性ステップから識別プローブを併存させることで、増幅工程に供したチューブを一切開封することなく一挙にハイブリダイズ産物を取得できることは好ましい。
【００６０】
識別プローブの特異性に基づけば、ハイブリダイズ産物としては、例えば、標的配列（標的核酸）が２種類あって、一方が、Ｔ／Ａの一塩基置換（ＳＮＰ）のＴ型（野生型）配列であり、他方がＡ型（変異型）配列であるとき、Ｔ／Ａが１：１のヘテロであっても、同２：０又は０：２のホモであっても、ＳＮＰにおいて可能性ある組合せに応じて特異的なハイブリダイズ産物を取得できる。
【００６１】
（増幅工程後におけるハイブリダイズ産物の取得）
また、ハイブリダイズ産物は、増幅工程後に取得することもできる。例えば、増幅工程における（１）〜（４）のステップ終了後、検出工程に先立って、識別プローブの併存下で（５）熱変成ステップと（６）冷却ステップを別途実施することでも、取得することができる。この場合、増幅工程の（４）伸長反応ステップ後には、プライマーの融解温度以下までの冷却工程を備えることができる。
【００６２】
なお、当業者は、用いる核酸増幅反応の種類等に応じて適宜異なる態様で増幅工程を実施できる。いわゆるＰＣＲ法の場合には、上記（４）伸長反応ステップ後に、最後の伸長反応を実施することができる。また、（４）伸長反応ステップ後又は最後の伸長工程後にプライマーセットの融解温度以下への冷却ステップを備えることもできる。
【００６３】
また、増幅工程における鋳型ＤＮＡ、プライマーの量（比率）のほか、識別プローブの量は、必要に応じて適宜設定することができる。なお、プライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを合成する種々の方法は当業者においては周知であり、同様に、オリゴヌクレオチドに対する標識要素の結合についても当業者において周知である。
【００６４】
（検出工程）
検出工程は、標的核酸を検出工程である。かかる検出工程は、取得したハイブリダイズ産物により前記標的核酸を検出する工程として実施することができる。ハイブリダイズ産物は、標的配列を識別し標的配列を含む一本鎖核酸を捕捉している。したがって、かかるハイブリダイズ産物を、ハイブリダイズ産物のまま検出することで標的核酸を検出することが好ましい。
【００６５】
ハイブリダイズ産物を検出するには、既に説明したように、識別プローブに付与した第２の識別配列を用いて当該第２の識別配列と特異的にハイブリダイズする捕捉プローブとを接触させてハイブリダイゼーションにより捕捉し検出することが好ましい。
【００６６】
典型的には、捕捉プローブを固定化した固相担体に対して、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの形態は特に限定しないで、第２の識別配列と特異的にハイブリダイズ可能な捕捉プローブを固定化した固相担体の捕捉プローブを含むキャビティにハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してハイブリダイゼーションを実施してもよい。また、捕捉プローブを固定化した固相担体に対してハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してクロマトグラフィーによりハイブリダイゼーションを実施してもよい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬するなどの極めて簡易な操作によって、ハイブリダイズ産物の分離・検出を行うことができる点において好ましい。また、その検出時間も、１５分から３０分以内など、極めて短時間で終了することができる点においても好ましい。なお、ハイブリダイゼーションに用いる固相担体等については後段で詳述する。
【００６８】
固相担体上に捕捉プローブによって捕捉されたハイブリダイズ産物を検出することにより、標的核酸を検出できる。ハイブリダイズ産物の検出方法は特に限定しないで、ハイブリダイズ産物に備える標識要素や、その他、ハイブリダイズ産物を物理化学的に検出可能な各種の検出方法を採用できる。
【００６９】
例えば、ハイブリダイズ産物が、標識要素を備えるとき、より具体的には、ハイブリダイズ産物が標識要素を備えるプライマー由来の伸長物を備えるときには、当該ハイブリダイズ産物を標識要素に基づいて検出することができる。既述の標識要素を用いた検出は、当該分野において周知である。
【００７０】
（ハイブリダイズ産物が標識物質を備える場合）
ハイブリダイズ産物が備える標識要素が、標識物質のときには、ハイブリダイズ産物を捕捉プローブで捕捉すれば、その標識物質のシグナルと捕捉プローブの有する固相担体上の位置情報に基づいて、ハイブリダイズ産物を検出し同定できる。
【００７１】
（ハイブリダイズ産物が標識物質結合物質を備える場合）
一方、ハイブリダイズ産物が備える標識要素が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類やオリゴヌクレオチドなどの標識物質結合物質のときには、最終的に検出のために用いられる標識物質は、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに先立って、あるいはハイブリダイゼーションに伴って、あるいはハイブリダイゼーション後において、ハイブリダイズ産物に供給される。
【００７２】
例えば、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに先立って、標識物質が供給される場合とは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に、例えば、アビジン結合着色ビーズ又は当該ビーズを含むハイブリダイゼーション液（クロマトグラフィーの場合には展開液である。以下同様。）を供給して、ハイブリダイズ産物に標識物質を結合させた後に固相担体に供給して捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに供することができる。
【００７３】
また、ハイブリダイゼーションに伴って標識物質を供給する場合としては、例えば、クロマトグラフィー用の固相担体の一部であって、展開液の開始直後に通過する部位などに標識物質を保持させておき、当該部位を通過するハイブリダイズ産物に標識物質を結合させて、さらに展開して、捕捉プローブとハイブリダイゼーションさせる態様が挙げられる。
【００７４】
また、ハイブリダイゼーション後に標識物質を供給する場合としては、例えば、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液又は当該反応液とハイブリダイゼーション液とを、捕捉プローブが固定化された固相担体に供してハイブリダイゼーション（クロマトグラフィー）を実施し、その後、別個に、標識物質を含むハイブリダイゼーション液を固相担体に供給して、固相担体において捕捉プローブで捕捉されたハイブリダイズ産物に標識物質を結合させる態様が挙げられる。
【００７５】
こうした２段階のハイブリダイゼーション、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに有用である。すなわち、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する第１のクロマトグラフィー工程と、第１のクロマトグラフィー工程後の固相担体に、標識物質を含む標識液を供給してクロマトグラフィーを実施する第２のクロマトグラフィー工程とを実施することができる。こうすることで、簡易な手順で標的核酸を検出できる。
【００７６】
例えば、第１のクロマトグラフィー工程は、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションのための工程であるが、核酸増幅反応を終了したままのチューブなどの容器に固相担体を挿入して核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬して実施できる。また、標識物質を含むハイブリダイゼーション液（標識液）が充填された又は充填した別の容器に、第１のクロマトグラフィー工程実施後の固相担体を挿入して標識液にその一部を浸漬して第２のクロマトグラフィー工程を実施して、ハイブリダイズ産物に対して標識物質を結合させることができる。こうすることで、ＰＣＲなどの核酸増幅反応後に、簡易かつ速やかにハイブリダイゼーションと検出を行うことができる。
【００７７】
検出工程に伴うハイブリダイゼーションは、当業者に周知の条件から適宜選択して実施できる。例えば、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションの場合、例えば、５〜４０℃程度、好ましくは１５〜３５℃程度、特に室温程度とすることができる。核酸クロマトグラフィーに要する時間は、核酸クロマトグラフィー担体の形状と基材の種類、展開媒体の組成に応じて、適宜設定することができる。典型的には、２〜５０分程度とすることができる。
【００７８】
また、ハイブリダイゼーション液は、特に限定されないで、必要に応じて有機溶媒を含む水性媒体やとするほか、核酸増幅反応液をそのまま用いることもできる。ハイブリダイゼーション液は、例えば、pHを一定単位にするための成分を含むことができる。このような成分として、公知の酢酸と酢酸ナトリウムからなる酢酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムからなるリン酸緩衝液、クエン酸とクエン酸ナトリウムからなるクエン酸緩衝液、PBSなどの緩衝成分が挙げられる。
【００７９】
なお、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイズ液を固相担体に展開するに際して、キャピラリー現象により液体の展開が実現できる範囲内において、固相担体を略鉛直に保持しても、略水平状体に保持してもよい。
【００８０】
（標的核酸の検出方法）
以上のことから、本明細書は、以下の標的核酸の検出方法も提供する。すなわち、標的配列を含む標的核酸を含む可能性のある試料を含む液体を、前記標的核酸を融解可能に加熱する工程と、前記標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブの存在下で、前記加熱工程後に前記液体を冷却して、前記標的配列を含む一本鎖核酸と前記識別プローブとのハイブリダイズ産物を取得する工程と、前記ハイブリダイズ産物を検出することにより前記標的核酸を検出する工程と、を備える、標的核酸の検出方法も提供される。この方法によれば、既に、十分な量の標的核酸を含み得る試料を有するときには、簡易かつ確実に標的核酸を検出することができる。この検出方法において、標的核酸、識別プローブ、ハイブリダイズ産物の取得、ハイブリダイズ産物の検出については、既に説明した各種態様を適用することができる。
【００８１】
なお、識別プローブは、冷却工程に存在する必要があるが、加熱工程において既に存在させてもよい。
【００８２】
以上説明したように、本検出方法によれば、標的核酸を簡易にかつ精度よく検出できる。特に、一塩基多型について、検出工程においてクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションを採用することで、従来に比してきわめて簡易かつ迅速に検出することができる。
【００８３】
（キット）
本明細書は、本検出方法によって標的核酸を検出するためのキット（以下、本キットという。）を提供することができる。本キットは、標的核酸中の標的配列を識別可能な１又は２以上の識別プローブを含むことができる。識別プローブは、上記した各種態様を採ることができる。識別プローブは、既述の第１の識別配列のほか、第２の識別配列を備えていることが好ましい。本キットは、識別すべき標的配列（標的核酸）の種類に応じて識別プローブを備えることができる。例えば、ＳＮＰを検出するための本キットは、ＳＮＰの野生型のほか１又は２以上の変異型に対応する識別プローブを含むことができる。
【００８４】
本キットは、核酸増幅反応の増幅産物又はその増幅工程に用いるものであるため、標的核酸を増幅できるプライマーセットをさらに含むことができる。プライマーセットについても、既に説明した各種態様を適宜採ることができる。プライマーセットの一方のプライマーには、標識要素を備えていることが好ましい。本キットは、増幅すべき標的核酸の種類に応じたプライマーセットを含むことができる。例えば、ＳＮＰを検出するための本キットは、当該ＳＮＰ（標的配列）を含むＤＮＡ二本鎖を増幅できるように１セットのプライマーセットを含むことができる。
【００８５】
本キットは、また、１又は２以上の識別プローブの第２の識別配列と特異的にハイブリダイズ可能な１又は２以上の捕捉プローブを備えることができる。捕捉プローブは、適当な固相担体に固定されていてもよい。固相担体に捕捉プローブを固定化しておくことで、複数の捕捉プローブが固定化された固相担体（例えば、平板状等）における個々の捕捉プローブの位置情報や、個々の捕捉プローブが固定化された固相担体（例えば、ビーズ等）に付与された識別情報（色や大きさ）によって、複数の標的核酸の検出が容易になるからである。
【００８６】
捕捉プローブが固定化された固相担体（ハイブリダイゼーションデバイス）について説明する。固相担体としては、担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。
【００８７】
なお、担体の形状は平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相担体は、好ましくは、担体が固相平板状であり、複数の捕捉プローブが一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個のプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸を検出するのに都合がよい。また、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションを意図した形態では、捕捉プローブが展開方向に沿って固定されるなどされる。かかるハイブリダイゼーションデバイスでは捕捉プローブの固定化位置により、結果物とプローブとの接触順序を制御できる。
【００８８】
捕捉プローブは、特に限定されないで、当業者に公知の方法で固相担体に固定することができる。例えば、捕捉プローブと固相担体とを、必要に応じてリンカーを介在させて、共有結合により固定化する手段；捕捉プローブと固相担体との間の静電的相互作用により固定化する手段などが例示される。捕捉プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化させ、さらに紫外線などで共有結合を生じさせる手段であってもよい。
【００８９】
クロマトグラフィー用のハイブリダイゼーションデバイスは、単一の固相担体で構成されている必要は必ずしもない。全体としてキャピラリー現象により展開媒体を移動可能であれば、複数の固相担体で連結されていてもよい。また、クロマトグラフィー用プローブ固定化体の全体形態は特に問わない。シート状や細い棒状など、キャピラリー現象によるクロマトグラフィー用液の展開拡散が可能な形態であればよい。好ましくは、長尺状体であって、その長手方向に沿う一つの端部がクロマトグラフィーの展開媒体に接触するようになっている。
【００９０】
クロマトグラフィー用のハイブリダイゼーションデバイスは、ハイブリダイゼーション液への浸漬により展開を開始する場合、チューブ中のハイブリダイゼーション液との接触を容易にするために、展開開始部分（浸漬部分）を先細り状の形態とすることもできる。展開開始部分であることを示す位置マーカーがデバイスに付されていてもよい。
【００９１】
本キットは、必要に応じて他の要素を含めることができる。他の要素は、例えば標的核酸を増幅するための試薬、鋳型核酸のポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられる。
【実施例１】
【００９２】
本実施例では、鋳型（試料）として、ｐＵＣにコードされたアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）の多型（野生型Ｔ／変異型Ｃ）に関して、ホモ（ＴＴ、ＣＣ）、ヘテロ（ＴＣ）のＤＮＡ断片（２００ｂｐ）を準備し、以下に示すプライマーで各ＤＮＡを増幅し、以下に示す野生型及び変異型をそれぞれ識別する識別プローブを用いて、ハイブリダイズ産物を取得し、クロマトグラフィーにて分離し検出した。
【００９３】
プライマーＦ：cgaaa aacgt tttcc aatga tgag (24mer) Tm:54.6℃
プライマーＲ：Bio-tggtt atggc agcac tgcat （20mer）Tm:57.5℃
【００９４】
野生型プローブ：tag1-tacac tattc tcag Tm:34.6℃
変異型プローブ：tag2-tacac tactc tcag Tm:37.5℃
【００９５】
なお、プローブの長さについては、予め、プライマーを用いた核酸増幅反応でプライマー／プローブ産物の形成、ターゲットへのアニール、ＳＮＰの検出特異性の検討結果に基づいて、１４ｍｅｒと決定した。
【００９６】
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、図１に示すように、野生型識別プローブを捕捉する野生型捕捉プローブと、変異型識別プローブを捕捉する変異型捕捉プローブとにライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの3’末端側にpolyT(20))を付加した配列をプローブとして使用し、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
【００９７】
（２）ターゲット遺伝子の増幅
各種のｐＵＣ断片を鋳型（試料）として用いた。なお、以下に示す増幅反応液には、野生型と変異型の鋳型ＤＮＡが全体で１ｐｇ含まれるように、野生型ＤＮＡ：変異型ＤＮＡを、1:0、0.75:0.25、0.5:０5、0.25:０.75、0:1）の各比率で含まれるようにした。
【００９８】
また、Ｒプライマーの５’末端にビオチンを結合した。野生型及び変異型識別プローブの５’末端側には、（１）で作製したクロマトグラフィー用ストリップの対応する捕捉プローブに相補的な塩基配列からなるタグ（tag1,2：DNA）を付加した。
【００９９】
遺伝子増幅酵素はタカラバイオ社のPremix ExTaqを用い、サーマルサイクラーはサーモジェン社のQuick Bathを用いた。
【０１００】
増幅反応液は、以下に示す通りとした。
（増幅反応液）
滅菌水                                  1.0 μL
SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)      5.0 μL
プライマー混合液（各2.5μM）            1.0 μL
識別プローブ溶液（各100nM）             2.0 μL
ゲノムDNA（1 pg/μL）or DNAフリー水     1.0 μL
計                                      10.0 μL 
【０１０１】
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（９７℃で２分加熱後、９７℃で５秒、６０℃で５秒、及び７２℃で５秒）を３０回繰り返し、９７℃で１分後、１５℃に約１分で冷却した。これにより、増幅反応液内には、それぞれの鋳型ＤＮＡと識別プローブとのハイブリダイズ産物が生成していると考えられた。
【０１０２】
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
図２に示すように、この増幅反応液にストリップの下端を浸漬して展開した（第１のクロマトグラフィー）。次いで、1.5mLチューブ内に充填した以下の展開液に増幅反応液で展開済みのテストストリップの下端を接触させて、再度展開した（第２のクロマトグラフィー）（図２参照）。
（展開液）
展開液         5.0 μL
純水           5.0 μL
ラテックス液   1.0 μL
計             11.0 μL 
【０１０３】
展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図３に示す。
【０１０４】
図３に示すように、野生型と変異型の比率に応じた色の濃さのラインを検出することができた。したがって、追加の加熱変性及び冷却のサブステップを含む増幅工程により、それぞれのＰＣＲチューブ内には、それぞれの型のＤＮＡの比率に応じ、各増幅断片と対応する識別プローブとのハイブリダイズ産物が形成されたと考えられた。
【０１０５】
したがって、本検出方法によれば、試料中に含まれる標的配列ないし標的核酸を高い特異性でしかも簡易かつ定量的に検出できることがわかった。
【実施例２】
【０１０６】
本実施例では、鋳型（試料）にｐＵＣ18を用いて、以下に示すプライマーで非対称PCRによりアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）配列を増幅し、以下に示す野生型及び変異型をそれぞれ識別する識別プローブを用いて、ハイブリダイズ産物を取得し、クロマトグラフィーにて分離し検出した。
【０１０７】
プライマーＦ：cgaaa aacgt tttcc aatga tgag (24mer) Tm:54.6℃
プライマーＲ：Bio-tggtt atggc agcac tgcat （20mer）Tm:57.5℃
【０１０８】
野生型プローブ：tag1-tacac tattc tcag Tm:34.6℃
変異型プローブ：tag2-tacac tactc tcag Tm:37.5℃
【０１０９】
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、図１に示すように、野生型識別プローブを捕捉する野生型捕捉プローブと、変異型識別プローブを捕捉する変異型捕捉プローブとにライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの3’末端側にpolyT(20))を付加した配列をプローブとして使用し、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
【０１１０】
また、Ｒプライマーの５’末端にビオチンを結合した。野生型及び変異型識別プローブの５’末端側には、（１）で作製したクロマトグラフィー用ストリップの対応する捕捉プローブに相補的な塩基配列からなるタグ（tag1,2：DNA）を付加した。
【０１１１】
遺伝子増幅酵素はタカラバイオ社のSYBR Premix ExTaq（Tli RNaseH Plus）を用い、サーマルサイクラーはサーモジェン社のQuick Bathを用いた。
【０１１２】
増幅反応液は、以下に示す通りとした。
（増幅反応液）
滅菌水                                           1.0 μL
SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)               5.0 μL
Rプライマー（2.5μM）                            1.0 μL
Fプライマー（2.5、1.25、0.6、0.25、0.1、0.05μM）1.0 μL
識別プローブ溶液（各1μM）                       1.0 μL
pUC18DNA（1 pg/μL）                             1.0 μL
計                                               10.0 μL 
【０１１３】
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（９７℃で２分加熱後、９７℃で5秒、６０℃で５秒、及び７２℃で５秒）を４０回繰り返し、９７℃で１分後、１５℃に約１分で冷却した。これにより、増幅反応液内には、それぞれの鋳型ＤＮＡと識別プローブとのハイブリダイズ産物が生成していると考えられた。
【０１１４】
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
1.5mLチューブ内に充填した以下の展開液にテストストリップの下端を接触させて、展開した（図５参照）。
（展開液）
PCR産物       10.0 μL
展開液        10.0 μL
ラテックス液  1.0 μL
計            21.0 μL 
【０１１５】
展開液はストリップ上部まで約15分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図５に示す。
【０１１６】
図に示すように、プライマーF濃度の減少に従って野生型検出ラインが強くなることを確認することができた。したがって、プライマーF濃度の減少に伴って1本差の増幅断片の蓄積量が増加し、増幅断片と識別プローブとのハイブリダイズ産物の形成が促進されたと考えられた。
【０１１７】
したがって、本検出方法と非対称PCRを併用することで、試料中に含まれる標的配列ないし標的核酸を高い感度でしかも簡易に検出できることがわかった。
【図１】
2017131166.tif 000003
【図２】
2017131166.tif 000004
【図３】
2017131166.tif 000005
【図４】
2017131166.tif 000006
【図５】
2017131166.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月29日(2016.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示する技術は、試料中に存在する標的核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中などに存在する特定の核酸（以下、標的核酸ともいう。）を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。
【０００３】
近年注目されている操作性に優れ、迅速、簡便な標的核酸の検出方法として、クロマトグラフィーに基づいた遺伝子検出方法がある（特許文献１〜３）。これらの方法は、核酸増幅法により、標識化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸を含むＤＮＡを増幅すると共に標識を導入し、この増幅産物からなる試料をクロマトグラフ用のテストストリップにアプライし、毛細管現象を利用してテストストリップ中を展開させ、当該テストストリップに予め固定化したプローブで増幅産物を捕捉して標識に基づくシグナルの有無で標的核酸を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１５４０７５号公報
【特許文献２】特開２００３−１９４８１７号公報
【特許文献３】特許第３００１９０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、この方法ではプライマーの塩基配列に基づき識別能によってのみ標的核酸を検出するものであるため、増幅産物中に存在する、例えば、一塩基多型を含む遺伝子型や変異を検出するなどの精密な配列の検出はできない。また、標識プライマーの利用は、検出には便宜であるが、プライマー同士でアニールして増幅したいわゆるプライマーダイマーも検出する危険が伴う。
【０００６】
本明細書は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、従来の標的核酸の検出方法に比べて、汎用性が高く操作が簡便である標的核酸の検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、増幅産物中に含まれる標的核酸と当該標的核酸中の標的配列を識別するタグ付きプローブとのハイブリダイズ産物を調製し、当該ハイブリダイズ産物を、前記タグとハイブリダイズ可能な捕捉プローブで検出する方法を見出した。そして、この方法によれば、従来、プライマーの識別能のみでは検出不可能であったＳＮＰなどの微小な標的配列もＰＣＲ等の核酸増幅反応を経由して簡易にかつ高い特異性で検出することができる。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【０００８】
（１）  標的配列を含む標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸を含む可能性のある試料に対して、核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、
前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
前記検出工程は、前記標的配列を識別する識別プローブと前記標的配列を含む一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を前記標的配列に関連付けられる捕捉プローブを用いて検出する工程であり、
前記識別プローブは、前記標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列と、を有し、
前記ハイブリダイズ産物は、前記第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する、方法。
（２）  前記増幅工程は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行う、（１）に記載の方法。
（３）  前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、（２）に記載の方法。
（４）  前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下で実施する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  前記増幅工程は、前記標的配列を含む前記一本鎖核酸を他方の一本鎖核酸よりも多く増幅する、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  前記検出工程は、前記ハイブリダイズ産物を、前記捕捉プローブを備える固相担体を用いてクロマトグラフィーによって分離することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  前記増幅工程は、前記識別プローブの存在下、前記標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを用いて行い、
前記識別プローブは、前記標的核酸に関連付けられた前記クロマトグラフィー用の固相担体上の捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  前記標的配列は、１又は２以上の一塩基多型を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  前記第１の識別配列は、少なくとも１つの前記一塩基多型を識別する塩基を前記識別配列のほぼ中央に備える、（８）に記載の方法。
（１０）  前記増幅工程は、増幅サイクルを前記識別プローブの存在下で実施し、前記ハイブリダイズ産物を取得する、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  前記ハイブリダイズ産物を、前記増幅産物を加熱変性し、前記識別プローブの存在下で冷却することにより取得する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで５分以内に冷却する、（１１）に記載の方法。
（１３）  前記識別プローブ及び前記一本鎖核酸のいずれの融解温度よりも低い温度まで３分以内に冷却する、（１２）に記載の方法。
（１４）  前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡおよびＲＰＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  標的核酸を検出するためのキットであって、
標的核酸を増幅するための核酸増幅反応のための試薬と、
前記標的配列を含む一本鎖核酸と前記標的配列を識別可能な識別プローブと、
前記識別プローブを捕捉可能な捕捉プローブを備えるクロマトグラフィー用の固相担体と、
を備え、
前記識別プローブは、前記標的配列と特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、前記固相担体上の前記捕捉プローブと特異的にハイブリダイズする第２の識別配列と、を有する、キット。
（１６）  前記試薬は、標識要素を備える少なくとも１種のプライマーを含むプライマーセットを含む、（１５）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の概要を示す図である。
【図２】実施例１で用いるクロマトグラフィーデバイスを示す図である。
【図３】実施例１で用いる２段階クロマトグラフィーを示す図である。
【図４】実施例１のクロマトグラフィーデバイスによる検出結果を示す図である。
【図５】実施例２のクロマトグラフィーデバイスによる検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、標的核酸の検出方法及びそのためのキット等に関する。本明細書に開示の標的核酸の検出方法（以下、単に本検出方法ともいう。）の概要を図１に例示する。
【００１１】
図１に示すように、本検出方法は、標的核酸を増幅工程において増幅して増幅産物を得る。識別プローブは、この増幅産物中の標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列と、標的核酸に関連付けられる捕捉プローブに特異的にハイブリダイズし、前記一本鎖核酸にハイブリダイズしない第２の識別配列とを有している。
【００１２】
増幅産物と識別プローブとを接触させ、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物を取得する。このハイブリダイズ産物は、第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する部分二本鎖となっている。
【００１３】
本検出方法におけるハイブリダイズ産物、すなわち、第１の識別配列と標的配列とのハイブリダイズを達成させて得られるハイブリダイズ産物は、そのまま、確実に捕捉プローブによって捕捉させるための捕捉要素である第２の識別配列を有することができる。このため、本検出方法によれば、核酸増幅反応の増幅産物を用いて高い検出感度及び精度を発揮できる。さらに、本検出方法によれば、確実にかつ容易に標的核酸を検出できる。
【００１４】
また、標的配列を含む一本鎖核酸が標識要素を備える場合には、得られるハイブリダイズ産物は、そのまま捕捉要素と標識要素とを備えることになるため、一層容易に標的核酸を検出できる。
【００１５】
本検出方法によれば、一塩基多型などの一塩基の相違を含む標的配列も、識別プローブにより識別可能であり、ハイブリダイズ産物として取得することができ、その後の検出工程に供することができる。
【００１６】
ハイブリダイズ産物は、例えば、核酸増幅反応による増幅産物を加熱して一旦融解し、識別プローブの存在下で冷却することで、識別プローブと増幅産物中の標的核酸とをハイブリダイズさせることで得ることができる。
【００１７】
増幅工程におけるいわゆる核酸増幅反応の熱変性−アニール−伸長反応のサイクル後に、熱変性させ、さらに冷却するサブステップにおいて、本発明者らは、意外にも、標的核酸の増幅産物のうち一本鎖核酸と識別プローブとが十分に特異的にハイブリダイズし得て、後段の検出工程で検出可能な程度にハイブリダイズ産物が得られることを見出した。本発明者らによれば、このようなハイブリダイズ産物を得るためには、例えば、核酸増幅反応に用いるプライマーとその相補鎖との融解温度よりも、識別プローブとその相補鎖との融解温度を低く設定することができる。
【００１８】
こうして得られる、標的核酸と識別プローブとの特異的ハイブリダイズ産物は、例えば、固相担体に固定された捕捉プローブ等で捕捉されることで、固相担体上で検出されるようになる。こうしたハイブリダイズ産物は、捕捉プローブを固相担体を用いてクロマトグラフィーによって分離し捕捉するのに都合がよい。
【００１９】
識別プローブによる標的配列の識別能は十分に高いため、ＳＮＰなどの一塩基の相違でも、十分に識別し、また、ホモ又はヘテロなどの変異の割合等に応じて定量的に標的配列にハイブリダイズし、検出することができる。
【００２０】
本明細書において、「標的核酸」とは、検出しようとする標的配列を含む核酸を意味している。標的核酸の由来は、特に限定しないで、各種生物材料（個体またはその組織、器官等の個体の一部のほか、排せつ物、体液等）ほか、人工的な核酸を含む人工材料が挙げられる。
【００２１】
本検出方法には、標的核酸を含む可能性のある生物材料又は人工材料自体又は必要に応じてこうした各種材料から核酸以外の構成成分の一部又は全部が除去されて核酸抽出試料を、試料として供給することができる。
【００２２】
「標的配列」は、２以上の塩基で表され、１又は２以上の塩基からなる欠失、挿入及び置換又はその組合せからなる変異、多型、属、種若しくは株の配列上の特徴を含んでいる「標的配列」は、典型的には、一塩基多型などの各種多型、変異、微生物の同定のための配列を含むことができる。
【００２３】
以下、本明細書に開示される検出方法及びキット等について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。ここで図１は、本検出方法の一例の概要を示す図である。
【００２４】
（標的核酸の検出方法）
本検出方法は、標的核酸を増幅するための核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する増幅工程と、前記標的核酸を検出する工程と、を備えることができる。
【００２５】
（増幅工程）
増幅工程は、標的核酸を含む可能性のある試料に対して標的核酸を増幅可能に設計したプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施して増幅産物を取得する工程である。プライマーセットを、例えば、図１に示すように、標的配列を含む可能性のある標的核酸を増幅できるように設計することができる。本検出方法においては、標的配列の有無にかかわらず、標的配列を含む可能性のある領域を増幅産物として取得すれば足りる。
【００２６】
本検出方法においては、１又は２以上の標的核酸を対象とすることができる。本検出方法は、標的核酸の検出を核酸増幅反応に関与しない識別プローブで行うため、複数の標的核酸を検出対象としても高い正確性と精度を確保することができる。２以上の標的核酸を検出対象とするときには、各標的核酸の増幅及び検出のために、複数のプライマーセット、識別プローブ及び捕捉プローブを用いる。
【００２７】
プライマーセットを構成するプライマー対は、以下の特徴を備えることができる。まず、プライマーセットによって増幅産物として取得する標的核酸の塩基長は特に限定しないで８０〜３００ｂｐとすることができるが、例えば、１００塩基以上２５０塩基以下とすることができる。この範囲であると、増幅産物の一本鎖核酸である一本鎖ＤＮＡ鎖と識別プローブとのハイブリダイズ産物を得られやすいからである。特に限定するものではないが、より好ましくは１５０塩基以上２２０塩基以下である。
【００２８】
プライマーセットを構成する各プライマーの長さも特に限定しないで、１５〜５０ヌクレオチド等とすることができる。より典型的には２０〜３０ヌクレオチドであり、例えば、１７ヌクレオチドから２５ヌクレオチド程度することができる。
【００２９】
プライマーセットの各プライマーの融解温度（Ｔｍ、℃）も、特に限定しないが、例えば、４５℃以上６５℃以下とすることができる。後述する識別プローブとの融解温度差を考慮すると、好ましくは５０℃以上６０℃以下である。
【００３０】
プライマーセットの各プライマーのいずれか一方には、標識要素を備えることが好ましい。こうしたプライマーセットによる増幅産物は、標識要素を備えることとなる。こうすることで、ハイブリダイズ産物は、検出のための操作を簡略化でき、検出工程における検出に都合がよい。
【００３１】
ハイブリダイズ産物に標識要素を付与する観点からは、識別プローブとハイブリダイズすることとなる一本鎖核酸が標識要素を備えるようにプライマーを設計することが好ましい。すなわち、識別プローブがアンチセンス鎖にハイブリダイズする場合には、アンチセンス鎖が標識要素を備えるように構成し、識別プローブがセンス鎖とハイブリダイズするとき場合には、センス鎖が標識要素を備えるように構成する。
【００３２】
ここで標識要素とは、例えば、標識物質及び標識物質結合物質が挙げられる。本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
【００３３】
標識物質は、目視（肉眼）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質若しくは着色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、より好適である。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
【００３４】
この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００３５】
標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
【００３６】
好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００３７】
標識物質結合物質は、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用、核酸−核酸相互作用等を利用して、最終的に標識物質を結合できる物質が挙げられる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類及び互いにハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ、オリゴヌクレオチドなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように構成される。
【００３８】
こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
【００３９】
増幅工程は、標的核酸を含む可能性のある試料に対して、こうしたプライマーセットのほか、ＤＮＡポリメラーゼ、各種塩基を備えるヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）とともに核酸増幅反応を実施する。核酸増幅反応は、概して、以下の（１）〜（４）のステップを備えている。通常、（２）〜（４）を１５回〜１００回以下程度、典型的には、２０回〜５０回程度繰り返すことにより、増幅産物を取得できる。増幅工程は、例えば、さらに、後述するハイブリダイズ産物を得るための（５）熱変性ステップ及び（６）の冷却ステップを備えていてもよい。
【００４０】
（１）サイクル前の熱変性ステップ
（２）熱変性ステップ
（３）アニーリングステップ
（４）伸長反応ステップ
（５）熱変性ステップ
（６）冷却ステップ
【００４１】
上記（１）〜（４）の各ステップは、それぞれ、一般的な条件が周知であり、当業者であれば、適宜公知の条件に基づいて設定することができる。例えば、（１）サイクル前の冷却ステップは、例えば、９０℃以上９９℃以下程度であり、（２）熱変性ステップも９０℃以上９９℃以下であり、（３）アニーリングステップは、例えば、プライマーの溶解温度に対して±６℃程度とすることができる。また、（４）伸長反応ステップは、用いるＤＮＡポリメラーゼの温度特性にもよるが、概して７２℃とすることができる。
【００４２】
例えば、（５）熱変性ステップは、他の熱変性ステップと同様９０℃以上９９℃以下程度で実施することができる。また、熱変性ステップは、こうした温度で好ましくは１０秒以上、より好ましく２０秒以上６０秒以下程度維持することが好ましい。さらに、例えば、（６）冷却ステップは、識別プローブの融解温度以下に冷却するステップである。冷却ステップの到達温度（冷却温度）としては、例えば、２５℃以下であり、好ましくは２０℃以下であり、より好ましくは１８℃以下であり、さらに好ましくは１５℃以下である。また、冷却温度に到達するまでの時間（冷却時間）としては、例えば、１５分以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは７分以下、さらに好ましくは５分以下、なお好ましくは３分以下、一層好ましくは１分以下程度で冷却するステップである。冷却時間が短いほど、検出に要する時間を短縮化することができる。なお、熱変性時間及び冷却時間がともに極めて短時間でよいため、検査時間の短縮化に有効である。
【００４３】
増幅工程における核酸増幅反応は、ＰＣＲのほか、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡおよびＲＰＡなどから適宜選択して用いることができる。
【００４４】
核酸増幅反応は、また、増幅産物のうち、標的配列を含む一本鎖核酸を他方の一本鎖核酸よりも多く増幅するように実施することが好ましい。いわゆる非対称ＰＣＲなどの非対称核酸増幅反応とすることが好ましい。こうすることで、ハイブリダイズ産物をより効率的及び高濃度で得ることができるようになる。こうした非対称核酸増幅反応は、より多く増幅しようとする一本鎖核酸を増幅するためのプライマーを他方のプライマーよりも多く存在するようにする。例えば、非対称ＰＣＲの場合、標的配列を含む一本鎖核酸用プライマー（Ａ）と他方の一本鎖核酸用プライマ−（Ｂ）との濃度比を、Ａ：Ｂ＝２：１〜５０：１とすることができる。
【００４５】
（標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物）
本検出方法では、標的核酸又はその増幅産物の標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブと、前記標的配列を含む一本鎖核酸とのハイブリダイズ産物を、検出工程において供する。本検出方法では、こうしたハイブリダイズ産物は、増幅工程内又は増幅工程後において取得することができる。以下、ハイブリダイズ産物及びその取得について説明する。
【００４６】
（識別プローブ）
識別プローブは、１又は２以上の標的核酸に対して、それぞれ設計して、１又は２以上を準備することができる。例えば、Ｔ／Ａの１塩基多型のとき、標的配列としては、Ｔ型（例えば、野生型）とＡ型（変異型）の２種類があり、標的核酸も２種類となる。この場合、識別プローブは、標的配列、すなわち、標的核酸に応じて、野生型標的配列向け及び変異型標的配列向けに、合計２種類準備される。このほか、識別プローブは、異なる変異や多型に対応して複数種類を一つの検出方法に供されてもよい。
【００４７】
ここで、識別プローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズする第１の識別配列を有することができる。識別プローブが第１の識別配列を有することで、標的配列を有する一本鎖核酸とハイブリダイズすることができる。
【００４８】
例えば、標的配列が一塩基多型の場合、１又は２以上の一塩基多型のうち少なくとも１つの一塩基多型を検出するための塩基は、第１の識別配列の塩基長の範囲のいずれの位置にあってもよい。任意の位置に設定しても、精度よく標的配列を検出することができる。すなわち、識別のための塩基は、中央側に存在するようにしてもよいし、３’末端又は５’末端にあってもよいし、末端よりも内側にあってもよい。
【００４９】
識別プローブにおける第１の識別配列の長さは特に限定しないが、プライマーセットによる標的核酸の増幅を確保できるように設計される。すなわち、（３）アニーリングステップではプライマーのみが標的核酸にアニールするが、このとき、識別プローブが標的核酸やプライマーにアニールしないことが好ましい。より具体的には、第１の識別配列の長さが長すぎる場合には、（３）アニーリングステップで標的核酸等にアニールする傾向が生じる。
【００５０】
また、第１の識別配列の長さは、特異的に標的配列とハイブリダイズするのに好適な長さであることが好ましい。すなわち、（６）冷却ステップで、非特異的に標的配列以外にハイブリダイズしないことが好ましい。より具体的には、第１の識別配列が長すぎると非特異的なハイブリダイズが生じ、第１の識別配列が短すぎるとハイブリダイズ自体が抑制される。
【００５１】
第１の識別配列の好適な長さは、標的配列の種類や、（３）アニーリングステップ及び（６）冷却ステップの条件に応じて適宜設定することができる。典型的には、１０〜２５ヌクレオチドとすることができる。例えば、一例であって限定されるものではないが、第１の識別配列は、１３塩基以上１５塩基以下程度としてもよい。
【００５２】
識別プローブは、その第１の識別配列と標的配列との融解温度が、標的核酸を増幅するためのプライマーセットの各プライマーの融解温度よりも低いことが好ましい。プライマーセットに比較して識別プローブの融解温度を十分低く設計することで、（５）熱変性ステップ後の（６）冷却ステップにおいて、標的配列と識別プローブとのハイブリダイズ産物とを取得することができる。どの程度、プライマーセットの融解温度から低ければよいかは、増幅反応に用いる熱変性温度、アニーリング温度等にもよるが、識別プローブの融解温度は、好ましくはプライマーセットの各プライマーの融解温度の平均温度よりも、１０℃以上低いことが好ましく、より好ましくは１５℃以上であり、さらに好ましくは１６℃以上であり、なお好ましくは１７℃以上であり、一層好ましくは１８℃以上低いことが好ましい。また、プライマーセットの平均融解温度から２０℃程度低くてもよい。
【００５３】
また、識別プローブは、その３’末端が、伸張反応が起こらないように公知のブロック剤によりブロックされていてもよい。例えば、３’末端をヒドロキシル基で修飾してもよい。例えば、米国特許第5,516,663号は、プローブを伸長不能にするために用いることができる修飾を記載している。
【００５４】
なお、識別プローブは、第１の識別配列に加えて、標的配列に関連付けられる捕捉プローブと特異的にハイブリダイズ可能な第２の識別配列を備えることができる。第２の識別配列を備えることで、捕捉プローブとのハイブリダイズ特異性を十分に確保できて確度の高い検出が可能となる。
【００５５】
第２の識別配列は、標的配列を含む一本鎖核酸（すなわち、増幅産物を構成する一方のＤＮＡ鎖）とは、特異的にハイブリダイズしない配列とする。こうすることで、図１に示すように、識別プローブが標的配列を有する一本鎖核酸と第１の識別配列を介してハイブリダイズしたとき、第２の識別配列は、一本鎖核酸とはハイブリダイズしない一本鎖領域の一部を構成することができる。第２の識別配列が一本鎖領域に含まれることで、捕捉プローブとのハイブリダイズを容易かつ確実となる。また、第２の識別配列は、例えば、人工的にクロスハイブリダイゼーションしないように設計された配列などとすることができる。
【００５６】
（ハイブリダイズ産物）
ハイブリダイズ産物は、増幅産物を構成する、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物は、図１に示すように、第２の識別配列を含む一本鎖領域を有する部分二本鎖核酸となっている。また、ハイブリダイズ産物は、標的配列を含む一本鎖核酸の長さに対して十分に短い識別プローブがハイブリダイズするものであるため、一本鎖核酸が５’末端等において標識要素を備える場合においても、標識要素が標識物質結合物質であるときなど、標識物質を容易に結合させることができる。
【００５７】
（増幅工程におけるハイブリダイズ産物の取得）
識別プローブと標的配列とのハイブリダイズ産物は、例えば、増殖工程内の少なくとも（６）冷却ステップにおいて、標的核酸ないしはその増幅産物の標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブを併存させることにより、取得することができる。本発明者らによれば、増幅産物や残存プライマー等が存在している中でさえも、冷却ステップにおいて識別プローブを併存させることにより、識別プローブと標的配列との特異的ハイブリダイズに基づくハイブリダイズ産物を取得することができる。増幅工程内においてハイブリダイズ産物を取得することで、追加の工程を実施することがなく、効率的である。
【００５８】
かかる増幅工程においては、（５）熱変性ステップは、標的配列を含む標的核酸を含む可能性のある増幅産物を含む液体（核酸増幅反応液）を、増幅産物を融解可能に加熱する。具体的には、既に説明した温度に加熱することができる。また、（６）冷却ステップは、前記液体を、標的配列を含む一本鎖核酸と識別プローブとのハイブリダイズ産物が得られるように冷却する。具体的には、既に説明した温度及び時間で冷却することができる。
【００５９】
さらに、識別プローブは、（６）冷却ステップの前段階の（５）熱変性ステップ又は段階の（２）〜（４）の増幅サイクルステップの段階においてプライマー等と併存されてもよいし、さらに（１）サイクル前の加熱変性ステップからプライマー等と併存されていてもよい。上記した識別プローブとしての１又は２以上の適性を備えている場合には、冷却ステップのみならず増幅ステップにおいても識別プローブを併存させうるからである。特に、増幅工程の当初から、すなわち、サイクル前の熱変性ステップから識別プローブを併存させることで、増幅工程に供したチューブを一切開封することなく一挙にハイブリダイズ産物を取得できることは好ましい。
【００６０】
識別プローブの特異性に基づけば、ハイブリダイズ産物としては、例えば、標的配列（標的核酸）が２種類あって、一方が、Ｔ／Ａの一塩基置換（ＳＮＰ）のＴ型（野生型）配列であり、他方がＡ型（変異型）配列であるとき、Ｔ／Ａが１：１のヘテロであっても、同２：０又は０：２のホモであっても、ＳＮＰにおいて可能性ある組合せに応じて特異的なハイブリダイズ産物を取得できる。
【００６１】
（増幅工程後におけるハイブリダイズ産物の取得）
また、ハイブリダイズ産物は、増幅工程後に取得することもできる。例えば、増幅工程における（１）〜（４）のステップ終了後、検出工程に先立って、識別プローブの併存下で（５）熱変成ステップと（６）冷却ステップを別途実施することでも、取得することができる。この場合、増幅工程の（４）伸長反応ステップ後には、プライマーの融解温度以下までの冷却工程を備えることができる。
【００６２】
なお、当業者は、用いる核酸増幅反応の種類等に応じて適宜異なる態様で増幅工程を実施できる。いわゆるＰＣＲ法の場合には、上記（４）伸長反応ステップ後に、最後の伸長反応を実施することができる。また、（４）伸長反応ステップ後又は最後の伸長工程後にプライマーセットの融解温度以下への冷却ステップを備えることもできる。
【００６３】
また、増幅工程における鋳型ＤＮＡ、プライマーの量（比率）のほか、識別プローブの量は、必要に応じて適宜設定することができる。なお、プライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを合成する種々の方法は当業者においては周知であり、同様に、オリゴヌクレオチドに対する標識要素の結合についても当業者において周知である。
【００６４】
（検出工程）
検出工程は、標的核酸を検出工程である。かかる検出工程は、取得したハイブリダイズ産物により前記標的核酸を検出する工程として実施することができる。ハイブリダイズ産物は、標的配列を識別し標的配列を含む一本鎖核酸を捕捉している。したがって、かかるハイブリダイズ産物を、ハイブリダイズ産物のまま検出することで標的核酸を検出することが好ましい。
【００６５】
ハイブリダイズ産物を検出するには、既に説明したように、識別プローブに付与した第２の識別配列を用いて当該第２の識別配列と特異的にハイブリダイズする捕捉プローブとを接触させてハイブリダイゼーションにより捕捉し検出することが好ましい。
【００６６】
典型的には、捕捉プローブを固定化した固相担体に対して、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの形態は特に限定しないで、第２の識別配列と特異的にハイブリダイズ可能な捕捉プローブを固定化した固相担体の捕捉プローブを含むキャビティにハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してハイブリダイゼーションを実施してもよい。また、捕捉プローブを固定化した固相担体に対してハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を供給してクロマトグラフィーによりハイブリダイゼーションを実施してもよい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬するなどの極めて簡易な操作によって、ハイブリダイズ産物の分離・検出を行うことができる点において好ましい。また、その検出時間も、１５分から３０分以内など、極めて短時間で終了することができる点においても好ましい。なお、ハイブリダイゼーションに用いる固相担体等については後段で詳述する。
【００６８】
固相担体上に捕捉プローブによって捕捉されたハイブリダイズ産物を検出することにより、標的核酸を検出できる。ハイブリダイズ産物の検出方法は特に限定しないで、ハイブリダイズ産物に備える標識要素や、その他、ハイブリダイズ産物を物理化学的に検出可能な各種の検出方法を採用できる。
【００６９】
例えば、ハイブリダイズ産物が、標識要素を備えるとき、より具体的には、ハイブリダイズ産物が標識要素を備えるプライマー由来の伸長物を備えるときには、当該ハイブリダイズ産物を標識要素に基づいて検出することができる。既述の標識要素を用いた検出は、当該分野において周知である。
【００７０】
（ハイブリダイズ産物が標識物質を備える場合）
ハイブリダイズ産物が備える標識要素が、標識物質のときには、ハイブリダイズ産物を捕捉プローブで捕捉すれば、その標識物質のシグナルと捕捉プローブの有する固相担体上の位置情報に基づいて、ハイブリダイズ産物を検出し同定できる。
【００７１】
（ハイブリダイズ産物が標識物質結合物質を備える場合）
一方、ハイブリダイズ産物が備える標識要素が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類やオリゴヌクレオチドなどの標識物質結合物質のときには、最終的に検出のために用いられる標識物質は、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに先立って、あるいはハイブリダイゼーションに伴って、あるいはハイブリダイゼーション後において、ハイブリダイズ産物に供給される。
【００７２】
例えば、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに先立って、標識物質が供給される場合とは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に、例えば、アビジン結合着色ビーズ又は当該ビーズを含むハイブリダイゼーション液（クロマトグラフィーの場合には展開液である。以下同様。）を供給して、ハイブリダイズ産物に標識物質を結合させた後に固相担体に供給して捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに供することができる。
【００７３】
また、ハイブリダイゼーションに伴って標識物質を供給する場合としては、例えば、クロマトグラフィー用の固相担体の一部であって、展開液の開始直後に通過する部位などに標識物質を保持させておき、当該部位を通過するハイブリダイズ産物に標識物質を結合させて、さらに展開して、捕捉プローブとハイブリダイゼーションさせる態様が挙げられる。
【００７４】
また、ハイブリダイゼーション後に標識物質を供給する場合としては、例えば、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液又は当該反応液とハイブリダイゼーション液とを、捕捉プローブが固定化された固相担体に供してハイブリダイゼーション（クロマトグラフィー）を実施し、その後、別個に、標識物質を含むハイブリダイゼーション液を固相担体に供給して、固相担体において捕捉プローブで捕捉されたハイブリダイズ産物に標識物質を結合させる態様が挙げられる。
【００７５】
こうした２段階のハイブリダイゼーション、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに有用である。すなわち、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液を固相担体に供給してクロマトグラフィーを実施する第１のクロマトグラフィー工程と、第１のクロマトグラフィー工程後の固相担体に、標識物質を含む標識液を供給してクロマトグラフィーを実施する第２のクロマトグラフィー工程とを実施することができる。こうすることで、簡易な手順で標的核酸を検出できる。
【００７６】
例えば、第１のクロマトグラフィー工程は、ハイブリダイズ産物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションのための工程であるが、核酸増幅反応を終了したままのチューブなどの容器に固相担体を挿入して核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬して実施できる。また、標識物質を含むハイブリダイゼーション液（標識液）が充填された又は充填した別の容器に、第１のクロマトグラフィー工程実施後の固相担体を挿入して標識液にその一部を浸漬して第２のクロマトグラフィー工程を実施して、ハイブリダイズ産物に対して標識物質を結合させることができる。こうすることで、ＰＣＲなどの核酸増幅反応後に、簡易かつ速やかにハイブリダイゼーションと検出を行うことができる。
【００７７】
検出工程に伴うハイブリダイゼーションは、当業者に周知の条件から適宜選択して実施できる。例えば、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションの場合、例えば、５〜４０℃程度、好ましくは１５〜３５℃程度、特に室温程度とすることができる。核酸クロマトグラフィーに要する時間は、核酸クロマトグラフィー担体の形状と基材の種類、展開媒体の組成に応じて、適宜設定することができる。典型的には、２〜５０分程度とすることができる。
【００７８】
また、ハイブリダイゼーション液は、特に限定されないで、必要に応じて有機溶媒を含む水性媒体やとするほか、核酸増幅反応液をそのまま用いることもできる。ハイブリダイゼーション液は、例えば、pHを一定単位にするための成分を含むことができる。このような成分として、公知の酢酸と酢酸ナトリウムからなる酢酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムからなるリン酸緩衝液、クエン酸とクエン酸ナトリウムからなるクエン酸緩衝液、PBSなどの緩衝成分が挙げられる。
【００７９】
なお、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイズ液を固相担体に展開するに際して、キャピラリー現象により液体の展開が実現できる範囲内において、固相担体を略鉛直に保持しても、略水平状体に保持してもよい。
【００８０】
（標的核酸の検出方法）
以上のことから、本明細書は、以下の標的核酸の検出方法も提供する。すなわち、標的配列を含む標的核酸を含む可能性のある試料を含む液体を、前記標的核酸を融解可能に加熱する工程と、前記標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な識別プローブの存在下で、前記加熱工程後に前記液体を冷却して、前記標的配列を含む一本鎖核酸と前記識別プローブとのハイブリダイズ産物を取得する工程と、前記ハイブリダイズ産物を検出することにより前記標的核酸を検出する工程と、を備える、標的核酸の検出方法も提供される。この方法によれば、既に、十分な量の標的核酸を含み得る試料を有するときには、簡易かつ確実に標的核酸を検出することができる。この検出方法において、標的核酸、識別プローブ、ハイブリダイズ産物の取得、ハイブリダイズ産物の検出については、既に説明した各種態様を適用することができる。
【００８１】
なお、識別プローブは、冷却工程に存在する必要があるが、加熱工程において既に存在させてもよい。
【００８２】
以上説明したように、本検出方法によれば、標的核酸を簡易にかつ精度よく検出できる。特に、一塩基多型について、検出工程においてクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションを採用することで、従来に比してきわめて簡単かつ迅速に検出することができる。
【００８３】
（キット）
本明細書は、本検出方法によって標的核酸を検出するためのキット（以下、本キットという。）を提供することができる。本キットは、標的核酸中の標的配列を識別可能な１又は２以上の識別プローブを含むことができる。識別プローブは、上記した各種態様を採ることができる。識別プローブは、既述の第１の識別配列のほか、第２の識別配列を備えていることが好ましい。本キットは、識別すべき標的配列（標的核酸）の種類に応じて識別プローブを備えることができる。例えば、ＳＮＰを検出するための本キットは、ＳＮＰの野生型のほか１又は２以上の変異型に対応する識別プローブを含むことができる。
【００８４】
本キットは、核酸増幅反応の増幅産物又はその増幅工程に用いるものであるため、標的核酸を増幅できるプライマーセットをさらに含むことができる。プライマーセットについても、既に説明した各種態様を適宜採ることができる。プライマーセットの一方のプライマーには、標識要素を備えていることが好ましい。本キットは、増幅すべき標的核酸の種類に応じたプライマーセットを含むことができる。例えば、ＳＮＰを検出するための本キットは、当該ＳＮＰ（標的配列）を含むＤＮＡ二本鎖を増幅できるように１セットのプライマーセットを含むことができる。
【００８５】
本キットは、また、１又は２以上の識別プローブの第２の識別配列と特異的にハイブリダイズ可能な１又は２以上の捕捉プローブを備えることができる。捕捉プローブは、適当な固相担体に固定されていてもよい。固相担体に捕捉プローブを固定化しておくことで、複数の捕捉プローブが固定化された固相担体（例えば、平板状等）における個々の捕捉プローブの位置情報や、個々の捕捉プローブが固定化された固相担体（例えば、ビーズ等）に付与された識別情報（色や大きさ）によって、複数の標的核酸の検出が容易になるからである。
【００８６】
捕捉プローブが固定化された固相担体（ハイブリダイゼーションデバイス）について説明する。固相担体としては、担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。
【００８７】
なお、担体の形状は平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相担体は、好ましくは、担体が固相平板状であり、複数の捕捉プローブが一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個のプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸を検出するのに都合がよい。また、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションを意図した形態では、捕捉プローブが展開方向に沿って固定されるなどされる。かかるハイブリダイゼーションデバイスでは捕捉プローブの固定化位置により、結果物とプローブとの接触順序を制御できる。
【００８８】
捕捉プローブは、特に限定されないで、当業者に公知の方法で固相担体に固定することができる。例えば、捕捉プローブと固相担体とを、必要に応じてリンカーを介在させて、共有結合により固定化する手段；捕捉プローブと固相担体との間の静電的相互作用により固定化する手段などが例示される。捕捉プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化させ、さらに紫外線などで共有結合を生じさせる手段であってもよい。
【００８９】
クロマトグラフィー用のハイブリダイゼーションデバイスは、単一の固相担体で構成されている必要は必ずしもない。全体としてキャピラリー現象により展開媒体を移動可能であれば、複数の固相担体で連結されていてもよい。また、クロマトグラフィー用プローブ固定化体の全体形態は特に問わない。シート状や細い棒状など、キャピラリー現象によるクロマトグラフィー用液の展開拡散が可能な形態であればよい。好ましくは、長尺状体であって、その長手方向に沿う一つの端部がクロマトグラフィーの展開媒体に接触するようになっている。
【００９０】
クロマトグラフィー用のハイブリダイゼーションデバイスは、ハイブリダイゼーション液への浸漬により展開を開始する場合、チューブ中のハイブリダイゼーション液との接触を容易にするために、展開開始部分（浸漬部分）を先細り状の形態とすることもできる。展開開始部分であることを示す位置マーカーがデバイスに付されていてもよい。
【００９１】
本キットは、必要に応じて他の要素を含めることができる。他の要素は、例えば標的核酸を増幅するための試薬、鋳型核酸のポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられる。
【実施例１】
【００９２】
本実施例では、鋳型（試料）として、ｐＵＣにコードされたアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）の多型（野生型Ｔ／変異型Ｃ）に関して、ホモ（ＴＴ、ＣＣ）、ヘテロ（ＴＣ）のDNA断片（２００ｂｐ）を準備し、以下に示すプライマーで各ＤＮＡを増幅し、以下に示す野生型及び変異型をそれぞれ識別する識別プローブを用いて、ハイブリダイズ産物を取得し、クロマトグラフィーにて分離し検出した。
【００９３】
プライマーＦ：cgaaa aacgt tttcc aatga tgag (24mer) Tm:54.6℃（配列番号１）
プライマーＲ：Bio-tggtt atggc agcac tgcat （20mer）Tm:57.5℃（配列番号２）
【００９４】
野生型プローブ：tag1-tacac tattc tcag Tm:34.6℃（配列番号３）
変異型プローブ：tag2-tacac tactc tcag Tm:37.5℃（配列番号４）
【００９５】
なお、プローブの長さについては、予め、プライマーを用いた核酸増幅反応でプライマー／プローブ産物の形成、ターゲットへのアニール、ＳＮＰの検出特異性の検討結果に基づいて、１４ｍｅｒと決定した。
【００９６】
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、図１に示すように、野生型識別プローブを捕捉する野生型捕捉プローブと、変異型識別プローブを捕捉する変異型捕捉プローブとにライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの3’末端側にpolyT(20))を付加した配列をプローブとして使用し、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
【００９７】
（２）ターゲット遺伝子の増幅
各種のｐＵＣ断片を鋳型（試料）として用いた。なお、以下に示す増幅反応液には、野生型と変異型の鋳型ＤＮＡが全体で１ｐｇ含まれるように、野生型ＤＮＡ：変異型ＤＮＡを、1:0、0.75:0.25、0.5:0.5、0.25:0.75、0:1）の各比率で含まれるようにした。
【００９８】
また、Ｒプライマーの５’末端にビオチンを結合した。野生型及び変異型識別プローブの５’末端側には、（１）で作製したクロマトグラフィー用ストリップの対応する捕捉プローブに相補的な塩基配列からなるタグ（tag1,2：DNA）を付加した。
【００９９】
遺伝子増幅酵素はタカラバイオ社のPremix ExTaqを用い、サーマルサイクラーはサーモジェン社のQuick Bathを用いた。
【０１００】
増幅反応液は、以下に示す通りとした。
（増幅反応液）
滅菌水                                1.0 μL
SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)    5.0 μL
プライマー混合液（各2.5μM）          1.0 μL
識別プローブ溶液（各100nM）           2.0 μL
ゲノムDNA（1 pg/μL）or DNAフリー水   1.0 μL
計                                    10.0 μL 
【０１０１】
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（９７℃で２分加熱後、９７℃で５秒、６０℃で５秒、及び７２℃で５秒）を３０回繰り返し、９７℃で１分後、１５℃に約１分で冷却した。これにより、増幅反応液内には、それぞれの鋳型ＤＮＡと識別プローブとのハイブリダイズ産物が生成していると考えられた。
【０１０２】
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
図２に示すように、この増幅反応液にストリップの下端を浸漬して展開した（第１のクロマトグラフィー）。次いで、1.5mLチューブ内に充填した以下の展開液に増幅反応液で展開済みのテストストリップの下端を接触させて、再度展開した（第２のクロマトグラフィー）（図２参照）。
（展開液）
展開液       5.0 μL
純水         5.0 μL
ラテックス液 1.0 μL
計           11.0 μL 
【０１０３】
展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図３に示す。
【０１０４】
図３に示すように、野生型と変異型の比率に応じた色の濃さのラインを検出することができた。したがって、追加の加熱変性及び冷却のサブステップを含む増幅工程により、それぞれのＰＣＲチューブ内には、それぞれの型のＤＮＡの比率に応じ、各増幅断片と対応する識別プローブとのハイブリダイズ産物が形成されたと考えられた。
【０１０５】
したがって、本検出方法によれば、試料中に含まれる標的配列ないし標的核酸を高い特異性でしかも簡易かつ定量的に検出できることがわかった。
【実施例２】
【０１０６】
本実施例では、鋳型（試料）にｐＵＣ18を用いて、以下に示すプライマーで非対称PCRによりアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）配列を増幅し、以下に示す野生型及び変異型をそれぞれ識別する識別プローブを用いて、ハイブリダイズ産物を取得し、クロマトグラフィーにて分離し検出した。
【０１０７】
プライマーＦ：cgaaa aacgt tttcc aatga tgag (24mer) Tm:54.6℃（配列番号１）
プライマーＲ：Bio-tggtt atggc agcac tgcat （20mer）Tm:57.5℃（配列番号２）
【０１０８】
野生型プローブ：tag1-tacac tattc tcag Tm:34.6℃（配列番号３）
変異型プローブ：tag2-tacac tactc tcag Tm:37.5℃（配列番号４）
【０１０９】
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、図１に示すように、野生型識別プローブを捕捉する野生型捕捉プローブと、変異型識別プローブを捕捉する変異型捕捉プローブとにライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの3’末端側にpolyT(20))を付加した配列をプローブとして使用し、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
【０１１０】
また、Ｒプライマーの５’末端にビオチンを結合した。野生型及び変異型識別プローブの５’末端側には、（１）で作製したクロマトグラフィー用ストリップの対応する捕捉プローブに相補的な塩基配列からなるタグ（tag1,2：DNA）を付加した。
【０１１１】
遺伝子増幅酵素はタカラバイオ社のSYBR Premix ExTaq（Tli RNaseH Plus）を用い、サーマルサイクラーはサーモジェン社のQuick Bathを用いた。
【０１１２】
増幅反応液は、以下に示す通りとした。
（増幅反応液）
滅菌水                                               1.0 μL
SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)                   5.0 μL
Rプライマー（2.5μM）                                1.0 μL
Fプライマー（2.5、1.25、0.6、0.25、0.1、0.05μM）    1.0 μL
識別プローブ溶液（各1μM）                           1.0 μL
pUC18DNA（1 pg/μL）                                 1.0 μL
計                                                   10.0 μL 
【０１１３】
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（９７℃で２分加熱後、９７℃で5秒、６０℃で５秒、及び７２℃で５秒）を４０回繰り返し、９７℃で１分後、１５℃に約１分で冷却した。これにより、増幅反応液内には、それぞれの鋳型ＤＮＡと識別プローブとのハイブリダイズ産物が生成していると考えられた。
【０１１４】
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
1.5 mLチューブ内に充填した以下の展開液にテストストリップの下端を接触させて、展開した（図５参照）。
（展開液）
PCR産物         10.0 μL
展開液          10.0 μL
ラテックス液    1.0 μL
計              21.0 μL 
【０１１５】
展開液はストリップ上部まで約15分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図５に示す。
【０１１６】
図に示すように、プライマーF濃度の減少に従って野生型検出ラインが強くなることを確認することができた。したがって、プライマーF濃度の減少に伴って1本差の増幅断片の蓄積量が増加し、増幅断片と識別プローブとのハイブリダイズ産物の形成が促進されたと考えられた。
【０１１７】
したがって、本検出方法と非対称PCRを併用することで、試料中に含まれる標的配列ないし標的核酸を高い感度でしかも簡易に検出できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１、２：プライマー
配列番号３、４：プローブ