(57)【要約】【課題】電磁誘導によって目的とする強度の磁界に細胞を曝露することが可能な細胞培養基板の提供。【解決手段】磁束を発生する磁束発生装置と、この磁束発生装置から発生する磁束に対して所定の配置で形成された、細胞付着性基質層と、を有する細胞培養基板；前記磁束発生装置は１つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記コイルの中心線と直交する平面内で、前記コイルの中心を中心として、同心円状をなしていることが好ましい。前記磁束発生装置は、同一平面内で接している２つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記２つのコイルの中心線と直交する平面内で、前記２つのコイルの接点を中心として、前記２つのコイルの接線に平行に形成されていることが好ましい。前記細胞培養基板を有する細胞刺激観察装置；前記細胞刺激観察装置を用いた観察方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁束を発生する磁束発生装置と、
この磁束発生装置から発生する磁束に対して所定の配置で形成された、細胞付着性基質層と、
を有する細胞培養基板。
【請求項２】
前記磁束発生装置は１つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記コイルの中心線と直交する平面内で、前記コイルの中心を中心として、同心円状をなしていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項３】
前記磁束発生装置は、同一平面内で接している２つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記２つのコイルの中心線と直交する平面内で、前記２つのコイルの接点を中心として、前記２つのコイルの接線に平行に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基板を有する細胞刺激観察装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞刺激観察装置を用いた観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電磁誘導によって目的とする強度の磁界に細胞を曝露することが可能な細胞培養基板、前記細胞培養基板を有する細胞刺激観察装置、並びに前記細胞刺激観察装置を用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、磁界による電磁誘導が原因となる神経刺激については、健康影響の防止の観点から鉄道を含めた一部の電気設備に放射量の規制が導入されている。例えば、鉄道の電気機器、電線路及び変電所等の地上電気設備から発生する磁界を対象とした規制として、国土交通省令第五十一条の二（電気設備からの電磁誘導作用による公衆の健康影響の防止）が追加された。この省令は「５０／６０Ｈｚの商用周波数において電磁誘導作用による健康への悪影響を防止するよう施設すること」と記され、その解釈基準には、発生する磁界は公衆の立ち入りエリアで２００μＴ以下との具体的な基準が示されている。
【０００３】
一方、医療応用としては、磁界による電磁誘導が原因となる神経刺激が既に臨床の現場で治験的に用いられている。例えば、特許文献１には、失調症の処置、脚部、腕部における大筋肉群のリハビリテーション、並びに体重減に寄与する腹壁部筋肉群の興奮および代謝率増加のために使用する磁気神経刺激装置等が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００１−５２６９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
電磁誘導が原因となる神経刺激については、国際非電離放射線防護委員会（ＩＣＮＩＲＰ）ならびにＩＥＥＥなどの国際機関において曝露許容量のガイドラインが提案されている。これらのガイドラインは０Ｈｚ〜３００ＧＨｚを対象としているが、神経刺激は１００ｋＨｚより低い周波数領域で発生すると考えられている。しかしながら、１００ｋＨｚ以下の許容量の根拠となっているのは、数例のヒトボランティアが参加した磁界曝露による神経刺激閾値の研究のみであり、例数も少なく、周波数的にも網羅しているとはいえない。したがって、周波数網羅的に科学的根拠を示す必要性は高く、特に０〜１００ｋＨｚの周波数を網羅的に検討するための試験系が求められている。
【０００６】
一方、臨床分野で用いられている治療のための磁気刺激は、経験則によるものがほとんどであり、科学的に推定された刺激法に基づいたものとはいえない。したがって、磁界の曝露によりどのくらいの広さの領域に、どの程度の誘導量が生じれば治療として効果的かについて検討するための試験系が求められている。
これらの課題を検討するための実験系として、動物個体への曝露、摘出した組織への曝露、細胞への曝露等が検討されているが、電磁誘導は３次元構造、物質の電気定数、磁界の曝露のされ方などに強く依存するため、適切に制御しながら実験をすることが難しいといった課題が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、実験に用いる磁界の磁束に対応して、細胞付着性基質層をパターニングし、そのパターン上で細胞を培養することで、電磁誘導によって目的とする強度の磁界に細胞を曝露することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は下記の特徴を有する細胞培養基板等を提供するものである。
（１）磁束を発生する磁束発生装置と、この磁束発生装置から発生する磁束に対して所定の配置で形成された、細胞付着性基質層と、を有する細胞培養基板。
（２）前記磁束発生装置は１つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記コイルの中心線と直交する平面内で、前記コイルの中心を中心として、同心円状をなしていることを特徴とする上記（１）に記載の細胞培養基板。
（３）前記磁束発生装置は、同一平面内で接している２つのコイルを有し、前記細胞付着性基質層は、前記２つのコイルの中心線と直交する平面内で、前記２つのコイルの接点を中心として、前記２つのコイルの接線に平行に形成されていることを特徴とする上記（１）に記載の細胞培養基板。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞培養基板を有する細胞刺激観察装置。
（５）上記（４）に記載の細胞刺激観察装置を用いた観察方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、磁界曝露による電磁誘導量を制御した環境で細胞を培養することが可能となる。また、磁界による電磁誘導に起因する神経刺激効果を科学的に適切に観察・評価することが可能となる。本発明により実験データを蓄積することで、実験的に周波数を網羅した神経刺激の閾値を示すことが可能となり、ガイドラインの許容量策定の根拠とすることができる。これは、実際に鉄道の一部に導入され、また現在も検討が続いている規制拡大の議論に対して明確な根拠の一つを与えるものとなりうる。また、磁気刺激については、本発明の細胞培養基板を用いて実験することにより得られる、神経刺激に関する、細胞毎の特性、組織での特性等についての知見に基づき、刺激の効率や正確性を向上させることが可能になるとともに、不要な刺激を低減し、人体への安全性をも高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】磁束発生装置と細胞付着性基質層とを有する細胞培養基板を示す概念図であり、このうち図１（Ａ）は１つの磁束発生装置を用いた場合を示し、（Ｂ）は２つの磁束発生装置を用いた場合を示す。
【図２】（Ａ）は、試験例１における、１つのコイルを用いて誘導電界量を検討した場合を示す図である。（Ｂ）は、試験例１における、ｘｙ平面、ｚ＝１０ｍｍにおける誘導電流密度分布を示す図である。（Ｃ）は、図２（Ｂ）中の破線で示されるカットラインの誘導電流密度を示す図である。（Ｄ）は、実施例１における、ｘｚ平面、ｙ＝４５ｍｍにおける誘導電流密度分布を示す図である。
【図３】実施例１における、細胞付着性基質層のパターニングを示す写真図である。
【図４】（Ａ）は、試験例２における、同一平面内で接している２つのコイルを用いて誘導電界量を検討した場合を示す図である。（Ｂ）は、試験例２における、ｘｙ平面、ｚ＝１０ｍｍにおける誘導電流密度分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の細胞培養基板は、磁束を発生する磁束発生装置と、この磁束発生装置から発生する磁束に対して所定の配置で形成された、細胞付着性基質層と、を有する。
図１は、磁束発生装置１と細胞付着性基質層２とを有する細胞培養基板３を示す概念図であり、このうち図１（Ａ）は１つの磁束発生装置を用いた場合を示し、（Ｂ）は２つの磁束発生装置を用いた場合を示す。
【００１１】
本発明における磁束は、一般的な物理学における磁束と同様の意味を有し、空間中の曲面を通り抜ける磁場の流束をいう。
【００１２】
本発明における磁束発生装置１は、磁束を発生させるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、図１（Ａ）又は図１（Ｂ）に示すように銅線を巻いて形成したコイルを含んでいてもよい。コイルの形状は特に限定されないが、例えば、円形、多角形等、又はこれらの組み合わせが挙げられる。磁束発生装置１は、図１（Ａ）に示すように１つのコイルを有していてもよく、図１（Ｂ）に示すように２つのコイルを有していてもよい。
【００１３】
コイルに流れる電流の大きさ、コイルの巻き数等は特に限定されないが、上述のとおり、健康影響の防止の観点から発生する磁界は公衆の立ち入りエリアで２００μＴ以下との基準が示されているので、２００μＴ程度までの磁界が発生するような電流の大きさ、コイルの巻き数であることが好ましい。
【００１４】
本発明における細胞付着性基質層２とは、後述する細胞付着性物質を一定の厚みをもって堆積したものをいう。例えば、細胞付着性物質をパターニングすることが好ましい。この場合、パターン幅は、１００〜６００μｍであることがより好ましく、２００〜５００μｍであることがより好ましい。ここでパターン幅とは、細胞付着性物質を線状にパターニングする場合の線幅をいう。パターン幅が１００μｍ未満の場合、細胞付着性物質の量が少ないため、付着する細胞数が減少し、細胞への刺激を適切に観察しにくくなる。一方、パターン幅が６００μｍ超の場合、細胞付着性物質の量が多いため、付着する細胞数が増大し、各々の細胞に十分な刺激が与えられにくくなる。
【００１５】
細胞付着性物質は、細胞を付着することができる物質であれば特に限定されないが、細胞外マトリックスを構成するタンパク質が好ましい。例えば、ラミニン、コラーゲン、ＰＥＩ等が挙げられる。細胞付着性物質としては、特に、ラミニンが好ましい。
【００１６】
本発明において、細胞付着性基質層２は、磁束発生装置１から発生する磁束に対して所定の配置で形成される。例えば、細胞付着性基質層２は、磁束発生装置１によって発生した誘導電流密度が大きい領域に形成することが好ましい。これにより、細胞付着性基質層２に付着した細胞を効率よく刺激することができる。
【００１７】
例えば、図１（Ａ）に示すように、磁束発生装置１が１つのコイルを有している場合には、細胞付着性基質層２は、前記コイルの中心線と直交する平面内で、コイルの中心を中心として、同心円状をなしていることが好ましい。また、図１（Ｂ）に示すように、磁束発生装置が、同一平面内で接している２つのコイルを有している場合は、細胞付着性基質層２は、前記２つのコイルの中心線と直交する平面内で、前記２つのコイルの接点を中心として、前記２つのコイルの接線に平行に形成されていることが好ましい。
【００１８】
本発明における細胞培養基板３においては、磁束発生装置１の上に基板を配置し、前記基板の表面（上）に細胞付着性基質層２を形成することが好ましい。そのため、この場合、前記基板の厚みの分だけ、細胞付着性基質層２は磁束発生装置１から離間して（から上方に）位置することとなる。前記基板の厚みは、５〜１５ｍｍであることが好ましく、７〜１３ｍｍであることがより好ましく、特に１０ｍｍであることが好ましい。
【００１９】
前記基板は、その上に細胞付着性基質層２を形成できるものであれば特に限定されないが、例えば、平板基板や培養容器が挙げられる。特に、ハンドリングの観点から、平板基板であることが好ましい。
【００２０】
前記基板が平板基板である場合は、磁束発生装置１の上に培養容器を設け、前記培養容器内に細胞付着性基質層２が形成された平板基板を配することが好ましい。
【００２１】
前記平板基板は、アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、塩化ビニル等の樹脂を主原料とする樹脂基板、ガラス基板等が挙げられ、樹脂基板であることが好ましく、アクリル基板が特に好ましい。
【００２２】
本発明では平板基板を、後述の培養容器のような容器内に充填された液体培地内に沈降させることが好ましい。この観点から、平板基板は用いる液体培地中に沈降可能なものであることが好ましく、液体培地の比重に応じて平板基板の比重及び材料を検討することも必要となる。
【００２３】
平板基板の大きさ、形状は特に限定されるものではないが、培養容器の底面の少なくとも一部を覆うことが可能な大きさ及び形状を有する平板基板が好ましい。具体的には、培養容器底面面積の好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の平面面積を有する平板基板を用いることが好ましい。
【００２４】
平板基板は、予め内面に親水化処理等が施されたものであってもよく、それら処理が施されていない未処理のものであってもよい。
【００２５】
平板基板として具体的には、培養容器として直径９０ｍｍの円形シャーレを用いる場合であれば、５０ｍｍ〜８５ｍｍの直径を有する円形平板基板、５０ｍｍ〜８５ｍｍ角の正方形平板基板、５０ｍｍ〜８５ｍｍの長さ及び幅を有する長方形平板基板等を用いることができる。
【００２６】
平板基板は、培養容器内の底面と必ずしも接している必要はなく、底面から浮力により浮上した状態で液体培地中に配されていてもよく、上方から支持された状態で液体培地中に配されていてもよく、支持台等を設けることにより培養容器底面と一定の間隙をもって配されていてもよい。
【００２７】
前記基板が培養容器である場合は、磁束発生装置１の上に培養容器を設け、前記培養容器の内壁表面に、直接、細胞付着性基質層２を形成してもよい。培養容器は、当分野において各種の細胞培養に用いられる培養容器であれば特に限定されるものではなく、シャーレ、プレート、フラスコ、バッグ等を利用することができる。このうち、シャーレ又はプレートが特に好ましい。
【００２８】
培養容器は、予め内面に親水化処理等が施されたものであってもよく、それら処理が施されていない未処理のものであってもよい。
【００２９】
本発明の細胞培養基板における培養容器内には、培地を充填する。培地は、当分野において細胞の培養に用いられる物であれば特に限定されるものではないが、通常液体培地が用いられる。液体培地は合成培地であっても、半合成培地又は天然培地であってもよい。培地の量は培養容器の容量に応じて適宜決定する。
【００３０】
本発明における細胞培養基板３の使用方法としては、細胞培養基板３における培養容器の培地に細胞を播種する方法が挙げられる。例えば、前記平板基板を使用し、液体培地を用いる場合、培養容器内に、細胞付着性基質層が設けられた平板基板と、液体培地とを入れた後、平板基板の上方から細胞を播種する方法が挙げられる。この場合、播種時においては、細胞の大半は平板基板の上面に存在することとなるが、細胞運動や培養容器内の対流等の影響により、一部の細胞が平板基板の下面側に移動し、平板基板下面と培養容器底面との間隙で培養されることとなりうる。そのため、細胞付着性基質層は、平板基板の両面に設けられていてもよく、細胞がより好適に培養され得るであろう面の側（上面又は下面）のいずれか一方のみに設けられていてもよい。
【００３１】
また、前記平板基板を使用し、液体培地を用いて、平板基板と培養容器内底面との間隙で細胞を培養する場合には、例えば、培養容器内に播種された細胞上に、培養容器の上方から平板基板を沈降させることによっても、細胞付着性基質層と細胞とが良好に接し得るように平板基板を配することができる。
【００３２】
本発明で用いる細胞としては、例えば、神経系細胞、樹状細胞、筋細胞等が挙げられ、特に、神経系細胞が好ましい。神経系細胞は、生体内で神経系を構成し得る細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞等のグリア細胞が挙げられる。また、神経系細胞は、分化誘導を行うことにより神経系細胞となりうる細胞であってもよく、例えば、神経幹細胞、マトリックス細胞、海綿芽細胞、グリオブラスト（グリア芽細胞）等が挙げられる。
【００３３】
本発明で用いる細胞は、細胞株として樹立された細胞であってもよく、生体から回収、分離した細胞であってもよい。また、本発明で用いる細胞は、単独（１種）の細胞種のみを含むものであってもよく、２以上の細胞種を含むものであってもよい。例えば、グリア細胞として、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア等の混在した生体由来の細胞群を用いてもよい。
【００３４】
容器内播種を行う細胞数は特に限定されるものではないが、播種された細胞が密集しない（コンフルエントとならない）程度の細胞数とすることが好ましい。例えば液体培養の場合であれば、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍＬ（好ましくは１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）程度の範囲内で、細胞種に応じて決定することが好ましい。
【００３５】
細胞の培養は、通常の方法で行うことができる。具体的には、２８℃〜４０℃（好ましくは３５〜３８℃）、飽和蒸気圧、１〜１０％（好ましくは５〜１０％）のＣＯ２濃度に設定したインキュベータ内で細胞を培養する。長期培養時には、常法により培地交換、継代等を適宜行うことが好ましい。また、培地交換や継代の際は、可能な限り、細胞培養基板３を動かさないように行うことが好ましい。
【００３６】
本発明における細胞刺激観察装置は、前記細胞培養基板３を有するものである。例えば、前記細胞培養基板３と、当分野において通常用いられる観察機器又は計測機器とを組み合わせたものが挙げられる。
【００３７】
本発明の観察方法は、前記細胞刺激観察装置を用いたものである。前記方法は、前記磁束発生装置から発生する磁束分布を計算する工程と、前記計算により得られた磁束分布に対応する分布で細胞付着性物質を形成する工程と、前記細胞付着性物質に細胞を付着させる工程と、前記磁束発生装置から磁束を発生させながら、前記細胞付着性物質上の細胞への影響を観察する工程と、を有する。
【００３８】
前記計算により得られた磁束分布に対応する分布で細胞付着性物質を形成する工程は、上記の細胞培養基板の場合と同様に、磁束発生装置から発生する磁束に対して所定の配置で細胞付着性基質層を形成する。
【実施例】
【００３９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
［試験例１］
１つのコイルを用いた場合の誘導電界量について検討を行った（図２（Ａ））。
２５回巻３段、直径１２０ｍｍのコイル４の上に直径９０ｍｍのガラス製の培養皿５を乗せ、培養皿５の中に培地を入れた。培地はＤ−ＭＥＭを用いた。コイル４に１０００Ａの電流を流した。以下の計算条件にしたがって、誘導電流密度を計算した。
セルサイズ：０．５ｍｍ
計算領域：１８１×１８１×２０セル
周波数２００Ｈｚ
培地の導電率：２Ｓ／ｍ
ｘｙ平面、ｚ＝１０ｍｍにおける誘導電流密度分布は図２（Ｂ）のとおりであった。図２（Ｂ）において、誘導電流密度が高いところは白、低いところは黒で表示されている。図２（Ｂ）中の破線で示されるカットラインの誘導電流密度は図２（Ｃ）のとおりであった。ｘｚ平面、ｙ＝４５ｍｍにおける誘導電流密度分布は図２（Ｄ）のとおりであった。図２（Ｂ）と同様、図２（Ｄ）も誘導電流密度が高いところは白、低いところは黒で表示されている。最大誘導電流密度は約１８Ａ／ｍ２となった。
【００４１】
［実施例１］
上記試験例１と同様のコイル４と培養皿５を用意し、上記の培養皿５の培地中に、６０ｍｍ角、３ｍｍ厚のアクリル基板を入れた。上記の誘導電流密度分布から、誘導電流の向きが円周方向であることを考慮し、図１（Ａ）に示すように細胞付着性物質のパターニングを行った。すなわち、コイル４の中心を中心として、第１円周を直径１０ｍｍ、第２円周を直径３０ｍｍ、第３円周を直径５０ｍｍとし、これらの円周に沿って、上記基板にラミニンをパターニングした（図３）。パターン幅は１００〜６００μｍであった。
【００４２】
［試験例２］
同一平面内で接している２つのコイルを用いた場合の誘導電界量について検討を行った（図４（Ａ））。５回巻１段、直径１００ｍｍのコイルを２つ接触させて置き、コイル６とした。その上に直径９０ｍｍのガラス製の培養皿５を乗せ、培養皿の中に培地を入れた。培地はＤ−ＭＥＭを用いた。コイル６に１０００Ａの電流を流した。以下の計算条件にしたがって、誘導電流密度を計算した。
セルサイズ：０．５ｍｍ
計算領域：１８１×１８１×２０セル
周波数２０ｋＨｚ
培地の導電率：２Ｓ／ｍ
ｘｙ平面、ｚ＝１０ｍｍにおける誘導電流密度分布は図４（Ｂ）のとおりであった。図４（Ｂ）において、誘導電流密度が高いところは白、低いところは黒で表示されている。
【００４３】
［実施例２］
上記試験例２と同様のコイル６と培養皿５を用意し、上記の培養皿５の培地中に、６０ｍｍ角、３ｍｍ厚のアクリル基板を入れた。上記の誘導電流密度分布から、誘導電流の向きが上下方向であることを考慮し、図１（Ｂ）に示すように細胞付着性物質のパターニングを行った。すなわち、２つのコイルの接点を中心として、２つのコイルの接線に平行に、上記基板にラミニンをパターニングした（図示略）。パターン幅は１００〜６００μｍであった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、電磁誘導によって目的とする強度の磁界に細胞を曝露することができるため、医学研究、生物研究等の基礎研究分野で広く利用することができる。
【符号の説明】
【００４５】
１    磁束発生装置
２    細胞付着性基質層
３    細胞培養基板
４    コイル（１個）
５    培養皿
６    コイル（２個）
【図１】
2017176057.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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