(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫応答を選択的に誘導できる無針注射器、及び、無針注射器を用いて哺乳動物の生体内に抗体を選択的に作成させる抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法を提供する。【解決手段】注射針を介することなく、ＤＮＡ溶液を注射対象領域に注射する無針注射器１であって、ＤＮＡ溶液を収容する充填室３２と、所定の点火器７１と、点火器での所定の点火薬の燃焼により加圧されたＤＮＡ溶液が流れ、注射対象領域に対して射出される射出口３１ａを有するノズル部３１と、を備え、ＤＮＡ溶液の射出のための加圧過程において、該加圧時の所定の燃焼生成物の温度が、点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから２０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、無針注射器。【選択図】図１
2017000667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
注射針を介することなく、ＤＮＡ溶液を注射対象領域に注射する無針注射器であって、
ＤＮＡ溶液を収容する収容部と、
点火直後の燃焼時にはプラズマを発生させ、その後常温となり燃焼生成物が凝縮すると該燃焼生成物に気体成分が含まれない、又は、凝縮前と比べて該燃焼生成物に含まれる気体成分が減少することで発生圧力が低下する圧力特性を示す点火薬を含む点火装置と、
前記点火装置での前記点火薬の燃焼により加圧されたＤＮＡ溶液が流れ、前記注射対象領域に対して射出される射出口を有するノズル部と、
を備え、
前記ＤＮＡ溶液の射出のための加圧過程において、該加圧時の前記燃焼生成物の温度が、前記点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから２０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、
無針注射器。
【請求項２】
前記加圧時の前記燃焼生成物の温度が、前記点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから１０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、
請求項１に記載の無針注射器。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の無針注射器を用いて、哺乳動物（ヒトを除く。）の生体内に、抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡがワクチンの形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物（ヒトを除く。）がマウスである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１抗原である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無針注射器及びそれを用いたＤＮＡ導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
注射針を介することなく注射を行う無針注射器では、加圧ガスやバネにより注射液が収容された収容室に対して圧力を加えることで注射成分を射出する構成が採られることがある。例えば、特許文献１に記載の無針注射器では、注射器本体の内部に複数のノズル孔が形成されるとともに、各ノズル孔に対応して射出時に駆動されるピストンを配置させる構成が採用されている。この構成により、複数のノズル孔から注射液を同時に噴射させて対象への均一な注射を実現しようとしている。
【０００３】
また、無針注射器での注射液の射出動力源として、加圧ガスを利用する形態がある。例えば、特許文献２や特許文献３に記載の無針注射器では、射出初期に瞬間的に大きな加圧を行った後、40〜50msecかけて加圧力を徐々に低減させていく加圧形態が例示されている。
【０００４】
一方で、特許文献４には、遺伝的ワクチン接種、遺伝子運搬および遺伝子治療のためのＤＮＡ、ＤＮＡ製剤および／または他のポリヌクレオチドを投与するための無針噴射式注射装置の使用により、インビボで発現されるタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法が記載されている。具体的には、無針注射器（ＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標名）製）を使用して動物においてポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答を誘導する方法が記載されている。また、その実施例には、無針注射器を用いてＤＮＡワクチンを被験動物の筋肉内に導入した場合に、有針注射器を用いた場合よりも有意な抗体応答を示したことが記載されている。
【０００５】
しかし、免疫応答においては、誘導されることが好ましくない抗体が産生されることもある。産生が誘導されることが好ましい抗体は産生され、一方で、産生が誘導されることが好ましくない抗体は産生されないようなＤＮＡやＤＮＡ製剤、さらにそれらの生体への導入方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５８２３４号公報
【特許文献２】米国特許第５３９９１６３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００１０１６８号明細書
【特許文献４】特表２００２−５１１３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこの様な状況下でなされたものであり、産生が誘導されることが好ましい抗体が産生され、一方で、産生が誘導されることが好ましくない抗体は産生されない、即ち、免疫応答を選択的に誘導できる無針注射器、及び、前記無針注射器を用いて哺乳動物の生体内に抗体を選択的に作成させる抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、無針注射器に点火薬による点火装置を用い、該点火
薬による燃焼生成物の特性、及び、点火によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力と燃焼生成物の温度とに着目した結果、下記の無針注射器が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下に示すとおりである。
【０００９】
〔１〕
注射針を介することなく、ＤＮＡ溶液を注射対象領域に注射する無針注射器であって、
ＤＮＡ溶液を収容する収容部と、
点火直後の燃焼時にはプラズマを発生させ、その後常温となり燃焼生成物が凝縮すると該燃焼生成物に気体成分が含まれない、又は、凝縮前と比べて該燃焼生成物に含まれる気体成分が減少することで発生圧力が低下する圧力特性を示す点火薬を含む点火装置と、
前記点火装置での前記点火薬の燃焼により加圧されたＤＮＡ溶液が流れ、前記注射対象領域に対して射出される射出口を有するノズル部と、
を備え、
前記ＤＮＡ溶液の射出のための加圧過程において、該加圧時の前記燃焼生成物の温度が、前記点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから２０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、
無針注射器。
〔２〕
前記加圧時の前記燃焼生成物の温度が、前記点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから１０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、
〔１〕に記載の無針注射器。
〔３〕
〔１〕又は〔２〕に記載の無針注射器を用いて、哺乳動物（ヒトを除く。）の生体内に、抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法。
〔４〕
前記ＤＮＡがワクチンの形態である、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前記哺乳動物（ヒトを除く。）がマウスである、〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕
前記抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１抗原である、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、免疫応答を選択的に誘導できる無針注射器、及び、前記無針注射器を用いて哺乳動物の生体内に抗体を選択的に作成させる抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第一の発明に係る注射器の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の第二の発明の一実施態様における、ＤＮＡ溶液の射出力の時間経過を示すグラフである。
【図３Ａ】本発明の第二の発明の一実施態様における、腫瘍移植後経過日数と腫瘍サイズとの関係を示すグラフである。
【図３Ｂ】本発明の第二の発明の一実施態様における、腫瘍移植後経過日数と腫瘍サイズとの関係を示すグラフである。
【図４Ａ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【図４Ｂ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【図５Ａ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【図５Ｂ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【図６Ａ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【図６Ｂ】本発明の第二の発明の一実施態様における、希釈倍率と４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、無針注射器の発明に係る第一の発明、及び、前記無針注射器を用いて、哺乳動物（ヒトを除く。）の生体内に、抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法の発明に係る第二の発明を含む。
【００１３】
＜第一の発明＞
本発明の第一の発明は、注射針を介することなく、ＤＮＡ溶液を注射対象領域に注射する無針注射器であって、ＤＮＡ溶液を収容する収容部と、点火直後の燃焼時にはプラズマを発生させ、その後常温となり燃焼生成物が凝縮すると該燃焼生成物に気体成分が含まれない、又は、凝縮前と比べて該燃焼生成物に含まれる気体成分が減少することで発生圧力が低下する圧力特性を示す点火薬を含む点火装置と、前記点火装置での前記点火薬の燃焼により加圧されたＤＮＡ溶液が流れ、前記注射対象領域に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記ＤＮＡ溶液の射出のための加圧過程において、該加圧時の前記燃焼生成物の温度が、前記点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから２０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで推移する、無針注射器である。
である。
【００１４】
本発明の第一の発明に係る注射器おいて、「先端側」とは、注射器から注射目的物質が射出される射出口が配置されている側を意味し、「基端側」とは、注射器において先端側とは反対の側を意味するものであり、これらの文言は、特定の箇所や位置を限定的に指すものではない。
【００１５】
本発明の第一の発明に係る注射器において、駆動部は、点火装置によって点火される火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして採用する。なお、火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、火薬としては、例えば、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスを含む火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンを含む火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅を含む火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄を含む火薬（ＡＦＯ）のうち何れか一つの火薬、又はこれらのうち複数の組み合わせからなる火薬であってもよい。これらの火薬の特徴としては、その燃焼生成物が高温状態では気体であっても常温では気体成分を含まないため、点火後燃焼生成物が直ちに凝縮を行う。それにより、ＤＮＡ溶液の射出のための加圧過程において、該加圧時の燃焼生成物の温度を、点火薬の燃焼によりＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから短時間に常温近傍まで推移させることができる。その時間は、通常２０ｍｓｅｃ以内であり、好ましくは１０ｍｓｅｃである。その結果、後述するように、生体内へ抗原をコードする領域を含むＤＮＡが導入された際に、免疫応答を選択的に誘導することができる。また、ガス発生剤の発生エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、ガス発生剤としては、シングルベース無煙火薬や、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。
【００１６】
上記駆動部による射出エネルギーはピストンを介してプランジャに伝えられ、プランジ
ャが充填室内を摺動することで、充填室に収容されているＤＮＡ溶液がノズル部に形成された流路に沿って押し出され、最終的に射出口から注射対象領域に向けて射出される。
【００１７】
ここで、本発明の第一の発明に係る注射器では、充填室には当初からＤＮＡ溶液が収容されているのではなく、射出口を有するノズルを介してＤＮＡ溶液を充填室内に吸引することにより収容する。このように、充填室への充填操作を必要とする構成を採用することで、必要とする任意のＤＮＡ溶液を注射することが可能となる。そのため、本発明の第一の発明に係る注射器では、シリンジ部と注射器本体とは着脱可能に構成されている。
【００１８】
以下に、図面を参照して本発明の第一の発明における一実施形態に係る注射器１について説明する。なお、以下の実施形態の構成は例示であり、本発明の第一の発明はこの実施の形態の構成に限定されるものではない。なお、注射器１の長手方向における相対的な位置関係を表す用語として、「先端側」及び「基端側」を用いる。当該「先端側」は、後述する注射器１の先端寄り、すなわち射出口３１ａ寄りの位置を表し、当該「基端側」は、注射器１の長手方向において「先端側」とは反対側の方向、すなわち駆動部７側の方向を表している。
【００１９】
（注射器１の構成）
図１は、注射器１の概略構成を示す図であり、注射器１のその長手方向に沿った断面図でもある。注射器１は、シリンジ部３とプランジャ４とで構成されるサブ組立体と、注射器本体６とピストン５と駆動部７とで構成されるサブ組立体とが一体に組み立てられた注射器組立体１０が、ハウジング（注射器ハウジング）２に取り付けられることで構成される。
【００２０】
上記の通り、注射器組立体１０は、ハウジング２に対して脱着自在となるように構成されている。注射器組立体１０に含まれるシリンジ部３とプランジャ４との間に形成される充填室３２にはＤＮＡ溶液が充填され、そして、当該注射器組立体１０は、ＤＮＡ溶液の射出を行う度に使い捨てられるユニットである。一方で、ハウジング２側には、注射器組立体１０の駆動部７に含まれる点火器７１に電力供給するバッテリ９が含まれている。バッテリ９からの電力供給は、ユーザがハウジング２に設けられたボタン８を押下する操作を行うことで、配線を介してハウジング２側の電極と、注射器組立体１０の駆動部７側の電極との間で行われることになる。なお、ハウジング２側の電極と注射器組立体１０の駆動部７側の電極とは、注射器組立体１０がハウジング２に取り付けられると、自動的に接触するように両電極の形状および位置が設計されている。またハウジング２は、バッテリ９に駆動部７に供給し得る電力が残っている限りにおいて、繰り返し使用することができるユニットである。なお、ハウジング２においては、バッテリ９の電力が無くなった場合には、バッテリ９のみを交換しハウジング２は引き続き使用してもよい。
【００２１】
また、図１に示す注射器本体６内には、特に追加的な火薬成分は配置されていないが、ピストン５を介して注射液にかける圧力推移を調整するために、点火器７１での火薬燃焼によって生じる燃焼生成物によって燃焼しガスを発生させるガス発生剤等を、点火器７１内や注射器本体６の貫通孔内に配置することもできる。点火器７１内にガス発生剤を配置する構成は、国際公開公報０１−０３１２８２号や特開２００３−２５９５０号公報等に開示されているように既に公知の技術である。また、ガス発生剤の一例としては、ニトロセルロース９８質量％、ジフェニルアミン０．８質量％、硫酸カリウム１．２質量％からなるシングルベース無煙火薬が挙げられる。また、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。貫通孔内に配置されるときのガス発生剤の寸法や大きさ、形状、特に表面形状を調整することで、該ガス発生剤の燃焼完了時間を変化させることが可能であり、これにより、注射液にかける圧力推移を所望の推移、すなわち注射対象領域に注射液が適切に到達し得
る推移とすることができる。本発明の第一の発明では、必要に応じて使用されるガス発生剤なども駆動部７に含まれるものとする。
【００２２】
＜第二の発明＞
本発明の第二の発明は、第一の発明の無針注射器を用いて、哺乳動物（ヒトを除く。）の生体内に、抗原をコードする領域を含むＤＮＡを導入する方法である。
【００２３】
（抗体）
後述の実施例に示される通り、当該導入方法により、産生が誘導されることが好ましい抗体が産生され、一方で、産生が誘導されることが好ましくない抗体が産生されない、即ち、免疫応答を選択的に誘導することができる。このような抗体の種類、サブタイプ等はいずれも特に制限されないが、ここでは例として、ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ２抗体を挙げて説明する。
【００２４】
ヘルパーＴ細胞の前駆細胞である０型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）は、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）または２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）に分化し、Ｔｈ１細胞は細胞性免疫を促進し、Ｔｈ２細胞は液性免疫を促進することが知られている。免疫系は、これらＴｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランスによって成立している。
【００２５】
Ｔｈ１細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（キラーＴ細胞、ＣＴＬ）の活性化に関与し、感染の防御や癌細胞に対する免疫作用を有する。そのため、Ｔｈ１細胞を用いた癌細胞に対する免疫療法も開発されている。ただし、Ｔｈ１細胞が優勢で、Ｔｈ２細胞が劣勢であると、自己の細胞をも攻撃してしまう自己免疫疾患を発症してしまう。
一方、Ｔｈ２細胞は、抗体を産生するＢ細胞に特に関与するものであり、生体内の広範囲で免疫作用を発揮することができる。ただし、Ｔｈ２細胞はアレルギー性炎症にも関与しており、種々のインターロイキンを分泌する。その結果、Ｂ細胞がＩｇＥ抗体産生細胞に分化したり、好酸球の活性化や脱顆粒を促進したりすることにより、アトピー性喘息やアレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患を引き起こすことが知られている。そのため、Ｔｈ１細胞が劣勢で、Ｔｈ２細胞が優勢であることは好ましくない。
このように、生体ではＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の一方が優勢である状態は好ましくなく、バランスが取れていることが好ましいが、癌治療においては、先に述べた免疫療法までもが開発されているように、Ｔｈ１細胞が優勢で、Ｔｈ２細胞が劣勢であることが好ましい。
【００２６】
この優劣は、抗体が産生されるまでのプロセスにおいて、それぞれの細胞が特異的に関与する抗体の抗体価を測定すれば判断できる。それぞれの細胞が特異的に産生に関与する抗体の種類は公知であるが、例えば、Ｔｈ１細胞はＩｇＧ２抗体（そのサブクラスであるＩｇＧ２ａ抗体などであってもよい。）の産生に関与し、Ｔｈ２細胞はＩｇＧ１抗体の産生に関与することが知られている。したがって、Ｔｈ１細胞が優勢で、Ｔｈ２細胞が劣勢であることが好ましい癌治療においては、ＩｇＧ２抗体が検出され、かつ、ＩｇＧ１抗体が検出されない、又は検出されても有効量でないことが好ましい。
【００２７】
抗体の検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法などの公知の方法が挙げられる。簡単に説明すれば、まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００２８】
（哺乳動物）
哺乳動物は、特に制限されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ等が挙げられる。好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ネコである。
【００２９】
（ＤＮＡ）
本発明の第二の発明におけるＤＮＡは、従来の遺伝子銃法やパーティクルガン法のように金コロイドに固定される必要はないため、従来の技術よりも調製が非常に簡易である。また、ＤＮＡが安定して存在し、また、導入される細胞を破壊するなどの悪影響がなければ、ＤＮＡは無菌水や無菌溶媒のほか、従来の遺伝子銃法等におけるＤＮＡ固定化金コロイド溶液に用いられる溶媒等の中に存在していてもよい。また、ＤＮＡワクチンのように賦形剤やアジュバント等が含まれている必要もなく、製剤化されている必要もない。
【００３０】
また、本発明の第二の発明におけるＤＮＡは、生体内で抗体を作成させる抗原をコードする領域を含み、哺乳動物の生体内（細胞内）に導入された場合に所定の抗原を発現しうるように設計されていれば、その形態は特に制限されない。
例えば、発現カセットまたは発現ベクターにＤＮＡが含まれた形態で設計されること等が挙げられる。さらに、例えば、導入される哺乳動物の種類および導入部位に適したプロモーターの制御下にＤＮＡが配置されていてもよい。さらに、抗原の発現量を増加させるために、１つまたは複数のエンハンサーが含まれていてもよい。
【００３１】
発現ベクターとしては、哺乳動物の生体内（細胞内）に導入された場合に該細胞内で所定の抗原を発現すれば、特に制限されない。例えば、哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドベクター等が挙げられる。当該プラスミドベクターは公知であり、当業者であれば入手可能である。
【００３２】
また、発現ベクター及び組換えベクターのサブクローニングは公知の方法に従って行うことができる。このとき、原核生物の宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属の菌株を挙げることができる。このとき、プロモーターとしては、例えば、トリプトファン・プロモーター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。さらに、宿主細胞から発現ベクターを抽出する方法も公知の方法に従うことができる。
【００３３】
（抗原）
本発明の第二の発明におけるＤＮＡは、哺乳動物の生体内（細胞内）に導入された場合に、生体内で抗体を作成させる抗原をコードする領域を含んでいる。
本発明の第二の発明における抗原には、抗原のアミノ酸配列のうち、１または数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、当該抗原と機能的に同等なタンパク質、すなわち当該抗原の活性を有するタンパク質が含まれる。さらに、抗原のアミノ酸配列全体が用いられてもよいが、抗原性が高いと認められる部分（特にエピトープ）が用いられてもよい。従って、前記ＤＮＡには、このようなタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡも含まれる。また、ｃＤＮＡのようにイントロンを含まない塩基配列でもよい。
尚、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することは公知である。
【００３４】
抗原は、ＤＮＡとして哺乳動物の生体内に導入されたときに、哺乳動物の生体内におい
て、当該抗原に対する抗体が産生されるならば特に制限されないが、腫瘍抗原が好ましい。
ここで、「腫瘍抗原」とは、細胞の癌化に伴って、その母細胞が保有する組織適合抗原、臓器・組織特異抗原など以外に新たに獲得され、免疫学的方法によって検出される抗原を意味する。腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原）、または腫瘍関連抗原（他の臓器・組織あるいは異種異系の正常細胞に存在したり、発生・分化の途上において発現する抗原）を含む。
【００３５】
本発明の第二の発明における腫瘍抗原の種類は特に制限されないが、好ましくはＮＹ−ＥＳＯ−１抗原である。
ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原をコードするＤＮＡとしては、例えば、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗原であれば、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。また、上記同様に、当該アミノ酸配列のうち、１または数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列からなるヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗原と機能的に同等なタンパク質、すなわちヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗原としての活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをも含む。
尚、抗原は、ＤＮＡが導入される動物種に由来する抗原であることが好ましい。例えば、ヒトに導入する場合には、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗原であることが好ましい。
【００３６】
ＤＮＡの導入経路は特に限定されないが、非経口であることが好ましい。例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内が挙げられる。好ましくは、皮下である。
ＤＮＡの導入量は、哺乳動物の疾患の種類や、程度、性別、年齢、体重、導入経路等によって異なるが、本発明の第二の発明の効果が発揮されれば特に制限されず、１回あたり、通常０.００１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０.０１μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０.１μｇ〜１００μｇである。
ＤＮＡは、他の薬剤等と併用することも可能である。他の薬剤等と同時にＤＮＡを投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００３７】
（ＤＮＡワクチン）
本発明の第二の発明におけるＤＮＡは、ワクチン化のための公知の方法を適宜採用することで、ワクチンの形態、即ちＤＮＡワクチンとすることができる。
この場合、ＤＮＡに、製剤上許容しうる担体（例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）、適切な賦形剤、アジュバント等を配合し製剤化して使用することができる。
【００３８】
また、ＤＮＡワクチンは、賦形剤または製剤上許容しうる担体を調製するために、薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。さらに、種々のアジュバントを含む乳濁液であってもよい。アジュバントは種々のものが公知であり、当業者であれば、適切なものを容易に選択することができる。さらには、上記アジュバントの他に、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【００３９】
ＤＮＡワクチンの導入量は、哺乳動物の疾患の種類や、程度、性別、年齢、体重、導入
経路等によって異なるが、本発明の第二の発明の効果が発揮されれば特に制限されず、ＤＮＡ量として、１回あたり、通常０.００１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０.０１μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０.１μｇ〜１００μｇである。
【００４０】
ＤＮＡワクチンは、他の薬剤またはワクチンと併用することも可能である。他の薬剤等と同時にＤＮＡワクチンを投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（プラスミドＤＮＡの製造）
ヒトNY-ESO-1遺伝子のcDNAをOrigene社より購入し（Cat#：SC303002）、公知の方法に
従って、当該遺伝子配列をpcDNA3.1(-)(ライフテクノロジー社)にサブクローニングした
。
【００４３】
（腫瘍細胞）
後述する腫瘍移植で用いる腫瘍細胞として、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を安定して発現するＣＴ２６細胞を用いた。
当細胞は、下記要領で作製した。培養したマウス大腸がん細胞ＣＴ２６細胞株をＰＢＳにて洗浄後、０．５％トリプシン含有ＰＢＳにて剥離し１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて回収した。遠心分離後（1200ｒｐｍ，５分，４℃）、上清を除き、OPTI-MEM培地にて２回洗浄し、OPTI-MEM培地にて一晩培養した。翌日、Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (ライフテクノロジー社)を用いてヒトNY-ESO-1遺伝子組み込みプラスミドを導入し培養した。トリプシン処理にて遺伝子導入CT26細胞を剥離回収し、350μg/ml G418を含有する１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で10日間培養後、リミッティングダイリューションによりモノクローン化を行った。樹立された、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質安定発現ＣＴ２６細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。
【００４４】
［実施例１］
（無針注射器の射出力の評価）
図１に示す無針注射器（ノズル径：直径０．１ｍｍ）に、３５μＬのＤＮＡ溶液（溶媒：ＰＢＳ、終濃度１μｇ／μＬ）を充填し、点火薬の燃焼によるＤＮＡ溶液の加圧から射出後までの注射器内の圧力（射出力）を評価した。火薬として、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）を３５ｍｇ用いた。
射出力の測定は、特開2005-21640記載の測定方法のように、射出の力を、ノズルの下流に配置されたロードセルのダイアフラムに分散して与えるようにし、ロードセルからの出力は、検出増幅器を介してデータ採取表示装置にて採取されて、時間毎の射出力（Ｎ）として表示、記憶されるという方法によって測定した。
図２は、ＤＮＡ溶液の射出力の時間経過を示すグラフである。ＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク射出力を迎えてから非常に短時間に加圧前の圧力に戻ることがわかった。
【００４５】
（抗腫瘍試験）
［実施例２−１（無針注射）］
上記実施例１で用いた無針注射器に、３５μＬのＤＮＡ溶液（溶媒：ＰＢＳ、終濃度１μｇ／μＬ）を充填し、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、日本SLC）において剃毛した
右後背部に注射した。１回目の投与日を第０日とし、２回目の投与を第８日に行った。
【００４６】
第１６日に、Ｔ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ社）に培養したNY-ESO-1遺伝子を安定導入した
マウス大腸がん細胞ＣＴ２６細胞株をＰＢＳにて洗浄後、２mlの０．５％トリプシン含有ＰＢＳにて細胞を剥離し８mlの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を回収した。遠心分離後（1200ｒｐｍ，５分，４℃）、上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地にて２回洗浄し、１×１０６個／１００μＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁を行った。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの剃毛した右腹部に１００μＬ／個体の量で皮下移植した。
【００４７】
当該移植後、移植した腫瘍の大きさ（長径および短径）を電子ノギスにて経時的に測定した。尚、本実施例は独立して６個体で実施した。
【００４８】
［比較例２−１（有針注射）］
上記注射に有針注射器を使用したこと以外は、実施例２−１と同様に行った。尚、本実施例は独立して５個体で実施した。
【００４９】
［比較例２−２（従来の遺伝子銃）］
上記注射に遺伝子銃（Helios Gene Gun システム（Bio-Rad社））を使用したこと以外
は、実施例２−１と同様に行った。尚、注射時のガス圧力は、350から400 pound-force per square inch（p.s.i）とし、プラスミドＤＮＡは１μｍの金粒子（Bio-Rad社）にコートした形態にて１μｇ／マウスにて投与した。また、本実施例は独立して４個体で実施した。
【００５０】
［比較例２−３（未処置）］
上記注射を実施しなかったこと以外は、実施例２−１と同様に行った。尚、本実施例は独立して４個体で実施した。
【００５１】
図３Ａは、各実施例の各個体における、経時的に測定した腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。また、図３Ｂは、各実施例における腫瘍の大きさの平均値の変化を示すグラフである。
これらの結果より、無針注射の場合は、従来の遺伝子銃を用いた場合ほど腫瘍の増大を抑制しないが、未処置及び有針注射の場合よりも腫瘍の増大を顕著に抑制することがわかった。
【００５２】
（抗体価測定試験１）
［実施例３−１（無針注射）］
上記実施例１で用いた無針注射器に、３５μＬのＤＮＡ溶液（溶媒：ＰＢＳ、終濃度１μｇ／μＬ）を充填し、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、日本SLC）において剃毛した
右後背部に注射した。１回目の投与日を第０日とし、２回目の投与を第８日に行った。
【００５３】
第１６日に、当該マウスから採血し、4℃にて一晩静置した後、遠心（10000rpm, 5分）を行い血清を分離して取得した。
【００５４】
取得した血清中に存在する抗ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗体（ｐａｎ−ＩｇＧ）の抗体価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。尚、本実施例は独立して６個体で実施した。
ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ社：Ｃａｔ＃ＴＰ３１３３１８）を０．４ｎｇ/ｍｌに濃度調整し、５０μｌ／ｗｅｌｌにて９６ウェル平底マキシソーププレー
ト(Ｎｕｎｃ社)に添加し、４℃にて一晩静置した。抗体溶液をデカンテーションで除き、洗浄バッファー（０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて４回洗浄した。ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌで添加し室温にて1時間
静置した。サンプル血清をブロッキングバッファーにて段階的に希釈した。ブロッキングバッファーをデカンテーションで捨て、希釈血清もしくはブロッキングバッファー（ブランクウェル）を１００μｌ／ｗｅｌｌにて添加し室温にて２時間静置した。デカンテーシ
ョンで希釈血清を捨て、洗浄バッファーにて4回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗
体をブロッキングバッファーで５０００倍に希釈して、１００μｌ／ｗｅｌｌにて添加し室温にて１時間静置した。デカンテーションで抗体溶液を捨て、洗浄バッファーにて４回洗浄した。洗浄バッファーを完全に除去した後に、ＴＭＢ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。室温にて３分間静置した後、０．１８Ｍの硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加、マイクロプレートリーダーモデル６８０（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの値よりブランクウェルの値を引いた数値を各ウェルの値としてデータ解析を行った。各サンプル、ｄｕｐｌｉｃａｔｅを作成した。
【００５５】
［比較例３−１（有針注射）］
上記注射に有針注射器を使用したこと以外は、実施例３−１と同様に行った。尚、本実施例は独立して５個体で実施した。
【００５６】
［比較例３−２（従来の遺伝子銃）］
上記注射に遺伝子銃（Helios Gene Gun システム（Bio-Rad社））を使用したこと以外
は、実施例３−１と同様に行った。尚、注射時のガス圧力は、350から400 p.s.iとし、プラスミドＤＮＡは１μｍの金粒子（Bio-Rad社）にコートした形態にて１μｇ／マウスに
て投与した。また、本実施例は独立して４個体で実施した。
【００５７】
［比較例３−３（未処置）］
上記注射を実施しなかったこと以外は、実施例３−１と同様に行った。尚、本実施例は独立して４個体で実施した。
【００５８】
図４Ａは、各実施例の各個体における、希釈倍率とＯＤ４５０値との関係を示すグラフである。また、図４Ｂは、各実施例における、希釈倍率とＯＤ４５０の平均値との関係を示すグラフである。
これらの結果より、無針注射の場合は、従来の遺伝子銃を用いた場合ほど大きな抗体価は示さないが、未処置及び有針注射の場合よりも顕著に大きな抗体価を示すことがわかった。
【００５９】
（抗体価測定試験２）
［実施例４−１、比較例４−１〜比較例４−３］
ＥＬＩＳＡ法で測定する抗体を、抗ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗体（ＩｇＧ１）にしたこと以外は、実施例３−１と同様に行ったものを実施例４−１（無針注射）とした。
同様に、ＥＬＩＳＡ法で測定する抗体を、抗ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗体（ＩｇＧ１）にしたこと以外は、比較例３−１、比較例３−２、比較例３−３と同様に行ったものを、それぞれ、比較例４−１（有針注射）、比較例４−２（従来の遺伝子銃）、比較例４−３（未処置）とした。
【００６０】
図５Ａは、各実施例の各個体における、希釈倍率とＯＤ４５０値との関係を示すグラフである。また、図５Ｂは、各実施例における、希釈倍率とＯＤ４５０の平均値との関係を示すグラフである。
これらの結果より、従来の遺伝子銃を用いた場合には大きな抗体価を示したが、無針注射の場合は、未処置の場合と同様に大きな抗体価を示さないことがわかった。
【００６１】
（抗体価測定試験３）
［実施例５−１、比較例５−１〜比較例５−３］
ＥＬＩＳＡ法で測定する抗体を、抗ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗体（ＩｇＧ２ａ）にしたこと以外は、実施例３−１と同様に行ったものを実施例５−１（無針注射）とした。
同様に、ＥＬＩＳＡ法で測定する抗体を、抗ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１抗体（ＩｇＧ２ａ）
にしたこと以外は、比較例３−１、比較例３−２、比較例３−３と同様に行ったものを、それぞれ、比較例５−１（有針注射）、比較例５−２（従来の遺伝子銃）、比較例５−３（未処置）とした。
【００６２】
図６Ａは、各実施例の各個体における、希釈倍率とＯＤ４５０値との関係を示すグラフである。また、図６Ｂは、各実施例における、希釈倍率とＯＤ４５０の平均値との関係を示すグラフである。
これらの結果より、無針注射の場合は、従来の遺伝子銃を用いた場合ほど大きな抗体価は示さないが、未処置及び有針注射の場合よりも顕著に大きな抗体価を示すことがわかった。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・・注射器
２・・・・ハウジング
３・・・・シリンジ部
４・・・・プランジャ
５・・・・ピストン
６・・・・注射器本体
７・・・・駆動部
８・・・・ボタン
９・・・・バッテリ
１０・・・・注射器組立体
３１・・・・ノズル部
３１ａ・・・射出口
３２・・・・充填室
７１・・・・点火器
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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