(57)【要約】【課題】試料中の標的生体分子の種類を簡便に判定することが可能な標的生体分子特定方法を提供する。【解決手段】（ａ）生体分子を含む試料を、標的生体分子と結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ）生体分子を含む試料と接触させたビーズを、各反応槽に配置する工程と、（ｃ）各反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ）各反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ）核酸伸長反応中のプロトン濃度を測定する工程と、（ｆ）測定された前記プロトン濃度の上昇に基づいて、反応槽毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｇ）光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度変化量に基づいて、リガンドの種類を反応槽毎に特定する工程と、を含む標的生体分子の特定方法。【選択図】図２
2017209050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
（ｂ）前記生体分子を含む試料と接触させた前記ビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
（ｄ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン濃度を測定する工程と、
（ｆ）測定された前記プロトン濃度の上昇に基づいて、各反応槽毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、
（ｇ）前記反応槽に配置された前記ビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記リガンドの種類を反応槽毎に特定する工程と、を含む、
標的生体分子の特定方法。
【請求項２】
前記標的生体分子が核酸であり、前記リガンドが前記標的生体分子である核酸とアニーリングし得るプライマーである、請求項１に記載の標的生体分子の特定方法。
【請求項３】
前記標的生体分子がタンパク質であり、前記リガンドが前記標的生体分子であるタンパク質と結合し得る抗体である、請求項１に記載の標的生体分子の特定方法。
【請求項４】
前記光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物が、光分解性カップリング剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
【請求項５】
工程（ｄ）の核酸伸長反応が、ＰＣＲ法又は等温増幅法により行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
【請求項６】
工程（ｅ）のプロトン濃度の測定が、ＩＳＦＥＴにより行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
【請求項７】
標的生体分子に結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズ。
【請求項８】
標的生体分子に結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズを含み、
前記複数のビーズには、ビーズ毎に、前記リガンドの種類に対応した分子数の前記化合物が固定化されている、
標的生体分子特定用ビーズのセット。
【請求項９】
複数の生体分子の１つと結合し得るリガンドが固定化されたビーズであって、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物が、前記リガンドの種類に対応する分子数固定化された複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、
前記ビーズが配置された前記反応槽内のプロトン濃度を前記反応槽毎に検出する検出部と、
前記検出部が検出する核酸伸長反応中の前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、
前記検出部が検出する光照射の前後の前記反応槽毎のプロトン濃度に基づいて、光照射の前後のプロトン濃度の変化量を算出し、算出された前記プロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記化合物の分子数の順位を反応槽毎に特定するビーズ特定部と、
前記ビーズ特定部が特定する前記化合物の分子数の順位に基づいて、前記リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、
を備える標的生体分子特定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイスループットで核酸分析を行う方法としては、光切断部位を介してビーズにプライマーを結合し、プライマーに試料中の核酸を捕捉させた後、プライマーを光誘導切断してＰＣＲを行い、標的核酸を増幅して増幅産物を分析する技術が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、増幅産物の分析を行う場合には、ビーズエマルジョンを回収して配列解析等を行う必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０１９０１９１号明細書
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施態様は、（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
（ｂ）前記生体分子を含む試料と接触させた前記ビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
（ｄ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、
（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン濃度を測定する工程と、
（ｆ）測定された前記プロトン濃度の上昇に基づいて、各反応槽毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、
（ｇ）前記反応槽に配置された前記ビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化されたリガンドの種類を反応槽毎に特定する工程と、を含む、
標的生体分子の特定方法である。
【０００５】
また、本発明の一実施態様は、標的生体分子に結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズである。
【０００６】
また、本発明の一実施態様は、標的生体分子に結合し得るリガンドと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズを含み、前記複数のビーズには、ビーズ毎に、前記リガンドの種類に対応した分子数の前記化合物が固定化されている、標的生体分子特定用ビーズのセットである。
【０００７】
また、本発明の一実施態様は、標的生体分子に結合し得るリガンドが固定化されたビーズであって、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物が、前記リガンドの種類に対応する分子数固定化された複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、前記ビーズが配置された前記反応槽内のプロトン濃度を前記反応槽毎に検出する検出部と、前記検出部が検出する核酸伸長反応中の前記反応槽毎のプロトンの濃度の上昇に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、前記検出部が検出する光照射の前後の前記反応槽毎のプロトン濃度に基づいて、光照射の前後のプロトン濃度の変化量を算出し、算出された前記プロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記化合物の分子数の順位を反応槽毎に特定するビーズ特定部と、前記ビーズ特定部が特定する前記化合物の分子数の順位に基づいて、前記リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、を備える標的生体分子特定装置である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１実施形態におけるビーズ体の一例を示す模式図である。
【図２】第１実施形態における光分解性保護基を有し、かつ脱保護によりプロトン濃度の変化を生じ得る化合物の分子数と、標的核酸用プライマーの対応関係を示す模式図である。
【図３】第１実施形態におけるビーズ体に標的核酸配列がアニーリングした状態の一例を示す模式図である。
【図４】本実施形態における反応槽へのビーズ体の配置の一例を示す模式図である。
【図５】核酸伸長反応におけるプロトン放出の一例を示す模式図である。
【図６】本実施形態におけるセンサの一例を示す模式図である。
【図７】本実施形態における標的核酸配列特定装置の構成の一例を示す図である。
【図８】本実施形態における核酸配列記憶部の構成の一例を示す図である。
【図９】第２実施形態におけるビーズ体の一例を示す模式図である。
【図１０】第２実施形態における標的タンパク質特定装置の構成の一例を示す図である。
【図１１】第２実施形態における抗原記憶部の構成の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜第１実施形態＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー（以下「標的核酸用プライマー」という）である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。
【００１０】
本実施形態の標的核酸配列の特定方法は、（ａ１）核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ１）前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、（ｃ１）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ１）前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ１）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、（ｆ１）前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｇ１）前記反応槽に配置された前記ビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記リガンドの種類を反応槽毎に特定する工程と、の各工程を有する。以下、各工程について説明する。
【００１１】
［標的核酸用プライマーとのアニーリング］
工程（ａ１）は、核酸を含む試料を、前記複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、光分解性保護基を有し、かつ脱保護によりプロトン濃度の変化を生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
【００１２】
まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１を参照して説明する。図１中、１はビーズ、２は標的核酸用プライマー、１０は光分解性保護基を有し、かつ脱保護によりプロトン濃度の変化を生じ得る化合物、１００はビーズ１に標的核酸用プライマー２と化合物１０が固定化されたビーズ体を示す。
【００１３】
本実施形態において、ビーズ１は、標的核酸用プライマー２が固定化するための担体として用いられる。一例として、ビーズ１の形状は、球状又はそれに近い形状である。ビーズ１の形状は、これに限るものではない。一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径１μｍから２５０μｍである。一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径３０μｍから８０μｍである。ビーズ１の大きさは、これらに限るものではない。
【００１４】
ビーズ１の材質は、特に限定されないが、例えば、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等を挙げることができる。また、反応槽への配置の観点から、磁性ビーズを用いてもよい。ビーズ１は、１種類の物質のみならず、２種類以上の物質からなるものであってもよい。また、ビーズ１は、表面コーティングされたものであってもよい。
【００１５】
図１に示すように、ビーズ１には、標的核酸用プライマー２が固定化されている。これらの核酸のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標的核酸用プライマー２をビオチン修飾し、ビーズ１の表面をアビジンでコーティングすることにより、アビジン−ビオチン結合を利用して、ビーズ１への両核酸の固定化を行うことができる。また、標的核酸用プライマー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
【００１６】
標的核酸用プライマー２は、目的とする標的核酸配列にアニーリングし得る配列を有する。一例として、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有する核酸である。標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列を鋳型とした核酸伸長反応を誘導する。一例として、標的核酸用プライマー２は、ＤＮＡである。標的核酸用プライマー２の配列は、目的とする標的核酸配列に応じて、適宜選択することができる。本実施形態においては、個々のビーズ１には、それぞれ異なる配列を有する標的核酸用プライマー２が固定化されている。
【００１７】
なお、図１では、ビーズ１に対して、標的核酸用プライマー２が１分子ずつしか固定化されていないが、ビーズ１に対して固定化されるこれらの核酸の数は１分子に限定されず、２分子以上を固定化することができる。一例として、標的核酸用プライマー２は、２以分子以上固定化される。ビーズ１に対して固定化される標的核酸用プライマー２の分子数は、特に限定されず、ビーズ１の表面積に応じて、標的核酸のアニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度の分子数とすることができる。なお、１つのビーズ１に対して固定化される標的核酸用プライマー２は、全て同一の標的核酸配列を標的とする。
【００１８】
また、ビーズ１に対して、同一の標的核酸配列を標的とするフォワードプライマーとリバースライマーの２種類の標的核酸用プライマー２を固定化してもよい。一例として、ビーズ１に対して、同じ分子数のフォワードプライマーとリバースプライマーとが固定化される。
【００１９】
ビーズ１には、標的核酸用プライマー２に加えて、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物１０が固定化されている。一例として、化合物１０は、図１に示されるような構造を有する。図１の化合物１０において、Ｒは置換基を有してもよい炭化水素基、Ａは官能基、Ｙは光分解性保護基を示す。
【００２０】
化合物１０は、紫外線等の光を照射すると、光分解性保護基Ｙが脱保護される。この際、官能基Ａの種類に応じて、プロトンの発生又は取り込みが生じる。例えば、官能基Ａが、−ＣＯ−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＯ−である場合、光分解性保護基Ｙの脱保護により、カルボン酸とアルコールが生じる。また、官能基Ａが、−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＯ−である場合、光分解性保護基Ｙの脱保護により、アミンとカルボン酸が生じる。また、官能基Ａが、−ＳＯ２−Ｏ−又は−Ｏ−ＳＯ２−である場合、光分解性保護基Ｙの脱保護により、スルホン酸とアルコールが生じる。これらの例では、これらの物質の生成により、プロトン発生が生じ、プロトン濃度が増大すると考えられる。なお、官能基Ａの種類は、これらに限定されない。
【００２１】
化合物１０の例としては、アミノ基、カルボニル基、スルホ基等が、光分解性保護基Ｙで保護された化合物を挙げることができる。そのような化合物の例としては、アミノ基、カルボニル基、スルホ基等を有する光分解性カップリング剤等を挙げることができる。また、光分解性カップリング剤の例としては、アミノ基、カルボニル基、スルホ基等を有する光分解性シランカップリング剤等を挙げることができる。光分解性シランカップリング剤の例としては、特開２００３−３２１４７９号、特開２００８−５０３２１号、特開２０１５−２１４５３１号等に記載のもの等を挙げることができる。なお、光分解性保護基Ｙは、光の照射によって脱保護される保護基であり、前記公報に記載されるものに限らず、公知のものを使用することができる。
【００２２】
一例として、化合物１０が光分解性シランカップリング剤である場合、ビーズ１の表面を水酸基で修飾し、化合物１０を反応させることにより、ビーズ１に対する化合物１０の固定化を行うことができる。
【００２３】
図２の例に示すように、ビーズ１に固定化される化合物１０の数は、ビーズ１に固定化される標的核酸用プライマー２の種類毎に異なっている。一例として、標的核酸用プライマー２−１が固定化されたビーズ体１００−１には、全ビーズ体中、１番目に少ない数の化合物１０が固定化されている。また、標的核酸用プライマー２−２が固定化されたビーズ体１００−２には、全ビーズ体中、２番目に少ない数の化合物１０が固定化されている。また、標的核酸用プライマー２−ｍが固定化されたビーズ体１００−ｍには、全ビーズ体中、ｍ番目に少ない数の化合物１０が固定化されている。このように、全ビーズ体中における固定化された化合物１０の数の順位と、標的核酸用プライマー２の種類とは、１対１の対応関係を有している。
【００２４】
本工程では、ビーズ１に標的核酸用プライマー２と化合物１０とが固定化されたビーズ体１００を、核酸を含む試料と接触させる。本実施形態において、核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからの核酸抽出物等を含む試料等を使用することができる。一例として、試料に含まれる核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの例としては、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを挙げることができる。試料に含まれる核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや修飾核酸であってもよい。
【００２５】
ビーズ体１００と核酸を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００と核酸を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００と核酸を含む試料との混合物は、標的核酸用プライマー２が標的核酸とアニーリングし得る条件に置かれる。アニーリング条件は、標的核酸用プライマー２の長さ等に応じて、適宜設定することができる。試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれている場合には、図３に示すように、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングし、ビーズ体１００に標的核酸３が捕捉される。一方、試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれていない場合には、標的核酸用プライマー２は試料中の核酸とはアニーリングしない。したがって、複数のビーズ体を試料と接触させた場合、標的核酸用プライマー２が標的核酸にアニーリングしているビーズ体１００と、標的核酸用プライマー２に標的核酸がアニーリングしていないビーズ体１００との混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００の数は、検出したい標的核酸の数に応じて、適宜選択することができる。
【００２６】
［反応槽へのビーズの配置］
工程（ｂ１）は、核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程である。本実施形態の工程（ｂ）を、図４を参照して、説明する。図４中、２０はビーズ配置用基板であり、２１は反応槽である。この一例においては、ビーズ配置用基板２０は、ｍ×ｎ個（ｍ、ｎはいずれも自然数。）の反応槽２１を備える。この反応槽２１をウエルＷともいう。
【００２７】
また、反応槽２１は、プロトン濃度を検知するためのセンサ３０を備えている。反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１は、センサ３０−１１を備える。ウエルＷｍｎは、センサ３０−ｍｎを備える。一例として、センサ３０は、反応槽２１の底面に配設される。センサ３０の配設位置は、これに限るものではない。また、一例として、センサ３０は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ；ＩＳＦＥＴ）である。
【００２８】
本実施形態において、ビーズ配置用基板２０の材質は、特に限定されないが、ガラス、シリコン、ポリマー等とすることができる。なお、ビーズ配置用基板２０にエラストラマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽２１とビーズ配置用基板２０との間に挟まれたときに生じる反応槽２１全体のビーズ配置用基板２０との密着性に及ぼす悪影響がエラストラマーの局所的な変形により回避される利点がある。
【００２９】
ビーズ配置用基板２０には、複数の反応槽２１が配設されている。配設される反応槽２１の数は、標的核酸用プライマーとのアニーリング工程で使用したビーズ体１００の数以上である必要がある。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１よりも若干大きいサイズである。一例として、ビーズ１のサイズの１〜２倍程度であり、１個のビーズ１を収納可能な程度の大きさとなっている。なお、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁は、核酸等の非特異的吸着を防止するブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メテクリオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等でコーティングされていてもよい。このようなコーティングが施してあることで、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁への核酸の非特異的吸着を抑制することができる。また、一例として絵、反応槽２１の内壁は、親水化されている。内壁が親水化されていることにより、ビーズ体１００の分散液をビーズ配置用基板２０上に滴下した際、反応槽２１内部へのビーズ体１００の充填効率が向上する。
【００３０】
本実施形態の工程（ｂ１）では、図４に示すように、核酸を含む試料と接触させた複数のビーズ体１００を、反応槽２１に、１個ずつ配置する。反応槽２１に、ビーズ体１００を配置する方法は、特に限定されず、例えば、ビーズ体１００を分散させた液体を、ビーズ配置用基板２０上に滴下し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段により、ビーズ体１００を反応槽２１に誘導してもよい。あるいは、ビーズ体１００の分散液にビーズ配置用基板２０を浸漬し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段を用いてもよい。
反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１には、ビーズ体１００−１１が配置される。ウエルＷｍｎには、ビーズ体１００−ｍｎが配置される。
【００３１】
また、ビーズ１に磁気ビーズを用いた場合には、ビーズ配置用基板２０の基板材料下に磁性体板と磁石を配置し、該磁石による磁力によりビーズ体１００を反応槽に誘導することもできる。この場合、基板材料下の磁石をビーズ配置用基板２０に対して平行方向に動かすことで、ビーズ体が分散し、反応槽２１へのビーズ体の充填効率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板２０に印加する磁場の強さは、特に限定されないが、一例として、１００〜１００００ガウスとすることができる。また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、ビーズ体１００は安定した配置を保持し続けることが可能となる。かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を挙げることができる。
【００３２】
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｃ１）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程（ｄ１）で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、ＤＮＡポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽２１の内壁に結合させておいてもよい。
【００３３】
一例として、核酸伸長反応としてＰＣＲ法や等温増幅法等の核酸増幅反応を行う場合は、本工程において、リバースプライマーを添加するもできる。リバースプライマーは、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーとしてもよく、各標的核酸配列に特異的なプライマーとしてもよい。
【００３４】
リバースプライマーは、一例として、ビーズ１に固定化しておくこともできる。また、リバースプライマーが、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーである場合には、一例として、当該ユニバーサルリバースプライマーは、反応槽２１の内壁に固定化しておくこともできる。リバースプライマーをビーズ１又は反応槽２１の内壁に固定化する場合、リバースプライマーは、一例として、ビーズ１側又は反応槽２１の内壁側に光切断部位を有する。光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとしては、例えば、ＰＣ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、特許文献１に記載のものなどを挙げることができる。あるいは、リバースプライマーは、１本鎖核酸切断酵素切断部位を有していてもよい。１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。そのような核酸基としては、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイオシンなどを挙げることができる。核酸増幅反応開始前に、光照射又は１本鎖核酸切断酵素処理を行って、リバースプライマーをビーズ１から切り離すことにより、核酸増幅反応を効率よく行うことが可能になる。
【００３５】
［核酸伸長反応］
工程（ｄ１）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。
核酸伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽２１内の温度を５５〜７０℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。
【００３６】
反応槽２１には、ビーズ体１００が1個ずつ配置されている。標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしているビーズ体１００では、標的核酸３を鋳型として、核酸伸長反応が起こる。一方、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしていないビーズ体１００では、核酸伸長反応は起こらない。
【００３７】
本実施形態において、核酸伸長反応は、必ずしも核酸増幅反応である必要はない。ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の密度が高い場合には、１度の伸長反応で検出に十分なプロトンが発生する。核酸伸長反応を１回しか行わない場合には、反応槽２１にリバースプライマーを添加する必要はない。
【００３８】
一方、本実施形態では、核酸増幅反応を行うこともできる。核酸増幅反応の方法には、公知の方法を用いることができる。一例として、核酸増幅反応には、ＰＣＲ法を用いる。また他の例として、ＬＡＭＰ法などの等温増幅法を用いる。なお、核酸増幅反応を行う場合には、上記のとおり、反応槽２１内にリバースプライマーが存在させておく必要がある。
【００３９】
［核酸伸長反応中のプロトン濃度の測定］
工程（ｅ１）は、核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン濃度を測定する工程である。
【００４０】
まず、図５を参照して、核酸伸長反応におけるプロトンの発生について説明する。図５中、Ｂ１〜Ｂ４は、塩基を示す。図５は、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３の塩基配列を有する核酸に、塩基Ｂ４を有するデオキシヌクレオシド三リン酸が結合して、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する例である。図５に示すように、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３の塩基配列を有する核酸から、１塩基伸長して、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する際には、１分子のプロトンとピロリン酸が放出される。すなわち、核酸伸長反応によって核酸が１塩基伸長すると、１分子のプロトンが発生する。したがって、核酸伸長反応中、各反応槽２１中のプロトン濃度を測定することにより、核酸伸長が生じたか否か反応槽２１毎に判定することができる。本工程において測定されたプロトン濃度は、後述の工程（ｅ）における核酸伸長の有無の判定に供される。
【００４１】
反応槽２１内のプロトン濃度は、センサ３０によって検出される。センサ３０は、一例として、ＩＳＦＥＴである。本実施形態に使用可能なＩＳＦＥＴとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／１０７０１４号に記載のもの等を挙げることができる。
【００４２】
センサ３０がＩＳＦＥＴである場合の、プロトン発生量の測定例について説明する。図５に、各反応槽２１に備えられるセンサ３０の構成を示す。センサ３０は、ゲート絶縁膜ＧＩＦと、Ｎ型半導体ＳＮ（ソースｓｒｃ）と、ソース端子ＴＳと、Ｎ型半導体ＳＮ（ドレインｄｒｎ）と、ドレイン端子ＴＤと、Ｐ型半導体ＳＰと、参照電極ＥＲと、ゲート電源ＶＧと、バイアス電源ＶＢと、電流検出器ＣＤとを備える。これら各部の構成については、既知のＩＳＦＥＴと同様であるため、説明を省略する。センサ３０は、溶液とゲート絶縁膜ＧＩＦとの間に発生する界面電位に応じた電流値のドレイン電流を電流検出器ＣＤによって検出することにより、プロトン濃度を測定する。
【００４３】
［核酸伸長の有無の判定］
工程（ｆ１）は、測定された前記プロトン濃度に基づいて、各反応槽毎に核酸伸長の有無を判定する工程である。
【００４４】
センサ３０による反応槽２１内のプロトン濃度の測定値が上昇したか否かに基づいて、反応槽２１内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽２１内のプロトン濃度が上昇した場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽２１内のプロトン濃度の上昇が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。
【００４５】
本実施形態においては、反応槽２１毎に配置されたセンサ３０によって、個々の反応槽２１内のプロトン濃度を検出し、反応槽２１毎に、核酸伸長の有無を判定する。
なお、センサ３０は、電流検出器ＣＤによって検出されるドレイン電流の大きさに応じて、反応槽２１内に存在する核酸伸長が生じたビーズ体１００の数を検出する構成であってもよい。
【００４６】
［化合物１０の分子数順位の特定］
工程（ｇ１）は、各反応槽に配置されたビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された標的核酸用プライマーの配列を反応槽毎に特定する工程である。
【００４７】
図２に例示するように、ビーズ１には、標的核酸用プライマー２の種類毎に、異なる分子数の化合物１０が固定化されている。紫外線等の光照射によって化合物１０の光分解性保護基Ｙが脱保護されると、ビーズ１に固定化された化合物１０の分子数に応じて、反応槽２１内のプロトン濃度の変化量が変化する。すなわち、ビーズ１に固定化された化合物の分子数が多くなるほど、光分解性保護基Ｙが脱保護されたときに生じるプロトン濃度の変化量は大きくなる。したがって、ビーズ１に対する光照射後のプロトン濃度の変化量を、各反応槽２１毎に順位付けすることにより、ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の配列を特定することができる。
【００４８】
本工程においては、各反応槽２１に配置されたビーズ体１００に対して、紫外線等の光照射を行う。照射する光は、化合物１０に含まれる光分解性保護基Ｙの種類に応じて適宜選択すればよい。一例として、光分解性シランカップリング剤等では、紫外線の照射が挙げられる。
【００４９】
ビーズ体１００に対する光照射の前後において、各反応槽２１毎に、プロトン濃度が測定される。各反応槽２１毎のプロトン濃度は、センサ３０によって測定される。測定された光照射の前後におけるプロトン濃度に基づいて、各反応槽２１毎に、光照射の前後におけるプロトン濃度の変化量を算出することができる。このプロトン濃度の変化量は、ビーズ体１００に固定化される化合物１０の分子数が多いほど、大きくなる。
【００５０】
本実施形態では、一例として、上記算出されたプロトン濃度の変化量に基づいて、各反応槽毎に配置されたビーズ体１００を順位付けする。すなわち、プロトン濃度の変化量が大きい順又は小さい順に、各ビーズ体１００に順位を付ける。この順位は、各ビーズ体１００に固定化される化合物１０の分子数の順位と対応している。したがって、各反応槽２１に配置されたビーズ体１００について、固定化される化合物１０の分子数の順位を特定することができる。
【００５１】
本工程における各反応槽への光照射は、一例として、工程（ｂ１）で各ビーズ体１００を反応槽２１に配置した後、工程（ｃ１）で各反応槽に核酸伸長反応に必要な試薬を添加する前に、行ってもよい。この場合、本工程の後、反応槽２１内を適切な緩衝液で洗浄し、反応槽２１内の反応液を入れ替えてもよい。一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより反応槽２１内の反応液を入れ替えることができる。反応槽２１内の反応液を入れ替えて、本工程で変動したプロトン濃度を初期化することにより、工程（ｄ１）の核酸伸長反応で発生するプロトンの検出を精度よく行うことができる。ただし、本工程の後の反応槽２１の洗浄は必須ではない。
【００５２】
また、一例として、本工程における各反応槽への光照射は、工程（ｄ１）の核酸伸長反応を行い、工程（ｅ１）で核酸伸長反応中のプロトン濃度を測定した後に、行ってもよい。この場合、核酸伸長反応後に、反応槽２１内を適切な緩衝液で洗浄し、反応槽２１内の反応液を入れ替えてもよい。一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、上記と同様に、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより反応槽２１内の反応液を入れ替えることができる。反応槽２１内の反応液を入れ替えて、核酸伸長反応によって生じたプロトンを除去することにより、本工程で生じるプロトン濃度の変化を精度よく検出することができる。ただし、工程（ｄ１）及び工程（ｅ１）の後の反応槽２１の洗浄は必須ではない。
なお、工程（ｆ１）の核酸伸長の有無の判定は、工程（ｅ１）の後であれば、本工程における光照射の前に行ってもよく、本工程における光照射の後に行ってもよい。
【００５３】
［標的核酸用プライマーの特定］
各ビーズ体１００に固定化された標的核酸用プライマー２の種類は、ビーズ体１００に固定化された化合物１０の分子数と対応付けられている。したがって、上記で特定された各反応槽のビーズ体１００の順位に基づいて、ビーズ体１００に固定化された標的核酸用プライマー２の種類を反応槽２１毎に特定することができる。
【００５４】
そして、工程（ｅ）により判定された各反応槽２１における核酸伸長の有無と、本工程により特定された各反応槽２１内の標的核酸用プライマー２の種類との照合により、核酸伸長有と判定された反応槽２１内の標的核酸用プライマー２の種類が特定される。すなわち、核酸を含む試料中に含まれる標的核酸配列を特定することができる。
【００５５】
本実施形態の方法によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた標的核酸用プライマー２を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
【００５６】
本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列の有無を、簡便に判定することができる。また、本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的核酸に対する標的核酸用プライマー２のアニーリングを効率よく行うことができる。
【００５７】
本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。
＜第２実施形態＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体（以下「標的抗原検出用抗体」という）である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。
【００５８】
本実施形態の方法は、（ａ２）タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ２）前記タンパク質を含む試料と接触させた前記ビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、（ｃ２）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ２）前記ビーズが配置された反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ２）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン濃度を測定する工程と、（ｆ２）測定された前記プロトン濃度の上昇に基づいて、各反応槽毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｇ２）前記反応槽に配置された前記ビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記標的抗原検出用抗体の種類を反応槽毎に特定する工程と、の各工程を含む。以下、各工程について説明する。
【００５９】
［標的タンパク質との抗原抗体反応］
工程（ａ２）は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
【００６０】
まず、本実施形態で用いるビーズについて、図９を参照して説明する。図９中、１はビーズ、５は標的抗原検出用抗体、１０は光分解性保護基を有し、かつ光分解性保護基の脱保護によりプロトンの発生又は取り込みを生じ得る化合物、１００−２はビーズ１に標的抗原検出用抗体５及び化合物１０が固定化されたビーズ体、４００は標的タンパク質を示す。
【００６１】
本実施形態においては、第１実施形態の標的核酸用プライマー２に替り、標的抗原検出用抗体５がビーズ１に固定化されている。標的抗原検出用抗体５は、目的とする標的タンパク質に特異的に結合し得る抗体である。標的抗原検出用抗体５は、公知の抗体取得方法により、得ることができる。また、標的抗原検出用抗体５は、どのような動物由来のものであってもよい。マウス抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体等、当技術分野で一般的に用いられる抗体を使用することができる。また、標的抗原検出用抗体５は、キメラ抗体、ヒト化抗体等の組み換え抗体であってもよい。また、標的抗原検出用抗体５は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等の抗体断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原に対する特異性及び結合性が維持されるこれらの抗体断片を包含する。
【００６２】
標的抗原検出用抗体５のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、第１実施形態の標的核酸用プライマー２同様に、アビジン-ビオチン結合を利用した固定化することができる。また、標的抗原検出用抗体５をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
【００６３】
標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１に対して、複数分子を固定化することができる。一例として、標的抗原検出用抗体５は、２分子以上がビーズ１に固定化される。標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１の表面積に応じて、アニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的抗原検出用抗体５を固定化する場合、１つのビーズ１に固定化される標的抗原検出用抗体５は、全て同一のタンパク質を標的とする。
【００６４】
ビーズ１には、標的抗原検出用抗体５が標的とするタンパク質の種類毎に、異なる分子数の化合物１０が固定化されている。化合物１０は、標的核酸用プライマー２の種類に替り標的抗原検出用抗体５の種類に対応させている他は、第１実施形態と同様である。また、ビーズ１についても、第１実施形態と同様である。
【００６５】
本実施形態の工程（ａ２）では、ビーズ１に標的抗原検出用抗体５及び化合物１０が固定化されたビーズ体１００−２を、タンパク質を含む試料と接触させる。本実施形態において、タンパク質を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからのタンパク質抽出物等を含む試料等を使用することができる。試料に含まれるタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、修飾タンパク質や組み換えタンパク質等であってもよい。
【００６６】
ビーズ体１００−２とタンパク質を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００−２とタンパク質を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００とタンパク質を含む試料との混合物は、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質に結合し得る条件に置かれる。結合条件は、標的抗原検出用抗体５の種類等に応じて、適宜設定することができる。
【００６７】
図９において、ビーズ体１００−２をタンパク質を含む試料と接触させると、該試料に標的タンパク質４００が含まれている場合、標的抗原検出用抗体５は、標的タンパク質４００に結合する。すなわち、標的タンパク質４００は、標的抗原検出用抗体５に結合し、ビーズ体１００−２に捕捉される。一方、試料中に標的タンパク質４００が含まれていない場合には、標的抗原検出用抗体５には何も結合しない。したがって、複数のビーズ体１００−２を試料と接触させた場合、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合しているビーズ体１００−２と、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合していないビーズ体１００−２との混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００−２の数は、検出したい標的タンパク質の数に応じて、適宜選択することができる。
【００６８】
［反応槽へのビーズの配置］
本実施形態の工程（ｂ２）は、第１実施形態の工程（ｂ１）と同様に行うことができる。
【００６９】
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｃ２）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
【００７０】
本実施形態の工程（ｃ２）では、第１実施形態の工程（ｃ１）で添加する試薬に加えて、シグナル生成用核酸３１０を結合させた２次抗体３０１を添加する。２次抗体３０１は、標的タンパク質４００に特異的に結合し得る抗体である。２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同じ抗体であってもよく、違う抗体であってもよい。一例として、２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同一のタンパク質に結合し、異なるエピトープを有する抗体である。
【００７１】
２次抗体３０１には、一例として、図９に示すように、シグナル生成用核酸３１０が結合されている。２次抗体３０１とシグナル生成用核酸３１０との結合は、一例として、アビジン-ビオチン結合を利用して行うことができる。
【００７２】
シグナル生成用核酸３１０は、一例として、図９に示すように、プライマーアニーリング領域３１１とシグナル生成用配列３１２とを含む。プライマーアニーリング領域３１１は、シグナル生成用核酸３１０の３’側に位置している。シグナル生成用核酸３１０は、一例として、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列であることができる。また、シグナル生成用核酸３１０は、一例として、プライマーアニーリング領域３１１が、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列である。シグナル生成用核酸３１０の配列は、特に限定されず、適宜選択することができる。なお、図９において、３００は、２次抗体３０１にシグナル生成用核酸３１０を結合させた複合体プローブを示す。
【００７３】
本工程では、一例として、複合体プローブ３００は、核酸伸長反応に必要な他の試薬を添加する前に、反応槽２１に添加される。この場合、一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００を反応槽２１から除去することができる。なお、複合体プローブ３００は、後述する工程（ｄ２）の核酸伸長反応の前であれば、どのようなタイミングで、試料又は反応槽２１に添加してもよい。
【００７４】
本工程においては、複合体プローブ３００に加えて、さらに、シグナル生成用プライマー３２０を添加する。シグナル生成用プライマー３２０は、複合体プローブ３００の添加後に反応槽２１に添加される。一例として、シグナル生成用プライマー３２０の添加前に、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００は、洗浄により反応槽２１から除去される。シグナル生成用プライマー３２０の反応槽２１への添加は、一例として、他の核酸伸長に必要な試薬と共に行うことができる。
【００７５】
上記以外の核酸伸長反応に必要な試薬については、第１実施形態の工程（ｃ１）と同じである。
【００７６】
［核酸伸長反応］
工程（ｄ２）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｄ１）と同様に行うことができる。なお、本工程では、図９に示すように、シグナル生成用配列３１２を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第１実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体５に標的タンパク質４００が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。
［プロトン濃度の検出］
工程（ｅ２）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量の測定をする工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｅ１）と同様に行うことができる。
［核酸増幅の有無の判定］
工程（ｆ２）は、工程（ｅ２）で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｆ１）と同様に行うことができる。
【００７７】
［化合物１０の分子数順位の特定］
工程（ｇ２）は、反応槽に配置されたビーズに光を照射し、前記光照射の前後における各反応槽内のプロトン濃度の変化量に基づいて、前記ビーズに固定化された前記リガンドの種類を反応槽毎に特定する工程である。
【００７８】
本工程も、第１実施形態における標的核酸用プライマー２に替えて、標的抗原検出用抗体５を用いている以外は、第１実施形態と同様に行うことができる。すなわち、第１実施形態と同様に、各反応槽におけるビーズ１に固定化された化合物１０の分子数の順位を特定し、該化合物１０の分子数の順位に基づいて、各反応槽における標的抗原検出用抗体５の種類を特定することができる。
【００７９】
各反応槽２１における化合物１０の分子数の順位の特定は、第１実施形態と同様に、行うことができる。例えば、各反応槽２１に配置されたビーズ体１００に対して、紫外線等の光照射を行い、当該光照射の前後におけるプロトン濃度の変化量を各反応槽２１毎に算出する。そして、前記各反応槽２１毎に算出されたプロトン濃度の変化量に基づいて、各反応槽２１における化合物１０の分子数の順位付けを行うことができる。
【００８０】
本実施形態における各反応槽への光照射も、第１実施例と同様に、一例として、工程（ｂ２）で各ビーズ体１００を反応槽２１に配置した後、工程（ｃ２）で各反応槽に核酸伸長反応に必要な試薬を添加する前に、行ってもよい。第１実施形態と同様に、本工程の後、反応槽２１内を適切な緩衝液で洗浄し、反応槽２１内の反応液を入れ替えてもよい。一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより反応槽２１内の反応液を入れ替えることができる。反応槽２１内の反応液を入れ替えて、本工程で変動したプロトン濃度を初期化することにより、工程（ｄ２）の核酸伸長反応で発生するプロトンの検出を精度よく行うことができる。ただし、本工程の後の反応槽２１の洗浄は必須ではない。
【００８１】
また、第１実施形態と同様に、一例として、本工程における各反応槽への光照射は、工程（ｄ２）の核酸伸長反応を行い、工程（ｅ２）で核酸伸長反応中のプロトン濃度を測定した後に、行ってもよい。第１実施形態と同様に、核酸伸長反応後に、反応槽２１内を適切な緩衝液で洗浄し、反応槽２１内の反応液を入れ替えてもよい。一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、上記と同様に、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより反応槽２１内の反応液を入れ替えることができる。反応槽２１内の反応液を入れ替えて、核酸伸長反応によって生じたプロトンを除去することにより、本工程で生じるプロトン濃度の変化を精度よく検出することができる。ただし、工程（ｄ２）及び工程（ｅ２）の後の反応槽２１の洗浄は必須ではない。
なお、第１実施形態と同様に、工程（ｆ２）の核酸伸長の有無の判定は、工程（ｅ２）の後であれば、本工程における光照射の前に行ってもよく、本工程における光照射の後に行ってもよい。
【００８２】
［標的抗原検出用抗体の特定］
第１実施形態と同様に、各ビーズ体１００に固定化された標的抗原検出用抗体５の種類は、ビーズ体１００に固定化された化合物１０の分子数と対応付けられている。したがって、上記で特定された各反応槽のビーズ体１００の順位に基づいて、ビーズ体１００に固定化された標的抗原検出用抗体５の種類を反応槽２１毎に特定することができる。
【００８３】
そして、工程（ｆ２）により判定された各反応槽２１における核酸伸長の有無と、本工程により特定された各反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類との照合により、核酸伸長有と判定された反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類が特定される。すなわち、タンパク質を含む試料中に含まれる標的タンパク質を特定することができる。
【００８４】
本実施形態の方法によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、標的タンパク質４００が結合した標的抗原検出用抗体５を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的タンパク質を特定することができる。
【００８５】
本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的タンパク質に対する標的抗原検出用抗体５の結合を効率よく行うことができる。
本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。
【００８６】
本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。
【００８７】
＜標的生体分子特定装置＞
［標的核酸配列特定装置の構成例］
上述した第１実施形態の方法を実現する標的核酸配列特定装置２００の構成の一例について、図７及び図８を参照して説明する。
図７は、本実施形態における標的核酸配列特定装置２００の構成の一例を示す図である。標的核酸配列特定装置２００は、ビーズ配置用基板２０と、演算装置２１０とを備える。
ビーズ配置用基板２０は、反応槽２１と、センサ３０とをそれぞれ複数備える。１つの反応槽２１には、１つのビーズ１が配置される。このビーズ１には、上述した標的核酸用プライマー２と、化合物１０とが固定化されている。この化合物１０は、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた分子数がビーズ１に固定化されている。つまり、反応槽２１には、標的核酸用プライマー２と、当該標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた分子数の化合物１０とが固定化されたビーズ１が配置される。標的核酸用プライマー２の核酸の配列と、化合物１０の分子数との対応関係は、演算装置２１０が備える核酸配列記憶部２１４に記憶されている。この核酸配列記憶部２１４の構成の具体例について、図８を参照して説明する。
【００８８】
図８は、本実施形態における核酸配列記憶部２１４の構成の一例を示す図である。核酸配列記憶部２１４には、ビーズＩＤと、ビーズ１に固定化された化合物１０の分子数の順位を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。ここで、ビーズＩＤとは、ビーズ１の種類、すなわち、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の配列の種類を識別する情報である。より具体的には、ビーズＩＤ−１００Ａには、分子数順位Ａと、標的核酸用プライマー配列Ａとが対応付けられている。つまり、核酸配列記憶部２１４に記憶されている情報によれば、ビーズ１に固定化される化合物１０の分子数順位を特定すれば、この分子数順位に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定することができる。
【００８９】
図７に戻り、演算装置２１０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を備えており、その機能部としての核酸伸長判定部２１１と、ビーズ特定部２１２と、標的核酸配列特定部２１３とを備えている。
核酸伸長判定部２１１は、核酸伸長反応中に、センサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽２１内における核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。具体的には、核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸伸長判定部２１１は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸伸長の有無を判定する。ここで、センサ３０は反応槽２１毎に備えられている。核酸伸長判定部２１１は、反応槽２１毎にセンサ３０の出力電流値を取得することにより、核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。
【００９０】
ビーズ特定部２１２は、光照射の前後でセンサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトン濃度に基づいて、光照射前後におけるプロトン濃度の変化量を算出する。ビーズ特定部２１２は、算出されたプロトン濃度の変化量に基づいて、化合物１０の分子数順位を反応槽２１毎に特定する。化合物１０の分子数順位の特定の具体的な手順については、上述の［化合物１０の分子数順位の特定］において詳細に説明したため、ここでの説明を省略する。
【００９１】
標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定部２１２が特定する化合物１０の分子数順位に基づいて、標的核酸用プライマー２の配列を反応槽２１毎に特定する。具体的には、標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定部２１２が特定した化合物１０の分子数順位を示す情報を取得する。標的核酸配列特定部２１３は、取得した化合物１０の分子数順位を示す情報を検索キーにして核酸配列記憶部２１４を検索する。上述したように、核酸配列記憶部２１４には、化合物１０の分子数順位を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。したがって、標的核酸配列特定部２１３は、化合物１０の分子数順位を示す情報を検索キーにした核酸配列記憶部２１４の検索の結果、化合物１０の分子数順位を示す情報に対応する標的核酸用プライマー２の配列を示す情報を得る。つまり、標的核酸配列特定部２１３は、化合物１０の分子数順位に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。標的核酸配列特定部２１３は、反応槽２１毎に上述の手順を繰り返すことにより、反応槽２１毎に化合物１０の分子数順位に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。
【００９２】
本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていない場合に、反応槽２１の番号と、当該反応槽２１に配置されたビーズ１の種類との対応関係を特定することができる。
【００９３】
なお、演算装置２１０は、その機能部としての伸長核酸種類特定部２１５を更に備えていてもよい。伸長核酸種類特定部２１５は、核酸伸長判定部２１１の判定結果と、標的核酸配列特定部２１３が特定した標的核酸用プライマー２の配列とに基づいて、核酸伸長有又は核酸伸長無と判定されたビーズ１の標的核酸用プライマー２の配列を特定する。この伸長核酸種類特定部２１５を備えることにより、複数の種類の標的核酸用プライマー２のうち、いずれの標的核酸用プライマー２によって核酸伸長が生じたのか（又は、生じなかったのか）を判定することができる。つまり本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
【００９４】
本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた標的核酸用プライマー２を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
【００９５】
本実施形態の標的核酸配列特定装置２００は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。
【００９６】
なお、本実施形態における標的核酸配列特定装置２００の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。
【００９７】
なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。
【００９８】
さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
【００９９】
［標的タンパク質特定装置の構成例］
上述した第２実施形態の方法を実現する標的タンパク質特定装置２００−２の構成は、上述の標的核酸配列特定装置２００において、標的核酸配列特定部２１３に替えて標的タンパク質特定部２１３−２、核酸配列記憶部２１４に替えて抗原記憶部２１４−２、伸長核酸種類特定部２１５に替えて結合タンパク質種類特定部２１５−２を備えたものとすることができる。図１０は、本実施形態における標的タンパク質特定装置２００−２の構成の一例を示す図である。また、図１１は、抗原記憶部２１４−２の構成の一例を示す図である。抗原記憶部２１４−２には、ビーズＩＤと、ビーズ１に固定化されたかごうぶつ１０の分子数の順位を示す情報と、標的抗原検出用抗体５の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。
【０１００】
本実施形態の標的タンパク質特定装置２００−２によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた反応槽２１に配置された標的抗原検出用抗体５を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的タンパク質を特定することができる。
【０１０１】
本実施形態の標的タンパク質特定装置２００−２は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。
【０１０２】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【符号の説明】
【０１０３】
１…ビーズ、２…標的核酸用プライマー、３…標的核酸、５…標的抗原検出用抗体、１０…光分解性保護基を有し、かつ脱保護によりプロトン濃度の変化を生じ得る化合物、２０…ビーズ配置用基板、２１…反応槽、３０…センサ、１００，１００−２…ビーズ体、２００…標的核酸配列特定装置、２００−２…標的タンパク質特定装置、２１１…核酸伸長判定部、２１２…ビーズ特定部、２１３…標的核酸配列特定部、２１３−２…標的タンパク質特定部、２１４…核酸配列記憶部、２１４−２…抗原記憶部、２１５…伸長核酸種類特定部、２１５−２…結合タンパク質種類特定部。
【図１】
2017209050.tif 000003
【図２】
2017209050.tif 000004
【図３】
2017209050.tif 000005
【図４】
2017209050.tif 000006
【図５】
2017209050.tif 000007
【図６】
2017209050.tif 000008
【図７】
2017209050.tif 000009
【図８】
2017209050.tif 000010
【図９】
2017209050.tif 000011
【図１０】
2017209050.tif 000012
【図１１】
2017209050.tif 000013