(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を効率良く凝集させ、かつ、未分化状態を保持しながら細胞を増殖させて、播種された細胞の損失を防止し、且つ均一なサイズの細胞凝集塊を形成することを目的とする。【解決手段】本発明に係る細胞培養担体は、多孔体からなるとともに、上面に複数のウェル３を有する基体２を備え、前記基体の上面の前記ウェルを除く部分の細胞接着性が前記ウェル内面の細胞接着性よりも低く形成されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔体からなるとともに、上面に複数のウェルを有する基体を備え、
前記基体の上面の前記ウェルを除く部分の細胞接着性が前記ウェル内面の細胞接着性よりも低く形成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
少なくとも前記基体の上面の前記ウェルを除く部分に、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることを特徴とする請求項１に記載された細胞培養担体。
【請求項３】
前記細胞非接着性膜は、ゼラチンを含む材料、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポロキサマー、ウシ血清アルブミン、ラミニンの少なくとも１種を含む材料により形成されていることを特徴とする請求項２に記載された細胞培養担体。
【請求項４】
前記請求項１乃至請求項３のいずれかに記載された細胞培養担体を用いる細胞培養モジュールであって、
前記細胞培養担体の裏面側に吸引部または／および表面側に加圧部を設けたことを特徴とする細胞培養モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や体性幹細胞等の未分化な細胞の培養に好適な細胞培養担体および細胞培養モジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離、目的とする組織細胞への分化・誘導、三次元培養技術、足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁、靭帯等の組織を作製することが可能となり、一部では、既に臨床応用が開始されている。
【０００３】
一方、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞に代表される未分化細胞は、他のすべての組織細胞に分化することができる全能性を有する細胞であることから、再生医療への応用が期待されている細胞である。このため、未分化細胞から組織細胞への分化誘導法の研究が盛んに進められている。
前記ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を再生医療の目的で使用するためには、これらの細胞を大量に増殖させる技術が必要である。
【０００４】
従来、上記のようなＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等に代表される未分化な細胞を増殖または維持するための一般的な培養担体としては、プラスチックシャーレ上に、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、マトリゲル等の生体内成分をコーティングしたものに、マウス由来やヒト組織由来の支持細胞を増殖させたものが用いられている。
【０００５】
例えば特許文献１には、表面が多孔体からなる複数の凹部（ウェル）が、基体表面にマトリックス状に配列されている細胞培養担体が開示されている。この特許文献１に示された細胞培養担体の構造の模式図を図６に示す。
この細胞培養担体３０は、表面が多孔体からなる複数の凹部（ウェル）３１が、基体表面にマトリックス状に配列されているものである。このような形状の細胞培養担体３０を用いることにより、基体表面に形成された凹部（ウェル）内３１のみで細胞を増殖させることが可能となり、ＥＳ細胞等の未分化細胞の細胞凝集塊（スフェロイド）のサイズ制御を行うことができる。
【０００６】
また、前記凹部３１の表面を多孔体で構成することにより、培養細胞が細胞培養担体３０の凹部３１内へ適度に接着し、かつ、剥離しやすくなる。
このため、培養細胞を回収する際、特に、ヒトｉＰＳ細胞等において好ましくない、長時間の酵素処理を要することなく、培養細胞の該培養担体に対する付着および剥離を、より効率的に行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、前記特許文献１に示された細胞培養担体にあっては、上記したように、ＥＳ細胞等の細胞凝集塊のサイズ制御が可能となり、培養細胞の該培養担体に対する付着および剥離を、より効率的に行うことができる。
しかしながら、図６に示すように細胞培養担体３０の表面３０ａに播種された未分化細胞は、自然沈降によって複数の凹部（ウェル）３１以外の細胞培養担体表面３０ａに播種される。その状態を図７に示す。尚、図７中、斜線部分は未分化細胞が播種された領域を示している。
【０００９】
このように播種された細胞は、複数の凹部（ウェル）３１内にだけでなく、凹部（ウェル）３１以外の細胞培養担体表面３０ａにも存在する。
この細胞培養担体表面３０ａに付着した未分化細胞のうち、細胞塊を形成できない細胞は死滅し、細胞塊を形成した細胞は不均一な細胞塊となるため、播種された細胞の多くが損失されることとなり、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を効率的に培養することができないという技術的課題があった。
【００１０】
本願発明者は、上記技術的課題を解決するために、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を細胞培養担体表面に播種する際、複数の凹部以外に播種された未分化細胞を凹部（ウェル）内へ導くことを前提に、細胞培養担体に改良を加え、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を効率良く凝集させ、かつ、未分化状態を保持しながら細胞を増殖させて、播種された細胞の損失を防止し、且つ均一なサイズの細胞凝集塊を形成することができる細胞培養担体、及び細胞培養モジュールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するためになされた本発明にかかる細胞培養担体は、多孔体からなるとともに、上面に複数のウェルを有する基体を備え、前記基体の上面の前記ウェルを除く部分の細胞接着性が前記ウェル内面の細胞接着性よりも低く形成されていることに特徴を有する。
尚、少なくとも前記基体の上面の前記ウェルを除く部分に、細胞の接着性を低下させる細胞非接着性膜が形成されていることが望ましい。
また、前記細胞非接着性膜は、ゼラチンを含む材料、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポロキサマー、ウシ血清アルブミン、ラミニンの少なくとも１種を含む材料により形成されていることが望ましい。
【００１３】
このように構成することにより、細胞の播種時に細胞培養担体の裏面側から吸引または／および表面側から加圧した際、基体上面においてウェルを除く部分の細胞接着性が、ウェル内よりも低いため、そこに播種された細胞を損失することなく効率的にウェル内に集めることができる。即ち、細胞培養担体に播種した細胞の殆どをウェル内に細胞凝集塊として取り込むことができる。
【００１４】
また、上記目的を達成するためになされた本発明にかかる細胞培養モジュールは、前記した細胞培養担体を用いる細胞培養モジュールであって、前記細胞培養担体の裏面側に吸引部または／および表面側に加圧部を設けたことに特徴を有する。
このようなモジュールによれば、基体上面においてウェルを除く部分の細胞接着性が、ウェル内よりも低いため、そこに播種された細胞を損失することなく効率的にウェル内に集めることができる。即ち、細胞培養担体に播種した細胞の殆どをウェル内に細胞凝集塊として取り込むことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の未分化細胞を効率良く凝集させ、かつ、未分化状態を保持しながら細胞を増殖させて、播種された細胞の損失を防止し、且つ均一なサイズの細胞凝集塊を形成することができる細胞培養担体、及び細胞培養モジュールを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の細胞培養担体の第１の実施形態を示す概念図（斜視図）である。
【図２】図２は、図１のＩ−Ｉ断面図である。
【図３】図３は、図１の細胞培養担体を保持するモジュールを模式的に示す断面図である。
【図４】図４は、図１の細胞培養担体の変形例を示す断面図である。
【図５】図５は、図１の細胞培養担体の他の変形例を示す断面図である。
【図６】図６は、従来の細胞培養担体を示す概念図（斜視図）である。
【図７】図７は、従来の細胞培養担体に未分化細胞を播種した状態を示す概念図（断面図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明にかかる細胞培養担体の第１の実施形態を、図1及び図２に基づいて説明する。
図示するように、この第１の実施形態の細胞培養担体１は、上面に複数のウェル３を有し、例えば平均細孔径が０．２μｍである細孔ｃを有し、気孔率が約４０％の多孔体からなる基体２から構成されている。前記基体２は、セラミックス多孔質焼成体で形成されている。図１に示すように、セラミックス粒子Ｓの間に前記細孔ｃが形成され、前記所定の気孔率に形成されている。
また、図２に示すように、前記基体２の厚さ寸法ｔ１（基体２の表面２ａから下面（裏面）２ｂまでの距離）は例えば２ｍｍに形成され、ウェル３の開口部の直径ｄは例えば２００〜３００μｍに形成され、深さｔ２（基体２の表面２ａからウェル最底部３ａまでの距離）は例えば２００〜３００μｍに形成されている。ここで、前記基体２は気孔率が３０％以上８０％以下、平均細孔径が０．０１μｍ以上１．０μｍ以下であることが好ましい。
【００１８】
このように、前記基体２は、特定の細孔径及び気孔率を有する多孔体から構成されているため、細胞培養担体１に未分化細胞を播種の際、図３に模式的に示すようなモジュール容器５（細胞培養モジュール）内に細胞培養担体１を配置し、例えば図２に矢印で示すように細胞培養担体１（基体２）の裏面側に設けた吸引部５ａから吸引を行うことができる（または、細胞培養担体１の上面側（表面側）に設けた加圧部５ｂから加圧してもよい）。
また、特定の平均細孔径とすることにより、細胞培養担体１のウェル３内に培養細胞が適度に接着することができ、かつ、より容易に剥離することができる。
【００１９】
また、図２に示すように前記基体２の上面において、前記複数のウェル３を除く部分には、所定厚さの細胞非接着性膜４が形成されている。この細胞非接着性膜４は、細胞の接着性を著しく低下させる物質、例えば、動物の結合組織の主成分であるコラーゲンから抽出したゼラチンにより形成されている。それにより細胞培養担体１表面において前記ウェル３を除く部分の細胞接着性が、前記ウェル３内面よりも低くなされている。なお、前記細胞非接着性膜４は、基体２の上面において、複数のウェル３を除く部分の全面に形成されていてもよいし、ある程度の面積に点在していてもよい。前記細胞非接着性膜４を基体２の上面に点在させる場合は、点在させた細胞非接着性膜４の総面積が基体２上面の面積の５０％以上になるように設けるのが好ましい。また、前記細胞非接着膜４の膜厚は特に限定されるものではないが、１０ｎｍ〜１０μｍの範囲であればよい。
【００２０】
尚、このように細胞接着性の差異を持たせるために、前記細胞非接着性膜４は、前記ゼラチンの他、寒天の主要な多糖成分であるアガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（poly 2-hydroxyethyl methacrylate,poly-HEMA）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ラミニン、ブロック重合体であるｐｏｌｏｘａｍｅｒのいずれかにより形成されてもよい。
また、細胞培養担体１の上面においてウェル３を除く部分に前記細胞非接着性膜４を形成するには、前記した細胞非接着性膜４の材料を溶かして溶液とし、例えばろ紙、スポンジ材、多孔性のゴム等に浸漬し、これを細胞培養担体１の上面に軽く押し当てる。それにより、ウェル３内部には前記溶液は入り込まず、ウェル３を除く部分に細胞非接着性膜４を形成することができる。
【００２１】
このように細胞培養担体１において、ウェル３を除く部分の細胞接着性が、前記ウェル３内面より低くなされることにより、例えば、細胞培養担体１をモジュール等の容器に組み込み、細胞培養担体１の裏側から減圧吸引（或いはウェル３側から加圧）すれば、ウェル３を除く部分に播種された細胞を損失させずに効率的にウェル３内に集めることができる。
【００２２】
尚、図２に示すように細胞非接着性膜４は細胞培養担体１上面においてウェル３を除く部分のみに形成したが、少なくともウェル３を除く部分に形成されていればよく、図２に示した形態に限定されるものではない。
例えば、図４に示すように、ウェル３の開口部からウェル３内の所定の深さまで細胞非接着性膜４を形成してもよい。
或いは、図５に示すように、細胞非接着性膜４の縁がウェル３の開口部内（中空）まで突出するように形成してもよい。
【００２３】
また、前記ウェル３の形状は、特に限定されるものではなく、基体２の表面２ａに上記サイズでの加工が可能である限り、種々の形状とすることができる。
特に、本発明に係る細胞培養担体１から剥離した細胞塊を浮遊培養に用いる場合には、剥離性および形成する塊の形状等の観点から、底面が半球状であることが好ましい。
また、本発明においては、ウェル３のサイズを径と深さで表現しているが、本発明でいうウェル３の径ｄは、開口面が多角形状である場合、細胞培養担体１の基体２の表面２ａのウェル３の開口面積を円に置き換えた場合の直径である。また、深さｔ２は、ウェル３の最も深い部分の深さである。
【００２４】
本発明に係る細胞培養担体１の材料としては、非金属無機材質が好ましく、特に、セラミックスが好適に用いられる。具体的な材質としては、生体安全性の高い、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、アルミナ−シリカ、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム等が挙げられるが、これらの中でも、生体安定性が確認されている、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、チタニアがより好ましい。特に、ジルコニアまたはアルミナが好ましい。
前記細胞培養担体１は、前記材料を用いて製作される多孔質焼成体であり、これにより培養担体に接着している細胞にも培養液を十分供給できる。
【００２５】
本発明にかかる細胞培養担体１を用いることにより、それぞれのウェル３の最底面部３ａに均一に未分化細胞を集めることができ、未分化の状態を保持したまま、細胞塊を形成することができ、均一なサイズの細胞塊を未分化な状態を保持したまま、大量かつ効率的に培養することができる。
尚、細胞培養担体１（基体２）の裏面側から正の圧力を加えることにより、吸引の場合と同様に、前記基体２の表面２ａと、ウェル最底部３ａとの間に圧力損失の差が生じ、培養細胞塊を細胞培養担体１から容易に剥離させることもできる。
【００２６】
以上説明したように、本発明にかかる細胞培養担体及び細胞培養モジュールにあっては、細胞の播種時に細胞培養担体の裏面側から吸引または／および表面側から加圧した際、基板２上面２ａにおいてウェル３を除く部分の細胞接着性が、ウェル３内よりも低いため、そこに播種された細胞を損失することなく効率的にウェル３内に集めることができる。即ち、細胞培養担体１に播種した細胞の殆どをウェル３内に細胞凝集塊として取り込むことができる。
【００２７】
尚、前記実施の形態においては、基体２の上面に細胞非接着性膜４を形成することにより、ウェル３を除く部分の細胞接着性を低下させるものとしたが、本発明にあっては、その構成に限定されるものでなく、ウェル３を除く部分の細胞接着性がウェル３内の細胞接着性よりも低くなれば如何なる構成も採用することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により限定解釈されるものではない。
細胞培養担体の基体を下記製造方法により製作した。
【００２９】
〈基体の作製および細胞培養担体の評価〉
（実施例１）
原料として平均粒径０．５μｍのアルミナ粉末（住友化学社製、ＡＫＰ−２０Ｃ）２００ｇと、分散剤としてポリアクリル酸アンモニウム（東亜合成社製、アロンＡ−３０ＳＬ）４ｇ及びエポキシ樹脂（ナガセケムテックス社製、デナコールＥＸ−６１４Ｂ）７ｇを、分散溶媒として純水５０ｇを、ボールミルで１５時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
【００３０】
さらにゲル化剤として３，３’−ジアミノジプロピルアミン（東京化成工業社製）２ｇを加えて、型に流し込み、アルミナ成形体を得た。この成形体を、１１００℃で２時間焼成して、アルミナセラミックス焼結体を得た。この得られた焼結体に、所定のウェルを多数形成し基体とした。
この基体の厚さを、２ｍｍ、また、前記ウェルの直径を２００μｍ、深さを２００μｍとした。この基体の平均細孔径は、０．２μｍ、気孔率は約４０％であった。
【００３１】
また、この基体の前記ウェルを除く部分の表面に細胞非接着性膜としてゼラチンを塗布した。具体的には、３％ゼラチン水溶液を浸み込ませたろ紙をクリーンベンチ内に置き、基体上面を軽く押し付け、基体上面の凹部を除く部分にゼラチン塗布し、クリーンベンチ内で一晩、ＵＶ照射して殺菌した。
この基体にヒトｉＰＳ細胞５×１０５個をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline；リン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌに懸濁させた懸濁液（５×１０５個／ｍｌ）を播種し、基体の下方より真空ポンプを用いて−９９ｋＰａで約９０秒吸引した後、ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。細胞懸濁培養液の吸引速度は約１０ｍｉｎ／ｍｌであった。
【００３２】
培養して１日経過後、培地交換を行い、回収した培地中の細胞数を数えた結果、細胞数は１×１０３個であった。
また、培養後の基体を１％グルタルアルデヒドで固定し、１％酸化オスミウムで処理後、凍結乾燥したサンプルをＳＥＭ（走査電子顕微鏡）観察した結果、培養１日後の基体上面のウェルを除く部分には細胞は殆ど無いことを確認した。更に培養３日目のサンプルには、基体上面のウェルを除く部分には細胞が無く、ウェル内には均一な細胞凝集塊を確認することができた。
以上の実施例１により、播種細胞を殆ど失うことなく、効率的に細胞凝集塊を形成できることを確認した。
【００３３】
（実施例２）
原料として平均粒径０．５μｍのアルミナ粉末（住友化学社製、ＡＫＰ−２０Ｃ）２００ｇと、分散剤としてポリアクリル酸アンモニウム（東亜合成社製、アロンＡ−３０ＳＬ）４ｇ及びエポキシ樹脂（ナガセケムテックス社製、デナコールＥＸ−６１４Ｂ）７ｇを、分散溶媒として純水５０ｇを、ボールミルで１５時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
【００３４】
さらにゲル化剤として３，３’−ジアミノジプロピルアミン（東京化成工業社製）２ｇを加えて、型に流し込み、アルミナ成形体を得た。この成形体を、１１００℃で２時間焼成して、アルミナセラミックス焼結体を得た。この得られた焼結体に、所定のウェルを多数形成し基体とした。
この基体の厚さを、２ｍｍ、前記ウェルの直径を３００μｍ、深さを３００μｍとした。この基体の平均細孔径は、０．２μｍ、気孔率は約３８％であった。
【００３５】
この基体上面のウェルを除く部分に、細胞非接着性膜としてポリヒドロキシエチルメタクリレート（poly 2-hydroxyethyl methacrylate,poly-HEMA,SIGMA,P3932）を塗布した。具体的には、ポリヒドロキシエチルメタクリレート１．２ｇを９５％エタノール４０ｍｌに溶かし、その溶液を浸み込ませたろ紙をクリーンベンチ内に置き、基体表面を軽く押し付け、基体上のウェルを除く部分にｐｏｌｙ−ＨＥＭＡを塗布した後、クリーンベンチ内で一晩ＵＶ照射し滅菌した。
この基体にヒトｉＰＳ細胞５×１０５個をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline；リン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌに懸濁させた懸濁液（５×１０５個／ｍｌ）を播種し、基体の下方より真空ポンプを用いて−９９ｋＰａで約９０秒吸引した後、ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。細胞懸濁培養液の吸引速度は約１０ｍｉｎ／ｍｌであった。
【００３６】
培養して１日経過後、培地交換を行い、回収した培地中の細胞数を数えた結果、細胞数は２×１０３個であった。
また、培養後の基体を１％グルタルアルデヒドで固定し、１％酸化オスミウムで処理後、凍結乾燥したサンプルをＳＥＭ（走査電子顕微鏡）観察した結果、培養１日後の基体上面のウェルを除く部分には細胞は殆ど無いことを確認した。更に培養３日目のサンプルには、基体上面のウェルを除く部分には細胞が無く、ウェル内には均一な細胞凝集塊を確認することができた。
以上の実施例２により、播種細胞を殆ど失うことなく、効率的に細胞凝集塊を形成できることを確認した。
【００３７】
（比較例１）
原料として平均粒径０．５μｍのアルミナ粉末（住友化学社製、ＡＫＰ−２０Ｃ）２００ｇと、分散剤としてポリアクリル酸アンモニウム（東亜合成社製、アロンＡ−３０ＳＬ）４ｇ及びエポキシ樹脂（ナガセケムテックス社製、デナコールＥＸ−６１４Ｂ）７ｇを、分散溶媒として純水５０ｇを、ボールミルで１５時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
【００３８】
さらにゲル化剤として３,３’−ジアミノジプロピルアミン（東京化成工業社製）２ｇを加えて、型に流し込み、アルミナ成形体を得た。この成形体を、１１００℃で２時間焼成して、アルミナセラミックス焼結体を得た。この得られた焼結体に、所定のウェルを多数形成し基体とした。
この基体の厚さを２ｍｍ、前記ウェルの直径を２００μｍ、深さを２００μｍとした。この基体の平均細孔径は、０．２μｍ、気孔率は約４０％であった。
【００３９】
この基体にヒトｉＰＳ細胞５×１０５個をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline；リン酸緩衝生理食塩水）１ｍｌに懸濁させた懸濁液（５×１０５個／ｍｌ）を播種し、基体の下方より真空ポンプを用いて−９９ｋＰａで約９０秒吸引した後、ＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。細胞懸濁培養液の吸引速度は約１０ｍｉｎ／ｍｌであった。
【００４０】
培養して１日経過後、培地交換を行い、回収した培地中の細胞数を数えた結果、細胞数は２×１０４個であった。
また、培養後の基体を１％グルタルアルデヒドで固定し、１％酸化オスミウムで処理後、凍結乾燥したサンプルをＳＥＭ（走査電子顕微鏡）観察した結果、培養１日後の基体上面のウェルを除く部分に細胞が存在することを確認した。更に培養３日目のサンプルには、基体上面のウェルを除く部分に細胞凝集塊の存在が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の細胞培養担体は、ＥＳ細胞や成体幹細胞等の未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得る。
【符号の説明】
【００４２】
１      細胞培養担体
２      基体
２ａ    上面（表面）
２ｂ    下面（裏面）
３      ウェル
３ａ    ウェル最底部
４      細胞非接着性膜
５      モジュール容器（細胞培養モジュール）
５ａ    吸引部
５ｂ    加圧部
ｄ      ウェル径
ｔ１    基体の厚さ
ｔ２    ウェル厚さ
【図１】
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【図２】
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【図３】
2017209081.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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