(57)【要約】【課題】培地中の窒素源の効率的な利用を図り、より経済的に有利にプロテアーゼを製造することのできる方法の提供。【解決手段】次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：（Ａ）エキス類を含有する第１の培地でプロテアーゼ生産性微生物を培養する工程、（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度培養する工程を含み、第２の培地中の窒素量が５００ｐｐｍ以上であり、第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率が０．７５以下である、プロテアーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）エキス類を含有する第１の培地でプロテアーゼ生産性微生物を培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度培養する工程
を含み、第２の培地中の窒素量が５００ｐｐｍ以上であり、第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率が０．７５以下である、プロテアーゼの製造方法。
【請求項２】
第１の培地中のエキス類の濃度が乾燥固形分として０．１〜２％（ｗ／ｖ）である請求項１項記載のプロテアーゼの製造方法。
【請求項３】
第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量が、以下の算出式で求められる菌体の濃度（ＯＤ６００値）についての百分率として６％以上である請求項１又は２記載のプロテアーゼの製造方法。
（第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量（％）＝
[第２の培地への菌体植え継ぎ後の、第２の培地のＯＤ６００値]／[第１の培地での培養終了時点の、第１の培地のＯＤ６００値]×１００）
【請求項４】
プロテアーゼ生産性微生物が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼの製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼがアルカリプロテアーゼである請求項１〜４のいずれか１項記載のプロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料用の洗浄剤や漂白剤には、その洗浄力を高めるために各種の酵素が配合されている。最も工業的に大量に生産されている衣料用酵素はアルカリプロテアーゼ等のプロテーゼであり、通常、これらはプロテアーゼ生産性微生物の培養を伴う発酵法により生産されている。
【０００３】
大量且つ廉価にプロテアーゼを得るには発酵生産性の向上が不可欠であり、現在までにプロテアーゼの高生産性化を図る技術として、遺伝学的手法によるプロテアーゼ生産性微生物の改変や、連続培養法による培養等が報告されている。
例えば、特許文献１には、アルカリプロテアーゼ高生産性変異バチルス属細菌が開示され、また、特許文献２には、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培地に培養してプロテアーゼを製造する方法において、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を５００ｍｇ／ｌ以下に維持しつつ培養するプロテアーゼの製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１６１２８４号公報
【特許文献２】特開昭６２−１２６９７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記特許文献１や２に記載されているように、一般的に、プロテアーゼの発酵生産用培地には、アミノ酸や酵母エキス等のエキス類を窒素源の一部として用いた富栄養な液体合成培地が用いられている。
しかしながら、培地にとりわけ窒素源の一部としてエキス類を多く加えることは生産コストの上昇を招く。また一方で、本発明者が発酵工程での物資収支を検討したところ、培地に添加した窒素源の多くは菌体増殖に消費されてしまい、窒素源からプロテアーゼへの変換率は低く、窒素源のプロテアーゼ生産への効率的な利用が望まれた。
したがって、本発明は、培地中の窒素源の効率的な利用を図り、より経済的に有利にプロテアーゼを製造することのできる方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プロテアーゼ生産性微生物を培養した後これの一部又は全部を植え継ぎ、窒素源の一部であるエキス濃度を低くした培地で連続的に培養することで、プロテアーゼの高生産性を維持しつつも、培地中の窒素源をプロテアーゼ生産へ効率的に利用させることができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）エキス類を含有する第１の培地でプロテアーゼ生産性微生物を培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度培養する工程
を含み、第２の培地中の窒素量が５００ｐｐｍ以上であり、第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率が０．７５以下である、プロテアーゼの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、培地に添加した窒素源の効率的な利用を図れるため、エキス類の使用量を減らすことができ、より経済的に有利にプロテアーゼを高生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のプロテアーゼの製造方法は、（Ａ）エキス類を含有する第１の培地でプロテアーゼ生産性微生物を培養する工程と、（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度培養する工程とを含み、第２の培地中の窒素量が５００ｐｐｍ以上であり、第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率が０．７５以下である、製造方法である。
【００１０】
〔工程（Ａ）〕
本工程は、エキス類を含有する第１の培地でプロテアーゼ生産性微生物を培養する工程である。
プロテアーゼ生産性微生物としては、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物等が挙げられる。なかでも、プロテアーゼ生産性の点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が好ましく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アルカリプロテアーゼ生産性微生物である、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４８２）、バチルス  クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ  Ｋ−１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ―ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）、バチルス  Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９２）（プロテアーゼＥ−１）、バチルス  エスピーＹ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９）、バチルス  ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１１６２）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）、ＮＣＩＢ１２２８９株、ＮＣＩＢ１２５１３株等が挙げられる。
微生物は、野生株、又は各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異株のいずれでもよく、また、公知の人為的な改変を付すことにより所望のプロテアーゼ生産能を付与したものであってもよい。
【００１１】
本発明で用いられる第１の培地はエキス類を含有する。ここで、培地は、合成培地、天然培地、或いは合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。
エキス類としては、特に限定されず、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス等が挙げられ、酵母エキス、魚肉エキスが好ましく、酵母エキスがより好ましい。酵母エキスは、酵母菌体を自己消化、酵素処理、熱水処理等の処理に供することで得られる抽出物であり、通常、原料となる酵母としてはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１２】
また、本発明で用いられる第１の培地は、窒素源として、エキス類の他にも、エキス類に由来しない窒素源を含有してもよい。
エキス類に由来しない窒素源としては、例えば、アンモニア、尿素、無機・有機アンモニウム塩、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物、コーングルテンミール、大豆粉、ポリペプトン、トリプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
これらの窒素源は、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００１３】
第１の培地中の窒素量は、菌体増殖および生産性の点から、好ましくは２０００〜１５０００ｐｐｍ（質量百万分率）、より好ましくは３０００〜１００００ｐｐｍ、より更に好ましくは４０００〜８０００ｐｐｍである。培地中の窒素量は、後述する全窒素分析により求めることができる。
また、第１の培地中、エキス類の濃度は、同様の点から、好ましくは乾燥固形分として０．１〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜２％（ｗ／ｖ）である。
【００１４】
また、第１の培地には、炭素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。
炭素源としては、例えば、糖類が挙げられる。糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等のニ糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。また、糖類を含有する糖液、例えば、でんぷんから得られる糖液や糖蜜（廃糖蜜）、セルロース系バイオマスから得られる糖液等を使用することもできる。なかでも、微生物の増殖の点から、グルコース、マルトースが好ましい。
第１の培地中の炭素源の濃度は、好ましくは５〜２５％（ｗ／ｖ）である。
【００１５】
無機塩類としては、例えば、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、リン酸塩等が挙げられる。
第１の培地中の無機塩類の濃度は、好ましくは０．５〜１％（ｗ／ｖ）である。
また、培地中には、抗生物質や微量成分を適宜必要に応じて添加しても良い。
【００１６】
第１の培地のｐＨ（２５℃、以下同じ）は、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。培地のｐＨは、適宜緩衝剤を用いて調整することができる。
尚、本明細書において、培地中の窒素量、エキス類の濃度、炭素源の濃度、無機塩類の濃度、ｐＨ等は、特段断らない限り初発（培地調製時又は培養開始時）の値である。
【００１７】
プロテアーゼ生産性微生物の培養は、通常の培養条件に従えばよい。
例えば、培養温度は、微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、好ましくは２０〜４８℃であり、より好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは２８〜３９℃である。
【００１８】
第１の培地に対する微生物の接種量は、例えば、上記枯草菌の場合、好ましくは０．１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００１９】
培養期間は、微生物の増殖に応じて１０時間〜７日、更に１２時間〜４日、更には２４時間〜３日が好ましい。
【００２０】
培養終了後の菌体の濃度（ＯＤ６００値）は、好ましくは４０〜１００である。このＯＤ６００値は、後記実施例記載の方法によって測定することができる。
また、培養終了後、第１の培地から菌体を取得する方法は、特に制限されず、適当な分離手段、例えば、傾斜法、遠心分離、濾過等が挙げられる。
【００２１】
〔工程（Ｂ）〕
本工程は、工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度培養する工程である。本工程は、例えば、前記菌体の一部又は全部を、第２の培地に接種して行うことができる。また、前記菌体の一部又は全部を培養槽に残し、これに第２の培地を加えて行うこともできる。生産効率の点から、好ましくは遠心分離等で分離した菌体を植え継ぐ方法である。
第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量は、窒素変換率及びプロテアーゼの生産性の点から、以下の算出式で求められる菌体の濃度（ＯＤ６００値）についての百分率が６％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることがより更に好ましい。また、同様の点から、１００％以下であることが好ましく、５０％以下であることが更に好ましく、３０％以下であることがより更に好ましい。
第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量（％）＝
[第２の培地への菌体植え継ぎ後の、第２の培地のＯＤ６００値]／[第１の培地での培養終了時点の、第１の培地のＯＤ６００値]×１００
【００２２】
第２の培地中のエキス類濃度（乾燥固形分）は、第１の培地中のエキス類濃度（乾燥固形分）に対して質量比率で０．７５以下である。この第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率は、窒素源の効率的な利用を図る点から、好ましくは０．５以下であり、さらに好ましくは０．３以下である。また、第１の培地中のエキス類の濃度に対する第２の培地中のエキス類の濃度の質量比率は０であってもよいが、プロテアーゼの生産性の点から、好ましくは０．１５以上である。
【００２３】
第２の培地中の窒素量は、５００ｐｐｍ以上であるが、プロテアーゼの生産性の点から、好ましくは１０００ｐｐｍ以上、より好ましくは２０００ｐｐｍ以上、更に好ましくは３５００ｐｐｍ以上である。また、第２の培地中の窒素量は、窒素源の効率的な利用を図る点から、好ましくは１５０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１００００ｐｐｍ以下、更に好ましくは７５００ｐｐｍ以下である。
【００２４】
第２の培地中の窒素量は、第１の培地中の窒素量に対する質量比率で、プロテアーゼの生産性の点から、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．５以上、更に好ましくは０．７以上、より更に好ましくは０．８以上である。また、窒素源の効率的な利用を図る点から、好ましくは０．９５以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８５以下である。
上述の範囲のとおりのエキス類濃度、窒素量を低減した培地で、第１の培地から植え継いだ菌体を連続的に培養することで、プロテアーゼの生産性を維持しつつも培地中の窒素源をプロテアーゼ生産へ効率的に利用させることができる。
【００２５】
第２の培地は、第１の培地と同様、窒素源の他、炭素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。具体的には、前述したとおりである。
【００２６】
工程（Ｂ）における微生物の培養は、工程（Ａ）における培養と同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。
本工程において培養は、好ましくは２８〜３９℃の温度下で、４８時間〜４日間行われるのが好ましい。
【００２７】
このような培養により、培地中の窒素源が効率よくプロテアーゼ生産に利用されて、プロテアーゼが高生産される。本発明において、プロテアーゼとしてはアルカリプロテアーゼが好ましい。
本発明において、培地中の窒素源からプロテアーゼへの窒素変換率（％）は、好ましくは２８％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは３２％以上である。
ここで、窒素変換率は、プロテアーゼの窒素濃度を、培地中の窒素濃度で割った値である。窒素変換率の算出方法の詳細は実施例に記載した。
【００２８】
本発明により得られた酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に必要に応じて、公知の方法により精製、結晶化、或いは造粒化して使用することができる。
一方、培養液から分離したプロテアーゼ生産性微生物は、再度、プロテアーゼ生産に再利用することができる。すなわち、工程（Ｂ）の後に、当該プロテアーゼ生産性微生物の一部又は全部を用いて、第２の培地で再度培養を１回以上、更に２回以上、更に３回以上繰り返す工程を行ってもよい。
【実施例】
【００２９】
［全窒素分析法］
全窒素分析計  ＴＮ−１００（三菱ケミカルコーポレーション製）を用いて、測定した。
【００３０】
［プロテアーゼ生産量の測定法］
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリプロテアーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍＬ、４０ｍＭ  Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温した。これに酵素液（培養上清）０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の変化に基づいてサンプル中のアルカリプロテアーゼ量を定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素活性を１Ｕとした。
【００３１】
［菌体濃度の測定法］
培養液の一部を分取したものを５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を用いて１００倍に希釈混合した後、Ｕ−２０００形日立分光光度計（日立製作所）を用いて波長６００ｎｍにおける濁度を測定し、希釈率からＯＤ６００値を算出した。
【００３２】
［窒素変換率の算出］
窒素変換率は次式により算出した。
窒素変換率（％）＝［プロテアーゼの窒素濃度（ｐｐｍ）］／［初期仕込み窒素濃度（ｐｐｍ）］×１００
（ここで、プロテアーゼ窒素濃度（ｐｐｍ）＝プロテアーゼ活性（Ｕ）×０．４２８（ｐｐｍ／Ｕ））
【００３３】
実施例１
（１）特開２０１４−１６１２８４に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を得た。
次いで、組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を、特開２０１４−１５８４３０に示すように構築した枯草菌変異株であるｒｅｃＡ遺伝子欠失株（ｋａｏ１１９株）にプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，ｖｏｌ．１６８，ｐ．１１１）によって導入し、形質転換体を得た。
【００３４】
前記で得た形質転換体を、ＬＢ培地（１質量％トリプトンペプトン、０．５質量％酵母エキス、０．５質量％ＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩）３０ｍＬに接種し、３９℃で２０時間振盪培養し、種菌とした。
【００３５】
次いで、前記種菌を第１の培地（１質量％魚肉エキス、０．５質量％酵母エキス、３．６質量％アミノ酸混合物、０．０７質量％金属塩、０．４質量％アンモニウム塩、０．２質量％リン酸二カリウム、１６質量％マルトース、０．００２質量％消泡剤、１５ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩、窒素量：５７５６ｐｐｍ、ｐＨ：６．１）１６００ｍＬに２％（ｖ／ｖ）接種し、３６℃、０．５ｖｖｍ、８００回転で３日間通気撹拌培養を行った。
培養終了後、無菌的に遠心分離（５℃、８０００ｒ／ｍｉｎ、１５分）を行って、菌体を回収した。培養終了後の菌体濃度（ＯＤ６００値）は８９であり、菌体を除いた培養液のアルカリプロテアーゼ生産量は２１８５Ｕ／Ｌであった。
【００３６】
（２）前記（１）で回収した菌体を、第１の培地からエキス類（魚肉エキス及び酵母エキス）を除いた以外は同じ組成の第２の培地（窒素濃度：４３１０ｐｐｍ）２０ｍＬに対し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が８９（第１の培地の培養終了後のＯＤ６００値に対し１００％）となる量で接種し、３６℃、２１０回転で４日間ひだ付フラスコにて継続培養を行った。
培養終了後、無菌的に遠心分離（５℃、８０００ｒ／ｍｉｎ、１５分）を行って菌体を除いて酵素液を得た。酵素液のアルカリプロテアーゼ生産量は３１５４Ｕ／Ｌであった。
【００３７】
実施例２
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表２に示す値に変え、第２の培地中のエキス類濃度を０質量％に変えて表２に示す窒素量（４３１０ｐｐｍ）にした以外は、実施例１と同じ培養をし、酵素液を得た。
【００３８】
実施例３〜６
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表２に示す値に変え、第２の培地中のエキス類濃度をそれぞれ０．１５質量％（実施例３）、０．３質量％（実施例４）、０．７５質量％（実施例５）、１．１２５質量％（実施例６）に変えて表２に示す窒素量（４４５５〜５３９４ｐｐｍ）にし、3日間培養した以外は、実施例１と同じ培養をし、酵素液を得た。
【００３９】
実施例７〜１０
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表１に示す値に変え、第２の培地中のエキス類濃度をそれぞれ０．１５質量％（実施例７）、０．３質量％（実施例８）、０．７５質量％（実施例９）、１．１２５質量％（実施例１０）に変えて表１に示す窒素量（４４５５〜５３９４ｐｐｍ）とし、3日間培養した以外は、実施例１と同じ操作を行った。
【００４０】
比較例１
第２の培地を、第１の培地と同じ組成の培地（窒素量：５７５６ｐｐｍ）にした以外は、実施例１と同じ操作を行った。
【００４１】
比較例２
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表２に示す値に変え、第２の培地を、第１の培地と同じ組成の培地（窒素量：５７５６ｐｐｍ）にした以外は、実施例１と同じ操作を行った。
【００４２】
比較例３
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表１に示す値に変え、第２の培地を、第１の培地と同じ組成の培地（窒素量：５７５６ｐｐｍ）にし、3日間培養した以外は、実施例１と同じ操作を行った。
【００４３】
比較例４
実施例１における第２の培地への菌体植え継ぎ量を、表２に示す値に変え、第２の培地を、培地（０．０８質量％魚肉エキス、０．０４質量％酵母エキス、０．３質量％アミノ酸混合物、０．０７質量％金属塩、０．０３質量％アンモニウム塩、０．２質量％リン酸二カリウム、１６％マルトース、０．００２％消泡剤、１５ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩、窒素量：４６８ｐｐｍ）にし、3日間培養した以外は、実施例１と同じ操作を行った。
【００４４】
上記実施例１〜１０及び比較例１〜４における培養条件、窒素変換率及びアルカリプロテアーゼ生産量を表１及び表２に示す。
【００４５】
【表１】
2017112847.tif 000002
【００４６】
【表２】
2017112847.tif 000003
【００４７】
上記のとおり、本発明の方法によれば、培地中の窒素源からプロテアーゼへの窒素変換率（％）が高いことが確認された。また、培地中の窒素量、特にエキス類を減らしてもプロテアーゼの生産性は維持されることが確認された。