(57)【要約】      （修正有）【課題】ファルネサールなどのアルデヒド化合物からファルネシル酸などのカルボン酸を製造するための酵素および当該酵素を有する微生物の提供、また、酵素あるいは微生物によるクリーンかつ環境低負荷なカルボン酸の製造方法の提供。【解決手段】以下の性質を有する、微生物由来の酵素：（１）作用：イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する、（２）分子量：約75kDa、（３）補酵素の要求性：無し。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を有する、微生物由来のポリペプチド：
（１）作用：イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する
（２）分子量：約75kDa
（３）補酵素の要求性：無し
【請求項２】
以下(ａ)〜(ｃ)のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド。
【請求項３】
以下(ａ)〜(ｃ)のいずれかのポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれかの塩基配列からなる核酸：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と70％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列であって、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項１、２、または、５に記載のポリペプチドを含む酵素組成物。
【請求項９】
イソプレノイド類のアルデヒド化合物からイソプレノイド類のカルボン酸を製造する方法であって、
請求項３もしくは４に記載の核酸を有し、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有する微生物、または、請求項７に記載の形質転換体をイソプレノイド類のアルデヒド化合物を含む溶媒中で培養する工程を含む、方法。
【請求項１０】
イソプレノイド類のアルデヒド化合物からイソプレノイド類のカルボン酸を製造する方法であって、
請求項１、２、または、５に記載のポリペプチドとイソプレノイド類のアルデヒド化合物とを作用させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤、抗リウマチ剤、化粧品原料、香料などとして有望な機能性イソプレノイド類のカルボン酸、対応するプレニルアルデヒドから生物学的に製造するための酸化酵素、酸化酵素をコードする遺伝子、および、酸化酵素を使用したカルボン酸化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、医薬品や化粧品、香料品の製造中間体として、多くのカルボン酸誘導体の製造方法が検討され、種々提案されている。
【０００３】
カルボン酸誘導体の化学合成法は、大量の過酸化マンガンなどの酸化剤を使用するために廃棄物の量が甚大であり、近年ではEUを中心に廃棄物量を規制する方向に向かっていた。また、複数の反応点で酸化反応が生じるため酸化反応の制御が困難であり、目的のカルボン酸の生成率が大きく低下する。また、それに伴って複雑な精製プロセスが必要であることから、より環境負荷の低いクリーンなカルボン酸製造技術の開発が強く求められている。イソプレノイド系のカルボン酸生産手段としての化学合成法は実用化されているが上記のような課題を有する。一方、生物や酵素を利用した方法の報告はあるものの実用化には至っていない。
【０００４】
例えば、ファルネシル酸を製造する方法として、植物細胞(カルス)を得て、ファルネソールからファルネシル酸を抽出する方法が知られている(特許文献１)。しかしながら、一般的に、汎用性やコスト性及び大量製造のために、更なる改良が必要と考えられる。
【０００５】
また、一般的に、アルデヒド化合物は揮発性有機物質とともに、発がん性、化学物質過敏症、シックハウス症候群など人体に悪影響を及ぼすことから、法律で規制されている。そのため、アルデヒド類を分解する酸化酵素の研究は、アルデヒド分解を主体として進められている。アルデヒド類を分解する酵素としては、基質特異性の広いアルコールオキシダーゼや、NAD+などの電子受容体を要求するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酸素を電子受容体とするアルデヒドオキシダーゼに分類される。産業利用上の利便性から、電子受容体の添加を必要とせず、大気中の酸素を利用できるオキシダーゼによるアルデヒドの酸化技術がより望ましい。
【０００６】
NADP+などの電子受容体あるいは補酵素を要求するアルデヒド脱水素酵素によるファルネサールの酸化反応は知られており、例えば、蚊のアラタ体でアルデヒドデヒドロゲナーゼがファルネサールをファルネシル酸に変換することなどが報告されているが(非特許文献１)、工業的な利用のためには、空気中の酸素のみを要求するオキシダーゼなどの酵素を用いた反応技術の開発が求められている。
【０００７】
例えば、非特許文献２は、新たなアルデヒドオキシダーゼの機能解析に関する研究報告が記載されている。しかし、グリコアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドなどを分解する反応に関するものであり、ファルネサールのようなイソプレノイド類のカルボン酸化合物を生産することを目的とするものではない。
【０００８】
また、特許文献２は、アルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を用いて、アルデヒド基からカルボキシル基への変換反応を行う方法が記載されている。しかし、リジンのα-アミノ保護体からα-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体、また、リジンやα-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体からα-アミノアジピン酸誘導体のような化合物の製造方法に関するものであり、ファルネサールのようなイソプレノイド類のカルボン酸化合物を対象とするものではない。
【０００９】
また、特許文献３は、アルデヒドオキシダーゼ遺伝子の利用技術であるが、アルデヒド化合物がインドールアセトアルデヒドでありカルボン酸がインドール酢酸であることを特徴とする技術であり、ファルネサールのようなイソプレノイド類のカルボン酸化合物を対象とするものではない。
【００１０】
また、特許文献４は、オキシドレダクターゼを酸化方法に使用する技術であり、漂白および／または洗浄組成物に使用するためのオキシドレダクターゼに関する内容であり、ファルネサールのようなイソプレノイド類のカルボン酸化合物を対象とするものではない。
【００１１】
上述の通り、アルデヒド化合物の一種であるファルネシル酸は、医薬中間体等の原料として有用な化学品であり、現在も、関節リウマチの痛みなどを緩解する経皮吸収型ステロイド剤(プレドニドロン製剤)の原料として実用されている。抗リウマチ薬の売上額の伸び率(2013年、国内)は、抗腫瘍薬、糖尿病治療薬に次いで伸び率が高いことから継続的な需要が見込まれる。また、ファルネシル酸は、種々のアミンを導入可能であることから、医薬品中間体の原料として、新たな抗がん剤や糖尿病治療薬などの開発への貢献が期待される。したがって、イソプレノイド系アルデヒド化合物を、よりクリーンかつ経済的な酸化反応によってカルボン酸に変換する技術は、今後も多くの産業に重要であるので、大量の二酸化マンガン等を使用する化学反応によって合成する技術を代替えしていくことが望まれている。一方、分子触媒を活用したファルネサール酸化反応の研究も進められているが、反応効率が悪く実用化には至っていない。その原因は、特定のアルデヒドのみをカルボン酸に変換する反応を設計することが困難であるためである。そのため、反応特異性の高い酵素反応による、カルボン酸製造技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００７−２２８８８３号公報
【特許文献２】特開２００５−３０４４７７号公報
【特許文献３】特開平１０−１０８６８０号公報
【特許文献４】特開平０６−２９２５７２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Rivera-Perez C, Nouzova C, Clifton ME, Garcia EM, LeBlance E, Noriega FG, Insect Biochem Mol Biol, 43(8), 675-682, 2013
【非特許文献２】Yamada M, Adachi K, Ogawa N, Kishino S, Ogawa J, Kataoka M, Shimizu S, Isobe K, Journal of Bioscience and Bioengineering, 119 (4), 410-415, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ファルネサールなどのイソプレノイド類のアルデヒド化合物からファルネシル酸などのイソプレノイド類のカルボン酸を製造するための酵素と微生物を提供し、酵素あるいは微生物によるクリーンかつ環境低負荷なカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記背景技術に示す通り、イソプレノイド系のアルデヒド化合物は、化学反応によって製造されているが、世界的な化学反応に対する廃棄物規制への動きから、よりクリーンかつ実用的な酸化反応の開発が求められている。アルデヒド酸化酵素に関しては多くの研究報告がなされてきたが、アルデヒド分解による環境浄化への貢献を目的とした研究も多く、化学品製造の中間体生成のために有効な技術開発には至っていない。また、特にファルネサールなどのアルデヒド化合物を当該酵素によってファルネシル酸などのカルボン酸へと変換する方法については一切報告されていない。
【００１６】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ファルネサールなどのイソプレノイド類のアルデヒド化合物からファルネシル酸などのイソプレノイド類のカルボン酸を製造するための酵素と微生物を提供し、酵素あるいは微生物によるクリーンかつ環境低負荷なカルボン酸の製造方法を提供する。
すなわち、本発明は以下の通りである：
本発明は、一実施の態様において、
〔１〕以下の性質を有する微生物に由来する酵素に関する：
（１）作用：イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する
（２）分子量：約75kDa
（３）補酵素の要求性：無し
【００１７】
また、本発明は、別の態様において、
〔２〕以下(ａ)〜(ｃ)のいずれかのポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド。
【００１８】
また、本発明は、別の態様において、
〔３〕以下(ａ)〜(ｃ)のいずれかのポリペプチドをコードする核酸に関する：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド。
【００１９】
また、本発明は、別の態様において、
〔４〕以下(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれかの塩基配列からなる核酸に関する：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と70％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列であって、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００２０】
また、本発明は、別の態様において、
〔５〕上記〔４〕に記載の核酸によりコードされるポリペプチドに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔６〕上記〔４〕に記載の核酸を含むベクターに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔７〕上記〔６〕に記載のベクターを含む形質転換体に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔８〕上記〔１〕、〔２〕、または、〔５〕に記載のポリペプチドを含む酵素組成物に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕イソプレノイド類のアルデヒド化合物からイソプレノイド類のカルボン酸を製造する方法であって、
上記〔３〕もしくは〔４〕に記載の核酸を有し、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有する微生物、または、上記〔７〕に記載の形質転換体をイソプレノイド類のアルデヒド化合物を含む溶媒中で培養する工程を含む、方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕イソプレノイド類のアルデヒド化合物からイソプレノイド類のカルボン酸を製造する方法であって、
上記〔１〕、〔２〕または、〔５〕に記載のポリペプチドとイソプレノイド類のアルデヒド化合物とを作用させる工程を含む、方法に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ファルネサールなどのアルデヒド化合物からファルネシル酸などのカルボン酸などの医薬・化粧・香料の中間体として有用な化合物を製造するためのアルデヒドオキシダーゼを提供し、クリーンかつ環境低負荷なカルボン酸製造技術を提供することができる。酵素による合成では、目的とするカルボン酸化合物を高純度で得られ、かつ、意図しない不純物の生成はない。また、当該酵素の反応にはNADP+などの電子受容体を必要とせず、空気中の酸素を使って反応を進めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、P.antarcticaの菌体増殖(OD610の濁度として測定)に対するファルネサールの影響を調べた結果を示すグラフである。5%で明らかに生育阻害がみられ、2%では菌体の生育阻害がほとんどないことを示す図である。
【図２】下記実施例１に記載の試験において、Pseudozyma antarcticaをファルネサールを含むＹＭ培養液中で培養し、得られた培養液中のファルネサールおよびファルネシル酸をガスクロマトグラフフィーで分析した結果を示すグラフである。図２は、当該培養後に培地中にファルネシル酸が生成されていることを示す。なお、図中のＡはファルネサールとファルネシル酸の合成品のガスクロマトグラフィーの結果であり、Ｂは培養後の菌体内と外の成分を分析した結果である。また、Ｃは培地中に検出された保持時間13.57分のピークを生じる化合物の化学構造を分子量から特定した結果を示す図である。
【図３】下記実施例２に記載の酸化酵素の精製に関するSDS-PAGEの結果を示す画像である。電気泳動的に75kDaのタンパク質を均一精製できたことを示す。
【図４】図４Ａは、下記実施例３の基質特異性の確認に用いた化合物の構造を示す図である。また、図４Ｂは、精製した酵素について基質特異性を調べた際の活性測定の結果を示すグラフである。
【図５】下記実施例４に記載の方法によりデータベースより見出された、配列番号３の部分アミノ酸配列と完全に一致する推定アミノ酸配列(配列番号１)を示す。アミノ酸配列中、太字は推定分泌シグナルを示し、下線は下記実施例４において解析した、精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を示す。
【図６】配列番号１の推定アミノ酸配列、配列番号２の塩基配列から推定されるタンパク質、及び、遺伝子の機能とドメイン解析の情報を示す図である。
【図７】本発明の酸化酵素の遺伝子を発現させるために作成した遺伝子発現ベクターの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
本発明は、イソプレノイド類のアルデヒド化合物を、空気中の酸素を用いてイソプレノイド類のカルボン酸へと酸化する反応を触媒する酸化酵素をコードする遺伝子を用い、当該酵素を遺伝子組換えなどで調製し、医薬中間体、化粧品・香料の原料となるイソプレノイド類のカルボン酸の製造に用いるものである。
【００２４】
本発明において使用する酸化酵素をコードする遺伝子の具体例は、Pseudozyma antarcticaから遺伝子工学的手法を用いて抽出単離した遺伝子である。この菌株は、糖脂質型バイオサーファクタント生産酵母であり、葉面から分離された微生物である。
【００２５】
また、本発明に係る酵素は、微生物由来であって、以下の性質を有するものである：
（１）作用：イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する
（２）分子量：約75kDa(SDSゲル電気泳動)
（３）補酵素の要求性：無し
なお、本発明に係る酵素は、担子菌酵母由来であることが好ましい。担子菌酵母としては、Pseudozyma属、Sporisorium属、Ustilago属、または、Melanopsishium属等を挙げることができ、これらの属由来の酵素が好ましい。なお、より好ましくは、Pseudozyma属由来の酵素である。なお、Pseudozyma属としては、以下に限定されないが、Pseudozyma antarcticaやPseudozyma aphidisなどを挙げることができる。本発明の好ましい実施の形態においては、Pseudozyma antarctica由来の酵素である。また、Sporisorium属としては、以下に限定されないが、Sporisorium reilianumを挙げることができる。また、Ustilago属としては、以下に限定されないが、Ustilago maydisやUstilago hordeiを挙げることができる。また、Melanopsishium属としては、以下に限定されないが、Melanopsishium pennsylvanicumを挙げることができる。
【００２６】
上記Pseudozyma antarctica由来の酸化酵素をコードする遺伝子は、以下のようにして、見出した。Pseudozyma antarcticaを、ファルネサールを誘導基質として添加した培地で培養し、次いで、当該培養液中のファルネサール酸化活性を過酸化水素の発生として追跡することにより当該培養液から均一精製した酵素を得て、当該酵素のアミノ末端配列情報を取得した。そして、当該情報を基に、データベースから対応する遺伝子およびアミノ酸配列を探し出すことで取得した。
【００２７】
このようにして取得されたPseudozyma antarcticaの酸化酵素のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。
【００２８】
本発明において提供する酸化酵素は、上記Pseudozyma tsukubaensis由来のもののみに限定されず、以下のポリペプチドも本発明の酵素として提供される。
すなわち、本発明の一態様は、以下(ａ)〜(ｃ)のポリペプチドである：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチド。
【００２９】
機能未知の遺伝子であっても、そのコードするアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と同一性が少なくとも70％以上であれば、同一機能を有するといえるから、このような機能未知の遺伝子および当該遺伝子によりコードされるポリペプチドであっても、本発明の酸化酵素および当該酵素をコードする遺伝子に包含され、産業上有用なカルボン酸を製造するための遺伝子材料またはポリペプチド材料として使用することができる。これらの酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、その配列からプライマーを設計、合成し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより容易に得ることできる。また、化学合成も可能である。
上述のように、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と一定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドを提供する。なお、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列と70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、本明細書においてアミノ酸配列または塩基配列の同一性というとき、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列(アラインメント)させ、その際に得られる最大のアミノ酸配列または塩基配列の同一性(％)をいう。アミノ酸配列または塩基配列の同一性については、公知の方法により解析することができる。例えば、BLASTアルゴリズムを実装したNCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)のblastp、blastnなどにより算出することができる。
【００３０】
なお、以下の表１に配列番号１のアミノ酸配列を用いて、blastpによるホモロジー検索をした結果の一部を示す。例えば、下記表１中に列挙するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と高い同一性を有し、また、スコアが大きく、かつ、E-Valueが小さい。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同様に、ソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有すると推定される。
【表１】
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【００３１】
一方、配列番号１に開示された内容に基づいて、通常の遺伝子組換え技術を用いて、数個のアミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等によって酸化酵素の機能を保持した誘導体を得ることは当業者にとって容易である。ゆえに、そのような常套手段で得られる酸化酵素の機能を保持した誘導体も本発明の範囲に含まれるものである。
ここで、「１若しくは数個のアミノ酸」とは、１〜70個、１〜60個であることが好ましく、１〜50個、１〜40個、１〜30個、１〜20個であることがより好ましく、１〜10個、１〜５個であることがさらに好ましい。
【００３２】
なお、本発明の一態様によれば、上記(ａ)〜(ｃ)のいずれかのポリペプチドをコードする核酸を含む。
また、別の態様によれば、本発明は以下の核酸も含む。
以下(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれかの塩基配列からなる核酸：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と70％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列であって、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００３３】
なお、上記のように、本発明は、配列番号２に示される塩基配列と一定の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸も提供する。なお、好ましくは、配列番号２の塩基配列と70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸である。
【００３４】
また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号２に示す塩基配列と90％、好ましくは95％の同一性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。ストリンジェントな条件としては、例えば、0.5M NaHPO4，7％SDS,1mM EDTAを含む緩衝液による65℃でのハイブリダイゼーション、および0.1XSSC，0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理を挙げることができる。
【００３５】
本発明の酸化酵素をコードする遺伝子を用いて当該酸化酵素を生産する場合、酸化酵素をコードする遺伝子を適当な発現ベクターにおけるプロモーターの下流に挿入することにより、酸化酵素発現ベクターを構築する。酸化酵素コードする遺伝子を挿入する発現ベクターとしては、プラスミド、コスミドあるいはウイルス由来のものであっても良い。
【００３６】
次いで、この組換え発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換する。得られる形質転換体は当該酸化酵素を生産できるように改変されたものである。次いで、該形質転換体を培地に培養し、形質転換体を含む培養物から当該酵素を採取する。この場合培養物から形質転換体を分離し、この分離した形質転換体から糖脂質を採取しても良いし、培地中から直接採取してもよい。
【００３７】
形質転換体の培養方法は特に限定はなく、既知の方法で培養すればよい。例えば、Pseudozyma属に属する株の形質転換体の場合、通常、pH5〜8、好ましくはpH6、20〜35℃、好ましくは22〜28℃で3〜7日間行えばよい。培養によって産生された酵素は、定法にしたがって培養液中から回収することができる。
【００３８】
本発明により提供される酵素は、イソプレノイド類のアルデヒド化合物をイソプレノイド類のカルボン酸へ酸化する作用を有するものである。ここで、「イソプレノイド類のアルデヒド化合物」とは、2-メチル-2-ブテン型の化合物にアルデヒドが組み合わさった構造を一部に有する化合物をいう。具体的には、以下に限定されないが、例えば、ファルネサール、シトラール、3-メチル-2-ブテナールなどの化合物である。本発明の酵素は、上記に列挙するイソプレノイド類のアルデヒド化合物から、ファルネシル酸、ゲラン酸、3-メチルクロトン酸などのイソプレノイド類のカルボン酸を生成する反応を触媒する。
本発明の酵素は、例えば、下記式で示すようなファルネサールからファルネシル酸を触媒する。
【化１】
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【００３９】
本発明により提供される酵素は、NADP+のような電子受容体を用いることなく、緩衝液中でイソプレノイド類のアルデヒド化合物と当該酵素とを反応させるだけで、イソプレノイド類のカルボン酸を製造することができるものである。反応溶液としては、酵素と基質との反応を阻害するものでなければ特に制限されず、たとえば、市販の緩衝液を使用することができる。また、当業者であれば、本願明細書の開示および技術常識に基づき、適宜反応条件を設定することができる。
【００４０】
以下の実施例で示す培養方法、発現ベクターおよび宿主微生物は、本発明の酸化酵素の発現に適した多くのベクターおよび宿主細胞の一例にすぎず、当業者ならば、当該技術分野の常套手段に従い、任意の宿主細胞で機能的な酸化酵素発現ベクターを構築することができる。プロモーターは既知のものから適宜選択するか、あるいは各種遺伝子から利用可能なものを選択して、新たに調製、あるいは合成したものでもよい。このように、本発明の発現ベクターは本明細書記載の例示のプラスミドに限定されず、通常の技術を用いて修飾(例えばプロモーターを交換する)することによって、異なる種類の微生物、また他の細胞内で機能的であり、および／または酸化酵素をうまく発現させることができる発現ベクターを構築することができる。
【００４１】
本発明の酸化酵素をコードする遺伝子を保持する発現ベクターで形質転換するために用いられる宿主細胞は、動物でも植物でも微生物でも遺伝子を発現して酵素を生産できればいずれでもよく、例えば、酵母、カビ等の真核微生物、さらには一般的に利用されている高等生物の細胞でも良い。このような高等生物の細胞としては動物細胞または培養植物細胞が挙げられる。
【００４２】
Pseudozyma属に属する微生物を宿主として用いる場合、配列番号２に記載のDNAをPCRで増幅して、一度大腸菌クローニングベクターに連結した後、Pseudozyma 属に属する株に適用可能な遺伝子発現ベクターに連結する。使用する遺伝子発現ベクターとしては、例えばpUXV1 ATCC 77463、pUXV2 ATCC 77464、pUXV5 ATCC 77468、pUXV6 ATCC 77469、pUXV7 ATCC 77470、pUXV8 ATCC 77471、pUXV3 ATCC 77465、pU2X1 ATCC 77466、pU2X2 ATCC 77467等が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用する用語「ベクター」は核酸配列、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスに由来するか、または化学的もしくは酵素的手段により合成されたDNAを指し、この中に１以上の核酸の断片が挿入もしくはクローン化され、ここで核酸は特定の遺伝子をコードする。ベクターはこの目的に１以上の独自な制限部位を含むことができ、そしてクローン化された配列が再生されるように定めた宿主もしくは生物中で自律的に複製することができる。ベクターは直線状、環状またはスーパーコイル状の立体配置を有することができ、そして特定の目的に他のベクターもしくは他の物質と複合化することができる。ベクターの成分は限定するわけではないがDNAを包含するDNA分子；切り出し(excision)タンパク質もしくは他の所望する生成物をコードする配列；および転写、翻訳、RNA安定性および複製のための調節要素を含むことができる。
【００４４】
また、本発明は、別の態様として、本発明に係る酵素を含む酵素組成物も提供する。本発明の酵素組成物は、本発明の酵素の他、酵素組成物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤、界面活性剤、分散剤、安定化剤などを含むことができる。本発明の酵素組成物の形状は、使用方法等を考慮して、適当な形状(粉末や液体状など)に調製することができる。
【００４５】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。以下の実験例において用いたプラスミド類、各種制限酵素やT4DNAリガーゼ、その他酵素類は全て購入可能なものであり、供給者の指示に従って使用した。また、ゲノム情報の解読、DNAのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養および培養物の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行った。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：ファルネサール酸化酵素のスクリーニング）
ファルネサールを大気中の酸素を使って酸化する酵素をスクリーニングするため、ファルネサールを誘導基質として添加したYM培養液で微生物を培養した。試験に用いる微生物としては、好気条件下で大量のバイオサーファクタント(糖脂質など)を分泌し、脂質代謝に関連する遺伝子群を豊富に保存し、かつ、様々な酵素(リパーゼや、生分解性プラスチック分解酵素など)を生産する微生物に着目し、担子菌系酵母である真核微生物Pseudozyma antarcticaを用いた。なお、誘導基質として添加するファルネサールの量は、菌体の生育を大きく阻害しない量とするため、0.5〜5％のファルネサールを培地中に添加して、培養を0〜5日間行い、細胞増殖を確かめた。培養期間中の細胞増殖を確かめるために、マイクロプレートリーダーを用いた濁度(OD610)の測定を行った。結果を図１に示す。当該結果より、P.antarctiaの培地に添加するファルネサールの寮は、生育阻害効果が少ない2％とした。
2％ファルネサールを添加した培地でP.antarcticaを3日間培養し、培地中の成分をガスクロマトグラフィーで分析したところ、ファルネシル酸が培地中に蓄積されていることが分かった。結果を図２に示す。
この結果から、培養液中には大気中の酸素を使ってファルネサールからファルネシル酸を生成する酸化酵素が含まれており、Pseudozyma antarcticaが当該酵素を産生していることが示唆された。
【００４７】
（実施例２：酸化酵素の精製）
2％ファルネサールを添加した培地でP.antarcticaを3日間培養した培養液を80％飽和硫安で沈殿させ、20mM Tris-HCl(pH6.0)で透析を行って硫安を除去したものを硫安沈殿画分とし、タンパク質量、酵素活性を測定することで目的のタンパク質が硫安沈殿画分に含まれていることを確認した。
なお、タンパク質量は、色素法(DC Protein Assay Reagent, BIO-RAD)により測定し、アルデヒドオキシダーゼ活性の測定は、以下の表２及び表３に示す試薬混合液を用いて測定した(なお、以下の試験においても、酵素活性(アルデヒドオキシダーゼ活性)の測定は同様にして行った)。
【表２】
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【表３】
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具体的には、酵素溶液(試料)を含む上記試薬混合液１を0.5ml調製し、40℃で反応を開始し、15分以上反応させた。その後、得られた反応液40μlに対して、1Mリン酸カリウム緩衝液、ABTS、ペルオキシダーゼ、超純水を添加して、表３の試薬混合液２を調製し、420nmでの吸光度の増加を分光光度計で測定する。１分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を１酵素単位(U)とした。
【００４８】
次に、硫安沈殿画分を陰イオンカラム(QXL)に供し、10mM Tris-HCl(pH6.0)で非吸着成分を流した後、0.25M NaClを含む10mM Tris-HCl(pH6.0)で酵素活性画分を溶出することができた。さらにこの溶出画分を50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で透析を行ってバッファー交換を行った後、陽イオンカラム(HiTrap SP XL)に供し、50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で非吸着成分を流した後、0.25M NaClを含む50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で酵素活性画分を溶出することができた。さらに、この溶出画分を50mM酢酸ナトリウム(pH6.0)で透析を行ってバッファー交換を行った後、陽イオンカラム(HiTrap SP XL)に供し、50mM酢酸ナトリウム(pH6.0)で非吸着成分を流した後、0.25M NaClを含む50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で酵素活性画分を溶出することができた。それぞれの精製画分はSDSゲル電気泳動を行い、電気泳動的に均一に精製できていることを確認した。結果を図３に示す。また、精製結果を示す表を表４に示す。酵素活性は上述の方法で測定した。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
（実施例３：基質特異性）
次に、精製した酵素を用いて基質特異性を調べた。基質としては、ファルネサールと構造の類似したイソプレノイド系のアルデヒド類を用いた。使用した基質の化学構造を図４Ａに示す。具体的な試験方法としては、上述の酵素活性の試験における試薬混合液１において、シトラールの代わりに各基質を用いた以外には、上述の酵素活性の試験と同様にして行った。
その結果、ファルネサールよりも、シトラールやメチルブテナールに対する反応性が高く、さらに、シンナムアルデヒドおよびメチルシンナムアルデヒドは、ファルネサールよりも200倍以上高い反応性を示すことが分かった。その結果を図４Ｂに示す。すなわち、当該酸化酵素は、NADP+のような電子受容体を用いることなく、緩衝液中で基質と酵素を混ぜるだけで、イソプレノイド系アルデヒド化合物をカルボン酸に変換する能力が高いといえる。
【００５１】
（実施例４：酸化酵素の遺伝子およびアミノ酸配列の取得と解析）
精製した75kDaの酵素のN末端配列の解析を定法にて決定した。その結果を次に示す。
AITNDAAKFV(配列番号３)
【００５２】
得られた配列番号３の部分アミノ酸配列と完全に一致する推定アミノ酸をもつ遺伝子の配列情報をデータベースが見出した。推定遺伝子の配列は配列番号１、推定アミノ酸配列は配列番号２に示す(図５)。また、配列番号２のアミノ末端側の45アミノ酸残基は、菌体外に分泌するためのシグナル配列であると考えられる。
【００５３】
得られた遺伝子をPCRで増幅し、P.antarcticaの遺伝子発現用ベクターpUXV1に挿入し、酸化酵素遺伝子の発現プラスミドを作成した。遺伝子発現のプロモーターには、P.antarcticaのアクチン遺伝子の推定プロモーター領域を使用した。作成したプラスミドのマップを図７に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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