(57)【要約】      （修正有）【課題】アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、喘息の有無や喘息の重症度を精度よく診断できる診断マーカーの提供。【解決手段】血清等の生体試料中の特定のマイクロＲＮＡ、例えばhsa-miR-185-5p（特定のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ）や、hsa-miR-486-5p（特定のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ）や、hsa-miR-144-5p（配特定のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ）を、喘息の診断マーカーとして用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡを検出することを特徴とする喘息を診断するためのデータを収集する方法。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
【請求項２】
喘息が気管支喘息であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡを検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする喘息の診断用キット。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
【請求項５】
喘息が気管支喘息であることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項４又は５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息を診断するためのデータを収集する方法や喘息の診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在社会においては、自動車や工場等からの排気ガス、化学物質、粉塵等による大気汚染が顕著となり、それに伴い気管支喘息患者数は増えている。喘息は、発作時に気管支平滑筋の収縮・攣縮が起こり、重積発作時は呼吸困難の状態から喘息死に至る重篤な疾患である。
【０００３】
喘息は要因や症状が複合的に絡み合うことが多く、その診断は難しいとされている。このため、国際指針のＧＩＮＡ（Global Initiative for Asthma）をはじめとして、各国において診断や治療のためのガイドラインが提案されている。しかしながらこのようなガイドラインは、あくまでも症状に応じた診断基準を提供するものであり、典型的な症状が現れていない患者に対しては診断を下しにくく、患者が早期に適切な診断や治療を受けられないおそれがある。また、喘息は重症度によって治療方針が異なるため、患者の負担やリスクを軽減するためにも、正確性の高い喘息の診断基準の確立が急務であった。  
【０００４】
近年、遺伝子レベルのアプローチによる喘息の診断方法が開発されてきている。例えば、気道上皮細胞の杯細胞への分化・増殖に関連する指標遺伝子の発現レベルを測定することにより、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患の検査方法が報告されている（特許文献１）。しかし、かかる方法では、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患とを区別することができず、また、喘息の重症度を判断できるかどうかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるかどうか不明である。また、ＩＬ１２Ｂ遺伝子多型及びＴ−ｂｅｔ遺伝子多型を検出することにより、喘息の遺伝的要因の検査方法が報告されている（それぞれ特許文献２及び３）。しかし、かかる方法により、環境等後天的な要因によって生じる喘息や、喘息の重症度を判断できるかどうかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるかどうか不明である。また、リンパ球における特定のマイクロＲＮＡが、小児喘息患者において高発現又は低発現していることが報告されている（非特許文献１）。しかし、かかる特定のマイクロＲＮＡは、喘息の重症度を判断できるものであるかや、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できるものであるかは不明である。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１２１２１８号公報
【特許文献２】特開２００６−１０１８４７号公報
【特許文献３】特開２００６−１４９２７６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Liu, F. et al., Mol. Med. Rep. 2012, 6: 1178-1182
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、喘息の有無や喘息の重症度を精度よく診断できる診断マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、気管支喘息（Bronchial Asthma；ＢＡ）患者由来の血清サンプルにおけるマイクロＲＮＡや、ＢＡ及びアトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis；ＡＤ）患者におけるマイクロＲＮＡと、アレルギー疾患の既往歴のない対照者におけるマイクロＲＮＡとを比較して解析を進めたところ、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、特定のマイクロＲＮＡの発現量の変化を指標として、喘息の有無や喘息の重症度を判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡ（以下、「喘息診断用マイクロＲＮＡ」ということがある。）を検出することを特徴とする喘息を診断するためのデータを収集する方法。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
（２）喘息が気管支喘息であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）以下の［Ａ群マイクロＲＮＡ］及び［Ｂ群マイクロＲＮＡ］から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡを検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする喘息の診断用キット。
［Ａ群マイクロＲＮＡ］
（１−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（１−２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
（２−１）配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（２−２）配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が減少するＲＮＡ
［Ｂ群マイクロＲＮＡ］
（３−１）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ
（３−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するＲＮＡ
（５）喘息が気管支喘息であることを特徴とする上記（４）に記載のキット。
（６）マイクロＲＮＡが、［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（２−１）のマイクロＲＮＡ、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）のマイクロＲＮＡであることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載のキット。
【００１０】
上記本発明の方法は、医師による喘息の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
【００１１】
また、本発明の実施の他の形態として、喘息診断用マイクロＲＮＡを検出することを特徴とする喘息の診断方法を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、小児気管支喘息等の喘息の有無や、喘息の重症度、具体的には、軽症の喘息（軽症間欠型喘息、軽症持続型喘息）を精度よく診断できるため、喘息の早期発見に必要な定期健診等の喘息の検診者の増加が期待される他、喘息の重症度（軽症間欠型、軽症持続型、中等症持続型、及び重症持続型）をより正確に分類し、効果的な喘息治療が可能となるため、ＱＯＬ（Quality of Life）の向上や医療費削減等の効果が期待される。また、喘息炎診断用マイクロＲＮＡが制御する遺伝子の発現を解明することにより、喘息の病態を反映したエンドタイプを明らかにし、より有効な喘息の個別治療法の開発につながることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＢＡ群（●）及び対照群（■）について、３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p；それぞれ図１Ａ、Ｂ、及びＣ）の発現量を解析した結果を示す図である。
【図２】ＢＡ群（●）及び対照群（■）について、クラスター１と他のクラスター（クラスター２〜４）との間で血清総ＩｇＥ値（図２Ａ）及びＦｅＮＯ（図２Ｂ）を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の喘息を診断するためのデータを収集する方法（以下、単に「本件収集方法」という）としては、例えば、被験者（提供者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ、すなわち、上記［Ａ群マイクロＲＮＡ］における（１−１）及び（１−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ１」という）、（２−１）及び（２−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ２」という）、並びに［Ｂ群マイクロＲＮＡ］における（３−１）及び（３−２）のマイクロＲＮＡ（以下、これらを総称して「喘息診断用マイクロＲＮＡ３」という）から選択される少なくとも１つ以上のマイクロＲＮＡの発現量を検出・定量し、喘息の有無や喘息の重症度、好ましくは軽症の喘息（軽症間欠型喘息、又は軽症持続型喘息）を診断するためのデータを収集する方法であれば特に制限されず、また、本発明の喘息の診断用キット（以下、単に「本件診断用キット」という）としては、喘息診断用マイクロＲＮＡを検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を、少なくとも１つ以上備える、喘息の有無や喘息の重症度、好ましくは軽症の喘息（軽症間欠型喘息、又は軽症持続型喘息）を診断するためのキットであれば特に制限されず、ここで本件診断用キットは、喘息を診断するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、喘息を診断するための説明書等の添付文書が通常含まれる。なお、喘息診断用マイクロＲＮＡには、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）が便宜上含まれる。
【００１５】
本件収集方法及び本件診断用キットにおける喘息診断用マイクロＲＮＡとしては、具体的には、喘息診断用マイクロＲＮＡ１〜３のいずれか１つのマイクロＲＮＡの他、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の２つのマイクロＲＮＡ、喘息診断用マイクロＲＮＡ１（［１−１］又は［１−２］）、喘息診断用マイクロＲＮＡ２（［２−１］又は［２−２］）、及び喘息診断用マイクロＲＮＡ３（［３−１］又は［３−２］）の３つのマイクロＲＮＡを挙げることができ、これらの中でも、精度よく喘息を診断できるため、喘息診断用マイクロＲＮＡ１〜３の３つのマイクロＲＮＡが好ましく、中でも上記（１−１）、（２−１）、及び（３−１）のマイクロＲＮＡ３つを好適に例示することができる。
【００１６】
本発明において「喘息」とは、気管や気管支等の気道、好ましくは気管支の慢性的な炎症や気道狭窄が生じた状態を意味する。また、本発明において「アトピー性皮膚炎」とは、増悪・寛解を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患を意味する。
【００１７】
本件収集方法における被験者としては、喘息かどうか不明な被験者（例えば、アトピー性皮膚炎患者）や、喘息の重症度が不明な喘息患者（例えば、アトピー性皮膚炎を併発した喘息患者）を挙げることができる。かかる喘息かどうか不明な被験者には、過去に喘息（小児喘息又は成人喘息）に罹患したことがあり、被検時に喘息かどうか不明な被験者も含まれ、また、上記喘息の重症度が不明な喘息患者には、過去に喘息（小児喘息又は成人喘息）に罹患したことがあり、被検時に喘息の重症度が不明な喘息患者も含まれる。なお、小児喘息患者とは、通常１６歳以下、好ましくは１５歳以下、より好ましくは１４歳以下の喘息患者を意味し、成人喘息患者とは、通常１５歳以上、好ましくは１６歳以上、より好ましくは１８歳以上の喘息患者を意味する。
【００１８】
上記生体試料としては、組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液、尿、唾液等の液性試料や、血液から調製された血清や血漿を挙げることができ、これらの中でも血清が好ましい。
【００１９】
本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ａ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ１及び２）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少している場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ａ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ１及び２）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少していない場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２０】
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ｂ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ３）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加している場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の［Ｂ群マイクロＲＮＡ］におけるマイクロＲＮＡ（喘息診断用マイクロＲＮＡ３）の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加していない場合、かかる被験者は喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２１】
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者（中等症持続型喘息患者、又は重症持続型喘息患者）由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者（軽症間欠型喘息患者、又は軽症持続型喘息患者）由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２２】
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して減少し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２３】
また、本件収集方法において、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息かどうか不明な被験者から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、対照者由来の生体試料と比較して増加し、かつ軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２４】
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ１の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２５】
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して減少していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ２の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２６】
また、本件収集方法において、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加している場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少していない場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、中症又は重症喘息患者由来の生体試料と比較して増加していない場合、或いは、喘息の重症度が不明な喘息患者（被験者）から採取された生体試料中の喘息診断用マイクロＲＮＡ３の発現量が、軽症喘息患者由来の生体試料と比較して増加又は減少している場合、かかる被験者は軽症の喘息に罹患している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２７】
本件収集方法において、上記対照者由来の生体試料としては、健常者由来の組織、細胞、器官、血液、尿、唾液、血清、血漿等の試料の他、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかに喘息に罹患していないと判断されるかかる試料を例示することができ、上記軽症、中症又は重症喘息患者由来の生体試料としては、軽症喘息患者（軽症間欠型喘息患者、又は軽症持続型喘息患者）、中症喘息患者（中等症持続型喘息患者）又は重症喘息患者（重症持続型喘息患者）由来の組織、細胞、器官、血液、尿、唾液、血清、血漿等の試料を例示することができる。また、これら対照者由来の生体試料や、軽症、中症又は重症喘息患者由来の生体試料は、採取された後に、被験者由来の生体試料と同様の処理が施されたものが好ましい。
【００２８】
本件収集方法において、喘息診断用マイクロＲＮＡの発現量を検出・定量する方法としては、喘息断用マイクロＲＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、喘息診断用マイクロＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いて喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、かかる逆転写産物を特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、被験者由来の生体試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いて喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでかかる逆転写産物をラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的に逆転写産物を標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
【００２９】
本件診断用キットにおけるプライマーとしては、喘息診断用マイクロＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）の上流又は下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー（対）であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ｃＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１０〜３０塩基を選択することができる。
【００３０】
本件診断用キットにおけるプローブとしては、喘息診断用マイクロＲＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。
【００３１】
本件診断用キットの標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
【００３２】
本発明において、「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、より好ましくは１〜４個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
１．喘息（小児気管支喘息）診断用マイクロＲＮＡの同定
１−１  血清由来のＲＮＡの抽出
千葉大学医学部附属病院小児科及び千葉県こども病院アレルギー膠原病科に通院中の、気管支喘息（ＢＡ）を罹患する１０〜１４歳の男子２名及び女子３名の計５名（ＢＡ群）、ＢＡとアトピー性皮膚炎（ＡＤ）の両方を罹患する１１〜１４歳の男子１名及び女子４名の計５名（ＢＡ／ＡＤ群）、並びにアレルギー疾患の既往歴のない１１〜１２歳の男子２名及び女子３名の計５名（対照群）から血液を採取し、血清サンプルを得た後、miRNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって血清サンプルからトータルＲＮＡを精製した。
【００３５】
１−２  マイクロＲＮＡの発現量の網羅的解析
上記トータルＲＮＡを鋳型として、miScript SYBR Green PCR Kit (1000)（Qiagen社製、Cat. No. 218075）を用い、添付のプロトコールにしたがって逆転写及びリアルタイムＰＣＲ法により１７９種類のヒトマイクロＲＮＡの発現量を網羅的に解析した。
【００３６】
１−３  結果
対照群と比較してＢＡ群において増減が認められたマイクロＲＮＡを解析したところ、４種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡは有意に増加することが確認された。
また、対照群と比較してＢＡ／ＡＤ群において増減が認められたマイクロＲＮＡを解析したところ、９種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡの発現量は有意に増加することが確認された。
これら発現量の増減が認められたマイクロＲＮＡのうち、ＢＡ群とＢＡ／ＡＤ群に共通して発現量の増減が認められたマイクロＲＮＡを調べたところ、２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p［配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］、及びhsa-miR-486-5p［配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］）の発現量は有意に減少し、１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p［配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡ］）の発現量は有意に増加することが確認された（表１参照）。なお、これら３種類のマイクロＲＮＡの検出に用いたプライマーセットを表２に示す。
【００３７】
【表１】
2017038553.tif 000002
【００３８】
【表２】
2017038553.tif 000003
【００３９】
以上の結果から、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも喘息を診断できる診断マーカーとして、３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）が同定された。
【実施例２】
【００４０】
２．喘息診断用マイクロＲＮＡを用いた小児気管支喘息の診断
同定した喘息診断用マイクロＲＮＡを用いて、小児気管支喘息を効果的に診断できるかどうかを、検体数を増やして解析した。対照群１３名及びＢＡ群６３名から、上記実施例１に記載の方法にしたがって、血清由来のトータルＲＮＡを精製し、上記３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量を解析した。その結果、実施例１の結果と同様に、ＢＡ群における２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p及びhsa-miR-486-5p、）の発現量は、対照群と比べ有意に減少し（図１Ａ及びＢ参照）、また、ＢＡ群における１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p）の発現量は、対照群と比べ有意に増加すること（図１Ｃ参照）が確認された。この結果は、２種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p及びhsa-miR-486-5p、）の発現量の減少や、１種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-144-5p）の発現量の増加を指標にして、喘息の有無を診断できることを示している。
【実施例３】
【００４１】
３．喘息診断用マイクロＲＮＡの発現量を指標としたクラスター解析
３−１  クラスター解析
千葉大学医学部附属病院及び千葉県こども病院の小児科外来に通院中の、小児気管支喘息を罹患する、又は罹患した経験のある６〜２１歳の男子４６名及び女子２１名の計６７名（ＢＡ群）について、年令、性別、家族歴、肥満の有無、ペットの飼育歴、他のアレルギー疾患の合併、末梢血好酸球数、血清総ＩｇＥ、１５項目の吸入抗原特異的ＩｇＥ、呼吸機能、呼気中一酸化窒素濃度（ＦｅＮＯ）、治療ステップ、治療コントロール状態等約６０項目を同時期に調査した。さらに、上記実施例１に記載の方法にしたがって、上記３種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p、hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量を解析し、かかる発現量を指標としてWard法によるクラスター解析を行った。
【００４２】
３−２  結果
ＢＡ群は４つのクラスターに分類され、そのうち、上記１種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p）の発現量が低く、かつ、上記２種類のマイクロＲＮＡ（hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量が高いクラスター（クラスター１）は、他のクラスター（クラスタ２〜４）と比べ、末梢血好酸球数、血清総ＩｇＥ値（図２Ａ参照）、及びＦｅＮＯ（図２Ｂ参照）が低く、軽症の小児気管支喘息に分類されることが示された。この結果は、１種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-185-5p）の発現量の減少や、２種類の喘息診断用マイクロＲＮＡ（hsa-miR-486-5p、及びhsa-miR-144-5p）の発現量の増加を指標にして、ＢＡ群の中から軽症の小児気管支喘息を診断できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によると、アトピー性皮膚炎を併発した場合でも、小児気管支喘息等の喘息の有無や喘息の重症度を精度よく診断できるため、喘息の診断や、喘息の重症度に合わせた個別的な治療に資するものである。
【図１】
2017038553.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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