(57)【要約】【課題】疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明の一実施形態に係る疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法は、下記工程（１）及び（２）を含む：（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び（２）前記１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）及び（２）を含む、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法：
（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び
（２）前記１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。
【請求項２】
前記高分子は、分子量が５ｋＤａ以上、１０００ｋＤａ以下の高分子である、
請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記高分子は、イムノグロブリン、アミロイド、サイトカイン、トランスフェリン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上である、
請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記疾患は、自己免疫疾患又はアレルギーである、
請求項１乃至３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記自己免疫疾患は、天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患である、
請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記アレルギーは、アレルギー性じんましん、ぜんそく、鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー及びアナフィラキシーからなる群より選択される疾患である
請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記高分子は、イムノグロブリンであり、
前記疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患である、
請求項１乃至６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記細胞は、血管内皮細胞である、
請求項１乃至７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施する、請求項１乃至８のいずれかに記載のスクリーニング方法：
（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の前記高分子の前記細胞による取り込み量を評価する工程；及び
（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下における前記取り込み量が、前記物質の不存在下における前記取り込み量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。
【請求項１０】
前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施する、請求項１乃至８のいずれかに記載のスクリーニング方法：
（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された非ヒト動物及び前記物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の前記高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び
（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された前記非ヒト動物における前記移行量が、前記物質を投与されていない前記非ヒト動物における前記移行量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、肥満細胞を枯渇させることができる化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、自己免疫疾患を治療する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００４−５３６０９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、自己免疫疾患が発症するメカニズムは未だ十分に解明されておらず、その効果的な予防又は治療方法の開発が望まれている。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニン方法は、下記工程（１）及び（２）を含む：（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び（２）前記１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。本発明によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することができる。
【０００７】
また、前記方法において、前記高分子は、分子量が５ｋＤａ以上、１０００ｋＤａ以下の高分子であることとしてもよい。また、前記方法において、前記高分子は、イムノグロブリン、アミロイド、サイトカイン、トランスフェリン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
【０００８】
また、前記方法において、前記疾患は、自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよい。また、この場合、前記自己免疫疾患は、天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、前記アレルギーは、アレルギー性じんましん、ぜんそく、鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー及びアナフィラキシーからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、前記方法において、前記高分子は、イムノグロブリンであり、前記疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患であることとしてもよい。また、前記方法において、前記細胞は、血管内皮細胞であることとしてもよい。
【０００９】
また、前記方法において、前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の前記高分子の前記細胞による取り込み量を評価する工程；及び（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下における前記取り込み量が、前記物質の不存在下における前記取り込み量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。
【００１０】
また、前記方法において、前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された非ヒト動物及び前記物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の前記高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された前記非ヒト動物における前記移行量が、前記物質を投与されていない前記非ヒト動物における前記移行量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る実施例１において、イムノグロブリンの培養細胞による取り込み量を評価した結果を示す説明図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果の一例を示す説明図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果の他の例を示す説明図である。
【図２Ｃ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果のさらに他の例を示す説明図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、イマチニブの投与後にイムノグロブリンを投与して、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果の一例を示す説明図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、イマチニブの投与後にイムノグロブリンを投与して、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果の他の例を示す説明図である。
【図３Ｃ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、ニロチニブの投与後にイムノグロブリンを投与して、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果を示す説明図である。
【図３Ｄ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、ＡＩＣＡＲの投与後にイムノグロブリンを投与して、血液中のイムノグロブリンの皮膚組織表皮細胞への移行量を評価した結果を示す説明図である。
【図４Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、予めイマチニブを投与され又は投与されることなく、イムノグロブリンを投与されたマウスの写真を示す説明図である。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、予めニロチニブを投与され又は投与されることなく、イムノグロブリンを投与されたマウスの写真を示す説明図である。
【図４Ｃ】本発明の一実施形態に係る実施例２において、予めＡＩＣＡＲを投与され又は投与されることなく、イムノグロブリンを投与されたマウスの写真を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。
【００１４】
本実施形態に係る疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（以下、「本方法」という。）は、下記工程（１）及び（２）を含む：（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び（２）当該１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。
【００１５】
すなわち、本方法の工程（１）では、まず、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質（以下、「ｃ−Ａｂｌ抑制物質」という。）を用意する。本実施形態において、「ｃ−Ａｂｌ」は、チロシンキナーゼ活性を有するｃ−Ａｂｌタンパク質である。また、「ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系」は、ｃ−Ａｂｌを発現している細胞において、ｃ−Ａｂｌが関与するシグナル伝達系である。そして、ｃ−Ａｂｌ抑制物質は、ｃ−Ａｂｌ発現細胞において、ｃ−Ａｂｌが関与するシグナル伝達系を抑制する物質である。
【００１６】
具体的に、工程（１）は、例えば、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選択される１以上の物質をｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意する：（ｉ）ｃ−Ａｂｌとの相互作用によりｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害する物質；、（ｉｉ）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与する、ｃ−Ａｂｌ以外のタンパク質の酵素活性を阻害する物質；、（ｉｉｉ）ｃ−Ａｂｌの遺伝子発現、又はｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与する、ｃ−Ａｂｌ以外のタンパク質の遺伝子発現を阻害する物質；、（ｉｖ）ｃ−Ａｂｌとｃ−Ａｂｌ受容体との相互作用を阻害する物質；及び（ｖ）ｃ−Ａｂｌ受容体を含む複合体の形成を阻害する物質。
【００１７】
なお、上記（ｉ）におけるｃ−Ａｂｌとの相互作用は、例えば、ｃ−Ａｂｌとの結合であることとしてもよい。また、上記（ｉｉ）におけるｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与するタンパク質は、例えば、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系の上流又は下流に存在し、当該ｃ−Ａｂｌの活性化に関与するシグナル伝達タンパク質であることとしてもよい。また、上記（ｉｉ）におけるタンパク質の酵素活性の阻害は、例えば、当該タンパク質との相互作用による阻害であることとしてもよく、当該タンパク質との結合による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｉｉｉ）における遺伝子発現の阻害は、例えば、当該遺伝子のプロモーター領域への転写抑制因子及び／又は転写活性化因子の結合抑制による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｉｖ）におけるｃ−Ａｂｌとｃ−Ａｂｌ受容体との相互作用の阻害は、例えば、当該ｃ−Ａｂｌ及び／又はｃ−Ａｂｌ受容体との結合による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｖ）におけるｃ−Ａｂｌ受容体を含む複合体は、例えば、当該ｃ−Ａｂｌ受容体と、そのリガンド分子とを含む複合体であることとしてもよい。また、上記（ｖ）における複合体の形成の阻害は、例えば、ｃ−Ａｂｌ受容体及び／又は当該複合体を形成するｃ−Ａｂｌ受容体以外の物質との相互作用による阻害であることとしてもよく、ｃ−Ａｂｌ受容体及び／又は当該複合体を形成するｃ−Ａｂｌ受容体以外の物質との結合による阻害であることとしてもよい。
【００１８】
工程（１）においては、既にｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制することが知られている物質を、ｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意することとしてもよい。また、工程（１）においては、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害することは知られていない物質が、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害するか否かを評価し、その結果、当該物質がｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害することが新たに確認された場合に、当該物質を、ｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意することとしてもよい。また、工程（１）においては、複数の物質の中から、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を選択することにより、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を用意することとしてもよい。
【００１９】
次に、本方法の工程（２）においては、上記工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を選択する。なお、工程（２）における高分子の細胞による取り込みは、例えば、当該細胞のエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスによる当該高分子の取り込みであることとしてもよい。
【００２０】
高分子は、疾患に関与する高分子であって、細胞により、その細胞内に取り込まれ得るものであれば特に限られない。高分子は、例えば、分子量が５ｋＤａ以上、１０００ｋＤａ以下の高分子であることとしてもよい。具体的に、高分子は、例えば、イムノグロブリン、アミロイド、サイトカイン、トランスフェリン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であってもよい。また、高分子は、例えば、蛍光色素、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子であることとしてもよい。
【００２１】
細胞は、上記高分子を取り込み得る細胞であれば特に限られない。細胞は、動物の細胞であることが好ましく、哺乳類の細胞であることが特に好ましい。具体的に、上記細胞は、ヒト、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットからなる群より選択されるげっ歯類）、ウサギ、イヌ及びブタからなる群より選択される哺乳類の細胞であることとしてもよく、ヒト、サル及びげっ歯類からなる群より選択される哺乳類の細胞であることが好ましく、ヒトの細胞であることが特に好ましい。
【００２２】
細胞は、初代細胞であってもよいし、株化細胞であってもよい。細胞は、体細胞であってもよいし、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞及び間葉系幹細胞からなる群より選択される）であってもよいし、当該幹細胞から誘導された分化細胞であってもよい。
【００２３】
細胞が体細胞、又は幹細胞から誘導された分化細胞である場合、当該細胞は、例えば、血管内皮細胞であることが好ましい。血管内皮細胞は、血管に由来する細胞であれば特に限られないが、例えば、臍帯静脈、皮膚組織内血管、脳微小血管、網膜微小血管及び腎血管からなる群より選択される血管に由来する細胞であることが好ましい。
【００２４】
工程（２）において、ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、高分子の細胞による取り込みを抑制するか否かを評価する方法は、特に限られず、例えば、当該高分子の当該細胞による取り込みを直接的に評価する方法であってもよいし、間接的に評価する方法であってもよい。
【００２５】
すなわち、工程（２）においては、例えば、次の工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の高分子の細胞による取り込み量を評価する工程；及び（２ｂ）当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における当該取り込み量が、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における当該取り込み量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する工程。この場合、本方法は、上記工程（１）及び（２）に代えて、上記工程（１）、（２ａ）及び（２ｂ）を含むこととしてもよい。
【００２６】
より具体的に、例えば、工程（２ａ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、培養液中の高分子の培養細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。すなわち、この場合、工程（２ａ）では、細胞、ｃ−Ａｂｌ抑制物質及び高分子を含む培養液中（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価するとともに、当該細胞及び当該高分子を含み当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を含まない培養中（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下）における当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。培養細胞は、上述のとおり特に限られないが、培養血管内皮細胞であることが好ましい。
【００２７】
また、例えば、工程（２ａ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物及び当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、体液中の高分子の細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。
【００２８】
すなわち、この場合、工程（２ａ）では、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における、体液中の高分子の細胞による取り込み量を評価するとともに、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における、当該体液中の当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。
【００２９】
体液は、上述した高分子を含むものであれば、特に限られず、例えば、血液又は組織間質液であることとしてもよい。細胞は、上述のとおり特に限られないが、血管内皮細胞であることが好ましい。すなわち、例えば、上記体液が血液である場合、上記細胞は血管内皮細胞であることが好ましい。非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳類であれば特に限られず、例えば、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットからなる群より選択されるげっ歯類）、ウサギ、イヌ及びブタからなる群より選択される哺乳類であることとしてもよく、げっ歯類であることが特に好ましい。
【００３０】
工程（２ａ）において高分子の細胞による取り込み量を評価する方法は、工程（２ｂ）においてｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下での当該取り込み量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下での当該取り込み量とを比較できる方法であれば特に限られないが、フローサイトメトリーにより当該取り込み量を評価することが好ましい。
【００３１】
すなわち、この場合、蛍光色素で標識された高分子を細胞に取り込ませ、又は細胞に取り込まれた高分子を蛍光色素で標識し、当該細胞に取り込まれた高分子の蛍光色素に由来する蛍光量をフローサイトメトリーで定量することにより、当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。
【００３２】
なお、工程（２ａ）においては、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子を使用し、当該ＲＩに由来する放射線量、当該非蛍光色素に由来する染色量、又は当該酵素と基質との化学反応生成物に由来する蛍光量又は染色量に基づき、当該高分子の細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。
【００３３】
そして、工程（２ｂ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における第一の取り込み量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における第二の取り込み量とを比較し、当該第一の取り込み量が当該第二の取り込み量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。
【００３４】
すなわち、例えば、高分子の細胞による取り込み量をフローサイトメトリーで評価する場合、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における取り込み量に対応して測定される第一の蛍光量（例えば、第一の平均蛍光強度）と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における取り込み量に対応して測定される第二の蛍光量（例えば、第二の平均蛍光強度）とを比較し、当該第一の蛍光量が当該第二の蛍光量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。
【００３５】
また、工程（２）においては、例えば、次の工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物及び当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び（２ｂ）当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された当該非ヒト動物における当該移行量が、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない当該非ヒト動物における当該移行量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する工程。この場合、本方法は、上記工程（１）及び（２）に代えて、上記工程（１）、（２ａ）及び（２ｂ）を含むこととしてもよい。
【００３６】
すなわち、まず工程（２ａ）では、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における、血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価するとともに、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における、血液中の当該高分子の血管内皮細胞を介した当該血管周囲組織への移行量を評価する。
【００３７】
具体的に、工程（２ａ）では、例えば、非ヒト動物の血管内の血液中から、当該血管の内壁を構成する当該血管内皮細胞を介して、当該血管の周囲の組織に移行した当該高分子の量を評価する。この場合、非ヒト動物の血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞に移行した高分子の量を評価することとしてもよい。
【００３８】
血管周囲組織は、血管を含む組織であれば特に限られず、例えば、皮膚、脳、眼、腎臓、筋肉、関節及び甲状腺からなる群より選択される１以上の血管周囲組織であることとしてもよく、皮膚の血管周囲組織であることが好ましい。
【００３９】
すなわち、例えば、工程（２ａ）では、非ヒト動物の皮膚の血管内の血液中から、当該血管の内壁を構成する血管内皮細胞を介して、当該血管の周囲の組織（例えば、当該皮膚の表皮組織及び／又は真皮組織）に移行した当該高分子の量を評価することとしてもよい。この場合、例えば、非ヒト動物の皮膚の血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞（例えば、当該皮膚の表皮細胞及び／又は真皮細胞）に移行した高分子の量を評価することとしてもよい。
【００４０】
また、工程（２ａ）においては、恒常的条件（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で非ヒト動物おける血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。この場合、高分子としては、非病原性の高分子（例えば、非病原性のイムノグロブリン）を使用することが好ましい。
【００４１】
工程（２ａ）において高分子の移行量を評価する方法は、工程（２ｂ）においてｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物での当該移行量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物での当該移行量とを比較できる方法であれば特に限られないが、フローサイトメトリーにより当該移行量を評価することが好ましい。
【００４２】
すなわち、この場合、蛍光色素で標識された高分子を非ヒト動物に投与し、又は血管周囲組織から採取された細胞に移行した高分子を蛍光色素で標識し、当該細胞に移行した高分子の蛍光色素に由来する蛍光量をフローサイトメトリーで定量することにより、当該高分子の当該細胞への移行量を評価する。
【００４３】
なお、工程（２ａ）においては、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子を非ヒト動物に投与し、当該ＲＩに由来する放射線量、当該非蛍光色素に由来する染色量、又は当該酵素と基質との化学反応生成物に由来する蛍光量又は染色量に基づき、血管周囲組織中の細胞への当該高分子の移行量を評価することとしてもよい。
【００４４】
そして、工程（２ｂ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における第一の移行量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における第二の移行量とを比較し、当該第一の移行量が当該第二の移行量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。
【００４５】
すなわち、例えば、血管周囲組織中の細胞への高分子の移行量をフローサイトメトリーで評価する場合、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における移行量に対応して測定される第一の蛍光量（例えば、第一の平均蛍光強度）と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における移行量に対応して測定される第二の蛍光量（例えば、第二の平均蛍光強度）とを比較し、当該第一の蛍光量が当該第二の蛍光量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。
【００４６】
なお、血管内の血液中の高分子の血管周囲組織への移行が、まず当該血液中の高分子が当該血管の内壁を構成する血管内皮細胞の細胞内に取り込まれ、次いで、当該高分子が当該血管内皮細胞から当該血管周囲組織へ放出されることにより起こる場合（すなわち、当該血管内皮細胞のトランスサイトーシスによって当該高分子が当該血液中から当該血管周囲組織へ移行する場合）、当該血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することで、当該高分子の当該血管内皮細胞による取り込みを間接的に評価することとなる。
【００４７】
本方法によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を効果的にスクリーニングすることができる。本方法に係る疾患は、細胞外の高分子の細胞による取り込みが関与する疾患であれば特に限られない。
【００４８】
すなわち、本方法に係る疾患は、自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよい。本方法に係る自己免疫疾患は、特に限られないが、例えば、天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、本方法に係るアレルギーは、特に限られないが、例えば、アレルギー性じんましん、ぜんそく、鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー及びアナフィラキシーからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。
【００４９】
また、本方法に係る疾患に関与する高分子はイムノグロブリンであり、当該疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患であることとしてもよい。
【００５０】
この場合、本方法は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、当該有効成分として選択する。
【００５１】
具体的に、工程（２）においては、上述した工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい。すなわち、上述した工程（２ａ）において、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のイムノグロブリンの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。
【００５２】
血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患は、例えば、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよく、自己抗体介在疾患（自己抗体の過剰な産生に関連して発症する疾患）であることとしてもよい。
【００５３】
この場合、本方法は、自己免疫疾患又はアレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、当該有効成分として選択することとしてもよい。
【００５４】
すなわち、例えば、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。また、例えば、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、ＩｇＥ及び／又はＩｇＧの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、アレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。
【００５５】
具体的に、工程（２）においては、上述した工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい。すなわち、本方法が自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法である場合、上述した工程（２ａ）において、細胞外のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。また、本方法がアレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法である場合、上述した工程（２ａ）において、細胞外のＩｇＥ及び／又はＩｇＧの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のＩｇＥ及び／又はＩｇＧの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。
【００５６】
また、本方法に係る疾患に関与する高分子はアミロイドであり、当該疾患は、アミロイドーシスであることとしてもよい。また、本方法に係る疾患に関与する高分子はサイトカイン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であり、当該疾患は、動脈硬化症であることとしてもよい。また、本方法に係る疾患に関与する高分子は脂質であり、当該疾患は、脂質異常症であることとしてもよい。
【００５７】
本方法は、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であるが、例えば、当該疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。また、本方法は、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。この場合、本方法は、細胞外のイムノグロブリンの血管内皮細胞による取り込みを抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよいし、血液中のイムノグロブリンの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行を抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよいし、血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞へのイムノグロブリンの移行を抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。
【００５８】
なお、本方法に係る疾患の予防及び／又は治療剤は、当該疾患の予防のため、及び／又は治療のために使用される医薬組成物である。具体的に、本方法に係る疾患の予防及び／又は治療剤は、例えば、当該疾患の予防のため、及び／又は治療のために、当該疾患を発症し得る患者又は当該疾患を既に発症している患者に投与される医薬組成物である。
【００５９】
本方法に係る予防及び／又は治療剤は、本方法により選択される１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を有効成分として含む。本方法に係る予防及び／又は治療剤は、本方法により選択される１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質からなる医薬組成物であることとしてもよいし、当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質（有効成分）と、薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物であることとしてもよい。
【００６０】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【００６１】
ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、培養液中のイムノグロブリンの培養細胞による取り込みを抑制することを確認した。ｃ−Ａｂｌ抑制物質としては、ｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害することが知られているイマチニブ（イマチニブメシル酸塩、和光純薬工業株式会社）又はニロチニブ（Ｃａｙｍａｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用した。血管内皮細胞としては、ヒト皮膚血管内皮細胞（ＨＤＢＥＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を使用した。イムノグロブリンとしては、蛍光色素で標識したＩｇＧであるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を使用した。
【００６２】
まずＨＤＢＥＣを、内皮細胞増殖培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０％〜８０％コンフルエントに到達するまで培養した。次いで、培地を、５μＭのイマチニブ又はニロチニブを含む培地に交換し、当該イマチニブ又はニロチニブを含む培地中でＨＤＢＥＣを２４時間培養した。なお、イマチニブ又はニロチニブを含む培地は、当該イマチニブ又はニロチニブをＰＢＳに溶解して添加剤を調製し、当該添加剤を新たな培地に添加することにより調製した。その後、イマチニブ又はニロチニブを含む培地に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧを添加し、当該培地中でＨＤＢＥＣを１時間インキュベートした。
【００６３】
一方、対照例１では、イマチニブ及びニロチニブは添加せず、イマチニブ及びニロチニブを含まない溶媒（ＰＢＳ）のみを添加した。また、対照例２では、イマチニブ、ニロチニブ、溶媒及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧのいずれも添加しなかった。
【００６４】
そして、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）下で、ＨＤＢＥＣの蛍光画像を取得し、当該蛍光画像に基づいて、当該ＨＤＢＥＣに取り込まれたＩｇＧの量を評価した。すなわち、コンピュータにインストールされた画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して、取得された蛍光画像中の１０個の細胞の各々の細胞質領域を手動で特定し、当該細胞質領域内のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧに由来するシグナルの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）（Ａ５９４−ＭＦＩ）を測定した。さらに、Ａ５９４−ＭＦＩからバックグラウンドのＭＦＩを差し引くことで、ΔＡ５９４−ＭＦＩを算出した。
【００６５】
図１には、ΔＡ５９４−ＭＦＩの算出結果を示す。図１の横軸において、左端の「Ｖｅｈ」は対照例２を示し、「Ｖｅｈ／Ａ５９４−ＩｇＧ」は対照例１を示し、「Ｉｍａｔｉｎｉｂ／Ａ５９４−ＩｇＧ」はイマチニブを添加した例を示し、「Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ／Ａ５９４−ＩｇＧ」はニロチニブを添加した例を示す。
【００６６】
図１に示すように、ＩｇＧとの接触前に予め血管内皮細胞をイマチニブ又はニロチニブで処理した例のΔＡ５９４−ＭＦＩは、対照例１のそれより顕著に低く、対照例２のそれと同程度であった。すなわち、イマチニブ及びニロチニブのそれぞれが、血管内皮細胞によるＩｇＧの取り込みを抑制することが確認された。
【００６７】
なお、ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みは、当該ＨＤＢＥＣを、カベオラ介在性エンドサイトーシス（ｃａｖｅｏｌａｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の選択的阻害剤であるナイスタチンで処理することによっても抑制された。
【００６８】
すなわち、まずＨＤＢＥＣを、内皮細胞増殖培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０％〜８０％コンフルエントに到達するまで培養した。次いで、ＨＤＢＥＣを、５０μｇ／ｍＬのナイスタチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中で３０分培養した。なお、培地へのナイスタチンの添加は、当該ナイスタチンをＰＢＳに溶解して添加剤を調製し、当該添加剤を培地に添加することにより行った。その後、ＨＤＢＥＣを、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧを含む培地中で１時間インキュベートした。一方、対照例では、ナイスタチンの添加に代えて、ナイスタチンを含まない溶媒のみを添加した。
【００６９】
そして、上述のイマチニブ及びニロチニブの例と同様に、ＨＤＢＥＣに取り込まれたＩｇＧの量を評価した。その結果、ナイスタチンによってＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みが顕著に抑制されることが確認された。
【００７０】
また、ＨＤＢＥＣを、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４標識ヒトＩｇＧを含む培地中で１時間インキュベートし、次いで、当該ＨＤＢＥＣを固定化し、さらに透明化処理し、その後、当該ＨＤＢＥＣを抗マウスカベオリン−１抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で一晩インキュベートした。さらに翌日、ＨＤＢＥＣを抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８標識抗体とともに室温で３０分インキュベートし、次いで、退色防止用封入材（ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ）で封入した。そして、ＨＤＢＥＣを蛍光顕微鏡（ＢＺ−９００、ＫＥＹＥＮＣＥ）下で観察した。その結果、ＨＤＢＥＣの細胞内のＩｇＧの多くはカベオリン−１に隣接して観察された。
【００７１】
ここで、公知文献“Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃ−Ａｂｌ  ａｎｄ  Ｐｒｄｘ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，  ２０５８１−２０５９１  （２０１３）”及び“Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ，  Ａ．Ｒ．  ＆  Ｍａｓｔｉｃｋ，  Ｃ．Ｃ．  ｃ−Ａｂｌ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｏｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  １４．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １５，  ２８９−２９８  （２００３）”では、カベオリン−１のリン酸化は、カベオリン介在性エンドサイトーシスにおける重要なステップであること、及びｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、その過程で主要な役割を果たしていることが報告されている。
【００７２】
したがって、上述したＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みには、ｃ−Ａｂｌを介したカベオリン介在性エンドサイトーシスが関与しており、当該ｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害するイマチニブ及びニロチニブが、当該ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みを阻害したものと考えられた。
【実施例２】
【００７３】
ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、非ヒト動物において、血液中から血管周囲組織へのイムノグロブリンの移行を抑制すること、及び自己免疫疾患の発症を抑制することを確認した。非ヒト動物としては、８週齢〜９週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）を使用した。
【００７４】
そして、非ヒト動物の自己免疫疾患モデルとして、マウス天疱瘡モデルを作製した。ここで、天疱瘡は、自己免疫疾患の一つ（より具体的には、自己抗体介在疾患（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の一つ）であり、自己の細胞が有するデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に対する抗体（抗Ｄｓｇ３自己抗体）の大量産生により発症する疾患である。天疱瘡患者においては、明らかな局所的炎症なしに自己抗体の血管周囲組織への沈着が認められる。抗Ｄｓｇ３自己抗体は表皮細胞の解離を引き起こし、その結果、天疱瘡患者の皮膚においては、水泡形成や脱毛が発生する。
【００７５】
マウス天疱瘡モデルは、抗Ｄｓｇ３自己抗体を使用して作製した。すなわち、まず、マウスＩｇＧ１サブタイプに属する、抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体を作製した。具体的に、公知文献”Ｔｓｕｎｏｄａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ  ３．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０，  ２１７０−２１７８  （２００３）”の記載に従って、病原性抗マウスＤｓｇ３モノクローナル抗体（ＡＫ２３）を産生するハイブリドーマ細胞と、非病原性抗マウスＤｓｇ３モノクローナル抗体（ＡＫ１８）を産生するハイブリドーマ細胞とを作製した。
【００７６】
次いで、これらのハイブリドーマ細胞をＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社）中、３７℃で１４日培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨｉＴｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して培養上清中に産生されたＩｇＧを精製することにより、ＡＫ２３及びＡＫ１８を得た。
【００７７】
病原性のＡＫ２３を１００μｇ、マウスの尾静脈に投与すると、投与後１０日の当該マウスの背中には顕著な脱毛が認められた。一方、局所炎症を引き起こす表皮細胞の解離を回避して、恒常的条件（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で血管周囲組織へのＩｇＧの移行動態を正確に評価する上では、非病原性のＡＫ１８が有用であった。
【００７８】
すなわち、ＰＢＳに溶解した１００μｇのＡＫ１８をマウスの尾静脈に投与し、当該投与の２４時間後に当該マウスの耳の皮膚組織を採取した。次いで、この皮膚組織を５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（合同酒精株式会社）及び１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で３０分インキュベートした。その後、ピンセットを使用して、皮膚組織から表皮を分離した。さらに、表皮を０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液中、３７℃で８分インキュベートし、７０μｍナイロンメッシュでろ過した。
【００７９】
得られた細胞懸濁液に、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ１抗体、ＰＢ標識抗マウスＣＤ４５抗体及びＦＩＴＣ標識抗マウスＥ−カドヘリン抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。そして、フローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーには、フローサイトメーター（ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、コンピュータにインストールされた解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）により分析した。
【００８０】
一方、対照例１では、ＡＫ１８に代えて、Ｄｓｇ３には結合しない非病原性のマウスＩｇＧ１（Ｃｔｒｌ  ＩｇＧ１）をマウスに投与した。また、対照例２では、ＡＫ１８に代えて、ＰＢＳのみをマウスに投与した。
【００８１】
図２Ａには、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４５−／Ｅ−カドヘリン＋細胞（表皮細胞）のＩｇＧ１に由来する平均蛍光強度（ＩｇＧ１−ＭＦＩ）を測定した結果を示す。図２Ａの横軸において、「ＰＢＳ」は対照例２を示し、「Ｃｔｒｌ  ＩｇＧ１」は対照例１を示し、「ＡＫ１８」はＡＫ１８を投与した例を示す。
【００８２】
図２Ａに示すように、ＡＫ１８を投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩは、対照例１及び対照例２のそれらに比べて顕著に大きかった。すなわち、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウスの耳の表皮には、対照例１，２に比べて顕著な量のＩｇＧ１が沈着していることが確認された。
【００８３】
図２Ｂには、同様にして、ＡＫ１８の投与直後、投与から１時間後、３時間後、６時間後及び２４時間後のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図２Ｂに示すように、表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、投与後１時間以内に上昇し始め、投与後６時間にはほぼプラトーに達した。
【００８４】
図２Ｃには、同様にして、ＡＫ１８の投与量を変えて、投与から２４時間後のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図２Ｃに示すように、表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルと、ＡＫ１８の投与量とには強い正の相関が認められた。
【００８５】
次に、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてイマチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、イマチニブ（５〜１５０ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日２回、２日続けて尾静脈に投与した。イマチニブの投与は、イマチニブメシル酸塩をＰＢＳで溶解して調製した溶液を投与することにより行った。
【００８６】
図３Ａには、イマチニブの投与量を変えて、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ａの横軸において、「ＰＢＳ」はイマチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「−／ＡＫ１８」はイマチニブ及び溶媒のいずれも投与せず、ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「２００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」、「６００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」、「２０００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」及び「６０００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」は、それぞれ予めイマチニブを２００μｇ、６００μｇ、２０００μｇ及び６０００μｇ投与し、その後、ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
【００８７】
図３Ａに示すように、イマチニブの投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低下した。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。
【００８８】
図３Ｂには、ＡＫ１８の投与量を変えて、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｂの横軸において、「ＰＢＳ」はイマチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「５０／ＡＫ１８（μｇ）」、「１００／ＡＫ１８（μｇ）」及び「２００／ＡＫ１８（μｇ）」の白抜き丸印（「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）は、それぞれ予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇ投与した例を示し、「５０／ＡＫ１８（μｇ）」、「１００／ＡＫ１８（μｇ）」及び「２００／ＡＫ１８（μｇ）」の黒塗り丸印（「Ｉｍａｔｉｎｉｂ」）は、予めイマチニブを６０００μｇ投与し、その後、それぞれＡＫ１８を５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇ投与した例を示す。
【００８９】
図３Ｂに示すように、ＰＢＳの投与後にＡＫ１８を投与した例（「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）では、ＡＫ１８の投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルも増加したのに対し、イマチニブの投与後にＡＫ１８を投与した例（「Ｉｍａｔｉｎｉｂ」）では、ＡＫ１８の投与量にかかわらず、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低く抑えられた。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。
【００９０】
また、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてニロチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ニロチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１回、経口投与した。
【００９１】
図３Ｃには、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｃの横軸において、「ＰＢＳ」はニロチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「Ｖｅｈ／ＡＫ１８」はニロチニブを投与せず、予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ／ＡＫ１８」は、予めニロチニブを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
【００９２】
図３Ｃに示すように、ＡＫ１８の投与前にニロチニブを投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、ＡＫ１８の投与前にニロチニブを投与しなかった例のそれより顕著に低かった。すなわち、予めニロチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。
【００９３】
また、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてＡＩＣＡＲ（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ＡＩＣＡＲ（Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（０．５−０．７５ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１回、皮下投与した。なお、ＡＩＣＡＲは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することによりｃ−Ａｂｌリン酸化反応を阻害することが知られている。
【００９４】
図３Ｄには、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｄの横軸において、「ＰＢＳ」はＡＩＣＡＲを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「Ｖｅｈ／ＡＫ１８」はＡＩＣＡＲを投与せず、予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「１０／ＡＩＣＡＲ（ｍｇ）／ＡＫ１８」及び「１５／ＡＩＣＡＲ（ｍｇ）／ＡＫ１８」は、それぞれ予めＡＩＣＡＲを１０ｍｇ及び１５ｍｇ投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
【００９５】
図３Ｄに示すように、ＡＫ１８の投与前にＡＩＣＡＲを投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、ＡＫ１８の投与前にＡＩＣＡＲを投与しなかった例のそれより顕著に低かった。また、ＡＩＣＡＲの投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低下した。すなわち、予めＡＩＣＡＲを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。
【００９６】
次に、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてイマチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ２３の投与前に、イマチニブ（５〜１５０ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日２回、２日続けて尾静脈に投与した。
【００９７】
図４Ａには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ａにおいて、「−」の３匹は、予めイマチニブを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の３匹は、イマチニブを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。
【００９８】
図４Ａに示すように、イマチニブを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めイマチニブを投与したマウスには脱毛が認められなかった。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。
【００９９】
また、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてニロチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ２３の投与前に、ニロチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日１回、７日続けて経口投与した。
【０１００】
図４Ｂには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ｂにおいて、「−」の４匹は、予めニロチニブを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の４匹は、ニロチニブを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。
【０１０１】
図４Ｂに示すように、ニロチニブを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めニロチニブを投与したマウスにはほとんど脱毛が認められなかった。すなわち、予めニロチニブを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。
【０１０２】
また、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてＡＩＣＡＲを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ＡＩＣＡＲ（０．５−０．７５ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日１回、４日続けて皮下投与した。
【０１０３】
図４Ｃには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ｃにおいて、「−」の３匹は、予めＡＩＣＡＲを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の３匹は、ＡＩＣＡＲを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。
【０１０４】
図４Ｃに示すように、ＡＩＣＡＲを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めＡＩＣＡＲを投与したマウスには僅かな脱毛しか認められなかった。すなわち、予めＡＩＣＡＲを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。
【０１０５】
なお、イマチニブ及びニロチニブは、Ｐｄｇｆｒ−α、Ｐｄｇｆｒ−β及びｃ−Ｋｉｔといった他のチロシンキナーゼをも阻害することが知られているため、当該他のチロシンキナーゼの関与についても確認した。
【０１０６】
まず抗マウスＰｄｇｆｒ−α抗体、抗マウスＰｄｇｆｒ−β抗体及び抗マウスｃ−Ｋｉｔ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、フローサイトメトリーにより、マウス耳の皮膚血管内皮細胞を分析した結果、当該血管内皮細胞は、Ｐｄｇｆｒ−αを発現していたが、Ｐｄｇｆｒ−β及びｃ−Ｋｉｔは発現していなかった。
【０１０７】
そこで、マウスにＡＫ１８を投与する前に、抗Ｐｄｇｆｒ−α阻害抗体であるＡＰ５（公知文献“Ｓａｎｏ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３，  ２９５５−２９６０  （２００１）”）を投与し、ＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した。しかしながら、ＡＰ５を投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩと、ＡＰ５を投与しなかった例のＩｇＧ１−ＭＦＩとで、ＡＫ１８の沈着量は変わらなかった。
【０１０８】
また、培養ＨＤＢＥＣを無血清培地中で５時間培養し、次いで、５０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中で１時間培養し、Δ５９４−ＭＦＩを測定した。しかしながら、ＰＤＧＦの存在下におけるΔ５９４−ＭＦＩと、ＰＤＧＦの不存在下におけるΔ５９４−ＭＦＩとで、ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込み量は変わらなかった。したがって、ＩｇＧの取り込みにおけるＰｄｇｆｒ−αの関与は小さいと考えられた。
【０１０９】
また、ｃ−Ｋｉｔの関与を確認するため、血管に沿って存在し、活性化によって血管の透過性を制御することのできる肥満細胞について検討した。すなわち、Ｍａｓ−ＴＲＥＣＫマウスの腹腔内に２５０ｎｇのジフテリア毒素を５日続けて投与することにより、肥満細胞欠損マウスを作製した（公知文献“Ｏｔｓｕｋａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２５５３８  （２０１１）”）。
【０１１０】
しかしながら、肥満細胞欠損マウスにおける皮膚へのＡＫ１８の沈着は、ジフテリア毒素を投与されていないマウスのそれに比べて、僅かに抑制されただけであった。したがって、ＩｇＧの沈着における肥満細胞の関与は小さいと考えられた。
【０１１１】
以上より、イマチニブ及びニロチニブは、主に血管内皮細胞におけるｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害することにより、血管を介した血液中から血管周囲組織へのＩｇＧの移行を抑制していると考えられた。
【０１１２】
また、上述の結果は、ｃ−Ａｂｌ抑制物質であるイマチニブ、ニロチニブ及びＡＩＣＡＲの、自己免疫疾患（例えば、自己抗体介在疾患、又は天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患）の予防及び／又は治療剤の有効成分としての使用を裏付けるものであるともいえる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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