(57)【要約】【課題】ＣＭＬ初期段階における正常な造血プロセスを白血病性プロセスに変換する機構を解明して、新たな慢性骨髄性白血病治療剤又は骨転移治療剤となりうる標的物質を見出すことを課題とした。【解決手段】ＣＭＬの初期段階における症状および病態を有するモデル動物を使用して、正常な造血プロセスを白血病性プロセスに変換する機構では、ＣＭＬ骨髄環境下において、好塩基球がＣＣＬ３を発現し、さらにＣＣＬ３は正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進することによって、慢性骨髄性白血病が発症することを見出した。さらに、好塩基球を減少させるなど、好塩基球の機能を直接的又は間接的に阻害することにより、慢性骨髄性白血病の発症又は骨転移を抑制することができることも確認した。これにより、好塩基球を標的物質とする新規な慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、並びに、新規な慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する試験化合物を選択することを特徴とする慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１に記載のスクリーニング方法：
（１）試験化合物を、放射線非照射のヒト以外の動物でありかつＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物の骨髄に、投与する工程、及び
（２）該骨髄中の好塩基球の発現量を測定する工程。
【請求項３】
前記慢性骨髄性白血病は初期段階の慢性骨髄性白血病である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ヒト以外の動物が免疫不全マウスまたは免疫不全ラットである、請求項１〜３のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記造血幹細胞がモデル動物と同種の動物由来の造血幹細胞である、請求項１〜４のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記髄腔が脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である、請求項１〜５のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
自己の正常造血幹細胞と移植された細胞が前記髄腔内に共存している、請求項１〜６のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する化合物又は抽出物を含む慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤。
【請求項９】
前記骨転移は乳癌による骨転移である、請求項８に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１０】
前記化合物がＣＣＲ５阻害剤である、請求項８又は９に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１１】
前記化合物がマラビロクである、請求項８〜１０のいずれか１に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１２】
前記化合物又は抽出物が、ビクリビロク、バイカリン・フラボノイド、Ｔｒｉｇｏｎｏｓｔｅｍａ  ｘｙｐｈｏｐｈｙｌｌｏｉｄｅｓ抽出物（ＴＸＥ）、又はＶａｔｉｃａ  ａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ抽出物である請求項８〜１０のいずれか１に記載の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病治療剤及び該治療剤をスクリーニングする方法に関し、より詳細には、慢性骨髄性白血病の初期段階の症状が誘導された非ヒト慢性骨髄性白血病モデル動物において、該白血病に関与する好塩基球を標的としたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（慢性骨髄性白血病）
慢性骨髄性白血病（以下、「ＣＭＬ」と称する場合もある）は、造血幹細胞（以下、「ＨＳＣ」と称する場合もある）の悪性腫瘍化から生じる骨髄増殖性腫瘍である。わが国における慢性骨髄性白血病の頻度は１０万人に１〜２人と比較的まれで、成人における白血病全体の約２０％を占める。
慢性骨髄性白血病の発症する原因は、明確には解明されていないが、慢性期、移行期および急性期（急性転化期）の３段階に分けられる（非特許文献１）。慢性期は無症状であり、病気の進行とともに、血液中の白血球数と血小板数が増加し、その後、次第に貧血になる。さらに、白血球数が増加するに従って、全身の倦怠感や、腹部の膨満感などの症状が現れる。９０％以上のＣＭＬ症例は、フィラデルフィア染色体の存在と関係している。この染色体は、染色体９と２２の間の相互転座から生じて、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を形成する（非特許文献２）。この遺伝子がＣＭＬの病原であり（非特許文献３）、骨髄中のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物（活性化型チロシンキナーゼ）を発現した白血病幹細胞｛ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（ＬＩＣｓ）｝の存在が、ＣＭＬの慢性期の開始に深く関わっている（非特許文献４）。
【０００３】
ＢＣＲ遺伝子のブレークポイントクラスタ領域は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質をコードしている。ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をＬＩＣ  に転換させることができる恒常的チロシンキナーゼ活性を示す。ＬＩＣは、異種白血病細胞を次々と病理学的に生じさせることができる（非特許文献３、４）。造血に必須の部位は、骨髄（ＢＭ）の限られた領域内にある。ＣＭＬの開始プロセスの間に、少数のＢＣＲ−ＡＢＬ−発現ＬＩＣは、多数の正常な造血性細胞と共存する。正確なメカニズムは不明であるが、ＬＩＣは、その後、正常なＨＳＣを圧倒し、造血系全体で優勢となり、正常な造血のプロセスを白血病性プロセスに変換する。
更に、ＣＭＬ患者は、頻繁に骨髄及び末梢血（ＰＢ）中に好塩基球増多症を示し、それは、急性期においてより明白になる（非特許文献５、６）。しかしながら、慢性骨髄性白血病進行における好塩基球様白血病細胞の病因的役割はほとんど知られていない。
【０００４】
ＣＣＬ３（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  ３）は、ＭＩＰ−１α（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）としても知られており、ＣＣケモカインファミリーに属する。生体内ＢＣＲ−ＡＢＬ発現誘導によって、骨髄中でＣＣＬ３の異常な発現が生じることが報告されている（非特許文献７）。さらに、ＣＣＬ３媒介シグナルは、Ａｂｌタンパク質のキナーゼ活性に応じて、正常なＨＳＣおよび白血病幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を、異なった方法で、制御することができることが報告されている（非特許文献８、９）。これらの報告は、ＣＭＬ発症の初期プロセスでの正常ＨＳＣと白血病幹細胞との間の相互作用に、ＣＣＬ３が潜在的に関与していることを示唆している（非特許文献７）。
しかし、ＣＣＬ３の正確な役割は、適切な実験モデル動物がないため不明であった。
【０００５】
本発明者らは、以前、非放射線照射マウスへの少数のＬＩＣの直接注入後にＣＭＬ様疾患を発症できることを示した。このモデルにおいて、白血病細胞由来ＣＣＬ３発現が優先的に正常なＨＳＰＣ（造血幹細胞・前駆細胞）に作用すること、及びこの作用が最終的に骨髄中のＬＩＣの支配的な増殖をもたらし得ることを示した。
しかしながら、ＣＣＬ３の細胞性ソース及び該作用の基礎となるメカニズムは不明であった（非特許文献１０、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許公開公報２０１４―１４０３３６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lahaye, T., et al. Response and resistance in300 patients with BCR-ABL-positiveleukemias treated with imatinib in a singlecenter: a 4.5-year follow-up. Cancer103, 1659-1669 (2005).
【非特許文献２】Bartram, C.R., et al. Translocation of c-ab1oncogene correlates with the presence of a Philadelphia chromosome in chronicmyelocytic leukaemia. Nature 306,277-280 (1983).
【非特許文献３】Sawyers, C.L. Chronic myeloid leukemia. NEngl J Med 340, 1330-1340 (1999).
【非特許文献４】Koschmieder, S., et al. Inducible chronicphase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in atransgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood 105, 324-334 (2005).
【非特許文献５】Cerny-Reiterer S, Ghanim V, Hoermann G, etal. Identification of basophils as a major source of hepatocyte growth factorin chronic myeloid leukemia: a novel mechanism of BCR-ABL1-independent diseaseprogression. Neoplasia. 2012;14(7):572-584.
【非特許文献６】Theologides A. Unfavorable signs in patientswith chronic myelocytic leukemia. Ann Intern Med. 1972;76(1):95-99.
【非特許文献７】Zhang, B., et al. Altered microenvironmentalregulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia.Cancer Cell 21, 577-592.
【非特許文献８】Eaves, C.J., Cashman, J.D., Wolpe, S.D. &Eaves, A.C. Unresponsiveness of primitive chronic myeloid leukemia cells tomacrophage inflammatory protein 1 alpha, an inhibitor of primitive normalhematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 12015-12019 (1993).
【非特許文献９】Wark, G., et al. Abl protein kinase abrogatesthe response of multipotent haemopoietic cells to the growth inhibitormacrophage inflammatory protein-1 alpha. Oncogene 16, 1319-1324 (1998).
【非特許文献１０】Baba T, Naka K, Morishita S, Komatsu N,Hirao A, Mukaida N.MIP-1alpha/CCL3-mediated maintenance of leukemia-initiating cells in theinitiation process of chronic myeloid leukemia. J ExpMed.2013;210(12):2661-2673.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＣＭＬ初期段階における正常な造血プロセスを白血病性プロセスに変換する機構を解明して、新たな慢性骨髄性白血病治療剤となりうる標的物質を見出すことを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＣＭＬの初期段階における症状および病態を有するモデル動物を使用して、正常な造血プロセスを白血病性プロセスに変換する機構では、ＣＭＬ骨髄環境下において、好塩基球がＣＣＬ３を発現し、さらにＣＣＬ３は正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進することによって、慢性骨髄性白血病が発症することを見出した。さらに、好塩基球を減少させるなど、好塩基球の機能を直接的又は間接的に阻害することにより、慢性骨髄性白血病の発症を抑制することができることも確認した。
これにより、好塩基球を標的物質とする新規な慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、並びに、新規な慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する試験化合物を選択することを特徴とする慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
２．以下の工程を含む前項１に記載のスクリーニング方法：
（１）試験化合物を、放射線非照射のヒト以外の動物でありかつＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物の骨髄に、投与する工程、及び
（２）該骨髄中の好塩基球の発現量を測定する工程。
３．前記慢性骨髄性白血病は初期段階の慢性骨髄性白血病である、前項１又は２に記載のスクリーニング方法。
４．前記ヒト以外の動物が免疫不全マウスまたは免疫不全ラットである、前項１〜３のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
５．前記造血幹細胞がモデル動物と同種の動物由来の造血幹細胞である、前項１〜４のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
６．前記髄腔が脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である、前項１〜５のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
７．自己の正常造血幹細胞と移植された細胞が前記髄腔内に共存している、前項１〜６のいずれか一に記載のスクリーニング方法。
８．好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する化合物又は抽出物を含む慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤。
９．前記骨転移は乳癌による骨転移である、前項８に記載の治療剤又は予防剤。
１０．前記化合物がＣＣＲ５阻害剤である、前項８又は９に記載の治療剤又は予防剤。
１１．前記化合物がマラビロクである、前項８〜１０のいずれか１に記載の治療剤又は予防剤。
１２．前記化合物又は抽出物が、ビクリビロク、バイカリン・フラボノイド、Ｔｒｉｇｏｎｏｓｔｅｍａ  ｘｙｐｈｏｐｈｙｌｌｏｉｄｅｓ抽出物（ＴＸＥ）、又はＶａｔｉｃａ  ａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ抽出物である前項８〜１０のいずれか１に記載の治療剤又は予防剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規な知見「ＣＭＬ骨髄環境下において、好塩基球がＣＣＬ３を発現し、さらにＣＣＬ３は正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進することによって、慢性骨髄性白血病が発症すること」を基にして、新規な慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法並びに新規な慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス骨髄中の制限された前駆細胞タイプによる恒常的なＣＣＬ３発現。（Ａ）全骨髄（ＢＭ）細胞は、非処理マウスの脛骨から採取した。ラットＩｇＧ２ａは、図で示されるアイソタイプコントロールとして使用した。ＭＰＯ（図なし）、ＣＤ１６／３２（図なし）、又はＣＤ３４（図なし）の発現は、全骨髄細胞又はｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＣＬ３発現細胞中で確認した。なお、３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｂ）ＣＣＬ３及びｃ−ｋｉｔ発現は、ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ３４＋ＭＰＯ＋細胞中で確認した（Ｒ１及びＲ２）。ｃ−ｋｉｔｈｉｇｈ及びｃ−ｋｉｔｌｏｗ領域中のＣＣＬ３＋細胞の割合を示す。ラットＩｇＧ２ａは、アイソタイプコントロールとして使用した。３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｃ）非処理マウスの大腿骨及び脛骨から採取された全骨髄細胞（１×１０７）並びに初代骨髄キメラマウスの大腿骨及び脛骨から採取された全骨髄細胞（１×１０７）を、それぞれ、半致死線量照射レシピエントマウスに静脈内注射して、初代及び２代目骨髄キメラを樹立した。移植８週間後、ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ３４＋ＭＰＯ＋細胞中のＣＣＬ３＋ｃ−ｋｉｔ−細胞の割合は、非処理骨髄細胞中の割合と比較した。データは、４回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。＊は、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．は、ダネットの検定による有意差がないことを示す。
【図２】骨髄中のＣＣＬ３の主要な産生細胞としての好塩基球。（Ａ）大腿骨及び脛骨の骨髄由来ＨＰＣを、２  Ｇｙ照射ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスの右脛骨の骨髄腔に注入した。ＣＤ４５．２＋ＭＰＯ＋ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗ細胞（Ｒ１及びＲ２）上でのｃ−ｋｉｔ及びＣＣＬ３の発現を確認した。ＣＤ４５．２＋ＭＰＯ＋ドナー由来骨髄細胞及びｃ−ｋｉｔｌｏｗＣＣＬ３＋細胞の割合は、それぞれ、上側及び下側の図中に示した。３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｂ）ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ１６／３２ｈｉｇｈ ｃ−ｋｉｔｌｏｗ細胞及びｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ１６／３２ｈｉｇｈ ｃ−ｋｉｔｈｉｇｈ ＧＭＰは、ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて、大腿骨及び脛骨の骨髄から単離した。得られた細胞は、ライト−ギムザ染色溶液で染色し、３回の独立した実験による代表的な結果を、１０  μｍのスケールバーと共に示す。ＣＣＬ３発現量は、定量ＰＣＲ解析を用いて確認した。３回の独立した実験により平均値±標準偏差を得た。テューキー＝クレイマーの検定における、＊は、Ｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）移植８週間後の非処理マウス又はキメラマウスの脛骨の骨髄中のｃ−ｋｉｔｌｏｗＣＤ４９ｂ＋ＦｃεＲ１＋細胞（Ｒ１とＲ２）におけるＣＣＬ３発現。ラットＩｇＧ２ａは、アイソタイプコントロールとして使用した。４回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｄ）脛骨の骨髄及び末梢血（ＰＢ）中のＣＤ２００Ｒ３＋ＦｃεＲ１＋ＣＤ３４＋ＦＳＣｈｉｇｈ（ＢａＰ１）、ＣＤ３４＋ＦＳＣｌｏｗ（ＢａＰ２）及びＣＤ３４ｌｏｗＦＳＣｌｏｗ細胞（Ｂａ）中のＣＣＬ３発現。ラットＩｇＧ２ａはアイソタイプコントロールとして使用した。３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。各集団中のＣＣＬ３の中間蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血のＢａ中のＭＦＩと比較した。＊＊は、Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．は、ダネットの検定による有意差がないことを示す。
【図３】ＣＣＬ３−／−ドナー細胞骨髄移植後の過度な造血再構成。ＣＤ４５．２＋野生型又はＣＣＬ３−／−マウスの大腿骨及び脛骨から採取された合計１×１０７骨髄細胞を、半致死線量照射ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスに静脈内注射して、初代骨髄キメラを樹立した。全骨髄細胞は、移植８週間後に初代骨髄キメラマウスから採取し、続いて２回目骨髄移植に使用した。（Ａ）末梢血中の、ＴＣＲ−β ｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞を除くドナー由来全ＷＢＣ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＬｙ６Ｇ＋顆粒細胞の数。非処理野生型及びＣＣＬ３−／−マウスの末梢血中の各細胞数は、棒グラフによって示す。データは、４〜６回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）ドナー由来ＣＤ３４−ＫＬＳ＋ＨＳＣ及びＣＤ３４＋ＫＬＳ＋ＭＰＰの数は、移植８週間後に非処理マウス及び各骨髄キメラの脛骨の骨髄中で測定した。データは、４回の独立した実験からの平均値±標準偏差を表す。（Ｃ）野生型ドナー細胞移植２週間後の非処理マウス及び骨髄キメラマウスの脛骨の骨髄中のＫＬＳ＋細胞におけるＫｉ６７及びＣＤ３４発現。ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−領域中のＫｉ６７ｈｉｇｈ細胞の割合を示す。４回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｄ）骨髄移植後の各時点でのＫＬＳ＋細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合。データは、４回の実験から得た平均値±標準偏差を表す。（Ａ、Ｂ及びＤ）＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．はマン・ホイットニーのＵ検定による有意差がないことを示す。
【図４】好塩基球由来ＣＣＬ３によるＨＳＰＣ増殖の抑制。（Ａ）ＫＬＳ＋細胞は、ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスの大腿骨及び脛骨の骨髄から単離し、  ＣＦＳＥで標識された。そして、ＣＤ４５．２＋野生型マウス又はＣＣＬ３−／−マウス由来好塩基球（Ｂａ）有り又は無しで共培養した。好塩基球媒介性増殖抑制値は、４日目に測定した。好塩基球媒介性増殖抑制値は、次の定式を用いて計算した：増殖抑制  ＝（ＭＦＩ（Ｂａ有り）−ＭＦＩ（Ｂａ無し））／（ＭＦＩ（前培養）−ＭＦＩ（Ｂａ無し））×１００。３回の独立した実験から得た代表的な結果と平均値±標準偏差は、それぞれ、左側と右側の図に示す。＊は、独立スチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示す。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋誘導型好塩基球欠損モデル（ＭＣＰＴ８−ＤＴＲ）マウス由来全骨髄細胞を、半致死線量照射ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスに静脈内注射して、骨髄キメラを樹立した。活性型ジフテリア毒素（ＤＴ）（４００  ｎｇ／マウス）を、表示した各時点で静脈注射した。同分量の不活性型ジフテリア毒素（ｍｕｔａｎｔ  ＤＴ）（Ｇｌｕ５２）は、同様の方法でコントロールとして注射した。（Ｃ）骨髄移植２４日後の脛骨の骨髄中のＣＤ３４−ＫＬＳ＋及びＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＫＬＳ＋ＨＳＣの数。データは４回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。＊は、マン・ホイットニーのＵ検定によるＰ＜０．０５を示す。（Ｄ）末梢血中の、ＴＣＲ−β  ｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞を除くドナー由来全ＷＢＣ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＬｙ６Ｇ＋顆粒細胞の数。平均値±標準偏差は、１１匹のＤＴ処理マウス（黒丸）又は８匹のｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｇｌｕ５２）処理マウス（白丸）から計算した。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．はマン・ホイットニーのＵ検定による有意差がないことを示す。
【図５】ＣＭＬ  骨髄中のＣＣＬ３発現好塩基球様白血病細胞の増殖。（Ａ）  ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウス由来ＬＩＣは、ＣＭＬモデルに使用した。ＣＤ４５．２＋レシピエント由来正常ＫＬＳ＋細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合は、脛骨の骨髄中で測定した。データは、４回の独立した実験から得た平均値±標準偏差で表す。＊はＰ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．はダネットの検定による有意差がないことを示す。（Ｂ）野生型ドナー由来ＬＩＣは、ＣＭＬモデルに使用した。好塩基球表現型マーカーの発現は、移植２〜３週間後の脛骨の骨髄中のＢＣＲ−ＡＢＬ（ＧＦＰ）−ＣＣＬ３＋正常細胞（Ｒ１）又はＧＦＰ＋ＣＣＬ３＋白血病細胞（Ｒ２）上で測定した。３回の独立した実験からの代表的な結果を示す。（Ｃ）移植３週間後にＣＭＬマウスから採取した正常な脛骨の骨髄細胞又はＧＦＰ＋骨髄白血病細胞中のＬｙ６Ｇ＋又はＦｃεＲ１＋細胞の割合。データは４回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。＊はＰ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．はマン・ホイットニーのＵ検定による有意差がないことを示す。（Ｄ）移植３週間後の脛骨の骨髄及び末梢血中のＧＦＰ＋白血病細胞上のＬｙ６Ｇ及びＦｃεＲ１の発現。４匹の個々の動物中から得た代表的な結果をＧＦＰ＋白血病細胞中のＬｙ６Ｇ−ＦｃεＲ１＋細胞の割合とともに示す。
【図６】骨髄及びＣＭＬ発症におけるＬＩＣの維持に対する好塩基球様白血病細胞の影響。（Ａ）ＭＣＰＴ８−ＤＴＲドナー由来ＬＩＣを、ＣＭＬモデルに使用した。ＤＴ（４００  ｎｇ／マウス）を、表示した各時点で静脈内注射した。コントロールとして、同分量のｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｇｌｕ５２）を、同様の方法で注射した。末梢血中のＷＢＣの数（Ｂ）、脾臓（ＳＰ）重量（Ｃ）、及び脛骨の骨髄中のＧＦＰ＋ＫＬＳ＋ＬＩＣの数（Ｄ）を測定した。各丸は、それぞれ個々のマウスを表す（ｎ＝６）。＊＊は、マン・ホイットニーのＵ検定によるＰ＜０．０１を示す。（Ｅ）ＤＴ又はｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｇｌｕ５２）を、表示した各時点で注入した。ＷＢＣの数を、骨髄移植２週間後から毎週測定した。白血病ではない生存率を測定した（ｎ＝１２）。死亡したマウス、又はＷＢＣ数が１５，０００／μｌに達したマウスを白血病と診断した。＊は、対数順位検定によるＰ＜０．０５を示す。
【図７】ＣＣＲ５（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ５）受容体アンタゴニスト（ＣＣＲ５阻害剤）であるＭＶＣ（マラビロク）によるＣＭＬ発症の予防。野生型のドナー由来ＬＩＣは、ＣＭＬモデルに供した。（Ａ）ＭＶＣ又はＶｅｈｉｃｌｅを３０ｍｇ／ｋｇ体重の服用量で、ＬＩＣ移植１〜２１日後に一日おきに経口胃管栄養により投与した。骨髄移植２週間後から、ＷＢＣの数を毎週測定した。白血病ではない生存率を測定した（ＭＶＣはｎ＝６、コントロールはｎ＝１０）。死亡したマウス、又はＷＢＣ数が１５，０００／μｌに達したマウスを白血病と診断した。＊は、対数順位検定によるＰ＜０．０５を示す。末梢血中のＷＢＣの数（Ｂ）、ＳＰ重量（Ｃ）、脛骨の骨髄中のＧＦＰ＋ＫＬＳ＋ＬＩＣの割合（Ｄ）を測定した（Ｃ及びＤ、３週間）。各丸は、個々のマウスを表す（ＭＶＣはｎ＝６、コントロールはｎ＝５）。＊＊はＰ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．はマン・ホイットニーのＵ検定による有意差がないことを示す。
【図８】ＣＣＬ３発現細胞のインビトロでの分化。実施例１に記載した通り、大腿骨及び脛骨の骨髄由来ＨＰＣを培養した。ｃ−ｋｉｔ及びＣＣＬ３の発現は、ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ３４＋ＭＰＯ＋細胞（Ｒ１）中で確認した。ｃ−ｋｉｔｈｉｇｈ及びｃ−ｋｉｔｌｏｗ領域中のＣＣＬ３＋細胞の割合を示す。３回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図９】成熟Ｔ細胞の放射線照射耐性。１０００万個の全骨髄細胞は、ＣＤ４５．２＋野生型マウスの大腿骨及び脛骨から採取し、半致死線量照射ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスに静脈内注射して、骨髄キメラを樹立した。（Ａ）ＣＤ４５．１＋レシピエント由来細胞上のＴＣＲ−βｃｈａｉｎ発現は、移植８週間後に末梢血中で測定した。ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２−レシピエント由来細胞及びＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞の割合は、中央及び右側図中でそれぞれ示す。５回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。（Ｂ）末梢血中のＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞及び胸腺中のＴＣＲ−βｃｈａｉｎｍｅｄｉｕｍ未成熟Ｔ細胞上のＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２発現は、移植８週間後に測定した。ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２−レシピエント由来細胞及びＣＤ４５．１−ＣＤ４５．２＋ドナー由来細胞の割合を示す。５回（末梢血）又は３回（胸腺）の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図１０】ＣＣＬ３−／−マウス由来骨髄細胞移植直後の長期的な過度の造血再構成。１０００万個の全骨髄細胞をＣＤ４５．２＋ＣＣＬ３−／−マウスの大腿骨及び脛骨から採取し、半致死線量照射ＣＤ４５．１＋コンジェニックマウスに静脈内注射して、骨髄キメラを樹立した。末梢血中のＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞を除くドナー由来全ＷＢＣの数（Ａ）又は脛骨の骨髄中のドナー由来ＣＤ３４−ＫＬＳ＋ＨＳＣの数（Ｂ）を測定した。Ａに関し、データは、３回の独立した実験から平均値±標準偏差を表す。Ｂに関し、各丸は、個々のマウスを表す（８週間後はｎ＝４、２０週間はｎ＝３）。Ｎ．Ｓ．は、独立スチューデントのｔ検定による有意差がないことを示す。
【図１１】ＣＣＲ１−／−及びＣＣＲ５−／−ドナー由来骨髄細胞の移植後による高い造血再構成能力。ＣＤ４５．２＋野生型、ＣＣＲ１−／−、又はＣＣＲ５−／−マウスの大腿骨及び脛骨から採取した５００万個の全骨髄細胞を、同数のＣＤ４５．１＋競合的骨髄細胞と混合し、続いて、半致死線量照射ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２異型遺伝子マウスに静脈内注射して、初代骨髄キメラを樹立した。全骨髄細胞は、移植８週間後に初代骨髄キメラから採取し、続いて、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２異型遺伝子レシピエントマウスにおける一連の骨髄移植に使用した。（Ａ）ＣＤ４５．２＋ＣＤ４５．１−ドナー由来のＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞を除く全ＷＢＣ又はＬｙ６Ｇ＋顆粒細胞のキメラ現象を、末梢血中で測定した。データは、５〜６回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋ＣＤ４５．１−ドナー由来ＫＬＳ＋細胞のキメラ現象を、移植８週間後に脛骨の骨髄中で測定した。データは、５〜６回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。（Ａ及びＢ）＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．はマン・ホイットニーのＵ検定による有意差がないことを示す。
【図１２】ＣＣＲ５−／−ドナー由来細胞の骨髄移植後の高レベルのキメラ現象の長期的な持続。ＣＤ４５．２＋野生型マウス（白丸）又はＣＣＲ５−／−マウス（黒丸）の大腿骨及び脛骨から採取した合計５×１０６  個の骨髄細胞を、同数のＣＤ４５．１＋競合的骨髄細胞と混合し、続いて、半致死線量照射ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２異型遺伝子マウスに静脈内注射して、骨髄キメラを樹立した。ＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞を除くＣＤ４５．２＋ＣＤ４５．１−ドナー由来全ＷＢＣのキメラ現象は、末梢血中で測定した。データは、６回（移植２０週間後まで）及び３回（４０週間後）の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。４０週間後の＊  は、独立スチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示す。
【図１３】ＣＣＲ１−／−及びＣＣＲ５−／− ｃ−ｋｉｔ＋  ＨＰＣの末梢血への動員阻止の機能不全。ＣＣＲ１−／−及びＣＣＲ５−／−ＣＤ４５．２＋ｃ−ｋｉｔ＋ＨＰＣの割合は、骨髄のキメラマウスの末梢血中で測定した（参照：図１１）。Ｌｙ６Ｇｃ−ｋｉｔ＋細胞（Ｒ１）中のＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２−及びＣＤ４５．１−ＣＤ４５．２＋細胞の割合を示す。５〜６回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図１４】インビトロの好塩基球分化プロセス。全骨髄細胞は、１０％ＦＢＳ及び１０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３補充Ｓ−ｃｌｏｎｅ培地中で１０日間培養した。培地の半分は、３日ごとに新鮮な培地と取り替えた。好塩基球は、ＣＤ４９ｂ  ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて更に濃縮した。分化した好塩基球中のＣＣＬ３発現を測定した。濃縮前後の分化好塩基球及びマスト細胞の割合を示す。
【図１５】ＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウス中のＣＣＬ３発現好塩基球の個体内での選択的減少。（Ａ）ＤＴ（４００  ｎｇ／マウス）を、ＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウスに静脈注射した。末梢血（白丸）及び脛骨の骨髄（黒丸）中の好塩基球の数。データは、３回の独立した実験から得た平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）ＤＴ又はｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｇｌｕ５２）を、ＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウスに静脈注射した。ＣＣＬ３とＣＤ２００Ｒ３の発現は、注入３日後に脛骨の骨髄中で測定した。ＣＣＬ３＋ＣＤ２００Ｒ３＋細胞の割合を示す。３回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図１６】マウスＣＭＬモデル中の骨髄内ＬＩＣのＴＫＩ耐性。野生型ドナー由来ＬＩＣをＣＭＬモデルに使用した。（Ａ）ダサニチブ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を、ＬＩＣ移植７〜２０日後に経口胃管栄養により毎日投与した。ＷＢＣの数は、２週間後、３週間後及びダサニチブ投与の停止４日後に測定した。各丸はそれぞれ個々のマウスを表す（ｎ＝５）。（Ｂ）図７の説明に記載の通り、マラビロク又はＶｅｈｉｃｌｅを投与した。ＢＣＲ−ＡＢＬ（ＧＦＰ）の発現は、ＬＩＣ移植３週間後にｌｉｎｅａｇｅｌｏｗｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋細胞（Ｒ１とＲ２）中で測定した。ＧＦＰ＋細胞の割合を示す。５〜６回の独立した実験から得た代表的な結果を示す。
【図１７】マラビロク処理による脾腫の減衰。ＬＩＣ移植（図７の説明に記載した）３週間後にＣＭＬマウスから採取したレシピエントＳＰ（脾臓）の肉眼での外観。スケールバーは、１０  ｍｍを示す。
【図１８】マラビロク投与による脛骨内腫瘍形成の抑制。（Ａ）実験の概要。４Ｔ１．３細胞をマウス脛骨内に注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｉｂｉａｌ  ｂｏｎｅ）した日（Ｄａｙ０）の２日後、４日後及び６日後にマラビロクを経口投与し、７日後に脛骨を回収（ｃｏｌｌｅｃｔ  ｂｏｎｅ）した。（Ｂ）脛骨パラフィン包埋組織切片における抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体を用いた免疫染色。マラビロクを投与したマウス（ＭＶＣ）及びコントロールマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の脛骨の骨髄腔の染色結果を示す。スケールバーは、２００  μｍを示す。（Ｃ）骨髄腔全体の面積に対する抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体陽性染色の割合（陽性率；％）の算出結果。データは４回の独立した実験から得た平均値±標準偏差で表す。※はｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（本発明の対象）
本発明の慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法（以後、「本発明のスクリーニング方法」と略する場合がある）は、下記実施例により、「ＣＭＬ骨髄環境下において、好塩基球がＣＣＬ３を発現し、さらにＣＣＬ３は正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進することによって、慢性骨髄性白血病が発症すること」を見出したことを利用している。
加えて、ＣＣＲ５阻害剤であるマラビロクは、慢性骨髄性白血病モデル動物の骨髄中のＬＩＣを劇的に減少させ、そして、ＣＭＬ発症を阻止したことを確認している。
骨髄は、造血作用により、組織・器官に通じた血管が豊富に存在する。そして、各組織・器官の癌（肺癌、乳癌、前立腺癌等）細胞が該血管を通じて骨髄に移動・定着して、骨転移が起る。本発明のスクリーニング方法は、好塩基球の機能を直接的又は間接的に阻害する化合物を選択する。該化合物は、骨髄内のＬＩＣの優性増殖を抑えることにより、慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤となるだけでなく、骨髄に移動した癌細胞の骨髄内での優性増殖を抑制することで転移の治療剤又は予防剤にもなる。従って、本発明のスクリーニング方法を用いて、好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する物質を同定することにより、新たな作用機序を持つ慢性骨髄性白血病治療剤及び／又は慢性骨髄性白血病の予防剤に加え、骨転移の治療剤又は予防剤を開発することができる。
【００１４】
（好塩基球）
本発明のスクリーニング方法で使用する「好塩基球」は、慢性骨髄性白血病モデル動物由来に限定されず、試験管内の培養下で生成されたものを含む。
また、「好塩基球改変体」とは、好塩基球と同等の機能を有し、かつ好塩基球との構造を比較して、アミノ酸配列に１〜５０、１〜３０、１〜１０、又は１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入等がされている構造を意味する。
加えて、本発明の「好塩基球改変体遺伝子」は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が好塩基球と同等の機能を有する遺伝子配列を意味する。
【００１５】
一般的にアミノ酸配列に置換、欠失、付加、または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術(Science, 219, 666-671 (1983)）を利用することができる。このような変異の導入において、タンパク質の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるタンパク質は、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００１６】
（好塩基球の作用を阻害）
本発明の「好塩基球の作用を阻害」とは、好塩基球の有する機能（特に、ＣＣＬ３などの生理活性物質の産生機能）を直接的又は間接的に喪失、低下させることを意味する。なお、「好塩基球改変体の作用を阻害」も上記と同様な意味である。
【００１７】
（好塩基球の発現を阻害）
本発明の「好塩基球の発現を阻害」とは、好塩基球遺伝子が好塩基球タンパク質に翻訳されるいずれかの段階を阻害することを意味する。なお、「好塩基球改変体の発現を阻害」も上記と同様な意味である。
【００１８】
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法を、以下に例示する。しかしながら、好塩基球若しくは好塩基球改変体の作用又は発現を阻害する試験化合物を選択することができれば特には限定されない。
なお、本発明の「試験化合物の選択」とは、試験化合物が慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤、さらには骨転移の治療剤又は予防剤として利用できるかを確認することである。すなわち、本発明のスクリーニング方法で得られた慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤の試験化合物（又は、骨転移の治療剤又は予防剤の試験化合物）は、さらに動物実験等で実用性を確認することができる。
【００１９】
本発明では、以下の工程を含むスクリーニング方法を例示することができる。
（１）試験化合物を、放射線非照射のヒト以外の動物でありかつＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物の骨髄に、投与する工程。
（２）骨髄中の好塩基球の発現量を測定する工程。
【００２０】
なお、好塩基球遺伝子若しくは好塩基球改変体遺伝子又は、好塩基球若しくは好塩基球改変体の発現量を測定する方法としては、以下の方法が例示されるが、特に限定されない。なお、発現量とは、例えば、コントロールと比較しての増減を意味する。
１）ＲＴ−ＰＣＲ法
２）免疫ブロット法
３）ＳＡＧＥ
４）抗好塩基球抗体を使用した免疫沈降法
５）プルダウン法
６）ＥＬＩＳＡ
７）ウエスタンブロット
８）ハイブリダイゼーション
９）フローサイトメトリー
１０）比重遠心法
１１）細胞浮遊液の染色標本
１２）病理組織の染色標本
より詳しくは、フローサイトメトリーを使用する場合には、骨髄中の細胞から好塩基球選択マーカーＣＤ２００Ｒ３及びＦｃεＲ１により好塩基球を分離する。そして、骨髄中の全細胞に対する好塩基球の割合を測定する。
【００２１】
（試験化合物）
本発明で用いる「試験化合物」としては任意の物質を使用することができる。試験化合物の種類は特に限定されず、公知の治療剤（特に、ＣＣＲ５阻害剤）、個々の低分子合成化合物（特にｓｉＲＮＡ）、天然物抽出物中に存在する化合物、合成ペプチドでもよい。
あるいは、試験化合物は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。試験化合物は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００２２】
（ＣＭＬモデル動物）
本発明のスクリーニングに使用する「ＣＭＬモデル動物」は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が、放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植されている。
本発明のＣＭＬモデル動物の作製方法は、造血幹細胞に、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する工程、および、得られたＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子導入済造血幹細胞を放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植する工程を含む。
【００２３】
本発明のＣＭＬモデル動物は、ヒトＣＭＬ発症初期段階の症状、骨髄状態、細胞状態を再現し、自然発症の白血病と類似した白血病過程、特に、発症初期段階を有する。このモデルを使用することにより、下記の実施例で示したように、正常な造血プロセスを白血病性プロセスに変換する機構では、ＣＭＬ骨髄環境下において、好塩基球がＣＣＬ３を発現し、さらにＣＣＬ３は正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進することによって、慢性骨髄性白血病が発症することを見出すことができた。
さらに、慢性骨髄性白血病の薬剤となる試験化合物を本発明のＣＭＬモデル動物に投与すれば、従来の慢性骨髄性白血病の薬剤とは異なり、ヒトＣＭＬ発症初期段階に効果のある薬剤をスクリーニングすることができる。
【００２４】
（動物）
ヒト以外の動物は、哺乳動物が好ましい。野生型（ＷＴ）動物、所望の遺伝子が欠損した動物、免疫不全動物等が挙げられる。好ましくは、免疫不全動物である。また、哺乳動物の中では、マウスまたはラットが好ましい。免疫不全マウスまたは免疫不全ラットがさらに好ましい。免疫不全のマウスやラットは、数種類開発されているが、胸腺を欠損しているヌードマウスまたはヌードラットが最も好ましく用いられる。
【００２５】
（放射線非照射）
従来、レシピエント動物は放射線照射により全身の免疫系が破壊されていた。しかし、本発明では、免疫系を破壊するような放射線の照射がされていないレシピエント動物を用いる。本発明のモデル動物は、放射線照射されないことにより、レシピエントの骨髄内部には、正常な造血幹細胞が存在している。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞を骨髄に移植することにより、正常な造血幹細胞とＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が髄腔内で共存し、ヒトのＣＭＬ発症初期段階の骨髄内の状態と同様の状態になる。
【００２６】
（髄腔移植）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞は、ヒト以外の動物の髄腔に移植する。髄腔は、骨髄の内腔である。本発明のスクリーニング方法では、注射器またはその他の道具にて、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞を、髄腔内に直接又は間接的に移植する。移植される骨髄の場所は、限定されず、移植可能であればどこでもよい。移植が容易な骨髄の髄腔は、脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である。また、複数回移植してもよい。マウスであれば、３〜９週齢、好ましくは、４〜８週齢、より好ましくは５〜７週齢のマウスに移植する。
【００２７】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子導入造血幹細胞）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する造血幹細胞は、レシピエントの動物とは別のまたは同一の動物の骨髄から得ることができる。採取した骨髄から既知の造血幹細胞の分子マーカーを用いて造血幹細胞を選択して得ることができる。たとえば、ｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）の細胞を選択することができる。前記造血幹細胞は、モデル動物と同種の動物由来であることが好ましい。モデル動物と同種の動物であって、野生型の動物由来であることが、さらに好ましい。
【００２８】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子）
本発明で用いるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子は、９と２２番染色体の相互転座の結果生じるＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ遺伝子が融合した遺伝子である。発現タンパク質がチロシンキナーゼ活性を有しＣＭＬの原因となる遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、文献Proc. Natl. Acad. Sci. USA  Vol. 83,pp.9768-9772, December 1986に記載の遺伝子配列が挙げられる。この配列の、一部欠失、置換、付加された配列も含まれる。これら一部欠失、置換、付加された配列は、好ましくは、上記配列と７０％以上、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００２９】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の導入）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の造血幹細胞への導入は、既知の方法により導入することが可能である。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子をウイルスベクターに挿入し、造血幹細胞に導入することができる。ウイルスベクターは既知のベクターを用いることができる。例えば、レトロウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクターが挙げられ、好ましくは、ＭＳＣＶベクターを用いることができる。また、遺伝子導入後の解析のために検出マーカーをコードする遺伝子を付加しておくことができる。例えば、蛍光物質であるＧＦＰをコードする遺伝子を付加することができる。
【００３０】
（移植細胞数）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞の移植細胞数は、適宜調整することができる。モデル動物がマウスの場合は、１マウスあたり、５０〜１００００個、好ましくは、１００〜１０００個、さらに好ましくは、２００〜８００個、最も好ましくは、４００〜５００個移植する。モデル動物がラットの場合は、１ラットあたり、１マウスあたりと同数の移植細胞数、２倍の移植数又は３倍の移植数で良い。
【００３１】
（使用時期）
本発明のＣＭＬモデル動物をＣＭＬ発症の初期段階のモデル動物として使用するときには、移植後１〜５週間、好ましくは移植後２〜４週間での使用が望ましい。
【００３２】
（移植後の症状）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞の移植細胞数は、上記に記載の通りわずかであり、この少量の造血幹細胞が、骨髄中でレシピエント自身の多数の正常の造血細胞およびドナーからの多数の正常な造血細胞と共存する。移植後、２〜３週間で、著しい白血球増加と脾臓の腫大を呈するＣＭＬ様疾患を発症する。このように、このＣＭＬモデル動物は、特にＣＭＬ発症の初期段階で、骨髄中の正常造血細胞と白血病幹細胞の間の相互作用を明らかにするために、非常に有用である。
さらに、このＣＭＬモデルで、右の脛骨の骨髄の髄腔へ直接移植した後、白血病幹細胞は、自発的に移動して、反対側の左の脛骨の骨髄の髄腔においても増殖した。加えて、ＣＭＬ患者において観察されるような、脾臓および肝臓において骨髄外造血が同様に再現された。このように、このＣＭＬモデル動物は、移植部位である始原部位から他の造血器官（例えば脾臓および肝臓）まで白血病幹細胞の浸潤を調べるためにも有用である。
【００３３】
（慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤）
下記の実施例により、ＣＣＲ５阻害剤（特に、マラビロク）が慢性骨髄性白血病又は骨転移（特に、乳癌による骨転移）の治療剤又は予防剤の有効成分として有効であることを確認している。
よって、本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤は、有効成分として、ＣＣＲ５阻害剤、特に、マラビロクを含有する。
加えて、本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤と公知の慢性骨髄性白血病の治療剤（例、チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ）又は骨転移治療剤を組み合わせて、慢性骨髄性白血病又は骨転移の患者に投与しても良い。
【００３４】
（ＣＣＲ５阻害剤）
本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤の有効成分として利用できるＣＣＲ５阻害剤は、マラビロク｛ＵＫ−４２７８５７  ４，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−｛（１Ｓ）−３−［３−（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−  ５−ｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）−  ８−ａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［３．２．１］ｏｃｔ−８−ｙｌ］−１−  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ｝ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）｝、ビクリビロク｛１−［（４，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］−  ４−［４−［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−１（Ｒ）−４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ−３（Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］−  ４−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ｝、バイカリン・フラボノイド、Ｔｒｉｇｏｎｏｓｔｅｍａ  ｘｙｐｈｏｐｈｙｌｌｏｉｄｅｓ抽出物（ＴＸＥ）、Ｖａｔｉｃａ  ａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ抽出物等を挙げることができるが、特にマラビロクが好ましい。
【００３５】
（マラビロク）
マラビロクは、ＨＩＶ感染症のＨＡＡＲＴ療法に用いられるＣＣＲ５阻害剤として市販されている。通常、成人にはマラビロクとして１回３００ｍｇを１日２回経口投与する。
【００３６】
本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤は、有効成分として好塩基球遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含有する。
本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤は、有効成分として好塩基球遺伝子のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムを含有する。
本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤は、有効成分として好塩基球を不活性化する抗体を含有する。
【００３７】
予防または治療等の目的に応じて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、液剤、注射剤（液剤、懸濁剤）または遺伝子療法に用いる形態などの各種の形態に、常法にしたがって調製することができる。本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療又は予防剤は、通常は１種または複数の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００３８】
本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療又は予防剤の投与量または摂取量については、本発明の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の慢性骨髄性白血病又は骨転移の治療剤又は予防剤は、１日１〜数回に分けて投与または摂取することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与または摂取してもよい。
【００３９】
以下に示す実施例によって、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例は、金沢大学動物実験規定及びヘルシンキ宣言に従って行なわれた。さらに、順天堂大学の倫理委員会（登録番号ＩＲＢ＃９６９）によって承認されている。
【実施例１】
【００４０】
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００４１】
（マウス）
特定病原体フリーの５〜６週齢オスＢＡＬＢ／ｃ及び無胸腺のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎから購入し、それぞれ、野生型及びヌードマウスとして使用した。ＣＤ４５．１  ＢＡＬＢ／ｃコンジェニックマウス及びＣＣＬ３−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。ＣＣＲ１−／−及びＣＣＲ５−／−マウスは、それぞれ、Ｄｒ． Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍ． Ｍｕｒｐｈｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）及び松島綱治博士（東京大学）によって提供された。これらの遺伝子欠損マウスは、８世代以上のＢＡＬＢ／Ｃマウスと交配して得た。ＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウス｛ｍＭＣＰ−８遺伝子プロモーター／エンハンサー領域にＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体）遺伝子を連結したトランスジェニックマウスであり、好塩基球にのみＤＴＲが発現している。その結果、ジフテリア毒素を投与すると、好塩基球が選択的に除去される｝は、公知の方法（参照：J Clin Invest. 2010;120(8):2867-2875.）により得た。マウスは、特定病原体フリー条件の下で飼育した。
【００４２】
（抗体）
以下のラット抗マウスモノクローナル抗体を使用した。
抗ＣＤ４（ＲＭ４−５；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ８（５３−６．７；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ３４（ＲＡＭ３４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ４５．１（Ａ２０；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４５．２（１０４；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４８（ＨＮ４８−１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ（ＡＣＫ２；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２００Ｒ３（Ｂａ１３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＦｃεＲ１（ＭＡＲ−１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗Ｋｉ６７（ＳｏｌＡ１５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−Ｌｙ−６Ａ／Ｅ／Ｓｃａ−１（Ｄ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＭＩＰ１−α／ＣＣＬ３（３９６２４；Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び抗−ＴＥＲ−１１９（ＴＥＲ−１１９；ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
マウス系統Ａｂ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｓｅｔは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。マウスミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）への交叉反応性を備えたマウス抗ラットＭＰＯモノクローナル抗体（２Ｄ４）は、Ａｂｃａｍから購入した。アルメニアンハムスター抗マウスＴＣＲ−β鎖（Ｈ５７−５９７）は、ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。個々のラットモノクローナル抗体のためのアイソタイプが一致したコントロールＩｇＧ及びコントロールのマウスＩｇＧは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００４３】
｛造血前駆細胞（ＨＰＣ）及びｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）骨髄細胞の調製｝
全骨髄細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した密度勾配遠心により分離した。その後、ｌｉｎｅａｇｅマーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、Ｂ２２０及びＴＥＲ−１１９）−ｃ−ｋｉｔ＋細胞及びｌｉｎｅａｇｅマーカー−ｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋細胞は、それぞれ、ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してソートし、ＨＰＣ及びＫＬＳ＋骨髄細胞として使用した。
【００４４】
（ＫＬＳ＋細胞増殖の好塩基球媒介性抑制）
ＣＤ４５．１＋ＫＬＳ＋骨髄細胞は、５  μＭカルボキシフルオセイン二酢酸（ＣＦＳＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した。続いて、それらを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００  ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００  ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び１０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈより）補充Ｓ−ｃｌｏｎｅ培地中で、インビトロで分化させたＣＤ４５．２＋野生型又はＣＣＬ３−／−好塩基球（図１４）の存在下又は非存在下で４日間培養した。ＣＤ４５．１＋ｃ−ｋｉｔｈｉｇｈ細胞におけるＣＦＳＥの中間蛍光強度（ＭＦＩ）は、培養前後で測定した。
【００４５】
（骨髄キメラの作製）
合計１×１０７骨髄細胞を、５．５Ｇｙ  Ｘ照射レシピエントマウスに静脈内注射した。いくつかの実施例では、２×１０５  ＨＰＣを、２Ｇｙ  Ｘ照射レシピエントマウスの右脛骨の骨髄腔に注入した。
【００４６】
（ＣＭＬモデルの作製）
野生型又はＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウスの骨髄から精製されたＫＬＳ＋細胞に、公知の方法｛参照：Nature.2010;463(7281):676-680｝によりＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰを有するレトロウイルスを感染させて、ＬＩＣを得た。３０  μｌ量のＬＩＣ（３０，０００個のＫＬＳ＋細胞に含まれる４００〜５００個のＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞）を、続いて２９  Ｇ  ｎｅｅｄｌｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｔｅｒｕｍｏ）で脛骨に注入した。いくつかの実施例では、各図の説明で詳述される通り、ジフテリア毒素（ＤＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、マラビロク（ｍａｒａｖｉｒｏｃ；ＭＶＣ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）又はダサニチブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を投与した。
【００４７】
（ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、及び定量リアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞から抽出し、その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲは、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＧＡＰＤＨ遺伝子（センス：  ５′−  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＣＡ−３′  配列番号１；  アンチセンス：  ５′−  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ−３′  配列番号２）及びＣＣＬ３遺伝子（センス：  ５′−  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＴＧＴ−３′  配列番号３；  アンチセンス：  ５′−ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＣＡ−３′  配列番号４）の特異的プライマーセットを用いたＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＶｉｉＡ７  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ上で行った。ＣＣＬ３遺伝子の相対的発現は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値を用いて、ΔΔＣｔ法により分析した。
【００４８】
（フローサイトメトリー）
単離された白血球は、様々な組み合わせの蛍光色素標識抗体で染色した。細胞内のＣＣＬ３及びＭＰＯ染色のために、白血球は、０．１％のＧｏｌｇｉＳｔｏｐ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）補充無血清Ｓ−Ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３培地（Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ）中で４時間培養した。
次に、細胞内のＣＣＬ３及びＭＰＯは、ＰＥ標識抗ＣＣＬ３  抗体及びビオチン標識抗ＭＰＯ  抗体で染色し、続いて、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、それぞれ、ＡＰＣ及びＡＰＣ−Ｃｙ７標識ストレプトアビジンと共に培養した。核内のＫｉ６７は、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ビオチン標識抗Ｋｉ６７抗体及びＡＰＣ標識ストレプトアビジンで連続して染色した。各分子の発現は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して決定し、さらにＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で分析した。
【００４９】
｛ＣＭＬ患者の骨髄生検材料でのＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＨＣ）評価｝
骨髄生検サンプルは、治療前に順天堂大学病院で診断されたＣＭＬ患者から得た。本実施例のために、４  μｍ切片は、パラフィン包埋組織から調製し、正電荷付与スライドガラスに置いた。ｍＲＮＡの二重染色は、キットに添付の指示書に従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ  ＩＳＨｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて行った。脱パラフィン組織サンプルは、前処理溶液で培養し、続いてプロテアーゼ処理した。ヒトＣＣＬ３−及びエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ）３−特異的プローブは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより設計／合成された。プローブセット及び増幅分子は、オリゴヌクレオチドの各ペアにハイブリダイズした。非結合プローブを洗浄により除去した後、サンプルは、沈殿を形成するｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ及びｆａｓｔ  ｂｌｕｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを分解するために、アルカリフォスファターゼで培養した。標的ｍＲＮＡのイメージは、ＤＰ２１  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃａｍｅｒａ（オリンパス）を用いて得た。
【００５０】
（統計分析）
データは、各図の説明において示された方法を用いて統計的に分析した。ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると判断した。
【実施例２】
【００５１】
（脊髄前駆細胞による恒常的ＣＣＬ３産生の確認）
本発明者らは、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ−未成熟白血病細胞及びより少ない程度でＢＣＲ−ＡＢＬ− ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ−非白血病細胞は、ＣＭＬ発症マウスの骨髄中でＣＣＬ３を発現していることを以前報告した（参照：非特許文献１０）。
本実施例では、正常なマウス骨髄中でＣＣＬ３発現を調べた。ＣＣＬ３発現は、非処理の正常な骨髄（参照：図１Ａ）中のｌｉｎｅａｇｅｌｏｗ細胞中で一貫して検出された。これらのＣＣＬ３発現細胞は、骨髄細胞の機能的なマーカーであるＭＰＯ、造血前駆細胞マーカーであるＣＤ３４及びＣＤ１６／３２の発現を有する未熟顆粒球系細胞の表現型を示し、ＳＣＦ受容体であるｃ−ｋｉｔ（図１Ｂ）を発現しなかった。更に、ＣＣＬ３は、骨髄移植後の同様の細胞集団においても検出された（図１Ｃ）。
【実施例３】
【００５２】
（好塩基球がＣＣＬ３の主要な産生細胞であるかの確認）
最初に、ＣＣＬ３を発現している骨髄前駆細胞の特徴を確認するために、インビトロ及びインビボでＨＰＣから骨髄前駆細胞への分化を誘導した。両方の条件の下で、ＨＰＣは、骨髄細胞へ分化し、付随的にｌｉｎｅａｇｅｌｏｗｃ−ｋｉｔｌｏｗＣＣＬ３＋細胞を生じさせた（図２Ａ及び図８）。骨髄細胞の中で、ＣＣＬ３は、新鮮分離されたｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ１６／３２ｈｉｇｈｃ−ｋｉｔｌｏｗ細胞集団において豊富かつ選択的に検出された。ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ１６／３２ｈｉｇｈｃ−ｋｉｔｌｏｗ細胞集団は、分葉核及び細胞質好塩基球顆粒を有し、ｌｉｎｅａｇｅｌｏｗＣＤ１６／３２ｈｉｇｈｃ−ｋｉｔｈｉｇｈ顆粒細胞マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞より小さかった（図２Ｂ）。さらに、ｃ−ｋｉｔｌｏｗＦｃεＲ１＋ＣＤ４９ｂ＋好塩基球は、非処理マウス及び骨髄キメラの骨髄中でＣＣＬ３を恒常的に発現した（図２Ｃ）。
これらの結果は、好塩基球がＣＣＬ３を発現できることを示す。骨髄中の好塩基球は、好塩基球選択マーカーＣＤ２００Ｒ３及びＦｃεＲ１を発現し、次の３つのサブセットに分類することができた：ＣＤ３４ｈｉｇｈ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）ｈｉｇｈ始原前駆細胞、ＣＤ３４ｈｉｇｈＦＳＣｌｏｗ前駆細胞及びＣＤ３４ｌｏｗＦＳＣｌｏｗ成熟細胞集団（ｍａｔｕｒｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ）（図２Ｄ）。ＣＣＬ３発現は、好塩基球前駆細胞において明らかであったが、好塩基球の成熟につれて減少した（図２Ｄ）。
以上により、骨髄中の好塩基球（好塩基球−ｌｉｎｅａｇｅ細胞）は、恒常的にＣＣＬ３を発現していることを確認した。
【実施例４】
【００５３】
（骨髄移植誘導造血再構成間のＨＳＰＣの一過性増殖に対するネガティブ調節因子としての骨髄内ＣＣＬ３の役割の確認）
非処理の野生型及びＣＣＬ３−／−マウス間では、造血性細胞集団において、いかなる差異も観察できなかった。この造血性細胞集団には、末梢血中の全白血球（ＷＢＣ）、Ｂ細胞、及び顆粒細胞（図３Ａ）、及び骨髄中のＨＳＣ及び多能性前駆細胞（ＭＰＰ）が含まれる（図３Ｂ）。次に、ストレス下において造血におけるＣＣＬ３の役割を調べるために、骨髄移植を行った。骨髄移植前処理として、レシピエントマウスを、５．５Ｇｙで全身照射した。照射量は、レシピエントマウスの損傷を低減するために、ドナー由来造血細胞との交換に必要とされる十分かつ最少量であった。これらの条件の下で、ＣＤ４５．１＋レシピエント由来細胞の約１０％（大部分はＴＣＲ−βｃｈａｉｎ＋Ｔ細胞）は、末梢血に残った（図９Ａ）。しかしながら、ＣＤ４５．１＋レシピエント由来細胞は、胸腺において分化したＴＣＲ−βｃｈａｉｎｍｅｄｉｕｍ未成熟Ｔ細胞中で観察できなかった（図９Ｂ）。したがって、これらの条件下では、造血系は、末梢血中の成熟したＴ細胞を除いて、ドナー由来細胞とほとんど置き換わった。よって、Ｔ細胞数の計数は、その後の骨髄キメラを使用した実施例において、造血再構成を決定するために除外した。ドナー細胞がＣＣＬ３−／−マウス由来であった場合、ドナー由来全細胞、Ｂ細胞及び顆粒細胞は、非処理マウス及び野生型由来骨髄細胞を移植されたマウスと比較して、末梢血中で過剰に再構成された（図３Ａ）。同様に、ＨＳＣとＭＰＰは、野生型ドナーから移植された骨髄細胞よりもＣＣＬ３−／−ドナーから移植された骨髄細胞中でより効率的に再構成された（図３Ｂ）。ＣＣＬ３−／−ドナー細胞と共に再構成された骨髄中で、ドナー由来の末梢血中の全ＷＢＣ及び骨髄中のＨＳＣの不自然な増加は、最初の骨髄移植後２０週でさえも持続した（図１０）。
さらに、ＣＣＬ３−／−ドナー細胞の野生型ドナー細胞と比較してより高い造血再構成能力は、第２回目の骨髄移植でも観察された（図３Ａ及び３Ｂ）。野生型骨髄細胞移植２週間後、ドナー由来ＫＬＳ＋細胞中のＫｉ６７発現は、一過的に増強され（図３Ｃ）、その後、ベースラインレベル以下に減少した（図３Ｄ）。一方、Ｋｉ６７恒常的発現は、ＣＣＬ３−／−キメラ中で持続した（図３Ｄ）。本発明者らを含むいくつかのグループは、ＣＣＬ３受容体ＣＣＲ１及びＣＣＲ５が正常なＨＳＰＣ上で発現することを報告している。競合的骨髄移植解析は、ドナー細胞中のＣＣＲ１又はＣＣＲ５の除去が、連続する骨髄移植後にＷＢＣと骨髄ＫＬＳ＋細胞のより高度なキメラ現象を引き起こすことを確認した（図１１Ａ  及び１１Ｂ）。
加えて、末梢血中のドナー由来ＷＢＣ割合の増加は、ＣＣＲ５−／−ドナー由来細胞の最初の骨髄移植後の４０週まで明らかであった（図１２）。本発明者らは、以前に、ＣＣＬ３の骨髄内注入は骨髄から末梢血中へのｃ−ｋｉｔ＋ＨＰＣの動員を誘導できることを確認している（参照：非特許文献１０）。しかし、競合的骨髄キメラマウスの末梢血中のＣＣＲ１−／−又はＣＣＲ５−／−ＨＰＣのどちらの動員過程においても欠陥は確認できなかった（図１３）。
以上により、これらの結果は、内因的に産生されたＣＣＬ３が骨髄中のＨＳＰＣの増殖を主として制御できるが、それらの動員は制御しないことを示す。
【実施例５】
【００５４】
（ＨＳＰＣ増殖のネガティブ制御因子としての好塩基球由来ＣＣＬ３の役割）
骨髄中の好塩基球のＣＣＬ３発現能力に関し、好塩基球由来ＣＣＬ３のＨＳＰＣに対する影響を確認した。ＣＤ４９ｂ＋ｃ−ｋｉｔｌｏｗＦｃεＲ１＋好塩基球は、インビトロで生成し（図１４）、ＨＳＰＣとの共培養に使用した。ＫＬＳ＋ＨＳＰＣ増殖は、野生型由来好塩基球存在下で著しく減少したが、ＣＣＬ３−／−マウス由来好塩基球存在下では減少しなかった（図４Ａ）。ＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウスへのＤＴの投与は、骨髄中のＣＣＬ３発現好塩基球の数と共に、末梢血と骨髄中の好塩基球数を選択的に減らした（図１５）。一方、ｍｕｔａｎｔ  ＤＴ（Ｇｌｕ５２）の投与は、好塩基球を減らさなかった。インビボでの好塩基球の機能を調べるために、野生型マウスに、骨髄移植のためのドナー細胞としてＭＣＰＴ８−ＤＴＲマウス由来骨髄細胞を移植し、骨髄移植後にＤＴ又はｍｕｔａｎｔ  ＤＴを静脈内に投与した（図４Ｂ）。ＤＴ処理は、ｍｕｔａｎｔ  ＤＴ処理と比較して、骨髄キメラマウス中の好塩基球を低減し、骨髄中でドナー由来ＣＤ３４−ＫＬＳ＋及びＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＫＬＳ＋ＨＳＣを最終的に増加させた（図４Ｃ）。さらに、ＤＴは、ｍｕｔａｎｔ  ＤＴと比較して、末梢血中のドナー由来全細胞、Ｂ細胞及び顆粒細胞の再構成を過剰にし（図４Ｄ）、ＣＣＬ３−／−ドナー由来細胞の骨髄移植の結果に類似した（図３）。
したがって、骨髄中の好塩基球は、ＣＣＬ３依存的にＨＳＰＣ増殖をネガティブに制御できることを確認した。
【実施例６】
【００５５】
（ＣＭＬ発症の重大な要因としての好塩基球様白血病細胞の役割）
本発明者らは、以前に、「ＢＣＲ−ＡＢＬ−変換されたＬＩＣの非照射マウスの骨髄腔への直接注入がＣＭＬ発症の初期における正常な造血系及び白血病細胞間の相互作用を正確に表すこと、そして、このモデルを使用して、内因的に産生されたＣＣＬ３が骨髄中のＬＩＣの維持を促進するためにＣＣＲ１又はＣＣＲ５発現非白血病ＨＳＰＣに作用していること」、を示した（参照：非特許文献１０）。
本実施例では、このモデルにおいて、骨髄移植中での結果と同様に（図３Ｄ）、Ｋｉ６７発現が骨髄中のレシピエント由来正常ＫＬＳ＋細胞中で一過的に増強された（図５Ａ）ことを確認した。ＨＳＰＣの増殖を抑制する好塩基球由来ＣＣＬ３の能力を考慮すると、この結果は、Ｋｉ６７発現のこの一過的な増加におけるＣＣＬ３の関与を示している。実際、ＣＭＬ発症の間、ＣＣＬ３発現ＢＣＲ−ＡＢＬ−正常造血性細胞（図５Ｂ）と類似した表現型を示すＣＤ４９ｂ＋ＦｃεＲ１＋ＣＤ２００Ｒ３＋ｃ−ｋｉｔｌｏｗである好塩基球様白血病細胞が、ＣＣＬ３を発現し、なおかつ末梢血中ではなく骨髄中で増殖した（図５Ｃ及び５Ｄ）。これらの結果と一致して、ＣＣＬ３発現は、ＣＭＬ患者の骨髄生検材料中のＥＮＰＰ３＋好塩基球様細胞中で主として確認できた。好塩基球様白血病細胞のＣＭＬ病態生理学における役割を確認するために、ＭＣＰＴ８−ＤＴＲドナー由来ＬＩＣを、非照射ヌードマウス中に移植した。続いて、該非照射ヌードマウスは、選択的に好塩基球様白血病細胞を低減するために、ＤＴ処理した（図６Ａ）。ＤＴ処理は、末梢血  ＷＢＣの数（図６Ｂ）、脾臓（ＳＰ）重量（図６Ｃ）、及び骨髄  ＬＩＣの数（図６Ｄ）の増加を低下させた。更に、持続したＤＴ処理は、ＣＭＬ発症を著しく遅らせた（図６Ｅ）。
これらの結果は、骨髄中の好塩基球様白血病細胞が、ＣＭＬ  骨髄中でＬＩＣの優勢な増殖促進させるＣＣＬ３の主要な産生細胞であることを示した。
【実施例７】
【００５６】
（ＣＭＬに対する有力な予防薬としてのＣＣＲ５阻害剤であるマラビロクの作用）
非照射ＣＭＬモデル中において、ＬＩＣ移植１週間後からの毎日のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるダサチニブ処理は、ＣＭＬ様白血球増加を低減させたが（図１６Ａ）、多数のＬＩＣが、骨髄中で残存した（図１６Ｂ）。さらに、ダサチニブ処理の停止は、白血球増加の進行を急速に誘導した（図１６Ａ）。
上記結果をＣＭＬに対する治療剤として利用できるかを確認するために、このＣＭＬモデルに強力なＣＣＲ５拮抗作用を有する抗ＨＩＶ薬であるマラビロクを投与した。マラビロクは、ＬＩＣ注入直後に投与した場合、骨髄中のＬＩＣの消失と共に（図７Ｄ及び１６Ｂ）、低下した白血球増加及び脾腫重量減少に示される通り（図７Ｂ、７Ｃ及び図１７）、劇的にＣＭＬ発症を防いだ（図７Ａ）。
【実施例８】
【００５７】
（骨転移に対する有力な予防薬としてのＣＣＲ５阻害剤であるマラビロクの作用）
ＣＣＲ５阻害剤であるマラビロクを投与すると、骨転移が抑制されるかを調べた。概要を図１８Ａに示す。
骨転移を高頻度で起こすマウス乳癌細胞株４Ｔ１．３細胞（本発明者らが、国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した４Ｔ１細胞株を、マウスに接種して骨に転移する細胞を選択し、樹立した細胞株）を、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に５×１０３細胞の濃度で懸濁した。該細胞懸濁液２０  μＬをＣＤ４５．２＋ＢＡＬＢ／ｃマウス脛骨内に注入した。
注入２日後、４日後、６日後に、３０  ｍｇ／ｋｇ体重のマラビロクを経口投与した。コントロールとして、各日にマラビロクの代わりに１匹あたり０．１  ｍＬの滅菌水を投与した。
注入７日後に脛骨を回収し、脱灰液｛Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｄｅｃａｌ  Ｕｎｉｔ；Ｉ．Ｅ．Ｄ  Ｕｎｉｔ（バイオケアメディカル）｝中に浸漬し、室温で一晩脱灰した。脱灰後、パラフィン包埋組織切片を作製した。
一次抗体として腫瘍マーカーである抗ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用い、二次抗体としてＭ．Ｏ．Ｍ  ＩｍｍＰｒｅｓｓ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）とＩｍｍＰＡＣＴ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いた免疫染色にて、骨髄腔全体の面積に対する腫瘍細胞の陽性率を算出した。免疫染色の画像取得及び陽性染色の検出は、メーカーの指示に従い、Ｂ２−７１０オールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス）を使用して行った。
免疫染色の結果、マラビロクを投与した場合、コントロールと比較して、陽性染色された面積が顕著に小さいことが確認できた（図１８Ｂ）。骨髄腔全体の面積に対する陽性率を算出した結果、コントロールでは、骨髄腔全体の面積に対する陽性率は約３２．３４％であったのに対し、マラビロクを投与した場合、骨髄腔全体の面積に対する陽性率は約１．９１％であった（図１８Ｃ）。すなわち、マラビロクを投与した場合、腫瘍形成を約１７分の１に抑制した。
以上より、マラビロクの投与は、骨髄中の癌細胞の定着及び腫瘍形成を抑制し、骨転移を抑制できることが明らかになった。よって、ＣＣＲ５阻害剤であるマラビロクは、癌細胞の骨髄内での増殖を抑制する、骨転移の有力な治療剤・予防剤となることが確認できた。
【００５８】
（総括）
以上の本実施例１〜８より、以下の点を確認した。
（１）ＣＣＬ３は、選択的に好塩基球で発現している。さらに、骨髄中の好塩基球は、炎症刺激なしでＣＣＬ３を発現する。それゆえに、ＣＣＬ３は、通常の生理的条件下と同様に、骨髄中の恒常性ケモカインとして機能する。
（２）骨髄中の好塩基球は、ＣＣＬ３依存的にＨＳＰＣ増殖をネガティブに制御できる。すなわち、好塩基球の作用又は発現を阻害する化合物は、ＨＳＰＣの増殖が抑制されている慢性骨髄性白血病の治療剤又は予防剤の有効成分となり得る。
（３）本実施例のＣＭＬモデルにより、好塩基球様白血病細胞は、ＣＣＬ３の発現を増幅する。そして、ＣＣＬ３は、骨髄中のＬＩＣを増幅させ、そして、ＣＭＬ発症を促進する。より詳しくは、好塩基球様白血病細胞由来のＣＣＬ３は、正常な造血と白血病プロセス間の相互作用に重要な役割を果し、ＣＭＬ骨髄環境下での正常造血幹細胞に対するＬＩＣの優性増殖を促進する。
（４）本実施例のＣＭＬモデルにより、マラビロクは骨髄中のＬＩＣを劇的に減少させ、そして、ＣＭＬ発症を阻止した。一方、ＣＭＬ標準治療剤であるダサチニブは、末梢血中の白血病細胞の数を減少することはできたが、本モデルの骨髄中のＬＩＣを減少させることはできなかった。加えて、ダサチニブ投与中止によりすべてのマウスが白血病に屈した。すなわち、マラビロクは、ＣＭＬ標準治療剤であるダサチニブと比較して、ＣＭＬのＬＩＣに対して、特に慢性白血病初期においてはより有効である。
（５）ＬＩＣは、チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性があることが知られている。そこで、ＣＣＲ５阻害剤（例、マラビロク）とＣＭＬ標準治療剤（例、チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ）の併用投与は、従来のＣＭＬ標準治療と比較して、優れている。
（６）本実施例において、マラビロクは、骨髄中の腫瘍形成を抑制し、さらに、乳癌による骨転移を抑制した。ＣＣＲ５阻害剤（例、マラビロク）の投与は、骨転移の治療・予防に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本願発明のＣＭＬモデル動物は、慢性骨髄性白血病の研究に利用することにより、新規治療方法、新規薬剤の開発に利用することができる。また、白血病治療剤候補のスクリーニングに用いることができる。
【図１】
2017146297.tif 000002
【図２】
2017146297.tif 000003
【図３】
2017146297.tif 000004
【図４】
2017146297.tif 000005
【図５】
2017146297.tif 000006
【図６】
2017146297.tif 000007
【図７】
2017146297.tif 000008
【図８】
2017146297.tif 000009
【図９】
2017146297.tif 000010
【図１０】
2017146297.tif 000011
【図１１】
2017146297.tif 000012
【図１２】
2017146297.tif 000013
【図１３】
2017146297.tif 000014
【図１４】
2017146297.tif 000015
【図１５】
2017146297.tif 000016
【図１６】
2017146297.tif 000017
【図１７】
2017146297.tif 000018
【図１８】
2017146297.tif 000019
【配列表】
2017146297000001.app