(57)【要約】【課題】耐培養液性に優れ、細胞低毒性であり、かつ、培養した細胞の接着率や生細胞率が高く、熱安定性に優れ、また紫外光を吸収しにくい細胞培養基材を提供すること。【解決手段】無機材料で構成された基板を備える細胞培養基材であって、細胞培養基材は、培養面に複数の凹凸構造を有し、ＪＩＳＢ０６０１及びＪＩＳＲ１６８３に準拠して原子間力顕微鏡で凹凸構造を測定したときに（測定領域は１μｍ四方、ローパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１ｎｍ、ハイパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１７０ｎｍである）、少なくとも１つの方向についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍである（平均線は、前記ハイパス用輪郭曲線フィルタにより遮断される長波長成分を表す曲線を最小二乗法により直線に補正したとき、その直線と平行かつ、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布５０％を示す線である）、細胞培養基材。【選択図】図１
2017205082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機材料で構成された基板を備える細胞培養基材であって、
前記細胞培養基材は、培養面に複数の凹凸構造を有し、
ＪＩＳＢ０６０１及びＪＩＳＲ１６８３に準拠して原子間力顕微鏡で前記凹凸構造を測定したときに（測定領域は１μｍ四方、ローパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１ｎｍ、ハイパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１７０ｎｍである）、
少なくとも１つの方向についての前記凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍである（平均線は、前記ハイパス用輪郭曲線フィルタにより遮断される長波長成分を表す曲線を最小二乗法により直線に補正したとき、その直線と平行かつ、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布５０％を示す線である）、細胞培養基材。
【請求項２】
前記輪郭曲線のウォーターシェッド法高さが０．１〜８ｎｍである（前記ウォーターシェッド法高さは、前記輪郭曲線における高さの累積相対度数分布１００％を示す上端線と高さの累積相対度数分布０％を示す下端線とを反転させて水平補正した状態で、ウォーターシェッド法により計測した前記輪郭曲線における反転後の谷の最下点と前記下端線との距離の平均である）、請求項１記載の細胞培養基材。
【請求項３】
Ｘ方向についての前記凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ１と、前記Ｘ方向と直交するＹ方向についての前記凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ２とのアスペクト比が１．９５以下である（前記アスペクト比は、前記平均長さＷ１、Ｗ２のうち、大きい方の値を小さい方の値で除した値の平均である）、請求項１又は２記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記培養面が、多孔質ＳｉＯ２膜で被覆された凹凸構造をなす、請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記培養面が、リン酸カルシウム化合物膜で被覆された凹凸構造をなす、請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記多孔質ＳｉＯ２膜又はリン酸カルシウム化合物膜の厚みが、１〜２００ｎｍである、請求項４又は５記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記無機材料がＳｉＯ２を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項８】
前記培養面にＢ２Ｏ３が含まれない、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項９】
可視光透過率が７０％以上である、請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
前記凹凸構造が、溝状、孔状又は鱗状である、請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の細胞培養基材で細胞を培養する工程を有する、細胞含有物の作製方法。
【請求項１２】
ポリスチレンからなる細胞培養基材を用いて細胞を培養し、前記細胞の密度が前記ポリスチレンからなる細胞培養基材の培養面の９０％となる培養時間を１Ｔとした場合に、請求項１〜１０のいずれか一項記載の細胞培養基材を用いて１／２Ｔ〜２／３Ｔの培養時間で細胞を培養する、細胞含有物の作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の細胞培養基材をオートクレーブ処理し、再利用用細胞培養基材を作製する、細胞培養基材の作製方法。
【請求項１４】
前記オートクレーブ処理後の細胞培養基材上のタンパク質を除去する、請求項１３記載の細胞培養基材の作製方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の細胞培養基材上の細胞を光学的に観察する、細胞観察方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の細胞培養基材上の細胞接着性タンパク質を除去するために用いられる、細胞接着性タンパク質を分解する成分を含有するメンテナンス液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、細胞含有物の作製方法、細胞培養基材の作製方法、細胞観察方法、細胞培養基材のメンテナンス液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、体外で細胞を培養して得られた細胞組織を、体内へ移植する再生医療技術が注目されている。例えば、生体組織へ分化する種々の細胞を細胞培養皿で培養し、ｉＰＳ細胞などの幹細胞や、骨、血管、皮膚、心臓などの生体組織を再生する再生医療技術の開発が進んでいる。
【０００３】
細胞の培養に用いられる基材としては、ポリスチレン細胞培養皿が一般的に用いられてきた。しかし、ポリスチレン細胞培養皿を培養基材として用いた場合、培養した細胞の接着率や生細胞率が低いという問題がある。また、ポリスチレン細胞培養皿の耐熱性は低いため、加熱滅菌によって再利用できないという問題がある。
【０００４】
特許文献１には、ポリスチレン細胞培養皿が一次細胞培養や血清を含まない細胞培養などの用途に適していないことに着目し、細胞を培養する基体の表面にコロイドシリカのフィルムを施した細胞培養装置が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、アモルファス二酸化珪素（シリカ）を有する表面上の分子あるいは分子集合体を酵素修飾することにより、生体活性表面を作り出す方法が記載されており、酵素修飾にポリペプチドを用いること、当該方法が細胞培養に利用されることが記載されている。
【０００６】
特許文献３には、メトキシエチルアクリレートと、ジメチルアクリルアミドの共重合体と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料とを含有する細胞培養基材が記載されている。
【０００７】
特許文献４には、細胞が三次元的に凝集した細胞塊（スフェロイド）を、コラーゲンゲルなどの添加物を用いることなく、均一な大きさに培養できる細胞培養基材として、基材の表面に深さ１００〜５００μｍ、内径１００〜１０００μｍの凹陥部が複数設けられた構造を有する細胞培養用基材が記載されている。当該細胞培養用基材は、さらに最頻ピッチが２ｎｍ〜１０μｍの連続した凹凸構造を有することも記載されている。
【０００８】
特許文献５には、細胞培養基材について、細胞凝集体（スフェロイド）の形成起点及び細胞凝集体の伸展に着目し、凝集体形成効率の向上に好適な構造として、ガラス基板の一方の面に、開口部がロート形状でその底部に細孔を有する凹部が複数配列されてなる細胞培養基材であって、凹部が、少なくともガラス基板洗浄工程、Ｃｒ膜マスク形成工程、レジストマスク形成工程、エッチングによるＣｒ膜マスク開口形成工程、ガラス基板のウエットエッチング工程からなるプロセスフローを介して形成された細胞培養基材が記載されている。
【０００９】
非特許文献１には、金ナノドット／ポリエチレングリコールの基材表面において、金ナノドットと他の金ナノドットとの間隔が、１１０ｎｍよりも５８ｎｍの場合に、細胞培養特性が良好になることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表平１１−５１３２５４号公報
【特許文献２】特表２００７−５３５３２０号公報
【特許文献３】特開２０１３−１０２７１３号公報
【特許文献４】特開２０１２−２４９５４７号公報
【特許文献５】特開２０１３−３９０７１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃａｖａｌｃａｎｔｉ−Ａｄａｍ，  Ｅ．Ａ．；  Ｍｉｃｏｕｌｅｔ，  Ａ．；  Ｂｌｕｍｍｅｌ，  Ｊ．，  Ａｕｅｒｎｈｅｉｍｅｒ，  Ｊ．；  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｈ．；  Ｓｐａｔｚ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｅｕｒ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８５  （２００６）  ２１９−２２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、ポリスチレン細胞培養皿に代わる細胞培養基材の研究開発が進められている。例えば、細胞培養基材としてポリスチレン細胞培養皿の上に無機材料を被覆することによって、耐培養液性に優れ、細胞へ毒性を与えずに細胞を培養することができる。しかしながら、培養した細胞の接着率や生細胞率、熱安定性に改善の余地があり、またポリスチレンを基板材料として使用するために紫外光吸収の問題があった。
【００１３】
本発明は、耐培養液性に優れ、細胞低毒性であり、かつ、培養した細胞の接着率や生細胞率が高く、熱安定性に優れ、また紫外光を吸収しにくい細胞培養基材の提供を目的とする。また、当該細胞培養基材を用いた細胞含有物の作製方法、細胞培養基材の作製方法、細胞観察方法及び細胞培養基材のメンテナンス液も提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、細胞培養時のメカニズムについて鋭意検討し、細胞培養基材への細胞の接着性を向上させ、細胞増殖等の高活性化を実現するためには、細胞の仮足に付いているインテグリンタンパク質や、細胞と基材との間に介在するフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリクスタンパク質を細胞培養基材の培養面に安定化させること、すなわちタンパク質の足場形成が重要であること、そのためには、インテグリンタンパク質（数ｎｍ〜数十ｎｍ）や、フィブリノーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリクスタンパク質（数ｎｍ〜数十ｎｍ）を収容し得る凹凸構造が所定程度に細胞培養基材の培養面に形成されていることによって、細胞接着性や生細胞率を向上させる可能性があることを見出した。
【００１５】
上記の知見に基づき、本発明者らは、以下の（１）〜（１６）の本発明を完成するに至った。
（１）無機材料で構成された基板を備える細胞培養基材であって、
前記細胞培養基材は、培養面に複数の凹凸構造を有し、
ＪＩＳＢ０６０１及びＪＩＳＲ１６８３に準拠して原子間力顕微鏡で前記凹凸構造を測定したときに（測定領域は１μｍ四方、ローパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１ｎｍ、ハイパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１７０ｎｍである）、
少なくとも１つの方向についての前記凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍである（平均線は、前記ハイパス用輪郭曲線フィルタにより遮断される長波長成分を表す曲線を最小二乗法により直線に補正したとき、その直線と平行かつ、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布５０％を示す線である）、細胞培養基材。
（２）前記輪郭曲線のウォーターシェッド法高さが０．１〜８ｎｍである（前記ウォーターシェッド法高さは、前記輪郭曲線における高さの累積相対度数分布１００％を示す上端線と高さの累積相対度数分布０％を示す下端線とを反転させて水平補正した状態で、ウォーターシェッド法により計測した前記輪郭曲線における反転後の谷の最下点と前記下端線との距離の平均である）、請求項１記載の細胞培養基材。
（３）Ｘ方向についての凹凸構造の輪郭曲線における周期Ｗ１と、Ｘ方向と直交するＹ方向についての凹凸構造の輪郭曲線における周期Ｗ２とのアスペクト比が１．９５以下である（アスペクト比は、周期Ｗ１、Ｗ２のうち、大きい方の値を小さい方の値で除した値の平均である）、（１）又は（２）記載の細胞培養基材。
（４）培養面が、多孔質ＳｉＯ２膜で被覆された凹凸構造をなす、（１）〜（３）のいずれか記載の細胞培養基材。
（５）培養面が、リン酸カルシウム化合物膜で被覆された凹凸構造をなす、（１）〜（３）のいずれか記載の細胞培養基材。
（６）多孔質ＳｉＯ２膜又はリン酸カルシウム化合物膜の厚みが、１〜２００ｎｍである、（４）又は（５）記載の細胞培養基材。
（７）無機材料がＳｉＯ２を含む、（１）〜（６）のいずれか記載の細胞培養基材。
（８）培養面にＢ２Ｏ３が含まれない、（１）〜（７）のいずれか記載の細胞培養基材。
（９）可視光透過率が、７０％以上である、（１）〜（８）のいずれか記載の細胞培養基材。
（１０）凹凸構造が、溝状、孔状又は鱗状である、（１）〜（９）のいずれか記載の細胞培養基材。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか記載の細胞培養基材で細胞を培養する工程を有する、細胞含有物の作製方法。
（１２）ポリスチレンからなる細胞培養基材を用いて細胞を培養し、細胞の密度がポリスチレンからなる細胞培養基材の培養面の９０％となる培養時間を１Ｔとした場合に、（１）〜（１０）のいずれか記載の細胞培養基材を用いて１／２Ｔ〜２／３Ｔの培養時間で細胞を培養する、細胞含有物の作製方法。
（１３）（１）〜（１０）のいずれか記載の細胞培養基材をオートクレーブ処理し、再利用用細胞培養基材を作製する、細胞培養基材の作製方法。
（１４）オートクレーブ処理後の細胞培養基材上のタンパク質を除去する、（１３）記載の細胞培養基材の作製方法。
（１５）（１）〜（１０）のいずれか記載の細胞培養基材上の細胞を光学的に観察する、細胞観察方法。
（１６）（１）〜（１０）のいずれか記載の細胞培養基材上の細胞接着性タンパク質を除去するために用いられる、細胞接着性タンパク質を分解する成分を含有する、メンテナンス液。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、耐培養液性に優れ、細胞低毒性であり、かつ、培養した細胞の接着率や生細胞率が高く、熱安定性に優れ、また紫外光を吸収しにくい細胞培養基材を提供することができる。さらに、本発明は、当該細胞培養基材を用いた細胞含有物の作製方法、細胞培養基材の作製方法、細胞観察方法及び細胞培養基材のメンテナンス液も提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態における凹凸構造の輪郭曲線の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１〜３及び比較例１〜２の細胞培養基材表面の結晶性を示すＸ線回折パターンを示す図であり、図２（ａ）は低角領域のＸ線回折パターン、図２（ｂ）は高角領域のＸ線回折パターンである。
【図３】実施例１〜３及び比較例１〜２の細胞培養基材の培養面の凹凸構造を示す原子間力顕微鏡像である。
【図４】実施例１〜３及び比較例１〜２の細胞培養基材の培養面の吸着タンパク質量を示すグラフである。
【図５】実施例１〜３及び比較例１〜２の細胞培養基材における、細胞の培養時間と細胞の生細胞率との関係を示すグラフである。
【図６】実施例１〜３及び比較例１〜２の細胞培養基材における、細胞の培養時間と細胞面積との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は当該実施形態によって限定的に解釈されるものではない。
【００１９】
（細胞培養基材）
本実施形態の細胞培養基材は、無機材料で構成された基板を備えかつ培養面に複数の凹凸構造を有する。
本実施形態において、ＪＩＳＢ０６０１（２０１３）及びＪＩＳＲ１６８３（２０１４）に準拠して、原子間力顕微鏡で凹凸構造を測定したときに（測定領域は１μｍ四方、ローパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１ｎｍ、ハイパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値が１７０ｎｍである）、少なくとも１つの方向についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍである。
【００２０】
原子間力顕微鏡における測定においては、原子間力を測定する探針を、試料である細胞培養基材の培養面に対し、高速にライン走査する方向をＡ方向とする。また、探針を高速にライン走査する始点位置を、Ａ方向と垂直に少しずつ移動させる方向をＢ方向とする。
細胞培養基材の培養面における測定領域は、１μｍ四方とし、Ａ方向に１μｍ、Ｂ方向に１μｍの領域を設定することができる。測定点数は、Ａ方向に２５６点、Ｂ方向に２５６点としてもよく、さらに微細に測定を行う場合には、Ａ方向に５１２点、Ｂ方向に５１２点としてもよく、測定領域の大きさなどに応じて適宜調整できる。
ローパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値を１ｎｍ、ハイパス用輪郭曲線フィルタのカットオフ値を１７０ｎｍと設定することで、長さ「１〜１７０ｎｍ」の輪郭曲線要素を検出できる。
【００２１】
原子間力顕微鏡における測定により、凹凸構造の輪郭曲線を得ることができる。図１は、一実施形態における凹凸構造の輪郭曲線の一例を示す、模式図である。
凹凸構造の輪郭曲線Ｍにおける平均線ＴＡより上側の部分が山、下側の部分が谷である。本発明における平均線は、ハイパス用輪郭曲線フィルタにより遮断される長波長成分を表す曲線を最小二乗法により直線に補正したとき、その直線と平行かつ、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布５０％を示す線である。なお、累積相対度数分布に関する「高さ」は、各箇所の縦座標軸値と縦座標軸値の最低値との差である。
図１に示すように、本実施形態における輪郭曲線Ｍは複数の山及び谷を有し、山Ｐ１、それに隣り合う谷（具体的には右隣）Ｑからなる曲線部分が一つの輪郭曲線要素であり、さらに山Ｐ２が連続する。したがって、輪郭曲線要素の長さは、山Ｐ１の起点Ａから山Ｐ１に隣接する谷Ｑの終点Ｂまでの距離である。本発明は、この輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍである方向を少なくとも１つ有するものである。
【００２２】
細胞の仮足に付いているインテグリンタンパク質や細胞外マトリクスタンパク質は約１〜１７０ｎｍの周期で存在する傾向にあることから、輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍであることによって、複数のインテグリンタンパク質や細胞外マトリクスタンパク質を凹部内に効率的に収容できる。輪郭曲線要素の長さの平均は、好ましくは１〜１３０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜８０ｎｍである。
本実施形態の細胞培養基材の培養面において、輪郭曲線要素の長さの平均が上記好ましい範囲内となる測定方向は、２方向以上であることが好ましい。これにより、インテグリンタンパク質や細胞外マトリクスタンパク質の収容性が向上し、細胞接着性が向上する傾向にある。
輪郭曲線要素の長さの平均が上記好ましい範囲内となる測定領域は、複数領域であることが好ましい。また、本実施形態の細胞培養基材の培養面における、輪郭曲線要素の長さの平均が上記好ましい範囲内となる測定領域の存在確率は、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。
【００２３】
輪郭曲線の高さは、細胞の培養面への接着性の観点から最適化することが好ましい。具体的には、輪郭曲線のウォーターシェッド法高さが０．１〜８ｎｍであることが好ましく、１〜６ｎｍであることがより好ましく、１〜５ｎｍであることがさらに好ましい。
この機構は次の通りと推測される。細胞外マトリクスタンパク質（フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）は、細胞が接着する前に細胞培養液から基材に吸着する。その中で細胞が結合、接着するのに重要なタンパク質は線維状であり、中心部が疎水性、末端部が静電気的に電荷を帯びている。このため、線維状タンパク質は、その末端部が凹凸構造に入り込みかつ中心部が凹凸構造に入り込まない場合に、基材に最も吸着されやすくなる。さらに、線維状タンパク質の密度が増えると、露出した疎水性の中心部同士の疎水性相互作用により線維状タンパク質分子が起立していき、細胞が結合可能な領域と細胞との接触頻度が高まり、細胞が結合しやすくなる。これらの相乗作用によって細胞接着率が高くなりやすい。ここで、細胞外マトリクスタンパク質の末端部のサイズ（水和した大きさ）は数ｎｍであることから、上記程度の輪郭曲線のウォーターシェッド法高さが好ましいと考えられる。
輪郭曲線のウォーターシェッド法高さは、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布１００％を示す上端線と高さの累積相対度数分布０％を示す下端線とを反転させて水平補正した状態で、ウォーターシェッド法により計測した輪郭曲線における反転後の谷の最下点と下端線との距離の平均である。ウォーターシェッド法による計測では、Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｓｏｉｌｌｅのアルゴリズム（Ｌ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｐ．  Ｓｏｌｌｅ  “Ｗａｔｅｒｓｈｅｄｓ  ｉｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｐａｃｅｓ：  Ａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，  １３（６），  ５８３  （１９９１）．）を適用したプログラムによって自動処理される。
【００２４】
本実施形態の凹凸構造は、上記測定方法で得られる輪郭曲線要素の長さの平均が、１〜１７０ｎｍである一方、上記特許文献４のように内径１００〜１０００μｍ、深さ１００〜５００μｍの凹陥部は、本実施形態の基材上には存在しなくてもよい。特に、内径１００〜１０００μｍ、深さ１００〜５００μｍの凹陥部の内面に凹凸構造を形成する特許文献４の態様は、スフェロイド（細胞塊）を形成するための構造であり、スフェロイドの形成を目的としない本実施形態には含まれないことが好ましい。
【００２５】
凹凸構造は、溝状、孔状又は鱗状の凹凸構造であることが好ましい。凹凸構造が溝状、孔状又は鱗状の凹凸構造であれば、タンパク質を規則的に収容することができ、接着する細胞を培養面上に規則的に形成することができる。中でも孔状の凹凸構造は、細胞外マトリクスタンパク質の有電荷末端部が凹凸構造に密着して包囲されるので、上記した細胞外マトリクスタンパク質の基材への吸着及び細胞外マトリクスタンパク質の起立が生じやすくなり、細胞接着率が高まりやすい点で有利である。また、例えば、溝状の凹凸構造であれば基板又は基材の表面を削ることによって作製でき、孔状の凹凸構造であれば基板又は基材の表面上から孔を形成する部材を押圧することによって作製できるなど、凹凸構造を容易に形成できる点で優れている。本実施形態において溝状とは、凹部が奥行き方向に連続的に形成された形状を意味し、タンパク質を規則的に収容する観点から直線状の溝構造が好ましい。また、孔状とは、基材上面から俯瞰した場合に孔が基材表面に点在している状態を意味する。また、鱗状とは、凸部の周囲に凹部が存在する凹凸構造を意味する。溝状、孔状又は鱗状の凹凸構造は、原子間力顕微鏡像として確認できる。
【００２６】
本実施形態において、Ｘ方向（凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均が１〜１７０ｎｍであることを満たす方向）についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ１と、Ｘ方向と直交するＹ方向についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ２とのアスペクト比は、１．９５以下であることが好ましい。アスペクト比は、平均Ｗ１、Ｗ２のうち、大きい方の値を小さい方の値で除した値の平均である。
アスペクト比が１．９５以下の場合は、細胞外マトリクスタンパク質の有電荷末端部が凹凸構造に密着して包囲されるので、上記した細胞外マトリクスタンパク質の基材への吸着及び細胞外マトリクスタンパク質の起立が生じやすくなり、細胞接着率が高まりやすい。より好ましくは、アスペクト比が１．５以下であり、さらに好ましくは１．２以下である。また、平均Ｗ１とＷ２とが同一の値の場合には、アスペクト比は下限である１を示す。
【００２７】
凹凸構造の表面粗さを示す指標として、ラフネス値を用いることもできる。ラフネス値とは、Ｒｏｏｔ−ｍｅａｎ−ｓｑｕａｒｅ値（Ｒｒｍｓ）によって、表面の粗さを数値化した値である。下記の数式中、ｎは測定点数（ｎ＝２６５×２６５）、ｈ（Ｘｉ）は測定点Ｘｉでの高さ、ｈは高さの平均値である。Ｒｒｍｓ値は、平均値ｈに対する偏差の２乗値の平均に対する平方根で表される。
【００２８】
【数１】
2017205082.tif 000003
【００２９】
本発明者らは、細胞の培養面への接着性（細胞接着性）について、以下のようなメカニズムを仮説として考えている。
すなわち、細胞培養基材中に細胞培養液を収容させると、以下の（１）〜（３）のプロセスが進行し、細胞が機能を発現すると考えている。
（１）培養面にイオン及び水が接触して水和層を形成すること（第１吸着プロセス）。
（２）培養面上の水和層に細胞培養液中のタンパク質が吸着し、タンパク質吸着層を形成すること（第２吸着プロセス）。
（３）細胞がタンパク質吸着層に接着し、伸展すること（第３接着プロセス）。
さらに、培養面の凹凸構造における凹部にタンパク質（の末端）が収容されることによって、細胞接着性や生細胞率が向上すると考えている。
【００３０】
＜培養基材＞
細胞培養基材は、無機材料で構成された基板を備える基材であれば特に限定されない。無機材料としては、例えば、酸化アルミニウム、窒化アルミニウム、窒化ホウ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、方解石、カルシウムカーボネート、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、極微細炭酸カルシウム、石膏、硫酸カルシウム、大理石、硫酸バリウム、炭酸バリウム、酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ストロンチウム、カオリンクレー、焼成クレー、タルク、セリサイト、光学ガラス、ガラスビーズ等が挙げられ、これらを１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
また、無機材料として、リン酸カルシウム化合物を用いてもよい。リン酸カルシウム化合物は、リン酸源（リン酸、第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、第１リン酸アンモニウム、第２リン酸アンモニウム、などより選択される１種以上の塩）と、カルシウム源（硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、などより選択される１種以上の塩）との混合物、又は混合反応物であることが好ましい。リン酸カルシウム化合物としては、リン酸一水素カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、リン酸一水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム無水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム１水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２）、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）が挙げられる。この中でも、細胞培養で有用な水酸アパタイトとリン酸八カルシウムが好ましく、より好ましくは生体・細胞親和性の高い水酸アパタイトである。
無機材料としては、酸化珪素（シリカ）であることが好ましく、石英ガラスがより好ましい。骨の副成分であるシリカを用いることによって、骨芽細胞の培養を高活性化することができる。また、側部は基板と同じ無機材料で構成されることが好ましい。なお、ホウ素の酸化物は生体にとって影響を与える恐れがあるため、細胞培養基材は、培養面にＢ２Ｏ３を含まないことが好ましい。なお、培養面にＢ２Ｏ３を含まなければ、非培養面にＢ２Ｏ３を含んでも含まなくてもよい。
無機材料で構成された基板を用いることによって、熱安定性、耐培養液性に優れ、細胞へ毒性を与えない細胞培養基材となる。また、ポリスチレンを基板材料として用いる場合に比べ、紫外光を吸収しにくい。
なお、例えば特許文献３のように、無機材料を含有する細胞培養基材であっても、メトキシエチルアクリレートとジメチルアクリルアミドとの共重合体のような有機化合物を含有するような場合には、本実施形態の細胞培養基材に含まれないことが好ましい。
【００３１】
＜細胞＞
細胞培養基材上で培養される細胞は特に限定されないが、例えば、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、筋線維芽細、肝細胞、ｉＰＳ細胞、末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、線維柱帯細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、内分泌細胞、クロム親和性細胞、管平滑筋細胞、毛母細胞、軟骨細胞、羊膜由来細胞、胎児腎由来細胞等が挙げられる。
【００３２】
＜膜＞
細胞培養基材の培養面は、多孔質ＳｉＯ２膜で被覆された凹凸構造をなすことが好ましい。多孔質ＳｉＯ２膜で被覆されることによって、細胞培養をより高活性化できる傾向にある。
【００３３】
細胞培養基材の培養面は、リン酸カルシウム化合物膜で被覆された凹凸構造をなすことも好ましい。リン酸カルシウム化合物膜で被覆されることによって、長時間培養時の生細胞率の向上や、細胞面積の増加など、細胞培養をより高活性化できる傾向にある。リン酸カルシウム化合物は、リン酸源（リン酸、第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、第１リン酸アンモニウム、第２リン酸アンモニウム、などより選択される１種以上の塩）と、カルシウム源（硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、などより選択される１種以上の塩）との混合物、又は混合反応物であることが好ましい。リン酸カルシウム化合物としては、リン酸一水素カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ４）、リン酸一水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム無水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二水素カルシウム１水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２）、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）が挙げられる。この中でも、細胞培養で有用な水酸アパタイトとリン酸八カルシウムが好ましく、より好ましくは生体・細胞親和性の高い水酸アパタイトである。
ただし、本発明は、上記膜で被覆されない無機材料（特にＳｉＯ２）基板からなる基材であっても、十分な細胞培養が可能である。この場合には、基板が純粋な無機材料（特にＳｉＯ２）組成であり、アモルファス構造（ＸＲＤより）であることが好ましいと考えられる。
【００３４】
多孔質ＳｉＯ２膜又はリン酸カルシウム化合物膜の厚みは、１〜２００ｎｍであることが好ましく、５〜１７０ｎｍであることがより好ましく、１０〜１６０ｎｍであることがさらに好ましく、４０〜１５０ｎｍであることが最も好ましい。膜厚が１〜２００ｎｍであることによって、被覆されていても、細胞培養基材の基板の表面形状と培養面の凹凸構造とが甚大には相違しにくく、細胞培養基材の所望される凹凸構造を形成しやすい。同じ観点で、上記膜は凹凸構造中にコンフォーマルに形成されていることが好ましい。また、多孔質ＳｉＯ２膜又はリン酸カルシウム化合物膜は、凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均やアスペクト比、輪郭曲線のウォーターシェッド法高さ、凹凸構造のラフネス値を微調整するために使用することもできる。例えば、膜厚が増すにつれ、輪郭曲線のウォーターシェッド法高さを大幅には変更させずに、輪郭曲線要素の長さの平均を下げる微調整が可能である。
膜厚の測定方法としては、細胞培養基材の表面において、膜のない領域と、膜のある領域とができるように、多孔質ＳｉＯ２膜又はリン酸カルシウム化合物膜を形成し、膜の無い領域と膜の有る領域との境界領域について、例えば原子間力顕微鏡または触針式表面形状測定器によって走査し、膜厚を計測することができる。膜のない領域を形成する方法としては、膜の形成を阻害する物質（例えば、耐薬品性のポリイミドテープ）を予め基板表面上の一部へ貼る方法が挙げられる。
また、細胞培養基材をそのままの状態で（非破壊で）膜厚を測定するには、Ｘ線反射率法（例えばリガク株式会社製、Ｓｍａｒｔ  Ｌａｂ  ９ｋＷ）によって、試料表面に極浅い角度（例えば、０．１〜５．０°）でＸ線を入射させ、その入射角の対鏡面方向に反射したＸ線強度プロファイルを測定し、既に知られている多孔質ＳｉＯ２膜やリン酸カルシウム化合物膜のシミュレーション結果と比較して、パラメータを最適化することにより、測定することができる。なお、収束イオン加工装置により細胞培養基材における膜断面を切り出し、高分解の透過型電子顕微鏡（例えば日立ハイテクノロジーズ株式会社製  ＨＴ７７００）により膜断面を観察し、膜厚を実測することも可能である。
【００３５】
細胞培養基材の可視光透過率が７０％未満であると、光の透過性能が低く観察感度が低くなってしまうので、細胞観察等の用途では問題である。したがって、本発明の実施形態では、細胞培養基材の可視光透過率が７０％以上であることが好ましい。これにより透明性に優れた細胞培養基材となり、光学顕微鏡による細胞観察が良好に行いやすい。より好ましくは可視光透過率が８０％以上であり、さらに好ましくは可視光透過率が９０％以上である。また、従来の可視光透過率７０％未満の細胞培養基材の代表例は、ポリスチレン培養皿の上に無機材料が被覆された基材であり、例えば、細胞親和性の高いリン酸カルシウムナノ結晶をキャスト法によりポリスチレン細胞培養皿を被覆した基材の場合、可視光透過率が６４％程度となるため、光学的観察に用いるには問題があり、加えて、キャスト法では粒子の並び方を制御できず、粒子の凝集体に起因する比較的粗い膜構造となり、光の乱反射を引き起こすため、細胞観察等の用途には問題があった。ポリスチレンによる紫外光吸収の点でも問題を有していたが、本実施形態の細胞培養基材は、ポリスチレンのような紫外光吸収性の材料を用いていないので、この問題を生じることもない。
【００３６】
（凹凸形成方法）
細胞培養基材の培養面に凹凸構造を形成する方法は、特に限定されず、公知の研削・研磨方法を用いることができる。一例として、細胞培養基材として石英ガラス（シリカ）を用いる場合に、研削及び研磨によって培養面の凹凸構造を形成する方法を、以下に説明する。
【００３７】
＜研削工程＞
研削工程は上下の定盤間に板状の被加工物を保持し、遊離砥粒を含む研磨液（研磨スラリー）を供給しながら定盤と被加工物とを回転させて相対移動することにより行う遊離砥粒法や、レジン、メタル、ビトリファイド等のボンドでダイヤモンド微粉をペレット状にし、このペレットを複数個配置した定盤によって研削液（クーラント）を供給しながら定盤と被加工物とを回転させて相対移動することにより行う固定砥粒法により行われることが一般的である。また、ダイヤモンドパッドによる研削を行ってもよい。研削工程を経た石英ガラス基板は、大きなうねり、欠け、ひび等の欠陥がほぼ除去される。
【００３８】
＜研削後の洗浄工程＞
研削工程を経た石英ガラス基板には、表面に研削液や石英ガラス粉が残存している可能性がある。そのため、洗浄工程を設けることが好ましい。洗浄工程においては、種々の洗浄方法を採用することができる。例えば、石英ガラス基板に対して、アルカリ洗浄のみを行ってもよく、また、酸洗浄を行った後にアルカリ洗浄を行ってもよく、また、酸洗浄のみを行ってもよい。
【００３９】
＜研磨工程＞
研磨工程は、最終的に必要とされる面粗さ（凹凸構造）が効率よく得られるように、ガラス基板の表面を研磨加工する工程である。この工程で採用される研磨方法としては、特に限定されず、両面研磨機において、研磨パッドおよび研磨液を使用して研磨することができる。なお、本実施形態においては凹凸構造が必須であるため、いわゆる鏡面研磨工程は行わないことが好ましい。
【００４０】
研磨パッドとしては、最終的に必要とされる面粗さ（凹凸構造）を得やすいように、硬質パッドを使用することが好ましく、たとえば発泡ウレタンを使用することが好ましい。研磨液としては、平均粒径が０．６〜２．５μｍの酸化セリウムを砥粒（研磨材）として使用し、この砥粒を水に分散させてスラリー状にしたものを使用することが好ましい。水と砥粒との混合比率は、１：９〜３：７程度である。
【００４１】
＜研磨後の洗浄工程＞
研磨工程後に、石英ガラス基板の洗浄工程を採用することが好ましい。洗浄方法としては特に限定されず、研磨工程後の石英ガラス基板の表面を清浄に洗浄できる方法であればいずれの洗浄方法でもよい。洗浄された石英ガラス基板は、必要に応じて超音波による洗浄および乾燥工程を行う。乾燥工程は、石英ガラス基板の表面に残る洗浄液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）等により除去した後、石英ガラス基板の表面を乾燥させる工程である。たとえば、スクラブ洗浄後の石英ガラス基板に水リンス洗浄工程を２分間行ない、洗浄液の残渣を除去する。次いで、ＩＰＡ洗浄工程を２分間行い、石英ガラス基板の表面に残る水をＩＰＡにより除去する。最後に、ＩＰＡ蒸気乾燥工程を２分間行い、石英ガラス基板の表面に付着している液状のＩＰＡをＩＰＡ蒸気により除去しつつ乾燥させる。石英ガラス基板の乾燥工程としては特に限定されず、たとえばスピン乾燥、エアーナイフ乾燥などの、石英ガラス基板の乾燥方法として公知の乾燥方法を採用することができる。
【００４２】
（細胞含有物の作製方法）
本実施形態の細胞含有物の作製方法は、細胞培養基材における凹凸構造に、細胞を適用して培養する工程を有する。細胞を凹凸構造に適用することによって、細胞培養が高活性化し、かつ、基材への接着性に優れた、細胞組織や生体組織などの細胞含有物を作製することができる。
【００４３】
細胞含有物の作製方法において、ポリスチレンからなる細胞培養基材を用いて細胞を培養し、細胞の密度がポリスチレンからなる細胞培養基材の培養面の９０％となる培養時間を１Ｔとした場合に、本実施形態の細胞培養基材を用いて１／２Ｔ〜２／３Ｔの培養時間で細胞を培養することが好ましい。例えば、ポリスチレンからなる細胞培養基材の培養面の９０％となる培養時間が２４時間である場合に対し、本実施形態の細胞培養基材を用いることによって、１２〜１６時間というより短い培養時間でも、細胞の密度が本実施形態の細胞培養基材の培養面の９０％になるまで、細胞培養することができる。
【００４４】
（再利用用細胞培養基材の作製方法）
本実施形態は、細胞培養基材をオートクレーブ処理し、再利用用の細胞培養基材を作製する方法を提供することができる。従来のポリスチレンディッシュでは、ガンマ線で滅菌処理を行うことが可能であった。しかし、ガンマ線滅菌装置は放射線の管理など大規模な設備となるため、細胞培養に用いられたポリスチレンディッシュは使用後に廃棄されることが多かった。これに対し、本実施形態の細胞培養基材は、無機材料で基板が構成されているため、オートクレーブ処理で滅菌処理することができる。このため、例えば実験室において使用直後の細胞培養基材をすぐに滅菌処理し、再利用用の細胞培養基材を作製することが可能となる。
【００４５】
オートクレーブ処理の条件は、細胞培養基材に用いる材料によって異なるが、例えば石英ガラス（シリカ）基板を用いる場合には、温度１００〜１５０℃、圧力０．１０ＭＰａ〜０．５ＭＰａ、加熱時間１〜３０分間で、好ましくは、温度１２１℃で飽和水蒸気圧０．２０ＭＰａで２０分間のオートクレーブ処理をする。
【００４６】
当該作製方法においては、オートクレーブ処理後の細胞培養基材上のタンパク質を除去することが好ましい。メンテナンス液を繰り返し用いて処理することによって、細胞培養基材上の残留物質であるタンパク質をより除去しやすくなる。
【００４７】
（メンテナンス液）
本実施形態の細胞培養基材のメンテナンス液は、細胞培養基材上の残留物質である細胞が分泌した細胞接着性タンパク質や細胞外マトリクス（例えばフィブリノーゲン）を除去するために用いられ、タンパク質を分解する成分を含有する。メンテナンス液としては、例えば、エタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞培養液（αＭＥＭ）を含むＦＢＳ／αＭＥＭ培地、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を用いて弱く結合したタンパク質等を除去することができる。次いで、超純水：アンモニア水：過酸化水素水の重量比が５：１：１である溶液または１Ｎの塩酸等を用いて強く結合したタンパク質等を分解・除去できる。最後に、超純水によって繰り返しリンスし清浄な表面を得ることができる。
【００４８】
（細胞観察方法）
本実施形態の細胞観察方法は、細胞培養基材上の細胞を光学的に観察する方法である。従来のポリスチレンディッシュは光を反射するため、光学的に観察することが困難であった。特に、波長２００〜４００ｎｍの紫外光を入射した場合、ポリスチレンから蛍光が発せられるため、紫外光下での観察には不向きであった。これに対し、本実施形態の細胞培養基材は、ポリスチレンのような紫外光吸収性の材料を用いておらず、また透明性に優れ、可視光透過性にも優れることから、細胞培養基材上の細胞を例えば光学顕微鏡で観察することが容易となる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の具体的な実施例について説明する。なお、本発明は当該実施例によって限定的に解釈されるものではない。
【００５０】
（実施例１）
シリカからなる石英ガラス基板の両表面を、両面研削機（浜井産業株式会社製、４ウェイ方式ラップ盤）を用いて研削加工した。研削加工には、砥粒に平成サンケイ株式会社製、ジルコニア系アルミナ（ＡＺ）微粉を用い、荷重は６０〜９０ｇ／ｃｍ２、定盤回転数を２０〜５０ｒｐｍにて実施した。研削後の石英ガラス基板の両表面を、両面研磨機（浜井産業株式会社製、４ウェイ方式  ポリッシュ盤）を用いて研磨加工した。研磨加工には、研磨用パットに発泡ウレタンパットを用い、砥粒に三井金属鉱業株式会社製、ＭＩＲＥＫ  Ｅを用い、荷重は６０〜１００ｇ／ｃｍ２、定盤回転数を２０〜５０ｒｐｍにて実施した。これにより、シリカ基板からなる細胞培養基材を作製した。
【００５１】
（実施例２）
（シリカ基板を多孔性シリカ膜で被覆した細胞培養基材の作製法）
５２４ｍｇのヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）を、１．４ｍｌの水に添加し、分散するまで攪拌して、溶液Ａを得た。次に、１．９４ｍｌのテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）に、０．４７２ｍｌの水、及び０．１ｍｌの０．１Ｎ−ＨＣｌを添加し、３０℃で６０分攪拌して、溶液Ｂを得た。溶液Ａ及び溶液Ｂを、ＴＭＯＳ／ＣＴＡＣがモル比で８となるように混合し、さらに０．１ｍｌの１Ｎ−ＨＣｌを添加して混合液Ｃを得た。混合液Ｃを室温（２０℃）で１５分攪拌後、培養面に凹凸形状を有する実施例１のシリカ基板（１２．５ｍｍ×２５ｍｍ）に対して、６０００ｒｐｍ、１０秒の条件でスピンコートを行った。混合液Ｃが塗布されたシリカ基板を６０℃で１８時間加熱し、ＣＴＡＣ／ＴＭＯＳ複合膜を形成した。さらに、当該複合膜が形成されたシリカ基板を４５０℃で６時間焼成した。これにより、シリカ基板が多孔性シリカ膜で被覆された細胞培養基材を作製した。多孔性シリカ膜の膜厚は１５０ｎｍであった。
膜厚の測定方法としては、耐薬品性のポリイミドテープ（登録商標名：カプトン）を予め基板表面上の一部へ貼り、成膜後の焼成処理前段階においてポリイミドテープを剥がし、焼成によって部分的に成膜された基材を得た。膜の無い領域（テープを貼りつけた箇所）と、膜の有る領域（貼り付けていない箇所）との境界領域を、触針式表面形状測定器（アルバック株式会社製、ＤＥＫＴＡＣＫ３ＳＴ）によって、ダイヤモンド探針により試料面を走査し、測定距離：１００μｍ、走査速度：５０ｓ、データ点数：８０００点、触針圧：３ｍｇの条件によって、高さプロファイルを得て、５箇所の値を平均し、膜厚を算出した。
【００５２】
（実施例３）
（シリカ基板がリン酸カルシウムで被覆された細胞培養基材の作製法）
１０００ｍｌのビーカに、７００ｍｌの水を入れ、次に、１１．９８５０ｇのＮａＣｌ、０．５２５ｇのＮａＨＣＯ３、０．３３６ｇのＫＣｌ、０．３４２ｇのＫ２ＨＰＯ４／３Ｈ２Ｏ、０．４５７５ｇのＭｇＣｌ／６Ｈ２Ｏ、５７ｍｌの１Ｎ−ＨＣｌ、０．４１７ｇのＣａＣｌ２、０．１０６５ｇのＮａ２ＳＯ４、９．０８５５ｇのＮａ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３を添加し、３６．５℃で攪拌した（攪拌は、シリカ基板を浸漬するまで行った）。次に、ビーカ内の溶液のｐＨ測定を行い、ｐＨが７．４になるまでＨＣｌを投入した。その後、当該溶液を１０００ｍｌのメスフラスコへ移し、アパタイト被覆液（１．５ＳＢＦ）を得た。３６．５℃の１．５ＳＢＦ（２ｍｌ）に実施例１のシリカ基板（１２．５ｍｍ×２５ｍｍ）を浸漬し、３５時間静置した。その後、シリカ基板を超純水により洗浄し、５５０℃で３時間焼成した。これにより、シリカ基板がリン酸カルシウム膜で被覆された細胞培養基材を作製した。リン酸カルシウム膜の膜厚は４０ｎｍであった。
膜厚の測定方法としては、実施例２と同様に、耐薬品性のポリイミドテープ（登録商標名：カプトン）を予め基板表面上の一部へ貼り、成膜後の焼成処理前段階においてポリイミドテープを剥がし、焼成によって部分的に成膜された基材を得た。膜の無い領域（テープを貼りつけた箇所）と、膜の有る領域（貼り付けていない箇所）との境界領域を、原子間力顕微鏡（エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製、プローブステーション名ＮａｎｏＮａｖｉ  ＩＩｓ／ユニット名Ｎａｎｏｃｕｔｅ）により計測した。具体的には、窒化シリコン製の探針がマウントされたカンチレバー（型番：Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ  ＳＩ−ＤＦ４０、バネ定数：２６Ｎ／ｍ、共振周波数：２９４Ｈｚ）によって、測定モード：ダイナミック・フォース・モード、走査範囲：１０μｍ×１０μｍ、走査周波数：１．００Ｈｚ、Ｘ方向データ点数：２５６点、Ｙ方向データ点数：２５６点とし、各点の高さを画像化した。高さとは、各測定点と測定点のうち最低高さとの差分とした。任意の画像断面の高さプロファイル５箇所の値を平均して膜厚を算出した。
【００５３】
上述のＳＢＦは、ヒトの血漿中の無機イオン濃度を人工的に再現した擬似体液であり、当該１．５ＳＢＦのイオン濃度（ｍＭ）は、Ｎａ＋：２１３．０、Ｋ＋：７．５、Ｍｇ２＋：２．２５、Ｃａ２＋：３．７５、Ｃｌ−：２２２．０、ＨＣＯ３−：６．３、ＨＰＯ４２−：１．５、ＳＯ４２−：０．７５、であった。
【００５４】
（比較例１〜２）
市販のホウ素含有シリケートガラス基板（松浪硝子工業株式会社製）からなる細胞培養基材を比較例１、ポリスチレンディッシュ（米国コーニングインターナショナル株式会社製）からなる細胞培養基材を比較例２とした。
【００５５】
（基板表面の原子組成分析）
実施例１〜３及び比較例１〜２の基材について、表面の原子組成を蛍光Ｘ線分析により測定した。また、可視光（４００〜８００ｎｍ）の平均透過率を測定した。日本分光株式会社製の紫外可視分光光度計Ｖ−７５０により、波長４００〜８００ｎｍにおける光の透過率を波長１ｎｍごとに測定した。ベースラインは空気とし、基材と膜へ入射した光強度のうち、透過した光強度の割合を透過率とした。各波長における透過率を全て平均し、可視光領域における平均透過率を算出した。測定結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2017205082.tif 000004
【００５７】
（Ｘ線回折パターン測定）
実施例１〜３及び比較例１〜２の基材について、Ｘ線回折パターンを測定した。測定結果を図２に示す。図２（Ａ）は、低角領域におけるＸ線回折パターンであり、図２（Ｂ）は、高角領域におけるＸ線回折パターンである。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）において、（ａ）〜（ｃ）は順に実施例１〜３を示し、（ｄ）〜（ｅ）は順に比較例１〜２を示している。図２（Ａ）のとおり、低角領域の測定では、（ｂ）のパターンだけに高強度のピークが見られた。この測定結果は、実施例２のシリカ基板を被覆するシリカ膜が規則ナノスケールの細孔構造であることを示すものである。また、図２（Ｂ）の高角領域の測定では、（ｃ）のパターンだけにピークが見られた。この測定結果は、実施例３のシリカ基板を被覆するリン酸カルシウム膜のＣａとＰを示すものである。
【００５８】
（凹凸構造の観察）
実施例１〜３及び比較例１〜２の基材について、培養面の超微細な凹凸構造を原子間力顕微鏡で観察した。図３は原子間力顕微鏡像であり、（ａ）〜（ｃ）は順に実施例１〜３を示し、（ｄ）〜（ｅ）は順に比較例１〜２を示している。また、図３（ａ）〜（ｅ）の画像は測定範囲が１μｍ２であり、各画像の右側には後述する輪郭曲線における高さを記載している。
【００５９】
図３（ａ）は、実施例１の基材の表面に複数の凹凸構造である直線状の溝構造が平行に形成されていることを示しており、Ｒｒｍｓ値は０．３８ｎｍであった。また、図３（ｂ）は、実施例２の基材表面に鱗状の凹凸構造が形成されており、Ｒｒｍｓ値は１．４３ｎｍであった。図３（ｃ）は、実施例３の基材表面に直線状の溝を伴う鱗状の凹凸構造が形成されており、Ｒｒｍｓ値は１．２１ｎｍであった。一方、比較例１の基材表面は不定形な形状であり、Ｒｒｍｓ値は２．１８ｎｍであった（図３（ｄ））。比較例２の基材表面には、ランダムな繊維状の組織が観察され、Ｒｒｍｓ値は１．８７ｎｍであった（図３（ｅ））
【００６０】
また、実施例１〜３及び比較例１〜２の基材について、表面形状を測定した。具体的には、ＪＩＳＢ０６０１（２０１３）、ＪＩＳＲ１６８３（２０１４）に準拠し、原子間力顕微鏡（プローブステーション名：ＮａｎｏＮａｖｉ  ＩＩｓ／ユニット名：Ｎａｎｏｃｕｔｅ、エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製）を用い、窒化シリコン製の探針がマウントされたカンチレバー（型番：Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ  ＳＩ−ＤＦ４０、バネ定数：２６Ｎ／ｍ、共振周波数：２９４Ｈｚ）を使用した。
測定条件は以下のとおりである。
測定モード：ダイナミック・フォース・モード
走査範囲：１μｍ×１μｍ
走査周波数：１．００Ｈｚ
Ｘ方向データ点数：２５６点、
Ｙ方向データ点数：２５６点、
ローパスフィルター値：１ｎｍ
ハイパスフィルター値：１５０ｎｍ。
【００６１】
原子間力顕微鏡による測定により得られた輪郭曲線を解析ソフトウェア（製品名：ＮａｎｏＮａｖｉ  ＩＩ／ＩＩｓ、エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製）で分析し、凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均、ウォーターシェッド法高さ、アスペクト比を算出した（表２参照）。なお、平均線は、前記ハイパス用輪郭曲線フィルタにより遮断される長波長成分を表す曲線を最小二乗法により直線に補正したとき、その直線と平行かつ、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布５０％を示す線とした。
ウォーターシェッド法高さは、輪郭曲線における高さの累積相対度数分布１００％を示す上端線と高さの累積相対度数分布０％を示す下端線とを反転させて水平補正した状態で、ウォーターシェッド法により計測した輪郭曲線における反転後の谷の最下点と下端線との距離を平均することによって算出した。ウォーターシェッド法による計測は、Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｓｏｉｌｌｅのアルゴリズム（Ｌ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｐ．  Ｓｏｌｌｅ  “Ｗａｔｅｒｓｈｅｄｓ  ｉｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｐａｃｅｓ：  Ａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，  １３（６），  ５８３  （１９９１）．）を適用したプログラムによって自動処理された。
アスペクト比は、Ｘ方向についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ１と、Ｘ方向と直交するＹ方向についての凹凸構造の輪郭曲線要素の長さの平均Ｗ２とを算出し、周期Ｗ１、周期Ｗ２のうち、大きい方の値を小さい方の値で除した値を平均することによって算出した。
【００６２】
【表２】
2017205082.tif 000005
【００６３】
（タンパク質吸着量の測定）
インキュベーター内（５％−ＣＯ２，３７℃）で、実施例１〜３及び比較例１〜２の基材に対しタンパク質の吸着を１時間行った。取り出し後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｗｔ％−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を２ｍｌ加えて、振盪機（１００ｒｐｍ）上で１時間、基材上へ吸着したタンパク質を取り除いた。取り除いた溶液を用い、比色定量法によってタンパク質吸着量測定を行った。具体的には、試薬「Ｑｕａｎｔｉ  Ｐｒｏ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＡ」と試薬「Ｑｕａｎｔｉ  Ｐｒｏ  ＢＣＡ  ＱＢ  Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を取り除いた溶液に加え、インキュベーター内で２４時間放置を行った。その後、ＵＶスペクトル測定より吸光度を測定し、吸着量を導いた。
【００６４】
比色定量法（ＢＣＡ法）は、２段階の反応を用いており、まず、タンパク質のペプチド結合により、Ｃｕ２＋イオンが還元されＣｕ＋となる。次に、以下に構造式を示すように２分子のビシンコニン酸（ＢＣＡ）がＣｕ＋イオンをキレート配位した、紫色の産物（Ｃｕ（Ｉ）（ＢＣＡ）２錯体）が生じる。紫色の発色強度は、タンパク質濃度に依存している。そのため、５６２ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を定量することができる。
【００６５】
【化１】
2017205082.tif 000006
【００６６】
タンパク質吸着量の測定結果を図４に示す。図４のとおり、アルブミンの吸着量は実施例１〜３よりも比較例１〜２の基材で多いのに対し、フィブリノーゲンの吸着量は実施例１〜３の方が比較例１〜２の基材よりも多い結果となった。このように、実施例１〜３の基材において吸着量が高いフィブリノーゲンは細胞接着性タンパク質であることから、細胞接着性に優れている。一方、比較例１〜２の基材において吸着量が高いアルブミンは細胞接着阻害性タンパク質であることから、細胞接着性に劣っている。
【００６７】
（細胞の生細胞率、接着面積の評価）
実施例１〜３及び比較例１〜２の基材について、滅菌及び洗浄を行った。具体的には、５０体積％、７０体積％及び９０体積％のエタノールを各３回、ＰＢＳを３回、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞培養液（αＭＥＭ）を含む１０体積％のＦＢＳ／αＭＥＭ培地を３回使用して、滅菌及び洗浄を行った。
【００６８】
骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を１０体積％のＦＢＳ／αＭＥＭ培地で１週間培養した。培養条件は、３７℃、ＣＯ２濃度５％、相対湿度９９％とした。培養後、ＰＢＳ、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＰＢＳで基材を洗浄し、基材に接着していない細胞を洗い流した。洗浄後、１０体積％のＦＢＳ／αＭＥＭ培地を添加した。
【００６９】
培養した細胞密度が５０００細胞／ｃｍ２の骨芽細胞様細胞を、実施例１〜３及び比較例１〜２の基材に播種した。培養条件は、３７℃、ＣＯ２濃度５％、相対湿度９９％とし、５時間、２２時間、５５時間及び７２時間後のそれぞれの生細胞率、細胞面積（細胞接着面積）を測定した。生細胞率は、ＭＴＴアッセイ法により測定した。ＭＴＴアッセイ法とは、細胞内に取り込まれたＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチル-チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕が細胞内のミトコンドリアの脱水素酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）によって還元され生じるフォルマザン色素を、ジメチルスルホキシドにより抽出する。そのフォルマザン色素溶液の波長５７０ｎｍの吸光度を比色定量し、生細胞率を計測する方法である。吸光度は、日本分光株式会社製の紫外可視分光光度計Ｖ−７５０により、バックグラウンドを１０体積％のＦＢＳ／αＭＥＭ培地とし、各培養時間における波長５７０ｎｍの吸光度を測定した。ここで、生細胞率（％）とは、本実施例および比較例のＭＴＴアッセイ法における最高の吸光度を１００％とし、各培養時間の吸光度の相対割合を％で表したものである。また、細胞面積とは、培養面に接着している細胞１個の面積であり、各培養時間において、オリンパス株式会社製の倒立型ルーチン顕微鏡ＣＫＸ４１によって画像化した細胞１００個についての面積を平均した値である。
【００７０】
図５は、実施例１〜３及び比較例１〜２の基材における、細胞の培養時間と細胞の生細胞率との関係を示すグラフである。図５に示すとおり、細胞培養時間が経過していくと、細胞が増殖し生細胞率が向上する傾向を示した。実施例１〜３については、細胞の培養時間が７２時間の場合に生細胞率が４０％を超えており、長時間の培養においても細胞の生存性が高いことを示した。この中でも、リン酸カルシウム膜で被覆された凹凸構造を備える実施例３は、細胞の培養時間が７２時間の場合に生細胞率が１００％に近い値を示した。また、比較例１は、培養面にＢ２Ｏ３を含む点でも、生細胞率が低くなりやすかったと考えられる。
【００７１】
図６は、実施例１〜３及び比較例１〜２の基材における、細胞の培養時間と細胞面積との関係を示すグラフである。図６に示すとおり、実施例１〜３及び比較例１については、培養時間が２２時間の時に細胞面積が最も大きくなる傾向を示した。一方、培養時間が５５時間、７２時間になると、細胞面積は減少する傾向を示した。これは細胞が増殖しすぎると細胞同士の間隔が詰まり、細胞が小さくなるためと考えられた。実施例１〜３については、細胞の培養時間が２２時間の場合に細胞面積が２０００μｍ２を超えており、細胞接着性に優れることを示した。この中でも、リン酸カルシウム膜で被覆された凹凸構造を備える実施例３は、細胞の培養時間が２２時間の場合に細胞面積が３０００μｍ２を超える高い値を示した。
【符号の説明】
【００７２】
Ｍ・・・凹凸構造の輪郭曲線
ＴＡ・・・高さの累積相対度数分布５０％を示す平均線
Ｐ１・・・第１の山
Ｐ２・・・第２の山
Ｑ・・・谷
Ａ・・・第１の山Ｐ１の起点
Ｂ・・・谷Ｑの終点
【図１】
2017205082.tif 000007
【図２】
2017205082.tif 000008
【図３】
2017205082.tif 000009
【図４】
2017205082.tif 000010
【図５】
2017205082.tif 000011
【図６】
2017205082.tif 000012