(57)【要約】【課題】増殖速度の早い細胞が混入した組織において、増殖速度の早い細胞の増殖能を抑制しつつ、癌細胞の培養に有利な培養環境を提供することにより、初代癌細胞由来の細胞を主要成分として含むスフェロイドが得られる、スフェロイド作製方法を提供すること。【解決手段】初代癌細胞のスフェロイド作製方法であって、全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む培地を用意する工程と、細胞との接着性を抑制する処理を施した細胞培養基材を用意する工程と、癌細胞を含む組織片から細胞を分取する工程と、前記培地中、前記細胞培養基材上に細胞を播種し、前記細胞を培養する工程と、を含むことを特徴とする初代癌細胞のスフェロイド作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代癌細胞のスフェロイド作製方法であって、
全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む培地を用意する工程と、
細胞との接着性を抑制する処理を施した細胞培養基材を用意する工程と、
癌細胞を含む組織片から細胞を分取する工程と、
前記培地中、前記細胞培養基材上に細胞を播種し、前記細胞を培養する工程と、を含むことを特徴とする初代癌細胞のスフェロイド作製方法。
【請求項２】
前記培地が、インスリンを含む、請求項１に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項３】
前記インスリンの濃度が、培地中１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである、請求項２に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項４】
前記培地が、ヒドロコルチゾン及び上皮成長因子から選ばれる１種以上をさらに含む、請求項１〜３いずれか１項に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項５】
前記培地が、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタミンから選ばれる１種以上をさらに含む、請求項１〜４いずれか１項に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項６】
前記培地が、エタノールアミン、トリヨードサイロニン、ＢＳＡ、及びフォスフォリルエタノールアミンから選ばれる１種以上をさらに含む、請求項１〜５いずれか１項に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項７】
前記細胞培養基材が、凸部上面が細胞接着面として機能する所定の凹凸構造を有する、請求項１〜６いずれか１項に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項８】
前記凹凸構造の凸部上面がピラー状、ドット状、ライン状、複数の連続したまたは連続しない多角形のパターン構造を有する、請求項７に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項９】
前記多角形のパターン構造間の幅が２０μｍ以下である、請求項８に記載のスフェロイド作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか１項に記載のスフェロイド作製方法により得たことを特徴とする、スフェロイド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のスフェロイドを得る工程と、
前記スフェロイドに対して薬剤を投与する工程と、を含むことを特徴とする
薬物スクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のスフェロイドを得る工程と、
前記スフェロイドに対して薬剤を投与し、薬剤による反応を観察する工程と、を含むことを特徴とする診断方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のスフェロイドを得る工程と、
前記スフェロイドに対して薬剤を投与し、薬剤による反応を観察する工程と、
がん細胞を含む組織片から分取した細胞の遺伝子配列を分析する工程と、
薬剤による反応と遺伝子配列分析結果を照合する工程とを含むことを特徴とする診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初代癌細胞のスフェロイド作製方法、スフェロイド、スクリーニング方法、及び、診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、創薬や再生医学に関わる研究開発の発展に伴い、生体組織の機能をより正しく理解するための研究の動きが急速に高まっている。生体組織機能の理解には、その組織を構成する細胞の性質を理解することが重要である。細胞レベルでの研究の手段としては、株化されている細胞を用いる系と、組織から目的とする細胞を直接取り出して培養する初代培養系がある。初代培養系では、個体から取り出した細胞を用いていることから、細胞そのものの形質および機能や細胞集団の構成が、生体内の状態を比較的良く反映していると考えられ、生体内で起きている現象の解明に非常に大きな意義を持つ。
【０００３】
初代培養系においては、増殖速度の速い細胞の混入・増殖をいかに抑えるかが、有用な研究結果を得る鍵となっている。例えば、混入した線維芽細胞の抑制方法として、培地中のアミノ酸を変更する方法、無血清・低カルシウム濃度を特徴とする培地を用いる方法、酵素に対する感受性の差を利用する方法、比重の違いを利用する方法、フィーダー細胞を用いる方法等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２２３６６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】（株）東京化学同人、「新生化学実験講座１８    細胞培養技術」，ｐ１１５−２１７，１９９０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、増殖速度の早い細胞が混入した組織において、増殖速度の早い細胞の増殖能を抑制しつつ、癌細胞の培養に有利な培養環境を提供することにより、初代癌細胞由来の細胞を主要成分として含むスフェロイドが得られる、スフェロイド作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、下記の手段により解決された。
＜１＞初代癌細胞のスフェロイド作製方法であって、全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む培地を用意する工程と、細胞との接着性を抑制する処理を施した細胞培養基材を用意する工程と、癌細胞を含む組織片から細胞を分取する工程と、前記培地中、前記細胞培養基材上に細胞を播種し、前記細胞を培養する工程と、を含むことを特徴とする初代癌細胞のスフェロイド作製方法。
＜２＞上記＜１＞のスフェロイド作製方法により得たことを特徴とする、スフェロイド。
＜３＞上記＜２＞のスフェロイドを得る工程と、前記スフェロイドに対して薬剤を投与する工程と、を含むことを特徴とする薬物スクリーニング方法。
＜４＞上記＜２＞のスフェロイドを得る工程と、前記スフェロイドに対して薬剤を投与し、薬剤による反応を観察する工程と、を含むことを特徴とする診断方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、増殖速度の早い細胞が混入した組織において、増殖速度の早い細胞の増殖能を抑制しつつ、癌細胞の培養に有利な培養環境を提供することにより、初代癌細胞由来の細胞を主要成分として含むスフェロイドが得られる、スフェロイド作製方法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ゲフェチニブに対する感受性を示す図である。
【図２】初代肺がん細胞の抗がん剤感受性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法＞
本発明の初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法は、初代癌細胞のスフェロイド作製方法であって、全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む培地を用意する工程と、細胞との接着性を抑制する処理を施した細胞培養基材を用意する工程と、癌細胞を含む組織片から細胞を分取する工程と、前記培地中、前記細胞培養基材上に細胞を播種し、前記細胞を培養する工程と、を含むことを特徴とする。
以下、各工程について説明する。なお、本発明において数値範囲等の範囲を表すａ〜ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂの数値をその範囲内に含む。また、本明細書では、本発明におけるスフェロイドとは、三次元的に細胞同士が集合・凝集化した細胞の集合体を意味する。
【００１１】
（培地準備工程）
本発明の初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法は、全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む培地を用意する工程を含む。
【００１２】
培地としては、任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ１２、ＭＣＤＢ培地等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの培地に血清や各種増殖因子、分化誘導因子を添加してもよい。
【００１３】
また、培地は、全体積中少なくとも１体積％以上の血清を含む。通常であれば、初代癌細胞を培養する場合には、間質系細胞の増殖を抑制するため低血清又は無血清培地が用いられるが、本発明においては血清を含むものを用いる。前記血清の濃度は、培地を１００体積％として１〜２０体積％であることが好ましく、３〜１５体積％であることがより好ましく、５〜１０体積％であることがさらに好ましい。
【００１４】
培地は、インスリンを含むものが好ましい。インスリンを含むことで、タンパク質合成を促進し細胞の増殖を促す。前記インスリンの濃度は、１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであることが好ましく、５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
【００１５】
前記培地は、さらにヒドロコルチゾン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）から選ばれる１種以上を含むことが好ましい。各成分の濃度は、１〜５０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜１００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、１０〜２０ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
【００１６】
前記培地は、さらにトランスフェリン、セレン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタミンから選ばれる１種以上を含むことが好ましい。トランスフェリンの濃度は、１〜１００μｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜５０μｇ／ｍＬであることがより好ましく、５〜２０μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。セレン酸ナトリウムの濃度は、１〜１００ｎＭであることが好ましく、１０〜１００ｎＭであることがより好ましく、３０〜８０ｎＭであることがさらに好ましい。ピルビン酸ナトリウムの濃度は、０．０１〜１００ｍＭであることが好ましく、０．１〜１０ｍＭであることがより好ましく、１〜５ｍＭであることがさらに好ましい。グルタミンの濃度は、０．０１〜１００ｍＭであることが好ましく、０．１〜１０ｍＭであることがより好ましく、１〜５ｍＭであることがさらに好ましい。
【００１７】
前記培地は、さらにエタノールアミン、トリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｕｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ＢＳＡ、及びフォスフォリルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）から選ばれる１種以上を含むことが好ましい。エタノールアミンの濃度は、１〜１００μＭであることが好ましく、１０〜１００μＭであることがより好ましく、３０〜５０μＭであることがさらに好ましい。トリヨードサイロニンの濃度は、１〜１００μＭであることが好ましく、５〜１００μＭであることがより好ましく、５〜２０μＭであることがさらに好ましい。ＢＳＡの濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜１０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、２〜５ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。フォスフォリルエタノールアミンの濃度は、１〜１００μＭであることが好ましく、５〜１００μＭであることがより好ましく、５〜２０μＭであることがさらに好ましい。
【００１８】
（細胞培養基材準備工程）
本発明の初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法は、細胞との接着性を抑制する処理を施した細胞培養基材を用意する工程を含む。
本発明における細胞培養基材は、細胞との接着性を抑制する処理を施したものである。細胞との接着の抑制は、（１）凸部上面が細胞接着面として機能する所定の凹凸構造、（２）高度な親水処理、（３）高度な疎水処理によって行うことを特徴とする。なお、凸部は、細胞が平面上に接着するのを阻害するために構成されている。
凸部上面が細胞接着面として機能する凹凸構造面は、培養する細胞の性質に応じて、ピラー状、ドット状、ライン状（ラインアンドスペース）、ホール状、複数の連続したまたは連続しない多角形のパターン構造等、種々の形状（なお、この形状は細胞培養基材を上方から見たときの形状をいう）とすることができるが、好ましくは、所定の平面形状からなる多角形を規則的に複数配列した構造の方が良い。例えば、平面形状が多角形である多角形を複数連続した構造とすることができる。この時、等方的に均一な構造上で目的細胞を成長させることができるという点で、正三角形、正方形、正六角形等の正多角形や、円形のものがより好ましい。また、ピラー状やホール状の凹凸構造と多角形状の凹凸構造とを組み合わせることも可能である。
【００１９】
上記多角形のパターン構造間の幅は、細胞を単層状ではなく三次元的に成長させたり（スフェロイド培養）、分化させたりし、より生体内に近い状態で培養するという観点からは、２０μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、３μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下というように、小さくなるほど好ましい。この理由としては、多角形間の幅が小さくなるほど、凹凸構造面に接着した細胞は、多くの仮足を成長させながらスフェロイドを形成させることができると考えられるためである。
【００２０】
また、多角形構造の深さは、培養する細胞の性質に応じて、１ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、１μｍ以上、１０μｍ以上、１００μｍ以上等種々の大きさに形成される。
【００２１】
また、この凹凸のアスペクト比としては、０．２以上、０．５以上、１以上、２以上等種々のものがある。
【００２２】
また、多角形の最小内径（好ましくは最大内径）は、３μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下というように、小さくなるほど、上述同様の理由により好ましい。ここで、内径とは、多角形に外接する２本の平行線間の距離を意味し、最小内径とは、多角形に外接する二本の平行線間の距離のうち最も短いものを言い、最大内径とは、多角形に外接する二本の平行線間の距離のうち最も長いものを言う。例えば、多角形が正六角形の場合には、対向する平行な辺と辺との間の距離が最小内径となり、対向する頂点間の距離が最大内径となる。また、多角形が長方形の場合には、短辺の長さが最小内径となり、対角線の長さが最大内径となる。
【００２３】
細胞接着の抑制を行う高度な親水処理とは、細胞を培養できるものであればどのような処理でも良いが、親水性の化合物をコーティングすることによって行い、例えば、Ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡコート、Ｈｙｄｒｏｇｅｌコート、Ｐｏｌｙ−ＰＥＧコート、リン脂質コートによって行われる。
【００２４】
細胞接着の抑制を行う高度な疎水処理とは、細胞を培養できるものであればどのような処理でも良いが、疎水性の化合物をコーティングすることによって行い、例えば、フッ素コートによって行われる。
【００２５】
本発明方法における細胞培養基材の形状は、細胞を培養できるものであればどのように形成しても良いが、例えば、フィルム状や基板状（プレート状）に形成でき、シャーレ、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、チェンバースライド等に用いることができる。また、凹凸構造は、基材上の少なくとも一部に形成されていればよい。
【００２６】
また、細胞培養基材の材質は、細胞に対し無毒性のものであればどのようなものでも良く、例えば、「ポリスチレン」、「ポリエチレン」、「ポリプロピレン」、「ポリイミド」、「ポリ乳酸やポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン等の生分解性ポリマー」、「環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）や環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）等の環状オレフィン系熱可塑性樹脂」、「アクリル樹脂」、「光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂等のその他の樹脂」、「酸化アルミニウム等の金属」、「ガラス」、「石英ガラス」、「シリコン」等を用いることができる。また、シリコンやガラス等からなる基板本体の表面に、「樹脂」、「フォトレジスト」、「酸化アルミニウム等の金属」等の被覆層が形成されたものを用いることもできる。
【００２７】
細胞は、親水性表面に接着し易く、疎水性表面には接着し難いことが知られているため、本発明方法における細胞培養基材の凹凸構造は、極性の調節により親水性の制御がなされているものであってもよい。調節方法としては、下記に示す方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
例えば、紫外線、電子線、ガンマ線、プラズマ等の照射による表面改質技術により、培養基材表面に例えば−Ｏや−ＯＨ基といった官能基を持たせ、極性を調節することができる。これにより、細胞が接着する凹凸構造面の極性を上げることができる。
【００２９】
また、極性を上げる物質または極性を下げる物質を用いることにより調節することもできる。極性を上げる物質としては、例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、ポリリジンの他、細胞外マトリックス成分等を用いることができ、細胞外マトリックスとしては、各種コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン等が挙げられる。極性を下げる物質としては、フッ素、シリコン、ポリヘマ（ｐｏｌｙ２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、アガー等を用いることができる。これらの物質を基材材料として用いること、また、凹凸構造面上に被覆させることにより、極性の調節が可能となる。
【００３０】
なお、本発明における細胞培養基材の凹凸構造面上は、播種する細胞種に応じて、平面形状、セル間の幅、培養基材の材質、極性等を適宜調節して行うのが良い。これにより、目的に応じたスフェロイドを取得することが可能となる。
【００３１】
細胞培養基材の製造方法は、凹凸構造を形成し得る方法であればいかなる方法でもよく、例えば、ナノインプリント技術、溶液キャスト法、エッチング、ブラスト、コロナ放電等を用いることができる。この時、より精密に形状等を制御できる点で、ナノインプリント技術による方法が好ましい。ナノインプリント技術による製法については、例えば、特開２０１０−２２３６６号公報を参照することができる。溶液キャスト法による製法については、例えば、特開２００８−２９６４８１号公報を参照することができる。
【００３２】
（癌細胞分取工程）
本発明の初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法は、癌細胞を含む組織片から細胞を分取する工程を含む。
【００３３】
本発明における癌細胞は、いかなるがん細胞であっても良いが、例えば、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、喉頭癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、肛門癌、その他各種癌細胞、各種幹細胞、各種前駆細胞、間葉系前駆細胞および、ＥＳ細胞、iPS細胞等が挙げられる。なお、細胞は単一の細胞に限らず、複数の細胞種の集合体であっても良い。
【００３４】
本発明方法における細胞としては、例えば、生体から摘出した組織片、細胞群を用いることができ、これらを必要に応じて酵素処理、密度勾配遠心処理、フィルター処理、磁気ビーズ、フローサイトメーター、その他なんらかの処理により分離精製したものであってもよい。なお、これらの細胞群は、同じ組織に由来し、分化段階の異なる細胞の集合体であってもよい。
【００３５】
（培養工程）
本発明の初代癌細胞を含むスフェロイド作製方法は、前記培地中、前記細胞培養基材上に細胞を播種し、前記細胞を培養する工程（培養工程）を含む。本発明における培養は、通常行われる操作と同様の培養手順により実施することができる。
【００３６】
（スフェロイド、薬物スクリーニング方法、診断方法）
このようにして本発明方法により得られたスフェロイドは、薬剤スクリーニング、食品機能性評価、薬品または食品の安全性評価、再生医療等に使用することができる。
本発明は、癌細胞と癌細胞以外の細胞が混在する場合に、癌細胞が増殖速度の速い細胞に駆逐されることなく、効率よくスフェロイドを形成することにより、簡便かつ安価に生体内組織に近い環境を作出することを可能とするため、再生医療、創薬のスクリーニング、細胞工学、組織工学などの医療・バイオテクノロジーに関わる広範な技術に使用できる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜検体入手及び前処理＞
病院において同意を得られた患者より摘出した肺がん組織の一部について、摘出後速やかに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加したチューブに移し、氷上にて保管した。分散処理に際しては、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を除去した後、組織洗浄液を添加・除去を３回繰り返して組織片を洗浄した後、組織の湿重量を測定した。
組織片を氷上の１０ｃｍシャーレにとり、組織洗浄液（０．５〜１ｍＬ）を添加してハサミで１ｍｍ角になるまでミンスした後、これを５０ｍＬのチューブに回収し、組織懸濁液とした。
前記組織懸濁液にコラゲナーゼ及びディスパーゼを添加した後、ウォーターバスで震盪させながら３７℃  ３０ｍｉｎで酵素処理を行った。酵素処理の反応液量は組織の湿重量３００ｍｇまでは５ｍＬ、３０１〜６００ｍｇは１０ｍＬとした。各酵素終濃度はコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）及びディスパーゼ（１０００ＰＵ／ｍＬ）とした。酵素反応後、一部を回収し、細胞・組織の分散性を確認した後、細胞数をカウントした。反応液の２倍量の組織洗浄液を加えて反応を弱め、１００μｍメッシュのセルストレーナーを通し、線維等の組織残渣を除去した。適量の組織洗浄液でチューブ及びセルストレーナーを洗いこみ、細胞を回収して３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心した。上清を除去した後、ペレットに組織洗浄液（１０ｍＬ）を加えて再懸濁し、３００ｘｇ、５ｍｉｎで遠心した。その後、１〜３ｍＬの組織洗浄液で再懸濁し、細胞数のカウントを行った。
【００３９】
（実施例１〜７、比較例１及び比較例２）
細胞播種及び培養
ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製の３次元培養プレートＮＣＰ−ＬＳ−９６（９６ｗｅｌｌ）に各種培養培地（１５０μＬ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温、７００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心した後、３７℃、１０ｍｉｎ静置してプレウェッティングした。カウントした細胞を１．５ｍＬチューブに必要量分取し、３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心して上清を除去した後、表１に示す組成の各種培養培地で２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製した。その１００μＬをプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件で培養を開始した。播種細胞数は、２×１０4ｃｅｌｌｓ／２５０μＬ／ｗｅｌｌであり、播種日をｄａｙ  ０とし、半量の培地交換をｄａｙ１、３及び５に実施した。
【００４０】
（培養後の生細胞数増加率（％）測定）
Ｄａｙ  ０又はＤａｙ  １における生細胞数に対するＤａｙ  ７での生細胞数増加率を求めた。生細胞増加率の算出はＡＴＰアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用）により行った。結果を表１に示す。
【００４１】
（細胞含有率（％，ＣＫ１９陽性率））
Ｄａｙ  １、７において、１．５ｍＬチューブに回収した細胞を３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心して上清を除去したペレットにＡｃｃｕｍａｘ（１００μＬ）を加え、３７℃で３０ｍｉｎ静置し、スフェロイドを分散させた。この細胞分散液に組織洗浄液を１ｍＬ加え、３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心した。上清を除去した後、ペレットに１０％中性緩衝ホルマリンを１００μＬ加えて１５ｍｉｎ静置し、細胞を固定した。固定後、組織洗浄液を１ｍＬ加え、３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心した。上清を除去後、組織洗浄液１ｍＬで再懸濁し、染色まで４℃で冷蔵保存した。３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心後、上清を除去し、ペレットに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＴＢＳ（５０μＬ）加え、１５ｍｉｎ静置した。その後、３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴを４５０μＬ加え、３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心した。上清を除去して５０μＬの３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで懸濁し、１ｈｒ静置し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで１００倍希釈したＣＫ１９抗体液を５０μＬ添加し、１次抗体を１ｈｒ反応させた。この際、抗体なしのネガティブコントロールも調製した。反応後、ＴＢＳＴ５００μＬを添加して３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心し、上清を除去したペレットに再度ＴＢＳＴ５００μＬ添加して３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心し、細胞を洗浄した。次に３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで１０００倍希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体液を５０μＬ添加し、２次抗体を１ｈｒ反応させた。反応後、３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ５００μＬ添加して３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心し、上清を除去したペレットに再度ＴＢＳＴ５００μＬ添加して３００ｘｇ、５ｍｉｎ遠心し、細胞を洗浄した。最後に３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで１μｇ／ｍＬに希釈したＤＡＰＩを１００μＬ添加した。
各サンプルを蛍光イメージング用のプレートに移し、ＣＫ１９および核染色の蛍光観察を行い、ＤＡＰＩ陽性細胞とＣＫ１９陽性細胞のカウントを行い、ＤＡＰＩ陽性細胞数に対するＣＫ１９陽性細胞数のカウントを行った。ＣＫ１９陽性細胞率を癌細胞含有率とした。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2017205021.tif 000002
【００４３】
（実施例８）
抗がん剤感受性試験
実施例５の培地（培養培地）で細胞懸濁液を調製し、ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製の３次元培養プレートＮＣＰ−ＬＳ−３８４（３８４ｗｅｌｌ）に３０００ｃｅｌｌｓ／８０μＬ／ｗｅｌｌの条件で播種した（ｄａｙ  ０）。ｄａｙ１に細胞を播種したｗｅｌｌより培地を４０μＬ除去し、新しい培養培地を４０μＬ添加した。
ｄａｙ  ３に培地を４０μＬ除去し、培養培地で目的の濃度（２及び１０μｍｏｌ／Ｌ）に希釈したゲフィチニブ溶液を４０μＬ添加した。ゲフィチニブの最終濃度は１及び５μｍｏｌ／Ｌとなる。また、コントロールとして、培養培地のみ添加した実験も行った。ｄａｙ  ７に各ｗｅｌｌから細胞を１．５ｍＬチューブに回収し、ＡＴＰ濃度を測定した。コントロールサンプルのＡＴＰ濃度を１００％とし、ゲフェチニブ添加群のＡＴＰ濃度比を細胞生存率とした。
【００４４】
（ＥＧＦＲ遺伝子変異検体の同定）
ＨＥ染色標本により腫瘍細胞が確認されたホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックより、１０μｍの厚さの連続切片にて未染標本スライド作製し、室温保存した。検体は脱パラフィン操作を行った後、コバスＤＮＡプレバレーションキットを用いて検体内のＤＮＡ抽出を行った。ＥＧＦＲ遺伝子変異の検出はコバスＥＧＦＲ変位検出キットを用いて、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ＡＲＭＳ法により行った。上記操作により、ＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１８、１９、２０、２１変異または欠損検体の同定を行った。
【００４５】
結果例
・図１の右図は感受性ＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１９欠損検体でありゲフェチニブに対する感受性が高いことが知られている（抗癌剤が効きやすい）
・図１の左図はＷＴでありゲフェチニブに対する感受性が低いことが知られている（抗癌剤が効かない）
図１の右図のサンプルはゲフェチニブに感受性を示すようなＥＧＦ受容体の遺伝子変異が無く、本法によるゲフェチニブの感受性が弱いことが示された。一方、図１の左図のサンプルはゲフェチニブに感受性を示すことが判明しているＥＧＦＲコード遺伝子のエクソン１９の塩基配列に欠損がみられるサンプルで、本法によるゲフェチニブの感受性も弱いことが示された。
【図１】
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【図２】
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