(57)【要約】【課題】クリーンルーム、充填剤、充填剤保管容器などの清浄度の維持、作業時間の短縮、労力軽減、装置の分解と組み立てに伴う作業難の軽減を図り、清浄で効率よく、スムーズに定置洗浄を行うことができるクロマトカラムの定置洗浄方法を提供する。【解決手段】カラム２の下端側に設けられた固定栓３と、該カラム２内に設けられた可動栓４とを有するクロマトカラムを定置洗浄する。可動栓４の固定を解除し、かつ、可動栓バルブ６を閉じた後、固定栓３の流入・流出口３ａから、洗浄水を通水することにより、可動栓を押し上げ、充填剤層８をほぐし、次いで、可動栓４を固定部材で固定すると共に可動栓バルブ６を開け、充填剤層８を流動化する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、
該カラムの一端側に設けられた固定栓と、
該カラム内に設けられた可動栓と、
該固定栓と可動栓との間のカラム内に形成された充填剤層と、
該固定栓及び可動栓にそれぞれ設けられた流入・流出口と、
該流入・流出口を開閉するためにそれぞれ設けられた固定栓バルブ及び可動栓バルブと、
該可動栓を該カラムに対し固定するための固定部材と
を有するクロマトカラムを定置洗浄する方法であって、
該固定部材による可動栓の固定を解除し、かつ、固定栓及び可動栓のうち上側の栓のバルブを閉じ、下側の栓の流入・流出口から洗浄水を通水することにより、可動栓と固定栓との間の空間の容積を広げ、押圧形成されていた充填剤層を下側の栓から離反させる工程と、
次いで、可動栓を固定部材で固定すると共に上側の栓のバルブを開け、充填剤をカラム内で崩落させてほぐす工程と
を有するクロマトカラムの定置洗浄方法。
【請求項２】
請求項１において、その後、洗浄液を下側の栓の流入・流出口からカラム内へ通液するか、又は、通液を一旦止めて漬け置いて、充填剤とカラム内壁面を薬品洗浄することを特徴とするクロマトカラムの定置洗浄方法。
【請求項３】
請求項２において、薬品洗浄後、下側の栓の流入・流出口から洗浄水を供給し、上側の栓の流入・流出口から流出させて、カラムおよび充填剤の洗浄液を洗い流し出すと共に、充填剤を流動させることを特徴とするクロマトカラムの定置洗浄方法。
【請求項４】
請求項３において、その後、下側の栓の流入・流出口からの洗浄水の通水を止めると共に、上側の栓のバルブを開け、上側の栓の流入・流出口から洗浄水を通水し、下側の栓の流入・流出口から流出させ、水流によって充填層を下側の栓の上側に形成することを特徴とするクロマトカラムの定置洗浄方法。
【請求項５】
請求項４において、その後、上側の栓のバルブを閉じ、可動栓を固定栓側へ移動させ、洗浄水のみを下側の栓の流入・流出口から排水し、充填層を形成することを特徴とするクロマトカラムの定置洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程で用いられるクロマトカラムを洗浄する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野での近年の進歩に伴って、タンパク質のような生体物質及び生化学物質を回収、精製及び分離するための迅速で一段と精密な技術が必要とされている。医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程ではクロマトグラフィーが広く用いられている。
【０００３】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（以下ゲル濾過と略）は、タンパク質や多糖類、核酸などの生体分子を精製する際に用いられる代表的な方法の一つである。ゲル濾過では、カラムに充填されたゲル粒子状の充填剤にサンプル通すことにより、様々な大きさの分子を分子量（ここでは溶液中での分子の大きさの意味）に従って分離することができる。担体には小さな孔が開いてあり、小さい分子はその孔に入り込むため、長い間カラム内にとどまることになる。そのため、高分子ほど早く溶出され、低分子ほど溶出されるまで時間がかかる。
【０００４】
一般に、一連のクロマト構成操作、分離精製操作と、メンテナンス作業は、例えば以下のように行われる。なお、以下の説明は、２０％エタノールに浸漬され保存された湿潤型のゲル状の充填剤を用いる場合を例にとったものである。
（１）  カラム準備
カラムを組み立て、水やエタノールなどで満たし、気泡を除去する。
（２）  充填剤準備
ゲル粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーで洗浄してエタノールから置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
（３）  充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、スラリー注入口をシールする。
（４）  クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的性分の分離精製を繰り返す。
（５）  充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、またはゲル状の充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出してＮａＯＨなどの洗浄液で洗浄する（薬品洗浄）。
（６）  前記工程（１）〜（５）を繰り返す。
【０００５】
特許文献１に記載のクロマトカラム装置では、下部フランジ（ベースプレート）と上部フランジ（トッププレート）がフランジ固定用の支持ロッドに固定され、下部フランジと上部フランジの間にカラム胴部（カラムチューブ）が固定され、カラム胴部の上部の開口部から固定栓（プランジャ）がカラム胴部内に導入され、固定栓の固定位置と下部フランジの間のカラム胴部内に、精製目的成分を吸脱着する充填剤を含むスラリーが、例えば、送液ポンプで充填され、充填層が形成される。
【０００６】
このようにして充填剤をカラムに充填した後、充填剤が均質に充填できている事を確認する。例えば、カラム胴部が透明な樹脂製の場合、目視で気泡の有無や充填剤充填層のヒビワレの有無など検査し、更に、トレーサーと称して、例えば、ＮａＣｌやアセトンなどの溶液をカラムへ注入してトレーサーのクロマトグラムを記録し、例えば、理論段数やクロマトグラムの対称性などを調べ、品質管理目標を満足する場合、精製目的成分の分離に着手する。
【０００７】
充填層に何らかの不具合があり（例えば、内部にヒビワレがある、充填剤の充填密度が不均質である、気泡が抜けてない等）、目視検査やトレーサーのクロマトグラムが品質管理基準を満足しない場合がある。このような場合には、殺菌（あるいは滅菌）の為の薬剤を含む洗浄液や精製目的成分を含む液を通液しても、液が充填層を均一に流れないため、充填層を十分殺菌（あるいは滅菌）できない、あるいは、精製目的成分を所定の純度や回収率で精製できないなどの問題がある。そこで、再度、充填剤をカラムへ充填し直す必要があり、充填剤を抜き出して、クロマトカラム装置を分解し、内部を洗浄して、再度、充填剤を充填し、充填後、充填層を含むカラム装置一式を洗浄する（定置洗浄）。
【０００８】
この定置洗浄は、埃や雑菌などの混入を防ぐため、通常は、所定以上の清浄度を有するクリーンルーム内で行われ、蒸留水や（超）純水などの洗浄水による水洗浄と、殺菌（あるいは滅菌）のための薬品、例えば、アルカリ剤などの洗浄液による薬品洗浄が行われる。
【０００９】
医薬品やファインケミカルや機能性成分などの分離・精製工程で用いられるクロマトカラム装置では、定置洗浄が充填操作毎に必要不可欠であり、その度毎に、充填剤の抜き出し、装置の分解および組み立て、充填剤の再充填が必要である。そのため、煩雑で時間と人手がかかるだけでなく、充填剤の抜き出しや再注入に際し、充填剤がこぼれたり、噴き出し、クリーンルームが汚れるなどの問題や、一旦抜き出した充填剤の保管容器（スペース、コスト、清浄性など）や清浄度維持の問題も無視できない問題となっている。
【００１０】
上記説明は工程（３）後の操作についてであるが、工程（５）についても同様の課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１０−５２５３７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、クリーンルーム、充填剤、充填剤保管容器などの清浄度の維持、作業時間の短縮、労力軽減、装置の分解と組み立てに伴う作業難の軽減を図り、清浄で効率よく、スムーズに定置洗浄を行うことができるクロマトカラムの定置洗浄方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のクロマトカラムの定置洗浄方法は、カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、該カラムの一端側に設けられた固定栓と、該カラム内に設けられた可動栓と、該固定栓と可動栓との間のカラム内に形成された充填剤層と、該固定栓及び可動栓にそれぞれ設けられた流入・流出口と、該流入・流出口を開閉するためにそれぞれ設けられた固定栓バルブ及び可動栓バルブと、該可動栓を該カラムに対し固定するための固定部材とを有するクロマトカラムを定置洗浄する方法であって、該固定部材による可動栓の固定を解除し、かつ、固定栓及び可動栓のうち上側の栓のバルブを閉じ、下側の栓の流入・流出口から洗浄水または洗浄液を通液することにより、可動栓と固定栓との間の空間の容積を広げ、押圧形成されていた充填剤層を下側の栓から離反させる工程と、次いで、可動栓を固定部材で固定すると共に上側の栓のバルブを開け、充填剤をカラム内で崩落させてほぐす工程とを有する。
【００１４】
本発明の一態様では、その後、洗浄液を下側の栓の流入・流出口からカラム内へ通液するか、又は、通液を一旦止めて漬け置いて、充填剤とカラム内壁面を薬品洗浄する。
【００１５】
本発明の一態様では、薬品洗浄後、下側の栓の流入・流出口から洗浄水を供給し、上側の栓の流入・流出口から流出させて、カラムおよび充填剤の洗浄液を洗い流し出すと共に、充填剤を流動させる。
【００１６】
本発明の一態様では、その後、下側の栓の流入・流出口からの洗浄水の通水を止めると共に、上側の栓のバルブを開け、上側の栓の流入・流出口から洗浄水を通水し、下側の栓の流入・流出口から流出させ、水流によって充填層を下側の栓の上側に形成する。
【００１７】
本発明の一態様では、その後、上側の栓のバルブを閉じ、可動栓を固定栓側へ移動させ、洗浄水のみを下側の栓の流入・流出口から排水し、充填層を形成する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明方法によると、充填剤を抜き出すことなく、充填剤およびカラムを定置洗浄することができる。これにより、大幅な省力化、時間短縮、汚染低減（充填剤のこぼれや噴き出しなし）、安全性向上（重量物取扱なし）等の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】クロマトカラムの概略的な縦断面図である。
【図２】クロマトカラムの洗浄方法を示す断面図である。
【図３】クロマトカラムの洗浄方法を示す断面図である。
【図４】クロマトカラムの洗浄方法を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を参照して実施の形態について説明する。図１は、本発明方法で洗浄されるクロマトカラム１の概略的な縦断面図である。
【００２１】
このクロマトカラム１は、筒軸心方向を上下方向（この実施の形態では鉛直方向）とした円筒状のカラム２と、該カラム２の下端に装着された固定栓３と、該カラム２内に上下動移動可能かつ固定部材（図示略）によって任意位置に固定可能とされた可動栓４と、固定栓３の流入・流出口３ａに設けられた固定栓バルブ５と、可動栓４の流入・流出口４ａに設けられた可動栓バルブ６とを有する。なお、固定栓３は、カラム２の下端外周に外向き鍔状に設けられたフランジ部（図示略）に対しボルトやクランプによって固定されている。
【００２２】
固定栓３と可動栓４との間に充填剤層８が形成されている。充填剤層８は可動栓４に接している。
【００２３】
図示は省略するが、固定栓３及び可動栓４の流入・流出口３ａ，４ａの充填剤層８側には多孔板等よりなるフィルタが設けられており、充填剤の流出が阻止されるよう構成されている。
【００２４】
図１では、バルブ５，６を開とし、固定栓３側から移動相を流入させ、可動栓４側から流出液（溶離液）を流出させているが、可動栓４側から固定栓３側に向って移動相を流通させてもよい。
【００２５】
なお、固定部材を有した可動栓としては、例えば、先端部が充填剤に対面し、可動栓の軸心部をカラムの軸心線方向に延在する可動栓コアと、該可動栓コアの先端側の外周に外嵌した環状のスクレーパと、該可動栓コアの基端側が内嵌した凹所を有するベースと、該スクレーパとベースとの間において該可動栓コアの外周を取り巻いているパッキンと、該可動栓コアをベースの該凹所に押し込む方向に引き付けるための引付手段とを備えてなり、可動栓コアの先端側の外周部にフランジ部が設けられ、前記スクレーパは該フランジ部に係合していることを特徴とする可動栓（特許第５５５２８５１号）など各種のものを用いることができる。
【００２６】
本装置を用いる一連のクロマト操作とメンテナンス作業は例えば以下の（１）〜（６）のように行われる。なお、以下の手順は、２０％エタノールに浸漬され保存された湿潤型のゲル状の充填剤を用いるときを例にとったものである。
（１）  カラム準備
カラムに固定栓を装着し、水やエタノールなどで満たし、気泡を除去する。
（２）  充填剤準備
ゲル粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーで洗浄してエタノールから置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
（３）  充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、可動栓を装着し、充填剤層を形成する。目視等で確認して問題あれば充填剤を引き抜かず後述の定置洗浄を行う。
（４）  クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的性分の分離精製を繰り返す。
（５）  充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、またはゲル状の充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外すか接合した状態で、充填剤を引き抜かず、次に説明する定置洗浄を行う。
（６）前記工程（４），（５）を繰り返す。
【００２７】
このクロマトカラムの定置洗浄方法について図２〜４を参照して説明する。
【００２８】
まず、可動栓４の固定部材による固定を解除し、かつ可動栓バルブ６を閉じる。次いで、図２（ａ），（ｂ）のように、固定栓３の流入・流出口３ａから、例えば、蒸留水や（超）純水などの洗浄水を通水することにより、可動栓４を押し上げ、可動栓４と固定栓３との間の空間の容積を広げる。図２（ａ）の通り、押圧されていた充填剤層８も流入水によって押し上げられ、固定栓３から離反し、次いで図２（ｂ）の通り崩落してほぐされる。
【００２９】
次いで、図２（ｃ）のように、一旦、可動栓４を固定部材により固定すると共に可動栓バルブ６を開けて洗浄水を上向流通水し、充填剤を流動化させる。充填剤が流動化することによって、例えば、充填剤層８中に滞留していた気泡や汚れが除去されると共に、充填剤層８の偏りが解消される。
【００３０】
次いで、洗浄水の代りにＮａＯＨなどの殺菌（あるいは滅菌）用の洗浄液をカラム内へ同様に上向流通液することで、流動化した充填剤とカラム２の内壁面を薬品洗浄する。なお、図２（ｃ）では、充填剤層を流動化させるときに、例えば、蒸留水や（超）純水などを用いたが、初めから洗浄液を通液して、充填剤層８をほぐして流動化させてもよい。
【００３１】
洗浄液でカラム２内が満たされた時点で、洗浄液の通液を止め、一定の漬け置き処理を行ってもよい。
【００３２】
薬品洗浄の後、再び固定栓３の流入・流出口３ａから、例えば蒸留水や（超）純水などの洗浄水を通水して、カラムおよび充填剤の洗浄液を洗い流し出す（水洗浄）。薬品洗浄時、洗浄液の通液を止めて、漬け置き洗浄した場合、充填剤がカラム底部に沈降し緩やかに堆積するが、固定栓３の流入・流出口３ａから、蒸留水や（超）純水などを通水することにより、この緩やかに堆積した充填剤が流動化する。
【００３３】
次いで、固定栓３の流入・流出口３ａからの水洗浄のための通水を停止し、図３（ａ）のように、可動栓バルブ６を開け、可動栓４の流入・流出口４ａから、例えば、蒸留水や（超）純水などを供給して下向流通水し、固定栓３の流入・流出口３ａから流出させる。これにより、流動化していた充填剤が、水流に従って、図３（ｂ）のように、固定栓３側へ移動し、充填剤層８が形成される。
【００３４】
図４（ａ），（ｂ）のように、固定栓バルブ５は開としたままとし、可動栓バルブ６を閉じ、可動栓４の固定を解除して下降させ、水のみを固定栓３の流入・流出口３ａから流出させる。
【００３５】
図４（ｃ）のように、充填剤層８と可動栓４とが接した時点、あるいは、可動栓４で僅かに充填剤層８を押圧した時点で、充填剤の再充填を完了し、可動栓４を固定部材で上下方向へ移動しないように固定した後、充填状態を目視やトレーサークロマトグラムなどの検査で確認する。
【００３６】
カラム直径が５０〜２０００ｍｍ（好ましくは１００〜１６００ｍｍ）のいずれのカラムについても本発明を使用することができる。カラム直径が５０〜１００ｍｍ程度であれば手動での可動栓の固定解除・可動栓高さ調整・再固定などの操作も容易である。しかしカラム直径が３００ｍｍを超えると人手でなく駆動手段による機械的操作を必要とするので本発明がより好適に用いられる。
【００３７】
上記説明は本発明の一例であり、本発明は上記以外の態様とされてもよい。例えば、上記実施の形態では、固定栓３をカラム２の下端側としているが、上下逆とし、固定栓３をカラム２の上端側としてもよい。
【符号の説明】
【００３８】
１  クロマトカラム
２  カラム
３  固定栓
４  可動栓
５  固定栓バルブ
６  可動栓バルブ
８  充填剤層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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