(57)【要約】      （修正有）【課題】成長因子に対して金属材料への結合性を付与する生体移植用部材の表面処理剤の提供。【解決手段】分子量が1万ダルトン以上の血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子とそれに結合されたチロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含むポリペプチドとを含む結合体、並びに該結合体を含む剤及び生体移植用部材。前記成長因子が、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）から選ばれる少なくとも一種の成長因子であり、前記チロシン誘導体が３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）であり、前記プロリン誘導体が４−ヒドロキシプロリン及び３，４−ジヒドロキシプロリンであり、前記ポリペプチドがリシン残基を含む、結合体であり、前記結合体を含む、生体移植用部材の表面処理剤。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が1万ダルトン以上の成長因子に、ポリペプチドが直接又はリンカーを介して結合した結合体であって、
前記ポリペプチドがチロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含む、結合体。
【請求項２】
前記成長因子が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記チロシン誘導体が3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）であり、前記プロリン誘導体が4-ヒドロキシプロリン及び3,4-ジヒドロキシプロリンである、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項４】
前記ポリペプチドがリシン残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合体を含む、生体移植用部材の表面処理剤。
【請求項６】
生体移植用部材が、ステント、インプラント、人工関節、人工骨及び整形外科用固定具からなる群より選択される、請求項５に記載の表面処理剤。
【請求項７】
生体移植用部材の表面が、チタン、クロム、コバルト、ステンレススチール及びこれらの合金、並びに金及び白金からなる群より選択される金属材料を含む、請求項５又は６に記載の表面処理剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合体を有する表面を備える、生体移植用部材。
【請求項９】
分子量が1万ダルトン以上の成長因子に、チロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含むポリペプチドが直接又はリンカーを介して結合した結合体の製造方法であって、
前記成長因子と前記ポリペプチドとをソルターゼを用いて結合する工程を含み、
前記成長因子と前記ポリペプチドのいずれか一方のC末端にC末端ソルターゼ認識モチーフが付加されており、他方のN末端にN末端ソルターゼ認識モチーフが付加されている、製造方法。
【請求項１０】
前記成長因子が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子である、請求項９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを結合した成長因子、具体的には金属等の材料に対して結合性を有するポリペプチドと分子量1万ダルトン以上の成長因子との結合体に関する。また本発明は、かかる結合体の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療デバイスには多くの金属材料が使用されている。生体移植等に使用される部材の材料表面の修飾は通常、細胞及び組織と接触するための適切な表面環境を提供する必要がある。成長因子の固定化は医療デバイスの表面修飾に広く用いられている方法の1つであるが、この修飾方法には制限がある。
【０００３】
表面修飾には一般的にシランカップリング法が用いられている。しかしながら最近では、従来の方法に加えて、イガイの接着活性から発想を得た生体擬態アプローチが開発されている。イガイは足糸と呼ばれる付着器官によって岩場等に張り付き、その足糸先端は、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）を多く含む接着性のタンパク質から構成されていることが知られている。このことを利用して、DOPAやその誘導体であるドーパミンが金属を含む様々な材料の表面修飾のために用いられている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
本発明者の研究グループも金属材料等に対して結合性を有するペプチドを成長因子へ連結させることを行ってきた（非特許文献１）。非特許文献１では、DOPAを含むペプチド配列を導入してより結合性の高い上皮成長因子(EGF)の創成を行った。
【０００５】
EGFは、分子量が比較的低いので（5千程度）固相合成することができるが、生理活性が不十分である。十分な生理活性を得るためには、分子量1万以上の、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、骨形成タンパク質（BMP）、線維芽細胞成長因子（FGF）のような成長因子を結合性にする必要がある。しかしながらこのような分子量1万以上のタンパク質は固相法で合成することは困難である。また、DOPAのような標準アミノ酸以外の構成要素を含むタンパク質は慣用的な遺伝子組換え法によって合成することは難しい。
【０００６】
本発明者の研究グループは、ハイドロキシアパタイト（HA）への結合に寄与するリン酸ペプチドをヒト骨形成タンパク質（hBMP4）へと連結させて、hBMP4のHAへの結合を増強することを報告している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５４５５０８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】第35回日本バイオマテリアル学会大会  要旨集2D-09, 2013年
【非特許文献２】Sakuragi M, et al., Biotechnol. Lett. 第33巻第1885-1890頁, 2011年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高分子量（分子量1万ダルトン以上）の成長因子に対して金属材料等への結合性を付与することを目的とする。また本発明は、そのような結合性が付与された成長因子を含む表面処理剤及び成長因子により表面処理された部材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、チロシン誘導体の1種である3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）を含むポリペプチドを、分子量1万ダルトンを超えるVEGFやBMP2などの成長因子に連結することに成功し、それによって成長因子に金属材料等からなる表面に対する結合性を付加することに成功した。また、得られた成長因子は、金属等に対する結合能と共に、細胞増殖を適度に増強する生物活性や細胞分化を誘導する生物活性を有していることも確認した。これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］分子量が1万ダルトン以上の成長因子に、ポリペプチドが直接又はリンカーを介して結合した結合体であって、
前記ポリペプチドがチロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含む、結合体。
［２］前記成長因子が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子である、［１］に記載の結合体。
［２−１］VEGFがヒトVEGFである、［１］又は［２］に記載の結合体。
［２−２］BMPがヒトBMP2である、［１］又は［２］に記載の結合体。
［３］前記チロシン誘導体が3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）であり、前記プロリン誘導体が4-ヒドロキシプロリン及び3,4-ジヒドロキシプロリンである、［１］又は［２］に記載の結合体。
［４］前記ポリペプチドがリシン残基を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の結合体。
［４−１］前記ポリペプチドが配列番号1〜7のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の結合体。
［４−２］成長因子とポリペプチドとがソルターゼを用いて結合されたものである、［１］〜［４］のいずれかに記載の結合体。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の結合体を含む、生体移植用部材の表面処理剤。
［６］生体移植用部材が、ステント、インプラント、人工関節、人工骨及び整形外科用固定具からなる群より選択される、［５］に記載の表面処理剤。
［７］生体移植用部材の表面が、チタン、クロム、コバルト、ステンレススチール及びこれらの合金、並びに金及び白金からなる群より選択される金属材料を含む、［５］又は［６］に記載の表面処理剤。
［８］［１］〜［４］のいずれかに記載の結合体を有する表面を備える、生体移植用部材。
［８−１］生体移植用部材が、ステント、インプラント、人工関節、人工骨及び整形外科用固定具からなる群より選択される、［８］に記載の生体移植用部材。
［９］分子量が1万ダルトン以上の成長因子に、チロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含むポリペプチドが直接又はリンカーを介して結合した結合体の製造方法であって、
前記成長因子と前記ポリペプチドとをソルターゼを用いて結合する工程を含み、
前記成長因子と前記ポリペプチドのいずれか一方のC末端にC末端ソルターゼ認識モチーフが付加されており、他方のN末端にN末端ソルターゼ認識モチーフが付加されている、製造方法。
［１０］前記成長因子が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子である、［９］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、金属材料等の無機材料への結合性が付与された成長因子、例えば血管内皮細胞成長因子（VEGF）や骨形成タンパク質（BMP）が提供される。かかる成長因子は、生体移植用部材などの材料に結合することができるため、かかる成長因子により部材表面を処理することにより、生体移植用部材の生体組織への適合性を向上させることができる。したがって、本発明は、医療、再生医療、歯科、医薬品、細胞及び組織工学などの分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】DOPA含有ポリペプチドと成長因子との結合体を作製するための合成スキームの一例を示す。
【図２】DOPA含有ポリペプチドと成長因子との結合体を作製するための合成スキームの別の例を示す。
【図３】VEGF及びVEGF-DOPAの電気泳動分析を示す概略図及び写真である。
【図４】VEGF（灰色線）及びVEGF-DOPA（黒色線）のCDスペクトルを示す。
【図５】コバルト−クロム合金ディスク上へのVEGF-DOPAの結合を示すグラフである。
【図６】種々のpH値におけるVEGF等の結合測定結果を示すグラフである。
【図７】溶解状態のVEGF等の細胞増殖活性を示す図である。増殖の程度は、細胞計数キットによりアッセイした（450nmでの吸光度）。
【図８】コバルト−クロム合金ディスクにVEGF等を処理した場合の細胞増殖活性を示す図である。増殖の程度は、細胞計数キットによりアッセイした（450nmでの吸光度）。
【図９】BMP2-YKYKYの発現及び精製を示す写真である。M:マーカー; 1:誘導前; 2:誘導後; 3:上清; 4:封入体; 5-6:流出画分; 7-9:溶出分。
【図１０】BMP2-YKYKYの質量分析を示す。
【図１１】チロシンヒドロキシラーゼ反応の検出を示す写真である。M: マーカー; 1:チロシンヒドロキシラーゼ反応前; 2:チロシンヒドロキシラーゼ反応後。
【図１２】チロシンヒドロキシラーゼ反応前後のNBT染色によるDOPA検出を示す写真である。
【図１３】様々な濃度のBMP2-YKYKYにより誘導されたC2C12細胞の細胞活性を示すグラフである。
【図１４】様々な濃度のBMP2-YKYKYにより誘導されたC2C12細胞の形態を示す写真である。
【図１５】チタンプレートに固定化されたBMP2-DOPAにより、hMSC細胞の分化が誘導されることを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、チロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含むポリペプチドと、分子量が1万ダルトン以上の成長因子とが、直接又はリンカーを介して結合した結合体に関する。かかる結合体は、その成長因子としての活性に基づいて、天然又は人工材料（例えば生体移植用部材）の表面に細胞成長活性又は細胞分化促進活性を付与する。またかかる結合体は、ポリペプチドがチロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも一種のアミノ酸残基を含むことから、そのポリペプチドの性質に基づいて、材料表面への結合性を付与し、このようなポリペプチドがない場合に比べて活性成分である成長因子の効果が延長する。
【００１５】
本発明に係る結合体に含まれるポリペプチドとは、金属材料やセラミックス材料等の無機材料への結合性を有するポリペプチドを意味し、具体的にはチロシン誘導体及びプロリン誘導体から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。本発明において使用するポリペプチドは、チロシン誘導体及び／又はプロリン誘導体を含み、部材への結合性を保持するものであれば、任意の長さの任意のアミノ酸配列を有するものとすることができる。
ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の数は特に限定されるものではないが、5アミノ酸以上とすることができ、好ましくは5〜20アミノ酸、より好ましくは5〜15アミノ酸の長さである。
【００１６】
ポリペプチドに含まれるチロシン誘導体は、部材への結合性を保持するものであれば任意の誘導体であってよく、例えば3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）である。
またプロリン誘導体も、部材や組織への結合性を保持するものであれば任意の誘導体であってよく、例えばヒドロキシプロリン（Hyp）、具体的には4-ヒドロキシプロリン及び3,4-ジヒドロキシプロリンである（Taylor, S. et al. trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxyproline, a New Naturally Occurring Amino Acid, Is the Sixth Residue in the Tandemly Repeated Consensus Decapeptides of an Adhesive Protein from Mytilus edulis. J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 10803-10804）。
ポリペプチドは、その結合性に寄与するチロシン誘導体及び／又はプロリン誘導体を含む限り、他のアミノ酸残基を含むものであってもよい。他のアミノ酸残基を含む場合、リシン（K）残基を含むことが好ましい。
【００１７】
好ましくは、本発明において使用するポリペプチドは、イガイ、フジツボ、イシサンゴなどの水性動物が産生する接着タンパク質に由来するポリペプチドであり、水中で長時間にわたり強固な接着を維持することができるものである。そのような接着タンパク質は当技術分野において公知であり、多数知られている。そのうちイガイ接着タンパク質（mussel adhesive protein：MAP）に由来するものが好ましい。イガイは、広範な天然物及び合成物（例えば、金属、ガラス、スレート、アセタール樹脂、テフロン、ポリプロピレン、石など）に接着することが知られており、イガイ接着タンパク質に由来するポリペプチドは、生体移植用部材への接着に優れていると考えられる。
【００１８】
そのような接着タンパク質に由来するポリペプチドとしては、例えばムラサキイガイの接着タンパク質に含まれる反復配列（Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys：配列番号1）を有するポリペプチドが知られている（Waite, JH., et al., J. Biol. Chem., 258:2911-2915, 1983、特開平6-87889号公報など）。このような水中接着タンパク質には、上述したようなチロシン誘導体、例えば3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）、及び／又はプロリン誘導体、例えばヒドロキシプロリン（Hyp）が含まれており、このようなチロシン誘導体及びプロリン誘導体が接着性に寄与していると考えられている。そのため、本発明においては、上述のように、例えば、チロシン誘導体及びプロリン誘導体を1若しくは複数含むポリペプチドを結合体のためのポリペプチドとして用いることができる。
【００１９】
より具体的には、ポリペプチドは、DOPAと他のアミノ酸残基（好ましくはリシン残基（K））を交互に又はランダムに含むポリペプチドが好ましい。このようなポリペプチドとしては、例えば、XKXKX（XはDOPAを表す：配列番号2）、XKKXX（XはDOPAを表す：配列番号3）、KXXKX（XはDOPAを表す：配列番号4）、KKXXX（XはDOPAを表す：配列番号5）、若しくはKXXXK（XはDOPAを表す：配列番号6）が挙げられる。
また、これらの配列にDOPA、リシン残基（K）若しくは他のアミノ酸残基（例えばアスパラギン酸残基（D））が付加した配列、例えばXKXKXDYDDDDK（XはDOPAを表す：配列番号7）からなるポリペプチドも好ましい。
さらに、ポリペプチドは、これらの配列を複数回繰り返し含むものであってもよい。
【００２０】
このようなポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により調製することができる。例えば、固相ペプチド合成法や、非天然アミノ酸をポリペプチドに導入するための遺伝子組換え法（例えば、Taira, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 374, 304-308、Noren, C.J. et al., Science 244:182-188, 1989、特許第4917044号など）を利用することができる。構成単位の一例であるDOPAは、チロシンをチロシンヒドロキシラーゼで処理することにより得ることができ、あるいは市販品として入手することも可能である。
また、後述するようにソルターゼの酵素反応を利用してポリペプチドと成長因子とを結合させようとする場合には、ソルターゼの認識配列を付加したポリペプチドを調製することが好ましい。
【００２１】
一方、本発明に係る結合体に含まれる成長因子は、分子量が1万ダルトン以上のものであれば特に限定されるものではない。そのような成長因子としては、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）（例えば、TGF-βファミリーに属する骨形成タンパク質（BMP））、線維芽細胞成長因子（FGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）などが挙げられる。好ましくは、血管内皮細胞成長因子（VEGF）及び骨形成タンパク質（BMP）から選ばれる少なくとも一種の成長因子を結合体に使用する。成長因子の分子量の上限も特に制限はないが、例えば5万ダルトン以下である。
【００２２】
VEGF（血管内皮細胞成長因子）は、血管内皮細胞増殖因子とも呼ばれ、血管内皮細胞に対して非常に特異性のある細胞分裂促進効果を有する糖タンパク質である。本発明において用いるVEGFの由来に限定はなく、例えばヒトVEGFを用いることができる。ヒトVEGFには、選択的スプライシングにより、アミノ酸数121（VEGF-121）、165（VEGF-165）、189（VEGF-189）及び206（VEGF-206）の複数の形態が存在する。これらは本発明においていずれもVEGFに含まれる。VEGFについては、その機能及びアミノ酸配列情報を含めて当技術分野においてよく知られている。
【００２３】
骨形成タンパク質（BMP）は、TGF-βファミリーに属し、骨治癒プロセス及び治療効果の増強において重要な役割を果たすことが知られるシグナル伝達タンパク質である。BMPは、注射により又はチタンと組み合わせて骨再生を刺激する際に適用されている。本発明において用いるBMPの由来に限定はなく、例えばヒトBMPを用いることができる。またBMPには、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF5、GDF6、GDF7などが含まれる。特に、BMP2又はBMP4を結合体に使用することが好ましく、BMP2を結合体に使用することが特に好ましい。BMPについても、その機能及びアミノ酸配列情報を含めて当技術分野においてよく知られている。
【００２４】
成長因子の調製は、当技術分野において公知の方法により実施することができる。成長因子はその分子量が1万ダルトン以上と大きいことから、固相合成法よりも遺伝子組換え手法により調製することが好ましい。例えば、成長因子をコードする核酸を、ソルターゼの認識配列（例えば配列番号8）をコードする核酸又はチロシン含有ペプチド（例えば配列番号18）をコードする核酸と共に発現ベクターに導入し、宿主細胞を発現ベクターで形質転換した後、宿主細胞において産生されるソルターゼ認識配列又はチロシン含有ペプチドが付加された成長因子を回収及び精製することができる。成長因子は、単量体で調製してもよいし、あるいはその多量体形態、例えば2量体などの形態で調製してもよい。
【００２５】
成長因子とポリペプチドとの結合は、直接的な結合であってもよいし、又はリンカーを介した結合であってもよい。具体的には、成長因子とポリペプチドとの結合を酵素法を利用して行うことができる。一例として、タンパク質連結酵素であるソルターゼ（Sortase）を用いることができる。この方法において、タンパク質中の特定の認識配列を認識して、2つのタンパク質又はポリペプチドを連結することができる酵素であれば任意のソルターゼを用いることができる。
【００２６】
代表的なソルターゼであるソルターゼAは、細胞表面タンパク質を細胞壁に固定するために黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）により生成されるトランスペプチダーゼである（Mazmanian SK, et al., Science 285:760-763, 1999）。この酵素は、一方のポリペプチドのC末端或いは末端付近における認識配列LPXTG（式中、Xは任意のアミノ酸である：配列番号8）と、別のポリペプチドのN末端におけるGGの短いモチーフを認識して、認識配列LPXTG中のTG間を切断し、両ポリペプチドの末端におけるグリシンを交換する。この独特の反応によってペプチドの連結が起こる。配列番号8を含む認識配列を利用して2つのタンパク質又はポリペプチドを結合させた場合、2つのタンパク質又はポリペプチドは、配列番号8を含むアミノ酸リンカーを介して結合することになる（例えば、図１）。
【００２７】
また別の黄色ブドウ球菌由来のソルターゼBは認識配列NPQTN（配列番号9）を認識してTN間を切断し（Bentley, ML, et al., J. Biol. Chem, 282(9):6571-6581, 2007）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）由来のソルターゼBは認識配列NPKTG（配列番号10）を認識してTG間を切断し（Maresso AW, et al., J. Bacteriol., 188(23): 8145-8152, 2006）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）由来のソルターゼCは認識配列LPNTA（配列番号11）を認識してTA間を切断し（Marraffini, LA, et al., J. Bacteriol., 189(17):6425-6436, 2007）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のソルターゼCは認識配列QVPTGV（配列番号12）を認識し（Barnett TC, J. Bacteriol. 186(17): 5865-5875, 2004）、ペプチド連結反応を行うことが知られており（例えば特開2009-189325号公報）、これらのソルターゼも本発明において用いることができる。
【００２８】
本明細書において、ポリペプチド又は成長因子のC末端及びN末端に存在するソルターゼ認識配列をそれぞれ「C末端ソルターゼ認識モチーフ」及び「N末端ソルターゼ認識モチーフ」という。ソルターゼを用いてポリペプチドと成長因子とを結合する場合、一方のC末端にC末端ソルターゼ認識モチーフを付加し、他方のN末端にN末端ソルターゼ認識モチーフを付加する。
【００２９】
ソルターゼの調製は当技術分野で公知であり、例えばソルターゼをコードする核酸を用いて遺伝子組換え法によって産生させることができる。あるいはソルターゼは市販品として入手することも可能である。ソルターゼは、粗精製酵素であってもよいし又は精製酵素であってもよい。また、ソルターゼを用いる反応は、使用するソルターゼの種類に応じて適切な温度（例えば30〜40℃）及びpH（例えばpH6〜8）において適切な時間（例えば1〜72時間）にわたって行うことができる。
【００３０】
またポリペプチドと成長因子とを結合する別の方法として、チロシンヒドロキシラーゼを用いる方法を採用することができる。ポリペプチドにチロシン誘導体として3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）を含めようとする場合には、成長因子とチロシン含有ペプチドとを融合させたタンパク質を、例えば遺伝子組換え手法により作製した後、得られた融合タンパク質のチロシンにチロシンヒドロキシラーゼを反応させることによって、チロシンからDOPAが合成され、DOPAを含むポリペプチドと結合した成長因子が得られる（例えば、図２）。
【００３１】
最後に、以上のように得られた反応物から、結合体を精製する。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの公知のタンパク質分離及び精製法を用いることができる。
【００３２】
得られた結合体は、その構成要素である成長因子のために、細胞（例えば血管内皮細胞）の細胞増殖活性又は細胞分化促進活性を有し、またポリペプチドのために、金属材料やセラミックス材料などの材料への結合性を有するものである。したがって、そのような性質を利用した様々な用途に適用することができる。
【００３３】
例えば、生体移植用部材を、成長因子と共に適用した場合には、移植部位における細胞の増殖や分化などが促進され、該部材の生体への定着や該部材の周囲の組織形成が促進される。従来では、成長因子タンパク質はin vivoにおいて半減期が短く、安定していないため、また材料への取り込み時又は材料からの放出後に簡単に分解されてしまうため、臨床用途が限られていた。本発明に係る結合体を利用することで、生体移植用部材の表面に成長因子を強固に結合させることが可能となる。そのため、本発明に係る結合体を生体移植用部材の表面処理剤として用いることができる。また、本発明に係る結合体を有する表面を備えた生体移植用部材を作製することができる。
【００３４】
生体移植用部材は、生体内への移植が予定される部材であれば任意の医療用、獣医用及び歯科用の部材とすることができる。例えば、ステント、インプラント、人工関節、人工骨、固定具（整形外科用）などが挙げられる。
【００３５】
生体移植用部材の形状及び素材は、目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではない。素材としては、金属、例えばチタン、クロム、コバルト、ステンレススチール及びこれらの合金、金、白金など、生分解性高分子、例えばポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリエステルなどが挙げられる。例えばステントを使用する場合には、チタン、クロム、コバルト、ステンレススチール、これらの合金などの金属からなる網目状構造を筒状に成形した形状とすることができる。本発明においては、生体移植用部材の表面が上記素材、例えば金属材料を含むものであればよく、表面以外の部分は任意の素材のものとすることができる。
【００３６】
本発明に係る生体移植用部材の表面処理剤は、本発明に係る結合体を約1〜99質量％の濃度で含有することが好ましく、約5〜90質量％の濃度で含有することがより好ましい。
【００３７】
本発明に係る生体移植用部材の表面処理剤を生体移植用部材に適用する場合、例えば約10〜40℃にて、pH約4.0〜9.0にて、約10分〜約24時間にわたり、本表面処理剤と生体移植用部材とを接触させることにより、生体移植用部材の表面に成長因子を結合させることができる。ここで、pHに依存して表面への成長因子の結合量が異なることがわかっているため（例えば、実施例３参照）、目的に応じて、反応pHを変更することが好ましい。具体的には、生体移植用部材への成長因子の結合量を増加させたい場合には、反応pHを約8.0〜9.0とする。一方、生体移植用部材への成長因子の結合量を低下させたい場合には、反応pHを約4.0〜6.0とする。
【００３８】
本発明に係る生体移植用部材の適用対象は、細胞（例えば血管内皮細胞）の増殖促進又は分化促進が望まれる部位（例えば創傷部位、移植部位など）を有する対象であれば特に限定されるものではない。例えば、動物、特にヒト、ペット動物（ネコ、イヌなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギなど）を挙げることができる。
【００３９】
生体移植用部材は、局所的に適用することができる。局所への適用とは、処置が必要な部位（例えば創傷部位若しくは移植部位）又はその近傍に、その部材を送達又は配置することである。そのような適用方法としては、埋め込み又は移植などが挙げられる。
【００４０】
生体移植用部材の適用量、適用回数及び適用期間は、その目的や適用方法、適用対象の状態、年齢及び体重などに応じて適宜設定することができ、当業者であれば適当な適用量、適用回数及び適用期間を調整することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【００４２】
なお実施例では、独立した実験を少なくとも3回実施した。3つのサンプルを各実験で分析し、代表的なデータを示した。対照群及び処理群で得られたデータの有意性は、対応のあるスチューデントt検定により統計学的に調べ、p値が0.05未満の場合（p<0.05）に有意とみなした。
【００４３】
［実施例１］DOPA含有ポリペプチドとVEGFとの結合体の作製
図１に示した合成スキームにしたがって、DOPA含有ポリペプチドとVEGFとの結合体を作製した。
【００４４】
（１）ソルターゼA認識部位を有するVEGFの調製
ソルターゼ認識部位を有する組換えVEGFは以下のように調製した。すなわち、マルトース結合タンパク質（MBP）のコード配列を有するプラスミドベクターpMAL-p2x（New England Biolabs）を用いて、MBP及びVEGFとソルターゼA認識配列との融合タンパク質のための発現ベクターを構築した。成熟ヒトVEGFタンパク質をコードするDNA配列は、以下のプライマーセット：5’-TGGATCCGACGACGATGATAAG-3’（配列番号13）及び5’-TAAGCTTTAACCACCAGTTTCAGGTAACCGCCTCGGCTT-3’（配列番号14）を用いたヒト胎盤総RNA（Clontech, Laboratories, Inc.）のRT-PCRにより得た。PCR産物には、制限部位（5’末端におけるBamHI及び3’末端におけるHindIII）と、ソルターゼA認識ペプチド配列（C末端におけるLPETGG（配列番号15））をコードする配列が含まれた。BamHI及びHindIIIによる消化後、PCR断片をpMAL-p2xのMBP配列の下流に挿入して、発現ベクター（pMAL-p2x-VEGF-L）を構築した。DNA配列を確認後、発現ベクターを大腸菌BL21-CodonPlus-RP株（Agilent Technology）に導入し、形質転換された大腸菌をLB培地において培養した。
【００４５】
組換え融合タンパク質（MBP-VEGF-LPETGG）の産生及び精製は、pMAL系（New England BioLab）の標準プロトコルにしたがって行った。簡単に説明すると、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を指数増殖期の大腸菌培養物に添加し、認識配列LPETGG（配列番号15）を有する融合タンパク質MBP-VEGFを発現させた。遠心して大腸菌細胞を回収し、超音波処理した。融合タンパク質は、超音波処理した大腸菌溶解物の上清から、アミロース樹脂（New England Biolabs）へのMBPのアフィニティにより精製した。
【００４６】
（２）ソルターゼA反応
DOPA含有ポリペプチド（XKXKX（XはDOPAを表す）：配列番号2）及び比較用ポリペプチド（YKYKY：配列番号18）に、それぞれソルターゼAの反応のためのグリシンを付加したポリペプチドGGGXKXKX（XはDOPAを表す：配列番号16）及びGGGYKYKY（配列番号17）を、理化学研究所脳科学総合研究センターの研究基盤センター内、生体物質分析支援ユニットにおいてFmoc基を用いる固相ペプチド合成法により合成した。
【００４７】
（１）で調製した融合タンパク質（MBP-VEGF-LPETGG）を活性化凝固第X因子（FXa, Novagen）で4℃にて一晩かけて消化し、融合タンパク質からMBP部分を除去した。残りのVEGF-LPETGGは消化後自発的に沈殿した。沈殿物をCaCl2溶液で3回洗浄し、尿素溶液（5M尿素, 0.2 M Tris-HCl pH, 8.5）に溶解した後、透析した。最終的に、ヒドロキシアパタタイトカラム、HAP-I型カラム（Bio-Rad）によりVEGF-LPETGGを精製した。精製タンパク質の量を、BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）によりBSAを標準として用いて測定した。
【００４８】
MBP部分を除去したVEGF-LPETGGに、5mMとなるようCaCl2を添加した。その後、DポリペプチドGGGXKXKX（配列番号16）又はGGGYKYKY（配列番号17）を20倍モル過剰量でVEGF-LPETGGと混合し、以前に報告（Yuan S, et al. Langmuir. 2011; 27(6); 2761-2774）されているように調製したソルターゼA（最終濃度0.3μM）を添加した。VEGF-LPETGGとポリペプチドGGGXKXKX（配列番号16）又はGGGYKYKY（配列番号17）との間で末端グリシンが置き換わるように、混合物を4℃で一晩インキュベートした。これにより、それぞれ、VEGFとDOPA含有ポリペプチド(XKXKX：配列番号2)との結合体（VEGF-LPETGGG-XKXKX、以下この結合体を「VEGF-DOPA」という）、および、比較用ポリペプチド（YKYKY：配列番号18）との結合体（VEGF-LPETGGG-YKYKY、以下この結合体を「VEGF-Y」をいう）を得た。
【００４９】
［実施例２］コンジュゲートされたVEGFの特性決定
電気泳動結果から、結合体VEGF-DOPAの合成が示された（図３）。
【００５０】
また、100μLのサンプル（0.03wt％）を用いて、分光光度計V-550（JASCO）において波長500 nmで濁度測定を行った。比較用ペプチドYKYKY（配列番号18）の色は全てのpH値において同じであったが、DOPA含有ペプチドXKXKX（X=DOPA：配列番号2）の色はpH依存性であった（データは示さない）。pH値が高くなると色が暗黄色になった。またXKXKX溶液の濁度もpHに依存し、pH値が高いほど濁度も高くなった。これらの結果は、以前に報告（Kitajima T, et al., Biomaterials. 2007; 28(11): 1989-1997、及びOta T, et al., J Thorac Cardiov Sur. 2008; 136(5): 1309-1317）されたドーパミン、DOPA、又はドーパミンコンジュゲートゼラチン溶液の結果と同様であった。マイケル付加反応又はシッフ塩基反応は、以前に報告（Yang SH, et al., J Am Chem Soc. 2011; 133(9): 2795-2797）されているように、高pHのドーパミン溶液中でよく起こると考えられる。これに基づき、XKXKXがドーパミン又はDOPAと同様の特性を有すると結論付けた。
【００５１】
分光光度計J-720（JASCO）を用いて円偏光二色性（CD）測定を実施した。1 mmキュベットを用いてサンプル容量250μL（100μg/mL）を測定した（スキャンタイプ：連続；スキャン速度：100 nm/min；応答時間：2.0 sec；帯域幅：1.0 nm）。各サンプルを2回測定し、平均スペクトルを得た。
CDスペクトルは、VEGF-DOPAは、市販のVEGFとほぼ同様の特有のベーターシート構造を持ち、パターンで、DOPA含有ポリペプチド導入によるコンフォメーションの変化は観測されなかった（図４）。
【００５２】
［実施例３］結合アッセイ
天然VEGF121タンパク質はR&D systemsより購入した。
コバルト−クロム合金円形ディスク（直径10 mm、厚さ1 mm）をVEGF-DOPAの溶液と共に4℃にて12時間インキュベートした後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。ディスクに結合したVEGFの量は、それぞれ以下の抗FLAG又は抗VEGFマウスモノクローナル抗体（R&D Systems）を用いて測定した。ディスクをPBS-Tween（0.2％v/v）ですすぎ、無脂肪乳水溶液（4％w/v）中で30分かけてブロッキングし、PBS-Tween（0.2％v/v）で再び3回洗浄し、抗体（1:500）と共に4℃で一晩インキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（GE Healthcare）で標識した二次抗体（抗マウスIgG）との室温にて1時間のインキュベーション後、AxioCam MRc5カメラ（Carl Zeiss Co., Ltd）を備えたAxioObserver蛍光顕微鏡により表面の画像を撮影した。結合したVEGFの量を、表面画像の顕微鏡写真においてAxioVision 4.8デジタルイメージソフトウエア（Carl Zeiss）により測定した。検量線を作成するため、種々の既知濃度の二次抗体（FITCとコンジュゲートしたもの）をコバルト−クロム合金ディスクの表面にスポットし、同様に処理した。
【００５３】
最初に、コバルト−クロム合金ディスク表面上への、DOPA含有ポリペプチドとの結合体（VEGF-DOPA）の結合を抗FLAG抗体により評価した（図５）。その結果、VEGF-DOPA（図中、D-FLAGで示す）は、対照であるチロシン含有ポリペプチドとの結合体VEGF-Y（図中、Y-FLAGで示す）より高い結合をもつことがわかった。
【００５４】
VEGF-DOPAのディスクへの結合はpH4.5よりもpH8.5において高かった（図６）。この結果は、DOPA含有ポリペプチドコンジュゲーションがアフィニティ結合に影響を及ぼし、その結合が主にVEGF-DOPAの表面濃度に依存していることを示している。
【００５５】
［実施例４］細胞培養試験
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）をLonzaから取得し、5％ウシ胎仔血清（FBS）、抗生物質、インスリン様成長因子、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、及び血管新生因子（塩基性線維芽細胞成長因子（FGF2）、上皮成長因子（EGF）及び血管内皮細胞成長因子（VEGF）など）を含有するEGM2培地（Lonza）中で増殖させた。
【００５６】
EGM2培地において37℃、95％加湿空気/5％CO2で維持したHUVECをトリプシン処理により回収し、以下の実験のために培地中に再懸濁した。
【００５７】
細胞増殖アッセイのため、HUVECを1％FBSを含むが血管新生因子を含まない基礎培養培地（EBM2, Lonza）中に回収した。細胞懸濁液に溶解状態のVEGF、VEGF-DOPA、VEGF-Yを加え、あるいは細胞懸濁液を実施例３のように調製した結合体VEGF-DOPA処理コバルト−クロム合金ディスクに添加した。培養培地を2日毎に交換し、培養の5日後に文献（Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, Ohkura Y, Ueno K. Talanta. 1997; 44(7):1299-1305）に記載の方法にしたがって細胞計数キットWST8（Dojindo）により細胞増殖を評価した。
【００５８】
溶解状態のVEGF、VEGF-Y及びVEGF-DOPAの細胞増殖活性を評価した結果を図７に示す。図７に示す通り、溶解状態ではVEGF、VEGF-Y及びVEGF-DOPAの活性の変化がないことがわかった。具体的には、VEGFを含む結合体VEGF-DOPA及びVEGF-Yは、内皮細胞基本培地EBM2よりは高く、専用培地EGM2よりは低い、内皮細胞成長促進能をもち、成長促進活性は濃度に比例したものの、ポリペプチド導入前後で活性の変化はほとんどなく、ポリペプチドの種類（チロシン含有又はDOPA含有）による相違もほとんどなかった。
【００５９】
VEGF、VEGF-Y及びVEGF-DOPAをそれぞれ処理したコバルト−クロム合金ディスク上における細胞増殖活性を評価した結果を図８に示す。図８に示すように、結合体VEGF-DOPAで金属を処理することにより、HUVECの成長が促進されることが示された。これは、VEGFがDOPA含有ポリペプチドとの結合によって金属表面に固定化されやすくなったためと考えられる。特に、高pHにてVEGF-DOPAで処理した表面は顕著な細胞増殖を示した。DOPAペプチドのコンジュゲーションは、おそらくそのカテコール部分に起因して（Lee H, Scherer NF, Messersmith PB. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(35):12999-3003.）、効率的な表面コーティングによって金属ディスク上での細胞増殖を増強する。
【００６０】
以上の実験で示したように、連結酵素を用いた方法により、VEGFをDOPA含有ポリペプチドとコンジュゲートした。コンジュゲーションにより、金属表面に対するVEGFの結合アフィニティは有意に増強され、特に高pHではその結合がさらに増強された。結合したVEGF結合体は細胞増殖を増強した。VEGFを金属ステントの修飾に使用した場合には、内皮細胞がその表面を覆うと考えられる。
【００６１】
［実施例５］DOPA含有ポリペプチドとBMP2との結合体の作製
DOPA及びリシンを含むポリペプチド（XKXKX（XはDOPAを表す）：配列番号2）をBMP2に付加するため、追加のチロシン残基及びリシン残基（YKYKY：配列番号18）をN末端に含有するBMP2遺伝子を設計し、BamHIおよびHindIIIを制限酵素として使用して、pET15b発現ベクターに遺伝子を融合した。この発現ベクターを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、融合タンパク質BMP2-YKYKYを大量発現させた。
【００６２】
調製された、チロシン及びリシンを含有するBMP2（BMP2-YKYKY）を、Ni-NTAカラムで精製した。図９に示すように、精製後に分子量が約15kDaの明瞭なバンドが観察された。BMP2-YKYKYの分子量は、質量分析法でも確認した（図１０）。
【００６３】
続いて、チロシン残基をヒドロキシル化してDOPAに変換するためにチロシンヒドロキシラーゼ（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）を用いた反応を図２に示すように行った。その結果、図１１に示されるように、チロシンヒドロキシラーゼ反応が検出された（M: マーカー; 1:チロシンヒドロキシラーゼ反応前; 2:チロシンヒドロキシラーゼ反応後）。よって、BMP2-YKYKY中に組み込まれたチロシン残基がチロシンヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化(DOPA化)されたことを確認した。
【００６４】
さらに、DOPAの生成は、紫色のニトロブルーテトラゾリウムクロリド（NBT）を用いた染色によっても確認した。図１２に示されるように、L-DOPAの形成をNBT染色により確認することができた。
【００６５】
以上のようにして、C末端にDOPAが結合したBMP2-XKXKX（以下この結合体を「BMP2-DOPA」という）を得た。
【００６６】
［実施例６］BMP2-YKYKYの生物活性確認
マウス筋芽細胞（C2C12）を、10％(v/v)ウシ胎仔血清（FBS）（Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA）、0.5％(v/v) L-グルタミン（Cellgro, Manassas, VA）及び1％(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン（Hy-Clone, Pittsburgh, PA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Hy-Clone, Pittsburgh, PA）において増殖させた。培地を1日おきに交換した。1Xトリプシン（Cellgro, Manassas, VA）を使用して、細胞の分割及びプレーティングの間、フラスコから細胞を剥離させた。
【００６７】
C2C12細胞におけるBMP2-YKYKYの生物活性の結果を図１３に示す。96穴プレート（Corning, NY, USA）を用い、各穴には100μL(5000 cells/mL)のC2C12細胞溶液、10％血清DMEM/H培地およびBMP2が様々な濃度（0〜3200 ng/mL）になるように加え、CO2インキュベーター（SANYO, Tokyo, Japan）を用いて、37 ℃、5％CO2条件下2日間培養した。細胞活性は、細胞中のアルカリフォスファターゼ（ALP）濃度を測定することにより得た。ALPは骨代謝のマーカーとして広く用いられている酵素であり、その濃度により細胞活性を測定することができる。ALP活性測定に際し、C2C12細胞を、細胞破砕溶液（0.1％Triton X, 50 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl, pH 7.6）により破砕し、上清を得た。これに、p-ニトロフェニルリン酸を含む炭酸塩緩衝液を加えると、上清中に含まれるALPによりp-ニトロフェニルリン酸がp-ニトロフェノールとリン酸に分解され、生成したp-ニトロフェノールが黄色を呈するため、Mithras LB940蛍光プレートリーダー(Berthold Japan K.K., Tokyo, Japan)を用いて、405nmの吸光度を測定することによりALP活性が定量可能である。この測定には、ALP Lab assay kit (Wako Pure Chemicals, Tokyo, Japan)を用い、測定手順はキットマニュアルに従った。その結果、BMP2-YKYKYの濃度が800 ng/mLの場合に、アルカリフォスファターゼ(ALP)活性が最高に達した。なお、様々なBMP2-YKYKY濃度でのC2C12細胞の状態を、図１４に示す。
【００６８】
［実施例７］チタンプレートに対する結合体BMP2-DOPAの生物活性
チタンプレート（直径15mm、厚さ1mm：（株）大阪真空機器製作所、大阪、日本）にBMP2-DOPAを吸着するのは以下の手順で行った。チタンプレートを洗浄するため、チタンプレートをヘキサン（ナカライテスク、京都、日本）に浸漬し、超音波洗浄機(PasolinaTM: Fisher Scientific, Walthan, MA, USA)で10分間超音波洗浄した。プレートを室温で乾燥後、6N HCl （和光純薬、大阪、日本）に浸漬し、さらに10分間超音波洗浄し、MilliQ水で洗浄した。さらに、UVライトを15分間チタンプレートに照射した。20μM BMP2-YKYKY及びBMP2-DOPA  PBS溶液(pH 8.5)を調製し、その溶液にチタンプレートを2時間浸漬した。その後、PBS溶液（pH 7.4）で3回チタンプレート表面を洗い流した。
【００６９】
ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を、10％(v/v)ウシ胎仔血清（FBS）（Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA）、0.5％(v/v) L-グルタミン（Cellgro, Manassas, VA）及び1％(v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン（Hy-Clone, Pittsburgh, PA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Hy-Clone, Pittsburgh, PA）において増殖させた。1Xトリプシン（Cellgro, Manassas, VA）を使用して、細胞の分割及びプレーティングの間、フラスコから細胞を剥離させた。6穴プレート（Corning, NY, USA）に培養したhMSC細胞を1 mL (5,000 cells/mL)入れ、さらにBMP2-DOPAコートしたチタンプレートを浸漬させて、37℃、5％CO2条件下でCO2インキュベーターを用いて10日間培養した。培地は1日おきに交換した。光学顕微鏡で培養した細胞を観察したところ、固定化BMP2-DOPAは、hMSC細胞の分化を誘導し、球状に形態変化したhMSC細胞が観察された。BMP2-DOPA非固定のチタンプレートのみを浸漬した、Controlではそのような細胞は観察されなかった。この結果により、本実施例に示した方法は、BMP2の骨形成に寄与する生物活性を維持しつつ、BMP2をチタン表面等の生体移植部材に固定化するのに有効であることが示された。
【００７０】
図１５に示した写真は、hMSCsにおいてBMP2-DOPAにより分化が誘導されたことを示している。hMSCsは、培養培地中へのBMP2-DOPA固定化チタンプレートの導入により形態変化した。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号1：人工（合成ペプチド）（6番及び7番のXaaはヒドロキシプロリン（Hyp）であり、9番のXaaは3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（Dopa）である）
配列番号2〜7、16：人工（合成ペプチド）（Xaaは3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（Dopa）である）
配列番号8：人工（ソルターゼ認識配列）（Xaaは任意のアミノ酸である）
配列番号9〜12、15：人工（ソルターゼ認識配列）
配列番号13〜14：人工（合成オリゴヌクレオチド）
配列番号17〜18：人工（合成ペプチド）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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