(57)【要約】【課題】種々の組織を局所的に薬剤に暴露したり、種々の組織に局所的に遺伝子を導入したりすることによって、ヘテロな状態の組織を作成することができるようにする。【解決手段】上側収容室内に、対象組織及び第１の培養液を収容する工程と、前記上側収容室の下方に位置する下側収容室内に、第２の培養液を収容して、前記対象組織の一部分を、前記上側収容室と下側収容室との間を仕切る境界板２６に形成された連通孔２７から、前記第２の培養液に暴露させる工程と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上側収容室内に、対象組織及び第１の培養液を収容する工程と、
前記上側収容室の下方に位置する下側収容室内に、第２の培養液を収容して、前記対象組織の一部分を、前記上側収容室と下側収容室との間を仕切る境界板に形成された連通孔から、前記第２の培養液に暴露させる工程と、
を含むことを特徴とするヘテロな状態の組織の作成方法。
【請求項２】
前記第２の培養液は薬剤を含む請求項１に記載のヘテロな状態の組織の作成方法。
【請求項３】
前記第２の培養液は別の薬剤を含む他の培養液に交換される請求項２に記載のヘテロな状態の組織の作成方法。
【請求項４】
前記第２の培養液は遺伝子を含む請求項１に記載のヘテロな状態の組織の作成方法。
【請求項５】
前記対象組織の一部分を前記第２の培養液に暴露させた後、前記対象組織を前記上側収容室から取出す工程を更に含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘテロな状態の組織の作成方法。
【請求項６】
上側収容室を含む上層部と、該上層部の下側に位置し、下側収容室を含む下層部と、前記上側収容室と下側収容室との間を仕切る境界板とを備え、
前記上側収容室内には、対象組織及び第１の培養液が収容され、
前記下側収容室内には、第２の培養液が収容され、
前記境界板には、前記対象組織が通過不能な連通孔が形成され、
前記対象組織の一部分は、前記連通孔から下側収容室に露出して前記第２の培養液に暴露されることを特徴とするヘテロな状態の組織の作成装置。
【請求項７】
前記下側収容室は、互いに連通する第１側部、中央部、及び、第２側部を含み、前記中央部の上面は前記境界板によって覆われ、前記対象組織の一部分は前記中央部に露出する請求項６に記載のヘテロな状態の組織の作成装置。
【請求項８】
前記第１側部及び第２側部の上面は少なくとも一部が開放され、前記第１側部及び第２側部の一方に液供給装置から培養液が供給され、他方から液排出装置によって培養液が排出される請求項７に記載のヘテロな状態の組織の作成装置。
【請求項９】
前記第１側部及び第２側部内に、エレクトロポレーション用の一対の電極が配設される請求項７に記載のヘテロな状態の組織の作成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヘテロな状態の組織の作成方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を利用したさまざまな研究が行われており、先行研究では、細胞が自発的に複雑な構造を形成する例が報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、塊状の細胞の一種であるスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を培養する方法や装置も提案されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−２２６０４６号公報
【特許文献２】特願２０１４−２３４０９７号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ．，Ｔａｋａｔａ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｄａ，Ｍ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｅ．，Ｏｋｕｄａ，Ｓ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓａｓａｉ、Ｙ．，“Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃ−ｃｕｐ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｎａｔｕｒｅ  ４７２，ｐｐ．５１−５６，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の技術では、各種の細胞組織を各種の薬剤に暴露したり、各種の細胞組織に外部から遺伝子を導入したりすることが想定されていなかった。
【０００６】
ここでは、前記従来の技術の問題点を解決して、種々の組織を局所的に薬剤に暴露したり、種々の組織に局所的に遺伝子を導入したりすることによって、ヘテロな状態の組織を作成することが可能な方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのために、ヘテロな状態の組織の作成方法においては、上側収容室内に、対象組織及び第１の培養液を収容する工程と、前記上側収容室の下方に位置する下側収容室内に、第２の培養液を収容して、前記対象組織の一部分を、前記上側収容室と下側収容室との間を仕切る境界板に形成された連通孔から、前記第２の培養液に暴露させる工程と、を含む。
【０００８】
他のヘテロな状態の組織の作成方法においては、さらに、前記第２の培養液は薬剤を含む。
【０００９】
更に他のヘテロな状態の組織の作成方法においては、さらに、前記第２の培養液は別の薬剤を含む他の培養液に交換される。
【００１０】
更に他のヘテロな状態の組織の作成方法においては、さらに、前記第２の培養液は遺伝子を含む。
【００１１】
更に他のヘテロな状態の組織の作成方法においては、さらに、前記対象組織の一部分を前記第２の培養液に暴露させた後、前記対象組織を前記上側収容室から取出す工程を更に含む。
【００１２】
また、ヘテロな状態の組織の作成装置においては、上側収容室を含む上層部と、該上層部の下側に位置し、下側収容室を含む下層部と、前記上側収容室と下側収容室との間を仕切る境界板とを備え、前記上側収容室内には、対象組織及び第１の培養液が収容され、前記下側収容室内には、第２の培養液が収容され、前記境界板には、前記対象組織が通過不能な連通孔が形成され、前記対象組織の一部分は、前記連通孔から下側収容室に露出して前記第２の培養液に暴露される。
【００１３】
他のヘテロな状態の組織の作成装置においては、さらに、前記下側収容室は、互いに連通する第１側部、中央部、及び、第２側部を含み、前記中央部の上面は前記境界板によって覆われ、前記対象組織の一部分は前記中央部に露出する。
【００１４】
更に他のヘテロな状態の組織の作成装置においては、さらに、前記第１側部及び第２側部の上面は少なくとも一部が開放され、前記第１側部及び第２側部の一方に液供給装置から培養液が供給され、他方から液排出装置によって培養液が排出される。
【００１５】
更に他のヘテロな状態の組織の作成装置においては、さらに、前記第１側部及び第２側部内に、エレクトロポレーション用の一対の電極が配設される。
【発明の効果】
【００１６】
本開示によれば、種々の組織を局所的に薬剤に暴露したり、種々の組織に局所的に遺伝子を導入したりすることによって、ヘテロな状態の組織を作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１の実施の形態における作成装置の構成を示す斜視図である。
【図２】第１の実施の形態における作成装置の下層部の構成を示す図である。
【図３】第１の実施の形態における作成装置の上層部の構成を示す図である。
【図４】第１の実施の形態における実際に作製された作成装置を示す写真である。
【図５】第１の実施の形態における作成装置の使用方法を示す図である。
【図６】第１の実施の形態における対象組織をヘテロな状態にする方法を説明する断面図である。
【図７】第１の実施の形態における境界板上に固定された対象組織の様子を説明する図及び写真である。
【図８】第１の実施の形態における境界板上に固定された対象組織の変形を説明する図である。
【図９】第１の実施の形態における作成装置を使用して作成したヘテロな状態の組織を説明する図及び写真である。
【図１０】第２の実施の形態における作成装置の使用方法を示す斜視図である。
【図１１】第２の実施の形態における作成装置を使用して作成したヘテロな状態の組織を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１９】
図１は第１の実施の形態における作成装置の構成を示す斜視図、図２は第１の実施の形態における作成装置の下層部の構成を示す図、図３は第１の実施の形態における作成装置の上層部の構成を示す図、図４は第１の実施の形態における実際に作製された作成装置を示す写真である。なお、図２及び３において、（ａ）は上面図、（ｂ）は斜視図であり、図４において、（ａ）は側面を示す写真、（ｂ）は上面を示す写真、（ｃ）は複数の作成装置を並列に並べた状態を示す写真である。
【００２０】
図において、１は本実施の形態における作成装置であって、ヘテロな状態の組織を作成するための装置である。ここで、組織とは、細胞組織であって、例えば、塊状の細胞の一種であるスフェロイド、動物の臓器の一部である組織片等である。また、ヘテロな状態とは、ホモジニアス（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）でなくヘテロジニアス（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）な状態であって、例えば、組織の一部分のみが各種の薬剤に暴露されたり、組織の一部分のみに各種の遺伝子が導入されたりすることにより、当該一部分又は当該一部分及びその近傍部分の性質乃至形質が局所的に組織の他の部分の性質乃至形質と異なっている状態である。なお、前記スフェロイドには、例えば、各種のガン細胞のスフェロイドや、ウシｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような幹細胞のスフェロイドが含まれる。また、前記組織片には、例えば、ヒトの肝臓の組織片、マウスの脳の組織片等のすべての組織片が含まれる。
【００２１】
なお、本実施の形態において、作成装置１の各部の構成及び動作を説明するために使用される上、下、左、右、前、後等の方向を示す表現は、絶対的なものでなく相対的なものであり、前記作成装置１の各部が図に示される姿勢である場合に適切であるが、その姿勢が変化した場合には姿勢の変化に応じて変更して解釈されるべきものである。
【００２２】
図に示される例において、前記作成装置１は、下層部１０と、該下層部１０の上に載置される上層部２０とを備える。前記下層部１０は、例えば、略直方体状の形状を有する下側本体１１と、該下側本体１１に形成された下側収容室としての下側ウェル１２とを含んでいる。また、前記上層部２０は、例えば、略円筒状の形状を有する上側本体２１と、該上側本体２１に形成された上側収容室としての上側ウェル２２とを含んでいる。
【００２３】
前記下側本体１１は、例えば、シリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から成る部材であるが、いかなる種類の材料から成るものであってもよく、また、その形状も、略直方体状に限定されるものでなく、いかなる形状であってもよい。図に示される例において、下側ウェル１２は、互いに隣接する第１側部１２ａ、中央部１２ｂ、及び、第２側部１２ｃを含んでいる。前記第１側部１２ａ、中央部１２ｂ、及び、第２側部１２ｃは、それぞれ、下側本体１１の厚さ方向（図１における上下方向）に延在する概略円筒状の空洞であり、図２（ａ）に示されるように、互いに隣接する空洞同士の一部が重複するように形成され、互いに連通している。なお、前記下側ウェル１２の下面は図示されない底板によって閉止され、前記下側ウェル１２の上面は開放されている。
【００２４】
前記上側本体２１は、例えば、シリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から成る部材であるが、いかなる種類の材料から成るものであってもよく、また、その形状も、略円筒状に限定されるものでなく、いかなる形状であってもよい。図に示される例において、上側ウェル２２は、上側本体２１の厚さ方向（図１における上下方向）に延在する概略円筒状の空洞である。そして、前記上側ウェル２２の下面は、境界板２６によって閉止され、前記上側ウェル２２の上面は開放されている。前記境界板２６は、例えば、ＰＤＭＳから成る厚さ約２０〔μｍ〕の薄膜部材であるが、いかなる種類の材料から成るものであってもよく、また、その厚さも適宜変更することができる。本実施の形態において、前記境界板２６の中央には、該境界板２６を厚さ方向（図１における上下方向）に貫通する連通孔２７が形成されている。該連通孔２７の直径は、例えば、１００〔μｍ〕以上であるが、これに限定されるものでなく、任意に設定することができる。前記連通孔２７の直径は、培養液が通過可能であって、かつ、後述される対象組織３１が通過不能な大きさに設定されるものであり、好適には１００〔μｍ〕〜３〔ｍｍ〕、さらに好適には１００〔μｍ〕〜５００〔μｍ〕である。
【００２５】
前記上層部２０が下層部１０の上に載置されると、前記上層部２０は、下側ウェル１２の中央部１２ｂの直上に位置し、少なくとも該中央部１２ｂの上面は上層部２０の下面によって覆われる。そして、上側ウェル２２と下側ウェル１２とは、連通孔２７を介して、連通する。例えば、前記上層部２０の外径は、中央部１２ｂの直径よりも大きく設定され、上側ウェル２２の直径は中央部１２ｂの直径と同等程度に設定されている。
【００２６】
図４は、実際に作製されたＰＤＭＳから成る作成装置１の写真であり、（ａ）は作成装置１の側面を撮影した写真、（ｂ）は作成装置１の上面を撮影した写真である。なお、実際にヘテロな状態の組織を作成する際には、図４（ｃ）に示されるように、複数の作成装置１を並列に配列して用いることが望ましい。
【００２７】
次に、前記作成装置１を使用してヘテロな状態の組織を作成する方法について説明する。まず、前記作成装置１の使用方法の概略について説明する。
【００２８】
図５は第１の実施の形態における作成装置の使用方法を示す図である。なお、図において、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ矢視断面図である。
【００２９】
図に示されるように、作成の対象となる組織としての対象組織３１は、上側ウェル２２内に収容される。前述のように、境界板２６に形成された連通孔２７のサイズは、対象組織３１が通過不能なように、該対象組織３１の外寸よりも小さく設定されている。なお、図に示される例において、対象組織３１の形状は、描画の都合上、球形となっているが、実際の対象組織３１の形状は、必ずしも球形ではないことを理解されたい。
【００３０】
そして、上側ウェル２２内には第１の培養液３５Ａが供給され、下側ウェル１２内には第２の培養液３５Ｂが供給されている。前記第１の培養液３５Ａと第２の培養液３５Ｂとは、必ずしも異なるものである必要はなく、同一のものである場合もある。なお、前記第１の培養液３５Ａと第２の培養液３５Ｂとを統合的に説明する場合には、培養液３５として説明する。
【００３１】
前記第１の培養液３５Ａは、必ずしも、上側ウェル２２内の全部を満たす必要はなく、対象組織３１の全体が覆われる程度の量であればよい。一方、前記第２の培養液３５Ｂは、下側ウェル１２内の全部を満たし、その表面（界面）が、上側ウェル２２の下面を閉鎖する境界板２６に到達していることが望ましい。これにより、対象組織３１における連通孔２７から下方に露出する部分は、第２の培養液３５Ｂに暴露されることとなる。
【００３２】
次に、前記作成装置１の使用方法について詳細に説明する。
【００３３】
図６は第１の実施の形態における対象組織をヘテロな状態にする方法を説明する断面図、図７は第１の実施の形態における境界板上に固定された対象組織の様子を説明する図及び写真、図８は第１の実施の形態における境界板上に固定された対象組織の変形を説明する図、図９は第１の実施の形態における作成装置を使用して作成したヘテロな状態の組織を説明する図及び写真である。なお、図６において、（ａ）〜（ｅ）は、各工程を示す図、（ｆ）及び（ｇ）は（ｅ）における要部拡大図であり、図７において、（ａ）は対象組織の断面図、（ｂ）は対象組織の上面を示す写真であり、図９において、（ａ）は組織の断面図、（ｂ）は組織の写真、（ｃ）及び（ｄ）は組織の蛍光写真である。
【００３４】
まず、図６（ａ）に示されるように、培養液３５も対象組織３１も収容されていない空の作成装置１を用意する。
【００３５】
続いて、該作成装置１の上側ウェル２２内に第１の培養液３５Ａを供給する。すると、該第１の培養液３５Ａは、境界板２６に形成された連通孔２７を通過して、下側ウェル１２に流入し、図６（ｂ）に示されるように、該下側ウェル１２に充満する。このとき、上側ウェル２２は、ある程度の第１の培養液３５Ａを収容しているが、第１の培養液３５Ａで充満されない状態となる。
【００３６】
続いて、図６（ｃ）に示されるように、導入装置４０を使用して、上側ウェル２２の上面から対象組織３１を上側ウェル２２内に導入する。この場合、対象組織３１とともに第１の培養液３５Ａも上側ウェル２２内に導入することが望ましい。これにより、第１の培養液３５Ａが上側ウェル２２内に補充される。なお、前記導入装置４０は、例えば、第１の培養液３５Ａに浸された状態の対象組織３１を導入できる程度に大径のピペット（Ｐｉｐｅｔｔｅ）であるが、対象組織３１を導入可能な装置乃至道具であれば、いかなる種類のものであってもよい。
【００３７】
上側ウェル２２内に対象組織３１が導入されるとともに、第１の培養液３５Ａが補充されるので、図６（ｄ）に示されるように、上側ウェル２２も第１の培養液３５Ａで充満される。すると、上側ウェル２２内の第１の培養液３５Ａの液面が、矢印Ｈで示されるだけ、下側ウェル１２内の第１の培養液３５Ａの液面より高くなるので、対象組織３１に、矢印Ｐで示されるように、液圧が作用する。その結果、対象組織３１は、境界板２６における連通孔２７の上に押し付けられた状態となり、その一部分が連通孔２７から下側ウェル１２の中央部１２ｂに露出する。
【００３８】
図７（ａ）には、境界板２６における連通孔２７の上に押し付けられた状態となっている対象組織３１が、細胞のスフェロイドである場合が示されている。該スフェロイドは、その大部分が上側ウェル２２内に位置するが、その下方の一部分が連通孔２７から下側ウェル１２に露出している。このような状態で培養されたスフェロイドは、図８に示されるように、分節型の形状に変化する。
【００３９】
図７（ｂ）には、実験例として、実際に作製された作成装置１の境界板２６における連通孔２７の上に、対象組織３１としてのスフェロイドが押し付けられた状態を、上方から撮影した写真が示されている。図７（ｂ）に示される例において、対象組織３１は、マウスＥＳ細胞のＥＢ（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）であり、連通孔２７の直径は２００〔μｍ〕である。
【００４０】
なお、下側ウェル１２内の培養液３５を第１の培養液３５Ａから第２の培養液３５Ｂに交換する場合には、図６（ｅ）に示されるように、下側ウェル１２の第１側部１２ａの上面から、液排出装置４２によって、下側ウェル１２内の第１の培養液３５Ａを吸引して排出するとともに、下側ウェル１２の第２側部１２ｃの上面から、液供給装置４１によって、下側ウェル１２内に第２の培養液３５Ｂを供給する。このように、下側ウェル１２の上面の一端から第１の培養液３５Ａを排出しつつ、下側ウェル１２の上面の他端から第２の培養液３５Ｂを供給することにより、下側ウェル１２内の培養液３５を第１の培養液３５Ａから第２の培養液３５Ｂに交換することができる。なお、前記液排出装置４２は、例えば、アスピレーター（Ａｓｐｉｒａｔｏｒ）であるが、培養液３５等の液体を吸引して排出可能な装置乃至道具であれば、いかなる種類のものであってもよい。また、前記液供給装置４１は、例えば、ピペットであるが、培養液３５等の液体を供給可能な装置乃至道具であれば、いかなる種類のものであってもよい。
【００４１】
前記液供給装置４１によって下側ウェル１２の第２側部１２ｃの上面から培養液３５を供給すると、図６（ｆ）に示されるように、下側ウェル１２の第１側部１２ａの上面においては、培養液３５の液面３５ｓが、表面張力により、球面のように盛り上がる。そこで、該球面の部分から、前記液排出装置４２によって培養液３５を吸引して排出することが望ましい。これにより、下側ウェル１２の第１側部１２ａの上面における培養液３５の液面３５ｓは、図６（ｇ）に示されるように、ほぼ平らになる。
【００４２】
このように、上側ウェル２２内に対象組織３１を移し替えることなく、下側ウェル１２内の培養液３５を第１の培養液３５Ａから第２の培養液３５Ｂに交換することができるので、対象組織３１の組織がダメージを受けることがなく、かつ、コンタミネーションの危険性がない。
【００４３】
ここで、第２の培養液３５Ｂが、例えば、所定の薬剤を含有したものであるとすると、対象組織３１における連通孔２７から下方に露出する部分は、局所的に、所定の薬剤に暴露されることとなる。これにより、前記対象組織３１は、一部分のみが所定の薬剤に暴露されることによって、当該一部分又は当該一部分及びその近傍部分の性質乃至形質が他の部分と異なったヘテロな状態の組織となる。そして、このようにヘテロな状態の組織となった対象組織３１を作成装置１の上側ウェル２２から取出すことにより、ヘテロな状態の組織を容易に、かつ、正確に観察したり検査したりすることができる。
【００４４】
また、第１の培養液３５Ａと第２の培養液３５Ｂとが互いに異なる薬剤を含有したものであるとすると、対象組織３１における上側ウェル２２内の部分と連通孔２７から下方に露出する部分とは、それぞれ、局所的に異なる薬剤に暴露されることとなる。これにより、前記対象組織３１は、複数の部分が異なる薬剤に暴露されることによって、当該部分同士又は当該部分及びその近傍部分同士の性質乃至形質が互いに異なったヘテロな状態の組織となる。そして、このようにヘテロな状態の組織となった対象組織３１を作成装置１の上側ウェル２２から取出すことにより、ヘテロな状態の組織を容易に、かつ、正確に観察したり検査したりすることができる。
【００４５】
本実施の形態においては、実験例として、細胞のスフェロイドの上下の部分を異なる蛍光物質で染色する実験が行われた。図９（ａ）には、境界板２６における連通孔２７の上に押し付けられた状態となっている対象組織３１が細胞のスフェロイドであり、上側ウェル２２内に第１の培養液３５Ａが供給され、下側ウェル１２内に第２の培養液３５Ｂが供給された場合が示されている。なお、対象組織３１は、マウスＥＳ細胞のＥＢである。
【００４６】
実際に作製された作成装置１内において、一晩培養された対象組織３１としてのスフェロイドは、図９（ａ）に示されるように、分節型の形状に変化した。続いて、上側ウェル２２内の第１の培養液３５Ａとして、蛍光色素であるＨｏｅｃｈｓｔを含有する培養液３５を使用し、下側ウェル１２内の第２の培養液３５Ｂとして、ミトコンドリアの蛍光染色色素であるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｒ）  Ｏｒａｎｇｅを含有する培養液３５を使用して、前記スフェロイドを染色した。そして、染色されたスフェロイドである対象組織３１は、作成装置１の上側ウェル２２から取出された。
【００４７】
図９（ｂ）には、取出されたスフェロイドの写真が示されている。分節型の形状になっていることが分かる。図９（ｃ）はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｒ）  Ｏｒａｎｇｅによる染色を示す取出されたスフェロイドの蛍光写真であり、図９（ｄ）はＨｏｅｃｈｓｔによる染色を示す取出されたスフェロイドの蛍光写真である。図９（ｂ）〜（ｄ）から、スフェロイドの各部が異なる色で染色されたことが分かる。
【００４８】
これにより、上側ウェル２２に供給される第１の培養液３５Ａと下側ウェル１２に供給される第２の培養液３５Ｂとを、互いに異なる薬剤を含有したものにすると、対象組織３１における上側ウェル２２内の部分と連通孔２７から下方に露出する部分とが、それぞれ、局所的に異なる薬剤に暴露され、性質乃至形質が互いに異なった複数の部分を備えるヘテロな状態の組織となることが確認された。
【００４９】
また、別の種類の薬剤をそれぞれ含有した複数種類の第２の培養液３５Ｂをあらかじめ用意しておき、下側ウェル１２に供給される第２の培養液３５Ｂを順次入れ替えることによって、複数種類の薬剤が対象組織３１に及ぼす影響を順次観察したり検査したりすることができる。すなわち、ある種の組織から成る対象組織３１に対して効果を発見する薬剤を見つけ出すための、薬剤のスクリーニングを効率的に行うことができる。
【００５０】
さらに、前記第２の培養液３５Ｂが、例えば、所定の遺伝子を含有したものであるとすると、対象組織３１における連通孔２７から下方に露出する部分には、局所的に、前記遺伝子が導入されることとなる。これにより、一部分のみに所定の遺伝子が導入されることによって、当該一部分又は当該一部分及びその近傍部分の性質乃至形質が他の部分と異なったヘテロな状態の組織となる。
【００５１】
例えば、生体内におけるガン細胞は、一般的に、血管に付着しているので、該血管に付着した部分が、まず、生体に投与されて血液中に含まれた抗がん剤等の薬剤に暴露され、前記血管に付着した部分又は当該部分及びその近傍部分の性質乃至形質が、薬剤によって、他の部分と異なった状態になる、と考えられる。したがって、上述のようにしてヘテロな状態の組織となった対象組織３１を作成装置１の上側ウェル２２から取出すことにより、生体内における各種の組織と同様の、ヘテロな状態の組織を観察したり検査したりすることができる。
【００５２】
このように、本実施の形態において、ヘテロな状態の組織の作成方法は、上側ウェル２２内に、対象組織３１及び第１の培養液３５Ａを収容する工程と、上側ウェル２２の下方に位置する下側ウェル１２内に、第２の培養液３５Ｂを収容して、対象組織３１の一部分を、上側ウェル２２と下側ウェル１２との間を仕切る境界板２６に形成された連通孔２７から、第２の培養液３５Ｂに暴露させる工程と、を含んでいる。これにより、容易に、かつ、確実にヘテロな状態の組織を作成することができる。
【００５３】
また、ヘテロな状態の組織の作成装置１は、上側ウェル２２を含む上層部２０と、上層部２０の下側に位置し、下側ウェル１２を含む下層部１０と、上側ウェル２２と下側ウェル１２との間を仕切る境界板２６とを備え、上側ウェル２２内には、対象組織３１及び第１の培養液３５Ａが収容され、下側ウェル１２内には、第２の培養液３５Ｂが収容され、境界板２６には、対象組織３１が通過不能な連通孔２７が形成され、対象組織３１の一部分は、連通孔２７から下側ウェル１２に露出して第２の培養液３５Ｂに暴露される。これにより、簡素な構成でありながら、容易に、かつ、確実にヘテロな状態の組織を作成することができる。そして、作成されたヘテロな状態の組織を作成装置１から取出して、正確に観察したり検査したりすること可能となる。
【００５４】
さらに、第２の培養液３５Ｂは薬剤を含む。したがって、局所的に薬剤の影響を受けた組織を作成することができる。
【００５５】
さらに、第２の培養液３５Ｂは別の薬剤を含む他の培養液に交換される。これにより、薬剤のスクリーニングを効率的に行うことができる。
【００５６】
さらに、下側ウェル１２は、互いに連通する第１側部１２ａ、中央部１２ｂ、及び、第２側部１２ｃを含み、中央部１２ｂの上面は境界板２６によって覆われ、対象組織３１の一部分は中央部１２ｂに露出する。さらに、第１側部１２ａ及び第２側部１２ｃの上面は少なくとも一部が開放され、第１側部１２ａ及び第２側部１２ｃの一方に液供給装置４１から培養液が供給され、他方から液排出装置４２によって培養液が排出される。これにより、第２の培養液３５Ｂを容易に入れ替えることができ、対象組織３１の組織がダメージを受けることがなく、かつ、コンタミネーションの危険性がない。
【００５７】
次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、前記第１の実施の形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
【００５８】
図１０は第２の実施の形態における作成装置の使用方法を示す斜視図、図１１は第２の実施の形態における作成装置を使用して作成したヘテロな状態の組織を示す写真である。なお、図１１において、（ａ）は組織の写真、（ｂ）は組織の蛍光写真である。
【００５９】
図１０に示されるように、本実施の形態において、作成装置１は一対の電極４５を更に備える。該電極４５の各々は、その先端が下側ウェル１２内の第１側部１２ａ及び第２側部１２ｃ内に配設され、その基端は図示されない電源に接続されている。これにより、下側ウェル１２内の培養液３５に電気パルスを印加することができる。
【００６０】
本実施の形態においては、実験例として、ヒトｉＰＳ細胞のスフェロイドに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子を導入する実験が行われた。
【００６１】
具体的には、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培養液を用いてヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２株）を培養することによって作成されたスフェロイドを対象組織３１として使用した。作成されたスフェロイドである対象組織３１は、作成装置１に移され、前記第１の実施の形態と同様に、上側ウェル２２内に収容された。また、該上側ウェル２２内には、第１の培養液３５Ａとして、前記Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培養液が供給された。さらに、下側ウェル１２内には、第２の培養液３５Ｂとして、ＧＦＰの遺伝子を懸濁させた細胞懸濁液、具体的には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培養液にｃａｇ−ＧＦＰ遺伝子を加えたものが供給された。
【００６２】
続いて、前記一対の電極４５により、下側ウェル１２内の第２の培養液３５Ｂに電気パルスとして、細胞膜に微細孔を穿つポアリングパルス、及び、遺伝子や薬剤を細胞内に送り込むトランスファーパルスが印加され、電気穿孔法、すなわち、エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）が行われた。前記ポアリングパルスは、電圧が２００〔Ｖ〕、パルス長が５〔ｍｓｅｃ〕、パルスインターバルが５０〔ｍｓｅｃ〕、パルス数が２、減衰率が１０であった。前記トランスファーパルスは、電圧が３０〔Ｖ〕、パルス長が５０〔ｍｓｅｃ〕、パルスインターバルが５０〔ｍｓｅｃ〕、パルス数が５、減衰率が１０であった。なお、エレクトロポレーションは、周知の方法であるので、その説明は省略する。これにより、対象組織３１における連通孔２７から下方に露出する部分に、ＧＦＰの遺伝子が導入された。
【００６３】
続いて、ＧＦＰの遺伝子が導入された対象組織３１は、作成装置１の上側ウェル２２から取出されて皿状の培養容器に移され、該培養容器内に収容された培地に浸された状態で培養された。
【００６４】
図１１には、前記培養容器内での培養開始から一晩経過した対象組織３１としてのヒトｉＰＳ細胞のスフェロイドの写真が示されている。図１１（ａ）は前記ヒトｉＰＳ細胞のスフェロイドの写真であり、図１１（ｂ）はＧＦＰの遺伝子による蛍光を観察するための前記ヒトｉＰＳ細胞のスフェロイドの蛍光写真である。
【００６５】
図１１から、対象組織３１としてのヒトｉＰＳ細胞のスフェロイドにおいては、ＧＦＰの遺伝子が導入された一部分又は当該一部分及びその近傍部分のみ、その性質が変化乃至その形質が転換して、局所的に、蛍光を発光していることが分かる。
【００６６】
これにより、下側ウェル１２内に供給される第２の培養液３５Ｂを所定の遺伝子を含有したものにすると、対象組織３１における連通孔２７から下方に露出する部分には、局所的に、前記遺伝子が導入され、これにより、前記対象組織３１は、一部分のみに所定の遺伝子が導入されることによって、当該一部分又は当該一部分及びその近傍部分の性質乃至形質が他の部分と異なったヘテロな状態の組織となることが確認された。
【００６７】
このように、本実施の形態においては、第２の培養液３５Ｂは遺伝子を含む。したがって、局所的に遺伝子が導入され、局所的に性質が変化したり形質が転換したヘテロな状態の組織を得ることができる。
【００６８】
また、第１側部１２ａ及び第２側部１２ｃ内に、エレクトロポレーション用の一対の電極４５が配設される。したがって、対象組織３１の一部分のみに確実に遺伝子を導入することができる。
【００６９】
以上説明したように、前記第１及び第２の実施の形態におけるヘテロな状態の組織の作成方法及びヘテロな状態の組織の作成装置１は、各種の細胞、スフェロイド、組織片等の組織の培養を行うことができるのみならず、生体内における各種の組織と同様のヘテロな状態の組織を容易に、かつ確実に作成することができるものである。したがって、前記第１及び第２の実施の形態における開示は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような幹細胞の分化誘導、ガン細胞その他の各種細胞や各種組織片の特定部位に対する各種薬剤の効果の確認、ガン細胞その他の各種細胞や各種組織片の特定部位に対して効果のある薬剤のスクリーニング、各種細胞や各種組織片の特定部位への所定の遺伝子の導入等のように、広汎な分野に適用することができる。
【００７０】
なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することにより、当然に考え付くことである。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、ヘテロな状態の組織の作成方法及び装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００７２】
１    作成装置
１０    下層部
１２    下側ウェル
１２ａ    第１側部
１２ｂ    中央部
１２ｃ    第２側部
２０    上層部
２２    上側ウェル
２６    境界板
２７    連通孔
３１    対象組織
３５Ａ    第１の培養液
３５Ｂ    第２の培養液
４１    液供給装置
４２    液排出装置
４５    電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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