(57)【要約】【課題】ビフェニル分解菌を効率よく、かつ精度よく探索することが可能なビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌を提供する。【解決手段】本発明の一形態に係るビフェニル分解菌の探索方法は、土壌から複数の菌を分離する工程を含む。  ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、上記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補が検出される。【選択図】図２
2017123797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌から複数の菌を分離し、
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、前記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、前記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出する
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項２】
請求項１に記載のビフェニル分解菌の探索方法であって、
前記土壌は、植物根圏土壌である
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のビフェニル分解菌の探索方法であって、
前記ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡは、複数の既知のビフェニル分解菌のビフェニル分解酵素のアミノ酸配列において相互に配列類似性の高いアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項４】
請求項３に記載のビフェニル分解菌の探索方法であって、
前記複数の既知のビフェニル分解菌は、５以上の既知のビフェニル分解菌を含む
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれの１項に記載のビフェニル分解菌の探索方法であって、さらに、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に前記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して前記ビフェニル分解菌候補が前記溶液中のビフェニル誘導体又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、前記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項６】
請求項１から５のうちのいずれか１項に記載のビフェニル分解菌の探索方法であって、
前記ビフェニル誘導体は、ＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）である
ビフェニル分解菌の探索方法。
【請求項７】
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
土壌から複数の菌を分離し、
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、前記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、前記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出し、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に前記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して前記ビフェニル分解菌候補が溶液中のビフェニル又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、前記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する
ことで検出されたビフェニル分解菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢｓは、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、ビフェニル誘導体の一つである。ＰＣＢｓは、一般に、耐熱性、電気絶縁性、耐薬品性等に優れた性質を有し、このような優れた性質を活かして非常に多岐にわたる分野の製品に使用されてきたが、生体に対する毒性が高いことが判明している。これにより、現在ではＰＣＢｓの使用が規制されているが、ＰＣＢｓは化学的な安定性が高いため、既に使用されている製品を介して生体や環境へ悪影響を及ぼすことが懸念されている。
【０００３】
そこで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を無害化する取り組みがなされている。
例えば、特許文献１には、微生物を含む組成物を用いてビフェニル又はその誘導体（例えばＰＣＢｓ）を分解させる技術が記載されている。同文献には、ＰＣＢｓ分解用組成物の製造に使用し得る微生物のスクリーニング方法として、ビフェニルを単一の炭素現として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことが記載されている（同文献の段落［0021］参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１７９８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のスクリーニング方法によれば、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物を繰り返しスクリーニングすることから、目的の微生物の探索に長時間を要していた。
また、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物を培養し、増殖させようとした場合、目的とする微生物以外の微生物も増殖する可能性があった。このため、培養工程の後、多くの検体を試験対象とした代謝試験を実施する必要が生じ、目的の微生物を取得するまでさらに長時間を要する可能性があった。
さらに、特殊な環境で長時間微生物を培養した場合、遺伝的な偏りが生じ、当初の生物相から変化が生じる可能性もあった。
【０００６】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、ビフェニル分解菌を効率よく、かつ精度よく探索することが可能なビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係るビフェニル分解菌の探索方法は、土壌から複数の菌を分離する工程を含む。
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、上記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補が検出される。
上記ビフェニル分解菌の探索方法によれば、土壌から分離した菌に対して、上記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、ビフェニル分解酵素をコードする遺伝子を有するビフェニル分解菌候補を簡便に、かつ効率よく検出することができる。さらに、ビフェニル分解酵素遺伝子の有無に基づいてビフェニル分解菌候補を検出できるため、ビフェニル分解菌の可能性が高いビフェニル分解菌候補を選抜することが可能となる。
【０００８】
上記土壌は、植物根圏土壌であってもよい。
植物根圏土壌は、微生物を豊富に含むため、ビフェニル分解菌候補を検出できる確率を高めることができる。
【０００９】
上記ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡは、複数の既知のビフェニル分解菌のビフェニル分解酵素のアミノ酸配列において相互に配列類似性の高いアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいてもよい。
これにより、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列を、多様な菌のビフェニル誘導体をコードするＤＮＡに共通する配列に基づいて決定することができ、ビフェニル分解菌候補を精度よく検出することができる。
【００１０】
この場合、上記複数の既知のビフェニル分解菌は、５以上の既知のビフェニル分解菌を含んでいてもよい。
これにより、ビフェニル分解菌候補をより精度よく検出することができる。
【００１１】
上記ビフェニル分解菌の探索方法は、さらに、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に上記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して上記ビフェニル分解菌候補が上記溶液中のビフェニル誘導体又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、上記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する工程を含んでいてもよい。
これにより、ビフェニル分解菌候補のうち、実際にビフェニル又はその誘導体を分解菌する菌をビフェニル分解菌と推定することができる。
【００１２】
具体的には、上記ビフェニル誘導体は、ＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）であってもよい。
【００１３】
本発明の他の形態に係るオリゴヌクレオチドは、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能である。
【００１４】
また、本発明のさらに他の形態に係るビフェニル分解菌は、
土壌から複数の菌を分離し、
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、上記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出し、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に上記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して上記ビフェニル分解菌候補が溶液中のビフェニル又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、上記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する。
【発明の効果】
【００１５】
以上のように、本発明によれば、ビフェニル分解菌を効率よく、かつ精度よく探索することが可能なビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ビフェニル分解菌として知られているシュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）KKS102株におけるＰＣＢｓの分解経路を模式的に示す図である。
【図２】本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
【図４】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図５】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図６】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図７】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図８】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図９】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図１０】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［本発明の概要］
本発明は、遺伝子マーカーを用いてビフェニル分解酵素遺伝子の有無を診断することで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌を検出することを特徴とする。以下、詳細について説明する。
【００１８】
［ビフェニル誘導体］
ビフェニル誘導体とは、ビフェニルを母体とし、ビフェニルに官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなどの改変がなされた化合物をいう。ビフェニル誘導体は、一般に安定性が高く、生分解性が低い。
具体的には、ビフェニル誘導体は、後述するＰＣＢｓ、アルキルビフェニル等が挙げられる。
【００１９】
［ＰＣＢｓ］
ＰＣＢｓは、上述のように、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、一般式は、C12H(10−n)Cln (1≦n≦10)で表される。具体的には、ＰＣＢｓとしては、３，４，４'，５−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３，３'，４，４'−ペンタクロロビフェニール、２，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２'，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール等を挙げることができる。
ＰＣＢは、通常ＰＣＢ単体の混合物として市販されており、これらがコンデンサやトランスに使用されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）のＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）、ＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロロベンゼン＝６０／４０（質量比）の混合物）や、三菱モンサント（株）のアロクロール１２５４（５４％ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等が挙げられる。
これらのＰＣＢｓは、ビフェニル分解菌により分解されることが知られている（特許文献１参照）。
【００２０】
［ビフェニル分解菌］
ビフェニル分解菌は、ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡ（以下、ビフェニル分解酵素遺伝子とも称する）を有する真正細菌である。ビフェニル分解菌としては、例えば、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルカニボラックス（Alcanivorax）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、コマモナス（Comamonas）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomanas）属、及びシュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）等に属する真正細菌が挙げられるが、これに限定されない。
なお、以下の説明において単に「菌」という場合、真正細菌をいうものとする。
ビフェニル分解酵素は、ビフェニルを分解する酵素であり、さらにビフェニルを分解することで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体も分解することが可能である。ビフェニル分解菌としては、具体的には、ビフェニルジオキシゲナーゼ、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ等を挙げることができる。
ビフェニル分解酵素遺伝子は、具体的には、ビフェニルジオキシゲナーゼをコードするＢｐｈＡ、ジハイドロジオールデヒドロゲナーゼをコードするＢｐｈＢ、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼをコードするＢｐｈＣ、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼをコードするＢｐｈＤ等が挙げられる。
【００２１】
図１は、ビフェニル分解菌として知られているシュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）KKS102株におけるＰＣＢｓの分解経路を模式的に示す図である（例えば、Kikuchi Y. et al, Journal of Bacteriology, Vol.176, No.6, p.1689-1694, 1994参照）。なお、上述の分解経路は一例であり、他の細菌においては異なる経路をとり得る。
この経路において、ＰＣＢｓは、まず、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）により、２つの水酸基（ＯＨ）が付加される。ＢｐｈＡ酵素は４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ４）から構成されている。そして、図１に示す通り、ＢｐｈＡ１とＢｐｈＡ２とが複合体を形成し、基質との結合及び酸素添加反応を触媒し、フェレドキシンが電子伝達体として機能し、フェレドキシンリダクターゼがＮＡＤ又はＮＡＤＰＨとフェレドキシンの酸化還元反応を触媒する。
続いてジヒドロジオールジヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ酵素）によって、ＢｐｈＡの産物から２つの水素が除かれた後、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ酵素）により、ＢｐｈＢ産物に酸素１分子が付加され、ＨＯＰＤＡ（ＢｐｈＤの誘導基質）が生成する。ついで、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ酵素）が、ＨＯＰＤＡを安息香酸と２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートとに分解する。
その後、図示はしないが、２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートヒドラターゼ（ＢｐｈＥ酵素）、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ（ＢｐｈＦ酵素）及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＧ酵素）によりアセチルＣｏＡとピルビン酸に転換されると考えられる。
【００２２】
［ビフェニル分解菌の探索方法］
図２は、本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
同図に示すように、本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法は、複数の菌を分離するステップ（ＳＴ１１）と、ビフェニル分解菌候補を検出するステップ（ＳＴ１２）と、ビフェニル分解菌候補に対してビフェニル分解試験を行い、ビフェニル分解菌を検出するステップ（ＳＴ１３）と、を含む。以下、各ステップについて説明する。
【００２３】
まず、図２に示すように、土壌から複数の菌を分離する（ＳＴ１１）。
ここでいう土壌は、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体による汚染が疑われていない土壌でもよい。本発明は、ビフェニル分解菌を非常に効率よく検出できるため、汚染が疑われていない土壌からでもビフェニル分解菌を検出することができる。
また、ここでいう土壌は、例えば植物根圏土壌でもよい。植物根圏土壌は、植物の根の周囲の土壌をいい、植物の根の一部を含んでいてもよい。植物の根は、呼吸の作用や栄養分と水分を吸収する作用によって、周囲の土壌の栄養分組成を変化させるとともに、ｐＨを変化させ得る。また、植物の根は、分泌物を分泌させるとともに、根毛を脱落させ得る。これにより、植物根圏土壌は、他の領域の土壌と比較して異なる組成を有し、一般に多くの微生物を含む。さらに、植物由来の化合物がビフェニル分解遺伝子を誘発させることが知られているため、このような化合物が存在し得る植物根圏土壌は、ビフェニル分解遺伝子を有するビフェニル分解菌を含む可能性がある。したがって、本発明の土壌として植物根圏土壌を用いることで、ビフェニル分解菌を検出する可能性を高めることができる。
なお、土壌は上記に限定されず、浄水場等の活性汚泥、ＰＣＢｓ等による汚染が疑われる土壌等でもよい。
【００２４】
このような土壌から複数の菌を分離するには、例えば、平板希釈法を適用することができる。具体的には、まず、採取された土壌を液体培地や滅菌水等で希釈する。例えば、植物の根を含む植物根圏土壌を採取した場合は、固形分である根などをすりつぶし、採取した土壌の重量の９倍の液体で希釈する。これを１０倍希釈として、例えば１０倍ずつ希釈していき、１０２倍、１０３倍、１０４倍…の土壌希釈液を生成する。この作業により生成された各土壌希釈液を、それぞれ寒天培地へ播種する。あるいは、既知の最適な希釈倍率の土壌希釈液のみを寒天培地へ播種してもよい。植物根圏土壌の場合、最適な土壌の希釈倍率は一例として１０８倍である。
寒天培地は、典型的には、シャーレを用いた平板培地であるが、これに限定されない。寒天培地は、滅菌処理したものを用いることができる。
そして、土壌希釈液を播種した寒天培地を１日〜１０日ほど培養し、複数の菌のコロニーを形成させることで、複数の菌を分離する。培養条件は特に限定されず、通常の細菌培養に用いる条件を適用することができる。形成されたコロニーは、次ステップにおいて検体として用いられる。なお、次ステップで用いられるコロニーは、隣接するコロニーと分離して形成されたものが用いられる。これにより、異なる菌株のコンタミネーションを防止することができる。
【００２５】
続いて、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、分離された複数の菌の遺伝子にハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出する（ＳＴ１２）。
本ステップでは、上記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした遺伝子を有する菌を、ビフェニル分解菌候補として検出することができる。
ここでいうハイブリダイズは、本発明のオリゴヌクレオチドがビフェニル分解酵素遺伝子内の標的配列と相補的に結合することである。
また、ここでいう「ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズする」とは、ビフェニル分解酵素遺伝子の一部のＤＮＡ配列にハイブリダイズすること、及びビフェニル分解酵素遺伝子の全体にハイブリダイズすることを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法のプライマー、ハイブリダイゼーション法の核酸プローブ、固相担体に結合された捕捉プローブ等、分子生物学的な種々の検出方法に用いることができる。なお、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識化されずに用いられてもよいし、放射性物質や蛍光・発光物質、酵素や酵素基質等の標識物によって標識化して核酸プローブやプライマーとして用いることもできる。オリゴヌクレオチドの詳細については、後述する。
【００２６】
分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出するには、例えば、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法により標的配列が増幅するか否か確認することができる。
具体的には、まず、前ステップにおいて形成されたコロニーに含まれる菌のＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅用反応液を調製する。テンプレートＤＮＡは、各コロニーに含まれる菌体からＤＮＡを抽出したものとすることができる。ＰＣＲ反応液は、テンプレートＤＮＡ、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファ、及び滅菌蒸留水等を混合したものとすることができる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファ等に替えて、予めこれらの試薬が混合された市販のＰＣＲ用酵素を用いることもできる。次に、サーマルサイクラー等を用いて熱変性反応、アニーリング反応、及び伸長反応を連続して行い、これを所定サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲ法による増幅反応を行う。ＰＣＲ法における反応条件等は、使用するポリメラーゼの種類やプライマーのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。そして、その反応後の反応液中の増幅産物を確認し、所望のＤＮＡ断片が増幅されているか否か確認する。このように、所望のＤＮＡ断片が増幅されている（陽性）菌を、ビフェニル分解菌候補として検出する。
増幅産物の確認方法も特に限定されず、例えば、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、シーケンス解析による塩基配列を決定する方法等を適用することができる。このうち、アガロースゲル電気泳動法が簡便に増幅産物を確認でき、より好ましい。
【００２７】
また、本ステップでは、１種類のビフェニル分解酵素に対応するオリゴヌクレオチドのみならず、異なるビフェニル分解酵素にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを用いて、ビフェニル分解菌候補を検出してもよい。上述のように、通常、ビフェニル分解菌は、ＢｐｈＡ，ＢｐｈＢ，ＢｐｈＣ及びＢｐｈＤ（ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤ）の分解酵素をコードするＤＮＡを有していると考えられる。このため、例えば、Ｓ１２のステップが以下のようなステップを含んでいてもよい。
まず、ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤのうちの１つの酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、Ｓ１１で分離された菌のＤＮＡにハイブリダイズさせる。その後、Ｓ１１で分離された菌、又は前ステップでハイブリダイズされた菌に、ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤのうちの他の酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
これにより、遺伝子診断によって実際にビフェニルの分解能を有する菌を精度よく検出することができる。
【００２８】
最後に、ＰＣＢｓを含む溶液中に検出されたビフェニル分解菌候補を添加してビフェニル分解菌候補が溶液中のＰＣＢｓを分解するか否か判定し（ビフェニル分解試験）、分解すると判定された場合、当該ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ１３）。
本ステップでは、まず、ビフェニル分解菌候補として検出された各菌を、ビフェニル又はその誘導体を添加した溶液に加え、ビフェニル又はその誘導体と反応させる。ビフェニルの誘導体としては、例えば、ＰＣＢｓ、アルキルビフェニル等を用いることができ、このうちＰＣＢｓとしては、上述の「ＰＣＢｓ」の説明で挙げた化合物等を用いることができる。また、ビフェニル又はその誘導体の溶液中の濃度としては、例えば０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度とすることができる。ビフェニル分解菌候補の添加量は特に限定されない。また、培地は、ビフェニル分解菌候補が培養可能な培養液を用いることができる。培養条件は特に限定されず、例えば温度が約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃であり、ｐＨは６〜９とすることができる。また、反応中、溶液を攪拌してもよい。反応期間は例えば１〜５日とすることができる。
続いて、各培養液中に添加したＰＣＢｓが分解されたか否か評価する。評価方法は、例えば、ガスクロマトグラフィ等を適用することができる。
【００２９】
以上の各ステップにより、ビフェニル分解菌を検出することができる。
なお、本発明のビフェニル分解菌の探索方法は、ＳＴ１１及びＳＴ１２のステップで精度よくビフェニル分解菌候補を検出できるならば、ＳＴ１３のステップを有さなくてもよい。
【００３０】
さらに、ＳＴ１３のステップでビフェニル分解菌候補を培養している間にＤＮＡ配列が変化する可能性がある場合には、以下に示すように再度遺伝子診断を行ってもよい。
すなわち、ＳＴ１３のステップの後、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、ＳＴ１３で推定されたビフェニル分解菌の遺伝子にハイブリダイズさせることで、上記推定されたビフェニル分解菌がビフェニル分解菌であることを確認してもよい。本ステップは、ＳＴ１２と同様に行うことができる。
また、本ステップにおけるオリゴヌクレオチドは、ＳＴ１２で用いたものと同一のオリゴヌクレオチドでもよいし、異なるものでもよい。例えば、本ステップで用いるオリゴヌクレオチドは、ＳＴ１２で用いたオリゴヌクレオチドがターゲットとするビフェニル分解酵素遺伝子とは異なるビフェニル分解酵素遺伝子をターゲットとするものでもよい。
これにより、ビフェニル分解能を有するビフェニル分解菌をより確実に探索することができる。
【００３１】
［オリゴヌクレオチド］
本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることができるものである。
上記ＤＮＡは、複数のビフェニル分解菌のビフェニル分解酵素のアミノ酸配列において相互に配列類似性の高いアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいてもよい。当該複数のビフェニル分解菌としては、ビフェニル分解酵素遺伝子を有し、かつそのビフェニル分解酵素遺伝子のアミノ酸配列が既知の細菌を適用することができる。具体的には、例えば、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルカニボラックス（Alcanivorax）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、コマモナス（Comamonas）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomanas）属、及びシュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）等に属する既知のビフェニル分解菌が挙げられる。
また、配列類似性の比較対象となる複数のビフェニル分解菌は、例えば、５以上のビフェニル分解菌を含んでいてもよく、より好ましくは８以上のビフェニル分解菌を含んでいればよい。これにより、アミノ酸配列の相同性について精度よく検討することができる。
また、配列類似性の高いアミノ酸配列は、例えば、比較対象となる複数のビフェニル分解菌において、同一のアミノ酸が４以上連続する配列を含むアミノ酸配列をいうものとする。
例えば、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用のプライマーの場合、上記アミノ酸配列に対応する塩基配列をそれぞれ有する複数のプライマーを混合した、いわゆる縮重プライマーとすることができる。これにより、上記アミノ酸配列に対応するコドンの揺らぎを考慮して、１回のＰＣＲでより多くの菌株を検出することができる。また、複数のプライマーの数は、例えば１２８以下、好ましくは４８以下、より好ましくは３２以下とすることができる。これにより、ＰＣＲ反応液中の実効的なプライマー濃度の低下を抑制し、プライマーの検出感度を維持することができる。
【００３２】
［ビフェニル分解菌］
本発明のビフェニル分解菌は、土壌から複数の菌を分離し（ＳＴ１１）、ＰＣＢｓを分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、当該分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、当該分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出し（ＳＴ１２）、ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に検出されたビフェニル分解菌候補を添加してビフェニル分解菌候補が溶液中のビフェニル又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ１３）、ことで検出されたビフェニル分解菌である。すなわち、本発明のビフェニル分解菌は、上記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることが可能なＤＮＡを有し、ＰＣＢｓを分解することが可能な菌である。
なお、本発明のビフェニル分解菌は、特定された種や属に属するものではなく、上記各ステップを実施することにより検出されるものであればよい。
【００３３】
［ビフェニル分解用組成物］
さらに、本発明のビフェニル分解菌は、ビフェニル又はその誘導体を分解するためのビフェニル分解用組成物に含まれていてもよい。この場合、ビフェニル分解用組成物には、ビフェニル分解菌を培養した培養物が含まれ得る。当該培養物は、菌体を含む培養液をそのまま粉体にしたものでもよい。また、当該培養物は、水や界面活性剤などで洗浄して菌体を回収したものでもよいし、遠心分離による集菌や密度勾配遠心法、二相分離法等により菌体を回収したものでもよい。
また、当該組成物が液剤である場合には、当該組成物は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、緩衝剤等を含んでいてもよい。
また、当該組成物が粉剤である場合には、上記培養物から得られる菌体を乾燥させ、粉末状にすることができる。また、当該組成物は、必要に応じて、スキムミルク等の保護剤、製剤化のための増量剤や賦形剤等を含んでいてもよい。
このようなビフェニル分解用組成物により、コンデンサやトランスその他の物品に含まれるＰＣＢｓを分解することで、ＰＣＢｓを無害化することが可能となる。
【００３４】
［本発明の作用効果］
以下、本発明の作用効果を、比較例を示して説明する。
図３は、本発明の比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
同図に示すように、比較例においては、まずＰＣＢｓ汚染土壌を少量採取し、ＰＣＢｓを添加した集積培養を行う（ＳＴ２１）。ビフェニル分解菌がビフェニルを単一の炭素源として生育し得るという特徴を鑑み、この集積培養は、所定濃度のビフェニルを炭素源として含む培地を用いて好気的に行うことができる（特許文献１参照）。これにより、ビフェニル耐性菌及びビフェニル資化菌を選択的に培養する。
続いて、培養された複数の菌を分離する（ＳＴ２２）。本ステップでは、ＳＴ２１において培養された培地又はその希釈液を寒天培地に塗布することで、寒天培地上にコロニーを形成させる。
続いて、本実施形態のＳＴ１３と同様に、ＰＣＢｓを含む溶液中に分離されたコロニーに含まれる菌を添加して当該菌が溶液中のＰＣＢｓを分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、当該菌をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ２３）。
【００３５】
上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法においては、集積培養により目的の遺伝的特性を有する菌を選抜するため、ＳＴ２１のステップに７日から３０日程度要していた。また、ＳＴ２２のステップはＳＴ１１と同様の５日程度、ＳＴ２３のステップはＳＴ１３と同様の７日程度要していた。
一方で、本実施形態の探索方法では、ＤＮＡマーカーを用いて遺伝子診断を行うＳＴ２２のステップに要する時間は、１〜２日程度である。すなわち、比較例の探索方法と比較して、全体の工程に要する時間を格段に短縮することが可能となる。
【００３６】
また、上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法においては、ＳＴ２３のビフェニル分解試験の対象となる菌が、集積培養されて分離された全ての菌となり得る。このため、網羅的に確認するためには、ビフェニル分解遺伝子の有無によらず集積培養されて分離された多数の菌に対して分解試験を行う必要があった。
一方で、本実施形態の探索方法では、ＳＴ１２のステップで遺伝子診断を行うため、ビフェニル分解菌である可能性の高い菌のみ分解試験の対象とすることができる。これにより、ＳＴ１３のステップにおける手数を大幅に減少させ、網羅的で、かつ非常に効率のよい選抜を行うことができる。また、分解試験に係るコストを低減できるとともに、全体のステップに要する時間をより一層短縮することができる。
【００３７】
さらに、上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法では、ビフェニル等の化合物を含む条件下で集積培養を行う際、ビフェニル資化菌のみならず、特殊な代謝系を有する菌が増加する可能性がある。これにより、生物相に偏りが生じる可能性があった。
一方で、本実施形態の探索方法では、培養期間が短いため、生物相の偏りに対するリスクを低減することができ、目的のビフェニル分解菌を容易に検出することができる。さらに、本実施形態の探索方法では、培養した菌のＤＮＡ配列が変異した可能性がある場合には、上記ＤＮＡマーカーを用いて再度遺伝子診断を行うことにより、確実にビフェニル分解菌を検出することが可能となる。
【００３８】
なお、本発明のビフェニル分解菌の探索方法を応用して、ビフェニル又はその誘導体を蓄積することが可能なビフェニル蓄積菌を探索してもよい。
この場合は、ビフェニル分解酵素に替えてビフェニル又はその誘導体の蓄積に関与する酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、これらの分離された複数の菌からビフェニル蓄積菌候補を検出することができる。
これによっても、ビフェニル及びその誘導体を処理することが可能な細菌を探索することができる。
【００３９】
以下、実施例を示し、本実施形態をより詳細に説明するが、本発明は実施例の記載に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
［実施例１：ＢｐｈＡ遺伝子にハイブリダイズするプライマー対の作成］
（プライマーの準備）
まず、ビフェニル分解酵素であるＢｐｈＡのアミノ酸配列が既知である菌を選択した。選択された細菌の一覧を、表１に示す。
【００４１】
【表１】
2017123797.tif 000003
【００４２】
続いて、これらの細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした。アミノ酸配列のアライメントには、GENETYX（登録商標）-MAC遺伝情報処理ソフトウェア（株式会社ゼネティックス製）を用いた。アライメントの結果を、図４、図５、図６及び図７に示す。同図中の「*」は、選択された複数の細菌において同一のアミノ酸となる配列を示す。
続いて、相互に配列類似性の高いアミノ酸配列を選択した。図４〜図７を参照し、例えば「*」が５以上連続する配列を選択した。この結果、フォワードプライマー候補（「Fwd1」、「Fwd2」、「Fwd3」）及びリバースプライマー候補（「Rev1」、「Rev2」、「Rev3」）の各アミノ酸配列が選択された。
【００４３】
そして、選択されたプライマー候補のアミノ酸配列に対応する塩基配列及びプライマーとしての配列適性に基づいて、フォワードプライマー（Forward Primer）及びリバースプライマー（Reverse Primer）の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を、表２に示す。なお、作成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも、３２種類の異なる配列のＤＮＡ断片を含む縮重プライマーである。また、表２中のフォワードプライマーのうちの１つと、リバースプライマーのうちの１つとからなるプライマーの組が、１つのプライマー対を構成し得る。
【００４４】
【表２】
2017123797.tif 000004
【００４５】
［実施例２：プライマー対を用いたビフェニル分解菌の探索］
続いて、実施例１で作成されたプライマーを用いて、ビフェニル分解菌の探索を行った。
【００４６】
（複数の菌の分離）
まず、異なる場所の複数の植物根圏土壌を採取した。植物根圏土壌としては、例えば、ラベンダー、シソ、パセリ等の根及びその周囲の土壌を採取した。
採取された土壌を段階的に希釈して寒天培地に塗布し、コロニーを形成させた。このうち、１０８倍希釈の土壌希釈液を塗布した寒天培地に形成されたコロニーが、隣接するコロニーと分離しており、コロニー数も適当であった。
続いて、１０８倍希釈の土壌希釈液を塗布した寒天培地に形成されたコロニーのうち、コロニーの形状、色等の外観が異なる約３０００個のコロニーを選択し、新しい寒天培地へ移植した。コロニーが移植された寒天培地を、マスタープレートと称する。移植されたコロニーは、識別のためナンバリングした。なお、同様の外観を有するコロニーは同一種である可能性が高いため、重複を避け、これらのうち１つのコロニーを選択するようにした。なお、本ステップは、約５００個のコロニーを選択し、移植する作業を６回繰り返すことで行った。
【００４７】
（遺伝子マーカーによるビフェニル分解菌候補の検出）
マスタープレートに形成された各コロニーから菌を採取してマイクロプレートの各ウェルに付着させ、当該各ウェルにＴＥ（Tris-EDTA）バッファを注入した。ＴＥバッファは、10mMのTris-HCl(pH8.0)及び1mMのEDTAからなる。そして、ＴＥバッファが注入されたマイクロプレートに対して９５℃、５分の加熱処理を行い、菌体からＤＮＡを溶出させた。
続いて、新たなＰＣＲ用マイクロプレートを準備し、実施例１で作成したフォワードプライマー（Forward Primer）１と、リバースプライマー（Reverse Primer）１をそれぞれ含むＰＣＲ反応液を分注した。このＰＣＲ反応液は、例えばフォワードプライマー、リバースプライマー、市販のＰＣＲ用酵素、滅菌水をそれぞれ含み、ＰＣＲ用酵素の製品マニュアル及びプライマーの縮重を参照して調製された。分注には、マルチチャンネルの分注器を使用した。このＰＣＲ反応液に、ピンレプリケータを用いて溶出されたＤＮＡを含むＤＮＡ溶液を少量混和させた。
続いて、調製したＰＣＲ反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、遺伝子増幅処理を行った。遺伝子増幅処理は、ＰＣＲ用酵素の製品マニュアルを参照し、実施した。なお、アニーリング温度は、プライマーのＴｍ値を考慮し、調整された。
続いて、反応後のＰＣＲ反応液から所定量を分取し、アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルを常法に従って染色し、紫外線（ＵＶ）ライトボックス上にてアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。プライマー対がハイブリダイズするＤＮＡ配列の塩基数から予測される長さのＤＮＡ断片が確認された場合、陽性と判定した。
その結果、約３０００個の菌株のうち、約２％で陽性と判定した。陽性と判定された菌株を、ビフェニル分解菌候補とした。
なお、本ステップ（ＳＴ１２）には、２日を要した。
【００４８】
（ビフェニル分解試験及びビフェニル分解菌の検出）
続いて、ビフェニル分解菌候補を用いて、ビフェニル分解試験を行った。
まず、ビフェニル分解菌候補を少量の液体培地にそれぞれ播種し、この液体培地にアルキルビフェニルをそれぞれ添加した。液体培地は、R2A液体培地、ISP Medium No2、SCD培地（カゼインダイジェスト培地）、及び水を等量ずつ混合したものを用いた。なお、ISP Medium No2は、酵母エキス、麦芽エキス、グルコース等を含む培地である。ビフェニル分解菌候補については、直径１〜２ｍｍのコロニーを２個程度播種した。アルキルビフェニルについては、2,2',5,5'-テトラメチルビフェニル、3,3',4,4'-テトラメチルビフェニル、3,3',5,5'-テトラメチルビフェニルをいずれも5 mg/lとなるように添加した。また、容器は、それぞれ25 mlの容量の共栓付試験管を用いた。
そして、これらのサンプルを30℃で４〜７日間振とう培養した。
続いて、サンプル中のアルキルビフェニルが分解されたか否かを判定するため、反応後の培養液中のアルキルビフェニルをヘキサンにより抽出し、ＧＣ（ガスクロマトグラフィ）−ＦＩＤにより分析した。
ＧＣ−ＦＩＤの条件は、以下の通りである。注入量は、2 μLであった。注入法は、スプリットレス注入法を適用した。注入口の温度は、250℃であった。加熱条件としては、オーブンセットポイントが100℃、そのまま１分維持し、その後20℃/分で200℃に達するまで温度を上昇させ、200℃から6℃/分で260℃に達するまで温度を上昇させ、260℃で１分間維持した。測定時間は、約17分であった。
なお、ビフェニル及び4,4'-ジメチルビフェニルは、内部標準物質として用いた。
評価方法としては、培養液に添加したアルキルビフェニルが半分以下に減少した菌株を、ビフェニル分解菌と推定した。
【００４９】
表３に、ＧＣ−ＦＩＤの分析結果の一例を示す。同表は、各サンプルのＧＣ−ＦＩＤによって得られたクロマトグラム（分析波形）に基づいて算出した、各物質のピーク面積値（エリア面積値）を示す。なお、同一条件下で、同一物質のピーク面積値は試料量におよそ比例することが知られている。
同表では、異なるビフェニル分解菌候補を播種した４種類のサンプルを用いており、それぞれサンプル１〜４と記載している。また、「STD 0.5 ppm」は、培養液に添加したものと同種のアルキルビフェニルをそれぞれ0.5 ppm（0.5 mg/l）相当となるように添加した混合標準液の結果を示し、「NC」は、サンプルと同様にアルキルビフェニルを添加し、かつビフェニル分解菌候補を播種していない、ネガティブコントロール（Negative Control）の結果を示す。また、「操作ＢＬ」は、クロマトグラフのベースラインの値を示す。
同表に示すように、サンプル１〜３とNCの結果とを比較すると、各アルキルビフェニルとも、ピーク面積値が半減していた。この結果から、サンプル１〜３に播種したビフェニル分解菌候補は、いずれもビフェニル分解菌と推定することができた。
【００５０】
【表３】
2017123797.tif 000005
【００５１】
さらに、推定されたビフェニル分解菌を用いて、再度実施例１で作成したプライマーによるＰＣＲを行い、陽性が確認できた菌株を、ビフェニル分解菌として決定し、保存した。
【００５２】
なお、上述の説明においては、フォワードプライマー１と、リバースプライマー１をプライマー対としてＰＣＲを行ったが、フォワードプライマー２及びリバースプライマー２、フォワードプライマー１及びリバースプライマー２、並びにフォワードプライマー２及びリバースプライマー１をそれぞれプライマー対として含むＰＣＲを行った場合も、同様にビフェニル分解菌候補の決定及びビフェニル分解菌の推定を行うことができた。
【００５３】
以上のように、実施例１で作成したプライマー対を用いて遺伝子診断をすることで、ビフェニル分解遺伝子を有すると推定されるビフェニル分解菌候補を選抜することができた。これにより、ビフェニル分解試験を実施する菌株数を大幅に減少させることができ、効率よくビフェニル分解菌を検出できることが確認された。
【００５４】
［実施例３：ＢｐｈＤ遺伝子にハイブリダイズするプライマー対の作成］
まず、ビフェニル分解酵素であるＢｐｈＤのアミノ酸配列が既知である菌を選択した。選択された細菌の一覧を、表４に示す。
【００５５】
【表４】
2017123797.tif 000006
【００５６】
続いて、これらの細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした。アライメントは、実施例１と同様に行った。アライメントの結果を、図８、図９及び図１０に示す。同図中の「*」は、選択された複数の細菌において同一のアミノ酸となる配列を示す。
続いて、相互に配列類似性の高いアミノ酸配列を選択した。図８〜図１０を参照し、例えば「*」が４以上連続する配列を選択した。この結果、フォワードプライマー候補（「Fwd1」、「Fwd2」）及びリバースプライマー候補（「Rev1」、「Rev2」）の各アミノ酸配列が選択された。
【００５７】
そして、選択されたプライマー候補のアミノ酸配列に対応する塩基配列に基づいて、フォワードプライマー（Forward Primer）及びリバースプライマー（Reverse Primer）の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を、表５に示す。なお、作成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも、４８種類又は３２種類の異なる配列のＤＮＡ断片を含む縮重プライマーである。また、表４中のフォワードプライマーのうちの１つと、リバースプライマーのうちの１つとからなるプライマーの組が、１つのプライマー対を構成し得る。
【００５８】
【表５】
2017123797.tif 000007
【００５９】
作成したこれらのプライマーを、実施例２で決定及び保存されたビフェニル分解菌を検体とするＰＣＲに用い、プライマー対がハイブリダイズするＤＮＡ配列の塩基数から予測される長さのＤＮＡ断片が検出できることを確認した。なお、ＰＣＲは、実施例２の「遺伝子マーカーによるビフェニル分解菌候補の検出」で説明した手順で行った。
これにより、実施例３で作成したプライマーも、本発明のオリゴヌクレオチドとしてビフェニル分解菌候補の検出に用いることができることが確認された。
【図１】
2017123797.tif 000008
【図２】
2017123797.tif 000009
【図３】
2017123797.tif 000010
【図４】
2017123797.tif 000011
【図５】
2017123797.tif 000012
【図６】
2017123797.tif 000013
【図７】
2017123797.tif 000014
【図８】
2017123797.tif 000015
【図９】
2017123797.tif 000016
【図１０】
2017123797.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月18日(2016.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢｓは、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、ビフェニル誘導体の一つである。ＰＣＢｓは、一般に、耐熱性、電気絶縁性、耐薬品性等に優れた性質を有し、このような優れた性質を活かして非常に多岐にわたる分野の製品に使用されてきたが、生体に対する毒性が高いことが判明している。これにより、現在ではＰＣＢｓの使用が規制されているが、ＰＣＢｓは化学的な安定性が高いため、既に使用されている製品を介して生体や環境へ悪影響を及ぼすことが懸念されている。
【０００３】
そこで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を無害化する取り組みがなされている。
例えば、特許文献１には、微生物を含む組成物を用いてビフェニル又はその誘導体（例えばＰＣＢｓ）を分解させる技術が記載されている。同文献には、ＰＣＢｓ分解用組成物の製造に使用し得る微生物のスクリーニング方法として、ビフェニルを単一の炭素現として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことが記載されている（同文献の段落［0021］参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１７９８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のスクリーニング方法によれば、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物を繰り返しスクリーニングすることから、目的の微生物の探索に長時間を要していた。
また、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物を培養し、増殖させようとした場合、目的とする微生物以外の微生物も増殖する可能性があった。このため、培養工程の後、多くの検体を試験対象とした代謝試験を実施する必要が生じ、目的の微生物を取得するまでさらに長時間を要する可能性があった。
さらに、特殊な環境で長時間微生物を培養した場合、遺伝的な偏りが生じ、当初の生物相から変化が生じる可能性もあった。
【０００６】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、ビフェニル分解菌を効率よく、かつ精度よく探索することが可能なビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係るビフェニル分解菌の探索方法は、土壌から複数の菌を分離する工程を含む。
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、上記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補が検出される。
上記ビフェニル分解菌の探索方法によれば、土壌から分離した菌に対して、上記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、ビフェニル分解酵素をコードする遺伝子を有するビフェニル分解菌候補を簡便に、かつ効率よく検出することができる。さらに、ビフェニル分解酵素遺伝子の有無に基づいてビフェニル分解菌候補を検出できるため、ビフェニル分解菌の可能性が高いビフェニル分解菌候補を選抜することが可能となる。
【０００８】
上記土壌は、植物根圏土壌であってもよい。
植物根圏土壌は、微生物を豊富に含むため、ビフェニル分解菌候補を検出できる確率を高めることができる。
【０００９】
上記ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡは、複数の既知のビフェニル分解菌のビフェニル分解酵素のアミノ酸配列において相互に配列類似性の高いアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいてもよい。
これにより、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列を、多様な菌のビフェニル誘導体をコードするＤＮＡに共通する配列に基づいて決定することができ、ビフェニル分解菌候補を精度よく検出することができる。
【００１０】
この場合、上記複数の既知のビフェニル分解菌は、５以上の既知のビフェニル分解菌を含んでいてもよい。
これにより、ビフェニル分解菌候補をより精度よく検出することができる。
【００１１】
上記ビフェニル分解菌の探索方法は、さらに、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に上記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して上記ビフェニル分解菌候補が上記溶液中のビフェニル誘導体又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、上記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する工程を含んでいてもよい。
これにより、ビフェニル分解菌候補のうち、実際にビフェニル又はその誘導体を分解菌する菌をビフェニル分解菌と推定することができる。
【００１２】
具体的には、上記ビフェニル誘導体は、ＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）であってもよい。
【００１３】
本発明の他の形態に係るオリゴヌクレオチドは、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能である。
【００１４】
また、本発明のさらに他の形態に係るビフェニル分解菌は、
土壌から複数の菌を分離し、
ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、上記分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出し、
ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に上記検出されたビフェニル分解菌候補を添加して上記ビフェニル分解菌候補が溶液中のビフェニル又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、上記ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する。
【発明の効果】
【００１５】
以上のように、本発明によれば、ビフェニル分解菌を効率よく、かつ精度よく探索することが可能なビフェニル分解菌の探索方法、それに用いるオリゴヌクレオチド、及びその方法により検出されたビフェニル分解菌を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ビフェニル分解菌として知られているシュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）KKS102株におけるＰＣＢｓの分解経路を模式的に示す図である。
【図２】本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
【図４】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図５】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図６】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図７】複数の細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図８】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図９】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【図１０】複数の細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした結果の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［本発明の概要］
本発明は、遺伝子マーカーを用いてビフェニル分解酵素遺伝子の有無を診断することで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌を検出することを特徴とする。以下、詳細について説明する。
【００１８】
［ビフェニル誘導体］
ビフェニル誘導体とは、ビフェニルを母体とし、ビフェニルに官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなどの改変がなされた化合物をいう。ビフェニル誘導体は、一般に安定性が高く、生分解性が低い。
具体的には、ビフェニル誘導体は、後述するＰＣＢｓ、アルキルビフェニル等が挙げられる。
【００１９】
［ＰＣＢｓ］
ＰＣＢｓは、上述のように、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、一般式は、C12H(10−n)Cln (1≦n≦10)で表される。具体的には、ＰＣＢｓとしては、３，４，４'，５−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３，３'，４，４'−ペンタクロロビフェニール、２，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２'，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール等を挙げることができる。
ＰＣＢは、通常ＰＣＢ単体の混合物として市販されており、これらがコンデンサやトランスに使用されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）のＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）、ＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロロベンゼン＝６０／４０（質量比）の混合物）や、三菱モンサント（株）のアロクロール１２５４（５４％ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等が挙げられる。
これらのＰＣＢｓは、ビフェニル分解菌により分解されることが知られている（特許文献１参照）。
【００２０】
［ビフェニル分解菌］
ビフェニル分解菌は、ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡ（以下、ビフェニル分解酵素遺伝子とも称する）を有する真正細菌である。ビフェニル分解菌としては、例えば、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルカニボラックス（Alcanivorax）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、コマモナス（Comamonas）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomanas）属、及びシュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）等に属する真正細菌が挙げられるが、これに限定されない。
なお、以下の説明において単に「菌」という場合、真正細菌をいうものとする。
ビフェニル分解酵素は、ビフェニルを分解する酵素であり、さらにビフェニルを分解することで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体も分解することが可能である。ビフェニル分解菌としては、具体的には、ビフェニルジオキシゲナーゼ、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ等を挙げることができる。
ビフェニル分解酵素遺伝子は、具体的には、ビフェニルジオキシゲナーゼをコードするＢｐｈＡ、ジハイドロジオールデヒドロゲナーゼをコードするＢｐｈＢ、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼをコードするＢｐｈＣ、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼをコードするＢｐｈＤ等が挙げられる。
【００２１】
図１は、ビフェニル分解菌として知られているシュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）KKS102株におけるＰＣＢｓの分解経路を模式的に示す図である（例えば、Kikuchi Y. et al, Journal of Bacteriology, Vol.176, No.6, p.1689-1694, 1994参照）。なお、上述の分解経路は一例であり、他の細菌においては異なる経路をとり得る。
この経路において、ＰＣＢｓは、まず、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）により、２つの水酸基（ＯＨ）が付加される。ＢｐｈＡ酵素は４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３、ＢｐｈＡ４）から構成されている。そして、図１に示す通り、ＢｐｈＡ１とＢｐｈＡ２とが複合体を形成し、基質との結合及び酸素添加反応を触媒し、フェレドキシンが電子伝達体として機能し、フェレドキシンリダクターゼがＮＡＤ又はＮＡＤＰＨとフェレドキシンの酸化還元反応を触媒する。
続いてジヒドロジオールジヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ酵素）によって、ＢｐｈＡの産物から２つの水素が除かれた後、２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ酵素）により、ＢｐｈＢ産物に酸素１分子が付加され、ＨＯＰＤＡ（ＢｐｈＤの誘導基質）が生成する。ついで、２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ酵素）が、ＨＯＰＤＡを安息香酸と２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートとに分解する。
その後、図示はしないが、２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートヒドラターゼ（ＢｐｈＥ酵素）、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ（ＢｐｈＦ酵素）及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＧ酵素）によりアセチルＣｏＡとピルビン酸に転換されると考えられる。
【００２２】
［ビフェニル分解菌の探索方法］
図２は、本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
同図に示すように、本発明に係るビフェニル分解菌の探索方法は、複数の菌を分離するステップ（ＳＴ１１）と、ビフェニル分解菌候補を検出するステップ（ＳＴ１２）と、ビフェニル分解菌候補に対してビフェニル分解試験を行い、ビフェニル分解菌を検出するステップ（ＳＴ１３）と、を含む。以下、各ステップについて説明する。
【００２３】
まず、図２に示すように、土壌から複数の菌を分離する（ＳＴ１１）。
ここでいう土壌は、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体による汚染が疑われていない土壌でもよい。本発明は、ビフェニル分解菌を非常に効率よく検出できるため、汚染が疑われていない土壌からでもビフェニル分解菌を検出することができる。
また、ここでいう土壌は、例えば植物根圏土壌でもよい。植物根圏土壌は、植物の根の周囲の土壌をいい、植物の根の一部を含んでいてもよい。植物の根は、呼吸の作用や栄養分と水分を吸収する作用によって、周囲の土壌の栄養分組成を変化させるとともに、ｐＨを変化させ得る。また、植物の根は、分泌物を分泌させるとともに、根毛を脱落させ得る。これにより、植物根圏土壌は、他の領域の土壌と比較して異なる組成を有し、一般に多くの微生物を含む。さらに、植物由来の化合物がビフェニル分解遺伝子を誘発させることが知られているため、このような化合物が存在し得る植物根圏土壌は、ビフェニル分解遺伝子を有するビフェニル分解菌を含む可能性がある。したがって、本発明の土壌として植物根圏土壌を用いることで、ビフェニル分解菌を検出する可能性を高めることができる。
なお、土壌は上記に限定されず、浄水場等の活性汚泥、ＰＣＢｓ等による汚染が疑われる土壌等でもよい。
【００２４】
このような土壌から複数の菌を分離するには、例えば、平板希釈法を適用することができる。具体的には、まず、採取された土壌を液体培地や滅菌水等で希釈する。例えば、植物の根を含む植物根圏土壌を採取した場合は、固形分である根などをすりつぶし、採取した土壌の重量の９倍の液体で希釈する。これを１０倍希釈として、例えば１０倍ずつ希釈していき、１０２倍、１０３倍、１０４倍…の土壌希釈液を生成する。この作業により生成された各土壌希釈液を、それぞれ寒天培地へ播種する。あるいは、既知の最適な希釈倍率の土壌希釈液のみを寒天培地へ播種してもよい。植物根圏土壌の場合、最適な土壌の希釈倍率は一例として１０８倍である。
寒天培地は、典型的には、シャーレを用いた平板培地であるが、これに限定されない。寒天培地は、滅菌処理したものを用いることができる。
そして、土壌希釈液を播種した寒天培地を１日〜１０日ほど培養し、複数の菌のコロニーを形成させることで、複数の菌を分離する。培養条件は特に限定されず、通常の細菌培養に用いる条件を適用することができる。形成されたコロニーは、次ステップにおいて検体として用いられる。なお、次ステップで用いられるコロニーは、隣接するコロニーと分離して形成されたものが用いられる。これにより、異なる菌株のコンタミネーションを防止することができる。
【００２５】
続いて、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、分離された複数の菌の遺伝子にハイブリダイズさせることで、上記分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出する（ＳＴ１２）。
本ステップでは、上記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした遺伝子を有する菌を、ビフェニル分解菌候補として検出することができる。
ここでいうハイブリダイズは、本発明のオリゴヌクレオチドがビフェニル分解酵素遺伝子内の標的配列と相補的に結合することである。
また、ここでいう「ビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズする」とは、ビフェニル分解酵素遺伝子の一部のＤＮＡ配列にハイブリダイズすること、及びビフェニル分解酵素遺伝子の全体にハイブリダイズすることを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法のプライマー、ハイブリダイゼーション法の核酸プローブ、固相担体に結合された捕捉プローブ等、分子生物学的な種々の検出方法に用いることができる。なお、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識化されずに用いられてもよいし、放射性物質や蛍光・発光物質、酵素や酵素基質等の標識物によって標識化して核酸プローブやプライマーとして用いることもできる。オリゴヌクレオチドの詳細については、後述する。
【００２６】
分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出するには、例えば、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法により標的配列が増幅するか否か確認することができる。
具体的には、まず、前ステップにおいて形成されたコロニーに含まれる菌のＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅用反応液を調製する。テンプレートＤＮＡは、各コロニーに含まれる菌体からＤＮＡを抽出したものとすることができる。ＰＣＲ反応液は、テンプレートＤＮＡ、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファ、及び滅菌蒸留水等を混合したものとすることができる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファ等に替えて、予めこれらの試薬が混合された市販のＰＣＲ用酵素を用いることもできる。次に、サーマルサイクラー等を用いて熱変性反応、アニーリング反応、及び伸長反応を連続して行い、これを所定サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲ法による増幅反応を行う。ＰＣＲ法における反応条件等は、使用するポリメラーゼの種類やプライマーのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。そして、その反応後の反応液中の増幅産物を確認し、所望のＤＮＡ断片が増幅されているか否か確認する。このように、所望のＤＮＡ断片が増幅されている（陽性）菌を、ビフェニル分解菌候補として検出する。
増幅産物の確認方法も特に限定されず、例えば、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、シーケンス解析による塩基配列を決定する方法等を適用することができる。このうち、アガロースゲル電気泳動法が簡便に増幅産物を確認でき、より好ましい。
【００２７】
また、本ステップでは、１種類のビフェニル分解酵素に対応するオリゴヌクレオチドのみならず、異なるビフェニル分解酵素にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを用いて、ビフェニル分解菌候補を検出してもよい。上述のように、通常、ビフェニル分解菌は、ＢｐｈＡ，ＢｐｈＢ，ＢｐｈＣ及びＢｐｈＤ（ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤ）の分解酵素をコードするＤＮＡを有していると考えられる。このため、例えば、Ｓ１２のステップが以下のようなステップを含んでいてもよい。
まず、ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤのうちの１つの酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、Ｓ１１で分離された菌のＤＮＡにハイブリダイズさせる。その後、Ｓ１１で分離された菌、又は前ステップでハイブリダイズされた菌に、ＢｐｈＡ〜ＢｐｈＤのうちの他の酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
これにより、遺伝子診断によって実際にビフェニルの分解能を有する菌を精度よく検出することができる。
【００２８】
最後に、ＰＣＢｓを含む溶液中に検出されたビフェニル分解菌候補を添加してビフェニル分解菌候補が溶液中のＰＣＢｓを分解するか否か判定し（ビフェニル分解試験）、分解すると判定された場合、当該ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ１３）。
本ステップでは、まず、ビフェニル分解菌候補として検出された各菌を、ビフェニル又はその誘導体を添加した溶液に加え、ビフェニル又はその誘導体と反応させる。ビフェニルの誘導体としては、例えば、ＰＣＢｓ、アルキルビフェニル等を用いることができ、このうちＰＣＢｓとしては、上述の「ＰＣＢｓ」の説明で挙げた化合物等を用いることができる。また、ビフェニル又はその誘導体の溶液中の濃度としては、例えば０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度とすることができる。ビフェニル分解菌候補の添加量は特に限定されない。また、培地は、ビフェニル分解菌候補が培養可能な培養液を用いることができる。培養条件は特に限定されず、例えば温度が約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃であり、ｐＨは６〜９とすることができる。また、反応中、溶液を攪拌してもよい。反応期間は例えば１〜５日とすることができる。
続いて、各培養液中に添加したＰＣＢｓが分解されたか否か評価する。評価方法は、例えば、ガスクロマトグラフィ等を適用することができる。
【００２９】
以上の各ステップにより、ビフェニル分解菌を検出することができる。
なお、本発明のビフェニル分解菌の探索方法は、ＳＴ１１及びＳＴ１２のステップで精度よくビフェニル分解菌候補を検出できるならば、ＳＴ１３のステップを有さなくてもよい。
【００３０】
さらに、ＳＴ１３のステップでビフェニル分解菌候補を培養している間にＤＮＡ配列が変化する可能性がある場合には、以下に示すように再度遺伝子診断を行ってもよい。
すなわち、ＳＴ１３のステップの後、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、ＳＴ１３で推定されたビフェニル分解菌の遺伝子にハイブリダイズさせることで、上記推定されたビフェニル分解菌がビフェニル分解菌であることを確認してもよい。本ステップは、ＳＴ１２と同様に行うことができる。
また、本ステップにおけるオリゴヌクレオチドは、ＳＴ１２で用いたものと同一のオリゴヌクレオチドでもよいし、異なるものでもよい。例えば、本ステップで用いるオリゴヌクレオチドは、ＳＴ１２で用いたオリゴヌクレオチドがターゲットとするビフェニル分解酵素遺伝子とは異なるビフェニル分解酵素遺伝子をターゲットとするものでもよい。
これにより、ビフェニル分解能を有するビフェニル分解菌をより確実に探索することができる。
【００３１】
［オリゴヌクレオチド］
本発明のオリゴヌクレオチドは、ビフェニル及びその誘導体を分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることができるものである。
上記ＤＮＡは、複数のビフェニル分解菌のビフェニル分解酵素のアミノ酸配列において相互に配列類似性の高いアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいてもよい。当該複数のビフェニル分解菌としては、ビフェニル分解酵素遺伝子を有し、かつそのビフェニル分解酵素遺伝子のアミノ酸配列が既知の細菌を適用することができる。具体的には、例えば、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルカニボラックス（Alcanivorax）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、コマモナス（Comamonas）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomanas）属、及びシュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）等に属する既知のビフェニル分解菌が挙げられる。
また、配列類似性の比較対象となる複数のビフェニル分解菌は、例えば、５以上のビフェニル分解菌を含んでいてもよく、より好ましくは８以上のビフェニル分解菌を含んでいればよい。これにより、アミノ酸配列の相同性について精度よく検討することができる。
また、配列類似性の高いアミノ酸配列は、例えば、比較対象となる複数のビフェニル分解菌において、同一のアミノ酸が４以上連続する配列を含むアミノ酸配列をいうものとする。
例えば、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用のプライマーの場合、上記アミノ酸配列に対応する塩基配列をそれぞれ有する複数のプライマーを混合した、いわゆる縮重プライマーとすることができる。これにより、上記アミノ酸配列に対応するコドンの揺らぎを考慮して、１回のＰＣＲでより多くの菌株を検出することができる。また、複数のプライマーの数は、例えば１２８以下、好ましくは４８以下、より好ましくは３２以下とすることができる。これにより、ＰＣＲ反応液中の実効的なプライマー濃度の低下を抑制し、プライマーの検出感度を維持することができる。
【００３２】
［ビフェニル分解菌］
本発明のビフェニル分解菌は、土壌から複数の菌を分離し（ＳＴ１１）、ＰＣＢｓを分解することが可能なビフェニル分解菌の有するビフェニル分解酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、当該分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、当該分離された複数の菌からビフェニル分解菌候補を検出し（ＳＴ１２）、ビフェニル又はその誘導体を含む溶液中に検出されたビフェニル分解菌候補を添加してビフェニル分解菌候補が溶液中のビフェニル又はその誘導体を分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、ビフェニル分解菌候補をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ１３）、ことで検出されたビフェニル分解菌である。すなわち、本発明のビフェニル分解菌は、上記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることが可能なＤＮＡを有し、ＰＣＢｓを分解することが可能な菌である。
なお、本発明のビフェニル分解菌は、特定された種や属に属するものではなく、上記各ステップを実施することにより検出されるものであればよい。
【００３３】
［ビフェニル分解用組成物］
さらに、本発明のビフェニル分解菌は、ビフェニル又はその誘導体を分解するためのビフェニル分解用組成物に含まれていてもよい。この場合、ビフェニル分解用組成物には、ビフェニル分解菌を培養した培養物が含まれ得る。当該培養物は、菌体を含む培養液をそのまま粉体にしたものでもよい。また、当該培養物は、水や界面活性剤などで洗浄して菌体を回収したものでもよいし、遠心分離による集菌や密度勾配遠心法、二相分離法等により菌体を回収したものでもよい。
また、当該組成物が液剤である場合には、当該組成物は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、緩衝剤等を含んでいてもよい。
また、当該組成物が粉剤である場合には、上記培養物から得られる菌体を乾燥させ、粉末状にすることができる。また、当該組成物は、必要に応じて、スキムミルク等の保護剤、製剤化のための増量剤や賦形剤等を含んでいてもよい。
このようなビフェニル分解用組成物により、コンデンサやトランスその他の物品に含まれるＰＣＢｓを分解することで、ＰＣＢｓを無害化することが可能となる。
【００３４】
［本発明の作用効果］
以下、本発明の作用効果を、比較例を示して説明する。
図３は、本発明の比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法を示すフローチャートである。
同図に示すように、比較例においては、まずＰＣＢｓ汚染土壌を少量採取し、ＰＣＢｓを添加した集積培養を行う（ＳＴ２１）。ビフェニル分解菌がビフェニルを単一の炭素源として生育し得るという特徴を鑑み、この集積培養は、所定濃度のビフェニルを炭素源として含む培地を用いて好気的に行うことができる（特許文献１参照）。これにより、ビフェニル耐性菌及びビフェニル資化菌を選択的に培養する。
続いて、培養された複数の菌を分離する（ＳＴ２２）。本ステップでは、ＳＴ２１において培養された培地又はその希釈液を寒天培地に塗布することで、寒天培地上にコロニーを形成させる。
続いて、本実施形態のＳＴ１３と同様に、ＰＣＢｓを含む溶液中に分離されたコロニーに含まれる菌を添加して当該菌が溶液中のＰＣＢｓを分解するか否か判定し、分解すると判定された場合、当該菌をビフェニル分解菌と推定する（ＳＴ２３）。
【００３５】
上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法においては、集積培養により目的の遺伝的特性を有する菌を選抜するため、ＳＴ２１のステップに７日から３０日程度要していた。また、ＳＴ２２のステップはＳＴ１１と同様の５日程度、ＳＴ２３のステップはＳＴ１３と同様の７日程度要していた。
一方で、本実施形態の探索方法では、ＤＮＡマーカーを用いて遺伝子診断を行うＳＴ２２のステップに要する時間は、１〜２日程度である。すなわち、比較例の探索方法と比較して、全体の工程に要する時間を格段に短縮することが可能となる。
【００３６】
また、上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法においては、ＳＴ２３のビフェニル分解試験の対象となる菌が、集積培養されて分離された全ての菌となり得る。このため、網羅的に確認するためには、ビフェニル分解遺伝子の有無によらず集積培養されて分離された多数の菌に対して分解試験を行う必要があった。
一方で、本実施形態の探索方法では、ＳＴ１２のステップで遺伝子診断を行うため、ビフェニル分解菌である可能性の高い菌のみ分解試験の対象とすることができる。これにより、ＳＴ１３のステップにおける手数を大幅に減少させ、網羅的で、かつ非常に効率のよい選抜を行うことができる。また、分解試験に係るコストを低減できるとともに、全体のステップに要する時間をより一層短縮することができる。
【００３７】
さらに、上記比較例に係るビフェニル分解菌の探索方法では、ビフェニル等の化合物を含む条件下で集積培養を行う際、ビフェニル資化菌のみならず、特殊な代謝系を有する菌が増加する可能性がある。これにより、生物相に偏りが生じる可能性があった。
一方で、本実施形態の探索方法では、培養期間が短いため、生物相の偏りに対するリスクを低減することができ、目的のビフェニル分解菌を容易に検出することができる。さらに、本実施形態の探索方法では、培養した菌のＤＮＡ配列が変異した可能性がある場合には、上記ＤＮＡマーカーを用いて再度遺伝子診断を行うことにより、確実にビフェニル分解菌を検出することが可能となる。
【００３８】
なお、本発明のビフェニル分解菌の探索方法を応用して、ビフェニル又はその誘導体を蓄積することが可能なビフェニル蓄積菌を探索してもよい。
この場合は、ビフェニル分解酵素に替えてビフェニル又はその誘導体の蓄積に関与する酵素をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを、分離された複数の菌のＤＮＡにハイブリダイズさせることで、これらの分離された複数の菌からビフェニル蓄積菌候補を検出することができる。
これによっても、ビフェニル及びその誘導体を処理することが可能な細菌を探索することができる。
【００３９】
以下、実施例を示し、本実施形態をより詳細に説明するが、本発明は実施例の記載に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
［実施例１：ＢｐｈＡ遺伝子にハイブリダイズするプライマー対の作成］
（プライマーの準備）
まず、ビフェニル分解酵素であるＢｐｈＡのアミノ酸配列が既知である菌を選択した。選択された細菌の一覧を、表１に示す。
【００４１】
【表１】
2017123797.tif 000018
【００４２】
続いて、これらの細菌におけるＢｐｈＡのアミノ酸配列をアライメントした。アミノ酸配列のアライメントには、GENETYX（登録商標）-MAC遺伝情報処理ソフトウェア（株式会社ゼネティックス製）を用いた。アライメントの結果を、図４、図５、図６及び図７に示す。同図中の「*」は、選択された複数の細菌において同一のアミノ酸となる配列を示す。
続いて、相互に配列類似性の高いアミノ酸配列を選択した。図４〜図７を参照し、例えば「*」が５以上連続する配列を選択した。この結果、フォワードプライマー候補（「Fwd1」、「Fwd2」、「Fwd3」）及びリバースプライマー候補（「Rev1」、「Rev2」、「Rev3」）の各アミノ酸配列が選択された。
【００４３】
そして、選択されたプライマー候補のアミノ酸配列に対応する塩基配列及びプライマーとしての配列適性に基づいて、フォワードプライマー（Forward Primer）及びリバースプライマー（Reverse Primer）の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を、表２に示す。なお、作成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも、３２種類の異なる配列のＤＮＡ断片を含む縮重プライマーである。また、表２中のフォワードプライマーのうちの１つと、リバースプライマーのうちの１つとからなるプライマーの組が、１つのプライマー対を構成し得る。
【００４４】
【表２】
2017123797.tif 000019
【００４５】
［実施例２：プライマー対を用いたビフェニル分解菌の探索］
続いて、実施例１で作成されたプライマーを用いて、ビフェニル分解菌の探索を行った。
【００４６】
（複数の菌の分離）
まず、異なる場所の複数の植物根圏土壌を採取した。植物根圏土壌としては、例えば、ラベンダー、シソ、パセリ等の根及びその周囲の土壌を採取した。
採取された土壌を段階的に希釈して寒天培地に塗布し、コロニーを形成させた。このうち、１０８倍希釈の土壌希釈液を塗布した寒天培地に形成されたコロニーが、隣接するコロニーと分離しており、コロニー数も適当であった。
続いて、１０８倍希釈の土壌希釈液を塗布した寒天培地に形成されたコロニーのうち、コロニーの形状、色等の外観が異なる約３０００個のコロニーを選択し、新しい寒天培地へ移植した。コロニーが移植された寒天培地を、マスタープレートと称する。移植されたコロニーは、識別のためナンバリングした。なお、同様の外観を有するコロニーは同一種である可能性が高いため、重複を避け、これらのうち１つのコロニーを選択するようにした。なお、本ステップは、約５００個のコロニーを選択し、移植する作業を６回繰り返すことで行った。
【００４７】
（遺伝子マーカーによるビフェニル分解菌候補の検出）
マスタープレートに形成された各コロニーから菌を採取してマイクロプレートの各ウェルに付着させ、当該各ウェルにＴＥ（Tris-EDTA）バッファを注入した。ＴＥバッファは、10mMのTris-HCl(pH8.0)及び1mMのEDTAからなる。そして、ＴＥバッファが注入されたマイクロプレートに対して９５℃、５分の加熱処理を行い、菌体からＤＮＡを溶出させた。
続いて、新たなＰＣＲ用マイクロプレートを準備し、実施例１で作成したフォワードプライマー（Forward Primer）１と、リバースプライマー（Reverse Primer）１をそれぞれ含むＰＣＲ反応液を分注した。このＰＣＲ反応液は、例えばフォワードプライマー、リバースプライマー、市販のＰＣＲ用酵素、滅菌水をそれぞれ含み、ＰＣＲ用酵素の製品マニュアル及びプライマーの縮重を参照して調製された。分注には、マルチチャンネルの分注器を使用した。このＰＣＲ反応液に、ピンレプリケータを用いて溶出されたＤＮＡを含むＤＮＡ溶液を少量混和させた。
続いて、調製したＰＣＲ反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、遺伝子増幅処理を行った。遺伝子増幅処理は、ＰＣＲ用酵素の製品マニュアルを参照し、実施した。なお、アニーリング温度は、プライマーのＴｍ値を考慮し、調整された。
続いて、反応後のＰＣＲ反応液から所定量を分取し、アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後、アガロースゲルを常法に従って染色し、紫外線（ＵＶ）ライトボックス上にてアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。プライマー対がハイブリダイズするＤＮＡ配列の塩基数から予測される長さのＤＮＡ断片が確認された場合、陽性と判定した。
その結果、約３０００個の菌株のうち、約２％で陽性と判定した。陽性と判定された菌株を、ビフェニル分解菌候補とした。
なお、本ステップ（ＳＴ１２）には、２日を要した。
【００４８】
（ビフェニル分解試験及びビフェニル分解菌の検出）
続いて、ビフェニル分解菌候補を用いて、ビフェニル分解試験を行った。
まず、ビフェニル分解菌候補を少量の液体培地にそれぞれ播種し、この液体培地にアルキルビフェニルをそれぞれ添加した。液体培地は、R2A液体培地、ISP Medium No2、SCD培地（カゼインダイジェスト培地）、及び水を等量ずつ混合したものを用いた。なお、ISP Medium No2は、酵母エキス、麦芽エキス、グルコース等を含む培地である。ビフェニル分解菌候補については、直径１〜２ｍｍのコロニーを２個程度播種した。アルキルビフェニルについては、2,2',5,5'-テトラメチルビフェニル、3,3',4,4'-テトラメチルビフェニル、3,3',5,5'-テトラメチルビフェニルをいずれも5 mg/lとなるように添加した。また、容器は、それぞれ25 mlの容量の共栓付試験管を用いた。
そして、これらのサンプルを30℃で４〜７日間振とう培養した。
続いて、サンプル中のアルキルビフェニルが分解されたか否かを判定するため、反応後の培養液中のアルキルビフェニルをヘキサンにより抽出し、ＧＣ（ガスクロマトグラフィ）−ＦＩＤにより分析した。
ＧＣ−ＦＩＤの条件は、以下の通りである。注入量は、2 μLであった。注入法は、スプリットレス注入法を適用した。注入口の温度は、250℃であった。加熱条件としては、オーブンセットポイントが100℃、そのまま１分維持し、その後20℃/分で200℃に達するまで温度を上昇させ、200℃から6℃/分で260℃に達するまで温度を上昇させ、260℃で１分間維持した。測定時間は、約17分であった。
なお、ビフェニル及び4,4'-ジメチルビフェニルは、内部標準物質として用いた。
評価方法としては、培養液に添加したアルキルビフェニルが半分以下に減少した菌株を、ビフェニル分解菌と推定した。
【００４９】
表３に、ＧＣ−ＦＩＤの分析結果の一例を示す。同表は、各サンプルのＧＣ−ＦＩＤによって得られたクロマトグラム（分析波形）に基づいて算出した、各物質のピーク面積値（エリア面積値）を示す。なお、同一条件下で、同一物質のピーク面積値は試料量におよそ比例することが知られている。
同表では、異なるビフェニル分解菌候補を播種した４種類のサンプルを用いており、それぞれサンプル１〜４と記載している。また、「STD 0.5 ppm」は、培養液に添加したものと同種のアルキルビフェニルをそれぞれ0.5 ppm（0.5 mg/l）相当となるように添加した混合標準液の結果を示し、「NC」は、サンプルと同様にアルキルビフェニルを添加し、かつビフェニル分解菌候補を播種していない、ネガティブコントロール（Negative Control）の結果を示す。また、「操作ＢＬ」は、クロマトグラフのベースラインの値を示す。
同表に示すように、サンプル１〜３とNCの結果とを比較すると、各アルキルビフェニルとも、ピーク面積値が半減していた。この結果から、サンプル１〜３に播種したビフェニル分解菌候補は、いずれもビフェニル分解菌と推定することができた。
【００５０】
【表３】
2017123797.tif 000020
【００５１】
さらに、推定されたビフェニル分解菌を用いて、再度実施例１で作成したプライマーによるＰＣＲを行い、陽性が確認できた菌株を、ビフェニル分解菌として決定し、保存した。
【００５２】
なお、上述の説明においては、フォワードプライマー１と、リバースプライマー１をプライマー対としてＰＣＲを行ったが、フォワードプライマー２及びリバースプライマー２、フォワードプライマー１及びリバースプライマー２、並びにフォワードプライマー２及びリバースプライマー１をそれぞれプライマー対として含むＰＣＲを行った場合も、同様にビフェニル分解菌候補の決定及びビフェニル分解菌の推定を行うことができた。
【００５３】
以上のように、実施例１で作成したプライマー対を用いて遺伝子診断をすることで、ビフェニル分解遺伝子を有すると推定されるビフェニル分解菌候補を選抜することができた。これにより、ビフェニル分解試験を実施する菌株数を大幅に減少させることができ、効率よくビフェニル分解菌を検出できることが確認された。
【００５４】
［実施例３：ＢｐｈＤ遺伝子にハイブリダイズするプライマー対の作成］
まず、ビフェニル分解酵素であるＢｐｈＤのアミノ酸配列が既知である菌を選択した。選択された細菌の一覧を、表４に示す。
【００５５】
【表４】
2017123797.tif 000021
【００５６】
続いて、これらの細菌におけるＢｐｈＤのアミノ酸配列をアライメントした。アライメントは、実施例１と同様に行った。アライメントの結果を、図８、図９及び図１０に示す。同図中の「*」は、選択された複数の細菌において同一のアミノ酸となる配列を示す。
続いて、相互に配列類似性の高いアミノ酸配列を選択した。図８〜図１０を参照し、例えば「*」が４以上連続する配列を選択した。この結果、フォワードプライマー候補（「Fwd1」、「Fwd2」）及びリバースプライマー候補（「Rev1」、「Rev2」）の各アミノ酸配列が選択された。
【００５７】
そして、選択されたプライマー候補のアミノ酸配列に対応する塩基配列に基づいて、フォワードプライマー（Forward Primer）及びリバースプライマー（Reverse Primer）の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を、表５に示す。なお、作成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも、４８種類又は３２種類の異なる配列のＤＮＡ断片を含む縮重プライマーである。また、表４中のフォワードプライマーのうちの１つと、リバースプライマーのうちの１つとからなるプライマーの組が、１つのプライマー対を構成し得る。
【００５８】
【表５】
2017123797.tif 000022
【００５９】
作成したこれらのプライマーを、実施例２で決定及び保存されたビフェニル分解菌を検体とするＰＣＲに用い、プライマー対がハイブリダイズするＤＮＡ配列の塩基数から予測される長さのＤＮＡ断片が検出できることを確認した。なお、ＰＣＲは、実施例２の「遺伝子マーカーによるビフェニル分解菌候補の検出」で説明した手順で行った。
これにより、実施例３で作成したプライマーも、本発明のオリゴヌクレオチドとしてビフェニル分解菌候補の検出に用いることができることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
Forward primer of primer pair hybridized with BphA gene
Forward primer of primer pair hybridized with BphA gene
Reverse primer of primer pair hybridized with BphA gene
Reverse primer of primer pair hybridized with BphA gene
Forward primer of primer pair hybridized with BphD gene
Forward primer of primer pair hybridized with BphD gene
Reverse primer of primer pair hybridized with BphD gene
Reverse primer of primer pair hybridized with BphD gene