(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便にミトコンドリアを高感度かつ特異的に標識できる蛍光化合物を提供。【解決手段】式（１）で表される化合物又はその塩を含むミトコンドリアの蛍光染色用蛍光組成物。2017031095.tif 000033［Ｒ１及びＲ２はハロゲン原子、Ｃ１〜１０のアルキル基、Ｃ１〜１０のアルコキシ基、Ｃ２〜１０のアルケニル基、Ｃ２〜１０のアルキニル基、Ｃ３〜１０のシクロアルキル基又はＣ４〜１０のシクロアルキルアルキル基；Ｒ３〜、Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン原子、Ｃ１〜１０のアルキル基、Ｃ１〜１０のアルコキシ基、Ｃ２〜１０のアルケニル基、Ｃ２〜１０のアルキニル基、Ｃ３〜１０のシクロアルキル基又はＣ４〜１０のシクロアルキルアルキル基；ｎ１は０〜５；ｎ２は０〜５；Ａは蛍光性有機基；ｍ１及びｍ２は０又は１；ただし、ｍ１＋ｍ２＝１］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2017031095.tif 000027
［式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
Ａは、蛍光性有機基を表し、
ｍ１及びｍ２は、０又は１である。ただし、ｍ１＋ｍ２＝１である。］で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ａが、以下の蛍光性有機基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【化２】
2017031095.tif 000028
［Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ６は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
【請求項３】
式（３）で表される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【化３】
2017031095.tif 000029
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１及びｎ６は、同一でも異なっていてもよく、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
【請求項４】
式（３）中、Ｒ７及びＲ８が、同一であって、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
ｎ７及びｎ８が、同一でも異なっていてもよく、１〜３のいずれかの整数であることを特徴とする請求項３に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
式（４）で表される請求項３又は４に記載の化合物又はその塩。
【化４】
2017031095.tif 000030
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物又はその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色に用いるための蛍光組成物。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ａ）ミトコンドリア標的候補物質の存在下で哺乳動物細胞を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）で培養した哺乳動物細胞を、請求項６に記載の蛍光組成物の存在下で培養する工程；
（ｃ）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
【請求項８】
以下の工程（ａ−１）〜（ｃ−１）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ａ−１）哺乳動物細胞を、請求項６に記載の蛍光組成物の存在下で培養する工程；
（ｂ−１）工程（ａ−１）で培養した哺乳動物細胞を、ミトコンドリア標的候補物質の存在下で培養する工程；
（ｃ−１）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
【請求項９】
以下の工程（ｂ−２）〜（ｃ−２）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ｂ−２）ミトコンドリア標的候補物質、及び請求項６に記載の蛍光組成物の存在下で哺乳動物細胞を培養する工程；
（ｃ−２）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
【請求項１０】
式（５）で表される化合物又はその塩。
【化５】
2017031095.tif 000031
［式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
Ｘは、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。］
【請求項１１】
式（６）で表される化合物又はその塩。
【化６】
2017031095.tif 000032
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ６は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアに特異的に局在する蛍光化合物又はその塩や、かかる蛍光化合物又はその塩を含有する、ミトコンドリアの蛍光染色に用いるための蛍光組成物や、かかる蛍光組成物を用いてミトコンドリア標的物質をスクリーニングする方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、真核生物細胞の細胞小器官の１つであり、主な機能は電子伝達系によるＡＴＰの生産である。生物の体内で消費するエネルギーのほとんどは、ミトコンドリアからＡＴＰとして供給される。ここ最近、ミトコンドリアは、エネルギー産生系という本来の機能とは別に、多様な機能に関与することが報告されている。例えば、ミトコンドリアを介するアポトーシス経路、ミトコンドリアの分解系、さらに、ミトコンドリアの異常を原因とする多数の疾患（ミトコンドリア病）の解明が、医学の分野では盛んに進められるようになった。
【０００３】
従来、細胞内ミトコンドリアの染色には、生体染色色素が用いられている。例えば、胚形成初期精子のミトコンドリア細胞内挙動を観察するために、Rhodamine（登録商標）１２３（invitrogen社製；cat. R302, R22420）やMito Tracker（登録商標）(invitrogen社製; cat. M7512)によって染色し、蛍光顕微鏡下で観察することが行われている（非特許文献１〜４）。また、ミトコンドリアへのターゲット配列を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２）、青色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）等の蛍光タンパク質に付加することにより、ミトコンドリアを可視化することも行われている（特許文献１、非特許文献５、６）。
【０００４】
しかし、前述の生体染色色素は、励起光により容易に退色してしまい、輝度が低下してしまう点、染色後においても色素が容易に解離してしまう点、色素によっては細胞を固定する必要がある点などの不十分な点があった。また、蛍光タンパク質を用いた前述のミトコンドリアの観察方法は、遺伝子組換え操作を伴うために時間対効果や費用対効果の面から十分なものではなかった。また、本発明者らは、エリスロポエチン発現増強作用や、ＡＴＰ産生促進作用を有する化合物について報告している（特許文献２）。しかし、特許文献２には、かかる化合物とミトコンドリア局在との関連性については明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３３３８４５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０８０６４０号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kaneda, H et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4542-4546.
【非特許文献２】Cummins, J. M et al., (1997) Zygote 5, 301-308.
【非特許文献３】Sutovsky, P. et al., (1996) Biol. Reprod. 55, 1195-1205.
【非特許文献４】Sutovsky, P. et al., (2000) Biol. Reprod. 63, 582-590.
【非特許文献５】Rizzuto, R et al., (1995) Curr. Biol. 5, 635-642.
【非特許文献６】Rizzuto, R et al., (1996) Curr. Biol. 6, 183-188.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、より簡便にミトコンドリアを高感度かつ特異的に標識できる蛍光化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−オキソ−１−フェニル−ブタン（特許文献２において化合物＃３と表記）を蛍光物質で修飾した蛍光化合物を合成したところ、かかる蛍光化合物はミトコンドリアに特異的に局在することが見いだされた。さらに、かかる蛍光化合物のミトコンドリアにおける蛍光輝度を指標として、ミトコンドリア標的物質をスクリーニングできることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕式（１）
【００１０】
【化１】
2017031095.tif 000002
［式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
Ａは、蛍光性有機基を表し、
ｍ１及びｍ２は、０又は１である。ただし、ｍ１＋ｍ２＝１である。］で表される化合物又はその塩（以下、「本件蛍光化合物類」ということがある。）。
〔２〕Ａが、以下の蛍光性有機基（２）であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の化合物又はその塩。
【００１１】
【化２】
2017031095.tif 000003
［Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ６は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
〔３〕式（３）で表される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物又はその塩。
【００１２】
【化３】
2017031095.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１及びｎ６は、同一でも異なっていてもよく、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
〔４〕式（３）中、Ｒ７及びＲ８が、同一であって、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
ｎ７及びｎ８が、同一でも異なっていてもよく、１〜３のいずれかの整数であることを特徴とする上記〔３〕に記載の化合物又はその塩。
〔５〕式（４）で表される上記〔３〕又は〔４〕に記載の化合物又はその塩。
【００１３】
【化４】
2017031095.tif 000005
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の化合物又はその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色に用いるための蛍光組成物。
〔７〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ａ）ミトコンドリア標的候補物質の存在下で哺乳動物細胞を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）で培養した哺乳動物細胞を、上記〔６〕に記載の蛍光組成物の存在下で培養する工程；
（ｃ）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
〔８〕以下の工程（ａ−１）〜（ｃ−１）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ａ−１）哺乳動物細胞を、上記〔６〕に記載の蛍光組成物の存在下で培養する工程；
（ｂ−１）工程（ａ−１）で培養した哺乳動物細胞を、ミトコンドリア標的候補物質の存在下で培養する工程；
（ｃ−１）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
〔９〕以下の工程（ｂ−２）〜（ｃ−２）を備えたことを特徴とするミトコンドリア標的物質のスクリーニング方法。
（ｂ−２）ミトコンドリア標的候補物質、及び上記〔６〕に記載の蛍光組成物の存在下で哺乳動物細胞を培養する工程；
（ｃ−２）前記蛍光組成物由来の蛍光輝度に基づき、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質であるかどうか評価する工程；
〔１０〕式（５）で表される化合物又はその塩。
【００１４】
【化５】
2017031095.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
Ｘは、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。］
〔１１〕式（６）で表される化合物又はその塩。
【００１５】
【化６】
2017031095.tif 000007
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ６は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。］
【発明の効果】
【００１６】
本件蛍光化合物類は、比較的短時間で生細胞中のミトコンドリアに特異的に局在する蛍光化合物であるため、本件蛍光化合物類を用いて細胞を蛍光染色すると、比較的簡単にミトコンドリアを高感度かつ特異的に蛍光標識することができる。また、本件蛍光化合物類は細胞毒性がないため、固定処理した細胞のみならず、生細胞におけるミトコンドリアのイメージング解析に有用である。さらに、ミトコンドリアに局在する本件蛍光化合物類の蛍光輝度を指標として、ミトコンドリア標的物質をスクリーニングすることができるため、ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼麻痺症候群）、ＭＥＬＡＳ（メラス：脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群）、ＭＥＲＲＦ（マーフ：赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）、Ｌｅｉｇｈ脳症（リー脳症：亜急性壊死性脳脊髄症）、Ｌｅｂｅｒ病（レーバー病）、Ｐｅａｒｓｏｎ病（ピアソン病）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）等のミトコンドリア病の治療剤の他、ミトコンドリア病やミトコンドリア異常に起因するがん、肺動脈性肺高血圧、動脈管開存症、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、視神経萎縮、糖尿病、虚血再灌流障害、心筋症、難聴、急性・慢性腎臓病、脳梗塞、膀胱癌、肝機能障害、ＡＬＳ、脆弱Ｘ症候群、副腎白質ジストロフィー等の疾患の治療剤の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）存在下でＬｅｉｇｈ細胞（図１Ａ）及びＨｅｐＧ２細胞（図１Ｂ）を培養し、イメージアナライザー解析した結果を示す図である。図中「式（４）で表される化合物」は式（４）で表される化合物の蛍光画像を示し、「ミトコンドリア」はミトコンドリア蛍光プローブ（MitoTracker Red CMSRos、Life Technologies社製）による蛍光画像を示し、「Ｍｅｒｇｅ画像」は前記２つの蛍光画像を重ねたものを示す。
【図２】健常者由来の線維芽細胞中のミトコンドリアに局在した本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）由来の蛍光強度を指標として、３種類の化合物（トランス−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸［図２Ａ］、ＩＡＡ［図２Ｂ］、及びインドメタシン［図２Ｃ］）のミトコンドリアへの結合レベルを検出した結果を示す図である。縦軸の「結合レベル（％）」は、上記化合物非存在下で培養した場合の本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）由来の蛍光強度を１００としたときの相対値で示し、横軸の「濃度（μＭ）」は、上記化合物の細胞培養液中の濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（化合物）
本発明の化合物は、式（１）で表される化合物である。
【００１９】
【化７】
2017031095.tif 000008
【００２０】
式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
Ａは、蛍光性有機基を表し、
ｍ１及びｍ２は、０又は１である。ただし、ｍ１＋ｍ２＝１である。
【００２１】
式（１）における炭素数１〜１０のアルキル基とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチルオ基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等を挙げることができる。
【００２２】
式（１）における炭素数１〜１０のアルコキシ基とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の直鎖状または分岐状のアルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ノニルオキシ基、ｎ−デシルオキシ基等を挙げることができる。
【００２３】
式（１）における炭素数２〜１０のアルケニル基とは、置換基を有していてもよい炭素数２〜１０の直鎖状または分岐状のアルケニル基を意味し、具体的には、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１，３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、１−ヘプテニル基、１−オクテニル基、１−ノネニル基、１−デセニル基等を挙げることができる。
【００２４】
式（１）における炭素数２〜１０のアルキニル基とは、置換基を有していてもよい炭素数２〜１０の直鎖状または分岐状のアルキニル基を意味し、具体的には、エチニル基、１−プロピニル基、１−ブチニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基、１−ヘプチニル基、１−オクチニル基、１−ノナイン基等を挙げることができる。
【００２５】
式（１）における炭素数３〜１０のシクロアルキル基とは、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０のシクロアルキル基を意味し、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等を挙げることができる。
【００２６】
式（１）における炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基とは、置換基を有していてもよい炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基を意味し、具体的には、シクロプロピルエチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロへキシルメチル基、シクロヘプチルエチル基、シクロオクチルメチル基、シクロノニルメチル基等を挙げることができる。
【００２７】
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を挙げることができる。
【００２８】
上記「置換基を有していてもよい」の置換基としては、フェニル基、ナフチル基等のアリール基、上記ハロゲン原子、上記アルコキシ基、カルボン酸基などを挙げることができる。
【００２９】
式（１）における蛍光性有機基（Ａ）としては、蛍光を発する有機基であれば特に制限されず、フェニル骨格、ピロール骨格、ピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格、フェナントレン骨格、ベンゾフェノン骨格、フルオレン骨格及びジフェニルチオエーテル骨格から選択される１又は２以上の骨格を含む有機基を挙げることができる。すなわち、式（１）における蛍光性有機基（Ａ）には、Dylight（登録商標） 405、Alexa（登録商標） Fluor 405、ATTO（登録商標） 425等の青色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基や、Alexa Fluor 488、5-FITC、BODIPY（登録商標） 492/515、FAM（登録商標）等の緑色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基や、Alexa Fluor 555、BODIPY TMR、Alexa Fluor 546等の黄色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基や、Alexa Fluor 594、BODIPY 650/665 Dye、Cy3（登録商標）等の赤色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基等が含まれる。
【００３０】
式（１）における蛍光性有機基としては、BODIPYの構造を有する以下の蛍光性有機基（２）を好適に例示することができる。
【００３１】
【化８】
2017031095.tif 000009
【００３２】
上記蛍光性有機基（２）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ７、Ｒ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基又はヘテロ原子を有していてもよい５〜１０員の芳香環基であり、
ｎ６は、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。
波線は隣接する炭素原子への結合を表す。
【００３３】
上記蛍光性有機基（２）における、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基及び炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基は、式（１）におけるハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基及び炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基と同じ定義であり、同様の例示を挙げることができる。
【００３４】
また、上記蛍光性有機基（２）における、ヘテロ原子を有していてもよい５〜１０員の芳香環基は、ヘテロ原子として酸素原子、窒素原子又は硫黄原子のいずれか１種以上を１〜４個有していてもよく、フェニル基、ナフチル基、ピロール基、ピラゾール基、イミダゾール基、オキサゾール基、イソキサゾール基、オキサジアゾール基、チアゾール基、イソチアゾール基、チアジアゾール基、ピリジン基、ピリダジン基、ピリミジン基、ピラジン基、トリアジン基、インドール基、イソインドール基、ベンゾピラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、ベンゾイソオキサゾール基、ベンゾイソチアゾール基、ベンゾオキサジアゾール基、ベンゾチアジアゾール基、ピロロピリジン基、ピラゾロピリジン基、イミダゾロピリジン基、ピロロピラジン基、ピラゾロピラジン基、イミダゾロピラジン基、ピロロピリミジン基、ピラゾロピリミジン基、プリン基、キノリン基、イソキノリン基、シノリン基、キナゾリン基、キノキサリン基等を挙げることができる。また、上記の芳香環基は置換基を有していてもよい。
上記置換基は、前記「置換基を有していてもよい」の置換基と同じ定義である。
【００３５】
蛍光性有機基（２）としては、例えば、以下の蛍光性有機基を挙げることができる。
【００３６】
【化９−１】
2017031095.tif 000010
【００３７】
【化９−２】
2017031095.tif 000011
【００３８】
前記式（１）で表される化合物の中でも、好ましくは、以下の式（３）で表される化合物又はその塩である。
【００３９】
【化１０】
2017031095.tif 000012
【００４０】
上記式（３）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ６は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基又はヘテロ原子を有していてもよい５〜１０員の芳香環基であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基であり、
ｎ１及びｎ６は、同一でも異なっていてもよく、０〜４のいずれかの整数であり、
ｎ２は、０〜５のいずれかの整数であり、
ｎ７及びｎ８は、同一でも異なっていてもよく、０〜３のいずれかの整数である。
【００４１】
上記式（３）における、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基及びヘテロ原子を有していてもよい５〜１０員の芳香環基は、式（１）におけるハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基及び炭素数４〜１０のシクロアルキルアルキル基、並びに、式（２）における蛍光性有機基におけるヘテロ原子を有していてもよい５〜１０員の芳香環基と同じ定義であり、同様の例示を挙げることができる。
【００４２】
式（３）中、Ｒ７及びＲ８は、同一であって、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、ｎ７及びｎ８が、同一でも異なっていてもよく、１〜３のいずれかの整数であることが、好ましい。
【００４３】
式（１）で表される化合物は、具体的には、特に以下の構造が好ましい。また、以下の構造の中でもより好ましくは、式（４）で表される化合物である。
【００４４】
【化１１−１】
2017031095.tif 000013
【００４５】
【化１１−２】
2017031095.tif 000014
【００４６】
【化１１−３】
2017031095.tif 000015
【００４７】
【化１１−４】
2017031095.tif 000016
【００４８】
【化１１−５】
2017031095.tif 000017
【００４９】
本件蛍光化合物類における塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等から生成された金属塩や、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、プロカイン等から生成された有機塩などが含まれる。
【００５０】
（化合物の合成）
本発明の式（１）で表される化合物は、公知の有機化学反応による有機合成手法を用いて合成することができる。
例えば、以下に示すように、ハロゲン化物（７）と蛍光性化合物の有機ホウ素体（８）とをパラジウム触媒及び塩基の存在下反応させる、鈴木−宮浦カップリング反応により連結することにより得られる。
【００５１】
【化１２】
2017031095.tif 000018
【００５２】
上記ハロゲン化物（７）の式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｎ２、ｍ１、ｍ２は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｎ２、ｍ１、ｍ２と同じ定義であり、Ｘは、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子から選択されるいずれかのハロゲン原子を表す。
上記有機ホウ素体（８）の式中、Ａは、式（１）におけるＡと同じ定義であり、Ｒａ、Ｒｂは、水酸基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂは、一緒になって環を形成してもよく、ピナコール又はトリメチレングリコールを表す。
【００５３】
上記パラジウム触媒としては、鈴木−宮浦カップリング反応に用いられるパラジウム触媒であれば特に限定されず、例えば酢酸パラジウム（II）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II)ジクロリド、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（II）ジクロリド−ジクロロメタン錯体、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（０）等の公知のパラジウム錯体を挙げることができ、好ましくは、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）である。効率よく反応が進行するために、例えばトリフェニルホスフィン、トリ−ｏ−トリルホスフィン、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン、トリス（ｏ−メトキフェニル）ホスフィン、ジブチルブチルホスホネート等リン配位子、トリフェニルヒ素等のヒ素配位子等を適宜添加してもよい。
【００５４】
上記塩基としては、鈴木−宮浦カップリング反応に用いられる塩基であれば特に限定されず、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン等のアミン類；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の無機塩基類を挙げることができる。
【００５５】
上記ハロゲン化物（７）は、例えば、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５が水素原子であるとき、ベンゼン化合物（９）を出発物質として合成することができる。
具体的には、まず、ベンゼン化合物（９）と無水マレイン酸とを、フリーデル−クラフツ反応を用いて、４−アリール−４−オキソ−２−ブテン酸（１０）を合成する。該フリーデル−クラフツ反応は、ルイス酸、リン酸、ポリリン酸等を触媒として作用させることで行い、触媒として好適には塩化アルミニウムが用いられる。
次に、得られた４−アリール−４−オキソ−２−ブテン酸（１０）とインドール化合物（１１）とをマイケル反応させることにより、インドール酢酸のα位にベンゾイルオキシ基が置換した化合物、すなわち、ハロゲン化物（７）を合成することができる。
【００５６】
【化１３】
2017031095.tif 000019
【００５７】
上記ベンゼン化合物（９）の式中、Ｒ１、ｎ１、ｍ１は、式（１）におけるＲ１、ｎ１、ｍ１と同じ定義であり、Ｘは、ハロゲン化物（７）におけるＸと同じ定義である。
上記インドール化合物（１１）の式中、Ｒ２、ｎ２、ｍ２は、式（１）におけるＲ２、ｎ２、ｍ２と同じ定義であり、Ｘは、ハロゲン化物（７）におけるＸと同じ定義である。
【００５８】
上記マイケル反応において、４−アリール−４−オキソ−２−ブテン酸（１０）のカルボキシル基は保護されていても保護されていなくてもよく、通常は保護する必要はないが、保護する場合、用いられる保護基としては、メチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、２，２，２−トリクロロエチルエステル及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエステル等を挙げることができる。インドールの窒素原子も保護されていても保護されていなくてもよく、保護する場合はベンジル系の保護基が好ましい。保護基を使用する場合、保護基を除去することで、ハロゲン化物（７）が合成できる。また、カルボン酸基及び/又はインドールの窒素原子が保護されたまま、前記有機ホウ素体（８）との鈴木−宮浦カップリング反応を行うこともできる。
【００５９】
上記ベンゼン化合物（９）としては、例えば、市販のブロモベンゼン等を挙げることができる。また、市販のベンゼンを出発物とし、公知の反応を行うことによって、ハロゲン基Ｘや置換基Ｒ２を導入してベンゼン化合物（９）を得ることもできる。
【００６０】
上記インドール化合物（１１）としては、例えば、市販のインドール等を挙げることができる。また、市販のインドールを出発物とし、公知の反応を行うことによって、ハロゲン基Ｘや置換基Ｒ１を導入してインドール化合物（１１）を得ることもできる。
【００６１】
また、上記ハロゲン化物（７）は、フィッシャーのインドール合成法によっても合成することができる。具体的には、フェニルヒドラジン化合物（１２）とアルデヒド化合物（１３）とを、酸触媒下反応させることによって、ハロゲン化物（７）を合成する。上記酸触媒としては、例えば、塩酸、硫酸、塩化亜鉛、トリフルオロボラン・ジエチルエーテル錯体等が用いられる。
【００６２】
【化１４】
2017031095.tif 000020
【００６３】
上記フェニルヒドラジン化合物（１２）の式中、Ｒ２、ｎ２、ｍ２は、式（１）におけるＲ２、ｎ２、ｍ２と同じ定義であり、Ｘは、ハロゲン化物（７）におけるＸと同じ定義である。
上記アルデヒド化合物（１３）の式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｍ１は、式（１）におけるＲ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｍ１と同じ定義であり、Ｘは、ハロゲン化物（７）におけるＸと同じ定義である。
【００６４】
上記フェニルヒドラジン化合物（１２）としては、例えば、市販の４−ブロモフェニルヒドラジン等を挙げることができる。また、市販のアニリンを出発物とし、公知の反応を行うことによって、ハロゲン基Ｘや置換基Ｒ２を導入し、さらにアミノ基をヒドラジンへと誘導することによって、フェニルヒドラジン化合物（１２）を得ることもできる。
【００６５】
上記アルデヒド化合物（１３）は、例えば以下に示すように、ベンゼン化合物（９）と、公知の反応により誘導して得た酸塩化物（１４）とをフリーデルクラフツ反応により連結し、アルコールの酸化及びメチルエステルの加水分解を行うことによって合成できる。
【００６６】
【化１５】
2017031095.tif 000021
【００６７】
上記酸塩化物（１４）の式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。
【００６８】
ハロゲン化物（７）の中でも、以下の式（５）で表される化合物又はその塩が好ましい。
【００６９】
【化１６】
2017031095.tif 000022
【００７０】
上記式（５）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｎ２は、式（１）におけるＲ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｎ２と同じ定義であり、Ｘは、ハロゲン化物（７）におけるＸと同じ定義である。
【００７１】
蛍光性化合物の有機ホウ素体（８）は、公知の有機化学反応を用い、蛍光性化合物にボロン酸基又はボロン酸エステル基を導入することによって合成することができる。
【００７２】
また、蛍光性有機基が、BODIPYの構造を有する（６）である場合、ピロール（１５）及び（１６）とボロン酸基又はボロン酸エステル基を有する芳香族アルデヒド（１７）との縮合の後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体と塩基の存在下、キノン系酸化剤による酸化をすることによって、有機ホウ素体を合成することができる。
【００７３】
【化１７】
2017031095.tif 000023
【００７４】
上記ピロール（１５）及び（１６）の式中、Ｒ７、Ｒ８、ｎ７、ｎ８は、式（２）におけるＲ７、Ｒ８、ｎ７、ｎ８と同じ定義である。
上記芳香族アルデヒド（１７）の式中、Ｒ６、ｎ６は、式（２）におけるＲ６、ｎ６と同じ定義である。
【００７５】
上記ピロール（１５）及び（１６）としては、例えば、市販のピロール、ジメチルピロール等を挙げることができる。また、上記ピロール（１５）及び（１６）は、市販のピロールを出発物とし、公知の反応を行うことによって置換基Ｒ７又はＲ８を導入し、得ることもできる。
【００７６】
上記芳香族アルデヒド（１７）としては、例えば、市販のｐ−ホルミルフェニルボロン酸等を挙げることができる。また、上記芳香族アルデヒド（１７）は、市販のｐ−ホルミルフェニルボロン酸を出発物とし、公知の反応を行うことによって置換基Ｒ６を導入し、得ることもできる。
【００７７】
以上の有機反応は、それぞれ溶媒中で行うことができるが、溶媒は反応温度や反応物等によって適宜選択される。また、上記有機反応の反応温度は、用いる溶媒の沸点等の条件によって適宜選択される。上記有機反応で溶媒を用いる場合、得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、残渣をそのまま次の反応に使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製を挙げることができる。
【００７８】
本発明の蛍光組成物としては、本件蛍光化合物類を有効成分として含有し、ミトコンドリアの蛍光染色に用いるためという用途に限定されたものであればよく、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、溶剤、ゲル化剤等の配合成分がさらに添加されたものを例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００７９】
本発明の蛍光組成物の使用形態としては、必要に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤、カプセル剤、溶液、乳剤を挙げることができる。
【００８０】
本発明のスクリーニング方法において、本件蛍光化合物類及び／又はミトコンドリア標的候補物質の存在下で哺乳動物細胞を培養する方法としては、本件蛍光化合物類及び／又はミトコンドリア標的候補物質（被検物質）がミトコンドリアに局在するのに十分な時間、哺乳動物細胞の培養に適した条件下で培養すればよく、時間、温度、培養液の種類等の培養条件は、哺乳動物細胞の特性も考慮して適宜選択することができる。培養時間は、本件蛍光化合物類の存在下で培養する場合、通常５分〜２４時間の範囲内、好ましくは１０分〜１２時間の範囲内、より好ましくは２０分〜６時間の範囲内、さらに好ましくは３０分〜３時間の範囲内、特に好ましくは４０分〜２時間の範囲内であり、ミトコンドリア標的候補物質の存在下で培養する場合、通常５分〜４８時間の範囲内、好ましくは１〜４２時間の範囲内、より好ましくは６〜３８時間の範囲内、さらに好ましくは１２〜３２時間の範囲内、特に好ましくは１８〜２６時間の範囲内である。また、培養温度は、通常２０〜３８℃の範囲内であり、好ましくは３５〜３７℃の範囲内である。また、培養液としては、血清含有又は無血清培養液、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液等の生理的水溶液を挙げることができ、ここで血清含有培養液としては、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＡＩＭ−Ｖ等）を挙げることができ、また、上記無血清培養液としては、市販のＢ２７サプリメント（−インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１〜３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。
【００８１】
上記哺乳動物細胞には、細胞周期のチェックポイント機構が正常な哺乳動物正常細胞や、細胞周期のチェックポイント機構が異常な哺乳動物癌細胞や、上記正常細胞にＳＶ４０由来のＴ抗原を発現させ、無限の増殖能を獲得した哺乳動物形質転換細胞等の他、多能性幹細胞（胚性幹細胞［ＥＳ細胞］、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞等）、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞などの哺乳動物幹細胞が含まれる。上記哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することが、中でも、ヒトを好適に例示することができる。
【００８２】
本発明のスクリーニング方法において、本発明の蛍光組成物（本件蛍光化合物類）由来の蛍光輝度（強度）は、本件蛍光化合物類及びミトコンドリア標的候補物質の存在下で培養した哺乳動物細胞に、蛍光顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダー等の蛍光測定装置を用いて励起光を照射し、検出する。
【００８３】
上記励起光を照射する哺乳動物細胞としては、蛍光顕微鏡で観察できるように調製したものであれば、固定処理したものであっても、生きた状態のものであってもよく、具体的には、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、エタノール、メタノール、アセトン等を用いてスライドグラスやカバーグラス上に固定処理した細胞や、Ｎｕｎｃ ９６マイクロウェルプレート（Thermo Scientific社製）、ガラスボトムウェルプレート（MatTek社製）等の生細胞観察用ディッシュ上に培養した生細胞を挙げることができる。また、細胞観察を容易にするために、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ＰＩ（Propidium Iodide）等のＤＮＡに結合して蛍光を発する核酸染色剤で哺乳動物細胞の細胞核を染色処理してもよい。
【００８４】
上記励起光の波長としては、本件蛍光化合物類の蛍光波長に応じて適宜選択することができる。例えば、本件蛍光化合物類における蛍光性有機基（Ａ）がDylight405、Alexa Fluor 405、ATTO 425等の青色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基の場合、蛍光波長は４２０〜４９０ｎｍであることから、哺乳動物細胞に照射する励起光の波長は、通常４００〜４４０ｎｍの範囲内であり、また、本件蛍光化合物類における蛍光性有機基（Ａ）がAlexa Fluor 488、5-FITC、BODIPY 492/515、FAM等の緑色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基の場合、蛍光波長は４９０〜５４０ｎｍであることから、哺乳動物細胞に照射する励起光の波長は、通常４４０〜５２０ｎｍの範囲内であり、また、本件蛍光化合物類における蛍光性有機基（Ａ）がAlexa Fluor 555、BODIPY TMR、Alexa Fluor 546等の黄色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基の場合、蛍光波長は５４０〜５９０ｎｍであることから、哺乳動物細胞に照射する励起光の波長は、通常５２０〜５１０ｎｍの範囲内であり、また、本件蛍光化合物類における蛍光性有機基（Ａ）がAlexa Fluor 594、BODIPY 650/665 Dye、Cy3等の赤色系蛍光物質の構造を有する蛍光性有機基の場合、蛍光波長は５９０〜８１０ｎｍであることから、哺乳動物細胞に照射する励起光の波長は、通常５１０〜７８０ｎｍの範囲内である。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法において、個々の細胞における蛍光輝度を算出する場合、本発明の蛍光組成物（本件蛍光化合物類）由来の蛍光輝度を含む蛍光画像を取得することが好ましい。かかる蛍光画像は、一般的なＰＣ等のコンピュータをコントローラとして用い、水銀ランプ、キセノンランプ、ヘリウム−カドミニウムレーザー、ＬＤ励起ＣＷ／Ｑ−ＣＷ（連続発振／準連続発振）固体レーザー等の励起光照射手段やＣＣＤカメラを備え、ＣＣＤカメラの撮影条件の制御、取得蛍光画像の画像化と表示、光源の光量の制御等を行うことができる蛍光顕微鏡を用いて取得することができる。本件蛍光化合物類が発光する蛍光輝度が飽和しないように、励起光側のフィルター、ダイクロイックミラー等の必要な設定を行い、さらには励起光の露光時間は通常１０秒以下であり、好ましくは３秒以下であり、より好ましくは１秒以下である。
【００８６】
上記取得した蛍光画像における蛍光輝度は、Image・J、Photoshop、LuminaVision ソフトウエア（Mitani Corporation製）、Thermo Scientific Cellomics Colocalization V4 BioApplication（Thermo Scientific社製）等の画像解析ソフトを用いて測定する。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法において、本発明の蛍光組成物由来の蛍光輝度が、コントロール（例えば、本発明のスクリーニング方法の各工程を、ミトコンドリア標的候補物質非存在下で行った場合に検出された蛍光輝度）と比較して低い場合、ミトコンドリア標的候補物質がミトコンドリア標的物質である可能性は高いと評価（判定）することができ、本発明の蛍光組成物由来の蛍光輝度が、前記コントロールと比較して変わらない場合、ミトコンドリア標的候補物質はミトコンドリア標的物質である可能性が低いと評価（判定）することができる。
【００８８】
本発明のスクリーニング方法によりミトコンドリア標的物質である可能性が高いと評価（判定）されたミトコンドリア標的候補物質は、ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼麻痺症候群）、ＭＥＬＡＳ（メラス：脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群）、ＭＥＲＲＦ（マーフ：赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）、Ｌｅｉｇｈ脳症（リー脳症：亜急性壊死性脳脊髄症）、Ｌｅｂｅｒ病（レーバー病）、Ｐｅａｒｓｏｎ病（ピアソン病）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）等のミトコンドリア病の候補治療剤に有利に適用することができる。かかるミトコンドリア病には、ミトコンドリア病やミトコンドリア異常に起因するがん、肺動脈性肺高血圧、動脈管開存症、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、視神経萎縮、糖尿病、虚血再灌流障害、心筋症、難聴、急性・慢性腎臓病、脳梗塞、膀胱癌、肝機能障害、ＡＬＳ、脆弱Ｘ症候群、副腎白質ジストロフィー等の疾患も便宜上含まれる。
【００８９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９０】
１．式（４）で表される化合物の合成
１−１  合成中間体（５−１）の合成
【００９１】
【化１８】
2017031095.tif 000024
【００９２】
［工程１］
１００ｍＬ丸底フラスコにブロモベンゼン（１０００ｍｇ，６．３７ｍｍｏｌ）及び無水マレイン酸（４９９ｍｇ，５．１０ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させた。撹拌しながら、三塩化アルミニウム（１２７３ｍｇ，９．５５ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、クロロホルム：メタノール＝９：１）により反応終了を確認し、丸底フラスコ中の固形物をパスツールピペットで砕きながら固形物ごと氷水（１００ｍＬ）に入れて反応を停止した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で抽出し、食塩水（１７０ｍＬ）で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をベンゼン／アセトンからの再結晶により精製して、trans−４−（４−ブロモフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸を（７９３ｍｇ，４８．８％）を淡黄色結晶として得た。：融点１５２．７〜１５４．３℃；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）δ  ８．０３（ｄ，Ｊ＝８．８，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．８，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）  δ  １８９．２３，１６６．３７，１３７．０３，１３６．５０，１３３．３７，１３３．００，１３１．４４，１２９．１６．
【００９３】
［工程２］
３０ｍＬ丸底フラスコにtrans−４−（４−ブロモフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（２００ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をベンゼン（４ｍＬ）で溶解させ、インドール（１３７ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ）加えて、７０℃で５時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２：１）を用いて精製を行い、式（５−１）で表される４−（４−ブロモフェニル）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（１５１ｍｇ，収率５２％）を得た。：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）δ １０．２４（s, １H） , ８．０２（d, J＝８．０, ２H）, ７．７８（d, J＝７．６，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ），７．４０（ｔ，Ｊ＝９．８，２Ｈ），７．１３（ｔ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．０５（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），４．５６（ｄｄ，Ｊ＝３．６，３．６，１Ｈ），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝３．６，４．４，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ  （ＣＤ３）２ＣＯ）  δ  Ｃ１９７．９０，１７５．０４，１３７．６２，１３６．６９，１３２．６１，１３０．７２，１２８．２５，１２７．４２，１２３．７４，１２２．３５，１１９．９８，１１９．７６，１１３．３３，１１２．２６，４２．３４ ，３８．４６．
【００９４】
１−２  合成中間体（６−１）の合成
【００９５】
【化１９】
2017031095.tif 000025
【００９６】
［工程３］
真空乾燥した３０ｍＬ丸底フラスコに２，４−ジメチルピロール（１０８ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を入れ無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させ、ｐ−ホルミルフェニルボロン酸（８５ｍｇ，０．５６８ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を１滴加え、窒素置換後、溶液が薄い赤色になるまで、常温で攪拌した。反応混合物をＴＬＣ（クロロホルム：アセトン＝１：１）により反応終了を確認した。
【００９７】
［工程４］
上記反応混合物に、ＤＤＱ（２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン，１２９ｍｇ，０．５６８ｍｍｏｌ）を加え室温で２０分間攪拌した。トリエチルアミン（０．８ｍＬ）とＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体，２．４ｍＬ）を加え室温で２時間攪拌した後、酢酸エチルと水をそれぞれ５０ｍＬ加えて抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧留去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝２：１）を用いて精製を行い、橙色結晶の化合物６−１（４７ｍｇ，収率２２．５％）を得た。：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ２）  δ  １．３５（ｓ，６Ｈ），２．５８（ｓ，６Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝１４．０，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）  δ  １４．４１，１４．５７，１７．１３，１８．４０，５８．４９，５８．９４，１２１．１９，１２１．３７，１２７．３７，１２７．８４，１３１．０４，１３１．２０，１３４．０６，１３６．３７，１３７．２７，１３９．７３，１４２．９４，１４３．１２，１５５．４６，１５５．７８．
【００９８】
１−３  式（４）で表される化合物の合成
【００９９】
【化２０】
2017031095.tif 000026
【０１００】
［工程５］
上記の４−（４−ブロモフェニル）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（５−１、４２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）と上記の化合物６−１（４６ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をジメトキシエタン／エタノール（１：１）混合溶媒（３ｍＬ）に溶解し、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，７ｍｇ，６μｍｏｌ）と２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）を加えた。７０℃で１時間撹拌した後、反応混合物をセライトろ過し、ろ液を６Ｎ塩酸溶液によってｐＨ３．０にした。上記ろ液に水（２５ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出し（２５ｍＬ×３）、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１５：１）を用いて精製を行い、橙色の針状結晶として式（４）で表される化合物（１６．９ｍｇ，収率２４％）を得た。: 融点２０１〜２０３℃；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．１６（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ），７．９８（ｔ，Ｊ＝１０．０，４Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），７．１０（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．０２（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），６．２０（ｓ，２Ｈ），４．３８（ｄｄ，Ｊ＝３．６，３．６，１Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１０．８，１Ｈ），３．３９  （ｄｄ，Ｊ＝３．６，３．６，１Ｈ），２．４７（ｓ，６Ｈ），１．４２（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；  δ  １９７．９５，１７４．７５，１５５．０１，１４３．３６，１４２．７２，１４１．４４，１３９．４２，１３６．２４，１３５．５６，１３４．０６，１３０．６４，１２８．８４，１２８．６８，１２７．７０，１２６．９６，１２６．２５，１２３．２７，１２１．４７，１２１．１５，１１９．０６，１１８．６２，１１１．９１，１１１．５２，４１．２４，３７．６６，１４．２５，１４．２０；ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）６１６．３［Ｍ＋Ｈ］＋．
【実施例２】
【０１０１】
２．本発明の蛍光化合物がミトコンドリアに局在することの確認
Ｌｅｉｇｈ脳症患者由来の皮膚線維芽細胞（Ｌｅｉｇｈ細胞）及びヒト肝臓癌由来の上皮性細胞（ＨｅｐＧ２細胞）を用いて、本発明の蛍光化合物がミトコンドリアに局在するかどうか解析した。
【０１０２】
２−１  方法
２−１−１  細胞培養
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ９６マイクロウェルプレート、Thermo Scientific社製）に、５，０００ 細胞／ウェルとなるようにＬｅｉｇｈ細胞及びＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣより入手）をそれぞれ播種し、１．０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、及び１００ Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(ナカライテスク社製)（以下、単に「細胞培養液」という）中で５．０％ ＣＯ２／２０％ Ｏ２、３７℃条件下で培養した。なお、Ｌｅｉｇｈ細胞は、Ｌｅｉｇｈ脳症患者に皮膚生検を行って皮膚線維芽細胞を得た後、細胞培養液中で培養することにより単離した。
【０１０３】
２−１−２  イメージアナライザー解析用細胞試料の調製
上記「２−１  細胞培養」の項目に記載の方法にしたがって培養したＨｅｐＧ２細胞、及び１０回継代（Passage 10）培養したＬｅｉｇｈ細胞を、１００ｎＭ式（４）で表される化合物を含有する細胞培養液中で１時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞核及びミトコンドリアの染色のために、１００ｎＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３４３２（ナカライテスク社製）及び１７．８μＭ MitoTracker Red CMSRos（Life Technologies社製）を含有する細胞培養液を添加し、３０分間培養した。
【０１０４】
２−１−３  イメージアナライザー解析
上記「２−１−２  イメージアナライザー解析用細胞試料の調製」の項目に記載の方法にしたがって調製した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１００μＬ ＰＢＳを添加し、セロミクスイメージアナライザー（ArrayScan HCS Reader version VTI、Thermo Scientific社製）を用い、励起フィルター（４６０〜５００ｎｍ）及び吸収フィルター（５１０〜５７０ｎｍ）により細胞イメージ画像を取得した。
【０１０５】
２−２  結果
本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）はミトコンドリアに局在する蛍光化合物であることが示された（図１参照）。なお、式（４）で表される化合物の最大励起波長は５０３ｎｍであり、最大蛍光波長は５１２ｎｍであった。
【実施例３】
【０１０６】
３．本発明の蛍光化合物を用いてミトコンドリア標的物質をスクリーニングできることの確認
次に、健常者由来の線維芽細胞を用いて、ミトコンドリアに局在する本発明の蛍光化合物の蛍光輝度を指標として、ミトコンドリア標的（局在）物質をスクリーニングできるかどうか解析した。
【０１０７】
３−１  方法
３−１−１  細胞培養
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ９６マイクロウェルプレート、Thermo Scientific社製）に、５，０００ 細胞／ウェルとなるように健常者由来の線維芽細胞（LONZA社製）を播種し、細胞培養液中で５．０％ ＣＯ２／２０％ Ｏ２、３７℃条件下で培養した。
【０１０８】
３−１−２  イメージアナライザー解析用細胞試料の調製
上記「３−１−１  細胞培養」の項目に記載の方法にしたがって培養した健常者由来の線維芽細胞を播種し、１日後に細胞培養液を除去し、ミトコンドリア膜間部位に局在するミトフィリン（Mitofilin）と結合する候補化合物３種（トランス−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸、インドール３−酢酸［ＩＡＡ］［ＷＡＫＯ社製］、及びインドメタシン［ナカライテスク社製］）を、それぞれ各濃度（０、０．３、１．０、３．０、１０、及び３０ μＭ）で含有する細胞培養液１００ μＬを添加した。一晩培養後、かかる細胞培養液を除去し、１００ｎＭ 式（４）で表される化合物を含有する細胞培養液を添加し、１時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞核及びミトコンドリアの染色のために、１００ｎＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３４３２（ナカライテスク社製）及び１７．８μＭ MitoTracker Red CMSRos（Life Technologies社製）を含有する細胞培養液を添加し、３０分間培養した。
【０１０９】
３−１−３  イメージアナライザー解析
上記「３−１−２  イメージアナライザー解析用細胞試料の調製」の項目に記載の方法にしたがって調製した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１００μＬ ＰＢＳを添加し、セロミクスイメージアナライザー（ArrayScan HCS Reader version VTI、Thermo Scientific社製）を用い、励起フィルター（４６０〜５００ｎｍ）及び吸収フィルター（５１０〜５７０ｎｍ）により細胞イメージ画像を取得した。細胞イメージ画像解析は、Thermo Scientific Cellomics Colocalization V4 BioApplication（Thermo Scientific社製）を使用した。
【０１１０】
３−２  結果
トランス−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸が濃度依存的に式（４）で表される化合物のミトコンドリアへの局在（結合）を阻害することが明らかとなった（図２Ａ参照）。一方、ＩＡＡ及びインドメタシンについては、式（４）で表される化合物のミトコンドリアへの結合阻害効果は認められなかった（図２Ｂ及びＣ参照）。これらの結果は、トランス−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸が本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）と競合的にミトコンドリアへ結合することを示すとともに、ミトコンドリアに局在した本発明の蛍光化合物（式（４）で表される化合物）由来の蛍光強度を指標として、ミトコンドリア標的物質（トランス−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸）をスクリーニングできることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明によると、ミトコンドリアを高感度かつ特異的に蛍光標識することができ、また、蛍光輝度を指標としてミトコンドリア標的物質をスクリーニングすることができるため、ＣＰＥＯ、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＲＦ、Ｌｅｉｇｈ脳症、Ｌｅｂｅｒ病、Ｐｅａｒｓｏｎ病、ＦＲＤＡ等のミトコンドリア病の治療剤の他、ミトコンドリア病やミトコンドリア異常に起因するがん、肺動脈性肺高血圧、動脈管開存症、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、視神経萎縮、糖尿病、虚血再灌流障害、心筋症、難聴、急性・慢性腎臓病、脳梗塞、膀胱癌、肝機能障害、ＡＬＳ、脆弱Ｘ症候群、副腎白質ジストロフィー等の疾患の治療剤の開発に資するものである。
【図１】
2017031095.tif 000034
【図２】
2017031095.tif 000035