(57)【要約】【課題】高い化学的ポテンシャルより迅速に生体膜に浸透するナノ粒子分散液を提供すること。【解決手段】水分子を取り込むことができるタンパク質を構成成分とするナノ粒子であって、ナノ粒子の内圧（Ｐ‘）が１０ａｔｍを超えるナノ粒子が含水溶媒中に分散されていることを特徴とするナノ粒子分散液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水分子を取り込むことができるタンパク質を構成成分とするナノ粒子の分散液であって、下記式（１）から計算される前記ナノ粒子の内圧（Ｐ‘）が１０ａｔｍを超えるナノ粒子が含水溶媒中に分散されていることを特徴とするナノ粒子分散液。
Ｐ‘＝２σ／γ×ａ＋Ｐ０              （１）
Ｐ‘：ナノ粒子の内圧（ａｔｍ）
ＰＯ：ナノ粒子分散液の圧（ａｔｍ）
σ：表面張力（Ｎ／ｍ）
γ：ナノ粒子の半径（ｍ）
ａ：９．８７×１０−６
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は少なくとも水分子を取り込むことが出来る１種以上のタンパク質を構成成分とするナノ粒子が大部分水からなる水溶液中に分散していることを特徴とするナノ粒子分散液であって、該ナノ粒子の内圧が１０ａｔｍを超え、そのことによって迅速に生体膜を浸透しうることを特徴とするナノ粒子を分散したナノ粒子分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
この２０年間で、最も注目を集めている技術領域の１つはナノ粒子に関わるものである。特に粒子径１０−１００ｎｍのナノ粒子の開発については、広範囲の科学者や技術者が試みている（非特許文献１）。
【０００３】
ナノ粒子を研究する技術範囲の広さは以下に示す学術論文が扱うテーマからもよく分かる。すなわち、研究分野では、１）ナノ粒子プローブを用いたＤＮＡ配列の検知（非特許文献２−４）、２）金属ナノ粒子を用いた電磁気エネルギー転移の局所的検地（非特許文献５）、３）Ａｕナノ粒子が哺乳類の細胞に取り込まれる状況（非特許文献６）、４）ナノ粒子を用いたリソグラフィー（非特許文献７）、５）Ａｇナノ粒子の形状による抗菌活性の飛躍的向上（非特許文献８）、６）抗がん剤のキャリアとしてナノ粒子（非特許文献９−１１）、７）ナノ粒子の触媒としての利用（非特許文献１２、１３）などがある。
【０００４】
また、商品開発分野では、ボツリヌス毒素等を包含したナノ粒子（特許文献１）、α−リポ酸と非イオン性界面活性剤と２価金属塩からなるα−リポ酸ナノ粒子（特許文献２）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体のいずれかで作製されたナノ粒子の表面にヒアルロン酸を配位したナノ粒子（特許文献３）、タンパク質を架橋処理して得られるクルクミンを内包するタンパク質ナノ粒子（特許文献４）なども報告されている。
【０００５】
また、ナノ粒子は粒子径が非常に小さいため、皮膚から体内に容易に浸透するようなナノ粒子をつくることが出来るならは、スキンケアの技術が大幅に向上することが期待されることから、皮膚浸透を目的とした技術も報告されている。例えば、非特許文献１４ではＡｇナノ粒子を用いた皮膚への浸透性に関する研究が報告されている。しかし、その浸透性は２４時間後での効果であり、浸透性の効果は弱い。また、非特許文献１５では粒子径が１５ｎｍであるＡｇナノ粒子をトルエン中でヒトの皮膚に浸透するかどうかを検証しているが、２４時間でわずかしか浸透していないことが示されている。
【０００６】
一方、本発明者らは、食品素材を用いたナノ粒子の開発に取り組んできた。例えば、ゼラチンとガレート型カテキンを用いて得られるナノ粒子の製造方法（特許文献５）、ホエイタンパク質とガレート型カテキンを用いて得られるナノ粒子の製造方法（特許文献６）、ゼラチンとガレート型カテキンを用いて得られる生理活性物質を安定化させるナノ粒子（特許文献７）、タンニン酸を用いて作製したナノ粒子（特許文献８）、生理活性物質の担持量を向上させたナノ粒子製造方法（特許文献９）などを報告している。本発明者らがこれまでに提案しているナノ粒子の主成分はゼラチン等のタンパク質とガレート基を有する化合物からなるものであって、その平均粒子径は１００ｎｍ以下であるナノ粒子である。また、このようなナノ粒子の応用として還元型ＣｏＱ１０のような不安定な生理活性物質を安定化させるものや、キャリアとしての機能を向上させるものを提案してきている。
【０００７】
一方、粒子径がナノメートルサイズであるナノ粒子は、表面張力と粒子径との関係より高い内圧を有していることが、流体力学の分野で公知のラプラスの方程式を用いた熱力学的計算によって予想することができるが、これまでに、ナノ粒子の内圧に着目したナノ粒子は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−１２９４２６号公報
【特許文献２】特許第０４６４７７０６号公報
【特許文献３】特開２０１０−１５０１５１号公報
【特許文献４】特開２００９−２４９３７０号公報
【特許文献５】特願２０１４−１６０７４５号公報
【特許文献６】特願２０１４−１６０７４９号公報
【特許文献７】特願２０１４−２２３４３２号公報
【特許文献８】特願２０１４−２２３４３３号公報
【特許文献９】特願２０１４−２６６８３８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chemphyschem 2000, 1, 18-52
【非特許文献２】Science 2000, 289, 1757-1760
【非特許文献３】Science 2003, 301, 1884-1886
【非特許文献４】Science 2002, 295, 1503-1506
【非特許文献５】Nature Medicine 2003, 2, 229-232
【非特許文献６】Nature Lette. 2006, 6, 662-668
【非特許文献７】J. Phys. Chem. B, 2001, 105, 5599-5611
【非特許文献８】Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73, 1712-1720
【非特許文献９】Adv. Drug Deliv. Rev., 2004, 56, 1649-1659
【非特許文献１０】J. Clinical Onocology, 2005, 23, 7794-7803
【非特許文献１１】PNAS 2006, 103, 6315-6320
【非特許文献１２】J. Phys. Chem. B., 2005, 109, 12663-12676
【非特許文献１３】J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 14278-14280
【非特許文献１４】Toxicology 2009, 255, 33-37
【非特許文献１５】Pharm. Res., 2011, 28, 2931-2944
【非特許文献１６】Thermodynamicse, Chapter 29, 1961,
【非特許文献１７】NanoToday, 2008, 3, 40
【非特許文献１８】Nano Lette., 2007, 7, 1542-1540
【非特許文献１９】J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 4700-4701
【非特許文献２０】Angew. Chem., 2001, 40, 4128-4158
【非特許文献２１】J. Nanobiotechnology, 2013, 11, 26
【非特許文献２２】Jirgensons, Brunoら、「コロイド化学」、培風館、1967年出版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、高い化学的ポテンシャルより迅速に生体膜に浸透するナノ粒子分散液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、これまでに報告したナノ粒子について、その用途開発も視野にさらなる技術開発を行ってきた。その中で、当該ナノ粒子を分散した水溶液を皮膚に塗布すると、水を塗布した場合と比べて、ナノ粒子分散液に由来すると考えられる冷涼感を強く感じることができるという現象を発見したことから、この原因を説明出来る理論的根拠を探したところ、ラプラスの方程式が見出された（非特許文献１６）。
即ち、ラプラスの方程式：
Ｐ‘−Ｐ０＝２σ／γ
Ｐ‘：粒子の内圧
ＰＯ：粒子分散液の圧
σ：表面張力
γ：粒子の半径
によると、Ｐ‘−Ｐ０は球内の過剰圧力を示し、この圧力はナノ粒子表面に配位する水の表面張力の２倍に比例し、球の半径γに逆比例する。
熱力学的な見地から言うと、圧力は単位体積当りのフリーエネルギーであることから、この圧力が大きければその粒子のもつフリーエネルギーも大きくなって、内圧の小さい粒子よりも活発に運動できることとなる。なお、化学物質のフリーエネルギーは物質の運動エネルギーに相当する。
したがって、理論上からいうと、球の内圧が１気圧を超えると、普通の１気圧のものよりもそのフリーエネルギーが大きくなって、何かこれまでと違った挙動を示すことが期待出来る。先のラプラス方程式においてγをカテキンやゼラチンのような個体の表面張力とすると、いくらその粒子径が１００ｎｍ以下としてもＰ‘−Ｐ０は１ａｔｍを超えることはない。したがって、本発明者らが見つけた前記現象の原因を説明するためには、本発明者らが開発したナノ粒子は水分子を数百個のオーダーで配位していると仮定する必要がある。
ここで、非特許文献１７では、最近のナノ粒子―タンパク質コロイドではかなりの数の水分子がタンパク質成分をもつナノ粒子に結合していることを仮定されていることから、前記ラプラス方程式の表面張力（δ）は殆ど媒体である水の表面張力に近似できると考えられる。即ち、δとして７１．２×１０−３Ｎ／ｍ、さらにγとして５０ｎｍを前記方程式に導入すると１４ａｔｍとなる。
そこで、本発明者らは、前記のようにナノ粒子の内圧の大きさが、皮膚透過性に影響することに着目することで、本発明を完成させた。
【００１２】
本発明の要旨は、水分子を取り込むことができるタンパク質を構成成分とするナノ粒子の分散液であって、下記式（１）から計算される前記ナノ粒子の内圧（Ｐ‘）が１０ａｔｍを超えるナノ粒子が含水溶媒中に分散されていることを特徴とするナノ粒子分散液に関する。
Ｐ‘＝２σ／γ×ａ＋Ｐ０              （１）
Ｐ‘：ナノ粒子の内圧（ａｔｍ）
ＰＯ：ナノ粒子分散液の圧（ａｔｍ）
σ：表面張力（Ｎ／ｍ）
γ：ナノ粒子の半径（ｍ）
ａ：９．８７×１０−６
なお、前記式（１）は、前記ラプラス方程式を変換したものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のナノ粒子分散液は、高い化学的エネルギーを有するナノ粒子が分散したナノ粒子分散液であるから、生体膜に浸透することができるため、例えば、生体膜への浸透性が重要な化粧品や医薬品クリームへの利用が期待されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例３における動物でのナノ粒子浸透性試験で、動物を用いてナノ粒子の浸透性の評価を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のナノ粒子分散液は、水分子を取り込むことができるタンパク質を構成成分とするナノ粒子の分散液であって、下記式（１）から計算される前記ナノ粒子の内圧（Ｐ‘）が１０ａｔｍを超えるナノ粒子が含水溶媒中に分散されていることを特徴とする。
Ｐ‘＝２σ／γ×ａ＋Ｐ０              （１）
Ｐ‘：ナノ粒子の内圧（ａｔｍ）
ＰＯ：ナノ粒子分散液の圧（ａｔｍ）
σ：表面張力（Ｎ／ｍ）
γ：ナノ粒子の半径（ｍ）
ａ：９．８７×１０−６
【００１６】
本発明のナノ粒子分散液は、前記のような特徴を有することで、ナノ粒子が高い化学的ポテンシャルを有することで、迅速に生体膜に浸透することが可能になる。
【００１７】
なお、本発明でいう「浸透性」とは、生体膜に塗布したときにナノ粒子が生体膜を通過することをいう。生体膜の通過は後述の実施例のようにナノ粒子成分の測定によって検証することが可能である。
また、本発明でいう「生体膜」とはタンパク質、脂質等で構成される生体由来の膜のことであり、例えば、ヒトや動物の皮膚、細胞膜などが挙げられる。また、後述の実施例で使用した卵殻膜は鶏卵を構成する卵殻内側の内膜のことであり、タンパク質繊維で構成されていることから、生体膜の一種である。
【００１８】
本発明において、ナノ粒子とは、平均粒子径が１４０ｎｍ未満の粒子をいう。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）にて測定することができる。
【００１９】
前記ナノ粒子は、水分子を取り込むことができるタンパク質を構成成分とする。
なお、本発明において「構成成分」とは、ナノ粒子を構成するための基材となる成分をいう。
前記水分子を取り込むことができるタンパク質とは、ナノ粒子を形成した場合に、タンパク質の周辺に溶媒に含まれる水分子を取り込むことができる性質を有するものであればよく、例えば、ゼラチン、コラーゲンおよびそれら分解物、乳清タンパク質などが挙げられるが、特に限定はない。
前記ナノ粒子中に含まれるタンパク質としては、１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００２０】
前記ナノ粒子は、前記タンパク質のみで構成されていてもよいし、タンパク質以外の構成成分を含有していてもよい。タンパク質以外の成分を含有するナノ粒子では、タンパク質は主要な構成成分であればよく、含有量としては特に限定はない。
【００２１】
前記タンパク質以外の構成成分としては、ガレート基を含有する化合物が挙げられる。
前記ガレート基を含有する化合物としては、ガレート型カテキン、タンニン酸、没食子酸、などが挙げられる。
【００２２】
前記ガレート型カテキンとしては、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）が挙げられる。前記ガレート型カテキンは、非重合体でも重合体でもよく、それらを混合しても、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点よりＥＧＣｇおよび／またはＥＣｇを含有することが好ましい。また、例えば、前記ガレート型カテキンを含む茶抽出物やコーヒー抽出物等もガレート型カテキンとして使用することができる。また、粒子作製の効率の面から、組成物中のガレート型カテキン量が２０重量％以上のものが好ましく、さらに好ましくは、３０重量％以上のもの、より好ましくは６０重量％以上のものがよい。
【００２３】
前記没食子酸としては、天然由来もしくは合成物いずれでもよい。没食子酸の誘導体としては、没食子酸メチル、没食子酸ドデシル、没食子酸プロピル、没食子酸イソアミル、２，３，４−トリヒドロキシベンゾフェノンなどが挙げられる。また、没食子酸や没食子酸の誘導体を含む組成物も使用することができ、例えば、五倍子、没食子、茶、オーク樹皮等の植物体から得られる抽出物が挙げられる。これらの、没食子酸や没食子酸の誘導体を含む組成物は没食子酸または没食子酸の誘導体の含有量が高いものが好ましく、前記含有量が１０重量％以上のものがより好ましい。但し、ナノ粒子の形成に使用できるのであれば特に限定はない。
【００２４】
前記タンニン酸としては、加水分解型タンニンが挙げられる。前記タンニン酸は、混合物でも、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点より加水分解型タンニンを９０％以上含有することが好ましい。
【００２５】
前記ナノ粒子中の前記ガレート基を含有する化合物の含有量としては、ナノ粒子が形成できればよく、特に限定はない。
【００２６】
本発明のナノ粒子としては、例えば、前記タンパク質と、前記ガレート基を含有する化合物とを構成成分とするナノ粒子が挙げられる。この態様のナノ粒子は、例えば、前記タンパク質の含有する溶液または分散液と、前記ガレート基を含有する化合物を含有する溶液または分散液とを混合し、前記混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子分散液を作製することができる。
【００２７】
この態様のナノ粒子において、その内圧は、ナノ粒子の粒子径を小さくしたり、ナノ粒子分散液の溶媒の種類を適宜選択したりすることによって調整することができる。
【００２８】
また、別の態様のナノ粒子としては、中心部がＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｂ等の金属、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２等の金属酸化物からなり、そのまわりに前記タンパク質をコート（コンジュゲート）したナノ粒子でもよい。
特に金属を中心部に有するナノ粒子は粒径が１０ｎｍ程度あるいはそれ以下と極めて小さく、先のラプラス方程式から計算される内圧は同じ媒体のδを用いる限り１００ｎｍのものよりも１０倍大きくなり、非常に大きなエネルギーを有することとなる。前記のような態様のナノ粒子の例としては、トランスフェリンをコートした金ナノ粒子（非特許文献１８）、金ナノ粒子ペプチド複合体（非特許文献１９）等が挙げられる。
また、非特許文献２０、２１に記載されるような多数のナノ粒子も本発明に使用できるナノ粒子である。
なお、この態様のナノ粒子では、ゼラチンなどの水分子を取り込むことができるタンパク質を粒子表面に公知の手法に基づいてコーティングしたナノ粒子の粒子径を小さくしたり、ナノ粒子分散液の溶媒の種類を適宜選択したりすることで、前記ナノ粒子の内圧を所望の範囲に調整することができる。
【００２９】
前記ナノ粒子分散液の含水溶媒としては、水が挙げられる。
水としては、純水、蒸留水、水道水、市販の飲料水などが挙げられるが特に限定はない。
また、前記含水溶媒は、水と混和できる有機溶媒を含有してもよい。前記有機溶媒としては、例えば、安全性の観点から、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、ブチレングリコール等が挙げられるが、特に限定はない。
前記含水溶媒中における有機溶媒の含有量としては、ナノ粒子の内圧力が１０ａｔｍを超える量であればよく、特に限定はない。
【００３０】
本発明のナノ粒子分散液では、下記式（１）で算出される前記ナノ粒子の内圧（Ｐ‘）が１０ａｔｍを超えるように調整されていることを一つの特徴とする。
Ｐ‘＝２σ／γ×ａ＋Ｐ０              （１）
Ｐ‘：ナノ粒子の内圧（ａｔｍ）
ＰＯ：ナノ粒子分散液の圧（ａｔｍ）
σ：表面張力（Ｎ／ｍ）
γ：ナノ粒子の半径（ｍ）
ａ：９．８７×１０−６
【００３１】
前記式（１）は、流体力学の分野で公知のラプラスの方程式より導き出されたものである。
前記ナノ粒子分散液の圧（ＰＯ）は、溶媒を構成する水の圧力で換算でき、本発明では１ａｔｍとする。
前記表面張力（σ）は、前記ナノ粒子分散液の溶媒の表面張力をいい、具体的には公知の方法に基づいて、例えば、公知の表面張力測定装置で測定することができる。
前記ナノ粒子の半径（γ）は、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）にて測定した平均粒子径を「直径」として、その２分の１を半径として算出することができる。
前記ａは、単位を調整するための換算計数である。
【００３２】
前記ナノ粒子の内圧については、例えば、ナノ粒子の平均粒子径を１００ｎｍ以下である場合には、１３ａｔｍ以上であることが好ましい。
【００３３】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
（実施例１：ナノ粒子分散液の作製）
ゼラチン（商品名：日本薬局方ゼラチン、新田ゼラチン社製）１ｇを蒸留水８９９ｇに添加し、６０℃で加温して溶解させた。溶解させたゼラチン溶液は６０℃で保温した。
次に、緑茶抽出物（サンフェノンＥＧＣｇ、ガレート型カテキン９８％、太陽化学社製）１．８ｇを蒸留水９８．２ｇに溶解させた。
次に、前記カテキン溶液と前記ゼラチン溶液とを均一に混合し、混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子分散液を得、これを３０℃で保温した。
次に、得られたナノ粒子分散液にエタノールを０重量％（本発明品１）、０．５重量％（本発明品２）、１．０重量％（本発明品３）、５重量％（本発明品４）、１０重量％（比較品１）となるように添加した。また、ゼラチンの代わりに乳清タンパク質を使用したナノ粒子（エタノール０重量％、本発明品５）も作製した。
各ナノ粒子分散液に含まれるナノ粒子の平均粒子径を、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）を用いて測定した。
また、各ナノ粒子分散液の表面張力は、国際法定計量機関（ＯＩＭＬ）に記載の３０℃での表面張力をもとに算出した。
次に、ナノ粒子分散液の圧（ＰＯ）を１ａｔｍとして、本発明品１〜５および比較品１のナノ粒子分散液中のナノ粒子の内圧を、前記式（１）に基づいて算出した。得られた結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2017031096.tif 000002
【００３６】
表１に示す結果より、本発明品１〜５のナノ粒子分散液では、平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子が分散されており、その内圧がいずれも１０気圧を超えていることが分かる。
これに対して、比較品１のナノ粒子分散液では、平均粒子径が１００ｎｍを超えており、内圧が１０気圧未満であることがわかる。
【００３７】
（実施例２：ナノ粒子の浸透性評価）
実施例１で作製した本発明品１〜４、比較品１を用い、生体膜を卵殻膜をとして浸透性の評価を実施した。
【００３８】
生卵より採取した卵殻膜を蒸留水で３回洗浄し、フランツセル（キーストンサイエンティフィック社製）にセットした。膜上部に各ナノ粒子分散液をセットし、膜下層には蒸留水をセットした。３０℃で保温しながら１時間静置し、下層２００μＬより酢酸エチルでガレート型カテキン（ＥＧＣｇ）を抽出した。抽出されたガレート型カテキンをＨＰＬＣにて測定し、検出されたガレート型カテキンの面積値より浸透性を比較した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2017031096.tif 000003
【００４０】
表２に示すように、本発明品１〜４の結果から、ナノ粒子の内圧が高いほど生体膜の浸透性が高いことが分かる。一方、比較品１のように、内圧が１０ａｔｍを下回るナノ粒子にはある程度の浸透性は認められるものの、本発明品１〜４との相対値を比べると顕著に低いことが分かる。これらの結果より、内圧が１０ａｔｍを超えるナノ粒子は生体膜への浸透性が高く有用であることがわかる。
【００４１】
（実施例３：動物でのナノ粒子浸透性試験）
動物を用いてナノ粒子の浸透性の評価を行った。
【００４２】
動物にはＩＣＲマウス（日本クレア社製）を用いて実施した。ＩＣＲマウス背部の毛を剃刀で除毛し、本発明品１および対照品として０．１８％カテキン（商品名：サンフェノンＥＧＣｇ、太陽化学社製）水溶液を１００μＬ塗布した。塗布1時間後、麻酔下でマウスを放血死させ、背部皮膚を採取し、湿重量を測定した。採取した皮膚を蒸留水で洗浄後に細かく裁断し、湿重量の１０倍容量のメタノールを添加した。超音波で１０分間処理して遠心分離し、メタノールを回収後、エバポレーターにて溶媒を除去した。溶媒を除去したサンプルを再度５０容量％メタノール２００μＬに再溶解させ、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）にてＥＧＣｇの定量を行った。得られた分析値より皮膚重量当りのカテキン含有量を算出した。結果を図１に示す。
【００４３】
図１に示すように本発明品は動物皮膚においても迅速に浸透することが出来ることがわかる。従って本発明品１は、塗布１時間で迅速に生体膜に浸透することができるナノ粒子である。
【図１】
2017031096.tif 000004