(57)【要約】【課題】発酵により糖から有機酸を製造する方法において、有機酸の製造効率を向上させる。【解決手段】遺伝子組み換えにより有機酸を発酵生産できる能力を付与した分裂酵母および原料液が導入された発酵設備内で、発酵設備内液中溶存酸素濃度を５ｐｐｂ以上、５００ｐｐｂ以下に制御しながら、発酵設備内の液の抜き出しを行うことなく、分裂酵母による発酵を行って有機酸を生産する工程（３）、発酵設備内の液の一部を抜き出して、有機酸を含む液を回収する工程（４）を有し、工程（２）から工程（４）は少なくとも２回以上繰り返し、工程（３）において、発酵により発酵設備内液中原料糖濃度が低下し、予め設定された原料糖濃度ｘ（単位：ｇ／Ｌ、ｘ≦１０）以下に達した時点以降に、工程（４）の抜き出しを開始し、工程（４）における前記発酵設備内液中溶存酸素濃度を、５ｐｐｂ以上に維持することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵設備に、遺伝子組み換えにより有機酸を発酵生産できる能力を付与した分裂酵母を導入する工程（１）、
発酵設備に、原料糖を含む原料液を導入する工程（２）、
前記分裂酵母および前記原料液が導入された前記発酵設備内で、該発酵設備内液中溶存酸素濃度を５ｐｐｂ以上、５００ｐｐｂ以下に制御しながら、該発酵設備内の液の抜き出しを行うことなく、前記分裂酵母による発酵を行って有機酸を生産する工程（３）、
前記発酵設備内の液の一部を抜き出して、有機酸を含む液を回収する工程（４）を有し、
前記工程（２）から前記工程（４）は少なくとも２回以上繰り返し、
前記工程（３）において、前記発酵により発酵設備内液中原料糖濃度が低下し、予め設定された原料糖濃度ｘ（単位：ｇ／Ｌ、ｘ≦１０）以下に達した時点以降に、前記工程（４）の抜き出しを開始し、
前記工程（４）における前記発酵設備内液中溶存酸素濃度を、５ｐｐｂ以上に維持することを特徴とする有機酸の製造方法。
【請求項２】
前記工程（３）における前記発酵設備内の液のｐＨが１．５〜３．５である、請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
前記分裂酵母が、有機酸とエタノールとを併産する酵母である、請求項１または２に記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
前記工程（４）の抜き出し開始時に、発酵設備内液中エタノール濃度が１ｇ／Ｌ以上である、請求項３に記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
前記分裂酵母の宿主が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
前記工程（４）における前記発酵設備内液中溶存酸素濃度を、６０ｐｐｂ以上、６０００ｐｐｂ以下の範囲内で、かつ前記液の抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度よりも５０ｐｐｂ以上高い状態が存在するように制御する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
前記工程（４）の抜き出し開始時に、発酵設備内液中有機酸濃度が４０ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
前記工程（４）において、前記発酵設備内液中原料糖濃度が０ｇ／Ｌとなる状態が存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項９】
前記工程（４）において、前記発酵設備内の液の一部を、固液分離手段を介して抜き出して、前記有機酸を含む液として、菌体を含まない分離液を得る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１０】
前記分離液中の原料糖濃度が１ｇ／Ｌ以下である、請求項９に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１１】
前記工程（４）において、前記固液分離手段で、前記分離液と、菌体を含む非分離液とに分離し、該非分離液を前記発酵設備内で循環させる、請求項９または１０に記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分裂酵母の発酵により有機酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば有機酸である乳酸は食品用途や、医療、化粧品等の化学原料用途に広く用いられている。また、乳酸を用いて得られるポリ乳酸は、微生物等により最終的に二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックとして注目されている。そのため、乳酸等の有機酸を安価に高い生産性で製造することが必要である。
【０００３】
乳酸の製造方法としては、乳酸菌により糖を発酵させ製造する生物学的方法が知られている。
下記特許文献１には、形質転換された特定の分裂酵母を、糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸が、乳酸脱水素酵素により還元されて乳酸が産生され、該乳酸を培養液から分離して取得する方法が記載されている。
特許文献１には、培養方法として回分培養と連続培養が記載されている。連続培養法では、例えば、培養中の培養槽から培養液の一部を引き抜き、引き抜いた培養液から菌体を分離して乳酸を含む発酵液を得るとともに、菌体を含む培養上清を回収し、該培養上清にグルコースや新たな培養液を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が記載されている。
【０００４】
下記特許文献２には、出芽酵母であるサッカロミセス・セレビシエを用い、バッチ発酵（ｐＨ５．０に自動制御）によりグルコースから乳酸塩を得た発酵試験例が記載されている。具体的に、グルコースを含有する無機培地を用い、ｐＨを５．０に自動制御しながら、酸素供給（溶存酸素濃度）を一定に保つと、酸素が制限（微生物の酸素要求量より酸素濃度が低い状態）になるまでバイオマスが指数関数的に増加し、酸素が制限になるとグルコースが消費されて乳酸塩およびピルビン酸塩が生産されたことが記載されている。グルコースが枯渇したらすぐに追加のグルコースを添加したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２１６２９号
【特許文献２】特表２００６−５２５０２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１記載の方法において、培養槽から培養液の一部を引き抜いて得られる液には、菌体、乳酸、残った糖が含まれている。かかる液に対して固液分離を行うと菌体は分離できるが、乳酸と糖を分離することは容易でない。このため、固液分離後の発酵液を精製する際に、糖に起因する着色が生じ易いという問題がある。
また本発明者等の知見によると、仮に培養槽において糖の全部が消費されるまで発酵を行った場合、糖がなくなった状態の培養槽中の液、および引き抜かれた液において、乳酸が経時的に減少する場合がある。これは菌体が飢餓状態となったために乳酸が消費されたと考えられる。かかる乳酸の減少が生じると、乳酸の製造効率が低下する。
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、発酵により糖から有機酸を製造する方法において、有機酸の製造効率を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の有機酸の製造方法は、発酵設備に、遺伝子組み換えにより有機酸を発酵生産できる能力を付与した分裂酵母を導入する工程（１）、発酵設備に、原料糖を含む原料液を導入する工程（２）、前記分裂酵母および前記原料液が導入された前記発酵設備内で、該発酵設備内液中溶存酸素濃度を５ｐｐｂ以上、５００ｐｐｂ以下に制御しながら、該発酵設備内の液の抜き出しを行うことなく、前記分裂酵母による発酵を行って有機酸を生産する工程（３）、前記発酵設備内の液の一部を抜き出して、有機酸を含む液を回収する工程（４）を有し、前記工程（２）から前記工程（４）は少なくとも２回以上繰り返し、前記工程（３）において、前記発酵により発酵設備内液中原料糖濃度が低下し、予め設定された原料糖濃度ｘ（単位：ｇ／Ｌ、ｘ≦１０）以下に達した時点以降に、前記工程（４）の抜き出しを開始し、前記工程（４）における前記発酵設備内液中溶存酸素濃度を、５ｐｐｂ以上に維持することを特徴とする。
【０００８】
前記工程（３）における前記発酵設備内の液のｐＨが１．５〜３．５であることが好ましい。
前記分裂酵母が、有機酸とエタノールとを併産する酵母であることが好ましい。
前記工程（４）の抜き出し開始時に、発酵設備内液中エタノール濃度が１ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
前記分裂酵母の宿主が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）であることが好ましい。
前記工程（４）における前記発酵設備内液中溶存酸素濃度を、６０ｐｐｂ以上、６０００ｐｐｂ以下の範囲内で、かつ前記液の抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度よりも５０ｐｐｂ以上高い状態が存在するように制御することが好ましい。
【０００９】
前記工程（４）の抜き出し開始時に、発酵設備内液中有機酸濃度が４０ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
前記工程（４）において、前記発酵設備内液中原料糖濃度が０ｇ／Ｌとなる状態が存在することが好ましい。
前記工程（４）において、前記発酵設備内の液の一部を、固液分離手段を介して抜き出して、前記有機酸を含む液として、菌体を含まない分離液を得ることが好ましい。
前記分離液中の原料糖濃度が１ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
前記工程（４）において、前記固液分離手段で、前記分離液と、菌体を含む非分離液とに分離し、該非分離液を前記発酵設備内で循環させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、発酵により糖から有機酸を製造する方法において、有機酸の製造効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の有機酸の製造方法の一実施形態の説明図である。
【図２】本発明の有機酸の製造方法の一実施形態の説明図である。
【図３】本発明の有機酸の製造方法の一実施形態の説明図である。
【図４】実施例１の結果を示すグラフである。
【図５】試験例１の結果を示すグラフである。
【図６】比較試験例１の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１〜３は、本発明の有機酸の製造方法の一実施形態における各工程を模式的に示した説明図である。
図中符号１は発酵槽、２は原料液供給経路、３は発酵液排出経路、４は戻り経路、１０は固液分離手段、１１は分離液排出経路をそれぞれ示す。図中、実線の矢印は液が流れている状態を表す。
本発明において、「発酵設備」とは、発酵槽１及び発酵槽１内と同じ状態にある系（発酵系）を構成する設備を意味する。すなわち図１〜３において、発酵槽１、発酵液排出経路３、戻り経路４、および、固液分離手段１０の一部（例えば膜分離装置であれば、膜の１次側）が発酵設備に含まれる。
本発明において、発酵とは分裂酵母を用いて原料糖を転換し目的とする有機酸を得る処理をいう。本発明における発酵液とは、発酵を経た液を意味し、分裂酵母、および発酵により生成した有機酸を含む。発酵液には原料糖が含まれていてもよい。
【００１３】
本実施形態において、発酵設備内（発酵系内）における液中の溶存酸素濃度は均一であるとみなし、発酵槽１内の液中溶存酸素濃度の値を発酵設備内液中溶存酸素濃度とする。
同様に、本実施形態において、発酵設備内（発酵系内）における液中の原料糖濃度は均一であるとみなし、発酵槽１内の液中原料糖濃度の値を発酵設備内液中原料糖濃度とする。
同様に、本実施形態において、発酵設備内（発酵系内）における液中のエタノール濃度は均一であるとみなし、発酵槽１内の液中エタノール濃度の値を発酵設備内液中エタノール濃度とする。
【００１４】
図示していないが発酵槽１内の液に酸素を供給する手段、該酸素の供給量を制御する手段、発酵槽１内の液中溶存酸素濃度を測定する手段、発酵槽１内の液中原料糖濃度をモニターする手段、発酵槽１内の液を均一に混合する手段、発酵槽１内の液温を所定の温度に保持する手段、および発酵槽１内の液を、発酵液排出経路３、固液分離手段１０および戻り経路４を順に通って、発酵槽１へ送液する送液手段が設けられている。また必要に応じて各種測定装置を設けることができる。
発酵槽１として、例えば気泡塔型発酵槽、撹拌翼付き発酵槽、管型発酵槽等が好適に用いられる。
発酵槽１の容量は、特に限定されず適宜設定できる。本実施形態において発酵槽１の容量は、本実施形態の構成による効果が得られやすい点、および有機酸の製造効率の点で０．３Ｌ以上が好ましく、１００Ｌ以上がより好ましく、１ｍ３以上がさらに好ましい。該容量の上限は定期保守・点検を行いやすい点からは１０００ｍ３以下が好ましく、６００ｍ３以下がより好ましい。
【００１５】
酸素は通常、気体として発酵槽１内の液に供給される。供給される気体は、少なくとも酸素を含み発酵に悪影響のない気体であればよい。例えば、純酸素でもよく、酸素と、酸素以外の気体の１種以上（空気、窒素、二酸化炭素、メタン等）との混合気体でもよく、空気でもよい。入手容易であるため空気を用いることが好ましい。
発酵槽１内の液に供給される気体の酸素濃度は、５〜５０体積％が好ましく、１５〜３０体積％がより好ましい。該酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると、分裂酵母が利用するために充分な量の酸素が供給しやすい。また該酸素濃度が上記範囲の上限値以下であると酸素濃度を高くする負荷が減るためガスの供給が容易になる。
発酵槽１内の液中の液中溶存酸素濃度を測定する手段としては、一般的な溶存酸素計を用いることができる。
発酵槽１内の液中原料糖濃度をモニターする手段としては、近赤外線センサー、酵素電極等を用いることができる。また試料を抜き出して高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法等で測定してもよい。
【００１６】
固液分離手段１０は、発酵液から菌体（分裂酵母）を含まない分離液を得る。残りの発酵液は戻り経路４を通って発酵槽１に送られる。分離液および残りの発酵液には有機酸が含まれる。ここにおいて、「菌体を含まない」とは、実質的に含まないことを意味する。湿重量で２０ｇ／Ｌ以下（好ましくは１０ｇ／Ｌ以下）の菌体（生菌）が含まれてもよい。
固液分離手段１０として、例えば、膜分離装置、遠心分離装置、抽出分離装置等が用いられる。菌体へのせん断応力等のストレスを抑制しやすい点、比較的装置の取り扱い性が容易である点で膜分離装置が好ましい。
膜分離装置としては、発酵液中の有機酸を透過し、菌体（分裂酵母）を透過しない分離膜を備えたものであればよく、公知の膜分離装置を適宜用いることができる。分離膜は有機膜であってもよく、無機膜であってもよい。分離膜の材質として、例えばポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、セラミックス等が挙げられる。これらのうち比較的安価かつ耐久性が高く、安定供給が可能という点からは、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが好ましい。
分離膜の形状は、特に限定されず、例えば平膜、中空糸膜などが挙げられる。
分離膜は、平均孔径が０．０１〜３μｍの細孔を有する多孔膜であることが菌体（分裂酵母）が透過しにくく、比較的高い透過流束（ｆｌｕｘ）を有する点で好ましい。分離膜の平均孔径は、０．１〜０．６５μｍがより好ましい。
膜分離装置の処理能力（透過流束）は、装置の規模によっても異なるが、例えば１〜１００Ｌ／ｍ２／ｈが好ましく、３〜３０Ｌ／ｍ２／ｈがより好ましい。
【００１７】
＜分裂酵母＞
本発明では菌体として遺伝子を組み替えた分裂酵母（本明細書では単に分裂酵母ということもある。）を用いる。本発明における分裂酵母はシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）を意味する。
本発明において「遺伝子を組み替えた」分裂酵母とは遺伝子工学的手法により人為的に遺伝子を改変させた分裂酵母を意味する。特に本発明においては、遺伝子の改変により有機酸を発酵生産できる能力が付与された分裂酵母を用いる。なお遺伝子の改変は、異種生物由来の遺伝子の組み込みを必須とする。さらに、遺伝子を改変させた分裂酵母は、分裂酵母が本来有する遺伝子の一部の削除または染色体上の別の部位への挿入が行われていてもよい。
宿主の分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。上記分裂酵母のうち、耐酸性が高く、有機酸の生産能力が高い点からシゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ｐｏｍｂｅともいう）が好ましい。
特に、糖から有機酸とエタノールを同時に生産（併産）する分裂酵母を用いることが、原料糖の利用効率を最終的に高くしやすく、工業的生産に好適である点で好ましい。かかる分裂酵母の具体例としてはＷＯ２０１１／０２１６２９（特許文献１）やＷＯ２０１３／１３７２７７に記載された、遺伝子を組み換えた分裂酵母が挙げられる。遺伝子を組み換えた分裂酵母は、特定の発酵条件（特に酸素濃度とｐＨの両方）を好適範囲に制御することにより、ほとんど増殖することなく原料糖から目的とする有機酸を生産することができる。
【００１８】
＜原料糖＞
原料糖は、分裂酵母が直接資化して有機酸を生産できるものであればよい。原料糖の好ましい例としては、リボース、アラビノース、キシロース等の五炭糖；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の六炭糖；スクロース、トレハロース、セルビオース、マルトース等の二糖類；セルロース、デンプン等の多糖類等が挙げられる。
これらのうち、資化が容易である点で六炭糖がより好ましく、グルコースが特に好ましい。
【００１９】
＜原料液＞
原料液は、原料糖を含有する液（通常は水溶液）である。原料糖の他に、例えば、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ等の金属元素、ミネラル分（微量元素類）およびビタミン類を含んでいてもよい。本実施形態において、原料液は菌体を含まない。
【００２０】
＜有機酸＞
本発明では、分裂酵母を用いて糖から有機酸を生産する。有機酸の例としては、酢酸、マロン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、等が挙げられる。ここでヒドロキシカルボン酸は有機酸として考える。また光学異性体が存在する場合には、Ｌ体、Ｄ体またはラセミ体であってもよい。ただし工業的有用性が高いことから光学純度は高いことが好ましい。光学純度としては９５％以上が好ましく、９９％以上がより好ましい。
これらのうち汎用性が高く、市場の発展性（合成繊維用途や車載用途、代替プラスチック用途等）が望める点で、特に乳酸、リンゴ酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸等が好ましい。
【００２１】
本発明の有機酸の製造方法は、有機酸を、沈殿を形成させることなく水溶液として得る方法に特に好適である。
また本発明の製造方法は、沸点が水（１００℃）よりも高い有機酸の製造方法として特に好適である。本発明の製造方法のうち、菌体（分裂酵母）を分離して得られる分離液が有機酸を含む水溶液である場合には、得られた有機酸と水を分離する手段として蒸留を適用することが考えられる。しかし一般に原料糖は、蒸留では高沸成分または残渣として分離されることになる。この際目的とする有機酸の沸点が水より低い場合は蒸留での分離が容易である。一方、目的とする有機酸の沸点が水よりも高い場合には、目的とする有機酸と原料糖の分離が困難になりやすい。このため分離液に含まれる原料糖の濃度を下げることにより、有機酸の精製（特に蒸留精製）の負荷を低減することができる。
【００２２】
＜培養工程＞
予め分裂酵母を含む培養液を調製することが好ましい。例えば、培養槽に液状の培地および分裂酵母を供給し、酸素を含む気体を連続的に供給しつつ、所定の培養温度に保持することにより培養液を得る。培養槽内の液（培養液）中の酸素濃度および培養温度は、菌体（分裂酵母）の増殖に適した培養条件に維持されるように制御される。通常、菌体（分裂酵母）の増殖に適した培養条件と、発酵による化成品の製造に適した発酵条件とでは好ましい酸素濃度条件が異なる。一般に発酵液中の好ましい酸素濃度は、培養に適した酸素濃度条件よりも低い。
【００２３】
以下に、図１〜３を用いて、本発明の有機酸の製造方法に関する実施態様の一例について説明する。
＜工程（１）（２）＞
まず、発酵設備内に分裂酵母を導入する（工程（１））。本実施形態では発酵槽１内に分裂酵母を導入する。具体的には分裂酵母を培養した培養液を発酵槽１内に導入する。
また発酵設備に原料液を導入する（工程（２））。本実施形態では、原料液供給経路２を介して発酵槽１内に原料液を導入する。分裂酵母の導入と、初回の原料液の導入は、どちらを先に行ってもよい。
そして、図１に示すように、発酵槽１内の液（培養液および原料液）を、発酵液排出経路３、固液分離手段１０および戻り経路４を順に通って、発酵槽１へ送液して循環させることが好ましい。
【００２４】
＜準備工程＞
図２に示すように、発酵槽１内の液を循環させながら、固液分離手段１０から分離液排出経路１１を経て、菌体を含まない分離液を抜き出すことにより、発酵槽１内の液中における菌体濃度（分裂酵母の濃度）を高めることができる。後述の工程（３）に先立ち、この方法で該菌体濃度を調整してもよい。
【００２５】
発酵槽１内での生菌の量は、事前の発酵試験により好適な範囲を求めることが好ましい。すなわち好適な生菌の菌体濃度を試験により求め、発酵槽１の実効容量を乗じて生菌量とする。菌体濃度は、菌体の種類や培養条件にもよるが、発酵槽１の容量を小さく抑えるために、ある程度高密度での発酵を行うことが好ましい。
例えば、分裂酵母を用いて、グルコースを原料糖とし、乳酸を目的の有機酸とする場合、発酵槽１の液中の生菌の量（菌体濃度）は、乾燥重量換算で１２〜７２ｇ／Ｌが好ましく、２４〜４８ｇ／Ｌがより好ましい。該生菌の量が上記範囲の下限値以上であると発酵槽の単位体積当たりの有機酸の生産速度を高くできる。また、上限値以下あると菌体にかかるストレスが低く抑制できる点で、また酸素および原料糖を菌体に充分にかつ平均的に行き渡らせることがしやすい点で好ましい。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度（以下「菌体濃度ＯＤ６６０」と記載する。）は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ＝１は、酵母乾燥重量の０．２ｇ／Ｌ、湿重量の０．８ｇ／Ｌに相当する。
【００２６】
＜工程（３）＞
このようにして分裂酵母および原料液が導入された発酵設備内で、該分裂酵母による発酵を行って有機酸を生産する（工程（３））。
本実施形態では、発酵槽１内の液を撹拌しつつ、また図１に示すように循環させながら、該液の温度を所定の発酵温度に制御し、発酵槽１内の液に、酸素を含む気体を通気させる。これにより該液中で発酵が進行し、酸素および原料糖が消費されて有機酸が生成される。エタノール等の副生成物が該有機酸と同時に生成されてもよい。特に発酵により有機酸とエタノールとが併産されることが好ましい。
好ましい発酵温度は、用いる分裂酵母によって応じて設定される。
工程（３）においては、発酵設備内の液の抜き出しは行わない。本実施形態では、上記のように発酵槽１内の液を循環させるが、該循環系からの液の抜き出しは行わない。
一方、工程（３）の途中において、工程（２）を追加で行ってもよい。すなわち発酵の途中で、連続的または断続的に、原料糖を含む原料液を発酵設備に導入してもよい。原料液の追加は、原料糖濃度が高い時点で発酵による有機酸生産速度が低下する場合等に好ましく適用できる。
【００２７】
工程（３）においては、発酵設備内液中溶存酸素濃度を５ｐｐｂ以上、５００ｐｐｂ以下に制御する。該溶存酸素濃度は、発酵槽１内の液に通気する、酸素を含む気体の酸素濃度または通気量（流量）、もしくは攪拌状態によって制御することができる。通気は連続的に行うことが好ましい。
該溶存酸素濃度が高いほど原料糖の消費速度は速くなり、目的とする有機酸の生産速度が速くなる代りに、菌体の増殖が優先して進むようになる。
該発酵設備内液中溶存酸素濃度は、１０〜２００ｐｐｂが好ましく、２０〜１５０ｐｐｂがより好ましい。該溶存酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると有機酸の良好な生産速度が得られやすい。該溶存酸素濃度が上記範囲の上限値以下であると有機酸の良好な収率が得られやすい。発酵設備内液中溶存酸素濃度が上記上限値を超えると、分裂酵母は原料糖を消費して菌体の増殖に用いる割合が大きくなる。
【００２８】
工程（３）において、例えば原料液を一括で投入した直後のように一時的に原料糖濃度が高くなった場合の、発酵槽１内の液中の原料糖の濃度は、５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、２００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１００ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。発酵槽１内の液中の原料糖の濃度は、発酵が進むと低下し、下限値はゼロであってもよい。該原料糖の濃度が上記範囲の上限値以下であると、生菌の菌体濃度を高く維持しやすい点で、また有機酸の生産効率を高くしやすい点で好ましい。
発酵槽１内の液中の目的の有機酸の濃度は、５〜２００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜１５０ｇ／Ｌがより好ましく、５０〜１２０ｇ／Ｌがさらに好ましい。該目的の有機酸の濃度が上記範囲の下限値以上であると有機酸の精製コストを抑制しやすく、上限値以下であると有機酸の良好な製造効率が得られやすい。
工程（３）の発酵開始後、発酵設備内液中原料糖濃度をモニターする。本実施形態では発酵槽１内の液中原料糖濃度をモニターする。
該発酵設備内液中原料糖濃度が、予め設定された濃度ｘ（単位：ｇ／Ｌ、ｘ≦１０）以下に低下した時点以降に次の工程（４）を行う。
【００２９】
＜工程（４）＞
工程（４）では、発酵設備内の液の一部を抜き出して、有機酸を含む液を回収する。
本発明において、「発酵設備内の液を抜き出す」とは、「発酵系内の液」を該発酵系外へ抜き出す操作を意味する。図１に示すように、発酵槽１内の液を、発酵液排出経路３、固液分離手段１０および戻り経路４を通って発酵槽１へ送液して循環させている場合、発酵槽１内と該循環経路内が「発酵系内」に該当する。
【００３０】
本実施形態において、工程（３）では、図１に示すように、発酵槽１内の液（発酵液）を、固液分離手段１０を介して循環させる。発酵設備内液中原料糖濃度が所定の濃度以下に低下したら、工程（４）で、図２に示すように固液分離手段１０から液（発酵液）を抜き出す。これにより発酵槽１内の液量が減少する。
固液分離手段１０では、菌体を含まない分離液（発酵液）が分離液排出経路１１を通って抜き出され、有機酸を含む液として回収される。菌体を含む非分離液は戻り経路４を通って発酵槽１へ送液され、発酵設備内で循環させる。
工程（４）で抜き出す液量は、発酵設備内（本実施形態では発酵槽１内、固液分離手段１０内、発酵液排出経路３内、および戻り経路４内）の液の合計量に対して、１０〜９０体積％が好ましく、２５〜７５体積％がより好ましく、３０〜７０体積％がさらに好ましい。該抜き出す液量が上記範囲の下限値以上であると、良好な有機酸生産速度が得られ、上限値以下であると分離液と非分離液との分離が容易となり、また、菌体へのストレスも抑制しやすい。
【００３１】
発酵設備内液中原料糖濃度のしきい値ｘ（単位：ｇ／Ｌ）は、１０ｇ／Ｌ以下であり、この値が小さいほど、原料糖の含有量が少ない発酵液（分離液）が得られる。該ｘは３ｇ／Ｌ以下が好ましく、１ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
後述の実施例に示されるように、工程（４）において、発酵設備内液中原料糖濃度が０ｇ／Ｌとなる状態が存在しても、反復回分発酵を安定して行うことができる。
発酵設備内液中原料糖濃度を０ｇ／Ｌとすると、有機酸を含み、原料糖を含まない発酵液（または分離液）を得ることができ、有機酸の製造効率を向上させるうえで好ましい。
【００３２】
工程（４）では、発酵設備内液中溶存酸素濃度を５ｐｐｂ以上に維持する。すなわち工程（４）における発酵設備内液中溶存酸素濃度は工程（３）の発酵設備内液中溶存酸素濃度と同じか高くすることが好ましい。該発酵設備内液中溶存酸素濃度は、発酵槽１内の液に通気する、酸素を含む気体の酸素濃度または通気量、もしくは攪拌状態によって制御することができる。該発酵設備内液中溶存酸素濃度は２０ｐｐｂ以上に維持されることが好ましく、６０ｐｐｂ以上に維持されることがより好ましい。工程（４）において、発酵設備内溶液中酸素濃度は、５ｐｐｂ以上に維持されれば充分であるが、特に６０ｐｐｂ以上である時間帯を設けることが好ましい。該時間帯は断続的でも連続的でもよい。１回の工程（４）の開始から終了までの時間、すなわち固液分離手段１０からの液の抜き出し開始から次工程で原料液が導入されるまでの時間に対して、発酵設備内溶液中酸素濃度が６０ｐｐｂ以上である時間帯の合計が５０％以上であることが好ましく、８０％以上がより好ましく、１００％でもよい。
該発酵設備内液中溶存酸素濃度が上記の範囲となるように通気することにより、発酵設備内液中原料糖濃度がｘｇ／Ｌ（ｘ≦１０）以下に低下した状態でも、発酵液中の乳酸の減少が抑えられる。仮に発酵設備内の原料糖濃度がゼロになり、発酵設備内液中溶存酸素濃度がゼロになると、分裂酵母は発酵とは逆に有機酸を資化し生菌率を維持する。このため工程（４）においては、発酵設備内液中溶存酸素濃度を、上記下限値を下回らないように維持する必要がある。このようにして発酵で生産された有機酸を消費することなく回収できる。
【００３３】
工程（４）において、発酵設備内液中の溶存酸素濃度を、６０ｐｐｂ以上、６０００ｐｐｂ以下の範囲内で、かつ前記液の抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度よりも５０ｐｐｂ以上高い状態が存在するように制御することが好ましい。
具体的には、工程（４）において抜き出しを開始した後、次工程で原料液が導入されるまでの間における、発酵設備内液中溶存酸素濃度の最大値が、６０ｐｐｂ以上、６０００ｐｐｂ以下の範囲内で、かつ抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度よりも５０ｐｐｂ以上高くなるように制御することが好ましい。
該発酵設備内液中溶存酸素濃度の最大値は、発酵槽１内の液に通気する、酸素を含む気体の酸素濃度または通気量、もしくは攪拌状態によって制御することができる。
該発酵設備内液中溶存酸素濃度の最大値は、抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度よりも１００ｐｐｂ以上高いことが好ましい。
【００３４】
工程（３）においては、発酵設備内液中溶存酸素濃度が上記の範囲内となるように通気されており、仮に工程（４）で発酵液の抜き出しを開始すると同時に、通気を停止すると、発酵設備内液中溶存酸素濃度はゼロとなる。すなわち発酵設備内液中溶存酸素は速やかに消費される。
これに対して、本実施形態では、工程（４）で発酵液の抜き出しを開始した後も、通気を継続する。
例えば工程（３）における通気量（一定でない場合は平均値）に対して、工程（４）における通気量（一定でない場合は平均値）を５０〜３００〜体積％とすることが好ましく、１００〜２００体積％とすることがより好ましい。
工程（３）における通気量（流量）および工程（４）における通気量（流量）はそれぞれ一定であることが好ましい。
【００３５】
工程（４）において、抜き出しを開始する時点における、発酵設備内液中有機酸濃度が高い方が、有機酸の製造効率を向上させるうえで好ましい。該有機酸濃度は発酵条件によって制御することができる。
具体的に、該発酵設備内液中有機酸濃度は５ｇ／Ｌ以上が好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がより好ましく、４０ｇ／Ｌ以上がさらに好ましい。該発酵設備内液中有機酸濃度の上限は特に限定されないが、分裂酵母にかかるストレス抑制の点では２００ｇ／Ｌ以上以下が好ましく、１５０ｇ／Ｌ以上以下がより好ましく、１２０ｇ／Ｌ以上以下がさらに好ましい。
【００３６】
分裂酵母が、有機酸とエタノールとを併産する酵母である場合、後述の試験例に示されるように、発酵設備内液中原料糖濃度がｘｇ／Ｌ（ｘ≦１０）以下に低下した状態において、酸素を含むガスの通気を行うことによって、発酵液中のエタノールを減少させて、乳酸の減少を抑えることができる。
これは、発酵設備内液中原料糖濃度が低下して飢餓状態にある分裂酵母が、エタノールを資化して生菌率を維持するためと考えられる。
この場合、工程（４）において、抜き出しを開始する時点における、発酵設備内液中エタノール濃度が１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、３ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、５ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。
エタノールは副生成物であり、該発酵設備内液中エタノール濃度の上限値は特に限定されないが、有機酸の良好な製造効率を得るうえで、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、３０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、２０ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。
【００３７】
＜分離液＞
本実施形態において分離液は、固液分離手段１０で分離され、分離液排出経路１１を通って抜き出される。分離液は、目的の有機酸を含み、菌体を含まない発酵液である。
工程（４）では、発酵設備内液中原料糖濃度がｘｇ／Ｌ（ｘ≦１０）以下に低下した時点以降に、分離液の抜き出しを開始するため、原料糖の含有量が少ない発酵液（分離液）が得られる。
該分離液中の原料糖濃度は１ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．５ｇ／Ｌ以下がより好ましく、０．１ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、ゼロであることが最も好ましい。
該分離液中の原料糖濃度が上記範囲であると、分離液（発酵液）を精製する際に、糖に起因する着色が良好に抑えられる。
【００３８】
＜反復回分発酵＞
工程（４）において、所定量の発酵液を抜き出した後、図３に示すように、発酵槽１に原料液を導入し（工程（２））、続いて工程（３）および工程（４）を順に行って反復回分発酵を行う。
さらに該工程（４）の後、同様に工程（２）〜工程（４）を複数回繰り返してもよい。
工程（４）の後に発酵槽１に導入する原料液を、直前の工程（４）で抜き出した発酵液と同量とすることが好ましい。
【００３９】
本実施形態によれば、工程（１）および工程（２）〜工程（４）を行うことにより、有機酸を含み原料糖の含有量が少ない発酵液（分離液）を得ることができる。
少なくとも工程（２）〜工程（４）は２回以上行い、これによって有機酸を効率良く製造することができる。本発明において、工程（２）〜工程（４）の繰り返し回数は、２回以上であるが、１０回以上が好ましく、２０回以上がより好ましい。繰り返し回数が多ければ原料糖からの有機酸の生産効率を高くできる点で好ましい。特に本発明にかかる分裂酵母は、好ましくは低ｐＨ環境において、菌体の増殖をほとんど行わず、原料糖のほとんどを有機酸等の発酵生産に使用できる。
特に、本実施形態では工程（４）において、菌体を含まない発酵液を抜き出し、菌体を含む液を発酵槽１に戻すため、菌体を追加的に導入しなくても反復回分発酵を行うことができる。
【００４０】
また、本発明において発酵設備内の液のｐＨは工程（３）または工程（４）において、好ましくは少なくとも工程（３）において、より好ましくは工程（３）及び工程（４）において、１〜６が好ましく、１〜５がより好ましく、１．５〜４．５がさらに好ましく、１．５〜３．５が特に好ましい。すなわち本発明において発酵設備内の液のｐＨは工程（３）において、１．５〜３．５であることが好ましい。なおこのｐＨは生産された有機酸により調整されることが好ましい。すなわち中和等は行わないことが好ましい。
本発明に用いる分裂酵母は耐酸性に優れ、生産された有機酸によりｐＨが低下しても安定して有機酸の発酵生産を継続することができる。また中和により中和塩が沈殿として生成することを回避しやすい。このため生産された有機酸の精製工程を簡素化しやすい。
【実施例】
【００４１】
以下、実験例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載によっては限定されない。本実施例において、含有量の単位「％」は、特に断りのない限り「質量％」を意味する。
【００４２】
［菌体（分裂酵母）］
ＡＳＰ４１５６株は、ＡＲＣ０１０株（ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照）を親株として、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁；及び国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット参照）にてｐｄｃ２  を欠損させ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  由来Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ｌｄｈ）遺伝子発現カセット（ｈＣＭＶ−ｐ．）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ  由来Ｄ−ｌｄｈ遺伝子発現カセット（ｈＣＭＶ−ｐ．）をそれぞれ１コピーずつ染色体へ組込み作製された２コピー導入株である。ロイシン及びウラシルの要求性は復帰されている。
このＡＳＰ４１５６株を菌体として、以下の試験に使用した。なおこのＡＳＰ４１５６株は、Ｄ−乳酸を主に発酵生産し、エタノールを副次的に発酵生産する能力を有する。
【００４３】
［培養液］
下記の条件で菌体を培養して、培養液を得た。
５ｍＬのＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）に、ＡＳＰ４１５６株を植菌し、試験管にて３２℃で２４時間培養し、前培養１とした。さらに１２０ｍＬのＹＥＳ培地に、前培養１で得られた培養液２．４ｍＬを植菌し、１Ｌ坂口フラスコにて３２℃で３２時間培養し、前培養２とした。
３Ｌジャーファーメンターを用いて、表１に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた初発培地（１Ｎの硫酸水溶液を用いてｐＨ４．５に調整済。）１８００ｍＬに、前培養２で得られた培養液２００ｍＬを加え、３０℃で培養を開始した。ただし初発培地は、培養液２００ｍＬを加えて２Ｌにした際に、以下の濃度となるように調整した。３３ｇ／Ｌの含水グルコース（含水率：８〜９％）、２０ｇ／ＬのＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５．３４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、微量元素類、およびビタミン類を含む。
３Ｌジャーファーメンターでの培養開始から４０時間後に、流加培地（１Ｎの硫酸水溶液を用いてｐＨ４．５に調整済。）を用いて流加を開始した。流加培地は以下の濃度となるように調整した。５５０ｇ／Ｌの含水グルコース（含水率：８〜９％）、５０ｇ／ＬのＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、９ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．４５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．５ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４、０．１４ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４、０．０４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、微量元素類、およびビタミン類を含む。
流加開始後、流加流量を経時的に増加させ、培養開始から１３２時間後に培養を終了した。培養中は１２．５％アンモニア水の添加制御により、ｐＨの下限値を４．５に保った。培養終了時の菌体濃度はＯＤ６６０値＝１３６（乾燥菌体重量２７ｇ／Ｌ）を示した。これを培養液とした。
【００４４】
［原料液］
原料糖としてグルコースを用いた。
１３６．４ｇ／Ｌの含水グルコース（含水率：８〜９％）、５ｇ／ＬのＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２．２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１．０５ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＫＣｌ、０．０４ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４、３．０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム、微量元素類、およびビタミン類を含む液を用意し、原料液とした。
【００４５】
測定方法は以下の方法を用いた。
［グルコース、エタノール、乳酸の濃度の測定］
グルコースまたはエタノールの濃度の測定には王子計測機器社製の酵素電極法バイオセンサＢＦ−５を用い、乳酸濃度の測定には、同バイオセンサＢＦ−７を用いた。
［ＤＯ（溶存酸素濃度）の測定］
ＤＯ（溶存酸素濃度）の測定にはメトラートレド社製のＩｎＰｒｏ６９００を用いた。
［ＯＤ６６０吸光度（発酵液濁度）］
ＯＤ６６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（ＪＡＳＣＯ  Ｖ−５５０  型）にて測定した。発酵液の原液で濃度が高い場合には、ＲＯ水により希釈を行い測定した。
［ｐＨ］
培養液または発酵液中のｐＨを常時測定しているプローブが示すオンラインｐＨ値と接取した実際の培養液または発酵液が示すｐＨを比較するために、ハンディｐＨ計（ＫＳ７２３）を用いた。
［生菌率］
発酵液をトリパンブルー染色液と等量混合し、検鏡観察にて染色された死細胞数と未染色の生細胞数をそれぞれ計数し、算出した。
［Ｄ−乳酸光学純度］
サンプルをフィルターろ過後、カラムの劣化を防ぐためｐＨ５付近へ調整するとともに希釈し乳酸濃度を１ｇ／Ｌとした。ＨＰＬＣ分析後、乳酸の光学純度を算出した。
【００４６】
＜実施例１＞
図１〜３に示す工程を繰り返すことで反復回分発酵を行った。すなわち遺伝子組み換えにより有機酸（Ｄ−乳酸）を発酵生産できる能力を付与した分裂酵母を用いて、Ｄ−乳酸の発酵生産を行った。
発酵槽１は小松川化工機社製、１Ｌ発酵槽を用いた。発酵槽１は、槽内を撹拌するための撹拌翼（上下２段）を備えている。
発酵槽１には気体（空気）を供給するために、上部から管を、その端部が底面付近となるように挿入した。すなわち気体の供給は発酵槽底部から液中に行うようにした。空気の供給にはエアコンプレッサーで加圧した圧縮空気をフィルターでろ過して用いた。
固液分離手段１０としては、膜分離装置（平均孔径：０．２μｍ、ポリスルホン製中空糸膜、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ｘａｍｐｌｅｒ  ＣＦＰ−２−Ｅ−３ＭＡ、膜面積は１１０ｃｍ２。）を用いた。
【００４７】
まず、培養液を発酵槽１内へ導入した（工程（１））。発酵槽１内への通気を開始した。通気量は０．２５Ｌ／分とした。発酵槽１内の液温は２８℃とした。
以下の方法で菌体濃度を調整した。すなわち発酵槽１内の液を濃縮するために、発酵槽１内の液を、発酵液排出経路３、固液分離手段１０および戻り経路４を順に通って発酵槽１へ戻る経路（以下、循環経路ということもある。）で循環させながら、固液分離手段１０から分離液排出経路１１を経て、分離液を抜き出した（図２）。分離液の抜き出し量は、発酵槽１内の液中における菌体濃度がＯＤ６６０値＝３６０（乾燥菌体重量７２ｇ／Ｌ）に濃縮される量とした。
こうして濃縮した後の、発酵槽１および循環経路内の液の合計量は２５０ｍＬであった。
【００４８】
次いで、以下の方法で発酵槽１内を初期状態とした。すなわち、液を循環させつつ、２５０ｍＬの原料液を供給した（工程（２）、図３）。発酵槽１および循環経路内の液の合計量が５００ｍＬとなった時点を発酵開始時（発酵時間０時間）とした。この時点の菌体濃度はＯＤ６６０値＝１８０（乾燥菌体重量３６ｇ／Ｌ）であった。
抜き出し時における循環経路内の液の流量は２４０ｍＬ／分とし、分離液の抜き出しを行っていない状態での、循環経路内の液の流量は１０ｍＬ／分とした（以下、同様）。
【００４９】
発酵開始後、循環経路内の液（発酵液）を循環させつつ、発酵槽１内の液中のグルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の経時変化を測定しながら発酵を行った（工程（３）、図１）。また発酵槽１内の液（発酵液）の溶存酸素濃度（ＤＯ）の経時変化を測定した。
発酵槽１内の液中原料糖濃度が０．６ｇ／Ｌ以下に低下したことを確認した後、循環経路内の液（発酵液）の２５０ｍＬ（全液量の１／２）を、固液分離手段１０を介して抜き出して、分離液を得た（工程（４）、図２）。２５０ｍＬを抜き出すのに約１時間かかった。
分離液の抜き出し中における、発酵槽１内の液の溶存酸素濃度（ＤＯ）が５ｐｐｂ以上に維持されるとともに、該ＤＯの最大値が、抜き出し開始直前よりも５０ｐｐｂ以上高く、かつ６０ｐｐｂ以上、６０００ｐｐｂ以下の範囲内となるように通気量を制御した。本例では分離液の抜き出し開始前および抜き出し中のいずれにおいても、０．２５Ｌ／分の流量で通気を継続して行った。
【００５０】
２５０ｍＬの抜き出しが終了した時点で、発酵槽１内に原料液を２５０ｍＬ導入して（工程（２）、図３）、再び発酵を開始した（工程（３）、図１）。分離液の引抜後も、０．２５Ｌ／分の流量で通気を継続して行った。
そして、発酵槽１内の液中原料糖濃度が０．６ｇ／Ｌ以下に低下したことが確認されたら、前回と同様にして、固液分離手段１０から２５０ｍＬの分離液を抜き出した後（工程（４）、図２）、２５０ｍＬの原料液を導入して（工程（２）、図３）、再度発酵を開始した。２５０ｍＬの原料液を導入するのにかかった時間は４分間であった。
これらの一連の操作を約２１０時間繰り返して、乳酸を含み、菌体を含まない分離液を断続的に得た。
【００５１】
発酵開始時（発酵時間０時間）から２１０．３時間後まで、発酵槽１内の液のｐＨを調整するための操作は特に行わなかったが、該ｐＨの値は２．２〜４．２の範囲内であった。より具体的には、発酵開始時のｐＨの値は４．２であり、発酵開始から２０時間後までは漸次低下する傾向にあり、その後はｐＨ２．２〜３．０の範囲内で推移した。
また、発酵開始時（発酵時間０時間）から２１０．３時間後まで、途中で菌体を追加することは行わなかった。発酵槽１内の液の菌体濃度を表すＯＤ６６０値は、発酵開始時は１８０に調整され、２１０．３時間後は約１３０程度であり、高い濃度に維持された。
また生菌率は、発酵開始時を１００％とすると、２１０．３時間後は約５０％であり、高い状態が維持された。
【００５２】
図４は、発酵開始時（発酵時間０時間）から２１０．３時間後までの、発酵槽１内のグルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の経時変化を示したグラフ（図４（Ａ））と、発酵槽１内の溶存酸素濃度（ＤＯ）の経時変化を示したグラフ（図４（Ｂ））を並べて示したものである。
【００５３】
図４（Ａ）に示されるように、発酵が開始されると発酵槽１内のグルコース濃度が低下し、かつ乳酸濃度およびエタノール濃度が増大している。このことから、発酵槽１内の液中でグルコースが消費されて乳酸およびエタノールが生産されたことがわかる。
図４（Ａ）に示されるように、本例の方法で発酵および分離液の抜き出しを反復して行うことにより、途中で菌体を補充することなく、約２１０時間で２４回の回分発酵を安定して行うことができた。
【００５４】
図４（Ｂ）のグラフにおいて、抜き出しが開始された後、抜き出しが終了するまでの間の、発酵槽１内の液の溶存酸素濃度（ＤＯ）は５ｐｐｂ以上に維持された。また該ＤＯの最大値は２５０ｐｐｂ〜１、０５０ｐｐｂであり、該最大値と抜き出し開始直前の該溶存酸素濃度との差は、２７０ｐｐｂ〜１、０００ｐｐｂ程度であった。
【００５５】
［乳酸生産速度］
分離液中の乳酸濃度から、乳酸生産速度（単位：ｇ／Ｌ／ｈ）を下記式（１）により求めた。
｛発酵ｔ時間における乳酸濃度（ｇ／Ｌ）−発酵開始時の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）｝／｛発酵ｔ時間（ｈ）｝  ・・・（１）
［対糖乳酸収率］
分離液中の乳酸濃度および糖濃度から、対糖乳酸収率（単位：％）を下記式（２）により求めた。
｛発酵ｔ時間における乳酸濃度（ｇ／Ｌ）−発酵開始時の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）｝／｛発酵開始時の糖濃度（ｇ／Ｌ）−発酵ｔ時間の糖濃度（ｇ／Ｌ）｝×１００  ・・・（２）
【００５６】
本例においてｔ＝２１０．３時間、糖濃度はグルコース濃度である。発酵開始時の乳酸濃度は３８．８ｇ／Ｌ、発酵開始時の糖濃度は５６．７ｇ／Ｌである。なお発酵開始時に含まれている乳酸は、発酵用菌体取得のために実施された培養段階で生成した乳酸の持ち込み分である。
発酵開始（ｔ＝０）から２１０．３時間後までに得られた分離液の合計量は６．４Ｌ、該分離液中のグルコース濃度は０．２ｇ／Ｌ、エタノール濃度はｇ／Ｌ、Ｄ−乳酸濃度は９８．２ｇ／Ｌ、Ｄ−乳酸光学純度は９８．９（％ｅ．ｅ．）であった。
乳酸生産速度は６．０ｇ／Ｌ／ｈであり、対糖乳酸収率は７９．９％であった。
【００５７】
このように、分離液に残存するグルコース濃度は、０．２ｇ／Ｌと非常に低い値を示した。
分離液中のＤ−乳酸濃度は９８．２ｇ／Ｌ、乳酸生産速度（回収発酵上清基準）は６．０ｇ／Ｌ／ｈ、対糖乳酸収率は７９．９％と高い乳酸生産性を示した。
分離液中のＤ−乳酸の光学純度は、９８．９％ｅ．ｅ．と非常に高い値を示した。
以上の結果より、本例によれば、乳酸を含み、グルコース濃度が非常に低い分離液を得ることができるとともに、発酵槽内のグルコース濃度がほぼゼロになった後も乳酸の減少が生じないため、乳酸を効率良く製造することができることがわかる。
【００５８】
＜試験例１＞
グルコース濃度がゼロになったときの、発酵に対する酸素濃度の影響を調べるために回分発酵を行った。菌体、培養液、原料液および装置は実施例１と同じものを用いた。
まず培養液および原料液を発酵槽１内へ導入し、０．２５Ｌ／分の流量で通気した。発酵槽１内の液温は２８℃とした。
発酵槽１内の液中における菌体濃度がＯＤ６６０値＝１８０となるように、実施例１と同様にして濃縮を行った。濃縮後の、発酵槽１および循環経路内の液の合計量は５００ｍＬであった。
濃縮終了時を発酵開始時（発酵時間０時間）とし、循環経路内の液（発酵液）を循環させつつ、発酵槽１内の液中のグルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の経時変化を測定しながら、７０時間発酵を行った。発酵開始から７．８時間後にグルコース濃度がゼロになったことを確認した。その後も通気を継続し条件を変えずに発酵を行った。
グルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の測定結果を図５に示す。
発酵時間が０時間、７．８時間、６９時間のときの各濃度および生菌率の測定結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2017205019.tif 000002
【００６０】
＜比較試験例１＞
本例が試験例１と異なる点は、グルコース濃度がゼロになった時点で通気を止めた点である。
すなわち試験例１と同様にして発酵を行ったところ、発酵開始から７．７時間後にグルコース濃度がゼロになったことを確認した。この時点で通気を中止した。
その他は試験例１と同様に、発酵槽１内の液中のグルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の経時変化を測定しながら、７０時間発酵を行った。
グルコース濃度、エタノール濃度、および乳酸濃度の測定結果を図６に示す。
発酵時間が０時間、７．７時間、６９時間のときの各濃度および生菌率の測定結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2017205019.tif 000003
【００６２】
図５、６、表１、２の結果に示されるように、グルコース濃度がゼロになった後に通気を継続した試験例１は、乳酸の減少が抑えられている。またエタノール濃度も減少していることから、エタノールが消費されて生菌率が維持されたと考えられる。
一方、グルコース濃度がゼロになった時点で、通気を止めた比較試験例１は、グルコース濃度がゼロになった時点以降、乳酸濃度が減少し、エタノール濃度が増加した。乳酸が消費され、エタノールが生成する反応が進んだと考えられる。
これらの結果より、実施例１において、発酵槽内のグルコース濃度がほぼゼロになった後も乳酸の減少が生じなかったのは、エタノールが消費されて生菌率が維持されたためと考えられる。
【符号の説明】
【００６３】
１  発酵槽
２  原料液供給経路
３  発酵液排出経路
４  戻り経路
１０  固液分離手段
１１  分離液排出経路
【図１】
2017205019.tif 000004
【図２】
2017205019.tif 000005
【図３】
2017205019.tif 000006
【図４】
2017205019.tif 000007
【図５】
2017205019.tif 000008
【図６】
2017205019.tif 000009