(57)【要約】【課題】新規なＢＤＮＦの産生促進剤を提供する。【解決手段】ヘリピロンＡを有効成分とするＢＤＮＦ産生促進剤。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリピロンＡを有効成分とするＢＤＮＦ産生促進剤。
【請求項２】
経口剤である請求項１に記載のＢＤＮＦ産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＢＤＮＦ産生促進剤を有効成分とする神経の伝達改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；以下、ＢＤＮＦと称する。）の産生促進剤および産生促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＤＮＦはニューロトロフィンファミリーに属する分泌性タンパク質である。その生理作用は、神経細胞の生存・維持や神経突起の形態調節など多岐にわたり、神経栄養因子として理解されている。最近では、ＢＤＮＦが記憶固定化など長期的な神経可塑性に関わることが明らかになっており、これはＢＤＮＦがシナプス構造を成熟化させる機能を有することと関係しているものと考えられている。また、多くの神経変性疾患や精神疾患において、ＢＤＮＦ発現減少が認められている。
また、ＢＤＮＦ遺伝子の発現制御系の解析から、ＢＤＮＦ遺伝子の発現制御系はシナプス活動の種類や強さと深く関わっており、神経回路を伝わってきた環境情報を遺伝情報に変換する上で根幹的な役割を果たしていることが明らかになってきている。  
【０００３】
ＢＤＮＦの産生促進剤やＢＤＮＦ遺伝子の発現促進剤にはいくつかの先行技術が存在する。
特許文献１（ＷＯ９９／０３８５３４国際公開公報）にはＮＯドナーを有効成分とするＢＤＮＦ分泌促進剤が開示されている。特許文献２（特開平７−２５７７７号公報）には、杏仁、麻黄、桂枝、人参、当帰、川弓、乾姜、甘草、石膏などの生薬を有効成分とするＢＤＮＦの合成促進剤が記載されている。特許文献３（特開２００９−０８４２７１号公報）には、アセチレン型ピレスノイド化合物を有効成分とするＢＤＮＦ誘導剤が記載されている。
【０００４】
一方、ヘリピロンＡは種々の植物に含有されている化合物であり、下記の一般式（１）で表される構造を持つ公知物質である。
【０００５】
【化１】
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一般式（１） 
【０００６】
本出願人はこのヘリピロンＡに注目して研究を行い、一重項酸素消去剤、皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤、一酸化窒素消去剤あるいは酸化防止剤などの用途（特許文献４：特許第５２６６０４６号公報）、アディポネクチン産生促進剤の用途（特許文献５：特許５７７０５７６号公報）、一酸化窒素産生促進剤の用途（特許文献６：特開２０１４−０４７１６０号公報）を見いだして特許出願している。
また、ヘリピロンＡの化学合成技術が公開されている（非特許文献１：Ｅｓａｈａｋ  Ａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１９８２，２１，２４３−２４４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９９／０３８５３４国際公開公報
【特許文献２】特開平０７−０２５７７７号公報
【特許文献３】特開２００９−０８４２７１号公報
【特許文献４】特許第５２６６０４６号公報
【特許文献５】特許第５７７０５７６号公報
【特許文献６】特開２０１４−０４７１６０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｓａｈａｋ  Ａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８２，２１，２４３−２４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＢＤＮＦ産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ヘリピロンＡの新たな用途を研究した結果、ＢＤＮＦ産生促進作用を知見したので提案する。
すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）ヘリピロンＡを有効成分とするＢＤＮＦ産生促進剤
（２）経口剤である（１）に記載のＢＤＮＦ産生促進剤
（３）（１）又は（２）に記載のＢＤＮＦ産生促進剤を有効成分とする神経の伝達改善剤
【発明の効果】
【００１１】
本発明の有効成分であるヘリピロンＡは、ＢＤＮＦ産生促進作用を有するため、ＢＤＮＦ産生が低下した状態を改善する。これによりＢＤＮＦが関与する種々の神経伝達障害や短期記憶を改善し、老化やアルツハイマー症に伴う種々の病態の治療・予防に役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】神経細胞中のＢＤＮＦがヘリピロンＡによって増加することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ヘリピロンＡを有効成分とするＢＤＮＦ産生促進剤に係るものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いるヘリピロンＡは化学的に合成される。あるいは植物から抽出することができる。合成方法は公知であるが、以下に概要を示す。
［ヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）の化学合成］
ヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）の化学合成については、上述したように非特許文献１（Ｅｓａｈａｋ  Ａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８２，２１，２４３−２４４）、に開示されている。
例えば、本発明では、次のように合成した。
４００ｍＬのヘキサン溶媒を用いて、四塩化チタンの存在下で化合物１  ジエチルケトン（３−ｐｅｎｔａｎｏｎｅ）１７２ｇと化合物２  テトラヒドロ−１，４−オキサジン（ｔｅｒａｈｙｄｒｏ−１，４−ｏｘａｚｉｎｅ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ））１，０００ｇを４℃で、３時間で反応させ、蒸留処理で精製し、化合物３（Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｅｎｙｌ）−ｔｅｒａｈｙｄｒｏ−１，４−ｏｘａｚｉｎｅ）５０３．５７ｇ（収率８１．１％）を得た。
２００ｍＬのトルエン溶媒を用いて、化合物３（Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｅｎｙｌ）−ｔｅｒａｈｙｄｒｏ−１，４−ｏｘａｚｉｎｅ）１６７ｇを化合物４  エチルマロニルクロライド（ｅｔｈｙｌ  ｍａｌｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）８１ｇとメタノール−氷冷（−１７℃〜−１１℃）条件で反応させ、一般式（２）で表される化合物５を合成した。
【００１４】
【化２】
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一般式（２）
【００１５】
化合物３と化合物４との反応は２Ｎ塩酸添加で終了させ、クロロホルム抽出後に硫酸マグネシウム乾燥処理を行った。その次に反応溶液にトルエン２００ｍＬと２５％塩酸４００ｍＬを順次加えて液−液分配でトルエン層を回収した。トルエン層を０．１Ｎ塩酸４００ｍＬで洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥処理後にトルエンを真空エバポレーターで除去して橙色油状溶液を得た。
この溶液にＰＰＡ（ポリリン酸）１ｋｇを加え、１１０℃〜１１８℃で環化して化合物５を合成した。化合物５は室温に冷却し、クロロホルム抽出で回収し、硫酸マグネシウム乾燥処理後に真空エバポレーターでクロロホルムを除去した。固形物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ））で橙色固形の化合物５を４５．７ｇ得た。本反応の収率は１８．３％であった。
【００１６】
この化合物５について１Ｎ塩酸の存在下でホルムアルデヒドを重合反応することで化合物６  ヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）を化学合成した。化合物５の４５．７ｇをエタノール４６０ｍＬに溶解し、濃塩酸２．５ｍＬの存在下でホルムアルデヒド（３７％）２４７．８１ｇを７９℃で還流反応させ、結晶が析出した。この結晶をエタノール３００ｍＬで洗浄し、白色結晶としてヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）を３４．０１ｇ得た。本反応の収率は７１．６％であった。
【００１７】
得られたヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）の物性値を以下に示す。
外観：白色結晶
ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，溶媒；ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ
δ＝ａ  １．２３１，ｂ  １．９６９，ｃ  ２．５５４，ｄ  ３．６１６，ｅ  １１．１９９
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，溶媒；ＣＤＣｌ３）
δ＝Ｉ→１６９．３３５（ｔ），Ｈ→１６８．４９９（ｍ），Ｇ→１６０．１６０（ｍ），Ｆ→１０８．７０９（ｍ），Ｅ→１０１．５９２（ｔ），Ｄ→２４．３６８（ｑｔ），Ｃ→１９．１７６（ｔ），Ｂ→１１．６８９（ｑｔ），Ａ→９．４７６（ｑ）
【００１８】
【化３】
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一般式（３）
【化４】
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一般式（４）
分子量：３２０．３４１ｇ／ｍｏｌ（質量分析）
分子式：Ｃ１７Ｈ２０Ｏ６  （質量分析）
融点  ：２１８−２２０℃
【００１９】
本発明のヘリピロンＡ（Ｈｅｌｉｐｙｒｏｎｅ  Ａ）を有効成分とするＢＤＮＦ産生促進剤としては、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２０】
ヘリピロンＡは神経細胞のＢＤＮＦ分泌量を増加させ、血中ＢＤＮＦ量の増加をもたらす。従って上記作用を有することにより、ＢＤＮＦの欠乏や不足に伴う各種疾患、特に神経系の障害や、記憶障害の改善剤として使用できる。
なおヘリピロンＡをＢＤＮＦ産生促進剤としてヒトに投与する場合は、経口投与が好ましく、成人１日当たり１ｍｇ〜１０ｇを投与すればよい。
【実施例】
【００２１】
ヘリピロンＡのＢＤＮＦ産生促進効果試験
ＢＤＮＦ産生促進試験としてラット胎仔から調製した初代培養神経細胞を用いて試験を
行った。
【００２２】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験］
１．試験方法
妊娠１７日目のＳＤラット（日本エスエルシー）から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した後、神経細胞分散液キット（住友ベークライト）を用いてキットに添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。調製したラット初代神経細胞を２％  Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、０．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むニューロベイサル培地（Ｇｉｂｃｏ）で４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように懸濁し、ポリ−Ｌ−リジンコートの４８ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に３５０μｌずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で１０日間培養した。
次いで、各ウェル当たり最終濃度１、３、１０μＭになるようにヘリピロンＡを添加した。ヘリピロンＡの添加後２４時間培養後上清を除去し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄後、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０）１５０μｌを加え細胞抽出液を調製した。調製した細胞抽出液中のＢＤＮＦ量を、ＢＤＮＦ  Ｅｍａｘ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて説明書に従って測定した。得られたＢＤＮＦ量は、ＢＣＡ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した各サンプルのタンパク質濃度で補正を行った。
【００２３】
２．試験結果
試験結果を図１に示す。ＢＤＮＦ量は、ヘリピロンＡ無添加の場合の測定結果を１００％とする相対値で表示した。図に示すように、ラット胎仔から得た初代神経細胞において、ヘリピロンＡの添加により神経細胞のＢＤＮＦ量の増加が確認された。また産生量は３μＭをピークとしていた。
以上の試験結果から、ヘリピロンＡは神経細胞のＢＤＮＦの産生を促進することが明らかとなった。したがって、ヘリピロンＡは、ＢＤＮＦが低下することに伴う神経障害や記憶障害に有用である。また遺伝子組換法によりＢＤＮＦ産生における培養液中の成分としてヘリピロンＡを用いることができる。
【図１】
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