(57)【要約】【課題】細胞の培養に用いられる培養液（培地）が血清を包含しない培養液であるのか血清を包含する培養液であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供。【解決手段】  本発明の判定システム及び判定方法では、培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定し、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定し、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する。【選択図】図１
2017205071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置と、
培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置と、
培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して収容する培養容器と、
培養された細胞に発現した遺伝子を分析する分析装置と、
分析装置の分析結果を解析する判断装置を備え、
前記判断装置は遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する機能と、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴とする判定システム。
【請求項２】
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置に収容する工程と、
細胞供給装置により培養液に培養するべき細胞を供給する工程と、
培養容器内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して細胞を培養する工程と、
培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する工程と、
遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴とする判定方法。
【請求項３】
血清が包含されていない培養液を用いて培養され、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しないことを特徴とする細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）の培養に用いられる培養液（或いは培地）に関する。より詳細には、本発明は培養液に血清が包含されているか否かを判定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種疾病に幹細胞を投与する治療が効果的であることが、近年、広く知られている。その際に、幹細胞を安全且つ効率的に培養することが必要である。そして幹細胞投与以外の分野においても、細胞を安全且つ効率的に培養する必要性が存在する。
細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）を培養するに際しては、培養液中に培養するべき細胞を投入して、所定の環境（例えば３７℃、５％ＣＯ２の環境）で保存することにより行われるのが一般的である。
【０００３】
ここで、上述した培養液が血清を含んでいると（所謂「血清培地」であると）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまい、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがある。
また、血清中に混入した病原体による感染症の恐れも存在する。さらに、血清はロットにより成分が異なることが知られており、血清を用いて培養を行う際には培養工程が不均質であることが問題となる。
それに加えて、血清を含む培養液で培養される細胞の特性が当該培養液中に混在する血清に依存するため、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうという問題も存在する。
【０００４】
上述した不都合を解消するためには、血清を包含しない培養液（所謂「無血清培地」）を用いることが好ましい。
しかし、現状で市販されている培養液の中には、血清含有量が比較的少ないものを「低血清培地」等と表記して販売しているケースも存在している。そのため、医療機関や研究機関の様に細胞を培養するために細胞培養液を購入する者（ユーザー）にとって、安全性、安定性が高い培養液（血清を包含しない培養液）であるか、安全性、安定性が低い培養液（血清を包含する培養液）であるかを判定することが困難な場合が多い。
特に（幹細胞投与等の）医療分野で細胞を培養する場合には、培養液の安全性、安定性が高い「血清を包含しない培養液」を使用したいという要請が非常に強い。それにもかかわらず、血清包含しない培養液であるか否かを簡易に且つ確実に判定する技術は、現状では提案されていない。
【０００５】
その他の従来技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてサンプル中の核酸の量を検出する技術が提案されている（例えば特許文献１参照）。
しかし、係る従来技術（特許文献１）は培養液が血清を包含するか否かを判定することを目的とはしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０２５６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、細胞の培養に用いられる培養液（培地）が「血清を包含しない培養液」であるのか或いは「血清を包含する培養液」であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の判定システム（１００）は、
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置（１：容器）と、
培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置（４：細胞供給ユニット或いはピペット等）と、
培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して収容する培養容器（５：恒環境ユニット）と、
培養された細胞に発現した遺伝子を分析する分析装置（６：例えばＰＣＲ用アナライザー或いは定量ＰＣＲ用アナライザー）と、
分析装置の分析結果を解析する判断装置（７：判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備え、
前記判断装置（７）は遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する機能と、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴としている。
【０００９】
また本発明の判定方法は、
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置（１：容器）に収容する工程と、
細胞供給装置（４：細胞供給ユニット：ピペット等）により培養液に培養するべき細胞を供給する工程と、
培養容器（５：恒環境ユニット）内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して細胞を培養する工程と、
培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する工程と、
遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴としている。
本発明の判定方法において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する前記工程では、ＰＣＲ法或いは定量ＰＣＲ法を実行するのが好ましい。
そしてＰＣＲ法或いは定量ＰＣＲ法を実行可能な装置（ＰＣＲ用アナライザー或いは定量ＰＣＲ用アナライザー）を分析装置として使用して、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する前記工程を行うことが好ましい。
【００１０】
本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液を用いて培養され、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しないことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
上述の構成を具備する本発明によれば、細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）を培養した後に、当該細胞において遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを測定することで、培養液中に血清が含まれているかどうかを判定することができる。
換言すれば、本発明において、培養液に血清が包含されている場合に当該培養液で細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該細胞において遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現するので、当該細胞を培養した結果、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現すれば培養液中に血清が包含されていると判定され、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しなければ培養液中に血清が包含されていないと判定される。
そのため本発明によれば、細胞を培養するための培養液が成分として血清を包含するか否かを、容易且つ確実に判定することが可能である。
【００１２】
上述した様に、本発明によれば培養液に血清が含まれているか否かを容易且つ確実に判定することが出来るので、培養液を本発明により判定することによって、当該培養液で培養された細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）が、血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することが出来る。
幹細胞投与治療において、血清存在下で培養された細胞は感染症等に汚染される危険性が高いので、その様な幹細胞が投与された患者は感染症等に罹患する可能性が高くなり、危険である。本発明により血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することにより、感染症発症等の危険性が少ない幹細胞を患者に投与することが出来て、幹細胞投与における安全性をさらに向上することが出来る。
【００１３】
さらに、上述した培養液が血清を含んでいないため（所謂「無血清培地」であるため）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまうことがなく、患者に投与した場合には免疫反応を起こしてしまう恐れがない。
さらに、血清を含まない培養液で細胞を培養するので、血清を包含する培養液の場合とは異なり、培養された細胞の特性は血清に依存することが無く、細胞の特性の幅が広くなってしまうことが防止される。
【００１４】
これに加えて、本発明によれば、培養液にヒト血清及び／又は動物（例えば牛）の血清を混合したか否かを判定することが出来るので、ウシ血清を用いた培養液を識別する従来技術（Ｎｅｕ５Ｇｃを測定する技術）とは異なり、ヒト血清を使用して培養された細胞であるか否かをも判定することが出来る。
さらに本発明により、血清が包含される培養液で幹細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該培養された細胞には遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現することが明らかになった。
そして本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液で培養されているため、異種抗原が取り込まれてしまうことはなく、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがない。また、血清中に混入した病原体による感染症も存在しない。さらに、培養工程が均質であり、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうこともない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態のブロック図である。
【図２】本発明の実施形態における判定の手順を示すフローチャートである。
【図３】血清を混入した培養液で培養された細胞及び無血清の培養液で培養された細胞において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かをＰＣＲ法を用いて測定した実験結果を示す図である。
【図４】脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の幹細胞、羊膜由来の幹細胞の各々を、ウシ胎児血清を混入した培養液で培養した場合と無血清の培養液で培養した場合において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かをＰＣＲ法を用いて測定した実験結果を示す図である。
【図５】ウシ胎児血清を混入した培養液で培養された細胞と、ヒト胎児血清を混入した培養液で培養された細胞と、無血清の培養液で培養された細胞において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かをＰＣＲ法を用いて測定した実験結果を示す図である。
【図６】複数種類の濃度でウシ胎児血清を無血清の培養液に混入し、各々の培養液で細胞を培養した場合に、培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かをＰＣＲ法を用いて測定した実験結果を示す図である。
【図７】血清を混入した培養液で培養された細胞及び無血清の培養液で培養された細胞において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かについて、定量ＰＣＲ法を用いて判定した実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
最初に図１、図２を参照して、本発明の実施形態に係る判定システム及び判定方法について説明する。
図１において、全体を符号１００で示す判定システム１００において、細胞の移動（或いは判定工程の順序）が矢印で表示されている。図１で示す判定システム１００は、収容装置１（容器）、細胞供給装置４（細胞供給ユニット：ピペット等）、培養容器５（恒環境ユニット）、分析装置６、判断装置７（判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備える。
図１において、符号ＣＦは培養液、符号ＳＣは培養するべき細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来或いは羊膜由来の間葉系幹細胞）、符号ＣＣは培養した細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来或いは羊膜由来の間葉系幹細胞）を表す。
【００１７】
判定システム１００において、収容装置１（容器）は、培養液供給ユニット８から供給される培養液ＣＦ（血清を包含するか否かを判定するべき培養液）を収容する。細胞が培養されるまでの工程（図２のステップＳ２で所定時間が経過するまで：ステップＳ２が「Ｙｅｓ」になるまで）では、判定対象である培養液ＣＦは収容装置１（容器）内に収容された状態となる。
細胞供給装置４（細胞供給ユニット）は、培養液ＣＦ（判定対象の培養液）に培養するべき細胞ＳＣを供給する。図示の実施形態では、培養するべき細胞ＳＣとして、例えば、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、羊膜由来の間葉系幹細胞を選択している。本明細書において、「細胞供給装置」という文言は、自動制御で作動する自動装置のみならず、オペレータがピペット等を使用する場合をも包含する趣旨で用いられている。
【００１８】
培養容器５（恒環境ユニット）は、培養するべき細胞ＳＣが供給された培養液ＣＦ（判定対象）を収容している収容装置１が収容され、静置された際に、細胞の培養に適切な環境を提供、維持する機能を有している。図示の実施形態では、培養容器５内では温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境が維持されている。
培養容器５では、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境下に静置されて、細胞ＳＣが培養される。
【００１９】
分析装置６は、培養容器５で培養された細胞である細胞ＣＣにおいて、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しているか否かを分析する機能を有する装置であり、例えば、ＰＣＲ法或いは定量ＰＣＲ法を実行することが出来る装置（ＰＣＲ用アナライザー或いは定量ＰＣＲ用アナライザー）である。分析装置６としては、公知市販のイメージアナライザー（例えば、ＧＥヘルスケア社製の商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００」）を使用出来る。
判断装置７（判断ユニット）は、分析装置６の分析結果を解析し、培養された細胞ＣＣにおいて遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しているか否かを判定する機能を有している。
【００２０】
判断装置７はＰＣ等の演算処理機能を備えた情報処理装置であって、分析装置６の分析結果を解析し、培養された細胞ＣＣにおいて遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しているか否かを決定する機能と、培養された細胞ＣＣに遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない場合には培養液ＣＦには血清が包含されていないと判定する機能と、培養された細胞ＣＣに遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した場合には培養液ＣＦには血清が包含されていると判定する機能を有している。
また、判断装置７は、本体部７Ａと表示部７Ｂを有し、表示部７Ｂに決定された蛍光強度特性その他の分析結果、判断結果を表示する機能を有している。図示はされていないが、情報処理装置に代えてオペレータにより「培養液ＣＦには血清が包含されているか否か」を判定することが可能であり、本明細書における「判断装置」という文言はその様な場合を包含する趣旨で用いられている。
なお、分析結果である分析装置６及び判断装置７において、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する手法に関しては、図３〜図７を参照して後述する。
【００２１】
次に、図示の実施形態において、培養液が血清を包含するか否かの判定手順（工程）を、主として図２のフローチャートを参照して説明する。
図２において、ステップＳ１では、血清を包含するか否かを判定するべき培養液を培養液供給ユニット８から収容装置１に供給する。
そして、培養液を収容した収容装置１に対して、細胞供給装置４により、培養するべき細胞（例えば、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、羊膜由来の間葉系幹細胞）を供給する。
さらに、ステップＳ１では培養するべき細胞が供給された培養液（判定対象の培養液）を収容した収容装置１を、培養容器５内に収容する。そして、培養容器５内に収容装置１を収容、静置した状態で、培養容器５を恒環境（例えば３７℃、５％ＣＯ２環境下）下で維持して、細胞の培養を開始する。
【００２２】
ステップＳ２では、上記培養開始からの経過時間を計測し、所定時間を経過したか否かを判断する。所定時間を経過した場合（ステップＳ２が「Ｙｅｓ」）、ステップＳ３に進む。一方、所定時間を経過していない場合（ステップＳ２が「Ｎｏ」）、ステップＳ２に戻り、ステップＳ２における「Ｎｏ」のループを繰り返す。
次のステップＳ３では、所定時間経過して培養された細胞（例えば脂肪由来、臍帯由来或いは羊膜由来の間葉系幹細胞）に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを判定する。ステップＳ３における「判定」は、分析装置６（例えば、ＰＣＲ用アナライザー、定量ＰＣＲ用アナライザー）における分析の結果に基づき、判断装置７で行う。
【００２３】
ステップＳ３において、培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したと判定された場合（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）は、ステップＳ４に進む。
一方、培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していないと判定された場合（ステップＳ３が「Ｎｏ」）には、ステップＳ５に進む。
なお、ステップＳ３における分析については、図３〜図７で後述する。
ステップＳ４では、「培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現した」との判定結果（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）に基づいて、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていると判定する。
一方、ステップＳ５では、「培養された細胞に遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現していない」との判定結果（ステップＳ３が「Ｎｏ」）に基づき、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていないと判定する。
上述した手順により、対象となる培養液が血清を包含するか否かが、正確に判定される。
【００２４】
血清が包含されていない培養液で培養された本発明の実施形態に係る細胞は、培養の過程で培養液を経由して異種抗原が取り込まれてしまう恐れは無い。そして、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがない。また、血清中に混入した病原体による感染症も存在しない。
さらに、実施形態に係る細胞の培養工程は均質であり、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうことはない。
【００２５】
［実験例１］
６種類の培養液で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞よりＲＮＡを抽出した後、逆転写反応を行いｃＤＮＡを調整した。逆転写反応は、1μｇのＲＮＡをもとに、Ｒａｎｄａｍ  ６ｍｅｒをプライマーとして、逆転写酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」）を用いて行った。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを測定した。
培養液としては、
古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％（本明細書では容積％）混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ：図３では符号「Ｆ３１」で示す）、
血清を包含していない第１の培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」：図３では符号「Ｆ３２」で示す）、
血清を包含していない第２の培養液（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＢ−ＣＤ」：図３では符号「Ｆ３３」で示す）、
血清を包含していない第３の培養液（コーニングインターナショナル株式会社製の商品名「ｓｔｅｍｇｒｏ」：図３では符号「Ｆ３４」で示す）、
血清を包含していない第４の培養液（出願人が製造した商品名「ＥＸＰＲＥＰ」：図３では符号「Ｆ３５」で示す）、
血清を僅かに包含する第４の培養液（低血清培地：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名「ＭｅｓｅｎＰｒｏ  ＲＳ」：図３では符号「Ｆ３６」で示す）、
の６種類を使用した。
【００２６】
上記６種類の培養液で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞について、以下の通り、ＰＣＲ反応を行った。
最初に下記を混合した。
酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ」）の５ユニット／μリットルのものを０．１μリットル（最終濃度：０．０２５ユニット／μリットル）、
調整剤（ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ：反応液の１／１０だけ混合用）を２μリットル、
核酸混合液（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ」）を１μリットル、
フォワードプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
リバースプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
２５ｎｇのＲＮＡに由来するｃＤＮＡ。
最後にＨ２Ｏを加え、反応液量を２０μリットルに調整した。
【００２７】
ここで、プライマーの配列は以下の通りである。
まず、図３〜図６において、内部標準として用いられた遺伝子（全てにおいて発現する遺伝子：図３〜図６における符号「ＧＡＰＤＨ」）において、
フォワードプライマーは  ａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｔｃａｇａｃａｃ
リバースプライマーは  ｇｃｃｃａａｔａｃｇａｃｃａａａｔｃｃ
である。
一方、遺伝子ＢＤＫＲＢ１において、
フォワードプライマーは  ｇｃｃｔｔｃａｔｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇａｇ
リバースプライマーは  ａｇｇｃｔｇｃａｇｃｇａｇｃｔａｔｇ
である。
一般的なサーマルサイクラーを用いて、
９５℃  １５秒
６０℃  １分
を１サイクルとして、３０サイクル反応を行った。
【００２８】
ＰＣＲ反応液のうち、１０μリットルを染色試薬（株式会社バイオクラフト製の商品名「ＧＲＧｒｅｅｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ」）１０μリットルと混合した後、アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲル電気泳動の後、分析装置（ＧＥヘルスケア社製の商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００」）を用いて、バンドを検出した。
検出したバンドが図３で示されている。
【００２９】
図３において、上述した通り、符号Ｆ３１で示す列は、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ３２で示す列は、血清を包含していない第１の培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ３３で示す列は、血清を包含していない第２の培養液（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＭ−ＣＤ」）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ３４で示す列は、血清を包含していない第３の培養液（コーニングインターナショナル株式会社製の商品名「ｓｔｅｍｇｒｏ」）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ３５で示す列は、血清を包含していない第４の培養液（出願人が製造した商品名「ＥＸＰＲＥＰ」）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ３６で示す列は、血清を僅かに包含する第４の培養液（低血清培地：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名「ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ」）で培養した細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示す。
内部標準ＧＡＰＤＨは、全ての場合に検出したバンドが顕現しており、実験例１が適切に行われていることを示している（図３の下段の行）。
【００３０】
図３から、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した細胞には遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現し（Ｆ３１）、血清を僅かに包含する第４の培養液（低血清培地：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名「ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ」）で培養した細胞にも遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現している（Ｆ３６）。
このことから、微量であってもウシ胎児血清を混合した培養液で培養した細胞には遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現することが明らかになった。
【００３１】
［実験例２］
次に実験例２では、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、羊膜由来の間葉系幹細胞の各々を、血清を包含する培養液で培養された場合と、無血清の培養液で培養された場合について、ＰＣＲ反応を用いて、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを測定した。
培養液としては、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ：図４では符号Ｆ４１、Ｆ４３、Ｆ４５で示す）と、血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」：図４では符号Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４６で示す）を用いた。
ＰＣＲ法については、実験例１と同様である。
【００３２】
図４において、上述した通り、符号Ｆ４１で示す列は、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ４２で示す列は、血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ４３で示す列は、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した臍帯由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ４４で示す列は、血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した臍帯由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ４５で示す列は、古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した羊膜由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示し、
符号Ｆ４４で示す列は、血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した羊膜由来の間葉系幹細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１と、内部標準ＧＡＰＤＨのバンドを示す。
実験例１と同様に、内部標準ＧＡＰＤＨでは全ての場合に検出したバンドが顕現しており、実験例２が適切に行われていることを示している。
【００３３】
図４から明らかな通り、血清を含む培養液で培養された幹細胞は、脂肪由来の間葉系幹細胞でも、臍帯由来の間葉系幹細胞でも、羊膜由来の間葉系幹細胞でも、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現した（Ｆ４１、Ｆ４３、Ｆ４５）。
一方、無血清培養液で培養された幹細胞は、脂肪由来の間葉系幹細胞でも、臍帯由来の間葉系幹細胞でも、羊膜由来の間葉系幹細胞でも、遺伝子ＢＤＫＲＢ１は顕現しなかった（Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４６）。
実験例２から、脂肪由来の間葉系幹細胞のみならず、臍帯由来の間葉系幹細胞でも、羊膜由来の間葉系幹細胞でも、図示の実施形態により遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現したか否かを判定して、使用された培養液が血清を包含するか否かを判定することが出来ることが明らかになった。
【００３４】
［実験例３］
脂肪由来の間葉系幹細胞を、ヒト血清を包含する培養液、ウシ胎児血清を包含する培養液、無血清の培養液で培養した各々の場合について、ＰＣＲ反応を用いて、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを測定した。
培養液としては、血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」：図５の符号Ｆ５１の列）、当該培養液にウシ胎児血清を添加したもの（ｓｆ−ＤＯＴ＋ＦＣＳ：図５の符号Ｆ５２の列）、当該培養液にヒト血清を添加したもの（ｓｆ−ＤＯＴ＋ＨＳ：図５の符号Ｆ５３の列）を用いた。
ＰＣＲ法と内部標準ＧＡＰＤＨについては、実験例１と同様である。
【００３５】
図５から明らかに様に、血清を包含していない培養液にウシ胎児血清を添加したもの（ｓｆ−ＤＯＴ＋ＦＣＳ：図５の符号Ｆ５２の上段）、と、血清を包含していない培養液にヒト血清を添加したもの（ｓｆ−ＤＯＴ＋ＨＳ：図５の符号Ｆ５３の上段）では、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現した。
実験例３から、図示の実施形態により遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現したか否かを調べることにより、培養液にウシ胎児血清が混入している場合でも、ヒト血清が混入している場合でも、判定することが出来ることが明らかになった。
【００３６】
［実験例４］
ウシ胎児血清を包含する培養液におけるウシ胎児血清の濃度を変えて複数種類の培養液を調整し、当該複数種類の培養液の各々で脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して、ＰＣＲ反応を用いて遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現したか否かを測定し、以て培養された幹細胞から遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現しなくなる（培養液における）ウシ胎児血清濃度を調べた。
実験例４において、ウシ胎児血清の濃度は、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、無添加（０％）の７種類とした。
ＰＣＲ法と内部標準ＧＡＰＤＨについては、実験例１と同様である。
【００３７】
図６において、「非添加」と表示されているのはウシ胎児血清が無添加（ウシ胎児血清濃度が０％）であることを示している。
図６から明らかな様に、ウシ胎児血清が添加されていない場合（図６の「非添加」の上段）には遺伝子ＢＤＫＲＢ１は発現しないが、ウシ胎児血清の濃度が１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％であれば遺伝子ＢＤＫＲＢ１は発現した。
実験例４から、培養液に添加されたウシ胎児血清の濃度が０．１％（容積％）以上であれば、当該培養液で培養された細胞から遺伝子ＢＤＫＲＢ１は発現することが明らかになった。
【００３８】
［実験例５］
実験例１〜実験例４は、ＰＣＲ法により遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現するか否かを調べたが、実験例５では定量ＰＣＲ法により遺伝子ＢＤＫＲＢ１が発現するか否かを調べた。
実験例５の結果を図７で示す。
【００３９】
図７において、符号Ｇ１は基準となる細胞（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＭ−ＣＤ」で培養されたＵＳＢ４０８Ｅ６Ｅ７ＴＥＲ−３３細胞）を包括的に示す符号であり、符号Ｇ１で示す細胞は培養の世代数が異なる２種類の細胞Ｆ７１、Ｆ７２を包含している。
ここで、図７の縦軸は、遺伝子ＢＤＫＲＢ１の発現量を符号Ｇ１で示す細胞における遺伝子ＢＤＫＲＢ１の発現量に対する相対的な比率である。従って、Ｇ１における種類の細胞Ｆ７１、Ｆ７２の縦軸の数値は１となる。
【００４０】
符号Ｇ３は６種類の異なる培養液で培養された脂肪由来の間葉系幹細胞を包括的に示しており、
古典的な培養液に１０％のウシ胎児血清を混合した培養液で培養した場合（符号Ｆ７３）、
第１の血清を包含していない培養液（無血清培地：出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した場合（符号Ｆ７４）、
第２の血清を包含していない培養液（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＭ−ＣＤ」）で培養した場合（符号Ｆ７５）、
第３の血清を包含していない培養液（コーニングインターナショナル株式会社製の商品名「ｓｔｅｍｇｒｏ」）で培養した場合（符号Ｆ７６）、
第４の血清を包含していない培養液（出願人が製造した商品名「ＥＸＰＲＥＰ」）で培養した場合（符号Ｆ７７）、
血清の含有量が少ない培養液（低血清培地：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名「ＭｅｓｅｎＰｒｏ」で培養した場合（符号Ｆ７８）、
を包含している。
符号Ｇ３は２種類の異なる培養液で培養された脂肪由来の間葉系幹細胞を包括的に示しており、
古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した場合（符号Ｆ７９）と、
血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した場合（符号Ｆ８０）、
を包含している。
【００４１】
符号Ｇ４も、符号Ｇ３と同様に、２種類の異なる培養液で培養された、Ｇ３とは異なるロットの脂肪由来の間葉系幹細胞を包括的に示しており、
古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した場合（符号Ｆ８１）と、
血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した場合（符号Ｆ８２）、
を包含している。
符号Ｇ５は、２種類の異なる培養液で培養された臍帯由来の間葉系幹細胞を包括的に示しており、
古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した場合（符号Ｆ８３）と、
血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した場合（符号Ｆ８４）、
を包含している。
【００４２】
符号Ｇ６は、２種類の異なる培養液で培養された羊膜由来の間葉系幹細胞を包括的に示しており、
古典的な培養液（αＭＥＭ）にウシ胎児血清を１０％混合した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で培養した場合（符号Ｆ８５）と、
血清を包含していない培養液（出願人が販売している培養液である商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養した場合（符号Ｆ８６）、
を包含している。
【００４３】
図７を参照すれば明らかな様に、定量ＰＣＲ法を用いた場合においても、実験例１〜実験例４と同様に、血清を包含する培養液で培養された細胞（脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）における遺伝子ＢＤＫＲＢ１の発現量（Ｆ７３、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８１、Ｆ８３、Ｆ８５）は、血清を包含しない培養液で培養された細胞（脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞）における遺伝子ＢＤＫＲＢ１の発現量（Ｆ７４〜Ｆ７７、Ｆ８０、Ｆ８２、Ｆ８４、Ｆ８６）と比較すれば、明らかに多い。
実験例５から、ＰＣＲ法のみならず、定量ＰＣＲ法を用いても、遺伝子ＢＤＫＲＢ１の発現の有無（或いは多寡）により、細胞を培養した培養液中に血清が包含されていたか否かを明確に判定できることが明らかになった。
【００４４】
実験例１〜５から、血清が包含されていない培養液を用いて培養された細胞であれば、脂肪由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、羊膜由来の間葉系幹細胞であっても、ＲＮＡを抽出した後、逆転写反応を行いｃＤＮＡを調整し、得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法或いは定量ＰＣＲ法を行っても、遺伝子ＢＤＫＲＢ１が顕現しないことが確認された。
換言すれば、本発明の細胞は、ＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行いｃＤＮＡを調整し、得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法或いは定量ＰＣＲ法を行っても、遺伝子ＢＤＫＲＢ１は顕現しない
【００４５】
図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。
例えば図示の実施形態では、主として脂肪由来、臍帯由来、羊膜由来の間葉系幹細胞を培養する場合について述べているが、骨髄由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞であっても同様である。すなわち、本発明によれば、脂肪由来、臍帯由来、骨髄由来、羊膜由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞の培養で使用される培養液が血清を包含するか否かを判断することが出来る。或いは、幹細胞以外の各種細胞を培養する場合においても、本発明を適用することが出来る。
【符号の説明】
【００４６】
１・・・収容装置（容器）
４・・・細胞供給装置（細胞供給ユニット）
５・・・培養容器（恒環境ユニット）
６・・・分析装置（アナライザー）
７・・・判断装置（判断ユニット）
７Ａ・・・本体部
７Ｂ・・・表示部
８・・・培養液供給ユニット
１００・・・判定システム
ＣＣ・・・培養した細胞
ＣＦ・・・培養液
ＳＣ・・・培養するべき細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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