(57)【要約】【課題】糖化酵素を効率的に再利用する装置を提供する。【解決手段】セルロース系原料を糖化する糖化装置であって、セルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加える混合手段と、前記混合手段がセルロース系原料を加えた糖化液からセルロース系原料を回収する回収手段と、前記回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化して糖化液を更に得る糖化手段と、を備える。【選択図】図１１
2017205018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系原料を糖化する糖化装置であって、
セルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加える混合手段と、
前記混合手段がセルロース系原料を加えた糖化液からセルロース系原料を回収する回収手段と、
前記回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化して糖化液を更に得る糖化手段と、を備える、
糖化装置。
【請求項２】
前記回収手段は、前記混合手段がセルロース系原料を加える糖化液に残留していた糖化残渣と共にセルロース系原料を回収し、
前記糖化手段は、前記回収手段が回収した糖化残渣とセルロース系原料とを酵素糖化して糖化液を更に得る、
請求項１に記載の糖化装置。
【請求項３】
前記セルロース系原料が、植物バイオマスである、請求項１または２に記載の糖化装置。
【請求項４】
前記セルロース系原料が、水熱分解処理された植物バイオマスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖化装置。
【請求項５】
前記糖化手段は、前記回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料に糖化酵素を補充して酵素糖化し、糖化液を更に得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖化装置。
【請求項６】
前記混合手段の一種であり、前記糖化手段において得られた糖化液にセルロース系原料を加える他の混合手段と、
前記回収手段の一種であり、前記他の混合手段がセルロース系原料を加えた糖化液からセルロース系原料を回収する他の回収手段と、
前記糖化手段の一種であり、前記他の回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化して糖化液を更に得る他の糖化手段と、を更に備える、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖化装置。
【請求項７】
前記回収手段は、フィルタープレスまたは遠心分離機である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物バイオマス等のセルロース系原料を酵素糖化する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、発酵法によるＬ−アミノ酸等の目的物質の工業生産においては、炭素源として、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の、植物由来の可食資源から得られた成分が使用されてきた。しかしながら、近年の人口増や開発途上国の生活レベル向上により、これらの食糧と競合する成分ではなく、植物由来の非可食バイオマス原料の利用について実用化検討が進められている。
【０００３】
このような植物由来の非可食バイオマス原料は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等によって構成されているが、これらの内、セルロースおよびヘミセルロースは、熱や酸などを用いる前処理行程、およびセルラーゼやキシラナーゼ等の糖化酵素による糖化処理行程等を経て、５単糖および６単糖へと変換され、発酵の原料として用いることができる（特許文献１、２）。
【０００４】
植物由来の非可食バイオマス原料の酵素糖化を工業レベルで実用化するためには、酵素コストの低減が課題となる。酵素コストの低減は、例えば、糖化酵素の使用量を低減することにより達成できる。糖化酵素の使用量を低減する方法としては、超音波を照射しながら糖化を行う方法（非特許文献１〜２）、糖化液から限外濾過により糖化酵素を回収して再利用する方法（特許文献３、非特許文献３〜４）、糖化液から糖化酵素の付着した糖化残渣を回収して次の回の酵素源として利用する方法（特許文献４〜５）、等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平9-507386号公報
【特許文献２】特表平11-506934号公報
【特許文献３】特開2006-087319号公報
【特許文献４】特開2010-098951号公報
【特許文献５】特許第5431499号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wood,B.E. et al., Biotechnol. Prog., 1997, 13(3): 232-237.
【非特許文献２】Tomme,P. et al., Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, 1995, Volume618: 145-163.
【非特許文献３】Ishihara,M. et al., Biotechnol.Bioeng.，1991, 37: 948-954.
【非特許文献４】安戸饒, 木材学会誌, 1989, 35(12): 1067-1072.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糖化酵素を効率的に再利用する装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、植物バイオマスの酵素糖化を行う際に、植物バイオマスを糖化酵素により糖化して得られた、糖化酵素を含有する糖化液に、次の回の酵素糖化における基質となる植物バイオマスを添加して回収し、
回収した植物バイオマスを基質および糖化酵素源として利用して次の回の酵素糖化を行うことで、糖化酵素を効率的に再利用できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
セルロース系原料を糖化する糖化装置であって、
セルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加える混合手段と、
前記混合手段がセルロース系原料を加えた糖化液からセルロース系原料を回収する回収手段と、
前記回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化して糖化液を更に得る糖化手段と、を備える、
糖化装置。
［２］
前記回収手段は、前記混合手段がセルロース系原料を加える糖化液に残留していた糖化残渣と共にセルロース系原料を回収し、
前記糖化手段は、前記回収手段が回収した糖化残渣とセルロース系原料とを酵素糖化して糖化液を更に得る、
［１］に記載の糖化装置。
［３］
前記セルロース系原料が、植物バイオマスである、［１］または［２］に記載の糖化装置。
［４］
前記セルロース系原料が、水熱分解処理された植物バイオマスである、［１］から［３］のいずれかに記載の糖化装置。
［５］
前記糖化手段は、前記回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料に糖化酵素を補充して酵素糖化し、糖化液を更に得る、［１］〜［４］のいずれかに記載の糖化装置。
［６］
前記混合手段の一種であり、前記糖化手段において得られた糖化液にセルロース系原料を加える他の混合手段と、
前記回収手段の一種であり、前記他の混合手段がセルロース系原料を加えた糖化液からセルロース系原料を回収する他の回収手段と、
前記糖化手段の一種であり、前記他の回収手段が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化して糖化液を更に得る他の糖化手段と、を更に備える、
［１］〜［５］のいずれかに記載の糖化装置。
［７］
前記回収手段は、フィルタープレスまたは遠心分離機である、
［１］〜［６］のいずれかに記載の糖化装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、糖化酵素を効率的に再利用することができる。よって、本発明の一態様によれば、セルロース系原料を糖化する際に用いられる糖化酵素の使用量を削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】糖化酵素としてCellic CTec2またはMeiji Acremonium cellulaseを用いて糖化反応を実施した場合の、酵素使用量と糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理稲藁）。
【図２】糖化酵素としてCellic CTec2またはMeiji Acremonium cellulaseを用いて糖化反応を実施した場合の、酵素使用量と糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理バガス）。
【図３】１段目の糖化反応の遠心残渣または水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して２段目の糖化反応を実施した場合の、酵素補充量と２段目糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理稲藁、糖化酵素：Cellic CTec2）。
【図４】１段目の糖化反応の遠心残渣または水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して２段目の糖化反応を実施した場合の、酵素補充量と２段目糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理稲藁、糖化酵素：Meiji Acremonium cellulase）。
【図５】１段目の糖化反応の遠心残渣または水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して２段目の糖化反応を実施した場合の、酵素補充量と２段目糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理バガス、糖化酵素：Cellic CTec2）。
【図６】１段目の糖化反応の遠心残渣または水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して２段目の糖化反応を実施した場合の、酵素補充量と２段目糖化率の関係を示す図（酵素基質：水熱処理バガス、糖化酵素：Meiji Acremonium cellulase）。
【図７】水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して糖化反応を繰り返し実施した場合の、各段における累積糖化率を示す図（酵素基質：水熱処理稲藁、糖化酵素：Cellic CTec2）。
【図８】水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して糖化反応を繰り返し実施した場合の、各段における累積糖化率を示す図（酵素基質：水熱処理稲藁、糖化酵素：Meiji Acremonium cellulase）。
【図９】水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して糖化反応を繰り返し実施した場合の、各段における累積糖化率を示す図（酵素基質：水熱処理バガス、糖化酵素：Cellic CTec2）。
【図１０】水熱処理物添加後遠心残渣に糖化酵素を補充して糖化反応を繰り返し実施した場合の、各段における累積糖化率を示す図（酵素基質：水熱処理バガス、糖化酵素：Meiji Acremonium cellulase）。
【図１１】図１１は、実施形態に係る糖化装置を示した図の一例である。
【図１２】図１２は、上記実施形態に係る糖化装置の第１変形例を示した図である。
【図１３】図１３は、上記実施形態に係る糖化装置の第２変形例を示した図である。
【図１４】図１４は、回収装置および後処理装置の変形例を示した図である。
【図１５】図１５は、前処理タンクおよび糖化タンクの変形例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係る糖化装置において実現される糖化方法の概要について説明する。
【００１３】
＜１＞セルロース系原料
本発明において、「セルロース系原料（cellulosic material）」とは、セルロースお
よび／またはヘミセルロースを含有する原料をいう。セルロース系原料としては、植物バイオマスが挙げられる。植物バイオマスとしては、木質系バイオマスや草本系バイオマスが挙げられる。植物バイオマスとして、具体的には、例えば、稲わら、麦わら、籾殻、サトウキビバガス、オイルパーム空果房、コーンストーバ、コーンコブ、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラス、廃木材が挙げられる。また、セルロース系原料としては、微結晶セルロース（アビセル）、ろ紙、古紙、パルプも挙げられる。セルロース系原料としては、１種の原料を用いてもよく、２種またはそれ以上の原料を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
植物バイオマス等のセルロース系原料は、そのまま、あるいは適宜、前処理に供してから、糖化処理に供してよい。前処理としては、水熱分解処理、蒸煮、爆砕、粉砕が挙げられる。これらの中では、水熱分解処理（「水熱処理」ともいう）が好ましい。これらの前処理は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、植物バイオマスは、
５ｍｍ以下に粉砕して、水熱分解処理に供してもよい。
【００１５】
水熱分解処理は、植物バイオマスを加圧熱水と対向接触させることにより行うことができる。このような処理は、例えば、特許第４４３６４２９号公報、特許４５２４３５１号公報、又は特許第４４２７５８３号公報に記載された装置を用いて行うことができる。植物バイオマスは、一般的に、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等の成分で構成されるが、植物バイオマスの水熱分解処理によって、リグニン成分及びヘミセルロース成分は植物バイオマスから熱水中に移行し、セルロース成分は固形分として残る。
【００１６】
水熱分解処理の反応温度（加圧熱水の温度）は、例えば、好ましくは１７５〜２４０℃、より好ましくは２００〜２３０℃であってよい。植物バイオマスの構成成分の内、ヘミセルロース成分は約１４０℃以上で、セルロースは約２３０℃以上で、リグニン成分は約１４０℃以上で溶解する。よって、上記範囲の温度で水熱分解処理を行うことにより、セルロース成分と他の成分とを十分に分離することができる。また、水熱分解処理の反応圧力（加圧熱水の圧力）は、装置内部が加圧熱水の状態となるよう、各温度の水の飽和蒸気圧より更に０．１〜０．５ＭＰａ高い圧力とするのが好ましい。反応時間は、通常２０分以下、好ましくは３〜１５分であってよい。
【００１７】
続いて、必要により熱水と固形分とを分離し、酵素糖化の基質として利用することができる。
【００１８】
＜２＞糖化酵素
本発明において、「糖化酵素」とは、セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。糖化酵素としては、セルラーゼやヘミセルラーゼが挙げられる。セルラーゼとしては、エンド型セルラーゼ（エンドグルカナーゼ；EC 3.2.1.4）、エキソ型セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ；EC 3.2.1.91）、セロ
ビアーゼ（β−グルコシダーゼ；EC 3.2.1.21）が挙げられる。なお、セルラーゼは、活
性測定に用いられる基質に応じて、アビセラーゼ、フィルターペーパーセルラーゼ（ＦＰアーゼ）、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）等とも呼ばれる。ヘミセルラーゼとしては、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、β−１，４−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）、アラビノフラノシダーゼ（EC 3.2.1.55）が挙げられる。糖化酵素としては、１種の酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。糖化酵素としては、糖化対象のセルロース系原料に含有される多糖の種類（すなわち、セルロースおよび／またはヘミセルロース）に応じて、適当なものを選択して利用することができる。
【００１９】
糖化酵素としては、微生物、動物、植物等いずれの由来のものを用いてもよい。また、糖化酵素としては、公知の糖化酵素のホモログや人為的改変体を用いてもよい。
【００２０】
糖化酵素としては、市販の酵素製剤を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
【００２１】
市販のセルラーゼ製剤としては、Cellic CTec2（Novozymes）、Meiji Acremonium Cellulase（Meiji Seika Pharma）、Spezyme CP（Genencor；Trichoderma reesei由来）が挙
げられる。市販のヘミセルラーゼ製剤としては、Cellic Htec（Novozymes）が挙げられる。
【００２２】
糖化酵素は、例えば、糖化酵素を生産する微生物を培養することにより製造できる。糖化酵素を生産する微生物は、本来的に糖化酵素を産生するものであってもよく、糖化酵素を産生するように改変されたものであってもよい。糖化酵素を生産する微生物としては、
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）等の糸状菌やクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）等の細菌が挙げられる。アクレモニウム・セルロリティカスとしては
、アクレモニウム・セルロリティカスC1株（特開2003-135052号公報）やアクレモニウム
・セルロリティカスCF-2612株（特開2008-271927号公報）が挙げられる。また、糖化酵素を生産する微生物は、例えば、糖化酵素をコードする遺伝子を宿主微生物に発現可能に導入することにより取得できる。宿主微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属細
菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。好ましい宿主微生物としては、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）やコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。各種糖化酵素のアミノ酸配列やそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。なお、糖化酵素は、糖化酵素をコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００２３】
糖化酵素を生産する微生物の培養条件は、微生物が生育でき、糖化酵素が生産される限り、特に制限されない。糖化酵素を生産する微生物は、例えば、細菌や糸状菌等の微生物を培養する通常の条件で培養することができる。具体的な培養条件については、例えば、アクレモニウム・セルロリティカス等の、糖化酵素を生産する各種微生物の培養条件を参照することができる。生産された糖化酵素は、例えば、培地等に含まれたまま、あるいは適宜、濃縮、希釈、乾燥、分画、精製、製剤化等の処理に供してから、本発明に用いる糖化酵素として利用できる。
【００２４】
＜３＞本発明において実現される糖化反応
本発明において実現される糖化方法は、セルロース系原料を糖化する方法であって、
（Ａ）第１のセルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する第１の糖化液と、第２のセルロース系原料とを接触させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、前記第２のセルロース系原料を回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）の後に、前記第２のセルロース系原料を酵素糖化し第２の糖化液を得る工程、を含む方法である。
【００２５】
糖化酵素は、一般的に、セルロース等の構造多糖に結合するドメインを有する。よって、第１の糖化液と第２のセルロース系原料とを接触させることにより、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素が第２のセルロース系原料に付着する。次いで、糖化酵素が付着した第２のセルロース系原料を回収し、糖化酵素の基質および糖化酵素源として利用することにより、糖化酵素を効率的に再利用でき、セルロース系原料を効率的に酵素糖化できる。
【００２６】
まず、工程（Ａ）を実施する。すなわち、第１の糖化液と第２のセルロース系原料とを接触させる。
【００２７】
第１の糖化液は、第１のセルロース系原料を糖化酵素により糖化して得られた糖化液である。第１のセルロース系原料を糖化酵素により糖化して第１の糖化液を得る工程を「第１の糖化工程」ともいう。本発明において実現される糖化方法は、工程（Ａ）の前に、第１の糖化工程を含んでいてもよい。第１の糖化液は、遊離の糖化酵素を含有する。具体的には、第１の糖化液は、第１の糖化工程に用いた糖化酵素の少なくとも一部を、遊離の状態で、すなわち上清中に、含有する。第１の糖化液が遊離の糖化酵素を含有することは、第１の糖化液の上清の糖化酵素活性を測定することにより確認できる。糖化酵素活性は、公知の手法により測定することができる。具体的には、例えば、微結晶セルロース（アビ
セル）やキシラン等の多糖を基質として酵素反応を行い、生成する還元糖量を指標として、基質に対応した糖化酵素活性を算出することができる。還元糖量は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法やソモギーネルソン法等の公知の手法により測定することができる。
【００２８】
第１の糖化工程の実施態様は、第１のセルロース系原料が糖化され、第１の糖化液が得られる限り、特に制限されない。糖化は、所望の程度に行うことができる。第１のセルロース系原料の性状は特に制限されない。すなわち、第１のセルロース系原料は、例えば、植物バイオマスの水熱分解処理により得られた固形画分（セルロース画分）等の固形原料であってもよいし、植物バイオマスの水熱分解処理により得られた熱水画分（ヘミセルロース画分）等の非固形原料であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。第１の糖化工程における糖化反応の反応条件は、糖化酵素の種類、第１のセルロース系原料の種類、所望の糖化率等の諸条件に応じて、適宜設定できる。すなわち、反応条件は、例えば、公知のセルラーゼ等の糖化酵素の反応条件を参照して、または予備実験に基づき、適宜設定できる。糖化反応は、水や水性緩衝液等の水性溶媒中で行うことができる。反応温度は、例えば、通常5〜95℃、好ましくは45〜60℃であってよい。ｐＨは、例えば、通常1〜11、好ましくは4〜6.5であってよい。第１のセルロース系原料の使用量は、反応液1 L
当たり、例えば、通常0.1 g乾燥重量〜200 g乾燥重量、好ましくは1 g乾燥重量〜100 g乾燥重量であってよい。糖化酵素の使用量は、第１のセルロース系原料1 g乾燥重量当り、
例えば、通常0.001〜1 g、好ましくは0.001〜0.3 gであってよい。反応時間は、例えば、通常1〜144時間、好ましくは24〜144時間であってよい。糖化反応は、静置で行ってもよ
く、撹拌や振盪しながら行ってもよい。このようにして、第１の糖化液が得られる。
【００２９】
このようにして得られた第１の糖化液と、第２のセルロース系原料とを接触させる。第２のセルロース系原料は、第１の糖化液との接触後に、第１の糖化液から固形分として回収可能なものであれば、特に制限されない。すなわち、第２のセルロース系原料としては、適当な固形原料を用いる。例えば、植物バイオマスを水熱分解処理に供し、固形画分と熱水画分を得た場合は、固形画分を第２のセルロース系原料として利用することができる。第２のセルロース系原料は、第１の糖化液との接触後に、第１の糖化液から固形分として回収可能なものであれば、第１のセルロース系原料と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。第２のセルロース系原料の使用量は、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素の少なくとも一部を吸着し回収できる限り、特に制限されない。第２のセルロース系原料の使用量は、第１の糖化液1 L当たり、例えば、通常0.1 g乾燥重量〜200 g乾燥重量、好まし
くは1 g乾燥重量〜100 g乾燥重量であってよい。接触の態様は、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素の少なくとも一部が第２のセルロース系原料に付着する限り、特に制限されない。例えば、第１の糖化液の入った容器に第２のセルロース系原料を添加してもよく、第２のセルロース系原料の入った容器に第１の糖化液を添加してもよく、第１の糖化液と第２のセルロース系原料とを容器に添加してもよい。第１の糖化液と第２のセルロース系原料は、さらに、振盪や撹拌等の適当な手段により混合してもよい。このようにして、第２のセルロース系原料に糖化酵素が付着する。
【００３０】
工程（Ａ）の後に、工程（Ｂ）を実施する。すなわち、第２のセルロース系原料を第１の糖化液から回収する。第２のセルロース系原料の回収は、適当な固液分離手法により実施できる。例えば、第２のセルロース系原料は、自然沈降、遠心分離、濾過、またはそれらの組み合わせにより、第１の糖化液から回収することができる。回収した第２のセルロース系原料は、適当な媒体を用いて洗浄することができる。洗浄に用いられる媒体としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。このようにして、糖化酵素が付着した第２のセルロース系原料が得られる。また、第２のセルロース系原料を第１の糖化液から回収することにより、第１の糖化液の上清が得られる。
【００３１】
工程（Ｂ）の後に、工程（Ｃ）を実施する。すなわち、回収した第２のセルロース系原
料を酵素糖化し、第２の糖化液を得る。工程（Ｃ）を「第２の糖化工程」ともいう。第２のセルロース系原料は、その全部を工程（Ｃ）に用いてもよく、その一部のみを工程（Ｃ）に用いてもよい。「一部」とは、例えば、回収した第２のセルロース系原料の全量の、５０％ｗ／ｗ以上、７０％ｗ／ｗ以上、または９０％ｗ／ｗ以上であってよい。通常は、第２のセルロース系原料の全部を工程（Ｃ）に用いればよい。工程（Ｃ）において、第２のセルロース系原料は、糖化酵素の基質として用いられ糖化される。また、工程（Ｃ）において、第２のセルロース系原料は、糖化されるだけではなく、糖化酵素源としても利用される。
【００３２】
なお、第１の糖化液は、未糖化のセルロース系原料（「糖化残渣（saccharification residue）」ともいう）を含有し得る。糖化残渣には、第１の糖化工程に用いた糖化酵素の一部が付着している。よって、本発明において実現される糖化方法では、糖化残渣を回収し、第２のセルロース系原料とともに、工程（Ｃ）における酵素糖化に利用するのが好ましい。糖化残渣は、その全部を工程（Ｃ）に用いてもよく、その一部のみを工程（Ｃ）に用いてもよい。「一部」とは、例えば、回収した糖化残渣の全量の、５０％ｗ／ｗ以上、７０％ｗ／ｗ以上、または９０％ｗ／ｗ以上であってよい。通常は、糖化残渣の全部を工程（Ｃ）に用いればよい。工程（Ｃ）において、糖化残渣は、糖化酵素源として利用されてよい。糖化残渣を回収し酵素源として利用することにより、糖化酵素を効率的に再利用できる。また、工程（Ｃ）において、糖化残渣は、糖化酵素の基質として用いられ糖化されてよい。糖化残渣がさらに糖化されることにより、プロセス全体としての糖化率を向上させることができる。糖化残渣は、第１の糖化液から固形分として回収することができる。回収した糖化残渣は、適当な媒体を用いて洗浄することができる。糖化残渣の回収および洗浄は、第２のセルロース系原料の回収および洗浄と同様に実施できる。糖化残渣は、単独で回収されてもよく、第２のセルロース系原料とともに回収されてもよい。例えば、あらかじめ糖化残渣を回収し、糖化残渣回収後の第１の糖化液（上清）と第２のセルロース系原料とを接触させ、第２のセルロース系原料を回収すれば、糖化残渣と第２のセルロース系原料を別個に回収することができる。また、糖化残渣を含有する第１の糖化液と第２のセルロース系原料とを接触させ、糖化残渣と第２のセルロース系原料をまとめて回収することもできる。
【００３３】
工程（Ｃ）においては、第２のセルロース系原料、あるいは、第２のセルロース系原料および糖化残渣のみを酵素源として糖化を行ってもよく、さらに糖化酵素を追加（補充）して糖化を行ってもよい。糖化酵素を追加する場合、糖化酵素を追加するタイミングは特に制限されない。糖化酵素は、例えば、工程（Ｃ）の開始時に追加されていてもよく、工程（Ｃ）の開始後に追加されてもよい。追加される糖化酵素は、第１の糖化工程で用いられた糖化酵素と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。追加される糖化酵素の量は、本発明において実現される糖化方法を用いない場合に通常追加される糖化酵素の量と、同一であってもよく、同一でなくてもよい。「本発明において実現される糖化方法を用いない場合」とは、例えば、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素を再利用しないこと以外は、本発明において実現される糖化方法と同一の条件で糖化を行う場合をいう。追加される糖化酵素の量は、例えば、本発明において実現される糖化方法を用いない場合に通常追加される糖化酵素の量の、９０％ｗ／ｗ以下、７０％ｗ／ｗ以下、または５０％ｗ／ｗ以下の量であってもよい。すなわち、本発明において実現される一態様によれば、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素を再利用することにより、糖化酵素の使用量を削減することができる。また、本発明において実現される一態様によれば、第１の糖化液中の遊離の糖化酵素を再利用することにより、糖化酵素の使用量を削減しない場合にも、糖化反応時間の短縮や糖化率の増大等の効果が得られると期待される。また、追加される糖化酵素の量は、例えば、第１の糖化工程（初回）において用いられた糖化酵素の量の、５０％ｗ／ｗ以下、４０％ｗ／ｗ以下、または３０％ｗ／ｗ以下の量であってもよい。
【００３４】
工程（Ｃ）においては、第２のセルロース系原料、あるいは、第２のセルロース系原料および糖化残渣のみを基質として糖化を行ってもよく、さらにセルロース系原料を追加して糖化を行ってもよい。セルロース系原料を追加する場合、セルロース系原料を追加するタイミングは特に制限されない。セルロース系原料は、例えば、工程（Ｃ）の開始時に追加されていてもよく、工程（Ｃ）の開始後に追加されてもよい。追加されるセルロース系原料の性状は特に制限されない。例えば、植物バイオマスの水熱分解処理により得られた熱水画分（ヘミセルロース画分）等の非固形原料を追加して糖化を行ってもよい。追加されるセルロース系原料は、第１のセルロース系原料と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。追加されるセルロース系原料は、第２のセルロース系原料と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。追加されるセルロース系原料の量は、例えば、第２のセルロース系原料の使用量の、１００％ｗ／ｗ以下、７０％ｗ／ｗ以下、５０％ｗ／ｗ以下、３０％ｗ／ｗ以下、１０％ｗ／ｗ以下であってよい。
【００３５】
工程（Ｃ）の実施態様は、第２のセルロース系原料が糖化され、第２の糖化液が得られる限り、特に制限されない。糖化は、所望の程度に行うことができる。工程（Ｃ）における糖化反応の反応条件は、糖化酵素の種類、第２のセルロース系原料の種類、所望の糖化率等の諸条件に応じて、適宜設定できる。すなわち、反応条件は、例えば、公知のセルラーゼ等の糖化酵素の反応条件を参照して、または予備実験に基づき、適宜設定できる。糖化反応は、水や水性緩衝液等の水性溶媒中で行うことができる。反応温度は、例えば、通常5〜95℃、好ましくは45〜60℃であってよい。ｐＨは、例えば、通常1〜11、好ましくは4〜6.5であってよい。第２のセルロース系原料の使用量（セルロース系原料を追加する場合は、第２のセルロース系原料と追加のセルロース系原料の総量）は、反応液1 L当たり
、例えば、通常0.1 g乾燥重量〜200 g乾燥重量、好ましくは1 g乾燥重量〜100 g乾燥重量であってよい。反応時間は、例えば、通常1〜144時間、好ましくは24〜144時間であって
よい。糖化反応は、静置で行ってもよく、撹拌や振盪しながら行ってもよい。いずれの条件も、工程（Ｃ）と第１の糖化工程とで、同一であってもよく、なくてもよい。このようにして、第２の糖化液が得られる。
【００３６】
さらに、このようにして得られた第２の糖化液を工程（Ａ）における第１の糖化液として用いて、工程（Ａ）〜（Ｃ）を繰り返してもよい。工程（Ａ）〜（Ｃ）を繰り返すことにより、糖化酵素をさらに効率的に再利用できる。繰り返しの回数は特に制限されない。繰り返しの回数は、例えば、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、または７回以上であってよい。
【００３７】
なお、工程（Ａ）〜（Ｃ）を１サイクル実施する間に、各工程は、１回ずつ実施されてもよく、そうでなくてもよい。例えば、第１の糖化工程を２回またはそれ以上実施して得られた２つまたはそれ以上の第１の糖化液を、まとめて、あるいはそれぞれ別個に、工程（Ａ）および（Ｂ）に供し、回収した第２のセルロース系原料をまとめて工程（Ｃ）に用いてもよい。また、例えば、１つの第１の糖化液を工程（Ａ）および（Ｂ）に供し、回収した第２のセルロース系原料を２またはそれ以上に分割して、第２の糖化工程を２回またはそれ以上実施してもよい。また、例えば、１つの第１の糖化液に対して、工程（Ａ）および（Ｂ）を２回またはそれ以上繰り返してもよい。
【００３８】
工程（Ａ）〜（Ｃ）を１回、あるいは２回以上繰り返して、本発明において実現される糖化方法を実施することにより、セルロース系原料の糖化液が得られる。すなわち、本発明において実現される糖化方法の一態様は、工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、セルロース系原料の糖化液を製造する方法であってよい。ここでいう「糖化液」としては、工程（Ｃ）で得られる第２の糖化液、工程（Ｂ）で得られる第１の糖化液の上清、第２のセルロース系原料や糖化残渣を回収する際の洗浄液等の、糖化により生成した成分を含有する任意の画分が挙げられる。糖化により生成した成分としては、グルコース、キシロース、アラビノ
ース等の単糖が挙げられる。例えば、セルロース成分を糖化することにより、グルコースを含有する糖化液が得られる。また、例えば、ヘミセルロース成分を糖化することにより、キシロースやアラビノースを含有する糖化液が得られる。これらの成分は、糖化液から適宜回収することができる。すなわち、本発明において実現される糖化方法の一態様は、工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、セルロース系原料から単糖を製造する方法であってもよい。
【００３９】
＜４＞本発明において実現される糖化方法の利用
本発明において実現される糖化方法を実施することにより得られた糖化液は、例えば、炭素源として微生物の培養に利用することができる。さらに、一態様においては、微生物を培養することにより、所望の目的物質を製造することができる。すなわち、本発明は、例えば、本発明において実現される糖化方法によりセルロース系原料の糖化液を得ること、該糖化液を含有する培地で目的物質の生産能を有する微生物を培養し、目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積させること、および該培地又は菌体より目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法を提供する。
【００４０】
糖化液は、そのまま、あるいは適宜、濃縮、希釈、乾燥、分画、精製等の処理に供してから、炭素源として微生物の培養に利用することができる。例えば、糖化により生成したグルコースやキシロース等の成分を所望の程度に分離精製して炭素源として用いてもよい。
【００４１】
培養される微生物は特に制限されない。微生物としては、酵母等の真核生物、細菌等の原核生物が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母が挙げられる。細菌としては、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア・ア
ナナティス（Pantoea ananatis）等のパントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター
（Enterobacter）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、エルビニア（Erwinia）属細菌、フォトラブダス（Photorhabdus）属細菌、プロビ
デンシア（Providencia）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、モルガネラ（Morganella）属細菌が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム（ブレビバクテリウム・フラバム）（Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum））やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオ
ニス）（Corynebacterium ammoniagenes（Corynebacterium stationis））等のコリネバ
クテリウム属／ブレビバクテリウム属細菌が挙げられる。
【００４２】
微生物を培養することにより目的物質を製造する場合、目的物質の生産能を有する微生物を用いる。目的物質は特に制限されない。目的物質としては、Ｌ−アミノ酸や核酸が挙げられる。本発明においては、１種の目的物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。
【００４３】
Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。
【００４４】
核酸としては、プリン系物質が挙げられる。プリン系物質としては、プリンヌクレオシ
ドおよびプリンヌクレオチドが挙げられる。プリンヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、キサントシン、およびアデノシンが挙げられる。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン−５’−リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン−５’−リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン−５’−リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。
【００４５】
目的物質の生産能を有する微生物は、本来的に目的物質の生産能を有するものであってもよく、目的物質の生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質の生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物に目的物質の生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質の生産能を増強することにより、取得できる。
【００４６】
例えば、Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）
。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素（目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含む）の活性を低下させること、Ｌ−アミノ酸の排出能を増強すること、等の改変によっても行うことができる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性の増強や低下等の改変を受ける酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、酵素活性の増強や低下等の改変とが組み合わされてもよい。
【００４７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００４８】
酵素活性の増強や低下等の改変は、遺伝子工学的手法により行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより行うことができる。また、酵素活性の低下は、例えば、同酵素をコードする遺伝子を破壊することにより行うことができる。
【００４９】
核酸等、その他の目的物質の生産能を有する微生物も、公知の手法を参照して育種することができる。
【００５０】
培養は、上記のようにして得られた糖化液を含有する培地を用いること以外は、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の条件、例えば、細菌等の微生物による目的物質の生産に用いられる通常の条件、で実施することができる。培地組成や培養条件は、使用する微生物の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【００５１】
培養は、例えば、糖化液に加えて、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種
有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する適当な培地を用いて行うことができる。すなわち、糖化液は、唯一炭素源（sole carbon source）として利用されてもよく、他の炭素源と併用されてもよい。他の炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。糖化液と他の炭素源とを併用する場合の、それらの比率は特に制限されない。炭素源以外の成分としては、上述したような窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分が挙げられる。また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００５２】
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、25℃〜40℃であってよい。培養期間は、例えば、12〜200時間であってよい。培養ｐＨは、例えば、4〜9に制御されてよい。ｐＨ調整には、ア
ンモニアガスやアンモニア水、およびその他の適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養
（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせ
により実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて実施してもよい。
【００５３】
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００５４】
生成した目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによって目的物質を回収することができる。目的物質は、所望の程度に精製されてよい。回収される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【００５５】
また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００５６】
本発明において実現される糖化方法の有効性について検証したので、その結果を以下に示す。
【００５７】
＜１＞材料と方法
＜前処理バイオマスの調製＞
前処理方法としては水熱処理、バイオマスとしては稲藁またはバガスを用いた。バガスはカッティングミル（Retsch社製SM100、スクリーン0.75mm）を用いて荒粉砕した。バイ
オマスと精製水を7％(w/v)で混合して1晩浸漬させた後、バッチ式小型水熱処理装置（オ
ーエムラボテック株式会社製070-07013）で水熱処理を行った。水熱処理は、攪拌速度を200rpmで一定とし、200℃で15分行った。水熱処理後の水熱処理スラリーは、濾紙（Advantec 5C）を用いた吸引ろ過で固液分離し、精製水で洗浄した。得られた固形分を水熱処理
バイオマスとした。
【００５８】
＜水熱処理バイオマスの水分含量の測定＞
水熱処理バイオマスの水分含量を次の方法で測定した。水熱処理バイオマスの適量を分取し、105℃で恒量になるまで乾燥し、乾燥後の重量減から、水分含量（％）を算出した
。水熱処理稲藁の水分含量は79.0％、水熱処理バガスの水分含量は78.9％であった。
【００５９】
＜水熱処理バイオマスのグルコース含量の測定＞
水熱処理バイオマスをステンレス製バットに移し実験室雰囲気で風乾後、ウィレーミルにより粉砕し、篩により粒径を約200〜500μmに調整し分析用試料とした。分析用試料の
適量（約0.3g）を天秤でビーカーに秤とり、72％硫酸3mlを加え、30℃でときどき撹拌し
ながら1時間置いた。この反応液を精製水84mlで耐圧瓶に完全に移した後、120℃で1時間
、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱分解した。加熱分解後、分解液と残渣を濾別し、濾液と残渣の洗液を加えて100mlに定容した物を検液とした。検液中のグルコースを、高速液体ク
ロマトグラフィー（GLサイエンス社製 GL-7400 HPLC system蛍光検出器）により定量した。得られた分解液のグルコース濃度、試料分解量、および上記水分含量から、絶乾重量ベースでのグルコース含量を算出した。水熱処理稲藁のグルコース含量は53.9％・dry、水
熱処理バガスのグルコース含量は60.6％・dryであった。
【００６０】
＜糖化酵素＞
糖化酵素としては、novozymes社製のCellic CTec2（ロット番号VCNI0018）またはMeiji
Seika Pharma社製のMeiji Acremonium Cellulase（ロット番号ACCFB-6220）を用いた。
【００６１】
＜糖化液のグルコース濃度の測定＞
糖化液のグルコース濃度は、サクラ精機株式会社製バイオテックアナライザーAS-320にて測定した。
【００６２】
＜糖化反応および糖化率の算出＞
糖化反応は、糖化反応液（組成は各実験による）を50mlチューブに入れ攪拌後、40℃にて10分間湯浴した後、ボックスシェーカーを用いて、50℃にて往復振盪（90rpm、振幅7cm）して実施した。糖化反応後、すみやかに氷上にて冷却し糖化反応を停止した。糖化反応液を2150gにて10分間遠心し、遠心上清と遠心残渣を得た。遠心残渣については、予め冷
却しておいた残渣体積の3倍量の精製水を加え攪拌した。10分後、再度2150gにて10分間遠心し、遠心残渣洗液と洗浄後遠心残渣を得た。先に得た遠心上清と残渣洗液を合わせ、糖化液とした。糖化液のグルコース量から、予め測定しておいた酵素に含有されるグルコース量を除去し糖化グルコース量とした。酵素基質（バイオマス）完全糖化時のグルコース量は、上記絶乾重量ベースでのグルコース含量を用いて求めた。完全糖化時のグルコース量に対する糖化グルコース量から、糖化率を算出した。
【００６３】
＜２＞水熱処理バイオマス糖化における酵素使用量と糖化率
50mlチューブに、酵素基質（バイオマス）として水熱処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）
または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）、クエン酸ナトリウムバッファー0.5M（pH4.75）1ml、酵素（Cellic CTec2またはMeiji Acremonium Cellulase）、精製水7mlを入れ
、50℃にて24時間糖化反応を行った。酵素添加量を適宜変更する事により、水熱処理物の乾燥重量1gあたりの酵素使用量と糖化率を算出した。結果を図1および図2に示す。糖化率90％を得る為に必要な酵素量は、酵素基質として水熱処理稲藁を用いた場合は、Cellic CTec2では水熱処理物乾燥重量1g当たり0.12g、Meiji Acremonium Cellulaseにおいては、
水熱処理物乾燥重量1g当たり0.040gであった（図1）。また、酵素基質が水熱処理バガス
の場合、糖化率90％を得る為に必要な酵素量は、Cellic CTec2では水熱処理物乾燥重量1g当たり0.28g、Meiji Acremonium Cellulaseでは、水熱処理物乾燥重量1g当たり0.091gで
あった（図2）。
【００６４】
＜３＞遠心残渣と水熱処理物添加後遠心残渣を用いた糖化反応
まず、1段目糖化反応を行った。50mlチューブに、酵素基質（バイオマス）として水熱
処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）、クエン酸ナトリウムバッファー0.5M（pH4.75）1ml、酵素（Cellic CTec2またはMeiji Acremonium Cellulase）、精製水7mlを入れ、50℃にて24時間糖化反応を行った。酵素基質として水熱処理稲藁を用いた際は、Cellic CTec2では0.061g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.12g）
、Meiji Acremonium Cellulaseでは、0.020g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.040g）の酵素を使用した。酵素基質が水熱処理バガスの場合は、Cellic CTec2は0.138g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.28g）、Meiji Acremonium Cellulaseは0.046g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.091g）の酵素を使用した。1段目糖化反応後、続けて、以下の条件で2段目糖化
反応を行った。
【００６５】
（2段目糖化反応：遠心残渣を利用した糖化反応の場合）
1段目糖化反応後、すみやかに氷上にて冷却し糖化反応を停止した。糖化液を2150gにて10分間遠心し、遠心残渣を得た。遠心残渣については、予め冷却しておいた残渣体積の3
倍量の精製水を加え、攪拌後、再度2150gにて10分間遠心し、上清を除去し洗浄後遠心残
渣を得た。洗浄後遠心残渣に2段目の酵素基質（バイオマス）として水熱処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）、クエン酸ナトリウムバッ
ファー0.5M（pH4.75）1ml、精製水7mlを入れ攪拌後、50℃にて24時間、2段目糖化反応を
行った。また、糖化時に、酵素を適量補充した条件においても糖化を行った。2段目糖化
反応後、糖化液中のグルコース量を算出した。当該グルコース量から、1段目遠心残渣が
糖化されて生成したグルコース量（別途、2段目の酵素基質を当重量の水に置き換えた条
件で2段目糖化反応を行って算出した）を除き、2段目糖化グルコース量を算出した。
【００６６】
（2段目糖化反応：水熱処理物添加後遠心残渣を利用した糖化反応の場合）
1段目糖化反応後、すみやかに氷上にて冷却し糖化反応を停止した。2段目糖化反応の酵素基質（バイオマス）として、予め冷却しておいた水熱処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）
または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）を添加し、攪拌した。10分後、2150gにて10分間遠心し、水熱処理物添加後遠心残渣を得た。水熱処理物添加後遠心残渣に予め冷却しておいた残渣体積の3倍量の精製水を加え、攪拌後、再度2150gにて10分間遠心し、上清を除去した。洗浄後の水熱処理物添加後遠心残渣に、クエン酸ナトリウムバッファー0.5M（pH4.75）1ml、精製水5ml入れ攪拌後、50℃にて24時間、2段目糖化反応を行った。また、
糖化時に、酵素を適量補充した条件においても糖化を行った。2段目糖化反応後、糖化液
中のグルコース量を算出した。当該グルコース量から、1段目遠心残渣が糖化されて生成
したグルコース量（別途、2段目の酵素基質を当重量の水に置き換えた条件で2段目糖化反応を行って算出した）を除き、2段目糖化グルコース量を算出した。
【００６７】
1段目糖化率と、遠心残渣および水熱処理物添加後遠心残渣のそれぞれを酵素源として
用いた場合の2段目糖化率を表1に示す。
【００６８】
【表１】
2017205018.tif 000003
【００６９】
試験した4条件（酵素基質と酵素の各組み合わせ；計４つ）の全てにおいて、遠心残渣
と水熱処理物添加後遠心残渣ともにセルラーゼ活性を保有していた。また、試験した4条
件の全てにおいて、水熱処理物添加後遠心残渣が遠心残渣より高い糖化率を示した事から、水熱処理物添加後遠心残渣が遠心残渣よりも高いセルラーゼ活性を保有している事が明らかとなった。より高い糖化率を得る為、遠心残渣または水熱処理物添加後遠心残渣に酵素を適量補充した条件にて糖化試験を行い、酵素補充量と糖化率の関係を調べた。結果を図3、図4、図5、図6に示す。
【００７０】
試験した4条件の全てにおいて、水熱処理物添加後遠心残渣が遠心残渣より高い糖化率
を示した。また、任意の糖化率を達成する為に必要な補充酵素量について、水熱処理物添加後遠心残渣は遠心残渣よりも少なくできる事が判り、水熱処理物添加後遠心残渣は遠心残渣よりも酵素削減ができる事が判った。
【００７１】
＜４＞水熱処理物添加後遠心残渣を利用した糖化反応の繰返し
まず、1段目糖化反応を行った。50mlチューブに、酵素基質（バイオマス）として水熱
処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）、クエン酸ナトリウムバッファー0.5M（pH4.75）1ml、酵素（Cellic CTec2またはMeiji Acremonium Cellulase）、精製水7mlを入れ、50℃にて24時間糖化反応を行った。酵素基質が水熱処理稲藁の場合は、Cellic CTec2は0.061g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.12g）、Meiji Acremonium Cellulaseは0.020g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.040g）の酵素を使用した。
酵素基質が水熱処理バガスにおいては、Cellic CTec2は0.138g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.28g）、Meiji Acremonium Cellulaseは0.046g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.091g）の酵素を使用した。1段目糖化反応後、すみやかに氷上にて冷却し、糖化反応を停止した。2段目糖化反応の酵素基質（バイオマス）として、予め冷却しておいた水熱処理稲藁2.38g（乾燥重量0.5g）または水熱処理バガス2.37g（乾燥重量0.5g）を糖化液に直接添加
後、攪拌した。10分後、2150gにて10分間遠心し、水熱処理物添加後遠心残渣と遠心上清
を得た。水熱処理物添加後遠心残渣については、予め冷却しておいた残渣体積の3倍量の
精製水を加え、攪拌後、再度2150gにて10分間遠心し、遠心残渣と残渣洗液を得た。先に
得た遠心上清と残渣洗液を合わせ、1段目糖化液とした。
【００７２】
次に2段目糖化反応を行った。洗浄後の水熱処理物添加後遠心残渣に、クエン酸ナトリ
ウムバッファー0.5M（pH4.75）1ml、酵素、精製水5ml入れ攪拌後、50℃にて24時間、2段
目糖化反応を行った。酵素基質として水熱処理稲藁を用いた場合は、Cellic CTec2は0.015g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.030g）、Meiji Acremonium Cellulaseは0.005g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.010g）の酵素を使用した。酵素基質が水熱処理バガスの場合においては、Cellic CTec2は0.035g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.069g）、Meiji Acremo
nium Cellulaseは、0.011g（水熱処理物乾燥重量1g当たり0.023g）の酵素を使用した。
【００７３】
さらに、2段目の糖化反応と同様の操作を以降6回繰り返す事により、1〜7段目糖化液をそれぞれ取得した。各段数においての、それまでに投入した酵素基質（バイオマス）の累計と、得られた糖化液中のグルコース量の累計から、累計糖化率を算出した。試験した4
条件の糖化率を図7、図8、図9、図10に示す。
【００７４】
試験した4条件のいずれも、1〜7段目全てで、糖化率85％以上を維持していた。なお、2段目以降では、1段目酵素使用量の1/4の酵素使用量で1段目とほぼ同等の糖化率を得た。
これらの事から、水熱処理物添加後遠心残渣を利用した酵素削減法が繰返す事ができる事が示された。なお、水熱処理物添加後遠心残渣を利用しない場合は、図1に示したように
、酵素基質が稲藁水熱物の場合、酵素としてCellic CTec2を水熱処理物乾燥重量1g当たり0.030g使用すると糖化率52％、酵素としてMeiji Acremonium Cellulaseを水熱処理物乾燥重量1g当たり0.010g使用すると糖化率50％となる。また、図2に示したように、酵素基質
が水熱処理バガスの場合、酵素としてCellic CTec2を水熱処理物乾燥重量1g当たり0.069g使用すると糖化率55％、酵素としてMeiji Acremonium Cellulaseを水熱処理物乾燥重量1g当たり0.023gすると糖化率66％となる。いずれも水熱処理物添加後遠心残渣を利用した試験で得た糖化率よりも20％以上低い値となる事からも、水熱処理物添加後遠心残渣の優位性が示された。
【００７５】
＜糖化装置の実施形態＞
以下、本発明の実施形態について説明する。上述した糖化方法は、例えば、以下に示す実施形態の糖化装置によって実現することが可能である。なお、以下に示す糖化装置は、本発明の実施形態を例示したものであり、本発明の技術的範囲を以下の形態に限定するものではない。
【００７６】
図１１は、実施形態に係る糖化装置を示した図の一例である。本実施形態に係る糖化装置１は、セルロース系原料を糖化する装置であり、図１１に示すように、混合タンク（本願でいう「混合手段」の一例である）２、回収装置（本願でいう「回収手段」の一例である）３、残渣糖化タンク（本願でいう「糖化手段」の一例である）４を備える。
【００７７】
混合タンク２は、糖化液（既述した「第１の糖化液」の一例に相当する）とセルロース系原料（既述した「第２のセルロース系原料」の一例に相当する）とを混合するタンクであり、混合タンク２において行われる処理よりも前に行われる上位工程の少なくとも一部を担う糖化タンク１０１においてセルロース系原料（既述した「第１のセルロース系原料」の一例に相当する）を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加えるタンクである。糖化タンク１０１では、前処理タンク１０２において水の追加によりスラリー化されたセルロース系原料に糖化酵素が追加され、酵素糖化が行われる。なお、本実施形態では、セルロース系原料が原料タンク７を経て混合タンク２に流入しているが、セルロース系原料を供給するタイミングを原料タンク７よりも上流側で調整自在であれば、原料タンク７を省略してもよい。また、上位工程とは、何れかの処理よりも前に行われる処理の工程を示す相対的な概念であり、特定の工程を示す概念ではない。
【００７８】
回収装置３は、糖化液からセルロース系原料を回収する装置であり、混合タンク２から移送される糖化液を処理する。回収装置３としては、固体と液体とを分離する各種のものを適用可能であり、例えば、糖化液を加圧濾過して固形のセルロース系原料を糖化液から分離するフィルタープレスを適用可能である。なお、本実施形態では、糖化タンク１０１の糖化液が固液分離を経ることなく回収装置３へ送られているため、回収装置３が糖化液から回収するセルロース系原料には糖化タンク１０１内の糖化残渣が含まれるが、糖化タ
ンク１０１から混合タンク２へ移送される途中で固液分離を更に行えば、回収装置３が回収するセルロース系原料に糖化残渣が含まれないようにすることもできる。
【００７９】
残渣糖化タンク４は、セルロース系原料を酵素糖化するタンクであり、回収装置３が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化する。なお、図１１では、残渣糖化タンク４において糖化酵素が追加（補充）されているが、回収装置３が回収したセルロース系原料に付着している糖化酵素の量や、残渣糖化タンク４において処理するセルロース系原料の量に応じて糖化酵素の追加を適宜省略してもよい。また、図１１では、回収装置３から残渣糖化タンク４へ繋がる移送経路の途中に残渣前処理タンク５が図示されており、残渣前処理タンク５においてセルロース系原料に水を追加してスラリー化する処理が行われているが、セルロース系原料への水の追加を回収装置３の下部、或いは残渣糖化タンク４にて行うことにより、残渣前処理タンク５を省略してもよい。また、図１１の残渣糖化タンク４には二重構造の側壁によって形成されるジャケット部６が図示されており、ジャケット部６に蒸気等を通気することにより残渣糖化タンク４内を加温可能にしているが、このような加温手段の要否は、公知のセルラーゼ等の糖化酵素の反応条件を参照して、または予備実験に基づいて適宜選択できる。
【００８０】
残渣糖化タンク４において得られた糖化液（既述した「第２の糖化液」の一例に相当する）は、後処理装置１０３において糖化残渣が除去された後に糖化液受入タンク１０４へ移送される。なお、糖化液受入タンク１０４には、回収装置３においてセルロース系原料が回収された糖化液も流入する。後処理装置１０３において除去された糖化残渣は、トラック等により系外へ移送される。後処理装置１０３としては、回収装置３と同様、固体と液体とを分離する各種のものを適用可能であり、例えば、糖化液を加圧濾過して固形のセルロース系原料を分離するフィルタープレス等を適用可能である。
【００８１】
ところで、図１１では、タンク間の経路等にポンプが図示されているが、本実施形態は、ポンプを使って移送を行うものに限定されるものではない。例えば、下流側のタンクを上流側のタンクより低い位置に設置すれば、ポンプを省略することもできる。また、図１１では、前処理タンク１０２や糖化タンク１０１、原料タンク７、混合タンク２、回収装置３、残渣前処理タンク５、残渣糖化タンク４、後処理装置１０３等によって直列に形成される一連の系統が１つのみ図示されているが、本実施形態は、このような系統を１つのみを有するものに限定されるものでなく、このような系統が並列に複数設けられていてもよい。また、図１１では、各タンク内に羽根を回転させる回転式の攪拌装置類が図示されているが、タンク内を攪拌する手段はこのような回転式の攪拌装置類に限定されるものでなく、例えば、気泡を発生させるバブラーや振動を発生させる振動子を用いた各種の攪拌装置を適用してもよい。
【００８２】
本実施形態に係る糖化装置１の運転操作は、例えば、ポンプや弁を適宜操作し、次のように行う。すなわち、糖化タンク１０１で糖化液の生成が完了した後、糖化タンク１０１の糖化液を混合タンク２へ移送する。また、原料タンク７から適当な量のセルロース系原料を混合タンク２へ移送する。次に、混合タンク２の糖化液を回収装置３へ移送し、糖化液からセルロース系原料を回収する。回収装置３で回収したセルロース系原料は残渣前処理タンク５へ移送し、セルロース系原料が回収された糖化液は糖化液受入タンク１０４へ移送する。セルロース系原料を残渣前処理タンク５へ移送した後は、残渣前処理タンク５に水を追加し、セルロース系原料をスラリー状にする。次に、残渣前処理タンク５内のスラリーを残渣糖化タンク４へ移送し、糖化酵素を適宜追加して酵素糖化を行い、糖化液を生成する。残渣糖化タンク４で糖化液が生成された後は、残渣糖化タンク４の糖化液を後処理装置１０３へ移送し、糖化残渣を除去する。そして、後処理装置１０３で糖化残渣を除去した糖化液を糖化液受入タンク１０４へ移送する。
【００８３】
本実施形態に係る糖化装置１をこのように運転操作すると、糖化タンク１０１からの糖化液と原料タンク７からのセルロース系原料とが混合タンク２内で接触するため、糖化液中に遊離していた糖化酵素がセルロース系原料に付着する。そして、糖化酵素が付着したセルロース系原料は回収装置３において糖化液から分離回収された後に残渣糖化タンク４へ移送され、酵素糖化する際のセルロース系原料として利用される。よって、残渣糖化タンク４では、回収装置３において糖化液から分離回収されたセルロース系原料が糖化されるだけではなく、糖化酵素源としても利用されることになる。したがって、糖化酵素の効率的な再利用が図られる他、糖化残渣の更なる糖化により、プロセス全体としての糖化率を向上させることができる。
【００８４】
＜糖化装置の第１変形例＞
図１２は、上記実施形態に係る糖化装置１の第１変形例を示した図である。上記実施形態に係る糖化装置１は、上位工程において生成された糖化液にセルロース系原料を加え、遊離の糖化酵素を回収する工程を１回行うものであったが、本第１変形例に係る糖化装置１０は、糖化酵素を回収する工程を２回行う。なお、本第１変形例の説明では、上記実施形態に係る糖化装置１と相違する点を中心に説明し、上記実施形態に係る糖化装置１と同様の部分については同一の符号を付してその説明を省略する。
【００８５】
本第１変形例に係る糖化装置１０は、上述した実施形態に係る糖化装置１と同様の混合タンク２、回収装置３、残渣糖化タンク４を備える他に、図１２に示すように、混合タンク（本願でいう「他の混合手段」の一例である）１２、回収装置（本願でいう「他の回収手段」の一例である）１３、残渣糖化タンク（本願でいう「他の糖化手段」の一例である）１４を備える。
【００８６】
混合タンク１２は、糖化液とセルロース系原料とを混合するタンクであり、混合タンク１２において行われる処理よりも前に行われる上位工程の少なくとも一部を担う残渣糖化タンク４においてセルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加えるタンクである。すなわち、混合タンク１２は、上位工程の少なくとも一部を担う残渣糖化タンク４からの糖化液を受け入れるタンクであるため、混合タンク２の視点から捉えると「第２の糖化液」の一例に相当することになる残渣糖化タンク４の糖化液は、混合タンク１２の視点から捉えると「第１の糖化液」の一例に相当することになる。また、混合タンク２の視点から捉えると「第２のセルロース系原料」の一例に相当することになる残渣糖化タンク４内のセルロース系原料は、混合タンク１２の視点から捉えると「第１のセルロース系原料」の一例に相当することになる。
【００８７】
回収装置１３は、回収装置３と同様、糖化液からセルロース系原料を回収する装置であり、混合タンク１２から移送される糖化液を処理する。
【００８８】
残渣糖化タンク１４は、残渣糖化タンク４と同様、セルロース系原料を酵素糖化するタンクであり、回収装置１３が糖化液から回収したセルロース系原料を酵素糖化する。なお、図１２では、回収装置１３から残渣糖化タンク１４へ繋がる移送経路の途中に残渣前処理タンク１５が図示されているが、上述した実施形態に係る残渣前処理タンク５と同様、残渣前処理タンク１５を省略してもよい。
【００８９】
本第１変形例に係る糖化装置１０であれば、糖化酵素を回収する工程を２回行うことができるため、上記実施形態に係る糖化装置１に比べて糖化酵素を更に効率的に再利用できる。また、糖化酵素の効率的な再利用が図られる他、糖化残渣の更なる糖化により、プロセス全体としての糖化率を向上させることができる。なお、混合タンク１２や回収装置１３、残渣糖化タンク１４を更に組み合わせていけば、糖化酵素を回収する工程を３回、４回、５回、６回、または７回以上繰り返すことも可能である。
【００９０】
＜糖化装置の第２変形例＞
図１３は、上記実施形態に係る糖化装置１の第２変形例を示した図である。上記実施形態に係る糖化装置１では、糖化液とセルロース系原料との混合を混合タンク２で行っていたが、本第２変形例に係る糖化装置２０は、混合タンク２を省略し、糖化液とセルロース系原料との混合を糖化タンク１０１で行っている。なお、本第２変形例の説明では、上記実施形態に係る糖化装置１と相違する点を中心に説明し、上記実施形態に係る糖化装置１と同様の部分については同一の符号を付してその説明を省略する。
【００９１】
すなわち、本第２変形例に係る糖化装置２０では、混合タンク２が省略される代わりに、混合タンク２に接続されていたセルロース系原料の供給経路が糖化タンク１０１に接続されている。そして、糖化タンク１０１は、タンク内で生成した糖化液とセルロース系原料とを混合することにより、糖化液とセルロース系原料とを混合する処理よりも前に行われる上位工程においてセルロース系原料を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する糖化液に、セルロース系原料を加える。よって、本第２変形例に係る糖化装置２０の場合、糖化タンク１０１が本願でいう「混合手段」の一例に相当することになる。また、本第２変形例において、回収装置３は、糖化タンク１０１から移送される糖化液を処理することになる。
【００９２】
このように構成される糖化装置２０であっても、実施形態に係る糖化装置１と同様、糖化タンク１０１の糖化液とセルロース系原料とが混合タンク２内で接触するため、糖化液中に遊離していた糖化酵素がセルロース系原料に付着する。そして、糖化酵素が付着したセルロース系原料は回収装置３において糖化液から分離回収された後に残渣糖化タンク４へ移送され、酵素糖化する際のセルロース系原料として利用される。よって、実施形態に係る糖化装置１と同様、残渣糖化タンク４では、回収装置３において糖化液から分離回収されたセルロース系原料が糖化されるだけではなく、糖化酵素源としても利用されることになる。したがって、糖化酵素の効率的な再利用が図られる他、糖化残渣の更なる糖化により、プロセス全体としての糖化率を向上させることができる。
【００９３】
＜回収装置および後処理装置の変形例＞
図１４は、回収装置３および後処理装置１０３の変形例を示した図である。上記実施形態や各変形例では、回収装置３や後処理装置１０３としてフィルタープレスを例示していたが、回収装置３や後処理装置１０３としては、固体と液体とを分離する各種のものを適用可能であり、例えば、図１４に示す回収装置３’や後処理装置１０３’のように、糖化液が流入する容器を高速回転させて固形のセルロース系原料を遠心分離する遠心分離機を適用することも可能である。フィルタープレスの場合、糖化液を加圧濾過する工程と、糖化液から分離された固形の残渣をフィルターから取り除く工程とを交互に繰り返すことになるため、回収装置３や後処理装置１０３は不可避的にバッチ処理となるが、本変形例の回収装置３’や後処理装置１０３’のように遠心分離機を適用すれば連続的な処理を実現することができるので、プロセス全体の処理効率を向上させることができる。なお、図１４では、図１３に示した第２変形例を更に変形した図が例示されているが、遠心分離機は、上記実施形態や各変形例の何れの回収装置３および後処理装置１０３にも適用できる。
【００９４】
＜前処理タンクおよび糖化タンクの変形例＞
図１５は、前処理タンク１０２および糖化タンク１０１の変形例を示した図である。上記実施形態や各変形例では、酵素糖化をバッチ処理で実現する前処理タンク１０２および糖化タンク１０１を例示していたが、酵素糖化は連続処理によって実現することも可能である。酵素糖化を連続処理するものとしては、例えば、図１５に示す糖化管１０５のように、チューブ状の形態を呈しており、糖化管１０５の入口側から流入した水、セルロース系原料および糖化酵素を、螺旋状の部材１０６を回転させながら糖化管１０５の出口側へ
漸次送り出しながら酵素糖化を連続的に行うものを挙げることができる。本願で開示する糖化装置は、このようにセルロース系原料を連続的に酵素糖化する上位工程から得た糖化液であっても、当該糖化液にセルロース系原料を加えて糖化酵素を回収し、糖化酵素の効率的な再利用やプロセス全体としての糖化率の向上を図ることができる。なお、セルロース系原料を連続的に酵素糖化する糖化管１０５は、前処理タンク１０２や糖化タンク１０１の代わりに適用するものに限定されるものでなく、例えば、残渣糖化タンク４，１４や残渣前処理タンク５，１５の代わりに適用してもよい。
【符号の説明】
【００９５】
１０１・・糖化タンク
１０２・・前処理タンク
１０３，１０３’・・後処理装置
１０４・・糖化液受入タンク
１０５・・糖化管
１０６・・部材
１，１０，２０，２０’・・糖化装置
２，１２・・混合タンク
３，３’，１３・・回収装置
４，１４・・残渣糖化タンク
５，１５・・残渣前処理タンク
６・・ジャケット部
７・・原料タンク
【図１】
2017205018.tif 000004
【図２】
2017205018.tif 000005
【図３】
2017205018.tif 000006
【図４】
2017205018.tif 000007
【図５】
2017205018.tif 000008
【図６】
2017205018.tif 000009
【図７】
2017205018.tif 000010
【図８】
2017205018.tif 000011
【図９】
2017205018.tif 000012
【図１０】
2017205018.tif 000013
【図１１】
2017205018.tif 000014
【図１２】
2017205018.tif 000015
【図１３】
2017205018.tif 000016
【図１４】
2017205018.tif 000017
【図１５】
2017205018.tif 000018