(57)【要約】【課題】コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体の調製方法を提供することである。また、該抗体の調製方法を用いた、コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体を高純度で製造する方法を提供することである。【解決手段】コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程（１）及び工程（２）を行うことを特徴とする抗体の調製方法により上記課題を解決した。（１）該抗体をエンドグリコシダーゼ（１）で処理して、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程（２）工程（１）で得られた「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、
少なくとも以下の工程（１）及び工程（２）を行うことを特徴とする抗体の調製方法。
（１）該抗体をエンドグリコシダーゼ（１）で処理して、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
（２）工程（１）で得られた「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
【請求項２】
コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、
上記工程（１）の前に、以下の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を行う請求項１に記載の抗体の調製方法。
（Ａ）上記抗体をエンドグリコシダーゼ（２）で処理して、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
【請求項３】
上記エンドグリコシダーゼ（１）がエンドグリコシダーゼＭ及びエンドグリコシダーゼＣＣからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は請求項２に記載の抗体の調製方法。
【請求項４】
上記工程（２）において、クロマトグラフィーを用いる請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項５】
更に、上記エンドグリコシダーゼ（２）を工程（Ａ）の後に除去する工程を含む請求項２ないし請求項４の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項６】
上記エンドグリコシダーゼ（２）が固定化したエンドグリコシダーゼである請求項２ないし請求項５の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項７】
上記エンドグリコシダーゼ（２）がエンドグリコシダーゼＳ及びエンドグリコシダーゼＤからなる群から選択される少なくとも１種である請求項２ないし請求項６の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項８】
上記「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」が哺乳動物細胞により産生された抗体である請求項１ないし請求項７の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項９】
上記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１ないし請求項８の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項１０】
上記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項１ないし請求項９の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項１１】
上記抗体がトラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブである請求項１ないし請求項１０の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
【請求項１２】
請求項１ないし請求項１１の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度抗体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項１１の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度な抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
高純度が９９％以上の高純度である請求項１２又は請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、及びＭ３から選択される１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体。
【請求項１６】
上記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
上記抗体がトラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブである請求項１５又は請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が９９％以上の高純度の抗体である請求項１５ないし請求項１７の何れかの請求項に記載の抗体。
【請求項１９】
少なくとも以下の工程（Ｇ１）を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
（Ｇ１）コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び／又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
【請求項２０】
少なくとも以下の工程（Ｇ２）を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
（Ｇ２）「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
【請求項２１】
少なくとも以下の工程（Ｇ３）を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
（Ｇ３）コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＭ３よりなる群から選択される１種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
【請求項２２】
請求項１５ないし請求項１８の何れかの請求項に記載の抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
【請求項２３】
請求項１９ないし請求項２２の何れかの請求項に記載の抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする抗体の品質管理方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の調製方法、該抗体の調製方法を用いた高純度抗体の製造方法、及び均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬として認可されている、エリスロポエチン、インフリキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムバブ等は、いずれもタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質である。特に癌治療に用いられている抗体はイムノグロブリンクラスがＩｇＧである。癌細胞に発現している抗原に上記ＩｇＧが結合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、シグナル伝達の変化等により抗癌活性を発揮する。
【０００３】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインに位置する２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ２９７）には不均一なＮ型糖鎖が付加されている。付加される糖鎖の種類により抗体の活性が変化することが知られている。例えば、α１−６結合フコース（以下、「コアフコース」と呼ぶことがある）が欠落すると、ＦｃγＲＩＩＩａを介するＡＤＣＣ活性が高まることが知られている（非特許文献１）。また、フコース欠損トラスツズマブは、フコースが付加されたトラスツズマブの少なくとも５０倍のＡＤＣＣ活性を有することが報告されており、同様な結果が、リツキシマブや抗ＣＣＲ４抗体（モガムリズマブ）等（非特許文献２）においても報告されている。
【０００４】
現在、抗体医薬の多くはヒト型の糖鎖を付加する哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞等）により製造されている。ＣＨＯ細胞等により産生された抗体の糖鎖は、糖鎖転移酵素により生合成されるため、糖鎖構造や糖鎖付加の量が、同じ細胞株であっても継代が異なることで変化することが知られている。このように、ＣＨＯ細胞等で製造された糖タンパク質は、アミノ酸配列レベルでは均一であっても、糖鎖レベルでは不均一となるとの問題があった。また、ヒト血清中ＩｇＧのＦｃに付加している糖鎖構造とＣＨＯで作成したＦｃの糖鎖構造は種類も存在比も全く異なっていることが報告されていた（非特許文献３）。
【０００５】
抗体のＮ結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖（ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）にマンノースのオリゴマーが結合している糖鎖）；複合型糖鎖（ジアセチルキトビオースにマンノース及びＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸の少なくとも１つが結合した糖鎖）；並びに混合（ｈｙｂｒｉｄ）型糖鎖（ジアセチルキトビオースに高マンノース型と複合型が混成している糖鎖）が存在する。さらにシアル酸（Ｓｉａ）の有無、結合様式の違い、コアフコースの有無、分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の有無等の違いがあり、これらの組み合わせで様々な種類の糖鎖が存在し得る。
したがって、現在市販されている抗体医薬は何れも多数の糖鎖構造を含んでおり、その品質維持が問題となっている。また、バイオシミラーの認可においても糖鎖構造の不均一さに基づき同一成分としての認可が困難となっており、例えば、エリスロポエチンはエポエチンカッパ等の異なる成分名で認可される等の措置が取られている。
【０００６】
抗体に付加された糖鎖の長さとそれが活性や安定性に与える影響が検討されており、糖鎖を短縮化した抗体を用いて、糖鎖の長さがＣＨ２ドメインの構造安定化と活性に影響を与えることが示されている（非特許文献４及び５）。また、医薬品として好ましい糖鎖構造の特性として、例えば、分岐ＧｌｃＮＡｃを含むＮ型糖鎖や、脱コアフコースが知られているが、現在市販されている抗体医薬の多くはこれらの糖鎖を１０％程度しか含んでいない。
【０００７】
このように、抗体における糖鎖構造の機能についての解析結果から、医薬品として好ましい特性を抗体に付与することができる均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。また、医薬品として十分な品質管理を達成するためにも、均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。
【０００８】
また、ＦｃγＲの遺伝子多型がＡＤＣＣ活性に影響を与えることが報告されている。リツキシマブを投与された患者のうち、ＦｃγＲＩＩＩａの１７６番目のアミノ酸がＶ／Ｖホモ接合体である場合、Ｆ／Ｆホモ接合体と比較して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３との結合力が強いことが報告されている（非特許文献６）。
また、ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／１５８Ｖの相同染色体を持つ患者、及び、ＦｃγＲＩＩａの１３１Ｈ／１３１Ｈの相同染色体を持つ患者は、ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｆ遺伝子を持つ患者やＦｃγＲＩＩａの１３１Ｒ遺伝子を持つ患者と比較して、リツキシマブへの反応性が高いことが報告されている（非特許文献７）。
また、抗イディオタイプ抗体によるワクチン療法においても、ＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖ／Ｖ遺伝子型は、Ｖ／Ｆ及びＦ／Ｆ遺伝子型と比較して無増悪生存率が高いことが報告されている（非特許文献８）。
【０００９】
このように、抗体医薬の効果は患者のＦｃγＲの遺伝子多型に依存することが知られているが、ＦｃγＲ遺伝子多型に応じて最適な効果を奏し得る糖鎖構造に関する報告はない。
したがって、好ましい糖鎖構造を解析する上でも、均一の糖鎖構造を有する抗体の製造方法の確立が望まれている。
【００１０】
これまで、抗体への糖鎖付与の制御のための検討が種々行われてきた。例えば、抗体の短縮化がＡｓｎ２９７への糖鎖付加や付加される糖鎖構造に与える影響が調べられている（非特許文献９）。また、抗体を産生させる細胞の種類によって付加される糖鎖が異なることが報告されている（非特許文献１０）。
また、抗体を大量に生産する生産株において、ＧｎＴＩＩＩを共発現させることで分岐ＧｌｃＮＡｃの付加された抗体の割合を高め、共発現させない場合と比較して１０〜２０倍低い濃度で標的細胞を殺傷すること（非特許文献１１）が報告されている。
【００１１】
また、脱コアフコースの方法として、ＦＵＴ８等のα−フコシルトランスフェラーゼをノックアウトする方法が開示されている（非特許文献３）。しかし、この方法はコアフコースのみをコントロールするものであり、糖鎖構造が均一な抗体を取得することはできなかった。
また、抗体の糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）及びその改変体（非特許文献１２及び１３）が報告されている。該エンドグリコシダーゼには糖鎖構造を認識し、特定の構造に対する特異性があることが知られている。例えば、該グリコシダーゼは、ＣＨＯ細胞で産生させた抗体に付加するあらゆる糖鎖構造を持つ糖鎖を認識し切断することはできず、不純物として未切断の糖鎖が付加された抗体が残存するという問題があった。
【００１２】
また、非特許文献１２ではコアフコースを除去するために、ＣＨＯ細胞から製造されたリツキサンをＥｎｄｏＳで加水分解し、さらにウシからのα−フコシダーゼを２０日反応させアクセプターのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−リツキサンを調製しているが、このような煩雑な方法は工業化には適さないという問題があった。
【００１３】
一方で、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリングに関しては、種々の報告が行われている。
非特許文献３には、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（Ｅｎｄｏ−Ｍ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで糖鎖が付加されていないインスリンにフコースが付加されていないＮ−グリカンを結合させたことや、Ｎ−グリコプロテインである単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）を合成したことが記載されている。また、特許文献１には糖タンパク質が有するＮ結合型糖鎖を加水分解により遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼＣＣ（Ｅｎｄｏ−ＣＣ）が記載されている。
【００１４】
しかし、糖タンパク質として抗体を用いる場合には、Ｆｃドメインの内側に糖鎖が位置することから、他の糖タンパク質とは異なりＥｎｄｏ−Ｍ又はＥｎｄｏ−ＣＣによって完全に糖鎖を切断することは難しいと考えられていた。
また、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリング手法としてエンドグリコシダーゼのトランスグリコシレーション反応を利用し、糖タンパク質の糖鎖を還元末端のＧｌｃＮＡｃを残して切断してアクセプタータンパク質を生成させた後、付加する目的糖鎖ドナーを残存ＧｌｃＮＡｃに転移させることにより目的の糖鎖を有する糖タンパク質を製造する方法が報告されている。この方法は、糖鎖ドナーとして均一糖鎖構造を有する糖鎖を用いることにより、任意の均一糖鎖構造を持つ糖タンパク質を合成する方法が開示されている（特許文献２）。
糖鎖リモデリング法を用いて均一糖鎖構造を有する糖タンパク質を合成するために、少なくとも、転移酵素、オキサゾリン誘導体、ドナー基質の３つの技術が必要だと考えられている。
【００１５】
非特許文献１４では、カイコ絹糸腺から産生された抗体を出発原料として糖鎖リモデリング法を用いてコアフコースを有さない均一糖鎖を持つトラスツズマブを調製している。
【００１６】
一方、アクセプタータンパク質として哺乳類動物細胞から生産された抗体を用いる場合には、コアフコースが結合しているＮ−アセチルグルコサミンとコアフコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンが混在している。そのため、目的とする糖鎖のみが付いたコアフコースを有する均一糖鎖構造を持つ抗体の製品としての生産に利用可能な製造方法に関する報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２０１５−８０４５３号公報
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２００７／１３３８５５
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Shinkawa,T.,et al.,J Biol Chem, 278:3466-3473(2003)
【非特許文献２】Niwa,R.,et al.,Cancer Res,64:2127-2133(2004)
【非特許文献３】Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotechnol Bioeng,87:614-622(2004)
【非特許文献４】Mimura,Y.,et al.,Mol Immunol,37:697-706(2000)
【非特許文献５】Krapp,S.,et al.,J Mol Biol,325:979-989(2003)
【非特許文献６】Wu,J.,et al.,J Clin Invest,100(5):1059-1070(1997)
【非特許文献７】Weng,W.K.,et al.,J Clin Oncol,21(21):3940-3947(2003)
【非特許文献８】Weng,W.K.,et al.,J Clin Oncol,22(23):4717-4724(2004)
【非特許文献９】Lund,J.,et al.,Eur J Biochem,267:7246-7257(2000)
【非特許文献１０】Lifely,M.R.,et al.,Glycobiology,5:813-822(1995)
【非特許文献１１】Davies,J.,et al.,Biotechnol Bioeng,74:288-294(2001)
【非特許文献１２】J.J.Goodfellow,et al.,J Am Chem Soc,134:8030-8033(2012)
【非特許文献１３】Collin,M.,et al.,EMBO J,20:3046-3055(2001)
【非特許文献１４】Kurogochi,M.,et al.,PLoS ONE,10:e0132848(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、前記問題点を解決し、コアフコースを有する抗体の調製方法を提供することである。また、該抗体の調製方法を用いた、コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体を高純度で製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定のエンドグリコシダーゼを使用することにより、「コアフコースを有する糖鎖構造を持つ抗体」の含有割合を増加させることができることを見出した。
また、特定のエンドグリコシダーゼ及び転移酵素を使用することによって、コアフコースを有し、かつ均一糖鎖構造を持つ抗体を調製できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程（１）及び工程（２）を行うことを特徴とする抗体の調製方法を提供するものである。
（１）該抗体をエンドグリコシダーゼ（１）で処理して、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
（２）工程（１）で得られた「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
【００２２】
また、本発明は、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、
上記工程（１）の前に、以下の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を行う上記の抗体の調製方法を提供するものである。
（Ａ）上記抗体をエンドグリコシダーゼ（２）で処理して、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
【００２３】
また、本発明は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度抗体の製造方法を提供するものである。
【００２４】
また、本発明は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度な抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質の製造方法である。
【００２５】
また、本発明は、コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、及びＭ３から選択される１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体である。
【００２６】
また、本発明は、少なくとも以下の工程（Ｇ１）を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
（Ｇ１）コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び／又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
【００２７】
また、本発明は、少なくとも以下の工程（Ｇ２）を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
（Ｇ２）「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
【００２８】
また、本発明は、少なくとも以下の工程（Ｇ３）を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
（Ｇ３）コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＭ３よりなる群から選択される１種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
【００２９】
また、本発明は、上記抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
【００３０】
また、本発明は、上記抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする抗体の品質管理方法である。
【００３１】
また、本発明は、上記抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする抗体の製造方法である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、前記問題点や上記課題を解決し、目的とする糖鎖（コアフコースを有する糖鎖）が付加された抗体を調製することができる。更に、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体を調製することができる。
特に、従来から抗体医薬の製造方法で用いられている、哺乳動物細胞から調製した抗体に対して、本発明の効果を発揮させることができる。
【００３３】
また、本発明によれば、酵素処理及び目的の抗体の回収という、簡単なステップにより、効率的かつ低コストで、目的とする糖鎖が付加された抗体を高純度で調製することができる。また、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体も、簡単なステップにより、効率的かつ低コストで高純度に調製することができる。
【００３４】
また、本発明の抗体の調製方法を用いることにより、目的とする糖鎖のみが付加された抗体を高純度に製造することができる、また、目的とする糖鎖のみが付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体も高純度に製造することができる。
【００３５】
また、本発明の抗体は、均一の糖鎖構造を有することにより、医薬品として使用することができる。また、「コアフコースの存在／不存在が糖タンパク質に及ぼす影響」等の検討に、本発明の抗体を利用することができる。
【００３６】
本発明の抗体の品質評価方法や抗体の品質管理方法等を用いることにより、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合が多いほど、抗体の品質が低いと評価することができる。また、該方法を用いて、「コアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】トラスツズマブ及びＥｎｄｏ−Ｍ又はＥｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後のトラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２Ａ】トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとＥｎｄｏ−Ｍ処理を行ったトラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２Ｂ】トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとＥｎｄｏ−ＣＣ処理を行ったトラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図３Ａ】トラスツズマブの糖ペプチド（灰色）とＥｎｄｏ−Ｍ処理後のトラスツズマブの糖ペプチド（黒色）の量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチドのイオン量（ｃｏｕｎｔｓ）である。
【図３Ｂ】トラスツズマブの糖ペプチド（灰色）とＥｎｄｏ−ＣＣ処理後のトラスツズマブの糖ペプチド（黒色）の量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチドのイオン量（ｃｏｕｎｔｓ）。
【図４】トラスツズマブ、Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後のトラスツズマブ及びＦＰＬＣによる分離精製後のトラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図５】Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後のトラスツズマブをＦＰＬＣで分離精製した際のクロマトグラムを示す。縦軸はＵＶ吸収強度、横軸はフラクション番号及び送液量である。両矢印で示した画分を回収した。
【図６】Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後のトラスツズマブ（分離精製前）及びＦＰＬＣによる分離精製後のトラスツズマブのＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図７】トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドと精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後のトラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図８】トラスツズマブの糖ペプチド（灰色）とＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製したトラスツズマブの糖ペプチド（黒色）を混ぜたものの糖ペプチドの量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチドのイオン量（ｃｏｕｎｔｓ）である。
【図９】トラスツズマブ及びトラスツズマブのアクセプターを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１０】トラスツズマブ、トラスツズマブのアクセプター及び糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１１】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ、Ｅｎｄｏ−Ｍで反応系のトラスツズマブ濃度を１μｇ／μＬ又は５μｇ／μＬに設定し、糖鎖加水分解した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ及びＥｎｄｏ−ＣＣで反応系のトラスツズマブ濃度を１μｇ／μＬ又は５μｇ／μＬに設定し、糖鎖加水分解した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１２】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドと糖鎖改変Ａ２トラスツズマブのエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトル：ａ）１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理したものとの混合物、ｂ）５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理したものとの混合物、ｃ）１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理したものとの混合物、ｄ）５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理したものとの混合物を示す。
【図１３】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチド（Ａ２）とエンド酵素処理後（１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理したもの（Ａ２＿ｅｎｄｏＭ１）、５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理したもの（Ａ２＿ｅｎｄｏＭ５）、１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理したもの（Ａ２＿ｅｎｄｏＣＣ１）、５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理したもの（Ａ２＿ｅｎｄｏＣＣ５））の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチドの量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチド量（ｆｍｏｌ）である。
【図１４】トラスツズマブ、トラスツズマブのアクセプター、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ、Ｅｎｄｏ−Ｍによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ及びＦＰＬＣでの分離精製後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１５】Ｅｎｄｏ−Ｍによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブをＦＰＬＣで分離精製した際のクロマトグラムを示す。縦軸はＵＶ吸収強度、横軸はフラクション番号及び送液量である。両矢印で示した画分を回収した。
【図１６】Ｅｎｄｏ−Ｍによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（分離精製前）及びＦＰＬＣによる分離精製後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブのＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図１７】トラスツズマブ、トラスツズマブのアクセプター、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ、Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ及びＦＰＬＣでの分離精製後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１８】Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブをＦＰＬＣで分離精製した際のクロマトグラムを示す。縦軸はＵＶ吸収強度、横軸はフラクション番号及び送液量である。両矢印で示した画分を回収した。
【図１９】Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（分離精製前）及びＦＰＬＣによる分離精製後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブのＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２０Ａ】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとＥｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２０Ｂ】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを混ぜたもののＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２１Ａ】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチド（灰色）とＥｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチド（黒色）の量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチド量（ｆｍｏｌ）である。
【図２１Ｂ】糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチド（灰色）とＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチド（黒色）の量比を示す。縦軸は抗体１００ｎｇ中の糖ペプチド量（ｆｍｏｌ）である。
【図２２】各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％、トラスツズマブ−Ｆ９７．１％、トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ０％、トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％及びトラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％）とＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８との結合試験の結果を示す。縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度、横軸はトラスツズマブ濃度である。
【図２３】各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ０％、トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％及びトラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％）のＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８結合試験のセンサーグラムを示す。
【図２４】トラスツズマブ、トラスツズマブのアクセプター、糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ、Ｅｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解後の糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ及びＦＰＬＣでの分離精製後の糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２５】トラスツズマブ、トラスツズマブのアクセプター、ＦＰＬＣでの分離精製後の各種糖鎖改変トラスツズマブ（糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ、糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ、糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブ、糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブ、糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブ及び糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２６】トラスツズマブ、ＰＮＧａｓｅ処理後のトラスツズマブ及びトラスツズマブのアクセプターを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２７】各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ０％、トラスツズマブ−Ｆ８４．２％、トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％及びトラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎ）とＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８との結合試験の結果を示す。縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度、横軸はトラスツズマブ濃度である。
【図２８】各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％、トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％及びトラスツズマブ  アクセプター）のＡＤＣＣ活性測定の結果を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性による発光量、横軸はトラスツズマブ濃度である。
【図２９】複合型糖鎖（複合型糖鎖の具体的な構造）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものでなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００３９】
＜抗体の調製方法＞
本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程（１）及び工程（２）を行うことを特徴とする抗体の調製方法である。
（１）該抗体をエンドグリコシダーゼ（１）で処理して、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
（２）工程（１）で得られた「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
【００４０】
本明細書中において、「コアフコース」とは、「糖鎖の還元末端に存在するα１−６結合フコース」を指す。
【００４１】
「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」とは、以下の抗体を指す。
（ｉ）「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
（ii）「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」を含有する抗体
（iii）「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
（iv）「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
（ｖ）「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」、「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
【００４２】
出発物質である「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物細胞により産生された抗体等が挙げられる。限定はされないが、原料抗体の調製しやすさ等の観点から、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を用いることが好ましい。
【００４３】
抗体は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類に分類されるが、上記抗体は何れの種類の抗体であってもよい。本発明で使用する抗体はＩｇＧ抗体であることが好ましい。
【００４４】
上記抗体の例として、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が、好ましいものとして挙げられる。
「非ヒト抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された抗体のことである。
「キメラ抗体」とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体のことである。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト由来の抗体のＣＤＲへ移植したものである。
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。
これらの抗体は公知の方法により作製することができる。
また、上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗体は、抗体の定常領域の一部又は全部を構成するＦｃ断片であってもよい。
【００４５】
上記抗体は抗体医薬であることが好ましく、特に、トラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブであることが好ましい。
【００４６】
＜＜工程（１）＞＞
工程（１）は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ（１）で処理して、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程である。
【００４７】
ここで、「エンドグリコシダーゼ（１）」とは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、「『フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミン』に結合している糖鎖」を加水分解する酵素である。すなわち、「エンドグリコシダーゼ（１）」とは、特定の糖鎖の構造を認識して、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。
エンドグリコシダーゼ（１）としては、例えば、エンドグリコシダーゼＭ（Ｅｎｄｏ−Ｍ）、エンドグリコシダーゼＣＣ（Ｅｎｄｏ−ＣＣ）等が挙げられる。
【００４８】
エンドグリコシダーゼＭについては、例えば、Kadowaki,S.,et al.,Agric Biol Chem,54:97-106(1990)に開示されている。エンドグリコシダーゼＣＣについては、例えば、特許文献１に開示されている。
エンドグリコシダーゼ（１）は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４９】
＜＜工程（２）＞＞
工程（２）は、上記工程（１）で得られた、「フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程である。工程（２）により上記抗体を除去することによって、コアフコースを有する糖鎖の含有割合が増加した抗体を得ることができる。
【００５０】
工程（２）では、上記工程（１）で得られた加水分解処理物をクロマトグラフィーに供することにより、「『フコースが結合していないＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖』が加水分解された抗体」を除去することが好ましい。
【００５１】
上記クロマトグラフィーの例として、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等が挙げられる。効率よく目的の抗体を除去することができる点で、イオン交換クロマトグラフィーを用いることが好ましい。
【００５２】
＜糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法＞
また、本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、上記工程（１）の前に、以下の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を行う抗体の調製方法であることが好ましい。
（Ａ）上記抗体をエンドグリコシダーゼ（２）で処理して、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
すなわち、工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（１）、工程（２）の順で行うことが好ましい。
【００５３】
本明細書において、「糖鎖部分を均一にする」とは、「抗体に結合している糖鎖構造を同一にする」ことを言う。
均一の糖鎖構造を持つ抗体には糖鎖結合部位が２箇所あり、（１）両方に糖鎖が結合したｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型、（２）片方に糖鎖が結合したｈｅｍｉ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型、及び（３）糖鎖が結合していないａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型が存在する(Wang,S,et al.,J Crom A,1217:6496-6502(2010))が、本発明では（１）の抗体の調製方法を示す。
【００５４】
＜＜工程（Ａ）＞＞
工程（Ａ）は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ（２）で処理して、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程である。
【００５５】
ここで、「エンドグリコシダーゼ（２）」とは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解し、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。
エンドグリコシダーゼ（２）としては、例えば、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ−Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ（Ｅｎｄｏ−Ｄ）等が挙げられる。
【００５６】
エンドグリコシダーゼＳについては、例えば、非特許文献１２や、W.Huang,et al.,J Am Chem Soc,134:12308-12318(2012)に開示されている。
エンドグリコシダーゼＤについては、例えば、Muramatsu,T.,J Biol Chem,246: 5535-5537(1971)に開示されている。
【００５７】
エンドグリコシダーゼ（２）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。エンドグリコシダーゼ（２）は、効率よくＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する点等で、Ｅｎｄｏ−Ｓ及びＥｎｄｏ−Ｄを組み合わせて使用することが好ましい。
【００５８】
エンドグリコシダーゼ（２）は、後述する工程（Ｂ）（均一な糖鎖を付加させる工程）において付加させた糖鎖が、残存するエンドグリコシダーゼ（２）によって加水分解を受けることを防止するために、工程（Ａ）の後に除去することが好ましい。
エンドグリコシダーゼ（２）の除去方法は、特に限定されないが、例えば、実施例のように、エンドグリコシダーゼ（２）を固定化することが好ましい。工程（Ａ）の後に濾過フィルターを用いて固定化酵素を分離することにより、固定化したエンドグリコシダーゼ（２）を除去することができる。
【００５９】
＜＜工程（Ｂ）＞＞
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた、上記「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程である。
【００６０】
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で得られた、上記「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に均一な糖鎖を付加させることができる。
【００６１】
例えば、上記「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」をアクセプターとして、均一な糖鎖をドナーとして、両者を、転移酵素を用いて反応させることにより、均一な（同一の）糖鎖を付加させることができる。
例えば、均一な糖鎖に対してオキサゾリンを結合させて得られた誘導体（糖鎖−オキサゾリン）等を糖鎖ドナーとして用いることができる。
【００６２】
工程（Ｂ）で、抗体に付加される均一な糖鎖の構造は、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、均一な糖鎖の構造の例として、Ｍ２型糖鎖（ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）に、２個のマンノースが結合している糖鎖）、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖等が挙げられる。
【００６３】
「高マンノース型糖鎖」とは、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃに、マンノースのオリゴマーが結合している糖鎖のことである。高マンノース型糖鎖の例として、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のマンノースよりなるマンノースオリゴマーが、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃに結合している、Ｍ３型、Ｍ４型、Ｍ５型、Ｍ６型、Ｍ７型、Ｍ８型、Ｍ９型等が挙げられる。
「複合型糖鎖」とは、ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）に、マンノース、及びＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸の少なくとも１つが結合した糖鎖のことである。
複合型糖鎖の例として、Ａ２型、Ｇ２型、Ｇ０型、Ｇ１ａ型、Ｇ１ｂ型等が挙げられる。複合型糖鎖の具体的な構造を図２７２９に示す。
【００６４】
工程（Ｂ）で用いる転移酵素は、上記「Ｎ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、上記均一な糖鎖を付加する作用を有する酵素であればよい。
転移酵素の例として、実施例で用いられたＥｎｄｏ−Ｓの変異型酵素（Ｅｎｄｏ−Ｓ  Ｄ２３３Ｑ）等の糖転移酵素（グライコシンターゼ）等が挙げられる。
【００６５】
本発明の抗体の調製方法によって得られる抗体は、コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、及びＭ３から選択される１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ抗体であることが好ましい。
【００６６】
＜高純度抗体の製造方法＞
本発明の高純度抗体の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
【００６７】
本発明において「高純度抗体」とは、抗体全体を１００％としたときに、２箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が９０％以上の抗体を指す。該同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が、９２％以上が好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００６８】
本発明によって得られた高純度抗体は、製薬学的に許容し得る担体と共に、公知の方法で製剤化することが可能である。製剤化された抗体の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用等の何れでもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
【００６９】
＜高純度な抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質の製造方法＞
本発明の高純度な抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
【００７０】
本発明において「高純度な抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質」とは、高純度な「『抗体のＦｃドメイン』を有する糖タンパク質」の意味であり、「抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質」全体を１００％としたときに、抗体のＦｃドメイン中の２箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する糖タンパク質の割合が９０％以上の糖タンパク質を指す。
【００７１】
該「同一の糖鎖構造を有する抗体のＦｃドメインを有する糖タンパク質」の割合が、９２％以上が好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００７２】
＜抗体＞
本発明の別の形態は、コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、及びＭ３から選択される１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体である。
【００７３】
上記本発明における上記抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることが好ましい。
また、本発明の抗体は抗体医薬であることが好ましく、特に、トラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブであることが好ましい。
また、本発明の抗体は、高純度の抗体である。「高純度の抗体」とは、抗体全体を１００％としたときに、２箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が９０％以上の抗体を指す。該同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が、９２％以上が好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００７４】
＜抗体の品質評価方法＞
本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程（Ｇ１）を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
（Ｇ１）コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び／又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
【００７５】
また、本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程（Ｇ２）を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
（Ｇ２）「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
【００７６】
また、本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程（Ｇ３）を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
（Ｇ３）コアフコースを有するＡ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＭ３よりなる群から選択される１種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
【００７７】
また、本発明の抗体の品質評価方法は、本発明の抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
【００７８】
上記抗体の品質評価方法は、必要に応じて、その他の工程を含んでいてもよい。
【００７９】
＜抗体の品質管理方法＞
本発明の抗体の品質管理方法は、上記抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする。
【００８０】
本発明の品質管理方法は、必要に応じて上記抗体の品質評価方法に加えて、別の方法を用いる、及び／又は他の工程を含んでいてもよい。
【００８１】
＜抗体の製造方法＞
本発明の抗体の製造方法は、上記抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする。
【００８２】
本発明の抗体の製造方法により、「コアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を製造することができる。
【００８３】
本発明によって得られた抗体は、製薬学的に許容し得る担体と共に、公知の方法で製剤化することが可能である。製剤化された抗体の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用等の何れでもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
【実施例】
【００８４】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
＜実施例１＞トラスツズマブのＥｎｄｏ−Ｍ又はＥｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解
チャイニーズハムスター卵巣細胞から産生された抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体、トラスツズマブ（中外製薬社、製品名ハーセプチン）１５０ｍｇを滅菌水１５ｍＬに溶解した。アミコンウルトラ−１５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながら５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換し、トラスツズマブを調製した。
上述のトラスツズマブ（５０μｇ）とＥｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業社、１．５μｇ）、又はＥｎｄｏ−ＣＣ（１．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量５０μＬとして３７℃で６０時間静置した。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに反応後の抗体０．５μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された（図１）。
【００８６】
＜実施例２＞エンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ）によって糖鎖切断されたトラスツズマブの糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ解析
トラスツズマブ（１０μｇ）及びエンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ）によって糖鎖加水分解が施されたトラスツズマブ（１０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、８０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ、３μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させた。反応溶液を９０℃で３０分間加熱することにより酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ、３ｍＬ）で脱塩し、濃縮した。これらに、それぞれ水（１０μＬ）とピリジン（５μＬ）を加え、エンド酵素によって処理が施されたトラスツズマブの方には２００ｍＭ軽水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には２００ｍＭ重水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（１０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。
【００８７】
その後、水（２００μＬ）を加え、エタノール（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＣ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料を水に溶かし、トラスツズマブ由来の重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行ったトラスツズマブ由来の軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で１：１に混ぜ合わせ、２００ｎｇ分をＺｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８  １．０×１５０ｍｍ  カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行った。
【００８８】
標識されたペプチド鎖（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）に糖鎖が結合した糖ペプチドの［ｍ−２Ｈ］２−イオンを検出して、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを比較した（図２Ａ及び図２Ｂ）。複合型ＧＮ１、ＧＮ１Ｆ、ＧＮ２、Ｇ１ＧＮ１Ｆ、ＧＮ２Ｆ、Ｇ１ＧＮ２、Ｇ１ＧＮ２Ｆ、Ｇ２ＧＮ２、Ｇ２ＧＮ２Ｆの糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１１９３．３（Ｈ）／１１９５．８（Ｄ）、１２６６．３（Ｈ）／１２６８．８（Ｄ）、１２９４．８（Ｈ）／１２９７．３（Ｄ）、１３４７．３（Ｈ）／１３４９．８（Ｄ）、１３４７．３（Ｈ）／１３４９．８（Ｄ）、１３６７．８（Ｈ）／１３７０．３（Ｄ）、１３７５．８（Ｈ）／１３７８．３（Ｄ）、１４４８．８（Ｈ）／１４５１．３（Ｄ）、１４５６．８（Ｈ）／１４５９．３（Ｄ）、１５２９．８（Ｈ）／１５３２．８（Ｄ）とハイマンノ−ス型Ｍ５の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１２５３．２（Ｈ）／１２５５．７（Ｄ）及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）ｍ／ｚ＝７４６．７（Ｈ）／７４９．２（Ｄ）とＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）ｍ／ｚ＝８１９．８（Ｈ）／８２２．３（Ｄ）をモニタリングした。これらのイオン量を比較して棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とフコース含有糖鎖割合を算出した（図３Ａ及び図３Ｂ）。
その結果、トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は８４．２％であった。Ｅｎｄｏ−Ｍ処理後のトラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が８６．７％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９８．６％であった。Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理後のトラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が７２．３％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９８．９％であった。このことから、Ｅｎｄｏ−Ｍが抗体のコアフコースなしの糖鎖を選択的に、Ｅｎｄｏ−ＣＣが抗体のコアフコースなしの糖鎖を優先的に切断できることがわかった。
【００８９】
＜実施例３＞トラスツズマブのＥｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解
トラスツズマブ（１．２ｍｇ）とＥｎｄｏ−ＣＣ（１２μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１．２ｍＬとして３７℃で６０時間静置した。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに反応後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された（図４）。
【００９０】
＜実施例４＞トラスツズマブＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体の分離精製とＨＰＬＣ分析
実施例３で調製したＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後のトラスツズマブ（５００μｇ）を４℃条件下で設置したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、４．６×１００ｍｍ）を使用して、流速１．３５ｍＬ／分で２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した（図５）。図５の両矢印で示した画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１０ｋＤａ、メルクミリポア社）の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。
【００９１】
分離精製の確認は、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社）を用いたＰｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４．０×２５０ｍｍ）と２８０ｎｍのＵＶ検出を使用して、流速１．０ｍＬ／分で１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１０００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるグラジェント溶出により行った。その結果、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型のトラスツズマブが分離精製できていることを確認した（図６）。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型のトラスツズマブを分離精製できたことが認められた（図４）。
【００９２】
＜実施例５＞Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製したトラスツズマブの糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ解析
トラスツズマブ（１０μｇ）及びＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製トラスツズマブ（１０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、８０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ、３μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させた。反応溶液を９０℃３０分間、加熱することにより酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ、３ｍＬ）で脱塩し、濃縮した。
【００９３】
これらに、それぞれ水（１０μＬ）とピリジン（５μＬ）を加え、Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製トラスツズマブの方には２００ｍＭ軽水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には２００ｍＭ重水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（１０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。
【００９４】
その後、水（２００μＬ）を加え、エタノール（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。
この試料を水に溶かし、トラスツズマブ由来の重水素標識された糖ペプチドとＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製したトラスツズマブ由来の軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で１：１に混ぜ合わせ、２００ｎｇ分をＺｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８  １．０×１５０ｍｍ  カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行った。
【００９５】
標識されたペプチド鎖（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）に糖鎖が結合した糖ペプチドの［ｍ−２Ｈ］２−イオンを検出して、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを比較した（図７）。複合型ＧＮ１、ＧＮ１Ｆ、ＧＮ２、Ｇ１ＧＮ１Ｆ、ＧＮ２Ｆ、Ｇ１ＧＮ２、Ｇ１ＧＮ２Ｆ、Ｇ２ＧＮ２、Ｇ２ＧＮ２Ｆの糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１１９３．３（Ｈ）／１１９５．８（Ｄ）、１２６６．３（Ｈ）／１２６８．８（Ｄ）、１２９４．８（Ｈ）／１２９７．３（Ｄ）、１３４７．３（Ｈ）／１３４９．８（Ｄ）、１３４７．３（Ｈ）／１３４９．８（Ｄ）、１３６７．８（Ｈ）／１３７０．３（Ｄ）、１３７５．８（Ｈ）／１３７８．３（Ｄ）、１４４８．８（Ｈ）／１４５１．３（Ｄ）、１４５６．８（Ｈ）／１４５９．３（Ｄ）、１５２９．８（Ｈ）／１５３２．８（Ｄ）とハイマンノース型Ｍ５の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１２５３．２（Ｈ）／１２５５．７（Ｄ）及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）ｍ／ｚ＝７４６．７（Ｈ）／７４９．２（Ｄ）とＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）ｍ／ｚ＝８１９．８（Ｈ）／８２２．３（Ｄ）をモニタリングした。これらの強度比を比較して棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した（図８）。
その結果、Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９７．１％であった。このことにより、精製過程で２つの重鎖の両方に糖鎖が付いているｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の抗体が分離できていることも示された。また、コアフコースを高純度（９７％以上）で含むトラスツズマブを調製できた。
【００９６】
＜実施例６＞固定化ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓの調製
ＧＳＴ融合Ｅｎｄｏ−Ｓ（ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓ）は、W.Huang,et al.,J Am Chem Soc,134:12308-12318(2012)を参考に大腸菌で発現及び精製した。固定化ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓは、１００μＬのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及び上述の１００μｇの精製したＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓを０．１５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液及び０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液存在化で混合し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び１Ｍ塩化ナトリウム水溶液の混合液で洗浄し、最後にＰＢＳに懸濁して調製した。
【００９７】
＜実施例７＞トラスツズマブのアクセプターの調製
調製したトラスツズマブ（１０ｍｇ）と実施例６で調製した固定化ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓをウェットボリュームで２４μＬ及びＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ（ＮＥＢ社、２５ユニット）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量１２５０μＬとして３７℃で２０時間回転振盪した。反応後、固定化ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓを含んだ反応液をＭｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｅｍｐｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に通し、固定化酵素を除去した。得られた濾液に２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＯＳＭＯＧＥＬ  ＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク社）をウェットボリュームで４０μＬ及びＣｈｉｔｉｎ  Ｒｅｓｉｎ（ＮＥＢ社）をウェットボリュームで１００μＬ加え、室温で１時間回転振盪した。このゲル担体を除いた液にＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで２８０μＬ加え、４℃で１４時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。
【００９８】
ゲル担体は４ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、５分間の洗浄作業を計３回、４ｍＬのＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭＥＤＴＡ）でのリンスを計２回、４ｍＬのＰＢＳでのリンスを１回行った。洗浄した担体に７００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２３．３μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
【００９９】
その結果、８．３ｍｇのトラスツズマブのアクセプターが得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしているトラスツズマブが確認された（図９）。
【０１００】
＜実施例８＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの調製
実施例７で調製したトラスツズマブのアクセプター（５ｍｇ）、糖供与体としてＡ２オキサゾリン（４．６８７５μｍｏｌ）、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓ  Ｄ２３３Ｑ（５００μｇ）を糖転移酵素として、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量１．２５ｍＬとして３７℃で１時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したＣＯＳＭＯＧＥＬ  ＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク社）をウェットボリュームで４００μＬ加えて室温で３０分回転振盪を行いＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑを吸着させた。
【０１０１】
このゲル担体を除いた液に同じく５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで２００μＬ加えて室温で１時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は４ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。
洗浄した担体に５００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１６．７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
【０１０２】
その結果、４．１ｍｇの糖鎖改変抗体が得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖受容体の転移により重鎖が高分子側にシフトしたことが確認された（図１０）。
【０１０３】
＜実施例９＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−Ｍによる加水分解
実施例８で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブをトラスツズマブ濃度１μｇ／μＬ又は５μｇ／μＬにしてＥｎｄｏ−Ｍによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度１μｇ／μＬでは、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（５０μｇ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業社、１．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量５０μＬとして３７℃で４８時間静置した。トラスツズマブ濃度５μｇ／μＬでは、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（５０μｇ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業社、１．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１０μＬとして３７℃で４８時間静置した。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにＥｎｄｏ−Ｍ加水分解後糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された（図１１）。
【０１０４】
＜実施例１０＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−ＣＣによる加水分解
実施例８で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブをトラスツズマブ濃度１μｇ／μＬ又は５μｇ／μＬにしてＥｎｄｏ−ＣＣによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度１μｇ／μＬでは、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（５０μｇ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（１．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量５０μＬとして３７℃で４８時間静置した。トラスツズマブ濃度５μｇ／μＬでは、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（５０μｇ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（１．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１０μＬとして３７℃で４８時間静置した。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された（図１１）。
【０１０５】
＜実施例１１＞エンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ  １μｇ／μＬ、５μｇ／μＬ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  １μｇ／μＬ、５μｇ／μＬ）によって糖鎖切断された糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ解析
糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（１０μｇ）及びエンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ  １μｇ／μＬ、５μｇ／μＬ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ  １μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ）によって糖鎖切断処理が施されたトラスツズマブ（１０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、８０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ、３μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させた。反応溶液を９０℃で３０分間加熱することにより酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ、３ｍＬ）で脱塩し、濃縮した。
【０１０６】
これらに、それぞれ水（１０μＬ）とピリジン（５μＬ）を加え、エンド酵素によって処理が施されたトラスツズマブの方には２００ｍＭ軽水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には２００ｍＭ重水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（１０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。
【０１０７】
その後、水（２００μＬ）を加え、エタノール（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。
この試料を水に溶かし、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で１：１に混ぜ合わせ、２００ｎｇ分をＺｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８  １．０×１５０ｍｍ  カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行った。
【０１０８】
標識されたペプチド鎖（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）に糖鎖が結合した糖ペプチドの［ｍ−２Ｈ］２−イオンを検出して、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを比較した（図１２）。
糖鎖改変されたＡ２Ｆ、Ａ２の糖鎖が結合した糖ペプチドｍ／ｚ＝１８２１．１（Ｈ）／１８２３．６（Ｄ）、１７４７．８（Ｈ）／１７５０．３（Ｄ）及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）ｍ／ｚ＝７４６．７（Ｈ）／７４９．２（Ｄ）とＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）ｍ／ｚ＝８１９．８（Ｈ）／８２２．３（Ｄ）をモニタリングした。
シアル酸を含むＡ２、Ａ２Ｆ糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと糖鎖が切断された中性ペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ）のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することによって、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した（図１３）。
【０１０９】
その結果、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖が９７．７％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は８２．３％であった。抗体濃度が１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が９６．６％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は８５．３％であった。抗体濃度が５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−Ｍで処理した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が９３．５％付加しており、そのうちコアフコ−スが結合している糖鎖は８７．８％であった。
【０１１０】
抗体濃度が１μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が８６．０％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９６．６％であった。抗体濃度が５μｇ／μＬでＥｎｄｏ−ＣＣで処理した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ以外）が３８．６％付加しており、そのうちコアフコ−スが結合している糖鎖は８４．３％であった。
このことから、Ｅｎｄｏ−Ｍは、抗体の糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無を見分けて、コアフコースのない糖鎖だけを切断できる。一方、Ｅｎｄｏ−ＣＣは、糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無に関わらず、糖鎖を切断出来るが、基質濃度を変えることによって、コアフコースなしの糖鎖の切断を優位にする制御ができることがわかった。
【０１１１】
＜実施例１２＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−Ｍによる加水分解
実施例８で調製した糖鎖改変トラスツズマブ（２ｍｇ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業社、２０μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１３３．３μＬとして３７℃で７２時間静置した。反応途中１２時間おきに２０μｇのＥｎｄｏ−Ｍを５回添加した。７２時間後この反応液にＰＢＳを１．２ｍＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで８０μＬ加えて４℃で１４時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は１．８ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に２００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を６．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
その結果、１．８ｍｇのＥｎｄｏ−Ｍ加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された（図１４）。
【０１１２】
＜実施例１３＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブＥｎｄｏ−Ｍ糖鎖加水分解体の分離精製とＨＰＬＣ分析
実施例１２で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブのＥｎｄｏ−Ｍ糖鎖加水分解体（５００μｇ）を４℃条件下で設置したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、４．６×１００ｍｍ）を使用して、流速１．３５ｍＬ／分で２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した（図１５）。図１５の両矢印で示した画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１０ｋＤａ、メルクミリポア社）の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社）を用いたＰｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４．０×２５０ｍｍ）と２８０ｎｍのＵＶ検出を使用して、流速１．０ｍＬ／分で１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１０００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブが分離精製できていることを確認した（図１６）。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを分離精製できたことが認められた（図１４）。
【０１１３】
＜実施例１４＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−ＣＣによる加水分解
実施例８で調製した糖鎖改変トラスツズマブ（１ｍｇ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（３０μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１ｍＬとして３７℃で４８時間静置した。４８時間後この反応液にＰＢＳを４００μＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで４０μＬ加えて４℃で１４時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は１ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に１００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３．３３μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
その結果、９００μｇのＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された（図１７）。
【０１１４】
＜実施例１５＞糖鎖改変Ａ２トラスツズマブＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体の分離精製とＨＰＬＣ分析
実施例１４で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブのＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体（５００μｇ）を４℃条件下で設置したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、４．６×１００ｍｍ）を使用して、流速１．３５ｍＬ／分で２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した（図１８）。図１８の両矢印で示した画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１０ｋＤａ、メルクミリポア社）の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社）を用いたＰｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４．０×２５０ｍｍ）と２８０ｎｍのＵＶ検出を使用して、流速１．０ｍＬ／分で１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）と１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１０００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブが分離精製できていることを確認した（図１９）。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブを分離精製できたことが認められた（図１７）。
【０１１５】
＜実施例１６＞Ｅｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ及びＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ解析
糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（１０μｇ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（１０μｇ）及びＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（１０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、８０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ、３μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させた。反応溶液を９０℃で３０分間加熱することにより酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ、３ｍＬ）で脱塩し、濃縮した。
【０１１６】
これらに、それぞれ水（１０μＬ）とピリジン（５μＬ）を加え、エンド酵素によって処理が施された糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ由来糖ペプチドには２００ｍＭ軽水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの糖ペプチドには２００ｍＭ重水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（１０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。
その後、水（２００μＬ）を加え、エタノール（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。
【０１１７】
この試料を水に溶かし、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で１：１に混ぜ合わせ、２００ｎｇ分をＺｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８  １．０×１５０ｍｍ  カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行った。
【０１１８】
標識されたペプチド鎖（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）に糖鎖が結合した糖ペプチドの［ｍ−２Ｈ］２−イオンを検出して、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った糖鎖改変Ａ２トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを比較した（Ｅｎｄｏ−Ｍ処理：図２０Ａ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理：図２０Ｂ）。
【０１１９】
糖鎖改変されたＡ２Ｆ、Ａ２の糖鎖が結合した糖ペプチドｍ／ｚ＝１８２１．１（Ｈ）／１８２３．６（Ｄ）、１７４７．８（Ｈ）／１７５０．３（Ｄ）及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）ｍ／ｚ＝７４６．７（Ｈ）／７４９．２（Ｄ）とＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）ｍ／ｚ＝８１９．８（Ｈ）／８２２．３（Ｄ）をモニタリングした。
シアル酸を含むＡ２、Ａ２Ｆ糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと、糖鎖が切断された中性ペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ、ｐｅｐ＋ＧｎＦ）のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とフコース含有糖鎖割合を算出した（Ｅｎｄｏ−Ｍ処理：図２１Ａ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理：図２１Ｂ）。
【０１２０】
その結果、糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖が９８．９％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は８５．６％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−Ｍ処理後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９７．６％であった。また、精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９４．７％であった。このことにより、精製過程で重鎖の両方に糖鎖が付いているｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の抗体が分離できていることも示せた。また、コアフコースを高純度（９４％以上）で含む糖鎖改変Ａ２Ｆトラスツズマブを調製できた。
【０１２１】
＜実施例１７＞各種トラスツズマブのマイクロプレートアッセイ法によるＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との結合試験
ＬＧ．Ｐｒｅｓｔａらの報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６,  ６５９１−６６０４）を参考にして、各種トラスツズマブのＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合試験を行った。
ヒト型ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８溶液（ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社、１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｆｉｔｉｃ社）に加えて４℃で一晩固定化した後に、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でブロッキングを行った。各ステップ間に１４０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄を行った。
【０１２２】
次にチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％）、実施例３及び４で調製したコアフコース含有率を９７．１％に向上させたトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ９７．１％）、実施例８で調製したコアフコース含有率が８５．６％である糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％）、実施例８、１２及び１３で調製したコアフコース含有率を９７．６％に向上させた糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％）及び非特許文献１４で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ０％）をそれぞれ１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した。
【０１２３】
各希釈溶液（１００μＬ）は、ヒト型ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８を固定化したプレートウェルに加えて、室温で２時間結合させた。プレ−トから抗体溶液を取り除き、十分に洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートｐｒｏｔｅｉｎＧ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を加え室温で１時間結合させた。発色試薬としてＴＭＢ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、室温で１５分間反応させ、０．１８Ｍ硫酸水溶液でクエンチした後にプレートリーダーで４５０ｎｍの波長を検出した。
【０１２４】
結果を図２２に示す。この結果より、抗体の糖鎖の種類がＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合に大きく関与していることがわかった。チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブはコアフコースが付いているが、糖鎖改変の有無に関わらずいずれのトラスツズマブも、コアフコースが付いていないカイコ絹糸腺産生の糖鎖改変Ａ２トラスツズマブに比して低い結合能を示した。このことより、コアフコースの有無がＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合活性に対し影響が大きいことがわかった。また、コアフコース含有率を高めたトラスツズマブ−Ｆ９７．１％は、トラスツズマブ−Ｆ８４．２％に比してＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合活性が大きく低下した。一方、糖鎖改変したトラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％とコアフコース含有率を高めたトラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％では結合活性に差は見られなかった。
【０１２５】
＜実施例１８＞各種トラスツズマブの表面プラズモン共鳴法によるＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との結合活性解析
ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ１００Ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、各種トラスツズマブのＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合活性を調べた。センサーチップＣＭ５にＰｒｏｔｅｉｎＡを３８６１ＲＵになるまで固定化したものに対し、それぞれ約２５０ＲＵとなるまでチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％）、実施例３及び４で調製したコアフコース含有率を９７．１％に向上させたトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ９７．１％）、実施例８で調製したコアフコ−ス含有率が８５．６％である糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％）、実施例８、１２及び１３で調製したコアフコ−ス含有率を９７．６％に向上させた糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％）及び非特許文献１４で調製した糖鎖改変Ａ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ０％）を吸着させた。その後、ヒト型ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８溶液を０．００１６μＭ、０．００８μＭ、０．０４μＭ、０．２μＭ及び１μＭの濃度で添加するシングルサイクル法という手法で各種トラスツズマブとＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８の結合活性を調べた。
【０１２６】
結果を図２３及び表１に示す。その結果、コアフコース含有量が増えるにつれて結合速度並びに解離速度が変化し解離定数が大きくなっていることがわかった。また、コアフコース含有量が多い（９７％以上）トラスツズマブは解離速度が非常に速いことがわかった。
表１は各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％、トラスツズマブ−Ｆ９７．１％、トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ０％、トラスツズマブ−Ａ２−Ｆ８５．６％及びトラスツズマブ−Ａ２−Ｆ９７．６％）のＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８結合活性を示す。表１より糖鎖改変していないトラスツズマブについても同様の結果が得られた。
【０１２７】
【表１】
2017031132.tif 000003
【０１２８】
＜実施例１９＞糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０及びＭ３トラスツズマブの調製
実施例７で調製したトラスツズマブのアクセプター（３．５ｍｇ）、糖供与体としてＧ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０またはＭ３オキサゾリン（２．１８７５μｍｏｌ）（Ｇ１ａ及びＧ１ｂは特願２０１５−２３４１８８に記載の方法により調製した）、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素ＧＳＴ−Ｅｎｄｏ−Ｓ  Ｄ２３３Ｑ（３５０μｇ）を糖転移酵素として、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に加え、総量８７５μＬとして３７℃で１時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したＣＯＳＭＯＧＥＬ  ＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク社）をウェットボリュームで２８０μＬ加えて室温で３０分回転振盪を行い、ＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑを吸着させた。
【０１２９】
このゲル担体を除いた液に同じく５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで１４０μＬ加えて室温で１時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は３．５ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍｌのＰＢＳでのリンスを３回行った。
洗浄した担体に３５０μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１１．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
【０１３０】
その結果、Ｇ２体２．５ｍｇ、Ｇ１ａ体２．７ｍｇ、Ｇ１ｂ体２．８ｍｇ、Ｇ０体２．５ｍｇ及びＭ３体２．６ｍｇの糖鎖改変抗体が得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに得られた糖鎖改変抗体をＧ２体は１μｇ、Ｇ１ａ体、Ｇ１ｂ体、Ｇ０体及びＭ３体は０．５μｇ供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖受容体の転移により重鎖が高分子側にシフトしたことが確認された。代表例としてＧ２体の電気泳動写真を図２４に示す。
【０１３１】
＜実施例２０＞糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−ＣＣによる加水分解
糖鎖改変Ｇ２体は、実施例１９で調製した糖鎖改変トラスツズマブ（８００μｇ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（２４μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量８００μＬとして３７℃で２４時間静置した。２４時間後この反応液にＰＢＳを６００μＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで３２μＬ加えて４℃で１５時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は８００μＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に８０μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
その結果、６８０μｇのＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブが得られた。
【０１３２】
糖鎖改変Ｇ１ａ体、Ｇ１ｂ体及びＧ０体は、それぞれ実施例１９で調製した糖鎖改変トラスツズマブ（７５０μｇ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（２２．５μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量７５０μＬとして３７℃で２４時間静置した。２４時間後この反応液にＰＢＳを６００μＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで３２μＬ加えて４℃で１５時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は７５０μＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に８０μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
【０１３３】
その結果、Ｇ１ａ体５８０μｇ、Ｇ１ｂ体６３０μｇ及びＧ０体５９０μｇのＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。
８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに得られたＥｎｄｏ−ＣＣ加水分解後糖鎖改変トラスツズマブをＧ２体は１μｇ、Ｇ１ａ体、Ｇ１ｂ体及びＧ０体は０．５μｇ供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。代表例としてＧ２体の電気泳動写真を図２４に示す。
【０１３４】
＜実施例２１＞糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のＥｎｄｏ−Ｍによる加水分解
実施例１９で調製した糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ（１．９ｍｇ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（５７μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量３８０μＬとして３７℃で４８時間静置した。４８時間後この反応液にＰＢＳを１ｍＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで８０μＬ加えて４℃で１５時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は１．８ｍＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に２００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を６．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながらＰＢＳに緩衝液置換した。
その結果、１．６５ｍｇのＥｎｄｏ−Ｍ加水分解後糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブが得られた。
８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体０．５μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。
【０１３５】
＜実施例２２＞糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体並びに糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブＥｎｄｏ−Ｍ糖鎖加水分解体の分離精製とＨＰＬＣ分析
実施例２０で調製した糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブのＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体並びに実施例２１で調製した糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブのＥｎｄｏ−Ｍ糖鎖加水分解体は、実施例１３と同様の手順で分離精製し、分離精製物の確認を実施した。ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムを用いた分離精製では、糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブのＥｎｄｏ−ＣＣ糖鎖加水分解体をそれぞれ５００μｇ使用した。また、糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブＥｎｄｏ−Ｍ糖鎖加水分解体は１回当たり５００μｇを使用し、計３回（計１５００μｇ）の操作を行い３回分の分離精製物を混合した。ＨＰＬＣシステムを用いた分離精製物の確認の結果、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変トラスツズマブがそれぞれ分離精製できていることを確認した。また、８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認により、重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０及びＭ３トラスツズマブを分離精製できたことが認められた（図２５）。
【０１３６】
＜実施例２３＞Ｅｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブ並びにＥｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブの糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ解析
実施例１９で調製した糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０及びＭ３トラスツズマブ、実施例２０及び実施例２２で調製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の精製した糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及びＧ０トラスツズマブ並びに実施例２１及び実施例２２で調製したＥｎｄｏ−Ｍ処理後の精製した糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブを使用し、実施例１６と同様の手順でＭＳ測定を行い、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した。
【０１３７】
その結果、糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブは糖鎖が９７．３％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９５．６％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９９％以上であった。
糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブは糖鎖が９８．４％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９３．０％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９９％以上であった。
糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブは糖鎖が９８．３％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９４．３％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９９％以上であった。
糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブは糖鎖が９８．５％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９１．６％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−ＣＣ処理後の糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９９％以上であった。
糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブは糖鎖が９７．１％付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９１．９％であった。一方、精製したＥｎｄｏ−Ｍ処理後の糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブは糖鎖が９９％以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は９９％以上であった。
このことにより、精製過程で重鎖の両方に糖鎖が付いているｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型の抗体が９９％以上分離できていることも示せた。また、コアフコースを高純度（９９％以上）で含む糖鎖改変Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０及びＭ３トラスツズマブを調製できた。
【０１３８】
＜実施例２４＞ＰＮＧａｓｅ処理によるトラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎの調製
調製したトラスツズマブ（８００μｇ）とＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＢ社、１５００ユニット）を１０ＸＧ７  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）中に加え、総量１６０μＬとして３７℃で１７時間静置した。１７時間後この反応液にＰＢＳを５００μＬ加え、同じくＰＢＳで平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）をウェットボリュームで３２μＬ加えて４℃で１５時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は８００μＬのＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０）で室温、１０分間の洗浄作業を計３回、１ｍＬのＰＢＳでのリンスを４回行った。洗浄した担体に８０μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２．６７μＬ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（分画分子量３０ｋＤａ、メルクミリポア社）で濃縮しながら２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に緩衝液置換した。
その結果、６６０μｇのトラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎが得られた。８．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに精製後の抗体１μｇを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎが確認された（図２６）。
【０１３９】
＜実施例２５＞各種トラスツズマブのマイクロプレートアッセイ法によるＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との結合試験
実施例１７と同様の手順で各種トラスツズマブのＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合試験をマイクロプレートアッセイ法により行った。結合試験に使用したトラスツズマブは、カイコ絹糸腺産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ０％）、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％）、実施例１９、２０及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％）、実施例１９、２１及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％）並びに実施例２４で調製した糖鎖を取り除いたトラスツズマブ（トラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎ）である。
【０１４０】
結果を図２７に示す。チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ及びコアフコース含有率を向上させた糖鎖改変トラスツズマブは、いずれもコアフコースが結合していないカイコ絹糸腺産生トラスツズマブに比して低い結合活性を示した。また、トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％及びトラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％は、糖鎖を除去したトラスツズマブ−ａｇｌｙｃｏｎに近い結合活性を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との相互作用が極めて弱いことがわかった。
【０１４１】
＜実施例２６＞各種トラスツズマブの表面プラズモン共鳴法によるＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との結合活性解析
実施例１８と同様の手順でＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ１００Ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、各種トラスツズマブのＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８に対する結合活性を調べた。結合試験に使用したトラスツズマブは、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％）、実施例１９、２０及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％）、実施例１９、２１及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％）である。
【０１４２】
結果を表２に示す。その結果、コアフコース含有率を向上させた糖鎖改変トラスツズマブは、コアフコース含有率が低いトラスツズマブ−Ｆ８４．２％に比していずれも解離定数ＫＤが大きくなり、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８との相互作用が弱まっていることがわかった。
表２は各種トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％、トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％及びトラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％）の平衡時の解離定数ＫＤを示す。
【０１４３】
【表２】
2017031132.tif 000004
【０１４４】
＜実施例２７＞各種トラスツズマブのＡＤＣＣ活性測定
トラスツズマブに対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性をＡＤＣＣ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。ＡＤＣＣ活性測定に使用したトラスツズマブはチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｆ８４．２％）、実施例１９、２０及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ２トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ａトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ１ｂトラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％）、コアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｇ０トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％）、実施例１９、２１及び２２で調製したコアフコース含有率を９９％以上に向上させた糖鎖改変Ｍ３トラスツズマブ（トラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％）並びに実施例７で調製したトラスツズマブのアクセプター（トラスツズマブ  アクセプター）である。
エフェクター細胞はキット付属であり、ＦｃγＲIIIａのＶ１５８バリアントを安定に発現し、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答配列を安定に保持する遺伝子組換えＪｕｒｋａｔ細胞である。ターゲット細胞はＨＥＲ２の高発現株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いた。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ及びピルビン酸を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、測定前々日に９６ウェル白色ソリッドプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１ウェル当たり５０００個を播種した。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩培養し、翌日ウェルより培地を入念に除き、各種トラスツズマブの段階希釈液５０μＬを加えた。段階希釈にはＡＤＣＣアッセイ培地（１０％Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）を用いた。段階希釈のスタートの抗体濃度は０．３３μｇ／ｍＬとし、以降１／３希釈を８回繰り返して計９段階の希釈液を調製した。これに抗体を含まないＡＤＣＣアッセイ培地を加えた計１０種の濃度の抗体希釈液を測定に用いた。
ターゲット細胞に抗体を加えた後はプレインキュベーション時間を設けず、直ちにエフェクター細胞を加えた。エフェクター細胞は、ＡＤＣＣアッセイ培地に懸濁し、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比が１５：１となるよう、１ウェル当たり７５０００個を加えた。この際、加える細胞懸濁液は２５μＬとなるよう調製した。エフェクター細胞を加えた後はプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で２４時間静置した。
測定当日、プレートはインキュベーターから取り出して室温で１５分以上静置し温度を下げ、ウェル内のＡＤＣＣアッセイ培地と等量のＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をウェルに加えた。５分経過したところでルシフェラーゼの化学発光強度を発光マイクロプレートリーダーＴｒｉＳｔａｒ２  ＬＢ−９４２（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）で測定した。
【０１４５】
結果を図２８に示す。コアフコース含有率が低いトラスツズマブ−Ｆ８４．２％がこの中では最も高い活性を示した。そして、トラスツズマブ−Ｇ２−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ａ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ１ｂ−Ｆ９９％、トラスツズマブ−Ｇ０−Ｆ９９％及びトラスツズマブ−Ｍ３−Ｆ９９％は、トラスツズマブ濃度が０．３３μｇ／ｍＬのときいずれも発光量が７０００ＲＬＵ以下となり、ＡＤＣＣ活性が大きく低下した。このことから、コアフコースの含有率がＡＤＣＣ活性と大きく関与していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明は、コアフコースを有しかつ均一な糖鎖構造を有する抗体を高純度に製造することができるので、均一な糖鎖構造を有する抗体（医薬品）を製造することが望まれている医薬品業界等において利用可能である。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２９】
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【図１】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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