(57)【要約】【課題】コラーゲン７又はその機能的断片を製造する方法、該方法で製造されるコラーゲン７又はその機能的断片、コラーゲン又はその機能的断片をコードする核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。【解決手段】コラーゲン７又はその機能性断片を製造する方法であって、  コラーゲン７又はその機能的断片と、任意的に、コラーゲン７の発現を増大させる１種類以上のポリペプチド、例えば、プロリダーゼとを発現するように組換え技術で操作された細胞を提供すること、及び  コラーゲン７又はその機能的断片及びプロリダーゼの産生に十分な条件で前記細胞を培養することを含み、これにより、コラーゲン７を製造する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を作成する方法であって、
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片をコードする外来導入核酸を含む細胞を提供する工程において、該細胞は、ヒトコラーゲン７又はその機能的断片の発現を増大させる１つ以上のポリペプチドを発現するように組換え技術で操作されており、前記１つ以上のポリペプチドがプロリダーゼを含む工程、及び
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片及びプロリダーゼの産生に十分な条件下で、前記細胞を培養する工程、
を含み、それにより、ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を作成する、方法。
【請求項２】
前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼを発現するように組換え技術でさらに操作されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、プロリダーゼをコードする外来導入核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする外来導入核酸を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、ヒトコラーゲン７又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、プロリダーゼをコードする核酸配列を含む第２の発現ベクターを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む第３の発現ベクターを含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターは、プロリダーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヒトコラーゲン７をコードする核酸配列が配列番号１の配列を含む、請求項１から１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を前記培養細胞から回収及び精製することをさらに含む、請求項１から１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を培養液から回収及び精製することをさらに含む、請求項１から１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０％がホモ３量体に取り込まれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０％が６量体に取り込まれる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を発現するのに適した細胞を作成する方法であって、
組換えヒトコラーゲン７又はその機能的断片を発現するように細胞を組換え技術で操作する工程、及び
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片の発現を増大させる１つ以上のポリペプチドを発現するように前記細胞を組換え技術でさらに操作する工程であって、前記１つ以上のポリペプチドがプロリダーゼを含む工程、
を含み、それにより、組換えヒトコラーゲン７又はその機能的断片を発現するのに適した細胞を作成する、方法。
【請求項１７】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を組換え技術で発現するように前記細胞を操作する前か、後か、同時かに、組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を組換え技術で操作することをさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を培養液から精製する工程をさらに含み、
該精製工程が、
細胞ならし培養液を提供すること、
タンパク質を硫酸アンモニウムで沈殿させること、
前記沈殿したタンパク質を可溶化させること、
前記可溶化したタンパク質を透析すること、
前記透析したサンプルを遠心して上清を形成すること、及び、
陰イオン交換クロマトグラフィーに前記上清を供すること、
を含み、それにより、ヒトコラーゲン７又はその機能的断片を精製する、請求項１から１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
組換え技術で操作された細胞において、
ヒトコラーゲン７又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第１の発現ベクターであって、前記核酸配列が、配列番号１の配列に対して９５％以上の同一性を有する高グリシンコドン最適化核酸配列を含む、第１の発現ベクター、及び
プロリダーゼをコードする第２の核酸配列を含む第２の発現ベクターであって、該プロリダーゼの発現が、該操作された細胞におけるヒトコラーゲン７又はその機能的断片の発現を増大させる、第２の発現ベクター、
を含む、組換え技術で操作された細胞。
【請求項２０】
グリコシルトランスフェラーゼをコードする第３の核酸配列を含む第３の発現ベクターをさらに含む、請求項１９記載の組換え技術で操作された細胞。
【請求項２１】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン７と、コラーゲン７関連の核酸及び細胞と、関連する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚、腱、靱帯及び骨のような結合組織を強化し支持するたん白質のファミリーである。係留繊維（anchoring fibrils）の主要成分であるコラーゲン７は、皮膚を含むさまざまな組織を強化し安定化する機能がある（非特許文献１）。
【０００３】
コラーゲン７は３本のプロ−α１（VII）ポリペプチド鎖として合成され、その後該ポリペプチド鎖は小胞体内でプロセッシング及びフォールディングされて、３重らせんのプロコラーゲン７たん白質となる。プロコラーゲン７は細胞外空間に分泌され、さらにプロセッシングされて成熟コラーゲン７になる（非特許文献２）。成熟コラーゲン７は数段階の重合プロセスを経て構造的な係留組織を形成する（非特許文献３）。皮膚では、これらの係留繊維は表皮基底膜ゾーンに存在する。標記基底膜ゾーンは皮膚最上層である表皮と、その下の真皮との間に位置する。この位置で、前記係留繊維は表皮基底膜を乳頭真皮に連結する。この連結は皮膚の表皮層及び真皮層を一体に保持して、皮膚に構造性及び安定性を提供する（非特許文献３）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chungら、Dermatol Clin 28(1): 93-105 (2010)
【非特許文献２】Fritschら、J Biol Chem 284(44): 30248-30256 (2009)
【非特許文献３】Villoneら、J Biol Chem 283(36): 24506-24513 (2008)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本開示は、コラーゲン７又はその機能的断片の製造方法を特徴とする。本発明の方法は、
コラーゲン７又はその機能的断片と、任意的に、１種類以上のポリペプチド、例えば、細胞内でのコラーゲン７産生を増大させる１種類以上のポリペプチド（例えば、プロリダーゼ（prolidase）及び／又はプロリルヒドロキシラーゼ（prolyl hydroxylase））とを発現するように遺伝的に改変された細胞、例えば、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞を提供すること、及び
前記細胞を、コラーゲン７又はその機能的断片の産生に十分な条件下で培養することを含み、これによりコラーゲン７又はその機能的断片を製造する。
【０００６】
１つの実施態様では、コラーゲン７はヒトコラーゲン７である。ある実施態様では、コラーゲン７は、高グリシンコドン最適化配列、例えば、本明細書に説明される高グリシンコドン最適化配列によりコードされる。１つの実施態様では、コラーゲン７は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。１つの実施態様では、コラーゲン７のアミノ酸配列は、配列番号２との同一性が少なくとも８０、９０、９５又は９９％である。１つの実施態様では、コラーゲン７のアミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個以内のアミノ酸残基だけ配列番号２と異なる。
【０００７】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリダーゼ又はその機能的断片を発現するように遺伝的に改変され、例えば、該プロリダーゼは、哺乳類、例えばヒトのプロリダーゼ、あるいは齧歯類、例えば、マウス、ラット又はハムスターのプロリダーゼであってよい。ある実施態様では、前記プロリダーゼは、ヒトのプロリダーゼ、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトプロリダーゼか、配列番号４との同一性が少なくとも８０、９０、９５又は９９％のアミノ酸配列を有するプロリダーゼか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個以内のアミノ酸残基だけ配列番号４と異なるアミノ酸配列を有するプロリダーゼかである。
【０００８】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片を発現するように遺伝的に改変され、例えば、該プロリルヒドロキシラーゼは哺乳類、例えばヒトのプロリルヒドロキシラーゼ、あるいは齧歯類、例えば、マウス、ラット又はハムスターのプロリルヒドロキシラーゼであってよい。ある実施態様では、前記プロリルヒドロキシラーゼは、ヒトのプロリルヒドロキシラーゼ、例えば、配列番号Ｘのアミノ酸配列を有するヒトプロリルヒドロキシラーゼか、配列番号Ｘとの同一性が少なくとも８０、９０、９５又は９９％のアミノ酸配列を有するプロリルヒドロキシラーゼか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個以内のアミノ酸残基だけ配列番号Ｘと異なるアミノ酸配列を有するプロリルヒドロキシラーゼかである。
【０００９】
ある実施態様では、前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片、例えば、シアリルトランスフェラーゼ又はその機能的断片を発現するように遺伝的に改変され、該グリコシルトランスフェラーゼは哺乳類、例えばヒトのグリコシルトランスフェラーゼ、例えばシアリルトランスフェラーゼ、あるいは齧歯類、例えば、マウス、ラット又はハムスターのグリコシルトランスフェラーゼであってよい。
【００１０】
ある実施態様では、前記グリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼ、例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼか、配列番号５との同一性が少なくとも８０、９０、９５又は９９％のアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個以内のアミノ酸残基だけ配列番号５と異なるアミノ酸配列を有するシアリルトランスフェラーゼかである。
【００１１】
ある実施態様では、前記遺伝的に改変された細胞は、コラーゲン７又はその機能的断片、例えば、高グリシンコドン最適化核酸配列、例えば、配列番号１の核酸配列をコードする核酸を含む。１つの実施態様では、前記核酸配列は、配列番号１との同一性が少なくとも８０、９０、９５又は９９％のアミノ酸配列を有する核酸配列か、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個以内のアミノ酸残基だけ配列番号１と異なる核酸配列かである。ある実施態様では、前記コドンの少なくとも８０、９０、９５又は９９％は配列番号１のコドン値を有する。
【００１２】
ある実施態様では、前記遺伝的に改変された細胞は、プロリダーゼ又はその機能的断片をコードする核酸を含む。
【００１３】
ある実施態様では、前記遺伝的に改変された細胞は、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸を含む。
【００１４】
ある実施態様では、前記遺伝的に改変された細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸を含む。
【００１５】
ある実施態様では、前記細胞は、コラーゲン７又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。ある実施態様では、前記発現ベクターは、プロリダーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列をさらに含む。ある実施態様では、前記発現ベクターは、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列をさらに含む。ある実施態様では、前記発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列をさらに含む。ある実施態様では、前記発現ベクターは、プロリダーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列と、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列とをさらに含む。ある実施態様では、前記発現ベクターは、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列と、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列とをさらに含む。
【００１６】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリダーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第２の発現ベクターを含む。
【００１７】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を第２の発現ベクターを含む。
【００１８】
ある実施態様では、前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第３の発現ベクターを含む。
【００１９】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリダーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第２の発現ベクターと、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第３の発現ベクターとを含む。
【００２０】
ある実施態様では、前記細胞は、プロリルヒドロキシラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第２の発現ベクターと、グリコシルトランスフェラーゼ又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む第３の発現ベクターとを含む。
【００２１】
ある実施態様では、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞か、齧歯類細胞、例えばラット、マウス又はチャイニーズハムスター細胞かである。
【００２２】
ある実施態様では、前記細胞はＣＨＯ細胞である。
【００２３】
ある実施態様では、前記細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【００２４】
ある実施態様では、前記方法は、コラーゲン７又はその機能的断片を前記培養細胞から回収することをさらに含む。
【００２５】
ある実施態様では、前記コラーゲン７又はその機能的断片は、培養液から回収される。
【００２６】
ある実施態様では、前記方法は、前記培養細胞からコラーゲン７又はその機能的断片を精製することをさらに含む。
【００２７】
ある実施態様では、前記方法は、前記培養液からコラーゲン７又はその機能的断片を精製することをさらに含む。
【００２８】
ある実施態様では、前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％がホモ３量体に取り込まれる。
【００２９】
ある実施態様では、前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％が６量体に取り込まれる。
【００３０】
別の態様では、本開示は、本明細書に説明されるベクターを特徴とする。
【００３１】
別の態様では、本開示は、本明細書に説明される細胞か、細胞の単離標品かを特徴とする。
【００３２】
別の態様では、本開示は、本明細書に説明されるコラーゲン７をコードする高グリシン最適化配列を特徴とする。
【００３３】
別の態様では、本開示は、本明細書に説明される細胞の単離標品であって、培養液と、前記細胞によって産生されるコラーゲン７又はその機能的断片とのいずれかをさらに含み得る、単離標品を特徴とする。
【００３４】
別の態様では、本開示は、コラーゲン７又はその機能的断片を発現するのに適する細胞を製造する方法を特徴とし、該方法は、
細胞、例えば、哺乳類細胞、例えば本明細書に説明される哺乳類細胞を組換え技術で操作して、組換えコラーゲン７又はその機能的断片を発現させること、及び、
任意的に、前記細胞を組換え技術で操作して、１種類以上のポリペプチド、例えば、前記細胞内でのコラーゲン７産生を増大させる１種類以上のポリペプチド（例えば、プロリダーゼ及び／又はプロリルヒドロキシラーゼ）を発現させることを含み、
これにより、組換えコラーゲン７を発現するのに適する細胞を製造する。
【００３５】
１つの実施態様では、前記方法は、高グリシンコドン最適化核酸配列、例えば、本明細書に説明される高グリシンコドン最適化核酸配列によりコードされるコラーゲン７を発現するように細胞を組換え技術で操作することを含む。
【００３６】
本方法のある実施態様では、前記細胞は、コラーゲン７又はその機能的断片を発現させるように組換え技術で操作され、前記細胞は、１種類以上のポリペプチド、例えば、前記細胞内でのコラーゲン７発現を増大させるポリペプチドを発現するように組換え技術で操作される。１つの実施態様では、前記細胞は、前記細胞が１種類以上のポリペプチド、例えば、前記細胞内でのコラーゲン７発現を増大させるポリペプチド、例えば、プロリダーゼ、プロリルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ及びこれらの機能的断片の１種類以上を発現するように組換え技術で操作される前に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現させるように組換え技術で操作される。
【００３７】
１つの実施態様では、前記細胞は、前記細胞が１種類以上のポリペプチド、例えば、前記細胞内でのコラーゲン７発現を増大させるポリペプチド、例えば、プロリダーゼ、プロリルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ及びこれらの機能的断片の１種類以上を発現するように組換え技術で操作された後に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現させるように組換え技術で操作される。
【００３８】
本方法のある実施態様では、前記細胞は、前記細胞が１種類以上のポリペプチド、例えば、前記細胞内でのコラーゲン７発現を増大させるポリペプチド、例えば、プロリダーゼ、プロリルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ及びこれらの機能的断片の１種類以上を発現するように組換え技術で操作されるのと同時に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現させるように組換え技術で操作される。
【００３９】
別の態様では、本発明は、本明細書に説明される方法によって製造されるコラーゲン７又はその機能的断片を特徴とする。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書に説明される方法によって製造されるコラーゲン７又はその機能的断片の精製又は単離標品を特徴とする。
【００４１】
別の態様では、本発明は、コラーゲン７又はその機能的断片の精製又は単離標品であって、前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％がホモ３量体に取り込まれる、精製又は単離標品を特徴とする。
【００４２】
別の態様では、本発明は、コラーゲン７又はその機能的断片の精製又は単離標品であって、前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％が６量体に取り込まれる、精製又は単離標品を特徴とする。
【００４３】
別の態様では、本発明は、コラーゲン７又はその機能的断片を精製する方法を特徴とし、該方法は、
細胞ならし培養液、例えば、本明細書に説明される細胞の培養からのならし培養液を提供すること、
前記培養液からのコラーゲン７又はその機能的断片を陰イオン交換クロマトグラフィー、例えば、Ｑセファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供することを含み、
これにより、コラーゲン７又はその機能的断片を精製する。
【００４４】
ある実施態様では、前記方法は、
ならし培養液、例えば、本明細書に説明される細胞の培養からのならし培養液を提供すること、
任意的に、たん白質を、例えば、硫酸アンモニウムで沈殿させて、たん白質の沈殿物を形成すること、
沈殿されたたん白質を可溶化して、可溶化たん白質を形成すること、
前記可溶化たん白質を透析して、透析物を形成すること、
透析されたサンプルを沈降させて上清を形成すること、及び、
前記上清を陰イオン交換クロマトグラフィー、例えば、Ｑセファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供することを含み、
これにより、コラーゲン７又はその機能的断片を精製する。
【００４５】
本発明の１つ以上の実施態様の詳細は、以下の説明に列挙される。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、本説明及び図面と、特許請求の範囲とから明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
定義
本明細書に用いられる、「発現するように組換え技術で操作される」又は「発現するように遺伝的に操作される」とは、たん白質を発現するように改変された細胞を指す。代表的な改変は、前記たん白質をコードする核酸の導入、又は、例えば、内在遺伝子を活性化する配列の導入により、前記たん白質をコードする内在配列を本来の内在配列以外の配列の制御下に置くことを含む。
【００４７】
本明細書で用いられるところの単離核酸分子は、その出所源のゲノムＤＮＡ又は細胞ＲＮＡの核酸から分離された核酸を意味する。これは、化学的方法、化学的及び生物学的な方法の併用、及び単離組換え核酸分子を含むが、これらに限定されない、適当な方法によって得られる核酸分子を含む。
【００４８】
本明細書で用いられる、核酸分子についての組換えは、分子生物学的技術を用いて作成された核酸分子に関する。本明細書で用いられる、たん白質又はポリペプチドの分子についての組換えは、単離核酸分子又は組換え核酸分子を利用して発現されるたん白質又はポリペプチドの分子に関する。
【００４９】
本明細書で用いられる、高グリシン最適化又は高グリシンコドン最適化とは、コラーゲン７又はその機能的断片をコードする核酸配列を指す。前記配列は、最も頻度の高いグリシンコドン以外のグリシンコドン（「低頻度コドン（less common codon）」という。）を少なくとも１個含む。ある実施態様では、前記低頻度グリシンコドンは、前記配列が発現されるであろう細胞についての最も頻度の高いグリシンコドン以外のものである。ある実施態様では、前記低頻度グリシンコドンは、本明細書で引用される細胞、例えば、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞についての低頻度グリシンコドンである。前記配列は、コラーゲン７の本来のヒト配列に存在しない低頻度グリシンコドンを実施態様によっては少なくとも１個、実施態様によっては少なくとも１０、２０又は３０個含む。ある実施態様では、前記グリシンコドンの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％が低頻度グリシンコドンである。
【００５０】
コラーゲン７
係留繊維の主要成分として、コラーゲン７は組織の一体性を維持する機能を有する。係留繊維は、皮膚、口腔粘膜及び頸部を含む複数の組織の上皮層及び間充織層の間の界面での連結複合体として機能する構造的要素である（Chungら、Dermatol Clin 28(1): 93-105 (2010)）。皮膚では、係留繊維は、表皮基底膜下部からその下の乳頭真皮まで伸長して、表皮基底膜と乳頭真皮との間の結合を確保する（Varkiら、J Med Genet 44:181-192 (2007)）。この結合は、表皮と真皮との間の密着を提供し維持して、皮膚の一体性に寄与するが、該一体性は、皮膚の適切な構造、機能及び恒常性に重要である（Villoneら、J Biol Chem 283(36): 24506-24513 (2008)）。
【００５１】
コラーゲン７をコードする核酸は以下に説明する方法で用い得る。高グリシンコドン最適化配列は特に好適である。ヒトコラーゲン７の代表的な高グリシンコドン最適化ヌクレオチド配列は以下のとおりである。
2017209117.tif 000002
【００５２】
2017209117.tif 000003
【００５３】
2017209117.tif 000004
【００５４】
2017209117.tif 000005
【００５５】
2017209117.tif 000006
【００５６】
ヒトコラーゲン７のアミノ酸配列は以下のとおりである。
2017209117.tif 000007
【００５７】
2017209117.tif 000008
【００５８】
プロリダーゼ
プロリダーゼは、細胞質イミドジペプチダーゼで、Ｃ末端プロリン又はヒドロキシプロリン残基を有するイミドジペプチドを特異的に切断する。本酵素は、コラーゲンの分解産物から主に由来するイミドジペプチドからコラーゲンその他のプロリン含有たん白質の再合成のためにプロリンを再利用するうえで重要な役割を果たす。（（Miltyk ら、 J Biochem 144(3): 409-414 (2008)）に参照されるとおり、）特異的な宿主細胞は、組換えコラーゲンたん白質の適切な合成を担保するために、プロリダーゼの添加を必要とする場合がある。本明細書に説明される、コラーゲン７を発現するように組換え技術で操作される宿主細胞は、ヒトプロリダーゼも発現するように組換え技術で操作してもよい。ヒトプロリダーゼの代表的なアミノ酸配列は以下のとおりである。
2017209117.tif 000009
【００５９】
ヒトプロリダーゼをコードする代表的な核酸配列は以下に提供される。
2017209117.tif 000010
【００６０】
グリコシルトランスフェラーゼ
ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞は、ヒトと類似のグリコシル化機構を備えているため、コラーゲン７のようなグリコシル化組換えたん白質を産生するために利用し得る。しかし、シアリル化に関しては留意すべき相違が存在する。ヒト由来Ｎ−結合型糖鎖はＫ２，３−及びＫ２，６−結合の両方で末端シアル酸残基を含むが、ＣＨＯ及びＢＨＫ細胞由来の糖たん白質ではＫ２，３末端シアル酸だけが存在する。実際、これらの細胞株は、Ｋ２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の機能的コピーを欠落している（Bragonziら、Biochim Biophys Acta 1474(3): 273-82 (2000)）。宿主細胞は、コラーゲン７、あるいはコラーゲン７及びプロリダーゼを発現するように組換え技術で操作される前か、後か、同時かに、ヒトグリコシルアミノトランスフェラーゼｒＳＴ６Ｇａｌ１を発現するように組換え技術で操作してもよい。
【００６１】
ドブネズミ（rattus norvegicus）ＳＴ６ベータ−ガラクトサミド・アルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｓｔ６Ｇａｌ１）の転写物変異体１（ｒＳＴ６Ｇａｌ１）は以下のとおりである。
2017209117.tif 000011
【００６２】
ヒトＳＴ６ベータ−ガラクトサミド・アルファ−２、６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｓｔ６Ｇａｌ１）の転写物変異体１（ｒＳＴ６Ｇａｌ１）は最適化され得る。
【００６３】
プロリルヒドロキシラーゼ
代表的なプロリルヒドロキシラーゼは以下に説明される。
2017209117.tif 000012
【００６４】
熱ショックたん白質４７（ＨＳＰ４７）
ＨＳＰ４７は、プロコラーゲン形成に機能する、小胞体局在シャペロンたん白質である。ＨＳＰ４７は、プロコラーゲンの小胞体内への移行を補助する。ＨＳＰ４７は、合成が完了するまでポリペプチドをフォールディングされない状態に保つのを補助し、プロコラーゲンのＨＳＰ４７からの放出は、プロコラーゲンのらせん形成によって駆動される。本発明の宿主細胞は、コラーゲン７、あるいはコラーゲン７及びプロリダーゼを発現するように操作される前か、後か、同時かにヒトＨＳＰ４７を発現するように組換え技術で操作してもよい。
【００６５】
シクロフィリンＢ（ＣｙｐＢ）
シクロフィリンＢは、小胞体内に存在するペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼである。シクロフィリンＢは、ＨＳＰ４７と協同してプロコラーゲンのフォールディング及び輸送を促進する機能を有する。本発明の宿主細胞は、コラーゲン７、あるいはコラーゲン７及びプロリダーゼを発現するように組換え技術で操作される前か、後か、同時かにヒトシクロフィリンＢを発現するように組換え技術で操作してもよい。
【００６６】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、小胞体局在チオールオキシドレダクターゼタンパク質である。ＰＤＩは、ジスルフィド結合の形成、還元及び異性化を触媒することを通じて、タンパク質のフォールディングを部分的に補助する。ＰＤＩは、Ｃプロペプチドドメイン間でのポリペプチド鎖間のジスルフィド結合形成の触媒を通じてコラーゲン３量体の安定化を促進する。本発明の宿主細胞は、コラーゲン７、あるいはコラーゲン７及びプロリダーゼを発現するように組換え技術で操作される前か、後か、同時かにヒトＰＤＩを発現するように組換え技術で操作してもよい。
【００６７】
オキソグルタル酸運搬体（ＯＧＣ）
オキソグルタル酸運搬体（ＯＧＣ）は、α−ケトグルタル酸をミトコンドリアの内膜を通過輸送して、脱炭酸化されたα−ケトグルタル酸のプロリンとの共役を促進する、ミトコンドリア局在タンパク質である。宿主細胞は、コラーゲン、あるいはコラーゲン及びプロリダーゼを発現するように組換え技術で操作される前か、後か、同時かにヒトＯＧＣを発現するように組換え技術で操作してもよい。
【００６８】
ベクター
本明細書で利用するのに適するベクターは、コラーゲン７、プロリダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ＨＳＰ４７、シクロフィリンＢ、ＰＤＩ又はＯＧＣか、プロコラーゲン集合又はフォールディングに関与する分子シャペロンか、これらの機能的部分かを発現できるベクターである。本明細書に説明されるタンパク質を発現させるために、適当なタンパク質又はその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適当なベクターに挿入してもよい。適当なベクターは、前記挿入された核酸配列発現のための必要かつ適切な転写及び翻訳制御配列を含む。当業者に知られた標準的な方法を、本明細書に説明される核酸配列を含む組換え発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、試験管内組換え法、合成法、及び、生体内組換え／遺伝的組換え法を含むが、これらに限定されない。方法の選択は、具体的なヌクレオチド断片の性質に依存し、当業者によって決定することができる。
【００６９】
本明細書で使用するのに適するベクターは、複製開始点と、制限エンドヌクレアーゼ配列部位とを含み得る。当業者なら、前記宿主細胞に使用するために適切な複製開始点と制限エンドヌクレアーゼ配列との知識を有するであろう。本明細書で使用するのに適切なベクターは、プロモーター及びエンハンサーエレメントを含むが、これらに限定されない、転写補助配列エレメントを含み得る。当業者は、前記宿主細胞に適当なプロモーター、誘導可能なプロモーター及びエンハンサーエレメントを含むが、これらに限定されない、さまざまな転写制御エレメントの知識を有するであろう。本明細書に使用するために適切なベクターは、前記宿主細胞が特定の条件下で増殖生存して、前記ベクターが導入された宿主細胞の選択を補助するのに必要な産物をコードする選択可能なマーカー遺伝子も含み得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質、薬剤又は毒素（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン、ヒグロマイシン等）への耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。当業者なら、前記宿主細胞に使用するのに適切な選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子をコードする配列の知識を有するであろう。
【００７０】
本明細書に説明される発現ベクターは、従来技術の形質転換又はトランスフェクション技術によって宿主細胞内に導入することができる。形質転換及びトランスフェクション技術は、（米国特許第６，６３２，６３７号明細書（ＭｃＧｒｅｗ）に参照されるとおり、）リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン利用トランスフェクション法、リポフェクタミン法、エレクトロポレーション法、顕微注入法及びウイルス利用トランスフェクション法を含むが、これらに限定されない。当業者なら、宿主細胞／ベクターの組合せにもとづいて、適切な形質転換及びトランスフェクション法の知識を有するであろう。組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、該組換えタンパク質の安定的発現が好ましい場合がある。前記組換えタンパク質を安定的に発現する宿主細胞を作成してもよい。
【００７１】
細胞
本明細書に説明される組換え発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され得るが、該宿主細胞は、特定の組換え発現ベクターからタンパク質コーディング領域を発現することができる生細胞を含む。「宿主細胞」という用語は、特定の細胞だけを指すのでなく、該特定の細胞の子孫か、子孫となる可能性のある細胞かも指す。突然変異か環境要因かのいずれかのためにある種の改変が生じ得るため、かかる子孫の細胞は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。さまざまな宿主細胞発現システムを本明細書に説明される核酸分子の発現に利用し得る。これらは、適切な核酸配列を含む組換え酵母又は菌類発現ベクターで形質転換された酵母又は菌類と、適切な核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター又は組換えプラスミド発現ベクターで感染又は形質転換された昆虫細胞システムと、適切な核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクションされた哺乳類細胞システム（例えば、霊長類細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞等）を含むが、これらに限定されない。適切な宿主細胞は、（米国特許第６，６３２，６３７号明細書（ＭｃＧｒｅｗ）に参照されるとおり、）線維芽細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｃ１２７、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ等を含むが、これらに限定されない、初代細胞又は形質転換細胞株を含み得る。他の適切な宿主細胞は当業者に知られている。
【００７２】
グリコシル化、リン酸化及びタンパク質産物のプロセシングを含むが、これらに限定されない、修飾は、タンパク質の機能にとって重要となり得る。異なる宿主細胞がタンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾のためのさまざまな特徴及びメカニズムを有する。増強ベクターに含まれる核酸配列の発現を変調するか、前記ベクターの核酸配列の発現を変調するか、ベクター配列にコードされる遺伝子産物を特定のやり方で修飾しプロセシングすることができる宿主細胞が選ばれ得る。哺乳類宿主細胞は、前記組換えタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを担保するために選ばれる場合がある。かかる哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ヒト線維芽細胞及びヒトケラチノサイトを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
細胞培養
標準的な細胞培養手順及び条件は、本明細書に説明される宿主細胞の培養に用いられる場合があり、当業者に知られている。ＨＥＫ２９３細胞のような組換えコラーゲン７の発現のために培養される宿主細胞は、（Chenら、J Bio Chem 277(18): 2118-2124 (2002)）、（Chen ら、J Bio Chem 275: 32(11): 24429-24435 (2000)）、（Chenら、J Bio Chem 276(24): 21649-21655 (2001)）に参照されるとおり、ルーティンで使われる細胞培養液（例えば、適切な血清、抗生物質等を用途に応じて添加した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２（１：１））で培養され得る。
【００７４】
宿主細胞は、組換えコラーゲン７又はその機能的断片の産生を最適化するために、他のタンパク質を発現するように作成してもよい。これは、コラーゲン７の核酸配列又は組換え発現ベクターを含む適切な核酸配列をコードする単離核酸又は組換え発現ベクターを宿主細胞内に外部から導入しることによる、本明細書に説明されるプロセシング酵素のプロリダーゼ及び／又はグリコシルトランスフェラーゼの共発現を含むが、これらに限定されない。コラーゲン７の３重らせん集合は、しばしばヒドロキシル化と、宿主細胞増殖培養液中にアスコルビン酸が存在することとが必要となる。文献（Chenら、J Bio Chem 277 (18): 2118-2124 (2002)）に実証されるとおり、アスコルビン酸存在下でＨＥＫ２９３細胞で産生され、回収され、精製された組換え７型コラーゲンは、７型コラーゲン単量体（各単量体２９０ｋＤａ）３本の会合体に相当する約９００ｋＤａのタンパク質として分泌された。アスコルビン酸を、組換えタンパク質の適切なプロセシングを補助するために宿主細胞培養条件に用いてもよい。ホスホ−アスコルビン酸（ＰＡＡ）、４ｍＭ  α−ケトグルタル酸、ＦｅＳＯ４又はオプチフェリン（商標）を含むが、これらに限定されない、前記細胞培養液の追加の添加物を、組換えタンパク質の適切なプロセシングを補助するために添加してもよい。
【００７５】
相同配列
本発明の方法及び組成物は、特定された配列を有するポリペプチド及び核酸か、これらと実質的に同一又は類似の配列、例えば、前記特定された配列との同一性が少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％以上の配列かを含む。アミノ酸配列の文脈では、「実質的に同一」という用語は、第１及び第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有することができるように、第２のアミノ酸配列中のアライメントのとれるアミノ酸残基とｉ）同一か、ｉｉ）保存的置換かである、アミノ酸残基の十分な又は最低限の数を含む第１のアミノ酸配列を指すように本明細書で用いられる。例えば、配列番号２、配列番号４又は氏６との同一性が、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、実質的に同一と定義される。
【００７６】
ヌクレオチド配列の文脈では、「実質的に同一」という用語は、第１及び第２のヌクレオチド配列が共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、共通の構造的ポリペプチドドメイン又は共通の機能的ポリペプチド活性かをコードするように、第２の核酸配列中のアライメントがとれるヌクレオチドと同一のヌクレオチドを十分な又は最低限の数含む第１の核酸配列を指すように本明細書では用いられる。例えば、配列番号１、３又は５との同一性が少なくとも約７０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であるヌクレオチド配列が実質的に同一と定義される。
【００７７】
「機能的変異体（functional variant）」という用語は、天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであって、前記天然に存在する配列の１種類以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
【００７８】
配列の間の相同性又は配列同一性（これらの用語は本明細書では交換可能に使用される）の計算は、以下のとおり行われる。
【００７９】
２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列の同一性の百分率を決定するために、前記配列は、最適の比較の目的のためにアライメントがとられる（例えば、最適のアライメントのために、第１又は第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入される場合があり、非相同性配列は比較の目的のためには無視される場合がある）。好ましい実施態様では、比較の目的のためにアライメントがとられる参照配列の長さは、該参照配列の少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、６０％で、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列中のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められているとき、前記分子はその位置で同一である（本明細書で用いられるところでは、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と均等である）。
【００８０】
前記２本の配列の間の同一性の百分率は、前記２本の配列の最適なアライメントをとるために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した。前記配列によって共有される同一性がある位置の数の関数である。
【００８１】
毛管電気泳動の比較と、２本の配列の間の同一性の百分率の決定とは、数学的なアルゴリズムを用いて達成できる。好ましい実施態様では、２本のアミノ酸配列の間の同一性の百分率は、（http://www.gcg.comで入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに取り込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）のアルゴリズムを用いて決定され、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ１６、１４、１２、１０、８、６又は４と、ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ１、２、３、４、５又は６とを用いる。さらに別の好ましい実施態様では、２本のヌクレオチド配列の間の同一性の百分率は、（http://www.gcg.comで入手可能な）前記ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスと、ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ４０、５０、６０、７０又は８０と、ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ１、２、３、４、５又は６とを用いる。特に好ましいパラメーターの組（かつ、特記がない場合に使用すべきパラメーターの組）は、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ１２、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ４、ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【００８２】
２本のアミノ酸又はヌクレオチド配列の間の同一性の百分率は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（(1989) CABIOS, 4:11-17）のアルゴリズムを用いて決定でき、該アルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれており、ＰＡＭ１２０ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅと、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ１２と、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ４とを用いる。
【００８３】
本明細書に説明される核酸及びタンパク質の配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために「クエリー配列」として公開データベースに対する検索を実行するのに使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行され得る。本発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター核酸（配列番号１）分子と相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で実行され得る。発明のＢＭＰ−１０／ＢＭＰ−１０レセプター（配列番号１）タンパク質分子と相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で実行され得る。比較の目的のためにギャップ入りアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に説明されるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴのプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＫＡＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【００８４】
列挙される核酸と、低、中又は高ストリンジェンシー条件下で雑種形成する配列も本明細書に含まれる。本明細書で用いられる用語「低ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、高ストリンジェンシー条件下又は非常に高いストリンジェンシー条件下」は、雑種形成及び洗浄の条件を説明する。雑種形成反応を実施するガイダンスは、引用により取り込まれる、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)の6.3.1-6.3.6節に見つけることができる。上記の文献には水溶液及び非水溶液を用いる方法が記載され、いずれかが使用できる。本明細書で参照される具体的な雑種形成条件は以下のとおりである。１）６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）約４５℃の低ストリンジェンシー雑種形成条件、の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、少なくとも５０℃での２回洗浄（低ストリンジェンシー条件については洗浄温度は５５℃まで上昇され得る）；２）６×ＳＳＣ、約４５℃の中程度のストリンジェンシー雑種形成条件の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃での１回以上の洗浄；３）６×ＳＳＣ、約４５℃の高ストリンジェンシー雑種形成条件の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での１回以上の洗浄；好ましくは、４）非常に高いストリンジェンシー条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃の後、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃での１回以上の洗浄。非常に高いストリンジェンシー条件（４）は、最も好ましい条件で、特記がない場合に使用されるべき条件である。
【００８５】
コラーゲン７又はその機能的断片の精製
本明細書に説明される組換え法により産生されるタンパク質は、当業者に知られた標準的なプロトコール（例えば、沈殿、遠心等）に従って宿主細胞培養システムから回収され得る。以下の文献（Chenら、J Bio Chem 277(18): 2118-2124 (2002)）に示されるとおり、本明細書で説明される組換えコラーゲン７は、宿主細胞培養液中に分泌され、硫酸アンモニウム沈殿とその後の遠心とにより回収することができる。本明細書に説明される組換え法及び分子生物学的方法により産生及び回収されるタンパク質は、当業者に知られた標準的なプロトコール（例えば、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳゲル電気泳動等）に従って精製し得る。本明細書に説明される組換えコラーゲン７は、以下の文献（Chenら、J Bio Chem 277(18): 2118-2124 (2002)）に示されるとおり、イオン交換クロマトグラフィーにより均一になるまで精製し得る。
【実施例】
【００８６】
実施例１  コラーゲン７の産生及び精製
細胞のサブカルチャー及び凍結
１．細胞をＰＢＳで洗浄（Ｐ１５０プレートあたり１０ｍＬ）する。
２．トリプシン（ＰＢＳ中に０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ）６ｍＬを添加し、３７℃のインキュベーターで４ないし６分間インキュベーションする。細胞は層状に剥離するであろう。
３．増殖培地６ｍＬを添加し、遠心機（conical centrifuge）で２Ｋ５分間遠心沈殿する。
４．前記細胞を増殖培地中に再懸濁し、細胞を１：５の比でサブカルチャーする。
５．細胞の凍結には、１０％ＤＭＳＯを含む増殖培地を用いる。コンフルエントのＰ１５０プレートから約２千万個の細胞が得られるであろう。
【００８７】
細胞の融解及び再増殖
１．ＲＤＥＢ／ＦＢ／Ｃ７（５×１０６）のバイアル１本をとり、３７℃の水浴中で短時間融解させる。
２．２０ｍＬの増殖培地を含むＰ１５０プレートに添加し、終夜インキュベーションする。
３．第２日目に新鮮な培地に交換する。細胞は２ないし３日後にコンフルエントに達するはずである。
４．３０μＬの培地を直接採取し、培地中にＶＩＩ型コラーゲンが存在することを確認するために、抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体を用いる免疫ブロッティングに供する。
【００８８】
増殖及び培地の回収
増殖培地：ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、Ｌ−グルタミン及びＬ−重炭酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ＤＭＥＭはカタログ番号５０−００３−ＰＢを１３．４８ｇ／Ｌで１０Ｌ調製し、ハムＦ１２培地はカタログ番号５０−０４０−ＰＢを１０．６４ｇ／Ｌで１０Ｌ調製する。）１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ−０２）、２００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４５４４）（１００ｍｇ／ｍＬストック溶液の１ｍＬを５００ｍＬの培地に添加）。
無血清培地：血清及びアスコルビン酸を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２。
１．遺伝子が改変された（gene-corrected）ＲＤＥＢ線維芽細胞をＰ１５０プレート、２０ｍＬの増殖培地でコンフルエントになるまで増殖させる。
２．朝（例えば月曜日の朝）に無血清培地１５ｍＬを添加する。
３．翌日の午後に培地を回収し、前記細胞に２０ｍＬの増殖培地を添加する（火曜日の午後）。
４．２日後、朝に再度無血清培地を添加する（木曜日の朝）。
５．前記培地を再度翌日午後（金曜日午後）に回収する。
６．このサイクルを次の月曜日から少なくとも３ないし４ヶ月、細胞が剥離するまで繰り返す（ときには、細胞は６ヶ月間も継続して大量のＶＩＩ型コラーゲンを分泌する）。
遺伝子が改変された線維芽細胞の無血清培地は、約４ないし８ｍｇ／ＬのＶＩＩ型コラーゲンを含む。精製後、１リットルの培地から０．７ないし１ｍｇのＶＩＩ型コラーゲンが通常得られた。
【００８９】
ＶＩＩ型コラーゲンの精製
材料
硫酸アンモニウム
ＥＤＴＡ、５００ｍＭ、ｐＨ８
ＮＥＭ：１００ｍＭ
ＰＭＳＦ：１００ｍＭ
Ｑセファロース（商標）ファーストフロー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−０５１０−０１）
１×バッファーＡ：    ６５ｍＭ  ＮａＣｌ
２５ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ８．６
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
２Ｌの１０×バッファーＡ：  ７６．１１ｇ  ＮａＣｌ
２５０ｍＬ    ２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６
４０ｍＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
バッファーＢ：    ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
５ｍＭ  ＥＤＴＡ
バッファーＣ：    ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５
２Ｍ  尿素
０．５Ｍ  ＮａＣｌ
第１日
１．細胞ならし培地を回収し、細胞残渣を除去するために３０００ｒｐｍ１０分間４℃で遠心する。
２．回収された体積（回収された全培地）を測定する。
３．阻害剤：５ｍＭ  ＥＤＴＡ（１００倍）、５０μＭ  ＮＥＭ及び５０μＭ  ＰＭＳＦ（２０００倍）を添加する。
４．氷上で硫酸アンモニウムを０．３ｇ／ｍＬになるようにゆっくりと添加する。
５．終夜４℃で攪拌する。
【００９０】
第２日
６．ベックマンＪ２−Ｍ１ローター１４で１３．０００ｒｐｍ、１．５−２時間遠心する。
７．上清を除去し、ペレットを１０−１５分間風乾させる。
８．ペレットをバッファーＡに溶解さｓる。回収体積５０ｍＬあたり１ｍＬのバッファーを用いる。
９．脱イオン水で透析膜をリンスする。
１０．１×バッファーＡに対して３回透析する。１回に２Ｌ用意し、２時間ごとに交換する。最後の交換後終夜透析する。透析液には１ｍＬのＮＥＭ及びＰＭＳＦを添加する。
【００９１】
第３日
１１．透析された培地を２０分間９Ｋで遠心沈殿する。体積変化に留意する。
１２．上清（Ｓ１）を除去し、別の試験管に入れる。
１３．ペレットを透析体積と等量のバッファーＢに再懸濁させる。
１４．約１０分間実験台上で静置する。
１５．９Ｋ２０分間遠心する。
１６．上清（Ｓ１’）を除去し、別の試験管に入れる。
１７．前記ペレットを２ｍＬのバッファーＣに再懸濁し、９Ｋ２０分間遠心し、上清（Ｓ２）を回収する。ＶＩＩ型コラーゲンは全ての画分に異なる純度で存在するであろう。Ｓ１画分はＶＩＩ型コラーゲンの約５０％を含むが、純度は非常に低い。典型的には、Ｓ１画分はこれ以降の精製には用いられない。良好な透析では、大半のコラーゲンはＳ１’画分により高い純度で存在するであろう。最適とはいえない透析では、大半がＳ１画分になり、非常に純度が低い。典型的には、Ｓ１’画分がさらなるＱ−セファロースカラム精製に供される。
【００９２】
Ｓ１’画分からのＶＩＩ型コラーゲンカラム精製
１８．カラムをセファロースビーズで充填し（ビーズは使用前に振盪させて溶液に懸濁しなければならない）、所望の体積になるまで沈殿させる。
カラム体積はＳ１’由来サンプルの装架体積の約１／２とすべきである。
１９．前記カラムは乾いてしまわないようにすべきである。バッファーＢをカラム体積の５倍量洗浄する（したがって、カラム体積が４ｍＬの場合はバッファーＢ２０ｍＬで洗浄する）。
２０．カラム体積と等量の洗浄用試験管及び溶出用試験管を用意する。
２１．（対照実験用にゲル電気泳動するため、）タンパク質サンプル２００μＬを小エッペンドルフ試験管に取り分けて、氷上で保存する。
２２．試験管にラベルを付ける。２×洗浄液（バッファーＢ）、０．３Ｍ、０．４Ｍ及び１．０Ｍ。「２×」と表示される全ての液はカラム体積の２倍の体積であることを意味する（したがって、カラム体積が４ｍＬの場合は８ｍＬ用いる）。カラム表面を過剰に乱さないように注意して、サンプルをカラムに装架する。「素通り」とラベルされた試験管を配置して、素通り画分を回収する。
２３．全てを氷上で保持する。前記サンプルが１回流し終わったら、素通り画分を装架して、「素通り」とラベルされた試験管で素通り画分を回収する。
２４．カラムが乾く前に、バッファーＢで２回洗浄し、「洗浄」とラベルされた試験管で回収する（したがって、４ｍＬならバッファーＢは８ｍＬ）。１．０Ｍ  ２×洗浄液（バッファーＢ）、２×０．３Ｍ、２×０．４Ｍ及び１．０Ｍ  Ａ、１．０Ｍ  Ｂを用いて、塩濃度を上げながら溶出を続け、停止させる（備考：大半のＣ７は１．０Ｍで溶出する）。先頭に２×と付される全てはカラム体積の２倍量を意味する（したがって、カラム体積が４ｍＬの場合は８ｍＬを用いる）。
２５．阻害剤ＰＭＳＦ及びＮＥＭの１：１００倍希釈液を各溶出用試験管に添加する（したがって、４０ｍＬの場合には４０μＬを用いる）。大半のＣ７は０．５−１Ｍ溶出画分に溶出するであろう。
２６．ゲル電気泳動のためのサンプルを作成する（ゲルは一度に９個のサンプルしか電気泳動できない）。９本の小エッペンドルフ試験管×２組（１組はウェスタンブロッティング用、もう１組はクーマジー染色用）に、装架、素通り、０．３、０．４・・・１．０Ｍとラベルする。
２７．装架用色素を作成する：１２μＬＢＭＥ／１００μＬ４×サンプルバッファー→ボルテックス攪拌
２８．前記色素の１０μＬを全ての試験管に添加する。
２９．１０μＬのサンプルをＥＣＬ用に、４０μＬをクーマジーブルー用に試験管に添加する。
３０．回収された画分をウェスタンブロッティング解析用と、クーマジーブルー染色用との両方のために６％アクリルアミドゲル上で電気泳動する。
【００９３】
ＶＩＩ型コラーゲンの濃縮及び濾過
１．０．５、０．７及び１．０Ｍ溶出液からのＶＩＩ型コラーゲン画分を混合してバッファーＢで３倍に（例えば、１７ｍＬを５０ｍＬに）希釈する。
２．希釈された画分５０ｍＬを１．５ｍＬのＱ−セファロースカラムに２回装架する。
３．１．５ｍＬのバッファーＢでカラムを２回洗浄する。
４．（試験管を１．０Ａ、１．０Ｂ及び１．０Ｃとラベルして）塩濃度１．０ＭのバッファーＢで３回カラムを溶出する。
５．濃縮液をＰＢＳで透析する。
６．０．２μＭのＳｕｐｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過する。
７．−８０℃の冷凍庫で保存する。
【００９４】
その他の実施態様は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【００９５】
他の実施態様
１．コラーゲン７を製造する方法であって、
コラーゲン７又はその機能的断片と、任意的に、コラーゲン７の発現を増大させる１種類以上のポリペプチド、例えば、プロリダーゼとを発現するように組換え技術で操作された細胞を提供すること、及び
コラーゲン７及びプロリダーゼの産生に十分な条件で前記細胞を培養することを含み、これにより、コラーゲン７を製造する、方法。
【００９６】
２．前記細胞はグリコシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝的に操作される、実施態様１に記載の方法。
【００９７】
３．前記グリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼである、実施態様２に記載の方法。
【００９８】
４．前記細胞は、コラーゲン７又はその機能的断片、例えば、本明細書に説明される高グリシンコドン最適化核酸配列をコードする外来導入核酸を含む、実施態様１に記載の方法。
【００９９】
５．前記細胞は、プロリダーゼをコードする外来導入核酸を含む、実施態様１に記載の方法。
【０１００】
６．前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする外来導入核酸を含む、実施態様１に記載の方法。
【０１０１】
７．コラーゲン７をコードする配列を含む発現ベクターを含む、実施態様１に記載の方法。
【０１０２】
８．前記細胞は、プロリダーゼをコードする配列を含む第２の発現ベクターを含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０３】
９．前記細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む第３の発現ベクターを含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０４】
１０．前記細胞は、プロリダーゼをコードする配列を含む第２の発現ベクターと、グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む第３の発現ベクターとを含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０５】
１１．前記発現ベクターは、プロリダーゼをコードする配列をさらに含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０６】
１２．前記発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列をさらに含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０７】
１３．前記発現ベクターは、プロリダーゼをコードする配列と、グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列とをさらに含む、実施態様７に記載の方法。
【０１０８】
１４．前記細胞は哺乳類細胞である、実施態様１に記載の方法。
【０１０９】
１５．前記細胞はＣＨＯ細胞である、実施態様１に記載の方法。
【０１１０】
１６．前記細胞はＨＥＫ２９３細胞である、実施態様１に記載の方法。
【０１１１】
１７．前記コラーゲン７はヒトコラーゲン７である、実施態様１に記載の方法。
【０１１２】
１８．前記プロリダーゼはヒトプロリダーゼである、実施態様１に記載の方法。
【０１１３】
１９．前記グリコシルトランスフェラーゼはヒトグリコシルトランスフェラーゼである、実施態様２に記載の方法。
【０１１４】
２０．コラーゲン７又はその機能的断片を前記培養細胞から回収することをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
【０１１５】
２１．前記コラーゲン７又はその機能的断片が培養液から回収される、実施態様１に記載の方法。
【０１１６】
２２．コラーゲン７又はその機能的断片を前記培養細胞から精製することをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
【０１１７】
２３．コラーゲン７又はその機能的断片を培養液から精製することをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
【０１１８】
２４．前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％がホモ３量体に取り込まれる、実施態様２３に記載の方法。
【０１１９】
２５．前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％が６量体に取り込まれる、実施態様２３に記載の方法。
【０１２０】
２６．本明細書に説明されるベクター。
【０１２１】
２７．本明細書に説明されるベクターを少なくとも２個含む、ベクターの組合せ。
【０１２２】
２８．本明細書に説明される細胞。
【０１２３】
２９．本明細書に説明される細胞の単離標品。
【０１２４】
３０．前記実施態様のいずれかに記載の細胞と、培養液と、前記細胞により産生されるコラーゲン７とを含む、細胞培養物。
【０１２５】
３１．コラーゲン７又はその機能的断片を発現するのに適する細胞を作成する方法であって、
組換えコラーゲン７又はその機能的断片を発現するように前記細胞を組換え技術で操作すること、及び、
任意的に、組換えプロリダーゼを発現するように前記細胞を組換え技術で操作することを含み、これにより、組換えコラーゲン７又はその機能的断片を発現するのに適する細胞を作成する、方法。
【０１２６】
３２．組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞が組換え技術で操作される前に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現するように前記細胞が組換え技術で操作される、実施態様３１に記載の方法。
【０１２７】
３３．組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞が組換え技術で操作された後に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現するように前記細胞が組換え技術で操作される、実施態様３１に記載の方法。
【０１２８】
３４．組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞が組換え技術で操作されるのと同時に、コラーゲン７又はその機能的断片を発現するように前記細胞が組換え技術で操作される、実施態様３１に記載の方法。
【０１２９】
３５．コラーゲン７又はその機能的断片を発現するように前記細胞が組換え技術で操作される前に、組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞が組換え技術で操作される、実施態様３１に記載の方法。
【０１３０】
３６．組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞を組換え技術で操作することをさらに含む、実施態様３１に記載の方法。
【０１３１】
３７．コラーゲン７又はその機能的断片を組換え技術で発現するように前記細胞を操作する前か、後か、同時かに、組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現するように前記細胞が組換え技術で操作される、実施態様３１に記載の方法。
【０１３２】
３８．本明細書に説明される方法により製造される、コラーゲン７又はその機能的断片。
【０１３３】
３９．本明細書に説明される方法により製造される、コラーゲン７又はその機能的断片の精製又は単離標品。
【０１３４】
４０．前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％がホモ３量体に取り込まれる、コラーゲンの単離又は精製標品。
【０１３５】
４１．前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％が６量体に取り込まれる、コラーゲンの単離又は精製標品。
【０１３６】
４２．コラーゲン７又はその機能的断片を精製する方法であって、
条件付けられた（ならし）細胞培養液を提供すること、
タンパク質を例えば硫酸アンモニウムで沈殿すること、
沈殿した前記タンパク質を可溶化すること、
可溶化した前記タンパク質を透析すること、
透析された前記サンプルを遠心して上清を形成すること、及び、
例えば、Ｑセファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに前記上清を供することを含み、これにより、コラーゲン７又はその機能的断片を精製する、方法。
【配列表】
2017209117000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月6日(2017.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
前記コラーゲン７又はその機能的断片の少なくとも３０％がホモ３量体に取り込まれる、請求項１から１３いずれか１項記載の方法。