(57)【要約】【課題】溶液中に存在する標的物質、特に抗体を効率良く短時間で吸着するに十分な結合力を有しており、かつ、標的物質に対して温和な条件、すなわち非侵襲な刺激により、吸着した標的物質を脱離することが可能な複合刺激応答性親和力制御型高分子を提供する。【解決手段】標的物質を吸着及び脱離可能な複合刺激応答性親和力制御型高分子であって、第１の刺激に応答しコンフォメーションが変化する高分子鎖と、前記高分子鎖に結合した複数種のリガンドとを有し、前記複数種のリガンドのうちの少なくとも一種が、第２の刺激により前記標的物質との結合力が変化するものであることを特徴とする。【選択図】図２
2017209604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を吸着及び脱離可能な複合刺激応答性親和力制御型高分子であって、
第１の刺激に応答しコンフォメーションが変化する高分子鎖と、前記高分子鎖に結合した複数種のリガンドとを有し、
前記複数種のリガンドのうちの少なくとも一種が、第２の刺激により前記標的物質との結合力が変化する、
前記複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項２】
複数種のリガンドが、標的物質に対して互いに異なる結合機構を介して結合するリガンドであり、
結合機構の一つが共有結合である、
請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項３】
共有結合がエステル結合である請求項２に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項４】
エステル結合を介して結合するリガンドが、ボロン酸である請求項３に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項５】
複数種のリガンドのうちの一種が、トリアジン誘導体である請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項６】
複数種のリガンドのうちのボロン酸以外の一種が、トリアジン誘導体である請求項４に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項７】
リガンドが二種類である請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項８】
各リガンドをそれぞれ１個有する請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項９】
高分子鎖に複数種のリガンドが離散的に結合している請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１０】
第１の刺激が温度変化である請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１１】
第２の刺激が化学物質である請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１２】
第２の刺激が、ジオールを構造中に有する化学物質である請求項４に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１３】
高分子鎖が、ポリ（Ｎ−置換アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−置換メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−二置換アクリルアミド）及びポリ（Ｎ，Ｎ−二置換メタクリルアミド）からなる群から選択される化学構造を含む請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１４】
標的物質が抗体である請求項１に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合刺激応答性親和力制御型高分子が、担体に結合してなる吸着材。
【請求項１６】
請求項１５に記載の吸着材が充填されたカラムに、前記標的物質及び不純物を含む溶液を通し、前記標的物質を前記吸着材に結合させる吸着工程と、
第１の刺激を与えて高分子鎖のコンフォメーションを変化させ、第２の刺激を与えてリガンドと前記標的物質との結合力を変化させることにより前記標的物質を脱離させる脱離工程と
を有する、標的物質の精製方法。
【請求項１７】
第１の刺激が温度変化であり、第２の刺激が糖を含有する溶出液の通液である請求項１６に記載の標的物質の精製方法。
【請求項１８】
標的物質が抗体である請求項１６に記載の標的物質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合刺激応答性親和力制御型高分子、吸着材及び標的物質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的物質、特にタンパク質に代表される生体分子を溶液中から回収・精製するプロセスは、バイオプロセスの基本工程としてその重要度が増している。特に、抗体医薬の進歩に伴い、培養液から目的とする抗体を劣化させることなく高効率・低コストで回収・精製する技術が求められている。
【０００３】
吸着材が有するリガンドと標的物質との間のアフィニティ（親和力）により、標的物質を固相に吸着させる原理に基づくアフィニティ精製は、溶液中に存在する標的物質の吸着材への吸着、非吸着成分の洗浄、溶離液による標的物質の吸着材からの脱離、の各工程からなる。このとき、溶離液としては、しばしば強酸や強塩基性の溶液が用いられる。これは、リガンドや標的物質のイオン化状態を変え、電荷反発によりリガンドと標的物質の間の相互作用を弱める必要があるためである。しかし、強酸や強塩基のような過酷なｐＨ環境では、しばしば生体分子は不安定となり、精製された標的物質が劣化することが問題となっている。また、リガンドやカラム材の劣化の懸念もある。
【０００４】
そこで、リガンドを改良し、温和なｐＨ条件で生体分子を精製可能としたアフィニティカラム用吸着材料が開発されている。特許文献１では、遺伝子組換えにより温和な酸で応答するようにプロテインＡを改変している。このように、リガンドがタンパク質である場合には、遺伝子組換え等の技術を適用することによって、応答するｐＨ値を調整することが比較的容易である。しかしながら、温和な酸性条件であっても、標的物質が抗体である場合には抗体が少なからず会合することがある。そのため、抗体医薬の精製プロセスにおいては、精製後に会合した抗体を除去するプロセスが必要となる場合が多い。
【０００５】
さらに、タンパク質由来のリガンドに比べて、より低コストである低分子リガンドでは、標的物質と相互作用する部位が小さいため、応答するｐＨ値の調整のために化学構造を修飾可能な部位が少なく、応答性を調整する自由度は低い（非特許文献１）。低分子リガンドとアミンを共重合させることでリガンド近傍の局所ｐＨを摂動させる報告があるが（非特許文献２）、一般的に適用可能な手法ではない。
【０００６】
リガンドを、温度に応答してコンフォメーションが変化する高分子鎖に結合することで、温度に応答して標的物質との結合及び脱離を制御する技術も報告されている。本手法は、ｐＨ条件を変化させることなく、ほぼ中性のｐＨ条件下で動作させることが可能な場合があり、標的物質の劣化リスクを回避できる可能性がある。例えば、特許文献２には温度応答性ポリアミノ酸に、非特許文献３にはマイクロ粒子表面における温度応答性高分子鎖であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）に、それぞれプロテインＡをリガンドとして固定化した吸着材料が開示されている。また、非特許文献３には低分子リガンドとして４−メルカプトエチルピリジンを結合させてなる吸着材料が開示されている。いずれにおいても、高分子鎖が伸長したコンフォメーションを有する低温条件では標的物質である抗体が吸着し、温度上昇によりコンフォメーションを凝集した状態に変化させることで吸着した抗体が脱離可能となることが示されている。
【０００７】
本手法は、温度変化による高分子鎖のコンフォメーションの収縮により、リガンドと抗体との立体的配置が制限される、すなわち立体障害が増加することにより、リガンドと抗体との結合が解離することを動作原理としている。すなわち、リガンドと標的物資との結合エネルギーは吸着工程、脱離工程を通して基本的に一定である。そのため、リガンドと標的物質との結合エネルギーが、温度変化に伴うコンフォメーションエネルギーの変化より大きい場合には、結合した標的物質の脱離が困難となる。一方、脱離が可能となるように標的物質との結合力が小さいリガンドを選択した場合、溶液中に存在する標的物質を十分に吸着できず、また、吸着に長時間を要するという課題を生じ、その結果、精製過程の効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−８１８６６号公報
【特許文献２】特開２０１４−２１９２４５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal of Chromatography B, 2000, 740, 1-15.
【非特許文献２】Chemical Science, 2012, 3, 1467-1471.
【非特許文献３】Biomacromolecules, 2016, 17, 280−290.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法では、溶液中に存在する標的物質、特に医薬として有益な抗体を、標的物質にダメージを及ぼすことなく、効率良く回収・精製することができないという課題が存在する。上記したように温度応答性高分子鎖を用いる方法は、標的物質を劣化させることなく固定・精製・脱離することで精製を行うことができるが、高効率な精製に不可欠である結合力と脱離性の両立が困難である。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、目的とするところは、溶液中に存在する標的物質、特に抗体を効率良く短時間で吸着するに十分な結合力を有しており、かつ、標的物質に対して温和な条件、すなわち非侵襲な刺激により、吸着した標的物質を脱離することが可能な複合刺激応答性親和力制御型高分子を提供することにある。また、その高分子を用いた吸着材、並びにその吸着材を用いて標的物質を高効率で精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討した結果、刺激に応答してコンフォメーションが変化する高分子鎖に、標的物質と会合する複数のリガンドを配置し、その複数のリガンドのうちの一種を、上記とは別の刺激により標的物質との結合力が変化するようなリガンドとしたマルチリガンド・マルチレスポンス型の複合刺激応答性親和力制御型高分子により、上記課題が解決されることを見出し、発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、標的物質を吸着及び脱離可能な複合刺激応答性親和力制御型高分子であって、第１の刺激に応答しコンフォメーションが変化する高分子鎖と、前記高分子鎖に結合した複数種のリガンドとを有し、前記複数種のリガンドのうちの少なくとも一種が、第２の刺激により前記標的物質との結合力が変化するものであることを特徴とする。また、本発明者らは、上記の複合刺激応答性親和力制御型高分子を担体に固定化した吸着材、並びに本吸着材を充填したカラムを用いた標的物質の効率的精製工程の発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１４】
本発明による複合刺激応答性親和力制御型高分子を用いることで、溶液中の標的物質を効率良く吸着・固定化することができ、また、標的物質に対して影響を及ぼさない温和な刺激により固定化した標的物質を脱離し溶出・回収することが可能となる。なお、上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】担体に結合した状態にある本発明の一実施形態に係る複合刺激応答性親和力制御型高分子の構造を模式的に示した図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る複合刺激応答性親和力制御型高分子により標的物質（抗体）を捕捉、吸着、脱離する工程を示した模式図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る複合刺激応答性親和力制御型高分子が表面に結合してなる吸着材の構造を模式的に示した図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る吸着材が充填された精製カラムを模式的に示した図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る複合刺激応答性親和力制御型高分子が表面に結合してなる吸着材を充填した精製カラムを用いて標的物質（抗体）を回収・精製する工程を示した模式図である。
【図６】実施例における複合刺激応答性親和力制御型高分子の合成スキームである。
【図７】ＳＰＲ法により測定した、ヒトＩｇＧ固定基板に対する複合刺激応答性親和力制御型高分子（Ｐｏｌｙｍｅｒ５）の吸着・脱離曲線である。
【図８】複合刺激応答性親和力制御型高分子が有するリガンド種並びにＰＮＩＰＡＭの平均重合度が、ヒトＩｇＧとの解離定数Ｋｄに及ぼす影響を示すグラフである。
【図９】フェニルボロン酸及びＰＡＭ２をリガンドとして有する複合刺激応答性親和力制御型高分子とヒトＩｇＧとの解離定数Ｋｄに及ぼす温度とグルコース添加の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について、図面等を適宜参照し説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において様々な変更及び修正が可能である。本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、以下の説明においては、標的物質として抗体を例とするが、本発明が対象とする標的物質はこれに限定されるものではない。生体分子や過酷なｐＨ条件で不安定な分子であれば、本発明の特徴を活かすことができる。さらに、本発明の概念を明瞭にするために、以下の説明及び図面においては複合刺激応答性親和力制御型高分子として、２種類のリガンドをそれぞれ１つ高分子鎖に結合させたデュアルリガンド型を好適な例として挙げる。しかしながら、本発明による複合刺激応答性親和力制御型高分子の化学構造はこれに限定されるものではない。
【００１７】
図１を適宜参照し、本発明の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０について説明する。図１は複合刺激応答性親和力制御型高分子１０の構造を模式的に示した図である。複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は、高分子鎖１１に、抗体に代表される標的物質と結合する能力を有する複数種のリガンドが結合して構成される。また、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は担体２０と結合する固定部１４を有する。複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が担体２０に固定化されることで全体として吸着材として機能する。
【００１８】
本実施形態では、標的物質に対して互いに異なる結合機構を介して結合する複数種のリガンドが同一の高分子鎖１１に結合してなる、すなわちマルチリガンド型であることを特徴とする。図１は、種類の異なる第１のリガンド１２と第２のリガンド１３がそれぞれ１つ、高分子鎖１１に結合したデュアルリガンド型の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を例示する。しかしながら、リガンド種の数、並びに高分子鎖１１に結合するリガンドの個数は特に制限されるものではなく、標的物質の結合部位の種類並びに配置に対応するように適宜選択すれば良い。一般にタンパク質や抗体等のバイオ物質は、特定の化学的・立体的構造を有し、リガンドとの結合能を有する結合部位が一義的に配置されている。そのため、高分子鎖が有するリガンド種、個数、並びに配置は標的物質の結合部位とその配置に相対するように決定することが望ましい。
【００１９】
高分子鎖１１は、刺激に応答してそのコンフォメーションが変化する機構を有する刺激応答性高分子鎖からなる。刺激としては、標的物質を劣化させない、もしくは標的物質に対する影響が少ない温和なものであれば特に限定されるものではなく、光、磁場、電場、超音波、温度等の物理的刺激、ｐＨ、塩濃度等の化学的刺激が好適な刺激として例示される。特に、刺激の印加が容易である点で温度変化を用いるのが望ましい。
【００２０】
以下、高分子鎖１１のコンフォメーションを変化させる刺激を温度とした場合を例に説明を行うが、本発明において高分子鎖１１のコンフォメーションを変化させる刺激は温度に限定されるものではない。他の刺激を適用する場合においてはその刺激に応答するよう高分子鎖１１の化学構造を決定すれば同様に用いることが可能である。
【００２１】
親水性の高分子は、水溶液中において水和により高分子鎖が広がったコンフォメーション、いわゆるコイル状のコンフォメーションをとる。一方、疎水性の高分子鎖は、脱水和により高分子鎖が凝集し、いわゆるグロビュール状のコンフォメーションとなる。温度応答性高分子鎖は、水系溶液中において温度の変化に応答して親・疎水性等の物理化学的特性が変化しコンフォメーション転移を引き起こす高分子である。温度応答性高分子は、その温度転移特性により低臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）型と高臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）型とに分類される。ＬＣＳＴ型の温度特性を有する高分子は、温度がＬＣＳＴより低い温度からＬＣＳＴを通過するときに親水性コンフォメーションから疎水性コンフォメーションへと変化する。ＵＣＳＴ型の温度特性を有する高分子は、温度がＵＣＳＴより低い温度からＵＣＳＴを通過するときに疎水性コンフォメーションから親水性コンフォメーションへと変化する。ＬＣＳＴ及びＵＣＳＴの厳密な値は、高分子鎖及び他の適用条件（溶媒、他の溶質、等）によって決まることが知られている。本発明に用いる場合、温度応答性高分子鎖が有する特性はＬＣＳＴ型あるいはＵＣＳＴ型のどちらであっても良い。
【００２２】
温度応答性高分子鎖としては種々の化学構造をもつものが知られているが、本発明に適用する場合、臨界溶液温度が、標的物質、すなわち抗体等の劣化が起こらない温度範囲内、すなわち非凍結温度〜５０℃の範囲内にあることが望ましい。このような特性を有する温度応答性高分子鎖としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をはじめとするポリ（Ｎ−置換アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）をはじめとするポリ（Ｎ−置換メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−二置換アクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−二置換メタクリルアミド）、ポリメチルビニルエーテル、ポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）共重合体、部分けん化ポリビニルアルコールをはじめとするポリビニルアルコール誘導体、及びメチルセルロースをはじめとするセルロース誘導体等が挙げられる。特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）は、その特性が詳しく調べられており、また臨界溶液温度が３３℃であることから温度制御が容易な点において好適な高分子鎖として挙げられる。
【００２３】
次に、リガンドについて説明する。リガンドとは、標的物質が有する結合部位に特異的に吸着する化学的・物理的特性や構造を有する原子集団である。リガンドは結合部位に応じてさまざまの種類のものが存在するが、大別して、タンパク質もしくは改変タンパク質に由来するものと、化学的に合成した低分子化合物からなるものがある。タンパク質由来のリガンドは、一般的に鍵と鍵穴の関係として記述されるほど特異性が高く、標的物質と強固に結合する。一方、結合の解離はリガンドが変性するような過酷な条件下で行うことが必要な場合が多く、標的物質の劣化が懸念される。一方、低分子リガンドはタンパク質由来のリガンドと比較して特異性が劣る場合が多いが、分子設計により、マイルドな刺激により結合を解離するものを合成することができる。また、一般的に、タンパク質由来のリガンドと比較して低価格である。本発明に適用するリガンドは特に制限されるものではないが、標的物質を劣化させることなく回収できる点において、低分子リガンドを用いることが望ましい。低分子リガンドには、標的物質の結合部位に対して物理的結合に代表される非共有結合を介して結合するものと、共有結合を形成して結合するものがある。
【００２４】
非共有結合を介して標的物質と結合する低分子リガンドとしては、例えば、３−チア−６−ピリジルヘキシルビニルスルホン、３−チア−６−アリールヘキシルビニルスルホン、３−オキサ−６−ピリジルヘキシルビニルスルホン、３−オキサ−６−アリールヘキシルビニルスルホン、３−アザ−６−ピリジルヘキシルビニルスルホン、３−アザ−６−アリールヘキシルビニルスルホン、ピリジルオリゴエチレングリコールビニルスルホン、アリールオリゴエチレングリコールビニルスルホン、（３−ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（４−ヒドロキシフェニルエチルアミノ）トリアジン誘導体、（４−ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（フェニルアミノ）トリアジン誘導体、（４−ヒドロキシ−１−ナフチルアミノ）（３−ヒドロキシフェニルアミノ）トリアジン誘導体、ミメティックレッド、ミメティックオレンジ、ミメティックイエロー、ミメティックグリーン、ミメティックブルー、ＴＧ１９３１８、ポリペプチド類、ペプチドデンドリマー類、プロテインＡ部分構造、プロテインＡ模倣構造、プロテインＧ部分構造、プロテインＧ模倣構造、レクチン、糖誘導体等が挙げられる。
【００２５】
共有結合を介して標的物質と結合する低分子リガンドとしては、アスパラギン残基上の糖鎖と共有結合するフェニルボロン酸や、ロドプシンと共有結合するレチナール等が例示される。
【００２６】
本実施形態に係る複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は、標的物質との結合機構が異なる複数種のリガンドを有することを特徴とするが、ここでは、２種のリガンドをそれぞれ１つ有するデュアルリガンド型を例として説明を続ける。高分子鎖１１に結合した第１のリガンド１２と第２のリガンド１３は、標的物質に対して異なった結合機構で結合する能力を有するものを採用することが望ましい。一般に、タンパク質に代表される生体分子は、一義的に決まった高次構造を有し、分子内の特定の部位が特定のリガンドと特異的に結合することが知られている。標的物質が有する結合部位とリガンドとの間の結合機構は、化学的な結合である共有結合、非共有結合である物理的な水素結合、イオン結合、ファンデル・ワールス力による結合、疎水性結合等からなる。本実施形態における第１のリガンド１２と標的物質間、第２のリガンド１３と標的物質間のそれぞれの結合は、その主たる結合機構が異なることを特徴とする。なお、主たる結合機構の組み合わせは特に制限されないが、少なくとも一つの結合機構は共有結合を主要因とする結合であることが望ましい。これは、共有結合が非共有結合と比較して結合エネルギーが大きく、標的物質と強固に結合する能力を有するためである。
【００２７】
第１のリガンドもしくは第２のリガンドのうち少なくとも一方は、高分子鎖１１のコンフォメーション変化を誘起する刺激とは別の種類の刺激により、標的物質との結合力が変化することを特徴とする。例えば、温度刺激によりコンフォメーション変化が誘起される温度応答性高分子を高分子鎖１１として適用した場合、第１のリガンドもしくは第２のリガンドのうち少なくとも一方は、温度以外の刺激、例えば化学物質、塩濃度やｐＨ等により標的物質との結合状態が変化するものを適用することが望ましい。このように複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を複数の刺激に応答するマルチレスポンス型とすることで、強固に結合した標的物質を、温和な刺激を複合的に作用させるにより効率的に脱離させることが可能となる。
【００２８】
標的物質として免疫グロブリン（ＩｇＧ）を対象とした場合を例に、リガンドと標的物質の結合部位の組み合わせについてさらに詳述する。ＩｇＧはＦａｂ部位とＦｃ部位からなることが知られている。ここで、改変タンパクリガンドであるプロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ部位のＣＨ２−ＣＨ３領域に物理的相互作用による非共有結合によって結合することが知られている。そのため、プロテインＡの構造を模倣したトリアジン誘導体系低分子リガンドも、この領域と非共有結合により結合する。また、ＩｇＧのＣＨ２領域のＮ２９７サイトに存在するアスパラギン残基に結合した糖鎖は、エステル結合、すなわち化学的結合によりリガンドと結合を形成することができる。ここで、アスパラギン残基上の糖鎖と結合する好適なリガンドとしてフェニルボロン酸等のボロン酸を例示できる。フェニルボロン酸は、糖鎖とボロン酸エステル結合を形成するだけでなく、その結合は、系にジオールを有する化合物、例えばグルコース等の糖類を置換物質として添加することで解離させることができる。
【００２９】
このように、温度応答性の高分子鎖１１に、第１のリガンド１２としてプロテインＡ模倣構造を有するトリアジン誘導体系低分子リガンドを、第２のリガンド１３としてアスパラギン残基に結合した糖鎖とエステル結合を形成するようなフェニルボロン酸基を結合したデュアルリガンド型の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は、高分子鎖のコンフォメーションを変化させる温度刺激と、第２のリガンド１３と標的物質であるＩｇＧとの化学結合を切断する置換物質の添加に応答し、ＩｇＧとの結合力が変化するマルチレスポンス特性を示すことになる。
【００３０】
図１に模式的に示すように、第１のリガンド１２及び第２のリガンド１３は、高分子鎖１１に化学結合により結合している。ここで、第１のリガンド１２と第２のリガンド１３は、標的物質と結合する際に、それぞれのリガンドが選択的に結合する標的物質の結合部位の配置と相対するように、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０の分子構造を設計することが望ましい。すなわち、標的物質と結合した状態において、高分子鎖１１における第１のリガンド１２と第２のリガンド１３間の距離が、標的物質における結合部位間の距離と同等となるように、高分子鎖１１の分子量や高分子鎖１１に対する各リガンドの配置を調整すると良い。例えば先に示したように、第１のリガンドとしてトリアジン誘導体系低分子を、第２のリガンドとしてフェニルボロン酸基を用いた場合、それぞれのリガンドが結合するＩｇＧの結合部位が特定される。そこで、ＩｇＧの立体構造解析データに基づき、両結合部位と両リガンドが安定的に相対して会合するように、高分子鎖１１上にトリアジン誘導体系低分子とフェニルボロン酸基を配置することが望ましい。このような分子構造を採用することにより、標的物質と複合刺激応答性親和力制御型高分子１０とが第１のリガンド１２及び第２のリガンド１３を介して結合した際の自由エネルギーが小さくなり、標的物質との強固な結合が可能となる。なお、水溶液中における高分子鎖のコンフォメーションはコイル状のコンフォメーションをとっており、リガンド間の距離は必ずしも高分子鎖が伸びた状態における値とはならない。複合刺激応答性親和力制御型高分子１０の分子構造を設計する際にはこの点に留意することが必要である。
【００３１】
複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は、担体２０に対して結合可能な固定部１４を有することが望ましい。固定部１４の化学構造は、担体２０の材質や固定機構に応じて最適なものを適宜選択することができる。例えば、担体２０がガラスに代表される無機物質の場合にはアルコキシシラン基や水酸基を、金等の金属の場合にはチオール基を用いることができる。また、担体２０が有機物の場合には、化学的に活性化した担体表面と共有結合を形成する官能基を用いることができる。例えば、固定部１４をアミノ基とした場合、担体表面を活性化してカルボン酸基を導入し、カルボジイミドを介して結合することが可能である。また、チオール−エン反応を用いたクリック結合等も用いることができる。なお、図１に示した複合刺激応答性親和力制御型高分子１０では、固定部１４が高分子鎖１１の末端に存在するよう図示されているが、固定部１４の位置はこれに限るものではない。固定部１４が高分子鎖１１の端部ではなく、中間部に存在していても良い。また、高分子鎖１１にリンカや第２の高分子鎖等を介して間接的に結合した、いわゆるスター状の構造であっても何ら問題はない。この際、第２の高分子鎖は刺激応答性である必要はない。
【００３２】
複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は適当な重合方法により合成すれば良いが、標的物質の構造に対応するように、可能な限り主鎖の分子量分布が小さく、かつリガンドや固定部の数・配置が一義的に決まった高分子が得られる精密重合法を適用することが望ましい。精密重合によると構造が一義的に決まった機能性高分子の合成が可能であり、特にリビング重合を用いると、高分子主鎖の分子量分布が小さくできるだけではなく、幅広い機能性基の導入と機能基の位置制御までもが可能である。例えば高分子鎖１１をＰＮＩＰＡＭとした場合、リビング重合法の一種である原子移動ラジカル重合法（Atom Transfer Radical Polymerization法）を用いることで分子量分布が非常に小さい単分散ポリマーを得ることができる。また、重合反応開始剤や反応性リビングポリマー末端等を適宜活用することでリガンドや固定部を一義的に導入することができる。なお、温度応答性高分子の場合、主鎖の分子量分布が小さくすると温度変化に伴うコンフォメーション転移がよりシャープに発現するという利点もある。このような挙動は、温度刺激により標的物質の吸脱着を行う際に、吸着と脱離の制御が明確となるため好適である。そのため、高分子鎖１１の数平均分子量Ｍｎに対する重量平均分子量Ｍｗの比は、１．０１以上１．４０以下、好ましくは１．０１以上１．３０以下、特に１．０１以上１．２０以下であることが望ましい。
【００３３】
次に、図２を適宜参照し、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を担体２０に固定化した吸着材を用いて標的物質を捕捉、結合、脱離するプロセスについて、引き続きデュアルリガンド型の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を適用する場合を例に説明する。以後の説明では、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は、温度刺激に応じてコンフォメーションが変化する高分子鎖１１、標的物質３０（抗体）の第１の吸着部位３１と物理結合する第１のリガンド１２、並びに標的物質３０の第２の吸着部位３２と化学的共有結合により結合し置換物質４３の添加により化学結合を切断可能な第２のリガンド１３から構成されるものとする。なお、本実施形態は本発明における標的物質の吸脱着プロセスの特徴を明瞭にするために好適な事例として例示するものであり、本発明による複合刺激応答性親和力制御型高分子１０の構成を限定するものではない。
【００３４】
まず、水系溶液中に溶解している標的物質３０を、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を用いて担体２０の表面に捕捉・吸着するプロセスについて説明する。捕捉プロセスは、温度応答性を有する高分子鎖１１が水和することで広がった、すなわちコイル状のコンフォメーションを有する温度条件下で実施する。例えば高分子鎖１１がＬＣＳＴ型の相図を有する場合には、標的物質の捕捉は臨界溶液温度以下で実施する。高分子鎖１１が水和し広がったコンフォメーションであるコイル状態においては、主鎖は熱揺らぎにより分子運動し、その自由度が大きい。そのため、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が有するリガンドは、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０近傍に存在する標的物質３０の吸着部位と容易に結合を形成し、もって標的物質３０が担体２０表面に捕捉される。なお、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が単独で水溶液中に溶解しているバルク状態と、担体表面に固定化され水溶液接している状態では臨界溶液温度に差が生じることがある。これは担体表面近傍においては局所的にｐＨや塩濃度がバルクとは異なるためである。捕捉時の温度の設定にはその点に留意する必要がある。
【００３５】
標的物質３０が複合刺激応答性親和力制御型高分子１０に捕捉された状態では、標的物質３０が有する第１の吸着部位３１が第１のリガンド１２と、第２の吸着部位３２が第２のリガンド１２と選択的に結合した状態にある。すなわち、標的物質３０は、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０と２種類の異なった機構に由来する結合を介して捕捉されており、両者間の結合が強固であるだけでなく、単一の機構による結合と比較して周囲の環境の変化に対してより安定な捕捉が実現できる。なお、結合状態における高分子鎖１１のコンフォメーションは、標的物質３０との結合により束縛され、そのコンフォメーションエネルギーは、一般的に、捕捉前の状態より高くなる。より強固な結合を実現するためには結合時のコンフォメーションエネルギーをなるべく小さくすることが望ましい。そのためには、標的物質３０と結合した状態で高分子鎖１１がなるべくリラックスしたコンフォメーションを維持できるように第１のリガンド１２と第２のリガンド１３を高分子鎖１１上に配置した分子設計とすることが重要である。
【００３６】
標的物質３０は、系に刺激を付与することにより、リガンドと結合部位間の結合を解離させ、担体２０の表面から脱離することができる。本実施形態では、この際に複数種の刺激を併用することで強固な固定を温和な刺激で解離させることを特徴とする。まず、第１の刺激は主鎖のコンフォメーションを変化させる作用を有する刺激を用いる。すなわち、高分子鎖１１が温度応答性を有する場合には、第１の刺激として温度変化を作用させることが好適である。臨界溶液温度を跨いで温度を変化させると、高分子鎖１１のコンフォメーションは、水和し広がったコイル状態から、脱水和し凝集したグロビュール状態に転移する。この際、第１のリガンドと第２のリガンド間に張力が作用し、各リガンドと標的物質の吸着部位との間の結合を解離するよう作用する。さらに、共有結合で強固に結合している第２のリガンドと第２の吸着部位との結合を解離する作用を有する物質を添加する。この第２の刺激による結合の切断により、高分子鎖１１のコンフォメーション変化が一段と促進され、最終的に標的物質３０が複合刺激応答性親和力制御型高分子１０から解離することで担体２０の表面から離脱する。
【００３７】
第２の刺激は系に置換物質４３を添加することで付与することができる。例えば、第２のリガンドと第２の吸着部位とがエステル結合を形成するようにリガンドを設計した場合には、置換物質４３の添加によるエステル交換反応を利用することができる。上述したフェニルボロン酸等のボロン酸をリガンドとして活用した場合には、ジオールを有する化学物質を置換物質４３として用いると、フェニルボロン基と結合部位との結合を置換することができる。特に、ジオールを有する化学物資として糖類を用いることは、標的物質に対する影響が極小である点において優れた方法である。
【００３８】
なお、高分子鎖１１が温度応答性を有することを特徴とするものであっても、主鎖の水和状態は温度だけでなく、ｐＨや塩濃度等にも影響を受けることがある。そのため、第１の刺激としてｐＨや塩濃度等、水和状態に変化を及ぼすものを用いることもできる。さらに、温度刺激を適用する場合においても、ｐＨや塩濃度等の値を適宜調整することで、臨界溶液温度を適当な値に調整することも可能である。標的物質が安定に存在する温度範囲が限定されている場合においては、このような方法で捕捉・吸着プロセスと脱離プロセスを実施する温度を調整することが望ましい。
【００３９】
本発明による複合刺激応答性親和力制御型高分子１０をアフィニティークロマトグラフィーによる標的物質の精製に用いるには、図３に模式的に示すように、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を、溶液に対して不溶な材質からなる担体２０に固定化し吸着材５０とすることが望ましい。担体２０としては、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を化学的に結合するよう表面を活性化できること、非特異的吸着がないこと、また、物理的・化学的に安定であることが望ましい。このような性質を有する材質としては、ポリスチレンやアガロース等の有機材料や、シリカゲル、多孔性ガラス等の無機材料が知られており、目的に応じて適宜適用すれば良い。また、担体の形状としては容器内に高密度で充填できるような形状、すなわちビーズ状であることが望ましい。さらに、標的物質との結合機会を向上させるためには、担体の表面積は大きいほど望ましい。そのためには、担体は、標的物質が侵入可能なサイズの微細孔を有する多孔質であることが望ましい。
【００４０】
図４は、吸着材５０を充填した精製カラム６０を示す。精製カラム６０は、容器に多数の吸着材５０を充填して構成される。
【００４１】
図５を適宜参照し、本発明に係る吸着材を充填した精製カラム６０を用いて溶液中の標的物質を精製する方法について、引き続き高分子鎖１１が温度応答性を有する、デュアルリガンド型の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を適用する場合を例として、以下に説明する。本実施形態による標的物質の精製方法は、精製カラム６０中の吸着材に標的物質を吸着させる工程、精製カラム内を洗浄し不純物を除去する工程、精製カラムから標的物質を複数の刺激を併用して脱離させ、回収する工程を含むことを特徴とする。
【００４２】
まず、吸着工程においては、標的物質３０と不純物７１とが混在した溶液７０を、吸着材５０を充填した精製カラム６０に導入する。この際、精製カラム６０内の温度は、吸着材５０の表面に固定した複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が標的物質３０を捕捉する温度、すなわち、高分子鎖１１が水和し広がったコンフォメーションであるコイル状態となる温度に設定する。複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が有する高分子鎖１１がＬＣＳＴ型の特性を有する場合には、臨界溶液温度以下の温度に設定すると良い。なお、臨界溶液温度は、溶液の塩濃度やｐＨ等の化学的組成に影響を受けて変化する場合が多い。そのため、設定温度は溶液の化学組成の変化に対応できるよう、幅を持たせることが望ましい。複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は標的物質３０を特異的に吸着する性質を有するため、溶液７０中に混在する不純物７１の多くは精製カラム６０内を通過し排出される。しかしながら、一部の不純物は精製カラム内に残留する可能性がある。この現象は不純物濃度が高い場合等において特に顕著に発現する。
【００４３】
精製カラム６０内に残留した不純物７１を除去するため、吸着工程の次に、洗浄工程を実施することが望ましい。なお、精製カラム６０内に残留した不純物７１量が少ない場合は、本工程は省略することができる。洗浄工程では、吸着工程において標的物質３０を吸着した精製カラム６０内に洗浄液７２を通液し、精製カラム内の空隙に残留している溶液７０に含まれる不純物７１や、吸着材５０に非特異吸着している不純物７１を洗浄除去する。洗浄液７２としては、水を溶媒とした緩衝液を用いることが好ましい。しかしながら、標的物質を劣化させない溶液であれば特に制限されるものではなく、水以外の溶媒を含んでいても構わない。洗浄工程は、複合刺激応答性親和力制御型高分子１０が標的物質３０を捕捉維持できる温度下、すなわち高分子鎖１１が水和し広がったコンフォメーションであるコイル状態となる温度下で実施する。本発明によるマルチリガンド型の複合刺激応答性親和力制御型高分子１０は標的物質３０と強固に結合する。そのため、精製カラム６０内から不純物７１を除去するのに十分な量の洗浄液７２を通液した後でも標的物質３０は吸着材５０表面に結合した状態で維持される。
【００４４】
脱離工程においては精製カラム６０に複数の刺激を与え、精製カラム６０内の吸着材５０表面に結合した標的物質３０を脱離・溶出させて回収する。まず、脱離工程においては、温度応答性の高分子鎖１１のコンフォメーション変化を誘起する第１の刺激を付与する。すなわち系の温度を、高分子鎖１１が水和し広がったコンフォメーションであるコイル状態となる温度から、高分子鎖１１が脱水和することで凝集しグロビュール状態となる温度へと変化させる。高分子鎖１１がＬＣＳＴ型の温度応答性を有する場合、吸着と洗浄工程時には臨界溶液温度以下に設定していた温度を、臨界溶液温度以上の温度に加温すれば良い。なお、高分子鎖１１が温度応答性を有することを特徴とするものであっても、主鎖の水和状態は温度だけでなく、ｐＨや塩濃度等にも影響を受けることがある。そのため、第１の刺激としてｐＨや塩濃度等、水和状態に変化を及ぼすものを用いることもできる。第１の刺激（温度刺激）により、第１のリガンドと第２のリガンドの２点で標的物質と結合している複合刺激応答性親和力制御型高分子１０の高分子鎖１１に凝集力が働き、結合点間には張力が作用する。この張力が、リガンドと吸着部位との間の結合、特に結合力が比較的小さい物理的結合を解離させるよう作用する。
【００４５】
さらに、リガンドと標的物質の吸着部位との結合力を変化させる第２の刺激を付与する。例えば先に示したように、ＩｇＧを標的物質とし、第１のリガンドとしてトリアジン誘導体系低分子を、第２のリガンドとしてフェニルボロン酸基を用いた場合には、第２の刺激としてジオールを有する化合物を置換物質として含有する脱離液７３を精製カラム６０内に通液すれば良い。
【００４６】
以上の複合刺激により、吸着材５０表面に固定されていた標的物質３０を温度や化学物質等のマイルドな刺激のみで効率的に脱離液７３に溶解させ回収することができる。なお、本方法において、第１の刺激と第２の刺激を付与する順番に特に制限はない。どちらかを先に付与しても良いし、両方を一度に作用させることも可能である。
【００４７】
吸着材５０を用いた精製プロセスは、例えば低いｐＨで分解や凝集体生成が発生する標的物質の精製に適用することでその特徴を活かすことができる。また、脱離した標的物質が中性に近いｐＨ領域の緩衝液に溶解した状態で得られるため、精製後の中和工程を必要としないのも利点である。なお、回収された溶液には、脱離液７３に含まれる置換物質４３が残存する場合があるが、置換物質４３としてグルコース等の糖類を適用することで影響を軽微にできる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
温度応答性を有する高分子鎖１１としてＬＣＳＴ型の温度応答性を有するＰＮＩＰＡＭに、第１のリガンドとしてトリアジン誘導体系プロテインＡ模倣分子２２／８（以後ＰＡＭ２と称す）を１つ、第２のリガンドとしてフェニルボロン酸を１つ結合させた複合刺激応答性親和力制御型高分子１０を用い、標的物質としてヒトＩｇＧ（ガンマグロブリン筋注）の精製に適用した例について、比較例とともに、以下詳述する。
【００５０】
＜複合刺激応答性親和力制御型高分子の合成＞
図６に示すスキームにより、高分子鎖１１としてＬＣＳＴ型の温度応答性を有するＰＮＩＰＡＭに、第１のリガンドとしてトリアジン誘導体系プロテインＡ模倣分子２２／８（以後ＰＡＭ２と称す）を１つ、第２のリガンドとしてフェニルボロン酸を１つ結合させた、単分散の複合刺激応答性親和力制御型高分子（図６の「Ｐｏｌｙｍｅｒ５」）を合成した。また、比較対象として、同一の分子量を有するＰＮＩＰＡＭに、リガンドとしてＰＡＭ２のみ、もしくはフェニルボロン酸のみを有する複合刺激応答性親和力制御型高分子を合成した。
【００５１】
ＰＡＭ２とフェニルボロン酸基をＰＮＩＰＡＭ主鎖上に導入しつつＰＮＩＰＡＭを精密に合成するための分子設計を以下に示す。
・ＰＡＭ２のトリアジンに結合した塩素は一級アミンと反応可能である。そこで、アミンをＰＮＩＰＡＭの明確な位置（末端）に配置し、ＰＡＭ２を導入する。
・フェニルボロン酸は対応するビニルモノマーである４−ビニルフェニルボロン酸（ＢＡＳｔ）が知られている。ただし、ボロン酸は重合制御に悪影響を及ぼすので、ピナコールで保護したモノマー（Ｂ（ｐｉｎ）Ｓｔ）を重合する。重合後脱保護してボロン酸に変換する。
・ＰＮＩＰＡＭは、ＮＩＰＡＭの原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ、制御ラジカル重合の一つ）で合成する。
【００５２】
具体的には、アミンを保護したＡＴＲＰ開始剤を設計し、ＮＩＰＡＭのＡＴＲＰを行った。ある程度ＮＩＰＡＭの重合を行った後、その末端からＢ（ｐｉｎ）Ｓｔを（共）重合した。そのポリマーに対し、ボロン酸の脱保護、アミンの保護基の脱保護、アミンへのＰＡＭ反応を行い、ＰＡＭ２を片末端、フェニルボロン酸を片末端に有するＰＮＩＰＭＡを得た。なお、ＰＡＭ２は開始剤を通じて導入するので、開始剤効率が１００％であり、導入反応が定量的であれば全てのポリマー鎖に一ユニット導入される。一方、フェニルボロン酸はモノマーで導入するので統計的に導入される。
【００５３】
ここで、ボロン酸の脱保護、アミンの保護基の脱保護、アミンへのＰＡＭ２反応を行う順番が重要となる。条件を種々検討した結果、（１）アミンの保護基の脱保護、（２）アミンへのＰＡＭ２反応、（３）ボロン酸の脱保護の順番に行うことで目的のポリマーが得られることが判明した。また、図６の合成スキームでは、Ｐｏｌｙｍｅｒ５（ＰＡＭ２とフェニルボロン酸を末端に有するもの）が目的の複合刺激応答性親和力制御型高分子であるが、途中で生成するＰｏｌｙｍｅｒ１（全て保護されたもの）、Ｐｏｌｙｍｅｒ３（アミンを末端に有するもの）、Ｐｏｌｙｍｅｒ４（ＰＡＭ２を末端に有するもの）や、Ｐｏｌｙｍｅｒ２（フェニルボロン酸を末端に有するもの）を比較サンプルとして使用した。
【００５４】
以下、各合成ステップについて詳述する。
開始剤１の合成
アルゴン雰囲気下で、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノエチル）カルバメート（９８４μＬ、６．２５ｍｍｏｌ）とＴＨＦ２０ｍｌをフラスコに加え、−７８℃で攪拌しながらＥｔ３Ｎ（０．９１ｍｌ、６．６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、２−クロロプロパノイルクロライド（０．６５３ｍｌ、６．６ｍｍｏｌ）を１０分ほどかけて滴下し、室温に戻して１８時間攪拌した。沈殿物を濾過によって除去し、減圧留去によって溶媒をエバポレーションした。得られた白色固体をメタノール１０ｍｌで溶かし、飽和Ｎａ２ＣＯ３３００ｍｌに滴下したところ、白色沈殿が生成した。沈殿物を濾過して溶媒を除去し、得られた固体をメタノールで溶解させた。不溶物を濾過によって除去した。溶媒を除去して終夜乾燥させたところ、白色固体として、６７０ｍｇの開始剤１が得られた。構造は１Ｈ ＮＭＲで帰属した。
【００５５】
Ｂ（ｐｉｎ）Ｓｔの合成
２００ｍｌフラスコに粉末状モレキュラーシーブス４Ａを１ｇ入れ、減圧しながらブラスターで加熱し、モレキュラーシーブスを活性化した。室温に戻してＡｒ置換した後、脱気した塩化メチレン５０ｍｌを加えた。Ａｒ雰囲気下で、ＢＡＳｔ（３．０１ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）とピナコール（２．５３ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌させた。沈殿物をセライト濾過で除去し、溶媒を除去したところ、無色透明の高粘度の液体として、３．７ｇのＢ（ｐｉｎ）Ｓｔが得られた。構造は１Ｈ ＮＭＲで帰属した。
【００５６】
ＮＩＰＡＭとＢ（ｐｉｎ）Ｓｔの共重合ポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒ１）の合成
操作はアルゴン雰囲気下で行った。シュレンク管ＡにＮＩＰＡＭ（４．５００ｇ、  ４．０×１０−２ｍｏｌ）とＣｕＣｌ（３９．３６ｍｇ、４．０×１０−４ｍｏｌ）をとり、撹拌子を入れた後、三方コックを装着した。ここに溶媒として２-プロパノール７．５ｍｌ、重合率を測定するための内部標準としてテトラリンを０．１２ｍｌ、触媒の配位子であるＭｅ６ＴＲＥＮ（０．１０７ｍｌ、４．０×１０−４ｍｏｌ）を加え、２０分以上撹拌させて溶液を調製した。別のシュレンク管Ｂには開始剤１（１００．３ｍｇ、４．０×１０−４ｍｏｌ、ＮＩＰＡＭモノマーに対して１／１００当量）をとり、撹拌子を入れて、三方コックを装着した後に溶媒の２-プロパノール３．７８ｍｌを加え、良く撹拌させて開始剤溶液を調製した。この溶液全てをシリンジでシュレンク管Ａに添加し、重合溶液を調製した。この時点で、内部標準（テトラリン）に対するＮＩＰＡＭ量を１Ｈ ＮＭＲで評価した。
【００５７】
この溶液を２５℃で１時間撹拌させ、一部の重合溶液について１Ｈ ＮＭＲを測定し、テトラリンのピークを基準として残存ＮＩＰＡＭの量を評価した。重合前の値と比較することで、ＮＩＰＡＭの重合率（転化率）を算出すると４３％であった。１００当量の条件で重合しているので、生成高分子鎖一本あたり平均的に４３ユニットのＮＩＰＡＭが重合したと考えられる。
【００５８】
上の重合が１時間経過したところで、脱気したＢ（ｐｉｎ）Ｓｔ（４６１ｍｇ、２．０×１０−３ｍｏｌ、開始剤の５当量）を添加した。Ｂ（ｐｉｎ）Ｓｔを添加してから１時間後、シュレンク管Ｂの三方コックをとり、空気に触れさせることで触媒を失活させ、重合反応を止めた。１Ｈ ＮＭＲからＮＩＰＡＭとＢ（ｐｉｎ）Ｓｔの転化率を算出すると、それぞれ５０％、４２％であった。平均的に４３ユニットのＮＩＰＡＭが重合したセグメントの後に、平均的に７ユニットのＮＩＰＡＭと平均的に２ユニットのＢ（ｐｉｎ）Ｓｔがランダム共重合したセグメントが結合したポリマーが生成したと考えられる。
【００５９】
生成ポリマーを精製するために、溶媒を減圧留去し、残存物をエタノールで再び溶解させた。ここに、金属吸着剤であるキョーワード２０００を加えて撹拌、遠心分離することで触媒を除去した。その後、エタノールで透析することによって未反応のモノマーを除去した。透析後、溶媒を減圧留去し、１，４−ジオキサンに溶かし、凍結乾燥させた。ＤＭＦを溶離液とするＧＰＣで生成ポリマーを解析すると、ＰＭＭＡ換算で、Ｍｎ＝１０，５００、Ｍｗ＝１５，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４５のポリマーが１．３０ｇ得られた。ここで得られたポリマーをＰｏｌｙｍｅｒ１として、以下の変換反応に供使した。
【００６０】
Ｐｏｌｙｍｅｒ１のＢｏｃ基脱保護反応（末端のアミン保護基の脱保護）
５０ｍｌナスフラスコに撹拌子とＰｏｌｙｍｅｒ１（２００ｍｇ、２．０×１０−５  ｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２４．２ｍｌを加え、三方コックを装着し、良く撹拌した。フラスコを氷浴に浸し、５分ほどかけてＴＦＡ４．２ｍｌを滴下した。その後、室温に戻して５時間撹拌した。蒸留水０．４２ｍｌを加えて、さらに２４時間撹拌させた。溶媒を除去した後、析出した白色固体を再びＴＨＦに溶かし、ＴＨＦで透析した。溶媒を除去後、１，４−ジオキサンに溶かし、凍結乾燥させた。白色の固体（Ｐｏｌｙｍｅｒ３）が１０７ｍｇ得られた。１Ｈ ＮＭＲとＨＰＬＣによって反応が進行したことを確認した。
【００６１】
Ｐｏｌｙｍｅｒ３の末端アミンへのＰＡＭ２導入反応
５０ｍｌの２口ナスフラスコの片方の口に三方コックを取り付け、撹拌子を入れ、Ｐｏｌｙｍｅｒ３（２５０ｍｇ、２．５×１０−５ｍｏｌ）、ＰＡＭ２（４７．５ｍｇ、１．２５×１０−４ｍｏｌ）をとり、１，４−ジオキサン８ｍｌを加えて溶解させた。もう一方の口にも三方コックを取り付け、フラスコ内をＡｒ雰囲気下にした。Ｅｔ３Ｎ１６０μｌを加え、１００℃のオイルバスで２１時間撹拌させた。放冷させた後、溶媒を除去し、析出した茶色の固体を再びエタノールで溶解させた。エタノール中で透析した。透析後、溶媒を除去し、１，４−ジオキサンに溶かし、凍結乾燥させた。薄茶色の固体（Ｐｏｌｙｍｅｒ４）が２２０ｍｇ得られた。１Ｈ ＮＭＲとＨＰＬＣによって反応が進行したことを確認した。
【００６２】
Ｐｏｌｙｍｅｒ４のピナコール脱保護反応（ボロン酸部位の脱保護）
５０ｍｌナスフラスコにＰｏｌｙｍｅｒ４（１９０ｍｇ、１．９×１０−５ｍｏｌ）、ＮａＩＯ４（９２．０ｍｇ、４．３×１０−４ｍｏｌ）をとり、ＴＨＦ８ｍｌ、Ｈ２Ｏ２．６７ｍｌを加えて３０分撹拌させた。１Ｎ  ＨＣｌａｑを０．０６７ｍｌ加えて、室温で１７時間撹拌させた。溶媒を除去し、析出した赤色の固体を再びエタノールで溶かし、エタノールで透析した。溶媒を除去後、１，４−ジオキサンに溶かし、凍結乾燥させた。ピンク色の固体（Ｐｏｌｙｍｅｒ５）が１３３ｍｇ得られた。
【００６３】
Ｐｏｌｙｍｅｒ１のピナコール脱保護反応（ボロン酸部位の脱保護）
５０ｍｌナスフラスコにＰｏｌｙｍｅｒ１（２００ｍｇ、２．０×１０−５ｍｏｌ）、ＮａＩＯ４（９６．２ｍｇ、４．５×１０−４ｍｏｌ）をとり、ＴＨＦ８ｍｌ、Ｈ２Ｏ２．６７ｍｌを加えて３０分撹拌させた。１Ｎ  ＨＣｌａｑを０．０６７ｍｌ加えて、室温で１７時間撹拌させた。沈殿物を濾過で除去し、ろ液をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ＝１／１（ｖ／ｖ）で透析した。溶媒を除去後、１，４−ジオキサンに溶かし、凍結乾燥させると、白色の固体（Ｐｏｌｙｍｅｒ２）が１５０ｍｇ得られた。１Ｈ ＮＭＲとＨＰＬＣによって反応の進行を確認した。
【００６４】
以上の方法によりＰＮＩＰＡＭの平均的に重合度が４３ユニットの一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子、すなわち、Ｐｏｌｙｍｅｒ１（リガンドをすべて保護）、Ｐｏｌｙｍｅｒ２（リガンドとしてフェニルボロン酸を有す）、Ｐｏｌｙｍｅｒ４（リガンドとしてＰＡＭ２を有す）及びＰｏｌｙｍｅｒ５（リガンドとしてフェニルボロン酸とＰＡＭ２を有す）を得た。さらに、上記と同様の合成スキームに従い、ＰＮＩＰＡＭの平均的に重合度が７６ユニット並びに１５０ユニットの一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子を合成した。
【００６５】
＜複合刺激応答性親和力制御型高分子のＬＣＳＴ評価＞
合成した一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子のＬＣＳＴ（下限臨界溶解温度）を調べた。溶媒は５ｍＭのＰＢＳ水溶液（ｐＨ７．４）を用い、ポリマーを０．１ｗｔ％で溶解させてフィルターを通したものをサンプルとした。６７０ｎｍの波長光にセットしたＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用い、１℃／分で昇温／降温して透過度を測定した。初期温度１０℃ではいずれのポリマー溶液においても透過率が１００〜９０％の状態であったが、温度を上昇させたところ、約３０℃において透過率が０％に急激に低下することが確認され、合成した一連のポリマーがＬＣＳＴ型の相図を有することが確認された。一般的にＰＮＩＰＡＭのＬＣＳＴは３７℃付近であることが知られているが、今回のポリマーはいずれも３０℃付近にＬＣＳＴを示した。これは、ボロン酸モノマーや開始剤等、ＰＮＩＰＡＭ主鎖に疎水性基が導入されたためと考察された。
【００６６】
＜ＳＰＲ法によるＩｇＧとの結合定数評価＞
合成した一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子と、金薄膜表面固定した抗体との吸着・脱離挙動を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）で解析した。ＳＰＲ法では、ガラス−（金薄膜）−溶液界面におけるレーザの全反射条件下で溶液界面に生じるエバネッセント波が金薄膜表面の自由電子を強制振動させる現象を用いる。自由電子が強制振動する条件下では、自由電子の振動に要するエネルギーがエバネッセント波から吸収されるため、レーザの反射率が減少する。レーザの反射率の変化量は金薄膜表面における分子の吸着量に比例することが知られているため、レーザの反射率の変化量を測定することにより、表面に吸着した複合刺激応答性親和力制御型高分子の量を測定することができる。
【００６７】
ＩｇＧ固定金表面の製作
チオール分子が金薄膜表面で自己組織化する現象を用いて金薄膜表面を表面修飾した。まず、ドライエッチャーを用いて、ＳＰＲ測定用の金薄膜（ガラス基板上に形成：膜厚５０ｎｍ）の表面の有機物を除去した。その後、アルキル鎖末端にポリエチレングリコールを介して、水酸基もしくはカルボキシル基を有するチオール分子が溶解したエタノール溶液中に金薄膜を一晩浸し、金薄膜表面に末端が水酸基とカルボキシル基を有するアルキルチオール分子からなる混合自己組織化膜を作製した。その後、自己組織化膜をエタノール及び純水で洗浄した。自己組織化膜の表面には、抗体の非特異吸着抑制に効果のあるポリエチレングリコール鎖が露出するように設計した。また、カルボキシル基が自己組織化膜の表面に露出するよう設計し、アミド結合による抗体の固定化を可能とした。
【００６８】
次に自己組織化膜の表面に以下の手順で抗体を固定化した。まず、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の１ｗｔ％水溶液（ｐＨ＝５．８）に自己組織化膜を浸漬し、３７℃で２時間放置して自己組織化膜表面のカルボキシル基をアミノ基に対して反応活性化した。リン酸緩衝液（ｐＨ＝５．８）で表面を洗浄後、抗体のリン酸緩衝溶液（０．１ｗｔ％、ｐＨ＝５．８）に浸漬して３７℃で２時間放置した。その後、未反応のカルボキシル基をエタノールアミンでブロッキングし、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝５．８）で表面を洗浄して、ヒトＩｇＧが固定化された表面を得た。
【００６９】
ＳＰＲ測定
ヒトＩｇＧを固定化した金薄膜表面に所定濃度（１０〜５０μＭ）の複合刺激応答性親和力制御型高分子溶液を連続的に作用させて複合刺激応答性親和力制御型高分子の吸着量の時間変化を測定した。所定時間（ｔ１）経過後、複合刺激応答性親和力制御型高分子溶液の代わりに緩衝溶液を連続的に作用させて、複合刺激応答性親和力制御型高分子の脱離量の時間変化を測定した。このように測定した吸着・脱離曲線を理論解析して、複合刺激応答性親和力制御型高分子の吸着速度定数と脱離速度定数を定量した。吸着・脱離曲線の測定には、市販のＳＰＲ測定装置を用い、評価試料の溶解性が担保された温度条件、すなわちｐＨ８．３においてＬＣＳＴより十分に低温である１５℃で測定した。
【００７０】
リガンド（Ｌ）と抗体（Ａ）の吸着平衡は、（１）式のように記述できる。また、抗体の吸着速度は、（２）式のように記述できる。なお、（２）式中のｋａ、ｋｄは、それぞれ（１）式の吸着速度定数、脱離速度定数である。
【００７１】
【数１】
2017209604.tif 000003
【００７２】
ＳＰＲ測定においてレーザ入射角を一定とし、時間ｔにおけるレーザ反射率の変化量をＲ（ｔ）、抗体全てにポリマーが吸着したときのレーザ反射率の変化量をＲｍａｘとすると、（２）式の［ＬＡ］と［Ａ］は、［ＬＡ］＝Ｒ（ｔ）、［Ａ］＝Ｒｍａｘ−  Ｒ（ｔ）と置き換えることができる（（３）式）。なお、測定中に複合刺激応答性親和力制御型高分子溶液の濃度（Ｃ）は変化しないため、［Ｌ］は一定値Ｃである。
【００７３】
【数２】
2017209604.tif 000004
【００７４】
ここで、Ｒ（０）＝０であることを考慮すると、（３）式から（４）式を導くことができる。
【００７５】
【数３】
2017209604.tif 000005
【００７６】
一方、吸着後に緩衝溶液を作用させて、ポリマーを脱離させた際の脱離速度は（５）式のように記述できる。
【００７７】
【数４】
2017209604.tif 000006
【００７８】
時間ｔ１秒後のレーザ反射率の変化量をＲ１とすると（Ｒ（ｔ１）＝Ｒ１）、（５）式から（６）式を導くことができる。
【００７９】
【数５】
2017209604.tif 000007
【００８０】
実験により得られたポリマーの吸着・脱離曲線を（４）式と（６）式を用いてフィッティングし、ｋａ、ｋｄ、及びＲｍａｘを求めた。また、ｋｄとｋａの比で表される解離定数Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａを算出した。Ｋｄ値は複合刺激応答性親和力制御型高分子とヒトＩｇＧの結合能が高いほど小さくなる。このＫｄ値を抗体吸着能の尺度とし、複合刺激応答性親和力制御型高分子とヒトＩｇＧの結合能力を比較した。
【００８１】
吸着挙動評価
図７に、試料としてＰＮＩＰＡＭの平均的に重合度が４３ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５（リガンドとしてフェニルボロン酸とＰＡＭ２を有す）のヒトＩｇＧ固定基板に対する吸着・脱離曲線を示す。測定は濃度Ｃを変化させ複数回実施し、得られた曲線を（４）式と（６）式を用いてフィッティングし会合定数Ｋｄを決定した。また同様に、ＰＮＩＰＡＭの平均的に重合度が４３ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ１（リガンドをすべて保護）、Ｐｏｌｙｍｅｒ２（リガンドとしてフェニルボロン酸を有す）、Ｐｏｌｙｍｅｒ４（リガンドとしてＰＡＭ２を有す）についても吸着・脱離曲線から会合定数Ｋｄを決定した。さらに、同様の方法で、７６ユニット及び１５０ユニットの一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子のヒトＩｇＧ固定基板に対する解離定数Ｋｄを決定した。
【００８２】
図８に、ＰＮＩＰＡＭの平均的に重合度が４３ユニット、７６ユニット並びに１５０ユニットの一連の複合刺激応答性親和力制御型高分子の、温度１５℃、ｐＨ８．３の条件下におけるヒトＩｇＧ固定基板に対する解離定数Ｋｄを示す。まず、すべての重合度において、リガンドを保護した複合刺激応答性親和力制御型高分子（Ｐｏｌｙｍｅｒ１）のＫｄはほぼ一定で、次に述べるリガンドを有する複合刺激応答性親和力制御型高分子よりも大きな値を示した。これは、Ｐｏｌｙｍｅｒ１がヒトＩｇＧを固定化した表面に対して吸着力が非常に弱いことを示している。
【００８３】
次に、フェニルボロン酸もしくはＰＡＭ２をリガンドとして有する複合刺激応答性親和力制御型高分子、すなわちＰｏｌｙｍｅｒ２及びＰｏｌｙｍｅｒ４のヒトＩｇＧ固定化表面に対する吸着挙動について考察する。Ｐｏｌｙｍｅｒ２及びＰｏｌｙｍｅｒ４のＫｄはＰｏｌｙｍｅｒ１と比較して小さな値を示し、ヒトＩｇＧ表面に対する吸着力が大きいことが判明した。これは、分子設計通りに複合刺激応答性親和力制御型高分子が有するリガンドがＩｇＧと特異的に結合したためであると考えられる。また、フェニルボロン酸を有するＰｏｌｙｍｅｒ２のＫｄは、ＰＡＭ２を有するＰｏｌｙｍｅｒ４のＫｄよりも小さいことが判明した。これは、フェニルボロン酸はＩｇＧに対して化学的相互作用であるエステル結合で吸着するのに対して、ＰＡＭ２は物理的相互作用で吸着するためであると考察される。
【００８４】
次に、フェニルボロン酸及びＰＡＭ２両方のリガンドを有する複合刺激応答性親和力制御型高分子（Ｐｏｌｙｍｅｒ５）のヒトＩｇＧ固定化表面に対する吸着挙動について考察する。まず、ＰＮＩＰＡＭの重合度が４３ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５を試料として得られたＫｄは、ＰＡＭ２のみを有するＰｏｌｙｍｅｒ４を用いて得られたＫｄとほぼ同程度の値となった。また、ＰＮＩＰＡＭの重合度が７６ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５を試料として得られたＫｄは、ＰＡＭ２のみを有するＰｏｌｙｍｅｒ４と比較してＫｄが顕著に減少し、フェニルボロン酸のみを有するＰｏｌｙｍｅｒ２のＫｄと同程度の値となった。４３ユニット及び７６ユニットについては、Ｐｏｌｙｍｅｒ５の明確な優位性は観測されなかったが、Ｐｏｌｙｍｅｒ５のヒトＩｇＧに対する吸着量は大きく、十分な結合力を有していることが分かった。一方、重合度が１５０ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５では、フェニルボロン酸もしくはＰＡＭ２のみを有するＰｏｌｙｍｅｒ２やＰｏｌｙｍｅｒ４と比較してＫｄが顕著に減少した。これは、重合度が１５０ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５はフェニルボロン酸もしくはＰＡＭ２のみを有する同重合度のＰｏｌｙｍｅｒ２やＰｏｌｙｍｅｒ４と比較してヒトＩｇＧに対する吸着量が大きいことを示しており、複数種のリガンドを有する効果が明確に認められた結果である。
【００８５】
以上得られた結果より、フェニルボロン酸とＰＡＭ２両方のリガンドを有するＰｏｌｙｍｅｒ５は、いずれもヒトＩｇＧに対して十分な結合力を有することが明らかとなった。また、ヒトＩｇＧに吸着する挙動はＰＮＩＰＡＭの重合度、すなわち、フェニルボロン酸基とＰＡＭ２基間の距離にも影響を受けることが判明した。フェニルボロン酸とＰＡＭ２はヒトＩｇＧのＦｃ部位に存在する特定の吸着部位とそれぞれ特異的に結合する。このことから、複合刺激応答性親和力制御型高分子が有するフェニルボロン酸とＰＡＭ２間にはヒトＩｇＧの吸着部位と立体的に相対できるよう十分な距離を持って離散的に配置されることが好ましいと考えられる。重合度４３ユニット並びに７６ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５の吸着力が同重合度のＰｏｌｙｍｅｒ２と同等の値にとどまったのは、フェニルボロン酸とＰＡＭ２間の距離が短く、より結合力の強いフェニルボロン酸とＩｇＧ上のフェニルボロン酸吸着部位が結合した状態で、ＰＡＭ２がその結合部位に届きにくい場合があるためであると考えられる。以上の結果より、複数のリガンドを、標的物質の相互作用部位と立体的に相対できるよう離散的に配置することで、標的物質に対する吸着量をより向上させることができることが示された。
【００８６】
吸着特性に対する温度並びにグルコースの影響
ヒトＩｇＧ固定化表面に対する、フェニルボロン酸基及びＰＡＭ２両方を有する複合刺激応答性親和力制御型高分子の吸着特性の、温度変化並びにグルコース添加による影響をＳＰＲ法により評価した。ＳＰＲ測定にはＰＮＩＰＡＭの重合度が４３ユニットと１５０ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５を用い、上記した方法と同様な手法を用いてヒトＩｇＧ固定化表面に対するＰｏｌｙｍｅｒ５の解離定数Ｋｄを測定した。測定は標的物質であるヒトＩｇＧに対してよりマイルドなｐＨ条件であるｐＨ７．４下で実施した。図９に結果を示す。
【００８７】
まず、温度の影響について調査した結果を述べる。測定は、Ｐｏｌｙｍｅｒ５をｐＨ７．４の緩衝溶液に溶解したサンプルを用いて、ＰＮＩＰＡＭのＬＣＳＴ以下である２０℃と、ＬＣＳＴ以上である３７℃で実施した。重合度が４３ユニット、１５０ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５とも、温度をＬＣＳＴ以下の２０℃からＬＣＳＴ以上の３７℃に変化させることで、解離定数Ｋｄが約２桁増大し、ヒトＩｇＧ表面に対する吸着能が大幅に低下することが判明した。これは、ＬＣＳＴ以上の温度ではＰｏｌｙｍｅｒ５の疎水性が増大し高分子鎖が凝集することで、リガンドの配置や配向の自由度が減少したためであると考えられる。
【００８８】
次に、Ｐｏｌｙｍｅｒ５を溶解した緩衝溶液にグルコースを濃度１．０Ｍで添加したサンプルを用いて、温度２０℃において同様方法で測定を実施した。その結果、グルコースを添加することで、添加無のサンプルと比較して、解離定数Ｋｄが約２桁増大し、ヒトＩｇＧ表面に対する吸着能が大幅に低下することが判明した。これは、Ｐｏｌｙｍｅｒ５が有するフェニルボロン酸基とグルコースがエステル結合を形成し、ヒトＩｇＧが有する結合部位であるアスパラギン残基上の糖鎖との結合能力が喪失したためであると考えられる。
【００８９】
以上の結果より、フェニルボロン酸基及びＰＡＭ２両方を有する複合刺激応答性親和力制御型高分子とヒトＩｇＧとの結合は温度並びにグルコースにより制御できることが示された。
【００９０】
＜ビーズ状吸着材の固定＞
次に、複合刺激応答性親和力制御型高分子を担体としてポリマービーズに固定し吸着材を製造した。ポリマービーズは以下の方法で製造した。
【００９１】
複合刺激応答性親和力制御型高分子の化学構造
複合刺激応答性親和力制御型高分子の担体への固定化を実現するため、上記したＳＰＲ法による評価で性能が実証されたフェニルボロン酸並びにＰＡＭ２両方を有するＰＮＩＰＡＭの重合度が１５０ユニットのＰｏｌｙｍｅｒ５をベースに、化学構造を一部変更した。具体的には図６に示した重合開始剤１を、ジアミン誘導体ベースのものから、アミノ基２つとカルボキシル基１つを有するリシン誘導体をベースとしたものに変更し、両アミノ基に対する保護基を使い分けることにより、１つのアミンにはＰＡＭ２を、もう一方のアミンに対しては担体への結合に用いる官能基を導入した。ＮＩＰＡＭの重合は上記した方法に準じてＡＴＲＰ法により実施し、Ｐｏｌｙｍｅｒ５Ａを得た。
【００９２】
ビーズ表面への固定化
得られた複合刺激応答性親和力制御型高分子Ｐｏｌｙｍｅｒ５Ａを市販の平均粒径９０μｍのアガロースビーズであるセファロースビーズ表面に以下の方法で固定した。まず、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液にＰｏｌｙｍｅｒ５Ａを溶解し１ｗｔ％とした溶液（２．０ｍＬ）を、予め１ｍＭ希塩酸にて洗浄しておいたＮＨＳ−活性化セファロース４ＦＦ（１．０ｍＬ）に加え、振盪しながら室温で一晩反応させた。得られたビーズは脱イオン水にて洗浄した。Ｐｏｌｙｍｅｒ５Ａのビーズへの固定化量は、反応液の残渣及び洗液中の残量を逆相ＨＰＬＣカラムにて分析し、未反応のＰｏｌｙｍｅｒ５Ａ吸着材料の量を定量することで決定した。また、レファレンスとして、ＮＨＳ−活性化セファロース４ＦＦのＮＨＳエステルを１ＭのＮａＯＨ水溶液にて失活させたビーズも調製した。
【００９３】
＜ビーズ状吸着材充填カラムへのＩｇＧの吸着と溶出＞
上記方法で製造したＰｏｌｙｍｅｒ５Ａを表面に固定化したビーズ状吸着材を１段階目流速０．２ｍＬ／分、２段階目流速１．２ｍＬ／分にてトリコーン５／５０カラムに充填した。
【００９４】
Ｐｏｌｙｍｅｒ５Ａを固定化したビーズ状吸着材を充填したカラムを用い、温度２０℃、ｐＨ７．４の条件において、ヒトＩｇＧの保持時間を評価した。測定にはｐＨ７．４、５ｍＭのＰＢＳ緩衝液を溶出液として用い、通液は流速０．５ｍＬ／分（線流速約１５０ｃｍ／ｈ、接触時間約２分）にて実施した。インジェクトするヒトＩｇＧ溶液は０．１ｗｔ％溶液、０．５ｍＬとした。カラムより流出する溶液の吸光度を測定することで、カラムより溶出するヒトＩｇＧ量の時間変化を計測した。その結果、Ｐｏｌｙｍｅｒ５Ａを固定化したビーズ状吸着材はレファレンスと比較してピーク面積が小さくヒトＩｇＧ吸着能を有していることが判明した。
【００９５】
次に、ヒトＩｇＧをビーズ状吸着材に吸着させたアガロースカラムに温度２０℃においてｐＨ７．４、５ｍＭのＰＢＳ緩衝溶液を通液することでカラムを洗浄した後、温度を３７℃に変化させ、濃度１．０Ｍとなるようにグルコースを溶解した緩衝溶液を通液した。溶出したＩｇＧ量を定量したところ、８５％のヒトＩｇＧを回収することができた。
【００９６】
以上の結果より、温度刺激に応答しコンフォメーションが変化するＰＮＩＰＡＭ主鎖にＰＡＭ２とフェニルボロン酸を有する複合刺激応答性親和力制御型高分子を表面に固定化した吸着材を用いることにより、ヒトＩｇＧに対して非侵襲である温和な温度と糖による刺激で効率良くヒトＩｇＧを精製できることが判明した。
【００９７】
以上、本発明の実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計変更等があっても、それらは本発明に含まれるものである。
【符号の説明】
【００９８】
１０  複合刺激応答性親和力制御型高分子
１１  高分子鎖
１２  第１のリガンド
１３  第２のリガンド
１４  固定部
２０  担体
３０  標的物質
３１  第１の吸着部位
３２  第２の吸着部位
４３  置換物質
５０  吸着材
６０  精製カラム
７０  溶液
７１  不純物
７２  洗浄液
７３  脱離液
【図１】
2017209604.tif 000008
【図２】
2017209604.tif 000009
【図３】
2017209604.tif 000010
【図４】
2017209604.tif 000011
【図５】
2017209604.tif 000012
【図６】
2017209604.tif 000013
【図７】
2017209604.tif 000014
【図８】
2017209604.tif 000015
【図９】
2017209604.tif 000016