(57)【要約】【課題】電位の変動を低減可能な電極を提供する。【解決手段】銀を主成分とする第１の部材と、塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を備えた電極。前記電極は、前記自己組織化単分子膜が、前記第２の部材の表面に化学吸着したアルカンチオール誘導体を含んでもよい。また、銀を主成分とする第１の部材と、塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を有する参照電極と、測定対象となる溶液中に含まれる生体分子を検出する検出部を備える作用電極と、を備えるセンサー。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀を主成分とするからなる第１の部材と、
塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、
前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を備えた電極。
【請求項２】
前記自己組織化単分子膜は、前記第２の部材の表面に化学吸着したアルカンチオール誘導体を含む、請求項１に記載の電極。
【請求項３】
前記第２の部材は前記第１の部材の表面に形成された層である、請求項１または２に記載の電極。
【請求項４】
前記電極は基板上に形成されており、前記第１の部材は前記基板の表面に形成された層である請求項１〜３の何れか一項に記載の電極。
【請求項５】
銀を主成分とする第１の部材と、塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を有する参照電極と、
測定対象となる溶液中に含まれる対象物を検出する検出部を備える作用電極と、を備えるセンサー。
【請求項６】
前記対象物は生体分子であり、
前記作用電極は、表面に前記生体分子と反応し得る捕捉部を有し、前記捕捉部における前記生体分子の反応に伴う電位変化を測定することにより前記生体分子を検出する、請求項５に記載のセンサー。
【請求項７】
前記生体分子は核酸であり、
前記捕捉部は検出対象の前記核酸とハイブリダイズし得る配列を有する捕捉プローブを有し、前記捕捉プローブと前記核酸とのハイブリダイズに伴う電位変化を測定することにより前記核酸を検出する、請求項６のセンサー。
【請求項８】
前記捕捉プローブが、検出対象の前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する、請求項７に記載のセンサー。
【請求項９】
前記作用電極の表面には、前記参照電極と同組成の自己組織化単分子膜が形成されている、請求項５〜８の何れか一項に記載のセンサー。
【請求項１０】
検出対象である前記核酸が、ｍｉＲＮＡである、請求項７又は８に記載のセンサー。
【請求項１１】
前記対象物は生体分子であり、
前記生体分子と、前記生体分子と選択的相互作用を示す特異的物質とを反応させ、測定対象となる溶液中に含まれる前記生体分子の存在量に相関させて可溶性物質を反応させ不溶性物質に変換して前記作用電極に沈着させ、沈着させた前記不溶性物質を電気的に検出する請求項５に記載のセンサー。
【請求項１２】
対電極を備え、前記作用電極と前記対電極との間に電位を印加した際の電流値を計測することにより前記不溶性物質の沈着量を測定する請求項１１に記載のセンサー。
【請求項１３】
前記可溶性物質は金属イオンである、請求項１１又は請求項１２に記載のセンサー。
【請求項１４】
請求項５〜１３の何れか一項に記載のセンサーを備える流体デバイス。
【請求項１５】
試料中の前記対象物を抽出する対象物精製部を備える、請求項１４に記載の流体デバイス。
【請求項１６】
前記対象物を含む液を循環させる循環流路を備え、
前記センサーが、前記循環流路に設けられる請求項１４又は１５に記載の流体デバイス。
【請求項１７】
請求項１〜４の何れか一項に記載の電極が形成された電極基板と、
測定対象となる液が流れる流路が形成され、前記流路中に前記電極が配置されるように前記電極基板に積層された流路基材と、
前記電極基板の前記電極を制御する制御回路を有する回路基板と、を備える、流体デバイス。
【請求項１８】
基板の一方の面側に、銀を主成分とする層状の第１の部材を形成する工程と、
前記第１の部材の表面に、塩化銀を主成分とする層状の第２の部材を形成する工程と、
前記第２の部材の表面に、自己組織化単分子膜を形成する工程と、を有する、電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電極、センサー、流体デバイスおよび電極の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体加工技術による化学センサー、バイオセンサーの微小化が進むにつれて、安定な電位を与えることのできる微小な電極の開発が求められるようになった（例えば、特許文献１および非特許文献１）。例えば、参照電極は、電位測定の基準となる電極であり、電気化学の基礎研究のみならず、バイオセンサーのような応用研究においても重要な構成要素である。電位測定により目的の生体分子の検出または濃度測定を行う場合は、参照電極を基準とする電位を指標として測定が行われる。このため、安定で信頼性の高い測定を行うためには、電位の安定した参照電極を用いることが必要となる。特許文献１に記載の参照電極によれば、全体が保護膜で覆われていると共に、薄膜骨組金属パターンにおけるその一部が電極端子部として露出して測定対象の溶液と接触する参照電極が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−４５８１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hiroaki Suzuki and Takumi Taura, Thin-Film Ag/AgCl Structure and Operational Modes to Realize Long-Term Storage, Journal of The Electrochemical Society, 148 E468-E474 (2001).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、特許文献１に記載の参照電極においては、Ｃｌイオンの流出により内部電解液が希釈すること等によって、参照電極の電位変動が生じるという問題があった。
【０００６】
本発明は、電位の変動を低減可能な電極を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施態様は、下記（１）〜（４）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における電極は、銀を主成分とするからなる第１の部材と、塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を備える。
（２）本発明の一実施態様におけるセンサーは、銀を主成分とする第１の部材と、塩化銀を主成分とし前記第１の部材の少なくとも一部と接する第２の部材と、前記第２の部材の表面に形成された自己組織化単分子膜と、を有する参照電極と、測定対象となる溶液中に含まれる対象物を検出する検出部を備える作用電極と、を備える。
（３）本発明の一実施態様における流体デバイスは、先に記載のセンサーを備える。
（４）本発明の一実施態様における電極の製造方法は、基板の一方の面側に、銀又は銀合金からなる層状の第１の部材を形成する工程と、前記第１の部材の表面に、塩化銀からなる層状の第２の部材を形成する工程と、前記第２の部材の表面に、自己組織化単分子膜を形成する工程と、を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１実施形態の電極の断面模式図である。
【図２】第１実施形態の電極におけるＡｇＣｌ層とＳＡＭ膜との結合を示す模式図である。
【図３】第１実施形態の電極において、ＳＡＭ膜を形成前のＡｇＣｌ層の表面のＸＰＳ分析の結果を表すグラフである。
【図４】第１実施形態の電極において、ＳＡＭ膜を形成後のＡｇＣｌ層の表面のＸＰＳ分析の結果を表すグラフである。
【図５】第１実施形態の電極において、ＳＡＭ膜を形成前のＡｇＣｌ層の表面を撮像したＳＥＭ画像である。
【図６】第１実施形態の電極において、ＳＡＭ膜を形成後のＡｇＣｌ層の表面を撮像したＳＥＭ画像である。
【図７】第２実施形態の核酸センサーの断面模式図である。
【図８】第２実施形態の作用電極に固定される捕捉プローブとして採用可能な第１の捕捉プローブの模式図である。
【図９】第２実施形態の作用電極に固定される捕捉プローブとして採用可能な第２の捕捉プローブの模式図である。
【図１０】第３実施形態の流体デバイスの分解図である。
【図１１】第４実施形態の流体デバイスの模式図である。
【図１２】第５実施形態の生体分子センサーの感知部（作用電極）における分析系の反応模式図であり、銀の沈着反応を説明する図である。
【図１３】第５実施形態の生体分子センサーの感知部（作用電極）における分析系の反応模式図であり、電気化学測定時に起こる銀の再イオン化反応を説明する図である。
【図１４】第５実施形態の生体分子センサーの平面模式図である。
【図１５】第５実施形態の生体分子センサーの断面模式図である。
【図１６】実施例および比較例の参照電極を市販の銀−塩化銀電極に接続した際の電位差の経時変化を示すグラフである。
【図１７】実施例および比較例の参照電極を金電極に接続した際の電位差の経時変化を示すグラフである。
【図１８】実施例の核酸センサーによる核酸の検出結果を示すグラフである。
【図１９】実施例の銀不溶化反応を示す模式図である。
【図２０】実施例の銀不溶化反応に伴う酵素量測定試験におけるピーク電位の刑事変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら、実施形態に係る参照電極およびその適用例について説明する。なお、本発明の範囲は、以下の実施の形態に限定されず、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等とを異ならせる場合がある。
【００１０】
＜第１実施形態＞
図１は、第１実施形態の電極５０の断面図である。
電極５０は、ベース層５１と、銀を主成分とするＡｇ層（銀層、第１の部材）５２と、塩化銀を主成分とするＡｇＣｌ層（塩化銀層、第２の部材）５３と、ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）５４と、を有し、基板４１の主面４１ａ側からこの順に形成されている。
なお、本明細書において、銀を主成分とするＡｇ層（第１の部材）および塩化銀を主成分とするＡｇＣｌ層（第２の部材）には、一般的に知られるＡｇ／ＡｇＣｌ電極としの機能を果たす程度に銀および塩化銀が、それぞれ含まれていればよい。
【００１１】
基板４１は、ガラス等の絶縁性の無機材料からなる。電極５０は、薄膜であればその形状は特に制限されず、上面視の形状は、円形、楕円形、矩形、三角形、多角形又は不定形でもよい。
【００１２】
ベース層５１は、基板４１の主面４１ａにスパッタリング等の成膜法により形成されている。ベース層５１は、導電性物質を含む層であれば、特に制限されず、例えば、金属や既述のカーボン材料等を含んで構成すればよい。ベース層５１は、例えば金または金化合物から構成されてもよく、その場合には測定対象である生体分子水溶液による腐食が生じないという効果を有する。ベース層５１を成膜するにあたって基板４１の主面４１ａに基板４１とベース層５１との接合性を高めるためのＣｒ層を予め設けてもよい。また、ベース層５１は、省略してもよい。
【００１３】
Ａｇ層５２は、基板４１の主面４１ａ側であって、ベース層５１の表面に形成されている。銀は、後述するＳＡＭ膜５４との親和性が高い。このため、Ａｇ層５２の表面にＡｇＣｌ層５３を設け、さらにＡｇＣｌ層５３の表面にＳＡＭ膜５４を形成することができる。Ａｇ層５２は、スパッタリングにより成膜できる。また、Ａｇ層５２は、銀ペーストをベース層５１に塗布し定着させることで形成してもよい。
【００１４】
ＡｇＣｌ層５３は、Ａｇ層５２の表面の一部または全部を被覆するように形成されている。ＡｇＣｌ層５３が、生体分子水溶液と接触していることで、水溶液との固液界面における電位を安定させた電極５０を構成できる。これは、塩化銀が生体分子水溶液と接触すると、ＡｇイオンとＣｌイオンとにかい離して平衡状態となるためであると考えられる。ＡｇＣｌ層５３は、Ａｇ層５２の表面を例えば塩化鉄（ＦｅＣｌ３）等の試薬と反応させることにより形成することができる。
なお、ＡｇＣｌ層（第２の部材）５３は、Ａｇ層５２と少なくとも一部と接するものであればよく、層状でなくてもよい。例えばこの場合、ＡｇＣｌ層５３は、Ａｇ層５２の表面に別途用意した塩化銀からなる薄膜を接合することにより形成してもよい。
【００１５】
ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜、ＳＡＭ；Self-Assembled Membrane）５４は、ＡｇＣｌ層５３の表面に形成され、ＡｇＣｌ層５３の表面を覆っている。ＳＡＭ膜５４は、ＡｇＣｌ層５３の表面を均一に覆う被覆層（被覆膜）である。ＳＡＭ膜は、ＡｇＣｌ層５３が測定対象の溶液と接する表面全体を覆っていてもよい。また、ＳＡＭ膜は、ＡｇＣｌ層５３の表面の一部を覆っておいてもよい。電極５０は、ＳＡＭ膜５４において測定対象の生体分子溶液と接する。
【００１６】
ＳＡＭ膜５４は、ＡｇＣｌ層５３の表面と有機化合物分子との相互作用を利用して、自己組織的に、高い秩序性を有する有機分子からなる単分子膜である。ＳＡＭ膜５４は、ＡｇＣｌ層５３の表面と有機化合物分子との相互作用を利用して、自己組織的に、高い秩序性を有する有機分子からなる単分子膜である。ＳＡＭ膜５４は、ＡｇＣｌ層５３の表面に化学吸着したＳＡＭ膜構成材料５４ａを含む。
なお、ＳＡＭ膜５４とＡｇＣｌ層５３の間の少なくとも一部に、異なる物質により形成される層（例えば緩衝層、バッファ層）が形成されていてもよい。また、異なる物質により形成される層はＳＡＭ膜の間に挟まれていてもよい。また、第１のＳＡＭ膜と第２のＳＡＭ膜とが形成されていてもよく、第１のＳＡＭ膜と第２のＳＡＭ膜との間に異なる物質により形成される層が存在してもよい。なお、第１のＳＡＭ膜と第２のＳＡＭ膜とは、異なる構成材料から構成されていてもよく、同じ構成材料から構成されていてもよい。
【００１７】
ＳＡＭ膜構成材料５４ａとしては、アルカンチオール誘導体が例示される。しかしながら、ＳＡＭ膜５４の組成はこれに限られるものではなく、ＡｇＣｌ層５３の表面を密に覆うものであれば、その組成は限定されない。本実施形態においては、ＳＡＭ膜構成材料５４ａとして、アルカンチオール誘導体のうちメルカプトヘキサノールを用いる。
アルカンチオール誘導体としては、例えば下記一般式（１１）〜（１６）で表される化合物が挙げられる。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
［前記一般式（１１）〜（１６）中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して１〜１００である。］
例えばｎ及びｍは、それぞれ独立して１〜３０であり、あるいは、それぞれ独立して１〜２０である。また、例えば、本実施形態において、前記一般式（１１）〜（１６）で表される化合物中、前記一般式（１４）で表される化合物が挙げられる。
前記一般式（１４）において、例えばｎは、１〜１５であり、あるいは、１〜１０である。係る化合物としては、ｎ＝６のメルカプトヘキサノールが挙げられる。
【００２０】
ＳＡＭ膜５４の膜厚は、ＳＡＭ膜構成材料５４ａの種類に依存するが、例えば１ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。このような膜厚の膜をＡｇＣｌ層５３の表面形成することにより、ＡｇＣｌ層５３の表面から生体分子溶液へのＣｌイオンの溶出を適度に抑制できる。
【００２１】
図２は、ＳＡＭ膜構成材料５４ａとしてアルカンチオール誘導体を用いる場合の、ＡｇＣｌ層５３との結合について説明する模式図である。アルカンチオール誘導体のチオール基に含まれる硫黄は銀、金などの貴金属との結合の親和性が高い。ＡｇＣｌ層５３の表面には、塩化銀のＣｌイオンが露出している。このような状況下で、アルカンチオール誘導体のチオール基の含硫黄化合物を作用させると、Ｃｌイオンが硫黄と置換して銀と硫黄とが結合する。このように、ＡｇＣｌ層５３の表面には、硫黄が結合してアルカンチオール誘導体が固定化される。なお、Ａｇ層５２の表面が、ＡｇＣｌ層５３から露出している部分では、アルカンチオール誘導体のチオール基の含硫黄化合物と銀とが作用して、硫黄が銀と直接結合する。
【００２２】
ＳＡＭ膜５４は、ＳＡＭ膜構成材料５４ａが溶解している溶液を、ＡｇＣｌ層５３の表面に付与し、乾燥させることで形成できる。ＡｇＣｌ層５３へのＳＡＭ膜構成材料溶液の付与方法としては、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布等の塗布により溶液を付与する方法、さらには、滴下法、スプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等により付与する方法が挙げられる。ＳＡＭ膜構成材料５４ａを溶解する溶媒としては、水、アルコール、または、これらの混合溶媒が用いられる。
【００２３】
ＳＡＭ膜５４が、ＡｇＣｌ層５３の表面に固定化されていることは、ＡｇＣｌ層５３の表面について、ＸＰＳ分析（X-ray Photoelectron Spectroscopy、Ｘ線光電子分光分析）を行うことで確認することができる。
図３および図４は、それぞれＳＡＭ膜５４を形成前後のＡｇＣｌ層５３の表面のＸＰＳ分析の結果を表すグラフである。ＳＡＭ膜５４の形成前（図３）においては、検知されなかった硫黄電子に由来するピークが、ＳＡＭ膜５４の形成後（図４）には、検出されている。
【００２４】
ＳＡＭ膜５４は、電極５０の表面における、生体分子水溶液とＡｇＣｌ層５３との間のＣｌイオンの受け渡しを、ＳＡＭ膜５４が設けられていない場合と比較して抑制する。ＳＡＭ膜５４が設けられることで、ＡｇＣｌ層５３からＣｌイオンが溶出しにくくなる。このため、ＳＡＭ膜５４を設けた電極５０は、対象の生体分子水溶液のＣｌイオン濃度に影響を及ぼしにくく、より安定した測定を可能とする。加えて、電極にＳＡＭ膜５４を設けることで、ＡｇＣｌ層５３からＣｌイオンが完全に溶出する迄の時間が長くなるために、電極５０を長寿命化することができる。
【００２５】
図５および図６は、それぞれＳＡＭ膜５４を形成前後のＡｇＣｌ層５３の表面を、ＳＥＭ（Scanning Electron Microscope、走査型電子顕微鏡）により同条件で撮像した画像である。ＳＡＭ膜５４の形成前（図５）と形成後（図６）とを比較すると、形成後のＳＥＭ画像は、解像が悪くなっていることがわかる。これは、ＳＥＭの撮像により対象であるＡｇＣｌ層５３の表面が帯電しているために起こるチャージアップと呼ばれる現象である。このように、ＡｇＣｌ層５３の表面に帯電が生じていることからも、ＳＡＭ膜５４を形成することで、ＡｇＣｌ層５３の表面において、電荷の受け渡しが抑制されていることが確認できる。このことから、ＳＡＭ膜５４によって、ＡｇＣｌ層５３は半絶縁状態になっているということができる。なお、ここで半絶縁状態とは、溶液との電気的なやり取り（より具体的にはＣｌイオンの溶出）を抑制した状態を意味する。したがって、ＡｇＣｌ層５３と溶液とが局所的に導通状態となっていても全体として電気的なやり取りが抑制されている状態は、半絶縁状態に含む。ＡｇＣｌ層５３の表面において、結晶粒の隙間は、入り組んだ形状となっているため、ＳＡＭ膜５４が形成されにくい領域となると考えられる。ＳＡＭ膜５４は、このような局所的な領域において、ＡｇＣｌ層５３と溶液とが電気的なやり取りを許容するためＡｇＣｌ層５３を半絶縁状態とすることができると考えられる。
【００２６】
電極５０は、一例として参照電極として使用することができる。電極５０を参照電極として用いる場合には、ＳＡＭ膜５４によりＡｇＣｌ層５３と水溶液との間でＣｌイオンの交換が抑制され、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出が生じにくくなる。一般的に、参照電極の固液界面の電位が不安定になる現象（電位ドリフトという）は、生体分子水溶液中のイオン濃度の増減により生じることが知られている。本実施形態の電極５０は、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出が抑制されることで、生体分子水溶液中のイオン濃度が変化しにくく、電極５０の電位ドリフトを抑制することができる。加えて、本実施形態の電極５０は、生体分子水溶液のＣｌイオン濃度の変化が少ないため、イオン濃度が安定するまで待機する必要がなく即座に測定を開始することができる。
また、本実施形態の電極５０は、Ｃｌイオンの溶出が少ないために、ＡｇＣｌ層５３からＣｌイオンが完全に溶出するまでの時間が長く高寿命とすることができる。さらに、本実施形態の電極５０によれば、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出は、ＡｇＣｌ層５３の表面全体から起こるために、局所的なＣｌイオンの消費が生じにくい。したがって、本実施形態の電極５０は、さらなる高寿命化を図ることができる。
加えて、ＳＡＭ膜５４により、電極５０への非特異吸着も抑制されるため、さらに電位の安定性に寄与できる。本実施形態によれば、安定した電位測定を可能とする参照電極を提供できる。
【００２７】
また、電極５０は、作用電極として使用してもよい。電極５０を参照電極として用いる場合には、ＳＡＭ膜５４によって電極５０の表面の非特異吸着を抑制することで計測電位を安定させることができる。
【００２８】
本実施形態の電極５０は、電気化学的なセンサーとして応用することができる。特に、電極５０は、以降の実施形態において説明するように、生体分子を検出するバイオセンサーとして応用できる。電極５０をバイオセンサーとして応用した場合に、検出対象となる生体分子としては、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、細胞外小胞体、抗体、抗原が例示できる。
【００２９】
＜第２実施形態＞
図７は、第２実施形態の核酸センサー４０の断面模式図である。例えば、核酸センサー４０は、基板（電極基板）４１と、基板４１の主面４１ａ上に形成された参照電極５０と、一対の作用電極６０と、を備える。また、核酸センサー４０は、参照電極５０と作用電極６０とに電気的に接続された図示略の電位測定部を備える。電位測定部は、参照電極５０と作用電極６０との電位差を測定する。核酸センサー４０は、参照電極５０および作用電極６０を測定対象となる溶液（生体分子水溶液）に接触させることで、生体分子水溶液中に含まれる目的の核酸（例、マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡという））を検出する装置である。
本実施形態の参照電極５０は、第１実施形態の電極５０と同一態様を有する。そのほか、第１実施形態と同一態様の構成要素については、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００３０】
（作用電極）
作用電極６０は、ベース層（作用電極側ベース層）６１と、ベース層６１の表面に形成されたＳＡＭ膜（作用電極側ＳＡＭ膜）６２および捕捉プローブ７０と、を有する。
【００３１】
ベース層６１は、基板４１の主面４１ａにスパッタリング等の成膜法により形成されている。なお、作用電極６０のベース層６１は、参照電極５０のベース層５１と同材料から構成してもよい。これにより、ベース層５１、６１を同時に形成することが可能となり、製造コストの削減が可能となる。
【００３２】
ＳＡＭ膜６２は、ベース層６１の表面を覆い、ベース層６１の表面に非特異吸着が起こることを抑制する。作用電極６０のＳＡＭ膜６２は、参照電極５０のＳＡＭ膜５４と同組成であり、ともに同組成のＳＡＭ膜構成材料５４ａからなる。これにより、作用電極６０のＳＡＭ膜６２を参照電極５０のＳＡＭ膜５４と同時に形成することが可能となり製造コストの圧縮を図ることができる。本実施形態において、作用電極６０のＳＡＭ膜６２は、ベース層６１の表面に化学吸着したアルカンチオール誘導体（例えば、メルカプトヘキサノール）からなる。なお、アルカンチオール誘導体のチオール基に含まれる硫黄は、金と作用して安定的に結合する。
【００３３】
捕捉プローブ７０は、検出対象の生体分子（核酸、ｍｉＲＡ）と反応し得る捕捉部７５を構成する。作用電極６０は、表面に捕捉部を有する。
捕捉プローブ７０は、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列を有する。なお、本明細書における「ハイブリダイズし得る」とは、用いられる捕捉プローブ７０の一部がストリンジェントな条件下で標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）以外の核酸分子にはハイブリダイズしない又はハイブリダイズしにくいことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
【００３４】
次に、図８、図９を基に、捕捉プローブ７０として採用可能な２種類の捕捉プローブ（第１の捕捉プローブ７０Ａおよび第２の捕捉プローブ７０Ｂ）を例示して説明する。なお、捕捉プローブ７０は、検出対象の核酸（ｍｉＲＮＡ）とハイブリダイズし得る配列を有するものであれば、ここで説明するものに限定されることはない。
【００３５】
図８は、第１の捕捉プローブ７０Ａの模式図である。第１の捕捉プローブ７０Ａは、第１の部分７１とステム部７３とスペーサ７４とを有する。第１の部分７１は、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる。ステム部７３は、ループ構造７３ｂとループ構造７３ｂと繋がる二本鎖７３ａとを有する。
【００３６】
ステム部７３の長さ（例、塩基数）は特に限定されないが、２本鎖７３ａを安定的に形成可能な長さを考慮し、目安として、８〜１５塩基程度とすればよい。ステム部７３は、全体が２本鎖７３ａの塩基対を形成している必要はないが、ステム部７３は第１の部分７１と隣接しており、第１の部分７１にはｍｉＲＮＡをハイブリダイズし得るので、ステム部７３のうち少なくとも第１の部分７１と隣接する塩基は、塩基対を形成していることが好ましい。
【００３７】
図９は、第２の捕捉プローブ７０Ｂの模式図である。第２の捕捉プローブ７０Ｂは、第１の捕捉プローブ７０Ａと比較して、ステム部７３を有していない点が異なる。
【００３８】
捕捉プローブ７０（第１の捕捉プローブ７０Ａおよび第２の捕捉プローブ７０Ｂ）は、ベース層６１に固定された状態でｍｉＲＮＡをハイブリダイゼーションするために分子的な自由度を確保するために、末端にスペーサ７４を有する。スペーサ７４の長さは、特に限定されないが、例えば、３塩基〜５０塩基であり、あるいは５塩基〜２５塩基である。ただし、スペーサ７４に用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサ７４に用いられる塩基数は０塩基でもよい。また、捕捉プローブ７０を、ＳＡＭ膜６２を構成するＳＡＭ膜構成材料の先端に構成することで、ＳＡＭ膜構成材料をスペーサ７４として用いてもよい。
【００３９】
捕捉プローブ７０は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、捕捉プローブ７０は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
【００４０】
核酸センサー４０は、参照電極５０および作用電極６０と電気的に接続される電位差測定部（図示略）を有する。電位差測定部は、参照電極５０と作用電極６０との電位差を測定することで、作用電極６０において捕捉プローブ７０が目的とするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を捕捉することにより生じる電極（固体）と溶液（液体）との固／液界面（固液界面とも称する）の電位の変化（表面電荷密度の変化）を検知する。これにより、生体分子水溶液中に目的のｍｉＲＮＡを含むか否かを容易に判定することができる。核酸センサー４０は、捕捉プローブ７０と目的の核酸とのハイブリダイズに伴う電位変化を測定することにより目的の核酸を検出する。
【００４１】
本実施形態の参照電極５０によれば、ＡｇＣｌ層５３の表面がＳＡＭ膜５４により覆われている。これにより、ＡｇＣｌ層５３と生体分子水溶液との間でＣｌイオンの交換が抑制され、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出が生じにくくなる。一般的に、参照電極の固液界面の電位が不安定になる現象（電位ドリフトという）は、生体分子水溶液中のイオン濃度が増減することで生じることが知られている。ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出が抑制されることで、生体分子水溶液中のイオン濃度が変化しにくく、参照電極５０の電位ドリフトを低減することができる。加えて、生体分子水溶液のＣｌイオン濃度の変化が少ないため、イオン濃度が安定するまで待機する必要がなく即座に測定を開始することができる。
【００４２】
また、本実施形態の参照電極５０は、Ｃｌイオンの溶出が少ないために、ＡｇＣｌ層５３からＣｌイオンが完全に溶出するまでの時間が長く高寿命とすることができる。さらに、本実施形態の参照電極５０によれば、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出は、ＡｇＣｌ層５３の表面全体から起こるために、局所的なＣｌイオンの消費が生じにくい。したがって、本実施形態の参照電極５０は、さらなる高寿命化を図ることができる。
【００４３】
本実施形態の核酸センサー４０は、例えば、がん細胞を被験者が有するか否かの判定に用いることができる。がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質やｍｉＲＮＡ等の核酸を発現している。人体の体液（血液、尿、唾液等）に分泌されるエクソソームには、分泌元の細胞由来のｍｉＲＮＡなどを発現しているため、体液中のエクソソームの膜内部に存在する生体分子を分析することで、生体内の異常を調べることができる。したがって、がん細胞由来エクソソーム中の所定のｍｉＲＮＡの発現量と、被検体由来のエクソソーム中のｍｉＲＮＡの発現量とを比較することでがん細胞の有無を評価できる。なお、ｍｉＲＮＡはエクソソーム中に存在するものには限定されない。例えば血液・尿・唾液などの体液中に存在するｍｉＲＮＡを直接検出してもよい。また、ｍｉＲＮＡの発現量を比較することによってその他の疾患の検出や診断を行うことも可能である。
【００４４】
本実施形態においては、参照電極５０は、基板４１上に形成されている。また、第１の部材としてのＡｇ層５２は基板４１の表面に、ベース層５１を介して形成された層である。同様に第２の部材としてのＡｇＣｌ層５３は、ベース層５１の表面に形成された層である。しかしながら、第１の部材５２および第２の部材５３は、これらの形態に限定されない。第１の部材５２および第２の部材５３は、互いに電気的に接続された棒状や板状等の独立した部材であってもよい。また、棒状の第１の部材５２の表面に層状の第２の部材が形成されていてもよい。第１の部材５２と第２の部材５３とは、互いに電気的に接続され、第２の部材５３の表面にＳＡＭ膜５４を形成するために露出する表面を有していれば、どのような形態にも限定さない。
【００４５】
＜第３実施形態＞
次に第３実施形態の流体デバイス２１について説明する。本実施形態の流体デバイス２１は、サンプル中のエクソソームが内包する生体分子（例えばｍｉＲＮＡ）を検出するデバイスである。
図１０は、流体デバイス２１の分解図である。流体デバイス２１は、後述するように第２実施形態の核酸センサー４０を含む。また、第２実施形態と同一態様の構成要素については、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００４６】
流体デバイス２１は、流路基材３０と、電極基板４１と、絶縁フィルム２４と、回路基板２５と、を備える。また、これら流路基材３０、電極基板４１、絶縁フィルム２４および回路基板２５は、この順で上下方向に積層されている。
【００４７】
（流路基材）
流路基材３０は、ＰＤＭＳ（Poly Dimethyl Siloxane、ポリジメチルキロキサン）からなる板材であり、上面３０ａと下面３０ｂとを有する。また、流路基材３０には、上面３０ａから下面３０ｂに貫通する一対の導入用貫通孔３２と１つの排出用貫通孔３１とを有する。流路基材３０の下面３０ｂには、それぞれの導入用貫通孔３２から延びて排出用貫通孔３１に繋がる凹溝状の流路３３が設けられている。
【００４８】
流路基材３０の下面３０ｂは、電極基板４１の主面４１ａに覆われる。一対の導入用貫通孔３２には、それぞれ検出対象となる生体分子（例えばｍｉＲＮＡ）を含む生体分子溶液を流路３３に供給する導入チューブが接続可能である。また、排出用貫通孔３１には導入チューブから流路３３を通過した生体分子溶液を排出する排出チューブが接続可能である。導入チューブから供給された生体分子溶液は、導入用貫通孔３２から流路３３を流れて排出用貫通孔３１に達する。排出チューブから排出された生体分子溶液は、外部に接続されたポンプを介して再度導入チューブから流路３３に供給される。このように、生体分子溶液は、流路３３を循環する。
【００４９】
流路基材３０の製造方法をついて説明する。
まず、平板状のガラス基板を用意し、当該ガラス基板に、微小な流路構造を形成するためのモールド型を形成する。ガラス基板としては、電極基板４１を用いてもよい。ガラス基板上に厚膜フォトレジストをコーティングしベーキングを施す。次いで、流路に対応するパターンを形成したフォトマスクを使用し露光した後、再度10分ベーキングを施す。次いで、厚膜フォトレジスト用現像液中で現像し、乾燥した。以上の工程を経て、流路構造形成用のモールド型を作製する。
次に、上述のモールド型を使用して流路基材３０を作製する。まず、モールド型を形成したガラス基板上にＰＤＭＳ前駆体と硬化剤の混合液を均一に塗布し、気泡を除去した後に硬化させる。次いで、硬化したＰＤＭＳをガラス基板から離形することで流路３３が設けられたＰＤＭＳの基材を成型することができる。さらに、導入用貫通孔３２および排出用貫通孔３１を機械的に加工することで、流路基材を作製することができる。
【００５０】
（電極基板）
電極基板４１の主面４１ａには、参照電極５０と一対の作用電極６０とが設けられている。電極基板４１と参照電極５０と、一対の作用電極６０は、第２実施形態と同様の構成を有し、これらが核酸センサー４０を構成する。参照電極５０は、ベース層５１と、銀を主成分とするＡｇ層５２と、塩化銀を主成分とするＡｇＣｌ層５３と、ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）５４と、を有する。また、作用電極６０は、ベース層（作用電極側ベース層）６１と、ベース層６１の表面に形成されたＳＡＭ膜（作用電極側ＳＡＭ膜）６２および捕捉プローブ７０と、を有する。
【００５１】
電極基板４１は、流路基材３０に重ねあわされる。これにより参照電極５０の少なくとも一部は、流路基材３０の排出用貫通孔３１と重なる。また、一対の作用電極６０の少なくとも一部は、それぞれ異なる流路３３中に配置される。
【００５２】
（絶縁フィルム）
絶縁フィルム２４は、例えばポリイミドからなる。絶縁フィルム２４は、回路基板２５に設けられた制御回路２５ａにおける不意の短絡を防ぐ。
【００５３】
（回路基板）
回路基板２５は、電極基板４１の電極（作用電極６０および参照電極５０）を制御する制御回路２５ａを有する。制御回路２５ａは、一対の作用電極６０および参照電極５０と電気的に接続されている。本実施形態において、制御回路２５ａと電極（作用電極６０および参照電極５０）との接続は、図示略の導線によってなされている。その他に、電極基板４１および絶縁フィルム２４にスルーホールを設けて制御回路２５ａと各電極とを接続してもよい。
【００５４】
（作用効果）
本実施形態の流体デバイス２１は、電極基板４１の作用電極６０における捕捉プローブ７０とｍｉＲＮＡとのハイブリダイズに伴う電位変化を回路基板２５において測定することにより核酸（例えばｍｉＲＮＡ）を検出することができる。
本実施形態によれば、図示略のポンプによって測定対象の生体分子溶液を循環させることでより高精度な核酸の検出が可能となる。
なお、本実施形態において、検出対象は、ｍｉＲＮＡであるものとしたが、他の生体分子（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡなどの核酸）であっても、同様の構成で検出が可能である。
【００５５】
＜第４実施形態＞
次に第４実施形態の流体デバイス１について説明する。本実施形態の流体デバイス１は、サンプル中のエクソソームが内包する生体分子（例えばｍｉＲＮＡ）を検出するデバイスである。
図１１は、流体デバイス１の模式図である。流体デバイスは、例えば、マイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）などである。なお、流体デバイス１は、後述するように生体分子検出部４に第２実施形態の核酸センサー４０を含む。
【００５６】
流体デバイス１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエクソソーム精製部２と、生体分子精製部（対象物精製部）３と、生体分子検出部４と、エクソソーム精製部２と生体分子精製部３を繋ぐ第１の流路５と、生体分子精製部３と生体分子検出部４を繋ぐ第２の流路６と、を備えている。
本実施形態において、第１の流路５は、生体分子を含むエクソソームの破砕液をエクソソーム精製部２から生体分子精製部３に送液する流路であり、第２の流路６は、精製された生体分子を含む溶液を生体分子検出部４に送液する流路である。
また、たとえば、本実施形態の流体デバイス１は、サンプルを導入し、エクソソームを破砕し、生体分子を精製し、生体分子を検出するデバイスである。
さらに、流体デバイス１は、第１の廃液槽７と、第２の廃液槽８と、第３の廃液槽９と、第１の廃液槽７とエクソソーム精製部２を繋ぐ第３の流路１０と、第２の廃液槽８と生体分子精製部３を繋ぐ第４の流路１１と、第３の廃液槽９と生体分子検出部４を繋ぐ第５の流路１２と、を備える。
【００５７】
（エクソソーム精製部）
エクソソーム精製部２は、エクソソームの固定と、エクソソームの破砕を行うものであり、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエクソソーム固定部２ｄを備える。エクソソーム精製部２は、導入する試薬別にインレットを備えることが好ましい。即ち、エクソソーム精製部２は、サンプル導入用インレット２ｂと破砕液導入用インレット２ｃを備えることが好ましく、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
【００５８】
エクソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。係る化合物を用いることにより、エクソソーム固定部２ｄ上に脂質二重膜を有するエクソソームを固定することができる。
なお、本明細書において、「エクソソーム固定部２ｄ上にエクソソームを固定する」とは、エクソソーム固定部にエクソソームを吸着させることも意味する。サンプル中からのエクソソームの単離が可能である。
【００５９】
疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。
飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数６〜２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
【００６０】
親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、ＰＥＧが好ましい。係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することが特に好ましい。
【００６１】
即ち、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、脂質−ＰＥＧ誘導体が好ましい。脂質−ＰＥＧ誘導体は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる。ＢＡＭとしては、例えば下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００６２】
【化２】
2017044674.tif 000004
【００６３】
［式中、ｎは１以上の整数である。］
エクソソーム固定部２ｄの層として用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００６４】
本実施形態の流体デバイス１における液体の駆動は、図示略の外部吸引ポンプによってなされ、液体の流れはバルブの開閉によって制御される。バルブは一例として空圧式バルブであり、バルブの開閉は、流体デバイス１に連結した外部空圧装置によって駆動・制御される。
【００６５】
エクソソームの分析において、まず上述したエクソソーム精製部において、サンプル導入用インレット２ｂにサンプルを注入し、流路２ｉのバルブ２ｆを開き、吸引によりサンプルをエクソソーム固定部２ｄに導入する。
分析に用いられるサンプル量としては、一例として数μＬから数ｍＬであり、例えば１ｍＬ程度である。
【００６６】
サンプルとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエクソソームを含有するものであれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、エクソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エクソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。
また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエクソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
【００６７】
検出対象の細胞としては、エクソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよいが、本実施形態においては、エクソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエクソソームとの親和性が非常に高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
【００６８】
エクソソーム固定部２ｄにエクソソームを特異的に結合させる観点から、エクソソーム固定部２ｄに非特異的吸着抑制部を設けることが好ましい。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理することが挙げられる。
【００６９】
エクソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエクソソームは、上述した疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエクソソームとの親和性が非常に高いため、サンプルをエクソソーム固定部２ｄに静置する必要はなく、連続的にエクソソーム固定部２ｄ上をサンプルが通過すると同時にサンプル中のエクソソームがエクソソーム固定部２ｄ上に捕捉される。
一例として、エクソソーム捕捉時の吸引圧力は、１ｋＰａ〜３０ｋＰａであり、捕捉に要する時間は１５秒程度である。エクソソーム固定部２ｄを通過した溶液は、バルブ１０ａを介して第３の流路１０を通り第１の廃液槽７へ送られる。
【００７０】
本実施形態の流体デバイス１において、エクソソーム固定部２ｄの天井高を低く設計しておくことが好ましい。これにより、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物と、エクソソームとの接触の機会を増し、エクソソームの捕捉効率を高めることができる。
【００７１】
血液中には、エクソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞もエクソソーム固定部２ｄに固定される可能性がある。エクソソーム固定部２ｄからこれらの細胞外小胞を除去する観点から、エクソソーム固定部２ｄ上のエクソソームを洗浄することが好ましい。
一例として、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、エクソソーム固定部２ｄに導入する。
本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエクソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、ＰＢＳ洗浄液５００μＬを吸引圧力１ｋＰａ〜３０ｋＰａで１５秒程度送液することにより洗浄される。エクソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第３の流路１０を通り第１の廃液槽７へ送られる。
【００７２】
次いで、エクソソーム固定部２ｄに固定されたエクソソームを破砕する。流路２ｊ上のバルブ２ｇを開き、破砕液導入用インレット２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエクソソーム固定部２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエクソソーム固定部２ｄを通ることにより、エクソソーム固定部２ｄ上に捕捉されたエクソソームが破砕され、エクソソームに内包される生体分子（核酸特にｍｉＲＮＡ）が放出される。
一例として、エクソソーム破砕時の吸引圧力は、１ｋＰａ〜３０ｋＰａであり、破砕に要する時間は３０秒程度である。エクソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第３の流路１０を通り第１の廃液槽７へ送られる。エクソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第１の流路５を通り生体分子精製部（対象物精製部）３へ送られる。
【００７３】
（生体分子精製部（対象物精製部））
生体分子精製部は、試料中の生体分子を抽出する。生体分子精製部３は、生体分子回収液導入用インレット３ｂと、生体分子固定部３ｃとを備えることが好ましく、更に生体分子洗浄液導入用インレット３ａを備えることがより好ましい。
生体分子固定部３ｃは、生体分子（核酸）を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エクソソームは、分泌元の細胞に由来する核酸を保持している。核酸としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。近年、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
生体分子固定部３ｃをエクソソーム破砕液が通過することにより、生体分子固定部３ｃ上に生体分子（核酸）が捕捉される。
一例として、エクソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、５０ｋＰａ〜７０ｋＰａであり、送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第４の流路１１を通り第２の廃液槽８へ送られる。
【００７４】
生体分子固定部３ｃに生体分子を固定した後、生体分子固定部３ｃを洗浄し、目的とする生体分子以外の夾雑物を取り除くことが好ましい。流路３ｅ上のバルブ３ｄを開き、生体分子洗浄液導入用インレット３ａに洗浄液を注入し、吸引により洗浄液を生体分子固定部３ｃへ導入する。洗浄液としては、例えば７０％〜８０％程度のエタノールが挙げられる。
一例として、洗浄時の洗浄液使用量は１ｍＬ程度であり、吸引圧力は、５０ｋＰａ〜７０ｋＰａであり、洗浄液の送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第４の流路１１を通り第２の廃液槽８へ送られる。
【００７５】
生体分子固定部３ｃを洗浄した後、生体分子固定部３ｃを乾燥させることが好ましい。これは、生体分子検出部への生体分子洗浄液の持ち込みを防止するためである。生体分子固定部３ｃは、生体分子洗浄液導入用インレット３ａから空気を吸引して生体分子固定部３ｃを通過させることにより乾燥させる。一例として、生体分子固定部３ｃ乾燥時の吸引圧力は、５０ｋＰａ〜７０ｋＰａであり、乾燥に要する時間は２分程度である。
【００７６】
次いで、生体分子固定部３ｃに固定された生体分子を溶出させる。生体分子の回収率を向上させるために、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入した後、一定時間保持させることが好ましい。流路３ｇのバルブ３ｆを開け、生体分子回収液導入用インレット３ｂに生体分子回収液を注入し、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入する。一例として、生体分子回収液は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒであり、該回収液の使用量は３０μＬであり、吸引圧力５０ｋＰａ〜７０ｋＰａで回収液を吸引し、回収液が生体分子固定部３ｃに到達した時点で吸引を停止させ、３分程度保持する。
【００７７】
次いで、生体分子固定部３ｃから生体分子を回収する。一例として、吸引圧力５０ｋＰａ〜７０ｋＰａで回収液を３０秒かけて回収する。回収された生体分子は第２の流路６を通り、生体分子検出部４へ送られる。一例として、生体分子検出部４への生体分子の吸引圧力は、６ｋＰａ以下であり、３０秒程度かけて送液する。
【００７８】
（生体分子検出部）
生体分子検出部４は、環状の循環流路４ｆを有する循環型混合部４ｃと、循環流路４ｆの経路中に設けられた核酸センサー４０と、を有する。
【００７９】
核酸センサー４０としては、第２実施形態において図７を基に説明したように、基板４１と基板４１上に設けられた参照電極５０と作用電極６０とを有している。参照電極５０は、ベース層５１と、銀を主成分とするＡｇ層５２と、塩化銀を主成分とするＡｇＣｌ層５３と、ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）５４と、を有する。また、作用電極６０は、ベース層（作用電極側ベース層）６１と、ベース層６１の表面に形成されたＳＡＭ膜（作用電極側ＳＡＭ膜）６２および捕捉プローブ７０と、を有する。生体分子検出部４は、作用電極６０に固定された捕捉プローブ７０と標的の核酸（例えばｍｉＲＮＡ）とのハイブリダイズに伴う電位変化を測定することにより核酸を検出する。
【００８０】
循環型混合部４ｃは、流路中に図示略のポンプバルブが設けられた循環流路４ｆを有する。循環流路４ｆには、生体分子精製部３から延びる第２の流路６と、第３の廃液槽９へ延びる第５の流路１２と、が接続されている。また、循環流路４ｆには、バルブ４ｅを介して洗浄液導入用インレット４ｂが接続されている。
【００８１】
生体分子が生体分子検出部４へ送られると、ポンプバルブ（図示略）が作動して循環流路４ｆにおいて生体分子水溶液が循環され混合する。一例としてポンプバルブ（図示略）の開閉を１０分間程度継続させる。液を循環させることにより短時間で効率よく、核酸センサー４０において、捕捉プローブ７０（図１参照）と標的の核酸とがハイブリダイズする。
【００８２】
次いで、バルブ４ｅを開け、洗浄液導入用インレット４ｂに洗浄液を注入し、核酸センサー４０に導入する。これにより、核酸センサー４０の作用電極６０に付着した非特異的吸着物を取り除くことができる。核酸センサー４０を洗浄した廃液は、バルブ１２ａを介して第５の流路１２を通り、第３の廃液槽９へ送られる。
【００８３】
次いで、核酸センサー４０において、参照電極５０に対する作用電極６０の電位を測定することで、核酸を検出する。
【００８４】
本実施形態の流体デバイスによれば、エクソソームから核酸を抽出して検出する作用を同一のデバイス中で迅速に行うことが可能となる。
【００８５】
＜第５実施形態＞
次に第５実施形態の生体分子センサー１４０について説明する。本実施形態の生体分子センサー１４０は、生体分子と選択的相互作用を示す特異的物質とを反応させ、測定対象となる溶液中に含まれる生体分子の存在量に相関させて不溶化反応を実施することによって可溶性物質を不溶性物質に変換して作用電極に沈着させ、沈着させた不溶性物質を電気的に分析する装置である。
【００８６】
図１２、図１３は、本実施形態の生体分子センサー１４０における分析系の反応模式図である。また、図１４は、生体分子センサー１４０の平面模式図であり、図１５は、生体分子センサー１４０の断面模式図である。
【００８７】
（生体分子の検出方法）
図１２、図１３に示す分析系では、抗原１０３を分析対象物質の生体分子とし、選択的相互作用として磁性微粒子１０５上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）による免疫複合体形成反応を利用し、試薬の１つとして、前記抗原に特異的に反応する抗体を酵素［例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）］で標識したＡＬＰ標識抗体１０４を使用する。
また、この分析系では、標識酵素による酵素反応として、以下に示す反応式１を利用し、不溶化反応として、反応式２を利用する。なお、図１２、図１３において、ｐＡＰＰはｐ−アミノフェニルホスフェート、ｐＡＰはｐ−アミノフェノールを、ｐＱＩはｐ−キノンイミンを、それぞれ、意味し、ｐＡＰＰはＡＬＰの基質である。また、反応式１における「（ＡＬＰ）」は、ＡＬＰが反応式１の触媒として関与することを示す。
更に、電気的分析法として、作用電極（作用極）１６０、対電極（対極）１７０、および参照電極（参照極）１５０を備えた電極部を用いる。
【００８８】
【化３】
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【００８９】
図１２、図１３に示す分析系では、磁性微粒子１０５上に分析対象の生体分子（抗原）に対する抗体１０２が予め固定化されている。電極部を構成する作用電極１６０は、感知部として機能する。まず、分析対象の生体分子（抗原１０３）が含まれる被検試料と固定化微粒子とＡＬＰ標識抗体１０４とを反応部で反応させると、固定化抗体微粒子／抗原／ＡＬＰ標識抗体の複合体が形成される。前記複合体の形成量は、披検試料中の生体分子の存在量に相関する。前記複合体が形成された後、適当な洗浄液でＢ／Ｆ分離を行い、感知部へ移動させ、感知部背面にある磁石（図示略）により磁性微粒子を感知部上に集める。また、予め感知部に抗体もしくは抗体が結合した微粒子を固定しておき、感知部上で抗体／抗原／ＡＬＰ標識抗体複合体の形成を行った後、適当な洗浄液でＢ／Ｆ分離を行うことも可能である。感知部上に抗体／抗原／ＡＬＰ標識抗体複合体が固定された磁性微粒子を集めた後、あるいは、感知部に移動させながら感知部に磁石により集めると同時に、標識酵素ＡＬＰの基質であるｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を、前記感知部の上流から分析系に供給すると、ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）に変換され（反応式１）、このとき、銀イオン（Ａｇ＋、水溶性）を共存させておくと、銀（Ａｇ、水不溶性）が析出し（反応式２）、感知部上に沈殿する（図１２参照）。感知部（作用電極）上に沈着した銀は、作用電極に付与された電位に応じて感知部上で再酸化する。銀の再酸化に伴い、作用電極と対電極の間には、電流が流れる（反応式３、図１３参照）。したがって、この電流を測定することにより再酸化された銀の量を測定でき、さら沈着した銀の量をも測定することができる。
【００９０】
（生体分子センサー）
次に本実施形態の生体分子センサー１４０について説明する。なお、第２実施形態において説明した核酸センサー４０と同一態様の構成要素については、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００９１】
図１４および図１５に示すように、生体分子センサー１４０は、基材（電極基板）１４１と、基材１４１と、基材１４１の主面１４１ａ上に形成された参照電極１５０と、作用電極１６０と、対電極１７０と、を有する。参照電極１５０、作用電極１６０および対電極１７０は、それぞれ同方向に筋状に延びる。作用電極１６０および対電極１７０は、平面視で参照電極を挟んで配置されている。また、作用電極１６０は、感知部としての面積を確保する為に、長さ方向の端部に円形に広がる面積確保部１６０ａを有する。
【００９２】
生体分子センサー１４０は、感知部表面に沈殿した不溶性物質を、電気化学的に分析する。生体分子センサー１４０は、感知部表面（作用電極１６０の表面）での電荷の変化を電流の変化として捉える。生体分子センサー１４０は、銀（Ａｇ）が沈着した作用電極１６０に、参照電極１５０を基準とした電圧を印加し、作用電極１６０に沈着させた銀をイオン（Ａｇイオン）に再酸化する。これにより作用電極１６０における電気化学的変化を電流の変化として、銀の沈着を検出する。
【００９３】
（参照電極）
参照電極１５０は、基材１４１の主面１４１ａ側から順に、ベース層１５１と、銀を主成分とするＡｇ層５２と、塩化銀を主成分とするＡｇＣｌ層５３と、ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）５４と、を有する。本実施形態においてベース層１５１は、導電性カーボンペーストを印刷形成されたカーボン電極である。また、Ａｇ層５２、ＡｇＣｌ層５３およびＳＡＭ膜５４は、第２実施形態と同様の構成を有する。
【００９４】
（作用電極、対電極）
作用電極１６０および対電極１７０は、参照電極１５０のベース層１５１と同様のカーボン電極であり、ベース層１５１と同時に印刷成形されている。
【００９５】
本実施形態の生体分子センサー１４０は、ＡｇＣｌ層５３の表面にＳＡＭ膜５４が形成された参照電極１５０を有する。これにより、ＡｇＣｌ層５３と水溶液との間でＣｌイオンの交換が、抑制され、ＡｇＣｌ層５３からのＣｌイオンの溶出が生じにくくなり、参照電極１５０の電位ドリフトを低減することができる。安定した電位で作用電極１６０と対電極１７０との間の電流値を測定することが可能となる。生体分子センサーは、参照電極を基準として作用電極１６０に所定の電圧を印加したときの作用電極１６０と対電極１７０との間に流れる電流値を測定することで、銀の沈着を検出すると共に沈着量を測定する。このため、参照電極の電位のドリフトを低減することで、測定値のばらつきを減らすことができ、測定対象となる生体分子の正確な検出が可能となる。
【００９６】
本実施形態の生体分子センサー１４０は、第４実施形態の流体デバイス１（図１１）と組み合わせてもよい。その場合には、流体デバイス１の核酸センサー４０に代えて生体分子センサー１４０を設ける。さらにその場合には、エクソソームを破砕する必要がないためエクソソーム精製部２を省略する。
【００９７】
以上に、本発明の様々な実施形態を説明したが、各実施形態における各構成およびそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換およびその他の変更が可能である。また、本発明は実施形態によって限定されることはない。
【実施例】
【００９８】
次に、実施例により本発明を説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９９】
［参照電極の作製］
実施例に係る参照電極５０の作製手順について、図１を参照しながら説明する。なお、ここでは作用電極６０の作製手順については、説明を省略する。
まず、基板４１を、Ｈ２ＳＯ４とＨ２Ｏ２との混合溶液（混合比１：１、温度２００℃）により１５分の洗浄を行う。
次いで、幅０．９ｍｍの開口を有するマスクを用いて、基板４１にＤＣスパッタを行う。これにより、ガラスからなる基板４１の主面４１ａに、Ｃｒ層（３０ｎｍ以下、図１において不図示）と、金からなるベース層５１（１５０ｎｍ以下）と、Ａｇ層５２（３μｍ以下）を順次形成する。
次いで、１ｍｏｌ／ＬのＦｅＣｌ３の水溶液に１分間浸漬させることにより、Ａｇ層５２の表面にＡｇＣｌ層５３（０．１ｎｍ以下）を形成した。
次いで、１ｍｍｏｌ／Ｌのメルカプトヘキサノールの水溶液に、室温で２４時間浸漬させることで、ＡｇＣｌ層５３の表面に、メルカプトヘキサノールをＳＡＭ膜構成材料５４ａとするＳＡＭ膜５４を形成した。
以上の工程を経て、実施例の参照電極５０を作製した。
また、上述の工程において、ＳＡＭ膜５４を形成する工程を省略した比較例の参照電極を別途用意した。
【０１００】
［参照電極の特性評価］
次に、実施例と比較例の参照電極の評価を行った。
図１６は、測定用緩衝液に浸漬させた実施例および比較例の参照電極と市販の銀−塩化銀電極とをそれぞれ接続した際の電位差の時間的変化の測定結果を示すグラフである。銀−塩化銀電極は、実施例および比較例の参照電極と比較して大型であるものの電位の安定性に優れ、実施例と比較例の参照電極の安定性を測定するための基準として用いることができる。
図１６に示すように、比較例の参照電極に対して、実施例の参照電極は、経時的な電位変化が小さかった。比較例の参照電極が-１．４ｍＶ／ｈｒの電位変化が生じたのに対して、実施例の参照電極は、±０．２ｍＶ／ｈｒ以内の電位変化に留まっていた。
【０１０１】
図１７は、測定用緩衝液に浸漬させた実施例および比較例の参照電極と金からなる作用電極とをそれぞれ接続した際の電位差の時間的変化の測定結果を示すグラフである。
図１７に示すように、比較例の参照電極に対して、実施例の参照電極は、経時的な電位変化が小さかった。比較例の参照電極においては、ＡｇＣｌ層からＣｌイオンが溶出して測定用緩衝液中のＣｌイオン濃度が変化したことで、大幅な電位の変動があったと考えられる。これに対して、実施例の参照電極においては、ＳＡＭ膜によりＡｇＣｌ層からのＣｌイオンの溶出が抑制されているために、測定用緩衝液のＣｌイオン濃度の変動がなく、電位が安定したものと考えられる。
【０１０２】
図１６および図１７に示す結果から、ＡｇＣｌ膜の表面にＳＡＭ膜を有する実施例の参照電力は、ＳＡＭ膜を有さない比較例の参照電極に対して、電位の安定性に優れていることが確認された。
【０１０３】
［核酸検出試験（核酸センサーへの応用）］
上述した工程を経て作製した参照電極を用いて、図１０に示す流体デバイス２１を構成し、流体デバイス２１内の核酸センサー４０により、様々な濃度における核酸（ｍｉＲＮＡ）の検出試験を行った。
【０１０４】
本試験においては、ｍｉＲ１６を標的（ターゲット）とする。作用電極６０にｍｉＲＮＡとの相同性が１００％の捕捉プローブ７０を形成した。また、ネガティブコントロールとして試験を行うｍｉＲ２１と捕捉プローブ７０との相同性は、３２％であった。様々な濃度のｍｉＲ２１（ターゲット）およびｍｉＲ２１（ネガティブコントロール）に対して、参照電極５０に対する作用電極の電位シフトを測定した。測定結果を図１８に示す。なお、図１８の横軸の単位［Ｍ］は、［ｍｏｌ／Ｌ］を表す。
【０１０５】
測定結果から、ターゲットであるｍｉＲ１６の濃度に依存して電位シフトが生ずることを確認した。また、非ターゲットのｍｉＲ２１に対する電位シフトが十分に小さいことが合わせて確認された。なお、ｍｉＲ１６に対する電位シフトの感度は、２０ｆＭと好感度であった。
【０１０６】
［銀不溶化反応を伴う酵素量測定試験（免疫測定装置への応用）］
銀イオン存在下で起こる化学反応を伴う応用例として、銀不溶化反応を伴う酵素量測定試験を行った。
まず、以下の手順により、図１４および図１５に示す生体分子センサー１４０を作製した。まず、市販のカーボン電極チップ（有限会社バイオデバイステクノロジーの丸型カーボン電極）を用意した。チップ（基材１４１）上のカーボン電極のうち２つをそれぞれ作用電極１６０および対電極１７０とした。メルカプトヘキサノール（以下ＭＣＨと呼ぶ）を参照電極１５０のＡｇＣｌ層５３の表面に修飾してＳＡＭ膜５４を形成した。以上の工程を経て、生体分子センサー１４０を作製した。この生体分子センサーを、参照電極にＭＣＨコートを施した「ＭＣＨコート有」の生体分子センサーと呼ぶ。
また、比較用の生体分子センサーとして、参照電極にＭＣＨの修飾を行わない（ＳＡＭ膜５４を形成しない）以外は、同様の手順で作製した生体分子センサーを用意した。比較用の生体分子センサーを「ＭＣＨコート無」の生体分子センサーと呼ぶ。
【０１０７】
次に、上述の「ＭＣＨコート有」および「ＭＣＨコート無」の生体分子センサーにおいて、以下の試験を行った。
まず、図１９に示すように、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ；和光純薬工業株式会社）を化学的に固定した磁性微粒子を、２ｍｍ×２ｍｍ×４ｍｍのネオジム磁石により作用電極上に捕捉し、ｐＡＰＰ（アブカム）およびＡｇＮＯ３（和光純薬工業株式会社）を含む水溶液（ＡｇＮＯ３；０．１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＡＰＰ；２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４；２ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）；１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）中で３分間放置した。これにより、反応式１および反応式２（実施形態参照）で示す銀沈着反応を行った。その後、１ｍｏｌ／ＬのＫＮＯ３溶液にて電極を洗浄し、再び１ｍｏｌ／ＬのＫＮＯ３溶液を加え電気化学アナライザａｌｓ１２３２Ｂ（ＡＬＳ社）を用いて、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）測定を行い、反応式３（実施形態参照）で表される銀再イオン化反応を行い、その際の電流値変化を測定した。さらに、銀イオンを含む緩衝溶液（ＡｇＮＯ３；２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４；２ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス；１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）に１時間接触させ、その前後で、再び、上述したように作用極上で銀の沈着および再イオン化を行い、ＤＰＶ測定におけるピーク電位を求めた。
【０１０８】
図２０に示すように、「ＭＣＨコート無」の生体分子センサーにおいては、銀イオンを含む緩衝溶液に、参照電極を６０分接触した場合、ピーク電位は約９％負側にシフトした。一方、「ＭＣＨコート有」の生体分子センサーにおいては、ピーク電位のシフト量が３％に抑制されていたことから、ＳＡＭ膜形成により、銀イオンを含む緩衝液との接触中に起こる参照電極の電位シフトを抑制できることが確認された。
【符号の説明】
【０１０９】
１、２１…流体デバイス、２…エクソソーム精製部、３…生体分子精製部（対象物精製部）、４…生体分子検出部、５、６、１０、１１、１２、３３…流路、７、８、９…第３の廃液槽、２４…絶縁フィルム、２５…回路基板、２５ａ…制御回路、３０…流路基材、４０…（核酸）センサー、４１、１４１…基板（電極基板）、５０、１５０…参照電極（参照極）、５１、６１、１５１…ベース層、５２…Ａｇ層（第１の部材）、５３…ＡｇＣｌ層（第２の部材）、５４、６２…ＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）、５４ａ…ＳＡＭ膜構成材料、６０、１６０…作用電極（作用極）、７０、７０Ａ、７０Ｂ…捕捉プローブ、７５…捕捉部、１０２…抗体、１０３…抗原、１０４…ＡＬＰ標識抗体、１０５…磁性微粒子、１４０…（生体分子）センサー、１７０…対電極（対極）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図５】
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【図６】
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