(57)【要約】【課題】特定の領域における外部からの刺激に対する応答を非破壊的に評価することが可能な細胞を含む三次元組織体の提供。【解決手段】第一の細胞を含む第一の細胞領域と、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞を含む第二の細胞領域とが存在し、前記第一の細胞が、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞である三次元組織体を提供する。【選択図】図１Ａ
2017209103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の細胞を含む第一の細胞領域と、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞を含む第二の細胞領域とが存在し、
前記第一の細胞が、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞であることを特徴とする三次元組織体。
【請求項２】
前記第二の細胞領域には、前記第一の細胞は存在しておらず、
前記第一の細胞領域には、前記第一の細胞が多く存在している請求項１に記載の三次元組織体。
【請求項３】
前記第一の細胞領域及び前記第二の細胞領域を含む領域に対する前記第一の細胞領域の割合が、前記第二の細胞領域の割合より少ない請求項１から２のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項４】
刺激を与える界面に垂直な軸に対して、一定の深さに前記第一の細胞領域の表面が存在する請求項１から３のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項５】
培養容器の内部に、前記第一の細胞領域及び前記第二の細胞領域が配置されている請求項１から４のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項６】
前記第一の細胞領域が、前記培養容器の周壁に接触していない請求項５のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項７】
前記第一の細胞が、レポーター遺伝子が導入されている請求項１から６のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項８】
前記第二の細胞が、光を発する細胞ではない請求項１から７のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項９】
前記第二の細胞が、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞である請求項１から７のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項１０】
前記第二の細胞が、レポーター遺伝子が導入されている請求項９に記載の三次元組織体。
【請求項１１】
前記第二の細胞が、前記第一の細胞とは異なるレポーター遺伝子が導入されている請求項９から１０のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項１２】
前記第二の細胞が、前記第一の細胞とは生理学的に種類が異なる請求項９から１１のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項１３】
前記第一の細胞及び前記第二の細胞とは異なる細胞を、１種類以上含む請求項１から１２のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項１４】
前記第一の細胞領域が、固定剤により位置が保持されている請求項１から１３のいずれかに記載の三次元組織体。
【請求項１５】
物質の安全性評価、物質の効能評価、又は薬剤のスクリーニングに用いられる請求項１から１４のいずれかに記載の三次元組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む三次元組織体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術と組織工学の進展に伴い、複数の細胞からなる組織を人工的に形成する技術の開発が行われている。
特に、医薬、化粧料、化学物質などの安全性や効能の評価には、動物の生体を使わずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する試験法（動物実験代替法）の開発が大きな課題となっている。しかしながら、生体における細胞の機能や薬剤への反応の過程を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全に再現することは難しい。ここで、一般的な二次元培養（単層培養）を用いるよりも、三次元培養を用いる方が生理的条件を模倣するために有用であることが、例えば、皮膚、肝臓、がん腫瘍などの研究において、既に知られている。
【０００３】
一方、細胞内で起こる様々な現象を解析する手段として、各種分子プローブを用いた計測法やバイオイメージング技術が開発されている。代表的な例として、レポーター遺伝子を細胞内に導入して、細胞内の遺伝子の転写活性を光により検出するレポーター遺伝子アッセイが知られている。このように、外部からの刺激に対する応答を光検出する手法は、薬剤などのスクリーニングツールとしても、知られている。
【０００４】
三次元培養皮膚細胞を被験物質に曝露する工程；細胞における特定のタンパク質及びそれらをコードする遺伝子から選択されるうちの少なくとも１の発現を測定する工程；及び測定された発現に基づいて被験物質の皮膚感作性を評価する工程、を含む物質の皮膚感作性の評価方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、少なくとも２つの異なる表現型の哺乳類細胞の三次元凝集体及び液体増殖培地を含有する哺乳類組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが提案されている（例えば、特許文献２参照）。また、特許文献２には、少なくとも１つの表現型の細胞は三次元凝集体を形成する前に蛍光染色で標識されており、哺乳類組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、前記細胞の増殖を阻害する抗がん剤などの物質をスクリーニングする方法が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、特定の領域における外部からの刺激に対する応答を非破壊的に評価することが可能な細胞を含む三次元組織体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の三次元組織体は、第一の細胞を含む第一の細胞領域と、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞を含む第二の細胞領域とが存在し、
前記第一の細胞は、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、特定の領域における外部からの刺激に対する応答を非破壊的に評価することが可能な細胞を含む三次元組織体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の三次元組織体の全体構成の一例を示す垂直方向の概略断面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の三次元組織体の全体構成の一例を示す水平方向の概略断面図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１の三次元組織体の作製方法の一例を示し、培養容器内にマイクロピペットを用いてＮＨＤＦ細胞を分注する様子を示す説明図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１の三次元組織体の作製方法の一例を示し、配置するＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞を固定するために、マイクロピペットを用いて凝固因子を添加し、薄膜を形成する様子を示す説明図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１の三次元組織体の作製方法の一例を示し、インクジェット方式のバイオプリンターＰを用いて、ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞の１個分以内の厚みで配置されるように吐出する様子を示す説明図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、実施例１の三次元組織体の作製方法の一例を示し、ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞の層の上に、コラーゲン液に懸濁したＮＨＤＦ細胞を、マイクロピペットＭで加え、細胞層が固化するまで静置する様子を示す説明図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、実施例１の三次元組織体の作製方法の一例を示し、ＤＭＥＭ培地を添加し、培養して三次元組織体を作製する様子を示す説明図である。
【図３】図３は、実施例１の三次元組織体をＺ−Ｓｔａｃｋ撮影した一例を示す画像である。
【図４】図４は、実施例２の三次元組織体の全体構成の一例を示す断面図である。
【図５】図５は、実施例３の三次元組織体の全体構成の一例を示す断面図である。
【図６】図６は、対照例１の三次元組織体の全体構成の一例を示す断面図である。
【図７】図７は、比較例１の三次元組織体の全体構成の一例を示す概略断面図である。
【図８】図８は、比較例２の三次元組織体の全体構成の一例を示す概略断面図である。
【図９Ａ】図９Ａは、対照例１の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例２の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例３の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例２、実施例３、及び対照例１の三次元組織体の平均発光強度と標準偏差を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例４の三次元組織体の全体構成の一例を示す水平方向の概略断面図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例４の三次元組織体の全体構成の一例を示す垂直方向の概略断面図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例５の三次元組織体の全体構成の一例を示す水平方向の概略断面図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例５の三次元組織体の全体構成の一例を示す垂直方向の概略断面図である。
【図１３】図１３は、実施例６の三次元組織体の全体構成の一例を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（三次元組織体）
本発明の三次元組織体は、第一の細胞を含む第一の細胞領域と、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞を含む第二の細胞領域とが存在し、前記第一の細胞は、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞（以下、「発光細胞」と称することもある）である。
【００１０】
本発明の三次元組織体は、従来の三次元組織体を用いた細胞応答の評価系では、三次元組織体内における細胞の配置や分布を制御するものではなく、組織体全体を破壊して平均的な反応を計測するものであった。そのため、複数種の細胞間の相互作用や、個々の細胞がおかれた微小環境の変化による応答性の差異、又は刺激源に対する距離や透過性・伝播性などの影響を含めた、三次元組織体内の特定の領域における応答を非破壊的に評価することが困難であるという知見に基づくものである。
【００１１】
前記三次元組織体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形成されるものであり、用途に応じて、形状、機能発現、細胞生存などの維持に必要な培養容器、培地、その他の公知の材料が適宜使用される。
前記三次元組織体は、三次元の各方向において、少なくとも細胞２個分の厚みで配置されている。
【００１２】
前記細胞の密度については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記三次元組織体は、細胞同士が直接結合していてもよく、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリリン、キチン、セルロースなどの細胞外基質（ＥＣＭ）や足場材料（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）や後述の固定剤が細胞の間に充填されていてもよい。
【００１３】
第一の細胞としての発光細胞を含む領域（第一の細胞領域）とは、前記発光細胞が多く存在することで特定される領域であり、体積で５０％以上（好ましくは体積で７０％以上）存在していることを意味する。これにより、第一の領域から発せられる光の検出を用いて、発光細胞が存在しない領域と区別し、刺激への反応を評価する対象となる領域の境界を定義することができる。
前記発光細胞とは異なる細胞（第二の細胞）を含む領域（第二の細胞領域）とは、前記発光細胞は存在していないことで特定される領域である。
前記発光細胞を含む領域と、前記発光細胞とは異なる細胞を含む領域とは、隣接していることが好ましい。ただし、２つの領域の境の間に、少量（体積で５０％未満）の前記発光細胞が散在している領域があってもよい。
【００１４】
外部からの刺激としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、刺激物質の曝露及び取り込み、温度や圧等の物理的変化、低酸素や酸化又は紫外線照射等のストレス要因への曝露、培養条件の変更、培養容器や足場材料への接触等の細胞周辺の微小環境に著しい変化をもたらすものなどが挙げられる。
前記外部からの刺激に対し、前記三次元組織体内の特定な位置にある細胞は、例えば、周辺組織の構造の違い又は刺激源からの距離により、他の領域に位置する細胞とは異なる反応を示す可能性がある。例えば、前記三次元組織体に、前記外部からの刺激を一定の方向から与えると、刺激を与える界面に垂直な軸に対する深さに応じて、刺激の度合い、すなわち細胞の反応が変化する可能性が推測される。よって前記発光細胞を含む領域は、その変化の評価を可能にするための適切な深さに配置することが好ましい。
前記三次元組織体は、例えば、刺激物質の安全性評価もしくは効能評価又は薬剤のスクリーニングに適用することができる。また、薬物動態研究や再生医療の開発などを目的に、三次元組織体を生きた動物に移植した後に、組織・臓器再生の経過を観察することもできる。
【００１５】
図１Ａ及び図１Ｂに、本発明の三次元組織体の全体構成の一例を示す。なお、図１Ａは、ｘｚ平面における垂直方向の概略断面図であり、図１Ｂは、図１ＢのＸ−Ｘ’方向の（ｘｙ平面における）水平方向の概略断面図である。
三次元組織体１０は、細胞Ａを含む領域１１、細胞Ｂを含む領域１２及び培地１３が、培養容器１４内に順次積層されている。
【００１６】
第一の細胞としての細胞Ｂは、発光細胞である。
第二の細胞としての細胞Ａは、細胞Ｂとは異なる発光細胞であってもよいし、発光細胞でなくてもよい。
細胞Ｂを含む領域１２の表面は、培養容器の存在による人為的結果を避けるために、培養容器１４の周壁に接触していないことが好ましい。具体的には、細胞Ｂを含む領域１２は、三次元組織体１０の中心部に配置されていることが好ましい。これにより、細胞Ｂを含む領域１２と培養容器１４の界面の影響を排除することができる。
【００１７】
細胞Ｂを含む領域（第一の細胞領域）及び細胞Ａを含む領域（第二の細胞領域）に対する細胞Ｂを含む領域の割合は、前記第二の細胞領域の割合より少ないことが好ましく、体積比では、０．５未満がより好ましく、０．３以下が更に好ましい。これにより、細胞Ｂを含む領域を限定し、全体とは区別して評価することができる。
細胞Ｂを含む領域１２は、刺激を与える界面に垂直な軸に対して、一定の深さに存在することが好ましい。これにより、刺激源からの距離又は刺激物質の浸透性の影響を評価することができる。
なお、三次元組織体は、細胞Ａを含む領域の内部に、細胞Ｂを含む領域が存在していればよく、細胞Ｂを含む領域は、層状でなくてもよい。
また、三次元組織体は、細胞Ａ及び細胞Ｂとは異なる細胞を含む領域が更に存在していてもよい。この場合、細胞Ａ及び細胞Ｂとは異なる細胞は、発光細胞であってもよいし、発光細胞でなくてもよい。
【００１８】
＜細胞Ａ、Ｂの配置方法＞
細胞の配置方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜使用することができ、例えば、ピペット分注、マイクロマニピュレーター、インクジェット法、ゲル押し出し法、スクリーン印刷等の転写法、光ピンセットなどが挙げられる。これらの中でも、細胞を効率よく数十μｍ２〜数ｍｍ２以下の狭い範囲の領域に薄く、均一に配置する点から、インクジェット法が好ましい。前記インクジェット法によれば、数ｐＬの液滴を吐出するため、細胞１〜１０個を精密に配置することができる。
【００１９】
＜細胞Ａ、Ｂ＞
前記細胞Ａ及びＢとしては、三次元組織体を形成することが可能であれば、特に限定されず、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞を使用することができる。これらの中でも、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的に処理しなければ、単離しない程度の細胞接着性を有する哺乳類又はヒト由来の接着性細胞が好ましい。
【００２０】
＜発光細胞＞
前記発光細胞は、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する。このため、外部からの刺激に応答して、細胞内に起きる様々な分子メカニズムを解析することができる。
化学発光は、化学反応に伴って発光する現象であり、例えば、ペルオキシダーゼが過酸化水素を分解すると起こるルミノール反応などが挙げられる。
生物発光は、生物体の行う化学発光であり、発光酵素などの働きによってエネルギーが光として放出される現象をいい、例えば、ホタルが持つルシフェラーゼ（酵素）がルシフェリン（基質）を酸化すると光が放出されることなどが挙げられる。
蛍光は、励起状態にある物質が基底状態へもどる際に，電子遷移に伴って放出される光であり、生物においては、例えば、オワンクラゲが持つＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に励起光を当てると緑色の光が放出されることなどが挙げられる。
【００２１】
発光細胞は、レポーター遺伝子が導入されていることが好ましい。これにより、応答をモニターする標的遺伝子の転写活性による発現レベルを測定することができる。
この場合、レポーター遺伝子は、発現レベルを測定する標的遺伝子のプロモーターの下流に連結されている。
前記レポーター遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、又はこれらの派生物などが挙げられる。
【００２２】
前記発光細胞は、定量性に優れており、長時間に渡り、安定に遺伝子の転写活性を測定することができることから、ルシフェラーゼ遺伝子を用いて形質転換された哺乳類細胞であることが好ましい。例えば、特開２０１５−１１９６４３号公報に公開されている、ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ人工染色体ベクターを導入する手法などが挙げられる。
その他の細胞を発光させる方法としては、特に限定されないが、細胞内の異なる分子の相互作用を評価する蛍光／発光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ）、酵素や結合因子などの活性や遊走の指標となる蛍光／発光基質の取り込み（蛍光カルシウムインジケーター、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ、Ｇｌｕｃｏｓｅ取込みイメージング、蛍光ナノ粒子プローブなど）、などの公知の方法を用いることができる。
なお、前記細胞Ａ及び細胞Ｂが発光細胞である場合は、異なる条件やタイミングで発光する発光細胞、異なる波長の光を発光する発光細胞などを用いて区別することができる。例えば、三次元組織体の深さに応じて、異なる波長の光を発光する発光細胞を配置することができる。また、異なる条件で発光する疾患細胞と正常細胞を共培養として配置し、お互いの反応を比較したりすることができる。
【００２３】
＜培養容器＞
前記培養容器は、三次元組織体の形成と維持に必要な土台や支持体となる基材からなる。
前記基材を構成する材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹脂、ガラス、金属などが挙げられる。
前記基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平面状のみならず、穴が開いた形状、メッシュ状、凹凸のある形状、ハニカム状などが挙げられる。
前記培養容器としては、細胞の接着と増殖に適した基材からなり、光透過性が高く、自己発光しないマルチウェルタイプのカルチャープレートやインサートなどを用いることが好ましい。
なお、三次元組織体１０では、細胞Ａを含む領域１１が培養容器１４に接触しているが、細胞Ａを含む領域１１が培養容器１４に常時接触していなくてもよい。また、三次元組織体１０は、培地１３や安全性評価又は効能評価する物質やスクリーニングする薬剤を出し入れするために、開放系となっているが、閉鎖系で環流培養が可能なものやマイクロ流路を持つチップ型などであってもよい。
【００２４】
＜培地＞
前記培地は、三次元組織体の形成と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧などの外部環境を整える溶液である。
前記培地としては、特に制限はなく、公知の培地の中から、用途に応じて、適宜選択すればよい。
なお、表面が空気に暴露されている皮膚のように、常時培地内に浸しておく必要のない三次元組織体においては、培地を適宜除去してもよい。
【００２５】
＜固定剤＞
細胞Ｂを特定の位置に固定し、三次元組織体の構造を保持するために、固定剤が必要な場合がある。細胞Ｂを固定する時間は、一時的であってもよいし、永続的であってもよいが、少なくとも三次元組織体を形成した後、細胞培養時及び使用時に形状が崩れない程度の時間を必要とする。また、固定剤は、細胞に悪影響を与えないような生体適合性があるものが望ましい。前記固定剤は、細胞と混合して配置してもよいし、細胞とは別に配置してもよい。
前記固定剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生体由来高分子（コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、フィブロインなど）、凝固因子（フィブリノーゲン／トロンビンなど）、接着因子（フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチドなど）、ポリ乳酸等の合成高分子、アルギン酸、ジェランガム等の多糖類／多価金属塩などが挙げられる。
細胞の配置方法によっては、固定剤は、２液以上の混合により増粘する相変化材料であることが好ましい。
前記固定剤として、２液以上の混合により増粘する相変化材料を使う際には、そのうちの１液を事前に細胞懸濁液に混合してもよいし、別途液滴を適切な位置に配置してもよい。なお、固定剤を用いる場合、前記固定剤は、三次元組織体中に残留していてもよいし、残留していなくてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
−細胞の準備−
細胞Ａとして、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（Ｌｏｎｚａ社製）（以下、「ＮＨＤＦ細胞」という）を用いた。
細胞Ｂとして、ＮＦ−κＢ転写因子の応答配列のプロモーターの下流にルシフェラーゼ配列が連結されている遺伝子を含む市販のマウス繊維芽細胞ＮＦｋＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＮＩＨ３Ｔ３  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）（以下、「ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞」という）を用いた。
まず、ＮＨＤＦ細胞及びＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞を、メーカー推奨の手順に従い、拡大培養した。
次に、トリプシン処理により細胞を単離した後、発光反応とは独立的に共焦点蛍光顕微鏡観察で識別可能にするために、ＮＨＤＦ細胞及びＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞を、それぞれＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（以上、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）で染色した。
【００２８】
−三次元組織体の作製−
図２Ａ〜図２Ｅに示すとおり、染色したＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞及びＮＨＤＦ細胞を用いて、三次元組織体を作製した。
まず、培養容器１４としての９６ウェルプレートサイズのウェル（０．３ｃｍ２）に、０．２質量％コラーゲン液に１×１０７細胞／ｍＬの密度で懸濁したＮＨＤＦ細胞を、マイクロピペットＭで２０μＬ分注し、細胞層が固化するまで３７℃のＣＯ２インキュベーターに静置した（図２Ａ参照）。
【００２９】
次に、配置するＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞を固定するために、凝固因子２１としての、２５ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンの水溶液を、マイクロピペットＭで数μＬ添加し、薄膜のみを残すために上清を除去した（図２Ｂ参照）。
【００３０】
次に、凝固因子としての、トロンビン２０Ｕ／ｍＬを含有するＤＭＥＭ培地に懸濁したＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞を、数十ｐＬに細胞が１〜１０個入った液滴を吐出するインクジェット方式のバイオプリンターＰ（自社開発のインクジェット方式バイオプリンターのプロトタイプ）を用いて、約１００細胞／ｍｍ２の密度で、ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞の１個分以内の厚みで配置されるように吐出した（図２Ｃ参照）。
【００３１】
次に、ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞の層の上に、０．２質量％コラーゲン液に１×１０７細胞／ｍＬの密度で懸濁したＮＨＤＦ細胞を、マイクロピペットＭで２０μＬ加え、細胞層が固化するまで３７℃のＣＯ２インキュベーターに静置した（図２Ｄ参照）。
【００３２】
次に、培地１３としての、ＤＭＥＭ培地を、マイクロピペットＭで１００μＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターに一晩静置し、三次元組織体１０を得た（図２Ｅ参照）。
【００３３】
次に、作製した三次元組織体１０を、共焦点蛍光顕微鏡ＦＶ１０ｉ−ＬＩＶ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で観察した。
図３に、三次元組織体１０をＺ−Ｓｔａｃｋ撮影した画像を示す。図３から、厚みが約１８０μｍの細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の中心部に異なる色の細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２が細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）の１個分の厚みで配置されていることが確認された。
【００３４】
（実施例２）
実施例１において、厚みが１．６ｍｍの細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の底部に細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２を配置した以外は、実施例１と同様にして、三次元組織体を得た（図４参照）。
【００３５】
（実施例３）
実施例１において、厚みが１．６ｍｍの細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の頂部に細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２を配置した以外は、実施例１と同様にして、三次元組織体を得た（図５参照）。
【００３６】
（対照例１）
実施例２において、細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の代わりに、ＤＭＥＭ培地を配置した以外は、実施例２と同様にして、三次元組織体を得た（図６参照）。
【００３７】
（比較例１）
図７に、比較例１の三次元組織体を示す。
特開２０１２−１７９０２０号公報の実施例１及び２で使用されている「３Ｄ培養皮膚モデルＥｐｉＤｅｒｍＴＭ（ＭａｔＴｅｋ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）」のように、観察する領域を特定する発光細胞が含まれていない場合、又は図７に示すように、含まれていても三次元組織体全体に無作為に分散している場合には、三次元組織体全体をバルクとした平均的な反応しか計測できず、三次元組織体の中のある特定な領域の反応がその他の領域とは異なるかを非破壊的に評価するには、発光細胞を対照となる領域に配置する技術を用いる必要がある。
【００３８】
（比較例２）
図８に、国際公開第２０００／７５２８６号パンフレットの実施例２（図３）を再現した比較例２の三次元組織体を示す。
図８に示すように、発光細胞とその他の細胞が全体的に混合されている場合には、三次元組織体全体をバルクとした平均的な反応しか計測できず、三次元組織体の中のある特定な領域の反応がその他の領域とは異なるかを非破壊的に評価するには、発光細胞を興味の対照となる領域に配置する技術を用いる必要がある。
【００３９】
次に、実施例２、実施例３、及び対照例１の三次元組織体の発光強度を測定した。図９Ａは対照例１の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示し、図９Ｂは実施例２の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示し、図９Ｃは実施例３の三次元組織体の発光強度測定時の様子を示す。
【００４０】
［発光強度］
ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞の発光を誘導するために、刺激物質７１としての、５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αの水溶液と、発光基質としての、２００μＭのＤ−ルシフェリンの水溶液を三次元組織体に加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターに４時間静置して反応させた。
次に、プレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて、ゲイン１７５、積分時間３秒間の設定で、三次元組織体（各８個）の発光強度を測定した。
このとき、ブランクとして、ＤＭＥＭ培地を用いた。表１に、三次元組織体の発光強度の測定結果を示す。
【００４１】
【表１】
2017209103.tif 000003
【００４２】
次に、三次元組織体の発光強度からブランクの発光強度を差し引いた後、平均発光強度及び標準偏差を算出した。
図１０に、実施例２、実施例３、及び対照例１の三次元組織体の平均発光強度と標準偏差を示す。
図９Ａ及び図１０は、対照例１である。
図９Ｃ及び図１０から、実施例３の三次元組織体は、細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の頂部に細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２が配置されているため、細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）が、頂部から添加した刺激物質（ＴＮＦ−α）７１に応答し、比較例１と同等の発光強度が検出されることがわかった。
一方、図９Ｂ及び図１０から、実施例２の三次元組織体は、細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の底部に細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２が配置されているため、発光強度が低下した。この結果から、実施例２の三次元組織体は、細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の厚みの影響により、刺激物質（ＴＮＦ−α）７１が、細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２まで浸透していないことが示唆された。
発光強度の低下が単に細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１に光吸収されていることによる可能性は、細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）の代わりに、刺激物質とは非依存的に発光する細胞を用いることで除外できた（例えば、恒常的に発現するプロモーターの下流にルシフェラーゼ配列が連結されている遺伝子を含むＴＫ−Ｌｕｃ細胞）。
これらの結果から、実施例２及び実施例３の三次元組織体は、特定の領域における発光強度、即ち、刺激物質に対する応答を非破壊的に評価できることが示された。また、実施例２及び実施例３を比較することにより、刺激物質への応答が三次元組織体内の領域の位置によって変化するかを評価できた。
【００４３】
（実施例４）
細胞Ｂを含む領域１２は層状でなくともよい。図１１Ａ及び図１１Ｂに示す例は、予め低吸着処理プレート（住友ベークライト株式会社製）を用いて、細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）の約３００μｍ直径の球体の塊（スフェロイド）を作製した。
次に、実施例１と同様にして、０．２質量％コラーゲン液に懸濁した細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を、培養容器１４に配置した。この時、培養容器１４としては、頂部からのみ刺激物質が添加可能な培養プレートではなく、Ｆａｌｃｏｎカルチャーインサート０．４μｍを用いた（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）。この培養容器を用いると、多孔膜で作られた底部８１（図１１Ｂ参照）からも三次元組織体全体を培養液及び刺激物質に水浸できた。
最後に、マイクロマニピュレーターを用いて、細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）のスフェロイドを、細胞Ａ（ＮＨＤＦ細胞）を含む領域１１の中心部に配置し、更にスフェロイドを完全に包埋するように０．２質量％コラーゲン液に懸濁した細胞Ａを追加する。実施例４を用いた場合、三次元組織体の外部から内部への刺激を受けて、中心部の発光強度、即ち刺激物質への応答が評価できた。
また、このような形状の容器を用いた場合、頂部の培地１３と底部の培養液４１は異なる刺激物質を含んでもよく、例えば、２種類の刺激物質が同時に中心の細胞Ｂを含む領域１２に到達した場合のみの反応を評価できた。
【００４４】
（実施例５）
細胞Ｂを含む領域１２は一体化していなくともよく、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、同一の三次元組織体において複数の細胞Ｂを含む領域が、Ｘ、Ｙ及びＺの特定な座標に配置されていてもよい。実施例５を作製するためには、培養容器１４としての３．５ｍｍサイズのカルチャーディッシュに、実施例１と同じインクジェット方式のバイオプリンターＰを用いて、予め設定した座標に細胞Ｂ（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞）を含む領域１２を９個のエリアに分けて配置した以外は、実施例１と同様にして、三次元組織体を構築した。
実施例５を用いた場合、刺激物質を添加した時の深さにおける浸透だけでなく、広範囲における反応の伝達速度などの評価も可能となる。
【００４５】
（実施例６）
細胞Ｂを含む領域１２は、図１３に示すように、細胞Ａを含む領域１１を包み込む形でもよい。実施例１と同じインクジェット方式のバイオプリンターＰを用いて予め細胞Ａを含む細胞シートと、細胞Ｂを含む細胞シートが２枚重ねに積層されるように構築し、筒状に丸めて内部を培養液で環流させた。この場合、筒の内側から放射状に外側に向かって刺激反応が変化するかを評価することができる。
【００４６】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  第一の細胞を含む第一の細胞領域と、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞を含む第二の細胞領域とが存在し、
前記第一の細胞が、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞であることを特徴とする三次元組織体である。
＜２＞  前記第二の細胞領域には、前記第一の細胞は存在しておらず、
前記第一の細胞領域には、前記第一の細胞が多く存在している前記＜１＞に記載の三次元組織体である。
＜３＞  前記第一の細胞領域及び前記第二の細胞領域を含む領域に対する前記第一の細胞領域の割合が、前記第二の細胞領域の割合より少ない前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜４＞  刺激を与える界面に垂直な軸に対して、一定の深さに前記第一の細胞領域の表面が存在する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜５＞  培養容器の内部に、前記第一の細胞領域及び前記第二の細胞領域が配置されている前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜６＞  前記第一の細胞領域が、前記培養容器の周壁に接触していない前記＜５＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜７＞  前記第一の細胞が、レポーター遺伝子が導入されている前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜８＞  前記第二の細胞が、光を発する細胞ではない前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜９＞  前記第二の細胞が、外部からの刺激に応答して、化学発光、生物発光又は蛍光によって光を発する細胞である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜１０＞  前記第二の細胞が、レポーター遺伝子が導入されている前記＜９＞に記載の三次元組織体である。
＜１１＞  前記第二の細胞が、前記第一の細胞とは異なるレポーター遺伝子が導入されている前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜１２＞  前記第二の細胞が、前記第一の細胞とは生理学的に種類が異なる前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜１３＞  前記第一の細胞及び前記第二の細胞とは異なる細胞を、１種類以上含む前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜１４＞  前記第一の細胞領域が、固定剤により位置が保持されている前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
＜１５＞  物質の安全性評価、物質の効能評価、又は薬剤のスクリーニングに用いられる前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の三次元組織体である。
【００４７】
前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の三次元組織体によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【００４８】
１０      三次元組織体
１１      細胞Ａを含む領域
１２      細胞Ｂを含む領域
１３      培地
１４      培養容器
２１      凝固因子
４１      培養液
７１      刺激物質
８１      底部
Ｍ      マイクロピペット
Ｐ      インクジェット方式のバイオプリンター
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４９】
【特許文献１】特開２０１２−１７９０２０号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／７５２８６号パンフレット
【図１Ａ】
2017209103.tif 000004
【図１Ｂ】
2017209103.tif 000005
【図２Ａ】
2017209103.tif 000006
【図２Ｂ】
2017209103.tif 000007
【図２Ｃ】
2017209103.tif 000008
【図２Ｄ】
2017209103.tif 000009
【図２Ｅ】
2017209103.tif 000010
【図３】
2017209103.tif 000011
【図４】
2017209103.tif 000012
【図５】
2017209103.tif 000013
【図６】
2017209103.tif 000014
【図７】
2017209103.tif 000015
【図８】
2017209103.tif 000016
【図９Ａ】
2017209103.tif 000017
【図９Ｂ】
2017209103.tif 000018
【図９Ｃ】
2017209103.tif 000019
【図１０】
2017209103.tif 000020
【図１１Ａ】
2017209103.tif 000021
【図１１Ｂ】
2017209103.tif 000022
【図１２Ａ】
2017209103.tif 000023
【図１２Ｂ】
2017209103.tif 000024
【図１３】
2017209103.tif 000025