(57)【要約】      （修正有）【課題】低濃度の8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの検出を可能とする、検出感度に優れた8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの定量方法を提供する。【解決手段】8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを含有する溶液を第１の逆相カラム１に送液し、水系溶媒を用いて逆相カラムから溶出させ、溶出した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン画分のみをオンラインで第２の逆相カラム２に送液し、第２の逆相カラムで8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを精製し、精製した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンをMS/MS/MSで測定、定量する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを含有する溶液を第１の逆相カラムに送液し、水系溶媒を用いて前記第１の逆相カラムから溶出させ、溶出した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン画分のみをオンラインで第２の逆相カラムに送液し、
第２の逆相カラムで8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを精製し、
精製した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンをMS/MS/MS測定し、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン量を定量する、
8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの定量方法。
【請求項２】
前記の、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを含有する溶液が、標準物質をさらに含有する、請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
前記標準物質が、安定同位体で標識した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンである、請求項２に記載の定量方法。
【請求項４】
前記の、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを含有する溶液が血液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項５】
前記第１の逆相カラムがアミド内包型逆相カラムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の定量方法。
【請求項６】
送液した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン溶液を水系溶媒で溶出することで8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン画分のみを溶出させる、第１の逆相カラムと、
第１の逆相カラムから溶出した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン画分のみをオンラインで送液する、送液手段と、
送液手段により送液された8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン画分から、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンを精製する、第２の逆相カラムと、
精製した8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンをMS/MS/MSで測定し、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン量を定量する、定量手段、
を備えた、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの定量装置。
【請求項７】
前記第１の逆相カラムがアミド内包型逆相カラムである、請求項６に記載の定量装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素による生体分子の酸化が生体に及ぼす影響について、これまでに多くの研究がなされている。生体が恒常性を維持する応答反応過程で、一定量の活性酸素は産生される。しかし、種々の疾患や喫煙等の外的要因によって過剰に発生した活性酸素は、種々の生体分子を酸化すると考えられている。このことから、不安定な活性酸素ではなく、活性酸素により酸化した生体分子の酸化生成物を指標とし、健康状態を評価する試みがなされている。
【０００３】
発ガン性物質、大気汚染、喫煙、精神的ストレスなどによって生体内に過剰に活性酸素が発生すると、活性酸素の作用によりＤＮＡは酸化損傷を受ける。
例えば、ＤＮＡの構成成分であるデオキシグアノシン（dG）が活性酸素により酸化されると、dGの８位の炭素がヒドロキシル化され、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（以下、「8-OHdG」ともいう）が生成する。8-OHdGが生成した場合、ＤＮＡ修復酵素の作用により、8-OHdGは正常なdGに置換される。このＤＮＡ修復過程において、8-OHdGは代謝されずに血液を経て尿中に排出される。さらに、尿中への8-OHdGの排泄量の増加は、糖尿病、肺癌、アトピー性皮膚炎、尿細管間質性腎炎、慢性肝疾患などの原因となることが知られている。
これらのことから8-OHdGは、活性酸素によるＤＮＡの損傷の程度、ひいては酸化ストレスの高低を鋭敏に反映するバイオマーカーとして利用されている。
【０００４】
これまでに、尿中の8-OHdGを定量する方法は多数報告されている。例えば、特許文献１には、陰イオン交換カラムと逆相カラムを接続し、生成した8-OHdGを電気化学検出にて分析する方法が報告されている。また、非特許文献１には、特異的な抗体を利用したELISA法により、0.5〜200ng/mLの範囲で8-OHdGを定量する方法が記載されている。また、非特許文献２には、対象成分を衝突解離させた第一フラグメントをモニターするMS/MSを用いた方法により、20pg/mL以上の範囲で8-OHdGを定量する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／５０１９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Y．Sato，et  al.，Free  Radical  Research，2013，vol．47(3)，p．181-191
【非特許文献２】Huang  C．Y.，et  al.，Toxicology  and  Applied  Pharmacology，2012，vol．262，p．349-354
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、尿中に蓄積された8-OHdGの定量方法については多数報告されている。しかし、生成した8-OHdGは一旦血液に排出された後に尿中に蓄積される。そのため、活性酸素によるＤＮＡの損傷の程度を早い段階で検知するには、8-OHdGの生成から一定時間の経過後でなければ蓄積されない尿中の8-OHdGよりも、8-OHdGの生成直後に排出される血液中の8-OHdGをバイオマーカーとして利用するのが好ましい。
しかし、体内で生成した8-OHdGは血液を介して尿中に蓄積されるので、尿中の8-OHdG濃度と比較すると、血液中に含まれる8-OHdGは低濃度である。
そのため、低濃度領域においても8-OHdGを正確に定量できる技術の開発が望まれている。
【０００８】
そこで本発明は、低濃度の8-OHdGの検出を可能とする、検出感度に優れた8-OHdGの定量方法の提供を課題とする。
さらに本発明は、低濃度の8-OHdGの検出を可能とする、検出感度に優れた8-OHdGの定量装置の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、8-OHdGを含有する溶液を第１の逆相カラムで粗精製し、粗精製した8-OHdGの画分のみをオンラインで第２の逆相カラムに送液して精製した後、コリジョンセル、及びリニアイオントラップを有するタンデム質量分析計を用いた2段階の衝突誘起解離に由来するフラグメントを検出し（MS/MS/MS）、精製した8-OHdGを測定することにより、低濃度の8-OHdGを検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１０】
本発明は、8-OHdGを含有する溶液を第１の逆相カラムに送液し、水系溶媒を用いて前記逆相カラムから溶出させ、溶出した8-OHdG画分のみをオンラインで第２の逆相カラムに送液し、第２の逆相カラムで8-OHdGを精製し、精製した8-OHdGをMS/MS/MSで測定し、8-OHdG量を定量する、8-OHdGの定量方法に関する。
【００１１】
また本発明は、送液した8-OHdG溶液を水系溶媒で溶出することで8-OHdG画分のみを溶出させる、第１の逆相カラムと、
第１の逆相カラムから溶出した8-OHdG画分のみをオンラインで送液する、送液手段と、
送液手段により送液された8-OHdG画分から、8-OHdGを精製する、第２の逆相カラムと、
精製した8-OHdGをMS/MS/MSで測定し、8-OHdG量を定量する、定量手段、を備えた、8-OHdGの定量装置に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の8-OHdGの定量方法によれば、血清中に含まれる8-OHdGのような、低濃度の8-OHdGを検出することができ、検出感度の高い8-OHdGの定量が可能である。
また本発明の8-OHdGの定量装置は、血清中に含まれる8-OHdGのような、低濃度の8-OHdGを定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の8-OHdGの分析装置の好ましい実施態様を模式的に示した図である。
【図２】図１に示す六方バルブ３の仕様を模式的に示す図である。
【図３】図１に示す七方バルブ４の仕様を模式的に示す図である。
【図４】試験例１で作製した、血清中に含まれる8-OHdGの第２フラグメントを分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図５】試験例１で作製した、血清に添加した8-OHdGの15N同位体の第２フラグメントを分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６】試験例２で作製した、8-OHdGの標準品をMS/MSにて測定した結果を示すクロマトグラムである。
【図７】試験例２で作製した、8-OHdGの標準品をMS/MS/MSにて測定した結果を示すクロマトグラムである。
【図８】試験例３で行った、オフライン固相抽出での8-OHdGの回収率を示すグラフである。
【図９】試験例３で行った、オンライン固相抽出での8-OHdGの回収率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書における「質量分析」とは、測定対象物質の定量値を絶対値又は相対値で算出し分析することを含む概念である。
【００１５】
本明細書における「8-OHdG」は、下記に示す構造式で表される化合物である。
前述のように、ＤＮＡの構成成分であるdGが活性酸素により酸化されると、dGの８位の炭素がヒドロキシル化され、8-OHdGが生成する。活性酸素によるdGの酸化は、ＤＮＡ、あるいは合成原料であるdGが損傷を受けた結果起こるものである。そのため8-OHdGは、ＤＮＡの損傷の程度を示す指標として用いられている。
生体内で生成された8-OHdGは、血液を経て尿中に蓄積され、最終的には尿として生体外へ排出される。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
本発明により8-OHdGを定量するための試料溶液（8-OHdGを含有する溶液）としては、尿、血液（血清、血漿）、髄液、唾液、細胞培養後の培地など、8-OHdGを含み得るあらゆる生体試料が挙げられる。これらの中でも、経時的な8-OHdG量の変動の解析に適した血液、特に、各種添加剤を含有しない血清が好ましい。
【００１８】
本発明の方法及び装置の好ましい実施態様について、図１〜３を参照しながら以下に説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００１９】
本発明の装置について、構成例を図１に示す。
図１に示す装置は、8-OHdGを粗精製するための第１の逆相カラム（逆相カラム１）と、8-OHdGを精製及び分離するための第２の逆相カラム（逆相カラム２）とが、バルブ（六方バルブ３）を介して接続されている。
逆相カラム１の上流には、カラムに保持された物質を溶出させる溶出液をバルブ（七方バルブ４）を介して各カラムに送液する送液ポンプユニット５と、試料溶液を各カラムに送液するオートサンプラー６が接続されている。送液ポンプユニット５は、２種以上のポンプを有しており、２種以上の溶出液によるグラジエント送液が可能なものが好ましい。
また、分取された8-OHdGを精製するため、バルブ４とバルブ３とが互いに接続されている。
さらに、逆相カラム２の下流には、バルブ３を介して、8-OHdGを定量するための質量分析装置７が接続されている。
【００２０】
オートサンプラー６により逆相カラム１に送液する試料溶液として、生体から採取した試料溶液をそのまま用いてもよいし、タンパク質を排除するため試料溶液に有機溶媒を添加することでタンパク質を沈殿させた上清を用いてもよいし、一定以上の分子量を有する物質を排除するため予め限外ろ過を行った試料溶液を用いてもよい。限外ろ過に用いるフィルターは、試料溶液の種類に応じて適宜選択することができる。前記フィルターの分画分子量としては、100kDa以上、50kDa以上、30kDa以上、10kDa、又は3kDa以上が好ましく、タンパク質をはじめとする夾雑成分を除くためには、分子分画量が3kDa以上であることが好ましい。
【００２１】
試料溶液には、8-OHdG量を正確に算出するために、標準物質を所定量含有させておくことが好ましい。標準物質を所定量含有させることで、8-OHdGと併せて標準物質も定量し、標準物質の定量値で8-OHdGの定量値を補正して、8-OHdG量を正確に算出することができる。
標準物質としては適宜選択することができる。例えば、蛍光物質や安定同位体で標識した8-OHdG、好ましくは安定同位体で標識した8-OHdG、より好ましくは窒素の安定同位体で標識した8-OHdG、を用いることができる。
試料溶液への前記標準物質の含有量は、試料溶液の種類に応じて適宜設定することができる。試料溶液が血液の場合、標準物質の含有量は100pg/mL以下が好ましく、50pg/mLがより好ましい。
【００２２】
逆相カラム１において、送液された試料溶液が、8-OHdGと共存成分とに高度に分離され、8-OHdG画分が溶出させる。
逆相カラム１に用いる充填剤としては、疎水性相互作用及び親水性相互作用（例えば、水素結合）に基づいて、8-OHdGとその他の成分とを分離できる、親水性基内包型逆相カラムが好ましい。ここで「親水性基内包型逆相カラム」とは、シリカゲルなどの機材に結合させた官能基中に、アミド基などの親水性基を含有させた充填剤からなるカラムを意味する。下記に、親水性基としてアミド基を用いた、親水性基内包型逆相カラムの充填剤の構造を模式的に示す。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
このようなカラムを用いることで、8-OHdGとその他の成分とを、官能基との疎水性相互作用の違いに基づき、分離することができる。さらに、8-OHdGはdGよりも多くの親水性基（水酸基）を有するので、親水性基に対する相互作用が大きくなる。そのため、前記官能基中に含有させたアミド基などの親水性基に対する親水性相互作用の違いに基づき、8-OHdGと、dGなどとの分離が可能となる。親水性基内包型逆相カラムを用いた場合、8-OHdGは他の成分と比べてカラムとの相互作用が強いため、カラムに対する8-OHdGの保持時間を長くし、カラムからの溶出時間を遅らせることができる。このようにして、8-OHdGを高度に分離することができる。
【００２５】
本発明で用いる逆相カラム１としては、RP-amide（商品名、SUPERCO社製）などが挙げられる。
また、逆相カラム１の長さ、内径、温度などの条件は、試料溶液に応じて適宜設定することができる。また、逆相カラム１に用いる充填剤の粒子径も適宜設定することができる。例えば、粒子径を5μm以下とすることで、8-OHdGの分離能が向上し、より高純度な精製が可能となる。また、逆相カラム１の温度も、試料溶液に応じて適宜設定することができる。例えば、カラム温度を30〜50℃に設定することが好ましい。
【００２６】
8-OHdG画分を逆相カラム１から溶出させるために用いる溶媒として、水系溶媒を用いる。ここで「水系溶媒」とは、水、又は室温にて水と完全に混和する有機溶媒を含有する溶媒を意味する。本発明で用いることができる水系溶媒としては、メタノール、アセトニトリル、イソプロパノールなどの有機溶媒の含有量が低い水溶液が好ましく、このような有機溶媒の含有量が1質量%以下の水系溶媒が好ましく、有機溶媒の含有量が0.1質量%以下の水系溶媒がより好ましい。具体的には、水、ギ酸水溶液、酢酸水溶液、プロピオン酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、クエン酸水溶液、などが挙げられる。このうち、ギ酸水溶液が好ましい。
溶出液の流速は、試料溶液に応じて適宜設定することができ、0.5mL/min以下が好ましく、0.15mL/min以下がより好ましい。
【００２７】
前記バルブ３は、通常、図３（Ａ）に示すポジションＡにセットされている。そして、逆相カラム１から8-OHdG画分が溶出されるタイミングを検知し、分析装置に備えたソフトウェアなどの制御により、バルブ３のポジションが図３（Ｂ）に示すポジションＢに切り替え、8-OHdG画分のみをオンラインで逆相カラム２に送液される。なお、逆相カラム１からの8-OHdG溶出のタイミングは、あらかじめ標準品を用いて逆相カラム１からの溶出時間を確認しておくことが好ましい。
ここで、本明細書中に記載される「オンライン」とは、カラムスイッチングが可能な分離手段により、逆相カラムで前処理を行った試料全量を、そのまま次の逆相カラムへと送液する手法を意味する。
【００２８】
本発明で用いる逆相カラム２としては、疎水性相互作用により、逆相カラム１でブロードに溶出した8-OHdGを濃縮し、シャープなピークとして検出できるカラムから適宜選択することができる。例えば、Unison  UK-C18（商品名、Imtakt社製）などが挙げられる。
また、逆相カラム２の長さ、内径、温度、粒子径などの条件は、試料溶液に応じて適宜設定することができる。また、逆相カラム２の温度も、試料溶液に応じて適宜設定することができる。例えば、カラム温度を30〜50℃に設定することが好ましい。
【００２９】
逆相カラム２に送液された8-OHdG画分は、逆相カラム２の先端に濃縮される。そして、逆相カラム２に溶出液を送液することで、8-OHdGを分離、精製する。8-OHdGの分離、精製は、水系溶媒や有機溶媒（メタノール、アセトニトリル、イソプロパノールなど）など用いて、有機溶媒の含有量を経時変化させるグラジエント溶出を常法に従い、行うことができる。
溶出液の流速は、試料溶液に応じて適宜設定することができ、0.2mL/min以下が好ましい。
【００３０】
逆相カラム１から逆相カラム２への8-OHdG画分の送液は、バルブ３のポジションを図３（Ｂ）に示すポジションＢにセットすることで行われる。また、溶出液の逆相カラム２への送液は、バルブ４のポジションを図２（Ｂ）に示すポジションＢに、バルブ３のポジションを図３（Ａ）に示すポジションＡに、それぞれセットすることで行われる。
そして、逆相カラム２から8-OHdG画分が溶出されるタイミングを常法により検知し、分析装置に備えたソフトウェアなどの制御により、バルブ３のポジションを図３（Ａ）に示すポジションＡに切り替えられることで、8-OHdG画分を質量分析装置７に送液する。なお、逆相カラム２からの8-OHdG溶出のタイミングは、あらかじめ標準品を用いて逆相カラム２からの溶出時間を確認しておくことが好ましい。
【００３１】
続いて、逆相カラム2で精製した8-OHdGを、質量分析装置７で分析する。
本発明で用いる質量分析装置７は、三連四重極型が好ましく、コリジョンセル、及びリニアイオントラップが組み込まれ、2段階の衝突誘起解離に由来するフラグメントを検出する（MS/MS/MS）機能を有するハイブリッド型がより好ましい。ハイブリッド型の市販品としては、QTRAP  5500（商品名、AB  SCIEX社製）などが挙げられる。
【００３２】
前記MS/MS/MSによる8-OHdGの定量方法の具体例を説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
プロトン化された8-OHdGの分子量は284Daである。そこでまず、質量分析装置７による質量分離により、284Daのイオン化分子を抽出する。続いて、一定量のエネルギーによりイオン化分子を断片化し、第１フラグメントである168Daを抽出する。さらに第１フラグメントを断片化した第２フラグメント140Daを検出する。これにより、8-OHdGの第２フラグメントに特徴的な信号を特異的に測定し、8-OHdGの定量を行う。
また、前述した、8-OHdGの標準物質を用いた場合、標準物質に含まれる同位体の数に応じて、各プロトン化分子の分子量が定まる。例えば、8-OHdGのすべての窒素原子（計５個）が15Nである場合、プロトン化分子の分子量は289Daであり、第１フラグメントの分子量は173Daであり、第２フラグメントの分子量は145Daである。
そして、8-OHdG由来のピーク面積を、所定量の標準物質に由来するピーク面積で補正し、試料溶液に含まれる8-OHdG量を算出することができる。
【００３３】
本発明によれば、後述の実施例でも示すように、数pg/mLのオーダーで8-OHdGを定量することができる。これは、従来のオンライン固相抽出による定量方法と比較して、8-OHdGの定量可能な範囲（下限値）を１０倍程度向上させることができる。
前述したように、生体内で生成した8-OHdGは血液を経て尿中に排出されるため、ＤＮＡは酸化損傷を早い段階で評価するには、尿中に蓄積された8-OHdGを定量するよりも、血液中の8-OHdGを定量することが好ましい。しかし、血液中の8-OHdG濃度は、尿中の8-OHdG濃度よりもかなり低いため、従来法では、血液中に含まれるようなごく微量の8-OHdGの定量は困難であった。
これに対して、本発明によれば、8-OHdGの検出感度を格段に向上させることで、血液中の8-OHdGの検出が可能となった。従って、ＤＮＡの酸化損傷により伴うリスクを従来よりも早い段階で予測、診断、又は評価する方法などに利用することができる。
【００３４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の8-OHdGの定量方法、及び8-OHdGの定量装置を開示する。
【００３５】
＜１＞8-OHdGを含有する溶液を第１の逆相カラムに送液し、水系溶媒を用いて前記第１の逆相カラムから溶出させ、溶出した8-OHdG画分のみをオンラインで第２の逆相カラムに送液し、
第２の逆相カラムで8-OHdGを精製し、
精製した8-OHdGをMS/MS/MSで測定し、8-OHdG量を定量する、
8-OHdGの定量方法。
【００３６】
＜２＞前記の、8-OHdGを含有する溶液に対して、第１の逆相カラムに送液する前に限外ろ過を行う、前記＜１＞項記載の定量方法。
＜３＞限外ろ過に用いるフィルターの分画分子量が、100kDa以上、50kDa以上、30kDa以上、10kDa、又は3kDa以上、好ましくは3kDa以上、である、前記＜２＞項記載の定量方法。
＜４＞前記の、8-OHdGを含有する溶液が、標準物質をさらに含有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の定量方法。
＜５＞前記標準物質が、安定同位体、好ましくは窒素の安定同位体、で標識した8-OHdGである、前記＜４＞項に記載の定量方法。
＜６＞前記の、8-OHdGを含有する溶液における、前記標準物質の含有量が100pg/mL以下、好ましくは50pg/mL以下、である、前記＜４＞又は＜５＞項に記載の定量方法。
＜７＞前記の、8-OHdGを含有する溶液が血液、好ましくは血清、である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の定量方法。
＜８＞前記第１の逆相カラムが親水性基内包型逆相カラム、好ましくはアミド内包型逆相カラム、である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の定量方法。
＜９＞前記第１の逆相カラムに対する8-OHdGの保持時間を、dGの保持時間よりも長くさせ、前記第１の逆相カラムからの8-OHdG画分の溶出時間を、dGの溶出時間よりも遅くさせる、前記前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の定量方法。
＜１０＞前記第１の逆相カラムからの8-OHdGの溶出を、水系溶媒、好ましくはギ酸水溶液、用いて行う、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の定量方法。
【００３７】
＜１１＞送液した8-OHdG溶液を水系溶媒で溶出することで8-OHdG画分のみを溶出させる、第１の逆相カラムと、
第１の逆相カラムから溶出した8-OHdG画分のみをオンラインで送液する、送液手段と、
送液手段により送液された8-OHdG画分から、8-OHdGを精製する、第２の逆相カラムと、
精製した8-OHdGをMS/MS/MSで測定し、8-OHdG量を定量する、定量手段、
を備えた、8-OHdGの定量装置。
＜１２＞前記第１の逆相カラムが親水性基内包型逆相カラム、好ましくはアミド内包型逆相カラム、である、前記＜１１＞項に記載の定量装置。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
試験例１
（１）試料の調製
凍結したヒトの血清を解凍して均一な液とした。窒素原子の安定同位体で標識した8-OHdG（以下、「15N同位体」という）が12.5pg入ったエッペンドルフチューブに、前記血清を250μL添加し、撹拌した。得られた混合物240μLを、分画分子量3kDa以上のフィルターを用いて、14,000×gで60分間限外ろ過した。得られたろ液を微量バイアル（Waters製）に移し、試料溶液を調製した。
【００４０】
（２）8-OHdG及び15N同位体の分画及び精製
送液ポンプユニット５（商品名：UltiMate  3000、Thermo  Scientific社製）及びオートサンプラ６（商品名：UltiMate  3000、Thermo  Scientific社製）を用いて、七方バルブ４（商品名：UltiMate  3000、Thermo  Scientific社製）のポジションを図２（Ａ）に示したポジションＡにセットし、試料溶液100μLを逆相カラム１（商品名：RP-Amide（アミド内包型逆相カラム）、カラム長：50mm、カラム内径：2mm、樹脂の粒子径：5μm、SUPELCO社製）に送液し、8-OHdGを分画した。カラム温度は40℃、流速は0.5mL/minとし、溶出には溶離液0.1%ギ酸水溶液を用いた。
【００４１】
8-OHdG及び15N同位体が逆相カラム１から溶出するタイミングで、六方バルブ３（商品名：QTRAP  5500、AB  SCIEX社製）のポジションを図３（Ｂ）に示したポジションＢに切り替えた。このタイミングで、逆相カラム１と逆相カラム２（商品名：Unison  UK-C18、カラム長：150mm、カラム内径：2mm、樹脂の粒子径：3μm、Imtakt社製）が接続され、逆相カラム１から溶出した8-OHdG及び15N同位体を逆相カラム２の先端で濃縮させた。この際、流速は0.15mL/minとした。
8-OHdG及び15N同位体が全て逆相カラム１から溶出したタイミングで六方バルブ３のポジションを図３（Ａ）に示したポジションＡに切り替え、七方バルブ４を図２（Ｂ）に示したポジションＢに切り替え、逆相カラム２の先端に濃縮された8-OHdG及び15N同位体を溶出させた。この際、溶出は溶離液(A)0.1%ギ酸水溶液100%から、6.5分間で溶離液(B)0.1ギ酸含有アセトニトリルの組成を65%まで上げるグラジエント条件にて溶出した。また、流速は0.2mL/minとした。
【００４２】
（３）8-OHdG及び15N同位体の測定
精製した8-OHdG及び15N同位体について、下記に示すように、第２フラグメントをMS/MS/MS（商品名：QTRAP5500、AB SCIEX社製）にて測定した。
一定量のエネルギーを負荷して8-OHdGのプロトン化分子（分子量284Da）を断片化し、第１フラグメント（分子量168Da）を抽出した。抽出した第１フラグメントをさらに断片化し、第２フラグメント（分子量140Da）を検出した。
15N同位体についても同様に断片化を行った。15N同位体の分子量は289Da、15N同位体の第１フラグメントの分子量は173Daであり、15N同位体の第二フラグメントの分子量は145Daである。
【００４３】
【化３】
2017020970.tif 000005
【００４４】
8-OHdGの第２フラグメントを分析したクロマトグラムを図４に、15N同位体の第２フラグメントを分析したクロマトグラムを図５に、それぞれ示す。
図４及び図５に示すように、血清中に含まれる8-OHdG、及び標準物質として添加した15N同位体、それぞれを測定できた。また、図４に示す8-OHdG由来のピーク面積を、図５に示す15N同位体のピーク面積で除した値を算出し、標準試料を用いて作成した検量線に回帰することで、血清中に含まれる8-OHdG量を算出することができる。
【００４５】
試験例２  MS/MS法とMS/MS/MS法との比較
8-OHdGの標準品を超純水に溶解して10pg/mLの溶液を調製し、試験例１と同様に8-OHdGの測定を行った。
また、前記の、8-OHdGの標準品に対して、質量分析方法をMS/MS/MSからMS/MSに変更した以外は、前述と同様に8-OHdGの測定を行った。
なお、逆相カラム２における8-OHdGの分離は、カラム温度を40℃、流速を0.2mL/minとし、溶出は溶離液(A)0.1%ギ酸水溶液100%から、10分間で溶離液(B)0.1ギ酸含有アセトニトリルの組成を100%まで上げるグラジエント条件にて行った。
【００４６】
MS/MS法で得られたクロマトグラムを図６に、MS/MS/MS法で得られたクロマトグラムを図７に、それぞれ示す。図６及び図７に示すように、MS/MS法と比べて、MS/MS/MS法を用いることによりS/N比が10倍程度向上し、より低濃度の8-OHdGが数pg/mLのオーダーで定量可能であった。
【００４７】
試験例３  オフライン固相抽出とオンライン固相抽出との比較
オフライン固相抽出とオンライン固相抽出、それぞれを行った場合の8-OHdGの回収率について、下記に示すように比較した。なお、血清には内因性の8-OHdGが含まれるため、8-OHdGの回収率は、超純水で溶解した15N同位体の面積値に対する、血清で溶解した15N同位体の面積値から算出した。
【００４８】
（１）オフライン固相抽出
8-OHdGの15N同位体を超純水、又はヒト血清に溶解して50pg/mLの溶液を調製した。
カラムとしてBond  Elut  C18/OH（100mg）とSep-Pack  C18（100mg）、溶離液としてメタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトンについて、それぞれの5%、15%、30%水溶液を用いた。
まず、各有機溶媒1mLを通液することでカラムを活性化した。続いて、超純水3mLにてカラムを平衡化し、ヒト血清に溶解した15N同位体溶液200μLを添加した。超純水500μLでカラムを洗浄した後、各溶離液500μLにて回収した画分を窒素噴霧条件下にて乾固し、超純水200μLで溶解し、LC-MS/MS/MSにて測定した。HPLC分離は、カラム温度を40℃、流速を0.2mL/minとし、溶出は溶離液(A)0.1%ギ酸水溶液100%から、10分間で溶離液(B)0.1ギ酸含有アセトニトリルの組成を100%まで上げるグラジエント条件にて行った。
上記条件下で行った試験のうち、回収率の高かった、Bond  Elut  C18/OHカラムを用いた場合の8-OHdGの回収率を示すグラフを図８に示す。
【００４９】
（２）オンライン固相抽出
8-OHdGの15N同位体を超純水又はヒト血清に溶解して200pg/mLの溶液を調製し、上述の試験例と同様に試験を行い、8-OHdGの回収率を算出した。その結果を図９に示す。
【００５０】
図８及び図９に示すように、オフライン固相抽出と比べて、オンライン固相抽出ではより高い回収率で8-OHdGの精製が可能であることが確認された。従って、オンライン固相抽出を行う本発明によれば、より低濃度の8-OHdGが定量可能である。
【００５１】
上記で示すように、本発明によれば、血清中に含まれる8-OHdGのように、試料中の8-OHdG量がごく微量である場合であっても、8-OHdGを検出することができ、検出感度に優れた8-OHdGの定量を可能とする。
【符号の説明】
【００５２】
１  第１の逆相カラム（逆相カラム１）
２  第２の逆相カラム（逆相カラム２）
３  六方バルブ
４  七方バルブ
５  送液ポンプユニット
６  オートサンプラ
７  質量分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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