(57)【要約】【課題】表面増強ラマン分光法は、低濃度でも計測可能ではあるが、増強度の再現性が不十分で、濃度の定量精度が悪く、信頼性が低いという課題があった。【解決手段】本発明は、共鳴レイリー散乱光を検出して、金属ナノ微粒子の凝集の進行度合いを検知することで、計測の信頼性を向上した、分子の濃度計測方法及び装置である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属ナノ微粒子を凝集させた、これに取り込まれた計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を観測し、計測対象分子の濃度を計測する方法であって、
（１）計測対象分子を含むサンプル液と、金属ナノ微粒子を含む溶液と、前記金属ナノ微粒子の凝集剤を含む溶液とを混合して、前記金属ナノ微粒子を、前記計測対象分子を取り込んで凝集させる工程、
（２）２個の前記金属ナノ微粒子が凝集したダイマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第１照射光と、３個の前記金属ナノ微粒子が凝集したトリマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第２照射光を同一位置に照射する工程、
（３）前記第１照射光７によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した第１レイリー散乱光１２の強度と、前記第２照射光によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した第２レイリー散乱光１３の強度と、前記第１照射光によって前記ダイマーで発生した計測対象分子の表面増強ラマン散乱光強度とを計測する工程、
（４）第１レイリー散乱光の強度と第２レイリー散乱光の強度を比較して、前記トリマーの生成を検知する工程、
（５）前記表面増強ラマン散乱光１の強度に基づき計測対象分子の濃度を算出する工程、
を有することを特徴とする表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法。
【請求項２】
前記工程（４）において、前記トリマーの生成を検知しない場合は、前記工程（５）で算出された濃度を有効とする工程を有することを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法。
【請求項３】
前記工程（４）において、前記トリマーの生成を検知した場合に、前記計測対象分子を含む溶液を希釈して、
再度、請求項１に記載の（１）、（２）、（３）、（４）を実行して、前記トリマーの生成を検知しない場合に、前記表面増強ラマン散乱光１の強度と希釈率に基づき計測対象分子の濃度を算出する工程を有することを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法。
【請求項４】
前記金属ナノ微粒子が、直径が４０ｎｍの銀ナノ微粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法。
【請求項５】
金属ナノ微粒子を凝集させた、これに取り込まれた計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を観測し、計測対象分子の濃度を計測する装置であって、
前記計測対象分子を含むサンプル液と、前記金属ナノ微粒子を含む溶液と、前記金属ナノ微粒子の凝集剤を含む溶液とを混合した混合液を流す流路と、
前記流路中を流れる液体に２個の前記金属ナノ微粒子が凝集したダイマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第１照射光を発生する第１光源と、
前記流路中を流れる液体に３個の前記金属ナノ微粒子が凝集したトリマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第２照射光を発生する第２光源と、
前記第１照射光と前記第２照射光を重ねて前記流路中の同一位置に照射する位置に配置された第１ダイクロイックミラーと、
前記流路中の第１照射光及び第２照射光の光路中で発生した散乱光の内、前記第１照射光によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した前記第１レイリー散乱光のみを分離する第２ダイクロイックミラーと、
前記第２ダイクロイックミラーにより分離された前記第１レイリー散乱光を検出する第１光センサと、
前記流路中の第１照射光及び第２照射光の光路中で発生した散乱光の内、前記第２照射光によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した第２レイリー散乱光のみを分離する第３ダイクロイックミラーと、
前記第３ダイクロイックミラーにより分離された前記第２レイリー散乱光を検出する第２光センサと、
前記流路中の第１照射光及び第２照射光の光路中で発生した散乱光の内、前記ダイマーで発生した前記計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を分光して検出する分光器と、
前記第１光センサの出力信号と前記第２光センサの出力信号より、前記流路中の第１照射光及び第２照射光の光路中での前記トリマーの生成を検知し、前記分光器の出力信号より前記計測対象分子の濃度を算出するコンピューターと
前記サンプル液を前記流路に一定流速で流入する第１シリンジポンプと、
前記金属ナノ微粒子を含む溶液液を前記流路に一定流速で流入する第２シリンジポンプと、
前記金属ナノ微粒子の凝集剤を含む溶液を前記流路に一定流速で流入する第３シリンジポンプと、
前記第１シリンジポンプ、前記第２シリンジポンプ、および前記第３シリンジポンプより注入された液体を混合して混合液を生成する十字形状流路と、
を具備する分子の濃度計測装置。
【請求項６】
請求項５に記載の分子の濃度計測装置であって、
前記コンピューターが、前記計測対象分子の濃度を算出する際に、前記サンプル液の希釈率を反映して濃度を算出する機能を有している。
【請求項７】
前記金属ナノ微粒子が、直径が４０ｎｍの銀ナノ微粒子であることを特徴とする、請求項５に記載の分子の濃度計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属ナノ微粒子において発生した局在化表面プラズモン共鳴により増強された計測対象分子のラマン散乱光を検出する表面増強ラマン分光法（Surface Enhanced RAMAN Spectroscopy）により、計測対象分子の濃度を計測する方法及び装置に関する。特に、溶液中に存在する分子の同定及びその濃度を計測する技術であり、低分子からタンパク質等の高分子でも、溶液中に存在する分子が計測対象分子である。
【背景技術】
【０００２】
分子を同定し濃度を計測する技術としては、例えばラマン分光法がある。これは、分子に光を照射して、この分子で発生したラマン散乱光を検出して分子を同定し濃度を計測する技術である。ここで、分子はその構造に応じた固有の波長ごとのラマン散乱光の強度の分布即ちスペクトルを示すので、そのスペクトルの形状より分子を同定できる。また、そのスペクトルの強度より分子の濃度を計測できる。
【０００３】
また、ラマン分光法を高感度化した表面増強ラマン分光法も知られている。これは、金属ナノ微粒子において発生した局在化表面プラズモン共鳴により増強される表面増強ラマン散乱現象を利用する方法である。ここで、金属ナノ微粒子とは、粒径が数ナノメートルから数百ナノメートルの金属の微粒子で、ある特定の波長の光が照射されると局在化表面プラズモン共鳴が起こる。その結果。金属ナノ微粒子の極近傍（粒径の０．１倍程度以下の領域）に光の電場が増強された領域（ホットスポット）が発生する。このホットスポットに位置する分子のラマン散乱光が増強されて表面増強ラマン散乱光となる。ホットスポットで増強される程度は、通常のラマン散乱光と表面増強ラマン散乱光の強度比で定義され、増強度と呼ばれる。増強度は最大で１０１５倍程度に到達している（非特許文献１参照）。
【０００４】
ホットスポットは、溶液中にコロイド状に分散された金属ナノ微粒子の周辺や、基板上に固定化された金属ナノ微粒子の周辺に発生する。溶液中にコロイド状に分散された金属ナノ微粒子に関しては、単独の状態即ちモノマー状態の金属ナノ微粒子よりも、いくつかの金属ナノ微粒子が凝集して形成された金属ナノ微粒子の凝集塊のほうが、電場がより増強されたホットスポットを発生する。（非特許文献１参照）。
【０００５】
表面増強ラマン散乱光は、通常のラマン散乱光と同様に、分子はその構造に応じた固有のスペクトルを示すので、そのスペクトルの形状より分子を同定できる。また、そのスペクトルの強度より分子の濃度を計測できる。
【０００６】
さらに、表面増強ラマン散乱光法と、共鳴ラマン分光法と組み合わせた、表面増強共鳴ラマン分光法（Surface Enhanced Resonant RAMAN Spectroscopy）も知られている。これは、局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長の光を計測対象分子が吸収する場合に実現できる分光法で、一つの分子でも検出できる高感度を示す（非特許文献１参照）。
【０００７】
この表面増強共鳴ラマン分光法を用いて、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を計測する技術が開示されている（特許文献１、２参照）。これらの技術は、ＨｂＡ１ｃを含む溶液と金属ナノ微粒子を含む溶液を混合して、この混合溶液に、ＨｂＡ１ｃが吸収し、かつ金属ナノ微粒子で局在化表面プラズモン共鳴が起こる波長の光を照射して、ＨｂＡ１ｃの表面増強共鳴ラマン散乱光を検出してＨｂＡ１ｃの濃度を計測している。これらの技術では、溶液中で金属ナノ微粒子を凝集させて凝集塊（クラスター）を形成し、ＨｂＡ１ｃはこの凝集塊に取り込まれる。この凝集塊中には強力なホットスポットが発生している。このホットスポットに位置するＨｂＡ１ｃが強力な表面増強共鳴ラマン散乱光を放出するので、高感度でＨｂＡ１ｃを計測できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１１９１９７号
【特許文献２】特表２０１０−５０７７９８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Lingxin Chen, Jaebum Choo, ” Recent advances in surface-enhanced  Raman scattering detection technology for microfluidic chips”, Electrophoresis (2008), 29, 1815-1828
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した従来の表面増強ラマン分光法により、計測対象分子の濃度を計測する技術では、信頼性に課題があった。
【００１１】
表面増強ラマン分光法では、計測対象分子の表面増強ラマン散乱光のスペクトルで計測対象分子を同定して、強度より濃度を算出する。この点ではラマン分光法と同様である。
【００１２】
ただし、表面増強ラマン分光法では、ホットスポット中の計測対象分子のラマン散乱光を増強するので、ラマン分光法よりも低濃度の計測対象分子でも計測が可能になる。即ち、計測対象分子が少なくても、検出可能な強度の表面増強ラマン散乱光を発生させられるので、低濃度の計測対象分子でも計測できる。ここで、ホットスポットによる増強度が大きいほど、より低濃度でも計測可能になる。
【００１３】
増強度は、ホットスポットの電場の４乗に比例するが、電場は金属ナノ微粒子の形状や、金属ナノ微粒子の凝集状態によって変化する。（非特許文献１参照）
例えば、計測対象分子を含むサンプル溶液中に共存する塩類の種類や濃度によって、金属ナノ微粒子の凝集状態が影響され、増強度が大きく変化する。この結果、計測対象分子の濃度が同一であっても、表面増強ラマン散乱光の強度も大きく変化する。従って、算出される濃度が異なることになり、濃度計測の信頼性が低くなる。
【００１４】
上記の様に、表面増強ラマン分光法は、低濃度でも計測可能ではあるが、増強度の再現性が不十分で、濃度の定量精度が悪く、信頼性が低いという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、金属ナノ微粒子を凝集させた、これに取り込まれた計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を観測し、計測対象分子の濃度を計測する方法であって、
（１）計測対象分子を含むサンプル液と、金属ナノ微粒子を含む溶液と、前記金属ナノ微粒子の凝集剤を含む溶液とを混合して、前記金属ナノ微粒子を、前記計測対象分子を取り込んで凝集させる工程、
（２）２個の前記金属ナノ微粒子が凝集したダイマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第１照射光と、３個の前記金属ナノ微粒子が凝集したトリマーにおいて局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を有する第２照射光を同一位置に照射する工程、
（３）前記第１照射光によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した第１レイリー散乱光１２の強度と、前記第２照射光によって前記ダイマーまたは／及びトリマーで発生した第２レイリー散乱光１３の強度と、前記第１照射光によって前記ダイマーで発生した計測対象分子の表面増強ラマン散乱光強度とを計測する工程、
（４）第１レイリー散乱光１２の強度と第２レイリー散乱光１３の強度を比較して、前記トリマーの生成を検知する工程、
（５）前記工程（４）において、前記トリマーの生成を検知しない場合は、前記表面増強ラマン散乱光１の強度に基づき計測対象分子の濃度を算出する工程
を有する表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法である。
【００１６】
さらに、表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測装置である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、表面増強ラマン分光法により計測対象分子の濃度を計測する技術で、金属ナノ構造の近傍に生成したホットスポットの増強度の一定化することで、濃度の定量精度を確保でき、信頼性を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法及び装置の原理を示す図。
【図２】本発明に係る計測対象分子と金属ナノ微粒子とのの凝集状態を示す概略図。
【図３】銀ナノ微粒子の凝集状態に応じた散乱断面積の波長依存性をＦＤＴＤシミュレーションにて算出した結果を示すグラフ。
【図４】ＦＤＴＤシミュレーションにて使用した銀ナノ微粒子のサイズ及び凝集状態を示した図。
【図５】実施例１，２の第１ダイクロイックミラー１０，２，３の反射率の波長依存性を示したグラフ。
【図６】ＦＤＴＤシミュレーションにて算出した、銀ナノ微粒子のダイマー周辺の電磁場分布を示した図。
【図７】ＦＤＴＤシミュレーションにて算出した、銀ナノ微粒子のダイマー周辺の電磁場分布を示した図。
【図８】ＦＤＴＤシミュレーションにて算出した、銀ナノ微粒子のトリマー周辺の電磁場分布を示した図。
【図９】ＦＤＴＤシミュレーションにて算出した、銀ナノ微粒子のトリマー周辺の電磁場分布を示した図。
【図１０】実施例１，２の構成と動作を説明する図。
【図１１】実施例１で作成した検量線を示すグラフ。
【図１２】直径が４０、５０、６０，７０，８０，１００ｎｍの銀ナノ微粒子のモノマーが水溶液（屈折率＝１．３３）中に分散されている状態の散乱断面積を示したグラフ。
【図１３】直径が４０、５、１０，２０，３０ｎｍの銀ナノ微粒子のモノマーが水溶液（屈折率＝１．３３３）中に分散されている状態の散乱断面積を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（実施の形態）
以下、本発明の実施の形態に関して図１を用いて説明する。本実施の形態では、金属ナノ微粒子として、銀ナノ微粒子（銀コロイドともいわれる）を用いた場合を説明する。
【００２０】
図１は、本発明の実施の形態における、表面増強ラマン分光法による分子の濃度計測方法及び装置の原理を示す説明図である。符号１は、流路を指し示す。流路１は、流れる液体を保持する。流路１は、流路１の外部から光を液体に照射すると同時に液体中で発生した光を外部に取り出せるようにガラス等の透明素材で構成されている部分を有する。符号２は、計測対象分子１９（図２に図示）を含む液体と、金属ナノ微粒子を含む水溶液と凝集剤を含む水溶液を混合した混合液を指し示す。
【００２１】
符号３は銀ナノ微粒子の単体（モノマー）を指し示す。符号４は、２個のモノマー３が凝集して生成された銀ナノ微粒子の２量体（ダイマー）を指し示す。符号５は、ダイマー４にモノマーの３が凝集して生成された銀ナノ微粒子の３量体（トリマー）を指し示す。モノマー３は、流路１を流れながら、他のモノマー３と計測対象分子を挟んで凝集してダイマー４が生成される。更にダイマー４は、流路１を流れながら、他のモノマー３と計測対象分子を挟んで凝集してトリマー５が生成される。即ち、図１に示したように流路１内を流れるに従って、モノマー３からダイマー４へ、更にトリマー５へと凝集が進行する。
【００２２】
モノマー３、ダイマー４、トリマー５では、局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長が異なる。この局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長を照射すると、照射した波長と同じ波長の共鳴レイリー散乱（Resonance Rayleigh scattering）光が発生する。この共鳴レイリー散乱光は局在化表面プラズモン共鳴の効果で増強されているので、通常のレイリー散乱光より高強度である。共鳴レイリー散乱光の発生と同時に、ダイマー４及びトリマー５に挟まれた計測対象分子の表面増強ラマン散乱光も発生する。
【００２３】
符号６はダイマー４の局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長の略平行光で偏光方向が紙面に対して垂直であるレーザー光を発する第１光源を指し示す。符号７は第１光源６より発せられ流路１中の混合液２を照射する第１照射光を指し示す。符号８はトリマー５の局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長の略平行光で偏光方向が紙面に対して垂直であるレーザー光を発する第２光源を指し示す。符号９は第２光源８より発せられ流路１中の混合液２を照射する第２照射光を指し示す。
【００２４】
符号１０は第１ダイクロイックミラーを指し示す。第１ダイクロイックミラー１０は、第２照射光９を反射するが、それ以外の波長の光を透過するので、第１照射光７は、第１ダイクロイックミラー１０を透過する。第１ダイクロイックミラー１０は、第１照射光７の光路と、第２照射光９の光路とを重ねて流路１中のサンプル２を照射するように配置されている。従って、第１照射光７と第２照射光９は、流路１中の同一位置を照射する。
【００２５】
符号１１は混合液２で発生した散乱光を指し示す。第１照射光７と第２照射光９の伝搬方向の垂直方向へ伝搬する成分である。符号１２は、第１照射光７によって発生したダイマー４または／及びトリマー５の第１レイリー散乱光を指し示す。第１レイリー散乱光１２の波長は第１照射光７と同一である。符号１３は、第２照射光９によって発生したダイマー４または／及びトリマー５の第２レイリー散乱光を指し示す。第２レイリー散乱光１３の波長は第２照射光９と同一である。
【００２６】
散乱光１１には、第１レイリー散乱光１２と、第２レイリー散乱光１３、さらに計測対象分子の表面増強ラマン散乱光が含まれている。ここで、後述する様に、ダイマー４の増強度がトリマー５の増強度大きく、かつ第１照射光７のパワーの方が第１照射光９パワーより十分大きく設定するので、検出対象分子の表面増強ラマン散乱光は主に、第１照射光７に励起されたダイマー４で発生する。
【００２７】
符号１４は第２ダイクロイックミラーを指し示す。第２ダイクロイックミラー１４は、散乱光１１のうち、第１レイリー散乱光１２を反射するが、それ以外の波長の光を透過する。符号１５は第１光センサ１５を指し示す。第１光センサ１５は、第１レイリー散乱光１２を検出する。
【００２８】
符号１６は、第３ダイクロイックミラーを指し示す。第３ダイクロイックミラー１６は、散乱光１１のうち、共鳴第２レイリー散乱光１３を反射するが、それ以外の波長の光を透過する。符号１７は第２光センサを指し示す。第２光センサ１７は、第２レイリー散乱光１３を検出する。
【００２９】
符号１８は、分光器を指し示す。分光器１８は、散乱光１１のうち、第１照射光７に励起されダイマー４で発生した計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を分光して検出する。分光器１８で検出する計測対象分子の表面増強ラマン散乱光の強度から、計測対象分子の濃度を算出し、表面増強ラマン散乱光のスペクトルより計測対象分子を同定する。この過程では、ダイマー４の増強度を基に計測対象分子の濃度を算出する。ここで、第１照射光７及び第２照射光９中にダイマー４のみが存在していれば算出精度は高い。一方、第１照射光７及び第２照射光９中にダイマー４とトリマー５が混在すると、トリマー５からも計測対象分子の表面増強ラマン散乱光が発生するので、ダイマー４の増強度を基に計測対象分子の濃度を算出すると誤差が生じる。
【００３０】
第１レイリー散乱光１２には、ダイマー４で発生した共鳴レイリー散乱光と、トリマー５で発生したレイリー散乱光とが含まれている。第２レイリー散乱光１３には、ダイマー４で発生したレイリー散乱光と、トリマー５で発生した共鳴レイリー散乱光とが含まれている。共鳴レイリー散乱光の方が、レイリー散乱光よりも大きい。従って、第１レイリー散乱光１２の強度に対しては、ダイマー４の寄与度が大きく、第２レイリー散乱光１３の強度に対しては、トリマー５の寄与度が大きい。本実施の形態では、第１レイリー散乱光１２を第１光センサ１５が検出し、第２レイリー散乱光１３を第２光センサ１７が検出しているので、第１光センサ１５の出力信号に比べて、第２光センサ１７の出力信号が十分小さければ、第１照射光９中にトリマー５が存在しないことになる。
【００３１】
従って、第１光センサ１５の出力信号と第２光センサ１７の出力信号の比より、トリマー５の存在を検知できる。トリマー５が存在している際は誤差が発生するので、この場合の計測を無効とする。
【００３２】
以上の様に、本実施の形態によって、誤差の原因となる第１照射光９中のトリマー５の存在を検知することで、計測の有効性を判断でき、計測の信頼性を確保することができる。
【００３３】
（実施例１）
本実施の形態における第１の実施例を以下に説明する。
【００３４】
以下、第１の実施例に関して図１〜図１１を用いて説明する。本実施の形態では、金属ナノ微粒子として、直径が４０ｎｍの銀ナノ微粒子（銀コロイドともいわれる）を用いた場合を説明する。
【００３５】
図２は、ダイマー４及びトリマー５が生成される際に計測対象分子１９が挟まれた場合の様子を示した図である（真ん中の図は計測対象分子１９の周辺の拡大図）。
【００３６】
図３は、図４で示したモノマー３、ダイマー４、及びトリマー５の銀ナノ微粒子が水溶液中に分散されている状態の散乱断面積を示したグラフである。図３のグラフの横軸は波長[ｎｍ]を、縦軸は、散乱断面積[ｍ２]を示す。実線はモノマー、点線はダイマー、一点破線はトリマーの断面積で、これらの値は、ＦＤＴＤ（Finite-difference time-domain method）シミュレーション法にて算出した。
【００３７】
図４は、モノマー３、ダイマー４、及びトリマー５の形状で、図３のシミュレーションは、この形状で実行した。即ち、銀ナノ微粒子の粒径（直径）は、４０ｎｍで、ダイマー４は、この銀ナノ微粒子２個が凝集したもので、銀ナノ微粒子の間隔は０．５ｎｍである。銀ナノ微粒子と計測対象分子１９が含まれる溶液を混合すると、図２に示した様に、銀ナノ微粒子が凝集する際にこの間隔に計測対象分子１９が取り込まれる。トリマー５は、この銀ナノ微粒子３個が凝集したもので、各銀ナノ微粒子の間隔は０．５ｎｍである。銀ナノ微粒子と計測対象分子１９が含まれる溶液を混合すると、銀ナノ微粒子はダイマー４からトリマー５へと凝集が進行し、図２に示した様に銀ナノ微粒子が凝集する際にこの間隔に計測対象分子１９が取り込まれる。
【００３８】
図３に示されるように、モノマー３、ダイマー４、及びトリマー５の散乱断面積は波長に応じて変化し、ある特定の波長で極大値を示す。この極大値周辺では、各銀ナノ微粒子に局在化表面プラズモン共鳴が発生している。局在化表面プラズモン共鳴により、レイリー散乱光が増強されて上記のような極大値を示す。このように、局在化表面プラズモン共鳴により増強されたレイリー散乱光を共鳴レイリー散乱（Resonance Rayleigh scattering）光と呼ぶ。
【００３９】
ダイマー４は波長＝６３５ｎｍで散乱断面積の最大値≒２．４×１０−１５ｍ２を示した。
【００４０】
この値はダイマー４の共鳴レイリー散乱光の散乱断面積で、ダイマー４の局在化表面プラズモン共鳴による増強度も波長＝６３５ｎｍで最大になる。
【００４１】
トリマー５は波長＝６８５ｎｍで散乱断面積の最大値≒７．３×１０−１５ｍ２を示した。この値はトリマー５の共鳴レイリー散乱光の散乱断面積で、トリマー５の局在化表面プラズモン共鳴による増強度も波長＝６８５ｎｍで最大になる。
【００４２】
また、ダイマーは波長＝６８５ｎｍで散乱断面積≒７．５×１０−１６ｍ２を示した。トリマーは波長＝６３５ｎｍで散乱断面積≒２．０×１０−１５ｍ２を示した。
【００４３】
表１は、波長が６３５ｎｍ、６８５ｎｍのダイマーの散乱断面積とその比、及び、波長が６３５ｎｍ、６８５ｎｍのトリマーの散乱断面積とその比を記載した表である。
【００４４】
【表１】
2017044624.tif 000003
【００４５】
上記の様に、ダイマー４は波長＝６３５ｎｍで最大の増強度を示し、トリマー５は波長＝６８５ｎｍで最大の増強度を示す。また、後述する様に、ダイマー４の増強度がトリマー５の増強度より大きいので、波長＝６３５ｎｍでダイマー４を励起すると最大の表面増強ラマン散乱光を発生するので、この波長で励起された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光で濃度を計測する。
【００４６】
従って、実施例では、第１照射光７の波長は６３５ｎｍに、第１照射光９の波長は６８５ｎｍに設定した。また、第１照射光７のパワーを１ｍＷに設定した。また、第１照射光９のパワーを０．０１ｍＷに設定した。この様に、第１照射光７のパワーを大きく設定することで、表面増強ラマン散乱光の強度も大きくできるので、より低濃度まで計測できる。
【００４７】
なお、第１照射光９のパワーを第１照射光７に比べて上記の様に小さくしても問題ない。通常の計測対象分子のラマン散乱断面積は、最大でも１０−３２ｍ２程度である。後述するが、銀ナノ微粒子のダイマーやトリマーで発生する増強度は最大でも、１０１２程度である。従って、銀ナノ微粒子のダイマーやトリマーで増強された計測対象分子の表面増強ラマン散乱光の断面積は、最大でも１０−２０ｍ２程度である。一方、表１に示した様に、銀ナノ微粒子のダイマーやトリマーの散乱断面積は、１０−１５ｍ２程度である。即ち、計測対象分子の表面増強ラマン散乱光の断面積は、銀ナノ微粒子のダイマーやトリマーの散乱断面積よりも５桁以上小さい。第１照射光９は、銀ナノ微粒子のダイマーのレイリー散乱とトリマーの共鳴レイリー散乱光を発生させるために使用する。従って、第１照射光９のパワーが、計測対象分子の表面増強ラマン散乱光を発生させるための第１照射光７より低くても、銀ナノ微粒子のダイマーやとトリマーの散乱断面積が、計測対象分子の表面増強ラマン散乱光の断面積よりも十分大きいため問題がない。
【００４８】
第１照射光７及び第１照射光９の波長に応じて、第１ダイクロイックミラー１０、第２ダイクロイックミラー１４、第３ダイクロイックミラー１６の特性を図５に示すように設定した。図５の横軸は波長を、縦軸は、反射率を示す。実線は第１ダイクロイックミラー１０，３の特性で、波長６８５ｎｍの光に対しては８２％の反射率を示し、反射波長域（半値全幅）は、約５ｎｍである。点線は第２ダイクロイックミラー１４の特性で、波長６３５ｎｍの光に対しては８２％の反射率を示し、反射波長域（半値全幅）は、約５ｎｍである。第１ダイクロイックミラー１０，２，３は、それぞれの反射波長域以外では、実質的に反射率はゼロで、透過率は実質的に１００％である。
【００４９】
図６および図７は、図４に示すダイマー４に、それぞれ、波長が６３５ｎｍ、６８５ｎｍの光を照射した際の、ダイマー４周辺の電場の分布を、ＦＤＴＤ（Finite-difference time-domain method）シミュレーション法にて算出して、２次元及び１次元で示した図である。ここで、照射光は、ｚ方向に伝搬する平面波で、ｘ方向に偏光した直線偏光である。また、照射光の電場の振幅（＝Ｅ）を１Ｖ／ｍとした。左の銀ナノ微粒子の中心位置の座標は(ｘ＝−２０．２５、  ｙ＝０、  ｚ＝０)、右の銀ナノ微粒子の中心位置の座標は(ｘ＝２０．２５、  ｙ＝０、  ｚ＝０)である。これらの銀ナノ微粒子の直径は４０ｎｍなので、左右銀ナノ微粒子の間隔は０．５ｎｍである。
【００５０】
図６および図７の上の図がｙ＝０におけるＥ２のｘｚ平面上の分布である。横軸はｘ座標を、縦軸はｚ座標を示す。Ｅ２の値の対数は、右端に示した濃淡スケール（gray scale）で表されている。gray scale＝６は、Ｌｏｇ１０Ｅ２＝６なので、Ｅ２＝１０６で、またgray scale＝０は、Ｌｏｇ１０Ｅ２＝０なので、Ｅ２＝１００を＝１である。Ｅ２＝１００＝１ということは、照照射光の電場の振幅（＝Ｅ）と同じである。従って、gray scale＞０の領域は、光の電場が増強された領域である。図から明らかな様に、銀ナノ微粒子の周辺が増強されている。特に２つの銀ナノ微粒子が近接する領域、即ち左右の銀ナノ微粒子の間の領域が増強された。この左右の銀ナノ微粒子の間の領域がホットスポットである。このホットスポットの中でも、左右の銀ナノ微粒子の中心からの中点即ちｘ＝０、ｙ＝０、ｚ＝０の点で最も増強された。
【００５１】
図６および図７の下の図が、ｙ＝０、ｚ＝０におけるＥ２のｘ軸上の分布である。横軸はｘ座標を、縦軸は、Ｅ２を示す。図から明らかな様に、左右の銀ナノ微粒子の中間位置即ちｘ＝０で、Ｅ２は最大値を示す。波長が６３５ｎｍの光を照射した場合である図６では、ｘ＝０においてはＥ２≒５．４×１０５であった。図２に示す様に、ここに計測対象分子１９が位置する。また、波長が６８５ｎｍの光を照射した場合である図７では、ｘ＝０においてはＥ２≒７．９×１０４であった。
【００５２】
図８および図９は、図４に示すトリマー５に、それぞれ波長が６３５ｎｍ、６８５ｎｍの光を照射した際の、トリマー周辺の電場の分布を、ＦＤＴＤ（Finite-difference time-domain method）シミュレーション法にて算出して、２次元及び１次元で示した図である。ここで、図６および図７と同様に、照射光は、ｚ方向に伝搬する平面波で、ｘ方向に偏光した直線偏光である。また、照射光の電場の振幅（＝Ｅ）を１Ｖ／ｍとした。
【００５３】
左の銀ナノ微粒子の中心位置の座標は(ｘ＝−４０．５、  ｙ＝０、  ｚ＝０)、中央の銀ナノ微粒子の中心位置の座標は(ｘ＝０、  ｙ＝０、  ｚ＝０)、右の銀ナノ微粒子の中心位置の座標は(ｘ＝４０．５、  ｙ＝０、  ｚ＝０)である。これらの銀ナノ微粒子の直径は４０ｎｍなので、左と中央、及び中央と右の銀ナノ微粒子の間隔は０．５ｎｍである。
【００５４】
図８および図９の上の図は、図６および図７の上の図と同様、ｙ＝０におけるＥ２のｘｚ平面上の分布である。横軸はｘ座標を、縦軸はｚ座標を示す。Ｅ２の値の対数は、右端に示した濃淡スケール（gray scale）で表されている。図から明らかな様に、銀ナノ微粒子の周辺が増強されている。特に２つの銀ナノ微粒子が近接する領域、即ち左と中央、及び中央と右の銀ナノ微粒子の間の領域が増強されている。この各銀ナノ微粒子の間の領域がホットスポットである。このホットスポットの中でも、左と中央の銀ナノ微粒子の中心からの中点即ちｘ＝−２０．２５、ｙ＝０、ｚ＝０の点、及び中央と右の銀ナノ微粒子の中心からの中点即ちｘ＝２０．２５、ｙ＝０、ｚ＝０の点が最も増強された。
【００５５】
図８および図９の下の図は、図６および図７の下の図と同様、ｙ＝０、ｚ＝０におけるＥ２のｘ軸上の分布である。横軸はｘ座標を、縦軸は、Ｅ２を示す。
【００５６】
図８および図９から明らかな様に、左と中央、及び中央と右の銀ナノ微粒子の中間位置、即ちｘ＝−２０．２５、及びｘ＝２０．２５で、Ｅ２は最大値を示した。波長が６３５ｎｍの光を照射した場合である図８では、ｘ＝−２０．２５、及びｘ＝２０．２５においてはＥ２≒１．６×１０５であった。図２に示す様に、ここに計測対象分子１９が位置する。また、波長が６８５ｎｍの光を照射した場合である図９では、ｘ＝−２０．２５、及びｘ＝２０．２５においてはＥ２≒３．０×１０５であった。
【００５７】
表２は、ダイマー４及びトリマー５において、照射光の波長が６３５、及び６８５ｎｍの際のホットスポット中の増強度即ちＥ４の値の最大値を示した表である。
【００５８】
【表２】
2017044624.tif 000004
【００５９】
ここに位置する計測対象分子１９は、通常のラマン散乱光よりも強度が増強度倍大きな、表面増強ラマン散乱光を発生させる。この表２から、明らかなように、照射光の波長が６３５ｎｍの際の、ダイマー４のホットスポットが最大の増強度＝２．９×１０１１を示した。これは、ダイマー４に波長が６３５ｎｍを照射すると、計測対象分子１９の最大の表面増強ラマン散乱光を発生させることを意味する。従って、計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光を観測して計測対象分子１９の濃度を計測する場合には、ダイマー４に対して６３５ｎｍの光を照射すると最も高精度に計測できる。
【００６０】
一方、トリマー５に対して６３５ｎｍの光を照射した際の増強度＝２．６×１０１０を示した。この増強度は、ダイマー４に対して１／１０以下である。
【００６１】
ダイマー４とトリマー５が照射光中に混在していると、計測対象分子１９のラマン散乱光が、ダイマー４のみの際とは異なる増強度で増強されるので計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度より計測対象分子１９の濃度を換算する際に誤差が発生する。即ち、第１照射光７及び第２照射光９中にトリマー５が混入すると、第１照射光７に対するトリマー５の増強度はダイマー４の増強度より小さいので、計測対象分子１９の濃度が同じでも、分光器１８で検出された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光の強度は、ダイマー４だけが存在する場合よりも小さくなる。この場合、後述する図１１の検量線を使用して濃度を算出すると、濃度を過小に算出してしまう。
【００６２】
以下に本実施例の動作を、図１０、図１１を用いて説明する。図１０において、１〜１９は、図１、図２の１〜１９と同一である（ただし、一部は図示せず）。符号２０は、流路１を有し、流路１にサンプル液、銀ナノ微粒子水溶液、凝集剤水溶液を注入するためのコネクタを保持できるデバイスを指し示す。
【００６３】
符号２１は、計測対象分子１９を含むサンプル液を流路１に注入する第１シリンジポンプを指し示す。符号２２はサンプル液を流路１に導くための第１配管チューブを指し示す。符号２３は、第１第２配管チューブ２５２をデバイスに固定する第１コネクタを指し示す。符号２４は、銀ナノ微粒子水溶液を流路１に注入する第２シリンジポンプを指し示す。符号２５は銀コロイド水溶液を流路１に導くための第２配管チューブを指し示す。符号２６は、第２配管チューブ２５をデバイスに固定する第２コネクタを指し示す。符号２７は、凝集剤水溶液を流路１に注入する第３シリンジポンプを指し示す。符号２８は凝集剤水溶液を流路１に導くための第３配管チューブを指し示す。符号２９は、第３配管チューブ２８をデバイスに固定する第３コネクタ２９を指し示す。
【００６４】
図１０に示すように、デバイスには、第１コネクタ２３、第２コネクタ２６，第３コネクタ２９より注入された各液体が混合されて混合液２となり流路１へ流れるように十字型の流路が形成されている。符号２９はコンピューターを指し示す。コンピューター２９は、分光器１８の出力信号を解析して、表面増強ラマン散乱光より計測対象分子の同定と検量線を用いた濃度の算出及び、後述する第１光センサ１５、第２光センサ１７の出力信号からのＲの算出を実行する。またコンピューター２９は、濃度やＲの表示も行う。
【００６５】
本実施例では、第１シリンジポンプ２１、第２シリンジポンプ２４、第３シリンジポンプ２７の単位時間当たりの注入体積即ち注入流速を、例えば、注入流速＝０．０１  μＬ／ｓに設定する。この様に設定すると、混合位置（十字の型の交差位置）から、第１照射光７及び第２照射光９の光路まで１０秒で到達する。また、銀ナノ微粒子水溶液は、例えば、直径＝４０ｎｍの銀ナノ微粒子を濃度＝１０−１０Ｍで含む。さらに、凝集剤水溶液は、銀ナノ微粒子の凝集する速度を制御するため混合する水溶液である。凝集剤は、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム等の塩類を濃度＝１０−１Ｍで含む。
【００６６】
本実施例においては、まず計測対象分子１９の濃度が既知のサンプルを用いて図１１に示す様な検量線を作成する。図１１において、横軸は計測対象分子１９の濃度、縦軸は分光器１８で検出された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光の強度を示す。この図１１では、縦軸は通常のラマン散乱光強度で規格化された強度を示す。第１照射光７及び第２照射光９中にダイマー４のみが存在する状態で、実線のような検量線を作成する。この検量線に基づき、分光器１８で検出された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光の強度より、濃度を算出する。
【００６７】
次に、流路１中での銀ナノ微粒子の凝集の進行度合いを確認する方法及び動作を述べる。
【００６８】
第１光センサ１５の出力信号Ｓ１と第２光センサ１７の出力信号Ｓ２の比であるＲを以下の（数１）で定義する。
【００６９】
（数１）
Ｒ＝Ｓ２／Ｓ１
ここで、
Ｓ１：第１光センサ１５の出力信号
Ｓ２：第２光センサ１７の出力信号
第１照射光７及び第２照射光９の光路長中にダイマー４しか存在しない場合のＳ１、Ｓ２は以下の（数２）で表される。
【００７０】
（数２）
Ｓ１＝（ダイマー４の波長が６３５ｎｍの散乱断面積）×（第１照射光７のパワー）×ｋ
Ｓ２＝（ダイマー４の波長が６８５ｎｍの散乱断面積）×（第１照射光９のパワー）×ｋ
ここで、
ｋは定数
表１及び、第１照射光７のパワー＝１ｍＷ、第１照射光９のパワー＝０．０１ｍＷから、Ｒ＝０．３１×０．０１／１＝０．００３１ になる。
【００７１】
一方、第１照射光７及び第２照射光９の光路中にトリマー５しか存在しない場合は、（数２）において、ダイマー４の散乱断面積の替わりにトリマー５の散乱断面積を代入すればよく、表１及び、第１照射光７のパワー＝１ｍＷ、第１照射光９のパワー＝０．０１ｍＷから、Ｒ＝３．７×０．０１／１＝０．０３７になる。
【００７２】
第１照射光７及び第２照射光９の光路中に存在するトリマー５のダイマー４に対する比率が増加するのに伴って（数２）において、トリマー５の散乱断面積の寄与度が増すので、Ｒは、０．００３１から０．０３７に増加する。この様に、Ｒは、第１照射光７及び第２照射光９の光路中に存在するトリマー５のダイマー４に対する比率に応じて増加する。即ち、Ｒは、流路１中の銀ナノ微粒子の凝集の進行度合いを反映している。
【００７３】
従って、コンピューター２９によって算出、表示されたＲより、トリマー５が、第１照射光７及び第２照射光９の光路長中に存在することを検知することで、凝集の進行度合いを確認できる。
【００７４】
以下に、銀ナノ微粒子の凝集の進行度合いを確認しながら、検量線を作成する例を説明する。
【００７５】
複数の異なる濃度、例えば、１０−４、１０−３、１０−２Ｍの計測対象分子１９を含む水溶液を作成する。これらをサンプル液として、第１シリンジポンプ２１に充填して、第１シリンジポンプ２１、第２シリンジポンプ２４、第３シリンジポンプ２７を動作させて、流路１中にサンプル液、銀ナノ微粒子水溶液と凝集剤水溶液を混合しながら注入して分光器１８により計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度を計測する。同時にＲを算出して、Ｒ≦０．００３１であれば、表面増強ラマン散乱光強度とサンプル液の計測対象分子濃度より、図１１の検量線を作成し、コンピューター２９に記憶させる。この様に、Ｒ≦０．００３１を確認することで、第１照射光７及び第２照射光９の光路中にダイマー４のみ存在している場合の、計測対象分子１９の濃度と表面増強ラマン散乱光強度の関係を示す検量線を作成できる。
【００７６】
次に、図１１の検量線を用いた計測対象分子１９の濃度計測方法及び動作を述べる。
【００７７】
生体の体液や、環境中の水から検体を採取してサンプルとして第１シリンジポンプ２１および第２シリンジポンプ２４に充填する。そして検量線を作成した際と同じ条件で、計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度を計測する。同時に、Ｒも算出して、Ｒ≦０．００３１であることが確認できたら、計測された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度より、図１１を用いて濃度を算出する。ここで、サンプル中に共存する銀ナノ微粒子に対する塩類やアミノ酸の濃度が高く、銀ナノ微粒子の凝集が過剰に進行して、第１照射光７及び第２照射光９の光路中にトリマー５が混在しており、Ｒ＞０．００３１であった場合は、計測は誤差が大きく無効とする。
【００７８】
以上の様に、本実施例によれば、銀ナノ微粒子の凝集を促進する塩類やアミノ酸がサンプル液中に多量に共存して、銀ナノ微粒子の凝集が過剰に進行した場合を検知することができる。これにより、誤差を含んだ計測を無効することができ、計測の信頼性を向上できる。
【００７９】
また、本実施例は、最大の増強度を示すダイマー４の表面増強ラマン散乱光に基づき濃度を算出するために、低濃度域までより高精度に計測できる。
【００８０】
さらに、本実施例では、凝集を最初の段階であるダイマー４の状態にまで進行した状態で計測するので、計測時間を短縮できる。例えば、本実施例では混合後、１０秒で計測できる。ダイマーになるとモノマーに比べて拡散速度が低下する。この速度低下によって、ダイマーがモノマーと遭遇してトリマーになる時間は、モノマー同士が遭遇してダイマーになる時間より長くなる。従って、凝集状態をトリマーが支配的になるまで進行させるには長時間を要する。
【００８１】
上記の様に、本実施例によれば、高信頼性、低濃度域で高精度及び高速計測などの効果を実現できる。
【００８２】
（実施例２）
本実施例では、実施例１で、サンプル中に共存する銀ナノ微粒子に対する塩類やアミノ酸の濃度が高く、銀ナノ微粒子の凝集が過剰に進行して、第１照射光７及び第２照射光９の光路中にトリマー５が混在しており、Ｒ＞０．００３１であった場合でも、計測対象分子の濃度を計測する例をしめす。
【００８３】
Ｒ＞０．００３１であった場合は、最初の計測した検体を、水で１／２に希釈する。この希釈により、塩類やアミノ酸の濃度も希釈され銀ナノ微粒子の凝集の進行を抑える。
【００８４】
そして、本実施例１と同様に、サンプルとして第１第２シリンジポンプ２４１に充填し検量線を作成した際と同じ条件で、計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度を計測する。同時に、Ｒも算出して、Ｒ≦０．００３１であることが確認できたら、計測された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度と、希釈率の逆数（即ち２倍）とに基づき、図１１を用いて濃度を算出する。即ち、まず、計測された計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度と図１１も用いて見かけの濃度を算出する。そしてこの見かけの濃度に希釈率の逆数（即ち２倍）をかけて真の濃度を算出する。
【００８５】
もし、未だＲ＞０．００３１であった場合は、検体を水で希釈する希釈率を更に上げて、計測対象分子１９の表面増強ラマン散乱光強度を計測する。そして、表面増強ラマン散乱光強度と、希釈率の逆数に基づき、図１１を用いて濃度を算出する。この動作をＲ≦０．００３１になるまで繰り返すことで、計測対象分子１９の濃度を高い信頼性で計測できる。これらの動作を実行するために、コンピューター２９に計測毎の希釈率を入力する。
【００８６】
なお、計測対象分子１９が環境中の気体に含まれる場合は、インピンジャ−等で水中に取り込むことでサンプル液を作成することができる。この場合では、環境中に浮遊する塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸塩、硝酸塩等が、計測対象分子１９と共にサンプル液中に取り込まれる。これらの濃度は、環境によって大きく変化するので、銀ナノ微粒子の凝集の進行速度が変化しやすいので、本発明の様に、凝集の進行度合いを確認する機能は特に効果を発揮する。
【００８７】
以上の様に、本実施例によれば、銀ナノ微粒子の凝集を促進する塩類やアミノ酸がサンプル中に共存して、銀ナノ微粒子の凝集が過剰に進行した場合を検知でき、計測精度の低下を未然に防止することができる。本実施例は様々な検体に対しても、計測の信頼性を維持できるので、広い用途に対して効果的である。
【００８８】
なお、本実施の形態では、表面増強ラマン分光法の場合を説明したが、本発明は、金属ナノ微粒子の凝集状態に影響される表面増強共鳴ラマン分光法にも同様に適用できる。
【００８９】
上記までは、直径が４０ｎｍの銀ナノ微粒子（銀コロイドともいわれる）を用いた形態について説明したが、局在化表面プラズモン共鳴が発生する条件であれば、他の直径や金属でも同様の効果が得られる。
【００９０】
以下、図１２、図１３、表３を用いて、銀ナノ微粒子の直径と局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長（共鳴波長と呼ぶ）の関係を説明する。
【００９１】
図１２は、直径が４０、５０、６０，７０，８０，１００ｎｍの銀ナノ微粒子のモノマーが水溶液（屈折率＝１．３３）中に分散されている状態の散乱断面積を示したグラフである。図１２のグラフの横軸は波長[ｎｍ]を、縦軸は、散乱断面積[ｍ２]を示す。実線のみは直径＝４０ｎｍ、○は直径＝５０ｎｍ、□は直径＝６０ｎｍ、△は直径＝７０ｎｍ、●は直径＝８０ｎｍ、■は直径＝１００ｎｍの銀ナノ微粒子の散乱断面積で、これらの値は、ＦＤＴＤ（Finite-difference time-domain method）シミュレーション法にて算出した。
【００９２】
図１３は、直径が４０、５、１０，２０，３０ｎｍの銀ナノ微粒子のモノマーが水溶液（屈折率＝１．３３３）中に分散されている状態の散乱断面積を示したグラフである。図１３のグラフの横軸は波長[ｎｍ]を、縦軸は、散乱断面積[ｍ２]を示す。ただし、縦軸は対数表示である。実線のみは直径＝４０ｎｍ、●は直径＝５ｎｍ、△は直径＝１０ｎｍ、□は直径＝２０ｎｍ、○は直径＝３０ｎｍ、の銀ナノ微粒子の断面積で、これらの値も、同様にＦＤＴＤ（Finite-difference time-domain method）シミュレーション法にて算出した。
【００９３】
図１２および図１３に示されるように、各直径の銀ナノ微粒子の散乱断面積は波長に応じて変化し、ある特定の波長で極大値を示す。この極大値周辺では、各銀ナノ微粒子に局在化表面プラズモン共鳴が発生し、この極大値を示す共鳴波長と呼ぶ。図１２および図１３から明らかな様に、共鳴波長は直径が大きくなるに従って、長波長化する。表３にこの直径と共鳴波長の関係をまとめた表を示す。
【００９４】
【表３】
2017044624.tif 000005
【００９５】
表３のように、モノマーの直径の増加により共鳴波長は長波長化する。
【００９６】
ダイマー、トリマーでの局在化表面プラズモン共鳴は、モノマーが近接することで個々のモノマーでの局在化表面プラズモン共鳴が相互作用（結合）し、新たに発生した局在化表面プラズモン共鳴である。この新な局在化表面プラズモン共鳴は、図３に示されるように長波長側に複数発生する。従って、モノマーが凝集して生成されるダイマー、トリマーにおいても、構成しているモノマーの直径の増加により共鳴波長は長波長化する。
【００９７】
以上の様に、金属ナノ微粒子の直径を変化させると、金属ナノ微粒子のモノマーにより構成されるダイマー、トリマーの共鳴波長も変化するが、それらの各共鳴波長に第１照射光７及び第２照射光９の波長を設定すれば同様の効果が得られる。ここで、当然だが、第１ダイクロイックミラー１０および第２ダイクロイックミラー１４の反射率が最大値を示す波長は第２照射光９の波長に、第３ダイクロイックミラー１６の反射率が最大値を示す波長は第１照射光７の波長に設定する。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、様々な環境においても高い信頼性で、液体中及び空気中の計測対象分子の濃度を計測するために用いられる。  
【００９９】
上記の開示内容から導出される発明が、以下、記述される。  
【０１００】
１．  液体または気体が、３つの金属粒子が凝集された３金属粒子凝集体を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ｓ１）  パワーＷ１および波長λ１を有する第１レーザー光およびパワーＷ２および波長λ２を有する第２レーザー光を前記液体または前記気体に向けて照射し、そして第１散乱光および第２散乱光を受光する工程、
ここで、
前記λ１は、２つの前記金属粒子が凝集された２金属粒子凝集体において局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長であり、
前記λ２は、前記３金属粒子凝集体において局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長であり、
前記第１散乱光は、前記液体または気体が前記２金属粒子凝集体および前記３金属粒子凝集体からなる群から選択される少なくとも一方を含有する場合に、前記液体または前記気体に向けて照射された第１レーザー光の散乱により生じ、
前記第２散乱光は、前記液体または気体が前記２金属粒子凝集体および前記３金属粒子凝集体からなる群から選択される少なくとも一方を含有する場合に、前記液体または前記気体に向けて照射された第２レーザー光の散乱により生じ、かつ
前記第１散乱光および前記第２散乱光は、それぞれ、λ１およびλ２のピーク波長を有しており、および
（ｓ２）  以下の数式（Ｉａ）が充足される場合に、前記液体または前記気体は前記３金属粒子凝集体を含有すると判定する工程。  
【０１０１】
Ｒ＞ｃ    （Ｉａ）
ここで、
ｃ：所定の値
Ｒ＝Ｓ２／Ｓ１
Ｓ２＝（波長λ２における前記２金属粒子凝集体の散乱断面積）×（前記パワーＷ２）
Ｓ１＝（波長λ１における前記２金属粒子凝集体の散乱断面積）×（前記パワーＷ１）
２．  項目１に記載の方法であって、
以下の数式（ＩＩ）〜数式（ＩＶ）が充足され、
ｃ＝０．３１×（前記パワーＷ２）／（前記パワーＷ１）  （ＩＩ）
λ２＝６８５ナノメートル  （ＩＩＩ）、
λ１＝６３５ナノメートル  （ＩＶ）
前記各金属粒子は、銀からなり、かつ
前記各金属粒子は、４０ナノメートルの粒径を有する。
【０１０２】
３．液体に含有される分子の濃度を測定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  金属粒子を前記液体に添加して、前記金属粒子を凝集させる工程、
（ｓ１）  工程（ａ）の後、パワーＷ１および波長λ１を有する第１レーザー光およびパワーＷ２および波長λ２を有する第２レーザー光を前記液体に向けて照射し、そして第１散乱光、第２散乱光、および表面増強ラマン散乱光を受光する工程、
ここで、
前記λ１は、２つの前記金属粒子が凝集された２金属粒子凝集体において局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長であり、
前記λ２は、２つの前記金属粒子が凝集された３金属粒子凝集体において局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長であり、
前記第１散乱光は、前記液体が前記２金属粒子凝集体または前記３金属粒子凝集体の少なくとも一方を含有する場合に、前記液体に向けて照射された第１光の散乱により生じ、
前記第２散乱光は、前記液体が前記２金属粒子凝集体または前記３金属粒子凝集体の少なくとも一方を含有する場合に、前記液体に向けて照射された第２光の散乱により生じ、
前記第１散乱光および前記第２散乱光は、それぞれ、λ１およびλ２のピーク波長を有しており、かつ
前記表面増強ラマン散乱光は、前記第１光の前記２金属粒子凝集体上での散乱により生じ、
（ｓ２）  以下の数式（Ｉｂ）が充足される場合に、前記液体は前記３金属粒子凝集体を含有しないと判定する工程、かつ
Ｒ≦ｃ    （Ｉｂ）
ここで、
ｃ：所定の値
Ｒ＝Ｓ２／Ｓ１
Ｓ２＝（波長λ２における前記２金属粒子凝集体の散乱断面積）×（前記パワーＷ２）
Ｓ１＝（波長λ１における前記２金属粒子凝集体の散乱断面積）×（前記パワーＷ１）
（ｂ）  前記工程（ｓ２）において、前記液体は前記３金属粒子凝集体を含有しないと判定された場合に、前記表面増強ラマン散乱光の強度に基づいて前記分子の濃度を算出する工程。
【０１０３】
４．  項目３に記載の方法であって、
以下の数式（ＩＩ）〜数式（ＩＶ）が充足され、
ｃ＝０．３１×（前記パワーＷ２）／（前記パワーＷ１）  （数式ＩＩ）
λ２＝６８５ナノメートル  （数式ＩＩＩ）
λ１＝６３５ナノメートル  （数式ＩＶ）
前記各金属粒子は、銀からなり、
前記各金属粒子は、４０ナノメートルの粒径を有する。
【０１０４】
散乱断面積は、金属粒子の粒径、金属粒子の材質、および波長に依存する。
【０１０５】
The invention derived from the above disclosure will be listed below.
1. A method for determining whether or not a liquid or a gas contains a three-metal-particle aggregate in which three metal particles are aggregated, the method comprising:
(s1) irradiating the liquid or the gas with a first laser light having a power W1 and a wavelength λ1 and a second laser light having a power W2 and a wavelength λ2, and receiving a first scattered light and a second scattered light, wherein
the wavelength λ1 is a wavelength at which a localized surface plasmon resonance is generated in a two-metal-particle aggregate in which two metal particle are aggregated;
the wavelength λ2 is a wavelength at which a localized surface plasmon resonance is generated in the three-metal-particle aggregate;
the first scattered light is generated by scatter of the first laser light with which the liquid or the gas is irradiated in a case where the liquid or the gas contains at least one selected from the group consisting of the two-metal-particle aggregate and the three-metal-particle aggregate;
the second scattered light is generated by scatter of the second laser light with which the liquid or the gas is irradiated in a case where the liquid or the gas contains at least one selected from the group consisting of the two-metal-particle aggregate and the three-metal-particle aggregate; and
the first scattered light and the second scattered light have wavelengths λ1 and λ2, respectively; and
(s2) determining that the liquid or the gas contains the three-metal-particle aggregate when the following mathematical formula (Ia) is satisfied.
R>c (Ia)
where
c: constant value
R=S2/S1
S2=(scattering cross section of the two-metal-particle aggregate at the wavelength λ2) x (the power W2)
S1=(scattering cross section of the two-metal-particle aggregate at the wavelength λ1) x (the power W1)
2. The method according to item 1, wherein
the following mathematical formulae (II) - (IV) are satisfied;
c=0.31 x (the power W2) x (the power W2)       (II)
λ2 = 685 nanometers      (III)
λ1 = 635 nanometers (IV)
each of the metal particles are formed of silver; and
each of the metal particle has a particle diameter of 40 nanometers.
3. A method for measuring a concentration of a molecule contained in a liquid, the method comprising:
(a) adding metal particles to the liquid to aggregate the metal particles;
(s1) irradiating the liquid with a first laser light having a power W1 and a wavelength λ1 and a second laser light having a power W2 and a wavelength λ2, and receiving a first scattered light, a second scattered light, and a surface-enhanced Raman scattering light, wherein
the wavelength λ1 is a wavelength at which a localized surface plasmon resonance is generated in a two-metal-particle aggregate in which two metal particle are aggregated;
the wavelength λ2 is a wavelength at which a localized surface plasmon resonance is generated in the three-metal-particle aggregate;
the first scattered light is generated by scatter of the first laser light with which the liquid is irradiated in a case where the liquid contains at least one selected from the group consisting of the two-metal-particle aggregate and the three-metal-particle aggregate;
the second scattered light is generated by scatter of the second laser light with which the liquid is irradiated in a case where the liquid contains at least one selected from the group consisting of the two-metal-particle aggregate and the three-metal-particle aggregate; 
the first scattered light and the second scattered light have wavelengths λ1 and λ2, respectively; and
the surface-enhanced Raman scattering light is generated by scatter of the first light on the two-metal-particle aggregate; and
(s2) determining that the liquid does not contain the three-metal-particle aggregate when the following mathematical formula (Ia) is satisfied.
R≦c     (Ib)
where
c: constant value
R=S2/S1
S2=(scattering cross section of the two-metal-particle aggregate at the wavelength λ2) x (the power W2)
S1=(scattering cross section of the two-metal-particle aggregate at the wavelength λ1) x (the power W1)
4. The method according to item 3, wherein
the following mathematical formulae (II) - (IV) are satisfied;
c=0.31 x (the power W2) x (the power W2)       (II)
λ2 = 685 nanometers      (III)
λ1 = 635 nanometers (IV)
each of the metal particles are formed of silver; and
each of the metal particle has a particle diameter of 40 nanometers.
【符号の説明】
【０１０６】
１  流路
２  混合液
３  銀ナノ微粒子のモノマー
４  銀ナノ微粒子のダイマー
５  銀ナノ微粒子のトリマー
６  第１光源
７  第１照射光
８    第２光源
９    第２照射光
１０  第１ダイクロイックミラー
１１  散乱光
１２  第１レイリー散乱光
１３  第２レイリー散乱光
１４  第２ダイクロイックミラー
１５  第１光センサ
１６  第３ダイクロイックミラー
１７  第２光センサ
１８  分光器
１９  計測対象分子
２０  デバイス
２１  第１シリンジポンプ
２２  第１配管チューブ
２３  第１コネクタ
２４  第２シリンジポンプ
２５  第２配管チューブ
２６  第２コネクタ
２７  第３シリンジポンプ
２８  第３配管チューブ
２９  第３コネクタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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