(57)【要約】【課題】  少量の試料で、簡便に再現性良く苦味抑制物質のスクリーニングを行う方法を提供する。【解決手段】  マウスの神経応答機構を用い、苦味物質および苦味抑制候補物質に対する神経応答強度を指標とすることを特徴とする苦味抑制物質の評価方法であって、  （Ａ）苦味物質単独の神経応答強度を確認する段階、  （Ｂ）苦味抑制候補物質単独の神経応答強度を確認する段階、及び  （Ｃ）苦味物質に苦味抑制候補物質を混合した場合の神経応答強度を確認する段階を含む苦味抑制物質の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの神経応答機構を用い、苦味物質および苦味抑制候補物質に対する神経応答強度を指標とすることを特徴とする苦味抑制物質の評価方法であって、
（Ａ）苦味物質単独の神経応答強度を確認する段階、
（Ｂ）苦味抑制候補物質単独の神経応答強度を確認する段階、及び
（Ｃ）苦味物質に苦味抑制候補物質を混合した場合の神経応答強度を確認する段階
を含む苦味抑制物質の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＡ、Ｂ、Ｃの段階における神経応答強度が、下記式を満たすとき、苦味抑制候補物質を苦味抑制物質と認定する、請求項１に記載の苦味抑制物質の評価方法。
（式）Ｃ＜Ａ＋Ｂ
【請求項３】
請求項１に記載のＡ、Ｂ、Ｃの段階における神経応答強度が、下記式を満たすとき、苦味抑制候補物質が効果の高い苦味抑制物質であると認定する、請求項１または２に記載の苦味抑制物質の評価方法。
（式）Ｃ＜（Ａ＋Ｂ）×８０％
【請求項４】
苦味抑制候補物質が、多糖類、糖アルコール、糖類またはそれらの組み合わせである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の苦味抑制物質の評価方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の苦味抑制物質の評価方法で認定された苦味抑制物質。
【請求項６】
請求項５に記載の苦味抑制物質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、苦味物質、苦味抑制候補物質、およびこれらの混合物のマウスの神経応答強度の測定を行い、苦味抑制物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
味覚情報は生体に必要な栄養物の弁別に重要な役割を担っている。甘味・うま味はエネルギー源や体の構成要素の検出、酸味・塩味は体内イオンの恒常性の維持、苦味は有毒物質の識別のための情報として重要である。
【０００３】
味覚受容は、口腔内に入ってきた味覚物質が味蕾を構成する味細胞の一部を刺激することによりはじまる。味覚物質により味細胞が刺激を受けると活動電位が発生し、シナプスを介して味覚情報が味神経に伝達される。味覚情報はさらに脳の味覚野に伝達すると、味として知覚される。
【０００４】
近年、味物質のスクリーニング方法として、マウスを利用する方法が研究されているが（特許文献１）、苦味抑制物質のスクリーニングに適した技術ではなかった。また、特許文献１の評価法は、ノックアウトマウスでの試験、野生型マウスでの試験、野生型マウスの行動試験を実施しなくてはならず煩雑な上、コストのかかるノックアウトマウスでの試験を実施しなければならなかった。
【０００５】
また、ノックアウトマウスを利用しない苦味抑制物質の同定方法として、野生型マウスの神経応答解析を活用した手法が研究されている（特許文献２）。しかし、特許文献２の評価方法は、神経応答解析の他、細胞培養実験や行動応答実験など複数の実験を実施しなければならず煩雑な上、実験期間が長期間必要なものであった。また、神経応答解析は、単に、（ｉ）苦味物質単独と（ｉｉ）苦味物質に苦味抑制物質を混合したときの神経応答強度を比較したものであり、苦味抑制物質単独の神経応答の影響を考慮していないものであった。すなわち、（ｉ）に比べ（ｉｉ）が低いことを満たす苦味抑制物質を同定するものであるため、例えば、苦味抑制物質単独の神経応答が極端に高い場合には（ｉ）に比べ（ｉｉ）が高くなり、苦味抑制物質のスクリーニングに適した技術ではなかった。
【０００６】
一方、苦味抑制物質をスクリーニングする方法としては、味覚の評価で一般的に用いられるヒトでの官能評価による方法が行われている。しかし、ヒトでの官能評価による方法は、訓練された評価者が必要であり、さらにデータの信頼性を担保するために多くの評価者による試験が必要となり、時間、労力、多量の試料を要するという問題があった。さらに、ヒトに好まれない味質はパネルへの負担が大きく、人体に影響を及ぼす恐れのある苦味物質は摂取そのものが不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１５４６６１号公報
【特許文献２】特表２００２−５３３６９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる事情に鑑みて発明されたものであり、少量の試料で、簡便に再現性良く苦味抑制物質のスクリーニングを行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために鋭意研究したところ、本発明者らは、マウスの神経応答の応答強度を解析することにより苦味抑制物質をスクリーニングする方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
より詳細には、本発明者らは、苦味物質と苦味抑制候補物質の混合物の応答強度、苦味物質単独の応答強度、及び苦味抑制候補物質単独の応答強度をそれぞれ測定する段階を含む苦味抑制物質の評価方法を確立した。
【００１１】
すなわち、本発明は、第一に、マウスの神経応答機構を用い、苦味物質および苦味抑制候補物質に対する神経応答強度を指標とすることを特徴とする苦味抑制物質の評価方法であって、
（Ａ）苦味物質単独の神経応答強度を確認する段階、
（Ｂ）苦味抑制候補物質単独の神経応答強度を確認する段階、及び
（Ｃ）苦味物質に苦味抑制候補物質を混合した場合の神経応答強度を確認する段階
を含む苦味抑制物質の評価方法である。
第二に、上記第一に記載のＡ、Ｂ、Ｃの段階における神経応答強度が、Ｃ＜Ａ＋Ｂを満たすとき、苦味抑制候補物質を苦味抑制物質と認定する、上記第一に記載の苦味抑制物質の評価方法である。
第三に、上記第一に記載のＡ、Ｂ、Ｃの段階における神経応答強度が、Ｃ＜（Ａ＋Ｂ）×８０％を満たすとき、苦味抑制候補物質が効果の高い苦味抑制物質であると認定する、上記第一または第二に記載の苦味抑制物質の評価方法である。
第四に、苦味抑制候補物質が、多糖類、糖アルコール、糖類またはそれらの組み合わせである、上記第一から第三のいずれか一つに記載の苦味抑制物質の評価方法である。
第五に、上記第一から第四のいずれか一つに記載の苦味抑制物質の評価方法で認定された苦味抑制物質である。
第六に、上記第五に記載の苦味抑制物質を含む組成物である。
【００１２】
本発明の対象となる苦味物質としては、特に制限はないが、苦味のある、医薬品成分や食品成分またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００１３】
本発明の対象となる苦味抑制候補物質としては、特に制限はないが、多糖類、糖アルコール、糖類またはそれらの組み合わせが特に好適である。
【００１４】
ここで本発明における多糖類とは、たとえば、寒天、タラガム、グァーガム、ローカストビーンガム、タマリンド種子多糖類、ジェランガム、キサンタンガム、アラビアガム、サイリュームシードガム、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ペクチン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、カラヤガム、プルラン、カルボキシメチルセルロース、カードラン、グルコマンナン、澱粉、ヒドロキシメチルセルロース、トラガントガムなどが挙げられる。
【００１５】
また、本発明における糖アルコールとは、たとえば、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、還元パラチノース、還元澱粉糖化物などを挙げることができる。
【００１６】
さらに、本発明における糖類とは、たとえば、キシロース、グルコース、マンノースなどに代表される炭素数が４以上の単糖類、ラクトース、マルトース、マルトトリオースなどに代表される炭素数が４以上の単糖類が２以上結合した少糖類、グルコースやキシロースなどを構成単位とするマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖などの各種オリゴ糖類などが挙げられる。
【００１７】
本発明では、好ましい態様として、苦味物質と苦味抑制候補物質の混合物を測定したときの応答強度が、苦味物質単独を測定した時の応答強度と、苦味抑制候補物質単独を測定した時の応答強度の和より小さい場合、苦味抑制候補物質を苦味抑制物質と認定するが、その中でも、混合物の応答強度が、苦味物質単独の応答強度と苦味抑制候補物質単独の応答強度との和の８０％に及ばない場合、苦味抑制候補物質を効果の高い苦味抑制物質と認定する。
【００１８】
また、本発明においては、認定された苦味抑制物質を特定の組成物に含むことができる。組成物は、固形状、粉状、結晶状、油状、溶液状など何れのものでも良く、例えば医薬組成物であれば、滋養強壮保健薬、解熱鎮痛消炎薬、向精神薬、抗不安薬、抗うつ薬、催眠鎮静薬、鎮痙薬、中枢神経作用薬、脳代謝改善剤、脳循環改善剤、抗てんかん剤、交感神経興奮剤、胃腸薬、制酸剤、抗潰瘍剤、鎮咳去痰剤、鎮吐剤、呼吸促進剤、気管支拡張剤、抗アレルギー薬、歯科口腔用薬、抗ヒスタミン剤、強心剤、不整脈用剤、利尿薬、血圧降下剤、血管収縮薬、冠血管拡張薬、末梢血管拡張薬、高脂血症用剤、利胆剤、抗生物質、化学療法剤、糖尿病用剤、骨粗しょう症用剤、抗リウマチ薬、骨格筋弛緩薬、鎮けい剤、ホルモン剤、アルカロイド系麻薬、サルファ剤、痛風治療薬、血液凝固阻止剤、抗悪性腫瘍剤、アルツハイマー病治療薬などから選ばれた１種または２種以上の成分が用いられる。また、食品組成物であれば、栄養補助食品等と呼ばれる食品サプリメントや特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品、健康食品などを挙げることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、少量の試料で、簡便に再現性良く苦味抑制物質のスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
本発明におけるマウスの神経応答機構を用いた鼓索神経応答記録は、以下のように行い、神経応答強度を求めた。
【００２２】
実験動物には８週齢、体重２０〜３０ｇの雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。実験動物をペントバルビタールナトリウム（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与にて麻酔し、ヘッドホルダーで仰臥位に固定し、気管カニューレを装着した。右側鼓索神経を舌神経から分かれ鼓室に入る直前で切断し、周囲の組織から分離後、銀塩化銀電極にのせた。不関電極は咬筋に装着した。測定に用いる試料を口腔内に投与し、口腔内での刺激で発生する鼓索神経の活動電位は増幅器（ＥＲ−１；Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，ＰＡ，アメリカ合衆国）にて増幅され、全神経線維束応答はオシロスコープとオーディオモニターにて観察された。さらに、応答をインテグレーターにて積分し、ＰｏｗｅｒＬａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｏｗｅｒＬａｂ／ｓｐ５；ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＳＷ，オーストラリア）を使用して、コンピューターに記録した。測定溶液は２秒間、流速０．５ｍｌ／秒で与え、洗浄には蒸留水を用いた。神経応答強度は、測定溶液の刺激開始５秒〜２０秒後までの大きさの平均値を求め、同様に求めた０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ（和光純薬工業株式会社製）応答を１とする相対値として求めた。
【００２３】
次に、苦味抑制効果の確認方法について説明する。
【００２４】
（苦味物質＋苦味抑制候補物質混合溶液の応答）、（苦味物質単独の応答）、（苦味抑制候補物質単独の応答）をそれぞれ測定し、（実測値）及び（予測値）を以下のように求めた。
（実測値）＝（苦味物質＋苦味抑制候補物質混合溶液の応答）
（予測値）＝（苦味物質単独の応答）＋（苦味抑制候補物質単独の応答）
そして、（実測値）＜（予測値）の場合に、苦味抑制候補物質は苦味物質に対する苦味抑制効果があるとみなした。
【００２５】
また、実施例および確認試験においては、苦味物質であるキニーネ硫酸塩は和光純薬工業株式会社の製品を、グルコサミン塩酸塩はグルコサミンＧＭというプロテインケミカル株式会社の製品を、それぞれ使用した。
【００２６】
さらに、実施例および確認試験において、以下の苦味抑制候補物質を使用した。
【００２７】
マンニトールはマンニットＰという三菱商事フードテック株式会社の製品を、ラクトースはＰｈａｒｍａｔｏｓｅ  ２００ＭというＤＦＥ  Ｐｈａｒｍａ社の製品を、エリスリトールはエリスリトール微粉という三菱化学フーズ株式会社の製品を、それぞれ使用した。
【００２８】
また、カラギーナンはＣＡＭ−１０００およびＣＡＭ−５００という三菱商事フードテック株式会社の製品を、キサンタンガムはエコーガムＴというＣＰケルコ社の製品と、グリンステッドキサンタンクリア８０というダニスコ社の製品を、それぞれ使用した。
【実施例１】
【００２９】
表１に記載の配合表からなる溶液を調製した。これら溶液に含まれる苦味抑制候補物質は蒸留水で溶かし、室温（２５℃）で使用した。
【００３０】
【表１】
2017044659.tif 000002
【００３１】
これらの試料を標準体重の成体マウス６匹に口腔内投与し、神経応答強度の平均値を求めた。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2017044659.tif 000003
【００３３】
これらの結果から、試験された苦味抑制候補物質のマンニトールにおいて実測値が予測値を下回り、マンニトールはキニーネ硫酸塩に対する苦味抑制効果が認められることが明らかとなった。
【実施例２】
【００３４】
表３に記載の配合表からなる溶液を調製した。これら溶液に含まれる苦味抑制候補物質は蒸留水で溶かし、室温（２５℃）で使用した。
【００３５】
【表３】
2017044659.tif 000004
【００３６】
これらの試料を標準体重の成体マウス５〜６匹に口腔内投与し、神経応答強度の平均値を求めた。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
2017044659.tif 000005
【００３８】
これらの結果から、試験されたすべての苦味抑制候補物質において実測値が予測値を下回り、これらの苦味抑制候補物質はキニーネ硫酸塩に対する苦味抑制効果が認められることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３９】
表５に記載の配合表からなる溶液を調製した。これら溶液に含まれる苦味抑制候補物質は蒸留水で溶かし、室温（２５℃）で使用した。
【００４０】
【表５】
2017044659.tif 000006
【００４１】
これらの試料を標準体重の成体マウス５〜９匹に口腔内投与し、神経応答強度の平均値を求めた。結果を表６に示す。
【００４２】
【表６】
2017044659.tif 000007
【００４３】
これらの結果から、試験された苦味抑制候補物質のマンニトールにおいて実測値が予測値を下回り、マンニトールはグルコサミン塩酸塩に対する苦味抑制効果が認められることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４４】
表７に記載の配合表からなる溶液を調製した。これら溶液に含まれる苦味抑制候補物質は蒸留水で溶かし、室温（２５℃）で使用した。
【００４５】
【表７】
2017044659.tif 000008
【００４６】
これらの試料を標準体重の成体マウス５〜１４匹に口腔内投与し、神経応答強度の平均値を求めた。結果を表８に示す。
【００４７】
【表８】
2017044659.tif 000009
【００４８】
これらの結果から、試験されたすべての苦味抑制候補物質において実測値が予測値を下回り、これらの苦味抑制候補物質はグルコサミン塩酸塩に対する苦味抑制効果が認められることが明らかとなった。
【００４９】
［確認試験１］
実施例１から２において使用したキニーネ硫酸塩について、苦味抑制候補物質無添加の溶液を基準品にして、キニーネ硫酸塩に各種苦味抑制候補物質を添加した苦味溶液の官能評価を行った。官能評価は、苦味抑制候補物質ごとに５名のパネルを用いて行い、一検体５ｍｌの溶液を使用した。官能評価溶液配合表を表９に示す。
【００５０】
【表９】
2017044659.tif 000010
【００５１】
苦味溶液の官能評価は、以下のように行った。
【００５２】
サンプルの「苦さ」について、基準品に対して非常に弱い（−２点）〜基準と同じ（０点）〜非常に強い（＋２点）の５段階の点数で評価した。評点の平均値が０より下かつ負の有意差が認められたものを「苦味が非常に弱い」として◎、評点が０より下のものを「苦味が弱い」として○、評点が０のものを「苦味が基準と同じ」として△、評点が０より上のものを「苦味が強い」として×、評点が０より上かつ正の有意差が認められたものを「苦味が非常に強い」として××と表記した。結果を表１０に示す。
【００５３】
【表１０】
2017044659.tif 000011
【００５４】
官能評価結果より、ラクトース及びエリスリトール以外のいずれの苦味溶液についても、基準品に比べ苦味抑制候補物質を添加したもので苦さが弱い、あるいは非常に弱いという評価になり、実施例１から２の神経応答結果と対応することが確認された。
【００５５】
［確認試験２］
実施例３から４において使用したグルコサミン塩酸塩について、苦味抑制候補物質無添加の溶液を基準品にして、グルコサミン塩酸塩に各種苦味抑制候補物質を添加した苦味溶液の官能評価を行った。官能評価は、苦味抑制候補物質ごとに５名のパネルを用いて行い、一検体５ｍｌの溶液を使用した。官能評価溶液配合表を表１１に示す。
【００５６】
【表１１】
2017044659.tif 000012
【００５７】
苦味溶液の官能評価は、確認試験１と同様に行った。結果を表１２に示す。
【００５８】
【表１２】
2017044659.tif 000013
【００５９】
官能評価結果より、ラクトース及びエリスリトール以外のいずれの苦味溶液についても、基準品に比べ苦味抑制候補物質を添加したもので苦さが非常に弱いという評価になり、実施例３から４の神経応答結果と対応することが確認された。
【００６０】
以上より、マウスの神経応答機構を用いた評価と官能検査の評価結果が対応することから、本発明に係る方法により、簡便に再現性良く苦味抑制物質のスクリーニングを行うことが可能となった。