(57)【要約】【課題】パルス周波数を可変可能とすることで高解像時の高画素化に対応し、かつ、低解像時にはＳＮ比の良好な画像を取得する。【解決手段】パルスレーザ光Ｌを射出し、パルスレーザ光Ｌのパルス周波数を変更可能な光源部２と、光源部２から発せられたパルスレーザ光Ｌを試料Ｘにおいて走査させる走査部３と、走査部３によりパルスレーザ光Ｌが走査されることにより試料Ｘにおいて発生した蛍光Ｆを検出する光検出部４と、取得される画像の画素数を設定する画素数設定部５と、画素数設定部５により設定された画素数に応じてパルス周波数を変更するとともに、取得される画像の輝度の画素数による変化を低減するように光源部２または光検出部４を制御する制御部６とを備える走査型レーザ顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルスレーザ光を射出し、該パルスレーザ光のパルス周波数を変更可能な光源部と、
該光源部から発せられたパルスレーザ光を試料において走査させる走査部と、
該走査部によりパルスレーザ光が走査されることにより試料において発生した蛍光を検出する光検出部と、
取得される画像の画素数を設定する画素数設定部と、
該画素数設定部により設定された画素数に応じてパルス周波数を変更するとともに、取得される画像の輝度の画素数による変化を低減するように前記光源部および／または前記光検出部を制御する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記光源部が、所定のパルス周波数のパルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を分割し、時間差を付与して合成するパルス分割部とを備える請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、該画素数設定部により設定された画素数に応じてパルス周波数を変更するとともに、パルス周波数に関わらず取得される画像の輝度が一定となるように前記光源部および／または前記光検出部を制御する請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記走査部が共振周波数近傍の一定の周波数でパルスレーザ光を走査させる請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光源からの光をパルス分割装置を用いて分割することにより、パルス周波数を増大させつつ観察を行う顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この顕微鏡は、パルス状のレーザ光の偏光方向に応じてパルスを分割する複数のパルス分割素子を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１２８２８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
パルスレーザ光を用いたレーザ顕微鏡で、レゾナント（共振）スキャナのような走査速度一定（走査速度を可変できない）高速スキャナで画像を取得する際、１画素の時間が短くその間に入射するパルス数が少ないため、解像度を高く設定する場合は、それにあわせてパルスレーザ光のパルス周波数を上げるもしくはパルス分割する必要がある。一方、ＳＮ比の良好な画像を取得するためには、蛍光の発光効率を高める必要があり、試料に照射するレーザ光のピークパワーを高くすることが効果的である。その為、画像を取得するエリアの解像度（ピクセル数）を可変するためには、それにあわせてパルスレーザ光のパルス周波数を可変することが望ましい。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のパルス分割装置では、パルス周波数（分割数）は固定であるため、設定する解像度に適したパルス周波数に設定することができない。
このような場合、パルス周波数は最も高い解像度にあわせて最も高い周波数（分割数）となる。
この場合、解像度を低く設定すると、パルス周波数が最も高い周波数になっているため、上記のとおりパルスレーザ光のピークパワーが低くなっているので、ＳＮ比の良好な画像を取得することができない。
【０００６】
本願は上述した事情に鑑みてなされものであって、パルス周波数を可変可能とすることで高解像時の高画素化に対応し、かつ、低解像時にはＳＮ比の良好な画像を得ることができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、パルスレーザ光を射出し、該パルスレーザ光のパルス周波数を変更可能な光源部と、該光源部から発せられたパルスレーザ光を試料において走査させる走査部と、該走査部によりパルスレーザ光が走査されることにより試料において発生した蛍光を検出する光検出部と、取得される画像の画素数を設定する画素数設定部と、該画素数設定部により設定された画素数に応じてパルス周波数を変更するとともに、取得される画像の輝度の画素数による変化を低減するように前記光源部および／または前記光検出部を制御する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。
【０００８】
上記態様においては、光源部から発せられたパルスレーザ光が走査部によって試料において走査されると、各走査位置において蛍光が発生し、発生した蛍光が光検出部により検出される。検出された蛍光の強度と、該蛍光が発生した走査位置とを対応付けて記憶することにより、試料の蛍光画像を取得することができる。
【０００９】
この場合において、画素数設定部により取得される画像の画素数が設定されると、制御部が画素数に応じてパルス周波数を設定する。高い画素数が設定されると高いパルス周波数が設定され、低い画素数が設定されると低いパルス周波数が設定される。制御部が光源部または光検出部を制御して、取得される画像の輝度の画素数による変化を低減するので、高画素化のためにパルス周波数を増大させても、パルスレーザ光のピークパワーの低下による輝度値変化を低減した良好な画像を取得することができる。また、低解像度の場合は、ＳＮ比の良好な画像を得ることができる。
【００１０】
上記態様においては、前記光源部が、所定のパルス周波数のパルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を分割し、時間差を付与して合成するパルス分割部とを備えていてもよい。
このようにすることで、レーザ光源から発せられた所定のパルス周波数のパルスレーザ光は、パルス分割部によって分割され時間差が付与されて合成されることで、パルス周波数を簡易に増大させることができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記制御部が、該画素数設定部により設定された画素数に応じてパルス周波数を変更するとともに、パルス周波数に関わらず取得される画像の輝度が一定となるように前記光源部および／または前記光検出部を制御してもよい。
このようにすることで、高画素化のためにパルス周波数を増大させても、輝度が変化せず良好な画像を取得することができる。
【００１２】
また、上記態様においては、前記走査部が共振周波数近傍の一定の周波数でパルスレーザ光を走査させてもよい。
このようにすることで、共振周波数近傍の一定の周波数でパルスレーザ光を高速に走査させても、パルス周波数を増大させて高分解能の明るい画像を迅速に取得することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高画素化のためにパルス周波数を増大させても、パルス周波数に関わらず取得される画像の輝度値変化を低減した良好な画像を取得することができ、また、低解像度の場合は、ＳＮ比の良好な画像を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示すブロック図である。
【図２】図１の走査型レーザ顕微鏡に備えられるパルス分割部のゼロ分割の状態を示す模式図である。
【図３】図１の走査型レーザ顕微鏡に備えられるパルス分割部の２分割の状態を示す模式図である。
【図４】図１の走査型レーザ顕微鏡に備えられるパルス分割部の４分割の状態を示す模式図である。
【図５】図２のパルス分割部の入力および出力を示す図である。
【図６】図３のパルス分割部の入力および出力を示す図である。
【図７】図４のパルス分割部の入力および出力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、パルスレーザ光Ｌを射出する光源部２と、該光源部２から発せられたパルスレーザ光Ｌを試料Ｘにおいて走査させる走査部３と、該走査部３によりパルスレーザ光Ｌが走査されることにより試料Ｘにおいて発生した蛍光Ｆを検出する光検出部４と、取得される画像の画素数を設定する画素数設定部５と、該画素数設定部５により設定された画素数に応じて光源部２および光検出部４を制御する制御部６と、光検出部４により取得された蛍光Ｆの強度と走査部３による走査位置とを対応付けて生成された画像を表示する表示部７とを備えている。
【００１６】
光源部２は、所定のパルス周波数のパルスレーザ光Ｌを射出するレーザ光源８と、該レーザ光源８から射出されたパルスレーザ光Ｌを分割し、分割されたパルスレーザ光Ｌに時間差を付与して合成するパルス分割部９とを備えている。
【００１７】
パルス分割部９は、例えば、図２から図４に示されるように、レーザ光源８から出力されたパルスレーザ光Ｌの光路上に挿脱される２つの分割ユニット１０，１１を備えている。各分割ユニット１０，１１は、２枚のハーフミラー１２，１３と２枚のミラー１４とを備えている。第１のハーフミラー１２はパルスレーザ光Ｌの光路に４５°の角度をなして挿入されることにより、パルスレーザ光Ｌの半分を透過し、半分を９０°偏向するようになっている。
【００１８】
偏向されたパルスレーザ光Ｌは、２枚のミラー１４によってクランク状に偏向された後、第２のハーフミラー１３によって第１のハーフミラー１２を透過したパルスレーザ光Ｌの光路に合波されるようになっている。
２つの分割ユニット１０，１１においては、ハーフミラー１２，１３によりクランク状の光路に分岐されて迂回させられることにより増加する光路長が相違している。具体的には、一方の分割ユニット１０により増加させられる光路長は、他方の分割ユニット１１により増加させられる光路長の半分に設定されている。
【００１９】
また、一方の分割ユニット１０により光路長が増加させられることによる遅延時間は、レーザ光源８から射出されるパルスレーザ光Ｌの間隔の１／２、他方の分割ユニット１１により光路長が増加させられることによる遅延時間は、レーザ光源８から射出されるパルスレーザ光Ｌの間隔の１／４に設定されている。すなわち、各分割ユニット１０，１１によれば、分割された各パルスレーザ光Ｌが時間差を付与された状態で合成されて出力されるようになっている。
【００２０】
走査部３は、例えば、レゾナントスキャナであり、共振周波数近傍で揺動させられることにより、パルスレーザ光Ｌを試料Ｘにおいて、高速に、２次元的に走査することができるようになっている。
【００２１】
光検出部４は、例えば、光電子増倍管を備えており、検出した蛍光Ｆの強度に応じた電流を出力することができるようになっている。また、光検出部４は、光電子増倍管から出力される電流信号を制御部６からの指令信号に応じて増幅するアンプを備えている。
画素数設定部５は、操作者が入力する入力装置であり、予め設定されている複数の画素数のなかからいずれかの画素数を選択して入力することができるようになっている。
【００２２】
制御部６は、光源部２、走査部３、光検出部４、画素数設定部５および表示部７との間で信号をやりとりするインタフェース回路（図示略）と、光照射制御プログラム、パルス周波数制御プログラム、検出器制御プログラムおよび観察条件判別プログラム等の各種プログラムおよび光検出部４により取得された蛍光画像情報を記憶するメモリ（図示略）と、メモリから読み出した各種プログラムを実行するＣＰＵ（図示略）とを備えている。
【００２３】
制御部６は、画素数設定部５において入力された画素数に応じて光源部２内のパルス分割部９を制御してパルス周波数を設定するようになっている。具体的には、図５から図７に示されるように、制御部６は、画素数が設定されると、画素数に応じて分割数を算出する。そして、制御部６は、分割数が２分割である場合には、一方の分割ユニット１０をパルスレーザ光Ｌの光路に挿入するとともに、設定されたパルス周波数に応じた指令信号を光検出部４のアンプに出力するようになっている。
【００２４】
さらに具体的には、図３に示されるようにパルス周波数を２倍（分割数を２分割）に設定したときには、図６に示されるように、単一の分割ユニット１０を通過することによってパルスレーザ光Ｌのピークパワーが半分になる。試料Ｘにおいて発生する蛍光強度は照射するパルスレーザ光Ｌのピークパワーの２乗に比例するので、アンプにより増幅するゲインとして、例えば、２２＝４を設定することにより、図５に示されるように、パルス周波数を増加させない場合と同等の強度の蛍光Ｆを得ることができるようになっている。
【００２５】
一方、図４に示されるようにパルス周波数を４倍（分割数を４分割）に設定したときには、２つの分割ユニット１０，１１を通過することによって、図７に示されるように、パルスレーザ光Ｌのピークパワーが１／４になるので、アンプにより増幅するゲインとして、例えば、２４＝１６を設定することにより、図５に示されるパルス周波数を増加させない場合と同等の強度の蛍光Ｆを得ることができるようになっている。
図１中、符号１５はダイクロイックミラーである。
【００２６】
このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いて試料Ｘの蛍光観察を行うには、まず、操作者が、装着されている対物レンズの倍率等を勘案して取得される画像の画素数を画素数設定部５により設定する。
【００２７】
画素数設定部５により画素数が設定されると、制御部６は、パルス分割部９を制御してパルスレーザ光Ｌのパルス周波数を設定する。画素数は３段階に設定可能であり、最も少ない画素数では、図２に示されるように、２つの分割ユニット１０，１１はパルスレーザ光Ｌの光路から離脱させられた状態に維持される。このとき、パルス分割部９から出力されるパルスレーザ光Ｌのパルス周波数は、レーザ光源８から射出されたままの値に維持される。
【００２８】
中間の画素数では、図３に示されるように、迂回光路長の長い一方の分割ユニット１０のみがパルスレーザ光Ｌの光路上に挿入される。このとき、パルス分割部９から出力されるパルスレーザ光Ｌのパルス周波数は、レーザ光源８から射出されたパルスレーザ光Ｌのパルス周波数の２倍の値に設定される。
【００２９】
さらに、最も多い画素数では、図４に示されるように、２つの分割ユニット１０，１１の両方が、パルスレーザ光Ｌの光路上に挿入される。このとき、パルス分割部９から出力されるパルスレーザ光Ｌのパルス周波数は、レーザ光源８から射出されたパルスレーザ光Ｌのパルス周波数の４倍の値に設定される。
【００３０】
そして、制御部６は、パルス分割部９の作動によってパルス周波数を増大させたときには、それに応じて光検出部４のアンプにより蛍光強度信号を増幅するゲインを増大させる。
このように本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、設定された画素数に応じてパルス周波数が設定されるので、低倍率広視野の画像を取得する場合等に、画素数の多い画像を取得して、精密な蛍光観察を行うことができる。
【００３１】
この場合に、画素数に応じてアンプにより増幅するゲインを設定するので、特に、走査部３として共振周波数近傍の一定の速度でパルスレーザ光Ｌを走査させるレゾナントスキャナを用いる場合にも、パルス周波数を増大させてパルスレーザ光Ｌのピークパワーの低下による輝度値変化を低減した高分解能の明るい画像を迅速に取得することができるという利点がある。また、画素数の少ない画像を取得する場合においては、パルスレーザ光Ｌのピークパワーの高い状態を維持するため、ＳＮ比の良好な画像を取得することができる。
【００３２】
なお、本実施形態においては、設定される画素数に応じて、光検出部４において蛍光強度にかけるゲインを切り替えることとしたが、これに代えて、制御部６は、設定される画素数に応じて、レーザ光源８のパワーを増減することにしてもよい。この場合には、パルス分割部９による分割数がＮ分割である場合には、レーザ光源８のパワーをＮ倍に増加させることにすればよい。あるいは、光検出部４におけるゲインの切替とレーザ光源８のパワーの増減とを組み合わせてもよい。
【００３３】
また、光源部２が、パルスレーザ光Ｌを分割するパルス分割部９を備えるものを例示したが、これに代えて、光源部２はパルス周波数を変更可能なレーザ光源８のみから構成されていてもよい。例えば、レーザ光源８の共振器長を変更することでパルス周波数を変更したり、レーザ光源８の種光の制御発振周波数を変更したりするものを採用してもよい。
【００３４】
また、パルスレーザ光Ｌの光路に挿脱される２つの分割ユニット１０，１１を有する場合を例示したが、１つまたは３以上の分割ユニットを備えていてもよい。また、ハーフミラー１２，１３およびミラー１４を組み合わせた分割ユニット１０，１１を例示したが、これに代えて、分割数を切替可能な他の任意の構成のものを採用してもよい。
【００３５】
また、本実施形態においては、分割数にかかわらず得られる蛍光画像の明るさが同等となるようにアンプのゲインまたはレーザ光源８のパワーを調節することとしたが、これに限られるものではなく、分割数によって取得される蛍光画像の明るさの差が低減するようにアンプのゲインまたはレーザ光源８のパワーを調節することにしてもよい。
【符号の説明】
【００３６】
１  走査型レーザ顕微鏡
２  光源部
３  走査部
４  光検出部
５  画素数設定部
６  制御部
８  レーザ光源
９  パルス分割部
Ｆ  蛍光
Ｌ  パルスレーザ光
Ｘ  試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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