(57)【要約】      （修正有）【課題】タウ蛋白質の蓄積を抑制しうるタウオパチーの進行抑制剤の提供。【解決手段】米、小麦等の植物や種子の細胞壁中フェルラ酸エステルや配糖体として存在し、抽出・単離・精製若しくは化学的に合成したフェルラ酸（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンゼンアクリル酸）を有効成分とするタウ蛋白質のリン酸化抑制剤、及びリン酸化タウ蛋白質による神経細胞死抑制剤。【効果】低下した神経細胞のプロテインフォスファターゼＰＰ２Ａが活性化され、タウ蛋白質のリン酸化が抑制され、その結果、神経細胞死が抑制され、アルツハイマー病等のタウオパチーの進行が抑制される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸を有効成分とするタウ蛋白質のリン酸化抑制剤。
【請求項２】
フェルラ酸を有効成分とするリン酸化タウ蛋白質による神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
フェルラ酸を有効成分とするタウオパチーの進行抑制剤。
【請求項４】
タウオパチーがアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ）、神経原線維型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）のいずれかである請求項３に記載のタウオパチー進行抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウオパチーの原因となるタウ蛋白質蓄積抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タウオパチーとは、タウ蛋白質の蓄積に伴って発症する中枢神経系、末梢神経系または自律神経系に影響を及ぼす障害をいう。近年の研究で、異常なタウ蛋白質の蓄積がアルツハイマー病をはじめとする神経変性障害にも関係していることが明らかになってきた。
タウオパチーに分類される疾患としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ）、神経原線維型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）等が知られている
【０００３】
異常なタウ蛋白質の一種として、高リン酸化されたタウタンパク質がある。タウ蛋白質は、アルツハイマー病に特異的なＳｅｒ３９６残基を含むいくつかのリン酸化部位で、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）により、インビボでリン酸化されることが明らかとなっている。さらに、ＧＳＫ３βは、プロテインキナーゼＡｋｔによってリン酸化されることも知られている。Ａｋｔの活性は、プロテインフォスファターゼＰＰ２Ａによって低減されることも明らかとなっている。
【０００４】
近年、ＰＰ２Ａが、ヒトの脳の総タウフォスファターゼ活性のおよそ７１％を占めることが明らかとなった。またアルツハイマー病の患者の脳において、総フォスファターゼ活性およびタウに対するＰＰ２Ａ活性が顕著に減少し、一方、ＰＰ２Ｂ等の他のフォスファターゼの活性は、アルツハイマー病の患者の脳において実際には増加しているという事実が見いだされている。ＰＰ２Ａ活性は、ヒトの脳における大部分のタウリン酸化部位のリン酸化のレベルと逆相関するが、これは、ＰＰ２Ａが、ヒトの脳における複数の部位でのリン酸化を制御する主要なタウフォスファターゼであることを示している。これは、アルツハイマー病の脳におけるタウの異常な高リン酸化が、部分的にＰＰ２Ａ活性の下方制御によるものであること、およびＰＰ２Ａの活性を増強するよう作用し得る物質は、タウオパチー神経障害の進行を抑制できる可能性が考えられる。
【０００５】
このような観点から、タウオパチーの治療用剤として多数の提案がなされている。例えば特許文献１には、ＧＳＫ３βによるタウ蛋白質のリン酸化を抑制し、ＰＰ２Ａを活性化する成分として、セレン酸またはセレン酸のナトリウム塩が有効であることが開示されている。
一方では、特許文献２のように変異型タウ蛋白質抗体を投与してリン酸化を抑制するための抗体ワクチンが提案されている。これらの２文献以外にも多数のタウ蛋白質の蓄積を抑制する物質が提案されている。現在もタウ蛋白質の量を減少させるか、またはタウ蛋白質のリン酸化に影響を及ぼし、かつ神経障害の処置または予防に有用な物質の探索が続いている。
【０００６】
また、近年植物由来の成分の利用に注目が集まっている。植物組織に多く存在するフェルラ酸は、人体への生理活性については解明されていない面が多い。フェルラ酸とジヒドロフェルラ酸は、細胞壁のリグノセルロース中でリグニンと多糖を繋ぎ合わせる役割を担っているが、米、小麦、大麦やコーヒー、リンゴ、アーティチョーク、ピーナッツ、オレンジ、パイナップルなどの種子の中にも見られ、その存在意義は不明な点が多い。通常、濃アルカリを用いて小麦や大豆のふすまから抽出される。またカフェ酸にＯ−メチルトランスフェラーゼが作用することにより、生合成されることが知られている。
特許文献３にはフェルラ酸がβ−アミロイドペプチドの強毒性フラグメントであるβ２５−３５の神経細胞由来ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する毒性を低下させ、ＮＧＦ様の活性を示すことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−０７４０５０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０８３８１号
【特許文献３】特願２００５−２７２３５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、フェルラ酸を有効成分とするタウオパチーの進行抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、フェルラ酸のβ−アミロイドの神経細胞毒性の機構を研究する過程で、フェルラ酸が、タウオパチーの原因であるタウ蛋白質のリン酸化を阻害し、タウオパチーの進行を抑制することを見いだし、本発明をなしたものである。
【００１０】
すなわち本発明の構成は以下のとおりである。
（１）フェルラ酸を有効成分とするタウ蛋白質のリン酸化抑制剤。
（２）フェルラ酸を有効成分とするリン酸化タウ蛋白質による神経細胞死抑制剤。
（３）フェルラ酸を有効成分とするタウオパチーの進行抑制剤。
（４）タウオパチーがアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ）、神経原線維型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）のいずれかである（３）に記載のタウオパチー進行抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、低下した神経細胞のＰＰ２Ａが活性化され、タウ蛋白質のリン酸化が抑制され、その結果神経細胞死が抑制され、タウオパチーの進行が抑制される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】神経細胞において、オカダ酸誘発性リン酸化タウ蛋白質の産生をフェルラ酸が抑制することを示すグラフである。
【図２】神経細胞においてオカダ酸によるフォスファターゼ阻害に伴って発生する神経細胞死をフェルラ酸が抑制することを示すグラフである。
【図３】フェルラ酸が神経細胞に内在するタウ蛋白質の２０２番目のセリンと２０５番目のスレオニンのリン酸化を抑制することを示すグラフである。
【図４】フェルラ酸が神経細胞に内在するタウ蛋白質の３９６番目のセリンのリン酸化を抑制しないことを示すグラフである。
【図５】フェルラ酸が神経細胞中のＰＰ２Ａの活性を促進させることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願は、フェルラ酸を有効成分とするタウ蛋白質のリン酸化抑制剤に関する発明である。
本発明に用いるフェルラ酸はリグニンの構成成分であり、樹木細胞壁を構成するセルロース、ヘミセルロース等とともにリグニンの基本成分として知られている。リグニンの構成成分と多くの抽出成分はフェニルプロパノイドと呼ばれ、アミノ酸の一種であるフェニルアラニンを経由して生合成される。
【００１４】
フェルラ酸は、米、小麦、野菜類、柑橘類などの植物や種子の細胞壁に、フェルラ酸エステルや配糖体として存在している。化学的に合成することもできるが、本発明においては植物中から抽出・単離・精製したものを用いるのが好ましい。また高純度のフェルラ酸の製造法として特公平７−７８０３２号公報に開示があり、これによって生産された高純度品が市場に供給されているので、これを本発明の実施に当たっては利用することができる。なお合成によって得られたフェルラ酸はシス型とトランス型が混在している。一方、植物から抽出されたフェルラ酸は、植物体内と同じくトランス型がほとんどであり、いずれの立体構造であっても使用可能である。
【００１５】
フェルラ酸を有効成分とするタウ蛋白質のリン酸化抑制剤にかかる発明は、フェルラ酸をそのまま、あるいは慣用の医薬用製剤担体とともに医薬用組成物して動物及びヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤や、注射剤、坐薬などの非経口剤があげられる。投与量は、通常成人でフェルラ酸の重量で１０〜１０００ｍｇを１日数回に分けて服用するのが適当である。
【００１６】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤は、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などの賦形剤を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中のフェルラ酸の配合量は特に限定されるものでなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の賦活剤の他に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。
【００１７】
結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが例示できる。界面活性剤としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが例示できる。滑沢剤として、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどが例示できる。流動性促進剤では軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが例示できる。
【００１８】
また注射剤などの非経口剤は、成人でフェルラ酸を一日あたり１〜１００ｍｇを静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などの剤形で投与することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００１９】
試験例１：フェルラ酸によるオカダ酸誘発リン酸化タウ蛋白質抑制効果試験
フォスファターゼ阻害剤であるオカダ酸（ＯＡ）添加により誘発されるリン酸化タウ蛋白質に対するフェルラ酸（ＦＡ）の影響について、以下の方法で実施した。
（１）試験方法
妊娠１７日目のＳＤラット（日本エスエルシー）から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した後、神経細胞分散液キット（住友ベークライト）を用いて添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。
調製したラット初代神経細胞を２％  Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、０．５  ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むニューロベイサル培地（Ｇｉｂｃｏ）で８×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、ポリ−Ｌ−リジンコートの４８ウエルプレート（ＩＷＡＫＩ）に３５０  μｌずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。
培養４日目に１００μＭフェルラ酸（東京化成）と６または８ｎＭのオカダ酸（和光純薬）を同時添加し、４時間培養後上清を除去し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄後、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたＲＩＰＡ溶液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１  ％  ＳＤＳ、０．５  ％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０）１５０μｌを加え細胞抽出液を調製した。
ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で蛋白質定量を行った後、調製した細胞抽出液に４倍希釈のＬａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ溶液（Ｂｉｏ−ｒａｄ）、終濃度５０  ｍＭ  ＤＴＴ（和光純薬）を加え９５℃、５分加熱し、電気泳動用のサンプルを調製した。１レーンあたり１．４μｇの蛋白質量のサンプルをＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸプレキャストゲル（４−２０％：２６レーン、Ｂｉｏ−ｒａｄ）にロードし、電気泳動を行った後、トランスブロットＴｕｒｂｏミディＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて２．５  Ａ、２５  Ｖ、９分の条件で転写反応を行った。
転写させたメンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ）に浸し、室温で１時間振盪させながらブロッキングした後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡）で１／２０００倍に希釈した抗ＰＨＦ−Ｔａｕモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、４℃、２４時間振盪させながら反応させた。
次いで０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）溶液で３回洗浄後、１０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  -ＴＢＳ溶液で１／１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浸し、室温で振盪させながら１時間反応させた。
反応終了後ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分反応させ発光量をＬＡＳ−４０００（富士フィルム）を用いて測定した。
測定したメンブレンは、リプローブ溶液（６  Ｍ  グアニジン、５０  ｍＭ  グリシン、０．０５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０  ｍＭ  ３−メルカプト−１，２−プロパンジオール）で室温、１５分反応後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した。その後、上記記載と同様な方法でＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅでブロッキング後、抗タウラビットポリクローナル抗体（１／３０００希釈、Ａｂ３：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（１／１００００希釈：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で反応後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分反応させ発光量をＬＡＳ−４０００（富士フィルム）を用いて測定した。
得られたウエスタンブロッティングの発光強度をＭｕｌｔｉ  Ｇａｎｇｅソフトを使用して測定し、リン酸化タウ蛋白質の発光強度を総タウ蛋白質の発光強度で補正した。
【００２０】
（２）結果
リン酸化タウ蛋白質の変化を図１に示した。
図１に示すように、オカダ酸は選択的にフォスファターゼを抑制するが、オカダ酸添加により誘導されるリン酸化タウ蛋白質は、オカダ酸の添加量に対して増加する。しかし、フェルラ酸を添加することによってタウ蛋白質のリン酸化が抑制されることが確認された。
すなわちフェルラ酸は、タウ蛋白質のリン酸化抑制剤として作用している。
【００２１】
試験例２：オカダ酸誘発神経細胞死抑制作用
フォスファターゼ阻害であるオカダ酸（ＯＡ）によるフォスファターゼ阻害により誘導される細胞死に対するフェルラ酸（ＦＡ）の抑制効果を以下の方法により試験した。
（１）試験方法
ヒト由来神経芽細胞腫から誘導されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００  μｌずつ播種後、３７℃、５％  ＣＯ２下で１８時間培養した。全量培地除去後、１％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に置換し、各濃度になるようにフェルラ酸（５０、１５０、５００  μＭ）、オカダ酸（１５、２０、２５  ｎＭ）を添加し、２４時間培養した。培養上清１００  μｌを回収し、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い添付の説明書に従い、培養上清中のＬＤＨ量をＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０を用いて測定した。
【００２２】
（２）結果
測定結果を図２に示す。培養上清中のＬＤＨは、神経細胞死に伴って増加する。図２に示すようにオカダ酸添加により、フォスファターゼが阻害され、神経細胞死が誘導される。フェルラ酸は、この神経細胞死に対して濃度依存的に抑制することが確認された。
【００２３】
試験例３：内在性リン酸化タウ蛋白質抑制試験
ラット初代神経細胞における内在性のリン酸化タウ蛋白質に対するフェルラ酸の作用を試験した。
（１）試験方法
試験例１と同様の方法によりラット初代神経細胞を調製した。
この神経細胞を、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、ポリ−Ｌ−リジンコートの４８ウエルプレートに３５０μｌずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２下で７日間培養した。
次いで、フェルラ酸をウエルあたり１５０、５００μＭになるように添加し、３日間培養した後、ＲＩＰＡ溶液で細胞抽出液を回収し、電気泳動用サンプルを調製した。
１レーンあたり１．２μｇのサンプルをＭｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｇｅｌｓ（４−２０％：１５レーン、Ｂｉｏ−ｒａｄ）にロードし、電気泳動を行った後、トランスブロットＴｕｒｂｏミディＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて２．５  Ａ、２５  Ｖ、７分の条件で転写反応を行った。転写させたメンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ）に浸し、室温で１時間振盪させながらブロッキングした後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで１／２０００倍に希釈した抗ＰＨＦ−Ｔａｕモノクローナル抗体、または１／５０００倍に希釈した抗リン酸化タウ（ｐＳ３９６）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浸し室温で１時間振盪させながら反応させた。ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄後、１０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  -ＴＢＳ溶液で１／１００００倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇＧ抗体、または１／５００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体に浸し、室温で振盪させながら１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分反応させ発光量をＬＡＳ−４０００（富士フィルム）を用いて測定した。測定したメンブレンは、リプローブ溶液（２％  ＳＤＳ、６２．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ６．７）、１００  ｍＭ  ３−メルカプト−１，２−プロパンジオール）で５０℃、３０分反応後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した。その後、上記記載と同様な方法でＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅでブロッキング後、抗タウラビットポリクローナル抗体（１／３０００希釈、Ａｂ３：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＲＰ抗ラビットＩｇＧ抗体（１／１００００希釈：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で反応後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分反応させ発光量をＬＡＳ−４０００（富士フィルム）を用いて測定した。得られたウエスタンブロッティングの発光強度をＭｕｌｔｉ  Ｇａｎｇｅソフトを使用して測定し、各リン酸化タウ蛋白質の発光強度を総タウ蛋白質の発光強度で補正した。
なお抗ＰＨＦ−Ｔａｕモノクローナル抗体は、タウ蛋白質の２０２番目のセリンと２０５番目のスレオニンがリン酸化された蛋白質を認識し、抗リン酸化タウ（ｐＳ３９６）抗体は３９６番目のセリンがリン酸化された蛋白質を認識する特異抗体である。また図３にｐＳ２０２／Ｔ２０５、図４にはｐＳ３９６と表記している。
【００２４】
（２）結果
抗ＰＨＦ−Ｔａｕモノクローナル抗体による測定結果を図３に、抗リン酸化タウ（ｐＳ３９６）抗体による測定結果を図４に示す。図３、図４からフェルラ酸は、内在性リン酸化タウ蛋白質を抑制するが、その作用はタウ蛋白質の２０２番目のセリン、２０５番目のスレオニンのリン酸化を抑制するが、一方３９６番目のセリンのリン酸化は抑制しないことが確認された。
【００２５】
試験例４：ＰＰ２Ａに及ぼす効果
タウ蛋白質の異常リン酸化を抑制することが明らかとなっているフォスファターゼＰＰ２Ａに及ぼすフェルラ酸の効果を確認した。
（１）試験方法
試験例１と同様の方法によりラット初代神経細胞を調製した。
この神経細胞を、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、ポリ−Ｌ−リジンコートの２４ウエルプレートに1.5ｍｌずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２下で７日間培養した。
次いで、フェルラ酸をウエルあたり５００μＭになるように添加し、３日間培養した後、プロテアーゼ阻害剤を含むイミダゾール溶液（20mＭ  imidazole-HCl, 2mM EDTA,  2mM EGTA  pH7.0）で細胞抽出液を回収し、PP2A Immunoprecipitation phosphatase Assay kit（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い添付の説明書に従いＰＰ２Ａ活性を測定した。またフェルラ酸無添加のウエルについても同様に測定した。
【００２６】
（２）結果
図５に測定結果を示す。フェルラ酸はＰＰ２Ａの活性を促進することが確認された。
【００２７】
以上の試験１〜４の結果から、フェルラ酸はＰＰ２Ａを活性化させ、タウ蛋白質のリン酸化を抑制していることが明らかとなった。また異常リン酸化を抑制し、ＰＰ２Ａ活性阻害による細胞死を抑制することができることが確認された。したがってフェルラ酸は、タウ蛋白質によるタウオパチーの進行を抑制できる。
【図１】
2017043563.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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