(57)【要約】【課題】簡便且つ高い確度で志賀毒素２ｅを検出し、豚の浮腫病を診断できる新たな技術を提供することを課題とする。【解決手段】志賀毒素２ｅに対する第１モノクローナル抗体、志賀毒素２ｅに対する第２モノクローナル抗体、及び膜担体を備え、前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体の片方又は両方が志賀毒素２ｅ特異抗体であり、前記第１モノクローナル抗体が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、前記第２モノクローナル抗体は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に担持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイスが提供される。【選択図】図１
2017044584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
志賀毒素２ｅに対する第１モノクローナル抗体、志賀毒素２ｅに対する第２モノクローナル抗体、及び膜担体を備え、
前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体の片方又は両方が志賀毒素２ｅ特異抗体であり、
前記第１モノクローナル抗体が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２モノクローナル抗体は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に担持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項２】
前記志賀毒素２ｅ特異抗体は志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する、請求項１に記載の試験デバイス。
【請求項３】
前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体の片方は志賀毒素２ｅのAサブユニットを認識する抗体であり、他方は志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する抗体である、請求項１に記載の試験デバイス。
【請求項４】
前記標識物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の試験デバイス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の試験デバイスを用いて、検体中の志賀毒素２ｅを検出することを特徴とする、豚浮腫病の診断方法。
【請求項６】
志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する、志賀毒素２ｅ特異モノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項６に記載のモノクローナル抗体を含む、志賀毒素２ｅ検出試薬。
【請求項８】
イムノクロマトグラフィー用である、請求項７に記載の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は豚浮腫病の診断に関する。詳細には、豚浮腫病の診断に有効な試験デバイス、診断方法、試薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
離乳豚における浮腫病（Edema disease:ED）は志賀毒素産生大腸菌（STEC）により引き起こされる。EDの典型的な症状は眼瞼に著明に認められる種々の臓器の浮腫の他、痙攣、麻痺、運動失調といった神経症状であり、それらの症状を呈さずに突然死するケースも報告されている(非特許文献１〜３)。EDの発生は散発的であり、発症率は感染豚の約16%程度であるが、発症した場合の致死率は高く、約64%と報告されている(非特許文献１、３)。
【０００３】
EDの主要な病原因子は志賀毒素２ｅ(以下、「Stx2e」とする。尚、Stxがベロ毒素(Vero toxin)とも呼ばれることから、「VT2e」と略称されることもある。)である。志賀毒素(Stx)は酵素活性を担う1分子のAサブユニットと糖脂質レセプター結合に関与する5分子のBサブユニット(非特許文献４〜６)で構成された複合体であり、血清学的に交差しないStx1とStx2、またそれぞれにアミノ酸配列や細胞への感受性の異なるいくつかのバリアント(Stx1a、Stx1c、Stx1d、Stx2a、Stx2b、Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f及びStx2g)が存在する。これらの中で、ある種のStx2はヒトのSTEC感染症における溶血性尿毒症症候群（HUS）の主要な原因因子と考えられている一方で、Stx2e産生株は唯一、仔豚に浮腫病を引き起こす。
【０００４】
ED発症豚から分離される大腸菌株の殆どがO138,O139,O141のO抗原を持つ株であり(非特許文献１〜３、７〜９)、それらの殆どがStx2e遺伝子(stx2e)及びF18線毛遺伝子(fedA)を保有している(非特許文献７、１０)ことから、糞便培養物を用いたPCRによるこれらの遺伝子の検出が最も迅速であり、現在、EDの診断で広く行われている。一方で、PCRによる診断は、不完全遺伝子などの理由で毒素の発現能がないStx遺伝子保有菌株を偽陽性として判定する可能性、標的菌の数が少ない場合や便培養中にPCRの阻害物質がある場合には偽陰性の判定をしてしまう可能性が考えられる(非特許文献１１〜１３)。ベロ細胞を用いた細胞傷害試験は菌の培養上清中のStx2e蛋白を検出するのに有効であるが、判定には数日を要し、また操作も煩雑であることから、簡便にStx2e蛋白を検出する診断キットが必要である。現在、逆受身ラテックス凝集反応（RPLA）、酵素抗体法（EIA）、イムノクロマトグラフィー（IC）を原理としたいくつかのキットが、ヒトの糞便培養または食品由来の分離菌から産生されるStx1とStx2の検出に用いられているが、現在の市販品はEDの診断に使われることを想定したものではなく、Stx2eに対しては感度が高くない（非特許文献１１、１３〜２０)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−２４０３５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Moxley RA. 2000. Edema disease. Vet Clin North Am Food Anim Pract 16:175-185.
【非特許文献２】Imberechts H, De Greve H, Lintermans P. 1992. The pathogenesis of edema disease in pigs. A review. Vet Microbiol 31:221-233.
【非特許文献３】Bertschinger HU, Gyles CL. 1994. Oedema Disease of Pigs, p 193. In Gyles CL (ed), Escherichia coli in Domestic Animals and Hunans. CAB International, Wallingford.
【非特許文献４】DeGrandis S, Law H, Brunton J, Gyles C, Lingwood CA. 1989. Globotetraosylceramide is recognized by the pig edema disease toxin. J Biol Chem 264:12520-12525.
【非特許文献５】Keusch GT, Jacewicz M, Acheson DW, Donohue-Rolfe A, Kane AV, McCluer RH. 1995. Globotriaosylceramide, Gb3, is an alternative functional receptor for Shiga-like toxin 2e. Infect Immun 63:1138-1141.
【非特許文献６】Lingwood CA, Law H, Richardson S, Petric M, Brunton JL, De Grandis S, Karmali M. 1987. Glycolipid binding of purified and recombinant Escherichia coli produced verotoxin in vitro. J Biol Chem 262:8834-8839.
【非特許文献７】Imberechts H, De Greve H, Schlicker C, Bouchet H, Pohl P, Charlier G, Bertschinger H, Wild P, Vandekerckhove J, Van Damme J, Van Montagu M, Lintermans P. 1992. Characterization of F107 fimbriae of Escherichia coli 107/86, which causes edema disease in pigs, and nucleotide sequence of the F107 major fimbrial subunit gene, fedA. Infect Immun 60:1963-1971.
【非特許文献８】Linggood MA, Thompson JM. 1987. Verotoxin production among porcine strains of Escherichia coli and its association with oedema disease. J Med Microbiol 25:359-362.
【非特許文献９】Uemura R, Sueyoshi M, Nagayoshi M, Nagatomo H. 2003. Antimicrobial susceptibilities of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from pigs with edema disease in Japan. Microbiol Immunol 47:57-61.
【非特許文献１０】Aarestrup FM, Jorsal SE, Ahrens P, Jensen NE, Meyling A. 1997. Molecular characterization of Escherichia coli strains isolated from pigs with edema disease. J Clin Microbiol 35:20-24.
【非特許文献１１】Bettelheim KA, Beutin L. 2003. Rapid laboratory identification and characterization of verocytotoxigenic (Shiga toxin producing) Escherichia coli (VTEC/STEC). J Appl Microbiol 95:205-217.
【非特許文献１２】Zhang W, Bielaszewska M, Friedrich AW, Kuczius T, Karch H. 2005. Transcriptional analysis of genes encoding Shiga toxin 2 and its variants in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 71:558-561.
【非特許文献１３】Friedrich AW, Bielaszewska M, Zhang WL, Pulz M, Kuczius T, Ammon A, Karch H. 2002. Escherichia coli harboring Shiga toxin 2 gene variants: frequency and association with clinical symptoms. J Infect Dis 185:74-84.
【非特許文献１４】Feng PC, Jinneman K, Scheutz F, Monday SR. 2011. Specificity of PCR and serological assays in the detection of Escherichia coli Shiga toxin subtypes. Appl Environ Microbiol 77:6699-6702.
【非特許文献１５】Park CH, Kim HJ, Hixon DL, Bubert A. 2003. Evaluation of the Duopath Verotoxin Test for Detection of Shiga Toxins in Cultures of Human Stools. J Clin Microbiol 41:2650-2653.
【非特許文献１６】Karmali MA, Petric M, Bielaszewska M. 1999. Evaluation of a microplate latex agglutination method (Verotox-F assay) for detecting and characterizing verotoxins (Shiga toxins) in Escherichia coli. J Clin Microbiol 37:396-399.
【非特許文献１７】Beutin L, Zimm ermann S, Gleier K. 1996. Rapid detection and isolation of shiga-like toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli by direct testing of individual enterohemolytic colonies from washed sheep blood agar plates in the VTEC-RPLA assay. J Clin Microbiol 34:2812-2814.
【非特許文献１８】Beutin L, Zimmermann S, Gleier K. 2002. Evaluation of the VTEC-Screen "Seiken" test for detection of different types of Shiga toxin (verotoxin)-producing Escherichia coli (STEC) in human stool samples. Diagn Microbiol Infect Dis 42:1-8.
【非特許文献１９】Beutin L, Steinruck H, Krause G, Steege K, Haby S, Hultsch G, Appel B. 2007. Comparative evaluation of the Ridascreen Verotoxin enzyme immunoassay for detection of Shiga-toxin producing strains of Escherichia coli (STEC) from food and other sources. J Appl Microbiol 102:630-639.
【非特許文献２０】Willford J, Mills K. Goodridge LD. 2009. Evaluation of three commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kits for detection of Shiga toxin. J Food Prot 72:741-747
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、特異的にStx2eを検出し、迅速且つ簡便に豚のEDを診断できる新たな技術の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題の下、豚のED診断キットの開発を目指した。まず、3種類の原理（RPLA、EIA、IC）のうち、その迅速性と簡便性を重視し、IC法を選択した。豚のEDに特化したIC法の実現のため、Stx2e特異的なモノクローナル抗体(mAb)の取得を試みた。試行錯誤の末、Stx2eトキソイド免疫マウスから、Stx2eに反応する複数のモノクローナル抗体（mAb）クローンを分離することに成功した。これらのクローンの一部はStx2eに特徴的なBサブユニットを認識するものであった。続いて、取得に成功した抗体クローンを利用してイムノクロマトグラフィーテスト用のテストストリップを作製し、その特性を調べた。その結果、他のバリアントには反応せず、Stx2eを特異的に検出できることが明らかとなった。また、豚の臨床分離株の培養上清を用いてその性能を評価したところ、Stx2eの特異的検出に成功した。即ち、豚のEDを迅速且つ簡便に診断できる方法及びそのためのデバイスを実現できた。ところで、豚からもStx2eとは異なるタイプのStx2遺伝子を保有する株が検出されている（参考文献２９、３０）。即ち、豚が他のタイプのStx2産生株を保菌している事例が存在する。実現に成功した方法はStx2eを特異的に検出できることから、このような事例にも対応可能である（偽陽性の判定をすることがない）。この点において本発明の方法の有用性ないし利用価値は、他のタイプのStx2も認識する抗体を用いているが故に偽陽性と判定する可能性がある従来の方法とは比較にならない。
以下の発明は上記の成果に基づく。
［１］志賀毒素２ｅに対する第１モノクローナル抗体、志賀毒素２ｅに対する第２モノクローナル抗体、及び膜担体を備え、
前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体の片方又は両方が志賀毒素２ｅ特異抗体であり、
前記第１モノクローナル抗体が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２モノクローナル抗体は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に担持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［２］前記志賀毒素２ｅ特異抗体は志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する、［１］に記載の試験デバイス。
［３］前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体の片方は志賀毒素２ｅのAサブユニットを認識する抗体であり、他方は志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する抗体である、［１］に記載の試験デバイス。
［４］前記標識物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の試験デバイス。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の試験デバイスを用いて、検体中の志賀毒素２ｅを検出することを特徴とする、豚浮腫病の診断方法。
［６］志賀毒素２ｅのBサブユニットを認識する、志賀毒素２ｅ特異モノクローナル抗体。
［７］［６］に記載のモノクローナル抗体を含む、志賀毒素２ｅ検出試薬。
［８］イムノクロマトグラフィー用である、［７］に記載の検出試薬。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】イムノクロマトグラフィーテストストリップの模式図。
【図２】取得に成功したStx2eに反応するマウスモノクローナル抗体の免疫学的特性。（Ａ）精製Stx2e（左）及びStx2a（右）に対するELISAによる各mAbの反応性。3回行った実験の平均値とSEMでデータを示した。（Ｂ）Stx2eを発現するリコンビナントE. coli MV1184株の細胞抽出液5μlに対する各mAb（1μg/ml）のウェスタンブロット解析。各レーンはブロッキングの後で切り離し、バンド検出時に再度並べて表示している。（Ｃ）ウェスタンブロット解析でStx2eに反応しなかった3種類のmAbクローンの、キメラ毒素（Stx2eA2B及びStx2A2eB。図中では「2eA2B」及び「2A2eB」と表記）を発現するリコンビナントE. coli MV1184株の細胞抽出液150μlに対する免疫沈降反応。「HC」と「LC」は各mAbの重鎖と軽鎖を示す。5μgの精製Stx2eを右端に泳動した。全ての実験においてクローン134（Hisタグ特異mAb）を陰性対照の抗体として用いた。
【図３】実験に使用した抗体の特性。Stx2eとStx2a間に交差性のある抗体名を網掛けで表示した。
【図４】（Ａ）テストストリップの特異性。Stx2e、Stx2a、Stx2c及びStx2d発現プラスミド(pBSK-Stx2e、pBSK-Stx2、pBSK-Stx2c及びpBSK-Stx2d)で形質転換した大腸菌の培養液をポリミキシンB処理後に遠心して得た上清150μlをテストストリップに展開した。テストストリップは毒素特異抗体（クローン55D1；1mg/ml）をテストライン（T）として、抗マウスIgGヤギ抗体（1mg/ml）をコントロールライン（C）としてメンブラン上にそれぞれ画線し、金コロイド標識mAbクローン45B2（Stx2eとStx2aに同等に交差反応する）を含ませて乾燥させたコンジュゲートパッドを貼付したものを用いた。（Ｂ）ウェスタンブロットによるAサブユニット特異mAbクローン45B2（1μg/ml）の各Stx2を発現するリコンビナントE. coli MV1184株の細胞抽出液5μlに対する反応性。（Ｃ）免疫沈降反応によるBサブユニット特異mAbクローン（47E10、55D1、65B2）の各Stx2を発現するリコンビナントE. coli MV1184株の細胞抽出液150μlに対する反応性。「134」は陰性対照のHisタグ特異mAbの結果である。
【図５】Stx2e特異mAb（クローン55D1）をテストラインに使ったイムノクロマトグラフィーテストストリップによるStx2eの検出。毒素特異抗体（クローン55D1；1mg/ml）をテストライン（T）として、抗マウスIgGヤギ抗体（1mg/ml）をコントロールライン（C）としてメンブラン上にそれぞれ画線した。金コロイド標識mAbクローン45B2（Stx2eとStx2aに同等に交差反応する）を含ませて乾燥させたコンジュゲートパッドを貼付したテストストリップに、150μlの各精製毒素又は菌体培養上清を展開した。「stx2e(+)」と「stx2e(-)」は、Stx2e遺伝子の有無をPCRで調べた豚由来臨床株の培養上清を示す。全ての試料は矢印の方向に流れる。
【図６】豚から分離された大腸菌株におけるStx2eの検出。毒素遺伝子の保有プロファイルが調べられている豚由来臨床株とテストストリップの反応性を調べた。stx2e：Stx2e遺伝子、lt：易熱性下痢毒素（LT）遺伝子、st：耐熱性下痢毒素（STaまたはSTb）遺伝子。「陰性」はこの表で示される毒素遺伝子がいずれも検出されなかった株を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第１の局面は、Stx2eの特異的な検出を可能にし、豚の浮腫病（ED）の診断に利用される試験デバイスを提供する。Stx2eはStx2バリアントの一つであり、他のバリアントと同様に1分子のAサブユニットと5分子のBサブユニットで構成される。プロトタイプのStx2（Stx2a）とのアミノ酸の相同性は、Aサブユニットが94%、Bサブユニットが84%である。Stx2eのAサブユニット（成熟体）及びBサブユニット（成熟体）のアミノ酸配列を配列表の配列番号１（Aサブユニット）及び配列番号２（Bサブユニット）に示す。
【００１１】
本発明の試験デバイスはイムノクロマトグラフィーの原理を利用するものであり、Stx2eに対する第１モノクローナル抗体、Stx2eに対する第２モノクローナル抗体、及び膜担体を備える。そして、第１モノクローナル抗体が膜担体に固定化されて検出部を構成する。一方、第２モノクローナル抗体は標識物質で標識されており、検出部から離れた位置に担持されている。
【００１２】
本発明の試験デバイスでは、第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体の片方又は両方が志賀毒素２ｅ（Stx2e）特異抗体である。本発明の試験デバイスは、この特徴によってStx2eの特異的検出を可能にし、信頼性の高い診断結果をもたらす。「志賀毒素２ｅ（Stx2e）特異抗体」はStx2eに対して高い特異性を示すものであり、例えば、他のサブタイプであるStx2a、Stx2c及びStx2dを認識しない。
【００１３】
本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されることを意味する。「担持」とは、担体の中又は表面を移動可能に配置されることを意味する。以下、図１（具体例であるテストストリップ）を参照しながら、試験デバイスの構成を説明する。第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体はいずれも抗Stx2e抗体である。第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体が、Stx2eタンパク質に対して特異性の異なる抗体であることが好ましい。例えば、第１モノクローナル抗体としてStx2eのBサブユニットを認識する抗体を採用し、第２モノクローナル抗体としてStx2eのAサブユニットを認識する抗体を採用する。或いは、第１モノクローナル抗体としてStx2eのAサブユニットを認識する抗体を採用し、第２モノクローナル抗体としてStx2eのBサブユニットを認識する抗体を採用する。Stx2eと他の３種のバリアント（Stx2a、Stx2c、Stx2d）の間ではBサブユニットの相同性が低い。この事実は、Stx2eのBサブユニットを認識するモノクローナル抗体は特異性が高いことを裏づけるとともに、それを利用すればStx2eとStx2a、Stx2c又はStx2dの識別が可能になることを意味する。この例のように、Stx2eのBサブユニットを認識するStx2e特異抗体を用いると、高い特異性でStx2eを検出可能となる。後述の実施例に示す通り、本発明者らは、独自の実験戦略によってStx2eのBサブユニットを認識するモノクローナル抗体の取得に成功した。Stx2eのBサブユニットを認識する抗体の具体例は、後述の実施例に示したクローン47E10、55D1、65B2である。他方、Stx2eのAサブユニットを認識する抗体の具体例は、同43F11、45B2、49B1、51A2、53C11、69G10である。
【００１４】
本発明の試験デバイスを構成する抗体（第１モノクローナル抗体及び第２モノクローナル抗体）は、本明細書の教示（特に実施例の記載）を参考にすれば、常法に従って作製したハイブリドーマから得ることができる。まず、抗原を用意する。例えば、Aサブユニットに２箇所の弱毒変異（E167Q＋R170L）を導入した遺伝子組換え弱毒変異毒素（mStx2e）を用意する。mStx2eは、それをコードする遺伝子を導入したプラスミドで形質転換した大腸菌等を利用して大量生産することができる。mStx2eをコードする遺伝子の配列を配列表の配列番号３に示す。
【００１５】
必要に応じて適切なアジュバントとmStx2eを混合した後、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得る。細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるポリエチレングリコール（PEG）法などにより行うことができる。細胞融合後、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）などの選択培地でハイブリドーマを選別し、Stx2eを認識する抗体を産生するハイブリドーマの能力について、精製毒素を用いたELISA法でスクリーニングする。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
【００１６】
第１モノクローナル抗体は捕捉抗体であり、担体に固定されて検出部を構成する。「検出部」とは、抗原抗体反応によって形成される、検体中の抗原と第２モノクローナル抗体の複合体を捕捉し、抗原の存在を検出する部位をいう。
【００１７】
担体には、静電作用や疎水相互作用等の物理的作用によりタンパク質を結合でき、且つ検体中の成分、抗原−第２モノクローナル抗体複合体などを展開できる材質のものが用いられる。膜担体の材質としてニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、セルロースアセテートを挙げることができる。好ましくは、担体は膜状（膜担体）である。検出部に加え、検体が適切に展開されたか否かを確認するための対照部を担体が備えることが好ましい。対照部には、第２モノクローナル抗体に結合可能な物質が固定されている。好ましくは、検出部と対照部は、担体上に、展開方向を横断する方向で線状に設置される（それぞれ「テストライン」および「コントロールライン」とも称される）。担体上の検出部及び対照部の位置関係は限定されないが、通常は、検出部よりも下流側に対照部が形成される。
【００１８】
捕捉抗体、及び第２モノクローナル抗体に結合可能な物質の固定方法は、担体の種類に応じて、常法に従って行うことができる。例えば、適切に希釈した抗体溶液を、市販の抗体塗布機を用いて塗布し、乾燥することで固定することができる。検出部位に固定される捕捉抗体の量は、例えば0.05〜10μgであり、好ましくは0.1〜3μgであり、更に好ましくは0.5〜1.0μgである。
【００１９】
第２モノクローナル抗体は、標識物質で標識された抗体、即ち「標識抗体」であり、検出部位とは離れた位置において膜などの担体に担持されている。典型的には、標識抗体を担持する担体は、捕捉抗体を固定化する担体とは別の部材である。第２モノクローナル抗体（標識抗体）を担持している標識抗体担持部材は、検出部よりも上流側に配置される。標識抗体担持部材は、乾燥状態で標識抗体を担持し、液体で浸潤すると標識抗体を放出する。標識抗体担持部材の材質としては、グラスファイバー、セルロースファイバー、プラスチックファイバーなどが挙げられる。標識抗体を含む適切な緩衝液に標識抗体担持部材を含浸させるか、または標識抗体を含む適切な緩衝液を標識抗体担持部材に添加して乾燥することにより、標識抗体担持部材に標識抗体を担持させることができる。標識抗体担持部材に担持させる標識抗体の量は、例えば0.01〜5μgであり、好ましくは0.1〜3μg、更に好ましくは0.3〜1.0μgである。
【００２０】
第２モノクローナル抗体の標識化は常法で行えばよい。標識化に利用する標識物質としては不溶性粒状物質が望ましい。不溶性粒状物質としては、ラテックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの合成高分子を色素分子で標識して得られる着色合成高分子粒子、金属コロイド粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、これらの混合物（例えば、金と白金の混合物、金と銀の混合物、パラジウムと白金の混合物）のコロイド粒子）、赤血球などが挙げられる。変化を目視で簡便かつ迅速に観察できる粒子が好ましく、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子を採用するとよい。粒子の粒径は、例えば15〜100nm、好ましくは30〜80nmである。金属コロイド粒子は市販品を用いても良いし、常法により調製しても良い。金属コロイド粒子の中でも、利用し易い等の理由から、金コロイド粒子が好ましい。
【００２１】
金属コロイド粒子の場合を例として標識化の方法を（一例）説明すると、1,000μlの抗Stx2eモノクローナル抗体溶液（100μg/mlになるように10mM Tris-HCl(pH9.2)で希釈）と、1,000μlの金コロイド溶液（例えばOD=12の原液500μlと10mM Tris-HCl(pH9.2)を500μl混合）を混合し、十分に攪拌した後に静置（10分〜20分）する。次いでポリエチレングリコールを含むBSA溶液を2,000μl加え、十分に攪拌した後に静置（10分〜20分）する。続いて、13,000rpmで15分間遠心処理し、上清を除去する。得られた沈殿（金属コロイド粒子で標識された抗Stx2eモノクローナル抗体）を回収する。このようにして得られた「金属コロイド粒子で標識された抗Stx2eモノクローナル抗体」は使用時まで保存液（例えば5%D-トレハロースと1%BSAを含むTris-HCl(pH7.0)）中で保存しておくことができる。尚、ブロッキング操作（BSA溶液の添加と遠心処理）は繰り返し行ってもよい（例えば合計２回）。
【００２２】
検体添加部材は、標識抗体担持部材の上流側に配置され、好ましくは、検体添加部材中の少なくとも下流側領域の下面が、標識抗体担持部材中の上流側の領域の上面と接触している。標識抗体担持部材の一部が、検体添加部材の下面と担体の上流側の領域の上面との間に挟み込まれていることが好ましい。好ましくは、担体の下流に配置される吸収部材が備えられる。吸収部材は、その上流側領域の下面が、担体の検出部よりも下流側に存在する領域の上面と接触するよう配置される。
【００２３】
本発明の試験デバイスでは、必要に応じて前処理した検体を検体添加部材に滴下すると、標識抗体担持部材に浸潤し、検体と標識抗体との混合物が担体（典型的には膜担体）に移動し、担体中にて検出部位に向けて展開する。検体にStx2eタンパク質（抗原）が含まれる場合（典型的には、EDに罹患した豚の検体の場合）、当該抗原と標識抗体とが免疫複合体を形成する。そして、検出部において抗原抗体反応によって、当該複合体が捕捉抗体に捕捉され、集積して発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の抗原の有無を判定することが可能となる。担体が対照部を備える場合には、検体中の抗原と複合体を形成せずに残留する標識抗体が検出部を素通りし、下流の対照部に固定された、標識抗体に結合可能な物質に捕捉され、集積して発色することになる。
【００２４】
本発明の試験デバイスに供する検体の例は、検査対象の豚から採取された糞便や直腸スワブの懸濁液やその上清、糞便や直腸スワブの培養液、そこから分離し、培養した菌体（TSB培地、CAYE培地、BHI培地等の培地で培養することができる。培養後、例えばポリミキシンBで処理して、菌体から毒素を溶出させるとよい）の培養上清、菌体破砕物、全血、血清、血漿である。検体は必要に応じて前処理に供される。検体の前処理として、検体を前処理試薬に溶解し、試験デバイスに滴下するための液体を調製することが挙げられる。このような前処理は、例えば、検体を展開可能にするため、或いは検体の良好な展開を可能にするために行われる。前処理試薬には各種緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などを用いることができる。非特異的結合反応を低下させる目的で前処理試薬に界面活性剤を含有させても良い。界面活性剤としてはTriton X-100(商品名、ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Tween80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）、CHAPS（3-[(3- コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルフォン酸）、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）などを用いることができる。２種類以上の界面活性剤を併用してもよい。
【００２５】
本発明の試験デバイスによる検出結果は、豚の浮腫病の診断に利用可能である。即ち、本発明の試験デバイスを用いた検出によって、豚の浮腫病を診断することができる。典型的には、検出部が呈色し、検体（糞便や直腸スワブの懸濁液、その上清、糞便や直腸スワブの培養液、糞便や直腸スワブから分離し、培養した菌体の培養上清、菌体破砕物、全血、血清、血漿等）の中に抗原が存在することが示された場合（陽性の場合）、豚浮腫病に罹患していると判定する。
【００２６】
ところで、本発明の試験デバイスの構成要素として使用されるモノクローナル抗体の中で、Stx2eのBサブユニットを認識するモノクローナル抗体は特異性の極めて高い抗体であり、それ自体が有用である。例えば、上記のようにイムノクロマトグラフィー用の抗体としての利用のみならず、他の免疫学的方法（例えば、ELISA法）への適用も期待される。即ち、Stx2eのBサブユニットを認識するモノクローナル抗体は、Stx2e検出用試薬の有効成分として各種検出方法に利用され得る。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
イムノクロマトグラフィーによる豚浮腫病の迅速且つ簡便な検査法の開発を目指し、以下の検討を行った。
１．材料と方法
（１）菌と毒素
Stx2e及びStx2a、並びにそれぞれの変異毒素（両者のキメラ毒素を含む）はそれぞれの発現プラスミドで形質転換したE. coli MV1184 (Takara Bio)で発現させた（参考文献２３）。Stx2e(野生型及び変異毒素)と、後述するBサブユニットにD17N変異を導入した変異Stx2は形質転換体の細胞抽出液を材料にしてImmobilized D-Galactose Gel (Thermo Fisher Scientific)でアフィニティ精製した（参考文献２３）。Stx2aはStx2（Aサブユニット）特異mAb（Clone 70F5）（参考文献２２）を固定化させたAffi-Gel Hz Hydrazide Gel (Bio-Rad, Hercules, CA)を使ってアフィニティ精製した。豚由来の大腸菌株は共立製薬株式会社（東京）から分与されたものを用いた。
【００２８】
Stx2a発現プラスミド(pBSK-Stx2)を元にして、Bサブユニットに2か所の変異（D16N+D24A）を導入し、Stx2cに相当する変異Stx2を発現するプラスミド(pBSK-Stx2c)を作製した。さらに、pBSK-Stx2cを元にして、Aサブユニットの3か所の変異(S19T+F291S+K297E)を導入し、Stx2dに相当する変異Stx2を発現するプラスミド(pBSK-Stx2d)を作製した。各変異Stx2プラスミドでE. coli MV1184を形質転換した。
【００２９】
（２）モノクローナル抗体（mAb）の作製
Stx2e特異mAb産生クローン及びStx2a特異mAb産生クローンは既報（参考文献２２）に準じて分離した。Stx2eの場合はAサブユニットに2か所の弱毒変異(E167Q+R170L)を導入した遺伝子組換え弱毒変異毒素（mStx2e）、Stx2aの場合はさらにBサブユニットにもD17N変異を導入した遺伝子組み換え弱毒変異毒素(mStx2)（参考文献２２、２３）を免疫原として用いた。5匹の雌のBALB/cマウス(6週齢; 日本SLC、静岡)に対し、10μgのmStx2e又はmStx2と、粘膜アジュバントとして同量の毒素原性大腸菌の易熱性下痢毒素変異体（参考文献２４）を混合したもの（7.5〜15μl）を経鼻免疫した。摘出した脾細胞をミエローマ細胞株P3U1と融合させた後、Stx2e特異ハイブリドーマクローンとStx2a特異ハイブリドーマクローンを、各精製毒素を用いたELISAにより選別した。各ハイブリドーマを腹腔内接種したマウスの腹水から、Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare)を用いて各mAbを精製した。各mAbのアイソタイプはMouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit (AbD Serotec, Kidlington, UK)で決定した。全ての動物実験は藤田保健衛生大学の動物実験管理規定に則って実施し、全ての方法は本学のIACUCで承認された(承認番号M2371)。
【００３０】
（３）IC用の被検試料の調製
各形質転換大腸菌を0.25%のグルコースを含むCAYE培地にて37℃で一晩培養した。各培養液はポリミキシンB硫酸塩(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を最終濃度が0.5 mg/ml(約5,000 U/ml)になるよう添加し、37℃で30分間インキュベートした。各上清を遠心で回収後、使用するまで-20℃で保管した。
【００３１】
（４）各mAbの感度と特異性の解析
各mAbのStx2eとStx2aに対する感度と特異性は、それぞれ既報（参考文献２２）の方法に準じてELISAとウェスタンブロットで決定した。ELISAでは精製した毒素を、ウェスタンブロットでは各毒素を発現する形質転換菌の抽出液をそれぞれ用いた。ELISAとウェスタンブロットの2次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体(SouthernBiotech, Birmingham, AL)（ELISA用）と西洋ワサビぺルオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体(Bio-Rad)（ウェスタンブロット用）を用いた。ウェスタンブロットで特異性が決定出来なかったStx2e特異mAbクローンについては免疫沈降を行った。それぞれ10μgのmAbと0.75mgのDynabeads（登録商標）Protein G(Thermo Fisher Scientific)を10分間反応させた後、Stx2eとStx2aのキメラ毒素を含む形質転換菌の抽出液150μlと10分間反応させた。各反応に先立って、ビーズは1 mlのPBSで3回洗浄した。洗浄したビーズペレットに20μlのSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、5分間沸騰水浴中で加熱後、10μlの上清を15 %ポリアクリルアミドゲルで泳動し、泳動後のゲルをCoomassie brilliant blue R-250で染色した。全ての実験で6×histidine (His)タグ特異mAbクローン134 （参考文献２２）を陰性対照とした。
【００３２】
Aサブユニット特異mAbクローン45B2の各Stx2（Stx2a、Stx2c、Stx2d、Stx2e）に対する特異性を検証するために、各毒素を発現する形質転換菌の抽出液を用いたウェスタンブロットで調べた。一方、Bサブユニット特異mAbクローン（47E10、55D1、65B2）の各Stx2（Stx2a、Stx2c、Stx2d、Stx2e）に対する反応性は同試料を用いた免疫沈降で調べた。
【００３３】
（５）ICテストストリップの作製（図１）
ICテストストリップは既報（参考文献２５）の方法に一部準じて作製した。各1 mg/mlのStx2e又はStx2a特異mAbと抗マウスIgGヤギ抗体(MP Biomedicals, Solon, OH)をHi-Flow Plus 135 membrane card (Millipore, Bedford, MA)にそれぞれテストライン及びコントロールラインとして画線し、37℃で2時間乾燥させた。メンブランは0.5 %カゼインを含む50 mM ホウ酸(pH 8.5)で45分間室温にてブロッキングした後、0.5 %スクロースを含む50mM Tris-HCl(pH 7.5)に30分間浸した。室温で一晩乾燥後、吸収パッドとしてCellulose fiber sample pad (Millipore)を貼付し、使用まで4℃で保存した。抗体への金コロイド粒子(WRGH2; 株式会社ワインレッドケミカル, 東京)の結合はメーカーの説明書に従って実施した。金コロイド標識抗体は1%BSAを含むPBSで希釈後にGlass fiber conjugate pad (Millipore)上に37℃で一晩乾燥させた。乾燥させたコンジュゲートパッドと、サンプルパッドとしてCellulose fiber sample padsを貼付して完全なテストストリップとし（図１）、使用まで4℃で保管した。
【００３４】
（６）被検試料におけるStx2eの検出
上述の方法で作製した各150μlの被検試料を平底の96-well multi plate (Becton Dickinson, Lowell, MA)のウェルに入れ、上述のコンジュゲートパッドとサンプルパッドを貼付したテストストリップを漬けた。30分以内の試料の展開後、テストラインとコントロールライン上の赤い線の出現を確認した。
【００３５】
２．結果
（１）mStx2e免疫マウスから調製したマウスモノクローナル抗体のStx2eに対する感度と特異性
金コロイド標識抗体とメンブラン上の捕捉抗体として使う候補抗体を得るため、抗Stx2e mAbの作製を試みた。その結果、9種の特異mAbクローンを分離した(図２（Ａ）左)。これらの中で3つのクローン(45B2、47E10、55D1)がStx2eに対して感度良く反応する抗体であった。9種のmAbの内、ウェスタンブロットにおいて6種のmAbはAサブユニットに反応し、残り3種(47E10、55D1、65B2)はA、Bどちらのサブユニットにも反応しなかった(図２（Ｂ）)。クローン45B2（Aサブユニット特異的）のみがStx2aにもStx2eと同じレベルで交差反応した(図２（Ａ）右)。この結果を踏まえ、キメラ毒素Stx2A2eB(Stx2aのAサブユニットとStx2eのBサブユニットからなる)とStx2eA2B(Stx2eのAサブユニットと、Stx2aのBサブユニットからなる)（参考文献２３）を用いた免疫沈降で3つのmAbクローンの特異性を決定できると予測した。3つ全てのmAbはStx2A2eBと反応したが、Stx2eA2Bとは反応しなかった(図２（Ｃ）)ことから、クローン47E10、55D1、65B2はBサブユニット特異mAbであることが示唆された。尚、各mAbの特性とアイソタイプを図３に示す。
【００３６】
（２）イムノクロマトグラフィーテストストリップの特異性の検証
作製したmAbが細菌の培養上清中のStx2eを検出するICに使えるかどうかを評価するためにテストストリップを作製した。ELISAの結果(図２)でStx2eに対して高い感度を示したmAbクローンを候補として選んだ。Stx2eとStx2aの両方に感度良く反応するmAb 45B2を金コロイド標識抗体、そしてStx2eのみに特異的なmAb 55D1をメンブラン上の捕捉抗体として採用した。各Stx2バリアント発現プラスミド(pBSK-Stx2e、pBSK-Stx2、pBSK-Stx2c、pBSK-Stx2d)で形質転換した大腸菌から、上記の方法で培養上清を回収し、被検試料とした。被検試料各150μlをテストストリップに供した。図４（Ａ）に示すように、Stx2e発現菌の培養上清のみ、明瞭なテストラインが認められた。クローン45B2はAサブユニット特異mAbであり、全てのStx2（Stx2a、Stx2c、Stx2d及びStx2e）のAサブユニットに反応することがウェスタンブロットで確認された（図４（Ｂ））。また、ELISAの結果から予想した通り、Bサブユニット特異mAbであるクローン55D1はStx2eに結合する一方、他の3つのStx2(Stx2a、Stx2c、Stx2d）には結合しないことが確認された（図４（Ｃ））。Bサブユニット特異mAbであるクローン47E10及び65B2も同様の特性を示した（図４（Ｃ））。
【００３７】
（３）イムノクロマトグラフィーテストストリップによるStx2eの検出
作製したテストストリップがStx2eを特異的かつ感度よく検出できることを、精製毒素（Stx2e、Stx2a）を使って確認した。図５に示すように、mAbs 45B2と55D1の組合せは100 ng/mlで明瞭に、また10 ng/mlでも僅かにStx2eを検出したが、Stx2aに対しては1,000 ng/mlでさえ検出できなかった。次に、このテストストリップの感度が臨床株から産生されるStx2eを検出するのに十分かどうかを確認するために、各菌の培養上清をテストストリップに供した。図５に示すように、Stx2e遺伝子(stx2e)陽性株では明瞭なテストラインが確認できたが、stx2e陰性株ではテストラインは認められなかった。そこで、病原遺伝子の保有プロファイルが調べられている豚由来臨床株の全てに対し、作製したテストストリップでの検査を行った。図６に示すように、stx2e陽性3株全ての培養上清中にStx2eを10分以内で検出できた。一方で、易熱性下痢毒素及び耐熱性下痢毒素遺伝子(lt及びst)を保有する株も含めた全てのstx2e陰性株では検出できなかった。
【００３８】
３．考察
PCRをベースとした遺伝子の検出方法は広く使われているが、遺伝子の検出結果からstx2d陽性又はstx2e陽性と判断されたものの実際にはmRNAの発現が低いことによる非産生株であった例が報告されている（参考文献１２）。また血清学的な方法については、例えばRPLA法は結果を得るのに16時間以上を要するという欠点がある。ELISA法は便サンプルからでも毒素を検出できる利点がある一方で、被検試料の数が少ない場合にはコスト高になる欠点がある（参考文献１１）。さらに、これらのキットによるstx2e陽性株におけるStx2e検出率は報告によって異なる（参考文献１２〜１４、１７〜１９、２６、２７）。このような結果の不一致（低い再現性）は、毒素低産生／非産生株の存在以外に、ポリクローナル抗体を用いるが故のロット差（即ち交差抗体の含有量の違いなど）、或いは、各バリアント毒素に対するmAbの交差反応性の違いに起因するのかもしれない。
【００３９】
Stx2eトキソイドを免疫したマウスから、6種のAサブユニット特異mAbクローンと3種のBサブユニット特異mAbクローンを分離することに成功した。これらのmAbクローンの内、クローン45B2だけがStx2aとも交差するクローンであり、残り8クローンはStx2eのみに反応するクローンであることを確認した。過去に作製したmAbクローンを含め、計21種のStx2a特異mAbクローンの内、9種がStx2eに交差することを見出した。興味深いことに、Bサブユニットに特異的な交差抗体クローンはなく、Aサブユニット特異的な交差抗体の中でさえ、両方の毒素に対して同じ感度を示したクローンの数は限られていた（データ示さず）。これらのデータは、1種類の毒素の免疫で作製したポリクローナル抗体を用いた数種類のバリアント毒素の検出方法の限界と、バリアント毒素に対して高度に交差反応するmAbの必要性を示唆している。
【００４０】
ELISAのデータ（図２）から期待されたように、金コロイド標識した45B2と膜上の捕捉抗体55D1の組合せはStx2eのみを検出した（図４）。この結果は、これらのmAbが豚の浮腫病の診断に有用であることを示す。
【００４１】
最近、複数のStxを検出可能なイムノクロマトグラフィーデバイスが報告された（参考文献２８）。Stx2bとStx2fに反応しないものの、Stx2eを含む他のStx2のみならず、Stx1にも交差反応するモノクローナル抗体を使った感度の高いキットであると言及されている。しかしながら、Stx2eとは異なるタイプのStx2の遺伝子（ヒトの疾患に関与するもの）保有株が健康な豚から単離されることがあることから（参考文献２９、３０）、複数のStx2バリアントを検出する上記報告のイムノクロマトグラフィーでは、豚のED診断に適用した際、偽陽性の問題が懸念される。
【００４２】
以上の通り、弱毒変異毒素（mStx2e）の免疫によって、Stx2e特異mAbを取得することに成功した。Stx2e特異mAbを用いて作製したテストストリップによれば、特異的且つ高感度で検体中のStx2eの検出が可能であった。この実験結果が裏づけるように、取得に成功したStx2e特異mAbを利用したイムノクロマトグラフィーは、豚のEDを迅速且つ簡便に診断することを可能にするものであり、その有用性は極めて高い。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
Stx2e特異mAbを用いた本発明のイムノクロマトグラフィー試験デバイスは、Stx2eの特異的な検出を可能にするものであり、豚のEDの診断に有用である。
【００４４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【００４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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