(57)【要約】【課題】付着性腫瘍細胞内に効率よく物質を輸送するためのリポソームを得る。【解決手段】長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにて修飾されたリポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにて修飾されたリポソーム。
【請求項２】
ペプチドのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
ペプチドの長さが１４〜数十アミノ酸である請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
ペプチドの長さが１４〜２４アミノ酸である請求項３記載のリポソーム
【請求項５】
ペプチドの長さが１６アミノ酸である請求項４記載のリポソーム。
【請求項６】
ペプチドでの修飾率が２０％以上である請求項１〜５のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項７】
長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、付着性腫瘍細胞の細胞膜に対して高い透過性を有するリポソームの製造方法。
【請求項８】
１４個〜数十個のヒスチジンからなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
１４〜２４個のヒスチジン残基からなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
１６個のヒスチジン残基からなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ペプチドの修飾率が２０％以上である、請求項７〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１２】
物質を細胞内に輸送する方法であって、下記工程：
輸送すべき物質を請求項１〜６のいずれかに記載のリポソームに封入し、次いで
輸送すべき物質が封入された上記リポソームを細胞に導入する
を含む方法。
【請求項１３】
細胞が付着性腫瘍細胞であり、物質が抗癌剤である請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達技術（Drug Delivery System: DDS）に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在ＤＤＳ分野において注目されている薬物輸送キャリアーの一つとしてリポソームが挙げられる。リポソームは、リン脂質二重層からなる数１００ｎｍの粒径をもつ微小なカプセルであり、その内部に様々な分子を封入することができる。さらに、生体適合性や生分解性にも優れていることから、理想的な薬物輸送キャリアーであると考えられ、リポソームを用いた多くのＤＤＳ研究が進められている（非特許文献１等参照）。
【０００３】
ＤＤＳ研究の一例として、抗癌剤を封入したリポソームを用いて癌治療を行う試みがなされている（非特許文献２等参照）。しかし、基本的にリポソームには細胞選択性がないというリポソームの欠点は克服されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】薬学雑誌  第１２８巻  第２号  １８５〜１８６ページ  （２００８）
【非特許文献２】N. Oku and Y. Namba, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 11, 231 (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような状況に鑑みると、特定の疾患を効率よく治療するためには特定の細胞に対して選択性のあるリポソームを用いることが必要である。とりわけ癌治療を効率的に行うためには腫瘍細胞に対する選択性のあるリポソームを用いる必要がある。したがって、本発明が解決しようとする課題は、腫瘍細胞に対して選択性のある高機能リポソームを得ることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ヒスチジン残基を多く含むペプチドにて表面を修飾したリポソームが腫瘍細胞に対して選択性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。したがって、本発明は以下のものを提供する。
【０００７】
（１）長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにて修飾されたリポソーム。
（２）ペプチドのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である（１）記載のリポソーム。
（３）ペプチドの長さが１４〜数十アミノ酸である（２）記載のリポソーム。
（４）ペプチドの長さが１４〜２４アミノ酸である（３）記載のリポソーム
（５）ペプチドの長さが１６アミノ酸である（４）記載のリポソーム。
（６）ペプチドでの修飾率が２０％以上である（１）〜（５）のいずれかに記載のリポソーム。
（７）長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、付着性腫瘍細胞の細胞膜に対して高い透過性を有するリポソームの製造方法。
（８）１４個〜数十個のヒスチジンからなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、（７）記載の製造方法。
（９）１４〜２４個のヒスチジン残基からなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、（８）記載の製造方法。
（１０）１６個のヒスチジン残基からなるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、（９）記載の製造方法。
（１１）ペプチドの修飾率が２０％以上である、（７）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）物質を細胞内に輸送する方法であって、下記工程：
輸送すべき物質を請求項１〜６のいずれかに記載のリポソームに封入し、次いで
輸送すべき物質が封入された上記リポソームを細胞に導入する
を含む方法。
（１３）細胞が付着性腫瘍細胞であり、物質が抗癌剤である（１２）記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、腫瘍細胞、とりわけ付着性腫瘍細胞に対する選択性の高い高機能リポソームが得られ、効率的な癌治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の修飾リポソーム表面のペプチド（Ｈ１６）修飾率と細胞膜透過性の関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の修飾リポソームの細胞選択性を調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の修飾リポソームの無血清培地および血清培地における細胞膜透過性を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、１の態様において、長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにて修飾されたリポソームを提供する。本発明の修飾リポソームは、腫瘍細胞の細胞膜、とりわけ付着性腫瘍細胞の細胞膜に対して高い透過性を示す。
【００１１】
本発明の修飾リポソームは、長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにてリポソームを修飾することによって得られる。
【００１２】
リポソームは脂質二重層によって包囲された数１００ｎｍ程度の粒径をもつ微少なカプセルであり、その内部に様々な物質を封入することができる。リポソームの製造方法としては、薄膜法，超音波処理法，有機溶媒注入法，界面活性剤除去法などが公知である。例えば超音波処理法の場合、リン脂質とコレステロールを水中に懸濁させ、懸濁液を超音波処理することによってリポソームを得ることができる。本発明に用いるリポソームの組成、サイズ等は特に限定されず、当業者はリポソームの組成や種類を適宜選択することができる。
【００１３】
リポソームへの物質の封入も公知方法にて行うことができる。本発明の修飾リポソーム中に封入される物質の種類は特に限定されない。脂溶性物質はリポソームの脂質二重層中に、水溶性物質は脂質二重層の内腔中に封入される。リポソーム中への脂溶性物質の封入方法も公知であり、多くの方法が用いられている。脂溶性物質をリポソーム中に封入する方法としては、例えば、目的物質をリン脂質やコレステロールと一緒に懸濁してリポソームを調製する方法がある。水溶性物質の封入法としては、ボルテックス法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、ｐＨ勾配法、イオン勾配法などの方法が知られている。また、脱水復水法は物質の性質によらず封入することができる。
【００１４】
本発明の修飾リポソームを修飾するペプチド（以下、「修飾用ペプチド」と称する）は、長さが数アミノ酸以上、好ましくは１４アミノ酸以上で、構成アミノ酸の半数以上がヒスチジンであるペプチドである。このようなペプチドにてリポソームを修飾して得られる本発明の修飾リポソームは、腫瘍細胞の細胞膜、とりわけ付着性腫瘍細胞の細胞膜に対して高い透過性を有する。
【００１５】
修飾用ペプチドの構成アミノ酸はヒスチジンが豊富であり、好ましくは構成アミノ酸残基の約８０％以上がヒスチジン残基であり、より好ましくは構成アミノ酸残基の約９０％以上がヒスチジン残基であり、さらに好ましくはすべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基である。
【００１６】
修飾用ペプチドを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基はいずれのアミノ酸残基であってもよく、天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、修飾アミノ酸残基、あるいは合成アミノ酸残基であってもよい。アミノ酸の合成や修飾は当業者が適宜行いうることである。好ましくは、修飾用ペプチドを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基は、ヒスチジンと類似の特性を有するアミノ酸残基である。
【００１７】
上述のごとく、修飾用ペプチドの好ましい長さは１４アミノ酸以上であり、好ましくは１６アミノ酸以上である。したがって、修飾用ペプチドの長さは、例えば、１４アミノ酸〜数十アミノ酸、１５アミノ酸〜数十アミノ酸、１６アミノ酸〜数十アミノ酸の範囲であってもよく、例えば１４アミノ酸〜２４アミノ酸の範囲であってもよく、１６アミノ酸であってもよい。数十アミノ酸とは、１４〜１００未満の範囲の任意のアミノ酸数を意味する。
【００１８】
修飾用ペプチドの特に好ましい例としては、すべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であって、ペプチドの長さが１４アミノ酸以上、例えば１４〜数十アミノ酸、１４アミノ酸〜２４アミノ酸、あるいは１６アミノ酸であるペプチドが挙げられる。
【００１９】
本明細書において、すべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であり、長さがｘアミノ酸である修飾用ペプチドを「Ｈｘ」と標記する。また、本明細書において、すべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であり、長さがｘアミノ酸である修飾用ペプチドによって修飾されたリポソームを「Ｈｘ−Ｌｉｐｏ」と標記する。例えば、すべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であり、長さが１６アミノ酸で修飾されたリポソームを「Ｈ１６−Ｌｉｐｏ」と標記する。
【００２０】
ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相合成法などの公知のペプチド合成法により調製することができる。あるいは修飾用ペプチドは、遺伝子組み換え法によっても調製することができる。
【００２１】
リポソームを修飾用ペプチドにて修飾する方法も公知であり、例えば修飾用ペプチドを疎水性基で修飾し、その疎水性基部分をリポソームの脂質二重層に取り込ませる方法が挙げられる。具体的には、修飾用ペプチドのＮ末端をミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基などで修飾したものをリポソーム溶液に添加し、混合することにより、リポソームを修飾用ペプチドにて修飾することができる。リポソームを修飾用ペプチドにて修飾する方法は上記方法に限定されないことはいうまでもない。
【００２２】
修飾用ペプチドによるリポソームの好ましい修飾率は、リポソームの組成やサイズ、修飾用ペプチドの構成アミノ酸や長さ、細胞の種類などによって様々であるが、通常の実験を行うことにより好ましい修飾率を見出すことができる。通常は、修飾率が高いほど、細胞膜透過性が向上する。例えば、１４個以上のヒスチジン残基からなる修飾用ペプチドにてリポソームを修飾する場合、修飾率が約１０％以上になると腫瘍細胞膜に対する透過性が高くなり、修飾率が約２０％以上になると腫瘍細胞膜に対する透過性が非常に高くなる。本明細書において、修飾率とは、リポソーム構成リン脂質のモル数に対する修飾用ペプチドのモル数をいう。修飾率は、添加する修飾用ペプチドの量を増減することによって調節することができる。
【００２３】
本発明は、もう１つの態様において、長さが１４アミノ酸以上であり、８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチドにてリポソームを修飾することを特徴とする、腫瘍細胞の細胞膜、特に付着性腫瘍細胞の細胞膜に対して高い透過性を有するリポソームの製造方法を提供する。リポソーム構成リン脂質のモル数に対して２０％以上の修飾用ペプチドを用いてリポソームを修飾することが好ましい。本発明の製造方法における修飾用ペプチドおよび修飾率についても上の説明があてはまる。
【００２４】
本発明は、もう１つの態様において、物質を細胞内に輸送する方法であって、輸送すべき物質を本発明の修飾リポソームに封入し、次いで、輸送すべき物質が封入された修飾リポソームを細胞に導入することを含む方法を提供する。輸送すべき物質は特に限定されず、蛋白、ポリペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、多糖類、オリゴ糖、単糖、その他の高分子化合物、低分子化合物、あるいは上記物質の混合物や複合体であってもよい。
【００２５】
上記方法において、細胞はいずれの細胞であってもよいが、腫瘍細胞が好ましく、とりわけ付着性腫瘍細胞が好ましい。付着性腫瘍細胞としては、ＨＴ１０８０（ヒト線維芽肉腫由来細胞）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ（ヒト肺扁平上皮癌由来細胞）、Ｕ２５１（ヒト神経膠腫由来細胞）、ＣａＣｏ−２（ヒト大腸癌細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）などが例示されるが、これらに限定されない。細胞が腫瘍細胞である場合、輸送すべき物質は典型的には抗癌剤である。本発明の方法にて輸送される抗癌剤はいずれの種類の抗癌剤であってもよく、癌の種類や程度、患者の状態等に応じて選択することができる。
【００２６】
抗癌剤を含有する本発明の修飾リポソームの投与形態いずれの形態であってもよく、例えば注射による患部への直接投与、静脈注射などが挙げられる。
【００２７】
本発明の修飾リポソームのさらなる特徴として、細胞膜透過性が血清の影響を受けないことが挙げられる。したがって、本発明の修飾リポソームは、血清の存在下においても安定して細胞膜を透過することができるので、生体外のみならず生体内での使用にも適する。したがって、本発明の修飾リポソームは実際の癌治療において有用であると考えられる。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１．  修飾リポソームの調製
リポソーム構成リン脂質であるジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロールをクロロホルムに溶解させ、それぞれ５００ｎｍｏｌと５０ｎｍｏｌを試験管内で混合した。その後、デシケーターで減圧乾燥し、さらに凍結乾燥機で乾燥させることで、リン脂質のフィルムを形成させた。次に、試験管に１０ｍＭ蛍光色素フルオレセイン（ｐＨ７．４に調節したＰＢＳに溶解）を５００μＬ添加し、水和させた。ボルテックス懸濁後、超音波処理を１分行い、室温暗所で３０分静置した。その後、凍結融解を５回繰り返し、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  社のリポソーム調製器（Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用し、１００ｎｍフィルターに１９回通過させることで、リポソーム溶液を調製した。調製したリポソーム溶液５０μＬをｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  ＴＭ  Ｓ−３００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供し、遠心分離（７３５ｘｇ、１分）によってゲル濾過精製を行った。
【００３０】
精製したリポソーム溶液に対して、任意濃度のＳＴＲ−Ｈ１６（Ｎ末端をステアリル化したＨ１６）またはＳＴＲ−Ｒ８（Ｎ末端をステアリル化した８個のアルギニン残基からなるペプチド）を添加し、室温かつ暗所で１時間インキュベーションすることで、Ｈ１６修飾リポソーム（Ｈ１６−Ｌｉｐｏ）またはＲ８修飾リポソーム（Ｒ８−Ｌｉｐｏ）を調製した。
【実施例２】
【００３１】
実施例２．  修飾率の検討
実施例１に記載した方法において、ＳＴＲ−Ｈ１６またはＳＴＲ−Ｒ８を、ＤＯＰＣに対するモル比で０、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０％としてＨ１６−ＬｉｐｏまたはＲ８−Ｌｉｐｏを調製し、ＨＴ１０８０細胞に対する細胞膜透過能を調べた。
【００３２】
Ｈ１６−ＬｉｐｏまたはＲ８−Ｌｉｐｏの細胞膜透過能をフローサイトメーターを用いて定量的に解析した。培養細胞を５．０×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように６ウェルマルチプレートに播種し、５．０％  ＣＯ２、３７℃の条件下で前培養した。２４時間後、新しい培地に交換し、Ｈ１６−Ｌｉｐｏ溶液またはＲ８−Ｌｉｐｏ溶液を終濃度１００μＭ（ＤＯＰＣ換算）となるように各ウェルに添加した。５．０％  ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン溶液（０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）処理により細胞を剥離した。遠心分離（５００ｘｇ、５分）により細胞を回収し、５００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ）によく懸濁した。細胞懸濁液を、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩに供し、細胞内蛍光強度を測定することで、Ｈ１６−Ｌｉｐｏの細胞膜透過能を評価した。この際、ペプチド未修飾のリポソーム（未修飾Ｌｉｐｏ）を、ネガティブコントロールとして用いた。
【００３３】
結果を図１に示す。修飾率１０％（ＤＯＰＣに対するｍｏｌ比）以上において、Ｈ１６−ＬｉｐｏはＲ８修飾リポソーム（Ｒ８−Ｌｉｐｏ）よりも高い細胞膜透過能（６．３倍以上）を示したことから、明確な細胞膜透過が起きていることが示唆された。さらに、修飾率２０％以上において、Ｈ１６−Ｌｉｐｏは非常に効率的な細胞膜透過（未修飾Ｌｉｐｏの１２．８倍以上）を示した。
【実施例３】
【００３４】
実施例３．  細胞選択性の検討
修飾率２０％として調製したＨ１６−Ｌｉｐｏの細胞選択性を調べた。供試細胞としてＨＴ１０８０（ヒト線維芽肉腫由来細胞：ＲＣＢ１９５６）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ（ヒト肺扁平上皮癌由来細胞：ＲＣＢ０４４４）、Ｕ２５１（ヒト神経膠腫由来細胞：ＲＣＢ０４６１）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞性白血病由来細胞：ＲＣＢ０８０６）、ＲＡＪＩ（ヒトバーキットリンパ腫由来細胞：ＲＣＢ１６４７）、ＫＧ−１（ヒト急性骨髄性白血病：ＲＣＢ１１６６）、ＴＨＰ−１（ヒト急性単球性白血病：ＲＣＢ１１８９）を用いた。ＨＴ１０８０とＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩの培養にはＭＥＭ培地、Ｕ２５１の培養にはＤ−ＭＥＭ培地、Ｊｕｒｋａｔ、ＲＡＪＩ、ＫＧ−１、ＴＨＰ−１の培養にはＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。各培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含有する状態で使用した。細胞膜透過能は、実施例２で記載した方法により測定した。
【００３５】
結果を図２に示す。Ｈ１６−Ｌｉｐｏは付着系細胞株（ＨＴ１０８０、ＲＥＲＦ、Ｕ２５１）に対して高い細胞膜透過を示し、特にヒト線維芽肉腫細胞株ＨＴ１０８０に対して最も高い細胞膜透過（未修飾Ｌｉｐｏの１２．８倍）を示した。
【実施例４】
【００３６】
実施例４．  細胞膜透過における血清の影響
修飾率２０％として調製したＨ１６−Ｌｉｐｏおよびヒト線維芽肉腫細胞株ＨＴ１０８０を用いて、細胞膜透過に対する血清（ウシ胎児血清）の影響について調べた。無血清培地（ＭＥＭ培地のみ）および血清培地（ＭＥＭ培地＋血清１０％）中での細胞膜透過能を調べた。
【００３７】
結果を図３に示す。無血清条件と比較して、血清の存在下においてＨ１６−Ｌｉｐｏは１４１％の細胞膜透過を示した（図３）。この結果から、Ｈ１６−Ｌｉｐｏは血清の存在下においても、安定して細胞膜を透過することが示された。このことから、本発明の修飾リポソームが実際の癌治療において有用であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、医薬品分野、特に抗癌剤の分野、および研究試薬分野等において利用可能である。
【図１】
2017031079.tif 000002
【図２】
2017031079.tif 000003
【図３】
2017031079.tif 000004
【配列表】
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