(57)【要約】【課題】高速かつ正確にスペクトルを計測すること【解決手段】互いに波長が異なる第１のパルス光１０と第２のパルス光２０を試料４２に照射し、誘導ラマン散乱によって得られるスペクトルを計測する誘導ラマン散乱顕微鏡は、前記第１のパルス光と前記第２のパルス光が照射されるＢＢＯ結晶５２を有し、ＢＢＯ結晶から出力される和周波発生光５３の光量の情報に基づいてスペクトルを補正する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得する計測装置であって、
前記第１及び第２のパルス光を受光して第３のパルス光を生成する非線形光学結晶と、
前記第３のパルス光の光量に基づいて前記スペクトルを補正する補正手段と、
を有することを特徴とする計測装置。
【請求項２】
前記スペクトルは誘導ラマン散乱によって得られることを特徴とする請求項1に記載の計測装置。
【請求項３】
前記第３のパルス光の光量の情報を取得する情報取得手段を有し、
前記補正手段は、前記情報取得手段が取得した前記情報に基づいて前記スペクトルを補正することを特徴とする請求項1または２に記載の計測装置。
【請求項４】
前記第１及び第２のパルス光のそれぞれを、前記試料に照射される光と前記非線形光学結晶に照射される光に分割する分割手段を有することを特徴とする請求項１乃至３のうちいずれか1項に記載の計測装置。
【請求項５】
前記第１のパルス光を生成する第１の光源と、
前記第２のパルス光を生成する第２の光源と、
を有することを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか1項に記載の計測装置。
【請求項６】
前記補正手段は、前記第３のパルス光の光量に基づいて、前記第１のパルス光と前記第２のパルス光の少なくとも一方の光強度を制御する制御手段を有することを特徴とする請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の計測装置。
【請求項７】
前記補正手段は、前記第１及び第２のパルス光の少なくとも一方の光路に配置され、前記少なくとも一方を増幅する増幅手段を有し、
前記制御手段は、前記第３のパルス光の光量に基づいて前記増幅手段の増幅率を制御することを特徴とする請求項６に記載の計測装置。
【請求項８】
前記スペクトルが計測されている間、前記制御手段は、前記第３のパルス光の光量の情報を常時取得して該情報に基づいて前記増幅手段の増幅率を連続的に制御することを特徴とする請求項７に記載の計測装置。
【請求項９】
前記第１のパルス光と前記第２のパルス光の少なくとも一方の光路に配置され、前記少なくとも一方の波長を掃引する波長掃引手段を有し、
前記スペクトルが計測される前に、前記制御手段は、前記波長掃引手段が掃引する各波長について前記第３のパルス光の光量に基づいて前記増幅手段の増幅率の情報を取得し、
前記補正手段は、前記波長掃引手段が掃引する各波長に対応する前記増幅率の情報を記憶する記憶手段を有し、
前記制御手段は、前記スペクトルが取得される際に、前記波長掃引手段が掃引する各波長に対して、前記記憶手段に記憶された前記増幅率の情報に基づいて前記増幅手段の増幅率を制御することを特徴とする請求項７に記載の計測装置。
【請求項１０】
前記補正手段は、前記第１のパルス光と前記第２のパルス光の少なくとも一方の光路に配置され、前記少なくとも一方を減光する、減光率が可変な減光フィルタを有し、
前記制御手段は、前記第３のパルス光の光量に基づいて前記減光フィルタの減光率を制御することを特徴とする請求項６に記載の計測装置。
【請求項１１】
前記補正手段は、
前記スペクトルを記憶する記憶手段と、
前記第３のパルス光の光量に基づいて前記記憶手段に記録された前記スペクトルの信号強度を調整する制御手段と、
を有することを特徴とする請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の計測装置。
【請求項１２】
前記第１のパルス光と前記第２のパルス光の少なくとも一方の光路に配置され、前記少なくとも一方の波長を掃引する波長掃引手段を有し、
前記補正手段は、前記波長掃引手段が掃引する各波長における前記第３のパルス光の光量の変動に更に基づいて前記スペクトルを補正することを特徴とする請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の計測装置。
【請求項１３】
前記第３のパルス光は和周波発生光であることを特徴とする請求項１乃至１２のうちいずれか１項に記載の計測装置。
【請求項１４】
前記第３のパルス光は差周波発生光であることを特徴とする請求項１乃至１２のうちいずれか１項に記載の計測装置。
【請求項１５】
互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得するステップと、
前記第１及び第２のパルス光が照射される非線形光学結晶から出力される第３のパルス光の光量に基づいて前記スペクトルを補正するステップと、
を有することを特徴とする計測方法。
【請求項１６】
コンピュータに請求項１５に記載の計測方法を実行させるためのプログラム。
【請求項１７】
互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得する計測装置に使用される補正装置であって、
前記第１及び第２のパルス光を受光して第３のパルス光を生成する非線形光学結晶と、
前記第３のパルス光の光量の情報に基づいて前記スペクトルを補正する補正手段と、
を有することを特徴とする補正装置。
【請求項１８】
互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得する計測装置であって、
前記第１及び第２のパルス光を受光して第３のパルス光を生成する非線形光学結晶と、
前記スペクトルの情報と前記第３のパルス光の光量の情報を出力する出力手段と、
を有することを特徴とする計測装置。
【請求項１９】
互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光から得られるスペクトルの情報と、前記第１及び第２のパルス光が照射された非線形光学結晶から出力される第３のパルス光の光量の情報と、を取得し、前記第３のパルス光の光量の情報に基づいて前記スペクトルの信号強度を調整する制御手段を有することを特徴とする信号処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、計測装置、計測方法、プログラム、補正装置および信号処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非線形光学過程を利用した非線形ラマン散乱計測装置が提案されている。非特許文献１は、非線形ラマン散乱計測装置として、誘導ラマン散乱（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）を利用したＳＲＳ計測装置を提案している。互いに波長が異なる２つのパルス光（以下、波長が短い方を「ポンプ光」、波長が長い方を「ストークス光」という）を試料に集光して照射する際、両パルス光の振動数の差が試料中の分子の振動数と一致すると照射点においてＳＲＳが生じる。この結果、ポンプ光の強度が減少し（誘導ラマン損失という）、ストークス光の強度が増大する（誘導ラマン利得という）。この強度変化を検出することで、試料における該当分子の分布のイメージングが可能となる。ポンプ光とストークス光の一方に予め強度変調を施しておくか、一方の繰り返し周波数を整数倍大きいものにしておくと、ＳＲＳによる強度変化も変調される。そのため、強度変調を施していない方の強度変化の変調分を、ロックインアンプを用いて検出すれば高感度にＳＲＳを検出することができる。
【０００３】
特定の波長のみを用いて分子振動を検出するだけでなく、広い振動数範囲での分子振動スペクトル（以下、「ラマンスペクトル」という）を検出すれば、試料識別の性能を遥かに向上することができる。非特許文献１は、１つ又は複数のオプティカルパラメトリック発振器（以後、ＯＰＯという）の発振波長可変機能を用いて、ポンプ光とストークス光のうち一方の光パルスの波長を掃引（スキャン）できるようにしたＳＲＳ計測装置を提案している。
【０００４】
ＯＰＯは比較的広い波長範囲を掃引できるので、広帯域のラマンスペクトルを取得することができるが、ＯＰＯを使った装置は一般に大型で高価になり、また波長掃引速度を高速にすることが難しい。そこで、特許文献１では、光源として低コストで小型化が可能なファイバレーザを使用し、且つ波長可変バンドパスフィルタを設けることで高速に照射パルスの光周波数を掃引できるＳＲＳ計測装置を提案している。
【０００５】
特許文献２は、第１のパルス光の繰り返し周波数が、第２のパルス光の繰り返し周波数の整数分の一であるＳＲＳ顕微鏡を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１１３６２３
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４０６１４号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｉｒｉｓｔｉａｎ  Ｗ．  Ｆｒｅｕｄｉｇｅｒ， ｅｔ  ａｌ．，  “Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  （誘導ラマン散乱を用いた顕微鏡による非標識の高感度生物医学的画像解析）”  サイエンス誌、第３２２巻第５２２２号、２００８年１２月１９日、ｐ．１８５７−１８６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１が提案するＳＲＳ計測装置は、波長を掃引している間に試料に照射されるパルス光の強度が一定であれば、正確なラマンスペクトルを得ることができる。しかしながら、実際は、試料に照射されるパルス光の強度は変動するため、計測されるラマンスペクトルの形状が歪み、正確なラマンスペクトルを得ることができないという問題があった。
【０００９】
本発明は、高速かつ正確にラマンスペクトルなどのスペクトルを計測することが可能な計測装置、計測方法、プログラム、補正装置および信号処理装置を提供することを例示的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の計測装置は、互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得する計測装置であって、前記第１及び第２のパルス光を受光して第３のパルス光を生成する非線形光学結晶と、前記第３のパルス光の光量に基づいて前記スペクトルを補正する補正手段と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高速かつ正確にスペクトルを計測することが可能な計測装置、計測方法、プログラム、補正装置および信号処理装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の誘導ラマン散乱顕微鏡の光路図である。（実施例１）
【図２】図１に示す誘導ラマン散乱顕微鏡におけるスペクトルスキャン時の位相整合の不一致を示す図である。（実施例１）
【図３】本発明の誘導ラマン散乱顕微鏡の光路図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施例を添付図面に基づいて説明する。
【実施例１】
【００１４】
図１は、本発明の実施例１に係る非線形ラマン散乱顕微鏡の光路図である。非線形ラマン散乱顕微鏡は、互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測する計測装置の一例である。同図において、１１は、波長が長いストークス光となる第１のパルス光１０を放射するパルスレーザ（第１の光源）であり、本実施例では、モードロックＹｂファイバレーザ光源（ＹｂＦＬ）を用いている。パルス光１０の中心波長は１０３０ｎｍ、パルス幅は数ピコ秒である。２１は、波長が短いポンプ光となる第２のパルス光２０を放射するパルスレーザ（第２の光源）であり、本実施例では、エルビウムドープトファイバレーザの射出光の第二高調波発生によって得られる波長７９０ｎｍのパルス光を用いている。このように、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０は互いに波長が異なる。
【００１５】
第１のパルス光１０の繰り返し周波数は４０ＭＨｚであり、第２のパルス光２０は繰り返し周波数８０ＭＨｚで放出されており、繰り返し周波数の比率が１：２となっている。第１のパルス光１０と第２のパルス光２０はともに数ピコ秒の時間幅を持つように発振されている。また、パルスレーザ１１は、後述するように発振タイミングを調節する機能を備えている。
【００１６】
ポンプ光とストークス光が試料に照射されるタイミングを同期させることによって、試料４２にはポンプ光のみの照射とポンプ光とストークス光の両光の照射が交互に生じる。ポンプ光とストークス光が同時に試料に照射された場合にのみＳＲＳが生じる。このため、試料中におけるポンプ光とストークス光の振動数の差と一致する振動数の分子の濃度に応じてポンプ光は誘導ラマン損失により第１のパルス光１０の繰り返し周波数である４０ＭＨｚで強度変調される。以下、ポンプ光のこの強度変調をＳＲＳ信号という。本実施例では、このポンプ光の強度変調を検出することによって該当分子の分布を測定している。
【００１７】
１２はスペクトルフィルタであり、第１のパルス光１０の波長切り出し帯域を選択する。スペクトルフィルタ１２は、第１のパルス光１０の光路に設けられる代わりに（あるいは、第１のパルス光１０の光路に設けられると共に）第２のパルス光２０の光路に設けられていてもよい。このため、スペクトルフィルタ１２は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０の少なくとも一方の光路に配置され、該少なくとも一方の波長を掃引する波長掃引手段として機能する。本実施例ではスペクトルフィルタ１２は、不図示のレンズおよび回折格子、あるいはガルバノミラーなどから構成されている。抽出する光の波長をコンピュータ４９により変化させることができる。
【００１８】
コンピュータ４９は、ＣＰＵ、ＭＰＵなどのプロセッサと、ハードディスクなどの記憶手段を有している。記憶手段は、コンピュータ４９に内蔵されてもよいし、通信可能に外付けされてもよい。例えば、記憶手段は、後述するように、スペクトルフィルタ１２が掃引する各波長に対応する増幅率の情報を記憶してもよい。コンピュータ４９は、後述する制御回路５６と通信可能に接続されており、制御回路５６は記憶手段の情報を参照することができる。
【００１９】
本実施例では、波長１０３０ｎｍを中心に、±１６ｎｍの幅で切り出し帯域を選択する。ＳＲＳ信号として計測されるラマンシフトは、数式（１）に示すように、ポンプ光とストークス光の光周波数の差によって決まる。このため、第１のパルス光１０の波長を掃引しながら波長が一定の第２のパルス光２０と同時に試料に照射することで試料のラマンスペクトルを計測することができる。
【００２０】
【数１】
2017020968.tif 000003
【００２１】
ここで、λｐはポンプ光の波長、λＳはストークス光の波長、
2017020968.tif 000004
【００２２】
はラマンシフトである。
【００２３】
スペクトルフィルタ１２の切り出し帯域において、数式（１）より、ラマンシフト約２８００から３１００ｃｍ−１の範囲にわたってラマンスペクトルを取得することが可能であり、有機物の分子のＣＨ結合のピークを測定できる。
【００２４】
１３はＹｂファイバアンプであり、スペクトルフィルタ１２によって切り出されたパルス光を増強させる増幅手段として機能する。但し、後述するように、ポンプ光が増幅されてもよいので、増幅手段は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０の少なくとも一方の光路に配置され、該少なくとも一方を増幅することができれば足りる。
【００２５】
２３はミラーであり、第２のパルス光２０を導く。ダイクロイックミラー４０は第１のパルス光１０と第２のパルス光２０を同軸に合波し、２次元に反射面の角度を変更可能なスキャナミラー６０に導く。スキャナミラー６０で反射された第１のパルス光１０と第２のパルス光２０は、対物レンズ４１に導かれる。第１のパルス光１０と第２のパルス光２０は、対物レンズ４１によって集光されて試料４２に照射され、試料４２を透過したパルス光は対物レンズ４３によって平行光となり、光学フィルタ４４へと導かれる。
【００２６】
光学フィルタ４４は、試料４２を透過したパルス光のうち、第１のパルス光１０を遮断し、第２のパルス光２０を透過させる。また、光学フィルタ４４は、コヒーレント・反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）等のＳＲＳ以外の非線形光学現象によって発生する光も取り除く。
【００２７】
光学フィルタ４４を透過した第２のパルス光２０は、光検出器４５へ導かれる。４６はロックインアンプであり、光検出器４５を通った電気信号からＳＲＳによる信号を取り出す。ロックインアンプ４６は、パルスレーザ１１の発振に同期した電気信号を参照信号４７として用いる。
【００２８】
スキャナミラー６０の角度を変えることによって試料上でのパルス光の照射位置を動かすことが可能であり、異なるスポット位置毎にＳＲＳを計測することができる。この際のＳＲＳ信号の強度をスキャナミラー６０の角度に応じて２次元に並べて表示すれば、ＳＲＳ強度の画像を得ることができる。
【００２９】
ポンプ光は、ＳＲＳによってストークス光の繰り返し周波数である４０ＭＨｚで強度変調されるため、光検出器４５によって得た電気信号は、ロックインアンプ４６で４０ＭＨｚ成分が取り出され、コンピュータ４９で画像化などの処理がなされる。
【００３０】
以上の構成によって、ＳＲＳ顕微鏡はＳＲＳによって得られるラマンスペクトルを計測することができる。
【００３１】
また、本実施例は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０の試料４２に照射される両パルスのタイミングを調節することができる。第１のパルス光１０は、ビームスプリッタ１４に入射し、分割される。第２のパルス光２０は、ビームスプリッタ２４に入射し、分割される。２５はミラーであり、第２のパルス光２０を導く。
【００３２】
２６はダイクロイックミラーであり、第１のパルス光１０を反射させ、第２のパルス光２０を透過させることにより、同軸に重ね合わせる。ダイクロイックミラー２６によって重ねあわされたパルス光は、レンズ２７によって２光子吸収素子３０上に集光照射され、２光子吸収素子３０内で２光子吸収を生じさせる。
【００３３】
２光子吸収素子３０は、第１のパルス光１０および第２のパルス光２０の波長域において通常（１光子吸収の場合）感度がないが２光子吸収過程が生じるものであればよく、例えば、ガリウム・ヒ素・リン（ＧａＡｓＰ）フォトダイオードを用いることができる。
【００３４】
２光子吸収素子３０は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０の２光子吸収素子３０上での照射位置と照射タイミングが一致した場合と両パルス光の照射位置と照射タイミングの何れかがずれた場合とで異なった強度の信号を出力する。この原理を利用して、同期制御装置３１は、後述の方法により、２光子吸収素子３０からの出力信号がある特定の強度を保つように第１の光源１１の発振タイミングを調節する。第１の光源１１の発振タイミングを高速で調節する具体的な方法として、特許文献２に記載されているように、同期制御装置３１の電気信号に応じて位相変調器３２を駆動させ、共振器長を外部から電気的に調節している。
【００３５】
本実施例では、ポンプ光とストークス光の光パルスが、試料４２上で同時に照射した際にＳＲＳ信号を計測可能である。ＳＲＳ信号の強度ＩＳＲＳは、数式（２）で示すように、ポンプ光とストークス光の強度の積に比例する。
【００３６】
【数２】
2017020968.tif 000005
【００３７】
ここで、Ｉｐ、ＩＳは、それぞれポンプ光とストークス光の光強度であり、Ｉｍχ（３）は、３次の非線形感受率の虚部を示す。
【００３８】
スペクトルフィルタ１２を使ってストークス光の中心波長を掃引した際に、ストークス光の強度ＩＳが変動すると、試料４２によるものではない強度変動がＩＳＲＳに重畳してしまい、計測されるラマンスペクトルは歪んでしまう。
【００３９】
本発明は、ＳＲＳ顕微鏡に補正装置を設けている。補正装置は、従来のＳＲＳ顕微鏡に装着されてもよい。本実施例の補正装置は、ビームスプリッタ５０からコントローラ５７までを備え、第１のパルス光１０の強度変動によるラマンスペクトルの歪みを補正する。
【００４０】
ダイクロイックミラー４０によって同軸に重ねられた第１のパルス光１０と第２のパルス光２０は、ビームスプリッタ５０によって同軸を維持したまま分波され、レンズ５１に導かれる。ビームスプリッタ５０は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０のそれぞれを、試料４２に照射される光と非線形光学結晶５２に照射される光に分割する分割手段として機能する。非線形光学結晶５２は、中心対称性がなく、第１及び第２のパルス光を受光して第３のパルス光を生成し、本実施例ではＢＢＯ（β-BaB2O4）結晶である。但し、非線形光学結晶は、ＫＴＰ結晶、ＬＢＯ結晶、ＢiＢＯ結晶、ＣＬＢＯ結晶など、ＢＢＯ結晶に限定されない。
【００４１】
第１のパルス光１０と第２のパルス光２０は、（集光）レンズ５１によってＢＢＯ結晶５２に集光され、ＢＢＯ結晶５２内で第３のパルス光としての和周波発生（ＳＦＧ）光５３を発生させる。なお、非線形光学結晶から出力される第３のパルス光は和周波発生（Ｓｕｍ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＳＦＧ）光だけでなく差周波発生（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＤＦＧ）光であってもよい。ＳＦＧでは、２つの光周波数ω１とω２の光から和の周波数ω３＝ω１＋ω２を有する光が発生する。ＤＦＧでは、２つの光周波数ω１とω２の光から差の周波数ω３＝ω１−ω２を有する光が発生する。但し、和周波発生光の方が差周波発生光よりも検出が容易であるというメリットがある。
【００４２】
５４はスペクトルフィルタであり、本実施例では、和周波発生光５３を透過し、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０を遮断する。５５は光電子増倍管であり、本実施例では和周波発生光５３を検出する。光電子増倍管５５は、非線形光学結晶から出力される第３のパルス光の光量の情報を取得する情報取得手段として機能する。光電子増倍管５５の電気信号出力は制御回路５６へ導かれる。制御回路５６はコンピュータ４９と一体であってもよい。
【００４３】
制御回路５６は、電気信号出力に応じて、Ｙｂファイバアンプ励起用レーザーダイオードのコントローラ５７を制御し、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率を変化させる。本実施例では、制御回路５６とコントローラ５７とＹｂファイバアンプ１３は、光電子増倍管５５が取得した情報に基づいてラマンスペクトルを補正する補正手段として機能する。特に、制御回路５６とコントローラ５７（並びに、実施形態によってはコンピュータ４９）は、光電子増倍管５５が取得した情報に基づいて、第１のパルス光１０の光強度を制御する制御手段として機能する。本実施例では、第１のパルス光１０の光強度を制御するために、光電子増倍管５５によって生成された電気信号が一定になるように、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率を制御しているが、パルスレーザ１１の出力を制御してもよい。なお、パルスレーザ１１の出力を制御するよりも、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率を制御する方が調整は容易になる。
【００４４】
和周波発生光５３の光強度は、数式（３）に示すように、和周波発生を表す２次の非線形分極ＰＳＦＧの二乗に比例し、ポンプ光の光電場Ｅｐとストークス光の光電場ＥＳの積の二乗に比例するため、ＳＲＳと同様にポンプ光とストークス光の強度の積に比例する。
【００４５】
【数３】
2017020968.tif 000006
【００４６】
同様の補正を、フォトダイオードの二光子吸収信号を用いて行うことも考えられる。その場合、数式（４）で示すように、補正に必要なポンプ光とストークス光の積の成分だけではなく、ポンプ光同士の二光子吸収信号成分、ストークス光同士の二光子吸収信号成分が重畳してしまうため、補正が困難になる。
【００４７】
【数４】
2017020968.tif 000007
【００４８】
ここで、ａ，ｂ，ｃは、比例定数、右辺第一項がポンプ光とストークス光による二光子吸収、第二項はポンプ光同士による二光子吸収、第三項は、ストークス光同士による二光子吸収である。
【００４９】
和周波発生光を用いてラマンスペクトルを補正する場合は、不要な信号である数式（４）の第二項と第三項が重畳しないため、本実施例の和周波発生光５３はＳＲＳ信号を補正するための制御信号として適している。
【００５０】
制御回路５６は、和周波発生光５３が一定となるようにＹｂファイバアンプ１３の増幅率を変化させるフィードバック制御を行う。これにより、スペクトルフィルタ１２を用いて波長を変更し、第１のパルス光１０の強度変化やタイミングズレが生じても、それを補正するように第１のパルス光１０の強度が補正され、ラマンスペクトルの歪みを補正することができる。
【００５１】
本実施例におけるフィードバック制御は、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率Ａを、数式（５）で示すように制御し、ストークス光強度を一定にするが、これには少なくとも２つの方法が考えられる。
【００５２】
第１の方法は、制御回路５６が、ラマンスペクトルが計測されている間、光電子増倍管５５から和周波発生光５３の光量の情報を常時取得して、取得した信号強度が一定になるようにＹｂファイバアンプ１３の増幅率を連続的に制御する方法である。
【００５３】
第２の方法では、予めスペクトルフィルタ１２を用いて波長をスキャンし、各波長における和周波発生光５３の強度ＩＳＦＧ（λ）を記憶し、その記録を参照してストークス光強度を変更する。第２の方法では、コンピュータ４９も補正手段における制御手段を構成する。第２の方法では、試料４２からのラマンスペクトルが計測される前に、コンピュータ４９が、スペクトルフィルタ１２を動作させる。そして、第１の方法と同様に、スペクトルフィルタ１２が掃引する各波長について光電子増倍管５５が取得した情報に基づいて制御回路５６は、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率の情報を取得し、コンピュータ４９がその記憶手段にその増幅率の情報を記憶する。あるいは、記憶手段は制御回路５６に設けられてもよい。そして、制御回路５６は、スペクトルが計測される際に、スペクトルフィルタ１２が掃引する各波長に対して、記憶手段に記憶された増幅率の情報に基づいてＹｂファイバアンプ１３の増幅率を制御する。第２の方法では、制御回路５６は、スペクトルが計測される際に、光電子増倍管５５から和周波発生光５３の光量の情報を常時取得しない。また、制御回路５６は、スペクトルフィルタ１２が掃引する波長の情報をコンピュータ４９から取得することができる。
【００５４】
【数５】
2017020968.tif 000008
【００５５】
ここで、ａは任意の定数である。この方法でも、予め記録しておいたＩＳＦＧの変動に応じて増幅率Ａを調整し、ラマンスペクトルの補正が可能である。
【００５６】
更に、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率を変更する代わりに、ＮＤフィルタ等の減光フィルタを用いて機械的に第１のパルス光１０の強度を減衰（調整）してもよい。この場合、ＮＤフィルタは、光軸に垂直な方向に移動可能に設けられており、移動方向に減光率の分布を有する（即ち、減光率が可変に構成されている）。なお、減光フィルタは、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０の少なくとも一方の光路に配置され、少なくとも一方を減光できれば足りる。制御回路５６は、上述した第１の方法または第２の方法と同様に、ラマンスペクトルが計測される前または最中に和周波発生光の情報を取得し、それに基づいて減光フィルタの移動手段を制御して減光フィルタを光軸に垂直に移動させてもよい。
【００５７】
なお、減光フィルタを光軸に垂直な方向に移動させる代わりに、回転によって減光率を調節してもよい。例えば、ターレットに互いに減光率が異なる複数の減光フィルタを設け、いずれか一つが光路に挿入されるように構成してもよい。
【００５８】
ファイバレーザの出力には、一般に、ＡＳＥノイズというパルス光になっていないノイズ光成分が含まれる。ＡＳＥノイズ光成分はＳＲＳに寄与しないため、単純にストークス光光源の強度を検出しただけではパルス光成分とＡＳＥノイズ光成分の分離はできず、ラマンスペクトルを正しく補正できない。一方、本実施例では、ポンプ光とストークス光の和周波発生光を用いてフィードバック制御を行っている。ＡＳＥノイズ光では和周波発生光に寄与しないため、パルスレーザ１１およびパルスレーザ２１の出力光のうち、ＳＲＳに寄与するパルス光成分のみを用いてフィードバック制御を行うことができ、ラマンスペクトルを補正する上で望ましい。
【００５９】
本実施例では、波長１０３０ｎｍを中心に、±１６ｎｍの幅で切り出し帯域を選択する。スペクトルフィルタ１２で波長を変更する際に、ＢＢＯ結晶５２での位相整合条件からのずれが大きくなってしまうと、フィードバック信号となる和周波発生光５３の出力が減少し、フィードバック制御が行えなくなるおそれがある。そのため、±１６ｎｍの幅でストークス波長を変更しても和周波発生光を得ることができることを確認する。
【００６０】
和周波発生光の強度ＩＳＦＧは、数式（６）で表すことができる。
【００６１】
【数６】
2017020968.tif 000009
【００６２】
ここで、Ｌは非線形光学結晶の長さであり、Δｋは、Δｋ＝２π（ｎｐ／λｐ  ＋  ｎＳ／λＳ  -  ｎＳＦＧ／λＳＦＧ）であり、位相の不一致を表す。ここで、λｐ、λＳ、λＳＦＧは、それぞれポンプ光、ストークス光、和周波発生光の波長であり、ｎｐ、ｎＳ、ｎＳＦＧはそれぞれポンプ光、ストークス光、和周波発生光の波長での非線形光学結晶の屈折率である。ポンプ光とストークス光の偏光方向をＢＢＯ結晶のｏｒｄｉｎａｒｙ軸に沿う様に入射させ、ｅｔｘｒａｏｒｄｉｎａｒｙ軸方向に偏光した和周波発生光を得る。このとき、ポンプ光（波長７９０ｎｍ）のＢＢＯ結晶のｏｒｄｉｎａｒｙ光に対する屈折率ｎｏｐは、約１．６６１であり、ストークス光（波長１０３０ｎｍ）のＢＢＯ結晶のｏｒｄｉｎａｒｙ光に対する屈折率ｎｏＳは、約１．６５５である。
【００６３】
和周波発生光の波長での屈折率ｎＳＦＧは、数式（７）で表すことができる。
【００６４】
【数７】
2017020968.tif 000010
【００６５】
ここで、Ｔは非線形光学結晶への入射角度、ｎｏＳＦＧ、ｎｅＳＦＧは、それぞれ、λＳＦＧにおけるＢＢＯ結晶のｏｒｄｉｎａｒｙ光に対する屈折率とｅｔｘｒａｏｒｄｉｎａｒｙ光に対する屈折率である。
【００６６】
λＳがストークス光の中心波長である１０３０ｎｍに設定されている際にΔｋ＝０となるように非線形光学結晶を配置してある状態を考える。図２は、スペクトルスキャン時の位相整合の不一致を示すグラフであり、横軸は非線形光学結晶への入射角度（°）、縦軸は位相整合のずれΔｋ［１／μｍ］を表している。実線は、波長が１０３０ｎｍの場合、波線は波長が１０４６ｎｍの場合を表している。
【００６７】
λＳＦＧは４４７ｎｍであり、図２の実線より、最適な角度は約２６°である。この角度を変えずに、λＳを１０４６ｎｍに掃引した場合の位相整合のずれΔｋを求める。この条件では、和周波光の波長λＳＨＧは、４５０ｎｍとなり、位相整合のずれΔｋは、図２の破線より０．００１０［１／μｍ］である。
【００６８】
数式（６）において、ストークス光の波長が１０３０ｎｍである場合は、位相整合のずれがなくΔｋ＝０となり、右辺＝１となる。非線形光学結晶として、厚さ０．５０ｍｍのＢＢＯ結晶を使用し、ストークス光の波長を波長可変幅の端である１０４６ｎｍに変更した場合は、ΔｋＬ＝０．５０となり、これを数式（６）に代入すると、右辺は約０．９８となる。よって、この組み合わせの場合、和周波発生光５３の強度が常に一定となるようにフィードバック制御を行うと、強度の誤差２％で和周波発生光５３を検出することができる。ストークス光の波長を変更しても、和周波発生光を検出することが可能であり、ラマンスペクトルの補正を行うことができる。更に、この２％の和周波発生光５３の強度変動によるフィードバック制御への影響を抑えたい場合は、数式（５）に示すように、和周波発生光５３の強度依存性をフィードバック制御を行う制御回路に記録する方法を取ればよい。
【００６９】
図２は、ＢＢＯ結晶に対する結果を示しており、他の非線形光学結晶に対して誤差が無視できない場合も考えられる。この場合、補正手段は、スペクトルフィルタ１２が掃引する各波長における和周波発生光の光量の情報と、和周波発生光の光量の変動の情報に基づいてラマンスペクトルを補正してもよい。
【００７０】
数式（２）と（３）に示すように、ＳＲＳ信号と和周波発生光５３はどちらもポンプ光とストークス光の積の形で記述することができるため、ポンプ光強度を調節するフィードバック制御を行う方法でもラマンスペクトルの補正は可能である。
【実施例２】
【００７１】
実施例１は、和周波発生光５３の強度が一定となるように、Ｙｂファイバアンプ１３の増幅率をフィードバック制御し、ラマンスペクトルの歪みを補正した。本実施例は、Ｙｂファイバアンプ１３の代わりに、コンピュータ４９内で数値的にラマンスペクトルの補正を行う。ラマンスペクトルの電気信号は予めコンピュータ４９の記憶手段に記憶されている。図３は、本発明の実施例２であるＳＲＳ計測装置の光路図である。実施例１との共通部分には、図１と同一の符号を付している。以下、本実施例と実施例１との違いを説明する。共通する構成については、説明を省略する。
【００７２】
本実施例の補正装置は、レンズ５１から制御回路５６およびコンピュータ４９となる。実施例１と同様に、本実施例でも、和周波発生光５３を検出する。光電子増倍管５５の電気信号出力は制御回路５６へ導かれ、制御回路５６は電気信号を記録し、制御回路５６の出力に応じて、コンピュータ４９でＳＲＳの信号強度を記録する際の比例定数を変化させる。コンピュータ４９での比例定数Ａは、数式（８）で定める。
【００７３】
【数８】
2017020968.tif 000011
【００７４】
ここで、ａは任意の定数、ＩＳＦＧは和周波発生光５３の信号強度である。これにより、ＩＳＦＧの変動に応じてコンピュータ４９内で記録するＳＲＳ信号強度の比例定数Ａを調整し、ラマンスペクトルの補正が可能である。
【００７５】
本実施例におけるフィードバック制御は、和周波発生光５３を常に取得して、取得した信号強度が一定になるようコンピュータ４９内で記録するＳＲＳの信号強度の比例定数Ａの調節を行ってもよい。あるいは、予めスペクトルフィルタ１２を用いて波長をスキャンし、各波長における和周波発生光５３の強度ＩＳＦＧ（λ）を制御回路５６内に記録する。そして、その記録を参照してコンピュータ４９内で記録するＳＲＳ信号強度の比例定数Ａを、数式（８）で示すように制御してもよい。
【００７６】
実施例１の方法では、フィードバック制御を行うに当たってストークス光の強度を減衰させているのに対して、本実施例ではストークス光の出力を減衰させないため、光源の最大出力まで利用することができるというメリットがある。
【００７７】
本発明は、互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得するステップを有する計測方法にも適用することができる。かかる計測方法は、第１のパルス光１０と第２のパルス光２０が照射される非線形光学結晶から出力される第３のパルス光の光量の情報に基づいてスペクトルを補正するステップを有する。また、かかる計測方法は、コンピュータに各ステップを実行させるプログラムとして具現化が可能であり、かかるプログラムも本発明の一側面を構成する。
【００７８】
計測装置は、（補正前の）ラマンスペクトルの情報と第３のパルス光の光量の情報を取得して出力（記憶または記録）する手段を有するだけでもよい。そして、計測装置とは、接続されていないコンピュータや画像処理装置（信号処理装置）において、出力手段から取得したかかる情報に基づいて実施例２の処理を行ってもよい。この場合、計測装置は、補正手段を有さず、別体の信号処理装置が補正手段を有することになる。
【００７９】
［変形例］
以上、本発明の好ましい実施形態及び実施例について説明したが、本発明はこれらの実施形態及び実施例に限定されず、その要旨の範囲内で種々の組合せ、変形及び変更が可能である。
【００８０】
本実施形態の非線形ラマン散乱計測装置は、ＳＲＳ顕微鏡に限らず、パルス光の強度変調を計測することができれば、誘導ラマン散乱以外の非線形ラマン散乱を利用した非線形ラマン散乱顕微鏡や、非線形ラマン散乱内視鏡などにも適用できる。例えば、非線形ラマン散乱はＣＡＲＳでもよい。また、互いに波長が異なる第１及び第２のパルス光が試料に照射されることにより強度変調された光を計測してスペクトルを取得することができる限り、非線形ラマン散乱以外の変調（例えば、蛍光など）を利用してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、非線形光学顕微鏡を用いた計測において試料に照射されるパルス光の強度およびタイミングの変動に起因するスペクトルの歪みを防止又は除去する用途に適用することができる。
【符号の説明】
【００８２】
１０…第１のパルス光、１３…Ｙｂファイバアンプ、２０…第２のパルス光、５２…ＢＢＯ結晶（非線形光学結晶）、５３…和周波発生光（第３のパルス光）、５６…制御回路（制御手段、補正手段）、５７…コントローラ（制御手段、補正手段）
【図１】
2017020968.tif 000012
【図２】
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【図３】
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