(57)【要約】【課題】既存の抗体やレセプターを含むタンパク質を用いて、短行程で短時間のうちにＱ−ｂｏｄｙやＵＱ−ｂｏｄｙのような蛍光標識タンパク質を提供する。【解決手段】  下記一般式（１）：【化１】2017020896.tif 000007（式中、Ｆは蛍光基であり、Ｒは、置換基を有していてもよい、炭素数が５以上の直鎖炭化水素からなる直鎖ソフトセグメント又はその主鎖の炭素の一部が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−又は−ＰＯＯ−で置換された直鎖ソフトセグメントを有するリンカー基である）で表される化合物を含む、タンパク質のＮ末端標識剤。【選択図】図３
2017020896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
2017020896.tif 000006
（式中、Ｆは蛍光基であり、
Ｒは、置換基を有していてもよい、炭素数が５以上の直鎖炭化水素からなる直鎖ソフトセグメント又はその主鎖の炭素の一部が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−又は−ＰＯＯ−で置換された直鎖ソフトセグメントを有するリンカー基である）
で表される化合物を含む、タンパク質のＮ末端標識剤。
【請求項２】
前記蛍光基が、ローダミン系、クマリン系、オキサジン系、カルボピロニン系、シアニン系、ピロメセン系、ナフタレン系、ビフェニル系、アントラセン系、フェナントレン系、ピレン系、カルバゾール系、Ｃｙ系、ＥｖｏＢｌｕｅ系、フルオレセイン系及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のＮ末端標識剤。
【請求項３】
前記蛍光基が、カルボキシテトラメチルローダミン、カルボキシフルオレセイン、ＡＴＴＯ６５５（登録商標）及びローダミングリーンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項２に記載のＮ末端標識剤。
【請求項４】
前記タンパク質が完全抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤。
【請求項５】
前記タンパク質が抗体のフラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤。
【請求項６】
タンパク質のＮ末端に請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤を用いて、前記蛍光基が導入された蛍光標識タンパク質。
【請求項７】
蛍光標識タンパク質の製造方法であって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤とタンパク質のＮ末端とを反応させる工程（ａ）、
を含む、蛍光標識タンパク質の製造方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）が溶液中で前記Ｎ末端標識剤と前記タンパク質とを接触させるものであり、該溶液のｐＨが、ｐＨ３〜７である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）における前記タンパク質が完全抗体又はそのフラグメントである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光標識タンパク質を作成するためのキットであって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤
を有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の標識を簡便に行うＮ末端標識剤や、かかるＮ末端標識剤を用いて標識した蛍光標識タンパク質及びその製造方法に関し、蛍光免疫測定法等に使用する蛍光標識抗体等を調製する技術として有用である。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定法として、抗原が結合していない状態には蛍光標識された抗体が消光（本明細書において、クエンチ、クエンチングとも呼ぶことがある）する一方、抗原が結合した場合に前記消光が解除される現象を用いた「均一系蛍光免疫測定法」が知られている（例えば、下記特許文献１参照）。この方法は、蛍光標識した抗体の断片、又は蛍光標識した一本鎖抗体を、抗原が含まれているか否かを検査する被検試料溶液に混合することにより行われる。この方法によれば、蛍光色素の蛍光強度と抗原濃度が正の相関関係にあることをもって、抗原の存在が結論付けられ、また、その相関度合いに基づいて抗原の濃度測定を行うことができる。このような消光とその解除の主たる要因は、抗体分子内の保存性の高いトリプトファン残基と蛍光色素が相互作用して蛍光色素を消光すると共に、抗原と結合することによって抗原依存的にかかる消光が解消されることにある。
【０００３】
測定に際し、蛍光標識した抗体の断片を用いる場合には、より詳細には、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのどちらか一方を蛍光標識した２本の抗体断片が用いられる。ここで、抗体軽鎖可変領域は「ＶＬ」と略記されることがあり、抗体重鎖可変領域は「ＶＨ」と略記されることがある。
【０００４】
また、測定に際し、蛍光標識した一本鎖抗体を用いる場合には、より詳細には、蛍光標識したＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドとが結合してなる一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」と略記されることがある。）が用いられる。
【０００５】
上記２種類の蛍光標識した抗体を総称して、「Ｑｕｅｎｃｈｂｏｄｙ（登録商標、以下同じ）」又は「Ｑ−ｂｏｄｙ（登録商標、以下同じ）」と呼ぶことがある。また、特に両者を区別する場合においては、前者（２本の抗体断片を用いる場合）を「ＶＨ＋ＶＬ型Ｑ−ｂｏｄｙ」と称し、後者（一本鎖抗体を用いる場合）を「ｓｃＦｖ型Ｑ−ｂｏｄｙ」と称することがある。
【０００６】
特許文献１に記載された手法の特徴は、大きく以下の３点にある。
【０００７】
第一の特徴は、洗浄工程が不要である点にある。これにより、少量のサンプルとＱ−ｂｏｄｙを混合して蛍光強度を測定するだけで測定が完了するため、この手法は極めて簡便な測定技術であるといえる。第二の特徴は、抗体中に存在する保存性の高いトリプトファンを消光に利用する点にある。すなわち、抗体の種類を変えても消光効果が得られるため、様々な抗体を用いて種々の物質を検出することに適用できる点において、この手法は汎用性に優れているといえる。第三の特徴は、抗原部位が１ヶ所でよい点にある。このため、原理的に低分子化合物に対しても適用できる。
【０００８】
このように、本手法は、洗浄工程を必要とせず、簡便な測定方法である。このため、本手法に基づく測定デバイスを、例えば携帯可能なサイズにまで小型化することが可能であり、また、この測定デバイスを用いることで、専門教育を受けていない一般の人が現場で測定することも可能であると想定される。
【０００９】
また、ＶＬ及び抗体軽鎖定常領域からなるポリペプチドと、ＶＨ及び抗体重鎖定常領域からなるポリペプチドとが、ジスルフィド結合で結合した１分子のヘテロダイマータンパク質からなるＦａｂ抗体（Fragment, antigen binding）を作成し、ＶＬ及びＶＨのそれぞれに同色又は異色の蛍光色素を標識した蛍光標識複合体が開発されている（特許文献２）。ＶＬ及びＶＨのそれぞれに同色の蛍光色素を標識した蛍光標識複合体では、上述した蛍光色素とトリプトファン残基との相互作用による消光に加え、色素間の消光効果（Ｈ−ｄｉｍｅｒ）が加わり、高い検出感度を得ることが可能である（特許文献２の図７、図８等）。ＶＬ及びＶＨのそれぞれに異色の蛍光色素を標識した蛍光標識複合体では、蛍光色素とトリプトファン残基との相互作用による消光と、色素間の消光効果に加え、ＦＲＥＴ効果による消光効果が加わり、さらに高い検出感度を得ることが可能である（特許文献２の図９、図１０等）。このような蛍光標識Ｆａｂ抗体複合体を総称して「ＵＱ−ｂｏｄｙ（登録商標、以下同じ）」と呼ぶことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０６１９４４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０６５３１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗原やリガンドが結合していない場合は消光し、結合がなされると消光が解除されるシステムは、医療の分野だけではなく、環境中の農薬検出や、毒素検出等の様々な分野で普及することが期待されている。既存の抗体やレセプターを含むタンパク質を用いて、容易にＱ−ｂｏｄｙやＵＱ−ｂｏｄｙのような蛍光標識タンパク質を作成する技術が求められている。
【００１２】
そこで、本発明の目的は、既存の抗体やレセプターを含むタンパク質を用いて、短行程で短時間のうちにＱ−ｂｏｄｙやＵＱ−ｂｏｄｙのような蛍光標識タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アルデヒド基に一定の長さのリンカーを介して蛍光基を結合させることで、既存の抗体等のタンパク質に対して蛍光色素を簡便に結合可能であり、これが蛍光免疫測定法等に利用可能であることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。
【００１４】
すなわち、本発明は、
［１］
下記一般式（１）：
【化１】
2017020896.tif 000003
（式中、Ｆは蛍光基であり、
Ｒは、置換基を有していてもよい、炭素数が５以上の直鎖炭化水素からなる直鎖ソフトセグメント又はその主鎖の炭素の一部が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−又は−ＰＯＯ−で置換された直鎖ソフトセグメントを有するリンカー基である）
で表される化合物を含む、タンパク質のＮ末端標識剤；
［２］前記蛍光基が、ローダミン系、クマリン系、オキサジン系、カルボピロニン系、シアニン系、ピロメセン系、ナフタレン系、ビフェニル系、アントラセン系、フェナントレン系、ピレン系、カルバゾール系、Ｃｙ系、ＥｖｏＢｌｕｅ系、フルオレセイン系及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、前記［１］に記載のＮ末端標識剤；
［３］前記蛍光基が、カルボキシテトラメチルローダミン、カルボキシフルオレセイン、ＡＴＴＯ６５５（登録商標）及びローダミングリーンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、前記［２］に記載のＮ末端標識剤；
［４］前記タンパク質が完全抗体である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＮ末端標識剤；
［５］前記タンパク質が抗体のフラグメントである、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のＮ末端標識剤；
［６］タンパク質のＮ末端に前記［１］〜［５］のいずれかに記載のＮ末端標識剤を用いて、前記蛍光基が導入された蛍光標識タンパク質；
［７］蛍光標識タンパク質の製造方法であって、
前記［１］〜［５］のいずれかに記載のＮ末端標識剤とタンパク質のＮ末端とを反応させる工程（ａ）、
を含む、蛍光標識タンパク質の製造方法；
［８］前記工程（ａ）が溶液中で前記Ｎ末端標識剤と前記タンパク質とを接触させるものであり、該溶液のｐＨが、ｐＨ３〜７である、前記［７］に記載の方法；
［９］前記工程（ａ）における前記タンパク質が完全抗体又はそのフラグメントである、前記［７］又は［８］のいずれかに記載の方法；
［１０］蛍光標識タンパク質を作成するためのキットであって、
前記［１］〜［５］のいずれかに記載のＮ末端標識剤
を有する、キット；
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、既存の抗体等のタンパク質を用いて、短工程で短時間のうちに、Ｎ末端に蛍光基を結合させることができる。既存のタンパク質を利用可能となったことで、ハイブリドーマの作成や遺伝子配列の解析も不要となり、均一系蛍光免疫測定法に利用可能なタンパク質を簡便に効率良く製造可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のＮ末端標識剤を用いて標識したタンパク質の一つの実施形態を模式的に示した図である。この実施形態では、抗原非存在下では蛍光がクエンチ（消光）される（真ん中）。抗原存在下では、クエンチが解消され、蛍光基がタンパク質から露出する（右側）。この場合、発生する蛍光強度は、抗原濃度と正の相関関係となり得る。
【図２】Ｎ末端標識剤の製造方法の一例を示す図である。
【図３】Ｎ末端標識剤を用いて標識された蛍光標識タンパク質における蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図４】種々の長さのリンカー基を有する蛍光標識タンパク質における蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図５】種々の長さのリンカー基を有する蛍光標識タンパク質における蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図６】種々の構造のリンカー基を有する蛍光標識タンパク質における蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図７】種々の種類の蛍光基を有する蛍光標識タンパク質における蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図８】種々の種類の蛍光基を有するＮ末端標識剤を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
［Ｎ末端標識剤］
本発明は、下記一般式（１）：
【化２】
2017020896.tif 000004
（式中、Ｆは蛍光基であり、
Ｒは、置換基を有していてもよい、炭素数が５以上の直鎖炭化水素からなる直鎖ソフトセグメント又はその主鎖の炭素の一部が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−又は−ＰＯＯ−で置換された直鎖ソフトセグメントを有するリンカー基である）
で表される化合物を含む、タンパク質のＮ末端標識剤である。すなわち、本発明におけるＮ末端標識剤は、末端にアルデヒド基を有し、Ｒで示されるリンカー基を介して、Ｆで示される蛍光基と結合している。また、リンカー基は、直鎖ソフトセグメントとその他の結合基を有していてもよい。
【００１８】
本明細書において、直鎖ソフトセグメントとは、主鎖に直鎖状基を有し、柔軟性を有するセグメントをいう。このような直鎖状基は、主鎖の回転性や屈曲性が阻害されにくい基が好ましい。直鎖炭化水素としては、例えば、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基等が挙げられる。
【００１９】
主鎖の回転性や屈曲性の観点から、直鎖炭化水素における炭素数は、５以上であり、６以上が好ましく、７以上がより好ましく、８以上がさらに好ましく、９以上がさらに好ましく、１０以上がさらに好ましく、１１以上がさらに好ましく、１２以上が特に好ましく、１３以上が最も好ましい。また、主鎖の回転性や屈曲性の観点から、直鎖炭化水素における炭素数は、１００以下とすることができ、９０以下とすることが好ましく、８０以下とすることがより好ましく、７０以下とすることがさらに好ましい。直鎖ソフトセグメントは、主鎖の炭素の一部が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−又は−ＰＯＯ−で置換されていてもよく、オキシアルキレン基等の繰り返し単位を有するものもこれに含まれる。
【００２０】
Ｎ末端標識剤により標識されたタンパク質において、蛍光基がトリプトファン残基の近傍に位置している場合、トリプトファン残基と蛍光基とが相互作用して、蛍光基がクエンチされ得る。タンパク質が抗体の場合は、抗原結合ポケットにおけるトリプトファン残基との間で、蛍光基が相互作用し得る。クエンチングの原理は、トリプトファン残基と蛍光基との相互作用に限定されるものではないが、リンカー基の構造や長さは、トリプトファン残基と蛍光基との相互作用に影響を及ぼすことが想定される。例えば、リンカー基が短すぎる場合や、長すぎる場合には、トリプトファン残基と蛍光基とが十分に相互作用することができない。また、例えば、リンカー基に環状構造が複数含まれている場合は、リンカー基の回転性や可動性が阻害され、トリプトファン残基と蛍光基とが十分に相互作用することができないことが想定される。
【００２１】
本明細書において、炭素数が５以上の直鎖炭化水素からなる直鎖ソフトセグメントは、置換基を有していてもよい。本明細書において、置換基としては、主鎖の回転性や屈曲性が阻害されにくい基であれば限定はされないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシレン基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、フェニル基、トルイル基、ナフチル基、ピリジル基、フラニル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、アセチル基、プロパノイル基、シクロヘキサンカルボニル基、ベンゾイル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ヒドロキシル基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、メチルシリル基、ジメチルシリル基、フルオロ基、クロロ基、トリフルオロメチル基、アミン基、アセタール基、ケタール基、アルデヒド基、ケトン基、イミン基、ニトリル基、カルボキシ基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホ基等が挙げられる。合成の容易さの観点から、置換基を有する場合は、メチル基、エチル基等が好ましい。
【００２２】
本明細書において、リンカー基は、直鎖ソフトセグメントの機能が阻害されにくい構造であれば、さらに別の結合基を含んでいてもよく、例えば、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキル基及びそれらの組合せからなる群より選択される。
【００２３】
限定はされないが、リンカー基は、置換基を有していてもよい、イミノ基、スクシニルアミノ基、アセタミド基、２−アミノペンタンアミド、２（２’）−アルキル−アミノアセチル基、カルバモイル基、アミノアルキル基、アミノアルキルオル基、グルタルアミド基、オルニチノ基、テオプロパノアイル基、Ｎ−（メルカプトメチル）プロピオンアミド基、２−（１，２−ジヒドロキシ−３−メルカプトプロピルチオ）プロパノイル基、アミノエタンチオール基、メルカプトプロパノール基、（ヒドロキシプロピルチオ）プロパンノアイル基、オキシ基、スクシニル基、アセチル基、オキソペンタノイル基等の結合基を含んでいてもよい。
【００２４】
また、限定はされないが、リンカー基は、置換基を有していてもよい、１個以上のアミノ酸の繰り返し単位を含むアミノ酸リンカー、ジスルフィドリンカー、リン酸エステルリンカー等の結合基を含んでいてもよい。
【００２５】
リンカー基がアルキレン基を含む場合は、限定はされないが、蛍光基のクエンチ効果を顕著に奏する観点から、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン基であることが好ましく、Ｃ３〜Ｃ１８アルキレン基であることがより好ましく、Ｃ４〜Ｃ１６アルキレン基であることがさらに好ましい。
【００２６】
リンカー基がＰＥＧ基を含む場合は、限定はされないが、蛍光基のクエンチ効果を顕著に奏する観点から、ＰＥＧ基の繰り返し単位数は、３〜２０が好ましく、４〜１８がより好ましく、５〜１５がさらに好ましく、６〜１２が特に好ましく、２〜１０が最も好ましい。
【００２７】
Ｎ末端標識剤により標識されるタンパク質は、特に制限されないが、標的物質と結合可能なタンパク質であることが好ましく、限定はされないが、例えば、抗体、タンパク質タグ、受容体、細胞接着分子等が挙げられる。
【００２８】
本明細書において、抗体とは、Ｂ細胞が産生する糖タンパク質であり、抗原を認識して結合する働きを有するものをいう。抗体は、免疫グロブリンとも呼ばれ、長いポリペプチド鎖（本明細書において抗体重鎖ともいう）と、短いポリペプチド鎖（本明細書において抗体軽鎖ともいう）をそれぞれ二本ずつ有し、これらがジスルフィド結合で繋がっている。このように抗体重鎖と抗体軽鎖をそれぞれ二本ずつ有している抗体を、本明細書においては、完全抗体という。
【００２９】
本明細書において、Ｎ末端標識剤により標識されるタンパク質として抗体を用いる場合は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いることも可能であり、市販のものであっても、合成したものであってもよい。抗体のアイソタイプとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれも用いることができ、入手のし易さの観点からＩｇＧが好ましい。抗体の由来は、特に制限されないが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ由来であることがより好ましく、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ又はヤギ由来であることがさらに好ましく、ヒト又はマウス由来であることが特に好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００３０】
用いられる抗体は、様々な抗原に対する抗体であってよく、対象となる抗原としては、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、糖脂質、低分子化合物等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス、動物組織等も対象となり得る。また、麻薬、爆薬、農薬、香料、公害物質等の低分子化合物を含む化学物質も対象となり得る。このような物質としては、例えば、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣ−Ａ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）等のカンナビノイドと呼ばれる大麻成分；アンフェタミン、メタンフェタミン、モルヒネ、ヘロイン、コデインなどの覚醒剤や麻薬類；アフラトキシン、ステリグマトシスチン、ネオソラニール、ニバレノール、フモニシン、オクラトキシン、エンドファイト産生毒素などのカビ毒；テストステロンやエストラジオールなどの性ホルモン；クレンブテロールやラクトパミンなどの飼料に不正に用いられる添加物；ＰＣＢ、ゴシポール、ヒスタミン、ベンツピレン、メラミン、アクリルアミド、ダイオキシンなどの有害物質；アセタミプリド、イミダクロプリド、クロルフェナピル、マラチオン、カルバリル、クロチアニジン、トリフルミゾール、クロロタロニル、スピノサド、ランネート、メタミドホス、クロルピリホスなどの残留農薬；ビスフェノールＡなどの環境ホルモンなどを挙げることができる。上記の物質は各物質の誘導体も含む。
【００３１】
完全抗体は、公知の手段により、その一部分を切断して用いることも可能である。完全抗体は、例えば、パパインにより切断することで、２つのＦａｂ部分と１つのＦｃ部分に分離することが可能である。また、完全抗体は、例えば、ペプシンにより切断することで、１つのＦ（ａｂ’）２部分と、１つのＦｃ’部分に分離することが可能である。本明細書において、完全抗体の一部分を抗体のフラグメントといい、１本鎖抗体［ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）］、Ｆａｂ部分、Ｆ（ａｂ’）２部分、可変領域（Ｆｖ）部分、Ｆｃ部分、Ｆｃ’部分等が含まれる。抗体のフラグメントは、抗原との結合が可能である観点から、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ部分、Ｆ（ａｂ’）２部分又はＦｖ部分が好ましい。また、Ｆｃ受容体と結合が可能である観点から、抗体のフラグメントは、Ｆｃ部分またはＦｃ’部分が好ましい。また、抗体のフラグメントは、公知の手段により、合成して用いることも可能である。
【００３２】
ｓｃＦｖ部分及びＦａｂ部分は、抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド１つと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチド１つからなり、Ｆ（ａｂ’）２部分及び完全抗体は、抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド２つと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチド２つからなる。
【００３３】
抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、及び、抗体軽鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域の両方を含む一本鎖抗体のポリペプチドは、公知の化学合成法、遺伝子組換え技術、抗体分子のタンパク質分解酵素による分解方法等を用いて調製することができるが、中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術により調製することが好ましい。遺伝子組換え技術により上記ポリペプチドを調製する場合には、抗体軽鎖可変領域又は抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを好適なベクターに導入して発現ベクターを作製し、バクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞などを宿主として用いた発現系や、無細胞翻訳系により目的のポリペプチドを発現させることができる。無細胞翻訳系においてポリペプチドの発現を行う場合は、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、ヌクレオチド３リン酸や各種アミノ酸を加えた反応液中で、ポリペプチドを発現させることができる。
【００３４】
Ｎ末端標識剤により標識されるタンパク質として抗体を用いる場合、蛍光基と抗体の可変領域におけるトリプトファンとの相互作用の観点から、抗体軽鎖可変領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付け系で第３５番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列を有することが好ましい。また、抗体重鎖可変領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付け系で第３６番目、第４７番目、又は第１０３番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３５】
本明細書において、タンパク質タグとは、他の分子とのアフィニティを利用したペプチドやタンパク質をいう。タンパク質タグは、他の分子とのアフィニティを有するタンパク質タグであれば特に制限されないが、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンペプチド配列タグ（ＨＡタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Biotin Carboxyl Carrier Protein（ＢＣＣＰ）タグ（ビオチン化ペプチド）等が挙げられる。蛍光基のクエンチ効果を顕著に奏する観点から、Ｈｉｓ  ｔａｇ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグが好ましい。タンパク質タグは、市販のものであっても、合成して得たものであってもよい。
【００３６】
本明細書において、受容体とは、リガンドとの結合性を有するタンパク質をいう。受容体は、リガンドとの結合性を有する受容体であれば特に制限されないが、分泌型受容体、膜結合型受容体、細胞内受容体のいずれも用いることができる。このような受容体は、天然に存在するものであっても、改変されたものであってもよい。受容体は、市販のものであっても、合成して得たものであってもよい。受容体の由来は、特に制限されないが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ由来であることがより好ましく、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ又はヤギ由来であることがさらに好ましく、ヒト又はマウス由来であることが特に好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。受容体は、リガンドとの結合性を有する限り、受容体のフラグメントを用いることも可能である。
【００３７】
本明細書において、分泌型受容体とは、膜貫通型受容体から膜貫通領域及び細胞内領域を除いた構造を有するものをいい、リガンドとの結合性を有するものであれば特に制限されない。
【００３８】
膜貫通型受容体としては、リガンドとの結合性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、イオンチャンネル連結型受容体、イオンチャンネルとは連結していない受容体、キナーゼタイプ受容体、非キナーゼタイプ受容体等が挙げられる。
【００３９】
核内受容体としては、リガンドとの結合性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、甲状腺ホルモン受容体型、レチノイドＸ受容体型、エストロゲン受容体型、ステロイドホルモン受容体型等が挙げられる。
【００４０】
本明細書において、細胞接着分子とは、細胞同士又は細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与する分子をいう。細胞接着分子としては、リガンドとの結合性を有する受容体であれば特に制限されないが、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、セレクチンファミリ一、ＭＡＭスーパーファミリー等が挙げられる。このような細胞接着分子は、天然に存在するものであっても、改変されたものであってもよい。細胞接着分子は、市販のものであっても、合成して得たものであってもよい。細胞接着分子の由来は、特に制限されないが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ由来であることがより好ましく、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ又はヤギ由来であることがさらに好ましく、ヒト又はマウス由来であることが特に好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。細胞接着分子としては、リガンドとの結合性を有する限り、細胞接着分子のフラグメントを用いることも可能である。
【００４１】
本明細書において、蛍光基は、本発明の効果を奏する限り限定はされないが、ローダミン系、クマリン系、オキサジン系、カルボピロニン系、シアニン系、ピロメセン系、ナフタレン系、ビフェニル系、アントラセン系、フェナントレン系、ピレン系、カルバゾール系、Ｃｙ系、ＥｖｏＢｌｕｅ系、フルオレセイン系又はこれらの誘導体等が挙げられる。中でも、蛍光基のクエンチ効果を顕著に奏する観点から、蛍光基は、ローダミン系蛍光基、オキサジン系蛍光基、Ｃｙ系、フルオレセイン系が好ましい。
【００４２】
蛍光基は、具体的には、例えば、ローダミン、クマリン、オキサジン、カルボピロニン、シアニン、ピロメセン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、フェナントレン、ピレン、カルバゾール、Ｃｙ、ＥｖｏＢｌｕｅ、フルオレセイン等を基本骨格として有する蛍光基、又はこれらの蛍光基の誘導体が挙げられる。
【００４３】
蛍光基は、より具体的には、例えば、ＣＲ１１０：carboxyrhodamine 110：Rhodamine Green（商標名）、ＴＡＭＲＡ：carbocytetremethlrhodamine：ＴＭＲ、Carboxyrhodamine 6G：ＣＲ６Ｇ、ＡＴＴＯ６５５（商標名）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名）：4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３（商標名）：4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０（商標名）：4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1, 3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、Ｃｙ３（商標名）、Ｃｙ３Ｂ（商標名）、Ｃｙ３．５（商標名）、Ｃｙ５（商標名）、Ｃｙ５．５（商標名）、ＥｖｏＢｌｕｅ１０（商標名）、ＥｖｏＢｌｕｅ３０（商標名）、ＭＲ１２１、ＡＴＴＯ ３９０（商標名）、ＡＴＴＯ ４２５（商標名）、ＡＴＴＯ ４６５（商標名）、ＡＴＴＯ ４８８（商標名）、ＡＴＴＯ ４９５（商標名）、ＡＴＴＯ ５２０（商標名）、ＡＴＴＯ ５３２（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ（商標名）、ＡＴＴＯ ５５０（商標名）、ＡＴＴＯ ５６５（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ ６１０（商標名）、ＡＴＴＯ ６１１Ｘ（商標名）、ＡＴＴＯ ６２０（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４（商標名）、ＡＴＴＯ ６３３（商標名）、ＡＴＴＯ ６４７（商標名）、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ（商標名）、ＡＴＴＯ ６５５（商標名）、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２（商標名）、ＡＴＴＯ ７００（商標名）、ＡＴＴＯ ７２５（商標名）、ＡＴＴＯ ７４０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（商標名）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、５（６）−ＴＡＭＲＡ−Ｘ（商標名）、５ＴＡＭＲＡ（商標名）、ＳＦＸ（商標名）、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン、５，６−ジカルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，４'，５'，７，７'−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，７，７'−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４'，５'−ジクロロ−２'，７'−��メトキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソシアネート（ＦＩＴＣ）、ナフトフルオレセイン等が挙げられる。中でも、蛍光基は、蛍光基のクエンチ効果を顕著に奏する観点から、ローダミン系蛍光基であるＴＡＭＲＡ、ＣＲ１１０、Rhodamine Green（商標名）、オキサジン系蛍光基であるＡＴＴＯ、Ｃｙ系蛍光基であるＣｙ３（商標名）、Ｃｙ５（商標名）、フルオレセイン系であるカルボキシフルオレセインが好ましく、５（６）−ＴＡＭＲＡ−Ｘ（商標名）、５ＴＡＭＲＡ（商標名）、ＡＴＴＯ  ６５５（商標名）、Ｃｙ３（商標名）、Ｃｙ５（商標名）、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５，６−ジカルボキシフルオレセインがより好ましい。
【００４４】
蛍光基とリンカー基を結合する際には、蛍光基を有する化合物の反応性末端と、リンカー基を有する化合物の末端との反応を行うことが可能である。このような反応としては、縮合反応によるアミド化等が挙げられる。このような反応において、リンカー基を有する化合物は、他方の末端にアルデヒド基を有していてもよいが、水酸基等の形で反応させた後に、デスマーチン酸化等の反応により、アルデヒド化することが好ましい。
【００４５】
［蛍光標識タンパク質］
本発明は、上記タンパク質のＮ末端に、上記Ｎ末端標識剤を用いて、上記蛍光基が導入された蛍光標識タンパク質に関する。本発明のＮ末端標識剤は、一方端にアルデヒド基を有するため、還元剤の存在下で、タンパク質のＮ末端と還元的アミノ化反応を起こすことが可能である。
【００４６】
蛍光標識タンパク質には、標識された蛍光基の蛍光を、消光することができるクエンチャーをさらに付加していてもよい。このようなクエンチャーとしては、抗原等の標的物質の非存在下では、クエンチャーが蛍光基を効果的に消光し、標的物質存在下においては、蛍光基の発光を阻害しない組合せを適宜選択することができる。このようなクエンチャーとしては、例えば、ＮＢＤ：７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ、ＡＴＴＯ、ＱＸＬ、ＱＳＹ、Ｃｙ、Ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ、ＩＲＤＹＥ等を基本骨格とする消光色素やこれらの消光色素の誘導体等が挙げられる。より具体的には、ＮＢＤ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１（商標名）、ＢＨＱ−２（商標名）、ＢＨＱ−３（商標名）、ＡＴＴＯ５４０Ｑ（商標名）、ＡＴＴＯ５８０Ｑ（商標名）、ＡＴＴＯ６１２Ｑ（商標名）、ＱＸＬ４９０（商標名）、ＱＸＬ５２０（商標名）、ＱＸＬ５７０（商標名）、ＱＸＬ６１０（商標名）、ＱＸＬ６７０（商標名）、ＱＸＬ６８０（商標名）、ＱＳＹ−３５（商標名）、ＱＳＹ−７（商標名）、ＱＳＹ−９（商標名）、ＱＳＹ−２１（商標名）、Ｃｙ５Ｑ（商標名）、Ｃｙ７Ｑ（商標名）、Ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（商標名）、Ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ（商標名）、ＩＲＤＹＥ ＱＣ−１（商標名）等が挙げられ、クエンチャーとしての効果を顕著に奏する観点から、ＮＢＤが好ましい。例えば、蛍光基としてローダミン系蛍光基を用いた場合には、ＮＢＤとの組合せを例示することができる。
【００４７】
本明細書において、Ｎ末端標識剤を用いて抗体に蛍光基を導入した場合、抗原の非存在下では、上記の蛍光基と抗体可変領域において保存されたトリプトファン残基との相互作用による蛍光基の消光が起こる。抗体に対して、同色の蛍光基が複数導入された場合、さらに蛍光基間のクエンチング効果が得られる。また、抗体に対して、異色の蛍光基が複数導入された場合、上記のトリプトファン残基によるクエンチング、蛍光基間のクエンチングに加え、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果によるクエンチングの効果が得られる。さらに、蛍光基とその蛍光基を消光するクエンチャーが共存する場合には、蛍光基とクエンチャー間のクエンチング効果により、ダイナミックレンジを増大することができる。図１では、Ｎ末端標識剤を用いて完全抗体に蛍光基を導入した場合の一例を示す。この実施形態では、抗原非存在下では蛍光がクエンチ（消光）される（真ん中）。抗原存在下では、クエンチが解消され、蛍光基がタンパク質から露出する（右側）。このような場合、発生する蛍光強度は、抗原濃度と正の相関関係となり得る。
【００４８】
Ｎ末端標識剤を用いてタンパク質タグ、受容体又は細胞接着分子に蛍光基を導入した場合、標的物質の非存在下では、タンパク質タグ、受容体又は細胞接着分子における疎水的、電気的に蛍光基と相互作用が可能な部分がクエンチャーとして働き、蛍光基の消光が起こり得る。タンパク質タグ、受容体又は細胞接着分子に対して、同色の蛍光基が複数導入された場合、さらに蛍光基間のクエンチング効果が得られる。また、タンパク質タグ、受容体又は細胞接着分子に対して、異色の蛍光基が複数導入された場合、上記のトリプトファン残基によるクエンチング、蛍光基間のクエンチングに加え、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果によるクエンチングの効果が得られる。さらに、蛍光基とその蛍光基を消光するクエンチャーが共存する場合には、蛍光基とクエンチャー間のクエンチング効果により、ダイナミックレンジを増大することができる。
【００４９】
別の実施態様として、蛍光標識タンパク質では、標的物質の存在下において、蛍光基の消光が起こる場合もあり得る。標的物質が蛍光基と、主として疎水的、電気的に相互作用が可能な場合には、標的物質の存在下において、より消光が強まることにより生じ得る。このような場合、発生する蛍光強度は、抗原濃度と負の相関関係となり得る。
【００５０】
本明細書において、Ｎ末端標識剤の製造方法は、公知の方法によることが可能であるが、例えば、市販の蛍光基を用いる場合は、蛍光基の保護基を上記のリンカー基を含む化合物で置換する。置換された反応物が末端にヒドロキシ基を有する場合、例えば、デスマーチン試薬を用いて、デスマーチン酸化を起こすことにより、末端をアルデヒド基に置換することができる。具体的には、実施例において詳述する
【００５１】
本明細書において、蛍光の測定には、通常、蛍光検出に用いる光源や測定装置を用いることができる。光源としては励起光波長を照射できるものであればよく、具体的には、水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ（発光ダイオード）、レーザー光等が挙げられる。この際、適当な蛍光フィルターを用いて特定の波長の励起光を得ることができる。蛍光測定装置としては、例えば、励起光の光源及びその照射システム、蛍光画像取得システム等を備えた蛍光顕微鏡等を利用することができ、例えば、ＭＦ２０／ＦｌｕｏｒｏＰｏｉｎｔ−Ｌｉｇｈｔ（オリンパス社製）やＦＭＢＩＯ−ＩＩＩ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）等が挙げられる。また、光源、照射システム、測定システムを備えた小型で持ち運び可能な蛍光検出装置を用いてもよい。このような小型の装置を用いることにより、被験試料の採取現場で測定が可能となる。なお、蛍光の検出は、蛍光スペクトルの検出であっても、特定の波長の蛍光強度の検出であってもよい。
【００５２】
また、蛍光標識タンパク質を非ヒト動物に投与した場合は、その体液や組織等を採取する他、非ヒト動物の検出対象領域に励起光を照射して、蛍光色素の蛍光を２次元又は３次元的に測定及び／又は検出することもでき、この場合、蛍光顕微鏡や蛍光イメージアナライザー、光源を備えた内視鏡等を使用する例を挙げることができる。また、検出の際には、内視鏡、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、超音波、顕微鏡等を用いて、非ヒト動物の個体、組織、又は細胞の構造を示す画像も合わせて取得することが好ましい。測定及び／又は検出された蛍光強度と標的物質量とが正の相関関係にある場合、検出された蛍光の２次元又は３次元的画像に基づいて、標的物質の局在（位置）及び／又は量を知ることができ、この際前記構造を示す画像と比較することもできる。蛍光強度と標的物質量とが正の相関関係にある場合、これらの蛍光の検出に際しては、蛍光標識タンパク質を含まない、又は検体を含まない測定用試料等をネガティブコントロールとして調製し、合わせて測定及び／又は検出することができる。また、上記ネガティブコントロールにおける蛍光測定値で、測定用試料における蛍光測定値を除した、蛍光強度比を用いて、標的物質量の測定等を行うこともできる。あるいは、蛍光強度と標的物質量とが正の相関関係にある場合、適宜設定した閾値を越える蛍光強度が得られた場合に、測定試料中に標的物質が存在すると判定することもできる。
【００５３】
本明細書において、照射する励起光及び、測定及び／又は検出する蛍光の波長は、使用する蛍光基の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、蛍光基にＴＡＭＲＡを用いた場合は、励起光波長５３０ｎｍと蛍光波長５８０ｎｍを用い、蛍光基にＡＴＴＯ６５５を用いた場合は、励起光波長６３０ｎｍと蛍光波長６８０ｎｍを用いることができる。また、２種類の異なる蛍光基を用いる場合も、励起光波長及び蛍光波長の組合せを適宜選択して用いることができる。
【００５４】
［蛍光標識タンパク質の製造方法］
本発明の蛍光標識タンパク質の製造方法は、上記Ｎ末端標識剤と上記タンパク質のＮ末端とを反応させる工程（ａ）を含む。工程（ａ）において、上記Ｎ末端標識剤は、末端のアルデヒド基が、タンパク質のＮ末端に対して、還元的アミノ化反応を起こして結合することができる。工程（ａ）において、溶液中で上記Ｎ末端標識剤と上記タンパク質とを接触させる場合は、上記溶液のｐＨは、ｐＨ３〜７とすることが好ましい。タンパク質のαアミノ基を効率的に反応させる観点から、上記溶液のｐＨは、ｐＨ３．５〜６とすることがより好ましく、ｐＨ４〜ｐＨ５．５とすることがさらに好ましく、ｐＨ４．５〜ｐＨ５とすることが特に好ましい。温度条件は、例えば、１〜３０℃とすることができ、２〜１０℃が好ましく、３〜５℃がより好ましい。反応時間は、例えば１分〜３日とすることができ、３０分〜２日が好ましく、１時間〜１日がより好ましい。
【００５５】
本明細書において、工程（ａ）で用いる還元剤としては、還元的アミノ化反応を起こすことができる限り制限されないが、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、２−ピコリンボラン等が挙げられる。効率的に反応させる観点から、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、２−ピコリンボランが好ましい。
【００５６】
蛍光標識タンパク質の製造方法は、さらに精製工程（ｂ）を含むことができる。蛍光標識タンパク質の精製方法としては、公知の方法を用いることが可能であり限定はされないが、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられる。効率的に反応させる観点から、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過を用いることが好ましい。
【００５７】
［蛍光標識タンパク質を作成するためのキット］
また、本発明は、蛍光標識タンパク質を作成するためのキットであって、上記のＮ末端標識剤を有するキットに関する。このようなキットには、さらに還元的アミノ化反応に用いられる通常の試薬（還元剤、ｐＨ調整剤等）、器具（精製に関する器具等）、取扱説明書等を含むことができる。
【実施例】
【００５８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
［実施例１］蛍光基ＴＡＭＲＡ−Ｘを用いたＮ末端標識剤の合成
１．5(6)-TAMRA-X-C8-OHの合成
図２に示されるように、5(6)-TAMRA-X-SEを用いて、5(6)-TAMRA-X-C8-OHを合成した。具体的には以下のとおりである。
10μLの100mM 5(6)-TAMRA-X-SE（6-(Tetramethylrhodamine-5-(and-6)-carboxamido)hexanoic acid, succinimidyl ester；Molecular Probes社製）、10μLのDMSO（Dimethyl sulfoxide）、100μLの100mM octanolamine及び20μLの100mM NaHCO3水和物を1.5mL低吸着チューブに加え、氷上で混和することで反応させた。この反応液に2μLの1M 酢酸を加えて中和し、その後140μLの0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）を加えた。この溶液から下記分取条件で、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により合成物を分取し、乾燥させた。この乾燥物を所定の濃度となるようにDMSOに溶かした。671.38 (MH+, monoisotopic)の5(6)-TAMRA-X-C8-OHを得た。質量分析条件は以下のとおりである。
【００６０】
（HPLC分取条件）
検出器：SPD-20A（島津製作所社製）、260nm吸光度検出
カラム：Xbridge C18 5μm 10x50mm column (Waters社製)
移動相A：0.1% TFA
移動相B：アセトニトリル（MeCN）
カラム温度：30℃
グラジエント条件：
0-100% B in A for 15min
流量：3.0mL/min
【００６１】
（質量分析条件）
分析装置：Voyager DE Pro（Applied Biosystems社製）
マトリックス：α-CHCA in 0.1%TFA/MeCN (1:1)溶液 (10 mg/ml)
測定モード：ポジティブ
外部標準物質：angiotensin II (1046.5)
【００６２】
２．5(6)-TAMRA-X-C7-Aldehydeの合成
図２に示されるように、得られた5(6)-TAMRA-X-C8-OHを用いて、5(6)-TAMRA-X-C7-Aldehydeを合成した。具体的には以下のとおりである。
175μLの2mM 5(6)-TAMRA-X-C8-OH、175μLのDMSO及び350μLの500mM Dess-Martin試薬（東京化成工業社製）を1.5mL低吸着チューブに加え、３７℃、１時間振とうさせながらインキュベートした。750μLの0.1% TFA溶液を加え、上記分取条件でHPLCにより合成物を分取し、乾燥させた。この乾燥物を100μLのトリフルオロ酢酸/アセトニトリル(1:1)に溶かし、このうちの1μLを用いて定量分析した。定量分析は下記定量・分析条件によるHPLCにて行った。再度、乾燥させ、この乾燥物を所定の濃度となるようDMSOに溶かした。Ｎ末端標識剤として、669.36 (MH+, monoisotopic)の5(6)-TAMRA-X-C7-Aldehydeを得た。質量分析条件は上記のとおりである。
【００６３】
（HPLC定量・分析条件）
検出器：SPD-20A（島津製作所社製）、260nm吸光度検出
カラム：Xbridge C18 2.5μm 4.6x20mm IS column (Waters社製)
移動相A：0.1% TFA
移動相B：アセトニトリル（MeCN）
カラム温度：30℃
グラジエント条件：0-100% D in C for 10min
流量：1.5mL/min
【００６４】
［実施例２］タンパク質の蛍光標識化
１．蛍光標識化反応（還元的アミノ化反応）
実施例１で合成したＮ末端標識剤を用いて、抗体のＮ末端の蛍光標識化を行った。
9μLの1.0mg/mL 抗体溶液、4.5μLの0.96mM 5(6)-TAMRA-X-C7-aldehyde (50% DMSO溶液)、4.5μLの192mM ピコリンボラン (18% DMSO溶液)、9μLの50mM クエン酸ナトリウムバッファー（pH4.8）を1.5mL低吸着チューブに加えた。この溶液を、４℃、２４時間インキュベートすることで還元的アルキル化反応を行った。
【００６５】
抗体溶液としては、以下のものを使用した。
１）抗サイロキシン抗体（Anti-Thyroxine: HyTest社製、clone#1H1）
２）抗インフルエンザ  ヘマグルチニン抗体（Anti-Influenza Hemagglutinin: MBL社製、clone# 5D8）
３）抗インフルエンザ  ヘマグルチニン抗体（Anti-Influenza Hemagglutinin: MBL社製、clone# TANA2）
４）抗FLAG抗体（Sigma社製、clone# M2）
５）抗His Tag抗体（Novagen社製）
６）抗BGP抗体由来scFv（N末端にMetAla（メチオニン及びアラニン）を付加して大腸菌により発現）
【００６６】
２．蛍光標識タンパク質のゲルろ過
Microspin G25 column (GEヘルスケア・ジャパン社製)を用いて、得られた反応液から蛍光標識タンパク質を溶出した。
具体的には、始めにMicrospin G25 columnを、HKM平衡化バッファー（HKMバッファー（25 mM HEPES-KOH(pH7.4), 5 mM MgCl2, 100 mM KCl）、0.1% PEG8000（Sigma社製）、0.05% Brij（非イオン性界面活性剤、和光純薬社製））で平衡化した。カラムの平衡化には、300μLのHKM平衡化バッファーをカラムに添加し、室温、3000rpmにて1分間遠心分離した。この操作を合計４回行った。その後、上記の蛍光標識化反応で得られた反応液全量をカラムに添加して、室温、3000rpmにて1分間遠心分離することで蛍光標識タンパク質を溶出した。
【００６７】
３．蛍光標識タンパク質の蛍光測定（抗原滴定）
（抗原溶液の作成）
抗原を純水若しくはDMSOで溶解し、10-1〜10-2溶液を作成した。その後、HKMバッファー若しくはDMSOを用いて、10-9溶液まで段階的に希釈した。各種抗体に対する抗原は以下のものを使用した。
１）サイロキシン抗原（Sigma社製）
２）インフルエンザ  ヘマグルチニンタグペプチド（和光純薬社製）
（抗インフルエンザ  ヘマグルチニン抗体のclone# 5D8とTANA2を用いた蛍光標識タンパク質では同一の抗原を使用した）
３）FLAGペプチド抗原（和光純薬社製）
４）Ｈｉｓペプチド抗原（和光純薬社製）
５）BGPペプチド抗原（Genscript社製）
【００６８】
（蛍光測定溶液の作製）
18.9μLのゲルろ過後サンプルと926.1μLのHKM蛍光バッファー（HKMバッファー、0.1% PEG8000、0.005% Brij）とを混合し、1.5mL低吸着チューブに100μLずつ計9本に分注した。その後、抗原溶液を加えないサンプルにはHKMバッファーもしくはDMSOのみを1.01μL添加し、残りのサンプルには段階希釈した抗原溶液1.01μLを添加し、軽くボルテックスにより混和し、スピンダウンし、25°C、1時間インキュベートした。その後、各蛍光標識タンパク質サンプルの95μLを蛍光測定に使用した。
【００６９】
（蛍光測定）
これらの蛍光標識タンパク質サンプルを蛍光分光光度計（Fluorolog-3; 堀場製作所製）を用いて蛍光強度測定を行った。蛍光基として、TAMRAを用いた場合には、励起波長（Ex）は550nmにセットし、蛍光波長（Em）565〜700nmでの蛍光強度を測定した。蛍光強度を比較する際は、極大波長となる580nmでの蛍光強度を使用した。
【００７０】
各種の抗体を用いた蛍光標識タンパク質サンプルの蛍光強度の測定結果を図３に示す。各グラフにおいて、横軸は抗原濃度を示し、縦軸は抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を蛍光強度比として示した。
【００７１】
図３に示すように、抗原の非存在下では、蛍光基はクエンチされていたが、抗原濃度が高くなるにつれ、蛍光基のクエンチが解除され、蛍光を発することが確認された。抗原未添加時の蛍光強度を１とした場合に対する、抗原添加後の蛍光強度の増幅率は、抗サイロキシン抗体を用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは１．７５倍、抗インフルエンザ  ヘマグルチニン抗体（clone# 5D8）を用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは１．４倍、抗インフルエンザ  ヘマグルチニン抗体（clone# TANA2）を用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは１．２倍、抗FLAG抗体を用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは１．６倍、抗His Tag抗体を用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは１．２倍、抗BGP抗体由来scFvを用いた蛍光標識タンパク質サンプルでは２．７倍だった。
【００７２】
［実施例３］種々のリンカー長を有するＮ末端標識剤を用いた測定
実施例１と同様の方法により、下記式（２）中、リンカー基内におけるｎを２、５、７、９と変更した種々のＮ末端標識剤を調製した。ｎ＝２の場合のＮ末端標識剤は5(6)-TAMRA-X-C2-CHO、ｎ＝５の場合のＮ末端標識剤は5(6)-TAMRA-X-C5-CHO、ｎ＝７の場合のＮ末端標識剤は5(6)-TAMRA-X-C7-CHO、ｎ＝９の場合のＮ末端標識剤は5(6)-TAMRA-X-C9-CHOと記載する。
【００７３】
【化３】
2017020896.tif 000005
【００７４】
実施例２と同様の方法により、種々のリンカー長を有するＮ末端標識剤を用いてタンパク質の蛍光標識化を行った。
【００７５】
各リンカー長の蛍光標識タンパク質サンプルを抗原と反応させ、波長550nmの励起光を照射し、蛍光分光光度計（Fluorolog-3）を用いて蛍光スペクトルを測定した。
【００７６】
各リンカー長の蛍光標識タンパク質サンプルの蛍光強度の測定結果を図４又は図５に示す。図４は、抗体溶液として抗FLAG抗体を用い、抗原としてFLAGペプチド抗原を用いた結果であり、図５は、抗体溶液として抗His Tag抗体を用い、抗原としてHisペプチド抗原を用いた結果である。
【００７７】
図４に示すように、抗体溶液として抗FLAG抗体を用いた場合、上記の化学式（２）においてｎ＝２、５、７又は９である場合、抗原存在下で、蛍光標識タンパク質サンプルの蛍光強度変化を検出できることが確認され、特にｎ＝５、７である場合に大きな蛍光強度変化が検出された。
【００７８】
図５に示すように、抗体溶液として抗His Tag抗体を用いた場合、上記化学式（２）においてｎ＝５、７である場合に、抗原存在下で、蛍光標識タンパク質サンプルの高い蛍光強度変化が検出された。
【００７９】
［実施例４］種々のリンカー基を有するＮ末端標識剤を用いた測定
リンカー基にＰＥＧ基を有するＮ末端標識剤を合成した。この合成は、5(6)-TAMRA-X-SEの代わりに、TAMRA-PEO8-SE（Biotium社製）を使用したことを除き、実施例３におけるTAMRA-X-C2-CHOの合成と同様にして行った。
【００８０】
実施例２と同様の方法により、リンカー基にＰＥＧ基を有するＮ末端標識剤を用いてタンパク質の蛍光標識化を行った。抗体溶液は抗サイロキシン抗体を使用し、抗原はサイロキシン抗原を使用した。
【００８１】
リンカー基にＰＥＧ基を有する蛍光標識タンパク質サンプルを抗原と反応させ、波長550nmの励起光を照射し、蛍光分光光度計（Fluorolog-3）を用いて蛍光スペクトルを測定した。
【００８２】
図６に示すように、リンカー基にＰＥＧ基を有する蛍光標識タンパク質サンプルにおいても、抗原存在下で、蛍光標識タンパク質サンプルの高い蛍光強度変化を検出することが確認された。
【００８３】
［実施例５］種々の蛍光基を有するＮ末端標識剤を用いた測定
蛍光基にFAM（Molecular Probes社製）、RhodamineRed（Molecular Probes社製）、RhodamineGreen （Molecular Probes社製）、BODIPY FL（Molecular Probes社製）、IC3（同仁化学社製またはBiosearch Technologies社製）、ATTO655（ATTO Tech社製）又はCy3（GE Lifescience社製）を用いたＮ末端標識剤を合成した。抗体溶液は抗FLAG抗体を用い、抗原はFLAGペプチド抗原を用いた。FAMの場合は、アルデヒドへの酸化反応の際に、Dess-Martin試薬の濃度を500mMから15mMに減じて、反応時間を4時間に延長した。その他の条件は、上記の実施例１に準じる。
【００８４】
Microspin G25 columnを、クエン酸平衡化バッファー（50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH4.8)、100mM KCl、0.1% PEG8000、0.1% Brij35）で平衡化した。300μLのHKM平衡化バッファーをカラムに添加し、室温、3000rpmにて1分間遠心分離した。この操作を合計４回行った。その後、1 mg/mL 抗FLAG抗体 9 μLと50 mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH 4.8) 9 μLの混合溶液をカラムに添加して、室温、3000rpmにて1分間遠心分離してバッファー交換を行った。溶出液に、0.96 mM の各蛍光基を有するN末端標識剤（50% DMSO溶液）4.5μLと192 mM ピコリンボラン（18% DMSO溶液）4.5μLを添加して、４℃、２４時間インキュベートすることで還元的アルキル化反応を行った。続いて、実施例２と同様にしてゲルろ過により蛍光標識タンパク質を溶出した。
【００８５】
種々の蛍光基を有する蛍光標識タンパク質サンプルを抗原と反応させ、それぞれの蛍光基の吸収極大の波長（TAMRA 550nm、FAM 495nm、RhodamineRed 570nm、RhodamineGreen 495nm、BODIPY FL 495nm、IC3 540nm、ATTO655 650nm、Cy3 540nm）の励起光を照射し、蛍光分光光度計（Fluorolog-3）を用いて蛍光スペクトルを測定した。各グラフにおいて、横軸は抗原濃度を示し、縦軸は抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を蛍光強度比として示した。
【００８６】
図７に示すように、種々の蛍光基を有する蛍光標識タンパク質サンプルにおいて、抗原の非存在下では、蛍光基はクエンチされていたが、抗原濃度が高くなるにつれ、蛍光基のクエンチが解除され、蛍光を発することが確認された。
【００８７】
図８に示す種々の蛍光基を有するＮ末端標識剤を用いた場合も、蛍光標識タンパク質サンプルが得られた。
【図１】
2017020896.tif 000008
【図２】
2017020896.tif 000009
【図３】
2017020896.tif 000010
【図４】
2017020896.tif 000011
【図５】
2017020896.tif 000012
【図６】
2017020896.tif 000013
【図７】
2017020896.tif 000014
【図８】
2017020896.tif 000015