(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト骨形成蛋白質（ＢＭＰ）９に結合する、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又は該抗体断片の提供。【解決手段】以下の（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体、又は該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体又は該抗体断片。下記（ａ）又は（ｂ）から選ばれる一の抗体が結合するエピトープに結合する。ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選ばれる、一の遺伝子組換え抗体であるモノクロナール抗体又は抗体断片。（ａ）３つの相補鎖決定領域（ＣＤＲ）がそれぞれ特定のアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ特定のアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体（ｂ）上記配列とは異なる特定のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ特定のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体、又は該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体若しくは該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項２】
前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体が結合するエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項３】
遺伝子組換え抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項４】
ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる１の遺伝子組換え抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項５】
以下の（ｃ）及び（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ｃ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
【請求項６】
配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１番目から３７番目までのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１の抗体断片である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え体ベクターが宿主細胞に導入された形質転換株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該モノクローナル抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する線維性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢＭＰ９（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）に結合する、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又は該抗体断片、該抗体又は該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする治療薬に関する。
【０００２】
また本発明は、前記抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、腎性貧血若しくはがん性貧血などの貧血、又は肝疾患、腎疾患、強皮症、心疾患若しくは肺線維症などの線維性疾患の治療に使用するための医薬組成物並びにそれを用いた貧血及び線維性疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＢＭＰ９は、Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９の略で、別名ＧＤＦ２とも呼ばれる。ＢＭＰ９は約２０種類からなるＢＭＰ（骨形成蛋白質）ファミリー分子に属し、ヒトＢＭＰ９は４２９アミノ酸からなる分泌蛋白質である（非特許文献１）。
【０００４】
ＢＭＰ９は、胎児期では脊髄又は体節間膜で、成体期では肝臓で主に発現し（非特許文献２、３及び４）、ヒトＢＭＰ９は血液中に２−１２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する血中循環因子であることが知られている（非特許文献５）。
【０００５】
生体内におけるＢＭＰ９の役割について、これまでＢＭＰ９欠損マウス又は動物への抗ＢＭＰ９抗体投与に基づく報告は行われたことがないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見に基づく報告はいくつか行われている。
【０００６】
例えば、肥大軟骨細胞の形成又は間葉細胞から軟骨への分化に対する促進作用の発現（非特許文献６、７及び８）、又は血液前駆細胞の産生若しくはコロニー形成に対する促進作用の発現（非特許文献９）である。また、ＢＭＰ９には、臓器の線維化を促進する作用があることが報告されている（特許文献１）。
【０００７】
抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体として、ＢＭＰ９に対する中和活性を有するモノクローナル抗体であるクローンＮｏ．３６０１０７（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、６Ｄ１０−１−１及び１０Ｄ５−２−３（特許文献２）、並びに３Ｃ７−３−１（特許文献３）が知られているが、その他の抗体は知られていなかった。
【０００８】
貧血とは“単位容積血液中の赤血球数、ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット値が正常より低下した状態”を指す（非特許文献１０）。赤血球産生調節には種々な因子が働くが、最も重要かつ特異的な因子はエリスロポエチン（以下、ＥＰＯと表記する）である。
【０００９】
ＥＰＯは後期赤芽球コロニー形成細胞（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＣＦＵ−Ｅ）の増殖・分化を促進し、結果的に生体内の赤血球を増加させる（非特許文献１０）。ＥＰＯは１６５アミノ酸からなる分子量３０ｋＤａの糖蛋白質ホルモンであり、主に腎臓から産生される（非特許文献１０）。
【００１０】
腎疾患に伴う貧血（腎性貧血）は、ＥＰＯの産生組織である腎臓が障害を受けることによりＥＰＯの産生が低下し、赤血球数が低下する、慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者に最も頻度の多い合併症である（非特許文献１１）。腎性貧血は、ＱＯＬに影響を与えるだけでなく、心血管病変の発症・進展・腎機能障害の進行にも影響を与えることが知られている（非特許文献１１、１２）。
【００１１】
腎性貧血治療薬である遺伝子組換えヒトエリスロポエチンと、最近発売された血中半減期が長い持続型の第二世代ＥＰＯ製剤は、広くＥＳＡ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と称される（非特許文献１３）。
【００１２】
ＥＳＡは強力な赤血球造血作用を有するが、腎不全透析患者の１５−２０％にはＥＳＡを投与しても貧血改善効果が乏しい症例が存在する（これをＥＳＡ抵抗性貧血又はＥＳＡ低反応性貧血と呼ぶ）（非特許文献１３）。
【００１３】
このようなＥＳＡ抵抗性を呈する患者へのＥＳＡの過剰投与は、生命予後の悪化を引き起こすことが大規模介入臨床試験（ＣＲＥＡＴＥ試験及びＣＨＯＩＲ試験）の結果より示されている（非特許文献１１、１２、１３）。
【００１４】
悪性腫瘍に伴う貧血（がん性貧血）は、種々のがんで認められる症状であり、その原因としては、失血を含む病状の進行に伴うものと、化学療法又は放射線療法などに関連したものとの２つがある（非特許文献１４）。
【００１５】
がん性貧血に対してもＥＳＡは有効であることが示されているが、ＥＳＡ投与によるがん増殖促進の可能性又は血栓梗塞症の増加の懸念も指摘されている（非特許文献１４）。
【００１６】
線維性疾患は、慢性炎症に伴って臓器の機能を担う上皮細胞・組織がＩ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスに置き換わる症状であり、線維化が進行すると最終的には臓器不全に至る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２８１５８号
【特許文献２】国際公開第２０１４／００７１９８号
【特許文献３】国際公開第２０１４／０５１１０９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，２９４（２００３）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２４，１７９３７（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ，９６，５３（２００２）
【非特許文献５】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１０２，８，９１４（２００８）
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１，１７，１３１２（２００４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，１，６４９（２００９）
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｏｎｅｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２６，６，１１６６（２０１１）
【非特許文献９】Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２１，２，７１（２００３）
【非特許文献１０】標準血液病学（医学書院）（２０００）
【非特許文献１１】血液フロンティア，１８，２，１７（２００８）
【非特許文献１２】腎と透析，７１，２，２４７（２０１１）
【非特許文献１３】臨床透析，２６、２，５９（２０１０）
【非特許文献１４】臨床透析，２６，２，２７６（２０１０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明が解決する課題は、抗ＢＭＰ９抗体を有効成分とする、治療剤を提供することにより、腎性貧血若しくはがん性貧血などの貧血、又は肝疾患、腎疾患、強皮症、心疾患若しくは肺線維症などの線維性疾患を改善することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、抗ＢＭＰ９抗体の生体内における作用を明らかにする目的で、ＢＭＰ９欠損マウスを用いて抗ＢＭＰ９抗体の取得を試みたところ、既存抗体に比して、著しくＢＭＰ９に対する中和活性が向上した抗ＢＭＰ９抗体の取得に成功した。更にこの抗ＢＭＰ９抗体は、既存抗体よりも強い赤血球造血作用を有することを見出した。
【００２１】
本発明者らはこれらの知見に基づき、抗ＢＭＰ９抗体を有効成分とする、腎性貧血若しくはがん性貧血などの貧血、又は肝疾患、腎疾患、強皮症、心疾患若しくは肺線維症などの線維性疾患に対する治療剤を提供できると考え、本発明を完成させるに至った。
【００２２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体、又は該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体若しくは該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（２）前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体が結合するエピトープに結合する、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）遺伝子組換え抗体である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（４）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる１の遺伝子組換え抗体である、（３）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）以下の（ｃ）及び（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ｃ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（６）配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１番目から３７番目までのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸に結合する、（１）〜（５）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（７）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１の抗体断片である（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体断片。
（８）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換え体ベクターが宿主細胞に導入された形質転換株。
（１１）（１０）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該モノクローナル抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１２）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
（１３）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（１４）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
（１５）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する線維性疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、既存抗体に比して、著しくＢＭＰ９に対する中和活性が向上した抗ＢＭＰ９抗体である。ＢＭＰ９は貧血及び線維性疾患等への関与が指摘されている分子である。このような特性を有する本発明の抗体を有効成分とすることにより、腎性貧血若しくはがん性貧血などの貧血、又は肝疾患、腎疾患、強皮症、心疾患若しくは肺線維症などの線維性疾患に対する治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のＢＭＰ９への結合特異性を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した図である。縦軸は吸光度（波長４５０−５７０ｎｍ）を示す。
【図２】図２は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体への結合活性をＥＬＩＳＡによって測定した図である。縦軸は吸光度（波長４５０−５７０ｎｍ）を示す。
【図３】図３は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の各種ＢＭＰ分子に対する中和活性を調査した図である。縦軸は阻害活性（％）を示す。
【図４】図４は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のＢＭＰ９中和活性を先行抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度を、縦軸は阻害活性（％）を示す。三角は１０Ｄ５−２−３抗体、四角は２５５−１３−１３抗体を示す。
【図５】図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の投与（４週間）による、マウス赤血球造血に対する作用を示す図である。図５（Ａ）のグラフは赤血球数（ＲＢＣ）の変化を示す。図５（Ａ）のグラフの横軸は抗体名と抗体投与量（ｍｇ／ｋｇ）を、縦軸は赤血球数（×１０４Ｃｅｌｌｓ／μＬ）を示す。図５（Ｂ）のグラフはヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の変化を示す。図５（Ｂ）のグラフの横軸は抗体名と抗体投与量（ｍｇ／ｋｇ）を、縦軸はヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝８）を示す。溶媒投与群に対する各抗体投与群の測定値の統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片に関する。
【００２６】
ヒトＢＭＰ９は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つ、一本鎖の前駆体蛋白質（Ｐｒｅ−Ｐｒｏ体）として合成される。この一本鎖のＰｒｅ−Ｐｒｏ体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、ゴルジ体にて、１番目から２２番目までのシグナルペプチド領域が切断された後、３９２番目に存在するシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体（Ｐｒｏ２量体）を形成する。
【００２７】
その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３１９番目と３２０番目のアミノ酸残基間で切断がおこり、ジスルフィド結合を持たないＮ末側段片のｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、２３番目のアミノ酸から３１９番目のアミノ酸までを含むペプチド）と配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣ末側断片（ｍａｔｕｒｅ領域）に分割される。
【００２８】
前記ｍａｔｕｒｅ領域は、ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域の切断後も、配列番号２の７３番目に残るシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体を形成する（以下、ｍａｔｕｒｅ２量体と表記する）。切断されたＮ末側のｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域の２分子は、このｍａｔｕｒｅ２量体１分子と非共有結合を介し複合体（以下、ｃｏｍｐｌｅｘ体とも言う）を形成し、その複合体の形で細胞から分泌される［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）］。ｍａｔｕｒｅ２量体及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域が結合した複合体のいずれも、ＢＭＰ９の機能を有している。
【００２９】
従って、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列のうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号２）を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号２）において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ならびに上述のｍａｔｕｒｅ２量体、及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域が結合した複合体も包含される。
【００３０】
前述のＢＭＰ９の機能としては、ＢＭＰ９の細胞内のシグナル伝達への関与をいう。細胞内のシグナル伝達では、ＢＭＰ９がＴＧＦβスーパーファミリーに属するタイプＩ及びタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、当該受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。
【００３１】
タイプＩ受容体としては、ＡＬＫ１及びＡＬＫ２が挙げられる。また、タイプＩＩ受容体としてはＢＭＰタイプＩＩ受容体（ＢＭＰＲＩＩ）、ａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩａ受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）、及びａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）が挙げられる。
【００３２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９、（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。
【００３３】
欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００３４】
ヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子としては、配列番号３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６２０４で示される塩基配列が挙げられる。そのうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する配列番号４で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号４で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００３５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００３６】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物又はオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００３７】
前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号４で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３８】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００３９】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００４０】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
【００４１】
配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
【００４２】
また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
【００４３】
さらに、配列番号１若しくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号１若しくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００４４】
本発明の抗体及び該抗体断片として、具体的には、以下の（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体、又は該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体若しくは該抗体断片が挙げられる。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）を含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）を含む抗体
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、下限は特に限定されないが、通常１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌ以上である。
【００４６】
本発明のモノクローナル抗体及び該抗体断片の結合解離定数（ＫＤ値）は、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定したセンサーグラムから、シングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により解析することで、算出することができる。
【００４７】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片とは、ヒトＢＭＰ９に前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体と同一又は部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片をいう。
【００４８】
前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体が結合するエピトープと同一又は部分的に同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片とは、前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる１の抗体が認識するヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片をいう。
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体及び該抗体断片として、具体的には、以下の（ｃ）及び（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体及び該抗体断片が挙げられる。
（ｃ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
【００５０】
さらに、本発明のモノクローナル抗体及び該抗体断片としては、前記（ｃ）及び（ｄ）から選ばれる１のモノクローナル抗体が結合するヒトＢＭＰ９に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片を挙げることができる。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体及び該抗体断片としては、具体的には、配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、１番目から３７番目までのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸に結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片が挙げられる。
【００５２】
本発明におけるヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を２つ含み、７３番目のシステイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。
【００５３】
本発明におけるＡＬＫ１としては、配列番号６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ４２６３７で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２２番目から１１８番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片が、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列又はその立体構造に結合することは、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ９又はヒトＢＭＰ９を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合活性を調べることができる方法などにより確認することができる。
【００５５】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）などを用いた表面プラズモン共鳴又はＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
【００５６】
抗原に対する抗体の結合解離定数（ＫＤ値）は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリー、いずれの方法からも、スキャッチャード・プロット、又は各装置の添付文書に従った解析を行うことで、求めることができる。
【００５７】
また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
【００５８】
ヒトＢＭＰ９を発現した組織としては、該ＢＭＰ９を発現していればいずれの組織でもよく、例えば、血液又は肝臓などが挙げられる。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００６０】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
【００６１】
エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
【００６２】
本発明のモノクローナル抗体及び該抗体断片は、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列若しくはその立体構造を認識し、かつ結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片、又はヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列若しくはその立体構造に結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片であることが好ましい。また、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列に含まれることが好ましい。
【００６３】
本発明におけるヒトＢＭＰ９の立体構造としては、配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。
【００６４】
ヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ９の天然型の立体構造のことをいう。
【００６５】
ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＢＭＰ９を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体を取得することができる。
【００６６】
抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
【００６７】
本発明における遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体としては、例えば、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
【００６８】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）からなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、前記のハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００６９】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００７０】
本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
【００７１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＢＭＰ９を特異的に認識し、かつヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００７２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００７３】
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体として具体的には、ＣＤＲ１〜３が配列番号２８〜３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３が配列番号３１〜３３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
【００７４】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
【００７５】
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
【００７６】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００７７】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。
【００７８】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
【００７９】
上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又は該抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又は該抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片に包含される。
【００８０】
欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１〜数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００８１】
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
【００８２】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、又はＬ−システインなどが挙げられる。
【００８３】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４−ジアミノブタン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００８４】
本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００８５】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００８６】
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
【００８７】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
【００８８】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させ、作製することもできる。
【００８９】
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
【００９０】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９１】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９２】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
【００９３】
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９４】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００９５】
本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９６】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００９７】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００９８】
本発明のモノクローナル抗体には、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的又は遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、又は定量用試薬として使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【００９９】
本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又は該抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又は該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【０１００】
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１０１】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、又は２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１０２】
低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０１０３】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【０１０４】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【０１０５】
これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的又は生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
【０１０６】
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのｅ−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０１０７】
蛋白質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素が挙げられる。
【０１０８】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有するＢＭＰ９が関与する疾患の治療剤に関する。
【０１０９】
ＢＭＰ９が関与する疾患としては、血液又は造血機能自体に原因がある一次性貧血、他の病気が原因でひき起こされる二次性貧血及び線維性疾患が挙げられる。一次性貧血としては、例えば、鉄欠乏性貧血、巨大赤芽球性貧血、溶血性貧血又は再生不良性貧血などが挙げられる。二次性貧血としては、例えば、腎疾患、感染症（例えば、結核、感染性心内膜炎又は肝膿瘍など）、膠原病（例えば、慢性関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスなど）、がんなどの悪性疾患、肝疾患又は内分泌疾患などが挙げられる。
【０１１０】
がんとしては、例えば、血液がん、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌又は膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液がん、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌又は前立腺癌が挙げられる。
【０１１１】
血液がんとしては、例えば、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞性リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＡＬＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬ）、その他リンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は、バーキットリンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
【０１１２】
肝疾患としては、例えば、肝線維症、慢性肝炎、肝硬変又は肝不全などが挙げられる。内分泌疾患としては、例えば、甲状腺機能低下症、副腎皮質機能低下症、下垂体機能低下症又は副甲状腺機能亢進症などが挙げられる。
【０１１３】
また線維性疾患とは、臓器組織の局所に線維成分が増加する線維化、及び、臓器の全体に広がる線維症を引き起こす疾患である。線維性疾患としては、肝臓、肺、腎臓、皮膚、骨髄、心膜又は血管等の組織で発生するものであれば、いずれでもよい。より具体的には、例えば、肝線維症、慢性肝炎、肝硬変若しくは肝不全を含む肝疾患、肺線維症、腎疾患、強皮症、骨髄線維症、心疾患又は血管線維症等が挙げられる。
【０１１４】
本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。
【０１１５】
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体若しくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
【０１１６】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与若しくは皮下投与を挙げられる。
【０１１７】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０１１８】
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１１９】
さらに、本発明は、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法に関する。
【０１２０】
本発明においてＢＭＰ９の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。
【０１２１】
免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。
【０１２２】
以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＢＭＰ９又はＢＭＰ９を発現した組織は、ＢＭＰ９全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＢＭＰ９を多量に発現しているヒト組織からＢＭＰ９を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＢＭＰ９の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１２３】
本発明で用いられるＢＭＰ９は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１２４】
まず、ＢＭＰ９をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【０１２５】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【０１２６】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１２７】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＢＭＰ９をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１２８】
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１２９】
また、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＢＭＰ９の生産率を向上させることができる。
【０１３０】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
【０１３１】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ  Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１３２】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１３３】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］が挙げられる。
【０１３４】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ  Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
【０１３５】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１３６】
宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
【０１３７】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
【０１３８】
以上のようにして得られるＢＭＰ９をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＢＭＰ９を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＢＭＰ９を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１３９】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたＢＭＰ９を得ることができる。
【０１４０】
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
【０１４１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。
【０１４２】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１４３】
ＢＭＰ９をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
【０１４４】
ＢＭＰ９の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるＢＭＰ９の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０１４５】
ＢＭＰ９が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＢＭＰ９を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１４６】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＢＭＰ９の生産量を上昇させることもできる。
【０１４７】
得られたＢＭＰ９は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
ＢＭＰ９が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１４８】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１４９】
ＢＭＰ９が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＢＭＰ９の不溶体を回収する。回収した該ＢＭＰ９の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＢＭＰ９を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１５０】
ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１５１】
また、本発明において用いられるＢＭＰ９は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１５２】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＢＭＰ９ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０１５３】
免疫は、動物の皮下、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１５４】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに２〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１５５】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０１５６】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。
【０１５７】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１５８】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１５９】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃にて、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７〜１４日間培養する。
【０１６０】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＢＭＰ９を含む抗原に反応し、ＢＭＰ９を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０１６１】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１６２】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラム又はプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
【０１６３】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１６４】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。
【０１６５】
（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＢＭＰ９をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いてもよい。
【０１６６】
抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１６７】
また、本発明のモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１６８】
さらに、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
【０１６９】
（６−ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
【０１７０】
得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＢＭＰ９をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
【０１７１】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
【０１７２】
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１７３】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０１７４】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。
【０１７５】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。
【０１７６】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。
【０１７７】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０１７８】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１７９】
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０１８０】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０１８１】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
【０１８２】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
【０１８３】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、又はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
【０１８４】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０１８５】
例えば、ＺＡＰ  ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ  Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。
【０１８６】
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。
【０１８７】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
【０１８８】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０１８９】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０１９０】
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０１９１】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。
【０１９２】
また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
【０１９３】
また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０１９４】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１９５】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。
【０１９６】
作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
【０１９７】
また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０１９８】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０１９９】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０２００】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０２０１】
次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０２０２】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
【０２０３】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
【０２０４】
又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
【０２０５】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２０６】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。
【０２０７】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０２０８】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
【０２０９】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２１０】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２１１】
例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２１２】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２１３】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えば、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。
【０２１４】
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。
【０２１５】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０２１６】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
【０２１７】
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
【０２１８】
例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
【０２１９】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
【０２２０】
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
【０２２１】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
【０２２２】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
【０２２３】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
【０２２４】
３．精製モノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
【０２２５】
ＢＭＰ９及びＢＭＰ９発現組織に対する結合活性は、前述の１−（６−ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６−ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
【０２２６】
４．本発明の抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ＢＭＰ９が関与する疾患の治療に用いることができる。
【０２２７】
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体若しくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０２２８】
投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０２２９】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。
【０２３０】
乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０２３１】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０２３２】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤又は噴霧剤などが挙げられる。
【０２３３】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
【０２３４】
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０２３５】
噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
【０２３６】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。使用する試薬類は、特に記載がない限り、添付文書に従い使用するものとする。
【実施例】
【０２３８】
［実施例１］
抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体の作製
１−１）ホモ接合型ＢＭＰ９ＫＯマウスの作製
ホモ接合型ＢＭＰ９ＫＯマウスは、国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例１−６に記載の方法に従い作製し、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体取得には、雌雄個体各１０匹を使用した。
【０２３９】
１−２）免疫原の調製
免疫原には、ｆｕｒｉｎ非切断体のヒトＢＭＰ９組換え蛋白質（ヒトＢＭＰ９  Ｐｒｏ２量体）を用いた。ヒトＢＭＰ９  Ｐｒｏ２量体は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２に記載のヒトＢＭＰ９発現ベクターとｆｕｒｉｎ阻害活性を持つａｌｐｈａ１−ＰＤＸ発現ベクターを２９３Ｆ細胞に共遺伝子導入させることにより作出した。培養上清からのヒトＢＭＰ９  Ｐｒｏ２量体の精製は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２に記載の方法に従い行った。
【０２４０】
用いたａｌｐｈａ１―ＰＤＸ発現ベクターは、［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、９５、７２９３（１９９８）］の論文に準じ、以下の方法で作製した。配列番号７はヒトａｌｐｈａ１−ＰＤＸ蛋白質のアミノ酸配列を示す。この配列をコードする配列番号８の塩基配列を、ｐＥＡＫ８ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （タカラバイオ社製）を用いて挿入し作製した。
【０２４１】
１−３）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
アジュバントに、ＲＩＢＩアジュバント（シグマ社製）、又はＡｌｕｍ＋百日咳ワクチンアジュバント（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１−２で調製したヒトＢＭＰ９  Ｐｒｏ２量体を抗原とする抗原懸濁液を添付文書に従い調製した後、実施例１−１で得られたＢＭＰ９  ＫＯ（−／−）マウスにｉ．ｐ．及びｓ．ｃ．経路で免疫した。免疫は、最終ブーストを含めて計３回又は４回行った。
【０２４２】
摘出した脾臓をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）中で細断した後、脾細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）により回収した。得られた脾細胞画分は、赤血球を含むことから、ＲＥＤ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）を添加し、氷上で処理することにより、赤血球を除去した。得られた脾細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；インビトロジェン社製）培地で２回洗浄した後、細胞融合に供した。
【０２４３】
１−４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株ｐ３−Ｕ１［Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５９７、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］をＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）にグルタミン（１．５ｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）及びＦＢＳ（１０％）を添加した培地（以下、正常培地と表記する）で培養し、細胞融合時に必要な細胞数（２×１０７個以上）を確保し、細胞融合に供した。
【０２４４】
１−５）ハイブリドーマの作製
実施例１−３で得られたマウス脾細胞と実施例１−４で得られた骨髄腫細胞を８：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分（細胞群）に対して、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−ＭＥＭ−ＤＭＳＯ）５００μＬを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、該細胞液にＭＥＭ培地５ｍＬを穏やかに揺らしながら加え、更にＭＥＭ培地を４５ｍＬ添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した。
【０２４５】
得られた沈殿画分（細胞群）を、ＨＡＴを含む正常培地を用いて９６ウェルプレートに２００μＬずつ播種した。このとき、脾細胞数がプレート１枚当たり１．５×１０６個／ｍＬになるように調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地交換は、ウェル内の細胞がスクリーニングに適した細胞数になるまで、ＨＡＴを含む正常培地を用いて適宜行った。
【０２４６】
１−６）抗ＢＭＰ９抗体産生ハイブリドーマの取得
抗ＢＭＰ９抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトＢＭＰ９を固相化させた固相抗原ＥＬＩＳＡ系を用いた。具体的には、実施例１−２で調製したヒトＢＭＰ９  Ｐｒｏ２量体、実施例３−１に記載のヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体、又はヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）にて２．０μｇ／ｍＬに調製したものを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
【０２４７】
固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９９９６８−３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。次に、一次抗体としてハイブリドーマ上清を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２４８】
このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４００倍希釈したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０２６０）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２４９】
このプレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度（４１５ｎｍ−４９０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
【０２５０】
上記のスクリーニングにて陽性と判断されたハイブリドーマは、Ｓ−ＣｌｏｎｅクローニングメデュームＣＭ−Ｂ（エーディア社製）を含むコンプリート培地にて限界希釈し、９６ウェルプレートに播種しクローン化を行った。クローン化は、１回目に陽性と判断したウェル由来のハイブリドーマに対して計１回行った。以上の操作により、２５５−１３−１３抗体を産生するハイブリドーマを単離した。
【０２５１】
１−７）ハイブリドーマのｅＲＤＦ培地への馴化
抗体を大量取得するため、ハイブリドーマの培地をクローニングメデュームからｅＲＤＦ培地［Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）１ｖ／ｖ％、Ｔｒａｎｓｆｅｌｉｎ  ５．５μｇ／ｍＬ、インシュリン  １０μｇ／ｍＬ、エタノールアミン  １．５３μｍｏｌ／Ｌ、及びＳｏｄｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｔｅ  ４．３ｎｇ／ｍＬを含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬製）］に、段階的に置換し、ハイブリドーマ細胞のｅＲＤＦ培地への馴化を行った。
【０２５２】
１−８）ハイブリドーマからの抗体の大量取得
実施例１−７で馴化したハイブリドーマを、大フラスコボトル１０本に播種した。培地にはｅＲＤＦ培地を用いた。３７℃にて６−８日間培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を０．２２μｍフィルターによりろ過した。
【０２５３】
フィルターでろ過した培養上清から、Ａｂ−Ｃａｐｔｕｒｅ（プロテノバ社製）を充填したオープンカラムを用いて、２５５−１３−１３抗体を精製した。
【０２５４】
［実施例２］
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による取得抗体の特異性の評価
取得した抗体のＢＭＰ９への特異性を確かめるため、ヒトＢＭＰ９及びヒトＢＭＰ９とホモロジーが最も高い分子であるヒトＢＭＰ１０への結合活性を比較する実験を行った。
【０２５５】
２−１）ｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域が結合した複合体の調製
評価には、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０共に、ｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域が結合した複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ体）を用いた。ヒトＢＭＰ９については、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２に記載のｃｏｍｐｌｅｘ体を、ヒトＢＭＰ１０については、国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例２０−２に記載のヒトＢＭＰ１０を、本実施例における“ｃｏｍｐｌｅｘ体”として調製した。
【０２５６】
２−２）固相抗原を用いたＥＬＩＳＡによる取得抗体の特異性の評価
実施例２−１で取得したヒトＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ体及びヒトＢＭＰ１０  ｃｏｍｐｌｅｘ体を、それぞれ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）にて３．０μｇ／ｍＬに調製したものを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
【０２５７】
固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９９９６８−３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、２５５−１３−１３抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて５００ｎｇ／ｍＬに調製した溶液を、一次抗体として５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２５８】
このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０４４７）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２５９】
このプレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェルで添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェルで添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果を図１に示す。
【０２６０】
図１に示すように、２５５−１３−１３抗体は、ヒトＢＭＰ９に強く結合するが、ヒトＢＭＰ１０には結合しないことが示された。この結果より、２５５−１３−１３抗体はヒトＢＭＰ９に特異的に結合する抗体であることが確認された。
【０２６１】
［実施例３］
固相抗原を用いたＥＬＩＳＡによる取得抗体のヒトＢＭＰ９に対する結合活性
３−１）ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体の調製
ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体発現ベクターは以下の手順で作製した。国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２−１で使用したｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９プラスミドをＮｈｅＩ及びＸｈｏＩを用いて酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。
【０２６２】
一方、ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体をコードするｃＤＮＡクローニングは、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２−１で使用したｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９プラスミドをテンプレートとして、配列番号９、１０に示したＦｗｄ／Ｒｖのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）を用い、９６℃にて２分間保温した後、９８℃にて１０秒間、５５℃にて５秒間、及び７２℃にて２分間を１サイクルとして３２サイクル反応を行った。切断したベクターと同様に、アガロースゲル電気泳動により、得られたインサートを精製した。
【０２６３】
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、インサートをｐＬＮ１Ｖ５ベクターに挿入してサブクローニングを行い、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅとした。配列番号１１及び１２に、ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体のアミノ酸配列及び塩基配列をそれぞれ示した。配列番号１３及び１４に、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅのＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ認識部位間へ挿入された塩基配列及び発現される蛋白質のアミノ酸配列をそれぞれ示した。
【０２６４】
ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製、Ｕ０４１４Ｂ）を用いてベクターを調製した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体を培養液中に発現させた。細胞上清を遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により取得した。
【０２６５】
続いて、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）を用いてヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体を精製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用い、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いた。
【０２６６】
ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、バッファーをＰＢＳに置換した。２８０ｎｍの吸光度を測定してヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体の濃度を決定した。分子吸光係数として、１．０５ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。
【０２６７】
３−２）固相抗原を用いたＥＬＩＳＡによる取得抗体の特異性の評価
実施例２−１で取得したヒトＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ体、実施例３−１で取得したヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を、それぞれ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）にて３．０μｇ／ｍＬに調製したものを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。
【０２６８】
固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９９９６８−３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【０２６９】
次に、２５５−１３−１３抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて５００ｎｇ／ｍＬに調製した溶液を、一次抗体として５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。  このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０４４７）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２７０】
このプレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェルで添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェルで添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果を図２に示す。
【０２７１】
図２に示すように、２５５−１３−１３抗体は、ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体には結合せず、ヒトＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ体及びヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体に結合することが示された。
【０２７２】
［実施例４］
取得した抗体のエピトープ解析
４−１）ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質及びヒトＢＭＰ１０蛋白質の調製
実施例２及び３の結果より、２５５−１３−１３抗体はヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域に結合するが、ヒトＢＭＰ９と最も高い相同性を有するヒトＢＭＰ１０には交差結合しないことが示された。次に、２５５−１３−１３抗体のエピトープ領域を探索する目的で、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の一部をヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域に置換したキメラ蛋白質を種々作製し、それらへの結合活性の有無を調べた。
【０２７３】
置換体を作製するにあたり、国際公開第２０１４／０５１１０９号の実施例２０に従い、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域（配列番号２）を３つの領域に分け、それぞれヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ａ、Ｂ及びＣと定義した。
【０２７４】
より具体的には、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ａは配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の１番目から３７番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ｂは配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の３８番目から７４番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ｃは配列番号２で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の７５番目から１１０番目までのアミノ酸配列である。
【０２７５】
またヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域についても、ＢＭＰ９との一次構造の相同性を基にして、対応する３つの領域に分け、それぞれヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ａ、Ｂ及びＣと定義した。  
【０２７６】
より具体的には、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ａは配列番号１５で表されるヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域の１番目から３６番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ｂは配列番号１５で表されるヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域の３７番目から７３番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ｃは配列番号１５で表されるヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域の７４番目から１０８番目までのアミノ酸配列である。
【０２７７】
これらの配列情報を基にして、ＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の領域Ａ、Ｂ及びＣのアミノ酸残基を、ＢＭＰ９と対応するＢＭＰ１０のアミノ酸残基に置換したキメラ蛋白質Ａ、Ｂ及びＣを設計した。
【０２７８】
ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質及びヒトＢＭＰ１０  ｃｏｍｐｌｅｘ体は国際公開第２０１４／０５１１０９号の実施例２０−２に従い、調製した。
【０２７９】
４−２）２５５−１３−１３抗体のＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質に対する特異的結合活性
取得したキメラ蛋白質を用いて、取得抗体の固相抗原ＥＬＩＳＡを行った。実施例２−１及び実施例４−１で調製したヒトＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ体、ＢＭＰ１０  ｃｏｍｐｌｅｘ体、ＢＭＰ９／１０キメラ組換え蛋白質Ａ、Ｂ及びＣを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液にて３μｇ／ｍＬに調製したものを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェル加え、４℃にて一晩静置して吸着させた。
【０２８０】
固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、２５５−１３−１３抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて５００ｎｇ／ｍＬに調製した溶液を、一次抗体として５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。
【０２８１】
このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０４４７）を５０μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置した。
【０２８２】
プレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて４５０、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２８３】
結果を表１に示す。表１内の＋及び−は、吸光度の値が１以上であった場合を＋とし、１未満であった場合を−とした。
【０２８４】
【表１】
2017025011.tif 000002
【０２８５】
表１に示すように、２５５−１３−１３抗体はヒトＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ体、ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ｂ及びヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ｃに対する結合に比べ、ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ａに対する結合はかなり弱かった。このことより、今回取得した２５５−１３−１３抗体は、ＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅのＡ領域を認識する抗体であることが分かった。
【０２８６】
これまで、Ａ領域のみを認識する抗体は報告されていない（国際公開第２０１４／０５１１０９号、国際公開第２０１４／００７１９８号）。従って、今回取得した２５５−１３−１３抗体は、既知抗体とは異なるエピトープを認識する抗体であることが明らかとなった。
【０２８７】
［実施例５］
取得抗体の各種ＢＭＰシグナルに対する阻害作用
２５５−１３−１３抗体がＢＭＰ９に対する特異的な中和抗体であることを再確認するため、各種ＢＭＰ蛋白質のシグナルを検出可能にした細胞（以下、ＢＭＰシグナル検出用細胞）を用いて、２５５−１３−１３抗体の各種ＢＭＰシグナルに対する阻害作用を検討した。
【０２８８】
５−１）ＢＭＰシグナルを検出可能にした細胞の作製
ＢＭＰシグナル検出用細胞は、Ｉｄ１−ＬｕｃプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に遺伝子導入させることにより作製した。
【０２８９】
Ｉｄ１−Ｌｕｃプラスミドは、ｐＮＬ４．０１［Ｎｌｕｃ＿ｍｉｎＰ＿Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ベクターを改変して作製）をＮｈｅＩサイトにより切断した後、配列番号１６に示される改変Ｉｄ１プロモーターの塩基配列をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）によって挿入することにより、作製した。
【０２９０】
ｐＮＬ４．０１［Ｎｌｕｃ＿ｍｉｎＰ＿Ｈｙｇｒｏ］ベクターは、ｐＮＬ２．１［Ｎｌｕｃ＿Ｈｙｇｒｏ］ベクターにｐＮＬ３．１［Ｎｌｕｃ＿ｍｉｎＰ］のｍｉｎＰ部分を移植して作製したベクターである。
【０２９１】
作製したＩｄ１−Ｌｕｃプラスミドは、エレクトロポレーション法にてＣＨＯ−Ｋ１細胞に遺伝子導入した。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅを５００μｇ／ｍＬとなるよう添加し、薬剤耐性株を選別することにより、Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞とした。
【０２９２】
５−２）取得抗体の各種ＢＭＰシグナルに対する阻害作用
９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒト各種ＢＭＰ  ｍａｔｕｒｅ２量体を終濃度で１０ｎｇ／ｍＬになるように、次いで２５５−１３−１３抗体希釈液を終濃度で１．０μｇ／ｍＬになるように添加した。
【０２９３】
ヒト各種ＢＭＰ  ｍａｔｕｒｅ２量体には、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ４、ヒトＢＭＰ６、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ１５、ヒトＧＤＦ５、ヒトＧＤＦ７（いずれもＲ＆Ｄシステムズ社製）を用いた。
【０２９４】
その後、Ｅｘｃｅｌｌ  ３２５培地［Ｅｘｃｅｌｌ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社製、Ｃａｔ＃１４３４０Ｃ−１０００ｍＬ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１×Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９３６７−３４）、０．５μｇ／ｍＬ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ］にて懸濁したＩｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞液を５×１０５個／ウェルになるように添加した。
【０２９５】
すべてのサンプル添加後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ測定液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を４０μＬ／ウェル加え撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。
【０２９６】
抗体の阻害活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ  ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ  ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図３に示す。
【０２９７】
図３に示すように、２５５−１３−１３抗体は、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ４、ヒトＢＭＰ６、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ１５、ヒトＧＤＦ５及びヒトＧＤＦ７によるシグナルは一切抑制せず、ヒトＢＭＰ９によるシグナルのみ特異的に抑制する抗体であることが明らかになった。
【０２９８】
［実施例６］
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いた新規取得抗体及び既知抗体のＢＭＰ９中和活性の比較
２５５−１３−１３抗体と既知抗体のＢＭＰ９に対する中和活性についてヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いて比較した。既知抗体には、１０Ｄ５−２−３抗体（国際公開２０１４／００７１９８号）を用いた。
【０２９９】
６−１）ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞の作製
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞（ＡＬＫ１／Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞）は、実施例５に記載のＢＭＰシグナル検出用細胞Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞に全長ヒトＡＬＫ１を強制発現させることにより作製した。
【０３００】
ヒトＡＬＫ１発現プラスミドは、両端にＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素サイトを持つヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡを、ｐＣＩ−ｎｅｏ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて組み込むことにより作製した。ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）は、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーとプライマーＦｗｄ／Ｒｖ（配列番号１８、１９）を用いたＰＣＲにより作製した。
【０３０１】
作製したヒトＡＬＫ１発現プラスミドは、エレクトロポレーション法にてＩｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞に導入した。Ｇ４１８を５００μｇ／ｍＬとなるよう添加し、薬剤耐性株を選抜することにより、ＡＬＫ１／Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞とした。
【０３０２】
６−２）新規取得抗体及び既知抗体のＢＭＰ９中和活性の比較
９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を終濃度で０．３ｎｇ／ｍＬになるように、次いでＢＭＰ９抗体（２５５−１３−１３抗体又は１０Ｄ５−２−３抗体）希釈液を終濃度で１０、３０、１００、３００、１０００又は３０００ｎｇ／ｍＬになるように添加した。
【０３０３】
その後、Ｅｘｃｅｌｌ  ３２５培地にて調製したＡＬＫ１／Ｉｄ１−Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞懸濁液を５×１０５個／ウェルになるように添加した。すべてのサンプル添加後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。
【０３０４】
２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ測定液を４０μＬ／ウェル加え、撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。抗体の阻害活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ  ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図４に示す。
【０３０５】
図４に示すように、いずれの抗体もＢＭＰ９に対する阻害作用を示した。１０Ｄ５−２−３抗体は、ＢＭＰ９活性を９０％以上阻害するために１０００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度が必要であったのに対し、２５５−１３−１３抗体は３０ｎｇ／ｍＬ以上の添加でＢＭＰ９活性をほぼ完全に阻害した。
【０３０６】
以上の結果より、２５５−１３−１３抗体は、既知抗体よりも著しくＢＭＰ９中和活性が向上した抗体であることが明らかになった。
【０３０７】
［実施例７］
正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの赤血球造血に対する取得抗体の作用
ＢＭＰ９抗体には赤血球増加作用があることが知られている（国際公開第２０１４／００７１９８号）。そこで、２５５−１３−１３抗体及び既知抗体の赤血球増加作用を比較した。
【０３０８】
既知抗体には、１０Ｄ５−２−３抗体（国際公開２０１４／００７１９８号）を用いた。実験には８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社製）を用いた。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＣＥ−２（日本クレア社製）を自由摂取で与えた。
【０３０９】
予備飼育後、体重を指標にして、５群に群分けし（各群ｎ＝８）、２５５−１３−１３抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体を０．２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．０２ｍｇ／ｍＬ又は０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを１０ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群にはＰＢＳを１０ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。
【０３１０】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で計４回投与した。初回投与から４週間後、イソフルラン麻酔下にて開腹後、後大静脈より採血を行い、ＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとした。得られた血液サンプルを生理食塩水にて２倍希釈し、自動血球計数装置ＡＤＶＩＡ１２０（バイエルメディカル社製）を用いて、赤血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。結果を図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示す。
【０３１１】
図５（Ａ）に示すように、１．０ｍｇ／ｋｇ投与群では、２５５−１３−１３抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体のいずれも、コントロール群に対して有意に赤血球数を増加させた。図５（Ｂ）に示すように、２５５−１３−１３抗体は、０．２ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ投与群のいずれも、ともにコントロール群に対して有意にヘモグロビン濃度を増加させ、１０Ｄ５−２−３抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇ投与群において、コントロール群に対して有意にヘモグロビン濃度を増加させた。
【０３１２】
以上の結果より、２５５−１３−１３抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても既存の抗体の活性を上回る抗体であることが示された。
【０３１３】
［実施例８］
取得抗体のＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子配列の単離
８−１）２５５−１３−１３抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの調製並びにＶＨ及びＶＬの遺伝子クローニング
２５５−１３−１３抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの調製及びＶＨ及びＶＬの遺伝子クローニングは、国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例１９に記載の方法に従い、実施した。
【０３１４】
８−２）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体Ｖ領域の遺伝子配列の解析
実施例８−１で得られた２５５−１３−１３抗体のＶＨのシグナル配列を含む全塩基配列を配列番号２０に、該配列から推定された、ＶＨのシグナル配列を含む全アミノ酸配列を配列番号２１に、ＶＬのシグナル配列を含む全塩基配列を配列番号２２に、該配列から推定された、ＶＬのシグナル配列を含む全アミノ酸配列を配列番号２３にそれぞれ示す。
【０３１５】
また、２５５−１３−１３抗体について、配列番号２０で表される塩基配列からシグナル配列を除いたＶＨ塩基配列を配列番号２４に、配列番号２２で表される塩基配列からシグナル配列を除いたＶＬ塩基配列を配列番号２５に、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からシグナル配列を除いたＶＨアミノ酸配列を配列番号２６に、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からシグナル配列を除いたＶＬアミノ酸配列を配列番号２７にそれぞれ示す。
【０３１６】
既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む２５５−１３−１３抗体をコードする完全長ｃＤＮＡであることが確認できた。
【０３１７】
２５５−１３−１３抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。２５５−１３−１３抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２８、２９及び３０に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１、３２及び３３にそれぞれ示す。
【０３１８】
［実施例９］
取得抗体のキメラ抗体作製及びビアコアによる結合活性の評価
９−１）２５５−１３−１３キメラ抗体の作製
２５５−１３−１３抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡをヒトγ鎖の定常領域と結合させ、当該抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡをヒトκ鎖の定常領域と結合させ、それぞれ、抗体発現ベクター（Ｎ５ＫＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ社製）のＳａｌＩ及びＢａｍＨＩサイト間、並びにＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩサイト間に挿入した。
【０３１９】
抗体発現ベクターに挿入した２５５−１３−１３キメラ抗体の重鎖塩基配列及び軽鎖塩基配列を配列番号３４、３５に、これによって発現する２５５−１３−１３キメラ抗体の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を配列番号３６、３７にそれぞれ示す。
【０３２０】
作製した発現ベクター及びＥｘｐｉ２９３Ｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて組換えキメラ抗体を発現させた。培養上清から、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて抗体を精製した。
【０３２１】
ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いてバッファーをＤ−ＰＢＳ（−）に置換した後、２８０ｎｍの吸光度を測定して抗体の濃度を決定した。分子吸光係数として、１．５９ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。
【０３２２】
９−２）ビアコアによる２５５−１３−１３キメラ抗体のヒトＢＭＰ９蛋白質への結合活性の評価
実施例９−１で得られた２５５−１３−１３キメラ抗体と、既知抗体である１０Ｄ５−２−３キメラ抗体（国際公開２０１４／００７１９８号）のヒトＢＭＰ９に対する結合活性を比較することを目的とし、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）によるＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。
【０３２３】
Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に固定化した。
【０３２４】
Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、１μｇ／ｍＬに調製した２５５−１３−１３キメラ抗体又は１０Ｄ５−２−３キメラ抗体を１０μＬ／分の流速で３０秒間添加した。
【０３２５】
次いで、１００ｎｇ／ｍＬより４倍希釈で段階的に５濃度にて調製したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質を３０μＬ／分の流速で、結合反応を２分間、解離反応を１５分間モニターした。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。
【０３２６】
算出された各抗体の結合速度定数（ｋａ１）、解離速度定数（ｋｄ１）及び解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］を表２に示す。
【０３２７】
【表２】
2017025011.tif 000003
【０３２８】
表２に示すように、２５５−１３−１３キメラ抗体は、ヒトＢＭＰ９蛋白質に対し、１．１Ｅ−１１程度の特異的な結合活性を有していることが確認された。また、その結合活性は、１０Ｄ５−２−３キメラ抗体よりもＫＤ値として２倍程度強いものであった。
【配列表フリーテキスト】
【０３２９】
配列番号１：ヒトＢＭＰ９蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号２：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＢＭＰ９蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号４：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号５：ヒトＢＭＰＲＩＩのアミノ酸配列
配列番号６：ヒトＡＬＫ１のアミノ酸配列
配列番号７：ヒトａｌｐｈａ１−ＰＤＸ蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号８：ヒトａｌｐｈａ１−ＰＤＸ蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号９：ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域に特異的なプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号１０：ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ領域に特異的なプライマーＲｖの塩基配列
配列番号１１：ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体のアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１２：ヒトＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ体をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１３：ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅのＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ認識部位間へ挿入された塩基配列
配列番号１４：ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅによって発現される蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１５：ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号１６：ｐＮＬ４．０１ベクターに挿入された改変Ｉｄ１プロモーターの塩基配列
配列番号１７：ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡ
配列番号１８：ヒトＡＬＫ１に特異的なプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号１９：ヒトＡＬＫ１に特異的なプライマーＲｖの塩基配列
配列番号２０：２５５−１３−１３抗体のＶＨ全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号２１：２５５−１３−１３抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号２２：２５５−１３−１３抗体のＶＬ全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号２３：２５５−１３−１３抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号２４：２５５−１３−１３抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２５：２５５−１３−１３抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２６：２５５−１３−１３抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２７：２５５−１３−１３抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２８：２５５−１３−１３抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号２９：２５５−１３−１３抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号３０：２５５−１３−１３抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３１：２５５−１３−１３抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号３２：２５５−１３−１３抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号３３：２５５−１３−１３抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３４：抗体発現ベクターに挿入した２５５−１３−１３  キメラ抗体重鎖塩基配列
配列番号３５：抗体発現ベクターに挿入した２５５−１３−１３  キメラ抗体軽鎖塩基配列
配列番号３６：発現させた２５５−１３−１３  キメラ抗体重鎖アミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号３７：発現させた２５５−１３−１３  キメラ抗体軽鎖アミノ酸配列（シグナル配列除く）
【図１】
2017025011.tif 000004
【図２】
2017025011.tif 000005
【図３】
2017025011.tif 000006
【図４】
2017025011.tif 000007
【図５】
2017025011.tif 000008
【配列表】
2017025011000001.app