(57)【要約】【課題】牛越菌等のリゾプス属の菌株の発酵生産物に特徴的に含まれる生理活性成分を特定し、その比活性を定量化するとともに、発酵生産物が様々な生理活性をもたらす基盤を科学的に明らかにすること。【解決手段】プロスタグランジンF２αを活性成分として含有するリゾプス菌の発酵生産物を含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物、リゾプス菌の発酵生産物の新規な製造方法、及び、リゾプス菌の発酵生産物の生理活性の評価方法であって、プロスタグランジンF２αの含有量を測定し、該測定値に基づき生理活性を評価することを含む、前記評価方法等。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾプス菌の発酵生産物を含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物。
【請求項２】
リゾプス菌の発酵生産物がプロスタグランジンF２αを活性成分として含有するものであることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
リゾプス菌が牛越菌（受託番号FERM - P03646）である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
発酵生産物が以下の特性：
１．水分41.8%の状態における組成： アミノ態窒素化合物21.5%、糖 33.0%、灰分 3.4%；
２．紫外線吸収スペクトル：  210nmおよび280nmに極大吸収を有する；
３．赤外線吸収スペクトル：  CO-NH、COOH、C-OHの存在が認められる；
４．溶剤に対する溶解性：  水に可溶、アルコールに僅かに可溶；
５ ．pH安定性：  pH2〜12で安定；
６．温度安定性：  100〜120℃、30分間の処理で安定；及び
７．水溶液の色調：  無色〜淡褐色、
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
プロスタグランジンF２αを活性成分として含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物。
【請求項６】
更年期障害が、血管運動神経障害様症状、ゆううつ、及び/又は頭痛の症状を伴う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
リゾプス菌の発酵生産物の製造方法であって、以下の工程：
（１）リゾプス菌の培養；
（２）水又は温水による抽出；
（３）抽出液の濃縮及び／又は分離精製；及び
（４）高温高圧による滅菌処理、
を含む、前記方法。
【請求項８】
リゾプス菌が牛越菌（受託番号FERM - P03646）である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
高温高圧の滅菌工程を、１１５〜１２１℃、１．５〜２．０気圧下で、１５〜１２０分間行う、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
リゾプス菌の発酵生産物の生理活性の評価方法であって、プロスタグランジンF２αの含有量を測定し、該測定値に基づき生理活性を評価することを含む、前記評価方法。
【請求項１１】
プロスタグランジンF２αの含有量を、ＥＬＩＳＡ測定キットによる定量的測定、又はプロスタグランジンF２α受容体（FR）を発現している細胞内のMAPKのリン酸化アッセイによる半定量的測定により測定する、請求項1０に記載の方法。
【請求項１２】
肝細胞株に於けるCYP1A1遺伝子発現誘導活性に基づく、リゾプス菌による発酵生産物の生理活性の評価方法。
【請求項１３】
CYP1A1遺伝子発現誘導活性を、定量的リアルタイム RT-PCRによるCYP1A1遺伝子発現レベル、又は、レポーターアッセイによるCYP1A1遺伝子の転写レベルで測定する、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾプス属の菌株を用いた発酵によって得られる、プロスタグランジン類を生理活性物質として含有する発酵生産物を含む医薬組成物、及び、該組成物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、ケカビ目のクモノスカビ科に属する菌類を用いた発酵生産物は、インドネシアをはじめとする東南アジアや岡山県などで、「テンペ」として古来より食されてきた。このようなクモノスカビ科に分類されるリゾプス属の菌株の一種であるリゾプス（Rhizopus）Ｕ−１（（株）牛越生理学研究所によって工業技術院微生物工業技術研究所に昭和５１年７月２７日付で寄託され、現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託されており、受託番号：FERＭ -P03646が付与されている。）による発酵生産物には、当初、鶏の産卵数が増加することからその活性が見出され、その後、牛、馬、豚などの家畜でも発情促進、受胎率向上などの生理活性・効果が認められている。更に、魚類への効果を検証した結果、成長促進、性成熟の促進、産卵数の増加などの様々な効果が認められている。以下、本明細書に於いて、上記リゾプス（Rhizopus）Ｕ−１を、単に「牛越菌」ともいう。
【０００３】
より具体的には、牛越菌による発酵生産物が有する作用・効果として、哺乳幼動物用下痢症予防治療効果（特許文献１）、動物細胞生育（増殖）促進効果（特許文献２）、動物に対する老化防止作用（特許文献３）、中性糖及び酸性糖等によるマイトジェン活性（特許文献４）、及び離乳子豚における離乳ストレスの緩和作用（非特許文献１）等を挙げることが出来る。
【０００４】
更に、近年、牛越菌の発酵生産物が動物の皮膚疾患を改善するサプリメントとして有効であることが示され（特許文献５）、原因不明の全身脱毛を起こしたポメラニアンなどに対して、劇的な発毛育毛効果が示された（非特許文献２）。
【０００５】
又、従来、兎を用いた動物実験の結果から、リゾプス属に属するある菌体又はその発酵物から有機溶剤可溶物を除去した水抽出物に、卵巣又は精巣のホルモン合成を促進する物質が含まれ、該物質は下垂体を刺激して、黄体形成ホルモンの放出量を促進増加したため、黄体形成ホルモンの生理作用により、卵巣及び精巣のホルモン合成能を高めていると考えられていた（特許文献６）。
【０００６】
一方で、リゾプスその他の糸状菌の培養培地でプロスタグラジンＦ2α（PGF2α）等のプロスタグランジン類の代謝生産が確認されている（非特許文献３）が、これら菌株の中に本発明に係る牛越菌は含まれていない。更に、それら菌株による発酵生産物による生理活性作用・効果に関しては何ら明らかにされていない。更に、Rhizopus oryzae KSD-815株の培養によって生産されるマイトジェン（MAPKやp38のリン酸化誘起成分）により、前立腺がんにおけるアポトーシスが誘発されることが示されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第１２６８５６６号明細書
【特許文献２】特許第３０２９３３１号明細書
【特許文献３】特開平５−９７７００号公報
【特許文献４】特開２００１−７８７９６号公報
【特許文献５】特開２００２−１５４９７５号公報
【特許文献６】特公昭４５−１２７５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「離乳子豚へのRhizopus oryzae水抽出物の給与が離乳ストレスに及ぼす影響」、日本養豚学会（2013.10.11）
【非特許文献２】「Rhizopus麹由来物質の投与により発毛を認めた脱毛症Xのポメラニアンの1例」、日本獣医皮膚科学会（2015.3.15）
【非特許文献３】“Production of Prostaglandins and Leukotrienes by Pathogenic Fungi”        Mairi C. Noverr, Galen B. Toews, and Gary B. Huffnagle, Infect Immun. 2002 Jan; 70(1): 400-402. PMCID: PMC127633
【非特許文献４】“γ-linolenic acid methyl ester from Rhizopus oryzae KSD-815 Isolated from Nuruk induces apoptosis in prostate cancer LNCaP cells”, Sang-Jin Lee, Sungyoul Hong, Gye-Won Kim, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, December 2010, Volume 53, Issue 6, pp 752-760
【非特許文献５】“Protective effect of aqueous extracts from Rhizopus oryzae on liver injury induced by carbon tetrachloride in fats”, Takehito Suzuki, Hideo Fukuoka, Setsuo Ushikoshi, Reiichiro Sato, Hidetoshi Morita and Tatsuya Takizawa, ANIMAL SCIENCE JOURNAL  2015,  86 (5), 532-540
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上に挙げたような牛越菌の発酵生産物が示す様々な生理活性作用・効果は、リゾプス属に属する他のいくつかの菌株による発酵生産物にも共通して見られることが示されている。
【００１０】
一方、一般的なクモノスカビ発酵生産物では、このような生理活性作用・効果は認められない。又、牛越菌の発酵生産物の様々な生理活性作用・効果は動物、魚類等で確認されているが、ヒトへの生理活性作用・効果はこれまで明確になっていなかった。
【００１１】
牛越菌を含む数種類のリゾプス菌の発酵生産物には以上に示したような様々な作用・効果が認められるにもかかわらず、これまで、その活性成分を特定することができず、その有効性を科学的に立証することができなかった。  
【００１２】
このため、科学的根拠に基づいて比活性を表示する手段がなく、製造方法の至適化もできなかった。又、科学的根拠に基づいた活性表示、品質管理を行うことができず、生産方法の管理は経験に基づくものに頼らざるを得なかった。更に、ヒトへの適用を目指した商品（医薬品、医薬部外品、食品添加物、健康食品、機能性表示食品 等）の開発は躊躇せざるを得なかった。
【００１３】
従って、牛越菌等のリゾプス属の菌株の発酵生産物に特徴的に含まれる生理活性成分を特定し、その比活性を定量化するとともに、発酵生産物が様々な生理活性をもたらす基盤を科学的に明らかにし、上記の課題を解決することが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、牛越菌の発酵生産物と複数の一般的なクモノスカビ発酵生産物のメタボローム解析による比較から、牛越菌の発酵生産物が示す生理活性作用・効果は、少なくともプロスタグランジンF２αに由来するものであることを確認し、更に、このようなプロスタグランジンF２αを含有する牛越菌の発酵生産物が、予想外にも、更年期障害、ホルモンバランスの異常による不調・愁訴等に対する治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明は、より具体的には以下の態様を提供するものである。
[態様１]
リゾプス菌の発酵生産物を含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物。
[態様２]
リゾプス菌の発酵生産物がプロスタグランジンF２αを活性成分として含有するものであることを特徴とする、態様１記載の医薬組成物。
[態様３]
リゾプス菌が牛越菌（受託番号FERM - P03646）である、態様１又は２記載の医薬組成物。
[態様４]
発酵生産物が以下の特性：
１．水分41.8%の状態における組成： アミノ態窒素化合物21.5%、糖 33.0%、灰分 3.4%；
２．紫外線吸収スペクトル：  210nmおよび280nmに極大吸収を有する；
３．赤外線吸収スペクトル：  CO-NH、COOH、C-OHの存在が認められる；
４．溶剤に対する溶解性：  水に可溶、アルコールに僅かに可溶；
５ ．pH安定性：  pH2〜12で安定；
６．温度安定性：  100〜120℃、30分間の処理で安定；及び
７．水溶液の色調：  無色〜淡褐色、
を有する、態様１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[態様５]
プロスタグランジンF２αを活性成分として含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物。
[態様６]
更年期障害が、血管運動神経障害様症状、ゆううつ、及び/又は頭痛の症状を伴う、態様１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[態様７]
リゾプス菌の発酵生産物の製造方法であって、以下の工程：
（１）リゾプス菌の培養；
（２）水又は温水による抽出；
（３）抽出液の濃縮及び／又は分離精製；及び
（４）高温高圧による滅菌処理、
を含む、前記方法。
[態様８]
リゾプス菌が牛越菌（受託番号FERM - P03646）である、態様７記載の製造方法。
[態様９]
高温高圧の滅菌工程を、１１５〜１２１℃、１．５〜２．０気圧下で、１５〜１２０分間行う、態様７又は８記載の方法。
[態様１０]
リゾプス菌の発酵生産物の生理活性の評価方法であって、プロスタグランジンF２αの含有量を測定し、該測定値に基づき生理活性を評価することを含む、前記評価方法。
[態様１１]
プロスタグランジンF２αの含有量を、ＥＬＩＳＡ測定キットによる定量的測定、又はプロスタグランジンF２α受容体（FR）を発現している細胞内のMAPKのリン酸化アッセイによる半定量的測定により測定する、態様1０に記載の方法。
[態様１２]
肝細胞株に於けるCYP1A1遺伝子発現誘導活性に基づく、リゾプス菌による発酵生産物の生理活性の評価方法。
[態様１３]
CYP１A1遺伝子発現誘導活性を、定量的リアルタイム RT-PCRによるCYP1A1遺伝子発現レベル、又は、レポーターアッセイによるCYP1A1遺伝子の転写レベルで測定する、態様１２記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、牛越株の発酵生産物の活性成分（生理活性物質）の少なくとも一つがプロスタグランジンF２αであることが特定され、その作用・活性の原因物質が科学的に立証された。プロスタグランジンF２αは、抗体を用いるＥＬＩＳＡキット等によって簡便に定量することが可能であるため、牛越菌の発酵生産物の生理活性等を定量・評価することが可能となった。
【００１７】
その結果、上記発酵生産物の品質管理、及び、その製造方法（培養、抽出、濃縮、滅菌等の各過程を含む）の至適化が可能となり、科学的根拠に基づいた製造・管理も可能となった。更に、その活性を客観的に表示することが可能となった。
【００１８】
また、牛越菌の発酵生産物のヒトへの適用を模索した結果、牛越菌の発酵生産物が、更年期障害、ホルモンバランスの異常による不調・愁訴等に対する治療効果を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】リゾプス菌の発酵生産物のメタボローム解析の結果を示す図。
【図２】牛越菌の発酵生産物に特徴的に出現するピークの精密質量クロマトグラムの結果を示す図。
【図３】本発明の発酵生産物のELISAでの定量結果を示す図（検量線、定量結果）。
【図４】本発明の発酵生産物のウェスタンブロット解析によるMAPKアッセイの結果を示す電気泳動の写真。
【図５】本発明の発酵生産物の定量的リアルタイム RT-PCRによるCYP1A1アッセイの結果を示す図。
【図６】本発明の発酵生産物のレポーターアッセイによるCYP1A1遺伝子発現の評価の結果を示す図。
【図７】本発明の発酵生産物の製造工程における高温高圧滅菌処理が、該発酵生産物のプロスタグランジンF２α含量及びMAPKを介したシグナル惹起活性に与える影響を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、リゾプス菌の発酵生産物を含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための（更年期障害の予防・治療・軽減を目的として使用する）医薬組成物又は食品に係る。
【００２１】
ここで、「リゾプス菌の発酵生産物」とは、例えば、本明細書に引用した各特許文献に記載されているような、当業者に公知の任意のリゾプス属の各種菌による発酵物からの水（または温水）抽出物質である。尚、これら各種菌は、公益財団法人  発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）、又は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ：千葉県木更市かずさ鎌足２−５−８）等の公的な寄託機関に寄託されており、それら寄託機関から容易に入手可能である。
【００２２】
リゾプス菌の発酵生産物は、特に、プロスタグランジンF２αを活性成分として含有するものであることが好ましい。この好適なリゾプス菌の一例として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託されている牛越菌（受託番号：FERM - P03646）を挙げることが出来る。既に記載したように、牛越菌の発酵生産物には、これまでに様々な生理活性機能が確認されているが、ヒトを対象とした、更年期障害の予防・治療・軽減に関連するか、又は、これらの用途を予想させるような作用・活性はこれまでに知られていない。
【００２３】
尚、特許文献２等に記載されているように、本発明の発酵生産物が有する代表的な特性は以下の通りである。尚、各値は、当業者に公知の方法・手段で測定した。
１．水分41.8%の状態における組成： アミノ態窒素化合物21.5%、糖 33.0%、灰分 3.4%；
２．紫外線吸収スペクトル：  210nmおよび280nmに極大吸収を有する；
３．赤外線吸収スペクトル：  CO-NH、COOH、C-OHの存在が認められる；
４．溶剤に対する溶解性：  水に可溶、アルコールに僅かに可溶；
５ ．pH安定性：  pH2〜12で安定；
６．温度安定性：  100〜120℃、30分間の処理で安定；及び
７．水溶液の色調：  無色〜淡褐色。
【００２４】
尚、本明細書の実施例１に示されるように、牛越菌の発酵生産物には、活性成分（生理活性物質）として、少なくともプロスタグランジンF２αが含有されていることが確認された。
【００２５】
これまで、プロスタグランジンF２αの活性作用として知られているのは、黄体退行による排卵誘発、子宮・気管支及び血管における収縮作用である。具体的には、プロスタグランジンF２αはヒトでは陣痛誘発・陣痛促進・分娩促進等のために子宮収縮剤として使用され、畜産においては繁殖に際して利用される。
【００２６】
従って、本発明は、プロスタグランジンF２αに関して、本発明者によって新たに見出された生理活性に基づき、該化合物（又は、その塩若しくはエステル等）を活性成分として含有する、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物又は食品にも係るものである。この場合には、プロスタグランジンF２αの由来・原料は特に制限はなく、化学合成品も含まれる。従って、プロスタグランジンF２αを活性成分として含む、更年期障害の予防・治療・軽減のための医薬組成物又は食品に於いて、該活性成分の由来・原料はリゾプス菌の発酵生産物に限定されるものではない。
【００２７】
ここで、「更年期障害」とは、一般的に、女性では、閉経に伴い女性ホルモンであるエストロゲンが低下することにより発生する。一方、男性では、概ね、４０歳以降、加齢やストレスなどにより男性ホルモンであるテストステロンが低下することにより発生する。
【００２８】
更年期障害の典型的な症状としては、女性の場合、自律神経失調症様の症状、頻脈、動悸、血圧の上下、腹痛、微熱、ほてり・のぼせ、多汗、頭痛、めまい、耳鳴り、肩こり、不眠、疲労感、口の渇き、のどのつかえ、息切れ、下痢、便秘、腰痛、しびれ、知覚過敏、関節痛、筋肉痛、性交痛、生理不順などの他に、ヒステリー情緒不安定やイライラ、抑うつ気分など精神的な症状を挙げることが出来る。特に、例えば、以下の実施例６で具体的に示されるような、血管運動神経障害様症状、ゆううつ、及び頭痛などの症状を挙げることができる。
【００２９】
一方、男性の場合には、性欲の低下、勃起障害などの性機能関連症状、抑うつ感、落胆、不安、疲労感、記憶力・集中力低下などの精神・心理症状、並びに、発汗、ほてり、睡眠障害、関節・筋肉関連の症状などの身体症状がある。
【００３０】
尚、本発明の発酵生産物の急性毒性を、雄マウス及びラットの経口投与で調べたところ、毒性が極めて低いことが確認されている。具体的には、マウスにおける単回投与毒性試験における経口投与による概算のLD５０値は雌雄ともに2000mg/10mL/kg以上であった。又、細菌を用いる復帰突然変異試験では突然変異誘発能を有さないことが確認された。更に、マウスを用いる小核試験においては小核を誘発しないことが確認されている。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の任意の常法により、錠剤、顆粒剤、散剤（粉剤）、コーティング剤、糖衣錠、カプセル剤等、或いは、シロップ等の液剤等の各種製剤に調剤化することが出来る。従って、本発明はこのような製剤にも係るものである。
【００３２】
尚、製剤の調剤化には、投与経路及び使用目的等に応じて、当業者に公知の適当な担体、例えば、乳糖、澱粉、ブドウ糖、ショ糖、セルロース、セルロース誘導体、脂肪酸グリセリド、水、アルコール等が用いられる。更に、これら製剤及び本発明の医薬組成物には、上記各種物質に加えて、必要に応じて、当業者に公知の任意の賦形剤、安定剤、乳化剤、結合剤、滑沢剤等を適宜含有させることが出来る。
【００３３】
因みに、本発明の医薬組成物の投与経路に特に制限はない。又、用量は、投与対象の種類・体重・年齢・症状、及び使用方法・投与経路等により異なるが、原料としてのリゾプス菌の発酵生産物の量として、一日当たり、通常は、0.01mg〜500ｇ／Kg（体重）、好ましくは、10〜500ｍｇ／Kg（体重）である。好適な対象は、哺乳類、特に、ヒトである。
【００３４】
又、本発明のリゾプス菌の発酵生産物又はプロスタグランジンF２αを、特定保健用食品、及び機能性表示食品等又はそれらの含有成分として使用する際には、タンパク質、糖質、脂質及びミネラル等の各種の栄養成分；各種ビタミン類及びそれらの誘導体；微生物、植物又は動物由来の各種抽出物等の健康食品素材；並びに、酸味料、甘味料、賦形剤、界面活性剤、滑沢剤、補助剤、酸味料、甘味料、矯味剤、香料、着色剤、及び安定化剤などの、食品衛生法第10条に基づく各種の指定添加物または既存添加物、一般飲食物添加物リストに収載されている、食品成分（食品添加物）として許容されるその他の任意の成分を含むことが出来る
【００３５】
既に述べたように、本発明のリゾプス菌の発酵生産物は、培養、抽出、濃縮、分離精製、及び、滅菌等の当業者に公知の各種の工程を含む任意の方法で製造することが出来る。
【００３６】
例えば、培養は、常法に従い、固体又は液体培地を用いる好気性培養により行うことができる。培地組成は蒸煮ふすま、大麦粉砕物、米糠、脱脂大豆、綿実粉等をベースとし、これに澱粉、グルコース、アラビノース、キシロース等の糖類、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキス等の窒素源、無機リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の無機塩類を添加することができる。中でも好ましい培地は、ふすま‐大麦に水を加えた培地である。蒸気滅菌した含水培地に、例えば、麦芽寒天培地のような当業者に公知の適当な培地で予め培養した種菌を植え、温度約１０〜４２℃、好ましくは約２６〜２８℃、約pH４〜９、好ましくは約４〜７で、約２〜１０日間好気性条件下で培養する。目的とする発酵生産物は菌体内に蓄積され、一般に約３〜８日の培養で最高に達する。
【００３７】
培養物から発酵生産物を取得するには、水、好ましくは60〜80℃の熱水による約１〜数時間程度の抽出が行われる。例えば、培養物を粉砕し、水を加え攪拌下に適宜加熱する。得られる水性混合物を濾過又は遠心分離等に付し、抽出液を分離する。かくして得られる水性抽出液に対して、必要に応じて、濃縮、並びに、フィルター、ろ布及びろ紙等による各種の濾過、デカンタ、透析、及び遠心分離のような適当な分離精製操作、及び、高温高圧滅菌処理等を行い、液体状の発酵生産物を得る。その後、凍結乾燥及び噴霧乾燥等から選択される適当な手段で乾燥させて、粉末状の発酵生産物を得る。以上の発酵生産物を医薬組成物の原料として使用することができるが、更に、例えば、ゲルろ過、イオン交換、逆相、アフィニティ等を適当に組み合わせたカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。
【００３８】
更に、本明細書の実施例５に示されるように、本発明者はリゾプス菌の発酵生産物の製造方法に於いて、高温高圧による滅菌処理を行うことによって、活性成分であるプロスタグランジンF２αの発酵生産物中の比活性が有意に高くなることを見出した。
【００３９】
従って、リゾプス菌の発酵生産物の新規な製造方法として、以下の工程：
（１）リゾプス菌の培養；
（２）水又は温水による抽出；
（３）抽出液の濃縮及び／又は分離精製；及び
（４）高温高圧による滅菌処理、
を含む、前記製造方法を挙げることが出来る。
【００４０】
上記の製造方法に於ける高温高圧による滅菌処理は、通常、例えば、約１１５〜１２１℃の温度範囲、約１．５〜２．０気圧の圧力範囲で、約１５〜１２０分間行うものであり、特に、約１２１℃及び約２．０気圧で約２０分間の処理が好ましい。又、濃縮及び／又は分離精製の順序、回数、種類及びそれらの実施条件等は当業者が適宜、選択することが出来る。更に、これらの操作の一部または全てを高温高圧による滅菌処理の前後のいずれか、またはその前後で実施することが出来る。
【００４１】
本発明の製造方法に於いては、約６０〜８０℃の温水により約１時間〜数時間の抽出を行うことが好ましい。
【００４２】
更に、本明細書の実施例に示されるように、本発明によってリゾプス菌の発酵生産物に含まれる活性成分の少なくとも一つとしてプロスタグランジンF２αが含まれていることが確認されたことによって、プロスタグランジンF２αの含有量の測定に基づき、該発酵生産物の生理活性を評価することが可能となった。
【００４３】
即ち、本発明は、更に、牛越菌等のリゾプス菌の発酵生産物の生理活性の評価方法であって、プロスタグランジンF２αの含有量を測定し、該測定値に基づき生理活性を評価することを含む、前記評価方法に係る。
【００４４】
本発明のリゾプス菌の発酵生産物におけるプロスタグランジンF２αの含有量は当業者に公知の任意の方法・手段で行うことが出来る。例えば、本明細書の実施例で行っているような、ＥＬＩＳＡ等の測定キットによる定量的測定、及び、プロスタグランジンF２α受容体（FR）を発現している細胞、例えば、ヒト子宮内膜癌細胞 Ishikawa cells内のMAPKのリン酸化（MAPKを介したシグナル惹起活性）アッセイ（ウェスタンブロット）による半定量的測定等を挙げることが出来る。
【００４５】
更に、本明細書の実施例に示されるように、牛越菌等のリゾプス菌による発酵生産物の肝細胞におけるCYP1A1遺伝子発現誘導活性に基づき、牛越菌等のリゾプス菌による発酵生産物の生理活性を評価することが可能となった。CYP1A1遺伝子発現誘導活性は、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、適当な肝細胞株を用いた定量的リアルタイム RT-PCR等によるCYP1A1遺伝子発現レベル、又は、レポーターアッセイ等によるCYP1A1遺伝子の転写レベルで測定することが可能である。
【００４６】
以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例の記載に基づき判断され、又は、これら記載に限定して解釈されるものではない。又、以下の実施例に於いて、特に記載のない場合には、当業者に公知の、当該技術分野に於ける通常の条件下で実験を実施した。尚、本明細書又は図中に於いて、牛越菌による発酵生産物は「ＲＵ」又は「Ｒ＆Ｕ」とも示される。
【実施例１】
【００４７】
以下の表１に示した、牛越菌による発酵生産物と複数の一般的なクモノスカビ（NITEからの分譲8株、市販されているテンペ菌1株の計10株）による発酵生産物をメタボローム解析に供し、比較解析を行った。尚、各菌株試料に於いて、上欄が「高温高圧滅菌処理あり」、下欄が「高温高圧滅菌処理なし」である。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
上記のメタボローム解析は、以下の通り実施した。
即ち、各発酵生産物に含まれる化合物成分を、Agilent社製Agilent 1200 series液体クロマトグラフィーで分離し、Thermo Scientific社製 LTQ Orbitrap XLで精密質量を測定した。化合物のイオン化はエレクトロスプレーイオン化法で行い、(+)イオンまたは(-)イオンを検出した。液体クロマトグラフィーはTOSO TSK-GEL ODS-100Vカラムを用い、A液（0.1%蟻酸を含む水）とB液（0.1%蟻酸を含むアセトニトリル）で作るグラディエント（B液0％からB液97％）で行うか、またはAdvanced Materials Technology HALO C18カラムを用い、A液（0.1%酢酸アンモニウムを含む50％メタノール）とB液（0.1%の酢酸アンモニウムを含むイソプロピルアルコール）で作るグラディエント（B液0％からB液100％）で行った。尚、化合物の抽出、メタボロームデータの解析法は文献、「Metabolite annotations based on the integration of mass spectral information. Yoko Iijima, Yukiko Nakamura, Yoshiyuki Ogata, Ken'ichi Tanaka, Nozomu Sakurai, Kunihiro Suda, Tatsuya Suzuki, Hideyuki Suzuki, Koei Okazaki, Masahiko Kitayama, Shigehiko Kanaya, Koh Aoki and Daisuke Shibata. Plant J. 2008 54:949-962.」 に従った。
【００５０】
尚、実施例１で用いた上記の発酵生産物は以下の方法で製造した。
（１）各菌株を麦芽寒天培地（シャーレ、麦芽寒天10ml）で28℃で3日間培養した。
（２）大麦及びふすまを各５g、蒸留水7.5mlを混合し、シャーレに入れ、高温高圧滅菌処理（116℃、20分、1.8気圧）して大麦ふすま培地を製造した。
（３）（２）で製造した培地に（１）で培養した菌株を寒天培地ごと1/2量投入し撹拌して、28℃で4日間培養した。
（４）培養したものを50mlの温水（60℃）で1時間浸潤撹拌後、ガーゼを用いて簡易ろ過し、遠心分離（3,000rpm/20分）にかけて上澄み液を採取した。
（５）上澄み液を2分し、一方を高温高圧滅菌処理（116℃、20分、1.8気圧）、もう一方は無処理とした。
【００５１】
その結果、図１のマスクロマトグラムに示されるように、市販テンペ菌及びNITEからの分譲8株には見られない、牛越菌の発酵生産物のみに特徴的に出現するピークが複数得られた。尚、図１に於けるマスクロマトグラムは、上から順に以下の８つの試料を用いた結果を示す。尚、各試料について２回の実験を行った。
１．017N1牛越菌株、高圧滅菌処理あり（１回目）
２．017N2牛越菌株、高圧滅菌処理あり（２回目）
３．018N1牛越菌株、高圧滅菌処理なし（１回目）
４．018N2牛越菌株、高圧滅菌処理なし（２回目）
５．019N1 市販テンペ菌、高圧滅菌処理あり（１回目）
６．019N2市販テンペ菌、高圧滅菌処理あり（２回目）
７．020N1市販テンペ菌、高圧滅菌処理なし（１回目）
８．020N2市販テンペ菌、高圧滅菌処理なし（２回目）
【００５２】
上記の牛越菌の発酵生産物に特徴的に出現するピークの精密質量から分子式を算出した結果、その中の一つのピークの分子式として「C20H34O5」が得られ、このピークはプロスタグランジンF２αと同定された（図２）。又、他にも、プロスタグランジンF２αに由来し、対イオンの違いから複数のピークに分離したと考えられるピークが観察された。以上の結果より、牛越菌の発酵生産物に特有に含有される成分はプロスタグランジンF２αであると考えられた。
【実施例２】
【００５３】
そこで次に、活性成分としてのプロスタグランジンF２αの定量方法を確立し、その生理活性を基盤としたRUの活性評価系の構築を試みた。まず、プロスタグランジンF２αの定量にあたっては、すでに市販されている測定キットを利用した。具体的には、オックスフォード バイオメディカル リサーチ 社 (Oxford Biomedical Research, Inc.) の Prostaglandin F2α, ELISA Kit (EA05) （国内代理店：フナコシ株式会社）を用い、製品添付のプロトコルに従って定量を行った。
【００５４】
その結果、図３に示すとおり、牛越菌の発酵生産物の希釈率に応じた定量数値が得られ、該発酵生産物にはプロスタグランジンF２αが含有されていることが検証された。
【００５５】
尚、  実施例２で用いた上記の発酵生産物は以下の手順で製造した。
（１）大麦及びふすまを各１kg、蒸留水1,500mlを弁当箱にいれてよく混合し、高温高圧滅菌処理（116℃、20  分、1.8気圧）して大麦ふすま培地を製造した。
（２）（１）で製造した培地菌株を植菌し、２８℃で３．５日間培養した。
（３）培養したものを10kg（培地重量の５倍）の温水（60℃）で1時間抽出した。
（４）連続式遠心分離器にてろ布と２Cのろ紙で濾過した。
（５）濾過液（（５）液）半分をビフネル漏斗、５Cろ紙で濾過し、５Ｃろ紙濾過液を再度ビフネル漏斗、５Ｃろ紙で濾過（５Ｃで２回濾過）した。
（６）得られた濾液を遠心（13,000rpm,  30分,  4℃）処理し、その 上清を試料として使用した。
【実施例３】
【００５６】
更に、Ishikawa cells （EC99040201：ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より市販）は、ヒト エストロゲン・プロゲステロンレセプターを発現する子宮内膜癌由来の細胞株であって、プロスタグランジンF２α受容体（FR）を発現することが知られている（J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89(2):986-993）ため、この細胞に対する牛越菌の発酵生産物の効果を検証した。即ち、Ishikawa cellsを対象に、上記論文に記載の方法に従って、牛越菌の発酵生産物による細胞内シグナル伝達の惹起を解析した。具体的には、事前にインドメタシン（8.4 μM）で該細胞を48時間処理し、内在的なプロスタグランジン類の生合成を阻害した。各種濃度の該発酵生産物で２時間刺激した後、細胞を溶解して回収した。SDS電気泳動によってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写した後、抗phospho-MAPK抗体（Cell Signaling Technology、#9106S）で活性化したMAPKを半定量的に検出した。
【００５７】
この結果、図４に示されるように、濃度依存的な細胞内シグナル伝達分子MAPKのリン酸化（活性化）が確認できた。従って、培養細胞を用いた牛越菌の発酵生産物の生理活性に関する実験からも、該生産物にはプロスタグランジンF２αが含まれていることが実証された。
【００５８】
従って、以上の実施例１〜実施例３の結果から、牛越菌の発酵生産物には、活性成分（生理活性物質）として、少なくともプロスタグランジンF２αが含有されていることが確認された。
【００５９】
更に、かかるプロスタグランジンF２α含有量を、ＥＬＩＳＡ等の測定キットによる定量的測定、及び、ヒト子宮内膜癌細胞 Ishikawa cells 内のMAPKのリン酸化アッセイによる半定量的測定等を用いることによって、牛越菌の発酵生産物に代表される、プロスタグランジンF２αを活性成分として含有する、リゾプス菌の発酵生産物の活性評価系が構築され、比活性の指標を与えることが可能となった。
【００６０】
尚、実施例３で使用した牛越菌の発酵生産物は以下の手順で製造した。
（１）大麦及びふすまを各40kg、水500Lをよく混合し、蒸気による滅菌（100℃、80      分）して大麦ふすま培地を製造した。
（２）（１）で製造した培地に菌株を植菌して、23〜28 ℃で 4〜5日間培養した。
（３）培養したものを５００Ｌの温水（50℃）で１時間抽出した。
（４）デカンタにより固形物を除去し、遠心分離（800メッシュ）した。
（５）濃縮（500Ｌ → 約15Ｌ）（糖度50％）した。
（６）高温高圧滅菌した（116℃、40分）。
（７）得られた液体にアミコールを配合して噴霧乾燥し、粉末を得た。
（８）該粉末を試料 6 g を 30 mL の milliQ 水に溶解した後、60℃にて1 時間撹拌し、遠心処理した（12,000 rpm, 30 min, 4℃）。
（９）更に、その上清をフィルター（2.0μm, 0.45μm, 0.22μm）で濾過した。
【実施例４】
【００６１】
更に、牛越菌の発酵生産物は肝臓への作用も知られていることから（非特許文献５等）、ヒト肝癌細胞HepG2に対して牛越菌の発酵生産物を添加して発現変動する遺伝子をRNAseq法により網羅的に解析した結果、発現変化が大きい遺伝子を複数選択した。その中の、肝細胞の特徴のひとつである解毒タンパク質CYP1A1の遺伝子発現が該発酵生産物により有意に昂進することを見出した。HepG2細胞において、該発酵生産物濃度2%程度まで濃度依存的にCYP1A1遺伝子発現が昂進することを定量的リアルタイム RT-PCR法にて確認した。
【００６２】
具体的には、HepG2細胞（TKG020：理研BRC から入手可能。http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB1886&type=1）に対し、各種濃度の牛越菌の発酵生産物で24時間刺激した。各群の細胞が発現するmRNAを精製し、逆転写した後、定量的リアルタイム RT-PCRによって、CYP1A1、G３PDHの発現量を測定した。得られた結果を、普遍的な遺伝子発現を示すG３PDHのmRNA量で補正し、CYP1A1のmRNA発現レベルとして、図５に示す。この結果、HepG2細胞においては、該発酵生産物の濃度2%程度まで、定量的に、CYP1A1遺伝子発現を昂進することが判明した。従って、このCYP1A1遺伝子発現誘導活性を指標として、牛越菌の発酵生産物の活性評価系を構築し、比活性の指標を与えることが可能となった。
【００６３】
また、ヒトCYP1A1プロモーター領域を含むルシフェラーゼ発現ベクターを構築し、レポーターアッセイを実施したところ、牛越菌の発酵生産物による同様の発現上昇が認められ、該発酵生産物によるCYP1A1遺伝子発現促進は、転写レベルでの制御であることが判明した（図６）。以上のことから、このレポーターアッセイによってCYP1A1遺伝子発現を指標として、本発明の発酵生産物の活性評価系の構築を図り、比活性の指標を与えることを可能とした。
【００６４】
尚、実施例４で使用した牛越菌の発酵生産物は実施例３で使用した発酵生産物と同じ方法で製造した。
【実施例５】
【００６５】
水抽出の際の温度及び時間、並びに、高温高圧滅菌の有無に関して、牛越菌の発酵生産物の製造方法の至適化を行った。すなわち、これらの条件を変えて牛越菌の発酵生産物を製造し、上記実施例に記載した各種試験に準じて、ELISAによるプロスタグランジンF２α含量及びMAPKを介したシグナル惹起活性で評価した。
【００６６】
実施した製造方法の手順は以下の通りである。
（１）大麦及びふすまを各20g、蒸留水20mlをよく混合し、高温高圧滅菌処理（116℃、20分、1.8気圧）して大麦ふすま培地を製造した。
（２）（１）で製造した培地に菌株を植菌して、２８ ℃で６５時間培養した。
（３）培養したものを２００mlの温水（60℃ 又は80℃）で１時間又は４時間抽出した。
（４）ガーゼを用いて簡易濾過したのち、遠心分離（2,000rpm, 20 min.）した。
（５）更に、濾紙（5C）で濾過した。
（６）高温高圧滅菌した（121℃、2.0気圧、20分）場合には、沈殿が生じたので、再度（４）と同様に遠心分離した。
【００６７】
その結果、発酵生産物のプロスタグランジンF２α含量及びMAPKを介したシグナル惹起活性に対して、抽出時間及び水の温度による影響はあまり見られないが、高温高圧滅菌処理することによって、これら指標のいずれもが顕著に向上したことが確認された（図７）。これらの結果に基づき、本発明の発酵生産物の最適な製造方法を選択することが可能となった。
【実施例６】
【００６８】
牛越菌の発酵生産物（リゾプス麹エキス）の、ヒト、特に女性の更年期障害への有効性を検証する臨床試験（ランダム化二重盲検並行群間比較試験）を実施した。以下の表２にその概要を示す。
【００６９】
【表２】
2017109932.tif 000004
【００７０】
実施例６で使用した、牛越菌の発酵生産物を含む「リゾプス麹エキス含有錠菓」は以下の手順で製造した。
（１）大麦及びふすまを各40kg、水500Lをよく混合し、蒸気による滅菌（100℃、80分）して大麦ふすま培地を製造した。
（２）（１）で製造した培地に菌株を植菌して、23〜28 ℃で 4〜5 日間培養した。
（３）培養したものを５００Ｌの温水（50℃）で１時間抽出した。
（４）デカンタにより固形物を除去し、遠心分離（800メッシュ）した。
（５）再度遠心分離（800メッシュ）した。
（６）セライト練り込み濾紙（NA-12）で濾過した。
（７）濾紙（No.26, 5C）で濾過した。
（８）濃縮（180Ｌ → 約3Ｌ）（糖度50％）した。
（９）高温高圧滅菌した（116℃、40分）。
（１０）得られた液体にデキストリンを配合して凍結乾燥し、粉末（発酵生産物）を得た。
（１１）粉末を打錠して、該粉末を５０％配合する錠剤を得た。
【００７１】
尚、具体的には、リゾプス麹エキス含有錠菓及びプラセボ錠菓は、夫々、以下の表３に示す栄養成分組成を有する。
【００７２】
【表３】
2017109932.tif 000005
【００７３】
摂取前に、有効性アンケート（クッパーマン更年期指数、SDS、STAI）、被験者背景調査、併用薬調査、排便に関するアンケート、体重、血圧、脈拍、臨床検査および自他覚症状の確認を行ない、これらの結果に基づき、組み入れ基準を満たしている者２０例を閉経状況、年齢およびクッパーマン更年期指数が２群間で偏りのないように層別ブロック化ランダム法により２群（リゾプス麹エキス含有錠菓摂取群またはプラセボ錠菓摂取群）に割付けた。尚、試験品群の平均年齢は、49.9±3.5歳、プラセボ品群の平均年齢は、49.6±3.6歳であった。両群ともに、閉経有りの者の比率は、50%であった。
【００７４】
摂取期間経過後（４週間後）に有効性アンケート（クッパーマン更年期指数、SDS、STAI）、併用薬調査、排便に関するアンケート、体重、血圧、脈拍、臨床検査および自他覚症状の確認を行った。
【００７５】
試験期間中、重篤な有害事象（被験者に生じたあらゆる好ましくない徴候、症状または病気）は発現せず、試験を中止した被験者はいなかった。
【００７６】
主要評価項目であるクッパーマン更年期指数、副次評価項目であるSDSおよびSTAIは、摂取前の値と摂取4週後の値について、各群内の比較は、Wilcoxonの符号付順位和検定によって検定を行った。有意水準は両側5％とした。摂取前、摂取4週後、摂取前後の変化量については、各群間の比較をマンホイットニーのU検定を行い比較した。有意水準は両側5％とした。摂取前後の変化量については、Studentのｔ検定を行った。
【００７７】
クッパーマン更年期指数の評価に於いては、摂取前後の変化量における群間の比較では、トータルスコアが、試験品群とプラセボ品群の摂取前後の変化量において、有意な差（ｐ値：0.0204）が認められた。また、下位スコアでは、血管運動神経障害様症状（ｐ値：0.0484）、ゆううつ（ｐ値：0.0321）および頭痛（ｐ値：0.0210）の項目において、試験品群とプラセボ品群の摂取前後の変化量において、有意な差が認められた。又、摂取前後の比較では、試験品群は、トータルスコア（ｐ値：0.0039）および下位スコアのゆううつ（ｐ値：0.0078）および頭痛（ｐ値：0.0156）の項目で、摂取前後で有意な差が認められた。プラセボ品群では、いずれの項目も摂取前後での有意な差は認められなかった。
【００７８】
また、STAIの摂取前後の変化量の群間の比較でも、特性不安スコアにおいて、試験品群とプラセボ品群の摂取前後の変化量に有意な差（ｐ値：0.0339）が認められた。
【００７９】
更に、SDS素点及びSDS指数に関しても、試験品群のトータルスコアにおいて、摂取前後で有意な差（いずれも、ｐ値：0.0156）が認められた。
【００８０】
以上を総括すると、牛越菌等のリゾプス菌の発酵生産物は、更年期症状の改善作用を有することが示され、牛越菌の菌発酵生産物は更年期障害の予防・軽減・治療に適用できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によって、牛越菌等のリゾプス菌の発酵生産物に含まれる活性成分の少なくとも一つがもプロスタグランジンF２αと特定された結果、該発酵生産物の活性の評価及びその製造方法の至適化が可能となった。
【００８２】
又、本発明におけるヒトモニター試験の結果、リゾプス菌の発酵生産物が更年期障害の予防・治療・軽減に有効であることを見出したことから、当該愁訴に対する安全かつ安価な医薬組成物、特定保健用食品、機能性表示食品、及び食品添加物等として開発できる。
【００８３】
女性の更年期障害は、（予備軍を含め）その罹患人口は膨大であるにもかかわらず、明確な原因究明や治療法の確立がなされておらず、その必要性が大きい。複数の治療薬や対症サプリメントなどは市販されているものの、一般に高価であり、手軽に服用を始められるものではなかった。本発明により、牛越菌の発酵生産物には更年期障害を軽減する効果が認められたため、該発酵生産物を、安価な医薬組成物、特定保健用食品、及び機能性表示食品等又はそれらの含有成分、並びに、食品添加物等として開発する道が拓かれた。
【００８４】
プロスタグランジンF２αは既知化合物であるものの、その製造・生産には高度な技術が必要であり、市販されてはいるものの非常に高価である。一方、牛越菌クモノスカビの発酵は、安価・簡便に実施することができるので、更に、これをプロスタグランジン含有製剤としても、上記の医薬組成物、特定保健用食品、及び機能性表示食品等又はそれらの含有成分、並びに、食品添加物等に利用する道が拓かれた。これにより、プロスタグランジン含有製剤を安価に供給することが可能となる。また、小動物への投与やヒトモニター試験の際には、経口摂取でその効果が観察されていることから、経口摂取可能なプロスタグランジン含有製剤、あるいは、各種のホルモン様作用惹起製剤として、開発することを可能にした。
【図１】
2017109932.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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