(57)【要約】【課題】  本発明は、生理活性を有する成分を含有するハトムギ抽出物の新規の生産方法等を提案することを目的とする。【解決手段】  生理活性を有する成分を含有するハトムギ抽出物の生産方法であって、ハトムギの部位に応じた抽出溶媒を用いて抽出する抽出ステップを含み、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、ハトムギの殻、薄皮、又は、渋皮である、ハトムギ抽出物の生産方法である。例えば、ハトムギの殻又は薄皮をエタノールで抽出することにより、ヒアルロン酸産生促進、コラーゲン産生促進、メラニン生成抑制、又は、抗菌活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を効率よく生産可能となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を有する成分を含有するハトムギ抽出物の生産方法であって、
ハトムギの部位に応じた抽出溶媒を用いて抽出する抽出ステップを含み、
前記抽出ステップにおいて、前記部位は、ハトムギの殻、薄皮、又は、渋皮である、ハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項２】
前記抽出ステップにおいて、
前記部位は、前記殻又は前記薄皮であり、
前記抽出溶媒は、水より極性の低い溶媒である、請求項１記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項３】
前記抽出ステップにおいて、
前記部位は、前記渋皮であり、
前記抽出溶媒は、水である、請求項１記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項４】
前記抽出ステップにおいて、
前記部位は、前記殻、前記薄皮、又は、前記渋皮であり、
前記抽出溶媒は、水である、請求項１記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項５】
前記部位は、前記殻又は前記薄皮である、請求項４記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項６】
前記部位は、前記殻である、請求項５記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項７】
前記抽出ステップにおいて、
前記部位は、前記薄皮であり、
前記抽出溶媒は、水より極性の低い溶媒である、請求項１記載のハトムギ抽出物の生産方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかの生産方法で生産されたハトムギ抽出物が有する成分を生理活性の有効成分として含有するスキンケア製品。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかの生産方法で生産されたハトムギ抽出物が有する成分を生理活性の有効成分として含有する健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハトムギ抽出物の生産方法、スキンケア製品及び健康食品に関し、特に、生理活性効果を有する成分を含有するハトムギ抽出物の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方や民間療法において、ハトムギ（学名：Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ.  ｍａ−ｙｕｅｎ、イネ科ジュズダマ属）の皮を剥いた種子部分（以下、「精白粒」という）はヨクイニンと呼ばれ、いぼ取りや利尿、抗腫瘍などの効果があるとされている。
【０００３】
また、ハトムギの硬い外皮、しぶ皮、及び、白い中実などにも栄養価が高く含まれており、ハトムギエキスを得るために抽出処理や酵素を加える処理を行う技術も知られている。（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−０４８７２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ハトムギのどの部位がどのような生理活性を有するのか、また、どのような方法によってそれらの生理活性を有する成分を含む抽出物を効率よく得ることができるかについて、十分には知られていなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、生理活性を有する成分を含有するハトムギ抽出物の新規の生産方法等を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の観点は、生理活性を有する成分を含有するハトムギ抽出物の生産方法であって、ハトムギの部位に応じた抽出溶媒を用いて抽出する抽出ステップを含み、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、ハトムギの殻、薄皮、又は、渋皮である、ハトムギ抽出物の生産方法である。
【０００８】
本発明の第２の観点は、第１の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、前記殻又は前記薄皮であり、前記抽出溶媒は、水より極性の低い溶媒である。
【０００９】
本発明の第３の観点は、第１の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、前記渋皮であり、前記抽出溶媒は、水である。
【００１０】
本発明の第４の観点は、第１の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、前記殻、前記薄皮、又は、前記渋皮であり、前記抽出溶媒は、水である。
【００１１】
本発明の第５の観点は、第４の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記部位は、前記殻又は前記薄皮である。
【００１２】
本発明の第６の観点は、第５の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記部位は、前記殻である。
【００１３】
本発明の第７の観点は、第１の観点のハトムギ抽出物の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、前記部位は、前記薄皮であり、前記抽出溶媒は、水より極性の低い溶媒である。
【００１４】
本発明の第８の観点は、第１から第７のいずれかの観点のハトムギ抽出物の生産方法で生産されたハトムギ抽出物が有する成分を生理活性の有効成分として含有するスキンケア製品である。
【００１５】
本発明の第９の観点は、第１から第７のいずれかの観点のハトムギ抽出物の生産方法で生産されたハトムギ抽出物が有する成分を生理活性の有効成分として含有する健康食品である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の各観点によれば、ハトムギの各部位から、ヒアルロン酸産生促進、コラーゲン産生促進、メラニン生成抑制、抗菌活性、抗リパーゼ活性（抗肥満）、抗アレルギー活性、及び、抗酸化活性のうち少なくとも一つの生理活性を有する成分を抽出することが可能となる。
【００１７】
ここで、ハトムギは外側から内側に向かって、殻、薄皮、渋皮、精白粒という構造になっている。従来、ハトムギの精白粒に、メラニン生合成抑制やヒアルロン酸産生促進等の生理活性の有効成分が含まれていることは知られていた。
【００１８】
しかし、精白粒以外の部位における具体的な生理活性は、本発明の発明者によって明らかにされたものである。発明者は、（１）ハトムギの部位によって異なる生理活性があること、（２）生理活性によっては、従来知られていた精白粒よりも良い活性を示す部位があること、さらに、（３）ハトムギの抽出において、ハトムギの部位及び所望の生理活性に応じた抽出溶媒を選択することが重要であることを明らかにした。なお、本発明の有効成分の構造等を直接的に特定するには、多くの時間を要する見通しである。
【００１９】
また、本発明の第２の観点によれば、ヒアルロン酸産生促進、コラーゲン産生促進、メラニン生成抑制、又は、抗菌活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの殻又は薄皮から効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの殻及び薄皮に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、殻及び薄皮の当該有効成分が水よりも極性が低い溶媒を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【００２０】
また、本発明の第３の観点によれば、ヒアルロン酸産生促進の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの渋皮から効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの渋皮に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、渋皮の当該有効成分が水を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【００２１】
また、本発明の第４の観点によれば、抗酸化活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの殻、薄皮又は渋皮から効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの殻、薄皮及び渋皮に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、殻、薄皮又は渋皮の当該有効成分が水を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【００２２】
さらに、本発明の第５の観点によれば、抗リパーゼ活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの殻又は薄皮から効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの殻又は薄皮に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、殻又は薄皮の当該有効成分が水を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【００２３】
さらに、本発明の第６の観点によれば、抗アレルギー活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの殻から効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの殻に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、殻の当該有効成分が水を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【００２４】
また、本発明の第７の観点によれば、抗アレルギー活性の生理活性を有するハトムギ抽出物を、ハトムギの薄皮からも効率よく抽出することが可能となる。ハトムギの殻に上記活性の有効成分が含まれていることに加え、殻の当該有効成分が水よりも極性の低い溶媒を用いて効率よく抽出されることは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ハトムギ抽出物によるヒアルロン酸産生への影響を示す図である。
【図２】ハトムギ抽出物によるコラーゲン産生への影響を示す図である。
【図３】ハトムギ抽出物がマウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞の細胞生存率とメラニン生合成量に与える影響を示す図である。
【図４】ハトムギのエタノール抽出物による黄色ブドウ球菌の抗菌作用を示す図である。
【図５】ハトムギ抽出物１ｍｇ中の相対ＯＲＡＣ値、及び、各ハトムギ抽出物の乾燥重量（ｇ）当たりの相対ＯＲＡＣ値を示す図である。
【図６】ハトムギ抽出物が膵リパーゼ活性に与える影響を示した図である
【図７】ハトムギ抽出物がβ−ヘキソサミニダーゼ抑制に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１  試料
本発明では、久留米南部商工会より供試された、福岡県久留米市三潴町産のハトムギを用いた。なお、ハトムギは外側から内側に向かって、殻（本願請求項の「殻」の一例）、薄皮（本願請求項の「薄皮」の一例）、渋皮（本願請求項の「渋皮」の一例）、種子という構造になっている。本願では、殻が付いた脱穀前のハトムギを「殻付」と表記する。ハトムギから殻のみ除いたものを「薄皮付」と表記する。また、薄皮付から薄皮のみ除いたものを「渋皮付」と表記する。「殻付」は、「殻・薄皮・渋皮・精白粒」からなる。また、「薄皮付」は精白前の状態であり、「薄皮・渋皮・精白粒」からなる。
【００２７】
ハトムギは、脱穀工程において、「薄皮付」と「殻」に分けられる。続いて、脱皮工程において、「薄皮付」が「渋皮付」と「薄皮」に分けられる。最後に、精白工程において「渋皮付」から種子部分である「精白粒」が得られ、副生成物として「渋皮（ぬか）」が発生する。
【００２８】
「殻付」、「殻」、「薄皮」、「薄皮付」、「精白粒」のハトムギを、凍結乾燥機にて乾固し、それぞれを水（純水）及びエタノール（本願請求項の「水より極性の低い溶媒」の一例）で抽出し、抽出物の機能性を検討した。具体的には、下記の手順（本願請求項の「ハトムギ抽出物の生産方法」の一例）で試料から抽出物を得た。
【００２９】
振とう抽出（本願請求項の「抽出ステップ」の一例）
試料の凍結乾燥物約５ｇ（５．０〜５．７ｇ）に対し、エタノール又は水（本願請求項の「抽出溶媒」の一例）を１００ｍｌ加え、４８時間、１８０ｒｐｍで振とうした。その後、エタノール抽出では、吸引ろ過にて抽出液を回収し、水抽出では、遠心分離を行い、上澄みを抽出液として回収した。
【００３０】
抽出液の濃縮・乾固
エタノール抽出の抽出液を、ロータリーエバポレーターにて濃縮した後、デシケータ内で溶媒除去し、エタノール抽出物を得た。また、水抽出の抽出液を、−８０℃のディープフリーザーにて冷凍後、凍結乾燥機で乾固し、水抽出物を得た。
【００３１】
表１に、各試料の生重量当たりの含水率（％）、乾燥重量当たりの水抽出率（％）、及び、乾燥重量当たりのエタノール抽出率（％）を示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
２  生理活性試験
上記で得られたタノール抽出物はＤＭＳＯ、水抽出物は滅菌水をそれぞれ溶媒として、任意の濃度に調製し、ハトムギ抽出物溶液として下記２−１から２−６の各生理活性効果試験に用いた。なお、図面中の「Ｗ」は水抽出物、「Ｅ」はエタノール抽出物であることを示している。
２−１  ヒアルロン酸・コラーゲン産生試験
２−２  メラニン生成抑制試験
２−３  黄色ブドウ球菌の抗菌活性試験
２−４  抗酸化活性試験
２−５  リパーゼ阻害活性試験
２−６  抗アレルギー試験
【００３４】
２−１  ヒアルロン酸・コラーゲン産生試験
ヒトの真皮は、約７０％がコラーゲンで占められており、その他は弾性線維、ヒアルロン酸等の線維から構成されている。加齢による真皮中のヒアルロン酸やコラーゲンの減少は、皮膚の弾力性の低下、シワやたるみの原因となる。また、ヒアルロン酸には水分を保持する作用もあるため、ヒアルロン酸の減少は、皮膚の乾燥の原因にもなる。
【００３５】
ヒアルロン酸及びコラーゲンは、どちらもヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）で産生される。この線維芽細胞によるヒアルロン酸及びコラーゲンの産生促進を促すことにより、皮膚のシワやたるみの予防及び改善並びに保湿効果が期待できる。
【００３６】
線維芽細胞培養系にハトムギ抽出物を添加し、ヒアルロン酸及びコラーゲンのそれぞれの産生量を確認することで、ハトムギ抽出物による肌の水分保持量の向上、肌質の改善等の効能を評価した。また、化粧品等の製品化にあたっては、細胞が死なないことが重要であるため、ヒアルロン酸及びコラーゲン産生試験後の細胞生存率も測定した。細胞生存率を求めることで、１つの細胞当たりでヒアルロン酸やコラーゲンの産生がどの程度促進されたかを評価することができる。具体的な実験の手順は、下記の通りである。
【００３７】
まず、エタノール抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で、水抽出物は滅菌水でそれぞれ任意の濃度となるよう調製した。また、ＤＭＳＯをコントロールとした。ヒアルロン酸産生試験ではＮ−アセチルグルコサミンをポジティブコントロールとして用いた。コラーゲン産生試験ではアスコルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
【００３８】
次に、ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞を２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、二酸化炭素５％、３７℃の条件下において、基礎培地で２４時間培養した。培地をハトムギ抽出物溶液に置き換え、さらに３日間培養し、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により、ヒアルロン酸量及びコラーゲン量を測定した。残った培地を洗い流して基礎培地を加え、１時間培養した後、ＭＴＴ法を用いて細胞生存率を測定した。
【００３９】
ＥＬＩＳＡ法（ヒアルロン酸量及びコラーゲン量の測定法）
ヒアルロン酸固相化マイクロタイタープレートの各ウェルに検体（最終培養液４〜５０倍希釈）とビオチン標識ＨＡＢＰの混合液を添加し室温で１時間反応させる。反応後、ウェル中の溶液を取り除き、よく洗浄した後にペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを加え、再度室温で３０分反応させる。再度、ウェル中の溶液を全て取り除き、よく洗浄した後、オルトフェニレンジアミンを加え酵素反応のよる発色を３０分行う。プレートリーダーを用い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定すれば、標準曲線から、ヒアルロン酸量の定量を行うことができる。コラーゲン量の測定についても同様である。
【００４０】
ＭＴＴ法（細胞生存率の測定法）
各ウェルにＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍｌ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を１０μｌ添加する。５％二酸化炭素、３７℃で４時間静置培養する。培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１００μｌずつ加え、遮光し、４時間室温で放置する。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とする。
【００４１】
図１及び図２は、それぞれ、各抽出物によるヒアルロン酸産生及びコラーゲン産生への影響を示す図である。棒グラフはヒアルロン酸産生量若しくはコラーゲン産生量（白）、又は、細胞生存率（黒）を示す。折れ線グラフは細胞生存率あたりのヒアルロン酸産生量又はコラーゲン産生量を示す。なお、図中に示すヒアルロン酸産生量、コラーゲン産生量、細胞生存率は、ＤＭＳＯを基準値１００とした場合の相対値である。また、棒グラフの値は３回測定の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。ＤＭＳＯと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示している。
【００４２】
ヒアルロン酸産生試験においては、ポジティブコントロールのアスコルビン酸と比較しても、全体的に高いヒアルロン酸産生能が観測された。特に、精白粒のエタノール抽出物、薄皮付のエタノール抽出物、殻付の水抽出物及び薄皮付の水抽出物が強い活性を示した。
【００４３】
薄皮付は、精白粒・渋皮・薄皮からなり、殻付は、さらに殻を含む。精白粒・薄皮・殻と比較して、薄皮付及び殻付の水抽出物で特に強い活性がみられたのは、薄皮付及び殻付に含まれていた渋皮の影響と推察される。つまり、渋皮にヒアルロン酸産生作用を有する親水性成分が多く含まれていることが示唆された。
【００４４】
また、コラーゲン産生試験においても、ポジティブコントロールのアスコルビン酸と比較しても、全体的に高いコラーゲン産生能が観測され、特に、薄皮・殻・薄皮付のエタノール抽出物の活性が強く、水抽出物も比較的強い活性を示した。ただし、水抽出物と比較すると、エタノール抽出物において強い活性がみられた。
【００４５】
２−２  メラニン生成抑制活性試験
メラニン色素は、本来、紫外線による皮膚障害を緩和するために大切な役割を果たしているが、過剰にメラニン産生が亢進した状態のシミ等の局所的な色素沈着は美容上の問題として大きな関心が寄せられている。メラニンはアミノ酸の一つＬ−チロシンを出発点として一連の酵素反応によりメラノサイト(メラニン細胞)において合成されケラチノサイト(角化細胞)へ移送される高分子色素の総称で黒色色素のユウメラニンと黄色色素のフェオメラニンの複合体として存在する。メラニン合成反応における律速酵素のチロシナーゼに対する阻害作用あるいは抗酸化作用等よってメラニンの産生が抑制されることが知られている。
【００４６】
各エタノール抽出物をＤＭＳＯで溶解させ、８０ｍｇ／ｍｌに調製した。その後、各サンプル溶液をＤＭＳＯで希釈し、４０ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌに調製した。同様に、水抽出物を滅菌水に溶解して、１６０、８０、４０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００４７】
細胞の前培養
シャーレ上に培養したＢ１６メラノーマ細胞培養液を血球計測板に１０μｌ添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（ＥＭＥＭ）培地を加え、細胞濃度を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製した。これを２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌずつ播種し、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間静置培養した。
【００４８】
ハトムギ抽出物溶液の添加
２４ウェルプレートの培地を除去し、新たにＥＭＥＭ培地９９８μｌとハトムギ抽出物溶液２μｌを添加した。これを５％二酸化炭素、３７℃で４８時間静置培養した。培養後、再び培地を除去し、ＥＭＥＭ培地９９８μｌとハトムギ抽出物溶液２μｌを添加し、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間静置培養した。
【００４９】
ＭＴＴ法による細胞生存率の測定
各ウェルにＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を５０μｌ添加し、５％二酸化炭素、３７℃で４時間静置培養した。培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１ｍｌずつ加え、遮光し、４時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とした。
【００５０】
メラニン生合成量の測定
培地を除去し、各ウェルに３００μｌのＰＢＳ（−）を加えて洗浄した。ＰＢＳ（−）を除去し、各ウェルに１ＭのＮａＯＨ溶液を１ｍｌずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、４時間放置した。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン生合成量の指標とした。
【００５１】
図３は、それぞれ（ａ）水抽出物、及び、（ｂ）エタノール抽出物が、マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞の細胞生存率とメラニン生合成量に与える影響を示す図である。横軸に示される濃度は最終濃度である。また、コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示している。
【００５２】
水抽出物において、殻付および精白粒でメラニン生成抑制活性が認められた。また、エタノール抽出物では、精白粒でメラニン生成抑制活性が認められた。ポジティブコントロールとして用いたアルブチンに次いで、精白粒のエタノール抽出物、殻付の水抽出物が強い活性を示した。また、全体的に、細胞生存率はほぼ１００％となり、細胞毒性は低いものと考えられた。
【００５３】
２−３  黄色ブドウ球菌の抗菌活性試験
黄色ブドウ球菌は、人体の皮膚表面や毛孔等に存在しており、アトピー性皮膚炎やニキビの増悪因子の一つである。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の供試菌株として、ＮＢＲＣ３３０１を用い、それをハトムギ抽出物存在下で一定時間培養した。培養の前後で黄色ブドウ球菌量の指標である濁度を測定し、ハトムギ抽出物による黄色ブドウ球菌抗菌作用を評価した。具体的な実験の手順は、下記の通りである。
【００５４】
エタノール抽出物はＤＭＳＯで、水抽出物は滅菌水で、それぞれ８０ｍｇ／ｍｌ、１６０ｍｇ／ｍｌに調製した。また、抽出物を含まないＤＭＳＯをコントロールとし、ソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
【００５５】
菌の前培養
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ（ＮＡ）培地上に培養した菌のコロニーを５ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地に加え、３７℃で１８時間振とう培養（１６０ｒｐｍ）して定常期の菌体を得た。得られた定常期の培養液をＮＢ培地で希釈し、６６０ｎｍにおける濁度を測定し、濁度が０．４になるよう調製した（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）。さらに、これを滅菌水で希釈し菌濃度を１０５ＣＦＵ／ｍｌとして抗菌試験に用いた。
【００５６】
抗菌活性の測定  
エッペンチューブに４４５μｌのＮＢ培地、５０μｌの菌液、５μｌのハトムギ抽出物溶液を加え、十分に混合した。ハトムギ抽出物の最終濃度は８００μｇ／ｍｌである。この溶液を９６ウェルプレートに１５０μｌずつ分注し（ｎ＝３）、３７℃で１８時間振とう培養（１１５０ｒｐｍ）した。培養後、６３０ｎｍにおける濁度を測定し、抗菌活性の指標とした。
【００５７】
水抽出物については、抗菌作用はあまり観測されなかった。図４は、エタノール抽出物による黄色ブドウ球菌の抗菌作用を示す図である。また、棒グラフの値は３回測定の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。ＤＭＳＯと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示している。殻及び薄皮のエタノール抽出物において、ポジティブコントロールのソルビン酸と同程度の黄色ブドウ球菌に対する強い抗菌活性が認められた。
【００５８】
２−４  抗酸化活性試験
酸素は生物が生きていく上で欠かせないが、体内に取り込まれたものも一部は「活性酸素」と呼ばれる通常の酸素よりも反応性が高い状態へと変わる。この活性酸素はエネルギー産生や体防御システムなどに利用されるが、高い反応性を有するため細胞機能に損傷を負わせたり、より高い反応性を有するフリーラジカル種が発生したりする原因となるなど様々な機能障害の原因となる。通常であればこれら「酸化ストレス」から体を防御する機構が働くが、その能力を超える活性酸素があると生体機能が損傷され、様々な慢性疾患の原因になるとされている。そこで必要以上の活性酸素種の生成を未然に防いだり、発生した活性酸素種やフリーラジカルを捕捉したりするような、体を防御する生体抗酸化機能を持つ物質あるいは機構を生物は必要としている。食品中にも様々な抗酸化因子があり、それらの成分の抗酸化能力を評価することは、生活習慣病の予防が必要とされている現代において注目すべきものである。
【００５９】
Oxygen  Radical  Absorbance  Capacity（ＯＲＡＣ）法
蛍光物質であるフルオレセインは４８５ｎｍの波長の光で励起し、５２０ｎｍ付近の波長の光を発光する。２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）から発生したペルオキシラジカルによってフルオレセインが酸化されると、光は消光していく。サンプル中に抗酸化物質が存在すると、ペルオキシラジカルは消去され、フルオレセインの消光スピードは遅くなる。ＯＲＡＣ法は、この消光スピードの遅延する能力をサンプルの抗酸化力として評価する方法である。抗酸化力は、抗酸化物質の一種であるトロロックスを標準物質とし、トロロックス等量で算出したＯＲＡＣ値で評価した。具体的な実験手順は下記の通りである。
【００６０】
フルオルセイン及びトロロックス、ＡＡＰＨを、それぞれリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、１．２ｍＭ、６μＭ、９４．４ｎＭのフルオルセイン溶液、２５μＭ、１２．５μＭ，６．２５μＭのトロロックス標準試料溶液、３１．７ｍＭのＡＡＰＨ溶液を調製した。ハトムギ抽出物については、１ｍｇ／ｍｌとなるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、これを原液として、任意の濃度に希釈したものを試料溶液として用いた。
【００６１】
トロロックス標準試料溶液、試料溶液、ブランク溶液（７５ｍＭリン酸緩衝液）を、それぞれ２０μｌずつ９６穴プレートの異なるウェルに滴下し、各ウェルに９４．４ｎＭフルオレセイン溶液を２００μｌずつ添加した。３７℃の湯浴で１０分間加温した後、さらに、溶液調製後１０分間３７℃で加温しておいた３１．７ｍＭのＡＡＰＨ溶液を７５μｌずつ８連ピペットで添加した。ＡＡＰＨを添加した３０秒後から測定を開始させ、３７℃、３０秒間隔で９０分間蛍光強度を測定した。各ウェルの蛍光強度から、下記の式を用いて、蛍光強度曲線下の面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ）を算出した。ｆ０は０秒時（測定開始時）の蛍光強度、ｆｉはｉ秒時の蛍光強度である。
【００６２】
【数１】
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【００６３】
トロロックス各標準液濃度（６．３３、３．１６、１．５８、０．７９μｇ／ｍｌ）のＡＵＣ（ＡＵＣＴｒｏｌｏｘ）から、ブランクのＡＵＣ（ＡＵＣＢｌａｎｋ）を差し引いた、増加量（ＡＵＣＴｒｏｌｏｘ−ＡＵＣＢｌａｎｋ）をｎｅｔＡＵＣとする。Ｘ軸にトロロックスのｎｅｔＡＵＣの平均値、Ｙ軸にトロロックス濃度をとり、検量線（一次回帰式、Ｙ=ａＸ＋ｂ）を作成した。
【００６４】
下記の式を用い、検量線の傾きａ及び切片ｂから、相対ＯＲＡＣ値を算出した。
【００６５】
【数２】
2017025018.tif 000005
【００６６】
図５（ａ）は、水抽出およびエタノール抽出物１ｍｇ中の相対ＯＲＡＣ値、図５（ｂ）は、各サンプル素材の乾燥重量（ｇ）当りの相対ＯＲＡＣ値を示す図である。図中の棒グラフの値は、４回測定した値の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。
【００６７】
素材の乾燥重量（ｇ）当りの相対ＯＲＡＣ値において、薄皮付の水抽出物で最も高い抗酸化活性が確認された。
【００６８】
ＯＲＡＣ値については、一般に野菜類＜果物＜ナッツ類＜香辛料の順に高い。Xianliらの報告（Journal  of  Agriculture  and  Food  Chemistry.  2004,52,  p.4026−4037）によると、野菜類のＯＲＡＣ値は、トマト（１．２ｍｇＴＥ／ｇ）からホウレン草（６．５ｍｇＴＥ／ｇ）までであり、薄皮付の水抽出物は、高い活性を示した。
【００６９】
２−５  リパーゼ阻害活性試験
リパーゼは脂肪を分解する酵素で、膵臓から十二指腸へ分泌されるリパーゼは脂肪の消化・吸収に大きく関与している。現在、肥満が原因となり、糖尿病に代表される代謝性疾患や血管疾患などの疾患を抱える人口が急増しており、肥満の解決は急務を有する事項の一つである。肥満の要因は環境、遺伝など数多くの要因があるが、肥満の原因自体は消費エネルギーよりも摂取エネルギーが過剰であることに尽きる。膵リパーゼはトリグリセライドを分解する酵素であり、脂肪の吸収に関与しているため、リパーゼ活性が阻害されるような物質は、摂取エネルギーを低下させ、抗肥満効果を発揮する有効なアプローチの一つとして考えられている。
【００７０】
４−メチルウンベリフェロンオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を基質として用い、リパーゼとの反応によって生成する４−メチルウンベリフェロンの蛍光を観測することにより、リパーゼの活性を測定した。具体的な実験手順は下記の通りである。
【００７１】
リパーゼ溶液の調製
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．３ｍＭ塩化カルシウムを含む１３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９８）に、膵臓由来リパーゼを溶解させ、１５０μｇ／ｍｌに調製した。
【００７２】
基質溶液の調製
４−メチルウンベリフェロンオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を上記の緩衝液に溶解させ、０．１ｍＭに調製した。
【００７３】
リパーゼ活性の測定
試験物質溶液２５μｌに、基質溶液５０μｌ加え、続いて、リパーゼ溶液２５μｌを加え、反応の開始とした。２５℃で３０分間インキュベートした後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌを加えて反応を停止させ、４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定した（蛍光波長：３５５ｎｍ、励起波長：４６０ｎｍ）。
【００７４】
リパーゼ活性（％）は、数３の式により算出した。ここで、Ｓはハトムギ抽出物溶液添加系の反応後の蛍光強度であり、ＳBｌankはハトムギ抽出物溶液と４−ＭＵＯのみの蛍光強度であり、Ｃはハトムギ抽出物溶液無添加系の反応後の蛍光強度であり、ＣBｌankは４−ＭＵＯのみの蛍光強度である。なお、ポジティブコントロールに、リパーゼ阻害剤として用いられるオルリスタットを使用した。
【００７５】
【数３】
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【００７６】
図６は、縦軸がリパーゼ活性であり、ハトムギ抽出物が膵リパーゼ活性に与える影響を示した図である。基質である４−ＭＵＯのみの蛍光強度を０、４−ＭＵＯにリパーゼを作用させたあとの蛍光強度を１００としてリパーゼ活性を測定した。縦軸の各値は平均値±標準偏差（ｎ＝４）で示しており、横軸の濃度は最終濃度である。コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示している。
【００７７】
図６に示す通り、殻および薄皮の水抽出物で一定の抗リパーゼ活性が観測された。
【００７８】
２−６  抗アレルギー試験
ラット肥満細胞ＲＢＬ−２Ｈ３からＩｇＥ刺激によって放出される顆粒中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し，その抑制作用を検討した。花粉症や食物アレルギーに代表されるアレルギー性疾患の最近の増加傾向は大きな社会問題となっている。これらの多くはＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型）と言われ食べ物や花粉中の特定タンパク質（抗原）が、体内に侵入したときに，肥満細胞における生体防御機構（抗原抗体反応）が過剰に反応して、鼻水や涙目などの炎症症状を起こす。この炎症反応を引き起こすヒスタミンなどの炎症介在物質を含む顆粒球が細胞外へと放出される反応を抑えることにより、アレルギー症状の緩和が期待できるとされている。
【００７９】
食品中の成分に抗アレルギー作用があるかどうかについて、ラット肥満細胞様細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３を用いて脱顆粒抑制作用の有無を調べた。具体的な、実験手順は下記の通りである。
【００８０】
９６ウェルプレートにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を分注し、一晩培養後、抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体を添加した。さらに、一晩培養後、Tyroid  bufferを添加し３０分後、ハトムギ抽出物溶液を添加した。３０分後にＤＮＰを添加し、上清を分取した。そこに、基質を添加した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８１】
また、ＭＴＴ法を用いて、細胞生存率も測定した。まず、Ｉ型コラーゲンコーティング２４ウェルプレートに４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、二酸化炭素インキュベーター（３７℃、二酸化炭素５％）で培養した。２４時間後、培地を交換しサンプルを１００μｇ／ｍＬになるように添加した。さらに、２４時間後、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を５０μｌずつ各ウェルに添加し、二酸化炭素インキュベーターに入れた。４時間後、培地を除去し、ＭＴＴを溶解させ、遮光し一晩放置した。翌日、プレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数の指標とした。
【００８２】
図７は、ハトムギ抽出物がβ−ヘキソサミニダーゼ抑制及び細胞生存率へ与える影響を示す図である。ＤＭＳＯをコントロールとして用い、縦軸の各値は、コントロールの値を１００とした時の、β−ヘキソサミニターゼ量及び細胞生存率であり、平均値±標準偏差（ｎ＝５）である。また、ハトムギ抽出物の最終濃度は２５０μｇ／ｍｌである。コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示している。
【００８３】
最終濃度２５０μｇ／ｍｌで活性を評価したところ、殻の水抽出物、精白粒の水およびエタノール抽出物において一定の抗アレルギー活性が認められた。全てのサンプルで細胞生存率はほぼ１００％であり、細胞毒性は認められなかった。
【００８４】
なお、本発明に係る生産方法において生産されたハトムギ抽出物を、ヒアルロン酸産生促進剤、コラーゲン産生促進剤、メラニン生成抑制剤、抗菌剤、抗アレルギー剤、抗リパーゼ剤として応用してもよい。また、スキンケア製品などの外皮用として応用してもよいし、健康食品などの飲食品として応用してもよい。
【００８５】
また、殻、薄皮又は渋皮に生理活性の有効成分が含まれている場合、従来副生成物とされていた殻、薄皮又は渋皮に精白粒を含めたものからハトムギ抽出物を生産してもよい。つまり、「殻付」「薄皮付」又は「渋皮付」のハトムギからハトムギ抽出物を生産してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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