(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物の提供。【解決手段】セリポリア・ラセラタ菌糸体の培養液抽出物の調製方法及び上記調製方法により調製される糖尿病合併症の予防又は治療用の精製菌体外多糖を含む薬学的組成物。セリポリア・ラセラタ菌糸体の培養液の抽出物の調製方法によると、従来の調製方法に比べて、抽出物内に菌体外多糖がより高い含有量で含まれていれることにより、糖尿病性疾患の薬学的組成物又は関連機能性食品の素材として応用できる精製菌体外多糖。約１２０ｋＤａの分子量を有し、約４０重量％の糖と約３３重量％の蛋白質を含む精製体外多糖。【選択図】図１９
2017025327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリポリア・ラセラタ菌糸体の培養培地から得られ、約１２０ｋＤａの分子量を有する、糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための精製菌体外多糖。
【請求項２】
上記糖尿病性疾患は、２型糖尿病であることを特徴とする、請求項１に記載の精製菌体外多糖。
【請求項３】
上記糖尿病合併症は、慢性高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、微小血管障害（ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および腎臓疾患（ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の精製菌体外多糖。
【請求項４】
約４０重量％の糖と約３３重量％のタンパク質とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の精製菌体外多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリポリア・ラセラタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ  ｌａｃｅｒａｔａ）菌糸体の培養液抽出物の調製方法および前記調製方法によって調製される糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
セリポリア・ラセラタは、白色腐朽菌の一種である。生態系でセルロース、ヘミセルロースなどの炭素源を利用するためにリグニン（Ｌｉｇｎｉｎ）分解という共同代謝を行う。
【０００３】
セリポリア・ラセラタの存在が２００２年に初めて学界に報告されたためか、セリポリア・ラセラタの産業化のための研究はごく少数に過ぎず、それもまた、土壌汚染防止剤化と漂白剤化に関する２つの研究のみがある。
【０００４】
食品および医薬品化の研究は、本発明者らによって出願された特許文献１の「糖尿病疾患の予防および治療のためのセリポリア・ラセラタの培養液抽出物の調製方法およびこれによるセリポリア・ラセラタ培養液抽出物」が国際的に唯一である。しかし、上記文献には、第1型糖尿病に対する効果のみが記載されている。
【０００５】
これまで、開発された糖尿病治療薬としては、血糖降下剤とインスリン注射剤があるが、これらは糖尿病の悪化を遅延させるだけであって、糖尿病合併症の防止および完治剤としての意味は有しない。
【０００６】
糖尿病および糖尿合併症の治療ができる方法は、まず、病気の進行を停止させる物質を開発する必要があり、次に、インスリン分泌調節を担当する膵臓のベータ細胞を再生させるか、再生を促進する物質を開発することである。
【０００７】
これまでの研究結果は、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液およびその乾燥物に含有された指標物質、菌体外多糖が糖尿病の進行を遮断して、膵臓のベータ細胞の再生を促すことに非常に有効な物質として確認されたことで、セリポリア・ラセラタの菌体外多糖の構造を解明し、その含有量を高めるための最適の培養方法を見つける研究が切実に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国特許第１０−１０３１６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するために提案されたもので、本発明で解決しようとする課題は、菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の含有量を増強させられる、改善されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法を提供しようとするものである。
【００１０】
本発明の他の解決しようとする課題は、本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法により調製された菌体外多糖の含有量が増加したセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物を有効成分として含有する糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記のような課題を解決するために、本発明は、セリポリア・ラセラタ菌糸体の液体培養、培養液の乾燥粉末化および溶媒抽出物の調製段階を含むセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法において、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養用培地は、砂糖１重量％〜２重量％、グルコース０．２重量％〜１重量％、でん粉０．２重量％〜１重量％、モロコシ粉０．１重量％〜０．５重量％、大麦粉０．１重量％〜０．５重量％、大豆粉０．２重量％〜２重量％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％および水９２重量％〜９８重量％を含み、水素イオン濃度がｐＨ４．５〜６．０であることを特徴とするセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法を提供する。
【００１２】
上記培養は、青色ＬＥＤ光源の下で行われることが好ましい。
【００１３】
上記培養は、二酸化炭素の濃度を１０００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍで維持して行われることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法によって調製されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物を有効成分として含有する糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。
【００１５】
上記糖尿病性疾患は、２型糖尿病であり得る。
【００１６】
上記糖尿病合併症は、慢性高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、微小血管障害（ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および腎臓疾患（ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群より選択することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法によれば、従来の本発明者らによる先行文献による調製方法に比べて抽出物内に菌体外多糖がより高い含有量で含まれていれることにより糖尿病性疾患の薬学的組成物または関連機能性食品の素材として応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１ａおよび図１ｂは、本発明のセリポリア・ラセラタ菌株のＩＴＳ‐５．８ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析した結果を示したものである。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、セリポリア・ラセラタ菌株の培養でｐＨおよび糖の種類による残存糖（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｓｕｇａｒ）の含有量を示したグラフと培養結果を示す図である。
【図３】図３は、糖の種類による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示すグラフである。
【図４】図４は、グルコース濃度による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示すグラフである。
【図５】図５は、窒素源による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示したグラフである。
【図６】図６は、窒素源として大豆粉の濃度による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示したグラフである。
【図７】図７は、微量元素による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示したグラフである。
【図８】図８は、微量元素ＭｇＳＯ４の濃度による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示したグラフである。
【図９】図９は、５Ｌ培養器で培養時間の経過による菌糸体の成長および菌体外多糖の含有量を示したグラフである。
【図１０】図１０は、培養物精製による菌体外多糖の分子量を測定したグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の糖尿病に対する活性を実験するための実験過程を模式的に示したものである。
【図１２】図１２は、２型糖尿病マウスにおいてセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の処理による食品の摂取量を示したグラフである
【図１３】図１３は、２型糖尿病マウスにおいてセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の処理による水分摂取量を示したグラフである。
【図１４】図１４は、２型糖尿病マウスにおいてセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の処理による体重増加の様相を示したグラフである。
【図１５】図１５は、正常マウスと２型糖尿病マウスおよびセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の処理マウスの肝臓状態を示す写真である。
【図１６】図１６は、空腹時の時間経過ごと血中グルコース濃度を示すグラフである。
【図１７】図１７は、グルコース経口投与後の時間経過ごとの血中グルコース濃度を示すグラフである。
【図１８】図１８は、６週間セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物を給餌したマウスを犠牲にした後の血中グルコース濃度を示すグラフである。
【図１９】図１９ａおよび図１９ｂは、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物がインスリンと類似の方法で、脂肪細胞の分化を促すことを示すグラフおよび顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、インスリンの有無によるセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の脂肪細胞分化の程度を示すグラフである。
【図２１】図２１ａおよび図２１ｂは、脂肪細胞におけるセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物によるインスリンシグナリングを示すデータである。
【図２２】図２２は、脂肪細胞におけるセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物によるＧＬＵＴ４の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、セリポリア・ラセラタ菌糸体の液体培養、培養液の乾燥粉末化および溶媒抽出物の調製段階を含むセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法において、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養用培地は、砂糖１重量％〜２重量％、グルコース０．２重量％〜１重量％、でん粉０．２重量％〜１重量％、モロコシ粉０．１重量％〜０．５重量％、大麦粉０．１重量％〜０．５重量％、大豆粉０．２重量％〜２重量％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％および水９２重量％〜９８重量％を含み、水素イオン濃度がｐＨ４．５〜６．０であることを特徴とするセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法を提供する。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明の発明者らは、糖尿病および糖尿病合併症の進行を遮断し、ベータ細胞の再生を促すのに効果が優れる指標物質が、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の菌体外多糖であることを発見しており、上記菌体外多糖の含有量を高められるセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法と、これによる糖尿病および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物の発明を完成した。
【００２２】
したがって、本発明は、セリポリア・ラセラタ菌糸体の液体培養、培養液の乾燥粉末化および溶媒抽出物の調製段階を含むセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法において、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養用培地は、砂糖１重量％〜２重量％、グルコース０．２重量％〜１重量％、でん粉０．２重量％〜１重量％、モロコシ粉０．１重量％〜０．５重量％、大麦粉０．１重量％〜０．５重量％、大豆粉０．２重量％〜２重量％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％および水９２重量％〜９８重量％を含み、水素イオン濃度がｐＨ４．５〜６．０であることを特徴とするセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法を提供する。
【００２３】
上記培養は、青色ＬＥＤ光源下において行われることが好ましい。
【００２４】
上記培養は、二酸化炭素の濃度を１０００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍで維持して行われることが好ましい。
【００２５】
好ましい例として、本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法は、次のような方法で調製することができる。
【００２６】
（ａ）セリポリア・ラセラタ菌糸体を培養して、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液を得る段階と、
（ｂ）上記培養液を真空乾燥または凍結乾燥させて粉末化する段階と、
（ｃ）上記粉末を水、エタノールおよびメタノールからなる群より１種以上選択された
溶媒で抽出する段階。
【００２７】
上記（ａ）段階におけるセリポリア・ラセラタ菌糸体の液体培養は、菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を得るために、セリポリア・ラセラタ菌糸体を液体内で培養することであり、上記液体培養のための培地組成物は、砂糖１重量％〜２重量％、グルコース０．２重量％〜１重量％、でん粉０．２重量％〜１重量％、モロコシ粉０．１重量％〜０．５重量％、大麦粉０．１重量％〜０．５重量％、大豆粉０．２重量％〜２重量％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．０５重量％〜０．１重量％および水９２重量％〜９８重量％を含んでもよい。
【００２８】
この際、液体培養は、２０℃〜２５℃で、水素イオン濃度（ｐＨ）４．５〜６．０、光源は青色ＬＥＤ、照度は０．５ＬＵＸを維持し、空気は０．５〜１．５（ｋｇｆ／ｃｍ２）に注入し、二酸化炭素の濃度は、１０００〜２０００ＰＰＭに維持しながら、８〜１３日間行われることが好ましく、２２℃、ｐＨ５、１．０（ｋｇｆ／ｃｍ２）、１５００ＰＰＭの条件で１０日間行われることが菌体外多糖の含有量が高いので最も好ましい。
【００２９】
上記（ａ）段階における母菌株は、ＰＤＡ培地状態において４℃で保管されている優良菌株の1つを、三角フラスコにＰＤＢ培地を用い、振とう培養器で２５℃の恒温を維持し、７日〜９日間培養過程を経たものを使用する。この際、接種源として投入される菌糸体の量は、培養する溶液の０．５％が最も好ましい。菌糸体量（％／１００ｍｌ）が高いからと言って、菌体外多糖の含有量も一緒に高まるものではないので、培地組成は菌糸体の成長に最も良好な栄養率および環境条件ではなく、菌体外多糖の含有量を最も高く形成させる選択的培養条件を適用しなければならない。
【００３０】
上記培養液は、菌糸体と水溶液で分離精製する。上記の分離精製は、遠心分離器で菌糸体を除去した溶液を、マルチフィルタープレス（Ｍｕｌｔｉ―ＳｈｅｅｔＦｉｌｔｅｒＰｒｅｓｓ）と振動遠心膜分離機（ＰＡＬＬＳＥＰ）で繰り返して精製した後、１分間紫外線（ＵＶ）を照射する。また、酸素を除去した後密封保管しなければならない。これは、溶液中に菌糸が存在する場合、菌糸の成長で有効成分の含有量に変化をもたらすからである。
【００３１】
（ｂ）段階では、前記（ａ）段階で調製された菌糸体培養液を真空乾燥または凍結乾燥させて粉末化する。上記乾燥は、高温で行う場合は有効物質の相当部分が消滅することが有り得るので、４０℃以下の低温、好ましくは３０℃以下の温度で４８時間〜９６時間行われることが好ましい。そして、（ｂ）段階における乾燥は、蒸発温度を相対的に高く設定する真空乾燥機よりも真空凍結乾燥機を使用することが、有効物質の含有量の変化が最小限になり、より好ましい。
【００３２】
（ｃ）段階では、（ｂ）段階で得られた菌糸体培養液建造物を溶媒で抽出して、本発明に係るセリポリア・ラセラタ菌糸体培養物抽出物である菌体外多糖を分離調製する。
【００３３】
上記のプロセスは、乾燥粉末５ｇに蒸留水１００ｍＬを添加してよく懸濁した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）し、これの上澄み液に、その量の２倍〜３倍に相当する冷たいアルコールを添加して、冷蔵庫（４℃）に入れて１２時間静置する。
【００３４】
上記静置液から上澄み液のみを再度遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）した後、沈殿物を回収して粗（ｃｒｕｄｅ）菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を調製する。上記抽出物は、３０℃以下で真空凍結乾燥することが好ましい。
【００３５】
このように、本発明によって調製されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液の抽出物は、ステロイド誘導糖尿病の治療に効果がある有効成分の含有量が著しく高く、関連疾病および合併症の進行を停止させ、治療する効果が非常に優れている。より具体的には、本発明に係るセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物は、抗糖尿効能があると知られている菌体外多糖が、培養液には０．３±０．０３％/１Ｌ、乾燥抽出物には５．００±０．０２％／１００ｇと非常に高い含有量で含まれている。
【００３６】
また、本発明は、本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法によって調製されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物を有効成分として含有する糖尿病性疾患と糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。
【００３７】
上記糖尿病性疾患は、２型糖尿病であり得る。
【００３８】
上記糖尿病合併症は、慢性高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、微小血管症（ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および腎臓疾患（ｋｉｄｎｅｙ）からなる群より選択され得る。
【００３９】
上記本発明のセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法によって調製されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物を有効成分として含有する薬学的組成物は、通常使用されている適切な担体、賦形剤、および希釈剤がさらに含まれてもよい。
【００４０】
たとえば、散剤の調製には、上記抽出物２００ｍｇ、米粉１００ｍｇ、タルク１０ｍｇを混合して調製した後、密閉袋に充填する。
【００４１】
たとえば、錠剤の調製は、上記抽出物１００ｍｇ、米粉５０ｍｇ、乳糖１０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、打錠し調製する。
【００４２】
たとえば、液剤の調製は、上記抽出物１００ｍｌ、異性化糖５ｇ、松脂香料（ｐｉｎｅ  ｆｒａｇｒａｎｃｅ）適量、防腐剤適量を懸濁して茶色の瓶に充填して調製する。この場合、前記抽出物の代わりに前記段階（ａ）の結果を直接使用することもできる。
【００４３】
以下では、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。下記の実施例は、本発明の好適な一具体例に過ぎなく、本発明の権利範囲が下記の実施例の範囲に限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例＞
１．セリポリア・ラセラタ培養液抽出物の調製
１−１．セリポリア・ラセラタ培養液の調製
セリポリア・ラセラタは、コナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から分離採取した後、継代培養により育成した母菌を−８０℃で冷凍保管し、保管中の菌株をＰＤＡ培地（８７プラスチック培養球）で２回〜３回の継代後、十分な数量の完全な菌株のみを４℃の冷蔵庫に保管して使用した。そして、三角フラスコにＰＤＢ培地６００ｍｌを造成した後、ＰＤＡ培養菌株１つを入れて８日間振とう培養した。そして、砂糖１．５重量％、グルコース０．５重量％、ジャガイモでん粉０．５重量％、小麦粉０．２５重量％、モロコシ粉０．２５重量％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）０．０５重量％、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％、リン酸二カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．０５重量％と水９６．８５重量％を含む液体培地を８００Ｉ発酵槽で１２１℃、１．５ｋｇｆ／ｃｍ２で２０分間殺菌した後、２３℃に冷却した状態でスターターとして使用するＰＤＢ培養菌株６００ｍｌを接種し、空気を０．５〜１．５（ｋｇｆ／ｃｍ２）で通気させながら、二酸化炭素の濃度は１０００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍで、セリポリア・ラセラタ菌糸体を２３℃の恒温で１０日間液体培養することにより、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液を調製した。
【００４５】
１−２．セリポリア・ラセラタ培養液抽出物の調製
調製されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液を、真空凍結乾燥機を用いて２５℃の低温で７２時間凍結乾燥させて粉末化した。乾燥粉末５ｇに蒸留水１００ｍｌを添加してよく懸濁した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）し、その上澄み液に、その量の２倍〜３倍に相当する冷たいアルコールを添加して、冷蔵庫（４℃）に入れて１２時間静置させた。上記の静置液から上澄み液のみを再度遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）した後、沈殿物を回収して粗菌体外多糖を抽出した。粗菌体外多糖は、凍結乾燥機で７２時間乾燥させて、完全な菌体外多糖を得た。
【００４６】
２．セリポリア・ラセラタ液体培養の最適化条件
２−１．実験方法
２−１−１．培養条件
振とうフラスコ培養条件によるセリポリア・ラセラタ液体培養条件の最適化のために炭水化物とタンパク質微量元素の種類と濃度による理化学的特徴および菌糸体と菌体外多糖の含有量を測定した。炭素源として、グルコース、スクロース、乳糖、果糖、ガラクトースの種類と濃度（３〜５％）に基づく特徴を評価し、窒素源として、トリプトン、酵母エキス、大豆粉、Ｌ−グルタミン酸、過硫酸アンモニウム、麦芽エキス、ペプトンの種類と濃度（０．２５％）による特徴を評価した。微量元素の種類として、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＣａＣｌ２を０．１％〜０．５％の濃度による特徴を評価した。培養条件として１０００ｍＬ三角フラスコに総ボリュームを８００ｍＬになるようにして、２５℃において１２０ｒｐｍの速度で８日間培養した後、分析した。５Ｌのジャーファーメンターでは総ボリュームを３Ｌにし、培養日数による理化学的特徴を分析した。
【００４７】
２−１−２．ｐＨ、酸度および糖度測定
ｐＨはｐＨメーター、糖度は電子糖度計を用いて測定し、酸度は培養液１０ｍＬをとり、ｐＨメーターを測定し、培養液のｐＨが８．３になるまで０．１ＮのＮａＯＨを加えた後、消費された０．１ＮのＮａＯＨ量を計算して酒石酸の含量を対比して計算した。
【００４８】
２−１−３．菌糸体および菌体外多糖含量の測定方法
培養液を１２０００ｘｇにおいて２０分間遠心分離し、沈んだ沈殿物を蒸留水に３回洗浄した後ろ過し、ろ液を凍結乾燥して重量を測定して菌糸体の生産量を測定する。培養液を１２０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上澄み液に２倍ボリュームに相当する冷たいイソプロピルアルコールを添加した。４℃で一晩おいた後、再度１２０００ｘｇで２０分間遠心分離して沈んだ沈殿物を蒸留水に溶かした後、凍結乾燥して重量を測定して菌糸体の生産量を測定する。
【００４９】
２−１−４．チロシン含量、プロテアーゼ、αアミラーゼ活性の測定、血栓溶解酵素活性の測定
セリポリア・ラセラタの培養液のペプチド生成程度を測定するためにフォーリンフェノール試薬を用いて、培養液中に存在するチロシン含量を測定した。培養液０．７ｍＬに０．４４Ｍトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）０．７ｍＬを添加し、３７℃で３０分間反応させた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を除去した。回収した上澄み液１ｍＬに０．５５ＭのＮａ２ＣＯ３２．５ｍＬとフェノール試薬０．５ｍＬを順番に入れて混合した後、３７℃の恒温水槽で３０分間反応させた。常温で冷却させた後、反応液の吸光度を分光光度計（ＵＮＩＯＮ、Ｋｏｎｔｒｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により６６０ｎｍにおいて測定した。
【００５０】
酵素活性は、αアミラーゼとプロテアーゼに分けて力価を測定し、培養液を酵素液として使用して酵素活性を測定した。αアミラーゼの基質としては、１％の可溶性澱粉（０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、１ｍＬを使用した。あらかじめ調製した酵素液を１ｍＬ添加して、３７℃で３０分間反応させた後、１Ｍ酢酸１０ｍＬで反応を停止させ、ヨウ化溶液（０．００５％Ｉ２＋０．０５％ＫＩ）２ｍＬを入れて発色させた後、６６０ｎｍにおいて吸光度を測定し、ブランクＯＤ値の１０％減少させることを１ｕｎｉｔとして試料１ｇに換算した後に表示した。対照群であるブランク試験は、あらかじめ調製した酵素液を１００℃で３０分間沸騰させ不活性化させた検液を使用した。
【００５１】
プロテアーゼの活性度は、基質として０．６％のカゼイン溶液０．３５ｍＬと酵素液０．３５ｍＬとをｅ−ｔｕｂｅに入れ恒温水槽で反応（３７℃、１０分）させた後、０．４４Ｍのトリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ）０．７ｍＬを入れて反応を停止した後、３７℃で３０分間静置した。この反応液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分）した後、ろ液１ｍＬに０．５５ＭのＮａ２ＣＯ３２．５ｍＬと３倍希釈されたフォーリン試薬０．５ｍＬを入れ、３７℃で３０分間反応させた後、６６０ｎｍにおいて吸光度を測定した。この反応条件下で１分間にチロシン１ｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００５２】
血栓溶解酵素の活性は、フィブリン平板法の一種であるＡｓｔｒｕｐとＭｕｅｌｌｅｒｔｚ方法を使用して測定した。フィブリンプレートは０．５％フィブリノゲンを０．０６７Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に溶解して、直径９ｃｍのペトリ皿に１０ｍＬを加えた。これに０．０６７Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に溶解したトロンビン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）０．１ｍＬを加えて迅速に混合した後、室温で３０分放置して固形化した。フィブリンプレートの各表示された場所に培養液を２０Ｌずつ点滴して、３７℃で２時間反応させた後、溶解面積で酵素活性を求めた。標準プラスミン酵素活性の標準曲線を作成した後、培養液中の血栓溶解酵素は、標準曲線と比較してプラスミンユニットに換算し、血栓溶解酵素活性（％）を示した。対照群としては精製された血栓溶解酵素であるプラスミン（５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を使用して計算した。
【００５３】
２−１−５．糖、タンパク質含有量の測定
糖の含有量は、フェノール-硫酸法で測定した。濃度別に希釈した試料１ｍＬに８０％フェノールを２５μＬ添加した後、硫酸を２．５ｍＬ添加して室温で冷却し、４２５ｎｍにおいて吸光度を測定して計算した。タンパク質含有量は、ＢＣＡ方法により測定され、標準としてウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を使用した。
【００５４】
２−１−６．ＧＰＣを用いた菌体外多糖（ＥＰＳ）分子量の測定
乾燥した粘質物を０．１ＭのＮａ２ＳＯ４／０．０５ＭのＮａＮ３（酢酸でｐＨを４に調整）溶液に１％になるように溶かした後、遠心分離後、上澄みのみを０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析した。分析条件は、検出器としてＲＩを用い、ＧＰＣカラムはＳｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０５  ＨＱ（登録商標；日本）を用い、移動相を０．１ＭのＮａ２ＳＯ４／０．０５ＭのＮａＮ３（酢酸でｐＨを４に調整）に、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎの速度で流した。標準曲線は、それぞれ異なる分子量（１３０ｋＤａ、４００ｋＤａ、７７０ｋＤａ、１２００ｋＤａ）を有するデキストラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を用いて作成しており、屈折率計を用いて、ＥＰＳの分子量を測定した（表１）。
【００５５】
【表１】
2017025327.tif 000003
【００５６】
２−２．実験結果
２−２−１．セリポリア・ラセラタＩＴＳ―５．８ｓ  ｒＤＮＡ配列解析の結果
セリポリア・ラセラタ菌株をＩＴＳ―５．８ｓ  ｒＤＮＡ配列を行った結果、セリポリア・ラセラタＦＪ４６２７４６と９２％の相同性を有することが分かった（図１）。
【００５７】
２−２−２．糖の種類と濃度による理化学的特性の評価
糖の種類による理化学的特性を評価するためにラクトース、スクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトースの５種類の糖を３％添加して７日間培養した。その結果、ｐＨおいては大きな差がなく、残糖の含有量においてグルコースが少し小さいことが確認された。また、炭素源の種類によって菌糸体ペレットの形や大きさが異なることが確認され、菌糸体の生育に炭素源が及ぼす影響が非常に大きいことが確認された。また、菌糸体含有量とＥＰＳ含量もグルコース添加区で最も高く、その次にフルクトースとスクロースが高かった。グルコースを濃度別（１５％）に添加して菌糸体とＥＰＳ含量を測定した結果、３％までの濃度依存的に高まっていき、それ以降は大きな変化がないことが分かり、グルコースの濃度は３％が最適条件であると選定した。
【００５８】
２−２−３．窒素源の種類と濃度による理化学的特性の評価
窒素源の種類による理化学的特性を評価するためにトリプトン、酵母エキス、大豆粉、Ｌ―グルタミン酸、過硫酸アンモニウム、麦芽エキス、ペプトンの７種類の窒素源を３％添加して７日間培養した。菌糸体含有量は、大豆粉添加区が最も高く、ＥＰＳ含量はトリプトン、酵母エキス、大豆粉、Ｌ―グルタミン酸が類似のレベルで高かったが、経済的、産業的な側面から菌糸体とＥＰＳの含有量がともに高い大豆粉を窒素源として選択した。大豆粉を０．２５％の濃度で添加したときｐＨは大きな変化はなく、糖度は大豆粉濃度に依存して増加した。チロシン含有量もまた、大豆粉濃度に依存して増加し、プロテアーゼとαアミラーゼの活性は大豆粉２３％添加区で高い傾向を示し、高濃度ではむしろ少し減少した。ところが、血栓溶解酵素の活性は、大豆粉濃度に依存して増加することを示した。菌糸体とＥＰＳ含有量は、炭素源の濃度と同様の傾向で３％までは増加の傾向を示すが、３％以降は大きな変化はないので、最適な濃度は３％であると選定した。大豆粉を添加して培養した培養物のＥＰＳの糖とタンパク質含有量を測定した結果、糖の含有量は約４０％、タンパク質含有量は約３３％前後であると示し、糖とタンパク質とが結合された多糖体という事実が確認された。下記表２は、大豆粉の含有量による化学的特性と酵素活性を示したものであり、表３は、大豆粉末の含有量による菌体外多糖の組成を示したものである。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
【表３】
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【００６１】
２−２−４．微量元素の種類と濃度による理化学的特性の評価
微量元素の種類による理化学的特性を評価するためにＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＣａＣｌ２の５種類の微量元素を０．５％添加して７日間培養した。その結果、菌糸体の含有量は、ＣｕＳＯ４添加区が最も高かったが、ＥＰＳの生産はＭｇＳＯ４添加区が最も高いのでＭｇＳＯ４を微量元素として選定した。微量元素濃度を０％〜０．２５％の濃度で添加して菌糸体とＥＰＳ含量を測定した結果、０．１５％の濃度までは増加されるが０．２２％では大きな差がないので、最適な濃度は、０．１５％に選定した。
【００６２】
２−２−５．培養期間による理化学的特性評価（５Ｌ  ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）
選定された最適培地を使用して、５Ｌ  ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒにおいて、培養期間による菌糸体とＥＰＳ含量を測定した結果、培養８日までは菌糸体の含有量に大きい変化はなかったが１０日以降に減少する傾向を示し、ＥＰＳは８日以降に増加する傾向を示したが有意な差はなかった。最適培養日数は８日と選定した。
【００６３】
２−２−６．菌体外多糖（ＥＰＳ）の特性評価
ＥＰＳを、２次精製、タンパク質加水分解酵素処理をして、タンパク質と糖含量を測定した結果、糖含量は、精製によってむしろ低くなる結果を示し、タンパク質含有量は高くなる傾向を示した。ＧＰＣを用いて、ＥＰＳ分子量を測定した結果、約１２０ｋＤａ前後であることが分かった。タンパク質加水分解酵素処理により分子量が若干減少することが分かった。
【００６４】
３．２型糖尿病モデルを用いたＣＬＤとＥＰＳの抗糖尿効果の検証
３−１．実験方法
３−１−１．セリポリア・ラセラタ培養液抽出物
本実験に使用したセリポリア・ラセラタ培養液抽出物は、上記の項目１．で調製されたものを使用した。
【００６５】
３−１−２．菌糸体および菌体外多糖含量の測定方法
凍結乾燥された培養液を１０％溶液に調製して遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）した後、上澄み液を分離する。分離した上澄み液の４倍のボリュームに相当する冷たいイソプロピルアルコールを添加して４℃で一晩置く。再度遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）して沈んだ沈殿物を回収し、凍結乾燥して重量を測定して、指標物質である菌体外多糖含有量を表示する。セリポリア・ラセラタの培養物の主な成分は炭水化物であり、粗炭水化物の含有量は７９％、粗タンパク質含有量は１５％程度を示した。
【００６６】
３−１−３．実験動物と実験の設計
セリポリア・ラセラタ培養物と菌体外多糖の血糖降下効果を調査するために、本実験では、２型糖尿病の代表的な動物モデルであるＣ５７ＢＬ／Ｋｓｊ（ＢＬ／Ｌｓ）ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｉａｂｅｔｉｃ（ｄｂ／ｄｂ）マウス（ＳＰＦ）を使用した。ｄｂ／ｄｂマウスは、４番染色体のレプチン受容体遺伝子であるＬｅｐｒに点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が惹起、糖尿病が誘発される動物として、レプチン受容体の減少により信号伝達能力が減少して血糖が増加し、インスリン非依存性糖尿病モデルとして確立され認められる動物として、基礎資料が豊富で、試験結果の評価および比較に適するので選択した。本研究で使用したｄｂ／ｄｂマウスは、３０４０ｇ程度の６週齢の雄であり、Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ.で生産し、中央実験動物（株）を介して供給され、約７日間の検疫順応および適応期間後の体重と血糖を測定し、試験実施に適して一般症状に異常がない健康な動物３０匹を選別した。
【００６７】
実験動物は、乱塊法（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）により、陰性対照群、菌体外多糖、低用量群（１５０ｍｇ／ｋｇ）、菌体外多糖の高容量群（３００ｍｇ／ｋｇ）および陽性対照群（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ―３００ｍｇ／ｋｇ）など、４群の血糖および体重が均等になるように分けて６週間飼育した。また、正常群および対照群もそれぞれ６匹を同じ条件で６週間飼育した。すべての試験物質および陽性対照物質は毎日同じ時間に経口投与し、正常群、陰性対照群のグループは、水を経口投与した（図１１）。６週の飼育期間中の体重の変化を、毎週1回測定し、血糖の変化を調べるために、１２時間の空腹時尾静脈血糖を血糖測定器（ＡＣＣＵ―ＣＨＥＫ  Ｓｅｎｓｏｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、毎週１回測定した。実験動物の飼料は、市販の実験動物固形飼料（Ｓａｍｔａｃｏ  ｃｏ．ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を供給し、水は自由摂取させた。動物飼育室の飼育条件は、１２時間明暗サイクル（午前８時〜午後８時照明）、温度２３±３℃、相対湿度５０±１０％になるように調節した。
【００６８】
３−１−４．経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ、Ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）
１２時間以上絶食させ、空腹時血糖値を測定した後、セリポリア・ラセラタの粉およびＥＰＳを濃度別に蒸留水に溶かした試料を、各群別に５匹ずつ、まず経口投与した。この時、対照群には生理食塩水を同量で投与した。それから、対照群を除いた他の群に４０％グルコースを２ｇ／ｋｇ  ｂｗの濃度で経口投与した後、３０分、６０分、９０分、１２０分に尾静脈から採血して血糖の変化を観察した。各時点の血糖増加値を計算して、血糖増加曲線を求めた。
【００６９】
３−１−５．実験動物の犠牲試料収集
血糖値の測定は、１２時間空腹時尾静脈から測定し、生化学分析のための血清は、１２時間以上空腹時の血液を採取しなければならなので、実験動物の犠牲は６週間飼育終了後、最終の６週目の血糖値を測定し、２日が経過した後に行われた。
【００７０】
実験動物の犠牲時、すべての動物は１２時間絶食後エーテルで麻酔し、腹部大静脈から血液を取って血清分離用チューブに分けて入れ、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後血清を得て、生化学的指標分析のための試料として用いた。犠牲直後すべての動物は、肝臓、腹部の脂肪などを摘出して重量を測定し、−８０℃で急速冷凍して、後の追加実験のために使用できるように保管した。肝臓、膵臓の一部は摘出して４％パラホルムアルデヒド溶液に固定し、組織分析に用いた。
【００７１】
３−１−６．血清Ｃ−ペプチド、インスリンおよびレプチン濃度
血糖関連の機能性指標である血清Ｃ−ペプチドとインスリン含量は、腹部大静脈から採取、分離した血清を使用して、それぞれ二重抗体Ｃ−ペプチド（ＤＰＣ、ＵＳＡ）とイン
スリンＲＩＡ  ｋｉｔ（ＤＰＣ、ＵＳＡ）を用いて、放射免疫測定方法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によってマウスレプチンＲＩＡ  ｋｉｔ（ＬＩＮＣＯ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００７２】
３−２実験結果
３−２−１．食餌摂取量および体重変化
６週間の実験動物の体重変化、食餌、飲水摂取量は、図１４、図１５、図１６の通りである。糖尿対照群とＥＰＳ摂取群の初期体重は３２ｇ程度と同様のレベルであり、６週間後にも体重において糖尿病対照群と実験群の間に大きな変化は見られず、実験期間中増加する傾向を示した。飼料と飲水摂取量において、正常群に比べて糖尿対照群が高い傾向を示し、陽性対照群であるＭＥＴ３００群は、飲水飼料摂取量が他のグループに比べて著しく低かった。
【００７３】
３−２−２．臓器の重量
実験動物の肝臓、腎臓、脾臓、腎臓脂肪および腹部脂肪の重量を測定した結果は、表４のとおりである。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
肝臓の重量は、糖尿病誘発群で急激に増加している傾向を見せ、サンプルを投与したグループで有意に減少する傾向を示した。糖尿誘発時肝臓に脂肪が蓄積されて肥大になるという報告と一致する傾向を示した。また、腎臓は、糖尿病の発症初期に糸球体ろ過量の増加とともに容積が増加すると言うが、本研究においても、糖尿病誘発群で腎臓の大きさが増加する傾向を示したが、有意義な差はなかった。また、脾臓もやはりグループ間の有意な差を示さなかった。腎臓脂肪は糖尿誘発群で急激に増加したが、ＥＰＳとセリポリア粉末投与により有意に減少される傾向を示したが、腹部脂肪は有意な差を示さなかった。
【００７６】
３−２−３．血糖値の変化に及ぼす影響
１２時間空腹時血糖値の変化を測定した結果は、図１６の通りである。初期血糖値は、すべてのグループが１５０ｍｇ／ｄＬ前後に同様のレベルを示したが、サンプル投与後一週間が過ぎた頃から血糖が少し上昇し始めており、３週間後に血糖値が急激に増加して、糖尿病対照群は、約４００ｍｇ／ｄＬの血糖値を示し、一方、メトホルミングループは、血糖値が上がらないことが分かった。その後、血糖値が持続的に上昇したがＥＰＳとセリポリア粉末を投与したグループは、糖尿対照群よりも血糖値が有意に減少する傾向を示した。
【００７７】
３−２−４．経口耐糖能
ＥＰＳとセリポリア粉末の耐糖能は、サンプル摂取６週目で測定し、その結果は図１７の通りである。糖尿対照群の場合血糖値は、血糖計の測定最高値である６００ｍｇ／ｄＬを示し、ブドウ糖負荷測定期間中継続して高血糖を維持した。一方、ＥＰＳとセリポリア粉末摂取群の初期空腹時の血糖値は５００ｍｇ／ｄＬとして糖尿病対照群と比較したら有意に低く、ブドウ糖負荷後時間が経過するにつれ、血糖が徐々に上昇して３０分後に血糖計最高測定値である６００ｍｇ／ｄＬであり、以降徐々に減少して１８０分後５２０ｍｇ／ｄＬで、初期血糖値と同様のレベルに回復した。
【００７８】
３−２−５．血糖値
６週間ＥＰＳを経口投与した後、犠牲にした後の血中グルコース濃度を測定した結果、ＤＭグループの血糖は約９００ｍｇ／ｄＬに上昇し、それに対してサンプルを投与したグループでは濃度依存的に血糖が減少し、ＥＰＳ３００グループは約７００ｍｇ／ｄＬまで減少して、ＥＰＳが血糖減少に有効な役割を果たすと推測される。
【００７９】
３−２−６．血清脂質レベルに与える影響
６週間ＥＰＳを経口投与した後、犠牲後の血清脂質レベルを測定した結果、総コレステロールと中性脂質の含有量が、ＤＭグループにおいてＮＣグループに比べて約２倍以上に増加する傾向を示したが、ＥＰＳ投与グループでは、有意に総コレステロールと中性脂質の含有量が低くなったことを確認した。また、ＥＰＳ投与グループでＨＤＬコレステロール含有量は有意に高くなり、ＬＤＬ-コレステロールの含有量は、有意に減少することが示され、ＥＰＳは２型糖尿病モデルにおいて体重減量には大きな変化がなかったが、血清脂質レベルを改善させる物質であることが確認された。
【００８０】
３−２−７．インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチンのレベルに与える影響
６週間ＥＰＳを経口投与した後の血清に含有されたインスリンとＣ―ペプチド、レプチンの含有量を測定した結果、インスリン含有量は、糖尿病誘発グループ間の有意な差はなく、Ｃ−ペプチドは、サンプル投与グループでＤＭグループより含有量が高くなることが確認された。これは、膵臓におけるインスリン分泌能が活発になるものと推測され、レプチン含有量もやはり増加してインスリン抵抗性に積極的な役割をすることが確認された。
【００８１】
４．菌体外多糖が３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるインスリンシグナル伝達の変換に及ぼす影響
４−１．実験方法
４−１−１．細胞培養
前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）は、生物学的特性がよく明らかにされていて、適切な条件下で培養すると、脂肪細胞に分化する性質を有しており、脂肪細胞の代謝過程において脂肪分解抑制あるいは合成研究に使用しているだけでなく、脂肪細胞は、インスリン標的細胞としてインスリンシグナル伝達システムを研究するために多く利用されている。実験に使用した３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞は、韓国細胞株銀行から分譲を受け、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、２００ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ペニシリン（１００００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）高グルコースで３日おきに変えて、３７℃、１０％ＣＯ２において培養した。継代培養を行う際には、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞が６０％〜８０％融合されたとき、培養細胞の表面をダルベッコリン酸緩衝整理食塩（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）溶液に洗浄した後、７５ｃｍ２フラスコあたり２．５％トリプシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）５００μＬを入れて３７℃、５分間培養して、フラスコで細胞を脱着して継代培養した。脱着された細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ高グルコース培養液１５ｍｌを浮遊させた新しいフラスコに移した。
【００８２】
４−１−２．脂肪細胞内へのグルコース摂取
３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞を細胞培養と同様の方法で融合されるまで培養し融合され、２日が過ぎて誘導分化物質である０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ）、２５μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ、  Ｓｉｇｍａ）、インスリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ高グルコースに変えて３日間培養し、２日に一回ずつ新しい培養液に変え脂肪細胞に変えた。そして、脂肪細胞に完全に転換される１０日〜１５日の間にブドウ糖摂取実験を行った。インスリンの作用力の程度を反映するグルコース摂取実験は、前日に、完全に脂肪細胞に変化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に２．５％トリプシン処理をした後、血球計（ｈａｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計算された２０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を２４ウェルプレートに移した。そして、ＤＭＥＭ低グルコースに培養液を変えて餓死させた。ウェルプレートに移した脂肪細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）を含有しているＨＥＰＥＳ溶液にセリポリア・ラセラタ培養液抽出物１０／ｍｌ、１／ｍｌそれぞれと、インスリンとを入れて、１．５時間３７℃で培養した。そして、細胞内に移動した後、代謝されないグルコース類似体である２−デオキシＤ−[３Ｈ]グルコース（２−ＤＧ）１０Ｃｉ／ｍｌを入れ、３７℃で１０分間再培養した。１０分後、冷たいＰＢＳで５回洗浄し、１Ｎ  ＮａＯＨで細胞を分解した後、１Ｎ  ＨＣｌで中和させ、グルコースの細胞内へ摂取した３Ｈの含有量を５分間ベータカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ(登録商標)２１００ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅ、ＩＬ）で測定した。非特異的なグルコース摂取を排除するためにグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の作用を抑制するサイトカラシンＢ（ｓｉｇｍａ）と一緒に培養したものも測定した。セリポリア・ラセラタ培養液抽出物にインスリン感受性製剤が含有されているのか否かを探索するにおいて、細胞内のグルコース摂取がインスリン５０ｎｇ／ｍｌである時が最高濃度であるため、実験に用いる低濃度はインスリン１ｎｇ／ｍｌにし、高濃度はインスリン２５ｎｇ／ｍｌに選択した。この実験は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にインスリン１ｎｇ／ｍｌと一緒に冬虫夏草の分画物を入れて１．５時間培養した後、グルコースの摂取程度をインスリン１ｎｇ／ｍｌにおける摂取程度と比較した。すべての実験は、３回繰り返しており、分離した物質がインスリンの作用と関係なく界面活性剤として作用し細胞膜を破壊してグルコース摂取を増加させることを排除するために、インスリン０ｎｇ／ｍｌにて分離した物質と一緒にグルコース摂取を測定した時、この値が基礎値よりも高いのは、グルコースの摂取を増加させたとしてもインスリン感受性製剤としての作用はないものとみなした。
【００８３】
４−１−３．インスリンシグナルシステムに関与するタンパク質発現の調査
実験のために３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に２．５％トリプシン処理をし、２４ウェルプレートに細胞を移した。そして、実験２４時間前に１０％ウシ胎仔血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｎｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）低グルコース培養液に変えて餓死させた。そして、ＰＢＳで洗浄をした後、ＨＥＰＥＳにセリポリア・ラセラタ培養液抽出物とインスリン１ｎｇ／ｍｌを入れ、１時間３７℃で培養した後、５０ｕｎｉｔアプロチニン、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有している、ＲＩＰＡバッファーを用いてアイス状態でウェルプレートから細胞を切り離した。切り離した細胞を１００００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心分離した。そして、遠心分離した下層液をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで希釈してＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動後、ニトロセルロースに移動してウサギＧＬＵＴ４抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、ＩＲ、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＭＡＰＫ、ＡＭＰＫ抗体を利用してウエスタンブロットを行った後、その含量をレーザー密度計により決定した。
【００８４】
４−２．実験結果
４−２−１．インスリン感受性
インスリンは、１型糖尿病と２型糖尿病の患者に治療薬として最も多く使われる物質である。インスリンは、脂肪細胞から分化を促進させる因子であり、インスリンが作用して含脂肪細胞が多く生成される。セリポリア・ラセラタの培養液抽出物（ＥＰＳ）は、インスリン性物質として濃度依存的に脂肪細胞の分化を促進させることが分かった。インスリンの代替となる天然物質としての可能性を確認した。
【００８５】
４−２−２．グルコース摂取
前脂肪細胞である３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞は、生物学的特性が明らかにされていて、適切な条件下で培養すると、脂肪細胞に分化する性質を有しているので、脂肪細胞の代謝過程において脂肪分解抑制または合成の研究に用いられている。本実験では、インスリンのような誘導物質の存在下では、酵素活性を急激に増加させて分化を促進する特性を利用して、インスリン感受性製剤の存在の可否を探索した。つまり、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞をインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾンのような誘導分化物質を添加し転換された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を実験に使用した。細胞内へのグルコース摂取は、グルコース運搬体であるＧＬＵＴ４によって細胞内に移動されたグルコース類似体の２−デオキシ−Ｄ−[３Ｈ]グルコースの量を測定した。グルコース摂取実験のために、２４時間前にＤＭＥＭ低グルコース培養液で絶食させ飢餓状態である３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＨＥＰＥＳとＥＰＳを一緒に処理することにより、ＥＰＳによる細胞内へのグルコース摂取の程度が分かった。実験対照群であるインスリン未処理のｂａｓａｌと比較して、すべてグルコース摂取は増加したものの、インスリンを処理したときには、インスリンが存在時にＥＰＳが感受性製剤として作用して、吸収を濃度的により増加させることを示した。
【００８６】
４−２−３．インスリンシグナルシステムに関与するタンパク質の発現
インスリンの細胞内シグナル伝達は、様々なプロセスを含み複雑に行われる。インスリンが標的細胞で作用する機序は、原形質膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）にあるインスリン受容体と結合することにより、様々なインスリンの作用が現れるようになる。つまり、インスリン受容体は、２つのα−サ−ブユニットとβ−サ−ブユニットとで構成されており、インスリンの作用は、まず、最初に血液内のインスリンが標的細胞のインスリン受容体のα−サ−ブユニットに結合することから始まる。そして、活性化したα−サ−ブユニットは細胞膜の内部にあるβ−サ−ブユニットのチロシンキナーゼを活性化させる。一般的に、β−サ−ブユニットのチロシンキナーゼの活性は、インスリン作用の初期段階として、インスリンの多くの生理的作用に欠かせないものと考えられている。
【００８７】
β−サ−ブユニットのチロシンキナーゼが活性化されると、インスリンシグナル伝達過程の様々な結合タンパク質であるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−３、ＩＲＳ−４、Ｓｈｃ、ｐ６０などをリン酸化させ、続いて、複雑な相互作用を持つ複数の下向性シグナル伝達経路を介して、インスリンのシグナル伝達が行われる。その中のＩＲＳのチロシンリン酸化は、最終的にホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）の活性化をもたらす。
【００８８】
ＰＩ３−キナーゼは、１１０−ｋＤａの触媒サブユニットと８５−ｋＤａとの規制サブユニットからなるヘテロダイマーとしてリン酸化したＩＲＳ−１とＩＲＳ−２は、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５サ−ブユニットと結合し、続いてｐ１１０サ−ブユニットを活性化させ、ホスファチジルイノシトール４，５−ジリン酸をホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−３，４，５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換させる。これらのホスファチジルイノシトールは、複数の成長促進因子の生物学的作用に重要な役割を果たすシグナル伝達物質として考えられるが、ホルモンシグナルの伝達過程において、これらのホスファチジルイノシトールそれぞれの正確な機能はまだ知られていなかった。このようなＰＩ３−キナーゼ経路を介し、その下位のｐ７０Ｓ６キナーゼなどが活性化されるなど、各種タンパク質とキナーゼなどが、リン酸化と脱リン酸化のシグナル伝達過程を経る。ＰＩ３−キナーゼの活性化は、グルコース移動、脂肪分解抑制、グリコーゲン合成、タンパク質合成から有糸分裂誘発に至るまで、インスリン刺激後の多くの作用に重要であるが、このような反応を起こすことにおいて、ＰＩ３−キナーゼがどのような関連があるかはまだはっきりしていない。
【００８９】
一方、チロシンキナーゼの活性、チロシンリン酸化がインスリンの作用において、常にすべての細胞において、すべての場合に必ず必要なものとは考えていない。チロシンリン酸化とは関係なく行われる過程があるといわれており、チロシンリン酸化とは無関係に行われる伝達経路の一つがＧタンパク質による伝達経路である。複数のＧタンパク質の中で最も研究が盛んに行われることは、様々な生物学的な信号を誘導するＧＴＰ結合タンパクであるＲａｓである。Ｒａｓは、ＳＯＳとＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）などにより調整され、このＲａｓの活性化は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、Ｒａｆ−１ＭＡＰＫ／Ｅがキナーゼ（ＭＡＰＫＫまたはＭＥＫ）、ｐ９０リボソーム性Ｓ６キナーゼなどの活性を順次に発生させる。また、Ｇタンパク質の一種であるＡＲＦとＲｈｏタンパク質は、ホスホリパーゼＤを活性化させることにより、糖輸送体の再循環に重要な役割をするものと考えられ、Ｒａｂ４タンパク質は、ＧＬＵＴ４の分泌と関係する経路に重要な役割をすると考えられる。このようなシグナル伝達経路の一部は、独立して、一部は相互調節作用を持ちながらグルコース輸送、酵素活性化タンパクおよび核酸の合成のような、最終的インスリンの生物学的な効果が発現されることになる。インスリンシグナル伝達過程には、多くのシグナル伝達機序と、多くのタンパク基質が存在し、そのうちのＩＲＳ−１がインスリンシグナルのリンク鎖の役割を中心的に果たし、ＩＲＳ−１がインスリン受容体のシグナルをＰＩ３−キナーゼ、ＧＲＢ−２、ＳＯＳ、Ｒａｓ、Ｒａｂ４、ＡＲＦ、ＳＹＰ、Ｎｃｋなどの信号物質に伝達する役割を果たすものと考えられている。本実験は、糖輸送体であるＧＬＵＴ４の発現を増加させたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物が、インスリンシグナル伝達体系にどのような影響を与えるかの実験を行った。つまり、インスリンシグナル伝達システムの中心的な役割のＩＲがセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物による細胞内ＩＲＳ−１の濃度を調べ、ＩＲＳ−１と結合してインスリンの信号を細胞内に伝達するＰＩ３−キナーゼの濃度を調べた。そして、ＩＲＳ−１とＰＩ３−キナーゼの信号を受けて、グルコースを移動させるＧＬＵＴ４の細胞内濃度も調べた。その結果、インスリンによってすべてのタンパク質がリン酸化され、ＥＰＳ処理によって発現量が増加することが確認された。ＥＰＳは、ＩＲとＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ経路を介してグルコースの吸収を促進させ、また、ＡＭＰＫのタンパク質発現を増加させ、グルコースの吸収を促進させることにより、インスリン抵抗性を改善することができる物質であると推測することができる。
【００９０】
５．指標物質および抗糖尿機能性物質の分析
５−１．実験方法
ＣＬＤ１００ｇを１．５Ｌの水に懸濁した後、ヘキサン１．５Ｌを加える。分液漏斗に入れ、ヘキサン不溶性層と可用性層とに分画して、上層部を収集した。下層と同じ体積のヘキサン溶媒を同じ方法で２回繰り返して、溶液の色が薄くなるまで、ヘキサン層に溶解可能な物質を最大限に取り出し画分および乾燥した。続いて塩化メチレン、酢酸エチル、ブタノールを上記と同じ方法で実行して、それぞれヘキサン可溶抽出物１５ｇ、塩化メチレン可溶抽出物２５ｇ、酢酸エチル可溶抽出物３０ｇ、ブタノール可溶抽出物１５ｇを得て、試料として使用した。
【００９１】
酢酸エチル可溶抽出物３０ｇを、溶出液（ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝１０：３：１）を用いてシリカゲルカラムクラクロマトグラフィー（１２×６０ｃｍメルク社、ＡＳＴＭ７７３４ドイツ）を実施した後、ＴＬＣパターンによって１５個の分画物を収得した。
【００９２】
５−２．２，５―ジヒドロキシ安息香酸化合物の分離
分画物のうち、６番目分画物の溶出液（トルエン：酢酸エチル：酢酸＝５：３：１）を用いてシリカゲルカラムクラクロマトグラフィー（１．５×１２ｃｍ、ＡＳＴＭ７７３４）により分離して、最終的に分離および精製するために、ＴＬＣ（展開溶媒／トルエン：酢酸エチル：酢酸＝５：４：１）上で、Ｒｆが０．５８である化合物７ｍｇを得ており、ＥＩ−ＭＡＳＳおよび１Ｈ−ＮＭＲ分析を介して下記化学式の２，５―ジヒドロキシ安息香酸に同情して試料として使用した。
【００９３】
【化１】
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【００９４】
５−３．プロトカテクアルデヒド化合物の分離
分画物のうち、７番目分画物の溶出液（トルエン：酢酸エチル：酢酸＝２．５：１：０．５）を用いて、シリカゲルカラムクラクロマトグラフィー（１．５×１５ｃｍ、ＡＳＴＭ７７３４）で分離して、最終的に分離および精製するために、ＴＬＣ（展開溶媒／トルエン：酢酸エチル：酢酸＝５：４：１）上でＲｆが０．５２である化合物２ｇを得て、ＥＩ−ＭＡＳＳおよび１Ｈ−ＮＭＲ分析により、下記化学式のプロトカテクアルデヒドに同定し、試料として使用した。
【００９５】
【化２】
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【００９６】
上記の２つの耐糖性物質の含有量を測定するために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｇｉｌｅｎｔ６４１０を使用し、イオン源は陰性とし、フラグメントは１５０にして分析した。ガス温度は３２０℃、ガス流速は毎分３５ｍＬの速度で流しながら分析し、キャピラリー電圧は４０００にした。ＨＰＬＣのカラムは、Ｅｐｉｃ  Ｃ１８を使用し、カラム温度は４０℃に維持した。移動相として０．１％ギ酸を含む蒸留水と０．１％ギ酸を含有したアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を使用した。
【００９７】
定量結果、抗糖尿効果があると報告された２，５−ジヒドロキシ安息香酸、プロトカテクアルデヒドが微量検出され、結果は下記の表５の通りである。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
５−３．菌体外多糖の分離
血糖降下に優れた効能があると報告された菌体外多糖の含有量を測定するために、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物５ｇに蒸留水１００ｍＬを添加してよく懸濁した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）し、これの上澄み液にその量の２倍〜３倍に相当する冷たいアルコールを添加して、冷蔵庫（４℃）に入れて１２時間静置した。上記の静置液から上澄み液のみを再度遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）した後、沈殿物を回収して粗菌体外多糖を抽出し、これを真空凍結乾燥した結果、指標物質である菌体外多糖の含有量が５．５±０．５％／１００ｍｇと示した。ＥＰＳの糖とタンパク質の含有量を測定した結果、糖の含有量は約４０％、タンパク質含有量は約３３％前後であることが示され、糖とタンパク質が結合された多糖体という事実が確認された。
【０１００】
上記で説明したように、本発明によれば、糖尿病と糖尿病合併症の治療と血糖降下に優れた効果があると知られている菌体外多糖が５．５±０．５％／１００ｍｇ、プロトカテクアルデヒドが１８．７９±０．８７（μｇ／ｇ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸が３７．６５±１．３２（μｇ／ｇ）以上含有されたセリポリア・ラセラタ菌糸体培養液の抽出物を提供することができる。
【０１０１】
６．げっ歯類毒性および効力試験
セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の安全性および効力試験をＧＬＰ認証機関であるＫ社にて、非臨床試験管理基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＬＰ）により実施した結果、２型糖尿病マウスにおいて、膵臓のベータ細胞が統計学的で有意なレベルに増加（膵臓、脾臓、胸腺の重量増加）し、対照薬として使用したファイザーのメトロポミン対比で安全で効能が優れているという試験結果を得た（表６）。
【０１０２】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、セリポリア・ラセラタ菌糸体培養液抽出物の調製方法および前記調製方法によって調製される糖尿病性疾患および糖尿病合併症の予防または治療のための薬学的組成物に関するもので、産業上の利用可能性が非常に高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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