(57)【要約】      （修正有）【課題】ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を予防又は治療するための医薬組成物、細胞内脂質輸送異常改善剤、及び、ＮＰＣ予防／治療薬又はＮＰＣ予防／治療薬候補物質、又は細胞内脂質輸送異常改善剤をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）生成阻害剤を含む、ＮＰＣを予防又は治療するための新規物質。前記ＣＩＰ生成阻外剤がセラミドキナーゼ生成阻外剤であり、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻外する核酸、又は当該核酸を含むベクターであり、当該核酸がｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸である組成物。【効果】新規物質は、Ｃ１Ｐ生成阻害によるＮＰＣ治療の作用機序は、細胞内脂質輸送異常、特に細胞内コレステロール輸送異常を直接改善するもので、ＮＰＣの根本治療につながる可能性がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）生成阻害剤を含む、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
Ｃ１Ｐ生成阻害剤がセラミドキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
セラミドキナーゼ阻害剤が、セラミドキナーゼ生成阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターであって、当該核酸がｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターであって、当該核酸がｓｉＲＮＡである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
セラミドキナーゼ阻害剤が、セラミドキナーゼ活性阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
セラミドキナーゼ活性阻害剤が、
・Ｎ−［２−（ベンゾイルアミノ）−６−ベンゾチアゾリル］トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−カルボキサミド（ＮＶＰ−２３１）、
・Ｆ−１２５０９Ａ、または、そのオレフィン異性体、シクロヘキサン誘導体、もしくは環化異性体、および
・セラミドキナーゼ活性を特異的に阻害する、これらの構造類似体
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
セラミドキナーゼ活性阻害剤が、ＮＶＰ−２３１である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）生成阻害剤を含む、細胞内脂質輸送異常改善剤。
【請求項１１】
細胞内脂質輸送異常が、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常である、請求項１０に記載の改善剤。
【請求項１２】
細胞内脂質輸送異常が、ＮＰＣ１タンパク質の変異または欠損に起因するものである、請求項１０または１１に記載の改善剤。
【請求項１３】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ脂質輸送異常である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１４】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１５】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内ラクトシルセラミド輸送異常である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１６】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１７】
細胞内脂質輸送異常が、小胞体における脂質の枯渇である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１８】
細胞内脂質輸送異常が、後期エンドソームおよび／またはライソゾームにおける脂質の蓄積である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項１９】
Ｃ１Ｐ生成阻害剤がセラミドキナーゼ阻害剤である、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の改善剤。
【請求項２０】
セラミドキナーゼ阻害剤が、セラミドキナーゼ生成阻害剤である、請求項１９に記載の改善剤。
【請求項２１】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターである、請求項２０に記載の改善剤。
【請求項２２】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターであって、当該核酸がｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸である、請求項２０に記載の改善剤。
【請求項２３】
セラミドキナーゼ生成阻害剤が、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターであって、当該核酸がｓｉＲＮＡである、請求項２０に記載の改善剤。
【請求項２４】
セラミドキナーゼ阻害剤が、セラミドキナーゼ活性阻害剤である、請求項１９に記載の改善剤。
【請求項２５】
セラミドキナーゼ活性阻害剤が、
・Ｎ−［２−（ベンゾイルアミノ）−６−ベンゾチアゾリル］トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−カルボキサミド（ＮＶＰ−２３１）、
・Ｆ−１２５０９Ａ、または、そのオレフィン異性体、シクロヘキサン誘導体、もしくは環化異性体、および
・セラミドキナーゼ活性を特異的に阻害する、これらの構造類似体
からなる群から選択される、請求項２４に記載の改善剤。
【請求項２６】
セラミドキナーゼ活性阻害剤が、ＮＶＰ−２３１である、請求項２５に記載の改善剤。
【請求項２７】
ＮＰＣ予防もしくは治療薬、または、ＮＰＣ予防もしくは治療薬候補物質をスクリーニングする方法であって、被験物質を準備する工程、被験物質のＣ１Ｐ生成阻害能を測定する工程、および、前記測定においてＣ１Ｐ生成阻害能を有することが示された被験物質がＮＰＣ予防もしくは治療薬、または、ＮＰＣ予防もしくは治療薬候補物質であると結論する工程を含む方法。
【請求項２８】
細胞内脂質輸送異常改善剤をスクリーニングする方法であって、被験物質を準備する工程、被験物質のＣ１Ｐ生成阻害能を測定する工程、および、前記測定においてＣ１Ｐ生成阻害能を有することが示された被験物質が細胞内脂質輸送異常改善剤であると結論する工程を含む方法。
【請求項２９】
細胞内脂質輸送異常が、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞内脂質輸送異常が、ＮＰＣ１タンパク質の変異または欠損に起因するものである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ脂質輸送異常である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内ラクトシルセラミド輸送異常である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞内脂質輸送異常が、細胞内コレステロール輸送異常である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を予防または治療するための医薬組成物、細胞内脂質輸送異常改善剤、および、ＮＰＣ予防／治療薬もしくはＮＰＣ予防／治療薬候補物質、または細胞内脂質輸送異常改善剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、中枢神経系障害を主徴とする常染色体劣性遺伝疾患であり、本邦の特定疾患の１つである。
【０００３】
ＮＰＣは、後期エンドソームに局在し細胞内の脂質輸送に関与するライソゾーム膜タンパク質ＮＰＣ１、またはライソゾーム分泌タンパク質ＮＰＣ２（ＨＥ１）の異常に起因する疾患であることが知られている（非特許文献１）。ＮＰＣ１やＮＰＣ２の機能異常によって、後期エンドソームおよび／またはライソゾーム内にスフィンゴミエリン、コレステロール、糖脂質等が蓄積し、それによって、ＮＰＣに特徴的な内臓症状、中枢神経系症状、精神症状等が発症すると考えられている。ＮＰＣに対しては、これまで種々の薬物療法が試みられてきたが、現在のところ、根治療法といえるものはない。
【０００４】
ミグルスタットは、現在本邦において承認された唯一のＮＰＣ治療薬である。ミグルスタットは、ＮＰＣにおいて蓄積するスフィンゴ糖脂質の生合成経路において、グルコシルセラミド合成酵素を阻害してグルコシルセラミドの生成を抑制するものである（非特許文献１）。しかしながら、ＮＰＣに対する治療効果は限定的である。
【０００５】
代替法として、近年、シクロデキストリン（２−ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン）の投与が試みられている。シクロデキストリンは環状オリゴ糖の一種であり、コレステロールを除去する作用を有する。ＮＰＣモデル細胞へのシクロデキストリンの投与は、コレステロール蓄積を軽減することが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、シクロデキストリンの治療効果もまた限定的である。
【０００６】
ＮＰＣの治療薬としては、その他様々な候補物質（ＮＳＡＩＤｓ／サイトカイン制御剤、クルクミン等）が提案されているが（非特許文献１）、いずれもＮＰＣの治療薬開発の必要性をなくすには不十分である。
【０００７】
したがって、ＮＰＣを予防または治療するための新規医薬組成物に対する需要は依然として高いままである。
【０００８】
また、ＮＰＣ以外にも、ライソゾームに関連する酵素の異常に起因して、種々の細胞内物質輸送異常、例えば、細胞内脂質輸送異常が観察されることが知られている。このような一群の障害は、ライソゾーム病と呼ばれ、本邦における特定疾患の１つとして難病指定されている。したがって、ＮＰＣまたはＮＰＣ以外の病気／障害に起因する細胞内物質輸送異常、特に、細胞内脂質輸送異常を改善または正常化するための新規薬剤に対する需要が存在する。
【０００９】
他方、スフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、アポトーシスや分化等、様々な細胞事象において脂質メディエーターとして作用することが知られており、その代謝産物の１つであるセラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）およびその生成酵素であるセラミドキナーゼもまた、膜融合、炎症、ＤＮＡ合成、細胞内カルシウム濃度の上昇等、複数の生理現象に関与していると考えられている（特許文献１、非特許文献２、３）。しかしながら、Ｃ１ＰとＮＰＣとの関連性、または、Ｃ１Ｐと細胞内脂質輸送異常との関連性について言及した報告は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−３３０７７３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】野口篤子ら、「Niemann-Pick病Ｃ型の治療」、神経内科、２０１４年、８０（６）：６５８−６６６頁
【非特許文献２】M.  SUGIURAら、The  Journal  of  Biological  Chemistry、２００２年、２７７：２３２９４−２３３００
【非特許文献３】S.  MITSUTAKEら、Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications、２００７年、３６３：５１９−５２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、ＮＰＣを予防または治療するための新規医薬組成物であって、従来の治療薬とは異なる作用機序に基づく医薬組成物を提供すること、細胞内脂質輸送異常を改善するための新規薬剤を提供すること、および／または新規ＮＰＣ予防／治療薬もしくはＮＰＣ予防／治療薬候補物質、または、細胞内脂質輸送異常改善剤の新規スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＰＣ細胞（ヒトＮＰＣ患者に由来するヒトＮＰＣ細胞、および、ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞であるＮＰＣモデル細胞）においてＣ１Ｐ濃度が亢進すること、および、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与によりＮＰＣ細胞内における脂質輸送異常、特に、コレステロール輸送異常が改善されることを初めて見出したものである。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、Ｃ１Ｐ生成阻害剤を含む、ＮＰＣを予防または治療するための医薬組成物を提供するものである。Ｃ１Ｐ生成阻害によるＮＰＣ治療の作用機序は、これまで報告されてきたミグルスタットやシクロデキストリンによるものとは異なり、細胞内脂質輸送異常、特に、細胞内コレステロール輸送異常を直接改善するものであるため、ＮＰＣの根本治療につながる可能性がある。
【００１５】
別の態様において、本発明は、Ｃ１Ｐ生成阻害剤を含む、細胞内脂質輸送異常改善剤を提供するものである。この態様において、細胞内脂質輸送異常は、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常、すなわち、ＮＰＣに起因する、または、ＮＰＣ細胞において観察される細胞内脂質輸送異常であってよく、好ましくは、ＮＰＣ１タンパク質の変異または欠損に起因するものであってよい。また、細胞内脂質輸送異常は、好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ脂質輸送異常であり、より好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常であり、さらに好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内ラクトシルセラミド輸送異常であり、特に好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常である。この態様において、細胞内脂質輸送異常は、小胞体における脂質の枯渇、ならびに／または、後期エンドソームおよび／もしくはライソゾームにおける脂質の蓄積であってよい。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、ＮＰＣ予防もしくは治療薬またはＮＰＣ予防もしくは治療薬候補物質、または細胞内脂質輸送異常改善剤をスクリーニングする方法を提供するものである。当該スクリーニング方法は、被験物質を準備する工程、被験物質のＣ１Ｐ生成阻害能を測定する工程、および、前記測定においてＣ１Ｐ生成阻害能を有することが示された被験物質が目的物質であると結論する工程を含む。この態様において、細胞内脂質輸送異常は、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常、すなわち、ＮＰＣに起因する、または、ＮＰＣ細胞において観察される細胞内脂質輸送異常であってよく、好ましくは、ＮＰＣ１タンパク質の変異または欠損に起因するものであってよい。また、細胞内脂質輸送異常は、好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ脂質輸送異常であり、より好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常であり、さらに好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内ラクトシルセラミド輸送異常であり、特に好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常である。この態様において、細胞内脂質輸送異常は、小胞体における脂質の枯渇、ならびに／または、後期エンドソームおよび／もしくはライソゾームにおける脂質の蓄積であってよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、従来公知の治療薬とは異なる作用機序に基づくＮＰＣを予防または治療するための新規医薬組成物が提供される。本発明に係るＣ１Ｐ生成阻害剤は、ＮＰＣの病態に密接に関連していると考えられている細胞内コレステロール輸送異常を正常化または改善するため、従来知られていなかったＮＰＣの根本治療がもたらされる可能性がある。加えて、本発明に係るＣ１Ｐ生成阻害剤は、その他の脂質の細胞内輸送異常を正常化または改善するため、従来の治療薬より優れたＮＰＣ治療がもたらされる蓋然性が高い。また、本発明に係るＣ１Ｐ生成阻害剤は、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常に限定されることなく、その他の要因により発生する細胞内脂質輸送異常の正常化または改善にも適用し得る。本発明に係るスクリーニング方法では、従来公知の治療薬とは異なる作用機序に基づくＮＰＣ予防／治療薬もしくはＮＰＣ予防／治療薬候補物質、または細胞内脂質輸送異常改善剤の入手が可能となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＮＰＣ細胞における、ＮＢＤ−セラミド代謝産物の生成量を示すものである。図１Ａ（左図）は、対照として使用したＪＰ１７細胞とＮＰＣ１を欠損したＡ１０１細胞におけるＮＢＤ−セラミドの各種代謝産物量を示すものである。図１Ｂ（右図）は，対照として使用したヒト由来の正常皮膚線維芽細胞（ＷＴ）とＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞（ＮＰＣ）におけるＮＢＤ−セラミドの各種代謝産物量を示すものである。各種セラミド代謝産物は、左から、セラミド、グルコシルセラミド、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）およびスフィンゴミエリンである。
【図２】ＮＰＣ細胞におけるコレステロール蓄積に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果を示すものである。図２Ａは、対照として使用したＪＰ１７細胞ではコレステロールの蓄積は観察されなかった一方、ＮＰＣ１を欠損したＡ１０１細胞では、後期エンドソームおよび／またはライソゾームにおけるコレステロールの特徴的な蓄積が観察されたこと、および、ＮＶＰ−２３１の添加により、当該コレステロール蓄積が軽減されたことを示している。図２Ｂは、ＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞にコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を添加した場合に、コレステロールの蓄積が観察された一方、当該細胞に、セラミドキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｅｒＫ）およびＮＶＰ−２３１を添加した場合には、当該コレステロール蓄積が軽減されたことを示している。この実験において、Ｆｉｌｉｐｉｎは、細胞内コレステロールを可視化するために使用されている。
【図３】ＮＰＣ細胞におけるＬＤＬに応答するＳＲＥＢＰ１の遅延活性化に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果を示すものである。図３Ａの上段では、対照として使用したＪＰ１７細胞では、培地より十分なコレステロール供給を受けているとき（ＦＢＳ）にはＳＲＥＢＰ１が小胞体に局在すること、培地中からのコレステロール供給が枯渇すると（ＬＰＤＳ）ＳＲＥＢＰ１が核内へ移行すること、および、この核内移行は、培地中にＬＤＬを添加すること（ＬＰＤＳ→ＬＤＬ）により回復し、ＳＲＥＢＰ１は再び小胞体に局在することを示している。図３Ａの下段では、ＮＰＣ１を欠損したＡ１０１細胞でも同様に、ＬＰＤＳで培養した際にはＳＲＥＢＰ１の核内への移行が観察されたが、この核内移行は、培地中にＬＤＬを添加すること（ＬＰＤＳ→ＬＤＬ）では回復しないこと、しかしながら、ＬＤＬと共にＮＶＰ−２３１を添加した際には（＋ＮＶＰ−２３１）、コレステロール輸送が改善し、小胞体におけるＳＲＥＢＰ１の局在が回復したことを示している。図３Ｂは、上記の実験結果を基に、ＳＲＥＢＰ１が核内に局在する細胞の割合を算出したものである。この実験において、ＳＲＥＢＰ１は、小胞体におけるコレステロール量の指標として使用されている。
【図４】ＮＰＣ細胞におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ局在に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果を示すものである。図４は、対照として使用したＪＰ１７細胞では、ラクトシルセラミドはゴルジ体に局在する一方、ＮＰＣ１を欠損したＡ１０１細胞では後期エンドソームに局在することを示している。図４は、さらに、Ａ１０１細胞にＮＶＰ−２３１を添加すると、ラクトシルセラミドがゴルジ体へ局在することを示している（ＮＶＰ−２３１）。この実験において、ＢＯＤＩＰＹは、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）を可視化するための蛍光標識として使用されている。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一態様において、本発明は、Ｃ１Ｐ生成阻害剤を含む、ＮＰＣを予防または治療するための医薬組成物に関するものである。
【００２０】
本発明のこの態様において、「Ｃ１Ｐ生成阻害剤」は、Ｃ１Ｐの生成に負の影響を及ぼすあらゆる物質を包含するものである。本発明者らによる実験によって、ＮＰＣ細胞においてＣ１Ｐ濃度が亢進されること、および、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与によりＮＰＣ細胞における細胞内脂質輸送異常、特に、細胞内コレステロール輸送異常が改善されることが見出されている。この実験結果は、Ｃ１Ｐの生成に負の影響を及ぼす物質がＮＰＣの予防または治療に有用であることを示すものである。
【００２１】
Ｃ１Ｐは、生体内において、セラミドキナーゼによって生成されることが知られている。したがって、本発明に係るＣ１Ｐ生成阻害剤は、好ましくは、セラミドキナーゼ阻害剤である。本発明において、「セラミドキナーゼ阻害剤」は、セラミドキナーゼの生成および／または活性に負の影響を及ぼすあらゆる物質を意味するものとして使用される。本発明においては、特に、セラミドキナーゼの生成に負の影響を及ぼす物質を「セラミドキナーゼ生成阻害剤」、セラミドキナーゼの活性に負の影響を及ぼす物質を「セラミドキナーゼ活性阻害剤」と称する。
【００２２】
セラミドキナーゼは、生体内においてセラミドをリン酸化する唯一の酵素であると報告されている（非特許文献３）。セラミドは、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物群の総称であり、脂肪酸部分の長さに応じてＣ６セラミドやＣ８セラミド等と呼称される生理活性物質である。本発明において、セラミドキナーゼは、かかるセラミドをリン酸化し、セラミド−１−リン（Ｃ１Ｐ）を生成する反応を触媒する酵素として定義される。本発明において、セラミドキナーゼは、あらゆる生物種に由来するセラミドキナーゼを意味するが、好ましくは、哺乳動物、爬虫類、魚類または鳥類に由来するセラミドキナーゼを意味し、より好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトまたはマウス、特に好ましくはヒトに由来するセラミドキナーゼを意味する。ヒトおよびマウスセラミドキナーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、２００２年に報告されている（非特許文献２）。その他、ジャイアントパンダ、グリーンアノール、コモンマーモセット、イヌ、シロサイ、ゼブラフィッシュ、ウマ、ネコ、セキショクヤケイ、ゴリラ、セイウチ、シャチ、カモノハシ、アナウサギ、オオガラゴ、ヒツジ、ドブネズミ、ボリビアリスザル、タスマニアデビル、キンカチョウ、アメリカマナティー、バンドウイルカおよびアフリカツメガエル等のセラミドキナーゼのアミノ酸配列が報告されている。
【００２３】
本発明において、セラミドキナーゼ生成阻害剤は、セラミドキナーゼの生成に負の影響を及ぼすあらゆる物質を包含するものであり、典型的には、セラミドキナーゼ遺伝子の発現に負の影響を及ぼすあらゆる物質を挙げることができる。本発明においては、セラミドキナーゼ遺伝子の発現に負の影響を及ぼす物質を「セラミドキナーゼ発現阻害剤」とも称する。セラミドキナーゼ発現阻害剤は、セラミドキナーゼ遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のあらゆる段階で作用するものであってよい。例えば、セラミドキナーゼ遺伝子の転写を阻害する物質、転写産物のプロセシングを阻害する物質、ｍＲＮＡの細胞質への輸送を阻害する物質、ｍＲＮＡを分解する物質、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する物質、翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質等を挙げることができる。
【００２４】
セラミドキナーゼ発現阻害剤は、好ましくは、セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸または当該核酸を含むベクターである。このような核酸としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、核酸アプタマー、デコイ核酸等を挙げることができるが、これらに限定されない。セラミドキナーゼの発現を特異的に阻害する核酸は、好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸であり、より好ましくは、ｓｉＲＮＡである。
【００２５】
「ｓｉＲＮＡ」は、狭義には、標的ｍＲＮＡを特異的に破壊する二本鎖ＲＮＡを意味するが、本発明においては、かかる二本鎖をループ領域を介して連結させた一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もまた包含するものとして定義される。ｓｉＲＮＡは、（１）セラミドキナーゼｍＲＮＡ（スプライシング前後のいずれも含む）のヌクレオチド配列に相補的なＲＮＡとその相補鎖からなる二本鎖領域を含むが、加えて、（２）各鎖の５’および／または３’末端に塩基対を形成しない付加的な塩基（オーバーハング）を含む付加的領域を有していてもよく、および／または（３）二本鎖を連結するループ領域を有していてもよい。二本鎖領域は、原則として、セラミドキナーゼｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なものであるが、必ずしも完全に相補的なものでなくてもよく、セラミドキナーゼｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、かつセラミドキナーゼｍＲＮＡの特異的破壊をもたらすものであれば本発明における二本鎖領域として使用可能である。
【００２６】
各鎖における二本鎖領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、１５、１６、１７、１８または１９塩基であり、その上限は、好ましくは１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基である。各鎖における二本鎖領域の塩基長は、好ましくは、１７〜２３塩基、より好ましくは、１９〜２１塩基である。
【００２７】
各鎖における付加的領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、１、２または３塩基であり、その上限は、好ましくは３、４または５塩基である。各鎖における付加的領域の塩基長は、好ましくは、１〜４塩基、より好ましくは、２〜３塩基である。
【００２８】
ループ領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、４、５、６、７、８、９または１０塩基であり、その上限は、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基である。ループ領域の塩基長は、好ましくは、５〜２０塩基、より好ましくは、４〜１５塩基、さらに好ましくは、３〜９塩基である。
【００２９】
ｓｉＲＮＡは、天然型のＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、培養液や生体中における安定性向上等の観点から、種々の化学修飾を加えたものでもよい。かかる化学修飾としては、例えば、糖部分における修飾（２’−Ｏメチル化等）、リン酸部分における修飾（チオリン酸化等）、塩基部分における修飾を挙げることができる。また、細胞への導入効率を高める観点からは、核酸鎖の末端にシグナルペプチドやコレステロール等を付加することも可能である。
【００３０】
ｓｉＲＮＡは、細胞内において、複数のタンパク質と共にＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を構成し、特定のｍＲＮＡに特異的なＲＮＡ干渉または遺伝子ノックダウンを触媒すると考えられている。ｓｉＲＮＡを利用したＲＮＡ干渉は広く使用されており、本発明においては、ｓｉＲＮＡを設計および／または導入するためのいずれの戦略および／または方法を使用可能である。上記の通り、セラミドキナーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既に報告されているから、かかる配列情報に基づき、常法により、本発明におけるｓｉＲＮＡを設計および／または導入することができる。例えば、以下の手順により、ｓｉＲＮＡを設計できる：（１）セラミドキナーゼのヌクレオチド配列を参照し、開始コドンから５０〜７５塩基以上下流の最初のＮＡ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれでもよく、好ましくはＡである）を見つける、（２）ＮＡおよびそれに後続する１７〜２３塩基（ＮＡと合わせて１９〜２５塩基）、好ましくは、１９〜２１塩基（ＮＡと合わせて２１〜２３塩基）についてＧＣ含量を計算し、５０％前後であることを確認する、および（３）ＮＣＢＩ等のデータベースを利用して、ＮＡおよびそれに後続する配列がセラミドキナーゼ遺伝子に特異的であることを確認する。このようにして決定した配列を有するｓｉＲＮＡは、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機により合成することができる。また、セラミドキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡは、例えば、サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から市販されているため、本発明におけるｓｉＲＮＡは市場を通じて入手することもできる。
【００３１】
本発明において、「アンチセンス核酸」は、セラミドキナーゼｍＲＮＡおよび／または遺伝子に特異的にハイブリダイズすることにより、その発現を阻害する核酸を意味する。アンチセンス核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラの何れであってもよいが、好ましくは、ＤＮＡである。アンチセンス核酸は、原則として、セラミドキナーゼｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なものであるが、必ずしも完全に相補的なものでなくてもよく、セラミドキナーゼｍＲＮＡおよび／または遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつその発現を阻害するものであれば、本発明におけるアンチセンス核酸として使用可能である。
【００３２】
アンチセンス核酸の塩基長は、その目的を達成する限り特に制限はなく、セラミドキナーゼｍＲＮＡの全長または部分に相当する塩基長であってよいが、かかる塩基長の下限は、好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、上限は、好ましくは、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５または１００である。アンチセンス核酸の塩基長は、好ましくは、１０〜１００塩基、より好ましくは、１５〜５０塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基である。
【００３３】
アンチセンス核酸は、天然型のＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、培養液や生体中における安定性向上等の観点から、種々の化学修飾を加えたものでもよい。かかる化学修飾としては、例えば、糖部分における修飾（２’−Ｏメチル化等）、リン酸部分における修飾（チオリン酸化等）、塩基部分における修飾を挙げることができる。また、細胞への導入効率を高める観点からは、核酸鎖の末端にシグナルペプチドやコレステロール等を付加することも可能である。
【００３４】
上記の通り、セラミドキナーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既に報告されているから、本発明におけるアンチセンス核酸は、当該配列情報に基づき、常法により設計および／または合成することができる。
【００３５】
本発明において、「リボザイム」は、セラミドキナーゼｍＲＮＡおよび／または遺伝子を切断する酵素活性を有する核酸分子を意味するものである。リボザイムは、通常、ＲＮＡ分子を意味するが、本発明においては、同様の機能を有するＤＮＡ分子も含むものとして使用される。
【００３６】
本発明において、「核酸アプタマー」は、特定の標的分子に結合する核酸分子であって、かつ、セラミドキナーゼの発現に負の影響を及ぼすものを意味する。
【００３７】
本発明において、「デコイ核酸」は、セラミドキナーゼにおける転写因子結合領域を模倣する核酸分子であり、セラミドキナーゼ遺伝子と転写因子との結合を競合的に阻害することによって、セラミドキナーゼの発現に負の影響を及ぼすものを意味する。
【００３８】
セラミドキナーゼの転写に影響を及ぼす因子としては、核内ホルモン受容体スーパーファミリーの一種であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体β（ＰＰＡＲβ）が知られている。ＰＰＡＲβは、インビボおよびインビトロの両方においてセラミドキナーゼのＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥｓ）に特異的に結合し、その転写量を上方制御する（K.  TSUJIら、FEBS  Journal、２００８年、２７５：３８１５−３８２６、非特許文献４）。したがって、ＰＰＡＲβに対する核酸アプタマーやデコイ核酸は、そのセラミドキナーゼ転写上方制御活性を阻害し、セラミドキナーゼ遺伝子の発現に負の影響を及ぼす蓋然性が高い。
【００３９】
セラミドキナーゼ発現阻害剤としては、上記の種々の核酸を含むベクターを使用することもできる。本発明におけるベクターは、上記核酸を輸送する能力を持つ核酸分子を意味するものである。本発明におけるベクターは、セラミドキナーゼ遺伝子の発現に負の影響を及ぼす限り特に限定されないが、好ましくは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
【００４０】
本発明におけるベクターでは、上記の種々の核酸が適切な発現制御配列と機能的に連結されていてもよい。発現制御配列は、上記核酸と隣接していてもよく、または、上記核酸とトランスまたは遠隔的に作用してもよい。発現制御配列は、それらと連結した上記核酸の発現やプロセシングに必要なポリヌクレオチド配列を意味し、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡプロセシングシグナル配列、細胞質ｍＲＮＡ安定化配列、翻訳効率増強配列、タンパク質安定性増強配列、タンパク質分泌増強配列等を挙げることができる。
【００４１】
本発明におけるプロモーター配列は、その目的に応じ、通常使用されるあらゆるものから選択可能である。本発明におけるプロモーター配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０由来プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ヒトＥＦ−１αプロモーター、ヒトＧＲＰ７８プロモーター／ＣＭＶエンハンサー、ヒトＧＲＰ９４プロモーター／ＳＶ４０エンハンサー等を挙げることができる。また、使用するウイルスに由来するプロモーターを使用することも可能である。
【００４２】
本発明におけるセラミドキナーゼ発現阻害剤は、核酸やベクター以外であってもよい。例えば、前述のＰＰＡＲβは、インビボおよびインビトロの両方においてセラミドキナーゼのＰＰＲＥｓに特異的に結合し、その転写量を上方制御することが知られているから、ＰＰＡＲβに作用し、その転写制御機構に対して負の影響を及ぼす物質であれば、セラミドキナーゼ遺伝子の転写に負の影響を及ぼす蓋然性が高く、したがって、本発明におけるセラミドキナーゼ発現阻害剤として使用し得る。
【００４３】
本発明におけるセラミドキナーゼ活性阻害剤としては、セラミドキナーゼに結合または何らかの作用を及ぼすことにより、セラミドキナーゼによるＣ１Ｐ生成活性を競合的または非競合的に阻害するあらゆる物質を挙げることができるが、実用性の観点からは、セラミドキナーゼの活性を特異的に阻害する物質が好ましい。ここで、競合的阻害剤は、セラミドキナーゼの活性部位へ直接作用することにより、セラミドキナーゼとその基質であるセラミドとの結合を競合的に阻害するものであり、非競合的阻害剤とは、セラミドキナーゼの活性部位以外の部位へ作用することにより、セラミドキナーゼの酵素活性を低下させるものである。
【００４４】
本発明において、セラミドキナーゼの活性を特異的に阻害する物質としては、セラミドキナーゼにおけるＣ１Ｐ生成活性を競合的または非競合的に阻害する小分子や、セラミドキナーゼに対する特異的な抗体または抗体断片等を挙げることができる。上記小分子は、好ましくは、Ｎ−［２−（ベンゾイルアミノ）−６−ベンゾチアゾリル］トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−カルボキサミド（ＮＶＰ−２３１）である。ＮＶＰ−２３１はＣＡＳ番号３６２００３−８６−６を付与された公知化合物であり、ケイマンケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、シグマアルドリッチ社等から市販されているため、容易に入手可能である。ＮＶＰ−２３１は、セラミドとセラミドキナーゼの結合を特異的かつ可逆的に阻害することが知られている（C.  GRAFら、Molecular  Pharmacology、２００８年、７４（４）：９２５−９３２、非特許文献５）。ＮＶＰ−２３１の構造類似体もまたセラミドキナーゼ阻害活性を示すことが知られており（特表２００９−５３１３６５号公報、特許文献２）、したがって、このような構造類似体もまた本発明におけるセラミドキナーゼの活性を特異的に阻害する物質として使用可能である。
【００４５】
セラミドキナーゼの活性を特異的に阻害する小分子としては、他に、Ｔｒｉｃｈｏｐｅｚｉｚｅｌｌａ  ｂａｒｂａｔａ  ＳＡＮＫ  ２５３９５から単離された天然の化合物であるＦ−１２５０９Ａ、そのオレフィン異性体もしくはシクロヘキサン誘導体、またはその環化異性体を挙げることもできる（特開２００６−２９８８４９号公報：特許文献３、特開２００９−０５１７４３号：特許文献４）。特に、環化異性体の一種としてメルクミリポア社から市販されている「Ｋ１」（ＣＡＳ番号：１２５８００５−８５−４）は、セラミドキナーゼへ対する特異性や細胞毒性が低いことから、本発明における好ましいセラミドキナーゼ活性阻害剤であり得る。
【００４６】
セラミドキナーゼの活性を特異的に阻害する物質としては、セラミドキナーゼに対する特異的な抗体または抗体断片等を挙げることができる。このような抗体または抗体断片等としては、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）または三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体等を挙げることができるが、これらに限定されない。上述の通り、セラミドキナーゼのアミノ酸配列は既に公開されているため、かかる配列情報を利用して、常法により、本発明における抗体または抗体断片を設計、合成することができる。
【００４７】
ある物質がセラミドキナーゼの活性に負の影響を及ぼすか否かは、常法により、容易に確認可能である。例えば、上記特許文献１〜４には、ある物質がセラミドキナーゼ阻害活性を有するか否かを試験する方法が開示されているため、かかる方法を参照してセラミドキナーゼ阻害活性を試験することができる。また、セラミドキナーゼ活性阻害剤をスクリーニングするためのキットとしては、Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．社よりＣｅｒａｍｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙという商品名で流通しているものが知られており、かかるキットを使用することにより、セラミドキナーゼの活性に負の影響を及ぼす物質を簡便に選別することができる。このような公知の試験系によってセラミドキナーゼ阻害活性を有することが確認された化合物は、原則として、本発明におけるセラミドキナーゼ活性阻害剤として使用し得る。
【００４８】
ある物質がセラミドキナーゼ活性阻害剤として使用し得るか否かは、例えば、以下のような工程において、常法に従い、確認可能である：（１）被験物質を準備する工程、（２）被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程、および、（３）前記測定においてセラミドキナーゼ活性阻害能を有することが示された被験物質がセラミドキナーゼ活性阻害剤であると結論する工程。
【００４９】
ある物質がセラミドキナーゼ活性阻害剤として使用し得るか否かを確認する方法において、「被験物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物等を含む、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品や、被験物質を生成する生細胞そのものを試験系に投入することも可能である。被験物質は、コンビナトリアルケミストリー技術等により人工的に製造した化合物ライブラリーとして提供されてよいし、固相合成やファージディスプレイ法等により製造したランダムペプチドライブラリーとして提供されてよいし、また、天然成分の精製、未精製品として提供されてもよい。
【００５０】
被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程には、当該目的を達成する限り、あらゆる方法を使用可能である。典型的には、かかる測定工程は、被験物質を、セラミドキナーゼ、基質（セラミド）、リン酸供給源等を含むインビトロ試験系に投入し、これを投入しない対照系と比べて、セラミドキナーゼによる基質リン酸化が阻害されたか否かを確認することによって行われる。この場合、基質やリン酸供給源に検出可能な標識を付加することが好ましい。また、セラミドキナーゼによるセラミドリン酸化は、カルシウムおよび／またはマグネシウム要求性であり、加えて、至適ｐＨが中性付近であることが知られているため、上記インビトロ試験系では、これらを満たす条件が設定されるのが好ましい。
【００５１】
「セラミドキナーゼ」については、既に、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が公開されているため、かかる配列情報を基に、常法に従い、調製することが可能である。例えば、セラミドキナーゼ遺伝子を包含するベクターを好適な宿主細胞に形質転換し、当該宿主細胞を好適な培養条件で培養することにより細胞溶解物または細胞分泌物として所期のセラミドキナーゼを得ることができる。また、セラミドキナーゼおよびセラミドキナーゼ遺伝子を含む核酸は、例えば、オープンバイオシステム社（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）等から市販されているため、これらの製品を市場より入手することも可能である。
【００５２】
「基質（セラミド）」としては、あらゆるセラミドを使用可能であり、「リン酸供給源」としては、あらゆるリン酸供給源を使用可能である。好ましいリン酸供給源としては、例えば、ＡＴＰやリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を挙げることができる。基質やリン酸供給源に検出可能な標識を付加することは、リン酸化の程度を容易に検出するために好ましい。標識としては、当該目的を達成するためのあらゆる標識を利用可能であるが、例えば、放射性標識や蛍光標識を好ましい標識として挙げることができる。かかる標識化リン酸供給源としては、例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰやＨ３［３２Ｐ］Ｏ４を挙げることができ、標識化基質としては、例えば、ＮＢＤ−Ｃ６−セラミド（V.  O.  Helenaら、Journal  of  Lipids、２０１２、Article  ID  404513、非特許文献６）を挙げることができる。ＮＢＤ−Ｃ６−セラミドは、例えば、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等から市販されており、したがって、市場を通じて容易に入手可能である。
【００５３】
インビトロ試験系において、リン酸化されたセラミド量を測定するために、リン酸化反応の終了後、培養物を有機溶媒抽出することができる。有機溶媒抽出により、培養物中に含まれる脂質成分をその他成分と隔離することができるため、本発明におけるセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程において好ましい処理である。かかる処理における有機溶媒としては、その目的を果たす限りあらゆるものを使用可能であり、例えば、クロロホルムとメタノールの１対１混合液を例示することができる。有機溶媒にて抽出した脂質成分を、濃縮後、薄層クロマトグラフィーにて展開することは、Ｃ１Ｐをその他脂質成分から分離するために好ましい処理である。薄層クロマトグラフィーは既知であり、あらゆる担体、展開溶媒を使用可能であるが、好ましくは、担体としてシリカゲルを、展開溶媒として１−ブタノール：酢酸：水を３：１：１で混合したものを挙げることができる。展開後、Ｃ１Ｐスポットにて標識として使用された放射性物質や蛍光物質等の強度を検出することによって、被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定することできる。
【００５４】
本発明において、培養物中に含まれるＣ１Ｐをその他の成分（特に、セラミド）と分離するために、固相抽出を利用することも可能である。非特許文献６には、固相と溶離液の適当な組み合わせにより、Ｃ１Ｐとセラミドの良好な分離が達成されたことが記載されており、かかる方法は、本発明においても利用可能である。
【００５５】
上記の通り、セラミドキナーゼは、生体内においてセラミドをリン酸化する唯一の酵素であると考えられているものの、セラミドキナーゼをノックアウトしたマウスにおいても細胞内Ｃ１Ｐ濃度が減少しないという観察結果が報告されている（非特許文献３）。したがって、セラキドキナーゼの関与しない、別の細胞内Ｃ１Ｐ生成経路が存在する可能性がある。上記の通り、本発明においては、ＮＰＣ細胞においてＣ１Ｐ濃度が亢進されること、および、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与によりＮＰＣ細胞におけるコレステロール輸送異常およびその他の脂質の輸送異常が改善されることが確認されているため、セラキドキナーゼの関与しない経路において細胞内Ｃ１Ｐの生成を阻害する分子もまた、ＮＰＣ細胞におけるコレステロール輸送異常およびその他の脂質の輸送異常を改善し、ＮＰＣの予防または治療に有用である蓋然性が高いため、本発明におけるＣ１Ｐ生成阻害剤として使用し得る。
【００５６】
「ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）」は、後期エンドソームに局在し細胞内の脂質輸送に関与するライソゾーム膜タンパク質ＮＰＣ１、またはライソゾーム分泌タンパク質ＮＰＣ２（ＨＥ１）の異常に起因する常染色体劣性遺伝疾患である。ＮＰＣ患者においては、ＮＰＣ１やＮＰＣ２の機能異常によって、後期エンドソームおよび／またはライソゾーム内に種々の脂質、例えば、コレステロール、スフィンゴ糖脂質（例えば、グルコシルセラミド）、スフィンゴリン脂質（例えば、スフィンゴミエリン）、スフィンゴシン等が蓄積することが知られている。本発明においては、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与により、ＮＰＣ細胞内におけるコレステロール輸送異常およびその他の脂質（例えば、スフィンゴ脂質）の輸送異常が改善されることを見出し、ＮＰＣを予防または治療するための新規医薬組成物を完成させたものである。
【００５７】
本発明における医薬組成物は、有効成分としてＣ１Ｐ生成阻害剤を含む他、その他の有効成分ならびに／または任意の担体および／もしくは添加剤を含有していてもよい。本発明の医薬組成物の投与方法としては、あらゆる方法を使用可能であるが、例えば、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、医薬製剤分野において通常用いられている種々の剤型に調製することができる。
【００５８】
経口投与の際の剤型としては、特に限定されないが、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等を例示することができる。また、これらの剤型について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等を施してもよい。静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与の際の剤型としては、特に限定されないが、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等を例示することができる。経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与の際の剤型としては、特に限定されないが、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等を例示することができ、これらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等を施すことができる。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、その剤形に応じて、薬学的に許容される担体および／または添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体および／または添加剤としては、特に限定されないが、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等を例示することができる。
【００６０】
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、投与対象である動物種やその年齢、体重、薬物受容性、病気の重篤度、有効成分の活性や種類、所望の効果、投与方法や剤型等に応じて適宜決定し得るものである。例えば、成人１日あたり有効成分量として０．０１ｍｇ〜１．０ｇ、好ましくは、０．１〜１００ｍｇ程度を挙げることができる。また、本発明の医薬組成物の投与回数についても特に限定されず、投与対象である動物種やその年齢、体重、薬物受容性、病気の重篤度、有効成分の活性や種類、所望の効果、投与方法や剤型等に応じて適宜決定し得るものである。
【００６１】
本発明は、別の態様において、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）生成阻害剤を含む、細胞内脂質輸送異常改善剤に関するものである。
【００６２】
本発明において、「細胞内脂質輸送異常」とは、正常の細胞内脂質輸送とは異なる細胞内脂質輸送の異常全般を意味するものであり、例えば、正常細胞では見られないような特定の細胞内小器官（小胞体、ゴルジ体、後期エンドソーム、ライソゾーム等）における脂質の枯渇や蓄積を意味するものである。本発明における細胞内脂質輸送異常は、典型的には、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常、即ち、ＮＰＣ患者やＮＰＣモデル細胞において観察される細胞内脂質輸送異常である。本発明における細胞内脂質輸送異常は、ＮＰＣ１タンパク質またはＮＰＣ２タンパク質のいずれの変異または欠陥に起因するものであってよいが、好ましくは、ＮＰＣ１タンパク質の変異または欠損に起因するものである。しかしながら、本発明における細胞内脂質輸送異常は、必ずしもＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常に限定されるものではない。
【００６３】
本発明において、「脂質」とは、生体を構成する物質群のうち水に不溶性を示す一群を意味するものである。脂質は、一般には、アルコールと脂肪酸のエステルである単純脂質（アシルグリセロール、セラミド、スフィンゴシン等）、その他さらにリン酸や硫酸、糖、アミノ基などを含む複合脂質（リン脂質、糖脂質等）、および、脂質の加水分解等により生成される誘導脂質（コレステロール、脂肪酸等）に大別することができる。本発明者らによる実験によって、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与により細胞内におけるコレステロールおよびラクトシルセラミドの輸送異常が実際に改善されることが確認されていることから、本発明におけるＣ１Ｐ生成阻害剤が、このような脂質一般の細胞内輸送異常の改善に有用であることが理解されるであろう。
【００６４】
本発明において、「細胞内脂質輸送異常」は、好ましくは、細胞内コレステロール輸送異常または細胞内スフィンゴ脂質輸送異常である。本発明において、「スフィンゴ脂質」は、長鎖成分としてスフィンゴイド類を含む脂質を意味するものである。「スフィンゴ脂質」は、一般に、分子中に糖を含む「スフィンゴ糖脂質」とリンを含む「スフィンゴリン脂質」に大別されるが、本発明における「スフィンゴ脂質」には、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合して形成されるセラミドや、スフィンゴシン等に代表されるスフィンゴイド類そのものも包含される。本発明における「スフィンゴ糖脂質」としては、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ガングリオシド類等を、「スフィンゴリン脂質」としては、スフィンゴミエリン、スフィンゴエタノールアミン、スフィンゴシン−１-リン等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明における細胞内スフィンゴ脂質輸送異常には、細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常および細胞内スフィンゴリン脂質輸送異常のいずれも包含されるが、好ましくは、細胞内スフィンゴ糖脂質輸送異常であり、より好ましくは、細胞内ラクトシルセラミド輸送異常である。
【００６５】
本発明において、細胞内脂質輸送異常は、例えば、小胞体における脂質の枯渇や、後期エンドソームおよび／またはライソゾームにおける脂質の蓄積として観察される。かかる小胞体における脂質（特に、コレステロール）の枯渇と、後期エンドソームおよび／またはライソゾームにおける脂質（特に、コレステロール）の蓄積は、特に、ＮＰＣの予防または治療方法を検討するに際しては、区別して検討されるべき現象である。ＮＰＣにおいては、小胞体における脂質（特に、コレステロール）の枯渇が各種症状を引き起こす素因となっている可能性がある。本発明者らの実験によって、ＮＰＣ細胞において実際に小胞体においてコレステロールが枯渇することが確認されている。
【００６６】
本発明において、「細胞内脂質輸送異常改善剤」は、細胞内脂質輸送異常を改善し得るあらゆる物質を包含するものである。当該改善剤としては、細胞内脂質輸送異常を完全に正常化できるものが好ましいが、当該輸送異常を部分的にでも改善し得る物質は、本発明における改善剤に包含される。
【００６７】
本発明のこの態様において、「Ｃ１Ｐ生成阻害剤」は、Ｃ１Ｐの生成に負の影響を及ぼすあらゆる物質を包含するものである。本発明者らによる実験によって、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与により細胞内脂質輸送異常、特に、細胞内コレステロール輸送異常が改善されることが見出されている。この実験結果は、Ｃ１Ｐの生成に負の影響を及ぼす物質が細胞内脂質輸送異常改善剤として使用し得ることを示すものである。上述のＮＰＣを予防または治療するための医薬組成物に関する態様において提示した「Ｃ１Ｐ生成阻害剤」に関する説明は、本態様における「Ｃ１Ｐ生成阻害剤」にも適用できる。なお、上記の通り、セラミドキナーゼは、生体内においてセラミドをリン酸化する唯一の酵素であると考えられているものの、セラミドキナーゼをノックアウトしたマウスにおいても細胞内Ｃ１Ｐ濃度が減少しないという観察結果が報告されている（非特許文献３）。したがって、セラキドキナーゼの関与しない、別の細胞内Ｃ１Ｐ生成経路が存在する可能性がある。上記の通り、本発明においては、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与により細胞内コレステロール輸送異常およびその他の脂質の輸送異常が改善されることが確認されているため、セラキドキナーゼの関与しない経路において細胞内Ｃ１Ｐの生成を阻害する分子もまた、本発明における細胞内脂質輸送異常改善剤として使用し得る。
【００６８】
本発明における改善剤は、有効成分としてＣ１Ｐ生成阻害剤を含む他、その他の有効成分ならびに／または任意の担体および／もしくは添加剤を含有していてもよい。本発明の改善剤の投与方法としては、あらゆる方法を使用可能であるが、例えば、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。本発明の改善剤は、かかる投与方法に応じて、医薬製剤分野において通常用いられている種々の剤型に調製することができる。
【００６９】
経口投与の際の剤型としては、特に限定されないが、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等を例示することができる。また、これらの剤型について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等を施してもよい。静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与の際の剤型としては、特に限定されないが、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等を例示することができる。経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与の際の剤型としては、特に限定されないが、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等を例示することができ、これらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等を施すことができる。
【００７０】
本発明の改善剤は、その剤形に応じて、薬学的に許容される担体および／または添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体および／または添加剤としては、特に限定されないが、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等を例示することができる。
【００７１】
本発明の改善剤の投与量は特に限定されず、投与対象である動物種やその年齢、体重、薬物受容性、病気の重篤度、有効成分の活性や種類、所望の効果、投与方法や剤型等に応じて適宜決定し得るものである。例えば、成人１日あたり有効成分量として０．０１ｍｇ〜１．０ｇ、好ましくは、０．１〜１００ｍｇ程度を挙げることができる。また、本発明の改善剤の投与回数についても特に限定されず、投与対象である動物種やその年齢、体重、薬物受容性、病気の重篤度、有効成分の活性や種類、所望の効果、投与方法や剤型等に応じて適宜決定し得るものである。
【００７２】
本発明は、別の態様において、ＮＰＣ予防もしくは治療薬、ＮＰＣ予防もしくは治療薬候補物質、または細胞内脂質輸送異常改善剤をスクリーニングする方法に関するものである。当該スクリーニング方法は、被験物質を準備する工程、被験物質のＣ１Ｐ生成阻害能を測定する工程、および、前記測定においてＣ１Ｐ生成阻害能を有することが示された被験物質が目的物質であると結論する工程を含む方法である。本発明者らは、Ｃ１ＰとＮＰＣとの関連性、および、Ｃ１Ｐと細胞内脂質輸送異常、特に細胞内コレステロール輸送異常との関連性を初めて発見したものであり、したがって、Ｃ１Ｐ生成阻害能を有する物質であれば、ＮＰＣ予防／治療薬もしくはＮＰＣ予防／治療薬候補物質、または細胞内脂質輸送異常改善剤として使用し得ると結論付けることができる。
【００７３】
本発明において、「ＮＰＣ予防または治療薬」とは、ＮＰＣに対して予防または治療活性を有するあらゆる物質を意味するものである。
【００７４】
本発明において、「ＮＰＣ予防または治療薬候補物質」とは、ＮＰＣに対して予防または治療活性を有することまでは確認されていないが、予防または治療活性を有することが推認されるあらゆる物質を意味するものである。
【００７５】
上記の通り、本発明に係るＣ１Ｐ生成阻害剤は、好ましくは、セラミドキナーゼ阻害剤であり、かかるセラミドキナーゼ阻害剤は、その作用機序に応じて、「セラミドキナーゼ生成阻害剤」と「セラミドキナーゼ活性阻害剤」に分類することができる。したがって、本発明におけるスクリーニング方法は、被験物質のセラミドキナーゼ生成阻害能を指標とする方法と、被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を指標とする方法に大別できる。前者は、好ましくは、セラミドキナーゼ発現阻害能を指標とする方法である。しかしながら、このことは、その他のＣ１Ｐ生成阻害能を指標とするスクリーニング方法を本発明から除外することを意味しない。上記の通り、セラミドキナーゼは、生体内においてセラミドをリン酸化する唯一の酵素であると考えられているものの、セラミドキナーゼをノックアウトしたマウスにおいても細胞内Ｃ１Ｐ濃度が減少しないという観察結果が報告されている（非特許文献３）。したがって、セラキドキナーゼの関与しない、別の細胞内Ｃ１Ｐ生成経路が存在する可能性があるところ、上記の通り、本発明においては、ＮＰＣ細胞においてＣ１Ｐ濃度が亢進されること、および、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の投与によりＮＰＣ細胞におけるコレステロール輸送異常およびその他の脂質の輸送異常が改善されることが確認されているため、セラキドキナーゼの関与しない経路において細胞内Ｃ１Ｐの生成を阻害する分子もまた、ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常、特に細胞内コレステロール輸送異常を改善し、ＮＰＣの予防または治療に有用である蓋然性が高く、また、同様に、ＮＰＣまたは非ＮＰＣにおける細胞内脂質輸送異常改善剤として有用である蓋然性が高い。
【００７６】
被験物質のセラミドキナーゼ生成阻害能を指標としたスクリーニング方法においては、既知のいずれの方法も使用可能であるが、好ましくは、以下の工程を含むものである：（１）被験物質を準備する工程、（２）被験物質のセラミドキナーゼ生成阻害能を測定する工程、および、（３）前記測定においてセラミドキナーゼ生成阻害能を有することが示された被験物質が目的物質であると結論する工程。
【００７７】
工程（１）において、当該被験物質には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物等を含む、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品や、被験物質を生成する生細胞そのものを試験系に投入することも可能である。被験物質は、コンビナトリアルケミストリー技術等により人工的に製造した化合物ライブラリーとして提供されてよいし、固相合成やファージディスプレイ法等により製造したランダムペプチドライブラリーとして提供されてよいし、また、天然成分の精製、未精製品として提供されてもよい。
【００７８】
工程（２）において、被験物質のセラミドキナーゼ生成阻害能を測定する工程においては、既知のあらゆる方法を使用可能であるが、好ましくは、以下の小工程を含むものである：（ａ）被験物質を、セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞またはインビトロ発現系と接触させる工程、および（ｂ）被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるセラミドキナーゼ発現量を測定する工程。
【００７９】
小工程（ａ）において、セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞とは、特定の培養条件下においてセラミドキナーゼの発現を測定可能な細胞である。セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞としては、セラミドキナーゼを発現する天然由来細胞、セラミドキナーゼを発現するように遺伝的に改変された細胞、または、セラミドキナーゼの転写調節領域に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。セラミドキナーゼの転写調節領域としては、ＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥｓ）を挙げることができるが（非特許文献４）、その他のあらゆる調節領域も利用可能である。レポーター遺伝子としては、検出可能な標識を直接的または間接的に生成するものであればいずれも使用可能であり、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、その他のマーカー遺伝子を挙げることができる。
【００８０】
小工程（ａ）において、セラミドキナーゼ発現を測定可能なインビトロ発現系とは、細胞を使用しない方法において、セラミドキナーゼ発現を測定可能とするあらゆる発現系を意味するものである。このようなインビトロ発現系としては、その目的を達成する限りあらゆる系を使用可能であるが、例えば、セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞からの抽出液や分泌液をそのまま使用したものや、また、セラミドキナーゼとその転写制御因子の結合を阻害するか否かを測定できる系を挙げることができる。
【００８１】
小工程（ａ）において、被験物質とセラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞またはインビトロ発現系を接触させる際の培地としては、その目的を達成する限り、あらゆるものを使用可能であるが、例えば、５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むハムＦ−１２培地、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）等を挙げることができる。培養条件や培養時間は、使用する細胞等に応じて適宜決定される。
【００８２】
小工程（ｂ）において、被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるセラミドキナーゼ発現量を測定する工程には、その目的を達成する限り、あらゆる方法を使用可能である。例えば、セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞として、セラミドキナーゼを発現する天然由来細胞またはセラミドキナーゼを発現するように遺伝的に改変された細胞を使用した場合、セラミドキナーゼ発現量は、その転写産物であるｍＲＮＡ（スプライシング前後のいずれも含む）を指標にして測定してもよいし、翻訳産物であるタンパク質またはその断片を指標にして測定してもよい。他方、セラミドキナーゼ発現を測定可能な細胞としてセラミドキナーゼの転写調節領域に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞を使用した場合、セラミドキナーゼ発現量は、レポーター遺伝子による発現産物を直接的または間接的に測定することにより決定されるのが好ましい。
【００８３】
小工程（ｂ）において、被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるセラミドキナーゼ発現量を測定する工程は、既知のあらゆる方法を利用可能である。小工程（ｂ）において、セラミドキナーゼのｍＲＮＡやタンパク質またはその断片を指標とする場合、あらゆる核酸検出方法および／またはタンパク質検出方法を利用可能である。このような核酸検出方法および／またはタンパク質検出方法としては、ノーザンブロット解析やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ウエスタンブロット解析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光イムノアッセイ、サンドイッチ法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００８４】
被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を指標としたスクリーニング方法においては、既知のいずれの方法も使用可能であるが、好ましくは、以下の工程を含むものである：（１）被験物質を準備する工程、（２）被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程、および、（３）前記測定においてセラミドキナーゼ生成阻害能を有することが示された被験物質が目的物質であると結論する工程。
【００８５】
工程（１）において、当該被験物質には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物等を含む、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品や、被験物質を生成する生細胞そのものを試験系に投入することも可能である。被験物質は、コンビナトリアルケミストリー技術等により人工的に製造した化合物ライブラリーとして提供されてよいし、固相合成やファージディスプレイ法等により製造したランダムペプチドライブラリーとして提供されてよいし、また、天然成分の精製、未精製品として提供されてもよい。
【００８６】
工程（２）において、被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程においては、既知のあらゆる方法を使用可能であるが、好ましくは、以下の小工程を含むものである：（ａ）被験物質をセラミドキナーゼ活性阻害試験系に添加する工程、および（ｂ）セラミドキナーゼ活性阻害試験系における被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程。
【００８７】
小工程（ａ）において、セラミドキナーゼ活性阻害試験系は、典型的には、セラミドキナーゼ、基質（セラミド）、リン酸供給源等を含むインビトロ試験系であるが、これに限定されない。また、セラミドキナーゼによるセラミドリン酸化は、カルシウムおよび／またはマグネシウム要求性であり、また、至適ｐＨが中性付近であることが知られているため、上記インビトロ試験系では、これらを満たす条件が設定されるのが好ましい。
【００８８】
小工程（ａ）において、「セラミドキナーゼ」は、既に、そのヌクレオチド配列、アミノ酸配列が公開されているため、かかる配列情報を基に、常法に従い、調製することが可能である。例えば、セラミドキナーゼを包含するベクターを好適な宿主細胞に形質転換し、当該宿主細胞を好適な培養条件で培養することにより細胞溶解物または細胞分泌物として所期のセラミドキナーゼを得ることができる。また、セラミドキナーゼおよびセラミドキナーゼ遺伝子を含む核酸は、例えば、オープンバイオシステム社（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）等から市販されているため、これらの製品を市場より入手することも可能である。
【００８９】
小工程（ａ）において、「基質（セラミド）」としては、あらゆるセラミドを使用可能であり、「リン酸供給源」としては、あらゆるリン酸供給源を使用可能である。好ましいリン酸供給源としては、例えば、ＡＴＰやリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を挙げることができる。基質やリン酸供給源に検出可能な標識を付加することは、リン酸化の程度を検出するために好ましい。標識としては、当該目的を達成するためのあらゆる標識を利用可能であるが、例えば、放射性標識や蛍光標識を好ましい標識として挙げることができる。かかる標識化リン酸供給源としては、例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰやＨ３［３２Ｐ］Ｏ４を挙げることができ、標識化基質としては、例えば、ＮＢＤ−Ｃ６−セラミド（V.  O.  Helenaら、Journal  of  Lipids、２０１２、Article  ID  404513、非特許文献６）を挙げることができる。ＮＢＤ−Ｃ６−セラミドは、例えば、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等から市販されており、したがって、市場を通じて容易に入手可能である。
【００９０】
小工程（ａ）におけるセラミドキナーゼ活性阻害試験系において、リン酸化されたセラミド量を測定するために、リン酸化反応の終了後、培養物を有機溶媒抽出することができる。有機溶媒抽出により、培養物中に含まれる脂質成分をその他成分と分離することができるため、セラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程において好ましい処理である。かかる処理における有機溶媒としては、その目的を果たす限り、あらゆるものを使用可能であり、例えば、クロロホルムとメタノールの１対１混合液を例示することができる。有機溶媒にて抽出した脂質成分は、濃縮後、薄層クロマトグラフィーにて展開することは、Ｃ１Ｐをその他脂質成分から分離するために好ましい処理である。薄層クロマトグラフィーは既知であり、あらゆる担体、展開溶媒を使用可能であるが、好ましくは、担体としてシリカゲルを、展開溶媒として１−ブタノール：酢酸：水を３：１：１で混合したものを挙げることができる。展開後、Ｃ１Ｐスポットにて標識として使用された放射性物質や蛍光物質等の強度を検出することによって、被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定することできる。
【００９１】
小工程（ａ）において、培養物中に含まれるＣ１Ｐをその他の成分（特に、セラミド）と分離するために、固相抽出を利用することも可能である。非特許文献６には、固相と溶離液の適当な組み合わせにより、Ｃ１Ｐとセラミドの良好な分離が達成されたことが記載されており、かかる方法は、本発明においても採用可能である。
【００９２】
小工程（ｂ）において、セラミドキナーゼ活性阻害試験系における被験物質のセラミドキナーゼ活性阻害能を測定する工程は、原則的に、被験物質を当該試験系に添加して、適当な培養条件、培養時間においてインキュベートすることが好適であるが、その目的を他姓する限り、あらゆる方法を使用可能である。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例において、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００９４】
［実施例１］
ＮＰＣ細胞におけるＮＢＤ−セラミド代謝
【００９５】
ＮＰＣ細胞における、各種セラミド代謝産物の生成量を確認するために、以下の実験を行った。ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞（Ａ１０１）およびその親株（ＪＰ１７）を１２ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むハムＦ−１２培地で２４時間培養した。細胞をＨＢＳＳバッファーで洗浄後、１０μＭのＮＢＤ−Ｃ６−セラミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むハムＦ−１２培地で３０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳバッファーで洗浄後、ＮＢＤ−Ｃ６−セラミドを含まないハムＦ−１２培地（３５０μＬ）に培地交換し、さらに２時間インキュベートした。その後、セルスクレーパーを用いて細胞を剥がし、培養上清と共にエッペンドルフチューブに移した。回収したサンプルのうち２００μＬをＢｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法により脂質抽出し、有機層を窒素ガスで濃縮後、全量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣシリカゲル６０）にスポットした。ＴＬＣを展開し（１−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１）、風乾後、ＬＡＳ１０００ｐｌｕｓにて青色ＬＥＤを照射することでＮＢＤの蛍光を検出した。
【００９６】
上記実験の結果、ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞（Ａ１０１）において、Ｃ１Ｐ濃度の顕著な亢進が観察された（図１Ａ）。
【００９７】
次に、ＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞（ＮＰＣ）および正常皮膚線維芽細胞（ＷＴ）を用いて上記と同様の実験を行った。なお、培養液は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用した。ＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞（ＮＰＣ）においても、Ｃ１Ｐ濃度の顕著な亢進が観察された（図１Ｂ）。ＮＰＣ細胞（ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞およびヒトＮＰＣ患者に由来するＮＰＣ細胞）においてＣ１Ｐ濃度が亢進することは、本実験によって初めて明らかとなった。
【００９８】
［実施例２］
ＮＰＣ細胞におけるコレステロール蓄積に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果
【００９９】
ＮＰＣ細胞において観察されるコレステロール蓄積に対する、Ｃ１Ｐ生成阻害剤の阻害効果を試験した。ＪＰ１７細胞およびＡ１０１細胞をガラス底培養皿に播種し、２４〜４８時間培養した。１００ｎＭのＮＶＰ−２３１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびＤＭＳＯを含む培養液、またはＮＶＰ−２３１を含まないＤＭＳＯ培養液（対照）に交換し、２４時間培養後、再び１００ｎＭのＮＶＰ−２３１およびＤＭＳＯを含む培養液、またはＮＶＰ−２３１を含まないＤＭＳＯ培養液（対照）に交換し、２４時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間インキュベートすることで固定した。０．５％サポニンを含むＰＢＳで１０分間インキュベートすることで透過処理を行った後、１００μｇ／ｍＬのｆｉｌｉｐｉｎ（シグマアルドリッチ）で３０分間インキュベートした。その後、Ｚｅｉｓｓデコンボリューション顕微鏡にて観察した。
【０１００】
上記実験の結果、ＪＰ１７細胞ではコレステロールの蓄積は観察されなかったが、ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞（Ａ１０１）では、後期エンドソームおよび／またはライソゾームにおけるコレステロールの特徴的な蓄積が観察された（図２Ａ、左および中央の写真）。Ａ１０１細胞にＣ１Ｐ生成阻害剤（セラミドキナーゼ活性阻害剤）であるＮＶＰ−２３１を添加すると、当該コレステロール蓄積が軽減された（図２Ａ、右の写真）。
【０１０１】
続けて、ＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞をガラス底培養皿に播種し、２４〜４８時間培養した。セラミドキナーゼのノックダウンはセラミドキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡ（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ｓｉＲＮＡ  （ｈ）：  ｓｃ−７２８６８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりトランスフェクションし、４８時間培養した。また、ＮＶＰ−２３１の処理および遊離コレステロールの観察は上記と同様の方法で行った。
【０１０２】
上記実験の結果、ＮＰＣ患者皮膚線維芽細胞にコントロールｓｉＲＮＡを投与した場合に、コレステロールの蓄積が観察された（図２Ｂ、左の写真）。当該細胞に、Ｃ１Ｐ生成阻害剤（セラミドキナーゼ生成阻害剤）であるセラミドキナーゼ特異的ｓｉＲＮＡを添加した際、および、Ｃ１Ｐ生成阻害剤（セラミドキナーゼ活性阻害剤）であるＮＶＰ−２３１を添加した際には、当該コレステロール蓄積が軽減された（図２Ｂ、中央および右の写真）。
【０１０３】
［実施例３］
ＮＰＣ細胞におけるＬＤＬに応答するＳＲＥＢＰ１の遅延活性化に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果
【０１０４】
ＳＲＥＢＰ１は、通常状態では小胞体に局在するが、小胞体内コレステロールが枯渇すると核内に移動し、転写制御因子として機能し、コレステロール取り込みを活性化させることが知られている。したがって、ＳＲＥＢＰ１の局在状態は、小胞体におけるコレステロールの存在量を反映するものである。本実験では、ＳＲＥＢＰ１を使用して、ＮＰＣ細胞における小胞体コレステロールの状態を観察し、および、ＮＰＣ細胞における小胞体コレステロールの状態に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果を測定した。
【０１０５】
ＪＰ１７細胞およびＡ１０１細胞をガラス底培養皿に播種し、２４〜４８時間培養した。１０％ＦＢＳあるいは１０％ＬＰＤＳ（リポタンパク質欠損血清、シグマアルドリッチ）を含む培地で４８時間培養した。ＬＰＤＳを含む培地で培養した細胞を１０％ＬＰＤＳおよび１００μｇ／ｍＬのＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培地に交換し、さらに６時間培養した。１００ｎＭのＮＶＰ−２３１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）はＬＤＬと同時に添加した。その後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間インキュベートすることで固定した。０．３％サポニンおよび３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間インキュベートすることで透過処理およびブロッキングを行った後、抗ＳＲＥＢＰ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む抗体希釈液（０．３％サポニンおよび３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１６時間、４℃にてインキュベートした。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗マウスＩｇＧ抗体を含む抗体希釈液で２時間インキュベートした後、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および５０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳで３０分間インキュベートした。その後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＦｌｕｏｖｉｅｗＦＶ５００）にて観察した（図３Ａ）。上記の実験結果を基に、ＳＲＥＢＰ１が核内に局在する細胞の割合を算出した。実験毎に３視野の画像をカウントした。グラフの縦軸は３回の実験結果の平均±Ｓ．Ｅ．で示した（図３Ｂ）。
【０１０６】
実験の結果、対照として使用したＪＰ１７細胞では、培地より十分なコレステロール供給を受けているときにはＳＲＥＢＰ１が小胞体に局在すること（図３Ａ、左上の写真）、培地中からのコレステロール供給が枯渇するとＳＲＥＢＰ１が核内へ移行すること（図３Ａ、中央上の写真、および図３Ｂ）が観察された。この核内移行は、培地中にＬＤＬを添加すると回復し、ＳＲＥＢＰ１は再び小胞体に局在するようになる（図３Ａ、右上の写真）。
【０１０７】
ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞（Ａ１０１）でも同様に、ＬＰＤＳで培養した際にはＳＲＥＢＰ１の核内への移行が観察されたが（図３Ａ、中央左下の写真）、ＪＰ１７とは異なり、この核内移行は、培地中にＬＤＬを添加することでは回復しなかった（図３Ａ、中央右下の写真、および図３Ｂ）。この実験結果は、外的にコレステロールを付加するだけでは、細胞内コレステロール輸送を改善し、小胞体におけるコレステロールの枯渇を改善し得ないことを示唆している。しかしながら、ＬＤＬと共にＣ１Ｐ生成阻害剤（セラミドキナーゼ活性阻害剤）であるＮＶＰ−２３１を添加すると、コレステロール輸送が改善し、小胞体におけるＳＲＥＢＰ１の局在が回復した（図３Ａ、右下の写真、および図３Ｂ）。
【０１０８】
［実施例４］
ＮＰＣ細胞におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ局在に対するＣ１Ｐ生成阻害剤の効果
【０１０９】
ＮＰＣにおけるコレステロール以外の脂質類の輸送異常の改善、正常化におけるＣ１Ｐ生成阻害剤の効果を確認するために、以下の実験を行った。ＪＰ１７細胞およびＡ１０１細胞をガラス底培養皿に播種し、２４〜４８時間培養した。１００ｎＭのＮＶＰ−２３１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびＤＭＳＯを含む培養液、またはＮＶＰ−２３１を含まないＤＭＳＯ培養液（対照）に交換し、２４時間培養後、再び１００ｎＭのＮＶＰ−２３１およびＤＭＳＯを含む培養液、またはＮＶＰ−２３１を含まないＤＭＳＯ培養液（対照）に交換し２４時間培養した。５０ｎＭのＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ（ＢＯＤＩＰＹ−ラクトシルセラミド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％ＢＳＡを含むハムＦ−１２培地で３０分間３７℃にてインキュベートした後、細胞を洗浄し、さらにハムＦ−１２培地で３０分間３７℃にてインキュベートした。その後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＦｌｕｏｖｉｅｗＦＶ５００）にて観察した。
【０１１０】
結果、対照として使用したＪＰ１７細胞では、ラクトシルセラミドはゴルジ体に局在する一方（図４、左の写真）、ＮＰＣ１を欠損したＣＨＯ細胞（Ａ１０１）では後期エンドソームおよび／またはライソゾームに局在することが観察された（図４、中央の写真）。他方、Ａ１０１細胞にＣ１Ｐ生成阻害剤（セラミドキナーゼ活性阻害剤）であるＮＶＰ−２３１を添加すると、ラクトシルセラミドのゴルジ体への局在が観察された（図４、右の写真）。この実験結果は、Ｃ１Ｐ生成阻害剤が、ＮＰＣにおける細胞内コレステロール輸送異常のみならず、その他の脂質類の細胞内輸送異常を改善または正常化することを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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