(57)【要約】      （修正有）【課題】安全性が非常に高い新規なホルムアルデヒド分解酵素の提供。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質からなるホルムアルデヒド分解酵素。（ａ）アスペルギルス・オリゼ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）（ａ）で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質（ｃ）（ａ）で表されるアミノ酸配列において、１或いは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入或いは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質【選択図】図３
2017127264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質からなるホルムアルデヒド分解酵素。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる、ホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドからなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）前記（ｉ）〜（ｉｖ）に相補的なポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素と、該ホルムアルデヒド分解酵素を担持する担体とを備えたホルムアルデヒド分解材。
【請求項７】
前記担体がセルロース、キチン、およびキトサンから選択される少なくとも一つを原料とするナノファイバーを備える請求項６に記載のホルムアルデヒド分解材。
【請求項８】
請求項６に記載のホルムアルデヒド分解材を備えた、空気清浄用フィルター、内装材、家具または塗料である製品。
【請求項９】
請求項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素、請求項５に記載の形質転換体、請求項６または７に記載のホルムアルデヒド分解材、もしくは請求項８に記載の製品を用いたホルムアルデヒドの分解方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス・オリゼ由来のホルムアルデヒド分解酵素およびホルムアルデヒド分解酵素を用いたホルムアルデヒドの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒドは、建材や家具の接着剤または塗料の成分として用いられているが、刺激性が強く、細胞毒性を有することから室内環境からの除去が望まれている。
【０００３】
このため、ホルムアルデヒドを分解する方法として、ホルムアルデヒド分解能力を有する微生物を用いたホルムアルデヒド分解方法（特許文献１）や、ホルムアルデヒド分解能力を有する微生物由来のホルムアルデヒド分解酵素を固定化したホルムアルデヒド除去剤を用いたホルムアルデヒドの除去方法（特許文献２）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第3774774号
【特許文献２】特許第4374595号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１ではホルムアルデヒドの存在環境下での生育能、すなわちホルムアルデヒドへの耐性を指標に菌株を選定しており、具体的にはペシロマイセス（Paecilomyces）属、ボトリチス（Botrytis）属、アスペルギルス（Aspergillus）属の特定の菌株を用いているが、菌株の安全性については考慮されていなかった。たとえば、ペシロマイセス属は土壌等に由来し、一般環境に広く分布するカビの一種であるが、大量の分生子を飛散させるため汚染カビとして知られている。また、ボトリチス属は草花、野菜、庭木、果樹等が感染する灰色カビ病の原因物質であり、安全性の点で検討の余地がある。アスペルギルス属についても種によっては感染症を引き起こすことが報告されており、使用時には注意が必要である。特許文献２でも特許文献１と同じ菌株を採用している。
【０００６】
本発明の目的は、安全性が非常に高いホルムアルデヒド分解酵素、ホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子、ホルムアルデヒド分解材、ならびにホルムアルデヒド分解酵素またはホルムアルデヒド分解材を用いたホルムアルデヒドの分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、日本で醤油、味噌、醸造酒等の製造に古くから利用されているアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の生産する酵素に着目し、ホルムアルデヒド分解能を検証したところ、期せずして非常に高いホルムアルデヒド分解能力があることを発見し、かかるホルムアルデヒド分解能力が細胞壁内に存在する菌体内酵素であることを見出し、酵素およびその遺伝子配列をも特定し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
【０００９】
項１．下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質からなるホルムアルデヒド分解酵素。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
項２．項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子。
【００１０】
項３．下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる、ホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子。
（ｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドからなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）前記（ｉ）〜（ｉｖ）に相補的なポリヌクレオチド
項４．項２または３に記載の遺伝子を含有するベクター。
【００１１】
項５．項４に記載のベクターを含む形質転換体。
【００１２】
項６．項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素と、該ホルムアルデヒド分解酵素を担持する担体とを備えたホルムアルデヒド分解材。
【００１３】
項７．前記担体がセルロース、キチン、およびキトサンから選択される少なくとも一つを原料とするナノファイバーを備える項６に記載のホルムアルデヒド分解材。
【００１４】
項８．項６に記載のホルムアルデヒド分解材を備えた、空気清浄用フィルター、内装材、家具または塗料である製品。
【００１５】
項９．項１に記載のホルムアルデヒド分解酵素、項５に記載の形質転換体、項６または７に記載のホルムアルデヒド分解材、もしくは項８に記載の製品を用いたホルムアルデヒドの分解方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、高い安全性で環境中、特に室内環境中のホルムアルデヒドを分解することができる。また、ホルムアルデヒド分解酵素の配列が特定されているため、遺伝子工学的手法等によりホルムアルデヒド分解酵素を大量生産することも可能である。かかるホルムアルデヒド分解酵素を担体に担持させれば、空気清浄用フィルター、内装材、家具または塗料等の種々の製品を用いてホルムアルデヒドを分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】リアルタイムＰＣＲの結果。
【図２】サザンハイブリダイゼーションによるalcA遺伝子の破壊の確認。（Ａ）対照株とalcA破壊株における遺伝子の配置の模式図、（Ｂ）サザンハイブリダイゼーションのブロッティング。レーン１：対照株、レーン２：alcA破壊株
【図３】ホルムアルデヒド濃度の継時的変化を示したグラフ。Blank: 試薬のみ。
【図４】（Ａ）気相中のホルムアルデヒド濃度の継時的変化を示す表。（Ｂ）図４Ａのグラフ。Blank: 試薬のみを充填。Cellurose：試薬とセルロースナノファイバーを充填。Chitosan：試薬とキトサンナノファイバーを充填。Cellurose/Enzyme：試薬とセルロースナノファイバーと酵素を充填。Chitosan/Enzyme：試薬とキトサンナノファイバーと酵素を充填。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、アスペルギルス・オリゼ由来のホルムアルデヒド分解酵素、その相同タンパク質、およびその変異型タンパク質を提供する。
【００１９】
すなわち本発明のホルムアルデヒド分解酵素には、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質からなるホルムアルデヒド分解酵素が含まれる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質
なお、配列番号１はアスペルギルス・オリゼのホルムアルデヒド分解酵素のアミノ酸配列である。
【００２０】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号１のアミノ酸配列とそれぞれ等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてホルムアルデヒド分解活性を保持する配列をいう。
【００２１】
一つの実施形態では、本発明のホルムアルデヒド分解酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなるホルムアルデヒド分解酵素である。別の実施形態では、本発明のホルムアルデヒド分解酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質である。さらに別の実施形態では、本発明のホルムアルデヒド分解酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質である。
【００２２】
本発明はまた、上記のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる、ホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子を提供する。
（ｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドからなり、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｖ）前記（ｉ）〜（ｉｖ）に相補的なポリヌクレオチド
なお、配列番号２はアスペルギルス・オリゼのホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子（２つのイントロンを有する）であり、配列番号３はアスペルギルス・オリゼのホルムアルデヒド分解酵素をコードする遺伝子のコーディング領域である。
【００２４】
本発明の遺伝子には、配列番号３のヌクレオチド（塩基）配列で示されるポリヌクレオチドにおいて、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠損あるいは挿入等によって部分的に塩基配列が変化したものであっても、ホルムアルデヒド分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子が包含される。
【００２５】
ここで「ストリンジエントな条件」とは、例えばMolecular cloning-a laboratory manual,2 nd edition（Sambrookら、1989）に記載の条件等が挙げられる。即ち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルト液および１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００２６】
なお、アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、例えば、Lipman-Pearson法（Science, 227,1435, 1985）等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。
【００２７】
また「ホルムアルデヒド分解活性」は、試料中のホルムアルデヒド濃度の経時的な測定により評価することができる。
【００２８】
本発明のホルムアルデヒド分解酵素は、アスペルギルス・オリゼの培養液から得ることが可能であるが、その遺伝子を遺伝子工学的にクローニングし、生産、取得することも可能である。
【００２９】
本発明のホルムアルデヒド分解酵素をアスペルギルス・オリゼの培養液から得る場合、ホルムアルデヒド分解酵素は細胞壁内に存在する菌体内酵素であるため、培養したアスペルギルス・オリゼの菌体を粉砕機等の破砕手段により破砕することで、ホルムアルデヒド分解酵素の分解能を飛躍的に向上させることができる。このようにして得た破砕液をそのまま精製を行わずに粗酵素として用いてもよいし、必要に応じて酵素をさらに精製してもよい。アスペルギルス・オリゼは古くから食品にも使用されているため、安全性に優れている。
【００３０】
本発明のホルムアルデヒド分解酵素を遺伝子工学的にクローニングして得る場合、ホルムアルデヒド分解酵素遺伝子のクローニング方法としては、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させるか、あるいは当該遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法で本発明のホルムアルデヒド分解酵素をコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、ホルムアルデヒド分解酵素を生産させる方法が採用できる。
【００３１】
また、本発明のホルムアルデヒド分解酵素遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、ホルムアルデヒド分解酵素を安定に発現させることができ、当該遺伝子を安定に保持できるベクターにホルムアルデヒド分解酵素遺伝子を組込めばよい。係る発現用ベクターとしては、大腸菌ベクター、枯草菌ベクター等が挙げられる。また昆虫細胞・バキュロウイルスによる発現系を利用することも可能である。
【００３２】
得られた組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換するには、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテントセル法やエレクトロポレーション法等を用いることができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられる。
【００３３】
形質転換体は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適度な条件下で培養すればよい。培養液から、一般的な方法により酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００３４】
本発明はまた、上記の本発明のホルムアルデヒド分解酵素と、該ホルムアルデヒド分解酵素を担持する担体とを備えたホルムアルデヒド分解材を提供する。
【００３５】
ホルムアルデヒド分解酵素を担持する担体としては、ホルムアルデヒド分解酵素を担持できる任意の担体であってよく、例えば酵素の固定化に使用される担体である活性炭、固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス、金属酸化物等の無機担体；ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高分子担体；セルロース、キチン、およびキトサンから選択される少なくとも一つを原料とするナノファイバー等が挙げられる。ホルムアルデヒド分解酵素を担体に担持させることで、液相中で培養した菌を用いて気相中のホルムアルデヒドの分解を行う際にも、菌を安定的に培養し、かつ気相での分解に応用できる。
【００３６】
担体のうち、シリカゲルはホルムアルデヒドを多量に吸着しうると共に、その表面をアミノ基で修飾しやすいため好ましい。なお、アミノ基で修飾とは、担体表面にアミノアルキルトリアルコキシシランを化学結合させる意味である。担体表面がアミノ基で修飾されているとホルムアルデヒドの吸着能力が長期間にわたって向上する。担体のうち、平均繊維径がナノメートルのオーダーであるナノファイバーは、ホルムアルデヒドの吸着作用を増大させるため好ましい。ナノファイバーは高圧噴射でセルロース、キチン、またはキトサンをナノファイバー化し、有害な有機溶媒を用いず水のみを用いてナノファイバーの分散流体を作成し、これを凍結乾燥して多孔質体とすることで、高耐水性および高強度のホルムアルデヒド吸着性のシートまたはフィルムを形成することができる。セルロースナノファイバー、キチンナノファイバー、およびキトサンナノファイバーのうち、ホルムアルデヒドの浄化量の点では、キトサンが特に好ましい。セルロースナノファイバー、キチンナノファイバー、およびキトサンナノファイバーの製造方法はそれぞれ公知であり、例えばセルロースナノファイバーの製造方法は特開２０１１−５６４５６号に、キチン・キトサンナノファイバーの製造方法は特開２０１１−１６７２３７に記載されている。ホルムアルデヒド分解酵素を担持するナノファイバーは、例えば、高圧噴射でセルロース、キチン、またはキトサンをナノファイバー化してナノファイバーの分散流体を作成し、この分散流体にホルムアルデヒド分解酵素を生産する菌体を含浸させるか、またはホルムアルデヒド分解酵素を混合し、凍結乾燥することにより製造することができる。
【００３７】
本発明はさらに、上記の本発明のホルムアルデヒド分解材を備えた製品を提供する。かかる製品としては、空気清浄用フィルター、内装材、家具または塗料が挙げられる。かかる製品によれば、部屋の美観を保ちつつ、特に室内環境のホルムアルデヒドを効果的に分解できる。
【００３８】
本発明はまた、本発明の上記のホルムアルデヒド分解酵素、上記形質転換体、上記ホルムアルデヒド分解材、または上記製品を用いたホルムアルデヒドの分解方法を提供する。本発明のホルムアルデヒドの分解方法において、ホルムアルデヒドの状態は気相であってもよいし、水等の液体に溶解した液相であってもよいし、地質改良剤または水質浄化剤等と混ぜた固相であってもよい。
【００３９】
一実施形態では、本発明のホルムアルデヒドの分解方法は、本発明の上記ホルムアルデヒド分解酵素、上記形質転換体、上記ホルムアルデヒド分解材、または製品を、上記ホルムアルデヒドと接触させることを含む。本発明の上記ホルムアルデヒド分解酵素、上記形質転換体、上記ホルムアルデヒド分解材、または上記製品をホルムアルデヒドに接触させることには、例えば、本発明のホルムアルデヒド分解酵素を含有する反応混合液、形質転換体、または該ホルムアルデヒド分解酵素を担持した担体、もしくはアルデヒド分解酵素を備えた製品等を、ホルムアルデヒドを含有する気体、液体、または固体に対面、噴霧、散布、塗布、浸漬または埋設させること等により、接触させることが含まれる。ホルムアルデヒドを含有する気体、液体、または固体は、ホルムアルデヒドの分解を妨げない限りにおいて、他の１つまたは複数の成分を含有してもよい。
【００４０】
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００４２】
実施例１  アスペルギルス・オリゼ中のホルムアルデヒド分解酵素の相同性検索
ホルムアルデヒド分解能を有するScheffersomyces stipitisのSsAdhlp(XM_001382885)遺伝子（アルコールデヒドロゲナーゼ部分mRNA）と相同性のあるアスペルギルス・オリゼの遺伝子について、BLASTおよびFASTAを用いて検索を行った。その結果、アスペルギルス・オリゼのalcA(AO090009000634)遺伝子が類似していることが明らかになった。配列番号１がalcAのアミノ酸配列、配列番号２がalcA遺伝子の塩基配列、配列番号３は２つのイントロンが存在しないalcA遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。
【００４３】
実施例２  リアルタイムPCRによる遺伝子発現量解析
RNAiso Plus(TAKARA)を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株からtotalRNAを抽出した。次に、OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TAKARA)を使用してmRNAを精製した。リアルタイムPCRはSuperScriptIII Two-Step qR-PCR with SYBR（登録商標）Greenキット(Invitrogen)を使用し、解析にはABI PRISM（登録商標） 7500を用いた。使用したPCRプライマーは下記のとおりである。又、反応条件としては逆転写反応及びリアルタイムPCR反応ともにメーカーの推奨条件に従った。アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株におけるリアルタイムPCRについてはKobayashi A et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2007;71:1797-1799を参照のこと。
順方向プライマー：TCCTAAACCAGGACCAGATGAGA（配列番号４）
逆方向プライマー：CCCTTCAAGGCGTGAAGGT（配列番号５）
図１はリアルタイムPCRの結果である。三角フラスコの気体内のホルムアルデヒド濃度が100ppmの場合に、0ppm対して約1.4倍発現比は増大しており、alcA遺伝子がホルムアルデヒド分解活性に関与していることが確認された。
【００４４】
実施例３  alcA破壊株の作製
１．遺伝子欠失破壊用DNA断片の作製
遺伝子破壊を試みる遺伝子の5'側領域（L側領域）と3'側領域（R側領域）の各1.0 kbのDNA領域をPCRで増幅した。また、欠失破壊株の選択用マーカーとしてウラシル合成に関連するpyrG栄養要求性マーカー遺伝子もPCRで増幅した。その後、L側領域, pyrG, R側領域を混合してPCRを行い、L側領域, pyrG, R側領域の順にDNA断片をつなぎ合わせた遺伝子破壊用DNA断片をFusion PCRにより作製した。用いた試薬を表１に示す。
【００４５】
Fusion PCRに用いたプライマーの配列を表２に示す。
【００４６】
L側領域, pyrG, R側領域の各DNA断片は、Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)で増幅した。テンプレートは全てアスペルギルス・オリゼ野生株RIB40の染色体DNAを用いた。
【００４７】
【表１】
2017127264.tif 000003
【００４８】
【表２】
2017127264.tif 000004
【００４９】
表１に示した上記の反応液50μlを0.2 ml反応チューブ中で混合してDNA Thermal Cyclerにセットし、以下の温度設定によりPCRを行った。
【００５０】
94℃、2分  1サイクル
94℃、15秒  63℃、30秒  68℃、2分30秒  35サイクル
68℃、7分  4℃、〜O/N  1サイクル
PCR反応液50μlに6×Loading Bufferを10μl添加して混和後、ウェル幅が1 cm程度のコームで作製した0.7％アガロースゲルに30μlずつ2レーンにサンプルを電気泳動した。目的のDNA断片のバンドを含むゲルを切り出し、Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System (プロメガ)を用いて、Nuclease Free Waterを50μlカラムに通し、カラムからDNAを溶出させ、DNA断片を精製した。
【００５１】
２． Fusion PCR
精製したL側領域, pyrG, R側領域の各DNA断片を並べてアガロースゲルで泳動し、バンドの濃さを参考にDNA断片のモル比がL側領域, pyrG, R側領域=1:3:1となるようにして、かつこれらの3つのDNA断片の合計液量が12 μl以内として、DNA断片を混合し、表３に示す反応系でFusion PCRを行った。
【００５２】
【表３】
2017127264.tif 000005
【００５３】
上記の反応液100μlを0.2 ml反応チューブ中で混合してDNA Thermal Cyclerにセットし、以下の温度設定によりPCRを行った。
【００５４】
94℃、2分  1サイクル
94℃、15秒  66℃、30秒  68℃、6分  35サイクル
68℃、7分  4℃、〜O/N  1サイクル
上記のPCRを2チューブ以上用いて行うことにより、遺伝子欠失破壊用DNA断片を20マイクログラム程度作製した。PCR反応液は、エタノール沈殿を行い、欠失破壊用DNA断片を精製した。当DNA断片は形質転換に使用するので、コンタミがおこらないよう、DNA溶解には滅菌水を用いた。
【００５５】
３．形質転換
アスペルギルス・オリゼNS4 ligD::ptrA ΔpyrG株の分生子懸濁液を、ウリジンを20 mM添加したポリペプトン−デキストリン液体培地（4 g デキストリン水和物（和光純薬）, 2 g ポリペプトン（ディフコ）, 0.2 g カザミノ酸（ディフコ）, 1 g KH2PO4, 0.2 g NaNO3, 0.1 g MgSO4・7H2O, pH 6.0）に植菌し、30℃、20時間振盪培養した。17G1滅菌済ガラスフィルターを用いて集菌後、菌体を滅菌水2回、滅菌0.8 M NaClで1回洗浄した。その後、菌体を30 mlのプロトプラスト化溶液(0.8 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 100 mg/30 ml Lysing enzyme (シグマ), 50 mg/30 ml Cellulase Onozuka R-10 (ヤクルト薬品), 100 mg/30 ml Yatalase (TAKARA))の入った50 ml容の滅菌済遠心チューブに移して懸濁し、30℃、50 rpm、2.5時間振盪しプロトプラスト化反応を行った。滅菌した17G3ガラスフィルターにて濾過し、濾液中のプロトプラストを3,000xg、4℃、5分間遠心分離して沈澱として得た。Solution B（1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl2, 10mM Tris-HCl、pH 7.5）にて3回プロトプラストを洗浄し、3,000xg、4℃、5分間遠心分離することで沈澱として得た。このプロトプラストをSolution B 1 mlで懸濁した。プロトプラスト懸濁液を200 μlずつ滅菌した1.5 mlエッペンドルフチューブに移し、それぞれにSolution C（50%(w/v) PEG♯3350, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl、pH 7.5）25μlと前述の形質転換用DNA溶液各10 μl（DNA量として20μg）を加えよく混合し、氷中で30分間放置した。50 ml容の遠心チューブに2 mlのSolution Bと1 mlのSolution Cとを加え混合し、そこにプロトプラスト懸濁液を加えて懸濁した。そして、70℃に温めておいたソルビトールを1.2 Mの濃度で添加したCzapek−Dox(CD)軟寒天最少培地10〜25 mlをそこに加えて混合し、ソルビトールを1.2 Mの濃度で添加したCD寒天培地に重層した。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。
【００５６】
形質転換後に再生した菌体のうちシングルコロニーを形成した菌体の分性子を単離し、CD寒天培地に植え継いだ。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。
【００５７】
４．単核分性子濃縮法による核の純化
アスペルギルス・オリゼの菌糸及び分生子は複数の核を有する多核の形態をとり、外から導入したDNAは一部の核の染色体だけに組み込まれる場合がある。従って、遺伝子欠失破壊株を作製する場合、当該遺伝子が欠失破壊された核だけが細胞に存在するホモカリオンとして純化することが必要である。その際に、形質転換候補株中に存在する単核の分生子を選抜し継代すれば、目的の遺伝子が欠失破壊された核のみを持つ株を純化できる確率が高くなる。そこで、単核の分生子は多核のそれと比較して大きさが小さいという特性を生かして、メンブランフィルターを通すことで単核の分生子を濃縮し、それらからコロニーが形成されるよう継代培養を行った。滅菌した0.01% Tween 20溶液に分生子を懸濁し、それをフィルターホルダーにセットした孔径5 μm、直径25 mmのISOPORETM MEMBRANE FILTER（ミリポア）にシリンジを用いて通した。この操作により、通過した分生子の約80%が単核の分生子からなる濃縮画分を調製した。これを適宜希釈して1つの分生子から１つのコロニーが形成されるようにCD寒天培地に撒いた。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。
【００５８】
５．遺伝子破壊株の確認
遺伝子破壊株の確認は、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションで行った。図２Ｂに示すように、対照株では１．１ｋｂに、alcA破壊株では３．３ｋｂにバンドが確認された。
【００５９】
実施例４  ａｌｃＡ破壊株を用いたホルムアルデヒド浄化試験
実施例３のａｌｃＡ破壊株を用いて、以下の通りにホルムアルデヒド浄化試験を行った。
【００６０】
具体的には、ホルムアルデヒドを所定濃度含有する溶液に菌体懸濁液を加え、３０℃で振とうした。振とう開始時から経時的に（３時間後、６時間後、９時間後、２４時間後、２７時間後）ホルムアルデヒド濃度を測定した。なお、ホルムアルデヒド濃度の測定にはＮａｓｈ法(T.Nash, Biochem.J., 55, 416(1953))を用いた。
【００６１】
図３に示すように、ａｌｃＡ破壊株では試薬のみ（Blank）の場合と同様、ホルムアルデヒド濃度の量は減少せず、ａｌｃＡ遺伝子を組み込んだ対照株では時間の経過と共にホルムアルデヒド濃度が減少した。これによりａｌｃＡがホルムアルデヒドの分解に関与することが示唆された。
【００６２】
実施例５  気相中でのホルムアルデヒド浄化試験
セルロースナノファイバーを、特開２０１１−５６４５６号に記載の方法により製造し、キトサンナノファイバーを、特開２０１１−１６７２３７に記載の方法により製造した。
【００６３】
セルロースナノファイバーのみを用いた場合と、セルロースナノファイバーとアスペルギルス・オリゼのホルムアルデヒド分解酵素（以下、単に酵素と呼ぶ）とを組み合わせて用いた場合とで、気相中のホルムアルデヒド浄化試験を行った。
【００６４】
また、キトサンナノファイバーのみを用いた場合と、キトサンナノファイバーとアスペルギルス・オリゼのホルムアルデヒド分解酵素（以下、単に酵素と呼ぶ）とを組み合わせて用いた場合とで、気相中のホルムアルデヒド浄化試験を行った。
【００６５】
具体的には、インジケータ内に気相のホルムアルデヒド５０ｐｐｍのみを充填した場合（Blank）、別のインジケータ内に気相のホルムアルデヒド５０ｐｐｍとセルロースナノファイバーを充填した場合（Cellurose）、別のインジケータ内に気相のホルムアルデヒド５０ｐｐｍとキトサンナノファイバーを充填した場合（Chitosan）、別のインジケータ内に気相のホルムアルデヒド５０ｐｐｍとセルロースナノファイバーと酵素を充填した場合（Cellurose/Enzyme）別のインジケータ内に気相のホルムアルデヒド５０ｐｐｍとキトサンナノファイバーと酵素を充填した場合（Chitosan/Enzyme）のそれぞれにおいて、充填後０、１、２、２０、２４時間後のホルムアルデヒド濃度の変化を測定した。
【００６６】
図４Ａ，Ｂに示すように、酵素とセルロースナノファイバーとを組み合わせて用いた場合では、セルロースナノファイバーによるホルムアルデヒドの吸着と、酵素によるホルムアルデヒドの分解とによって、高いホルムアルデヒド分解能が得られた。また、酵素とキトサンナノファイバーとを組み合わせて用いた場合では、キトサンナノファイバーによるホルムアルデヒドの吸着と、酵素によるホルムアルデヒドの分解とによって、高いホルムアルデヒド分解能が得られた。ホルムアルデヒドの浄化能は、セルロースナノファイバーまたはキトサンナノファイバーの吸着能と、酵素の浄化能とにより高められていることが示唆された。なお、キトサンナノファイバーと酵素を用いた場合、セルロースナノファイバーと酵素を用いた場合と比較してホルムアルデヒドの分解能が有意に高く、ホルムアルデヒドの浄化に優れていることも判明した。
【図１】
2017127264.tif 000006
【図２】
2017127264.tif 000007
【図３】
2017127264.tif 000008
【図４】
2017127264.tif 000009
【配列表】
2017127264000001.app