(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍を有する患者への投与に好適な遺伝子改変型Ｔ細胞をプライミングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の提供。【解決手段】腫瘍を有する患者に投与するために好適な遺伝子改変型抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、治療される患者に由来する腫瘍抗原受容体発現標的Ｔ細胞、成熟樹状細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を共培養することを含み、そして前記感作リンパ球は、第２の健常ドナーからの抹消血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）と、第１の健常ドナーからの非増殖ＡＰＣｓを培養することによって得られる、方法。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者に投与するために好適な遺伝子改変型抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、治療される患者に由来する腫瘍抗原受容体発現標的Ｔ細胞、成熟樹状細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を共培養することを含み、そして前記感作リンパ球は、第２の健常ドナーからの抹消血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）と、第１の健常ドナーからの非増殖ＡＰＣｓを培養することによって得られる、方法。
【請求項２】
前記腫瘍抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非増殖抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記成熟樹状細胞は、まず、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約１〜７日間培養して未熟樹状細胞を得ること、次に、少なくとも約１２時間培養することで前記未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とすることができる第２の組成物を加えることによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンαまたはインターフェロンβ、およびＴＬＲ３リガンドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、インターフェロンγ、ＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ４リガンド、ならびにＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニストを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ−Ｉ：Ｃであり、かつ、前記ＴＬＲ８アゴニストはＲ８４８である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は約４〜２０日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１は細胞培養に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記細胞を新たな樹状細胞、抗ＣＤ３抗体、新たな感作同種異系リンパ球とともに培養すること、および所望により外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養に添加することにより再刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ-Ｉ：Ｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記非増殖ＡＰＣｓは前記成熟樹状細胞に対して自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非増殖ＡＰＣｓは照射された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および癌治療の分野、より具体的には、遺伝子改変型抗原特異的Ｔ細胞の活性化方法および前記方法により生産される遺伝子改変型Ｔ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は腫瘍または感染細胞を認識し、これらの標的細胞を殺傷することによって疾病の発症を防ぐ。しかしながら、特異的Ｔ細胞の存在下で発症する癌または慢性感染により示されるように、腫瘍または病原体と免疫系の相互作用は複雑であり、それにより、これらの病原体または腫瘍は明らかにＴ細胞の監視を逃れることができる。
【０００３】
病原性侵入物を実質的に検知するＴ細胞の能力は、その極めて多様な受容体レパートリーにより付与されるものであり、これにより、Ｔ細胞プールは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された際に莫大な数のペプチドを認識することが可能となる。それにもかかわらず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したシグナル伝達（シグナル１）は、共刺激分子が増殖、生存、および分化に不可欠なシグナル（シグナル２）を提供するので、十分なＴ細胞の活性化には及ばない。実際に、シグナル２を受け取らずにシグナル１のみを受け取るナイーブＴ細胞は無力（不応答）となるか、またはアポトーシスを経て死に至る。完全なＴ細胞の活性化にはシグナル１と２の組込みが必要であり、これらのシグナルの強度はその後のＴ細胞プールのサイズを定める。さらに、エフェクターＴ細胞への完全な分化は一般に第３のシグナルに依存し、この第３のシグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって可溶型で供給され、必要とされるエフェクターＴ細胞のタイプを指示するシグナルを提供する。この「３シグナル」の概念は、ナイーブＴ細胞の活性化とそれに続くエフェクターＴ細胞の形成の１つのモデルを表している。さらに、免疫系は多数の多様な共刺激分子を提供し、これらの種々のタイプのシグナル２および３は全て、それら固有のユニークな方法でＴ細胞応答の質に寄与している。共刺激シグナルおよび可溶型のシグナル３は、生存、細胞周期の進行、発達するエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞またはメモリー細胞のいずれに分化するかなどの、Ｔ細胞活性化の特定の側面に働き得る。
【０００４】
今般、成熟抗原提示樹状細胞（ＤＣ）は、長命のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するためには、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む他のリンパ球による「助け」が必要であることが一般に認知されている。この「助け」は成熟ＤＣをさらに分化させ、このプロセスはライセンシングとして知られる。「ヘルパー」シグナルは、ＤＣに対して、共刺激分子のアップレギュレーション、サイトカインの分泌、および数種の抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを含む複数の作用を持ち、これらは全て、同族Ｔ細胞、特にＣＤ８+Ｔ細胞を最適に活性化するＤＣの能力を累積的に増強する。さらに、「ヘルパー」リンパ球はまた、Ｔ細胞の生存、細胞周期の進行、発達するエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞またはメモリー細胞のいずれに分化するかに直接影響を及ぼす因子を発現または分泌し得る。
【０００５】
慢性感染または急速進行性の癌に対抗するための１つの戦略は、宿主において特異的Ｔ細胞応答を回復させるためのエフェクターＴ細胞の移入を含む養子Ｔ細胞療法である。望まれる特異性のＴ細胞を得るための最近の技術開発は、様々な臨床現場で養子Ｔ細胞療法を使用することへの関心の高まりを作り出した。養子細胞移入療法とは、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化および拡大培養された自己腫瘍反応性Ｔ細胞の投与である。癌治療における養子細胞移入療法の使用にはいくつかの潜在的利点がある。腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍の免疫原性特性にかかわらずにｅｘ  ｖｉｖｏで活性化され、拡大培養して増数することができ、しかも、それらの養子移入の前にＴ細胞の機能的および表現型的な質を選択することができる。
【０００６】
養子移入後、Ｔ細胞が定着腫瘍の退縮を引き起こすためには、いくつかの事象が起こらなければならない。より具体的には、Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的再刺激によって活性化されなければならず、次に、これらのＴ細胞は有意な腫瘍量の破壊を引き起こし得るレベルまで数を増さなければならなず、抗腫瘍細胞は全ての腫瘍細胞の根絶を完了するまで十分に長い期間生存しなければならない。
【０００７】
これまでに、固形腫瘍を有する患者に養子移入するための細胞を選択するために使用された判定基準は、抗腫瘍Ｔ細胞の、ＩＦＮ−γ放出能および共培養時の腫瘍細胞殺傷能であった。しかしながら、今般、これらの判定基準だけではｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が予測できないことが明らかである。非特許文献１は、完全なエフェクター特性を獲得し、かつ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗腫瘍反応性の増強を示すＣＤ８+Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍退縮の誘発および治癒に効果が低いことを見出した。
【０００８】
従来技術による方法は、臨床上適切なレベルの腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を得るために１回以上の再刺激を必要とする。例えば、非特許文献２および非特許文献３が参照され、この場合には、約１９％の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを達成するために再刺激１〜２回が必要であった。再刺激はこれらの細胞を低活性とし、アポトーシスに近づける。
【０００９】
初代ヒトリンパ球への遺伝子移入により、抗腫瘍特異性を有する操作細胞を与えることができる腫瘍抗原受容体分子の導入が可能となる（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変することができる。Ｙａｎｇら（非特許文献７）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入により抗腫瘍Ｔ細胞を作出する方法を開示している。彼らは、抗腫瘍Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現するようにＣＤ８+Ｔ細胞の遺伝子改変を行うためにレンチウイルス介在系を用いる。ＣＤ８+Ｔ細胞を効果的に拡大培養するために、同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の照射フィーダー細胞と抗ＣＤ３抗体からなる迅速拡大培養（ＲＥＰ）プロトコール（Ｒｉｄｅｌｌらの特許文献１；１９９８）が使用された。しかしながら、たとえｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞の拡大培養に極めて効率的であったとしても、このＲＥＰプロトコールが誘導するＴ細胞は通常、再注入した後の生存能および拡大能が最適には満たないものである（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，８２７，６４２号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：  １６１６−１６２６  （２００５）
【非特許文献２】Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３１０（２００６），  ４０−５０
【非特許文献３】Ｇｒｉｔｚａｐｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００８；  １８１；  １４６−１５４
【非特許文献４】Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９；  ９：  ３９６−４０８
【非特許文献５】Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００３；  ３：  ３５−４５
【非特許文献６】Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２００５；  ２２：  ４０３−４１４
【非特許文献７】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ２０１０，  ｖｏｌ．  ３３；  ６４８−６５８
【非特許文献８】Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００４，  １７３：  ７１２５−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
よって、養子免疫療法に使用するための、再注入後の抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存を高める、Ｔ細胞集団を調製する方法の大きな必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
概要
本発明は、腫瘍を有する患者への投与に好適な遺伝子改変型の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。この方法は、治療される患者に由来する抗原受容体発現標的Ｔ細胞、樹状細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を共培養することを含む。
【００１４】
本発明はまた、前記方法により得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびそれらの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、従来のＭＬＲ（＝同種感作同種異系リンパ球；ＡＳＡＬ）において、照射した同種異系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したリンパ球は、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である、共培養した成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０の発現を著しく増強することを示す。
【図２】図２は、γ線照射ＡＳＡＬが、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である、共培養した成熟単球由来ＤＣ上のＣＤ７０の発現を増強することを示す。
【図３】図３は、ＡＳＡＬを、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣと共培養すると、実質的なＩＬ−１２生産が誘導されることを示す。
【図４】図４は、ＡＳＡＬを、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣと共培養すると、実質的なＩＦＮ−γ生産が誘導されることを示す。
【図５】図５は、ＡＳＡＬを、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣと共培養すると、実質的なＩＬ−２生産が誘導されることを示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ−図６Ｃは、成熟単球由来ＤＣを、ＣＤ４+、ＣＤ８+またはＣＤ５６+リンパ球を除去したＡＳＡＬと共培養した結果としてのＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ生産を示す。
【図７】図７は、ＡＳＡＬを、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣと共培養すると、非感作同種異系ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖性応答が高まることを示す。
【図８】図８は、同種異系ＣＤ８+標的細胞の初回刺激の際に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの標的細胞が、初回標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された場合に、ＣＤ２７発現同種異系反応性ＣＤ８+標的細胞の数の増加がもたられることを示す。
【図９】図９は、同種異系ＣＤ８+標的細胞の初回刺激の際に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である照射ＰＢＭＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの標的細胞が、初回標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された場合に、アポトーシス性（アネキシン−Ｖ陽性）標的細胞の数の減少がもたらされることを示す。
【図１０】図１０は、同種異系ＣＤ８+標的細胞の初回刺激の際に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である照射単球由来ＤＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの同種異系反応性ＣＤ８+標的細胞が、初回標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された場合に、より強い（６倍の）二次的増殖性応答がもたらされることを示す。
【図１１】図１１は、同種異系ＣＤ８+標的細胞の初回刺激の際に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である照射単球由来ＤＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの同種異系反応性ＣＤ８+標的細胞が、初回標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された場合に、ＩＦＮ−γ生産の実質的増大がもたらされることを示す。
【図１２】図１２は、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟した単球由来ＤＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、抗ＣＤ３抗体に対するＦｃ−γ受容体であるＣＤ６４を発現するＤＣの数が増えることを示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ３＋標的Ｔ細胞（非トランスフェクト）が成熟ＤＣおよび照射ＡＳＡＬとともに、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）およびＩＬ−２を添加した培地で１２日間共培養され拡大されるＡＳＡＬプロトコールが、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＴ細胞に比べて、アポトーシス誘導Ｈ2Ｏ2処理に対する耐性がより高いＴ細胞を誘導することを示す。
【図１４】図１４は、ＣＤ３＋標的Ｔ細胞（非トランスフェクト）が成熟ＤＣおよび照射ＡＳＡＬとともに、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）およびＩＬ−２を添加した培地で１２日間共培養され拡大されるＡＳＡＬプロトコールが、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＴ細胞に比べて、アポトーシス誘導ドキソルビシン処理に対する耐性がより高いＴ細胞を誘導することを示す。
【図１５】図１５は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の、膠芽腫癌細胞で発現されたＧＤ２抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）での効率的レンチウイルストランスフェクションを示す（＞４０％のトランスフェクト細胞）。
【図１６】図１６は、ＡＳＡＬプロトコールが、標準的なＲＥＰプロトコールに比べて、ＣＡＲでトランスフェクトされたＣＤ３＋Ｔ細胞の同等の拡大培養を誘導することを示す。
【図１７】図１７は、ＡＳＡＬプロトコールが、ＲＥＰプロトコールに比べて、ＣＡＲトランスフェクトＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に拡大培養することを示す。
【図１８】図１８は、ＡＳＡＬプロトコールが、ＲＥＰプロトコールに比べて、同等またはより多数の、ＣＤ２７を発現するＣＡＲトランスフェクトＣＤ３＋Ｔ細胞を誘導することを示す。
【図１９】図１９は、ＡＳＡＬプロトコールが、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞の特異的殺傷能と同等の、ＧＤ２発現腫瘍細胞の特異的殺傷能を有するＣＡＲトランスフェクトＴ細胞を拡大培養することを示す。無関連のＴ２細胞を対照標的として用いた。菱形（◆）＝ＲＥＰ対ＧＤ２陰性標的；四角（■）＝ＡＳＡＬ対ＧＤ２陰性標的；三角（▲）＝ＲＥＰ対ＧＤ２発現標的細胞；クロス（×）＝ＡＳＡＬ対ＧＤ２発現標的。
【図２０】図２０は、ＣＤ１０７ａ（溶解性顆粒エキソサイトーシスのマーカー）の膜発現によって測定されるＣＡＲトランスフェクトＴ細胞における腫瘍特異的細胞傷害活性が、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞に比べて、ＣＡＲトランスフェクトＴ細胞がＡＳＡＬプロトコールで拡大培養された場合には、潜在的腫瘍由来抑制因子（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−βおよび／またはＨ2Ｏ2）に対する耐性がより高いことを示す。黒い柱＝ＲＥＰで拡大培養されたＴ細胞；白い柱＝ＡＳＡＬプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞。
【図２１】図２１は、相互作用および標的細胞の殺傷後のＣＡＲトランスフェクトＴ細胞の増殖性応答が、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞に比べて、より高く、潜在的腫瘍由来抑制因子への曝露に対する耐性がより高いことを示す。Ａ：免疫抑制剤無し；Ｂ：ＩＬ−１０／ＴＧＦ−β処理；Ｃ：Ｈ2Ｏ2処理；Ｄ：ＩＬ−１０／ＴＧＦ−βおよびＨ2Ｏ2処理。
【００１６】
定義
本発明を記載する前に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるので、本明細書で使用する用語は単に特定の実施形態を記載する目的で用いられ、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうではないことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含むことを述べておかなければならない。
【００１８】
また、用語「約」は、適切であれば、示された値の＋／−２％、好ましくは＋／−５％、最も好ましくは数値の＋／−１０％の偏差を示すために用いられる。
【００１９】
本発明に関して、用語「抗原特異的」とは、自己のＭＨＣ分子上に提示される短いユニークなペプチド配列の、ユニークなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による特異的認識／結合に関する。
【００２０】
本発明に関して、用語「プライミング」および「活性化」とは、「ヘルパー」細胞が同時に存在する状態または同時に存在しない状態で抗原提示細胞により刺激されるようになったナイーブ抗原特異的Ｔ細胞で起こるプログラムされた活性化プロセスに関する。
【００２１】
本発明に関して、用語「レスポンダー細胞」とは、共培養された同種異系ＰＭＢＣに対して活性化および／または増殖により応答する、限定されるものではないがＴ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む、種々のリンパ球部分集団に関する。
【００２２】
本発明に関して、用語「感作した細胞」とは、共培養された、ＰＢＭＣを含む、同種異系細胞により予め活性化された、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む、種々のリンパ球部分集団に関する。
【００２３】
本発明に関して、用語「標的細胞」とは、抗ＣＤ３抗体などの抗体と組み合わせた同種異系または自己のいずれかのＡＰＣにより刺激されるようになったＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。患者のリンパ球（標的細胞）採取部位は、例えば、末梢血、腫瘍、腫瘍所属リンパ節または骨髄である。
【００２４】
本発明に関して、単球由来ＤＣに関して用語「成熟」とは、未熟ＤＣをＬＰＳなどの微生物産物またはＴＮＦ−αおよび／もしくはＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターで刺激することにより誘導される、限定されるものではないがＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＣＲ７を含む、それらの「成熟マーカー」の発現に関する。
【００２５】
未熟ＤＣは、高いエンドサイトーシス活性と低いＴ細胞活性化能を特徴とする細胞である。未熟ＤＣは、周囲環境をウイルスおよび細菌などの病原体に関して絶えずサンプリングしている。未熟ＤＣは病原体を貪食し、それらのタンパク質を分解して小片とし、成熟時には、ＭＨＣ分子を用いて、それらの細胞表面にこれらの断片を提示する。同時に、それらは、それらのＴ細胞活性化能を著しく増強するＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０など、Ｔ細胞の活性化において共受容体として働く細胞表面受容体をアップレギュレートする。それらはまた、樹状細胞を血流を通じて脾臓へ、またはリンパ系を通じてリンパ節へ送る走化性受容体ＣＣＲ７もアップレギュレートする。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、それらは、非抗原特異的共刺激シグナルとともに、病原体に由来する抗原を提示することにより、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。成熟ＤＣはおそらく、体内を循環し適切なシグナルに応じてＤＣまたはマクロファージのいずれかに変化することができる白血球細胞である単球から生じる。そして、これらの単球は骨髄中の幹細胞から形成される。単球由来ＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏでは末梢血単球から生成できる。
【００２６】
本発明に関して、細胞の「非増殖性」という用語は、細胞分裂による後代形成が不能となった細胞を示すために用いる。この細胞はそれでもなお、刺激に対して応答したり、またはサイトカインなどの細胞産物の生合成および／または分泌を行ったりすることができる。細胞を非増殖性とする方法は当技術分野で公知である。細胞を非増殖性とする好ましい方法は、マイトマイシンＣなどの抗増殖薬による処理、またはγ線照射などの照射である。固定または透過処理を施された分裂不能の細胞も、非増殖性細胞の例である。
【００２７】
本発明に関して、用語「混合リンパ球反応」、「混合リンパ球培養」、「ＭＬＲ」、およびＭＬＣは、アロタイプが異なる最低２つの異なるＴ細胞集団を含む混合物を表すために互換的に用いられる。少なくとも１つの、アロタイプが異なる細胞はリンパ球である。これらの細胞は一定時間一緒に培養されると、好適な条件下でリンパ球が刺激される。ＭＬＲの目的の多くは、リンパ球の増殖を誘導するなどの同種異系刺激を提供することであるが、示されない限り、培養中の増殖は必要でない。適切な文脈では、これらの用語はあるいはこのような培養に由来する細胞の混合物を意味する場合もある。
【００２８】
本明細書において、用語「治療」とは、治療される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を意味し、予防のため、または臨床病理学の過程で行われる場合もある。望ましい効果としては、疾病の発生または再発の予防、症状の緩和、および疾病の任意の直接的または間接的病理帰結の軽減、転移の防止、疾病進行の減速、病態の改善または軽減、および予後の緩解または改善が含まれる。
【００２９】
用語「抗原提示細胞」、または「ＡＰＣ」は、無傷な完全細胞、ならびに好ましくはクラスＩ  ＭＨＣ分子と会合した１以上の抗原の提示を誘導し得るその他の分子（全て同種異系起源）、および同種異系免疫応答を誘導し得るあらゆるタイプの単核細胞の双方を含む。完全な生細胞をＡＰＣとして使用することが好ましい。好適なＡＰＣの例としては、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、ＤＣ、単球由来ＤＣ、マクロファージ由来ＤＣ、Ｂ細胞および骨髄性白血病細胞、例えば、細胞株ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＨＬ−６０またはＣＥＭ−ＣＭ３などの完全細胞である。骨髄性白血病細胞は、いわゆる前単球を提供するとされている。
【００３０】
用語「癌」、「新生物」および「腫瘍」は互換的に用いられ、本明細書および特許請求の範囲で見られるように、単数形または複数形で、それらを宿主生物にとって病的とする悪性化を受けた細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性化部位の近傍から得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書において、癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含まれる。これには転移した癌細胞、ならびに癌細胞に由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化するタイプの癌に関して、「臨床上検出可能な」腫瘍とは、例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診などの手法によって、腫瘍塊に基づいて検出可能なものである。本発明に関連する腫瘍／癌の限定されない例としては、癌腫（例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌および膵臓癌）、肉腫（例えば、骨癌および滑膜癌）、神経内分泌腫瘍（例えば、膠芽腫、髄芽細胞腫および神経芽腫）、白血病、リンパ腫および扁平上皮癌（例えば、子宮頸癌、膣癌および口腔癌）がある。さらに、本発明に関連する腫瘍／癌の限定されない例としては、神経膠腫、線維芽細胞腫、神経肉腫、子宮癌、黒色腫、精巣腫瘍、星状細胞腫、異所性ホルモン産生腫瘍、卵巣癌、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、血管作用性腸管ペプチド分泌腫瘍、頭頸部扁平上皮細胞癌、食道癌、または転移性癌がある。前立腺癌および乳癌が特に適している。
【００３１】
本発明に関して、用語「培養する」とは、様々な種類の培地での細胞または生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を意味する。培養増殖された細胞の後代はその親細胞と完全に（形態的、遺伝的、または表現型的に）同一でない場合があると理解される。好適な培養培地は当業者により選択可能であり、このような培地の例としては、ＲＰＭＩ培地またはイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）がある。
【００３２】
用語「主要組織適合複合体」および「ＭＨＣ」とは、Ｔ細胞に対する抗原提示および迅速な移植片拒絶に必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を意味する。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によりコードされているタンパク質は「ＭＨＣ分子」として知られ、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子には、ＭＨＣにコードされている鎖がβ２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合したものからなる膜ヘテロ二量体タンパク質である。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞により発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原提示において機能を果たすことが示されている。クラスＩ分子には、ヒトではＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃが含まれる。クラスＩ分子は一般に、８〜１０アミノ酸長のペプチドと結合する。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子もまた、膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。
【００３３】
クラスＩＩ  ＭＨＣはＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗原提示に関与することが知られており、ヒトでは、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、およびＤＲが含まれる。クラスＩＩ分子は一般に、１２〜２０アミノ酸残基長のペプチドと結合する。用語「ＭＨＣ拘束」とは、プロセシングを受けた後にのみ抗原の認識が可能となるＴ細胞の特徴を意味し、結果として生じた抗原ペプチドは自己クラスＩまたは自己クラスＩＩ  ＭＨＣ分子のいずれかと会合して提示される。
【００３４】
用語「ワクチン」、「免疫原」、または「免疫原性組成物」は、ヒトまたは動物被験体に投与された際に一定程度の特異的免疫を付与することができる化合物または組成物を意味するために本明細書で用いられる。本開示に使用する場合、「細胞ワクチン」または「細胞免疫原」とは、所望により不活性化された少なくとも１つの細胞集団を有効成分として含む組成物を意味する。本発明の免疫原、および免疫原性組成物は活性型であるが、これはそれらが宿主の免疫系により少なくとも部分的に媒介される特異的免疫応答（抗腫瘍抗原または抗癌細胞応答など）を刺激し得ることを意味する。この免疫応答は、抗体、免疫反応性細胞（ヘルパー／インデューサーまたは細胞傷害性細胞など）、またはそれらの任意の組合せを含んでよく、好ましくは、その治療が対象とする腫瘍上に存在する抗原に向けられたものである。この応答は、単回用量または多回用量のいずれかの投与によって被験体において惹起または再刺激され得る。
【００３５】
化合物または組成物は、ａ）ナイーブ個体における抗原（腫瘍抗原など）に対する免疫応答の生成；またはｂ）個体における、その化合物または組成物が投与されなかった場合に生じるものを超える免疫応答の再構築、追加免疫、または維持、のいずれかが可能であれば「免疫原性」である。組成物は、単回用量または多回用量で投与された際にこれらの判定基準のいずれかを達成可能であれば、免疫原性である。
【００３６】
説明
本発明は、抗ＣＤ３抗体と組み合わせた、樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞による活性化の際に抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存の増大を促進するための、同種感作した同種異系リンパ球（ＡＳＡＬ）の生産に関する。
【００３７】
本発明は、ヒト健常血液ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびその部分集団を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づくが、ここで、抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導におけるＡＳＡＬの正の調節の役割が実証された。同種異系ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、ＡＳＡＬの存在下で同種異系反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および生存を追跡すると、再刺激後の増殖能は５倍を超える増大を示し、アポトーシス細胞死は１０％から５％に減少した。
【００３８】
抗原特異的ヒトＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞は、腫瘍抗原受容体をコードする遺伝子の形質導入またはトランスフェクションによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで作出することができる。本発明は、標的抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された（ウイルス形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の遺伝物質導入法による）Ｔ細胞を含む養子免疫療法に用いるためのＴ細胞集団を調製し；これらの操作Ｔ細胞を、感作した同種異系リンパ球および抗ＣＤ３抗体の存在下、ＤＣで活性化し；これらの細胞を培養で拡大し；及び、これらの細胞を患者に再導入する方法に関する。
【００３９】
ＡＳＡＬの添加は、抗原提示ＤＣ上での共刺激分子ＣＤ７０の強くアップレギュレートされた発現をもたらし、かつ、Ｔ細胞の１型ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への運命決定によく知られた正の影響を持つ２つの因子ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生産をもたらす。さらに、ＡＳＡＬの添加は、Ｔ細胞に関するよく知られた増殖因子ＩＬ−２の生産をももたらした。特に、ＣＤ７０が介在する相互作用は、最近、連続して何回も分裂することで活性化されたＴ細胞の生存を増進し、それにより、エフェクターＴ細胞の蓄積に寄与することが示された。
【００４０】
より具体的には、本発明は、腫瘍を有する患者への投与に好適な遺伝子改変型の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。この方法は、治療される患者に由来する腫瘍抗原受容体発現標的Ｔ細胞を、ＤＣ、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を共培養することを含み、前記ＡＰＣは好ましくは前記リンパ球に対して同種異系であり、かつ、前記樹状細胞は好ましくは単球に由来する。抗ＣＤ３抗体の添加は、Ｆｃ／Ｆｃ受容体の相互作用によるそれらの、樹状細胞との結合をもたらし、これにより、抗体アームを有する樹状細胞はＣＤ３発現Ｔ細胞と直接相互作用してこれを活性化することができる。
【００４１】
標的Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）コード遺伝子で形質転換させることもできるし、あるいはまた興奮性シグナルをＴ細胞にＭＨＣにより制限を受けない方法で中継することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用によって形質転換させることもできる。従って、細胞内Ｔ細胞活性化ドメインと融合した細胞外抗原認識ドメインから構成されるこれらのハイブリッドタンパク質は、それらのヒト白血球抗原の遺伝子型にかかわらず患者に使用することができる。遺伝子の形質転換前に、標的Ｔ細胞は、続いての形質転換を最適化するために抗ＣＤ３抗体で予め刺激することが好ましい。好適ないずれのＣＡＲを本発明に用いてもよい。ＣＡＲリガンドは腫瘍細胞によって発現されなければならない。好適なＣＡＲの選択および調製は当業者に知られている技術上の範囲内である。ＣＡＲリガンドの限定されない例としては、ＶＥＧＦＲ−２（血管内皮増殖因子受容体−２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＧＤ２（ガングリオシド抗原）がある。
【００４２】
ＴＣＲコード遺伝子またはＣＡＲコード遺伝子のＴ細胞への遺伝子形質転換は、トランスフェクションまたは形質導入などの当業者に知られている好適ないずれの方法を用いて行ってもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ．  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ参照）。トランスフェクションはウイルスベクターを用いて行うこともできる。ウイルスベクターの限定されない例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。形質導入としては、限定されるものではないが、プラスミドの電気転移、トランスポゾン／トランスポゼース系およびマイクロインジェクションが挙げられる。
【００４３】
ＡＳＡＬは、混合白血球反応から得られるレスポンダー細胞であり、次に、樹状細胞および標的細胞とともに、抗ＣＤ３抗体を含有する培養培地で培養される。前記ＡＳＡＬはその患者に対して、および、前記樹状細胞に対して自己または同種異系であり得る。前記樹状細胞は治療される患者に対して、および、初回のＭＬＲに誘導されるＡＳＡＬの活性化に用いた刺激細胞に対して自己または同種異系であり得る。前記ＡＳＡＬは、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む末梢血リンパ球からなる群から選択される。前記標的細胞はＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞である。
【００４４】
本発明の方法では、ＣＤ３抗体はトランスフェクトされたＴ細胞の非特異的刺激剤として働く（前記Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体がＴ細胞上のＣＤ３分子と結合した際に活性化されるようになる）。トランスフェクトされたＴ細胞と樹状細胞は自己または同種異系である。ＣＤ３抗体はまたＡＳＡＬも再刺激するが、これはＡＳＡＬが樹状細胞に対して自己または同種異系であり得ることを意味する。好ましくは、樹状細胞とＡＳＡＬは同種異系である。樹状細胞とＡＳＡＬはまた、必ずしも必要ではないが好ましくは、トランスフェクトされた患者Ｔ細胞に対して同種異系（すなわち、健常血液ドナー由来）である。
【００４５】
ＡＳＡＬの添加はさらに、高レベルのＣＤ２７を発現する標的ＣＤ８+Ｔ細胞の集団の富化をもたらす。ＣＤ２７+  ＣＤ８+Ｔ細胞は、増殖のための抗原由来自己分泌シグナルを提供できることから、おそらく養子免疫療法にとってより有効なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）である。このようなヘルパー非依存性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、生存および拡大培養のためにＩＬ−２またはＣＤ４＋Ｔ細胞の形での外因的助けを必要としないであろう。よって、本発明は、ＩＬ−２などの付加的サイトカイン、またはＣＤ４+Ｔ細胞の不在下または低存在下での強い細胞傷害活性に関してプログラムされたＣＤ８+Ｔ細胞集団を被験体に提供することにより、免疫介在性疾患を治療するための方法を提供する。この方法は細胞溶解性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大培養に特に有用であるが、腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の拡大培養にも使用可能である。
【００４６】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球の総数に対するパーセンテージとして表した細胞溶解性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、いっそうより好ましくは少なくとも約２５％、いっそうより好ましくは少なくとも約３０％、最も好ましくは少なくとも約３５％である。
【００４７】
ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は両方とも効率的な細胞傷害性に必要である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞傷害性であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−２などの成長増殖因子を放出する。ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大に有利な拡大培養プロトコールはｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を損なうと思われるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数がＣＤ４＋Ｔ細胞の数を上回ることが好ましい（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０；３３：６４８）。
【００４８】
より具体的には、本発明の方法は、腫瘍を有する患者への投与に好適なＴＣＲまたはＣＡＲで形質転換された抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関し、前記方法は、以下の工程：
ａ）患者または健常ドナー由来の非増殖抗原提示細胞を、前記抗原提示細胞に対して同種異系である末梢血単核細胞とともに培養する工程、
ｂ）患者または健常ドナー由来の単球を、その単球を成熟ＤＣへ成熟させる組成物中で培養する工程（この組成物はさらに下記に記載される）、および
ｃ）工程ａ）から得られた、限定されるものではないがＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、同種感作したリンパ球を、工程ｂ）から得られた成熟ＤＣとともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴＣＲまたはＣＡＲで形質転換された標的細胞を伴って、抗ＣＤ３抗体を含有する培養培地中で共培養する工程
を含む。
【００４９】
前記単球由来ＤＣは、まず、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約２〜７日間、好ましくは約５日間単球を培養して未熟ＤＣを得て、次に、少なくとも約１２〜７２時間、好ましくは約２４〜４８時間培養することにより未熟ＤＣを成熟ＤＣとすることができる第２組成物を加えることによって得られる。この第２の組成物は、未熟ＤＣを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために使用可能な成熟単球由来ＤＣとすることができる成分を含む。一実施形態では、第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンβおよびＴＬＲ３リガンド、例えばポリ−Ｉ：Ｃ（Ｍａｉｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｐｈａ−ｔｙｐｅ−１  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ＤＣｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＴＬ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４；６４：５９３４−５９３７）を含む。別の実施形態では、第２の組成物は、インターフェロンγ、ＴＬＲ３および／もしくはＴＬＲ４リガンドならびにＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８リガンドならびに／またはＴＬＲ９リガンドを含む。ＴＬＲ３リガンドの限定されない例はポリ−Ｉ：Ｃであり、ＴＬＲ７／８リガンドの限定されない例はＲ８４８であり、ＴＬＲ９リガンドの限定されない例はＣｐＧである。
【００５０】
同種異系リンパ球の感作は、不活性化した抗原提示細胞を、健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに培養することを含む従来の混合白血球反応（ＭＬＲまたはＭＬＣ混合白血球培養）によって誘導され、この場合、前記抗原提示細胞は前記リンパ球に対して同種異系である。ＭＬＲの性能は当業者にはよく知られている（Ｊｏｒｄａｎ  ＷＪ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ＭＡ．  Ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２；２６０：  １−１４）。ＭＬＲでは、２個体からのＰＢＭＣ（主としてリンパ球）を組織培養において数日間混合する。不適合個体からのリンパ球は互いに刺激し合って有意に増殖するが（例えば、トリチウム化チミジンの取り込みにより測定される）、適合個体からのリンパ球はそうではない。一方向性ＭＬＣでは、これらの個体の一方からのリンパ球が、マイトマイシンなどの抗増殖薬または照射によって前処理され、それにより、他の個体からの非処理のリンパ球のみが外来の組織適合抗原に応答して増殖することができる。
【００５１】
このＭＬＲに用いられる抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来ＤＣからなる群から選択される。
【００５２】
本発明の方法では、これらの細胞（治療される患者由来の腫瘍抗原受容体発現標的Ｔ細胞、樹状細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球）は約２０日間、好ましくは約４〜２０日間、好ましくは約６〜２０日間、より好ましくは７〜１４日間、最も好ましくは約９〜１４日間共培養される。
【００５３】
細胞増殖および生存を最適化するために細胞培養に外因性のＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を加えることができる。
【００５４】
プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記細胞を新たなＤＣ、抗ＣＤ３抗体、および前記リンパ球に対して同種異系である非増殖性抗原提示細胞により活性化された新たな感作リンパ球とともに培養すること、および所望により外因性のＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を細胞培養に加えることによって再刺激することもできる。
【００５５】
本発明はまた、上記の方法により得ることができる免疫原性組成物、ならびに上記の方法により得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。
【００５６】
抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は患者への投与に好適であり、好ましくは、下記の特徴のうち少なくとも１つを有する。
・増殖能
・低レベルのアポトーシスマーカーアネキシン−Ｖの発現（すなわち、ＦＡＣＳ測定により、アネキシン−Ｖ陽性染色を示す細胞が４０％以下、好ましくは２０％以下であるべきである）
・細胞表面におけるＣＤ２７および／またはＣＤ２８の発現
【００５７】
本発明の方法により得ることができる特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のさらなる能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、抗原特異的Ｔ細胞に対してＭＨＣ適合性である腫瘍細胞または腫瘍負荷抗原提示細胞によって活性化され、かつ／または前記腫瘍細胞または腫瘍負荷抗原提示細胞を殺傷する能力である。本発明の方法により得ることができる特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよび／またはＨ2Ｏ2などの免疫抑制因子とともに前培養しても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて関連する腫瘍標的細胞を殺傷する能力を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて関連する腫瘍標的細胞の殺傷の後にも増殖能を有し、ならびにＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよび／またはＨ2Ｏ2などの免疫抑制因子とともに前培養しても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて関連する腫瘍標的細胞の殺傷の後にも増殖能を有する。
【００５８】
本発明は、薬剤として使用するためならびに薬剤の製造を目的とした前記抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の使用のための、本発明の方法により得られる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。
【００５９】
さらに、本発明は、腫瘍の治療に用いるため、またはヒトにおいて抗腫瘍免疫応答を惹起するため、ならびに腫瘍の治療もしくはヒトにおいて抗腫瘍免疫応答の惹起を目的とした薬剤の製造のために、本発明のまたは上記で定義された方法によって得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の使用に関する。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は初回刺激後あるいはまた再刺激後に投与することができる。一実施形態では、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、治療用癌ワクチンと組み合わせて投与される。
【００６０】
ヒト被験体の治療における養子細胞療法にＴ細胞集団を使用する方法は、当技術分野の臨床家に知られている。本明細書に記載され、当技術分野で公知の方法に従って調製されたＴ細胞集団は、このような方法で使用可能である。例えば、例えば、腫瘍浸潤リンパ球をＭＡＲＴ−Ｉ抗原特異的Ｔ細胞とともに使用する養子細胞療法が診療所で試験されている（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：２４１−２５０，  ２００５）。腎細胞癌を有する患者に照射自己腫瘍細胞の接種が行われた。採取された細胞が抗ＣＤ３モノクローナル抗体およびＩＬ−２で二次的な活性化を受けた後、前記患者に再投与された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１  ：８８４−８９０，  ２００３）。
【００６１】
抗原でプライミングしたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＣにより媒介されるそれらの初期プライミングの際にＡＳＡＬに曝した場合、再刺激時に増殖の増大およびアポトーシスの低減を受ける。よって、ワクチン接種前および／または接種中に養子移入により患者に戻された場合に、ワクチン接種時の二次的Ｔ細胞応答を増強するための方法も本発明により企図される。
【００６２】
本発明はまた、癌ワクチン療法を改善するための方法も提供する。多くの腫瘍は、免疫系による破壊の標的として働く可能性のある外来抗原を発現する。癌ワクチンは、被験体において、体液成分と細胞成分の両方を含む全身性の腫瘍特異的免疫応答を生成する。この応答は、ワクチン組成物を腫瘍から離れた部位または局在している腫瘍部位に投与することにより、被験体自身の免疫系から惹起される。抗体または免疫細胞は腫瘍抗原に結合し、腫瘍細胞を溶解させる。しかしながら、癌患者のワクチン接種時にＴ細胞の応答性を増強する必要がなおある。従って、ワクチン接種前または接種時の、高増殖能を有する予め活性化されたアポトーシス耐性腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移入は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるワクチンにより媒介される免疫応答を増強する可能性がある。
【００６３】
本発明による組成物はまた、治療用癌ワクチンと組み合わせて投与することもできる。このような治療用癌ワクチンの限定されない例としては、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ腫瘍を負荷したＤＣ、サイトカイン産生腫瘍細胞、ＤＮＡワクチン接種およびＴＬＲ−リガンドを腫瘍抗原と組み合わせて使用するワクチンがある。
【００６４】
本発明の方法により得ることができる細胞は、ヒトなどの生物に直接投与して、それらの活性化の際の抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存を高めることができる。これらの細胞の投与は、多くの場合、薬学上許容される担体を伴い、細胞を導入して最終的に哺乳類の血液または組織細胞と接触させるために通常使用される任意の経路による。
【００６５】
例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、および腫瘍内経路などの非経口投与に好適な製剤および担体は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤、およびその製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性等張無菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液を含む。静脈投与が本発明のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の好ましい投与方法である。
【００６６】
本発明に関して患者に投与されるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の用量は、患者において免疫応答を増強するために十分なものでなければならない。よって、細胞は腫瘍抗原に対して有効な免疫応答を惹起するため、かつ／または症状および／もしくはその疾患由来の合併症を緩和、軽減、治癒または少なくとも部分的に阻止するために十分な量で患者に投与される。これを遂行するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量は、生産される細胞の活性および患者の病態、ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定される。癌などの疾患の治療または予防において投与される細胞の有効量を決定するに当たり、医師は疾患の進行および関連するいずれの腫瘍抗原に対する免疫応答の誘導も評価する必要がある。
【００６７】
従来技術の方法に比べて本発明にはいくつかの主な利点がある。本発明は、再刺激の必要のない高レベルの腫瘍特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を提供する。再刺激はこれらの細胞を低活性とし、アポトーシスに近づける。よって、再刺激の必要がなく腫瘍特異的Ｔ細胞を効果的に拡大培養する方法が有利である。加えて、細胞を再刺激する必要がなければ、腫瘍特異的Ｔ細胞はより短い期間で患者に戻すことができ、コスト効果が上がる。さらに、本発明の方法を使用すれば、極めてコストのかかるプロセスであるサプレッサー細胞の除去または外因性増殖因子の添加の必要も無くなる。腫瘍浸潤リンパ球（ｌｙｍｐｏｈｏｃｙｔｅｓ）から培養された自己腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移入は、ヒトにおいて進行性腫瘍の退縮を引き起こすことができるが、ほとんどのヒト腫瘍から確実に培養できるわけではない。従って、多数の血液由来Ｔ細胞を腫瘍抗原特異的Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子を発現するように操作する方法が開発された。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の場合、ヒト白血球抗原遺伝子型に関わらずに患者に使用することができる。
【００６８】
本発明の方法の拡大培養効力はＲＥＰプロトコールと同等であるが、本方法で拡大培養されたＡＳＡＬは、ＲＥＰにより拡大培養されたＴ細胞に比べて、ｉｎ  ｖｉｖｏではるかに高い殺傷能を有する。この主な理由は、ＲＥＰにより生産されたＴ細胞は、本発明の方法で拡大培養されたＴ細胞に比べて、腫瘍が作り出す免疫抑制環境に対して耐性が低いということである。さらに、本発明の方法は、ＲＥＰプロトコールに比べて高率でＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大培養するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大培養に有利なプロトコールは低いｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を示すので、このことは有利である。
【００６９】
開示された種々の態様および特徴のいずれの組合せも本発明に包含される。
【００７０】
本発明を以下の限定されない例によりさらに説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１
材料および方法：  同種感作した同種異系リンパ球（ＡＳＡＬ）は、組織培養フラスコ内の血清不含Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地中で５〜７日間、健常血液ドナー由来のγ線照射ＰＢＭＣと同種異系ドナー（前記健常血液ドナーに対して）由来の非照射ＰＢＭＣを１：１の比で共培養することによる標準的な一方向性混合白血球反応（ＭＬＲ）において生成した。未熟ＤＣの増殖のため、健常血液ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配（ノルウェー、オスロ、Ｎｙｃｏｍｅｄ社、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で単離した。単離されたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（ＵＫ、ペイズリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁させ、２４ウェルプラスチック培養プレートに２．５×１０6細胞／ウェルで播種し、２時間接着させた。非接着細胞を除去し、残った接着単球を組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（ＵＫ、アビンドン、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；共に１，０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地で４〜６日間培養した。未熟ＤＣの成熟は、インキュベーションの最後の２４時間に培養培地にＩＦＮ−α（３，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ−γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍＬ）（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびｐ−Ｉ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；２０μｇ／ｍＬ）を添加することにより誘導した。
【００７２】
ＦＡＣＳ分析により測定したところ、成熟ＤＣ集団は全て７０％を超えるＣＤ８３＋ＤＣを含有していた。
【００７３】
洗浄後、成熟ＤＣを非照射またはγ線照射（２５グレイ）ＡＳＡＬとともにＸ−ＶＩＶＯ  １５培地で２４時間共培養し、ＦＡＣＳにより分析した。同種異系反応性リンパ球の感作は、刺激細胞としてγ線照射ＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞として非照射ＰＢＭＣを用いて血清不含培養培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）中で５〜６日間、初回の一方向性ＭＬＲを行うことにより実施した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ７０をＦＡＣＳ試験に用いた。
【００７４】
結果  図１に示されるように、ＡＳＡＬは、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０の発現を著しく増強する。
【００７５】
図２に示されるように、γ照射ＡＳＡＬも同様に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０の発現を増強する。
【００７６】
図３、４および５に示されるように、ＡＳＡＬとＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟ＤＣの共培養は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の実質的な生産を誘導する。
【００７７】
実施例２
材料および方法：  ＡＳＡＬは、刺激因子として照射同種異系ＰＢＭＣを用い、７日間の従来のＭＬＲで生成した（実施例１参照）。採取および照射の後に、ＡＳＡＬのバルク集団（「ＭＬＲ」）またはＣＤ４+、ＣＤ８+またはＣＤ５６+（ＮＫ／ＮＫＴ）細胞を除去したＡＳＡＬを、成熟同種異系単球由来ＤＣ（ＡＳＡＬのプライミングに用いたＰＢＭＣに対して自己）とともに共培養した。２４時間後に共培養上清を採取し、その後、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ生産に関してアッセイした。
【００７８】
結果：  ＩＬ−２生産は厳格にＣＤ４に依存していることが判明したが（図６Ａ）、ＩＬ−１２生産（図６Ｂ）はＡＳＡＬに全く依存しないことが示され、ＩＦＮ−γ生産（図６Ｃ）は、このＡＳＡＬ集団内で、共培養されて同種プライミングされたＣＤ４+、ＣＤ８+およびＣＤ５６+（ＮＫ／ＮＫＴ）に部分的に依存することが示された。
【００７９】
実施例３
材料および方法：  未熟ＤＣは、単球のプラスチック接着により生成した。単球は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＦＳを両方とも１０００Ｕ／ｍＬで添加したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ中で７日間培養した。ＤＣの成熟は、インキュベーションの最後の２日間に５０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、２５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１β、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γ、３０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮ−αおよび２０μｇ／ｍＬポリＩ：Ｃを加えることによって誘導した。
【００８０】
ＡＳＡＬは、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５中で７日間、γ線照射同種異型ＰＢＭＣと、ＤＣドナーに対する非照射自己ＰＢＭＣを１：１の比で共培養することによる一方向性混合リンパ球反応で生成した。
【００８１】
ＣＤ８+Ｔリンパ球は、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５中で培養された自己ＰＢＭＣからの陽性選択により、７日間で終濃度０．５×１０6リンパ球／ｍＬで単離された。ＰＢＭＣを遠心分離し、ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ−２Ｍ  ＥＤＴＡに終濃度１×１０7／８０μＬで再懸濁させた。ＰＢＭＣをＣＤ８+マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともに４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、再懸濁させ、ＬＳ  ＭＡＣＳカラムにのせた。非標識細胞を洗い流し、ＣＤ８+リンパ球を含有する全流出液を回収した。単離されたＣＤ８+Ｔリンパ球を、予温したＰＢＳ−１％ＢＳＡに１×１０6／ｍＬの濃度となるように再懸濁させ、３７℃で１０分間、１０μΜ  ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色した。５ｍＬの氷冷Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地を加えることによって染色を終了させ、氷上で５分間インキュベートした。細胞を培地で２回洗浄し、終濃度が１×１０6／ｍＬとなるように再懸濁させた。染色されたＣＤ８+Ｔリンパ球を、照射および同種感作を行った同種異型ＰＢＭＣおよび成熟自己ＤＣとともに４：４：１の比で４〜７日間共培養した。培養後、リンパ球を採取し、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２７−ＡＰＣおよびアネキシンＶで染色した。増殖しているＣＤ８+Ｔリンパ球のパーセンテージはフローサイトメトリーにより決定し、総リンパ球に対するパーセンテージとして表した。
【００８２】
結果：  結果：図７に示されるように、照射「同種ヘルパー」（＝ＡＳＡＬ）の添加は、ＣＤ８+Ｔの細胞分裂を著しく高める（低い蛍光強度を有する細胞が多い＝ドットプロットにおいて左側にドットが多い）。よって、ＡＳＡＬは、単球由来ＤＣの、同種異系反応性ＣＤ８+Ｔ細胞において増殖性応答を誘導する能力を高める。
【００８３】
実施例４
材料および方法：  実施例１の材料および方法を参照。
ＣＤ８＋リンパ球はＤＣ、照射ＡＳＡＬ（前記ＤＣに対して同種異系）を６日間共培養した後に単離し（抗体コーティング磁性ビーズによる陰性選択を使用）、次に、Ｂ細胞（初回刺激の際に用いたＤＣに対して自己）で再刺激し、ＣＤ２７およびアネキシン−Ｖの発現に関して染色を行った。続いての分析はＦＡＣＳにより行った。
【００８４】
結果：  図８に示されるように、初回刺激の際にＡＳＡＬを添加すると、ＣＤ８+細胞をＢ細胞で再刺激した場合のＣＤ２７の発現が実質的に増強された。
【００８５】
初回刺激の際にＡＳＡＬを添加すると、ＣＤ８＋細胞をＢ細胞で再刺激した場合のアネキシン−Ｖ（アポトーシスマーカー）の発現が実質的に低減され（図９参照）、従って、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞はアポトーシス進入耐性が高くなる。
【００８６】
実施例５
材料および方法：  実施例４の材料および方法を参照。
Ｂ細胞で再刺激する前に、プライミングおよび単離を行ったＣＤ８+細胞を３Ｈ−チミジンでパルス処理した。
【００８７】
結果：  図１０に示されるように、初回刺激の際にＡＳＡＬを添加すると、再刺激後の同種異系反応性ＣＤ８+細胞の増殖性応答が著しく増強された（３Ｈ−チミジンの組み込みにより測定、ｃｐｍ／分、３日目）。
【００８８】
実施例６
材料および方法：  実施例４の材料および方法を参照。
Ｂ細胞と予め活性化したＣＤ８+細胞を２日間共培養した後、培養上清を採取し、従来のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりＩＦＮ−γ生産に関して分析した。
【００８９】
結果：  図１１は、初回刺激の際にＡＳＡＬを添加すると、再刺激後の同種異系反応性ＣＤ８+細胞によるＩＦＮ−γの生産が実質的に増強されたことを示す。
【００９０】
実施例７−ＣＡＲでトランスフェクトされたＴ細胞の拡大培養
材料および方法：
基本培養培地は、１０％ヒト血清、１％ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、１％ＨＥＰＥＳ、０．５％Ｌ−グルタミンおよび１６０μｌ  βメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ培地１６４０からなった。
【００９１】
未熟ＤＣは、単球のプラスチック接着により生成した。次に、単球を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＦＳを両方とも１０００Ｕ／ｍＬで添加した基本培養培地で７日間培養した。ＤＣの成熟は、インキュベーションの最後の２４時間に２０ｕｇ／ｍＬポリ−Ｉ：Ｃ、２．５ｕｇ／ｍＬ  Ｒ８４８および５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γを添加することによって誘導した。
【００９２】
ＡＳＡＬは、基本培養培地中で７日間、γ線照射ＰＢＭＣと非照射同種異系ＰＢＭＣを１：１の比で共培養することによる一方向性混合リンパ球反応で生成した。
【００９３】
Ｔ細胞のトランスフェクション：  まず、単離されたＰＢＭＣ（５×１０（５）／ｍＬ）を、ＤＣ培地にＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）および抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加することにより、３日間活性化した。その後、ＣＡＲ−レンチウイルス（２０μＬ）、Ｓｅｑｕａ−Ｂｒｅｎｅ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）を含有する培養培地で４時間インキュベートすることにより、非接着細胞（主として活性化されたＴ細胞）をＧＤ２（神経芽細胞腫細胞上で発現の高いガングリオシド抗原）に対するＣＡＲでトランスフェクトした。洗浄後、細胞を、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）を添加した培地で５日間培養した。その後、トランスフェクションレベルを、レンチウイルス−ＣＡＲに対するＰＥ−Ａコンジュゲート抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【００９４】
Ｔ細胞の拡大培養：  洗浄後、続いて、ＣＡＲでトランスフェクトされたＴ細胞を、成熟ＤＣ＋照射ＡＳＡＬ＋ＣＡＲトランスフェクトＴ細胞（１：４：１比）、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）およびＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）からなるＡＳＡＬプロトコールか、または３つの異なるドナーに由来する照射同種異系ＰＢＭＣ＋ＣＡＲトランスフェクトＴ細胞（１００：１比）、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）およびＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍＬ）からなる標準的ＲＥＰプロトコール（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０；３３：６４８）のいずれかを用い、Ｔ−２５フラスコにて１２日間、培養培地中で拡大培養した。長期培養のために、３日目、６日目および９日目に培養培地を除去し、新鮮培地、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２および５０ｎｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３を補充した。
【００９５】
フローサイトメトリー分析：  前記細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７  ＣＤ６４およびＣＡＲ（ＧＤ２））に対する特異的蛍光団（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＡＰＣ、またはフィコエリトリン（ＰＥ））標識抗体（カリフォルニア州、サンディエゴ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いることにより、室温で１５分間（遮光）で染色した。ＦＡＣＳ分析はＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＵＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行い、データをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩソフトウエアで分析した。
【００９６】
アポトーシスアッセイ：  アネキシンＶアポトーシスアッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、対照培地での、および続いてアポトーシス誘導剤（Ｈ２Ｏ２またはドキソルビシン）を２４時間加えた培地での種々の拡大培養プロトコールで１２日間拡大培養した後のＴ細胞の生存率を評価した。簡単に述べると、Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、結合バッファーに再懸濁させ、次に、アネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびプロピジウムヨージド（ＰＩ）とともに室温で１５分間インキュベートした後に、洗浄およびフローサイトメトリー分析を行った。
【００９７】
腫瘍細胞殺傷の測定：  ＣＡＲでトランスフェクトされ、拡大培養された（１２日）Ｔ細胞を、丸底９６ウェルプレートの各ウェル内で、ＧＤ２発現神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３（ルシフェラーゼリポート遺伝子を共発現する）とともに種々のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）で４８時間共培養した。トランスフェクトおよび拡大培養されたＴ細胞の、関連の腫瘍細胞を溶解させる能力を、ルシフェラーゼ発現アッセイ（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ，  ＰｌｏＳ  １  ，  ２０１０，５，ｅ１  １８６７）を用いて評価した。関連の細胞生存率（％）は生値の発光量（ＲＬＵ）として計算し、エフェクターＴ細胞を用いない場合の標的細胞（ＩＭＲ−３）から得られたルシフェラーゼ活性に対して正規化した。
【００９８】
潜在的腫瘍由来抑制因子に曝されたＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷もまた、エフェクターＴ細胞上の溶解性顆粒エキソサイトーシスのマーカーである膜結合ＣＤ１０７ａに対するコンジュゲート抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価した。Ｔ細胞を、標的細胞と共培養する前に、ＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍＬ）に４時間、Ｈ２Ｏ２（２５ｕＭ）に２４時間、またはＨ２Ｏ２（２４時間）と組み合わせてＩＬ−１０およびＴＧＦ−β（両方とも４時間）に曝した。
【００９９】
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（ＵＳＡ、オレゴン州、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、潜在的腫瘍由来抑制因子に事前曝露した場合としない場合の、標的抗原発現腫瘍細胞の相互作用／殺傷４日後のＴ細胞の増殖を評価した。Ｔ細胞を、標的細胞と共培養する前に、ＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍＬ）に４時間、Ｈ２Ｏ２（２５ｕＭ）に２４時間、またはＨ２Ｏ２（２４時間）と組み合わせてＩＬ−１０およびＴＧＦ−β（両方とも４時間）に曝した。
【０１００】
結果：
図１２に示されるように、ＡＳＡＬのプライミングに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である、照射した成熟単球由来ＤＣに照射ＡＳＡＬを添加すると、ＣＤ６４（Ｆｃ−γＲ）を発現するＤＣの数が増える。この受容体は可溶性抗ＣＤ３抗体のＦｃ部分を捕捉すると予想される。このような抗ＣＤ３「アームを有する」ＤＣは、次に、共培養された自己または同種異系ＣＤ３発現Ｔ細胞と直接相互作用してそれを活性化し得る。
【０１０１】
図１３は、Ｈ2Ｏ2処理後の生存率を示す。ＡＳＡＬプロトコールは、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＴ細胞に比べてアポトーシス誘導Ｈ2Ｏ2処理に対する耐性が高いＴ細胞を誘導する。Ｈ2Ｏ2は周知の腫瘍内免疫抑制因子であり、ＡＳＡＬプロトコールはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍由来Ｈ2Ｏ2に優れた耐性を有するＴ細胞を拡大培養すると予想できる。
【０１０２】
図１４は、ドキソルビシン処理後の生存率を示す。ＡＳＡＬプロトコールは、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＴ細胞に比べて、アポトーシス誘導ドキソルビシン処理に対する耐性がより高いＴ細胞を誘導する。ドキソルビシンは頻用される抗癌薬であるので、ＡＳＡＬプロトコールはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてドキソルビシンとの併用抗癌治療によって誘導されるアポトーシスに対して優れた耐性を有するＴ細胞を拡大培養すると予想できる。
【０１０３】
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＧＤ２抗原（膠芽腫癌細胞上で発現される）に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で効果的にトランスフェクトされる（＞４０％のトランスフェクト細胞）（図１５参照）。左の図はトランスフェクション前、右の図はトランスフェクション後を示す。右上４分の１内にあるドットは全て、ＣＡＲでトランスフェクトされたＴ細胞を表す。
【０１０４】
ＡＳＡＬプロトコールは、標準的ＲＥＰプロトコールに比べて、ＣＡＲトランスフェクトＣＤ３＋Ｔ細胞の同等の拡大培養を誘導するが（図１６参照）、ＲＥＰプロトコールに比べて高率でＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大培養する（図１７参照）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大培養に有利な拡大培養プロトコールはｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を損なうと思われるので（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０；３３：６４８）、この所見は臨床上重要である。
【０１０５】
さらに、ＡＳＡＬプロトコールは、ＲＥＰプロトコールに比べて、同等または多数のＣＤ２７発現ＣＤ３＋Ｔ細胞を誘導する（図１８参照）。ヒトに養子移入された後のＴ細胞の存続は再注入されたＴ細胞上での高レベルのＣＤ２７発現と直接的に相関することが示されているので、この所見は臨床上意味がある。ＣＤ２７+  ＣＤ８+Ｔ細胞は、抗原により駆動される、増殖のための自己分泌シグナルを提供することができることから、養子免疫療法にとっておそらくより有効なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）となる。このようなヘルパー非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生存および拡大培養のために、ＩＬ−２またはＣＤ４+Ｔ細胞の形での外因的助けを必要としないであろう。
【０１０６】
図１９に示されるように、ＡＳＡＬプロトコールは、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞の特異的殺傷能と同等の特異的殺傷能を有するＣＡＲトランスフェクトＴ細胞を拡大培養する。
【０１０７】
ＣＡＲトランスフェクトＴ細胞の腫瘍特異的細胞傷害能（ＣＤ１０７ａの膜発現により測定される）は、ＲＥＰプロトコールで拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞に比べて、ＣＡＲトランスフェクトＴ細胞がＡＳＡＬプロトコールで拡大培養された場合には、潜在的腫瘍由来抑制因子（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−βおよび／またはＨ2Ｏ2）の曝露に対する耐性が高い（図２０参照）。
【０１０８】
標的細胞の相互作用および殺傷後のＣＡＲトランスフェクトＴ細胞の増殖性応答は、ＲＥＰプロトコール（Ｔ細胞を拡大培養するために頻用されるプロトコール；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０；３３：６４８参照）で拡大培養されたＣＡＲトランスフェクトＴ細胞に比べて、高く、潜在的腫瘍由来抑制因子に対する耐性が高い。よって、標的細胞の殺傷後、本発明の方法により生成されたＴ細胞は再刺激され、従って、新たな癌細胞を攻撃および殺傷する。
【０１０９】
本明細書では特定の実施形態を詳細に開示したが、これは単に説明のために例として示したものであり、以下の添付の特許請求の範囲に関して限定を意図するものではない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な置換、変更および改変を行うことができることが本発明者により意図される。
【図１】
2017127314.tif 000003
【図２】
2017127314.tif 000004
【図３】
2017127314.tif 000005
【図４】
2017127314.tif 000006
【図５】
2017127314.tif 000007
【図６Ａ】
2017127314.tif 000008
【図６Ｂ】
2017127314.tif 000009
【図６Ｃ】
2017127314.tif 000010
【図７】
2017127314.tif 000011
【図８】
2017127314.tif 000012
【図９】
2017127314.tif 000013
【図１０】
2017127314.tif 000014
【図１１】
2017127314.tif 000015
【図１２】
2017127314.tif 000016
【図１３】
2017127314.tif 000017
【図１４】
2017127314.tif 000018
【図１５】
2017127314.tif 000019
【図１６】
2017127314.tif 000020
【図１７】
2017127314.tif 000021
【図１８】
2017127314.tif 000022
【図１９】
2017127314.tif 000023
【図２０】
2017127314.tif 000024
【図２１】
2017127314.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月5日(2017.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者に投与するために好適な遺伝子改変型抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、治療される患者に由来する腫瘍抗原受容体発現標的Ｔ細胞、成熟樹状細胞、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を抗ＣＤ３抗体の存在下で共培養することを含み、そして前記感作リンパ球は、第２の健常ドナーからの抹消血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）と、第１の健常ドナーからの非増殖ＡＰＣｓを培養することによって得られる、方法。
【請求項２】
前記腫瘍抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非増殖抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記成熟樹状細胞は、まず、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で１〜７日間培養して未熟樹状細胞を得ること、次に、少なくとも１２時間培養することで前記未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とすることができる第２の組成物を加えることによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンαまたはインターフェロンβ、およびＴＬＲ３リガンドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、インターフェロンγ、ＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ４リガンド、ならびにＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニストを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ−Ｉ：Ｃであり、かつ、前記ＴＬＲ８アゴニストはＲ８４８である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は４〜２０日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１が細胞培養に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記細胞を新たな樹状細胞、および新たな感作同種異系リンパ球とともに抗ＣＤ３抗体の存在下で培養することにより再刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記細胞を新たな樹状細胞、新たな感作同種異系リンパ球とともに抗ＣＤ３抗体の存在下で培養すること、および外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養に添加することにより再刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ-Ｉ：Ｃを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記非増殖ＡＰＣｓは前記成熟樹状細胞に対して自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記非増殖ＡＰＣｓは照射された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）である、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2017127314000001.pdf