(57)【要約】      （修正有）【課題】微細藻類に由来する脂肪酸生産性向上に関わる新規遺伝子、並びに該遺伝子を用いた脂肪酸の製造方法の提供。【解決手段】クロロサルシノプシス・バストロピエンシス由来のある特定のヌクレオチド配列を持つ８種類の脂肪酸生産性向上遺伝子、又は該配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる脂肪酸生産性向上遺伝子。該脂肪酸生産性向上遺伝子を含むベクター及び該ベクターを藻類、大腸菌等に導入した形質転換体、並びに該形質転換体を用いた高級脂肪酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる脂肪酸生産性向上遺伝子：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号２で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び、
配列番号８で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１記載の脂肪酸生産性向上遺伝子にコードされるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の脂肪酸生産性向上遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
前記形質転換体が植物、動物、微生物、又はそれらの細胞若しくは組織である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
前記形質転換体が微生物である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記微生物が藻類又は大腸菌である、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項記載の形質転換体を栽培、飼育、又は培養することを含む、脂肪酸の製造方法。
【請求項９】
前記脂肪酸が、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
宿主における請求項１記載の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現を強化することを含む、該宿主の脂肪酸生産性の向上方法。
【請求項１１】
前記宿主が植物、動物、微生物、ならびにそれらの細胞及び組織からなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主が微生物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が藻類又は大腸菌である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸が、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸生産性向上に関わる新規遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は、主にグリセリンとエステル結合したグリセリドを主成分とする油脂として動物、植物、微生物等の天然資源に蓄積されている。脂肪酸を含む油脂は、一般に、上記油脂を蓄積した天然資源から圧搾や抽出により採取された後、分解、脱色、脱臭等の各種処理を行うことで製造されている。油脂としては、大豆油、パーム油、ヤシ油、菜種油、コーン油、オリーブ油、ひまわり油、ひまし油、亜麻仁油などの植物油、牛脂、豚脂、魚油などの動物油等が知られている。また、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｆｉｓｔｕｌｉｆｅｒａ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ属やＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属の微細藻類が油脂を生産する藻類として注目されている（非特許文献１参照）。さらに、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の糸状菌等が油脂を生産する微生物として知られている（非特許文献２参照）。
【０００３】
脂肪酸は、潤滑油、樹脂素材等として工業分野で利用されているほか、医薬や化粧料、日用品、食品の原料、及びバイオ燃料などとしても使用されている。しかし、上記天然資源からの脂肪酸の製造は原料の供給量及び生産性に限界がある。油脂の増産は環境破壊の問題、食糧との競合の問題を伴う。一方、脂肪酸は化学合成によっても製造することができるが、脂肪酸種によっては合成が難しいため高価になることがある。脂肪酸は今後も需要量の増加が見込まれるため、環境破壊や食糧と競合することなく、目的の種類の脂肪酸をより大量に、かつ安価に製造する方法が求められている。
【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして微細藻類が注目を集めている。微細藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産できる。しかも、微細藻類は海藻などの食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、微細藻類は、他の植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告や、培養や脂質の抽出が容易であるとの報告もある（特許文献１参照）。しかし、微細藻類の脂肪酸合成に関わる酵素やその遺伝子については未だ多くが不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２５１４５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】井山ら、「油脂原料をどうする」、財団法人  油脂工業会館  油脂原料確保研究会、平成２１年４月
【非特許文献２】佐野、油化学、第３９巻第４号（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、脂肪酸生産性向上に関わる新規遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体、ならびに該形質転換体を用いた脂肪酸の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、優れた脂肪酸生産能力を有する微細藻類において、脂肪酸生産性向上に関わる遺伝子について鋭意探索を行った。その結果、緑藻綱のクロロサルシノプシス（Ｃｈｌｏｒｏｓａｒｃｉｎｏｐｓｉｓ）属から、脂肪酸生産性向上に関わる新規遺伝子を見出した。さらに、本発明者らは、当該遺伝子の発現を強化した形質転換体では、脂肪酸生産性が向上することを見出した。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる脂肪酸生産性向上遺伝子：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号２で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び、
配列番号８で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
を提供する。
【００１０】
さらなる一態様において、本発明は、上記脂肪酸生産性向上遺伝子にコードされるポリペプチドを提供する。
【００１１】
さらなる一態様において、本発明は、上記脂肪酸生産性向上遺伝子を含むベクターを提供する。
【００１２】
さらなる一態様において、本発明は、上記ベクターを含む形質転換体を提供する。
【００１３】
さらなる一態様において、本発明は、上記形質転換体を栽培、飼育、又は培養することを含む、脂肪酸の製造方法を提供する。
【００１４】
さらなる一態様において、本発明は、植物、動物又は微生物における上記脂肪酸生産性向上遺伝子の発現を強化することを含む、該植物、動物又は微生物の脂肪酸生産性の向上方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、新規な脂肪酸生産性向上遺伝子を提供する。植物、動物又は微生物において本発明の遺伝子の発現を強化することによって、該植物、動物又は微生物の脂肪酸生産性を向上させることができ、効率の良い生物学的脂肪酸生産を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＫＳＭ−ＷＡ１５２株の顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１８】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．６）、ＧＥＮＥＴＹＸ  ネットワーク版（Ｖｅｒ．１１）（いずれもソフトウェア開発）などのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１９】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００２０】
本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上２００個以下、好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下、さらにより好ましくは１個以上２０個以下、なお好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は複数個のヌクレオチドの付加が含まれる。
【００２１】
本明細書において、遺伝子の「制御領域」とは、該遺伝子を発現させるための配列であり、例えば、プロモーターやターミネーター等の発現調節領域、転写開始点などが挙げられる。
【００２２】
また本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００２３】
本明細書において、別途限定がない限り、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域を基点とした、５’側及び３’側に続く領域を示す。
【００２４】
本明細書において、形質転換体又はその宿主の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該形質転換体の宿主に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該形質転換体の宿主に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、形質転換体に含まれる「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、宿主に存在しておらず、外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された形質転換体の宿主と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００２５】
本明細書において、形質転換体の「宿主」とは、遺伝的改変により該形質転換体へと形質転換される生物又は細胞をいう。「宿主」は、原核生物であっても真核生物であってもよく、単細胞生物であっても多細胞生物であってもよく、さらに多細胞生物の場合、生物個体であっても、そこから分離された細胞であってもよい。「宿主」の例としては、植物、動物若しくは微生物、又はそれらの細胞若しくは組織が挙げられる。
【００２６】
本明細書において、植物又は動物とは、多細胞からなる植物体又は動物体だけでなく、それらから分離した細胞も含み、また微生物とは、微細藻類、細菌、糸状菌、酵母等の一般的に微生物に分類される生物をいう。
【００２７】
本明細書において、本発明の遺伝子の発現を強化した形質転換体における「脂肪酸生産性向上」とは、該形質転換体における目的の脂肪酸種の生産量が、該遺伝子発現強化前又は該遺伝子発現強化を行っていない宿主（すなわち、対照）の生産量を１００％としたときに、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上、なお好ましくは１５０％以上であることをいう。該形質転換体における脂肪酸の生産量は、ガスクロマトグラフィー質量分析、薄層クロマトグラフィー分析等によって測定することができる。
【００２８】
なお、本明細書において、遺伝子発現強化とは、宿主が該遺伝子を本来有しない場合は、宿主内にて作動可能に該遺伝子を導入して該遺伝子を発現させることをいい、宿主が該遺伝子を本来有している場合は、宿主の該遺伝子の発現量を増加させることをいう。よって、遺伝子発現強化により、いずれの宿主においても、該遺伝子の発現量が増加することになる。
【００２９】
本発明は、新規な脂肪酸生産性向上遺伝子を提供する。本発明の遺伝子の発現を強化させた宿主、すなわち本発明の遺伝子の発現量が増加した形質転換体は、脂肪酸生産量が増加する。したがって、上記本発明の遺伝子は、宿主の脂肪酸生産性を向上させる機能を有する。
【００３０】
本出願人は、以前に、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス（Ｃｈｌｏｒｏｓａｒｃｉｎｏｐｓｉｓ  ｂａｓｔｒｏｐｉｅｎｓｉｓ）に属する微細藻類微生物から脂肪酸生産性株を見出した。当該株は、２０１４年１０月２日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている（ＫＳＭ−ＷＡ１５２株：受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７９）。本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子は、上記脂肪酸生産性クロロサルシノプシス・バストロピエンシス株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７９）における探索から見出だされた。
【００３１】
本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子としては、以下の（Ａ）〜（Ｈ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
（Ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号１で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で７２％（vs. ref|XP_002954301.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_106317 [Volvox carteri f. nagariensis]、又はgb|EFJ44725.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_106317 [Volvox carteri f. nagariensis]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３３】
（Ｂ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号２で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で５０％（vs. ref|XP_002956027.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_107029 [Volvox carteri f. nagariensis]、又はgb|EFJ42987.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_107029 [Volvox carteri f. nagariensis]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３４】
（Ｃ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号３で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で４８％（vs. ref|XP_002956027.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_107029 [Volvox carteri f. nagariensis]、又はgb|EFJ42987.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_107029 [Volvox carteri f. nagariensis]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３５】
（Ｄ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号４で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で５４％（vs. ref|XP_001693038.1| predicted protein [Chlamydomonas reinhardtii]、又はgb|EDP03607.1| predicted protein [Chlamydomonas reinhardtii]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３６】
（Ｅ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号５で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で７６％（vs. ref|XP_002953943.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_121243 [Volvox carteri f. nagariensis]、又はgb|EFJ44972.1| hypothetical protein VOLCADRAFT_121243 [Volvox carteri f. nagariensis]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３７】
（Ｆ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号６で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で６４％（vs. ref|XP_002952694.1| 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase [Volvox carteri f. nagariensis]、又はgb|EFJ46247.1| 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase [Volvox carteri f. nagariensis]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３８】
（Ｇ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号７で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で７４％（vs. ref|XP_001689663.1| chloroplast glycerolipid omega-3-fatty acid desaturase [Chlamydomonas reinhardtii]、又はgb|EDP09401.1| chloroplast glycerolipid omega-3-fatty acid desaturase [Chlamydomonas reinhardtii]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００３９】
（Ｈ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドは、宿主におけるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸の生産量を向上させる機能を有し、なかでも、Ｃ１２：０脂肪酸の生産量の向上効果が高い。配列番号８で示されるヌクレオチド配列と公知のヌクレオチド配列との同一性は、最大で３３％（vs. ref|WP_014431947.1| hypothetical protein [Caldilinea aerophila]、ref|YP_005440604.1| hypothetical protein CLDAP_06670 [Caldilinea aerophila DSM 14535 = NBRC 104270]、又はdbj|BAL98706.1| hypothetical protein CLDAP_06670 [Caldilinea aerophila DSM 14535= NBRC 104270]）である。したがって、該ポリヌクレオチドは新規ポリヌクレオチドである。
【００４０】
上記配列番号１〜８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１〜８で示されるヌクレオチド配列のいずれかに対して、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４１】
上記（Ａ）〜（Ｈ）のポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ただしＲＮＡの場合、配列番号１〜８で示される配列中のチミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）である。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
【００４２】
上記本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１〜８で示されるヌクレオチド配列に基づいて、本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡを人工合成することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの人工合成には、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。あるいは、脂肪酸生産性クロロサルシノプシス・バストロピエンシス株から、定法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１記載の方法）に従って、配列番号１〜８で示されるポリヌクレオチドをクローニングすることができる。
【００４３】
本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子が由来するクロロサルシノプシス・バストロピエンシス株としては、好ましくは下記性質を有する株が挙げられる：
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：５μｍ〜１０μｍ
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる１８Ｓ  ｒＤＮＡを有する、
当該性質を有するクロロサルシノプシス・バストロピエンシス株の例としては、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＫＳＭ−ＷＡ１５２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７９）、及びクロロサルシノプシス・バストロピエンシスＵＴＥＸ１６９８株（ＵＴＥＸ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）が挙げられる。
【００４４】
配列番号１〜８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号１〜８で示されるヌクレオチド配列に対してヌクレオチドを欠失、置換、付加、又は挿入する変異を導入することによって調製することができる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５８１−６２１，１９９５）に記載の方法、などが挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
【００４５】
上記遺伝子を遺伝子工学的手法に従って発現させることによって、本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子にコードされるポリペプチドを調製することができる。例えば、後述する発現ベクターに本発明の遺伝子を組み込み、発現させることによって、該遺伝子がコードするポリペプチドを得ることができる。遺伝子の発現には、細胞系及び無細胞系のいずれを使用することもできる。
【００４６】
また上記本発明の遺伝子は当該遺伝子を含む、より大きなＤＮＡ断片として用いることもできる。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明の遺伝子、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
【００４７】
本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子は、ベクターに組み込まれていてもよい。好ましくは、本発明の遺伝子を含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明の遺伝子を宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内で該遺伝子を発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、上記本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
【００４８】
具体的なベクターの例としては、微生物を宿主とする場合には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）II  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＴＶ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ系ベクター（宝酒造社製）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｐｌａｓｍｉｄ  １５（２）；ｐ．９３−１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＲＳ４０３（ストラタジーン社製）、ｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＦＬＡＧ系ベクター（シグマアルドリッチ）、ｐＴＡＣ系ベクター（シグマアルドリッチ）、ｐＴ７系ベクター（シグマアルドリッチ）、及びｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン社製）が挙げられる。宿主が大腸菌の場合、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（−）、又はｐＭＷ２１８／２１９がより好ましい。
【００４９】
藻類を宿主とする場合には、例えば、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、Ｐ６６（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｐ−３２２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＰｈａ−Ｔ１、及びｐＪ  ＥＴ１（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。植物細胞を宿主とする場合には、例えば、ｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック社製）、及びＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。
【００５０】
動物を宿主とする場合には、例えば、ＰｒｏＦｏｌｄ（タカラバイオ社製）、ＢａｃＰＡＫ（タカラバイオ社製）、ＴｒｉＥｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ＢｌｕｅＢａｃ、ＣｏＢｌａｓｔ、ＤＥＳＴ、及びＦａｓｔＢａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）が挙げられる。
【００５１】
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞内で本発明の遺伝子を発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点などが挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主生物又は宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
【００５２】
具体的なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳｐｏＶＧプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Ｎａｐｉｎ遺伝子プロモーター、植物由来Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質ＶＣＰ１遺伝子のプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のプロモーター（Ａｓｔｒｉｄ  Ｖｉｅｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２；８（１１）：ｅ１００３０６４．ｄｏｉ：１０．１３７１）が挙げられる。
【００５３】
選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子（アミノ酸合成関連遺伝子等）の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００５４】
上記本発明の遺伝子を含有するベクター又はＤＮＡ断片を宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を得ることができる。該本発明の遺伝子を含むベクター又は外来ＤＮＡ断片を含有する形質転換体においては、形質転換前の宿主と比較して、上記本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現が強化される。言い換えると、該本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現量が向上する。遺伝子の発現量は該遺伝子の転写量に基づいて測定することができる。遺伝子の転写量は、定量ＰＣＲによるｍＲＮＡ量測定、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ−Ｓｅｑ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により測定することができる。
【００５５】
本発明の形質転換体の宿主となる微生物は、原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物やバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、及び糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ・エスピー（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。また、微生物としては、微細藻類も好ましい。該微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属に属する藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属に属する藻類、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属に属ずる藻類又はクロロサルシノプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属又はクロロサルシノプシス属に属する藻類がより好ましい。植物としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ナタネ、トウモロコシ、ダイズ、ココヤシ、パーム、ゴマ、クフェア又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００５６】
上記宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
【００５７】
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換体は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子であり、宿主が細胞である場合、該抗生物質添加培地で細胞を培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換体を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主細胞に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換体を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転換体のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００５８】
上記本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子を含むベクター又は外来ＤＮＡ断片を含有する形質転換体は、形質転換前（宿主）と比べて該本発明の遺伝子の発現が強化されており、これによって脂肪酸生産性が向上している。すなわち、宿主の細胞に本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子を導入したり、又は宿主の細胞が本来有する脂肪酸生産性向上遺伝子の制御領域を改変して該遺伝子の発現を強化することによって、宿主の脂肪酸生産性を向上させることができる。制御領域改変の方法は限定されないが、例えばプロモーター配列の改良やより強力なプロモーター配列との置換などを用いることができる。
【００５９】
本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現強化によって生産性が向上する脂肪酸の種類としては、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸が挙げられ、好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である。より好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸、及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である。さらに好ましくは、Ｃ１６：１（ｎ−９）脂肪酸及びＣ１８：１（ｎ−９）脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００６０】
上記本発明の形質転換体は、脂肪酸生産性が向上しているため、該形質転換体（例えば、植物、動物若しくは微生物、又はそれらの細胞若しくは組織）を栽培、飼育又は培養することにより、効率よい脂肪酸生産が可能になる。したがって、本発明はまた、上記本発明の形質転換体を栽培、飼育又は培養することを含む脂肪酸の製造方法を提供する。該方法で製造される脂肪酸種の例としては、上述した本発明の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現強化によって生産性が向上する脂肪酸種が挙げられる。
【００６１】
本発明の製造方法における形質転換体の栽培、飼育又は培養は、該形質転換体を含む微生物、植物体、動物体、又は該植物体若しくは動物体の細胞若しくは組織を栽培、飼育又は培養することを包含する。該形質転換体を栽培、飼育又は培養するための肥料、飼料、培地、及び栽培条件、飼育条件、培養条件は、該形質転換体の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、該形質転換体の宿主である植物体、動物体、微生物、又は該植物体若しくは動物体の細胞若しくは組織に対して通常用いられる肥料、飼料、培地、及び栽培条件、飼育条件、培養条件を採用することができる。
【００６２】
例えば、形質転換体が微細藻類の場合、その培養は、微細藻類の一般的な培養条件に従って行うことができる。例えば、適当な淡水用の培地中で、光照射下、微細藻類の培養に用いられる一般的培養手段により、本発明の形質転換体の培養を行うことができる。
【００６３】
例示として、微細藻類である本発明の形質転換体の培養手順を以下に説明する。しかしながら、本発明による形質転換体の培養手順は、以下に限定されるものではない。
【００６４】
培地は適宜選択することができ、具体例としてはＡＦ６培地、Ｃ培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地及びＷＡ培地が挙げられる。例えば、Ｃ培地をベースに、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類等を添加した培地を使用することができる。ここで、窒素源としては、ＮａＮＯ３、Ｃａ（ＮＯ３）２などが挙げられる。リン源としては、グリセロリン酸ナトリウムなどが挙げられる。金属塩としては、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＣｏＣｌ２などが挙げられる。ビタミン類としては、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２、Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌなどが挙げられる。好ましい培地としては、後述の実施例に示すＷＡ培地が挙げられる。培地は、オートクレーブ等により殺菌又は精密ろ過等により除菌して使用することが好ましい。
【００６５】
培地に接種する微細藻類の量は適宜設定することができる。例えば、培養培地当りの接種量は１．０〜１０．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）が好ましく、１．０〜５．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）がより好ましい。培養温度は、微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲で適宜設定することができる。例えば、一般的には１０℃以上３０℃以下が好ましく、１５℃以上２５℃以下がより好ましい。また、屋外施設において培養する場合は成り行きであってもよい。
【００６６】
微細藻類の培養では、細胞が光合成できるように、光照射をしながら培養することが好ましい。この場合の光源としては、人工光又は太陽光の何れでもよい。また、光照度は、１００ルクス以上１００，０００ルクス以下であればよく、１，０００ルクス以上５０，０００ルクス以下が好ましく、１，０００ルクス以上１０，０００ルクス以下がより好ましく、２，０００ルクス以上４，０００ルクス以下がさらに好ましい。
【００６７】
上記微細藻類の培養においては、連続して光照射を行ってもよいし、明暗周期を設定して光照射を行ってもよい。明暗周期を設定して光照射を行う場合、光照射の間隔は適宜設定することができる。例えば、２４時間の明暗周期を設定することが好ましい。具体的には、２４時間のうち、明期は好ましくは８時間以上２４時間未満、より好ましくは１０時間以上１８時間以下、さらに好ましくは１１時間以上１３時間以下、なお好ましくは１２時間である。
【００６８】
培養時の培地のｐＨは適宜設定することができ、一般的には６．５以上８．０以下であり、好ましくはｐＨ７．０以上８．０以下である。培地のｐＨは、適当な酸又は塩基を加えることにより調整することができる。培養期間は、脂肪酸を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖するよう適宜設定することが好ましい。例えば、培養期間は、好ましくは７日以上１２０日以下、より好ましくは７日以上３０日以下である。培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養であればよい。上記微細藻類の培養装置は、屋内装置及び屋内施設のいずれであってもよい。また、回分培養、半回分培養、連続培養等から任意の培養形式を選択することができる。以上のような条件から微細藻類が増殖可能な装置、施設及び培養形式を適宜選択して、微細藻類を培養することができる。
【００６９】
大腸菌を宿主とする形質転換体の培養としては、ＬＢ培地又はＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。  
【００７０】
形質転換体内において産生された脂質の単離、採取は、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、培養物や形質転換体から、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法の具体的な例としては、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００７１】
上記画分に含まれる目的の脂肪酸は、遊離脂肪酸若しくはその塩の形態、アルコールやグリセリンとのエステルの形態、又はそれらの混合物の形態であり得る。例えば、該画分は、本発明の製造方法により製造された脂肪酸を含む油脂であり、該油脂は、遊離脂肪酸若しくはその塩として、又はモノ−、ジ−若しくはトリグリセリドの構成脂肪酸として、本発明の製造方法により製造された脂肪酸を含有する。
【００７２】
上記画分からの目的の脂肪酸の分離は、常法により行うことができる。例えば、画分中の脂肪酸を脂肪酸エステルの状態とした後、尿素付加法、銀錯体法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法、超臨界クロマトグラフィー法などを行うことによって目的の脂肪酸種を分離又は精製することができる。
【００７３】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７４】
〔１〕以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる脂肪酸生産性向上遺伝子：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号２で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号６で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び、
配列番号８で示されるヌクレオチド配列、又は該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００７５】
〔２〕上記脂肪酸生産性向上遺伝子が、
好ましくは、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス由来であり；
より好ましくは、下記の（ｉ）〜（ｖｉ）の性質を有するクロロサルシノプシス・バストロピエンシスである：
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：５μｍ〜１０μｍ
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖ）コロニーの色：濃緑色（寒天を含む藻類用Ｃ培地、若しくは寒天を含むＷＡ培地上）
（ｖｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる１８Ｓ  ｒＤＮＡを有する、
〔１〕に記載の脂肪酸生産性向上遺伝子。
【００７６】
〔３〕上記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスが、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＫＳＭ−ＷＡ１５２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７９）、若しくはクロロサルシノプシス・バストロピエンシスＵＴＥＸ−Ｂ１６９８株である〔２〕に記載の脂肪酸生産性向上遺伝子。
【００７７】
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の脂肪酸生産性向上遺伝子にコードされるポリペプチド。
【００７８】
〔５〕〔４〕記載の脂肪酸生産性向上遺伝子を含むベクター。
【００７９】
〔６〕〔５〕記載のベクターを含む形質転換体。
【００８０】
〔７〕好ましくは、上記形質転換体が植物、動物、微生物、又はそれらの細胞若しくは組織である、〔６〕記載の形質転換体。
【００８１】
〔８〕上記形質転換体が微生物である、〔７〕記載の形質転換体。
【００８２】
〔９〕上記微生物が藻類又は大腸菌である、〔８〕記載の形質転換体。
【００８３】
〔１０〕〔６〕〜〔９〕のいずれか１項記載の形質転換体を栽培、飼育又は培養することを含む、脂肪酸の製造方法。
【００８４】
〔１１〕上記脂肪酸が、
好ましくはＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸であり、
より好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種であり、
なお好ましくは、Ｃ１６：１脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１０〕記載の方法。
【００８５】
〔１２〕宿主における〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の脂肪酸生産性向上遺伝子の発現を強化することを含む、該宿主の脂肪酸生産性の向上方法。
【００８６】
〔１３〕上記宿主が植物、動物、微生物、ならびにそれらの細胞及び組織からなる群より選択される、〔１２〕記載の方法。
【００８７】
〔１４〕上記宿主が微生物である、〔１３〕記載の方法。
【００８８】
〔１５〕上記微生物が藻類又は大腸菌である、〔１４〕記載の方法。
【００８９】
〔１６〕上記脂肪酸が、
好ましくはＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸であり、
より好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸、及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種であり、
なお好ましくは、Ｃ１６：１脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１２〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９１】
参考例１  クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＫＳＭ−ＷＡ１５２株
（１）形態学的性質
クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＫＳＭ−ＷＡ１５２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７９）は、下記に示す形態を有しており、藻類学における分類手法に基づいて、緑色植物門に属する微細藻類であることが推定された。ＫＳＭ−ＷＡ１５２株の顕微鏡写真を図１に示す。
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：５μｍ〜１０μｍ（培養期間が長くなると細胞のサイズも多少大きくなる
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖ）コロニーの色：濃緑色（寒天を含む藻類用Ｃ培地、若しくは寒天を含むＷＡ培地上）
【００９２】
（２）化学分類学的性質
ＫＳＭ−ＷＡ１５２株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列より、化学分類学的性質の検討を行った。ＫＳＭ−ＷＡ１５２株を単離培養した試験管から培養液５００μＬを回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｓｏｉｌ（商品名、ＭＡＣＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてプロトコールに従いゲノムＤＮＡを調製した。Ｌｉｍ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９（５），ｐ．１６４７−１６５５（１９９３）、及びＫ，Ｒｏｍａｒｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｍｏｎｏｌ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．，４９（３），ｐ．７８４−７９８（２００４）に記載の情報、並びにＮＢＲＣ  ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ社の１８Ｓ  ｒＤＮＡ情報を元にヌクレオチド配列のアライメントを行い、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子増幅用のユニバーサルプライマーのデザインを行った。各ユニバーサルプライマーのヌクレオチド配列を表１に示す。
【００９３】
【表１】
2017127278.tif 000002
【００９４】
配列番号１１及び１２のプライマーを用い、ＫＳＭ−ＷＡ１５２株のＤＮＡをテンプレートとし、１８Ｓ  ｒＤＮＡをＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のプロトコールに従いＰＣＲを行った。具体的には、９４℃にて２分間保温した後、９８℃にて１０秒間、次いで５５℃にて３０秒間、さらに６８℃にて２分間保温処理する処理を３０サイクル行った後、次操作に供するまで４℃にて保管した。ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、得られたＰＣＲ産物の精製を行った。溶出には滅菌水１００μＬを用いた。
【００９５】
ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．３．１（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と３１００ｘｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、得られたＰＣＲ産物のヌクレオチド配列の確認を行った。上記で調製したＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１３及び１４のシークエンスプライマーを用いて反応を行った。精製にはＭｏｎｔａｇｅ  ＳＥＱ９６  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた。ヌクレオチド配列の解析はＧＥＮＥＴＹＸ  ネットワーク版  Ｖｅｒ．１１．１．３（ソフトウエア開発社製）を用いた。得られたヌクレオチド配列はＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてホモロジー検索を行った。
【００９６】
得られたＫＳＭ−ＷＡ１５２株１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、遺伝子配列を指標とした分子系統解析において、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスＵＴＥＸ１６９８株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子（配列番号１０）の１７〜１６８９位の配列と１００％一致することが判明した。したがって、微細藻類の分類上の特性より得られる同定結果と同じく、単離したＫＳＭ−ＷＡ１５２株はクロロサルシノプシス・バストロピエンシスであることが確かめられた。
【００９７】
参考例２  ＫＳＭ−ＷＡ１５２株の脂肪酸生産能
ＫＳＭ−ＷＡ１５２株の培養には、表２記載のＷＡ培地を用いた。培養容器に滅菌した１００ｍＬ容三角フラスコ（ＰＹＲＥＸ（登録商標）製）と綿栓（アズワン製、商品名：ＣＳ−２８）を使用し、フィルターユニット（ナルジェヌンク製）を用いてろ過滅菌した上述のＷＡ培地５０ｍＬを三角フラスコに分注した。培地のｐＨはＮａＯＨにて７．５に調整した。予め同液体培地により継代培養していたＫＳＭ−ＷＡ１５２株の培養液１ｍＬを新しい培地に接種し、２０℃、蛍光灯下、照度３，０００ルクス、１２時間明暗条件下で２か月間静置培養した。なお、培地のｐＨはＮａＯＨにて７．５になるよう適宜調整した。培養により得られた沈殿画分を８０℃にて約３〜１６時間乾燥させ、乾燥藻体とした。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
得られた乾燥藻体の全重量を測定後、培養液２ｍＬに相当する乾燥藻体に対して内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加し、次いでクロロホルム１．０ｍＬ及びメタノール０．５ｍＬを添加して激しく攪拌後１５分間放置した。その後１．５％ＫＣｌ  ０．５ｍＬを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層約５０μＬに窒素ガスを吹き付けて乾固し、テトラヒドロフラン（和光純薬社製）５０μＬ及びナトリウムメトキシド（和光純薬社製）０．５ｍＬを添加し、３５℃で９０分恒温した。続いてイソオクタン０．４ｍＬ及び飽和食塩水０．５ｍＬを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離を行い、上層であるイソオクタン層を回収し、脂肪酸のエステル化物を含む画分を得た。
【０１００】
参考例３に示す方法により、得られた脂肪酸エステル化物を含む画分中の脂肪酸種の同定を行った。ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）分析より得られたクロマトグラムのフラグメントパターンをデータベースより検索した結果、試料に含まれる脂肪酸エステル化物の成分として９，１０−メチレンヘキサデカン酸、９，１０−メチレンオクタデカン酸、１０−ヒドロキシオクタデカン酸、９，１０−エポキシオクタデカン酸、２０−メチルヘンエイコサン酸が同定された。したがって、ＫＳＭ−ＷＡ１５２株による脂肪酸の生産を確認することができた。
【０１０１】
参考例３  脂肪酸の定量
培養物から回収した脂肪酸エステル化物を含む画分中の脂肪酸エステル化物の定量は、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）により、下記の条件で行った。
装置：６８９０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ  ２０ｍ×０．１ｍｍ×０．１μｍ
（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
移動相：高純度ヘリウム（流速０．７ｍＬ／分）
昇温プログラム：５０℃（２分）、２００℃（１２．５分）、２３０℃（１．５分）
注入口検出器温度：２５０℃
注入法：スプリットレスモード
サンプル注入量：１μＬ
キャリアガス：ヘリウム
ＭＳ測定モード：Ｓｃａｎ
溶媒待ち時間：５分
ＭＳ温度：２３０℃（イオン源）、１５０℃（四重極）
脂肪酸エステル化物中の脂肪酸種の同定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）社及びＴｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＯＣＳ）社のデータベースに記載の各種脂肪酸のマススペクトル情報を参考に行った。
【０１０２】
実施例１  ＫＳＭ−ＷＡ１５２株からの脂肪酸生産性向上遺伝子の同定
（１）ＲＮＡ抽出
下記の４株よりＲＮＡを抽出した。
（i）  ＫＳＭ−ＷＡ１５２クローン株のうち、水酸化脂肪酸生産能及びエポキシ脂肪酸生産能を有する株（２週間培養）
（ii） ＫＳＭ−ＷＡ１５２クローン株のうち、水酸化脂肪酸生産能を有する株（２週間培養）
（iii）上記（i）株の４週間培養株
（iv） 上記（ii）株の４週間培養株
（i）と（ii）で生産する脂肪酸種に違いがあることに基づいて、取得したデータのうち（i）、（ii）との遺伝子発現値の比較によりエポキシ化酵素遺伝子の同定を行った。また培養後期（４週間）には培養初期（２週間）と比較して脂肪酸の生産量が増大することから、（i）と（iii）、及び（ii）と（iv）の遺伝子発現値の比較に基づいて水酸化酵素遺伝子及びエポキシ化酵素遺伝子の同定を行った。
【０１０３】
０．５ｍｍガラスビーズ（安井器機）を少量入れた破砕用チューブに培養藻類サンプルを１ｍＬ加え、遠心集菌した（８，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）。上清を除去した後に５００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５：２４：１（Ｗａｋｏ）を添加して激しく撹拌を行い、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）して水層を回収する作業を２回行った。以降のＲＮＡ精製はＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。５０μＬの滅菌水で溶出し、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた濃度測定及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた精度確認を行った。
【０１０４】
（２）脂肪酸生産性向上遺伝子候補配列の決定
ＲＮＡ溶液２μｇをＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社高速シーケンサーＭｉｓｅｑにて解析するｄｓＤＮＡを調製した。その際、フラグメント長が２６０ｂｐになるように調整した。また、各サンプルは次に示すｉｎｄｅｘを用いてラベル化した。
（i）  :ｉｎｄｅｘＡＲ００３
（ii） :ｉｎｄｅｘＡＲ００９
（iii）:ｉｎｄｅｘＡＲ０２０
（iv） :ｉｎｄｅｘＡＲ０２１
調製した上記４つのサンプルを当量ずつ混合し、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ  ｖ３（１５０ｃｙｃｌｅ）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシーケンスを行い、ｉｎｄｅｘ別のｆａｓｔｑファイルを取得した。Ｍｉｓｅｑによるシーケンス及びデータ解析は、解析ソフトＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣバイオジャパン）を使った。
【０１０５】
ＣＬＣ解析より出力された解析データ（ｃｓｖファイル形式）にはＭｉｓｅｑより出力されたｃｏｎｔｉｇ（遺伝子数）の情報が含まれており、その情報を他生物種の既知遺伝子のデータベースと比較することで各ｃｏｎｔｉｇがどのような遺伝子であるかを推測することができる。今回のシーケンス解析により出力された２７，６８６個のｃｏｎｔｉｇ情報をＱｕｅｒｙとし、Ｓｕｂｊｅｃｔとして以下の４つのデータベースを構築した。なお解析においては各ｃｏｎｔｉｇについてＳｃｏｒｅ、ｅ−ｖａｌｕｅ、遺伝子長、同一性、データベースとの相同性を比較、また水酸化脂肪酸及びエポキシ脂肪酸を生産する株（i）又は（iii）と水酸化脂肪酸のみ生産する株（ii）又は（iv）の発現値（ＲＰＫＭ値）との比が１以上、あるいは４週間培養株（iii）又は（iv）と２週間培養株（i）又は（ii）とのＲＰＫＭ値の比が１以上のｃｏｎｔｉｇに絞り、Ｓｃｏｒｅの上位３個の配列について候補遺伝子を選抜した。
＜利用したデータベース＞
１．ＴＡＩＲデータベースに登録されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの全タンパク配列
２．ＮＣＢＩデータベースに登録されているＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａの全タンパク配列
３．ＮＣＢＩデータベースに登録されているＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの全タンパク配列
４．ＮＣＢＩデータベースに登録されている植物ｈｙｄｒａｔａｓｅの全タンパク配列
候補として選抜されたｃｏｎｔｉｇについて、ｆｏｒｗａｒｄ側、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ側それぞれについてコドンの読み枠を先頭、２つ目の塩基及び３つ目の塩基からの３パターンずつ（計６パターン）からアミノ酸配列に変換し、ＯＲＦが最も長い読み枠のアミノ酸配列を脂肪酸生産性向上遺伝子の候補配列として決定した。結果、８つのｃｏｎｔｉｇ（遺伝子）（Ａ）〜（Ｈ）が選抜された（表３）。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
（３）候補遺伝子による脂肪酸生産性向上機能の確認
上記（２）で選抜した８つの候補遺伝子（Ａ）〜（Ｈ）をＫＳＭ−ＷＡ１５２株より単離した。上記（１）と同様の手順でＫＳＭ−ＷＡ１５２株からＲＮＡ溶液を調製した。該ＲＮＡ溶液から、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。なお、逆転写のプライマーにはｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を使用し、下記ＰＣＲ用の鋳型となるｃＤＮＡを調製した。
【０１０８】
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表４〜５（ａ）に示すプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、各候補遺伝子の断片を調製した。なお、ポリメラーゼにはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、［９４℃  １ｍｉｎ→（９８℃  １０ｓｅｃ  →  ６０℃  １５ｓｅｃ  →  ６８℃  ３０ｓｅｃ）×  ２５ｃｙｃｌｅｓ  →  ４℃］で反応を行った。また、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を鋳型とし、表４〜５（ｂ）に示すプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、各候補遺伝子用のプラスミドベクターを増幅し、次いでＤｐｎＩ（ＴａＫａＲａ）処理によりベクター消化を行った。候補遺伝子及びプラスミドベクターのＰＣＲ断片を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて精製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて各候補遺伝子とプラスミドベクターの断片の融合を行い、得られた候補遺伝子発現用プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（ＴａＫａＲａ）に形質転換した。表５記載のチェック用プライマー対を用いて、細胞内に目的のプラスミドが構築されていることをシーケンス及びバンドサイズにて確認した後に、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（Ｗａｋｏ）２ｍＬにて細胞を一晩培養し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてプラスミド抽出を行った。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
抽出した各候補遺伝子発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ２７株（ｆａｄＤ-）に導入した。得られた８種の形質転換体をＬＢ培地（アンピシリン含有）で３７℃にて１６〜２４時間前培養した後に、２ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）（５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン含有）に２０μＬ植菌し、３０℃にて１６〜２４時間培養した。培養液１ｍＬをサンプリングし、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加後、クロロホルム０．５ｍＬ及びメタノール１．０ｍＬ、２Ｎ  ＨＣｌ  ０．０１ｍＬを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後１．５％ＫＣｌ  ０．５ｍＬ及びクロロホルム０．５ｍＬを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層約５０μＬに窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ  ＫＯＨ  ０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１４％三フッ化ホウ素メタノール１．０ｍＬを添加し、８０℃で１０分恒温した。ヘキサン１．０ｍＬ及び飽和食塩水１．０ｍＬを添加して攪拌後、３０分放置した。３０００ｒｐｍ、５分遠心分離を行い、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸画分を得、参考例３の方法に従い脂肪酸定量及び脂肪酸種解析を行った。
【０１１２】
ＧＣ／ＭＳ（ＥＩ）分析より得られたクロマトグラムの各フラグメントパターンをデータベースより検索した結果、試料に含まれる成分として、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、９−ヘキサデカン酸（Ｃ１６：１（ｎ−９））、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１（ｎ−９））が同定された。したがって、遺伝子（Ａ）〜（Ｈ）の発現が、形質転換体の脂肪酸生産に寄与していることが確認された。
【０１１３】
ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、９−ヘキサデカン酸（Ｃ１６：１（ｎ−９））、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１（ｎ−９））について、遺伝子（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかを導入した形質転換体と遺伝子非導入宿主（対照）とで生産性を比較した。参考例３の方法に従って形質転換体と対照における各種脂肪酸種生産量を定量し、対照の生産量を１００％としたときの形質転換体の生産量を算出した。その結果、遺伝子（Ａ）〜（Ｈ）導入細胞では、上記脂肪酸種のいずれかの生産量が１２０％以上増大することが分かった（表６）。したがって、遺伝子（Ａ）〜（Ｈ）の発現により、形質転換体の脂肪酸生産性が遺伝子非導入宿主に対して向上することが確認された。
【０１１４】
【表６】
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【図１】
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【配列表】
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