(57)【要約】      （修正有）【課題】増加したＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の存在と関連した疾患状態の治療方法の及びＥｒｂＢ４活性化因子を含む組成物の提供。【解決手段】ＥｒｂＢ４活性化因子としてニューレグリン−４の有効量の投与。該疾患状態としては、炎症性腸疾患、壊死性大腸炎、急性肺損傷、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、放射線療法誘発性の腸障害、Ｉ型糖尿病、ＮＡＳＨ、胃腸炎又は尿路感染症のうちのいずれか１つ又は複数。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象での、増加したＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の存在と関連した疾患状態の治療方法であって、
ａ．ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、
ｂ．該対象の疾患状態を治療するために治療有効量の該活性化因子を該対象に投与することと
を含む、前記治療方法。
【請求項２】
前記疾患状態が、炎症性腸疾患、壊死性大腸炎、急性肺損傷、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、放射線療法誘発性の腸障害、Ｉ型糖尿病、ＮＡＳＨ、胃腸炎または尿路感染症のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、ＩＢＤと診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、急性肺損傷と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、壊死性腸炎と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ＥｒｂＢ４の直接的な活性化因子または間接的な活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、小分子、ポリペチド、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、経口的に、吸入によって、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、浣腸によってまたは吸入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子の有効量が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子の有効量が、約０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２〜０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０〜２５ｍｇ／ｋｇ、２５〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０〜３５ｍｇ／ｋｇ、３５〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０〜４５ｍｇ／ｋｇ、４５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１１００ｍｇ／ｋｇ、１１００〜１２００ｍｇ／ｋｇ、１２００〜１３００ｍｇ／ｋｇ、１３００〜１４００ｍｇ／ｋｇ、１４００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜１６００ｍｇ／ｋｇ、１６００〜１７００ｍｇ／ｋｇ、１７００〜１８００ｍｇ／ｋｇ、１８００〜１９００ｍｇ／ｋｇ、１９００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、２０００〜２１００ｍｇ／ｋｇ、２１００〜２２００ｍｇ／ｋｇ、２２００〜２３００ｍｇ／ｋｇ、２３００〜２４００ｍｇ／ｋｇ、２４００〜２５００ｍｇ／ｋｇ、２５００〜２６００ｍｇ／ｋｇ、２６００〜２７００ｍｇ／ｋｇ、２７００〜２８００ｍｇ／ｋｇ、２８００〜２９００ｍｇ／ｋｇまたは２９００〜３０００ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥｒｂＢ４＋マクロファージ数の増加が、基準値と比較した増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記基準値が、通常の対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基準値が、疾患状態であると診断されかつ治療に成功した対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象のＩＢＤを治療するための医薬組成物であって、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１７】
ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象の壊死性大腸炎を治療するための医薬組成物であって、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１８】
ＥｒｂＢ４活性化因子を含む、急性肺損傷、ＣＯＰＤ、１型糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である、請求項１６、１７または１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた、認可番号ＤＫ０９５００４の下の政府支援で行われた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＥｒｂＢ４活性化因子を使用して、それを必要とする対象での、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加と関連する疾患状態を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の全ての刊行物は、個別の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれた場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。以下の記述は、本発明の理解に有用となり得る情報を含む。これは、本明細書で提供されるいかなる情報も、先行技術である若しくは現在特許請求されている発明に関連する、または具体的若しくは黙示的に参照される、いかなる刊行物も先行技術であると認めるものではない。
【０００４】
ＥｒｂＢ４は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２及びＥｒｂＢ３も含まれる受容体チロシンキナーゼファミリーのうち、最も解明されていないメンバーである（非特許文献１）。ＥｒｂＢは、へパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベタセルリン及びヘレグリン／ニューレグリンファミリーを含む一連のリガンドを認識して、それにより活性化される（非特許文献２）。リガンドの結合に伴って、受容体の二量体化、チロシンキナーゼ活性の増加及びＣ末端チロシン残基上での自己リン酸化が発生し、次いで下流エフェクターに対するドッキング部位が与えられる（非特許文献３）。種々のリガンドは、それぞれ異なるＥｒｂＢ受容体に対して異なった特異性及び親和性を示し、多様な二量体化パターン、シグナル伝達及び細胞応答を刺激する（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
ＥｒｂＢ４は、他のチロシンキナーゼと自己を区別するいくつかの特徴を有しており、ヒト疾患でのシグナル伝達及び潜在的役割の両面で固有な標的となっている。ＥｒｂＢ４は、ヘレグリン／ニューレグリン増殖因子及びＥＧＦファミリー因子のサブセットのいずれにも結合し得る（非特許文献６）が、少なくとも１つのペプチドリガンド（ＮＲＧ４）は、ＥｒｂＢ４と排他的関係にあり、ＥｒｂＢ１〜３とは結合しない（非特許文献７）。更に、ＥｒｂＢ４は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３よりも、多様かつ限定性の高い部位であるＳＨ２を含む標的と結合する（非特許文献８）。したがって、ＮＲＧ４による選択的なＥｒｂＢ４活性化は、他のＥＧＦ様分子またはヘレグリンファミリー分子による刺激とは異なる細胞事象を誘発する場合がある。
【０００６】
ＥｒｂＢ４は、炎症性サイトカインによって結腸上皮細胞に誘発され、ＩＢＤ患者の炎症した結腸粘膜中に高レベルで存在する（非特許文献９）。これは、ＥｒｂＢ４の異所性過剰発現が、培養されたマウス結腸上皮細胞をリガンド依存的な方法でサイトカイン誘発性アポトーシスから保護するため、病理学的プロセスというよりもむしろ代償性の保護反応であると思われる（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。しかしながら、これらの研究は、ＥｒｂＢ４機能に関する大部分の研究と同様に、共有性ＥｒｂＢリガンドのヘレグリン（ＨＲＧ）−１βまたはＨＢ−ＥＧＦを使用したものであり、シグナル特異性の問題を引き起こした。
【０００７】
上記のように、ＥｒｂＢ４受容体チロシンキナーゼは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの疾患時に結腸上皮に誘発され、ＥｒｂＢ４に特異的なリガンドであるニューレグリン−４は腸炎モデルマウスにおいて保護性を示す。興味深いことに、炎症時に免疫細胞が集まる粘膜下基質にもＥｒｂＢ４は顕著に検出可能である。従来の研究では、循環しているヒト単球及びニューロンマクロファージ（Ｍφ）でのＥｒｂＢ４の発現が示されたが、例えば、腸管Ｍφ、肺胞Ｍφ、心筋内Ｍφ、肝Ｍφなどでの発現及びＭφの生物学的役割は未知である。Ｍφは疾患の発生に重要な役割を果たすことから、本発明者らは、受容体媒介性のＥｒｂＢ４シグナル伝達が、炎症時のＭφ数を制限する抗炎症機構であり得るという仮説を立てた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wieduwilt, M. J., and Moasser, M. M. (2008) Cellular and molecular life sciences: CMLS 65, 1566-1584
【非特許文献２】Wilson, K. J., et al., 2nd. (2009) Pharmacology & therapeutics 122, 1-8
【非特許文献３】Bublil, E. M., and Yarden, Y. (2007) Current opinion in cell biology 19, 124-134
【非特許文献４】Saito, T. et al. (2004) Endocrinology 145, 4232-4243
【非特許文献５】Sweeney, C. et al., 3rd. (2000) J Biol Chem 275, 19803-19807
【非特許文献６】Jones, J. T., et al. (1999) FEBS letters 447, 227-231
【非特許文献７】Harari, D., et al. (1999) Oncogene 18, 2681-2689
【非特許文献８】Kaushansky, A., et al. (2008) Chem Biol 15, 808-817
【非特許文献９】Frey, M. R., et al. (2009) Gastroenterology 136, 217-226
【非特許文献１０】Hilliard, V. C., et al. (2011) American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology 301, G338-346
【非特許文献１１】Frey, M. R., et al. (2010) Laboratory Investigation 90, 1415-1424
【発明の概要】
【０００９】
ＥｒｂＢ４は、その活性化因子であるニューレグリン−４の存在下で、古典的シグナル伝達を呈し、上皮細胞の生存、上皮細胞の増殖、上皮細胞の運動性及び上皮細胞完全性の維持を促進する。本明細書に記載するように、本発明者らは、活性化ＥｒｂＢ４が炎症性マクロファージにおいて全く固有の役割を果たすことを確認した。具体的には、炎症性状態を招くマクロファージの分化が、マクロファージ上でのＥｒｂＢ４の発現を誘発し、後続のＥｒｂＢ４活性化がこれらの細胞のアポトーシスを促進する。ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスの促進に活性化ＥｒｂＢ４が果たす、この役割は、これまでに記載事例がなく、予想外なものである。ＮＲＧ−４が腸上皮細胞のアポトーシスを阻止するという以前の発見（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＪＫら，（２０１２）．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−４  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（４７）：３９８５０−８）に基づくと、これは全く予測されていない。したがって、本明細書では、ＥｒｂＢ４における活性化因子（例えばニューレグリン−４）を用いた、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加と関連する疾患状態の治療方法を提供する。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加が見られることと関連した疾患状態の治療方法である。本方法は、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、疾患状態を治療するために治療有効量の活性化因子を対象に投与することとを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、炎症性マクロファージは、Ｍ１マクロファージであり、ＥｒｂＢ４＋である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、疾患状態は、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、急性肺損傷、肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、尿路感染症、胃腸炎、放射線療法誘発性の腸障害またはＩ型糖尿病である。
【００１３】
一実施形態では、対象は、基準値と比較してＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージの数が増加している。
【００１４】
別の実施形態では、対象は、基準値と比較してＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加しており、ＩＢＤと診断されている。
【００１５】
更に別の実施形態では、対象は、基準値と比較してＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加しており、壊死性大腸炎と診断されている。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ＥｒｂＢ４の直接の活性化因子または間接的な活性化因子である。例示的実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、小分子、ポリペチド、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。
【００１７】
本明細書では、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された対象でのＩＢＤの治療方法であり、該対象のＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している場合の治療方法も提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、ＩＢＤを治療するために治療的有効量の活性化因子を対象に投与することとを含む。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子はニューレグリン−４である。一実施形態では、炎症性マクロファージは、Ｍ１マクロファージであり、ＥｒｂＢ４＋である。
【００１８】
本明細書では、壊死性腸炎（ＮＥＣ）と診断された対象でのＮＥＣの治療方法であり、該対象のＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している場合の治療方法も提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、対象のＮＥＣを治療するために治療的有効量の活性化因子を対象に投与することとを含む。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子はニューレグリン−４である。一実施形態では、炎症性マクロファージは、Ｍ１マクロファージであり、ＥｒｂＢ４＋である。
【００１９】
本明細書では、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された対象でのＩＢＤの治療方法であり、該対象のＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している場合の治療方法も提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、対象のＩＢＤを治療するために治療的有効量の活性化因子を対象に投与することとを含む。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子はニューレグリン−４である。一実施形態では、炎症性マクロファージは、Ｍ１マクロファージであり、ＥｒｂＢ４＋である。
【００２０】
本明細書では、急性肺損傷と診断された対象での急性肺損傷の治療方法であり、該対象のＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している場合の治療方法も提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、対象の急性肺損傷を治療するために治療的有効量の活性化因子を対象に投与することとを含む。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子はニューレグリン−４である。一実施形態では、炎症性マクロファージは、Ｍ１マクロファージであり、ＥｒｂＢ４＋である。
【００２１】
各種実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、浣腸によってまたは吸入によって投与される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子の有効量は、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量である。有効量は、当業者に明らかであろう。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４＋マクロファージ数の増加は、基準値と比較した増加である。一実施形態では、基準値は、通常の（即ち、健常な、または対照となる）対象におけるＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージの平均数または中央数である。別の実施形態では、基準値は、疾患状態であると診断され、治療に成功した対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である。各種実施形態では、成功した治療には、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％のうちいずれかの症状改善を含む。
【００２３】
本明細書では、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象のＩＢＤを治療するための医薬組成物も提供される。組成物は、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む。
【００２４】
更に本明細書では、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象の壊死性腸炎を治療するための医薬組成物を提供する。組成物は、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む。
【００２５】
本明細書では、急性肺損傷、ＣＯＰＤ、１型糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物も提供される。組成物は、ＥｒｂＢ４の活性化因子を含む。
【００２６】
本明細書で提供される医薬組成物の各種実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。
【００２７】
本明細書では、それを必要とする対象のＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数を減少させるための薬剤も提供される。薬剤は、有効量のＥｒｂＢ４活性化因子を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはニューレグリン−４類似体またはニューレグリン−４模倣体である。
【００２８】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］
治療を必要とする対象での、増加したＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の存在と関連した疾患状態の治療方法であって、
ａ．ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、
ｂ．該対象の疾患状態を治療するために治療有効量の該活性化因子を該対象に投与することと
を含む、前記治療方法；
［２］
前記疾患状態が、炎症性腸疾患、壊死性大腸炎、急性肺損傷、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、放射線療法誘発性の腸障害、Ｉ型糖尿病、ＮＡＳＨ、胃腸炎または尿路感染症のうちのいずれか１つまたは複数である、［１］に記載の方法；
［３］
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、ＩＢＤと診断されている、［１］に記載の方法；
［４］
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、急性肺損傷と診断されている、［１］に記載の方法；
［５］
前記対象が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数の増加を有しており、壊死性腸炎と診断されている、［１］に記載の方法；
［６］
炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、［３］に記載の方法；
［７］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ＥｒｂＢ４の直接的な活性化因子または間接的な活性化因子である、［１］に記載の方法；
［８］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、小分子、ポリペチド、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される、［６］に記載の方法；
［９］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である、［７］に記載の方法；
［１０］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、経口的に、吸入によって、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、浣腸によってまたは吸入によって投与される、［１］に記載の方法；
［１１］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子の有効量が、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量である、［１］に記載の方法；
［１２］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子の有効量が、約０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２〜０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０〜２５ｍｇ／ｋｇ、２５〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０〜３５ｍｇ／ｋｇ、３５〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０〜４５ｍｇ／ｋｇ、４５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１１００ｍｇ／ｋｇ、１１００〜１２００ｍｇ／ｋｇ、１２００〜１３００ｍｇ／ｋｇ、１３００〜１４００ｍｇ／ｋｇ、１４００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜１６００ｍｇ／ｋｇ、１６００〜１７００ｍｇ／ｋｇ、１７００〜１８００ｍｇ／ｋｇ、１８００〜１９００ｍｇ／ｋｇ、１９００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、２０００〜２１００ｍｇ／ｋｇ、２１００〜２２００ｍｇ／ｋｇ、２２００〜２３００ｍｇ／ｋｇ、２３００〜２４００ｍｇ／ｋｇ、２４００〜２５００ｍｇ／ｋｇ、２５００〜２６００ｍｇ／ｋｇ、２６００〜２７００ｍｇ／ｋｇ、２７００〜２８００ｍｇ／ｋｇ、２８００〜２９００ｍｇ／ｋｇまたは２９００〜３０００ｍｇ／ｋｇである、［１］に記載の方法；
［１３］
ＥｒｂＢ４＋マクロファージ数の増加が、基準値と比較した増加である、［１］に記載の方法；
［１４］
前記基準値が、通常の対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である、［１３］に記載の方法；
［１５］
前記基準値が、疾患状態であると診断されかつ治療に成功した対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である、［１３］に記載の方法；
［１６］
ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象のＩＢＤを治療するための医薬組成物であって、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む、前記医薬組成物；
［１７］
ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ数が増加している対象の壊死性大腸炎を治療するための医薬組成物であって、ＥｒｂＢ４活性化因子を、ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発する量で含む、前記医薬組成物；
［１８］
ＥｒｂＢ４活性化因子を含む、急性肺損傷、ＣＯＰＤ、１型糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬組成物；ならびに
［１９］
前記ＥｒｂＢ４活性化因子が、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である、［１６］、［１７］または［１８］に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図を参照して例示的実施形態を示す。本明細書で開示される実施形態及び図は、限定的なものではなく例示的なものと見なされることを意図する。
【００３０】
【図１−１】本発明の実施形態に従って、マクロファージの炎症性活性化がインビトロでＥｒｂＢ４の発現を誘発することを表す。（図１Ａ）ＩＦＮγ／ＬＰＳにより古典的活性化されたＢＭＤＭ、（図１Ｂ）ＩＬ−４により代替的活性化されたＢＭＤＭ、（図１Ｃ）ＩＦＮγ／ＬＰＳにより活性化されたＢＭＤＣ、（図１Ｄ）ＬＰＳにより活性化された好中球に関して、刺激後６時間の、ＥｒｂＢファミリーメンバーのＲＮＡ発現を判定した。Ａ〜Ｄの場合、群あたりｎ＝４〜６の独立した実験である。ＮＤは検出不能である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０である。
【図１−２】本発明の実施形態に従って、マクロファージの炎症性活性化がインビトロでＥｒｂＢ４の発現を誘発することを表す。（図１Ｅ）一次抗体に対するブロッキングペプチドあり、またはなしでの、ＥｒｂＢ４（赤）、細胞核（青）を示すＢＭＤＭの免疫蛍光染色（３回の独立した実験の代表）である。（図１Ｆ）刺激なし（ナイーブ）または２４時間の古典的活性化（Ｍ１）後の、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４（全長、ＦＬ：細胞内ドメイン、４ＩＣＤ）のウエスタンブロット。ｎ＝４の独立した実験からの代表的ブロット。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０である。
【図２】本発明の実施形態に従って、補充されたマクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発されることを表す。
【図３】本発明の実施形態に従って、ＮＲＧ４がＭ１刺激性マクロファージのアポトーシスを誘発することを表す。
【図４】本発明の実施形態に従って、ＤＳＳ大腸炎ではＮＲＧ４が消失することを表す。
【図５】本発明の実施形態に従って、ＬｙｓＭ／ＥｒｂＢ４ＦＦマウスがＤＳＳによって大幅に体重減少することを表す。
【図６】本発明の実施形態に従って、マクロファージ流入中のＮＲＧ４治療が大腸炎を改善することを表す。
【図７】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４を発現するマクロファージが呼吸炎症に存在することを表す。
【図８】本発明の実施形態に従って、ＮＲＧ４がマウスの炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発することを表す。（図８Ａ）古典的活性化（Ｍ１）または代替的活性化（Ｍ２）されたＢＭＤＭをＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間処理し、レサズリンベースの細胞滴定アッセイによって分析し、対照と比較して細胞数を評価した。（図８Ｂ）古典的活性化されたＢＭＤＭを２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ４中和抗体（Ｅ４ＢＡ）あり、またはなしで３０分間、事前培養し、ＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）あり、またはなしで４８時間処理したものを染色して、切断されたカスパーゼ−３を検出した。ＴＭは培養液の透射光イメージである。（図８Ｃ）古典的活性化されたＢＭＤＭをＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間処理したものをアネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色して、フローサイトメトリーにより分析し、アポトーシス細胞を測定した。各パネルはｎ＝３〜６の独立した実験である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図９Ａ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。リガンド結合後のマクロファージ内での潜在的ＥｒｂＢ４シグナル伝達の図解モデル。段階１）ＡＤＡＭ１７による細胞外受容体の切断、段階２）γ−セクレターゼによる細胞内切断及びＥｒｂＢ４細胞内ドメイン（４ＩＣＤ）の生成、段階３）活性シグナル伝達断片４ＩＣＤの種々の細胞内区画への遊走。
【図９Ｂ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。古典的活性化されたＢＭＤＭをメタロプロテアーゼ阻害剤（ＧＭ６００１、１０μＭ）、γ−セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、１０μＭ）またはＡＤＡＭ１７阻害剤（ＧＷ２８０２６４Ｘ、３μＭ）、続いて１００ｎｇ／ｍＬのＮＲＧ４及び１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳにて１時間、前処理した。細胞生存率は、レサズリンベースの細胞滴定アッセイによって分析した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図９Ｃ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。ＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）あり、またはなしで４８時間、処理され、古典的活性化されたＢＭＤＭのミトコンドリアに局在化するＥｒｂＢ４の免疫蛍光分析。矢印は、ＥｒｂＢ４／ミトコンドリアの重なり合う代表的な細胞を指している。ｎ＝４の独立した実験である。
【図１０Ａ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。ヒト単球由来マクロファージは、非分化（Ｍ０）、古典的活性化（Ｍ１）または代替的活性化（Ｍ２）状態であり（ｎ＝８ドナー）、指定された時点で収集し、フローサイトメトリーによってＥｒｂＢ４の発現を染色／分析した。タンパク質発現の代表的フロープロット及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。古典的活性化ヒトマクロファージ（ｎ＝８ドナー）に、ＥｒｂＢ４のｓｉＲＮＡをトランフェクトし、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳに、指定された濃度のＮＲＧ４を添加して４８時間処理し、アネキシンＶ染色をアポトーシス（ｎ＝８ドナー）の尺度としてフローサイトメトリーにより分析した。ＮＲＧ４の治療は、ＥｒｂＢ４の発現のピークで、Ｍ１分化後７２時間に開始した。ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた未処理細胞または指定のような細胞と比較して、有意性を算出した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１０Ｃ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。ＥｒｂＢ４ノックダウンを、フローサイトメトリーによって検証した（ｎ＝８ドナー）。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１１】本発明の実施形態に従って、ＤＳＳ大腸炎時に、ＥｒｂＢ４が誘発され、Ｌｙ６Ｃ＋マクロファージに発現することを表す。（図１１Ａ）ＤＳＳ大腸炎に罹患させたマウスからの結腸粘膜をフローサイトメトリーにより分析し、ＥｒｂＢ４＋である細胞の比率を測定した。ＤＳＳを与えなかったマウス（水）、４日間の３％ＤＳＳ後のマウス（損傷期）及び４日間の３％ＤＳＳ後、３日間はＤＳＳなしのマウス（炎症期）について、ＥｒｂＢ４＋集団の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（図１１Ｂ）指定された時点での総粘膜細胞質の比率による、Ｆ４／８０＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの分析。（図１１Ｃ）Ｌｙ６Ｃ＋／ＥｒｂＢ４＋及びＬｙ６Ｃ−／ＥｒｂＢ４＋集団を分析した。図全体で、群当たりｎ＝９〜１０マウス、３件の独立したＤＳＳ大腸炎実験による。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図１２−１】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４リガンドであるＮＲＧ４の投与が炎症を改善し、結腸マクロファージ数を減少させることを表す。（図１２Ａ）急性ＤＳＳ大腸炎に罹患したマウスからの結腸ホモジェネートの炎症性サイトカインレベルを、ｑＰＣＲによって分析した。（図１２Ｂ）ＮＲＧ４及び各サイトカインの発現に対する、補正値、ｒ値及びｐ値である。３件の独立した実験における、条件当たりｎ＝１０マウスであった。（図１２Ｃ）全てのマウスでのＮＲＧ４とＴＮＦの相対レベル間の補正プロット。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４である。
【図１２−２】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４リガンドであるＮＲＧ４の投与が炎症を改善し、結腸マクロファージ数を減少させることを表す。（図１２Ｄ）４日間、３％のＤＳＳを飲料水で与えた後、ＤＳＳを除外し、毎日ＮＲＧ４（１００μｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を投与したマウスの体重を毎日記録した。（図１２Ｅ）７日目に、マクロファージ関連の炎症性サイトカインのレベルについて、結腸ホモジェネートをｑＰＣＲにより分析した。（図１２Ｆ）大腸炎のパラメータを７日目に測定し、（図１２Ｇ）結腸単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーによりＦ４／８０ＨＩ／ＣＤ１１ｂＨＩマクロファージレベルについて分析し、定量化した（Ｈ）。群当たりｎ＝１０マウスであった。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本明細書で言及された参考文献は全て、完全に記載された場合と同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。Ａｌｌｅｎら，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）、Ｈｏｒｎｙａｋら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００８）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３版，改訂版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）、及びＧｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、当業者にとって本出願で使用する多くの用語の一般的な便覧となる。抗体の調製方法の参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）、Ｋoｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９、Ｑｕｅｅｎ及びＳｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６年１２月）、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。
【００３２】
小児科学については、Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｔｈｅ  ５−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔ  ４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，（Ｊｕｎｅ  １６，２００５）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｌａｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｏｕｓｅ  Ｏｆｆｉｃｅｒｓ  １７版，Ｍｏｓｂｙ（Ｊｕｎｅ  ２４，２００５）、及びＨａｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）１８版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００６）を参照されたい。
【００３３】
当業者は、本明細書に記載するものと類似した、または同等である多くの方法及び材料を承知しており、これらを本発明の実施に使用し得る。事実、本発明は、いかなる場合も記載されている方法及び材料に限定されない。本発明の目的では、以下の用語は次のように定義される。
【００３４】
別段の指定のない限り、本出願の特定の実施形態を記述する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示対象は、単数及び複数の両方に適用されると見なすことができる。本明細書の値の範囲の記述は、単にその範囲内に当てはまる各独立した値を個別に参照する簡便な方法として提供されるものである。本明細書で特に指示しない限り、各単一値はそれが本明細書に個別に記述された場合と同様に本明細書に組み込まれる。本明細書に記載する全ての方法は、本明細書で特に指定されない限り、または特に文脈上の明確な矛盾がない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関して示される、全ての例または例示的な語（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、単に本出願を詳細に解明することを目的としており、別途特許請求の範囲に記載されない限り、本出願の範囲を限定するものではない。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ」に由来しており、非限定的実施例を示すために、本明細書で使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は用語「ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ」と同義である。本明細書のいかなる語も、特許請求の範囲に記載されていない任意の要素が本出願の実施に必須であることを示すものと解釈すべきではない。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、ある実施形態に有用である組成物、方法及びその対応する成分に関して使用されるが、有用であるかどうかを問わず、指定されていない要素も包含する余地がある。一般に本明細書で使用される用語は、通常「開放的」用語であること（例えば、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は「を含んでいるが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「ｈａｖｉｎｇ」は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」は「含むが、限定されない」と解釈されるべきであるなど）を意図することを当業者は理解されよう。
【００３６】
「有益な結果」は、病状の重症度の軽減または緩和、病状の悪化防止、病状の治癒、病状の発生予防、患者が病状を発症する確率の低減、及び患者の生命または余命の延長を含み得るが、決してこれらに限定されない。有益なまたは望ましい臨床結果として、１つ以上の症状の緩和、欠損範囲の減少、疾患進行状態の安定化（即ち、悪化させない）、転移または侵襲性の遅延化または緩徐化、及び疾患に伴う症状の改善または緩和が挙げられるが、これらに限定されない。治療には、治療を受けていない対象と比較した、対象の死亡率減少または寿命延長も含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」は本明細書で開示する薬剤を、所望する部位に少なくとも部分的に薬剤を局在化させる方法または経路で、対象に配置することを指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「試料」または「生体試料」は、生物学的生体から取得または分離された試料、例えば、対象から得た体液試料を意味する。例示的な生体試料としては、口腔粘膜細胞、粘液、全血、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、リンパ液、糞便抽出物、痰、その他の体液若しくは生体流体、細胞試料、組織試料、腫瘍試料、及び／または腫瘍生検などが挙げられるが、これらに限定されない。この用語には、上述の試料の混合物も含まれる。用語「試料」には、未処理の、または前処理された（若しくは事前に処理された）生体試料も含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、対象から得た１種以上の細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は腫瘍細胞の試料であり得、例えば、試料は癌細胞、腫瘍からの細胞及び／または腫瘍生検を含み得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「対象」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル及びマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、家ネコなどのネコ科動物、及びイヌ、キツネ、オオカミなどのイヌ科動物が挙げられる。用語「患者」、「個体」及び「対象」は、本明細書で同義に用いられる。一実施形態では、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書に記載の方法を用いて、家畜化された動物及び／またはペットを治療することができる。
【００４０】
対象とは、モニタリングを必要とする疾患状態（例えば、癌または感染症）またはこのような疾患状態に関連する１つ以上の合併症を罹患しているまたは有していると以前に診断または同定されたもの、及び場合によって疾患状態または疾患／病状に関連する１つ以上の合併症の治療を既に実施しているものであり得る。あるいは、対象は、疾患状態または疾患／症状に関連する１つ以上の合併症を有すると以前に診断されなかった対象でもあり得る。例えば、対象は、疾患状態または疾患状態に関連した１つ以上の合併症に対する１つ以上の危険因子を呈している対象、または危険因子を呈していない対象であり得る。特定の疾患状態の治療を「必要とする対象」は、その疾患／病状を有する対象、その症状、またはその疾患を発症する危険性を有すると診断された対象であり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、本明細書で開示する１つ以上のペプチド、またはその突然変異体、変異体、類似体若しくは誘導体を含む医薬組成物が、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減するための量を指し、所望の効果を提供するのに十分な薬学的組成物の量を言う。本明細書で使用される場合、用語「治療的有効量」は、いかなる医療的処置にも適用できる妥当なベネフィット／リスク比で障害を治療するための組成物の十分量を意味する。
【００４２】
治療的にまたは予防的に有意な症状の軽減とは、対照または未処置の対象、またはＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）の投与前の対象の状態と比較して、測定されたパラメータが、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％またはそれ以上である。測定された、または測定可能なパラメータには、疾患を臨床的に検出可能なマーカー、例えば、レベルの上昇または低下を示す生物学的マーカー、ならびに臨床的に許容された、線維症及び／または炎症についての症状の尺度またはマーカーに関連するパラメータを含む。ただし、本明細書で開示される組成物及び製剤の合計の一日用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。必要とされる厳密な量は、治療される疾患の種類、対象の性別、年齢及び体重などの要因に応じて異なる。
【００４３】
本発明で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」または「改善」は、治療的処置を指し、疾患または障害に伴う病状の進行または重症度を後退、緩和、改善、阻害、緩徐化または停止することを目的とするものである。用語「治療すること」には、（肝臓または肺の）線維症、ＩＢＤ、急性肝損傷、ＣＯＰＤ、アテローム性動脈硬化症、放射線療法誘発性の腸障害または糖尿病などの病状、疾患または障害の少なくとも１つの有害事象または症状を軽減または緩和することを含む。治療は通常、１つ以上の症状または臨床マーカーが低下する場合に「有効」である。あるいは、治療は疾患の進行が減少するまたは停止する場合に「有効」である。即ち、「治療」には、単に症状またはマーカーの改善にとどまらず、治療をしない場合に予測される症状の進行または悪化を少なくとも緩徐化する停止も含む。有益な、または望ましい臨床結果としては、検出可能な、または検出不可能な、１つ以上の症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患状態の安定化（即ち、悪化しない）、疾患の進行の遅延化または緩徐化、疾患状態の遅延化または一時的緩和、及び（部分的または完全な）改善などが挙げられるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語はまた、（一時的緩和療法を含めた）疾患の症状または副作用の軽減をもたらすことも含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「炎症性腸疾患」または「ＩＢＤ」は、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性の病状を指すが、これらに限定されない。ＩＢＤに加えて、ＥｒｂＢ４活性化因子（ニューレグリン−４など）によって標的となり得る腸の炎症性病状として、壊死性腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、転換大腸炎、ベーチェット病、胃腸炎及び分類不能大腸炎が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＥｒｂＢ４＋炎症性マクロファージ」は、ＥｒｂＢ４を発現する炎症性マクロファージを指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ＥｒｂＢ４＋マクロファージ」マクロファージは、ＥｒｂＢ４を発現し、炎症性マクロファージであるマクロファージを指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「薬剤」とは、医薬組成物または組成物を指す。
【００４８】
長期にわたる炎症を防止するためには、攻撃対象の消散後に組織から炎症性マクロファージが有効にクリアランスされることが重要である。クリアランスの不良は、炎症性腸疾患などの病状の一因となり得るため、治療的な標的であり得る。しかしながら、炎症性マクロファージの終結を誘発するシグナル伝達経路の規定は不完全である。本発明者らは、以前はマクロファージ生物学上の役割が未知であった、ＥｒｂＢ４受容体チロシンキナーゼが、この過程に関与するかどうかを試験した。インビトロでは、培養マウス及びヒトマクロファージの炎症性活性化は、ＥｒｂＢ４の発現を誘発したが、対照的に、他のファミリーメンバーのＥｒｂＢは、炎症性細胞内に誘発されず、それ以外の自然免疫系統（樹状細胞、好中球）は検出可能なレベルのＥｒｂＢ４を発現しなかった。ＥｒｂＢ４リガンドであるニューレグリン−４（ＮＲＧ４）を用いた、活性化された炎症性マクロファージの治療は、アポトーシスを誘発した。ＥｒｂＢ４は炎症性細胞内のミトコンドリアに局在化し、アポトーシスはＥｒｂＢ４細胞内ドメインの切断断片を産生するプロテアーゼに依存した。このことは、この断片及びミトコンドリア経路のアポトーシスが必要であることを示唆した。インビボでは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの実験的なＤＳＳ大腸炎の間、ＥｒｂＢ４が炎症性マクロファージに高度に発現した。このモデルの活動性炎症はＮＲＧ４の発現を抑制した。このことから、マクロファージが持続し炎症が続いている可能性がある。大腸炎時の外因性ＮＲＧ４の投与が、結腸マクロファージ数を減少させ、炎症を改善することは、この概念と一致する。これらのデータは、マクロファージのアポトーシスにおけるＥｒｂＢ４の新規な役割を規定し、大腸炎の消散を促進できるフィードバック阻害の機構を示すものである。特定の理論に束縛されるものではないが、発明者は、ＥｒｂＢ４によるシグナル伝達が炎症性Ｍφの生存及び／または機能を低減する抗炎症性フィードバック阻害機構として機能すると想定している。本仮説の当然の帰結として、炎症性Ｍφ上のＥｒｂＢ４は大腸炎の消散を促進することから、ＩＢＤの潜在的な治療対象である。
【００４９】
治療法
したがって、本明細書では、ＥｒｂＢ４＋Ｍφ数の増加が見られることと関連した疾患状態の症状を治療、抑制、軽減及び／または疾患状態の予防を促進する方法を提供する。本方法は、疾患状態の症状を治療、抑制、軽減する及び／または疾患状態の予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供することと、対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、疾患状態は、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、急性肺損傷、肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、ＣＯＰＤ、アテローム性動脈硬化症、またはＩ型糖尿病である。一実施形態では、基準値と比較して、ＥｒｂＢ４＋Ｍφ数の増加が見られる。
【００５０】
本明細書ではまた、ＥｒｂＢ４＋Ｍφの発現増加によりＥｒｂＢ４＋Ｍφ数の増加が見られる対象での、炎症性腸疾患の症状を治療、抑制、軽減及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４＋Ｍφの発現が増加した対象での、炎症性腸疾患の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、炎症性腸疾患の既存治療と併用しても良い。例えば、ＥｒｂＢ４活性化因子は、炎症性腸疾患を治療するために、既存療法、例えば、食事の変更ならびに治療薬の投与、例えば限定するものではないが、スルファサラジン（Ａｚｕｌｆａｄｉｎｅ）、メサラミン（Ａｓａｃｏｌ、Ｐｅｎｔａｓａ）、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、６−ＭＰ（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、サイクロスポリン、メトトレキサート、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、ブデソニド（Ｅｎｔｏｃｏｒｔ  ＥＣ）及びコルチコステロイド（プレドニソン）の投与と併用しても良い。ＥｒｂＢ４活性化因子と共に用いることができる既存療法の用量は、当業者に明らかである。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＩＢＤの既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＩＢＤの既存療法を、同時に施しても良い。
【００５１】
更に本明細書では、ＥｒｂＢ４＋Ｍφ数の増加が見られる対象において、壊死性腸炎の症状を治療、抑制、軽減及び／またはその予防を促進する方法を提供する。本方法は、ＥｒｂＢ４＋Ｍφの発現が増加した対象での、壊死性腸炎の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、壊死性腸炎の既存治療、例えば限定するものではないが、経腸栄養の停止、経鼻胃管減圧の実施、広域抗生物質、静脈内輸液補助及び手術の開始と併用しても良い（Ｓｈａｒｍａ，Ｒ及びＨｕｄａｋ，Ｍ．Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；４０（１）：２７-５１、Ｋａｓｉｖａｊｊｕｌａ  Ｈ及びＭａｈｅｓｈｗａｒｉ  Ａ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１４  Ｍａｙ；８１（５）：４８９−９７）。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及び壊死性腸炎の既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及び壊死性腸炎の既存療法を、同時に施しても良い。
【００５２】
本明細書では、必要とする対象での、放射線療法誘発性の腸障害の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、放射線療法誘発性の腸障害の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。
【００５３】
本明細書では、必要とする対象での、急性肺損傷（ＡＬＩ）の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、ＡＬＩの症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、ＡＬＩの既存治療または潜在的（新規）治療と併用しても良い。例えば、ＥｒｂＢ４活性化因子は、換気療法及び換気療法以外を含む既存療法と併用しても良い。ＡＬＩのための付加的治療として、スタチン、骨髄由来間葉幹細胞、エアゾール療法、コルチコステロイド、ベータ受容体アドレナリン作動薬及び血管拡張剤の使用が挙げられるが、これらに限定されない（Ｊａｉｎ  Ｒ，ＤａｌＮｏｇａｒｅ  Ａ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．２００６；８１：２０５−２１２、Ｇｒｏｓｈａｕｓ  ＨＥ，Ｍａｎｏｃｈａ  Ｓ，Ｗａｌｌｅｙ  ＫＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＪＡ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｄｅｍａ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．２００４；８：２３４−２４２、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＡＰ，Ｂｅｒｎａｒｄ  ＧＲ．Ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｌａｎｃｅｔ．２００７；３６９：１５５３−１５６４、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．及びＭａｔｔｈａｙ，Ｍ．Ｊ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ  Ｐｕｌｍ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  Ａｕｇ；２３（４）：２４３-２５２；Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＲＭら，Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１３  Ａｕｇ；３４（４）：４８７−９８）。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＡＬＩの既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＡＬＩの既存療法を、同時に施しても良い。
【００５４】
本明細書では、必要とする対象での、肝線維症の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、肝線維症の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、肝線維症の既存治療、例えば限定するものではないが、食事の変更、ライフスタイルの変更、抗線維化薬、抗炎症剤及び抗酸化剤と併用しても良い（Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．及びＢｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５  Ｆｅｂ  １  １１５（２）：２０９-２１８、Ｄｅｔｌｅｆ  Ｓｃｈｕｐｐａｎ及びＹｏｎｇ  Ｏｏｋ  Ｋｉｍ．Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（５）：１８８７−１９０１）。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及び肝線維症の既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及び肝線維症の既存療法を、同時に施しても良い。
【００５５】
本明細書では、必要とする対象での、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、非アルコール性脂肪肝炎の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、非アルコール性脂肪肝炎の既存治療、例えば限定するものではないが、食事の変更、ライフスタイルの変更、総コレステロール値の低下（例えば、スタチンの使用）、減量、運動、アルコール消費の低減若しくは中断、またはこれらの組み合わせと併用しても良い。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＮＡＳＨの既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＮＡＳＨの既存療法を、同時に施しても良い。
【００５６】
本明細書では、必要とする対象での、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、ＣＯＰＤの症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、ＣＯＰＤの既存治療、例えば限定するものではないが、食事の変更、ライフスタイルの変更、短時間作用型の気管支拡張薬、長時間作用型の気管支拡張薬、ホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）阻害剤（ロフルミラストなど）、コルチコステロイド及びメチルキサンチンと併用しても良い（Ｈｏｂａｒｔ  Ｌ．，Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｋ．及びＫａｒｉｎｅ，Ｔ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ  ＧＯＬＤ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ａｍ  Ｆａｍ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．２０１３  Ｎｏｖ  １５；８８（１０）：６５５−６６３）。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＣＯＰＤの既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＣＯＰＤの既存療法を、同時に施しても良い。
【００５７】
本明細書では、必要とする対象での、アテローム性動脈硬化症の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、アテローム性動脈硬化症の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、アテローム性動脈硬化症の既存治療、例えば限定するものではないが、食事の変更、ライフスタイルの変更、スタチン、抗血小板薬、ベータ受容体遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウム拮抗剤、ＰＣＳＫ９阻害剤と併用しても良い（Ｔａｂａｓ，Ｉ．ら，Ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｐｒｉｌ  １３，２０１５．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ２０９／ｎｏ．１，ｐｇ１３−２２；、Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．及びＮｏｅｌｓ，Ｈ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．１７，ｐｇ．１４１０-１４２２  （２０１１））。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びアテローム性動脈硬化症の既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びアテローム性動脈硬化症の既存療法を、同時に施しても良い。
【００５８】
本明細書では、必要とする対象での、糖尿病の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進する方法も提供する。本方法は、対象での、糖尿病の症状を治療、抑制、軽減する及び／またはその予防を促進するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。一実施形態では、糖尿病はＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。各種実施形態において、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）を、Ｉ型糖尿病の既存治療、例えば限定するものではないが、食事の変更、ライフスタイルの変更及びインスリン療法と併用しても良い（Ｃｈｉａｎｇ，Ｊら．Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ：Ａ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｊｕｌｙ  ２０１４  ｖｏｌ．３７  ｎｏ．７，ｐｇ．２０３４−２０５４）。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＩ型糖尿病の既存療法を、逐次的に施しても良い。別の実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）及びＩ型糖尿病の既存療法を、同時に施しても良い。
【００５９】
本明細書に記載する方法の各種実施形態では、基準値は、通常の（即ち、健常な、または対照となる）対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である。更に別の実施形態では、基準値は、疾患状態と診断された対象、及び前記疾患状態の治療を受けている、または受けた対象におけるＥｒｂＢ４＋マクロファージの平均数または中央数である。代表的実施形態では、基準値に対して、疾患状態の対象でのＥｒｂＢ４＋炎症性Ｍφは、少なくとも、または約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％増加する。代表的実施形態では、基準値に対して、疾患状態の対象でのＥｒｂＢ４＋炎症性Ｍφは、少なくともまたは約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍またはこれらの組み合わせに増加する。
【００６０】
本明細書ではまた、必要とする対象でのＥｒｂＢ４＋Ｍφの細胞死を誘発する方法も提供する。本方法は、対象での、ＥｒｂＢ４＋Ｍφの細胞死を誘発するような、ＥｒｂＢ４活性化因子を提供すること、及び対象に有効量の活性化因子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子からなる群から選択される。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。一実施形態では、対象はＩＢＤを有している。更に別の実施形態では、対象は壊死性腸炎を有している。別の実施形態では、対象は急性肺損傷を有している。更に別の実施形態では、対象は肝線維症を有している。別の実施形態では、対象はアテローム性動脈硬化症を有している。更に別の実施形態では、対象は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有している。付加的な実施形態では、対象はＩ型糖尿病を有している。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、直接的な活性化因子であり、例えば、ＥｒｂＢ４のリン酸化を誘発または増加させることにより、活性化因子とＥｒｂＢ４とを結合させ、ＥｒｂＢ４を活性化する。いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４の活性化因子は、間接的なＥｒｂＢ４活性化因子であり、活性化因子がＥｒｂＢ４の阻害因子を阻害して、ＥｒｂＢ４を活性化する。一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子はニューレグリン−４である。
【００６２】
本明細書では、対象がＥｒｂＢ４の活性化因子を用いた治療を受けている、または受けた場合に、ＥｒｂＢ４＋Ｍφ数の増加に伴う疾患状態の治療の有効性を評価するためのアッセイも提供する。アッセイには、対象から試料を採取すること、試料を分析して試料中のＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルを判定すること、ＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルが基準値に対して減少している場合に治療が有効であると判定し、あるいはＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルが基準値に対して変化しないか、または増加する場合には治療が無効であると判定することを含む。一実施形態では、基準値は、治療開始前の対象のＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルである。一実施形態では、基準値が、通常の（例えば、健常な）対象のＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルである場合に、対象からの試料中のＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルが、基準値のＥｒｂＢ４＋Ｍφのレベルと同様である場合に治療を有効であると判定する。一実施形態では、疾患状態はＩＢＤである。更に別の実施形態では、疾患状態は壊死性腸炎である。別の実施形態では、疾患状態は急性肺損傷である。更に別の実施形態では、疾患状態は肝線維症である。別の実施形態では、疾患状態はアテローム性動脈硬化症である。更に別の実施形態では、疾患状態は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。付加的な実施形態では、疾患状態はＩ型糖尿病である。
【００６３】
特許請求の範囲に記載された方法に使用するＥｒｂＢ４活性化因子を、各種方法、例えば限定するものではないが、エアゾール、経鼻、経口、経粘膜、経皮、非経口、舌下、埋込型ポンプ、連続注入、局所塗布、浣腸、カプセル及び／または注射を利用して投与して良い。いくつかの実施形態では、疾患状態はＮＥＣまたはＩＢＤであり、ＥｒｂＢ４活性化因子は経口投与される。いくつかの実施形態では、疾患状態は急性肺損傷であり、ＥｒｂＢ４活性化因子の投与様式はエアゾールである。
【００６４】
本発明によって治療される対象は、哺乳動物の対象、例えばヒト、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス及びラットを含む。
【００６５】
治療的用量
本発明のいくつかの実施形態では、組成物中のＥｒｂＢ４活性化因子の有効量は、約１〜１０ｍｇ／日、１０〜５０ｍｇ／日、５０〜１００ｍｇ／日、１００〜１５０ｍｇ／日、１５０〜２００ｍｇ／日、１００〜２００ｍｇ／日、２００〜３００ｍｇ／日、３００〜４００ｍｇ／日、４００〜５００ｍｇ／日、５００〜６００ｍｇ／日、６００〜７００ｍｇ／日、７００〜８００ｍｇ／日、８００〜９００ｍｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／日、１０００〜１１００ｍｇ／日、１１００〜１２００ｍｇ／日、１２００〜１３００ｍｇ／日、１３００〜１４００ｍｇ／日、１４００〜１５００ｍｇ／日、１５００〜１６００ｍｇ／日、１６００〜１７００ｍｇ／日、１７００〜１８００ｍｇ／日、１８００〜１９００ｍｇ／日、１９００〜２０００ｍｇ／日、２０００〜２１００ｍｇ／日、２１００〜２２００ｍｇ／日、２２００〜２３００ｍｇ／日、２３００〜２４００ｍｇ／日、２４００〜２５００ｍｇ／日、２５００〜２６００ｍｇ／日、２６００〜２７００ｍｇ／日、２７００〜２８００ｍｇ／日、２８００〜２９００ｍｇ／日または２９００〜３０００ｍｇ／日の範囲内であり得る。本発明の一実施形態では、ＥｒｂＢ４は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。
【００６６】
本明細書の更に別の実施形態では、特許請求の範囲に記載の方法で使用されるＥｒｂＢ４活性化因子の有効量は、０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２〜０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、６〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、７〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０〜２５ｍｇ／ｋｇ、２５〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０〜３５ｍｇ／ｋｇ、３５〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０〜４５ｍｇ／ｋｇ、４５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１１００ｍｇ／ｋｇ、１１００〜１２００ｍｇ／ｋｇ、１２００〜１３００ｍｇ／ｋｇ、１３００〜１４００ｍｇ／ｋｇ、１４００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜１６００ｍｇ／ｋｇ、１６００〜１７００ｍｇ／ｋｇ、１７００〜１８００ｍｇ／ｋｇ、１８００〜１９００ｍｇ／ｋｇ、１９００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、２０００〜２１００ｍｇ／ｋｇ、２１００〜２２００ｍｇ／ｋｇ、２２００〜２３００ｍｇ／ｋｇ、２３００〜２４００ｍｇ／ｋｇ、２４００〜２５００ｍｇ／ｋｇ、２５００〜２６００ｍｇ／ｋｇ、２６００〜２７００ｍｇ／ｋｇ、２７００〜２８００ｍｇ／ｋｇ、２８００〜２９００ｍｇ／ｋｇまたは２９００〜３０００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。本発明の一実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子は、ニューレグリン−４またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩である。
【００６７】
有効量のＥｒｂＢ４活性化因子、例えばニューレグリン−４の通常用量は、既知の治療的化合物を用いる場合は製造業者によって推奨される範囲内であり、またインビトロ反応または動物モデルでの反応ごとに当業者に指示される範囲内であり得る。実際の容量は、医師の判断、患者の病状、例えば、関連する培養細胞または組織培養された組織試料のインビトロ反応性、または適切な動物モデルで観察された反応に基づいた治療方法の効果に依存し得る。各種実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）の有効量は、対象に有効量のＥｒｂＢ４活性化因子を投与するためには、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上であって良く、その場合の有効量は本明細書に記載された、いずれか１以上の用量である。各種実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）は、対象が疾患状態を発症する前、発症中、または発症後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１日に１〜３回または週に１〜７回、対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１〜５日、１〜５週、１〜５か月または１〜５年の間、対象に投与される。
【００６８】
医薬組成物
各種実施形態では、本発明は、有効量のニューレグリン−４などのＥｒｂＢ４活性化因子、または治療的有効量のニューレグリン−４などのＥｒｂＢ４活性化因子若しくはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩と、薬学的に許容される賦形剤／担体とを含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に安全で非毒性であり、望ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、ヒトの薬学的使用のためだけでなく獣医学的使用のためにも許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であっても良い。
【００６９】
各種実施形態において、本発明による医薬組成物は、任意の投与経路を介した送達に合わせて製剤化することができる。「投与経路」は、当該技術分野で既知のいずれかの投与経路を指すことができ、エアゾール、浣腸、経鼻、経口、舌下、経粘膜、経皮、非経口または経腸を含み得るが、これらに限定されない。「非経口」は、一般に、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、鞘内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜または経気管を含む、注射に関連する投与経路を指す。非経口経路による場合、組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態であっても良く、または凍結乾燥粉末としての形態であっても良い。非経口経路による場合、組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態であっても良い。経腸経路による場合、医薬組成物は、制御された放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、ミクロスフェア若しくはナノスフェア、または脂質ベシクル若しくはポリマーベシクルの形態であり得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「非経口投与」及び「非経口投与された」は、経腸及び局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを指す。本明細書で使用される場合、用語「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」及び「末梢投与された」は、標的部位、組織または器官への直接的な投与ではなく、対象の循環系に入ることで代謝及び他の同様の作用を受けるような、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）の投与を指す。
【００７１】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に安全で非毒性であり、望ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、ヒトの薬学的使用のためだけでなく獣医学的使用のためにも許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であっても良い。
【００７２】
本発明による医薬組成物は、いかなる薬学的に許容される担体も含有することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、目的の化合物を、１つの組織、器官または身体の一部から、別の組織、器官または身体の一部へと運ぶまたは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを指す。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料またはこれらの組合せであって良い。担体の各成分は、製剤の他の成分と適合性でなければならないという点で、「薬学的に許容される」ものでなければならない。担体の各成分は、それが接触し得る任意の組織または器官との接触に使用するのにも適していなければならない。このことは、担体の各成分が、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性またはその治療上の有益性を過度に上回る任意の他の合併症の危険性を備えていてはならないことを意味する。
【００７３】
本発明による医薬組成物は、経口投与用に、カプセル化、錠剤化またはエマルジョン若しくはシロップ剤に調製することもできる。薬学的に許容される固体または液体担体を、組成物を増強または安定化するために、あるいは組成物の調製を容易にするために添加しても良い。液体担体として、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール及び水が挙げられる。固体単体として、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、石膏、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンが挙げられる。担体には、単独でまたはワックスに加えて、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの徐放性材料も含むことができる。
【００７４】
医薬製剤は、錠剤形態のための製粉、混合、造粒、及び必要な場合には圧縮を伴うか、あるいは硬質ゼラチンのカプセル形態のための製粉、混合及び充填を伴う、従来の薬学技術に従って作製される。液体担体が使用される場合、製剤はシロップ、エリキシル、エマルジョンまたは水性若しくは非水性懸濁液の形態である。このような液体製剤は、直接経口投与するか、または軟質ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００７５】
本発明による医薬組成物は、治療的有効量で送達され得る。厳密な治療的有効量は、所与の対象における治療の有効性の点で最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は、様々な要因に依存して変化し、要因には、治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学及び生物学的利用能を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患の種類及び段階、一般的身体状態、所与の用量に対する応答性ならびに薬剤の種類を含む）、製剤において薬学的に許容される１または複数の担体の性質及び投与経路を含むが、これらに限定されない。臨床及び薬理学技術分野の当業者であれば、決められた実験を通じて、例えば、化合物の投与に対する対象の反応をモニタリングすること、及びそれに応じて用量を調整することにより、治療的有効量を決定できるであろう。追加のガイダンスについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編，２０版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【００７６】
治療剤は単回投与または複数回投与にて患者に投与することができる。複数回投与の場合、各回の間隔を、例えば１時間、３時間、６時間、８時間、１日、２日、１週間、２週間または１か月ごとに分けて投与しても良い。例えば、治療剤を、例えば２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、１０週間、１５週間、２０週間またはそれ以上の間隔で投与することができる。各種実施形態において、組成物は、１日に１〜３回または週に１〜７回、対象に投与される。各種実施形態では、組成物は、１〜５日、１〜５週、１〜５か月または１〜５年の間、対象に投与される。特定の対照についての具体的な用量レジメンは、個々の必要性に応じて、及び組成物の投与を管理または監督する個人の職業的判断に応じて、経時的に調整すべきであることを理解すべきである。例えば、低用量では十分な治療的活性が得られない場合に、治療剤の用量を増加することができる。最終的に主治医が適切な量及び用量レジメンを決定することになるが、本明細書で開示するＥｒｂＢ４活性化因子またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩の治療的有効量は、０．０００１、０．０１、０．０１  ０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、５００または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはμｇ／ｋｇ用量で与えることができる。有効用量はインビトロまたは動物モデル試験のバイオアッセイまたはシステムから導出される用量反応曲線から推定することができる。
【００７７】
本明細書で使用される有効量は、疾患の症状の発生を遅延化する、疾患の症状の過程を変更する（例えば、限定するものではないが、疾患の症状の進行を緩徐化する）、または疾患の症状を後退させるのに十分な量も含み得る。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、いずれの所与の症例においても、決められた実験のみを使用して、当業者が適切な「有効量」を決定することができる。
【００７８】
有効量、毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物において、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとっての致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％での治療的有効用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって、決定することができる。用いる剤形及び利用される投与経路に応じて、用量を変えることができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。治療指数の大きい組成物及び方法が好ましい。治療的有効量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、細胞培養または適切な動物モデルにて決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半数阻害を達成する、ＥｒｂＢ４活性化薬剤の濃度）を含む範囲の循環血漿中濃度を動物モデルで達成する用量を処方することができる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定できる。何らかの特定の用量の効果を、適切なバイオアッセイによってモニターすることができる。医師は用量を決定して、観察された治療効果に合わせて、必要に応じて調整することができる。
【００７９】
用語「薬学的に許容される」は、堅実な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題若しくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合った化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、液体または個体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、封入材料、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム若しくは亜鉛のステアレートまたはステアリン酸）、または溶媒封入材料などの、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）の安定性、溶解性または活性の維持に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、この製剤の他の成分と適合性があり、かつ患者に有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料の一部の例として、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖、（２）コーンスターチ及び馬鈴薯澱粉などのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ココアバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤、（８）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油、（９）プロピレングリコールなどのグリコール、（１０）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びプロピレングルコール（ＰＥＧ）などのポリオール、（１１）エチルオレエート及びエチルラウレートなどのエステル、（１２）寒天、（１３）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１４）アルギン酸、（１５）パイロジェンフリー溶液、（１６）等張生理食塩水、（１７）リンゲル溶液、（１８）ｐＨ緩衝液、（１９）ポリエステル、ポリカーボネート及び／またはポリ無水物、（２０）ポリペプチド及びアミノ酸などの充填剤、（２１）血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの血清成分、（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール、ならびに（２３）薬学的処方に用いられる他の適合可能な非毒性物質が挙げられる。製剤に遊離剤、コーティング剤、防腐剤及び酸化防止剤が存在しても良い。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」またはそれに類する用語は、本明細書で同じ意味で用いられる。
【００８０】
本明細書に記載するＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）は、化合物を固体、液体またはゲル形態で対象に投与するために特別に処方することができる。これには、（１）例えば、無菌液若しくは懸濁液としての、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内若しくは硬膜外注射による非経口投与、または徐放性製剤、（２）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏または徐放性パッチ若しくはスプレーとしての局所塗布、（３）例えば、ペッサリー、クリーム若しくはフォームとしての膣内若しくは直腸内投与、（４）眼球内、（５）経皮、（６）経粘膜、（７）経鼻または（８）舌下に適合させたものを含む。加えて、本明細書に記載するＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）は、患者に埋め込むこと、またはドラッグデリバリーシステムを用いて注入することができる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６（１９８４）、Ｌｅｗｉｓ編．"Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ"（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）、米国特許第３，７７３，９１９号及び同第３，２７０，９６０号を参照されたい。
【００８１】
本明細書に記載する方法で使用できる製剤の更なる実施形態及びＥｒｂＢ４の活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）の投与様式を、以下に示す。
【００８２】
非経口剤形ＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）の非経口剤形は、様々な経路によって対象に投与することもでき、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋肉内、腹腔内及び動脈内を含むがこれらに限定されない。非経口剤形の投与は、通常、汚染物質に対する患者の自然防御力を回避するので、非経口剤形は、無菌であるか、または患者への投与前に殺菌できることが好ましい。非経口剤形の例として、注射用に準備された溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクル中で溶解または懸濁して準備する乾燥生成物、注射用に準備された懸濁液、放出制御性の非経口剤形及びエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本開示の非経口剤形を提供するために使用できる好適なビヒクルは、当業者に周知である。非限定的例としては、滅菌水；ＵＳＰ注射用水；生理食塩水；グルコース溶液；限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液などの水溶性ビヒクル；限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールなどの水混和性ビヒクル；限定されないが、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、エチルオレエート、イソプロピルミリステート及び安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルが挙げられる。
【００８４】
エアゾール製剤ＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）は、適切な噴射剤、例えば、従来のアジュバントを有する、プロパン、ブタンまたはイソブタンのような炭化水素噴射剤と共に、加圧エアゾール容器内に封入することができる。ＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）を、ネブライザーまたは噴霧器の非加圧形態で投与することもできる。ＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）は、例えば、吸入器を用いて、乾燥粉末の形態で気道に直接投与することもできる。
【００８５】
好適な粉末組成物の例として、ラクトースと完全に混合されたＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）の粉末製剤、または気管支内投与において許容される他の不活性粉末が挙げられる。粉末組成物は、エアゾールディスペンサーによって投与することも、カプセルを貫通して吸入に適した安定流で粉末を噴出する装置へ、対象が挿入可能な壊れやすいカプセルに入れることもできる。組成物には、噴射剤、界面活性剤及び共溶媒を含むことができ、好適な絞り弁によって閉じる従来のエアゾール容器に充填することができる。
【００８６】
気道に送達するためのエアゾールは、当技術分野において既知である。例えば、Ａｄｊｅｉ，Ａ．及びＧａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１：５６５−５６９（１９９０）、Ｚａｎｅｎ，Ｐ．及びＬａｍｍ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１１４：１１１−１１５（１９９５）、Ｇｏｎｄａ，Ｉ．"Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ，"ｉｎ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６：２７３−３１３（１９９０）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４０：１３１７−１３２４（１９８９）、ペプチド及びタンパク質の全身送達にも可能であるエアゾール（Ｐａｔｔｏｎ及びＰｌａｔｚ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，８：１７９−１９６（１９９２）、Ｔｉｍｓｉｎａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１０１：１−１３  （１９９５）、及びＴａｎｓｅｙ，Ｉ．Ｐ．，Ｓｐｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒｋｅｔ，４：２６−２９（１９９４）、Ｆｒｅｎｃｈ，Ｄ．Ｌ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ａ．及びＮｉｖｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｓｃｉ．，２７：７６９−７８３（１９９６）、Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ．，Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５８：１−１０（１９８９）、Ｒｕｄｔ，Ｓ．及びＲ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２２：２６３−２７２（１９９２）、Ｔａｂａｔａ，Ｙ，及びＹ．Ｉｋａｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２２：８３７−８５８（１９８８）、Ｗａｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２：１０  １−２０  １９９５）、Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．及びＰｌａｔｚ，Ｒ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，８：１７９−１９６（１９９２）、Ｂｒｙｏｎ，Ｐ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，５：１０７−１３２（１９９０）、Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２８：１５７９−８５（１９９４）、Ｄａｍｍｓ，Ｂ．及びＢａｉｎｓ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）、Ｎｉｖｅｎ，Ｒ．Ｗ．ら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１２（９）；１３４３−１３４９（１９９５）、ならびにＫｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．ら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３（１）：８０−８３（１９９６）を参照されたい。これら全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
水は一部の化合物の劣化を促し得るため、本明細書に記載するＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）の製剤は、活性成分として開示された化合物を含む無水医薬組成物及び剤形を更に包含する。例えば、水の添加（例えば、５％）は、貯蔵寿命または製剤の経時的安定性などの特徴を判定するために、長期保存をシミュレートする手段として医薬分野において広く受け入れられている。例えば、Ｊｅｎｓ  Ｔ．Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３７９−８０（２版，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．：１９９５）を参照されたい。本開示の無水医薬組成物及び剤形は、無水または低水分の含有成分及び低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。製造、包装及び／または保管時に水分及び／または湿気との大幅な接触が予期される場合、ラクトース、及び一級または二級アミンを含む少なくとも１つの活性成分を含む医薬組成物及び剤形は、無水であることが好ましい。無水組成物は、水への露出を防止するための既知の材料を使用して包装され、好適な処方書キット内に封入できることが好ましい。好適な包装の例として、気密封止箔、プラスチック、乾燥剤の有無を問わない単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック及びストリップパックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
放出制御性及び徐放性剤形。本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）は、放出制御性または徐放性手段によって、対象に投与することができる。理想的には、医学的治療に最適に設計された放出制御性製剤の使用は、最小限の時間で病状を治癒または制御するために、用いる原薬が最小限であることを特徴とする。放出制御性製剤の利点としては、１）薬物活性の延長、２）用量頻度の削減、３）患者コンプライアンスの向上、４）薬物総使用量の減少、５）局所副作用または全身副作用の軽減、６）薬物蓄積の最小化、７）血中濃度の変動軽減、８）治療有効性の改善、９）薬物活性の相乗作用または損失の低減、及び１０）疾患または病状の速度制御の改善が挙げられる（Ｋｉｍ，Ｃｈｅｒｎｇ−ｊｕ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  Ｄｅｓｉｇｎ，２（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．：２０００）。放出制御性製剤を使用すると、化合物の作用開始、作用持続時間、治療可能時間域内の血漿濃度及びピーク血中濃度を制御することができる。特に、放出制御性または徐放性の剤形または製剤を使用すると、式（Ｉ）の化合物の最大効果が確実に達成される一方で、薬物の過小量投与（即ち、最小治療レベル以下になる）ならびに薬物の毒性基準の超過の両方により生じ得る、潜在的副作用及び安全性の懸念を最小限に抑えることができる。
【００８９】
様々な既知の放出制御性または徐放性の剤形、製剤及び装置を、本明細書に記載するＥｒｂＢ４活性化因子（例えば、ニューレグリン−４）の用途に適合させることができる。例として、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、同第５，７３３，５６６号、同第６，３６５，１８５  Ｂ１号の記載が挙げられるが、これらに限定されない。これらの剤形を使用すると、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル類、浸透膜、浸透圧システム（例えばＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ））、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、若しくはミクロスフィアまたはこれらの組み合わせを使用して、様々な比率で所望の放出プロファイルを実現し、１つ以上の活性成分の放出を緩徐化または制御することができる。加えて、イオン交換物質を使用すると、固定化した吸着性の塩形態の開示された化合物を調製し、それにより薬物の制御された送達をもたらすことができる。特定の陰イオン交換樹脂の例として、Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ５６８及びＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）ＡＰ１４３（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，Ｐａ．ＵＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法に用いられるＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）は、徐放的にまたは律動的に対象に投与される。パルス療法は、同じ量の組成物を経時的に不連続に投与する形態ではなく、同じ用量の組成物を頻度を減らして投与するか、または用量を減らして投与する構成である。徐放性またはパルス投与は、障害が持続的に対象に生じているとき、例えば対象が持続性症状または慢性症状のウイルス感染症を有する場合に特に好ましい。パルスごとに用量を減らすことができるため、治療期間にわたり患者に投与されるＥｒｂＢ４活性化因子（例えばニューレグリン−４）の総量が最小化される。
【００９１】
パルス間の間隔は、必要な場合、当業者が決定することができる。多くの場合、パルス間の間隔は、次のパルスの送達前に、組成物または組成物の活性成分が、対象に全く検出されないときに、別の用量の組成物を投与することによって、算出することができる。間隔は、組成物の生体内半減期から算出することもできる。間隔は、生体内半減期より長いか、または組成物半減期の２倍、３倍、４倍、５倍及び更には１０倍長くなるように算出され得る。注入または他の形態の患者への送達により、組成物をパルス投与するための各種方法及び装置は、米国特許第４，７４７，８２５号、同第４，７２３，９５８号、同第４，９４８，５９２号、同第４，９６５，２５１号及び同第５，４０３，５９０号に開示されている。
【００９２】
キット
本発明はまた、炎症性腸疾患、壊死性大腸炎、ＣＯＰＤ、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病、ＡＬＩ、放射線療法誘発性の腸障害、肝線維症、ＮＡＳＨ、胃腸炎または尿路感染症を治療するキットにも関する。キットは、本発明の組成物のうちの少なくとも１つを含む、材料または成分の組み合わせである。したがって、いくつかの実施形態では、本キットは、上記のニューレグリン−４などのＥｒｂＢ４活性化因子、またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩を含む組成物を含有する。
【００９３】
本発明のキットを構成する成分の正確な性質は、その意図された目的に依存する。一実施形態では、キットは、特にヒト対象のために構成される。更に別の実施形態では、キットは、農場動物、家畜及び実験動物などの対象を治療する、獣医学的用途のために構成されるが、これらに限定されない。
【００９４】
使用説明書がキットに含まれる場合がある。「使用説明書」は、通常は、対象における炎症性腸疾患、壊死性大腸炎、ＣＯＰＤ、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病、急性肺損傷または肝線維症などを治療するために、キットの成分を使用して望ましい結果を得るべく用いられる技術を説明する具体的な表示を含む。キットには、当業者によって容易に理解されるような、測定器具、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容される担体、シリンジまたは他の有用な道具類などの、他の有用な構成要素も含む場合がある。
【００９５】
キットに組み立てられた材料または成分を、それらの操作性及び有用性を維持する任意の簡便かつ好適な方法で格納し、施術者に提供することができる。例えば、成分は、溶解、脱水または凍結乾燥形態であり得、それらは室温、冷蔵または冷凍温度で提供することができる。成分は通常、好適な包装材料に収容されている。本明細書で使用される場合、用語「包装材料」は、本発明の組成物などのキットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的構造物を指す。包装材料は、好ましくは無菌の、汚染のない環境を提供するために、周知の方法で構成される。本明細書で使用される場合、用語「パッケージ」は、個々のキット成分を保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、箔及びそれに類するものなどの好適な固体マトリックスまたは材料を指す。したがって、例えば、パッケージは、ニューレグリン−４などのＥｒｂＢ４活性化因子、またはその薬学的な等価物、類似体、誘導体、模倣体若しくは塩を含む好適な量の本発明の組成物を収容するために使用されるボトルであり得る。包装材料は、一般に、キット及び／またはその成分の内容及び／または目的を示す外部ラベルを有する。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明を詳細に例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。具体的な材料が言及されている範囲で、実施例は例示だけを目的としており、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の能力を行使することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物質を開発することができる。
【００９７】
長期にわたる炎症を防止するためには、攻撃対象の消散後に組織から炎症性マクロファージが有効にクリアランスされることが重要である。クリアランスの不良は、炎症性腸疾患などの病状の一因となり得るため、治療的な標的であり得る。しかしながら、炎症性マクロファージの終結を誘発するシグナル伝達経路の規定は不完全である。本発明者らは、以前はマクロファージ生物学上の役割が未知であった、ＥｒｂＢ４受容体チロシンキナーゼが、マクロファージのクリアランスに関与するかどうかを試験した。
【００９８】
急性ＤＳＳ大腸炎の発症中に、ＥｒｂＢ４リガンドであるニューレグリン−４（ＮＲＧ４）を投与した場合としない場合とで、マクロファージ上でのＥｒｂＢ４の発現及びＣ５７Ｂｌ／６マウスの結腸でのマクロファージを、フローサイトメトリーによって評価した。培養したマウス及びヒトの一次マクロファージを活性化させ、ＮＲＧ４で処置し、アポトーシスを測定した。骨髄系統にＥｒｂＢ４を欠損するマウスを、ＤＳＳ大腸炎に罹患させ、大腸炎の重症度及び回復度を分析した。
【００９９】
ＤＳＳ大腸炎発症中のマウスでは、ＥｒｂＢ４が炎症性マクロファージ上で高度に発現した。炎症性活性は、インビトロのマウス及びヒトのマクロファージ上でＥｒｂＢ４を誘発した。これらの細胞上でのＥｒｂＢ４の活性化によって、ＥｒｂＢ４細胞内ドメイン断片のタンパク分解産生に依存するアポトーシスが生じた。活動性炎症がＮＲＧ４の発現を抑制したことから、この欠損がマクロファージの持続及び炎症進行を可能にしていると見なされ得る。大腸炎時の外因性ＮＲＧ４の投与が、結腸マクロファージ数を減少させ、炎症を改善することは、この概念と一致する。更に、骨髄性系統のＥｒｂＢ４を欠損しているマウスは、大腸炎の悪化を呈し、回復することはなかった。これらのデータは、マクロファージのアポトーシスにおけるＥｒｂＢ４の新規な役割を規定し、大腸炎の消散を促進できるフィードバック阻害の機構を示すものである。
【０１００】
実施例１
マクロファージの炎症性活性は、ＥｒｂＢ４の発現を誘発する
Ｍφは、細菌のクリアランスに関与する炎症性Ｍ１サブセットから、恒常性及び治癒促進性反応に関与する抗炎症性Ｍ２サブセットに至る一連の広範な特徴を有する。骨髄由来Ｍφを図１の実験に使用した。これは、骨髄由来細胞が、容易に増殖可能なナイーブ単球／Ｍφ集団の代表であり、この集団がＭ１またはＭ２表現型に確実に分化され、炎症中の腸内組織へのマクロファージ補充源となり得るためである。
【０１０１】
炎症性活性によって、Ｍφ内でＥｒｂＢ４が調節されるかどうか判定するため、Ｍ１分化したＭφ及び対照ＭφからＲＮＡを収集し、全４つのＥｒｂＢファミリーメンバーの発現について、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により分析した。ＥｒｂＢ４は、炎症性活性により１０倍誘発され（図１Ａ；対照（ＰＢＳ）またはＩＦＮγ／ＬＰＳで刺激された（Ｓｔｉｍ）Ｍφ、＊＊はｐ＜０．０１、ｎ＝４マウス）、増加を示した唯一のファミリーメンバーであった。ＬＰＳ後のＭφ上での免疫蛍光分析でも、膜及び核に局在したＥｒｂＢ４染色の顕著な増加を示し（図１Ｅ）、ＥｒｂＢ４受容体の全長及び切断された細胞内ドメイン両方での発現（図１Ｆ）と一致した。
【０１０２】
実施例２
補充されたマクロファージ上でＥｒｂＢ４が誘発される
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３％のデキストラン硫酸ナトリウム水溶液（ＤＳＳ）を４日間与え（急性期）、以降の３日間は、ＤＳＳを与えなかった（炎症期）。一方の対照群には、７日間ＤＳＳを与えなかった。結腸組織を収集して、ディスパーゼＩＩ及びコラゲナーゼを使用して消化した後、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ及びＥｒｂＢ４で染色した。細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ  ＦＡＣＳ装置にてフローサイトメトリーにより処理し、ＦｌｏＪｏを使用して解析した。
【０１０３】
図２に示すように、結腸のＤＳＳ誘発に続く、炎症期及び急性期両方でＥｒｂＢ４＋マクロファージ数の増加が見られる。このことは、ＥｒｂＢ４＋マクロファージが主に大腸炎時の循環から補充されることを示す。
【０１０４】
実施例３
ニューレグリン−４は、炎症性Ｍ１で刺激されたマクロファージのアポトーシスを誘発する
ＩＦＮγ／ＬＰＳ処理したＭφを、ＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）＋／−ＥｒｂＢ４遮断抗体（Ｅ４ＢＡ：２μｇ／ｍＬ）に４８時間曝露し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって計数した。ｎ＝４、＊はｐ＜０．０１である。図３Ａに示すように、ＥｒｂＢ４の活性化により、培養中の生存可能なＭ１分化されたＭφの数が減少した。
【０１０５】
ＣＭＧ１４−１２の条件培地を使用して、骨髄由来マクロファージを生成し、９６穴プレートに配置した。次に、ニューレグリン−４（ＮＲＧ４）またはＥｒｂＢ４中和抗体（Ｅ４ＢＡ）ありまたはなしで、細胞をＩＦＮγで一晩処理した後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）処理した。４８時間後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定して染色し、切断されたカスパーゼ−３及びＤＡＰＩを検出した。図３Ｂに示すように、ニューレグリン−４処理は、高確率の細胞で、アポトーシスの標識である切断されたカスパーゼ−３の発現を誘発した。
【０１０６】
実施例４
ニューレグリン−４の発現は、ＤＳＳ大腸炎で消失する
ＩＢＤでは、ＥｒｂＢ４に特異的なリガンドＮＲＧ４の結腸発現の減少、それによるＮＲＧ４−ＥｒｂＢ４シグナル伝達能の減少が見られる。これがＤＳＳ大腸炎モデルで再現されるかを判定するため、３％のＤＳＳで４日間処理したマウス（急性）及び４日間のＤＳＳ処理後、３日間ＤＳＳなしであったマウス（回復）からの結腸粘膜擦過から調製したＲＮＡで、ＮＲＧ４の発現を分析した。未処理のマウスと比較して、急性ＤＳＳ群及び回復ＤＳＳ群は、ＮＲＧ４の発現が有意に低下している（図４）。
【０１０７】
実施例５
ＬｙｓＭ／ＥｒｂＢ４ＦＦマウスは、ＤＳＳにおいて大幅な体重減少を示す
マクロファージを含む骨髄細胞系統にＥｒｂＢ４を欠損したマウス（ＬｙｓＭ／ＥｒｂＢ４ＦＦ）及び欠損のない同腹仔対照（ＥｒｂＢ４ＦＦ）を３％のＤＳＳで処理し、６日過ぎからＤＳＳを排除した。体重を大腸炎の重症度を示す尺度として毎日記録した。
【０１０８】
図５に示すように、ＬｙｓＭ／ＥｒｂＢ４ＦＦマウスは同腹仔対照よりも多く体重が減少し、マクロファージ内のＥｒｂＢ４の欠損が大腸炎の重症度を高める結果を示した。
【０１０９】
実施例６
マクロファージ流入時のＮＲＧ４治療は、大腸炎を改善する
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）水溶液を４日間与え、以降の３日間はＤＳＳを与えなかった。マクロファージが結腸に補充される、実験最後の４日間に、腹腔内注射により、毎日、ニューレグリン−４（１００μｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを送達した。体重を大腸炎の重症度を示す指標として毎日記録した。７日目に、マクロファージ流入のフローサイトメトリー分析及びマクロファージ発現性の炎症性サイトカインのｑＲＴ−ＰＣＲ分析のため結腸組織を収集した（図６Ａ）。フローサイトメトリー実験のために、結腸組織をディスパーゼＩＩ及びコラゲナーゼを使用して消化した後、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｂで染色した。細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ  ＦＡＣＳ装置にてフローサイトメトリーにより処理し、ＦｌｏＪｏを使用して解析した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを結腸組織から単離し、ｃＤＮＡに変換して、ＴａｑＭａｎマスターミックス及びプライマーを使用してサイトカインの発現を分析した。
【０１１０】
ニューレグリン−４で処理されたマウスでは、ＤＳＳが誘発する体重減が阻止され（図６Ｂ）、ＰＢＳ処理されたマウスと比較して、マクロファージ発現性のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦ及びＩＬ−６（図６Ｃ））の発現が低下した。フローサイトメトリーによるＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの分析により、ＤＳＳによる大腸炎の誘発後に、ＮＲＧ４治療がマクロファージ数の低下をもたらしたことが明らかとなった（図６Ｄ）。
【０１１１】
実施例７
ＥｒｂＢ４を発現しているマクロファージは、呼吸器炎症に存在する
ＥｒｂＢ４を発現しているマクロファージが呼吸器炎症にも存在するかどうかを試験するために、Ｂｕｃｋｌｅｙら，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１５（ＰＭＩＤ：  ２６１６０８７２）に従って、５０ｎｇ／肺ヒト組換えアネキシンＶを、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスからの肺切片には気管内点滴注入により、８週齢のＣ５７ＢＬマウスには気管内エアゾールにより、２週間、週２回ずつ攻撃投与した。アネキシンＶの最後の投与後１４日目（最初の点滴注入から２８日目）に、肺を固定し、パラフィン包埋して、切片化した。ＥｒｂＢ４及びＦ４／８０（マクロファージマーカー）で切片を染色した。損傷した肺に、ＥｒｂＢ４＋マクロファージ（図７、画像で矢印により示された例）が容易に検出された。
【０１１２】
実施例８
動物実験：全ての動物は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  ＃Ａ３２７６−０１）により認可及び監視された。マウスは、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｓ  ＡｎｇｅｌｅｓのＡＡＡＬＡＣ認証動物療養施設で、不断の水及び食餌を有する標準条件下に収容された。実験には、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した、８〜１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを使用した。急性大腸炎を発症させるため、３％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲水で４日間、マウスに与えた後（損傷期）、以降の３日間は飲水にＤＳＳを含有しなかった（炎症期）。以前に記載されたように（Ｌｉｎ  Ｗ，Ｍａ  Ｃ，Ｓｕ  Ｆ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｌａｉ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｔら，Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＩＢＤｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．Ｇｕｔ．２０１６；ｇｕｔｊｎｌ-２０１５-３１００９６）、完全に固まった糞を０、液状便を４とする０〜４までの一連の段階別に糞便のスコアを記録した。
【０１１３】
骨髄マクロファージ及び樹状細胞の培養：マウスから単離した骨髄を、Ｍ−ＣＳＦを含有する濾過されたＣＭＧ１４−１２条件培地（１：２０）にて培養し、以前に記載されたように骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を生成した（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｋａｊｉ  Ｋ，Ｋｕｄｏ  Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｂｅｉｎｇ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｍａｔｕｒｅ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；１５（８）：１４７７-８８、Ｋａｗａｎｅ  Ｋ，Ｆｕｋｕｙａｍａ  Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｎａｇａｓｅ  Ｈ，Ｏｈｓａｗａ  Ｙ，Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｙら，Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４（２）：１３８-４４、Ｏｋａｂｅ  Ｙ，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１４；１５７（４）：８３２-４４）。または、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＭＣ２０１５）にて、以前に記載されたように骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を生成した（Ｉｎａｂａ  Ｋ，Ｉｎａｂａ  Ｍ，Ｒｏｍａｎｉ  Ｎ，Ａｙａ  Ｈ，Ｄｅｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｉｋｅｈａｒａ  Ｓら，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．ＪＥｘｐＭｅｄ．１９９２；１７６：１６９３-７０２）。ＢＭＤＭでは、３日目に付着細胞を洗浄して、７〜８日目の実験までＭ−ＣＳＦ含有培地を再供給した。Ｍ１分化させるため、細胞を１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγによって１６時間、前処理し、その後、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによって刺激した。Ｍ２分化させるため、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｇｉｂｃｏ，ＰＭＣ００４６）にて刺激した。ＢＭＤＣでは、培養３日目にＧＭ−ＣＳＦを細胞に再供給した。７日後、付着細胞（富化された樹状細胞群）を、新しい実験用プレートにゆっくりと移した。以前に記載されたように、好中球を、パーコールによる密度勾配分離によってＣ５７／Ｂｌ７マウスの骨髄から単離した（Ｂｏｘｉｏ  Ｒ，Ｂｏｓｓｅｎｍｅｙｅｒ−Ｐｏｕｒｉe  Ｃ，Ｓｔｅｉｎｃｋｗｉｃｈ  Ｎ，Ｄｏｕｒｎｏｎ  Ｃ，Ｎusｅ  Ｏ．Ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｊａｎ  １４；７５（４）：���０４-１１）。簡潔には、１００％のパーコール（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７−０８９１−０１）（パーコール９部：ＰＢＳ１部）を、ＰＢＳを使用して７８％、６９％及び５２％溶液に希釈して、骨髄を最上層として５ｍＬ管中に重層した。１５００ｇで３０分間遠心後、７８％と６９％との境界にある細胞層を単離して、次の試験に使用した。
【０１１４】
免疫蛍光染色：カバーグラス上で増殖したＢＭＤＭを、３０分間、氷冷アセトンで固定し、１０％のヤギ血清で室温にて１時間ブロッキングして、１：２００比の一次抗体及びＥｒｂＢ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２８３）と共に一晩培養した。抗原性ペプチドの競合対照を実施して、特異性を確認した。細胞を洗浄し、室温にて１時間、１：１０００の二次ウサギ抗マウスＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した後、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｈ−１５００）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤によって封入した。
【０１１５】
リアルタイムＰＣＲ：オンカラムでのＲＮＡ単離及び精製（ＯＭＥＧＡ  Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、細胞及び組織からＲＮＡを収集し、高効率ｃＤＮＡ逆転写酵素キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３６８８１４）にてｃＤＮＡを生成した。発現の定量分析を、ＴａｑＭａｎアッセイ（ＥＧＦＲ（Ｍｍ０１１８７８５８＿ｍ１）、ＥｒｂＢ２（Ｍｍ００６５８５４１＿ｍ１）、ＥｒｂＢ３（Ｍｍ０１１５９９９９＿ｍ１）、ＥｒｂＢ４（Ｍｍ０１２５６７９３＿ｍ１）、ＮＲＧ４（Ｍｍ００４４６２５４＿ｍ１）、ＩＦＮγ（Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍ１）、ＩＬ１β（Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ＴＮＦ（Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１）、ＩＬ６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）及びＩＬ１２（Ｍｍ００４３４１６９＿ｍ１）、ＨＰＲＴ（Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ１）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅサーモサイクラーにて実施した。変化倍率は、２−ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１；２５（４）：４０２-８）を使用して算出した。結果は、参照遺伝子としてＨＰＲＴを使用して、対照群または非治療群と比較した遺伝子発現の平均倍率変化として表す。
【０１１６】
ウエスタンブロッティング：細胞及び組織からタンパク質溶解物を収集し、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害物質カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃１８６１２７８）ならびにホスファターゼ阻害剤カクテル２及び３（Ｓｉｇｍａ，Ｐ５７２６  及び  Ｐ００４４）を含む、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した（Ｆｒｅｙ  ＭＲ，Ｅｄｅｌｂｌｕｍ  ＫＬ，Ｍｕｌｌａｎｅ  ＭＴ，Ｌｉａｎｇ  Ｄ，Ｐｏｌｋ  ＤＢ．Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ４  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＮＦ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３６（１）：２１７-２６）。タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃５００）によって測定した。３０μｇのタンパク質／コンディショニングを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＷ０４１２Ａ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレンへ転写した。メンブレンを５％乳でブロッキングし、１：１０００のＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃４２６７）、１：１０００のＥｒｂＢ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃２１６５）、１：１０００のＥｒｂＢ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃１２７０８）、４℃で一晩の場合には１：１０００のウサギ抗ＥｒｂＢ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２８３）、または室温にて１時間の場合には１：１０，０００のマウス抗アクチン（Ｓｉｇｍａ，Ａ１９７８）を用いて標識し、続いて室温にて１時間、１：１０，０００のＩＲＤｙｅをコンジュゲートしたロバ抗ウサギ（ＬＩ−ＣＯＲ，＃９２６−６８０２３）及びロバ抗マウス（ＬＩ−ＣＯＲ，＃９２６−３２２１２）にて標識し、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージング装置（ＬＩ−ＣＯＲ）で定量化した。
【０１１７】
マウス細胞の生存率及びアポトーシスのアッセイ：１ウェルにつき細胞４０，０００個となるように、ＢＭＤＭを９６穴プレートに入れた。細胞を洗浄して、１０％の加熱不活化したＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシン、ならびに所与の１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγを加えたＤＭＥＭ中で一晩プレート培養した。一部の実験では、更に細胞を、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ４中和抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０５−４７８）（Ｊａｙ  ＳＭ，Ｋｕｒｔａｇｉｃ  Ｅ，Ａｌｖａｒｅｚ  ＬＭ，Ｄｅ  Ｐｉｃｃｉｏｔｔｏ  Ｓ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＪＦら，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂｉａｓ  ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（３１）：２７７２９-４０）で３０分間、前処理した後、１００ｎｇ／ｍＬのＮＲＧ４（Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ）と共に１時間、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に４８時間、培養した。結果に記載されているようにＮＲＧ４及びＬＰＳによる治療前に、一部の細胞を、１０μＭのメタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（Ｔｏｃｒｉｓ，＃２９８３）、１０μＭのγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（Ｔｏｃｒｉｓ，＃２６３４）または３μＭのＡＤＡＭ１７阻害剤ＧＷ２８０２６４Ｘ（Ａｏｂｉｏｕｓ，Ｉｎｃ．）にて前処理した。相対的な細胞数を、製造業者の取扱説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ８０８１）に従って、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（レサズリンベースのアッセイ）によって測定した。ＢＭＤＭ中の活性なカスパーゼ−３を分析するため、細胞を氷冷アセトンで３０分間、固定し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９６６９）にプレコンジュゲートされたカスパーゼ−３断片に対する抗体と共に４℃で一晩培養した。翌日、細胞をＰＢＳで５分ずつ５回洗浄して、画像撮影した。アポトーシスイベントを累積的に観察するため、本発明者らは、アネキシンＶ染色により膜ホスファチジルセリンの反転の分析を実施した。治療後の細胞を、アネキシンＶアポトーシスキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖ１３２４１）を使用してアネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物で染色し、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて分析した。
【０１１８】
ヒト骨髄細胞の一次培養、ＭＤＭ分化及び細胞生存率：Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内倫理委員会によって承認及び監視されるプロトコルに従って、インフォームドコンセントを得た。乾癬、ＳＬＥ、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む自己免疫／炎症性疾患の個人歴若しくは家族歴のない健常な個人、またはＨＩＶ歴のない健常な個人を募集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＤ１４ポジティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）または接着によって単球をＰＢＭＣから精製して、純度を試験し、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えて、７日間培養し、１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下でＭＤＭに分化させた。ＭＤＭを、ＮＲＧ４あり、またはなしで、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｍ１分化）または２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｍ２分化）で刺激した。記載の場合では、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒテクノロジー（Ａｍａｘａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＥｒｂＢ４（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に対する、１００ｎＭのスクランブルしたｓｉＲＮＡ、またはＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（４種類の商用設計済みｓｉＲＮＡのプール）を培養液に導入した。アネキシンＶ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーによってアポトーシスを検出した。透過性細胞中の細胞内タンパク質を、抗ＥｒｂＢ４（Ａｂｃａｍ，ａｂ３２３７５）を用いてフローサイトメトリーによって検出した。
【０１１９】
フローサイトメトリー：単一の細胞懸濁液を生成するために、以前に記載されたように、結腸粘膜を単離して、２％の熱不活化ＦＢＳ、０．２ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ４６９３）、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ，＃１１０８８８８２００１）及び０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ，ＤＮ２５）を含む、１００ｍＬのＤＭＥＭ中にて３７℃で３０分間、消化した（Ｐｕｎｉｔ  Ｓ，Ｄｕｂe  ＰＥ，Ｌｉｕ  ＣＹ，Ｇｉｒｉｓｈ  Ｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｐｏｌｋ  ＤＢ．Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１５；１４９（４）：９９３-１００５．ｅ２）。個体群分析の実験のため、４％のホルムアルデヒドで細胞を固定し、続いて０．０１％のサポニンで透過処理した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％の熱不活性化ＦＢＳ）中でＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５３１４２，１：１００）と共に１５分間、細胞を培養し、続いて抗体Ｆ４／８０−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＦ４８０２０，１：１００）、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＲＭ２８０５，１：１００）、及びＬｙ６Ｃ−ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６２７２７，１：１００）をプレコンジュゲートした蛍光色素分子と共に、３０分間培養した。また、モノクローナルＥｒｂＢ４に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ３２３７５，１：４０）と共に３０分間、続いて抗ウサギＰＥ（Ａｂｃａｍ，Ａ１０５４２，１：１００）と共に３０分間、細胞を培養した。細胞をＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて分析した。
【０１２０】
統計方法：統計解析及びプロットは、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して生成した。平均＋／−ＳＥＭをバーグラフで記述した。多重比較の補正のため、必要に応じて、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙ事後検定を使用して、統計的差を判定した。統計的有意差は、ｐ＜０．０５と指定した。
【０１２１】
マクロファージの古典的活性化はＥｒｂＢ４の発現を誘発する一方で、代替的活性化はそれを阻害する
ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼは、その上皮細胞増殖及び遊走での役割について主に研究されてきた。しかしながら、最近の研究で、このファミリーの一部のメンバーはマクロファージを含む免疫細胞にも存在することが明らかになった（ＴｙｎｙａｋｏｖＳａｍｒａ  Ｅ，Ａｕｒｉｅｌ  Ｅ，Ｌｅｖｙ−Ａｍｉｒ  Ｙ，Ｋａｒｎｉ  Ａ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＥｒｂＢ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  Ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ  Ｉｎｔ．２０１１；２０１１：５６１２６２、Ｌｕ  Ｎ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃａｏ  Ｈ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｖａｎ  Ｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫら，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９２（３）：１０１３-２３）。この受容体ファミリーのうち生化学的に最も異なるメンバーであるＥｒｂＢ４は、炎症した組織中に誘発される（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＪＫ，ＭｃＣａｎｎ  ＳＰ，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｖ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｆｒｅｙ  ＭＲ．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−４  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｎｏｖ  １６；２８７（４７）：３９８５０-８）が、マクロファージ中で役割を有するかどうかについては検討されていなかった。
【０１２２】
マクロファージは、様々な炎症性及び抗炎症性機能に加え、組織修復を実行する一連のサブタイプを従えて存在する。マクロファージを、細菌クリアランスに関与する炎症性状態（古典的活性化Ｍ１）、または恒常性及び治癒促進性反応に関与する抗炎症性状態（代替活性化Ｍ２）へと誘導することで、インビトロでその機能を実験的に評価することができる（Ｍｏｓｓｅｒ  ＤＭ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＪＰ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；８（１２）：９５８-  ６９）。本発明者らは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を産生して、Ｍ１及びＭ２状態へと分化させ、ｑＰＣＲによってＥｒｂＢファミリーメンバーの発現パターンを測定した。インターフェロン（ＩＦＮ）γ＋リポポリサッカリド（ＬＰＳ）による古典的活性化は、６時間後に１０倍のＥｒｂＢ４を誘発した。一方、対照的に、他のＥｒｂＢファミリーメンバーであるＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３は全て有意に減少した（図１Ａ）。本発明者らは、ＩＦＮγ＋ＬＰＳによる炎症性活性化の後、継代マクロファージ細胞株、ＲＡＷ２６７．０１中でのＥｒｂＢ４のｍＲＮＡの誘導も観察した（データ示さず）。この反応が炎症性Ｍ１活性化に特異的であったかどうかを試験するために、本発明者らは、インターロイキン（ＩＬ）−４による、マクロファージのＭ２状態への代替的分化についても検討した。Ｍ２分化は、ＥｒｂＢ４を誘発せず、代わりにＥｒｂＢ４の発現の有意な減少をもたらした（図１Ｂ）。これらのデータは、マクロファージ集団の中で、ＥｒｂＢ４は主に炎症性細胞に限られていることを示唆している。
【０１２３】
他の自然免疫細胞（樹状細胞及び好中球）も、細菌の細胞膜ＬＰＳに反応し得るため（Ｌｉｎｇ  ＧＳ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ，Ｗｏｏｌｌａｒｄ  ＫＪ，Ｓｚａｊｎａ  Ｍ，Ｆｏｓｓａｔｉ−Ｊｉｍａｃｋ  Ｌ，Ｔａｙｌｏｒ  ＰＲら，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＣＤ１１ｂ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＴＬＲ４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３０３９-５１）、ＥｒｂＢ４の誘発が、生来の骨髄性細胞におけるＴＬＲ４誘発性シグナル伝達の一般的特徴であるかどうかを、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＩＦＮγ＋ＬＰＳに曝露する、または骨髄から単離した好中球をＬＰＳに曝露することにより試験した。ＬＰＳによって刺激されたＢＭＤＣは、異なるプロファイルのＥｒｂＢ調節を示し、ＥｒｂＢ４はこれらの細胞に検出されなかった（図１Ｃ）。更に、ＬＰＳによって刺激された骨髄から単離された好中球も、ＥｒｂＢ４は検出不能なレベルであった（図１Ｄ）。このことは、ＬＰＳによるＥｒｂＢ４の誘発は、一般的なＴＬＲ４反応よりむしろ、マクロファージに特異的な結果であることを示唆している。
【０１２４】
タンパク質レベルでＭ１マクロファージにＥｒｂＢ４が誘発されることを確認するために、免疫蛍光法及びウエスタンブロット分析を実施した。ＬＰＳを攻撃投与されたマクロファージ上の免疫蛍光染色は、形質膜及び細胞内の両方で、ＥｒｂＢ４タンパク質発現の上昇を示した（図１Ｅ）。このパターンは、全長形態及びタンパク質分解により切断された細胞内ドメイン（４ＩＣＤ）形態の受容体両方の発現と一致している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＣＣ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＧ，Ｖｉｄａｌ  ＧＡ，Ｂｕｒｏｗ  ＭＥ，Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢＳ，Ｍａｒｒｅｒｏ  Ｌら，Ｔｈｅ  ＥＲＢＢ４／ＨＥＲ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ａｓ  ａ  ＳＴＡＴ５Ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；１６７（３）：４６９-７８）。ＥｒｂＢ４タンパク質の誘発（全長及び４ＩＣＤの両方）は、ナイーブとＭ１マクロファージとの対比（図１Ｆ）及びＬＰＳ処理されたＲＡＷ２６７．０１細胞のウエスタンブロット分析によっても観察された。
【０１２５】
ＥｒｂＢ４に特異的なリガンドＮＲＧ４は、炎症性マクロファージアポトーシスを誘発する
炎症性マクロファージ生物学におけるＥｒｂＢ４の役割を決定するために、腸組織に発現したＥｒｂＢ４に特異的なリガンドＮＲＧ４を使用して、これらの細胞のシグナル伝達を刺激した。４８時間の処置後、Ｍ２マクロファージではなくＭ１マクロファージにおいて細胞数の有意な減少を観察した。これは、ＮＲＧ４がＭ１マクロファージの増殖または生存を選択的に阻害することを示している（図８Ａ）。マクロファージのＬＰＳ活性化が、細胞増殖を停止させることが報告されており、本発明者らはＥｄＵ染色によって培養組織内でこのことを確認した。更に、ＮＲＧ４の有無に関わらず、ＥｄＵの取り込み率に変化は見られず、増殖に対する効果は除外された。そこで、ＥｒｂＢ４活性化が細胞死を誘発しているかどうかを検討した。ＮＲＧ４への曝露により、切断されたカスパーゼ−３の染色に有意な増加が生じた（図８Ｂ）。このことは、これらの細胞の末期アポトーシスが進行していることを表す。この反応はＥｒｂＢ４中和抗体による前処理によってブロックされたことから、ＮＲＧ４−ＥｒｂＢ４結合の必要性を示した。経時的なアポトーシスの累積イベントを評価する、別のアポトーシス指標として、アネキシンＶ分析を実施した。切断されたカスパーゼ−３の結果と同様に、アネキシンＶ染色は、ＮＲＧ４による治療に反応してアポトーシスの有意な増加を示した（図８Ｃ）。これらの結果は、炎症性マクロファージ内でのＥｒｂＢ４シグナル伝達の刺激が、これらの細胞の蓄積を制限する機構であることを示唆している。
【０１２６】
ＮＲＧ４により誘発されるマクロファージ死は、プロテアーゼ活性を必要とする
（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、続いてγ−セクレターゼによる）ＥｒｂＢ４のリガンド誘導性の２段階タンパク質分解切断は、一部の細胞型で発生する。その結果、生じる可溶性の４ＩＣＤ細胞内ドメイン断片は、細胞質、核またはミトコンドリアに局在し、細胞挙動を調節し得る（図９Ａ）。特に、乳癌細胞では、４ＩＣＤとミトコンドリアとの結合がアポトーシスを刺激するが（Ｎａｒｅｓｈ  Ａ，Ｌｏｎｇ  Ｗ，Ｖｉｄａｌ  ＧＡ，Ｗｉｍｌｅｙ  ＷＣ，Ｍａｒｒｅｒｏ  Ｌ，Ｓａｒｔｏｒ  ＣＩら，Ｔｈｅ  ＥＲＢＢ４／ＨＥＲ４  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ４ＩＣＤ  ｉｓ  ａ  ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；６６（１２）：６４１２-２０）、非形質転換細胞において、これは観察されなかった。本発明者らは、プロテアーゼ阻害剤を使用して、この機構がＮＲＧ４により誘発されるマクロファージアポトーシスで役割を果たし得るかどうかを試験した。γ−セクレターゼ（ＤＡＰＴ，１０μＭ）、広範なメタロプロテアーゼ活性（ＧＭ６００１，１０μＭ）またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７（ＧＷ２８０２６４Ｘ，３μＭ）のいずれかの阻害は、ＮＲＧ４により誘発される細胞死を妨げた（図９Ｂ）。この観察と一致して、ＥｒｂＢ４はＮＲＧ４による治療後、マクロファージ内のミトコンドリアと共局在した（図９Ｃ）。このことは、ＮＲＧ４の効果が４ＩＣＤ世代を経て、場合によりミトコンドリアのアポトーシス経路を刺激し得ることを示唆している。
【０１２７】
古典的活性化されたヒトマクロファージは、ＥｒｂＢ４を発現し、ＮＲＧ４刺激に応答してアポトーシスを受ける
ヒト生物学と本発明者らの知見との関連を評価するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、マクロファージを産生して分化させ、フローサイトメトリーによりＥｒｂＢ４の発現を評価した。マウス細胞と同様に、ヒトマクロファージの炎症性Ｍ１活性化はＥｒｂＢ４の発現を誘発し、ここではフローサイトメトリーによりタンパク質の発現を評価した（図１０Ａ）。誘発は、刺激後少なくとも９６時間持続した。このことは、リガンドに対する応答能が経時的に維持されることを示唆している。これらの細胞のＭ２代替的活性化は、ＥｒｂＢ４のレベルに影響を及ぼさなかった（図１０Ａ）。マウスでの知見と同様に、ＮＲＧ４への曝露は、アネキシンＶ染色により測定されたように、ヒトＭ１マクロファージの用量依存的アポトーシスを誘発した（図１０Ｂ）。ｓｉＲＮＡによる効果的なＥｒｂＢ４ノックダウン（図１０Ｃ）は、この反応を阻害し（図１０Ｂ）、受容体特異性が確認された。本発明者らの知見は、複数種間でのマクロファージ生物学においてＥｒｂＢ４のシグナル伝達軸が果たす保存的な役割を示唆しており、ヒトの健康維持にこのフィードバック機構が潜在的に関連することを裏付けている。
【０１２８】
ＥｒｂＢ４は、ＤＳＳ大腸炎時に誘発され、Ｌｙ６Ｃ＋炎症性マクロファージに発現する
マクロファージで発現したＥｒｂＢ４が、生体内での腸炎症性疾患に役割を果たしているかどうかを判定するために、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によるマウス大腸炎の実験的モデルにおいて、補充されたマクロファージでＥｒｂＢ４が発現するかどうかを試験した。このモデルで、Ｌｙ６Ｃ＋炎症性マクロファージの流入は、病原性にとって重要である（Ａｘｅｌｓｓｏｎ  ＬＧ，Ｌａｎｄｓｔｒoｍ  Ｅ，Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ＴＪ，Ｇｒoｎｂｅｒｇ  Ａ，Ｂｙｌｕｎｄ−Ｆｅｌｌｅｎｉｕｓ  ＡＣ．Ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  （ＤＳＳ）  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＣＤ４（＋）−ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ａｔｈｙｍｉｃ  ａｎｄ  ＮＫ−ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．１９９６；４５（４）：１８１-９１、Ｚｉｇｍｏｎｄ  Ｅ，Ｖａｒｏｌ  Ｃ，Ｆａｒａｃｈｅ  Ｊ，Ｅｌｍａｌｉａｈ  Ｅ，Ｓａｔｐａｔｈｙ  ＡＴ，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  Ｇら，Ｌｙ６Ｃｈｉ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｇｉｖｅ  ｒｉｓｅ  ｔｏ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１２；３７（６）：１０７６-９０）。３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを飲水で４日間、マウスに与え、急性結腸損傷（損傷期）を誘発させ、以降の３日間はＤＳＳを与えなかった（炎症期）。以前に公開済みの知見（Ｆｒｅｙ  ＭＲ，Ｅｄｅｌｂｌｕｍ  ＫＬ，Ｍｕｌｌａｎｅ  ＭＴ，Ｌｉａｎｇ  Ｄ，Ｐｏｌｋ  ＤＢ．Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ４  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＮＦ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３６（１）：２１７-２６）と一致して、単細胞分離された粘膜のフローサイトメトリー分析によって、結腸内のＥｒｂＢ４＋細胞が全体的に増加することを確認した（図１１Ａ）。また、予測通りに、結腸内のＦ４／８０＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ数は、７日目の炎症期に有意に増加した（図１１Ｂ）。これらの細胞でのＥｒｂＢ４の発現の特徴を決定するために、ＥｒｂＢ４に加えて、炎症時に、組織に補充される炎症単球／マクロファージを表すＬｙ６Ｃについても、Ｆ４／８０＋／ＣＤ１１ｂ＋集団を分析した。炎症期までに、Ｌｙ６Ｃ＋／ＥｒｂＢ４＋マクロファージの新規集団が、結腸内に出現した（図１１Ｃ）。ＥｒｂＢ４＋マクロファージの大多数はＬｙ６Ｃ＋であったため、Ｌｙ６Ｃ−／ＥｒｂＢ４＋集団に有意な変化はなかった。総合すると、これらの結果は、炎症時に結腸に補充された炎症性Ｌｙ６Ｃ＋マクロファージに、ＥｒｂＢ４が発現することを示している。
【０１２９】
ＮＲＧ４はＤＳＳ大腸炎によって抑制され、炎症を起こした結腸のマクロファージ量は再投与により減少する
ヒトＩＢＤ及びマウス慢性大腸炎では、ＥｒｂＢ４に特異的なリガンドＮＲＧ４の発現が消失し、ＥｒｂＢ４シグナル伝達軸が調節不全になる可能性があることを前述した（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＪＫ，ＭｃＣａｎｎ  ＳＰ，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｖ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｆｒｅｙ  ＭＲ．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−４  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｎｏｖ  １６；２８７（４７）：３９８５０-８）。ＮＲＧ４は結腸間葉に最も顕著に発現するが（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＪＫ，  ＭｃＣａｎｎ  ＳＰ，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｖ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｆｒｅｙ  ＭＲ．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−４  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｎｏｖ  １６；２８７（４７）：３９８５０-８）、Ｆｅｎｇ及びＴｅｉｔｅｌｂａｕｍは、上皮の発現も検出し（Ｆｅｎｇ  Ｙ，Ｔｓａｉ  Ｙ，Ｘｉａｏ  Ｗ，Ｒａｌｌｓ  ＭＷ，Ｓｔｏｅｃｋ  Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＬら，Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１７−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｌｐｈａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；３５（２１）：３６０４-２１）、本発明者らは腸細胞及び免疫細胞での発現調節を検出した。このように、ＮＲＧ４は、結腸の複数の細胞型に由来する可能性が高い。大腸炎でのＮＲＧ４の消失が、損傷／炎症サイクル早期の急性進行状態によって引き起こされるかどうかを判定するため、３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを４日間与え（損傷期）、ＤＳＳ後３日間経つ（炎症期）マウスからの結腸組織を分析した。ＮＲＧ４の発現は損傷期に減少し、更に炎症期の間も、ダウンレギュレーションが観察された。このことは、ＮＲＧ４の抑制が、早期に結腸内で発生し、炎症性マクロファージが補充される間、維持されることを示す（図１２Ａ）。予測されたように、組織及びマクロファージで誘導される炎症性サイトカイン、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１β及びＩＬ−１２の増加は、ＤＳＳ処置以降も観察された（図１２Ａ）。以前の報告は、炎症性サイトカインが脂肪細胞内（Ｗａｎｇ  ＧＸ，Ｚｈａｏ  ＸＹ，Ｍｅｎｇ  ＺＸ，Ｋｅｒｎ  Ｍ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ａ，Ｃｈｅｎ  Ｚら，Ｔｈｅ  ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ｎｒｇ４  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｎｏｖ  １７；２０（１２）：１４３６-４３）、または腸内（Ｆｅｎｇ  Ｙ，Ｔｓａｉ  Ｙ，Ｘｉａｏ  Ｗ，Ｒａｌｌｓ  ＭＷ，Ｓｔｏｅｃｋ  Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＬら，Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１７−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｌｐｈａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；３５（２１）：３６０４-２１、Ｆｅｎｇ  Ｙ，Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ＤＨ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＴＮＦ−α  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１２；３０２（２）：Ｇ２３６-４９）でのＮＲＧ４の発現を阻害し得ることを示唆した。これらの観察結果と一致して、ＴＮＦとＮＲＧ４との間に有意な負の相関（ｒ＝−０．４２１、ｐ＝０．０２）が見られた（図１２Ｂ、Ｃ）。これらの観察結果は、結腸炎症の開始時に、ＮＲＧ４の発現の阻害が急性的に発生することを示しており、ＩＢＤにおいてＮＲＧ４が消失することを示した本発明者らの先の研究を強化するものである。更に、これらの知見は、ＮＲＧ４の発現がＴＮＦによって直接、またはＴＮＦを誘発する同じ病原性プロセスによって抑制され得ることを示唆している。
【０１３０】
大腸炎時にＮＲＧ４の交換により、マクロファージ集団が治療的に変化するかどうかを試験するために、マウスにＤＳＳを与え、大腸炎が確定された後、４日目〜７日目のマクロファージ流入が最大である期間にＮＲＧ４（１００μｇ／ｋｇ）を毎日腹腔内注射して治療した（図１１Ｂ）。ＮＲＧ４治療により、ＤＳＳにより誘発された体重減から回復し（図１２Ｄ）、マクロファージにより発現された炎症性サイトカインＴＮＦ、ＩＬ６及びＩＦＮγのレベルが低下し（図１２Ｅ）、大腸短縮及び下痢が改善された（図１２Ｆ）。Ｆ４／８０ＨＩ／ＣＤ１１ｂＨＩ細胞の結腸単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、本発明者らのインビトロでの観察と一致し、ＮＲＧ４治療が結腸組織においてマクロファージ数を３６％減少させることを示した（図１２Ｇ、Ｈ）。したがって、確定された急性大腸炎において治療的に与えられた場合、ＮＲＧ４は結腸でのマクロファージ数を減少させ、疾患を改善する。
【０１３１】
炎症の調節不全はＩＢＤを含めた多くの慢性疾患の根源的な特徴である。一過性の損傷及び外来性微生物との相互作用が頻繁である腸管においては、組織炎症を急速かつ攻撃的に開始し、攻撃対象を効果的に消失させる必要があるが、宿主損傷及び慢性を防止するために効率的に緩和されることも必要である。したがって、抗炎症フィードバック機構は、恒常性を維持するために炎症性反応を速やかに終結させなければならない。本明細書で本発明者らは、ＥｒｂＢ４のシグナル伝達がこのような機構の一例を示すという新規の知見を報告している。これは、炎症性マクロファージ死による結腸炎症の消散を促進する、数少ない既知の組織由来シグナルの１つである。
【０１３２】
マクロファージは、腸内炎症の重要な媒介因子である。炎症性Ｌｙ６Ｃ＋マクロファージは、適応免疫応答の補充及び活性化を調製し、上皮損傷及びバリア機能の喪失をもたらし得る炎症因子（ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２）を攻撃的に分泌する。したがって、異常な、または慢性の炎症を防止するためには、これらの細胞の厳密な制御が必要である。動物モデルでは、血流から補充されたＬｙ６Ｃ＋マクロファージが炎症を増強する。このことは、過敏性反応が疾患の一因となり得ることを示唆している。対照的に、組織常在性マクロファージ集団（ＣＸ３ＣＲ１＋）は抗炎症シグナルを統合して、分泌することにより、腸炎を予防し、組織の修復及び回復を促進する。マクロファージ集団における、サブセットに特異的な調節機構を特定することは、これらの集団の治療的な利用に向けた重要なステップである。本発明者らの結果は、ＥｒｂＢ４がナイーブまたは抗炎症性のマクロファージではなく、Ｌｙ６Ｃ＋炎症性マクロファージの細胞生存を特異的に制限する、重要なシグナル伝達経路であることを示している（図８）。
【０１３３】
このデータは、マクロファージの炎症性活性化がＥｒｂＢ４受容体の強固な発現を誘発すること、及び急性大腸炎が、ＥｒｂＢ４を発現するマクロファージの補充と関連することを示している（図１及び図１１）。近年、数多くの研究報告で、従来、上皮細胞機能の調節への関与が示唆されていた増殖因子受容体、例えばＥＧＦＲ／ＥｒｂＢファミリーメンバー、ＦＧＦＲ及びＩＧＦ−Ｒなどが、造血細胞系統にも発現することが明らかにされた。しかしながら、現在まで、その発現を調節するもの、またはＥｒｂＢ受容体が免疫細胞において果たす役割については、ほとんどわかっていない。増殖因子シグナルは、上皮内での確立された増殖促進機能及び生存機能と比べて、免疫細胞内では極めて異なる機能を実行し得る。しかしながら、マクロファージサブタイプの発現、マクロファージ生物学におけるＥｒｂＢ４の機能的役割、及び結腸マクロファージでのＥｒｂＢ４の発現は、現在まで特定されていなかった。
【０１３４】
マクロファージ内のＥｒｂＢ４シグナル伝達が細胞死を導くという知見は、非形質転換細胞に関する以前の研究において、主に生存促進性の役割が観察されたという点で予想外に思われるだろう（Ｍaaｔｔa  ＪＡ，Ｓｕｎｄｖａｌｌ  Ｍ，Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ＴＴ，Ｐｅｒｉ  Ｌ，Ｌａｉｎｅ  ＶＪＯ，Ｉｓｏｌａ  Ｊら，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＥｒｂＢ４  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００６；１７（１）：６７-７９、Ｋａｎｇ  ＨＧ，Ｊｅｎａｂｉ  ＪＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｋｅｓｈｅｌａｖａ  Ｎ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｈ，Ｍａｙ  ＷＡら，Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｗｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｏｉｋｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ４  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（７）：３０９４-１０５；Ｂｅｒｎａｒｄ  ＪＫ，ＭｃＣａｎｎ  ＳＰ，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｖ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｆｒｅｙ  ＭＲ．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−４  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｎｏｖ  １６；２８７（４７）：３９８５０-８）。乳癌細胞でのＥｒｂＢ４に対するアポトーシス反応は以前に観察されていたが、本発明者らの知見はマクロファージについての類似の機構に関わり得るものである。マクロファージ（図９）及び乳癌細胞いずれの場合にも、受容体の切断及び４ＩＣＤ細胞内シグナル伝達断片の産生を示す可能性が高い、ニューレグリンで刺激されるアポトーシスに、タンパク分解活性が必要であると思われる。ＮＲＧ４治療されたマクロファージでは、免疫染色パターンが、ミトコンドリアに対する４ＩＣＤの局在と一致しており、ミトコンドリア媒介性アポトーシスが作用様式であり得る（図９Ｃ）。相対的な受容体のレベルが役割を果たしているか、または４ＩＣＤの局在性を調節する細胞内シャペロンの発現差（細胞質、核、ミトコンドリアの対比）が関与している場合がある。更に、ＥｒｂＢ４は、シグナル伝達結果の差の一因となり得る複数のスプライス変異体を有する。例えば、細胞質ドメインの変異体ＣＹＴ１は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を誘発するＳＨ２結合部を有し、これに対してＣＹＴ２変異体は有しない。Ｅｌｅｎｉｕｓのグループは、繊維芽細胞を使用して、アイソフォームの特異的反応を比較し、代替的状況下で、ＥｒｂＢ４が細胞生存または細胞死のいずれをも促進できることを示した。マクロファージのシグナル伝達結果における、スプライシング、環境的状況及び他の相互作用経路の相対的役割を評価するため、更なる研究が必要である。
【０１３５】
マクロファージによって発生する自然炎症は、主に自己制限プロセスと考えられてきた。しかしながら、粘膜炎症の消散は活性プロセスであることが明らかになりつつある。したがって、炎症の消散する機構を理解することが、この分野の重要な課題として浮上した。マクロファージのクリアランスを誘導する機構は、よく理解されていない。慢性炎症において、これらの細胞は循環からの補充によって継続的に補給され、フィードフォワードループを生成し得る。慢性炎症の一因となり得る１つの態様は、これらの細胞の適切な自己終結の不全である。大腸炎では、ＮＲＧ４の発現が阻害され、ＥｒｂＢ４のシグナル伝達回路が不完全、または変更されることになる。本明細書で、本発明者らは、ＮＲＧ４のこの消失が急性大腸炎モデルの早期に発生すること、及びＮＲＧ４レベルがＴＮＦ発現と負に相関していること（図１２）を示すことによって以前の知見を強化した。ＤＳＳ大腸炎の損傷が誘発された後、消失したＮＲＧ４を外因性投与によって補充し、この回路を終結することにより、炎症が有意に減衰し、結腸マクロファージ数が減少した（図１２）。ＥｒｂＢ４の発現は、骨髄由来の樹状細胞及び好中球で検出されなかった（図１）。マクロファージは、ＥｒｂＢ４の発現が検出された唯一の骨髄細胞であることから、本発明者らのＮＲＧ４レスキュー実験の結果と合わせて、この知見は、マクロファージのＥｒｂＢ４シグナル伝達が大腸炎の抗炎症フィードバック機構であるという見解を裏付ける。ＮＲＧ４のダウンレギュレーションが、攻撃に対する最大限の自然免疫応答のために必要であり得、再発現の不全は慢性大腸炎の一因となり得る可能性がある。将来の研究によって、結腸でのＮＲＧ４の主要な細胞源及びＮＲＧ４の発現を調節する方法を特定することにより、慢性大腸炎の原因である可能性がある機構に対する洞察が得られるであろう。更に、マクロファージは免疫応答の発生を形成する初期の応答細胞であるため、マクロファージでのＥｒｂＢ４の消失が、大腸炎の発生及び消散に関与し得る方法で、適応免疫にどのような影響を与え、微生物相などの局在化因子を潜在的に変化させるかを理解するには、長期のインビボ研究が必要となる。
【０１３６】
要約すると、本発明者らのデータは、炎症時に、ＥｒｂＢ４がフィードバック阻害の様式として、マクロファージに誘発されることを示している。ＥｒｂＢ４の活性化は、炎症性マクロファージのクリアランスを誘発し、回復を促進する。ＮＲＧ４の外因性投与、またはこれらの細胞でのＥｒｂＢ４シグナル伝達を活性化する他の方法を特定することは、ＩＢＤ患者及び慢性のマクロファージ依存的炎症を有する他の患者の疾患を緩和するための有望な手法である。更に、異なる細胞型では、ＥｒｂＢ４のシグナル伝達が正反対の役割をすること、即ち、マクロファージのアポトーシスを誘導する一方で、上皮の生存を支援することは、損傷及び炎症に対して、ＥｒｂＢ４のシグナル伝達が協調的な回復促進の役割を果たすことを示唆している。
【０１３７】
本発明の各種実施形態は上述した通りである。これらの記述は上記の実施形態を直接説明しているが、本明細書に記載されかつ説明される具体的な実施形態に対して、当業者は改変及び／または変形例を考案し得ることが理解される。本記述の範囲内に含まれる、いかなるこのような改変及び／または変化も同様にその中に含まれることが意図される。特に記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲における単語及び用語は、当技術分野の当業者にとって、通常及び使い慣れた意味を与えられることを本発明者らは意図する。
【０１３８】
本発明の各種実施形態に関する前述の記述は、本出願の提出時点で本出願人に既知であるものを提示しており、例示及び説明目的を意図したものである。本発明の記載は、網羅的であることも、開示された厳密な形態に本発明を限定することも意図しておらず、上記の教示に照らして多くの改変及び変形例が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理及びその実際の適用を説明するため、かつ、当業者が、企図される特定の用途に適合するように、各種実施形態に及び各種改変を加えて本発明を利用できるようにするために有用である。したがって、本発明は本発明を実施するために開示された特定の実施形態に限定されるものではないことが意図される。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態を提示及び記載したが、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそれよりも広い態様から逸脱することなく、変更及び改変を行えることは当業者に明らかであろう。一般に本明細書で使用される用語は、通常「開放的」用語であること（例えば、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は「を含んでいるが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「ｈａｖｉｎｇ」は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」は「含むが、限定されない」と解釈されるべきであるなど）を意図することを当業者は理解されよう。
【図１−１】
2017109987.tif 000002
【図１−２】
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【図２】
2017109987.tif 000004
【図３】
2017109987.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2017109987.tif 000008
【図６Ｂ】
2017109987.tif 000009
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
2017109987.tif 000012
【図８】
2017109987.tif 000013
【図９Ａ】
2017109987.tif 000014
【図９Ｂ】
2017109987.tif 000015
【図９Ｃ】
2017109987.tif 000016
【図１０Ａ】
2017109987.tif 000017
【図１０Ｂ】
2017109987.tif 000018
【図１０Ｃ】
2017109987.tif 000019
【図１１】
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【図１２−１】
2017109987.tif 000021
【図１２−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月15日(2016.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【図１−１】本発明の実施形態に従って、マクロファージの炎症性活性化がインビトロでＥｒｂＢ４の発現を誘発することを表す。（図１Ａ）ＩＦＮγ／ＬＰＳにより古典的活性化されたＢＭＤＭ、（図１Ｂ）ＩＬ−４により代替的活性化されたＢＭＤＭ、（図１Ｃ）ＩＦＮγ／ＬＰＳにより活性化されたＢＭＤＣ、（図１Ｄ）ＬＰＳにより活性化された好中球に関して、刺激後６時間の、ＥｒｂＢファミリーメンバーのＲＮＡ発現を判定した。Ａ〜Ｄの場合、群あたりｎ＝４〜６の独立した実験である。ＮＤは検出不能である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０である。
【図１−２】本発明の実施形態に従って、マクロファージの炎症性活性化がインビトロでＥｒｂＢ４の発現を誘発することを表す。（図１Ｅ）一次抗体に対するブロッキングペプチドあり、またはなしでの、ＥｒｂＢ４（赤）、細胞核（青）を示すＢＭＤＭの免疫蛍光染色（３回の独立した実験の代表）である。（図１Ｆ）刺激なし（ナイーブ）または２４時間の古典的活性化（Ｍ１）後の、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４（全長、ＦＬ：細胞内ドメイン、４ＩＣＤ）のウエスタンブロット。ｎ＝４の独立した実験からの代表的ブロット。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０である。
【図２】本発明の実施形態に従って、補充されたマクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発されることを表す。
【図３】本発明の実施形態に従って、ＮＲＧ４がＭ１刺激性マクロファージのアポトーシスを誘発することを表す。
【図４】本発明の実施形態に従って、ＤＳＳ大腸炎ではＮＲＧ４が消失することを表す。
【図５】本発明の実施形態に従って、ＬｙｓＭ／ＥｒｂＢ４ＦＦマウスがＤＳＳによって大幅に体重減少することを表す。
【図６Ａ】本発明の実施形態に従って、マクロファージ流入中のＮＲＧ４治療が大腸炎を改善することを表す。
【図６Ｂ】本発明の実施形態に従って、マクロファージ流入中のＮＲＧ４治療が大腸炎を改善することを表す。
【図６Ｃ】本発明の実施形態に従って、マクロファージ流入中のＮＲＧ４治療が大腸炎を改善することを表す。
【図６Ｄ】本発明の実施形態に従って、マクロファージ流入中のＮＲＧ４治療が大腸炎を改善することを表す。
【図７】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４を発現するマクロファージが呼吸炎症に存在することを表す。
【図８】本発明の実施形態に従って、ＮＲＧ４がマウスの炎症性マクロファージのアポトーシスを誘発することを表す。（図８Ａ）古典的活性化（Ｍ１）または代替的活性化（Ｍ２）されたＢＭＤＭをＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間処理し、レサズリンベースの細胞滴定アッセイによって分析し、対照と比較して細胞数を評価した。（図８Ｂ）古典的活性化されたＢＭＤＭを２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ４中和抗体（Ｅ４ＢＡ）あり、またはなしで３０分間、事前培養し、ＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）あり、またはなしで４８時間処理したものを染色して、切断されたカスパーゼ−３を検出した。ＴＭは培養液の透射光イメージである。（図８Ｃ）古典的活性化されたＢＭＤＭをＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間処理したものをアネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色して、フローサイトメトリーにより分析し、アポトーシス細胞を測定した。各パネルはｎ＝３〜６の独立した実験である。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図９Ａ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。リガンド結合後のマクロファージ内での潜在的ＥｒｂＢ４シグナル伝達の図解モデル。段階１）ＡＤＡＭ１７による細胞外受容体の切断、段階２）γ−セクレターゼによる細胞内切断及びＥｒｂＢ４細胞内ドメイン（４ＩＣＤ）の生成、段階３）活性シグナル伝達断片４ＩＣＤの種々の細胞内区画への遊走。
【図９Ｂ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。古典的活性化されたＢＭＤＭをメタロプロテアーゼ阻害剤（ＧＭ６００１、１０μＭ）、γ−セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、１０μＭ）またはＡＤＡＭ１７阻害剤（ＧＷ２８０２６４Ｘ、３μＭ）、続いて１００ｎｇ／ｍＬのＮＲＧ４及び１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳにて１時間、前処理した。細胞生存率は、レサズリンベースの細胞滴定アッセイによって分析した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図９Ｃ】本発明の実施形態に従って、メタロプロテアーゼＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びγ−セクレターゼがＮＲＧ４により誘発されるマクロファージのアポトーシスに必要であることを表す。ＮＲＧ４（１００ｎｇ／ｍＬ）あり、またはなしで４８時間、処理され、古典的活性化されたＢＭＤＭのミトコンドリアに局在化するＥｒｂＢ４の免疫蛍光分析。矢印は、ＥｒｂＢ４／ミトコンドリアの重なり合う代表的な細胞を指している。ｎ＝４の独立した実験である。
【図１０Ａ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。ヒト単球由来マクロファージは、非分化（Ｍ０）、古典的活性化（Ｍ１）または代替的活性化（Ｍ２）状態であり（ｎ＝８ドナー）、指定された時点で収集し、フローサイトメトリーによってＥｒｂＢ４の発現を染色／分析した。タンパク質発現の代表的フロープロット及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。古典的活性化ヒトマクロファージ（ｎ＝８ドナー）に、ＥｒｂＢ４のｓｉＲＮＡをトランフェクトし、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳに、指定された濃度のＮＲＧ４を添加して４８時間処理し、アネキシンＶ染色をアポトーシス（ｎ＝８ドナー）の尺度としてフローサイトメトリーにより分析した。ＮＲＧ４の治療は、ＥｒｂＢ４の発現のピークで、Ｍ１分化後７２時間に開始した。ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた未処理細胞または指定のような細胞と比較して、有意性を算出した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１０Ｃ】本発明の実施形態に従って、炎症性活性化によって、ヒト単球由来マクロファージ上にＥｒｂＢ４が誘発され、ＮＲＧ４により誘発されるアポトーシスを媒介することを表す。ＥｒｂＢ４ノックダウンを、フローサイトメトリーによって検証した（ｎ＝８ドナー）。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４、††はｐ＜１ｘ１０−５である。
【図１１】本発明の実施形態に従って、ＤＳＳ大腸炎時に、ＥｒｂＢ４が誘発され、Ｌｙ６Ｃ＋マクロファージに発現することを表す。（図１１Ａ）ＤＳＳ大腸炎に罹患させたマウスからの結腸粘膜をフローサイトメトリーにより分析し、ＥｒｂＢ４＋である細胞の比率を測定した。ＤＳＳを与えなかったマウス（水）、４日間の３％ＤＳＳ後のマウス（損傷期）及び４日間の３％ＤＳＳ後、３日間はＤＳＳなしのマウス（炎症期）について、ＥｒｂＢ４＋集団の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（図１１Ｂ）指定された時点での総粘膜細胞質の比率による、Ｆ４／８０＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの分析。（図１１Ｃ）Ｌｙ６Ｃ＋／ＥｒｂＢ４＋及びＬｙ６Ｃ−／ＥｒｂＢ４＋集団を分析した。図全体で、群当たりｎ＝９〜１０マウス、３件の独立したＤＳＳ大腸炎実験による。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図１２−１】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４リガンドであるＮＲＧ４の投与が炎症を改善し、結腸マクロファージ数を減少させることを表す。（図１２Ａ）急性ＤＳＳ大腸炎に罹患したマウスからの結腸ホモジェネートの炎症性サイトカインレベルを、ｑＰＣＲによって分析した。（図１２Ｂ）ＮＲＧ４及び各サイトカインの発現に対する、補正値、ｒ値及びｐ値である。３件の独立した実験における、条件当たりｎ＝１０マウスであった。（図１２Ｃ）全てのマウスでのＮＲＧ４とＴＮＦの相対レベル間の補正プロット。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４である。
【図１２−２】本発明の実施形態に従って、ＥｒｂＢ４リガンドであるＮＲＧ４の投与が炎症を改善し、結腸マクロファージ数を減少させることを表す。（図１２Ｄ）４日間、３％のＤＳＳを飲料水で与えた後、ＤＳＳを除外し、毎日ＮＲＧ４（１００μｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を投与したマウスの体重を毎日記録した。（図１２Ｅ）７日目に、マクロファージ関連の炎症性サイトカインのレベルについて、結腸ホモジェネートをｑＰＣＲにより分析した。（図１２Ｆ）大腸炎のパラメータを７日目に測定し、（図１２Ｇ）結腸単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーによりＦ４／８０ＨＩ／ＣＤ１１ｂＨＩマクロファージレベルについて分析し、定量化した（Ｈ）。群当たりｎ＝１０マウスであった。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、†はｐ＜１ｘ１０−４である。
【外国語明細書】
2017109987000001.pdf