(57)【要約】      （修正有）【課題】移植可能な再生臓器構築に必要となる三次元血管網を有する器官形成技術の提供。【解決手段】三次元血管網を有する器官を、非ヒト動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法であって、（ａ）非ヒト動物において、生体に接続されたまま、１又は複数の血管を、構造体を貫通するように、配置するステップ、又は、生体外で、単離された１又は複数の血管を、構造体を貫通するように配置した後に、「単離された１又は複数の血管」を生体内の血管に接続するステップ、ここで、構造体はその内部に中空部を備えるように構成され、且つ、構造体の内部には、器官原基が含まれており；（ｂ）構造体の内部において、血管及び構造体の内部に含まれる器官原基をｉｎ  ｖｉｖｏで培養することにより、構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官を形成させるステップを、含む三次元血管網を有する器官を形成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元血管網を有する器官を、非ヒト動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法であって、
下記のステップ：
（ａ）前記非ヒト動物において、
生体に接続されたまま、１又は複数の血管を、構造体を貫通するように、配置するステップ、または、生体外で、単離された１又は複数の血管を、構造体を貫通するように配置した後に、前記「単離された１又は複数の血管」を生体内の血管に接続するステップ、ここで、前記構造体はその内部に中空部を備えるように構成され、かつ、前記構造体の内部には、器官原基が含まれており；
（ｂ）前記構造体の内部において、前記血管および前記構造体の内部に含まれる前記器官原基をｉｎ  ｖｉｖｏで培養することにより、前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官を形成させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）は、
（ｉ）前記血管を前記構造体に貫通するように配置する前に、前記構造体の内部に、前記器官原基を含めることを特徴とするか、又は、
（ｉｉ）前記血管を前記構造体に貫通するように配置した後に、前記構造体の内部に、前記器官原基を含めることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）において、前記構造体の内部には、前記器官原基に加えて、さらに血管構成細胞が含まれている、
方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記血管構成細胞が、血管内皮細胞及び／又は間葉系幹細胞を含む、
方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）において、前記構造体の内部には、さらに血管新生因子が含まれている、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記血管新生因子が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βからなる群から選択される、
方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記器官原基が、毛包原基、歯胚原基、肝臓原基、腎臓原基、ラトケ嚢、および、内分泌器官の原基からなる群から選択される、
方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記器官原基が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、多能性前駆細胞、成体幹細胞、又は、これらを遺伝的に改変させた多能性細胞より作製した再生器官原基である、
方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、
下記のステップ：
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の後に、形成された三次元血管網を有する器官を、同所的又は異所的に移植するステップ
をさらに含む、
方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記構造体が、細胞を通過させないが、液性因子を通過させることが可能な透析膜からなる、
方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記非ヒト動物の代わりに、ヒトを用いる、
方法。
【請求項１２】
三次元血管網を有する器官の形成用組成物であって、
前記組成物は、略シート状組成物であり、１又は複数の開口部を備え、かつ、内部に中空部を備える構造体として構成させることができ、
ここで、
１又は複数の血管が、前記開口部を通じて、前記構造体を貫通するように配置され、
前記構造体は、前記血管が通過する前記開口部を除き、実質的に閉鎖され、
前記構造体の内部には、器官原基が含まれ、及び
前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官が形成される、
ことを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）、三次元血管網を有する器官。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法によって得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）、三次元血管網を有する器官。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の三次元血管網を有する器官を含む、再生臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元血管網を有する器官をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させる方法に関する。また、本発明は、三次元血管網を有する器官の形成用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の再生医療では、幹細胞を移植して、移植先の臓器又は組織の生理機能を回復させる、「細胞移入療法」が実用化されている。しかしながら、次世代の再生医療として、機能不全に陥った臓器を、再生医学を用いて人為的に構築した、再生臓器に置き換えることにより、生理機能を回復させる、いわゆる「臓器置換再生医療」の実現が望まれている。
【０００３】
生体内の臓器は、高密度な細胞の三次元的な集合体である。その内部には、三次元的な（毛細）血管網が張り巡らされており、この血管網を介した、ガス交換、栄養供給、老廃物の代謝等により、臓器は、高密度な細胞集団であるにも関わらず、維持され、かつ機能している。
【０００４】
したがって、人為的に、移植可能な再生臓器を構築する際には、生体内の臓器が有する三次元血管網と同様の三次元血管網が必要不可欠となる。
【０００５】
これまでに、生体内損傷部位の再生のために、細胞シートを積層化（多層化）して移植させる技術が報告されている。非特許文献１は、心筋組織の損傷部位の治療において、外科的にアクセスが可能な血管の近くに、３層以上の心筋細胞シートの積層を行っても、再生される心筋組織の厚みは変化しなかったことを報告する一方で、前記血管の近くに、第１の１層の心筋細胞シートを移植し、前記血管が当該細胞シート内へ侵入して十分な血管系が形成される期間を待ってから、第２の１層の細胞シートを第１の細胞シート上に移植するといった態様で、血管新生の期間を置きながら、細胞シートの積層を複数回行うことにより、従来よりも厚い心筋組織を構築することができたことを報告している。しかしながら、当該非特許文献の技術では、損傷組織の回復に、複数回の手術が必要となり、再生臓器の構築に不可欠な三次元血管網の構築の速度や損傷組織の再生の速度を促進することはできない。
【０００６】
非特許文献２は、移植した心筋細胞の層状シート内の血管新生を促進するために、内皮細胞を混入させた心筋細胞シートを作製したところ、当該細胞シート内で内皮細胞のネットワークの形成が認められたこと、当該細胞シートを移植することで、心筋細胞のみの細胞シートと比較して、心筋組織の再生が促進されたことを報告している。しかしながら、当該非特許文献の技術では、細胞シートという、平面（２次元的な）構造のシートを用いた、２次元的な血管網構築に留まり、再生臓器の構築に不可欠な、三次元血管網の効率的な提供には至っていない。
【０００７】
また、非特許文献３は、心筋細胞シートを、ラットから切除した大動脈外周に巻きつけることで、三次元的な管状の心筋組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築し、次いで、異なるラット個体の大動脈との置換移植を行ったところ、ホスト心臓の自律拍動とは異なる、移植心筋組織独自の自律拍動が確認できたこと（自律拍動する心筋チューブ（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｕｂｅｓ）が形成できたこと）を報告している。かかる報告は、自律拍動する心筋チューブの、補助心臓としての利用可能性を示すものであり、臓器機能の一部を代替できる、補助臓器としての利用可能性を示すものである。しかしながら、当該非特許文献の技術は、単に、既存の生体血管に臓器機能の一部を付与することを意図したものであり、血管新生させた三次元血管網を積極的に構築する技術とは全く異なる。
【０００８】
非特許文献４は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）とヒト臍帯上位脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコラーゲンゲルに混入させ、次いで、ｈＭＳＣ‐ＨＵＶＥＣ混入コラーゲンゲルを、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの頭蓋冠に移植したところ、ｈＭＳＣとＨＵＶＥＣに由来する血管が、長期間、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定し、かつ、機能的であったことを報告している。しかしながら、当該非特許文献の技術では、レシピエント（移植を受ける対象）由来の様々な細胞（例えば、間葉系細胞等）が、移植部分の周辺組織から混入する。また、周辺組織からの血管誘導を制御していないので、あらゆる所から新生血管が移植細胞中に侵入する。したがって、当該非特許文献の技術を用いても、形成される三次元血管網を摘出及び移植することはできない。
【０００９】
このように、従来技術では、移植可能な再生臓器構築に必要な、三次元血管網の構築が十分ではない。このような背景から、再生臓器構築に向けて、臓器の実質細胞（主要な機能を担う細胞）を維持し、かつ、機能させるための、三次元血管網の構築技術の確立が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｐｐ．  １‐２０，  ２００６
【非特許文献２】Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００８，  １１８  ［ｓｕｐｐｌ  １］，  ｐｐ．  Ｓ１４５‐Ｓ１５２
【非特許文献３】Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００６，  １１４  ［ｓｕｐｐｌ  １］：  ｐｐ．  Ｉ−８７‐Ｉ−９３
【非特許文献４】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａｕ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｂｌｏｏｄ，  ２００８  １１１：  ｐｐ．  ４５５１−４５５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、移植可能な再生臓器構築に必要となる、三次元血管網を有する器官の形成技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
生体内における血管形成は、胎児期の血管発生と、成熟血管から新たな血管が分岐する、血管新生に大別される。
胎児期の血管の発生は、中胚葉由来の血球血管芽細胞や血管芽細胞などの血管内皮前駆細胞が集積して管腔構造を作り、一様な血管径の血管が集合した原始血管叢の形成（脈管形成）から始まる。その後、血管新生、動静脈分化、及び、血管の成熟化といった、血管リモデリングにより、機能的な血管網が形成される。
一方、成熟血管からの血管新生は、腫瘍細胞や創傷治癒などの限られた場合にのみ生じる。具体的には、低酸素や低栄養状態に陥った細胞から放出される、ＶＥＧＦなどの血管新生因子に、既存の血管内皮細胞が応答することで、新たに血管の分岐・伸長が生じ、さらにその周囲を、血管周皮細胞（ぺリサイト）が被覆することで、新たに成熟した血管網が形成される。
【００１３】
また、臓器（例えば、肝臓や腎臓）は、１つの動脈が臓器内に移入し、臓器の内部で三次元的に（毛細）血管が広がり、１つの静脈へと再び収束して臓器外に移出する血管経路により、生体の血管と連絡していることが知られている。すなわち、移植可能な臓器の人工的な製造には、臓器実質を構成する細胞・組織を製造するのみでは足りず、臓器実質とともに、移植可能な態様で三次元血管網が形成されることが必要である。
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、胎児性の器官原基が、正常な発育を経て臓器実質を構成する細胞・組織へと発達するという特徴だけではなく、発育の過程で血管新生因子を産生して、器官の内部および周囲の血管新生を促進するという特徴を有することに着目し、これらの特徴を利用することで、生体内の臓器が有する三次元血管網と同様の三次元血管網を有する器官を、人為的に誘導・構築できることを見出した。すなわち、本発明者らは、生体内の血管を、構造物で包むようにして、前記構造物の内部に閉鎖空間（本明細書において、場合により、「チャンバー」とも呼ぶ）を創り出し、その閉鎖空間内に、器官原基を含めて、前記血管を生体に接続させて、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養すると、臓器型の三次元血管網を有する器官の形成（製造）が可能となることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、一実施態様において、
三次元血管網を有する器官を、非ヒト動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法であって、
下記のステップ：
（ａ）前記非ヒト動物において、
生体に接続されたまま、１又は複数の血管を、構造体を貫通するように、配置するステップ、または、生体外で、単離された１又は複数の血管を、構造体を貫通するように配置した後に、前記「単離された１又は複数の血管」を生体内の血管に接続するステップ、ここで、前記構造体はその内部に中空部を備えるように構成され、かつ、前記構造体の内部には、器官原基が含まれており；
（ｂ）前記構造体の内部において、前記血管および前記構造体の内部に含まれる前記器官原基をｉｎ  ｖｉｖｏで培養することにより、前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官を形成させるステップ
を含む、方法に関する。
【００１６】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記ステップ（ａ）は、
（ｉ）前記血管を前記構造体に貫通するように配置する前に、前記構造体の内部に、前記器官原基を含めることを特徴とするか、又は、
（ｉｉ）前記血管を前記構造体に貫通するように配置した後に、前記構造体の内部に、前記器官原基を含めることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記ステップ（ａ）において、前記構造体の内部には、前記器官原基に加えて、さらに血管構成細胞が含まれていることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記血管構成細胞が、血管内皮細胞及び／又は間葉系幹細胞を含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記ステップ（ａ）において、前記構造体の内部には、さらに血管新生因子が含まれていることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記血管新生因子が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記器官原基が、毛包原基、歯胚原基、肝臓原基、腎臓原基、ラトケ嚢、および、内分泌器官の原基からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記器官原基が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、多能性前駆細胞、成体幹細胞、又は、これらを遺伝的に改変させた多能性細胞より作製した再生器官原基であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の方法の一実施態様においては、前記方法において、
下記のステップ：
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の後に、形成された三次元血管網を有する器官を、同所的又は異所的に移植するステップ
をさらに含むことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記構造体が、細胞を通過させないが、液性因子を通過させることが可能な透析膜からなることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の方法の一実施態様においては、
前記非ヒト動物の代わりに、ヒトを用いることを特徴とする。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、
三次元血管網を有する器官の形成用組成物であって、
前記組成物は、略シート状組成物であり、１又は複数の開口部を備え、かつ、内部に中空部を備える構造体として構成させることができ、
ここで、
１又は複数の血管が、前記開口部を通じて、前記構造体を貫通するように配置され、
前記構造体は、前記血管が通過する前記開口部を除き、実質的に閉鎖され、
前記構造体の内部には、器官原基が含まれ、及び
前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官が形成される、
ことを特徴とする、組成物に関する。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、上述の本発明のいずれかの方法によって得られ得る（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）、三次元血管網を有する器官に関する。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、上述の本発明のいずれかの方法によって得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）、三次元血管網を有する器官に関する。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、上記の本発明のいずれかの方法によって得られ得る（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）、または、得られ得た（ｏｂｔａｉｎｅｄ）三次元血管網を有する器官を含む、再生臓器に関する。
【００３０】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明に含まれることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法によれば、１又は複数の血管が構造体の内部に移入し、構造体が内部に有する中空部（好ましくは、実質的に閉鎖的な空間）に三次元血管網を有する器官が形成され、１又は複数の血管へと再び収束した血管が構造体の内部から移出する、生体の臓器の血管構造を模した器官を形成することができる。
好ましい一態様において、最初に封入した１又は複数の血管以外の血管は、三次元血管網が形成される、前記構造体の内部に、周囲から侵入することができない。したがって、構造体の内部に移出入する血管の数を制御することができる。
形成される三次元血管網を有する器官は、構造体の内部に含めたまま、又は、構造体から取り外して、生体外で用いることができる。構造体の内部に移入した血管と移出した血管とは維持されているので、これらの血管を、同種又は異種の動物の血管に、同所的又は異所的に血管縫合等により接続することで、形成される三次元血管網を容易に移植することが可能である。また、本発明の方法によって製造した三次元血管網を有する器官は、移植を行う前に、例えばＷＯ２０１１／０９３２６８に記載のような臓器又は組織の灌流培養方法及び灌流培養装置に接続し、生体外での培養を行ってもよい。
好ましい別の態様において、三次元血管網が形成される中空部のサイズを所望により変更することで、所望のサイズの三次元血管網を有する器官を形成させることができる。
好ましいさらに別の態様において、三次元血管網が形成される中空部の形状を所望により変更することで、例えば、所望の臓器又は組織が有する三次元血管網の形態と実質的に同一または類似する形態を有する、三次元血管網を有する器官を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の一実施態様である、三次元血管網を有する器官の製造方法の模式図である。
【図２】胎齢１２日のマウス胎児から取得した肝臓原基の左葉、及び血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）を含むゲル（図２上）、又は、胎齢１２日のマウス胎児から取得した肝臓原基の左葉、及び血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）とＶＥＧＦを含むゲル（図２下）を、Ｂａｌｂ／ｃ  ｓｌｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの背部皮下にチャンバー移植して７日後又は１４日後に得られた、チャンバー内の形成物のＨＥ染色による組織構造の解析結果を示す図である。
【図３】胎齢１４日のマウス胎児から取得した歯胚とＶＥＧＦを含むゲルを、Ｂａｌｂ／ｃ  ｓｌｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの背部皮下にチャンバー移植して３日後又は７日後に得られた、チャンバー内の形成物のＨＥ染色による組織構造の解析結果を示す図である。
【図４】胎齢１８日のマウス胎児から取得したラトケ嚢とＶＥＧＦを含むゲル（図４上）、又は、胎齢１８日のマウス胎児から取得したラトケ嚢と血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）とＶＥＧＦ（図４下）を含むゲルを、Ｂａｌｂ／ｃ  ｓｌｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの背部皮下にチャンバー移植して７日後又は１４日後に得られた、チャンバー内の形成物のＨＥ染色による組織構造の解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の実施態様について説明する。
【００３４】
本明細書において、「三次元血管網」とは、三次元的な細胞の塊（例えば、生体内の臓器又は組織）中に観察されるような、二次元的（平面的）ではなくて、三次元的に広がった血管経路による網状構造を意味する。
【００３５】
本明細書において、「臓器型の三次元血管網」とは、１つの動脈経路から、三次元的に（毛細）血管が広がり、１つの静脈経路へと再び収束する、生体内の臓器の血管網構造と同様に、１つの血管経路から、三次元的に（毛細）血管が広がり、１つの血管経路へと再び収束する、三次元血管網を意味する。本発明において、臓器型の三次元血管網とは、場合により、生体内の臓器内を通り抜ける血流の出入口となる特定の血管を含む、三次元血管網と同様に、本発明における構造体の内部を通り抜ける血流の出入口となる特定の血管を含む、三次元血管網を意味してよい。
【００３６】
本発明において、「臓器又は組織」とは、同所性移植又は異所性移植を意図する臓器又は組織であれば特に限定されず、例えば、肝臓、心臓、脳、肺、腎臓、胃、腸、膵臓、精巣、卵巣、眼球、骨、歯、及びそれらの構成器官や周囲組織を挙げてもよい。
【００３７】
本発明において、「移植」とは、ドナー（移植される臓器又は組織又は細胞等を提供する）からレシピエント（移植を受ける対象）に臓器又は組織又は細胞等を移し植えることであり、移植の種類は特に限定されない。移植の種類は、例えば、ドナーとレシピエントの関係による分類では、自家移植、同系移植、同種移植、異種移植等が挙げられる。また、例えば、ドナーの状態による分類では、生体移植、脳死移植、心停止移植等が挙げられる。
一態様において、本発明において、チャンバー移植に用いられる血管を提供するドナーは、チャンバー移植を受けたレシピエントの生体内で形成された三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体を提供される、レシピエントとなり得ることが理解される。また、チャンバー移植を受けるレシピエントは、生体内で形成された三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体を提供する、ドナーともなり得ることが理解される。
【００３８】
本明細書において、再生臓器とは、バイオテクノロジーや再生医療の技術を用いて製造される臓器であって、生体内の臓器の機能や構造等を、一部又は全部模倣した臓器、又は、当該臓器の一部又は全部の機能を有する組織を意味してよい。再生臓器は、生体内の臓器を代用するか、又は、生体内の臓器の機能を補助するか、又は、回復することが可能である。
【００３９】
<三次元血管網を有する器官を、動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法>
本発明の一実施態様は、三次元血管網を有する器官を、動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法であって、下記のステップ：
（ａ）前記動物において、生体に接続されたまま、１又は複数の血管を、構造体を貫通するように、配置するステップ、または、生体外で、単離された１又は複数の血管を、構造体を貫通するように配置した後に、前記「単離された１又は複数の血管」を生体内の血管に接続するステップ、ここで、前記構造体はその内部に中空部を備えるように構成され、かつ、前記構造体の内部には、器官原基が含まれており；
（ｂ）前記構造体の内部において、前記血管および前記構造体の内部に含まれる器官原基をｉｎ  ｖｉｖｏで培養することにより、前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官を形成させるステップ
を含む、製造方法であることを特徴とする。技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の１又は複数を適宜組み合わせて、本発明を実施してよい。
【００４０】
本明細書において、「チャンバー移植（法）」とは、チャンバー（閉鎖空間）を設けて、その内部に、移植等する臓器、組織又は器官を封入し、かつ、チャンバーを血管で貫通させて、当該血管により、チャンバーの内部の臓器、組織又は器官等に栄養供給等を行い、チャンバーの内部の臓器、組織又は器官等をｉｎ  ｖｉｖｏで培養させる、本発明者らが発明した新しい移植（法）である。
従来の皮下移植では、移植部分に、臓器、組織、器官等を、レシピエント（移植を受ける対象）中の生体組織に接触させるようにして移植していた。
本発明に用いられるチャンバー移植では、移植の対象となる器官（又は臓器）の材料となる器官原基等は、構造体の内部に隔離される状態（すなわち、閉鎖空間（チャンバー）内に隔離される状態）でレシピエントに提供される。当該器官原基は、レシピエントに血管網を形成させるのに用いる血管を介してのみ、レシピエント中の生体組織と連絡することができる。前記血管は、構造体を貫通させるように構成されるので、閉鎖空間内で、前記器官原基等と連絡／接触することが可能である。これにより、前記血管から栄養供給等を受けた前記器官原基は、前記血管以外とは、レシピエント中の生体組織と接触せずに増殖することができる。このようなチャンバー移植を用いることにより、構造体の内部に備えられる中空部に、血管を新生させて、三次元血管網を有する器官を形成することができる。本明細書において、チャンバー移植（法）は、以下に、さらに説明され、関連するすべての記述が、チャンバー移植（法）の、非限定的な一態様であることを、当業者は理解する。
【００４１】
本発明において、用いることのできる動物としては、限定はされないが、例えば、非ヒト動物（非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、サル等）、非哺乳動物（魚類、爬虫類、両生類、鳥類等））、及び、ヒトであってよい。
【００４２】
本発明は、あらゆる動物を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養することにより、三次元血管網を有する器官又は当該三次元血管網を含む再生臓器を形成させてよい。また、形成される三次元血管網を有する器官又は当該三次元血管網を含む再生臓器、又は、それを含む構造体は、あらゆる動物に対して、同所的又は異所的に、あらゆる移植態様（自家移植、同系移植、同種移植、異種移植、人工移植等）で移植するのに用いてよい。好ましい一実施態様において、本発明において用いられる動物は、異所性の移植に適合するために、免疫不全であるか、又は、免疫抑制剤等を用いて、一時的に、免疫反応が機能不全であってよい。
ｉｎ  ｖｉｖｏで三次元血管網を有する器官又は再生臓器を形成させる動物と、形成された三次元血管網を有する器官又は当該三次元血管網を含む再生臓器、又は、それを含む構造体の移植を受ける動物が異種である場合や異なる個体である場合、三次元血管網を有する器官又は再生臓器を形成させる動物において、三次元血管網の形成のために構造体に貫通させて用いられる血管は、形成された「三次元血管網を有する器官又は当該三次元血管網を含む再生臓器、又は、それを含む構造体」の移植を受ける動物由来の血管であることが好ましい。
【００４３】
本発明において、三次元血管網を形成するのに利用される「１又は複数の血管」とは、非分岐状又は分岐状である、１又は複数の血管であってよい。前記血管は、三次元血管網を有する器官を形成させる動物に対して、同種または異種の動物由来のものであってよく、異種であるのが好ましい。例えば、三次元血管網を有する器官をラットやブタでｉｎ  ｖｉｖｏで形成させる場合、前記血管は、それぞれ、マウスやヒトから摘出された血管を用いてよい。前記「摘出される血管」は、脳死又は心停止によって死亡した、ヒト移植提供者由来であってもよい。あるいは、前記血管は、多能性幹細胞であるＥＳ細胞やｉＰＳ細胞や多能性前駆細胞等から分化させて作製した、人工血管であってもよい。「ｉＰＳ細胞」は、例えば成体の細胞に転写因子をコードする４つの遺伝子を導入することで作製された、ＥＳ細胞によく似た多能性幹細胞である（Ｃｅｌｌ．，  Ｖｏｌ  １２６，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  ２５  Ａｕｇｕｓｔ  ２００６，  ｐｐ．  ６６３‐６７６）。ただし、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ細胞としての性質を有している限り、どのような方法によって製造されたｉＰＳ細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞は、患者由来の体細胞から作製可能であるため、倫理的問題や免疫拒絶のリスクも少なく、移植可能な組織や器官を再生し得る細胞として、好ましい。多能性幹細胞や多能性前駆細胞の由来としては、限定はされないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル由来の細胞を用いることができる。また、前記血管は、生体に由来しない材料、例えば、ナイロンやテフロンなどの合成高分子材料を含むか、又は、当該合成高分子材料で製造した人工血管と組み合わせて用いてもよい。
【００４４】
本発明において、「１又は複数の血管」を貫通させる「構造体」は、その内部に中空部（閉鎖空間）を備え、当該中空部を前記血管が貫通し、かつ、当該中空部に器官原基等が含まれる構成を採用できるものであれば、どのような形態であってもよい。前記構造体は、構造体の内部に含まれる細胞及び構造体の外部に存在するレシピエントの組織由来の細胞を透過させないもの（細胞不透過性の材料、膜、フィルムなど）であればどのような材料で構成されていてもよい。前記構造体は、例えば、本発明における、「略シート状組成物」から形成されるか、当該略シート状組成物から形成されたもの（すなわち、前記略シート状組成物があらかじめ成形されて、例えば、袋状などの、三次元的な形態を有する）であってよい。本発明における構造体は、限定はされないが、成形しやすい材料から形成されるのが好ましい。また、例えば形成される三次元血管網を有する器官又は再生臓器を、構造体から取り外して使用することを企図する場合、本発明における構造体は、血管や、構造体の内部に含まれる器官原基等と、非接着性であるか、又は、容易に分離できることが好ましい。当該構造体は、伸縮又は変形が可能な材料を用いてもよい。
【００４５】
本発明における構造体の内部に備えられる中空部のサイズを所望により変更することで、所望のサイズを有する三次元血管網を有する器官又は再生臓器を、当該中空部内で形成させることができる。また、本発明における構造体の内部に備えられる中空部の形状を所望により変更することで、例えば、移植を意図する臓器又は組織の形態又はそれらが有する三次元血管網と実質的に同一または類似した形態を有する、三次元血管網を有する又は再生臓器を、当該中空部内で形成することができる。本発明における構造体は、チャンバー移植を受ける動物の生体外に、構造体の一部が突出する（はみ出す）ように、生体内に配置してもよい。
【００４６】
一実施態様において、前記「構造体」は、前記血管に貫通させる前に、又は、生体内に配置される前に、前記構造体の内部に、器官原基等が、あらかじめ含まれていてよい。あるいは、別の実施態様において、前記「構造体」は、前記血管を貫通させた後に、又は、生体内に配置された後に、前記構造体の内部に、器官原基等が含まれてよい。
【００４７】
本発明において、血管新生因子とは、脈管形成又は血管新生に関与する因子であれば、特に限定されない。血管新生因子としては、限定はされないが、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ｂ−ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノーゲンアクチベーター、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、プロスタグランジン類、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）を挙げてもよい。
【００４８】
本発明において、器官原基とは、生体において、発生の段階が進むと特定の器官に発生することが決定づけられた胚の領域または胚の構造をいい、単に「原基」と呼ばれることもある。生体におけるほぼ全ての器官は、胎児期の発生プログラムによって上皮系幹細胞と間葉系幹細胞から誘導された器官原基から発生し、所定の位置、所定の数に発達する。器官原基は発生の過程で血管産生因子を産生し、器官原基の内部又は周囲に血管を誘導することから、本発明における構造体の内部に器官原基を内包させて培養することにより、三次元血管構造を有する器官を製造することができる。本発明において用いる器官原基は、胎児性のものであってもよく、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から人工的に誘導した器官原基（再生器官原基といってもよい）であってもよい。
【００４９】
本発明の方法に用いられる器官原基の種類は特に限定されないが、例えば毛包原基、歯胚原基、肝臓原基、腎臓原基、ラトケ嚢、または、内分泌器官（例えば、副腎、膵臓、甲状腺、副甲状腺）の原基を挙げることができる。
【００５０】
また、本発明の方法によって形成される、三次元血管網を有する器官は、生体における器官と同様に完全な構造および機能を有する器官であってよく、生体における器官の構造および機能の一部を有する器官であってもよい。例えば、内分泌器官の器官原基を用いて本発明の方法を実施する場合、形成される器官は、生体における内分泌器官を完全に代替しうる構造および機能を有していなくとも、少なくとも内分泌機能を有していれば、例えば内分泌疾患の治療に好適に用いることができる。また、腎臓は泌尿器系器官としての機能だけでなく、エリスロポエチンを分泌する内分泌器官としての機能も有する。腎臓原基を用いて本発明の方法を実施する場合、形成される器官は、生体における腎臓を完全に代替しうる構造および機能を有していなくとも、少なくとも内分泌機能（例えば、エリスロポエチン分泌機能）を有していれば、例えば内分泌疾患の治療に好適に用いることができる。
【００５１】
また、本発明において、構造体の内部に含まれる、器官原基の種類、形状、大きさ、血管構成細胞の細胞数等は、目的とする三次元血管網を有する器官や再生臓器のサイズ等に応じて、当業者が、適宜、決定することができる。
【００５２】
本発明において、「生体に接続されたまま、１又は複数の血管を、構造体を貫通するように、配置する」とは、前記血管が構造体に配置される際、前記血管がレシピエント（生体）から分離（単離）されることなく、生体に物理的に連結したまま、構造体が配置されることを意味してよい。前記血管は、生体に接続されたまま、生体の臓器又は組織から、全体的又は部分的に剥離されて、構造体を貫通するような態様で、当該構造体で封入されるのが好ましい。当該剥離される血管は、レシピエントにあらかじめ移植された同種もしく異種の動物由来の血管又は人工血管であるのが好ましく、異種の動物由来の血管であるのがより好ましい。同種もしく異種の動物由来の血管又は人工血管をあらかじめレシピエントに移植しておく場合、好ましくは免疫不全動物であるレシピエントに、あらかじめ用意した前記血管を、レシピエントが有する既存の血管と置換するか、又は、シャントとして（血液が本来通るべき血管と別のルートを流れる状態を作り出すように）移植しておき、前記移植した血管に、構造体を貫通させるのが好ましい。前記移植した血管が異種の動物由来の血管である場合、形成される三次元血管網を有する器官もしくは当該三次元血管網を含む再生臓器又はそれを含む構造体は、前記「異種の動物」に（前記移植した血管を再度、生体内に戻すような態様で、）移植することが好ましい。
【００５３】
前記血管を前記構造体に貫通させるプロセスは、例えば、前記血管を、あらかじめ、生体外で構造体に貫通するように配置してから、前記構造体を貫通させた前記血管を、移植を意図する場所で、生体内の血管に、血管縫合等により接続させてもよい。かかる場合、前記構造体を貫通させた前記血管を、生体内の血管に連結させる前に、前記構造体の内部に、器官原基や血管構成細胞を含めてもよい。あるいは、前記構造体を貫通させた前記血管を、生体内の血管に接続させた後に、器官原基や血管構成細胞を含めてもよい。
【００５４】
前記構造体の内部に含まれる器官原基や血管構成細胞と、前記構造体を貫通する血管とは、前記器官原基や血管構成細胞に、前記血管から栄養供給等が行われる限り、接しなくてもよいが、接するのが好ましい。
【００５５】
本発明において、１又は複数の血管が構造体を貫通するとは、構造体に備えられる中空部を、血管が貫通するようにして移出入することを意味してよい。血管が構造体を移出入する部分、すなわち、構造体に備えられる開口部は、１又は複数であってよい。例えば、複数（例えば２つ）に分岐した血管が、構造体に備えられる、前記分岐した血管の数に対応した数の開口部を通じて、構造体の中空部に移入し、さらに、移入した血管の数と同一でも異なっていてもよい、複数に分岐した血管が、それぞれ、移入した開口部（移入用開口部）とは別の開口部（移出用開口部）を通じて、構造体の中空部から移出してもよい。また、例えば、当該開口部が１つの場合には、１又は複数の血管が、同一の開口部を通じて、構造体に備えられる中空部を移出入するように構成させることができる。
好ましい一実施態様において、１つの非分岐状の血管が、１つの開口部に移入し、構造体の中空部を貫通し、かつ、別の１つの開口部から移出するように構成させてよい。これにより、構造体の中空部に、臓器型の三次元血管網を有する器官を構築させることができる。
【００５６】
血管を構造体に貫通させて、かつ、前記構造体の内部に器官原基や血管構成細胞等が含まれる状態にした後には、前記血管が通過する前記開口部を除き、構造体を実質的に閉鎖させるのが望ましい。ここで、「実質的に閉鎖させる」とは、構造体の内部に、外部から細胞や血管が侵入しないように構成させ、かつ、構造体の内部から外部に器官原基や血管構成細胞等が漏れ出さず、構造体の中空部に形成される新生血管が、外部に侵出しないように構成させることを意味する。一実施態様において、構造体の内部に含まれる器官原基や血管構成細胞等は、構造体の内部から外部に漏れ出さないように、例えば、ゲル状物質等に混合されて含まれていてもよく、又は、前記構造体の内部に包埋又は接着されていてもよい。
【００５７】
本発明において、「ｉｎ  ｖｉｖｏで培養する」とは、限定はされないが、チャンバー移植を受けたレシピエントを生育させることを意味してよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで培養する期間は、チャンバー移植に用いる構造体の大きさ；構造体の内部に含まれる、細胞の種類、細胞数や細胞の増殖速度；形成させる三次元血管網を有する器官又は再生臓器のサイズ等に応じて、当業者が、適宜、決定することができる。
【００５８】
本発明において、血管構成細胞とは、血管を構成する細胞であれば特に限定されない。器官原基に、血管構成細胞を組み合わせて、構造体の内部に含め、ｉｎ  ｖｉｖｏ培養させることで、血管新生を安定化することができる。血管構成細胞としては、限定はされないが、血球血管芽細胞や血管芽細胞などの血管内皮前駆細胞；血管内皮細胞（例えば、静脈内皮細胞及び動脈内皮細胞）；血管幹細胞；血管平滑筋細胞や血管周皮細胞（ペリサイト）などの血管壁細胞；間葉系幹細胞；繊維芽細胞；血球細胞；その他の血管形成を補助する細胞を挙げてもよい。前記間葉系幹細胞は、血管新生された血管の、壁細胞の前駆細胞として、血管を効率的に安定化できる。一実施態様において、器官原基と一緒に含まれる血管構成細胞は、血管内皮細胞及び／又は間葉系幹細胞を含むことが好ましい。本発明で用いる血管構成細胞は、生体由来のものであってもよく、多能性幹細胞であるＥＳ細胞やｉＰＳ細胞や多能性前駆細胞等から分化させて作製した、血管構成細胞であってもよい。
【００５９】
器官原基と血管構成細胞とは、器官原基の性質、種類、増殖安定性；血管新生の効率；形成される三次元血管網の態様；三次元血管網とネットワークを形成する細胞の機能や性質等に応じて、当業者が、適宜、所定の混合比率で、前記構造体の内部に含めることができる。
【００６０】
一実施態様において、前記構造体の内部には、さらに、血管新生因子が含まれていてよい。すなわち、前記構造体が備える中空部に、器官原基から産生される血管新生因子とは別に、追加で血管新生因子を注入等してもよい。
【００６１】
本発明における前記ステップ（ｂ）により形成される三次元血管網を有する器官は、移植等を意図する臓器又は組織の機能の全部又は一部を有するか又は模倣する、再生臓器として機能できることが理解されよう。形成される再生臓器は、生体から摘出後、構造体の内部から取り出して（取り外して）、又は、構造体の内部に含めたままで、用いてよい。また、生体から摘出した再生臓器は、同所的又は異所的な移植に用いてもよい。前記再生臓器は、対象となる臓器又は組織又はそれらの一部と、機能を代替、補強又は回復させるために、三次元血管網を形成させる際に最初に用いた、構造体の内部に移出入させた血管と、移植を受ける生体の血管とを、血管縫合等させることで、生体に接続させてもよい。
【００６２】
当業者であれば、器官原基、血管構成細胞や、場合により、血管新生因子や薬剤等の各因子を、所望の順番で、適宜、構造体の内部に含めて、チャンバー移植、三次元血管網の形成又は再生臓器の形成等を行うことができることが理解されよう。例えば、血管構成細胞は、器官原基と同時に構造体の内部に含めてもよいし、あるいは、器官原基よりも前又は後に構造体の内部に含めてもよい。また、器官原基から産生される血管新生因子とは別に、構造体へ追加の血管新生因子を注入する場合には、器官原基や血管構成細胞を構造体へ含める際に追加の血管新生因子を同時に注入してもよく、器官原基や血管構成細胞を構造体へ含める際とは異時に追加の血管新生因子を注入してもよい。
【００６３】
本発明において、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成された三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体を摘出した後には、生命維持の観点から、例えば人工血管等を用いて、切除された生体内の血管どうしを連結することが好ましい。
【００６４】
別の実施態様において、本発明は、本発明の「三次元血管網を有する器官を、動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法」によって形成され得る（得られ得る（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ））、三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体を提供する。ここで、形成され得る（得られうる）三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体とは、本明細書において具体的に例示された方法によって製造されるものには限定されず、本発明の概念に含まれるあらゆる形成方法によって製造されるものも対象となる。
【００６５】
さらに、別の実施態様において、本発明は、本発明の「三次元血管網を有する器官を、動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏで、形成させる方法」によって形成された（得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ））、三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体を提供する。形成された三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体は、生体から摘出後、移植等に用いてよい。また、本発明の方法によって製造した三次元血管網を有する器官は、移植を行う前に、例えばＷＯ２０１１／０９３２６８に記載のような臓器又は組織の灌流培養方法及び灌流培養装置に接続し、生体外での培養を行ってもよい。
【００６６】
本発明において、形成される三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体の移植は、形成される三次元血管網を有する器官もしくは再生臓器又はそれを含む構造体の温度を４℃〜３７℃の状態を維持しながら行うことができ、１５℃〜３３℃の状態を維持しながら行われることが好ましく、２０℃〜２５℃の状態を維持しながら行われることが最も好ましい。
【００６７】
<三次元血管網の形成用組成物>
本発明の別の実施態様は、三次元血管網を有する器官の形成用組成物であって、
前記組成物は、略シート状組成物であり、１又は複数の開口部を備え、かつ、内部に中空部を備える構造体として構成させることができ、
ここで、
１又は複数の血管が、前記開口部を通じて、前記構造体を貫通するように配置され、
前記構造体は、前記血管が通過する前記開口部を除き、実質的に閉鎖され、
前記構造体の内部には、器官原基が含まれ、及び
前記構造体の内部の中空部において三次元血管網を有する器官が形成される、
ことを特徴とする。
技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の１又は複数を適宜組み合わせて、本発明を実施してよい。
【００６８】
本発明の三次元血管網を有する器官の形成（製造）に用いることができる略シート状組成物（すなわち、実質的にシート状の組成物）は、前記血管を最終的に封入する（包み込む）ことができれば、どのような形状であってもよい。略シート状組成物は、あらかじめ、内部に中空部を有するように成形されていてもよいし、又は、前記血管を封入するように配置させる際に、内部に中空部を有するように成形されてもよい。例えば、重ね合わせた２つの略シート状組成物の内側の外周同士を、袋状になる（閉鎖空間となる）ように、最終的には一周にわたって固定して、内部に中空部を備える構造体を設けてもよい。あるいは、１つの略シート状組成物を半分に折り曲げて、接触する内側の外周同士を、例えば、餃子（中国や日本の食べ物の一種）の皮で食材を包むような態様で、内部に空間ができるように固定してもよい。あるいは、１つの略シート状組成物を折りたたむか、複数の略シート状組成物を繋ぎ合わせて、内部に中空部を有する、例えば、実質的に柱体（円柱や角柱（直方体、立方体を含む）等）の形状、実質的に錐体（円錐や角錐等）の形状、実質的に球の形状等に構成してもよい。
【００６９】
前記略シート状組成物は、構造体の内部に含まれる細胞、及び、構造体の外部に存在するレシピエントの組織由来の細胞を透過させないもの（細胞不透過性の材料、膜、フィルムなど）であればどのような材料で構成されていてもよい。また、前記略シート状組成物は、生体適合性の材料で構成されるのが好ましい。また、前記略シート状組成物は、伸縮又は変形が可能な材料を用いてもよい。好ましい一実施態様において、前記略シート状組成物は、構造体の内部に含まれる細胞及び構造体の外部に存在するレシピエントの組織由来の細胞を通過させないが、液性因子（水やサイトカイン等）を（自由に）通過させることが可能な材料（例えば、透析膜などの半透膜／多孔質膜）からなってよい。前記略シート状組成物の材料としては、限定はされないが、例えば、再生セルロース（セロファン）、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、テフロン、ポリエステル系ポリマーアロイ、又は、ポリスルホンであってよい。
【００７０】
また、例えば、形成される三次元血管網を有する器官又は再生臓器を構造体から取り外して使用することを企図する場合、前記略シート状組成物は、血管や、構造体の内部に含まれる細胞等と、非接着性であるか、又は、容易に分離できることが好ましい。また、前記略シート状組成物は、構造体の内部を容易に確認できるように、透明又は半透明であるのが好ましい。
【００７１】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００７２】
本明細書において用いられる「含有する」又は「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除しない。前記それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除してもよい場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という用語があてられてよい。用語「含有する」又は「含む」の概念は、用語「からなる」の概念を包含する。
【００７３】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００７４】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
【００７５】
第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００７６】
本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられるあらゆる数値は、特に明示がない限り、用語「約」の意味を包含するものとして解釈される。
【００７７】
本明細書中に引用される文献は、それらのすべての開示が、本明細書中に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの先行技術文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解する。
【００７８】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００７９】
器官原基（及び血管構成細胞）のチャンバー移植
発生過程にある胎児から取得した未熟な細胞は、血管新生因子を豊富に放出することで知られている。本実施例においては、複数種の胎児性の器官原基を用いた、チャンバー移植を行った。
移植直後の器官原基は、自然拡散による物質供給のみによって維持される。したがって、器官原基を血管に近接して設置し、かつ、器官原基に対する血管構成細胞の懸濁液の容量を少なくすることが好ましいことを本発明者らは発見した。また、血管に近接して設置することを可能とし、かつ、移植物の大きさを最小限にするために、使用するゲルの量や細胞数を減少させたところ、チャンバー移植に多種多様な組織が利用できることを本発明者らは発見した。
【００８０】
<器官原基のチャンバー移植>
血管構成細胞として、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）及びｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）をそれぞれ培養後、回収し、セルカウントを行った。ＨＵＶＥＣ（８×１０５細胞）とｈＭＳＣ（２×１０５細胞）を、５０ｍｌチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、ニュージャージー州、アメリカ）中で混合した。培養培地に含まれるサイトカインの影響を除くために、無添加ＤＭＥＭ培地を添加して遠心を２回繰り返し、細胞の洗浄を行った。細胞懸濁液を１．５ｍｌチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、東京、日本）に移し、再度遠心を行った後に上清を全て取り除き、タッピングを行った。次いで、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ（新田ゼラチン、大阪、日本）中に懸濁し、チャンバー移植に用いた。
【００８１】
ヌードマウスの背部皮下の血管を含む皮下組織を部分的に剥離し、次いで、剥離した一本の血管部分に、アロンアルファＡ（三共、東京、日本）を用いて、分子量５０ｋＤカットオフの透析膜（エーディア、東京、日本）製のチャンバーを設置した。次いで、チャンバー上部に設けていた未封入部分から、剥離した皮下組織内の血管に直接触れるように器官原基を設置した後、既に調製したＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣの細胞懸濁液含有ゲルを、当該器官原基に対して、上からかぶせるように添加した。次いで、当該未封入部分を密封し、チャンバー内には剥離した血管が一本貫通している以外は、完全に閉鎖的な空間を作った。
チャンバー移植に使用した器官原基と血管構成細胞等の組み合わせは次の通りである：
（１）胎齢１２日のマウス胎児から取得した肝臓原基の左葉；血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）を添加したｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ；
（２）胎齢１２日のマウス胎児から取得した肝臓原基の左葉；血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）とＶＥＧＦを添加したｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ；
（３）胎齢１４日のマウス胎児から取得した歯胚とＶＥＧＦを添加したｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ；
（４）胎齢１８日のマウス胎児から取得したラトケ嚢とＶＥＧＦを添加したｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ；
（５）胎齢１８日のマウス胎児から取得したラトケ嚢と血管構成細胞（ＨＵＶＥＣ及びｈＭＳＣ）とＶＥＧＦを添加したｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｙｐｅ−ＩＡ
なお、ＶＥＧＦは終濃度１００ｎｇ／ｍｌにて使用した。
チャンバーを設置した皮膚をそれぞれ縫合し、経過を観察した。
【００８２】
<器官原基（及び血管構成細胞）のチャンバー移植後の組織解析>
移植した器官原基の組織構造の解析を行うために、上記歯胚を除く各器官原基を移植したヌードマウスを、移植後７日目又は１４日目まで育成した。また、歯胚の移植を行ったヌードマウスを移植後３日目又は７日目まで育成した。次いで、各マウスを屠殺し、チャンバー内の形成物をホルマリン固定した。それぞれの形成物について、５μｍの組織薄片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行った。ＨＥ染色は、常法により、マイヤーヘマトキシリン（Ｗａｋｏ、大阪、日本）で染色した後に、１％エオシン液（武藤化学株式会社、東京、日本）で染色して実施した。
その結果、肝臓原基を用いたチャンバー移植では、７日目、１４日目において肝細胞の生着が確認できた（図２）。歯胚を用いたチャンバー移植では、３日目において歯胚の組織構造が維持され、間葉側からの血管の侵入も確認された。さらに、７日目においては、３日目と比べて、硬組織の蓄積が進み、組織発生が進んでいる事が確認できた（図３）。ラトケ嚢を用いたチャンバー移植では、７日目において組織構造の維持が認められ、１４日目においては脳下垂体に認められる房状の組織構造が確認できた（図４）。
以上の結果から、器官原基を用いてチャンバー移植を行った場合、器官原基の発生に伴い組織内に三次元血管網が構築されたことが確認され、チャンバー内での再生器官の培養ならびに育成が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の三次元血管網を有する器官をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させる方法は、再生医療分野や、医薬品等の効果を評価するスクリーニングシステムへの応用等において有利に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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