(57)【要約】【課題】本発明は、病原体の免疫抑制機能をブロックする方法を提供する。【解決手段】本発明は、病原体の免疫抑制機能をブロックする組成物を、病原体が存在する環境に適用することを備える。免疫抑制機能は、病原体によって分泌又は産生される免疫抑制物質によってもたらされる。組成物は、免疫抑制物質又はその断片を識別する抗体を含む機能阻害剤を含有する。機能阻害剤組成物の用途も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の内部又は外部に定着した細菌性病原体に前記病原体の免疫抑制機能をブロックする組成物を直接的又は間接的に適用するステップを備える、生体の免疫を高める方法。
【請求項２】
前記組成物は、前記病原体が定着した前記生体の内部に適用される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細菌性病原体は、ピロリ菌、アクロバクター  スイス（Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｉｓ）、タネレラ  フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、ポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アグリゲイティバクター  アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、及び、ヘリコバクター  フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ）からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記細菌性病原体の前記免疫抑制機能は、前記病原体によって分泌、又は産生される免疫抑制物質によってもたらされ、かつ、病原体の前記免疫抑制機能をブロックする前記組成物は、前記免疫抑制物質の機能をブロックする機能阻害剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記病原体によって分泌又は産生される前記免疫抑制物質は、ヒートショックプロテイン又はその断片を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ヒートショックプロテインは、ヒートショックプロテイン６０又はその断片を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ヒートショックプロテイン６０は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｎｏ．１の配列を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記機能阻害剤は、化学物質又は前記免疫抑制物質若しくはその断片を識別する抗体を含む請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記機能阻害剤は、前記免疫抑制物質又はその断片を識別する抗体のヒト化産物を含む請求項４記載の方法。
【請求項１０】
前記機能阻害剤は、前記ヒートショックプロテイン又はその断片を識別する抗体を含む請求項５記載の方法。
【請求項１１】
前記機能阻害剤は、前記ヒートショックプロテイン又はその断片に対する前記生体の免疫応答によって自然に生成した抗体を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、有効量の前記免疫抑制物質及びその医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む請求項４記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、免疫刺激効果を高めるアジュバントをさらに含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記病原体に対する免疫応答を刺激又は増強する医薬品の調製における、請求項８から１１のいずれか一項記載の機能阻害剤の用途。
【請求項１５】
前記病原体の存在又は異常発現に関連した病気又は症状を治療又は予防する医薬品の調製における請求項８から１１のいずれか一項記載の機能阻害剤の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体により誘導される免疫抑制機能をブロックする方法、及び前記方法の用途に関し、特に、病原体に対する宿主の免疫系を増強するために、病原体によって分泌、又は産生される免疫抑制物質によってもたらされる免疫抑制機能をブロックする方法、及び前記方法の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ・ピロリ菌）は、世界の成人人口の半数に感染しているグラム陰性菌である。ピロリ菌によって誘発される慢性的な炎症は、引き起こされた胃炎の程度と範囲によっては、消化性潰瘍、胃ガンのような様々な結果につながり得る。Ｔｈ１優位に偏った粘膜免疫応答は宿主中で活性化されるが、免疫応答は、ピロリ菌に対する防御免疫を起こすのに十分ではなく、ある患者における慢性的な感染及び胃病変の発生をもたらした。以前の研究では、ピロリ菌ライセートは、マイトジェン誘導性のＴ細胞増殖を阻害し得ることが明らかにされており、それは免疫抑制活性に関連するある因子がライセート中に存在することを示している。そのような因子は、細菌病原性遺伝子ＣａｇＡ及びＶａｃＡとは独立して、Ｔ細胞活性を減弱させる。ピロリ菌がどのように直接的に又は間接的にＴ細胞媒介性免疫を抑制するかを説明するために、いくつかのメカニズムが提案されてきた：ピロリ菌は、アルギナーゼによって、Ｔ細胞の増殖及びＴＣＲの発現を阻害し、阻害性サイトカインＴＧＦ−βの放出を刺激し、ＶａｃＡを介してインバリアント鎖依存的な抗原提示を妨げ、ＣａｇＡのリン酸化を介してＤＣの機能を負に制御し、又は、ＶｉｒＢ７及びＶｉｒＢ１１を介してプロフェッショナル食細胞による食作用を抑制することができる。
【０００３】
上記のメカニズムの関与の可能性にもかかわらず、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、現在、Ｔ細胞活性の阻害、及び、炎症と細菌持続性とのバランスにおける主要な制御成分と考えられている。２００３年には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ピロリ菌誘導性免疫病変、及び定着に関与することが報告された。さらなる研究により、宿主Ｔｒｅｇ細胞は、ピロリ菌に感染した宿主を過剰な胃の炎症及び吐き気、膨満感、潰瘍、胃出血などの症状から保護する上で重要であり、同時に胃及び十二指腸の粘膜での細菌の定着を促進することが示された。また、胃上皮細胞によるＢ７−Ｈ１の発現は、ピロリ菌暴露に続くＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の発生を促進するが、これは、この病原体が宿主Ｔｒｅｇ細胞の誘導を促進することを示している。その後の研究は、これらのピロリ菌誘導性Ｔｒｅｇ細胞の機能を調べ、それらがピロリ菌特異的エフェクターＴ細胞の活性を抑制し、又はアネルギーを誘導し得ることを示した。加えて、ピロリ菌誘導性胃炎は、細菌の定着、及び、粘膜のＴＧＦ−β１の発現の程度と相関する、ＦｏｘＰ３＋内在性Ｔｒｅｇ細胞の動員と関連している。まとめると、これらの知見は、ピロリ菌感染によって誘導される宿主のＴｒｅｇ応答が、ピロリ菌に対する免疫応答の重要な調節因子であり、ピロリ菌関連疾患の発病に関与していることを示している。
【０００４】
ピロリ菌ヒートショックプロテイン６０（ＨｐＨＳＰ６０）は、単球における炎症性サイトカイン及びＴＧＦ−β１の発現を誘導することができる。ＨｐＨＳＰ６０はウレアーゼを伴う細菌細胞壁に発現していることが報告されており、胃上皮細胞に対する接着分子として機能することができる。加えて、抗ＨＳＰ６０抗体の投与は、ピロリ菌の増殖を妨げることが見出された。従って、ＨｐＨＳＰ６０は、ピロリ菌の生存に必須の因子であるだけでなく、ヒトの胃への定着を容易にする重要な産物である。しかし、多くの研究は、ＨｐＨＳＰ６０が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、及びＩＬ−６などの炎症性サイトカインを強く誘導することにつながる強力な免疫原として作用することを示してきた。これらのサイトカインは、感染部位での炎症を決定づけ、そのようなＨｐＨＳＰ６０誘導性炎症は、血管新生及び転移を含む悪性腫瘍形成のプロセスを促進する可能性をもち得る。ＨｐＨＳＰ６０は、ヒト宿主におけるピロリ菌感染のための重要な病原因子でもある。
【０００５】
まとめると、ＨｐＨＳＰ６０とＴｒｅｇ細胞との関係は興味深く、かつ、さらなる研究に値する。しかし、ほとんどの過去の研究はＨｐＨＳＰ６０によって誘導される炎症に焦点を当てている。非常に少数の研究が、ＨｐＨＳＰ６０と、宿主内で発現する免疫抑制応答との関係について述べている。
【０００６】
米国特許第６４０３０９９号明細書は、ヒートショックプロテイン、及び、莢膜オリゴ糖又は多糖を含む共役化合物を開示した。その化合物は、抗多糖抗体の形成を誘導することができる。そのヒートショックプロテインは、ピロリ菌ヒートショックプロテインを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明の目的は、病原体によって誘導される免疫抑制機能をブロックする方法を提供することである。この発明の別の目的は、病原体によって誘導される免疫抑制機能をブロックするための用途を提供することである。
【０００８】
この発明の目的はまた、病原体によって分泌又は産生される免疫抑制物質によってもたらされる免疫抑制機能をブロックする方法、及び、その方法の用途を提供することである。
【０００９】
この発明の目的はまた、生体の免疫を改善する新規な方法、及び、その方法の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この発明によれば、ある病原体は、それらの宿主の免疫を抑制することができる。このような免疫抑制機能は、特に、その病原体によって分泌又は産生される免疫抑制物質によってもたらされる。その免疫抑制物質の機能を妨げることにより、その病原体の免疫抑制機能をブロックすることが可能である。免疫抑制機能が妨げられると、宿主の免疫活性は抑制されない。抑制されていない、又は高まった前記宿主の免疫機能は、病原体を減少させ、又は消失させることさえも可能である。
【００１１】
この発明の一態様によれば、生体の免疫を改善する新規な方法、及び、病気の予防、治療のための医薬品の調製におけるその方法の用途が提供される。
【００１２】
この発明によれば、生体の免疫を高める方法は、病原体の免疫抑制機能をブロックする組成物を、生体の内部又は外部に定着した細菌性病原体に直接的又は間接的に適用するステップを備える。ある特定の実施形態において、その組成物は、病原体が付着した生きている宿主生物に適用される。そのようなかつ他の実施形態では、病原体の免疫抑制機能は、病原体によって分泌又は産生される免疫抑制物質によってもたらされる。従って、病原体の免疫抑制機能をブロックする組成物は、免疫抑制物質の機能をブロックする機能阻害剤を含む。機能阻害剤は、免疫抑制物質又はその断片を識別する抗体を含む。免疫抑制物質はタンパク質であってもよく、その場合、断片はそのタンパク質のアミノ酸配列断片を含む。前記抗体は、免疫抑制物質に対する生体の免疫応答によって自然に生成されるものであってもよい。その抗体は、その抗体のヒト化抗体であってもよい。
【００１３】
その組成物は、有効量の免疫抑制物質、及び、その医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでもよい。その組成物はさらに、免疫刺激効果を高めるアジュバントを含んでもよい。
【００１４】
この発明の用途は、病原体に対する免疫応答を刺激又は増強する医薬品の調製において免疫抑制物質を使用することを含む。この発明の用途はまた、病原体の存在又は異常な発現に関連する病気又は症状を治療又は予防する医薬品の調製において免疫抑制物質を使用することを含んでもよい。
【００１５】
特定の実施形態によれば、生体の免疫を高める方法は、病原体によって分泌又は産生されるヒートショックプロテインの機能をブロックする機能阻害剤を病原体が存在する環境に適用するステップを備える。このような実施形態では、その環境は、病原体が付着した生きている宿主生物を含む。病原体は、生きている宿主生物の表面に付着するピロリ菌、又は、如何なる細菌であってもよい。
【００１６】
そのようなかつ他の実施形態では、機能阻害剤は、ヒートショックプロテイン、又はその断片を識別する抗体を含む。その抗体は、ヒートショックプロテイン又はタンパク質のアミノ酸配列断片に対する生体の免疫応答によって自然に生成されるものであってもよい。その抗体は、その抗体のヒト化抗体であってもよい。
【００１７】
その組成物は、有効量の前記機能阻害剤、及び、その医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでもよい。その組成物はさらに、免疫刺激効果を高めるアジュバントを含んでもよい。この発明の用途は、前記病原体に対する免疫応答を刺激又は増強する医薬品の調製における機能阻害剤を用いることを含む。この発明の用途はまた、病原体の存在又は異常な発現に関連する病気又は傷害を治療又は予防する医薬品の調製において機能阻害剤を使用することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＢＭＣ増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果を示す。
【図２】Ｔ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果を示す。
【図３】図３Ａから図３Ｃはそれぞれ、ＰＢＭＣ細胞周期に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果を示す。
【図４】ＨｐＨＳＰ６０によるＴｒｅｇ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導に関する実験結果を示す。
【図５】Ｔｒｅｇ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果を示す。
【図６】Ｔ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０誘導性Ｔｒｅｇ細胞の効果に関する実験結果を示す。
【図７】ＨｐＨＳＰ６０免疫抑制機能のブロックによるピロリ菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長阻害に関する実験結果を示す。
【図８】ＨｐＨＳＰ６０免疫抑制機能のブロックによるピロリ菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長阻害に関する別の実験結果を示す。
【図９】ＨｐＨＳＰ６０免疫抑制機能のブロックによるＴｒｅｇ細胞の阻害に関する実験結果を示す。
【図１０】Ｔｒｅｇ細胞成長を誘導するＨｐＨＳＰ６０の活性配列に関する実験結果を示す。
【図１１】図１０に示した実験結果を定量化して示す。
【図１２】抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の免疫学的メカニズムの研究に関する実験結果を示す。
【図１３】マウス胃粘膜におけるＴｒｅｇ細胞発現に対する抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の効果に関する実験結果を示す。
【図１４】マウス胃粘膜におけるＩＬ−１０発現に対する抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の効果に関する実験結果を示す。
【図１５】ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によるＨｐＨＳＰ６０断片の認識に関する実験結果を示す。
【図１６】ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によるＨｐＨＳＰ６０断片の認識に関するさらなる実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
如何なる理論によっても本発明は限定されるものではないが、本発明によれば、ある病原体は、増殖又は宿主に病気を引き起こすために、免疫抑制物質を分泌又は産生することによって、宿主の免疫を抑制することができる。そのような病原体の例には、ピロリ菌、並びに、アクロバクター  スイス（Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｉｓ）、タネレラ  フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、ポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アグリゲイティバクター  アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のような他の類似の細菌が含まれる。本発明者らは、ヒートショックプロテインは、そのような免疫抑制物質の一つであることを見いだした。この発明の実施形態によれば、ピロリ菌ヒートショックプロテイン６０（ＨｐＨＳＰ６０）は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのような免疫抑制ホルモンの産生を刺激し、かつ、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導するために、単球と反応することができる。結果として、宿主の免疫は抑制され、宿主をピロリ菌の慢性的な感染に抵抗できなくする。
【００２０】
本発明は、宿主の免疫を高める新規な方法を開発した。免疫抑制物質の機能をブロックする機能阻害剤は、免疫抑制物質の機能を妨げるために用いられる。こうして、Ｔｒｅｇ細胞の増殖は効果的に阻害され、宿主の免疫抑制応答は消失する。
【００２１】
この発明の機能阻害剤は、免疫抑制物質又はその断片を識別し、かつ、免疫抑制物質の機能をブロックすることができる物質を含む。免疫抑制物質がヒートショックプロテインである場合、機能阻害剤は、ヒートショックプロテインのアミノ酸配列、又は、その断片を識別することができる抗体である。
【００２２】
機能阻害剤は、大量生産を容易にするために、モノクローナル抗体の形態で調製してもよい。機能阻害剤は、医薬的に許容される担体又は希釈剤と共に、医薬組成物として調製されてもよい。その組成物はさらに、免疫刺激効果を高めるアジュバントを含んでもよい。アジュバントの一例は、上記の米国特許第６４０３０９９号明細書に開示される免疫刺激剤である。医薬組成物は、病原体に対する免疫応答を刺激又は改善する薬として用いてもよい。また、病原体の存在若しくは異常な発現に関連する病気又は傷害を治療又は予防する薬として用いてもよい。
【００２３】
以下では、この発明の病原体の免疫抑制機能をブロックする方法、及び病原体の免疫抑制機能をブロックすることの用途を説明するために、ある実施例が図面を参照して詳述されるだろう。しかし、この発明の範囲は詳述される実施形態のいずれにも限定されないと理解される。例えば、詳細な説明において、ピロリ菌の発病メカニズム及びＨｐＨＳＰ６０に対する機能阻害剤は、本発明を説明する例として用いられるが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ（慢性的な腸炎の既知の原因）、及びＡｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｉｓ（歯周病の既知の原因）のような他の細菌のヒートショックプロテインはまた、ＨｐＨＳＰ６０  １０１−２００のようなＨｐＨＳＰ６０と同一の断片を含む。従って、この発明の方法及び用途はまた、これら及び他の病原性細菌、並びに、類似の発病メカニズムを有する他の病原体に有用である。
【００２４】
（実施形態１）ＰＢＭＣ及びＴ細胞の細胞培養及び単離
健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて密度勾配遠心分離によって単離し、かつ、１０％不活性化ウシ胎児血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁した。単球枯渇のために、ＰＢＭＣｓは、１０６／ｍｌの密度で１０ｃｍディッシュにて、単球を付着させるためオーバーナイトで培養した。次に、懸濁した細胞は、１５分間の１５００ｒｐｍでの遠心分離によって回収した。総Ｔ細胞は、磁力選別装置（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡ、アメリカ合衆国）を用いたネガティブセレクションによってＰＢＭＣｓから単離した。簡易的に、ＰＢＭＣｓは、ビオチン結合抗体のカクテルとインキュベートし、続いて磁気除去用のマイクロビーズ結合抗ビオチン抗体（Ａｂｓ）とインキュベートした。Ｔ細胞は、製造者のプロトコルに従って溶出した。
【００２５】
（実施形態２）ＰＢＭＣ増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果
異なる量のＨｐＨＳＰ６０、ｒＧＦＰ又はボイルしたＨｐＨＳＰ６０で処理した、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で刺激したＰＢＭＣｓの増殖を細胞増殖アッセイによりモニターした。細胞増殖を測定するために、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞０．２ｍｌを、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で予め被覆した９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに播種した。細胞増殖は９６時間後のＭＴＴアッセイによって決定した。結果を図１：ＰＢＭＣ増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果に示す。そこで示すデータは、増殖率として報告される。  
【００２６】
細胞増殖率は、次のように計算した：増殖率（１００％）＝（抗ＣＤ３＋ＨｐＨＳＰ６０処理細胞のＯＤ５９５）／（抗ＣＤ３処理細胞のＯＤ５９５）×１００％。未処理群と有意に異なる結果は、＊（ｐ＜０．０５）で示した（ｎ＝１５）。
【００２７】
図１において、（◆）は、ＨｐＨＳＰ６０がＰＢＭＣに添加された後、Ｔ細胞の増殖が阻害されることを示す。（■）は、この実験系において対照タンパク質であるｒＧＦＰが、Ｔ細胞の増殖に影響しないことを示す。この対照ユニットの結果は、特定のタンパク質でなければＴ細胞の増殖を阻害することができないことを示す。（▲）は、ボイルしたＨｐＨＳＰ６０を表し、これは、ＨｐＨＳＰ６０の配列を含むが、そのタンパク質構造が破壊されている。結果は、ボイルしたＨｐＨＳＰ６０がＴ細胞の増殖に影響しないことを示す。
【００２８】
（実施形態３）ＰＢＭＣ中のＴ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の影響
抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で処理した後、ＰＢＭＣｓは、ＨｐＨＳＰ６０（２００ｎｇ）で処理したか、又は、これで処理しなかった。ＰＢＭＣｓ中のＴ細胞又は非Ｔ細胞は、ＣＤ３表面マーカー染色によって識別した。次に、細胞数は、引き続きフローサイトメーター解析で計算した。
【００２９】
ＣＤ３表面マーカー染色では、細胞を回収し、マウス抗ヒトＣＤ３ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（ＯＫＴ３）１μｇで染色し、続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ二次抗体（Ａｂｓ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ、アメリカ合衆国）０．５μｇで染色した。ＦｏｘＰ３細胞内染色では、細胞を回収し、固定と膜透過処理の前に、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ、アメリカ合衆国）で染色し、続いて、製造者のプロトコルに従って、マウス抗ヒトＦｏｘＰ３−ＰＥモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、アメリカ合衆国）で細胞内染色した。細胞周期アッセイでは、７２時間後に細胞を回収し、１０６個の細胞を７０％氷冷エタノールで固定した。ＤＮＡは、ＤＮＡ染色バッファー（５％  トリトン−Ｘ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ、及び４μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム）で室温にて３０分染色した。その後、ＤＮＡ量の変化を検出した。蛍光は、ＦＡＣＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）及びＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて解析した。結果を図２：Ｔ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果に示す。
【００３０】
図２では、増殖率は次のように計算した：増殖率（倍）＝（抗ＣＤ３／ＨｐＨＳＰ６０処理群のＴ細胞又は非Ｔ細胞数）／（未処理対照群のＴ細胞又は非Ｔ細胞数）。有意差は、＊（ｐ＜０．０５）で示した（ｎ＝４）。結果は、ＨｐＨＳＰ６０が、Ｔ細胞の増殖を阻害できることを示す。この図において、（□）はＰＢＭＣ中のＴ細胞を表す。（■）はＰＢＭＣ中の非Ｔ細胞を表す。明らかにＨｐＨＳＰ６０が阻害しているのは、Ｔ細胞の増殖である。
【００３１】
（実施形態４）細胞周期に対するＨｐＨＳＰ６０の効果
ＰＢＭＣの細胞周期に対するＨｐＨＳＰ６０の効果を決定した。実施形態３のＰＢＭＣ産物から、ＰＢＭＣｓ単独、ＣＤ３活性化ＰＢＭＣｓ、及び、抗ＣＤ３とＨｐＨＳＰ６０とで処理したＰＢＭＣｓをそれぞれ得た。ｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２／Ｍ期にある細胞のパーセンテージを観察し、図３Ａから図３Ｃに示すようにヒストグラムにプロットして表した。図３Ａから図３Ｃはそれぞれ、ＰＢＭＣの細胞周期に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果を示す。数値は、３回の繰り返しを代表するものである。
【００３２】
図３Ａから図３Ｃは、ＨｐＨＳＰ６０がＴ細胞の死滅を引き起こすよりもむしろ、Ｔ細胞の増殖を阻害することを示す。図３Ａは、ＣＤ３で活性化していないＴ細胞（細胞単独）が、休止期（Ｇ０／Ｇ）にとどまることを示す。図３Ｂは、ＣＤ３による活性化の後、Ｔ細胞の増殖は活性化され、典型的な細胞周期の画像が得られることを示す。図３Ｃは、図３Ｂと実質的な差がないことを示す。抗ＣＤ３とＨｐＨＳＰ６０とで処理したＰＢＭＣｓ（抗ＣＤ３＋ＨｐＨＳＰ６０）は、ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期（細胞の死滅を表す）にある割合が、抗ＣＤ３群の場合と同じ割合を示した。実験結果は、ＨｐＨＳＰ６０の役割がＴ細胞の死滅よりもむしろ増殖阻害であることを示す。
【００３３】
（実施形態５）ＨｐＨＳＰ６０によるＴｒｅｇ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導の結果
ＨｐＨＳＰ６０で処理したＰＢＭＣｓ中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率を、経時的に測定した。抗ＣＤ３対照群と比較した有意差は、＊（ｐ＜０．０５）で示した（ｎ＝５）。結果は、図４：ＨｐＨＳＰ６０によるＴｒｅｇ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導に関する実験結果に示す。
【００３４】
ＣＤ４とＦｏｘＰ３とは、Ｔｒｅｇ細胞のマーカーであるので、図４からＴ細胞の成長におけるＨｐＨＳＰ６０の効果を識別することができる。この図において、「（●）細胞単独」はＴ細胞の元々の成長曲線を表す。「（■）抗ＣＤ３」はＣＤ３により活性化したＴ細胞の成長曲線を表す。「（▲）抗ＣＤ３＋ＨｐＨＳＰ６０」はＴ細胞の顕著な増殖を示す。実験結果は、ＨｐＨＳＰ６０がＴｒｅｇ細胞の増殖を増強できることを示す。
【００３５】
（実施形態６）ＨｐＨＳＰ６０はＴｒｅｇ細胞の増殖を増強する
実施形態５に続き、総ＲＮＡ単離のために、細胞を、７２時間後に回収した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、ＦｏｘＰ３  ｍＲＮＡの発現を測定するために用いた。抗ＣＤ３対照群と比較した有意差は、＊（ｐ＜０．０５）で示した（ｎ＝４）。結果は、図５：Ｔｒｅｇ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０の効果に関する実験結果に示す。
【００３６】
ＦｏｘＰ３はＴｒｅｇ細胞のマーカーであるから、Ｔｒｅｇ細胞が活性化される場合、ＦｏｘＰ３の発現も増加する。図５のｍＲＮＡアッセイ結果は、ＨｐＨＳＰ６０の添加に続き、ＦｏｘＰ３の発現が顕著に増加することを示す。この実験はさらに、ＨｐＨＳＰ６０の添加がＴｒｅｇ細胞の増殖を増強するという事実をサポートする。
【００３７】
（実施形態７）Ｔ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０誘導性Ｔｒｅｇ細胞の活性
機能的アッセイは、細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０誘導性Ｔｒｅｇ細胞の活性を測定するために用いた。その結果を図６に示す。図６は、Ｔ細胞増殖に対するＨｐＨＳＰ６０誘導性Ｔｒｅｇ細胞の効果に関する実験結果を示す。ヒストグラム上の数字は、増殖性細胞のパーセンテージを示す。ヒストグラムは、３回の繰り返しを代表するものである。
【００３８】
実験結果は、Ｔｒｅｇ細胞の細胞数が増加する場合、それに応じてＴ細胞の活性が阻害されることを示す。これは、ＨｐＨＳＰ６０がＰＢＭＣに添加される場合、Ｔｒｅｇ細胞の増加により、Ｔ細胞の活性が阻害されることを証明する。
【００３９】
（実施形態８）抗ＨｐＨＳＰ６０血清、及び、ＨｐＨＳＰ６０モノクローナル抗体の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔａｉｐｅｉ、台湾から購入し、病原体フリーアイソレーター内で維持した。全ての飼料、水、ケージ、及び、床敷は、使用前に滅菌した。免疫応答を引き起こすために、５週齢の雄マウスにＨｐＨＳＰ６０を静脈（ｉ．ｖ．）注射した。ＨｐＨＳＰ６０の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）を繰り返した後に、マウスの血液を回収した。「抗ＨｐＨＳＰ６０血清」と称される抗ＨｐＨＳＰ６０抗体を含有する血清を得るために、血清を単離する。このステップの産物は、ポリクローナル抗体である。
【００４０】
マウス脾細胞は、ハイブリドーマを形成するために、マウスミエローマ細胞と融合させた。この産物は、特異抗体を単離するために、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりさらにスクリーニングする。
【００４１】
得られた細胞株を希釈し、９６ウェルの細胞培養プレートに再分配した。各ウェルは、確実に１つの細胞のみを含むように計算する。細胞が成長してコロニーを形成した後、特異抗体を得るために、コロニーをＥＬＩＳＡによって再スクリーニングする。こうして、モノクローナル抗体を得る。
【００４２】
（実施形態９）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨｐＨＳＰ６０ブロックによるピロリ菌の除菌の評価
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔａｉｐｅｉ、台湾から購入し、病原体フリーアイソレーター内で維持した。全ての飼料、水、ケージ、及び、床敷は、使用前に滅菌した。ピロリ菌を接種する前に、５週齢の雄マウスに実施形態８で得た抗ＨｐＨＳＰ６０血清０．１ｍｌを静脈（ｉ．ｖ．）注射した。抗血清処理の２４時間後に、生きているピロリ菌（ＡＴＣＣ  １５４１５株、約１０９コロニー形成単位）を含むＢＨＩ  Ｂｒｏｔｈ  ０．５ｍｌを３日間に２回マウスに強制経口投与して、感染させた。ピロリ菌の感染が成立した後、そのマウスに抗ＨｐＨＳＰ６０血清０．１ｍｌを３日おきに静脈（ｉ．ｖ．）注射した。
【００４３】
ピロリ菌接種後８週目に、全てのマウスを無菌的に屠殺し、無傷な胃を小彎に沿って開いた。それぞれの胃は、胃体部及び胃前庭部を含む２つの等しい縦断標本に切断した。ピロリ菌の除菌は、ピロリ菌の再培養、及び、ＦｏｘＰ３の発現用の免疫組織化学染色によって分析した。
【００４４】
結果は、平均値±ＳＥＭとして表す。統計的有意差は、片側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を用いて評価した。 Ｐ＜０．０５を有意とみなした。結果を図７、図８及び図９に示す。これらのうち、図７及び８は、それぞれ、ＨｐＨＳＰ６０免疫抑制機能のブロックによる、ピロリ菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長阻害に関するいくつかの実験結果を示す。図９は、ＨｐＨＳＰ６０免疫抑制機能のブロックによる、Ｔｒｅｇ細胞の阻害に関する実験結果を示す。
【００４５】
図７及び図８は、抗ＨｐＨＳＰ６０血清が、ピロリ菌接種後８週目に、胃組織ライセートからのピロリ菌コロニーの再培養を顕著に減少させることを示す。抗体によるコロニー減少のメカニズムを決定するために、ピロリ菌に感染した胃組織におけるＴｒｅｇ細胞の発現を評価した。図９は、抗ＨｐＨＳＰ６０血清処理が胃粘膜でのＴｒｅｇ細胞の発現を顕著に減少させることを明らかにする。これらの結果は、慢性的なピロリ菌感染がＨｐＨＳＰ６０と関連していること、及び、ＨｐＨＳＰ６０のブロックが、ピロリ菌の定着、及びＴｒｅｇ細胞の発生を減少させ得ることを示している。
【００４６】
（実施形態１０）ＨｐＨＳＰ６０におけるＴｒｅｇ細胞誘導性配列の位置
Ｔｒｅｇ細胞を誘導するＨｐＨＳＰ６０の活性配列の位置を決めるために、ＨｐＨＳＰ６０の全配列又は断片を認識する抗ＨｐＨＳＰ６０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を調製する。実施形態９の方法を用いる。抗ＨｐＨＳＰ６０血清で２４時間処理した後に、マウスを、ピロリ菌に感染させた。それによってピロリ菌の感染が成立される。次に、０．１ｍｌのＰＢＳ、血清、抗ＨｐＨＳＰ６０血清、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及びＬＨＰ−２（５Ａ８）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をマウスに３日おきにそれぞれ静脈（ｉ．ｖ．）注射した。マウスは、８週後に屠殺した。胃におけるピロリ菌の寄生を確認するために、胃壁をすり潰し、得た胃のホモジネートを、ピロリ菌  ｉｎｃｕｂａｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＥＹＥ  ａｇａｒ）でインキュベートした。結果を図１０：Ｔｒｅｇ細胞成長を誘導するＨｐＨＳＰ６０の活性配列に関する実験結果に示す。
【００４７】
図１０に示すように、プレート上の赤いスポットは、ピロリ菌のコロニーである。この実験は、抗ＨｐＨＳＰ６０血清が、ピロリ菌の増殖を阻害する一方で、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体が、ピロリ菌を完全に消失させ得ることを明らかにしている。
【００４８】
ピロリ菌のコロニー数（ＣＦＵ）は、ＥＹＥプレート上の赤いコロニーを数えることによって決定した。有意差は、＊（ｐ＜０．０５）によって示す。結果を図１１に示す。図１１は、図１０に示した実験結果を定量化して示す。図１１に示すように、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体を添加した後、ピロリ菌は、完全に消失した。
【００４９】
（実施形態１１）抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の免疫学的メカニズム
抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の免疫学的メカニズムを理解するために、実施形態１０に従って、ピロリ菌接種後２週目、３週目、８週目で、マウスの胃ウレアーゼ活性を測定した。ウレアーゼ活性は、対照マウス（ピロリ菌感染なし）の胃ウレアーゼ活性で正規化される。結果を図１２：抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の免疫学的メカニズムの研究に関する実験結果に示す。この図は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体が、ピロリ菌の増殖を阻害し、又は、ＨｐＨＳＰ６０の活性を阻害することによって、ピロリ菌を消失すらさせることを示す。
【００５０】
ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体は、ＨｐＨＳＰ６０のアミノ酸配列１０１から２００位を抗原として用いて生成した。この抗体ＬＨＰ−１（９Ｅ４）を含むハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０、アメリカ合衆国、ＡＴＣＣ名称：ＰＴＡ−１２２９００（： ＡＴＣＣ受託番号）で寄託した。寄託の日付は２０１６年３月２日である。
【００５１】
（実施形態１２）胃粘膜におけるＴｒｅｇ細胞の発現評価
胃粘膜におけるＴｒｅｇ細胞の発現における抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の効果を理解するために、実施形態１０で得たマウスの胃を中性緩衝１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。５マイクロメートルの切片をＨ＆Ｅ染色剤で染色した後、ＦｏｘＰ３を免疫組織化学染色した。結果を図１３に示す。図１３は、マウス胃粘膜におけるＴｒｅｇ細胞発現に対する抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の影響に関する実験結果を示す。この図では、すべての画像は、８週目に屠殺されたマウスの代表的なものである（２００μｍ原倍率×１００）。結果は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体で処理したマウスの胃粘膜においてＴｒｅｇ発現が、観察されないことを示す。
【００５２】
（実施形態１３）マウス胃粘膜におけるＩＬ−１０発現に対するＨｐＨＳＰ６０の効果
実施形態１０で得たマウスの胃は、中性緩衝１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。５マイクロメートルの切片をＨ＆Ｅ染色剤で染色した後、ＩＬ−１０を免疫組織化学染色した。結果を図１４に示す。図１４は、マウス胃粘膜におけるＩＬ−１０発現に対する抗ＨｐＨＳＰ６０抗体の効果に関する実験結果を示す。この図では、すべての画像は、８週目で屠殺されたマウスの代表的なものである（２００μｍ原倍率×１００、１００μｍ原倍率×２００）。結果は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体で処理されたマウスの胃粘膜においてＩＬ−１０発現が、観察されないことを示す。
【００５３】
（実施形態１４）ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によって識別可能なＨｐＨＳＰ６０断片
ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体は、異なる長さのＨｐＨＳＰ６０の断片を識別するために用いて、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によって認識され得るＨｐＨＳＰ６０の断片を決定する。結果を図１５に示す。 図１５は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によるＨｐＨＳＰ６０断片の認識に関する実験結果を示す。この図では、濃いスポットは陽性と識別されることを表す。識別されようとしている断片は以下のものを含むが、ほとんどのマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はカッパ型であるため、ＩｇＫを陽性コントロールとして用いる：
Ｗｈｏｌｅ：ＨｐＨＳＰ６０全長、すなわち１−５４７位。
１−２００：ＨｐＨＳＰ６０の１−２００位を含む断片。
１０１−２００：ＨｐＨＳＰ６０の１０１−２００位を含む断片。
１−２５０：ＨｐＨＳＰ６０の１−２５０位を含む断片。
２００−３００：ＨｐＨＳＰ６０の２００−３００位を含む断片。
３００−５４７：ＨｐＨＳＰ６０の３００−５４７位を含む断片。
【００５４】
結果は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によって識別可能なＨｐＨＳＰ６０の断片が、１０１−２００位の配列であることを示し、そのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＯ：１）は、
ＥＧＬＲＮＩＴＡＧＡＮＰＩＥＶＫＲＧＭＤＡＫＡＡＥＡＩＩＮＥＬＫＫＡＳＫＫＶＧＧＫＥＥＩＴＱＶＡＴＩＳＡＮＳＤＨＮＩＧＫＬＩＡＤＡＭＥＫＶＧＫＤＧＶＩＴＶＥＥＡＫＧＩＥＤＥＬＤＶＶＥＧＭＱＦＤＲＧＹＬＳ
である。
【００５５】
（実施形態１５）ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によって識別可能なＨｐＨＳＰ６０の断片のさらなる限定
実施形態１４の方法に従い、より短い長さの異なる断片を識別するために、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体を用いる。結果を図１６に示す。 図１６は、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によるＨｐＨＳＰ６０断片の認識に関するさらなる実験の結果を示す。この図では、濃いスポットは陽性と識別されることを表す。△［１］は、陽性の結果を伴うＨｐＨＳＰ６０の１３４−２００位を表す一方で、 △［５］は、陰性の結果を伴うＨｐＨＳＰ６０の１０１−１６８位を表す。従って、ＬＨＰ−１（９Ｅ４）抗体によって識別可能なＨｐＨＳＰ６０断片は、ＨｐＨＳＰ６０のアミノ酸１６９−２００位を含むことを結論付けることができ、その配列は、
ＫＤＧＶＩＴＶＥＥＡＫＧＩＥＤＥＬＤＶＶＥＧＭＱＦＤＲＧＹＬＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＯ：２）
である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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