(57)【要約】【課題】高コスト化及び大型化を招くことなく、細胞の種類及び細胞の状態を正確かつ迅速に測定することができる測定装置の提供。【解決手段】細胞乃至組織周辺の変化を測定する手段と、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する培養手段と、前記緩衝液Ａ中の糖濃度よりも高濃度であり、かつ過剰な糖を含有する液Ｂを、前記細胞乃至組織が培養されている前記緩衝液Ａに対して供給する手段と、を備える測定装置である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞乃至組織周辺の変化を測定する手段と、
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する培養手段と、
前記緩衝液Ａ中の糖濃度よりも高濃度であり、かつ過剰な糖を含有する液Ｂを、前記細胞乃至組織が培養されている前記緩衝液Ａに対して供給する手段と、を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記測定する手段が、プロトン濃度の変化による電位変化を測定するセンサーである請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
前記緩衝液Ａが、糖を含有しない請求項１から２のいずれかに記載の測定装置。
【請求項４】
前記液Ｂを供給する手段が、前記細胞乃至組織を少なくとも１時間培養後、前記液Ｂを供給する請求項１から３のいずれかに記載の測定装置。
【請求項５】
前記液Ｂが、前記緩衝液Ａに糖を溶解した液であり、
前記液Ｂが、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグルコースを含有する請求項１から４のいずれかに記載の測定装置。
【請求項６】
解糖系促進剤である２，４−ジニトロフェノールを供給する手段をさらに備える請求項１から５のいずれかに記載の測定装置。
【請求項７】
解糖系阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースを供給する手段をさらに備える請求項１から６のいずれかに記載の測定装置。
【請求項８】
前記緩衝液Ａが、純水、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、及びＮａＨ２ＰＯ４を所定の割合において含有する請求項１から７のいずれかに記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞等のヒト幹細胞を用いた再生医療に大きな期待が寄せられており、ｉＰＳ細胞を分化させて神経細胞、網膜細胞等の様々な細胞を作り出し、細胞治療に用いる試みが世界中で進められている。
【０００３】
一方で、ｉＰＳ細胞から分化し移植される細胞の中に残存した未分化のｉＰＳ細胞が腫瘍化することが問題となっている。このことがｉＰＳ細胞を再生医療に応用する上での大きな障壁となっており、残存した未分化のｉＰＳ細胞を非侵襲であり、かつ効率よく測定するための技術が望まれている。また、ｉＰＳ細胞を分化誘導した後の細胞種の判定、誘導された細胞の活性度及び質の判定などができる判定技術が期待される。
しかし、再生医療のような診断を行った後の細胞は体内へと導入されるため、非侵襲であることが望まれている。
【０００４】
生細胞は、栄養物、及び酸素を周囲の媒質から消費し、イオン、二酸化炭素、乳酸塩、及び様々なタンパク質を含む代謝副生成物を細胞外環境に排出している。これらの栄養物等の摂取及び代謝副生成物の排出の速度からは、細胞内で行われている代謝プロセスに関する重要な情報を得ることができる。
【０００５】
そこで、そのような判定技術として、これまで蛍光染料を用いて前記生細胞の代謝プロセスを調べるための以下のような機器が開発されている。
細胞培養のためのレセプタクルを有し、細胞培養を測定するための単数又は複数のセンサーが設けられており、かつ反応チャンバを制限する運動可能な分離部材が設けられている細胞培養の分析を実施する装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、複数のｐＨセンサーを、細胞媒質の測定に対して適用することができることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
さらに、細胞の媒質の元の体積を減少させて、媒質の縮小された体積を規定し、前記媒質の縮小された体積内で細胞に関連するイオン等の成分を分析することにより、細胞の複数の生物学的活性を測定するための装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、高コスト化及び大型化を招くことなく、細胞の種類及び細胞の状態を正確かつ迅速に測定することができる測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としての本発明の測定装置は、細胞乃至組織周辺の変化を測定する手段と、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する培養手段と、前記緩衝液Ａ中の糖濃度よりも高濃度であり、かつ過剰な糖を含有する液Ｂを、前記細胞乃至組織が培養されている前記緩衝液Ａに対して供給する手段と、を備える。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、高コスト化及び大型化を招くことなく、細胞の種類及び細胞の状態を正確かつ迅速に測定することができる測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、増殖細胞の代謝を示す概略説明図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、心筋細胞の代謝を示す概略説明図である。
【図２】図２は、ｐＨとポテンシャルとの関係を示す図である。
【図３】図３は、ｉＰＳ由来の心筋塊の位相差顕微鏡画像である。
【図４】図４は、本発明の測定装置の一例を示す概略図である。
【図５】図５は、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む糖が飢餓状態である細胞乃至組織の位相差顕微鏡による画像である。
【図６】図６は、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まない糖が飢餓状態である細胞乃至組織の位相差顕微鏡による画像である。
【図７】図７は、実施例１０及び実施例１１における、飢餓状態の時間と、細胞周辺の電位差との関係を示す図である。
【図８】図８は、実施例１２及び実施例１３における、飢餓状態における培養時のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係を示す図である。
【図９】図９は、実施例１４及び実施例１５における、液Ｂ中のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（測定装置）
本発明の測定装置は、細胞乃至組織周辺の変化を測定する手段と、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する培養手段と、前記緩衝液Ａ中の糖濃度よりも高濃度であり、かつ過剰な糖を含有する液Ｂを、前記細胞乃至組織が培養されている前記緩衝液Ａに対して供給する手段と、を備え、更に必要に応じて、その他の手段を備えてなる。
本発明の測定装置は、従来の測定装置では、細胞の種類を正確に測定することができないという問題があるという知見に基づくものである。
【００１１】
ここで、図１Ａ及び図１Ｂを用いて、増殖細胞、及び心筋細胞における代謝の違いについて説明する。図１Ａは、増殖細胞の代謝を示す概略説明図である。図１Ｂは、心筋細胞の代謝を示す概略説明図である。
図１Ａに示すように、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞等の増殖細胞においては、グルコース等を糖として活発に細胞内に取り込んだ後、前記グルコースは解糖系を亢進させることにより、ピルビン酸を産生する。その後、産生された前記ピルビン酸の多くは、ミトコンドリアにおいてＡＴＰを大量に生産するＴＣＡサイクル（クエン酸回路）には供されず、乳酸に変換されて細胞外に排出される。さらに、アミノ酸や核酸を多く合成する。
一方、図１Ｂに示すように、心筋細胞においては、前記増殖細胞と同様に、グルコース等を細胞内に取り込んだ後、前記グルコースは解糖系に供され、ピルビン酸が産生される。その後、前記ピルビン酸は、ＴＣＡサイクル（クエン酸回路）に供され、酸化的リン酸化によって効率よくＡＴＰが産生され、乳酸は少量しか産生されず、細胞外に排出される乳酸も少量である。このように、前記増殖細胞と、前記心筋細胞とは、グルコース等を細胞内に取り込んだ場合におけるグルコースの代謝プロセスが異なることが報告されている（Ｓｈｏｇｏ  Ｔｏｈｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ,１２，１２７−１３７（２０１３））。
【００１２】
そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、下記の知見を得た。
前記増殖細胞及び前記心筋細胞のように、細胞種によって、グルコース等の糖を細胞内に取り込んだ後の代謝プロセスが異なり、また、代謝プロセスが同じであっても、細胞種によって、代謝速度、代謝活性等は異なると考えられる。そこで、細胞内の解糖系に着目し、細胞外に排出される乳酸に由来する水素イオンによって細胞外の電位及びｐＨが変化するという知見を得た。
そこで、糖を飢餓状態である細胞乃至組織に、過剰な糖を含有する液Ｂを供給することにより、前記過剰な糖を含有する液Ｂの供給前後の前記細胞乃至組織周辺の変化の差に基づいて、細胞種の測定、及び細胞の状態の測定をする。
【００１３】
＜培養手段＞
前記培養手段は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する手段である。
【００１４】
前記培養手段としては、糖が飢餓状態にある細胞乃至組織を培養可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、センサーウエルなどが挙げられる。
前記培養手段としては、糖が飢餓状態にある細胞乃至組織を培養可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記細胞乃至組織が培養手段の底面に接着していることが好ましい。
前記培養手段の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養手段の底面は、細胞乃至組織が接着できるようにポリスチレン等の接着性基質が好ましい。
また、前記培養手段の底面には、センサーの基盤が配置され、液漏れが無いようにウエルと結合されていることが好ましい。
【００１５】
＜＜細胞乃至組織＞＞
前記細胞乃至組織は、糖が飢餓状態にあれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細菌類、菌類、酵母菌、原核細胞、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、又はそれらの不死化細胞などが挙げられる。これらの中でも、ヒト細胞が好ましい。
前記ヒト細胞としては、例えば、線維芽細胞（ＮＨＤＦ等）、ＨｅＬａ細胞、心筋細胞、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ等）などが挙げられる。
【００１６】
前記糖が飢餓状態にある細胞乃至組織としては、培養手段の底面に接着していてもよく、センサー表面に付着していてもよく、細胞を飢餓状態にするための液中に遊離していてもよい。前記細胞を培養した培養手段の少なくとも一部には、生きた組織を含んでいてもよい。
なお、前記細胞乃至組織を緩衝液Ａを用いて一定時間以上培養することにより、前記細胞乃至組織を、糖が飢餓状態とすることができる。
【００１７】
前記細胞乃至組織の培養手段への播種濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、１×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。前記播種濃度が、１×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、前記細胞乃至組織を好適に培養できる。
また、心筋細胞の培養手段への播種濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、３００μｍ以上４００μｍ以下の心筋塊（１５，０００個／塊）が好ましい。心筋塊を測定する場合は、必ずしも心筋塊がセンサーウエル上に接着している必要はない。
図３に、３００μｍ以上４００μｍ以下のｉＰＳ由来の心筋塊の位相差顕微鏡画像を示す。
前記細胞乃至組織の播種濃度は、例えば、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。前記細胞は、遊離状態であると、略球状の形状をとるため、体積平均粒径を測定することができる。
【００１８】
前記糖が飢餓状態にある細胞乃至組織としては、飢餓状態にする前に、前記培養手段内において培養され、正常に増殖していることが好ましく、前記培養手段の底面に接着していることがより好ましい。前記細胞乃至組織が、前記培養手段の底面に接着していることにより、前記培養手段の下側に存在するセンサーにより、前記細胞乃至組織周辺の変化を測定することができる。
【００１９】
前記糖が飢餓状態にある細胞乃至組織としては、５ｍｍｏｌ／Ｌ(ｍＭ)以下のグルコースを含む液により調整されることが好ましく、グルコースを含まない液により調整されることがより好ましい。前記糖が飢餓状態にある細胞乃至組織が、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグルコースを含む液により調整されると、糖の供給が少なく、前記細胞乃至組織を飢餓状態にすることができる。
前記５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含む緩衝液Ａにより調整するとは、正常な細胞乃至組織を、通常の条件下、及び培地により培養した後に、前記培地を５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグルコースを含む液に変更して培養することを意味する。
【００２０】
前記培地を５ｍｍｏｌ／Ｌ以下糖を含む緩衝液Ａに変更した後の培養としては、特に制限はなく、培養温度、培養装置、糖が飢餓状態である時間（飢餓状態培養時間）、培地中の二酸化炭素濃度、培地の供給方法、培地の供給量、ｐＨなどの条件を目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
前記培養温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、培養温度は２５℃以上４５℃以下が好ましく、３３℃以上４０℃以下がより好ましく、３６℃以上３８℃以下が特に好ましい。前記培養温度が、２５℃以上４５℃以下であると、細胞を好適に培養することができる。
【００２２】
前記培養装置としては、細胞を至適培養温度に保温し培養することができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。
【００２３】
前記糖が飢餓状態である時間（飢餓状態培養時間）としては、前記細胞乃至組織を飢餓状態にできれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２０分間以上が好ましく、１時間以上がより好ましく、１時間以上１２時間以下が特に好ましい。前記培養時間が、２０分間以上であると、細胞を好適に飢餓状態にすることができ、過剰な糖を含有する液Ｂを供給した場合に、供給前後の細胞乃至組織周辺の変化が顕著になり、細胞の測定に有利となる。
【００２４】
−緩衝液Ａ−
前記緩衝液Ａとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有し、純水、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、及びＮａＨ２ＰＯ４を含有することが好ましい。前記カルシウムイオン及び前記マグネシウムイオンを含むことにより、糖が飢餓状態である細胞乃至組織を培養する場合に、前記培養手段の底面に接着した前記細胞乃至組織が、前記底面から剥がれることなく培養することができる。
【００２５】
前記５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含む緩衝液Ａの供給手段としては、特に制限はなく、例えば、目的に応じて適宜選択することができ、インクジェット、ディスペンサー、ピペット、アスピレータなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
−細胞乃至組織を飢餓状態にする前の培養−
前記細胞乃至組織は、飢餓状態に供する前に、正常に細胞を増殖及び定着させるために培養を行うことが好ましい。
【００２７】
前記細胞乃至組織を飢餓状態にする前の培養としては、特に制限はなく、培養温度、培養装置、培養時間、培地、培地中の二酸化炭素濃度、培地の供給方法、培地の供給量、ｐＨなどの条件を目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
前記培養温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、培養温度は２５℃以上４５℃以下が好ましく、３３℃以上４０℃以下がより好ましく、３６℃以上３８℃以下が特に好ましい。前記培養温度が、２５℃以上４５℃以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
【００２９】
前記培養装置としては、細胞を至適培養温度に保温し培養することができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。
【００３０】
前記培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１２時間以上６０時間以下が好ましく、１５時間以上５０時間以下がより好ましい。前記培養時間が、１２時間以上６０時間以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
また、細胞が増殖、及び伸展し、細胞間で接着していることを確認するには、組織体をヘマトキシリン・エオジン法（ＨＥ）染色し、例えば、組織体断面観察像により断面を観察することにより、組織体中の空隙割合や細胞の伸展度合いにより確認することができる。
【００３１】
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成で分類される培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）等の形状により分類される培地などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
【００３２】
前記動物細胞の培養に用いられる培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄ−ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３３】
前記培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２体積％以上５体積％以下が好ましく、３体積％以上４体積％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、２体積％以上５体積％以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
【００３４】
前記培地の供給方法としては、特に制限はなく、例えば、目的に応じて適宜選択することができ、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
前記培地の供給量としては、１×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、１×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下となるように供給することが好ましい。前記細胞数が、５×１０５個以上５×１０８個以下であると、細胞の増殖、及び伸展に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００３６】
前記ｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、４以上７以下が好ましく、５以上６以下がより好ましい。
【００３７】
なお、培養において、使用する試薬は、滅菌処理されたものを用いることが好ましく、培養操作、及び培養装置は、無菌処理されたものを用いることが好ましい。
【００３８】
＜供給する手段＞
前記液Ｂを供給する手段しては、前記細胞乃至組織を少なくとも１時間培養後、前記液Ｂを供給することが好ましい。
前記供給する手段は、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）を含有する液を供給する手段、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含有する液を供給する手段をさらに有することが好ましい。
前記供給としては、例えば、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）を含有する液の供給、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含有する液の供給などが挙げられる。
また、前記供給としては、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）を含有する液を供給後に、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含有する液を供給することが好ましい。
【００３９】
前記供給する手段としては、特に制限はなく、例えば、目的に応じて適宜選択することができ、インクジェット吐出手段、ディスペンサー、ピペット、アスピレータなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４０】
＜＜液Ｂ＞＞
前記液Ｂとしては、前記培養手段内において培養されている糖が飢餓状態である細胞乃至組織に対して過剰な糖を含有すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコースなどが挙げられる。
前記糖の濃度としては、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。前記濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であると、前記培養手段内の糖が飢餓状態にある細胞乃至組織に対して過剰な糖を供給することができる。
【００４２】
前記液Ｂとしては、糖以外の組成が、前記カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグルコースを含む緩衝液Ａと同様であることが好ましい。
【００４３】
＜＜２，４−ジニトロフェノール＞＞
２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）は、解糖系促進剤として用いられ、下記構造式で表される。
【化１】
2017127288.tif 000002
【００４４】
前記２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）は、酸化的リン酸化の脱共役剤として最もよく知られており、生化学領域では、化学浸透や他の膜輸送プロセスが関わる生体エネルギー論的研究でよく用いられる。
また、酸化的リン酸化の脱共役剤として機能する２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）をヒト非小細胞性上皮性肺がん細胞に作用させて、クエン酸回路に使用されるピルビン酸を、解糖系において乳酸の生成に使用することができることが報告されている（Ｗｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９２（１），Ｃ１２５−１３６（２００７））。
【００４５】
前記２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）は、細胞内外の水素イオンに対するイオノフォア（プロトノフォア）として機能し、細胞外から細胞内へ水素イオンを運搬するＦ型ＡＴＰ合成酵素を通らずに、濃度勾配に従って内膜を通過して細胞外から細胞内に水素イオンを流入させることができる。その結果、内膜を挟んだ水素イオンの濃度が消失してしまうため、水素イオンはＡＴＰ合成酵素を通過しなくなり、ＡＴＰは合成されなくなる。すなわち、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）により、電子伝達系がＡＴＰを合成することなく「空回り」する。ＴＣＡ回路から電子伝達系の流れが継続する限り、酸素は使われるため、「無駄に」酸素が消費されることになる。
【００４６】
これにより、細胞における酸素が欠乏し、嫌気的条件になることにより、ピルビン酸が乳酸の生成に利用され、細胞外へ排出される乳酸由来の酸性度（プロトン濃度）を上昇させることができる。
【００４７】
前記２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）としては、糖が飢餓状態である細胞乃至組織に、過剰な糖を含有する液Ｂを供給した後に供給することが好ましい。過剰な糖を含有する液Ｂを供給した後に供給することにより、過剰な糖を用いて解糖系によりピルビン酸を産生し、乳酸を生成することができ、糖が飢餓状態である細胞乃至組織に、過剰な糖を含有する液Ｂを供給しただけの場合と比較して、細胞外の電位の増加を測定しやすくなる。
また、前記２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）としては、緩衝液Ａ等に溶解させた液として供給することが好ましい。
【００４８】
前記２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。前記含有量が、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であると、解糖系促進剤としての効果を得ることができる。
【００４９】
＜＜２−デオキシ−Ｄ−グルコース＞＞
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、解糖系阻害剤として用いられ、下記構造式で表わされるように、グルコースの２位の水酸基（ＯＨ）が水素原子（Ｈ）に置換されたグルコース誘導体である。
【化２】
2017127288.tif 000003
【００５０】
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、グルコースと同じようにグルコース輸送体（グルコース・トランスポーター）であるＧＬＵＴ１を利用して細胞内に取り込まれる。
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、細胞内に入るとヘキソキナーゼ（Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）によってリン酸化され、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸に変換される。リン酸化されるとグルコース・トランスポーター（ＧＬＵＴ１）を通過できないため細胞外へ出られなくなる。なお、ヘキソキナーゼによる６位のリン酸化は、解糖系によるグルコースの代謝の最初のステップで、細胞内に取込んだグルコースを細胞内に留めることを目的としている。
【００５１】
通常、リン酸化反応後、グルコース−６−リン酸はさらに解糖系で代謝されてエネルギー産生に使われ、ペントース・リン酸経路により核酸等の物質合成の材料としても利用される。しかし、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸は、解糖系酵素で代謝できないため、細胞内に蓄積する。特に、多くのがん細胞はフォスファターゼの活性が低いので、一旦細胞内に入った２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸に変換されたあとは細胞外に出ることができず、さらに解糖系酵素で代謝されることもないため、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸の状態で細胞内に蓄積する。２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）によってエネルギー産生が低下するとそのストレス応答によってグルコーストランスポーターの発現がさらに増え、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の取り込みをさらに増やす傾向にある。細胞内で蓄積した２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸は、ヘキソキナーゼとヘキソース・フォスフェート・イソメラーゼとを拮抗阻害する。これにより、解糖系により産生されるピルビン酸の量も少なくなり、前記ピルビン酸から生成される乳酸も少なくなることが推測される。
【００５２】
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）としては、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞等に用いた場合、前記線維芽細胞、及び前記ＨｅＬａ細胞は、２−ＤＧのリン酸化活性を有しており、前記２−ＤＧが強い解糖系阻害剤として働くと考えられるため、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞などに用いることが好ましい。一方、肝臓細胞、腎臓細胞等のような細胞は、糖新生を行えるため、前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、解糖系阻害剤としての効果は期待できない。
【００５３】
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）としては、糖が飢餓状態である細胞乃至組織に、過剰な糖を含有する液Ｂを供給した後に供給することが好ましく、糖が飢餓状態である細胞乃至組織に、過剰な糖を含有する液Ｂを供給し、さらに、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）を供給した後に供給することがより好ましい。過剰な糖を含有する液Ｂを供給した後に供給することにより、過剰な糖により解糖系におけるピルビン酸の産生が増加し、乳酸の生成が増加した際に、解糖系におけるピルビン酸の産生を阻害し、乳酸の生成を阻害することにより、細胞外における乳酸由来のプロトン濃度の減少に起因する電位の減少を測定しやすくなる。
また、前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）としては、緩衝液Ａ等に溶解させた液として供給することが好ましい。
【００５４】
前記２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以上６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。前記含有量が、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であると、解糖系阻害剤としての効果を得ることができる。
【００５５】
＜センサー＞
前記センサーは、前記培養手段内に配され、前記液Ｂの供給前後の前記細胞乃至組織周辺の変化を測定する。
前記細胞乃至組織周辺の変化としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電位変化、ｐＨ変化などが挙げられる。これらの中でも、電位変化が好ましい。
前記センサーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロトン濃度の変化を測定することなどが挙げられる。
【００５６】
本発明に用いるセンサーの動作原理と構成について説明する。
図２は、ｐＨとポテンシャルとの関係を示す図である。
図２に示すように、水素イオンによる電解質３（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）とイオン感応膜であるＳｉ３Ｎ４膜２との界面に生じる化学ポテンシャルは、参考電極ＶＲＥＦが一定である場合、（ａ）水素イオン濃度が低い場合と、（ｂ）水素イオン濃度が高い場合とにおいて、ネルンストの式に従い、室温（２５℃）において５９ｍＶ／ｐＨの割合で変化（Δφｓ）することが知られている。また、広く用いられているＩＳＦＥＴ電極４は、前記Ｓｉ３Ｎ４膜２の界面に生じる化学ポテンシャルの変化を一定の電流を流すことにより読出することができる。
【００５７】
前記センサー面下の半導体１表面では水素イオンの濃度（絶縁体ＳｉＯ２膜５を介してＳｉ３Ｎ４膜２の界面に生じる化学ポテンシャル）に応じたポテンシャルの井戸が形成される
【００５８】
前記センサーにおける測定条件としては、ペルチェ素子を用いて３７℃にコントロールした条件下において測定することができる。
前記センサーの電極としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の電極を選択することができ、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極などが挙げられる。
前記センサーにおける測定液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記緩衝液Ａを用いることができる。
【００５９】
前記センサーを用いて、前記細胞乃至組織周辺の変化を測定する場合、前記センサー上で前記細胞乃至組織周辺の変化を測定するために、培養した前記細胞乃至組織を、ピペット等を用いてセンサー上に移動させてもよい。この場合、細胞乃至組織、特に心筋細胞にストレスを与えると、すぐに拍動が止まってしまうこともあるため、細胞にストレスを与えないように培養手段内に予めセンサーを設けて変化を測定することが好ましい。
【００６０】
前記センサーの前記培養手段内における配置としては、前記細胞乃至組織周辺の電位を測定できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記培養手段の下側が好ましい。
【００６１】
図４は、本発明の測定装置の一例を示す概略図である。図４に示すように、本発明の測定装置は、培養手段４内に細胞乃至組織２を有し、前記培養手段４の下側にセンサー１を有する。前記細胞乃至組織２を、緩衝液Ａ３で培養することにより、糖が飢餓状態である細胞乃至組織２を得ることができる。前記糖が飢餓状態である細胞乃至組織を有する前記培養手段４に、供給する手段６を用いて過剰な糖を含有する液Ｂ  ５を供給することにより、糖が飢餓状態である細胞乃至組織２を糖が過剰状態にすることができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。なお、滴下する液は、３７℃恒温にして用いた。
【００６３】
（参考例１）
−糖が飢餓状態である細胞乃至組織の培養におけるカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの影響の評価−
ＮＨＤＦ（ロンザジャパン株式会社製、ヒト皮膚線維芽細胞）を、自家製のセンサーウエルに、播種濃度が１．０×１０５個／ｍＬとなるように添加して、インキュベーター（装置名：ＣＯ２インキュベータ、パナソニック株式会社製）を用いて、３７℃で、２日間培養した。なお、培地は、Ｄ−ＭＥＭ（ハイグルコース入り）（和光純薬工業株式会社製）を用いた。次に、前記培地を、下記表１に示すように、カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含みグルコースを含まない液Ａ、又はカルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まずグルコースを含まない液Ａ’に変更して、インキュベーターを用いて、３７℃で、１２時間培養した。培養した各細胞を位相差顕微鏡（装置名：ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）を用いて観察したところ、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含みグルコースを含まない液Ａを用いて培養した細胞は、センサーウエルの底面に密着していることが分かる（図５）。これに対して、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まずグルコースを含まない液Ａ’を用いて培養した細胞は、センサーウエルの底面から剥がれていることが分かる（図６）。
【００６４】
【表１】
2017127288.tif 000004
前記表１中の緩衝剤：和光純薬工業株式会社製
【００６５】
前記カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まずグルコースを含まない液Ａ’を用いて培養してセンサーウエルの底面から剥がれた細胞をトリパンブルーにより染色したところ青く変化することはなかった。これにより、前記細胞は、センサーウエルから剥がれただけで死んでいないことが分かる。
【００６６】
（実施例１）
ＮＨＤＦを培地（Ｄ−ＭＥＭ（ハイグルコース入り、和光純薬工業株式会社製）１ｍＬの入った自家製センサーウエルに播種濃度が１．０×１０５個／ｍＬとなるように撒き、インキュベーターを用いて３７℃で２日間培養した。その後、前記培地を前記表１に示す組成であるグルコースを含まない緩衝液Ａ  １ｍＬに変更し、センサー上において３７℃で１時間培養して、糖が飢餓状態であるＮＨＤＦを得た。なお、位相差顕微鏡を用いて、前記糖が飢餓状態であるＮＨＤＦが前記センサーウエルの底面に接着していることが確認できた。
【００６７】
前記培養した糖が飢餓状態であるＮＨＤＦが載る前記センサーを用いて、ＮＨＤＦ周辺の電位を測定した。測定開始５分間後にグルコースを含まない緩衝液Ａに１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを、前記センサーウエル内に滴下し、５分間経過後のＮＨＤＦ周辺の電位を測定した。得られた電位から、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差を算出したところ、１３ｍＶの電位上昇が認められた。結果を下記表２に示す。
【００６８】
（参考例２）
ネガティブコントロール実験（以下、「コントロール実験」とも称することがある）として、実施例１において、ＮＨＤＦを用いなかった以外は、実施例１と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下前後の電位を測定した。前記コントロール実験においては、過剰な糖を含有する液Ｂを滴下しても、滴下前後において電位は変化しなかった。
【００６９】
（実施例２）
実施例１において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）に変更した以外は、実施例１と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下直前と５分間後との電位を測定した。得られた電位から、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差を算出したところ、１７ｍＶの電位上昇が確認された。結果を下記表２に示す。
【００７０】
【表２】
2017127288.tif 000005
【００７１】
実施例２におけるＨｅＬａ細胞においては、実施例１のＮＨＤＦに比べて電位上昇が顕著であり、がん細胞において解糖系が働く強さに起因していると推測される。このことから、明確にＮＨＤＦ及びＨｅＬａ細胞における電位差により細胞種を測定できており、測定装置として用いることができることが分かる。
【００７２】
（実施例３）
ｉＰＳ由来の心筋塊（１５，０００個／塊、株式会社リプロセル製）を心筋用培地（Ｒｅｐｒｏ  ｃａｒｄｉｏ２  Ｃｕｌｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、株式会社リプロセル製）にして、ディッシュ内にて２日間培養した。その後、前記培地を、グルコースを含まない緩衝液Ａ  ３ｍＬに変更し、実施例１と同様にディッシュ内にて、３７℃で４時間培養して、糖が飢餓状態である心筋細胞を得た。なお、位相差顕微鏡を用いて、前記糖が飢餓状態である心筋塊の拍動が確認できた。拍動が確認された心筋塊をピペットにてディッシュから吸い取り、緩衝液Ａを１ｍＬ（３７℃）入れてあるセンサーウエルへと心筋塊を移し変え、センサー上に心筋塊を置いた。
【００７３】
実施例１と同様にして、グルコースが１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の液Ｂ  ０．１ｍＬ滴下し、滴下直前及び滴下５分間後の電位をそれぞれ測定し、電位差を求めた。本実施例では液Ｂを滴下しても、拍動が止まることはなかった。
また、コントロール実験として、心筋塊を用いなかったこと以外は、上記と同様にして、液Ｂ滴下直前及び滴下５分間後の電位をそれぞれ測定した。得られた電位から、実施例３において、コントロール実験の電位に対する電位差を求めた。その結果を表３に示す。
【００７４】
（実施例４）
実施例３と同じ実験であるが、本実施例では液Ｂを供給することにより心筋塊の拍動が止まってしまったことが、位相差顕微鏡を用いることにより確認できた。この理由は明らかではないが、過剰なグルコースが急激に加わったため、細胞の生体活動が急激に活発化され、酸素が欠乏するなどのストレスがかかったためであると推測される。
この時のＢ液滴下前後の電位をコントロール実験との電位差として測定した。その結果を表３に示す。
【００７５】
（実施例５）
実施例３と同じ実験であるが、本実施例では心筋塊をセンサーウエルへ移し変えただけで心筋塊の拍動が止まってしまったことが、位相差顕微鏡を用いることにより確認できた。この理由は明らかではないが、移し替える際の温度変化や圧力変化などのストレスがかかったためであると推測される。また、液Ｂを供給しても心筋塊の拍動は止まったままであった。この時のＢ液滴下前後の電位をコントロール実験との電位差として測定した。その結果を表３に示す。
【００７６】
以上の結果から、心筋細胞における拍動がある場合とない場合とで実験を行ったが、表３から分かるように、拍動がある場合にはコントロール実験との電位差は非常に低く、ｐＨはほとんど酸性側に変化していないことが分かる。しかし、拍動がない場合にはコントロール実験との電位差が大きく、酸性側に対してｐＨが０．２１〜０．２６の違いが観測された。特に拍動の有無の違いが電位差に及ぼす効果は大きく、液Ｂを供給した効果よりも大きかった。すなわち、心筋塊の拍動について本発明の測定装置で調査する場合は、実施例１、及び実施例２のように液Ｂ滴下前後の電位差によって評価するのではなく、コントロール実験での電位との電位差をもって行うことで、図１で説明したような細胞内の解糖系の働きを明確に評価できると考えられる。すなわち、図１で示したように、心筋が拍動している際は大量のエネルギーを必要とするためＴＣＡサイクルが活発に働き、グルコースから代謝されたピルビン酸の多くはＴＣＡサイクルに消費されるため、解糖系の最終物質である乳酸は少量しか排出されない。また、拍動が止まり、エネルギー代謝が通常の細胞と同じような解糖系に切り替わることにより多くの乳酸が排出されるようになる、と考えられる。すなわち、心筋拍動の有無によるエネルギー代謝経路のメカニズムがこのセンサーによって観察できており、細胞を測定するための測定装置として機能することが分かった。
【００７７】
【表３】
2017127288.tif 000006
なお、前記表３中のｐＨ差が負の値である場合は、酸性側に動いていることを示している。
【００７８】
（実施例６）
＜グルコース、インスリン、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース供給の影響の評価１＞
実施例１と同様にして、糖が飢餓状態であるＮＨＤＦを得、過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後の電位を測定した。得られた電位から、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差を算出したところ、１３ｍＶの電位上昇が認められた。
次に、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下１０分間経過後に、１００μｇ／ｍＬインスリン（和光純薬工業株式会社製）０．１ｍＬを滴下し、５分間後の電位を測定した。得られた電位から、インスリン滴下前後の電位差を算出したところ、電位は変化しなかった。
その後、インスリン滴下１０分間経過後に、５００ｍｍｏｌ／ｍＬ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、和光純薬工業株式会社製）０．１ｍＬを滴下し、５分間後の電位を測定した。得られた電位から、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下直前と滴下５分間後の電位差を算出したところ、２５ｍＶの電位降下が認められた。結果を下記表４に示す。
【００７９】
（実施例７）
＜グルコース、インスリン、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース供給の影響の評価２＞
実施例６において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞に変更した以外は、実施例６と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下直前と滴下５分間後との電位差、インスリン滴下直前と滴下５分間後との電位差、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下直前と滴下５分間後との電位差を算出した。その結果、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差は１７ｍＶの電位上昇が認められ、インスリン滴下前後の電位差の変化は認められず、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下前後の電位差は、３０ｍＶの電位下降が認められた。結果を下記表４に示す。
【００８０】
（参考例３）
コントロール実験として、実施例６において、ＮＨＤＦを用いなかった以外は、実施例６と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。
次に、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下５分間経過後に、１００μｇ／ｍＬインスリン０．１ｍＬを滴下し、電位を測定した。その結果、滴下前後の電位変化は認められなかった。
その後、インスリン滴下４分間経過後に、５００ｍｍｏｌ／ｍＬ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）０．１ｍＬを滴下し、電位を測定した。その結果、滴下前後の電位変化は認められなかった。
以上の結果から、細胞周辺において電位変化が起こる場合は、各液の滴下によって、細胞外の酸性度が変化しているためであると考えられる。
【００８１】
【表４】
2017127288.tif 000007
【００８２】
前記表４の結果から、細胞種の違いにより、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下による電位下降量が異なり、前記電位下降量を指標とすることにより、細胞種の違いを本発明の測定装置により測定することができることが分かった。
【００８３】
（実施例８）
＜グルコース、２，４−ジニトロフェノール、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース供給の影響の評価１＞
実施例６と同様にして、糖が飢餓状態であるＮＨＤＦを得、実施例６と同様にして、電位センサーを取り付け、測定開始から５分間後に、１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。得られた電位から、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差を算出したところ、１３ｍＶの電位上昇が確認された。
次に、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下５分間経過後に、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）０．１ｍＬを滴下し、電位を測定した。得られた電位から、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下前後の電位差を算出したところ、９ｍＶの電位上昇が確認された。
その後、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下５分間経過後に、５００ｍｍｏｌ／ｍＬ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）０．１ｍＬを滴下し、電位を測定した。得られた電位から、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下前後の電位差を算出したところ、３０ｍＶの電位降下が確認された。結果を下記表５に示す。
【００８４】
以上の結果から、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下により、電位の上昇が確認されたことから、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）は、解糖系に対する刺激剤として使用することができることが分かる。
さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下により、顕著な電位の下降が認められることが分かる。
【００８５】
（実施例９）
＜グルコース、２，４−ジニトロフェノール、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース供給の影響の評価２＞
実施例８において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞に変更した以外は、実施例８と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下直前と滴下５分間後との電位差、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下前後の電位差、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下前後の電位差を算出した。その結果、過剰な糖を含有する液Ｂの滴下前後の電位差は１７ｍＶの電位上昇が認められ、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下前後の電位差は、１３ｍＶの電位上昇が認められ、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下前後の電位差は、３８ｍＶの電位下降が認められた。結果を下記表５に示す。
【００８６】
以上の結果から、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下により、電位の上昇が確認されたことから、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）は、解糖系に対する刺激剤として使用することができることが分かる。
さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）滴下により、顕著な電位の下降が認められることが分かる。
【００８７】
（参考例４）
コントロール実験として、実施例８において、ＮＨＤＦを用いなかった以外は、実施例８と同様にして、過剰な糖を含有する液Ｂを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。
次に、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下５分間経過後に、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）０.１ｍＬを滴下し、電位を測定した。その結果、滴下前後の電位変化は認められなかった。
その後、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）滴下５分間経過後に、５００ｍｍｏｌ／ｍＬ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）０．１ｍＬを滴下し、電位を測定した。その結果、滴下前後の電位変化は認められなかった。
以上の結果から、細胞周辺において電位変化が起こる場合は、各液の滴下によって、細胞外の酸性度が変化しているためであると考えられる。
【００８８】
【表５】
2017127288.tif 000008
【００８９】
前記表５の結果から、細胞種の違いにより、各液の滴下による電位上昇量又は電位下降量が異なり、前記電位上昇量又は前記電位下降量を指標とすることにより、細胞種の違いを本発明の測定装置により測定することができることが分かった。
また、滴下した２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）は、細胞種の測定のための薬剤として有効であることが分かった。
【００９０】
（実施例１０）
＜飢餓状態の時間と、細胞周辺の電位差との関係の評価１＞
実施例１と同様にして、ＮＨＤＦを２日間培養した。その後、培地を緩衝液Ａ  １ｍＬに変更し、電位センサー上において、３７℃で２０分間、１時間、４時間、又は１２時間培養して、飢餓状態での培養時間が異なる糖が飢餓状態であるＮＨＤＦを得た。その後、グルコースを含まない緩衝液Ａに１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。結果を図７に示す。
なお、コントロール実験として、ＮＨＤＦのない培養したセンサーウエルに対して、１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂを滴下して、過剰な糖を含有する液Ｂを供給して５分間後の電位を測定した。コントロール実験においては、過剰な糖を含有する液Ｂを滴下しても、滴下前後において電位は変化しなかった。
【００９１】
図７の結果から、緩衝液Ａにおける培養時間が長い細胞の方が、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下後の電位変化が大きいことが分かる。
【００９２】
（実施例１１）
＜飢餓状態の時間と、細胞周辺の電位差との関係の評価２＞
実施例１０において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞に変更した以外は、実施例１０と同様にして、グルコースを含まない緩衝液Ａに１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後の電位を測定した。結果を図７に示す。
図７の結果から、飢餓状態における培養時間が長い細胞の方が、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下後の電位変化が大きいことが分かる。
【００９３】
図７の結果から、実施例１０及び実施例１１において、飢餓状態における培養時間が長い細胞の方が、細胞種を測定するための細胞種間の電位差が大きくなることが分かり、飢餓状態における培養時間は１時間以上必要であることが分かった。
【００９４】
（実施例１２）
＜飢餓状態における培養時のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係の評価１＞
実施例１０と同様にして、ＮＨＤＦを２日間培養した。その後、培地を、下記（１）〜（５）に示す飢餓状態用培養液に変更し、３７℃、４時間電位センサー上で培養し、電位を測定した。次に、５００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下５分間後の電位を測定した。結果を図８に示す。
−飢餓状態用培養液−
（１）グルコースを含まない緩衝液Ａ
（２）緩衝液Ａに２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを添加した液
（３）緩衝液Ａに５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを添加した液
（４）緩衝液Ａに７ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを添加した液
（５）緩衝液Ａに１０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを添加した液
なお、コントロール実験として、上記（１）〜（５）に示す飢餓状態用培養液１ｍＬをそれぞれ入れたＮＨＤＦのない培養したセンサーウエルに対して、５００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを添加した過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下して、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下５分間後の電位を測定したが、滴下前後において電位は変化しなかった。
図８の結果から、飢餓状態における培養時の添加グルコース濃度が低い細胞の方が、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下後の電位変化が大きいことが分かる。
【００９５】
（実施例１３）
＜飢餓状態における培養時のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係の評価２＞
実施例１２において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞に変更した以外は、実施例１２と同様の測定を行った。結果を図８に示す。
図８の結果から、飢餓状態における培養時の添加グルコース濃度が低い細胞の方が、細胞種を測定するための細胞種間の電位差が大きくなることが分かり、過剰な糖を含有する液Ｂ滴下後の電位変化が大きいことが分かる。
【００９６】
（実施例１４）
＜過剰な糖を含有する液Ｂ中のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係の評価１＞
実施例１０と同様にして、ＮＨＤＦを２日間培養した。その後、培地を、グルコースを含まない緩衝液Ａに変更し、実施例１と同様にして、電位センサー上において、３７℃、４時間培養した。その後、下記（１）〜（６）に示す過剰な糖を含有する液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。結果を図９に示す。
−過剰な糖を含有する液Ｂ−
（１）グルコースを添加していない緩衝液Ａ
（２）２５ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを緩衝液Ａに添加して過剰な糖を含有する液Ｂ
（３）１００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを緩衝液Ａに添加して過剰な糖を含有する液Ｂ
（４）３００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを緩衝液Ａに添加して過剰な糖を含有する液Ｂ
（５）５００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを緩衝液Ａに添加して過剰な糖を含有する液Ｂ
（６）１，０００ｍｍｏｌ／Ｌグルコースを緩衝液Ａに添加して過剰な糖を含有する液Ｂ
なお、コントロール実験として、グルコースを含まない緩衝液Ａを１ｍＬ入れたＮＨＤＦのない培養したセンサーウエルに対して、上記（１）〜（６）に示す糖過剰状態用培養液Ｂ  ０．１ｍＬを滴下し、滴下直前と滴下５分間後との電位を測定した。前記コントロール実験においては、滴下前後において電位は変化しなかった。
【００９７】
図９の結果から、過剰な糖を含有する液Ｂ中のグルコース濃度が高い方が、液Ｂ滴下後の電位変化が大きいことが分かる。
【００９８】
（実施例１５）
＜過剰な糖を含有する液Ｂ中のグルコース濃度と、細胞周辺の電位差との関係の評価２＞
実施例１４において、ＮＨＤＦをＨｅＬａ細胞に変更した以外は、実施例１４と同様の測定を行った。結果を図９に示す。
【００９９】
図９の結果から、実施例１４及び実施例１５において、過剰な糖を含有する液Ｂ中のグルコース濃度が高い方が、細胞種を測定するための細胞種間の電位差が大きくなり、また、細胞種の測定においては、過剰な糖を含有する液Ｂ中のグルコース濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上が有効であることが分かった。
【０１００】
図９の結果から、細胞種の測定を行うには、細胞を糖が少ない飢餓状態にした後に、高い濃度のグルコースを含有する糖が過剰状態である液Ｂを供給して細胞を刺激することにより、細胞種間の電位差の違いを求めることができ、感度の高い細胞種の測定を行うことができることが分かった。
【０１０１】
また、上記の結果から、本発明の測定装置は、非侵襲により細胞種の測定、及び細胞の状態を測定することができることが分かった。
【０１０２】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  細胞乃至組織周辺の変化を測定する手段と、
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の糖を含有する緩衝液Ａ中において、一定時間以上前記細胞乃至組織を培養する培養手段と、
前記緩衝液Ａ中の糖濃度よりも高濃度であり、かつ過剰な糖を含有する液Ｂを、前記細胞乃至組織が培養されている前記緩衝液Ａに対して供給する手段と、を備えることを特徴とする測定装置である。
＜２＞  前記測定する手段が、プロトン濃度の変化による電位変化を測定するセンサーである前記＜１＞に記載の測定装置である。
＜３＞  前記緩衝液Ａが、糖を含有しない前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜４＞  前記液Ｂを供給する手段が、前記細胞乃至組織を少なくとも１時間培養後、前記液Ｂを供給する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜５＞  前記液Ｂが、前記緩衝液Ａに糖を溶解した液であり、
前記液Ｂが、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグルコースを含有する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜６＞  解糖系促進剤である２，４−ジニトロフェノールを供給する手段をさらに備える前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜７＞  解糖系阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースを供給する手段をさらに備える前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜８＞  前記緩衝液Ａが、純水、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、及びＮａＨ２ＰＯ４を所定の割合において含有する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜９＞  前記細胞乃至組織が、ヒト細胞である前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１０＞  前記ヒト細胞が、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞、及び心筋細胞から選択される少なくとも１種である前記＜９＞に記載の測定装置である。
＜１１＞  前記細胞乃至組織の培養手段への播種濃度が、１×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１２＞  前記２，４−ジニトロフェノールの濃度が、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である前記＜６＞から＜１１＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１３＞  前記２−デオキシ−Ｄ−グルコースの濃度が、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である前記＜７＞から＜１２＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１４＞  前記２，４−ジニトロフェノールの濃度が、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｍｏｌ／Ｌ以下である前記＜６＞から＜１３＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１５＞  前記２−デオキシ−Ｄ−グルコースの濃度が、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以上６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である前記＜７＞から＜１４＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１６＞  前記培養手段が、センサーウエルである前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１７＞  前記心筋細胞の前記培養手段への播種濃度が、３００μｍ以上４００μｍ以下の心筋塊である前記＜１０＞から＜１６＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１８＞  前記液Ｂが、糖以外の組成が前記緩衝液Ａと同じである前記＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜１９＞  前記液Ｂを供給する手段が、前記細胞乃至組織を少なくとも１時間以上１２時間以下培養した後、前記液Ｂを供給する前記＜１＞から＜１８＞のいずれかに記載の測定装置である。
＜２０＞  前記液Ｂの供給する手段が、インクジェット、ディスペンサー、ピペット、及びアスピレータから選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜１９＞のいずれかに記載の測定装置である。
【０１０３】
前記＜１＞から＜２０＞のいずれかに記載の測定装置によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１０４】
【特許文献１】特許第４７５５３４６号公報
【特許文献２】特表２００７−５０５３１６号公報
【非特許文献】
【０１０５】
【非特許文献１】Ｐａｒｃｅ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６（４９２７），２４３−２４７（１９８９）
【符号の説明】
【０１０６】
１  センサー
２  細胞乃至組織
３  緩衝液Ａ
４  培養手段
５  液Ｂ
６  供給する手段
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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