(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物由来酵素転換反応においてレバウジオシドＡの低い生産率の限界を克服し、生産効率が高いレバウジオシドＡの製造方法の提供。【解決手段】１）スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ；（２）前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップ；を含む、レバウジオシドＡの製造方法。【選択図】図３
2017148050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ；
（２）前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップ；を含む、レバウジオシドＡの製造方法。
【請求項２】
前記スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記スクロース合成酵素は、スクロース合成酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記スクロース合成酵素が配列番号３の配列を有する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）、バンブサ・オルダミイ（Ｂａｍｂｕｓａ  ｏｌｄｈａｍｉｉ）、ブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、またはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ） 由来の糖転移酵素である、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記糖転移酵素が配列番号４の配列を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記（１）ステップ及び前記（２）ステップが同一の反応系で連続的に行われる、請求項１から７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記同一の反応系では、反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドＡを製造する方法。
【請求項１１】
前記反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）、バンブサ・オルダミイ（Ｂａｍｂｕｓａ  ｏｌｄｈａｍｉｉ）、ブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、またはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の糖転移酵素である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項による製造方法によって製造されたレバウジオシドＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクロースとステビオシドを原料とし、スクロース合成酵素及び糖転移酵素の反応によってレバウジオシドＡを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘味度が砂糖の２００倍以上である高甘味料ステビア（ｓｔｅｖｉａ）は、菊科植物であるステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）の熱水抽出から得られる。ステビア抽出物の甘味成分中の甘味質が砂糖と最も類似しており、苦味がなく、甘味度が砂糖の４００倍と知られているレバウジオシドＡ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ）は、非改良植物体の場合、抽出物の約２０％内外のみを占めており、抽出物中の最も高い含量を示す成分は、レバウジオシドＡの前駆体であるステビオシドである。したがって、高純度のレバウジオシドＡを生産するためには、レバウジオシドＡ高含量種子の改良、栽培、収獲、品種管理などの時間とコスト的な面で経済的な問題が伴ってきた。
【０００３】
このような問題を解決するために、ステビオシドをレバウジオシドＡに転換しようとする努力が多角的になされてきたが、代表的な例として、土壌微生物由来のベータ―１，３―グルカナーゼを用いて酵素転換反応によってステビオシドにブドウ糖１分子を結合させることによってレバウジオシドＡに転換する方法を挙げることができる（大韓民国特許出願公開第２００４―００２６７４７号及び米国特許登録第６４６９９４７号）。前記酵素転換反応に使用される糖供与基質としては、代表的にベータ―１，３―グルカンであるカードランを例として挙げることができるが、カードランは、溶解度の低い、高価な原料であって、産業化への適用が難しいという短所を有する。また、カビ発酵を通じてステビオシドをレバウジオシド配糖体に転換するという報告があるが、微生物の培養に半月ほど要し、レバウジオシドＢなどその他のステビオール配糖体も生産され、最終的なレバウジオシドＡへの転換率は４０％ほどに留まるという短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記のように、微生物由来酵素転換反応においてレバウジオシドＡの低い生産率の限界を克服し、生産効率が高いレバウジオシドＡの製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、手順が簡単であり、コストが節減され、時間の消耗が少ないので、産業上の有用性が高いレバウジオシドＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様態において、
（１）スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ；
（２）前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップ；を含む、レバウジオシドＡの製造方法が提供される。
【０００７】
本発明の他の様態において、スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドＡを製造する方法が提供される。
【０００８】
本発明の更に他の様態において、本発明に係るレバウジオシドＡを製造する方法によって製造されたレバウジオシドＡが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るレバウジオシドＡの製造方法は、副産物がほとんどない高純度及び高収率のレバウジオシドＡを提供する。
【００１０】
本発明に係るレバウジオシドＡの製造方法は、安価な原料を用いるので経済的であり、手順が簡単で、時間の消耗が少ないので、レバウジオシドＡの大量生産に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】スクロース合成酵素によってフルクトース及びブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェートが生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果であって、図１で（ａ）は、反応０時間であるときにウリジンジホスフェート（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、反応１時間後、スクロース合成酵素によってブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（２）が生成されることを示す。
【図２】糖転移酵素によってステビオシドがレバウジオシドＡに転換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。（ａ）は、反応０時間であるときにステビオシド（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、反応０．５時間後、ステビオシド（１）とレバウジオシドＡ（２）が全て存在することを示し、（ｃ）は、反応１時間後、ステビオシド（１）がレバウジオシドＡ（２）に全て転換されたことを示す。
【図３】スクロース合成酵素と糖転移酵素によってステビオシド（１）からレバウジオシドＡ（２）が生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。（ａ）は、ステビオシド基質濃度を１００ｍＭとし、反応０時間であるときにステビオシド（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、ステビオシド基質濃度を１００ｍＭとし、反応２４時間後にはレバウジオシドＡ（２）のみが存在することを示し、（ｃ）は、ステビオシド基質濃度を２５０ｍＭとし、反応２４時間後にはステビオシド（１）とレバウジオシドＡ（２）が全て存在することを示す。
【図４】スクロース合成酵素と糖転移酵素の最適なｐＨ評価結果を示すグラフである。
【図５】スクロース合成酵素と糖転移酵素の最適な温度評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一様態は、
（１）スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ；及び
（２）前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップ；を含む、レバウジオシドＡの製造方法に関する。前記（１）ステップ及び前記（２）ステップは、順次行われてもよく、同一の反応系で連続的に行われてもよいが、同一の反応系で連続的に行われることが好ましい。
【００１３】
本発明の他の様態は、スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドＡを製造する方法に関する。前記スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素の反応は、同一の反応系での反応であってもよい。
【００１４】
本願において、「同一の反応系」という用語は、一つの反応系あるいは反応システムで反応が連続的に起こることを意味する。
【００１５】
スクロース合成酵素は、植物の糖代謝で可逆的に果糖にヌクレオチドジホスフェートが結合されたブドウ糖を転移し、スクロースを生産する役割を担当する。本発明では、５〜１０のｐＨ範囲でスクロースとヌクレオチドジホスフェートを反応し、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェート及び果糖に分離する活性を示す。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートは、糖転移酵素によってステビオシドと反応し、レバウジオシドＡを生成することができる。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
本発明において、前記化学式１及び２は、それぞれ別途の反応器で順次進めれられてもよいが、一つの反応器で連続反応によって進められることが好ましい。
【００２０】
本発明において、前記化学式１と２を一つの反応式で表現すると、下記の通りである。
【００２１】
【化３】
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【００２２】
本発明において、前記のような化学式３によってステビオシド１３―Ｏ―グルコースのＣ―３'位置に特異的に一つのグルコースを結合させ、レバウジオシドＡを高収率で合成する連続反応システムを提供する。
【００２３】
本発明において、スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素であってもよく、このうち、米、トウモロコシ、小麦、あるいは麦に由来したスクロース合成酵素であることが好ましく、米、特にオリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に由来したスクロース合成酵素であることが特に好ましい。前記スクロース合成酵素は、スクロース合成酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものであってもよい。前記スクロース合成酵素は、前記大腸菌などから生産された後、追加的に精製されたものであってもよい。前記スクロース合成酵素は、当業界に知られており、特別に制限されるものではないが、配列番号３の配列を含んでもよい。
【００２４】
本発明において、スクロースは、スクロース合成酵素の基質として作用し、ヌクレオチドジホスフェートにブドウ糖を提供できるものであれば制限されなく、例えば、原糖または砂糖であってもよい。
【００２５】
本発明において、前記ヌクレオチドジホスフェートとしては、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドが使用されてもよく、このうち、ウリジンジホスフェートが使用されることが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記（１）ステップまたは化学式１では、反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲であってもよく、反応温度が３０℃〜５５℃で、反応ｐＨが６〜９の範囲であることが好ましく、反応温度が３５℃〜５０℃で、反応ｐＨが７〜８の範囲であることが特に好ましい。本発明において、前記（１）ステップまたは化学式１では、反応時間が３０分〜４８時間の範囲であって、反応時間が１時間〜３６時間の範囲であることが好ましく、反応時間が１時間〜２４時間の範囲であることが特に好ましいが、特別な制限はない。
【００２７】
本発明において、糖転移酵素は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）、バンブサ・オルダミイ（Ｂａｍｂｕｓａ  ｏｌｄｈａｍｉｉ）、ブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の糖転移酵素であってもよい。前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）、バンブサ・オルダミイ（Ｂａｍｂｕｓａ  ｏｌｄｈａｍｉｉ）由来の糖転移酵素であることが好ましく、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）由来の糖転移酵素であることが特に好ましい。前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものであってもよい。前記糖転移酵素は、前記大腸菌などから生産された後、追加的に精製されたものであってもよい。前記糖転移酵素は、当業界に知られており、特別に制限されるものではないが、配列番号４の配列を含むものであってもよい。
【００２８】
本発明において、ステビオシドは、ステビア・リバウンディアナ熱水あるいはエタノール水溶液抽出物またはその精製物、または抽出物のレバウジオシドＡ生産後の副産物であって、ステビオシドの含量は、全体のステビオール配糖体の重量を基準にして１０重量％以上であって、５０重量％以上であることが好ましく、７０重量％以上であることが特に好ましく、８０重量％以上であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明において、前記（２）ステップまたは化学式２では、反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲であってもよく、反応温度が３０℃〜５５℃で、反応ｐＨが６〜９の範囲であることが好ましく、反応温度が３５℃〜５０℃で、反応ｐＨが７〜８の範囲であることが特に好ましい。本発明において、前記（２）ステップまたは化学式２では、反応時間が３０分〜４８時間の範囲であって、反応時間が１時間〜３６時間の範囲であることが好ましく、反応時間が１時間〜２４時間の範囲であることが特に好ましいが、特別な制限はない。
【００３０】
本発明において、前記スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドＡを製造するステップでは、反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲であってもよく、反応時間が３０℃〜５５℃で、反応ｐＨが６〜９の範囲であることが好ましく、反応時間が３５℃〜５０℃で、反応ｐＨが７〜８の範囲であることが特に好ましい。
【００３１】
本発明において、前記ヌクレオチドジホスフェートとしては、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドが使用されてもよく、ウリジンジホスフェートが使用されることが好ましい。
【００３２】
本発明の更に他の様態において、本願に記載の製造方法によって製造されたレバウジオシドＡが提供される。
【００３３】
本発明に係るレバウジオシドＡは、ステビオール配糖体に存在するステビオシドの全量を原料として生産されるという特徴を有する。このような特徴は、配糖体内のステビオシドの含量を５重量％以内に、好ましくは３重量％以内に、特に好ましくは１重量％以内にし、精製工程でステビオシドとレバウジオシドＡとの分離過程を省略可能にするので、コストを節減するという効果を期待することができる。また、本発明のように、原料にステビオール配糖体としてステビオシド以外の少量のレバウジオシドＡのみが存在する場合、酵素転換反応を通じてステビオール配糖体中のレバウジオシドＡの含量が９９％以上である高純度の製品を生産できるという長所を保有する。また、本反応において、糖供与体として使用されるスクロースは、既存の各発明の原料であるカードランに比べて少なくとも５０分の１水準の価格で購入が可能であり、結果的に、高純度のレバウジオシドＡを既存に比べて低コスト／高効率で生産可能である。
【００３４】
以下、本発明のために各実施例を挙げて詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本願発明の一例示に過ぎなく、発明の内容がこれに限定されると解釈してはならない。
【実施例１】
【００３５】
遺伝子の確保及び組換えタンパク質の生産
【００３６】
１）スクロース合成酵素遺伝子組換え大腸菌の製造
【００３７】
ＰＣＲに使用されたプライマーの配列は、スクロース合成酵素遺伝子の両側末端の一部の配列と、それぞれＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIの制限酵素の認識配列とを含む。
【００３８】
（ＦＯＲＷＡＲＤ）５'―ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＣＧ―３'
【００３９】
（ＢＡＣＫＷＡＲＤ）５'―ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣ―３'
【００４０】
遺伝子の増幅のために、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の恒温処理過程を３０回繰り返し、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得ることができた。
【００４１】
獲得したｃＤＮＡ切片をｐＥＴ―２８ａ（＋）ベクターに挿入した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。形質転換された大腸菌は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた平板培地で塗抹し、カナマイシンに対する耐性がある菌株を１次的に選別した。１次的に選別された各菌株をそれぞれ液体培養した後、ＤＮＡを精製してＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIに二重切断したとき、約２．５ｋｂのＤＮＡ断片が確認された菌株を最終的に選別した。自動塩基配列分析機を用いて塩基配列を分析した結果、報告されたスクロース合成酵素遺伝子塩基配列と本研究で得られたスクロース合成酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）とは同一であり、次のように確認された。
【００４２】
ＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＣＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＣＧＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＧＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧＣＧＡＧＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＴＡＡ
【００４３】
２）糖転移酵素遺伝子組換え大腸菌の製造
【００４４】
ＰＣＲに使用されたプライマーの配列は、ステビア・リバウンディアナ由来の糖転移酵素遺伝子の両側末端の一部の配列と、それぞれＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIの制限酵素の認識配列とを含む。
【００４５】
（ＦＯＲＷＡＲＤ）５'―ＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧＡ―３'
【００４６】
（ＢＡＣＫＷＡＲＤ）５'―ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＧＴ―３'
【００４７】
遺伝子の増幅のために、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の恒温処理過程を３０回繰り返し、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物を得ることができた。獲得したｃＤＮＡ切片をｐＥＴ―２８ａ（＋）ベクターに挿入した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。形質転換された大腸菌は、カナマイシンが含まれた平板培地で塗抹し、カナマイシンに対する耐性がある菌株を１次的に選別した。１次的に選別された各菌株をそれぞれ液体培養した後、ＤＮＡを精製してＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIに二重切断したとき、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が確認された菌株を最終的に選別した。自動塩基配列分析機を用いて塩基配列を分析した結果、報告された糖転移酵素遺伝子塩基配列と本研究で得られた糖転移酵素遺伝子の塩基配列（配列番号２）は同一であり、次の通りである。
【００４８】
ＡＧＡＡＧＴＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＡＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＣＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＧＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＴＣＧＴＴＧＴＡＡ
【００４９】
３）組換えタンパク質の生産
【００５０】
冷凍保管された組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株をＬＢ培地５ｍｌが入っている試験管（ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅ）に接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃の培養器で種菌培養を実施した。種菌培養された培養液をＬＢ培地５００ｍｌが入っている２０００ｍｌのフラスコに添加し、本培養を実施した。また、６００ｎｍでの吸光度が０．４になるとき、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ―Ｄ―１―チオガラクトチオピラノシド）を添加し、スクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）及び糖転移酵素（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の大量発現をそれぞれ誘導した。前記過程中の撹拌速度は１８０ｒｐｍに、培養温度は３７℃に維持されるように調節し、ＩＰＴＧを添加した後、撹拌速度は１２０ｒｐｍ、培養温度は１６℃にして培養した。前記形質転換された菌株の培養液を６，０００×ｇで４℃で２０分間遠心分離し、５０ｍＭトリス―塩酸緩衝溶液で２回洗浄した後、５０ｍＭトリス―塩酸緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を添加し、前記細胞溶液を超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で破砕した。また、細胞破砕物は、再び１３，０００×ｇで４℃で２０分間遠心分離し、細胞上澄液のみを酵素液として分離した。各酵素の特性を正確に把握するために、Ｎｉ―ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムを用いてそれぞれ精製した。精製した酵素の分子量をＳＤＳ―ＰＡＧＥで測定した結果、米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素は９２ｋＤａ（配列番号３）で、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来の糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は５７ｋＤａ（配列番号４）であることを確認した。
【実施例２】
【００５１】
ＨＰＬＣを用いた各酵素活性の測定
【００５２】
１）スクロース合成酵素の活性測定
【００５３】
米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性は、ＨＰＬＣを用いて測定した。米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性測定のためのＨＰＬＣ分析条件は、次の通りである。
【００５４】
ＨＰＬＣ分析条件
【００５５】
検出器の波長（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）：２６０ｎｍ
【００５６】
流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１ｍｌ／ｍｉｎ
【００５７】
試料注入量（Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．）：１０μｌ
【００５８】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）
【００５９】
溶媒（Ｓｏｌｖｅｎｔ）：Ａ：１００ｍＭのリン酸カリウム内の８ｍＭの過硫酸テトラブチルアンモニウム（８ｍＭ  Ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  １００ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）［ｐＨ５．３］
【００６０】
Ｂ：７０％のＡ溶媒＋３０％のメタノール
【００６１】
Ａ溶媒１００％から始めて、分析１５分にＢ溶媒の濃度を２０％まで上昇した後、１７分にＡ溶媒１００％に転換し、全ての分析所要時間は３０分に設定する。
【００６２】
米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性に対しては、原糖あるいは砂糖（スクロース）とウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を反応し、ブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が生成されるか否かを酵素反応で確認した。酵素反応条件は、次の通りである。
【００６３】
５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に溶解されたスクロース１００ｍＭ、ウリジンジホスフェート１０ｍＭ及び実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌのスクロース合成酵素に対して１時間にわたって温度３７℃で酵素反応を行った。１００℃で５分間加熱しながら反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を実施し、ブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェートの生産量を測定した。分析の結果、ウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に、初期のモル濃度に比べて９０％転換されたことを確認した（図１）。図１において、（ａ）は、反応０時間であるときにウリジンジホスフェート（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、反応１時間後、スクロース合成酵素によってブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（２）が生成されることを示す。
【００６４】
２）糖転移酵素の活性測定
【００６５】
ステビア（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来の糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性測定のためのＨＰＬＣ分析条件は、次の通りである。
【００６６】
ＨＰＬＣ分析条件
【００６７】
検出器の波長（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）：２１０ｎｍ
【００６８】
流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１ｍｌ／ｍｉｎ
【００６９】
試料注入量（Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．）：１０μｌ
【００７０】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（５μｍの細孔径  （ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ））
【００７１】
溶媒（Ｓｏｌｖｅｎｔ）：アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）：１０ｍＭのリン酸ナトリウム（１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）［ｐＨ２．６］＝３２：６８
【００７２】
ステビア（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来の糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性に対しては、ステビオシドにブドウ糖１分子を結合させ、レバウジオシドＡに転換されるか否かを酵素転換反応で確認した。酵素反応条件は、次の通りである。５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解されたステビオシド（＞９６％）２ｍＭ、ウリジンジホスフェートグルコース１０ｍＭ及び実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌステビア由来の糖転移酵素に対して１時間にわたって温度３７℃で酵素反応を行った。ここで、酵素反応の基質として使用したステビオシドは、純粋なステビオシド９６％以上であり、レバウジオシドＡが約３％ほど含有された混合試料を用いることによって、ＨＰＬＣ分析時の反応前後の標準物質として活用した。１００℃で５分間加熱しながら反応を停止させた後、ＨＰＬＣを実施し、レバウジオシドＡの生産量を測定した。分析の結果、ステビオシドからレバウジオシドＡに、モル濃度に比べて１００％転換されたことを確認した（図２）。図２は、糖転移酵素によってステビオシドがレバウジオシドＡに転換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。図２において、（ａ）は、反応０時間であるときにステビオシド（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、反応０．５時間後、ステビオシド（１）とレバウジオシドＡ（２）が全て存在することを示し、（ｃ）は、反応１時間後、ステビオシド（１）がレバウジオシドＡ（２）に全て転換されたことを示す。
【実施例３】
【００７３】
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応によるステビオシドからレバウジオシドＡへの転換率の測定
【００７４】
スクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）と糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の同一の反応系反応によってステビオシドからレバウジオシドＡへの転換率を確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース１Ｍ、ウリジンジホスフェート２０ｍＭ、ステビオシド１００ｍＭ〜２５０ｍＭ及び実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌのスクロース合成酵素と実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌの糖転移酵素が含まれた５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に対して２４時間にわたって温度４５℃で酵素反応を行った。本反応に使用された基質は、実施例２に明記された混合物としてのステビオシドである。反応完了後、１００℃で５分間加熱しながら反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を実施し、ステビオシドの濃度によるレバウジオシドＡの発生濃度を測定した。ステビオシドからレバウジオシドＡへの転換率は、使用されたステビオシドのモル濃度に対して生産されたレバウジオシドＡのモル濃度で計算された（図３及び表１（反応２４時間後の転換率））。
【００７５】
【表１】
2017148050.tif 000006
【００７６】
図３は、前記スクロース合成酵素と糖転移酵素によってステビオシド（１）からレバウジオシドＡ（２）が生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。図３において、（ａ）は、ステビオシド基質濃度を１００ｍＭとし、反応０時間であるときにステビオシド（１）のみが存在することを示し、（ｂ）は、ステビオシド基質濃度を１００ｍＭとし、反応２４時間後にはレバウジオシドＡ（２）のみが存在することを示し、（ｃ）は、ステビオシド基質濃度を２５０ｍＭとし、反応２４時間後にはステビオシド（１）とレバウジオシドＡ（２）が全て存在することを示す。
【実施例４】
【００７７】
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応のｐＨ安定性
・
米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）によって生産されたブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、糖転移酵素によってステビオシドと反応してレバウジオシドＡに転換され、ウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を解離することができる。前記２種の酵素が一つの反応器に存在し、レバウジオシドＡが生産されるときの最適なｐＨを確認した。最適なｐＨを確認するためのＨＰＬＣ分析条件は、次の通りである。
【００７８】
ＨＰＬＣ分析条件
【００７９】
検出器の波長（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）：２１０ｎｍ
【００８０】
流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１ｍｌ／ｍｉｎ
【００８１】
試料注入量（Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．）：１０μｌ
【００８２】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（５μｍの細孔径  （ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ））
【００８３】
溶媒（Ｓｏｌｖｅｎｔ）：アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）：１０ｍＭのリン酸ナトリウム（１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）［ｐＨ２．６］＝３２：６８
【００８４】
スクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）と糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との複合反応によって最適なｐＨを確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース１Ｍ、ウリジンジホスフェート２０ｍＭ、ステビオシド４０ｍＭ、及び実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌのスクロース合成酵素と実施例１―３で製造された０．１ｍｇ／ｍｌの糖転移酵素が含まれた５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に対して１時間にわたって温度４５℃で酵素反応を行った。ここで、ｐＨ２．５〜１２．０バッファーとしては、汎用バッファー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いた。１００℃で５分間加熱しながら反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を実施し、レバウジオシドＡの生成率を測定した。レバウジオシドＡの生成量を互いに比較し、最大値を示す反応系の反応ｐＨがこの複合反応の最適なｐＨとして求められる。スクロース合成酵素と糖転移酵素の複合反応の最適なｐＨは、温度４５℃、６０分間の反応で約ｐＨ７．５付近と確認された（図４及び表２）。
【００８５】
【表２】
2017148050.tif 000007
【実施例５】
【００８６】
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応の温度安定性
【００８７】
米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のスクロース合成酵素（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）によって生産されたブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、糖転移酵素によってステビオシドと反応してレバウジオシドＡに転換され、ウリジンジホスフェート（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を解離することができる。前記２種の酵素が一つの反応器に存在し、レバウジオシドＡが生産されるときの最適な温度を確認した。最適な温度を確認するためのＨＰＬＣ分析条件は、次の通りである。
【００８８】
ＨＰＬＣ分析条件
【００８９】
検出器の波長（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）：２１０ｎｍ
【００９０】
流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：１ｍｌ／ｍｉｎ
【００９１】
試料注入量（Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．）：１０μｌ
【００９２】
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）：Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（５μｍの細孔径（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ））
【００９３】
溶媒（Ｓｏｌｖｅｎｔ）：アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）：１０ｍＭのリン酸ナトリウム（１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）［ｐＨ２．６］＝３２：６８
【００９４】
スクロース合成酵素（Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）と糖転移酵素（ＵＤＰ―ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との複合反応によって最適な温度を確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース１Ｍ、ウリジンジホスフェート２０ｍＭ、ステビオシド４０ｍＭ及び０．１ｍｇ／ｍｌのスクロース合成酵素と０．１ｍｇ／ｍｌの糖転移酵素が含まれた５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に対して、１時間にわたって４℃、２０℃、３０℃、３７℃、４５℃、６０℃、７０℃、８０℃の温度で酵素反応を行った。１００℃で５分間加熱しながら反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を実施し、レバウジオシドＡの生成量を互いに比較し、最大値を示した反応系の反応温度がこの複合反応の最適な温度として求められる。
【００９５】
スクロース合成酵素と糖転移酵素との複合反応の最適な温度は、ｐＨ６．５、６０分間の反応で約４５℃付近と確認された。酵素相対活性を図５及び表３に示した。
【００９６】
【表３】
2017148050.tif 000008
【図１】
2017148050.tif 000009
【図２】
2017148050.tif 000010
【図３】
2017148050.tif 000011
【図４】
2017148050.tif 000012
【図５】
2017148050.tif 000013
【配列表】
2017148050000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月24日(2017.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＡを製造するためにスクロース合成酵素と糖転移酵素を使用する使用方法であって、
前記スクロース合成酵素を、スクロースとヌクレオチドジホスフェートとを反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するために使用し、
前記糖転移酵素を、前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートとステビオシドとを反応させ、レバウジオシドＡを製造するために使用することを特徴とする使用方法。
【請求項２】
前記スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素である、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記スクロース合成酵素は、スクロース合成酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記スクロース合成酵素が配列番号３の配列を有する、請求項３に記載の使用方法。
【請求項５】
前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）、バンブサ・オルダミイ（Ｂａｍｂｕｓａ  ｏｌｄｈａｍｉｉ）、ブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、またはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ） 由来の糖転移酵素である、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項６】
前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項７】
前記糖転移酵素が配列番号４の配列を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項８】
前記スクロース合成酵素と前記糖転移酵素を同一の反応系で使用し、前記同一の反応系における反応温度が２０℃〜６０℃で、反応ｐＨが５〜１０の範囲である、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項９】
スクロース合成酵素、糖転移酵素、スクロース、ヌクレオチドジホスフェートおよびステビオシドを含む、レバウジオシドＡ製造用組成物。