(57)【要約】【課題】有用な生理活性を有するステリルグリコシドの効率的な製造法を確立し、化粧品原料あるいは飲食品原料を提供すること。【解決手段】少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物にホスホリパーゼを作用させて酵素反応を行うことにより前記リン脂質を加水分解する工程を含む、ステリルグリコシドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物にホスホリパーゼを作用させて酵素反応を行うことにより前記リン脂質を加水分解する工程を含む、ステリルグリコシドの製造方法。
【請求項２】
前記酵素反応後に、ステリルグリコシドとリン脂質由来酵素反応生成物とを有機溶媒で抽出する工程、及びリン脂質由来酵素反応生成物を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載のステリルグリコシドの製造方法。
【請求項３】
製造したステリルグリコシドを粉末化する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のステリルグリコシドの製造方法。
【請求項４】
ホスホリパーゼがホスホリパーゼBまたはホスホリパーゼCである、請求項１から３の何れか一項に記載のステリルグリコシドの製造方法。
【請求項５】
ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼB又はホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼCと、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼCとを、同時に用いて前記酵素反応を行う、請求項１から４の何れか一項に記載のステリルグリコシドの製造方法。
【請求項６】
ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼBとホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼA1とを同時に用いて前記酵素反応を行う、請求項１から４の何れか一項に記載のステリルグリコシドの製造方法。
【請求項７】
５０〜９０％のステリルグリコシドと、１０〜５０％のフィトステロールとを含む、ステリルグリコシド含有組成物。
【請求項８】
請求項７に記載のステリルグリコシド含有組成物を含有する化粧品。
【請求項９】
請求項７に記載のステリルグリコシド含有組成物を含有する、飲食品添加物又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来リン脂質中に微量存在するステリルグリコシドの効率的な製造方法及びステリルグリコシドを高濃度に含有する含有物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステリルグリコシドとは、ステロール骨格にグルコース等がαまたはβ−グルコシド結合した糖脂質であり、高等植物に広く分布している。ステリルグリコシドの用途及び機能としては、毛髪化粧品（特許文献２、特許文献３、特許文献８）、ヒートショック蛋白質誘導活性（非特許文献１）、並びに栄養吸収促進剤（特許文献９）等が知られている。
【０００３】
ステリルグリコシドは、酵母等の微生物菌体（特許文献４）や植物抽出物や大豆レシチン等に含まれていることが知られており、シリカゲルカラムクロマト法、二酸化炭素超臨界クロマト法等の製造法が示されている（特許文献５、特許文献６、特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４９３３４３２号公報
【特許文献２】特許第４８１７１８２号公報
【特許文献３】特開２００８−２４６２８号公報
【特許文献４】特開２００７−２９５８４８号公報
【特許文献５】特願昭６２−２３８２９９号公報
【特許文献６】特願平１−１９６８６４号公報
【特許文献７】特願平１０−１９５２７８号公報
【特許文献８】特願２００２−２１１９３４号公報
【特許文献９】特願平７−３２９３８０号公報
【特許文献１０】特許第３０２２１３１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】セルストレスとシャペロン、５巻、３〜７頁、２０００年
【非特許文献２】FEBSジャーナル、280巻、３７８０〜３７９６頁、２０１３年
【非特許文献３】Biosci.Biotechnol.Biochem.７０巻、３７７〜３８６ページ、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、ステリルグリコシドは有用な生理活性を有するが、植物体にはステリルグリコシドは微量しか含まれていない。従って、植物由来リン脂質から、ステリルグリコシドを効率的に単離する手法が望まれている。本発明の課題は、有用な生理活性を有するステリルグリコシドの効率的な製造方法を確立することである。本発明の別の課題は、上記製造法で製造したステリルグリコシドを含む化粧品、飲食品添加物及び飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題を達成するために、ステリルグリコシドを含有するリン脂質混合物中のリン脂質を加水分解反応により消去する方法に関して鋭意研究を行った結果、複数のリン脂質分子種（レシチン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾレシチン）を完全にホスホリパーゼで加水分解して遊離脂肪酸又はジグリセリドに変換し、ステリルグリコシドを残存させることができることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物にホスホリパーゼを作用させて酵素反応を行うことにより前記リン脂質を加水分解する工程を含む、ステリルグリコシドの製造方法。
［２］  前記酵素反応後に、ステリルグリコシドとリン脂質由来酵素反応生成物とを有機溶媒で抽出する工程、及びリン脂質由来酵素反応生成物を除去する工程をさらに含む、［１］に記載のステリルグリコシドの製造方法。
［３］  製造したステリルグリコシドを粉末化する工程をさらに含む、［１］又は［２］に記載のステリルグリコシドの製造方法。
［４］  ホスホリパーゼがホスホリパーゼBまたはホスホリパーゼCである、［１］から［３］の何れかに記載のステリルグリコシドの製造方法。
［５］  ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼB又はホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼCと、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼCとを、同時に用いて前記酵素反応を行う、［１］から［４］の何れかに記載のステリルグリコシドの製造方法。
［６］  ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼBとホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼA1とを同時に用いて前記酵素反応を行う、［１］から［４］の何れかに記載のステリルグリコシドの製造方法。
［７］  ５０〜９０％のステリルグリコシドと、１０〜５０％のフィトステロールとを含む、ステリルグリコシド含有組成物。
［８］  ［７］に記載のステリルグリコシド含有組成物を含有する化粧品。
［９］  ［７］に記載のステリルグリコシド含有組成物を含有する、飲食品添加物又は飲食品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法によれば、高純度のステリルグリコシドを効率よく取得でき、化粧品原料あるいは機能性飲食品原料への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】酵素反応前後の薄層クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図２】シリカゲルクロマトグラフィー後の薄層クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施の形態について以下に説明する。
［１］ステリルグリコシドの製造方法
本発明のステリルグリコシドの製造方法は、少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物にホスホリパーゼを作用させて酵素反応を行うことにより前記リン脂質を加水分解する工程を含むことが特徴である。
【００１２】
本発明においては、少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物を原料として使用する。原料として用いる少なくともステリルグリコシドとリン脂質とを含む混合物としては、大豆レシチン、菜種レシチン、トウモロコシレシチン、タバコレシチン（Phytochemistry,1970, Vol.9,pp.819 to 822）などの植物由来リン脂質を含む原料を用いることができる。これらリン脂質を含む原料中には０．２〜３%程度のステリルグリコシドが含まれる。これらのリン脂質混合物を原料にしてシリカゲルカラム等を用いてステリルグリコシドを精製することも可能であるが、極めて効率が悪く実用的ではない。
【００１３】
植物リン脂質にはレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などの複数の分子種が存在する。リン脂質に作用する加水分解酵素としてはホスホリパーゼA、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD等が知られている。これら酵素は、リン脂質の加水分解部位が異なる酵素である。リン脂質を除去する酵素として酵素反応後のステリルグリコシド精製を考慮するとホスホリパーゼA,ホスホリパーゼB、及びホスホリパーゼCが適している。特に好ましくは、本発明で使用するホスホリパーゼは、ホスホリパーゼBまたはホスホリパーゼCである。
【００１４】
これらの酵素はその起源によってリン脂質分子種に対する基質特異性が異なる。
例えばキャンディダ・シリンドラセ由来のホスホリパーゼBは大豆リン脂質の中でホスファチジルイノシトール以外のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸等に良好に作用してこれらリン脂質を効率良く脂肪酸に変換できる（特許文献１）がホスファチジルイノシトールは分解しないで残存する。特許文献１０に示されているホスホリパーゼA１はホスファチジルコリンに作用してリゾレシチンに変換する酵素として知られるが、鋭意検討した結果ホスファチジルイノシトールを加水分解しリゾホスファチジルイノシトールを残存することなく完全に遊離脂肪酸あるいはジグリセリドに変換できることがわかった。
【００１５】
本発明の一例としては、ステリルグリコシドを含有する大豆由来レシチンまたは大豆由来リゾレシチンを緩衝液に分散させ、大豆レシチン中に含有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールを加水分解する酵素を添加して全てのリン脂質を加水分解して遊離脂肪酸に変換することができる。
【００１６】
本発明においては好ましくは、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼBとホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼA1とを同時に用いて前記酵素反応を行うことができる。使用する酵素としては、ストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼB（非特許文献２）、キャンディダ・ユチルス由来のホスホリパーゼB（非特許文献３）あるいはキャンディダ・シリンドラセ由来のホスホリパーゼB（特許文献１）と糸状菌由来のホスホリパーゼA１（特許文献１０）を使用することができる。
【００１７】
これらのリン脂質に作用して脂肪酸を遊離させる酵素の他に、リン脂質を加水分解してジグリセリドに変換させる微生物由来のホスホリパーゼCと、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼCを組み合わせてリン脂質を加水分解させても良い。さらにまた、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼCを同時に用いて酵素反応を行うこともできる。即ち、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼB又はホスファチジルイノシトールに基質特異性を有するホスホリパーゼCと、ホスファチジルイノシトールに基質特異性を有しないホスホリパーゼCとを、同時に用いて前記酵素反応を行うことができる。
【００１８】
使用する酵素の量は、標品中の酵素純度にもよるが０．０１％から０．５％程度が好ましく、特に０．１〜０．２％程度が好ましい。反応液中には酵素反応を促進させるカルシウムイオン等を適宜添加してもよい。
【００１９】
酵素反応を行う反応温度は２０℃から７０℃の範囲で行うことができ好ましくは３０℃から６０℃が好ましく、４０℃から５０℃が特に好ましい。反応時間としては、用いる酵素の量にもよるが６〜２０時間である。製造工程の作業効率を考慮すると１５から１８時間が好ましい。反応のｐＨは酵素反応速度が最大になるｐＨを選択すれば良い。酵素反応の進行の程度は下記のふたつの方法で行うことができる。反応の進行程度は薄層クロマトグラフィーで観察するのが簡便である。反応液にクロロホルム‐メタノール混合液（１：１）を添加し十分に攪拌混合し３０００回転で２分間遠心分離を行いクロロホルム層を薄層クロマトグラフィー用ガラスプレートにスポットし、クロロホルム：メタノール：水（４０：３０：４）の展開溶媒で展開し脂質成分の検出はリン酸‐硫酸‐酢酸銅（８％：２％：３％）溶液を噴霧し１５０℃で加熱することで行うことができる。薄層クロマトグラフィーではホスファチジルコリンとホスファチジルイノシトールの分離が不十分であるので、正確なホスファチジルイノシトールの定量にはホスファチジルイノシトールに作用する特異的な酵素法での分析法が好ましい。具体的には上記クロロホルム層を一定量試験管にとり溶媒を留去後１０％トリトンＸ１０0を加え溶解後，ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ、１０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８）を添加し３７℃で反応後、トリグリセリド測定キット（和光純薬社）試薬１‐試薬２（１：１）を添加後５５０nmの吸光度を測定することでホスファチジルイノシトールの定量が可能である。
【００２０】
本発明のステリルグリコシドの一般的な製造方法は、次のとおりである。
（工程１）
植物由来のレシチンあるいはリゾレシチン分散液に前述した酵素を用いてリン脂質が完全に消失するまで反応を行う。使用するホスホリパーゼＢとしてはストレプトマイセス属由来、キャンディダ・ユチルス由来、キャンディダ・シリンドラセ由来の酵素が好ましいが、品質面及び工業的な安定供給されているキャンディダ・シリンドラセ由来の酵素が特に好ましい。ホスホリパーゼＡとしては糸状菌由来酵素が特に好ましい。ホスホリパーゼＣとしてはバチルス属由来酵素が好ましい。植物由来のレシチンとしては大豆由来、菜種由来、ヒマワリ由来等のリン脂質を使用できるが、供給面で安定している大豆由来レシチンあるいは大豆由来リゾレシチンを使用することが特に好ましい。使用する濃度は５〜３０％であるが１０〜２０％が特に好ましい。
【００２１】
（工程２）
次に、酵素反応物にヘキサン、ヘプタン、トルエン等の有機溶媒を添加して、脂質を抽出する。反応液に対して等量から３倍量の溶媒の使用が好ましいが１．５から２倍量の有機溶媒を使用するのが特に好ましい。有機溶媒層にはステリルグリコシドとリン脂質由来酵素反応生成物である遊離脂肪酸が含有される。得られる抽出液を減圧濃縮して溶媒を留去することにより、ステリルグリコシドとリン脂質由来酵素反応生成物（遊離脂肪酸）を回収することができる。
【００２２】
（工程３）
酵素反応によって生成されるリン脂質由来酵素反応生成物（遊離脂肪酸）を除去する目的でアセトンあるいはエタノールを添加する。ステリルグリコシドはこれらの溶媒に不溶性であるので沈殿物を回収し高純度のステリルグリコシドを得ることができる。
【００２３】
（工程４）
ステリルグリコシドは水に対して殆ど溶解性を示さないため、リポソーム製剤とすることが化粧品、飲食品添加物又は飲食品に添加して利用する上では好ましい。例えば、ステリルグリコシドをヘキサン、ヘプタン、トルエン等の溶媒に溶解し、レシチン、フィトステロールを加え溶媒を留去することによって乾燥粉末を得ることができる。本発明によるステリルグリコシドの製造方法は、上記の通り、製造したステリルグリコシドを粉末化する工程をさらに含む方法でもよい。添加するレシチンとしては安定性に優れた水素添加レシチンあるいはジパルミトイルレシチン等の合成レシチンを使用できるが精製大豆レシチンの水素添加物がより好ましい。添加するレシチン濃度はステリルグリコシド０．１ｇに対して１〜１０ｇ、フィトステロールは０．２５〜２ｇの使用が好ましい。
【００２４】
［２］ステリルグリコシド含有組成物
本発明はさらに、５０〜９０％のステリルグリコシドと、１０〜５０％のフィトステロールとを含むステリルグリコシド含有組成物に関する。
上記した（工程１）〜（工程３）を経て回収される高純度のステリルグリコシドを含む組成物は、好ましくは、５０〜９０％のステリルグリコシドと、１０〜５０％のフィトステロールとを含む組成物である。本発明の方法により製造されるフィトステロール含有組成物は、ステリルグリコシドとフィトステロールとを所定の含有量で含有する組成物であり、出願人の知る限り従来報告のない新規な組成物である。
【００２５】
上記した本発明のステリルグリコシド含有組成物は、化粧品、飲食品添加物又は飲食品中に添加して使用することができる。例えば、本発明のステリルグリコシド含有組成物を、上記の（工程４）に記載した方法によりリポソーム製剤とし、これを化粧品、飲食品添加物又は飲食品中に添加してもよい。
【００２６】
本発明の化粧品としては、例えば、洗浄剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーローション、アフターシェーブローション、ボディーローション、化粧ローション、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、エモリエントクリーム、エアゾール製品、消臭剤、芳香剤、脱臭剤または入浴剤などを挙げることができる。
【００２７】
本発明の化粧品には、例えば、界面活性剤、保湿剤、動植物由来又は微生物由来の油脂、シリコーン、アルコール、動植物由来又は微生物由来のエキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、着色剤、香料などを適宜配合することができる。
【００２８】
本発明の飲食品添加物としては、例えば、ｐＨ調整剤、保存料、殺菌料、酸化防止剤、防カビ剤、日持向上剤、着色料、発色剤、漂白剤、光沢剤、香料、香辛料抽出物、甘味料、酸味料、調味料、苦味料、乳化剤、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊料、膨張剤、ガムベース、イーストフード、軟化剤、栄養強化剤などを挙げることができる。
【００２９】
本発明の飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品などが含まれる。飲食品としては、例えば、栄養補助食品またはサプリメントとしての錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。さらに、飲料、麺類、菓子類及びパン類、水産・畜産加工食品、乳製品、油脂および油脂加工食品、調味料、レトルト食品、冷菓などでもよい。
【００３０】
以下に実施例を挙げより詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ホスホリパーゼＢとホスホリパーゼＡとの併用効果
３０ｍＭ塩化カルシウムを含有する０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ５.５（１０ｍｌ）に大豆レシチン（ＳＬＰホワイト）粉末を２０％になるよう添加し、キャンディダ・シリンドラ由来ホスホリパーゼＢ２０ｍｇ単独及び糸状菌由来ホスホリパーゼＡ１（２０ｍｇ）を添加した条件で４０℃で１６時間攪拌しながら反応を行った。反応後クロロホルム：メタノール（１：１）混合液２０ｍｌを添加して十分攪拌混合した後３０００回転で２分間遠心分離した。クロロホルム層２マイクロリットルを試験管に移し溶媒を蒸去した後２％トリトンＸ１００（１００マイクロリットル）を加え３７℃で溶解させた。これに１０ｍＭ塩化マグネシウム及び２Ｕ／ｍｌのバチルス由来のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（シグマ社）を含有する０．１Ｍトリス塩酸バッファー５００マイクロリットルを加え、３７℃で１０分間反応後、臨床検査用トリグリセリドキット（和光純薬社）の試薬１と試薬２を混合した発色試薬１ｍｌを添加してホスファチジルイノシトール由来のジグリセリドを定量した。表１に示したようにキャンディダ・シリンドラ由来ホスホリパーゼＢを使用した条件ではホスファチジルイノシトールが残存した。一方キャンディダ・シリンドラ由来ホスホリパーゼＢに糸状菌由来ホスホリパーゼＡ１を添加した反応条件ではホスファチジルイノシトールが完全に消失した。図１にキャンディダ・シリンドラ由来ホスホリパーゼＢに糸状菌由来ホスホリパーゼＡ１を添加した反応条件で酵素反応させた抽出液の薄層クロマトグラフィーの結果を示した。
【００３２】
【表１】
2017042163.tif 000002
【００３３】
実施例２：ステリルグリコシドの調製
３０ｍＭ塩化カルシウムを含有する０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ５.５（２００ｍｌ）に大豆レシチン（辻製油社製ＳＬＰホワイト）粉末を２０％になるよう添加し、キャンディダ・シリンドラ由来ホスホリパーゼＢ４００ｍｇと糸状菌由来ホスホリパーゼＡ１（４００ｍｇ）を添加した条件で４０℃で１８時間攪拌しながら反応を行った。反応液に４００ｍｌのヘキサンを添加して脂溶性成分を抽出した。ヘキサン層を集め減圧乾燥し、固形分を４０ｍｌのヘキサンに溶解し、これに１６０ｍｌのアセトンを加え生じた沈殿物を集めた。この沈殿物を６０ｍｌのアセトンで十分洗浄した。得られた沈殿物を少量のヘキサンに溶解しロータリーエバポレーターで減圧濃縮し約６０％純度のステリルグリコシド６２０ｍｇを得た（沈殿物には約４０％のフィトステロールが含まれる）。ステリルグリコシドの純度測定は下記の方法で実施した。メルク社製薄層クロマト用ガラスプレートに前記試料を５ｍｇ/mlのクロロホルムに溶解し、１０マイクロリットルをスポットした。クロロホルム：メタノール：水（６０：３０：４、V/V）で添加後３％酢酸銅：８％リン酸：２％硫酸混合液をスプレーし、プレートを風乾後１５０℃で５分間発色を行った。プレートをCSアナラーザー（アトー社）にかけてスキャンし定量した。図１に示したように酵素反応によってホスファチジルコリンをはじめ全てのリン脂質は加水分解を受け遊離脂肪酸に変換されたが、ステリルグリコシドは全く変化せず残存した。
【００３４】
実施例３：高純度ステリルグリコシドの精製
実施例２で得られたステリルグリコシド３００ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解し、シリカゲル（メルク社）を充填したガラスカラム（１．６ｘ３５ｃｍ）にかけた。クロロホルム５０ｍｌ、次いで５％メタノール含有のクロロホルム１００ｍｌ、１０％メタノール含有のクロロホルム１００ｍｌで溶出した。１０ｍｌずつのフラクションに分け薄層クロマトグラフィーで脂質成分を確認後ステリルグリコシド画分を集めロータリーエバポレーターで溶媒を除去しステリルグリコシド１７５ｍｇを得た。図２に示したように精製したステリルグリコシドは試薬として市販されているステリルグルコシド標品（シグマ社製）とＲｆ値が一致した。
【００３５】
実施例４：高純度ステリルグリコシド含有リポソームの調製
実施例２で得られたステリルグリコシド２３０ｍｇを２５ｍｌのシクロヘキサンに溶解し、これに６．４ｇの水素添加レシチン、１．６ｇのフィトステロールを添加溶解し、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し粉末７．９ｇを得た。
【図１】
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【図２】
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