(57)【要約】【課題】      本願発明は、日本山ニンジンについて、抽出される抽出物を活用する手段を提案する。【解決手段】  スキンケア製品の生産方法であって、日本山ニンジンから抽出物を抽出する抽出ステップを含む、スキンケア製品の生産方法である。特に、ヒアルロン酸産生促進作用や表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用を有するスキンケア製品を生産するためには、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いることが有効となる。また、各生理活性作用の原因となる物質を特定することにより、スキンケア製品を効率よく生産することを可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スキンケア製品の生産方法であって、
日本山ニンジンから抽出物を抽出する抽出ステップを含む、スキンケア製品の生産方法。
【請求項２】
前記スキンケア製品は、ヒアルロン酸産生促進剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、ヒアルロン酸産生促進作用を有する物質を抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項３】
前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項２記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項４】
前記抽出溶媒としてエタノールを用いる、請求項３記載のヒアルロン酸産生促進剤の生産方法。
【請求項５】
前記スキンケア製品は、表皮ブドウ球菌に対する抗菌剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質を抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項６】
前記表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質として、（１）式で表されるアンゲリシン、（２）式で表されるルテオリン、（３）式で表されるフマル酸及び（４）式で表されるオレイン酸のうち少なくとも１つを抽出する、請求項５記載のスキンケア製品の生産方法。
【化１】
2017071573.tif 000003
【請求項７】
前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項５又は６記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項８】
前記スキンケア製品は、アクネ菌に対する抗菌剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、アクネ菌に対する抗菌作用を有する物質を抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項９】
前記アクネ菌に対する抗菌作用を有する物質として、（５）式で表されるβ‐アミリンを抽出する、請求項８記載のスキンケア製品の生産方法。
【化２】
2017071573.tif 000004
【請求項１０】
前記スキンケア製品は、黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質として、（２）式で表されるルテオリン、（６）式で表されるケンフェロール、（７）式で表されるケンフェロールルテノシド、（８）式で表されるアデノシン及び（３）式で表されるフマル酸のうち少なくとも１つを抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【化３】
2017071573.tif 000005
【請求項１１】
前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項１０記載のスキンケア製品の生産方法。
【請求項１２】
前記スキンケア製品は、大腸菌に対する抗菌剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、大腸菌に対する抗菌作用を有する物質として、（９）式で表されるヒュウガニンＥ及び（１０）式で表されるクロロゲン酸メチルエステルのうち少なくともいずれかを抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【化４】
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【請求項１３】
前記スキンケア製品は、メラニン産生阻害剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、メラニン産生阻害作用を有する物質として、（１１）式で表されるイソプテリキシン、（９）式で表されるヒュウガニンＥ、（１２）式で表されるケルセチン、（２）式で表されるルテオリン、（６）式で表されるケンフェロール及び（１３）式で表される5-ヒドロキシメチル-2-フラルデヒドのうち少なくとも１つを抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【化５】
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【請求項１４】
前記スキンケア製品は、メラニン産生促進剤を含有し、
前記抽出ステップにおいて、メラニン産生促進作用を有する物質として、（１４）式で表されるソラレン、（１５）式で表されるクロロゲン酸及び（１０）式で表されるクロロゲン酸メチルエステルのうち少なくとも１つを抽出する、請求項１記載のスキンケア製品の生産方法。
【化６】
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【請求項１５】
試料からスキンケア有効成分を抽出するスキンケア有効成分の抽出方法であって、
前記試料として日本山ニンジンを用い、抽出溶媒として水よりも極性の低い溶媒を用いる、スキンケア有効成分の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スキンケア製品の生産方法及びスキンケア有効成分の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる日本山ニンジンと言われるセリ科植物には、イヌトウキ（犬当帰：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ）とヒュウガトウキ（日向当帰：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｔｅｎｕｉｓｅｃｔａ  ｖａｒ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ）という２種類の学名のシシウド属に属する植物がある。日本山ニンジンは、イヌトウキ及びヒュウガトウキとこれらの近似植物の総称と言われることもある。総称と捉えれば、イヌトウキとヒュウガトウキの他にも、トウキ、ホッカイトウキ、セイヨウトウキ、カラトウキ、シシウド、アシタバという同属の学名のものが含まれる。
【０００３】
イヌトウキは、一般的には、肝障害、アレルギー、炎症、糖尿病や高血圧の治療に有効であるといわれている（例えば、非特許文献１参照）が、本格的には研究されていない。他方、ヒュウガトウキについては、種々の研究により、抽出物の生理活性が明らかにされてきている（例えば、特許文献１、非特許文献２及び３参照。）。例えば、特許文献１には、ヒュウガトウキの抽出物がメラニン色素の増殖を促進し、皮膚又は毛髪の黒化促進剤等として有用であることが開示されている。なお、ヒュウガトウキは、平成１４年１１月に厚生労働省から医薬品（生薬）の認定を受けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１０２０６８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Taniguchi  M、外４名著，The  115th  Annual  Meeting  of  the  Pharmaceutical  Society  of  Japan，Sendai，March  1995，Abstract  of  Papers  II，p.194．
【非特許文献２】松下洋一、外３名著，ヒュウガトウキ（Angelica  furcijuga  Kitagawa）葉および茎の分離・分析，Memoirs  of  the  Faculty  of  Engineering，Miyazaki  University，38:87-90，2009-09-30．
【非特許文献３】藤原博士、外６名著，ヒュウガトウキ（Angelica furcijuga）のメラニン色素産生能への影響，Jpn  Phaimacok  Ther(薬理と治療)，vol.38，no.12，2010．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、日本山ニンジンからの抽出物の生理活性は研究の余地が残されており、薬理効果等について、氷山の一角を明らかにしたにすぎない。例えば、特許文献１には、抽出物が有する具体的な有効成分を特定する記載がない。その結果、日本山ニンジンからの抽出物を用いた製品も、バリエーションの拡大や有効成分の特定といったさらなる研究開発が期待されている。
【０００７】
ゆえに、本願発明は、日本山ニンジンから抽出される抽出物を有効に活用する、スキンケア製品の生産方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の観点は、スキンケア製品の生産方法であって、日本山ニンジンから抽出物を抽出する抽出ステップを含む、スキンケア製品の生産方法である。
【０００９】
本発明の第２の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、ヒアルロン酸産生促進剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、ヒアルロン酸産生促進作用を有する物質を抽出する。
【００１０】
本発明の第３の観点は、第２の観点のスキンケア製品の生産方法であって、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる。
【００１１】
本発明の第４の観点は、第３の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記抽出溶媒としてエタノールを用いる。
【００１２】
本発明の第５の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、表皮ブドウ球菌に対する抗菌剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質を抽出する。
【００１３】
本発明の第６の観点は、第５の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質として、（１）式で表されるアンゲリシン、（２）式で表されるルテオリン、（３）式で表されるフマル酸及び（４）式で表されるオレイン酸のうち少なくとも１つを抽出する。
【００１４】
本発明の第７の観点は、第５又は第６の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる。
【００１５】
本発明の第８の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、アクネ菌に対する抗菌剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、アクネ菌に対する抗菌作用を有する物質を抽出する。
【００１６】
本発明の第９の観点は、第８の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記アクネ菌に対する抗菌作用を有する物質として、（５）式で表されるβ‐アミリンを抽出する。
【００１７】
本発明の第１０の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する物質として、（２）式で表されるルテオリン、（６）式で表されるケンフェロール、（７）式で表されるケンフェロールルテノシド、（８）式で表されるアデノシン及び（３）式で表されるフマル酸のうち少なくとも１つを抽出する。
【００１８】
本発明の第１１の観点は、第１０の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる。
【００１９】
本発明の第１２の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、大腸菌に対する抗菌剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、大腸菌に対する抗菌作用を有する物質として、（９）式で表されるヒュウガニンＥ及び（１０）式で表されるクロロゲン酸メチルエステルのうち少なくともいずれかを抽出する。
【００２０】
本発明の第１３の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、メラニン産生阻害剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、メラニン産生阻害作用を有する物質として、（１１）式で表されるイソプテリキシン、（９）式で表されるヒュウガニンＥ、（１２）式で表されるケルセチン、（２）式で表されるルテオリン、（６）式で表されるケンフェロール及び（１３）式で表される5-ヒドロキシメチル-2-フラルデヒドのうち少なくとも１つを抽出する。
【００２１】
本発明の第１４の観点は、第１の観点のスキンケア製品の生産方法であって、前記スキンケア製品は、メラニン産生促進剤を含有し、前記抽出ステップにおいて、メラニン産生促進作用を有する物質として、（１４）式で表されるソラレン、（１５）式で表されるクロロゲン酸及び（１０）式で表されるクロロゲン酸メチルエステルのうち少なくとも１つを抽出する。
【００２２】
本発明の第１５の観点は、試料からスキンケア有効成分を抽出するスキンケア有効成分の抽出方法であって、前記試料として日本山ニンジンを用い、抽出溶媒として水よりも極性の低い溶媒を用いる。
【００２３】
上記で挙げた化学物質の化学式（１）〜（１５）を図１０に記載する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の各観点によれば、日本山ニンジンから、特定の生理活性効果を有する抽出物を抽出してスキンケア製品に活用可能となる。
【００２５】
さらに、本発明の第２の観点によれば、日本山ニンジンからヒアルロン酸産生促進作用を有する物質を抽出可能となる。さらに、本発明の第３の観点によれば、安定してヒアルロン酸産生促進作用のある物質を生産することが容易となる。
【００２６】
さらに、本発明の第５から第１２の観点によれば、日本山ニンジンから抗菌作用を有する物質を抽出することが可能となる。発明者らは、日本山ニンジンの抽出物質の中でも特にどの物質が、黄色ブドウ球菌・大腸菌・アクネ菌・表皮ブドウ球菌の中でもどの細菌に対して、抗菌作用を顕著に有するか見出した。これにより、日本山ニンジンの抽出物から抗菌作用を有する製品を効率よく生産することが容易となる。
【００２７】
本発明の第１３及び第１４の観点によれば、日本山ニンジンからメラニン産生促進／阻害作用を有する物質を抽出することが可能となる。発明者らは、日本山ニンジンの抽出物質の中でも特にどの物質がメラニン産生促進／阻害作用を顕著に有するか見出した。これにより、日本山ニンジンの抽出物からメラニン産生促進／阻害剤を効率よく生産することが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】日本山ニンジンからのエタノール抽出物のヒアルロン酸産生促進作用を示す図である。
【図２】日本山ニンジンからの単離物質（クマリン類）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【図３】日本山ニンジンからの単離物質（フェノール類）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【図４】日本山ニンジンからの単離物質（その化合物）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【図５】黄色ブドウ球菌に対する日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用を示す図である。
【図６】大腸菌に対する日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用を示す図である。
【図７】アクネ菌に対する日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用を示す図である。
【図８】表皮ブドウ球菌に対する日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用を示す図である。
【図９】日本山ニンジン抽出物の濃度変化による、表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用の変化を示す図である。
【図１０】日本山ニンジン抽出物から単離された物質の構造式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
１．１  エタノール抽出物及び水抽出物の抽出方法
日本山ニンジンの地上部２０ｇを１５０ｍｌのエタノールに浸漬し、常温で時々攪拌しながら一昼夜置いた後にろ過した。ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液（エタノール抽出液）から溶媒を除去し、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で任意の濃度に調製し、以下の実験に用いた。
【００３０】
また、日本山ニンジンの地上部２０ｇを１００ｍＬの水に浸漬し、先のエタノールと同様に抽出を行った。水抽出液は、凍結乾燥器ＴＡＩＴＥＣ（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）ＶＤ−２５０Ｒを用いて溶媒を除去した。
【００３１】
１．２  単離・同定方法
上記抽出方法で得られたエタノール抽出物溶液及び水抽出物溶液を、シリカゲルカラムを用いて、ヘキサン、酢酸エチル、メタノールでグラジエントをかけて複数に分画した。画分ごとにＮＭＲ測定を行い、既報の文献にて報告されているデータを比較することで、図１０に示す通りに単離物質を同定した。
【００３２】
上記方法により日本山ニンジンから得られた抽出物又は単離物質について、ヒアルロン酸産生促進作用、メラニン生合成の促進/阻害作用、抗菌作用をそれぞれ検討した。
【００３３】
２  日本山ニンジン抽出物のヒアルロン酸産生促進作用の検討
ヒアルロン酸は、主に皮膚真皮の主要な細胞である繊維芽細胞やその他の結合組織の細胞によって産生され、細胞外マトリックスの主成分となっており、様々な細胞間相互作用に関与している。繊維芽細胞培養系に被験物質を添加し、ヒアルロン酸の産生促進を確認することで、被験物質による肌の水分保持量の向上、肌質の改善等の効能を評価することができる。また、化粧品等の製品化にあたっては、細胞が死なないことが重要である。そのため、細胞生存率も評価した。
【００３４】
まず、水抽出物及びエタノール抽出物を最終濃度が２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌになるようＤＭＳＯで調製し、被験物質溶液として用いた。また、ネガティブコントロールとして抽出物を含まないＤＭＳＯを用いた。
【００３５】
ＮＨＤＦ細胞を５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、基礎培地で２４時間培養した。培地を被験物質溶液に置き換え、さらに３日間培養し、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりヒアルロン酸量を測定した。残った培地を洗い流して基礎培地を加え、１時間培養した後、ＭＴＴ法を用いて細胞生存率を測定した。ここで用いたＥＬＩＳＡ法及びＭＴＴ法について、下記で簡単に説明する。
【００３６】
ＥＬＩＳＡ法（ヒアルロン酸量の測定法）
ヒアルロン酸固層化マイクロタイタープレートの各ウェルに検体（最終培養液４〜５０倍希釈）とビオチン標識ＨＡＢＰの混合液を添加し室温で１時間反応させる。反応後、ウェル中の溶液を取り除き、よく洗浄した後にペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを加え、再度室温で３０分反応させる。再度、ウェル中の溶液を全て取り除き、よく洗浄した後、オルトフェニレンジアミンを加え酵素反応のよる発色を３０分行う。プレートリーダーを用い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定すれば、既知ヒアルロン酸による標準曲線から、ヒアルロン酸量の定量を行うことができる。
【００３７】
ＭＴＴ法（細胞生存率の測定法）
各ウェルにＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍｌ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を１０μｌ添加する。５％ＣＯ２、３７℃で４時間静置培養する。培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１００μｌずつ加え、遮光し、４時間室温で放置する。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とする。
【００３８】
図１は、左から順にＤＭＳＯ、１２．５μｇ／ｍｌのエタノール抽出物、６．２５μｇ／ｍｌのエタノール抽出物を加えた場合の、ヒアルロン酸産生量（ＨＡ）、細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、細胞あたりのヒアルロン酸産生量（ＨＡ／Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す棒グラフである。なお、縦軸の値は、コントロールであるＤＭＳＯを加えたサンプルの値を１００とした時の相対値である。
【００３９】
ネガティブコントロールと比較して、エタノール抽出物を加えた場合ではヒアルロン酸産生増加の傾向が観察された。また、エタノール抽出物を適度な濃度に調節した結果、図１に示すような濃度では細胞生存率が１００％近くに保たれており、細胞あたりのヒアルロン酸産生量で考えても、エタノール抽出物を加えることによりヒアルロン酸産生量の増加が観察された。ここで、エタノールは、本願請求項における「水よりも極性の低い溶媒」の一例である。他方、水抽出物を加えた場合は、ネガティブコントロールと比較した明確な傾向が本願出願時点では確認されていない。
【００４０】
３  日本山ニンジン抽出物及び単離物質のメラニン産生促進／阻害作用の検討
続いて、メラニン産生促進／阻害作用の検討では、図１０に構造式を示す日本山ニンジンからの単離物質２１種類が、Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響を評価した。
【００４１】
シャーレ上に培養したＢ１６メラノーマ細胞培養液（Ｅａｇｌｅ‘ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（ＥＭＥＭ））を血球計測板に１０μｌ添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にＥＭＥＭ培地を加え、細胞濃度を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製した。これを２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌずつ播種し、５モル％ＣＯ２、３７℃で２４時間静置培養した。培養後、２４ウェルプレートの培地を除去し、新たにＥＭＥＭ培地９９８μｌとサンプル溶液２μｌを添加した。これを５モル％ＣＯ２、３７℃で４８時間静置培養した。培養後、再び培地を除去し、ＥＭＥＭ培地９９８μｌとサンプル溶液２μｌを添加し、５モル％ＣＯ２、３７℃で２４時間静置培養した。培養後、下記の方法でメラニン生合成量を測定した。また、ヒアルロン酸産生促進作用の検討と同様に、ＭＴＴ法により細胞生存率も測定した。
【００４２】
培地を除去し、各ウェルに３００μｌのＰＢＳ（−）（すなわち、カルシウムが含まれないもの）を加えて洗浄した。ＰＢＳ（−）を除去し、各ウェルに１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を１ｍｌずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、４時間放置した。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン生合成量の指標とした。
【００４３】
図２から図４に、日本山ニンジンの各単離物質を加えた場合の、メラニン産生量及び細胞生存率を示している。ポジティブコントロールとしては、アルブチンを用いた。アルブチンは、メラニン産生を阻害する効能があり、美白有効成分として化粧品によく配合されている。なお、縦軸の値は、コントロールであるＤＭＳＯを加えたサンプルの値を１００とした時の相対値である。
【００４４】
図２はクマリン類、図３はフェノール類、図４はその他の化合物の結果を示している。この結果から、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、ケルセチン、ルテオリン、ケンフェロール、5-ヒドロキシメチル-2-フラルデヒドは、メラニン産生阻害作用が観測された。逆にメラニン産生促進作用が観測されたものは、ソラレン、クロロゲン酸、クロロゲン酸メチルエステル等である。これらの単離物質は、結果のグラフに示すような濃度範囲では、細胞生存率を高く保ちながら、メラニン産生促進／阻害作用を発揮することが期待される。なお、β―アミリン及びα―グルチトールでも、メラニン産生促進作用が観測された。
【００４５】
４  日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用の検討
続いて、下記の方法により、黄色ブドウ球菌・表皮ブドウ球菌・大腸菌・アクネ菌に対する日本山ニンジン抽出物及び単離物質の抗菌作用を検討した。
【００４６】
日本山ニンジン抽出物及び単離物質は、任意の濃度となるようＤＭＳＯで調製した。
【００４７】
菌の前培養
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ（ＮＡ）培地上に培養した菌のコロニーを５ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地に加え、３７℃で２２時間振とう培養（１１６０ｒｐｍ）して定常期の菌体を得た。得られた定常期の培養液をＮＢ培地で希釈し、ＯＤ６６０＝０．４になるよう調製した（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）。さらに、これをＮＢ培地で希釈し菌濃度を１０５  ＣＦＵ／ｍｌとして抗菌試験に用いた。
【００４８】
抗菌作用の測定
エッペンチューブに４４５μｌのＮＢ培地、５０μｌの菌液、５μｌの被験物質溶液を加え、十分に混合した。この時点で各被験物質の最終濃度は１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌとなる。この溶液を９６ウェルプレートに１５０μｌずつ分注し（ｎ＝３）、３７℃で２２時間振とう培養（１１５０ｒｐｍ）した。培養後、６３０ｎｍにおける濁度を測定し、抗菌作用の指標とした。なお、コントロールとしてＤＭＳＯ、ポジティブコントロールとしてソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）もしくは塩化ベンザルコニウム（Ｂｅｎｚｙｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた。ソルビン酸はよく食品等に保存料として添加されている化合物であり、塩化ベンザルコニウムは抗菌薬としてニキビの治療薬などに含有されている化合物である。
【００４９】
図５は、縦軸が濁度であり、黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用の結果を示している。水抽出物では抗菌作用は見られなかったが、エタノール抽出物では高い抗菌作用が観測された。また、ルテオリン、ケンフェロール、ケンフェロールルテノシド、アデノシン、フマル酸等の単離物質においても高い抗菌作用が観測された。抗菌薬の薬効の指標である最小発育素子濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の値でも評価を行った。エタノール抽出物では、ＭＩＣ＝４００μｇ／ｍｌ、ルテオリンでは、ＭＢＣ＝１００μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝７５μｇ／ｍｌ、ケンフェロールでは、ＭＩＣ＝１００μｇ／ｍｌ、ケンフェロールルテノシド及びアデノシンはどちらも、ＭＩＣ＝４００μｇ／ｍｌ、フマル酸は、ＭＢＣ＝３５０μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝２００μｇ／ｍｌであった。
【００５０】
図６は、縦軸が濁度であり、大腸菌に対する抗菌作用の結果を示している。水抽出物及びエタノール抽出物では抗菌作用は見られなかったが、単離物質についても検討したところ、ヒュウガニンＥ及びクロロゲン酸メチルエステルでは、高い抗菌作用が観測された。ヒュウガニンＥ及びクロロゲン酸メチルエステルは、ＭＢＣ＝２００μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝１５０μｇ／ｍｌであり、ポジティブコントロールのソルビン酸は、ＭＩＣ＝４００μｇ／ｍｌであったため、ヒュウガニンＥ及びクロロゲン酸メチルエステルはソルビン酸よりを高い抗菌作用も持つことが明らかになった。
【００５１】
図７は、縦軸が濁度であり、アクネ菌に対する抗菌作用の結果を示している。水抽出物及びエタノール抽出物では抗菌作用は見られなかったが、β−アミリンで高い抗菌作用が観測された。ポジティブコントロールとして用いた塩化ベンザルコニウムでは、ＭＢＣ＝２７５μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝３２５μｇ／ｍｌであり、β−アミリンでは、ＭＢＣ＝１２．５μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝１２．５μｇ／ｍｌであったため、β−アミリンは塩化ベンザルコニウムよりを高い抗菌作用も持つことが明らかになった。
【００５２】
図８は、縦軸が濁度であり、表皮ブドウ球菌に対する抗菌作用の結果を示している。黄色ブドウ球菌と同様に、水抽出物では抗菌作用は見られなかったが、エタノール抽出物では高い抗菌作用が観測された。また、アンゲリシン、ルテオリン、フマル酸、オレイン酸等の単離物質においても高い抗菌作用が観測された。エタノール抽出物では、ＭＩＣ＝４００μｇ／ｍｌ、ＭＢＣ＝４００μｇ／ｍｌ、アンゲリシンでは、ＭＩＣ＝５０μｇ／ｍｌ、ルテオリンでは、ＭＢＣ＝１００μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝５０μｇ／ｍｌ、フマル酸では、ＭＢＣ＝３２５μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ＝２００μｇ／ｍｌ、オレイン酸では、ＭＩＣ＝４００μｇ／ｍｌであった。
【００５３】
さらに、表皮ブドウ球菌については、エタノール抽出物・水抽出物をそれぞれ最終濃度が２００、４００、８００、１６００μｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯで調製し、エタノール抽出物及び水抽出物の濃度を変えて抗菌作用を評価した。
【００５４】
図９に、表皮ブドウ球菌に対する、各濃度のエタノール抽出物及び水抽出物の抗菌作用の結果を示している。エタノール抽出物では、２００μｇ／ｍｌでは抗菌作用は薄れてくるが、４００μｇ／ｍｌまでは表皮ブドウ球菌に対して抗菌作用を示す。また、水抽出物では、４００μｇ／ｍｌで抗菌作用が薄れてくるが、８００μｇ／ｍｌまでは高い抗菌作用が観察された。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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