(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロＲＮＡの一定温度、一段階操作で迅速に測定する方法の提供。【解決手段】・ｍｉＲＮＡと相補的な配列を有する第１のプライマー、・ｍｉＲＮＡと相同的な配列を有し、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する第２のプライマーを用い、（ｉ）ｍｉＲＮＡと第１のプライマーとの間で２本鎖を形成させ、ｍｉＲＮＡを鋳型として相補的なｃＤＮＡを合成し、（ｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、（ｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡと第２のプライマーとの間で２本鎖を形成させ、１本鎖ＤＮＡを鋳型として、ｍｉＲＮＡに相同的な配列及びＲＮＡ転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成させ、（ｉｖ）当該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させ、（Ｖ）検出する、ｍｉＲＮＡの測定方法。【選択図】図１
2017148040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲＮＡの測定方法であって、
・ｍｉＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第１のプライマー、および
・当該ｍｉＲＮＡの一部と相同的な配列を有し、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第２のプライマー
を用いて、
（ｉ）ｍｉＲＮＡと第１のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ｍｉＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により当該ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し、
（ｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡと第２のプライマーとの間でＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、当該ｍｉＲＮＡに相同的な配列及びＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｉｖ）当該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物を生成させ、
（Ｖ）生成したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、さらに以下の（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）を含む方法：
（ｖｉ）（ｉｖ）で生成したＲＮＡ転写産物と第３のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ＲＮＡ転写物を鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によりＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成し（ここで第３のプライマーは、第１のプライマーの一部又は全部を含む配列である）、
（ｖｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖をリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｖｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡに対し（ｉｉｉ）と同様の工程を行う。
【請求項３】
第１のプライマーがステムループ構造を有する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｉｉ）または（ｖｉｉｉ）のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
すべての工程が一定温度条件下で行われる、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
伸長された第一のプライマー及び／又は伸長された第３のプライマーを鋳型として生成されたＲＮＡを検出する、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、発現パターンが組織特異的であり、がん組織では正常組織と発現パターンが大きくことなることから新たなバイオマーカーとして注目されている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡの検出は一般的に、非特許文献２に記載のようなＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて行われる。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ｍｉＲＮＡから逆転写によってｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製する工程と、ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行う工程の２段階が必要であり、検出までに時間を要した。またＰＣＲ法はその特性上、反応温度の昇降が必要であり、短時間で温度昇降が可能な装置も必要であった。
【０００３】
一定温度条件下、一段階操作でＲＮＡを検出する方法として非特許文献３に記載のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法が知られている。従来のＴＲＣ法では、ＲＮＡ増幅を行うための、２つのプライマーと検出プローブの結合する領域が測定対象のＲＮＡ鎖中にそれぞれ必要であり、ｍｉＲＮＡのような短鎖のＲＮＡを検出することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】細胞工学  Ｖｏｌ．３２  Ｎｏ．１  ２０１３．８５
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２００５、Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２０  ｅ１７９
【非特許文献３】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１４：７７−８６，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ｍｉＲＮＡを一定温度、一段階操作で迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）ｍｉＲＮＡの測定方法であって、
・ｍｉＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第１のプライマー、および
・当該ｍｉＲＮＡの一部と相同的な配列を有し、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第２のプライマー
を用いて、
（ｉ）ｍｉＲＮＡと第１のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ｍｉＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により当該ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し、
（ｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡと第２のプライマーとの間でＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、当該ｍｉＲＮＡに相同的な配列及びＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｉｖ）当該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物を生成させ、
（Ｖ）生成したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする測定方法。
（２）（１）に記載の方法において、さらに以下の（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）を含む方法：（ｖｉ）（ｉｖ）で生成したＲＮＡ転写産物と第３のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ＲＮＡ転写物を鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によりＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成し（ここで第３のプライマーは、第１のプライマーの一部又は全部を含む配列である）、
（ｖｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖をリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（ｖｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡに対し（ｉｉｉ）と同様の工程を行う。
（３）第１のプライマーがステムループ構造を有する（１）又は（２）に記載の方法。
（４）（ｉｉｉ）または（ｖｉｉｉ）のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）すべての工程が一定温度条件下で行われる、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）伸長された第一のプライマー及び／又は伸長された第３のプライマーを鋳型として生成されたＲＮＡを検出する、（１）〜（５）いずれかに記載の方法。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
（１）測定原理
本発明の測定原理の概略を図１に示す。図１は本発明の代表的な測定原理を示す図であり、本発明はこれに限定されない。
（ｉ）ｍｉＲＮＡと第１のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ｍｉＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により当該ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する。即ち、逆転写酵素活性により、第１のプライマーが伸長される。
（ｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させる。即ち、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の働きにより、ｍｉＲＮＡ鎖が分解される。
（ｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡと第２のプライマーとの間でＤＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、当該ｍｉＲＮＡに相同的な配列及びＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成させる。即ち、プロモーター配列を有する第２のプライマーと、伸長された第１のプライマー間でＤＮＡ二本鎖が形成され、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の働きで、各プライマーの３’末端が伸長し、プロモーター配列のＤＮＡ二本鎖が形成される。
（ｉｖ）当該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、ＲＮＡ転写産物を生成させる。即ち、プロモーター配列依存的ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の働きで、ＲＮＡが合成される。
（Ｖ）生成したＲＮＡを検出する。即ち、合成されたＲＮＡをモレキュラービーコンなどの配列特異的プローブで検出する。
（ｖｉ）一方、（ｉｖ）で生成したＲＮＡ転写産物と第３のプライマーとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、ＲＮＡ転写物を鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によりＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する。ここで第３のプライマーは、第１のプライマーの一部又は全部を含む配列である。即ち、（ｉｖ）で生成されたＲＮＡと第３のプライマー間でＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成され、逆転写酵素活性により第３のプライマーが伸長される。
（ｖｉｉ）得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖をリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により分解して１本鎖ＤＮＡを生成させる。即ち、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の働きにより、ＲＮＡ鎖が分解される。
（ｖｉｉｉ）生成した１本鎖ＤＮＡに対し（ｉｉｉ）と同様の工程を行う。即ち、伸長された第３のプライマーと第２のプライマーとの間でＤＮＡ二本鎖が形成され、以下（ｉｉｉ）と同様の工程を行うことにより、ＲＮＡ増幅サイクルが進行する。
【０００９】
（２）第１のプライマー
本発明の第１のプライマーは、ｍｉＲＮＡの一部と相補的な配列を有するものであればよく特に限定されない。ここでｍｉＲＮＡの一部とは、好ましくはｍｉＲＮＡの４〜１８塩基、更に好ましくは５〜１０塩基である。また、ｍｉＲＮＡの一部とは、好ましくはｍｉＲＮＡの塩基配列全体の７５％以下であってよく、更に好ましくは３０％以下であってよい。また、好ましくは１０％以上であってよく、更に好ましくは１５％以上であってよい。第１のプライマーの二次構造は特に限定されないが、成熟ｍｉＲＮＡと未成熟ｍｉＲＮＡを識別するため、ステムループ構造を持つことが好ましい。また、第１のプライマーの長さは、１０〜７０塩基が好ましく、４０〜６０塩基が更に好ましい。
【００１０】
（３）第２のプライマー
本発明の第２のプライマーは、ｍｉＲＮＡの一部と相同的な配列を有し、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーター配列を有するものである。その結果第２のプライマーは、逆転写反応によって伸長された第１のプライマー及び第３のプライマーと二本鎖形成可能な配列である。ここでｍｉＲＮＡの一部とは、好ましくはｍｉＲＮＡの４〜２０塩基、更に好ましくは１０〜１８塩基である。また、ｍｉＲＮＡの一部とは、好ましくはｍｉＲＮＡの塩基配列全体の２５％以上であってよく、更に好ましくは７０％以上であってよい。また、好ましくは９０％以下であってよく、更に好ましくは８５％以下であってよい。具体的なプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。また、第２のプライマーの長さは、１５〜６０塩基が好ましく、３０〜５５塩基が更に好ましい。
【００１１】
（４）第３のプライマー
本発明の第３のプライマーは、第１のプライマーの一部又は全部を含む配列であればよく、特に限定されない。例えば、第１のプライマーと全く同じ配列のプライマーを第３のプライマーとして用いてもよいし、第１のプライマーの一部の配列を第３のプライマーとして用いてもよい。ここで第１のプライマーの一部とは、好ましくは第１のプライマーの６〜２５塩基、更に好ましくは１５〜２０塩基である。また、第１のプライマーの一部とは、好ましくは第１のプライマー全長の５０％以下であってよく、更に好ましくは４０％以下であってよい。また、好ましくは５％以上であってよく、更に好ましくは１０％以上であってよい。特に、第１のプライマーのループ部分を含む配列であることが好ましい。また、第３のプライマーの長さは、６〜４０塩基が好ましく、１５〜２０塩基が更に好ましい。
【００１２】
（５）検出
本発明におけるシグナルの検出は、ＲＮＡポリメラーゼによって生産される転写産物であるＲＮＡ鎖を検出することで行えばよく特に限定されない。ＲＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系をもちいてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、転写産物であるＲＮＡ配列がＲＮＡｚｙｍｅ活性を有するように第１のプライマー配列又は第３のプライマー配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。
【００１３】
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いればよい。また実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０  東ソー製）を用いてもよい。
【００１４】
（６）酵素
本発明の方法には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を用いる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のいずれかを兼ね備えた酵素を用いてもよいし、各ポリメラーゼ活性を有する酵素をそれぞれ用いてもよい。第１のプライマーにステムループプライマーを用いる際には、鎖置換活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３などを用いればよい。また、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＡＭＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（Ｍ−ＭｕＬＶ）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅなどを用いればよい。特に本発明では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては９６−７を、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてはＴ７を、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてはＡＭＶを用いることが好ましい。またリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素としては、ＲＮａｓｅＨ、ＡＭＶがあげられ、特にＡＭＶが好ましい。
【００１５】
（７）温度
本発明の測定方法において、各工程の温度は、各酵素が機能し、かつＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成可能な温度であればよく特に限定されない。好ましくは、２５〜６０℃、さらに好ましくは３７〜４６℃の範囲で行えばよい。本発明によれば、検出工程も含めてすべての工程を一定温度で行うことができる。
【発明の効果】
【００１６】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｉＲＮＡの検出方法では、温度昇降機器及び、二段階の操作が必要であった。本発明の方法では、ＴＲＣ反応を用いて、一定温度条件下、一段階操作でｍｉＲＮＡを迅速に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の測定系の概要を示す図である。
【図２】実施例３で各濃度のｍｉＲＮＡを測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
【図３】実施例４でｌｉｎ−４及びｍｉＲ−７を測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
【図４】実施例５でｍｉＲ−２１を測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
【図５】実施例６および実施例７でｍｉＲ−２１を測定した際の蛍光強度変化を示す図である。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明をｍｉＲＮＡの一種であるｌｉｎ−４およびｍｉＲ−２１の検出の実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
【００１９】
実施例１  プライマー、ｍｉＲＮＡ及びモレキュラービーコンの作製
第１のプライマー（配列番号１）、第２のプライマー（配列番号２）、第３のプライマー（配列番号３）、ｌｉｎ−４（ｍｉＲＮＡ、配列番号４）、ｍｉＲ−７（ｍｉＲＮＡ、配列番号５）はそれぞれ、グライナー社による受託合成により作製した。第１のプライマーは、ステムループ構造（ステム；配列番号１の１〜１４位及び３１〜４４位、ループ；配列番号１の１５〜３０位）を持ち、３’末端にｌｉｎ−４と相補的な配列を６塩基（配列番号１の４５〜５０位）持つよう設計した。第２のプライマーは５’末側にＴ７プロモーター配列（配列番号２の１〜２８位）を持ち、ｌｉｎ−４と相同的な配列を１５塩基（配列番号２の３３〜４７位）持つよう設計した。第３のプライマーは第１のプライマーのループ部分の一部１６塩基（配列番号１の１１〜２６位）を含むよう設計した。
【００２０】
実施例２  モレキュラービーコン作製
配列番号６の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾したモレキュラービーコン及び、配列番号１１の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾したモレキュラービーコンはグライナー社による受託合成により作製した。
【００２１】
実施例３  ｍｉＲＮＡの測定（ｌｉｎ−４の測定）
ｌｉｎ−４を第１から第３のプライマー及びモレキュラービーコンを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度（終濃度）などの詳細を以下に示す。ＭｇＣｌ２  １８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ６０ｍＭ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．２Ｕ／μＬ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭ、ＮＴＰ  ３ｍＭ、  ＩＴＰ（ＳＩＧＭＡ製）３．０６ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１２ｍｇ／ｍｌ、ＡＭＶ  ７．４Ｕ、ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ２％、  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １４２Ｕ／３０μＬ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ  ２Ｕ／３０μＬ、ＫＣｌ  ４０ｍＭ、第１のプライマー  １０００ｎＭ、第２のプライマー  １．５μＭ、第３のプライマー  ０．７μＭ、モレキュラービーコン  ３００ｎＭ。反応温度４２℃。
【００２２】
上記測定溶液中に図２に記載の各終濃度のｌｉｎ−４を共存させ、モレキュラービーコン由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図２に示す。ｌｉｎ−４濃度に応じて時間あたりの蛍光強度増幅が異なることが確認された。
【００２３】
実施例４  ｍｉＲＮＡの測定（特異性評価）
実施例３で示した測定溶液中に、ｌｉｎ−４又はｍｉＲ−７を１００ｎＭ共存させて、モレキュラービーコン由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図３に示す。ｌｉｎ−４以外のｍｉＲＮＡ存在下では蛍光増幅しないことが確認された。
【００２４】
以上の結果から、本発明の方法により、配列特異的にｍｉＲＮＡを測定できることが確認された。
【００２５】
実施例５  ｍｉＲ−２１の検出
ｍｉＲ−２１（配列番号７）のｍｉＲＮＡを第１から第３のプライマー（配列番号８〜１０）及び５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾したモレキュラービーコン（配列番号１１）を用いて測定した。第１のプライマー（配列番号８）はステムループ構造（ステム；配列番号８の１〜１４位及び３１〜４４位、ループ；配列番号８の１５〜３０位）を持ち、３’末端にｍｉＲ−２１と相補的な配列を６塩基（配列番号８の４５〜５０位）持つよう設計した。第２のプライマー（配列番号９）は５’末側にＴ７プロモーター配列（配列番号９の１〜２８位）を持ち、ｍｉＲ−２１と相同的な配列を１８塩基（配列番号９の３５〜５２位）持つよう設計した。第３のプライマー（配列番号１０）は第１のプライマーのループ部分の一部１１塩基（配列番号８の１５〜２５位）を含むよう設計した。
【００２６】
測定溶液中の酵素濃度、基質濃度（終濃度）などの詳細を以下に示す。ＭｇＣｌ２  １８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ６０ｍＭ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．２Ｕ／μＬ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭ、ＮＴＰ  ３ｍＭ、  ＩＴＰ（ＳＩＧＭＡ製）３．０６ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１２ｍｇ／ｍｌ、ＡＭＶ  ７．４Ｕ、ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ２％、  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １４２Ｕ／３０μＬ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ  ２Ｕ／３０μＬ、ＫＣｌ  ４０ｍＭ、第１のプライマー  １０００ｎＭ、第２のプライマー  １．５μＭ、第３のプライマー  ０．７μＭ、モレキュラービーコン（配列番号１１）  ３００ｎＭ。反応温度４２℃。
【００２７】
上記測定溶液中に図４に記載の各終濃度のｍｉＲ−２１を共存させ、モレキュラービーコン由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図４に示す。グラフの横軸には反応試薬添加からの経過時間、縦軸には蛍光強度比（蛍光強度を初期蛍光強度で割った値）を示す。ｍｉＲ−２１濃度に応じて時間あたりの蛍光強度比の増幅が異なることが確認された。
【００２８】
以上の結果から、プライマー配列及び、プローブ配列を変更することで、本発明の方法を用いて、様々なｍｉＲＮＡが検出可能であることが示された。
【００２９】
実施例６  培養上清エキソソーム中のｍｉＲＮＡの検出（Ｈｅｌａ細胞）
Ｈｅｌａ細胞の培養上清中のエキソソームには配列番号７のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）が多く存在することが知られている（ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１３，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／２５３９５７）。本発明の方法を用いた培養上清中エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ検出方法を以下に示す。
【００３０】
（１）培養上清中エキソソームの回収
Ｈｅｌａ細胞を血清含有培地で培養した後、Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ＦＢＳ（フナコシ）を用いた培地に交換し、培養した後上清を回収した。その後、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  （ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）及び、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて試薬のプロトコールに従いエキソソーム由来のｍｉＲＮＡを回収した。
【００３１】
（２）ｍｉＲＮＡの検出
（１）の方法で回収したｍｉＲＮＡを実施例５に示した方法と同様の方法を用いて検出した。
【００３２】
実施例７  培養上清エキソソーム中のｍｉＲＮＡの検出（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）
実施例６と同様の方法を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清中のエキソソームより、ｍｉＲＮＡを回収し、回収したｍｉＲＮＡの検出を行った。実施例６及び実施例７のｍｉＲＮＡ検出の結果を図５に示す。結果からＨｅｌａ細胞培養上清中のエキソソームから回収したｍｉＲＮＡの方が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養上清中エキソソームから回収したｍｉＲＮＡより、ｍｉＲ−２１を多く含むことが示唆された。
【００３３】
以上の結果から、本発明の方法を用いて、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡが検出可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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