(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ、また、高発現型の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ及びハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするタンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ。前記ＤＮＡでコードされる２６個以下のアミノ酸からなる、アミノ酸配列をＣ末端に含む、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びこれをコードする遺伝子。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ。
【請求項２】
前記ペプチドが２６個以下のアミノ酸からなる請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１、２、３、または４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号５で表される塩基配列を含む請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号５、６、７、または８で表される塩基配列からなる請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をＣ末端に有する変異型タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をＣ末端に含む、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ。
【請求項９】
下記（Ａ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれる、請求項８に記載の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ：
（Ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｄ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｅ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｆ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｇ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項１１】
配列表の配列番号１３、１４、１５、または１６で表される塩基配列からなる請求項１０に記載の遺伝子。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡに関する。本発明はまた、上記のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含む変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術においては、目的の遺伝子が導入された形質転換細胞を選別するために、薬剤耐性遺伝子が利用されている。薬剤耐性遺伝子のうち、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子がコードするハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼについては、野生型に対し高い耐熱性を有する変異体を得たことが特許文献１で報告されている。しかし、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの機能改変の報告例は少ない。
【０００３】
タンパク質の変異体の探索において、より高活性の変異体が得られる場合、タンパク質の立体構造等の変化等に基づく場合のほか、タンパク質の発現量が増加する場合があると考えられる。遺伝子の発現量には、翻訳後のタンパク質の性質や、転写や翻訳段階の要因が関与し得、例えば、特許文献２では、遺伝子の高発現能を有する５’−非翻訳領域ＤＮＡ配列について開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２４５２６１号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡを提供することを課題とする。本発明は、また、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するベクターを提供することを課題とする。
別の観点からは、本発明は、高い薬剤耐性の形質転換体を与えるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子およびそれにコードされる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの探索の過程で得られた高薬剤耐性のクローンがハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを高発現していることを見出した。さらに検討を重ね、これらのクローンで発現している変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのＣ末端をコードする塩基配列として共通する配列を見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は以下＜１＞〜＜１３＞を提供するものである。
＜１＞配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ。
＜２＞上記ペプチドが２６個以下のアミノ酸からなる請求項１に記載のＤＮＡ。
＜３＞配列表の配列番号１、２、３、または４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする＜１＞に記載のＤＮＡ。
＜４＞配列表の配列番号５で表される塩基配列を含む＜１＞または＜２＞に記載のＤＮＡ。
【０００８】
＜５＞配列表の配列番号５、６、７、または８で表される塩基配列からなる＜１＞に記載のＤＮＡ。
＜６＞配列表の配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ。
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をＣ末端に有する変異型タンパク質。
＜８＞＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をＣ末端に含む、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ。
【０００９】
＜９＞下記（Ａ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれる＜８＞に記載の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ：
（Ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｄ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｅ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｆ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｇ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ。
【００１０】
＜１０＞＜８＞または＜９＞に記載の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
＜１１＞配列表の配列番号１３、１４、１５、または１６で表される塩基配列からなる＜１０＞に記載の遺伝子。
＜１２＞＜１０＞または＜１１＞に記載の遺伝子を含むベクター。
＜１３＞＜１２＞に記載のベクターを含む形質転換体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡが提供される。このＤＮＡを用いて、タンパク質の発現量を増加させる機能を有するベクターを提供することができる。また、このＤＮＡを構造遺伝子の一部として導入することにより、この構造遺伝子にコードされる変異型タンパク質の発現量を増加させることができる。例えば、本発明により、高い薬剤耐性の形質転換体を与えるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ハイグロマイシンＢ高耐性コロニー（ｍｕｔ１〜ｍｕｔ２０）から回収されたプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌のハイグロマイシンＢ耐性試験結果を示す図である。
【図２】ハイグロマイシンＢ高耐性コロニー（ｍｕｔ１〜ｍｕｔ８、ｍｕｔ１０、ｍｕｔ１２、ｍｕｔ１８）から回収されたプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌のハイグロマイシンＢ耐性試験結果を示す図である。
【図３】ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌のｍＲＮＡ量を示す図である。
【図５】ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌のｍＲＮＡ量の経時変化を示す図である。
【図６】免疫ブロットによるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ検出（Ａ）とその量（Ｂ）を示す図である。
【図７】ペプチドタグ一部欠損型プラスミドを含む大腸菌のハイグロマイシンＢ耐性試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
［タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡ］
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードし、タンパク質の発現量を増加させる機能を有する。本発明のＤＮＡが発現系において、構造遺伝子の一部として導入されていることにより、上記の遺伝子を発現させて得られるタンパク質の量を増大させることができる。
後述の実施例で示すように、本発明のＤＮＡを導入することにより、構造遺伝子に基づくｍＲＮＡ量が増加することから、タンパク質発現の過程においてｍＲＮＡの安定性が増加していると考えられ、このことに由来してタンパク質の量が増大すると考えられる。
【００１５】
本明細書において、発現量の増加は、本発明のＤＮＡが導入されていない構造遺伝子でコードされるタンパク質の発現量と比較した増加であり、例えば、対応する天然型のタンパク質の発現量と比較した増加であればよい。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、発現系において、構造遺伝子の一部として導入されていればよい。本明細書において、「導入」は「挿入」または「付加」を意味する。特に、本発明のＤＮＡは、天然型のタンパク質をコードする塩基配列の下流にあり、かつ、翻訳される領域の塩基配列として存在していることが好ましい。本発明のＤＮＡは、さらに構造遺伝子の末端に導入されていることが好ましい。特に、発現するタンパク質のＣ末端のアミノ酸配列をコードするように導入されていることが好ましい。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、３０個以下のアミノ酸からなるペプチドをコードしていることが好ましく、２６個以下のアミノ酸からなるペプチドをコードしていることがより好ましい。特に、本発明のＤＮＡが、構造遺伝子の一部として導入される場合、当該構造遺伝子でコードされるタンパク質のＣ末端の１１〜３０個のアミノ酸配列をコードしていることが好ましく、１１〜２６個のアミノ酸配列をコードしていることがより好ましい。
【００１８】
本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号１、２、３、または４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。
具体的な塩基配列として、配列表の配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１、２、３、または４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡとしては、それぞれ具体的に配列表の配列番号５、６、７、または８で表される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
タンパク質の発現量を増加させる機能を有する配列表の配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも本発明の一態様である。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、その塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとＢＬＡＳＴ解析で９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡの取得方法については特に制限はなく、例えばホスホアミダイト法などにより合成してもよく、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造してもよい。
【００２１】
［タンパク質の製造］
本発明のＤＮＡは発現系において、タンパク質を高発現させるために用いることができる。
本発明のＤＮＡを用いたタンパク質の製造は、本発明のＤＮＡを挿入または付加した遺伝子を用いればよい。
【００２２】
（遺伝子の取得）
本発明のＤＮＡを用いたタンパク質の製造の際は、まず、タンパク質をコードする遺伝子を取得する。例えば天然型の遺伝子を大腸菌由来のｃＤＮＡライブラリーなどから取得すればよい。適当なプライマーを設計し、それらを用いて取得した遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行えばよい。遺伝子の一部の断片をＰＣＲ等により得た場合には、作製した断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望のタンパク質をコードする遺伝子を得ることもできる。
【００２３】
その後、上記のように得られる遺伝子に本発明のＤＮＡを挿入または付加することができる。挿入または付加は上記タンパク質をコードする遺伝子の下流側に行うことが好ましい。ＤＮＡを挿入または付加する方法としては、公知の方法をいずれも用いることができる。特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてもよく、制限酵素を利用してもよい。
【００２４】
（ベクター）
得られた遺伝子はベクターに挿入して増幅することができる。用いることができるベクターの種類は特に限定されず、宿主中で複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。
【００２５】
遺伝子をベクターに挿入するには、まず、精製された遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適宜末端を平滑化、脱リン酸化等した後、公知のベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などをとることができる。
【００２６】
ベクターは、プロモータが機能的に連結された発現ベクターであることが好ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。例えば、大腸菌で作動可能なプロモータとして、ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどを用いてもよい。
【００２７】
ベクターはターミネータを含むことが好ましい。ベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス  ＶＡ  ＲＮＡ  をコードするもの）のような要素を有していてもよい。その他、スプライシングシグナル、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）などを含むように調製することもできる。ベクターは宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよい。
【００２８】
ベクターはさらに選択マーカーを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンＢのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
ＤＮＡ、プロモータ、ならびに所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００２９】
プラスミドとしては、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pET21、pET28、pGEX-4T、pQE-30、pQE-60などの大腸菌宿主用プラスミド、pUB110、pTP5などの枯草菌用プラスミド、YEp13、YEp24、YCp50などの酵母宿主用プラスミド、pBI221、pBI121などの植物細胞宿主用プラスミドなどを用いてもよい。ファージDNAとしてはλファージなどが挙げられる。更に、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３０】
（形質転換体）
タンパク質をコードする遺伝子または組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
上記遺伝子またはベクターを導入する宿主細胞は、上記遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌細胞、および昆虫、植物、または動物の細胞などの高等真核細胞等が挙げられる。
【００３１】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３２】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３３】
他の真菌細胞の例としては、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞が挙げられる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００３４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００３５】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W. H. Freeman and Company）、ニューヨーク（New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３６】
植物細胞を宿主として用いる場合には、特開２００３−７９３７２号公報の段落００３４〜００３６の記載を参照することができる。
本発明において、宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。
【００３７】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得ればよい。この無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製品を得ることができる。
【００３８】
［本発明のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を含む変異型タンパク質］
本発明のＤＮＡを含むベクターまたは本発明のＤＮＡを含む遺伝子を利用して、所望のタンパク質を高い濃度で得ることができる。そのため、本発明のＤＮＡを用いてタンパク質を高い効率で生産できる。
得られるタンパク質は、本発明のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を含む変異型タンパク質である。本発明のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列は、変異型タンパク質のいずれの位置に含まれていてもよいが、末端に含まれることが好ましく、Ｃ末端に含まれることがさらに好ましい。
【００３９】
［変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ］
上記のタンパク質の製造方法で得られるタンパク質として、変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼが挙げられる。本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼは、本発明のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をＣ末端に含み、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性とは、ハイグロマイシンＢをリン酸化することにより、ハイグロマイシンＢの抗菌活性を失わせる活性を意味する。
【００４０】
本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼは、以下Ａ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれるものであればよい。
（Ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｄ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｅ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｆ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｇ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ；
（Ｈ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ活性を有する変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ。
【００４１】
配列番号９、１０、１１、１２で表されるアミノ酸配列それぞれの１位〜３４２位は、天然型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列において、Ｎ末端のメチオニンに隣接するＣ末側にグリシンが付加されて、Ｍｅｔ−がＭｅｔ−Ｇｌｙとなり、かつ、３１２位のアルギニンがシステインとなった配列に該当している。
【００４２】
本明細書において「１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００４３】
配列番号９、１０、１１、１２で表されるアミノ酸配列の１位〜３４２位において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列の好ましい例としては、３１２位のシステインがアルギニンに置換した配列、および２８７位のアラニンがバリンに置換した配列が挙げられる。
【００４４】
本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを作製する場合には、例えば天然型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの情報を利用すればよい。所望の変異を導入するための遺伝子の操作方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。
【００４５】
発現量を増加させる機能を有する本発明のＤＮＡでコードされるアミノ酸配列をコードする塩基配列は上述のように、挿入または付加すればよい。
得られる変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の例としては、配列表の配列番号１３、１４、１５、または１６で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００４６】
このように得られる遺伝子に基づき、タンパク質の製造として上述したように、変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを製造すればよい。
【００４７】
本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼは化学合成により製造してもよい。
【００４８】
［変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの用途］
本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの遺伝子は、この遺伝子により形質転換された細胞株をハイグロマイシンＢ耐性にすることができる。従って、ハイグロマイシンＢを添加した培地での培養では、上記遺伝子を有する細胞株のみが生育するため、本発明の変異型ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの遺伝子は、発現系において選択マーカーとして使用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例において、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをＨＰＴという。
【００５０】
１．高活性（高発現）ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの探索
（ａ）ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴの作製
ＨＰＴのｃＤＮＡ配列を鋳型ＤＮＡ（Template 1）とし、プライマー１（5'- ATATCCATGGGCAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC -3'）（配列番号１７）およびプライマー２（5'- ATATGGATCCCGTTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC -3'）（配列番号１８）を用いてＰＣＲ法によりＨＰＴ遺伝子を増幅した。以下の反応溶液２５μＬにて行った。
5 x PrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus)               10.0μＬ
dNTP Mixture(2.5 mM each)                      4.0μＬ
プライマー１(10μM)                            1.5μＬ
プライマー２(10μM)                            1.5μＬ
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(2.5 unit/μＬ)    1.0μＬ
Template 1                                      250 ng
滅菌蒸留水を加えて50 μＬに調製
【００５１】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。
（１）９８℃    ２分
（２）９８℃    １０秒
（３）５５℃    １５秒
（４）６８℃    １分
（５）６８℃    １０分
（６）  ４℃    保持
（２）〜（４）を３０サイクル行った。
【００５２】
ＰＣＲ増幅産物は制限酵素Nco IおよびBam HIにより消化し、DNA Ligation kit<Mightty Mix>(TAKARA)を用いて、ｐＥＴ２８ｂプラスミド（Novagen）のNco IおよびBam HIサイトに挿入して連結した。この連結したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ）を用いて大腸菌コンピテントセル（ＤＨ５α）を形質転換した。形質転換した大腸菌細胞に、５００μＬのＬＢ液体培地を加え、３７℃で、１時間培養した。培養後の大腸菌細胞を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて１２時間培養した。コロニーは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、０．１％のＬ−アラビノースを含むＬＢ液体培地で３７℃にて１６時間培養し、回収した大腸菌細胞からHiYield Plasmid Mini Kit (RBC Bioscience)を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
【００５３】
（ｂ）変異型ＨＰＴ遺伝子ライブラリーの作製
変異型ＨＰＴ遺伝子の作製にはGeneMorph II random Mutagenesis Kit (Agilent)を使用した。ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴを鋳型ＤＮＡ（Template 2）としてプライマー３（5'- CGCGAAATTAATACGACTCACTATA -3'）（配列番号１９）およびプライマー４（5'- TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG -3'）（配列番号２０）を用いて以下の反応溶液２５μＬを準備しＰＣＲ法によってＨＰＴ遺伝子を増幅した。
滅菌蒸留水                                    35μＬ
10 x Mutazyme II reaction buffer                5μＬ
40 mM dNTP mix (200μM each final)              1μＬ
プライマー３                                    1μＬ
プライマー４                                    1μＬ
Mutazyme II DNA polymerase (2.5 U/μＬ)         1μＬ
Template 2 (250ng/μＬ)                         5μＬ  
Total                                          50μＬ
【００５４】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。
（１）９５℃    ２分
（２）９５℃    １分
（３）５０℃    １分
（４）７２℃    １分３０秒
（５）７２℃    １０分
（６）  ４℃    保持
（２）〜（４）を３０サイクル行った。
【００５５】
前述の操作によって得たＰＣＲ増幅産物を制限酵素Xba IおよびBam HIにより消化し、DNA Ligation kit<Mightty Mix> (TAKARA)を用いてｐＥＴ２８ｂプラスミドのXba IおよびBam HIサイトに挿入して連結した。この連結したプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌コンピテントセル（ＤＨ５α）を形質転換した。形質転換した大腸菌細胞に、５００μＬのＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間培養した。培養後の大腸菌細胞を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて１２時間培養した。全ての大腸菌コロニーをＬＢ液体培地で回収し、QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡ集団を変異型ＨＰＴ遺伝子ライブラリーとして、これ以降の実験に用いた。
【００５６】
（ｃ）ハイグロマイシンＢ耐性クローンの選抜
前述の操作によって変異型ＨＰＴ遺伝子ライブラリーを大腸菌コンピテントセル（ＢＬ２１−ＡＩ）に形質転換した。形質転換した大腸菌細胞に５００μＬのＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間培養した。培養後の大腸菌細胞を２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて１２時間培養し、ハイグロマイシンＢ高耐性コロニー（ｍｕｔ１〜ｍｕｔ２０）を単離した。ハイグロマイシンＢ高耐性コロニーは２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、０．１％のＬ−アラビノースを含むＬＢ液体培地で３７℃にて１６時間培養し、回収した大腸菌細胞からHiYield Plasmid Mini Kit(RBC Bioscience)を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
【００５７】
（ｄ）ハイグロマイシンＢ耐性試験
各コロニー（ｍｕｔ１〜ｍｕｔ２０）由来の上記で回収した各プラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ２８ｂプラスミド（empty）、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ(HPT-c-His)、ならびにＨisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴが発現するようにｐＥＴ２８ｂを用いて別途調製したプラスミド (HPT)をそれぞれ保持する大腸菌を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その培養液をＯＤ600＝０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１になるようにＬＢ培地で希釈した。各希釈液  １０μＬを２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むあるいは含まない、ＬＢ固体培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラビノース  ０．１％）に滴下し、３７℃で１６時間培養した。結果を図１に示す。
【００５８】
さらに、ｍｕｔ１〜ｍｕｔ８、ｍｕｔ１０、ｍｕｔ１２、およびｍｕｔ１８由来のプラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ２８ｂプラスミド（empty）、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ(HPT-c-His)、ならびにＨisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴが発現するようにｐＥＴ２８ｂを用いて別途調製したプラスミド（HPT）をそれぞれ保持する大腸菌を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その培養液をＯＤ600＝０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１になるようにＬＢ培地で希釈した。各希釈液１０μＬを７５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むあるいは含まない、ＬＢ固体培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラビノース  ０．１％）、および１０００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むあるいは含まない、ＬＢ固体培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラビノース  ０．１％）に滴下し、３７℃で１６時間培養した。結果を図２に示す。図２より、ｍｕｔ８が最も高いハイグロマイシンＢ耐性を示していることがわかる。
【００５９】
（ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡ（mut 8）、ｐＥＴ２８ｂプラスミド（empty）、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ(HPT-c-His)、ならびにＨisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴが発現するようにｐＥＴ２８ｂを用いて別途調製したプラスミド(HPT)をそれぞれ保持する大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その後、Ｌ−アラビノースを終濃度０．１％になるように添加し、さらに３７℃で４時間培養した。その大腸菌の総タンパク質溶液を試料として、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。各レーンには１０μｇのタンパク質を供した。電気泳動後の１０％ポリアクリルアミドゲルはCoomassie Brilliant Blue 染色することでタンパク質を検出した。
結果を図３に示す。
Emptyで観測されていないバンド（＊）として、ｍｕｔ８において、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴで観測されたバンドよりも高分子量にバンドが確認された。
【００６０】
（ｆ）ｍＲＮＡ量
Real-time PCRを用いて以下の手順で、ｍＲＮＡ量を測定した。
Real-time PCRは、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)を用いた。また、Real-time PCRの解析は、LightCycler(登録商標)96 System(Roche)を用いて行った。
（ｆ-ｉ）  ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡ（mut 8）ならびにＨisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴが発現するようにｐＥＴ２８ｂを用いて別途調製したプラスミド(HPT)をそれぞれ保持する大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その後、Ｌ−アラビノースを終濃度０．１％になるように添加し、さらに３７℃で４時間培養した。その大腸菌を試料としてホットフェノール法によるTotal RNAの粗精製、Rneasy(登録商標) Mini Kit(Qiagen)およびRNase-Free DNase Set(Qiagen)による再精製を行った。さらに、PrimeScript RT Master Mix (TAKARA)によってcDNA を合成した。ＨＰＴ遺伝子の検出にはプライマー５（5'- ACATTGGGGAGTTTAGCGAGAG -3'）（配列番号２１）とプライマー６（5'- AGCGGGCAGTTCGGTTT -3'）（配列番号２２）また、NPTII遺伝子の検出にはプライマー７（5'- TCCCCGGGAAAACAGCA -3'）（配列番号２３）とプライマー８（5'- CAAAATCACTCGCATCAACCA -3'）（配列番号２４）を用いた。ｍＲＮＡ量はｐＥＴ２８ｂに含まれるNPTII遺伝子対応のｍＲＮＡ量に基づいて標準化した。結果を図４に示す。
図４から、ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡからは、Ｈisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴを発現するプラスミドからと比較して、約２倍のｍＲＮＡが転写されていることが分かる。
【００６１】
（ｆ-ｉｉ）ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡおよびｐＥＴ２８ｂ由来のＨｉｓタグの付かないＨＰＴ（ＨＰＴ）をそれぞれ保持する大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その後、Ｌ−アラビノースを終濃度０．１％になるように添加し、さらに３７℃で４時間培養した。Ｌ−アラビノース添加後、０、１２、３、４時間後の各大腸菌を試料としてホットフェノール法によるＴｏｔａｌ  ＲＮＡの粗精製、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）  およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）による再精製を行った。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＴＡＫＡＲＡ）によって  ｃＤＮＡ  を合成した。ＨＰＴ遺伝子の検出にはプライマー５（配列番号２１）とプライマー６（配列番号２２）また、ＮＰＴＩＩ遺伝子の検出にはプライマー７（配列番号２３）とプライマー８（配列番号２４）を用いた。ｍＲＮＡ量はｐＥＴ２８ｂにコードされるＮＰＴＩＩ遺伝子対応のｍＲＮＡ量に基づいて標準化した。結果を図５に示す。
【００６２】
図５から、アラビノース添加から１時間後において、ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡからは、天然型のＨＰＴを発現するプラスミドからと比較して、約０．５倍のｍＲＮＡが転写されているが、４時間後では約３倍のｍＲＮＡが転写されていることが分かる。ｍＲＮＡの安定性の増加により大腸菌内でｍＲＮＡが蓄積しやすくなり、時間の経過とともに、ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ量が相対的に増加したと考えられる。
【００６３】
（ｇ）免疫ブロット
さらに、免疫ブロットを行った。
ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡならびにＨisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴが発現するようにｐＥＴ２８ｂを用いて別途調製したプラスミド(HPT)をそれぞれ保持する大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その後、Ｌ−アラビノースを終濃度０．１％になるように添加し、さらに３７℃で４時間培養した。その大腸菌の総タンパク質溶液を試料として、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。各レーンには２．５μｇのタンパク質を供した。電気泳動後のゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質を転写した。ＨＰＴタンパク質の検出には、一次抗体として、抗ＨＰＴ抗体（Ａｎｔｉ−ＨＰＴ：  ＭＢＳ）を１０，０００倍希釈で、二次抗体として、抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ：  ＭＢＬ）を１０，０００倍希釈で使用した。タンパク質の検出にはECL-select(GE-Healthcare）、冷却ＣＣＤカメラ（Light Capture: Gentaur Molecular Products）を使用した。また、定量のための画像解析にはImage J（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いた。
結果を図６（Ａ）、（Ｂ）に示す。
図６（Ａ）、（Ｂ）から、ｍｕｔ８由来のプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌においては、Ｈisタグおよびリンカーが付かないＨＰＴを発現するプラスミドを保持する大腸菌と比較して、１．５倍程度の高濃度でＨＰＴが発現していることがわかる。
【００６４】
２．高発現ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの配列
ｍｕｔ１〜ｍｕｔ２０由来のそれぞれのプラスミドＤＮＡ溶液をシークエンス反応に用いた。以下の組成の反応溶液１０μＬを準備し、シークエンス反応を行った。
5 x sequence buffer                     1.5μＬ
プライマー (3.2μM)                     1.0μＬ
BigDye                                  1.0μＬ
プラスミドDNA                            300 ng
水を加えて10μＬに調製
【００６５】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。
（１）９６℃    １分
（２）９５℃    １０秒
（３）５０℃    ５秒
（４）６０℃    ４分
（５）  ４℃    保持
（２）〜（４）を３０サイクル行った。
【００６６】
3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いた解析によって、プラスミドＤＮＡに含まれる塩基配列を同定した。
その結果、ｍｕｔ１〜ｍｕｔ８、ｍｕｔ１０〜ｍｕｔ１３、ｍｕｔ１６、およびｍｕｔ１７由来のプラスミドＤＮＡにおいては、天然型ＨＰＴをコードする塩基配列のＨＰＴの下流側に２６アミノ酸からなるペプチドタグアミノ酸配列（配列番号４）をコードする塩基配列が確認された。この配列は、ｐＥＴ２８ｂ由来のＨisタグおよびリンカーをコードする塩基配列において、２塩基が欠失した配列に該当していた。さらに、ｍｕｔ４においては天然型ＨＰＴの２８６位（２８７位）のアラニンのバリンへの置換に該当する変異があり、ｍｕｔ８（配列番号１３）においては天然型ＨＰＴの３１１位（３１２位）のアルギニンのシステインへの置換に該当する変異が見られた。（括弧内のアミノ酸の位置は、探索過程でNco I 制限酵素部位を設けるため、天然型ＨＰＴのN末端対応部分のATGのあとにGGCが付加されているために1位ずれた後の位置である。）
【００６７】
３．タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡの確認
（ａ）ペプチドタグ一部欠損型プラスミドの作製
最も高いハイグロマイシンＢ耐性を示したｍｕｔ８から回収されたプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８）に基づき、ペプチドタグ一部欠損型プラスミドを作製した。上記２６アミノ酸からなるペプチドタグを有する変異ＨＰＴに対し、Ｃ末端が５アミノ酸欠損したｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−２１ＡＡ、Ｃ末端が１０アミノ酸欠損したｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−１６ＡＡ、Ｃ末端が１５アミノ酸欠損したｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−１１ＡＡを調製した。
【００６８】
ペプチドタグ一部欠損型プラスミドＤＮＡの作製には、Dpn Iを介した部位特異的変異導入法を用いた。ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８を鋳型ＤＮＡ（Template 3）として以下の反応溶液２５μＬを準備しＰＣＲ法によりペプチドタグ一部欠損型プラスミドを増幅した。ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−２１ＡＡの増幅にはプライマー９（5'- TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCT -3'（配列番号２５））およびプライマー１０（5'- GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG -3'（配列番号２６））、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−１６ＡＡの増幅にはプライマー９およびプライマー１１（5'- CCTCAGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTGATC -3'（配列番号２７））、ｐＥＴ２８ｂ−ＨＰＴ−ｍｕｔ８−１１ＡＡの増幅にはプライマー９およびプライマー１２（5'- CCTCATGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC -3'（配列番号２８）を使用した。
10 x PCR buffer for KOD -Plus- Neo        2.5μＬ
2 mM dNTPs                                2.5μＬ
25 mM MgSO4                               1.5μＬ
プライマー９(10μM)                      0.75μＬ
プライマー１０、１１、または１２(10μM)  0.75μＬ
Template 3                                  10 ng
滅菌蒸留水を加えて25μＬに調製
【００６９】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。
（１）９４℃    ２分
（２）９８℃    １０秒
（３）５５℃    ３０秒
（４）６８℃    ５分
（５）  ４℃    保持
（２）〜（４）を３０サイクル行った。
【００７０】
ＰＣＲ増幅産物はエタノール沈殿により精製後、制限酵素Dpn Iにより鋳型ＤＮＡ（Template 3）を消化し、DNA Ligation kit<Mightty Mix> (TAKARA)を用いてセルフライゲーションにより環状化した。（１）と同様の方法により、環状化したプラスミドＤＮＡを大腸菌コンピテントセル（ＤＨ５α）に形質転換し、目的のＤＮＡ配列を含むプラスミドＤＮＡを得た。
【００７１】
（ｂ）ハイグロマイシンＢ耐性試験
得られたペプチドタグ一部欠損型プラスミドを保持する大腸菌を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で液体培養した。その培養液をＯＤ600＝０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１になるようにＬＢ培地で希釈し、各希釈液  １０μＬを２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むあるいは含まない、ＬＢ固体培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラビノース  ０．１％）に滴下し、３７℃で１６時間培養した。結果を図７に示す。
【００７２】
図７よりわかるように、ペプチドタグ一部欠損型プラスミドを保持するいずれの大腸菌も高ハイグロマイシンＢ耐性を示していた。すなわち、１１アミノ酸からなるペプチドタグを有する変異ＨＰＴ、１６アミノ酸からなるペプチドタグを有する変異ＨＰＴ、および２１アミノ酸からなるペプチドタグを有する変異ＨＰＴのいずれを発現した大腸菌も、２６アミノ酸からなるペプチドタグを有する変異ＨＰＴと同等、またはそれ以上の薬剤耐性を示した。
【００７３】
４．タンパク質の発現量を増加させる機能を有するＤＮＡの応用
配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列をＣ末端側に有する変異型タンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ）について設計し、上記変異ＨＰＴと同様に細胞中での発現量を調べたところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて高い発現量を示すバンドが確認された。
【図１】
2017169564.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2017169564.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【配列表】
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