(57)【要約】【課題】ろ過圧の上昇を抑制可能な、イオン交換膜クロマトグラフィーによるタンパク質の精製方法を提供する。【解決手段】目的タンパク質と、目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、目的タンパク質を精製する方法であって、ａ）珪藻土又は活性炭のいずれかを少なくとも含有するデプスフィルターにより溶液をろ過する前ろ過工程と、ｂ）細孔径が０．１μｍ以上５．０μｍ以下であるアニオン交換膜により溶液をろ過する精製工程と、ｃ）精製された目的タンパク質を回収する回収工程と、を含み、ｂ）工程の前に、ａ）工程が実施される、タンパク質の精製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質と、前記目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、前記目的タンパク質を精製する方法であって、
ａ）珪藻土又は活性炭のいずれかを少なくとも含有するデプスフィルターにより前記溶液をろ過する前ろ過工程と、
ｂ）細孔径が０．１μｍ以上５．０μｍ以下であるアニオン交換膜により前記溶液をろ過する精製工程と、
ｃ）精製された前記目的タンパク質を回収する回収工程と、
を含み、
ｂ）工程の前に、ａ）工程が実施される、タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記アニオン交換膜が、グラフト高分子鎖を含有する、請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記アニオン交換膜が、弱アニオン交換基を有する、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項４】
前記アニオン交換膜が、中空糸膜である、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項５】
前記ａ）工程により、ＤＮＡの７０％以上が除去される、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記ａ）工程により、ＤＮＡの９０％以上が除去される、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記目的タンパク質が、Ｆｃ含有タンパク質である、請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項８】
前記不純物が、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、脱離プロテインＡの少なくとも１つを含む、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記目的タンパク質と、前記目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液が、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養液を精製した溶液である、請求項１から８のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精製技術に関し、特にタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び医療などの分野において、様々な有用タンパク質を効率的に精製する方法が重要な技術として認識されている。即ち、タンパク質はその性質によって特定の機能を示すため、目的とするタンパク質を単離し、精製する技術が各分野において求められている。一般に有用タンパク質は、ヒトを含む動物由来のものとして抽出される場合と、目的とするタンパク質の遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した大腸菌、あるいは培養細胞により発現させて得られる場合と、に大別される。いずれの場合においても、目的とするタンパク質を単離、精製するためには、複数の工程に渡る複雑なプロセスを用いる必要がある。
【０００３】
動物由来の有用タンパク質として、代表的なものに、動物由来の細胞株を用いる培養細胞によって産生されるモノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などの抗体タンパク質、さらには、ヒトから採血された血液から得られる、フィブリノゲン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、免疫グロブリン、血清アルブミン、トロンビン、アンチトロンビン、及びトランスフェリンなどの、各種の血漿分画製剤がある。これら、動物細胞培養液から得られる抗体タンパク質は、遠心分離、及び精密ろ過膜による除濁の後に、クロマトグラフィー工程によって精製される（例えば、非特許文献１参照。）。ここで、クロマトグラフィー工程は、目的とするタンパク質を、吸着して回収する工程（バインド・アンド・エリュート）と、不純物となるタンパク質などを吸着して、目的タンパク質を透過して回収する工程（フロースルー）と、に大別される。
【０００４】
近年、タンパク質製造の大規模化、効率化の観点で、高速処理に適した膜クロマトグラフィーが注目されている。膜クロマトグラフィーは、従来のクロマトビーズ充填カラムに比べて１０倍以上の処理スピードで、目的タンパク質を処理することができる（例えば、非特許文献２）。タンパク質の工業的な精製において、膜クロマトグラフィー、特に、イオン交換膜クロマトグラフィーは、処理スピードの速さが重視されるフロースルー工程で採用が進んでいる。
【０００５】
膜クロマトグラフィーの中でも、グラフト高分子鎖を有する膜は、高分子量の不純物を大量に吸着しやすいことが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。タンパク質を産生する細胞や大腸菌から得られた精製中間体は、目的タンパク質以外に、高分子量の不純物（夾雑物）を含むため、グラフト高分子鎖を有するイオン交換膜を、工業規模のタンパク質精製において採用する試みが検討されている。
【０００６】
グラフト高分子鎖を有するイオン交換膜を、タンパク質の精製に適応することで、高分子量の不純物（夾雑物）を効率的に除くことが可能となるが、不純物が膜の流路を塞ぐことにより、場合によっては、ろ過圧力の上昇が観察される場合がある。工業的なタンパク質精製における膜クロマトグラフィー工程において、通液時の圧上昇は、膜の破れ、配管や接続部からの漏れ等の重大なリスクを伴う。また、通液時の圧上昇により、目的とする処理量に達する前に、イオン交換膜の交換や再生をする必要があり、結果的に、精製コストを不本意に悪化させる場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＳＣＡＬＥ  ＢＩＯＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ”、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ２００７  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、ＵＳ．
【非特許文献２】Ｎ．Ｋｕｂｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  ｐｏｒｏｕｓ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｇｅｌ  ｂｅａｄ−ｐａｃｋｅｄ  ｂｅｄ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１７（１９９６）１３５−１４２
【非特許文献３】Ｉ．Ｋｏｇｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈａｉｎｓ  Ｇｒａｆｔｅｄ  ｏｎｔｏ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｈｏｌｌｏｗ−Ｆｉｂｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０００、１６、４５６−４６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に示したように、膜によるクロマトグラフィー工程は、高速で不純物を除去して目的物を精製する目的に有用である。しかしながら、細胞培養液などは高分子量の不純物を含むため、高分子量不純物が膜の流路を塞ぎ、ろ過圧力の上昇を引き起こす懸念がある。
【０００９】
かかる状況に鑑み、本発明は、ろ過圧の上昇を抑制可能な、イオン交換膜クロマトグラフィーによるタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン交換膜クロマトグラフィー工程のプレフィルター工程として、特定の構成要件を満たすデプスフィルターによる前ろ過工程を実施することで、アニオン交換膜クロマトグラフィー工程での、ろ過圧力上昇を、有意に低減できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の態様は、目的タンパク質と、目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、目的タンパク質を精製する方法であって、ａ）珪藻土又は活性炭のいずれかを少なくとも含有するデプスフィルターにより溶液をろ過する前ろ過工程と、ｂ）細孔径が０．１μｍ以上５．０μｍ以下であるアニオン交換膜により溶液をろ過する精製工程と、ｃ）精製された目的タンパク質を回収する回収工程と、を含み、ｂ）工程の前に、ａ）工程が実施される、タンパク質の精製方法であること、を要旨とする。
【００１２】
上記の目的タンパク質を精製する方法において、アニオン交換膜が、グラフト高分子鎖を含有してもよい。アニオン交換膜が、弱アニオン交換基を有してもよい。アニオン交換膜が、中空糸膜であってもよい。
【００１３】
上記の目的タンパク質を精製する方法において、ａ）工程により、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の７０％以上が除去されてもよい。あるいは、ａ）工程により、ＤＮＡの９０％以上が除去されてもよい。
【００１４】
上記の目的タンパク質を精製する方法において、目的タンパク質が、Ｆｃ含有タンパク質であってもよい。
【００１５】
上記の目的タンパク質を精製する方法において、不純物が、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、脱離プロテインＡの少なくとも１つを含んでいてもよい。
【００１６】
上記の目的タンパク質を精製する方法において、目的タンパク質と、目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液が、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養液を精製した溶液であってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の、アニオン交換膜を用いた精製方法によれば、動物細胞培養液などに含まれる、高分子量成分を含む、広い分子量範囲の不純物タンパク質を有効に除去することができ、さらに、高分子量不純物による膜の閉塞による圧上昇を低減することができ、有用タンパク質の工業的な精製を、迅速に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試験液１を実施例に係るデプスフィルターで前ろ過後、アニオン交換膜に通液した時の膜間差圧（ＴＭＰ）の変化を示すグラフである。
【図２】比較例に係る膜間差圧（ＴＭＰ）の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することが可能である。
【００２０】
本実施の形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質と、目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、目的タンパク質を精製する方法であって、ａ）珪藻土又は活性炭のいずれかを少なくとも含有するデプスフィルターにより溶液をろ過する前ろ過工程と、ｂ）細孔径が０．１μｍ以上５．０μｍ以下であるアニオン交換膜により溶液をろ過する精製工程と、ｃ）アニオン交換膜から目的タンパク質を回収する回収工程と、を含み、ｂ）工程の前に、ａ）工程が実施され、精製工程における圧上昇が、工業的に許容できるレベルまで低減される、タンパク質の精製方法である。
【００２１】
本実施の形態で用いられるデプスフィルターは、珪藻土、及び（又は）活性炭を含有していれば、いかなる形態でもよい。一般的に市販されているデプスフィルターとしては、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（商標）ＡＰシリーズ、ＳＰシリーズ、ＬＡシリーズ、ＺＡシリーズ、デリピットシリーズ、ＶＲシリーズ、マキシマイザーシリーズ、ＥＸＴシリーズ、ＳＬＰシリーズ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（商標）ＤＥシリーズ、ＣＥシリーズ、Ａ１ＨＣシリーズ、Ｘ０ＨＣシリーズ、Ｂ１ＨＣシリーズ、Ｃ０ＨＣシリーズ、Ｄ０ＨＣシリーズ、及びＰａｌｌ製ＳＵＰＲＡｃａｐシリーズなどが挙げられる。この中でも、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＺＡシリーズ、デリピットシリーズ、ＳＬＰシリーズ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（商標）ＤＥシリーズ、Ａ１ＨＣシリーズ、そしてＳＵＰＲＡｃａｐシリーズは、次のイオン交換膜クロマトグラフィー工程での、ろ過圧力上昇を、優位に低減できるという点で好ましく、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＺＡシリーズ、ＳＬＰシリーズ、そしてＳＵＰＲＡｃａｐシリーズが最も好ましい。
【００２２】
本実施の形態で用いられるアニオン交換膜は、アニオン交換基、及びグラフトを有した多孔膜状のクロマトグラフィー担体である。一般に市販されているアニオン交換膜としては、旭化成メディカル製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ、Ｐａｌｌ製ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、Ｎａｔｒｉｘ製ａｄｓｅｐｔＱ、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどが挙げられる。
【００２３】
アニオン交換膜の細孔径は、０．１μｍ以上５．０μｍ以下、好ましくは０．２μｍ以上１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．２μｍ以上０．６μｍ以下である。細孔径が大きいと、不純物の除去性が低い傾向となることから、細孔径は、５．０μ以下とすることが好ましい。細孔径を小さくすると、不純物の除去性を高めることができる。一方で、細孔径が小さくなると、従来は溶液を通液する際の圧力が高くなる傾向があるが、本実施の形態では、デプスフィルターの前ろ過工程組み合わせることにより、圧上昇を抑制することができる。
【００２４】
アニオン交換膜は、アニオン交換基を有する。アニオン交換基は例えば３級アミンである。アニオン交換膜の、体積あたりのリガンド密度に対応する、イオン交換容量の値は、０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ以上１．０ｍｍｏｌ／ｍＬ以下が好ましく、より好ましくは、０．４ｍｍｏｌ／ｍＬ以上０．８ｍｍｏｌ／ｍＬ以下である。イオン交換容量が高いほど、リガンド密度が高いため、高分子量タンパク質の吸着に有利であるが、高すぎると、高分子量タンパク質のアニオン交換膜のグラフト鎖への進入が阻害され、吸着量が飽和する傾向にある。
【００２５】
弱アニオン交換膜は、弱アニオン交換基として１〜３級アミノ基を有し、強アニオン交換膜は、強アニオン交換基として４級アミノ基を有する。強アニオン交換膜は、溶液の水素イオン指数（ｐＨ）条件に対する適用範囲が広く、弱アニオン交換膜は、溶液の電気伝導度に対する適用範囲が広いといった特徴がある。タンパク質の精製は、一般的に、中性のｐＨ領域で実施されるため、溶液の電気伝導度に対する適用範囲が広いといった特徴を有する、弱アニオン交換膜が好適に用いられる。３級アミノ基であるジエチルアミノ基を有する弱アニオン交換膜は、特に好適に用いられる。
【００２６】
本実施の形態の方法に用いられるアニオン交換膜は、グラフト高分子鎖を有することが好ましい。本実施の形態の方法に用いられるアニオン交換膜は、既存の膜（基材膜）に、機能を有する高分子鎖（グラフト高分子鎖）を導入（グラフト）することにより、高分子量の不純物（夾雑物）を効率的に除くことが可能となる。基材膜としては、中空糸膜等が使用可能である。
【００２７】
アニオン交換膜に溶液を通液する際の通液速度は、精製処理の効率化のためにより速いことが好ましい。通常のビーズカラムにタンパク質を吸着させる場合、通液速度が速くなると、吸着性能が低下する。特に１分間当たりのカラム体積の５倍以上の体積の溶液を供給する速度で通液すると、タンパク質の吸着性能は著しく低下する。これに対し、アニオン交換膜はタンパク質の吸着性能は通液速度に殆ど依存しない。したがって、カラムを用いた場合に比べて明確に処理効率が向上するために、アニオン交換膜に溶液を通液する速度は、１分間当たりアニオン交換膜の体積の５倍以上の体積の溶液を供給することに相当する流速、即ち、５ＭＶ／分以上が可能であり、より好ましくは１０ＭＶ／分以上である。流速の上限は、用いる溶液の粘度及び濁度などの性状に依存するが、通液の際の膜間差圧を検知することにより、容易に設定することができる。ここで、溶液とは、タンパク質溶液、並びにアニオン交換膜の平衡化、洗浄及びタンパク質の溶出に用いる塩溶液のことを指す。
【００２８】
アニオン交換膜に通液するタンパク質溶液のｐＨは、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の不純物タンパク質を膜に吸着させるため、不純物タンパク質の等電点（ｐＩ）より、高い値に調整する。ｐＨを不純物タンパク質のｐＩより高くすることにより、不純物タンパク質はアニオン交換膜に吸着される。タンパク質溶液が塩を含む場合、吸着が有効になされるためには、溶液のｐＨは不純物タンパク質のｐＩより、十分に高い値であることが好ましい。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは吸着される不純物タンパク質のｐＩよりも、１以上高い値であることが好ましい。
【００２９】
また、アニオン交換膜に通液するタンパク質溶液のｐＨは、目的タンパク質を膜に吸着させる場合には、目的タンパク質のｐＩより、高い値に調整する。ｐＨを目的タンパク質のｐＩより高くすることにより、目的タンパク質はアニオン交換膜に吸着される。タンパク質溶液が塩を含む場合、吸着が有効になされるためには、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより、十分に高い値であることが好ましい。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは吸着される目的タンパク質のｐＩよりも、１以上高い値であることが好ましい。
【００３０】
目的タンパク質を含む溶液をアニオン交換膜に通液し、透過液として精製されたタンパク質を回収する場合には、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより低い値であることが好ましいが、溶液が塩を含む場合には、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより高い値であることも可能である。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは吸着される目的タンパク質のｐＩ（ｐＩｂ）に対して、ｐＩｂ＋１より低く調整されれば、ｐＩの値より高いｐＨであっても、目的タンパク質を透過液として回収することができる。
【００３１】
アニオン交換膜に吸着した目的タンパク質を溶出、回収する場合、塩を含む溶液、又は吸着されたタンパク質のｐＩ値よりもｐＨを低く調整した溶液を、溶出液として用いる。塩濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌ以上２．０ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、より好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である。塩濃度が低すぎると、十分な溶出が得られない傾向にあり、塩濃度が高すぎると、目的タンパク質溶液の脱塩に負荷がかかる傾向にある。ｐＨを調整した溶液のｐＨは、塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の場合に、目的タンパク質のｐＩより低い値に調整することが好ましく、その範囲において具体的な値は目的タンパク質の種類に依存する。
【００３２】
目的タンパク質を溶出、回収する場合の効率を示す、膜体積あたりの回収量は、精製処理が迅速かつ効率的に実施されるために、１０ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上である。膜体積あたりの回収量は、用いるアニオン交換膜の目的とするタンパク質の吸着容量及び供給量によって異なるが、これらの値が大きいほど大きくなる。したがって、目的とする高分子量タンパク質の吸着容量の大きなアニオン交換膜が用いられる。
【００３３】
本実施の形態の目的タンパク質は特に限定されないが、血漿分画製剤として回収される、有用なタンパク質である免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、フィブリノゲン、大腸菌あるいは細胞培養によって得られる酵素、並びに動物あるいは植物の組織から抽出される、リコンビナントタンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、及びモノクローナル抗体等の有用タンパク質が挙げられ、本実施の形態に係る精製方法は、これらのタンパク質の精製に有効である。
【００３４】
アニオン交換膜によって除去される高分子量不純物の種類は特に限定されないが、動物細胞の培養により生産された目的タンパク質を含む精製中間体を精製する場合、目的タンパク質の凝集体、宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、脂質、及びウイルス等が挙げられる。動物細胞により生産された目的タンパク質が、Ｆｃタンパク質である場合、その粗精製には、プロテインＡクロマトグラフィーが使用される。プロテインＡクロマトグラフィーから脱離した、脱離プロテインＡも、アニオン交換膜によって除去される高分子量不純物となりうる。
【００３５】
また、アニオン交換膜に吸着する不純物は、溶出条件を制御することによって除去することができる。例えば、目的タンパク質ではない低分子量の不純物タンパク質は、一般に高分子量タンパク質を溶出するための溶液の塩濃度より低い塩濃度の溶液で溶出される傾向にある。そのため、例えば、予め０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の低塩濃度の溶出液で低分子量タンパク質を溶出し、次いで０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の高塩濃度の溶出液で精製された目的タンパク質を溶出し、回収する。
【００３６】
目的タンパク質と、目的タンパク質以外の不純物と、を含有する溶液の具体例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養液を精製した溶液であるが、これに限定されない。
【００３７】
本実施の形態に係る目的タンパク質を精製する方法において、ａ）工程により、ＤＮＡの例えば７０％以上、好ましくは９０％以上が除去される。
【００３８】
以下、実施例及び比較例（本明細書中において、単に「実施例等」ともいう。）に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本実施の形態の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【実施例１】
【００３９】
１）細胞培養液の調整
抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１１５ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞（リコンビナントＣＨＯ細胞）は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
【００４０】
２）不純物含有液中の不純物濃度測定
ＨＣＰ濃度は、市販のＨＣＰ定量キット（Ｃｙｇｎｕｓ製Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を用いて定量した。ＤＮＡ濃度を、市販の定量装置Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製Ｑｕｂｉｔ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、及び市販の定量キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製Ｑｕｂｉｔ  ｄｓ  ＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）で測定した。
【００４１】
３）アニオン交換膜への不純物含有液通液試験（圧上昇試験）
上記、培養上澄を凍結融解し、０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過したろ液を、圧上昇試験の試験液１として用いた。まず、デプスフィルターとして、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ９０ＺＡ（膜面積２５ｃｍ2）を、ＧＥヘルスケア製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒのカラムポートに取り付け、取扱説明書に記載された方法でフラッシングした後、不純物含有液をデプスフィルター１ｃｍ2あたり６ｍＬ通液し、ろ液を回収した（前ろ過工程）。上記操作を、繰り返し実施し、次のアニオン交換膜による通液試験に必要な量の試験液を取得した。試験液に含まれるＤＮＡを測定したところ、前ろ過工程前のＤＮＡは４５００ｎｇ／ｍＬであったが、前ろ過工程後は３１０ｎｇ／ｍＬであった。
次に、グラフト鎖を有し、アニオン交換基として３級アミンを有する多孔膜状のアニオン交換膜として、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  （ＱＳＤ）  ０．６ｍＬ  （細孔径０．２−０．３μｍ、イオン交換容量０．５５−０．６ｍｍｏｌ／ｍＬ）を、ＧＥヘルスケア製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒのカラムポートに取り付け、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を５ＭＶ／分の流速で５０ＭＶ程度通液し、アニオン交換膜（ＱＳＤ）を平衡化した。次いで、上記不純物含有液６００ｍＬ（１０００ＭＶ相当）を、５ＭＶ／分の流速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液した（通液工程）。通液時のろ過圧力（膜間差圧ＴＭＰ）は、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒの圧力計の表示圧から、モジュールを除いた、配管圧力損出を差し引いた値を用いた。
【００４２】
４）結果
アニオン交換膜（ＱＳＤ）に試験液を通液した時のろ過圧力（ＴＭＰ）を、図１にプロットした。１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）通液しても、ろ過圧力の上昇は１００ｋＰａ未満であった。
【実施例２】
【００４３】
デプスフィルターとして、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ５５ＳＬＰ（膜面積２５ｃｍ2）を用いた以外、実施例と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。デプスフィルターによる前ろ過後の試験液に含まれるＤＮＡを測定したところ、１３０ｎｇ／ｍＬであった。実施例１と同様に、１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、図１に示すように、ろ過圧力の上昇は１００ｋＰａ未満であった。
【実施例３】
【００４４】
デプスフィルターとして、Ｐａｌｌ製ＳＵＰＬＡ  ｃａｐ  ＨＰ  ＰＤＤ１グレード（膜面積２６ｃｍ2）を用いた以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。実施例１と同様に、１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、図１に示すように、ろ過圧力の上昇は１００ｋＰａ未満であった。
【実施例４】
【００４５】
デプスフィルターとして、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  デリピット（膜面積２５ｃｍ2）を用いた以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、ろ過圧力の上昇は、図１に示すように、３００ｋＰａ未満であった。
【実施例５】
【００４６】
デプスフィルターとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（商標）Ａ１ＨＣ（膜面積２３ｃｍ2）を用いた以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、ろ過圧力の上昇は、図１に示すように、３００ｋＰａ未満であった。
【実施例６】
【００４７】
１）プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅを充填したもの）に、実施例１で得られた培養上澄を２Ｌ添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））２０ｍＬを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を２４０ｍＬ通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。
【００４８】
２）圧上昇試験
プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製工程で取得したＡＥ６Ｆ４抗体を含むプロテインＡクロマトグラフィー溶出液をプールし、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３．５に調整後、室温で１時間放置し、低ｐＨ処理を行った。所定時間経過後、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓで中和し、その後、市販のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、３０Ｋ）で、２０ｍＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にバッファー交換した液を試験液２として用い、実施例１に従い、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ９０ＺＡ（膜面積２５ｃｍ2）で前ろ過を実施した後、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。試験方法は、実施例１に準じた。その結果、１０００ＭＶの試験液２を、５ＭＶ／分という高速で通液しても、ろ過圧力の上昇は、１００ｋＰａ未満であった。
【実施例７】
【００４９】
デプスフィルターとして、３Ｍ製Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ５５ＳＬＰ（膜面積２５ｃｍ2）を用いた以外、実施例６と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。実施例１と同様に、１０００ＭＶの試験液２を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、ろ過圧力の上昇は１００ｋＰａ未満であった。
【実施例８】
【００５０】
デプスフィルターとして、Ｐａｌｌ製ＳＵＰＬＡ  ｃａｐ  ＨＰ  ＰＤＤ１グレード（膜面積２６ｃｍ2）を用いた以外、実施例６と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。実施例１と同様に、不純物含有液１０００ＭＶを、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液しても、ろ過圧力の上昇は１００ｋＰａ未満であった。
【００５１】
［比較例１］
デプスフィルターを用いない以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。なお、デプスフィルター以外のプレフィルターも用いなかった。約１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液したところ、図２に示すように、ろ過圧力が上昇し、３００ｋＰａを超えたため、通液試験を中止した。
［比較例２］
プレフィルターとして、ＡＵＴＯＦＩＬ（商標）０．１μｍ（膜面積６４ｃｍ2）を用いた以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。約１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液したところ、図２に示すように、ろ過圧力が上昇し、３００ｋＰａを超えたため、通液試験を中止した。
【００５２】
［比較例３］
プレフィルターとして、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉｐａｋ（商標）２０、０．１μｍ（膜面積１００ｃｍ2）を用いた以外、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜（ＱＳＤ）のろ過圧力（ＴＭＰ）を測定した。約１０００ＭＶの試験液１を、５ＭＶ／分という高速でアニオン交換膜（ＱＳＤ）に通液したところ、ろ過圧力が上昇し、３００ｋＰａを超えたため、通液試験を中止した。
【図１】
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【図２】
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