(57)【要約】      （修正有）【課題】コマモナス・テストステロニYU14-111株が産生する野生型ポリ塩化ビフェニル類分解酵素の工業的な生産性を、組換え大腸菌による発現系を用いて向上させる。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は特定な配列のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有しかつビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質であって、大腸菌で発現させたときに、コマモナス・テストステロニ由来の野生型ポリ塩化ビフェニル類分解酵素よりも発現量が増加するタンパク質。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有しかつビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列の7〜1426番目の部分からなるDNA、又は当該部分の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有しかつビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットをコードするDNA。
【請求項３】
前記ビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットのＮ末端から150番目までのアミノ酸配列をコードする翻訳領域が、大腸菌においてコドン最適化されている請求項２に記載のDNA。
【請求項４】
前記Ｎ末端から150番目までのアミノ酸配列に含まれる１又は複数のプロリン残基のコドンが、大腸菌におけるプロリンのレアコドンを含まないように改変されている請求項３に記載のDNA。
【請求項５】
前記Ｎ末端から150番目までのアミノ酸配列に含まれる少なくとも１つのイソロイシン残基のコドンが、大腸菌におけるイソロイシンのレアコドンを含まないように改変されている請求項３又は４に記載のDNA。
【請求項６】
請求項２〜５いずれか一項に記載のDNAと、それに機能的に連結された発現調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項７】
配列番号１又は３に示す塩基配列からなるDNAと、それに機能的に連結された発現調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の発現ベクターを含む組換え大腸菌。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え大腸菌の培養物を含む、ポリ塩化ビフェニル類を分解するための微生物触媒製剤。
【請求項１０】
前記組換え大腸菌の培養物として、ポリ塩化ビフェニル類に対する基質特異性の異なる少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を含む、請求項９に記載の微生物触媒製剤。
【請求項１１】
請求項８に記載の組換え大腸菌を培養し、培養菌体内でビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を発現させることを含む、ポリ塩化ビフェニル類を分解するための微生物触媒製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたビフェニル-2,3-ジオキシゲナーゼタンパク質、それをコードするDNA、当該DNAとそれに機能的に連結された発現調節配列とを含む発現ベクター、その発現ベクターを含む組換え大腸菌、及び当該組み換え大腸菌を培養して得られるポリ塩化ビフェニル類を分解するための微生物触媒製剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ塩化ビフェニル類（以下、「PCBs」という。）は生体毒性や環境汚染で深刻な原因を生む、難分解性の有機塩素化合物の一つである。低環境負荷な無害化技術として微生物酵素の利用が期待されており、これまでにPCBsを分解する多くのビフェニル資化菌が分離されている。例えば、本発明者らは、２〜５塩素置換PCBsに対してすぐれた分解性を有する新規な微生物株、コマモナス・テストステロニ(Comamonas  testosteroni) YU14-111株を単離した（特許文献１参照）。とりわけて、この菌株は4,4’-ジクロロビフェニルに対し優れた分解活性を示すビフェニル-2,3-ジオキシゲナーゼ（以下、「2,3-BDO」という。）活性を有するPCBs分解細菌である。
【０００３】
分解対象となるPCBsは約７０〜１２０同族体の混合物であるため、基質特異性が厳格な酵素、単独種での分解は難しい。この課題に対して、ビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性を改変してより幅広い種類のPCBs同族体を分解しようという試みがある。ビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性については、バークホルデアリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)LB400株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの活性は、2,3-BDOのみならず、ビフェニル3,4-ジオキシゲナーゼ（以下、「3,4-BDO」という。）活性を有することが示されている（例えば、非特許文献１参照）。また、基質特異性に関与するアミノ酸残基については、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes) KF707由来のbphA1遺伝子を用いて詳細に検討されている（例えば、特許文献２参照）。この報告では、ランダムプライマー法により種々の突然変異を導入し、特定のアミノ酸置換を有する変異体BphA1の基質特性を解析したところ、BphA1タンパク質の376番目のアミノ酸をスレオニンからアスパラギンに置換することによって、2,5,4’-トリクロロビフェニルに対する3,4-BDO活性を獲得することが示されている。
しかしながら、3,4-BDO活性を有する酵素は、4,4’-ジクロロビフェニルのような二重パラ置換PCB同族体に対する活性が弱く（例えば、非特許文献２、TABLE1参照）、基質特異性の改善のみによって、複雑な同族体混合物であるPCBs含有廃棄物を無害化することは困難であった。
【０００４】
本発明者らは、これまでに環境から約200株の好気性PCBs分解細菌を単離し（以下、「野生株」という。）、2,3-BDO活性が優勢であることを確認するとともに、同族体分解特性が異なる数株を選抜して複合細菌触媒化すると分解性を向上でき、その効果に複合比が重要であることを見出している（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2013-179890号公報
【特許文献２】特開2000-69967号公報
【特許文献３】特開2015-139432号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bedard,D.L. et al., Applied Environmental Microbiology Vol.51, No.4, pp. 761-768, 1986.
【非特許文献２】Suenaga, T. et al., Journal of Bacteriology Vol.184, No.13, pp.3682-3688, 2002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
コマモナス・テストステロニYU14-111株が産生する2,3-BDOは、基質特異性の異なる他のBODと組み合わせて複合化することにより、PCBsを環境省指定の安全基準値以下まで分解しうるすぐれた酵素であるが、これまでは、野生株を培養することで酵素を得ていたため、発現調節が難しく、工業的に生産するにあたっては生産性が低いことが大きな課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は課題解決するためになされたものであって、コマモナス属細菌が産生する2,3-BDOを、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌で発現させるとともに、アミノ酸配列も一部、バークホルデアリア属細菌のものへ改変することにより、PCBs同族体に対する基質特異性に優れ、酵素の生産性も向上するという知見に基づく。すなわち、本発明の１つの実施形態において、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有しかつビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質（改変タンパク質）が提供される。この改変タンパク質は、大腸菌で発現させたときに、コマモナス・テストステロニ由来の野生型BphA1よりも発現量が増加する新規なキメラタンパク質である。
【０００９】
本発明の他の実施形態では、配列番号１に示す塩基配列の7〜1426番目の部分からなるDNA又は当該部分の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有しかつ前記改変タンパク質をコードするDNAが提供される。このDNAは、当該改変タンパク質であるビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットのＮ末端から150番目までのアミノ酸配列をコードする翻訳領域が、大腸菌においてコドン最適化されていることが好ましく、とりわけ、プロリン残基及び／又はイソロイシン残基のコドンが、大腸菌におけるそれぞれのレアコドンを含まないように改変されていることがさらに好ましい。さらに別の実施形態では、前記DNAと、そのDNAによりコードされる改変タンパク質を大腸菌内で発現させるために、機能的に連結された発現調節配列とを含む発現ベクターが提供される。さらになお異なる実施形態における発現ベクターは、ビフェニルジオキシゲナーゼ複合体をコードする配列番号１又は３に示す塩基配列からなるDNAと、それに機能的に連結された発現調節配列とを含む。
本発明のさらなる実施形態では、当該発現ベクターで形質転換された組換え大腸菌及び当該組換え大腸菌を培養することにより得られるポリ塩化ビフェニル分解用の微生物触媒製剤等が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、コマモナス・テストステロニYU14-111株を培養して野生型ビフェニルジオキシゲナーゼ(BphA1)を発現させる場合と較べて、組換え大腸菌におけるBphA1 タンパク質の発現量を顕著に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる改変BphA1と、その野生型酵素のアミノ酸配列（配列番号４）を整列させた図である。
【図２】配列番号１で示される塩基配列の7〜542番目の部分からなるDNA（改変bphA1）と、その野生型酵素の塩基配列（配列番号３）を整列させた図である。
【図３】コマモナス・テストステロニYAZ2株の野生型BphA発現用プラスミド（１）及び大サブユニット(BphA1)キメラ型ビフェニルジオキシゲナーゼ発現用プラスミド（２）の構造を示す。
【図４】プラスミドpEA1A2A3A4(Y2)又はpEA1(LY)A2A3A4(Y2)で形質転換した大腸菌BL21(DE3)株を培養して発現させたタンパク質を、ゲル濃度12.5%のSDS-PAGEにより解析した結果を示す。
【図５】ビフェニルジオキシゲナーゼを発現する野生株及び遺伝子組み換え株の生育速度を比較した結果である。
【図６】野生株及び遺伝子組み換え株におけるBphA1発現量を比較した結果である。
【図７】野生型又は改変型BphAを発現させた大腸菌懸濁液を用いて、PCB同族体の分解特性を比較した結果である。
【図８】野生型BphAを発現する大腸菌BL21(DE3)/pEA1A2A3A4(Y2)の生育曲線と、IPTGで発現誘導後の菌体によるPCB分解率を示す。
【図９】改変型BphAを発現する大腸菌BL21(DE3)/pEA1(LY)A2A3A4(Y2)の生育曲線と、IPTGで発現誘導後の菌体によるPCB分解率を示す。
【図１０】野生型と遺伝子組換え大腸菌株を用いてそれぞれ単独で、あるいは複合化したときのPCB分解率を比較したグラフである。複合比はいずれも２：８である。
【図１１】組換え菌株複合化によるPCB分解試験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[用語の定義]
本明細書において、用語「改変」又は「改変された」とは、野生型酵素のアミノ酸配列の一部を人為的に欠失、付加又は置換することにより元のアミノ酸配列とは異なるタンパク質を作製することをいう。
「キメラ型」とは、上記改変されたタンパク質の一つの態様であって、２種類の野生型タンパク質の部分を連結し、全体として野生型タンパク質と同様の機能を有する新たなタンパク質の型をいう。
「ビフェニルジオキシゲナーゼ複合体」とは芳香環水酸化酵素の一種であり、多成分酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼ（BphA酵素）そのものを指す。複数の酵素群が関与し、多段階反応で触媒されるビフェニル分解代謝において、初発反応である酸素分子のビフェニル環への導入を触媒する末端ジオキシナーゼ(BphA1/BphA2)、NADHからの電子伝達に関与するフェレドキシン（BphA3）及びフェレドキシン還元酵素（BphA4）とから構成される。末端ジオキシゲナーゼは鉄・硫黄を含むタンパク質であり、大サブユニット（BphA1）と小サブユニット（BphA2）の二つのサブユニットで構成されている。
「コドン最適化」とは、同一のアミノ酸配列を維持しつつ、少なくとも1つのアミノ酸残基のコドンを、その宿主細胞、例えば大腸菌の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。生物間のコドン使用頻度における差異は、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関する場合が多く、特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。従って、本発明のDNAは、コドン最適化に基づいて、大腸菌における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/において入手可能な「Codon  Usage  Database」において容易に入手可能である。
【００１３】
[改変タンパク質]
本発明の改変タンパク質は、コマモナス・テストステロニYAZ2株（特許文献１に記載のYU14-111株と実質的に同一の別の単離株であり、微生物触媒製剤の製造を目的に、マスターセルバンクへ保管されている）由来の野生型酵素である2,3-BDO大サブユニット（BphA1）に対し、そのＮ末端領域の所定のアミノ酸を改変したものである。この野生型酵素は、本発明者らによって見いだされたものであり、コマモナス属に属する微生物が有するビフェニル分解酵素群の１つとしてすでに報告されている（特許文献１）。本発明の１つの実施形態である改変タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と、上記野生型タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）とのアライメントを図１に示す。図１においてBphA1(Y2)とは、コマモナス・テストステロニYAZ2株由来の野生型酵素であり、BphA1(LY)とは、本発明の１つの実施形態である改変タンパク質である。
それぞれＮ末端からのアミノ酸配列を一文字記号で表すとともに同一のアミノ酸残基に＊を付した。図１に示したように、BphA1(LY)は、野生型BphA1(Y2)のＮ末端から約150番目までの領域における所定のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか欠失しているが、約150番目よりＣ末端側の両者の配列は全く同一である。その結果、全体で約９３％の配列同一性を有する。なお、BphA1(LY)のＮ末端側から150アミノ酸残基は、Burkholderia xenovorans LB400 株由来の2,3-BDO大サブユニット（BphA1）配列（GenBank Accession No.ABE37059）と同一である。したがって、これら２つの菌株由来のビフェニルジオキシゲナーゼをＮ末端側から150番目で組換えたキメラタンパク質ということもできる。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、前記改変タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらになお好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質を含む。すなわち、当該タンパク質は、他のサブユニットであるBphA2と共に、末端ジオキシゲナーゼ複合体を形成してビフェニル環へ酸素分子を導入する酵素活性を害さない範囲内において配列番号２に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの（以下、「相同体」又は「ホモログ」と称する場合もある。）ということもできる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００１５】
アミノ酸配列の「同一性パーセント（％）」は、参照ポリペプチド配列に対して、配列をアラインし、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するために、ギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の範囲内の様々な方法、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegAlign (DNASTAR)ソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者であれば、配列をアラインするための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。なお、図１に示すアライメントは、遺伝情報処理ソフトウェアであるGenetyx-Mac (株式会社ゼネティクス)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて解析したものである。
【００１６】
ここで、本発明の改変タンパク質の作用効果としては、組み換え大腸菌内において発現量が増加することが挙げられる。工業的に確立された大腸菌は、病原性を有しておらず、遺伝子発現調節機構の最も良く解析された微生物であり、取り扱いが簡単でタンパク質の実生産に適している。実例として、遺伝子組換えタンパク質医薬品などでの製造実績がある。
大腸菌細胞内での遺伝子発現は、一般的には転写レベルで制御されていると考えられている。しかしながら、本発明の改変タンパク質の大腸菌における発現は、野生型酵素と同じプロモーター配列を用いて転写制御した場合でも、野生型酵素に比べて顕著な発現量の増加が認められることから、転写反応後の段階、例えば、翻訳の効率や、発現したタンパク質の細胞内での安定性等が向上している可能性がある。
【００１７】
[改変タンパク質をコードするDNA及び発現ベクター]
本発明の異なる実施形態において、上記改変タンパク質をコードする塩基配列を含むDNA、及び当該DNAとそれに機能的に連結された発現調節配列を含む発現ベクターを提供する。用語「機能的に連結された」とは、単一核酸フラグメント上の核酸配列同士の関係であって、一方の核酸に起因する、あるいは翻訳された蛋白質の機能が他方のそれにより影響を受ける関係のことをいう。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響する場合、このプロモーターは、コード配列に機能的に連結されている(すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある)。本実施形態に関連するDNAは、配列番号１に示す塩基配列の7〜1426番目の部分を含むことが好ましい。図２には、当該実施形態における改変タンパク質をコードするDNAの5’-非翻訳領域とＮ末端の約160アミノ酸残基をコードする塩基配列について、野生型bphA1(Y2)と改変型bphA1(LY)とのアライメントを示す。図２に示したように、これらの配列間には塩基置換及びギャップが存在し、約150番目よりＣ末端側のアミノ酸残基をコードする両者の塩基配列は全く同一である。その結果、改変型bphA1(LY)の塩基配列は、開始コドン上流の 46 塩基を含み、bphA1 の停止コドンまでの配列全体について、野生型bphA1(Y2)の塩基配列に対して約８９％の配列同一性を示した。また、本実施形態のDNAは、ビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての酵素機能を有するタンパク質をコードする限り、上記配列領域に１又は数個の塩基配列の欠失、付加、置換があってもよく、配列番号１に示す塩基配列の7〜1426番目の部分塩基配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の配列同一性があればよい。
【００１８】
本実施形態のDNAの作用効果としては、大腸菌内において発現量が増加した改変タンパク質をコードするとともに、発現量が増加する原因として、転写産物であるmRNAの構造が大腸菌内での翻訳効率の向上に寄与している可能性がある。例えば、大腸菌の場合、転写開始部位からSD配列及び翻訳開始領域を含むmRNAの5’-末端領域の配列がリボソームや翻訳開始因子との結合を促進する上で重要であることが知られている。また、mRNAのコドン配列に対応する細胞内のtRNAの量が翻訳効率を律速する場合もある。野生型BphA1(Y2) のN末端から150アミノ酸残基中の２つのプロリン残基（Pro69及びPro138）にはレアコドン (CCC) が使用されているが、改変型BphA1(LY)においてこれに対応する２つのプロリン残基のコドンは、Pro68がCCTへ、Pro137がCCGへ置換されていることから、改変型BphA1のＮ末端領域アミノ酸の大腸菌におけるコドン使用頻度の改善も発現効率を向上させる１つの要因と考えられる。したがって、本実施形態におけるDNAは、前記ビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットのＮ末端から150番目までのアミノ酸配列における１又は複数のプロリン残基のコドンが大腸菌におけるレアコドン(CCC)を含まないように改変されていることが好ましい。さらに、これらのプロリン残基のすべてのコドンが大腸菌におけるレアコドン(CCC)を含まないように改変されていることがなお好ましい。この他、大腸菌ではイソロイシンをコードするAUAもレアコドンとして知られており、これらのレアコドンを含まないことによってコドン最適化される。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施形態として、配列番号１又は３に示す塩基配列からなるDNAと、それに機能的に連結された発現調節配列とを含む発現ベクターが提供される。配列番号１に示す塩基配列は、上記改変タンパク質であるBphA1に加えて、BphA2、BphA3及びBphA4の各タンパク質のコード領域を含み、大腸菌内においてこれらの複合酵素タンパク質を同一のプロモーターの調節下に発現することができる。さらに別の実施形態における発現ベクターは、配列番号３に示す塩基配列を有する、コマモナス・テストステロニYAZ2株が産生する野生型BphA1のコード配列も含みうる。野生型BphA1は、改変型に比べて組換え大腸菌での発現量は劣るものの、これを用いた遺伝子組換え技術による製造方法は、コマモナス・テストステロニYAZ2株を用いる製造方法に比較して大きな利点がある。例えば、コマモナス・テストステロニYAZ2株では発現誘導剤にビフェニルを使用する必要がある。これは作業者の健康障害を引き起こす可能性があり、これを防止するために設備の密閉化や局所排気装置の設置など生産系の排気設備に大きな費用投資が必要となる。また、コマモナス・テストステロニYAZ2株の生育速度は大腸菌と比べて遅く（図５）、このような低い生産性を改善することができる。
【００２０】
本発明の種々の実施形態における発現ベクターは、上記DNAを含む限り、発現ベクターに含まれるプロモーター等の発現調節領域の種類、ベクターの種類などは特に限定されるものではない。例えば、ベクターの種類としては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ファージミドなどが挙げられ、直鎖状であっても環状であってもよい。また、シャトルベクターを用いることもできる。組み換え大腸菌内で複製可能なプラスミドとしては、例えばpET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18等が挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。
【００２１】
ベクターに改変タンパク質をコードするDNAを挿入するには、まず、精製された遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、目的のタンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明において使用するベクターには、プロモーター、目的のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、選択マーカーなどを連結することができる。プロモーターは、大腸菌等の宿主微生物中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００２２】
微生物の形質転換は、上記組換えベクターを、目的とするタンパク質が発現し得るように宿主微生物中に導入することにより行うことができる。具体的な微生物の例としては、大腸菌JM109株、BL21(DE3)株、W3110株、HB101株などが挙げられる。これらの微生物は、ATCCやDSMZ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、目的のポリペプチドを発現させることができる微生物であればどのようなものでも利用することができる。
【００２３】
外来遺伝子を微生物に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Sambrook,  J.,  Russell,  D.  W.,  "Molecular  cloning−A  laboratory  manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。微生物への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。形質転換体の選択もまた、当技術分野で公知の方法、例えば薬剤耐性遺伝子を利用した選択等を用いて行うことができる。
【００２４】
[組換え大腸菌の培養方法]
遺伝子組換え型PCBs分解細菌の培養法について述べる。培地は、Luria Broth（1.0%トリプトン、0.5%イースト・エキストラクト、0.5%塩化ナトリウム）（以下、「LB培地」とする。）や2×YT培地（1.6%トリプトン、1.0%イースト・エキストラクト、0.5%塩化ナトリウム）を用いる事ができ、より好ましくはTerrific Brothを改変した2.4%イースト・エキストラクトと1.2%トリプトンを主成分とし、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ70mMを6対4の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にpH6.8〜7.5で調整したもの（以下、「TB改変培地」とする。）が望ましい。
【００２５】
本培養に至る前に、前培養を行う事が好ましく、より好ましくは二段階の前培養を行う事が望ましい。二段階の前培養を行う場合、培地量の5〜10倍、あるいはそれ以上の容積の試験管などに、上記のいずれかの培地を2〜3mLまで、アンピシリンを100μg/mLあるいは適量、あるいは発現プラスミドに適した抗生物質の適量を加え、15〜18%(w/w)までに調整したグリセロールへ、菌体の濁度（OD660値）が0.1〜0.9までとなるように-80℃以下で凍結保存した細菌株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、3〜5時間まで培養し、次に2×YT培地あるいはTB改変培地を300mLまで、直ちにその全量を投入し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、7〜9時間まで培養する。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。
【００２６】
本培養は、羽根付きフラスコと恒温振盪培養機との組み合わせで行う事ができ、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いる事が望ましい。培養装置を限定するものではないが、試作においては、エイブル株式会社製、微生物培養装置BMS-05NCを用いる事ができる。抗生物質の添加の有無など、前培養と同条件に整えた2×YT培地あるいはTB改変培地2.7〜3Lまでに対し、そこへ前培養した培養液を投入する。この場合の菌液の濁度は、OD660=0.03〜0.08までとなるように調整するのが良く、OD660=0.05が望ましい。撹拌翼の回転数は400〜700rpmまでとし、空気の曝気は4〜5L/分までとし、温度は30〜35℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良く、その場合は排圧を0.005〜0.01MPaまでとなるよう調節する事が望ましい。培養は6〜10時間まで行うのが良く、8時間が望ましい。必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）などを培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。さらに、より好ましくは培養が4〜8時間、さらに培養液の濁度がOD660=1.5〜12.0までにIPTGなどを添加する事が望ましく、誘導は1〜2時間行う事が望ましい。培養液の溶存酸素濃度（DO値）が下がり止まった後、DOが上がり始める前に培養を終了する事が望ましい。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。この培養法で、最終的に1Lあたり湿重量として9g以上の遺伝子組換え型PCBs分解細菌が得られる。
【００２７】
［ポリ塩化ビフェニル分解用微生物製剤の調製方法］
前述の方法で得られた細菌体は、重力あるいは遠心による回収時において、生理食塩水あるいは20mMのリン酸塩緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム塩を用いるのが良い。その後、菌体に対し細胞保護作用を示す賦形剤を添加する。例えば、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムなどの糖質を用い、菌体濃度5〜15%(w/v)までに対し1〜3%(w/v)まで加えると、最終的に-20〜-80℃までに温度制御された冷凍庫などで保存できる。とりわけ乳糖は、費用対効果や細胞保護作用の面で優れているので、これを用いることが望ましい。
【００２８】
賦形剤とした糖質類と混合した湿菌体の乾燥は、凍結乾燥機やドラムドライヤー、スプレードライヤーを用いることができるが、スプレードライヤーが望ましい。発明を限定するものでないが、例えば、試作用としては、EYELA製SD-1000型を用いることができる。本機は、乾燥経路において、蒸発缶とサイクロンを備える。乾燥に重要な入口温度として、蒸発缶前の吸気管に温度センサーが取り付けてあり、また出口温度として、蒸発缶とサイクロンの間に温度センサーが取り付けてある。本乾燥工程においては、本機の入口温度を100〜120℃まで、出口温度を60〜70℃までの範囲で設定することが望ましい。その他に、ブロア風量は毎分0.75立米までとし、噴霧圧力は70〜90kPa、送液量は毎分5〜15mLまでとする。
【００２９】
賦形剤とした糖質、0.4〜0.6gと混合して凍結した菌体、あるいは培養後、糖質と混合して凍結せず用意した湿菌体を2〜3g用い、最終液量22〜28mLに調製した試料を、上記に示す設定を施したスプレードライヤーなどが指定する試料容器に入れて取り付ける。実際に乾燥作業に入る前に、蒸留水などを通液して、出口温度を適値へと調節してから行うことが望ましい。本乾燥工程から回収された乾燥菌体は0.2〜0.7gとなり、投入した原材料の重量に対する紛体の収率は32〜49%(w/w)となる。
【００３０】
他方で、菌体のみ、及び賦形剤を含む菌体原液両方を加温加熱、水分のみを蒸発させ、その残留固形分を秤量した結果から、原液固形分濃度（スラリー濃度）を導き出した結果、菌体のみで0.03g/mL、賦形剤とした糖質で、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを含む菌体の全てで0.05g/mLだった。したがって、触媒中の菌体量は60%(w/w)であり、賦形剤とした糖質は40%(w/w)であることを特徴とする微生物触媒製剤が完成する。
【００３１】
［ポリ塩化ビフェニルの分解反応］
本発明の微生物製剤を用いるPCBsの分解方法は、上記で乾燥した菌体を水性媒体に分散させたものとPCBsとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた微生物触媒製剤を、比較的低濃度のPCBs汚染油と接触させたときに高いPCBs分解活性を発揮することができる。
【００３２】
本発明で対象となるPCBsとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１〜10個である。平均置換塩素原子数は、一般に２〜６個である。本発明では、これらのPCBsから選択された少なくとも一種を用いることができ、それぞれ単独で又は二種以上を任意に組み合わせたものも用いることができる。一般に、PCBsは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる配合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上209種類の同族体が存在し、市販品には、およそ70から100、あるいはこれらを越える数の同族体が配合存在している。
【００３３】
本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるPCBsとしては、特徴的には、3,4,4’,5-テトラクロロビフェニルや3,3’,4,4’-テトラクロロビフェニル、3,3’,4,4’,5-ペンタクロロビフェニル、2,3,3’,4,4’-ペンタクロロビフェニル、2,3,4,4’,5-ペンタクロロビフェニル、2,3’,4,4’,5-ペンタクロロビフェニル、2’,3,4,4’,5-ペンタクロロビフェニルに加えて、2,2’,4,4’-テトラクロロビフェニルや2,2’,4,5-テトラクロロビフェニル、2,2’,3,5’-テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
PCBsは、通常PCB単体の配合物として市販されており、これがコンデンサーやトランス、カーボン紙、塗料など、これらに限定せず、様々な工業製品に使用されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）が製造販売したカネクロールKC-200（２塩化ビフェニル）やKC-300（３塩化ビフェニル）、KC-400（４塩化ビフェニル）、KC-500（５塩化ビフェニル）、KC-600（６塩化ビフェニル）、KC-1000(KC500／トリクロルベンゼン＝60/40（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール1254（54％Chlorine）等も挙げられる。
【００３５】
本発明の微生物製剤を用いるPCBsの分解反応は、PCBsを含む油性成分と、上記微生物製剤及び場合により界面活性剤を含む水性媒体と、を混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンを通気、攪拌する工程と、を含む。分解すべきPCBsは、エマルジョン全量に対し0.05〜1000mg/L、好ましくは1〜100mg/L程度含むことができ、当該エマルジョン中に、本発明の微生物製剤を0.2〜20重量%、好ましくは2〜12重量%程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トライトンX-100等の界面活性剤0.005％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、あらかじめPCBsを含む油の粘性を下げる処理（例えば、アルコール化等）を行っても良い。反応条件は、約20〜40℃、好ましくは25〜35℃、さらに好ましくは約30℃に調温し、pHは6〜9とし、攪拌した状態で約12〜72時間処理することができ24時間以内が好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌でき、そこへ酸素マイクロバブルを供給できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が小型化できることにより、微量PCBs汚染廃棄物を保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる（参考文献として特開2015-12830号公報を参照できる）。あるいは、PCBsで汚染した土壌や河川、湖沼などの原位置近辺においても、これらを浚渫あるいは取り出した後、処理作業を行うことができる。
【００３６】
本発明の微生物触媒製剤は、水性媒体と混合した際、元の微生物菌体粒子まですぐに分散して均一な分散液を形成することが、PCBsの分解反応を促進する上で好ましい。油性成分に溶解しているPCBsは、水性媒体と混合して形成されるエマルジョン中で、本発明の微生物製剤の細胞膜を透過し、あるいは細胞膜の近くで、一群のPCBs分解酵素と接触することでその分解反応が進むと考えられる。したがって、当該微生物触媒製剤の分散性は、基質であるPCBsとの接触頻度を増加させる上で反応速度論的にも極めて重要な性質である。
さらに本発明の微生物触媒製剤は、基質特異性の異なる複数のビフェニルジオキシゲナーゼを、それぞれ過剰発現させた複数の微生物触媒製剤を組み合わせることが好ましい。上述したように、分解すべきPCBsは、その置換塩素原子の数と位置において極めて不均一な化合物集団であるから、様々な形態の汚染物に含まれるPCBsの性状に合わせて、複数の微生物触媒製剤の混合率を調整し、最適なPCBs分解用組成物を調製しうることも本発明の１つの利点である。
【実施例】
【００３７】
発明者らは、微生物触媒製剤であるコマモナス・テストステロニYU14-111株（以下「YU14-111株」とする。）が産生するビフェニルジオキシゲナーゼの低い発現量を改善するため、その発現に関わる遺伝子領域を組換え技術により大腸菌へ移植した。このため、コマモナス・テストステロニYAZ2株（以下、「YAZ2株」とする。）由来のビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子（bphA1A2A3A4(Y2)）をpET-15bへ挿入したプラスミドpEA1A2A3A4(Y2)を構築した。YU14-111株とYAZ2株のbphオペロン配列は完全に一致していること、および両株によるPCB分解活性には差がないことを発明者らはすでに確認している。なお、このYAZ2株は、２０１６年２月２９日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に本出願人により寄託され、受託番号NITE P-02213が付与されている。構築したpEA1A2A3A4(Y2)により大腸菌株の形質転換を行い、ビフェニルジオキシゲナーゼ発現を試みた。その結果、組換え大腸菌株はYU14-111株と同等のPCB分解活性を示したが、IPTGによる酵素の誘導発現において、投与の量や時間の調節の幅が狭いことが判り、また組換え大腸菌のタンパク質発現を解析したSDS-PAGEでは、BphA1(Y2)サブユニットタンパク質の発現量が著しく低いことが確認できた（図４及び６）。そこで、BphA1(Y2)サブユニットの発現量を改善するため、次のような実験を行った。
【００３８】
［実施例１］野生型またはキメラ型大サブユニットをもつYAZ2株のビフェニルジオキシゲナーゼ発現用プラスミドの構築
YAZ2株の野生型ビフェニルジオキシゲナーゼ発現用プラスミドの構築方法について以下に説明する。YAZ2株のbphオペロン上においてbphA1A2A3とbphA4は離れた位置に存在するため、pEA1A2A3A4(Y2)の構築は２段階で行った。最初に、YAZ2株菌体の熱抽出物を鋳型とし、以下に記載したプライマー１と２の組合せにより、94℃、2分 →［98℃、10秒 → 60℃、15秒 → 68℃、3分（30サイクル）］→ 68℃、5分のPCRを行い、YAZ2株のBphA1A2A3をコードする領域およびその上流域を含む約2.5 kbpのDNA断片を増幅した。得られたDNA断片をXbaIとNdeIで切断した後、ゲル抽出法により精製し、プラスミドベクター pET-15b（Novagen社）のXbaI-NdeI切断部位へ挿入し、中間プラスミドpEA1A2A3(Y2)を得た。挿入したDNA配列については、PCRで起き得る誤った遺伝子置換が無いことを確認した。
【００３９】
次に、YAZ2株のBphA4をコードする約1.3 kbpのDNA断片を、YAZ2株菌体の熱抽出物を鋳型とし、プライマー３と４との組合せにより、94℃、5分 →［98℃、10秒 → 62℃、15秒 → 68℃、2分（27サイクル）］→ 68℃、5分の反応条件によるPCRで増幅した。
上記プライマー１から４までの各配列は以下の通りであり、うちIn-Fusionクローニングに必要な15塩基の配列を( )でそれぞれ括った。
【００４０】
Primer 1 BphA1-pmFw(XbaI): 5’-ATGCATTCTAGACCGGGCCTTTTAATGTTGGCA-3’（配列番号５、下線：制限酵素XbaI認識配列）
Primer 2 BphA3-tmRv(NdeI): 5’-ATGCATCATATGTCAGGCATGCAGCGCGGCTGCA-3’（配列番号６、下線：制限酵素NdeI認識配列）
Primer 3 iFbphA3A4-Fw: 5’-(TGCATGCCTGACATA)TGAGTCGTCGAGTAACCTCACTA-3’（配列番号７、下線：制限酵素NdeI認識配列）
Primer 4 iFbphA4pET-Rv: 5’-(GTTAGCAGCCGGATC)CTACGACTGCGGGGCATGCGCATT-3’（配列番号８、下線：制限酵素BamHI認識配列）
【００４１】
最後に、得られたDNA断片を、NdeIおよびBamHIで切断した上記中間プラスミドpEA1A2A3(Y2)に、Clontech社のIn-Fusion HD Cloning Kit を用いてクローニングした。これによって、YAZ2株の野生型BphA1A2A3A4(Y2)発現用プラスミドpEA1A2A3A4(Y2)（図３（１））を得た。
【００４２】
引き続き、キメラ型大サブユニットをもつビフェニルジオキシゲナーゼ BphA1(LY)A2A3A4(Y2)発現用プラスミドの構築について以下に説明する。本実施例ではYAZ2株のビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニットBphA1(Y2)の発現量を増加させるために、BphA1(Y2)のＮ末端側部分のアミノ酸を、適当な長さで対応するバークホルデリア・ゼノボランスLB400株（以下、「LB400株」という。）由来のBphA1(LB400)配列と置き換えた複合体BphA1サブユニット、BphA1(LY)を作製した。より詳細には、YAZ2株とLB400株のBphA1サブユニットアミノ酸配列の比較から、両者が一致するとともに遺伝子配列の同一性も高い、YAZ2株のアミノ酸残基番号で149〜154残基の領域におけるキメラタンパク質の作製を考えた。このＮ末端側の約150アミノ酸領域には、ビフェニルジオキシゲナーゼ活性に重要なFeSクラスター結合部位が含まれるものの、ビフェニルやPCBの結合部位にあたるアミノ酸配列は含まれていないため、基質への結合性や特異性に与える影響は僅かだと想定した。
【００４３】
人工遺伝子として有機化学合成したLB400株のBphA1A2遺伝子とその上流域46 bpを含む、約2,100bp（配列番号９、特許文献３に記載）のDNA配列をクローニングベクターpUC57（Thermo Fisher Scientific）へ挿入したプラスミド、pUC57-bphA1A2(LB400)を鋳型とし、以下に記載したプライマー５と６の組合せでもって、94℃、5分 →［98℃、10秒 → 60℃、15秒→ 68℃、50秒（25サイクル）］→ 68℃、3分のPCRを行い、LB400株のBphA1のＮ末端部分153アミノ酸残基をコードする領域およびその上流域を含む約520 bpのDNA断片を増幅した。一方、自家株であるYAZ2株BphA1の149アミノ酸残基以降およびBphA2A3をコードする約2 kbpのDNA断片を、YAZ2株のBphA1A2A3A4発現用に構築したプラスミドpEA1A2A3A4(Y2)（プラスミドDNAベクターは、Novagen社のpET-15bを使用した。）を鋳型とし、プライマー７と８との組合せにより、94℃、5分 →［98℃、10秒 → 60℃、15秒→ 68℃、2分20秒（25サイクル）］の反応条件によるPCRで増幅した。
【００４４】
上記プライマー５から８までの各配列は以下の通りであり、うちIn-Fusionクローニングに必要な15塩基の配列を( )でそれぞれ括った。
Primer 5 iFpETA1(LB)-F: 5’-(ACAATTCCCCTCTAG)ATATTTTTTCCGCCCTGCCAAG-3’（配列番号１２、下線：制限酵素XbaI認識配列）
Primer 6 iFA1(LB50-Y2)-R: 5’-(AAGCCGCAGTCGCCT)TCTTTCTTG-3’（配列番号１３）
Primer 7 iFA1(LB50-Y2)-F: 5’-(AGGCGACTGCGGCTT)CGACA-3’ （配列番号１４）
Primer 8 iFbphA3A4(Y2)-R: 5’-(ACTCGACGACTCATA)TGTCAGGCAT-3’（配列番号１５、下線：制限酵素NdeI認識配列）
【００４５】
次に、プラスミドpEA1A2A3A4(Y2)をXbaIおよびNdeIで切断し、BphA4(Y2)遺伝子のみを含む線状化プラスミドを準備した。最後に、Clontech社のIn-Fusion HD Cloning Kit を用いて、この線状化プラスミドに上記２種類のPCR増幅DNA断片をマルチクローニングした。本方法によって、目的とするキメラ型BphA1を持つBphA1(LY)A2A3A4(Y2)発現用プラスミドpEA1(LY)A2A3A4(Y2)（図３（２））を得た。
【００４６】
［発現タンパク質の解析］
上記で作製したプラスミドpEA1A2A3A4(Y2)又はpEA1(LY)A2A3A4(Y2)で形質転換した大腸菌BL21(DE3)株を、アンピシリンを添加した2×YT培地で、温度30℃で培養し、OD660=3で最終濃度0.1mMのIPTGを添加する直前（０時間）、およびそれぞれの形質転換株においてPCB分解活性が最も高くなる、IPTGを添加してから１時間後（pEA1A2A3A4(Y2)の場合）または２時間後（pEA1(LY)A2A3A4(Y2)の場合）にそれぞれの菌体を回収した。採取した菌体を緩衝液に懸濁後、SDSおよびメルカプトエタノール存在化で 100℃、５分間処理し、得られた溶液中の菌体総タンパク質をゲル濃度12.5％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により解析した結果を図４に示す。
図４に示されるように、分子量約51.5kのBphA1タンパク質は、野生型酵素遺伝子を有する組換え体BL21(DE3)/ pEA1A2A3A4(Y2)ではIPTG添加の前後においてほとんど差がなくその発現量は著しく少ないが、キメラタンパク質をコードする組換え体BL21(DE3)/ pEA1(LY)A2A3A4(Y2)では、IPTGの添加によって有意に発現量が増加していた。よって、本発明に係る改変BphA1タンパク質は、組換え大腸菌細胞内における発現量が顕著に増加していることが判った。
【００４７】
［実施例２］ビフェニルジオキシゲナーゼを発現する種々の細菌の生育速度とBphA1発現量の比較
野生株 YU14-111 及び実施例１で作製した２種類の遺伝子組換え大腸菌株について、ビフェニルジオキシゲナーゼを最も効率よく発現する条件で培養し、菌体の生育及び集菌時の最終濁度（収量）を比較した。培養条件は、300 mL の羽根つきフラスコに 60 mL の培養液（野生株：合成培地、遺伝子組換え株：アンピシリンを含む 2xYT 培地）を準備し、温度 30℃、120 rpm で振盪した。酵素誘導剤として、野生株には終濃度 0.1% のビフェニルを培養開始時に、遺伝子組換え菌株には終濃度 0.1 mM IPTG を O.D.=3 の時に、それぞれ添加した。
その結果、図５及び表１に示したように、(a)野生株 YU14-111の増殖速度は、(b)及び(c)の遺伝子組換え大腸菌株に比べて遅く、集菌時の菌体濃度(OD660)で比較すると約5分の１以下となった。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
次に、ビフェニルジオキシゲナーゼを高発現させた野生株（YU14-111[YU]）および２種類の遺伝子組換え大腸菌株(BL21(DE3)/pEA1A2A3A4(Y2)[Y2] ）、BL21(DE3) /pEA1(LY)A2A3A4(Y2)[LY]）について、懸濁液の濁度（O.D.660=1.8 の懸濁液を 30μl 分）、または細胞数（5.4×107cells）で標準化した量の菌体総タンパク質をSDS-PAGE により分離し、（Ａ）クマシーブリリアントブルーまたは（Ｂ）抗BphA1抗体を用いて染色した結果を図６に示す。使用した抗BphA1抗体は、YU14-111株（YAZ2株）BphA1 の Ｎ末端 20アミノ酸残基を抗原とするため、Ｎ末端側 150残基を LB400株由来の配列に置き換えたキメラ型 BphA1(LY) は、染色されない（図６（Ｂ））。しかしながら、細胞数で標準化した場合の野生株(YU)及び野生型組換え体(Y2)の抗体染色の結果から、菌体１個あたりのBphA1発現量はほぼ同じと考えられる。コマモナス属細菌は大腸菌よりもサイズが小さいため菌体濁度で標準化すると約２倍量の発現が認められる（図６（Ｂ））。
【００５０】
一方、以上の結果を合わせて考えると、表１の結果より野生型BphA1組換え大腸菌(Y2)の収量は菌体濁度で野生株(YU)の約５倍であるから、発現した酵素タンパク質量は約2.5倍となる。さらに改変キメラ型BphA1組換え菌(LY)については、図６（Ａ）の結果から菌体１個あたりのBphA1発現量を約１０倍と見積もると、表１の結果より菌体収量が約８倍であるから、最終的な生産量は約８０倍にも達することになる。したがって、組換え大腸菌による改変（キメラ型）ビフェニルジオキシゲナーゼの生産性は培養時間の短縮及び発現したタンパク質量の観点から大きく改善された。
【００５１】
［実施例３］組換え大腸菌株を用いたPCB同族体分解特性の比較
上記実施例２で回収した組換え大腸菌株を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で洗浄後、同様な緩衝液へ再度懸濁した。この組換え大腸菌株の菌体の懸濁液を最終濃度がOD660=10となるように調整し、商用PCBであるカネクロールKC-300で調製したPCBs溶液を、最終濃度5ppmとなるように加え、温度30℃で24時間、50rpmの速度で転倒撹拌することでPCBsを分解させた。
【００５２】
反応後の溶液中に残存するPCBs量は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（Agilent Technologies  7890A/5975C）（以下、GC/MS）を用いて測定した。GC/MSの分析条件は、日本機械学会、第２３回環境工学総合シンポジウム2013講演論文集、No.13-15に掲載の「ビフェニルジオキシゲナーゼ高発現細菌製剤の超音波利用型マイクロバブルによる触媒反応制御（著者：原富次郎、幕田寿典、高塚由美子、佐野克典、新國時生）」にしたがった。分析手順は、反応溶液に適量の塩酸を加えて反応を停止させた後、内部標準物質としたアントラセンを、反応開始時点のPCBs濃度5ppmに対して1.6ppmとなるように添加し、反応溶液の２倍量の酢酸エチル（和光純薬工業、特級品）で２回液液抽出した。次に、反応溶液中の残存PCBsが移行した有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、GC/MSの検出限界感度に応じて、適宜、酢酸エチルで希釈しGC/MSへ注入した。この場合のGC/MSの検出限界は10ppt以下であることが望ましい。
【００５３】
PCBsの定量データは次の手順により解析した。GC/MSで計測した試料中のPCBsのピーク総面積を、同様にコントロールとして計測したPCBs標準品の総面積で除算し、さらにこの値を、内部標準物質としたアントラセン面積を用いて補正することで、正しいPCBsの濃度を算出することができる。最後に、このPCBs濃度を用いてPCBsの分解率を導いた。これらPCBs濃度およびPCBs分解率を求める計算式は以下の通りである。
【００５４】
PCBs濃度[ppm]＝コントロール標準品PCBs濃度[ppm]×(試料中PCBs総面積値/コントロールPCBs総面積値)×(コントロール中アントラセンの面積値／試料中アントラセンの面積値)
PCBs分解率[%]＝{(分解前のPCBs濃度[ppm]−分解後のPCBs濃度[ppm])/分解前のPCBs濃度[ppm]}×100
【００５５】
２種類の組換え大腸菌細胞BL21(DE3)/pEA1A2A3A4(Y2)、及びBL21(DE3)/ pEA1(LY)A2A3A4(Y2)によるカネクロールKC-300の分解活性を比較した結果を図７に示す。わずかに分解特性が異なるものの両者は同様のPCB同族体分解特性を示した。
【００５６】
［実施例４］組換え大腸菌株によるタンパク質の発現誘導条件の検討
最も高活性な菌体を得るための発現誘導条件を調べるために、上記の実施例２と同様の方法で、プラスミドpEA1A2A3A4(Y2)又はpEA1(LY)A2A3A4(Y2)で形質転換した大腸菌BL21(DE3)株を、アンピシリンを含む2×YT培地を用いて温度30℃で培養した。培養液のOD660=0.6のとき最終濃度0.05、0.1、0.2あるいは0.4mMとなるようIPTGを添加し、さらに培養を続け、60、90、120及び240分後に菌体をそれぞれ採取した。採取した全ての菌体はリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、同様の緩衝液で濃度OD660=10となるよう懸濁液を調整して、濃度5ppmのカネクロールKC-300を用いた24時間の分解試験へ供した。
【００５７】
以下に本試験結果を説明する。
図８には、４種類のIPTG濃度で発現誘導した際のBL21(DE3)/pEA1A2A3A4(Y2)菌株の生育曲線と、経時的に採取した菌体によるPCBs分解率の結果を示す。その結果、IPTGの最終濃度が0.1mMの場合で誘導後60分後の菌体が最も高いPCBs分解活性を示した。しかしながら、発現誘導後の時間が60分を経過すると、0.1mM以上のIPTG濃度では発現菌体のPCBs分解活性が急に低下した。SDS-PAGEによる解析で、発現した組換えタンパク質は分解されることなく菌体内に蓄積されていたため、何らかの理由で活性を失っていることが示唆された。
【００５８】
一方、図９には、４種類のIPTG濃度で発現誘導した際のBL21(DE3)/ pEA1(LY)A2A3A4(Y2)菌株の生育曲線と、経時的に採取した菌体によるPCBs分解率の結果を示す。その結果、IPTGの最終濃度が0.1mMの場合で誘導後120分後の菌体が最も高いPCBs分解活性を示した。また、発現誘導後60分〜120分の間で発現菌体のPCBs分解活性が安定であることから、高活性な培養菌体を取得する培養条件が野生型酵素に比べて容易であることが示唆された。
【００５９】
［実施例５］各種複合化微生物製剤によるPCBs分解試験
上記の実施例６と同様なBL21(DE3)/ pEA1A2A3A4(Y2)、及びBL21(DE3)/pEA1(LY)A2A3A4(Y2)発現菌体とコマモナス・テストステロニYAZ2株の懸濁液を用い、これら単独の発現菌体又はBphA1A2A3A4(LB400)発現菌体（特許文献３参照）と複合化した微生物触媒製剤と5ppmのカネクロールKC-300とを、温度30℃で24時間にわたり接触反応させた。反応後の残存PCBsは、上記の実施例２に記載したGC-MS法と同様な方法で分析し、解析結果を表２、図１０及び図１１に示した。複合比はいずれも２＋８である。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
表２及び図１０より、菌体の複合比別にPCBsの分解率を比較すると、BphA1A2A3A4(LB400)発現菌体単独の時では84.5%±0.6、YU14-111株単独の時では68.8%±0.7、野生型BphA(Y2)発現株単独では 64.8%±3.0、改変型BphA発現株単独では67.7%±1.0であるのに対し、複合化菌体製剤ではいずれも90％を上回った。本解析は分析回数ｎ＝３として行なった。
また、BL21(DE3)/pEA1A2A3A4(Y2)又はBL21(DE3)/ pEA1(LY)A2A3A4(Y2)発現菌体とBphA1A2A3A4(LB400)発現菌体とを２：８の比で複合化した微生物製剤によるPCB分解試験の結果は、図１１および表２に示すように、野生株YU14-111との複合化（表２、YU+LB）と同様に、国の廃棄物処理基準である0.5ppmを下回る残存濃度までKC-300を分解しうることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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