(57)【要約】【課題】マラリアワクチンとして有用なポリペプチドを提供すること。【解決手段】以下の（1-1）、（1-2）又は（1-3）で表される、生体抗マラリア活性賦活能を有するポリペプチド：（1-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列を含み、且つ全長が200残基長以下であるポリペプチド、（1-2）前記（1-1）のポリペプチドに対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチド、又は（1-3）前記（1-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（1-1）、（1-2）又は（1-3）で表される、生体抗マラリア活性賦活能を有するポリペプチド：
（1-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列を含み、且つ全長が200残基長以下であるポリペプチド、
（1-2）前記（1-1）のポリペプチドに対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチド、又は
（1-3）前記（1-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記連続するアミノ酸配列が、配列番号2又は配列番号3に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記連続するアミノ酸配列の長さが20残基長以上である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
全長が100残基長以下である、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記（1-1）のポリペプチドが、前記連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを含有する、マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン。
【請求項７】
ヒト用ワクチンである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
さらにアジュバントを含有する、請求項６又は７に記載のワクチン。
【請求項９】
以下の（2-1）、（2-2）又は（2-3）で表されるアミノ酸配列に対する抗体：
（2-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列、
（2-2）前記（2-1）のアミノ酸配列に対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、又は
（2-3）前記（2-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１０】
ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを動物に免疫することを含む、請求項９又は１０に記載の抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアワクチンとして有用なポリペプチド、抗マラリア活性を有する抗体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は、途上国等において年間多大な人的、社会的損害を生じさせている。なかでも、マラリア原虫感染症は年間2億人が感染し、50万〜60万人が死亡するにもかかわらず、未だ有効な予防ワクチンが存在しない。従って、マラリアワクチン開発は急務である。
【０００３】
しかしながら、過去30〜40年に亘って、数多くのワクチン臨床試験が行われて来たにもかかわらず、いずれも有効性が示せず頓挫してきた。そのなかで、感染防御を獲得した成人の血清中に、抗マラリア活性を持つ抗体が認識する分子としてSERA（serine repeat antigen）タンパクが同定された（例えば非特許文献１を参照）。
【０００４】
その後、リコンビナントSERAタンパクを抗原としてワクチン開発が行われてきた。マラリア流行地であるウガンダにおける臨床試験からワクチン誘導抗体価が高ければ高いほどマラリア防御効果が高いことが示され、更なる改善が望まれていた。
【０００５】
このような状況下で、自然免疫で獲得された抗体の認識エピトープが、SERAタンパクのN末端に存在する8 merリピート領域および／又はセリンリッチ領域であることが報告されいる。そして、これに基づいてこれらの領域を複数セット含むポリペプチドがマラリアワクチンとして有用であることが報告されている（特許文献１）。また一方で、SERAタンパクのN末端側の領域（47kd領域）に基づいて改変されたオリジナルSE36ポリペプチドが、マラリアワクチンとして有用であることも報告されている（特許文献１等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2010/126151号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bzik DJ, Li WB, Horii T, Inselburg J.Mol Biochem Parasitol. 1988 Sep;30(3):279-88.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、マラリアワクチンとして有用なポリペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、オリジナルSE36ポリペプチドの投与により、血清のマラリア原虫増殖阻害活性が上昇すること（すなわち、生体の抗マラリア活性が賦活されること）を見出した。そして、この血清中の抗体のエピトープマッピングを行ったところ、従来重要と考えられていたN末端ではなく、中央領域がエピトープであることが見出された。これらの知見に基づいて、該エピトープを含む比較的短いポリペプチドを用いることにより、効率的にマラリア原虫増殖阻害活性を有する抗体を誘導可能であることを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１１】
項１．  以下の（1-1）、（1-2）又は（1-3）で表される、生体抗マラリア活性賦活能を有するポリペプチド：
（1-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列を含み、且つ全長が200残基長以下であるポリペプチド、
（1-2）前記（1-1）のポリペプチドに対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチド、又は
（1-3）前記（1-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド．
項２．  前記連続するアミノ酸配列が、配列番号2又は配列番号3に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列である、項１に記載のポリペプチド．
項３．  前記連続するアミノ酸配列の長さが20残基長以上である、項１又は２に記載のポリペプチド．
項４．  全長が100残基長以下である、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド．
項５．  前記（1-1）のポリペプチドが、前記連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド．
項６．  項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを含有する、マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン．
項７．  ヒト用ワクチンである、項６に記載のワクチン．
項８．  さらにアジュバントを含有する、項６又は７に記載のワクチン．
項９．  以下の（2-1）、（2-2）又は（2-3）で表されるアミノ酸配列に対する抗体：
（2-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列、
（2-2）前記（2-1）のアミノ酸配列に対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、又は
（2-3）前記（2-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド．
項１０．  ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である、項９に記載の抗体．
項１１．  項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを動物に免疫することを含む、項９又は１０に記載の抗体を製造する方法．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、マラリアワクチンとして有用なポリペプチド、及びこれを含むマラリアワクチンを提供することができる。さらに、該ポリペプチドにより、抗マラリア活性を有する抗体を得ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】検体血清の培養マラリア原虫増殖阻害活性を示す（実施例1）。横軸中、「Medium」は、検体血清に代えて培地を加えた場合（コントロール）で純然たる対照であることを示す。縦軸は、培養マラリア原虫増殖阻害活率（％）を示す。横軸中、「Jap. Naive」は、ワクチンを接種していない日本人を示す。「Ugandan Pool」は、ウガンダ人の血清プールを用いた場合を示す。「0 W」は、ワクチン接種前を示す。「4 W」は、オリジナルSE36ポリペプチドの初回投与から4週間経過後の血清を用いた場合を示す。「8 W」は、オリジナルSE36ポリペプチドの2回目投与から4週間経過後（初回投与から8週間経過後）の血清を用いた場合を示す。
【図２】エピトープマッピング用ペプチド（ペプチド1〜15）が、オリジナルSE36ポリペプチドのどの部位に相当するかについて表す模式図である（実施例2）。図中、SE36はオリジナルSE36ポリペプチドの二次構造の模式図を示し、その下にPeptide seriesとして記載される各矢印線が、各エピトープマッピング用ペプチドが、オリジナルSE36ポリペプチドのどの部位に相当するかについて表している。
【図３】エピトープマッピングの結果を示す（実施例2）。横軸の数値は、エピトープマッピングに用いたペプチドの番号を示し、縦軸は、ペプチド1〜15全てに対する検体血清の反応量に対する、各ペプチドに対する検体血清の反応量の割合を示す。各プロットは各検体血清の結果を示し、「Average」は各検体血清の結果の平均値を示し、「Median」は各検体血清の結果の中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１５】
１．ポリペプチド
本発明は、以下の（1-1）、（1-2）又は（1-3）で表される、生体抗マラリア活性賦活能を有するポリペプチド：
（1-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列を含み、且つ全長が200残基長以下であるポリペプチド、
（1-2）前記（1-1）のポリペプチドに対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチド、又は
（1-3）前記（1-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
に関する（本明細書において、「本発明のポリペプチド」と示すこともある。）。以下に、これについて説明する。
【００１６】
ポリペプチド（1-1）は、SERAタンパクに由来するオリジナルSE36ポリペプチドの中央領域（配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列）を含むポリペプチドである。
【００１７】
SERA（serine repeat antigen）タンパクは、赤血球内期のPf遺伝子により発現される合計989アミノ酸からなる分子量115kdのタンパク抗原であり、その構造はN末端からC末端方向に順に、47kd−50kd−18kdの3つのドメインからなる。これらのドメインの前駆体としてのSERAは、合計5868塩基からなるSERA遺伝子（DNA）上に分散する4つのエキソンによる発現後、赤血球内期でのメロゾイト放出の際にプロセッシングされ、上記3ドメインに開裂する（Molecular and Biochemical Parasitology,86,pp.249-254,1997;及びExperimental Parasitology,85,pp.121-134,1997）。なお、SERA遺伝子（DNA）とこれがコードするアミノ酸配列の完全長データはGenBankで公開され入手可能である（Accession Number:J04000;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。また、SERAのN末端側の領域（以下「47kd領域」と表記する）は、合計382アミノ酸残基からなり、その配列に係るPf株間のホモロジー検索によれば、アミノ酸の欠失や付加、約20ヵ所におけるアミノ酸の変異（非同義置換）等の散在がみられ、多様である（Molecular and Biochemical Parasitology,同前;及びExperimental Parasitology,同前）。
【００１８】
オリジナルSE36ポリペプチドは、前述した熱帯熱マラリア原虫PfのHonduras-1株（以下、「Hond-1」と略記することがある）のSERAの47kd領域を基礎とするSE47’抗原（Vaccine,14,pp.1069-1076,1996；以下、「SE47’」と略記する）に由来する。オリジナルSE36ポリペプチドは、Hond-1のSERAの47kdを構成する合計382アミノ酸のN末端のメチオニンを起点（第1番アミノ酸）としてC末端方向に順次、序数付けした第16番めのアミノ酸（アスパラギン）のコドンを、開始コドン（メチオニン）に置換し、かつ、第382番めのアミノ酸（グルタミン酸）の後に翻訳停止コドンを隣接挿入し、更に、そのセリン反復領域を占める合計33個の重合セリン残基（第193番から第225番セリンまで）を切除した合計334アミノ酸からなるポリペプチドである。このオリジナルSE36ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号19として具体的に示される。オリジナルSE36ポリペプチドは、天然型の上記SERAタンパクよりも高い免疫原性を有している。
【００１９】
生体抗マラリア活性賦活能とは、生体に投与することにより、その生体のマラリア原虫増殖阻害活性を向上させることができる性能（換言すれば、その生体の血清内の、マラリア原虫増殖阻害活性を有する抗体の抗体価を高めることができる性能）である。該性能の有無は、例えば次のように判定することができる。被検ポリペプチドを生体に投与（投与は1回のみであっても、複数回（例えば2〜3回）であってもよい。）して、最後の投与から一定期間経過後（例えば1〜16週間、好ましくは2〜8週間）に得られた血清のマラリア原虫増殖阻害活性を測定し、該活性が、コントロール血清（被検ポリペプチドを投与していない生体から得られた血清）よりも高ければ、被検ポリペプチドが生体抗マラリア活性賦活能を有すると判定することができる。より具体的には、実施例1の方法に従って判定することができる。
【００２０】
生体抗マラリア活性賦活能における「生体」とは、マラリアが感染し得る生体である限り特に限定されない。該生体としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、本発明のポリペプチドがより効率的に生体抗マラリア活性賦活能を発揮できるという観点から、好ましくはヒトが挙げられる。
【００２１】
生体抗マラリア活性賦活能における「マラリア」とは、SERAタンパクを発現し得るマラリアである限り特に制限されない。該マラリアとしては、例えば熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア等が挙げられる。これらの中でも、本発明のポリペプチドがより効率的に生体抗マラリア活性賦活能を発揮できるという観点から、好ましくは熱帯熱マラリアが挙げられる。
【００２２】
配列番号1に示されるアミノ酸配列（オリジナルSE36ポリペプチドの127〜252番目のアミノ酸からなる配列）内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列（本明細書において、「連続するアミノ酸配列」又は「エピトープ配列」と示すこともある。）としては、より効率的に生体抗マラリア活性を賦活できるという観点から、好ましくは配列番号2（オリジナルSE36ポリペプチドの127〜190番目のアミノ酸からなる配列）又は配列番号3（オリジナルSE36ポリペプチドの233〜252番目のアミノ酸からなる配列）に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列が挙げられ、より好ましくは配列番号20（オリジナルSE36ポリペプチドの149〜190番目のアミノ酸からなる配列）又は配列番号3に示されるアミノ酸配列内の連続するアミノ酸配列が挙げられる。
【００２３】
上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）の長さは、12残基長以上であれば抗体を誘導することができるので、この長さであれば特に制限されない。より効率的に生体内で抗体を誘導できるという観点から、好ましくは20残基長以上である。上限は特に制限されないが、例えば100残基長、好ましくは60残基長、より好ましくは40残基長、さらに好ましくは30残基長である。
【００２４】
ポリペプチド（1-1）においては、上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）が1つのみ含まれていてもよく、2以上（例えば2〜6、2〜4、2〜3等）含まれていてもよい。
【００２５】
ポリペプチド（1-1）は、上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）以外の他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、他のアミノ酸配列は、ポリペプチド（1-1）が生体抗マラリア活性賦活能を有する限りにおいて特に制限されない。例えば、オリジナルSE36ポリペプチド内の配列が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００２６】
ポリペプチド（1-1）が他のアミノ酸配列を含む場合、他のアミノ酸配列の長さは、生体に投与した際に、マラリア原虫増殖阻害活性を有する抗体をより効率的に誘導することができるという観点から、より短いこと（例えば100残基長以下、好ましくは60残基長以下、より好ましくは40残基長以下、さらに好ましくは20残基長以下、よりさらに好ましくは10残基長以下、特に好ましくは5残基長以下）であることが望ましい。特に、ポリペプチド（1-1）は、上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００２７】
ポリペプチド（1-1）の全長は200残基長以下、好ましくは100残基長以下、より好ましくは60残基長以下、さらに好ましくは40残基長以下、よりさらに好ましくは30残基長以下である。
【００２８】
ポリペプチド（1-2）において、複数個とは、例えば2〜10個であり、好ましくは2〜5個であり、より好ましくは2〜3個であり、さらに好ましくは2個である。
【００２９】
ポリペプチド（1-2）におけるアミノ酸変異は、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００３０】
或いは、ポリペプチド（1-2）におけるアミノ酸変異は、上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）以外の他のアミノ酸配列内の変異であることが好ましい。また、該変異が、上記連続するアミノ酸配列（又はエピトープ配列）内における変異である場合、その変異部位は、マラリア原虫（特に熱帯熱マラリア原虫）のSERAタンパクにおける、株間でアミノ酸種類に変異がある部位（（Molecular and Biochemical Parasitology,86,pp.249-254,1997;及びExperimental Parasitology,85,pp.121-134,1997））に相当する部位であることが好ましい。例えば、熱帯熱マラリア原虫の株間でSERAタンパクのN末端から142番目のアミノ酸に変異がある場合は、該アミノ酸はオリジナルSE36ポリペプチドのN末端から127番目のアミノ酸に相当するので、これに相当するアミノ酸（配列番号1及び2のN末端から1番目のアミノ酸）の変異が好ましい。
【００３１】
ポリペプチド（1-3）における同一性とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc．Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statisticsfor multiple high−scoringsegments in molecular sequences．”NatlAcad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、NationalCenter of BiotechnologyInformation（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。
【００３２】
ポリペプチド（1-3）において、同一性は、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上である。
【００３３】
ポリペプチド（1-3）におけるアミノ酸変異の態様は、上記したポリペプチド（1-2）におけるアミノ酸変異の態様と同様である。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、生体抗マラリア活性賦活能を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。
【００３６】
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００３７】
さらに、本発明のポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、なども包含される。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、生体抗マラリア活性賦活能を有する限りにおいて、常用の不活化剤で固定化することにより立体構造を安定化したものであってもよい。不活化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β−プロピオラクトン等が挙げられる。ホルマリンを使用する場合、その添加量は約0.005〜0.1％（v/v）、不活化温度は約4〜38℃、不活化時間は約5〜180日である。但し、不活化により抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要に応じて、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。なお、本来のPfコドンを有するSE36遺伝子（DNA）は、大腸菌での発現効率が低い。このため、大腸菌を宿主として製造する場合は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする自然界のPfコドンを全て大腸菌コドンに変換することが望ましい。これにより、本発明のポリペプチドの効率的な産生を行うことができる。Pfコドンから大腸菌コドンへの机上の変換は、例えば、GenBankのCoden Usageデータベースや発明者の既報（前述のVaccine；及びMolecular Biochemistry of Parasitology、63、265-273、1994）等を参考に用いることにより行うことができる。大腸菌コドンへの変換においては、N末端アミノ酸を開始コドンのMetに置換する以外は、自然界におけるPf本来のアミノ酸配列を十分に重視し、その抗原性がアミノ酸の非同義置換により損なわれないよう留意する。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、合成後、精製してもよい。本発明のポリペプチドが形質転換細胞外へ分泌される場合には、該細胞の培養物の除菌培養液を本発明のポリペプチド抽出の出発材料として用いる。該細胞内に蓄積される場合は、例えば、培養物から遠心、濾過等により集菌し採取した菌体から本発明のポリペプチドを抽出する。先ず、抽出第一段階としての菌体の破砕には、酵素による消化、浸透圧による破壊、急激な加圧減圧、超音波、種々のホモジナイザー等々を用いることができる。次いで、菌体破砕物を分別するための手段として、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、吸脱着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳動、カラムクロマトグラフィー、支持体、透析、塩析等を、それぞれ組合せて用いることができる。また、これ等の手段の適用においては、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度等の物理化学的条件を適宜、設定できる。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、例えば後述のようにマラリアワクチンの有効成分として有用である。
【００４４】
また、本発明のポリペプチドは、マラリア診断薬の有効成分としても有用である。すなわち、本発明によれば、本発明のポリペプチドを有効成分として含有するマラリア原虫感染症の診断剤を提供することができる。例えば、本発明のポリペプチドを抗原とし、マラリア原虫の感染が疑われる患者の血清等を被験試料として、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等によって抗SERA抗体を検出することができる。これにより、被験試料に抗体が検出されればマラリア原虫に感染していると診断される。
【００４５】
２．ワクチン
本発明は、本発明のポリペプチドを含有する、マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン（本明細書において、「本発明のワクチン」と示すこともある。）に関する。
【００４６】
本発明のワクチンの対象生物は、マラリアが感染し得る生体である限り特に限定されない。該生体としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、本発明のワクチンがより効率的にその効果を発揮できるという観点から、好ましくはヒトが挙げられる。
【００４７】
本発明のワクチンの対象マラリアは、SERAタンパクを発現しうるマラリアである限り特に制限されない。該マラリアとしては、例えば熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア等が挙げられる。これらの中でも、本発明のワクチンがより効率的にその効果を発揮できるという観点から、好ましくは熱帯熱マラリアが挙げられる。
【００４８】
本発明のワクチンは、本発明のポリペプチドを含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えばワクチンの耐熱性を増強する安定化剤、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバント等が挙げられる。
【００４９】
安定化剤としては、例えば、糖類やアミノ酸類を挙げることができ、
また、アジュバントとしては、例えば、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムゲル等）、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等を挙げることができる。アジュバントとして好ましくは、水酸化アルミニウムゲル、及びヒト型TLR9リガンドアジュバント、具体的にはK3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpG ODNアジュバント ）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）等を挙げることができる。アジュバントの組み合わせとしては、上記ヒト型TLR9リガンドアジュバント同士の組み合わせのほか、(a)水酸化アルミニウムゲルとK3（KタイプCpGアジュバント）；(b)水酸化アルミニウムゲルとD35（DタイプCpGアジュバント）；及び(c)水酸化アルミニウムゲルとsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）の組み合わせを挙げることができ、より好ましい組み合わせとしては(a)水酸化アルミニウムゲルとK3（KタイプCpGアジュバント）の組み合わせを挙げることができる。
【００５０】
本発明のワクチンは、上記以外にも、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等を含んでいてもよい。
【００５１】
本発明のワクチンの剤形としては、特に限定されず、例えば水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等の注射剤；  錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；  点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。
【００５２】
本発明のワクチン中の本発明のポリペプチドの含有量は、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば例えば0.0001〜95重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【００５３】
本発明のワクチンは、特に制限されないが、例えば1回の投与における本発明のポリペプチド投与量が、1μg〜200μgとなるように用いられることが好ましい。投与間隔及び回数は、特に制限されないが、例えば約1〜8週間間隔で1〜5回程度行うことが好ましい。
【００５４】
３．抗体
本発明は、以下の（2-1）、（2-2）又は（2-3）で表されるアミノ酸配列に対する抗体：
（2-1）配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列、
（2-2）前記（2-1）のアミノ酸配列に対して1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、又は
（2-3）前記（2-1）のポリペプチドと90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
に関する（本明細書において、「本発明の抗体」と示すこともある。）。以下に、これについて説明する。
【００５５】
「配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列」について、複数個の定義について、同一性の定義について、及びアミノ酸変異の態様については、上述「１．ポリペプチド」における定義と同様である。
【００５６】
「配列番号1に示されるアミノ酸配列内の12残基長以上の連続するアミノ酸配列」としては、例えば、後述の実施例2のエピトープマッピングで用いたペプチド7〜11（好ましくはペプチド7〜9及び11）が挙げられる。
【００５７】
抗体の種類としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。なお、ヒトキメラ抗体とは、抗体の可変領域がヒト以外の動物（例えばマウス、ウシ等）由来の配列であり、抗体の定常領域がヒト由来の配列である抗体である。
【００５８】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、本発明のポリペプチドを家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のポリペプチドをマウス、ウシ等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００５９】
抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００６０】
本発明の抗体は、例えば医薬組成物（特にマラリア治療剤）の有効成分として有用である。マラリア治療剤の態様については、上記した本発明のワクチンと同様である。
【００６１】
また、本発明の抗体は、マラリア原虫感染症の診断に使用することができる。すなわち、本発明によれば、本発明の抗体を有効成分として含有するマラリア原虫感染症の診断剤を提供することができる。本発明の抗体は、抗原検出用として使用でき、マラリア原虫の感染が疑われる患者の血清等の被験試料中に抗原が検出されれば、マラリア原虫に感染していると診断することができる。
【実施例】
【００６２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６３】
参考例1：オリジナルSE36ポリペプチドの調製
＜参考例1-1：発現系の構築＞
オリジナルSE36ポリペプチド（配列番号19）の発現系の構築は、次のように行った。
【００６４】
Pfコドンから大腸菌コドンに机上で変換した全長SE36遺伝子DNA塩基配列を8分割し、各分割断片のセンス(+)鎖とアンチセンス(-)鎖の単鎖DNA断片を合計16本(8対)合成すると共にアニーリングし、合計8対の2本鎖DNAを調製の後、これ等を相互に連結し、全長SE36遺伝子を作成し、その発現ベクターを構築した。
【００６５】
尚、合成DNA断片のクローニングと連結の基本操作は、Sambrookらの方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)により行った。
【００６６】
前記の単鎖DNA断片はそれぞれ、DNA/RNAシンセサイザー“Applied Biosystem model 392”[PE社(米国)製]を用いて合成した。これ等の合成断片は、10%(W/V)ポリアクリルアミド(50mM Tris-ホウ酸塩、pH8.3,1mM EDTA,及び8M 尿素を含有)の電気泳動により精製した。次いで、20p molesの精製断片DNAの各+と-の相補鎖を混合の後、緩衝液(20μlの20mM Tris-HCl、pH7.0、50mM NaCl、及び2mM MgCl2)中で85℃、5分間、保温した。
【００６７】
更に、上記両鎖の相補領域をアニーリングするため、ZymoreactorII[ATTO社(日本)製]を用い、その温度を5℃/5分の割合で55℃まで、次に、5℃/10分の割合で25℃まで下げた。アニーリング終了の後、等量の緩衝液[20mM Tris-HCl、pH7.8、10mM MgCl2、5mMのジチオスレイトール(DTT)、4種のnucleoside-5'-triphosphate(NTP)の各1mM NTP、及び3unitsのT4 DNAポリメラーゼ]を添加混合し、4℃で5分、25℃で5分、更に、37℃で120分、順次、保温した。
【００６８】
これより得られた各2本鎖DNA断片は、SE36遺伝子の構築に用いるため、制限酵素KpnI及びBamHIで消化し、pBluescriptII SK+と大腸菌XL1-Blueでクローニングかつ増幅し、各クローンの上記DNA断片の塩基配列をdideoxy法で決定すると共に、全長SE36遺伝子をカバーする8クローンを選定した。これ等の8クローン(8対)の合成2本鎖DNA断片を連結することにより全長SE36遺伝子の2本鎖DNAを調製した。
【００６９】
尚、その際、Pf本来のアミノ酸配列が変化しないよう配慮された塩基配列を利用して、連結用の制限酵素サイトが各対DNAの両末端に導入された。次いで、全長SE36遺伝子は、pBluescriptII SK+でクローニングの後、大腸菌XL1-Blueに移入し増幅すると共に、その塩基配列をdideoxy法で決定した。
【００７０】
次いで、上記クローンの制限酵素NdeI-BamHI断片をプラスミドpET-3aのNdeI及びBamHI両切断サイトに挿入連係し、SE36発現ベクターpET-SE36を構築した。この発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)pLysSに移入することにより形質転換体、大腸菌BL21(DE)pLysS/pET-SE36を作製し、これを大腸菌BL/SE36と命名した。
【００７１】
＜参考例1-2：ポリペプチドの発現と精製＞
上記で得た大腸菌BL/SE36をアンピシリン50μg/ml含有のLB培地[Bacto-trypton 1%(W/V)、Bacto-yeast extract 0.5%(W/V)、及びNaCl 1%(W/V)]で37℃にて18時間培養しシードを調製した。次いで、上述の新鮮LB培地5Lに上記シード50mlを接種した後、37℃で培養した。菌数が1×108/mlに達した時点で、IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を、最終濃度が50μg/mlになるよう添加混合の後、更に、37℃にて3時間培養した。培養終了後、遠心(5,000rpm、10分)により集菌し、細胞ペースト3.2gを得た。このペーストを、9.6mlの氷冷した溶菌(lysis)緩衝液(50mM Tris-HCl、pH8.0、及び1mM EDTA)に懸濁の後、以下(1)-(6)の操作を記載の順に、4℃で行った。
【００７２】
(1)超音波処理
超音波(19.5kHz、50W)で20秒間、6回処理により上記ペースト細胞を破砕の後、その遠心(15,000rpm、30分)上清を採取し、20ml容のビーカーに移注した。
【００７３】
(2)硫安塩析I
上記ビーカー内液に、攪拌下で2.37gの結晶(NH4)2SO4を35%(W/W)飽和になるよう添加混合し、更に、30分間撹拌を続け塩析を行った。次いで、これを遠心(12,000rpm、10分)し、その上清を捨て、沈渣に、30%(W/W)硫安飽和になるよう9mlの氷冷硫安溶液[1.1M(NH4)2SO4を含有の前記lysis緩衝液]を加え、懸濁した。この懸濁液を遠心(12,000rpm、10分)し、その上清を捨てた後、8.8mlの溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA,50mM 2-メルカプトエタノール、9M 尿素、及び1%(W/V)Tween 80]を添加し、沈渣を再懸濁し回収した。この再懸濁液の1/2量(4.4ml)を60℃で10分間保温し、再び氷冷の後、0.45μm-フィルター[Millipore社(米国)製]で濾過した。
【００７４】
(3)カラム精製I
上記濾液を、GF緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、50mM 2-メルカプトエタノール、及び8M 尿素]で平衡化したSephacryl S-300(26/60)カラムクロマトグラフィー(流速0.3ml/分、4℃)で分画(3.5ml/分画)した後、第22-43各分画をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その泳動像に基づき検出されるSE36タンパク質を多量に含む第32-37分画をプールした。残りの再懸濁液(4.4ml)も上記と同様に処理した後、前記の分画プールと併せて次(4)の操作に用いた。
【００７５】
(4)カラム精製II
上記の分画プールを室温に置き、攪拌下でこの分画プール1ml当たり0.093gの(NH4)2SO4を添加混合し、硫安の最終濃度が0.7Mになるよう調整した。一方、容量13mlの水性カラムOctyl Sepharose(Pharmacia Biotech)を10倍量のHlC緩衝液[0.7M(NH4)2SO4を含有の前記GF緩衝液]で平衡化した。このカラムに上記の硫安濃度調整の分画プールを流速0.5ml/分にて流入した。更に、吸光度が下がるまで、HlC緩衝液を流入の後、確認のため、(NH4)2SO4を含有しないGF緩衝液により吸着成分を溶出した。このカラムでの未吸着分画を透析バッグに入れ、1Lの20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)(1mM EDTA含有)を外液に用い4℃で10時間、透析した。尚、この透析の間、外液を2回交換した。
【００７６】
(5)硫安塩析II
透析済みバッグを更に、0.3Lの50%(W/W)飽和(NH4)2SO4溶液[20mM Tris-HCl(pH8.0)及び1mM EDTA含有]を外液に用い4℃で10時間、透析することにより、タンパク質を沈澱させた。この沈殿物は、遠心(12,000rpm、10分)により、沈渣として回収の後、2mlのGF緩衝液に懸濁した。
【００７７】
(6)カラム精製III
上記の懸濁液を60℃で10分間保温の後、4℃に戻した。これを前記0.45μm-フィルターで濾過し、その濾液を流速0.3ml/分にて、GF緩衝液2[10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA、20mM 2-メルカプトエタノール、及び8M 尿素]で平衡化した前記S-300カラム(26/60)にかけ分画した。前述(3)と同様にして、各分画のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、SE36タンパク質の分画を選別の後、これ等をプールして該分画12mlを得た。この分画プールを希釈用緩衝液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、及び2M尿素]に撹拌添加し、SE36タンパク質の濃度が25μg/mlとなるように希釈した。この希釈液を2LのPBS[9mM NaHPO4、3mMNaH2PO4、及び137mM NaCl(pH7.4)]を外液に用い4℃で10時間、透析した。尚、この透析の間、外液を2回交換した。次いで、透析終了後の内液を、Centprep 30で濃縮した後、Durapore 0.22μm-フィルター[Millipore社(米国)製]で濾過滅菌し、オリジナルSE36ポリペプチドを1mg/mlの濃度で含有する無菌標品10mlを得た。
【００７８】
＜参考例1-2：アミノ酸配列決定＞
前述のようにして得られたオリジナルSE36ポリペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質シークエンサーApplied Biosystems 473A[PE社(米国)製]を用いるエドマン分解により決定し、配列番号19に記載されるアミノ酸配列を有することが確認された。
【００７９】
実施例1：オリジナルSE36ポリペプチドによる生体抗マラリア活性賦活
オリジナルSE36ポリペプチドを接種した日本人から得られた血清について、培養マラリア原虫の増殖阻害活性を測定した。この活性がより高ければ、オリジナルSE36ポリペプチドによる、生体の抗マラリア活性を賦活する効果がより高いと判断できる。具体的には以下のように行った。
【００８０】
＜実施例1-1：オリジナルSE36ポリペプチドの投与、及び血清の調製＞
日本人に対して、事前に採血した後、オリジナルSE36ポリペプチド及びアジュバントを皮下注射により投与した（n=18）。1人当たりの投与量は、オリジナルSE36ポリペプチドが0.05あるいは0.1mgであり、アジュバントである水酸化アルミニウムゲルが0.5あるいは1.0mg、K3（KタイプCpGアジュバント）が0.5あるいは1.0mgであった。初回投与から4週間後、採血してから、初回投与と同様に2回目の投与を行った。さらに、2回目の投与から4週間後（初回投与から8週間後）に採血した。
【００８１】
一方で、コントロールとして、マラリアに感染したことの無い日本人（n = 8）、及びウガンダ人成人（n = 45）からも採血した。ウガンダにおいては1人当たり、1.3回／年の頻度でマラリアに感染するといわれており、このためウガンダ人の血清のマラリア原虫増殖阻害活性は比較的高いと考えられる。
【００８２】
上記で採血して得られた血液から定法に従って血清を調製した。
【００８３】
＜実施例1-2：培養マラリア原虫の増殖阻害活性を測定＞
以下に示す4日間の日程で、培養マラリア原虫の調製、及び増殖阻害活性の測定を行った。
【００８４】
1日目
＜パーコール処理＞
パーコールを1xRPMIで希釈して、2種類のパーコール濃度（58.5％及び40％）のパーコール溶液を用意した。これを用いて、遠心管内で、下層：58.5％のパーコール溶液3 ml、及び上層：40％パーコール溶液の2層からなる密度勾配を調製した。一方で、Late Trophozoite/Schizonte-richの原虫培養液を50mlチューブに移し、2000rpm,5min,RT,(Accel2,Decel2)で遠心した。遠心後、上清を取り除いたあと、1xRPMI 24mlを加え再度遠心した。遠心後、上清を取り除いたあと、1xRPMI 1mlを加え、上記で調製した密度勾配を有する遠心管の最上層にのせ、3100rpm,15min,RT(Accel2,Decel1)で遠心した。遠心後、58.5％パーコール溶液層の上に集まったLate Trophozoite/Schizonte-richの原虫を回収し、15mlチューブ内で1xRPMI 3mlと混合してから2000rpm,5min,RT,(Accel2,Decel2)で遠心した。上清を取り除いたあと1xRPMI 5mlを加え再度遠心した。遠心後、上清を取り除いたあと新しい培地（赤血球2%,人血清10%培地)を加えた。培地は原虫量にあわせ調製した（1〜5ml）。
【００８５】
＜ソルビトール処理＞
パーコール処理から6〜8時間経過後に、パーコール処理済の原虫培養液を1xRPMIで1回洗った。遠心して、上清を取り除いたあと、5％ソルビトール溶液を加えて10分間静置した。その後遠心し、上清を取り除いたあと1xRPMI 5mlで2回洗った。新たに人血清10％培地を加え培養を続けた（赤血球2〜3%)
2日目
原虫培養液を顕微鏡観察し、リングを確認した。人血清5%,AlbuMAX0.25%を含む培地に交換した。
【００８６】
3日目
原虫培養液を顕微鏡観察し、segmenterの割合が60％以上になるタイミングで増殖実験を開始した。本実験においては、U底の96穴プレートを使用し、スメアをひくために1サンプル当たり2wellを使用し、1well当たりの最終液量は25ulとした。まず、プレートのまわり1周にミリQを加えておいた。原虫培養液を2000rpm,5min,RT,(Accel2,Decel2)で遠心した。上清を取り除いたあと人血清50%,AlbuMAX0.5%の培地を加えた。赤血球濃度は2％とした(最終濃度は1％)。各wellにおいて、得られた原虫培養液12.5ul、実施例1-1で調製した検体血清5ul、及びIncomplete Medium（IM：ヒト血清を添加していない培地）7.5ul混合して、培養を開始した。また、これとは別に、コントロールとして、検体血清に代えてIMを加えて培養を開始した。
【００８７】
4日目
mature schizonteがいないことを確認後、スメアをひいて、顕微鏡観察によりマラリア原虫が感染した赤血球の割合（感染率）を計測した。計測された感染率を以下の式：
増殖阻害率＝[1-（検体血清群感染率/コントロールの感染率）] x 100  (%)
に代入して、増殖阻害率を算出した。
【００８８】
結果
結果を図１に示す。図１に示されるように、オリジナルSE36ポリペプチドの投与により、血清のマラリア原虫増殖阻害活性が上昇すること（すなわち、生体の抗マラリア活性を賦活されること）が示された。また、その活性は、たった2回しか投与していない場合であっても、年間1回以上感染するといわれているウガンダにおける成人（すなわち、マラリアに数十回感染していると考えられる）の活性よりも高いものであった（図1の「8 W」）。
【００８９】
実施例2：エピトープマッピング
実施例1で得られた、オリジナルSE36ポリペプチドの投与後の検体血清（2回目投与から4週間経過後の血清）を用いてエピトープマッピングを行った。具体的には次のように行った。
【００９０】
（１）固相化抗原の固相化
(1)固相化抗原（オリジナルSE36配列内の連続する42又は40アミノ酸残基からなるペプチド：ペプチド1〜15（配列番号4〜18））を、固相化用緩衝液（50ｍM炭酸―重炭酸緩衝液、ｐH9.6）で0.33μMに希釈した。なお、ペプチド1〜15がオリジナルSE36ポリペプチドのどの部位に相当するかについて表す模式図を、図２に示す。
(2)固相化抗原溶液を96wellプレートに、1well当たり50μずつ添加した。この時、以下の表1に示されるように、一つのプレートに固相化抗原15種類全てが固相化されるようにした。なお、表1中、A〜H及び1〜12はプレートの行及び列を示す記号であり、Bはブランク（緩衝液のみ添加。固相化抗原は添加しない。）のウェルを示し、(1)−(15)はウェルに添加した固相化抗原（ペプチド1〜15）の番号を示し、#1〜#6は以下の工程で添加する検体血清の番号を示す。
【００９１】
【表１】
2017210441.tif 000002
【００９２】
(3)プレートをラップで包む、またはプレートシールを貼り、プレートミキサーで振とう後、冷蔵庫（2−8℃）で一晩静置した。
【００９３】
（２）プレートの洗浄
(1)マイクロプレートウォッシャ−を用い、固相化プレートを175μl/well PBS-Tで３回洗浄した。
(2)洗浄後、ペーパータオルで水気を切った。
【００９４】
（３）ブロッキング
(1)ブロッキング液（5wt/v%スキムミルク/PBS(-)）をすべてのウェルに100μlずつ添加した。
(2)プレートをラップで包む、またはプレートシールを貼り、恒温器 (37±1℃)で60~120分間静置した。
【００９５】
（４）プレートの洗浄
手順（２）と同様に洗浄した。
【００９６】
（５）血清サンプルの一次希釈
検体血清を以下の表2に示すとおりに（トータルIgGの力価に基づいて）希釈液（5wt/v％スキムミルク/PBS-T）で希釈した。なお、表2中、(1)〜(15)はウェルに添加した固相化抗原（ペプチド1〜15）の番号を示す。また、1サンプルにつき、希釈率はすべて同じとし、二回測定する場合は、別のプレートで測定することとした。
【００９７】
【表２】
2017210441.tif 000003
【００９８】
（６）固相化プレートへの血清サンプルの添加
(1)マルチチャンネルピペットを使い、希釈した検体血清を50μlずつペプチド1セットのそれぞれのウェル（例えば、表1のA1-H1とA7-H7）に添加した。
(2)プレートをラップで包む、またはプレートシールを貼り、プレートミキサーで振とう、もしくは指で数回タップして混合した後、恒温器(37±1℃)で60~120分間静置した。
【００９９】
（７）プレートの洗浄
手順（２）と同様に洗浄した。
【０１００】
（８）酵素標識抗体の添加
(1)酵素標識ヤギ抗ヒトIgG抗体（Cappel#55220）を希釈液（5wt/v%スキムミルク/PBS-T）で至適濃度に希釈した（1,000倍希釈）。
(2)得られた抗体希釈液をすべてのウェルに50μlずつ添加した。
(3)プレートをラップで包む、またはプレートシールを貼り、プレートミキサーで振とう、もしくは指で数回タップして混合した後、恒温器(37±1℃)で60~120分間静置した。
【０１０１】
（９）プレートの洗浄
手順（２）と同様に洗浄する。
【０１０２】
（１０）基質液の添加
(1)まず、基質液を調製した。OPD錠（和光純薬工業＃154−01673）を一錠あたり基質緩衝液30mlに溶解した。使用直前に30mlあたり30％過酸化水素水を60μl添加した。
(2)使用直前に調整した基質液をすべてのウェルに50μlずつ添加し、プレートをプレートミキサーで振とう、もしくは指で数回タップして混合した。
(3)アルミホイルで遮光し、室温（22−28℃）で15分間反応させた。
【０１０３】
（１１）反応の停止
反応停止液をすべてのウェルに50μlずつ添加し、プレートをプレートミキサーで振とうした。
【０１０４】
（１２）吸光度測定
(1)プレートをマイクロプレートリーダーにセットし、シェイキング機能で数回振とう後、492nmにおける吸光度（O.D.492nm）を測定した。
(2)測定データをマイクロプレートリーダー付属ソフトウェアの形式とテキスト形式（もしくはExcel形式）で保存した。
(3)測定値を各検体血清のデータ毎に次式：
Percentage＝検体血清とペプチド1〜15のいずれかとの反応量（吸光度に基づく値）／検体血清とペプチド1〜15全てとの反応量の総和
に代入して、算出された値をグラフ化した（図３）。なお、反応量は、固相化抗原である各ペプチドが添加されたウェルの吸光度から、固相化抗原が添加されていないウェルの吸光度を減じて得られる値に基づいて算出される値である。
【０１０５】
結果
結果を図３に示す。図３に示されるように、オリジナルSE36ポリペプチドの投与は、該ポリペプチドの中央領域（ペプチド7〜11（特にペプチド7〜9及び11））を認識するもののそれ以外のペプチドはほとんど認識しない抗体を誘導していることが明らかとなった。また、この結果と図２の模式図から、オリジナルSE36ポリペプチド投与により誘導される抗体のエピトープは、オリジナルSE36ポリペプチドの127〜252番目（特に127〜190番目（特に149〜190番目）及び233〜252番目）のアミノ酸領域であることが示唆された。
【０１０６】
なお、従来は、オリジナルSE36ポリペプチドのN末端領域（ペプチド1〜3中の8 merリピート領域、セリンリッチ領域）が熱帯熱マラリア原虫に対する抗体の防御エピトープであるとされていたところ、この発見は全くの予想外であった。
【０１０７】
以上より、オリジナルSE36ポリペプチドの上記した中央領域のエピトープを含む比較的短いポリペプチドを免疫することにより、オリジナルSE36ポリペプチド又は該ポリペプチドのN末端領域を反復させたポリペプチドを免疫する場合よりも、より効率的に、生体内において、マラリア原虫増殖阻害活性を有する抗体を誘導可能であること（すなわち、生体の抗マラリア活性を賦活可能であること）が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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