(57)【要約】【課題】癌、好ましくはスキルス胃癌をはじめとする胃癌の罹患の有無若しくは罹患の可能性の判別方法、又はこれらの癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供することを課題とする。【解決手段】IGF1R遺伝子の変異を検出する工程を含む、癌の罹患の有無又は癌の罹患の可能性の判別方法、並びにIGF1R遺伝子の変異を有する被験者の癌を治療及び／又は予防するための、IGF1R阻害剤を含む医薬組成物。【選択図】図３
2017042111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の罹患の有無又は罹患の可能性の判別方法であって、
被験者から得られたサンプルにおいてIGF1R遺伝子の変異を検出する検出工程、及び
前記変異が検出された場合に、該被験者が癌に罹患しているか又は罹患する可能性が高いと決定する決定工程を含み、前記変異が、
（a）CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子を形成する変異であって、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、
（i）配列番号33で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜10位のアミノ酸を含み、かつ配列番号34で示されるアミノ酸配列における少なくとも850位〜1367位のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
（ii）（i）のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
（iii）（i）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記変異、又は
（b）IGF1R遺伝子のコピー数が増加した重複変異
である、前記方法。
【請求項２】
前記5'末端領域が、CD44遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合遺伝子のコピー数が２以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程が、ゲノム上の前記融合遺伝子、前記融合遺伝子から発現したmRNA、又は前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
癌が未分化癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
未分化癌が、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又はスキルス胃癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
IGF1R遺伝子の変異を有する被験者の癌を治療及び／又は予防するための、IGF1Rの阻害剤を有効成分として含む医薬組成物であって、前記変異が、
（a）CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子を形成する変異であって、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、
（i）配列番号33で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜10位のアミノ酸を含み、配列番号34で示されるアミノ酸配列における少なくとも900位〜1388位のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
（ii）（i）のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
（iii）（i）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記変異、又は
（b）IGF1R遺伝子のコピー数が増加した重複変異
である、前記医薬組成物。
【請求項９】
前記5'末端領域が、CD44遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記融合遺伝子のコピー数が２以上である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列
を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌が未分化癌である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
未分化癌が、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又はスキルス胃癌である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
IGF1Rの阻害剤が、リンシチニブ（linsitinib）、IGF1Rの阻害性核酸、BVP-51004、GSK1904529A、GSK1838705A、NVP-AEW541、及びBMS-754807からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
CD44タンパク質の一部及びIGF1Rタンパク質の一部を含む融合ポリペプチドであって、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列、
配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基酸配列、又は
配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列
を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１５に記載のポリペプチド又は請求項１６若しくは１７に記載のポリヌクレオチドからなる癌検出用マーカー。
【請求項１９】
CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子、又は該融合遺伝子から発現したmRNAを特異的に検出するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットであって、
（１）フォワードプライマーが配列番号31の連続する14〜30塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32の相補的な配列の連続する14〜30塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は
（２）フォワードプライマーが配列番号31の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、
前記プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の罹患の有無又は癌の罹患の可能性の判別方法、及び癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全世界において主要な死因の一つであり、なかでも胃癌は世界の癌による死因の第3位を占め、毎年約70万人が胃癌により亡くなっている。胃癌の一種であるスキルス胃癌は、早期から胃の粘膜下に広がる浸潤性の癌であり、レントゲン撮影や上部消化管内視鏡検査によっても発見が困難である。スキルス胃癌が進行すると5年生存率が約1割程度となり、きわめて予後不良である（非特許文献１）。しかも、スキルス胃癌の発症年齢は30〜40代と若年であり、有効な治療法もほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chen C. Y. et al., Hepatogastroenterology, 2002, Vol. 49, pp. 874-877.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、癌、好ましくはスキルス胃癌をはじめとする胃癌の罹患の有無若しくは罹患の可能性の判別方法、又はこれらの癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、癌細胞株であるOCUM-8から調製したcDNAを網羅的に配列解析することにより、IGF-1R遺伝子の変異が発癌原因となること、及びIGF-1Rの阻害剤が、IGF-1R遺伝子の変異を有する被験者の癌に対する有効な治療剤となり得ることを見出し、本願発明を完成させた。
【０００６】
したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）癌の罹患の有無又は罹患の可能性の判別方法であって、被験者から得られたサンプルにおいてIGF1R遺伝子の変異を検出する検出工程、及び前記変異が検出された場合に、該被験者が癌に罹患しているか又は罹患する可能性が高いと決定する決定工程を含み、前記変異が、（a）CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子を形成する変異であって、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、（i）配列番号33で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜10位のアミノ酸を含み、かつ配列番号34で示されるアミノ酸配列における少なくとも850位〜1367位のアミノ酸を含むアミノ酸配列、（ii）（i）のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は（iii）（i）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記変異、又は（b）IGF1R遺伝子のコピー数が増加した重複変異である、前記方法。
（２）前記5'末端領域が、CD44遺伝子のプロモーター領域を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記融合遺伝子のコピー数が２以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記検出工程が、ゲノム上の前記融合遺伝子、前記融合遺伝子から発現したmRNA、又は前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）癌が未分化癌である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）未分化癌が、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又はスキルス胃癌である、（６）に記載の方法。
（８）IGF1R遺伝子の変異を有する被験者の癌を治療及び／又は予防するための、IGF1Rの阻害剤を有効成分として含む医薬組成物であって、前記変異が、（a）CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子を形成する変異であって、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、（i）配列番号33で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜10位のアミノ酸を含み、配列番号34で示されるアミノ酸配列における少なくとも900位〜1388位のアミノ酸を含むアミノ酸配列、（ii）（i）のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は（iii）（i）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記変異、又は（b）IGF1R遺伝子のコピー数が増加した重複変異である、前記医薬組成物。
（９）前記5'末端領域が、CD44遺伝子のプロモーター領域を含む、（８）に記載の医薬組成物。
（１０）前記融合遺伝子のコピー数が２以上である、（８）又は（９）に記載の医薬組成物。
（１１）前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドが、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、（８）〜（１０）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１２）癌が未分化癌である、（８）〜（１１）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１３）未分化癌が、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又はスキルス胃癌である、（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）IGF1Rの阻害剤が、リンシチニブ（linsitinib）、IGF1Rの阻害性核酸、BVP-51004、GSK1904529A、GSK1838705A、NVP-AEW541、及びBMS-754807からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤である、（８）〜（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１５）CD44タンパク質の一部及びIGF1Rタンパク質の一部を含む融合ポリペプチドであって、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
（１６）（１５）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１７）配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列、配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基酸配列、又は配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む、（１６）に記載のポリヌクレオチド。
（１８）（１５）に記載のポリペプチド又は（１６）若しくは（１７）に記載のポリヌクレオチドからなる癌検出用マーカー。
（１９）CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子、又は該融合遺伝子から発現したmRNAを特異的に検出するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットであって、（１）フォワードプライマーが配列番号31の連続する14〜30塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32の相補的な配列の連続する14〜30塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は（２）フォワードプライマーが配列番号31の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、前記プライマーセット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によって、新規なIGF1R遺伝子の変異を検出することで、迅速かつ簡便に癌の罹患の有無又は罹患の可能性を判別することができる。また、本発明の医薬組成物により、IGF-1R遺伝子の変異を有する被験者に対して効果的な治療及び／又は予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、CD44-IGF1R融合遺伝子によってコードされるタンパク質の一例を示す模式図である。該タンパク質は、Lectin（レクチン）ドメイン及びTM（膜貫通）ドメインを欠くCD44のN末端領域と、FN3(フィブロネクチン3）型ドメインを欠き、Kinase（キナーゼ）ドメイン及びTMドメインを含むIGF1RのC末端領域とからなる。
【図２】図2は、CD44-IGF1R融合遺伝子における融合領域及びその周辺の塩基配列を示す。CD44遺伝子部分を枠で囲まれていない領域で、IGF1R遺伝子部分を枠で囲んだ領域で示す。また、各遺伝子につき、エクソン部分を大文字かつ太文字で、イントロン部分を小文字で示す。
【図３】図3は、形質転換した3T3細胞の増殖アッセイを示す。aは遺伝子を挿入していないレトロウィルスで形質転換した細胞を示す。bは野生型のCD44遺伝子を、cは野生型のIGF1R遺伝子を、dはCD44とIGF1Rの融合遺伝子を、eはCD44とIGF1Rの融合遺伝子（ただし、IGF1R中のチロシンキナーゼ酵素活性を欠く変異を有する）を、それぞれ含むレトロウィルスで形質転換した細胞を示す。fは公知の発癌性融合遺伝子であるEML4（エキノダームマイクロチューブルアソシエートプロテインライク4、echinoderm microtubule associated protein-like 4）-ALK（アナプラスチックリンフォーマキナーゼ、Anaplastic Lymphoma Kinase）を含むレトロウィルスで形質転換した細胞を示す。
【図４】図4は、形質転換した3T3細胞の、ヌードマウスにおける腫瘍形成アッセイを示す。形質転換した3T3細胞を、ヌードマウスに接種して腫瘍形成能の有無を観察した。a〜fの意味は、上記の通りである。図中の数字は、（腫瘍が形成された部位の数）／（細胞を接種した部位の数）を示す。
【図５】図5は、IGF1R阻害剤（リンシチニブ)による細胞株の増殖抑制効果を示す。Aはスキルス胃癌細胞株であるOCUM-8、Bはスキルス胃癌細胞株であるNUGC4に対する効果を示す。縦軸は生細胞数の、リンシチニブ非投与時を1としたときの相対値を、横軸はリンシチニブの投与濃度を示す。
【図６】図6は、リンシチニブを各濃度で加えたOCUM-8細胞（A）又はNUGC4細胞（B）における、p-IGF1R抗体又はIGF1R抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。p-IGF1R抗体はリン酸化IGF1Rに対する抗体を、IGF1R抗体はリン酸化の有無にかかわらずIGF1Rを認識する抗体を用いた際の結果をそれぞれ示す。
【図７】図7は、IGF1Rに対するshRNA（#1〜#3のいずれか）及びGFPを発現するレトロウイルスベクターをOCUM-8細胞（A）又はNUGC4細胞（B）に導入した際の、GFP陽性細胞率の推移を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．癌の罹患の有無又は罹患の可能性の判別方法
一態様において、本発明は、癌の罹患の有無又は罹患の可能性の判別方法であって、被験者から得られたサンプルにおいてIGF1R（insulin-like growth factor 1 receptor、インスリン様成長因子1受容体）遺伝子の変異を検出する検出工程、及び前記変異が検出された場合に、該被験者が癌に罹患しているか又は罹患する可能性が高いと決定する決定工程を含む前記方法に関する。
【００１０】
本明細書において、癌の種類は、IGF1R遺伝子の変異に起因するものであれば、特に限定しないが、例えば、脳腫瘍、咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、小腸癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは胃癌が挙げられる。本発明の方法を適用することができる癌として、好ましくは未分化な細胞が癌化したものである未分化癌が挙げられる。本明細書において、「未分化癌」は、未分化な細胞が癌化したものである未分化癌に加えて、低分化な細胞が癌化したものである低分化癌を含む。未分化癌の例として、例えば、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又は胃の浸潤性未分化癌（スキルス胃癌）、特に好ましくはスキルス胃癌が挙げられる。
【００１１】
本明細書において、「被験者」は、癌の罹患が疑われる個体、及び健常な個体のいずれであってもよい。癌の罹患が疑われる個体について本発明の方法を適用することにより、癌の罹患の有無をより正確に判断することができ、健常な個体について本発明の方法を適用することにより、被験者が将来的に癌に罹患する可能性の高さを判断することができる。
【００１２】
本明細書において、「サンプル」とは、本発明の方法に供される生体試料を意味する。本発明において使用可能なサンプルとしては、限定するものではないが、例えば生体から単離した細胞又は組織が挙げられる。組織の例として、癌の病変部位、例えば、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、胃、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、卵巣、好ましくは胃等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。
【００１３】
本発明の方法の検出工程において検出される「IGF1R遺伝子の変異」は、CD44遺伝子とIGF1R遺伝子の融合遺伝子が形成される融合変異、又はIGF1R遺伝子のコピー数が増加する重複変異である。本発明の方法の検出工程において検出される融合変異及び重複変異について、以下に詳細に説明する。
【００１４】
＜融合変異＞
本明細書において、IGF1R遺伝子の「融合変異」とは、CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子を形成する変異である。前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、（i）配列番号33(ヒトCD44のアミノ酸配列)で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜5位、1位〜10位、又は1位〜22位のアミノ酸を含み、配列番号34(ヒトIGF1Rのアミノ酸配列)で示されるアミノ酸配列における少なくとも950位〜1367位、900位〜1367位、850位〜1367位、若しくは829位〜1367位のアミノ酸を含むアミノ酸配列、好ましくは配列番号33で示されるアミノ酸配列における少なくとも1位〜22位のアミノ酸を含み、配列番号34で示されるアミノ酸配列における少なくとも829位〜1367位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含んでよい。
【００１５】
また、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、（ii）上記（i）のアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。本明細書において、同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
【００１６】
また、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、（iii）上記（i）又は（ii）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含んでよい。本明細書において、「１若しくは数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
【００１７】
前記融合遺伝子は、好ましくはCD44遺伝子のエクソン1から2〜16のいずれかまで、及びIGF1R遺伝子のエクソン12から最終エクソンまで、を含むmRNAを発現する。したがって、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、好ましくは配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む。前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、特に好ましくは配列番号16で示されるアミノ酸配列、配列番号16で示されるアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む。
【００１８】
前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、好ましくはIGF1R遺伝子に由来するキナーゼ活性を有する。本明細書において、「キナーゼ活性」とは、チロシンをリン酸化する酵素としての活性を意味する。ポリペプチドのキナーゼ活性の有無は、本分野で公知の方法により特定することができ、例えば融合遺伝子を適当な細胞（例えば哺乳類細胞）に導入し、リン酸化IGF1Rに対する抗体を用いて自己リン酸化の有無を調べることで決定することができる。キナーゼ活性の測定法の詳細については、例えば本明細書の実施例５を参照されたい。
【００１９】
また、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドは、好ましくは造腫瘍能活性を有する。ポリペプチドの造腫瘍能活性の有無は、本分野で公知の方法により特定することができ、例えば融合遺伝子を適当な細胞（例えば哺乳類細胞）に導入し、該細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍の形成の有無を観察することによって決定することができる。造腫瘍能活性の有無の測定法の詳細については、例えば本明細書の実施例４を参照されたい。
【００２０】
前記融合遺伝子は、好ましくはCD44遺伝子のプロモーター領域を含む。また、前記融合遺伝子は、好ましくはゲノムにおけるコピー数が２以上、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上である。前記融合遺伝子は、CD44遺伝子のプロモーター領域を有すること、及び／又は複数のコピーが存在することによって、過剰発現していることが好ましい。
【００２１】
＜重複変異＞
本明細書において、IGF1R遺伝子の「重複変異」とは、IGF1R遺伝子のコピー数が増加した変異を意味する。重複変異を有する被験者において、IGF1R遺伝子のゲノムにおけるコピー数は、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上である。本明細書において、IGF1R遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号34で示されるアミノ酸配列、配列番号34で示されるアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号34で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む。
【００２２】
IGF1R遺伝子によりコードされるポリペプチドは、好ましくはIGF1R遺伝子に由来するキナーゼ活性を有する。
【００２３】
＜変異を検出する検出工程＞
本発明の判別方法において、IGF1R遺伝子の変異を検出する工程は、例えば、ゲノム上のIGF1R遺伝子若しくは前記融合遺伝子、前記融合遺伝子から発現したmRNA、又は前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出する工程であってよい。
【００２４】
ゲノム上の遺伝子の検出は、例えば公知の方法により抽出したゲノムDNAを用いて行うことができ、ゲノムDNAの抽出は、市販のDNA抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。また、前記融合遺伝子から発現したmRNAを検出する工程は、mRNAを用いて行ってもよいし、サンプルから抽出したmRNAを逆転写したcDNAを用いて行ってもよい。mRNAの抽出及び逆転写は、例えば市販のmRNA抽出キット及び逆転写キットを用いて簡便に行なうことができる。
【００２５】
ゲノム上のIGF1R遺伝子若しくは前記融合遺伝子、又は前記融合遺伝子から発現したmRNAを検出する工程は、公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるPCR法、Real-time PCR法、LCR(Ligase chain reaction)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、及びin situ hybridization法等）に従って実施することができる。例えば、被験者から得られたサンプル由来の核酸、例えばmRNA等を用いて、適当なプライマーを用いる遺伝子増幅技術、又は適当なプローブを用いるハイブリダイゼーション技術等を利用する。ゲノム上のDNA又はmRNAの検出は定性的又は定量的に行うことができ、定量的に行う場合、DNA又はmRNA量は、例えば遺伝子増幅反応方法にて測定することができる。
【００２６】
本検出工程において前記融合遺伝子を検出するために用いられるプライマーは、前記融合遺伝子を特異的に増幅できるものであれば、特に限定されず、前記融合遺伝子、又は前記融合遺伝子から発現したmRNAの塩基配列に基づいて設計することができる。同様に、本検出工程において前記融合遺伝子を検出するために用いられるプローブは、前記融合遺伝子に特異的にハイブリダイズできるものであれば、特に限定されず、前記融合遺伝子、又は前記融合遺伝子から発現したmRNAの塩基配列に基づいて設計することができる。前記融合遺伝子を検出するために用いることができるプライマー及びプローブとして、例えば以下の＜５．IGF1R遺伝子の変異を検出するためのプライマー、プローブ、及びこれらを含むキット＞において記載するプライマーセット及びプローブが挙げられる。
【００２７】
本検出工程においてゲノム上のIGF1R遺伝子のコピー数を測定するために用いるプライマー及びプローブは、IGF1R遺伝子を特異的に増幅又はIGF1R遺伝子に特異的にハイブリダイズできるものであれば特に限定されず、IGF1R遺伝子（配列番号45）、又はIGF1R遺伝子から発現したmRNAに由来するcDNAの塩基配列（配列番号44）に基づいて設計することができる。IGF1R遺伝子を増幅するためのプライマー配列の例として、例えば（１）フォワードプライマーが配列番号44又は45の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号44又は45の相補的な配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は（２）フォワードプライマーが配列番号44又は45の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号44又は45の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC (83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００２９】
IGF1R遺伝子を増幅するためのプローブの例として、例えば、（１）配列番号44又は45の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（２）配列番号44又は45の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
IGF1R遺伝子の変異の有無は、各技術に適した方法によって確認することができる。例えば、PCR法では、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認することで、変異の有無を検出することができる。例えば、融合遺伝子又は前記融合遺伝から発現したmRNAに相当するサイズを有する増幅断片が得られた場合、被験者から得られたサンプルにおいて、前記融合遺伝子が存在していたことが推定される。このようにして、IGF1R遺伝子の変異の有無を検出することができる。
【００３１】
前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出する工程は、例えば被験者から得られたサンプル由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドに対して、抗CD44抗体及び抗IGF1R抗体を用いて、又は前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いて、免疫学的測定法又は酵素活性測定法等を行うことにより、実施できる。好適には、前記融合遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウエスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。
【００３２】
本発明の方法は、他の方法（例えば、レントゲン撮影及び内視鏡検査等）と組み合わせて用いることができる。他の癌の判別方法又は診断方法と組み合わせることで、本発明の判別方法の精度を高めることができる。
【００３３】
２．医薬組成物
一態様において、本発明は、IGF1R遺伝子の変異を有する被験者の癌を治療及び／又は予防するための、IGF1Rの阻害剤を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、有効成分としてIGF1Rの阻害剤を含む。IGF1Rの阻害剤は、IGF1Rの活性を阻害し得るものであれば特に限定しないが、例えば、リンシチニブ（linsitinib）（例えば、Cancer Res., 2013, 73(2):834-43参照）、IGF1Rの阻害性核酸、BVP-51004（例えば、Oncol. Lett., 2010, 1(1), 195-201参照）、GSK1904529A（例えば、Cell Death Dis., 2012, 3(6), e336参照）、GSK1838705A（例えば、Mol Cell Proteomics., 2012, 11(6), M112.017764参照）、NVP-AEW541（例えば、Cancer Discov. 2012, 2(3), 227-235参照）、及びBMS-754807（Clin Cancer Res,2013, 19(11):2984-94）が挙げられる。これらの阻害剤は単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
本明細書において、阻害性核酸にはshRNA及びsiRNAが含まれる。「shRNA」（short hairpin RNA）とは、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって下記のsiRNA又は成熟型二本鎖miRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖RNAをいう。つまり、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成ことによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成している。
【００３６】
本明細書において、「siRNA」（低分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。
【００３７】
IGF1Rに対するsiRNA若しくはshRNAは、IGF1Rの配列に基づいて、当業者であれば適宜設計することができる。そのような配列として、例えば配列番号41〜43のいずれかで示される配列を含むヌクレオチド由来のshRNAが挙げられる。阻害性核酸は、ベクターに導入して被験者に投与することが好ましく、阻害性核酸の送達に用いることができるベクターとして、例えばレトロウィルスベクターpMKO.1-GFPが挙げられる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、IGF1Rの阻害剤以外に、他の有効成分、例えば、5-FU（フルオロウラシル）、メトトレキサート、ロイコボリン、及びトラスツズマブ等の抗癌剤を含んでもよい。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、原則として当該分野で公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を用いればよい。具体的な製剤化の方法は、投与方法によって異なる。投与方法は、経口投与と非経口投与に大別され、投与方法は適宜選択することができる。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、製薬上許容可能な担体を添加してもよい。
【００４０】
「製薬上許容可能な担体」とは、薬剤の製剤化や生体への適用を容易にし、その有効成分の作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられる。
【００４１】
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００４３】
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【００４４】
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【００４５】
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【００４６】
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４７】
経口剤の剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【００４８】
本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、その具体例としては、注射による投与が挙げられる。本発明の医薬組成物を注射で投与する場合、製薬上許容可能な溶媒と混合し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加えた懸濁液剤として調製することができる。
【００４９】
「製薬上許容可能な溶媒」は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は油性液のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、及び塩化ナトリウム、並びに低濃度の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80（TM）、HCO-60）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油性液としては、ゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として例えば安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用することもできる。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。
【００５０】
注射剤は、製薬上許容される賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよい。
【００５１】
注射は、例えば、血管内注射、リンパ管内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられ、全身投与である血管内注射又はリンパ管内注射等の循環器内投与が好ましいが、リンパ腫へ直接的に投与する局所投与であってもよい。
【００５２】
本発明の医薬組成物における有効成分の含有量は、原則1回の投与でその有効成分が標的部位に達し得る量、かつそれを適用する被験者に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量であればよい。このような含有量は、癌の進行度、IGF1R阻害剤の種類、腫瘍の大きさ、医薬組成物の剤形及び投与方法によって異なるが、当業者によって適宜定められる。
【００５３】
本発明の医薬組成物が投与される被験者（本発明の医薬組成物の適用対象となる被験者）が有するIGF1R遺伝子の変異については、上記＜１．癌の罹患の有無又は罹患の可能性の判別方法＞において記載した通りであるからここでは記載を省略する。
【００５４】
本発明の医薬組成物の治療及び／又は予防の対象となる癌の種類は、IGF1R遺伝子の変異に起因するものであれば、特に限定しないが、例えば、脳腫瘍、咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、小腸癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは胃癌が挙げられる。本発明の医薬組成物を適用することができる癌として、好ましくは未分化癌、例えば、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、若しくは卵巣の未分化癌、未分化のリンパ腫若しくは黒色腫、又は胃の未分化癌（スキルス胃癌）、特に好ましくはスキルス胃癌が挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、例えば、本発明の方法、すなわち、癌の罹患の有無又は癌の罹患の可能性の判別方法を適用した被験者に対して投与することができる。癌を罹患している被験者に対して本発明の医薬組成物を投与することで治療的効果が、癌を罹患する可能性が高い被験者に対して本発明の医薬組成物を投与することで予防的効果が期待される。
【００５６】
３．癌の治療及び／又は予防方法
一態様において、本発明は、上記IGF1Rの阻害剤、又は上記医薬組成物を被験者に投与することを含む、IGF1R遺伝子の変異を有する被験者の癌の治療及び／又は予防方法に関する。
【００５７】
本発明の治療及び／又は予防方法は、好ましくは本発明の方法、すなわち、癌の罹患の有無又は癌の罹患の可能性の判別方法を適用した被験者に対して行うことができる。すなわち、上記判別方法によって癌を罹患していると判別された被験者に対してIGF1Rの阻害剤又は上記医薬組成物を投与することにより治療効果が、癌を罹患する可能性が高いと判別された被験者に対してIGF1Rの阻害剤又は上記医薬組成物を投与することにより予防的効果が期待される。
【００５８】
４．融合ポリペプチド及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
一態様において、本発明は、CD44タンパク質の一部及びIGF1Rタンパク質の一部を含む融合ポリペプチドであって、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列、配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16〜30のいずれかで示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチドに関する。好ましくは前記融合ポリペプチドは、配列番号16で示されるアミノ酸配列、配列番号16で示されるアミノ酸配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号16で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含む。
【００５９】
本発明の融合ポリペプチドは、好ましくはIGF1R遺伝子に由来するキナーゼ活性を有する。また、本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは造腫瘍能活性を有する。キナーゼ活性及び造腫瘍能活性の測定方法については、上記＜融合変異＞において記載した通りであるからここでは記載を省略する。
【００６０】
前記融合ポリペプチドは、例えば、前記融合遺伝子を有すると判断された被験者から得られたサンプルから、又は、前記融合遺伝子又はその断片を適当なベクターに組込み、このベクターを導入した宿主細胞から、公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体等を利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理等、を単独で又は1以上組み合わせて用いて精製することが可能である。
【００６１】
また、一態様において、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列、配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号1〜15のいずれかで示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。好ましくは前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1で示される塩基配列、配列番号1で示される塩基配列に対して例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法として、例えば、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちcDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸配列を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、及び（３）化学合成法を挙げることができる。例えば、前記融合遺伝子を有すると判断された被験者から得られたサンプルから抽出されたmRNAに対してPCRを行うことにより、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
【００６３】
また、一態様において、本発明は、前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドからなる癌検出用マーカーに関する。
【００６４】
５．IGF1R遺伝子の変異を検出するためのプライマー、プローブ、及びこれらを含むキット
一態様において、本発明は、IGF1R遺伝子の変異を検出するためのプライマーセットに関する。本発明のプライマーセットは、IGF1R遺伝子の変異を検出できるものであれば特に限定しないが、例えば、（１）フォワードプライマーが配列番号31（CD44遺伝子のエクソン1〜イントロン1の配列）の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32（IGF1R遺伝子のイントロン11-最終エクソン（エクソン21）の配列）の相補的な配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は（２）フォワードプライマーが配列番号31の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号32の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
【００６５】
本発明のプライマーセットは、好ましくは前記融合遺伝子から発現したmRNAの配列を基に設計することができる。したがって、本発明のプライマーセットは、例えば、フォワードプライマーが配列番号35の1位〜82位の配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号35の83位〜1711位の配列の相補的な配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は（２）フォワードプライマーが配列番号35の1位〜82位の配列の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号35の83位〜1711位の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
【００６６】
本発明のプライマーセットは、CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子（例えば、上記＜融合変異＞において記載した融合遺伝子）、又は該融合遺伝子から発現したmRNAを特異的に検出することができる。
【００６７】
また、PCR産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、フォワードプライマーとリバースプライマーは、ゲノムDNA又はmRNA若しくはcDNAを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが、例えば10kbp以下、好ましくは5kbp以下、4kbp以下、3kbp以下、2kbp以下、又は1kb以下になるように設定するのが適切である。
【００６８】
一態様において、本発明は、IGF1R遺伝子の変異を検出するためのプローブに関する。本発明のプローブは、IGF1R遺伝子の変異を検出できるものであれば特に限定しないが、例えば、（１）配列番号31の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列、及び配列番号32の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（２）配列番号31の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列、及び配列番号32の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなってよい。
【００６９】
本発明のプローブは、好ましくは該融合遺伝子から発現したmRNAの配列を基に設計することができる。したがって、本発明のプローブは、例えば、配列番号35の1位〜82位の配列の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列、及び配列番号35の83位〜1711位の配列の相補的な配列の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなるか、又は（２）配列番号35の1位〜82位の配列の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列、及び配列番号35の83位〜1711位の配列の相補的な配列の連続する少なくとも7、例えば10、好ましくは15の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなってよい。
【００７０】
本発明のプローブは、CD44遺伝子の5'末端領域を5'側に含み、IGF1R遺伝子の3'末端領域を3'側に含む融合遺伝子（例えば、上記＜融合変異＞において記載した融合遺伝子）、又は該融合遺伝子から発現したmRNAを特異的に検出することができる。
【００７１】
本発明のプライマー及びプローブは、当業者に知られる公知の方法により製造することができ、限定されるものではないが、例えば化学合成法によって製造することができる。
【００７２】
一態様において、本発明は、上記プライマーセット又はプローブを含む、IGF1R遺伝子の変異を検出するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマーセット又はプローブに加えて、例えば、バッファー、酵素、及び使用説明書等を含んでもよい。
【実施例】
【００７３】
［実施例１：スキルス胃癌細胞株における融合遺伝子の探索］
＜方法＞
１．細胞培養
スキルス胃癌細胞株NUGC4はJCRB細胞バンク（http://cellbank.nibio.go.jp）より入手した。他のスキルス胃癌細胞株OCUM-8（Takemura S. et al., “Novel models for F human scirrhous gastric carcinoma in vivo” Cancer Sci. 95, pp. 893-900, 2004）は八代正和博士より供与された。マウス3T3線維芽細胞とヒトHEK293細胞はAmerican Type Culture Collectionより入手した。いずれの細胞株もDulbecco’s modified Eagle’s medium-F12（DMEM-F12）培養メディウム（Invitrogen社より購入）に仔牛胎児血清を10%、L-glutamineを2 mMになるよう添加した培地で培養した。なお、後の実施例における細胞培養の手順も、同様の手順により行った。
【００７４】
２．網羅的遺伝子配列解析
OCUM-8細胞よりRNAをRNeasy Mini kit（QIAGEN社）にて調製し、NEBNext Ultra Directional RNA library kit (New England BioLabs社）を用いて、添付のプロトコルに従ってcDNAを合成した。さらに、このcDNAよりHiSeq2500シーケンサー（Illumina社）を用いて、大量の塩基配列情報を得た。実際には、HiSeq 2500のpaired-end optionを用い、各クラスターの両端から100 bp塩基配列を読んだ。これら大量の配列情報から、deFuseソフトウェア（https://bitbucket.org/dranew/defuse）を用いて、融合遺伝子cDNAの候補を選び出した。
【００７５】
＜結果＞
OCUM-8細胞から調製したmRNAよりcDNAを合成し断片化した。これらcDNA断片の両端配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に塩基配列解析をし、計2億1千万個のリード情報を得た。その中で異なる遺伝子が融合しているものを探したところ、細胞膜タンパクをコードするCD44（Cluster of differentiation 44）遺伝子とインスリン様成長因子1受容体（insulin-like growth factor 1 receptor）遺伝子の融合cDNAを発見した。この遺伝子融合によってCD44 cDNA（NM_000610）の塩基番号501が、IGF1R cDNA（NM_000875）の塩基番号3529につながる（CD44のエクソン1からIGF1Rのエクソン12につながるcDNA（配列番号35）、タンパク質コード部分のcDNA配列は配列番号1）。本cDNAは、CD44タンパク質のアミノ末端側22アミノ酸とIGF1Rタンパク質のカルボキシル末端側539アミノ酸がin-frameでつながった新規融合タンパク質CD44-IGF1Rをコードしている（配列番号16、図1）。CD44-IGF1Rタンパク質はCD44のアミノ末端22アミノ酸がIGF1Rの膜蛋白貫通ドメインの直上につながる形になり、計561アミノ酸のタンパク質をコードする。またCD44-IGF1Rには、IGF1Rが持つチロシンキナーゼドメインが含まれる。
【００７６】
また、大規模ながんゲノムプロジェクトの塩基配列データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap）においても、CD44とIGF1R遺伝子の融合をサポートするRNAの存在を見つけることができたことから、これらの融合遺伝子は臨床検体にも存在すると考えられた。
【００７７】
［実施例２：ゲノム上の遺伝子融合部位の確認］
＜方法＞
CD44-IGF1R全長cDNAを得るために、実施例１と同様に調製したOCUM-8細胞のcDNAを基質としてCD44上のセンスプライマー（5’-TTCGCTCCGGACACCATGGACAAG-3’（配列番号37））とIGF1R上のアンチセンスプライマー（5’-GATCCAAGGATCAGCAGGTCGAAG-3’（配列番号38））を用いてpolymerase chain reaction (PCR)反応を行った。反応はPrimerSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）を用い添付のプロトコルに従って、98℃10秒−68℃4分半のサイクルを40回行った。またゲノム上のCD44とIGF1Rの融合点を明らかにするために、OCUM-8よりゲノムDNAをQIAamp DNA Mini kit（QIAGEN社）により調製し、そのゲノムDNAを基質として、CD44遺伝子上のセンスプライマー5’-TGGACAAGTTTTGGTGGCACGCAG-3’（配列番号39）とIGF1R遺伝子上のアンチセンスプライマー5’-TCACTGGCCCAGGAATGTCATCTG-3’ （配列番号40）を用いて上記と同様にPCRを行った。
【００７８】
＜結果＞
両遺伝子のゲノムレベルでの融合を確認するためにOCUM-8からゲノムDNAを調製し、染色体11番の短腕上に存在するCD44遺伝子のエクソン1上にセンスプライマーを設置し、染色体15番長腕上に存在するIGF1R遺伝子のエクソン12上にアンチセンスプライマーを設置してPCR反応をしたところ、PCR産物が得られ、実際にCD44遺伝子とIGF1R遺伝子が融合していることが確認された。PCR産物の塩基配列を決定したところ（図2、配列番号36）、CD44遺伝子はエクソン1から1499 bp離れたイントロン1内の箇所で切断され、IGF1R遺伝子のエクソン12から917 bp上流に融合していることがわかった。したがってOCUM-8細胞はt(11p13;15q26)染色体転座を有することになる。
【００７９】
［実施例３：融合遺伝子のコピー数の推定］
＜方法＞
OCUM-8細胞より実施例２と同様の方法で得たゲノムDNAをsingle nucleotide polymorphism (SNP)測定DNAマイクロアレイであるHumanOmni2.5 BeadChip (Illumina社)にハイブリダイズさせ、そのデータを元にQuantiSNPソフトウェア（Colella S. et al., “QuantiSNP: an Objective Bayes Hidden-Markov Model to detect and accurately map copy number variation using SNP genotyping data” Nucleic Acids Res., 35, pp. 2013-2025, 2007）を用いて各SNP箇所の染色体コピー数を計測した。
【００８０】
＜結果＞
OCUM-8細胞の染色体コピー数を調べたところ、染色体15番の99,470,155塩基対から99,877,293塩基対までの領域がコピー数4になっていた。本領域はIGF1R遺伝子を含む。また染色体11番の35,204,885塩基対から35,331,935塩基対までの領域もコピー数が4になっており、同領域にはCD44遺伝子が含まれる。すなわちCD44遺伝子とIGF1R遺伝子は融合するだけでなく、融合遺伝子を含む染色体の領域が増幅していた。
【００８１】
［実施例４：CD44-IGF1R融合遺伝子の機能解析］
＜方法＞
１．遺伝子クローニング
CD44-IGF1R全長cDNAは、実施例１と同様の方法によって調製した。EML4-ALK cDNAは肺がん患者よりクローニングしたものを用いた（Nature 448:561-566, 2007）。また、CD44-IGF1Rの227番目（野生型IGF1Rでは1033番目のアミノ酸に相当）のリジン残基をメチオニンに置換したCD44-IGF1R(KM)変異体のcDNAはCD44-IGF1R cDNAを元にSite-Directed Mutagenesis kit（Life Technologies社）により作成した。
【００８２】
２．癌化能アッセイ
CD44-IGF1R、野生型CD44、野生型IGF1R、CD44-IGF1R(KM)、EML4-ALK各cDNAをpMXSレトロウィルスベクター（Cell Biolabs Inc社）に挿入し、エコトロピックレトロウィルス用パッケージングプラスミド（タカラバイオ社）と共にHEK293細胞にLipofectamine 2000キット（Life Technologies社）を用いてリポフェクション法により導入した。組換えレトロウィルスが含まれる培養上清を2日後に回収し、1×10６個の3T3細胞に感染させた。感染2日後に培地を5%牛血清（calf serum: CS, Invitrogen社）含有DMEM-F12（Life Technologies社）に交換して培養を続け、形質転換能を評価した。ヌードマウス造腫瘍能アッセイは、ウィルス感染後2日目の3T3細胞を5×105個ずつヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成を観察することにより行った。
【００８３】
＜結果＞
CD44-IGF1Rが、癌遺伝子であることを確認するため、野生型CD44、野生型IGF1R、CD44-IGF1Rをそれぞれマウス線維芽細胞3T3に導入し、その癌化能を調べた。なおCD44-IGF1R(KM)は、ATP結合に必要なリジン残基がメチオニン残基に変わり、ATPが結合できなくなるため、IGF1R中のチロシンキナーゼ酵素活性がキャンセルされた変異体である。これら各遺伝子を発現する組換えレトロウィルスを作成し、3T3に感染させ、2週間後の細胞を撮影した（図3）。遺伝子を挿入していないレトロウィルス（Mock）や野生型CD44発現ウィルスを感染させても形質転換フォーカスは作られない。野生型のIGF1Rを導入すると細胞密度は上がったように見えるが形質転換フォーカスは作られず明らかな癌化能は認められない。一方、CD44-IGF1R導入によって明瞭な形質転換フォーカスが数多く作られたが、CD44-IGF1R(KM)導入では形質転換能は無くなったことから、CD44-IGF1Rはそのチロシンキナーゼ活性依存性に癌化能を有することがわかった。また強力な形質転換能が知られるEML4-ALK癌遺伝子導入によっても明瞭な形質転換フォーカスが作られた。
【００８４】
同様の遺伝子導入3T3細胞を、ヌードマウスの皮下に摂取して造腫瘍能アッセイを行った（図4）。各遺伝子発現細胞毎に4箇所の皮下接種を行ったが、CD44-IGF1R発現3T3細胞は16日目において、4箇所とも腫瘍を形成した。また他の癌遺伝子であるEML4-ALK発現3T3細胞も同様に全4箇所で腫瘍を形成した。しかし、野生型の全長CD44や全長IGF1R発現3T3細胞は腫瘍を全く形成せず、酵素活性のないCD44-IGF1R(KM)も同様であった。これらの実験によりCD44-IGF1R融合型キナーゼはin vitroでもin vivoでも造腫瘍能を有することが確認された。
【００８５】
［実施例５：OCUM-8細胞およびNUGC4細胞における細胞増殖アッセイ及びウエスタンブロッティング］
＜方法＞
細胞増殖アッセイ
OCUM-8およびNUGC4細胞の培養上清にIGF1R特異的阻害剤であるリンシチニブ（linsitinib）（Selleck社）を35nM〜700nMで添加し、4日後に細胞数をCellTiter-Blue assay（Promega社）で測定した。
ウエスタンブロッティング
上記細胞増殖アッセイと同様の条件で増殖させたOCUM-8およびNUGC4細胞をバッファー（1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4）で可溶化し、500 μgの可溶画分から抗IGF1R抗体（Cell Signaling Technologies社 #9750）を用いて免疫沈降した。免疫沈降物をSDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をして、同じ抗体あるいは抗リン酸化IGF1R抗体（Cell Signaling Technologies社 #3918）でそれぞれウエスタンブロッティングした。
【００８６】
＜結果＞
CD44-IGF1R融合キナーゼは癌化能を持ち、しかもOCUM-8においてきわめて大量に産生されていることから、OCUM-8細胞はCD44-IGF1Rの活性依存的に生存している可能性がある。そこでIGF1Rキナーゼ特異的阻害剤linsitinibによるOCUM-8への影響を検討した。その結果、linsitinibの培養上清への添加により、その濃度依存性にOCUM-8細胞の増殖は抑制された（図5）。一方、IGF1Rが野生型であるNUGC4の場合、linsitinib添加による増殖抑制効果は認められなかった。
【００８７】
次にOCUM-8細胞を可溶化してIGF1R抗体により免疫沈降し、抗リン酸化IGF1R抗体を用いてウエスタンブロッティングした。75 kDaのCD44-IGF1Rが強くチロシンリン酸化されており、添加されるlinsitinibの濃度依存性にそのリン酸化が弱まることがわかる（図6A左）。同じ免疫沈降物をIGF1R抗体自体でウェスタンブロットしたところ、CD44-IGF1Rタンパク質の量自体はlinsitinib添加によって変わっていなかった（図6A右）。一方、CD44-IGF1Rが存在しないNUGC4細胞で同じ実験をすると弱く野生型のIGF1Rタンパク質が発現しているが（図6B右）そのチロシンリン酸化はlinsitinibの添加にかかわらずほとんど認められない（図6B左）。
【００８８】
［実施例６：IGF1Rに対するshRNAによる、OCUM-8細胞の増殖阻害］
＜方法＞
レトロウィルスベクターpMKO.1-GFP（Addgene社）にshort hairpin RNA (shRNA)配列を挿入し、VSV-Gパッケジーングプラスミド（Addgene社）と共にHEK293細胞にLipofectamine 2000キット（Life Technologies社）を用いてリポフェクション法により導入した。用いたshRNA配列は以下の通りである。
#1: 5’-GCTGATGTGTATGTTCTTGATCTCGAGATCAGGAACGTACACATCAGC-3’（配列番号41）、
#2: 5’-CCAAGTCTGAGTAAGATGATTCTCGAGAATCATCTTGCTCAGGCTTGG-3’（配列番号42）、
#3: 5’-CTGACATGGGTCTTTAAGAATCTCGAGGTTCTTAAAGGCCCATGTCAG-3'（配列番号43）。
【００８９】
組換えレトロウィルスが含まれる培養上清を2日後に回収し、OCUM-8細胞とNUGC4細胞にそれぞれ感染させた。感染後green fluorescence protein (GFP)陽性細胞の割合をフローサイトメーターFACSCato II（BD Biosciences社）で測定することにより、shRNA発現細胞の割合を計算した。
【００９０】
＜結果＞
Linsitinibの増殖抑制効果がCD44-IGF1Rの活性を阻害することによるものであることを直接確認するために、IGF1Rに対するshRNAを導入し、CD44-IGF1Rの転写を抑制して細胞の増殖阻害活性の有無を調べた。shRNA発現レトロウィルスはGFPを同時に発現するため、shRNA導入細胞の割合はGFP陽性率で表すことができる。OCUM-8およびNUGC4細胞にshRNA・GFP発現レトロウィルスを感染させた後、フローサイトメトリーにてGFP陽性細胞を系時的に測定した。図7に示すように、OCUM-8細胞は、コントロールshRNA導入によりGFP陽性率が変化しない一方、IGF1Rに対する3種類のshRNAいずれを導入した細胞も速やかに増殖が抑制された（図7A）。一方、NUGC4細胞はIGF1Rに対するshRNAの影響は軽微である（図7B）。以上よりOCUM8細胞はIGF1Rの活性依存性に増殖しており、IGF1Rを標的とする阻害剤はCD44-IGF1R陽性細胞の優れた治療薬になることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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