(57)【要約】【課題】インピーダンス分光法を使用するタンパク質生成プロセスのリアルタイムでのモニタリングおよび制御を提供すること。【解決手段】タンパク質の分離、精製、抽出、および／または分画プロセスのモニタリングおよび／または制御のための方法およびシステムを提供する。タンパク質プロセスを受けたタンパク質混合物のインピーダンスを測定し、ターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較する。測定されたインピーダンスがターゲット基準インピーダンス値の許容範囲内でない場合、タンパク質混合物またはタンパク質プロセスのパラメータを調整する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１０年１２月１６日に出願された米国仮出願第６１／４２３，８９１号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、電気化学インピーダンス分光法に関し、より具体的には、電気化学インピーダンス分光法を使用した生体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｌｕｉｄ）由来のタンパク質懸濁液調製プロセスおよび／またはタンパク質分離プロセスをインプロセスでモニタリング、調整、および／または制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
血漿タンパク質は、人体における広範な種々の機能（血液量、浸透圧、粘度、および血液の他の重要な物理的パラメータの維持など）に役立つ。多数の商業的プロセスは、治療用途で血漿からこれらのタンパク質を分離および精製するために行われている。いくつかの一般的なタンパク質精製方法には、硫酸アンモニウムおよび類似の塩を使用した沈殿、低温のエタノールまたはアセトンおよびその他（アルコールおよびケトンなど）での有機溶媒沈殿、ゲル上での選択的吸着、等電沈殿、および吸着剤を使用したクロマトグラフィが含まれる。血液タンパク質を選択的に分画および精製するためのさらに他のプロセスは、アミノ酸、水溶性有機ポリマー、および塩基性アミノ基を含む水不溶性高分子電解質ポリマーの使用を含む。
【０００４】
多数のタンパク質の抽出および精製技術は、タンパク質溶液の多数の性質の調整による生体液（血漿または血漿溶液など）中の所望のタンパク質の溶解度の変更に基づく。塩の添加および溶液の希釈により、タンパク質の電解質との相互作用が等電点条件下および酸または塩基として解離した場合の両方で相互に異なる低イオン強度の範囲で分離することができる。タンパク質の溶解度を、アルコール、アセトン、または他の水混和性有機溶媒のタンパク質溶液への添加によって減少させることもできる。アルコールの沈殿作用と塩相互作用との間のバランスにより、分離すべきタンパク質が所望の溶解度になり得る種々の条件を達成することが可能である。このバランスを、各タンパク質成分についてのｐＨおよび温度に基づいて変化させることができる。しかし、所望のタンパク質の変性を回避するために、十分に低い温度を維持すべきである。さらに、ｐＨを、緩衝液（酢酸緩衝液または既知のイオン強度の他の緩衝液など）の添加によって制御し、等電点の差および分離すべきタンパク質成分の塩との相互作用の方向を利用するために調整することができる。最後に、タンパク質濃度を所望の量のタンパク質沈降物を得るためにできる限り低く維持してタンパク質−タンパク質相互作用を最小にすることができる。溶液または懸濁液中の成分の数が増加するにつれて、または、複数の成分が類似の物理化学的性質を有する場合、単一のタンパク質型の溶解度を低下させるようにより多くのこれらの変数を正確に制御しなければならない。
【０００５】
これらの抽出および／または精製された血漿タンパク質をヒトに治療的に使用することができるので、かかる抽出および精製プロセスには、厳格な品質管理（最終生成物が一貫し且つ安全であり、混合物の化学的性質が意図するプロセス設計と一致し続けることを確実にするための生体液のモニタリングおよび分析試験など）が必要である。例えば、従来のモニタリング技術（酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）または表面プラズモン共鳴の使用など）を使用して、調製したサンプル中の抗体活性量を決定することができる。他の一般的なモニタリング法（逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、または陽イオン交換クロマトグラフィなど）には、サンプルおよびコントロールの調製ならびにタンパク質分解をモニタリングするための一定期間のインキュベーションが必要である。さらに、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動技術を使用して抗体不純物を決定することができる。
【０００６】
不運にも、多数のこれらの公知のモニタリング技術および制御技術は高価であり、必須の分析を行うための特殊な抗原、試薬、および装置を必要とし得る。実際、多数のこれらの公知の技術は、サンプル調製、特定のインキュベーション期間、および／または他の時間のかかる工程が必要であるので、リアルタイムでの分離プロセスのモニタリングおよび制御に不適切である。
【０００７】
したがって、タンパク質プロセスの理解を深め、プロセス制御を改良し、そして／または一貫した生成物の品質を達成することができる改良された様式での懸濁液および溶液のインプロセスモニタリングのためのプロセス解析工学（ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＰＡＴ）法およびシステムが必要である。本明細書中で使用する場合、ＰＡＴには、例えば、最終生成物の品質を保証することを目的とした原料および工程中材料ならびにプロセスの重要な品質および性能属性の時宜を得た（すなわち、処理中の）測定によって製造をデザイン、分析、および／または制御するためのシステムが含まれる。迅速で信頼でき、維持に手間がかからず、装置の使用（解体する必要のない装置の使用または容易に洗浄されるセンサの使用など）が容易な方法を使用してこれらの所望の属性を得ることができたなら有利であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
インピーダンス分光法（ＩＳ）を使用して、多数のタイプのタンパク質溶液、懸濁液、およびコロイド（血漿、血漿画分、および血漿溶液などの生体液が含まれる）の電気的性質および／または電気化学的性質を特徴づけることができることが見いだされている。本明細書中に記載の例示的な実施形態は、タンパク質溶液調製プロセス、タンパク質抽出プロセス、タンパク質精製プロセス、および／またはタンパク質画分の保存プロセス中のプロセスパラメータのインプロセスでの迅速且つ信頼されるモニタリングおよび／または制御のためにＩＳを利用する。
【０００９】
下記のように、本発明の一定の実施形態により、タンパク質プロセスに関与するタンパク質含有混合物のインピーダンスの測定が可能である。かかるインピーダンス測定値を使用して、プロセスを減速したり停止したりすることなく基準インピーダンス値またはインピーダンス値の基準範囲との比較によって混合物および／またはタンパク質プロセスのパラメータを決定および／または制御することができる。したがって、開示のシステムおよび方法は、サンプル調製または他の時間のかかる試験手順を必要とせずに、実施者が、タンパク質含有混合物の性質についての情報にリアルタイムまたはほぼリアルタイムでアクセスすることを可能にすることによってプロセス制御能力を改善し、時宜を得たプロセスの調整を容易にし、そして／または一貫した品質を有する生成物の調製を補助することができる。
【００１０】
本発明の１つの態様は、生体液からタンパク質を分離する方法を提供することにある。生体液中のタンパク質の溶解度を修正するパラメータを調整することができ、生体液のインピーダンスをパラメータの調整前、調整中、および／または調整後にモニタリングすることができる。生体液のインピーダンスを、生体液からのタンパク質のターゲット分離度（ｔａｒｇｅｔ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）に対応し得るターゲットインピーダンス値と比較することができる。溶解度を修正するパラメータを、インピーダンスが受容可能な許容差を超えてターゲットインピーダンス値から逸脱する場合にさらに修正することができる。さらなる修正には、生体液のインピーダンスをターゲットインピーダンス値またはほぼターゲットインピーダンス値にするのに必要なパラメータの修正量の決定、任意選択的に、この修正量によるパラメータの修正が含まれ得る。本発明のいくつかの態様では、パラメータの修正が任意ではないと認識されるであろう。さらに、修正は手動または自動であり得る。例示的な生体液は、血漿、分画血漿中間体、タンパク質溶液、タンパク質懸濁液、および／または濾過細胞培養懸濁液であり得る。
【００１１】
本発明の別の態様では、インピーダンス値のターゲット基準範囲内のインピーダンスを有するタンパク質懸濁液の調製方法を提供する。タンパク質の固体および／またはペーストを、溶媒と混合してタンパク質懸濁液を形成することができる。タンパク質懸濁液のインピーダンスを混合工程の前、間、および／または後にモニタリングすることができ、インピーダンスを、インピーダンス値のターゲット基準範囲および／または単一のターゲット基準インピーダンス値と比較することができる。混合工程、モニタリング工程、および比較工程を、インピーダンスがインピーダンス値のターゲット基準範囲内であり、そして／またはインピーダンスが単一のターゲット基準インピーダンス値の受容可能な量内であるまで反復することができる。
【００１２】
本発明の別の態様では、容器内の生体液からのタンパク質の分離を制御するためのプロセス制御システムを提供する。このシステムは、インピーダンス計を備えることができ、インピーダンス計を生体液のインピーダンスを計測するように適合することができる。インピーダンス計は、２つ以上の電極を備えることができる。２つ以上の電極は、生体液を介して電気信号を送信することができる第１の電極または第１の電極対および第１の電極対から電気信号を受信することができる第２の電極または第２の電極対を備えることができる。第１の電極対を、容器の第１のポート内に挿入するように構成することができ、第２の電極対を、容器の第１のポート内または第２のポート内に挿入するように構成することもできる。さらに、システムは、インピーダンス計に電気的に接続されたコンピュータをさらに備えることができる。コンピュータを、インピーダンス計から生体液のインピーダンスの測定値を回収するように適合させることができ、そして／またはインピーダンス測定値が許容差を超えてターゲットインピーダンス値および／またはターゲット基準インピーダンス範囲から逸脱する場合に生体液中でのタンパク質の溶解度を修正するパラメータを自動的に調整するように適合させることができる。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、タンパク質分離プロセスにおける反応器中でのタンパク質懸濁液調製のためのプロセス制御システムを提供する。システムは、タンパク質懸濁液のインピーダンス測定のためのインピーダンス計を備えることができる。インピーダンス計は、２つ以上の電極（タンパク質懸濁液を介して電気信号を送信することができる第１の電極対が含まれる）を備えることができる。第１の電極対を、反応器の第１の反応器ポート内に挿入するように構成することができる。インピーダンス計は、第１の電極から電気信号を受信するための第２の電極対をさらに備えることができる。一般に、第２の電極対を、反応器の第１の反応器ポートまたは第２の反応器ポート内に挿入するように構成することもできる。システムは、インピーダンス計に電気的に接続されたコンピュータをさらに備えることができる。コンピュータを、インピーダンス計からタンパク質懸濁液のインピーダンスの測定値を回収するように適合させ、測定値がインピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合にタンパク質分離プロセス中のその後の工程を自動的に誘導するように適合させることができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、タンパク質分離プロセスのモニタリング方法を提供することにある。本方法は、複数の周波数でタンパク質懸濁液のインピーダンスを測定して測定されたインピーダンススペクトルを得ることを含むことができる。この測定したインピーダンススペクトルを、既知のインピーダンススペクトル（すなわち、基準インピーダンススペクトル）と対比または比較することができる。比較に基づいて、タンパク質溶液の少なくとも１つの物理的性質または化学的性質を特徴づけることができ、タンパク質溶液および／またはタンパク質分離プロセスを修正することができる。この修正は、物理的性質または化学的性質の特徴づけに基づくということができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、タンパク質精製プロセスのモニタリング方法を提供することにある。本方法は、タンパク質含有混合物（血漿溶液または血漿懸濁液など）のインピーダンスを所定の周波数および周波数範囲で測定し、測定されたインピーダンスを基準インピーダンスと比較してタンパク質精製プロセスの少なくとも１つの特性を決定する工程を含む。
【００１６】
実施形態のさらなる特徴および利点は以下で説明されており、その説明から一部が明らかであろう。本発明の目的および他の利点は、その明細書の記載および特許請求の範囲ならびに添付の図面中の例示的な実施形態で特に指摘されたシステムおよび方法によって認識および達成されるであろう。
【００１７】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示および説明を目的とし、特許請求の範囲に記載の発明をさらに説明することを意図すると理解すべきである。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
生体液からタンパク質を分離するための方法であって、上記方法は：
上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正するパラメータを調整する工程、
上記調整する工程中に上記生体液のインピーダンスをモニタリングする工程、
上記インピーダンスと、上記生体液からの上記タンパク質のターゲット分離度に対応するターゲットインピーダンス値とを比較する工程、および
上記インピーダンスが受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合に上記パラメータをさらに修正する工程
を含む、方法。
（項目２）
上記パラメータが、溶質濃度、溶媒濃度、ｐＨ、イオン強度、および温度からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記修正する工程が、上記インピーダンスが上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも０．５％逸脱する場合に上記パラメータをさらに修正することを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記修正する工程が、上記インピーダンスが上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも１．０％逸脱する場合に上記パラメータをさらに修正することを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記修正する工程が、上記インピーダンスが上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも５％逸脱する場合に上記パラメータをさらに修正することを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記修正する工程が、上記インピーダンスが上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合にオペレータに通知を提供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記修正する工程が上記生体液の分析を誘導することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記生体液が、血漿、分画血漿中間体、タンパク質の溶液および懸濁液、ならびに細胞培養懸濁液からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記生体液が血漿または分画血漿中間体である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記タンパク質が分画血漿生成物である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記分画血漿生成物が、アルブミン、α１−プロテイナーゼインヒビター、抗血友病因子、フォンヴィルブラント因子複合体、抗インヒビター凝固剤複合体、抗トロンビン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、凝固因子、フィブリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、プロテインＣ濃縮剤、およびトロンビンからなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記修正する工程が、上記インピーダンスが上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合に上記パラメータを自動的に修正することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記修正する工程を実質的にリアルタイムで行う、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記修正する工程をリアルタイムで行う、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記修正する工程が：
上記インピーダンスが上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合に上記生体液のインピーダンスを上記ターゲットインピーダンス値にまたはほぼ上記ターゲットインピーダンス値にするのに必要とされる上記パラメータの修正量を決定すること、および
上記修正量だけ上記パラメータを修正すること
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
インピーダンス値のターゲット基準範囲内のインピーダンスを有するタンパク質懸濁液を調製するための方法であって、上記方法は：
タンパク質の固体またはペーストを溶媒と混合して上記タンパク質懸濁液を形成する工程、
上記タンパク質懸濁液のインピーダンスを上記混合する工程中にモニタリングする工程、
上記インピーダンスを上記インピーダンス値のターゲット基準範囲と比較する工程、および
上記インピーダンスが上記インピーダンス値のターゲット基準範囲内になるまで上記混合する工程、上記モニタリングする工程、および上記比較する工程を繰り返す工程
を含む、方法。
（項目１７）
上記タンパク質の固体またはペーストが血漿分画プロセス由来の分画血漿中間体または分画血漿生成物である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記血漿分画プロセスが、コーンプロセス、オンクリープロセス、キスラープロセス、テシュナープロセス、またはこれらの組み合わせを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記血漿分画プロセスがコーンプロセスであり、上記分画血漿中間体が上記コーンプロセス由来の画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、画分ＩＶ−４、および画分Ｖからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記血漿分画プロセスがオンクリープロセスであり、上記分画血漿中間体が上記オンクリープロセスの画分ＩＩ＋ＩＩＩＷ、画分ＩＩ、および画分ＩＩＩからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記血漿分画プロセスがキスラープロセスであり、上記分画血漿中間体が上記キスラープロセスの沈降物Ａ、沈降物Ｂ、沈降物ＩＶ、沈降物Ｃ、および沈降物Ｄからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
上記血漿分画プロセスがテシュナープロセスであり、上記分画血漿中間体が上記テシュナープロセスの沈降物Ｇを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
上記インピーダンス値のターゲット基準範囲が、上記タンパク質懸濁液の目標とする均一性の程度に対応する、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
上記タンパク質懸濁液の上記インピーダンスが、上記インピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合にオペレータに通知する工程をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２５）
上記タンパク質懸濁液の上記インピーダンスが、上記インピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合に上記タンパク質懸濁液を自動的に濾過する工程
をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２６）
容器中の生体液からのタンパク質分離を制御するためのプロセス制御システムであって、
上記生体液のインピーダンスを測定するためのインピーダンス計であって、
上記生体液を介して電気信号を送信するための第１の電極であって、上記第１の電極が上記容器の第１のポート内に挿入されるように構成されている、第１の電極、および
上記第１の電極から上記電気信号を受信するための第２の電極であって、上記第２の電極が上記容器の上記第１のポートまたは第２のポート内に挿入されるように構成されている、第２の電極を備えるインピーダンス計、ならびに
上記インピーダンス計に電気的に接続されたコンピュータであって、上記コンピュータが、
上記インピーダンス計から上記生体液のインピーダンスの測定値を回収し、かつ
上記測定値が受容可能な許容差を超えてターゲットインピーダンス値から逸脱する場合に上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正するパラメータを自動的に調整するように適合されている、コンピュータ
を備える、プロセス制御システム。
（項目２７）
上記容器が反応器、濾過器、または遠心分離機である、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目２８）
上記第２の電極が、上記第１の電極を有する上記容器の上記第１のポート内に挿入されるように構成されている、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目２９）
上記パラメータが、溶質濃度、溶媒濃度、ｐＨ、イオン強度、および温度からなる群より選択される、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目３０）
上記コンピュータに制御可能に接続された通知システムをさらに含み、上記通知システムが、上記測定値が上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合にオペレータに通知するように適合されている、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目３１）
上記コンピュータが、上記測定値が上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも０．５％逸脱する場合に上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正する上記パラメータを自動的に調整するように適合されている、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目３２）
上記コンピュータが、上記測定値が上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも１％逸脱する場合に上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正する上記パラメータを自動的に調整するように適合されている、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目３３）
上記コンピュータが、上記測定値が上記ターゲットインピーダンス値から少なくとも５％逸脱する場合に上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正する上記パラメータを自動的に調整するように適合されている、項目２６に記載のプロセス制御システム。
（項目３４）
上記反応器が、回分反応器、半回分反応器、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、管状反応器、固定層反応器、および流動層反応器からなる群より選択される、項目２７に記載のプロセス制御システム。
（項目３５）
タンパク質分離プロセスにおいて反応器中のタンパク質懸濁液を調製するためのプロセス制御システムであって、
上記タンパク質懸濁液のインピーダンスを測定するためのインピーダンス計であって、
上記タンパク質懸濁液を介して電気信号を送信するための第１の電極であって、上記第１の電極が上記反応器の第１の反応器ポート内に挿入されるように構成されている、第１の電極、および
上記第１の電極から上記電気信号を受信するための第２の電極であって、上記第２の電極が上記反応器の上記第１の反応器ポートまたは第２の反応器ポート内に挿入されるように構成されている、第２の電極
を備えるインピーダンス計、ならびに
上記インピーダンス計に電気的に接続されたコンピュータであって、上記コンピュータが、
上記インピーダンス計から上記タンパク質懸濁液のインピーダンスの測定値を回収し、かつ
上記測定値がインピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合に上記タンパク質分離プロセス中のその後の工程を自動的に誘導するように適合されている、コンピュータを備える、プロセス制御システム。
（項目３６）
上記第２の電極が、上記第１の電極を有する上記容器の上記第１のポート内に挿入されるように構成されている、項目３５に記載のプロセス制御システム。
（項目３７）
上記インピーダンス値のターゲット基準範囲が、上記タンパク質懸濁液の目標とする均一性の程度に対応している、項目３５に記載のプロセス制御システム。
（項目３８）
上記コンピュータに制御可能に接続された通知システムをさらに含み、上記通知システムが、上記測定値が上記インピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合にオペレータに通知するように適合されている、項目３５に記載のプロセス制御システム。
（項目３９）
生体液からタンパク質を分離するためのタンパク質分離プロセスを制御するための方法であって、上記方法は：
上記タンパク質分離プロセスの工程から生体液のインピーダンス測定値を得る工程、
上記生体液のインピーダンス測定値をターゲットインピーダンス値の受容可能な許容差内にするのに必要とされる上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正するパラメータの修正量を決定する工程、および
上記修正量だけ、上記生体液中の上記タンパク質の溶解度を修正する上記パラメータを調整する工程
を含む、方法。
（項目４０）
上記タンパク質分離プロセスの上記工程が、上記生体液から上記タンパク質を沈殿させることを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記タンパク質分離プロセスの上記工程が、上記タンパク質を精製または濃縮することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
上記パラメータが、溶質濃度、溶媒濃度、ｐＨ、イオン強度、および温度からなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
上記決定する工程が、上記測定値が上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合にオペレータに通知を提供することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
上記調整する工程が上記生体液の分析を誘導することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４５）
上記生体液が、血漿、分画血漿中間体、タンパク質の溶液および懸濁液、ならびに細胞培養懸濁液からなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４６）
上記生体液が血漿または分画血漿中間体である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記タンパク質が分画血漿生成物である、項目３９に記載の方法。
（項目４８）
上記分画血漿生成物が、アルブミン、α１−プロテイナーゼインヒビター、抗血友病因子、フォンヴィルブラント因子複合体、抗インヒビター凝固剤複合体、抗トロンビン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、凝固因子、フィブリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、プロテインＣ濃縮剤、およびトロンビンからなる群より選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記調整する工程が、上記測定値が上記受容可能な許容差を超えて上記ターゲットインピーダンス値から逸脱する場合に上記パラメータを自動的に調整することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５０）
上記調整する工程を実質的にリアルタイムで行う、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記調整する工程をリアルタイムで行う、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
上記タンパク質分離プロセスの上記工程が連続フロープロセスを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５３）
上記生体液が上記連続フロープロセス由来のインライン流体である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
上記タンパク質分離工程が回分プロセスを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５５）
上記生体液が上記回分プロセス由来の回分混合物である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
上記タンパク質分離工程が濾過プロセスを含む、項目３９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、タンパク質プロセスの制御および／またはモニタリングのための本発明のプロセス制御システムの例示的な実施形態を示す。
【図２】図２は、図１のプロセス制御システムと共に使用するためのプローブの例示的な実施形態を示す。
【図３】図３は、例示的な修正コーン分画プロセスのフローチャートを示す。
【図４】図４は、アルブミン溶液のインピーダンスが溶液のｐＨに相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図５】図５は、アルブミン溶液のインピーダンスが溶液のナトリウム濃度に相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図６】図６は、アルコール濃度２０％で懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストのインピーダンスが溶液中のタンパク質分離度に相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図７】図７は、脱クリオ血漿溶液のインピーダンスが血漿中のアルコール濃度に相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図８】図８は、アセタート−ホスフェート緩衝液に懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストのインピーダンスが懸濁液のエイジングに相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図９】図９は、緩衝液に懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの経時的なＩｇＧ中心対平均（Ｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｖｓ．  Ａｖｅｒａｇｅ）の例示的なグラフを示す。
【図１０】図１０は、緩衝液に懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの経時的なΔＲｅ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１１】図１１は、緩衝液に懸濁された画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの経時的なΔＩｍ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１２】図１２は、画分ＩＩ＋ＩＩＩを利用した濾過プロセスおよび後洗浄プロセスにおける複数の工程でのＩｇＧ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１３】図１３は、画分ＩＩ＋ＩＩＩを利用した濾過プロセスおよび後洗浄プロセスにおける複数の工程でのΔＲｅ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１４】図１４は、画分ＩＩ＋ＩＩＩを利用した濾過プロセスおよび後洗浄プロセスにおける複数の工程でのΔＩｍ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１５】図１５は、アルコール添加プロセスを受けた５％アルブミン溶液についてのΔＲｅ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【図１６】図１６は、アルブミン溶液のインピーダンスが溶液のアルコール濃度と相関し得ることを示す例示的なナイキストプロットを示す。
【図１７】図１７は、アルコール添加プロセスを受けた５％アルブミン溶液についてのΔＲｅ  Ｚ中心対平均の例示的なグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本明細書中で使用した全ての用語は、他で提供しない限り、当該分野の通常の意味を有することが意図される。全濃度を、混合物の全体積に対する特定の成分の体積百分率の単位で示す。別に特定されない限り、用語「混合物」は、少なくとも２つの物質を含む固体、液体、溶液、懸濁液、またはコロイドをいうことができる。用語「タンパク質混合物」を、少なくとも１つのタンパク質を含む混合物と定義する。いくつかの実施形態では、「タンパク質混合物」は、「生体液」（血漿、プール血漿、血漿混合物、分画血漿生成物、分画血漿中間体、タンパク質の溶液または懸濁液、細胞培養懸濁液、またはこれらの任意の組み合わせなどであるが、これらに限定されない）をいうことができる。本明細書中で使用する場合、プール血漿を、任意の数のドナーから回収し、組み合わせた全血成分をいうことができる。一定の実施形態では、プール血漿を、ドナー約２００人、ドナー約５００人、ドナー約１０００人、ドナー約２，０００人、またはドナー約５，０００人、またはそれを超えるドナーから回収することができる。
【００２０】
本発明は、一般に、タンパク質混合物を利用または作製するタンパク質プロセスをリアルタイムまたはほぼリアルタイムでモニタリングおよび／または制御することが可能なシステムおよび方法を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「タンパク質プロセス」には、任意の多数の商業的プロセス（タンパク質分離プロセス、タンパク質精製プロセス、タンパク質抽出プロセス、タンパク質分画プロセス、タンパク質の処方、タンパク質混合物の生成、タンパク質混合物の保存、タンパク質画分の保存、タンパク質ペーストの保存、およびタンパク質の最終的な容器での保存などであるが、これらに限定されない）が含まれる。
【００２１】
例示的なタンパク質プロセスには、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９−４７５（１９４６），Ｃｏｈｎら（「コーン分画プロセス（Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」または「コーンプロセス（Ｃｏｈｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」）（その全体が本明細書中で参考として援用される）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１：５４１−５５０（１９４９），Ｏｎｌｃｅｙら（「オンクリー分画プロセス（Ｏｎｃｌｅｙ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」または「オンクリープロセス（Ｏｎｃｌｅｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」）（その全体が本明細書中で参考として援用される）；Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．７：４１４−４２４（１９６２），Ｋｉｓｔｌｅｒら（「キスラー分画プロセス（Ｋｉｓｔｌｅｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」または「キスラープロセス（Ｋｉｓｔｌｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」）（その全体が本明細書中で参考として援用される）；およびＶｏｘ  Ｓａｎｇ  ９２：４２−４４（２００７），Ｔｅｓｃｈｎｅｒら（「テシュナー分画プロセス（Ｔｅｓｃｈｎｅｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」または「テシュナープロセス（Ｔｅｓｃｈｎｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のタンパク質プロセスおよびこれらのプロセスの任意の変形形態が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質プロセスをモニタリングおよび／または制御するためにＩＳを使用する本明細書中に記載のシステムが任意の数のタンパク質プロセスに有用であるが、多数の例示的なタンパク質プロセスが本明細書中に詳述されているが、本発明が記載のこれらの例示的なタンパク質プロセスのみに決して制限されないことが理解されるであろう。実際に、本明細書中に記載のシステムは、イオン濃度、タンパク質濃度、水混和性有機沈殿剤濃度（例えば、アルコール）、ｐＨ、温度、および／またはこれらの任意の組み合わせの調整による生体液中の所望のタンパク質の溶解度の変化に基づく任意のタンパク質の抽出技術および／または精製技術に有用であり得る。
【００２２】
用語「分画血漿中間体」は、コーン画分Ｉ、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ、コーン画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、コーン画分ＩＶ−１、コーン画分ＩＶ−４、および／またはコーン画分Ｖ（コーン分画プロセス由来）；オンクリー画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ、オンクリー画分ＩＩ、および／またはオンクリー画分ＩＩＩ（オンクリー分画プロセス由来）；キスラー沈降物Ａ、キスラー沈降物Ｂ、キスラー沈降物ＩＶ、キスラー沈降物Ｃ、および／またはキスラー沈降物Ｄ（キスラー分画プロセス由来）；テシュナー沈降物Ｇ（テシュナー分画プロセス由来）；および／またはこれらの任意の組み合わせ、修正形態、または変形形態をいうが、これらに限定されない。
【００２３】
用語「分画血漿生成物」には、血漿から分離された任意のタンパク質またはタンパク質生成物（アルブミン、α１−プロテイナーゼインヒビター、抗血友病因子、フォンヴィルブラント（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎ）因子複合体、抗インヒビター凝固剤複合体（ａｎｔｉ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、抗トロンビン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、凝固因子、フィブリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、プロテインＣ濃縮剤、トロンビン、ならびに／またはこれらの種々の組み合わせおよび変形形態などであるが、これらに限定されない）が含まれる。典型的には、分画血漿生成物は、ヒト患者への投与のために十分に無菌性であり得る。
【００２４】
本発明の一定の実施形態では、タンパク質プロセスを受けたタンパク質混合物中のタンパク質の溶解度を修正するパラメータを、モニタリング、調整、および／または修正する。かかるパラメータには、例えば、以下が含まれ得る：混合物のタンパク質のｐＨ、伝導率、液体／固体分離、水混和性有機沈殿剤濃度、タンパク質凝集、密度、流量、粘度、タンパク質濃度、温度、および／またはエイジング。
【００２５】
一般に、本発明は、プロセスによって利用または調製されたタンパク質混合物のインピーダンス測定値を使用したタンパク質プロセスのモニタリングおよび／または制御に関する。本発明は、特定の性質を直接測定することなくタンパク質混合物をタンパク質プロセスの任意の段階で特徴づけることが可能である。むしろ、タンパク質混合物のインピーダンスを、タンパク質プロセス中にリアルタイムまたはほぼリアルタイムで測定することができ、これらのインピーダンス測定値を使用して、情報が望まれる混合物またはプロセスの性質またはパラメータを間接的に決定することができる。得られた情報を使用して、プロセスまたは混合物を調整することができる。したがって、開示のシステムおよび方法は、サンプル調製または他の時間のかかる試験手順を必要とせずに、実施者がタンパク質含有混合物の性質についての情報にリアルタイムまたはほぼリアルタイムでアクセスすることを可能にすることによってプロセス制御能力を改善し、時宜を得たプロセスの調整を容易にし、そして／または一貫した品質を有する生成物の調製を補助することができる。「ほぼリアルタイム」は、測定可能な量および／または相当量によってプロセスの性質が変化しないような時間枠内でプロセスをモニタリングおよび／または調整することができることを意味する。例えば、「ほぼリアルタイム」は、タンパク質プロセスおよび／またはタンパク質混合物に応じて、１秒内、５秒内、１０秒内、２０秒内、３０秒内、１分内、２分内、５分内、１０分内、または１５分内であり得る。好ましくは、「ほぼリアルタイム」は、１秒内、５秒内、１０秒内、２０秒内、３０秒内、または１分内であり得る。
【００２６】
本明細書中に記載の例示的な実施形態は、タンパク質溶液調製プロセス、タンパク質抽出プロセス、タンパク質精製プロセス、および／またはタンパク質画分の保存プロセスなどのタンパク質プロセスの間にタンパク質プロセスのパラメータの迅速かつ信頼できるインプロセスでのモニタリングおよび／または制御のためにＩＳを利用する。一定の実施形態では、例えば、タンパク質混合物と電気的に接触した電気プローブを使用してタンパク質プロセスに関与するタンパク質含有混合物の複素インピーダンスの任意の数の測定値を得ることができる。かかるインピーダンス測定値を使用して、基準インピーダンス値またはインピーダンス値の基準範囲との比較によってタンパク質プロセスの任意の工程での混合物のパラメータまたは状態を決定することができる。実質的に類似のタンパク質プロセス中の実質的に類似のタンパク質混合物についての基準インピーダンス値またはインピーダンス値の基準範囲を、事前に測定または決定することができる。
【００２７】
一定の実施形態では、測定されたインピーダンス値が基準インピーダンス値またはインピーダンス値の基準範囲の受容可能な許容差内である場合、調整や修正を行うことなくタンパク質プロセスを継続することが許可される。しかし、測定されたインピーダンス値が受容可能な許容差を超えて基準インピーダンス値またはインピーダンス値の基準範囲から逸脱する場合、タンパク質プロセスおよび／またはタンパク質混合物に対して調整がなされ得る。
【００２８】
受容可能な許容差が任意の数のパラメータ（特定のタンパク質プロセスまたはプロセス内の工程、特定のタンパク質混合物、および所望の最終生成物などが含まれるが、これらに限定されない）に依存すると理解されるであろう。さらに、受容可能な許容差は、タンパク質混合物のインピーダンス値とタンパク質混合物の物理化学的特性との相関関係に応じて変化するであろう。いくつかの例示的な実施形態では、受容可能な許容差は、測定されたインピーダンス値と基準インピーダンス値との間の、約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または約０．１％〜約１％の差であり得る。一定の実施形態では、受容可能な許容差は、基準インピーダンス値の０．５％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％以下であり得る。他の実施形態では、受容可能な許容差は、基準インピーダンス値を得るために使用される経験的データの１標準偏差または１標準偏差内、２標準偏差または２標準偏差内、または１標準誤差内にあり得る。
【００２９】
他の実施形態では、タンパク質混合物のインピーダンスを、任意の妥当な期間に（タンパク質混合物を使用したタンパク質プロセスの各プロセス工程の間中が含まれる）リアルタイムまたはほぼリアルタイムで決定することができる。タンパク質プロセス中の任意の時期に、測定されたインピーダンス値が基準インピーダンス値の所望の範囲または「ターゲット」範囲外であると決定された場合、タンパク質混合物またはタンパク質プロセスを変更または調整することができる。いくつかの実施形態では、変更または調整は自動であり得、そして／またはコンピュータ化することができる一方で、変更または調整は手動であり得る。他の実施形態では、混合物のインピーダンスの測定、測定されたインピーダンス値のインピーダンス値の基準範囲との比較、およびタンパク質混合物またはタンパク質プロセスの変更または調整の実行を、測定したインピーダンスが基準インピーダンス値のターゲット範囲内になるまで所望されるか必要とされる通りに、継続または反復することができる。
【００３０】
１つの例示的な実施形態では、変更または調整を、タンパク質混合物中のタンパク質の溶解度を修正するパラメータに対して行うことができる。タンパク質混合物のタンパク質を修正するパラメータは、例えば、以下であり得る：溶質濃度、溶媒濃度、ｐＨ、イオン強度、および／または温度。かかるタンパク質混合物のパラメータまたはパラメータの組み合わせを変更または修正するための任意の数の方法（例えば、塩、アルコール、水、酸、および／または塩基などの成分のタンパク質混合物への添加；例えば、濾過などによるタンパク質混合物からの成分の除去；タンパク質混合物の加熱および／または冷却；および／またはタンパク質混合物の外部エネルギー源への暴露など）が存在することが認識されるであろう。
【００３１】
別の例示的な実施形態では、望ましいかまたはターゲットの基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲は、タンパク質混合物の任意の数の物理的性質および／または化学的性質に相関し得る。タンパク質懸濁液のインピーダンスを、タンパク質懸濁液を使用するタンパク質プロセスの多数の段階（タンパク質抽出、分離または精製プロセスなど）で決定することができる。測定されたインピーダンス値を特性（例えば、タンパク質濃度、塩濃度、タンパク質分解の程度（例えば、タンパク質の分解活性（結合活性、酵素活性、抗原／抗体活性などが含まれるが、これらに限定されない））、タンパク質エイジング、および／またはタンパク質の分離度など）と相関させることにより、各インピーダンス測定値によってその特性の概算が可能になる。このような方法で、プロセスに関する情報を得ることができ、この情報に基づいてプロセスを変更することができる。
【００３２】
測定されたインピーダンス値として記載されているが、任意の数の測定されたインピーダンス値を所望されるか必要とされるとおりにタンパク質混合物から得て、一定の確実性の程度までタンパク質混合物のインピーダンスを決定することができると認識されるであろう。連続測定までおよび連続測定を含む任意の時間間隔で測定することができる。さらに、タンパク質混合物（タンパク質沈降物などであるが、これに限定されない）のインピーダンスをタンパク質混合物内の複数の位置で決定して均質性を保証することができる。これは、溶液または沈降物を均質にするのがより困難な大規模製造プロセスで重要である。さらに、単一のタンパク質プロセス中に、インピーダンス測定値を任意の数の工程にわたってｉｎ−ｓｉｔｕまたはｅｘ−ｓｉｔｕで得ることができる。このような方法で、測定されたインピーダンス値を、例えば、ロットから採取したサンプルの測定の代わりにタンパク質混合物の全ロットまたはバッチにわたって決定することができる。しかし、所望される場合、サンプルのインピーダンスを測定することができる。
【００３３】
図１を参照して、例示的なプロセス制御システム１００を示す。このシステムは、反応器または容器１５０内に含まれるタンパク質混合物（生体液など）のインピーダンスをタンパク質プロセス中に１つ以上の周波数で測定することができる。示すように、制御システム１００は、一般に、任意の伝導性手段１３０（絶縁電線など）によって取り付けられたプローブ１２０を有するインピーダンス計１１０を備える。別の実施形態では、制御システム１００は、インピーダンス計１１０に取り付けられた１対のプローブ１２０を備えることができる。１つのプローブ１２０のみを示しているが、任意の数のプローブ１２０（２、３、４、５、１０、１５、または２０個のプローブが含まれるが、これらに限定されない）をインピーダンス計１１０に取り付けることができ、それらを反応器または容器１５０の至る位置に配置することができると認識されるであろう。
【００３４】
一定の実施形態では、インピーダンス計１１０は、電気信号を出力して電気信号を受信することができる任意の電子機器であり得る。インピーダンス計１１０は、取り付けたプローブ１２０によって一定の電圧、電流、および／または周波数で電気信号を発生することができ、このプローブ１２０は反応器または容器１５０中のタンパク質混合物中に配置することができる。プローブ１２０を、プローブ１２０が反応器または容器１５０中に含まれる生体液と直接または間接的に電気的に接触するように反応器または容器１５０の反応器ポート１６０内に挿入されるように適合することができる。また、単一の反応器ポート１６０を示しているが、任意の数の反応器ポート１６０（２、３、４、５、１０、１５、２０、または２５個のポート１６０などであるが、これらに限定されない）が反応器または容器１５０中に存在することができると認識されるであろう。さらに、単一のプローブ１２０を単一の反応器ポート１６０内に挿入することができる。あるいは、プローブ対１２０または複数のプローブ１２０を単一の反応器ポート１６０内に挿入することができる。
【００３５】
一般に、インピーダンス計１１０は、約２０Ｈｚ〜約２０ＭＨｚの間の周波数の正弦電気信号を発生して送信する能力を有し得る。好ましい実施形態では、発生電気信号は、約０．０２ｋＨｚ〜約８４３ｋＨｚであり得る。別の実施形態では、発生電気信号は約０．０５ｋＨｚ〜約０．１ｋＨｚであり得る。インピーダンス計１１０は、約１〜約５００ｍＶ（その間の任意および全ての値が含まれる）のＡＣ電気信号を発生して送信する能力をさらに有し得るが、使用される電気信号は混合物の最小限の摂動のみを生じて疑似線形電流レスポンスが得られるべきである。インピーダンス計１１０は、一旦電気信号が取り付けたプローブ１２０によって混合物中を伝搬すると、電気信号をさらに受信することができる。
【００３６】
一定の実施形態では、インピーダンス計１１０は、反応器または容器１５０中の生体液に送信した電気信号と電気信号が生体液中を伝搬した後に受信したか得られた信号との差を検出することによってタンパク質混合物のインダクタンス、キャパシタンス、抵抗、ならびに／またはインピーダンスの実数成分および虚数成分（以下にさらに説明する）を測定することができる。１つの例示的な実施形態では、インピーダンス計１１０は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅ４９８０Ａ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬＣＲ  ｍｅｔｅｒであり得る。別の例示的な実施形態では、インピーダンス計１１０はＡｇｉｌｅｎｔ  ４９８９  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬＣＲ  ｍｅｔｅｒであり得る。
【００３７】
示すように、インピーダンス計１１０を、インピーダンス計１１０から受信したデータを保存および処理するためのメモリを有するコンピュータ１４０に制御可能におよび／または電気的に接続することができる。コンピュータ１４０を、当該分野で公知の任意の手段（有線ネットワーク接続および無線ネットワーク接続の両方が含まれる）によってインピーダンス計１１０に接続することができる。示していないが、コンピュータを、多数の公知の周辺機器（例えば、キーボード、マウス、ディスプレイ、タッチスクリーン、プリンタ、および／またはユーザの入力および／または出力を容易にする任意の他の装置が含まれる）のいずれかに接続することができる。あるいは、コンピュータ１４０およびインピーダンス計１１０を単一のデバイスに統合することができると考えられる。
【００３８】
１つの例示的な実施形態では、コンピュータ１４０を、タンパク質混合物中に配置したプローブ１２０を有するインピーダンス計１１０からのタンパク質混合物のインピーダンスの測定値を回収するように適合させる。コンピュータを、インピーダンス計１１０を制御するように適合させることができる（例えば、電気信号の出力など）。
【００３９】
別の例示的な実施形態では、コンピュータ１４０を、反応器または容器１５０中のタンパク質混合物のパラメータを分析および／または調整するように適合させることができる。パラメータは、タンパク質混合物からタンパク質が沈殿することができるようにタンパク質混合物中のタンパク質の溶解度を修正することができる。例えば、コンピュータ１４０を、さらなる電気的プロセス装置または機械的プロセス装置（示さず）に制御可能に接続することができ、この装置を反応器または容器１５０に接続することもできる。例示的なプロセス装置には、ポンプ、バルブ、加熱装置または冷却装置、ミキサー、およびコンテナなどの装置が含まれるが、これらに限定されない。このような方法で、コンピュータ１４０をプロセス装置を制御するように適合することができ、それにより、プロセスパラメータ（添加物の添加速度または温度の上昇もしくは低下など）を調整することができる。示していないが、コンピュータ１４０を、警告システム（可聴警報システムおよび／またはビジュアルアラートシステムなど）にさらに接続することができる。
【００４０】
一定の実施形態では、タンパク質混合物の測定されたインピーダンスが受容可能な許容差を超えてターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲から逸脱する場合、タンパク質混合物中のタンパク質の溶解度を修正するパラメータを調整するようにコンピュータ１４０を適合させることができる。１つの実施形態では、ターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲を、例えば、コンピュータ１４０によってアクセスすることができるデータベースに保存することができる。次いで、コンピュータ１４０を、インピーダンス計１１０から受信および／または保存された測定されたインピーダンス値と保存された基準インピーダンス値（すなわち、ターゲット基準インピーダンス値および基準インピーダンス値のターゲット範囲）とを比較することができる。一般に、受容可能な許容差を、特定のプロセス、混合物、または所望の生成物に関する情報（例えば、以前の生成プロセスから得たデータ、任意の特定のプロセス、混合物、または所望の生成物についての標準操作手順由来のパラメータなど）に基づいてユーザによって入力するか、コンピュータ１４０によって決定することができる。タンパク質混合物の測定されたインピーダンスが受容可能な許容差を超えてターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲から逸脱する場合、自動的にオペレータに警告するようにコンピュータ１４０をさらに適合させることができる。
【００４１】
反応器または容器１５０として記載しているが、本発明がこれらに制限されず、タンパク質混合物を所望の期間含有および／または移送することができる任意の装置が本発明と適合可能であることが考えられると理解されるであろう。したがって、反応器または容器１５０は、装置の任意の部分（例えば、１つ以上のケトル、バット、タンク、ボトル、バッグ、濾過器、遠心分離機、シンク、および／または任意の他の適合可能なコンテナなど）であり得る。１つの特定の実施形態では、反応器または容器１５０はタンパク質混合物を含む移送ラインであり得、移送ラインを、例えば、ステンレス鋼、ガラス、またはプラスチックなどの材料から作製することができる。別の実施形態では、反応器または容器１５０は、クロマトグラフィカラム（ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、またはイムノアフィニティカラムなどであるが、これらに限定されない）であり得る。さらに別の例示的な実施形態では、反応器または容器１５０は、例えば、充填ベッド構成または膨張ベッド（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）構成のクロマトグラフィカラムであり得る。他の例示的な実施形態では、反応器または容器１５０は、以下であり得る：回分反応器、半回分反応器、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、管状反応器、固定層反応器、または流動層反応器。
【００４２】
反応器または容器１５０を、処理室内に配置することができるか、例えば、絶縁ステンレス鋼またはガラスで裏打ちされたパイプによって処理室に接続することができると理解されるであろう。さらに、いくつかの実施形態では、冷却コイルおよび／または加熱コイル（示さず）を、温度を低下させ得る速度を増大させるために例示的なシステムの反応器またはケトル１５０に隣接させるかその周囲に配置することができる。
【００４３】
図２を参照すると、プローブ２００の例示的実施形態を示す。プローブ２００を、当該分野で公知の任意の手段（以下が含まれるが、これらに限定されない：ワイヤ、絶縁電線、無線技術、フィッティング、クランプ、螺子、クリップ、および接着剤など）によってインピーダンス計に接続することができる。１つの実施形態では、プローブ２００は、少なくとも１つの送信電極２１０および少なくとも１つの受信電極２２０を備える。少なくとも１つの送信電極２１０をインピーダンス計に電気的に接続し、電気信号（すなわち、励起信号）を、インピーダンス計から少なくとも１つの送信電極２１０に伝搬することができるように適合することができる。電気信号は、タンパク質混合物に接触しているか、タンパク質混合物中に沈められているか配置されている少なくとも１つの送信電極２１０から混合物を通して流れることができ、少なくとも１つの受信電極２２０（この電極も混合物に接触するか、混合物中に沈めるか配置することができる）によって受信することができる。少なくとも１つの受信電極２２０を、電気信号を受信するように適合することができ、電気信号を少なくとも１つの受信電極２２０からインピーダンス計２１０に送信することができるようにインピーダンス計に電気的に接続することができる。一般に、少なくとも１つの送信電極２１０を、電極が相互に接触することを防止するために少なくとも１つの受信電極２２０から絶縁することができる。１つの例示的なプローブ２００は、ＡＢＢモデルＴＢ４５７滅菌可能伝導性センサである。１つの例示的な実施形態では、少なくとも１つの送信電極２１０は１対の電極を備え、少なくとも１つの受信電極２２０も１対の電極を備える。
【００４４】
単一のプローブ２００が１対の電極または任意の数の送信電極２１０もしくは受信電極２２０を備えることができ、送信電極２１０および受信電極２２０として特徴づけられるが、任意の電極を極性に応じて受信電極、送信電極、または受信電極と送信電極との両方であるように適合させることができると認識されるであろう。さらに、任意の数のプローブ２００を使用して混合物の電気化学的性質および電気的性質（インピーダンスなどであるが、これらに限定されない）を測定することができると認識されるであろう。さらに、各プローブ２００は、任意の他のプローブ２００の異なる周波数または同一周波数で電気信号を発することができる。
【００４５】
１つの例示的な実施形態では、単一のプローブ２００をタンパク質混合物（例えば、血漿など）中に沈めることができ、血漿のインピーダンスをタンパク質の精製プロセスまたは分離プロセス中に測定することができる。別の例では、２つ以上のプローブ２００を生体液（アルブミン溶液などであるが、これらに限定されない）内の複数の位置に沈めることができ、各位置のインピーダンス測定値を同一の励起周波数で得ることができる。さらに別の例では、単一のプローブ２００を使用して、タンパク質濃度（例えば、ＩｇＧ濃度）を有するタンパク質懸濁液のインピーダンスを複数の周波数にてリアルタイムで測定することができる。
【００４６】
インピーダンス分光法
本発明の１つの態様では、タンパク質プロセスのモニタリングおよび／または制御は、タンパク質混合物のインピーダンス測定のための任意の適切な方法およびデバイスを利用することができる。１つの例示的な実施形態では、正弦電気信号（すなわち、励起信号）を任意の液体（例えば、タンパク質溶液またはタンパク質懸濁液など）に印加することができる。信号は、一般に、インピーダンス測定値によって系に最小の摂動しか生じないように約１〜約１００ｍＶの範囲であり得る。式１に示すように、例示的な励起信号は、時間依存ポテンシャルＥ（ｔ）、振幅Ｅ０、および周波数ωを有する。半径方向周波数ωは、２пとｆ（周波数：単位ヘルツ）との積に等しい（すなわち、ω＝２пｆ）。
【００４７】
【数１】
2017071648.tif 000002
一旦励起信号がタンパク質混合物を通じて伝搬されると、得られた電流を測定して混合物のインピーダンスを測定することができる。式２に示すように、測定した電流Ｉ（ｔ）を、励起信号と同一の周波数で正弦波に近似することができるが、位相シフトする。
【００４８】
【数２】
2017071648.tif 000003
（式中、Ｉ（ｔ）は、時間ｔでの電流であり、ここで、振幅Ｉ０であり、φだけ位相シフトする）。
【００４９】
オームの法則（式３）を使用して、大きさＺ０、周波数（ω）、および位相シフト（φ）の関数として特定の時間での混合物のインピーダンスを示すことができる。
【００５０】
【数３】
2017071648.tif 000004
さらに、インピーダンスを、周波数空間において式４に示すように実数部（抵抗を示す）および虚数部（リアクタンスを示す）を有する複素数として示すこともできる。
【００５１】
【数４】
2017071648.tif 000005
従って、複素インピーダンスは、印加した励起信号の周波数に伴って変化するであろう。
【００５２】
複素インピーダンスを実数成分および虚数成分によって示すので、これらの成分のうちのいずれかを、タンパク質混合物の複素インピーダンス測定値から決定することができる。さらに、測定される特定のタンパク質混合物に応じて、実数成分または虚数成分のいずれかを、他よりもタンパク質混合物の性質、パラメータ、または状態と強く相関させることができる。したがって、１つの実施形態では、インピーダンスの実数成分または虚数成分のいずれかを、独立して基準インピーダンス値と比較して、タンパク質混合物またはタンパク質プロセスに関する情報を決定することができる。
【００５３】
測定されたインピーダンスの実数成分および虚数成分が同一の周波数または異なる周波数でタンパク質混合物の性質と強く相関し得るとさらに認識されるであろう。例えば、タンパク質懸濁液のインピーダンスの実数成分が約１．６ｋＨｚ〜約１６ｋＨｚの周波数で特定のタンパク質混合物またはタンパク質混合物の状態と強く相関し得る一方で、同一のタンパク質混合物のインピーダンスの虚数成分が約１６ｋＨｚ〜約５０ｋＨｚの周波数でタンパク質混合物またはタンパク質混合物の状態と強く相関し得る。
【００５４】
一方、いくつかの実施形態では、インピーダンスの実数成分または虚数成分のみを決定し、基準インピーダンス値と比較することができる。他の実施形態では、複素インピーダンス（実数成分および虚数成分の両方を含む）を測定し、ターゲット基準インピーダンス値またはターゲット基準インピーダンス値の範囲と比較することができる。
【００５５】
基準曲線の作成
一旦タンパク質混合物のインピーダンスが測定されると、測定されたインピーダンス値を、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較することができる。特に、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲は、タンパク質プロセス（分離プロセス、抽出プロセス、または分画プロセスなど）における任意の工程のターゲット値を示し得る。他の変数が不変のままである場合にタンパク質プロセス中の特定の工程での基準混合物と実質的に類似の組成を有することが望ましい任意のその後のタンパク質混合物が実質的に類似のインピーダンスを有するべきであるので、基準インピーダンス値を「ターゲットインピーダンス値」または「ターゲット基準インピーダンス値」ということができる。
【００５６】
１つの例示的な実施形態では、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲を、基準タンパク質プロセスに供した基準タンパク質混合物のインピーダンスの予備測定および相関によって決定するか確認することができる。基準タンパク質混合物および基準タンパク質プロセスの両方は、その後の非基準タンパク質混合物および非基準タンパク質プロセスと実質的に類似し得、それらについての情報は、相関が正確であることが望ましい。
【００５７】
例えば、既知の物理的特性および化学的特性を有する基準タンパク質混合物のインピーダンスを、混合物を基準タンパク質プロセスに供する前に測定し、記録することができる。任意のその後の非基準タンパク質混合物のインピーダンスをこの基準インピーダンス値と比較して、非基準混合物が基準混合物と実質的に類似し、したがって、特定のタンパク質プロセスに適切であるかどうかを決定することができる。
【００５８】
別の例では、基準タンパク質プロセスの第１の工程を、基準タンパク質混合物に対して行うことができ、第１の工程を通してインピーダンスを測定および記録して基準プロセスの第１の工程に対応する基準インピーダンス値および／または基準インピーダンス値の範囲を得ることができる。この第１の基準プロセスの工程中に、インピーダンス記録に加えて基準混合物の１つ以上の物理的特性または化学的特性を慎重に調整して測定することができる。複素数の線形および／または非線形回帰分析または他の数学的技術を使用して、基準混合物のインピーダンスを、プロセスの第１の工程中にタンパク質混合物の特定の測定した特性と相関させることができる。したがって、実質的に類似の非基準プロセスを受けた実質的に類似の非基準タンパク質混合物のインピーダンスは、得られた基準インピーダンス値または値の範囲と実質的に類似すべきである。したがって、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲を、「ターゲット基準インピーダンス値」、「ターゲットインピーダンス値」、または「インピーダンス値のターゲット基準範囲」ということができる。
【００５９】
この基準インピーダンス値を得る手順を所望されるか必要とされるとおりに反復して基準タンパク質プロセス中の複数の工程についての基準インピーダンス値を得ることができると認識されるであろう。同様に、この手順を、多数のタンパク質混合物について反復することができる。さらに、基準インピーダンス値および測定したタンパク質混合物の特性の両方を、例えば、データベースに記録することができる。このような方法で、タンパク質混合物および／またはタンパク質プロセス中の特定の工程の特性に基づいた基準インピーダンス値の任意の所望のスペクトルを得ることが可能である。
【００６０】
より好ましい実施形態では、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲を、各データポイントの実際の測定よりもむしろ相関および外挿によって決定することができる。例えば、種々の数の基準インピーダンス値を既知のパラメータを有するタンパク質混合物について測定することができる。一般に、タンパク質混合物の１つ以上のパラメータを別の既知の値に調整することができ、さらなるインピーダンス測定値を確認することができる。分析技術（線形および／または非線形回帰分析など）を使用して、タンパク質混合物のインピーダンスの実数部および／または虚数部を、調整したパラメータに相関させることができる。このような方法で回帰式を決定することができ、この回帰式を使用してさらなるデータポイントを予測することができる。かかる相関および外挿を当該分野で公知の多数の方法でコンピュータ化することができ、かかる計算を、インピーダンス計に取り付けたコンピュータ上か、いくつかの実施形態では、インピーダンス計自体の統計ソフトウェアによって行うことができると理解されるであろう。
【００６１】
別の例示的な実施形態では、基準タンパク質プロセスを意図的に変更して、インピーダンス値の許容範囲に対して許容可能な最大または最小の基準インピーダンス値または限度を得ることができる。例えば、得られたタンパク質混合物中のエタノール濃度が２０体積％であるように特定のタンパク質プロセスがタンパク質混合物にエタノールを添加する必要がある場合、１５体積％または２５体積％のタンパク質混合物の生成の点のみが異なる別の理想的な基準タンパク質プロセスのための基準インピーダンス値を得ることができる。このような方法で、実施者は、測定されたインピーダンス値を基準インピーダンス値の範囲と比較して非基準タンパク質混合物のアルコール含有量が１５％と２５％との間であるかどうかを決定することができるであろう。
【００６２】
基準インピーダンス値を多数の異なる励起周波数で測定、決定、または計算することができると理解されるであろう。上記で考察するように、特定のタンパク質混合物に応じて、タンパク質を通して伝搬された電気信号の周波数は、インピーダンスの実数成分またはインピーダンスの虚数成分により強く相関し得る。したがって、複数の周波数でインピーダンスを決定することにより、測定されたインピーダンスの実数成分および／または虚数成分と特定のタンパク質混合物の特性との間の相関が最も強い場合、統計ソフトウェアを使用して使用に最適な周波数範囲を確立することができるようなさらなる情報を得ることができる。いくつかの実施形態では、周波数、インピーダンス値、タンパク質混合物の組成、タンパク質混合物のパラメータ、および／または時間の全てをデータベースに記録することができる。
【００６３】
さらに別の実施形態では、基準タンパク質混合物の実数および／または虚数インピーダンスを単一の周波数で測定し、タンパク質プロセスを受けるタンパク質混合物中のタンパク質の溶解度を修正する特定のパラメータ（ｐＨ、伝導率、液体／固体分離、水混和性有機沈殿剤濃度、タンパク質凝集、密度、流量、粘度、タンパク質濃度、温度、および／またはタンパク質のエイジングなどであるが、これらに限定されない）と相関させることができる。例えば、既知のアルコール濃度を有する基準タンパク質混合物のインピーダンスの実数部を励起周波数０．０２ｋＨｚで測定し、アルコール濃度のインピーダンスとの相関をその周波数について近似することができる。次いで、混合物のアルコール濃度を調整し、近似アルコール濃度を、事前に計算した相関を使用して決定することができる。次いで、相関の正確度を、近似アルコール濃度を既知または測定した濃度と比較することによって決定することができる。
【００６４】
一旦基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲が測定され、確認され、保存され、既知であり、そして／または利用可能であると、タンパク質混合物の測定されたインピーダンス値をそれと比較することができる。１つの実施形態では、混合物のインピーダンスを所定の時間間隔で決定することができ、各インピーダンス測定値を基準タンパク質プロセス中の同一の時間間隔で取得した基準インピーダンス値と比較することができる。測定されたインピーダンス値が基準インピーダンス値の受容可能な偏差内である場合、タンパク質プロセスは修正せずに継続してもよい。しかし、測定されたインピーダンス値が受容可能なインピーダンス値の範囲外である場合、プロセスを調整するか、タンパク質混合物を直接調整することができる。あるいはまたはさらに、オペレータにその偏差を通知することができる。
【００６５】
例示的なタンパク質プロセス
本発明は、生体液からのタンパク質の任意の特定の分離および／または精製プロセスに必ずしも制限されない。実際に、生体液からのタンパク質の任意の分離および／または精製プロセスを、プロセスにおける変更の任意の適切な型の測定のための手段としてＩＳを利用する本発明のプロセス制御システムを使用して制御、調整、および／またはモニタリングすることができると考えられる。ＩＳを使用して任意の適切なタンパク質プロセス（例えば、コーン分画プロセス、キスラープロセス、オンクリープロセス、またはその修正形態など）中の任意の工程の組成を測定し、その進行をモニタリングすることができる。特に適切なプロセスは、米国特許第５，１７７，１９４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。好ましい実施形態では、本発明のプロセス制御システムを使用して、ヒトへの投与のための精製分画タンパク質生成物の生成のために血漿分画プロセス中の任意の工程を制御、調整、および／またはモニタリングすることができる。一般に、血漿混合物のインピーダンスを各分画および／または精製プロセスの工程を通して１つの周波数または複数の周波数で測定することができ、測定されたインピーダンス値をターゲット基準インピーダンス値またはターゲット基準インピーダンス値の範囲と連続的に比較して測定されたインピーダンス値が受容可能な許容差内であるかどうかを決定する（すなわち、プロセスが正しく進行しているかどうかを決定する）ことができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、プロセスの工程には、他の変数を一定に保ちながら変更すべき血漿混合物の単一の変数のみ（すなわち、アルコール濃度）を必要とし得る。この特定の実施形態では、インピーダンスを測定し、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較してプロセスの工程の結果（すなわち、血漿混合物中の得られたアルコール濃度）を決定することができる。他の実施形態では、プロセスの工程には調整すべき複数の変数（すなわち、アルコール濃度、ｐＨ、および温度）を必要とし得るので、インピーダンスを使用して得られた血漿の単一のパラメータの実際の値を決定することができない。むしろ、インピーダンスを測定して、測定されたインピーダンス値を得ることができ、測定されたインピーダンス値をターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲と比較してプロセスがプロセス計画に従って進行しているかどうかを決定することができる。上で詳述のように、測定されたインピーダンス値がターゲット基準インピーダンス値の受容可能な許容差内である場合、自動的かプロセスを手動で制御することができるオペレータへの通知のいずれかによってその後の工程にプロセスを進めることができる。さらに、測定されたインピーダンス値が受容可能な許容差を超えてターゲットインピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲から逸脱する場合、プロセスを自動的に調整することができるか、プロセスまたはプロセスによって利用される混合物を手動で調整することができるようにオペレータに通知することができる。
【００６７】
コーン分画プロセスをモニタリングおよび／または制御する方法
１つの例示的な実施形態では、血漿分画プロセスは、コーン分画プロセスまたはその任意の変形であり得る。例えば、本発明のプロセス制御システム（図１および２に示す例示的な実施形態などであるが、これらに限定されない）を使用して、コーン分画プロセスまたはその任意の変形からの任意のタンパク質血漿中間体の調製を制御、調整、および／またはモニタリングすることができる。特定の実施形態では、ＩＳを使用して、コーン分画プロセス、またはその任意の変形、修正形態、および／もしくは組み合わせからの寒冷沈降物、画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、画分ＩＶ−１、画分ＩＶ−４、および／または画分Ｖの生成をモニタリングすることができる。
【００６８】
図３に関して、コーン分画プロセスの例示的な変形を示す。この変形は、新鮮および／または解凍した血漿を組み合わせて血漿プールを形成することができる。示した例示的なプロセスでは、分画が寒冷沈降物単離工程から開始され、この工程はＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。一旦寒冷沈降物が血漿プールから除去されると、残存するタンパク質混合物を脱クリオ血漿（ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）ということができる。
【００６９】
画分Ｉ
例示的なプロセス中の次の工程は、画分Ｉを単離することであり、この画分Ｉは、典型的にはフィブリノゲンを含む。脱クリオ血漿から画分Ｉを沈降させるために、血漿混合物を穏やかに撹拌し、温度を約０℃〜約２℃にする。血漿混合物のインピーダンスを継続的に測定し、ターゲット基準インピーダンス値または基準インピーダンス値のターゲット範囲と比較して受容可能な温度に到達したときを決定することができる。
【００７０】
撹拌中、エタノール濃度が、例えば、約５３％の十分量のエタノール−水混合物を血漿混合物に添加して、得られた血漿溶液のエタノール濃度を約８体積％エタノールにすることができる。この工程を図３に示し、例えば、図１および２に示す例示的なシステムを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。具体的には、血漿混合物のアルコール濃度を、アルコール添加プロセスの工程中の混合物のインピーダンスの測定によって決定または推定して、測定されたインピーダンス値を得ることができ、測定されたインピーダンス値をプロセス中のこの特定の工程について事前に決定したターゲット基準インピーダンス値またはターゲット基準インピーダンス値の範囲と比較することができる。１つの実施形態では、測定されたインピーダンス値が基準インピーダンス値のターゲット範囲内である場合、プロセスは分画プロセス中のその後の工程を自動的に誘導することができる。
【００７１】
ついで、緩衝液（酢酸ナトリウム−酢酸などであるが、これに限定されない）の添加をＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御して溶液のｐＨを約７．０〜約７．４に増大させる。血漿混合物の他の変数を変更することなく緩衝液が添加される場合、インピーダンスを測定して基準インピーダンス値と比較し、溶液のｐＨを決定することができる。しかし、エタノール−水混合物を有する溶液中に緩衝液を添加する場合、血漿混合物のインピーダンスを測定し、両方の変数の変化に基づいて事前に決定した基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較して、プロセス計画に従ってプロセスを進めるかどうかを決定することができる。
【００７２】
エタノール−水混合物および／または緩衝液の添加中に、当該分野で公知の任意の手段（例えば、水浴および／または冷却ケーブル）によって血漿溶液の温度を約−２℃〜約−３℃に低下させる。また、ＩＳを使用して、インピーダンスを測定し、測定されたインピーダンス値を実質的に類似のプロセスパラメータ下および実質的に類似の血漿混合物を使用して決定した基準インピーダンス値と比較することによってこの工程をモニタリングおよび／または制御することができる。１つの実施形態では、アルコールおよび緩衝液の総添加時間は、約１時間〜約２時間、好ましくは約９０分間である。
【００７３】
一旦上記システムのパラメータが得られると、画分Ｉを、例えば、約−２℃〜約−３℃の温度での遠心分離によって血漿溶液から除去することができる。インピーダンスをタンパク質凝集度および／またはタンパク質分離度に相関させることができるので（以下の実施例ＶＩＩＩおよび図６を参照のこと）、この除去工程をＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。遠心分離中のインピーダンスの測定により、測定されたインピーダンス値が基準インピーダンス値のターゲット範囲内であるか、ターゲット基準インピーダンス値の受容可能な許容差内である場合に、プロセスを自動的に停止させることができるか、オペレータに通知が送られ得る。
【００７４】
最後に、一旦画分Ｉ沈降物が得られると、この沈降物を未乾燥状態にて約−５℃で保存することができるが、２〜３ヶ月後にフィブリノゲンの損失が予想される。タンパク質エイジングを画分Ｉ沈降物のインピーダンスと相関させることができるので、かかる損失をＩＳを使用してモニタリングすることができる。したがって、保存された画分Ｉ沈降物のインピーダンスを測定することができ、測定されたインピーダンス値を基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較してフィブリノゲンの損失を決定することができる。
【００７５】
コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ
例示的なコーン分画プロセス中の次の工程は、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを生成するであろう。この画分は、約３０％〜約８５％のＩｇＧポリクローナル抗体、約５％〜約３０％のＩｇＡ、約１％〜約２５％のＩｇＭ、および微量の他の成分（例えば、凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ならびにαおよびβグロブリンなど）を含む。ＩＳを使用してこのプロセス中の複数の変数および／またはサブ工程をモニタリングおよび／または制御することができると考えられる。
【００７６】
血漿溶液からのコーン画分Ｉの除去後、得られた上清を約−５℃に冷却し、緩衝液の添加によってｐＨを約６．７〜約６．９に調整する。緩衝液は当該分野で公知の任意の緩衝液であり得るが、好ましくは、画分Ｉの除去プロセスで使用した緩衝液と同一の緩衝液であり得る。さらに、エタノール濃度約５３％の冷エタノール溶液を、得られた血漿溶液中のアルコール濃度が約２５体積％アルコールであるように上清に添加する。１つの実施形態では、アルコールおよび緩衝液に必要な総添加時間は約５時間である。画分Ｉに関して上記のように、ＩＳを使用して、これらのプロセスの工程のそれぞれを、逐次的に行っても組み合わせて行ってもモニタリングおよび／または制御することができる。さらに、ＩＳを画分Ｉに関して上記と類似の様式で使用して、遠心分離および回収などの方法（これらに限定されない）を使用して得られた懸濁液由来の画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈降をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００７７】
一旦除去されると、画分ＩＩ＋ＩＩＩを、測定可能なタンパク質分解を起こさずに約１年間未乾燥形態で保存することができる。未乾燥の画分ＩＩ＋ＩＩＩのインピーダンスを上記のようにタンパク質分解に相関させることができ、未乾燥形態の実質的な変化を、好ましくはリアルタイムまたはほぼリアルタイムでのインピーダンスの反復的および／または連続的な測定および比較を介して、オペレータへの通知によって防止することができると考えられる。
【００７８】
画分ＩＶ−１
同様に、ＩＳを使用して、画分ＩＩ＋ＩＩＩの除去に起因する上清からのコーン画分ＩＶ−１の沈降中の複数の工程をモニタリングおよび／または制御することができる。このプロセスでは、約０oＣの水を最初に上清に添加して溶液のエタノール濃度を約１８体積
％エタノールに減少させることができる。緩衝液（画分Ｉおよび／または画分ＩＩ＋ＩＩＩを得るために使用した緩衝液など）を、ｐＨを約５．０〜約５．４に低下させるように血漿溶液に添加することができる。１つの実施形態では、温度を、プロセスを通して約−５℃に一定に保持する。ＩＳを使用して、画分Ｉに関して上記の様式に類似の様式で、血漿混合物のアルコール濃度および／またはｐＨを、これらの変数が同時に変化するか個別の工程で変化するかに無関係にモニタリングおよび／または制御することができる。
【００７９】
アルコールおよび緩衝液の添加完了後、血漿混合物を約１時間撹拌し、約６〜約８時間静置して沈降を完了させる。インピーダンスをタンパク質凝集、タンパク質エイジング、およびタンパク質濃度などの変数と相関させることができるので、撹拌した血漿混合物のインピーダンス測定値を使用して、沈降物の完全性を有効に決定することができ、それによって有用な時間が節約される。画分ＩＶ−１懸濁液のインピーダンスをリアルタイムまたはほぼリアルタイムでモニタリングし、インピーダンス値のターゲット基準範囲および／またはターゲットインピーダンス値と比較して沈降物の完全性を決定することができる。測定されたインピーダンスがインピーダンス値のターゲット基準範囲内である場合、プロセスは次の工程を続けることができる。別の実施形態では、一旦測定されたインピーダンスがインピーダンス値のターゲット基準範囲内であると、オペレータに警告することができる。
【００８０】
画分ＩＶ−１を、例えば、遠心分離によって血漿溶液から除去することができ、かかる除去を画分Ｉに関して上記のようにＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。
【００８１】
画分ＩＶ−４
コーン画分ＩＶ−４は、主に、αおよびβグロブリンならびにアルブミンからなる。１つの例示的な実施形態では、ＩＳを使用して、血漿混合物からの画分ＩＶ−４の生成における種々のプロセスの工程をモニタリングおよび／または制御することができる。一旦画分ＩＶ−１が血漿混合物から除去されると、ｐＨを約５．８に増大させるために約９０分間にわたって緩衝液を混合物に添加することができる。緩衝液の添加後、エタノール溶液（９５％エタノール溶液など）を溶液に添加して、エタノール濃度を約４０体積％に増大させることができる。温度を、プロセスを通して約−５℃に一定に保持することができる。画分Ｉに関して上記のように、ＩＳを使用して、独立して変化するか組み合わせて変化するかに無関係に血漿混合物のｐＨ、アルコール濃度、および／または温度をモニタリングおよび／または制御することができる。画分ＩＶ−４を、例えば、遠心分離によって溶液から除去することができ、かかる除去を、画分Ｉに関して上記と類似の様式でＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。
【００８２】
画分Ｖ
コーン画分Ｖは、出発血漿プール中に存在するほとんどのアルブミンを含み、一般に、３％未満のα−グロブリンおよび０．５％未満のβ−グロブリンを含む。画分Ｉに関する上記のＩＳ法を使用して、血漿溶液（画分ＩＶ−４の除去後に残存する上清など）からの画分Ｖの精製をモニタリングおよび／または制御することができ、この画分Ｖは少量の懸濁材料と共に主にアルブミンを含むと考えられる。この懸濁材料を、例えば、濾過によって除去して高度に清澄化した画分を生成することができる。１つの実施形態では、０．５％洗浄標準スーパーセル（ｓｕｐｅｒ  ｃｅｌ）を血漿溶液に添加し、得られた懸濁液を濾過器にて約−５℃で濾過する。タンパク質混合物のインピーダンスを、濾過工程を通して測定し、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較することができる。
【００８３】
濾過後、例えば、溶液１リットル当たり約０．１モルの塩化ナトリウムを含む４０％エタノール溶液の使用によって後洗浄工程を行うことができる。インピーダンスをタンパク質濃度およびタンパク質凝集と相関させることができるので、後洗浄工程を、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。したがって、血漿混合物のインピーダンスを後洗浄プロセスを通して測定して、測定されたインピーダンスが基準インピーダンス値のターゲット範囲内であるときを決定する（したがって、後洗浄が完了したときを決定する）ことができる。
【００８４】
清澄化後、全濾液および洗液を溶液に合わせ、溶液のｐＨを緩衝液（酢酸ナトリウム−酢酸など）の添加によって約４．８に低下させる。緩衝液添加中に温度を約−５℃〜約−６℃に一定に保持し、前記緩衝液添加を約２時間にわたって行う。溶液を撹拌することなく少なくとも３時間静置し、画分Ｖペーストを、例えば、遠心分離または濾過によって沈殿させることができる。また、ＩＳを使用して、上記のように緩衝液の添加、温度変化、および／または画分Ｖの分離度をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００８５】
１つの実施形態では、画分Ｖペーストをさらに精製して、一定の臨床応用で使用するために電解質含量を除去することができ、かかる精製を、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。この実施形態では、上記のエタノール溶液および緩衝液を約２時間にわたって画分Ｖペーストに添加して、約３％タンパク質、１０％エタノール、０．０１Ｍ塩を含み、ｐＨが約４．５〜約４．７の溶液を調製することができる。一般に、添加中に温度を約−２℃〜約−３℃に低下させる。得られた混濁した溶液を穏やかであるが徹底的にさらに約２時間撹拌する。
【００８６】
さらに別の実施形態では、上記実施形態由来の得られた溶液を、例えば、約０．２５％の標準スーパーセルの溶液への懸濁および濾過パッドによる約−２℃での濾過によってさらに濾過することができる。任意のアルブミンが濾過ケークを塞ぐ場合、例えば、−２℃の約１０％エタノールを含む小体積の溶液を使用してアルブミンを洗い流すことができる。ＩＳを使用して濾過プロセスおよび後洗浄プロセスの工程をモニタリングおよび／または制御することができ、画分Ｖの精製に関して本明細書中に記載されているが、任意の分画血漿中間体を濾過および／または洗浄することができ、かかる濾過および／または洗浄を、本明細書中に記載のＩＳ技術によってモニタリングおよび／または制御することができると認識されるであろう。例えば、図１７に示すように、ＩＳを使用して、画分ＩＩ＋ＩＩＩの後洗浄および／または濾過をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００８７】
別の実施形態では、溶液中の不安定な不純物のレベルがＩＳ法または他の方法のいずれかによって所望するレベルまたは許容されるレベルよりも高いと決定される場合、洗浄のエタノール濃度を約１０％から約１５％に上昇させることができ、温度を約−２℃〜約−５℃に低下させることができる。また、ＩＳを使用して、上記のようにこのプロセスの工程をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００８８】
一旦濾過されると、アルブミンを、例えば、９５％エタノール溶液の添加によって溶液のエタノール濃度を約４０％に上昇させることによって濾液から沈殿させることができる。エタノール添加中、温度を約−５℃〜約−６℃に低下させながら、例えば、重炭酸ナトリウムの添加によってｐＨを約５．０〜約５．４に上昇させることができる。このプロセスを完了するまで約２時間要し得、一旦所望のパラメータが得られると（インピーダンス測定値を使用して測定および／または決定する場合）、遠心分離または濾過によってアルブミンを除去することができる。アルブミンを、実用的な低温での凍結状態から乾燥させることができる。
【００８９】
本発明のプロセス制御システムを使用して、上記のコーン分画プロセスの多数の変形形態における任意の工程を制御、調整、および／またはモニタリングすることができると認識されるであろう。例えば、１つの実施形態では、本発明のプロセス制御システム（図１および２に示す例示的な実施形態などであるが、これらに限定されない）を使用して、キスラープロセスまたはその任意の変形からの任意の中間組成物の調製を制御、調整、および／またはモニタリングすることができる。特定の実施形態では、インピーダンス分光法を使用して、キスラープロセスまたはその任意の変形形態、組み合わせ、もしくは修正形態からのキスラー沈降物Ａ、キスラー沈降物Ｂ、キスラー沈降物ＩＶ、キスラー沈降物Ｃ、キスラー沈降物Ｄの生成における各工程をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００９０】
別の例示的な実施形態では、タンパク質プロセスを制御および／またはモニタリングするためにインピーダンス測定値を使用する本発明のプロセス制御システム（図１および２に示す例示的な実施形態などであるが、これらに限定されない）を使用して、テシュナープロセスまたはその任意の変形からの任意の中間組成物の調製を制御、調整、および／またはモニタリングすることができる。インピーダンスを測定し、テシュナープロセス中の任意のプロセスの工程（寒冷分離、血液凝固因子および抗トロンビンの吸着、修正エタノール分画、Ｓ／Ｄ処理、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、限外濾過／ダイアフィルトレーション、ナノ濾過、濃縮処方充填（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａ  ｆｉｌｌｉｎｇ）、凍結乾燥、および／またはインキュベーションなどであるが、これらに限定されない）で基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲と比較することができる。特定の実施形態では、インピーダンス分光法を使用して、テシュナー沈降物Ｇ生成中の各工程をモニタリングおよび／または制御することができる。本発明のシステムおよび方法が特定のタンパク質プロセスに制限されないので、テシュナープロセスの任意の変形形態、組み合わせ、または修正形態をＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができると認識されるであろう。
オンクリー分画プロセスをモニタリングおよび／または制御する方法
別の例示的なプロセスでは、本発明のプロセス制御システムを使用して、オンクリー分画プロセスまたはその任意の変形中の任意の工程を制御、調整、および／またはモニタリングすることができる。特定の実施形態では、ＩＳを使用して、画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ、画分ＩＩ、および画分ＩＩＩの各生成工程中のアルコール濃度、イオン強度、ｐＨ、温度、精製、遠心分離、タンパク質分離、タンパク質凝塊形成、タンパク質濃度、および／またはタンパク質エイジングをモニタリングおよび／または制御することができる。
【００９１】
画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ
１つの実施形態では、本発明のインピーダンスモニタリングおよび制御技術を、画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ生成プロセスで使用する。第１に、画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈降物を、画分ＩＩ＋ＩＩＩ：水の体積比約１：５、約１：１０、約１：１５、または約１：２０で冷水に懸濁することができる。かかる体積比を上記のようにＩＳを使用して決定することができる。なぜなら、これらの値がタンパク質濃度に対応し得るからである。得られた血漿混合物のイオン強度を上記のようにＩＳを使用してモニタリングし、そして／または例えば、リン酸ナトリウム溶液の添加によって約０．００３ｍ〜約０．００５ｍに調整することができる。得られた混合物のアルコール濃度が約２０％〜約２５体積％アルコールであるようにエタノール溶液を血漿混合物に添加することもできる。かかるアルコールの添加を、例示的なコーン分画プロセスに関して上記と類似の様式でＩＳを使用して制御および／またはモニタリングすることができる。一般に、溶液の温度をプロセス中に約−５℃に低下させることができ、例えば、酢酸緩衝液または希釈水酸化ナトリウムの使用によってｐＨを約７．２〜約７．６に維持または調整することができる。これらのプロセスの工程を、組み合わせて完了するか独立して完了するかに無関係に、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。一旦必要なパラメータが得られると、画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ沈降物を、当該分野で公知の任意の手段（約−５℃での遠心分離および／または濾過が含まれるが、これらに限定されない）によって回収することができる。
【００９２】
画分ＩＩおよびＩＩＩ
本出願のインピーダンス測定、モニタリングおよび制御技術は、任意の数の分画血漿中間体（画分ＩＩ＋ＩＩＩｗなどであるが、これに限定されない）の保存プロセスならびに／または個々の成分および小成分（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）への分離プロセスで有用であると考えられる。１つの例示的な実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩｗ沈降物を約−５℃の十分量の水に溶解して、タンパク質濃度１％の溶液を得ることができる。温度の変化およびタンパク質濃度の両方を、例示的なコーン分画プロセスに関して上記と類似の様式でＩＳを使用して決定および／または制御することができる。溶液のｐＨを保持するか約７．２に調整することができ、得られた溶液のアルコール濃度が約２０体積％〜約２５体積％アルコールであるように冷エタノールを添加することができ、かかるプロセスの工程を、上記のようにＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。１つの実施形態では、溶液を約−５℃で約２〜約２４時間静置する。上記のように、ＩＳを使用して、例えば、血漿混合物の遠心分離によって約９５％〜約９９％のＩｇＧポリクローナル抗体、少なくとも０．０１％〜約２％のＩｇＭ、および微量の塩を含む画分ＩＩの分離をモニタリングおよび／または制御することができる。
【００９３】
一旦画分ＩＩが血漿混合物から除去されると、ＩＳを使用して、ｐＨ約５．７への調整および最終濃度が約２５体積％アルコールに到達するためのアルコールの添加による上清からの画分ＩＩＩの沈降を制御および／またはモニタリングすることができる。ついで、混合物を、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる分離度に応じて、約２〜約２４時間さらに修正することなく静置することができる。ついで、微量の凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、αおよびβグロビン、ならびに脂質と共に少なくとも約２５％のＩｇＧポリクローナル抗体、少なくとも約５％〜約３０％のＩｇＡ、および約１％〜約２５％のＩｇＭを含む画分ＩＩＩを、例えば、ＩＳによってモニタリングおよび／または制御した遠心分離によって除去することができる。重要なことに、基準インピーダンス値または基準インピーダンス値の範囲が事前に得られる限り、各工程を独立して完了するか他の工程と組み合わせて完了するかに無関係に画分ＩＩＩ生成中の各工程でＩＳを使用することができる。
【００９４】
免疫グロブリン精製プロセスのモニタリングおよび／または制御方法
別の実施形態では、本明細書中に記載のインピーダンスシステムおよびインピーダンス方法を使用して、分画血漿中間体（コーン画分Ｉ、コーン画分ＩＩ、コーン画分ＩＩＩ、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩ、および／またはコーン画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩなどであるが、これらに限定されない）からの免疫グロブリンの分離をモニタリングおよび／または制御することができる。第１の工程では、分画血漿中間体を実質的に変性しない温度および酸性ｐＨで水に懸濁する。本明細書中で使用する場合、「実質的に変性しない」は、この用語が言及する条件によって免疫血清グロブリンの生物学的活性が実質的に不可逆的に喪失されないことを意味する。かかる温度およびｐＨレベルを、例示的なコーン分画プロセスに関する上記と類似の様式でＩＳを使用して決定、モニタリング、調整、および／または制御することができる。
【００９５】
粗血漿タンパク質画分を、画分重量の約５〜約１０倍の冷水に懸濁することができる。水を、好ましくは、免疫血清グロブリンタンパク質の実質的な変性を防止する低温で維持する。約０℃〜約１０℃、好ましくは約１℃〜約３℃を典型的に使用する。さらに、懸濁液を、任意選択的に変性させない酸で酸性化することができ、懸濁液のｐＨを約４．５〜約５．５、好ましくは約５．０〜約５．２に保持することができる。例示的なコーン分画プロセスについて上記と同様に、この例示的な免疫グロブリン精製プロセスの温度およびｐＨ値を、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することもできる。
【００９６】
タンパク質沈殿剤の添加により、非血清グロブリンタンパク質、脂質、およびいくつかのウイルスを、免疫血清グロブリンを実質的に沈殿させることなく懸濁液から沈殿させることができる。実質的に変性させない水溶性タンパク質沈殿剤がタンパク質精製分野で周知であり、適切なタンパク質沈殿剤には、例えば、種々の分子量形態のポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、ポリビニルピロリドン、およびプルロニックが含まれる。タンパク質沈殿剤を、固体または市販の固体粉末もしくはフレーク由来の水性濃縮物として粗血漿タンパク質懸濁液に添加することができる。タンパク質沈殿剤の実際の使用量は、懸濁液において使用した特定の沈殿剤、温度、ｐＨ、およびタンパク質濃度に応じて変化するであろうが、ＩＳを使用して、これらのパラメータに基づいて添加をモニタリングおよび／または制御することができる。一般に、沈殿を低温（例えば、約１０℃未満）で維持し、平衡に到達するまで（例えば、一般に、約１時間以上）進行させる。
【００９７】
沈殿後、免疫グロブリン含有脂質を、沈殿に起因する固体−液体混合物から回収する。清澄化液体を従来の固体−液体分離技術（遠心分離および濾過など）によって回収することができ、かかる回収を、例示的なコーン分画プロセスに関して上記と類似の様式でＩＳを使用してモニタリングして完全性（タンパク質の分離度）および／またはプロセスパラメータを決定することができる。
【００９８】
粗血漿タンパク質画分中に依然として存在し得る感染性ウイルスを、殺ウイルス量のウイルス不活性薬を清澄化免疫血清グロブリン含有液体に添加することによって不活化することができる。一般に、本発明のインピーダンス技術は、ウイルス不活性薬（界面活性剤（例えば、オキシエチル化アルキルフェノール、Ｃ１２〜２２脂肪酸とヘキサトール無水物との部分エステルのポリエチル化誘導体、リン酸の低級アルキルエステル、およびその組み合わせ）など）の添加のモニタリングで有用であると考えられる。一般に、ウイルス不活化工程を、ウイルス不活化条件下で行う。これらの条件には、約１０℃〜約３０℃、好ましくは約１８℃〜約２２℃の温度が含まれる。さらに、十分なインキュベーション時間は約１時間であり得る。
【００９９】
別の実施形態では、一旦ウイルス不活化が完了すると、免疫グロブリン含有溶液を陽イオン交換樹脂と接触させてウイルス不活性薬および他の非血清グロブリン夾雑物を除去することができる。例として、溶液を陽イオン交換樹脂（カルボキシメチルアガロースなど）を充填したカラムに通すことができる。カラムを、樹脂を塩形態に変換することができる緩衝液（酢酸緩衝液など）で平衡化する。溶液のインピーダンスを測定し、実質的に類似の成分を使用した実質的に類似のプロセス由来の基準インピーダンス値と比較することができるように、得られた混合物を、ＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することができる。
【０１００】
免疫グロブリン含有溶液のカラムへのローディング前に、溶液の塩濃度をＩＳを使用してモニタリングし、平衡緩衝液の塩濃度と実質的に等しい量に調整することができる。一般に、溶液のカラムへのローディング後、カラムを平衡のために使用した緩衝液と同一の緩衝液で逐次的に洗浄し、洗浄プロセスをＩＳを使用してモニタリングおよび／または制御することもできる。
【０１０１】
次いで、免疫グロブリンを、免疫グロブリンを実質的に溶離するのに十分なｐＨおよびイオン強度を有する実質的に変性させない緩衝液を使用して陽イオン交換樹脂から溶離することができる。コーン分画プロセスに関して上記と類似の様式で、ＩＳを使用して、パラメータ（ｐＨ（好ましくは約７．０〜約８．５）、塩濃度、ポリエチレングリコール、および／またはグリシン濃度など）を確認することができる。一旦免疫グロブリンが溶離されると、溶離液を濃縮および濾過することができ、プロセスを所望されるか必要とされるとおりに繰り返すことができる。１つの実施形態では、免疫グロブリン濃度が、ＩＳを使用して決定した場合、要望するか必要な値未満である場合にプロセスを繰り返すことができる。溶液のインピーダンスに測定可能な変化も有意な変化ももたらさない溶液の他の成分のわずかな変化は溶液の任意の特定の特性（イオン濃度、タンパク質濃度、水混和性有機沈殿剤濃度、ｐＨ、温度および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる）とのインピーダンス値の全体的な相関に実質的にも有意にも影響を及ぼさないと考えられる。
【０１０２】
上記の説明および図面は本発明を例示するが、本発明を制限すると解釈されない。本発明の種々の実施形態の完全な理解のために多数の特定の詳細な情報を記載しているが、場合によっては、本発明の実施形態の考察を簡潔にするために周知または従来の詳細な情報は記載していない。
【実施例】
【０１０３】
実施例Ｉ
１つの例示的な実施形態では、基準インピーダンス値の範囲を、多数の異なる周波数およびｐＨ値でアルブミン溶液について測定した。測定した所定量の塩基性溶液をアルブミン溶液に添加する一方で、全ての他の物理的性質および化学的性質を一定に保持した。複数のインピーダンス測定値を多数の周波数で取り、汎用コンピュータに保存した。これらの工程を、ｐＨレベル３．２、４．２、および７．４について繰り返した。データは、５体積％アルブミン溶液の複素インピーダンスがｐＨに依存し、相関し得ることを示す。
【０１０４】
図４に関して、例示的なナイキストプロットを示し、ここでは、２ＫＨｚ〜１．７ＭＨｚの範囲の複数の周波数および複数のｐＨレベルで５体積％アルブミン溶液のインピーダンスの実数部を同一溶液のインピーダンスの虚数部に対してプロットしている。したがって、例示的なナイキストプロットの目視によってインピーダンスに及ぼすｐＨの影響が明らかに認められ、したがって、インピーダンスはｐＨに相関し得る。
【０１０５】
１つの例示的な実施形態では、図４のナイキストプロットを使用して、ｐＨレベル以外が同一または類似の組成を有するサンプル溶液のｐＨレベルを、２ＫＨｚ〜１．７ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、外挿することができる。図４に示すナイキストプロットに類似のナイキストプロットを使用して任意の溶液のインピーダンス値が溶液のｐＨと相関し得ると考えられる。
【０１０６】
アルブミン溶液のインピーダンスの実数部および虚数部（それぞれ、Ｒｅ  ＺおよびＩｍ  Ｚ）のその溶液のｐＨ濃度との相関を決定した。実施すべき最適周波数範囲を決定するために、統計ソフトウェア（Ｍｉｎｉｔａｂ  １５．１．１．０）を使用し、以下の線形回帰式を決定した。
【０１０７】
【数５】
2017071648.tif 000006
以下の表Ｉは、Ｒｅ  Ｚ（周波数５０ｋＨｚ未満）およびＩｍ  Ｚ（周波数５０ＫＨｚ超）とｐＨとの間に強い相関（Ｒ２＞９５％）を示すインピーダンス測定値の結果を示す。異なる周波数での係数Ａ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’、および対応する決定係数（Ｒ２）を解き、表Ｉに示す。Ｒｅ  Ｚについての６．３、１５．９、および５０．２ならびにＩｍ  Ｚについての１５９．０および５０２．４の最適周波数範囲（太字で示す）を、Ｒｅ  ＺまたはＩｍ  ＺのいずれかについてＲ２≧９５％である範囲と定義した。
【０１０８】
【表１】
2017071648.tif 000007
実施例ＩＩ
５体積％アルブミン溶液の複素インピーダンスは、ナトリウム濃度に依存することが示された。基準インピーダンス値の範囲を、多数の異なる周波数およびナトリウム濃度で測定した。測定した所定量のナトリウムをアルブミン溶液に添加する一方で、全ての他の物理的性質および化学的性質を一定に保持し、複数のインピーダンス測定値を異なる周波数で取り、汎用コンピュータに保存した。これらの工程を、０重量％、３．３重量％、９．５重量％、および１５重量％のナトリウム濃度について完了した。
【０１０９】
図５に関して、例示的なナイキストプロットを示し、ここでは、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の複数の周波数および複数のナトリウム濃度レベルで、５体積％アルブミン溶液のインピーダンスの実数部を同一溶液のインピーダンスの虚数部に対してプロットしている。示すように、インピーダンス値を、０重量％、３．３重量％、９．５重量％、および１５重量％のナトリウムレベルについて複数の周波数で決定した。したがって、例示的なナイキストプロットの目視によってアルブミン溶液のインピーダンスに及ぼすナトリウム濃度の影響が認められ、したがって、インピーダンスはナトリウム濃度に相関し得る。
【０１１０】
１つの例示的な実施形態では、図５のナイキストプロットを使用して、ナトリウム濃度以外が同一または類似の組成を有するサンプル溶液のナトリウム濃度を、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、外挿することができる。図５に示すナイキストプロットに類似のナイキストプロットを使用して任意の溶液のインピーダンス値が溶液のナトリウム濃度と相関し得ると考えられる。
【０１１１】
実施例ＩＩＩ
２０体積％のアルコールを含む画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液の複素インピーダンスは、遠心分離の際に減少することを示した。１つの例示的な実施形態では、基準インピーダンス値の範囲を、遠心分離の前後に多数の異なる周波数で測定した。遠心分離を、５０００Ｇの力にて−３oＣで３０分間行った。
【０１１２】
結果を図６の例示的なナイキストプロットに示し、ここでは、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の複数の周波数で、溶液のインピーダンスの実数部を同一溶液のインピーダンスの虚数部に対してプロットしている。示すように、２０％アルコールの画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液のインピーダンスは、遠心分離プロセスの影響を受けた。したがって、インピーダンスは、液体−固体分離度に相関し得る。
【０１１３】
１つの例示的な実施形態では、図６のナイキストプロットを使用して、液体−固体分離度以外が同一または類似の組成を有するサンプル溶液の液体−固体分離度を、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、外挿することができる。図６に示すナイキストプロットに類似のナイキストプロットを使用して任意のタンパク質懸濁液のインピーダンス値が液体−固体分離度と相関し得ると考えられる。
【０１１４】
実施例ＩＶ
脱クリオ血漿混合物の複素インピーダンスは、アルコール濃度に依存すると決定した。基準インピーダンス値の範囲を、多数の異なる周波数およびアルコール濃度で測定した。所定量のアルコールを脱クリオ混合物に添加する一方で、全ての他の物理的性質および化学的性質を一定に保持し、複数のインピーダンス測定値を異なる周波数で取り、汎用コンピュータに保存した。これらの工程を、０体積％、８体積％、および２０体積％のアルコール濃度について完了した。さらに、２回目の試行に、これらの工程を、１１体積％、１４体積％、および１７体積％のさらなるアルコール濃度について完了した。
【０１１５】
図７に関して、例示的なナイキストプロットを示し、ここでは、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の複数の周波数および複数のアルコール濃度レベルで、脱クリオ血漿混合物のインピーダンスの実数部を、同一溶液のインピーダンスの虚数部に対してプロットしている。インピーダンス値を、０体積％、８体積％、１１体積％、１４体積％、１７体積％、および２０体積％のアルコール濃度レベルについて複数の周波数で決定した。したがって、例示的なナイキストプロットの目視によって脱クリオ血漿混合物のインピーダンスに及ぼすアルコール濃度の影響が明らかに認められ、したがって、インピーダンスは脱クリオ血漿混合物のアルコール濃度に相関し得る。
【０１１６】
１つの例示的な実施形態では、図７のナイキストプロットを使用して、サンプル脱クリオ血漿溶液中のアルコール濃度を、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、アルコール濃度を知ることなく外挿することができる。
【０１１７】
実施例Ｖ
アセタート−ホスフェート緩衝液に懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの複素インピーダンスを、タンパク質エイジングに依存すると決定した。基準インピーダンス値の範囲を、多数の異なる周波数および懸濁液のエイジング時間で測定した。複数のインピーダンス測定値を異なる周波数および各所定の時間間隔で取り、これらの測定値を汎用コンピュータに保存した。インピーダンスを、約０分間〜長時間（すなわち、「一晩」）の範囲の時間間隔で測定した。図８に認められるように、タンパク質溶液がエイジングするにつれて、かかる溶液のインピーダンスは時間をわたって変化し得る。
【０１１８】
図８に関して、例示的なナイキストプロットを示し、ここでは、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の複数の周波数および０分間〜長時間（すなわち、「一晩」）の範囲の複数の時間で、懸濁液のインピーダンスの実数部を同一懸濁液のインピーダンスの虚数部に対してプロットしている。示すように、インピーダンス値を、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを添加する前のアセタート−ホスフェート緩衝液について多周波数８１０で決定した。インピーダンス値を、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの添加時８２０、添加の１時間後８３０、および添加の長時間後８４０に多周波数で決定した。したがって、例示的なナイキストプロットの目視によってアセタート−ホスフェート緩衝液に懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストに及ぼすエイジングの影響が明らかに認められ、インピーダンスはかかるエイジングに相関し得る。
【０１１９】
１つの例示的な実施形態では、図８のナイキストプロットを使用して、タンパク質混合物の熟成期間（ａｇｅ）を、約１ＫＨｚ〜約２ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、外挿することができる。図８に示すナイキストプロットに類似のナイキストプロットを使用して任意のタンパク質溶液のインピーダンス値がその熟成期間と相関し得ると考えられる。
【０１２０】
実施例ＶＩ
１つの例示的な実施形態では、ＩＳを使用して、生体液中のヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の濃度をモニタリングした。生体液のインピーダンスの実数部および虚数部（それぞれ、Ｒｅ  ＺおよびＩｍ  Ｚ）の生体液中のＩｇＧ濃度との相関を、懸濁プロセス中の一定の周波数での生体液のインピーダンスの測定によって決定した。約１．６Ｌの画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを、抽出緩衝液組成物に懸濁した。混合物を１０リットルのジャケット付きプロセスタンクに含め、水浴を使用して温度を一定に保持した。
【０１２１】
ＩｇＧ濃度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．より販売しているＩｍａｇｅ（登録商標）８００免疫化学システムを使用して所定の時間で測定した。濃度の測定値を、式７にしたがって計算した対応するＩｇＧ濃度中心対平均値と共に以下の表ＩＩに示し、図９にグラフで示す。
【０１２２】
【数６】
2017071648.tif 000008
【０１２３】
【表２】
2017071648.tif 000009
インピーダンスを表ＩＩに示した所定の同一時間間隔でモニタリングして、ＡＢＢ  ＴＢ４５７滅菌可能伝導性センサを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ４９８９  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬＣＲ  ｍｅｔｅｒを使用してＲｅ  ＺおよびＩｍ  Ｚを決定した。さらに、基準インピーダンス（Ｒｅ  Ｚ緩衝液およびＩｍ  Ｚ緩衝液）を、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの添加前の抽出緩衝液の複素インピーダンス測定によって決定した。式８〜１１に示すように、これらの測定値を各Ｒｅ  ＺおよびＩｍ  Ｚ測定値から引いてΔＲｅ  ＺおよびΔＩｍ  Ｚを決定する。
【０１２４】
【数７】
2017071648.tif 000010
インピーダンスの実数部および虚数部を、各インピーダンス信号がＩｇＧ濃度と強く相関することが事前に決定された周波数（ｆ）で決定した。Ｒｅ  Ｚ測定値を周波数１．６ｋＨｚ（ｌｏｇ（ｆ）＝３．２）で取り、中心対平均値を式９にしたがって計算し、図１０にグラフで示す。Ｉｍ  Ｚ測定値を周波数５０．２ｋＨｚ（ｌｏｇ（ｆ）＝４．７）で取り、中心対平均値を式１１にしたがって計算し、図１１にグラフで示す。表ＩＩＩは測定値の結果を示し、ΔＩｍ  Ｚ中心対平均およびΔＲｅ  Ｚ中心対平均をさらに含む。
【０１２５】
【表３】
2017071648.tif 000011
実施すべき最適周波数範囲を決定するために、統計ソフトウェア（Ｍｉｎｉｔａｂ  １５．１．１．０）を使用し、以下の線形回帰式を決定した。
【０１２６】
【数８】
2017071648.tif 000012
異なる周波数での係数Ａ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’、および対応する決定係数（Ｒ２）、ならびに回帰の標準誤差（Ｓ）を解き、表ＩＶに示す。次いで、１．５９、６．３、１５．９、および５０．２の最適周波数範囲（以下に太字で示す）を、ΔＲｅ  ＺまたはΔＩｍ  ＺのいずれかについてＲ２≧９５％である範囲と定義した。Ｓは最小である。
【０１２７】
【表４】
2017071648.tif 000013
表ＩＶのデータから認められるように、インピーダンスの実数部および虚数部の両方は画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液のＩｇＧ濃度と相関し得る。さらに、インピーダンスの実数部または虚数部を決定し、基準インピーダンス値と比較して、画分ＩＩ＋ＩＩＩ懸濁液中のＩｇＧ濃度を決定することができる。
【０１２８】
好ましくは、インピーダンス測定値のために使用した周波数範囲は、表Ｖに列挙した最適周波数範囲内であるべきである。
【０１２９】
【表５】
2017071648.tif 000014
実施例ＶＩＩ
生体液のインピーダンス（Ｒｅ  Ｚおよび／またはＩｍ  Ｚ）は、濾過プロセスおよび後洗浄プロセス中の所定の周波数範囲でヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度と相関した。画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを、抽出緩衝液組成物に懸濁した。１．６Ｌの懸濁液を、温度制御用の水浴を備えた１０リットルのジャケット付きプロセスタンクに含め、濾過プロセスおよび後洗浄プロセスで利用した。
【０１３０】
１Ｌのサンプルをプロセスの各工程（Ｆ１、Ｆ２、ＰＷ１、ＰＷ２、ＰＷ３）で回収し、各々でＩｇＧ濃度ならびにＲｅ  ＺおよびＩｍ  Ｚを測定した。結果を、式７にしたがって計算したＩｇＧ中心対平均値と共に以下の表ＶＩに示す。各プロセスの工程でのＩｇＧ中心対平均値を、図１２にグラフで示す。
【０１３１】
【表６】
2017071648.tif 000015
各サンプルのインピーダンスの実数部（Ｒｅ  Ｚ）および虚数部（Ｉｍ  Ｚ）を、各インピーダンス信号がＩｇＧ濃度と強く相関することが事前に決定された周波数（ｆ）で測定した。Ｒｅ  Ｚ測定値を周波数０．６３ｋＨｚ（ｌｏｇ（ｆ）＝２．８）で取り、中心対平均値を式９にしたがって計算し、図１３にグラフで示す。Ｉｍ  Ｚ測定値を周波数１６ｋＨｚ（ｌｏｇ（ｆ）＝４．２）で取り、中心対平均値を式１１にしたがって計算し、図１４にグラフで示す。以下の表ＶＩＩは測定値の結果を示し、計算されたΔＩｍ  Ｚ中心対平均およびΔＲｅ  Ｚ中心対平均の値をさらに含む。
【０１３２】
【表７】
2017071648.tif 000016
Ｍｉｎｉｔａｂ  １５．１．１．０コンピュータソフトウェアを使用して、インピーダンスの実数部および虚数部（ΔＲｅ  ＺおよびΔＩｍ  Ｚ）と測定された特性（ΔＩｇＧ）との間の相関が最も強い最適周波数範囲を確立した。上述の式１２および１３による線形回帰式を決定し、異なる周波数での係数Ａ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’、および対応する決定係数（Ｒ２）、ならびに回帰の標準誤差（Ｓ）を表ＶＩＩＩに示す。０．６３、６．３、および１５．９の最適周波数範囲（以下に太字で示す）を、ΔＲｅ  ＺまたはΔＩｍ  ＺのいずれかについてＲ２≧９５％である範囲と定義した。Ｓは最小である。
【０１３３】
【表８】
2017071648.tif 000017
表ＶＩＩおよびＶＩＩＩに示すように、インピーダンスの実数部および／または虚数部の両方を、画分ＩＩ＋ＩＩＩペースト懸濁液の濾過および／または後洗浄プロセスの工程中のＩｇＧ濃度の制御および／またはモニタリングのために使用することができる。インピーダンス測定値を本明細書中に提供したデータと相関させて、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストの濾過および／または後洗浄プロセスの工程中のＩｇＧ濃度を外挿することができる。本明細書中に提供したデータにしたがって、ＩｇＧ濃度測定のための最適周波数範囲を表ＩＸに示す。
【０１３４】
【表９】
2017071648.tif 000018
実施例ＶＩＩＩ
１つの例示的な実施形態では、多数の異なる周波数およびアルコール濃度において、５体積％アルブミン溶液についての基準インピーダンス値の範囲を測定した。９５体積％エタノール溶液を、水浴中の１０Ｌジャケット付きタンク中の１．６ｋｇの水および０．４ｋｇのアルブミンの溶液に漸増的に添加した。エタノール溶液を−１℃の温度で添加した。溶液が５体積％エタノールに到達した場合に、多数の周波数での複数のインピーダンス測定値を取り、汎用コンピュータに保存した。これらの工程を、１０体積％エタノール、１５体積％エタノール、２０体積％エタノール、２５体積％エタノール、および３０体積％エタノールで繰り返した。基準インピーダンス値をプロットし、比較して、アルブミン溶液のインピーダンスに及ぼすアルコール濃度の影響を決定した。
【０１３５】
得られたナイキストプロットを図１６に示し、ここでは、１ＫＨｚ〜２ＭＨｚの範囲の多周波数１６３０および５体積％〜３０体積％の範囲の複数のアルコール濃度１６４０で、溶液のインピーダンスの実数部１６１０をインピーダンスの虚数部１６２０に対してプロットしている。インピーダンスの実数部１６１０および虚数部１６２０を、１ＫＨｚ〜２ＭＨｚの間の多数の周波数１６３０で決定することができ、測定されたインピーダンス値を、例えば、測定されたインピーダンス値との比較のために汎用コンピュータ上のデータベースに保存する事ができる。例えば、図１６のナイキストプロットを使用して、アルコール濃度以外が同一または類似の組成を有するサンプル溶液中のアルコール濃度を、１ＫＨｚ〜２ＭＨｚの範囲の周波数でのかかる溶液のインピーダンス測定値に基づいて、外挿することができる。図１６に示すナイキストプロットに類似のナイキストプロットを使用してアルコールを含む任意の溶液のインピーダンス値が相関し得ると考えられる。
【０１３６】
アルコール濃度のインピーダンスの実数部との相関のための最適周波数範囲も、種々のエタノール濃度で決定した。インピーダンスの実数部（Ｒｅ  Ｚ）を、ＡＢＢモデルＴＢ４５７滅菌可能伝導性センサを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ４９８９  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬＣＲ  ｍｅｔｅｒを使用して、表Ｘに示す各アルコール濃度で測定した。
【０１３７】
【表１０】
2017071648.tif 000019
表Ｘに示すΔＲｅ  ＺおよびΔＲｅ  Ｚ中心対平均を、式１４および１５を使用して計算し、図１５にグラフで示す。
【０１３８】
【数９】
2017071648.tif 000020
Ｍｉｎｉｔａｂ  １５．１．１．０コンピュータソフトウェアを使用して、ΔＲｅ  Ｚとアルコール濃度（ＡＣ）との間の相関が最も強い最適周波数範囲を確立した。式１０の線形回帰式を決定し、異なる周波数での係数Ａ、Ｂおよび対応する決定係数（Ｒ２）、ならびに回帰の標準誤差（Ｓ）を表ＸＩに示す。０．０２、０．６３、１．５９、６．３、１５．９、および８４３．４の最適周波数範囲（以下に太字で示す）を、ΔＲｅ  ＺについてＲ２≧９５％である範囲と定義した。Ｓは最小である。
【０１３９】
【表１１】
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表ＸおよびＸＩに示すように、インピーダンスの実数部を、アルブミン含有溶液へのアルコール添加中のアルコール濃度のモニタリングおよび／または制御のために使用することができる。アルブミン含有溶液へのアルコール添加の測定のために見出された最適周波数範囲を表ＸＩＩに示す。
【０１４０】
【表１２】
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実施例ＩＸ
複素インピーダンスは、アルコール添加プロセス中の所定の周波数で脱クリオ血漿のアルコール濃度に相関した。９５体積％エタノール溶液を、水浴中の１０Ｌのジャケット付きタンク中の４．２４ｇの５Ｍ酢酸および３．４３ｋｇの脱クリオ血漿の溶液に漸増的に添加した。約０．２３７ｋｇのエタノール溶液を−２℃の温度で１．５時間にわたって添加して、８体積％のアルコール混合物を得た。さらに、０．０１８ｋｇの緩衝液を添加した。インピーダンスの実数部を、ＡＢＢモデルＴＢ４５７滅菌可能伝導性センサを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ４９８９  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬＣＲ  ｍｅｔｅｒを使用して、表ＸＩＩＩに示す各アルコール濃度で決定した。さらに、アルコール濃度を、さらに５時間にわたって８％から２０体積％まで増大させ、さらなるインピーダンス測定値を取った。
【０１４１】
【表１３】
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表ＸＩＩＩに示すΔＲｅ  ＺおよびΔＲｅ  Ｚ中心対平均を、式１４および１５を使用して計算し、図１７にグラフで示す。
【０１４２】
Ｍｉｎｉｔａｂ  １５．１．１．０コンピュータソフトウェアを使用して、ΔＲｅ  Ｚとアルコール濃度（ＡＣ）との間の相関が最も強い最適周波数範囲を確立した。式１２の線形回帰式を決定し、異なる周波数での係数Ａ、Ｂおよび対応する決定係数（Ｒ２）、ならびに回帰の標準誤差（Ｓ）を表ＸＩＶに示す。０．０５、０．１、１．５９、６．３、１５．９、５０．２、および１５９の最適周波数範囲（以下に太字で示す）を、ΔＲｅ  ＺについてＲ２≧９５％である範囲と定義した。Ｓは最小である。
【０１４３】
【表１４】
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表ＸＶＩＩおよびＸＩＶに提供したデータに示すように、インピーダンスを使用して、脱クリオ血漿溶液へのアルコール添加中のアルコール濃度をモニタリングおよび／または制御することができることが見出された。脱クリオ血漿溶液へのアルコール添加の測定のために見出された最適周波数範囲を表ＸＶに示す。
【０１４４】
【表１５】
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本明細書中に記載され、且つ特許請求の範囲に記載の発明は、本明細書中に開示の特定の実施形態によってその範囲を制限されることが意図されない。これは、これらの実施形態が本発明のいくつかの態様を説明することを意図するからである。任意の等価な実施形態が、本発明の範囲内であることが意図される。実際のところ、本明細書中に示されるか記載される実施形態に加えて、本発明の種々の修正が前述から当業者に明らかであろう。かかる修正形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることも意図される。本明細書中に引用した全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【外国語明細書】
2017071648000001.pdf