(57)【要約】【課題】準備や操作が簡便で、高回収率と高蛋白除去率の両方を同時に達成でき、高純度のウイルス精製物を低コストで調製できる、ウイルスの精製方法を提供する。【解決手段】本発明の精製方法は、ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス上清を回収する工程（ａ−１）と、前記ウイルス上清を温度０〜１０℃及び遠心力１９０〜１５００×ｇの条件下で５〜３０分間遠心処理する工程（ｂ−１）と、前記遠心処理したウイルス上清を孔径２〜７μｍのフィルターで濾過処理する工程（ｃ−１）と、得られたウイルス液を温度０〜１０℃及び遠心力４０００〜７０００×ｇの条件下で３０〜１８０分間遠心処理して固形物を得る工程（ｄ−１）とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス上清を回収する工程（ａ−１）と、
前記ウイルス上清を温度０〜１０℃及び遠心力１９０〜１５００×ｇの条件下で５〜３０分間遠心処理する工程（ｂ−１）と、
前記遠心処理したウイルス上清を孔径２〜７μｍのフィルターで濾過処理する工程（ｃ−１）と、
得られたウイルス液を温度０〜１０℃及び遠心力４０００〜７０００×ｇの条件下で３０〜１８０分間遠心処理して固形物を得る工程（ｄ−１）と、
を含む、
ウイルスの精製方法。
【請求項２】
前記ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記ウイルスがヒトヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、並びにこれらに由来する変異ウイルス及び組換ウイルスからなる群から選択される、請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記ウイルスが麻疹ウイルスである、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
前記培養物を温度３０〜４０℃で７２〜１２０時間感染増幅処理した後に前記工程（ａ−１）を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項６】
前記ウイルス上清を温度０〜１０℃で２０〜３０時間暗所静置した後に前記工程（ｂ−１）を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項７】
更に、前記工程（ｃ−１）で得られた濾液をタンジェンシャルフローフィルトレーション処理する工程（ｃ−２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項８】
更に、前記固形物をｐＨ５．０〜１０．０のリン酸緩衝生理食塩水と混合し、この混合物を温度０〜１０℃及び遠心力４０００〜７０００×ｇの条件下で３０〜１８０分間遠心処理する工程（ｄ−２）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項９】
前記固形物が６０％以上の感染性ウイルス回収率を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記固形物が９５％以上の蛋白除去率を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項１１】
前記固形物が１．０×１０4以上の純度（ＴＣＩＤ50／μｇ値）を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精製方法。
【請求項１２】
ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス上清を回収する工程（ａ−１）と、
前記ウイルス上清を温度０〜１０℃及び遠心力１９０〜１５００×ｇの条件下で５〜３０分間遠心処理する工程（ｂ−１）と、
前記遠心処理したウイルス上清を孔径２〜７μｍのフィルターで濾過処理する工程（ｃ−１）と、
得られたウイルス液を温度０〜１０℃及び遠心力４０００〜７０００×ｇの条件下で３０〜１８０分間遠心処理して固形物を得る工程（ｄ−１）と、
前記固形物をポリマーで処理する工程（ｅ−１）と、
を含む、
ポリマー修飾ウイルスの製造方法。
【請求項１３】
前記ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが正に荷電した蛋白質及びポリペプチド、正に荷電したデンドリマー、正に荷電した合成ポリマー、正に荷電した多糖類、並びにこれらの誘導体及び塩からなる群から選択される、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
麻疹ウイルスを感染させた細胞の培養物を精製して得られるウイルス精製物であって、
ＴＣＩＤ50値が１．０×１０4〜２．５×１０5の前記ウイルス精製物を０．１〜０．５μｇのポリエチレンイミンで処理して得られるポリマー修飾ウイルスが−２．０〜２．０ｍＶの電位を示す、
ウイルス精製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス精製物を得るための精製方法、このウイルス精製物を用いてポリマー修飾ウイルスを調製する製造方法、及び当該精製方法によって得られるウイルス精製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、悪性腫瘍に対する新たな治療法として腫瘍溶解性ウイルス療法が関心を集めている。腫瘍溶解性ウイルス療法では、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス等といった多くのウイルスが試されており、中でも、高い安全性、向細胞性、及び腫瘍溶解効果の点から麻疹ウイルスが有望視されている。
【０００３】
麻疹ウイルスを悪性腫瘍の臨床治療に用いるためには、高濃度又は高力価の麻疹ウイルス精製物が大量に必要とされる。従って、麻疹ウイルスに感染した細胞の培養液から臨床投与可能な麻疹ウイルス精製物を得るための精製方法の開発が求められている。
【０００４】
麻疹ウイルスの精製方法としては密度勾配超遠心法が知られている。例えば非特許文献１に記載されているように、ショ糖密度勾配超遠心法によって比較的高い純度の麻疹ウイルス精製物を低コストで調製できる。
【０００５】
米国における腫瘍溶解性麻疹ウイルス療法の臨床試験では、通常、非特許文献２に記載されているようにタンジェンシャルフローフィルトレーション法（ＴＦＦ法）を用いてラージスケールで麻疹ウイルスを精製する。この方法は操作が簡便であり、スケールアップが容易で大量の麻疹ウイルス上清を処理でき、回収率が高いという利点を有する。
【０００６】
陰イオン交換クロマトグラフィー法（ＡＥ法）も麻疹ウイルスの精製に利用できる。この方法は高い蛋白除去率を示し、ある程度多量の麻疹ウイルス上清を処理できる。
【０００７】
一方、腫瘍溶解性ウイルス療法では、ウイルスをそのまま生体内に投与すると、抗体による中和等のためウイルスの抗腫瘍活性が大きく抑制される場合が多い。従って、長期的な抗腫瘍効果が得られにくい。そこで本発明者らは、ウイルスの抗腫瘍活性を増強し長時間維持する目的で、遺伝子改変ウイルスを複数のイオン性ポリマーで被覆して複合体を形成する技術を開発した（特許文献１）。これにより得られるポリマー修飾腫瘍溶解性ウイルスは、中和抗体の存在下、生体内及び生体外で未修飾ウイルスよりも強い腫瘍溶解活性を示す。
【０００８】
上記ポリマー修飾腫瘍溶解性ウイルスの製造にも、ウイルスの精製が大きく影響する。蛋白除去率や純度等に優れたウイルス精製物を用いることで、容易且つ効率的にポリマー修飾腫瘍溶解性ウイルスを製造できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２０１１／１３５７３４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bellini J W et al, J. gen. Virol., (1979) 43, 633-639
【非特許文献２】Langfield K K et al, ASGCT Mole Ther, (2004) 9, S31-S31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記密度勾配超遠心法はスケールアップに限界があり、最大処理量が約５０ｍｌと少なく、加えて非常に煩雑な準備作業を要する。上記タンジェンシャルフローフィルトレーション法はウイルス精製物の純度をある程度まで改善できるものの、蛋白除去率が低く、膜の準備や後処理に時間がかかるという問題がある。更に、上記陰イオン交換クロマトグラフィー法は回収率が低く、カラムがつまりやすいため消耗品コストが高く、後処理として脱塩が必要である。
【００１２】
本発明の目的は、準備や操作が簡便で、高回収率と高蛋白除去率の両方を達成でき、高純度のウイルス精製物を低コストで調製でき、タンジェンシャルフローフィルトレーション法等と組み合わせることで大量のウイルス上清を処理することが可能な、ウイルスの精製方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、上記精製方法によって得られたウイルス精製物をポリマー修飾することで容易且つ効率的にポリマー修飾ウイルスを製造できる、ポリマー修飾ウイルスの製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、上記精製方法によって得られ、上記ポリマー修飾ウイルスの製造方法に好適に用いられる、ウイルス精製物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ウイルス上清を低速遠心処理及び濾過処理し、得られたウイルス液を特定条件下で遠心処理するという簡便な方法によって、意外にも、高回収率と高蛋白除去率の両方を達成でき、高純度のウイルス精製物が低コストで得られることを見出し、本発明に想到した。
【００１６】
本発明の一態様によれば、ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス上清を回収する工程（ａ−１）と、前記ウイルス上清を温度０〜１０℃及び遠心力１９０〜１５００×ｇの条件下で５〜３０分間遠心処理する工程（ｂ−１）と、前記遠心処理したウイルス上清を孔径２〜７μｍのフィルターで濾過処理する工程（ｃ−１）と、得られたウイルス液を温度０〜１０℃及び遠心力４０００〜７０００×ｇの条件下で３０〜１８０分間遠心処理して固形物を得る工程（ｄ−１）とを含むウイルスの精製方法が提供される。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、上記工程（ａ−１）、（ｂ−１）、（ｃ−１）、及び（ｄ−１）と、上記固形物をポリマーで処理する工程（ｅ−１）とを含むポリマー修飾ウイルスの製造方法が提供される。
【００１８】
本発明の更に他の態様によれば、麻疹ウイルスを感染させた細胞の培養物を上記精製方法によって精製して得られるウイルス精製物であって、ＴＣＩＤ50値が１．０×１０4〜２．５×１０5の前記ウイルス精製物を０．１〜０．５μｇのポリエチレンイミンで処理して得られるポリマー修飾ウイルスが−２．０〜２．０ｍＶの電位を示す、ウイルス精製物が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のウイルスの精製方法は、準備や操作が簡便で、高回収率と高蛋白除去率の両方を同時に達成でき、高純度のウイルス精製物を低コストで調製できる。また、この精製方法は精製前後で感染性が減弱化しにくいという利点がある。この精製方法はタンジェンシャルフローフィルトレーション法等と組み合わせることが可能であり、この場合には大量のウイルス上清を処理できる。
【００２０】
本発明のポリマー修飾ウイルスの製造方法によれば、上記本発明の精製方法によって得られたウイルス精製物を用いることで、容易且つ効率的にポリマー修飾ウイルスを製造できる。
【００２１】
本発明のウイルス精製物は上記本発明の精製方法によって調製できる。このウイルス精製物を利用すると、ポリエチレンイミンを少量しか用いずに効率的にポリマー修飾ウイルスを調製でき、そのためポリマー修飾ウイルスのポリエチレンイミン毒性を軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１並びに比較例１及び６において麻疹ウイルスに添加したポリエチレンイミンの量とポリマー修飾ウイルスの電荷との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のウイルスの精製方法は、ウイルスを感染させた細胞の培養物からウイルス上清を回収する工程（ａ−１）と、ウイルス上清を低速遠心処理する工程（ｂ−１）と、ウイルス上清を濾過処理する工程（ｃ−１）と、得られたウイルス液を特定条件下で遠心処理する工程（ｄ−１）とを含む。
【００２４】
本発明の精製方法は、エンベロープを有するウイルスの精製に好適に使用できる。エンベロープを有するウイルスとしては、ヒトヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、並びにこれらに由来する変異ウイルス及び組換ウイルス等が挙げられる。本発明の精製方法は麻疹ウイルスの精製に特に有効である。
【００２５】
上記麻疹ウイルスは、例えばアフリカミドリザル腎細胞由来ベロ細胞に感染させて培養上清に放出された麻疹ウイルスであってよい。麻疹ウイルスはワクチン株であることが好ましく、具体的には、例えばＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株、ＡＩＫ株、Ｓｃｈｗａｒｚ株、これらの変異株等から選択できる。これらの麻疹ウイルスはアメリカ培養細胞系統保存機関ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）等から入手できる。また、本発明者らが開発した遺伝子改変麻疹ウイルスＭＶ−ＮＰＬ株も使用できる。ＭＶ−ＮＰＬ株はインターフェロン抵抗性を有し、そのため担腎癌免疫不全マウスに対して顕著な抗腫瘍効果を示す。
【００２６】
細胞としては、ベロ細胞、ｈｅｋ２９３細胞、ヒーラ細胞等を使用してよい。特に、麻疹ウイルスワクチン株の感染レセプターであるＣＤ４６の発現量の観点から、霊長類の培養細胞が好ましい。これら細胞はＡＴＣＣ等から入手できる。また、ライフテクノロジーズジャパン株式会社から購入可能な浮遊細胞Ｅｘｐｉ２９３Ｆも本発明で使用できる。
【００２７】
細胞にウイルスを感染させる方法は特に限定されない。例えば、細胞をコンフルエンス７０％〜８０％程度まで培養し、上清を除去し、多重感染度ＭＯＩが０．０１〜０．１程度のウイルスを添加して感染させることができる。細胞を培養する際には、通常のディッシュ、コーニング社製セルスタック等の多重層ディッシュ、ＣＥＳＣＯ社製ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ワケンビーテック株式会社より入手可能）等の高密度培養システム等を用いてよい。この培養に用いる培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ／５〜１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製無血清培地ＶＰＳＦＭ／４ｍＭのＬ−グルタミン、ＧＥヘルスケア社製ハイクローン／８ｍＭのＬ−グルタミン等が挙げられる。
【００２８】
ウイルスを添加した後に細胞を培養してよい。培養条件は特に限定されないが、例えば５％ＣＯ2インキュベーターを用い３７℃で２時間培養してよい。
【００２９】
工程（ａ−１）において培養物からウイルス上清を回収する。ウイルス上清はウイルスと共に細胞デブリス等を含んでよい。回収方法は特に限定されないが、例えば、デカンテーション法、ピペットを用いて採取する方法等の一般的手法を用いてよい。
【００３０】
工程（ａ−１）でウイルス上清を回収する前に、培養物を温度３０〜４０℃で７２〜１２０時間感染増幅処理するのが好ましい。「感染増幅処理」はウイルスを感染させた細胞内でウイルスを増殖させる処理を意味する。実際の操作としては、例えばウイルス感染細胞を単にインキュベーター等の中に静置することで、感染増幅処理を行うことができる。感染増幅温度が３０℃未満であると、細胞が死んでしまいウイルス増幅できない場合がある。感染増幅温度はより好ましくは３０〜３４℃であり、特に好ましくは３２℃である。感染増幅処理は細胞変性が略全体に広がるまで行うのが好ましく、７２〜９６時間行うのがより好ましい。
【００３１】
工程（ｂ−１）において遠心処理を行う際の温度は０〜１０℃である。この温度が０℃未満であると、ウイルス上清が凍結する場合がある。一方、１０℃を超えると感染性（ウイルス力価）が低下する場合がある。この温度は好ましくは２〜６℃であり、特に好ましくは４℃である。
【００３２】
工程（ｂ−１）において遠心処理を行う際の遠心力は１９０〜１５００×ｇである。この遠心力が１９０×ｇ未満であると、死細胞等の夾雑物が沈殿（固体）化しにくい。一方、１５００×ｇを超えると、ウイルス粒子が沈殿化し、回収率が低下する場合がある。この遠心力は好ましくは３００〜１２００×ｇであり、特に好ましくは４００〜８００×ｇである。
【００３３】
工程（ｂ−１）において遠心処理を行う時間は５〜３０分間である。この時間が５分間未満であると十分に死細胞等の夾雑物が沈殿化できない。一方、３０分間を超えると、ウイルス粒子が沈殿化し、回収率が低下する場合がある。この時間は好ましくは８〜２０分間、特に好ましくは１０〜１５分間である。
【００３４】
上述した条件で工程（ｂ−１）を行うことによって効果的にデブリス等を除去できる。工程（ｂ−１）の遠心処理に用いる装置は特に限定されず、例えば株式会社トミー精工製高速遠心機を使用してよい。また、ベックマン・コールター社製オプティマＬ−９０Ｋ等のスイング型ローターを搭載可能な装置も使用できる。工程（ｂ−１）のみのウイルス回収率はほぼ１００％とすることが可能である。
【００３５】
工程（ｂ−１）は、工程（ａ−１）を行った後ただちに開始するのが好ましい。この場合、高い感染性ウイルス回収率が得られる。一方で、工程（ａ−１）で回収したウイルス上清を温度０〜１０℃で２０〜３０時間暗所静置した後に工程（ｂ−１）を行うことも好ましい。暗所静置中にウイルス上清に含まれる感染細胞からウイルスが放出され、高力価のウイルス液が得られる場合がある。暗所静置する際の温度は好ましくは２〜６℃である。暗所静置は４℃で２４時間行うのが特に好ましい。
【００３６】
工程（ｃ−１）では孔径２〜７μｍのフィルターを用いてウイルス上清を濾過処理し、デブリス等を更に除去する。フィルター孔径が２μｍ未満であるとウイルスがフィルターを通過できない場合がある。一方、７μｍを超えるとコンタミネーションの恐れがある。フィルター孔径は好ましくは３〜５μｍであり、特に好ましくは３μｍである。２種類以上のフィルターを併用してもよい。例えば、孔径３μｍのフィルターと孔径５μｍのフィルターを併用して濾過処理を行ってよい。
【００３７】
工程（ｃ−１）の濾過処理ではサーモサイエンティフィック社製ボトルトップフィルターやミリポア社製ニトロセルロース膜等のラボスケールのフィルターを使用してよい。また、ポール社製プロファイルスターやＧＥヘルスケア社製ＵＬＴＡプライムＧＦのような製造で使用可能なフィルターを用いてもよい。いずれの場合も、工程（ｃ−１）のみのウイルス回収率はほぼ１００％である。
【００３８】
本発明では、工程（ｃ−１）で得られた濾液をタンジェンシャルフローフィルトレーション処理（ＴＦＦ処理）する工程（ｃ−２）を行ってもよい。通常、タンジェンシャルフローフィルトレーション処理では供給液に圧力を加えて濾過を行う。この圧力によって小さな分子や粒子等の一部が濾過膜を通過する。濾過膜を通過せず濾液（透過液）側に出なかった供給液を循環させ、繰り返し濾過を行うことにより、徐々に濾過膜を通過させる。
【００３９】
工程（ｃ−２）のタンジェンシャルフローフィルトレーション処理では、５０〜９００ｋＤａ、好ましくは１００〜７５０ｋＤａの限外濾過膜が使用できる。例えば、ラボスケールＴＦＦシステム（メルクミリポア社製）において限外濾過フィルターペリコン１００ｋＤａ（メルクミリポア社製）を使用してよい。この場合、通常、ウイルスは供給液（工程（ｃ−１）で得られた濾液）内に留まり、ウイルス液が効率的に濃縮される。即ち、工程（ｃ−２）では、蛋白等の除去率の改善、精製純度の向上、溶媒置換、及びウイルス液の濃縮が可能である。従って、工程（ｃ−２）を行うと大量のウイルス上清を処理できる。
【００４０】
工程（ｃ−２）では、例えば、循環流速が好ましくは１０〜３０ｍｌ／分・ｃｍ2、特に好ましくは１８ｍｌ／分・ｃｍ2となるように圧力を印加してよい。この場合、例えば２０〜６０分間かけて５００ｍｌのウイルス液を５０〜１００ｍｌまで濃縮することができる。この処理を行う際の温度は、好ましくは０〜３５℃、より好ましくは２〜３０℃、特に好ましくは２５℃である。ただし、用いるウイルスや条件によっては、２〜６℃程度の低温で行うのが特に好ましい場合もある。
【００４１】
また、本発明の精製方法は陰イオン交換クロマトグラフィー法又はショ糖密度勾配超遠心法と組み合わせることも可能である。
【００４２】
工程（ｄ−１）において、工程（ｃ−１）又は（ｃ−２）で得られたウイルス液を遠心処理して固形物を得る。この固形物は通常はペレット状であり、ウイルス精製物として使用できる。
【００４３】
工程（ｄ−１）において遠心処理を行う際の温度は０〜１０℃である。温度が０℃未満であると、ウイルス粒子が破損し感染性が減弱化する場合がある。また、１０℃を超える場合も、同様に感染性が減弱化する場合がある。この温度は好ましくは２〜６℃であり、特に好ましくは４℃である。
【００４４】
工程（ｄ−１）において遠心処理を行う際の遠心力は４０００〜７０００×ｇである。この遠心力が４０００×ｇ未満であると、沈殿（固体）化しにくい。麻疹ウイルスのように宿主細胞膜由来のエンベロープを有し粒子サイズが均一ではないウイルスの場合は、特に沈殿（固体）化しにくい。一方、７０００×ｇを超えるとウイルス粒子が破損し感染性が減弱化する場合がある。この遠心力は好ましくは５０００〜６５００×ｇであり、特に好ましくは６０００×ｇである。
【００４５】
工程（ｄ−１）において遠心処理する時間は３０〜１８０分間である。この時間が３０分間未満であると、十分に沈殿化できない場合がある。一方、１８０分間を超えるとウイルス粒子が破損し感染性が減弱化する場合がある。この時間は好ましくは４５〜９０分間であり、特に好ましくは６０分間である。
【００４６】
工程（ｄ−１）の遠心処理は１段階で行ってよいが、２段階や３段階等の複数の段階に分けて行ってもよい。各段階の間で上澄みを除去してよく、またウイルス液を追加してもよい。また、この場合は複数段階の遠心時間の総計が３０〜１８０分間となるよう調整する。例えば、１段階目でウイルス液を６０分間遠心処理し、遠心上澄みを除き、得られた固形物にウイルス液を追加した後、２段階目の遠心処理を６０分間行ってよい。
【００４７】
工程（ｄ−１）の遠心処理に用いる装置は特に限定されないが、例えばベックマン・コールター社製オプティマＬ−９０Ｋに同社製ＳＷ３２Ｔｉローターをセットして使用できる。遠心処理後には上清を廃棄し固形物を得てよい。この固形物は、例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水等に溶解させて−８０℃で保存することができる。
【００４８】
工程（ｄ−１）の後、上記固形物（ウイルス精製物）をリン酸緩衝生理食塩水と混合し、得られた混合物を更に遠心処理する工程（ｄ−２）を行ってもよい。
【００４９】
工程（ｄ−２）で用いるリン酸緩衝生理食塩水のｐＨは、通常５．０〜１０．０である。このｐＨが５．０未満であるか、或いは１０．０を超える場合には、ウイルス粒子が破損し感染性が失われる恐れがある。ｐＨは好ましくは６．０〜８．０であり、より好ましくは７．０〜８．０であり、特に好ましくは７．５である。
【００５０】
工程（ｄ−２）の遠心処理は上記工程（ｄ−１）と同様に行ってよく、温度、遠心力、時間、装置等の好ましい形態も上記工程（ｄ−１）のそれらと同様である。
【００５１】
上述した通り、本発明の精製方法は工程（ａ−１）、（ｂ−１）、（ｃ−１）、及び（ｄ−１）を含む。これらの工程はいずれも準備や操作が非常に簡便であり、またコスト面でも有利である。
【００５２】
上記固形物（ウイルス精製物）は、通常４５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上の感染性ウイルス回収率を示す。条件を適宜選択することによって感染性ウイルス回収率を９５％以上に改善することも可能である。即ち、本発明では従来の陰イオン交換クロマトグラフィー法等よりも高い感染性ウイルス回収率が得られる。
【００５３】
本発明において、「感染性ウイルス回収率」は、工程（ａ−１）で回収したウイルス上清に含まれる感染性ウイルスの量（力価）に対する、固形物（ウイルス精製物）に含まれる感染性ウイルスの量（力価）の割合を百分率で示したものである。「感染性ウイルス」は細胞変性を起こすことが可能なウイルスを指す。麻疹ウイルスを用いる場合は、Ｈ蛋白及びＦ蛋白を利用して感染して細胞変性を引き起こすことが可能な麻疹ウイルスを指す。
【００５４】
感染性ウイルスの量（力価）は、例えば以下のとおり算出できる。まず細胞を９６穴プレートに５．０×１０3細胞／１００μｌ・穴で播種し孵置する。ウイルス試料をライフテクノロジーズ社製ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉで１００倍希釈して力価算定用ウイルス液を調
製する。この力価算定用ウイルス液を１０倍ずつ段階希釈して希釈系列液を調製する。孵置した細胞に１穴当たり５０μｌの希釈系列液を添加し、１２０時間後に５０％以上細胞変性効果が認められた穴の数をカウントし、式ｌｏｇ10（ＴＣＩＤ50）＝−Ｌ＋ｄ（Ｓ−０．５）＋ｌｏｇ10（１／ｖ）を用いて感染性ウイルス力価を算出する。式中、ＬはＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉで１００倍希釈した際の希釈倍率の常用対数、即ち最高濃度ウイルス液
の希釈倍率の常用対数であり、ｄは力価算定用ウイルス液を１０倍ずつ段階希釈した際の段階希釈倍率の常用対数であり、ｖは細胞に希釈系列液を添加したときの該液の量（ｍｌ）であり、Ｓはカウントした穴数を８で除した値である。
【００５５】
上記固形物（ウイルス精製物）は、通常９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは実質的に１００％の蛋白除去率を示す。従来のタンジェンシャルフローフィルトレーション法では感染性ウイルス回収率は高いものの蛋白除去率が低く、従来の陰イオン交換クロマトグラフィー法では蛋白除去率は高いものの感染性ウイルス回収率が低いのに対し、本発明の精製方法は高い感染性ウイルス回収率と高い蛋白除去率の両方を同時に達成することができる。非常に簡便な特定条件下での遠心処理によってこのような効果が得られることは、従来技術から予期できるものではない。
【００５６】
本発明において、「蛋白除去率」は、工程（ａ−１）で回収したウイルス上清に含まれる蛋白の量に対する、該ウイルス上清から除去された蛋白の量の割合を百分率で示したものである。除去された蛋白の量は、ウイルス精製物の蛋白量から計算できる。蛋白の量は、例えばサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製アルブミン基準蛋白を用いて検量線を作成し、同社製ＢＣＡプロテインアッセイキットによって測定できる。
【００５７】
本発明の精製方法によって得られる上記固形物（ウイルス精製物）は、好ましくは１．０×１０4以上、より好ましくは２．５×１０4以上、特に好ましくは６．０×１０4以上のＴＣＩＤ50／μｇ値を示す。「ＴＣＩＤ50／μｇ値」は力価を蛋白量で割って得られる純度の値である。
【００５８】
本発明のポリマー修飾ウイルスの製造方法は、上記工程（ａ−１）、（ｂ−１）、（ｃ−１）、及び（ｄ−１）を含み、加えて上記固形物（ウイルス精製物）をポリマーで処理する工程（ｅ−１）を含む。この製造方法は更に上記工程（ｃ−２）及び／又は（ｄ−２）を含んでもよい。
【００５９】
「ポリマーで処理」とは、ポリマーを上記固形物（ウイルス精製物）に接触させる処理を指す。この処理により、ウイルスをポリマーで被覆するか、或いはウイルスの表面にポリマーを均一に吸着させるのが好ましい。この場合、ウイルスの細胞表面への結合が強くなる。
【００６０】
ポリマーとしては、カチオン性ポリマーが好ましく使用できる。ポリマーは、更に好ましくは正に荷電した蛋白質及びポリペプチド、正に荷電したデンドリマー、正に荷電した合成ポリマー、正に荷電した多糖類、並びにこれらの誘導体及び塩からなる群から選択され、特に好ましくはポリエチレンイミンである。
【００６１】
工程（ｅ−１）でポリマー処理を行う際には、ウイルス精製物にポリマーを添加し混合すればよい。具体的には、ポリマーとしてポリエチレンイミンを使用する場合、タイテック社製マイクロミキサーＥ−３６等の装置を用いて、１２００〜２５００ｒｐｍで５〜１５分間程度（好ましくは１０分間程度）混合することで、ポリエチレンイミンを均一に吸着させることできる。
【００６２】
ポリエチレンイミンの質量は１０〜６０ｋＤａであることが好ましく、３０〜５０ｋＤａであることがより好ましく、４０ｋＤａであることが特に好ましい。このようなポリエチレンイミンは公知の方法によって合成できる。また、本発明ではポリサイエンス社等から市販されているポリエチレンイミンを使用してもよい。
【００６３】
例えば、本発明の精製方法によって麻疹ウイルス感染細胞培養物を精製して得られるウイルス精製物は、通常は陰性荷電であり、−２０〜−５ｍＶ程度の電位を示す。該ウイルス精製物が１．０×１０4〜２．５×１０5のＴＣＩＤ50値を示すとき、０．１〜０．５μｇの陽性荷電ポリエチレンイミンで処理すると、得られるポリマー修飾ウイルスは−２．０〜２．０ｍＶの電位を示す。本発明の精製方法で調製したこのようなウイルス精製物は、他の方法で調製したウイルス精製物や精製前のウイルス上清と比較して、より少ない量のポリエチレンイミンでの処理で−２．０〜２．０ｍＶの電位を示し得る。即ち、本発明の精製方法で得たウイルス精製物を利用することによって、ポリエチレンイミンを少量しか用いずに効率的にポリマー修飾ウイルスを調製でき、そのためポリマー修飾ウイルスのポリエチレンイミン毒性を軽減できる。低いポリエチレンイミン毒性は腫瘍溶解性ウイルス療法に利用する際に非常に有利である。
【００６４】
ウイルス精製物をカチオン性ポリマーで処理した後、更にアニオン性ポリマーで処理してもよい。カチオン性ポリマー処理及びアニオン性ポリマー処理を繰り返して多重加工してもよい。これによりポリマー修飾ウイルスの抗腫瘍効果を改善できる。また、調製及び取り扱いが簡便で、保存性に優れたウイルス複合体が得られる。
【００６５】
アニオン性ポリマーとしては、多糖類及びその誘導体（ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸等）、ポリアミノ酸（ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等）、合成高分子（ポリエチレングリコール誘導体、（メタ）アクリル酸の（共）重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル誘導体、スクシンイミジル化ポリ−Ｌ−リジン等）等が挙げられる。麻疹ウイルス精製物をポリエチレンイミン及びコンドロイチン硫酸で処理して得たポリマー修飾ウイルスは、糖鎖ポリマー修飾腫瘍溶解性遺伝子改変麻疹ウイルス療法に有用である。
【００６６】
このようなポリマー処理は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、フォーミーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レンチウイルス、狂犬病ウイルス、ポックスウイルス、粘液腫ウイルス、これらに由来する変異ウイルス及び組換ウイルス等のウイルスに対して行ってよい。特に、エンベロープを持たず、遺伝子治療に用いられることが多いアデノウイルスに対して非常に有効である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
１．感染、培養、及び感染増幅
コーニング社製培養容器セルファクトリー（１段）を使用し、ＧＥヘルスケア社製のハイクローンＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ／８ｍＭのＬ−グルタミンからなる培地中で、ＡＴＣＣから入手したベロ細胞を３７℃で４継代かけて順化培養した。この細胞を細胞数５×１０7でセルファクトリーに播種した後、３７℃で６時間接着培養し、上清を除去し、２４ｍｌの培地に多重感染度ＭＯＩが０．０１の麻疹ウイルスを添加した。麻疹ウイルスとしては本発明者らが開発したＭＶ−ＮＰＬ株を使用した。麻疹ウイルス添加後、５％ＣＯ2インキュベーターを用い３７℃で２時間培養した。得られた培養物に１１６ｍｌのウイルス溶液を加え、３２℃で９６時間感染増幅処理した。
【００６９】
２．工程（ａ−１）
感染増幅処理した培養物から、ディスポーザブルメスピペット（コーニング社製）を用いて、デブリスを含むウイルス上清を回収した。
【００７０】
３．工程（ｂ−１）
回収したウイルス上清を５０ｍｌコニカルチューブに分注し、株式会社トミー精工製高速遠心機を用いて温度４℃及び遠心力８００×ｇの条件下で１５分間低速遠心処理して、デブリスの一部を除去した。
【００７１】
４．工程（ｃ−１）
遠心処理したウイルス上清を、孔径３μｍのニトロセルロースフィルター及び孔径５μｍのニトロセルロースフィルター（共にミリポア社製）を用いて濾過し、デブリスを更に除去した。
【００７２】
５．工程（ｄ−１）
工程（ｃ−１）で得られたウイルス液を、温度４℃及び遠心力６０００×ｇの条件下で６０分間遠心処理した。この処理は、ベックマン・コールター社製オプティマＬ−９０Ｋに同社製ＳＷ３２Ｔｉローターをセットし、専用の丸底チューブにウイルス液を入れて行った。遠心処理後、上清を廃棄してペレット状の麻疹ウイルス精製物を得た。工程（ｄ−１）の条件を表１に示す。
【００７３】
６．感染性ウイルス回収率の算出
工程（ａ−１）で回収したウイルス上清及び麻疹ウイルス精製物の感染性ウイルス量（感染性ウイルス力価）を算出し、感染性ウイルス回収率を求めた。感染性ウイルス量（力価）は以下の通り算出した。まず、ベロ細胞を９６穴プレートに５．０×１０3細胞／１００μｌ・穴で播種し、５．０％ＣＯ2の条件下、３７℃で６〜８時間孵置した。ウイルス試料をライフテクノロジーズ社製ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉで１００倍希釈して力価算定用
ウイルス液を調製した。この力価算定用ウイルス液を１０倍ずつ段階希釈して希釈系列液を調製した。孵置した細胞に１穴当たり５０μｌの希釈系列液を添加し、１２０時間後に５０％以上細胞変性効果が認められた穴の数をカウントし、式ｌｏｇ10（ＴＣＩＤ50）＝−Ｌ＋ｄ（Ｓ−０．５）＋ｌｏｇ10（１／ｖ）を用いて感染性ウイルス力価を算出した。式中、ＬはＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉで１００倍希釈した際の希釈倍率の常用対数（最高濃度
ウイルス液の希釈倍率の常用対数）であり、ｄは力価算定用ウイルス液を１０倍ずつ段階希釈した際の段階希釈倍率の常用対数であり、ｖは細胞に希釈系列液を添加したときの該液の量（ｍｌ）であり、Ｓはカウントした穴数を８で除した値である。得られた感染性ウイルス回収率を表１に示す。
【００７４】
７．蛋白除去率の算出
工程（ａ−１）で回収したウイルス上清及び麻疹ウイルス精製物の蛋白量を測定し、蛋白除去率を算出した。蛋白量は、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製ＢＣＡプロテインアッセイキットを使用し、同社製アルブミン基準蛋白を用いて検量線を作成して、以下の通り測定した。まず、基準蛋白及びウイルス試料を同社製９６穴プレート（９６Ｆ  ＷＩＴＨＯＵＴ  ＬＩＤ  ＳＨ  ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ  ＰＬＡＴＥ）にそれぞれ２５μＬ入れた。基準蛋白及びウイルス試料の各々にキット付属のＢＣＡ試薬を２００μｌ加え、パーキンエルマー社製ＥｎＳｐｉｒｅを用いて振盪を行い、３７℃で３０分間インキュベーター内に静置した。ＥｎＳｐｉｒｅで５７０ｎｍの吸光度を測定し、得られた吸光度から蛋白濃度の検量線を作成し、ウイルス試料の蛋白量を計算した。得られた蛋白除去率を表１に示す。
【００７５】
８．純度（ＴＣＩＤ50／μｇ値）の算出
上記感染性ウイルス力価を蛋白量で割り、麻疹ウイルス精製物の純度（ＴＣＩＤ50／μｇ値）を算出した。得られた純度を表１に示す。
【００７６】
９．ポリエチレンイミン処理及び電荷測定
麻疹ウイルス精製物をポリエチレンイミン処理し、電荷の変化を観測した。詳しくは、まず、麻疹ウイルス精製物を感染性ウイルス力価（感染性ウイルス濃度）が２．５×１０5になるように１．５ｍｌチューブに分取し、これに質量４０ｋＤａのポリサイエンス社製ポリエチレンイミンを添加した。更に、生理食塩水を加え、全量が１ｍｌとなるよう調整した。これをタイテック社製マイクロミキサーＥ−３６にセットし、１０分間混合してポリマー修飾ウイルスを調製した。得られたポリマー修飾ウイルスをマルバーン社製ディスポーザブルゼータ電位用セルに注入し、同社製ゼータサイザーナノを用いて電荷を測定した。ポリエチレンイミンの添加量を変えて同様の操作を行い、添加量と電荷との関係を求めた。結果を図１のグラフに示す。図１において、縦軸はポリマー修飾ウイルスの電荷を表し、横軸はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加量を表す。
【００７７】
実施例２
工程（ｄ−１）において遠心処理を遠心力７０００×ｇで行ったこと以外は実施例１と同様に、実施例２の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。
【００７８】
実施例３
工程（ｄ−１）において遠心処理を温度１０℃で行ったこと以外は実施例１と同様に、実施例３の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。
【００７９】
実施例４
工程（ｄ−１）において、工程（ｃ−１）で得られたウイルス液を温度４℃及び遠心力６０００×ｇの条件下で６０分間遠心処理した後、上澄みを除去し、３５ｍｌのウイルス液を追加して、同じ条件下で更に６０分間遠心処理したこと以外は実施例１と同様に、実施例４の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。
【００８０】
実施例５
感染増幅処理を１時間行ったこと以外は実施例１と同様に、実施例５の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。
【００８１】
実施例６
工程（ｃ−１）で得られたウイルス液をタンジェンシャルフローフィルトレーション処理（ＴＦＦ処理）してから工程（ｄ−１）を行ったこと以外は実施例１と同様に、実施例６の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。なお、タンジェンシャルフローフィルトレーション処理は、ラボスケールＴＦＦシステムに濾過膜としてミリポア社製ペリコン１００ｋＤａを用い、循環流速が１８ｍｌ／分・ｃｍ2となるように圧力を印加し、温度２５℃で３０分間行った。
【００８２】
実施例７
工程（ｄ−１）で得られたペレットをｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水と混合し、この混合物を温度４℃及び遠心力６０００×ｇの条件下で６０分間遠心処理し、上清を廃棄してペレット状の麻疹ウイルス精製物を得たこと以外は実施例１と同様に、実施例７の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。
【００８３】
実施例８
工程（ａ−１）で回収したウイルス上清を温度４℃で２４時間暗所静置した後に工程（ｂ−１）を行ったこと以外は実施例１と同様に、実施例８の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００８４】
比較例１
実施例１において工程（ａ−１）で回収したウイルス上清を精製することなく、実施例１と同様の方法で純度を算出した。結果を表１に示す。また、麻疹ウイルス精製物に替えてこのウイルス上清を用いて、実施例１と同様にポリエチレンイミン添加量とポリマー修飾ウイルスの電荷との関係を求めた。結果を図１のグラフに示す。
【００８５】
比較例２
工程（ｄ−１）において遠心処理を遠心力３０００×ｇで行ったこと以外は実施例１と同様に、比較例２の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００８６】
比較例３
工程（ｄ−１）において遠心処理を温度２５℃で行ったこと以外は実施例１と同様に、比較例３の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００８７】
比較例４
工程（ｄ−１）において遠心処理を１５分間行ったこと以外は実施例１と同様に、比較例４の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００８８】
比較例５
実施例１において工程（ｃ−１）で得られたウイルス液をタンジェンシャルフローフィルトレーション処理（ＴＦＦ処理）して比較例５の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。なお、タンジェンシャルフローフィルトレーション処理は、ラボスケールＴＦＦシステムにおいて濾過膜としてミリポア社製ペリコン１００ｋＤａを用い、循環流速が１８ｍｌ／分・ｃｍ2となるように圧力を印加し、温度２５℃で３０分間行った。
【００８９】
比較例６
実施例１において工程（ｃ−１）で得られたウイルス液を陰イオン交換クロマトグラフィー処理（ＡＥ処理）し、更に脱塩処理を行って比較例６の麻疹ウイルス精製物を調製し、感染性ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度を算出した。結果を表１に示す。なお、陰イオン交換クロマトグラフィー処理は、アプライドバイオシステムズ社製ＰＯＲＯＳ  ＨＱカラムを使用し、２０ｍＭのビス−トリスプロパン／ＨＣｌを用いてｐＨ６．９の条件下で行った。脱塩処理はミリポア社製１００ｋＤａスピンカラムを用いて行った。また、比較例６の麻疹ウイルス精製物を用いて、実施例１と同様にポリエチレンイミン添加量とポリマー修飾ウイルスの電荷との関係を求めた。結果を図１のグラフに示す。
【００９０】
【表１】
2017195829.tif 000002
【００９１】
表１から明らかなように、本発明の精製方法によって得られる本発明のウイルス精製物は、ウイルス回収率、蛋白除去率、及び純度のいずれにおいても優れた結果を示す。実施例１〜４と比較例１〜４を比べると、本発明では、遠心処理という簡便な手法を用い、遠心力、遠心温度、及び遠心時間をそれぞれ特定範囲に調節することによって、顕著な効果が得られることが分かる。
【００９２】
また、比較例５及び６の結果から、従来のタンジェンシャルフローフィルトレーション法では感染性ウイルス回収率は高いものの蛋白除去率が低く、従来の陰イオン交換クロマトグラフィー法では蛋白除去率は高いものの感染性ウイルス回収率が低いことが分かる。これに対し、本発明の精製方法は、非常に簡便な工程を行うのみで、高い感染性ウイルス回収率と高い蛋白除去率の両方を同時に達成することができる。
【００９３】
更に、図１に示したように、実施例１では、ＴＣＩＤ50値を２．５×１０5に調整した場合、ウイルス精製物は陰性荷電であり約−１５ｍＶの電位を示すが、僅か０．１μｇ程度の陽性荷電ポリエチレンイミンで処理しただけで、ポリマー修飾ウイルスが−２．０〜２．０ｍＶ程度の電位を示す。比較例１及び６では、同等の電位を得るためには６倍から数十倍ものポリエチレンイミンが必要となる。このように、本発明のウイルス精製物を利用すると少量のポリエチレンイミンで効率的にポリマー修飾ウイルスを調製でき、そのためポリマー修飾ウイルスのポリエチレンイミン毒性を軽減できる。従って、本発明のウイルス精製物から製造したポリマー修飾ウイルスは腫瘍溶解性ウイルス療法に非常に有用である。
【図１】
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