(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸を含有する粘膜適用組成物の生体組織表面に対する濡れ性を高めること。【解決手段】ヒアルロン酸と、該ヒアルロン酸を構成する糖鎖に結合している非イオン性水溶性ポリマー鎖と、を有する修飾ヒアルロン酸を含有する粘膜適用組成物が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と、該ヒアルロン酸を構成する糖鎖に結合している非イオン性水溶性ポリマー鎖と、を有する修飾ヒアルロン酸を含有する、粘膜適用組成物。
【請求項２】
前記非イオン性水溶性ポリマー鎖がポリオキシアルキレン鎖である、請求項１に記載の粘膜適用組成物。
【請求項３】
前記ポリオキシアルキレン鎖がポリオキシエチレン鎖である、請求項２に記載の粘膜適用組成物。
【請求項４】
前記非イオン性水溶性ポリマー鎖が、その一端が前記糖鎖に結合しているグラフト鎖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粘膜適用組成物。
【請求項５】
角結膜上皮層障害の予防又は治療剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粘膜適用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜適用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、炎症及び損傷のような粘膜の障害に対して治療効果を有することが知られている（例えば、特許文献１）。従来、ヒアルロン酸を含む適用剤の粘膜上での滞留性を改善するために、疎水基の導入のような方法でヒアルロン酸を修飾することが提案されている（例えば、特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１−２３８５３０号公報
【特許文献２】特開２００９−５１１４２３号公報
【特許文献３】特開２０１２−２１１１７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、本発明者らの検討によれば、ヒアルロン酸を含有する組成物を、角膜及び結膜のような粘膜に適用すると、粘膜上の体液の生体組織表面に対する濡れ性が低下する傾向がある。例えば涙液の生体組織表面に対する濡れ性が不足すると、涙液安定性の低下を招く。涙液安定性の低下は、ドライアイ等の症状の原因となり得る。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ヒアルロン酸を含有する粘膜適用組成物の生体組織表面に対する濡れ性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面は、ヒアルロン酸と、ヒアルロン鎖を構成する糖鎖に結合した非イオン性水溶性ポリマー鎖と、を有する修飾ヒアルロン酸を含有する、粘膜適用組成物に関する。
【０００７】
非イオン性水溶性ポリマー鎖は、ポリオキシアルキレン鎖を含んでいてもよい。ポリオキシアルキレン鎖はポリオキシエチレン鎖であってもよい。非イオン性水溶性ポリマー鎖は、その一端が糖鎖に結合しているグラフト鎖であってもよい。
【０００８】
本発明の粘膜適用組成物は、角結膜上皮層障害の治療又は予防剤であってもよい。言い換えると、本発明に係る修飾ヒアルロン酸を、角結膜上皮層障害の予防又は治療剤である粘膜適用組成物を製造するために使用することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ヒアルロン酸を含有する粘膜適用組成物の生体組織表面に対する濡れ性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】動的接触角の測定結果を示すグラフである。
【図２】動的接触角の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
（修飾ヒアルロン酸）
一実施形態に係る修飾ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸を構成する糖鎖に結合した非イオン性水溶性ポリマー鎖とを有する。ヒアルロン酸を構成する糖鎖は、下記式（１）で表される二糖単位を有しており、この二糖単位が繰り返して連結した構造を有する。ヒアルロン酸及び修飾ヒアルロン酸中のカルボキシル基の一部又は全部が、ナトリウム塩等の塩を形成していてもよい。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
糖鎖を構成する二糖単位の一部に、非イオン性水溶性ポリマー鎖が結合している。下記式（２）は、非イオン性水溶性ポリマー鎖を含む基Ｘが結合している二糖単位を表し、ｐは１又は２である。ＤＳは式（１）の二糖単位に由来する原子から構成される部分を示す。式（２）中のＸが有する非イオン性水溶性ポリマー鎖は、その一端が糖鎖に結合しているグラフト鎖である。
【００１５】
【化２】
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【００１６】
式（２）の二糖単位の具体例としては、下記式（２Ａ）、（２Ａ）’、（２Ｂ）又は（２Ｃ）で表される基が挙げられる。
【００１７】
【化３】
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【００１８】
これら式中のＸは、非イオン性水溶性ポリマーに由来する１価の基である非イオン性水溶性ポリマー鎖を有している。Ｘは、非イオン性水溶性ポリマー鎖とヒアルロン酸を構成する糖鎖とを連結する２価の連結基を更に含み得る。
【００１９】
非イオン性水溶性ポリマー鎖は、任意の割合で水に溶解する非イオン性水溶性ポリマーから誘導される１価の基である。非イオン性水溶性ポリマー鎖を誘導する非イオン性水溶性ポリマーの具体例としては、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００２０】
ポリオキシアルキレンに由来する非イオン性水溶性ポリマー鎖（ポリオキシアルキレン鎖）は、例えば、下記式（１０）で表される。
【００２１】
【化４】
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【００２２】
式中、Ｒ１はアルキレン基を示し、Ｒ２は水素原子又はアルキル基を示し、ｎは２以上の整数を示す。Ｒ１及びＲ２はポリオキシアルキレンが水溶性を有する範囲で、任意に選択できる。Ｒ１は典型的にはエチレン基である。すなわち、非イオン性水溶性ポリマー鎖がポリオキシエチレン鎖であってもよい。Ｒ２の具体例としては、メチル基及びエチル基が挙げられる。
【００２３】
式（２）及び（２Ａ）〜（２Ｃ）中のＸは、非イオン性水溶性ポリマー鎖を導入する反応に応じて、種々の連結基を有し得る。非イオン性水溶性ポリマー鎖を導入する反応の例としては、以下の反応式（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｘ−３）、（Ｘ−４）、（Ｘ−５）又は（Ｘ−６）で表される反応が挙げられる。これら反応式中、ＤＳは、式（１）の二糖単位のうち、反応に利用される官能基以外の部分の構造を表す。
【００２４】
【化５】
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【００２５】
反応式（Ｘ−１）〜（Ｘ−４）は、式（１）の二糖単位が有するカルボキシル基を利用する反応であり、式（２Ａ）又は（２Ａ）’の二糖単位を生成する。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は炭素数２〜４のアルキレン基を示す。Ｘ２は非イオン性水溶性ポリマー鎖を示し、これは例えば式（１０）で表される基であってもよい。これは反応式（Ｘ−５）、（Ｘ−６）でも同様である。
【００２６】
反応式（Ｘ−１）では、式（１）の二糖単位のカルボキシル基と、アミノ基及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２０）の化合物との反応により、式（２Ａ）−ａで表される二糖単位が生成する。反応式（Ｘ−２）では、式（１）の二糖単位のカルボキシル基と、ヒドラジド基及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２１）の化合物との反応により、式（２Ａ）−ｂで表される二糖単位が生成する。反応式（Ｘ−３）では、式（１）の二糖単位のカルボキシル基と、式（２２）のジヒドラジド化合物との反応により、式（１）−ｘで表される二糖単位が生成し、これとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（ＮＨＳ基）及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２３）の化合物との反応により、（２Ａ）−ｃで表される二糖単位が生成する。反応式（Ｘ−４）では、式（１）の二糖単位のカルボキシル基と、エポキシ基及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２４）の化合物との反応により、式（２Ａ）−ｄで表される二糖単位が生成する。
【００２７】
【化６】
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【００２８】
反応式（Ｘ−５）は、式（１）の二糖単位が有する１級水酸基を利用する反応であり、式（２Ｂ）の二糖単位を生成する。反応式（Ｘ−５）では、式（１）の二糖単位の１級水酸基と、ビニルスルホン基及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２５）の化合物との反応により、式（２Ｂ）−aで表される二糖単位が生成する。
【００２９】
反応式（Ｘ−６）は、式（１）の二糖単位の隣接する水酸基を利用する反応であり、式（２Ｃ）の二糖単位を生成する。隣接する水酸基の酸化により、２個のアルデヒド基を有する式（１）−ｙの二糖単位を生成し、これとアミノ基及び非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する式（２０）の化合物との反応（還元的アミノ化反応）により、式（２Ｃ）−ａで表される二糖単位が生成する。
【００３０】
修飾ヒアルロン酸において、非イオン性水溶性ポリマー鎖は、以上説明したようにグラフト鎖として糖鎖に結合していてもよいし、他の形態で糖鎖に結合していてもよい。例えば、非イオン性水溶性ポリマー鎖中の末端以外のモノマー単位が、直接、又は種々の連結基を介して糖鎖に結合していてもよい。１本の非イオン性水溶性ポリマー鎖が、２箇所以上で糖鎖と結合していてもよい。
【００３１】
修飾ヒアルロン酸全体の質量に対する非イオン性水溶性ポリマー鎖の質量の比率は、３〜８０質量％であってもよい。非イオン性水溶性ポリマー鎖の割合がこれら範囲内にあることにより、修飾ヒアルロン酸による生体組織表面に対する濡れ性向上の効果が特に顕著に得られる。同様の観点から、非イオン性水溶性ポリマー鎖の比率は、好ましくは５〜８０質量％であり、より好ましくは１０〜５０質量％である。修飾ヒアルロン酸が式（２）の二糖単位を含む場合、式中のＸに相当する部分の質量を、修飾ヒアルロン酸に含まれる非イオン性水溶性ポリマー鎖の質量とみなすことができる。
【００３２】
非イオン性水溶性ポリマー鎖の部分の分子量は、好ましくは２００〜２００００であり、より好ましくは５００〜５０００である。これにより、濡れ性向上の点で更に優れた効果が得られる。修飾ヒアルロン酸が式（２）の二糖単位を含む場合、式中のＸに相当する部分の分子量を、修飾ヒアルロン酸に含まれる非イオン性水溶性ポリマー鎖の分子量とみなすことができる。
【００３３】
修飾ヒアルロン酸における、非イオン性水溶性ポリマー鎖の導入率は、ヒアルロン酸を構成する糖鎖を構成する二糖単位の全量に対する、非イオン性水溶性ポリマー鎖が導入された二糖単位の比率（モル％）として定義される。非イオン性水溶性ポリマー鎖の導入率は、好ましくは０．１〜９０モル％であり、より好ましくは０．５〜５０モル％である。導入率がこれら範囲内にあることにより、修飾ヒアルロン酸による生体組織表面に対する濡れ性向上の効果が特に顕著に得られる。この導入率は、例えば１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに基づいて決定することができる。
【００３４】
修飾ヒアルロン酸の分子量は、好ましくは２０万〜２０００万であり、より好ましくは８０万〜５００万である。これにより、濡れ性向上の点で更に優れた効果が得られる。ここでの分子量は絶対分子量であり、これは、多角度レーザ光散乱検出器を用いたゲル浸透クロマトグラフの分析により、求めることができる。
【００３５】
（粘膜適用組成物）
一実施形態に係る粘膜適用組成物は、上述の実施形態に係る修飾ヒアルロン酸を有効成分として含有する。粘膜適用組成物は、水を含有する、液状、ゲル、又は半固形の製剤であってもよい。修飾ヒアルロン酸は、水に溶解していてもよいし、粒子状の状態で製剤中に分散していてもよい。
【００３６】
粘膜適用組成物における修飾ヒアルロン酸の含有量は、投与形態等に応じて適宜設定されるが、例えば、粘膜適用組成物の質量を基準として、０．０２〜２．０質量％、又は０．１〜０．５質量％であってもよい。粘膜適用組成物における水の含有量は、特に制限されないが、例えば、粘膜適用組成物の質量を基準として、９８〜９９．９８質量％、又は９９．５〜９９．９質量％であってもよい。
【００３７】
粘膜適用組成物は、医学的、薬剤学的又は生物学的に許容されるその他の成分を更に含んでもよい。その他の成分としては、例えば、アルコール（エタノール等）、リン脂質、界面活性剤、張度剤、緩衝液系、保存剤、粘調剤、酸化防止剤が挙げられる。粘膜適用組成物が修飾ヒアルロン酸以外の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００３８】
張度剤の例としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムのような金属塩、及び、マンニトールのような糖アルコールが挙げられる。緩衝液系としては、例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム又はホウ酸が、適切なｐＨを維持するために用いられ得る。保存剤としては、例えば、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウムブロミド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム塩、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、及びグルコン酸クロルヘキシジンが挙げられる。酸化剤防止剤としては、例えば、ビタインＥ及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、並びにブチル化ヒドロキシアニソールが挙げられる。
【００３９】
粘膜適用組成物は、例えば、粘膜組織の保護、粘膜乾燥の予防、及び粘膜障害の予防若しくは治療から選ばれる目的で、ヒト、又はヒト以外の哺乳動物の任意の粘膜に適用される。粘膜適用組成物は、異常な状態の粘膜だけでなく、正常な状態の粘膜にも適用することができる。
【００４０】
本実施形態に係る粘膜適用組成物は、角膜及び結膜の生体組織表面への高い濡れ性を有しており、ドライアイを効果的に抑制できることから、これら粘膜（角結膜）へ適用される製剤として特に有用である。そのため、粘膜適用組成物は、角結膜へ適用される点眼用液体製剤（点眼剤）であってもよい。粘膜適用組成物は、ヒアルロン酸が従来用いられている障害に対して用いることができ、例えば角結膜上皮層障害に対する予防又は治療剤として特に優れた効果を発揮し得る。角結膜上皮層障害の例としては、角膜乾燥症（ドライアイ）、角結膜炎、点状表層角膜炎（ＳＰＫ）、角膜上皮びらん、角膜上皮欠損及び角膜腫瘍が挙げられる。粘膜適用組成物の適用量は、目的及び効果等に応じて、適宜調整される。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
１．修飾ヒアルロン酸の合成
（合成例１）
下記反応式（Ｉ）に従って、ポリオキシエチレン鎖を有する修飾ヒアルロン酸（ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸、ＰＥＧ−ＨＡ）を合成した。式中、ｎはヒアルロン酸（ＨＡ）の糖鎖又はポリオキシエチレン鎖の構成単位（二糖単位又はオキシエチレン基）の繰り返し数を表す整数である。反応式は、便宜的に、ｎ個の二糖単位の全てにポリオキシエチレン鎖が導入された状態を示しているが、実際にはポリオキシエチレン鎖はヒアルロン酸中の一部の二糖単位に導入される。
【００４３】
【化７】
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【００４４】
水１２．５ｍＬ及びＴＨＦ１２．５ｍＬと、ヒアルロン酸ナトリウム０．１０ｇ（０．２５ｍｍｏｌ／二糖単位、重量平均分子量１９０万）とを含む溶液に、０．００７６ｇ（０．００３５ｍｍｏｌ）のα−アミノプロピル−ω−メトキシ，ポリオキシエチレン（ＰＥＧ−Ａｍｉｎｅ）（分子量２１８２、日油株式会社、ＭＥＰＡ−２０Ｈ）、０．００２８g（０．００９ｍｍｏｌ）のトリス［２−（２−メトキシエトキシ）エチル］アミン（ＴＤＡ−１）及び０．００２６ｇ（０．００９ｍｍｏｌ，水分５．６０％）の４−（４，６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）を順次加え、溶液を室温で２４時間撹拌した。その後、溶液に０．５ｍＬの５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。溶液を更に一晩撹拌した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を水２００ｍＬ及びエタノール５０ｍＬに溶解し、クロスフローろ過装置（ビバフロー２００、分画分子量５０００、ザルトリウス社製）を用いて精製した。約５０ｍＬに濃縮した限外ろ過液に塩化ナトリウム３gを加え、固形分を溶解した。そこにエタノール２１６ｍＬを徐々に滴下し、生じた沈殿物を濾別して、純度８０％エタノール、及び純度９９％以上のエタノールで順次洗浄した。その後、室温で減圧乾燥し、ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸の白色固体０．０９ｇを得た。
【００４５】
（合成例２）
水１００ｍＬ及びＴＨＦ１００ｍＬと、ヒアルロン酸ナトリウム１．００ｇ（２．５ｍｍｏｌ／二糖単位、重量平均分子量１９０万）とを含む溶液に、０．３５５ｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のＰＥＧ−Ａｍｉｎｅ（日油株式会社、ＭＥＰＡ-２０Ｈ）、０．１３１ｇ（０．４１ｍｍｏｌ）のＴＤＡ−１及び０．１１９ｇ（０．４１ｍｍｏｌ，水分５．６０%）のＤＭＴ−ＭＭを３０分間隔で加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶液に０．５ｍＬの５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。溶液を更に一晩撹拌した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を水２００ｍＬ及びエタノール５０ｍＬに溶解し、クロスフローろ過装置（ビバフロー２００、分画分子量５０００、ザルトリウス社製）を用いて精製した。限外ろ過液を孔径０．２μｍの濾紙によって濾過した後、凍結乾燥して、ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸の白色固体０．６６gを得た。
【００４６】
（合成例３）
水１００ｍＬ及びＴＨＦ１００ｍＬと、ヒアルロン酸ナトリウム１．００g（２．５ｍｍｏｌ／二糖単位、重量平均分子量１９４万）とを含む溶液に、０．７８６g（０．３６ｍｍｏｌ）のＰＥＧ−Ａｍｉｎｅ（日油株式会社、ＭＥＰＡ−２０Ｈ）、０．２９１g（０．９０ｍｍｏｌ）のＴＤＡ−１及び０．２６４g（０．９０ｍｍｏｌ、水分５．６０％）のＤＭＴ−ＭＭを順次加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶液に０．５ｍＬの５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。溶液を更に一晩撹拌した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を水２００ｍＬ及びエタノール５０ｍＬに溶解し、クロスフローろ過装置（ビバフロー２００、分画分子量５０００、ザルトリウス社製）を用いて精製した。限外ろ過液を孔径０．２μｍの濾紙によって濾過した後、凍結乾燥して、ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸の白色固体０．９５gを得た。
【００４７】
（比較合成例１）
下記反応式（ＩＩ）に従って、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドに由来する疎水基が導入された修飾ヒアルロン酸（ＥＤＣ修飾ヒアルロン酸、ＥＤＣ−ＨＡ）を合成した。反応式は、便宜的に、ｎ個の二糖単位の全てに疎水基が導入された状態を示しているが、実際には疎水基はヒアルロン酸中の一部の二糖単位に導入される。なお、活性エステルからの異性化によるＥＤＣ−ＨＡの生成は既知である。
【００４８】
【化８】
2017025016.tif 000010
【００４９】
水３００ｍＬと、ヒアルロン酸ナトリウム１．５ｇ（３．７５ｍｍｏｌ／二糖単位、重量平均分子量１９６万）とを含む溶液に、１０７．８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）を加え、１Ｍ塩酸でｐＨ４．７〜５．１に調整しながら溶液を１時間撹拌した。次いで、分画分子量１４０００の透析チューブを用いて溶液を水で２日間透析した。透析後の溶液に塩化ナトリウム１２ｇを加え、エタノール８００ｍＬを滴下し、生じた沈殿物を濾別した。沈殿物を順に純度８０％エタノール、純度９９％以上のエタノールで洗浄後、室温で減圧乾燥し、ＥＤＣ修飾ヒアルロン酸の１．４ｇを白色固体として得た。
【００５０】
（比較合成例２）
下記反応式（ＩＩＩ）に従って、桂皮酸３−アミノプロピルに由来する疎水基が導入された修飾ヒアルロン酸（桂皮酸修飾ヒアルロン酸、ＣＡ−ＨＡ）を合成した。反応式は、便宜的に、ｎ個の二糖単位の全てに疎水基が導入された状態を示しているが、実際には疎水基はヒアルロン酸中の一部の二糖単位に導入される。
【００５１】
【化９】
2017025016.tif 000011
【００５２】
４０３ｍｇ／２ｍＬのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）の水溶液、３３６ｍｇ／２ｍＬのＥＤＣＩ・ＨＣｌの水溶液、及び４２３ｍｇ／２ｍＬの桂皮酸３−アミノプロピル塩酸塩の水溶液を、水１５０ｍＬ／ジオキサン７５ｍＬとヒアルロン酸ナトリウム１．０ｇ（２．５ｍｍｏｌ／二糖単位、重量平均分子量１９６万）とを含む溶液に加えた。２．５時間撹拌した後、５００ｍｇ／１０ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。更に溶液を一晩撹拌後、塩化ナトリウム６ｇを加え、溶解した。エタノール４００ｍＬを滴下し、生じた沈殿物を濾別した。沈殿物を順に純度８０％エタノール、純度９９％以上のエタノールで２回洗浄後、室温で減圧乾燥し、粗精製品１．０ｇを白色固体として得た。
粗精製品１．０gを３％食塩水５５５ｍＬ（０．１８％）に溶解し、そこにエタノール９４７ｍＬを滴下し、生じた沈殿物を濾別した。沈殿物を純度８０％エタノール、純度９９％以上のエタノールで２回洗浄後、室温で減圧乾燥し、桂皮酸修飾ヒアルロン酸１．０ｇを白色固体として得た。
【００５３】
２．評価
（１）修飾ヒアルロン酸の分析
修飾ヒアルロン酸の絶対分子量、及びポリオキシアルキレン鎖又はＥＤＣＩ若しくは経皮酸に由来する疎水基の導入率を、以下の手順で測定した。表１に測定結果を示す。
【００５４】
分子量
約０．０５ｇ（乾物換算量）の試料を５０ｍＬメスフラスコに量りとり、超純水に溶解した。得られた溶液を、純水で更に希釈して濃度０．００５質量％とした後、孔径０．２μｍのフィルターでろ過して、ゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）分析用の試料溶液を準備した。
得られた試料溶液を用いて、以下の条件でＧＰＣ分析を行った。散乱強度は散乱角度２１．７°〜９０°の８検出器を用いて測定した。データ処理ソフトウェアとしてＷｙａｔｔ社製ＡＳＴＲＡ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．７３．０４を使用して、データ処理した。
・ＧＰＣカラム：昭和電工社製ＳＢ８０６ＨＱ、１本
・示差屈折率検出器：昭和電工社製ＲＩ−７１Ｓ
・多角度レーザ光散乱検出器：Ｗｙａｔｔ社製ＤＡＷＮ  ＥＯＳ
・溶媒：硝酸ナトリウムの０．２ｍｏｌ／ｌ水溶液
・測定温度４０℃
・流速０．３ｍｌ／分
・データ取得間隔１回／２秒
【００５５】
導入率
修飾ヒアルロン酸の試料をヒアルロニダーゼで酵素消化した。試料を凍結乾燥してから、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸に関しては、ヒアルロン酸のアセチル３Ｈのピークと、ポリオキシエチレン鎖の酸素原子に隣接したＣＨ２のピークとの比率に基づいて、導入率を算出した。ＥＤＣ修飾ヒアルロン酸に関しては、ヒアルロン酸のアセチル基のピーク（３Ｈ）と、ジメチルアミノ基のＮ原子に隣接する２つのＣＨ３のピーク（６Ｈ）の比率に基づいて、導入率を算出した。桂皮酸修飾ヒアルロン酸に関しては、ヒアルロン酸のアセチル基のピーク（３Ｈ）と、桂皮酸エステルのカルボニルに隣接したＣＨ（１Ｈ）のピークの比率に基づいて、導入率を算出した。導入率とＰＥＧ−Ａｍｉｎｅの分子量から、修飾ヒアルロン酸（ＰＥＧ−ＨＡ）の質量に対する、導入されたポリオキシエチレン鎖の比率を求めた。
【００５６】
【表１】
2017025016.tif 000012
【００５７】
（２）粘度
合成例２及び３のＰＥＧ修飾ヒアルロン酸の試料を２ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に濃度０．３質量％又は０．５質量％で溶解して、粘度測定用の試料溶液を調製した。レオメーターとしてフィジカ社製  ＭＣＲ３００を用いて、以下の条件で粘度を測定した。修飾ヒルロン酸を溶解していないリン酸緩衝生理食塩水（２ｍＭ  ＰＢＳ）、及び重量平均分子量９０万の未修飾のヒアルロン酸のＰＢＳ溶液の粘度も測定した。表２に測定結果を示す。
・測定治具：ＣＰ５０−１（コーンプレート）
・測定距離：０．０７０ｍｍ
・測定温度：２５℃
・せん断速度：３５ｓ−１
・解析ソフト：DKSH  Japan製US200/32  Service  V2.43
【００５８】
【表２】
2017025016.tif 000013
【００５９】
（３）表面張力
ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸、ＥＤＣ修飾ヒアルロン酸及び経皮酸ヒアルロン酸の試料を、２ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に０．１質量％、０．３質量％又は０．５質量％の濃度で溶解して、表面張力測定用の試料溶液を調製した。全自動接触角計（協和界面科学社製ＤＭ−５００）を用い、測定用のニードルとしてテフロン（登録商標）コート針２８Ｇを用いて表面張力を５回測定し、それらの平均値を算出した。協和界面科学社製FAMASを解析ソフトとして用い、Young-Laplace法によりデータを解析した。修飾ヒルロン酸を溶解していないリン酸緩衝生理食塩水（２ｍＭ  ＰＢＳ）の表面張力も測定した。表３に測定結果を示す。
【００６０】
【表３】
2017025016.tif 000014
【００６１】
（４）動的接触角
フッ素含有メタクリレート系化合物及びケイ素含有メタクリレート系化合物によって親水性処理されたガラス基板を準備した。曲面（曲率半径：８．００ｍｍ）を有する親水性処理されたガラス基板上での試料溶液の液滴の拡散を連続的に分析することで、動的接触角を測定した。動的接触角により評価される親水性処理ガラス基板への濡れ性が高いことは、生体組織表面への濡れ性が高いことに対応する。
【００６２】
ＰＥＧ修飾ヒアルロン酸の試料を、２ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に０．３質量％又は０．５質量％の濃度で溶解して、動的接触角測定用の試料溶液を調製した。全自動接触角計（協和界面科学社製Ｄｒｏｐ−Ｍａｓｔｅｒ  ＤＭｓ−４０１）を用い、測定用のニードルとしてテフロン（登録商標）コート針２８Ｇを用い、生理食塩水に浸した基板は取り出してから１分後に測定を開始した。液量１μＬの液滴が基板に接触してから１００μ秒毎に接触角を１０回測定した。協和界面科学社製ＦＡＭＡＳを解析ソフトとして用い、θ／２法により解析した。
【００６３】
未修飾のヒアルロン酸（ＨＡ）、及び修飾ヒルロン酸を溶解していないリン酸緩衝生理食塩水（２ｍＭ  ＰＢＳ）についても同様に動的接触角を測定した。図１は濃度０．３質量％の試料溶液の動的接触角を示すグラフであり、図２は濃度０．５質量％の試料溶液の動的接触角を示すグラフである。
【００６４】
図１及び図２に示されるように、修飾ヒアルロン酸（ＰＥＧ−ＨＡ）を含む試料溶液は、未修飾のヒアルロン酸（ＨＡ）を含む試料溶液と比較して顕著に低い接触角を示した。このことから、非イオン性水溶性ポリマー鎖を有する修飾ヒアルロン酸を含む組成物が、生体組織表面に対して高い濡れ性を有するといえる。
【図１】
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【図２】
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