(57)【要約】      （修正有）【課題】癌ワクチンにおいて足場を用いるための組成物及び方法を提供する。【解決手段】多孔性三次元足場を備えた、癌と診断された対象においてプロセシングされた腫瘍抗原をインサイチューで産生するための装置であって、該足場が、（ａ）癌細胞の化学誘因物質及び細胞毒性誘発組成物を含む第一の領域、及び、（ｂ）免疫細胞補充組成物を含む第二の領域、を含み、ここで、該足場が、癌と診断された対象に投与され、且つ、循環性癌細胞を蓄積するのに十分な期間、インサイチューにおいて維持された癌細胞含有足場が得られ、且つ、該細胞含有足場が、細胞毒性因子又は細胞溶解性因子に接触して癌細胞を破壊して、それによりプロセシングされた腫瘍抗原を産生する、装置。【選択図】図１２
2017071638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性三次元足場を備えた、癌と診断された対象においてプロセシングされた腫瘍抗原をインサイチューで産生するための装置であって、
該足場が、
(a)癌細胞の化学誘引物質および細胞毒性誘発組成物を含む第一の領域；および
(b)免疫細胞補充組成物を含む第二の領域、
を含み、
ここで、
該足場が、癌と診断された対象に投与され、かつ循環性癌細胞を蓄積するのに十分な期間、インサイチューにおいて維持されて癌細胞含有足場が得られ、かつ
該細胞含有足場が、細胞毒性因子または細胞溶解性因子に接触して癌細胞を破壊して、それによりプロセシングされた腫瘍抗原を産生する、
装置。
【請求項２】
前記細胞含有足場が、外部からの熱、超音波、レーザー照射、またはγ線照射に接触する、請求項1記載の装置。
【請求項３】
前記レーザー照射が紫外線または近赤外線のレーザー照射を含む、請求項2記載の装置。
【請求項４】
前記細胞毒性誘発組成物が高体温誘発組成物を含む、請求項1記載の装置。
【請求項５】
前記高体温誘発組成物が磁性ナノ粒子または近赤外線（NIR）吸収ナノ粒子を含む、請求項4記載の装置。
【請求項６】
前記高体温誘発組成物が磁性ナノ粒子を含み、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために、該磁性ナノ粒子を細胞毒性因子または細胞溶解性因子に接触させ、それによって前記癌細胞を崩壊させ、かつプロセシングされた腫瘍抗原を産生し、該細胞毒性因子または細胞溶解性因子が交番磁界を含む、請求項5記載の装置。
【請求項７】
前記高体温誘発組成物が、金ナノロッド、金ナノシェル、金ナノケージ、貴金属ナノ粒子、炭素ナノチューブ、炭素ナノ粒子、およびグラファイトナノ粒子からなる群より選択されるNIR吸収ナノ粒子を含み、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために、該NIR吸収ナノ粒子を細胞毒性因子または細胞溶解性因子に接触させ、それによって前記癌細胞を崩壊させ、かつプロセシングされた腫瘍抗原を産生し、該細胞毒性因子または細胞溶解性因子がNIR照射を含む、請求項5記載の装置。
【請求項８】
前記癌細胞の化学誘引物質が、CCL-21、CCL-19、SDF-1、VEGF、およびIL-4からなる群より選択されるケモカインを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の装置。
【請求項９】
前記癌が循環性腫瘍細胞を特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の装置。
【請求項１０】
前記対象が転移性癌状態または白血病と診断されている、請求項1〜9のいずれか一項記載の装置。
【請求項１１】
前記第二の領域が細胞毒性誘発組成物を含まない、請求項1〜10のいずれか一項記載の装置。
【請求項１２】
前記第一の領域がコアとして構成され、かつ、前記第二の領域がシェルとして構成される、請求項1〜11のいずれか一項記載の装置。
【請求項１３】
前記第一の領域と前記第二の領域が層状である、請求項1〜11のいずれか一項記載の装置。
【請求項１４】
前記第一の領域が多孔性三次元足場内にコンパートメントを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の装置。
【請求項１５】
3次元多孔性ポリマー足場を備える、腫瘍抗原プロセシング装置であって、該足場が、
(a)癌細胞のための化学誘引物質および細胞毒性誘発組成物を含む第一の領域；および
(b)免疫細胞補充組成物を含む第二の領域、
を含む、
腫瘍抗原プロセシング装置。
【請求項１６】
前記細胞毒性誘発組成物が高体温誘発粒子を含む、請求項15記載の装置。
【請求項１７】
前記細胞毒性誘発組成物が金ナノ粒子または金ナノロッドを含む、請求項15記載の装置。
【請求項１８】
前記免疫細胞補充組成物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む、請求項15〜16のいずれか一項記載の装置。
【請求項１９】
前記第二の領域が細胞毒性誘発組成物を含まない、請求項15〜18のいずれか一項記載の装置。
【請求項２０】
前記第一の領域がコアとして構成され、かつ、前記第二の領域がシェルとして構成される、請求項15〜19のいずれか一項記載の装置。
【請求項２１】
前記第一の領域と前記第二の領域が層状である、請求項15〜19のいずれか一項記載の装置。
【請求項２２】
前記第一の領域が多孔性三次元足場内にコンパートメントを含む、請求項15〜19のいずれか一項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体として癌ワクチンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は毎年、全世界の全死亡人口の約13％を占める。既存の樹状細胞をベースとする治療戦略は、主として、患者の腫瘍の生検材料から単離される癌抗原を用いた活性化のための多くの細胞を生成するための、樹状細胞のエクスビボでの操作に基づく。これらのエクスビボの技術は侵襲的でありかつ費用がかかるので、外科的な生検およびエクスビボでの細胞操作に依らない樹状細胞をベースとする癌ワクチン戦略を開発することが緊急に必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、患者から生検材料を採取し、エクスビボにおいて腫瘍細胞をプロセシングし、その後に、プロセシングした腫瘍抗原を患者にワクチン接種する必要なしに、ワクチン接種のための腫瘍抗原が生成されるという、癌治療における重大な画期的進歩である。今や、体内に移植される足場を用いたインサイチューでの癌抗原の生成を介して、ワクチンを患者に合わせて製造しなくても患者専用の癌ワクチンを得ることができる。患者に配置後の三次元（3D）ワクチン足場に対して癌の生細胞を補充し、かつ、補充された癌細胞のその後の破壊を誘発するように該足場を処理する。癌細胞の破壊および／または溶解は、足場においてインサイチューで抗原を生成する。
【０００４】
従って、本発明は、プロセシングした（例えば、細胞解離性）腫瘍抗原をインサイチューにおいて産生するための生検不要の方法を特徴とする。例えば、腫瘍抗原は、無傷の腫瘍細胞から遊離して、細胞断片に結合し、またはその自然発生状態から変更されている細胞に結合する。先ず、多孔性の三次元の足場を、癌と診断された対象に投与する。足場は癌細胞の化学誘引物質を含む。このような分子（ならびにそれらのアミノ酸（aa）および核酸（na）の配列）は当技術分野において周知である。例えば、癌細胞の化学誘引物質は、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド21（CCL-21、GenBankアクセッション番号：（aa）CAG29322.1 (GI:47496599)、（na）EF064765.1 (GI:117606581)、参照により本明細書に組み入れられる）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド19（CCL-19、GenBankアクセッション番号：（aa）CAG33149.1 (GI:48145853）、（na）NM_006274.2 (GI:22165424)、参照により本明細書に組み入れられる）、ストローマ細胞由来因子-1（SDF-1、GenBankアクセッション番号：（aa）ABC69270.5 (GI:85067619）、（na）E09669.1 (GI:22026296）、参照により本明細書に組み入れられる）、血管内皮増殖因子（例えば、VEGFA;GenBankアクセッション番号：（aa）AAA35789.1 (GI:181971）、（na）NM_001171630.l (GI:284172472）、参照により本明細書に組み入れられる）、およびインターロイキン-4（IL-4、GenBankアクセッション番号：（aa）AAH70123.l (GI:47123367)、参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択されるケモカインである。
【０００５】
足場は、循環性癌細胞が蓄積するのに十分な期間、インサイチューで維持され、それによって、癌細胞含有足場が得られる。最後に、該細胞含有足場を細胞毒性因子または細胞溶解性因子と接触させて、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する。細胞毒性因子または細胞溶解性因子は、それぞれ、細胞の死または溶解を惹起する組成物および/または条件である。例えば、細胞は癌細胞である。治療される患者は、循環性腫瘍細胞、例えば、転移性腫瘍細胞を特徴とする癌を含む。例えば、対象は、転移性癌の条件または血液由来の癌もしくは循環系の癌、例えば白血病と診断されている。細胞毒性因子または細胞溶解性因子は、金粒子などの熱電導性組成物、および／または外部からの熱、超音波、レーザー照射もしくはγ線照射の適用を含む。例えば、癌細胞の細胞毒性または細胞溶解は、熱伝導性組成物も含有する細胞含有足場への条件（例えば、上記などのエネルギー源）を適用することによって誘発される。レーザー照射の適切なタイプは紫外線または近赤外線のレーザー照射を含む。
【０００６】
例示的な足場組成物は、米国特許第2008-0044900 A1（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。適切な足場には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー（例えば、PLGAポリマー）、アルギナートおよびアルギナート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ラミニンを豊富に含むゲル、アガロース、天然および合成多糖類、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）（PAM）、ポリ（アクリラート）、修飾スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（ビニルピロリドン）、ならびに上記の任意のコポリマーまたはグラフトコポリマーが含まれる。一つの好ましい足場組成物はRGD修飾アルギナートを含む。
【０００７】
足場組成物は0.01mm3〜100mm3である。例えば、足場組成物は1mm3〜75mm3、5mm3〜50mm3、10mm3〜25mm3である。好ましくは、足場組成物は1mm3〜10mm3のサイズである。
【０００８】
足場の空隙率は装置からの細胞の出／入りに影響する。孔はナノ多孔性、ミクロ多孔性またはマクロ多孔性である。多孔性ポリマー装置は、細胞の装置へのおよび装置からの移動を促進するために、整列したおよび／または相互接続した孔を備える。例えば、DCなどの免疫細胞が装置に補充され、抗原、例えば、癌細胞から遊離して装置に誘引された抗原を捕捉し、続いて、装置から離れて流入領域リンパ節などの身体のその他の部位に移動するために相互接続した孔を介して装置から遊走する。例えば、ナノ孔の直径は約10nmよりも小さく；ミクロ孔は直径 約100nm〜20μmの範囲であり；かつ、マクロ孔は約20μmよりも大きい（好ましくは、約100μm、200μm、300μmよりも大きく、さらに約400μmよりも大きい）。一つの例において、足場は直径 約400〜500μmの整列または相互接続した孔を持つマクロ多孔性である。
【０００９】
任意で、足場は高体温誘発組成物をさらに含む。適切な高体温誘発組成物は磁性ナノ粒子または近赤外線（NIR）吸収ナノ粒子を含む。いくつかのケースでは、ナノ粒子は磁性であり、かつ、方法は、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために磁性ナノ粒子を交番磁界（AMF）と接触させる工程、それによって癌細胞を変質または崩壊させる工程、およびプロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む。もう一つの例において、方法は、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するためにNIRナノ粒子をNIR照射と接触させる工程、それによって癌細胞を変化または崩壊させる工程、およびプロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む。高体温は、摂氏37度超の局所的温度を特徴とする。例えば、装置の温度は、一時的に40、45、50、60、70、75、80、85、90、95度、またはそれ以上よりまで加熱される。
【００１０】
粒子のサイズは、本発明の足場に合わせて調整される。例えば、ナノ粒子は200nmよりも小さい直径、例えば、2nmよりも大きく150nmよりも小さい直径、例えば、5〜100nm、例えば、10〜50nmの直径を含む。例示的な粒子は45nmよりも小さく、例えば、40nm、または15nmよりも小さく、例えば13nmである。適切なNIRナノ粒子は、金ナノロッド、金ナノシェル、シリカナノ粒子、金ナノケージ、貴金属ナノ粒子、炭素ナノチューブ、炭素ナノ粒子、およびグラファイトナノ粒子を含む。
【００１１】
本明細書に記載される方法は、哺乳動物の癌の治療に有用である。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ならびに食糧摂取のために飼育される家畜または動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヤギであることができる。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。
【００１２】
本発明は、多孔性ポリマー、癌細胞のための化学誘引物質、高体温誘発粒子などの細胞変質または細胞破壊（例えば、細胞毒性または細胞溶解性）組成物または因子を含む腫瘍抗原プロセシング装置も提供する。高体温誘発ナノ粒子は、外的なエネルギー源を適用すると足場内の細胞を細胞破壊温度まで加熱する粒子である。例えば、エネルギー源は、熱、AMFまたはNIRなどの照射の型である。
【００１３】
例示的な装置は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などの免疫細胞（例えば、DC）補充組成物を備える。一つの例において、化学誘引物質、細胞毒性組成物または細胞溶解性組成物、および免疫細胞補充組成物は多孔性ポリマー全体に散在する。別の例において、多孔性ポリマーは、化学誘因物質と、細胞毒性誘発組成物または細胞溶解誘発組成物とを含む第一の領域、および免疫細胞補充組成物を含む第二の領域を含む。後者の例では、領域は、層状またはコアシェル構造で構成され、それによって、第一の領域がコアとして配列され、かつ第二の領域がシェルとして配列される。例示的な細胞毒性誘発（または細胞溶解誘発）組成物は、上に記載され、例えば、高体温誘発粒子である。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「単離された」または「精製された」ヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、化学誘引物質、サイトカイン、またはケモカインヌクレオチドもしくはポリペプチド）は、実質的にその他のヌクレオチドおよびポリペプチドを含まない。精製されたヌクレオチドおよびポリペプチドは、化学的に合成される場合、細胞性の物質またはその他の化合物も含まない。精製された化合物は、関心対象の化合物の重量（乾燥重量）に基づいて少なくとも60％である。好ましくは、調製物は、関心対象の化合物の、重量に基づいて少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％である。例えば、精製されたヌクレオチドおよびポリペプチド、例えば、化学誘引物質、サイトカインまたはケモカインは、重量に基づいて、所望の少糖類の少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％または100％（w/w）であるものである。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。ヌクレオチドおよびポリペプチドは精製されて、ヒト、ならびに伴侶動物（イヌ、ネコ）および家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタの動物、ならびに家禽）などの動物による摂取のための多くの製品において使用される。「精製された」は、例えば、感染性または毒性の物質を含まない、ヒトの対象への投与において安全である無菌性の程度も定義する。
【００１５】
同様に、「実質的に純粋」とは、自然の状態でそれを伴う成分から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、自然の状態でそれらが結合するタンパク質および天然の有機分子を伴わない、重量に基づいて少なくとも60％、70％、80％、90％、95％または実に99％である場合、実質的に純粋である。
【００１６】
低分子は、ペプチド、擬似ペプチド（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約5,000グラムよりも小さい分子量を持つ有機および無機の化合物（ヘテロ有機および有機金属の化合物を含む）、1モル当たり約2,000グラムよりも小さい分子量を持つ有機または無機の化合物、1モル当たり約1,000グラムよりも小さい分子量を持つ有機または無機の化合物、1モル当たり約500グラムよりも小さい分子量を持つ有機または無機の化合物、ならびに、これらの化合物の塩、エステル、および薬学的に許容されるその他の形態を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
製剤または製剤成分の「有効な量」および「治療上有効な量」という用語とは、所望の効果を与えるための製剤または成分の十分な量を意味する。例えば、癌細胞の化学誘引物質の「有効な量」は、細胞変質刺激または細胞破壊刺激の適用前に足場装置において2つまたはそれ以上の癌細胞の蓄積をもたらすのに必要な化合物の量である。究極的には、適切な量および投与計画は主治医である医師または獣医師が決定する。
【００１８】
本明細書で用いられる「治療する」および「治療」という用語は、症状の重症度および／もしくは頻度の低減をもたらすため、症状および／もしくはそれらの根底にある原因を排除するため、ならびに／または損傷の改善もしくは矯正を促進するために、有害な状態、疾患または疾病に苦しんでいる臨床的に症候性の個体への物質または製剤の投与を指す。「予防する」および「予防」という用語は、特定の有害な状態、疾患または疾病に感受性であるかまたはかかりやすく、従って、症状および／またはそれらの根底にある原因の発現の予防に関する、臨床的には無症候性の個体への物質または組成物の投与を指す。
【００１９】
「含む（including）」、「含有する（containing）」、または「〜を特徴とする」と同義である「含む（comprising）」というつなぎの用語は、包括的または大まかであり、追加の、列挙されない要素または方法の工程を除外するものではない。これに対して、「〜からなる」というつなぎの表現は、特許請求の範囲に明記されないあらゆる要素、工程、または成分を除外する。「本質的に〜からなる」というつなぎの表現は、特許請求の範囲を明記される材料または工程に限定し、特許請求される発明の基礎的なおよび新規の特徴に大きく影響しないそれらを許容する。
【００２０】
[本発明1001]
プロセシングされた腫瘍抗原をインサイチューにおいて産生するための生検不要の方法であって、癌と診断された対象に、癌細胞の化学誘引物質を含む多孔性三次元足場を投与する工程、該足場を、循環性癌細胞を蓄積するのに十分な期間、インサイチューにおいて維持して、癌細胞含有足場を得る工程、および、該細胞含有足場を細胞毒性因子または細胞溶解性因子に接触させて、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程を含む、方法。
[本発明1002]
前記細胞毒性因子が、前記細胞含有足場への外部からの熱、超音波、レーザー照射、またはγ線照射の適用を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記レーザー照射が紫外線または近赤外線のレーザー照射を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記足場が高体温誘発組成物をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記高体温誘発組成物が磁性ナノ粒子または近赤外線（NIR）吸収ナノ粒子を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記ナノ粒子が磁性であり、かつ、前記方法が、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために磁性ナノ粒子を交番磁界に接触させる工程、それによって前記癌細胞を崩壊させる工程、および、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記NIRナノ粒子が、金ナノロッド、金ナノシェル、金ナノケージ、貴金属ナノ粒子、炭素ナノチューブ、炭素ナノ粒子、およびグラファイトナノ粒子からなる群より選択され、かつ、前記方法が、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために該NIRナノ粒子をNIR照射に接触させる工程、それによって前記癌細胞を崩壊させる工程、および、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記癌細胞の化学誘引物質が、CCL-21、CCL-19、SDF-1、VEGF、およびIL-4からなる群より選択されるケモカインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記癌が循環性腫瘍細胞を特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記対象が転移性癌状態または白血病と診断されている、本発明1001の方法。
[本発明1011]
多孔性ポリマー、癌細胞のための化学誘引物質、および細胞毒性誘発組成物を備える、腫瘍抗原プロセシング装置。
[本発明1012]
前記細胞毒性誘発組成物が高体温誘発粒子を含む、本発明1011の装置。
[本発明1013]
前記細胞毒性誘発組成物が金ナノ粒子または金ナノロッドを含む、本発明1011の装置。
[本発明1014]
免疫細胞補充組成物をさらに備える、本発明1011の装置。
[本発明1015]
前記免疫細胞補充組成物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む、本発明1014の装置。
[本発明1016]
前記化学誘引物質、前記細胞毒性誘発組成物、および前記免疫細胞補充組成物が前記多孔性ポリマー全体に散在する、本発明1014の装置。
[本発明1017]
前記多孔性ポリマーが、前記化学誘引物質および前記細胞毒性誘発組成物を含む第一の領域、ならびに、前記免疫細胞補充組成物を含む第二の領域を含む、本発明1014の装置。
[本発明1018]
前記第一の領域がコアとして構成され、かつ、前記第二の領域がシェルとして構成される、本発明1015の装置。
本発明のその他の特徴および利点は、それらの好ましい態様についての以下の記載および特許請求の範囲から明らかとなる。別途定義される場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を持つ。以下に記載されるものと同等または等価の方法および材料は、本発明の実践または試験において用いることができるが、以下では適切な方法および材料について記載する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、Genbank/NCBIアクセッション番号、およびその他の参照は、参照により全体が組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が管理する。さらに、材料、方法および実施例は、説明のためのものであり、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】足場への末梢血樹状細胞（DC）の補充、補充されたDCへの癌抗原の負荷、およびCpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG-ODN）／ポリ（エチレンイミン）（PEI）、例えば、PEI縮合CpG ODNなどのDCの成熟（危険信号によって誘発される）を示す略図である。
【図２】患者への移植後にワクチン足場に補充されている循環性内因性癌細胞、足場でのインサイチューにおける腫瘍抗原の遊離につながる補充された癌細胞のその後の破壊、およびDCの活性化／遊離した腫瘍抗原の負荷を示す略図である。
【図３】CCL-21の濃度勾配に対応する白血病細胞の遊走を示す棒グラフである。
【図４】ブランクおよび負荷した足場に対する白血病細胞のインビボ補充を示す棒グラフである。
【図５】CCL-21によって足場に補充された蛍光ナノ粒子（NP）で標識された白血病細胞を示す、マウスから回収された外移植された足場の写真である。
【図６】図6Aは、金ナノロッド（GNR）がポリ（ラクチドおよびグリコリド）（PLG）マクロ多孔性足場（GNR-PLG足場）に組み込まれた足場の写真である。図6Bは、マクロ多孔性足場構造の顕微鏡像を例示する顕微鏡写真である。左下隅の目盛りは200μmである。図6Cは、ポリ（エチレングリコール）（PEG）でコーティングされた金ナノロッド（GNR）を示す顕微鏡写真である。
【図７】図7Aは、PLG足場に組み込まれたGNRの固有の最大吸収を示す線グラフである。図7Bは、808nm連続ダイオードレーザー照射後のGNR-PLG足場の熱画像の顕微鏡写真である。
【図８】図8Aは、異なるレーザー出力の適用後のGNR-PLG足場の温度を示す線グラフである。図8Bは、同一のGNR-PLG足場において繰り返し近赤外線（NIR）照射が複数の高体温を可能にすることを示す線グラフである。
【図９】ハーフブランクPLG足場に物理的に接続して808nmのレーザーを照射したGNR-PLG足場の熱画像を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図10Aは、GNRを組み込まれたコアからなる単一のPLG足場の写真である。図10Bは、GNRを組み込まれたコアからなる単一のPLG足場の熱画像の写真である。図10Cは、PLG足場の十分に相互接続した孔構造を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図11Aは、43℃での熱ショック後の癌細胞培養物の熱ショックタンパク質（HSP）レベルを例示する棒グラフである。図11Bは、熱ショック溶解物および凍結融解溶解物によるインビトロDC活性化を示す棒グラフである。
【図１２】図12Aは、GNR-PLG足場内のレーザー照射（808nm）された細胞（白血病細胞）の図である。図12Bは、様々な温度への曝露後の癌細胞中のHSP70のレベルを示す棒グラフである。図12Cは、照射後の45℃での24時間インキュベートが最も高いHSPレベルを生じることを示すウェスタンブロットの写真である。
【図１３】NIR照射後の45℃での活性化されたDC細胞表面マーカーを伴うGNR-PLG足場における相対的細胞集団を示す棒グラフである。
【図１４】図14Aは、白血病細胞を播種したNIR照射GNR-PLG足場の熱画像の写真である。図14Bは、NIR照射適用後のGNR-PLG足場における白血病細胞の生存率を示す棒グラフである。
【図１５】図15Aは、白血病細胞を播種してC57BL/6Jマウスの皮下に移植したNIR照射GNR-PLG足場の熱画像の写真である。図15Bは、NIR照射適用後のGNR-PLG足場内のインビボ白血病細胞生存率を示す棒図表の棒グラフである。
【図１６】図16Aおよび16Bは、DCの補充および活性化を示す棒グラフである。
【図１７】図17Aおよび17Bは、流入領域リンパ節組織における流入領域リンパ節細胞数およびDC活性化を示す棒グラフである。
【図１８Ａ】レーザー照射を用いたPLGワクチンにおけるDCの補充および活性化を示す棒グラフである。
【図１８Ｂ】レーザー照射を用いたPLGワクチンにおけるDCの補充および活性化を示す棒グラフである。
【図１８Ｃ】レーザー照射を用いたPLGワクチンにおけるDCの補充および活性化を示す棒グラフである。
【図１８Ｄ】レーザー照射を用いたPLGワクチンにおけるDCの補充および活性化を示す棒グラフである。
【図１９】凍結／融解癌細胞溶解物と比較した、熱ショック癌細胞溶解物を用いたDC活性化を示す棒グラフである。
【図２０Ａ】リポ多糖類（LPS）に対するDC反応性を示す散布図である。
【図２０Ｂ】リポ多糖類（LPS）に対するDC反応性を示す散布図である。
【図２０Ｃ】リポ多糖類（LPS）に対するDC反応性を示す棒グラフである。
【図２０Ｄ】リポ多糖類（LPS）に対するDC反応性を示す棒グラフである。
【図２１Ａ】コアシェル構造を持つ抗原生成癌ワクチン装置の写真である。
【図２１Ｂ】単相性、層状およびコアシェル構造を持つ抗原生成癌ワクチンのヤング率の特徴を示す棒グラフである
【図２１Ｃ】抗原生成癌ワクチン足場装置の一連の写真である。上段は装置のFLIR熱画像化（熱像記録法）の結果を示して、下段は可視画像化（写真法）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
三次元（3D）足場は、樹状細胞（DC）に一時的な滞留を与えかつインサイチューでの宿主DCの輸送および活性化を効果的に調節すると共に、免疫系の寛容化している部分の上方制御を防ぎ、かつ、癌に対する治療的保護作用を提供する。例えば、本明細書に記載される癌ワクチンのシステムにおいて、DCの化学誘引物質（GM-CSF）、癌抗原（腫瘍溶解物）、および危険信号（CpGオリゴヌクレオチド）を負荷したマクロ孔質ポリ（ラクチドおよびグリコリド）（PLG）足場の移植が、足場への末梢DCの補充、補充されたDCへの癌抗原の負荷、および危険信号によるそれらの成熟を招いた（図1）。抗原提示成熟DCは、リンパ節に移動して、強力な細胞毒性Tリンパ球（CTL）反応を生じた。この方法では、本ワクチンシステムは、強い抗癌免疫応答のトリガーであり、癌の根絶を可能にした。このような一つのシステムは、抗原を生成するために治療される患者由来の腫瘍生検材料を用い、腫瘍組織のエクスビボでの操作およびプロセシングを必要とする。さらに、本システムは、各ワクチンが（その同一の患者からの腫瘍溶解物を用いて）治療される特定の個体のために製造されることを必要とする。本発明の方法はこれまでに記載されたシステムの改善を表す。
【００２３】
本明細書に記載される通り、ワクチンを患者に合わせて製造しなくても、患者特異的な抗腫瘍免疫応答および負担となっている腫瘍の縮小が達成された。むしろ、癌抗原は体内に移植されたポリマーの足場においてインサイチューで生成される。対象の循環系に存在する癌生細胞は患者に配置後のワクチン足場に補充されて、補充された癌細胞のその後の破壊は足場においてインサイチューで抗原を生成する（図2）。
【００２４】
足場への循環性癌細胞の補充
この方法で治療されるのに適した癌は、血流中に循環している原発性または転移性癌細胞が存在している、癌である。これらの細胞は、特定のケモカインの濃度勾配に反応しての遊走特性を特徴とする。従って、循環性癌細胞は、特定のケモカインが組み込まれている移植された足場に補充される。
●循環性癌細胞：様々な癌における転移性癌細胞、白血病細胞。
●癌細胞の化学誘引物質：癌のタイプに応じた様々なケモカイン（例えば、CCL-21、CCL-19、SDF-1、VEGF、IL-4など）。
●3D足場：生分解性多孔性ポリマー、多孔性無機材料、会合したナノ粒子、ナノチューブ、ナノロッドなどを含む、孔を持ってケモカインを負荷するように設計された様々なタイプの3D足場。
【００２５】
足場に対する外部刺激による補充された癌細胞の破壊
以下に記載する通り、足場への癌細胞の補充の他に、癌抗原を含有する溶解物をインサイチューにおいて生成するように癌細胞を補充した後に癌細胞を死滅させるために様々な外部刺激が用いられる。補充された癌細胞を死滅させるために、外部刺激は移植された足場に適用可能である。
●外部からの加熱
●超音波
●レーザー照射：UV、近赤外線レーザー
●γ線照射
●ナノ粒子（NP）媒介性高体温
○磁性ナノ粒子を負荷した足場のための交番磁界（AMF）。
○近赤外線（NIR）吸収ナノ粒子（例えば、金ナノロッド、金ナノシェル、金ナノケージ、その他の貴金属ナノ粒子、炭素ナノチューブ、炭素ナノ粒子、グラファイトなど）を負荷した足場のためのNIR照射。
【００２６】
補充されたDCおよび癌細胞の操作の分離
癌細胞を死滅させるために用いられる信号はDC機能に対して負の影響を及ぼさないので、場合によっては、補充されたDCおよび癌細胞を分離することが望ましい。以下に記載する通り、この隔離は、各細胞タイプの補充の時間的な順序を通じての制御により、または足場の特定領域への外部刺激の適用を可能にする細胞の空間的な隔離により達成される。
【００２７】
・細胞補充の順序の時間的制御
すべての細胞を同時に補充するのではなく、先ず癌細胞が、補充され、かつ、溶解物を生成するために破壊される。その後、癌細胞は、外部刺激によってDCを損傷することなく、癌抗原の部位にDCを補充する。この目的のために、足場からDCおよび癌細胞への異なる化学誘引物質の放出特性を制御することが可能である。例えば、放出特性を制御するためにポリマーワクチン足場の調製において、異なる分解特性および／または各ケモカインに対する異なる分子親和性を持つポリマーの異なる組成物が用いられる。
【００２８】
・足場の特定領域への外部刺激の適用を可能にするための足場の空間的制御
足場はまた、一部の特定のコンパートメントに存在する癌細胞を特異的に死滅させるためにそのコンパートメントのみが外部刺激の影響を受けて、それによってその他のコンパートメント内の無傷および機能性のDCの維持が可能であるように、コンパートメント化される。この目的のため、足場の様々な構造上の変更が用いられる。癌細胞を死滅させるためのナノ粒子（NP）媒介性高体温の場合、NPは、足場の特定の部分に組み込まれ、NP部分における特異的な高体温を可能にし、DCが補充されるその他の部分に対しては高体温の影響は微々たるものである。
【００２９】
インサイチュー抗原産生癌ワクチン
タンパク質薬物（例えば、サイトカインおよびモノクローナル抗体）を用いる免疫療法は癌管理のための一つのアプローチである。免疫療法の別の型である治療的な癌ワクチンは癌を治療するための別のアプローチである。癌ワクチンは強い抗腫瘍免疫活性を引き起こすように設計され、かつ、抗原特異的細胞毒性（CD8+）Tリンパ球（CTL）の誘導はそれらの機能の決定的な局面である。活性化されたCD8+ T細胞は、腫瘍細胞上に存在する特異的標識（抗原）を認識すると腫瘍細胞を死滅させ、かつ、この認識は、その抗原に特異的なT細胞受容体（TCR）への標識の結合に依存する。樹状細胞（DC）は最も重要な抗原提示細胞（APC）であり、CTL反応の開始において中心的な役割を果たす。
【００３０】
本明細書に記載される発明に先立って、Provengeとして公知であるDCをベースとする最初の治療的癌ワクチンが食品医薬品局によって承認された。癌治療におけるこの画期的進歩は癌と闘うための患者自身の免疫系の刺激を示した。しかしながら、この治療は、これらの細胞を多量に生成するため、および癌抗原で細胞を活性化するためのDCのエクスビボでの操作をベースとするものであり、従って、高いコストと多大な規制上の負担とを強いられる。加えて、腫瘍はこの治療で根絶されず、患者の生存時間の延長は4カ月が限度とされている。この画期的進歩は、癌治療に対して大きな影響を持ち得るが、DCをベースとする癌ワクチン戦略におけるさらなる進歩を遂げること、およびエクスビボでの操作への依存を回避することの必要性を強調するものでもある。
【００３１】
材料科学における発展は、診断、癌治療、および組織再生を含む幅広い生物医学的な適用において、新規医用材料と、材料の適用とをもたらす。特に、ナノ粒子および巨視的な三次元の医用材料は、多くの臨床適用において多大な可能性を秘めている。本明細書に記載される通り、それらのナノサイズおよび容易な表面変更の故に、画像化または治療様式を実現するために腫瘍およびリンパ節を含む様々な組織に対するナノ粒子のターゲティングが用いられる。3Dの巨視的スケールの医用材料、特に多孔性足場については、成長因子の制御された放出、細胞送達および組織再生を伴う適用に関して広範囲にわたって探索が行われている。これらの材料は、典型的には、材料の壁からの細胞情報伝達分子の物理的特性および提示を通しての制御によって、内在する細胞の運命が調節されることを可能にする微小環境を作り出す。これらの3Dの巨視的スケールの材料およびナノ粒子は、特に特異的免疫細胞集団のターゲティングおよびプログラミングによる、癌の状況におけるワクチンの開発に有用である。
【００３２】
以下の実施例に記載する通り、DCに一時的な滞留場所を与える多孔性ポリマーマトリックスは、インサイチューにおける宿主DCの輸送および活性化を効果的に調節し、同時に免疫系の寛容化している部分の上方制御を防ぎ、かつ、癌に対する治療的保護を提供する。（i）DCを補充するためのGM-CSFと、（ii）DCを成熟させるためのCpG/PEI複合体と、（iii）癌抗原の混合物を供給するための腫瘍溶解物とを組み込むマクロ多孔性PLG足場はこの目的のために開発された。皮下移植されると、GM-CSFが放出されて、顕著な数の宿主DCを補充するために周辺組織における濃度勾配を確立した。補充されたDCへのポリマーからのCpG/PEI複合体の提示は、足場におけるDCの成熟およびそれらのLN-ホーミングを増加させた。これらの足場は、ワクチン接種後に、予防モデルにおいて生残率90％の黒色腫、ならびに黒色腫および神経膠芽細胞腫の治療モデルにおいて50％を上回る生残率の黒色腫に対する強い特異的なCTL反応を誘発した。このシステムは、抗原クロスプレゼンテーションにおいて極めて重要な、顕著な数の形質細胞様DC（pDC）およびCD8+ DCを含む様々なDCサブセットを補充し、これらのDCサブセットの数はワクチンの有効性と強く相関した。このワクチンはまた免疫寛容を生じるサイトカイン（例えば、IL-10、TGF-β）の局所濃度およびT調節細胞の数を減少させて、その成功の鍵となる局面が耐性を下方制御する能力に関連することを示唆する。ポリマーミクロスフェアが、補充された細胞の滞留を与えることなく生理活性物質の持続的で局在的な放出をもたらすために代わりに用いられる場合に、ワクチンの有効性が著しく低下したので、これらの作用はポリマーがマクロ多孔性の足場の物理的形状を持つ場合にのみ見出された。この結果は、宿主環境要因が最小限になり外因性の成熟因子が高度に濃縮される微小環境を作り出すことが、病理学に関連する重要な免疫寛容化要因が存在する癌などの状況において免疫応答をプログラムし直すための鍵であることを示す。
【００３３】
しかしながら、このシステムの限界は、それが、患者由来の腫瘍生検材料、ならびに、癌抗原を生成するためのエクスビボでの操作およびプロセシングを必要とすることである。細胞の生検またはエクスビボでのいかなる操作も伴うことなく体に移植された足場においてインサイチューで癌抗原を生成するためのシステムはこれまでのシステムを上回る改善を示す。患者専用の癌ワクチンを作製するために、癌細胞が3Dワクチン足場に補充される改良型の足場システムが開発され、それらの補充された癌細胞の変質または破壊により足場においてインサイチューで細胞溶解物が生成される。
【実施例】
【００３４】
実施例1：癌細胞の補充およびその後の外部刺激による補充された癌細胞の破壊によるインサイチュー抗原生成癌ワクチン
白血病細胞を補充するための金ナノロッド負荷癌ワクチン足場と、熱ショックタンパク質に結合した癌抗原を生成するためのNIR照射媒介性高体温によるそれらのその後の破壊との例を以下に記載する。足場が癌細胞を補充できることを実証するために、マウス白血病細胞（C1498）を、化学誘引物質としてCCL-21を用いたトランスウェルアッセイ法で調べた。C1498はCCL-21の濃度勾配に対して強い遊走を示した（図3）。
【００３５】
実施例2：白血病細胞のインビボ補充
白血病細胞のインビボ補充は、GFP発現白血病細胞を用いて特徴決定された。いかなるケモカインも伴わないPLG足場（ブランク）、GM-CSFを負荷した足場（G）、GM-CSFおよびCCL-21を負荷した足場（G+C）をC57BL/6Jマウスの皮下に移植して、GFP-白血病細胞を4日目に尾静脈注入により血液中に注入した。足場を6日目に回収して、足場内の細胞を単離してFACSで分析した（図4）。さらに、蛍光NP標識した白血病細胞を注入したマウスから回収した足場を蛍光画像化装置（Xenogel）で画像化した（図5）。双方の結果により、足場から放出されたCCL-21が動物において白血病細胞の補充を増大させることを示された。
【００３６】
実施例3：高体温媒介性抗原生成
補充された癌細胞からの高体温媒介性抗原生成を達成するために、製造工程においてPLGマクロ多孔性足場に金ナノロッド（GNR）を組み込まれた（GNR-PLG足場）（図6）。GNR-PLG足場は250〜440umの孔を持ち、GNRは足場全体に組み込まれて、その結果、得られるPLG足場は暗色となった。細胞に対する毒性物質として公知であるGNR製造工程で用いられた元々の界面活性物質（臭化セチルトリメチルアンモニウム）から毒性を除去するために、GNRの表面をポリ（エチレングリコール）（PEG）で修飾した。
【００３７】
PLG足場に組み込まれたGNRは、約810nmにおいて固有の最大吸収および最大強度を示し、これは、その波長域において組織および水による吸収が最小であることからインビボ照射において望ましい（図7A）。808nm連続ダイオードレーザーを用いて照射されると、GNR-PLG足場の温度は室温から40℃（図7B）に上昇した。
【００３８】
以下に示す通り、GNR-PLG足場の温度は、レーザーの異なる出力を適用することによって室温から最高約70℃までの範囲で制御された（図8A）。対照的に、GNRの組み込みを伴わないブランクの足場は、GNR-PLG足場に適用された最も高い出力での照射においても温度の顕著な変化を示さず、NIR媒介性高体温がGNRを組み込んだ足場において特異的に誘発され得ることを示している。任意で、強い免疫活性化を惹起するために多くの抗原生成が用いられる。繰り返しNIR照射は、同一のレーザー出力を用いることによるターゲティング温度の低下を伴うことなく、同一のGNR-PLG足場において多数の高体温を可能にした（図8B）。
【００３９】
実施例4：NIR光のGNR吸収
NIR光がPLG足場の特定の部分においてGNRによって吸収されるために、PLG足場のGNR組み込み領域における局所的高体温は可能である。ハーフGNR-PLG足場およびハーフブランクPLG足場を物理的に接続し、かつ、足場全体をカバーするために大きなビームサイズを用いて808nmのレーザーを照射した結果、GNR-PLG足場側面にのみ特異的な加熱が生じた（図9）。この構成は異なるコンパートメント、即ち、癌細胞のためのコンパートメントおよびDCのためのコンパートメントを持つ、移植可能な足場を示す。癌細胞のためのコンパートメントのみが加熱されるが、DCのためのコンパートメントは正常なDC機能を可能にするように元のまま（加熱されていない）である。
【００４０】
実施例5：GNRを組み込まれたコアおよび正常なシェルを持つPLG足場
GNRを組み込まれたコア部分および正常なシェル部分からなる単一のPLG足場（図10A）を癌特異的加熱のために作製した（図10B）。異なるコンパートメントおよび十分に相互接続した孔構造を持つこの単一のPLG足場（図10C）は高体温後のDCによる効率的な癌抗原の取り込みを可能にする（図10C）。
【００４１】
実施例6：熱ショック癌細胞
熱ショックが熱ショック癌細胞から産生されるHSPのアジュバント効果のためにより多くの免疫原性抗原を誘導することができるかどうかを調べるために、43℃の恒温水槽での熱ショック後に癌細胞培養物のHSPレベルを分析した（図11A）。一般的な溶解物生成方法である凍結融解法に比べて、熱ショック条件では細胞溶解物および細胞培養培地の双方において典型的なHPSであるHSP70がより多く得られた。熱ショック溶解物および凍結融解溶解物によるインビトロDC活性化は、熱ショック溶解物が高いHSPのために高いDC活性化特性を持つことを示した（図11B）。
【００４２】
実施例7：癌細胞由来HSPを誘導するためのNIR照射
GNR-PLG足場へのNIR照射が、足場に存在する癌細胞からHSPを誘導するかどうかを調べるために、GNR-PLG足場に白血病細胞を播種した後、808nmレーザーを照射した（図12A）。HSP70レベルを検討するために照射による様々な温度について調べ、45℃までの照射が最大のHSP70レベルを惹起することが示された（図12B）。さらに、ウェスタンブロットのデータは、45℃での照射後24時間のインキュベートが最も高いHSPを生成することを示した。
【００４３】
実施例8：樹状細胞の活性化
インビトロDC、例えば骨髄由来樹状細胞（BMDC）の、NIR照射後の45℃でのGNR-PLG足場からの細胞溶解物を用いた活性化は、活性化されたDCの代表的な細胞表面マーカーであるCCR7およびCD86に関して未照射細胞溶解物に比べて高いDCの活性化を示し（図13）、NIR照射が、GNR-PLG足場に存在する癌細胞からの高い免疫原性の癌抗原のインサイチュー生成を引き起こすことを示す。
【００４４】
実施例9：インビトロにおけるNIR照射後の癌細胞の生存率
NIR照射後のGNR-PLG足場におけるインビトロ癌細胞生存率について評価した。GNR-PLG足場に白血病細胞を播種して、温度を40、45、および50℃まで上昇させるためにNIR照射を行い、アラマーブルーアッセイ法により細胞の生存率を確認した（図14）。温度が高ければ高いほど、細胞の生存率は低かった。さらに、二回目の照射ではすべての条件においてさらに低い生存率となった。これらのデータは、GNR-PLG足場においてNIR照射によって惹起される高体温のために癌細胞が死滅したことを示す。
【００４５】
実施例10：インビボにおけるNIR照射後の癌細胞の生存率
インビボ補充を模倣するために、白血病細胞を播種したGNR-PLG足場をC57BL/6Jマウスの皮下の組織内に移植し、足場を45および50℃までNIRレーザーで照射した。インビトロの実験と同様に、より高い温度の条件では細胞の生存率が低下し（図15）、NIR照射が、GNR-PLG足場において補充された癌細胞に対する熱ショックを誘発したことを示す。移植した足場装置への循環性癌細胞の補充、外力、例えば照射の適用による癌細胞の変質または破壊は、装置内での腫瘍抗原の有効性の向上をもたらす。癌における装置内での腫瘍抗原の有効性の向上はDC活性化の増大およびより有効な癌ワクチンをもたらす。
【００４６】
実施例11：移植した装置のインビボ照射はDC活性化の増大および補充されたDC数の増加をもたらす
インビボ樹状細胞補充およびレーザー照射を用いた活性化について評価した。106個のEG7.Ovaリンパ腫細胞をGM-CSFと共にGNR-PLG足場に負荷した。足場をC57BL/6Jマウスの皮下に移植した。移植後3日に足場の位置に45℃まで5分間、808nmのNIRレーザーを照射した。移植後7日に足場を回収して消化し、樹状マーカー（CD11c）および活性化マーカー（CD86）について細胞を分析した。図16A〜Bは、レーザー照射が、補充された樹状細胞のパーセントを有意（n＝3、p＜0.05）に増大させ（A）、足場内においてそれらを活性化する（B）ことを示す。
【００４７】
実施例12：移植した装置のインビボ照射はDC活性化の増大および流入領域リンパ節における活性化されたDC数の増加をもたらす
レーザー照射を用いた流入領域リンパ節におけるインビボ樹状細胞活性化について検討した。106個のEG7.Ovaリンパ腫細胞をGM-CSFと共にGNR-PLG足場に負荷した。足場をC57BL/6Jマウスの背部の皮下に移植した。移植後3日に足場の位置に45℃まで5分間、808nmのNIRレーザーを照射した。移植後7日に流入領域リンパ節（鼠径リンパ節を含む）を回収して消化し、樹状マーカー（CD11c）および活性化マーカー（CD86）について細胞を分析した。図17A〜Bは、レーザー照射が、流入領域リンパ節を有意（n＝3、p＜0.05）に肥大させ（A）、これが炎症後の反応であり、かつ、リンパ節内の活性化樹状細胞の数を増加させたこと（B）を示す。これらのデータは、補充されたDCが足場装置を離れて流入領域リンパ節（即ち、移植された装置の場所とは異なる解剖学的部位）に遊走する／移動したことを示す。
【００４８】
実施例13：免疫細胞活性化のためのさらなる危険信号としての照射
インビボ樹状細胞補充およびレーザー照射を用いた全PLGワクチンにおける活性化について評価した。106個のEG7.Ovaリンパ腫細胞を、GM-CSFと、DCを活性化するための危険信号として機能する濃縮CpG-ODNと共にGNR-PLG足場に負荷した。足場をC57BL/6Jマウスの皮下に移植した。移植後3日に足場の位置に45℃まで5分間、808nmのNIRレーザーを照射した。移植後7日に足場を回収して消化し、樹状マーカー（CD11c）および活性化マーカー（CD86）について細胞を分析した。図18A〜Dは、レーザー照射が補充されたDCのパーセント（A）および総数（B）をさらに増加させ（n＝3、p＜0.05）、足場の位置においてそれらを活性化すること（C〜D）を示す。このデータは、レーザー照射が免疫細胞活性化のためのさらなる危険信号として機能することを示す。
【００４９】
実施例14：癌細胞の高体温処理
熱ショックB16細胞溶解物を用いたインビトロBMDC活性化について評価した。熱ショック細胞溶解物を調製するために、予め加温した恒温水槽において10x106個のB16黒色腫細胞に45℃で5分間、熱ショックを与えた。従来法の細胞溶解物は3サイクルの凍結融解手順を用いて作製した。調製した溶解物を106個のBMDCと共に18時間インキュベートした。BMDC活性化マーカーであるMHCIIおよびCD86を、フローサイトメトリーを用いて分析した。細胞にCD11c＋DCに関してゲートを掛けた。図19は、熱ショック細胞から生成された溶解物が従来法の細胞溶解物よりもより多く（p＜0.05）の活性化されたDCを生成できることから、熱ショック細胞から生成された溶解物がDCを活性化するための危険信号として機能することを示している。
【００５０】
実施例15：LPS反応性に対する温度の影響
高温はインビトロにおいてBMDCのLPSに対する反応性の低下を誘発する。106個/ウェルのBMDCに50℃で5分間、熱ショックを与えた。続いて、それらを、免疫細胞活性化を上方制御できる免疫アジュバントであるLPSを加えてまたは加えないで、インキュベートした。活性化マーカーであるCD86およびMHC-IIをフローサイトメトリーで分析した。図20A〜Dは、熱ショックがBMDCのLPS刺激に対する反応能力を抑制できることを示す。従って、補充されたDCを照射から保護するために代替となる足場構造が開発された。
【００５１】
実施例16：コアシェル構築物を有する装置
補充されたBMDCの直接の死滅は避けるが、補充された癌細胞の熱ショックは可能にするように、GNR足場の代替構造であるコアシェル型の足場が工学的に操作された。内部コアの足場は癌を補充するケモカインおよびGNRを負荷するように設計され（色は負荷されたGNRのために暗色である）；外側シェルの足場はDCを補充するためにGM-CSFのみを負荷する。圧縮試験は、この足場スキームが従来法の足場スキームよりも低いヤング率を持つことを示す（図21A〜C）。この設計では、内部コアの足場に補充される癌細胞のみがレーザー照射の熱ショックに供されて、外側シェルの足場の補充されたDCは熱ショックを回避する。
【００５２】
その他の態様
本発明はその詳細な説明と関連して記載されており、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によって限定される本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定することを意図するものではない。その他の局面、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内のものである。
【００５３】
本明細書に言及される特許および科学文献は、当業者に有効な知識を確立するものである。本明細書において記載されるすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は参照により組み入れられる。本明細書に記載される公開されたすべての外国の特許および特許出願は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されるアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBIの提出は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されるその他のすべての刊行された参照、資料、原稿、および科学文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５４】
本発明は特にその好ましい態様に関して示されて記載されるが、当業者は、添付の特許請求に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その中において形態および詳細の様々な変更が行われ得ることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年1月11日(2017.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセシングされた腫瘍抗原をインサイチューにおいて産生するための生検不要の方法であって、癌と診断された対象に、癌細胞の化学誘引物質を含む多孔性三次元足場を投与する工程、該足場を、循環性癌細胞を蓄積するのに十分な期間、インサイチューにおいて維持して、癌細胞含有足場を得る工程、および、該細胞含有足場を細胞毒性因子または細胞溶解性因子に接触させて、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞毒性因子が、前記細胞含有足場への外部からの熱、超音波、レーザー照射、またはγ線照射の適用を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記レーザー照射が紫外線または近赤外線のレーザー照射を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記足場が高体温誘発組成物をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記高体温誘発組成物が磁性ナノ粒子または近赤外線（NIR）吸収ナノ粒子を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子が磁性であり、かつ、前記方法が、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために磁性ナノ粒子を交番磁界に接触させる工程、それによって前記癌細胞を崩壊させる工程、および、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記NIRナノ粒子が、金ナノロッド、金ナノシェル、金ナノケージ、貴金属ナノ粒子、炭素ナノチューブ、炭素ナノ粒子、およびグラファイトナノ粒子からなる群より選択され、かつ、前記方法が、インサイチューにおいて局所的高体温を誘発するために該NIRナノ粒子をNIR照射に接触させる工程、それによって前記癌細胞を崩壊させる工程、および、プロセシングされた腫瘍抗原を産生する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
前記癌細胞の化学誘引物質が、CCL-21、CCL-19、SDF-1、VEGF、およびIL-4からなる群より選択されるケモカインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記癌が循環性腫瘍細胞を特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が転移性癌状態または白血病と診断されている、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
多孔性ポリマー、癌細胞のための化学誘引物質、および細胞毒性誘発組成物を備える、腫瘍抗原プロセシング装置。
【請求項１２】
前記細胞毒性誘発組成物が高体温誘発粒子を含む、請求項11記載の装置。
【請求項１３】
前記細胞毒性誘発組成物が金ナノ粒子または金ナノロッドを含む、請求項11記載の装置。
【請求項１４】
免疫細胞補充組成物をさらに備える、請求項11記載の装置。
【請求項１５】
前記免疫細胞補充組成物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む、請求項14記載の装置。
【請求項１６】
前記化学誘引物質、前記細胞毒性誘発組成物、および前記免疫細胞補充組成物が前記多孔性ポリマー全体に散在する、請求項14記載の装置。
【請求項１７】
前記多孔性ポリマーが、前記化学誘引物質および前記細胞毒性誘発組成物を含む第一の領域、ならびに、前記免疫細胞補充組成物を含む第二の領域を含む、請求項14記載の装置。
【請求項１８】
前記第一の領域がコアとして構成され、かつ、前記第二の領域がシェルとして構成される、請求項15記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
例示的な装置は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などの免疫細胞（例えば、DC）補充組成物を備える。一つの例において、化学誘引物質、細胞毒性組成物または細胞溶解性組成物、および免疫細胞補充組成物は多孔性ポリマー全体に散在する。別の例において、多孔性ポリマーは、化学誘引物質と、細胞毒性誘発組成物または細胞溶解誘発組成物とを含む第一の領域、および免疫細胞補充組成物を含む第二の領域を含む。後者の例では、領域は、層状またはコアシェル構造で構成され、それによって、第一の領域がコアとして配列され、かつ第二の領域がシェルとして配列される。例示的な細胞毒性誘発（または細胞溶解誘発）組成物は、上に記載され、例えば、高体温誘発粒子である。