(57)【要約】【課題】  Ｄ-プシコースとＤ-アロースとＤ-フルクトースを含む原液から、高純度でＤ-プシコースまたはＤ-アロースを含む溶液を分離する方法の提供。【解決手段】  ケトース３−エピメラーゼ作用と、Ｌ-ラムノースイソメラーゼ作用を併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ）属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｄ-またはＬ-ケトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中で該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースを生成するとともに、生成するケトースを可逆的ケトース-アルドース異性化して対応するアルドースを生成し、該水性媒体中から該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースおよびそれを変換したアルドースを採取することを特徴とするケトースおよび／またはアルドースの製造方法であって、前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物である方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトース３−エピメラーゼ作用と、Ｌ-ラムノースイソメラーゼ作用を併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ）属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｄ-またはＬ-ケトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中で該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースを生成するとともに、生成するケトースを可逆的ケトース-アルドース異性化して対応するアルドースを生成し、該水性媒体中から該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースおよびそれを変換したアルドースを採取することを特徴とするケトースおよび／またはアルドースの製造方法であって、前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物である方法。
【請求項２】
出発段階のＤ-またはＬ-ケトースがＤ-フラクトースであり、対応するケトースおよびそれを変換したアルドースがＤ-プシコースおよびＤ-アロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対応するケトースおよびそれを変換したアルドースの採取は、反応混合液からボロン酸ゲルに吸着して対応するケトースおよびそれを変換したアルドースを分画することである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対応するケトースおよびそれを変換したアルドースであるＤ-プシコースとＤ-アロースの採取は、Ｄ-プシコースおよびＤ-アロースを含む反応混合液からボロン酸ゲルに吸着してＤ-プシコースおよびＤ-アロースを分画することである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケトース３−エピメラーゼ作用と、Ｌ-ラムノースイソメラーゼ作用を併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ）属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、ケトースおよび／またはアルドースを製造する方法に関する。また、ケトースおよびアルドースの混合液からケトースまたはアルドースを分離する方法に関し、特に、希少糖類の一つとしてその特性や機能性が注目されるＤ-プシコースまたはＤ-アロースの分離方法に関し、とくに糖のシスジオール構造がホウ酸と可逆的に結合することを利用し、アフィニティークロマトグラフィーによりボロン酸ゲルからなるカラムに吸着し、溶離液を用いてＤ-プシコースまたはＤ-アロースを溶離させる、Ｄ-プシコースとＤ-アロースとＤ-フルクトースを含む溶液からＤ-プシコースまたはＤ-アロースを高純度で分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
希少糖プシコース（アルロース）含有シロップ「レアシュガースウィート」(登録商標)の大量生産の工場ができて、まず香川県内に行き渡たり、現在は取扱店が全国規模になってきている。このシロップは、非特許文献１によると、Ｄ-プシコース５．４ｇ/１００ｇ、Ｄ-ソルボース５，３ｇ/１００ｇ、Ｄ-タガトース２．０ｇ/１００ｇ、Ｄ-アロース１，４ｇ/１００ｇ、Ｄ-マンノース４．３ｇ/１００ｇが含まれていることが明らかにされている。このシロップが甘味料として優れているのは数種類の希少糖を含んでいるからではないのかと言われている。ロブリー・ドブリュイン-ファン エッケンシュタイン転位反応による平衡反応を応用すると、Ｄ体のフラクトース、グルコース、プシコース、マンノース、アロース、アルトロースからは、これら糖のいずれかもしくは混合糖が得られる。Ｄ体のタガトース、タロース、ガラクトース、ソルボース、グロース、イドースからは、これら糖のいずれか、もしくは混合糖が得られる。Ｌ体についても同様の反応が進行する。糖組成物の生理的な作用の観点から、特定のヘキソースの有する生理的な作用に着目して、特定のヘキソースを含有する糖組成物を製造することができる（特許文献１）。希少糖であるＤ-プシコースとＤ-アロースはさまざまな生理活性作用をもつことから注目され、需要が高まっている。
【０００３】
非特許文献２には、グルコースをフルクトースに変換するために用いられるＤ-キシロースイソメラーゼと、フルクトースからＤ-プシコースを生産するために用いられるＤ-ケトヘキソース・３−エピメラーゼの二種類の酵素を組み合わせて用いることで、Ｄ-グルコースから直接Ｄ-プシコースを製造する方法が開示されている。このＤ-プシコースをＬ-ラムノースイソメラーゼを用いて異性化することによって希少糖Ｄ-アロースを生産することができる。Ｄ-プシコースからＤ-アロースを生産するためには、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 
ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＬＬ１７２由来の酵素（Ｌ-ラムノースイソメラーゼ）が必要である（特許文献２）。
Ｌ-ラムノースイソメラーゼ （Ｌ-ｒｈａｍｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）は、香川県の土壌中から分離された微生物であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 
ｓｔｕｔｚｅｒｉの生産する酵素であり、ケトース-アルドース間の可逆的異性化反応を触媒する酵素である。本酵素により、Ｄ-プシコースを基質にＤ-アロースを生産することが可能となった。
【０００４】
従来より、炭水化物原料混合溶液からプシコースなどの微少量の単糖類を不純物として分離除去する技術として、結晶法やイオン交換樹脂、ゼオライトによる吸着分離法等が知られている。また、擬似移動層式クロマト分離装置を用いて、糖類を含む原液からグルコースやフルクトースを含む画分を分離するようにした技術も知られている。さらにまた、希少糖類であるプシコースを生産対象糖類として、それを大量に分離生産する技術として、プシコースとフルクトースを含む原液から、溶離液として水を用いてプシコースを多く含むプシコース画分とフルクトースを多く含むフルクトース画分とを分離する方法として、擬似移動層式クロマト分離装置を用いた分離方法が知られている（特許文献３）。
また、５０％Ｄ-プシコースを原料にして酵素反応でＤ-アロースを生産した場合、生産物は、３５％Ｄ-プシコースと１５％Ｄ-アロースの混合溶液として得られる。酵素反応産物からＤ-アロースを回収するに際し、Ｄ-アロースのアルコールに難溶性の性質を利用してＤ-アロースを結晶化させ、Ｄ-アロースの結晶を分離することを特徴とする高純度Ｄ-アロースの分離回収法が知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１０/１１３７８５
【特許文献２】ＷＯ２００４/０６３３６９
【特許文献３】特許第４６２７８４１号公報
【特許文献４】特許第３９７５２７４号公報
【特許文献５】特開２００６−１５３５９１号公報
【特許文献６】特開２００４−２９８１０５号公報
【特許文献７】特開平１０−１５５４８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】応用糖質科学第５巻第１号４４−４９（２０１５）
【非特許文献２】Ｊ．of Fermentation and Bioengineering, 80(1),1995,p.101-3
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2168-2171.
【非特許文献４】Technical Information Bulletin Number AL-102, Boric Acid Gel for column chromatography, PRODUCT NO. 18,445-4  （登録商標）1978 by Aldrich Chemical Company, Inc.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さまざまな生理活性作用をもつことから注目され希少糖を組み合わせた希少糖の混合物を安価な原料糖から生産することを目的とする。それは安価な原料糖から希少糖の混合物を直接に製造する態様を含み、また、製造された希少糖を含む混合物から希少糖を分離する態様も含む。より具体的には、希少糖であるＤ-プシコースとＤ-アロースの生産効率の向上を目的とする。さらに、希少糖類のＤ-プシコースやＤ-アロースの特性や機能性に着目し、Ｄ-プシコースとＤ-アロースとＤ-フルクトースを含む原液から、高純度でＤ-プシコースまたはＤ-アロースを含む溶液を分離する方法を提供することにある。
Ｄ-プシコースは果糖から生産し、両者の混合液を得た後に分離工程が必要である（特許文献５）。さらに、Ｄ-アロースは生産したＤ-プシコースを原料にして同様の工程を経て生産する（特許文献６）。そのため、Ｄ-アロースを得るためには同様の工程を２度繰り返す必要があるために、コストを軽減することが困難である。そこで両者を一括して効率的に生産する方法が求められてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、Ｄ-プシコースとＤ-アロースとＤ-フルクトースを含む溶液から高純度のＤ-プシコースまたはＤ-アロースを含む溶液を分離する方法について検討した結果、Ｄ-プシコース３−エピメラーゼ、およびＬ-ラムノースイソメラーゼを併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ）属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いて両希少糖を生産し、アフィニティークロマトグラフィーによりボロン酸ゲルからなるカラムに吸着して分離することにより工業的に有効な高純度でＤ-プシコースまたはＤ-アロース溶液を生産できることを見いだし、本発明に到達したものである。
【０００９】
希少糖であるＤ-プシコースとＤ-アロースはさまざまな生理活性作用をもつことから注目され、需要の高まりが予想されており、これらの生産効率の向上を目指し、これら２つの希少糖を生産する酵素であるＤ-プシコース３−エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼを併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ）属に属する微生物（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６）を単離し、その特性解析を行ってきた。本発明はこれらの部分精製酵素を用いた両希少糖生産の生産方法について改良した結果と、ボロン酸ゲルによる分離回収技術を提供するものである。
【００１０】
本発明は、以下の（１）ないし（４）に記載のケトースおよび／またはアルドースの製造方法を要旨とする。
（１）ケトース３−エピメラーゼ作用と、Ｌ-ラムノースイソメラーゼ作用を併せもつシネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ）属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、Ｄ-またはＬ-ケトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中で該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースを生成するとともに、生成するケトースを可逆的ケトース-アルドース異性化して対応するアルドースを生成し、該水性媒体中から該ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースおよびそれを変換したアルドースを採取することを特徴とするケトースおよび／またはアルドースの製造方法であって、前記微生物が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物である方法。
（２）出発段階のＤ-またはＬ-ケトースがＤ-フラクトースであり、対応するケトースおよびそれを変換したアルドースがＤ-プシコースおよびＤ-アロースである、上記（１）に記載の方法。
（３）対応するケトースおよびそれを変換したアルドースの採取は、反応混合液からボロン酸ゲルに吸着して対応するケトースおよびそれを変換したアルドースを分画することである、上記（１）に記載の方法。
（４）対応するケトースおよびそれを変換したアルドースであるＤ-プシコースとＤ-アロースの採取は、Ｄ-プシコースおよびＤ-アロースを含む反応混合液からボロン酸ゲルに吸着してＤ-プシコースおよびＤ-アロースを分画することである、上記（２）に記載の方法。
（５）培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
また、本発明は、以下の（６）に記載の微生物を要旨とする。
（６）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、生産効率の向上を目指し、希少糖であるＤ-プシコースとＤ-アロースというこれら２つの希少糖を生産する酵素であるＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６と命名され、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２として寄託されたＤ-プシコース３−エピメラーゼ作用、およびＬ-ラムノースイソメラーゼ作用を併せもつ微生物を提供することができる。
本発明に係るＤ-プシコースボロン酸ゲルによる分離回収技術の分離方法は、
前処理不要で、分離対象になる物質の定量ができる。また、（１）ケトースの３位をエピマー化した対応するケトースを生成するＤ-タガトース ３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）反応後のケトース間分離、（２）ケトースを可逆的ケトース-アルドース異性化して対応するアルドースを生成する、あいはアルドースを可逆的アルドース-ケトース異性化して対応するケトースを生成する、各種イソメラーゼ反応後のケトース・アルドース間の分離、（３）ＲＳＳのプシコースの精製など、これまで分離できなかった物質をこの分離装置で分離できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ボロン酸を用いたＤ-フルクトースとＤ-プシコース間の分離、およびＤ-プシコースとＤ-アロース間の分離と連続生産の概要図を示す。
【図２】ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物を用いてＤ-フラクトースからＤ-プシコースとＤ-アロースを生産した反応液をＨＰＬＣにより分析した結果を示す図面と、図中のピークが、Ｄ-グルコース、Ｄ-フラクトース、Ｄ-アロース、緩衝液グリシン、Ｄ-プシコースであることを示す表を示す。
【図３】６種類の異性化酵素を用いて異性化糖を調製した時の酵素反応条件についてまとめた表である。
【図４】図２に示された反応液のボロン酸ゲル溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図５】ＳｍＤ-ＧＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-グルコースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図６】ＣｐＬ-ＲＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-マンノースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図７】ＫｐＤ-ＡＩを用いてＬ-タガトースとＬ-ガラクトースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図８】５％レアシュガースウィートのボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図９】ＰｓＬ-ＲｈＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アロースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１０】ＫｐＤ-ＡＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アルトロースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１１】ＰｃＤ-ＴＥを用いてＤ-フルクトースとＤ-プシコースを生産した反応液のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１２】本発明のＮＮ-６株由来のＤＮＡの塩基配列（塩基数６６３）と公知の１６ＳｒＲＮＡをコードする領域のＤＮＡの塩基配列を比較する図面である。
【図１３】本発明のＮＮ-６株由来のＤＮＡの塩基配列（塩基数６６３）と公知のＳｈｉｎｅｌｌａ ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓの相同性を説明する図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［ＮＮ-６株の同定］
本発明者は数多く単離した菌株の中にケトース３−エピメラーゼとＬ-ラムノースイソメラーゼを産生する微生物ＮＮ-６株を見出し、研究室内で保管して実験に使用していた。その後、ＮＮ-６株は、一般的に微生物の同定用いられる方法ＢＬＡＳＴを使って、１６ＳｒＲＮＡをコードする領域ＤＮＡの一部（塩基数６６３）を解析したところ（図１２参照）、９９％でＳｈｉｎｅｌｌａ 
ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓと一致した（図１３参照）。これは研究室内での解析結果であり、他のＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ともほぼ同じ相同性を示しているので、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６と命名した。現在、客観的な結果を得るため、外部機関に配列解読を委託している。
本出願に際し、ケトース３−エピメラーゼ活性とＬ-ラムノースイソメラーゼ活性を併せて有するＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに２０１８年２月１７日付で寄託し、まず、ＡＰ−０２２０２として受領書が発行された。微生物の生存確認試験を実施し結果が肯定的であればすみやかに受託証が発行され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２として寄託されたこととなる。本寄託により、ＮＮ-６は、はじめて一定の条件下で分譲可能となり、本願発明に係る微生物の存在が担保されるとともに、第三者がその発明を実施することができる環境で保管されることとなった。
すなわち、本発明の微生物は、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６と命名され、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２として寄託されたＤ-プシコース３−エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼ産生微生物である。
【００１５】
Ｄ-プシコース３−エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼは、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いることができる。培養物の処理物が、培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品が例示される。すなわち、該Ｄ-プシコース３−エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼは精製酵素、未精製酵素をそのまま用いてもよいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素としてもよい。
酵素はＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２）から一般的な超音波破砕機を使用する抽出法で抽出した。理論的には無細胞状態であるが、ゼロではない。部分精製に関しては、これも従来技術にある、ポリエチレングリコール#６０００（ＰＥＧ）による分画手法である。Ｄ-プシコース３-エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼはともにＰＥＧ２０％画分に最も回収される。
〈ポリエチレングリコール分画〉については、特許文献７に記載された方法に準拠した以下の通りである。粗酵素液を、氷冷し、これに０．０１Ｍになるよう塩化マンガンを添加し、３０分間放置したあと不溶物を遠心分離して除去した。次いで、ポリエチレングリコール粉末を１０ｗ／ｖ％になるように加え、攪拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。得られた上清にポリエチレングリコールを終末２０ｗ／ｖ％になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離し、沈殿を採取した。これに適宜緩衝液を添加し溶解させ、部分精製とする。
【００１６】
［ケトース３−エピメラーゼ活性とＬ-ラムノースイソメラーゼ活性］
（ケトース３−エピメラーゼ）
Ｄ-タガトース３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）は、ケトースの第３位炭素の可逆的エピ化反応を触媒する酵素である。香川大学農学部の土壌中から分離された微生物シュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）が生産する（非特許文献３）。香川大学の何森健らによって、Ｄ-フルクトースをＤ-プシコースに変換する酵素として発見された。ケトースの第３位炭素のエピ化酵素としては世界で初めての例である。シュードモナス・チコリ由来Ｄ‐タガトース３‐エピメラーゼ（ＰｃＤ-ＴＥ）は、Ｄ‐タガトースだけではなく、Ｄ‐フルクトース（Ｄ‐タガトースの４位エピマー）にも作用しＤ‐プシコースを生成できることがわかった。このＰｃＤ-ＴＥの発見によって希少糖生産は飛躍的に進展した。
（Ｌ-ラムノースイソメラーゼ）
Ｌ-ラムノースイソメラーゼは、香川県の土壌中から分離された微生物であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉの生産する酵素であり、ケトース-アルドース間の可逆的異性化反応を触媒する酵素である。香川大学の何森健らによって、プシコースをアロースに変換する酵素として発見された。
［果糖からの希少糖Ｄ-プシコース、Ｄ-アロースの一括生産］
（ケトース３−エピメラーゼ活性とＬ-ラムノースイソメラーゼ活性）
Ｄ-タガトース３-エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼは希少糖酵素と呼び、希少糖の生産に最重要の酵素である。
これら二つの希少糖酵素活性を持つことはＤ-フラクトースをＤ-プシコースとＤ-アロースに変換する酵素を発見したことであり、重大な発見である。
Ｄ-フルクトースを基質に反応させるとＤ-プシコースとＤ-アロース以外に、Ｄ-アロースと同率くらいでＤ-グルコースも混在してくることがわかった。Ｄ-グルコースの生成が酵素反応によるものなのか、ｐＨ８での反応によるアルカリ異性化によるものなのか、解明しなくてはならない。Ｄ-グルコースが生じにくい反応条件などをこれから検討することとしている。
【００１７】
［糖の単離］
希少糖類であるプシコースを生産対象糖類として、それを大量に分離生産する技術として、プシコースとフルクトース（果糖）を含む原液から、溶離液として水を用いてプシコースを多く含むプシコース画分とフルクトースを多く含むフルクトース画分とを分離する方法として、擬似移動層式クロマト分離装置を用いた分離方法が知られている（特許文献３）。これは２種間の分離となるのでフルクトース、プシコース、アロースの３者の分離のデータはまだ取っていない。
［ボロン酸ゲルによるＤ-プシコース、Ｄ-アロースの一括分離］
［ボロン酸アフィニティーカラム］
ボロン酸によるアフィニティークロマトグラフィー材料のための支持体マトリックス
シリカ、ポリスチレン、及びポリメタクリレートに基づく支持体マトリックスが使用されている。
ボロン酸によるアフィニティーマトリックスは、例えば、ボロン酸ゲル（ポリメタクリレートによる支持体）が市販されている。ボロン酸によるアフィニティークロマトグラフィーに用いられる原理、理論、及びデバイスは、非特許文献４においても説明されている。
図１に、ボロン酸を用いたＤ-フルクトースとＤ-プシコース間の分離、およびＤ-プシコースとＤ-アロース間の分離と連続生産の概要図を示す。Ｄ-フルクトースとＤ-プシコース間の分離、およびＤ-プシコースとＤ-アロース間の分離については成功している。回収した原料を高濃度の原料に戻して再反応できるかについては未検討であるが、問題ないと考えている。ボロン酸アフィニティーカラムの利点は、反応と分離を一体化できることと脱塩のコストを削減できることである。
【００１８】
現在、実サンプルでボロン酸ゲルの分離条件を検討している中で、Ｄ-グルコースが無いＤ-フラクトース、Ｄ-プシコース、Ｄ-アロースの３者の分離は容易であるが、Ｄ-グルコースがあるとＤ-アロース画分に混在してくる。１．Ｄ-グルコース＋Ｄ-アロース、２．Ｄ-フルクトース、３．Ｄ-プシコースの３つの画分になり、おそらく４者の分離はできないと予想される。
Ｄ-グルコース＋Ｄ-アロースの画分は、酵母処理でグルコースを消費させアロースのみにするなどで製造することは可能であるし、擬似移動クロマトを使えば確実に分離できる。
【００１９】
［レアシュガースウィートの分離］
希少糖プシコース（アルロース）含有シロップ「レアシュガースウィート」の大量生産の工場ができて、まず香川県内に行き渡たり、現在は取扱店が全国規模になってきている。このシロップが甘味料として優れているのは数種類の希少糖を含んでいるからだと言われている（非特許文献１参照）。すなわち、ロブリー・ドブリュイン-ファン エッケンシュタイン転位反応による平衡反応を応用すると、Ｄ体のフラクトース、グルコース、プシコース、マンノース、アロース、アルトロースからは、これら糖のいずれかもしくは混合糖が得られる。Ｄ体のタガトース、タロース、ガラクトース、ソルボース、グロース、イドースからは、これら糖のいずれか、もしくは混合糖が得られる。Ｌ体についても同様の反応が進行する。糖組成物の生理的な作用の観点から、特定のヘキソースの有する生理的な作用に着目して、特定のヘキソースを含有する糖組成物を製造することができる（特許文献２）。
【００２０】
本発明を実施例により詳細に説明する。本発明は、これらの実施例により限定されることはない。
【実施例】
【００２１】
［粗酵素の調整］
Ｄ-フルクトースからＤ-プシコースとＤ-アロースというこれら２つの希少糖を生産する酵素であるＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．ＮＮ-６と命名され、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２から粗酵素を調製した。ＢＲＡＮＳＯＮ社製Ｍｏｄｅｌ２５０にて超音波破砕した。Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ１００％、２分間の条件で１０回処理したとき両者の活性が最も高かった。
［酵素の固定化］
得られた粗酵素液に終濃度１ｍＭとなるように塩化マンガンを添加した後、６０℃、３０分の熱処理により不要なタンパク質を沈殿させた。遠心分離により不溶性タンパク質を除去した。その上清に、ポリエチレングリコール#６０００（ＰＥＧ）分画により両酵素を部分精製した。この画分を用いて固定化担体の再検討したところ、両酵素ともダイヤイオンＨＰＡ２５Ｌに固定化したときに最大活性を示した。
【００２２】
［ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０２で特定される微生物を用いたＤ-フラクトースからのＤ-プシコースとＤ-アロースの生産］
両酵素が固定化された固定化酵素を用いて５％（ｗ/ｗ）Ｄ-フラクトースからＤ-プシコースとＤ-アロースを生産した結果、反応は４８時間後に平衡に達した。Ｄ-フラクトースからのＤ-プシコースとＤ-アロースの生産結果は、ＨＰＬＣ分析により図２に示すとおり、この反応液中にはＤ-グルコースが含まれており、このときの組成比は、Ｄ-グルコース：Ｄ-フラクトース：Ｄ-プシコース：Ｄ-アロース＝７：６２：２１：１０であった。図２中の表の上から順に、ピークが、Ｄ-グルコース、Ｄ-フラクトース、Ｄ-アロース、緩衝液グリシン、Ｄ-プシコースであることが示されている。
【００２３】
ボロン酸アフィニティーカラムを用いてケトースとアルドース等の糖混合物を分離するための試料を製造した。
［他の異性化酵素による希少糖の生産（１種類の酵素を使用した例）］
１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｂｉｉ  ＳＴ２４株由来のＤ-タガトース ３-エピメラーゼ（ＰｃＤ-ＴＥ）
２．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ＬＬ１７２株由来のＬ-ラムノースイソメラーゼ（ＰｓＬ-ＲｈＩ）
３．Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｈｏｍｉｎｉｓ株由来のＬ-リボースイソメラーゼ（ＣｐＬ-ＲＩ）
４．Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ４０ｂ株由来のＤ-アラビノースイソメラーゼ（ＫｐＤ-ＡＩ）
５．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ  １４ａ株由来のＬ-アラビノースイソメラーゼ（ＢｐＬ-ＡＩ）
６．市販のＤ-グルコースイソメラーゼ（シグマアルドリッチ社製
Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ由来、ＳｍＤ-ＧＩ）
の６種類の異性化酵素を用いた。
【００２４】
上記のＰｃＤ-ＴＥ、ＰｓＬ-ＲｈＩ、ＣｐＬ-ＲＩ、ＫｐＤ-ＡＩ、ＢｐＬ-ＡＩの５種は、本発明者の属する研究室で調製した酵素である。うち、ＰｃＤ-ＴＥ、ＰｓＬ-ＲｈＩ、ＣｐＬ-ＲＩは組換え体であり、ＫｐＤ-ＡＩおよびＢｐＬ-ＡＩは野生株より、それぞれ以下のように調製した。
各組換え体を１００ｍｌのＳＢ培地に植菌し、アンピシリンを終濃度が１００μｇ/ｍｌとなるように添加した。１２時間培養後、ＩＰＴＧ
（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ-Ｂ-Ｄ-ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度が１ｍＭとなるよう添加して、誘導を４時間行った。
ＢｐＬ-ＡＩは酵母エキス（ＹＥ）培地（ｐＨ７．０）に１％のＬ-グルタミン酸ナトリウムを添加した培地を用い、５５℃で２４時間培養した。
ＫｐＤ-ＡＩは酵母エキス（ＹＥ）培地（ｐＨ７．０）に１％のＤ-アラビノースを添加した培地を用い、３０℃で２４時間培養した。
遠心分離にて回収した各菌体を以下のように緩衝液で懸濁させた。
ＰｃＤ-ＴＥ：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
ＰｓＬ-ＲｈＩ、ＣｐＬ-ＲＩ、ＫｐＤ-ＡＩ、ＢｐＬ-ＡＩ：５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
懸濁させた菌体をＢＲＡＮＳＯＮ社製Ｍｏｄｅｌ２５０にて
Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ５０％、１分の条件で３回超音波破砕した。その各上清を粗酵素液として酵素反応に用いた。
ＳｍＤ-ＧＩは市販の固定化微生物の状態の顆粒を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄したものを酵素反応に用いた。
【００２５】
上記の６種類の異性化酵素を用いて以下の異性化糖を調製した。
１．ＰｃＤ-ＴＥを用いてＤ-フルクトースとＤ-プシコース、Ｌ-ソルボースとＬ-タガトース（なお、Ｌ-ソルボースとＬ-タガトースは現在分離中）
２．ＰｓＬ-ＲｈＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アロース、Ｌ-タガトースとＬ-タロース（なお、Ｌ-タガトースとＬ-タロースは現在分離中）
３．ＣｐＬ-ＲＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-マンノース、Ｌ-ソルボースとＬ-グロース（なお、Ｌ-ソルボースとＬ-グロースは現在分離中）
４．ＫｐＤ-ＡＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アルトロース、Ｌ-タガトースとＬ-ガラクトース
５．ＢｐＬ-ＡＩを用いてＬ-ソルボースとＬ-イドース（なお、Ｌ-ソルボースとＬ-イドースは現在分離中）
６．ＳｍＤ-ＧＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-グルコース
６種類の異性化酵素を用いて異性化糖を調製した時の酵素反応条件について図３の表にまとめた。
【００２６】
［ケトースとアルドースの分離］
（ボロン酸アフィニティーカラムの調整）
φ０．６ｍｍ×３００ｍｍの空カラムにシグマアルドリッチ社製のボロン酸ゲル（粒径０．１−０．４ｍｍ、ＣＡＳ番号４１６８５−８４−１）を充填した。このカラムを汎用のＨＰＬＣポンプに接続し、ＲＩ検出器で溶離パターンを分析した。各サンプル（５％、０．２ｍｌ）を２５℃前後（室温）下で、溶離液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた。
以下に各結果を示す。
【００２７】
図４は、図２に示された反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１にはＤ-アロースと同率くらいでＤ-グルコースも混在してくることが示されている。Ｄ-フラクトースとＤ-プシコースの分離は成功したことが示されている。
【００２８】
図５は、ＳｍＤ-ＧＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-グルコースを生産し、酵素反応後の５％Ｄ-フルクトースとＤ-グルコースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-グルコース、画分２としてＤ-フラクトースを分離することに成功したことが示されている。
【００２９】
図６は、ＣｐＬ-ＲＩを用いてＤ-フルクトースとＤ-マンノースを生産し、酵素反応後の５％Ｄ-フルクトースとＤ-マンノースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-マンノース、画分２としてＤ-フラクトースを分離することに成功したことが示されている。
【００３０】
図７は、ＫｐＤ-ＡＩを用いてＬ-タガトースとＬ-ガラクトースを生産し、酵素反応後の５％Ｌ-タガトースとＬ-ガラクトースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＬ-ガラクトース、画分２としてＬ-タガトースを分離することに成功したことが示されている。
【００３１】
図８は、５％レアシュガースウィートをボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-アロースがメインピーク、画分２としてＤ-フラクトースがメインピーク、画分３としてＤ-プシコースを分離することが示されている。
【００３２】
図９は、ＰｓＬ-ＲｈＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アロースを生産し、酵素反応後の５％Ｄ-プシコースとＤ-アロースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-アロース、画分２としてＤ-プシコースを分離することに成功したことが示されている。
【００３３】
図１０は、ＫｐＤ-ＡＩを用いてＤ-プシコースとＤ-アルトロースを生産し、酵素反応後の５％Ｄ-プシコースとＤ-アルトロースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-アルトロース、画分２としてＤ-プシコースを分離することに成功したことが示されている。
【００３４】
図１１は、ＰｃＤ-ＴＥを用いてＤ-フルクトースとＤ-プシコースを生産し、酵素反応後の５％Ｄ-フルクトースとＤ-プシコースを含む反応液をボロン酸アフィニティーカラムに流し込み、溶離液として５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）用いて流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出させた時のボロン酸ゲルの溶出パターンと各画分のＨＰＬＣ分析の結果を示す。画分１としてＤ-フルクトース、画分２としてＤ-プシコースを分離することに成功したことが示されている。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
Ｄ-タガトース３-エピメラーゼおよびＬ-ラムノースイソメラーゼは希少糖酵素と呼び、希少糖の生産に最重要の酵素であり、これら二つの希少糖酵素活性を持つ酵素を発見したことであり、重大な発見であり、各種希少糖の生産に寄与することが期待される。
また、複数種の希少糖の組合せは、各希少糖特有の機能の総和のみならず、新しい甘味料となり得ること分かってきた。例えば、希少糖プシコース（アルロース）含有シロップ「レアシュガースウィート」(登録商標)が甘味料として優れているのは数種類の希少糖を含んでいるからではないのかと言われており、このシロップを原料にして、Ｄ-フルクトース、Ｄ-グルコース、Ｄ-プシコース、Ｄ-ソルボース、Ｄ-タガトース、Ｄ-アロース、Ｄ-マンノースなどの任意の組合せの糖混合物の提供が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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