(57)【要約】【課題】ドリフトの影響を受けることなく所望の位置で画像を取得する。【解決手段】観察対象物２の所定の第１位置に対物レンズ２１の焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、対物レンズ２１の焦点位置を焦点維持制御が実行された第１位置から光軸Ｏ１方向に所定間隔の第２位置に移行し、第２位置に対物レンズ２１の焦点位置を維持する焦点維持制御を実行させる移行制御を実行する制御部７１を備える。【選択図】図１
2017097301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象物の所定の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行し、前記第２位置に前記対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行させる移行制御を実行する制御部を備える制御装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記第１位置及び前記第２位置を含む前記所定間隔ごとの複数の位置において前記焦点維持制御を実行し、前記複数の位置の各々への前記移行制御を実行し、前記複数の位置において前記撮像制御を実行する請求項１に記載の制御装置。
【請求項３】
前記制御装置は、
光源と、
前記光源からの光に基づく光像を前記観察対象物を収容する容器にある界面上に結像させ、前記界面からの前記光像の反射光を受光して前記光像の反射像を結像させるフォーカス用光学系と、
前記反射像の結像位置に設けられ、前記反射像を検出する光電変換器と、
前記観察対象物を収容する容器にある界面の位置を検出する界面検出部と、
を含み、
前記フォーカス用光学系は、該光学系の第２光軸方向に移動可能なレンズを含み、
前記制御部は、前記光電変換器からの信号に基づき前記界面検出部に前記界面の検出を実行させ前記検出結果を基に前記レンズを前記第２光軸方向に移動させることで前記界面と前記焦点位置との距離を変更し、該距離の変更に基づき前記対物レンズと前記観察対象物との少なくとも一方を前記光軸方向に前記所定間隔移動させる請求項１または請求項２に記載の制御装置。
【請求項４】
前記制御部は、前記対物レンズと前記観察対象物との少なくとも一方を前記光軸方向に前記所定間隔移動させ、該所定間隔の移動に合わせて前記界面検出部が前記光電変換器からの信号に基づき前記界面を検出する位置に前記レンズを前記第２光軸方向に移動させる請求項３に記載の制御装置。
【請求項５】
前記制御部は、前記観察対象物についての前記所定間隔ごとの画像群の取得を複数回実行する場合に、前記移行制御が実行されたときの各位置を記憶し、記憶した前記各位置に基づいて次回以降の画像群の取得時おける前記移行制御を実行する請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項６】
前記制御部は、前記複数の位置の各々において複数回撮像させる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の制御装置を備えた顕微鏡装置。
【請求項８】
観察対象物の所定の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行し、前記第２位置に前記対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行させる移行制御を実行することを備える制御方法。
【請求項９】
コンピュータに、
観察対象物の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行させる移行制御を実行する制御処理を実行させる制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御装置、顕微鏡装置、制御方法、及び制御プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
観察対象の試料の内部を観察する場合において、光学顕微鏡における焦点を調節する装置として次のような装置が知られている。特許文献１に記載されている装置においては、試料の界面（例えばカバーガラスの面）に対してオートフォーカス制御を行い、対物レンズの焦点位置を界面の位置（基準位置）に調節する。また、上記の装置は、対物レンズの焦点位置を撮影領域上限に移動させ、撮像装置で撮像を行う。また、上記の装置は、撮像を行った後、撮影Ｚ間隔分だけ対物レンズの焦点位置を移動させつつ撮像を行い、この動作を測定が終了するまで繰り返し実行する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許７，３４５，８１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、試料に対する対物レンズの光軸方向の複数の位置で撮像を行っている間に、周囲の温度変化などによって、例えば培養容器の底部の膨張などにより観察中の試料がゆっくりと動いてしまう。このように試料の位置が動く現象をドリフトという。試料がドリフトすると、試料における光軸方向の所望の位置の画像を取得することができなくなってしまう。特に、撮影枚数が多くなると光軸方向の各々の位置で画像を取得する時間が長くなってしまい、ドリフトの影響が大きくなってしまう。
【０００５】
本発明の態様では、ドリフトの影響を受けることなく光軸方向の所望の位置で画像を取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１態様によれば、観察対象物の所定の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行し、前記第２位置に前記対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行させる移行制御を実行する制御部を備える制御装置が提供される。
【０００７】
本発明の第２態様によれば、上記の制御装置を備えた顕微鏡装置が提供される。
【０００８】
本発明の第３態様によれば、観察対象物の所定の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行し、前記第２位置に前記対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行させる移行制御を実行することを備える制御方法が提供される。
【０００９】
本発明の第４態様によれば、コンピュータに、観察対象物の第１位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、前記対物レンズの焦点位置を前記焦点維持制御が実行された前記第１位置から前記光軸方向に所定間隔の第２位置に移行させる移行制御を実行する制御処理を実行させる制御プログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の態様によれば、ドリフトの影響を受けることなく所望の位置で画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態に係る制御装置を備えた顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２】図１に示す顕微鏡装置の制御系の構成を示すブロック図である。
【図３】オフセットレンズを移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）はオフセットレンズを移動したときの状態を表す図であり、（ｃ）は焦点位置が調節された状態を表す図である。
【図４】Ｚスタック撮影を行う際の撮影位置を示す図である。
【図５】Ｚスタック撮影における撮影位置の変化と時間との関係を示す図である。
【図６】試料ドリフトにより所望の撮影位置と対物レンズの焦点位置とのずれが生じた状態を示す図である。
【図７】試料ドリフトに追従して対物レンズの焦点位置を所望の撮影位置に合わせた状態を示す図である。
【図８】Ｚスタック撮影を行う前の前処理の手順を示すフローチャートである。
【図９】第１実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。
【図１０】図９のステップＳ１３、Ｓ１６及びＳ１９の処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１０の処理中の動作を示す図である。
【図１２】第２実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。
【図１３】オフセットレンズを移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）は対物レンズの焦点位置を撮影領域下限の位置に移動させた状態を表す図であり、（ｃ）は光像の結像位置が基準面となるようにオフセットレンズを移動させた状態を表す図である。
【図１４】第３実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。
【図１５】第３実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。また、図面においては、実施形態を説明するため、一部分を大きくまたは強調して記載するなど適宜縮尺を変更して表現する場合がある。
【００１３】
＜第１実施形態＞
図１は、実施形態に係る制御装置を備えた顕微鏡装置１の構成を示す図である。図１において、ＸＹＺ座標系を用いて図中の方向を説明する。このＸＹＺ座標系においては、水平面に平行な平面をＸＹ平面とする。このＸＹ平面において紙面の右方向をＸ方向と表記し、ＸＹ平面においてＸ方向に直交する方向（紙面の表から裏に向かう方向）をＹ方向と表記する。また、ＸＹ平面に垂直な方向（上下方向）をＺ方向と表記する。
【００１４】
図１に示す実施形態に係る顕微鏡装置１は、観察の対象物である試料２（標本又は観察対象物ともいう。）の拡大像を形成して試料２の観察に用いられる光学顕微鏡と、この光学顕微鏡の動作を制御する制御装置とを備えている。光学顕微鏡は、ＸＹステージ１０、結像光学系２０、界面検出部３０、第２光源４０、照明光学系５０、撮像部６０、信号処理部６１、及び駆動部１１，３４，３６を有している。この光学顕微鏡は、試料２の下に対物レンズ２１が配置され、下側から試料２を観察する倒立型顕微鏡である。制御装置は、制御部７１、入力部７２、及び記憶部７３を有している。結像光学系２０は対物レンズ２１と撮像部６０間の光路であるが、照明光学系５０である第２光源４０から対物レンズ２１までの光路の内、ダイクロイックミラー５２から対物レンズ２１までの光路は照明光学系５０と共通の光路となる。
【００１５】
ＸＹステージ１０上には試料２を収容した試料容器３が載置される。試料容器３は透明なプラスチックで成形され、底部にはカバーガラスを貼り付けてある。試料２は例えば蛍光染色されたＨｅＬａ細胞とされる。使用者（観察者、作業者）は、試料容器３内における様々な濃度の溶液（媒質）中にＨｅＬａ細胞を保持させる。なお、図１において、試料２は試料容器３上に浮いているのではなく試料容器３に載置されている。本実施形態において、試料２の中心部分（例えば細胞の核の部分）が、使用者が観察したい部分である。この部分のＺ方向の位置の面を試料面２ａ（又は標本面）という。
【００１６】
ＸＹステージ１０には下側（対物レンズ２１側）からの光（つまり、Ｚ方向の光）を試料２に導く開口部１０ａが試料容器３の位置に対応して形成されている。ＸＹステージ１０は、ステージ駆動部１１による駆動に応じてＸ方向及びＹ方向に移動する。これにより、撮像対象の試料２（試料容器３）が対物レンズ２１の対向位置に移動される。ステージ駆動部１１は、制御部７１からの制御信号に基づいて、ＸＹステージ１０をＸ方向及びＹ方向に移動させる。
【００１７】
結像光学系２０は、対物レンズ２１及び結像レンズ２２を有している。対物レンズ２１は、ＸＹステージ１０の下側に配置されている。対物レンズ２１の同焦点距離は、対物レンズ２１の胴付き面（対物レンズ２１の取り付け基準面、フランジ面）から対物レンズ２１の焦点位置の面（焦点面）までの距離、すなわち、試料面２ａに焦点が合っているときの対物レンズ２１の胴付き面から試料面２ａまでの距離である。一般に、対物レンズ２１の同焦点距離は一定距離に設計されている。また、対物レンズ２１及び結像レンズ２２は、同一の光路上に配置されている。対物レンズ２１及び結像レンズ２２の光軸が第１光軸Ｏ１である。本実施形態では、第１光軸Ｏ１の方向はＺ方向となっている。なお、以下の説明において、対物レンズ２１のＺ方向の焦点位置を焦点位置Ｆという。図１に示す例では、焦点位置Ｆは試料面２ａの位置に一致している。
【００１８】
本実施形態では、界面検出部３０は、試料２を保持する試料容器３の底部（ボトム）の上面３ａの位置を界面として検出する。しかし、「界面」はこれに限定されるものではない。例えば液浸対物レンズを用いた観察の場合、容器とこれに収容される標本が接触している面である底部を界面としてもよい。また乾式対物レンズを用いた観察の場合、容器を載置する顕微鏡のステージと接触する容器の面部を界面としてもよい。更に観察試料を密閉した空間内に収容可能な培養容器を用い、容器の上面部に観察試料が張り付く（ぶら下がった状態）で存在する場合は、容器の上面部を界面とすることでもよい。
【００１９】
界面検出部３０は、図１に示すように、フォーカス用照明光学系３０Ａ、フォーカス用結像光学系１０７、レンズ駆動部３４、光電変換器１３０、及び信号処理部１３１を有している。なお、フォーカス用照明光学系３０Ａ及びフォーカス用結像光学系１０７をフォーカス用光学系という。フォーカス用照明光学系３０Ａは、その光軸である第２光軸Ｏ２上に順に、第１光源（光源）１２０、第１コレクタレンズ１２１、スリット板１２２、第２コレクタレンズ１２３、第１瞳制限マスク１２４、ハーフミラー１２５、オフセットレンズ（レンズ）３２、可視光カットフィルタ１４０、及びダイクロイックミラー３３が配設されている。スリット板１２２の中央部には長方形の細長いスリット開孔１２２ａが形成されており、スリット板１２２は、スリット開孔１２２ａの長手方向が図１において紙面に垂直方向に延びるように第２光軸Ｏ２を中心に配設されている。
【００２０】
第１光源１２０から出射された赤外光（近赤外光）は、第１コレクタレンズ１２１で集光されてスリット板１２２に入射し、試料２の界面と共役位置に配置したスリット板１２２のスリット開孔１２２ａを通り、第２コレクタレンズ１２３で平行光に変換され、第１瞳制限マスク１２４に照射される。第１瞳制限マスク１２４は、瞳の半分を遮光するものであり、光軸を中心にスリット状の赤外光の長手方向の中心線にそって半分が遮光されるように配設されている。第１瞳制限マスク１２４を通過した赤外光Ｌａは、ハーフミラー１２５を透過する。なお、ハーフミラー１２５は、フォーカス用照明光学系３０Ａとフォーカス用結像光学系１０７の光軸が交差する点に配設されており、赤外光の一部を反射して、他の一部を透過するものであり、後述するように、フォーカス用結像光学系１０７でも共用されている。
【００２１】
ハーフミラー１２５を透過した赤外光Ｌａは、オフセットレンズ３２で距離率変化を受けた後、可視光カットフィルタ１４０で赤外光Ｌａに含まれる可視光成分が除去される。可視光カットフィルタ１４０で可視光成分が除去された赤外光Ｌａは、ダイクロイックミラー３３で対物レンズ２１側に反射され、対物レンズ２１に導かれる。ダイクロイックミラー３３は、結像光学系２０とフォーカス用照明光学系３０Ａの光軸Ｏ１，Ｏ２が交差する点に配設されている。後述するように、ダイクロイックミラー３３は結像光学系２０でも共用されている。ダイクロイックミラー３３は、結像光学系２０の光路上のアフォーカル系に配設され、赤外光を反射して可視光を透過する作用をする。
【００２２】
対物レンズ２１は、赤外光を集光させて試料容器３の底部に照射する。対物レンズ２１による赤外光に基づく光像のＺ方向の結像位置を結像位置Ａという。図１に示す例では、結像位置Ａは試料容器３の底部の上面３ａの位置に一致している。なお、対物レンズ２１は、結像光学系２０でも共用されている。
【００２３】
フォーカス用結像光学系１０７は、上述のようにフォーカス用照明光学系３０ＡによりＸＹステージ１０上の試料容器３の底部に照射されて反射するスリット状の赤外光を受光するものである。ここで、対物レンズ２１で結像された赤外光は、試料容器３の底部の上面３ａで反射される。以下の説明において、上面３ａのことを反射面という。なお、反射面３ａのことを界面又は境界面ともいう。上面３ａで反射した赤外光は、対物レンズ２１を通過し、ダイクロイックミラー３３で側方に反射され（赤外光Ｌｄ）、さらに可視光カットフィルタ１４０で可視光成分が除去される。可視光カットフィルタ１４０を通過した赤外光Ｌｄはオフセットレンズ３２に導かれる。レンズ駆動部３４は、制御部７１からの制御信号に基づいてオフセットレンズ３２を第２光軸方向Ｏ２に移動させる。
【００２４】
オフセットレンズ３２を通過した赤外光Ｌｄは、ハーフミラー１２５に入射する。ハーフミラー１２５に入射した赤外光Ｌｄの一部は、上方に反射されフォーカス用結像光学系１０７に導かれる。フォーカス用結像光学系１０７は、その光軸に沿って、ハーフミラー１２５、オートフォーカス用対物レンズ１２６、オートフォーカス用リレーレンズ１２７、第２瞳制限マスク１２８、オートフォーカス用リレーレンズ１２７、シリンドリカルレンズ１２９、及び光電変換器（オートフォーカス用ＣＣＤセンサ）１３０が配設されている。ハーフミラー１２５で反射された赤外光Ｌｄは、オートフォーカス用対物レンズ１２６で集光されて結像光に変換されスリット像（光像）を結像する。オートフォーカス用リレーレンズ１２７，１２７は、オートフォーカス用対物レンズ１２６によって結像されたスリット像（赤外光Ｌｅ）をリレーし、シリンドリカルレンズ１２９を経て、光電変換器１３０の撮像面にスリット像（光像）を再結像する。
【００２５】
なお、第２瞳制限マスク１２８は、瞳の半分を遮光するように配設されており、遮光される領域は、上記に述べた第１瞳制限マスク１２４によって遮光される領域に対応している。また、シリンドリカルレンズ１２９は、所定方向のみに屈折作用を持つレンズであり、赤外光Ｌｅを図１において紙面に垂直方向（スリット像の長手方向）に圧縮して、光電変換器１３０の撮像面に結像させる作用をする。
【００２６】
光電変換器１３０は、例えば試料容器３の底部の上面３ａ（反射面）からの反射光（赤外光）を受光し、受光した光を電気信号に変換するラインＣＣＤセンサ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）である。光電変換器１３０は、電気信号を信号処理部１３１に出力する。信号処理部１３１は、光電変換器１３０からの電気信号に対して信号処理を施すことにより電気信号に応じた検出信号を生成し、生成した検出信号を制御部７１に出力する。
【００２７】
図１の例では、対物レンズ２１と界面検出部３０とは結合されている。ユニット駆動部３６は、制御部７１からの制御信号に基づいて、対物レンズ２１及び界面検出部３０をＺ方向に移動させる（つまり、上下移動させる）。なお、図１においては図示していないが、複数個の対物レンズを切り替えるレボルバは、対物レンズ２１と界面検出部３０との結合部分に設けられる。ただし、対物レンズ２１とレボルバと界面検出部３０の位置関係はこれ限定されるものではなく、第１光源１２０と光電変換器及びオフセットレンズ３２、レンズ駆動部３４をレボルバとは隔離して配置することも可能である。この場合、ダイクロイックミラー３３へ第１光源１２０からの光を導く光学系を設ける必要がある。また、このような配置にすることにより、例えば焦点調節のために対物レンズ２１を保持したレボルバをＺ方向に移動させる場合、第１光源１２０と光電変換器及びオフセットレンズ３２、レンズ駆動部３４は、レボルバとは別体として配置されるので、レボルバの上下動速度に悪影響を及ぼすことが避けられる。
【００２８】
第２光源４０は、試料２の例えば蛍光観察を行うための励起照明光を照射するＬＥＤである。照明光学系５０は、コリメータレンズ５１及びダイクロイックミラー５２を含んでいる。コリメータレンズ５１は、第２光源４０から照射された照明光を平行光束又は略平行光束に変換する。ダイクロイックミラー５２は、照明光を反射し、蛍光を透過する。このダイクロイックミラー５２は、結像光学系２０の光路上に配置されている。このダイクロイックミラー５２は、コリメータレンズ５１を通過した照明光（平行光束又は略平行光束）の一部を反射して対物レンズ２１に導く。また、このダイクロイックミラー５２は、試料２からの信号光（例えば、照明光により励起された蛍光）を透過して結像レンズ２２に導く。図１示す結像光学系２０及び照明光学系５０において、実線は、第２光源４０から放出された光の光路を示している。
【００２９】
ここで、第２光源４０から照射された照明光が撮像部６０で受光されるまでの過程を説明する。第２光源４０から照射された照明光は、コリメータレンズ５１で平行光束又は略平行光束に変換される。コリメータレンズ５１で平行光束又は略平行光束に変換された照明光は、ダイクロイックミラー５２でＺ方向に反射される。そして、ダイクロイックミラー５２で反射された蛍光は、赤外光カットフィルタ１４１で赤外光成分が除去された後、ダイクロイックミラー３３を透過して対物レンズ２１に導かれる。対物レンズ２１は、照明光を集光させて試料容器３内の試料２に照射する。上述したように、図１においては、対物レンズ２１の焦点位置Ｆは試料面２ａの位置となっている。
【００３０】
試料２からの信号光は再び対物レンズ２１を通過し、対物レンズ２１を通過した信号光はダイクロイックミラー３３を透過する。ダイクロイックミラー３３を透過した信号光の一部は、赤外光カットフィルタ１４１で赤外光成分が除去された後、ダイクロイックミラー５２を透過して結像レンズ２２に導かれる。結像レンズ２２は、信号光を撮像部６０の受光面（撮像面）に結像させる。なお、赤外光カットフィルタ１４１は、上述のように赤外光成分を除去するものでも良いが、例えば、第１光源１２０から出射される赤外光（近赤外光）の波長帯のみを反射し、それよりも短い波長を透過し、かつ、それよりも長い波長も透過する特性を有するものでも良い。
【００３１】
撮像部６０は、ＸＹステージ１０上の試料２の画像を取得する。この撮像部６０は、例えば受光した信号光を電気信号（画素ごとの画像信号）に変換するＣＣＤセンサで構成される。この撮像部６０は、変換した電気信号を信号処理部６１に出力する。信号処理部６１は、撮像部６０から出力された電気信号に対して信号処理を施すことで画像データを生成する。そして、信号処理部６１は、生成した画像データを制御部７１に出力する。
【００３２】
制御部７１は、顕微鏡装置１の制御全般を司る処理部である。この制御部７１は、記憶部７３に記憶されている制御プログラムに基づいて各種の制御及び処理を実行する。この制御部７１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などの演算装置を備えている。入力部７２は、使用者による操作部（図示を省略）の操作に応じてオフセット値ＯＳの情報を含む各種情報を入力する。記憶部７３は、試料２の画像データ、撮影条件（例えば、後述する撮影Ｚ間隔、層数、撮影ｐａｓｓ数上限、撮影時間間隔、撮影領域の下限及び上限における対物レンズ２１及びオフセットレンズ３２の位置）などを記憶する。また、記憶部７３は、制御部７１に各種の制御及び処理を実行させるための制御プログラムも記憶する。
【００３３】
図２は、図１に示す顕微鏡装置１の制御系の構成を示すブロック図である。なお、図２に示す構成において、図１に示した構成と同一構成については同一符号を付して重複する説明を省略する。
【００３４】
制御部７１は、ステージ駆動部１１に対して制御信号を出力してステージ駆動部１１を駆動させることにより、撮像対象の試料２（試料容器３）が対物レンズ２１の対向位置となるようにＸＹステージ１０をＸＹ方向に移動させる。また、制御部７１は、信号処理部１３１からの検出信号に基づいて反射像を検出し、検出した反射像に基づいて反射面３ａの位置を認識する。そして、制御部７１は、認識した反射面３ａの位置からＺ方向に一定距離（オフセット値ＯＳ）離れた位置に焦点位置Ｆを維持する焦点維持制御を実行する。このとき、制御部７１は、所定の位置に焦点位置Ｆを維持するために、レンズ駆動部３４
に対しては、制御信号を出力してレンズ駆動部３４は一定位置に保ち、ユニット駆動部３６に対しては、界面検出部３０の信号処理部１３１が生成する検出信号に基づく制御信号を出力して、ユニット駆動部３６を駆動させる。この場合、オフセットレンズ３２の第２光軸Ｏ２方向の位置は一定位置に固定され、対物レンズ２１及び界面検出部３０の第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）の位置は反射面３ａ（界面）の位置の変化に合わせて上下移動される。
【００３５】
また、制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置を焦点維持制御が実行されている位置から第１光軸Ｏ１方向に所定間隔（例えば図３に示すオフセット値ＯＳであって撮影Ｚ間隔という。）離れた位置に移行（移動）させる移行制御（移動制御）を実行する。このとき、制御部７１は、焦点位置Ｆを変更するために、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力してレンズ駆動部３４を駆動させるとともに、ユニット駆動部３６に対して界面検出部３０の信号処理部１３１が生成する検出信号に基づく制御信号を出力して、ユニット駆動部３６を駆動させる。この場合、オフセットレンズ３２の第２光軸Ｏ２方向の位置は、対物レンズ２１の焦点位置の第１光軸Ｏ１方向への移動量（撮影Ｚ間隔）に対応する移動量だけ離れた位置となる。また、対物レンズ２１及び界面検出部３０の第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）の位置は、オフセットレンズ３２の移動に伴う反射面３ａ（界面）の位置の変化に合わせて撮影Ｚ間隔分だけ移動される。
【００３６】
また、制御部７１は、試料２における複数の位置において撮像部６０に撮像させて、複数枚の画像を取得する撮像制御を実行する。
【００３７】
なお、ＸＹステージ１０、結像光学系２０（対物レンズ２１、結像レンズ２２）、界面検出部３０、撮像部６０、信号処理部６１、駆動部１１，３４，３６、制御部７１などで構成される装置を、顕微鏡装置１における焦点調節装置という。
【００３８】
次に、オフセットレンズ３２の作用について説明する。図３は、オフセットレンズを移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）はオフセットレンズを移動したときの状態を表す図であり、（ｃ）は焦点位置が調節された状態を表す図である。
【００３９】
なお、図３においては、オフセットレンズ３２の作用の説明に必要な構成についてだけ示している。すなわち、図３においてはダイクロイックミラー３３を省略している。また、図３においては、オフセットレンズ３２は凸レンズ３２ａと凹レンズ３２ｂとで構成されている。また、図１においてはコレクタレンズを示していなかったが、フォーカス光学系３０Ａはコレクタレンズを備え、そのコレクタレンズによって第１光源１２０からの赤外光が平行光束又は略平行光束に変換されるものとする。また、図３において、赤外光を点線で示し、照明光及び信号光を実線で示している。
【００４０】
オフセットレンズ３２は、第２光軸Ｏ２方向に移動することにより、対物レンズ２１を介して反射面３ａに照射される赤外光に基づく光像の結像位置ＡをＺ方向に移動させる働きをする。このように、光像の結像位置Ａが移動することにより、反射面３ａで反射される光像の反射像の結像位置も第２光軸Ｏ２方向に移動される。
【００４１】
図３（ａ）では、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが反射面３ａに位置し、かつ、対物レンズ２１の焦点位置Ｆも反射面３ａに位置するように、凹レンズ３２ｂの第２光軸Ｏ２方向の位置と、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）のＺ方向（第１光軸Ｏ１方向）の位置とが調節されている。なお、対物レンズ２１の同焦点距離は一定距離であり、対物レンズ２１の焦点位置も対物レンズ２１の胴付き面から一定距離の位置となっている。この状態がオフセット値ＯＳが０の状態である。
【００４２】
図３（ｂ）では、凹レンズ３２ｂが第２光軸Ｏ２方向の第１光源１２０側へ距離ｘだけ移動することにより、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが対物レンズ２１に近づくように反射面３ａの位置からＺ方向に移動する。この状態では、結像位置Ａと、反射面３ａの位置にある焦点位置Ｆとがずれている。
【００４３】
図３（ｃ）では、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）がＺ方向の試料２側へ移動することにより、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが反射面３ａの位置に移動し、対物レンズ２１の焦点位置Ｆも同じ距離だけＺ方向に移動する。図３（ｃ）では相対的に試料がＺ方向に移動（試料２を載置したステージをＺ方向に移動）しているように示してある。この状態では、結像位置Ａが反射面３ａに位置し、かつ、結像位置Ａと焦点位置Ｆとがずれている。結像位置Ａと焦点位置Ｆとのずれ量（結像位置Ａから焦点位置Ｆまでの距離）がオフセット値ＯＳである。
【００４４】
このように、制御部７１は、オフセットレンズ３２（凹レンズ３２ｂ）を第２光軸Ｏ２方向に移動させることによりオフセット値ＯＳを調節することができる。また、制御部７１は、結像位置Ａが反射面３ａの位置となるように対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させることにより、常に反射面３ａから一定距離（一定量）だけＺ方向に離れた位置（試料２の内部）に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを合わせることができる。
【００４５】
次に、Ｚスタック撮影について説明する。図４は、Ｚスタック撮影を行う際の撮影位置を示す図である。また、図５は、Ｚスタック撮影における撮影位置の変化と時間との関係を示す図である。Ｚスタック撮影とは、対物レンズ２１（対物レンズ２１の焦点位置）を対物レンズ２１の光軸である第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）に所定間隔ごとに移動させつつ、所定間隔ごとの各位置において試料の撮影を行うことをいう。Ｚスタック撮影のことをＺ方向スライス撮影や断層撮影ともいう。
【００４６】
図４及び図５に示すように、Ｚスタック撮影は、試料容器３内の試料２の中心部分（例えば細胞の核の部分）を撮影領域（第１光軸Ｏ１方向の領域）とし、撮影領域の下限から上限までの間における撮影Ｚ間隔ごとの各位置（各撮影位置）を対物レンズ２１の焦点位置として撮影（撮像）を行う。図４及び図５では、４つの位置で撮影を行う例を示しているが、４つ未満の位置であっても、５つ以上の位置であってもよい。
【００４７】
また、図４及び図５に示す例では、試料容器３と試料２とが接触している面である底部を界面とし、この界面を基準面としている。そして、基準面から第１光軸Ｏ１方向に一定距離の位置を撮影領域の下限としている。この撮影領域の下限の撮影位置を第１層という。第１層から撮影Ｚ間隔だけ第１光軸Ｏ１方向に離れた撮影位置を第２層という。第２層から撮影Ｚ間隔だけ第１光軸Ｏ１方向に離れた撮影位置を第３層という。第２層から撮影Ｚ間隔だけ第１光軸Ｏ１方向に離れた撮影位置を第４層という。この第４層が撮影領域の上限である。図５は、タイムラプス観察の例である。図５に示すように、対物レンズ２１の焦点位置が各層に位置しているときに撮影（撮像）が行われる。各層において１回だけ撮像が行われる場合と複数回撮像が行われる場合とがある。
【００４８】
撮影領域の下限から上限までの各層における一連の撮影動作を撮影ｐａｓｓという。１回の撮影ｐａｓｓで各層における複数の画像が取得される。本実施形態では、図５に示すように、試料２に対して複数回の撮影ｐａｓｓの動作が実行される。１つの撮影ｐａｓｓの動作が終了してから次の撮影ｐａｓｓの動作が開始されるまでに所定の時間間隔が設けられる。この時間間隔を撮影時間間隔という。
【００４９】
次に、本発明の概要について説明する。図６は、試料ドリフトにより所望の撮影位置と対物レンズ２１の焦点位置とのずれが生じた状態（従来法での状態）を示す図である。試料２のＺ方向の撮影領域の上限は観察者が予め設定するが、図６では、例えば図６中の試料２の二重楕円部の内側の楕円部の最頂部である、界面からＺ方向に最も離れた位置（例えば細胞核の外郭部であって、界面からＺ方向に最も離れた位置）を上限と設定している。この上限が第４層となる。図６に示すように、試料２（試料２を収容した試料容器３）の位置は、周囲の温度変化や振動などによって時間の経過とともに徐々に変化する。例えば、周囲の温度変化などによりＸＹステージ１０などが第１光軸Ｏ１の方向（Ｚ方向）に伸び縮みすることで、試料２（試料容器３）のＺ方向の位置が変化する。このような現象をドリフト（試料ドリフト）という。図６に示す例では、試料２（試料容器３）が温度変化などによって徐々に下がっている（ステージ下部の対物レンズ２１側に近づく）。このように試料２のドリフトが生じると、対物レンズ２１と試料２との距離が時間の経過とともに変化する。
【００５０】
従来、Ｚスタック画像を取得する場合、観察者は撮影ｐａｓｓを開始する前にまず基準面（例えば界面の位置）を決定し、次に基準面からＺ方向に離れた観察位置の決定を行う。そして基準面とＺ方向の観察位置の距離を予め記憶する。Ｚ方向の観察位置が複数ある場合は、基準面から異なる複数のＺ位置を記憶する。
【００５１】
次に、撮影ｐａｓｓのタイミングになった際、従来では、図６の撮影ｐａｓｓ１のステップになり第１層から第４層の各層を撮影する場合、最初の層（例えば第１層）を観察するときのみ基準面である界面に対物レンズ２１の焦点合わせを実行し、この基準位置を撮影ｐａｓｓ１での新たな基準面とする。そして、第１層から第４層の観察では、この新たな基準面を基に、予め記憶された各層の観察位置であるＺ位置を読み出し、対物レンズ２１のＺ方向の位置を変えることで各層の観察を行う。
【００５２】
図６の撮影ｐａｓｓ１内における撮影領域の上限である第４層に着目すると、観察者が予め定めた第４層のＺ方向の位置は、上記のように試料２の二重楕円部の内側の楕円部の最頂部である、界面からＺ方向に最も離れた位置であるが、観察を実行する際の第４層のＺ方向の位置（図６の撮影ｐａｓｓ１における右側の状態）は、試料２の二重楕円部の外側の楕円部の最頂部である、界面からＺ方向に最も離れた位置となっている。この位置は、予め定めた上限の位置である第４層の位置とはずれが生じた状態になっている。これは、撮影ｐａｓｓ１内においてもドリフトにより試料２が下ってしまい、第４層の撮影を実行するタイミングでは、撮影ｐａｓｓ１の開始時とは基準面のＺ方向の位置が変わってしまうことに起因する。この場合、使用者が予め決定した試料２における所望の撮影位置の画像を取得することができなくなる。
【００５３】
上記のように、図６に示す例では、撮影ｐａｓｓの動作開始前に基準面（界面）を検出し、基準面を検出した後、Ｚスタック撮影における各層の撮影を行うことで試料２のドリフトの影響を低減しようとしているが、試料２のドリフトによって試料２が時間の経過とともに下がっていくと、撮影ｐａｓｓの動作中に対物レンズ２１と試料２との距離が短くなり、対物レンズ２１の焦点位置が本来撮影したかった試料２における撮影位置の上方にずれてしまう。また、Ｚスタック撮影における各層の撮影を行う場合、撮影領域の下限から上限までの各層の撮影を行っている間にドリフトの影響が大きくなり、対物レンズ２１の焦点位置が本来撮影したかった試料２における撮影位置とのずれも大きくなる。この場合、図６に示す例では、このずれは撮影領域の上限に近づく程大きくなる。従来では、撮影ｐａｓｓ２においても撮影ｐａｓｓ１と同様の制御を行う。従って、撮影ｐａｓｓ２の開始に際し、基準面のＺ方向の位置を新たに決定し直すことから撮影ｐａｓｓ１で基準面を決定した以降のドリフトの影響は解消されるが、撮影ｐａｓｓ２内で生じるドリフトの影響は解消されない。
【００５４】
また、各層において複数回の撮像を行うことで複数枚の画像を取得する場合、複数回の撮像を行う間に発生するドリフトの影響により、１つの層において取得した複数枚の画像の撮影位置が画像ごとにずれてしまう。各層において複数回の撮像を行う場合としては、各層において励起波長を変えて複数回の撮像を行う場合や、各層において複数回の撮像で取得した複数枚の画像から超解像の画像を構築する場合などである。また、ＸＹステージ１０を移動させてから撮影を開始するまでの間に発生するドリフトの影響により、対物レンズ２１の焦点位置が本来撮影したかった撮影位置からずれてしまう。
【００５５】
図７は、本発明に関わる図であり、試料ドリフトに追従して対物レンズ２１の焦点位置を所望の撮影位置に合わせた状態を示す図である。図７に示すように、本発明の制御装置は、ドリフトの影響による試料２の位置（試料２を収容した試料容器３）の変化に追従して、常に基準面（界面）から一定距離だけＺ方向に離れた位置（撮影位置）に対物レンズ２１の焦点位置を維持する（例えば、撮影ｐａｓｓの実行期間中、界面検出部３０がオン状態）。図７に示す例では、試料２（つまり基準面）が徐々に下がっていくようにドリフトしている。このドリフトの影響による基準面からの反射光の変化を界面検出部３０の光電変換器１３０は受光し、信号処理部１３１は、光電変換器１３０からの電気信号に対して信号処理を施すことにより電気信号に応じた検出信号を生成する。制御部７１は、信号処理部１３１が生成した検出信号の変化に基づき、ユニット駆動部３６により対物レンズ２１の焦点位置を徐々に下げていく。このとき、基準面から対物レンズ２１の焦点位置までの距離（つまりオフセット値ＯＳ）は一定である。そして、撮影位置を上の層に移行する場合（つまり、撮影位置を第１層から第２層、第２層から第３層、第３層から第４層に移行する場合）、制御部７１は、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力してレンズ駆動部３４を駆動させるとともに、ユニット駆動部３６に対して界面検出部３０の信号処理部１３１が生成する検出信号に基づく制御信号を出力してユニット駆動部３６を駆動させることで、対物レンズ２１の焦点位置を現在の位置（試料２のドリフトに追従して対物レンズ２１の焦点位置を変化させている位置）から撮影Ｚ間隔だけＺ方向上方に移動させる。
【００５６】
このように、本発明では、Ｚスタック画像を取得する際、撮影ｐａｓｓ内においてＺ方向に観察位置を変更する際、その都度、基準面を決定する。従って、撮影ｐａｓｓ内において試料２のドリフトが発生した場合でも、常にドリフトの影響による試料２のＺ方向の位置変化に合わせて対物レンズ２１の焦点位置を変化させているので、対物レンズ２１の焦点位置と所望の撮影位置とのずれを撮影ｐａｓｓ内においても回避することができる。本発明では、撮影ｐａｓｓ内において試料２のＺ方向の位置変化に合わせて対物レンズ２１の焦点位置を変化させる制御を継続して実行しても良いが、このような制御は、少なくとも撮影ｐａｓｓ内のＺ方向の所定の層を観察する際の直前に制御を開始していればよい。例えば、第１層の観察時期と第２層の観察時期の時間間隔が長い場合は、第１層の観察後、対物レンズ２１の焦点位置を変化させる制御は一旦オフとし、第２層の観察時期の直前に上記制御をオンとしてもよい。また、この場合、上記制御は上記直前でなくてもよく、第２層の観察時期が予め設定される場合であれば、この設定された観察時期の所定の比較的長い時間前でもよい。この場合、焦点位置を変える制御の動作時間を鑑みて、上記制御を実行することで予め定めた第２層の観察時期への影響を防止することができる。
【００５７】
更に、本発明では、撮影ｐａｓｓ内においてＺ方向に観察位置を変更する際、その都度、基準面を決定し、対物レンズの焦点位置を変更する制御が実行されるが、例えば露光時間等の撮影条件や、ドリフトの速度の大きさ（試料２の単位時間当たりのＺ方向の変化量）によっては、撮影動作中は焦点維持制御をオフにしてもよい。これにより、撮影中の対物レンズのＺ方向の位置は、撮影動作前に決められた位置で固定された状態で撮影動作が実行されるので撮影動作中に対物レンズのＺ方向の移動がなされることがない。そして、撮影動作が終了したことを検知したら焦点維持制御を再度オンとしてもよい。この制御は、例えば予め設定される露光時間に対応し、撮影動作中の焦点維持制御のオン、オフが自動的に切り替えられるようにしてもよい。
【００５８】
なお、顕微鏡装置において様々な実験条件における試料２の画像を取得し、取得した画像を解析する。これにより、試料２の反応の分析が行われる。この場合、一つの試料容器３内のウェルの数は少ないものでは６個程であるが、多いものでは１０００個以上になる。従って、顕微鏡装置は多数の画像を取得する必要がある。また、顕微鏡装置が一つのウェルに対して複数の異なる視野の画像を取得する場合がある。また、顕微鏡装置が同じ視野であっても複数の波長チャネルの画像を取得する場合もある。このため、顕微鏡装置は１回に数万枚の画像を取得しなければならない事態も生じ得る。
【００５９】
このような場合、短時間に画像を取得することが重要となる。特に、細胞等を生きたまま観察する必要がある場合には、撮影中に試料２の状態が変化してしまう。従って、同一の実験条件で画像を取得するためには、すべての画像の取得時間を短縮する必要がある。また、高画質の画像を取得することも重要となる。高画質の画像を取得するためには、適正な焦点位置で試料２の撮像を行う必要がある。
【００６０】
次に、上記した顕微鏡装置１の動作について説明する。
【００６１】
図８は、Ｚスタック撮影を行う前の前処理の手順を示すフローチャートである。図８に示す処理において、使用者は、観察対象の試料２（標本）をＸＹステージ１０上に載置する（ステップＳ１）。そして、使用者は、操作部を操作することで、顕微鏡装置１を試料２の観察に適した状態に設定する（ステップＳ２）。例えば、使用者は、光源４０の照明光の明るさを試料２の観察に適した明るさに設定することなどを行う。
【００６２】
次に、使用者は、顕微鏡装置１を覗いて像を観察しながら、対物レンズ２１を光軸Ｏ１方向に移動させ観察対象の試料２を撮影する撮影領域下限を決定する。そして、使用者は、操作部を操作して、上記決定した撮影領域下限における対物レンズ２１及びオフセットレンズ３２の位置の情報を記憶部７３に記憶する（ステップＳ３）。同様に、使用者は、顕微鏡装置１を覗いて像を観察しながら、観察対象の試料２を撮影する撮影領域上限を決定する。そして、使用者は、操作部を操作して、上記決定した撮影領域上限における対物レンズ２１及びオフセットレンズ３２の位置の情報を記憶部７３に記憶する（ステップＳ４）。
【００６３】
使用者は、操作部を操作して撮影ｐａｓｓ数の上限の情報を設定する（ステップＳ５）。また、使用者は、操作部を操作して撮影Ｚ間隔及び撮影時間間隔の情報を設定する（ステップＳ６）。そして、制御部７１は、ステップＳ３，Ｓ４，Ｓ６で設定された撮影領域下限、撮影領域上限、及び撮影Ｚ間隔の情報に基づいて、撮影領域における層数を決定する（ステップＳ７）。ここで、撮影領域上限から撮影領域下限を引いた値が撮影Ｚ間隔で割り切れない場合は、使用者によって決定された撮影領域上限を超えた位置（撮影領域上限よりも上方の位置）であって撮影Ｚ間隔の倍数の位置を撮影領域上限としてもよい。次に、使用者は、操作部を操作して、Ｚスタック撮影の開始指示を行う（ステップＳ８）。制御部７１は、Ｚスタック撮影の開始指示に応じて図９示すＺスタック撮影の処理を開始する。
【００６４】
なお、撮影Ｚ間隔、層数、撮影ｐａｓｓ数上限、撮影時間間隔、撮影領域下限、及び撮影領域上限を撮影条件という。なお、層数の決定方法は、ステップＳ７で説明した方法に限定されない。例えば、制御部７１は、撮影領域の中心位置から撮影領域下限までの距離に基づいて撮影領域の下半分の層数を決定し、撮影領域の中心位置から撮影領域上限までの距離に基づいて撮影領域の上半分の層数を決定してもよい。また、制御部７１は、撮影領域下限及び撮影領域上限と、層数から撮影Ｚ間隔を決定してもよい。
【００６５】
図９は、第１実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。なお、Ｚスタック撮影を開始する前は、界面検出部３０はオフ状態であるものとする。図９に示す処理において、制御部７１は、Ｚスタック撮影の開始指示を受けると、まず、界面検出部３０がオン状態であるか否かを確認し（ステップＳ１１）、界面検出部３０がオン状態でない場合（つまりオフ状態である場合）は（ステップＳ１１のＮＯ）、界面検出部３０をオン状態に設定する（ステップＳ１２）。
【００６６】
界面検出部３０がオン状態になると、ステップＳ１３以降の処理（ステップＳ１３〜Ｓ２０）の実行中、界面検出部３０が基準面（反射面３ａ）を検出し、検出した基準面（反射面３ａ）の位置に応じた検出信号を制御部７１に出力する。そして、ステップＳ１３以降の処理（ステップＳ１３〜Ｓ２０）の実行中、制御部７１は、焦点維持制御を実行する。すなわち、制御部７１は、信号処理部１３１からの検出信号に基づいて基準面（反射面３ａ）の位置を認識し、認識した基準面の位置に応じた制御信号をユニット駆動部３６に出力することで、光像（スリット像）の結像位置Ａが基準面の位置となるように対物レンズ２１及び界面検出部３０の位置に移動させる（図３（ｃ）参照）。
【００６７】
次に、制御部７１は、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の焦点位置を撮影領域下限の位置（第１層の位置）に移動させる制御（移行制御）を実行する（ステップＳ１３）。このとき、制御部７１は、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力してレンズ駆動部３４を駆動させることにより、オフセットレンズ３２の第２光軸Ｏ２方向の位置を、対物レンズ２１の焦点位置の第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）への移動量（対物レンズ２１の初期位置から撮影領域下限の位置までの距離）に対応する量だけ移動させる。また、制御部７１は、ユニット駆動部３６に対して制御信号を出力してユニット駆動部３６を駆動させることにより、対物レンズ２１及び界面検出部３０の第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）の位置を、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて移動させる。これにより、対物レンズ２１の焦点位置が撮影領域下限の位置まで移動される。
【００６８】
次に、制御部７１は、撮像部６０に制御信号を出力することで、撮像部６０に撮像を実行させる（ステップＳ１４）。そして、制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮影領域上限に達したか否か判定する（ステップＳ１５）。制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮像領域上限に達していないと判定した場合（ステップＳ１５のＮＯ）、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の焦点位置（試料２のドリフトが生じている場合は、焦点維持制御によりドリフトに追従して対物レンズ２１の焦点位置を変化させている現在の位置）を撮影Ｚ間隔分だけ上方に移動させる制御（移行制御）を実行する（ステップＳ１６）。このとき、制御部７１は、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力してレンズ駆動部３４を駆動させることにより、オフセットレンズ３２の第２光軸Ｏ２方向の位置を、対物レンズ２１の焦点位置が撮影Ｚ間隔に対応する移動量だけ移動させる。また、制御部７１は、ユニット駆動部３６に対して制御信号を出力してユニット駆動部３６を駆動させることにより、対物レンズ２１及び界面検出部３０の第１光軸Ｏ１方向（Ｚ方向）の位置を、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて移動させる。これにより、対物レンズ２１の焦点位置が撮影Ｚ間隔だけ移動される。
【００６９】
制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮影領域上限に達したと判定した場合（ステップＳ１５のＹＥＳ）、撮影ｐａｓｓ数を１加算する（ステップＳ１７）。そして、制御部７１は、撮影ｐａｓｓ数が（撮影ｐａｓｓ数の上限＋１）の値であるか否か判定する（ステップＳ１８）。制御部７１は、撮影ｐａｓｓ数が（撮影ｐａｓｓ数の上限＋１）の値であると判定した場合（ステップＳ１８のＹＥＳ）、予め設定した撮影ｐａｓｓ数の撮影動作を実行したと認識して処理を終了する。
【００７０】
制御部７１は、撮影ｐａｓｓ数が（撮影ｐａｓｓ数の上限＋１）の値でないと判定した場合（ステップＳ１８のＮＯ）、予め設定した撮影ｐａｓｓ数の撮影動作を実行していないと認識して、ステップＳ１６において複数回実行されたことによる対物レンズ２１の総移動量（撮影Ｚ間隔×（層数−１））だけ対物レンズ２１の焦点位置を移動させる移行制御を行う（ステップＳ１９）。これにより、対物レンズ２１の焦点位置が撮影領域下限の位置に戻る。制御部７１は、ステップＳ１９の処理を実行してから予め設定された撮影時間間隔が経過したか否かを判定する（ステップＳ２０）。制御部７１は、撮影時間間隔が経過したと判定した場合（ステップＳ２０のＹＥＳ）、ステップＳ１４の処理に移行させる。これにより、次の撮影ｐａｓｓにおける撮影領域下限から撮影領域上限までの撮影動作が実行される。
【００７１】
図１０は、図９のステップＳ１３、Ｓ１６及びＳ１９の処理（移行制御処理）を示すフローチャートである。ステップＳ１３、ステップＳ１６及びステップＳ１９の処理（移行制御処理）が開始されると、図１０に示す対物レンズ２１の焦点位置を移行させる処理が行われる。図１０に示す処理において、制御部７１は、まず、フラグの値を０に設定する（ステップＳ２１）。そして、制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置の目標値を設定する（ステップＳ２２）。そして、制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置の現在値と目標値とを比較し、現在値と目標値の差ｄ（目標値の位置から現在値の位置を引いた値）を算出する（ステップＳ２３）。ここで、目標値としては、ステップＳ１３の処理中の場合は、対物レンズ２１の焦点位置の初期位置から撮影領域下限の位置までの距離であり、ステップＳ１６の処理中の場合、撮影Ｚ間隔の距離である。また、ステップＳ１９の処理中の場合、撮影領域上限の位置から撮影領域下限の位置までの距離である。
【００７２】
制御部７１は、現在値と目標値の差ｄが０であるか否か判定する（ステップＳ２４）。差ｄが０であると判定した場合（ステップＳ２４のＹＥＳ）、制御部７１は処理を終了する。一方、差ｄが０でないと判定した場合（ステップＳ２４のＮＯ）、差ｄが０より大きいか否か判定する（ステップＳ２５）。差ｄが０より大きいと判定した場合（ステップＳ２５のＹＥＳ）、フラグの値が１であるか否か判定し（ステップＳ２６）、フラグの値が１である場合は、規定量ｐ（ｎ）をｐ（ｎ−１）／ｍ（ただし、ｍは１より大きい値）に設定する（ステップＳ２７）。そして、制御部７１は、差ｄ（ｄ＞０）が０に近付く方向にオフセットレンズ３２を規定量ｐ（ｎ）移動させる（ステップＳ２８）。また、制御部７１は、フラグの値を２に設定し（ステップＳ２９）、ステップＳ２３の処理に移行させる。
【００７３】
一方、制御部７１は、ステップＳ２５において差ｄが０より小さいと判定した場合（ステップＳ２５のＮＯ）、フラグの値が２であるか否か判定し（ステップＳ３０）、フラグの値が２である場合は、規定量ｐ（ｎ）をｐ（ｎ−１）／ｍ（ただし、ｍは１より大きい値）に設定する（ステップＳ３１）。そして、制御部７１は、差ｄ（ｄ＜０）が０に近付く方向にオフセットレンズ３２を規定量ｐ（ｎ）移動させる（ステップＳ３２）。また、制御部７１は、フラグの値を１に設定し（ステップＳ３３）、ステップＳ２３の処理に移行させる。
【００７４】
図１１は、図１０の処理中の動作を示す図である。図１１において、横軸はオフセットレンズ３２の位置を示し、縦軸は対物レンズ２１の焦点位置を示す。図１１に示すように、オフセットレンズ３２の位置と対物レンズ２１の焦点位置の関係は線形ではない。
【００７５】
図１１に示す例では、最初、現在値と目標値の差ｄが０でなく（ステップＳ２４のＮＯ参照）、その差ｄが０より大きく（ステップＳ２５のＹＥＳ参照）、さらに、フラグの値が１ではなく０であるので（ステップＳ２６のＮＯ参照）、差分ｄ（ｄ＞０）が０に近付くような方向にオフセットレンズ３２が規定量ｐ１だけ移動される（ステップＳ２８参照）。そして、フラグの値が２に設定される（ステップＳ２９参照）。
【００７６】
このようなステップＳ２３からＳ２９の処理が繰り返し実行されることにより、オフセットレンズ３２の位置が目標値に対応する位置を超える。この場合、現在値と目標値の差ｄが０より小さいと判定され（ステップＳ２５のＮＯ参照）、フラグの値が２であるので（ステップＳ２９、Ｓ３０参照）、規定量ｐ２を規定量ｐ１／ｍの値に設定される（ステップＳ３１）。そして、差分ｄ（ｄ＜０）が０に近付くような方向にオフセットレンズ３２が規定量ｐ２だけ移動される（ステップＳ３２参照）。そして、フラグの値が１に設定される（ステップＳ３３参照）。
【００７７】
このようなステップＳ２３〜Ｓ２５及びステップＳ３０〜Ｓ３３の処理が繰り返し実行されることにより、オフセットレンズ３２の位置が目標値に対応する位置を超える。この場合、現在値と目標値の差ｄが０より大きいと判定され（ステップＳ２５のＹＥＳ参照）、フラグの値が１であるので（ステップＳ３３、Ｓ２６参照）、規定量ｐ３が規定量ｐ２／ｍの値に設定される（ステップＳ２７）。そして、差分ｄ（ｄ＞０）が０に近付くような方向にオフセットレンズ３２が規定量ｐ３だけ移動される（ステップＳ２８参照）。そして、フラグの値が２に設定される（ステップＳ２９参照）。
【００７８】
上記の処理を実行することで、対物レンズ２１の焦点位置が最終的に目標値に到達する。図１０及び図１１に示したように、第１実施形態では、制御部７１はオフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の位置を移動させる。
【００７９】
以上に説明したように、第１実施形態では、観察対象物（試料）２を収容する容器３にある界面の位置を検出する界面検出部３０と、観察対象物２の所定の第１位置に対物レンズ２１の焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を光軸Ｏ１方向に移動させることで、対物レンズ２１の焦点位置を焦点維持制御が実行されている第１位置から光軸Ｏ１方向に所定間隔の第２位置に移行させる移行制御を実行し、第１位置及び第２位置において撮像部６０に撮像させる撮像制御を実行する制御部７１と、を備える。このような構成によれば、ドリフトの影響を受けることなく所望の位置で画像を取得することができる。
【００８０】
また、第１実施形態では、制御部７１は、第１位置及び第２位置を含む所定間隔（撮影Ｚ間隔）ごとの複数の位置において焦点維持制御を実行し、複数の位置の各々への移行制御を実行し、複数の位置において撮像制御を実行するので、１つの観察対象物２に対して複数の位置で撮像することで複数枚の画像を取得するまでの時間がかかってしまう場合でも、例えば時間経過に伴う温度変化などのために発生するドリフトの影響を受けることなく複数の位置で複数枚の画像を取得することができる。また、本発明において、第１位置とは界面または界面から対物レンズ２１の光軸Ｏ１方向に所定の距離だけ離れた位置を称する。
【００８１】
また、第１実施形態では、界面検出部３０は、光源３１と、光源３１からの光に基づく光像を対物レンズ２１を介して界面上に結像させ、界面からの光像の反射光を対物レンズ２１を介して受光して光像の反射像を結像させるフォーカス用光学系３０Ａ，１０７と、フォーカス用光学系３０Ａ，１０７による反射像の結像位置に設けられ、反射像を検出する光電変換器１３０と、を含み、フォーカス用光学系３０Ａ，１０７は、該光学系の第２光軸Ｏ２方向に移動可能なレンズ３２を含み、制御部７１は、光電変換器１３０からの信号に基づき界面検出部３０に界面の検出を実行させつつレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に移動させることで界面と焦点位置との距離（オフセット値ＯＳ）を変更し、該距離の変更に連動させて対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を光軸Ｏ１方向に所定間隔移動させる。このような構成によれば、界面検出部３０で界面を検出しつつレンズ３２の移動に連動させて対物レンズ２１の焦点位置を所望の位置に移動させることができるので、ドリフトの影響を受けることなく対物レンズ２１の焦点位置を所望の位置に移動させることができる。
【００８２】
＜第２実施形態＞
上記した第１実施形態では、制御部７１がオフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の焦点位置を所望の位置に移動させていた。これに対して、第２実施形態では、制御部７１が対物レンズ２１の焦点位置を所望の位置に移動させてから、その焦点位置の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいてオフセットレンズ３２の位置を制御部７１が移動させる。なお、顕微鏡装置１の構成は図１で説明した構成と同様であるので、重複する説明を省略する。
【００８３】
図１２は、第２実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。図１２に示す処理において、ステップＳ１１、Ｓ１２の処理は図９に示した処理と同様であるので、説明を省略する。制御部７１は、ユニット駆動部３６に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の焦点位置を撮影領域下限の位置（第１層の位置）に移動させる（ステップＳ１３Ａ）。このとき、対物レンズ２１の移動に伴って光像の結像位置Ａと基準面の位置とがずれてしまう。そこで、制御部７１は、レンズ駆動部３４に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の移動によって生じた光像の結像位置Ａと基準面の位置とのずれがなくなるようにオフセットレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に所定量移動させる（ステップＳ１３Ｂ）。
【００８４】
ステップＳ１３Ａ，Ｓ１３Ｂの処理中における対物レンズ２１及びオフセットレンズ３２の移動を図１３に基づいて説明する。図１３は、対物レンズ２１を移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）は対物レンズの焦点位置を撮影領域下限の位置に移動させた状態を表す図であり、（ｃ）は光像の結像位置が基準面となるようにオフセットレンズを移動させた状態を表す図である。図１３（ａ）は、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが反射面３ａ（基準面）に位置し、かつ、対物レンズ２１の焦点位置Ｆも反射面３ａに位置している。このとき、界面（基準面）において、オフセット値ＯＳが０の状態で、界面検出部３０がオン状態となっている。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）の状態から対物レンズ２１の焦点位置を撮影領域下限の位置（第１層の位置）に移動させた状態に移行している（ステップＳ１３Ａ参照）。このとき、対物レンズ２１の移動に伴って光像の結像位置Ａと反射面３ａ（基準面、界面）がずれてしまう。図１３（ｃ）は、対物レンズ２１の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて、制御部７１がレンズ駆動部３４に制御信号を出力することによりオフセットレンズ３２の位置を移動させ、光像の結像位置Ａと反射面３ａ（基準面）との位置のずれがなくなった状態を示している。
【００８５】
ステップＳ１４、Ｓ１５の処理は図９に示した処理と同様であるので、説明を省略する。制御部７１は、ユニット駆動部３６に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の焦点位置（試料２のドリフトが生じている場合は、焦点維持制御によりドリフトに追従して対物レンズ２１の焦点位置を変化させている現在の位置）を撮影Ｚ間隔だけ移動させる（ステップＳ１６Ａ）。このときも、対物レンズ２１の移動による光像の結像位置Ａと基準面の位置のずれに伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて、制御部７１はレンズ駆動部３４に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の移動によって生じた光像の結像位置Ａと基準面の位置とのずれがなくなるようにオフセットレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に移動させる（ステップＳ１６Ｂ）。
【００８６】
ステップＳ１７、Ｓ１８の処理は図９に示した処理と同様であるので、説明を省略する。制御部７１は、ユニット駆動部３６に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の焦点位置を（撮影Ｚ間隔×（層数−１）だけ移動させる（ステップＳ１９Ａ）。このときも、対物レンズ２１の移動による光像の結像位置Ａと基準面の位置のずれに伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて、制御部７１はレンズ駆動部３４に制御信号を出力することにより、対物レンズ２１の移動によって生じた光像の結像位置Ａと基準面の位置とのずれがなくなるようにオフセットレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に移動させる（ステップＳ１９Ｂ）。
【００８７】
以上のように、第２実施形態では、制御部７１は、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を光軸Ｏ１方向に所定間隔移動させ、該所定間隔の移動に合わせて界面検出部３０が光電変換器１３０からの信号に基づき界面を検出する位置にレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に移動させるので、対物レンズ２１を所定間隔だけ直接移動させることとなり、焦点位置の層間の移動を高速に行うことができる。
【００８８】
＜第３実施形態＞
第３実施形態では、１回目の撮影ｐａｓｓにおいて移行制御を実行した際のオフセットレンズ３２の位置を記憶しておき、２回目以降の撮影ｐａｓｓにおいて記憶したオフセットレンズ３２の位置を使用して移行制御を行う。
【００８９】
図１４及び図１５は、第３実施形態に係るＺスタック撮影の処理を示すフローチャートである。図１４及び図１５に示す処理において、ステップＳ４１〜Ｓ４３の処理は図９のステップＳ１１〜Ｓ１３の処理と同様であるため、説明を省略する。制御部７１は、ステップＳ４３で移動させた際のオフセットレンズ３２の位置を記憶する（ステップＳ４４）。ステップＳ４５〜Ｓ４７の処理は図９のステップＳ１４〜Ｓ１６の処理と同様であるため、説明を省略する。制御部７１は、ステップＳ４７で移動させた際のオフセットレンズ３２の位置を記憶する（ステップＳ４８）。
【００９０】
ステップＳ４９、Ｓ５０の処理は図９のステップＳ１７、Ｓ１８の処理と同様であるため、説明を省略する。制御部７１は、オフセットレンズ３２の位置をステップＳ４４で記憶した位置に移動させ、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の焦点位置を第１層の位置（撮影領域下限の位置）へ移動させる（ステップＳ５１）。そして、制御部７１は、撮影時間間隔が経過したか否か判定し（ステップＳ５２）、撮影時間間隔が経過したと判定した場合（ステップＳ５２のＹＥＳ）、撮像部６０に制御信号を出力することで、撮像部６０に撮像を実行させる（ステップＳ５３）。次に、制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮影領域上限に達したか否か判定する（ステップＳ５４）。制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮像領域上限に達していないと判定した場合（ステップＳ５４のＮＯ）、オフセットレンズ３２の位置をステップＳ４８で記憶した位置に移動させ、オフセットレンズ３２の移動に伴う信号処理部１３１からの検出信号の変化に基づいて対物レンズ２１の焦点位置を次の層の位置へ移動させる（ステップＳ５５）。このようなステップＳ５３〜Ｓ５５の処理を撮影領域上限に達するまで繰り返し実行する。制御部７１は、対物レンズ２１の焦点位置が撮像領域上限に達したと判定した場合（ステップＳ５４のＹＥＳ）、ステップＳ４９の処理に移行させる（ステップＳ５４のＹＥＳ）。
【００９１】
以上のように、第３実施形態では、制御部７１は、１回目の撮影ｐａｓｓで記憶したオフセットレンズ３２の位置に基づいて２回目以降の撮影ｐａｓｓにおける移行制御を実行するので、対物レンズ２１の焦点位置を探す手間が省け、より高速に焦点位置の移動を行うことができる。また、記憶したオフセットレンズ３２の位置に復帰することで精度よくオフセットレンズ３２を移動させることができる。
【００９２】
また、制御部７１は、撮影領域下限、撮影領域上限、及び撮影Ｚ間隔の撮影条件から、各層におけるオフセットレンズ３２の位置を線形補間等により算出して記憶部７３に記憶しても良い。この場合、Ｓ４３、Ｓ４７におけるオフセットレンズ３２の移動には記憶部７３に記憶した位置を適用する。また、この場合、Ｓ４４、Ｓ４８におけるオフセットレンズ位置の記憶を行う必要が無い。このようにすることで、１回目の撮影ｐａｓｓから記憶したオフセットレンズ３２の位置に基づいて移行制御を実行するので、対物レンズ２１の焦点位置を捜す手間が省け、さらに高速にＺスタック撮影を行う事が出来る。
【００９３】
＜第４実施形態＞
上記した第３実施形態では、図９に示した第１実施形態の処理において、１回目の撮影ｐａｓｓの移行制御の後に記憶したオフセットレンズ３２の位置を使用して、２回目以降の撮影ｐａｓｓの移行制御を実行していた（図１４及び図１５参照）。しかし、図１２に示した第２実施形態の処理においても、１回目の撮影ｐａｓｓの移行制御の後に記憶したオフセットレンズ３２の位置を使用して、２回目以降の撮影ｐａｓｓの移行制御を実行してもよい。この場合、制御部７１は、図１２のステップＳ１３Ｂの処理の実行後に図１４のステップＳ４４の処理（オフセットレンズ３２の位置の記憶）を行い、図１２のステップＳ１６Ｂの処理の実行後に図１４のステップＳ４８の処理（オフセットレンズ３２の位置の記憶）を行う。そして、制御部７１は、図１２のステップＳ１８のＮＯの場合（すなわち撮影ｐａｓｓ数が（上限＋１）でない場合）、図１５のステップＳ５１〜Ｓ５５の処理を実行する。このような構成によっても、１回目の撮影ｐａｓｓで記憶したオフセットレンズ３２の位置に基づいて２回目以降の撮影ｐａｓｓにおける移行制御を実行するので、対物レンズ２１の焦点位置を探す手間が省け、より高速に焦点位置の移動を行うことができる。また、記憶したオフセットレンズ３２の位置に復帰することで精度よくオフセットレンズ３２を移動させることができる。
【００９４】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は、上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能である。また、上記の実施の形態で説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。そのような変更または改良、省略した形態も本発明の技術的範囲に含まれる。また、上記した実施の形態や変形例の構成を適宜組み合わせて適用することも可能である。
【００９５】
図１に示した光学顕微鏡は倒立型顕微鏡であったが、このような顕微鏡に限定されず、上記した実施の形態や変形例の構成は正立型顕微鏡などにも適用することが可能である。また、図１に示した光学顕微鏡の照明装置として反射式照明を利用していたが、透過式照明を利用してもよい。
【００９６】
また、試料２を収容する容器は試料容器３を用いていたが、このような構成に限らず、例えば試料２をカバーガラスとスライドガラスとで挟み込む構成でもよい。また、界面３ａは試料容器３の底部の底面としていたが、赤外光の反射が強ければ試料容器３の底部の上面であってもよい。
【００９７】
また、光電変換器１３０はラインＣＣＤセンサを用いていたが、ラインＣＭＯＳセンサ（ＣＭＯＳ：Complementary Metal Oxide Semiconductor：相補性金属酸化膜半導体）を用いてもよい。
【００９８】
また、オフセットレンズ３２は、凹レンズ３２ｂを第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更するように構成していたが、凸レンズ３２ａを第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更してもよく、また凸レンズ３２ａ及び凹レンズ３２ｂの両方を第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更してもよい。
【００９９】
また、焦点調節装置のすべての構成が顕微鏡装置１に設けられていない構成でもよい。例えば、制御部７１、入力部７２、記憶部７３などの構成が顕微鏡装置１とは別のコンピュータなどの装置に設けられてもよい。また、顕微鏡装置１は画像解析装置や画像解析用の制御プログラムを備えたコンピュータなどと接続されてもよい。また、制御部７１に制御・処理を実行させる制御プログラムは記憶部７３に記憶されていたが、制御プログラムは記憶媒体に記憶させてもよい。
【０１００】
また、撮像部６０によって１回に撮像される試料２（サンプル）の数は１つに限らず、２つ以上であってもよい。また、撮像部６０はＣＣＤセンサを用いていたが、ＣＣＤセンサに代えてＣＭＯＳセンサを用いてもよい。
【０１０１】
また、ユニット駆動部３６は、対物レンズ２１と界面検出部３０とが結合されたユニットをＺ方向に移動させていたが、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよい。また、ステージ駆動部１１、レンズ駆動部３４、及びユニット駆動部３６の駆動方法は、電動モータの回転させる方法が想定される。しかし、このような駆動方法に限定されず、例えばピエゾ素子をＸＹステージ１０、オフセットレンズ３２の保持部、及び対物レンズ２１の取り付け部に取り付けて、ピエゾ素子により移動させてもよい。
【符号の説明】
【０１０２】
１…顕微鏡装置、２…試料（観察対象物）、３…試料容器（容器）、１０…ＸＹステージ１０…ステージ駆動部、２１…対物レンズ、３０…界面検出部、３０Ａ…フォーカス用照明光学系（フォーカス光学系）、３１…第１光源（光源）、３２…オフセットレンズ（レンズ）、３４…レンズ駆動部、３６…ユニット駆動部、６０…撮像部、６１…信号処理部、７１…制御部、７２…入力部、ＯＳ…オフセット値、Ａ…結像位置、Ｆ…焦点位置、Ｏ１…第１光軸、Ｏ２…第２光軸、１３０…光電変換器、１０７…フォーカス用結像光学系（フォーカス光学系）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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