(57)【要約】【課題】本発明は、これまで遺伝子導入や薬剤耐性を利用した形質転換体の選抜が非常に困難であった単子葉植物を含む広い植物種において、プラスチド形質転換体を効率よく製造する方法を提供する。【解決手段】（ａ）植物組織に、プラスチド内で起こる化学反応を担う代謝酵素をコードする遺伝子を導入する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記遺伝子が発現していない植物細胞は増殖抑制される培養条件で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程と、を有することを特徴とする、プラスチド形質転換体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物組織に、プラスチド内で起こる化学反応を担う代謝酵素をコードする遺伝子を導入する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記遺伝子が発現していない植物細胞は増殖抑制される培養条件で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程と、
を有することを特徴とする、プラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子であり、
前記工程（ｂ）が、
前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程、
である、請求項１に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項３】
前記遺伝子が亜硝酸還元酵素遺伝子である、請求項２に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項４】
前記代謝酵素が、シキミ酸経路を担う代謝酵素であり、
前記植物組織が、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンの少なくとも１種以上を必須アミノ酸とし、
前記工程（ｂ）が、
前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記必須アミノ酸を含有していない培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程、
である、請求項１に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項５】
前記プラスチドが、葉緑体、白色体、アミロプラスト、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、又は原色素体（プロプラスチド）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）において、前記植物組織に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換体から、植物体を形成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
【請求項８】
請求項６に記載のプラスチド形質転換体の製造方法により製造されたプラスチド形質転換体又は前記プラスチド形質転換体から形成された植物体から、前記外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスチド形質転換体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物のプラスチド（色素体）は、植物細胞内にある色素を含んだ細胞小器官であり、独自のゲノムを有し、自己増殖を行う。プラスチドの１種である葉緑体は、植物細胞を最も特徴づけるものであり、光合成や、炭素・窒素・硫黄同化等を行う。葉緑体は、そのゲノム中に緑葉における全可溶性タンパク質の５０％にものぼるタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、非常に高いタンパク質合成能力を有する。特に高等植物では、細胞内に多数の葉緑体が存在しており、葉緑体ゲノムの数は核ゲノムの５，０００〜１０，０００倍と言われている。植物体中に多数存在する葉緑体に外来遺伝子を導入することにより、当該外来遺伝子がコードするタンパク質を植物体中で大量生産させることができるため、プラスチド形質転換技術は、安価なタンパク製造技術の１つとして注目されている。
【０００３】
高等植物のプラスチド形質転換は、基本的には、プラスチドゲノムと相同な配列間に目的遺伝子と薬剤選抜マーカー遺伝子を挟むように設計したベクターを導入することにより行う。当該ベクターをパーティクルガンにより植物細胞に導入した後、相同組換えにより形質転換したプラスチドゲノムを含む細胞を選抜薬剤入りの培地（選抜培地）上で繰り返し培養し、形質転換プラスチドを含む細胞を選抜する。この過程で野生型プラスチドと形質転換プラスチドが混在する状態（ヘテロプラズミック）の細胞集団を、全ての細胞が形質転換プラスチドを保持する状態（ホモプラズミック）へと変え、選抜されたホモプラズミック形質転換細胞から植物体を再生することによりプラスチド形質転換植物を得る。すなわち、プラスチド形質転換法は大きく、プラスチドゲノムへの外来遺伝子の導入による形質転換工程と、形質転換したプラスチドゲノムを含む細胞、植物体を選抜する工程から構成される。
【０００４】
このような方法による高等植物のプラスチド形質転換はこれまでに多くの植物で試みられているが、安定した形質転換系が確立されているのは双子葉植物であるタバコのみである。タバコのプラスチド形質転換法では、緑葉からの再分化系を利用した葉組織片への導入が一般的である。導入後の形質転換プラスチドの選抜は、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン不活化遺伝子（アミノグリコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ；ａａｄＡ）を選抜マーカーとしたスペクチノマイシン耐性選抜（非特許文献１参照。）、カナマイシン耐性遺伝子を選抜マーカーとしたカナマイシン耐性選抜（非特許文献２、３参照。）、ｂａｒ遺伝子による除草剤ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）耐性選抜（非特許文献４参照。）等により行われている。
【０００５】
一方、単子葉植物では、双子葉植物で成功している選抜方法を用いてプラスチド形質転換体の作製が試みられている。例えば、タバコと同様のａａｄＡ遺伝子／ストレプトマイシン選抜又はｂａｒ遺伝子／ＰＰＴ選抜により、イネのカルス（脱分化細胞群）へのプラスチド形質転換を行ったことが報告されている（非特許文献５、６、７参照。）。しかし、いずれの報告においても、作製されたのはヘテロプラズミック形質転換体であり、ホモプラズミック形質転換体は得られておらず、さらに形質転換体の作製効率も低かった。その他、トウモロコシの多芽体を導入材料とし、ａａｄＡ遺伝子選抜によりプラスチド形質転換体が作製できるとの報告があるものの、具体的な方法についての詳細は不明である（特許文献１参照。）。
【０００６】
このように、単子葉植物においてプラスチド形質転換が困難であるのは、双子葉植物で成功している選抜方法では単子葉植物の選抜が難しいことが大きな要因であると考えられる。薬剤に対する感受性や細胞内の応答系はそれぞれの種で異なるため、目的の種に応じた従来選抜法の改変や新規選抜系の開発が必要である。実際に、単子葉植物は、タバコ等で広く利用されているスペクチノマイシンに耐性を持つため、ａａｄＡ遺伝子／スペクチノマイシン選抜によっては、非形質転換体を完全に除くことができない。
【０００７】
単子葉植物に有効な形質転換体の選抜方法としては、核ゲノムをターゲットとした形質転換において、いくつかの薬剤耐性遺伝子を選抜マーカーとする選抜方法が開発されている。最も広く利用されているのは、抗生物質ハイグロマイシンとその耐性遺伝子による選抜方法であり、除草剤ホスフィノスリシンやグリホサートによる選抜法も有効に利用されている。ただし、核ゲノムの真核型タンパク質発現系は、原核型システムを含むプラスチドゲノムのタンパク質発現系と異なるため、真核型システムのみに有効なハイグロマイシンはプラスチド形質転換法には利用できない。核ゲノムをターゲットとした形質転換において使用されている薬剤耐性遺伝子を用いた選抜方法の中には、単子葉植物プラスチド形質転換法に適用可能なものもあるが、それらの選抜効果は限定的かつ不安定である（非特許文献７参照。）。その他、単子葉植物イネにおいて、核ゲノムをターゲットとした形質転換における選抜方法としては、亜硝酸還元酵素遺伝子を選抜マーカー遺伝子とした核形質転換法が報告されている（特許文献２、非特許文献８参照。）。
【０００８】
一方で、形質転換工程に関わる技術のうち、プラスチドへの遺伝子導入を促進する方法として、プラスチドが分化し、かつ、再分化能が低下していないカルスに外来遺伝子を導入する方法が開示されている（特許文献３参照。）。当該方法は、葉緑体の発達を促進する転写因子を過剰発現させた形質転換イネから誘導された緑色カルスを導入材料として利用するものであり、通常導入材料とされるプラスチドが未発達な黄白色カルスへの導入と比較して導入効率が上昇することが示されている。しかしながら当該方法は、あらかじめ核ゲノムへの形質転換を行って適切に緑化カルスを形成する系統を作製する必要があり、工程の増加に加え、他の単子葉植物への適用性も不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１９８７０４号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／０１２５２０号
【特許文献３】特許第５３２０７８２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Svab and Maliga，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，vol.90，p.913-917.
【非特許文献２】Carrer et al.，Molecular Genetics and Genomics，1993，vol.241，p.49-56.
【非特許文献３】Hunag et al.，Molecular Genetics and Genomics，2002，vol.268，p.19-27.
【非特許文献４】Ye et al.，plant Physiology，2003，vol.133，p.402-410.
【非特許文献５】Khan and Maliga，Nature Biotechnology，1999，vo.17，p.910-915.
【非特許文献６】Lee et al.，Molecules and Cells，2006，vol.21，p.401-410.
【非特許文献７】Li et al.，Agricultural Sciences in China，2009，vol.8，p.643-651.
【非特許文献８】Nishimura et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，vol.102，p.11940-11944.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献２等において報告されている亜硝酸還元酵素遺伝子を選抜マーカー遺伝子とした核形質転換方法を用いることにより、充分な選抜効率によってイネの核形質転換体を作製できる。しかし、当該選抜方法が、プラスチド形質転換にも適用できるかどうかは不明であった。
【００１２】
本発明は、これまで遺伝子導入や薬剤耐性を利用した形質転換体の選抜が非常に困難であった単子葉植物を含む広い植物種において、プラスチド形質転換体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究した結果、植物における代謝経路のうち、プラスチド内で起こる化学反応を利用することにより、プラスチド形質転換体の製造における形質転換体の選抜効率を高められることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法、プラスチド形質転換体、及びタンパク質の製造方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］  （ａ）植物組織に、プラスチド内で起こる化学反応を担う代謝酵素をコードする遺伝子を導入する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記遺伝子が発現していない植物細胞は増殖抑制される培養条件で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程と、
を有することを特徴とする、プラスチド形質転換体の製造方法。
［２］  前記遺伝子が、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子であり、
前記工程（ｂ）が、
前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程、
である、前記［１］のプラスチド形質転換体の製造方法。
［３］  前記遺伝子が亜硝酸還元酵素遺伝子である、前記［２］のプラスチド形質転換体の製造方法。
［４］  前記代謝酵素が、シキミ酸経路を担う代謝酵素であり、
前記植物組織が、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンの少なくとも１種以上を必須アミノ酸とし、
前記工程（ｂ）が、
前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記必須アミノ酸を含有していない培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程、
である、前記［１］のプラスチド形質転換体の製造方法。
［５］  前記プラスチドが、葉緑体、白色体、アミロプラスト、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、又は原色素体（プロプラスチド）である、前記［１］〜［４］のいずれかのプラスチド形質転換体の製造方法。
［６］  前記工程（ａ）において、前記植物組織に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入する、前記［１］〜［５］のいずれかのプラスチド形質転換体の製造方法。
［７］  前記工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換体から、植物体を形成する、前記［１］〜［６］のいずれかのプラスチド形質転換体の製造方法。
［８］前記［６］のプラスチド形質転換体の製造方法により製造されたプラスチド形質転換体又は前記プラスチド形質転換体から形成された植物体から、前記外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、形質転換体の選抜において、植物において広く保存されている代謝経路のうち、プラスチド内で起こる化学反応を利用している。このため、当該方法により、多くの植物においてプラスチド形質転換体を非常に効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）植物組織に、プラスチド内で起こる化学反応を担う代謝酵素をコードする遺伝子を導入する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、前記遺伝子が発現していない植物細胞は増殖抑制される培養条件で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程。
【００１７】
形質転換がなされていないにもかかわらず選抜されてしまう偽陽性を抑制して選抜効率を高めるためには、プラスチド形質転換体の製造において用いられる選抜マーカー遺伝子としては、プラスチドゲノムに組込まれてプラスチド内で発現した場合に、発現前には増殖不可能であった培養条件での培養が可能となるものが好ましい。そこで、本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法においては、代謝経路のうち、プラスチド内で起こる化学反応を利用する。具体的には、選抜マーカーとして、「プラスチド内で起こる化学反応を担う代謝酵素をコードする遺伝子」（以下、「プラスチド代謝酵素遺伝子」ということがある。）を用いる。プラスチド代謝酵素遺伝子がプラスチド内で発現すると、当該遺伝子がコードする代謝酵素が関与している化学反応が促進される結果、形質転換前の細胞と形質転換後の細胞でその形質が大きく変化し得る。この形質の変化を利用して形質転換体の選抜を行う。
【００１８】
本発明において用いられるプラスチド代謝酵素遺伝子としては、植物において広く保存されている代謝経路であって、少なくともその一部の化学反応がプラスチド内で起こるものが好ましい。様々な植物種を宿主とした場合でも、選抜マーカー遺伝子として利用できるためである。植物において広く保存されており、かつ少なくともその一部の化学反応がプラスチド内で起こる代謝経路としては、例えば、亜硝酸代謝経路とシキミ酸代謝経路が挙げられる。
【００１９】
亜硝酸代謝経路は、植物体外から吸収された硝酸態窒素を、植物体内で利用可能な形態に変換する代謝経路であり、植物全体で広く保存されている（Krapp A. Current Opinion in Plant Biology, 2015, vol. 25, p115-122.）。植物体においては、植物体外から吸収された硝酸態窒素は、細胞質内でまず硝酸還元酵素によって亜硝酸に還元される。生じた毒性のある亜硝酸態窒素は、プラスチド内に取り込まれた後、亜硝酸還元酵素等の亜硝酸毒性消去遺伝子がコードするタンパク質によって速やかにアンモニアに変換され、窒素源として細胞増殖・シュート再生に利用される。
【００２０】
選抜に亜硝酸代謝経路を利用する場合、選抜マーカー遺伝子としては、「亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子」（以下、「亜硝酸毒性消去遺伝子」ということがある。）を用いる。前述のように、植物において亜硝酸は、プラスチド内で行われる窒素代謝過程の中間代謝物であり、細胞毒性を引き起こすことが知られている。通常は、亜硝酸還元酵素により速やかにアンモニアに代謝されているため毒性影響は見られないが、内在の亜硝酸還元酵素の代謝能を超える量の亜硝酸条件で培養すると、カルス増殖及びシュート再生が著しく抑制される。プラスチド形質転換によりプラスチド内に亜硝酸毒性消去遺伝子を導入することによって、形質転換体では、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質により植物体内の過剰な亜硝酸が代謝される結果、内在の亜硝酸還元酵素の代謝能を超える量の亜硝酸条件であっても生存が可能になる。
【００２１】
亜硝酸毒性消去遺伝子としては、亜硝酸還元酵素遺伝子が好ましい。亜硝酸還元酵素遺伝子としては、亜硝酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されるものではなく、宿主となる植物種由来の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよく、宿主とは異なる生物種由来の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよい。また、元々生物が有している天然の亜硝酸還元酵素をコードした遺伝子であってもよく、天然の亜硝酸還元酵素を適宜改変したタンパク質をコードした遺伝子であってもよい。当該改変としては、例えば、亜硝酸還元酵素活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させるものや、亜硝酸還元酵素のＮ末端やＣ末端に、各種タグを付加するもの等が挙げられる。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。また、天然の亜硝酸還元酵素をコードした遺伝子の場合、天然の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよく、縮重コドンを、宿主となる植物においてコドン使用頻度の高いものに置換した亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよい。
【００２２】
亜硝酸還元酵素遺伝子としては、具体的には、フェレドキシン亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ＮｉＲ遺伝子）が挙げられる。フェレドキシン亜硝酸還元酵素は、フェレドキシンを電子供与体として機能する亜硝酸還元酵素であり、亜硝酸イオンをアンモニアに変換する作用を持つ。亜硝酸還元酵素遺伝子としては、例えば、イネ由来のＮｉＲ遺伝子（D50556.1、非特許文献８）、トウモロコシ由来のＮｉＲ遺伝子（EU957616.1，XP_008648080.1、Lahners K. et al., Plant Physiol. 1988, vol. 88, p741-746）、コムギ由来のＮｉＲ遺伝子（FJ527909.1）、オオムギ由来のＮｉＲ遺伝子（AK371794.1,S78730.1）、ソルガム由来のＮｉＲ遺伝子（XM_002454557.1）等の単子葉植物由来の亜硝酸還元酵素遺伝子や、タバコ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（AB093533.1,AB245431.1、Kronenberger J. et al., Mol. Gen. Genet., 1993, vol. 236, p203-208.）、シロイヌナズナ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（NM_127123.2）、キュウリ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（EF397679.1）、ジャガイモ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（U76701.1）、ウマゴヤシ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_003614772.1）、チャノキ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（JX987133.1）、マメナシ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（KC545876.1）、モモ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（AB061671.1）、イヌカタヒバ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_002987367.1）、ホウレンソウ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（Back E. et al., Mol. Gen. Genet., 1988, vol. 212, p20-26.）等の双子葉植物由来の亜硝酸還元酵素遺伝子や、ヒメツリガネゴケ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_001776973.1）、クラミドモナス由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_001696735.1）、クロレラ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_005844460.1）等の藻類やコケ類由来の亜硝酸還元酵素遺伝子等が挙げられる（番号は、いずれもＮＣＢＩ登録番号）。工程（ａ）において植物組織に導入される亜硝酸還元酵素遺伝子としては、ＮｉＲ遺伝子が好ましく、単子葉植物由来のＮｉＲ遺伝子がより好ましく、イネ科植物由来のＮｉＲ遺伝子がさらに好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜硝酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子がよりさらに好ましい。
【００２３】
亜硝酸還元酵素遺伝子以外であっても、植物体内における亜硝酸濃度を低下させるタンパク質や、亜硝酸による毒性を軽減させ得る機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を、亜硝酸毒性消去遺伝子として用いることができる。例えば植物細胞内では、硝酸還元酵素による亜硝酸を一酸化窒素に還元する経路の存在が知られており、また、一部の細菌では、亜硝酸から硝酸を生成する亜硝酸酸化酵素が存在する。これらの酵素は、亜硝酸還元酵素遺伝子と同様に亜硝酸の存在量を減少させることによって亜硝酸の毒性を直接的に打ち消すことができる。一方、亜硝酸により引き起こされる細胞毒性は亜硝酸がペルオキシダーゼやヘモグロビンと反応することにより発生する二酸化窒素がタンパク質の酸化やニトロ化、膜脂質の過酸化、ＤＮＡの突然変異等を誘発することに起因すると推測されている。したがって、亜硝酸と作用するペルオキシダーゼやヘモグロビンの存在量又は作用機序の調節により間接的に亜硝酸毒性を消去できる可能性もある。そこで、亜硝酸と作用するペルオキシダーゼの存在量を低下させるタンパク質をコードする遺伝子や、ペルオキシダーゼやヘモグロビンによって生じた二酸化窒素がタンパク質の酸化等を誘発することを抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、亜硝酸毒性消去遺伝子として用いることができる。
【００２４】
培地から吸収された硝酸態窒素が硝酸還元酵素によって亜硝酸に還元された後、生じた亜硝酸態窒素がプラスチド内で亜硝酸毒性消去遺伝子がコードするタンパク質によって速やかにアンモニアに変換されるという亜硝酸代謝系は、ほぼ全ての植物において保存されている代謝系である。つまり、亜硝酸毒性消去遺伝子を選抜マーカーとして用いる本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、様々な植物において実施することができる。実際に、ＮｉＲ遺伝子等の亜硝酸還元酵素遺伝子を有する多くの植物種において、硝酸還元酵素遺伝子は、イネ（X15819.1、Hamat HB et al., Mol. Gen. Genet., 1989, vol.218, p93-98.）、トウモロコシ（NM_001305856.1、Morrison KM. etal., Physiologia Plantarum, 2010, vol.140, p334-341.）、オオムギ（X57844.1、Schnorr KM  et al., Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 227, p411-416.）、ソルガム（XM_002444445.1）、アワ（XM_004973598.2）、ブラキポディウム（XM_003570500.2）、タバコ （AB245431.1）、シロイヌナズナ（J03240.1、Crawford NM. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, vol.85, p5006-5010.）、ルベラナズナ（XM_006300626.1）、セイヨウアブラナ（D38220.1）、アマナズナ（XM_010473671.1）、トウゴマ（AF314093.1）、テンサイ （EU163265.1）、ハツカダイコン（KM272859.1）、ニンジン（HQ402930.1）、ダイズ （NM_001251221.1、Wu S., et al., Plant Mol. Biol., 1995, vol.29, p491-506.）、インゲンマメ（XM_007141046.1）イチゴ（XM_004300392.2）、ウマゴヤシ（HQ840748.1）、トマト（XM_004250307.2）、ジャガイモ（NM_001288022.1）、キュウリ（HM755943.1）、メロン（XM_008462231.1）、カボチャ（M33154.1）、ホウレンソウ（M32600.1）、ゴマ（XM_011099324.1）、ワタ（XM_012612465.1）、ハス（XM_010247609.1）、ヨーロッパブドウ （JF796047.1）、モモ（AB061670.1）、ミカン（XM_006434048.1）、マメナシ（KC545876.1）、カカオ （XM_007018888.1）、アブラヤシ（XM_010910909.1）、ナツメヤシ（XM_008796303.1）、ヤトロファ （XM_012222767.1）、ポプラ（XM_011013830.1）、ユーカリ（XM_010065034.1）、シラカンバ （X54097.1）、ナツボダイジュ（AY138811.1）、ホワイトマルベリー （KF992020.1）、バナナ（XM_009419369.1）、ヒメツリガネゴケ（AB231618.1）、クロレラ（U39930.1）、ボル ボックス（XM_002955110.1）、ドナリエラ（KC108654.1）等の多くの植物において保存されている。
【００２５】
選抜に亜硝酸代謝経路を利用し、選抜マーカー遺伝子として亜硝酸毒性消去遺伝子を用いる場合には、工程（ｂ）として、工程（ａ）において亜硝酸毒性消去遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに亜硝酸毒性消去遺伝子が導入されたプラスチド形質転換細胞（プラスチド形質転換体）を選抜する。
【００２６】
植物体を亜硝酸を過剰に含む培地上で培養した場合、野生型プラスチドのみを持つ細胞は亜硝酸代謝が滞り、蓄積した亜硝酸の毒性により細胞は死滅する。一方で、プラスチド形質転換により亜硝酸毒性消去遺伝子の過剰発現カセットが組込まれた形質転換プラスチドを含む細胞は、亜硝酸代謝が活発化されるため細胞増殖・シュート再生が可能となる。つまり、工程（ｂ）においては、プラスチドゲノムに亜硝酸毒性消去遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体は増殖又は分化できるが、非形質転換体は、増殖が抑制され、最終的には死滅することにより、プラスチド形質転換体を選抜できる。
【００２７】
シキミ酸代謝経路は、シキミ酸、コリスミ酸を介して、芳香族アミノ酸を生合成する代謝経路であり、植物全体で広く保存されている（Maeda H. and Dudareva N. Annual Review of Plant Biology, 2012, vol.63, p73-105）。詳細には、プラスチド内において、まず、ＤＡＨＰ（3-Deoxy-D-Arabino-Heptulosonate 7-Phosphate）シンターゼにより、解糖系により合成されたホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とペントースリン酸経路により合成されたエリトロース  ４−リン酸（Ｅ４Ｐ）からＤＡＨＰが合成される。次いで、ＤＨＱＳ（3-Dehydroquinate synthase）によりＤＡＨＰが脱リン酸化されて３−デヒドロキナ酸となり、ＤＨＤ（3-Dehydroquinate dehydratase）とＳＤＨ（shikimate dehydrogenase）によりシキミ酸が合成される。シキミ酸は、ＳＫ（Shikimate Kinase）によりリン酸化された後、ＥＰＳＰ（5-Enolpyruvylshikimate 3-Phosphate）シンターゼによりＥＰＳＰが合成され、ＣＳ（Chorismate synthase）によりＥＰＳＰからコリスミ酸が合成される。
【００２８】
芳香族アミノ酸のうちトリプトファンは、以下のようにして合成される。まず、ＡＳα（anthranilate synthase α subunit）とＡＳβ（anthranilate synthase β subunit）により、コリスミ酸とグルタミンから合成されたアントラニル酸と、５−ホスホリボシル １−二リン酸からＰＡＴ（Phosphoribosylanthranilate transferase）により５−ホスホリボシルアントラニル酸が合成される。次いで、ＰＡＩ（Phosphoribosylanthranilate isomerase）により５−ホスホリボシルアントラニル酸からＣｄＲＰ（1-(o-carboxyphenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate）が合成され、ＩＧＰＳ（Indole-3-glycerol phosphate synthase）によりインドール−３−グリセロールリン酸が合成された後、ＴＳα（Trp synthase αsubunit）及びＴＳβ（Trp synthase β subunit）によりトリプトファンが合成される。
【００２９】
芳香族アミノ酸のうちチロシンは、以下のようにして合成される。まず、ＣＭ（Chorismate Mutase）によりコリスミ酸からプレフェン酸が合成される。次いで、ＰＤＨ（prephenate dehydrogenase）によりプレフェン酸から４−ヒドロキシフェニルピルビン酸が合成され、次いでＨＰＰ−ＡＴ（4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase）とグルタミン酸によりチロシンが合成される。プレフェン酸とグルタミン酸からＰＰＡ−ＡＴ（prephenate aminotransferase）により合成されたアロゲン酸からも、ＡＤＨ（arogenate dehydrogenase）によりチロシンが合成される。
【００３０】
芳香族アミノ酸のうちフェニルアラニンは、以下のようにして合成される。まず、ＣＭ（Chorismate Mutase）によりコリスミ酸からプレフェン酸が合成される。次いで、ＰＤＴ（prephenate dehydratase）によりプレフェン酸からフェニルピルビン酸が合成され、次いでＰＰＹ−ＡＴ（4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase）とグルタミン酸によりによりフェニルアラニンが合成される。プレフェン酸とグルタミン酸からＰＰＡ−ＡＴ（prephenate aminotransferase）により合成されたアロゲン酸からも、ＡＤＴ（arogenate dehydratase）によりフェニルアラニンが合成される。
【００３１】
トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンは、ホルモン等の原料であり、植物の生育に必須の成分である。このため、シキミ酸経路が阻害されこれらの芳香族アミノ酸が合成できなくなった植物では、必須アミノ酸として植物体外から取り入れる必要があり、必須アミノ酸を含有しない培地中では増殖することができない。そこで、本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法では、選抜マーカー遺伝子として、シキミ酸経路を担う代謝酵素をコードする遺伝子を用いることができる。具体的には、シキミ酸経路を担う代謝酵素の発現や機能が抑制された結果、少なくとも１種の芳香族アミノ酸を必須アミノ酸とする植物を導入材料とし、当該代謝酵素をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子とし、工程（ｂ）において、形質転換前の植物組織が必須アミノ酸とする芳香族アミノ酸を含有しない培地で培養する。当該培地では、形質転換され、自力で芳香族アミノ酸を合成できるようになった形質転換体のみが増殖できるため、効率よくプラスチド形質転換体を選抜することができる。
【００３２】
例えば、ＣＳをコードする遺伝子をノックアウトした変異植物では、コリスミ酸が合成できず、３種の芳香族アミノ酸の全てが必須アミノ酸となる。そこで、工程（ａ）として、ＣＳをコードする遺伝子をノックアウトした変異植物由来の植物組織に、ＣＳをコードする遺伝子を導入した後、工程（ｂ）として、当該遺伝子が導入された植物組織を、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンを含有していない培地で培養することにより、プラスチド形質転換体が選抜できる。また、例えば、ＡＳαをコードする遺伝子をノックアウトした変異植物では、チロシンとフェニルアラニンは合成できるものの、トリプトファンは合成できない。そこで、工程（ａ）として、ＡＳαをコードする遺伝子をノックアウトした変異植物由来の植物組織に、ＡＳαをコードする遺伝子を導入した後、工程（ｂ）として、当該遺伝子が導入された植物組織を、トリプトファンを含有していない培地で培養することにより、プラスチド形質転換体が選抜できる。
【００３３】
また、プラスチドでは、脂肪酸生合成の重要な反応も行われている（Harwood，Biochim. Biophys. Acta, 1996, vol.1301, p7-56.）。そこで、プラスチド内で起こる脂肪酸生合成の基質となる物質の生合成経路を利用することによっても、プラスチド形質転換体の選抜を行うことができる。
【００３４】
例えば、イネ科植物においては、特定の脂肪酸代謝経路に関与する酵素を阻害する除草剤と、当該除草剤に対する耐性を有する変異型酵素が知られている。野生型植物は、当該除草剤によって脂肪酸代謝が阻害される結果生育が阻害されるが、変異型酵素が発現している植物体では、当該除草剤の存在下でも必要な脂肪酸代謝が進行し、生育が可能となる。これを利用して、形質転換体の選抜を行うことができる。本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法では、選抜マーカー遺伝子として、除草剤耐性を有する変異型酵素をコードする遺伝子を用いることができる。具体的には、野生型等の除草剤耐性を有する変異型酵素を発現していない植物を導入材料とし、除草剤耐性を有する変異型酵素をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子とし、工程（ｂ）において、除草剤を含有させた培地で培養する。当該培地では、形質転換され、除草剤耐性を有する変異型酵素を発現している形質転換体のみが増殖できるため、効率よくプラスチド形質転換体を選抜することができる。このような除草剤と当該除草剤耐性を有する代謝酵素としては、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を阻害する除草剤フルアジホップブチルと、フルアジホップブチル耐性を有する変異型ＡＣＣａｓｅ（ＡＣＣａｓｅの変異型ＣＴドメイン）が挙げられる。なお、ＡＣＣａｓｅは、アセチルＣｏＡのアセチル基にＣＯ２を結合させてマロニルＣｏＡを合成する酵素であり、脂肪酸生合成経路の初発酵素である。
【００３５】
本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法においては、工程（ａ）において、形質転換体の選抜マーカーとして用いる選抜マーカー遺伝子を導入する。具体的には、選抜マーカー遺伝子を組込んだベクターを植物組織へ導入する。
【００３６】
選抜マーカー遺伝子を組込むベクターとしては、プラスチド内において当該ベクターが組み込まれた外来遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限されるものではない。当該ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やｐＵＣ系ベクターなどをベクターバックボーンとして使用し、これらのマルチクローニングサイト等に、プラスチドゲノム配列中の隣接する２種の相同組換えターゲット配列をクローニングする。当該２種の相同組換えターゲット配列の間に上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、５’調節領域、選抜マーカー遺伝子のポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットを組込むことにより、選抜マーカー遺伝子をプラスチド内で発現させるベクターが得られる。また、選抜マーカー遺伝子の上流にプロモーター配列を組込まず、プラスチドゲノム内の内生遺伝子のプロモーター配列又はその下流配列を相同組換えターゲット配列の１つとし、その下流に５’調節領域、選抜マーカー遺伝子のポリヌクレオチド、ターミネーター配列、もう一方の相同組換えターゲット配列を順に有するプロモーターレス発現カセットを組込むことによっても選抜マーカー遺伝子をプラスチド内で発現させるベクターが得られる。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００３７】
当該ベクターにおいて、選抜マーカー遺伝子の上流にあり、選抜マーカー遺伝子を発現させるプロモーターとしては、プラスチド内でプロモーターとして機能するものであればよく、特に限定されるものではないが、原核型のプロモーターであることが好ましい。
【００３８】
プラスチド内で選抜マーカー遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、リボゾームＲＮＡオペロンプロモーター（Ｐｒｒｎ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質をコードするｐｓｂＡ遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）、リブロース−１，５−ジリン酸カルボキシラーゼの大サブユニットをコードするｒｂｃＬ遺伝子プロモーター（ＰｒbｃＬ）などが挙げられる。
【００３９】
また、選抜マーカー遺伝子配列の上流に付加する５’調節領域の配列としては、例えば、大腸菌ファージＴ７のｇｅｎｅ１０遺伝子５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、ｒｂｃＬ遺伝子の５’−ＵＴＲ、ｐｓｂＡ遺伝子の５’−ＵＴＲ、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅβサブユニット遺伝子ａｔｐＢ遺伝子の５’−ＵＴＲ、ｐｓｂＡ遺伝子の翻訳開始コドン下流の配列（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ：ＤＢ−ｂｏｘ）、破傷風菌毒素断片Ｃ遺伝子ＴｅｔＣのＤＢ−ｂｏｘ、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子のＤＢ−ｂｏｘ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子ＮＰＴIIのＤＢ−ｂｏｘなどが挙げられる。
【００４０】
工程（ａ）において、植物組織へのベクターの導入は、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００４１】
工程（ａ）において選抜マーカー遺伝子を導入するための導入材料となる植物組織は、植物由来の組織であれば特に限定されるものではない。例えば、植物の形質転換体の作製において一般的に導入材料として用いられる未分化のカルスに、選抜マーカー遺伝子を導入することができる。未分化のカルスは、常法により調製することができる。
【００４２】
なお、選抜マーカーとして亜硝酸毒性消去遺伝子を用いる場合には、工程（ａ）の形質転換において、亜硝酸毒性消去遺伝子を導入する材料としては、亜硝酸態窒素に対する感受性が、野生型の植物組織と同程度のものであればよく、素の遺伝子型は特に限定されるものではない。すなわち、当該導入材料は、野生型の植物組織であってもよく、何等かの遺伝子改変がなされた変異型の植物組織であってもよい。
【００４３】
工程（ａ）の形質転換において、選抜マーカー遺伝子を導入する材料としては、発達したプラスチドを有する植物組織を用いてもよい。未分化のカルスではプラスチドは発達しておらず、未分化のプロプラスチド（原色素体）であるが、発達したプラスチドを有する植物組織を導入材料とすることにより、プラスチドゲノムへの形質転換効率を改善することができる。
【００４４】
導入材料として用いる発達したプラスチドを有する植物組織としては、分化した植物体の組織であってもよく、カルスをプラスチドが発達するまで分化させたものであってもよい。プラスチドの分化誘導は、カルスの培養条件の調整や植物ホルモン処理等により行うことができる。なお、プラスチドとしては、アミロプラスト、葉緑体、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、有色体、白色体、原色素体（プロプラスチド）を挙げることができる。本発明においては、葉緑体、アミロプラスト、エチオプラスト、白色体、又は原色素体が好ましく、特に葉緑体が好ましい。
【００４５】
例えば、プラスチドが葉緑体の場合には、植物体の葉や茎の切片を導入材料として用いてもよく、緑化カルスや多芽体等のようにカルスから葉緑体分化が誘導されたものであってもよい。緑化カルスは、カルス中のプロプラスチドが葉緑体に分化するように誘導されたものである。また、多芽体は、カルスが分化し、塊状の多数の芽を持つ組織が形成されたものである。カルスから緑化カルスや多芽体への誘導は、オーキシン、サイトカイニン等の分化や脱分化に寄与する植物ホルモンのバランスが調節された培地でカルスを培養することにより行うことができる。例えば、カルスの培養培地のオーキシン濃度を低下させ、サイトカイニン濃度を上昇させることにより、葉緑体形成が誘導され、緑化カルスが得られる。また、多芽体は、カルスの培養培地からサイトカイニンのみを低濃度に含有する培地でカルスを培養することにより得られる。
【００４６】
葉緑体分化を誘導するカルスとしては、葉等の葉緑体を多く含む組織の細胞を脱分化させたカルスであってもよく、完熟種子や未熟胚、根等の非緑色組織の細胞を脱分化させたカルス（非緑色組織由来のカルス）であってもよい。カルスは、植物組織をオーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンを含有する培地で培養するなど、常法により製造できる。
【００４７】
発達したプラスチドを有する植物組織は、カルスに、プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることによって得ることもできる。また、プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた形質転換体由来のカルスを誘導してプラスチドが形成されるように分化させたものであってもよい。分化を誘導するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、転写因子であるＧＬＫ遺伝子（Rossini et al.，Plant Cell，2001，vol.13，p.1231-1244.）や、シロイヌナズナのＣＥＳ１０１遺伝子（ＲＬＫ  ｆａｍｉｌｙ：Niwa et al.，Plant Cell Physioly，2006，vol.47，p.319-331.）等が挙げられる（特許文献３参照。）。プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子のカルス又は植物体への導入は、植物体への形質転換において一般的に用いられている方法を用いて行うことができる。
【００４８】
工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換体から植物体を形成することができる。具体的には、選抜されたプラスチド形質転換体を、再分化を促進するようホルモンバランスを調整した亜硝酸含有培地に移植し、明所で培養することによって植物体を形成する。
【００４９】
本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法において、工程（ａ）において、前記植物組織に、選抜マーカー遺伝子と共に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入することにより、選抜マーカー遺伝子とその他の外来遺伝子が導入された形質転換体を製造することができる。例えば、当該他の外来遺伝子の発現カセットを、選抜マーカー遺伝子の発現カセットと同じベクターに組込むことにより、選抜マーカー遺伝子とその他の外来遺伝子の両方がプラスチドゲノムに組込まれたプラスチド形質転換体を製造できる。当該他の外来遺伝子としては、特に限定されるものではないが、構造遺伝子であることが好ましく、医薬品や工業原料として有用なタンパク質をコードする構造遺伝子であることがより好ましい。
【００５０】
選抜マーカー遺伝子と共に外来遺伝子を導入した形質転換体を生育させることにより、当該形質転換体のプラスチド内に、当該外来遺伝子がコードするタンパク質が発現して蓄積した植物体が得られる。そこで、当該形質転換体又は当該形質転換体から形成された植物体から、当該外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することによって、タンパク質を製造することができる。当該形質転換体の生育は、形質転換前の宿主の植物体と同様に行うことができる。また、形質転換体からのタンパク質の回収は、タンパク質の性質等を考慮し、一般的に植物体から特定のタンパク質を回収する場合と同様の手法で行うことができる。例えば、生育させた形質転換体を細断した後ホモジナイズし、得られた組織抽出物をクロマトグラフィー法等により分画し、目的のタンパク質が濃縮された画分を回収することができる。
【００５１】
本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、特に、これまで遺伝子導入や形質転換体の選抜が非常に困難であった単子葉植物のプラスチド形質転換体の製造に用いられることが好ましい。中でも、イネ、ソルガム、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、スイッチグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等のイネ科植物のプラスチド形質転換体の製造に用いられることが好ましい。例えば、イネ科植物のように生長が早く植物体の大きなバイオマス植物に、有用タンパク質をコードする遺伝子をプラスチドゲノムに組込むことにより、有用タンパク質を大量生産することが可能なプラスチド形質転換体が得られる。