(57)【要約】【課題】  本発明は、日本山ニンジンから抽出される抽出物を有効に活用する、抗肥満剤の生産方法等を提供する。【解決手段】  植物由来の成分を有効成分として含有する生理活性剤の生産方法であって、日本山ニンジンから前記有効成分を抽出する抽出ステップを含み、前記有効成分は、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用の少なくともいずれか一つの抗肥満作用の有効成分である、生理活性剤の生産方法である。適切な抽出溶媒を選択することで、日本山ニンジンからリパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する成分を効率よく抽出することが可能となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の成分を有効成分として含有する生理活性剤の生産方法であって、
日本山ニンジンから前記有効成分を抽出する抽出ステップを含み、
前記有効成分は、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用による抗肥満作用の有効成分である、生理活性剤の生産方法。
【請求項２】
前記有効成分は、リパーゼ活性阻害作用の有効成分であり、
前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項１記載の生理活性剤の生産方法。
【請求項３】
前記有効成分は、構造式が（１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（２）式で表されるイソプテリキシン、（３）式で表されるヒュウガニンＥ又は（４）式で表されるアンジェリシンである、請求項２記載の生理活性剤の生産方法。
【化１】
2017025017.tif 000005
【請求項４】
前記有効成分は、脂肪細胞分化誘導阻害作用の有効成分であり、
前記抽出ステップにおいて、エタノール、又は、エタノールよりも極性の高い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項１記載の生理活性剤の生産方法。
【請求項５】
前記抽出溶媒として、水を用いる、請求項４記載の生理活性剤の生産方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の生産方法で生産された生理活性剤を含有する食品、医薬部外品又は医薬品。
【請求項７】
リパーゼの活性を阻害するリパーゼ活性阻害剤であって、
構造式が（１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（２）式で表されるイソプテリキシン、（３）式で表されるヒュウガニンＥ又は（４）式で表されるアンジェリシンを有効成分として含有するリパーゼ活性阻害剤。
【化２】
2017025017.tif 000006
【請求項８】
請求項７に記載のリパーゼ活性阻害剤を含有する食品、医薬部外品又は医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ活性阻害剤及び脂肪細胞分化誘導阻害剤の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる日本山ニンジンと言われるセリ科植物には、イヌトウキ（犬当季：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ）とヒュウガトウキ（日向当季：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｔｅｎｕｉｓｅｃｔａ  ｖａｒ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ）という２種類の学名のシシウド属に属する植物がある。日本山ニンジンは、イヌトウキ及びヒュウガトウキとこれらの近似植物の総称と言われることもある。総称と捉えれば、イヌトウキとヒュウガトウキの他にも、トウキ、ホッカイトウキ、セイヨウトウキ、カラトウキ、シシウド、アシタバという同属の学名のものが含まれる。
【０００３】
イヌトウキは、一般的には、肝障害、アレルギー、炎症、糖尿病や高血圧の治療に有効であるといわれている（例えば、非特許文献１参照）が、本格的には研究されていない。他方、ヒュウガトウキについては、種々の研究により、抽出物の生理活性が明らかにされてきている（例えば、非特許文献２及び３参照。）。なお、ヒュウガトウキは、平成１４年１１月に厚生労働省から医薬品（生薬）の認定を受けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Taniguchi  M、外４名著，The  115th  Annuaｌ  Meeting  of  the  Pharmaceuticaｌ  Society  of  Japan，Sendai，March  1995，Abstract  of  Papers  II，p.194．
【非特許文献２】松下洋一、外３名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica  furcijuga  Kitagawa）葉および茎の分離・分析，Memoirs  of  the  Facuｌty  of  Engineering，Miyazaki  University，38:87-90，2009-09-30．
【非特許文献３】藤原博士、外６名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica furcijuga）のメラニン色素産生能への影響，Jpn  Phaimacok  Ther(薬理と治療)，voｌ.38，no.12，2010．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、日本山ニンジンからの抽出物の生理活性は研究の余地が残されており、薬理効果等について、氷山の一角を明らかにしたにすぎない。そのため、日本山ニンジンからの抽出物を用いた製品において、バリエーションの拡大や有効成分の特定といったさらなる研究開発が期待されている。
【０００６】
ゆえに、本発明は、日本山ニンジンから抽出される抽出物を有効に活用する、抗肥満剤の生産方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の観点は、植物由来の成分を有効成分として含有する生理活性剤の生産方法であって、日本山ニンジンから前記有効成分を抽出する抽出ステップを含み、前記有効成分は、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用による抗肥満作用の有効成分である、生理活性剤の生産方法である。
【０００８】
本発明の第２の観点は、第１の観点の生理活性剤の生産方法であって、前記有効成分は、リパーゼ活性阻害作用の有効成分であり、前記抽出ステップにおいて、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、生理活性剤の生産方法である。
【０００９】
本発明の第３の観点は、第２の観点の生理活性剤の生産方法であって、前記有効成分は、構造式が（１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（２）式で表されるイソプテリキシン、（３）式で表されるヒュウガニンＥ又は（４）式で表されるアンジェリシンである、生理活性剤の生産方法である。
【００１０】
本発明の第４の観点は、第１の観点の生理活性剤の生産方法であって、前記有効成分は、脂肪細胞分化誘導阻害作用の有効成分であり、前記抽出ステップにおいて、エタノール、又は、エタノールよりも極性の高い溶媒を抽出溶媒として用いる、生理活性剤の生産方法である。
【００１１】
本発明の第５の観点は、第４の観点の生理活性剤の生産方法であって、前記抽出溶媒として、水を用いる、生理活性剤の生産方法である。
【００１２】
本発明の第６の観点は、第１から第５の観点のいずれかに記載の生産方法で生産された生理活性剤を含有する食品、医薬部外品又は医薬品である。
【００１３】
本発明の第７の観点は、リパーゼの活性を阻害するリパーゼ活性阻害剤であって、構造式が（１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（２）式で表されるイソプテリキシン、（３）式で表されるヒュウガニンＥ又は（４）式で表されるアンジェリシンを有効成分として含有するリパーゼ活性阻害剤である。
【００１４】
本発明の第８の観点は、第７の観点に記載のリパーゼ活性阻害剤を含有する食品、医薬部外品又は医薬品である。
【００１５】
【化１】
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【発明の効果】
【００１６】
本発明の各観点によれば、日本山ニンジンから、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する成分を抽出し、それらを有効成分として含有する抗肥満剤等を提供可能となる。
【００１７】
日本山ニンジンに、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する成分が含有されていることは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００１８】
本発明の第２の観点によれば、適切な抽出溶媒を選択することで、日本山ニンジンからリパーゼ活性阻害作用を有する成分を効率よく抽出することが可能となる。
【００１９】
本発明の第３の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した、イソエポキシプテリキシン、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、アンジェリシン、又は、ソラレンのうち少なくともいずれか一つを有効成分として含有するリパーゼ活性阻害剤を提供することが可能となる。
【００２０】
ここで、イソエポキシプテリキシン、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、アンジェリシン、及び、ソラレン、これら５つの化合物がリパーゼ活性阻害作用を有することは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００２１】
特に、イソエポキシプテリキシン、又は、イソプテリキシンを有効成分として用いた場合には、一般にリパーゼ活性阻害剤として一般に用いられているオルリスタットと同程度、又は、それ以上に強力なリパーゼ活性阻害剤を提供することが可能となる。
【００２２】
本発明の第４又は第５の観点によれば、適切な抽出溶媒を選択することで、日本山ニンジンから脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する成分を効率よく抽出することが可能となる。なお、本観点における有効成分の構造等を直接的に特定するためには、多くの時間を要する見通しである。
【００２３】
本発明の第６の観点によれば、日本山ニンジンから、リパーゼ活性阻害作用又は脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する成分を抽出し、それらを有効成分として含有する食品、医薬部外品又は医薬品を提供することが可能となる。
【００２４】
本発明の第７及び８の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した成分に限らず、イソエポキシプテリキシン、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、アンジェリシン、又は、ソラレンのうち少なくともいずれか一つを有効成分として含有するリパーゼ活性阻害剤等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】日本山ニンジンからの抽出物及び単離物質のリパーゼ阻害作用を示す図である。
【図２】日本山ニンジンからの抽出物の脂肪細胞分化誘導阻害作用を示す図である。
【図３】日本山ニンジンからの抽出物の脂肪細胞分化誘導阻害作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．１  エタノール抽出物及び水抽出物の抽出（本願請求項における「抽出ステップの」一例）
日本山ニンジンの地上部２０ｇを１５０ｍｌのエタノール（本願請求項における「水よりも極性の低い溶媒」及び「極性溶媒」の一例）に浸漬し、常温で時々攪拌しながら一昼夜置いた後にろ過した。ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液（エタノール抽出液）から溶媒を除去し、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で任意の濃度に調製し、以下の実験に用いた。
【００２７】
また、日本山ニンジンの地上部２０ｇを１００ｍＬの水（本願請求項における「極性溶媒」の一例）に浸漬し、先のエタノールと同様に抽出を行った。水抽出液は、凍結乾燥器ＴＡＩＴＥＣ（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）ＶＤ−２５０Ｒを用いて溶媒を除去した。
【００２８】
１．２  単離・同定方法
上記抽出方法で得られたエタノール抽出物溶液及び水抽出物溶液を、シリカゲルカラムを用いて、ヘキサン、酢酸エチル、メタノールでグラジエントをかけて複数に分画した。画分ごとにＮＭＲ測定を行い、既報の文献にて報告されているデータを比較することで、単離物質を同定した。
【００２９】
上記方法により日本山ニンジンから得られた抽出物又は単離物質について、リパーゼ活性阻害作用及び脂肪細胞分化誘導阻害作用をそれぞれ検討した。
【００３０】
２  日本山ニンジン抽出物及び単離物質のリパーゼ活性阻害作用の検討
リパーゼは、消化液に含まれる脂質分解酵素である。このリパーゼによる脂質の分解を阻害すると、分解されなかった脂質は体内に吸収されずに排泄されるため、リパーゼ活性阻害剤は抗肥満薬として用いられている。
４−メチルウンベリフェロンオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を基質として用い、リパーゼとの反応によって生成する４−メチルウンベリフェロンの蛍光を観測することにより、リパーゼの活性を測定した。
【００３１】
リパーゼ溶液の調製
１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１．３ｍＭ  塩化カルシウムを含む１３ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９８）に、膵臓由来リパーゼを溶解させ、５０Ｕ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌに調製した。
【００３２】
基質溶液の調製
４−メチルウンベリフェロンオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を上記の緩衝液に溶解させ、０．０５ｍＭに調製した。
【００３３】
サンプル溶液の調製
各抽出物及び単離物質を３％ＤＭＳＯに溶解させ、上記緩衝液で２５μｌにメスアップし、任意の濃度に調製した。
【００３４】
リパーゼ活性の測定
サンプル溶液２５μｌに、基質溶液５０μｌ加え、続いて、リパーゼ溶液２５μｌを加え、２５℃で３０分間反応させた。そこに、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌを加えて反応を停止させた後、４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定した（Ｅｍ：３５５ｎｍ、Ｅｘ：４６０ｎｍ）。
リパーゼ活性（％）は、数１の計算式により算出した。ここで、Ｓはサンプル添加系の反応後の蛍光強度であり、ＳBｌankはサンプルと４−ＭＵＯのみの蛍光強度であり、Ｃはサンプル無添加系の反応後の蛍光強度であり、ＣBｌankは４−ＭＵＯのみの蛍光強度である。なお、ポジティブコントロールに、リパーゼ阻害剤として用いられるオルリスタットを使用した。
【００３５】
【数１】
2017025017.tif 000004
【００３６】
図１（ａ）は、縦軸がリパーゼ活性であり、日本山ニンジンの水抽出物及びエタノール抽出物によるリパーゼ活性への影響を示す図である。水抽出物では、ブランクとほぼ変わらない結果となったが、エタノール抽出物では、ポジティブコントロールのオルリスタットと同様にリパーゼ活性阻害作用が観測された。
【００３７】
図１（ｂ）は、日本山ニンジンからの単離物質であるイソエポキシプテリキシン、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、ベルガプテン、アンジェリシン、ソラレンによるリパーゼ活性への影響を示す図である。ベルガプテン及びソラレン以外の単離物質では、リパーゼ活性阻害作用が観測された。特に、イソエポキシプテリキシン及びイソプテリキシンは、ポジティブコントロールのオルリスタットよりも、強いリパーゼ活性阻害作用を有することが明らかとなった。
【００３８】
３  日本山ニンジン抽出物の脂肪細胞分化誘導阻害作用の検討
脂肪前駆細胞は脂肪細胞へと分化する過程で細胞内に脂肪を蓄積する。マウス線維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞が脂肪細胞へと分化誘導される際に、細胞内に蓄積される脂肪滴を親油性色素のオイルレッドＯで染色することにより脂肪蓄積量を測定した。
【００３９】
サンプル溶液の調製
日本山ニンジンからの各抽出物はＤＭＳＯで溶解させ、任意の濃度に調製した。
【００４０】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養と脂肪細胞への分化（脂肪細胞分化試験）
続いて、３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養と脂肪細胞分化の実験手順を示す。３Ｔ３−Ｌ１細胞を０．８×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう２４ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭで培養した。コンフルエント２日後に、培養液を１０％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、１０ｕｇ／ｍｌインスリン及び０．５ｍＭＩＢＭＸを含むＤＭＥＭの分化誘導培地に交換し、そこにサンプル溶液も加え、２日間培養を続けた。さらに、１０ｕｇ／ｍｌインスリンを加えた１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地を交換してから５日間培養した後、培養を終了させた。
【００４１】
なお、脂肪細胞分化誘導阻害剤は抗肥満薬としての活用が期待されるが、製品化にあたっては、細胞が死なないことが重要である。そのため、下記の細胞滴検出試験と併せて、ＭＴＴ法により細胞生存率の測定も行った。
【００４２】
オイルレッドＯ染色法（細胞滴検出試験）
培養終了後に、脂肪滴の染色試薬であるオイルレッドＯを滴下し、染色された脂肪滴を顕微鏡で観察した。また、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、脂肪細胞分化誘導率の指標とした。
【００４３】
ＭＴＴ法（細胞生存率の測定法）
脂肪細胞分化試験後に、残った培地を洗い流して基礎培地を加え、さらに１時間培養した後、各ウェルにＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍｌ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を１０μｌ添加した。５％ＣＯ２、３７℃で４時間静置培養した後、培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１００μｌずつ加え、遮光し、４時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とした。
【００４４】
図２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞の顕微鏡写真である。上段の写真は左から、未処理対照、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロールであるベルベリン、下段は左から、エタノール抽出物（８０μｇ／ｍｌ）、水抽出物（８０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加えた３Ｔ３−Ｌ１細胞の顕微鏡写真である。黒く示された部分が、オイルレッドＯ色素に染色された脂肪滴である。ＤＭＳＯのみを加えたものに比べ、水抽出物及びエタノール抽出物を加えたものでは、染色部分の減少が認められ、脂肪滴量の減少が示唆された。
【００４５】
また、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することで脂肪蓄積量を求め、画像だけでなく吸光度でも脂肪細胞の分化を評価し、その結果を図３に示した。図３（ａ）は、左から順に０、２０、４０、８０μｇ／ｍｌのエタノール抽出物存在下での、細胞生存率及び脂肪細胞分化誘導率を示している。図３（ｂ）は、左から順に０、８０、１６０、３２０μｇ／ｍｌの水抽出物存在下での、細胞生存率及び脂肪細胞分化誘導率を示している。なお、試験物質溶液添加時の細胞生存率及び脂肪細胞分化誘導率は、未処理対照の脂肪蓄積量を基準（１００％）とし、相対値（％）で示した。
【００４６】
エタノール抽出物及び水抽出物の両方において、細胞生存率が高く保たれる濃度範囲において、脂肪細胞の分化を阻害する作用があり、特に、水抽出物による強い阻害作用が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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