(57)【要約】【課題】  造骨型骨転移モデル動物を製造するための方法を提供すること。【解決手段】  非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与し、該非ヒト動物の動脈又は静脈に前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある腫瘍細胞を注入することによって、造骨性病変が広範囲に形成される非ヒト動物を１００％の確率で製造することに成功した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造骨型骨転移モデル動物を製造するための方法であって、非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程とを含み、かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
【請求項２】
造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入し、造骨性病変を形成させる工程と、
（３）該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記造骨性病変の部位において前記被験化合物を検出する工程と、
（５）検出された前記被験化合物の造骨性病変の部位における集積の程度を指標として、当該化合物が造骨型骨転移を検出できるか否かを判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
【請求項３】
造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程と、
（３）該腫瘍細胞の注入前、注入時又は注入後に、当該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記被験化合物を摂取させた非ヒト動物において、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（５）工程（２）において前記腫瘍細胞を注入した非ヒト動物に、前記被験化合物を摂取させずに、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した造骨性病変の程度を比較し、工程（４）において検出した造骨性病変の程度が、工程（５）において検出した造骨性病変の程度よりも低い場合に、前記被験化合物は造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞を注入する血管が伏在動脈である、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
造骨型骨転移モデル動物であって、カルシニューリン阻害剤が投与され、動脈又は静脈に腫瘍細胞が注入されることにより造骨性病変が形成され、かつ前記腫瘍細胞と同種異系又は異種の関係にある非ヒト動物。
【請求項８】
前記腫瘍細胞が前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、請求項７に記載の造骨型骨転移モデル動物。
【請求項９】
前記非ヒト動物がげっ歯類である、請求項７又は８に記載の造骨性転移モデル動物。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞を注入される血管が伏在動脈である、請求項７〜９のうちのいずれか一項に記載の造骨型骨転移モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造骨型骨転移モデル動物の製造方法に関する。また、本発明は、前記製造方法を利用する、造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法、及び造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法にも関する。さらに、本発明は、前記製造方法によって製造された造骨型骨転移モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨転移とは、腫瘍細胞が血管を通って移動し、その病巣を骨に形成することであり、病理学的には、主に、造骨型、溶骨型、それらが混在する混合型、及び造骨も溶骨も確認されない骨梁間型の４類型に分類される。また昨今の原発巣に対する有効な治療方法の増加に伴い、癌患者の延命が可能になった反面、骨転移によって、痛み、骨折、麻痺等の様々な重篤な症状が引き起こされ、患者の生活の質を低下することが問題となっている。特に、造骨型骨転移の患者は生存期間が他の類型よりも長く、当該転移を治療又は予防するための方法の開発が強く求められている。
【０００３】
また近年、癌の治療薬・診断薬の開発において、その効能効果やＡＤＭＥを評価するため、担癌モデル動物の作製が試みられている。造骨型骨転移に関しても、腫瘍細胞を骨髄腔内に注入することによって、そのモデル動物を作製することができた旨の報告がなされている（非特許文献１及び２）。しかしながら、当該動物は、腫瘍細胞を骨に直接注入することによって作製されるものであり、血管を移動して病巣が骨に形成されるという、元来の発生機序とは異なるため、モデル動物としての有効性に欠く。
【０００４】
また、造骨型骨転移に関しては、腫瘍細胞を心臓の左心室内又は尾静脈内に注入することによって、そのモデル動物の作製を試みたという報告もなされている（非特許文献２）。しかしながら、このような血管を介する方法により得られた動物において、骨転移を示唆する後肢運動障害は認められたものの、シンチグラフィーによって検出されるほどの造骨性病変は検出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ  Ｆ．ら、Ｉｎｔ.  Ｊ.  Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、１２２（４）、７５１〜７６０ページ
【非特許文献２】Ｌｉｅｐｅ  Ｋ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５年、２５（２Ａ）、１０６７〜１０７３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、腫瘍細胞が血管を通って移動することにより、造骨性病変が骨に形成される非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ラットにカルシニューリン阻害剤を投与した上で、そのラットと同種異系の関係にある腫瘍細胞を動脈に注入した場合、広範囲な造骨性病変が極めて高い確率にて形成されることを見出した。
【０００８】
本発明は、以上の研究結果に基づくものであり、造骨型骨転移モデル動物の製造方法に関する。また、本発明は、造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法、及び造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法にも関する。さらに、本発明は、前記製造方法によって製造された造骨型骨転移モデル動物に関し、より具体的には、以下の通りである。
【０００９】
＜１＞  造骨型骨転移モデル動物を製造するための方法であって、非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程とを含み、かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
＜２＞  造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入し、造骨性病変を形成させる工程と、
（３）該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記造骨性病変の部位において前記被験化合物を検出する工程と、
（５）検出された前記被験化合物の造骨性病変の部位における集積の程度を指標として、当該化合物が造骨型骨転移を検出できるか否かを判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
＜３＞  造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程と、
（３）該腫瘍細胞の注入前、注入時又は注入後に、当該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記被験化合物を摂取させた非ヒト動物において、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（５）工程（２）において前記腫瘍細胞を注入した非ヒト動物に、前記被験化合物を摂取させずに、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した造骨性病変の程度を比較し、工程（４）において検出した造骨性病変の程度が、工程（５）において検出した造骨性病変の程度よりも低い場合に、前記被験化合物は造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法。
＜４＞  前記腫瘍細胞が前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の方法。
＜５＞  前記非ヒト動物がげっ歯類である、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一に記載の方法。
＜６＞  前記腫瘍細胞を注入する血管が伏在動脈である、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の方法。
＜７＞  造骨型骨転移モデル動物であって、カルシニューリン阻害剤が投与され、動脈又は静脈に腫瘍細胞が注入されることにより造骨性病変が形成され、かつ前記腫瘍細胞と同種異系又は異種の関係にある非ヒト動物。
＜８＞  前記腫瘍細胞が前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、＜７＞に記載の造骨型骨転移モデル動物。
＜９＞  前記非ヒト動物がげっ歯類である、＜７＞又は＜８＞に記載の造骨性転移モデル動物。
＜１０＞  前記腫瘍細胞を注入される血管が伏在動脈である、＜７＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載の造骨型骨転移モデル動物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、非ヒト動物において、造骨性病変を１００％という極めて高い確率にて形成することが可能となる。また、形成される造骨性病変の部位は広範囲に及ぶ。さらには、腫瘍細胞を注入する動脈又は静脈の血流を追うことにより又は制御することにより、所望の骨に造骨性病変を形成させることもできる。そのため、本発明の製造方法、及び当該方法によって製造される造骨型骨転移モデル動物を用いることにより、効率かつ感度良く、造骨型骨転移の治療、予防又は診断に有用な化合物のスクリーニングを行うことも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】シクロスポリンを投与し、ラット前立腺癌細胞（ＡＴ６−１）を伏在動脈に注入したＳＤラットの下肢骨（大腿骨及び脛骨）の断面をトルイジンブルーにて染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中真ん中の写真には、ＡＴ６−１が転移した部位（白黒表示ではグレーにて示される箇所、又はカラー表示では水色にて示される箇所）が付されており、右側の写真には、さらに造骨性病変部位（白黒表示では白にて示される箇所、又はカラー表示では黄色にて示される箇所）が付されている。
【図１Ｂ】図１Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（１）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。また、「ＢＭ」と付されている箇所は骨髄であり、「ＣＢ」と付されている箇所は皮質骨であり、「Ｏｓ」と付されている箇所は類骨であり、「Ｔｕ」と付されている箇所はＡＴ６−１が転移している部位である（以下、図中の表記については、図１Ｃ〜Ｆ、５Ｂ及び５Ｃにおいても同様）。
【図１Ｃ】図１Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（２）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図１Ｄ】図１Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（３）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図１Ｅ】図１Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（４）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図１Ｆ】図１Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（５）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図２】シクロスポリンを投与してＡＴ６−１を伏在動脈に注入したＳＤラット（図中、左側）と、シクロスポリンを投与せずにＡＴ６−１を伏在動脈に注入したコペンハーゲンラット（図中、右側）とにおいて、下肢骨断面をトルイジンブルーにて染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。なお、図中の表記については、図１Ａと同様である。
【図３Ａ】ＡＴ６−１を伏在動脈に注入したヌードラットの下肢骨断面をトルイジンブルーにて染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。なお、図中の表記については、図１Ａと同様である。
【図３Ｂ】図３Ａにおいて大きい方の四角で囲まれている部位を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中の表記については、図１Ｂと同様である。
【図３Ｃ】図３Ａにおいて小さい方の四角で囲まれている部位を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中の表記については、図１Ｂと同様である。
【図４】シクロスポリンを投与し、ラット前立腺癌細胞（ＡＴ６−１）を伏在動脈に注入したＳＤラットの下肢（移植肢）をＣＴにて解析した結果を示す図である。図中、矢印が指し示す部位は、造骨性病変部位であり、三角が指し示す部位は、ＡＴ６−１が転移している部位である。
【図５Ａ】シクロスポリンを投与し、ラット乳癌細胞（ＭＲＭＴ−１）を伏在動脈に注入したＳＤラットの下肢骨（大腿骨及び脛骨）の断面をトルイジンブルーにて染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中右側の写真には、ＭＲＭＴ−１が転移した部位（白黒表示ではグレーにて示される箇所、又はカラー表示では水色にて示される箇所）が付されており、さらに造骨性病変部位（白黒表示では白にて示される箇所、又はカラー表示では黄色にて示される箇所）が付されている。
【図５Ｂ】図５Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（１）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】図５Ａにおける右側の写真において四角で囲まれている部位（２）を拡大して観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜造骨型骨転移モデル動物、及びその製造方法＞
本発明の造骨型骨転移モデル動物を製造するための方法は、非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程とを含み、かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある方法にある。
【００１３】
本発明において、「造骨型骨転移」とは、非ヒト動物に注入した腫瘍細胞が、骨組織に作用することにより、当該非ヒト動物において、骨形成が促進された部位（造骨性病変）が少なくとも１箇所形成されることを意味する。すなわち、本発明における骨転移には、造骨型（造骨型優位）のみならず、溶骨性病変等も認められる混合型も含まれる。また、溶骨型（溶骨型優位）であっても、造骨性病変も形成されている限り、それも含まれる。
【００１４】
本発明において、造骨型骨転移モデル作製のために用いられる「非ヒト動物」としては、特に制限はなく、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物等の脊椎動物を挙げられるが、ヒト以外であればいずれでもよく、その性別、週齢含め、特に限定されるものではない。また、本発明にかかる「非ヒト動物」は、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、より好ましくはラットであり、さらに好ましくはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット又はＷｉｓｔｅｒラットである。さらにまた、後述の実施例に示す通り、本発明にかかる「非ヒト動物」は、免疫機能（Ｔ細胞の機能等）が抑制されていない非ヒト動物であることが好ましい。
【００１５】
本発明において、腫瘍細胞を注入される前又は注入時に投与される「カルシニューリン阻害剤」は、カルシニューリンの酵素活性を抑制する活性を有する化合物を意味し、例えば、シクロスポリン、タクロリムスが挙げられるが、好ましくは、シクロスポリンである。また、カルシニューリン活性の抑制によって、ＩＬ−２の産生が抑制されることが知られている。したがって、当該化合物は、ＩＬ−２産生を抑制する活性を有する化合物であってもよい。なお、本発明における「抑制」には、部分的な抑制のみならず、完全なる抑制（阻害）も含まれる。
【００１６】
また、カルシニューリン阻害剤の非ヒト動物の投与方法としては特に制限はなく、経口投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与が挙げられる。
【００１７】
また、カルシニューリン阻害剤の投与は、腫瘍細胞を注入する前にカルシニューリンの酵素活性を抑制しておくという観点から、当該注入前であることが望ましいが、腫瘍細胞の注入と同時に行ってもよい。さらに、カルシニューリン阻害剤の投与は、単回であってもよく、複数回の投与であってもよく、ドラッグデリバリーシステム（浸透圧ポンプ）等を利用した持続的投与であってもよい。また、カルシニューリン阻害剤の投与は、後述の腫瘍細胞注入後にも引き続き行ってもよい。さらに、作業の容易さという観点から、カルシニューリン阻害剤を非ヒト動物の皮下に持続的に投与することが好ましい。また、カルシニューリン阻害剤の投与量としては、対象とする非ヒト動物の種類、体重、年齢等に応じ、当業者であれば適宜調整し得るが、通常１〜１５０ｍｇ／体重ｋｇであり、好ましくは、２〜５０ｍｇ／体重ｋｇであり、かかる量を１回に投与してもよく、また複数回に分けて（例えば、２週間毎日）投与してもよい。
【００１８】
本発明において、カルシニューリン阻害剤の投与後又は投与時に非ヒト動物に注入される腫瘍細胞は、骨組織において骨形成を促進する活性を有する腫瘍細胞であればよく、例えば、前立腺癌、乳癌、消化器癌（胃未分化癌等）、卵巣癌の細胞が挙げられるが、実際の癌患者における造骨型骨転移の発生頻度の高さから、前立腺癌細胞又は乳癌細胞であることが好ましく、ラット前立腺癌細胞又はラット乳癌細胞であることがより好ましい。ラット前立腺癌細胞においては、Ｒ−３３２７又はその派生株がさらに好ましく、ＡＴ６−１が特に好ましい。ラット乳癌細胞においては、ＭＲＭＴ−１がさらに好ましい。なお、本発明にかかる腫瘍細胞は、それが注入される非ヒト動物と同種異系又は異種の関係にあることが必要である。
【００１９】
本発明において、注入される腫瘍細胞の数としては、対象とする非ヒト動物の種類、体重、週齢等に応じ、当業者であれば適宜調整し得るが、通常一注入部位あたり１．０×１０４〜１．０×１０７個であり、好ましくは１．０×１０４〜５．０×１０５個であり、より好ましくは２．５×１０４〜２．０×１０５個である。
【００２０】
また、腫瘍細胞は、通常溶液に懸濁し、注射によって注入される。このような溶液としては、細胞の生存に適した溶液であればよく、例えば、緩衝液（ＨＢＳＳ、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等）、培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ等）が挙げられる。
【００２１】
さらに、腫瘍細胞を注入する時期としては、シクロスポリン投与後又は投与時（持続的投与である場合には、その投与開始後又は投与開始時）であればよく、対象とする非ヒト動物の種類、体重、年齢等に応じ、当業者であれば適宜調整し得るが、通常１〜５日目であり、好ましくは２〜５日目である。また、腫瘍細胞の注入は通常１回であるが、複数回に分けて行ってもよい。
【００２２】
なお、本発明において、「日目」は、投与を開始した日等の最初の日を含めないで数えた日数とする。
【００２３】
また、本発明において腫瘍細胞は動脈又は静脈から注入される。注入される動脈又は静脈としては特に制限はなく、造骨性病変の形成を望む骨に応じ、その骨に対して血流方向の上流側に位置する、すなわち、その血流にのることにより、注入された腫瘍細胞の目的とする骨への送達を可能とする動脈又は静脈が好適に用いられる。また、上流側に位置する動脈又は静脈を用いずとも、当業者であれば、周囲の血管を結紮等することにより、血流を制御し、所望の骨に腫瘍細胞を到達させることができる（例えば、非特許文献２において示されているように、腹部静脈をクリップして血流を止めることにより、尾静脈から注入した腫瘍細胞を腰椎に誘導することができる）。さらに、下肢骨において造骨性病変を形成させる場合には、例えば、伏在動脈、浅腹壁動脈、上腹壁動脈、下腹壁動脈、大腿深動脈、外側回旋動脈、膝窩動脈、外腸骨動脈を用いることができるが、作業の容易さという観点から、より好ましくは、伏在動脈、浅腹壁動脈又は上腹壁動脈への注入であり、特に好ましくは伏在動脈への注入である。
【００２４】
そして、以上説明した製造方法によれば、後述の実施例に示す通り、非ヒト動物において、造骨性病変を１００％という極めて高い確率にて形成すること可能となる。また、形成される造骨性病変の部位は広範囲に及ぶ。さらには、腫瘍細胞を注入する動脈又は静脈の血流を追うことにより又は制御することにより、所望の骨に造骨性病変を形成させることもできる。したがって、本発明の製造方法によって製造される造骨型骨転移モデル動物は、造骨型骨転移の治療、予防又は診断に有用な化合物のスクリーニングを行う上で有用である。然るに、本発明は、下記造骨型骨転移モデル動物も提供する。
【００２５】
造骨型骨転移モデル動物であって、カルシニューリン阻害剤が投与され、動脈又は静脈に腫瘍細胞が注入されることにより造骨性病変が形成され、かつ前記腫瘍細胞と同種異系又は異種の関係にある非ヒト動物。
【００２６】
また、本発明において、造骨性病変が形成される時期は、用いる非ヒト動物及び注入する腫瘍細胞の種類及細胞数等によるが、通常、腫瘍細胞を注入してから１４〜２８日目である。また、このようにして形成される造骨性病変の部位の範囲としても、用いる非ヒト動物及び腫瘍細胞の種類等によるが、骨の長軸方向の断面において、その断面全体を１００％とした際に、通常０．５％以上であり、好ましくは１％以上であり、より好ましくは２％以上である。さらに、造骨性病変が形成される部位としては特に制限はなく、通常、骨髄腔外であるが、骨髄腔内であってもよい。また、本発明の造骨型骨転移モデル動物は、骨転移の他、他臓器（肺、リンパ節、肝臓、腎臓等）への転移が同時に認められるものであってもよい。
【００２７】
＜造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法＞
上述の通り、本発明によって製造される造骨型骨転移モデル動物においては、所望の骨において１００％の確率で広範囲に及ぶ造骨性病変が形成されるため、造骨型骨転移の診断に有用な化合物のスクリーニングにおいても好適に用いることができる。
【００２８】
したがって、本発明は、造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための下記方法をも提供する。
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入し、造骨性病変を形成させる工程と、
（３）該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記造骨性病変の部位において前記被験化合物を検出する工程と、
（５）検出された前記被験化合物の造骨性病変の部位における集積の程度を指標として、当該化合物が造骨型骨転移を検出できるか否かを判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある、造骨型骨転移を検出するための化合物をスクリーニングするための方法。
【００２９】
工程（１）及び（２）については上述の通りである。そして、これら工程を経て製造された造骨型骨転移モデル動物に摂取させる「被験化合物」としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖等）、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、脂質、及び各化合物から構成されるライブラリー、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。また、これら化合物を後述の方法にて検出するため、標識を施してもよい。このような標識としては、放射性同位体（９９ｍＴｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、３Ｈ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、１５Ｏ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、１１Ｃ、１３Ｎ等）、常磁性同位体（１５３Ｇｄ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、５６Ｆｅ等）、造影剤（ガドリニウム、ガドリニウム錯体、ヨード造影剤等）、蛍光物質（インドシアニングリーン、ＩＲＤｙｅ８００シリーズ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、蛍光放出金属（１５２Ｅｕ、ランタン系列等）等）、化学発光物質又は生物発光物質（ルミノール、イミダゾール、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）が挙げられる。また、被験化合物と標識との結合は、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば直接的に化学結合してもよいし、あるいは適当なリンカーを介して間接的に結合してもよい。
【００３０】
また、被験化合物の非ヒト動物の摂取方法としては特に制限はなく、経口投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与が挙げられる。また、摂取させる被験化合物の濃度、回数及び期間としては、特に制限はなく、その種類や性質（溶解度、毒性等）によって適宜調整され得る。
【００３１】
被験化合物の検出方法としても特に制限はなく、当業者であれば適宜公知の手法を用いて行うことができる。かかる公知の手法としては、インビボ法である場合には、バイオイメージング技術（シンチグラフィー、単一光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター体軸断層撮影法（ＣＡＴ、ＣＴ）、ＰＥＴ／ＣＴ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が挙げられる。また、インビトロ法である場合には、例えば、シンチグラフィー、蛍光顕微鏡による観察、質量分析、液体クロマトグラフィー分析が挙げられる。
【００３２】
そして、本発明においては、このようにして検出された前記被験化合物の造骨性病変の部位における集積の程度を指標として、当該化合物が造骨型骨転移を検出できるか否かを判定することができる。「集積の程度」とは、例えば、造骨性病変の部位において検出された、被験化合物からのシグナルの強度（放射線量、蛍光強度、発光強度等）、被験化合物の量が挙げられる。また、このような判定方法としては特に制限はなく、例えば、本発明の方法により造骨性病変が形成された骨における被験化合物の集積の程度が、造骨性病変が形成されていない骨のそれよりも有意に高ければ、当該被験化合物は造骨型骨転移を検出できる化合物であると判定することができる。
【００３３】
＜造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法＞
上述の通り、本発明によって製造される造骨型骨転移モデル動物においては、所望の骨において１００％の確率で広範囲に及ぶ造骨性病変が形成されるため、造骨型骨転移の治療又は予防に有用な化合物のスクリーニングにおいても好適に用いることができる。
【００３４】
したがって、本発明は、造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための下記方法をも提供する。
（１）非ヒト動物にカルシニューリン阻害剤を投与する工程と、
（２）該非ヒト動物の動脈又は静脈に腫瘍細胞を注入する工程と、
（３）該腫瘍細胞の注入前、注入時又は注入後に、当該非ヒト動物に被験化合物を摂取させる工程と、
（４）前記被験化合物を摂取させた非ヒト動物において、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（５）工程（２）において前記腫瘍細胞を注入した非ヒト動物に、前記被験化合物を摂取させずに、造骨性病変の程度を検出する工程と、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した造骨性病変の程度を比較し、工程（４）において検出した造骨性病変の程度が、工程（５）において検出した造骨性病変の程度よりも低い場合に、前記被験化合物は造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程とを含み、
かつ前記非ヒト動物と前記腫瘍細胞とが同種異系又は異種の関係にある、造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法。
【００３５】
工程（１）及び（２）、並びに工程（３）における被験化合物及びその摂取方法については上述の通りである。また、被験化合物の摂取は、腫瘍細胞の注入前、注入時又は注入後であってもよいが、造骨型骨転移の治療に有用な化合物のスクリーニングを目的とする場合には、腫瘍細胞の注入後に被験化合物を非ヒト動物に摂取させることが望ましく、造骨性病変形成後に摂取させることがより望ましい。また、造骨型骨転移の予防に有用な化合物のスクリーニングを目的とする場合には、腫瘍細胞の注入前に被験化合物を非ヒト動物に摂取させることが望ましい。
【００３６】
また、このような工程を経た非ヒト動物における「造骨性病変の程度の検出」とは、例えば、後述の実施例に示すような、顕微鏡による観察、ＰＥＴ、ＣＡＴ、ＣＴ、ＰＥＴ／ＣＴ、マイクロフォーカスＸ線ＣＴ（μＣＴ）、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、軟Ｘ線写真撮影、ＭＲＩ等による骨形態の観察が挙げられる。また、骨形成マーカー（骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）、Ｉ型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（ＰＩＣＰ）、Ｉ型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（ＰＮＣＰ））の検出によっても行うことができる。またマーカーの検出方法としては、例えば、免疫組織化学的解析、ＣＬＥＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。さらに、造骨性病変の程度の検出は、造骨型骨転移によって生じる症状（運動障害、骨折等）の検出であってもよい。
【００３７】
そして、このようにして検出された造骨性病変の程度を、被験化合物を摂取させていない非ヒト動物のそれと比較し、低くなっている場合には、前記被験物質は造骨型骨転移を抑制する活性を有する化合物であると判定することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
本発明者らは、以下に示す４つの方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００４０】
（実施例１）
先ず、シクロスポリンをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに投与した。そして、その投与を開始してから５日目に、当該ＳＤラットの伏在動脈にラット前立腺癌細胞を注入した。
【００４１】
（比較例１）
ＳＤラットの代わりにコペンハーゲンラットを用い、また当該ラットにシクロスポリンを投与しなかったこと以外は、実施例１に記載の方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００４２】
（比較例２）
ＳＤラットの代わりにコペンハーゲンラットを用い、また当該ラットにシクロスポリン投与を開始してから４日目に癌細胞を注入したこと以外は、実施例１に記載の方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００４３】
（比較例３）
ＳＤラットの代わりにＦ３４４ヌードラット（Ｔ細胞機能欠如ラット）を用い、また当該ラットにシクロスポリンを投与しなかったこと以外は、実施例１に記載の方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００４４】
また、これら４つの作製方法において用いたラット、細胞及び実験方法の仔細は以下の通りである。
【００４５】
＜ラット及び細胞＞
ＳＤラットは日本エスエルシー株式会社から提供を受け、９週齢の雄を３匹用いた。コペンハーゲンラットは、日本エスエルシー株式会社から提供を受け、比較例１では１０週齢の雄を２匹と１３週齢の雄を３匹、計５匹用い、比較例２では１７週齢の雄を２匹用いた。Ｆ３４４ヌードラットは、日本クレア株式会社から提供を受け、１９週齢の雄を２匹用いた。
【００４６】
また、これらラットに注入した前立腺癌細胞は、コペンハーゲンラットに由来する前立腺癌細胞株  Ｒ−３３２７のサブライン  ＡＴ６−１である。すなわち、ＡＴ６−１とそれを注入するラットとは、実施例１及び比較例３においては同種異系の関係にあり、比較例１及び２においては同種同系の関係にある。
【００４７】
＜シクロスポリンの投与＞
前記ラットには、以下の通り、浸透圧ポンプを皮下に埋め込むことにより、シクロスポリンを持続的に投与した。
【００４８】
先ず、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐ、Ｍｏｄｅｌ：２ＭＬ４）とそれに装着する流量調節器（ｆｌｏｗ  ｍｏｄｅｒａｔｏｒ）の空重量を測定した。次に、約２ｍＬのシクロスポリン溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、ノバルティスファーマ社製、製品名：サンディミュン（登録商標）点滴静注用２５０ｍｇ）を吸引した２ｃｃシリンジ（テルモ社製）に、充填管（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｔｕｂｅ）を装着した後、シリンジ内の泡を放出した。次いで、浸透圧ポンプの挿入口を上にして垂直に保定し、挿入口に充填管を差し込み、充填管が進まなくなる位置まで挿入した。そして、シリンジのプランジャーをゆっくり押して、シクロスポリン溶液を浸透圧ポンプ内に注入した。次いで、挿入口から当該溶液の漏れ出しを確認した後、注入を止め、充填管を抜いた。漏れ出した溶液をキムワイプ等で拭い取った後、流量調節器を浸透圧ポンプの挿入口から挿入し、フランジがポンプに付くまで押し込み、また漏れ出した溶液をキムワイプ等で拭い取った。そして、流量調節器を装着した浸透圧ポンプの重量を測定し、前記空重量に基づき、注入されたシクロスポリン溶液の重量（容量）を算出した。なお、算出した容量が、浸透圧ポンプ充填容量（Ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）の９０％以上となったものは、泡が混入している可能性が極めて低いため合格とし、以下の通りにしてラットに埋め込んだ。
【００４９】
上記の通りにしてシクロスポリン溶液を浸透圧ポンプに充填した後、ラットをイソフルランで麻酔し、腹臥位で保定し，頸部から腰部の背面を剃毛した。背腰部の皮膚を１ｃｍほど鋏で切開し、その切開部に浸透圧ポンプを挿入した後、５−０の縫合糸で皮膚を縫合した。そして、抗生物質（ホスホミンＳ）を１０μＬ皮下注射し、ケージに戻して飼育した。なお、比較例１及び３においては、上記浸透圧ポンプ埋め込みの手術を施さずに、下記前立腺癌細胞をラットに注入した。
【００５０】
＜前立腺癌細胞の注入＞
シクロスポリンの投与を開始してから、その４若しくは５日目に、又はシクロスポリンを投与せずに、前立腺癌細胞（ＡＴ６−１）を以下の通りにしてラットの大腿動脈分岐枝である伏在動脈に注入した。
【００５１】
先ず、ＡＴ６−１をトリプシン処理して培養皿から剥離して細胞数を測定し、２×１０６個／ｍＬになるようＣａ２＋／Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に浮遊させ、ラットに注入するまで氷冷した。
【００５２】
また、ラットをイソフルランで麻酔し、仰臥位にて保定した後、後肢鼠径部を剃毛し、７０％エタノール／イソジンにて消毒した。次いで、メタカム０．５％注射液を０．０１〜０．０２ｍＬ（０．２ｍｇ／ｋｇ）皮下注射した後、鼠径部皮膚を約２〜３ｃｍ切開した。そして、浅腹壁動脈、伏在動脈等を確認した上で、血管、神経周囲の被膜を剥離し、伏在動脈、静脈及び神経をそれぞれ剥離し、独立させた。次いで、膝窩動脈分岐部より遠位部の伏在動脈に、結紮糸（３−０）を１本通し、浅腹壁動脈分岐部周囲の組織を剥離した（この結紮糸を、縫合糸（１）とも称する）。浅腹壁動脈分岐部と膝窩動脈分岐部間の大腿動脈（浅腹壁動脈分岐部より少し遠位部）に結紮糸を１本通し、伏在動脈に沿って平滑筋弛緩剤（パパベリン塩酸塩注射液）を数滴滴下した（この結紮糸を、縫合糸（２）とも称する）。
【００５３】
２９Ｇマイジェクターに、前記細胞浮遊液０．１ｍＬを吸引し、縫合糸（１）及び（２）の端を鉗子で挟み、細胞の逆流及び伏在動脈から末梢への流入を避けるため、伏在動脈を吊り上げた。綿棒を伏在動脈の下に挿入した上で、吊り上げた伏在動脈の遠位部から中枢方向に注射針を刺入し，細胞浮遊液をゆっくり注入した（０．１ｍＬ／１０秒）。そして、注射針をゆっくり抜き，出血が無いことを確認して刺入口に瞬間接着剤（製品名：アロンアロファ）を滴下し、その上に脂肪塊を乗せて刺入口を塞ぎ，出血が無いことを確認した。次いで、縫合糸（１）及び（２）を弛め、大腿動脈からの血流を再開し，出血が無いことを確認した。さらに、７０％エタノールで術野を満たし、血管外に漏出した腫瘍細胞を除去すべく、約１０秒間置いた。次いで、７０％エタノールを脱脂綿に吸引し、術野を生食液で満たした後、十分に洗浄した。再度、生食液で術野を洗浄した後、術野の筋肉，組織を整復し，縫合糸（５−０）で皮膚を閉じた。
【００５４】
なお、実施例１、比較例１及び３においては、上記方法にて片方の後肢に細胞浮遊液を注入して処置し、もう片方の後肢については、細胞浮遊液の代わりにＨＢＳＳを注入した以外は、上記の通り処置した。また、比較例２においては、上記方法にて両方の後肢に細胞浮遊液を注入して処置した。そして、このように処置した後、抗生物質（ホスホミンＳ）を皮下注射し、ラットをケージに戻して飼育した。
【００５５】
＜骨未固定凍結切片のトルイジンブルー染色＞
前立腺癌注入ラットにおける造骨型骨転移を検出するため、以下の通りにしてトルイジンブルー染色を行った。
【００５６】
先ず、大腿骨、脛骨及び腓骨を、股関節と足首辺りで切断し、それらの間の関節を外さずに、前立腺癌を上述の通り注入したラットからこれら３つの骨（下肢骨）を単離し、川本フィルム法（硬組織の未固定非脱灰凍結切片作成法）に沿って、凍結切片を調製した。
【００５７】
より具体的には、後述の通り、骨表面に造骨性病変が形成され得るため，周囲の筋肉を少し残す感じで、前立腺癌を注入してから２〜３週間後のラットより下肢骨を摘出した。次いで、大腿骨頭及び脛骨遠位端を切断し、下肢骨を松葉状に曲げて，大腿骨近位及び脛骨遠位切断端を糸で結び固定した。
【００５８】
次に、前記下肢骨をステンレス製メッシュおたま（調理用あく取り用器具）に載せて冷却液（イソペンタン／ドライアイス）中に沈め、おたまを動かしながら急速冷凍した（約１０秒間）。次いで、ステンレス製の包埋用容器に予め冷蔵した包埋剤（ＳＣＥＭ，Ｓｅｃｔｉｏｎ−ｌａｂ製）を入れ、骨表面の冷却材をふき取り、下肢骨を包埋剤中に沈めた。そして、包埋容器全体を冷却液中に沈め、包埋容器を動かしながら凍結した（包埋剤上面の凍結が始まる程度まで、約１０秒間）。包埋剤の上面と冷却液面が同じ高さになるように包埋容器を引き上げ、その状態で包埋剤を完全に凍結した。得られた包埋ブロックをクリオスタット庫内（−２０℃）に移し、骨長軸に平行な断面が得られるよう、クリオスタットにて５μｍの切片を調製した。次いで、クリオスタット内に３０分間放置して，凍結乾燥した後、クリオスタットから取出し、室温にて１分間乾燥させた。次いで、無水エタノールに３〜５秒間浸し、その後キムタオルで余分なエタノールを吸取り、直ちに４％パラホルムアルデヒド溶液に１分間以上浸した。純水に１０秒間出し入れすることにより洗浄した後、０．０５％トルイジンブルー溶液（ｐＨ７）に５分間浸した。次いでまた、純水に３０秒間出し入れすることにより洗浄した後、余分な水をキムタオルで吸取った。そして、専用封入剤ＳＣＭＭ−Ｒ３数滴を組織面に滴下した後、カッターを用いて，スライドグラスの両面テープの内側で切片支持用粘着フィルムを切断した。また、ＳＣＭＭ−Ｒ３を数滴滴下した別の新しいスライドグラスを用意し、それに組織面を下にして先の切片支持粘着フィルムをかぶせた。細切したろ紙２枚を切片支持用粘着フィルム上で左右になぞりながら滑らせ、余分なＳＣＭＭ−Ｒ３を吸取った。なお．スライドグラスと当該フィルムとの間に泡が入った場合は、フィルムを先細ピンセットで持ち上げて、ＳＣＭＭ−Ｒ３を１，２滴滴下し、再度ろ紙で余分なＳＣＭＭ−Ｒ３を吸取った。次いで、切片封入装置にスライドグラスをセットし、紫外線を１分間照射した後、水洗に供した。
【００５９】
そして、このようにして調製した骨未固定凍結切片をデジタル顕微鏡（キーエンス社製、オールインワン顕微鏡）にて観察し、染色像を得た。得られた結果において、前立腺癌を注入してから１８日目の代表的な染色像を図１Ａ〜３Ｃに示す。
【００６０】
＜コンピューター断層撮影（ＣＴ）＞
前立腺癌注入ラットにおける造骨型骨転移を検出するため、以下の通りにしてＣＴ解析も行った。すなわち、前立腺癌を注入してから１５〜２０日目のラットにイソフルランを導入して麻酔し、仰向けの状態でラット用保定ベッドにテープ等を用い、腹部及び脚部を固定した。次いで、当該ラットをＣＴ装置内に入れ、Ｘ線を照射し、以下に示す撮影条件にて、後肢の膝関節部周囲のＣＴ画像（ｒａｗファイル）を取得した。
Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｃｏｕｎｔ：１８０ｖｉｅｗｓ
Ｆｒａｍｅｓ  ａｖｅｒａｇｅｄ：１ｆｒａｍｅｓ／ｖｉｅｗ
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｂｉｎｎｉｎｇ：２ｘ２
Ｘ−ｒａｙ  ｔｕｂｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ：「Ｄｅｆａｕｌｔ（１５０  μＡ）」
Ｘ−ｒａｙ  ｔｕｂｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：７５ｋＶ
Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｉｍｅ：２３０ｍｓ
Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：２．６
得られたｒａｗファイルをＴｒｉｆｏｉｌ  Ｃｏｎｓｏｌｅで再構成し（再構成条件：Ｈａｌｆ  Ｒｅｓ）、再構成画像を画像表示ソフトにて更に変換してｈｄｒ及びｉｍｇファイルを作成し，これらをＩｍａｇｅＪにて読み込み、画像を表示させ、解析した。得られた結果を図４に示す。
【００６１】
図１Ａ〜Ｆに示す通り、実施例１に記載の方法にて調製されたラットにおいては、腫瘍細胞注入後２〜３週間程度で、当該細胞の脛骨表面及び骨髄腔内における転移が認められた（図１Ａ〜Ｆにおいて、白黒表示ではグレーにて示される箇所、又はカラー表示では水色にて示される箇所）。さらには、脛骨近位又は大腿骨遠位（膝の近く）の骨髄腔外にて、広範囲に及び、造骨性病変が形成されることが明らかになった。さらに、図４に示す通り、実施例１に記載の方法にて調製されたラットについては、ＣＴ解析でも造骨性病変を検出できることが明らかになった。また、このような広範囲の造骨性病変の形成は、作製した全てのラット（３匹の片方の後肢に腫瘍細胞を移植した結果，３肢が陽性（３肢中３肢、１００％））において認められ、実施例１に記載の方法は、造骨性病変形成の効率においても極めて優れた方法であることも明らかになった。
【００６２】
なお、図には示さないが、シクロスポリンの投与を開始してから３日目にラット前立腺癌細胞を注入した以外は、実施例１に記載の方法を用い、別途３匹のラットの計５下肢（右下肢のみ細胞注入処理が１匹、左右両下肢に細胞注入処理が２匹）を処置した結果、いずれのラットの下肢においても、前記同様に、骨髄腔外にて広範囲に造骨性病変が形成されることが確認された。また、これら腫瘍細胞を注入したラットに対し、注入後１８日目（右下肢のみ細胞注入処理の１匹）、及び２２日目又は２３日目（左右両下肢に細胞注入処理を施した２匹）に、新生骨部分に集積する放射性医薬品（ヒドロキシメチレンジホスホン酸テクネチウム（９９ｍＴｃ）、製品名：クリアボーン（登録商標）、日本メジフィジックス株式会社製）を用いて解析し、当該放射性医薬品が集積した造骨性病変部の面積を評価したところ、断面全体（脛骨及び大腿骨）を１００％とした場合に、その病変部位の割合は、１．２２±０．６３％（下肢別に、それぞれ０．９１％、０．５０％、１．６７％、０．９５％、２．０５％）であった。
【００６３】
一方、シクロスポリンを投与せずコペンハーゲンラットを用いた比較例１に記載の方法においては、作製した全てのラット（４匹の片方の後肢に腫瘍細胞を移植した結果，４肢が陽性（４肢中４肢、１００％）の骨髄腔外において造骨性病変の形成は検出された。
【００６４】
しかしながら、その部位は極めて小さいものであった（図２  参照）。また、２匹のコペンハーゲンラットにシクロスポリンを投与して左右の後肢に腫瘍細胞を移植した結果、１肢のみにおいて（４肢中１肢、２５％）、骨髄腔外における造骨性病変の形成が検出された（比較例２）。またその病変部位は比較例１同様に微小なものであった。さらに、シクロスポリンを投与せずヌードラットを用いた比較例３に記載の方法においては、片方の後肢に腫瘍細胞を移植した２匹のラットのうち、その１匹（５０％）において、骨髄腔外における比較的広範囲な造骨性病変の形成は検出されたが（図３Ａ〜Ｃ  参照）、その部位は実施例１のそれと比べると同等以下であった。
【００６５】
以上の通り、ラットにカルシニューリン阻害剤の１種であるシクロスポリンを投与した上で、そのラットと同種異系の関係にある腫瘍細胞を動脈に注入した場合に、広範囲な造骨性病変が１００％という極めて高い確率にて形成されることが明らかになった（実施例１）。
【００６６】
一方、同種同系の関係にある腫瘍細胞をラットの動脈に注入しても、得られる造骨性病変は極めて小さく（比較例１及び２）、さらにシクロスポリンを投与することによって、その病変形成の確率は２５％に低減してしまった（比較例２）。
【００６７】
なお、非特許文献２においても、本願の比較例１及び２同様に、ＡＴ６−１の親株であるＲ−３３２７を、それと同種同系の関係にあるコペンハーゲンラットの心臓の左心室内又は尾静脈内に注入し、造骨型骨転移モデルの作製が試みられている。しかしながら、かかる方法においても、シンチグラフィーによって検出されるほどの造骨性病変は検出されていない。このように、腫瘍細胞とそれを注入するラットとが同種異系の関係にあり、また腫瘍細胞を注入する部位が血管系である場合には、造骨性病変が形成されない、または検出が困難なほどその病変が微小となることが示唆される。
【００６８】
また、カルシニューリン阻害剤は免疫抑制剤として通常用いられることが知られている。しかしながら、比較例３に示す通り、免疫機能が抑制されているラット（ヌードラット）において、そのラットと同種異系の関係にある腫瘍細胞を動脈に注入しても、その病変形成の確率は５０％に低減してしまい、実施例１における極めて高い造骨性病変形成の確率は、免疫機能の抑制によるものではないことが示唆される。
【００６９】
さらに、本発明者らは、本発明の方法によれば、造骨性病変を１００％という極めて高い確率にて形成することが可能となるということを、以下に示す方法にて確認した。
【００７０】
（実施例２）
ＳＤラットの代わりにＷｉｓｔｅｒラット（９週齢の雄２匹）を用い、またシクロスポリンの投与を開始してから３日目に、当該ラットの伏在動脈にラット前立腺癌細胞（ＡＴ６−１、２×１０５個／肢）を両方の後肢に注入した以外は、実施例１に記載の方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００７１】
（実施例３）
ＳＤラットの代わりにＷｉｓｔｅｒラット（９週齢の雄２匹）を用い、またシクロスポリンの投与を開始してから３日目に、当該ラットの伏在動脈にラット乳癌細胞（ＭＲＭＴ−１、２．５×１０４個／肢）を両方の後肢に注入した以外は、実施例１に記載の方法にて、造骨型骨転移モデル動物の作製を試みた。
【００７２】
なお、Ｗｉｓｔｅｒラットは、日本エスエルシー株式会社から提供を受けた。また、ＭＲＭＴ−１は、ＳＤラットに由来する乳癌細胞株である。したがって、実施例２及び３においても、腫瘍細胞とそれを注入するラットとは同種異系の関係にある。
【００７３】
そして、このようにして調製したラットの下肢（移植肢）を、腫瘍細胞注入後１７日目に上記ＣＴにて解析した。さらに、上記トルイジンブルー染色により、実施例２においては、腫瘍細胞注入後１９日目のラット（２匹）を解析し、実施例３においては、腫瘍細胞注入後１９日目のラット１匹を、腫瘍細胞注入後２１日目にもう１匹のラットを解析した。
【００７４】
その結果、図には示さないが、いずれの解析方法によっても、実施例２において、広範囲の造骨性病変が１００％の確率にて形成することが確認できた。
【００７５】
また同様に、実施例３においても、広範囲の造骨性病変が１００％の確率にて形成することが、いずれの解析方法によっても確認することができた。より具体的には、実施例３における代表的な染色像（図５Ａ〜５Ｃ）に示す通り、腫瘍細胞注入後２〜３週間程度で、大腿骨遠位及び脛骨近位（膝の近く）から下肢下方に向けて、脛骨表面及び骨髄腔内において、転移が認められた。さらには、大腿骨遠位（膝の近く）及び脛骨近位の骨髄腔外にて、広範囲な造骨病変を検出することができた。そして、このように、前立腺癌細胞に限らず、乳癌細胞を注入しても、本発明の方法によれば、極めて高い確率にて造骨型骨転移モデル動物を製造できることも確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上説明したように、本発明によれば、非ヒト動物において、造骨性病変を１００％という極めて高い確率にて形成することが可能となる。また、形成される造骨性病変の部位は広範囲に及ぶ。さらには、腫瘍細胞を注入する動脈又は静脈の血流を辿ることにより又は制御することにより、所望の骨に造骨性病変を形成させることもできる。
【００７７】
したがって、本発明の製造方法、及び当該方法によって製造される造骨型骨転移モデル動物は、造骨型骨転移の治療、予防又は診断に有用な化合物のスクリーニングを行う上で有用である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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