(57)【要約】【課題】  微生物由来の酵素を利用して、高炭素数の分岐鎖状アルコールの原料となる化合物を効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】  Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓからｉＰ等のサイトカイニンと同様の活性を有するメチル化サイトカイニンを同定し、前記メチル化サイトカイニンが、ｆａｓ４遺伝子がコードするイソペンテニル基転移酵素と、ｆａｓ４遺伝子の上流に存在する２つのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子がコードする２種のタンパク質とによって生合成されることを見い出した。さらに、前記２種のタンパク質はいずれもイソペンテニル二リン酸を特異的にメチル化する酵素活性を有し、それらを利用することで高炭素数の分岐鎖状アルコールの原料となる化合物を効率的に製造することが可能であることを見い出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をイソペンテニル二リン酸に接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むことを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むことを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をイソペンテニル二リン酸に接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むことを特徴とする、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むことを特徴とする、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項５】
前記メチル化イソペンテニル二リン酸が３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸であることを特徴とする、請求項３又は４に記載のメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法で得られた３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸を脱リン酸させ、還元させて３−メチル−１−ペンタノール又は３−エチル−１−ペンタノールを得ることを特徴とする、３−メチル−１−ペンタノール又は３−エチル−１−ペンタノールの製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の製造方法で得られた３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸にイソペンテニル基転移酵素を接触させてモノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン又はジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニンを得ることを特徴とする、モノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン又はジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニンの製造方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有することを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を含有することを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイソペンテニル二リン酸のメチル化方法及びメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法に関する。詳しくは、イソペンテニル二リン酸を特異的にメチル化することが可能なタンパク質を用いたイソペンテニル二リン酸のメチル化方法、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法、及びメチル化イソペンテニル二リン酸の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素数が５以上の高炭素数の分岐鎖状アルコールは、従来から医薬、農薬、香料、化成品等の幅広い分野で用いられており、近年では、燃料価格の高騰、環境汚染、化石燃料の枯渇等の問題から、化石燃料の代替燃料としても注目されている。このような高炭素数の分岐鎖状アルコールを生産する手段としては、安全性や環境負荷の観点から、酵素や微生物を使用した方法の開発がなされており、例えば、Ｚｈａｎｇら、ＰＮＡＳ、２００８年、１０５巻、２０６８３〜２０６８８頁（非特許文献１）には、大腸菌においてケトメチルバレラートから３−メチル−１−ペンタノールを生産する方法が記載されている。
【０００３】
また、イソペンテニル二リン酸（ＩＤＰ）は、サイトカイニン（ＣＫ）の生合成に用いられるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＤＰ）の異性体であり、ほとんどの植物において生合成されている。イソペンテニル二リン酸は脱リン酸させ、還元させることによって容易に炭素数５の分岐鎖状アルコールであるイソペンタノールを得ることができるため、高炭素数の分岐鎖状アルコールの原料として有用である。しかしながら、メチルペンタノール（炭素数６）等に比べると炭素数が少ないため、化石燃料の代替燃料としては未だ不十分であった。
【０００４】
ところで、植物の適切な成長においては、サイトカイニンやオーキシン等の植物ホルモンの植物体内バランスが適切に調節されることが必要である。天然に存在するサイトカイニンは、Ｎ６位に異なる側鎖を有するアデニン誘導体であり、主なサイトカイニンとしては、Ｎ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、トランスゼアチン（ｔＺ）、シスゼアチン（ｃＺ）、ジヒドロゼアチン（ＤＺ）のようなＮ６位がプレニル化したイソプレノイドサイトカイニンが知られている。これらのサイトカイニンの生合成においてはジメチルアリル二リン酸及びアデノシンリン酸を基質とするイソペンテニル基転移酵素（ＩＰＴ）が触媒として機能しており、例えば、ｉＰは、イソペンテニル基転移酵素によってジメチルアリル二リン酸及びアデノシンリン酸からｉＰヌクレオチドが合成され、次いで、サイトカイニン活性化酵素（ＬＯＧ）によってｉＰヌクレオチドからリボースリン酸が外されることで生合成される。また、ｔＺは、ｉＰヌクレオチドのプレニル側鎖のトランス末端が水酸化されてｔＺヌクレオチドが合成され、次いで、サイトカイニン活性化酵素によってｔＺヌクレオチドからリボースリン酸が外されることで生合成される。
【０００５】
多くの植物病原菌は、異常な器官形成を引き起こす植物ホルモンを自ら合成したり、宿主の炭素代謝を改変して上記植物ホルモンのバランスを崩すことで病原性を発揮している。例えば、グラム陽性菌の放線菌Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ（ロドコッカス・ファシアンス（Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ））は、植物に感染すると、ｌｅａｆｙ  ｇａｌｌ（葉状瘤）として知られる、葉の奇形及びシュートの過剰形成症状をひきおこすことが知られている。Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓの病原性決定因子はｆａｓ遺伝子座（複数のサイトカイニン生合成遺伝子をコードするオペロン）内に存在していることがわかっており（Ｓｔｅｓ  Ｅら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１１年、４９（１）（非特許文献２））、例えば、上記サイトカイニンの生合成を触媒するイソペンテニル基転移酵素をコードしているｆａｓ４遺伝子は病原性を発揮するために不可欠であるとされている（Ｓｔｅｓ  Ｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１３年、３４２（２）、１８７−１９５頁（非特許文献３））。
【０００６】
しかしながら、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓにはこのようにｆａｓ遺伝子群が存在しているにもかかわらず、ｇａｌｌ形成を引き起こす他の病原菌（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ，  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔｏｎｏｉ等）と比べて、培養濾液から検出されるサイトカイニン濃度が非常に低い。さらに、ｌｅａｆｙ  ｇａｌｌの表現型は非常に特徴的であり、上記の他の病原菌のいずれによってもｌｅａｆｙ  ｇａｌｌ形成は引き起こされない。そのため、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓによるｌｅａｆｙ  ｇａｌｌの形成とサイトカイニンとの関係は未だ明らかではなかった。さらに、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓは、既知のサイトカイニンに加えて新規のサイトカイニンを合成するのではないかと長い間考えられてきたが、そのような分子種はこれまで発見されていなかった（Ｇｏｅｔｈａｌｓ  Ｋら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００１年、３９、２７−５２頁（非特許文献４））。
【０００７】
また、ｆａｓ４遺伝子の上流には２つのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子が存在していることがわかっていたが、これらのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子の機能は未だ知られていなかった（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇら、ＰＮＡＳ、２００８年、１０５巻、２０６８３〜２０６８８頁
【非特許文献２】Ｓｔｅｓ  Ｅら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０１１年、４９（１）
【非特許文献３】Ｓｔｅｓ  Ｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１３年、３４２（２）、１８７−１９５頁
【非特許文献４】Ｇｏｅｔｈａｌｓ  Ｋら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００１年、３９、２７−５２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物由来の酵素を利用して、高炭素数の分岐鎖状アルコールの原料となる化合物を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、先ず、後述の実施例において示すとおり、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓのｆａｓ４遺伝子の上流に存在する２つのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子（以下、場合により、それぞれ「ｍｔ１遺伝子」及び「ｍｔ２遺伝子」という）とサイトカイニン合成との関係を調べるために、大腸菌においてｆａｓ４遺伝子、ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子（ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２）；ｆａｓ４遺伝子及びｍｔ１遺伝子（ｆａｓ４ｍｔ１）；並びに、ｆａｓ４遺伝子及びｍｔ２遺伝子（ｆａｓ４ｍｔ２）をそれぞれ外来的に共発現させ、得られた培養濾過物を質量分析（ＭＳ）によって分析した。その結果、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ２の濾過物からはいずれも、アデニン骨格を持ち、かつ、分子量２１８の化合物と一致するピーク、及び、分子量２３２の化合物と一致するピークが検出され、分子量２１８及び分子量２３２の２つのサイトカイニン様の化合物が得られることが明らかになった（図３）。なお、ｆａｓ４ｍｔ１の濾過物からは分子量２１８の化合物がわずかに検出された。これらの化合物の構造を高分解能ＭＳ及びＮＭＲ分析によって決定したところ、ｆａｓ４ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２の濾過物から得られる前記サイトカイニン様の化合物は、モノ・メチル化されたｉＰ（モノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（式（１））、以下、場合により「１ＭｅｉＰ」という）とジ・メチル化されたｉＰ（ジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（式（２））、以下、場合により「２ＭｅｉＰ」という）とであることが明らかになった。
【００１１】
【化１】
2017012011.tif 000002
【００１２】
また、本発明者らは、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの活性を調べるために、シロイヌナズナの野生型及びａｈｋ３ａｈｋ４の２重変異体（サイトカイニン認識機能が欠損している変異体）を、ｉＰ、ｔＺ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの存在下でそれぞれ生育させ、根の成長を観察した。その結果、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの存在下では、ｉＰ及びｔＺの存在下と同様に、野生型では主根成長が阻害されたのに対して、変異体では主根成長が阻害されなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。さらに、サイトカイニン情報伝達系の主要構成因子であり、外因性のサイトカイニンに応答して誘導されるタイプＡ  ＡＲＲ５及びＡＲＲ６の遺伝子発現は、ｉＰに応じた誘導と同様に、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの濃度に依存して誘導された（図６Ａ及び図６Ｂ）。これらの結果から、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰが標準的なサイトカイニンと同等の活性を有していることが明らかになった。
【００１３】
また、本発明者らは、植物体内での１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの安定性を調べるために、シロイヌナズナの野生型に１３Ｃラベルした等量のｉＰ（１３Ｃ−ｉＰ）、非ラベルの１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰを与えてこれらの植物体内における残存量を測定した。その結果、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰは１３Ｃ−ｉＰに比べて残存量が多く、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰはｉＰと比較して植物体内で安定であることが明らかになった。
【００１４】
さらに、本発明者らは、ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子にコードされるタンパク質の活性を調べるために、大腸菌においてｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子をそれぞれ外来的に共発現させて得られたタンパク質（以下、場合により、それぞれ「ＭＴ１」及び「ＭＴ２」という）の活性を測定した。その結果、ＭＴ１及びＭＴ２はいずれもジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＤＰ）は基質にせず、イソペンテニル二リン酸（ＩＤＰ）の側鎖末端を特異的にメチル化する酵素活性を有していることが明らかになった。さらに、イソペンテニル二リン酸とＭＴ１との反応、イソペンテニル二リン酸とＭＴ２との反応においては、それぞれ、互いに構造の異なる反応産物が得られることがガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）により明らかになった。すなわち、ＭＴ２によってイソペンテニル二リン酸の側鎖末端がモノ・メチル化され、更に二重結合部位の転移による異性化が起こった３メチル２ペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）が得られることが明らかになった。また、ＭＴ１によっては、構造決定にはいたらなかったものの、側鎖末端がモノ・メチル化されたイソペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＩＤＰ）が得られることが明らかになり、さらに、Ｍｅ−ＩＤＰをＭＴ２の基質にすることによって、イソペンテニル二リン酸がジ・メチル化、異性化された３エチル２ペンテニル二リン酸（２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）が得られることが明らかになった（図１）。また、ｆａｓ４遺伝子がコードするイソペンテニル基転移酵素（以下、場合により「ＦＡＳ４」という）によって、Ｍｅ−ＤＭＡＤＰからは１ＭｅｉＰが、２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰからは２ＭｅｉＰが、それぞれ得られることが明らかになった。図１に、ＭＴ１、ＭＴ２及びＦＡＳ４による１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの合成経路を示す。
【００１５】
これらのＭｅ−ＩＤＰ及びＭｅ−ＤＭＡＤＰは、イソペンタノールよりも炭素数が多く化石燃料の代替燃料としても有用性が高い、３−メチル−１−ペンタノール及び３−エチル−１−ペンタノールを簡便に合成することが可能な原料にもなる。図２に、Ｍｅ−ＩＤＰから得られる２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ、並びに、Ｍｅ−ＤＭＡＤＰをそれぞれ原料とする３−エチル−１−ペンタノール及び３−メチル−１−ペンタノールの合成経路を示す。
【００１６】
このように、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓから、ｉＰ等のサイトカイニンと同様の活性を有するメチル化サイトカイニン（１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰ）を同定し、前記メチル化サイトカイニンが、ｆａｓ４遺伝子がコードするイソペンテニル基転移酵素（Ｆａｓ４）と、ｆａｓ４遺伝子の上流に存在する２つのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子（ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子）がコードする２種のタンパク質（ＭＴ１及びＭＴ２）とによって生合成されることを見い出した。さらに、本発明者らは、前記２種のタンパク質（ＭＴ１及びＭＴ２）はいずれもイソペンテニル二リン酸を特異的にメチル化する酵素活性を有し、それらを利用することで高炭素数の分岐鎖状アルコールの原料となる化合物を効率的に製造することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、イソペンテニル二リン酸を特異的にメチル化することが可能なタンパク質を用いたイソペンテニル二リン酸のメチル化方法、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法、及びメチル化イソペンテニル二リン酸の用途に関し、より詳しくは、以下のとおりである。
【００１８】
［１］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をイソペンテニル二リン酸に接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むことを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１９】
［２］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むことを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２０】
［３］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をイソペンテニル二リン酸に接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むことを特徴とする、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２１】
［４］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むことを特徴とする、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２２】
［５］前記メチル化イソペンテニル二リン酸が３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸であることを特徴とする、［３］又は［４］に記載のメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法。
【００２３】
［６］［５］に記載の製造方法で得られた３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸を脱リン酸させ、還元させて３−メチル−１−ペンタノール又は３−エチル−１−ペンタノールを得ることを特徴とする、３−メチル−１−ペンタノール又は３−エチル−１−ペンタノールの製造方法。
【００２４】
［７］［５］に記載の製造方法で得られた３メチル２ペンテニル二リン酸又は３エチル２ペンテニル二リン酸にイソペンテニル基転移酵素を接触させてモノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン又はジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニンを得ることを特徴とする、モノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン又はジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニンの製造方法。
【００２５】
［８］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含有することを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２６】
［９］以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を含有することを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、新規なイソペンテニル二リン酸のメチル化方法及びメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法を提供することが可能となる。
【００２８】
また、本発明の方法によって得られるメチル化イソペンテニル二リン酸を用いることにより、化石燃料の代替燃料としても有用な高炭素数の分岐鎖状アルコールを容易に得ることが可能となる。さらに、本発明の方法によって得られるメチル化イソペンテニル二リン酸を用いることにより、サイトカイニンと同様の活性を有し、かつ、植物体内で安定なメチル化サイトカイニンを容易に得ることも可能となる。また、ＭＴ１及びＭＴ２はいずれもイソペンテニル二リン酸に対する基質特異性が高く副反応による副生成物の生成が少ないため、メチル化イソペンテニル二リン酸を効率的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの合成経路である。
【図２】３−メチル−１−ペンタノール及び３−エチル−１−ペンタノールの合成経路である。
【図３】実施例１で得られた培養生成物のマスクロマトグラムの結果を示すグラフである。
【図４Ａ】実施例１で得られた分子量２１８の化合物の高分解能エレクトロスプレー−イオン化質量分析の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例１で得られた分子量２３２の化合物の高分解能エレクトロスプレー−イオン化質量分析の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例１のｉＰ、ｔＺ及び１ＭｅｉＰと主根の長さとの関係を示すグラフである。
【図５Ｂ】実施例１のｉＰ、ｔＺ及び２ＭｅｉＰと主根の長さとの関係を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例１のｉＰ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの濃度とＡＲＲ５のＡＣＴ８に対する相対発現量との関係を示すグラフである。
【図６Ｂ】実施例１のｉＰ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの濃度とＡＲＲ６のＡＣＴ８に対する相対発現量との関係を示すグラフである。
【図７】実施例１の１３Ｃ−ｉＰ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの残存量を示すグラフである。
【図８Ａ】実施例２で得られた反応生成物のエレクトロスプレー−イオン化質量分析の結果を示すグラフ（ｍ／ｚ＝２４５）である。
【図８Ｂ】実施例２で得られた反応生成物のエレクトロスプレー−イオン化質量分析の結果を示すグラフ（ｍ／ｚ＝２５９）である。
【図８Ｃ】実施例２で得られた反応生成物のエレクトロスプレー−イオン化質量分析の結果を示すグラフ（ｍ／ｚ＝２７３）である。
【図９Ａ】イソプレノールのガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】プレノールのガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｃ】実施例２でＩＤＰ及びＭＴ２を用いて得られた反応生成物を脱リン酸させた後のガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｄ】３−メチル−２−ペンテン−１−オールのガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｅ】実施例２でＩＤＰ、ＭＴ１及びＭＴ２を用いて得られた反応生成物を脱リン酸させた後のガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｆ】３−エチル−２−ペンテン−１−オールのガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図９Ｇ】実施例２でＩＤＰ及びＭＴ１を用いて得られた反応生成物を脱リン酸させた後のガスクロマトグラフ質量分析の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３の高速液体クロマトグラフィー分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００３１】
＜イソペンテニル二リン酸のメチル化活性を有するタンパク質（ＭＴタンパク質）＞
本発明のイソペンテニル二リン酸のメチル化方法及びメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法は、イソペンテニル二リン酸のメチル化活性を有するタンパク質を用いるものである。
【００３２】
本発明において、イソペンテニル二リン酸のメチル化活性を有するタンパク質（ＭＴ１及びＭＴ２：以下、場合により「ＭＴタンパク質」と総称する）とは、イソペンテニル二リン酸の４位又は５位の炭素原子に結合した水素原子をメチル基に置換するメチル化活性を示すタンパク質（メチルトランスフェラーゼ）を意味する。
【００３３】
本発明者らは、上記のように、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓにおいて、ｆａｓ４遺伝子の上流に存在する２つのメチルトランスフェラーゼ様遺伝子（ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子）がコードする２種のタンパク質（ｍｔ１遺伝子がコードするタンパク質：ＭＴ１、ｍｔ２遺伝子がコードするタンパク質：ＭＴ２）がイソペンテニル二リン酸を特異的にメチル化する酵素活性を有することを見い出した。Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のｍｔ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のｍｔ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２に、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ１のアミノ酸配列を配列番号３に、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ２のアミノ酸配列を配列番号４に、それぞれ示す。したがって、本発明に係る「ＭＴタンパク質」の態様には、「（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質」が含まれる。
【００３４】
また、自然界において、ヌクレオチド配列の変異によってコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするＲ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のｍｔ１遺伝子及び／又はｍｔ２遺伝子のヌクレオチド配列情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列とは異なるが、イソペンテニル二リン酸をメチル化する酵素活性を維持した又はより向上させたＭＴ１及び／又はＭＴ２を調製することもできる。したがって、本発明に係る「ＭＴタンパク質」の他の態様には、「（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。ここで「複数」とは、改変後のタンパク質が、イソペンテニル二リン酸をメチル化する活性を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜数個（例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜４個、１〜２個）である。
【００３５】
このような改変体をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、例えば、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ１及びＭＴ２をコードする遺伝子（ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子）のヌクレオチド配列情報に基づき、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を利用して調製することが可能である。
【００３６】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードする遺伝子（ｍｔ１遺伝子及びｍｔ２遺伝子）のヌクレオチド配列情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ以外の他の菌から、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするポリヌクレオチド（相同遺伝子）をそれぞれ取得することが可能である。したがって、本発明にかかる「ＭＴタンパク質」の態様には、「（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質」も含まれる。
【００３７】
このような相同遺伝子を単離するためには、通常、厳密な条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％  ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３８】
さらに、このような方法にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。したがって、本発明に係る「ＭＴタンパク質」の態様には、「（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。配列の同一性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラムを利用して決定することができる。また、配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列との相同性は、それぞれ７０％以上あればよいが、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、更に好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
【００３９】
相同遺伝子がコードするＭＴタンパク質は、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓとは異なる微生物から単離された遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。このようなＭＴタンパク質としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ（ストレプトマイセス・ツルギジスカビエス（Ｓｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ））由来のＭＴ１及びＭＴ２が挙げられる。Ｓｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ由来のｍｔ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号５に、Ｓｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ由来のｍｔ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号６に、Ｓｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ由来のＭＴ１のアミノ酸配列を配列番号７に、Ｓｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ由来のＭＴ２のアミノ酸配列を配列番号８に、それぞれ示す。Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓとＳｔ．ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓとの間において、ｍｔ１遺伝子のヌクレオチド配列の相同性は７３％、ｍｔ２遺伝子のヌクレオチド配列の相同性は７４％、ＭＴ１のアミノ酸配列の相同性は７６．６％、ＭＴ２のアミノ酸配列の相同性は７３．９％である。
【００４０】
他方、例えば、イソペンテニル二リン酸と構造が一部共通する炭素数が１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）をメチル化する酵素としてゲラニル二リン酸メチルトランスフェラーゼ（ＧＰＰＭＴ）が知られているが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｓｔ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＧＰＰＭＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列とＲ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のｍｔ１遺伝子のヌクレオチド配列及びｍｔ２遺伝子のヌクレオチド配列との相同性はそれぞれ５４％及び５６％であり、Ｓｔ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＧＰＰＭＴのアミノ酸配列とＲ．ｆａｓｃｉａｎｓ由来のＭＴ１のアミノ酸配列及びＭＴ２のアミノ酸配列との相同性はそれぞれ３８．７％及び３９％である。なお、後述するとおり、本発明に係るＭＴ１及びＭＴ２により、イソペンテニル二リン酸はメチル化されるが、ゲラニル二リン酸はメチル化されない。
【００４１】
また、上述の各種ＭＴタンパク質が、イソペンテニル二リン酸をメチル化する活性を有していることは、例えば、イソペンテニル二リン酸及び必要に応じて塩化マグネシウム等を含む緩衝液と各ＭＴタンパク質とをインキュベーションし、インキュベーション後の溶液中にメチル化イソペンテニル二リン酸が得られることをガスクロマトグラフ質量分析等によって確認することで評価することができる（実施例２を参照のこと）。このような活性としては、例えば、得られたメチル化イソペンテニル二リン酸量から算出されるＫｃａｔが、ＭＴ１については配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質におけるＫｃａｔの５０％以上であることが好ましく、ＭＴ２については配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質におけるＫｃａｔの５０％以上であることが好ましい。
【００４２】
本発明に係るＭＴタンパク質は、公知の方法を適宜利用して得ることできる。例えば、先ず、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ等の目的の微生物から慣行法によってＭＴタンパク質をコードするＤＮＡを単離する。次いで、単離したＤＮＡを含む発現ベクターを調製し、これを宿主微生物に導入した形質転換体を培養してＭＴタンパク質を発現させることにより、培養物から本発明に係るＭＴタンパク質を組み換えタンパク質として得ることができる。
【００４３】
前記ＤＮＡの単離方法としては、例えば、目的の微生物から抽出したゲノムＤＮＡ、又は、目的の微生物から抽出したｍＲＮＡを基に合成したｃＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等のベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、ｍｔ１遺伝子（例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列）及びｍｔ２遺伝子（例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列）に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する方法；ｍｔ１遺伝子（例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列）及びｍｔ２遺伝子（例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列）に基づいて作成したプライマーを用いて、目的の微生物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；人工的に化学合成する方法が挙げられる。
【００４４】
前記発現ベクターは、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含むベクターであり、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主微生物に導入された場合、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。前記発現ベクターの構築の手順及び方法は、公知の方法を適宜利用することができる。また、前記発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入してＭＴタンパク質を発現させるために、本発明に係るＭＴタンパク質をコードするＤＮＡの他に、その発現を制御するポリヌクレオチド配列や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが好ましい。前記発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、又はシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００４５】
前記宿主微生物としては、特に限定されず、例えば、糸状菌、酵母、大腸菌、放線菌などが挙げられる。また、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。これらの微生物に前記発現ベクターを導入する形質転換は、公知の方法に従って実施することができる。本発明に係るＭＴタンパク質は、こうして調製した形質転換体を適当な培地で培養することにより、その培養物（例えば培養微生物細胞）から回収することができる。形質転換体の培養条件としては、例えば、宿主微生物の培養条件を適用することができる。また、培養物からＭＴタンパク質を回収する方法としては、例えば、ＭＴタンパク質を宿主微生物（例えば大腸菌）内で発現させ、形質転換体の培養終了後、培養微生物細胞を遠心分離や濾過等によって回収し、細胞を破砕して得られる液を粗酵素として用いることもできる。さらに、この上清液を、限外濾過法等によって濃縮し、防腐剤等を加えて濃縮酵素とすることもできる。また、前記粗酵素又は前記濃縮酵素を、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製してもよい。或いは、精製用タグを付加したＭＴタンパク質を宿主微生物（例えば大腸菌）内で発現させ、その粗抽出液をタグ付きタンパクの精製用カラムに通した後にタグ付きタンパク質を溶出させることで精製してもよい。
【００４６】
＜イソペンテニル二リン酸のメチル化方法、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法＞
本発明は、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をイソペンテニル二リン酸に接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むイソペンテニル二リン酸のメチル化方法、並びに、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をイソペンテニル二リン酸に接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法を提供する。
【００４７】
本発明においては、図１に示すように、ＭＴ１をイソペンテニル二リン酸に接触させることにより、イソペンテニル二リン酸の５位がモノ・メチル化されたモノメチルイソペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＩＤＰ）が得られる。また、ＭＴ２をイソペンテニル二リン酸に接触させることにより、４位がモノ・メチル化され、更に二重結合部位の転移による異性化が起こった３メチル２ペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）が得られる。さらに、ＭＴ１及びＭＴ２をイソペンテニル二リン酸に接触させることにより、ＭＴ１によって得られたＭｅ−ＩＤＰがＭＴ２によって更にメチル化され、イソペンテニル二リン酸がジ・メチル化され、更に異性化された３エチル２ペンテニル二リン酸（２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）が得られる。なお、ＭＴ２によって得られたＭｅ−ＤＭＡＤＰは、ＭＴ１及びＭＴ２によっては更にメチル化されない。また、ＭＴ１及びＭＴ２は基質特異性が高く、例えば、イソペンテニル二リン酸の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＤＰ）や、イソペンテニル二リン酸と構造が一部共通するゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）はＭＴ１及びＭＴ２の基質にはならない。
【００４８】
前記接触方法としては、イソペンテニル二リン酸及び必要に応じて塩化マグネシウム等を含む緩衝液に、ＭＴ１及び／又はＭＴ２を添加してインキュベーションする方法が挙げられる（実施例２を参照のこと）。また、２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰを得る場合には、先ずＭＴ１を添加して反応液中のイソペンテニル二リン酸を反応させてＭｅ−ＩＤＰを得た後にＭＴ２を添加することが好ましい。
【００４９】
前記インキュベーションの条件としては、酵素反応が阻害されない条件であれば特に制限されず、例えば、１５〜３７℃において０．１〜２４時間であることが好ましい。また、イソペンテニル二リン酸の濃度としては、反応液中に５〜５００μＭであることが好ましく、ＭＴタンパク質の濃度としては、反応液中に１〜２０μＭであることが好ましい。
【００５０】
ＭＴ１及びＭＴ２としては、精製、粗精製、或いは濃縮されたタンパク質の形態で用いることができ、例えば、上記ＭＴタンパク質の調製において述べた方法で得られる粗酵素、濃縮酵素、及びこれらの精製物を用いてもよい。また、ＭＴ１及びＭＴ２の基質となるイソペンテニル二リン酸としては、特に制限されず、植物体内や微生物体内で合成されたものであっても化学的に合成されたものであってもよい。
【００５１】
さらに、前記接触方法としては、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を含む培養系において発現させたＭＴ１及び／又はＭＴ２と接触させてもよい。したがって、本発明は、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてイソペンテニル二リン酸をメチル化せしめる工程を含むことを特徴とする、イソペンテニル二リン酸のメチル化方法、並びに、ＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を培養して発現させた組み換えタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程を含むことを特徴とする、メチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法を提供する。
【００５２】
前記形質転換体及びその培養方法としては、例えば、上記ＭＴタンパク質の調製において述べた形質転換体及びその培養方法が挙げられる。前記形質転換体としては、ＭＴ１を調製する場合にはＭＴ１をコードするＤＮＡが導入された形質転換体、ＭＴ２を調製する場合にはＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体、ＭＴ１とＭＴ２との混合組成物を調製する場合にはＭＴ１をコードするＤＮＡ及びＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体が挙げられる。また、後述するサイトカイニンを製造することを目的とする場合には、工程数が少なく簡易であるという観点から、前記形質転換体としては、更にＦＡＳ４をコードするＤＮＡが導入された形質転換体であることが好ましい。なお、複数種のタンパク質をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入する場合、それらは同一の発現ベクター上にあっても別の発現ベクター上にあってもよい。
【００５３】
また、培養系において発現させたＭＴ１及び／又はＭＴ２と接触させるイソペンテニル二リン酸は、培養系に添加されたイソペンテニル二リン酸であってもよく、当該培養系における前記形質転換体内で合成されたものであってもよく、それらの両方であってもよい。
【００５４】
本発明においては、連続的に基質及びＭＴタンパク質の供給が可能であり、かつ、工程数が少なく簡易であるという観点から、前記形質転換体においてＭＴタンパク質を発現させると共に基質となるイソペンテニル二リン酸を合成させて、イソペンテニル二リン酸とＭＴ１及び／又はＭＴ２とを培養物中で接触させ、培養物中にメチル化イソペンテニル二リン酸を得ることが好ましい。このような形質転換体を調製するために用いられる宿主微生物としては、ほとんどの宿主微生物となり得る微生物においてイソペンテニル二リン酸は合成され、例えば、上記ＭＴタンパク質の調製において述べた宿主微生物が挙げられる。これらの中でも、イソペンテニル二リン酸を大量に合成可能であることから、放線菌が好ましい。
【００５５】
なお、培養物中に得られたメチル化イソペンテニル二リン酸は、形質転換体の培養終了後、培養微生物細胞を遠心分離や濾過等によって除去して得られる上清液を、例えば、塩析法、有機溶媒抽出法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて精製することによって回収することができる。
【００５６】
＜イソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物＞
本発明は、上記のＭＴ１及び／又はＭＴ２を含有するイソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物、並びに、上記のＭＴ１及び／又はＭＴ２をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を含有するイソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物を提供する。
【００５７】
本発明のイソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物としては、前記ＭＴタンパク質又はＭＴタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換体以外に、他のタンパク質、培養液、担体又は媒体、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等が更に含有されていてもよい。他のタンパク質としては、例えば、イソペンテニル基転移酵素活性を有するＦＡＳ４、サイトカイニン活性化酵素、牛血清アルブミン等が挙げられる。
【００５８】
本発明のイソペンテニル二リン酸のメチル化用組成物を用いることにより、上記の方法でＭＴタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させて該イソペンテニル二リン酸をメチル化せしめることができる。ＭＴ１を含有する組成物を用いることでＭｅ−ＩＤＰが；ＭＴ２を含有する組成物を用いることでＭｅ−ＤＭＡＤＰが；ＭＴ１及びＭＴ２を含有する組成物を用いるか、又は、ＭＴ１を含有する組成物の後にＭＴ２を含有する組成物を用いることで２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰが；それぞれ得られる。また、例えば、ＭＴ２及びＦＡＳ４を含有する組成物を用いるか、又は、ＭＴ２を含有する組成物の後にＦＡＳ４を含有する組成物を用いることで１ＭｅｉＰが；ＭＴ１、ＭＴ２及びＦＡＳ４を含有する組成物を用いるか、又は、ＭＴ１を含有する組成物、ＭＴ２を含有する組成物、ＦＡＳ４を含有する組成物を順に用いることで２ＭｅｉＰが；それぞれ得られる。
【００５９】
＜アルコールの製造＞
本発明のメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法において得られたメチル化イソペンテニル二リン酸は、二リン酸を脱リン酸させ、炭素−炭素二重結合を還元させることによって、高炭素数の分岐鎖状アルコールを容易に得ることができる。図２に示すように、メチル化イソペンテニル二リン酸がＭＴ２によって得られた３メチル２ペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）である場合、得られるアルコールは３−メチル−１−ペンタノールであり、メチル化イソペンテニル二リン酸がＭＴ１及びＭＴ２によって得られた３エチル２ペンテニル二リン酸（２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）である場合、得られるアルコールは３−エチル−１−ペンタノールである。イソペンタノールは分岐鎖状アルコールであるため化石燃料の代替燃料として有用であるが、３−メチル−１−ペンタノール及び３−エチル−１−ペンタノールはイソペンタノールよりも炭素数が更に多いため、化石燃料の代替燃料として更に有用である。
【００６０】
前記脱リン酸の方法としては、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、プロテインホスファターゼを用いる方法、アルカリフォスファターゼを用いる方法、酸性フォスファターゼを用いる方法等が挙げられる。前記還元の方法としても、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、水素を添加する方法や、プレニルレダクターゼを用いる方法等が挙げられる。前記脱リン酸及び還元は同時に行っても、脱リン酸の後に還元を行っても、還元の後に脱リン酸を行ってもよい。
【００６１】
＜サイトカイニンの製造＞
本発明のメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法において得られたメチル化イソペンテニル二リン酸は、イソペンテニル基転移酵素を接触させることにより、メチル化サイトカイニンを容易に得ることができる。図１に示すように、メチル化イソペンテニル二リン酸がＭＴ２によって得られた３メチル２ペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）である場合、得られる化合物はｉＰがモノ・メチル化されたモノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（１ＭｅｉＰ）であり、メチル化イソペンテニル二リン酸がＭＴ１及びＭＴ２によって得られた３エチル２ペンテニル二リン酸（２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）である場合、得られる化合物はｉＰがジ・メチル化されたジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（２ＭｅｉＰ）である。これらのメチル化サイトカイニン（メチル化されたｉＰ）はｉＰ等の標準的なサイトカイニンと同等の活性を有しており、かつ、ｉＰと比較して植物体内で安定であるため、新規のサイトカイニンとして有用である。
【００６２】
前記イソペンテニル基転移酵素としては、例えば、ｆａｓ４遺伝子にコードされるＦＡＳ４が挙げられる。
【００６３】
前記接触方法としては、メチル化イソペンテニル二リン酸（Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ又は２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ）及び必要に応じて塩化マグネシウム等を含む緩衝液に、イソペンテニル基転移酵素を添加してインキュベーションする方法が挙げられる。
【００６４】
前記メチル化イソペンテニル二リン酸としては、例えば、上記のイソペンテニル二リン酸のメチル化方法又はメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法で得られるものを用いることができる。また、上記のイソペンテニル二リン酸のメチル化方法又はメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法に用いられる形質転換体を含む培養系にイソペンテニル基転移酵素を添加してインキュベーションしてもよい。
【００６５】
さらに、本発明のサイトカイニンの製造においては、上記のイソペンテニル二リン酸のメチル化方法又はメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法に用いられる形質転換体として、ＦＡＳ４をコードするＤＮＡが更に導入された形質転換体を用いることが好ましい。それにより、培養物中において発現したＭＴタンパク質とイソペンテニル二リン酸とを接触させてメチル化イソペンテニル二リン酸を得る工程と、メチル化イソペンテニル二リン酸にＦＡＳ４を接触させてメチル化サイトカイニンを得る工程とを連続的に実施することができるため、工程数が少なく簡易に、前記メチル化サイトカイニンを得ることができる。このような形質転換体としては、ＭＴ１をコードするＤＮＡ及びＦＡＳ４をコードするＤＮＡ；ＭＴ２をコードするＤＮＡ及びＦＡＳ４をコードするＤＮＡ；又はＭＴ１をコードするＤＮＡ、ＭＴ２をコードするＤＮＡ及びＦＡＳ４をコードするＤＮＡ；がそれぞれ宿主微生物に導入された形質転換体が挙げられる。
【００６６】
なお、培養物中に得られたメチル化サイトカイニンは、形質転換体の培養終了後、培養細胞を遠心分離や濾過等によって除去して得られる上清液を、例えば、塩析法、有機溶媒抽出法、固相抽出法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて精製することによって回収することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記の実施例において、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓとしては、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）から入手したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ６１６２（ＡＴＣＣ  ３５０１４、Ｔｉｌｆｏｒｄ  １９３６）を用いた。
【００６８】
（実施例１）
＜培養生成物の調製−メチル化サイトカイニンの製造−＞
先ず、ｍｔ１遺伝子の翻訳領域（ｍｔ１、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＪＮ０９３０９１、領域：７６２９１−７７１４２）及びｍｔ２遺伝子の翻訳領域（ｍｔ２、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＪＮ０９３０９７、領域：７７１８２−７８０３３）を、ＰＣＲ法を用いてＲ．ｆａｓｃｉａｎｓから抽出したＤＮＡを鋳型としてそれぞれ増幅させた。また、ｆａｓ４遺伝子の翻訳領域（ｆａｓ４、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｚ２９６３５、領域：４２６７−５０３４）についても、ＰＣＲ法を用いてＲ．  ｆａｓｃｉａｎｓから抽出したＤＮＡを鋳型として増幅させた。次いで、得られた各ＰＣＲ産物を、ｆａｓ４ｍｔ１、ｆａｓ４ｍｔ２、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２の組み合わせとなるようにｐＣＯＬＤ−ＩＶベクター（タカラ社製）に導入し、発現ベクターを調製した。各発現ベクターをｐＧ−Ｔｆ２で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、アンピシリンを用いて形質転換体を選抜し、変更Ｍ９培地（組成：１Ｍ  ソルビトール、１×Ｍ９塩、１％  カザミノ酸、２％  スクロース、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ  塩化カルシウム、５μｇ／ｍＬ  チアミン、２．５ｍＭ  ベタイン、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン、２５μｇ／ｍＬ  カナマイシン、２０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍＬ  テトラサイクリン、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）において、１５℃で２０時間培養した。
【００６９】
培養終了後、０．４５μｍの膜濾過を行って培養物を濾過し、セルフリーの大腸菌濾過液を、ＳＰＥカートリッジ（ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ  ６ｇ、次いで、１Ｍのギ酸で平衡化したＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ  ６ｇ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に通した。次いで、ＭＣＸカートリッジをメタノール及び０．３５Ｍ  ＮＨ４ＯＨで順に洗浄した後、０．３５Ｍ−ＮＨ４ＯＨの６０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液を用いて培養生成物を溶出させた。溶出液は乾燥させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−ＬＨ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製し、得られた画分は、セミ分取ＨＰＬＣ（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８、５．０μｍ、１９×１００ｍｍ、流量：６ｍＬ／ｍｉｎ、移動相：２％（ｖ／ｖ）の酢酸を含むアセトニトリル）によって更に精製した。
【００７０】
＜培養生成物の分析＞
先ず、得られた培養生成物について、質量分析を実施した。エレクトロスプレー−イオン化四重極型タンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ｑＭＳＭＳ）は、Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、ＵＰＬＣは、ＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＯＤＳカラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を使い、２成分の傾斜濃度勾配（溶媒Ａ：０．０６％（ｖ／ｖ）酢酸；溶媒Ｂ：０．０６％（ｖ／ｖ）酢酸  メタノール）を２５０μＬ／ｍｉｎの流速で用いた。分離には９９％の溶媒Ａ及び１％の溶媒Ｂから、５５．０％  溶媒Ａ＋４５．０％  溶媒Ｂへと直線的に４分間で濃度上昇させた後、３０．０％  溶媒Ａ＋７０．０％  溶媒Ｂへと直線的に３分間で濃度上昇させ、その後、１．０％  溶媒Ａ＋９９．０％  溶媒Ｂに１分間で上昇させた。その後、４分間で９９．０％  溶媒Ａ＋１．０％  溶媒Ｂに戻し、数分間平衡化させた。また、キャピラリーは３．１３ｋＶの電圧で保持した。その結果、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ２の濾過物からはいずれも、分子量２１８の化合物と一致するピーク、及び、分子量２３２の化合物と一致するピークが検出された。図３には、得られた培養生成物のマスクロマトグラムの結果を示す。図３において、（ａ）から（ｅ）は、サイトカイニンの基本骨格であるアデニン環に由来する物質をｍ／ｚ＝１３６でモニターしたもの、（ｆ）及び（ｇ）は、それぞれ、ｍ／ｚ＝２１８及び２３２でモニターしたものであり、ピーク２は分子量２１８の化合物と一致するピーク、ピーク３は分子量２３２の化合物と一致するピークである。また、図３中、ｆａｓ４ｍｔ１、ｆａｓ４ｍｔ２、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２は、遺伝子が当該組み合わせとなるように調製した発現ベクターを導入した形質転換体の培養物から得られた培養生成物、Ｅｍｐは上記ＤＮＡを含まない発現ベクターを導入した形質転換体の培養物から得られた培養生成物を、それぞれ用いた結果を示し、ＳｔａｎｄａｒｄはｉＰ（分子量２０４）を用いた結果を示す。
【００７１】
また、得られた培養生成物のうち、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ２の濾過物から得られた、分子量２１８の化合物及び分子量２３２の化合物について、高分解能質量分析器Ｑ-Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてフラグメンテーションパターンの分析と、解析プログラムＭａｓｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によるフラグメントの構造解析予測を行った。図４Ａに分子量２１８の化合物について得られた結果を、図４Ｂに分子量２３２の化合物について得られた結果を、それぞれ示す。
【００７２】
また、得られた培養生成物のうち、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ２の濾過物から得られた、分子量２１８の化合物、及び、分子量２３２の化合物について、ＮＭＲ分析を実施した。ＮＭＲスペクトルはＡｖａｎｃｅｌｌ−７００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ社製、１Ｈ：７００．１５４ＭＨｚ、１３Ｃ：１７６．０６１  ＭＨｚ）、５ｍｍφのｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅを備えた低温プローブを用いて２９８Ｋで測定した。結果を以下に示す。
【００７３】
分子量２１８の化合物：
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝１２．８６（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），５．３２（ｔ，６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），１．９８（ｑ，６．９３  Ｈｚ，２Ｈ），１．７（ｓ，３Ｈ），０．９５（ｔ，７．３９Ｈｚ，  ３Ｈ）；
分子量２３２の化合物：
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝１２．９１（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），５．２５（ｔ，６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），２．１３（ｑ，７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９９（ｑ，７．３Ｈｚ，２Ｈ），０．９７（ｔ，７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｔ，７．４Ｈｚ，３Ｈ）。
【００７４】
以上の結果から、ｆａｓ４ｍｔ１ｍｔ２及びｆａｓ４ｍｔ２の組み合わせとなるように調製した発現ベクターを導入した形質転換体の培養物から得られた培養生成物は、モノメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（１ＭｅｉＰ、分子量２１８）及びジメチルＮ６−（Δ２−イソペンテニル（２ＭｅｉＰ、分子量２３２）であることが確認された。
【００７５】
＜１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの評価＞
ｉＰ、ｔＺ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰを水で１００ｎＭに希釈し、これをそれぞれ含む寒天プレート上においてシロイヌナズナの野生株（ＷＴ、コロンビア種（Ｃｏｌ−０））及びＣＫ受容体ａｈｋ３ａｈｋ４の２重変異体（ａｈｋ３ａｈｋ４、Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍら、ＰＮＡＳ、２００４年、１０１（２３）、８８２１−８８２６頁に記載の変異体）を発芽させ、根の成長を観察した。７日間生育後の主根の長さを示すグラフを図５Ａ〜図５Ｂに示す。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは、ｉＰ、ｔＺ、１ＭｅｉＰ又は２ＭｅｉＰを用いずに生育させた結果を示す。
【００７６】
また、ｉＰ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの濃度が０〜１０−６Ｍとなるように水で希釈した溶液をそれぞれ準備し、２２℃において、蛍光灯（１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、１６時間点灯／８時間消灯  サイクル）の下で２週間生育させたＷＴの根に各溶液をそれぞれ真空で１時間浸透させ、その後直ちに液体窒素（−８０℃）で凍らせた。次いで、ＲＮＥａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、遺伝子特異的プライマー、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及びＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、各植物体におけるＡＲＲ５、ＡＲＲ６及びＡＣＴ８の遺伝子発現解析を行った。ＡＲＲ５及びＡＲＲ６のＡＣＴ８に対する相対発現量（％）を示すグラフを図６Ａ及び図６Ｂにそれぞれ示す。
【００７７】
さらに、１３ＣでラベルしたｉＰ、非ラベルの１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの濃度が１μＭとなるように水で希釈した溶液をそれぞれ準備し、２２℃において、蛍光灯（１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、１６時間点灯／８時間消灯  サイクル）の下で２週間生育させたＷＴの苗の根に各溶液をそれぞれ真空で１時間浸透させた。次いで、苗を水に移し、一定の時間間隔で苗を回収して各植物体内における１３Ｃ−ｉＰ、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰの残存量を定量した。結果を図７に示す。
【００７８】
以上の結果から、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰは標準的なサイトカイニンと同等の活性を有しており、かつ、ｉＰに比べて植物体内で安定であることが確認された。また、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰは、Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓに感染したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ  ｃｖ．  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ）の葉において検出されることも確認された。
【００７９】
（実施例２）
＜培養生成物の調製−ＭＴタンパク質の調製−＞
先ず、ｍｔ１遺伝子の翻訳領域及びｍｔ２遺伝子の翻訳領域を、ＰＣＲ法を用いてＲ．ｆａｓｃｉａｎｓから抽出したＤＮＡを鋳型としてそれぞれ増幅させた。次いで、得られた各ＰＣＲ産物をそれぞれｐＣＯＬＤ−Ｉベクター（タカラ社製）に導入して発現ベクターを調製した。各発現ベクターをｐＧ−Ｔｆ２で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、アンピシリンを用いて形質転換体を選抜し、変更Ｍ９培地（組成：１Ｍ  ソルビトール、１×Ｍ９塩、１％  カザミノ酸、２％  スクロース、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ  塩化カルシウム、５μｇ／ｍＬ  チアミン、２．５ｍＭ  ベタイン、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン、２５μｇ／ｍＬ  カナマイシン、２０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍＬ  テトラサイクリン、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）において、１５℃で２０時間培養した。
【００８０】
培養終了後、遠心によって大腸菌細胞を回収し、Ｌｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  βメルカプトエタノール、１０ｍＭ  イミダゾール）にけん濁し、塩化リゾチーム処理（１ｍｇ／ｍＬ）で細胞壁を消化した。その後、超音波処理で細胞膜を破壊し、遠心によって不溶物を除いた上清を、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｏｓｅカラム（キアゲン社製）に通し、洗浄バッファー（５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  βメルカプトエタノール、２０ｍＭ  イミダゾール、１５％  グリセロール）でカラムを洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  βメルカプトエタノール、２５０ｍＭ  イミダゾール、１５％  グリセロール）で溶出することにより、発現させたＭＴタンパク質（Ｈｉｓタグ−組み換えタンパク質）をそれぞれ得た。ｍｔ１を含む発現ベクターを導入した形質転換体の培養物から得られたタンパク質をＭＴ１、ｍｔ２を含む発現ベクターを導入した形質転換体の培養物から得られたタンパク質をＭＴ２とした。
【００８１】
＜ＭＴタンパク質の活性評価−イソペンテニル二リン酸（ＩＤＰ）のメチル化−＞
各培養生成物から得られたＭＴ１及びＭＴ２の濃度がそれぞれ４０μｇ／１００μＬとなるように、ＭＴバッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、０．５ｍＭのジチオスレイトール）、２．５ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ、和光純薬社製）、基質として１００μＭのＩＤＰ、ＤＭＡＤＰ又はＧＰＰと混合して全量を１００μＬとし、３０℃で２０時間反応させた（ＭＴ１、ＭＴ２）。また、ＭＴ１及びＭＴ２の濃度がいずれも４０μｇ／１００μＬとなるように組み合わせ、前記ＭＴバッファ、２．５ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ、和光純薬社製）、１００μＭのＩＤＰ、ＤＭＡＤＰ又はＧＰＰと混合して全量を１００μＬとし、３０℃で２０時間反応させた（ＭＴ１＋ＭＴ２）。
【００８２】
各反応生成物について、エレクトロスプレー−イオン化質量分析を行った。エレクトロスプレー−イオン化質量分析（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ  ２０００（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、ＨＰＬＣは、ＡＳ１１−ＨＣカラム（２５０×２ｍｍ、１３μＭ、Ｄｉｏｎｅｘ社製）を使い、２成分の傾斜濃度勾配（溶媒Ａ：０．０５％（ｖ／ｖ）アンモニア水、９％（ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ  １０．６；溶媒Ｂ：１Ｍアンモニウム・ギ酸塩、９％（ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ  ９．３）を２５０μＬ／ｍｉｎの流速で用いた。分離には９５％の溶媒Ａ及び５％の溶媒Ｂから、１００％の溶媒Ｂへと直線的に４０分間で濃度上昇させ、その後２０分間の平衡状態を保った。また、キャピラリーは３．５ｋＶの電圧において２５０℃で保持した。結果を図８Ａ〜図８Ｃに示す。図８ＡはＩＤＰ及びＤＭＡＤＰ（いずれもｍ／ｚ＝２４５）のピークを、図８Ｂはｍ／ｚ＝２５９に近い分子量を有する化合物のピークを、図８Ｃはｍ／ｚ＝２７３に近い分子量を有する化合物のピークを、それぞれ示す。また、図中、ｃｏｎｔｒｏｌは、たんぱく質を添加せずに得られた生成物の分析結果を示す。これより、ＭＴ１又はＭＴ２によってＩＤＰから分子量がｍ／ｚ＝２５９に近い化合物が、ＭＴ１及びＭＴ２によってＩＤＰから分子量がｍ／Ｚ＝２７３に近い化合物が、それぞれ得られることが確認された。
【００８３】
さらに、各反応生成物について、それぞれアルカリホスファターゼ（タカラ社製）を添加して１５〜３０分間反応させて脱リン酸させ、反応物をジエチルエーテルで抽出して精製し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を留去して、ｎ−ヘキサンに懸濁させた。得られたヘキサン懸濁液について、５９７５Ｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ａｘｉｓ  ｍａｓｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を備えた７８９０Ａ  ＧＣシステムを用いてフラグメンテーションパターンのガスクロマグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。ＩＤＰ及びＭＴ２を用いて得られた反応生成物、ＩＤＰ、ＭＴ１及びＭＴ２を用いて得られた反応生成物、ＩＤＰ及びＭＴ１を用いて得られた反応生成物の分析結果を、それぞれ順に、図９Ｃ、図９Ｅ及び図９Ｇに示す。また、イソプレノール、プレノール、３−メチル−２−ペンテン−１−オール、３−エチル−２−ペンテン−１−オールを用いて得られた反応生成物の分析結果を、それぞれ順に、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｄ、及び図９Ｆに示す。
【００８４】
以上の結果から、ＭＴ２によってＩＤＰの４位がモノ・メチル化され異性化が起こったＭｅ−ＤＭＡＤＰ（ｍ／ｚ＝２５９）が、ＭＴ１及びＭＴ２によって、ＩＤＰがジ・メチル化され異性化が起こった２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰ（ｍ／ｚ＝２７３）が、それぞれ得られることが確認された。なお、入手可能な標品とのフラグメントパターンが一致しなかったことから構造の同定にはいたらなかったものの、ＭＴ１によってＩＤＰがモノ・メチル化されることは確認された。さらに、ＭＴ１及びＭＴ２を用いてもＤＭＡＤＰ及びＧＰＰはメチル化されず、ＭＴ１及びＭＴ２はＩＤＰに対して高い基質特異性を有していることが確認された。
【００８５】
（実施例３）
＜培養生成物の調製＞
先ず、ｆａｓ４遺伝子の翻訳領域を、ＰＣＲ法を用いてＲ．ｆａｓｃｉａｎｓから抽出したＤＮＡを鋳型として増幅させた。次いで、得られた各ＰＣＲ産物をｐＣＯＬＤ−Ｉベクター（タカラ社製）に導入して発現ベクターを調製し、実施例２に記載の方法と同様にして精製し、Ｈｉｓタグ−組み換えタンパク質（ＦＡＳ４）を得た。また、実施例２と同様にしてＭＴ１及びＭＴ２を得た。
【００８６】
＜連続的な活性の評価−メチル化サイトカイニンの製造−＞
ＭＴ１又はＭＴ２の濃度が４０μｇ／１００μＬとなるように、ＭＴバッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、０．５ｍＭのジチオスレイトール）、２．５ｍＭのＳＡＭ（和光純薬社製）及び１００μＭのＩＤＰと混合して全量を１００μＬとし、３０℃で２０時間反応させた（ＭＴ１、ＭＴ２）。次いで、ＦＡＳ４が４０μｇ／１００μＬとなるように更に添加して２５℃で２時間反応させた。また、一方のＭＴタンパク質（ＭＴ１又はＭＴ２）を用いて上記条件で反応させた後、他方のＭＴタンパク質（ＭＴ２又はＭＴ１）が４０μｇ／１００μＬとなるように更に添加して３０℃で２０時間反応させ（ＭＴ１−＞ＭＴ２、ＭＴ２−＞ＭＴ１）、更にその後、ＦＡＳ４が４０μｇ／１００μＬとなるように更に添加して２５℃で２時間反応させた。
【００８７】
各反応生成物について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５／ＺＱ−ＭＳ２０００、Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ＯＤＳカラム（５μｍ、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで０．１％  酢酸の状態からメタノールの直線グラジエント（０％で１ｍｉｎ、０〜５０％まで１５ｍｉｎで上昇、その後、５０〜７０％まで６ｍｉｎで上昇）で分析を行った。結果を図１０に示す。
【００８８】
以上の結果から、ＭＴ２によって得られたＭｅ−ＤＭＡＤＰはＦＡＳ４によって１ＭｅｉＰとなり、ＭＴ１、ＭＴ２の順に作用させて得られた２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰはＦＡＳ４によって２ＭｅｉＰとなることが確認された。また、ＭＴ１によって得られたＭｅ−ＩＤＰはＦＡＳ４の基質にはならず、ＭＴ２、ＭＴ１の順に作用させても２Ｍｅ−ＤＭＡＤＰはわずかしか得られなかった。これより、１ＭｅｉＰ及び２ＭｅｉＰは図１に示す経路で合成されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上説明したように、本発明によれば、新規なイソペンテニル二リン酸のメチル化方法及びメチル化イソペンテニル二リン酸の製造方法を提供することが可能となる。
【００９０】
また、本発明の方法によって得られるメチル化イソペンテニル二リン酸を用いることにより、化石燃料の代替燃料としても有用な高炭素数の分岐鎖状アルコールを容易に得ることが可能となる。さらに、本発明の方法によって得られるメチル化イソペンテニル二リン酸を用いることにより、サイトカイニンと同様の活性を有し、かつ、植物体内で安定なメチル化サイトカイニンを容易に得ることも可能となる。また、ＭＴ１及びＭＴ２はいずれもイソペンテニル二リン酸に対する基質特異性が高く副反応による副生成物の生成が少ないため、メチル化イソペンテニル二リン酸を効率的に製造することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号：１
＜２２３＞  ロドコッカス・ファシアンス  ｍｔ１
配列番号：２
＜２２３＞  ロドコッカス・ファシアンス  ｍｔ２
配列番号：３
＜２２３＞  ロドコッカス・ファシアンス  ＭＴ１
配列番号：４
＜２２３＞  ロドコッカス・ファシアンス  ＭＴ２
配列番号：５
＜２２３＞  ストレプトマイセス・ツルギジスカビエス  ｍｔ１
配列番号：６
＜２２３＞  ストレプトマイセス・ツルギジスカビエス  ｍｔ２
配列番号：７
＜２２３＞  ストレプトマイセス・ツルギジスカビエス  ＭＴ１
配列番号：８
＜２２３＞  ストレプトマイセス・ツルギジスカビエス  ＭＴ２
【図１】
2017012011.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2017012011.tif 000011
【図７】
2017012011.tif 000012
【図８Ａ】
2017012011.tif 000013
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2017012011.tif 000015
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2017012011.tif 000017
【図９Ｃ】
2017012011.tif 000018
【図９Ｄ】
2017012011.tif 000019
【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【配列表】
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