(57)【要約】      （修正有）【課題】低侵襲な手法で、膵癌の前癌病変であるＩＰＭＮと膵癌を識別して、これらの疾患の罹患の有無を検査する技術の提供。【解決手段】体液中のエクソソーム中に、膵管内乳頭粘液腫瘍に特有のＲＮＡ分子と膵癌に特有のＲＮＡ分子が存在しており、これらをバイオマーカーとして使用することによって、低侵襲な手法で、膵管内乳頭粘液腫瘍と膵癌を識別して、これらの疾患の罹患の有無を検査することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子からなる、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断に使用するバイオマーカー。
【請求項２】
膵管内乳頭粘液腫瘍の診断に使用するバイオマーカーであって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１〜３に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
膵癌の診断に使用するバイオマーカーであって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
被験者から採取された体液中のエクソソームから、配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を検出する工程を含む、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の検査方法。
【請求項５】
前記体液が血液である、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
膵管内乳頭粘液腫瘍の検査方法であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１〜３に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４又は５に記載の検査方法。
【請求項７】
膵管内乳頭粘液腫瘍の検査方法であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４又は５に記載の検査方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分子の検出が、次世代シーケンサー法によって行われ、
エクソソームから抽出された全ＲＮＡの逆転写反応が、下記(i)のＬＮＡ及び／又は(ii)のＬＮＡの存在下で行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
(i)配列番号１１に示す塩基配列からなり、第１位、第８位、第１１位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
(ii)配列番号１２に示す塩基配列からなり、第１位、第４位、第９位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
【請求項９】
配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を検出する試薬を含む、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断薬。
【請求項１０】
前記試薬が、前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能なプライマー又はプローブである、請求項９に記載の診断薬。
【請求項１１】
配列番号１１に示す塩基配列からなり、第１位、第８位、第１１位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
【請求項１２】
配列番号１２に示す塩基配列からなり、第１位、第４位、第９位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断に使用するためのバイオマーカーに関する。また、本発明は、当該バイオマーカーを用いた膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の検査方法に関する。更に、本発明は、当該検査方法に使用される膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会を迎え、悪性腫瘍の治療は国民的な課題になっている。癌の対策には、早期発見によって低悪性度の状態で適切な治療を行うことが重要であり、癌の診断技術について精力的な検討が行われている。
【０００３】
癌の中でも、膵癌は、非常に悪性度が高く、進行が速い悪性腫瘍であることが知られている。一方、従来の血液検査技術では、膵癌の検出感度が低く、低悪性度の状態で早期に発見することができないという問題点がある。低悪性度の膵癌は、造影ＣＴや造影ＭＲＩ等の画像診断によって検出することが可能であるが、早期の膵癌は自覚症状が殆どないこと、造影剤の副作用の発現の問題があること、造影ＣＴの場合には被爆の問題があること等から、早期の膵癌を目的として画像診断を頻回に行うことが困難である。
【０００４】
一方、従来、発癌メカニズムの１つとして、ＤＮＡメチル化による癌抑制遺伝子のサイレンシングが知られている。これまでに、本発明者は、膵癌で２７個のＤＮＡの新規メチル化異常を発見し、膵癌の診断キット化を試みている（非特許文献１、特許文献１〜６参照）。このようなＤＮＡの新規メチル化異常の検出には、基本的には生検が必要となるところ、膵臓は、生検により膵炎を発症するリスクが高い臓器であり、膵液採取によって重篤な膵炎が生じることもある。そのため、自覚症状が殆どない低悪性度の膵癌の診断のために生検を行うことは現実的ではない。また、膵管内乳頭粘液腫瘍（ＩＰＭＮ、Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm）は、年５％程度の割合で癌化し、膵癌の前癌病変といわれており、膵癌の早期発見には、ＩＰＭＮの罹患を正確に見つけることが重要である。しかしながら、膵液採取については前述するリスクがあるため、ＩＰＭＮ患者への生検は一般的に禁忌といわれている。
【０００５】
また、血液検査によって膵癌関連タンパク質を検出したり、循環血中の膵癌細胞や膵癌マーカーＤＮＡを検出したりすることにより、生検を行わずに膵癌の検査を行うことは可能である。しかしながら、これらの検査手法では、ある程度の膵癌が進行して、癌関連タンパク質、腫瘍細胞、腫瘍マーカーＤＮＡ等の量が増大していなければ検出できないという欠点があり、膵癌を低悪性度の状態で早期に発見することができない。また、近年、画像診断装置の高性能化によって、多くのＩＰＭＮを発見することが可能になっているが、定期検査をしているにも拘らず、切除不能膵癌の状態で発見されることがあり、癌化するＩＰＭＮをより正確に検出する技術を確立することが急務になっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hagihara A. et al., Oncogene. 2004; 23(53): 8705-10
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−８７０４５号公報
【特許文献２】特開２００５−８７０４６号公報
【特許文献３】特開２００５−８７０４７号公報
【特許文献４】特開２００５−８７０４８号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０４９号公報
【特許文献６】特開２００５−８７０５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ｍｉＲＮＡは、循環血中に浮遊していた状態と細胞が放出するエクソソームに含まれた状態で存在している。その条件下で末梢血中に安定な状態で存在している。エクソソームは細胞間で情報を伝達することが知られており、エクソソームを放出する細胞の細胞質に存在するｍｉＲＮＡがエクソソームとともにドナー細胞に伝達される。ｍｉＲＮＡ発現はＤＮＡのメチル化により制御されていることが知られている。そこで、エクソソーム中のｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ分子の発現は発がんなどの変化を表現系が現れる前から反映している可能性があるために、エクソソーム中のｍｉＲＮＡをＩＰＭＮや膵癌を検出できれば、生検によらず超早期に膵癌を発見したり、膵癌の発症リスクがある患者を早期に捕捉したりすることができ、膵癌を安全且つ超早期に発見することが可能になると考えられる。しかしながら、従来、血中に存在するＲＮＡ分子について、ＩＰＭＮと膵癌を識別できるバイオマーカーについては十分な検討がなされていないのが現状である。
【０００９】
本発明の目的は、低侵襲な手法で、膵癌の前癌病変であるＩＰＭＮと膵癌を識別して、これらの疾患の罹患の有無を検査する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、体液中のエクソソーム中に、ＩＰＭＮに特有のＲＮＡ分子と膵癌に特有のＲＮＡ分子が存在しており、これらをバイオマーカーとして使用することによって、低侵襲な手法で、ＩＰＭＮと膵癌を識別して、これらの疾患の罹患の有無を検査することが可能になることを見出した。更に、本発明者は、血中のエクソソームから抽出した全ＲＮＡから、前記ＲＮＡ分子を検出する際に、特定の塩基配列のＬＮＡプローブを使用することにより、解析に不要な低分子ＲＮＡ（small RNA）を効率的に除去し、前記ＲＮＡ分子を高精度に検出することが可能になることをも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子からなる、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断に使用するバイオマーカー。
項２．  膵管内乳頭粘液腫瘍の診断に使用するバイオマーカーであって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１〜３に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、項１に記載のバイオマーカー。
項３．  膵癌の診断に使用するバイオマーカーであって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、項１に記載のバイオマーカー。
項４．  被験者から採取された体液中のエクソソームから、配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を検出する工程を含む、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の検査方法。
項５．  前記体液が血液である、項４に記載の検査方法。
項６．  膵管内乳頭粘液腫瘍の検査方法であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号１〜３に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、項４又は５に記載の検査方法。
項７．  膵管内乳頭粘液腫瘍の検査方法であって、前記ＲＮＡ分子が、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種である、項４又は５に記載の検査方法。
項８．  前記ＲＮＡ分子の検出が、次世代シーケンサー法によって行われ、
エクソソームから抽出された全ＲＮＡの逆転写反応が、下記(i)のＬＮＡ及び／又は(ii)のＬＮＡの存在下で行われる、項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
(i)配列番号１１に示す塩基配列からなり、第１位、第８位、第１１位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
(ii)配列番号１２に示す塩基配列からなり、第１位、第４位、第９位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
項９．  配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を検出する試薬を含む、膵管内乳頭粘液腫瘍又は膵癌の診断薬。
項１０．  前記試薬が、前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能なプライマー又はプローブである、項９に記載の診断薬。
項１１．  配列番号１１に示す塩基配列からなり、第１位、第８位、第１１位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
項１２．  配列番号１２に示す塩基配列からなり、第１位、第４位、第９位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、低侵襲な手法で、ＩＰＭＮと膵癌を識別して、これらの疾患の罹患の有無を検査することができる。特に、本発明の一態様では、膵癌の前癌病変といわれているＩＰＭＮの罹患の有無を検査できるので、膵癌の発症リスクがある患者を早期に捕捉して、膵癌の超早期の発見に寄与できる。また、本発明の一態様では、従来技術では発見が困難だった低悪性度の早期の膵癌を検出することもできるので、膵癌患者に対して早期治療を施すことも可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
バイオマーカー
本発明のバイオマーカーは、ＩＰＭＮ又は膵癌の診断に使用するバイオマーカーであって、配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子である。配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるＲＮＡ分子は、従来報告されていない低分子ＲＮＡであり、新規ｍｉＲＮＡであろうことがmiRDeep2（http://genomewiki.ucsc.edu/index.php/Hg19#genome#size#statistics）によって高い蓋然性で推定されている。
【００１４】
本発明のバイオマーカーは、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるＲＮＡ分子であってもよいが、これらのＲＮＡ分子がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの前駆体の状態をとり得る場合、本発明のバイオマーカーは、これらの前駆体であってもよい。
【００１５】
本発明のバイオマーカーとなるＲＮＡ分子の内、配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子はＩＰＭＮに特異的に認められるバイオマーカーであり、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子は膵癌に特異的に認められるバイオマーカーである。即ち、ＩＰＭＮに罹患しているか否かを検査する場合には、配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中の少なくとも１種をバイオマーカーとして使用すればよく、また罹患しているか否かを検査する場合には、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中の少なくとも１種をバイオマーカーとして使用すればよい。
【００１６】
ＩＰＭＮのバイオマーカーとして使用される配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の内、好ましくは配列番号１に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子が挙げられる。また、膵癌のバイオマーカーとして使用される配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の内、好ましくは配列番号４及び５に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子、更に好ましくは配列番号４に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子が挙げられる。
【００１７】
検査目的がＩＰＭＮの罹患の有無の場合、配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から１種のものをバイオマーカーとして使用してもよく、またこれらの塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から２又は３種のものをバイオマーカーとして組み合わせて使用してもよい。また、検査目的が膵癌の罹患の有無の場合、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から１種のものをバイオマーカーとして使用してもよく、またこれらの塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から２種以上のものをバイオマーカーとして組み合わせて使用してもよい。更にＩＰＭＮと膵癌の双方の罹患の有無を検査目的とする場合であれば、配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から少なくとも１種のＲＮＡ分子と、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中から少なくとも１種のＲＮＡ分子とを組み合わせて使用すればよい。
【００１８】
本発明のバイオマーカーは、体液中のエクソソームに存在するＲＮＡ分子である。本発明のバイオマーカーの検出対象となるエクソソームの由来については、血液、唾液、リンパ液、尿等の体液であればよいが、血液は、ＩＰＭＮ又は膵癌に伴う前記ＲＮＡ分子量が高いことから、検出対象となるエクソソームの由来として好適である。血液については、全血、全血の液体画分、血漿画分、血清画分等のいずれであってもよいが、好ましくは血清が挙げられる。
【００１９】
本発明のバイオマーカーにおいて、体液の由来生物（即ち、被験者）としては、好ましくはヒトが挙げられる。即ち、ＩＰＭＮ又は膵癌の検査対象となる動物として、好ましくはヒトである。但し、ＩＰＭＮ又は膵癌の検査対象となる動物は、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類；マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜等の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００２０】
検査方法
本発明の検査方法は、ＩＰＭＮ又は膵癌の検査方法であって、被験者から採取された体液中のエクソソームにおける前記バイオマーカーを検出する工程を含むことを特徴とする。前述するように、前記バイオマーカーは、ＩＰＭＮ又は膵癌を罹患している者の体液中のエクソソームにおいて特異的に認められるので、これらのバイオマーカーを指標とすることにより、被験者のＩＰＭＮ又は膵癌の罹患の有無を検査することができる。
【００２１】
本発明の検査方法は、具体的には、被験者の体液からエクソソームを採取する工程、採取されたエクソソームから全ＲＮＡを抽出する工程、及び抽出された全ＲＮＡから前記バイオマーカーを検出する工程を経ることにより実施される。
【００２２】
被験者の体液からエクソソームを採取する方法としては、前記バイオマーカー検出用の試料として使用可能なものが得られる限り特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。例えば、エクソソームの分離は超遠心処理により行うことができるが、より簡便には、商業的に入手可能なキットを用いてエクソソームの分離を行うことができる。商業的に入手可能なエクソソーム分離キットとしては、具体的にはＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ溶液、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ−ＴＣ等（いずれもＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が挙げられる。
【００２３】
採取されたエクソソームから全ＲＮＡを抽出する方法については、特に制限されず、公知のＲＮＡを抽出方法で行えばよい。具体的には、エクソソームから全ＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法等が挙げられる。
【００２４】
抽出された全ＲＮＡから前記バイオマーカーを検出する方法については、特に制限されず、公知の塩基配列特異的ＲＮＡ検出法で行えばよい。具体的には、抽出された全ＲＮＡから前記バイオマーカーを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、次世代シークエンサー法等が挙げられる。
【００２５】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法は、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によりｃＤＮＡの増幅を行った後に、得られたｃＤＮＡを鋳型として検出目的となるＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡを増幅可能なプライマーを用いて増幅させる方法である。
【００２６】
また、前記ＲＴ−ＰＣＲ法において、検出目的となるＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡを増幅可能なプライマーについては、当該ＲＮＡ分子の配列情報に基づいて、当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
【００２７】
前記マイクロアレイ法としては、目的となるＲＮＡ分子を検出できることを限度として特に制限されないが、例えば、以下の手順で行う方法が挙げられる。先ず、抽出した全ＲＮＡを標識する。次いで、検出目的となるＲＮＡ分子に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイに、標識化した全ＲＮＡを接触させてハイブリダイゼーションを行う。その後、マイクロアレイを洗浄して、前記プローブにハイブリダイズしているＲＮＡ分子を検出することによって、目的のＲＮＡ分子を検出できる。
【００２８】
また、前記ノーザンブロット法としては、目的となるＲＮＡ分子を検出できることを限度として特に制限されないが、例えば、以下の手順で行う方法が挙げられる。先ず、抽出した全ＲＮＡを、電気泳動によって鎖長に応じて分画し、これを電気泳動のゲルからメンブレンに転写する。次いで、分画したＲＮＡが転写された前記メンブレンを、検出目的となるＲＮＡ分子に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなる標識化プローブと、所定のバッファー中でインキュベートする。その後、前記プローブの標識を検出することによって、目的のＲＮＡ分子を検出できる。
【００２９】
前記バイオマーカーの検出を次世代シークエンサー法によって行う場合、抽出した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡの増幅させる際に、前記バイオマーカー以外の非コーディング低分子ＲＮＡ（small non-coding RNA）が逆転写されるのを抑制し、前記バイオマーカーを効率的に検出させるために、(i)配列番号１１に示す塩基配列からなり、第１位、第８位、第１１位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、及び／又は(ii)配列番号１２に示す塩基配列からなり、第１位、第４位、第９位、第１５位、第１９位及び第２０位を構成するヌクレオシドの糖残基の２’位と４’位の炭素原子が２’位側から−Ｏ−ＣＨ2−で架橋されているＬＮＡを添加することができる。抽出した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる際に、(i)のＬＮＡを添加すると、当該ＬＮＡがｍｉＲ４８６−５ｐにハイブリダイズすることにより、エクソソームに多量に存在するｍｉＲ４８６−５ｐが逆転写されるのを抑制し、目的のＲＮＡ分子の効率的な検出を行うことが可能になる。また、抽出した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる際に、(ii)のＬＮＡを添加すると、当該ＬＮＡがＹ４ ＲＮＡにハイブリダイズすることにより、エクソソームに多量に存在するＹ４ ＲＮＡが逆転写されるのを抑制し、目的のＲＮＡ分子の効率的な検出を行うことが可能になる。抽出した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる際に、(i)のＬＮＡ及び／又は(ii)のＬＮＡを逆転写反応液に添加する場合、その添加量については、特に制限されないが、例えば、逆転写反応を行う逆転写反応液中での濃度として、(i)のＬＮＡが１〜３０μＭ程度、好ましくは５〜１０μＭ程度、更に好ましくは８〜９μＭ程度、及び／又は(ii)のＬＮＡが１〜３０μＭ程度、好ましくは５〜１０μＭ程度、更に好ましくは８〜９μＭ程度が挙げられる。
【００３０】
また、抽出された全ＲＮＡから前記バイオマーカーを検出する方法については、前述する方法の他、蛍光プローブ法（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む））、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法等の定量ＰＣＲ法等で行ってもよい。
【００３１】
斯くして、被験者から採取された体液中のエクソソームから前記バイオマーカーが検出された場合には、ＩＰＭＮ又は膵癌に罹患している可能性があると診断される。より具体的には、前記バイオマーカーとして、配列番号１〜３に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中の少なくとも１種を使用して本検査方法を実施し、当該バイオマーカーが検出された場合には、ＩＰＭＮに罹患している可能性があると診断される。また、前記バイオマーカーとして、配列番号４〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の中の少なくとも１種を使用して本検査方法を実施し、当該バイオマーカーが検出された場合には、膵癌に罹患している可能性があると診断される。
【００３２】
診断薬
本発明の診断薬は、ＩＰＭＮ又は膵癌を診断するために使用される診断薬であって、配列番号１〜１０に示す塩基配列を含む各ＲＮＡ分子よりなる群から選択される少なくとも１種のＲＮＡ分子を検出する試薬を含有することを特徴とする。本発明の診断薬は、前述するＩＰＭＮ又は膵癌の検査方法を簡易に行うための診断薬である。
【００３３】
配列番号１〜１０に示す塩基配列を含むＲＮＡ分子の少なくとも１種を検出する試薬としては、例えば、前述する検査方法をＰＣＲ法にて行う場合であれば、具体的には、前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な一対のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）が挙げられる。また、前述するＩＰＭＮ又は膵癌の検査方法をＰＣＲ法にて行う場合であれば、具体的には、前述する検査方法をマイクロアレイ法又はノーザンブロット法にて行う場合であれば、前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能なプローブが挙げられる。前述する検査方法をマイクロアレイ法にて行う場合には、本発明の診断薬において、前記ＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能なプローブはマイクロアレイに固定された状態で含まれていてもよい。
【００３４】
また、本発明の診断薬には、必要に応じて、体液からエクソソームを回収するために必要となる試薬、エクソソームから全ＲＮＡを抽出するために必要となる試薬が含まれていてもよい。
【００３５】
更に、前述する検査方法を次世代シーケンサー法にて行う場合であれば、本発明の診断薬には、前述する(i)のＬＮＡ及び／又は(ii)のＬＮＡが含まれていてもよい。
【００３６】
(i)のＬＮＡ及び／又は(ii)のＬＮＡ
前述する(i)のＬＮＡは、抽出された全ＲＮＡを逆転写に供してｃＤＮＡを増幅させる際に、ｍｉＲ４８６−５ｐが逆転写されるのを抑制し、ｍｉＲ４８６−５ｐによる悪影響を防止することができるので、前述する(i)のＬＮＡは、前記バイオマーカーの検出におけるＲＴ-ＰＣＲ法に使用されるだけでなく、ｍｉＲ４８６−５ｐ以外のＲＮＡ分子の検出におけるＲＴ-ＰＣＲ法においても使用することができる。
【００３７】
また、前述する(ii)のＬＮＡは、抽出された全ＲＮＡを逆転写に供してｃＤＮＡを増幅させる際に、Ｙ４ ＲＮＡが逆転写されるのを抑制し、Ｙ４ ＲＮＡによる悪影響を防止することができるので、前述する(i)のＬＮＡは、前記バイオマーカーの検出におけるＲＴ-ＰＣＲ法に使用されるだけでなく、Ｙ４ ＲＮＡ以外のＲＮＡ分子の検出におけるＲＴ-ＰＣＲ法においても使用することができる。
【００３８】
特に、ｍｉＲ４８６−５ｐ及びＹ４ ＲＮＡは、体液（特に血液）から採取されたエクソソーム中に多量に存在しているので、ｍｉＲ４８６−５ｐ及びＹ４ ＲＮＡ以外のＲＮＡ分子の検出を目的とし、体液から採取されたエクソソーム中の全ＲＮＡに対して転写反応を行う際に好適に使用される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に示す試験は大阪市立大学医学部の倫理委員会の審査・承認を得て実施した。
【００４０】
１．対象
大阪市立大学医学部付属病院に通院中又は入院中の２４名の患者を対象とした。なお、患者の内訳は、膵癌に罹患している患者８名、ＩＰＭＮに罹患している患者８名、非膵臓疾患の患者８名である。
【００４１】
２．エクソソームの採取
各患者から、同意を得て血液を採取した。採取された血液から血清を得た。得られた各血清にエクソクイック（米国、SBI社）を混和し４℃で一晩放置した後に遠心分離することにより、エクソソームを回収した。
【００４２】
３．エクソソームから全ＲＮＡの抽出
各患者から得られたエクソソームに対して、miRNeasy mini kit（ドイツ国、キアゲン社）を用いて、エクソソームに含まれる全ＲＮＡを抽出した。
【００４３】
４．次世代シークエンサーを使用したエクソソーム中のＲＮＡ分子の発現解析
次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を使用して、エクソソーム中のＲＮＡ分子の発現解析を行った。具体的には、先ず、エクソソームから抽出した全ＲＮＡ（約５０ｎｇ〜１μｇ）に対して、３’末端及び５’末端にアダプターをライゲートした。次いで、２５ｍＭのｄＮＴＰ  ＭｉｘでＲＮＡ濃度が６．２５μMになるように希釈した後に、表１に示す(i)のＬＮＡ及び(ii)のＬＮＡを濃度が８．２３μMになるように添加して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを増幅させた。
【００４４】
【表１】
2017158545.tif 000002
【００４５】
得られたｃＤＮＡをＰＣＲ（１６サイクル）にて増幅させた後に、ｃＤＮＡコンストラクトを精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用してライブラリサイズ１５０ｂｐ前後にピークを確認した後に、Ｑｕｂｉｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｓＤＮＡ  ｋｉｔを用いてｃＤＮＡライブラリーの濃度を２ｎＭに調整した。次いで、Ｍｉｓｅｑのマニュアルに従って、ｃＤＮＡの解析を行った。
【００４６】
５．結果
次世代シークエンサーを使用したエクソソーム中のＲＮＡ分子の発現解析を行った結果、ＩＰＭＮ患者から得られたマイクロソームには、表２に示す(A)〜(C)のＲＮＡ分子が特異的に検出された。また、膵癌患者から得られたマイクロソームには、(D)〜(J)のＲＮＡ分子が特異的に検出された。即ち、本結果から、エクソソーム中の(A)〜(C)のＲＮＡ分子は、ＩＰＭＮの診断マーカーとして利用でき、更にエクソソーム中の(D)〜(J)のＲＮＡ分子は、膵癌の診断マーカーとして利用できることが明らかとなった。
【００４７】
また、(A)〜(J)の各ＲＮＡ分子はmiRDeep2（http://genomewiki.ucsc.edu/index.php/Hg19#genome#size#statistics）によって、新規ｍｉＲＮＡであろうことも推定された。
【表２】
2017158545.tif 000003
【配列表】
2017158545000001.app