(57)【要約】【課題】バイオレメディエーション、特にバイオオーグメンテーション法によるシアン汚染土壌・地下水の浄化を目標に、高い分解能を有するシアン分解菌を獲得して、当該シアン分解菌をシアン汚染物質の浄化手段とすることを課題とする。【解決手段】微生物によるシアン分解が確認されたシアン汚染地下水からゲノムＤＮＡを精製し、１６ＳｒＲＮＡ  遺伝子をＰＣＲで増幅してシーケンス解析を行った。その結果、地下水中にはシアン加水分解酵素であるニトリラーゼを所有する、新規のペドバクター属細菌の存在が確認され、これを単離したところ、優れたシアン分解能が確認された。このシアン分解能を有する新規の細菌を、シアン汚染物質に作用させることにより、これを浄化することが可能であり、上記の課題が解決されることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアン分解能を有する、新規のペドバクター（Pedobacter）属に属する細菌。
【請求項２】
請求項１に記載のペドバクター属に属する細菌を、シアン汚染物に作用させて当該汚染物を浄化することを特徴とする、浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境汚染物の浄化能を有する細菌、及び、当該細菌を用いる汚染物の浄化方法、より詳しくは、シアン分解能を有する細菌、及び、当該シアン分解菌を用いるシアン汚染物の浄化方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
工場等から環境中に排出されるシアン化合物は、細胞内呼吸阻害を引き起こす毒性の高い物質である。
【０００３】
シアン（Cyanide）で汚染された土壌の浄化法の一つとして、微生物の生分解能を利用したバイオレメディエーションが挙げられる。特に、分解能を有する微生物を外部で培養し、汚染サイトに投入するバイオオーグメンテーション法は、確実な浄化を期待することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、バイオレメディエーション、特にバイオオーグメンテーション法によるシアン汚染土壌・地下水の浄化を目標に、高い分解能を有するシアン分解菌を獲得して、当該シアン分解菌をシアン汚染物質の浄化手段とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
微生物によるシアン分解が確認されたシアン汚染地下水からゲノムＤＮＡを精製し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅してシーケンス解析を行った。その結果、地下水中にはシアン加水分解酵素であるニトリラーゼを発現する  Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳＭ２３６６（以下、ＤＳＭ２３６６という）と９７％の相同性を有する微生物の存在が確認された。以下、この微生物を本発明のペドバクター属細菌という。
【０００６】
図１は、上記の本発明のペドバクター属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するＰＣＲにより得られた遺伝子増幅産物の電気泳動図である。約１５００ｂｐのバンドにおいて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅が確認された。図２は、当該増幅産物を組み込んだプラスミドを用いて行われた、本発明のペドバクター属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシーケンス解析により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子において、本発明のペドバクター属細菌（上段：配列番号１）とＤＳＭ２３６６（下段：配列番号２）の遺伝子の塩基配列を比較したものである。
【０００７】
さらに、上記の汚染地下水から精製したゲノムＤＮＡより、本発明のペドバクター属細菌由来のニトリラーゼ遺伝子に対して、ＰＣＲによる当該遺伝子の増幅を行った。このＰＣＲでは、ＤＳＭ２３６６由来のニトリラーゼ遺伝子に特異的なプライマーの設計を行い、上記の汚染地下水から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型にして遺伝子増幅を行った。
【０００８】
図３は、このニトリラーゼ遺伝子の増幅産物の電気泳動図である。約６２０ｂｐの目的塩基長の遺伝子増幅が確認された。配列番号３は、ニトリラーゼ遺伝子の塩基配列の保存性が比較的保たれている３’側領域における、本発明のペドバクター属細菌のニトリラーゼ遺伝子の部分塩基配列を示している。配列番号４は、ＤＳＭ２３６６のニトリラーゼ遺伝子全体の塩基配列である。
【０００９】
次に、本発明のペドバクター属細菌が地下水中のシアン分解を担っていると考え、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を指標に、本発明のペドバクター属細菌を単離した。この菌の培養液にシアン化カリウムを加えると、シアン分解が確認された（図４）。
【００１０】
図４−１は、本発明のペドバクター属細菌の培養液（生菌数：約６Ｅ＋８ cells/ml）にシアン化カリウムを添加し、シアンが分解されていくことを確認した試験の結果を示す図面である。ＢＬはブランクで、同じ培地条件で菌が入っていない試験系である。
【００１１】
図４−２は、本発明のペドバクター属細菌の培養後、遠心分離によって、菌を洗った後、培地を培養液ではなく、生理食塩水（有機物なし）と生理食塩水に酵母エキスを添加して、本発明のペドバクター属細菌によるシアンの分解を検討した結果を示す図面である。この結果より、本発明のペドバクター属細菌は、生理食塩水という有機物が実質的に存在しない条件でも、シアンを十分に分解することが明らかになった。
【００１２】
図４−３は、実際の汚染された地下水（ｐＨ１０程度）に、シアン化カリウムを添加して、当該環境におけるシアンの分解の試験の結果を示した図面である。地下水はそのままの生地下水と、ろ過して滅菌した地下水を使用した。ＢＬにおいては菌の添加は行わなかった。その結果、本発明のペドバクター属細菌を添加した系では、シアンの明確な分解が確認された。生地下水と滅菌地下水に差は実質的に認められなかった。よって、現実の地下水においても、本発明のペドバクター属細菌は、しっかりとシアンを分解することが明らかになった。しかも、ｐＨが１０という特殊なアルカリ環境でも問題無くシアンが分解される。実際のシアン汚染地下水汚染の性質上、ｐＨが高いことが多い。また、ｐＨが高いとシアンが揮発しにくいことから、安全上もこのようなアルカリ環境下でシアンの微生物浄化を行うことが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、優れたシアン分解活性を有するペドバクター属に属する新規の細菌が見出され、これにより、シアン汚染物質の浄化手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のペドバクター属細菌における、ＰＣＲにより得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の電気泳動図である。
【図２】本発明のペドバクター属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシーケンス解析により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子において、本発明のペドバクター属細菌（上段）とＤＳＭ２３６６（下段）の遺伝子の塩基配列を比較したものである。下段でマークされた部分は、両者の塩基が異なることを示している。
【図３】本発明のペドバクター属細菌における、ＰＣＲにより得られたニトリラーゼ遺伝子の増幅産物の電気泳動図である。
【図４−１】本発明のペドバクター属細菌の培養液にシアン化カリウムを添加し、シアンが分解されていくことを確認した試験の結果を示す図面である。
【図４−２】本発明のペドバクター属細菌の培養後、遠心分離によって、菌を洗った後、培地を培養液ではなく、生理食塩水（有機物なし）と生理食塩水に酵母エキスを添加して行った、本発明のペドバクター属細菌によるシアンの分解試験の結果を示す図面である。
【図４−３】実際の汚染された地下水（ｐＨ１０程度）に、シアン化カリウムを添加して、本発明のペドバクター属細菌による、当該環境におけるシアンの分解の試験の結果を示した図面である。
【図２】
2017006048.tif 000002
【図４−１】
2017006048.tif 000003
【図４−２】
2017006048.tif 000004
【図４−３】
2017006048.tif 000005
【図１】
2017006048.tif 000006
【図３】
2017006048.tif 000007
【配列表】
2017006048000001.app