(57)【要約】【課題】本発明は、実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤および放射線感受性試験方法を提供する。【解決手段】ヒト又はその他の哺乳動物のがん組織由来のがん幹細胞をがん幹細胞表面マーカの発現、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ法又はヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素の染色程度により分離・抽出し、次いで該がん幹細胞を無処置又は予め抗がん剤を投与した実験動物に移植して、同時に又は所定時間をおいて、一回又は複数回にわたり抗がん剤の投与若しくは放射線照射又は抗がん剤の投与と放射線照射とを併用することにより、がん幹細胞又はがん幹細胞を含むがん細胞集団への殺細胞効果を求めることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又はその他の哺乳動物のがん組織由来のがん幹細胞を分離・抽出し、次いで該がん幹細胞を無処置又は予め抗がん剤を投与した実験動物に移植して、同時に又は所定時間をおいて、一回又は複数回にわたり抗がん剤の投与若しくは放射線照射又は抗がん剤の投与と放射線照射を併用することにより、がん幹細胞又はがん幹細胞を含むがん細胞集団への殺細胞効果を求めることを特徴とする実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法。
【請求項２】
前記がん幹細胞の分離、抽出は、固形がん若しくはその転移巣を細胞化してから、又は血液、骨髄、胸水若しくは腹水からがん細胞を採取し、次いでそのまま又は一定時間培養した後、ＣＤ１３３，ＣＤ４４，ＣＤ１３，ＣＤ２４，ＣＤ９０，ＣＤ４７からなる群より選択される一個以上のがん幹細胞表面マーカーを発現しているがん幹細胞、又はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ法で検出されるがん幹細胞を蛍光顕微鏡下において目視で分離、抽出し又はフローサイトメトリー法で分離、抽出することを特徴とする請求項１記載の実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法。
【請求項３】
前記がん幹細胞の分離、抽出は、固形がん若しくはその転移巣を細胞化してから、又は血液、骨髄、胸水若しくは腹水からがん細胞を採取し、次いでそのまま又は一定時間培養した後、ヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素及びヨウ化プロピジウムで染色されないサイドポピュレーション細胞を蛍光顕微鏡下において目視で分離、抽出し又はフローサイトメトリー法で分離、抽出することを特徴とする請求項１記載の実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト又はその他の哺乳動物に適用される新規ながん幹細胞に対する抗がん剤および放射線による感受性試験方法に関し、特に、実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤および放射線感受性試験方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がん組織中には抗がん剤（従来技術１）および放射線（従来技術２）による治療効果の乏しいがん幹細胞と言われる細胞群がある。このがん幹細胞は、高い造腫瘍能を有し、自己複製能を有し、また多分化能を有する細胞群とされており、しかも、がん幹細胞は抗がん剤や放射線療法などの治療法に対し抵抗性を示すことが知られている。このがん幹細胞の制圧こそ「がん」の根治に求められるものである。しかし、現在実験動物を用いたがん幹細胞に対する有効な抗がん剤および放射線感受性試験方法は確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Boman BM, Huang E. Human colon cancer stem cells: a new paradigm in gastrointestinal oncology. J Clin Oncol. 2008;26: ｐ2828-2838.
【非特許文献２】Pajonk F, Vlashi E. Characterization of the stem cell niche and its importance in radiobiological response. Semin Radiat Oncol. 2013; 23(4): ｐ237-241.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的にがん幹細胞に対する抗がん剤および放射線感受性試験法は、がん組織から取り出したがん幹細胞を用いてシャーレや試験管内でインビトロ、いわゆる生体外で、又は実験動物個体レベルである生体内で、いわゆるインビボで試みられているものであるが、インビトロで得られた試験結果と、それを臨床実際で応用した結果とには相当の乖離が生じている実情がある。また、インビトロでは効果を発揮し得ないプロドラッグがあるので、インビトロでは正確な評価が得られない実情もある。
【０００５】
本発明は、これらの課題を解決したものであって、臨床応用に直結した実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤および放射線感受性試験方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、本発明の請求項１に係る実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法は、ヒト又はその他の哺乳動物のがん組織由来のがん幹細胞を分離・抽出し、次いで該がん幹細胞を無処置又は予め抗がん剤を投与した実験動物に移植して、同時に又は所定時間をおいて、一回又は複数回にわたり抗がん剤の投与若しくは放射線照射又は抗がん剤の投与と放射線照射とを併用することにより、がん幹細胞又はがん幹細胞を含むがん細胞集団への殺細胞効果を求めることを特徴とする。なお、予め抗がん剤を投与した実験動物に該がん幹細胞を移植したときは、該抗がん剤のみの殺細胞効果を評価するため、その後の抗がん剤の投与や放射線照射を行わない場合がある。
【０００７】
この構成によれば、対象のがん幹細胞を分離・抽出し、これを無処置又は予め抗がん剤を投与したマウス、ラットなどの実験動物に移植して、同時に又は所定時間をおいて、抗がん剤の投与若しくは放射線照射又は抗がん剤の投与と放射線照射とを併用することで、がん幹細胞又はがん幹細胞を含むがん細胞集団への殺細胞効果を求めることができ、抗がん剤の評価や放射線照射の効果をインビボで得ることができる。また、実験動物を用いて感受性試験を行うことによりインビトロでは薬効のないプロドラッグの評価が得られ、ヒトおよびその他の哺乳動物の臨床実際に応用可能な評価を得ることができる。また、この抗がん剤の範疇には、がん幹細胞の増殖、転移に関する分子を標的としてがん細胞の増殖を抑制するとともに、がん細胞の転移をも抑制して抗がん効果をもたらす分子標的薬を含む。
【０００８】
また、請求項２に係る実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法は、請求項１に記載の感受性試験方法において、前記がん幹細胞の分離、抽出は、固形がん若しくはその転移巣を細胞化してから、又は血液、骨髄、胸水若しくは腹水からがん細胞を採取し、次いでそのまま又は一定時間培養した後、ＣＤ１３３，ＣＤ４４，ＣＤ１３，ＣＤ２４，ＣＤ９０，ＣＤ４７からなる群より選択される一個以上のがん幹細胞表面マーカーを発現しているがん幹細胞、又はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ法で検出されるがん幹細胞を蛍光顕微鏡下において目視で分離、抽出し又はフローサイトメトリー法で分離、抽出することを特徴とする。
【０００９】
これらのがん細胞表面マーカーは、例えば、大腸がん：ＣＤ１３３，肝臓がん：ＣＤ１３３、肺がん：ＣＤ４４，乳がん：ＣＤ４４，ＣＤ２４などを示すがん幹細胞マーカーであり、このマーカー単体又はマーカーを組合わせることにより特定の生きたがん幹細胞を蛍光顕微鏡下又はフロサイトメトリー法で分離、抽出することができる。また、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ法は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）試薬によりＡＬＤＨ酵素活性を測定して、がん幹細胞を同定分離する。がん幹細胞としての能力の高い生細胞を同定する特徴を有する。
【００１０】
また、請求項３に係る実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法は、請求項１に記載の感受性試験方法において、前記がん幹細胞の分離、抽出は、固形がん若しくはその転移巣を細胞化してから、又は血液、骨髄、胸水若しくは腹水からがん細胞を採取し、次いでそのまま又は一定時間培養した後、ヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素及びヨウ化プロピジウムで染色されないサイドポピュレーション細胞を蛍光顕微鏡下において目視で分離、抽出し、又はフローサイトメトリー法で分離、抽出することを特徴とする。
【００１１】
サイドポピュレーション細胞は、ＤＮＡ結合色素であるヘキスト３３３４２蛍光色素を排出する能力を持つ細胞集団であって、がん細胞において、このサイドポピュレーション細胞にがん幹細胞が多く存在する。また、ヨウ化プロピジウムは死細胞を染色するので、染色されない細胞が生細胞であり、これにより死細胞を除外することができる。この請求項３の構成により、がん細胞からヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素及びヨウ化プロピジウムで染色されないサイドポピュレーション細胞を蛍光顕微鏡下において目視で識別しマイクロマニュピレータで抽出し、又はフローサイトメトリー法で分離、抽出することにより生きたがん幹細胞を得ることができ、これを実験動物に移植することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る請求項１から３に記載の実験動物を用いたがん幹細胞に対する抗がん剤及び放射線感受性試験方法によれば、特定のがん組織又はがん細胞から生きたがん幹細胞の分離・抽出が簡易に確実に行うことができると共に、特定のがん幹細胞を実験動物に移植して、インビボで抗がん剤の投与若しくは放射線照射又は両者を併用することにより殺細胞効果を確実に、しかも容易に把握し易い。ひいては、特定のがん幹細胞に対する抗がん剤の効用や放射線治療の評価を簡易に、迅速に得ることができる。また、インビボでしか効果が確認できないプロドラッグの評価が可能となる。また、分子標的薬を含む抗がん剤投与や放射線照射のがん幹細胞への効果をインビボで簡易に、早く確認できるから、これらの研究・開発に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施の形態に係わるヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素とヨウ化プロピジウムで二重染色したフジモト腹水腫瘍細胞の蛍光顕微鏡写真で、同一視野で撮影した３枚であり、矢印はサイドポピュレーション細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明はがん組織より分離したがん幹細胞を直接実験動物に移植し、そこに抗がん剤の投与ないし放射線照射あるいは両者を併用することにより実施される抗がん剤および放射線感受性試験法に係るものである。実験動物を用いて感受性試験を行うことによりインビトロでは薬効のないプロドラッグを含めヒトおよびその他の哺乳動物の臨床実際に応用可能なデータが得られる。
【００１５】
がん幹細胞の分離は固形がんおよびその転移巣は常法により細胞化してから、また、血液、骨髄、胸水あるいは腹水などのがん細胞は常法により採取し、そのまま或いは一定時間培養したのち、次の方法で行う。すなわちＣＤ１３３（大腸がん、肝臓がん、脳腫瘍に係る）、ＣＤ４４（肺がん、乳がん、胃がん、大腸がん、膵臓がん、前立腺がん、骨肉腫、卵巣がん、膀胱がん、頭頚部がん、脳腫瘍に係る）、ＣＤ１３（血液がんに係る）、ＣＤ２４（乳がん、膵臓がんに係る）、ＣＤ９０（肺がん、肝臓がんに係る）、ＣＤ４７（膀胱がん、白血病に係る）などのがん幹細胞のマーカー単独又は複数種類のマーカーを発現しているがん細胞やＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）試薬により検出されるがん幹細胞、又はヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素及びヨウ化プロピジウムに染色されないサイドポピュレーション細胞などを蛍光顕微鏡下に目視で、あるいはフローサイトメトリー法などにより分離・抽出する。また、ヘキスト３３３４２及びヨウ化プロピジウムにより同時に二重染色して、染色されないものをサイドポピュレーション細胞として分離することが可能であり、また、ヘキスト３３３４２で染色してサイドポピュレーション細胞を分離し、引き続いてヨウ化プロピジウムで染色して生きたサイドポピュレーション細胞を分離することも可能である。
【００１６】
分離・抽出したがん幹細胞は１個ないし任意の個数をマウス、ラット、ブタ、サルなどの実験動物の腹腔内、胸腔内、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、脳脊髄内、および腎被膜下などに注入ないし移植する。注入ないし移植する部位としては１か所でもよいし、同一組織・体腔だけでなく異なる組織や体腔にわたる何か所でもよい。これらがん細胞集団からのがん幹細胞の分離、抽出作業、引き続いて行う実験動物へのがん幹細胞への移植は、無菌操作下で行うことが肝要である。
【００１７】
抗がん剤や分子標的薬の投与はさまざまの投与量と時間間隔で任意の回数をがん幹細胞の移植前、移植と同時に又は移植後に静脈内、動脈内、経口的、皮下、皮内、筋肉内、体腔内、脳脊髄腔内、直腸内あるいは皮膚表面などに行うが、これらの時間帯を組み合わせて投与したりあるいは持続投与することも可能である。投与する抗がん剤は１種類だけでなく数種類の抗がん剤を組み合わせて、単一経路または複数の経路で、かつ複数回投与する場合は同一経路または異なった経路で用いることも可能である。
【００１８】
放射線照射は上述のがん幹細胞を移植ないし注入し定着した部位に対しＸ線、電子線、陽子線および重粒子線のいずれかを用いて、さまざまな照射線量を、さまざまな照射方法、任意の分割回数で、あるいは下記の放射性同位元素（ＲＩ）をさまざまな線量強度、さまざまな経路で、がん幹細胞の移植直後よりさまざまな時間間隔を置いて任意の回数照射あるいは刺入ないし投与する。刺入するＲＩには125Ｉ、198Ａｕおよび192Ｉｒなどがあり、投与されるＲＩには131Ｉ、90Ｙおよび89Ｓｒなどがある。
【００１９】
このあと上述の抗がん剤療法あるいは放射線療法あるいは両者の併用療法を行った実験動物の経過観察を行い、がん発生の有無、がんを発生した場合はがんの増大の速度、転移の有無やその性状、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）、あるいは生存時間などを抗がん剤療法あるいは放射線療法を行わなかった対照と比較する。
【００２０】
これにより抗がん剤・分子標的薬療法の場合は、有効な抗がん剤・分子標的薬の種類、投与量、その組み合わせおよび投与方法、投与時期および投与回数などを知ることができる。
【００２１】
放射線療法の場合は有効な放射線の種類、照射線量および照射方法など、そして有効なＲＩ、その線量強度および刺入ないし投与方法など、さらにがん幹細胞の移植後の有効な適用時間などを知ることができる。
【００２２】
抗がん剤療法と放射線療法を併用する場合は、これを構成する上述の抗がん剤療法および放射線療法の有効な適用順序、ならびにがん幹細胞移植時点を中心に移植前、移植と同時に又は移植後、あるいはその組み合わせのいずれが有効かを知ることができる。
【００２３】
ヒトおよびその他の哺乳動物のがん病巣より感受性試験のための材料を採取するにあたり、外科手術による方法だけでなく生検のような方法で得られるような少量の検体で賄えるならば、がんに罹患したヒトおよびその他の哺乳動物の侵襲及び苦痛は少なく応用範囲は広くなりほぼ全症例に適用される。すなわち、得られた少量の検体材料を無菌操作下に固形がんは常法により細胞化したあと、血液、骨髄、胸水あるいは腹水などのがん細胞は常法により採取し、そのまま或いは一定時間培養したのち、生理食塩水など適切な溶液を用いて腫瘍細胞浮遊液を作製する。
【００２４】
次にＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ４７などのがん幹細胞のマーカーを発現しているがん細胞やＡＬＤＥＦＬＵＯＲ法で検出されるがん幹細胞、又はヘキスト３３３４２ＤＮＡ蛍光色素及びヨウ化プロピジウムに染色されないサイドポピュレーション細胞などを分離・抽出するが、検体量が少ない時は腫瘍細胞浮遊液をスライドグラスに載せ蛍光顕微鏡下に目視でマイクロマニュピュレーターを用いて行えばよく、検体量が多い時はフローサイトメトリー法で行うことができる。
【００２５】
以下に実施例を示し、前述のように、実験動物への移植、抗がん剤および放射線療法、さらに効果判定を行う。本実施例は、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスで継代維持されているフジモト腹水腫瘍を用いる。以下、無菌操作下にフジモト腹水腫瘍担がんマウスより少量の腹水を採取し、次いで生理食塩水で希釈して腫瘍細胞浮遊液を作製する。図１に示すように、細胞浮遊液 ０．０３ｍｌをスライドグラス上に載せヘキスト３３３４２とヨウ化プロピディウムで二重染色し、蛍光顕微鏡下でいずれの蛍光をも発しないものをサイドポピュレーション細胞として、その２個をマイクロマニュピュレーターを用いて取り出した。そのサイドポピュレーション細胞を２匹の雄４週齢Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスにそれぞれ１個ずつ腹腔内移植した。
【００２７】
その直後その一方のマウスに抗がん剤であるブレオマイシン ３７．０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内投与した。なお、ブレオマイシン３７．０ｍｇ／ｋｇの１回腹腔内投与によるフジモト腹水腫瘍担がんマウスの生存延長効果は認められていない。このような組み合わせのマウスを２１組作製した。このあと２１組のマウスが腫瘍を発生するかどうかを観察したところ、ブレオマイシン非投与の対照マウスでは２１匹中１０匹に腫瘍を発生し平均 ２３．０±２．５１日で死亡したが、ブレオマイシン投与の２１匹中３匹に腫瘍を発生し平均２０．７日で死亡した。
【００２８】
以上の結果よりフジモト腹水腫瘍由来のがん幹細胞は、抗がん剤であるブレオマイシン３７．０ｍｇ／ｋｇの１回投与に感受性のあることが判明した。
【００２９】
（実施例２）
Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスで継代維持されているフジモト腹水腫瘍を用いる。以下、無菌操作下にフジモト腹水腫瘍担がんマウスより少量の腹水を採取し、次いで生理食塩水で希釈して腫瘍細胞浮遊液を作製する。図１に示すように、細胞浮遊液 ０．０３ｍｌをスライドグラス上に載せヘキスト３３３４２とヨウ化プロピディウムで二重染色し、蛍光顕微鏡下でいずれの蛍光をも発しないものをサイドポピュレーション細胞として、その２個をマイクロマニュピュレーターを用いて取り出した。そのサイドポピュレーション細胞を２匹の雄５週齢Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスにそれぞれ１個ずつ右大脳半球内に移植した。
【００３０】
その直後より総吸収線量８ＧｙのＸ線を１日当たり２Ｇｙずつ４日間連日頭部に分割照射した。なお、総吸収線量８ＧｙのＸ線４回分割照射はマウスの下肢フット・パッドに発生せしめたフジモト腹水腫瘍による皮下腫瘤に対する治療効果は認められない。このような組み合わせのマウスを１８組作製し、３か月間観察を行った。非照射の対照マウスでは１８匹中６匹が３０日以内に衰弱死亡した。照射マウス１８匹中２匹が３０日以内に衰弱死亡した。死亡したマウスは全例剖検により頭蓋内腫瘍を認めた。
【００３１】
以上の結果よりフジモト腹水腫瘍由来のがん幹細胞は総吸収線量８ＧｙのＸ線の４回分割照射に感受性のあることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
がん幹細胞への殺細胞効果に関し、抗がん剤の改良、開発や放射線治療の改善にに利用されるのみならず、がん幹細胞を含む特定のがん腫瘍に対する抗がん剤や放射線による治療分野に適用することができる。
【図１】
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