(57)【要約】【課題】新規な神経筋接合部形成促進薬、およびそれを含有する治療剤等を提供することを主な課題とする。【解決手段】本発明として、例えば、ジスルフィラム、ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン、スピペロン、またはホルモテロールを有効成分として含有することを特徴とする神経筋接合部形成促進薬や、それを含有する、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療剤、筋力増強剤、およびＥＳまたはｉＰＳ由来神経細胞移植に際して同時または逐次的に投与される神経接合部形成促進薬等を挙げることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィラム、ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン、スピペロン、またはホルモテロールを有効成分として含有することを特徴とする、神経筋接合部形成促進薬。
【請求項２】
請求項１に記載の神経筋接合部形成促進薬を含有する、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
【請求項３】
神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害が、加齢性筋弱衰症（サルコペニア）、神経原性疾患（ニューロパチー）、および筋原性疾患（ミオパチー）からなる群から選択される、請求項２に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
【請求項４】
神経原性疾患（ニューロパチー）が、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、筋委縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、および神経筋接合部疾患からなる群から選択される、請求項３に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
【請求項５】
筋原性疾患（ミオパチー）が、先天性ミオパチー、代謝性ミオパチー、および筋ジストロフィーからなる群から選択される、請求項３に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
【請求項６】
ＥＳまたはｉＰＳ由来神経細胞移植に際して同時または逐次的に投与されるものである、請求項１に記載の神経接合部形成促進薬。
【請求項７】
請求項１に記載の神経筋接合部形成促進薬を含有する、筋力増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋または神経疾患治療薬の技術分野に属する。本発明は、低分子化合物を有効成分として含有する神経筋接合部形成促進薬に関するものである。詳しくは、本発明は、神経筋接合部の形成を促進することにより神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害を治療もしくは緩和、または予防し、骨格筋量を回復することができる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は、運動やスポーツ競技だけでなく、一般的な日常生活を送るためにも非常に重要なヒトの器官である。骨格筋は中枢神経によって制御される運動神経によって支配されており、当該運動神経からのアセチルコリン等の信号伝達物質によって収縮しその能力を発揮する。運動神経と骨格筋の接合部は神経筋接合部（ＮＭＪ）と称され、骨格筋の機能と、その維持に重要な働きを担っていることが解明されてきている（非特許文献１)。
【０００３】
身体における骨格筋の量は、その機能を維持するために非常に重要であり、その量の大幅な減少は、身体能力ひいてはＱＯＬ（クオリティ  オブ  ライフ）の大幅な低下を引き起こす。通常の健康な状態では、骨格筋の量は合成と分解のバランスによって維持されており、大きく変動することは一般的にはない。しかし、老化、疾病、長期間の安静臥床またはギブス固定、あるいは長期の無重力状態によって骨格筋量の大幅な低下が引き起こされる。
【０００４】
高齢者、特に６０歳以上の高齢者における老化による筋肉の減少は、加齢性筋弱衰症（サルコペニア）と呼ばれる。サルコペニアにおいて、筋繊維数は連続的に大幅な減少が見られ、身体能力障害および虚弱を引き起こす。サルコペニアは、高齢者の身体の機能性および自立度に大きく影響を与える要因であるが、現在のところ適切な治療薬は存在しない。そして、この症状は、神経筋接合部における、繰り返される除神経／神経再生によって引き起こされると考えられている。また、サルコペニアについては、神経筋接合部の信号伝達異常が病態機構であることが近年示唆されている（非特許文献２、３）。
【０００５】
同様の骨格筋の減少は、老化だけでなく、様々な病態によっても引き起こされる。結果として筋肉の減少を引き起こす神経筋疾患は大きく分けると、神経原性疾患（ニューロパチー）と筋原性疾患（ミオパチー）の２種類に大別される。神経原性疾患は神経と神経筋接合部に起因する疾患であり、例えば、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、筋委縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、神経筋接合部疾患が挙げられる。筋原性疾患としては、筋肉に起因する疾患で、例えば、先天性ミオパチー、代謝性ミオパチー、筋ジストロフィーが挙げられる。
【０００６】
神経原性疾患である筋委縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）のような運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、重篤な骨格筋、平滑筋等を含む筋肉の萎縮と筋力低下が見られる神経変性疾患で、極めて進行が速く、半数ほどが発症後３年から５年で呼吸筋麻痺により死亡する。この疾患においては運動ニューロンの変性により、骨格筋、平滑筋等を含む筋力低下および手足の麻痺等の症状が引き起こされる。
【０００７】
また、筋原性疾患である筋ジストロフィーおよび先天性ミオパチーについては、現在はステロイド療法以外に治療法のない難病である。これらの病気は、筋線維の破壊・変性（筋壊死）と再生を繰り返しながら、次第に筋萎縮と筋力低下が進行していく遺伝性筋疾患の総称である。これらの病気においても神経筋接合部の信号を促進することにより、症状の改善が見られることがモデル動物での実験で報告されており、神経筋接合部の機能の重要性が示されている（非特許文献４）。
【０００８】
一方、先天的な遺伝子の欠損により引き起こされる先天性筋無力症においては、この病態の研究から神経筋接合部に関する様々な知見が得られている（非特許文献５）。先天性筋無力症は、神経筋接合部を構成するタンパク質をコードする遺伝子の欠損から引き起こされることが解明されてきており、当該原因遺伝子として、受容体型チロシンキナーゼＭｕＳＫ、ＭｕＳＫと複合体を形成するＬｒｐ４、運動神経から分泌されＭｕＳＫと結合しＭｕＳＫを活性化させるアグリン、神経伝達物質であるアセチルコリンの受容体であるＡＣｈＲ、およびＡＣｈＲをクラスター化させるＲａｐｓｎ等が研究され、その働きが解明されてきている。
【０００９】
さらに、近年、重度の神経損傷に対してＥＳ／ｉＰＳ由来神経細胞移植による治療法の研究が活発になされている。移植された神経細胞はその機能を発揮するためには他の神経細胞との回路網、または骨格筋等の細胞との接合部を形成することが必要不可欠である。しかし、移植神経細胞による神経回路網形成の制御については未だ研究が進んでいないのが現状である。
【００１０】
そして、従来、上述の病態に対しての治療剤としては、例えば、先天性筋無力症および重症筋無力症に対してはネオスチグミン等のような神経伝達物質であるアセチルコリンを分解する酵素であるコリンエステラーゼの阻害剤が、ＡＬＳに対してはグルタミン酸による神経細胞への毒性の抑制剤であるリルゾール（2-Amino-6-trifluoromethoxybenzothiazole）、および神経細胞へのラジカル毒性の抑制剤であるエダラボン（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone、ラジカット（登録商標））が使用されている。しかしながら、これらの薬剤は、病状の進行を抑制することはできるものの、根本的な疾患の治療効果は有していない。
【００１１】
さらに上述の薬剤に加えて、このような神経筋接合部の機能低下等によって引き起こされる骨格筋量の低下を、治療または緩和するために、特許文献１では神経筋接合部に分泌されるタンパク質であるヒトアグリンのドメインを投与することが試みられている。当該文献では、ヒトアグリンのドメインの投与によりヒトのサルコペニアと良い相関を示すサルコペニアマウスの症状を回復できることを示している。しかし、当該文献で開示されているのはタンパク質であり、低分子化合物を用いることは開示されていない。
【００１２】
また、特許文献２においては、脂肪球被膜成分を有効成分とした筋量増強剤が開示されている。当該筋量増強剤には、筋肉量増加作用、筋委縮抑制作用、神経筋接合部形成促進作用があることが示されている。しかし、当該文献で開示されているのはミルクムチン等の糖タンパク質と脂質を含む製剤であり、低分子化合物を用いることは開示されていない。
【００１３】
ジスルフィラム（Ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、1,1',1'',1'''-[disulfanediylbis(carbonothioylnitrilo)]tetraethane）は、ノックビン（登録商標）の名称で知られ、慢性アルコール中毒に対する抗酒療法剤として用いられている。当該薬物の作用標的はアルデヒド脱水素酵素であり、薬理作用は当該酵素の阻害により少量の酒量であっても悪酔いの原因であるアセトアルデヒドを蓄積させ、悪酔いの状態を作り出すことである。近年、ジスルフィラムは抗血管新生剤としての薬理作用も研究されるようになってきている。
【００１４】
ラベプラゾール（Ｒａｂｅｐｒａｚｏｌ、(RS)-2-([4-(3-methoxypropoxy)-3-methylpyridin-2-yl]methylsulfinyl)-1H-benzo[d]imidazole）は、パリエット（登録商標）の名称で知られ、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、または逆流性食道炎に対する治療剤として用いられている。酸分泌細胞による酸性領域で活性型であるチオエーテル体となり、プロトンポンプの活性を阻害し胃酸の分泌を抑制する。
【００１５】
メチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、6α‐Methyl‐11β,17,21‐trihydroxypregna‐1,4‐diene‐3,20‐dione）は、メドロール（登録商標）の名称で知られるステロイド・糖質コルチコイド系薬剤であり、気管支喘息、関節リウマチ、急性または慢性の自己免疫疾患、悪性リンパ腫、あるいは全身性エリテマトーデス等の幅広い病状の治療に用いられている。
【００１６】
スピペロン（Ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ、8-[4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl]-1-phenyl-1,3,8-triazaspiro[4.5]decan-4-one）は、スピロピタン（登録商標）の名称で知られ、従来は抗精神病薬として用いられている。スピペロンは脳の中枢に、主に脳内のドーパミンＤ２受容体を遮断することで直接作用し、統合失調症を始めとする様々な精神病に伴う症状を改善する働きがある。
【００１７】
ホルモテロール（Ｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ、(RS,SR)-N-[2-hydroxy-5-[1-hydroxy-2-[1-(4-methoxyphenyl) propan-2-ylamino]ethyl] phenyl]formamide）は、オーキシス（登録商標）等の名称で知られる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療に用いられるβ２受容体拮抗薬である。その薬理作用は、β２アドレナリン受容体に結合することにより平滑筋を弛緩させ気道を拡張し、その結果として呼吸を容易にすることである。
【００１８】
ナブメトン（Ｎａｂｕｍｅｔｏｎｅ、4-(6-methoxy-2-naphthyl)-2-butanone）は、レリフェン（登録商標）等の名称で知られる、非ステロイド系抗炎症薬である。その薬理作用は、シクロオキシゲナーゼを阻害することによりプロスタグランジンの合成を抑制することであり、その結果として抗炎症、鎮痛作用を示す。
【００１９】
上記６種の薬物は、それぞれ特有の化学構造を有し、それぞれ異なった作用部位に対して異なった薬理作用を有することで知られている。そして、従来、これらの薬物について、神経筋接合部の形成を促進すること、あるいは神経筋接合部の疾患に対する薬理作用は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２６６１５号
【特許文献２】特開２０１３−１００２７５号公報
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Gonzalez-Freire M, de Cabo R, Studenski SA, Ferrucci L, Front Aging Neurosci., (2014), 6:208., doi:10.3389/fnagi.2014.00208.
【非特許文献２】Deschenes MR, Roby MA,Eason MK,Harris MB., Exp Gerontol.,(2010),45(5):389-93.,doi:10.1016/j.exger.2010.03.007.
【非特許文献３】Pannerec A, Springer M, MigliavaccaE, Ireland A, Piasecki M, Karaz S, Jacot G, Metairon S, Danenberg E, Raymond F, Descombes P, McPhee JS, Feige JN., Aging(Albany NY)., (2016), Mar 24., PMID27019136.
【非特許文献４】Arimura S, Okada T, Tezuka T, Chiyo T, Kasahara Y, Yoshimura T, Motomura M, Yoshida N, Beeson D,Takeda S, Yamanashi Y., Science, (2014), 345(6203):1505-8., doi:10.1126/science.1250744.
【非特許文献５】大野欽司，ＢＲＡＩＮ  ａｎｄ  ＮＥＲＶＥ，（２０１１），６３巻，７号，６６９〜６７８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、新規な神経筋接合部形成促進薬を提供することを主な課題とする。また、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための新規な治療剤なども提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、既存のジスルフィラムやラベプラゾールなどが神経筋接合部の形成を促進しうることを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、下記を挙げることができる。
【００２４】
［１］ジスルフィラム、ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン、スピペロン、またはホルモテロールを有効成分として含有することを特徴とする、神経筋接合部形成促進薬。
［２］上記［１］に記載の神経筋接合部形成促進薬を含有する、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
［３］神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害が、加齢性筋弱衰症（サルコペニア）、神経原性疾患（ニューロパチー）、および筋原性疾患（ミオパチー）からなる群から選択される、上記［２］に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
［４］神経原性疾患（ニューロパチー）が、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、筋委縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、および神経筋接合部疾患からなる群から選択される、上記［３］に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
［５］筋原性疾患（ミオパチー）が、先天性ミオパチー、代謝性ミオパチー、および筋ジストロフィーからなる群から選択される、上記［３］に記載の治療剤もしくは緩和剤、または予防剤。
【００２５】
［６］ＥＳまたはｉＰＳ由来神経細胞移植に際して同時または逐次的に投与されるものである、上記［１］に記載の神経接合部形成促進薬。
［７］上記［１］に記載の神経筋接合部形成促進薬を含有する、筋力増強剤。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る神経筋接合部形成促進薬（以下、「本発明促進薬」ともいう。）によれば、神経筋接合部の形成を効果的に促進することができることから、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療もしくは緩和、または予防に対して効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ジスルフィラムによるＭｕＳＫ／ＡＴＦ２シグナル伝達経路の活性化効果を示す。
【図２】上段は、ａｇｒｉｎ＋ジスルフィラムのリン酸化ＭｕＳＫであるＭｕＳＫ―ＰのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を、下段は上段に基づきタンパク質量を数値化した結果を、それぞれ表す。横軸はジスルフィラムの添加量（μＭ）を示す。
【図３】（Ａ）図は、筋管を形成した培養Ｃ２Ｃ１２細胞におけるアセチルコリンレセプターの凝集を、免疫蛍光染色にて白く可視化した写真である。（Ｂ）図は、免疫蛍光染色の蛍光（白色）強度を画像解析ソフトにて数値化した結果を表す。
【図４】（Ａ）図は、神経再支配モデルマウスにおける、神経再支配後の前脛骨筋の湿重量の健側比を表す。横軸は術後経過時間（週）を、縦軸は健側比（％）を、それぞれ示す。実線はジスルフィラム群の結果を、破線はプラセボ群の結果を、点線はコントロールの結果を、それぞれ示す。（Ｂ）図は、前脛骨筋の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の測定結果を表す。横軸は術後経過時間（週）を、縦軸は活動電位（ｍＶ）を、それぞれ示す。
【図５】Ｃｈｒｎｅの発現量を表す。右カラムはジスルフィラム群の結果を、左カラムはプラセボ群の結果を、それぞれ示す。
【図６】Ｃｏｌｑの発現量を表す。右カラムはジスルフィラム群の結果を、左カラムはプラセボ群の結果を、それぞれ示す。
【図７】Ｒａｐｓｎの発現量を表す。右カラムはジスルフィラム群の結果を、左カラムはプラセボ群の結果を、それぞれ示す。
【図８】各薬物によるＭｕＳＫ／ＡＴＦ２シグナル伝達経路の活性化効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明促進薬は、ジスルフィラム、ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン、スピペロン、またはホルモテロールを有効成分（以下、単にこれらを「有効成分」ともいう。）として含有することを特徴とする。
【００２９】
本発明促進薬の有効成分に係るジスルフィラム、ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン、スピペロン、およびホルモテロールは、既存の薬物である。ジスルフィラム（下記構造式（１））は、日本薬局方にも収載されている抗酒癖剤であり、慢性アルコール中毒に対する抗酒療法に使われ、その薬剤は、例えばノックビン（登録商標）として市販されている。ラベプラゾール（下記構造式（２））は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、または逆流性食道炎に対する治療剤として用いられ、その薬剤は、例えば、パリエット（登録商標）として市販されている。メチルプレドニゾロン（下記構造式（３））は、ステロイド・糖質コルチコイド系薬剤であり、気管支喘息、関節リウマチ、急性または慢性の自己免疫疾患、悪性リンパ腫、あるいは全身性エリテマトーデス等の幅広い病状の治療に用いられており、その薬剤はメドロール（登録商標）として市販されている。スピペロン（下記構造式（４））は、抗精神病薬として用いられており、その薬剤はスピロピタン（登録商標）として市販されている。ホルモテロール（下記構造式（５））は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療に用いられるβ２受容体拮抗薬であり、その薬剤は、例えば、オーキシス（登録商標）として市販されている。ナブメトン（下記構造式（６））は、非ステロイド系抗炎症薬であり、その薬剤は、例えば、レリフェン（登録商標）等として市販されている。
【００３０】
当該６種の化合物は周知の薬物であり、その製造方法も知られている。なお、有効成分に光学異性体が存在する場合や有効成分が塩を形成しうる場合、これら光学異性体や塩も当該有効成分に含まれる。
【００３１】
【化１】
2017197436.tif 000002
【００３２】
【化２】
2017197436.tif 000003
【００３３】
【化３】
2017197436.tif 000004
【００３４】
【化４】
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【００３５】
【化５】
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【００３６】
【化６】
2017197436.tif 000007
【００３７】
本発明促進薬は、神経筋接合部の形成を効果的に促進することができることから、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療もしくは緩和、または予防に対して有効である。したがって、本発明促進薬を含有する、神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害のための治療剤もしくは緩和剤、または予防剤（以下、これらを合わせて「本発明治療剤等」ともいう。）も本発明に含まれる。
【００３８】
神経筋接合部の異常に起因する疾患または障害としては、例えば、加齢性筋弱衰症（サルコペニア）、神経原性疾患（ニューロパチー）、筋原性疾患（ミオパチー）を挙げることができる。かかる神経原性疾患（ニューロパチー）としては、例えば、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、筋委縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、神経筋接合部疾患を挙げることができる。かかる筋原性疾患（ミオパチー）としては、先天性ミオパチー、代謝性ミオパチー、筋ジストロフィーを挙げることができる。
【００３９】
本発明促進薬は、ＥＳまたはｉＰＳ由来神経細胞移植に際して同時または逐次的に投与することもできる。これによって、例えば、ＥＳ／ｉＰＳ由来神経細胞移植に際して、移植された神経細胞と他の神経細胞との回路網、または骨格筋等の細胞との接合部の形成を容易にすることができる。そして、本発明促進薬の投与により、ＥＳまたはｉＰＳ由来神経細胞移植による生体の機能回復の効果をさらに促進することができる。
【００４０】
本発明促進薬ないし本発明治療剤等は、例えば、各有効成分に採用されている形態に加工して製造することができる。具体的には、各有効成分を、そのまま又は医薬上許容される無毒性かつ不活性な担体中に、０．０１〜９９．５重量％の範囲内で、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲内で配合することによって製造することができる。
上記担体として、固形、半固形又は液状の希釈剤、充填剤、その他の処方用の助剤を挙げることができる。これらを一種又は二種以上用いることができる。
【００４１】
本発明促進薬ないし本発明治療剤等の剤型としては、有効成分などによって異なるが、例えば、固形又は液状の用量単位で、末剤、カプセル剤、錠剤、糖衣剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤等の経口投与製剤、注射剤、点滴製剤、坐剤等の非経口投与製剤のいずれの形態をもとることができる。徐放性製剤であってもよい。注射剤は、用時調製の注射用キットないし点滴用キットであってもよい。
【００４２】
末剤は、有効成分を適当な細かさにすることにより製造することができる。
散剤は、有効成分を適当な細かさにし、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱粉、マンニトールのような可食性炭水化物と混合することにより製造することができる。任意に風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、香料等を添加することができる。
【００４３】
カプセル剤は、まず上述のようにして粉末状となった末剤や散剤あるいは錠剤の項で述べるように顆粒化したものを、例えば、ゼラチンカプセルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造することができる。滑沢剤や流動化剤、例えば、コロイド状のシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固形のポリエチレングリコールを粉末状のものに混合し、その後充填操作を行うことにより製造することもできる。崩壊剤や可溶化剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加すれば、カプセル剤が摂取されたときの医薬の有効性を改善することができる。また、有効成分の微粉末を植物油、ポリエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤とすることもできる。
【００４４】
錠剤は、賦形剤を加えて粉末混合物を作り、顆粒化もしくはスラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えた後、打錠することにより製造することができる。
粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述の希釈剤やベースと混合することにより製造することができる。必要に応じて、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール）、溶解遅延化剤（例えば、パラフィン）、再吸収剤（例えば、四級塩）、吸着剤（例えばベントナイト、カオリン）等を添加することができる。
【００４５】
粉末混合物は、まず結合剤、例えば、シロップ、澱粉糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子物質溶液で湿らせ、攪拌混合し、これを乾燥、粉砕して顆粒とすることができる。このように粉末を顆粒化する代わりに、まず打錠機にかけた後、得られる不完全な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能である。このようにして作られる顆粒に、滑沢剤としてステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオイル等を添加することにより、互いに付着することを防ぐことができる。
また、錠剤は、上述のように顆粒化やスラグ化の工程を経ることなく、有効成分を流動性の不活性担体と混合した後に直接打錠することによっても製造することができる。
【００４６】
こうして製造された錠剤にフィルムコーティングや糖衣を施すことができる。シェラックの密閉被膜からなる透明又は半透明の保護被覆、糖や高分子材料の被覆及びワックスよりなる磨上被覆をも用いることができる。
【００４７】
他の経口投与製剤、例えば、液剤、シロップ剤、トローチ剤、エリキシル剤もまたその一定量が有効成分の一定量を含有するように用量単位形態にすることができる。
【００４８】
シロップ剤は、有効成分を適当な香味水溶液に溶解して製造することができる。エリキシル剤は、非毒性のアルコール性担体を用いることにより製造することができる。
懸濁剤は、有効成分等を非毒性担体中に分散させることにより製造することができる。必要に応じて、可溶化剤や乳化剤（例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類）、保存剤、風味付与剤（例えば、ペパーミント油、サッカリン）等を添加することができる。
必要であれば、経口投与のための用量単位処方をマイクロカプセル化することができる。当該処方はまた、被覆をしたり、高分子・ワックス等中に埋め込んだりすることにより作用時間の延長や持続放出をもたらすこともできる。
【００４９】
非経口投与製剤は、皮下・筋肉又は静脈内注射用とした液状用量単位形態、例えば、溶液や懸濁液の形態をとることができる。当該非経口投与製剤は、有効成分の一定量を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は溶解し、次いで当該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造することができる。注射液を等張にするために非毒性の塩や塩溶液を添加することができる。また、安定剤、保存剤、乳化剤等を添加することもできる。同様に点滴製剤とすることもできる。
【００５０】
坐剤は、有効成分を低融点の水に可溶又は不溶の固体、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、半合成の油脂［例えば、ウイテプゾール（登録商標）］、高級エステル類（例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル）又はそれらの混合物に溶解又は懸濁させて製造することができる。
【００５１】
本発明促進薬ないし本発明治療剤等の投与量は、有効成分の種類、疾患ないし障害の種類、体重、年齢等の患者の状態、剤形、投与方法、投与経路、症状の程度等によって異なる。ジスルフィラムについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲内が適当であり、１．６７ｍｇ／ｋｇ〜８．３３ｍｇ／ｋｇの範囲内が好ましい。ラベプラゾールについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇの範囲内が適当であり、０．１７ｍｇ／ｋｇ〜０．３３ｍｇ／ｋｇの範囲内が好ましい。ナブメトンについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与が適当である。メチルプレドニゾロンについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲内が適当である。スピペロンについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり２．５μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇの範囲内が適当であり、８．３３μｇ／ｋｇ〜７５．０μｇ／ｋｇの範囲内が好ましい。ホルモテロールについては、一般には成人（体重６０ｋｇ）に対して、有効成分の用量として、１日当たり０．０３μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇの投与（吸入）が適当である。場合によっては、これ以下でも足りるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。
【００５２】
本発明促進薬ないし本発明治療剤等の投与方法としては、例えば、経口投与、静脈内投与、門脈内投与、皮下投与、点滴投与、局所投与（例、経粘膜投与、経鼻投与、吸入投与、経皮投与）を挙げることができる。投与回数は、有効成分の種類や用量、剤形、患者の状態等によって異なるが、例えば、１日１回〜数回又は１日〜数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００５３】
次に試験例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はそれら試験例に限定されるものではない。
【００５４】
［試験例１］ジスルフィラムによるＭｕＳＫ／ＡＴＦ２シグナル伝達経路の活性化
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）２９３に、ＬＲＰ４、ＭｕＳＫ、ｎｅｕｒａｌ ａｇｒｉｎの各ｃＤＮＡと、ＡＴＦ２−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ   ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ、コントロールとしてｐｈＲＬ−ＴＫ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて遺伝子導入した。この遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに１．０×１０４個／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。ジスルフィラムを１０μＭの濃度となるように添加し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＰＯＷＥＲＳＣＡＮ４（ＤＳ  Ｐａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）にて測定した。その結果を図１に示す。
【００５５】
図１に示すように、ジスルフィラムを添加することにより、ＡＴＦ２の活性化が観察された。ＡＴＦ２はアセチルコリンレセプターの凝集を誘導するＭｕＳＫの下流で転写活性が促進されることが知られていることから、ジスルフィラムはＭｕＳＫのシグナル伝達経路を活性化することが明らかである。
【００５６】
［試験例２］ウエスタンブロッティングによるＭｕＳＫリン酸化の確認
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３を６ウェルプレートに１．０×１０５個／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、７２時間培養を行い、これにＬＲＰ４、ＦＬＡＧタグ付きＭｕＳＫのｃＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて遺伝子導入した。この遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞を３６時間培養後、１０ｎｇ／ｍＬのａｇｒｉｎ（蛋白質）を添加した。そのａｇｒｉｎ存在下において、溶解したジスルフィラムを０、５、１０、２０または５０μＭの濃度となるように細胞に添加し、さらに２４時間培養した後、ＰＬＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに１μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、１μｇ／ｍＬ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、１０μｇ／ｍＬ  ａｐｒｏｎｔｉｎｉｎ、１ｍＭ  ｖａｎａｄａｔｅを添加した溶液を細胞に加え、細胞の総たんぱく質を回収した。これを用いて抗リン酸化チロシン抗体による免疫沈降した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動により回収したタンパク質を分離し、メンブレンへ転写後に抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を行った。
【００５７】
コントロールとして、同様に免疫沈降する前の総たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動後、メンブレンへ転写し、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を行った。免疫沈降されたリン酸化ＭｕＳＫ（ＭｕＳＫ−Ｐ）、β−ａｃｔｉｎのタンパク質量をＩｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定し、数値化した。その結果を図２に示す。
【００５８】
図２に示すように、ジスルフィラムは、用量依存的に細胞内におけるＭｕＳＫのリン酸化を促進することが明らかである。
【００５９】
［試験例３］アセチルコリンレセプター凝集試験
４８ウェルプレートにマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、ＲＢＲＣ−ＲＣＢ０９８７）を播種し、２％のウマ血清を添加して１週間筋管分化誘導を行った。その後、培地に１０ｎｇ／ｍＬのａｇｒｉｎ（蛋白質）を添加し、そのａｇｒｉｎ存在下において、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解したジスルフィラムを０μＭ、１０μＭ、２０μＭの濃度で添加し、１６時間培養を行った。α−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを培養液全体の２％の割合で添加して染色し、さらに１時間の培養後、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した。染色されたアセチルコリンレセプターの凝集を１ウェルにつき８か所無作為に倒立蛍光顕微鏡ＩＸ７１（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）にて写真撮影し、画像解析ソフトＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて解析した。その結果を図３に示す。なお、図３（Ｂ）グラフ中、「ＤＭＳＯ」は、ａｇｒｉｎ存在下、溶媒のＤＭＳＯのみを細胞に添加したジスルフィラム０μＭの条件のものを示す。「ａｇｒｉｎ（−）」は、ａｇｒｉｎも添加しない条件のものを示す。
【００６０】
図３（Ａ）の可視化した写真からも明らかなように、ａｇｒｉｎ存在下おいては、ジスルフィラム添加によりアセチルコリンレセプターの凝集を示す白色に染色された部分の数、および輝度の上昇が見られた。図３（Ｂ）に示す通り、１０μＭ、２０μＭのジスルフィラム添加時に単位面積当たりのアセチルコリンレセプター凝集数が増加し、２０μＭのジスルフィラム添加時に単位面積当たりのアセチルコリンレセプターの染色輝度が増加することが確認された。これはジスルフィラムが、ａｇｒｉｎ存在下でアセチルコリンレセプター凝集を促進したためと考えられる。
【００６１】
［試験例４］病態モデルマウスを用いたジスルフィラムの効果の確認
（１）８週齢、雄のＣ５７／ＢＬ６マウスの左後肢を切開し、前脛骨筋を支配している腓骨神経を前脛骨筋入口部で結紮切離し脱神経を行った。続いて、足関節レベルで脛骨神経を切断し、その近位断端を、前脛骨筋の遠位３分の１の部分に縫合してＮｅｕｒｏｔｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌマウスを作成した。マウスを、陰性コントロールとしての脱神経群（Ｎｅｕｒｏｔｉｚａｔｉｏｎ）、Ｎｅｕｒｏｔｉｚａｔｉｏｎ＋プラセボ群（プラセボ群）、Ｎｅｕｒｏｔｉｚａｔｉｏｎ＋ジスルフィラム群（ジスルフィラム群）の３群に分け、ジスルフィラム群には、術翌日より、体重１ｇあたり１００μｇのジスルフィラムを溶解したオリーブオイルを、プラセボ群には同量のオリーブオイルのみを、ディスポーザルゾンデ（フチガミ社製）を用いて４週間連日経口投与した。薬剤の投与の効果は、下記のように前脛骨筋における筋湿重量、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）およびｍＲＮＡ量を測定することによって行った。
【００６２】
（２）筋湿重量の計測
術後２週、４週、８週の時点でマウスの両側の前脛骨筋を採取して筋湿重量を計測した。術後４週までは計測当日までプラセボもしくはジスルフィラムを投与し、４週以降は投与を中止して８週で計測を行った。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４（Ａ）から明らかな通り、術後４週の時点において、ジスルフィラム群でプラセボ群に対して有意に筋湿重量が増加していることが確認された。
【００６４】
（３）電気生理学的検査
術後２週、４週、８週の時点でＮｅｕｒｏｐａｃｋΣ（日本光電社製）を用いて、前脛骨筋の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を測定した。測定は、坐骨神経を直接電極で刺激し、前脛骨筋の中央部に記録電極を刺入して行った。プラセボもしくはジスルフィラムの投与は術翌日から４週まで行った。その結果を図４（Ｂ）に示す。
【００６５】
図４（Ｂ）から明らかな通り、術後２週の時点において、ジスルフィラム群でプラセボ群より有意にＣＭＡＰが高い結果となっており、ジスルフィラム群では、プラセボ群と比較してより早期から神経再支配が行われていることが確認された。
【００６６】
（４）ｍＲＮＡ量の計測
上記と同様に、術後８週の時点でプラセボ群、ジスルフィラム群のマウスの前脛骨筋を採取した。液体窒素で急速冷凍後、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で筋を粉砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを抽出して、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡに対して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ社製）酵素とマーカー遺伝子特異的なプライマーを用いてｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）で行い、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を計測した。マーカー遺伝子として、成熟した神経筋接合部に特異的に発現するアセチルコリンレセプターのεサブユニットであるＣｈｒｎｅ、アセチルコリンエステラーゼのコラーゲンテイルペプチドであるＣｏｌｑ、ＡＣｈＲの接着分子であるＲａｐｓｎを選択・測定した。その結果を図５〜７に示す。なお、各グラフは、それぞれβ２ＭＧ（ベータ―２ミクログロブリン）の発現量で標準化している。
【００６７】
図５〜７から明らかな通り、ジスルフィラムの投与により、神経再支配筋内において神経筋接合部に特異的に発現するＣｈｒｎｅ、Ｃｏｌｑ、Ｒａｐｓｎの各遺伝子の発現が増加する傾向にあることを確認した。
【００６８】
以上の通り、ジスルフィラムはＭｕＳＫ／ＡＴＦ２シグナル伝達経路を活性化することから、神経筋接合部の形成を促進することが明らかである。実際、病態モデルマウスを用いた実験において、筋湿重量の増加や早期の神経再支配が行われ、また神経再支配筋内において神経筋接合部に特異的に発現する各遺伝子の発現が増加する傾向も確認された。
【００６９】
［試験例５］その他の有効成分による神経筋接合部の形成促進効果の確認
ラベプラゾール、ナブメトン、メチルプレドニゾロン（６α）、スピペロン、およびホルモテロール（フマル酸塩）についても、試験例１と同様の実験を行った。その結果をジスルフィラムによる結果を含めて図８に示す。
【００７０】
図８に示すように、他の５種の薬物についてもジスルフィラムと同様、ＭｕＳＫ／ＡＴＦ２シグナル伝達経路を活性化した。したがって、これらの薬物についても神経筋接合部の形成を促進することが明らかであり、筋湿重量の増加や早期の神経再支配なども推測される。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明促進薬は、神経筋接合部の形成を促進することで、神経原性疾患、筋原性疾患等を治療もしくは緩和または予防することができることから、それを含む薬剤は産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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