(57)【要約】      （修正有）【課題】クローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法において用いるための薬物の提供。【解決手段】フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバー、特に、フィブロネクチンのドメインＥＤ−Ａに結合する特異的な結合メンバー、を含む治療有効量の薬物を患者に投与することを含む、患者におけるＩＢＤを処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法において用いるための、フィブロネクチンのエキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）アイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー。
【請求項２】
ＣＤまたはＵＣのようなＩＢＤを処置するための薬物を製造するための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーの使用。
【請求項３】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーを含む治療有効量の薬物を患者に投与することを含む、患者におけるＩＢＤを処置する方法。
【請求項４】
特異的な結合メンバーはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する、請求項１に記載の使用のための特異的な結合メンバー、請求項２に記載の使用、または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
特異的な結合メンバーは、ＩＬ−１０のような免疫抑制性または抗炎症性の分子にコンジュゲートしている、請求項１もしくは４に記載の使用のための特異的な結合メンバー、請求項２または４に記載の使用、または請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
特異的な結合メンバーは、切断可能なリンカーによって生理活性分子にコンジュゲートしている、請求項５に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項７】
ＩＢＤを診断する方法において用いるための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー。
【請求項８】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する、請求項７に記載の使用のための特異的な結合メンバー。
【請求項９】
検出可能な標識または放射性同位体にコンジュゲートしている、請求項７または８に記載の使用のための特異的な結合メンバー。
【請求項１０】
特異的な結合メンバーにコンジュゲートしている分子の、ＩＢＤ組織の新生脈管構造への送達において用いるための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー。
【請求項１１】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する、請求項１０に記載の使用のための特異的な結合メンバー。
【請求項１２】
分子は、ＩＬ−１０のような免疫抑制性または抗炎症性の分子である、請求項１０または１１に記載の使用のための特異的な結合メンバー。
【請求項１３】
特異的な結合メンバーは、フレームワークならびに１セットの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し、
または、ＶＨドメインは、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３内に１０個以下のアミノ酸置換を有する１セットの相補性決定領域を含む、
請求項１および４〜１２のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、請
求項２に記載の使用、または請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＨドメインフレームワークはヒト生殖系列フレームワークである、請求項１３に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項１５】
ＶＨドメインは配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項１６】
特異的な結合メンバーは、１セットの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含むＶＬドメインをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項１７】
ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有し、
または、ＶＬドメインは、相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３内に１０個以下のアミノ酸置換を有する１セットの相補性決定領域を含む、
請求項１６に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項１８】
ＶＬドメインフレームワークはヒト生殖系列フレームワークである、請求項１６または１７に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項１９】
ＶＬドメインは配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２０】
特異的な結合メンバーは単鎖Ｆｖを含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２１】
結合メンバーは小型免疫タンパク質（ＳＩＰ）である、請求項２０に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２２】
ＩＢＤは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）ではない、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２３】
ＩＢＤはコラーゲン性大腸炎である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２４】
ＩＢＤはリンパ球性大腸炎である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２５】
ＩＢＤは虚血性大腸炎である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２６】
ＩＢＤは空置性大腸炎である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２７】
ＩＢＤはベーチェット病である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２８】
ＩＢＤは不確定の大腸炎である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のための
特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項２９】
ＩＢＤはクローン病（ＣＤ）である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のための特異的な結合メンバー、使用または方法。
【請求項３０】
配列番号１３に示す配列を有する、ＩＬ−１０にコンジュゲートしているフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する結合メンバーを含むコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置および検出に関する。本発明は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバー、特に、フィブロネクチンのドメインＥＤ−Ａに結合する特異的な結合メンバーの使用を伴う。特異的な結合メンバーは、例えば、インターロイキン−１０などの免疫抑制性または抗炎症性の分子にコンジュゲートしていてよい。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸および小腸に罹患する一群の炎症性状態である。ＩＢＤの主なタイプには、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）がある。ＩＢＤの病原性は、腸における慢性的な炎症状態に寄与し、炎症状態を永続化させる様々な血管新生の調節によって特徴付けられる（非特許文献１）。クローン病は消化管の任意の部分に罹患し得るが、潰瘍性大腸炎は結腸および直腸に限定されるのが典型的である（非特許文献２）。潰瘍性大腸炎の処置は、重症度に応じて、その症状を制御するための免疫抑制を必要とし得、処置は通常、抗炎症性の分子の投与を伴う。
【０００３】
ＩＢＤは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２（例えば、ＩＬ−１２ｐ７０）などの炎症促進性サイトカインの上方制御によって特徴付けられることが知られている。例えば、クローン病は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３およびＩＦＮ−γ／ＩＬ−１７の過剰生成に関連することが知られている（非特許文献３）。活動性のクローン病の間にＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３が合成されることも報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は糖タンパク質であり、様々な正常組織および体液において広く発現される。フィブロネクチンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分であり、細胞接着、細胞遊走、止血、血栓形成、創傷治癒、組織の分化、および癌化を含めた、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たす。
【０００５】
ＦＮの様々なアイソフォームが、サイトカインおよび細胞外ｐＨによって変調されるプロセスである、転写一次産物であるＦＮのｐｒｅ−ｍＲＮＡの３領域（ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、ＩＩＩＣＳ）の選択的スプライシングによって産生される（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。フィブロネクチンは、選択的スプライシングを経験し得る２つのＩＩＩ型球状エキストラドメインであるＥＤ−ＡおよびＥＤ−Ｂを含んでいる（非特許文献８、非特許文献９）。マウスフィブロネクチンおよびヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ａは９６．７％同一である（アミノ酸９０個の配列２つの間でアミノ酸３個のみが異なる）。
【０００６】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａの発現は、乳癌における（非特許文献１０、非特許文献１１）、および肝臓癌における（非特許文献１２、非特許文献１３）、腫瘍細胞および固形腫瘍においてｍＲＮＡレベルで、ならびに線維肉腫、横紋筋肉腫、およびメラノーマにおいて単離されたタンパク質のレベルで（非特許文献１４）報告されている。癌以外では、フィブロネクチンのＥＤ−Ａの発現は、関節リウマチにおいて報告されている（特許文献１）。特許文献２はまた、子宮内膜症、乾癬、および乾癬性関節炎におけるフィブロネクチンのＥＤ−Ａの発現を報告しているが、組織化学的分析により、多発性硬化症および潰瘍性大腸炎におけるＥＤ−Ａの発現は非常に弱いものから実質的に存在しないものであることが明らかになった。Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌらによって報告された免疫組織化学分析は（非特許文献１５）、ＣＤ患者の炎症を起こした腸管粘膜では、対照の粘膜に比べてＥＤ−Ａ発現が低減し、潰瘍性大腸炎では増大することが示されている。非特許文献１５はまた
、ＣＤ患者の線維性の粘膜におけるＥＤ−ＡおよびＥＤ−Ｂのアイソフォームの発現の増大を報告している。ＥＤ−ＡおよびＥＤ−Ｂのアイソフォームは創傷治癒に関与することが知られているので、これらのフィブロネクチンアイソフォームは線維性の粘膜において発現することが予想される。非特許文献１５において、対照の患者に由来する粘膜と比べてＣＤ患者の炎症を起こした腸管粘膜におけるＥＤ−Ａの発現が低下することから、ＥＤ−Ａが（活動性の）ＣＤの間に発現される示唆はない。ＩＢＤを処置または診断するための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する結合メンバーの使用は、この文書にも開示されていない。
【０００７】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、免疫系の重要なレギュレーターとして機能する、抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−１０は免疫系において多くの様々な役割を有することが知られているが、ＩＬ−１０の主要な２つの活性には、マクロファージによるサイトカイン生成の阻害、およびＴ細胞活性化の間のマクロファージの付属機能の阻害が含まれる（非特許文献１６）。これらの作用の効果により、ＩＬ−１０は免疫系において主に抗炎症の役割を果たすようになる。ＩＬ−１０は当初、サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として知られており、このタンパク質の発見はこのタンパク質の生物学的活性に基づくものであった（非特許文献１７）。ＩＬ−１０はよく知られている抗炎症性の性質のため、ＩＬ−１０治療はクローン病（ＣＤ）における潜在的な新たな抗炎症治療として導入された（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）。
【０００８】
Ａｓａｄｕｌｌａｈら（非特許文献２１）は、数々の炎症性疾患におけるインターロイキン−１０療法の最新技術を再考するものである。Ａｓａｄｕｌｌａｈらは、慢性炎症性腸疾患を再考するにあたり、いくつかの大規模な多施設治験を行い、軽度／中等度または治療不応性のＣＤを有する患者、および全身投与による内視鏡的な術後発生を防ぐために回腸または回腸結腸の治療的切除を行った患者においてＩＬ−１０の複数の投与量を試験したことを報告している（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。このデータは、ＩＬ−１０療法は安全であり、十分に認容されることを示す。しかし、ＩＬ−１０処置は、プラセボ処置に比べて、著しく高い寛解率または臨床的改善をもたらさなかった。
【０００９】
全体的に見て、臨床結果は不満足であることが判明し、この治療戦略での期待外れに対するいくつかの説明が、ＨｅｒｆａｒｔｈおよびＳｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ（非特許文献２２）によって論じられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０５６２６８
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０７８９５０
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｈｉｄｌｏｗら、２００６年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９巻、Ｇ５〜Ｇ１８頁
【非特許文献２】Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＲＷ、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＤＥ、Ｑａｄｉｒ  Ｋ、Ｕｒｂａｎ  ＪＦ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＪＶ（２００３年）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｌ．、９８巻、２０３４〜２０４１頁
【非特許文献３】Ｓｔｒｏｂｅｒら（２００７年）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１７巻（３）、５１４〜５２１頁
【非特許文献４】Ｆｕｓｓら２００６年、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．、１２巻、９〜１５頁
【非特許文献５】Ｂａｌｚａ（１９８８年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２２８、４２〜４４頁
【非特許文献６】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ（１９８９年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０６巻、１１３９〜１１４８頁
【非特許文献７】Ｂｏｒｓｉ（１９９０年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２６１巻、１７５〜１７８頁
【非特許文献８】ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ（１９９５年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２２巻、２６１〜２７１頁
【非特許文献９】Ｋａｓｐａｒら（２００６年）Ｉｎｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ、１１８巻、１３３１〜１３３９頁
【非特許文献１０】Ｊａｃｏｂｓら（２００２年）Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ、３３巻、２９〜３８頁
【非特許文献１１】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（１９９９年）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、９０巻、３２０〜３２５頁
【非特許文献１２】Ｏｙａｍａら（１９８９年）ＪＢＣ、２６４巻、１０３３１〜１０３３４頁
【非特許文献１３】Ｔａｖｉａｎら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５６巻、８２０〜８２５頁
【非特許文献１４】Ｂｏｒｓｉら（１９８７年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０４巻、５９５〜５６０頁
【非特許文献１５】Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ．（２００７年）２２巻、６１１〜６２３頁
【非特許文献１６】Ａｂｂａｓ  Ａ、Ｌｉｃｈｔｍａｎ  Ａ、Ｐｏｂｅｒ  Ｊ．、１９９４年、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第２版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ
【非特許文献１７】Ｄｅｌｖｅｓ  Ｐ、Ｒｏｉｔｔ  Ｉ（編集）、１９９８、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１８】Ｆｅｄｏｒａｋら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０００年）１１９巻、１４７３〜１４８２頁
【非特許文献１９】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０００年）１１９巻、１４６１〜１４７２頁
【非特許文献２０】Ｃｏｌｏｍｂｅｌら、Ｇｕｔ（２００１年）４９巻、４２〜４６頁
【非特許文献２１】Ａｓａｄｕｌｌａｈら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、（２００３年）、５５巻、２４５〜２６９頁
【非特許文献２２】ＨｅｒｆａｒｔｈおよびＳｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ、Ｇｕｔ（２００２年）５０巻、１４６〜１４７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、多様なＩＢＤ状態の効果的な処置が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは驚くべきことに、ＩＬ−１０に融合した抗−ＥＤＡ抗体は、（ｉ）ＩＢＤ疾患マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで炎症を起こした結腸の部位に選択的に局在化し、（ｉｉ）ＩＢＤ疾患マウスにおけるある種の炎症促進性サイトカイン、特に、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ７０の血清レベルを低減することができることを見出した。
【００１４】
Ｔｉｌｇら（Ｇｕｔ（２００２年）、５０巻、１９１〜１９５頁）は、クローン病患者
を組換えヒトＩＬ−１０で処置するとインターフェロン−ガンマを誘発することを報告しているため、ＩＬ−１０に融合した抗−ＥＤＡ抗体の投与による炎症促進性サイトカインの下方制御は特に驚くべきことであった。Ｓｈｉｂａｔａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９８年）１６１巻、４２８３〜４２８８頁）も、ＩＬ−１０はＮＫ細胞のＩＮＦ−ガンマ生成を増強するが、ＩＦＮ−ガンマ誘導性因子のマクロファージ生成は阻害すると報告している。
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＩＢＤの処置の方法において用いるための、フィブロネクチン（Ａ−ＦＮ）のエキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）アイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子を提供する。本発明は、ＩＢＤを処置するための薬物を製造するための、フィブロネクチンのエキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）アイソフォームに結合する特異的な結合メンバー、例えば抗体分子の使用も提供する。本発明は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーを含む治療有効量の薬物を患者に投与することを含む、患者におけるＩＢＤを処置する方法も提供する。特異的な結合メンバーが、ヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合するのが好ましい。
【００１６】
本発明のこの第１の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。
【００１７】
本発明のこの第１の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、免疫抑制性または抗炎症性の活性を有する分子、検出可能な標識、放射性同位体、または生理活性分子、例えば、サイトカイン、ホルモン、治療用放射性同位体、細胞毒性薬物にコンジュゲートしていてよい。特異的な結合メンバーは、切断可能なリンカーによって生理活性分子にコンジュゲートしていてよい。
【００１８】
好ましい一実施形態において、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、免疫抑制性または抗炎症性の活性を有する分子、例えばＩＬ−１０にコンジュゲートしている。
【００１９】
本明細書で言及するＩＢＤは、活動性のＩＢＤであってよい。特に、ＩＢＤはクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、または不確定の大腸炎であってよい。ＩＢＤは、ＣＤまたはＵＣであってよい。ＩＢＤは、ＣＤ、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、または不確定の大腸炎であってよい。一実施形態において、ＩＢＤはＵＣではない。ＩＢＤは、典型的に、結腸および直腸における炎症に制限されないＩＢＤ、例えばＣＤであってよい。ＩＢＤは結腸の内壁（ｌｉｎｉｎｇ）のみに罹患しないＩＢＤであってよい。ＩＢＤがＣＤであるのが好ましい。本明細書で用いられる、ＣＤ、ＵＣ、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、および不確定の大腸炎の語は、それぞれ、活動性のＣＤ、活動性のＵＣ、活動性のコラーゲン性大腸炎、活動性のリンパ球性大腸炎、活動性の虚血性大腸炎、活動性の空置性大腸炎、活動性のベーチェット病、および活動性の不確定の大腸炎を指し得る。
【００２０】
第２の態様において、本発明は、特異的な結合メンバーにコンジュゲートしている分子のＩＢＤ組織への送達において用いるための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子を提供する。本発明は、特異的な結合メンバーにコンジュゲートしている分子をＩＢＤ組織に送達するための薬物を製造するための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子の使用も提供する。本発明は、ヒトまたは動物におけるＩＢＤ組織に分子を送達する方法も提供し、分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結
合する特異的な結合メンバーにコンジュゲートしてコンジュゲートを形成し、方法はコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む。特異的な結合メンバーが、ヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合するのが好ましい。
【００２１】
本発明のこの第２の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。
【００２２】
本発明のこの第２の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、検出可能な標識、放射性同位体、または生理活性分子、例えば、サイトカイン、ホルモン、治療用放射性同位体、または細胞毒性薬物にコンジュゲートしていてよい。特異的な結合メンバーは、切断可能なリンカーによって生理活性分子にコンジュゲートしていてよい。
【００２３】
特異的な結合メンバー、例えば抗体分子が、ＩＬ−１０にコンジュゲートしているのが好ましい。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、ＩＢＤを診断する方法において用いるための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子を提供する。本発明は、ＩＢＤを診断するための診断用生成物を製造するための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーの使用も提供する。本発明は、ヒトまたは動物におけるＩＢＤを検出または診断する方法も提供し、方法は、
（ａ）ヒトまたは動物に、フィブロネクチンのＥＤ−Ａドメインに結合する特異的な結合メンバーを投与する工程と、
（ｂ）ヒトまたは動物の身体のＩＢＤの部位における特異的な結合メンバーの存在または非存在を決定する工程と
を含み、
特異的な結合メンバーのＩＢＤの部位への局在によりＩＢＤの存在が示される。
【００２５】
特異的な結合メンバーがヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合するのが好ましい。
【００２６】
本発明のこの第３の態様において用いるための、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。
【００２７】
本発明のこの第３の態様において用いるための、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、検出可能な標識、または放射性同位体にコンジュゲートしていてよい。
【００２８】
第４の態様において、本発明は、ＩＢＤ組織を画像化する方法において用いるための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーを提供する。本発明は、ＩＢＤ組織を画像化するための画像化剤を製造するための、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーの使用も提供する。本発明は、ヒトまたは動物におけるＩＢＤ組織を検出または画像化する方法も提供し、方法は、
（ａ）ヒトまたは動物に、フィブロネクチンのＥＤ−Ａドメインに結合する特異的な結合メンバーを投与する工程と、
（ｂ）ヒトまたは動物の身体のＩＢＤ組織に対する特異的な結合メンバーの結合を検出する工程と
を含む。
【００２９】
特異的な結合メンバーがヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合するの
が好ましい。
【００３０】
本発明のこの第４の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。
【００３１】
本発明のこの第４の態様において用いるための特異的な結合メンバー、例えば抗体分子は、検出可能な標識、または放射性同位体にコンジュゲートしていてよい。
【００３２】
第５の態様において、本発明は、ＩＬ−１０にコンジュゲートしている、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、例えばＥＤ−Ａに結合する結合メンバーを含むコンジュゲートを提供し、コンジュゲートは配列番号１３に示す配列を有する。このコンジュゲートを、本明細書ではＦ８−ＩＬ１０と呼ぶ。このコンジュゲートのＶＨドメインとＶＬドメインとは、アミノ酸５個のリンカーによって連結されており（図１Ｂを参照されたい）、コンジュゲートは、溶液中で非共有結合性のホモ二量体を形成することが予想される。
【００３３】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する抗体分子、および／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａであってよく、抗体は、本明細書に記載するＦ８抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つまたはそれ以上含む。これらの配列を以下に提供する（配列番号１〜６を参照されたい）。Ｆ８抗体のＣＤＲ配列も図１に示す。
【００３４】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、本発明に記載する１つまたはそれ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、ならびに場合により、１セットのＣＤＲを形成するためのＣＤＲ１およびＣＤＲ２も含むことができる。
【００３５】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、抗体のＣＤＲのＨおよび／またはＬの１セットを含むのが好ましく、本明細書に記載するＦ８抗体は、開示するＣＤＲのセットのＨおよび／またはＬ内に１０個以下、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有する。
【００３６】
置換は、潜在的にＣＤＲのセット内の任意の残基でなされてもよく、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３内であってもよい。
【００３７】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、抗体分子、例えば、ヒト抗体分子を含むことができる。特異的な結合メンバーは、通常、抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。特異的な結合メンバーのＶＨドメインも、本発明において用いるために提供する。各ＶＨおよびＶＬドメイン内に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、およびフレームワーク領域（「ＦＲ」）がある。ＶＨドメインは１セットのＨＣＤＲを含み、ＶＬドメインは１セットのＬＣＤＲを含む。抗体分子は、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体のＶＨドメインを含むことができる。これは代替的に、またはやはり、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体のＶＬドメインを含むことができる。本明細書に開示する、ＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、およびＨＣＤＲのセット、およびＬＣＤＲのセットは全て、本発明において用いるための特異的な結合メンバーの実施形態を表す。本明細書に記載する、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。したがって、１セットのＨＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、１セットのＬＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。別段の記載がなければ、「ＣＤＲのセット」は、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
【００３８】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、Ｈ
ＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体のＶＨドメインを含むことができ、ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、場合によりＨＣＤＲ２は配列番号２であり、かつ／またはＨＣＤＲ３は配列番号３である。
【００３９】
典型的に、ＶＨドメインはＶＬドメインと対形成して抗体の抗原結合部位を提供するが、以下にさらに論じる通り、ＶＨまたはＶＬドメインを単独で用いて抗原に結合させてもよい。このように、本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体のＶＬドメインをさらに含むことができ、ＬＣＤＲ１は配列番号４であり、場合によりＬＣＤＲ２は配列番号５であり、かつ／またはＬＣＤＲ３は配列番号６である。
【００４０】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーがフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する抗体分子を含むことができるのが好ましく、抗体分子はＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインはフレームワークおよび１セットの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＶＬドメインは相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００４１】
抗体の１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１セットのＣＤＲを、本発明において用いるための抗体分子を提供するために、フレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）にグラフトしてもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子セグメント配列を含むことができる。このように、フレームワークは、生殖系列化されていてよく、それによってフレームワーク内の１つまたはそれ以上の残基が、最も類似するヒト生殖系列フレームワークにおける等価な位置の残基に適合するように変更される。本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、ＤＰ４７など、ヒト生殖系列フレームワークに１セットのＨＣＤＲを含むＶＨドメインを有する、単離された抗体分子であってよい。通常、特異的な結合メンバーはまた、ヒト生殖系列フレームワークなどに、１セットのＬＣＤＲを含むＶＬドメインを有する。ＶＬドメインのヒト生殖系列フレームワークはＤＰＫ２２であってよい。
【００４２】
本発明において用いるためのＶＨドメインが、Ｆ８抗体のＶＨドメインである、配列番号７のアミノ酸配列を有し得るのが好ましい。本発明において用いるためのＶＬドメインが、野生型Ｆ８抗体のＶＬドメインである、配列番号８のアミノ酸配列を有し得るのが好ましい。
【００４３】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、ペプチドのリンカーによって接続されているＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよく、または単鎖Ｆｖを含むことができる。当業者であれば、好適な長さおよび配列の、例えば、アミノ酸の長さ少なくとも５または少なくとも１０個、アミノ酸の長さ最大約１５個、最大約２０個、または最大約２５個である、リンカーを選択することができる。リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧ（配列番号９）を有することができる。
【００４４】
特異的な結合メンバーは、遺伝子融合によって構築される、多価または多特異性のフラグメントである、ダイアボディであってよい（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年ａ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４
４〜６４４８頁）。
【００４５】
特異的な結合メンバーが、溶液中で（安定な）非共有結合性のホモ二量体を形成するｓｃＦｖであるのが好ましい。例えば、本明細書に記載するＦ８抗体およびＦ８−ＩＬ１０コンジュゲートは両方とも、溶液中で（安定な）非共有結合性のホモ二量体を形成することが予想されるｓｃＦｖを含む。
【００４６】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、例えば、（Ｌｉら、（１９９７年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻、７３１〜７３６頁）に記載される、ミニ免疫グロブリンまたは小型免疫タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＩＰ）からなっていてもよい。ＳＩＰは、ヒトＩｇＥ分泌型アイソフォームであるＩｇＥ−Ｓ２のＣＨ４ドメインに融合しているｓｃＦｖ分子を含み（εＳ２−ＣＨ４；Ｂａｔｉｓｔａら、（１９９６年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８４巻、２１９７〜２０５頁）、ホモ二量体のミニ免疫グロブリン抗体分子を形成することができる。
【００４７】
あるいは、本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、通常１つまたはそれ以上のＣＤＲによって提供される、非抗体分子内の抗原結合部位、例えば、非抗体タンパク質骨格における１セットのＣＤＲを含むことができる。非抗体および抗体の分子を含めた特異的な結合メンバーは、本明細書の他所により詳しく記載されている。
【００４８】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、配列番号７に示すＦ８抗体のＶＨドメイン、および／または配列番号８に示すＦ８抗体のＶＬドメインを含む抗体分子であってよい。本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、配列番号１１に示す配列を含む抗体分子であってよい。本発明のＩＬ−１０にコンジュゲートしている特異的な結合メンバーは、配列番号１３に示す配列を含むことができる。
【００４９】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーはまた、抗ＥＤ−Ａ抗体のＨ１、Ｂ２、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ５、Ｃ８、Ｆ１、Ｂ７、Ｅ８、もしくはＧ９のＣＤＲ、もしくはこれらのバリアント、または抗ＥＤ−Ａ抗体のＨ１、Ｂ２、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ５、Ｃ８、Ｆ１、Ｂ７、Ｅ８、もしくはＧ９、もしくはこれらのバリアントのＶＨおよび／またはＶＬドメインの１つまたはそれ以上、例えば６個全てを含むことができる。これらの抗体のＣＤＲ配列、ならびにＶＨおよびＶＬドメイン配列は、ＷＯ２０１０／０７８９５０に開示されている。
【００５０】
本発明において用いるのに適するバリアントは、本明細書に記載するＦ８抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、抗体の抗原結合部位を含み、配列番号７として示すＶＨドメインの５位のロイシン（Ｌ）残基がバリン（Ｖ）で置換されており、かつ／または配列番号８として示すＶＬドメインの１８位のアルギニン（Ｒ）残基がリジン（Ｋ）で置換されている。
【００５１】
本発明のこれらおよび他の態様を以下にさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の重鎖（ＶＨ）（配列番号７）のアミノ酸配列を示す図である。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号１）に下線を付す。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号２）をイタリックで示し、下線を付す。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号３）を太字で示し、下線を付す。
【図１Ｂ】ＶＨとＶＬドメインとの間の抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体リンカー配列のアミノ酸配列を示す図である（配列番号９）。
【図１Ｃ】抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す図である（配列番号８）。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号４）に下線を付す。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号５）をイタリックで示し、下線を付す。抗ＥＤ−Ａ  Ｆ８抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６）を太字で示し、下線を付す。
【図１Ｄ】抗体をＩＬ−１０にコンジュゲートさせた場合のＦ８抗体とＩＬ−１０との間のリンカーのアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｅ】ヒトＩＬ−１０のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＩＢＤおよび健常マウスからの結腸のオートラジオグラフィーの結果を示す図である。結腸を収集し、リン光体−イメージングスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に２４時間、およびＳｔｏｒｍ  ８６０によるイメージングに曝露した。レーン１：注射６時間後に０群（健常マウス）から収集した結腸；レーン２：注射６時間後に２群（ＩＢＤマウス）から収集した結腸；レーン３：注射２４時間後に０群（健常マウス）から収集した結腸；レーン４：注射２４時間後に２群（ＩＢＤマウス）から収集した結腸。
【図３】健常または疾患マウスにおける１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の体内分布を示す図である。チャートは、（Ａ）注射後６時間、（Ｂ）注射後２４時間、および（Ｃ）注射後９６時間の、健常および疾患マウスにおける１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の体内分布を示す。９６時間では、疾患マウスの結腸および腸間膜リンパ節（Ｌ．Ｎ．）における１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の優先的な蓄積が、健常マウスに比べて明白である。これらの実験に用いたＦ８−ＩＬ１０コンジュゲートの配列を、配列番号１３に示す。
【図４】Ｆ８−ＩＬ１０で処置したマウスにおけるサイトカインレベルを示す図である。上のチャートは、健常マウス（水）、処置を受けなかった疾患マウス（３％ＤＳＳ）、小型免疫タンパク質のフォーマットのＦ８抗体を投与した疾患マウス（Ｆ８  ＳＩＰ）、Ｆ８−ＩＬ１０を投与した疾患マウス（Ｆ８−ＩＬ１０）の、血清中のサイトカインレベルを表す。報告するサイトカインレベル（血清１ｍｌあたりのタンパク質のｐｇとして表す）は：インターロイキン１β、（ＩＬ１−ｂ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２ｐ７０）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、およびインターロイキン６（ＩＬ６）である。
【図５】Ｆ８−ＩＬ１０で処置したマウスにおけるサイトカインレベルを示す図である。上のチャートは、健常マウス（水）、処置を受けなかった疾患マウス（３％ＤＳＳ）、小型免疫タンパク質のフォーマットにおけるＦ８抗体を投与した疾患マウス（Ｆ８ＳＩＰ）、Ｆ８−ＩＬ１０を投与した疾患マウス（Ｆ８−ＩＬ１０）の、血清中サイトカインレベルを表す。報告するサイトカインレベル（そのレベルを血清１ｍｌあたりのタンパク質のｐｇとして表す）は：ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）である。
【図６】ＳＩＰフォーマットにおけるＦ８抗体、およびフォンウィルブランド因子でプロービングした、潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患している患者からの結腸組織の検体の組織化学的分析を示す図である。Ｆ８抗体およびフォンウィルブランド因子で観察される染色パターンは、Ｆ８は、潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患している患者において、新たに形成された血管を染色するが、正常な血管は染色しないことを示す（フォンウィルブランド因子は、正常の脈管形成のマーカーとしてルーチンで用いられる）。
【図７】潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患している患者の結腸組織（右）、ならびに罹患していない結腸（左）の検体の組織化学的分析を示す図である。Ｆ８抗体で観察される染色パターンは、Ｆ８染色は、罹患している結腸における新たに形成される血管を、より強力に染色することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
用語
フィブロネクチン
フィブロネクチンは、選択的スプライシングに供される抗原であり、本明細書の他所に記載する通り、数々の代替的なフィブロネクチンのアイソフォームが知られている。エキストラドメイン−Ａ（ＥＤＡまたはＥＤ−Ａ）も、ＥＤ、エキストラタイプＩＩＩリピートＡ（ＥＩＩＩＡ）、またはＥＤＩとして知られている。ヒトＥＤ−Ａの配列は、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻、５８５３〜５８６８頁、およびＰａｏｌｅｌｌａら（１９８８年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻、３５４５〜３５５７頁によって公表されている。ヒトＥＤ−Ａの配列はまた、受諾番号Ｐ０２７５１の下に寄託されているアミノ酸配列のアミノ酸１６３１〜１７２０（フィブロネクチンＩＩＩ型１２；エキストラドメイン２）として、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース上で入手できる。マウスＥＤ−Ａの配列は、受諾番号Ｐ１１２７６の下に寄託されているアミノ酸配列のアミノ酸１７２１〜１８１０（フィブロネクチンＩＩＩ型１３；エキストラドメイン２）として、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース上で入手できる。
【００５４】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム（Ａ−ＦＮ）はエキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）を含む。ヒトＡ−ＦＮの配列は、受諾番号Ｐ０２７５１の下にＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース上で入手できる、対応するヒトフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。マウスＡ−ＦＮの配列は、受諾番号Ｐ１１２７６の下にＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース上で入手できる、対応するマウスフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。Ａ−ＦＮは、フィブロネクチンのヒトＥＤ−Ａアイソフォームであってよい。ＥＤ−Ａは、ヒトフィブロネクチンのエキストラドメイン−Ａであってよい。
【００５５】
ＥＤ−Ａは、選択的スプライシングによってフィブロネクチン（ＦＮ）中に挿入され、ＦＮのドメイン１１と１２との間に位置する、アミノ酸９０個の配列である（Ｂｏｒｓｉら、１９８７年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０４巻、５９５〜６００頁）。ＥＤ−Ａは、血漿型のＦＮ中には主に非存在であるが、胚形成、組織のリモデリング、線維症、心臓移植、および固形腫瘍の増殖の間は大量にある。
【００５６】
選択的スプライシング
選択的スプライシングは、ＤＮＡの一次ＲＮＡ転写物のスプライシングの様々なパターンが生じて様々なｍＲＮＡを生成することを指す。イントロンを切り出した後、選択により、ｍＲＮＡを形成するのにどのエクソンが一緒にスプライシングされるかが決定され得る。選択的スプライシングにより、様々なエクソンおよび／または様々な数のエクソンを含む様々なアイソフォームの生成がもたらされる。例えば、１つのアイソフォームは、１つまたはそれ以上のエクソンに対応するさらなるアミノ酸配列を含むことができ、１つまたはそれ以上のエクソンは１つまたはそれ以上のドメインを含むことができる。
【００５７】
特異的な結合メンバー
これは、相互に特異的に結合する１対の分子の１メンバーを記述するものである。特異的な結合対のメンバーは、天然由来でも、または全体的もしくは部分的に合成で生成されていてもよい。分子の対の１メンバーはその表面上、または孔上に、分子の対の他のメンバーの特定の空間および極性の組織化に結合し、ゆえに相補的である区域を有する。結合対のタイプの例として、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質がある。本発明は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
【００５８】
特異的な結合メンバーは、通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、特異的な結合メンバーは、抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であってよい。特異的な結合メンバーは、本明細書に言及する通り、抗体分子であるのが好ましい。
【００５９】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはチトクロームＢなどの非抗体タンパク質骨格
上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配置によって（ＨａａｎおよびＭａｇｇｏｓ、（２００４年）、ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ、１２巻（５）：Ａ１〜Ａ６頁；Ｋｏｉｄｅら、（１９９８年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８４巻、１１４１〜１１５１頁；Ｎｙｇｒｅｎら、（１９９７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻、４６３〜４６９頁）、または所望の標的に対する結合特異性を付与するタンパク質骨格内のループのアミノ酸残基をランダム化もしくは変異することによって提供することができる。タンパク質における新規な結合部位を操作するための骨格は、Ｎｙｇｒｅｎら（１９９７年）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻、４６３〜４６９頁）によって詳しく概説されている。抗体ミミックに対するタンパク質骨格はＷＯ／００３４７８４に開示されており、ＷＯ／００３４７８４の発明者らは、少なくとも１つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体ミミック）を記載している。１セットのＨＣＤＲなど、１つまたはそれ以上のＣＤＲをその中にグラフトする適切な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。骨格は、ヒトまたは非ヒトのタンパク質であってよい。非抗体タンパク質骨格の利点は、少なくともいくつかの抗体分子よりも小型であり、かつ／または製造が容易である骨格分子における抗原結合部位を提供し得ることである。小型サイズの結合メンバーは、細胞に侵入し、組織深部に浸透し、もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的の抗原のタンパク質孔内に結合する能力などの、有用な生理学的性質を付与し得る。非抗体タンパク質骨格における抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ、２００４年、ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ、１２巻（４２）、Ａ１〜Ａ７頁に概説されている。ループ（単数または複数）のアミノ酸配列を特異的に、またはランダムに変異させて標的の抗原に結合する抗原結合部位を創出する、安定なバックボーンおよび１つまたはそれ以上の可変のループを有するタンパク質が典型的である。このようなタンパク質には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、およびリポカリンが含まれる。他の手法には、分子内ジスルフィド結合を有するシクロチド−小型タンパク質をベースとした、合成の「マイクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）」（Ｓｅｌｅｃｏｒｅ  ＧｍｂＨ）が含まれる。
【００６０】
抗体の配列および／または抗原結合部位の他に、本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、例えば、フォールディングされたドメインなどのペプチドまたはポリペプチドを形成する、または抗原に結合する能力に加えて別の機能的な特徴を分子に付与するための、他のアミノ酸を含むことができる。本発明において用いるための結合メンバーは検出可能な標識を保有していてよく、または免疫抑制性もしくは抗炎症性の効果を発揮する分子である毒素、もしくはターゲティングモイエティもしくは酵素にコンジュゲートしていてよい（例えば、ペプチド結合またはリンカーによって）。本発明において用いるための結合メンバーがインターロイキン１０にコンジュゲートしているのが好ましい。
【００６１】
例えば、結合メンバーは、触媒部位（例えば、酵素ドメインにおける）、および抗原結合部位を含むことができ、抗原結合部位は抗原に結合し、ゆえに触媒部位の標的を抗原とする。触媒部位は、切断などによって、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
【００６２】
しかし、注目される通り、ＣＤＲは非抗体の骨格によって輸送され得、ＣＤＲまたは１セットのＣＤＲを輸送するための骨格は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の配列、またはこれらの実質的な一部分であるのが一般的であり、これらの骨格では、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、再配列した免疫グロブリン遺伝子によってコードされる、天然に存在するＶＨおよびＶＬの抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する。免疫グロブリンの可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔら（１９８７年）（Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、第４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、および現在インターネット上で入手できるこの最新版（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ、または任意のサーチエンジンを用いて「Ｋａｂａｔ」で見出される）を参考にして決定することができる。
【００６３】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（１９８７年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｋａｂａｔら、（１９９１年ａ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ
Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、およびその後の版）によって規定される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものとされる。抗体が、重鎖ＣＤＲを３個、および軽鎖ＣＤＲを３個含むのが典型的である。ＣＤＲ（単数または複数）の語は、場合によって、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性によって結合を担うアミノ酸残基の大多数を含む領域の１つもしくはいくつか、または全てを示すために本明細書において用いられる。
【００６４】
６個の短いＣＤＲ配列の中で、重鎖の３番目のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）はより大きなサイズの可変性（本質的に、それを生じる遺伝子の配置のメカニズムによる、より大きな多様性）を有する。知られている最長のサイズはアミノ酸２６個であるが、アミノ酸２個ほどに短くてもよい。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的に役割を果たす（Ｓｅｇａｌら、（１９７４年）、ＰＮＡＳ、７１巻、４２９８〜４３０２頁；Ａｍｉｔら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、：７４７〜７５３頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７７〜８８３頁；Ｃａｔｏｎら、（１９９０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻、１９６５〜１９６８頁；Ｓｈａｒｏｎら、（１９９０年ａ）、ＰＮＡＳ、８７巻、４８１４〜４８１７頁；Ｓｈａｒｏｎら、（１９９０年ｂ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻、４８６３〜４８６９頁；Ｋａｂａｔら、（１９９１年ｂ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻、１７０９〜１７１９頁）。
【００６５】
抗体分子
これは、天然でも、または部分的もしくは完全に合成で生成されたものでも、免疫グロブリンを記載するものである。この語は、抗体の抗原結合部位を含めた、任意のポリペプチドまたはタンパク質にも関する。本明細書において、本発明は天然の形態の抗体に関するものではなく、すなわち抗体は天然の環境におけるものではなく、天然の源から精製によって単離および入手することができ、またはそうでなければ遺伝的組換えによって、もしくは化学合成によって得ることができ、次いで、これらは後に記載する非天然のアミノ酸を含むことができることを理解されたい。抗体の抗原結合部位を含む抗体フラグメントには、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗体分子、およびダイアボディが含まれる。
【００６６】
モノクローナル抗体および他の抗体を取り、組換えＤＮＡ技術の技法を用いて、標的の抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。このような技法は、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡ、または抗体のＣＤＲを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを伴い得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８Ａ、またはＥＰ−Ａ−２３９４００、およびそれに続く文献の大方を参照されたい。ハイブリドーマ、または抗体
を生成する他の細胞を、生成された抗体の結合特異性を変更し得、または変更し得ない、遺伝的変異または他の変更にかけてもよい。
【００６７】
抗体は数々の方法で改変され得るので、「抗体分子」の語は、必要とされる特異性および／または抗原に対する結合性を有する抗体の抗原結合部位を有する任意の結合性のメンバーまたは物質を網羅するものと解釈されたい。したがって、この語は、天然でも、または完全に、もしくは部分的に合成でも、抗体の抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含めた、抗体のフラグメントおよび誘導体を網羅するものである。別のポリペプチド（例えば、別の種に由来し、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する）に融合している、抗体の抗原結合部位、または同等物を含めたキメラ分子がしたがって含まれる。キメラの抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびにそれに続く文献の大方に記載されている。
【００６８】
抗体の操作の技術分野に利用できるさらなる技法により、ヒトおよびヒト化の抗体を単離することが可能になっている。例えば、ヒトハイブリドーマは、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２００１年）、Ｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＬＬＣ；ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５によって記載されている通りに作製することができる。結合メンバーを産生するのに確立されている別の技法であるファージディスプレイは、ＷＯ９２／０１０４７（以下に詳しく記載する）、および米国特許ＵＳ５９６９１０８、ＵＳ５５６５３３２、ＵＳ５７３３７４３、ＵＳ５８５８６５７、ＵＳ５８７１９０７、ＵＳ５８７２２１５、ＵＳ５８８５７９３、ＵＳ５９６２２５５、ＵＳ６１４０４７１、ＵＳ６１７２１９７、ＵＳ６２２５４４７、ＵＳ６２９１６５０、ＵＳ６４９２１６０、ＵＳ６５２１４０４、ならびにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２００１年）、Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＬＬＣ；ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５など、多くの出版物に詳しく記載されている。マウスの抗体遺伝子を不活性化し、ヒトの抗体の遺伝子で機能的に置き換え、マウスの免疫系の他の構成成分はインタクトなままであるトランスジェニックマウスを、ヒトの抗体を単離するのに用いることができる（Ｍｅｎｄｅｚら、（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ、１５巻（２）：１４６〜１５６頁）。
【００６９】
例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６巻、５７〜８６頁またはＫｒｅｂｓら（２００１年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４巻、６７〜８４頁によって記載されているように、合成の抗体分子を、適切な発現ベクター内で合成され、組み立てられたオリゴヌクレオチドによって産生された遺伝子から、発現によって創出してもよい。
【００７０】
全抗体のフラグメントは、結合性の抗原の機能を遂行することができることが示されている。結合性フラグメントの例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻、５５２〜５５４頁；Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻、４８４〜４９０頁）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）連結された２個のＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによってＶＨドメインとＶＬドメインとが連結されている、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８
３頁）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築される多価または多特異性のフラグメントである「ダイアボディ」（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年ａ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁）がある。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨとＶＬドメインとを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化することができる（Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４巻、１２３９〜１２４５頁）。ＣＨ３ドメインに接続しているｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｈｕら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻（１３）、３０５５〜６１頁）。結合性フラグメントの他の例にはＦａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨがあり、Ｆａｂ’は、抗体のヒンジ領域からのシステインを１つまたはそれ以上含めた、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を加えることによりＦａｂフラグメントと異なり、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を保有するＦａｂ’フラグメントである。
【００７１】
本発明において用いるための抗体フラグメントは、本明細書に記載する抗体分子のいずれか（例えば、ＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、もしくは本明細書に記載する抗体のいずれかのＣＤＲを含む抗体分子）から出発して、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化などの方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断によって得ることができる。別の様式では、本発明の抗体フラグメントは、遺伝的組換えなどの当業者にはよく知られている技法によって、またはそうでなければＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって供給されるものなどの自動ペプチド合成機などによるペプチド合成によって、または核酸の合成および発現によって得ることができる。
【００７２】
本発明による機能的な抗体フラグメントは、その半減期が化学修飾によって、特にＰＥＧ化によって、またはリポソーム中への組み込みによって増大する、任意の機能的なフラグメントを含む。
【００７３】
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の、すなわち抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の、小型の単量体の抗原結合性フラグメントである（Ｈｏｌｔら（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻、４８４〜４９０頁）。ＶＨ  ｄＡｂは、ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ）に天然に存在し、ラクダ科動物を標的の抗原で免疫化し、抗原特異的なＢ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることによって生成することができる。ｄＡｂは細胞培養物においても生成できる。ｄＡｂは、サイズが小型であり、溶解性が良く、温度安定性であるため、特に生理学的に有用で、選択およびアフィニティ成熟に適切となっている。本発明の結合メンバーは、本明細書に実質的に説明するＶＨもしくはＶＬドメイン、または本明細書に実質的に説明する１セットのＣＤＲを含むＶＨもしくはＶＬドメインを含むｄＡｂであってよい。
【００７４】
本明細書で用いられる、「実質的に説明する」の句は、本明細書に記載する結合メンバーのＶＨまたはＶＬドメインの関連のＣＤＲの特徴（複数可）が、本明細書に配列を説明する特定の領域に同一であるか、または高度に類似することを指す。本明細書に記載する、１つまたはそれ以上の可変ドメインの特定の領域（複数可）に関して「高度に類似する」の句は、１個から約５個、例えば、１個から３個、または１個、または２個、または３個、または４個を含めた、１個から４個のアミノ酸置換が、ＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメインにおいてなされ得ることを企図するものである。
【００７５】
二重特異性抗体または二機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子において組み合わされている第２世代のモノクローナル抗体を形成する（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＢｏｈｌｅｎ、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖ．、１８
巻、４１１〜４１９頁）。これらの使用は、これらが新たなエフェクター機能をリクルートし、または腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的化する能力から、診断分野および治療分野の両方で実証されている。二重特異性抗体を用いようとする場合、二重特異性抗体は、化学的に、もしくはハイブリッドのハイブリドーマから調製するなどの多様な方法で製造することができる従来の二重特異性抗体であってよく（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年ｂ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４巻、４４６〜４４９頁）、または上記に言及した二重特異性抗体のフラグメントのいずれかであってもよい。これらの抗体は化学的方法によって（Ｇｌｅｎｎｉｅら、（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻、２３６７〜２３７５頁；Ｒｅｐｐら、（１９９５年）Ｊ．Ｈｅｍａｔ．、３７７〜３８２頁）、または体細胞の方法によって（Ｓｔａｅｒｚ  Ｕ．Ｄ．およびＢｅｖａｎ  Ｍ．Ｊ．（１９８６）ＰＮＡＳ、８３巻；Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６年）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、２１０〜２２８頁）、しかし同様に、ヘテロ二量体化を強制させ、したがって探求する抗体の精製プロセスを促進する遺伝子操作技法によって（Ｍｅｒｃｈａｎｄら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻、６７７〜６８１頁）得ることができる。二重特異性抗体の例には、特異性の異なる２つの抗体の結合ドメインを用いることができ、短い柔軟性のペプチドによって直接連結するＢｉＴＥ（商標）技術のものが含まれる。これは２つの抗体を短い単一のポリペプチド鎖上で組み合わせるものである。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域なしで、可変ドメインのみを用いて、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減して構築することができる。
【００７６】
二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディとして、またはそうでなければ二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、２つの二重特異性抗体を、当技術分野において知られているルーチンの方法を用いて連結して４価の抗体を形成することができる。
【００７７】
二重特異性の全抗体に対立するものとして、二重特異性ダイアボディも、容易に構築し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させることができるので、とりわけ有用であり得る。好適な結合特異性のダイアボディ（および、抗体フラグメントなどの他の多くのポリペプチド）は、ライブラリーからファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて容易に選択することができる。ダイアボディの１本のアームを、標的の抗原に対して向けられる特異性などと一定に維持しようとする場合、他方のアームを変化させ、好適な特異性の抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性な全抗体は、Ｒｉｄｇｅｗａｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、６１６〜６２１頁に記載される代替的な操作方法によって作製することができる。
【００７８】
標的の抗原に対する抗体を得るために、当技術分野において多様な方法が利用できる。抗体は、特に、ヒトの、マウスの、キメラの、またはヒト化起源のモノクローナル抗体であってよく、これらは、当業者にはよく知られている標準方法に従って得ることができる。
【００７９】
一般的に、特にマウス起源の、モノクローナル抗体またはその機能的なフラグメントを調製するには、特に、マニュアルである「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．、７２６頁、１９８８年）に記載されている技法に、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁によって記載されているハイブリドーマから調製する技法に言及することができる。
【００８０】
モノクローナル抗体は、例えば、Ａ−ＦＮに対して免疫化した動物細胞から、または前
記モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むそのフラグメントの１つ、例えば、ＥＤ−Ａを含み、もしくはＥＤ−Ａからなるフラグメント、またはＥＤ−Ａのペプチドフラグメントから得ることができる。Ａ−ＦＮ、またはこれらのフラグメントの１つは、特に、通常の作業方法に従って、Ａ−ＦＮまたはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列に含まれている核酸配列で出発する遺伝的組換えによって、Ａ−ＦＮおよび／またはそのフラグメントのペプチド配列に含まれているアミノ酸の配列から出発するペプチド合成によって生成することができる。
【００８１】
モノクローナル抗体は、例えば、Ａ−ＦＮ、または前記モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むＡ−ＦＮのフラグメントの１つ、例えば、ＥＤ−Ａを含みもしくはＥＤ−Ａからなるフラグメント、またはＥＤ−Ａのペプチドフラグメントをカラム上に予め固定化した、アフィニティカラム上で精製することができる。モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上のクロマトグラフィーによって精製することができ、その後に残留のタンパク質の不純物、ならびにＤＮＡおよびＬＰＳそれ自体を除去する目的のイオン交換クロマトグラフィーが続き、または続かず、その後に二量体または他の多量体の存在による潜在的な凝集物を除去するためにセファロースゲル上の排除クロマトグラフィーが続き、または続かない。これらの技法全てを同時に、または引き続き用いることができる。
【００８２】
抗原結合部位
これは、標的の抗原の全てまたは部分に結合し、相補的である分子の部分を記載するものである。抗体分子では、これは抗体の抗原結合部位と呼ばれ、標的の抗原の全てまたは部分に結合し、相補的である抗体の部分を含む。抗原が大型である場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し得、この部分をエピトープと呼ぶ。抗体の抗原結合部位は、１つまたはそれ以上の抗体の可変ドメインによって提供され得る。抗体の抗原結合部位は、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができる。
【００８３】
単離された
これは、本発明において用いるための特異的な結合メンバー、またはこのような特異的な結合メンバーをコードする核酸が、概ね本発明にしたがう状態を述べることを指す。このように、特異的な結合メンバーである、本発明のＶＨおよび／またはＶＬドメインは、例えば、これらの天然の環境から、実質的に純粋な、もしくは均一な、または核酸の場合は、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外を起源とする核酸もしくは遺伝子がない、もしくは実質的にない形態において、単離および／または精製されて提供され得る。単離されたメンバーおよび単離された核酸は、天然の環境において、またはこのような調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる組換えＤＮＡ技術による場合は、これらが調製される環境（例えば、細胞培養物）において、これらが一緒に見出される他のポリペプチドまたは核酸など、これらが天然に関連する物質がなく、または実質的にない。特異的な結合メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと調合し、さらに実際的な目的で単離することができ、例えば、メンバーは通常、免疫アッセイで用いるためのマイクロタイタープレートをコーティングするのに用いる場合はゼラチンもしくは他の担体と混合され、または診断もしくは治療において用いる場合は薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合される。特異的な結合メンバーは、天然に、もしくは異種性の真核細胞（例えば、ＣＨＯもしくはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３））細胞の系によってグリコシル化されていてよく、またはこれらは（例えば、原核細胞における発現によって生成される場合は）非グリコシル化であってよい。
【００８４】
抗体分子を含む異種性の調製物を、本発明において用いることができる。例えば、このような調製物は、多様な程度のグリコシル化を有する、および／または誘導体化されたアミノ酸を有する、例えば、ピログルタミン酸残基を形成するためのＮ−末端のグルタミン
酸の環化を有する、全長の重鎖とＣ末端のリジンを欠く重鎖との抗体の混合物であってよい。
【００８５】
抗原、例えば、Ａ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する１つまたはそれ以上の特異的な結合メンバーは、本発明による特異的な結合メンバー、および抗原またはそのフラグメント、例えば、ＥＤ−Ａを含みもしくはＥＤ−Ａからなるフラグメント、またはＥＤ−Ａのペプチドフラグメントのライブラリーと接触させ、抗原に結合することができるライブラリーの１つまたはそれ以上の特異的な結合メンバーを選択することによって得ることができる。
【００８６】
抗体のライブラリーを、反復性コロニーフィルタースクリーニング（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（ＩＣＦＳ）を用いてスクリーニングしてもよい。ＩＣＦＳでは、いくつかの結合特異性をコードするＤＮＡを含むバクテリアを液体培地中で増殖させ、指数関数的な増殖の段階に到達したら、これらの数十億個を、適切に前処理したメンブレンフィルターからなる増殖支持体上に分配し、これを完全にコンフルエントな細菌のコロニーが出現するまでインキュベートする。第２の捕捉基質は、予め加湿し、所望の抗原で覆われた別のメンブレンフィルターからなる。
【００８７】
次いで、捕捉メンブレンフィルターを、適切な培養培地を含むプレート上に配置し、増殖フィルターで覆い、細菌のコロニーで覆われた表面が上方を指す。このようにして得たサンドイッチを室温で約１６時間インキュベートする。このようにして、拡散性の作用を有する抗体フラグメントｓｃＦｖをコードする遺伝子の発現を得ることができ、その結果、捕捉メンブレン上に存在する抗原と特異的に結合するフラグメントが捕捉される。次いで、捕捉メンブレンを処理すると、この目的で通常用いられる比色分析技法で、結合した抗体フラグメントのｓｃＦｖが指摘される。
【００８８】
捕捉フィルター上の着色したスポットの位置により、増殖メンブレン上に存在し、捕捉された抗体フラグメントを生成する対応する細菌コロニーに立ち返ることができる。このようなコロニーを収集し、細菌を増殖させ（これら数十億個が新たな培養メンブレン上に分配されている）、上記に記載した手順を繰り返す。次いで、選択に用いた抗原に対して向けられるモノクローナル抗体のフラグメントの潜在的な供給源を各々が表す、単一の陽性のコロニーに相当する捕捉メンブレン上に陽性のシグナルが得られるまで、類似のサイクルを行う。ＩＣＦＳは、ＷＯ０２４６４５５などに記載されている。
【００８９】
ライブラリーは、粒子または分子の複合体上に、例えば、バクテリオファージ（例えば、Ｔ７）粒子などの複製可能な遺伝子パッケージ、または他のｉｎ  ｖｉｔｒｏのディスプレイ系にディスプレイされ、抗体のＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含む各粒子もしくは分子の複合体がその上にディスプレイされ、および場合により、存在する場合にはＶＬドメインもディスプレイされ得る。ファージディスプレイは、ＷＯ９２／０１０４７、ならびに例えば、米国特許ＵＳ５９６９１０８、ＵＳ５５６５３３２、ＵＳ５７３３７４３、ＵＳ５８５８６５７、ＵＳ５８７１９０７、ＵＳ５８７２２１５、ＵＳ５８８５７９３、ＵＳ５９６２２５５、ＵＳ６１４０４７１、ＵＳ６１７２１９７、ＵＳ６２２５４４７、ＵＳ６２９１６５０、ＵＳ６４９２１６０、およびＵＳ６５２１４０４に記載されている。
【００９０】
抗原に結合することができ、バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子または分子複合体上にディスプレイされる結合メンバーを選択した後、核酸を、前記選択された結合メンバーをディスプレイするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から取ってもよい。このような核酸は、引き続き結合メンバーまたは抗体のＶＨもしくはＶＬ可変ドメインの生成において、前記選択された結合メンバーをディスプレイするバクテ
リオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から取った核酸の配列を有する核酸から発現させることにより、用いることができる。
【００９１】
前記選択された結合メンバーの抗体のＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する、抗体のＶＨ可変ドメインは、このようなＶＨドメインを含む結合メンバーと同様に、単離された形態において提供され得る。
【００９２】
Ａ−ＦＮ、またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａ、または他の標的の抗原もしくはアイソフォームに結合する能力を、例えば、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と、Ａ−ＦＮまたはＡ−ＦＮのフラグメント、例えば、フィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する結合に対して競合する能力を、さらに試験することができる。
【００９３】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに特異的に結合し得る。本発明の特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と同じ親和性で（例えば、ｓｃＦｖフォーマットにおいて）、またはそれより良好な親和性で結合し得る。本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、３×１０−８ＭのＫＤで、またはそれより良好な親和性で結合し得る。本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、２×１０−８ＭのＫＤで、またはそれより良好な親和性で結合するのが好ましい。本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、１．７×１０−８ＭのＫＤで、またはそれより良好な親和性で結合するのがより好ましい。本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、１．４×１０−８ＭのＫＤで、またはそれより良好な親和性で結合するのがさらにより好ましい。本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに、３×１０−９ＭのＫＤで、またはそれより良好な親和性で結合するのが最も好ましい。
【００９４】
本発明の特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチン抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８のＥＤ−Ａ上の同じエピトープに結合し得る。
【００９５】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａ以外の分子に対していかなる重大な結合を示し得ない。特に、特異的な結合メンバーは、フィブロネクチンの他のアイソフォーム、例えば、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォームおよび／またはＩＩＩＣＳアイソフォームに結合し得ない。
【００９６】
本明細書に開示する抗体分子のバリアントを生成し、本発明において用いることができる。ＣＤＲ、抗体のＶＨまたはＶＬドメイン、特にＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域、ならびに結合メンバーのアミノ酸配列内に置換をなすのに必要とされる技法は、一般的に、当技術分野において入手できる。バリアントの配列は、活性に対して最小の、または有益な効果を有するように予想され得、またはされ得ない置換を用いて作製することができ、Ａ−ＦＮおよび／もしくはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する能力に対して、かつ／または任意の他の所望の性質に対して試験することができる。
【００９７】
その配列を本明細書に具体的に開示するＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの、可変ドメインアミノ酸配列のバリアントを、論じる通り、本発明に従って用いることができる。特定のバリアントは、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、および／または挿入）を含むことができ、約２０個未満の変更、約１５個未満の変更、約１０個未満の変更、または約５個未満の変更であってよく、５、４、３、２
、または１個であってよい。変更は、１つもしくはそれ以上のフレームワーク領域、および／または１つもしくはそれ以上のＣＤＲにおいてなされてよい。変更は通常、機能の喪失をもたらさず、したがってこのように変更されたアミノ酸配列を含む特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する能力を保持し得る。例えば、本明細書に記載するアッセイなどで測定すると、このような特異的な結合メンバーは変更が行われていない特異的な結合メンバーと同じ量的結合を保持し得る。このように変更されたアミノ酸配列を含む特異的な結合メンバーは、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する、改善された能力を有し得る。例えば、本明細書に言及する、ＥＤ−ＡアイソフォームまたはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する特異的な結合メンバーは、ＶＨおよび／またはＶＬドメインのフレームワーク領域内にアミノ酸置換を１０個以下、例えば、５、４、３、２、または１個有する、配列番号７に示すＶＨドメインおよび配列番号８に示すＶＬドメインを含むことができる。このような特異的な結合メンバーは、配列番号７に示すＶＨドメインおよび配列番号８に示すＶＬドメインを含む特異的な結合メンバーと同じもしくは実質的に同じ親和性で、ＥＤ−ＡアイソフォームもしくはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合することができ、または配列番号７に示すＶＨドメインおよび配列番号８に示すＶＬドメインを含む特異的な結合メンバーよりも高い親和性で、ＥＤ−ＡアイソフォームもしくはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合し得る。
【００９８】
本発明において用いるためのＣＤＲ由来の配列を保有する新規なＶＨまたはＶＬ領域は、全体の可変ドメイン内に変異を産生するように、１つまたはそれ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて産生することができる。いくつかの実施形態において、１つまたは２つのアミノ酸置換は、全体の可変ドメインまたはＣＤＲのセット内になされる。用いることができる別の一方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域の変異誘発を指示することである。
【００９９】
先に述べた通り、本明細書に実質的に記載するＣＤＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的な一部分におけるＣＤＲとして保有され得る。本明細書に実質的に記載するＨＣＤＲ３の配列は、本発明の実施形態を表し、例えば、その各々はヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な一部分におけるＨＣＤＲ３として保有され得る。
【０１００】
本発明で用いる可変ドメインは、任意の生殖系列の、もしくは再配列されたヒト可変ドメインから得ることができ、もしくは由来していてよく、または知られているヒト可変ドメインのコンセンサスもしくは実際の配列をベースとした合成の可変ドメインであってよい。可変ドメインは、非ヒト抗体に由来していてよい。本発明において用いるためのＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリー中に導入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓら（１９９２）は、可変ドメイン区域の５’終端に向けられ、または５’終端に隣接するコンセンサスプライマーをヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと組み合わせて用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーを生成する方法を記載している。Ｍａｒｋｓらは、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができる方法をさらに記載している。類似の技法を用いて、本発明のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルした完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明において用いるための結合メンバーを提供してもよい。次いで、レパートリーを、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイ系、またはＫａｙ、Ｗｉｎｔｅｒ、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９６年）を含めた後続の大方の文献のいずれかなど、適切な宿主系においてディスプレイすることができ、したがって適切な結合メンバーを選択することができる。レパートリーは、１０４個の個々のメンバーから上方向の任意のものから、例えば、少なくとも１
０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、または少なくとも１０１０個のメンバーからなっていてよい。
【０１０１】
同様に、ＣＤＲの１つもしくはそれ以上、または３つ全てを、次いでＡ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する結合メンバー（単数または複数）に対してスクリーニングされる、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリー中にグラフトしてもよい。
【０１０２】
抗体Ｆ８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の１つもしくはそれ以上もしくは抗体Ｆ８のＨＣＤＲのセットを用いてもよく、かつ／または抗体Ｆ８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の１つもしくはそれ以上もしくは抗体Ｆ８のＬＣＤＲのセットを用いてもよい。
【０１０３】
同様に、本明細書に開示する、他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲのセット、およびＨＣＤＲのセット、および／またはＬＣＤＲのセットを用いてもよい。
【０１０４】
Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａを、ＩＢＤを処置するための薬物の調製において用いるための、特異的な結合メンバー、例えば抗体分子に対するスクリーニングにおいて用いてもよい。スクリーニングは、本明細書他所に開示するレパートリーのスクリーニングであってよい。
【０１０５】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な一部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、これらの介在性のフレームワーク領域と一緒に含んでいてよい。その一部分はまた、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含むことができ、この５０％は第１のフレームワーク領域のＣ末端５０％、および第４のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端終端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常関連しないものであってよい。例えば、組換えＤＮＡ技法によってなされる本発明の特異的な結合メンバーの構築により、クローニングまたは他の手技のステップを促進するように導入されるリンカーによってコードされるＮ末端またはＣ末端の残基の導入がもたらされ得る。他の手技のステップは、本明細書の他所に開示する可変ドメインを、抗体定常領域、他の可変領域（例えば、ダイアボディの生成における）、または本明細書他所により詳しく論じる検出可能／機能的な標識を含めたさらなるタンパク質配列に接続するためのリンカーの導入を含む。
【０１０６】
特異的な結合メンバーは、１対のＶＨおよびＶＬドメインを含んでいてよいが、ＶＨまたはＶＬドメインの配列のいずれかをベースとする単一の結合ドメインも本発明において用いることができる。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特異的に、標的の抗原に結合することができることが知られている。例えば、上記のｄＡｂの考察を参照されたい。
【０１０７】
単一の結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインを、Ａ−ＦＮおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合することができる２ドメインの結合メンバーを形成することができる相補性のドメインに対してスクリーニングするのに用いることができる。これは、ＨまたはＬ鎖いずれかのクローンを含む個々のコロニーを用いて、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーに感染させ、得られた２本鎖の結合メンバーを、この参考文献に記載するものなどのファージディスプレイ技法に従って選択する、ＷＯ９２／０１０４７に開示されている、いわゆる階層的二重コンビナトリアルの手法を用いて、ファージディスプレイスクリーニング法によって、実現することができる。この技法は、Ｍａｒｋｓ、１９９２年にも開示されている。
【０１０８】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、抗体の定常領域またはその部分
、例えば、ヒト抗体定常領域またはその部分をさらに含むことができる。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣκまたはＣλ鎖、例えばＣλを含めた、抗体の軽鎖定常ドメインのＣ末端終端に付着していてよい。同様に、ＶＨドメインをベースにした特異的な結合メンバーは、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭに由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは部分、ならびにアイソタイプサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対するＣ末端（例えば、ＣＨ１ドメイン）に付着していてよい。これらの性質を有し、可変領域を安定化する、任意の合成の、または他の定常領域バリアントも本発明の実施形態において有用である。
【０１０９】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、検出可能または機能的な標識で標識化されていてよい。標識は、それだけには限定されないが、蛍光、放射標識、酵素、化学発光、または光増感剤を含めた、シグナルを生成し、またはシグナルを生成するように誘発され得る任意の分子であってよい。このように、結合は、蛍光もしくは発光、放射能、酵素活性、または光吸収を検出することにより、検出および／または測定することができる。検出可能な標識は、当技術分野において知られている従来の化学反応を用いて、本発明において用いるための抗体に付着していてよい。
【０１１０】
標識が、目視検査、電磁放射線、熱、および化学試薬などの外部手段によって検出可能なシグナルを生成することができる、多数の方法がある。標識はまた、本発明において用いるための抗体に結合する別の特異的な結合メンバーに、または支持体に結合していてよい。
【０１１１】
標識化された特異的な結合メンバー、例えば、検出可能な標識で標識化されたｓｃＦｖは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断的に、かつ／または治療的に用いることができる。
【０１１２】
例えば、放射標識した結合メンバー（例えば、放射性同位体にコンジュゲートしている結合メンバー）を、放射線診断法および放射線治療において用いることができる。本発明において用いるための結合メンバーにコンジュゲートしていてよい放射性同位体には、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４７Ｓｃ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１２１Ｓｎ、１６１Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１０５Ｒｈ、１７７Ｌｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、２１１Ａｔ、および２２５Ａｃなどの同位体が含まれる。１８Ｆおよび１２４Ｉなどのポジトロン放射体、または９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および１２３Ｉなどのガンマ放出体が診断応用に（例えば、ＰＥＴに）用いられ、１３１Ｉ、９０Ｙ、および１７７Ｌｕなどのベータ放出体が、好ましくは治療応用に用いられる。２１１Ａｔおよび２２５Ａｃなどのアルファ放出体も治療に用いることができる。
【０１１３】
例えば、検出可能な標識で標識化されている本発明において用いるための特異的な結合メンバーを用いて、ヒトまたは動物におけるＩＢＤを検出し、診断し、またはモニタリングすることができる。
【０１１４】
本発明の特異的な結合メンバーを、ＩＢＤの診断において用いるための診断用生成物の製造に用いることができる。
【０１１５】
本発明において用いるための結合メンバーと、病変における標的細胞に対して殺生物性の、細胞毒性の免疫抑制性の、または抗炎症性の効果を発揮する分子と、このような病変に存在する細胞外マトリックス構成成分に対して向けられる抗体との間のコンジュゲートまたは融合を、本発明において用いることができる。例えば、コンジュゲートしている分子はインターロイキン−１０であってよい。このようなコンジュゲートを、本明細書に言
及するＩＢＤの処置などのために、治療的に用いることができる。
【０１１６】
特異的な結合メンバーの、殺生物性または細胞毒性の分子との融合またはコンジュゲートの生成および使用は、例えばＷＯ０１／６２２９８に記載されている。
【０１１７】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、（ｉ）細胞の相互作用によって標的の細胞に対して抗炎症性の効果を発揮する分子、抗炎症性の分子、サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、および（ｉｉ）フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する特異的な結合メンバーのコンジュゲートであってよい。
【０１１８】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、（ｉ）免疫抑制性または抗炎症性の効果を発揮する分子、および（ｉｉ）フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する特異的な結合メンバーのコンジュゲートであってよい。
【０１１９】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーが、（ｉ）インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、および（ｉｉ）フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する特異的な結合メンバーのコンジュゲートであるのが好ましい。このような特異的な結合メンバーは、ＩＢＤの処置に関する本明細書に開示する本発明の態様において有用である。
【０１２０】
本明細書に記載するのはまた、（ｉ）細胞の相互作用により標的の細胞に対して殺生物性もしくは細胞毒性の効果、または免疫抑制性もしくは抗炎症性の効果を発揮する分子、ならびに（ｉｉ）フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームおよび／またはフィブロネクチンのＥＤ−Ａに対する結合メンバーのコンジュゲートである。このようなコンジュゲートは、殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性、もしくは抗炎症性の分子、および前記結合メンバーを含む融合タンパク質を含むのが好ましく、または結合メンバーが２本鎖もしくは多数鎖である場合、融合タンパク質は、殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性、もしくは抗炎症性の分子、および前記結合メンバーのポリペプチド鎖構成成分を含む。結合メンバーが単鎖ポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子であるのが好ましい。
【０１２１】
本明細書で言及するコンジュゲートは、融合タンパク質として発現され得る。このように、免疫抑制性または抗炎症性の分子および単鎖Ｆｖ抗体分子を含む融合タンパク質を、本発明において用いることができる。
【０１２２】
細胞の相互作用によって標的細胞に対するその効果を発揮する免疫抑制性または抗炎症性の分子を、標的細胞と直接相互作用させてもよく、標的細胞上の膜結合した受容体と相互作用させてもよく、または細胞膜の電気化学ポテンシャルを攪乱してもよい。分子がＩＬ−１０であるのが好ましい。
【０１２３】
特異的な結合メンバーとコンジュゲートしている分子がＩＬ−１０であるのが好ましい。
【０１２４】
下記に詳しく論じる通り、本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、抗体分子であるのが好ましく、または抗体の抗原結合部位を含む。特異的な結合メンバーが、単鎖抗体などの単鎖ポリペプチドであり得るのが便利である。これにより、免疫抑制性または抗炎症性の分子（例えば、インターロイキン−１０もしくはＴＧＦベータ）など、単鎖抗体を含む融合タンパク質が便利に生成できるようになる。抗体の抗原結合部位は、別々のポリペプチドにおける、例えば、完全な抗体における、またはＦａｂもしくはダイア
ボディなどの抗体フラグメントにおける、抗体のＶＨドメインと抗体のＶＬドメインとの会合によって提供され得る。特異的な結合メンバーが２本鎖または多数鎖の分子（例えば、それぞれＦａｂもしくは全抗体）である場合、免疫抑制性または抗炎症性の分子は、例えば、特異的な結合メンバーにおける１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖との融合ポリペプチドとしてコンジュゲートしていてもよい。
【０１２５】
特異的な結合メンバーは、免疫抑制性または抗炎症性の分子とペプチド結合によって、すなわち、前記分子および特異的な結合メンバーまたはそのポリペプチド鎖構成成分を含む融合ポリペプチド内で、コンジュゲートしていてもよい（例えば、Ｔｒａｃｈｓｅｌらを参照されたい）。コンジュゲーションのための他の手段には、化学的コンジュゲーション、特に二機能的試薬を用いた（例えば、ＤＯＵＢＬＥ−ＲＥＡＧＥＮＴＳ（商標）Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ、Ｐｉｅｒｃｅを用いた）架橋結合が含まれる。
【０１２６】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸も提供する。核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。核酸は、ＣＤＲもしくはＣＤＲのセット、またはＶＨドメインもしくはＶＬドメイン、または抗体の抗原結合部位もしくは抗体分子、例えば、ｓｃＦｖもしくはＩｇＧ、例えば、上記に規定するＩｇＧ１をコードしていてよい。ヌクレオチド配列は、本明細書に開示するＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードしていてよい。
【０１２７】
本明細書にさらに開示するのは、上記に記載するポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物である。
【０１２８】
上記のような構築物を１つまたはそれ以上含む、組換えの宿主細胞も提供する。任意のＣＤＲもしくはＣＤＲのセット、またはＶＨドメインもしくはＶＬドメイン、または抗体の抗原結合部位もしくは抗体分子、例えば、提供するｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４をコードする核酸も、コードされた生成物を生成する方法同様に記載するが、この方法はコードする核酸からの発現を含む。発現は、好適な条件下で、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによって便利に実現することができる。ＶＨもしくはＶＬドメイン、または特異的な結合メンバーの発現による生成の後、任意の適切な技法を用いて単離および／または精製し、次いで適宜用いることができる。
【０１２９】
核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、完全または部分的に合成であってよい。本明細書に記載するヌクレオチド配列に対する言及は、文脈により他のものが要求されなければ、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、Ｔに対してＵが置き換えられている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１３０】
抗体のＶＨ可変ドメインを生成する方法、コードする核酸から発現を引き起こすことを含む方法も記載する。このような方法は、宿主細胞を、前記抗体のＶＨ可変ドメインを生成するための条件下で培養することを含むことができる。
【０１３１】
生成の方法は、生成物を単離および／または精製するステップを含むことができる。生成の方法は、生成物を、薬学的に許容される賦形剤など、少なくとも１つのさらなる構成成分を含む組成物に配合することを含むことができる。
【０１３２】
多様な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現させるための系は、よく知られている。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母菌、およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニックの植物および動物が含まれる。抗体および抗体フラグメントの原核細胞における発現は、当技術分野において十
分に確立されている。概説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、５４５〜５５１頁を参照されたい。一般的な細菌の宿主は大腸菌である。
【０１３３】
培養物中の真核細胞における発現も、Ｃｈａｄｄら（２００１年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻、１８８〜１９４頁；Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻、１１７頁；ＬａｒｒｉｃｋおよびＴｈｏｍａｓ（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻、４１１〜４１８頁など、特異的な結合メンバーを生成するための選択肢として当業者にはやはり利用可能である。異種性のポリペプチドを発現させるのに当技術分野において利用できる哺乳動物細胞系統には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、ＹＢ２／０ラットミエローマ細胞、ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児網膜細胞、およびその他多数が含まれる。
【０１３４】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および適宜他の配列を含めた、好適な制御配列を含む適切なベクターを選択し、または構築することができる。ベクターは、適宜、ファージミドなどのプラスミド、または’ファージなどウイルスのものであってよい。さらに詳しくは、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。核酸構築物の調製、変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入、および遺伝子の発現など、核酸の手技のための多くの知られている技法およびプロトコール、ならびにタンパク質の分析は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９年）第４版、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに詳しく記載されている。
【０１３５】
宿主細胞は、本明細書に記載する核酸を含むことができる。このような宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってよく、培養物中であってよい。このような宿主細胞はｉｎ  ｖｉｖｏであってよい。宿主細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで存在することにより、本発明において「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」すなわち細胞内抗体として用いるための結合メンバーの細胞内発現が可能になり得る。イントラボディは遺伝子治療に用いることができる。
【０１３６】
本明細書に開示する核酸を宿主細胞中に導入することを含む方法も記載する。導入は、任意の利用できる技法を用いることができる。真核細胞に対して、適切な技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソームが媒介するトランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニア、もしくは昆虫細胞に対してバキュロウイルス）を用いた形質導入を含むことができる。核酸の、宿主細胞、特に真核細胞における導入は、ウイルスまたはプラスミドベースの系を用いることができる。プラスミド系は、エピソームに維持することができ、または宿主細胞中もしくは人工の染色体中に組み込むことができる。組み込みは、単一または複数の遺伝子座での１つまたはそれ以上のコピーの、ランダムによる、または標的化組み込みによる、いずれかであってよい。細菌細胞に対して、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含むことができる。
【０１３７】
導入の後に、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することによ
り、核酸からの発現を引き起こし、または発現させてもよい。発現された生成物の精製は、当業者には知られている方法によって実現することができる。
【０１３８】
核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に組み込むことができる。組み込みは、標準の技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を包含することによって促進され得る。
【０１３９】
上記の特異的な結合メンバーまたはポリペプチドを発現させるために、発現系において上記に記載した構築物を用いることを含む方法も記載する。
【０１４０】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、ヒトまたは動物対象、例えば、ヒトにおける診断または処置の方法において用いるようにデザインされている。本発明において用いるための特異的な結合メンバーを、ＩＢＤの診断または処置において用いることができる。
【０１４１】
したがって、本発明は、記載した特異的な結合メンバーの投与を含む処置の方法、このような特異的な結合メンバーを含む医薬組成物、および投与のための薬物の製造における、例えば、特異的な結合メンバーを薬学的に許容される賦形剤と配合することを含む薬物または医薬組成物を作製する方法における、このような特異的な結合メンバーの使用を提供する。薬学的に許容されるビヒクルはよく知られており、当業者によって、選択した有効化合物（複数可）の性質および投与様式の関数として適応される。
【０１４２】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、通常、医薬組成物の形態において投与され、医薬組成物は、特異的な結合メンバーの他に少なくとも１つの構成成分を含むことができる。このように、本明細書に記載し、本発明に従って用いるための医薬組成物は、有効成分の他に、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者にはよく知られている他の材料を含むことができる。このような材料は非毒性でなければならず、有効成分の効能を妨害してはならない。担体または他の材料の厳密な性質は投与経路に依存し、投与経路は経口、吸入、または静脈内などの注射であってよい。
【０１４３】
例えばナノボディなどの経口投与用の医薬組成物も、本発明において想定される。このような経口製剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、または半固体の形態であってよい。錠剤は、ゼラチンなどの固体の担体、またはアジュバントを含むことができる。液体の医薬組成物は、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体の担体を一般的に含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなどのグリコールも含まれ得る。
【０１４４】
静脈内注射または患部の注射に対して、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口投与に許容される水溶液の形態である。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液など等張のビヒクルを用いて適切な溶液を調製することが十分にできる。保存剤、安定化剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤を、必要に応じて用いることができる。医薬製剤を調製するための多くの方法が当業者には知られている。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０１４５】
組成物は、処置しようとする状態に応じて、単独で、または他の処置との併用において、同時に、もしくは経時的に、または別の治療薬（単数もしくは複数）との併用調製物と
して投与することができる。
【０１４６】
本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、さらなる薬用の構成成分と組み合わせて併用療法の一部として用いることができる。併用処置、特に、本発明において用いるための特異的な結合メンバーの１つまたはそれ以上の他の薬物との併用を用いて、著しい相乗効果を提供することができる。本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、本明細書に列挙する１つまたはそれ以上の状態を処置するために、同時に、もしくは経時的に、または別の治療薬（単数もしくは複数）との併用調製物として投与することができる。
【０１４７】
例えば、本発明において用いるための特異的な結合メンバーは、ＩＢＤを処置するための既存の治療薬と併用して用いることができる。
【０１４８】
本発明において用いるための特異的な結合メンバー、および上記のさらなる薬用の構成成分の１つまたはそれ以上を、薬物の製造において用いることができる。薬物は、個体に対して別個に、または併用して投与することができ、したがって特異的な結合メンバー、およびさらなる構成成分を、併用の調製物として、または別個の調製物として含むことができる。別個の調製物を用いて、別個の、経時的または同時の投与を促進することができ、経口投与および非経口投与など、異なる経路による成分の投与が可能になる。
【０１４９】
本発明に従って、提供する組成物を哺乳動物に投与することができる。投与は、患者に利益を示すのに十分である、「治療有効量」におけるものであってよい。このような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも寛解であってよい。したがって、「ＩＢＤの処置」は、少なくとも１つの症状の寛解を指す。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置するものの性質および重症度、処置する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、組成物の送達部位、特異的な結合メンバーのタイプ、投与の方法、投与の日程計画、ならびに医師（ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）に知られている他の因子に依存する。投与量に対する判断などの処置の処方箋は、一般診療医および他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度および／または処置する疾患の進行に依存し得る。抗体の好適な投与量は当技術分野においてよく知られている（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎら（１９９１年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７巻、６５９〜６６４頁；および、  Ｂａｇｓｈａｗｅら（１９９１年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、４巻、９１５〜９２２頁）。本明細書に示される特定の投与量、または投与する薬物のタイプに好適であるとしてＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３年）におけるものも用いることができる。本発明において用いるための特異的な結合メンバーの治療有効量または適切な投与量は、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性とｉｎ  ｖｉｖｏの活性とを動物モデルにおいて比較することによって決定することができる。マウスおよび他の試験動物における有効な投与量をヒトに外挿するための方法は知られている。厳密な投与量は、抗体が診断用であるか、予防用であるか、または処置用であるか、処置しようとする区域のサイズおよび位置、抗体の厳密な性質（例えば、全抗体、フラグメント、またはダイアボディ）、および抗体に付着している任意の検出可能な標識または他の分子の性質を含めた数々の因子に依存する。典型的な抗体の投与量は、全身適用に対して１００μｇから１ｇ、および局所適用に対して１μｇから１ｍｇの範囲にある。初期に高負荷投与量を、引き続き１つまたはそれ以上の低投与量を投与してもよい。抗体は全抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプであってよい。これは、成人患者の単一処置用の投与量であり、小児および乳児に対して比例的に調節することができ、他の抗体のフォーマットに対して分子量に比例して調節することもできる。処置は、医師の裁量で、毎日、週２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返すことができる。処置は、皮下投与に対して２週間毎から４週間毎、静脈投与に対して４週間毎から８週間毎であってよい。本発明のいくつかの実
施形態において、処置は周期的であり、投与の間の周期は約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、または約１か月に１回である。本発明の他の実施形態において、処置は、外科手術の前および／または後に与えることができ、外科手術処置の解剖学的部位に直接投与または適用することができる。
【０１５０】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
炎症性腸疾患は、結腸および小腸に罹患する一群の炎症状態である。ＩＢＤの主なタイプには、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）があり、ＩＢＤの他のタイプには、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、および不確定の大腸炎が含まれる。ＣＤは、消化管の任意の部分に罹患し得るが、ＵＣは結腸および直腸に限定されるのが典型的である。
【０１５１】
本明細書に言及するＩＢＤは、ＣＤ、ＵＣ、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、または不確定の大腸炎であってよい。特に、本明細書で用いられる、ＣＤ、ＵＣ、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、および不確定の大腸炎の語はそれぞれ、活動性のＣＤ、活動性のＵＣ、活動性のコラーゲン性大腸炎、活動性のリンパ球性大腸炎、活動性の虚血性大腸炎、活動性の空置性大腸炎、活動性のベーチェット病、および活動性の不確定の大腸炎を指し得る。一実施形態において、ＩＢＤはＣＤまたはＵＣであってよい。別の一実施形態において、ＩＢＤは、ＣＤ、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病、または不確定の大腸炎であってよい。さらなる一実施形態において、ＩＢＤはＵＣではない。ＩＢＤは、ＣＤなど、結腸および直腸における炎症に典型的には限定されないＩＢＤであってよい。ＩＢＤは結腸の内壁のみに罹患しないＩＢＤであってよい。好ましい一実施形態において、ＩＢＤはＣＤである。ＩＢＤが活動性のＣＤであるのが最も好ましい。
【０１５２】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の実験上の実施例を含めた本開示から、当業者には明らかである。
【０１５３】
本明細書に言及する文書は全て、その全文を参照によって本明細書に組み込む。
【０１５４】
本明細書で用いられる「および／または」は、他者とともに、または他者なしでの、特定される２つの特徴または構成成分の各々の特定の開示と理解されたい。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、特定の開示として、各々を本明細書に個々に記載するように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々と理解されたい。
【０１５５】
文脈が他のものを指示しなければ、上記に記載した特徴の記述および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態に限定されず、記載する全ての態様および実施形態に等しく適用される。
【０１５６】
本発明のある種の態様および実施形態を、これより実施例により、上記に記載する図を参考にして説明する。
【０１５７】
実験
材料と方法
マウスＩＢＤモデル
ＤＳＳの投与を伴うＩＢＤに対するマウスモデルは当技術分野において知られている。適切なマウスモデルは、例えば、Ｏｋａｙａｓｕら（１９９０年）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９８巻、６９４〜７０２頁にも記載されている。
【０１５８】
本明細書に記載する実験では、７日間、飲料水中に３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（ＭＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）を含めた後、通常の飲料水を３〜５日与えることによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に大腸炎を誘発した。対照のマウスには、試験の経過を通して標準の水を与えた。マウスを、３〜５日目のヘモカルトおよび毎日の体重変化によって明らかにされる、疾患の誘導／進行に対してモニタリングした。水中ＤＳＳを休止した後、マウスを３〜５日の多様な時間で安楽死させて、Ｆ８−ＩＬ−１０の標的化、局在化、および薬理学的効果を評価した。
【０１５９】
１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０放射ヨウ素標識、精製、特徴付け、および投薬溶液の調製
ヨード安息香酸スクシンイミジル（ＳＩＢ）を用いて１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０を調製した（ＺａｌｕｔｓｋｙおよびＮａｒｕｌａ（１９８８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４８巻、１４４６〜１４５０頁；ＺａｌｕｔｓｋｙおよびＮａｒｕｌａ（１９８７年）Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．、３８巻、１０５１〜１０５５頁；Ｃｈｅｎｇら（２００２年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５巻、３０４８〜３０５６頁）。簡潔に述べると、ヨウ素１２５（２０μＬ〜２．０ｍＣｉ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のアリコートを、１．５％酢酸（ｖ：ｖ）を含むメタノール（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μＬ中の酸化体としてＮＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１０μｇと一緒に、Ｎ−スクシンイミジル−３−（トリ−ｎ−ブチルスタニル）安息香酸（Ｃ２３Ｈ３５ＮＯ４Ｓｎ；ＭＷ＝５０８．２３、Ｔｅｘａｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸによって合成されたもの）２．５μｇと反応させた。周囲温度で１５分インキュベートした後、硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０μｇ（還元剤）を加えることによって、反応溶液中の残余の酸化体をクエンチし、周囲温度でさらなる５分間インキュベートした。１２５Ｉ−標識したＳＩＢを、周囲温度で２０分間、ｐＨ８．０でインキュベートすることによって、Ｆ８−ＩＬ１０抗体（およそ０．２ｍｇ、出発のモル比は中間体対抗体でおよそ２．５：１）にコンジュゲートさせた。放射標識した生成物（１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０）を、予め平衡にしたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて精製し（カラム上の潜在的な非特異的なタンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンを用いて飽和させた後、少なくとも３カラム容積のＰＢＳでカラムをすすぐことにより）、ＰＢＳ中に溶出した。放射化学収率およそ３０％を得た。
【０１６０】
１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の放射化学的純度（ＲＣＰ）および生理活性をそれぞれ、サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）、およびＥＤＡ−アフィニティカラムによって特徴付けた。ＳＥＣ分析では、およそ１μＣｉの１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０生成物溶液を、サイズ排除カラム（Ｇ３０００ＳＷｘｌ、東ソー株式会社バイオサイエンス事業部、東京、日本）を装着したＨＰＬＣ（直列の放射性検出器を装着した、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００）に注入し、流速１ｍＬ／分の２５ｍＭリン酸バッファー、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８の移動相溶媒で溶出した。１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の同一性を、放射測定クロマトグラムにおける保持時間をＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラム中の基準のＦ８／ＩＬ１０の保持時間と比べることによって確定した。１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０に対して９９％を超えるＲＣＰが得られ、放射活性特異的活性はおよそ４．５ｍＣｉ／ｍｇであった。
【０１６１】
１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の生理活性を、ＥＤＡアフィニティカラムアッセイによって決定した。簡潔に述べると、１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０のアリコート（およそ１μＣｉ）を、予め平衡にしたＥＤＡアフィニティカラム（ＥＤＡ樹脂２５０μＬを含む。非特異的な結合部位をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ２ｍＬでブロックし、次いでカラムをＰＢＳ８ｍＬで洗浄することにより予め平衡化を行った）上に負荷した。アフィニティカラムをＢＳＡ６ｍＬ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）で洗浄し、溶離液を分画として（ｆｒａｃｔｉｏ
ｎａｌｌｙ）採取した。採取した溶離液中の放射能、およびアフィニティカラム上の残余を、ガンマカウンターで測定した。ＥＤＡ−樹脂カラム中に保持された放射能の、負荷した放射能の合計に対するパーセント値を算出した。アフィニティカラムに保持された放射能のパーセント値６４％を、１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０に対して得た。
【０１６２】
１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０を非標識のＦ８／ＩＬ１０（Ｆ８／ＩＬ１０保存溶液）および配合バッファーと混合して必要とされる最終濃度にすることにより、ＰＫおよび組織分布試験に用いる投薬溶液を調製した。試験物品の溶液を投薬日に調製し、周囲温度にした後、動物に投与した。
【０１６３】
ＩＢＤマウスモデルにおける１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の体内分布および結腸への局在化
非処置またはＤＳＳ処置したマウスを両方とも、投薬のおよそ２〜４日前（ＤＳＳ開始後５〜７日目）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）水（２０ｍＭ）で処置して、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生された任意の潜在的な非結合の遊離Ｉ−１２５の甲状腺取込みを阻止した。ＤＳＳ処置開始後９日目、単一投与量の１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０を静脈内投与（ＩＶ）した。１群あたりの投与量および放射能を以下に概要する：
ｉ）０群−マウス１匹あたりのおよその投与量：５ｍｇ／ｋｇ
０群−マウス１匹あたりのおよその放射能：７．５μＣｉ（比放射能７５ｕＣｉ／ｍｇ）
ｉｉ）１群−マウス１匹あたりのおよその投与量：５ｍｇ／ｋｇ
１群−マウス１匹あたりのおよその放射能：１０μＣｉ（比放射能１００ｕＣｉ／ｍｇ）
ｉｉｉ）２群−マウス１匹あたりのおよその投与量：０．１５ｍｇ／ｋｇ
２群−マウス１匹あたりのおよその放射能：１２μＣｉ（比放射能４４９０ｕＣｉ／ｍｇ）
【０１６４】
亜群のマウスを、５分、１、３、６、２４、４８、および９６時間に出血させ、次いで多様な組織を採取した。血液試料を、心穿刺または眼窩後出血のいずれかによって、血清分離採取管中に採取した。血液試料を１００００ｇで５分間遠心分離することにより、血清試料を収集した。組織採取には、動物を屠殺し、血液サンプリングおよび全身の灌流の直後に対象の組織を採取した。およそ１０分間、ヘパリン−ＰＢＳ（２５単位／ｍＬ）およそ２０ｍＬを投与することにより、全身の血液の灌流を行った。脳、腸間膜リンパ節、皮膚、脂肪、骨格大腿筋、肺、心臓、脾臓、肝臓、胃、小腸、大腸、および腎臓を含めた対象の組織を採取し、重量測定した。ＧＩの内容物は除去した。組織試料の放射能（ｃｐｍにおける合計計数値）をガンマカウンターによって直接測定した。
【０１６５】
疾患マウスおよび健常マウスの結腸のオートラジオグラフィー
０群および２群のマウスからの結腸に対して結腸のオートラジオグラフィーを行った。結腸を収集し、その内容物を除去し、組織をリン光体イメージングスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に２４時間曝露し、Ｓｔｏｒｍ８６０によって画像化した。結果を図２に示す。レーン１：０群（健常マウス）から注射６時間後に収集した結腸、レーン２：２群（ＤＳＳ処置マウス）から注射６時間後に収集した結腸、レーン３：０群（健常マウス）から注射２４時間後に収集した結腸、レーン４：２群（ＤＳＳ処置マウス）から注射２４時間後に収集した結腸。１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０のパッチ状の局在化が、ＤＳＳ処置したマウスにおける結腸に沿って観察され、正常マウスでは観察されず、このモデルにおける不規則な結腸の炎症、および標的ＥＤＡの関連の発現プロファイルに一致した。
【０１６６】
血清および組織における放射能の当量濃度の決定ならびに薬物動態学的計算値
１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の血清の当量濃度（ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）を、ＴＣＡ（トリク
ロロ酢酸）沈澱性の（タンパク質関連の）放射能の測定値に基づいて推定した。ＴＣＡ沈澱に対して、血清試料のアリコート（５０μＬ）をマウス血清５０μＬと混合した後、２０％ＴＣＡ溶液１００μＬを加えた。試料混合物を１００００ｇで５分間回してタンパク質を沈澱させた。上清中の合計およびＴＣＡ可溶性の放射能を決定した。所与の試料中のＴＣＡ沈澱性の放射能（ｃｐｍ）、投薬溶液の比放射能（タンパク質１ｍｇあたりのＴＣＡ沈澱性のｃｐｍ）、ならびに試料（ｔＳ）および投薬溶液（ｔＤ）の測定日を用い、式：［ＴＣＡ沈澱性のｃｐｍ／ＥＸＰ（−０．６９３／６０．２＊（ｔＳ−ｔｄ））］／［比放射能（ｃｐｍ／ｍｇ）＊試料体積（ｍＬ）］を用いて、所与の試料中の試験物品の当量濃度（ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）を算出した。
【０１６７】
組織中１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の当量濃度（ｎｇ  ｅｑ．／ｇ）の定量化を、１２５Ｉの物理的崩壊半減期に対して補正した後、式：［試料のｃｐｍ／ＥＸＰ（−０．６９３／６０．２＊（ｔＳ−ｔＤ））］／［比放射能（ｃｐｍ／ｍｇ）＊試料重量（ｍｇ）］を用いて、試料中の合計放射能の測定値、および投薬溶液の比放射能に基づいて算出した。組織試料に対して均一化またはＴＣＡ−沈澱は行わなかった。放射性の当量濃度（血清に対してｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ、組織に対してｎｅ  ｅｑ．／ｇ）の他に、１グラムあたりの注射した投与量のパーセント値（％ＩＤ／ｇ）、および／または注射した投与量のパーセント値（％ＩＤ）も、対象の血清および組織に対して算出した。
【０１６８】
正常（０群）およびＤＳＳ処置（１群）マウスにおける１２５Ｉ−Ｆ８／ＩＬ１０の生体分布を、注射６時間後（図３Ａ）、２４時間後（図３Ｂ）、および９６時間（図３Ｃ）後に決定した。
【０１６９】
測定した時間点の血清または組織の平均濃度でＰＫパラメータを算出した。薬物動態学的ソフトウエアパッケージの非コンパートメント分析モジュールであるＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた。濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）を、線形台形法を用いて算出した。
【０１７０】
ＩＢＤのマウスモデルにおけるＦ８−ＩＬ１０の治療的処置の、血清サイトカインレベルに対する影響
ＩＬ−１０は炎症促進性サイトカインを低減することが知られているので、本発明者らは、ＩＢＤのマウスモデルにＦ８−ＩＬ１０を投与すると、このモデルにおける血清サイトカイン応答に影響を及ぼすか否かを試験した。ＤＳＳ処置を開始後３、６、および９日目、マウス１匹あたり２００μｇのＦ８／ＩＬ１０、または対照の小型免疫タンパク質（Ｆ８−ＳＩＰ）をＩＶ投与した（ｎ＝１０マウス／群）。この投与レジメンは、コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける有効なレジメンと同じであった（Ｓｃｈｗａｇｅｒ  Ｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（２００９年）１１巻、Ｒ１４２頁）。対照群には、非疾患（レギュラーの水）および非処置疾患が含まれた（ｎ＝１０マウス／群）。ＤＳＳの開始後１０日目、局在化試験に対して上記に記載した通りに血液を採取し、血清を得た。血清を、ＭＳＤ法のプラットホームおよびマウス７ｐｌｅｘＭＳＤキットを用い、製造元の指示に従って（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮｇ、ＩＬ−６、ＫＣ、ＩＬ−１０、およびＴＮＦａのレベルに対して評価した。サイトカインのレベルを、図４および５において、血清１ｍｌあたりのタンパク質のｐｇとして表す。
【０１７１】
ＥＤＡ発現に対するヒト組織染色
潰瘍性大腸炎に罹患している６０歳女性患者、およびクローン病に罹患している４２歳男性患者の結腸組織をＯＣＴ包埋した検体を凍結し、免疫組織化学的分析を行った。両方の検体をＳＩＰフォーマットにおけるＦ８抗体、およびフォンウィルブランド因子で検査
した。
【０１７２】
さらに、クローン病または潰瘍性大腸炎を有する同じ患者（クローン病患者ｎ＝３、およびＵＣ患者ｎ＝５）から対にした、罹患および非罹患の凍結生検検体を、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）から得た。凍結試料を、ドライアイス上に置いて解凍を防ぎ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＃４５８３）で充填した標準（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ４５５７）のＣｒｙｏｍｏｌｄ中に包埋し、ドライアイスで冷却しておいたイソペンタン中で瞬間凍結させた。組織ブロックをＬｅｉｃａ  ＣＭ１８５０クリオスタット上で４ミクロンの薄片にし、スライドガラス上に配置し、免疫組織化学（ＩＨＣ）を行うまで−８０℃で貯蔵した。ＩＨＣを開始する際、組織を冷（−２０Ｆ）メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ４１２Ｐ−４）に浸漬して、貯蔵とともに形成し得る水分を除去し、室温で２０分空気乾燥した。次いで、組織を冷（−２０Ｆ）アセトン（ＡＣＲＯＳ  ＣＡＳ  ＃
６７−６４−１）中に１０分間浸漬し、室温で１０分空気乾燥した。
【０１７３】
組織スライドを、適切なＶｅｎｔａｎａバーコードで標識し、フィブロネクチンＦ８  ＳＩＰまたはＫＳＦ  ＳＩＰ（対照の抗体）のＩＨＣ用にＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ中に配置した。内在性のビオチンを、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｓブロック（Ｖｅｎｔａｎａ  ７６０−４２１２）中５％正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ０１５−０００−１２０）２０分間、およびＶｅｎｔａｎａビオチンブロッキングキット（Ｖｅｎｔａｎａ  ７６０−０５０）８分間の両方でブロッキングした。フィブロネクチンＦ８  ＳＩＰまたはＫＳＦをＤａｋｏ抗体希釈液（Ｓ０９０８）（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中１：２００濃度に希釈し（スライド１枚あたり１００ｕｌ）、４０分間インキュベートした。スライドを、ヘマトキシリンおよびブルーイング（ｂｌｕｉｎｇ）試薬で対比染色（各４分）した後、作業（ｒｕｎ）を完了した。スライドを除去し、その後の脱水およびカバーガラス用にＶｅｎｔａｎａ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ中に配置した。ＩＨＣの代表的な画像を図７に示す。潰瘍性大腸炎患者ＵＨ０５０１−３４（上）およびクローン病患者ＵＨ０４０５−０９（下）からの、非罹患（左）および罹患（右）の組織試料からのＩＨＣ。
【０１７４】
結果
結腸のオートラジオグラフィー
図２は、非疾患マウス（水）（レーン１および３）、または疾患マウス（ＤＳＳ処置）（レーン２および４）の、放射標識したＦ８−ＩＬ１０を投与し６時間後（レーン１および２）または２４時間後（レーン３および４）いずれかの結腸のオートラジオグラフィーを示す。これは、Ｆ８−ＩＬ１０は、正常の結腸よりも炎症を起こした結腸に多く蓄積することを実証している。Ｆ８−ＩＬ１０が罹患している結腸に局在するパッチ状の外観は、不定のレベルの炎症およびこのモデルにおいて結腸の長さに沿って観察されるＥＤＡ発現に一致し、炎症でのＦ８−ＩＬ１０の局在をさらに支持するものである。
【０１７５】
疾患マウスおよび健常マウスにおける１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の体内分布
図３は、正常（水）マウスと比べた疾患（ＤＳＳ）マウスにおける、６、２４、および９６時間の時間点の、結腸および腸間膜リンパ節（Ｌ．Ｎ．）における１２５Ｉ−Ｆ８−ＩＬ１０の蓄積を示す。図２同様、これらのデータは、ＤＳＳ処置マウスでは、Ｆ８−ＩＬ１０が結腸および関連のリンパ節を標的化することを実証している。またこれらの試験より、血清半減期はおよそ３．５時間であることが決定され、結腸におけるＦ８−ＩＬ１０の半減期はおよそ３５時間であり；１０倍の増大は組織残留性の増強を示唆している。これは、Ｆ８−ＩＬ１０は結腸の炎症の間、結腸および腸間膜リンパ節を標的化するだけでなく、一旦存在すると循環中よりも長期間残留することを示す。まとめると、これらのデータは、ヒトにおけるクローン病および潰瘍性大腸炎など、結腸における炎症の条件下
では、Ｆ８−ＩＬ１０はこれらの部位を優先的に標的化し、残留することを示唆している。
【０１７６】
疾患マウスおよび健常マウスからの血清におけるサイトカインレベル
図４は、治療モダリティにおいてＦ８−ＩＬ１０を投与すると、対照群に比べて、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＦＮγ、およびＩＬ−６の血清レベルの有意な低減をもたらすことを示すものである。
【０１７７】
図５は、治療モダリティにおいてＦ８−ＩＬ１０を投与しても、対照群に比べて、ＴＮＦ−アルファおよびケラチノサイト由来のケモカイン（ＫＣ）の増大をもたらさず、ＩＬ−１０レベルの増大をもたらすことを示す。ＤＳＳモデルにおける図４のこれらサイトカインのレベルの増大は、結腸における疾患の誘導に関連する。図４のこれら炎症性サイトカインの低減、およびＩＬ−１０の増大は、ＩＬ−１０の知られている生物学的効果に一致する（Ａｂｂａｓ  Ａ、Ｌｉｃｈｔｍａｎ  Ａ、Ｐｏｂｅｒ  Ｊ．、１９９４、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第２版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｄｅｌｖｅｓ  Ｐ、Ｒｏｉｔｔ  Ｉ（編集）、１９９８年、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。このようにＦ８−ＩＬ１０は、ＩＢＤの設定における炎症および病態に関連するサイトカインを低減することによって、このＩＢＤのモデルにおける薬理学的活性を実証する。これらの炎症促進性サイトカインは、ＩＢＤ患者では上方制御されることが知られているので、Ｆ８−ＩＬ１０の投与によってこれらのサイトカインが下方制御されれば、Ｆ８−ＩＬ１０がｉｎ
ｖｉｖｏでＩＢＤを処置するのに有益である可能性があることが示唆される。インターフェロンγおよびＩＬ−１２ｐ７０は特に、ＣＤ患者では上方制御されることが知られており、本明細書に開示するデータは、Ｆ８−ＩＬ１０の投与はしたがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤを処置するのに特に有用である可能性があることを示唆している。
【０１７８】
免疫組織化学
図６は、Ｆ８  ＳＩＰ抗体は、新たに形成した血管を染色するが、潰瘍性大腸炎に罹患している患者における正常な血管は染色しないことを示す。（フォンウィルブランド因子は、正常な脈管構造のマーカーとしてルーチン的に用いられる。）
【０１７９】
図７は、ＥＤＡに対して免疫組織化学によって染色した、クローン病またはＵＣの対となった生検試料の代表的な画像を示す。矢印は、各画像内の血管を示す。罹患している血管において周囲の血管を染色する強度は、同じ患者からの非罹患の試料に比べて増大する。これは、ＥＤＡ発現の増大は、これらのヒト疾患の設定において結腸の炎症区域の標的化の増大をもたらし得ることを示唆する。要約すると、マウスＩＢＤモデルにおけるＦ８−ＩＬ１０に観察される、結腸を標的化した分布および血清サイトカインの低減、およびヒトクローン病および潰瘍性大腸炎に罹患している結腸組織における血管の周囲のＥＤＡの発現の増大は、ひとまとめに、Ｆ８−ＩＬ１０を投与するとＩＢＤを有する患者を標的化し、正の影響を及ぼし得ることを示唆する証拠を提供する。
【０１８０】
本出願において開示する配列
配列番号１（Ｆ８抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１）
ＬＦＴ
配列番号２（Ｆ８抗体ＶＨドメインのＣＤＲ２）
ＳＧＳＧＧＳ
配列番号３（Ｆ８抗体ＶＨドメインのＣＤＲ３）
ＳＴＨＬＹＬ
配列番号４（Ｆ８抗体ＶＬドメインのＣＤＲ１）
ＭＰＦ
配列番号５（Ｆ８抗体ＶＬドメインのＣＤＲ２）
ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号６（Ｆ８抗体ＶＬドメインのＣＤＲ３）
ＭＲＧＲＰＰ
配列番号７（Ｆ８抗体ＶＨドメイン）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８（Ｆ８抗体ＶＬドメイン）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＰＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＭＲＧＲＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号９（Ｆ８抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカー）
ＧＧＳＧＧ
配列番号１０（Ｆ８抗体のＶＬドメインとＩＬ−１０との間のリンカー）
ＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧ
配列番号１１（ヒトＩＬ−１０）
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ配列番号１２（Ｆ８抗体）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＰＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＭＲＧＲＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１３（Ｆ８−ＩＬ１０）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＳＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＰＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＭＲＧＲＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ
【図１Ａ】
2017197558.tif 000002
【図１Ｂ】
2017197558.tif 000003
【図１Ｃ】
2017197558.tif 000004
【図１Ｄ】
2017197558.tif 000005
【図１Ｅ】
2017197558.tif 000006
【図２】
2017197558.tif 000007
【図３】
2017197558.tif 000008
【図４】
2017197558.tif 000009
【図５】
2017197558.tif 000010
【図６】
2017197558.tif 000011
【図７】
2017197558.tif 000012
【配列表】
2017197558000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月14日(2017.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームに結合する特異的な結合メンバーを含む治療有効量の薬物を患者に投与することを含む、患者におけるＩＢＤを処置する方法。
【外国語明細書】
2017197558000001.pdf