(57)【要約】【課題】羊水幹細胞を外科的治療や各種皮膚ケアに応用する技術を提供する。【解決手段】羊水幹細胞を含む細胞シート。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊水幹細胞を含む細胞シート。
【請求項２】
自家移植用又は他家移植用である、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項３】
前記羊水幹細胞がＣＤ１１７陽性細胞である、請求項１又は２に記載の細胞シート。
【請求項４】
細胞密度が３×１０５個／ｃｍ２以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞シート。
【請求項５】
ＣＤ１１７陽性羊水細胞を回収する工程と、
回収した前記細胞を３×１０５個／ｃｍ２以上の密度で培養基材上に播種してシート状に培養する工程と、
前記培養基材から、前記細胞をシート状に剥離して回収する工程と、
を含む、細胞シートの製造方法。
【請求項６】
前記培養基材は、表面に温度応答性ポリマーがコートされた培養基材である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の製造方法により製造された細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊水幹細胞を含む細胞シート及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
羊水は妊娠初期から分娩に至るまで卵膜内を満たしている液体であり、分娩の際には胎児娩出の前後に母体から体外へ流出し不要となるものである。胎児は羊水の中で浮遊して成長していく。羊水は、胎児及び胎盤から常に生成されていると考えられているが、詳細は未だに不明である。また、妊娠中期に行われる羊水検査では、羊水穿刺により羊水が採取される。この時、採取による羊水の減少が胎児に影響を及ぼすことはなく、羊水は再生され補充される。
【０００３】
羊水中には羊水細胞と呼ばれる細胞が含まれている。羊水細胞は胎生期の胎児の臓器由来の細胞である。非特許文献１には、ヒト羊水細胞からｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）陽性細胞を取得したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pozzobon M., et al., Isolation of c-Kit+ Human Amniotic Fluid Stem Cells from Second Trimester, Methods in molecular biology, 1035, 191-198, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
羊水細胞は、幼若性を有しているため、分裂再生能力に優れ、可塑性を持ち、免疫寛容が大きいと考えられる。そこで、本発明は、羊水幹細胞をＨＬＡ型によらない外科的治療及び皮膚ケアに応用する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
（１）羊水幹細胞を含む細胞シート。
（２）自家移植用又は他家移植用である、（１）に記載の細胞シート。
（３）前記羊水幹細胞がＣＤ１１７陽性細胞である、（１）又は（２）に記載の細胞シート。
（４）細胞密度が３×１０５個／ｃｍ２以上である、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞シート。
（５）ＣＤ１１７陽性羊水細胞を回収する工程と、回収した前記細胞を３×１０５個／ｃｍ２以上の密度で培養基材上に播種してシート状に培養する工程と、前記培養基材から、前記細胞をシート状に剥離して回収する工程と、を含む、細胞シートの製造方法。
（６）前記培養基材は、表面に温度応答性ポリマーがコートされた培養基材である、（５）に記載の製造方法。
（７）（５）又は（６）に記載の製造方法により製造された細胞シート。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、羊水幹細胞をＨＬＡ型によらない外科的治療及び皮膚ケアに応用する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は実験例２でＣＤ１１７抗体によって分離した後の羊水細胞の光学顕微鏡写真である。（ａ）は倍率４倍の写真であり、（ｂ）は倍率１０倍の写真であり、（ｃ）は倍率２０倍の写真である。
【図２】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、ＣＤ１１７陽性羊水細胞の表面抗原マーカーをフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、実験例２において、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を骨に分化誘導し、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ染色によって骨に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は２０倍である。（ｂ）は、実験例２において、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を脂肪組織に分化誘導し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ染色によって脂肪に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は２０倍である。（ｃ）は、実験例２において、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を軟骨組織に分化誘導し、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色及びヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色によって軟骨組織に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は４０倍である。
【図４】実験例３で製造した細胞シートの写真である。
【図５】（ａ）は、実験例４における細胞シートのＨＥ染色結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例４において、細胞シートを抗ビメンチン抗体で染色した結果を示す写真である。
【図６】（ａ）は、実験例５における対照群の創部の代表的な写真である。また、（ｂ）は、実験例５における治療群の創部の代表的な写真である。
【図７】実験例５における対照群及び治療群の創部面積の変化を示すグラフである。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５における、創傷作製から２１日目の創部のピクロシリウスレッド染色の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［細胞シート］
１実施形態において本発明は、羊水幹細胞を含む細胞シートを提供する。本実施形態の細胞シートは、細胞シートを構成する細胞に羊水幹細胞を含んでいる。羊水幹細胞は低侵襲で採取することができ、採取しても胎児への悪影響を及ぼさないことから、治療用幹細胞として使用する場合の倫理的な問題が少ない。
【００１０】
羊水幹細胞としては、例えばＣＤ１１７陽性細胞が挙げられる。実施例において後述するように、ＣＤ１１７陽性羊水幹細胞は、骨、軟骨、脂肪組織等への分化能を有することが確認できており、治療用幹細胞として有用である。羊水幹細胞は羊水中に存在し、その羊水は妊娠中に一定量を採取しても、自然に再生され補充され得ることから羊水幹細胞を複数回にわたり回収することも可能である。そのため、出生後に本法による治療が予測される胎児に対しては出生前に十分量の治療用細胞を確保可能である。また、本邦では胎児染色体検査目的に年間約２万件の羊水検査が行われており、正常核型であることが判明し無事に出産を終えると、培養された羊水細胞は医療廃棄物として破棄されている。このため、臍帯血バンクのようなバンク化も現実的である。
【００１１】
本実施形態の細胞シートは、後述する細胞シートの製造方法により製造することができるものであり、羊水幹細胞をシート状に培養させたものである。したがって、本実施形態の細胞シートは、「羊水幹細胞から製造された細胞シート」、あるいは、「羊水幹細胞をシート状に培養させて得られた細胞シート」等といい換えることもできる。
【００１２】
また、羊水幹細胞をシート状に培養する過程で羊水幹細胞が分化し、幹細胞としての性質が失われた細胞からなるシートも本発明に包含される。このように、本実施形態の細胞シートは、細胞シートを構成する細胞の少なくとも一部が羊水幹細胞であることが好ましいが、分化した細胞であってもよい。
【００１３】
本実施形態の細胞シートは、シート状の形状を有していることから外科的治療等に利用することが容易である。例えば、出生前に超音波診断等により診断された、胎児の先天性疾患の治療等に本実施形態の細胞シートを利用することができる。このような先天性疾患としては、例えば、口蓋裂、口唇裂、先天性心疾患、臍帯ヘルニア、腹壁破裂、脊髄髄膜瑠等が挙げられる。本実施形態の細胞シートは、これらの疾患の治療前の臓器保護や、治療後の創傷治癒促進、ケロイド治療、アンチエージングを含む各種皮膚ケア等の目的に使用することができる。
【００１４】
また、本実施形態の細胞シートは、出生前の羊水穿刺により採取された羊水から予め作製しておくことができるため、出生後に直ちに自家移植による治療に利用することも可能である。また、本実施形態の細胞シートは、免疫寛容が大きいことから、自家移植のみならず他家移植に利用した場合においても拒絶反応が少ないと考えられる。
【００１５】
本実施形態の細胞シートは、細胞密度が３×１０５個／ｃｍ２以上であることが好ましい。実施例において後述するように、上記の範囲の細胞密度の細胞シートは、形状を維持することができる十分な強度を有しており、取り扱いが容易であり応用しやすい特長を有する。
【００１６】
［細胞シートの製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を回収する工程と、回収した前記細胞を３×１０５個／ｃｍ２以上の密度で培養基材上に播種してシート状に培養する工程と、前記培養基材から、前記細胞をシート状に剥離して回収する工程と、を含む、細胞シートの製造方法を提供する。本発明の羊水幹細胞は、通常の幹細胞と異なり、羊水から細胞を採取する際に非接着性の培養ディッシュにおいて接着した細胞を取得し継代したものである。そして、驚くべきことに約３×１０５個／ｃｍ２という高濃度でプラスチックディッシュに播種したところ、３日間という短期間で多分化能を有する幹細胞からなる細胞シートを作成することができた。
【００１７】
（ＣＤ１１７陽性羊水細胞を回収する工程）
本工程では、羊水細胞からＣＤ１１７陽性細胞を回収する。羊水細胞としては、羊水穿刺により採取した羊水に含まれる細胞を用いることができる。
【００１８】
ＣＤ１１７陽性細胞の回収は、羊水採取直後に行ってもよいが、羊水に含まれる羊水細胞の数が少ないことから、羊水細胞をある程度培養して増殖させた後にＣＤ１１７陽性細胞の回収を行うほうが作業しやすい。
【００１９】
羊水細胞の増殖では、細胞接着因子等が表面にコートされていない、非コートの培養基材を用いることが好ましく、培養基材に接着した細胞を用いる。培養基材の材質としては、例えばポリスチレン、ガラス等が挙げられる。
【００２０】
ＣＤ１１７陽性羊水細胞の回収は、ＣＤ１１７に対する抗体を用いた、セルソーターによる分離、磁気ビーズ及びマグネティックスタンドを用いた分離等により行うことができる。回収したＣＤ１１７陽性羊水細胞は、再び培養して増殖させてもよい。しかしながら、ＣＤ１１７陽性羊水細胞（羊水幹細胞）の分化を抑制する観点から、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を回収した後の細胞培養は最小限にすることが好ましい。
【００２１】
（シート状に培養する工程）
本工程では、回収したＣＤ１１７陽性羊水細胞をシート状に培養する。例えば、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を、培養基材上にある程度高密度に播種して培養することにより、シート状に培養することができる。
【００２２】
実施例において後述するように、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を３〜６×１０５個／ｃｍ２以上の密度で培養基材上に播種してシート状に培養すると、シート形状を維持することができる十分な強度を有する細胞シートを形成することができる。播種するＣＤ１１７陽性羊水細胞の細胞密度の上限は、特に制限されない。細胞シートの形成に要する培養時間としては、例えば約３日間が挙げられるが限定されない。
【００２３】
（細胞をシート状に剥離して回収する工程）
本工程では、シート状に培養したＣＤ１１７陽性羊水細胞を培養基材から剥離する。ＣＤ１１７陽性羊水細胞は、物理的な損傷を与えずにシート状に剥離することが好ましい。
【００２４】
例えば、培養基材として、表面に温度応答性ポリマーがコートされた培養基材を用い、当該培養基材上でシート状にＣＤ１１７陽性羊水細胞を培養することにより、細胞に物理的な損傷を与えずにシート状に剥離することができる。
【００２５】
温度応答性ポリマーとしては、特に制限されないが、ポリ−Ｎ−イソプピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等が挙げられる。温度応答性ポリマーがコートされた培養基材としては、一般的に市販されているものを使用してもよい。ポリ−Ｎ−イソプピルアクリルアミドがコートされた培養基材の場合、３２℃を境に基材表面が可逆的に疎水性と親水性に変化する。そこで、３７℃でＣＤ１１７陽性羊水細胞をシート状に培養した後、培養基材を３２℃未満の温度、例えば２０〜２５℃で１５分程度インキュベートすることにより、細胞に物理的な損傷を与えることなくシート状に剥離させることができる。剥離させた細胞シートは、回収して外科的治療等に利用することができる。
【実施例】
【００２６】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２７】
［実験例１］
（ヒト羊水細胞の培養）
ヒト羊水細胞を採取して培養した。ヒト羊水としては、慶應義塾大学病院倫理委員会承認のもと、染色体検査を目的に慶應義塾大学病院で羊水検査を実施した患者のうち、同意の得られた患者のヒト羊水を用いた。羊水検査の実施時期は妊娠１５週から妊娠１７週であり、採取した羊水の検体量は５〜１０ｍＬであった。また、羊水中の羊水細胞の数は１〜２×１０４／ｍＬであった。
【００２８】
ヒト羊水を遠心分離し、上清を除いた後、コートされていないカバーガラスを乗せた３５ｍｍディッシュに播種し、３７℃で培養した。培地は、Ｃｈａｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｋｉｔ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、２ｍＭペニシリン及びストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したものを用いた。
【００２９】
培地の量は、２ｍＬ／３５ｍｍディッシュとした。５〜７日目に培地交換を行い、１０〜１２日目に初回の継代を行った。初回継代後は、培地をＥｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに変更し、プラスティック製１００ｍｍディッシュで培養した。細胞が８０〜９０％コンフルエントになったところで継代を繰り返した。
【００３０】
Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍの組成は、ＭＥＭ  Ａｌｐｈａ（Ｇｉｂｃｏ社）培地中、２０％Ｃｈａｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、１５％ウシ胎児血清（ｂｉｏｗｅｓｔ社）、２ｍＭペニシリン及びストレプトマイシ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンであった。
【００３１】
［実験例２］
（ＣＤ１１７陽性細胞の解析）
実験例１において、Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに変更してから２回継代後のヒト羊水細胞から、ＣＤ１１７陽性細胞を分離して解析を行った。
【００３２】
より具体的には、まず、市販のキット（商品名「ＣＤ１１７  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔ」、「ＭＳ  ＭＡＣＳ（Ｒ）  Ｃｏｌｕｍｎｓ」、「ＭｉｎｉＭＡＣＳ（ＴＭ）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ」、いずれもミルテニーバイオテク社）を用いてＣＤ１１７陽性細胞を回収した。続いて、回収したＣＤ１１７陽性細胞をＥｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍを用いて更に培養した。
【００３３】
図１（ａ）〜（ｃ）は、培養した羊水細胞の光学顕微鏡写真である。図１（ａ）は倍率４倍の写真であり、図１（ｂ）は倍率１０倍の写真であり、図１（ｃ）は倍率２０倍の写真である。
【００３４】
続いて、ＣＤ１１７陽性羊水細胞の性質を確認するため、フローサイトメトリーにより表面抗原マーカーの確認を行った。図２（ａ）〜（ｈ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。その結果、間葉系幹細胞マーカーである、ＣＤ２９（図２（ａ））、ＣＤ４４（図２（ｂ））、ＣＤ７３（図２（ｃ））、ＣＤ９０（図２（ｄ））、ＣＤ１０５（図２（ｅ））は陽性であった。また、単球、造血幹細胞、白血球のマーカーである、ＣＤ１４（図２（ｆ））、ＣＤ３４（図２（ｇ））、ＣＤ４５（図２（ｈ））は陰性であった。以上の結果は、ＣＤ１１７陽性羊水細胞が間葉系幹細胞マーカーを発現していることを示す。
【００３５】
また、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を骨、軟骨及び脂肪組織に分化誘導し、これらの組織への分化能を有しているか否かを検討した。図３（ａ）は、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を骨に分化誘導し、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ染色によって骨に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は２０倍である。図３（ｂ）は、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を脂肪組織に分化誘導し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ染色によって脂肪に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は２０倍である。図３（ｃ）は、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を軟骨組織に分化誘導し、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色及びヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色によって軟骨組織に分化したことを確認した結果を示す写真である。倍率は４０倍である。その結果、ＣＤ１１７陽性羊水細胞が、骨、軟骨及び脂肪組織への分化能を有することが確認された。
【００３６】
以上の結果から、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を間葉系幹細胞として利用することができることが確認された。
【００３７】
［実験例３］
（細胞シートの製造）
温度応答性ポリマーを用いると、トリプシン処理等を行わなくても、温度を変化させることで細胞をディッシュから剥離させることができる。そこで、温度応答性ポリマーでコートされたディッシュを用いることにより、ＣＤ１１７陽性羊水細胞で細胞シートを製造することを試みた。
【００３８】
ディッシュとしては、温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が均一に固定化されたディッシュ（商品名「Ｕｐ  Ｃｅｌｌ（登録商標）３．５ｃｍディッシュ」、セルシード社）を使用した。このディッシュは、３２℃を境に基材表面が可逆的に疎水性と親水性に変化するものである。
【００３９】
ディッシュに播種する細胞密度、培養時間等を検討した結果、次の条件により、ＣＤ１１７陽性羊水細胞で細胞シートを製造することに成功した。
【００４０】
まず、ＣＤ１１７陽性羊水細胞を、３〜５×１０６個／ディッシュで上記のディッシュ（商品名「Ｕｐ  Ｃｅｌｌ（登録商標）３．５ｃｍディッシュ」、セルシード社）に播種し、３７℃で３日間培養した。ＣＤ１１７陽性羊水細胞としては、継代回数が５〜１０回の細胞を使用した。続いて、ディッシュを２０〜２５℃で１５分程度インキュベートすることにより、物理的に無傷な細胞をシート状に剥離させ、細胞シートを回収した。図４に製造した細胞シートの代表的な写真を示す。
【００４１】
細胞シートの製造に用いる細胞数について検討した結果、３×１０６個／３．５ｃｍディッシュ（約３×１０５個／ｃｍ２）以上の細胞密度で細胞を播種すると、取り扱いに十分な強度を有する厚みの細胞シートを得ることができる傾向にあった。
【００４２】
［実験例４］
（細胞シートの解析）
実験例３と同様にして作製した細胞シートのパラフィン包埋切片を作製し、病理組織学的検討を行った。具体的には、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、及び間葉系細胞マーカーであるビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の免疫染色を行った。
【００４３】
図５（ａ）は、細胞シートのＨＥ染色結果を示す写真である。図５（ｂ）は、細胞シートを抗ビメンチン抗体で染色した結果を示す写真である。その結果、ＣＤ１１７陽性羊水細胞で作製した細胞シートは、ビメンチン陽性であり、羊水が由来する間葉系細胞の特徴を有していることが明らかとなった。
【００４４】
［実験例５］
（細胞シートがマウス皮膚創傷治癒に与える影響の検討）
８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスにイソフルランによる吸入麻酔を導入した。続いて、マウスの背部に皮膚全層欠損創を１匹あたり２箇所ずつ作製した。創傷の一方を治療群とし、他方を対照群とした。治療群には、実験例３と同様にして作製した細胞シート（細胞数３×１０６個）を創部に貼付した。一方、対照群には何も貼付しなかった。続いて、創傷作製から７、１４、２１日目に創部を観察した。
【００４５】
図６（ａ）は、対照群の創部の代表的な写真である。また、図６（ｂ）は、治療群の創部の代表的な写真である。また、図７は、対照群及び治療群の創部面積の変化を示すグラフである。図７において、創部面積は、作製した創傷の面積を１００％とした割合で示す。
【００４６】
その結果、対照群及び治療群において、創部面積の縮小率に有意差は認められなかった。この結果から、ヒト細胞由来の細胞シートを、免疫不全でないマウスに移植したのにもかかわらず、拒絶反応を起こさず、創傷治癒を遅延させることもなく創部が治癒したことが明らかとなった。
【００４７】
また、創傷作製から１４、２１日目に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた後、皮膚組織を採取し、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定し、パラフィン包埋切片を作製した。
【００４８】
続いて、作製した組織切片を、各種染色法（ＨＥ染色、マッソントリクローム染色、エラスチカワンギーソン染色、ピクロシリウスレッド染色）で染色して組織学的評価を行い、再上皮化、肉芽形成、コラーゲン組成を比較検討した。
【００４９】
なお、マッソントリクローム染色は、膠原線維を選択的に染めることで、膠原線維と筋線維を染め分ける染色法である。また、エラスチカワンギーソン染色は、結合組織中の弾性線維と膠原線維を染め分け、かつ筋線維等との鑑別も可能である同時多目的染色法である。また、ピクロシリウスレッド染色は、組織切片中のＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲン線維を染め分ける染色法である。
【００５０】
その結果、マッソントリクローム染色にて創傷作製から１４日目の創部の再上皮化率を比較したところ、両群間に有意差は認められなかった（ｎ＝５）。また、エラスチカワンギーソン染色にて創傷作製から１４日目の肉芽組織面積を評価したところ、両群間に有意差は認められなかった（ｎ＝５）。
【００５１】
一方、創傷作製から２１日目には対照群、治療群のいずれにおいても創部は治癒したが、創傷作製から２１日目の創部の組織をピクロシリウスレッド染色し、偏光顕微鏡観察によりコラーゲン組成を検討したところ、対照群ではＩ型コラーゲンの過剰発現が認められたのに対し、治療群においてはＩ型コラーゲンの発現は少なく、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が多く認められた（ｎ＝５）。
【００５２】
図８（ａ）及び（ｂ）は、ピクロシリウスレッド染色の結果を示す写真である。図８（ａ）は治療群の結果を示し、図８（ｂ）は対照群の結果を示す。創傷治癒過程におけるＩ型コラーゲンの過剰発現は、ケロイド化や創部瘢痕化の原因となる現象である。この結果から、本細胞シートを患部に貼付することにより、拒絶反応を起こすことなしに遅延なく創傷治癒させることができ、創傷の合併症であるケロイド化や創部瘢痕化を抑制することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、羊水幹細胞を外科的治療や各種皮膚ケアに応用する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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