(57)【要約】【課題】ウイルスの精製に有用な、成形繊維から得られた、クロマトグラフィー、特に、イオン交換クロマトグラフィー用の吸着媒体を提供する。【解決手段】ある特定の実施形態では、その官能化成形繊維は、通常の繊維と比べて繊維の表面積を大幅に増加させるフィブリル化または隆起した構造を示す。高表面積繊維にイオン交換官能性を提供する表面ペンダント官能基を付加することができる。このペンダント官能性は、インフルエンザなどのウイルスのイオン交換クロマトグラフィー精製に有用である。【選択図】図１
2017158594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のウイルスを精製する方法であって、前記サンプルを繊維媒体のベッドと接触させることを含み、前記媒体中の繊維は、本体領域および前記本体領域から延びている複数の突起部を含み、前記繊維は、クロマトグラフィーを可能にする官能性をその上に付与されている、方法。
【請求項２】
前記官能性が前記繊維にグラフトされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記官能性がフロースルーモードでの精製を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記官能性がバインド／エリュートモードでの精製を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換官能性が陽イオン交換官能性であり、かつ、前記精製が５〜８の範囲のｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記官能性が陰イオン交換官能性であり、かつ、前記精製が７〜９の範囲のｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記繊維がトリメチルアミンで官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
繊維がデージー、雪片および太陽形からなる群から選択される形状を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２６号の優先権を主張するものであり、その開示内容は、本明細書の一部として援用する。
【０００２】
分野
本明細書に開示する実施形態は、ワクチンおよびウイルスの精製及び、モノクローナル抗体供給流の精製のためのウイルスクリアランス用途にも好適なクロマトグラフィー媒体に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ワクチンの調製のための新たな精製技術の開発は、最近のパンデミック発生への対応としてだけでなく新規治療用途にも大きな関心事である。そのような新規技術は、収率を向上させ、製品の純度を高め、生産速度を速めるために一般的に必要とされる。現行使用されているワクチン精製技術としては、塩化セシウム密度勾配遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、およびクロマトグラフィーが含まれる。これらの技術のそれぞれには異なる利点および欠点があり、ワクチン製造業者は、生産規模、純度、および製品コスト要件に基づいて特定の精製技術を選択しなければならない。典型的なワクチン精製プロセスは、図１に示されるプロセスフロー図に記載されている。
【０００４】
タンジェンシャルフロー濾過法および勾配遠心分離法はどちらも、ワクチンの生産において広く使用されているが、これらの単位操作は、コストと時間のかかるバッチ操作であり、拡張性に乏しく、特殊な装置および人員を必要とし、低収率および感染性の喪失をもたらす。そのような操作に使用される装置はほとんど使い捨てではなく、次のバッチのための精製装置を準備するためにコストのかかる再生、清浄、およびバリデーションのプロセスを行わなければならない。
【０００５】
対照的に、ワクチンのバインド／エリュート法(bind/elute)によるクロマトグラフィー精製では、精製プロセスをはるかにより大きな規模で行うことができるため、ビーズベースの樹脂を使用することは関心事である。残念なことに、これらの用途の市販の樹脂は、一般に、あまりにも小さすぎてより大きなウイルス粒子が接近できない孔径を呈する。結果として、このような媒体は、ウイルスがビーズの外表面にしか接近できないことから、低い結合容量を示す。このような低結合容量に、この用途に好適なクロマトグラフィー樹脂に関連する高コストが加味されるので、このようなプロセスを費用効果の高いものにするために、製造業者は、クロマトグラフィー媒体を用いて多数回のバインド／エリュート・カラム再生サイクルを行う必要がある。再生プロセスは、製品スループットの低下、バッファーおよび洗浄剤の消費増大、バリデーションコスト、ならびに資本設備要件の増大によって、生産コストをさらに増加させる。ウイルスに対する結合容量を増大し得る新規技術が現在開発中であり、これらには、膜吸着剤、モノリス、および市販の樹脂系を用いたフロースルー吸着精製法が含まれる。膜吸着剤およびモノリスは、これらの用途での結合容量の増大を可能にし得るが、これらの技術は、一般に、それら自体の規模に限界があり、そのような精製媒体は極めて高コストであるので、使い捨てデバイスとしてのこれらの製品の使用は阻まれ、従来から価格に敏感なワクチン産業への採用をさらに制限する可能性がある。
【発明の概要】
【０００６】
概要
当技術分野で現在知られている精製技術の限界の多くに取り組むために、非常に低コストの熱可塑性繊維とその繊維の表面にリガンド官能性を含む新しいタイプのクロマトグラフィー媒体が開発されている。リガンドは、例えば、イオン交換によって、細胞培養物供給流からウイルスを選択的に結合することができる。結合したウイルスは、その後、例えばより高いイオン強度の溶出バッファーを使用することによるなど、溶液条件を変更すると、クロマトグラフィー媒体から遊離させることができる。繊維に基づく固定相は、無孔であり、高ウイルス結合容量を得るために十分な表面積を提供する複雑な表面構造を示す。ウイルス結合は繊維の表面上でのみ起こるので、多孔質ビーズに基づくバインド／エリュートシステムの場合に見られるような、ウイルス結合に伴うサイズ排除問題はない。さらに、ウイルス粒子は、対流によってリガンド部位へ直接輸送され得るため、そのシステムでは拡散限界はなく、ワクチン供給流は、例えば、はるかに速い流速またはより短い滞留時間で処理され得る。
【０００７】
ある特定の実施形態よれば、クロマトグラフィー媒体は、成形繊維から得られる。ある特定の実施形態では、成形繊維は、フィブリル構造または隆起構造を呈する（例えば、図１（ｂ））。これらの隆起は、通常の繊維と比べて繊維の表面積を大幅に増加させることができる（例えば、図１（ａ））。従って、一般に、ベッド透過性の著しい低下および相応の流速低下をもたらす繊維径の縮小を行うことなく、高表面積が得られる。ある特定の実施形態に従う高表面積繊維の例は、Ａｌｌａｓｓｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（ローリー、ＮＣ）から市販されている「翼状」繊維である。Ａｌｌａｓｓｏ社の翼状繊維の断面ＳＥＭ画像を図１（ｄ）に示す。これらの繊維は１ｇ当たり約１〜１４平方メートルの範囲の表面積を呈する。繊維媒体の表面積測定値は、クリプトンまたは窒素ガスを使用するブルナウアー、エメット、およびテラー（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，  Ｅｍｍｅｔｔ，ａｎｄ  Ｔｅｌｌｅｒ）（ＢＥＴ）の方法のような、従来のガス吸着技術によって決定される。
【０００８】
また、陰イオン交換（ＡＥＸ）官能性を、例えば、高表面積繊維に提供する表面ペンダント官能基を付加する方法も本明細書に開示される。このペンダント官能性は、インフルエンザなどのワクチンおよびウイルスのイオン交換クロマトグラフィー精製に有用である。
【０００９】
本明細書に開示する実施形態はまた、高表面積官能化繊維を含む媒体でワクチンおよびウイルスを精製するための方法に関する。これらの方法は、フロースルーモードまたはバインド／エリュートモードで実施することができる。
【００１０】
ある特定の実施形態によれば、本明細書に開示する媒体は、高いベッド透過性（例えば、３００〜９００ミリダーシー）、ビーズベースのクロマトグラフィー媒体と比べて低い材料コスト、２０〜６０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの動的結合、高い分離効率（例えば、ＨＥＴＰ＜０．１ｃｍ）、５０〜２００ｍｇ／ｇ  ＩｇＧの静的結合容量、およびリガンド結合部位への吸着質の速い対流支配輸送を備えている。
【００１１】
ある特定の実施形態によれば、ユニークな高表面積の押出成形繊維（例えば、熱可塑性繊維）の使用により、０．５〜６ｍｍの間の長さのカット繊維がランダムに配向した充填ベッドとして構成される場合、高流量透過性（液体）および等流分布が可能となる。そのような繊維表面を官能化する化学処理方法が提供され、吸着相互作用に基づいた分離が可能になる。化学処理方法は、イオン性、親和性、疎水性などの相互作用または相互作用の組合せのいずれかに基づいて、そのような繊維に様々な表面化学官能性を付与することができる。繊維生産と単純な表面化学処理プロセスを組み合わせた効率的使用によって、生物薬剤学ならびにワクチン生産およびウイルス精製において、経済的で容易に拡張可能な精製操作技術がもたらされる。
【００１２】
ある特定の実施形態によれば、拡散輸送の影響により接触時間がより長く、それゆえ、処理速度がより遅いビーズベースの媒体に対し、繊維表面への、また繊維表面からの溶質の物質輸送は、媒体を通る流体の対流によって大きく制御されることから、速い処理速度を可能にする吸着分離材料が提供される。ビーズ細孔の立体的制限により従来のビーズベースの媒体を用いて効率的に分離することができない、ウイルスなどの大きい生物学的種を捕捉または除去する能力が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）従来技術による繊維の概略図である。（ｂ）ある特定の実施形態に従って使用することができる隆起繊維の概略図である。（ｃ）ある特定の実施形態による、ペンダント基が付いた図１ｂの繊維の概略図である。（ｄ）ある特定の実施形態に従って使用することができる隆起繊維のＳＥＭ画像である。（ｅ）ある特定の実施形態による繊維の官能化の概略図である。
【図２】ある特定の実施形態による選択吸着剤についてのＢＳＡ−ラテックス粒子の静的結合容量のプロットである。
【図３】（ａ）〜（ｄ）様々な繊維のＳＥＭ画像である。
【図４】ＡＥＸ繊維媒体、ならびに選択した市販の膜吸着剤およびビーズベースのＡＥＸ媒体について収集したフロースルー画分のΦ６  ＬＲＶのプロットである。
【図５】溶出プールΦ６力価のプロットである。
【図６】ウイルスクリアランスの比較のプロットである。
【図７】インフルエンザウイルスブレイクスルーのプロットである。
【図８】インフルエンザウイルスブレイクスルーのプロットである。
【図９】フロースルーＭＶＭクリアランスＬＲＶ値のプロットである。
【図１０】ある特定の実施形態による、雪片の形をした繊維の断面図である。
【図１１】ある特定の実施形態による、太陽の形をした繊維の断面図である。
【図１２】ある特定の実施形態による、デージーの形をした繊維の断面図である。
【図１３】（ａ）〜（ｅ）ある特定の実施形態による、突起部および分岐状副突起部を有する繊維の断面図である。
【図１４】（ａ）〜（ｄ）ある特定の実施形態による、表面積が増大した成形繊維の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本明細書に開示する実施形態による成形繊維媒体は、繊維自体の表面にのみ依存する。成形繊維は高表面積だけでなくフローに対する高透過性も与えるため、容量および効率に関する性能目標を達成するために繊維担体上の利用可能な表面積を増すために、アガロースヒドロゲルまたは多孔質粒子を追加する必要がない。さらに、ヒドロゲルまたは多孔質粒子を追加することにより表面積を増大させる必要がないため、本明細書に記載する媒体の製造コストが最小限に抑えられる。
【００１５】
繊維は、任意の長さおよび直径のものであってよく、好ましくは、カット繊維もしくは短繊維または不織布である。繊維は、一体構造として接合されている必要はないが、個々の個別存在物として有効に機能することができる。繊維は、長さが不定の糸もしくはモノフィラメントなどの連続長の形態であってよく、または繊維は、不織布もしくは織布などの繊維材料（例えば、短繊維）を細断すること、結晶成長法などによって形成された連続長の繊維を個片に切断することなどによって、より短い個々の繊維の形にしてもよい。好ましくは、繊維は、熱可塑性ポリマー、例えば、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミド、熱可塑性ウレタン、コポリエステル、または液晶性ポリマーで作製されたものである。約１〜３デニールの繊維が好ましい。ある特定の実施形態では、繊維の断面長は約１μｍ〜約１００μｍであり、断面幅は約１μｍ〜約１００μｍである。１つの好適な繊維の断面長は約２０μｍであり、断面幅は約１０μｍであり、約１．５デニールである。約１０，０００ｃｍ2／ｇ〜約１，０００，０００ｃｍ2／ｇの範囲の表面積を有する繊維が好適である。好ましくは、繊維の断面長は約１０〜２０μｍである。
【００１６】
ある特定の実施形態では、繊維は、記載する用途に適合する適当なポートおよび寸法を有するデバイスまたは容器に容易に圧縮充填することができる。また、繊維は、不織布産業において一般的な、スパンボンディング法（連続フィラメント）または湿式堆積法（カット繊維）によって作出される不織布シート素材材料のような予備成形ベッド形式で使用することができる。好適な予備成形繊維形態としては、シート、マット、ウェブ、モノリスなどが挙げられる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、繊維断面は、全体として翼状の形をしており、本体領域、およびその本体領域から外側へ放射状に延びている複数の突起部を有する。突起部は、繊維の長さに沿って延びる共線形チャネルのアレイを形成し、一般に、そのようなチャネルは、１繊維当たり２０〜３０本である。ある特定の実施形態では、突起部の長さは、本体領域の長さより短い。ある特定の実施形態では、繊維断面は、全体として翼状の形をしており、中間領域は、繊維の中心を下方に向かう縦方向の軸を含み、かつこの中間領域から延びる複数の突起部を有する（図１（ｄ））。ある特定の実施形態では、複数の突起部は、中間領域からほぼ放射状に延びている。この構成の結果、これらの突起部によって複数のチャネルが画定される。突起部間の好適なチャネル幅は、約２００〜約１０００ｎｍ範囲である。好適な繊維は、米国特許出願公開第２００８／０１０５６１２号に開示されており、この開示内容は、本明細書の一部として援用する。ある特定の実施形態では、繊維は、本体領域およびその本体領域から延びている１つまたは複数の突起部を含む。また、それらの突起部は、それらの突起部から延びている突起部を有していてよい。突起部は、直線状であっても曲線状であってもよい。突起部は、実質的に同じ長さのものでも異なる長さのものでもよい。本体領域は、突起部の厚さより大きい厚さを有する領域を有していてよい。典型的な形状としては、図１０に示すような雪片形状、図１１に示すような太陽形状、および図１２に示すようなデージー形状が挙げられる。さらに詳しくは、図１０の雪片形状は中央本体部分を含み、その中央本体部分から複数の突起部が外側へ延びている。これらの突起部の各々は、突起部からその長さに沿って外側へ延びている複数のより短い様々な長さの二次的突起部または副突起部を有する。また、図１１に示す太陽形状も中央本体部分を含み、その中央本体部分から複数の曲線状の突起部が外側へ延びている。図１２に示すデージー形状は、中央中実本体部分を含み、その中央中実本体部分から複数の突起部が外側へ延びており、これらの突起部にはこれ以上の突起部の追加はない。
【００１８】
本体領域は、中実（例えば、図１２）または中空（例えば、図１０および図１１）であってよく、実質的に線形または非線形であってよい。他の例示的な形状としては、図１３（ａ）〜（ｅ）に示すような分岐構造を含む成形繊維が挙げられる。従って、図１３（ａ）は、星形状であり、中実の中央本体領域を有し、その中央本体領域から６つの等ペース(equally paced)の直線状突起部が対称に外側へ延びている。図１３（ｂ）に示す繊維は、中実の中央本体領域を有し、その中央本体領域から直線状の突起部のセットが外側へ延びており、セット内の各突起部は同じ方向に延びている。図１３（ｃ）に示す繊維は、中央本体領域を有し、その中央本体領域から３つの等間隔の直線状突起部が異なる方向に延びている。各突起部は、その突起部から、末端自由端の二次的突起部または副突起部が中央本体領域に向かう角度で延びている。図１３（ｄ）の繊維は、二次的突起部または副突起部が中央本体領域から離れる角度で延びていることを除き、図１３（ｃ）のものと類似している。図１３（ｄ）の繊維は、各二次的突起部または副突起部では、その末端自由端に追加の突起部があることを除き、図１３（ｄ）のものと類似している。
【００１９】
他の例示的な形状としては、図１４（ａ）〜（ｄ）に示すように、中空コアを有する繊維、マイクロフィラメントバンドル、または波状リボンの形をした繊維が挙げられる。図１４（ａ）および（ｂ）は、中空コアおよび交互の山と谷を画定する複数の突起部を有する閉多角形を例示している。図１４（ｃ）は、各繊維間の間隙空間にアクセス可能な表面積を有する単一のフィラメントを形成するために、集合体として接合された繊維バンドルを例示している。図１４（ｄ）は、ジグザグのパターンを有する成形繊維を例示している。
【００２０】
繊維形状は、Ｈｉｌｌｓ、Ｉｎｃ．（西メルボルン、ＦＬ）製の異相構造繊維紡績機を使用して作出し得る。成形異相構造繊維は、市販の繊維紡績装置および米国特許第５，１６２，０７４号に記載されているような特注設計の繊維ダイスタックを使用して調製することができ、その開示内容は、本明細書の一部として援用する。２台の押出成形機が溶融加工可能な材料を一般的なスピンヘッドに供給する。スピンヘッドはダイスタックを含み、このダイスタックによって溶融物流は分割され、個別のフィラメントへと方向が変えられ、これらのフィラメントは、スピナレットを通って出た後に収束される。各フィラメントの断面は、一次材料および、所望の繊維形状に対するネガとなる二次材料により所望の繊維形状を有する。特徴サイズおよび近接の両面において、一次材料が押出成形されただけでは不可能である繊維断面における繊維の特徴付けが二次材料の存在によって可能になる。押出成形後、二次材料は、通常、溶解によって、取り除かれ、所望の断面を有する高表面積繊維が残される。繊維の最終断面の詳細は、ダイスタック、加工条件、スピナレット形状、ならびに一次ポリマーおよび二次ポリマーの選択の組合せによって決定される。
【００２１】
ダイスタックは、非常に入り組み、複雑で多様な断面を作出するために作製することができる。一次材料は、溶融紡糸することができる任意の材料、例えば、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレンなどであってよい。二次材料もまた、任意の溶融紡糸可能な材料であってよいが、二次材料は容易に取り除かれることが好ましい。従って、好ましい材料は、可溶性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、可溶性コポリエステルなどである。
【００２２】
ある特定の実施形態によれば、陰イオン交換官能性を高表面積繊維に提供する表面ペンダント官能基が取り付けられる。このペンダント官能性は、インフルエンザなどのワクチンおよびウイルスの陰イオン交換クロマトグラフィー精製に有用である。
【００２３】
高表面積繊維の表面官能化は、二段階プロセスによって達成することができる。好適な官能化法はグラフト重合であり、図１（ｅ）に示すスキーム１に例示している。この実施形態では、高表面積繊維は、グリシジルメタクリレートモノマー、硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）、およびＨＮＯ3の水溶液と３５℃にて空気中で１時間反応させる。これらの条件下で、ナイロン繊維表面のセリウム酸化により、フリーラジカルが発生し、グリシジルメタクリレートポリマーの表面グラフト重合が開始される。このような条件下で、表面開始重合プロセスにより、重合されるグリシジルメタクリレートモノマーの重合の「触手」が生成される。このようにして、グリシジルメタクリレートポリマーは繊維表面に共有結合により取り付けられる。このようなプロセスは、グラフト重合として知られている。
【００２４】
第２の合成段階において、ある特定の実施形態では、ポリ（グリシジルメタクリレート）修飾繊維材料は、すぐに水で洗浄され、室温にて１８時間、トリメチルアミン（２５重量％）水溶液で処理される。これらの条件下で、ポリ（グリシジルメタクリレート）触手に残っているエポキシ基がトリメチルアミンと反応し、ワクチン精製用途に所望の陰イオン交換官能性を提供することができるペンダント陽イオン性トリメチルアルキルアンモニウム（Ｑ）官能性を得ることができる。
【００２５】
好適なカラム充填密度約０．１〜０．４ｇ／ｍｌの間、好ましくは、約０．３２ｇ／ｍｌで、ベッド高さ１〜５ｃｍにより、クロマトグラフィー評価において許容される性能を得るために十分な流れの均一性が提供される。
【００２６】
ある特定の実施形態では、媒体（官能化充填繊維）は、ビーズベースの媒体とは異なり、乾燥した充填済み形態でユーザーに届けることができる。繊維は、熱的または化学的手段によって溶解して、圧力容器に収納することができる半剛体構造を形成することができる。このような構築によって、媒体および付属デバイスは、即時使用が可能である。クロマトグラフィー用のビーズベースの媒体は、一般的には、ばら材料（湿潤）として届けられ、この場合、圧力容器（カラム）に装填し、様々な手段によって、空隙またはチャネルのない十分に充填されたベッドを作出することがユーザーに求められる。一般的には、充填の均一性を確認するために追跡検査が必要である。これに対して、ある特定の実施形態によれば、製品が即時使用可能な状態で到着するため、ユーザーによる充填の必要はない。
【００２７】
成形繊維媒体は、多孔質クロマトグラフィービーズと比べて、その形態の性質によって特定の利点を提供する。一般には、ビーズベースのクロマトグラフィーでは、分離プロセスの律速段階は、拡散によって制御される、多孔質ビーズの深さへの吸着質（溶質）の浸透である。タンパク質などの高分子では、この拡散輸送は比較的遅くなることがある。本明細書に開示する高表面積繊維では、結合部位は、繊維の外側に露出しているため、フロー流中の吸着質分子のアクセスは容易である。このアプローチによって提供される迅速な輸送は、短い滞留時間（速い流速）を可能にし、それによって、擬似移動床システムなどの手段による媒体の迅速な循環を可能にする。処理速度は、生物学的製剤の生産において重要なパラメーターであるため、本明細書に記載する繊維ベースのクロマトグラフィー媒体は、従来のビーズベースの媒体と比べて、プロセス面で特定の利点を有する。
【００２８】
従来のクロマトグラフィー樹脂は、多孔質ビーズ、一般には、アガロース、合成ポリマー、およびシリカまたはガラスのビーズで始まる。これらの材料は、一般的に、高価であり、非官能化アガロースビーズは、１Ｌ当たり３００ドル〜３５０ドルの間のコストがかかり、定孔ガラスは、１Ｌ当たり６００ドル〜１０００ドルの間のコストがかかる。これに対して、良好なクロマトグラフィー特性を得るのに適当な密度および厚さでの、本明細書に記載する高表面積繊維の不織布ベッドは、１Ｌ当たり２０ドル〜５０ドルの間のコストであると推定される。このコスト面での利点により、この新しいクロマトグラフィー媒体は、１回使用後、または最も多い可能性としては１回の生産運転で複数回のサイクルの後の使い捨てに好適な価格設定がなされた「使い捨て」技術（すなわち、１回使用）として市販することができる可能性が高くなる。
【００２９】
開示内容が本明細書の一部として援用される米国特許出願公開第２０１２／００２９１７６号において開示されている実施形態の表面官能化繊維媒体（例えば、ＳＰ官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維、ＳＰＦ１）は、充填ベッド形式で高透過性を示している。充填密度に依存して、ベッド透過性は、１４０００ミリダーシー超〜１０００ミリダーシー未満の範囲であり得る。低充填密度０．１ｇ／ｍＬ（１ｇの媒体／９．３ｍＬのカラム容量）では、線速度９００ｃｍ／時間でベッド透過性１４２００ミリダーシーを測定により示した。この値は、広い速度範囲（４００〜１３００ｃｍ／時間）にわたって変わらない。このような挙動は、充填繊維ベッドが高い線速度で圧縮を受けないことを示している。表面官能化繊維媒体（ＳＰ官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維、ＳＰＦ１）をより高い充填密度０．３３ｇ／ｍＬ（１ｇの媒体／２．８５ｍＬのカラム容量）へとその後圧縮することにより、線速度９００ｃｍ／時間でベッド透過性１０００ミリダーシーとなった。同様に、この値１０００ミリダーシーは、線速度範囲４００〜１３００ｃｍ／時間にわたって変わらなかった。好適な充填密度は、約０．１〜約０．５ｇ／ｍｌの間を含む。
【００３０】
バイオセパレーションに使用される従来の充填ベッド式イオン交換クロマトグラフィー媒体、例えば、ＰｒｏＲｅｓ−Ｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、ビルリカ、ＭＡ）では、上記の場合と同様の寸法の充填ベッド（ベッド深さ３ｃｍ、内径１１ｍｍのヴァンテージ（Ｖａｎｔａｇｅ）カラム、カラム容量２．８５ｍＬ）で透過性の値１９００ミリダーシーを測定により示した。膜吸着剤では、典型的な透過性の値は１〜１０ミリダーシーの範囲にある。ＰｒｏＲｅｓ−Ｓでは、４００〜１３００ｃｍ／時間の速度範囲にわたってベッド透過性の著しい変化は測定により示されなかった。この挙動は半剛体ビーズ、例えば、ＰｒｏＲｅｓ−Ｓで予想されたが、より圧縮性の高い媒体（例えば、アガロースビーズ）は、充填ベッドの著しい圧縮による高い線速度（＞２００ｃｍ／時間）でのベッド透過性の著しい低下を示すと予想される。
【実施例】
【００３１】
高表面積繊維の表面官能化手順およびトリメチルアミンによるエポキシ環開環手順の例を下に示す（実施例１および実施例２）。
【００３２】
トリメチルアルキルアンモニウム（Ｑ）触手官能化高表面積繊維（ＡＥＸ繊維媒体）の調製。
【００３３】
実施例１．非修飾ナイロン繊維のグラフト重合。５００ｍＬのボトルに、Ａｌｌａｓｓｏ社製ナイロン繊維１０ｇおよび水（４６６ｍＬ）を入れた。１Ｍ  ＨＮＯ3溶液（１４．４ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続いて、１Ｍ  ＨＮＯ3中硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）０．４Ｍ溶液（１．２０ｍＬ、０．４８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１５分間撹拌した。グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、３．３９ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３５℃に１時間加熱した。室温への冷却後、固体を脱イオン水で洗浄し（３×３００ｍＬ）、湿った材料を次の工程ですぐに使用した。
【００３４】
実施例２．エポキシ官能化繊維のＱ官能化（ＡＥＸ繊維媒体）。２Ｌのボトルに、上の実施例１からの湿ったＧＭＡ官能化繊維、水（５００ｍＬ）およびメタノール（５００ｍＬ）中５０重量％トリメチルアミン（水）溶液を入れた。混合物を室温で１８時間撹拌した。続いて、繊維固体を、０．５Ｍ硫酸中０．２Ｍアスコルビン酸溶液（３×４００ｍＬ）、脱イオン水（３×４００ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（３×４００ｍＬ）、脱イオン水（３×４００ｍＬ）およびエタノール（１×４００ｍＬ）で洗浄した。材料を炉に入れ、４０℃で４８時間乾燥させた。１１．７４ｇの白色の繊維状固体を得た。
【００３５】
ＡＥＸ繊維媒体の機能性能。実施例２に記載したＡＥＸ繊維媒体の性能を、下に示す実施例に記載するように、様々なウイルスクリアランスおよびワクチン精製用途について評価した。
【００３６】
実施例３．ＡＥＸ繊維媒体のカラム充填。内径１１ｍｍのヴァンテージカラムに、２５ｍＭ  ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）１００ｍＬ中の、上の実施例２に記載したＡＥＸ繊維媒体１．０ｇのスラリーを入れた。繊維媒体をベッド深さ３．０ｃｍ（カラム容量２．８５ｍＬ、繊維充填密度０．３５ｇ／ｍＬ）に圧縮した。繊維ベッド透過性は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８バッファーを流速２．０ｍＬ／分でカラムに流し、電子圧力トランスデューサーによりカラム圧力降下を測定することによって評価した。繊維ベッド透過性の値を下の表１に示す。
【００３７】
【表１】
2017158594.tif 000003
【００３８】
実施例４．ＢＳＡコーティングラテックスビーズを使用したＡＥＸ繊維媒体へのウイルス結合のシミュレーション。Ｐｏｓｔｎｏｖａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．製のＢＳＡコーティングポリスチレンラテックス粒子（粒径１００ｎｍ）を、インフルエンザウイルスのサイズ特性および電荷特性をシミュレーションするためのモデルとして使用した。ＢＳＡ−ラテックス粒子の２ｍｇ／ｍＬ溶液をｐＨ８の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファーにより調製し、ＡＥＸ繊維媒体の静的結合容量を決定し、市販のＱタイプの樹脂（Ｑ−セファロースファーストフロー、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）ならびに市販のＱタイプの膜吸着剤（メンブレン−Ｑ）の値と比較した。これらの結果を下の表２および図２に要約する。ＡＥＸ繊維媒体の、ＢＳＡコーティングラテックス粒子に対する静的結合容量は、非官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維媒体または市販のＱ−セファロースファーストフロークロマトグラフィー樹脂のいずれと比べても著しく大きい。Ｑ−セファロース樹脂の低結合容量は、大きなＢＳＡ−ラテックス粒子によりアクセス可能な、利用できる表面積が制限されていることによって説明できる。さらに、ＡＥＸ繊維媒体の結合容量は、市販のメンブレン−Ｑ膜吸着剤と同程度である。図３は、ＢＳＡ−ラテックス粒子を使用した静的結合実験後のＡＥＸ繊維媒体および非修飾Ａｌｌａｓｓｏ社製翼状繊維のＳＥＭ画像を示している。ＡＥＸ繊維媒体では、かなりの量の粒子が観察され、繊維表面をほぼ完全に覆っている。非官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維を使用した対照実験では、未処理のＡｌｌａｓｓｏ社製繊維の表面にごく少数の粒子しか吸着されない。この場合、結合は、ＢＳＡ−ラテックス粒子と未処理Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維との間での非特異的結合相互作用に起因し得る。
【００３９】
【表２】
2017158594.tif 000004
【００４０】
実施例５．ウイルスのバインド／エリュート精製のための繊維媒体性能。バクテリオファージΦ６に対する静的結合容量および溶出回収の測定結果を下の表３に示す。５本のプラスチック遠心管に、実施例２のＡＥＸ繊維媒体および非官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維サンプルを、下の表に記載する量で入れた。各繊維サンプルおよび対照のチューブに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ添加）５ｍＬを加えて１０分間撹拌しながら平衡化した。チューブを室温において卓上遠心機により４０００ｒｐｍで１０分間回転させ、繊維媒体をペレット化した。上清２．５ｍＬを除去し、各チューブに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ添加）中１．７×１０7ｐｆｕ／ｍＬのΦ６溶液２．５ｍＬを加えた。サンプルを室温で１時間撹拌した。その後、チューブを室温において卓上遠心機により４０００ｒｐｍで１５分間回転させ、繊維媒体をペレット化した。上清２．５ｍＬを除去し、これらのサンプルを、結合していないΦ６について、プラーク形成アッセイによりアッセイした。チューブを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ添加）洗浄液２．５ｍＬで３回、遠心分離しながら洗浄し、各洗浄と上清２．５ｍＬの除去の間で繊維媒体をペレット化した。洗浄後、各チューブに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８、０．１８ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ添加）中１．０Ｍ  ＮａＣｌ溶液２．５ｍＬを加えた（総容量５ｍＬ、最終ＮａＣｌ濃度は０．５Ｍである）。サンプルを室温で１０分間撹拌した。その後、チューブを室温において卓上遠心機により４０００ｒｐｍで１０分間回転させ、繊維媒体をペレット化した。上清２．５ｍＬを除去し、これらの溶出サンプルを、プラーク形成アッセイにより溶出したΦ６についてアッセイした。実施例２のＱ官能化触手繊維媒体は、有意なバクテリオファージΦ６の対数減少値（ＬＲＶ）３．１および溶出回収率４０％を示している。この性能は、商業的なウイルスクロマトグラフィー用途で使用されている膜ベースの陰イオン交換媒体と同程度である。本発明のＱ官能化繊維媒体は、フロースルーウイルスクリアランスもしくはバインド／エリュートウイルス精製用途に向けて、充填済みデバイス形式またはクロマトグラフィーカラムに組み込むことができる。これに対して、非官能化Ａｌｌａｓｓｏ社製繊維サンプルは、Φ６バクテリオファージに対する結合容量をほとんど示していない（Φ６  ＬＲＶ＝０）。
【００４１】
【表３】
2017158594.tif 000005
【００４２】
実施例６．Φ６のＬＲＶ、Φ６結合容量、および溶出プールΦ６回収量の決定。実施例３に記載したプロセスに従って、実施例２からのＡＥＸ繊維媒体を使用して、２本の内径１１ｍｍのヴァンテージカラムに充填した。ＡＥＸ繊維媒体カラムをＢｉｏＣＡＤクロマトグラフィーワークステーションに取り付け、ＨＥＴＰ、ピークの非対称性を、２％アセトン溶液３０μｌ注入および溶出剤として２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）バッファーを流速３．２ｍＬ／分（線速度２００ｃｍ／時間）で用いて測定した。ＨＥＴＰおよびピークの非対称はそれぞれ、０．０８ｃｍおよび２．８を測定により示した。ＡＥＸ繊維媒体カラムを、シュードモナスバクテリオファージΦ６供給流（０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１．０×１０9ｐｆｕ／ｍＬ）を用いて、動的結合容量、ウイルスの対数減少値（ＬＲＶ）、およびΦ６回収について試験し、性能を、２つの市販の陰イオン交換膜吸着剤および市販のビーズベースの陰イオン交換体と比較した。ＡＥＸ繊維媒体カラムを、３５ＣＶの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で平衡化した。その後、各カラムに、１４０ＣＶのシュードモナスバクテリオファージΦ６供給流（０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中約９．３×１０8ｐｆｕ／ｍＬ）溶液をロードし、２０×フロースルー画分７ＣＶを収集した。ロード後、カラムを、３０ＣＶの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で洗浄した。結合されたΦ６を、１５ＣＶの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１．０Ｍ  ＮａＣｌ溶液で溶出した。フロースルーサンプル、洗浄サンプル、および溶出サンプルを、プラーク形成アッセイによりΦ６力価について分析した。同様の手順に従って、膜吸着デバイスおよびＱ−セファロースファーストフローカラムを評価した。これらのデバイスを、１５ＣＶの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で平衡化した。その後、各カラムに、１４０ＣＶのシュードモナスバクテリオファージΦ６供給流（０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中約１．４×１０9ｐｆｕ／ｍＬ）溶液をロードし、５×フロースルー画分２８ＣＶを収集した。ロード後、カラムを、１５ｍＬの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で洗浄した。結合されたΦ６を、１５ＣＶの０．０６２５％ＨＳＡ添加２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１．０Ｍ  ＮａＣｌ溶液で溶出した。フロースルーサンプル、洗浄サンプル、および溶出サンプルを、プラーク形成アッセイによりΦ６力価について分析した。性能データを下の表４ならびに図４および図５に要約する。膜吸着剤（ザルトバインド−Ｑ（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ−Ｑ）およびクロマソルブ（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ））ならびにＱ−セファロースファーストフロー樹脂は総て、Φ６に対して非常に低い結合容量を示した。これは、Φ６の早期ブレイクスルー、およびそれに対応した、最初の２８ＣＶフロースルー時点について表で報告した低いΦ６  ＬＲＶ値によって示されている。膜吸着デバイスおよびＱ−セファロース樹脂カラムについて報告した溶出プールのΦ６力価もまた、かなり低く、これらの材料がΦ６バクテリオファージに対して低結合容量である��とをさらに反映している。これに対して、ＡＥＸ繊維媒体カラムでは、本発明者らは、Φ６に対してずっと高い結合容量を見出し、同じ２８ＣＶフロースルー時点でΦ６  ＬＲＶは約３である。溶出プールのΦ６力価は比較サンプルよりずっと高く、最終Φ６力価はΦ６ロード力価より高い。これは、ＡＥＸ繊維媒体カラムのΦ６結合容量がかなりのものであり、この媒体は出発供給より高い値までΦ６バクテリオファージを濃縮することが可能であることを示している。
【００４３】
【表４】
2017158594.tif 000006
【００４４】
実施例７．バクテリオファージΦＸ１７４のＬＲＶの決定。実施例３に記載したプロセスに従って、実施例２からのＡＥＸ繊維媒体を使用して、２本の内径１１ｍｍのヴァンテージカラムに充填した。ＡＥＸ繊維媒体カラムをＢｉｏＣＡＤクロマトグラフィーワークステーションに取り付け、ＨＥＴＰおよびピークの非対称性を、２％アセトン溶液３０μｌ注入および溶出剤として２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）バッファーを流速３．２ｍＬ／分（線速度２００ｃｍ／時間）で用いて測定した。ＨＥＴＰおよびピークの非対称はそれぞれ、０．１０ｃｍおよび２．０を測定により示した。ＡＥＸ繊維媒体カラムを、ΦＸ１７４供給流（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１．２８×１０7ｐｆｕ／ｍＬ）を用いて、ウイルスの対数減少値（ＬＲＶ）について試験し、性能を、２つの市販のクロマソルブ（商標）陰イオン交換膜吸着剤と比較した。ＡＥＸ繊維媒体カラムを、３５ＣＶ（１００ｍＬ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で平衡化した。その後、各カラムに、３８０ＣＶ（１０８０ｍＬ）のバクテリオファージΦＸ１７４供給流（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１．２８×１０7ｐｆｕ／ｍＬ）溶液をロードし、１００ＣＶ、２００ＣＶ、３００ＣＶ、および３７０ＣＶ時点で４×フロースルーグラブ画分１ｍＬを収集した。同様の手順に従って、クロマソルブ（商標）膜吸着デバイスを評価した。これらのデバイスを、３０ｍＬ（３７５ＣＶ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で平衡化した。その後、各デバイスに、７５０ＣＶ（６０ｍＬ）のバクテリオファージΦＸ１７４供給流（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中約１．２８×１０7ｐｆｕ／ｍＬ）溶液をロードし、２５ＣＶ、３７５ＣＶおよび７５０ＣＶ時点で３×フロースルーグラブ画分１ｍＬを収集した。フロースルーグラブサンプルを、プラーク形成アッセイによりΦＸ１７４力価について分析した。性能データを下の表５および図６に要約する。これらの条件下では、ＡＥＸ繊維媒体カラムおよびクロマソルブ（商標）膜吸着デバイスはどちらも、良好なΦＸ１７４ウイルスクリアランス性能を示し、ΦＸ１７４のＬＲＶ値は４より大きいかまたは４にほぼ等しい。
【００４５】
【表５】
2017158594.tif 000007
【００４６】
実施例８．清澄ＭＤＣＫ細胞培養物からのインフルエンザウイルスのバインド・エリュート法による精製。実施例３に記載した手順に従って、実施例２からのＡＥＸ繊維媒体を１１ｍｍヴァンテージカラムに充填した。ＡＥＸ繊維媒体の性能を、インフルエンザウイルスのバインド／エリュート精製に関して、市販のＡＥＸビーズおよび膜吸着剤と比較した。市販の充填済みＱタイプ樹脂ハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）（商標）Ｑ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．ＰＮ：１７−５０５３−０１）ならびに市販の強塩基性ＡＥＸ膜吸着デバイス（ザルトバインド（登録商標）−Ｑ、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ＡＧ  ＰＮ：Ｑ５Ｆ）を比較のために選択した。インフルエンザウイルス細胞培養物は、マイクロキャリア沈降、デカンテーション、その後、不溶性の混入物を除去するためのステリカップ（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）（登録商標）−ＧＰフィルターユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ：ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ）による濾過によって回収した。血球凝集（ＨＡ）アッセイにより、インフルエンザウイルス濃度は出発供給で９１３１ＨＡＵ／ｍＬと決定された。総てのデバイスを、少なくとも５カラム容量（ＣＶ）の０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２で平衡化した。この同じバッファーを洗浄工程に使用した。１．５Ｍ  ＮａＣｌ含有ソレンセンリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２を溶出バッファーとして使用した。試験は、ＡＥＸ繊維媒体およびハイトラップＱ  ＦＦデバイスについて二反復で行った。カラムには小型蠕動ポンプを使用して送り、膜デバイスには１０ｍＬシリンジによって、遅い定常圧力を用いて送った。フロースルーサンプル、ロードサンプル、および溶出サンプルを収集し、ＨＡアッセイにより試験した。試験パラメーターおよび結果を下の表６および表７ならびに図７に要約する。この評価から、ビーズベースのハイトラップ（商標）Ｑ  ＦＦ陰イオン交換体で低いインフルエンザウイルス結合容量が認められる。これは、ザルトバインド（登録商標）−Ｑ膜吸着剤（Ｑ５Ｆ）と比べて、その早期のインフルエンザウイルスブレイクスルーによって明らかである。ザルトバインド（登録商標）−Ｑ膜吸着剤は、インフルエンザウイルスに対してより高い結合容量を示しており、溶出後、結合されたインフルエンザウイルスは収率５７％で回収される。供給制限により、ＡＥＸ繊維媒体デバイスには、インフルエンザウイルスを７．６×１０5ＨＡＵ／ｍＬまでしかロードしておらず、この物質は収率３４〜６７％で回収された。ビーズベースのハイトラップ（商標）Ｑ  ＦＦ陰イオン交換媒体と比べて、ＡＥＸ繊維媒体カラムは、インフルエンザウイルスに対してずっと高い結合容量を示しており、これらのデバイスは、ザルトバインド（登録商標）−Ｑ（Ｑ５Ｆ）膜吸着剤と少なくとも同じくらい高いインフルエンザウイルス結合容量を示し得る。
【００４７】
【表６】
2017158594.tif 000008
【００４８】
【表７】
2017158594.tif 000009
【００４９】
実施例９．清澄ＭＤＣＫ細胞培養物からのインフルエンザウイルスのバインド・エリュート法による精製。実施例３に記載した手順に従って、実施例２からのＡＥＸ繊維媒体を１１ｍｍヴァンテージカラムに充填した。ＡＥＸ繊維媒体の性能を、インフルエンザウイルスのバインド／エリュート精製に関して、市販のＡＥＸビーズと比較した。市販の充填済みＱタイプ樹脂：ハイトラップ（商標）Ｑ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．ＰＮ：１７−５０５３−０１）を比較のために選択した。インフルエンザウイルス細胞培養物は、マイクロキャリア沈降、デカンテーション、その後、不溶性の混入物を除去するためのステリカップ（登録商標）−ＧＰフィルターユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ：ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ）による濾過によって回収した。血球凝集アッセイにより、インフルエンザウイルス濃度は出発供給で４３８９ＨＡＵ／ｍＬと決定された。総てのデバイスを、少なくとも５カラム容量（ＣＶ）の０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有ソレンセンリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２で平衡化した。同じバッファーを洗浄工程に使用した。１．５Ｍ  ＮａＣｌ含有ソレンセンリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２を溶出バッファーとして使用した。試験は二反復で行った。カラムには小型蠕動ポンプを使用して送った。フロースルーサンプル、ロードサンプル、および溶出サンプルを収集し、ＨＡアッセイにより試験した。試験パラメーターおよび結果を下の表８および表９ならびに図８に要約する。この評価から、ビーズベースのハイトラップ（商標）Ｑ  ＦＦ陰イオン交換体で低いインフルエンザウイルス結合容量が認められる。これは、ＡＥＸ繊維媒体カラムと比べて、その早期のインフルエンザウイルスブレイクスルーによって明らかである。ＡＥＸ繊維媒体はインフルエンザウイルスに対して著しく高い結合容量を示しており、溶出後、結合されたインフルエンザウイルスは収率４２％で回収される。供給制限により、ＡＥＸ繊維媒体デバイスには、インフルエンザウイルスを１．０５×１０6ＨＡＵ／ｍＬまでしかロードしておらず、このロードレベルまでインフルエンザウイルスブレイクスルーは観察されなかった。
【００５０】
【表８】
2017158594.tif 000010
【００５１】
【表９】
2017158594.tif 000011
【００５２】
実施例１０．ＭＶＭのＬＲＶの決定。実施例３に記載したプロセスに従って、実施例２からのＡＥＸ繊維媒体を使用して、２本の内径６．６ｍｍのオムニフィット（Ｏｍｎｉｆｉｔ）カラムに充填した。各カラムに、ＡＥＸ繊維媒体０．３５ｇを、ベッド深さ３．０ｃｍおよびカラム容量１ｍＬに充填した。ＡＥＸ繊維媒体カラムのウイルスクリアランス性能を、１７．６ｇ／Ｌのマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）感染ｍＡｂ供給流（２．０×１０6  ＴＣＩＤ50／ｍＬ）を用いて評価し、その性能を、２つの市販のクロマソルブ（商標）デバイスおよび１つのザルトバインド−Ｑ陰イオン交換膜吸着剤と比較した。関連ｍＡｂ供給流のより良いシミュレーションを行うために、供給には約８４ｐｐｍの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入物を含めた。ＡＥＸ繊維媒体カラムを、１００ＣＶ（１００ｍＬ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７で平衡化した。その後、各カラムに４１１ＣＶ（４１１ｍＬ）のＭＶＭ感染ｍＡｂ供給流をロードし、完了量０．２ｋｇ／Ｌ、１．８ｋｇ／Ｌ、３．５ｋｇ／Ｌ、５．２ｋｇ／Ｌ、および７．０ｋｇ／Ｌ  ｍＡｂの時点で、５×フロースルーグラブ画分１ｍＬを収集した。同様の手順に従って、クロマソルブ（商標）デバイスおよびザルトバインド（登録商標）−Ｑの膜吸着デバイスを評価した。これらのデバイスを、１０ｍＬ（１２５ＣＶ）の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７で平衡化した。その後、クロマソルブ（商標）デバイスおよびザルトバインド（登録商標）−Ｑデバイスに、４００ＣＶ（クロマソルブ（商標）デバイスの場合３２ｍＬ、ザルトバインド（登録商標）−Ｑデバイスの場合５６ｍＬ）のＭＶＭ感染ｍＡｂ供給流をロードし、完了量０．２ｋｇ／Ｌ、１．８ｋｇ／Ｌ、３．５ｋｇ／Ｌ、５．２ｋｇ／Ｌ、および７．０ｋｇ／Ｌ  ｍＡｂの時点で、５×フロースルーグラブ画分１ｍＬを収集した。注：ザルトバインド（登録商標）−Ｑ膜吸着デバイスについては、完了量５．２ｋｇ／Ｌおよび７．０ｋｇ／Ｌ  ｍＡｂの時点で収集を行わなかった。フロースルーグラブサンプルを、ＴＣＩＤ５０アッセイによってＭＶＭ感染について分析した。性能データを下の表１０および図９に要約する。これらの条件下では、ＡＥＸ繊維媒体カラムおよびクロマソルブ（商標）膜吸着デバイスはどちらも、良好なＭＶＭウイルスクリアランス性能を示し、７ｋｇ／Ｌほどの高いｍＡｂ完了量レベルでＭＶＭ  ＬＲＶ値≧４である。これに対して、市販のザルトバインド（登録商標）−Ｑ膜吸着デバイスは、低いｍＡｂ完了量レベルで３未満の低いＭＶＭ  ＬＲＶ値を示している。
【００５３】
【表１０】
2017158594.tif 000012
【図１】
2017158594.tif 000013
【図２】
2017158594.tif 000014
【図３】
2017158594.tif 000015
【図４】
2017158594.tif 000016
【図５】
2017158594.tif 000017
【図６】
2017158594.tif 000018
【図７】
2017158594.tif 000019
【図８】
2017158594.tif 000020
【図９】
2017158594.tif 000021
【図１０】
2017158594.tif 000022
【図１１】
2017158594.tif 000023
【図１２】
2017158594.tif 000024
【図１３】
2017158594.tif 000025
【図１４】
2017158594.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月19日(2017.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のウイルスを精製する方法であって、前記サンプルを繊維媒体のベッドと接触させることを含み、前記媒体中の繊維は、本体領域および前記本体領域から延びている複数の突起部を含み、前記繊維は、クロマトグラフィーを可能にする官能性をその上に付与されており、かつ前記繊維は、各繊維間の間隙空間にアクセス可能な表面積を有する単一のフィラメントを形成するために、集合体として接合された繊維バンドルである、方法。
【請求項２】
前記官能性が前記繊維にグラフトされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記官能性がフロースルーモードでの精製を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記官能性がバインド／エリュートモードでの精製を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記官能性が陽イオン交換官能性であり、かつ、前記精製が５〜８の範囲のｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記官能性が陰イオン交換官能性であり、かつ、前記精製が７〜９の範囲のｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記繊維がトリメチルアミンで官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2017158594000001.pdf