(57)【要約】      （修正有）【課題】植物や酵母からの抽出における抽出工程や濃縮工程を含む複雑さを伴わず、１種類の微生物を用いた例と比較して十分に高いプトレッシン（１，４ジアミノブタン）の生産量が得られ、遺伝子組換え微生物を用いる方法より安全性が高く、簡便で十分な収量が得られる新しいプトレッシンの製造方法の提供。【解決手段】アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物およびＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で共培養するプトレッシン製造方法。アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が、大腸菌又はサルモネラ・エンテリカであり、ＡｇＤＩ経路を有する微生物が、エンテロコッカス科、ストレプトコッカス科、ラクトバシラス科、シュードモナス科に属する微生物であり、特にエンテロコッカス・フェカリスであるプトレッシンを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレッシンを製造する方法であって、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物およびＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で共培養する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
共培養する工程が、
（Ａ）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養し；そして、
（Ｂ）ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を（Ａ）の培養物に添加して共培養する；
ことにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する微生物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が、大腸菌（Escherichia coli）またはサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＡｇＤＩ経路を有する微生物が、エンテロコッカス科（Enterococcuaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）に属する微生物である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＡｇＤＩ経路を有する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が大腸菌（Escherichia coli）であり、ＡｇＤＩ経路を有する微生物がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
酸性条件がｐＨ４．０以上、ｐＨ７．０未満である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
共培養する工程におけるアルギニンの添加量が、０．１ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、共培養物の培養液からプトレッシンを分離する工程、を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
プトレッシンを製造する方法であって、以下の工程：
（１）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養する；
（２）工程（１）の培養物から培養上清を得る；
（３）ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を、工程（２）の培養上清に添加して培養する；及び
（４）工程（３）の培養液からプトレッシンを分離する；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物およびＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を利用したプトレッシンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは、第１級アミノ基を２つ以上有する脂肪族炭化水素の総称であり、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）は最も単純なポリアミンの一つである。腸内細菌が産生するポリアミンは、腸管バリア機能の増強作用、抗変異原性、および抗酸化作用を有するなど、宿主の健康に強く関係していることから、ポリアミン産生に関与する菌種や産生経路の解明は重要なテーマである。現在、腸内細菌のポリアミン生合成系の研究は個々の菌種を対象に行われているが、ポリアミン生合成経路が特定されているのは一部の病原菌等に限られている。また、菌体外（腸管腔内）へのポリアミン放出メカニズム、およびその生理学的意義（なぜ菌体外へ放出するのか）はそれらの菌種においても解明されていない。
【０００３】
現在の市場に存在するポリアミン高含有食品素材は植物（特許文献１、特許文献２）や酵母（特許文献３）などからの抽出物である。植物や酵母からの抽出によりポリアミンを得るにあたっては、その抽出工程や濃縮工程を含む複雑さを伴う。このような事情を考慮すると微生物による発酵生産の方が簡便であり、コストダウンに繋がる可能性が高い。微生物を利用したプトレッシンの製造方法としては、１種類の微生物を用いた例（特許文献４）や、遺伝子組換えなどを行った変異体微生物を用いた例（特許文献５）などが存在する。しかし、１種類の微生物を用いた例では十分に高いプトレッシンの生産量が得られておらず、また遺伝子組換え微生物を用いる方法は食品材料の生産には適してないなど、課題も存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２６３８１
【特許文献２】特開２０１２−２３６８０３
【特許文献３】特開２００１−８６６３
【特許文献４】特開２００６−１９１８０８
【特許文献５】特表２０１０−５３５０２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の背景から、安全性が高く、簡便で十分な収量が得られる新しいプトレッシンの製造方法が依然として求められている。本発明は、そのような条件を満たす新しいプトレッシンの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上に鑑み、本件の発明者は、ヒト腸管内で最も多く存在しているプトレッシンが、前駆体であるアルギニンの経口投与により濃度依存的に誘導されることをin vivo試験で確認されたこと注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、単独菌株より混合培養の方がプトレッシンを多く産生することを見いだし、腸管内では単独の細菌ではなく、複数の細菌の共同作用によりプトレッシンを生合成し、放出していると仮説を立てた。そして、アルギニンからプトレッシンを菌体外へ産生する細菌の組合せを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００７】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
【０００８】
［１］プトレッシンを製造する方法であって、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物およびＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で共培養する工程を含む、前記方法。
【０００９】
［２］共培養する工程が、
（Ａ）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養し；そして、
（Ｂ）ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を（Ａ）の培養物に添加して共培養する；
ことにより行われる、［１］に記載の方法。
【００１０】
［３］アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する微生物である、［１］または［２］に記載の方法。
【００１１】
［４］アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が、大腸菌（Escherichia coli）またはサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）である、［３］に記載の方法。
【００１２】
［５］ＡｇＤＩ経路を有する微生物が、エンテロコッカス科（Enterococcuaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）に属する微生物である、［１］ないし［４］のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
［６］ＡｇＤＩ経路を有する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）である、［５］に記載の方法。
【００１４】
［７］アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が大腸菌（Escherichia coli）であり、ＡｇＤＩ経路を有する微生物がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）である、［１］または［２］に記載の方法。
【００１５】
［８］酸性条件がｐＨ４．０以上、ｐＨ７．０未満である、［１］ないし［７］のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
［９］共培養する工程におけるアルギニンの添加量が、０．１ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である、［１］ないし［８］のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
［１０］さらに、共培養物の培養液からプトレッシンを分離する工程、を含む、［１］ないし［９］のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
［１１］プトレッシンを製造する方法であって、以下の工程：
（１）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養する；
（２）工程（１）の培養物から培養上清を得る；
（３）ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を、工程（２）の培養上清に添加して培養する；及び
（４）工程（３）の培養液からプトレッシンを分離する；
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１９】
２種類以上の微生物の共同作用を利用することにより、１種類の微生物を用いる場合よりも、プトレッシンを効率よく産生させることができる。また、本発明の方法は遺伝子組換え体を使うものではないので、食品材料の生産という観点から安全性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物と、ＡｇＤＩ経路を有する微生物の２種類の微生物によるプトレッシン製造方法の概略図である。アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物としてE. coli、ＡｇＤＩ経路を有する微生物としてEn. faecalisを例示した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２２】
＜プトレッシンの製造方法＞
本発明は、２種類以上の微生物の共同作用を利用したプトレッシン製造方法に関する。より具体的には、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物とＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を利用したプトレッシン製造方法に関する。
【００２３】
アルギニン依存的耐酸性機構とは、一部の微生物が持つ機構であり、当該微生物は酸性条件下でアルギニンを吸収し、アグマチンを放出する。ＡｇＤＩ経路とは、一部の微生物が持つアグマチン代謝経路であり、アグマチンを吸収後、アグマチンデイミナーゼという酵素を用いてアグマチンを分解し、プトレッシンカルバモイルプトレッシンを介してプトレッシンを産生する経路である。
【００２４】
本件の発明者は、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物が産生する代謝産物を利用してＡｇＤＩ経路を有する微生物がプトレッシンを生合成し、放出することを見いだした。本出願は、異なる微生物の一方が上記の代謝経路の一方を有し、他方が上記の代謝経路のもう一方を有することにより、当該異なる微生物の共同作用を利用したプトレッシンの製造方法を提供する。
【００２５】
第一の態様において本出願は、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物およびＡｇＤＩ経路を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で共培養する工程を含む、プトレッシンの製造方法を提供する。
【００２６】
アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物には、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する微生物が含まれるが、これに限定されない。好ましい態様において、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物は、エシェリキア（Escherichia）属またはサルモネラ（Salmonella）属に属する微生物である。各属の中では、特に大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）が好ましく、これらのいずれかを適宜選択してもよい。サルモネラ・エンテリカは、大腸菌の近縁であり、大腸菌と同様の代謝経路を持つことが知られている（Brenneman, K. E., et al., (2013) J. Bacteriol., 195(13): 3062-3072）。
【００２７】
ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物には、エンテロコッカス科（Enterococcuaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）に属する微生物が含まれるが、これに限定されない。これらの微生物は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）と同様の代謝経路を持つことが知られている（Ladero, V., et al., (2011) Appl. Envion. Microbiol., 77(18): 6409-6418; Nakada, Y., et al., (2001) J. Bacteriol., 183(22): 6517-6524）。好ましい態様において、ＡｇＤＩ経路を有する微生物は、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、および、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から選択してもよい。別の好ましい態様において、ＡｇＤＩ経路を有する微生物は、エンテロコッカス科に属する微生物である。さらに好ましい態様において、ＡｇＤＩ経路を有する微生物は、エンテロコッカス・フェカリスである。
【００２８】
上記共培養の工程において、微生物はアルギニンの存在下で培養される。培養液中のアルギニン濃度は、特に限定されないが０．１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、または１．０ｍＭ以上であってよい。アルギニン濃度の上限は、特に限定されないが、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７５ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下であってよい。アルギニン濃度の上限および下限は、上記の範囲からそれぞれ適宜選択することができる。好ましい態様において、培養液中のアルギニン濃度は、１．０ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００２９】
上記共培養の工程において、微生物は酸性条件下で培養される。酸性条件は、ｐＨ４．０以上、ｐＨ７．０未満の範囲であれば、特に限定されない。好ましい態様において、酸性条件の下限は、ｐＨ４．０以上、ｐＨ４．５以上、ｐＨ５．０以上、またはｐＨ５．５以上であり、上限は、ｐＨ７．０未満、ｐＨ６．５以下、またはｐＨ６．０以下である。酸性条件の下限および上限は、上記の範囲からそれぞれ適宜選択することができる。特に好ましい態様において、酸性条件はｐＨ４．０以上、ｐＨ６．０以下である。
【００３０】
上記共培養の工程において、共培養は当業者が利用可能ないずれかの培地を用いて行ってもよい。本発明の方法においては、培養液中の菌数が増えるほどプトレッシン産生量が増加する傾向が観察されている。この観点から培地成分が微生物の増殖に必要な成分が十分に含まれている培地が好ましい。また、共培養は、回分培養（すなわち、培養中に培地成分を添加しない方式）で行ってもよく、または、流加培養（すなわち、培養中に培地成分を添加し続ける方式）で行ってもよい。回分培養は、比較的簡便に工業化できるというメリットがある。一方、流加培養を用いた場合は、培養中に培地成分が添加され続けるので、培養液中の菌数は一般的に増加する。このため、流加培養を用いることによりプトレッシン生産量の増加が期待できる。培地の種類、培地成分の量、および培養方式などは、様々な状況を考慮して当業者が適宜選択することができる。
【００３１】
上記共培養の工程において、共培養を行う時間は特に限定されず、当業者は共培養液をサンプリングして培養液中のプトレッシン量を測定することにより、適宜設定することができる。共培養の培養時間は、例えば、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、であってもよい。
【００３２】
上記共培養の工程において、共培養は、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物及びＡｇＤＩ経路を有する微生物が培養の際にともに存在している状態を実現するものであれば、培養する順番は問わない。好ましい態様においては、アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を先に培養し、ＡｇＤＩ経路を有する微生物を後から添加して共培養する。すなわち、共培養の工程は以下の手順：
（Ａ）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養し；そして、
（Ｂ）ＡｇＤＩ経路（アグマチンデイミナーゼ代謝経路）を有する微生物を（Ａ）の培養物に添加して共培養する；
ことにより行われてもよい。
【００３３】
上記工程（Ａ）の培養を行う時間は、特に限定されないが、例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、であってよい。上記工程（Ｂ）の共培養を行う時間は、特に限定されないが、例えば、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、であってもよい。
【００３４】
本発明のプトレッシンの製造方法は、さらに、前記共培養物の培養液からプトレッシンを分離する工程を含んでもよい。プトレッシンを分離する工程においては、上記の共培養の工程で得た培養液からプトレッシンを分離および／または精製する。培養液からのプトレッシンの分離は、公知の方法を含むいかなる方法で行ってもよい。例えば、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過、遠心分離、などにより行ってもよい。プトレッシンの分離・精製は、プトレッシンが菌体と分離されていればよい。したがって、プトレッシンを分離する工程の結果、精製したプトレッシンを得てもよく、あるいはプトレッシンを粗精製物として得てもよい。
【００３５】
第二の態様において本出願は、以下の工程：
（１）アルギニン依存的耐酸性機構を有する微生物を、アルギニンの存在下、酸性条件下で培養する；
（２）工程（１）の培養物から培養上清を得る；
（３）ＡｇＤＩ経路を有する微生物を、工程（２）の培養上清に添加して培養する；及び
（４）工程（３）の培養液からプトレッシンを分離する；
を含む、プトレッシンを製造する方法を提供する。
【００３６】
上記第二の態様において、アルギニン耐酸性機構を有する微生物、ＡｇＤＩ経路を有する微生物、アルギニンの量および酸性条件等の培養条件、ならびにプトレッシンの分離の手法として意図される範囲については、上記第一の態様おいて記載したとおりである。
【００３７】
上記第二の態様の工程（１）において、培養を行う時間は特に限定されないが、例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、であってよい。
【００３８】
上記第二の態様の工程（３）において培養を行う時間は特に限定されない。当業者は共培養液をサンプリングして培養液中のプトレッシン量を測定することにより、適宜設定することができる。例えば、６時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間であってもよい。
【００３９】
上記第二の態様の工程（２）において、培養上清を得る方法は、公知の方法を含むいかなる方法で行ってもよい。例えば、遠心分離、フィルター滅菌、菌体の固定化技術を用いた手法、などにより行うことができる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４１】
実施例１：アルギニンからプトレッシンを産生する微生物の組合せの探索
表１に示す腸内常在菌１４菌種の中から最もプトレッシン産生量が多い２菌種の組合せを探索した。
【００４２】
【表１】
2017158434.tif 000002
【００４３】
上記１４菌種の中から２菌種の組合せ、すなわち計９１通りの組合せについて、アルギニン（終濃度１ｍＭ）を添加した培養液（ＧＡＭブイヨン）中で２４時間共培養した。培養開始から７時間および２４時間五の培養液中のプトレッシン濃度を超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）にて測定した。
【００４４】
この結果、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）を含む８通りの組合せ（表２）において、培養液中のプトレッシン濃度が５ｍＭ以上であることを確認した。また、１菌種のみを培養した場合と比較して、下記の菌種の組合せを培養した場合には、培養液中のプトレッシンの濃度が、平均で約１１．１倍増加した。このことは、プトレッシンは複数菌種の共同作用により合成されていることを示している。
【００４５】
【表２】
2017158434.tif 000003
【００４６】
実施例２：培養液のｐＨの影響
実施例１で見いだした８通りの菌種の組合せの中から、プトレッシン産生量が最も多かった大腸菌（E. coli）およびエンテロコッカス・フェカリス（En. faecalis）の組合せをモデルケースとして、培養液中のｐＨの違いによるプトレッシン産生量の変化について検討した。
【００４７】
E. coliおよびEn. faecalisを、異なるｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）のアルギニン添加培養液中で、実施例１と同様に共培養し、そして培養液中プトレッシン濃度を測定した。その結果、混合培養によるプトレッシン産生量は、ｐＨが中性域（ｐＨ７．０及び７．５）よりも弱酸性域（ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０）で増加した。
【００４８】
実施例３：２段階培養
大腸菌（E. coli）およびエンテロコッカス・フェカリス（En. faecalis）の間で代謝産物の輸送が行われているかを確認する目的で以下の実験を行った。
【００４９】
２種類の菌種のうち一方について、アルギニン添加培養液（ｐＨ６．０）で単菌培養を行った。その培養上清をフィルター滅菌した後、もう一方の菌種を植菌して培養した。その後、培養液中のプトレッシン濃度を実施例１と同様に測定した。
【００５０】
その結果、E. coliの培養上清を用いてEn. faecalisを培養した際にプトレッシン産生量の増加が認められた。このことは、E. coliが産生する代謝産物を利用して、En. faecalisがプトレッシンを生合成し、放出していることを示している。
【００５１】
実施例４：プトレッシンの製造
Escherichia coli MG1655株とEnterococcus faecalis V583株（ＡＴＣＣ (American Type Culture Collectionより購入）を用いて以下の実験を行った。
【００５２】
培地
以下の培地を使用した。培養条件は、特記しなければ３７℃、嫌気培養である。
【００５３】
【表３】
2017158434.tif 000004
【００５４】
実験
１日目に、E. coli MG1655株をＡ培地において前培養を一晩行った。２日目に、アルギニンを加えたＢ培地を用いて、初期ＯＤ６００＝０．０１相当量のE. coli MG1655株の菌体を加え、本培養を開始した。そして、En. faecalis V583株の前培養をＡ培地にて行った。３日目に、本培養開始後２４時間にてサンプリングを行い、同時にEn. faecalis V583株の菌体を初期ＯＤ６００＝０．０１相当量で加え、培養を継続した。４日目に、本培養開始後４８時間にてサンプリングを行い、培養液中のプトレッシン濃度を確認した。
【００５５】
結果
その結果、培養液中にプトレッシンが蓄積していることを確認した（表４）。
【００５６】
【表４】
2017158434.tif 000005
【００５７】
同様に、Escherichia coli JCM5491株とEnterococcus faecalis JCM5803（理化学研究所より分譲）を用いて、プトレッシン製造実験を行った。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
2017158434.tif 000006
【００５９】
以上から、菌株の種類によらず、大腸菌（E. coli）およびエンテロコッカス・フェカリス（En. faecalis）の組合せを用いることにより、高い収率でプトレッシンが製造できることが明らかとなった。
【００６０】
実施例５：培養条件の検討による高収率化
Ａ培地およびＢ培地の代わりに、５０ｍＭアルギニンを添加し、ｐＨを調整（ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０）したＧＡＭブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を用いた他は、実施例４と同様の実験を行った。ＧＡＭブイヨンの組成は表６に示すとおりである。
【００６１】
【表６】
2017158434.tif 000007
【００６２】
結果を表７に示す。
【００６３】
【表７】
2017158434.tif 000008
【００６４】
培養条件の変更により、プトレッシンの産生量が向上した。この結果は、ｐＨ以外にも培養条件のさらなる変更により、プトレッシン産生量の向上が期待できることを示すものである。
【図１】
2017158434.tif 000009