(57)【要約】      （修正有）【課題】標的遺伝子の発現を抑制できる非ヌクレオチド構造を利用した一本鎖核酸分子の提供。【解決手段】Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、テレフタル酸誘導体（ＴＰ）を介して連結し、前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする、人工マッチ型ｍｉＲＮＡの提供。【選択図】図１
2017012028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、下記式（ＴＰＡ）を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする、人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制方法。
【化１】
2017012028.tif 000026
【請求項２】
前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有する、請求項１記載の発現抑制方法。
【請求項３】
前記オーバーハングが、０〜４塩基長である、請求項２記載の発現抑制方法。
【請求項４】
前記Ｘ領域が、前記ガイド鎖配列と付加配列とからなり、前記付加配列が、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している、請求項１から３のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項５】
前記Ｘ領域における前記付加配列の長さが、０〜５塩基長である、請求項４記載の発現抑制方法。
【請求項６】
前記Ｘ領域の長さが、１９〜３３塩基長である、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項７】
前記Ｙ領域の長さが、２１〜３５塩基長である、請求項１から６のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項８】
全長が、４０〜６８塩基長である、請求項１から７のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項９】
前記一本鎖核酸の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項１０】
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項１１】
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項１２】
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、非ヒト動物に投与する、請求項１から１０のいずれか一項に発現抑制方法。
【請求項１３】
疾患の治療方法であって、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、下記式（ＴＰＡ）を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、
前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする、治療方法。
【化２】
2017012028.tif 000027
【請求項１４】
前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有する、請求項１３記載の治療方法。
【請求項１５】
前記オーバーハングが、０〜４塩基長である、請求項１４記載の治療方法。
【請求項１６】
前記Ｘ領域が、前記ガイド鎖配列と付加配列とからなり、前記付加配列が、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している、  請求項１３から１５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１７】
前記Ｘ領域における前記付加配列の長さが、０〜５塩基長である、請求項１６記載の治療方法。
【請求項１８】
前記Ｘ領域の長さが、１９〜３３塩基長である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１９】
前記Ｙ領域の長さが、２１〜３５塩基長である、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項２０】
全長が、４０〜６８塩基長である、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項２１】
前記一本鎖核酸の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列である、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項２２】
前記疾患が、がんである、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項２３】
前記疾患が、肺がんである、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有するｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、３’末端に１〜４塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）が切り出される。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症，ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａのｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現が抑制されることによって、癌の治療が可能になるため、注目されている（特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１０／０５６７３７  Ａ２
【特許文献２】ＷＯ  ２０１２／１０６５９１  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ２０１１／０８８３０９  Ａ１
【特許文献４】ＷＯ  ２０１２／００５３６８  Ａ１
【特許文献５】ＷＯ  ２０１２／０１７９１９  Ａ１
【特許文献６】ＷＯ  ２０１３／１０３１４６  Ａ１
【特許文献７】ＷＯ  ２０１３／１３３２２１  Ａ１
【特許文献８】ＷＯ  ２０１３／１３３３９３  Ａ１
【特許文献９】ＷＯ  ２０１３／１８００３８  Ａ１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｅｉｔｅｒｓ，  ２００９，  Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １２，  ５１−６０
【非特許文献２】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １８，  １８１−１８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記ｍｉＲＮＡを応用するにあたっては、例えば、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡや二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡ模倣体を使用する方法等がある。しかし、二本鎖ＲＮＡを用いる方法は、使用に先立って、二本の一本鎖核酸分子をアニーリングする必要があり、また、二本鎖を認識するＴＬＲ３等によって自己免疫を発生する可能性がある。
【０００７】
本出願人は、これまでに様々な非ヌクレオチド構造を利用した一本鎖核酸分子を創意工夫の上開発してきた（特許文献４〜９）。そこで、本発明は、これまでの研究成果により得られた知見に基づき、非ヌクレオチド構造を利用した一本鎖核酸分子である、人工マッチ型ｍｉＲＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、
Ｘ領域、Ｙ領域およびリンカー領域を有する一本鎖核酸であり、
具体的には、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、リンカー領域（テレフタル酸誘導体）を介して連結し、前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。
【００１２】
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの一例を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１におけるウェルあたりの細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１６】
（１）人工マッチ型ｍｉＲＮＡ
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域、Ｙ領域およびリンカー領域を有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、リンカー領域（テレフタル酸誘導体）を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
【００１８】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、自己免疫に関与するＴＬＲ３、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等に認識されることも回避できる。
【００１９】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおける前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、図１に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置され、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、テレフタル酸誘導体（図において「ＴＰ」で表す）を介して連結している。
【００２０】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むため、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とは、例えば、分子内アニーリングする。分子内アニーリングとは、例えば、自己アニーリングともいう。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前記分子内アニーリングした領域において、二本鎖が形成されるともいう。
【００２１】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
【００２２】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、前述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含む。成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／等）。したがって、例えば、これらの公知の成熟ｍｉＲＮＡの情報に基づいて、前記Ｘ領域を設定できる。前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とは、ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）のＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）タンパク質に取り込まれ、ターゲットのｍＲＮＡに結合する鎖である。
【００２３】
前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列のみからなってもよいし、さらに付加配列を有してもよい。後者の場合、前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列と前記付加配列とからなり、前記付加配列は、例えば、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している。
【００２４】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とをアライメントした際、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含む。前記Ｙ領域は、例えば、前記Ｘ領域と完全に相補的な配列のみからなってもよいし、前記相補的な配列の他に、さらにオーバーハングを有してもよい。すなわち、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有してもよい。ここで、前記Ｙ領域のオーバーハングとは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした場合に、前記Ｙ領域が前記Ｘ領域よりも過剰に有する末端の塩基である。オーバーハングの長さ（Ｏ）は、例えば、下記式で表すことができる。
オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］−［Ｘ領域の全長の塩基数（Ｘ）］
【００２５】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００２６】
前記Ｘ領域において、前記ガイド鎖配列の長さは、特に制限されず、例えば、報告されている成熟ｍｉＲＮＡにおけるガイド鎖配列の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、１９塩基長、２０塩基長であり、上限が、例えば、２５塩基長、２４塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜２５塩基長、２０〜２４塩基長である。
【００２７】
前記Ｘ領域が前記付加配列を有する場合、前記付加配列の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、５塩基長、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜５塩基長、１〜４塩基長、２〜３塩基長である。
【００２８】
前記Ｘ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３３塩基長、３０塩基長、２８塩基長、２６塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３３塩基長、１９〜３０塩基長、２１〜２８塩基長、２３〜２６塩基長である。
【００２９】
前記Ｙ領域が前記オーバーハングを有する場合、前記オーバーハングの長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜４塩基長、１〜３塩基長、２塩基長である。
【００３０】
前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
【００３１】
前記Ｙ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３５塩基長、３２塩基長、３０塩基長、２８塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３５塩基長、２１〜３５塩基長、１９〜３２塩基長、２１〜３０塩基長、２３〜２８塩基長である。
【００３２】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの全長（Ｔ）は、特に制限されず、下限が、例えば、３８塩基長、４２塩基長、４６塩基長であり、上限が、例えば、６２塩基長、５８塩基長、５４塩基長であり、範囲が、例えば、３８〜６２塩基長、４２〜５８塩基長、４６〜５４塩基長である。  
【００３３】
前記成熟ｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）の成熟ｍｉＲＮＡでよい。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
【００３４】
ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１、ＢＣＬ−２等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、がん（肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等）等の疾患を予防または治療できる。前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの場合、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡのポリヌクレオチドは、例えば、配列番号３からなる塩基配列があげられる。
【００３５】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【００３６】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００３７】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【００３８】
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【００３９】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
【００４０】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられる。
【００４１】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【００４２】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー領域は、例えば、下記化学式（Ｉ−０）で表わされる。
【００４３】
【化１】
2017012028.tif 000003
【００４４】
前記化学式（Ｉ−０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ−０）であり、
Ａは、任意の原子団である。
【００４５】
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。条件（１）  前記Ｘ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ−０）の構造と結合する。条件（２）  前記Ｘ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ−０）の構造と結合する。
【００４６】
前記化学式（Ｉ−０）において、例えば、Ｑ１１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ１がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１１がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。また例えば、Ｑ１２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ２がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１２がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。
【００４７】
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２は、例えば、それぞれカルボニル基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表されることがより好ましい。
【００４８】
【化２】
2017012028.tif 000004
2017012028.tif 000005
【００４９】
前記化学式（Ｉα２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
【００５０】
【化３】
2017012028.tif 000006
【００５１】
なお、Ｑ１１およびＱ１２がカルボニル基であり、かつＱ１およびＱ２がイミノ基である場合、前記化学式（Ｉ−０）のリンカー残基は、カルボン酸アミド残基であるということもできるが、カルボン酸残基であるということもできる。例えば、後述の実施例における「ＴＰＡ」構造は、テレフタル酸アミド残基であるということもできるが、前記化学式（Ｉα３）で表されるテレフタル酸の残基であるということもできる。
【００５２】
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表されることがより好ましい。
【００５３】
【化４】
2017012028.tif 000007
2017012028.tif 000008
【００５４】
前記化学式（Ｉβ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
【００５５】
【化５】
2017012028.tif 000009
【００５６】
本発明の天然型ｍｉＲＮＡにおいて、前記リンカー残基が、アミノ酸残基である場合、前記アミノ酸残基は、例えば、下記化学式（Ｉ）で表わされる。なお、下記化学式（Ｉ）の構造は、前記化学式（Ｉ−０）で表される構造の一例である。
【００５７】
【化６】
2017012028.tif 000010
【００５８】
前記式（Ｉ）中、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１およびＬ２は、前記と同様である。
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
【００５９】
【化７】
2017012028.tif 000011
【００６０】
前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、芳香族性原子団、ヘテロ芳香族性原子団、およびヘテロ脂環式原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。前記ヘテロ芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、縮環系ヘテロアリール、縮環系ヘテロアリールアルキル、縮環系アルキルヘテロアリール等が挙げられる。また、前記化学式（Ｉ）、（Ｉα）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
【００６１】
本発明において、「アミノ酸」は、前述のとおり、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に−ＮＨ２基を含まず、イミノ基（−ＮＨ−）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、後述するとおり、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。例えば、後述する化学式（Ｉａ２）または（Ｉａ３）で表される化合物も、分子中にアミノ基およびカルボキシ基を含むため、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。したがって、例えば、前記化学式（Ｉ）において、原子団Ａが、後述の化学式（Ａ２）または化学式（Ａ２ａ）で表される構造は、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、例えば、後述の実施例における「ＴＰＡ」構造も、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、本発明において、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
【００６２】
本発明の天然型ｍｉＲＮＡの前記アミノ酸残基において、前記アミノ酸は、例えば、前述のとおり、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
【００６３】
【化８】
2017012028.tif 000012
【００６４】
前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
【００６５】
【化９】
2017012028.tif 000013
【００６６】
なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
【００６７】
【化１０】
2017012028.tif 000014
2017012028.tif 000015
【００６８】
前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）が例示でき、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
【００６９】
【化１１】
2017012028.tif 000016
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2017012028.tif 000022
【００７０】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【００７１】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、がん（乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん）があげられる。
【００７２】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
【００７３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【００７４】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。
【００７５】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【００７６】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【００７７】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
【００７８】
（２）組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【００７９】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【００８０】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【００８１】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【００８２】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を選択すればよい。
【００８３】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
【００８４】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【００８５】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００８６】
本発明の組成物は、例えば、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【００８７】
本発明の組成物において、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを効率よくデリバリーすることができる。
【００８８】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【００８９】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
【００９０】
（３）発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００９１】
本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、成熟ｍｉＲＮＡによる発現抑制があげられる。
【００９２】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【００９３】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを単独で投与してもよいし、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【００９４】
（４）治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００９５】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
【００９６】
（５）人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用である。
【００９７】
本発明の一本鎖核酸は、疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、前記一本鎖核酸は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡであり、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。
【００９８】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖に基づいて、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを合成し、Ｈ１２９９細胞の増殖の抑制を確認した。
【０１００】
（１）人工マッチ型ｍｉＲＮＡの合成
実施例の人工マッチ型ｍｉＲＮＡとして、前記ガイド鎖（配列番号１）と付加配列とからなるＸ領域と、前記Ｘ領域に完全に相補的な配列とオーバーハングとからなるＹ領域とが、下記式のテレフタル酸誘導体の非ヌクレオチド構造（配列において［ＴＰ］で表す）を介して連結しているマッチ型ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３）を合成した。下記配列において、下線部が、前記ガイド鎖に対応する。前記マッチ型ｍｉＲＮＡにおける前記非ヌクレオチド構造は、下記式で表され、前記マッチ型ｍｉＲＮＡの合成において、テレフタル酸アミダイト（ＷＯ２０１３／１３３３９３参照）を使用することにより導入した。また、人工マッチ型ｍｉＲＮＡに対するネガティブコントロールとして、前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたガイド鎖とそれに対応するパッセンジャー鎖とからなるマッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル（配列番号４）を合成した。
【０１０１】
【化１２】
2017012028.tif 000023
【０１０２】
これらのｍｉＲＮＡの配列及び構造を、以下に示す。下記において、下線部で示す配列が、ガイド鎖に相当する。
成熟ｍｉＲ−３４ａ
ガイド鎖（配列番号１）
５’−UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU−３’
成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブル
ガイド鎖（配列番号２）
５’−UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG−３’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３）
５’−UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU−３’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル（配列番号４）
５’−UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGUCC-[TP]-GGACAACCGACCCGAUAACGAUACAUA−３’
【０１０３】
【化１３】
2017012028.tif 000024
【０１０４】
（２）肺がん由来細胞に対する人工マッチ型ｍｉＲＮＡの影響
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）に導入し、前記細胞への影響を確認した。
【０１０５】
（２−１）トランスフェクション
前記ｍｉＲＮＡを、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）で溶解し、１０μｍｏｌ／ＬのｍｉＲＮＡ溶液を調製した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０１０６】
まず、細胞を前記培地中に懸濁し、２４穴プレートに４００  μＬずつ、１  ｘ  １０４  細胞  ／  ウェルとなるように分注した。前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ｍｉＲＮＡをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。トランスフェクションは、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定した。下記組成において、（Ａ）  は前記トランスフェクション試薬であり、（Ｂ）  はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、（Ｃ）  は前記ＲＮＡ溶液であり、三者を合わせて１００  μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ｍｉＲＮＡの最終濃度は  １０  ｎｍｏｌ／Ｌとした。トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を３日間培養した。そして前記３日間の培養後、培養細胞について以下に示す確認を行った。
【０１０７】
【表１】
2017012028.tif 000025
【０１０８】
（２−２）細胞数のカウント
培養後の培養細胞について、ウェルあたりの細胞数をカウントした。この結果を図２に示す。図２は、ウェルあたりの細胞数を示すグラフである。図２において、「Ｍｏｃｋ」はトランスフェクション試薬のみを添加した細胞、「Ｓｃｒａｍｂｌｅ」はネガティブコントロールのｍｉＲ−３４ａスクランブル、「ｍｉＲ−３４ａ」は実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａの結果を示す。図２に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最も細胞数を減少させた。
【０１０９】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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