(57)【要約】      （修正有）【課題】カニューレ挿入を必要とすることなく、生物学的組織から生存細胞を単離するための装置及び方法の提供。【解決手段】第１の部分１および第２の部分９を有する筐体と、複数の中空穿通構造体８の保持部７であって、中空穿通構造体８は、保持部７を介して流体連通する少なくとも１つのオリフィスを備えており、保持部７と、生物学的組織６の支持部５と、を備える、生物学的組織用の灌流装置であって、生物学的組織６の支持部５は、前記筐体内で保持部７に対して、第１の部分１と第２の部分９とが連結されて筐体が形成されることによって中空穿通構造体８が保持部７に近接するような間隔をあけて配置されている、灌流装置、及び、生物学的組織６を解離して目的の細胞を得るための方法における、前記灌流装置の使用。【選択図】図１
2017099382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の部分（１）および第２の部分（９）の２つの部分を有する筐体と、
複数の中空穿通構造体（８）の保持部（７）であって、前記中空穿通構造体（８）は、前記保持部（７）を介して流体連通する少なくとも１つのオリフィスを備えている、保持部（７）と、
生物学的組織（６）の支持部（５）と、
を備える、生物学的組織用の灌流装置であって、
前記第１の部分（１）と前記第２の部分（９）とが連結されて前記筐体が形成されることによって前記中空穿通構造体（８）が前記保持部（７）に近接するように、前記生物学的組織（６）の支持部（５）が前記筐体内で前記保持部（７）に対して間隔をあけて配置されていることを特徴とする、灌流装置。
【請求項２】
前記第１の部分（１）と前記第２の部分（９）とが連結されて筐体が形成されることによって、中空穿通構造体（８）が前記生物学的組織（６）に少なくとも部分的に穿通することを特徴とする、請求項１に記載の灌流装置。
【請求項３】
前記筐体の前記第１の部分（１）および前記第２の部分（９）がそれぞれ、これら２つの部分を連結させるための対応する閉鎖機構（１１、１２）を備えていることを特徴とする、請求項１または２に記載の灌流装置。
【請求項４】
前記中空穿通構造体（８）が、前記保持部（７）から１〜１００ｍｍ延在していることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項５】
前記中空穿通構造体（８）が、針状、円錐状または角錐状の形状を有する細長い物体であることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項６】
前記支持部（５）が、フィルター、メッシュ、ラック、グリッド、またはオリフィス付きプレートであることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項７】
前記保持部（７）の挿入および筐体からの取り外しが可能であることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項８】
前記筐体の前記第１の部分（１）および前記第２の部分（９）が、流体用の格納キャビティ（１４）を備えていることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項９】
前記筐体の前記第１の部分（１）および／または前記第２の部分（９）が、流体の入力および／または出力用の少なくとも１つのオリフィス（１０、１３）を備えていることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の灌流装置。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項に記載の装置を用いて生物学的組織を解離する方法において、前記第１の部分（１）と前記第２の部分（９）とを連結させて前記筐体を形成させることによって前記中空穿通構造体（８）の少なくとも１つを前記生物学的組織に少なくとも部分的に穿通させ、かつ、前記生物学的組織を解離して目的の細胞にするための少なくとも１つの薬剤を、前記中空穿通構造体（８）を通じて前記生物学的組織（６）中に施与することを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記生物学的組織（６）をまず緩衝液で洗浄することにより、前記生物学的組織（６）から目的でない細胞を取り除くことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的組織（６）を解離するための薬剤および／または緩衝液を、前記生物学的組織（６）中に繰り返し施与することを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的組織（６）を解離するための薬剤が、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、サーモリシン、ヒアルロニダーゼ、クロストリパイン、およびクロストリジウム・ヒストリチカム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼ、プロナーゼ、ＤＮアーゼＩ、ペプシン、プロテイナーゼＫ、リゾチーム、二価イオンのためのキレート剤、ならびにこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
目的の細胞が組織常在性細胞であることを特徴とする、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的組織が、脾臓、心臓、肝臓、脳、および他の神経組織、腎臓、肺、膵臓、胸部、臍帯、皮膚、胎盤、卵巣、卵管、子宮、前立腺、扁桃腺、胸腺、胃、精巣、気管、軟骨、腱、骨、骨格筋、平滑筋、消化管、結腸、腸、膀胱、尿道、目、胆嚢、細胞培養に由来する小器官、および腫瘍に由来する小器官からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空針アレイを通じて生物学的組織に適切な剥離剤を送達することによって該生物学的組織から目的の生存細胞を単離するための方法に関する。前記方法により、前記目的の細胞が組織の下部構造から剥離される。
【０００２】
相互に強度に結合することで例えば上皮細胞のような生物学的組織を形成している細胞を、該組織から単離して単一の生存細胞にすることは、困難である。生物学的組織の下部構造を機械的に破壊し、得られた砕片から単一の細胞を単離することは可能ではあるものの、こうして得られる無傷の生存細胞の収量はかなり低い。
【０００３】
より緩やかな灌流法で器官から細胞を単離することが知られているが、これには適切な血管を通じた該器官への一連の緩衝液の煩雑な灌流が必要である。こうした方法は、心筋細胞または肝細胞等の単離に関して知られている。
【０００４】
インタクトな肝細胞を単離するための手法が初めて採用されたのは、Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｓｃｈ  （１９６７）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３５，  ６７５−６８４においてであり、これに、Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｎｄ  （１９６９）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４３，  ５０６−５２０、Ｓｅｇｌｅｎ  （１９７６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３，  ２９−３４、およびＫｌａｕｎｉｇ  （１９８１）  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １７，  ９１３−９２５において改良が加えられた。成果として得られたのは２段階灌流プロトコルであり、このプロトコルは数十年後でもなお、多量の生存肝細胞をもたらす現在の標準的な手法の代表的なものとなっている。通常は、緩い結紮糸を肝臓近傍の適切な血管（ラット：門静脈、マウス：大静脈）の周囲に配置し、この血管にカニューレを挿入し、そして糸端部を引き締めることによりこの結紮糸を固定する。第一に、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含む低カルシウム緩衝液を約１０〜１５ｍｌ／分の流量で１０〜１５分間にわたって血管を通じて器官に送達することによって、カルシウム依存性の細胞間結合を弱め、そして血液細胞を除去する。第二に、目的の細胞を損傷することなく結合組織を破壊して細胞をさらに遊離させるために、コラゲナーゼを（１ｍｌ当たり約０．１  Ｗｕｅｎｓｃｈ  Ｕｎｉｔｓで）含む緩衝液を、約１０〜１５ｍｌ／分の流量で（ラット：１０〜１５分間；マウス：５〜１０分間）器官に通す。ここで、肝臓を動物から取り出して、ペトリ皿上の適切な培地内に置くことができる。肝被膜を引き裂くことによって遊離された肝細胞を剥離し、これをさらに、１００μｍのナイロンメッシュフィルターを通じたろ過と、（場合により繰り返し行う）低スピン遠心分離ステップ（５０ｇを４℃で５分間）による肝細胞の濃縮とによって、精製する。
【０００５】
より大きな脊椎動物の肝臓からの肝細胞の単離には、および／または、成人の心筋細胞の単離には、類似の、但しエクスビボでの方法が用いられている。こうした用途においては、血管へのカニューレ挿入の前に目的の器官を切除する。
【０００６】
ヒト肝細胞の作製に関しては、Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｔｈｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｒｅｖｉｅｗ，  （２０００），  １１−１５におけるＧｏｍｅｚ−ＬｅｃｈｏｎおよびＣａｓｔｅｌｌによる評論”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”を参照されたい。組織をできるだけ速やかに氷に載置し、大脈管を検査する。切断面の最も大きな血管にカニューレを挿入し、該カニューレを組織接着剤で固定する。第１のステップでは、肝臓組織に、ＥＧＴＡ（またはＥＤＴＡ）を含む低カルシウム緩衝液を約１０ｍｌ／カテーテルで十分に灌流する。第２のステップでは、組織が不可逆的な変形を示すまで、同一の流量で、約０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ含有酵素混合物を灌流する。コスト削減のため、大抵は酵素緩衝液を再循環させる。消化後、肝臓組織をスパチュラを用いて穏やかに分散させる。げっ歯類の手法と同様に、細胞懸濁液をろ過し、かつ、低スピン遠心分離を（場合により繰り返し）行うことによって肝細胞を濃縮する。
【０００７】
心筋細胞は、いわゆるランゲンドルフ灌流系によって作製される。身体から心臓を速やかに切除し、そして顕微鏡下にカニューレを大動脈内に慎重に挿入して結紮糸で固定する。その後、心臓にカルシウム不含の緩衝液を灌流して収縮を停止させ、次いでコラゲナーゼベースの酵素溶液を灌流して心臓の細胞外マトリックスを消化する。消化後、鉗子を用いて心臓を機械的に分離し、そして心筋細胞を分散させて単一の細胞の懸濁液とする。
【０００８】
同様の手法で、カニューレを気管内に挿入して固定し、そして適切な緩衝液および酵素を施与することによって、肺胞上皮細胞を単離する。
【０００９】
米国特許第２０１１０２９５１４９号明細書には、組織片の研磨抽出により組織を可溶化させるための装置が開示されている。該装置を真空により組織に固定し、研磨成分を用いて該組織から細胞を切断し、さらに該細胞を適切な酵素により液状化させる。
【００１０】
要するに、生物学的組織からの細胞に関する知られている単離法は、煩雑で時間がかかり、そして常に熟練者によって行われている。
【００１１】
他の技術分野においては、複数のカニューレを通じて例えば皮膚のような組織に薬理学的活性化合物を注入することが知られている。例えば米国特許第６６８９１０３号明細書、米国特許第８３４９５５４号明細書、米国特許第８３６６６７７号明細書、米国特許第８７０８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２１３３３５号明細書、国際公開第２０１４／０４７２８７号または欧州特許第２７４９３０６号明細書に開示されているように、カニューレを組み合わせることにより、共通の注入管腔を有するアレイとすることができる。これらの刊行物には、組織を分離することによって単一の細胞を作製することについての記載はない。
【００１２】
概要
したがって本発明の一目的は、例えば血管のような別個の管腔または腔部への時間がかかりかつ不便であるカニューレ挿入を必要とすることなく、生物学的組織から生存細胞を単離するための装置および方法を提供することであった。
【００１３】
驚くべきことに、生物学的組織から目的の細胞を剥離する薬剤を、複数の注入部位を含む装置によって該生物学的組織へ送達することができ、それにより、該目的の細胞が、該目的の細胞の良好な収量および生存率でもって単一の細胞の懸濁液として剥離される。
【００１４】
したがって本発明の目的は、以下：
２つの部分、すなわち第１の部分（１）および第２の部分（９）を有する筐体；
複数の中空穿通構造体（８）の保持部（７）、ここで、前記中空穿通構造体（８）は、前記保持部（７）を介して流体連通する少なくとも１つのオリフィスを備えている；
生物学的組織（６）の支持部（５）
を含む生物学的組織用の灌流装置であって、
前記生物学的組織（６）の支持部（５）は、前記筐体内で前記保持部（７）に対して、前記第１の部分（１）と前記第２の部分（９）とが連結されて前記筐体が形成されることによって前記中空穿通構造体（８）が前記保持部（７）に近接するような間隔をあけて配置されている、灌流装置である。
【００１５】
支持部（５）に載置した生物学的組織（６）に向かって先細状になっている中空穿通構造体（８）を有する保持部を手で押圧することによって、該中空穿通構造体（８）が該生物学的組織（６）に少なくとも部分的に穿通することができる。この穿通プロセスのトリガは手動によることもできるが、好ましくは筐体の閉鎖がトリガとなる。筐体の第１の部分および第２の部分は次のように適合または配置されており、すなわち、該第１の部分（１）と該第２の部分（９）とが連結されて該筐体が形成されることによって中空穿通構造体（８）が生物学的組織（６）に少なくとも部分的に穿通しうるように、適合または配置されている。
【００１６】
本発明の他の目的は、開示される装置を用いて生物学的組織を解離するための方法であって、第１の部分（１）と第２の部分（９）とを連結させて筐体を形成させることによって中空穿通構造体（８）の少なくとも１つを前記生物学的組織に少なくとも部分的に穿通させ、かつ前記生物学的組織を解離して目的の細胞にするための少なくとも１つの薬剤を前記中空穿通構造体（８）を通じて前記生物学的組織（６）中に施与する前記方法である。
【００１７】
目的の細胞への生物学的組織の「解離」という用語は、目的の細胞を殺すことも破壊することも溶解することもなく、細胞構造、細胞凝集体または細胞マトリックスを少なくとも部分的に破壊するあらゆるプロセスを指す。最善の状態では、目的の細胞は単一の単離された生存細胞として得られる。例えば、生物学的組織として肝臓を使用する場合には、本発明の装置を用いて肝臓中に適切な酵素を施与する。肝臓組織を解離することにより、肝臓から離れない単一の肝細胞が得られる。目的の細胞を収穫するために、肝臓の上皮細胞シート（肝被膜）を機械的に開き、そしてこれらの肝細胞から残りの組織を洗い落とすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、第１の部分（１）および第２の部分（９）を有する筐体であって、前記第１の部分（１）および前記第２の部分（９）はそれぞれ閉鎖機構（１１、１２）を有する筐体と、前記筐体に収まるサイズまたは外径を有するフィルターケージ（４）および支持部（５）と、複数の中空穿通構造体（８）の保持部（７）であって、前記筐体に収まるサイズまたは外径を有するものである保持部（７）と、前記保持部（７）を介して流体連通する中空穿通構造体（８）と、入力／出力ポート（１０、１３）と、を有する本発明の装置の変形例を示す。
【図２】図２は、本発明の装置の変形例を示す。
【図３】図３は、本発明の装置の変形例を示す。
【図４】図４は、流体用の格納キャビティ（１４）および統合ポンプ（１５）を示す。
【図５】図５は、流体用の格納キャビティ（１４）および統合ポンプ（１５）を示す。
【図６】図６は、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）遠心分離によるさらなる肝細胞の濃縮を行って従来技術による灌流技術によって単離されたマウス肝細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図７】図７は、パーコール遠心分離によるさらなる肝細胞の濃縮を行わずに灌流ステップなしで機械的／酵素的プロトコルによって単離されたマウス肝細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】図８は、パーコール遠心分離によるさらなる肝細胞の濃縮を行って本発明により調製したマウス肝細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図９】図９は、パーコール遠心分離によるさらなる肝細胞の濃縮を行って本発明により調製したラット肝細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１０】図１０は、流体用の格納キャビティ（１４）および統合ポンプ（１５）を示す。
【図１１】図１１は、得られた単一の細胞を、マックスクワントフローサイトメーターで分析した図である。
【図１２】図１２は、顕微鏡分析によって、主に典型的な棒状の心筋細胞が示された図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明の方法および装置により得られる細胞は、当業者に知られている方法を用いた培養、分析および／または患者への移植が可能である。
【００２０】
本発明の装置
本発明の装置を、例示的に複数の実施形態において図１〜図５において示す。
【００２１】
好ましい一実施形態においては、筐体の第１の部分（１）および第２の部分（９）はそれぞれ、これら２つの部分を連結させるための対応する閉鎖機構（１１、１２）を備えている。
【００２２】
他の実施形態においては、筐体の第１の部分（１）および第２の部分（９）は、流体の入力および／または出力用の少なくとも１つのオリフィス（１０、１３）を備えている。本実施形態においては、中空穿通構造体（８）は、保持部（７）を介してこれらのオリフィス（１０、１３）の少なくとも１つと流体連通する少なくとも１つのオリフィスを備えている。
【００２３】
該装置の筐体は、好ましくは該筐体の第１の部分および第２の部分の対応する閉鎖機構により水密での開閉が可能である。筐体の第１の部分（１）および第２の部分（９）の対応する閉鎖機構（１１、１２）は、ねじ、バヨネットマウント、円錐形の閉鎖部、ねじり閉鎖部、磁石またはボルト頭部であってもよく、これらそれぞれによって、該筐体の第１の部分と第２の部分とを連動または連結させることができる。さらに、筐体の第１の部分および第２の部分のうちの一方は、フリップカバーとして構成されていてもよいし、該筐体のそれぞれもう一方の部分に適切な閉鎖機構を備えたヒンジ付きキャップとして構成されていてもよい。
【００２４】
筐体の第１および第２の部分と、閉鎖機構（１１、１２）と、保持部（７）とは、組み合わされて１つまたは２つの単独の部品となっていてもよいし、別々に設けられていてもよい。筐体の第１および第２の部分と、閉鎖機構（１１、１２）の一方または双方とが別々の器具である場合には、該器具に、該装置を閉鎖した際の機械的な結合を可能にするための手段、例えばアパーチャーを設ける必要がある。
【００２５】
生物学的組織を流体透過性の支持部（５）に載置し、その後、該生物学的組織を該支持部と穿通針（すなわち、保持部）との間で押圧することによって、中空穿通構造体（８）が該生物学的組織に少なくとも部分的に穿通する。
【００２６】
支持部（５）は、穿通構造体が組織を押圧する際に、保持部（７）の相手方部品としての役割を果たす。この目的のために、組織を支持部に載置して該組織を穿通構造体に押し付けることもできるし、組織を穿通構造体に載置して該組織を支持部に押し付けることもできる。
【００２７】
支持部（５）は、筐体（すなわち、第１の部分または第２の部分）の一体化部分であってもよいし、挿入および該筐体からの取り外しが可能であってもよい。後者の場合、支持部は筐体より小さな直径を有する必要がある。針が組織に穿通する際に、支持部（５）は、保持部（７）に機械的な相手方部品を提供する機能を有する。その場合、支持部（５）の設計は重要ではなく、（組織が流体に浸漬するのを防ぐために）フィルター、メッシュ、ラック、グリッドの形態で提供されることができ、またさらにはオリフィス付きプレートの形態で提供されてもよい。
【００２８】
保持部（７）は挿入および筐体からの取り外しが可能であり、すなわち本体筐体に収まるサイズまたは外径を有するべきである。好ましくは、保持部（７）は、水密で筐体に収まるサイズまたは外径を有し、かつ／または、流体（剥離剤）が該保持部／中空穿通構造体（８）を迂回するのを避けるのに適した封止部を備えている。
【００２９】
「中空穿通構造体」という用語は、尖った端部を備えた針状、円錐状または角錐状の形状を有するあらゆる細長い物体を指す。以下で、「中空穿通構造体」という用語と「針」という用語とは同義語として用いられる。
【００３０】
中空穿通構造体および保持部は、別々に製造されていてもよいし１つの部品として製造されていてもよい。
【００３１】
好ましくは、中空針（８）は、該針の開口部が生物学的組織の内部に位置していない場合に、すなわち該針が該組織に穿通しなかったかまたは該組織を貫通した場合に、該針を通る薬剤の流れを停止させるための手段を備えている。
【００３２】
中空穿通構造体（８）は、０．０５〜５ｍｍの、好ましくは０．２〜１ｍｍの、最も好ましくは０．３〜０．７ｍｍの、底部での外径を有することができ、かつ無関係に、０．０２〜４ｍｍの、好ましくは０．１〜１ｍｍの、最も好ましくは０．１〜０．６ｍｍの、底部での内径を有することができ、かつ無関係に、１〜１００ｍｍの、好ましくは２〜２０ｍｍの、最も好ましくは４〜５ｍｍの長さを有することができる。
【００３３】
中空穿通構造体（８）の数は生物学的組織のサイズに依存し、２〜５００の間で、好ましくは５〜１００の間で、最も好ましくは２０〜７０の間で、可変である。中空穿通構造体（８）は、保持部上にいかなる幾何学的配置または配列で配置されていてもよく、同一の長さを有することもできるし異なる長さを有することもできる。保持部は、本体筐体内に機械的に固定されていなくてもよい。このことによって、生物学的組織のサイズおよび厚さに応じて、様々な数の中空穿通構造体（８）および／または様々な長さの中空穿通構造体（８）および／または保持部上の様々な幾何学的配置または配列の中空針を有する、様々な保持部の使用が可能となる。
【００３４】
生物学的組織のサイズ、厚さおよび外側の形状に応じて、中空穿通構造体（８）の数、長さ、外／内径および面積を、最大の穿通効果が達成されるように選択することができる。
【００３５】
本発明の装置、すなわち、第１の部分および第２の部分を含む筐体と、保持部（７）と、中空穿通構造体（８）とは、同一の材料から製造されていてもよいし異なる材料から製造されていてもよく、例えばステンレス鋼、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリオレフィン、例えばポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ乳酸またはポリアミドから製造されていてよい。
【００３６】
本発明の装置は、当業者に知られているいかなる方法によって製造されていてもよい。好ましい方法は、射出成形、および、例えば押出堆積法、熱溶解積層法、ステレオリソグラフィまたは感光性ポリマーデジタル・ライト・プロセッシングによる３Ｄプリンティングである。
【００３７】
本発明による灌流装置は、生物学的組織と機械的に接触する部分のみ、すなわち複数の中空針の保持部および支持部のみが単回使用の使い捨てであるのに対して、本体筐体およびキャップは適切な洗浄後に複数回使用可能である、という利点を有する。本発明の変形においては、本装置は使い捨てとして提供される。
【００３８】
本発明による灌流装置は手動で使用することができ、すなわちシリンジおよび適切な容器を用いて使用することができるが、１つまたは複数のポンプおよびチューブセットを含む自動化された環境での使用も可能である。
【００３９】
他の実施形態においては、本装置は、図１０に示すように歯車ポンプのような少なくとも１つのポンプを備えている。該ポンプは筐体の入力／出力オリフィスに直接接続されていてもよいし、ろ過システムかまたは細胞の剥離プロセスを監視するための検出装置を備えていてもよい。該ポンプは、筐体の第１の部分かまたは第２の部分かのいずれかにおいて該筐体に組み込まれていてもよいし、外部に設けられ、かつ適切なチューブセットを用いて該装置に接続されていてもよい。生物学の観点では、該ポンプの位置は重要ではない。該ポンプは、内部モーターにより駆動されてもよいし外部モーターにより駆動されてもよい。ポンプが筐体の第１の部分かまたは第２の部分に組み込まれている場合には、該ポンプおよび該筐体は、好ましくは、保持部（７）に関して開示されているように３Ｄプリンティングマニュファクチュアリング法により造形されている。
【００４０】
本発明の方法
本発明の方法は、複数の中空穿通構造体（８）を生物学的組織に少なくとも部分的に穿通させることを特徴とする。本明細書において使用する場合に、「穿通」という用語は、剥離剤を生物学的組織の中に施与するために針が該生物学的組織内に位置していることを意味する。穿孔または穿刺により針が生物学的組織を通り抜けることは望ましくない。なぜならその場合には、剥離剤が該生物学的組織に入らないか、または、剥離剤が該生物学的組織に、目的の細胞を剥離させるほど十分には入らないためである。本発明の方法においては、大部分の針が生物学的組織の内部に位置するように、そして穿孔または穿刺により生物学的組織を通り抜けることのないように配慮すべきである。最善の状態では、すべての針が、生物学的組織の中に、該生物学的組織の厚さの３０〜７０％に、好ましくは該生物学的組織の厚さの約５０％に位置している。
【００４１】
本発明の方法においては、生物学的組織が流体透過性の支持部（５）と針との間で押圧されることによって、該針が該生物学的組織に少なくとも部分的に穿通する。支持部（５）は、例えばフィルターケージ（４）のフィルター領域であることができ、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨにより市販されている「スマート・ストレーナー（Ｓｍａｒｔ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ）」フィルターケージのフィルター領域であることができる。
【００４２】
本発明による方法の一実施形態においては、生物学的組織を支持部に、例えばすでに開示された装置のフィルターケージのメッシュに載置して本体筐体をキャップで閉鎖し、そして、該キャップの少なくとも１つのオリフィスを通じて、該生物学的組織を解離するための少なくとも１つの薬剤を施与し、そして、該本体筐体のもう一方の端部、好ましくは該本体筐体の下方端部で該少なくとも１つのオリフィスからの通過分を回収することによって、複数の中空針を該生物学的組織に穿通させる。
【００４３】
本発明の一変形においては、少なくとも１つの薬剤を、剥離剤の余剰体積が生物学的組織から漏出するような量で該生物学的組織中に施与し、かつ該薬剤の余剰体積を該生物学的組織中に再度施与する。「余剰体積」という用語は、生物学的組織の体積に比べてはるかに大きな体積の薬剤を施与し、そして該生物学的組織に取り込まれない薬剤の体積が漏出することを意味する。本実施形態は、最初の新鮮な流れにおいて薬剤を施与し、これを一定の漏出流としてかまたはバッチ式のいずれかで生物学的組織中に再循環させることを含みうる。
【００４４】
漏出流は、目的の細胞をすでに含んでいてもよい。本変形においては、１サイクルまたは複数サイクルの後に漏出流を細胞懸濁液として回収することができる。
【００４５】
本発明の方法は、多種多様な生物学的組織への適用が可能である。しかし、生物学的組織の調製および巨視的な特性に依っては、薬剤の施与によって該生物学的組織の細胞の下部構造から目的の細胞が崩壊されはするものの、該目的の細胞を該生物学的組織から剥離／抽出することは不可能であり、かつ／または、該目的の細胞が該生物学的組織から離れない場合がある。こうしたことは、生物学的組織の外部構造がなおもインタクトである場合か、あるいは、生物学的組織が被膜、例えば上皮細胞シートを備えている場合に起こりうる。こうした生物学的組織から目的の細胞を抽出するには、被膜を機械的に開くことが必要である。
【００４６】
本発明の他の実施形態においては、生物学的組織中に少なくとも１つの剥離剤を施与した後に、該生物学的組織を機械的に開いて該生物学的組織から目的の細胞を抽出する。本実施形態の変形においては、切断、穿孔により生物学的組織を機械的に開くか、または適切な器具により該生物学的組織を手で断裂させる。好ましい変形においては、本発明の装置は、生物学的組織を機械的に開くための手段を備えており、例えば本体筐体、フィルターケージまたは中空針の支持部に内蔵された切断器具を備えている。他の変形においては、例えば組織に対して保持部を回転させることによって、中空穿通構造体を切断器具として用いる。
【００４７】
本方法は、生物学的組織を解離するための少なくとも１つの薬剤を投与する前に、望ましくない「目的でない細胞」、例えば血液細胞を取り除くための追加のステップを含むことができる。このステップでは、生物学的組織中に少なくとも１つの洗浄流体を施与することによって、該生物学的組織から目的でない細胞を抽出する。本発明による方法のこの変形においては、生物学的組織（６）をまず緩衝液で洗浄することにより該生物学的組織（６）から目的でない細胞を剥離させ、そして該目的でない細胞を含む流体を格納キャビティ（１４）内に格納する。
【００４８】
さらに他の変形においては、生物学的組織（６）を解離するための薬剤および／または緩衝液を、例えばポンプにより該生物学的組織（６）中に繰り返し施与する。この変形においては、流体を生物学的組織（６）上／中に数回再循環させることで収量を増加させる。
【００４９】
目的の細胞
本発明の方法は、あらゆる種類の目的の細胞の作製への適用が可能であり、ここで、該目的の細胞は、組織常在性細胞、特に脊椎動物または無脊椎動物の組織に由来する細胞、好ましくは上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、肝細胞、肝星細胞、心筋細胞、有足細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、神経性細胞、例えばニューロン、アストロサイト、ミクログリアおよびオリゴデンドロサイト、白血球、例えば樹状細胞、好中球、マクロファージおよびリンパ球、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびタイプ１〜３の自然リンパ球細胞、組織幹細胞、例えばＭＳＣ、ならびに上述の細胞の始原細胞である。
【００５０】
生物学的組織
本発明の方法は、あらゆる種類の生物学的組織への適用が可能であり、例えば脊椎動物または無脊椎動物の器官への適用が可能であり、好ましくは、脾臓、心臓、肝臓、脳、および他の神経組織、腎臓、肺、膵臓、胸部、臍帯、皮膚、胎盤、卵巣、卵管、子宮、前立腺、扁桃腺、胸腺、胃、精巣、気管、軟骨、腱、骨、骨格筋、平滑筋、消化管、結腸、腸、膀胱、尿道、目、胆嚢、細胞培養に由来する小器官、および腫瘍に由来する小器官への適用が可能である。
【００５１】
解離剤
本明細書において使用する場合の「解離剤」という用語は、目的の細胞自体に影響を与えずに組織内の該目的の細胞の足場を破壊するために使用される物質を含む、流体、例えば緩衝液を意味する。この足場は、該細胞と細胞外マトリックスとの相互作用か、または該細胞と隣接する細胞との相互作用に由来する。こうした相互作用、例えば密着結合、ギャップ結合、接着斑および半接着斑は、例えばカドヘリン、コネキシン、クローディンおよびインテグリンといったタンパク質によって主にカルシウム依存的に構築される。したがって、組織の完全性を破壊する剥離剤は、細胞外マトリックスまたは細胞外タンパク質−タンパク質の相互作用を低下させるカルシウム不含および／または低カルシウムの薬剤および／または酵素を含むことができる。剥離剤の成分の施与は、逐次的に行われてもよいし同時に行われてもよい。
【００５２】
例えば、生物学的組織（６）を解離するための薬剤は、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、サーモリシン、ヒアルロニダーゼ、クロストリパイン、およびクロストリジウム・ヒストリチカム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の中性プロテアーゼ、プロナーゼ、ＤＮアーゼＩ、ペプシン、プロテイナーゼＫ、リゾチーム、二価イオンのためのキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩）、ならびにこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５３】
カルシウム不含または低カルシウムの緩衝液を施与し、次いで細胞外マトリックスまたは細胞外タンパク質−タンパク質の相互作用を低下させる酵素含有緩衝液を施与する、という別々の施与が好ましい。低カルシウム薬剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはクエン酸塩を含む緩衝液であってもよい。
【００５４】
本発明による方法の他の実施形態においては、第１のステップにおいて、カルシウム不含の緩衝液または低カルシウムの緩衝液を使用し、かつ第２のステップにおいて、カルシウムイオン含有緩衝液、好ましくは少なくとも５０μＭのカルシウムイオンを含有する緩衝液およびカルシウム依存性酵素を使用する。
【００５５】
最も好ましくは、第１のステップにおいて、カルシウム不含の緩衝液または低カルシウムの緩衝液を使用し、かつ第２のステップにおいて、カルシウムイオン含有緩衝液濃縮物およびカルシウム依存性酵素を濃縮物として第１の緩衝液に添加する。
【００５６】
緩衝液として、生理学的範囲内のｐＨ値、オスモル濃度およびイオン濃度を有するあらゆる水性流体を使用することができる。好ましい緩衝液は、完全な形態かまたはその変形のいずれかであって、フェノールレッドを含むかまたは含まず、ＨＥＰＥＳを含むかまたは含まず、グルコースを含むかまたは含まず、場合によりタンパク質成分、例えばＦＣＳ（ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ））、ＦＢＳ（ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ））、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む、ＰＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）、ＥＢＳＳ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＲＰＭＩ−１６４０である。緩衝液のｐＨは、６．０〜８．０であり、好ましくは７．０〜７．５である。
【００５７】
組織に施与される第１の緩衝液は、該組織内での血液凝固を避けるために、抗凝血物質例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩またはヘパリンを含むことができる。
【００５８】
酵素
本発明の方法においては、例えばＢａｒｒｙ、ＥｄｗａｒｄｓおよびＢａｒｒｉｔｔ（１９９１）においてＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２１に開示されている多種多様な酵素を使用することができる。剥離剤の成分として、以下の酵素を使用することができる。
【００５９】
クロストリジオペプチダーゼＡとも称されるクロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼ（ＥＣ  ３．３．２４．３）は、その天然コンフォメーションでそのらせん領域においてコラーゲン分子の加水分解的開裂を引き起こしうる酵素混合物の一種である。これらの酵素はコラーゲンに極めて特異的であり、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘ＝中性アミノ酸）モチーフに対する特異性を示す。これらは活性のためにＣａ２＋を必要とし、通常はＺｎ２＋を含む。コラゲナーゼは、他の多くの細菌源（例えば、アクロモバクター・イオファグス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｏｐｈａｇｕｓ）、結核菌、緑膿菌および他の微生物）から単離されることも可能である。しかし、クロストリジウム・ヒストリチカムはコラゲナーゼの主な商業的供給源を提供する。粗製調製物は、夾雑プロテアーゼ活性、例えばクロストリパイン、中性プロテアーゼ、そしてさらに、トリプシン活性、カゼイナーゼ活性およびリパーゼ活性をも含む。これらはきつく螺旋状に巻かれてはいないコラーゲンの一部を加水分解することができる。こうした夾雑活性の相対的な量の差異が、観測されたロット間変動の要因である。
【００６０】
エンド−Ｎ−アセチルヘキソサミン結合に対する特異性を示すエンド型グリコシダーゼの一種であるヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３５）は、通常は、ウシおよびヒツジの精巣に由来する。これは、ほぼすべての結合組織の基質において認められるグリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸における、２−アセトアシド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース残基とＤ−グルクロン酸残基との間の１，４−結合を加水分解する。
【００６１】
膵臓セリンプロテアーゼの一種であるトリプシン（ＥＣ  ３．４．２１．４）は、優先的に、塩基性アミノ酸、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リジンのカルボキシル基を含む結合でペプチドを加水分解することが可能であり、また若干のエステラーゼおよびアミダーゼ活性を示す。精製されたトリプシンはネイティブなコラーゲンに対しては効力を示さないため、成人の肝臓組織の分離における単独での使用には適さない。
【００６２】
クロストリパイン（ＥＣ  ３．４．２２．８）、例えばコラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチカムに由来し、かつアルギニンのカルボキシルペプチド結合に対して高特異的である。これはカルシウムによって活性化され、商業的な粗コラゲナーゼ調製物中に認めることができる。
【００６３】
エンドグリコシダーゼの一種であるリゾチーム（ＥＣ  ３．２．１．１７）は、グリコサミノグリカンにおけるＮ−アセチルムラミン酸残基とＮ−アセチルグルコサミン残基との間のβ−１，４結合の加水分解を触媒する。
【００６４】
ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）から単離された非特異的プロテアーゼの一種であるプロナーゼ（ＥＣ  ３．３．２４．４）は、天然に存在するほぼすべてのペプチド結合を加水分解する。
【００６５】
バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）により産生されるプロテアーゼの一種であるディスパーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．２８）は、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶを分解することができ、かつより低い程度ではあるもののコラーゲンＩを分解することができ、かつロイシンまたはフェニルアラニンを伴って結合を加水分解することができる。
【００６６】
セリンプロテアーゼの一種である膵エラスターゼ（ＥＣ  ３．４．２１．３６）あるいはエラスターゼ１は、コラーゲンと共に結合組織の機械的特性を決定づける弾性線維の一種であるエラスチンを分解する。
【００６７】
酵素活性のためにＺｎ２＋を必要としかつ構造安定性のために４つのＣａ２＋を必要とする、バチルス・サーモプロテオリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）により産生される熱安定性の中性メタロプロテアーゼの一種であるサーモリシン（ＥＣ  ３．４．２４．２７）は３４．６ｋＤａの分子量を有しており、特にペプチド結合を含む疎水性アミノ酸の加水分解を触媒する。
【００６８】
システインプロテアーゼの一種であるパパイン（ＥＣ  ３．４．２２．２）は、パパイヤ由来の酵素である。
【００６９】
膵液の消化酵素成分の一種であるキモトリプシン（ＥＣ  ３．４．２１．１）は、十二指腸においてタンパク質およびポリペプチドを消化し、かつ優先的に、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）でペプチドアミド結合を切断する。不活性前駆体（キモトリプシノーゲン）として合成された後、これはトリプシン切断によって活性化される。
【００７０】
エンギオドンチウム・アルブム（Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）（旧名：トリチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ））により産生される２８．９ｋＤａの広域スペクトルのセリンプロテアーゼの一種であるプロテイナーゼＫ（ＥＣ  ３．４．２１．６４）は、毛髪ケラチンを消化することができる。これは、分子生物学において、タンパク質を消化し、それによって核酸調製物から夾雑物を除去するために一般的に使用される。
【００７１】
ペプシン（ＥＣ  ３．４．２３．１）は、そのチモーゲン（ペプシノーゲン）が胃における主細胞によって放出されるものであり、食品タンパク質をペプチドに分解する。これは、疎水性でかつ好ましくは芳香族のアミノ酸間の、例えばフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン間のペプチド結合の切断において、最も効率的である。
【００７２】
ＤＮアーゼＩ（ＥＣ  ３．４．２１．１）は、ＤＮＡを、ピリミジンヌクレオチドに隣接するホスホジエステル結合で優先的に切断するヌクレアーゼの１種であり、これにより、３’位に遊離ヒドロキシル基を有しかつ５’末端にリン酸基を有するポリヌクレオチドが生成され、概してテトラヌクレオチドが生成される。これは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびクロマチンに作用する。組織分離に関して、ＤＮアーゼＩは、遊離ＤＮＡによって引き起こされる細胞凝集の低減に有用である。
【００７３】
本発明による方法の一実施形態においては、第１の灌流サイクルにおいてカルシウム不含の緩衝液が使用され、かつ第２の灌流サイクルにおいて、著量の、好ましくは少なくとも５０μＭのカルシウムと好ましくは０．０５〜１  Ｗｕｅｎｓｃｈ  Ｕｎｉｔｓのクロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼとを含有する緩衝液が使用される。本発明による方法の他の実施形態においては、第１のサイクルにおいて低カルシウム緩衝液が使用され、かつ第２のサイクルにおいて、著量の、好ましくは少なくとも５０μＭのカルシウムと好ましくは０．０５〜１  Ｗｕｅｎｓｃｈ  Ｕｎｉｔｓのクロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼとを含有する緩衝液が使用される。
【００７４】
洗浄流体
本発明の方法において使用される洗浄流体は、生理学的範囲内のｐＨ、オスモル濃度およびイオン濃度を有する水性緩衝液を含むことができる。好ましい緩衝液は、完全な形態かまたはその変形のいずれかであって、フェノールレッドを含むかまたは含まず、グルコースを含むかまたは含まず、場合によりタンパク質成分、例えばＦＣＳ（ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ））、ＦＢＳ（ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ））、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む、ＰＢＳ、Ｄ−ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）、ＥＢＳＳ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＲＰＭＩ−１６４０である。緩衝液のｐＨは、６．０〜８．０であり、好ましくは７．２〜７．４である。
【００７５】
方法の使用
本発明の方法および装置を、適切な生物学的組織から上述の目的の細胞を単離するために使用することができる。こうして単離された目的の細胞は、研究、診断および細胞治療における様々な用途での使用が可能である。例えば、本発明の装置および方法を用いて単離された肝細胞、心筋細胞または初代細胞をアッセイにおいて使用することによって、こうした細胞自体か、またはこうした細胞と他の細胞種もしくは検体との反応のいずれかを調べることができる。肝細胞および心筋細胞は、化学物質、特に潜在的な薬物化合物の毒性スクリーニングに有用な供給源である。本発明の装置および方法はさらに、損傷臓器に移植するための生存細胞の単離への使用、または人工臓器もしくは人工的な類臓器構造体の創作への使用が可能である。
【００７６】
以下の実施例は、特定の目的の細胞および組織、特に肝臓からの肝細胞に限定されたものであるが、本装置および本方法は無脊椎動物または脊椎動物に由来するあらゆる生物学的組織の分離への使用が可能であるため、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【００７７】
実施例：
比較例１：一般的に用いられている、マウス肝臓の灌流
マウスの初代肝細胞を、ゴールドスタンダード（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；  ６３３，  １８５−１９６におけるＬｉら（２０１０）の手法）に従って単離した。加熱モジュールおよび蠕動ポンプ（流量３．２ｍｌ／分）をキャリブレーションして、チューブ出口で３７℃となるようにした。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを殺した後、この動物を四肢のテーピングにより固定した。下腹部の皮膚を通じて胸郭の側面まで切開を行い、皮膚を胸部に折り返した。腸を右に動かして、門静脈および大静脈を露出させた。この肝臓近傍の大静脈の周囲で、縫合糸をゆるく縛った。この大静脈にカニューレを挿入し、このカニューレの周囲で縫合糸を縛った。このカニューレの内部針を取り除いた後、このカニューレにチューブを接続して、灌流媒体Ｉ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  グルコースおよび０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を肝臓に灌流した。この灌流の開始直後に、門静脈を切断して血液を排出させた。数秒後、この肝臓には血液が存在していない。１５分間灌流した後に、このチューブを、気泡を導入することなく灌流緩衝液ＩＩ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２およびコラゲナーゼを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）の瓶に移し、肝臓にさらに１５分間灌流した。その後、この灌流を停止し、この肝臓全体を慎重に切除して、灌流媒体ＩＩを含むペトリ皿に移した。肝被膜を鉗子で引き裂いた。このサンプルをピペットで数回慎重に砕き、この細胞懸濁液を１００μｍのスマート・ストレーナーに移した。通過分を４℃で６４ｇで５分間遠心分離することにより、肝細胞をペレット化した。このサンプルの一部を、パーコール遠心分離ステップによりさらに精製した。この目的のために、この細胞懸濁液を同一体積の９０％パーコール／１０％ＰＢＳと混合し、６４ｇで５分間遠心分離した。このペレットをＰＢＳ中で一度洗浄した。得られた単一の細胞を、マックスクワント（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ）フローサイトメーターで分析した（図６ａおよび６ｂ）。肝細胞の収量（パーコールの前／後でそれぞれ、マウス肝臓１つ当たり１×１０８／０．８×１０８）、およびヨウ化プロピジウムの取り込みにより測定された生存率（パーコールの前／後でそれぞれ、８５／９４％）は、良好な性能を示していた。生存率を、顕微鏡分析（トリパンブルー染色）により確認した。肝細胞を培養物にうまく取り込み、そしてこの肝細胞は少なくとも２日間生存した。
【００７８】
比較例２：灌流を行わない、機械および酵素の組み合わせによる肝臓分離
ＣＤ１マウスを殺した後、肝臓を慎重に切除して、灌流媒体Ｉを含むペトリ皿に移した。洗浄したこの肝臓を、灌流媒体Ｉ  ５ｍｌを含むジェントルマックスＣチューブ（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃ  Ｔｕｂｅ）に移し、ジェントルマックスオクト（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ）でプログラムｈ＿ｔｕｍｏｒ＿０３を起動させることにより、この組織を機械的に切断してより小さな断片とした。１５分間のインキュベートステップの後、このサンプルを遠心分離し、ペレットを灌流緩衝液ＩＩ中で一度洗浄した。その後、コラゲナーゼおよびＤＮアーゼを含む灌流緩衝液ＩＩ中で、このペレットを１５分間インキュベートした。このインキュベート後、このサンプルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨより入手可能なスマート・ストレーナーフィルターケージ上に移した。通過分を４℃で６４ｇで５分間遠心分離することにより、この肝細胞をペレット化した。得られた単一の細胞を、マックスクワントフローサイトメーターで分析した（図７ａおよび７ｂ）。肝細胞の収量（マウス肝臓１つ当たり２×１０６）、およびヨウ化プロピジウムの取り込みにより測定された生存率（２％）は、極めて低かった。パーコール遠心分離ステップの後に、細胞ペレットは視認不可能であった。したがって、灌流を行わない、機械的な分離と酵素的な分離との組み合わせは、生存肝細胞の取得には有用ではない。
【００７９】
実施例３：中空針アレイを用いたマウス肝臓の灌流
プラスチック保持部内での平行の６４本の中空針（ステンレス鋼；長さ：１８ｍｍ；内径：０．１９ｍｍ；外径：０．３４ｍｍ）を有する図１に示す組織灌流器具を利用した。蠕動ポンプを７５ｍｌ／分に設定し、加熱モジュールをキャリブレーションして、チューブ出口で３７℃となるようにした。このチューブの出口をこのポンプの入口に接続した。比較例１とは対照的に、このチューブの出口に、中空針アレイを含む組織灌流器具を接続した。ＣＤ１マウスを殺した後、肝臓を解剖し、ペトリ皿上でＰＢＳで洗浄し、スマート・ストレーナーのナイロンメッシュに載置した。この組織灌流器具に灌流緩衝液Ｉ（比較例１を参照のこと）を充填し、そして単純にこの肝臓の上に配置することによって、すべての中空針出口がこの組織に挿入されるようにした。２分間にわたってこの組織から血液を除いた後、循環を導入することにより、必要な緩衝液体積を低減させた。この目的のために、第２のチューブを使用して、通過分と緩衝液を含むフラスコとを接続した。１５分後、灌流緩衝液Ｉから第２のチューブの出口を取り外すことにより、この循環を停止させた。第１のチューブの入口を、気泡を導入することなく、灌流緩衝液ＩＩを含む第２のフラスコに入れ込んだ。２分後、通過分と灌流緩衝液ＩＩを含むフラスコとを接続することにより、循環を導入した。１５分後、ポンプを停止し、この組織灌流器具を取り外した。灌流したこの組織を、５ｍｌの灌流緩衝液ＩＩを含むペトリ皿に慎重に移した。
【００８０】
肝被膜を鉗子で引き裂いて細胞を剥離した。このサンプルをピペットで数回慎重に砕き、この細胞懸濁液を１００μｍのスマート・ストレーナーに移した。通過分を４℃で６４ｇで５分間遠心分離することにより、肝細胞をペレット化した。このサンプルの一部を、パーコール勾配遠心分離によりさらに精製した。得られた単一の細胞を、マックスクワントフローサイトメーターで分析した（図８ａおよび８ｂ）。肝細胞の収量（パーコールの前／後でそれぞれ、肝臓１つ当たり８．６×１０７／６．６×１０７）、およびヨウ化プロピジウム染色により算出された生存率（パーコールの前／後でそれぞれ、７７／９２％）は、優れた結果を示していた。肝細胞を培養物にうまく取り込み、そしてこの肝細胞は少なくとも２日間生存した。他のマウス系統を用いても、同等の性能が達成された（Ｂａｌｂ／ＣおよびＣ５７／Ｂｌ６）。
【００８１】
実施例４：
中空針アレイを用いたラット肝葉の灌流
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを殺し、肝臓を解剖して単一の葉にした。これらの葉の一方を、実施例３と同一の組織灌流器具を用いて処理した。得られた単一の細胞を、マックスクワントフローサイトメーターで分析した（図９ａおよび９ｂ）。肝細胞の収量（パーコールの前／後でそれぞれ、肝葉１つ当たり７．１×１０８／３．７×１０８）、およびヨウ化プロピジウム染色により算出された生存率（パーコールの前／後でそれぞれ、９０／８７％）は、優れた結果を示していた。他のラット系統（スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ））を用いても、同等の性能が達成された。
【００８２】
総括すると、結果は、この組織灌流器具を用いた新たな手法が、微小血管を見つけて操作するための高度な訓練を受けた者にしか行うことのできない複雑で不便な従来技術の手法の優れた代替物であることを示している。
【００８３】
実施例５：中空針アレイを用いたマウス心臓の灌流
図１に示した通りであるが、但しプラスチック保持部内での平行の中空針（ステンレス鋼；長さ：１８ｍｍ；内径：０．１９ｍｍ；外径：０．３４ｍｍ）を７本に減らした組織灌流器具を利用した。蠕動ポンプを３０ｍｌ／分に設定し、加熱モジュールをキャリブレーションして、チューブ出口で３７℃となるようにした。このチューブの出口をこのポンプの入口に接続した。このチューブの出口に、中空針アレイを含む組織灌流器具を接続した。ＣＤ１マウスを殺して胸部を開き、心臓からの上行血管と下行血管とを縫合により塞いだ。これらの血管をこの縫合の隣で切断し、心臓をペトリ皿上でＰＢＳで洗浄してスマート・ストレーナーのナイロンメッシュに載置した。この組織灌流器具に灌流緩衝液ＩＩＩ（２，３−ブタンジオンモノオキシムを含むカルシウム不含のタイロード）を充填し、そして単純にこの心臓の上に配置することによって、すべての中空針出口がこの組織に挿入されるようにした。９０秒間にわたって組織から血液を除いた後、循環を導入することにより、必要な緩衝液体積を低減させた。この目的のために、第２のチューブを使用して、通過分と緩衝液を含むフラスコとを接続した。１０分後、灌流緩衝液ＩＩＩから第２のチューブの出口を取り外すことにより、この循環を停止させた。第１のチューブの入口を、気泡を導入することなく、灌流緩衝液ＩＶ（コラゲナーゼおよびトリプシンと共に２，３−ブタンジオンモノオキシムを含むタイロード）を含む第２のフラスコに入れ込んだ。２分後、通過分と灌流緩衝液ＩＶを含むフラスコとを接続することにより、循環を導入した。１５分後、ポンプを停止し、この組織灌流器具を取り外した。灌流したこの組織を、ＦＣＳを含むタイロード５ｍｌを含むペトリ皿に慎重に移した。
【００８４】
心膜を鉗子で引き裂いて細胞を剥離した。このサンプルをピペットで数回慎重に砕き、この細胞懸濁液を１００μｍのスマート・ストレーナーに移した。通過分を４℃で８８ｇで１分間遠心分離することにより、心筋細胞をペレット化した。このサンプルの一部を、パーコール勾配遠心分離によりさらに精製した。
【００８５】
得られた単一の細胞を、マックスクワントフローサイトメーターで分析した（図１１ａおよび１１ｂ）。高い散乱パラメーターを有する心筋細胞の収量（心臓１つ当たり０．９×１０６）、およびヨウ化プロピジウム染色により算出された生存率（８３％）は、良好な結果を示していた。顕微鏡分析によって、主に典型的な棒状の心筋細胞が示された（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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