(57)【要約】【課題】簡便に作製でき、安定した表現型を呈する睡眠障害モデル非ヒト動物を提供する。【解決手段】本発明の睡眠障害モデル非ヒト動物は、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする。本発明の睡眠障害評価用動物細胞は、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項２】
前記カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質が、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質、又は細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質である、請求項１に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項３】
前記細胞膜上、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質が、電位依存性カルシウムチャネル、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＴＲＰ）チャネル、ストア作動性カルシウムチャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＳＯＣ ｃｈａｎｎｅｌ、ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＣＲＡＣ  ｃｈａｎｎｅｌ）、ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉａｏｘａｚｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、カルシウムポンプ（Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ；ＰＭＣＡ）、陽イオン−カルシウム交換輸送体（Ｃａｔｉｏｎ／Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ；ＣａＣＡ）ファミリータンパク質、Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＨＣＮチャネル）、Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＣＮＧチャネル）、Ｔｗｏ−ｐｏｒｅチャネル（ＴＰＣ）、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、イノシトールトリスリン酸受容体（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＰ３Ｒ）、ＴＲＩＣチャネル及びリアノジン受容体からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項２に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項４】
前記細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質が、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、在来型プロテインキナーゼＣ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ／ｃｌａｓｓｉｃａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ｃ−ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓe；ＣａＭＫ）、ホスホリパーゼＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ；ＰＬＣ）及びＳ１００Ｂタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項２又は３に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項５】
前記ＣａＭＫをコードする遺伝子がＣａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子である、請求項４に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項６】
前記カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子がＫｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項７】
前記電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子がＣａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項８】
前記ＰＭＣＡをコードする遺伝子がＡｔｐ２ｂ３遺伝子である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項９】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子がＮｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子である、請求項３〜８のいずれか一項に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
【請求項１０】
カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１１】
前記カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質が、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質、又は細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質である、請求項１０に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１２】
前記細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質が、電位依存性カルシウムチャネル、ＴＲＰチャネル、ＳＯＣチャネル、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、ＰＭＣＡ、ＣａＣＡファミリータンパク質、ＨＣＮチャネル、ＣＮＧチャネル、ＴＰＣ、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、ＩＰ３Ｒ、ＴＲＩＣチャネル及びリアノジン受容体からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項１１に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１３】
前記細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質が、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、ｃ−ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＰＬＣ及びＳ１００Ｂタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項１１又は１２に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１４】
前記ＣａＭＫをコードする遺伝子がＣａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子である、請求項１３に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１５】
前記カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子がＫｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１６】
前記電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子がＣａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１７】
前記ＰＭＣＡをコードする遺伝子がＡｔｐ２ｂ３遺伝子である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１８】
前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子がＮｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項１９】
前記睡眠障害評価用動物細胞が神経細胞である、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
【請求項２０】
睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
被検化合物の投与下で請求項１〜９のいずれか一項に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンを測定する測定工程と、
測定された前記睡眠パターンが、前記被検化合物の非投与下で測定された前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンと比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、
を備えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
被検化合物の投与下で、野生型の動物細胞又は請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度を測定する測定工程と、
測定された前記カルシウムイオン濃度が、前記被検化合物の非投与下で測定された前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度と比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、
を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、睡眠障害モデル非ヒト動物、睡眠障害評価用動物細胞、及びそれらを用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
睡眠障害（例えば、不眠症、過眠症等）は未だ決定的な治療法が存在しない疾患である。また、睡眠障害は、その他の疾患との合併が多いことが知られている。特に、精神疾患（例えば、うつ病、痴呆症、統合失調症等）又は神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん等）との合併は広く知られている。睡眠障害に対する診断法及び治療法の開発には、睡眠覚醒のメカニズムを理解することが必要不可欠である。
【０００３】
睡眠はヒトを含む多種の生物で観察される基本的な生理現象であり、睡眠を制御する因子は主にハエを用いたフォワードジェネシスによる探索で、概日時計に関係した遺伝子を中心に複数特定されてきた。
【０００４】
特許文献１には、概日時計により発現が変動する遺伝子が開示されている。また、特許文献２には、概日時計に関連する遺伝子を変異させることにより、睡眠障害モデルマウスを作製する方法が記載されている。
【０００５】
また、非特許文献１には、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）遺伝子が体内時計に関連する遺伝子であり、ＣａＭＫＩＩ阻害剤により概日時計の時刻をリセットできることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再公表ＷＯ９９／１４３２４号公報
【特許文献２】特開２００３−７０３７６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kon, N., et al., “CaMKII is essential for the cellular clock and coupling between morning and evening behavioral rhythms,” GENES & DEVELOPMENT, 28:1101-1110, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１、２及び非特許文献１に記載されている遺伝子は、概日時計に関連する遺伝子であり、概日時計とは別の睡眠時間を直接制御している遺伝子は未解明のままであった。
また、表現型から遺伝子に遡るフォワードジェネティクスに基づいた、睡眠時間を直接制御する遺伝子の探索は、遺伝子と表現型との結びつけに多くの時間とコストを要する。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便に作製でき、安定した睡眠パターンの表現型を呈する睡眠障害モデル非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、遺伝子と表現型とを直接結びつけることができるリバースジェネティクスを利用して、カルシウムイオンの流入に伴う神経細胞の過分極が睡眠を誘導することを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする睡眠障害モデル非ヒト動物。
［２］前記カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質が、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質、又は細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質である、［１］に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［３］前記細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質が、電位依存性カルシウムチャネル、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＴＲＰ）チャネル、ストア作動性カルシウムチャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＳＯＣ ｃｈａｎｎｅｌ、ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＣＲＡＣ  ｃｈａｎｎｅｌ）、ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉａｏｘａｚｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、カルシウムポンプ（Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ；ＰＭＣＡ）、陽イオン−カルシウム交換輸送体（Ｃａｔｉｏｎ／Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ；ＣａＣＡ）ファミリータンパク質、Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＨＣＮチャネル）、Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＣＮＧチャネル）、Ｔｗｏ−ｐｏｒｅチャネル（ＴＰＣ）、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、イノシトールトリスリン酸受容体（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＰ３Ｒ）、ＴＲＩＣチャネル及びリアノジン受容体からなる群から選ばれる少なくとも一つである、［２］に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［４］前記細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質が、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、在来型プロテインキナーゼＣ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ／ｃｌａｓｓｉｃａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ｃ−ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓe；ＣａＭＫ）、ホスホリパーゼＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ；ＰＬＣ）及びＳ１００Ｂタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、［２］又は［３］に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［５］前記ＣａＭＫをコードする遺伝子がＣａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子である、［４］に記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［６］前記カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子がＫｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子である、［３］〜［５］のいずれか一つに記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［７］前記電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子がＣａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子である、［３］〜［６］のいずれか一つに記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［８］前記カルシウムポンプをコードする遺伝子がＡｔｐ２ｂ３遺伝子である、［３］〜［７］のいずれか一つに記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［９］前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子がＮｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子である、［３］〜［８］のいずれか一つに記載の睡眠障害モデル非ヒト動物。
［１０］カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損していることを特徴とする睡眠障害評価用動物細胞。
［１１］前記カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質が、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質、又は細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質である、［１０］に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１２］前記細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質が、電位依存性カルシウムチャネル、ＴＲＰチャネル、ＳＯＣチャネル、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、ＰＭＣＡ、ＣａＣＡファミリータンパク質、ＨＣＮチャネル、ＣＮＧチャネル、ＴＰＣ、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、ＩＰ３Ｒ、ＴＲＩＣチャネル及びリアノジン受容体からなる群から選ばれる少なくとも一つである、［１１］に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１３］前記細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質が、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、ｃ−ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＰＬＣ及びＳ１００Ｂタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、［１１］又は［１２］に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１４］前記ＣａＭＫをコードする遺伝子がＣａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子である、［１３］に記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１５］前記カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子がＫｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子である、［１２］〜［１４］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１６］前記電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子がＣａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子である、［１２］〜［１５］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１７］前記カルシウムポンプをコードする遺伝子がＡｔｐ２ｂ３遺伝子である、［１２］〜［１６］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１８］前記ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体遺伝子がＮｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子である、［１２］〜［１７］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［１９］前記睡眠障害評価用動物細胞が神経細胞である、［１０］〜［１８］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞。
［２０］睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、被検化合物の投与下で［１］〜［９］のいずれか一つに記載の睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンを測定する測定工程と、測定された前記睡眠パターンが、前記被検化合物の非投与下で測定された前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンと比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、を備えることを特徴とする方法。
［２１］睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、被検化合物の投与下で、野生型の動物細胞又は［１０］〜［１９］のいずれか一つに記載の睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度を測定する測定工程と、測定された前記カルシウムイオン濃度が、前記被検化合物の非投与下で測定された前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度と比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、を備えることを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便に作製でき、安定した睡眠パターンの表現型を呈する睡眠障害モデル非ヒト動物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明におけるカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路について示す概略図である。
【図２】一般的な徐波睡眠の脳波を示す図である。
【図３】神経細胞の細胞膜上に存在するイオンチャネルを示す図である。
【図４】（Ａ）試験例１におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、Ｋｃｎｎ２遺伝子及びＫｃｎｎ３遺伝子をノックアウトしたマウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。（Ｂ）試験例１における基礎ＥＥＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、脳波（脳電図））／ＥＭＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ、筋電図）を測定する方法を用いて、野生型マウス及びＫｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウスでの睡眠パターンを計測した結果を示すグラフである。
【図５】試験例１におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子及びＣａｃｎａ１ｈ遺伝子をノックアウトしたマウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。
【図６】試験例１におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子をＳｅｔ１及びＳｅｔ２のガイドＲＮＡによりノックアウトしたマウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。
【図７】試験例１におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子及びＣａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。
【図８】（Ａ）試験例２におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体阻害剤であるｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ（ＰＣＰ）を０ｍｇ／ｋｇ、１３．３ｍｇ／ｋｇ又は２６．７ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した野生型マウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。（Ｂ）試験例２におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体阻害剤であるＭＫ−８０１を０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した野生型マウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。（Ｃ）試験例２における基礎ＥＥＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、脳波（脳電図））／ＥＭＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ、筋電図）を測定する方法を用いて、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体阻害剤であるＭＫ−８０１を０ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した野生型マウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。
【図９】試験例３におけるＳｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法を用いて、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体阻害剤であるＭＫ−８０１を０ｍｇ／Ｌ、１６ｍｇ／Ｌ、３２ｍｇ／Ｌ、６４ｍｇ／Ｌ又は９６ｍｇ／Ｌ経口投与した野生型マウスでの睡眠パターンを測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞
本発明は、一実施形態において、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損している、睡眠障害モデル非ヒト動物を提供する。
【００１５】
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、簡便に作製することができ、概日時計に影響を与えることなく、安定した表現型を呈する。さらに、前記睡眠障害モデル非ヒト動物を用いることにより、睡眠障害の原因解明、治療薬の探索の効率を飛躍的に向上させることができる。また、睡眠障害と密接な関係にある精神疾患や神経変性疾患の原因解明、治療薬の探索へ貢献することを期待できる。
【００１６】
本発明者らは、睡眠時に観察される特徴的な脳波である徐波形成に必要な遺伝子を特定するために、平均場近似（多数の要素が相互作用しているような集団を解析するために用いられる数学的な近似手法）を施したコンピュータモデルを作製し、解析することで、カルシウムイオンの流入に伴う神経細胞の過分極が徐波形成に極めて重要であることを見出した。さらに、この徐波形成に必要な遺伝子群を特定し、この遺伝子群の機能を全部又は一部欠損させることにより、睡眠障害モデル非ヒト動物を完成させた。
また、この遺伝子群がコードするタンパク質によって引き起こされる、睡眠覚醒に関連したカルシウムの細胞内外への流出及び流入による経路を、「カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ／ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）」と名付けた。
【００１７】
図１は、本発明におけるカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路について示す概略図である。図１の「Ｓｌｅｅｐ（徐波睡眠時）」において、神経細胞の細胞膜上に存在するカルシウム流入に関連する膜タンパク質（チャネル）が開くことにより、細胞質内にカルシウムが流入し、過分極となることにより睡眠が誘導され、Ｂｕｒｓｔと呼ばれるギザギザとした高振幅の波形が形成される（図２中のＸ参照。）。また、細胞質内のカルシウム依存的にカリウムを流出するチャネルが開くことにより、細胞外へカリウムが流出し、波形が下がり落ち着く（図２中のＹ参照。）。徐波睡眠ではこのＸとＹとからなる波形を繰り返すことが知られている。
【００１８】
また、図１の「Ｗａｋｅ（覚醒時）」において、神経細胞の細胞膜上に存在するカルシウム流出に関連する膜タンパク質（チャネル）が開くことにより、細胞外へカルシウムが流出し、脱分極となることにより神経細胞の興奮が誘導され、典型的な覚醒状態の脳波の波形を形成する。また、カルシウム依存性の酵素、ミトコンドリアや小胞体上に存在するカルシウムに関連する膜タンパク質の働きによっても、細胞質内のカルシウム濃度が変化し、徐波睡眠と覚醒とが切り替わると考えられる。
【００１９】
一般的に、「徐波睡眠」とは、ノンレム睡眠のうち、出現する脳波の特徴として、図２に示す周波数の低い成分が中心となる睡眠を意味する。ヒトにおいては、下記表１に示すステージＩＩＩ及びＩＶが該当し、ノンレム睡眠の中では、深い睡眠にあたることから、健常者では熟眠感と関連があるとされている。
【００２０】
【表１】
2017158528.tif 000002
【００２１】
＜カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質＞
本実施形態において、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質とは、上述のカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路において、神経細胞の細胞質内のカルシウム濃度の変化を引き起こすタンパク質であればよい。カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質、細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質等が挙げられる。
【００２２】
［細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質］
神経細胞の細胞膜上に存在するタンパク質としては、例えば、電位依存性カルシウムチャネル、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＴＲＰ）チャネル、ストア作動性カルシウムチャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＳＯＣ ｃｈａｎｎｅｌ、ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ；ＣＲＡＣ  ｃｈａｎｎｅｌ）、ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉａｏｘａｚｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、カルシウムポンプ（Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ；ＰＭＣＡ）、陽イオン−カルシウム交換輸送体（Ｃａｔｉｏｎ／Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ；ＣａＣＡ）ファミリータンパク質、Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＨＣＮチャネル）、Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄチャネル（ＣＮＧチャネル）、Ｔｗｏ−ｐｏｒｅチャネル（ＴＰＣ）、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、イノシトールトリスリン酸受容体（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＰ３Ｒ）、ＴＲＩＣチャネル、リアノジン受容体等が挙げられる。
【００２３】
電位依存性カルシウムチャネルとは、一般的に、細胞膜上に存在する膜タンパク質であって、膜電位の脱分極を感知して活性化（開口確率が上昇）し、細胞外から細胞内へカルシウムを選択的に透過させるイオンチャネルである。
電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｃａｖ１．１（Ｃａｃｎａ１ｓ）遺伝子、Ｃａｖ１．２（Ｃａｃｎａ１ｃ）遺伝子、Ｃａｖ１．３（Ｃａｃｎａ１ｄ）、ＣａＶ１．４（Ｃａｃｎａ１ｆ）遺伝子、Ｃａｖ２．１（Ｃａｃｎａ１ａ）遺伝子、Ｃａｖ２．２（Ｃａｃｎａ１ｂ）遺伝子、ＣａＶ２．３（Ｃａｃｎａ１ｅ）遺伝子、ＣａＶ３．１（Ｃａｃｎａ１ｇ）遺伝子、ＣａＶ３．２（Ｃａｃｎａ１ｈ）遺伝子、ＣａＶ３．３（Ｃａｃｎａ１ｉ）遺伝子等が挙げられる。中でも、脳に多く発現し、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させる電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子であることが好ましい。
【００２４】
ＴＲＰチャネルとは、ショウジョウバエの光受容応答変異株の原因遺伝子として発見されたチャネル分子であり、哺乳類においては２８種の遺伝子が同定され、Ｃ、Ｍ、Ｖ、ＭＬ、Ｐ、Ａといった６つのサブファミリーを構成する。ＴＲＰチャネルは、温度、機械刺激、痛み、酸−塩基といった種々の物理化学的刺激によって活性化されるカチオンチャネルファミリーを形成している。その多くがＣａ２＋透過能を有し、中枢及び末梢神経系を始めとするほぼ全ての組織に発現が見られる。
ＴＲＰチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、ＴＲＰ  ｃｌａｓｓｉｃ（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（ＴＲＰＣ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｃ１遺伝子、Ｔｒｐｃ２遺伝子、Ｔｒｐｃ３遺伝子、Ｔｒｐｃ４遺伝子、Ｔｒｐｃ５遺伝子、Ｔｒｐｃ６遺伝子、Ｔｒｐｃ７遺伝子）、ＴＲＰ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ（ＴＲＰＭ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍ１遺伝子、Ｔｒｐｍ２遺伝子、Ｔｒｐｍ３遺伝子、Ｔｒｐｍ４遺伝子、Ｔｒｐｍ５遺伝子、Ｔｒｐｍ６遺伝子、Ｔｒｐｍ７遺伝子、Ｔｒｐｍ８遺伝子）、ＴＲＰ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＰＶ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｖ１遺伝子、Ｔｒｐｖ２遺伝子、Ｔｒｐｖ３遺伝子、Ｔｒｐｖ４遺伝子、Ｔｒｐｖ５遺伝子、Ｔｒｐｖ６遺伝子）、ＴＲＰ  ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ（ＴＲＰＭＬ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍｌ１遺伝子、Ｔｒｐｍｌ２遺伝子、Ｔｒｐｍｌ３遺伝子）、ＴＲＰ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ（ＴＲＰＰ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｐ１遺伝子、Ｔｒｐｐ２遺伝子、Ｔｒｐｐ３遺伝子、Ｔｒｐｐ５遺伝子）、ＴＲＰ  アンキリン（ＴＲＰＡ）遺伝子（Ｔｒｐａ遺伝子）等が挙げられる。
【００２５】
ＳＯＣチャネルとは、細胞膜上に存在し、小胞体に貯蔵されたＣａ２＋の枯渇によって活性化（開口確率が上昇）し、細胞外から細胞内へＣａ２＋を流入させるカルシウムチャネルである。ＳＯＣチャネルは、小胞体のＣａ２＋枯渇を感知した小胞体Ｃａ２＋センサー分子ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＳＴＩＭ）（ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２が存在する。）との相互作用を介して４量体を形成し、活性化（開口確率が上昇）する。
ＳＯＣチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｏｒａｉファミリー遺伝子群（Ｏｒａｉ１遺伝子、Ｏｒａｉ２遺伝子、Ｏｒａｉ３遺伝子）等が挙げられる。
【００２６】
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体とは、細胞膜上に存在し、学習や記憶において中心的な役割を果たす、ＧｌｕＲ１−ＧｌｕＲ４の４つのサブユニットからなる４量体の、グルタミン酸の結合により活性化される陽イオン透過性チャネルである。サブユニットの構成によって、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンに対する透過性が変化することが知られている。
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、例えば、ＧｌｕＲ１遺伝子、ＧｌｕＲ２遺伝子、ＧｌｕＲ３遺伝子、ＧｌｕＲ４遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
カイニン酸型グルタミン酸受容体とは、細胞膜上に存在し、ＧｌｕＫ１−ＧｌｕＫ５の五つのサブユニットからなる５量体の陽イオン透過性チャネルである。海馬での発現が強く、記憶、学習に重要な役割を果たすことが知られている。
カイニン酸型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、例えば、ＧｌｕＫ１遺伝子、ＧｌｕＫ２遺伝子、ＧｌｕＫ３遺伝子、ＧｌｕＫ４遺伝子、ＧｌｕＫ５遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体とは、細胞膜上に存在し、興奮性のシナプス伝達に関与し、シナプス後膜に存在し、グルタミン酸の結合により、活性化（開口確率が上昇）するイオンチャネルである。また、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体はカルシウムに対して、高い透過性を有する。
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、３つのサブユニットが存在し、ＧｌｕＮ１（Ｎｒ１）サブユニットをコードする遺伝子、ＧｌｕＮ２（Ｎｒ２）サブユニットをコードするファミリー遺伝子群（ＧｌｕＮ２Ａ（Ｎｒ２ａ）遺伝子、ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｎｒ２ｂ）遺伝子、ＧｌｕＮ２Ｃ（Ｎｒ２ｃ）遺伝子、ＧｌｕＮ２Ｄ（Ｎｒ２ｄ）遺伝子）、ＧｌｕＮ３サブユニットをコードするファミリー遺伝子群（ＧｌｕＮ３Ａ（Ｎｒ３ａ）遺伝子、ＧｌｕＮ３Ｂ（Ｎｒ３ｂ）遺伝子）等が挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、Ｎｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子であることが好ましい。
【００２９】
カルシウム依存性カリウムチャネルとは、細胞膜上に存在し、細胞質内のカルシウム濃度の上昇によって、活性化（開口確率が上昇）し、細胞内から細胞外へカリウムを流出させるカリウムチャネルである。
カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、ＫＣａ１．１（Ｋｃｎｍａ１）遺伝子、ＫＣａ２．１（Ｋｃｎｎ１）遺伝子、ＫＣａ２．２（Ｋｃｎｎ２）遺伝子、ＫＣａ２．３（Ｋｃｎｎ３）遺伝子、ＫＣａ３．１（Ｋｃｎｎ４）遺伝子、ＫＣａ４．１（Ｋｃｎｔ１）遺伝子、ＫＣａ４．２（Ｋｃｎｔ２）、ＫＣａ５．１（Ｋｃｎｕ１）遺伝子等が挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるカルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｋｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子であることが好ましい。
【００３０】
ＰＭＣＡとは、細胞膜上及び小胞体膜上に存在し、細胞質内のカルシウム濃度の上昇した際に、外部エネルギーとしてＡＴＰの加水分解で供給されるエネルギーにより活性化（開口確率が上昇）し、細胞内から細胞外へカルシウムを流出させるカルシウムチャネルである。
ＰＭＣＡをコードする遺伝子としては、例えば、ＰＭＣＡ１（Ａｔｐ２ｂ１）遺伝子、ＰＭＣＡ２（Ａｔｐ２ｂ２）遺伝子、ＰＭＣＡ３（Ａｔｐ２ｂ３）遺伝子、ＰＭＣＡ４（Ａｔｐ２ｂ４）遺伝子等が挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるＰＭＣＡをコードする遺伝子としては、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子であることが好ましい。
【００３１】
ＣａＣＡとは、細胞膜上及びミトコンドリア膜上に存在し、細胞質内のカルシウム濃度の上昇した際に、１つのカルシウムイオンを細胞外又はミトコンドリアの外膜と内膜の膜間スペースに流出される代わりに、細胞内又はミトコンドリア内（マトリックス）へ３つのプロトン（水素イオン）、ナトリウムイオン又はカリウムイオンを流入させる輸送体である。
ＣａＣＡをコードする遺伝子としては、例えば、ナトリウム／カルシウム交換輸送体（Ｎａ＋／Ｃａ２＋  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ；ＮＣＸ）ファミリー遺伝子群（Ｎｃｘ１遺伝子、Ｎｃｘ２遺伝子及びＮｃｘ３遺伝子）、カリウム依存性ナトリウム／カルシウム交換輸送体（Ｋ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎａ＋／Ｃａ２＋  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ；ＮＣＫＸ）ファミリー遺伝子群（Ｎｃｋｘ１遺伝子、Ｎｃｋｘ２遺伝子、Ｎｃｋｘ３遺伝子、Ｎｃｋｘ４遺伝子及びＮｃｋｘ６遺伝子）等が挙げられる。
【００３２】
ＨＣＮチャネルとは、細胞膜上に存在し、細胞膜の過分極に応じて開く非選択的陽イオンチャネルである。中枢神経系に発現しており、６回膜貫通型のαサブユニットが４つ集まって一つのイオンチャネルを構成する。
ＨＣＮチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｈｃｎ１遺伝子、Ｈｃｎ２遺伝子、Ｈｃｎ３遺伝子、Ｈｃｎ４遺伝子等が挙げられる。
【００３３】
ＣＮＧチャネルとは、細胞膜上に存在し、細胞の過分極や脱分極に伴い、細胞内の環状ヌクレオチドによって活性化される、非選択的陽イオンチャネルである。
ＣＮＧチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｃｎｇａサブファミリー遺伝子群（Ｃｎｇａ１遺伝子、Ｃｎｇａ２遺伝子、Ｃｎｇａ３遺伝子、Ｃｎｇａ４遺伝子）、Ｃｎｇｂサブファミリー遺伝子群（Ｃｎｇｂ１遺伝子、Ｃｎｇｂ２遺伝子）等が挙げられる。
【００３４】
ＴＰＣとは、２回膜貫通型のイオンチャネルが２つ直列でつながったような、４回膜貫通型の選択的陽イオンチャンネルである。エンドリソソーム膜上に、ニコチン酸アデニンジヌクオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）関連カルシウムチャネルとして存在し、細胞小器官のカルシウムイオン放出に寄与することが知られている。
ＴＰＣをコードする遺伝子としては、例えば、Ｔｐｃｎ１遺伝子、Ｔｐｃｎ２遺伝子等が挙げられる。
【００３５】
酸感受性イオンチャネルとは、細胞膜上に存在し、細胞外水素イオンによって活性化される陽イオンチャネルである。
酸感受性イオンチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  （Ａｓｉｃ）１遺伝子、Ａｓｉｃ２遺伝子、Ａｓｉｃ３、Ａｓｉｃ４遺伝子等が挙げられる。
【００３６】
Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体とは、細胞膜上に存在し、５量体のリガンド依存性チャネルファミリーの一種であり、非選択的陽イオン透過チャネルである。ニコチン型アセチルコリン受容体や、５−ＨＴ３受容体（セロトニン受容体の一つ）を含む。
Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体をコードする遺伝子としては、例えば、ｎＡＣｈＲファミリー遺伝子群（Ｃｈｒｎａ１遺伝子、Ｃｈｒｎａ２遺伝子、Ｃｈｒｎａ３遺伝子、Ｃｈｒｎａ４遺伝子、Ｃｈｒｎａ５遺伝子、Ｃｈｒｎａ６遺伝子、Ｃｈｒｎａ７遺伝子、Ｃｈｒｎａ９遺伝子、Ｃｈｒｎｂ２遺伝子、Ｃｈｒｎｂ３遺伝子、Ｃｈｒｎｂ４遺伝子、Ｃｈｒｎｄ遺伝子、Ｃｈｒｎｅ遺伝子、Ｃｈｒｎｇ遺伝子）、５−ＨＴ３受容体ファミリー遺伝子群（Ｈｔｒ３ａ遺伝子、Ｈｔｒ３ｂ遺伝子）等が挙げられる。
【００３７】
Ｐ２Ｘ受容体とは、細胞膜上に存在し、細胞外のＡＴＰをリガンドとして活性化されるリガンド依存性チャネルである。Ｐ２Ｘ１−Ｐ２Ｘ７からなる３量体の非選択的陽イオンチャネルである。
Ｐ２Ｘ受容体をコードする遺伝子としては、例えば、Ｐ２ｒｘ１遺伝子、Ｐ２ｒｘ２遺伝子、Ｐ２ｒｘ３遺伝子、Ｐ２ｒｘ４遺伝子、Ｐ２ｒｘ５遺伝子、Ｐ２ｒｘ６遺伝子、Ｐ２ｒｘ７遺伝子等が挙げられる。
【００３８】
カルシウムユニポーターとは、ミトコンドリア膜上に存在し、細胞質内のカルシウム濃度の上昇によって、活性化（開口確率が上昇）し、ミトコンドリアの外膜と内膜の膜間スペースからミトコンドリア内（マトリックス）へカルシウムを流入させるカルシウムチャネルである。
カルシウムユニポーターをコードする遺伝子としては、例えば、Ｍｃｕ遺伝子等が挙げられる。
【００３９】
ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質とは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のサブファミリーの一つであり、ミトコンドリア膜上及び小胞体膜上に存在しミトコンドリア膜と小胞体膜との間におけるカルシウムの制御を行うカルシウムチャネルである。また、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリーはアポトーシスの抑制性を有する。
ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、Ｂｃｌ−２遺伝子、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
ＩＰ３Ｒとは、小胞体膜上に存在し、イノシトールトリスリン酸（ＩＰ３）により活性化（開口確率が上昇）し、小胞体内から細胞質へカルシウムを流出させるカルシウムチャネルである。ＩＰ３Ｒは特に、小脳において豊富に発現している。
ＩＰ３Ｒをコードする遺伝子としては、例えば、Ｉｐ３ｒ１遺伝子、Ｉｐ３ｒ２遺伝子、Ｉｐ３ｒ３遺伝子等が挙げられる。
【００４１】
ＴＲＩＣチャネルとは、小胞体膜上に存在する陽イオン透過性チャネルである。リアノジン受容体、イノシトール３リン酸受容体によって小胞体からカルシウムイオンが放出された際に、カウンターイオンとして陽イオンを流入させる働きを有する。
ＴＲＩＣチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、Ｔｒｉｃ−ａ遺伝子、Ｔｒｉｃ−ｂ遺伝子等が挙げられる。
【００４２】
リアノジン受容体とは、小胞体膜上に存在し、細胞質のカルシウム濃度の上昇により活性化（開口確率が上昇）し、小胞体内から細胞質へカルシウムを流出させるカルシウムチャネルである。
リアノジン受容体をコードする遺伝子としては、例えば、Ｒｙｒ１遺伝子、Ｒｙｒ２遺伝子、Ｒｙｒ３遺伝子等が挙げられる。
【００４３】
［カルシウムの結合により機能を調節されるタンパク質］
神経細胞内に存在するカルシウムの結合により機能を調節されるタンパク質としては、例えば、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、在来型プロテインキナーゼＣ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ／ｃｌａｓｓｉｃａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ｃ−ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓe；ＣａＭＫ）、ホスホリパーゼＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ；ＰＬＣ）、Ｓ１００Ｂタンパク質等が挙げられる。
【００４４】
カルモジュリンとは、細胞内の至る所に存在し、約１４８残基のアミノ酸から構成される約１６ｋＤａのカルシウム結合タンパク質である。カルモジュリンは４つのＥＦハンド型カルシウム結合性ドメイン（ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ）を有するため、それぞれにカルシウムイオンが結合することができ（カルモジュリン１分子あたり４つのカルシウムイオンが結合可能）、小胞体におけるカルシウム貯蔵に関与するタンパク質である。
カルモジュリンをコードする遺伝子としては、例えば、Ｃａｌｍ１遺伝子、Ｃａｌｍ２遺伝子、Ｃａｌｍ３遺伝子等が挙げられる。
【００４５】
カルパインとは、細胞内のカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムが結合することにより活性化され、標的タンパク質の一部を分解することで、標的タンパク質の機能を不可逆的に変化させる細胞内プロテアーゼである。
カルパインをコードする遺伝子としては、例えば、カルパイン１（Ｃａｐｎ１）遺伝子、カルパイン２（Ｃａｐｎ２）遺伝子、カルパイン３（Ｃａｐｎ３）遺伝子、カルパイン５（Ｃａｐｎ５）遺伝子、カルパイン６（Ｃａｐｎ６）遺伝子、カルパイ７（Ｃａｐｎ７）遺伝子、カルパイン８（Ｃａｐｎ８）遺伝子、カルパイン９（Ｃａｐｎ９）遺伝子、カルパイン１０（Ｃａｐｎ１０）遺伝子、カルパイン１１（Ｃａｐｎ１１）遺伝子、カルパイン１２（Ｃａｐｎ１２）遺伝子、カルパイン１３（Ｃａｐｎ１３）遺伝子、カルパイン１４（Ｃａｐｎ１４）遺伝子、カルパイン１５（Ｃａｐｎ１５）遺伝子、アンドログロビン（Ａｄｇｂ）遺伝子、カルパインスモールサブユニット１（ｃａｌｐａｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｓｕｂｕｎｉｔ１；ｃｓｓ１）（Ｃｐｎｓ１）遺伝子、カルパインスモールサブユニット２（ｃａｌｐａｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｓｕｂｕｎｉｔ１；ｃｓｓ２）（Ｃｐｎｓ２）遺伝子等が挙げられる。
【００４６】
カルシニューリンとは、脳神経系に豊富に発現するカルシウム−カルモジュリン依存的セリン−スレオニンタンパク質脱リン酸化酵素であり、触媒サブユニットであるカルシニューリンＡとカルシウム結合（調節）サブユニットであるカルシニューリンＢとからなる。細胞内のカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウム結合（調節）サブユニットにカルシウムが結合すると、カルモジュリン（カルシウムにより活性化される）と結合し、触媒サブユニットが活性化され、標的タンパク質を脱リン酸化し、これによりシグナル伝達に関与する。
カルシニューリンをコードする遺伝子としては、カルシニューリンＡファミリー遺伝子群（Ｐｐｐ３ｃａ遺伝子、Ｐｐｐ３ｃｂ遺伝子、Ｐｐｐ３ｃｃ遺伝子）、カルシニューリンＢファミリー遺伝子群（Ｐｐｐ３ｒ１遺伝子、Ｐｐｐ３ｒ２遺伝子）等が挙げられる。
【００４７】
ｃ−ＰＫＣとは、カルシウム依存性のタンパク質リン酸化酵素であり、標的タンパク質のセリン又はトレオニンのリン酸エステル化反応を触媒する。
ｃ−ＰＫＣをコードする遺伝子としては、例えば、ＰＫＣα（Ｐｒｋｃａ）遺伝子、ＰＫＣβＩ（Ｐｒｋｃｂ）遺伝子、ＰＫＣβＩＩ遺伝子、ＰＫＣγ（Ｐｒｋｃｇ）遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
ＣａＭＫとは、細胞内のカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウム−カルモジュリン複合体の直接結合により活性化される、カルシウム−カルモジュリン依存的セリン−スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。本明細書において、ＣａＭＫは、脳内に豊富に存在することから、特に、複数のタンパク質をリン酸化する多機能性カルシウム−カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素を意味する。多機能性カルシウム−カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素には、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶの３つのサブファミリーが存在する。
ＣａＭＫをコードする遺伝子としては、例えば、ＣａＭＫＩサブファミリー遺伝子群（Ｃａｍｋ１遺伝子、Ｐｎｃｋ遺伝子、Ｃａｍｋ１ｇ遺伝子、Ｃａｍｋ１ｄ遺伝子）、ＣＡＭＫＩＩサブファミリー遺伝子群（Ｃａｍｋ２ａ遺伝子、Ｃａｍｋ２ｂ遺伝子、Ｃａｍｋ２ｇ遺伝子、Ｃａｍｋ２ｄ遺伝子）、ＣＡＭＫＩＩサブファミリー遺伝子（Ｃａｍｋ４遺伝子）等が挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるカルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子であることが好ましい。
【００４９】
ＰＬＣとは、細胞内のカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムが結合することにより活性化し、リン酸エステル基の直前でリン脂質を切断する酵素である。ＰＬＣは、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）をジアシルグリセロール（ＤＡＧ） 及びイノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）へと切断する。切断されたＩＰ３は、上述のＩＰ３Ｒを活性化させる。ＰＬＣは、６種類のアイソタイプ（β、γ、δ、ε、η、ζ）に分類される。
ＰＬＣをコードする遺伝子としては、例えば、ＰＬＣβファミリー遺伝子群（Ｐｌｃｂ１遺伝子、Ｐｌｃｂ２遺伝子、Ｐｌｃｂ３遺伝子、Ｐｌｃｂ４遺伝子）、ＰＬＣγファミリー遺伝子群（Ｐｌｃｇ１遺伝子、Ｐｌｃｇ２遺伝子）、ＰＬＣδファミリー遺伝子群（Ｐｌｃｄ１遺伝子、Ｐｌｃｄ３遺伝子、Ｐｌｃｄ４遺伝子）、ＰＬＣε遺伝子（Ｐｌｃｅ１遺伝子）、ＰＬＣη遺伝子ファミリー遺伝子群（Ｐｌｃｈ１遺伝子、Ｐｌｃｈ２遺伝子）、ＰＬＣζ遺伝子（Ｐｌｃｚ１遺伝子）、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ−ｌｉｋｅファミリー遺伝子群（Ｐｌｃｌ１遺伝子、Ｐｌｃｌ２遺伝子）等が挙げられる。
【００５０】
Ｓ１００Ｂタンパク質とは、脳での発現の多く、ＥＦハンド型カルシウム結合性ドメイン（ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ）を有する、分子量が８〜１４ｋＤａ程度の低分子量のＳ１００タンパク質群の一つである。Ｓ１００Ｂタンパク質は、中でもグリア細胞の一種であるアストロサイトに選択的に発現することが知られている。
Ｓ１００Ｂタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、Ｓ１００ｂ遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
本明細書において、「機能の全部又は一部が欠損している」とは、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）が、変更、削除、置換或いは挿入等される、又は相同組換えされることにより、本来の標的遺伝子が欠損、欠失又は変化し、標的遺伝子の全部又は一部が発現できず、標的遺伝子の生理的機能の全部又は一部を果たすことができない状態を意味する。「機能の全部又は一部が欠損している」状態において、相同染色体上の標的遺伝子の片方が欠損、欠失又は変化していてもよく、両方が欠損、欠失又は変化していてもよい。
すなわち、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、標的遺伝子がノックアウト或いはノックダウンされた非ヒト動物、又は標的遺伝子に外来遺伝子がノックインされた非ヒト動物である。
さらに、本明細書において、「機能の全部又は一部が欠損している」とは、薬物等の化合物により、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）の転写又は翻訳の全部又は一部が抑制される、又は前記化合物が発現したタンパク質に結合することにより、機能の全部又は一部が阻害されている状態を意味する。
すなわち、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、化合物存在下で標的遺伝子の機能の全部又は一部が阻害された非ヒト動物である。
【００５２】
本明細書において、変更、削除、置換或いは挿入等される、又は相同組換えされることを「遺伝子を改変する」と称する場合がある。
本明細書において、上述の用語「変更」、「削除」、「挿入」及び「置換」等の遺伝子改変手段は、限定した意味で使用されているものではない。また、いずれかの遺伝子改変手段に厳密に区別して使用する意図で用いる必要もなく、結果としていずれかの遺伝子改変手段によりカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子が改変されてカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子の発現が抑制され、その機能の全部又は一部が不能になっていることを意味するものとして使用される。しかしながら、上述の手段は、一般的には、後述のような意味として使用しているものと理解することができる。
【００５３】
つまり、一般的には、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの１つ又はそれ以上の塩基が変更して、標的遺伝子の発現産物の全部又は一部が機能しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「削除」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を欠失させることにより、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「置換」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を標的遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「挿入」とは、標的遺伝子中に、それ以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該標的遺伝子以外のＤＮＡを挿入した標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
また、遺伝子の変更、削除、挿入又は置換等の遺伝子改変手段は、２つ以上の方法を組み合わせて、標的遺伝子に対して同時に使用されていてもよい。
また、上述のカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子において、単独の遺伝子を改変させてもよく、２つ以上の遺伝子を同時に改変させてよい。
【００５４】
本実施形態において、用いられる非ヒト動物としては、睡眠する非ヒト動物であれば、特別な限定はなく、例えば、神経システムの比較的発達した無脊椎動物（例えば、昆虫類（例えば、ショウジョウバエ、ミツバチ等）、甲殻類（例えば、サソリ等）等の節足動物、軟体動物（例えば、アメフラシ等）等）、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）等が挙げられる。中でも、脊椎動物が好ましく、鳥類又は哺乳類がより好ましく、哺乳類がさらに好ましい。哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の齧歯目の哺乳類が好ましい。
【００５５】
マウスとしては、例えば、純系としてはＣ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統等が挙げられ、交雑系としてはＢ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統等が挙げられ、これらに限定されない。ラットの具体例としては、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５６】
＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）を改変するための公知の遺伝子改変技術を用いて、作製することができる。
また、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、野生型の非ヒト動物に、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）の機能を阻害する化合物を投与することにより、作製することができる。投与する化合物は、標的遺伝子の種類により、適宜選択することができる。例えば、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接結合する阻害剤としては、例えば、ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ（ＰＣＰ）、ＭＫ−８０１等が挙げられる。投与量は、対象となる非ヒト動物の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
【００５７】
［ノックアウト又はノックインによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物において、標的遺伝子をノックアウトされた非ヒト動物を作製する場合、又は標的遺伝子に外来遺伝子がノックインされた非ヒト動物を作製する場合に、用いられる公知の遺伝子改変技術としては、ＣＲＩＳＰＲシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法、公知の相同組換え方法（例えば、外来遺伝子と該外来遺伝子の上流（５’側）及び下流（３’側）に標的遺伝子の挿入を行う遺伝子座と相同な配列を有する遺伝子を含むベクターを用いることで、対象となる非ヒト動物に導入する方法等）等が挙げられる。中でも、選択的且つ部位特異的に遺伝子を改変できることから、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物は、従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術を用いて作製することが好ましい。従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術によれば、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物を効率よく得ることができる。
【００５８】
従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術を用いて、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物を作製する方法を、以下に詳細に説明する。
【００５９】
（導入工程）
まず、睡眠障害モデルを構築したい非ヒト動物由来の受精卵に、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを導入する。ガイドＲＮＡの導入方法としては、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。中でも、操作が簡便であることから、エレクトロポレーション法であることが好ましい。用いられる受精卵の由来元となる非ヒト動物としては、上述の＜＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００６０】
２つ以上の複数の遺伝子を標的遺伝子とする場合は、それぞれの遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むガイドＲＮＡを２種類以上設計し、導入すればよい。これにより、複数の異なる遺伝子又は同一遺伝子内の複数箇所を同時に高効率で編集することができる。
【００６１】
Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの導入後、前記受精卵を対応する非ヒト動物の子宮又は卵管へ移植し、発生させることで、睡眠障害モデル非ヒト動物を簡便に得ることができる。また、得られた睡眠障害モデル非ヒト動物において、標的遺伝子がヘテロ型遺伝子改変（ゲノム上の一方のアリルが改変された）非ヒト動物であった場合、該ヘテロ型遺伝子改変非ヒト動物同士を交配させることにより、ホモ型遺伝子改変（ゲノム上の両方のアリルが改変された）非ヒト動物を得ることができる。
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物には、上述のヘテロ型遺伝子改変非ヒト動物及びホモ型遺伝子改変非ヒト動物の子孫も含まれる。
【００６２】
「Ｃａｓ９」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーの一つであり、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
【００６３】
本明細書において、Ｃａｓタンパク質ファミリーとしては、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知)、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、又はそれらの改変されたもの等が挙げられる。
【００６４】
Ｃａｓ９は、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の最初又は最後のヌクレオチドから、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれ以上の塩基対以内での、一方又は両方の鎖の切断を指向する。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかはＣａｓ９の由来となる細菌種によって異なるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を含め大部分のＣａｓ９はＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
【００６５】
また、本実施形態で用いられるＣａｓ９としては、標的配列を含む標的遺伝子の一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体であってよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ(一本鎖を切断する)に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例には、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが含まれ、これらに限定されない。また、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン(ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ)は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く変異したＣａｓ９を生産することができる。この場合、その他のＤＮＡ切断活性を有する酵素と融合したキメラ酵素であることが好ましい。Ｄ１０Ａ変異は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９を生産するために、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ又はＮ８６３Ａ変異のうち１つ又は複数と組み合わされていてもよい。変異したＣａｓ９のＤＮＡの切断活性が、その非変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％又は０．０１％未満の場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くとみなされる。
【００６６】
本明細書において、「ガイドＲＮＡ」とは細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものである。本実施形態におけるガイドＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００６７】
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物を作製する方法において、標的遺伝子は、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子である。カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において、例示したものと同様のものが挙げられる。カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子は遺伝子内又は近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。
【００６８】
本明細書において、「ＰＡＭ配列」とはＣａｓ９により認識され得る配列であって、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣａｓ９の由来となる細菌種によってさまざまである。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」(Ｎは任意の塩基を表す)の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」(Ｎは任意の塩基を表す)の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。認識するＰＡＭ配列が短く編集可能な標的遺伝子が制限されにくいことから、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であることが好ましい。
【００６９】
また、導入工程において、Ｃａｓ９タンパク質の代わりに、Ｃａｓ９タンパク質をコードする塩基配列からなるＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含むベクターを導入してもよい。
【００７０】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列は、真核生物細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。真核生物細胞としては、特定の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又は非ヒト霊長類等が挙げられ、これらに限定されない。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される動物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される動物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１５年１２月１６日に訪問）に掲載されている「Codon  Usage  Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（例えば、Nakamura,Y.ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000」Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)、参照）。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする配列中の１つ又は複数のコドンは、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【００７１】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、肝炎ウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００７２】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡに作動可能に連結された、プロモーターを含んでいてもよい。プロモーターとしては、例えば、ウイルス性プロモーター、発現誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又はエンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーター等が挙げられる。上記プロモーターは、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）に連結されていることが好ましい。
【００７３】
本明細書において、「ウイルス性プロモーター」とは、ウイルス由来のプロモーターを意味する。由来となるウイルスとしては、例えばサイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、シミアンウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。
【００７４】
本明細書において、「発現誘導性プロモーター」とは、化学薬剤、物理的ストレスなどの特定の刺激を与えたときに発現させたい遺伝子（本実施形態においては、Ｃａｓ９遺伝子）を発現することができ、刺激の非存在下では発現活性を示さないプロモーターを意味する。発現誘導性プロモーターとしては、例えば、ＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター）プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター系、及び翻訳又は転写についての阻害配列を不可逆的に欠失させるための「ｌｏｘ  ｓｔｏｐ  ｌｏｘ」系等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において、「組織特異的プロモーター」とは、特定の組織においてのみ活性を有するプロモーターを意味する。組織特異的プロモーターとしては、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞又は乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーター又はＷＡＰプロモーター；腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーター又は神経フィラメントプロモーター；Edlundら、Science, 230:912-916(1985)に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７６】
エンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期遺伝子のプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１のロング・ターミナル・リピートの一部の配列からなるＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルスの前初期（ＩＥ）遺伝子エンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターからなるＣＡＧプロモーター等が挙げられる。特に、ＣＡＧプロモーターは、発現させたい遺伝子（本実施形態においては、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の３’末端にウサギのβ−グロビン遺伝子のｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌサイトを有することにより、発現させたい遺伝子（本実施形態においては、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡ）をほぼ全身で過剰発現させることができる。
【００７７】
中でも、プロモーターとしては、全身で恒常的に高発現させたい場合においては、ウイルス性プロモーター又はＣＡＧプロモーターであることが好ましい。また、Ｃａｓ９の発現する時期又は発現する組織を調整した場合においては、発現誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターであることが好ましい。
【００７８】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡ）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の転写を指向するものを意味する。
【００７９】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記のウイルス由来、各種ヒト又は非ヒト動物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等を挙げることができる。その他Ｃａｓ９タンパク質をコードする塩基配列からなるＲＮＡ或いはｃＤＮＡをさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
【００８０】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）が作動可能に連結されていてもよい。
【００８１】
ＮＬＳとしては、例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ;ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳ);アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ;配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ;インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）;筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）;ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）;マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）;インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲ（配列番号１２）;肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）;マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）;ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）;ステロイドホルモンレセプター（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００８２】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子が作動可能に連結されていてもよい。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ  ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【００８３】
導入工程において、ガイドＲＮＡとともに外来遺伝子を導入してもよい。外来遺伝子を一緒に導入することにより、標的遺伝子が切断後、相同組換えにより標的遺伝子は外来遺伝子に置換（ノックイン）され、標的遺伝子の発現の全部又は一部が抑制されることにより、睡眠障害モデル非ヒト動物を得ることができる。
【００８４】
外来遺伝子は、該外来遺伝子を含むベクターを用いて導入することが好ましい。使用するベクターとしては、発現ベクターが好ましい。発現ベクターとしては、上述の「Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、外来遺伝子を含むベクターは、外来遺伝子の５’末端及び３’末端に、標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡが連結されていることが好ましい。標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡの塩基数としては、１００塩基以上３００塩基以下であることが好ましい。
外来遺伝子を含むベクターは、さらに、外来遺伝子の５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【００８５】
（切断工程）
受精卵に導入されたＣａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターから発現されたＣａｓ９タンパク質も含む）と、ガイドＲＮＡとは、温和な条件で混合することで、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成する。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下であればよく、ｐＨは４以上１０以下であればよい。よって、生きた受精卵内においても、前記Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成することができる。
【００８６】
前記Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、ガイドＲＮＡの一部が標的遺伝子に結合し、Ｃａｓ９が標的遺伝子中のＰＡＭ配列を認識する。続いて、３塩基上流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断し、平滑末端を作製する。より具体的には、Ｃａｓ９がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、標的遺伝子の二重らせん構造が引き剥され、ガイドＲＮＡ中の標的遺伝子に相補的な塩基配列とアニーリングすることで、標的遺伝子の二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で、標的遺伝子のリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。
【００８７】
（改変工程）
続いて、前記ガイドＲＮＡと前記標的遺伝子の相補的結合によって決定される領域において、標的遺伝子の機能の全部或いは一部が破壊（ノックアウト）又は置換（ノックイン）された睡眠障害モデル非ヒト動物を得ることができる。
【００８８】
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物が得られたことの確認については、組織から染色体ＤＮＡを抽出しサザンブロット法やＰＣＲ法で行うことができる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。目的遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なってもよい。
【００８９】
また、樹立した動物系統について、ヘテロ型遺伝子改変非ヒト動物及びホモ型遺伝子改変非ヒト動物の表現型を解析することもできる。
【００９０】
［ノックダウンによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］
また、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物において、標的遺伝子をノックダウンされた非ヒト動物を作製する場合に、用いられる公知の遺伝子改変技術としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を用いる方法等が挙げられ、これに限定されない。例えば、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで非ヒト動物に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００９１】
「ノックダウン」とは、特定の遺伝子の発現量を抑制することを意味する。遺伝子の発現量の抑制は、例えば、遺伝子の転写量を減少させること、翻訳を阻害することなどにより、達成することができる。本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物において、ノックダウン非ヒト動物とは、該動物のカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している動物をいう。
【００９２】
「ＲＮＡｉ」とは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを非ヒト動物に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００９３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸を用いて、本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物を作製する方法を、以下に詳細に説明する。
【００９４】
（ｓｉＲＮＡの設計）
まず、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを設計する。ｓｉＲＮＡは、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。また、選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８〜３０塩基のもの、或いは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０〜７０％となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。ｓｉＲＮＡは、さらに、選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。また、設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
【００９５】
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。また、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、２つ以上の標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００９６】
ｓｉＲＮＡ合成法としては、例えば、Ｄｉｃｅｒ法等が挙げられる。Ｄｉｃｅｒ法によるｓｉＲＮＡ合成法は、以下の通りである。まず、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子をコードする遺伝子の配列のスタートコドンから５００ｂｐ〜１ｋｂｐの遺伝子配列をベクター等に組み込み、その遺伝子配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを転写させた後、アニーリングしてｄｓＲＮＡを作製する。次に、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅにより、このｄｓ−ＲＮＡを３’末端側に２塩基の突出末端をもつ２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡにプロセッシングさせることで、合成することができる。
【００９７】
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡ とは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。このステムループ構造を有するＲＮＡ分子は生体内のＤｉｃｅｒ等によりプロセッシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
【００９８】
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２〜１２０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子をコードする遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８〜５０塩基、好ましくは２１〜３０塩基である。
【００９９】
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１００】
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８〜２５塩基（例えば、約２２塩基）である。
【０１０１】
（ｓｉＲＮＡの導入）
続いて、睡眠障害モデルを構築したい非ヒト動物の体内に、設計したｓｉＲＮＡを導入する。導入方法としては、注射剤等を用いた、皮下投与方法、静脈内投与方法、腹腔内投与等が挙げられる。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを導入してもよい。発現ベクターが好ましい。発現ベクターとしては、上述の「Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、さらに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【０１０３】
本実施形態の睡眠障害モデル非ヒト動物が得られたことの確認については、上述の［ノックアウト又はノックダウンによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］において、例示したものと同様の方法が挙げられる。
【０１０４】
＜＜睡眠障害評価用動物細胞＞＞
一実施形態において、本発明は、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子の機能の全部又は一部が欠損している、睡眠障害評価用動物細胞を提供する。
【０１０５】
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞は、簡便に作製することができ、安定した睡眠パターンの表現型を呈する。また、前記睡眠障害評価用動物細胞の細胞質のカルシウム濃度を測定することにより、睡眠障害の程度を簡単に評価することができる。
【０１０６】
＜カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子＞
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞において、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様に、例えば、神経細胞の細胞膜上、ミトコンドリア膜上又は小胞体膜上に存在するタンパク質、細胞質内に存在し、カルシウムの結合により機能が調節されるタンパク質等が挙げられる。
【０１０７】
［細胞膜上、ミトコンドリア膜上、小胞体膜上或いはエンドソーム膜上に存在するタンパク質］
神経細胞の細胞膜上に存在するタンパク質としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様に、例えば、電位依存性カルシウムチャネル、ＴＲＰチャネル、ＳＯＣチャネル、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、カイニン酸型グルタミン酸受容体、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体、カルシウム依存性カリウムチャネル、ＰＭＣＡ、ＣａＣＡファミリータンパク質、ＨＣＮチャネル、ＣＮＧチャネル、ＴＰＣ、酸感受性イオンチャネル、Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体、Ｐ２Ｘ受容体、カルシウムユニポーター、ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質、ＩＰ３Ｒ、ＴＲＩＣチャネル、リアノジン受容体等が挙げられる。
【０１０８】
電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、脳に多く発現し、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させる電位依存性カルシウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子又はＣａｃｎａ１ｈ遺伝子であることが好ましい。
【０１０９】
ＴＲＰチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１０】
ＳＯＣチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１１】
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１２】
カイニン酸型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１３】
ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子としては、Ｎｒ２ａ遺伝子又はＮｒ２ｂ遺伝子であることが好ましい。
【０１１４】
カルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるカルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｋｃｎｎ２遺伝子又はＫｃｎｎ３遺伝子であることが好ましい。
【０１１５】
ＰＭＣＡをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるＰＭＣＡをコードする遺伝子としては、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子であることが好ましい。
【０１１６】
ＣａＣＡをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１７】
ＨＣＮチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１８】
ＣＮＧチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１１９】
ＴＰＣをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２０】
酸感受性イオンチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２１】
Ｃｙｓ−ｌｏｏｐ受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２２】
Ｐ２Ｘ受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２３】
カルシウムユニポーターをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２４】
ＢＣＬ−２  ｌｉｋｅサブファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２５】
ＩＰ３Ｒをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２６】
ＴＲＩＣチャネルをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２７】
リアノジン受容体をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２８】
［カルシウムの結合により機能を調節されるタンパク質］
細胞質内に存在するカルシウムの結合により機能を調節されるタンパク質としては、例えば、カルモジュリン、カルパイン、カルシニューリン、在来型プロテインキナーゼＣ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ／ｃｌａｓｓｉｃａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ｃ−ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓe；ＣａＭＫ）、ホスホリパーゼＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ；ＰＬＣ）、Ｓ１００Ｂタンパク質等が挙げられる。
【０１２９】
カルモジュリンをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３０】
カルパインをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３１】
カルシニューリンをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３２】
ｃ−ＰＫＣをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３３】
ＣａＭＫをコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させた際に睡眠障害の表現型を顕著に示すことから、遺伝子の機能の全部又は一部を欠損させるカルシウム依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子又はＣａｍｋ２ｂ遺伝子であることが好ましい。
【０１３４】
ＰＬＣをコードする遺伝子としては、例えば、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３５】
Ｓ１００Ｂタンパク質をコードする遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１３６】
本実施形態において、用いられる動物細胞としては、睡眠する動物由来の細胞であれば、特別な限定はない。由来となる動物としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、ヒト由来の細胞も含む。
【０１３７】
細胞の種類としては、細胞質内のカルシウムイオン濃度が測定可能なものであれば、特別な限定はなく、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられる。
【０１３８】
生体を構成する体細胞には、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞、骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、単核細胞等が挙げられる。
【０１３９】
体細胞には、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられる。
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられる。
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞または生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【０１４０】
癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられる。
【０１４１】
本実施形態において、用いられる動物細胞としては、中でも、神経細胞であることが好ましい。
本明細書において、「神経細胞」とは、他の神経細胞或いは刺激受容細胞からの刺激を受け、別の神経細胞、筋或いは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。また、神経細胞は、細胞マーカー（例えば、β−チューブリン等）を発現しているものを意味する。
また、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞は、神経細胞に分化し得る細胞として維持しておき、必要に応じて神経細胞に分化させてもよい。神経細胞に分化されていることは、例えば、抗β−チューブリン抗体により、細胞マーカーであるβ−チューブリンを検出することにより確かめることができる。神経細胞に分化し得る細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の万能細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞等が挙げられる。
【０１４２】
本明細書において、「神経幹細胞」とは、自己複製能を持つだけでなく、中枢神経系を構成する主要な細胞種であるニューロン、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）のいずれにも分化する多分化能を有する幹細胞を意味する。この神経幹細胞から自己複製能を持つ少し分化した前駆細胞が分裂する。さらに、神経前駆細胞からは神経細胞、グリア前駆細胞からはグリア細胞が生み出される。
また、神経細胞に分化し得る細胞は、使用する培地に、神経細胞の分化を誘導する化合物を添加し培養することにより、神経細胞に分化誘導させることができる。また、該化合物を添加することにより、分化の速度をさらに早めることができ、また一定の分化方向に分化を制御することができる。神経細胞の分化を誘導する化合物としては、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、ｄＢｕ−ｃＡＭＰ、スタウロスポリン等が挙げられ、これら２種類以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。
神経細胞の分化を誘導する化合物の濃度は、特に限定されず、１ｎＭ以上１μＭ以下であってよく、５ｎＭ以上５００ｎＭ以下であってよい。上記範囲内であることにより、より効率的に神経細胞に分化し得る細胞から神経細胞へ分化誘導することができる。
【０１４３】
＜睡眠障害評価用動物細胞の作製方法＞
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞は、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）を改変するための公知の遺伝子改変技術を用いて、作製することができる。また、上述の睡眠障害モデル非ヒト動物から採取した細胞、これを株化した細胞を用いることもできる。
また、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞は、野生型の動物細胞に、標的遺伝子（本発明においては、『カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子』）の機能を阻害する化合物を投与することにより、作製することができる。投与する化合物は、標的遺伝子の種類により、適宜選択することができる。例えば、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接結合する阻害剤としては、例えば、ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ（ＰＣＰ）、ＭＫ−８０１等が挙げられる。投与量は、対象となる動物細胞の数、処理時間、阻害剤の種類等を勘案して適宜調節される。投与回数としては、１日平均当たり、１回〜数回投与すればよい。投与形態としては、例えば、培地等に混合する方法が挙げられる。
【０１４４】
［ノックアウト又はノックインによる睡眠障害評価用動物細胞の作製方法］
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞において、標的遺伝子がノックアウトされた動物細胞を作製する場合、又は標的遺伝子に外来遺伝子がノックインされた動物細胞を作製する場合に、用いられる公知の遺伝子改変技術としては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、選択的且つ部位特異的に遺伝子を改変できることから、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞は、従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術を用いて作製することが好ましい。従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術によれば、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞を効率よく得ることができる。
【０１４５】
従来のＣＲＩＳＰＲシステムを活用した遺伝子改変技術を用いて、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞を作製する方法を、以下に詳細に説明する。
【０１４６】
（導入工程）
まず、睡眠障害を評価したい動物由来の細胞（好ましくは、神経細胞）に、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを導入する。ガイドＲＮＡの導入方法としては、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。中でも、操作が簡便であることから、エレクトロポレーション法であることが好ましい。用いられる細胞の由来元となる動物としては、上述の＜＜睡眠障害評価用動物細胞＞＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１４７】
２つ以上の複数の遺伝子を標的遺伝子とする場合は、それぞれの遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むガイドＲＮＡを２種類以上設計し、導入すればよい。これにより、複数の異なる遺伝子又は同一遺伝子内の複数箇所を同時に高効率で編集することができる。
【０１４８】
Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの導入後、前記動物細胞を培養することで、睡眠障害評価用動物細胞を簡便に得ることができる。本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞には、睡眠障害評価用動物細胞を継代培養した細胞も含まれる。
【０１４９】
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞を作製する方法において、標的遺伝子は、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子である。カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子としては、上述の＜＜睡眠障害モデル非ヒト動物＞＞において、例示したものと同様のものが挙げられる。カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子は遺伝子内又は近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。
【０１５０】
また、導入工程において、Ｃａｓ９タンパク質の代わりに、Ｃａｓ９タンパク質をコードする塩基配列からなるＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含むベクターを導入してもよい。
【０１５１】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、特に制限されず、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１５２】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡに作動可能に連結された、プロモーターを含んでいてもよい。プロモーターとしては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１５３】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。その他、Ｃａｓ９タンパク質をコードする塩基配列からなるＲＮＡ或いはｃＤＮＡをさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
【０１５４】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）が作動可能に連結されていてもよい。
【０１５５】
ＮＬＳとしては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１５６】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子が作動可能に連結されていてもよい。蛍光タンパク質としては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１５７】
また、Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターは、該Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡの上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子が作動可能に連結されていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。薬物耐性遺伝子を含むことにより、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、外来遺伝子が導入された細胞を選択することができる。
【０１５８】
導入工程において、ガイドＲＮＡとともに外来遺伝子を導入してもよい。外来遺伝子を一緒に導入することにより、標的遺伝子が切断後、相同組換えにより標的遺伝子は外来遺伝子に置換（ノックイン）され、標的遺伝子の発現の全部又は一部が抑制されることにより、睡眠障害評価用動物細胞を得ることができる。
【０１５９】
外来遺伝子は、該外来遺伝子を含むベクターを用いて導入することが好ましい。使用するベクターとしては、発現ベクターが好ましい。発現ベクターとしては、上述の＜睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
また、外来遺伝子を含むベクターは、外来遺伝子の５’末端及び３’末端に、標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡが連結されていることが好ましい。標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡの塩基数としては、１００塩基以上３００塩基以下であることが好ましい。
外来遺伝子を含むベクターは、さらに、外来遺伝子の５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子、薬剤耐性遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【０１６０】
（切断工程）
受精卵に導入されたＣａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクターから発現されたＣａｓ９タンパク質も含む）と、ガイドＲＮＡとは、温和な条件で混合することで、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成する。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下であればよく、ｐＨは４以上１０以下であればよい。よって、生きた受精卵内においても、前記Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を形成することができる。
【０１６１】
前記Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、ガイドＲＮＡの一部が標的遺伝子に結合し、Ｃａｓ９が標的遺伝子中のＰＡＭ配列を認識する。続いて、３塩基上流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断し、平滑末端を作製する。より具体的には、Ｃａｓ９がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、標的遺伝子の二重らせん構造が引き剥され、ガイドＲＮＡ中の標的遺伝子に相補的な塩基配列とアニーリングすることで、標的遺伝子の二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で、標的遺伝子のリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。
【０１６２】
（改変工程）
続いて、前記ガイドＲＮＡと前記標的遺伝子の相補的結合によって決定される領域において、標的遺伝子の機能の全部或いは一部が破壊（ノックアウト）又は置換（ノックイン）された睡眠障害評価用動物細胞を得ることができる。
【０１６３】
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞が得られたことの確認については、上述の［ノックアウト又はノックダウンによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］において、例示したものと同様の方法が挙げられる。
【０１６４】
［ノックダウンによる睡眠障害評価用動物細胞の作製方法］
また、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞において、標的遺伝子をノックダウンされた動物細胞を作製する場合に、用いられる公知の遺伝子改変技術としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を用いる方法等が挙げられ、これに限定されない。例えば、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで非ヒト動物に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【０１６５】
ＲＮＡｉ誘導性核酸を用いて、本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞を作製する方法を、以下に詳細に説明する。
【０１６６】
（ｓｉＲＮＡの設計）
まず、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを設計する。ｓｉＲＮＡは、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。また、選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８〜３０塩基のもの、或いは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０〜７０％となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。ｓｉＲＮＡは、さらに、選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。また、設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
【０１６７】
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。また、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、２つ以上の標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１６８】
ｓｉＲＮＡ合成法としては、例えば、Ｄｉｃｅｒ法等が挙げられる。Ｄｉｃｅｒ法によるｓｉＲＮＡ合成法は、上述の［ノックダウンによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］に示した通りである。
【０１６９】
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。
【０１７０】
例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２〜１２０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子、又は該遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子をコードする遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８〜５０塩基、好ましくは２１〜３０塩基である。
【０１７１】
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１７２】
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８〜２５塩基（例えば、約２２塩基）である。
【０１７３】
（ｓｉＲＮＡの導入）
続いて、睡眠障害評価を行いたい動物細胞に、設計したｓｉＲＮＡを導入する。導入方法としては、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。中でも、操作が簡便であることから、エレクトロポレーション法であることが好ましい。
【０１７４】
ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを導入してもよい。発現ベクターが好ましい。発現ベクターとしては、上述の「Ｃａｓ９をコードする塩基配列からなるＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、さらに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子、薬剤耐性遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【０１７５】
本実施形態の睡眠障害評価用動物細胞が得られたことの確認については、上述の［ノックアウト又はノックダウンによる睡眠障害モデル非ヒト動物の作製方法］において、例示したものと同様の方法が挙げられる。
【０１７６】
＜＜睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法＞＞
＜睡眠障害モデル非ヒト動物を用いる方法＞
一実施形態において、本発明は、睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、被検化合物の投与下で上述の睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンを測定する測定工程と、測定された前記睡眠パターンが、前記被検化合物の非投与下で測定された前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンと比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、を備える、方法を提供する。
【０１７７】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、睡眠障害の治療に有用な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。また、睡眠障害と密接な関係にある精神疾患や神経変性疾患の治療薬の探索へ貢献することを期待できる。
【０１７８】
睡眠障害と密接な関係にある精神疾患としては、例えば、統合失調症、うつ病、痴呆症、不安障害等が挙げられる。また、睡眠障害と密接な関係にある神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、ハンチントン病等が挙げられる。従って、本実施形態のスクリーニング方法によれば、これらの精神疾患や神経変性疾患の治療に有効な化合物を探索することができる。
【０１７９】
本実施形態のスクリーニング方法について、以下に詳細に説明する。
【０１８０】
［測定工程］
まず、上述の睡眠障害モデル非ヒト動物に被検化合物を投与し、睡眠時に睡眠パターンを測定する。被検化合物の投与量は、対象となる非ヒト動物の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
【０１８１】
睡眠パターンを測定方法としては、例えば、呼吸パターンを測定する方法、脳波及び筋電図の波形を測定する方法、目視により行動を観察する方法等が挙げられる。これらを組み合わせて行い、睡眠パターンを評価してもよい。
【０１８２】
従来では、睡眠パターンの測定は、脳波及び筋電図の波形を測定する方法によってのみ行われており、脳波を取得するための電極を手術によって頭蓋骨に装着する必要があり、侵襲が大きく、多くの時間とコストを要していた。
これに対し、本実施形態において用いられる呼吸パターンを測定する方法（Ｓｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法）（参考文献：Sunagawa, A. G., “Mammalian reverse genetics without crossing reveals Nr3a as a short-sleeper gene”, Cell Reports, 14, 1-16, 2016.）は、非侵襲かつ高効率に睡眠表現型を解析することができる。ＳＳＳ法を用いた睡眠表現型解析は以下の通りである。まず、マウスをチャンバー内に収容する。続いて、マウスに侵襲を加えることなく呼吸パターン（１〜１０Ｈｚの呼吸周波数）を検出する。続いて、検出した呼吸パターンに基づいて、全自動で睡眠及び覚醒の解析（総睡眠時間、睡眠／覚醒振幅、睡眠から覚醒に切り替わる確率（Ｐｓｗ）及び覚醒から睡眠に切り替わる確率（Ｐｗｓ））を行い、簡便に睡眠表現型を得ることができる。「睡眠／覚醒振幅」は、睡眠時間の変動係数であり、毎日の睡眠サイクル内における睡眠時間の変化、すなわち、概日時計の変化に関連している。よって、「睡眠／覚醒振幅」が野生型の非ヒト動物と変わらない場合、概日時計は変化していないと判定することができる。
【０１８３】
被検化合物としては、睡眠障害の治療に有用である可能性がある化合物であればよく、特別な限定はない。また、被検化合物は、経口的投与等、脳内に直接投与されない場合が多いため、血液脳関門（Ｂｒａｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＢＢ）を通過することができると考えられている、約５００ダルトンより小さい親油性分子であることが好ましい。また、被検化合物は、ＢＢＢを通過することができるようなキャリアを備えていてもよい。
また、被検化合物としては、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質を標的とする化合物であることが好ましい。
【０１８４】
［判定工程］
続いて、測定された前記睡眠パターンが、前記被検化合物の非投与下で測定された前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンと比較する。比較した結果、前記被検化合物の投与下における睡眠パターンが変化している場合、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する。
比較対象となる前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンの測定結果は、前記被検化合物投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠パターンの測定と並行して行った試験の測定結果でもよく、独立して行った試験の測定結果でもよい。
また、前記被検化合物の非投与下の試験に使用する前記睡眠障害モデル非ヒト動物は、前記被検化合物の投与下の試験に使用する前記睡眠障害モデル非ヒト動物と、同種、同系統、同腹の動物であること好ましく、さらには、同性、同じ週齢（年齢）の動物であることが好ましい。
【０１８５】
例えば、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間と比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間が長くなっている場合、睡眠作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
一方、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間と比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間が短くなっている場合、覚醒作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
【０１８６】
また、睡眠と覚醒とは互いが拮抗しあう関係にあり、上述のＳＳＳ法では、睡眠から覚醒に切り替わる確率（Ｐｓｗ）及び覚醒から睡眠に切り替わる確率（Ｐｗｓ）を測定することができる。よって、本実施形態のスクリーニング方法における睡眠パターンは、睡眠時間、脳波及び筋電図だけでなく、このＰｓｗ及びＰｗｓも包含する。
【０１８７】
よって、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間と比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物の睡眠時間に変化が見られない場合においても、上述のＰｓｗ又はＰｗｓに変化が見られることで、睡眠障害の治療薬として有用な化合物と判定することができる。
【０１８８】
例えば、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｓｗと比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｓｗが上昇している場合、覚醒作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
一方、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｓｗと比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｓｗが低下している場合、睡眠作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
【０１８９】
また、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｗｓと比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｗｓが上昇している場合、睡眠作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
一方、前記被検化合物の非投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｗｓと比較して、前記被検化合物の投与下における前記睡眠障害モデル非ヒト動物のＰｗｓが低下している場合、覚醒作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
【０１９０】
さらに、うつ病患者のＰｓｗ及びＰｗｓでは、健常者のＰｓｗ及びＰｗｓと比較して、いずれの値も上昇することが知られているため、本実施形態のスクリーニング方法を用いて、いずれの値も低下する化合物を探索することにより、うつ病の治療薬を得ることができる。
また、統合失調症の患者のＰｓｗ及びＰｗｓでは、健常者のＰｓｗ及びＰｗｓと比較して、いずれの値も低下することが知られているため、本実施形態のスクリーニング方法を用いて、いずれの値も上昇する化合物を探索することにより、統合失調症の治療薬を得ることができる。
【０１９１】
＜睡眠障害評価用動物細胞を用いる方法＞
一実施形態において、本発明は、睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、被検化合物の投与下で、野生型の動物細胞又は上述の睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度を測定する測定工程と、測定された前記カルシウムイオン濃度が、前記被検化合物の非投与下で測定された前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞の細胞質内のカルシウムイオン濃度と比較して変化していた場合に、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する判定工程と、を備える、方法を提供する。
【０１９２】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、睡眠障害の治療に有用な化合物を簡便にスクリーニングすることができる。また、睡眠障害と密接な関係にある精神疾患や神経変性疾患の治療薬の探索へ貢献することを期待できる。
【０１９３】
本実施形態のスクリーニング方法について、以下に詳細に説明する。
【０１９４】
［測定工程］
まず、野生型の動物細胞（好ましくは、又は上述の睡眠障害評価用動物細胞（好ましくは、動物細胞は神経細胞である。）に被検化合物を投与し、細胞質中のカルシウムイオン濃度を測定する。被検化合物の投与量は、対象となる動物細胞の数、処理時間等を勘案して適宜調節される。投与回数としては、１日平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。投与形態としては、例えば、培地等に混合する方法が挙げられる。カルシウムイオン濃度を測定するタイミングは、被検化合物の投与直後から２４時間後までであることが好ましい。
【０１９５】
本明細書において、「野生型の動物細胞」とは、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子が正常且つ健常な動物由来の細胞であってもよく、株化された動物細胞であってもよい。野生型の動物細胞の由来となる動物としては、上述の＜＜睡眠障害評価用動物細胞＞＞において、例示されたものと同様のものが挙げられる。また、野生型の動物細胞の種類としては、上述の＜＜睡眠障害評価用動物細胞＞＞において、例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１９６】
使用する培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。培養工程において、培地は細胞の増殖速度に応じて、適宜新しいものに交換すればよい。
【０１９７】
培養条件は、動物細胞の培養に適した条件であれば、特に限定されず、例えば、動物細胞を培地に播種する密度は、１×１００〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０２〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。培養温度は、２５℃以上４０℃以下が好ましく、３０℃以上３９℃以下がより好ましく、３５℃以上３９℃以下がさらに好ましい。培養時間は動物細胞の生育状態によって適宜設定することができる。培養環境は、約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
【０１９８】
カルシウムイオン濃度の測定方法としては、公知の測定方法を用いることができる。公知の測定方法としては、例えば、ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１等のカルシウム指示薬を用いる方法（参考文献：Nature, 290, 527, 1981; J. Cell. Biol., 94, 325, 1982）、カルシウム二価イオン感受性微少電極を用いる方法（参考文献：“Detection and Measurement of Free Ca2+ in cells”, Elsevier, North-Holland, Amsterdam, 1979）、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用する方法、カルシウムイオン感受性発光タンパク質エクオリンを用いる方法（参考文献：Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 229, 1967）等が挙げられる。
【０１９９】
［判定工程］
続いて、測定された前記カルシウムイオン濃度が、前記被検化合物の非投与で測定した前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞と比較する。比較した結果、前記被検化合物の投与下におけるカルシウムイオン濃度が変化している場合、前記被検化合物は睡眠障害の治療に有用な化合物であると判定する。
比較対象となる前記被検化合物の非投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度の測定結果は、前記被検化合物投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度の測定と並行して行った試験の測定結果でもよく、独立して行った試験の測定結果でもよい。
また、前記被検化合物の非投与下の試験に使用する前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞は、前記被検化合物の投与下の試験に使用する前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞と、同種の動物由来であることが好ましく、さらには、同じ培養日数、同じ継代回数であることが好ましい。
【０２００】
例えば、前記被検化合物の非投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度と比較して、前記被検化合物の投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度が高くなって場合、睡眠作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
一方、前記被検化合物の非投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度と比較して、前記被検化合物の投与下における前記野生型の動物細胞又は前記睡眠障害評価用動物細胞のカルシウムイオン濃度が低くなっている場合、覚醒作用のある薬として有用な化合物と判定することができる。
【０２０１】
本実施形態のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで簡便に多数の被検化合物を評価することができるため、動物実験を行う前段階の予備的なスクリーニング方法として有用である。
【０２０２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２０３】
［実施例１］
（１）コンピュータモデルによる候補遺伝子の選定
睡眠時に観察される特徴的な脳波である徐波形成に必要な遺伝子を特定するために、平均場近似（多数の要素が相互作用しているような集団を解析するために用いられる数学的な近似手法）を施したコンピュータモデルを作製し、神経細胞の細胞膜上に存在するイオンチャネル（図３、参照）の開閉及び該イオンチャネルのノックアウトモデルをシミュレーションし、解析した。その結果、カルシウムイオンの流入に伴う神経細胞の過分極／脱分極が徐波形成に極めて重要であるが明らかとなった。さらに、この徐波形成に必要なカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子のうち、７遺伝子（Ｃａｍｋ２ａ遺伝子、Ｃａｍｋ２ｂ遺伝子、Ｋｃｎｎ２遺伝子、Ｋｃｎｎ３遺伝子、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子、Ｃａｃｎａ１ｈ遺伝子、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子）を選定した。
【０２０４】
（２）ノックアウトマウスの作製
上記（１）で選定された７遺伝子のノックアウトマウスを作製した。作製方法は以下の通りである。なお、使用したマウスは全て、１２時間明所、１２時間暗所のサイクル下で飼育した。
【０２０５】
（２−１）ガイドＲＮＡの設計
上記（１）で選定された７遺伝子のガイドＲＮＡをオンラインＣＲＩＳＰＲ  ガイドＲＮＡデザインツール（http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp）、又はｍｍ１０ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９データベース（http://www.crispr.riken.jp/）を用いて、設計した。また、各標的遺伝子におけるマウスゲノム内のオフターゲット配列をＣＲＩＳＰＲデザインツール（http://tools.genome-engineering.org）を用いて、確認した。
【０２０６】
（２−２）ガイドＲＮＡの合成
まず、上記（１）で選定された７遺伝子を含むｐＸ３３０  ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃４２２３０）から一般的なリバースプライマー（配列番号１７：５’−ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣ−３’）及びフォワードプライマー１（下記、表２参照。）を用いて、ＰＣＲにより各７遺伝子の標的配列を含むガイドＲＮＡの部分断片を増幅した。Ａｔｐ２ｂ３については、Ｓｅｔ１及びＳｅｔ２の２種類のフォワードプライマーを用いて、それぞれ標的配列を含むガイドＲＮＡを増幅した。
【０２０７】
【表２】
2017158528.tif 000003
【０２０８】
続いて、Ｔ７プロモーターが融合した各ガイドＲＮＡ鋳型は、上述の一般的なリバースプライマー（配列番号１７：５’−ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣ−３’）及びフォワードプライマー２（下記、表３参照。）を用いて、ＰＣＲにより増幅し、ガイドＲＮＡを得た。続いて、Ｔ７プロモーターが融合した各ガイドＲＮＡを鋳型として、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｔ７  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いたインビトロ転写を行い、ガイドＲＮＡを得た。得られたガイドＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いて精製した。
【０２０９】
【表３】
2017158528.tif 000004
【０２１０】
（２−３）Ｃａｓ９ｍＲＮＡの合成
Ｔ７プロモーターと融合したＣａｓ９のコード領域を含むｐ３ｓ−Ｃａｓ９ＨＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃４３９４５）をＸｂａＩ（タカラ社製）で線状化し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｔ７  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いたインビトロ転写を行い、Ｃａｓ９ｍＲＮＡを得た。得られたＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いて精製した。
【０２１１】
（２−４）受精卵へのマイクロインジェクション
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウス（４〜６週齢、日本クレア社製）と、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウス（日本クレア社製）とを交配させた。続いて、顕微解剖により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスの卵管から受精卵を採取した。続いて、採取した受精卵は、ＫＳＯＭ培地（メルクミリポア社製又はＡＲＫリソース社製）を用いて、５％二酸化炭素環境下において、３７℃で維持培養した。続いて、採取した受精卵をＭ２培地（メルクミリポア社製又はＡＲＫリソース社製）に移し、室温で、受精卵の細胞質に（２−２）及び（２−３）で得られた各ガイドＲＮＡ（１５０ｎｇ／μＬ）、並びにＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）を同時に注入した。細胞質への注入方法としては、公知の方法（参考文献：Sumiyama, K., et al., “A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection”, Genomics 95, 306-311, 2010.）を参考にして行った。
マイクロインジェクション後、受精卵をＫＳＯＭ培地（メルクミリポア社製又はＡＲＫリソース社製）を用いて、５％二酸化炭素環境下において、３７℃で１時間培養した。１５〜３０個の受精卵を、雌の偽妊娠ＩＣＲマウスの卵管に移植し、睡眠障害モデルマウスのＦ１世代を得た。
【０２１２】
（２−５）ノックアウトの確認
上記（１）で選定された７遺伝子のノックアウトの確認を行った。まず、野生型マウス及びノックアウトマウスの尾静脈から血液を採取し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、取扱い説明書に従い、血液からゲノムＤＮＡを得た。続いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００／ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＧＣ（タカラ社製）を用いた定量ＰＣＲを行った。使用したプライマーを表４に示す。野生型マウスのゲノムＤＮＡを用いて、検量線を作成した。また、マウスのハウスキーピング遺伝子であるＴｂｐの量を定量し、内部対照とした。
【０２１３】
【表４】
2017158528.tif 000005
【０２１４】
定量ＰＣＲにより、ノックアウトした遺伝子は検出されなかった。さらに、ノックアウトされていることを確実にするために、Ｋｃｎｎ２遺伝子、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子（Ｓｅｔ２を用いてノックアウトしたもの）、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子及びＣａｍｋ２ｂ遺伝子については、第２の定量ＰＣＲを行った。使用したプライマーを表５に示す。
【０２１５】
【表５】
2017158528.tif 000006
【０２１６】
第２の定量ＰＣＲにおいても、ノックアウトした遺伝子は検出されなかった。続いて、さらに、ノックアウトされていること確実にするために、Ｋｃｎｎ２遺伝子、Ｃａｃｎａ１ｈ遺伝子及びＣａｍｋ２ａ遺伝子について、遺伝子座のシークエンシングを行った。まず、表６に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより該遺伝子座の領域を含むゲノムＤＮＡを増幅した。
【０２１７】
【表６】
2017158528.tif 000007
【０２１８】
続いて、得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、シークエンスを行った。シークエンスの結果、ノックアウトした遺伝子の塩基配列が欠損していることが確かめられた。
【０２１９】
［試験例１］
実施例１で得られた８種のノックアウトマウスにおける睡眠パターンを測定した。
【０２２０】
（１）Ｓｎａｐｐｙ  Ｓｌｅｅｐ  Ｓｔａｇｅｒ（ＳＳＳ）法による睡眠パターンの測定
実施例１で作製した８種のノックアウトマウスについて、ＳＳＳ法（参考文献：Sunagawa, A. G., “Mammalian reverse genetics without crossing reveals Nr3a as a short-sleeper gene”, Cell Reports, 14, 1-16, 2016.）を用いて睡眠パターンを測定した。
まず、実施例１で作製した８種のノックアウトマウスをそれぞれ５〜１０匹ずつチャンバー内に収容した。続いて、７日間、マウスに侵襲を加えることなく、ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ（ＷＢＰ）システムを用いて、呼吸パターン（１〜１０Ｈｚの呼吸周波数）を検出した。
続いて、検出した呼吸パターンに基づいて全自動で睡眠及び覚醒の解析を行い、睡眠時間、睡眠／覚醒振幅、Ｐｗｓ及びＰｓｗを得た。結果を図４（Ａ）、図５〜７に示す。図４（Ａ）は、Ｋｃｎｎ２遺伝子及びＫｃｎｎ３遺伝子をノックアウトしたマウスにおける睡眠パターンを示すグラフである。図５〜７はそれぞれ、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子、Ｃａｃｎａ１ｈ遺伝子、Ａｔｐ２ｂ３遺伝子（Ｓｅｔ１及びＳｅｔ２のガイドＲＮＡを用いてノックアウトしたもの）、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子及びＣａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスにおける睡眠パターンを示すグラフである。各図中の「Ｓｌｅｅｐ  ｔｉｍｅ」とは総睡眠時間を示し、「Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ」とは、睡眠／覚醒の振幅を示し、睡眠時間の変動係数である。睡眠／覚醒振幅は、毎日の睡眠サイクル内における睡眠時間の変化、すなわち、概日時計の変化に関連している。また、「Ｐｓｗ」は睡眠から覚醒に切り替わる確率を示し、「Ｐｗｓ」は覚醒から睡眠に切り替わる確率を示している。
【０２２１】
図４（Ａ）から、Ｋｃｎｎ２遺伝子及びＫｃｎｎ３遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、睡眠時間が短くなることが明らかとなった。Ｋｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が６０６．３±１４．７分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝５）であり、野生型のマウスより１２９．３分（〜２．６Ｓ．Ｄ．）睡眠時間が短かった。また、Ｋｃｎｎ３遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が６２９．１±１１．８分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝６）であり、野生型のマウスより１０６．６分（〜２．１Ｓ．Ｄ．）睡眠時間が短かった。
また、Ｋｃｎｎ２遺伝子及びＫｃｎｎ３遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、Ｐｗｓの値が低い傾向であり、Ｐｓｗの値がやや高い傾向であることから、覚醒状態が優位であると推察された。
【０２２２】
図５から、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子及びＣａｃｎａ１ｈ遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、睡眠時間が短くなることが明らかとなった。Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が６５５．１±１３．４分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝１０）であり、野生型のマウスより８０．５分（１．５９Ｓ．Ｄ．、ｐ＜０．００１）睡眠時間が短かった。また、Ｃａｃｎａ１ｈ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が６４７．６±２０．１分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝５）であり、野生型のマウスより８８．１分（１．７３Ｓ．Ｄ．、ｐ＜０．００１）睡眠時間が短かった。
また、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子及びＣａｃｎａ１ｈ遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、Ｐｗｓの値が低い傾向であり、覚醒状態が優位であると推察された。
【０２２３】
図６から、Ｓｅｔ１及びＳｅｔ２のガイドＲＮＡを用いてＡｔｐ２ｂ３遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、睡眠時間が長くなることが明らかとなった。Ｓｅｔ１のガイドＲＮＡを用いてＡｔｐ２ｂ３遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が７７７．８±８．５分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝１２）であり、野生型のマウスより５３．６分（〜１．０７Ｓ．Ｄ．、ｐ＜０．０５）睡眠時間が長かった。
また、Ｓｅｔ１及びＳｅｔ２のガイドＲＮＡを用いてＡｔｐ２ｂ３遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、Ｐｓｗの値がやや低い傾向であり、睡眠状態が優位であると推察された。
【０２２４】
図７から、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子及びＣａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、睡眠時間が短くなることが明らかとなった。Ｃａｍｋ２ａ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が６４８．８±２９．５分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝６）であり、野生型のマウスより５０．１分（１．２７Ｓ．Ｄ．、ｐ＜０．００１）睡眠時間が短かった。また、Ｃａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、睡眠時間が５７８．６±１４．７分（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝５）であり、野生型のマウスより１２０．３分（３．０４Ｓ．Ｄ．、ｐ＜０．００１）睡眠時間が短かった。
また、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子及びＣａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、Ｐｗｓの値が低い傾向であり、Ｐｓｗの値がやや低い傾向であることから、覚醒状態が優位であると推察された。特に、Ｃａｍｋ２ｂ遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、Ｐｗｓの値が低い傾向が顕著であり、そのため、Ｃａｍｋ２ａ遺伝子をノックアウトしたマウスよりも睡眠時間がより短かったものと考えられた。
【０２２５】
以上のことから、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子をノックアウトすることにより、睡眠障害モデルマウスを得られることが明らかとなった。
【０２２６】
（２）脳波及び筋電図による睡眠パターンの測定
遺伝子のノックアウトが呼吸パターンの表現型に影響を与える可能性を排除するために、従来の睡眠パターンの測定方法である基礎ＥＥＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、脳波（脳電図））／ＥＭＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ、筋電図）の測定を行った。
まず、野生型のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、日本クレア社製）（ｎ＝３）及び実施例（１）で作製したＫｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウス（ｎ＝７）を用いて、公知の方法（参考文献：Sunagawa, A. G., “FASTER: an unsupervised fully automated sleep staging method for mice”, Genes to Cells, 18, 502-518, 2013.）であるＦＡＳＴＥＲ法に基づき、６日間、基礎ＥＥＧ／ＥＭＧの測定を行った。結果を図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）において、「Ｓｌｅｅｐ  ｄｕｒａｔｉｏｎ」とは総睡眠時間を示し、「ＮＲＥＭ  ｄｕｒａｔｉｏｎ」はノンレム睡眠期間を示し、「ＲＥＭ  ｄｕｒａｔｉｏｎ」はレム睡眠期間を示している。
【０２２７】
図４（Ｂ）から、Ｋｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、野生型のマウスと比較して、総睡眠時間の有意な減少に加えて、ノンレム睡眠期間が有意に減少することが明らかとなった。
さらに、野生型のマウス及びＫｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウスについて、睡眠不足試験後（Ａｆｔｅｒ  ｓｌｅｅｐ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ（Ａｆｔｅｒ  ＳＤ））の睡眠パターンを計測した（図４（Ｂ）の「Ａｆｔｅｒ  ＳＤ」参照。）。
その結果、野生型のマウスでは、ノンレム睡眠期間が通常の計測結果と比較して有意に上昇したのに対し、Ｋｃｎｎ２遺伝子をノックアウトしたマウスでは、ノンレム睡眠期間に変化が見られなかった。
【０２２８】
以上のことから、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子のノックアウトは呼吸パターンの表現型に影響を与えず、睡眠障害を引き起こすことが示唆された。
【０２２９】
［試験例２］
（１）Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体阻害剤の投与
野生型のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、日本クレア社製）の腹腔内に、２００μＬの生理食塩水に０ｍｇ／ｋｇ、１３．３ｍｇ／ｋｇ若しくは２６．７ｍｇ／ｋｇとなるように溶解したｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ（ＰＣＰ）塩酸塩（既報に従い合成。参考文献：Prashad, M., et al., “1,2,3-Triazole as a safer and practical substitute for cyanide in the Bruylants reaction for the synthesis of tertiary amines containing tertiary alkyl or aryl groups”, Tetrahedron Letters 46, 5455-5458, 2005.）、又は２００μＬの生理食塩水に０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ若しくは２０ｍｇ／ｋｇとなるように溶解したＭＫ−８０１マレイン酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログＮｏ．０９２４、ロットＮｏ．９Ａ／１５１９１５）をそれぞれ注射した。
ＰＣＰ塩酸塩は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に直接結合し、機能を阻害する阻害剤であり、ＭＫ−８０１マレイン酸塩は、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のうちＧｌｕＮ２Ａ（Ｎｒ２ａ）及びＧｌｕＮ２Ｂ（Ｎｒ２ｂ）に特異的に結合し、機能を阻害する阻害剤である。
【０２３０】
（２）ＳＳＳ法による睡眠パターンの測定
続いて、試験例１の（１）と同様の方法を用いて、睡眠パターンを検出した。
続いて、検出した呼吸パターンに基づいて全自動で睡眠及び覚醒の解析を行い、睡眠時間、振幅、Ｐｗｓ及びＰｓｗを得た。結果を図８（Ａ）（ＰＣＰ塩酸塩投与群）及び（Ｂ）（ＭＫ−８０１マレイン酸塩投与群）に示す。
【０２３１】
図８（Ａ）及び（Ｂ）から、ＰＣＰ塩酸塩又はＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度依存的に、睡眠時間が短くなることが明らかとなった。また、ＰＣＰ塩酸塩又はＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度依存的に、Ｐｗｓの値が低くなり、Ｐｓｗの値が高くなっており、ＰＣＰ塩酸塩又はＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度の上昇に伴い、覚醒状態が優位になると推察される。
【０２３２】
（３）脳波及び筋電図による睡眠パターンの測定
続いて、ＭＫ−８０１マレイン酸塩を２ｍｇ／ｋｇ投与した野生型マウスを用いて、試験例１の（２）と同様の方法を用いて、睡眠パターンを検出した。結果を図８（Ｃ）に示す。
【０２３３】
図８（Ｃ）から、ＭＫ−８０１マレイン酸塩を２ｍｇ／ｋｇ投与した野生型マウスにおいて、ＭＫ−８０１マレイン酸塩を非投与である野生型マウスと比較して、総睡眠時間の有意な減少に加えて、ノンレム睡眠期間が有意に減少することが明らかとなった。
【０２３４】
以上のことから、カルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質の一つであるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体は、睡眠覚醒に関与していることが確かめられた。また、ＰＣＰ又はＭＫ−８０１のようなカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質に直接作用する化合物を投与することにより、睡眠障害の治療薬のスクリーニングを行うことができることが示唆された。
【０２３５】
［試験例３］
（１）ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体阻害剤の投与
薬物の長期治療による影響を検証するために、野生型のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、日本クレア社製）の飲用水に、ＭＫ−８０１マレイン酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログＮｏ．０９２４、ロットＮｏ．９Ａ／１５１９１５）を０ｍｇ／Ｌ、１６ｍｇ／Ｌ、３２ｍｇ／Ｌ、６４ｍｇ／Ｌ及び９６ｍｇ／Ｌとなるように希釈し、７日間与えた。
【０２３６】
（２）ＳＳＳ法による睡眠パターンの測定
続いて、試験例１の（１）と同様の方法を用いて、睡眠パターンを検出した。
続いて、検出した呼吸パターンに基づいて全自動で睡眠及び覚醒の解析を行い、睡眠時間、振幅、Ｐｗｓ及びＰｓｗを得た。結果を図９に示す。
【０２３７】
図９から、ＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度依存的に、睡眠時間が短くなることが明らかとなった。また、ＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度依存的に、Ｐｗｓの値が低くなり、Ｐｓｗの値がやや低くなっており、ＭＫ−８０１マレイン酸塩の濃度の上昇に伴い、覚醒状態が優位になると推察される。
【０２３８】
以上のことから、ＭＫ−８０１のようなカルシウムイオン依存性過分極／脱分極経路に関連する遺伝子がコードするタンパク質に直接作用する化合物を投与することにより、睡眠障害の治療薬のスクリーニングを行うことができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０２３９】
本発明によれば、簡便に作製でき、安定した睡眠パターンの表現型を呈する睡眠障害モデル非ヒト動物を提供することができる。さらに、前記睡眠障害モデル非ヒト動物を用いることにより、睡眠障害の原因解明、治療薬の探索の効率を飛躍的に向上させることができる。また、睡眠障害と密接な関係にある精神疾患や神経変性疾患の原因解明、治療薬の探索へ貢献することを期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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