(57)【要約】【課題】  新しい非蛍光性タンパク質、及びそれを利用した移植方法を提供する。【解決手段】  蛍光性タンパク質であるmonomeric Plumの変異体であって、（１）monomeric Plumと同じ抗原性を示す、（２）実質的に非蛍光性である、（３）monomeric Plumのアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である、といった特徴を有するmonomeric Plumの変異体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質の変異体であって、以下の特徴を有する蛍光性タンパク質の変異体、
（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、
（２）実質的に非蛍光性である、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。
【請求項２】
チロシン以外のアミノ酸が、グリシンであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光性タンパク質の変異体。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の蛍光性タンパク質の変異体。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現することを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物が、ブタであることを特徴とする請求項６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法であって、移植ドナーとする非ヒトクローン哺乳動物が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物であり、移植レシピエントとする非ヒトクローン哺乳動物が請求項１乃至３のいずれか一項に記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物であることを特徴とする非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。
【請求項９】
非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする請求項８に記載の非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法、
（１）核ドナー細胞を調製し、その核ドナー細胞に請求項５に記載のベクターを導入し、請求項４に記載の遺伝子を発現させる工程、
（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、
（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、非ヒトクローン哺乳動物を得る工程。
【請求項１１】
非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする請求項１０に記載の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光タンパク質と同じ抗原性を示す非蛍光性タンパク質、前記非蛍光性タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、前記非蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物、前記非蛍光性タンパク質を利用した非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法、及び前記蛍光タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
移植医学研究において、蛍光タンパク質は移植されたドナー細胞、組織、臓器の追跡マーカーとして非常に有用である。遺伝的均一性の高い近交系動物間の移植では拒絶反応は起きにくいが、移植ドナーが蛍光タンパク質を発現する場合は、蛍光タンパク質がレシピエント体内で抗原となり、拒絶反応を起こす。このような拒絶反応は、移植片の生着率の低下を招き、移植実験の成否や正確な評価に影響をきたす。
【０００３】
蛍光タンパク質の蛍光を消失させた変異体を発現させた動物は、蛍光タンパク質に対し免疫寛容となる。このため、このような動物をレシピエントとした移植方法が以前から提案されている（特許文献１）。例えば、特許文献１には、GFPのアミノ酸配列における67位のチロシンをアラニンに置換し、GFPと同じ抗原性を示し、蛍光を発しない変異体を作製することが記載されており、また、この変異体を発現するマウスに、GFPを発現するマウスの細胞を移植する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2008-245522号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１では、蛍光タンパク質としてGFPが使われているが、GFPは自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の影響を受けやすいという問題がある。また、特許文献１では、近交系動物間で移植を行っているが、このような移植法では、ドナーとレシピエントの遺伝的バックグラウンドが完全に一致していないという問題がある。更に近交系が確立されていない動物間ではこのような移植法は適用できないという問題もある。
【０００６】
本発明は、以上のような従来技術の問題を解決し、新しい非蛍光性タンパク質、及びそれを利用した移植方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、非蛍光化する蛍光タンパク質としてGFPの代わりに遠赤色蛍光を発するmonomeric Plumを使用することにより、自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の問題を解決できるという着想を得て、この着想をもとにさらに研究を進めた。その結果、monomeric Plumのアミノ酸配列における68番目のチロシンをグリシンに置換することにより、monomeric Plumと同じ抗原性を維持しつつ蛍光を消失させ得ることを見出した。また、この非蛍光性タンパク質を利用した移植を、特許文献１のように、近交系動物間で行うのではなく、クローン動物間で行うことにより、monomeric Plum遺伝子を除いて、ドナーとレシピエントの遺伝的バックグラウンドを完全に一致させ得ることを見出した。
【０００８】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１１〕を提供する。
〔１〕配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質の変異体であって、以下の特徴を有する蛍光性タンパク質の変異体、
（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、
（２）実質的に非蛍光性である、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。
【００１０】
〔２〕チロシン以外のアミノ酸が、グリシンであることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光性タンパク質の変異体。
【００１１】
〔３〕配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光性タンパク質の変異体。
【００１２】
〔４〕〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子。
【００１３】
〔５〕〔４〕に記載の遺伝子を含むベクター。
【００１４】
〔６〕〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現することを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【００１５】
〔７〕非ヒト哺乳動物が、ブタであることを特徴とする〔６〕に記載の非ヒト哺乳動物。
【００１６】
〔８〕非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法であって、移植ドナーとする非ヒトクローン哺乳動物が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物であり、移植レシピエントとする非ヒトクローン哺乳動物が〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物であることを特徴とする非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。
【００１７】
〔９〕非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする〔８〕に記載の非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。
【００１８】
〔１０〕以下の工程を含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法、
（１）核ドナー細胞を調製し、その核ドナー細胞に〔５〕に記載のベクターを導入し、〔４〕に記載の遺伝子を発現させる工程、
（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、
（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、非ヒトクローン哺乳動物を得る工程。
【００１９】
〔１１〕非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする〔１０〕に記載の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、monomeric Plumを発現する細胞、組織、臓器を移植しても、拒絶反応を起こさない非ヒト哺乳動物が提供される。monomeric Plumは自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の影響を受けにくく、移植細胞等の追跡用マーカーとして優れている。従って、monomeric Plumを発現する細胞等に対して拒絶反応を起こさない前記非ヒト哺乳動物は、移植実験用動物として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】改変されたPlum（mPlum）タンパク質発現ベクター及びmPlum導入遺伝子で形質転換されたブタ胎仔線維芽細胞（PFF）。（Ａ）mPlum発現ベクター（pCX-mPlum-puroR）の構造。mPlum cDNAにおいて、68番目のアミノ酸をコードするTAC（チロシン）がGGC（グリシン）に置き換えられた（Y68G）。（Ｂ−Ｄ、Ｂ’−Ｄ’）野生型ブタ胎仔線維芽細胞（WT-PFFs; Ｂ、Ｂ’）、pCX-Plum-puroRでトランスフェクトされたPFFs（Plum-PFFs; Ｃ、Ｃ’)、及びpCX-mPlum-puroRでトランスフェクトされたPFFs（mPlum-PFFs; Ｄ、Ｄ’）の明視野（Ｂ−Ｄ）および蛍光像（Ｂ’−Ｄ’）。Plum-PFFsが赤色蛍光を示したのに対し（Ｃ、Ｃ’)、mPlum-PFFsは蛍光を発しなかった（Ｄ、Ｄ’）。図中のスケールバーは200μmである。
【図２】核ドナーとしてmPlum-PFFsを用いた体細胞核移植胚。（Ａ−Ｃ、Ａ’−Ｃ’）核移植胚から発生した胚盤胞の形態。クローン胚盤胞の明視野（Ａ−Ｃ）及び蛍光像（Ａ’−Ｃ’）。（Ａ、Ａ’）WT-PFFsで再構成したクローン胚盤胞（励起下で蛍光を示さない）。（Ｂ、Ｂ’）Plum-PFFsを用いて作製したクローン胚盤胞（赤色蛍光を発する）。これらの写真は、本発明者の以前の研究（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）で作製されたクローン胚盤胞の未発表写真である。（Ｃ、Ｃ’）mPlum-PFFsを用いて得られたクローン胚盤胞（励起下で蛍光を示さない）。図中のスケールバーは100μmである。（Ｄ）核ドナーとしてmPlum-PFFsを使用して作製されたクローン胚盤胞（N=10）の遺伝子型。単為生殖胚（胚盤胞）を野生型コントロール（N=4）として使用した。矢頭は検出されたバンドを示す。
【図３】mPlum-PFFsで再構成された核移植胚から発生したクローン胎仔の分析。（Ａ−Ｃ、Ａ’−Ｃ’）クローン胎仔の明視野（Ａ−Ｃ）及び蛍光像（Ａ’−Ｃ’）。（Ａ、Ａ’）WT-PFFsから作製されたクローン胎仔。これらの写真は、本発明者らの別の研究（未発表）で作製された年齢をマッチさせたクローン胎仔の未発表写真である。（Ｂ、Ｂ’）Plum-PFFsから発生したクローン胎仔。これらの写真は、本発明者らの以前の研究（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）で作製された年齢をマッチさせたクローン胎仔の未発表写真である。（Ｃ、Ｃ’）mPlum-PFFsから作製されたクローン胎仔。スケールバーは5mmである。（Ｄ）mPlum-PFFsから発生したクローン胎仔のサザンブロット分析。各胎仔に組み込まれた導入遺伝子のコピー数を、対照レーンのバンド強度と比較することによって定義した。（Ｅ）mPlum-PFFsから作製されたクローン胎仔から樹立した線維芽細胞のウェスタンブロット分析。βアクチンを対照として使用した。Ｎ：WT-PFFsを陰性対照として使用した。Ｐ：本発明者らの以前の研究（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）でPlum遺伝子を有するクローン胎仔から樹立された細胞を陽性対照として使用した。矢頭は、予測されたバンドを示す。（Ｆ−Ｈ、Ｆ’−Ｈ’）Ａ−Ｃにおける野生型の胎仔（Ｆ、Ｆ’）、Plum遺伝子を有するトランスジェニック胎仔（Ｇ、Ｇ’）、及びmPlumトランスジェニック胎仔（Ｈ、Ｈ’）から確立された線維芽細胞の明視野（Ｆ−Ｈ）及び蛍光像（Ｆ’−Ｈ’）。スケールバーは100μmである。（Ｉ）野生型胎仔（上）、Plumトランスジェニック胎仔（中央）、及びmPlumトランスジェニック胎仔（下）から確立された線維芽細胞のフローサイトメトリー分析。X軸及びY軸は、それぞれ、蛍光強度及び細胞数を示す。
【図４】mPlum-PFFsから作製されたmPlumトランスジェニッククローン胎仔から確立された線維芽細胞のCAGプロモーターのDNAメチル化解析。白及び黒の円は、それぞれ、非メチル化及びメチル化CpGを示す。
【図５】核ドナーとしてNeomPlum-PFFs-2から作製されたクローン子豚の表現型解析。（Ａ）mPlum遺伝子を有するトランスジェニッククローン子孫のPCR分析。Ｎ：陰性対照（WT）。Ｐ：陽性対照（mPlum発現ベクター; pCX-mPlum-puroR）。矢頭は検出されたバンドを示す。（Ｂ）トランスジェニッククローン子孫のウェスタンブロット分析。βアクチンを対照として使用した。Ｎ：陰性対照（WT）。Ｐ：陽性対照（Plum遺伝子を有するトランスジェニッククローンブタの細胞（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）を用いた。）。矢頭は検出されたバンドを示す。（Ｃ）野生型（上）、Plumトランスジェニック（中央）、及びmPlumトランスジェニックの子孫（下）から得られたリンパ球のフローサイトメトリー分析。X軸及びY軸は、それぞれ、蛍光強度及び細胞数を示す。（Ｄ−Ｉ’）野生型（上）、Plumトランスジェニック（中央）、及びmPlumトランスジェニックブタ（下）の腎臓（Ｄ−Ｆ’）及び心臓（Ｇ−Ｉ’）の組織のHE及び免疫組織化学染色。mPlumトランスジェニッククローンブタの組織（Ｆ’、Ｉ’）は、Plum遺伝子を発現する組織（Ｅ’、Ｈ’）と同様に、ポジティブな抗DsRed抗体染色を示した。図中のスケールバーは100μmである。
【図６】Plum遺伝子を発現するトランスジェニッククローン子孫の種々の組織における蛍光発現の分析。野生型ブタ、Plumトランスジェニックブタ（Plum）、及びmPlumトランスジェニックブタ（mPlum）の組織を、左レーン、中央レーン、及び右レーンの各パネルに示した。mPlumトランスジェニックブタの組織は励起下で蛍光を示さない。図中のスケールバーは5mmである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）蛍光性タンパク質の変異体
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質の変異体であって、（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、（２）実質的に非蛍光性である、及び（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である、という特徴を有するものである。
【００２３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質は、monomeric Plum又は単にPlumと呼ばれる遠赤色蛍光を発する蛍光性タンパク質である。この蛍光性タンパク質は、サンゴ（Discosoma sp.）由来の赤色蛍光タンパク質であるDsRedの変異体である。この蛍光性タンパク質をコードするcDNAを含むベクターは、タカラバイオ社から販売されている。
【００２４】
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質（monomeric Plum）と同じ抗原性を示す。従って、本発明の変異体を発現する動物に、monomeric Plumを発現する細胞等を移植しても、その動物の体内にmonomeric Plumに対する抗体は産生されないと考えられる。monomeric Plumと同じ抗原性を示すかどうかは、本発明の変異体を発現する動物に、monomeric Plumを発現する細胞等を移植し、その動物の体内にmonomeric Plumに対する抗体が産生されるかどうか調べる方法、あるいは移植した細胞等の増殖性を調べる方法などにより判断できる。また、monomeric Plumと特異的に結合する抗体（例えば、タカラバイオ社ら販売されている抗DsRed抗体など）を用いたウェスタンブロッティングなどによってもmonomeric Plumと同じ抗原性を示すかどうかを判断することができる。
【００２５】
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、実質的に非蛍光性である。本明細書において「実質的に非蛍光性」とは、蛍光顕微鏡で実質的に蛍光が観察されないことをいう。具体的には、monomeric Plumと比較して蛍光強度が１％以下のような場合は、「実質的に非蛍光性」に該当する。
【００２６】
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。「配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸」とは、アミノ酸配列の同一性に基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列（monomeric Plumのアミノ酸配列）と整列させた場合に、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸を意味する。「チロシン以外のアミノ酸」は特に限定されないが、分子量の小さいアミノ酸が好ましく、グリシンが特に好ましい。
【００２７】
本発明の蛍光性タンパク質の変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸であり、かつ、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるものであれば特に限定されない。最も好ましいアミノ酸としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列（即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンをグリシンに置き換えたアミノ酸配列）を挙げることができるが、これ以外のアミノ酸配列であってもよい。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、68番目のグリシンがチロシンに置換されることはない）からなり、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるアミノ酸配列であってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、本発明の蛍光性タンパク質の変異体のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と高い同一性を示すアミノ酸配列（但し、68番目のグリシンがチロシンに置換されることはない）であって、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるアミノ酸配列であってもよい。ここでいう「高い同一性」とは、通常９５％以上の同一性、好ましくは９７％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００２８】
（Ｂ）蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物
本発明の非ヒト哺乳動物は、上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現することを特徴とするものである。
【００２９】
本発明の非ヒト哺乳動物は、主に移植実験のレシピエントとして用いられるので、ドナーとなる遺伝的に同一又は均質な個体の存在が前提となる。このため、本発明の非ヒト哺乳動物は、近交系動物又はクローン動物であることが好ましく、クローン動物であることが特に好ましい。クローン動物は、遺伝的に同一な個体を多数得ることのできる体細胞核移植によって得られるものが好ましい。本発明者らは、以前に、Plumを発現するトランスジェニッククローンブタを作製する方法について発表しているので（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）、体細胞核移植によって得られるクローン動物は、この方法に従って作製することができるが、他の方法に従って作製してもよい。
【００３０】
体細胞核移植によるクローン動物の作製方法としては、例えば、（１）核ドナー細胞を調製する工程、（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、及び（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、クローン動物を得る工程を含む方法を示すことができる。
【００３１】
工程（１）で使用する核ドナー細胞はクローン動物の作製に一般的に用いられているものでよく、例えば、胎仔線維芽細胞、唾液腺幹細胞、卵管由来線維芽細胞などを使用することができ、これらの中でも胎仔線維芽細胞を使用するのが好ましい。これらの細胞は公知の方法によって調製することができる。調製した核ドナー細胞は、細胞周期を休止期に誘導する。休止期への誘導は、血清飢餓培養法（Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.）、接触阻止法（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）などにより行うことができ、核ドナー細胞として胎仔線維芽細胞を用いた場合には、血清飢餓培養法によって行うのが好ましい。
【００３２】
工程（２）におけるレシピエント卵の除核は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、Polejaeva IAらの文献 （Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）に記載されている方法などを挙げることができる。
【００３３】
工程（２）で使用するレシピエント卵は、ヒト以外の哺乳動物の卵であればどのようなものでもよいが、工程（１）で調製する核ドナー細胞と同じ種類の動物の卵を用いるのが好ましい。また、除核は未受精卵に対して行うことが好ましく、特に第一極体の放出後の成熟卵に対して行うのが好ましい。
【００３４】
工程（３）におけるレシピエント卵と核ドナー細胞の融合は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気融合法、注入法などによって行うことができる。電気融合法は、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）の記載に従って行うことができ、注入法はOnishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）の記載に従って行うことができる。電気融合法による電気刺激は、核ドナー細胞の核が卵に移植され、正常な胚が形成され得る範囲内であれば特に限定されないが、例えば、直流パルスであれば電圧は100〜300V/mm、時間は10〜30 micro-sec、回数は1〜3回とするのが好ましく、交流を併用する場合は周波数は1〜5MHz、電圧は1〜10V、時間は1〜30secとするのが好ましい。融合処理後の卵には、活性化処理を行うのが好ましい。活性化処理は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気刺激や塩化ストロンチウム処理などにより行うことができる。電気刺激による活性化処理としては、電圧30〜200 V/mm、時間10〜200 micro-sec、1〜5 回の直流パルスを印加する方法などを例示できる。また、活性化処理は、融合処理から0〜6時間後に行うのが好ましい。また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。
【００３５】
工程（４）における融合卵の培養は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Betthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。培地としては、NCNU23培地、TCM199、BECM、PZM培地などを使用することができる。
【００３６】
工程（５）におけるクローン胚の卵管あるいは子宮への移植は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Onishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190）やBetthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。レシピエント動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されないが、核ドナー細胞を採取した動物と同じ種類の動物を用いることが好ましい。クローン胚は、正常なクローン動物に生育できるものであれば特に限定されないが、１細胞期から胚盤胞期の胚を使用するのが好ましい。
【００３７】
哺乳動物の種類は、ヒト以外の哺乳動物であればどのようなものでもよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サルなどが挙げることができる。これらの哺乳動物の中でもブタを特に好ましいものとして挙げることができる。これは、１）ブタはヒトと同じ手術（術具、術式）が利用できる、２）ブタではヒトの手術時の合併症が再現されることから、ヒトの前臨床試験が可能である、３）ブタではヒトと同じ投与量及び投与方法による薬効の検証が可能である、といった理由からである。
【００３８】
蛍光性タンパク質の変異体の発現は、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を動物に導入することより行うことができる。
【００３９】
蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、市販のPlum遺伝子をもとに、当業者の既知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Molecular Cloning: A laboratory  Mannual, 2nd ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,  NY.,1989、及びCurrent Protocols in Molecular Biology， Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)）などにより作製することができる。また、市販の変異用キット、例えば、QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)などを使って、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を作製することもできる。
【００４０】
遺伝子の導入は、トランスジェニック動物の作製に用いられる一般的な方法に従って行うことができる。前記したように、本発明の非ヒト哺乳動物はクローン動物であることが好ましいが、この場合、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は核ドナー細胞に導入することが好ましい。核ドナー細胞へ遺伝子を導入する方法としては、例えば、細胞内に遺伝子を導入できるベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）を使用する方法、電気パルスで遺伝子を導入する方法（エレクトロポレーション法）、細胞にガラス針などで直接遺伝子を注入する方法（マイクロインジェクション法）、リポソームに包含させて遺伝子を導入する方法などを挙げることができる。後述する実施例で述べるように、導入した遺伝子はメチル化によるサイレンシングを受ける可能性がある。これを避けるため、相同組換などにより、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を、遺伝子を安定的に発現できる領域に導入してもよい。このような遺伝子を安定的に発現できる領域としては、ROSA26領域を例示できる。ROSA26領域は、マウスのものがよく知られているが、マウス以外の動物、例えば、ラット（Kobayashi et al., Stem Cells Dev. 2012 Nov 1;21(16):2981-6. doi: 10.1089/scd.2012.0065）やブタ（Li et al., Cell Res. 2014 Apr;24(4):501-4. doi: 10.1038/cr.2014.15.及びKong et al., PLoS One. 2014 Sep 18;9(9):e107945. doi: 10.1371/journal.pone.0107945.）などにおいても知られている。
【００４１】
蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、この遺伝子を適当なプロモーター下流に連結した遺伝子構築物とすることが好ましい。プロモーターとしては、非ヒト哺乳動物で作動可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーターなどを挙げることができる。各哺乳動物由来のプロモーターとしては、例えば、アルブミン、エンドセリン、メタロチオネイン、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α(EF-1α)、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなどのプロモーターを挙げることができる。好ましいプロモーターとしては、βアクチンプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターなどが挙げられる。遺伝子構築物においては、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含んでいてもよい。使用できるエンハンサー配列としてはCMVエンハンサーなどが挙げられる。また、遺伝子構築物においては、必要に応じて、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子の下流には、ポリAシグナルを連結してもよい。更に、必要に応じて真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3'下流に連結してもよい。
【００４２】
（Ｃ）蛍光性タンパク質の変異体を利用した移植方法
本発明の非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法は、移植ドナーとする非ヒトクローン哺乳動物が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物であり、移植レシピエントとする非ヒトクローン哺乳動物が上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものである。
【００４３】
クローン動物は遺伝的に同一であることから、これらの動物間では本来拒絶反応は起きない。しかし、通常、移植ドナー細胞等には追跡マーカーとして蛍光タンパク質を発現させるため、この蛍光タンパク質がレシピエント体内で抗原となり、拒絶反応を引き起こす。本発明の移植方法では、レシピエントに上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現させ、これにより拒絶反応を回避する。
【００４４】
本発明の移植方法は、例えば、以下のような用途に用いることができる。
１）ヒト膵島移植の予備実験
本発明の移植方法は、ヒトの膵島移植において、膵島の機能をより高く発揮させるべく、ヒト以外の哺乳動物間で予備実験を行い、どこに移植すれば定着率が高いのか、さらには血糖値改善の効果が高いかを確認(つまり移植部位の決定)するために用いることができる。哺乳動物としては、ブタを用いるのが好ましい。ブタでは、ヒトの臨床で使用される術具(デバイス)・術式をそのまま利用して移植手術が可能であり、この点が大きなメリットである。また、マウスはヒトと比べ血糖値が高めであるのに対し、ブタの血糖値はヒトに近く、ブタで得た知見をそのままヒトへ外挿できるというメリットもある。
【００４５】
２）癌細胞移植後の転移の追跡
本発明の移植方法は、Plumで標識された癌細胞を移植して、転移の状況を観察するという用途にも用いることができる。光の組織透過性は、その波長に大きく影響するため、GFPと比べ、長波長のPlumタンパク質はin vivo imagingに適している(組織透過性が良い)。即ち、組織深部の蛍光イメージングを感度良く可能にすることができる。
【００４６】
３）その他の用途
本発明の移植方法は、上記以外にも、細胞シート・オルガノイド等の人工組織構造体移植、肝細胞・心筋細胞等の細胞移植、中枢・末梢神経細胞移植、網膜修復等を目的とする眼球への細胞移植、軟骨・靱帯・人工骨等の移植などに用いることができる。このような用途においても、哺乳動物としては、ブタを用いるのが好ましい。蛍光タンパク質発現クローンブタと非蛍光タンパク質発現クローンブタの組み合わせ、あるいは蛍光タンパク質発現細胞とその細胞に免疫寛容なクローンブタの組み合わせを用いることの、小実験動物（マウス・ラット）にはないメリットは、ブタの体格がヒトに近く、ヒト用の医療機器や術式が適用できる点である。例えば、ヒトに用いられる内視鏡術によって、人工組織や細胞をブタに移植することができる。細胞や人工組織構造体の移植を伴う再生医療では、自家移植が前提となる場合が多いので、本発明で実現する移植用ドナーとレシピエントの組み合わせは、自家移植の状況を再現していることになる。また、細胞や人工組織構造体の移植研究においては、ヒトに外挿できる移植のスケール（移植する細胞の数など）で実験が行われることが必須である。ヒトへの有効性を主張するためには、小さなマウス・ラットのスケールでのデータではなく、体格がヒトに近いブタでの実施が必須である。
【実施例】
【００４７】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
〔材料と方法〕
（１）動物の管理と試薬
本実施例に記載したすべての動物実験は、明治大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された(IAUCU-11-0002, -12-0008)。特記しない限り試薬は、Sigma-Aldrich社(St. Louis, MO, USA)から購入した。
【００４９】
（２）mPlum発現ベクターの構築
pCX-Plum-puroRベクター（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）を基にmPlum発現ベクターを構築した。本実施例で使用される発現ベクターは、サイトメガロウイルス最初期（IE）エンハンサーの付いたニワトリβアクチンプロモーター（CAGプロモーター）、mPlum cDNA、ポリアデニル化シグナルを含むウサギβグロビン3'隣接配列、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターによって駆動されるピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子からなった（図１Ａ）。発現ベクター中のPlum cDNAのY68G変異は、部位特異的突然変異誘発によって誘導された。最後に、構築されたmPlum発現ベクター（pCX-mPlum-puroRと名付けられた（図１Ａ））は、3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いた配列決定により確認された。4.3-kbの導入遺伝子断片は、SalI (Takara Bio、Shiga, Japan)及びBamHI (Takara Bio)を用いた酵素消化によって プラスミドベクターから切り出され、ゲル電気泳動により分離され、QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて精製された。
【００５０】
（３）核ドナー細胞の調製
Kurome M et al., J Reprod Dev 435 2008; 54: 254-258の記載に従い、雌ブタ胎仔線維芽細胞の初代培養を核ドナー細胞のために準備した。ブタ胎仔線維芽細胞（PFFs）を、15％ウシ胎仔血清(FBS, Bovogen  Biologicals Pty Ltd., Victoria, Australia)及び抗生物質-抗真菌剤溶液(Life Technologies)を補充した最小必須培地(MEM Alpha, Life Technologies)中で、I型コラーゲン被覆ディッシュ(AGC Techno Glass, Shizuoka, Japan)を用い、37℃の5％CO2を含む加湿雰囲気中で、培養した。
【００５１】
トランスフェクションのために、PFFsを70〜90％コンフルエンスまで培養し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で2回洗浄し、0.05％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(trypsin-EDTA, Life Technologies)で処理した後、回収した。その後、回収した細胞（6.0×105）を、Neon Transfection System kit (Life Technologies)の一部として供給されている60μlの再懸濁緩衝液に再懸濁し、1.5μgの線形化pCX-mPlum-puroRを加えた。次いで、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの条件は、パルス電圧を1100 Vとし、パルス幅を30ミリ秒とし、パルス数を1とした。エレクトロポレーションから48時間後、細胞を2.5 μg/mlのピューロマイシンを含む培地に移した。培養12日目に、ピューロマイシン耐性細胞を回収し、I型コラーゲン被覆ディッシュ(AGC Techno Glass)上に播種した。これらの細胞（mPlum-PFFs）を2〜3日以内にコンフルエンスまで増殖させ、次いでmPlumを発現するトランスジェニック胎仔を作製するための核ドナー細胞として後で使用するために凍結保存した。以前に作製された（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）Plum導入遺伝子を発現する対照PFFs（Plum-PFFs）も培養した。
【００５２】
（４）フローサイトメトリー分析
確立された形質転換線維芽細胞の蛍光及びトランスジェニッククローン胎仔からの血液細胞を、561-nm (黄色−緑色)レーザーを備えたBD FACSAria III cell sorter (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)によって分析した。赤血球を除去するために、全血細胞をBD Pharm Lyse (Becton, Dickinson and Company) 試薬で処理した。前方及び側方散乱特性に基づいたゲーティング戦略によってリンパ球集団を選択した。
【００５３】
（５）体細胞核移植（SCNT）
SCNTは、Matsunari H et al., Cloning Stem Cells 2008; 10: 313-323及びWatanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177の記載の方法に若干の変更を加えて行った。簡単に説明すると、第一極体を含み、インビトロで成熟した卵母細胞を、面取りピペットを用いて、10mMのHEPES及び0.3％(w/v)ポリビニルピロリドン(HEPES-TL-PVP)を含むタイロード乳糖培地中で、0.1μg/mlのデメコルチン、5μg/mlのサイトカラシンB(CB)、及び10% FBSの存在下で、極体及び隣接する細胞質を穏やかに吸引することによって除核した。
【００５４】
核ドナー細胞は、2日間の血清飢餓による細胞周期同期化後に使用した。一つの核ドナー細胞を、除核された卵母細胞の囲卵腔に挿入した。核ドナー細胞-卵母細胞複合体を、0.15mM MgSO4, 0.01%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)及び0.5 mM HEPESを含む280mMのマンニトール溶液(pH 7.2; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)に入れ、その後、二つの電極針間に保持した。単一の直流（DC）パルス（267 V/mm, 20 μsec）とパルス前後の交流（AC）フィールド（2 V、1 MHz、5 sec）によって、細胞融合装置(LF201, Nepa Gene, Chiba, Japan)を用いて膜融合を誘導した。再構築された胚を、ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したブタ受精卵培地-5(PZM-5; Research Institute for the  Functional Peptides, Yamagata, Japan)中で、1〜1.5時間培養し、その後に電気的活性化を行った。電気的活性化を誘導するため、再構築された胚を、融合チャンバースライドの二つのワイヤ電極間（これらは1.0 mm離れている）に並べた。融合チャンバースライドには、280 mM マンニトール、0.05 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4 及び 0.01% (w/v) PVAからなる活性化溶液が充填されている。電気パルス機(Multiporator, Eppendorf, Hamburg, Germany)を用いて、150V/mmの単一のDCパルスが、100 μsec間適用された。活性化後、再構築された胚を、PZM-5中で3時間、5 μg/ml CB及び500 nM Scriptaidの存在下で、培養し、その後更に12〜15時間、500 nM Scriptaidの存在下で培養した。これらの処理の後、クローン胚は、PZM-5中で7日間培養し、それらのインビトロでの発達を評価した。
【００５５】
胚培養を、38.5 ℃で、5% CO2、5% O2、及び90% N2の加湿雰囲気中で行った。桑実胚期の後、胚を、10％FBSを補充したPZM-5中で培養した。
【００５６】
（６）レシピエントブタへのクローン胚の移植
体重100〜105 kgの未経産ブタ(Large White/Landrace × Duroc)をクローン胚のレシピエントとして用いた。発情を誘導するために、ブタに、1,000 IUのウマ絨毛性ゴナドトロピン(eCG, ASKA Pharmaceutical, Tokyo, Japan)の単回筋肉内注射をした。1,500 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG, Kyoritsu Pharmaceutical, Tokyo, Japan)の筋肉内注射によって排卵を誘発させた。この注射はeCG注射の66時間後に行った。hCG注射の約146時間後に、5又は6日間培養されたクローン胚をレシピエントの子宮角に外科的に移植した。
【００５７】
（７）トランスジェニッククローン胚、胎仔、子豚の生産
7日目のクローン胚盤胞の一部を、20％のエチレングリコール(Nacalai Tesque)及び5mg/ mlのHoechst 33342を含むHEPES-TL-PVPとともに、ガラススライド(Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, Japan)上に載せた。細胞数を求めるため、これらの胚を蛍光顕微鏡(TE-300 microscope, Nikon, Tokyo, Japan)で調べた。
【００５８】
クローン胎仔を回収するために、SCNT胚を移植したレシピエントブタを、妊娠37-38日に安楽死させた。これらの胎仔をmPlum導入遺伝子の組込み及び発現を調べるために使用した。若返らせた線維芽細胞(NeomPlum-PFFs)の生成のためにも胎仔を使用した。mPlumを発現するクローン子豚を生産するために、核ドナーとしてNeomPlum-PFFsを用いて、SCNTを行った。クローン子豚の組織/器官における蛍光を、蛍光顕微鏡(MVX10, Olympus; excitation, 532.5-587.5 nm; emission, 607.5-682.5 nm)を用いて調べた。
【００５９】
（８）サザンブロット分析による導入遺伝子のコピー数の推定
ゲノムDNAを、トランスジェニッククローン胎仔の皮膚サンプルから、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。精製ゲノムDNA（5μg）をPstI(Takara Bio)で消化し、ゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブレン(Hybond N+, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, UK)に移した。膜をブロッキング試薬(Blocking One, Nacalai Tesque)で、25℃、30分間ブロックした。ブロッキング後、膜を、ハイブリダイゼーション溶液(DIG Easy Hyb, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)中でインキュベートし、DNA標識試薬(DIG DNA Labeling Mix, Roche Diagnostics)を用いたPCRによって調製されたジゴキシゲニン（DIG）標識mPlumプローブとハイブリダイズさせた。化学発光試薬(DIG Luminescent Detection Kit, Roche Diagnostics)を用いてブロットを可視化し、シグナルをImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences)で検出及び画像化した。ブタのゲノムに組み込まれた導入遺伝子のコピー数を、ハイブリダイゼーションシグナルとコピー数コントロールのそれとを比較することによって決定した。標準シリーズ（二倍体ゲノムあたり1〜10コピー）を作成するために、コピー数コントロールを希釈した。
【００６０】
（９）遺伝子型決定
mPlum導入遺伝子を、直接ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、胚盤胞からMightyAmp DNA polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan)を用いて、増幅した。プライマー配列は、5’-CTACAAGACCGACATCAAGCTG -3’（配列番号３）及び 5’-ACAGCTATGACTGGGAGTAGTCAGG-3’ （配列番号４）である。その後、Nested PCRを、適切なプライマー（5'-ACGAGGACTACACCATCGTGG-3'（配列番号５）および5'-TGTTCATGGCAGCCAGCATATGG-3'（配列番号６））で、PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio)を用いて、行った。Matsunari H et al., J Reprod Dev 2012; 58: 599-608の記載に従って単為生殖胚を作製した。
【００６１】
（１０）ウェスタンブロット分析
クローン胎仔の皮膚及び肝臓を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Nacalai Tesque)を含む溶解及び抽出緩衝液(RIPA buffer, Thermo Scientific, MA, USA)中でホモジナイズし、4℃で5分遠心分離（12,000×g）し、上清を集めた。サンプルのタンパク質濃度を、Lowry法に基づくDCタンパク質アッセイ(Bio-Rad, CA, USA)を用いて定量した。
【００６２】
抽出物からの約10μgのタンパク質を10％SDS-PAGEに供し、エレクトロブロッティングによってHybond-P PVDF膜(GE Healthcare Bio-Sciences, NJ, USA)に移した。膜は、Blocking One (Nacalai Tesque)で、25℃で30分間ブロックした。ブロッキング後、膜を、Plumタンパク質を認識する抗DsRed抗体(1:1,000 dilution; Takara bio)と共に25℃で1時間インキュベートし、続いて、HRP結合抗ウサギIgG抗体(1:10,000 dilution; Santa Cruz Biotechnology) と共に25℃で1時間インキュベートした。ブロットを、ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Bio-Sciences)を用いて、可視化した。シグナルを、ImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences)を用いて、検出及び画像化した。
【００６３】
（１１）免疫組織化学
得られたクローン子豚から摘出された腎臓及び心臓組織を、4％パラホルムアルデヒド溶液(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)中で固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、標準的な方法を用いてヘマトキシリンで染色した。固定化切片を、ブロッキング溶液(2% BSA/DPBS)と共に1時間インキュベーションし、次いで、ウサギ抗DsRed抗体(Takara bio)で1時間処理した。過剰な抗体を除去した後、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies)と共に2時間インキュベートした。スライドを、Biorevo BZ9000 microscope (Keyence, Osaka, Japan)を用いて可視化した。
【００６４】
（１２）DNAメチル化解析
ゲノムDNA抽出及び亜硫酸水素変換を、Arai Y et al., Genesis 2013; 51: 763-776の記載に従って行った。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、DNA精製キット(DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN)を用いて、胎仔から単離された線維芽細胞から精製し、制限酵素HindIII(Takara Bio)で消化した。QIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いて消化されたゲノムDNAを精製した後、ゲノムDNAの亜硫酸水素変換を、EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA)を用いて行った。亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNAを、BioTaq HS DNA polymerase (Bioline, London, UK)で、ニワトリβ-アクチンプロモーターに特異的なプライマー(Forward, 5’-TTTGTGGTTGYGTGAAAGTTTTG-3’（配列番号７）; Reverse, 5’-CCACACCCCCTACTCACC-3’ （配列番号８）)を用いて、増幅した。PCRは、以下の条件で行った： 95℃, 10 min; 40 cycles of 95℃, 30 sec; 60℃, 30 sec; 72℃, 1 min; final extension 72 C, 2 min。増幅したPCR産物を、pGEM T-Easyベクター(Promega, Madison, WI, USA)にクローニングし、メチル化状態を決定するために6〜8個のクローンを配列決定した。
【００６５】
（１３）統計分析
実験結果を、平均（SEM）の平均±標準誤差として表した。データを、SPSS 16.0 software (SPSS, Chicago, IL, USA)を用いて解析した。比例したデータについては、群間の差は、χ2検定を用いて分析した。胚盤胞の細胞数データについては、群間の差は、スチューデントのt検定によって決定した。有意水準は、P <0.05に設定した。
【００６６】
〔実験結果〕
（１）mPlum遺伝子を導入した核ドナー細胞の調製と体細胞核移植胚の生産
mPlum-PFFsの形態や増殖能は、トランスフェクション及びピューロマイシン選択後に正常だった。mPlum-PFFsを蛍光顕微鏡で調べると、それらは蛍光を発していなかった（図１Ｄ、Ｄ’）。
【００６７】
全部で127の核移植胚を、核ドナーとしてmPlum-PFFsを使用して再構築した。正常卵割率及び胚盤胞形成率は、それぞれ81.9％（104/127）と75.6％（96/126）であった。得られた胚盤胞における細胞の平均数は109.8±4.5だった。胚発生と胚盤胞の細胞数は、本発明者らの以前の研究で作製された同じPFFs（非トランスフェクト）及びPlum遺伝子導入PFFsを用いたSCNT胚に匹敵した（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）。
【００６８】
蛍光はクローン胚盤胞のいずれにおいても検出されなかった（図２Ｃ、Ｃ’）。一方、それらの胚盤胞はPlum導入遺伝子を有していることがPCR分析によって確認された（図２Ｄ）。
【００６９】
（２）mPlum遺伝子を有するトランスジェニッククローン胎仔の生産
全部で71の核移植胚を一頭のレシピエントブタに移植した。そのレシピエントブタから、37-38日目に開腹によって、8個体（11.3％）の胎仔を得た（表１）。
【００７０】
【表１】
2017197487.tif 000002
【００７１】
これらの胎仔は、励起下でPlumの蛍光を発しなかった（図３Ｃ、Ｃ’）。皮膚を、線維芽細胞(NeomPlum-PFFs)の初代培養を確立するために、クローン胎仔から採取した（図３Ｈ、Ｈ’）。サザンブロット分析は、1〜10コピーの導入遺伝子が線維芽細胞に組み込まれたことを明らかにした（図３Ｄ）。ウェスタンブロット分析は、mPlumタンパク質がトランスジェニッククローン胎仔＃2おいてのみ発現したことを示した（図３Ｅ）。フローサイトメトリーを用いた分析は、＃2胎仔から樹立された線維芽細胞が、野生型（WT）と同様に、Plum蛍光を発現しなかったことを確認した（図３Ｉ）。
【００７２】
本発明者らは、8個体の胎仔から確立された線維芽細胞を用いて、導入遺伝子のCAGプロモーター領域のDNAのメチル化分析もおこなった。結果は、トランスジェニック胎仔#6、7、及び8において導入遺伝子のCAGプロモーター領域が高度にメチル化された状態であったことを示した（図４）。このことは、これらの胎仔においてmPlumタンパク質の発現が阻害されていたことを示唆する。
【００７３】
しかし、ウェスタンブロット法によって全くmPlumの発現を示さないクローン胎仔には、CAGプロモーター領域のメチル化状態の低い胎仔も含まれていた（＃1、3、4、5）。このことは、導入遺伝子が変異又はヘテロクロマチン領域に組み込まれたことを示唆する。
【００７４】
（３）mPlum遺伝子を有するトランスジェニッククローン子豚の生産
SCNT胚を、＃2胎仔(NeomPlum-PFFs-2)から確立された若返らせた核ドナー細胞を用いて作製した。これらの胚を、1頭のレシピエントブタに移植した。その結果、4個体の子孫を得たが、すべて死産であった(4/89, 4.5%)（表１）。これらの子孫がmPlum遺伝子を保有することをPCR分析によって確認した（図５Ａ）。
【００７５】
mPlum遺伝子を有するクローン子孫では、試験した11種類の細胞、組織、器官においてPlumの蛍光は観察されなかった。前記した細胞等には、リンパ球、皮膚、腎臓、膵臓、血管、心臓、骨格筋、肝臓、肺、脾臓、及び腸が含まれる（図５Ｃ、６）。しかしながら、抗DsRed抗体を用いたウェスタンブロット分析は、4つのすべての子孫の肝臓組織においてmPlumタンパク質の産生を検出した（図５Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、移植医学研究に有用なので、このような研究に関連する産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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