(57)【要約】【課題】  ＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異に基づくタンパク質を検出することによる、被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の存在を検出する方法及び被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌を診断する方法を提供することを課題とする。【解決手段】  被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）チロシンキナーゼドメインの９７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）チロシンキナーゼドメインの９７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱癌におけるＦＧＦＲを阻害する薬剤に対する耐性の原因である新たなゲートキーパー変異を同定する方法及び被験者におけるＦＧＦＲを阻害する薬剤に対する耐性を有する膀胱癌の出現を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）は受容体チロシンキナーゼの１種であり、ＦＧＦＲのリガンドとしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が知られている。ＦＧＦＲファミリーは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４の４種類からなる。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを有する膜貫通蛋白質から構成される。細胞外ドメインは２つ又は３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＦＧＦＲは、ヘパリンやヘパラン硫酸プロテオグリカンの存在下でＦＧＦと結合することにより活性化される。ＦＧＦについては、ヒトでは２２種類のＦＧＦが存在することが知られている。これらのうち、ＦＧＦ１１からＦＧＦ１４を除くそれぞれのＦＧＦが、１つ又は複数のＦＧＦＲと結合する能力を有する。ＦＧＦがＦＧＦＲに結合することで受容体チロシンキナーゼが活性化され、下流にシグナルが伝達される。ＦＧＦＲの発現部位や発現時期の差異によって、細胞遊走や細胞増殖などの複雑な生体機能を制御している。
【０００３】
ＦＧＦＲファミリーのうち、ヒトのＦＧＦＲ３遺伝子については現在までに３つのスプライシングバリアント（ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント１（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＭ＿０００１４２．４）、バリアント２（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＭ＿０２２９６５．３）及びバリアント３（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＭ＿００１１６３２１３．１））の存在が知られており、これらはそれぞれＦＧＦＲ３蛋白質のアイソフォーム１（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００１３３．１）、アイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０７５２５４．１）及びアイソフォーム３（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１５６６８５．１）に対応する。これらのうちアイソフォーム２のみが膜貫通ドメインを欠くことから、アイソフォーム２は可溶性ＦＧＦＲ３として知られている。
【０００４】
ＦＧＦＲ阻害剤としては、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８、ＪＮＪ−４２７５６４９３（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２５： ５５２−５６３, ２０１４）のような化合物が例示される。これらの化合物はいずれも、臨床試験実施中のＦＧＦＲ阻害剤である。また、２−［４−（｛５−［（２、６−ジフルオロ−３、５−ジメトキシベンジル）オキシ］ピリミジン−２−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（国際公開第２０１３／１２９３６９号の実施例１１３の化合物；以下化合物Ａとも表記）についてもＦＧＦＲ阻害剤であることが知られている。
【０００５】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をはじめとするチロシンキナーゼは、種々のがんにおいてキナーゼドメイン内に存在するゲートキーパー変異（キナーゼのＡＴＰポケット底部のアミノ酸変異）がキナーゼ阻害剤に対する耐性の獲得に関与していることが確認されている。ＦＧＦＲに関しては、横紋筋肉腫や乳癌において、ＦＧＦＲ４のゲートキーパー変異の存在が報告されている（非特許文献１、２）。一方、ＦＧＦＲ１及び２のゲートキーパー変異に関しては、がん患者におけるその存在は知られていないが、ＦＧＦＲ１あるいはＦＧＦＲ２のゲートキーパー変異体を人工的に発現させた細胞が、ＦＧＦＲ阻害剤であるＢＧＪ３９８に耐性になることが報告されている（非特許文献３）。また、ＦＧＦＲ３に関しては、多発性骨髄腫細胞において、ＦＧＦＲ阻害剤添加により、ゲートキーパー変異として、アイソフォーム１における、シグナル配列を含むアミノ末端（Ｎ末端）から５５５番目に対応する位置のバリンからメチオニンへのアミノ酸変異（Ｖ５５５Ｍ）が見出されており、このゲートキーパー部位の点変異の出現が、ＦＧＦＲ阻害剤に対する耐性を引き起こしていることが報告されている（非特許文献４）。また、カルナバイオサイエンス社（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｎａｂｉｏ.ｃｏｍ／ｊａｐａｎｅｓｅ）より、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）＿Ｖ５５５Ｍ蛋白質（ＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）のＶ５５５Ｍ変異蛋白質）及びＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）＿Ｖ５５５Ｌ蛋白質（ＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）のＮ末端から５５５番目に対応する位置のバリンからロイシンへのアミノ酸変異（Ｖ５５５Ｌ）蛋白質）が市販されている。
【０００６】
しかし、これまでに、膀胱癌細胞で、ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインにおいてＦＧＦＲ阻害剤添加によるゲートキーパー変異が生じることや、ゲートキーパー変異が生じた細胞がＦＧＦＲ阻害剤耐性を獲得するとの報告は無い。
【０００７】
膀胱癌は、膀胱の尿路上皮粘膜より発生する悪性腫瘍である。病理組織学的には，そのほとんどが尿路上皮癌であり、扁平上皮癌および腺癌の割合は低い。また、膀胱癌の発症率は、女性に比べ男性で高い。膀胱癌の危険因子として、喫煙、職業性の発癌物質への暴露、膀胱内慢性炎症、ある特定の抗がん剤や放射線治療に伴う二次発癌等の医学的要因があげられている。
【０００８】
膀胱癌は深達度により、癌が粘膜から粘膜下層にとどまっている筋層非浸潤性癌と筋層や結合組織に及んでいる浸潤性癌に分けられる。筋層非浸潤性癌の治療は主に内視鏡的切除術並びにＢＣＧ（結核ワクチン）若しくは抗がん剤の膀胱内注入療法が行われている。一方、浸潤性癌の治療は膀胱全摘又は転移が認められる場合には、Ｍ−ＶＡＣ療法 （メソトレキセート、ビンブラスチン、アドリアマイシン及びシスプラチン）若しくはＧＣ療法（ゲムシタビン及びシスプラチン）が行われている。
【０００９】
しかし、近年の研究によって、膀胱癌におけるＦＧＦＲ３の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの活性化点変異、並びにＦＧＦＲ３融合遺伝子の存在が明らかとなり、これらの遺伝子変異を有する膀胱癌患者に対するＦＧＦＲ阻害剤の臨床試験が行われている。
【非特許文献１】「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１２年、１８巻（３号）、ｐ．７４８−７５７
【非特許文献２】「アプライド  イムノヒストケミストリー  アンド  モレキュラー  モルフォロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０１５年、２３巻（２号）、ｐ．９７−１０３
【非特許文献３】「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、（米国）、２０１４年、１１１巻（４５号）、ｐ．Ｅ４８６９−Ｅ４８７７
【非特許文献４】「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、（英国）、２０１３年、３２巻、ｐ．３０５９−３０７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
膀胱癌における、ＦＧＦＲを阻害する薬剤に対する耐性の原因である新たなゲートキーパー変異を見出し、これにより、被験者におけるＦＧＦＲを阻害する薬剤に対する耐性を有する膀胱癌の出現を検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、膀胱癌細胞株へのＦＧＦＲ阻害剤の長期曝露により生じた、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｍ（配列番号６で示したアミノ酸配列のＮ末端より５５７番目のバリンをメチオニンに置換したもの）遺伝子変異を有する膀胱癌細胞株、及びＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｌ（配列番号６で示したアミノ酸配列のＮ末端より５５７番目のバリンをロイシンに置換したもの）をゲノム編集技術であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて導入した膀胱癌細胞株において、ＦＧＦＲ阻害剤による細胞増殖能阻害活性が解除されることを見出した（実施例１）。本発明者らは、本知見から、膀胱癌における、ＦＧＦＲ３遺伝子のゲートキーパー変異を見出し、ＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌患者を選別することを可能とした。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１８］に関する。
［１］被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）チロシンキナーゼドメインの９７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）又は（２）に記載のＦＧＦＲ３における変異である、［１］に記載の方法：
（１）ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）の５５７番目のバリンからロイシンへの変異。
［３］前記変異が下記（１）又は（２）に記載のＦＧＦＲ３における変異である、［１］又は［２］に記載の方法：
（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異；又は
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３の５５７番目のバリンからロイシンへの変異。
［４］ 前記変異の存在を検出する工程が、被験者から得た試料中のＦＧＦＲ３遺伝子のチロシンキナーゼドメインの２８９番目のグアニンからアデニン、チミン又はシトシンへの変異の存在を検出することを含む、［１］に記載の方法。
［５］前記変異の存在を検出する工程が、下記（１）又は（２）に記載のＦＧＦＲ３遺伝子における変異の存在を検出することを含む、［１］、［２］又は［４］に記載の方法：
（１）ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）遺伝子の１６６９番目のグアニンからチミン又はシトシンへの変異。
［６］前記変異の存在を検出する工程が、下記（１）又は（２）に記載のＦＧＦＲ３遺伝子における変異の存在を検出することを包む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法：
（１）配列番号５に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異；又は
（２）配列番号５に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子の１６６９番目のグアニンからチミン又はシトシンへの変異。
［７］前記変異がＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異である、［２］に記載の方法。
［８］前記変異が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異である、［３］に記載の方法。
［９］前記変異の存在を検出する工程が、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異の存在を検出することを含む、［５］に記載の方法。
［１０］前記変異の存在を検出する工程が、配列番号５に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異の存在を検出することを含む、［６］に記載の方法。
［１１］ＦＧＦＲ阻害剤が２−［４−（｛５−［（２、６−ジフルオロ−３、５−ジメトキシベンジル）オキシ］ピリミジン−２−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＪＮＪ−４２７５６４９３のいずれかである、[１] 〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ＦＧＦＲ阻害剤が２−［４−（｛５−［（２、６−ジフルオロ−３、５−ジメトキシベンジル）オキシ］ピリミジン−２−イル｝アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノールである、[１] 〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］被験者が膀胱癌患者である、[１] 〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌を診断する方法であって、［１］〜［１２］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［１６] 被験者から試料を得る工程を包含する、［１５］に記載の方法。
［１７］被験者が膀胱癌患者である、［１５］又は［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］変異が検出された場合に、被験者がＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌に罹患している可能性が高いと判断する工程をさらに含む、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の検出方法は、被験者のうち、ＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌患者を選別する方法として利用できる。また、本発明の選別方法によれば、膀胱癌患者に対して既存のＦＧＦＲ阻害剤の適用対象者であるか否かを選別することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法は、被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の存在を検出する方法であり、被験者から得た試料中のＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインにおける点変異の存在を検出する工程を含む。
【００１５】
被験者から得る試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好ましくは生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写、逆転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００１６】
現在まで、ＦＧＦＲ３には３つのアイソフォーム、アイソフォーム１、２及び３が存在することが知られている。ＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）は全長８０６アミノ酸（シグナル配列を含む。以下同じ。）からなる。例えば、野生型のＦＧＦＲ３（アイソフォーム１）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ３（アイソフォーム２）は全長６９４アミノ酸からなる。例えば、野生型のＦＧＦＲ３（アイソフォーム２）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）は全長８０８アミノ酸からなる。例えば、野生型のＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。また、ＦＧＦＲ３の３つのアイソフォームは、共通のチロシンキナーゼドメインを有する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインとは、アイソフォーム１のアミノ酸第４５９〜７９２位、アイソフォーム２のアミノ酸第３４７〜６８０位、アイソフォーム３のアミノ酸第４６１〜７９４位にそれぞれ対応する、３３４アミノ酸からなる領域を意味する。野生型のＦＧＦＲ３アイソフォーム１〜３のチロシンキナーゼドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。
【００１７】
本発明の方法における検出対象となる変異（「検出対象変異」とも称する）は、ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメイン内の変異であり、具体的には、ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインの９７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異である。検出対象変異の例としては、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３チロシンキナーゼドメインの９７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異が挙げられる。本検出対象変異は、ＦＧＦＲ３遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における変異に起因し、従って、本発明の方法において遺伝子変異の存在を検出してもよい。このような遺伝子変異は、ＦＧＦＲ３遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２８９番目のグアニンからアデニン、チミン又はシトシンへの変異であり、その代表的な例としては、配列番号７に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２８９番目のグアニンからアデニン、チミン又はシトシンへの変異が挙げられる。
【００１８】
前述の検出対象変異は、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）においては５５７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異に対応する。また、これらの変異にそれぞれ対応するＦＧＦＲ３遺伝子における変異としては、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニン、チミン又はシトシンへの変異が挙げられる。一つの実施形態において、検出対象変異は、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異である。一つの実施形態において、当該変異を検出する工程は、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異の存在を検出することを含む。
【００１９】
本発明の方法における検出対象変異のより具体的な例としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３の５５７番目のバリンからメチオニン又はロイシンへの変異が挙げられる。また、これらに対応するＦＧＦＲ３遺伝子における変異の例としては、配列番号５に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニン、チミン又はシトシンへの変異が挙げられる。一つの実施形態において、検出対象変異は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３の５５７番目のバリンからメチオニンへの変異である。また、一つの実施形態において、当該変異を検出する工程は、配列番号５に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ３遺伝子の１６６９番目のグアニンからアデニンへの変異の存在を検出することを含む。
【００２０】
本明細書中、前記ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）におけるバリン（Ｖ）からメチオニン（Ｍ）への変異をＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｍ、バリン（Ｖ）からロイシン（Ｌ）の変異をＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｌとも称する。本発明の方法においては、検出対象変異を有する蛋白質（「変異型蛋白質」とも称する）又は検出対象変異を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド（「変異型ポリヌクレオチド」とも称する）のいずれを検出対象としてもよい。
【００２１】
本発明の検出方法において変異型ポリヌクレオチドの存在を検出する場合、本検出工程は、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異型ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物又は逆転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異型ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出並びにｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。
【００２２】
本検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、本検出工程は、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ  ＴＭＡ  ｓｙｓｔｅｍ）法等）を用いて、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域（「検出対象変異領域」とも称する）を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について塩基配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような塩基配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。
【００２３】
前述の核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異型ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００２４】
核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ−ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、まず、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲによる伸長反応でのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解される。本分解反応により蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質が蛍光を発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異となる。
【００２５】
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ＤＮＡチップ上の各遺伝子プローブへのハイブリダイズの強度を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅａｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。
【００２６】
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。
【００２７】
当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００２８】
本発明の検出方法においては、被験者から得た試料中の変異型蛋白質の存在を検出してもよく、例えば、変異型蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて実施できる。このような抗体の作製及び抗体を用いた蛋白質の検出は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００２９】
一つの実施形態において、本発明の方法におけるＦＧＦＲ阻害剤は、化合物Ａ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＪＮＪ−４２７５６４９３である。好ましくは、本発明の方法におけるＦＧＦＲ阻害剤として、化合物Ａである。
【００３０】
一つの実施形態において、本発明の方法は、被験者から試料を得る工程を含む。
【００３１】
一つの実施形態において、本発明の方法における被験者は膀胱癌患者である。
【００３２】
本発明の検出方法は、被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、本発明の検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者の罹患している膀胱癌がＦＧＦＲ阻害剤耐性である可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。
【００３３】
本発明の方法において、検出対象変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者の膀胱癌が既存のＦＧＦＲ阻害剤に対して耐性になっている可能性が高いと判定できる。ＦＧＦＲ阻害剤耐性になった患者で検出対象変異が認められたという報告は今のところなく、このようなＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌患者に対する確立した治療方針はない。それゆえ、今後アンメットメディカルニーズが高くなると予想される。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００３５】
［実施例１］
化合物Ａを膀胱癌細胞株であるＵＭ−ＵＣ−１４細胞に長期曝露することにより、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）にＶ５５７Ｍ変異を有するＵＭ−ＵＣ−１４＿ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｍ細胞を作成した。また、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを用いて、ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｌ遺伝子を発現するＵＭ−ＵＣ−１４＿ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｌ細胞を作成した。
ＵＭ−ＵＣ−１４細胞、ＵＭ−ＵＣ−１４＿ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｍ細胞又はＵＭ−ＵＣ−１４＿ＦＧＦＲ３（アイソフォーム３）＿Ｖ５５７Ｌ細胞を、２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／９０μＬずつ９６穴プレートへ播種し、翌日に化合物（化合物Ａ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＪＮＪ―４２７５６４９３）溶液（１０μＬ／ｗｅｌｌ）を添加した(ＤＭＳＯの最終濃度０．１％)。各化合物はＤＭＳＯにて溶解し、最高濃度１ｍＭよりＤＭＳＯにて３倍公比（９点希釈及びＤＭＳＯのみ）で段階希釈し、培養培地（ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））にて１００倍希釈して調製した。化合物添加５日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ７５７３））にて化合物の細胞増殖阻害を評価した。測定機器はＡＲＶＯ  Ｘ３（パーキンエルマー）を使用した。なお、化合物の代わりにＤＭＳＯを添加したウェルの測定値を０％阻害、各化合物添加前の測定値を１００％阻害とし、非線形回帰よりＧＩ50値(５０％増殖阻害濃度)を算出した。結果を表１に示す。なお、ＵＭ−ＵＣ−１４細胞はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，カタログ番号０８０９０５０９）から購入した。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
本結果より、４種のＦＧＦＲ阻害剤はゲートキーパー変異を有する細胞では細胞増殖阻害活性が減弱することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の検出方法は、被験者におけるＦＧＦＲ阻害剤耐性膀胱癌を検出するのに有用である。
【配列表】
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