(57)【要約】【課題】核酸増幅反応と固相担体上での検出を含むリステリア・モノサイトゲネス由来の核酸の検出方法において、プライマーダイマーの形成を回避することを可能とする、判定精度の高い検出手段を提供する。【解決手段】リステリア・モノサイトゲネスに由来する標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、増幅産物を固相担体に結合させるためのプライマーセットであって、標的核酸に含まれる第１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１のプライマーと、標的核酸において第１の塩基配列よりも下流に位置する第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２のプライマーとを含み、第１のプライマー及び第２のプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含むプライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来する標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、増幅産物を固相担体に結合させるためのプライマーセットであって、
標的核酸に含まれる第１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１のプライマーと、
標的核酸において第１の塩基配列よりも下流に位置する第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２のプライマーと
を含み、
第１のプライマー及び第２のプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む
プライマーセット。
【請求項２】
標的核酸が、ｉａｐ遺伝子、ｈｌｙ遺伝子、ｌｍａ遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌ遺伝子、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｓｓｒ遺伝子、ｆｌａ遺伝子、ｐｌｃ遺伝子、ｐｒｆ遺伝子又はｍｐｌ遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
標的核酸がｉａｐ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（１ａ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（１ｂ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（２ａ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（２ｂ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
標的核酸がｈｌｙ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（３ａ）配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（３ｂ）配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（４ａ）配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（４ｂ）配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
標的核酸がｈｌｙ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（７ａ）配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（７ｂ）配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（８ａ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（８ｂ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項６】
標識部が、標識物質と結合可能なポリヌクレオチド又は低分子化合物を含むタグである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
結合部が、固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出する方法であって、
試料から取得されたＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
核酸増幅反応の生成物を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での増幅産物を検出する検出工程と
を含む方法。
【請求項９】
標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
標識部の前記タグに標識物質を結合させる標識工程を更に含む
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を２５サイクル以上行う工程である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸増幅工程が、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットにおける第１のプライマー及び第２のプライマーの各々の反応開始時の濃度が０．０５μＭ以上となる条件でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出するためのキットであって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットと、
結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
を含むキット。
【請求項１３】
結合部と結合可能な部分を一部に含む前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
結合部と結合可能な部分を一部に含む前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスを含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア・モノサイトゲネスに由来する標的核酸を増幅し検出するためのプライマーセットに関する。
【０００２】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネス及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出する方法に関する。
【０００３】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネス及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
食中毒の発生や感染拡大を防止するためには、食品等から食中毒の原因菌を迅速に検出・同定することが重要である。食中毒の原因菌同定では、培養検査が一般的であるが、培養に日数を要するため、食中毒の発生や感染拡大の防止においては迅速性の観点から問題がある。
【０００５】
特に、人畜共通感染性の有害微生物であり、食中毒の原因菌となるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、増殖速度が非常に遅いため、培養検査では検出までに長時間を要することから、迅速な検出手段の提供が求められている。
【０００６】
培養法に代わる病原菌の同定法として、対象菌のゲノムＤＮＡ上の特定領域を増幅し、検出する核酸検査法が実用化されつつある。例えば、非特許文献１および非特許文献２では、リステリア・モノサイトゲネスのｉａｐ遺伝子内、ｈｌｙ遺伝子内、もしくはｐｒｆ遺伝子内に設計したそれぞれのプライマーセットを用いて各遺伝子を増幅し、増幅産物を電気泳動で分離し、検出する核酸検査法が開示されている。
【０００７】
また、非特許文献３および非特許文献４では、それぞれリステリア・モノサイトゲネスのｈｌｙ遺伝子内、もしくはｉｎｌ遺伝子内に設計したそれぞれのプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより各遺伝子を増幅し、核酸の増幅量をモニタリングし、検出する核酸検査法（リアルタイムＰＣＲ法）が開示されている。
【０００８】
電気泳動法を利用した核酸検査法においては、増幅した核酸を電気泳動にて分離、蛍光色素とＵＶ照射にて検出するが、操作が煩雑であり、結果の確認までに時間を要することや、発がん性の色素が必要であるといった理由から、なお改善の余地がある。
【０００９】
また、リアルタイムＰＣＲ法を利用した核酸検査法においては、自動でモニタリングできるという点で電気泳動法と比較して簡便さが向上しているが、大型の装置が必要となり、高度な解析と作業スペースが必要といった問題がある。
【００１０】
操作がより簡便な検出方法として核酸クロマトグラフィー法が開発されている。核酸クロマトグラフィー法は、その迅速性と簡便性から広く一般的に利用されている。この検出方法は大きく２つの方法に分類される。１つ目の方法が、特許文献１に開示されている。特許文献１では、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な遺伝子を標的としてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と記載する）を行い、標的ＤＮＡを二本鎖核酸として得る。一方で、標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチドからなる捕捉用プローブが結合され、標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な標識付の相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブが保持された固相支持体を用意する。標的ＤＮＡを一本鎖化し固相支持体に接触させることにより、標的ＤＮＡを捕捉し標識して検出する。この方法は増幅産物の電気泳動による分離やリアルタイムＰＣＲで使用するような大型の装置が不要であるため操作が簡便である。しかしながら、特許文献１のこの方法は、ＰＣＲにより増幅された標的ＤＮＡを二本鎖から一本鎖へ変性させる工程が必要であり、手順が煩雑であるとともに、二本鎖核酸への再会合を生じやすく感度が低下するという問題がある。
【００１１】
もう1つの方法としては、特許文献２に開示されている方法がある。特許文献２では、標的核酸に特異的なプライマーにタグを付して用いて、標的核酸を含むＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行っている。得られた増幅産物を、多孔質状の固相担体内をキャピラリー現象により拡散・移動させ、増幅産物の両端に付されたタグを介して標識及び固相担体に捕捉・結合し、標的核酸を目視にて検出する。この方法は、特許文献１に記載のような、熱変性の必要は無く簡便に標的を検出可能であり、一本鎖核酸から二本鎖への再会合による感度低下の心配もなくより優れているといえる。しかしながら、この検出方法においては、増幅産物の両端に付されたプライマー由来のタグに依拠して、標識及び固相担体への捕捉・結合を行っているために、標的核酸に由来する特異的な増幅産物と、非特異的な反応により形成されるプライマーダイマーとを区別できない場合がある。プライマーダイマーの形成は、従来の電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法では標的の増幅産物長の違いにより区別できるため支障とはならないが、特許文献２のように、増幅産物の両端に付されたプライマー由来のタグに依拠して、標識及び固相担体への捕捉・結合を行う検出法では、形成されたプライマーダイマーを検出してしまうことにより偽陽性判定を行うおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１３−１９８４８２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０７０６１８
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Annals of Biological Research, 2012, 3 (4): 1880-1884
【非特許文献２】日本食品微生物学会雑誌, 2000, 17 (2)： 121-126,
【非特許文献３】FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE, 2006, 3, Number 4,
【非特許文献４】Biomed Environ Sciences, 2014, 27(10): 770-778
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の通り、核酸増幅反応により、プライマーに由来する固定化用のタグと検出用のタグ又は標識物質とが付加された標的核酸の増幅産物を生成し、生成された増幅産物を固相担体上で固定し検出する核酸クロマトグラフィー法では、核酸増幅反応においてプライマーダイマーが形成されると、プライマーダイマーと標的核酸の増幅産物とが検出時に区別できず偽陽性を示すという問題があった。
【００１５】
そこで本発明は、核酸増幅反応と固相担体上での核酸増幅産物の検出（例えば、核酸クロマトグラフィー法）を含むリステリア・モノサイトゲネス由来の核酸の検出方法において、プライマーダイマーの形成を回避することを可能とする、判定精度の高い新たな検出手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記課題を解決する手段として以下の発明を開示する。
（１）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来する標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、増幅産物を固相担体に結合させるためのプライマーセットであって、
標的核酸に含まれる第１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１のプライマーと、
標的核酸において第１の塩基配列よりも下流に位置する第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２のプライマーと
を含み、
第１のプライマー及び第２のプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む
プライマーセット。
（２）標的核酸が、ｉａｐ遺伝子、ｈｌｙ遺伝子、ｌｍａ遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌ遺伝子、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｓｓｒ遺伝子、ｆｌａ遺伝子、ｐｌｃ遺伝子、ｐｒｆ遺伝子又はｍｐｌ遺伝子であることを特徴とする、（１）のプライマーセット。
（３）標的核酸がｉａｐ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（１ａ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（１ｂ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（２ａ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（２ｂ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
（２）のプライマーセット。
（４）標的核酸がｈｌｙ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（３ａ）配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（３ｂ）配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（４ａ）配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（４ｂ）配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
（２）のプライマーセット。
（５）標的核酸がｈｌｙ遺伝子であり、
第１のプライマーが、
（７ａ）配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（７ｂ）配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２のプライマーが、
（８ａ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド、又は
（８ｂ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチド
を含む
（２）のプライマーセット。
（６）標識部が、標識物質と結合可能なポリヌクレオチド又は低分子化合物を含むタグである、（１）〜（５）のいずれかのプライマーセット。
（７）結合部が、固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、（１）〜（６）のいずれかのプライマーセット。
（８）試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出する方法であって、
試料から取得されたＤＮＡを鋳型とし、（１）〜（７）のいずれかのプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
核酸増幅反応の生成物を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での増幅産物を検出する検出工程と
を含む方法。
（９）標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
標識部の前記タグに標識物質を結合させる標識工程を更に含む
（８）に記載の方法。
（１０）核酸増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を２５サイクル以上行う工程である、（８）又は（９）の方法。
（１１）核酸増幅工程が、（１）〜（７）のいずれかのプライマーセットにおける第１のプライマー及び第２のプライマーの各々の反応開始時の濃度が０．０５μＭ以上となる条件でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程である、（８）〜（１０）のいずれかの方法。
（１２）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出するためのキットであって、
（１）〜（７）のいずれかのプライマーセットと、
結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
を含むキット。
（１３）結合部と結合可能な部分を一部に含む前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスを含む、（１２）のキット。
（１４）標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、（１２）又は（１３）のキット。
（１５）結合部と結合可能な部分を一部に含む前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物（増幅産物）を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスを含む、（１４）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、試料中のリステリア・モノサイトゲネスを高精度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はラテラルフロー型核酸検出デバイス１０の模式図を示す。１：固相担体、２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、３：サンプルパッド（反応系受容部）、４：吸収パッド、５：基材、６：固相担体１の、タグ捕捉手段を含む部分。
【図２】図２は、実施例１試験１で得られた、各プライマーセットを用いたネガティブコントロールのＰＣＲ反応液の、核酸クロマトグラフィーにおける試験結果を示す写真である。
【図３】図３は、実施例１試験１において、ネガティブコントロール試験で着色した、Ｍｏｎｏプライマーセットを用いたＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動法により解析した結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例１試験２で得られた、Ｉａｐプライマーをプライマーセットとして用い、各濃度のリステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの増幅産物の核酸クロマトグラフィーによる検出結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例１試験２で得られた、Ｈｌｙプライマーをプライマーセットとして用い、各濃度のリステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの増幅産物の核酸クロマトグラフィーによる検出結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のプライマーセット
本発明は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来する標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、増幅産物を固相担体上で検出するためのプライマーセットを提供する。
【００２０】
本発明において核酸及びポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、より好ましくはＤＮＡである。また核酸及びポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド数は特に限定するものではなくオリゴヌクレオチドも包含する。
【００２１】
本発明において標的核酸とはその全体又は部分を増幅の対象とする核酸を指す。標的核酸はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸であればよく、リステリア・モノサイトゲネスに天然に存在する核酸であってもよいし、天然に存在する核酸から人為的に調製された核酸であってもよい。標的核酸としては例えばゲノムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等が挙げられ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡが特に好ましい。ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の各用語はその断片も包含する。標的核酸は一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖標的核酸を用いる場合は、通常の変性処理により一本鎖化して核酸増幅反応に用いることができる。標的核酸が二本鎖である場合、標的核酸の塩基配列とは、どちらか一方の鎖に含まれる塩基配列を指す。
【００２２】
標的核酸の具体例としては、リステリア・モノサイトゲネスのｉａｐ遺伝子、ｈｌｙ遺伝子、ｌｍａ遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌ遺伝子、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｓｓｒ遺伝子、ｆｌａ遺伝子、ｐｌｃ遺伝子、ｐｒｆ遺伝子又はｍｐｌ遺伝子が挙げられる。各遺伝子は、上記の通り、各遺伝子に対応する塩基配列を含むゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸であることができ、その部分塩基配列からなる断片であってもよい。
【００２３】
ｉａｐ遺伝子とは、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する、ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （侵入関連タンパク質）  ｐ６０をコードする遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号１５に示す塩基配列を有する。
【００２４】
ｈｌｙ遺伝子とは、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する、Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ Ｏ（リステリオリシンＯ）をコードする遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号１６に示す塩基配列を有する。
【００２５】
ｌｍａ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号１９に示す塩基配列を有する。
ａｃｔＡ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２０に示す塩基配列を有する。
【００２６】
ｉｎｌ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号１７に示す塩基配列を有する。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２１に示す塩基配列を有する。
【００２７】
ｓｓｒ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２２に示す塩基配列を有する。
ｆｌａ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２３に示す塩基配列を有する。
【００２８】
ｐｌｃ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２４に示す塩基配列を有する。
ｐｒｆ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号２５に示す塩基配列を有する。
ｍｐｌ遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスに特異的な配列を有する遺伝子であり、ゲノムＤＮＡ中では配列番号１８に示す塩基配列を有する。
【００２９】
本発明のプライマーセットは第１のプライマー（フォワードプライマーとして機能する）と、第２のプライマー（リバースプライマーとして機能する）とを含み、第１のプライマー及び第２のプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含むことを特徴とする。そこで以下、第１のプライマー、第２のプライマー、標識部、結合部の特徴について順に詳細に説明する。
【００３０】
なお、本発明において、「塩基配列Ｘと相同な塩基配列Ｙ」、或いは、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが相同である」、というとき、塩基配列ＸとＹとが同一である場合に限らず、塩基配列Ｘの相補配列を含む核酸（例えば標的核酸又はその相補鎖）と、塩基配列Ｙを含む核酸（例えば第１又は第２のプライマーのプライマー部分）とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせである限り、塩基配列ＸとＹとが部分的に異なっていてもよい。例えば、塩基配列Ｘの相補配列からなる核酸と、塩基配列Ｙからなる核酸とが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。典型的には、塩基配列Ｘと「相同な」塩基配列Ｙというとき、塩基配列ＸとＹとが以下の関係のいずれかを満たすことを指す。
【００３１】
（Ａ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが同一である。なお、塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方がＤＮＡの塩基配列であり、他方がＲＮＡの塩基配列である場合、一方におけるチミンと他方におけるウラシルとは同一の塩基であるとみなす。
【００３２】
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
【００３３】
（Ｃ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｄ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
【００３４】
前記（Ｂ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
【００３５】
前記（Ｃ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
【００３６】
前記（Ｃ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【００３７】
前記（Ｄ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４０〜６８℃、好ましくは４０〜６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１〜７×ＳＳＣ、０．０２〜３％  ＳＤＳ、温度４０℃〜６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜０．３％  ＳＤＳ、温度５０〜６５℃で行うことができる。
【００３８】
１．１．第１のプライマー及び第２のプライマー
第１のプライマーは、プライマー部分として、標的核酸に含まれる第１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む。
一方、第２のプライマーは、プライマー部分として、標的核酸において第１の塩基配列よりも下流（すなわち３’末端側）に位置する第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
このプライマーセットを用いることにより、標的核酸における第１の塩基配列の５’末端の塩基から、第２の塩基配列の３’末端の塩基までの領域を増幅することができる。増幅される該領域の長さは特に限定されないが通常は４０塩基以上、又は１００塩基以上の長さであり、上限は特に限定されないが通常は１０００塩基以下、５００塩基以下又は４００塩基以下の長さである。
「相同」については上記で定義した通りである。
【００４０】
第１の塩基配列及び第２の塩基配列はそれぞれ、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
【００４１】
本発明において「プライマー部分」とは、核酸増幅反応において標的核酸又はその相補鎖にアニーリングして伸長反応の起点となるポリヌクレオチドを含む部分であり、後述する標識部、結合部及びそれらを連結する基を含まない。
【００４２】
第１のプライマーのプライマー部分を構成するポリヌクレオチドは、その３’末端に第１の塩基配列と相同な塩基配列を含んでいればよく、第１の塩基配列と相同な塩基配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。第１のプライマーのプライマー部分を構成するポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
【００４３】
同様に、第２のプライマーのプライマー部分を構成するポリヌクレオチドは、その３’末端に第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列を含んでいればよく、第２の塩基配列に対する相補塩基配列と相同な塩基配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。第２のプライマーのプライマー部分を構成するポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。
【００４４】
本発明において第１のプライマー及び第２のプライマーのそれぞれのプライマー部分を構成するポリヌクレオチドは、公知の手法により製造することができ、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。
【００４５】
第１のプライマーは、前記ポリヌクレオチドと、後述する標識部又は結合部の一方を有し、さらに必要に応じて後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結された構造を有する。第１のプライマーにおいて、標識部及び結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的核酸との又は標的核酸に相補的な核酸とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【００４６】
同様に、第２のプライマーは、前記ポリヌクレオチドと、後述する標識部又は結合部の一方を有し、さらに必要に応じて後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結された構造を有する。第２のプライマーにおいて、標識部及び結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的核酸との又は標的核酸に相補的な核酸とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【００４７】
１．２．プライマーの好適な組み合わせ１
本発明のプライマーセットにおける第１の好適な組み合わせでは、
第１のプライマーが前記（１ａ）又は（１ｂ）のポリヌクレオチドを含み、且つ、
第２のプライマーが前記（２ａ）又は（２ｂ）のポリヌクレオチドを含む。
このプライマーセットは、ｉａｐ遺伝子を標的核酸とする場合に特に好適である。
【００４８】
前記（１ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列１ａとする。この塩基配列１ａは、配列番号１の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号１の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列１ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００４９】
塩基配列１ａが配列番号１の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１ａは、配列番号１の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号１の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列１ａが配列番号１の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列１ａは、配列番号１の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号１の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１５の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列と、配列番号１の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００５０】
前記（１ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１ａを含んでいればよく、塩基配列１ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（１ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１５に示すｉａｐ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列１ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（１ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列１ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５１】
前記（１ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列１ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（１ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列１ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００５２】
前記（１ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（１ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列１ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号１に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５３】
前記（２ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列２ａとする。この塩基配列２ａは、配列番号２の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号２の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列２ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００５４】
塩基配列２ａが配列番号２の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２ａは、配列番号２の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号２の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列２ａが配列番号２の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２ａは、配列番号２の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号２の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１５の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列と、配列番号２の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００５５】
前記（２ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２ａを含んでいればよく、塩基配列２ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（２ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１５の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列２ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（２ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列２ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５６】
前記（２ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列２ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（２ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列２ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００５７】
前記（２ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（２ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列２ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号２に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５８】
１．３．プライマーの好適な組み合わせ２
本発明のプライマーセットにおける第２の好適な組み合わせでは、
第１のプライマーが前記（３ａ）又は（３ｂ）のポリヌクレオチドを含み、且つ、
第２のプライマーが前記（４ａ）又は（４ｂ）のポリヌクレオチドを含む。
このプライマーセットは、ｈｌｙ遺伝子を標的核酸とする場合に特に好適である。
【００５９】
前記（３ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列３ａとする。この塩基配列３ａは、配列番号３の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号３の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列３ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００６０】
塩基配列３ａが配列番号３の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列３ａは、配列番号３の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号３の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列３ａが配列番号３の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列３ａは、配列番号３の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号３の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１６の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号３の塩基配列と、配列番号３の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００６１】
前記（３ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列３ａを含んでいればよく、塩基配列３ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（３ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（３ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１６に示すｈｌｙ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列３ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（３ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列３ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００６２】
前記（３ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号３の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列３ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（３ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列３ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００６３】
前記（３ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列３ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（３ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（３ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列３ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号３に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００６４】
前記（４ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列４ａとする。この塩基配列４ａは、配列番号４の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号４の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列４ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００６５】
塩基配列４ａが配列番号４の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列４ａは、配列番号４の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号４の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列４ａが配列番号４の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列４ａは、配列番号４の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号４の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１６の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号４の塩基配列と、配列番号４の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００６６】
前記（４ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列４ａを含んでいればよく、塩基配列４ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（４ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（４ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１６の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列４ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（４ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列４ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００６７】
前記（４ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列４ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（４ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列４ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００６８】
前記（４ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列４ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（４ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（４ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列４ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号４に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００６９】
１．４．プライマーの好適な組み合わせ３
本発明のプライマーセットにおける第３の好適な組み合わせでは、
第１のプライマーが前記（７ａ）又は（７ｂ）のポリヌクレオチドを含み、且つ、
第２のプライマーが前記（８ａ）又は（８ｂ）のポリヌクレオチドを含む。
このプライマーセットは、ｈｌｙ遺伝子を標的核酸とする場合に特に好適である。
【００７０】
前記（７ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列７ａとする。この塩基配列７ａは、配列番号７の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号７の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列７ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００７１】
塩基配列７ａが配列番号７の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列７ａは、配列番号７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号７の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列７ａが配列番号７の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列７ａは、配列番号７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号７の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１６の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号７の塩基配列と、配列番号７の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００７２】
前記（７ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列７ａを含んでいればよく、塩基配列７ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（７ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（７ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１６に示すｈｌｙ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列７ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（７ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列７ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７３】
前記（７ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号７の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列７ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（７ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列７ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００７４】
前記（７ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列７ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（７ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（７ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列７ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号７に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７５】
前記（８ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列８ａとする。この塩基配列８ａは、配列番号８の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号８の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列８ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００７６】
塩基配列８ａが配列番号８の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列８ａは、配列番号８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号８の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列８ａが配列番号８の塩基配列と前記（Ｂ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列８ａは、配列番号８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号８の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１６の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号８の塩基配列と、配列番号８の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００７７】
前記（８ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列８ａを含んでいればよく、塩基配列８ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（８ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（８ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１６の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列８ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（８ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列８ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７８】
前記（８ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列８ａ）のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む、塩基数４０以下のポリヌクレオチドである。前記（８ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列８ａのうち３’末端から連続した１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【００７９】
前記（８ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列８ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（８ｂ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（８ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列８ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号８に示す塩基配列のうち３’末端から連続した１０塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００８０】
１．５．標識部
標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
【００８１】
標識物質は増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは増幅産物を後述する固相担体に捕捉するのを妨げるものでなければよい。標識物質は検出の際に発色の良いものであることが好ましく、後述する固相担体や核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ〜１００ｎｍの粒径とすることができる。色素として、蛍光色素（フルオロセイン、シアニン等）等も使用可能であるが、その場合は各蛍光色素の励起波長光を照射し、検出することが好ましい。
【００８２】
標識部として利用可能な標識用タグは、標識物質と結合可能なものであればよく、標識物質の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。標識用タグの一つの好ましい形態としては、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。標識用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５〜５０、好ましくは１０〜３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号２６に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドや、配列番号２７に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。標識用タグのもう一つの好ましい形態としては、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ等の低分子化合物からなるものである。
【００８３】
標識部が上記の標識用タグである場合、標識物質と標識用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と標識用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、標識用タグがポリヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）に結合させ、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と標識用タグとを間接的に結合することができる。標識物質とポリヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃〜４０℃にて、１０ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６〜７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。
【００８４】
また、標識用タグが低分子化合物の場合、それと特異的に結合するタンパク質（例えばビオチンに結合するアビジン、ＦＩＴＣに結合するタンパク質）、抗体（例えば抗ＤＩＧ抗体）、アプタマー等の結合性物質と連結した標識物質により標識することができる。この場合、標識用タグと結合性物質とは、各種中性付近の緩衝液を用いて結合させることができる。
【００８５】
標識部（標識用タグ又は標識物質）と、第１のプライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、第２のプライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、標識部のうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと標識部とが結合される。このような「スペーサー」としては、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、標識部の二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’−５’結合、３’−３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００８６】
【化１】
2017158523.tif 000002
【００８７】
式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の３’端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の５’端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
【００８８】
脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’ 式（ＩＩ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
【００８９】
式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【００９０】
また、他のスペーサーとしては、以下の式（ＩＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’−（ＯＣnＨ2n）Ｌ−Ｏ−３’ 式（ＩＩＩ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌは４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
【００９１】
式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。
【００９２】
他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
【化２】
2017158523.tif 000003
【００９３】
これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドにリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
【００９４】
１．６．結合部
結合部は、後述する固相担体と結合可能なタグである。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
結合部として利用可能な固定化用タグは、固相担体と結合可能なものであればよく、固相担体の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。固定化用タグは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。固定化用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５〜５０、好ましくは１０〜３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号２６に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドや、配列番号２７に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。
【００９５】
固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。
【００９６】
固相担体は、少なくとも一部の部分が固定化用タグと結合可能なように構成されていればよく、より好ましくは一部の部分のみが固定化用タグと結合可能なように構成されている。固相担体の特定の部分のみを固定化用タグと結合可能なように構成することによって、固相担体に捕捉された増幅産物は前記部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【００９７】
固相担体と固定化用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と固定化用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、固定化用タグがポリヌクレオチドを含む場合、固相担体に当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）を固定化してタグ捕捉手段とし、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と固定化用タグとを間接的に結合することができる。固相担体へのポリヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、標識用タグと標識物質との結合に関して上記した条件により行うことができる。ポリヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の部分に限局して固定化することによって、捕捉された増幅産物は所定の部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【００９８】
結合部（固定化用タグ）と、第１のプライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、第２のプライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、固定化用タグのうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと固定化用タグとが結合される。結合部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーの具体例は、標識部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーに関して上述したものと同様である。
【００９９】
２．本発明の検出方法
本発明は、上記のプライマーセットを用いて、試料中のリステリア・モノサイトゲネス及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出する方法を提供する。
検出対象試料は特に限定されないが、典型的には、飲食品、動物植物等の生体の一部（器官、組織、細胞等）、糞便、微生物、ウイルス等を含む試料が挙げられる。
【０１００】
試料から取得されたＤＮＡを、核酸増幅反応に鋳型として利用する。該ＤＮＡは、試料から抽出され精製された形態であってもよいし、試料から抽出され粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度でＤＮＡを含む試料であれば、試料自体をそのまま核酸増幅反応に含めることもできる。また試料から調製されたｃＤＮＡも「試料から取得されたＤＮＡ」として利用可能である。
以下、核酸増幅工程、検出工程、標識工程について説明する。
【０１０１】
２．１．核酸増幅工程
核酸増幅工程は、試料から取得されたＤＮＡを鋳型とし、上述したプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う工程である。
核酸増幅反応は、一般的なＰＣＲ法に従って行うことができる。すなわち、標的核酸を含む鋳型ＤＮＡに対し本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、所望の領域が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。
【０１０２】
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
【０１０３】
ホットスタートＰＣＲ法は、プライマーダイマーの形成を抑制する効果が期待できることから有用である。ホットスタートＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）等の市販のホットスタートＰＣＲ用試薬を用いて行うことができる。また、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ，  ＵＮＧ  ｐｌｕｓ（登録商標）を使用することもでき、このキットを用いることで核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションを抑制する効果も期待できる。
【０１０４】
ＰＣＲ法でのサイクル数は２５サイクル以上が好ましく、３０サイクル以上がより好ましい。サイクル数の上限は特に限定されないが通常は６０サイクル以下、好ましくは５０サイクル以下である。一般的には、サイクル数が多いほど増幅倍率を高めることができると同時にプライマーダイマーが反応系中に生成され易くなる。しかし、本発明のプライマーセットを用いると、ＰＣＲ法でのサイクル数を２５サイクル以上としてもプライマーダイマーの生成が少なく、試料中の微量な標的核酸を十分に増幅することができ、高感度での検出が可能となる。
【０１０５】
ＰＣＲ法での反応系中の開始時のプライマー濃度は特に限定されず、鋳型となるＤＮＡ量等に応じて適宜調整することができる。反応系中の反応開始時の好ましいプライマー濃度としては、第１のプライマー及び第２のプライマーが各々０．０５μＭ以上、１．０μＭ以下という濃度が挙げられる。０．０５μＭ未満の場合、検出感度が低下して基準となる検出感度の低下が生じる可能性がある。また、プライマー濃度の上限は特に限定されないが、好ましくは１.０μＭである。
【０１０６】
核酸増幅工程において鋳型ＤＮＡ中に標的ＤＮＡが含まれている場合、増幅産物として、一方の端に前記標識部が連結し、他方の端に前記結合部が連結した二本鎖の標的ＤＮＡが反応系中に形成される。
【０１０７】
２．２．検出工程
検出工程は、前記核酸増幅工程における核酸増幅反応の生成物を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での増幅産物を検出する工程である。
【０１０８】
標識部が上述の標識用タグである場合には、標識物質を標識用タグに結合させる標識工程を更に行えばよい。標識部が上述の標識物質である場合には標識工程は不要である。検出工程において「標識部を指標として」とは、標識部が標識用タグである場合には標識工程を経て結合した標識物質を指標として増幅産物を検出することを指し、標識部が標識物質である場合には該標識物質を指標として増幅産物を検出することを指す。
【０１０９】
核酸増幅反応の生成物とは、増幅産物を含んでいる可能性のある核酸増幅反応の反応液や、該反応液から増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。
固相担体は前記の「１．６．結合部」において詳述した通りである。
【０１１０】
固相担体の結合部と結合可能な部分への、前記生成物の接触は、固相担体と結合部との組合せに応じて、前記生成物中に増幅産物が含まれていた場合に前記部分に増幅産物の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば前記「１．６．結合部」で説明したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５〜９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
【０１１１】
増幅産物の検出は、固相担体に捕捉された増幅産物に結合した前記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。増幅産物が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された増幅産物の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、核酸増幅反応の反応系中の増幅産物（標的核酸）の有無を判別することができるとともに、試料中でのリステリア・モノサイトゲネス及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸の有無を判別することができる。
【０１１２】
２．３．標識工程
標識工程は、本発明のプライマーセットに含まれる前記標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、核酸増幅反応の生成物と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、核酸増幅反応の生成物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
【０１１３】
標識物質と前記生成物との接触は、標識物質と標識用タグとの組合せに応じて、前記生成物中に増幅産物が含まれていた場合に標識物質と増幅産物の標識用タグとが結合するように適宜調節された条件（例えば前記「１．６．結合部」で説明したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５〜９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
【０１１４】
３．本発明のキット
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネス及び／又はリステリア・モノサイトゲネスに由来する核酸を検出するためのキットであって、本発明のプライマーセットと、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体とを含むキットを提供する。該キットは本発明の検出方法において利用することができる。
【０１１５】
本発明のプライマーセットにおける標識部が標識用タグである場合には、本発明のキットは、標識物質を更に含むことができる。
固相担体及び標識物質は、後述する核酸検出デバイスの形態とすることができる。
本発明のキットにはさらに、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。
【０１１６】
４．核酸検出デバイス
上述の検出工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、核酸増幅反応の反応系中の増幅産物（標的核酸）の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
【０１１７】
核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により標識された核酸増幅産物を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。
【０１１８】
本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図１に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図１中に示される符号に対応する。
【０１１９】
図１の核酸検出デバイス１０は、基材５の上に、核酸増幅反応の反応系を受容するための反応系受容部であるサンプルパッド３、標識物質を保持するコンジュゲートパッド２、増幅産物に含まれる結合部と結合可能な部分６を一部に含む多孔質固相担体１、及び吸収パッド４を互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体１の部分６は、増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、上記オリゴヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。サンプルパッド３、コンジュゲートパッド２、固相担体１及び吸収パッド４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識部が標識物質である場合には、コンジュゲートパッド２は省略することができる。
【０１２０】
核酸増幅工程により得られた核酸増幅反応の反応系をサンプルパッド３に添加する。前記反応系をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド３に添加された前記反応系は、図１中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。
【０１２１】
また別の態様としては、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に当該核酸検出デバイスを入れ、サンプルパッド３を核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液に浸漬させる方法で展開することもできる。その場合、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器にサンプルパッド３が入るように、サンプルパッド３の幅は２.０〜１０．０ｍｍにすることが好ましく、２.０〜５．０ｍｍにすることがより好ましい。
【０１２２】
前記標識部が標識用タグである実施形態では、反応系中の増幅産物は標識物質が保持されたコンジュゲートパッド２を通過する際に、標識物質と接触し、標識用タグを介して標識物質により標識される。
【０１２３】
次いで、反応系中の増幅産物は、固相担体１を通過する際に、部分６に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体１に捕捉・結合される。
【０１２４】
試料中に標的核酸が存在する場合には、捕捉手段を含む固相担体１の部分６に捕捉・結合された増幅産物に結合した標識物質が部分６に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して部分６が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、試料中の標的核酸の有無を判別することができる。
【０１２５】
（実施例）
本発明を以下の実験結果に基づき具体的に説明するが本発明はこれらによって限定されるものではない。
【０１２６】
[実施例１］
＜材料＞
（Ｉ）リステリアに特徴的な遺伝子を検出するためのプライマー候補の設計
リステリア・モノサイトゲネスに特徴的な遺伝子を増幅するためのプライマーセットの候補として、以下の７種類のプライマーセット（フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との対）を設計した。
【０１２７】
【表１】
2017158523.tif 000004
【０１２８】
Ｉａｐプライマーセットは、配列番号１５に示すｉａｐ遺伝子の第４８６〜６１６番の領域を増幅するよう設計した。
Ｈｌｙプライマーセットは、配列番号１６に示すｈｌｙ遺伝子の第１０４４〜１２７７番の領域を増幅するよう設計した。
【０１２９】
Ｈｌｙ１プライマーセットは、配列番号１６に示すｈｌｙ遺伝子の第８３１〜１２８６番の領域を増幅するよう設計した。
Ｈｌｙ２プライマーセットは、配列番号１６示すｈｌｙ遺伝子の第６５２〜８９１番の領域を増幅するよう設計した。
【０１３０】
Ｍｏｎｏプライマーセットは、配列番号１５に示すｉａｐ遺伝子の第７３６〜１０８８番の領域を増幅するよう設計した。
Ｉｎｌプライマーセットは、配列番号１７に示すｉｎｌＡ遺伝子の第１２１１〜１３７０番の領域を増幅するよう設計した。
【０１３１】
ＣＤプライマーセットは、配列番号１８に示すｍｐｌ遺伝子の第−２５〜１３６番の領域を増幅するよう設計した。なおＣＤプライマーセットのフォワードプライマー（配列番号１３）は、リステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡにおいて配列番号１８に示すｍｐｌ遺伝子の上流の領域（ｈｌｙ遺伝子とｍｐｌ遺伝子の間の領域）の−２５〜−６の位置に設計されている。
【０１３２】
各プライマーセットのフォワードプライマーのプライマー部分を構成するＤＮＡ（表１に示す）の５’末端には、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Ｉで表される二価基を介して、以下のフォワードプライマー用タグ配列からなるＤＮＡを連結した。このとき、上記式Ｉに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の５’端と、フォワードプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の３’端のリン酸基と、各フォワードプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの５’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
５’−ＧＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡ−３’（配列番号２６）
【０１３３】
各プライマーセットのリバースプライマーのプライマー部分を構成するＤＮＡ（表１に示す）の５’末端には、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Ｉで表される二価基を介して、以下のリバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡを連結した。このとき、上記式Ｉに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の５’端と、リバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の３’端 のリン酸基と、各リバースプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの５’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
５’−ＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号２７）
【０１３４】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＩａｐプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号２８に、リバースプライマーの全配列を配列番号２９に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号３０に、リバースプライマーの全配列を配列番号３１に示す。
【０１３５】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙ１プライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号３２に、リバースプライマーの全配列を配列番号３３に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙ２プライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号３４に、リバースプライマーの全配列を配列番号３５に示す。
【０１３６】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＭｏｎｏプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号３６に、リバースプライマーの全配列を配列番号３７に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＩｎｌプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号３８に、リバースプライマーの全配列を配列番号３９に示す。
【０１３７】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＣＤプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号４０に、リバースプライマーの全配列を配列番号４１に示す。
配列番号２８〜４１に示す塩基配列からなるタグ配列及びリンカー配列を含む各プライマーの合成はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。
【０１３８】
（ＩＩ）オリゴヌクレオチド結合金コロイドの作製
Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記の配列番号４２で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。
【０１３９】
インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
【０１４０】
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’−ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ−ＳＨ−３’（配列番号４２）
【０１４１】
配列番号４２で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端のシトシンヌクレオチドの３’位のリン酸基と、ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ（ｍは６）で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。
【０１４２】
（ＩＩＩ）タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
タグ捕捉手段として、下記配列番号４３で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’−ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ−３’（配列番号４３）
【０１４３】
（ＩＶ）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図１の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。
すなわち、基材５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド２として上記（ＩＩ）で作製したコンジュゲートパッド、部分６に捕捉手段として上記（ＩＩＩ）で作製したタグ捕捉手段を備えたメンブレン（固相担体）１、サンプルパッド３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図１に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０を作製した。
【０１４４】
＜試験１：非特異的検出の有無の確認試験＞
リステリア・モノサイトゲネス由来の鋳型ＤＮＡを、前記各プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、プライマーダイマーの非特異的な着色による偽陽性が生じるか否かを確認した。
【０１４５】
リステリア・モノサイトゲネスＤＮＡコントロール（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を滅菌水にて希釈し５０ ｐｇ／μＬとしたものを、リステリア・モノサイトゲネス由来の鋳型ＤＮＡ溶液として本試験に用いた。
【０１４６】
ＰＣＲ試薬としてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用い、全量２５μＬの、次表に示す組成のＰＣＲ反応液を調製した。
【０１４７】
【表２】
2017158523.tif 000005
【０１４８】
ネガティブコントロールとして、上記鋳型ＤＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水を１μＬ用いた以外は同様の組成のＰＣＲ反応液を調製した。
５μＭ  フォワードプライマー溶液及び５μＭ  リバースプライマー溶液は所定のプライマーを５μＭの濃度となるように滅菌蒸留水中に溶解させたものである。
【０１４９】
ＰＣＲは、９５℃で２分間加熱した後、９５℃２０秒間−６０℃３０秒間−７２℃３０秒間を１サイクルとして、４０サイクル実施し、第４０サイクル完了後に４℃に冷却する、という条件で行った。
【０１５０】
上記条件でのＰＣＲ後の反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０に適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、前記デバイス１０上のサンプルパッド３にＰＣＲ後の反応液５μＬを添加し、さらに８０μＬの展開溶液（界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液）を添加することで、反応液を展開した。室温で１０分後、メンブレン１上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無を目視で確認した。
【０１５１】
上記試験の結果、表１に示す７つのプライマーセットのいずれを用いた場合にも、鋳型ＤＮＡをＰＣＲ増幅させた試験区では、タグ捕捉手段を含む部分６の金コロイドに由来する赤色の着色が確認できた。ただし、Ｈｌｙ１プライマーセット、Ｍｏｎｏプライマーセット、Ｉｎｌプライマーセットを用いた場合には、鋳型ＤＮＡを反応系に添加しないネガティブコントロール試験においても部分６の着色が観察された。一方、Ｉａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセット、ＣＤプライマーセットを用いた場合には、ネガティブコントロール試験での部分６の着色は全く観察されなかった。ネガティブコントロール試験の結果を表３及び図２に示す。
【０１５２】
【表３】
2017158523.tif 000006
【０１５３】
Ｈｌｙ１プライマーセット、Ｍｏｎｏプライマーセット、Ｉｎｌプライマーセットを用いた場合のネガティブコントロール試験での着色の原因を調べるためにＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動法により解析したところ、図３に示すように標的ＤＮＡの増幅長とは異なり短い領域の増幅が見られたことからプライマーダイマーの形成が認められ、これらが核酸クロマト型チップ上で検出され、偽陽性判定の原因となっていたことが判明した。図３ではＭｏｎｏプライマーセットを用いた場合のネガティブコントロール試験のＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動法の結果を左側に示し、プライマー及びプライマーダイマーを含む標準試料のアガロースゲル電気泳動法の結果を右側に示す。図示しないが、Ｈｌｙ１プライマーセット及びＩｎｌプライマーセットを用いた場合についても同様の結果が得られた。
【０１５４】
以上の結果から、Ｉａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセット及びＣＤプライマーセットを用いることにより、リステリア・モノサイトゲネスゲノムＤＮＡを特異的に増幅することができ、増幅産物は、該ＤＮＡに由来しないプライマーダイマーによる偽陽性を生じないことが確認された。
【０１５５】
＜試験２：高感度検出性の確認試験＞
上記試験１において非特異的着色（偽陽性）を生じないことが確認された４つのプライマーセット（Ｉａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセット及びＣＤプライマーセット）の中から、リステリア・モノサイトゲネスゲノムＤＮＡを高感度に検出可能なプライマーセットを選抜するために以下の試験を行った。
【０１５６】
表２に示すＰＣＲ反応液組成において、鋳型ＤＮＡ溶液として５０ｐｇ／μＬ、５ｐｇ／μＬ又は０．５ｐｇ／μＬの各濃度に調整した鋳型ＤＮＡ溶液１μＬを用いた以外は、試験１と同様の条件及び手順にてＰＣＲ増幅及び核酸クロマトグラフィー法による検出を行った。ネガティブコントロール試験（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）として、鋳型ＤＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水を用いて同様の試験を行った。
デバイス１０のタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無の観察結果を次表に示す。
【０１５７】
【表４】
2017158523.tif 000007
【０１５８】
図４には、Ｉａｐプライマーセットを用いた検出試験でのデバイス１０での部分６を含む固相担体１の写真を示す。図５には、Ｈｌｙプライマーセットを用いた検出試験でのデバイス１０での部分６を含む固相担体１の写真を示す。図４及び５において「Ｌｉｓｔｅｒｉａ検出ライン」は部分６に相当する。「内部標準ライン」は、固相担体１の部分６以外の部分に形成した、コントロールとして予め添加される対照核酸（内部標準物質）の増幅および／または標識反応産物を検出するための対照検出部である。「内部標準ライン」は、増幅反応および／または標識反応が正常に進行したかどうかを評価するために用いられ、「内部標準ライン」におけるシグナルを検出することで、酵素などの試薬が正常に機能したこと、および実験操作が問題なく適切に行われたことを評価し、検査結果の信頼性を確認するために利用する。
【０１５９】
上記結果から、Ｉａｐプライマーセット、およびＨｌｙプライマーセットは、０．５ｐｇ／ｔｅｓｔの微量のゲノムＤＮＡを検出可能であることが確認された。すなわちＩａｐプライマーセット、およびＨｌｙプライマーセットが核酸クロマトグラフィー法を用いてリステリア・モノサイトゲネスを高感度かつ特異的に検出可能なプライマーセットであることが判明した。
【０１６０】
［実施例２］
＜材料＞
（Ｉ）リステリアに特徴的な遺伝子を検出するためのプライマー候補の設計
実施例１の表１で示す７種のプライマーセットを用いた。
各プライマーセットのフォワードプライマーのプライマー部分の５’末端には、下記の式ＩＶで表されるビオチン含有標識用タグを連結した。具体的には、下記の式ＩＶで表される、ビオチンの構造を含む一価基のリン酸基と、各フォワードプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの５’位の水酸基とでリン酸エステル結合を形成することにより、式ＩＶで表される一価基をプライマー部分の５’末端に連結した。
【０１６１】
【化３】
2017158523.tif 000008
【０１６２】
各プライマーセットのリバースプライマーのプライマー部分を構成するＤＮＡ（表１に示す）の５’末端には、ポリメラーゼ反応を阻害する５’-５’結合である逆位配列構造を含む、下記の式Ｖで表される二価基を介して、実施例１（Ｉ）に記載の配列番号２７に示すリバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡを連結した。このとき、下記の式Ｖで表される、逆位配列構造を含む二価基の５’端に、リバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端が接続し、該二価基の３’端に、各リバースプライマーのプライマー部分を構成するＤＮＡ（表１に示す）の５’末端が接続するように連結した。このとき、下記の式Ｖで表される二価基の５’端のリン酸基と、配列番号２７のリバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端のヌクレオチドのデオキシリボース上の３’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の３’端と、各リバースプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボース上の５’位のリン酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
【０１６３】
【化４】
2017158523.tif 000009
【０１６４】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＩａｐプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号４４に、リバースプライマーの全配列を配列番号４５に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号４６に、リバースプライマーの全配列を配列番号４７に示す。
【０１６５】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙ１プライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号４８に、リバースプライマーの全配列を配列番号４９に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＨｌｙ２プライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号５０に、リバースプライマーの全配列を配列番号５１に示す。
【０１６６】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＭｏｎｏプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号５２に、リバースプライマーの全配列を配列番号５３に示す。
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＩｎｌプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号５４に、リバースプライマーの全配列を配列番号５５に示す。
【０１６７】
上記のタグ配列及びリンカー配列を含むＣＤプライマーセットのフォワードプライマーの全配列を配列番号５６に、リバースプライマーの全配列を配列番号５７に示す。
配列番号４４〜５７に示す塩基配列からなるタグ配列及びリンカー配列を含む各プライマーの合成はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。
【０１６８】
（ＩＩ）ストレプトアビジン結合ラッテックスの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス（青色）（固形分１０％（ｗ／ｗ）、Ｂａｎｇｓ社製）とストレプトアビジン（和光純薬工業社製）を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したＭＥＳ緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、ストレプトアビジン結合ラッテックス（青色）を作製した。このラテックス溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、熱風乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
【０１６９】
（ＩＩＩ）タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
実施例１（ＩＩＩ）で記載した方法で、同様にタグ捕捉用のプローブを配置したメンブレンを作製した。
【０１７０】
（ＩＶ）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
上記（ＩＩ）で作製したコンジュゲートパッドをコンジュゲートパッド２として用いる以外は、実施例１の（ＩＶ）と同様の方法にて核酸検出デバイスを作製した。
【０１７１】
＜試験1＞
上記（Ｉ）で作製した各プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、プライマーダイマーの非特異的な着色による偽陽性が生じるか否かを実施例１と同様に確認した。
鋳型ＤＮＡ溶液は実施例１で作製したリステリア・モノサイトゲネスＤＮＡ５０ ｐｇ／μＬを用いた。
【０１７２】
ＰＣＲ試薬としてＴａｋａｒａ  Ｔａｑ  ＨＳ（登録商標）,  ＵＮＧ  ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、全量２５μＬの、次表に示す組成のＰＣＲ反応液を調製した。
【０１７３】
【表５】
2017158523.tif 000010
【０１７４】
ネガティブコントロールとして、上記鋳型ＤＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水を１μＬ用いた以外は同様の組成のＰＣＲ反応液を調製した。
【０１７５】
５μＭ  フォワードプライマー溶液及び５μＭ  リバースプライマー溶液は所定のプライマーを５μＭの濃度となるように滅菌蒸留水中に溶解させたものである。
ＵＮＧはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを指す。
【０１７６】
ＰＣＲは、２５℃１０分間加温し、９５℃で２分間加熱した後、９８℃１０秒間−６０℃３０秒間−７２℃３０秒間を１サイクルとして、４０サイクル実施し、第４０サイクル完了後に４℃に冷却する、という条件で行った。
【０１７７】
上記条件でのＰＣＲ後の反応液を、核酸検出デバイスに適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、ＰＣＲ反応液を含むチューブに展開バッファー（界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液）８０μｌを添加、混和した後、その反応チューブに前記（ＩＶ）で作製した核酸検出デバイスをサンプルパッド３の側から差し込み展開を開始した。室温で１０分後、メンブレン１上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無を目視で確認した。
【０１７８】
上記試験の結果、表１に示す７つのプライマーセットのいずれを用いた場合にも、鋳型ＤＮＡをＰＣＲ増幅させた試験区では、タグ捕捉手段を含む部分６のポリスチレンラテックス（青色）による青色の着色が確認できた。ただし、Ｈｌｙ１プライマーセット、Ｍｏｎｏプライマーセット、Ｉｎｌプライマーセットを用いた場合には、鋳型ＤＮＡを反応系に添加しないネガティブコントロール試験においても部分６の着色が観察された。一方、Ｉａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセット、ＣＤプライマーセットを用いた場合には、ネガティブコントロール試験での部分６の着色は全く観察されなかった。
【０１７９】
＜試験２：高感度検出性の確認試験＞
上記試験１において非特異的着色（偽陽性）を生じないことが確認された４つのプライマーセット（Ｉａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセット及びＣＤプライマーセット）の中から、リステリア・モノサイトゲネスゲノムＤＮＡを高感度に検出可能なプライマーセットを選抜するために以下の試験を行った。
【０１８０】
表５に示すＰＣＲ反応液組成において、鋳型ＤＮＡ溶液として５０ｐｇ／μＬ、５ｐｇ／μＬ又は０．５ｐｇ／μＬの各濃度に調整した鋳型ＤＮＡ溶液１μＬを用いた以外は、試験１と同様の条件及び手順にてＰＣＲ増幅及び核酸クロマトグラフィー法による検出を行った。ネガティブコントロール試験（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）として、鋳型ＤＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水を用いて同様の試験を行った。
デバイスのタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無の観察結果を次表に示す。
【０１８１】
【表６】
2017158523.tif 000011
【０１８２】
上記結果から、標識用のタグにビオチンを、結合部に逆位構造をスペーサーとして介したオリゴヌクレオチドタグをそれぞれ用いたＩａｐプライマーセット、およびＨｌｙプライマーセットにおいても、０．５ｐｇ／ｔｅｓｔの微量のゲノムＤＮＡを検出可能であることが確認された。また、Ｈｌｙ２プライマーセット、およびＣＤプライマーセットを用いた場合も５０ｐｇ／ｔｅｓｔのゲノムＤＮＡを検出可能であることが確認された。すなわち、片側に低分子化合物を含むタグを用いた場合でもＩａｐプライマーセット、Ｈｌｙプライマーセット、Ｈｌｙ２プライマーセットおよびＣＤプライマーセットが核酸クロマトグラフィー法を用いてリステリア・モノサイトゲネスを高感度かつ特異的に検出可能なプライマーセットであることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
本発明のプライマーセット、方法及びキットは、食中毒の原因菌となるリステリア・モノサイトゲネスの正確で簡便な検出に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１８４】
配列番号１：Ｉａｐフォワードプライマー
配列番号２：Ｉａｐリバースプライマー
配列番号３：Ｈｌｙフォワードプライマー
配列番号４：Ｈｌｙリバースプライマー
配列番号５：Ｈｌｙ１フォワードプライマー
配列番号６：Ｈｌｙ１リバースプライマー
配列番号７：Ｈｌｙ２フォワードプライマー
配列番号８：Ｈｌｙ２リバースプライマー
配列番号９：Ｍｏｎｏフォワードプライマー
配列番号１０：Ｍｏｎｏリバースプライマー
配列番号１１：Ｉｎｌフォワードプライマー
配列番号１２：Ｉｎｌリバースプライマー
配列番号１３：ＣＤフォワードプライマー
配列番号１４：ＣＤリバースプライマー
配列番号１５：ｉａｐ遺伝子
配列番号１６：ｈｌｙ遺伝子
配列番号１７：ｉｎｌＡ遺伝子
配列番号１８：ｍｐｌ遺伝子
配列番号１９：ｌｍａ遺伝子
配列番号２０：ａｃｔＡ遺伝子
配列番号２１：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子
配列番号２２：ｓｓｒ遺伝子
配列番号２３：ｆｌａ遺伝子
配列番号２４：ｐｌｃ遺伝子
配列番号２５：ｐｒｆ遺伝子
配列番号２６：タグ配列
配列番号２７：タグ配列
配列番号２８：Ｉａｐフォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のアデニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号２９：Ｉａｐリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３０：Ｈｌｙフォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３１：Ｈｌｙリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のシトシンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３２：Ｈｌｙ１フォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３３：Ｈｌｙ１リバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３４：Ｈｌｙ２フォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のアデニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３５：Ｈｌｙ２リバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のシトシンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３６：Ｍｏｎｏフォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のシトシンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３７：Ｍｏｎｏリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３８：Ｉｎｌフォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号３９：Ｉｎｌリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号４０：ＣＤフォワードプライマー／２０位のアデニンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号４１：ＣＤリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｉの二価基を介して連結されている。
配列番号４２：プローブ／３’末端にチオール基が導入されている。
配列番号４３：プローブ
配列番号４４：Ｉａｐフォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号４５：Ｉａｐリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号４６：Ｈｌｙフォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号４７：Ｈｌｙリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のシトシンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号４８：Ｈｌｙ１フォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号４９：Ｈｌｙ１リバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号５０：Ｈｌｙ２フォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号５１：Ｈｌｙ２リバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のシトシンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号５２：Ｍｏｎｏフォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号５３：Ｍｏｎｏリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号５４：Ｉｎｌフォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号５５：Ｉｎｌリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のグアニンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
配列番号５６：ＣＤフォワードプライマー／式ＩＶのビオチン含有基が５’末端に結合している。
配列番号５７：ＣＤリバースプライマー／２０位のチミジンヌクレオチドと２１位のチミジンヌクレオチドとは、式Ｖの二価基を介して連結されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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