(57)【要約】【課題】(1)マンナンを加水分解しても単糖（マンノース等）の生成が極めて少なく、高収率でマンノビオースを得ることができる新規なマンナナーゼ及び(2)かかるマンナナーゼを産生する微生物。【解決手段】次の理化学的性質を有するマンナナーゼＭＮ−１  1）作用：マンナンに作用してマンノビオースを優先的に生成する。2）基質特異性：β−１，４マンノピラノシド結合を加水分解する。3）安定ｐＨは４〜７。4）作用温度は３０〜５０℃。5）温度安定性は５０℃以下。6）分子量は４万。バチルス属に属しマンナナーゼを産生するバチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が産生するマンナナーゼであって、以下の性質：
1) 作用：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースを優先的に生成する。
2) 基質特異性：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない。
3) 安定ｐＨ：ｐＨ４．０〜７．０の範囲で最適ｐＨでの活性に対し５０％以上の活性を示す。
4) 作用適温：最大活性の８０％以上の活性を示す温度範囲は３０〜５０℃である。
5）温度安定性：ｐＨ５において６０分間保持をした場合、３０℃以下では活性に変化なく、４０℃で９０％以上の活性が残存し、６０℃以上では失活する。
6）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定して４０，０００である。
を有することを特徴とするマンナナーゼ。
【請求項２】
該微生物が、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する、請求項１記載のマンナナーゼ。
【請求項３】
該バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６）であることを特徴とする請求項２に記載のマンナナーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のマンナナーゼを使用する、食品用マンノオリゴ糖の製造法。
【請求項５】
請求項１記載のマンナナーゼを産生する、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物である、バチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマンナン類多糖を選択的に分解する新規なマンナナーゼ及びこれを産生する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食物繊維等の分解には酸分解、アルカリ分解又は酵素分解等が用いられてきたが、これらの方法では単糖類の生成が多く、食物繊維等の改質（例えば可溶化、低分子化等）やオリゴ糖を目的とする場合にはその収率が下がる欠点を有している場合がある。
【０００３】
食物繊維のなかでも、マンナン等の植物由来の繊維はβ−１，４マンノシド結合した主鎖を有し、このβ−１，４マンノシド結合を加水分解する酵素としてβ−１，４マンナナーゼが知られているが、従来知られているβ−１，４マンナナーゼは単糖（マンノース）まで分解してしまう場合が多い。
【０００４】
一方、バチルス属のベレゼンシス（特許文献１）、バチルス属のポリミキサ（特許文献２）、バチルス属のコアグランス（特許文献３）、アシネトバクター属菌株（特許文献３）、ペニシリウム属菌株（特許文献４）、バチルス・アミロリケファシエンス株（非特許文献１）等から得られるマンナナーゼがすでに報告されている。しかし、従来知られている酵素は、いずれもβ−１，４マンノシド結合を加水分解して単糖類（マンノース）にまで分解して、マンノオリゴ糖の生成が少ないものであって、マンノビオースを優先的に生成して、マンノオリゴ糖を高収率で得られるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−６０８０５号公報
【特許文献２】特開２００２−６５２５７号公報
【特許文献３】特開平８−３２２４７７号公報
【特許文献４】特開２０００−４１６６３号公報
【特許文献５】特開２００１−１４５４８５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】African Journal of Biotechnology Vol. 7 (8), pp. 1123-1128, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、マンナン類多糖類を分解し、マンノオリゴ糖を高収率で特にマンノビオースおよびマンノトリオースを高収率で得る新しいマンナナーゼ源を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題に対して鋭意検討を重ねた結果、ある特定の微生物が課題を解決するマンナナーゼを産生することを見出し、本発明を完成させた。
即ち本発明は、
（１）微生物が産生するマンナナーゼであって、以下の性質：
1) 作用：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースを優先的に生成する、
2) 基質特異性：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない、
3) 安定ｐＨ：ｐＨ４．０〜７．０の範囲で最適ｐＨでの活性に対し５０％以上の活性を示す、
4) 作用適温：最大活性の８０％以上の活性を示す温度範囲は３０〜５０℃である、
5）温度安定性：ｐＨ５において６０分間保持をした場合、３０℃以下では活性に変化なく、４０℃で９０％以上の活性が残存し、６０℃以上では失活する、
6）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定して４０，０００である、
を有することを特徴とするマンナナーゼ、
（２）該微生物が、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する、（１）記載のマンナナーゼ、
（３）該バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６）であることを特徴とする（２）に記載のマンナナーゼ、
（４）（１）〜（３）いずれか１つに記載のマンナナーゼを使用する、食品用マンノオリゴ糖の製造法、
（５）（１）記載のマンナナーゼを産生する、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物である、バチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６）、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るマンナナーゼは、従来知られていたマンナナーゼに比べ、β−１，４マンノシド結合を加水分解して単糖類（マンノース）を殆ど生成せず、マンノオリゴ糖、特にマンノビオースの生成が多いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係るマンナナーゼは、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス（Amyloliquefaciens）種のバチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７の微生物から得られ、以下の理化学的性質を有することを特徴としている。
1) 作用：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースおよびマンノトリオースを生成し単糖（マンノース等）を殆ど遊離しない。
2) 基質特異性：マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない。
3) 安定ｐＨ：ｐＨ４．０〜７．０の範囲で５０％以上の残存活性を示す。
4) 作用適温：最大活性の８０％以上の活性を示す温度範囲は３０〜５０℃である。
5）温度安定性：ｐＨ５において６０分間保持をした場合、３０℃以下では活性に変化なく、４０℃で９０％以上の活性が残存し、６０℃以上では失活する。
6）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定して４０，０００である。
【００１１】
上記マンナナーゼは、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス（Amyloliquefaciens）種のバチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター  微生物寄託受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８１６、受領日：2014年3月7日）の培養液から好適に採取することができる。
【００１２】
前記細菌は、形態：桿菌、グラム染色性：陽性、運動性：有、鞭毛の着生状態：周毛、酸素に対する態度：好気性又は通性嫌気性、カタラーゼ反応：陽性、リパーゼ活性：無、芽胞を形成するので、バチルス属有胞子桿菌に一致する性状を持っている。標準寒天培地上に生育したコロニーから定法に従ってＤＮＡを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて同定したところ、Bacillus Amyloliquefaciensと同定された。
本発明を実施する具体的態様を以下に実施例を用いて説明する。
【実施例】
【００１３】
実施例１  
香川県高松市付近から採取した土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、分離用寒天培地（＊１）に塗布し、３７℃で１〜２日間培養しコロニーを形成させた。コロニー周辺にマンナンの分解に基づく透明帯（ハロー）を形成するものを選出し、マンナナーゼ生産菌を取得した。菌学的性質は前記に記載した通りであった。
【００１４】
次に、これら取得菌を更に液体培地（＊２）に接種し３７℃にて３日間振とう培養し、遠心分離（１０，０００rpm×１０分）して得た上清について次の方法でマンナナーゼ活性を測定（＊３）した。
【００１５】
以上の方法にてマンナナーゼ活性の強い菌をスクリーニングし、バチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７を得た。
【００１６】
＊１（分離用寒天培地）・・・ココナッツマンナン １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、寒天 １．５％、ｐＨ７  
＊２（液体培地）・・・ココナッツマンナン ２％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、ｐＨ７
＊３〔マンナナーゼ活性測定法〕・・・１％のココナッツマンナンを含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．９ｍｌに適当に希釈した培養液０．１ｍｌを加え、４０℃で１０分間反応させた後、生じた還元糖をソモギー・ネルソン法にて定量した。酵素活性は、１分間にマンノースとして１μｍｏｌに相当する還元糖量を生成する力価を１単位とした。
【００１７】
実施例２  
実施例１で得たバチルス・アミロリケファシエンスＭＮ４７を液体培地（実施例１の＊２と同様）に接種し３７℃で４日間振とう培養し、菌体を遠心分離して得た上清液を粗酵素マンナナーゼＭＮ−１とした。ｐＨ５におけるマンナナーゼ活性（実施例１の＊３の方法による）は５単位／ｍｌであった。
【００１８】
次に、ココナッツマンナン ０．５ｇに前記粗酵素マンナナーゼＭＮ−１を１００単位加え、ｐＨ５（５ｍＭの酢酸緩衝液で反応液量は５０ｍｌ）、４０℃で１８時間反応させた。
【００１９】
反応後１００℃で３分間加熱して酵素失活させ、遠心分離（８０００rpm×１０分）して上清を減圧濃縮し５０％の収率でマンノオリゴ糖を得た。
【００２０】
得られたマンノオリゴ糖をＨＰＬＣにて下記条件にて分析したところ、マンノビオース８８％、マンノトリオース７％およびマンノースは５％であった。
【００２１】
（ＨＰＬＣ条件）
システム：ICS-3000 (DIONEX社製)；カラム：CarboPack PA1（DIONEX社製）；溶出液：20mM NaOH；流速：1.0 ml / min；検出器：ＰＡＤ；カラムオーブン：30℃
【００２２】
比較例１  
市販マンナナーゼ（新日本化学工業株式会社製）１００単位を実施例２と同様にしてマンナンに加え、ｐＨ５にて１２時間反応させ、オリゴ糖を得た。
【００２３】
ＨＰＬＣにより分析した結果、収率４０％、マンノビオース４８％、マンノトリオース２２％マンノース３０％であった。
【００２４】
（最適ｐＨ及びｐＨ安定性）
前記〔マンナナーゼ活性測定法〕に準じてマンナナーゼＭＮ−１の最適ｐＨを調べた。尚、使用した緩衝液は、ｐＨ３〜５はクエン酸緩衝液、ｐＨ４及び５は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８はリン酸緩衝液、ｐＨ８及び９はトリス緩衝液、ｐＨ１０及び１１はグリシン緩衝液を用いた。
【００２５】
又、各々のｐＨ（ｐＨ３〜５はクエン酸緩衝液、ｐＨ４及び５は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８はリン酸緩衝液、ｐＨ８及び９はトリス緩衝液、ｐＨ１０及び１１はグリシン緩衝液）にて酵素液を４℃、２４時間保持した後の残存活性を前記〔マンナナーゼ活性測定法〕に従って測定してｐＨ安定性を調べた。結果、最適ｐＨは、ｐＨ５付近で、ｐＨ安定性はｐＨ４．０〜７．０の範囲で５０％以上の残存活性を示した。
【００２６】
（最適温度度及び温度安定性）
上記記載と同様にして得られたマンナナーゼＭＮ−１の最適温度及び温度安定性（各温度で６０分間処理した後の残存活性を測定) を前記〔マンナナーゼ活性測定法〕により調べた。結果、最大活性の８０％以上の活性を示す最適温度範囲は３０〜５０℃であった。また温度安定性は３０℃以下では活性に変化なく、４０℃で９０％以上の活性が残存し、６０℃以上では失活した。
【００２７】
上記記載と同様にして得られたマンナナーゼＭＮ−１を次記クロマトグラフィー法により精製し、ＳＤＳポリクリルアミドゲル電気泳動法により単一バンドを示した。分子量マーカーよりマンナナーゼＭＮ−１は分子量４万であることがわかった。
〔クロマトグラフィー法による精製〕
【００２８】
マンナナーゼＭ−１粗酵素液を
予め５０ｍＭ Tris・ＨＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液で平衡化したCapto Qカラムに通液した。通過液を、透析チューブに入れ、５ｍＭ Tris・ＨＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液に対して透析を行った。透析処理液を５ｍＭTris・ＨＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液で予め平衡化したCapto Qカラムに通液後、同緩衝液を通液した。 次に、０〜１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液でリニアグラジエントを行い、活性フラクションを回収し、分画分子量が１万以下の限外濾過膜で脱塩、濃縮した。これを凍結乾燥して精製酵素を得た。精製酵素の比活性は７０単位/ｍｇ蛋白質であった。