(57)【要約】      （修正有）【課題】試料を長時間観察する際に、熱変形の影響を低減する機構を備えた生体試料分析装置を提供する。【解決手段】フローセル５００と、フローセル５００内に設けられ生体試料が通過する孔を有する基板と、フローセル５００を固定する固定部材（サンプルホルダ）と、生体試料が孔を通過時に当該生体試料を検出する、生体試料分析装置であって、フローセル５００を固定部材に保持する、弾性体を備え、孔を通過する直線に沿って、フローセル５００と固定部材が接している。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を保持するフローセルと、当該フローセル内に設けられ生体試料が通過する孔を有する基板と、当該フローセルを固定する固定部材と、生体試料が孔を通過時に当該生体試料を検出する、生体試料分析装置であって、
フローセルを固定部材に保持する、弾性体を備え、
前記孔を通過する第１の直線に沿って、前記フローセルと固定部材が接していることを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
フローセルの形状は、前記第１の直線と平行でなく、かつ、前記孔を通過する第２の直線に線対称である生体試料分析装置。
【請求項３】
請求項３において、
フローセルと固定部材は、前記第２の直線を挟んで、２箇所で接している生体試料分析装置。
【請求項４】
請求項１において、
さらに、前記前記第１の直線と平行でなく、かつ、前記孔を通過する第３の直線上で、前記フローセルと固定部材が接している生体試料分析装置。
【請求項５】
請求項４において、
フローセルと固定部材は、前記第１の直線上で孔を挟んで、２箇所で接している生体試料分析装置。
【請求項６】
請求項４または５において、
フローセルと固定部材は、前記第３の直線上で孔を挟んで、２箇所で接している生体試料分析装置。
【請求項７】
請求項１において、
生体試料を固定し、当該生体試料を前記基板に対して垂直方向に移動させる駆動機構を備えている生体試料分析装置。
【請求項８】
請求項１において、
フローセルの内部に、基板の両側にそれぞれ生体試料の検出用の電極を備えている生体試料分析装置。
【請求項９】
請求項１において、
フローセルと固定部材は、接触面において、互いに水平方向に並んで配置されている生体試料分析装置。
【請求項１０】
請求項１において、
フローセルと固定部材は、接触面において、互いに垂直方向に並んで配置されている生体試料分析装置。
【請求項１１】
生体試料を保持するフローセルと、当該フローセル内に設けられ生体試料が通過する孔を有する基板と、当該フローセルを固定する固定部材と、生体試料が孔を通過時に当該生体試料を検出する、生体試料分析装置であって、
フローセルを固定部材に対して保持する、フローセルの周囲に設けられた少なくとも３つの弾性体を備えており、
これらの弾性体は、力の関係が釣り合っている生体試料分析装置。
【請求項１２】
請求項１１において、
フローセルの外接円の中心に前記孔が配置されている生体試料分析装置。
【請求項１３】
請求項１１において、
フローセルの重心に前記孔が配置されている生体試料分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノポアを通過する生体試料を計測することにより、生体試料を分析する生体試料分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノポアＤＮＡシーケンスに関する特許文献１には、「ナノポアの内径は約１０ｎｍであった。」と記載されており、ナノポアＤＮＡシーケンサのシステムには、高精度化が要求されている。
【０００３】
ナノポアＤＮＡシーケンサは、伸長反応や蛍光ラベルは行わずに、ＤＮＡの塩基配列を電気的に直接計測する手法として注目を浴びている。直接計測法にはいくつかの手法が提案されているが、その一つに封鎖電流方式がある。薄膜に透過電子顕微鏡などによって数ｎｍのポア（ナノポア）を作製し、その薄膜の両側に電解質溶液を満たした液槽を設ける。それぞれの液槽に電極を設け、これらの電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。イオン電流は一次近似としてナノポアの断面積に比例する。ＤＮＡがナノポアを通過する際に、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、イオンが通過できる有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異や、塩基の種類を判別する。
【０００４】
ＤＮＡの１本鎖や２本鎖がナノポアを通過する間、ナノポアの位置を長時間高精度に保持し続けることが重要である。
【０００５】
また温度の変化よって、ＤＮＡの１本鎖や２本鎖とナノポアの位置関係が崩れ、一度計測したＤＮＡを２度計測してしまうような熱ドリフト現象が発生すると、ＤＮＡ配列を正確に解析できないため、これをより小さくするようにシステムを構成することが求められる。
【０００６】
特許文献２には、熱ドリフトを低減する方法として、フォーカス調整するラックとステージの間に、熱膨張係数の異なる材料のロッドを組み合わせ、対物レンズの光軸方向の熱膨張を補償し、全体の温度変化による熱ドリフトしない構造が開示されている。
【０００７】
更に、特許文献３には、対物レンズの先端部に、標本側の光軸方向のステージの基準面に当接し、対物レンズの光軸方向の位置決めを行う位置決め部材を設け、熱膨張に起因する対物レンズの光軸方向の熱ドリフトを容易、確実に低減することができることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２−０４３０２８号公報
【特許文献２】特開平０９−１２００３０号公報
【特許文献３】特開２００３−０２９１６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、ナノポアＤＮＡシーケンサのシステムには、熱ドリフトの抑制が求められるが、特許文献２に開示された技術によれば、熱膨張補正用のロッドが、上下動作機構に比べ長く、片持ちの形状になっているため、外部振動の影響を受けやすく、さらに、熱膨張による長さの変化は各材質がもっている固有の線膨張係数に比例することがわかっているが、熱膨張補正用のロッドに異種材料を使用することで、バイメタル効果が起こり、線膨張係数の計算どおりにはならず、熱ドリフトするという問題があった。
【００１０】
また、特許文献３に開示された技術によれば、フォーカス方向の相対位置関係を一定に保つことが可能であるが、フォーカス方向に可動するレンズ保持部材が対物レンズ内に必須な構成で、可動するためのガタあり、高精度に維持するような構成にはなっていない。さらに、ステージの基準面がバイメタル効果で、たわむことを考慮した構成になっていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、複雑な機械、電気的機構および制御システムが必要とせず、フローセルと、フローセル内に設けられ生体試料が通過する孔を有する基板と、フローセルを固定する固定部材（サンプルホルダ）と、生体試料が孔を通過時に当該生体試料を検出する、生体試料分析装置であって、フローセルを固定部材に保持する、弾性体を備え、孔を通過する直線に沿って、フローセルと固定部材が接していることを特徴とする生体試料分析装置。
【発明の効果】
【００１２】
上記構成によれば、温度変動が起こったとしても、数ナノメートルオーダーの熱ドリフトを抑制し、長時間計測を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】生体試料分析装置の構成と生体試料分析チップの拡大図の一例を示す図である。
【図２】生体試料分析チップによって取得される配列読取例である。
【図３】生体試料分析チップの固定方法示す上面図である。
【図４】図３の熱変形後を示す上面図である。
【図５】第１実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す上面図である。
【図６】図５の熱変形後を示す上面図である。
【図７】ＦＥＭ解析による図３の熱変形後を示す上面図である。
【図８】ＦＥＭ解析による図５の熱変形後を示す上面図である。
【図９】第２実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す上面図である。
【図１０】図９の熱変形後を示す上面図である。
【図１１】第３実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す上面図である。
【図１２】第４実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す上面図である。
【図１３】第５実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す上面図である。
【図１４】図１３の熱変形後を示す上面図である。
【図１５】第６実施例における生体試料分析チップの固定方法を示す断面図である。
【図１６】本発明の生体試料分析装置の構成と生体試料分析チップの拡大図の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【００１５】
〔装置の概要説明〕
各実施例で述べる「ナノポア」とは、薄膜の表裏を貫通するように設けたナノサイズの孔である。薄膜は主に無機材料から形成される。薄膜材料は、他に、有機物質、高分子材料などを含む。
【００１６】
はじめに、本発明のナノポアデバイスを用いた生体試料分析装置を説明する。図１は、生体試料分析装置の構成の一例を示す図であり、生体試料分析チップによる塩基配列読取機能を有している。
【００１７】
図１に示すように、生体試料分析装置（例えば、ＤＮＡ解析装置）１００は、ナノポアデバイス（仕切り体）１０１、当該ナノポアデバイス１０１により分けられた二つの槽１０２Ａ及び１０２Ｂ、二つの槽を電気的に接続する電極１０４及び電源１０５、先端に取り付けられたシリコンチップ１０８に化学的にＤＮＡ１１１の一端を固定するプローブ１０７、プローブを駆動させる駆動機構１０９とを備えている。
二つの槽１０２Ａ、１０２Ｂには、電解質溶液１０３が満たされている。このナノポアデバイス１０１で仕切られた流路全体をフローセルと呼ぶ。
【００１８】
プローブ１０７の先端に取り付けられたシリコンチップ１０８に化学的にＤＮＡ１１１の一端を固定し、駆動機構１０９によって、槽１０２Ｂの上方に設けられた、フローセル開口部１１０から進入すると、液中のＤＮＡ１１１は、ナノポアデバイス１０１のナノポアを通して、一方の槽１０２Ａから反対側の槽１０２Ｂへ移動するが、通り過ぎることはない。ナノポアに導入されたＤＮＡ１１１の一端を駆動ステージ１０９によって引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。電流値は、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  図示せず）に記録される。
【００１９】
〔検出原理の説明〕
図１の円形内に、ナノポアデバイス１０１の拡大図を示す。ナノポアデバイス１０１は、ナノポア１１３と、ナノポア１１３が形成された薄膜（ナノポア薄膜）１１２とを備える。上述の通り、ナノポアデバイス１０１の上下の槽１０２Ａ、１０２Ｂには電解質溶液１０３が満たされている。そのため、ナノポアデバイス１０１を介して上下に電圧を印加すると、電解質溶液１０３中のイオン由来の、ナノポア１１３のポア径の断面積に応じた電流が検出される。ＤＮＡ１１１が駆動機構１０９によって、ナノポア１１３を通過すると、イオンの流れが妨げられるため、電流値は、ナノポア１１３中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少する。ＤＮＡ１１１は、説明の簡便化のため、以下、図１の円形内に示すように、球体（ビーズ）を用いて説明する。
【００２０】
生体試料分析装置１００では、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）塩基種毎の電流値の変化量の違いから塩基識別を行う。
【００２１】
図２は、電極１０４で電圧を印加することにより読み取られる塩基種ごとの電流変化の例である。配列読取例２００に示されるように、４種類の塩基ごとに異なる電流値が検出される。
【００２２】
〔比較例〕
ここで、比較例として、フローセルの水平方向（ＸＹ方向）の固定方法を図３に示す。ナノポアデバイスが固定された、樹脂材料などで製作されたフローセル３１６を、金属などで製作されたフローセルホルダ３０１に固定のためのあて面３０２Ａ及び３０２Ｂを設け、当該あて面３０２Ａ及び３０２Ｂにバネ３０３で押さえつけて固定する。このような固定方法では、ΔＴ℃温度変化した場合、Ｙ軸と平行なあて面３０２Ａからの距離をＬ１、Ｘ軸と平行なあて面３０２Ｂからの距離をＬ２、フローセル材料の線膨張係数をαとし、熱ドリフト量が数式１、数式２のように計算されることがわかっている。
【００２３】
【数１】
2017116435.tif 000003
【００２４】
【数２】
2017116435.tif 000004
【００２５】
図４は、ΔＴ℃温度変化した場合の熱ドリフトを示している。ナノポアが式１、式２に従い、斜め下に熱変形し、移動している。熱ドリフトを低減させるためには、Ｌ１，Ｌ２，αを小さくする必要がある。
【００２６】
しかし、二つの槽１０２Ａ、１０２Ｂに電解質溶液１０３が満たされていることから、αを小さくするため、材料を変えることや、Ｌ１，Ｌ２を小さくするため、あて面近くに設計することは、流路があることから、スペース上難しい。また、α、Ｌ１、Ｌ２を小さくしても、ナノメートルオーダーの熱変形を低減することは困難である。
【００２７】
〔本発明の特徴を示す第１の固定方法〕
本発明の生体試料分析装置は、ナノポアデバイスを有するフローセルと、当該フローセルを固定するフローセルホルダを備えている。
【００２８】
図５は、フローセル５００とフローセルホルダ５０１の第１の実施形態を示している。フローセルホルダ５０１に固定するためのあて面５０２Ａ及び５０２Ｂを直交する２方向に１箇所ずつ設け、フローセル５００をあて面５０２Ａ及び５０２Ｂにバネ５０３で押さえつけて固定している。上記の２方向に伸びる直線は、ナノポア１１３を通過する直線である。ここで、本実施形態では、バネ５０３を一つ設けているが、フローセル５００をあて面５０２Ａに押しつけるバネと、あて面５０２Ｂに押しつけるバネを別々に設けてもよい。
【００２９】
図６は本発明のフローセル５００とフローセルホルダ５０１にΔＴ℃の温度変化を与えた場合の熱ドリフトを示している。ナノポア１１３を通る直交する２つの直線上にあて面５０２Ａ及び５０２Ｂを設置することで、式１、式２のＬ１、Ｌ２を０にすることができ、フローセル５００自体の熱変形は発生するが、ナノポア１１３の位置は変化しない。この発明により、線膨張係数αの影響を無視することができ、材料を自由に選択することができる。
【００３０】
このとき、バネ５０３はフローセル５００の材料よりも剛性が低い。そのため、熱変形を阻害することはない。また、あて面５０２Ａ及び５０２Ｂに固定するためのバネ５０３は、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、熱変形を阻害しない弾性体を２つ形成しても良い。
【００３１】
〔効果を説明する解析結果〕
図７、図８は、本発明の効果を示すため、比較例を示す図３のフローセル１０６と本発明の図５のフローセル５００をＦＥＭ解析した結果を示す。図中の一点鎖線は、あて面３０２Ａ及びＢ、あて面５０２Ａ及び５０２Ｂの位置を示している。図７において、図３のフローセル１０６をＰＭＭＡ（α＝９０×１０＾−６）とし、Ｌ１＝３０ｍｍ、Ｌ２＝４０ｍｍとすると、＋１℃の温度変化に対して、ＦＥＭ解析を行い、Ｘ方向の熱ドリフト量がΔＬ１＝２．７μｍ、Ｙ方向の熱ドリフト量がΔＬ２＝３．６μｍとなった。また本発明について、同様のＦＥＭ解析を行い、ナノポアの熱ドリフト量がＸＹ方向ともに０μｍとなり、本発明の効果が確認できる。
【００３２】
本実施形態によれば、熱ドリフトを低減することができる。
【００３３】
〔本発明の特徴を示す第２の固定方法〕
図９は、本発明の第２の実施形態のフローセル９００とフローセルホルダ９０１を示すものである。この実施形態では、フローセル９００を固定するあて面９０２Ａ及び９０２Ｂが２方向に２箇所ずつに設置されている。ここでは、フローセル９００をフローセルホルダ９０１に押しつけるために、二つのバネ９０３を用いているが、２方向のあて面９０２Ａ及び９０２Ｂに固定するためのバネ９０３は、少なくとも１つ以上あれば良い。ここでも、第１の実施形態と同様に、あて面９０２Ａ及び９０２Ｂがナノポア１１３を通過する互いに直交する２つの直線上に設けられている。あて面９０２Ａ及び９０２Ｂは、ナノポア１１３を通過する直線上に、ナノポア１１３を挟んだ両脇に一つずつ設けられている。
【００３４】
図１０には、熱変形後のフローセルを示すもので、ΔＴ℃温度変化しても、ナノポア中心を通る直線上にあて面を設置することで、式１、式２のＬ１、Ｌ２を０にすることができ、フローセル自体の熱変形は発生するが、ナノポアの位置は変化しない。
【００３５】
このとき、バネはフローセルの材料よりも剛性が低い。そのため、熱変形を阻害することはない。また、あて面に固定するためのバネは、本実施形態に限定されるものではなく、例えば、熱変形を阻害しない弾性体を少なくとも１つ以上形成すれば良い。
【００３６】
〔本発明の特徴を示す第３の固定方法〕
図１１は、本発明の第３の実施形態のフローセル１１００とフローセルホルダ１１０１を示すもので、この実施形態ではナノポア中心を通る直線上にあて面１１０２を１方向に２箇所（ナノポアを挟んだ両側に１箇所ずつ）設置することで、式１のＬ１を０にすることができ、Ｘ方向の熱ドリフトが０μｍとなる。
【００３７】
Ｙ方向に関しては、Ｘ方向のあて面１１０２上の直線と平行でない直線１１０４に線対称な形状にすることで、ナノポア中心にＹ方向の熱ドリフトが発生し、フローセル１１００自体の熱変形は発生するが、ナノポアの位置は変化しない。直線１１０４は、ナノポア１１３を通過し、かつ、あて面１１０２を通過する直線と直交している。
【００３８】
このとき、固定バネ１１０３はフローセル１１００の材料よりも剛性が低い。そのため、熱変形を阻害することはない。また、あて面に固定するためのバネ１１０３は、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、熱変形を阻害しない弾性体を少なくとも１つ以上形成すれば良い。
【００３９】
〔本発明の特徴を示す第４の固定方法〕
図１２は、本発明の第４の実施形態のフローセル１２００とフローセルホルダ１２０１を示すもので、この実施形態ではナノポア中心を通る直線上にあて面１２０２を１方向に１面設置し、あて面に対して、回転モーメントを与えるバネ１２０３を設置することで、式２のＬ２を０にすることができ、Ｙ方向のが０μｍとなる。図１２に示す通り、フローセル１２００とフローセルホルダ１２０１は、ナノポア１１３を挟んで、２箇所で接している。
【００４０】
Ｘ方向に関しては、ナノポア中心に点対称な形状にすることで、ナノポア中心にＸ方向の熱ドリフトが発生し、フローセル１２００自体の熱変形は発生するが、ナノポアの位置は変化しない。
【００４１】
このとき、固定バネ１２０３はフローセル１２００の材料よりも剛性が低いので、熱変形を阻害することはない。また、あて面１２０２に固定するためのバネは、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、熱変形を阻害しない弾性体を少なくとも１つ以上形成すれば良い。
【００４２】
〔本発明の特徴を示す第５の固定方法〕
図１３は、本発明の第５の実施形態のフローセル１３００とフローセルホルダ１３０１を示すもので、この実施形態ではナノポア１１３中心を通る直線上にあて面を設置せず、少なくとも３つ以上のバネ１３０３を設置する。フローセル１３００の形状は、ナノポア中心に点対称な形状となっている。
【００４３】
図１４は、熱変形後のフローセル１３００を示すもので、ΔＴ℃温度変化しても、ナノポア１１３中心に点対称な形状にすることで、ナノポア１１３中心に放射上に熱ドリフトが発生し、フローセル１３００自体の熱変形は発生するが、ナノポアの位置は変化しない。
【００４４】
このとき、バネ１３０３はフローセルの材料よりも剛性が低いので、熱変形を阻害することはない。また、あて面に固定するためのバネは、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、熱変形を阻害しない弾性体を少なくとも３つ以上形成すれば良い。
【００４５】
〔本発明の特徴を示す第６の固定方法〕
図１５は、本発明の第６の実施形態のフローセル１５００とフローセルホルダ１５０１を示すもので、これまでナノポア１１３を有する生体試料分析チップ面上の熱ドリフトに対する補償について言及してきたが、第６実施形態は、鉛直方向、紙面上Ｚ方向に関する熱ドリフト低減方法である。
【００４６】
本発明の第６の実施形態では，ナノポア１１３を有する生体試料分析チップの中立面上を通る直線上に、少なくとも１面以上、あて面１５０２が設置されている。またフローセル１５００をＺ方向に固定するバネ１５０３が，少なくとも１つ以上あれば良い。
【００４７】
ΔＴ℃温度変化しても、ナノポアを有する生体試料分析チップの中立面上を通る直線上にあて面１５０２を設置することで、あて面１５０２からナノポアを有する生体試料分析チップの中立面までの距離を０にすることができ、フローセル１５００自体の熱変形は発生するが、ナノポアを有する生体試料分析チップの中立面は変化しない。
このとき、バネ１５０３はフローセル１５００の材料よりも剛性が低いので、熱変形を阻害することはない。また、あて面に固定するためのバネは、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、熱変形を阻害しない弾性体，例えば、ゴムなどで固定しても良い。
【００４８】
これまでの実施例において，ナノメートルの穴（ナノポア）の中心に対して，フローセル３０１を加工するが，誤差０にすることは難しい。実際は，誤差が発生し，微小な熱ドリフトが発生する。しかし，それは，本発明の効果を否定するものではない。
【００４９】
図１６に示すように、生体試料分析装置システムに対して，ナノポアとＤＮＡの距離をセンシングし，シリコン基板を駆動するステージにフィードバックし，さらに高精度化を行うことができる。
【符号の説明】
【００５０】
１００：生体試料分析装置
１０１：ナノポアを有するが設置された仕切り体（ナノポアデバイス）
１０２Ａ，１０２Ｂ：槽
１０３：電解質溶液
１０４：電極
１０５：電源
１０６：フローセル
１０７：プローブ
１０８：シリコンチップ
１０９：駆動機構
１１０：フローセル開口部
１１１：ＤＮＡ
１１２：ナノポア
１１３：ナノポア薄膜
２００：配列読取例
３０１：フローセルホルダ
３０２：あて面
３０２Ａ：Ｘ方向あて面
３０２Ｂ：Ｙ方向あて面
３０３：バネ
５００：フローセル
５０１：フローセルホルダ
５０２：あて面
５０２Ａ：Ｘ方向あて面
５０２Ｂ：Ｙ方向あて面
５０３：バネ
９００：フローセル
９０１：フローセルホルダ
９０２：あて面
９０２Ａ：Ｘ方向あて面
９０２Ｂ：Ｙ方向あて面
９０３：バネ
１１００：フローセル
１１０１：フローセルホルダ
１１０２：あて面
１１０３：バネ
１１０４：対称軸
１２００：フローセル
１２０１：フローセルホルダ
１２０２：あて面
１２０３：バネ
１２０４：対称軸
１３００：フローセル
１３０１：フローセルホルダ
１３０２：あて面
１３０３：バネ
１５００：フローセル
１５０１：フローセルホルダ
１５０２：あて面
１５０３：バネ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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