(57)【要約】【課題】            スフェロイドに対する毒性の低い酸素濃度測定試薬およびこれを用いたスフェロイド内の酸素濃度測定方法を提供すること。【解決手段】        Ｃ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を含有するスフェロイド内酸素濃度測定試薬。（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＣ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とを接触させる工程と、（ｃ）りん光の測定により、りん光の強度の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むスフェロイド内酸素濃度測定方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を含有することを特徴とするスフェロイド内酸素濃度測定試薬。
【請求項２】
（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＣ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とを接触させる工程と、（ｃ）りん光の測定により、りん光の強度の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むことを特徴とするスフェロイド内酸素濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイド内の酸素濃度をリアルタイムに可視化・定量する試薬およびこれを用いたスフェロイド内の酸素濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬開発や分子生物学研究において細胞培養技術によって培養した細胞やマウス等の実験動物が、薬剤の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターとして使用されている。
【０００３】
一方で、従来の平面細胞培養技術で培養した細胞では、細胞が二次元方向に広がった単層細胞であるため、生体内と同等の三次元組織を構築することができず、また、細胞が体内で有している特異的な機能を長時間維持することができず、そのことに起因してシミュレーションの精度が担保できないという問題があった。
【０００４】
また、マウス等の実験動物により生体組織そのものをシミュレーターとして用いる場合、取り扱いが不便であることや、複数の細胞から構成される複雑系の組織であるため、シミュレーションのスループットや得られるデータの精度に課題があった。
【０００５】
そこで近年、生体内と同等の機能を有する三次元組織であるスフェロイド培養が注目されている。例えば、底面がロート状のウェルに複数の単一細胞を播種し、底面でこの単一細胞を凝集及び分散させてスフェロイドを培養するもの（特許文献１）や、所定のポリマー混合物のキャスト液表面に水を結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニカム構造体上でスフェロイドを培養するものがある（特許文献２）。
【０００６】
さらに、本発明者らは、形状や大きさ、材質が制御された細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体及びスフェロイド付き容器を開発し、培養底面に付着した制御されたスフェロイド培養を行うことに成功している（特許文献３）。
【０００７】
スフェロイド培養においては、スフェロイド中心部と周辺部の微小環境における酸素濃度の違いが、スフェロイドの品質や、スフェロイドによる生体のがん組織等の状態の再現に影響を及ぼすことが知られており、スフェロイド培養における酸素濃度測定はスフェロイド培養研究において重要な課題となっている。
【０００８】
生体組織あるいは細胞中の酸素濃度を非侵襲的にリアルタイムで検出する方法の開発は、細胞生物学や医療の分野において重要な課題となっている。生体組織中の酸素濃度を定量するための従来法としては、（１）微小電極を組織に挿入して測定する方法、（２）常磁性プローブ分子のＥＳＲ信号幅が周辺の酸素濃度に依存して変化することを利用する方法、（３）ニトロイミダゾール系低酸素組織診断薬剤を使う方法、（４）水溶性ポルフィリン誘導体、ルテニウム錯体等の発光測定に基づく酸素濃度測定法、などが知られている。（１）の微小電極を用いる方法は、電極近傍の一点における酸素分圧しか測定できない。また、侵襲性であるという欠点を持つ。（２）のＥＳＲ信号に基づく方法では、リアルタイムでの酸素濃度測定はできない。（３）のニトロイミダゾール系薬剤を用いる方法は、低酸素細胞内でニトロイミダゾールが還元されて細胞内タンパク質に結合しトラップされることを利用する。この方法では、薬剤の代謝に時間を要するため、薬剤投与後数時間経過しないとデータが得られない、という欠点をもつ。（４）の方法は、水溶性ポルフィリン誘導体やルテニウム錯体のりん光寿命が血中酸素濃度に依存して変化する（消光を受ける）ことを利用して酸素濃度を定量する方法である。この方法は、非侵襲で組織における酸素分圧を可視化できるという大きな利点を有するが、試薬が水溶性であるため、得られるデータは血中酸素濃度に限られる。
【０００９】
前記方法に加えて、群馬大学飛田らは、りん光を発することが知られているイリジウム（ＩＩＩ）錯体を用いて平面培養細胞及び生体組織中における酸素濃度測定方法を開発している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−３２７４６２号公報
【特許文献２】特開２００２−３３５９４９号公報
【特許文献３】特許４１５９１０３号公報
【特許文献４】特開２０１０−４４０５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、平面細胞培養における酸素濃度測定は、低酸素化の培養環境から酸素雰囲気下の測定環境へ移行した際に、細胞内の低酸素状態が速やかに解消するため、リアルタイムの低酸素状態の測定が難しい課題があった。加えて、スフェロイド培養における酸素濃度を、リアルタイムかつスフェロイドに非侵襲的かつ毒性を与えない方法で測定をすることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明は、生体組織シミュレーターとしてのスフェロイド培養において、スフェロイドに対する毒性の低い酸素濃度測定試薬およびこれを用いた酸素濃度測定方法を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明者らは、酸素濃度に応じてりん光を発する複数の化合物の中から、Ｃ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）（以下、ＢＴＰ）が、スフェロイド内酸素濃度の測定に有効かつ毒性の低い化合物であることを見出した。そして、当該化合物が発するりん光の強度を測定することにより、スフェロイド内の酸素濃度を測定する方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明の要旨は以下の通りである。
【００１５】
本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬は、Ｃ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を含有することを特徴とする。
【００１６】
本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法は、（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＣ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とを接触させる工程と、（ｃ）りん光の測定により、りん光の強度の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬およびスフェロイド内酸素濃度測定方法を用いることにより、例えばがん研究において、スフェロイド内の酸素濃度をリアルタイムで測定し、がん組織の微小環境における酸素濃度変化が及ぼす影響を評価することができる。これにより、がんメカニズム解明に寄与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】スフェロイドに対するＢＴＰの細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ−２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ−１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰの濃度を示す。
【図２】スフェロイドに対するＢＴＰ−ＮＨ２の細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ−２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ−１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰ−ＮＨ２の濃度を示す。
【図３】スフェロイドに対するＢＴＰ−ＮＭｅ２の細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ−２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ−１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰ−ＮＭｅ２の濃度を示す。
【図４】ＨＴ−２９細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図５】ＢＴ−４７４細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図６】ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図７】Ｐａｎｃ−１細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図８】ＨＴ−２９細胞におけるＢＴＰ−ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図９】ＢＴ−４７４細胞におけるＢＴＰ−ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１０】ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰ−ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１１】Ｐａｎｃ−１細胞におけるＢＴＰ−ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１２】ＨＴ−２９細胞におけるＢＴＰ−ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１３】ＢＴ−４７４細胞におけるＢＴＰ−ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１４】ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰ−ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【図１５】Ｐａｎｃ−１細胞におけるＢＴＰ−ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ−ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１９】
赤色りん光を示すＣ−ｃｉｓ，Ｎ−ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２−（２’−ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）−ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ−Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）（以下ＢＴＰと表記する）及び、ＢＴＰの発光特性にほとんど関与しない補助配位子であるアセチルアセトン配位子に代えて、末端にアミノ基を有する配位子を配位させたＢＴＰ−ＮＨ２、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基を有する配位子を配位させたＢＴＰ−ＮＭｅ２をスフェロイドに作用させ、スフェロイドに対する細胞毒性を調査した。あわせてスフェロイド内低酸素強度を示す赤色りん光の観察を実施した。
【００２０】
細胞株は、大腸がん細胞株ＨＴ−２９、乳がん細胞株ＢＴ−４７４、膵臓がん細胞株ＭｉａＰａＣａ２及びＰａｎｃ−１の４種類を用いた。また、各種がん細胞株のスフェロイドを得るために、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｐｌａｔｅ（ＮＣＰ）を用いて３次元培養を行った。
【００２１】
上記４種の細胞株について細胞懸濁液を細胞密度１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＮＣＰ（ＬＳ９６）に播種した後、ＢＴＰ、ＢＴＰ−ＮＨ２およびＢＴＰ−ＮＭｅ２を終濃度０〜１０μＭの範囲で培地に添加し、７日間培養を行った。
【００２２】
培養日数３日目及び７日目にＢＴＰ及びその派生体の各種濃度について、スフェロイド内の低酸素強度を調査するために蛍光顕微鏡を用いて明視野像及び蛍光観察像を取得した。蛍光顕微鏡観察には、ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＳ１００（Ｎｉｋｏｎ）及びＧ−２Ａフィルターセットを用いた。
【００２３】
蛍光観察後に、ＨＴ−２９、ＭｉａＰａＣａ２及びＰａｎｃ−１、３種類のそれぞれの細胞毒性を評価するために各ポイントｎ＝３についてＡＴＰアッセイを行った。ＡＴＰアッセイにはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
【００２４】
ＢＴＰは５μＭでは３種類の細胞株に対しておよそ生存率８０％と弱い細胞毒性を示した（図１）。
【００２５】
ＢＴＰ−ＮＨ２は、５μＭでは３種類の細胞株に対して生存率０％であった（図２）。
【００２６】
ＢＴＰ−ＮＭｅ２は５μＭでは３種類の細胞株に対しておよそ生存率０％であった（図３）。２μMにおいてもＭｉａＰａＣａ２（図３ｂ）を除く２種の細胞株（図３ａおよび図３ｃ）において生存率５０％を下回っており、ＢＴＰに比べて高い細胞毒性を示した。
【００２７】
ＢＴＰを処理したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、濃度依存的にりん光シグナルが増しており、５μＭ以上でスフェロイド内部に強いりん光シグナルを示した（図４、５、６及び７）。このシグナルはスフェロイドサイズが大きくなるに従い、また細胞間接着が強くなるに従い、強くなる傾向が観察された。
【００２８】
ＢＴＰ−ＮＨ２を処理したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、１μＭでスフェロイド内部にりん光シグナルを示した。しかしながらそれ以上の濃度においてはその強い細胞毒性によりスフェロイドサイズが小さくなる、あるいはスフェロイドが見られなくなった（図８、９、１０及び１１）。
【００２９】
ＢＴＰ−ＮＭｅ２を処理したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、細胞傷害性のある２μＭで一部の細胞株において強いシグナルを示したが、全体としてりん光シグナルは弱い傾向にあった。また、２μＭ以上の濃度においてはその強い細胞毒性によりスフェロイドサイズが小さくなる、あるいはスフェロイドが見られなくなった（図１２、１３、１４及び１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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