(57)【要約】【課題】フコキサンチンの生産能を向上するベクター及びフコキサンチンの生産能が向上された遺伝子組み換え海産珪藻及びフコキサンチンの生成方法を提供する。【解決手段】海産珪藻由来のPtfcpA（Phaeodactylum tricornutum fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A gene）プロモーターと、このプロモーターの下流側に、海産珪藻由来のフィトエン合成酵素をコードする遺伝子とを有していることを特徴とするベクターである。更に、抗生物質選別用の遺伝子を備えると共に、前記フィトエン合成酵素をコードする遺伝子のＣ末端側に、高感度緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有する。このベクターが、宿主としての前記海産珪藻内に組み込まれた、フコキサンチンを生成するための遺伝子組み換え海産珪藻である。【選択図】図４
2017012135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
海産珪藻由来のPtfcpA（Phaeodactylum tricornutum fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A gene）プロモーターと、該プロモーターの下流側に、前記海産珪藻由来のフィトエン合成酵素をコードする遺伝子とを有していることを特徴とするベクター。
【請求項２】
更に、抗生物質選別用の遺伝子を備えると共に、
前記フィトエン合成酵素をコードする遺伝子のＣ末端側に、高感度緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有することを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
請求項１又は２記載のベクターが、宿主としての前記海産珪藻内に組み込まれた、フコキサンチンを生成するための遺伝子組み換え海産珪藻。
【請求項４】
前記海産珪藻は、フコキサンチン生産能を有することを特徴とする請求項３記載の遺伝子組み換え海産珪藻。
【請求項５】
前記海産珪藻は、海産の羽状類珪藻であるPhaeodactylum tricornutum Bohlinであることを特徴とする請求項３又は４記載の遺伝子組み換え海産珪藻。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載の遺伝子組み換え海産珪藻を培地中で培養することにより生成された培地から、前記フコキサンチンを抽出する工程を含むことを特徴とするフコキサンチンの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海産珪藻におけるフコキサンチンの生産能を向上させるベクター、遺伝子組み換え海産珪藻及びフコキサンチンの生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
海産珪藻類は、無尽蔵とも言える太陽光エネルギーならびに海水を利用して持続的に増殖し、かつ増殖速度が高い生物群であることから、将来に向けて有用物質の生産者として有望と考えられる。
海産珪藻類が含有する物質として、カロテノイドの1種であるフコキサンチンに、抗酸化作用（非特許文献１）、抗肥満作用・抗糖尿病作用（非特許文献２及び３）、抗がん作用（非特許文献４）があるとの報告がされ、近年注目されている。
【０００３】
抗肥満作用に関しては、ヒト（肥満白人女性）がフコキサンチンを一日2.4mgを16日間摂取したときに、プラセボ（対照）と比較して、体脂肪及び体重が有意に減少したとの報告があり（Diabet Obesity Met 12:72-81,2010）、フコキサンチンは、微量でも効果を発現する有用性の高い物質である。
フコキサンチンは、珪藻類やワカメやコンブをはじめとする褐藻類により生産されることが知られているが、その含有量は乾重量当たり0.1 %程度と僅かにすぎない。
このように、野生株によるフコキサンチンの生産量は少ないため、フコキサンチンの応用は未だ実現していない。
しかも、アスタキサンチン等の他のカロテノイドが化学合成により供給されているのとは異なり（例えば、特許文献１）、フコキサンチンは、複雑な分子構造を持つことから、化学合成に成功した例は知られていない。また、遺伝子組み換えによる供給や収量の向上に成功した例も、知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sachindra et al., 2007, Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine carotenoid fucoxanthin and its metabolites. J.Agric. Food Chem. 55(21):8516-8522.
【非特許文献２】Hosokawa et al., 2010, Fucoxanthin regulates adipocytokine mRNA expression in white adipose tissue of diabetic/obese KK-Ay mice. Arch. Biochem. Biophys. 504(1):17-25.
【非特許文献３】Woo et al., 2010, Fucoxanthin supplementation improves plasma and hepatic lipid metabolism and blood glucose concentration in high-fat fed C57BL/6N mice. Chem. Biol. Interact. 186: 316-322.
【非特許文献４】Mikami and Hosokawa, 2013, Biosynthetic pathway and health benefits of fucoxanthin, an algae-specific xanthophyll in brown seaweeds. Int. J. Mol. Sci. 14(7): 13763-13781.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１７２２９３号公報（段落0003）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、フコキサンチンの生産能を向上するベクター及びフコキサンチンの生産能が向上された遺伝子組み換え海産珪藻及びフコキサンチンの生成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、種々のプロモーターを用いてフコキサンチン生産能を有する海産珪藻への遺伝子導入を試みたが、多くのプロモーターでは、フコキサンチンの生産能は向上しなかった。しかし、海産珪藻由来の内在性のPtfcpA（Phaeodactylum tricornutum fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A gene）プロモーターを用いて、当該海産珪藻由来のフィトエン合成酵素をコードする遺伝子を、当該海産珪藻に導入したところ、驚くべきことに、当該海産珪藻のフコキサンチン生産能が向上されることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、前記課題は、本発明によれば、海産珪藻由来のPtfcpA（Phaeodactylum tricornutum fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A gene）プロモーターと、該プロモーターの下流側に、前記海産珪藻由来のフィトエン合成酵素をコードする遺伝子とを有するベクターにより解決される。
【０００８】
ベクターが、このように構成されているため、遺伝子導入による海産珪藻におけるフコキサンチンの生産能の向上が可能となる。
フコキサンチンは、有用物質であることが認識されながらも、化学合成や、遺伝子組み換えによる収量向上の成功例がなく、褐藻類や珪藻類の野生株に微量に含まれているものを抽出する以外の生産方法がなかったが、本発明によれば、有用物質であるフコキサンチンを、従来よりも効率よく生産することが可能となる。
【０００９】
このとき、更に、抗生物質選別用の遺伝子を備えると共に、前記フィトエン合成酵素をコードする遺伝子のＣ末端側に、高感度緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有するとよい。
抗生物質により選別された形質転換体クローンのすべてに目的遺伝子がゲノムへ組み込まれているとは限らず、また、組込みが確認されている形質転換体クローンにおいても、目的遺伝子のタンパク質が発現しているとは限らないため、抗生物質選別用の遺伝子のみでは、形質転換体クローンを充分に選別できないが、本発明では、抗生物質選別用の遺伝子を備えると共に、前記フィトエン合成酵素をコードする遺伝子のＣ末端側に、高感度緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有するため、抗生物質により選別された形質転換体クローンを培養し、高感度緑色蛍光タンパク質由来の蛍光を有するクローンを蛍光顕微鏡を用いて選別することで、タンパク質を発現している形質転換体クローンを容易に選別することができる。
【００１０】
また、上記ベクターが宿主としての前記海産珪藻内に組み込まれた、フコキサンチンを生成するための遺伝子組み換え海産珪藻であるとよい。
このように、海産珪藻におけるフコキサンチンの生産能を向上可能なベクターが組み込まれているため、フコキサンチンの生産能の高められた遺伝子組み換え海産珪藻を構成できる。
【００１１】
前記海産珪藻は、フコキサンチン生産能を有するとよい。
このように、フコキサンチン生産能を有する海産珪藻を用いているため、フコキサンチンの生産能の高められた遺伝子組み換え海産珪藻を構成できる。
前記海産珪藻は、海産の羽状類珪藻であるPhaeodactylum tricornutum Bohlinであるとよい。
【００１２】
上記遺伝子組み換え海産珪藻を培地中で培養することにより生成された培地から、前記フコキサンチンを抽出する工程を含むことを特徴とするフコキサンチンの生成方法であるとよい。
本発明の遺伝子組み換え海産珪藻を用いてフコキサンチンの製造を行うことで、フコキサンチンを、従来よりも高い生産性で効率よく製造することができ、フコキサンチンの生産に必要な時間やコストを低減化することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遺伝子導入による海産珪藻におけるフコキサンチンの生産能の向上が可能となる。
フコキサンチンは、有用物質であることが認識されながらも、化学合成や、遺伝子組み換えの成功例がなく、褐藻類や珪藻類の野生株に微量に含まれているものを抽出する以外の生産方法がなかったが、本発明によれば、有用物質であるフコキサンチンを、従来よりも効率よく生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】珪藻について予想されるフコキサンチンの生合成経路を示すフロー図であり、（Ａ）は、MEP経路、（Ｂ）は、予想されるカロテノイド生合成経路を示す。
【図２】P. tricornutum由来PSY遺伝子の単離と連結を示すフロー説明図であり、（Ａ）は、Ptpsy断片の増幅と精製、（Ｂ）は、Ptpsy断片とegfp断片の連結PCR、（Ｃ）は、Ptpsyとegfpの連結遺伝子（Ptpsy::egfp）断片の精製を示す説明図である。
【図３】Ptpsy断片，egfp断片及びPtpsyとegfpの連結遺伝子Ptpsy::egfpのDNA断片のアガロースゲル電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図４】実施例で構築した形質転換ベクターの構造を示す図である。
【図５】共焦点レーザー顕微鏡を用いた野生株と実施例の形質転換体クローンの典型的な写真である。
【図６】ゲノミックPCRに用いたプライマーPtfcpAPro-(attB1)F及びプライマーEGFP(qPCR)-Rの位置を示す図である。
【図７】形質転換体クローンの電気泳動結果を示す写真である。
【図８】野生株と形質転換体クローンのカロテノイド総量の統計解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、細胞当たりのカロテノイド総量、（Ｂ）は、培養液当たりのカロテノイド総量である。
【図９】野生株と形質転換体クローンにおけるHPLCを用いたカロテノイド成分の解析の結果を示すグラフであって、（Ａ）は、野生株（WT）の結果、（Ｂ）は、形質転換体クローン（#2-12）の結果である。
【図１０】HPLCを用いた野生株及び形質転換体クローンのフコキサンチン量とβ-カロテン量の分析結果を示すグラフであって、（Ａ）は、細胞当たりのβ-カロテン量、（Ｂ）は、培養液当たりのβ-カロテン量、（Ｃ）は、細胞当たりのフコキサンチン量、（Ｄ）は、培養液当たりのフコキサンチン量である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜遺伝子組み換え珪藻＞
以下、本発明の遺伝子組み換え珪藻について説明する。
本発明の遺伝子組み換え珪藻は、宿主となる海産珪藻に、宿主と同じ海産珪藻株由来の酵素をコードする遺伝子が導入された、フコキサンチンを生成するための遺伝子組み換え珪藻である。
フコキサンチンとは、非プロビタミンＡ類のカロテノイドの一種で、キサントフィルに属する成分である。近年、フコキサンチンについて、抗肥満・抗糖尿病作用、抗癌作用、生体内抗酸化作用、血管新生抑制作用、及び抗炎症作用などの機能が報告されている。
【００１６】
宿主となる海産珪藻としては、フコキサンチン生産能を有する海産珪藻を用いることができる。
例えば、フェオダクチラム  トリコルナータム（Phaeodactylum tricornutum）などのフェオダクチラム属（Phaeodactylum）に属する単細胞珪藻、タラシオシラ  シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）などのタラシオシラ属（Thalassiosira）に属する単細胞珪藻や、シクロテラ  クリプティカ(Cyclotella cryptica)、シクロテラ  メネギニアナ (Cyclotella meneghiniana)、スケルトネマ  コスタツム(Skeletonemacostatum)、ニッチア  ラエビス(Nitzschia laevis)、キートセロス グラシリス(Chaetocerosgracilis)が挙げられる。
本発明では、海産の羽状類珪藻であるPhaeodactylum tricornutum Bohlin（National Research Institute of Aquaculture, Fisheries Research Agency, Japan, Strain NRIA-0065）（以下、「P. tricornutum NRIA-0065株」という。）を用いることができる。
【００１７】
海産珪藻由来の酵素をコードする遺伝子としては、海産珪藻、特に宿主と同じ海産珪藻の株から単離したフィトエン合成酵素（PSY）遺伝子を用いることができる。
本発明では、海産の羽状類珪藻であるPhaeodactylum tricornutum Bohlin（National Research Institute of Aquaculture, Fisheries Research Agency, Japan, Strain NRIA-0065）（以下、「P. tricornutum NRIA-0065株」という。）から単離したフィトエン合成酵素（PSY）遺伝子であって、配列番号１で示される遺伝子（当該遺伝子によりコードされるフィトエン合成酵素（PSY）のアミノ酸配列を配列番号２に示す）を用いることができる。
フィトエン合成酵素とは、図１（Ｂ）のカロテノイド生合成経路において、PSYで示す酵素であり、ゲラニルゲラニル二リン酸（Ｃ２０）からフィトエンへの生合成反応の酵素である。
【００１８】
なお、図１は、羽状類珪藻Phaeodactylumtricornutumについて予想されるフコキサンチンの生合成経路であり（Coesel et al.,(2008) Evolutionary origins and functions of the carotenoid biosynthetic pathway in marine diatoms. PLoS One 3(8): e2896.）、（Ａ）は、MEP経路、（Ｂ）は、予想されるカロテノイド生合成経路を示す。
MEP経路とは、IPP（イソペンテニル二リン酸）生合成経路の一つであって、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸から、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-リン酸（MEP）を経由して、ジメチルアニル二リン酸（DMAPP）とイソペンテニル二リン酸(IPP)を生合成する経路である。
図１において、破線の四角内は、中心類珪藻Thalassiosira pseudonanaの予想カロテノイド生合成経路を示し、Bertrand,(2010), Coesel et al., (2008), Dambek et al., (2012), Hemmerlin (2013), Lohr et al., (2012), Mikami and Hosokawa, (2013), and Vranova et al., (2013)を元に作成したものである。
図１における略語の定義は、次の通りであり、DXS: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXR:1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, MCT:2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase, CMK:4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kinase, MDS: 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase, HDS: 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate synthase, HDR: 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase, IDI: isopentenyl diphosphate:dimethylallyl diphosphate isomerase, GGDS: geranylgeranyl diphosphate synthase, PSY: phytoene synthase,PDS: phytoene desaturase, Z-ISO: 15-cis-ζ-carotene isomerase, ZDS: ζ-carotene desaturase, CRTISO: carotenoid isomerase, LCYB: lycopene β-cyclase, LUT-like: lutein deficient-like, ZEP: zeaxanthin epoxidase, VDE: violaxanthin de-epoxidase, VDL: violaxanthin de-epoxidase-like, NXS: neoxanthin synthaseである。
【００１９】
本発明のフィトエン合成酵素としては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるP. tricornutum NRIA-0065株由来の合成酵素、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる合成酵素、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなる合成酵素が挙げられる。
【００２０】
本発明において、「海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子」とは、上記P. tricornutum NRIA-0065株由来の合成酵素関連遺伝子と機能的に均等な遺伝子をいう。
海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子として、以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
【００２１】
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、フィトエン合成に関与するタンパク質をいう。
また、本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。
【００２２】
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5% SDS、５×デンハート及び100mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２３】
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【００２４】
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
ここで、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、１〜２５個のアミノ酸であり、好ましくは１〜１０個のアミノ酸であり、より好ましくは１〜５個のアミノ酸であり、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸である。なお、付加には、両末端への１から数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２５】
「海産珪藻のフィトエン合成酵素をコードする遺伝子」として、海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子を用いることができ、具体的には、上述のフコキサンチン生産能を有する海産珪藻において、主にゲノム解析により同定されたフィトエン合成酵素相同遺伝子が挙げられ、これらは本発明において好ましく用いられる。
【００２６】
このような目的タンパク質又は目的ポリペプチドである海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子の導入は、例えば、ベクターによる導入又はゲノムへの挿入により行うことができる。
ベクターによって導入する場合、海産珪藻のフィトエン合成酵素関連遺伝子に相当する遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられる。
【００２７】
ベクターは、抗生物質選別用の遺伝子を備えると共に、フィトエン合成酵素をコードする遺伝子のＣ末端側に、高感度緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有すると好適である。
つまり、本実施形態のベクターは、目的遺伝子用のカセットと抗生物質選別用のカセットの２つが組み込まれた形質転換ベクターとして構築されている。そして、導入遺伝子がゲノムに組み込まれ、かつ、導入遺伝子が翻訳レベル（タンパク質）で発現している形質転換体の選別を簡便にするために、目的遺伝子のＣ末端に高感度緑色蛍光タンパク質EGFPの遺伝子を連結している。
【００２８】
それに対し、従来、Phaeodactylum tricornutumの形質転換体作製において、pPha-T1プラスミド（Zaslavskaia, L.A., Lippmeier, J.C., Kroth, P.G., Grossman, A.R. and Apt,K.E. (2000) Transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum(Bacillariophyceae) with a variety of selectable marker and reportergenes. Journal of Phycology 36, 379-386）のマルチクローニングサイトに目的遺伝子のみを組み込んだベクターが構築され用いられる技術が知られている（Radakovits, R, Eduafo, P.M., Posewitz, M.C. (2011) Geneticengineeringoffattyacidchainlengthin Phaeodactylumtricornutum. Metabolic Engineering 13, 89-95., Yoshinaga, R, Niwa-Kubota, M., Matsui, H., Matsuda, Y. (2014) Characterization of iron-responsive promoters in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Marine Genomics 16, 55-62）。
上記文献Zaslavskaia et al., (2000)のpPha-T1プラスミドにおいても、目的遺伝子用のカセットと抗生物質選別用のカセットの2つが組み込まれているのみである。
【００２９】
これらの文献に記載された従来技術では、目的遺伝子のみを導入した場合、抗生物質により選別された形質転換体クローンを培養し、ゲノムDNAを抽出し、PCRにより導入遺伝子の断片を増幅することで、ゲノムへの組み込みを確認する。導入遺伝子のタンパク質の発現について調べるためには、導入遺伝子のタンパク質に対する抗体を作製する必要がある。
抗生物質により選別された形質転換体クローンの全てに目的遺伝子がゲノムへ組み込まれているとは限らず、また、組み込みが確認されている形質転換体クローンにおいても、目的遺伝子のタンパク質が発現しているとは限らない。
そこで、本実施形態では、抗生物質により選別された形質転換体クローンを培養し、EGFP由来の蛍光を有するクローンを蛍光顕微鏡を用いて選別することで、タンパク質を発現している形質転換体クローンを容易に選別することができるように構成している。
【００３０】
また、ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したＤＮＡ断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。
【００３１】
上記の方法により、本発明の遺伝子組み換え珪藻を構築することができる。
本発明の遺伝子組み換え珪藻は、フィトエン合成酵素関連遺伝子の発現に関する改変を行っていない野生型の親微生物である海産珪藻と比較して、フコキサンチンの生産性が向上している。
【００３２】
＜遺伝子組み換え海産珪藻を用いたフコキサンチンの生成方法＞
本発明のフコキサンチンの生成方法では、培地中で遺伝子組み換え海産珪藻を培養する培養工程と、培地からフコキサンチンを抽出する抽出工程を行う。
培養工程において、培地は、海産珪藻を生育させるのに適した培地であれば、いずれも使用できる。例えば人工海水または海水に窒素、リン酸等の栄養塩、ビタミン類、微量元素を添加したものを用いることができる。f/2培地、BG11培地、IMK培地などが好適に用いられる。
【００３３】
f/2培地は、例えば、NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4・ 2H2O 0.6 mg, ビタミン B12 0.05 μg, ビオチン 0.05 μg, チアミン HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2金属（Na2EDTA ・ 2H2O 440 mg ,FeCl3・ 2O 316 mg ,CoSO4・ 7H2O 1.2 mg ,ZnSO4 ・ 7H2O 2.1 mg ,MnCl2 ・ 4H2O 18 mg ,CuSO4 ・ H2O 0.7 mg ,Na2MoO4 ・ 2H2O 0.7 mg ,蒸留水 100 mL）0.1 mL ,海水 99.9 mL を配合することにより作製できる。また、H2SeO3が0.1292μg添加されていてもよい。
【００３４】
BG11培地は、例えば、NaNO3 150 mg, K2HPO4・ 3H2O 4 mg, MgSO4 ・ 7H2O 7.5 mg, CaCl2 ・ 2H2O 3.6 mg, クエン酸 0.6 mg, クエン酸第二鉄アンモニウム 0.6 mg, Na2EDTA - Mg 0.1 mg, Na2CO3 2 mg, 微量金属混合液 A5 + Co（H3BO3 286 mg, MnCl2 ・ 4H2O 181 mg, ZnSO4 ・ 7H2O 22.2 mg, Na2MoO4 ・ 2H2O 39 mg, CuSO4 ・ 5H2O 7.9 mg, Co(NO3 )2・6H2O 4.9 mg, 蒸留水100 mL）0.1 mL, 蒸留水99.9 mLを配合して、pH 7.4とし、1.5 gの寒天を100 mLの培地に加えて、固体培地とすることにより作製できる。
IMK培地は、例えば、ダイゴIMK粉末培地（日本製薬株式会社）25.2mgを100mLの海水に溶解させることにより作製する。121℃で20分間オートクレーブ処理してもよい。
【００３５】
培養工程は、通気培養、振とう培養、攪拌培養、及び通気攪拌培養等、通気性を高めた方法で行うことが好ましい。
培養は、光照射条件下で行い、照射方法は連続照射、光周期照射で行うことができる。
【００３６】
このようにして培養した藻類からフコキサンチンを常法に従い抽出する。フコキサンチンは、当技術分野に公知の抽出方法により採取することができる。例えば、海産珪藻をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法や、フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してから、有機溶媒によって抽出する方法などが適用できる。
【００３７】
海産珪藻からフコキサンチンを抽出するための溶剤は、フコキサンチンを抽出できるものであれば特に限定されないが、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、等用いることができる。例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等のアルコール類、メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、クロロホルム等の有機塩素系炭化水素、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香属炭化水素類等の有機溶媒を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３８】
この有機溶媒は、海産珪藻の乾燥体に対し１:１００〜１００：１、好ましくは１:５０〜５０：１の割合で用いることができる。上記有機溶媒を用いる抽出は常法により行うことができ、例えば、有機溶媒としてエタノールを用いる場合であれば、０℃〜６０℃、好ましくは５℃〜４０℃の温度で、０．５時間〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間抽出を行えば良い。また、抽出に当たっては、必要により、超音波、撹拌機等により撹拌を行っても良い。このようにして得られた有機溶媒抽出物をそのまま、あるいは残渣を除去後、液体高速クロマトグラフを用いてイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーなどにより、フコキサンチンを分離、精製することができる。
【００３９】
本発明の遺伝子組み換え海産珪藻を用いてフコキサンチンの製造を行うことで、フコキサンチンを、従来よりも高い生産性で効率よく製造することができ、フコキサンチンの生産に必要な時間やコストを低減化することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を、具体的実施例により説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
＜微細藻の培養＞
フコキサンチンを大量に生産する形質転換体作成に海産の羽状類珪藻であるPhaeodactylum tricornutum Bohlin（National Research Institute of Aquaculture, Fisheries Research Agency, Japan, Strain NRIA-0065）（以下、「P. tricornutum NRIA-0065株」という。）を用いた。
P. tricornutum NRIA-0065株を、室戸海洋深層水をベースとしたf/2液体培地（Guillard, 1975, Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Culture of Marine Invertebrate Animals (eds Smith, W., Chanley, M., and Guillard, R. L.). Springer US. pp 29-60.）を用いて、20℃、12時間明期・12時間暗期、約90 μmol photons/m2/sの光条件下で静置培養を行った。
【００４１】
＜フィトエン合成酵素遺伝子クローニングのためのRNA抽出＞
P. tricornutumNRIA-0065株からフィトエン合成酵素遺伝子(phytoene synthase (PSY) gene: psy)（以下、「Ptpsy」という。）を単離するため、増殖期と定常期のP. tricornutum NRIA-0065株からRNA抽出を行い、cDNAを作成した。RNA抽出、及びDNaseI処理は、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN Inc., CA）とRNase-Free DNase Set（QIAGEN Inc., CA）を用いて、それぞれのプロトコルに従って行った。分光光度計DU730（Beckman Coulter, Inc., CA）と超微量測定用キュベットnanoVette（Beckman Coulter, Inc., CA）を用いて、抽出したRNAの濃度測定を行った。濃度測定後、逆転写キット（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)（Takara Bio Inc., Otsu, Japan）を用いて、P. tricornutum NRIA-0065株は、約100 ngのtotal RNAからプロトコルに従ってcDNAを作成した。得られたcDNA溶液は、-20℃に保存した。
【００４２】
＜PSY遺伝子のクローニング、及び3’末端へのプローブ遺伝子の連結＞
P. tricornutum NRIA-0065株のゲノム解析、及びトランスクリプトーム解析（RNA-seq）を行い、データベースを得た。
一方、アメリカ合衆国エネルギー省（United States Department of Energy, DOE）により設置されたJoint Genome Institute（JGI）のP. tricornutum CCAP1055/1株のゲノム解析データベース（http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html）からキーワード検索によりPSY遺伝子を探索した。探索して得たこのPSY遺伝子配列を元に、P. tricornutum NRIA-0065株のゲノム解析、及びトランスクリプトーム解析（RNA-seq）で得られたデータベースに対して、BLAST検索を行い、PSY候補の遺伝子配列とそのアミノ酸配列を得た。BioEdit Sequence Aligment Editor（www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html）のClustalW Multiple aligmentを用いて、他の生物のPSYのアミノ酸配列とアライメントをとり、相同性、及びドメインの確認を行った。確認後、PSY候補のmRNA配列のコーディング領域を増幅するプライマーを設計した。プライマーには、図２に示すように、後述するatt配列、または連結用の配列を付加している。PSY遺伝子のクローニングに用いたプライマーを、表１及び配列番号３〜６に示している。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
図２（Ａ）のように、P. tricornutum NRIA-0065株由来のPSY遺伝子（Ptpsy）（配列番号１）と、プローブ遺伝子となる高感度緑色蛍光タンパク高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein）EGFPの遺伝子（以下、「egfp」という。）とを、増幅させ、精製した。
その後、図２（Ｂ）のように、Ptpsyは、その3末端側にリンカー配列（Gx5 linker）(Ali et al, 2010, Genetic characterization of HIV type 1 Nef-induced vesicle secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses 26(2): 173-192.）を介してプローブ遺伝子egfpと連結させた。
図２（Ｂ）上段のように、5’末端にGatewayシステム（MultiSite Gateway（登録商標） Pro, Life Technologies Corporation, CA）のatt配列を付加する配列番号３のforwardプライマー（PtPSY-(attB4r)F）と、3’末端に終始コドンの配列を除去し、egfpと連結させるリンカー配列を付加する配列番号４のreverseプライマー（PtPSY-(Gx5)R）を設計し、増殖期のcDNAからPCRにより目的DNA断片を増幅し、精製した。
【００４５】
図２（Ｂ）下段のように、Ptpsyと連結させるegfpの断片を、5’末端にリンカー配列（Gx5 linker）を付加する配列番号５のforwardプライマー（EGFP-(Gx5)F）と3’末端にatt配列を付加する配列番号６のreverseプライマー（EGFP-(B3r)R）を用いて作成した。
リンカー配列を有するPtpsy断片とegfpの2つを鋳型として、配列番号３のforwardプライマー（PtPSY-(attB4r)F）と配列番号６のreverseプライマー（EGFP-(B3r)R）を用いてPCRを行い、2つのDNA断片を連結し、図２（Ｃ）に示す目的サイズのPCR産物であるPtpsyとegfpの連結遺伝子Ptpsy::egfpを得た。
【００４６】
PCRは、PrimeSTAR（登録商標）GXL DNA Polymerase（Takara Bio Inc., Otsu, Japan)を用いてプロトコルに従い、反応系を25 μLとすることで行った。また、それぞれの目的DNA断片は、PCRによる増幅後に精製を行った。PCR後の反応溶液をアガロース電気泳動により、目的サイズのPCR産物を分離して、目的DNA断片を含む部位を切り出した。
図２（Ａ）のPtpsy断片及びegfp断片及び（Ｃ）のPtpsyとegfpの連結遺伝子Ptpsy::egfpのDNA断片のアガロースゲル電気泳動分析の結果を図３に示す。
その後、QIAquick（登録商標） Gel Extraction Kit（QIAGEN Inc., CA）を用いてDNA断片の精製を行った。
【００４７】
＜形質転換ベクターの構築＞
形質転換ベクターをGatewayシステム（MultiSite Gateway（登録商標） Pro, Life Technologies Corporation, CA）を用いて構築した。構築した形質転換ベクターを、図４に示す。
Ptpsyを発現誘導させるプロモーターとして、P. tricornutum UTEX 646株由来の内在性の配列番号７のPtfcpA（Phaeodactylum tricornutum fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein A gene）プロモーター（PtfcpA pro.）を用いた。ターミネーターは、海産珪藻由来の配列番号８のCffcpAターミネーターを用いた。各エントリークローンと抗生物質ZeocinTM耐性遺伝子Sh bleが組み込まれているpCfcp-ble（Poulsen and Kroger, 2005）が基本ベクターのデスティネーションベクターを用いることで形質転換ベクターを構築した。
Ptpsyには、Gx5 linkerを介してレポーター遺伝子としてEGFP遺伝子が連結されている。
【００４８】
＜パーティクルガン法による形質転換＞
培養2週間弱の定常期初期にあるP. tricornutum NRIA-0065株に対してPDS-1000/He Biolisticシステム（Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System, Bio-Rad, CA）を用いたパーティクルガン法により形質転換を試みた。
PDS-1000/He Biolisticシステムのプロトコルに従い、図４の形質転換ベクターを直径1.1 μmのタングステン粒子（Tungsten particle M17, Bio-Rad, CA）に付着させた。形質転換を行う宿主P. tricornutum NRIA-0065株は、100 μLのf/2液体培地中に1 × 108細胞となるように調整し、プラスチックシャーレ（直径9 cm、高さ1.5 cm）に約20 mLの量で作成したf/2寒天培地（0.5 % agarose HGS, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）の中央に移し、ガラス製のスプレッダーを用いて直径約3 cmに拡げた。タングステン粒子を打ち込む条件は、650 psiラプチャーディスクを2枚用いて、Heガス圧の条件を約1,300 psiに設定し、ラプチャーディスクとマクロキャリアーとの距離が約2 cm、ストッピングスクリーンと標的であるP. tricornutum NRIA-0065株との距離を約６ cmとした。形質転換直前に同じ培養から調整したP. tricornutum NRIA-0065株に対して、各処理区に付きシャーレ4枚の形質転換を行った。
【００４９】
パーティクルガン法による遺伝子の導入後、f/2寒天培地から2 mLのf/2液体培地を用いて寒天培地上のP. tricornutum NRIA-0065株細胞を回収し、24穴プレートに移し、24時間の培養を行った。24時間の培養後、500 μg/mLのZeocinTM（InvivoGen, CA）を含むf/2寒天選択培地（0.5 % agarose HGS）上で培養し、形質転換体の選抜を行った。4週間の培養後、寒天選択培地上にコロニーが形成された。
寒天選択培地上に60クローンの形質転換体が得られた。このスクリーニング段階における形質転換体のポジティブクローン数を、表２に示す。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
寒天培地上に形成されたコロニーを形質転換体由来のコロニーとして、以降の実験に用いた。
【００５２】
＜寒天選択培地上の形質転換体の確認と培養＞
f/2寒天培地上に得られた形質転換体由来のコロニーを300 μg/mLのZeocinTMを含むf/2寒天選択培地（0.5 % agarose HGS）に継代すると共に、顕微鏡観察のために300 μg/mLのZeocinTMを含むf/2液体培地500 μLが入った48穴プレート（MICROPLATE 48 Well/Flat Bottom, AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Shizuoka, Japan）に植藻した。
【００５３】
＜蛍光顕微鏡を用いた導入遺伝子の発現解析＞
導入したPtpsy::egfpの発現を確認するために、EGFP蛍光を利用した。48穴プレートを用いた培養系の形質転換体クローンを蛍光顕微鏡（IX70, Olympus Corporation, Tokyo, Japan）を用いて観察した。導入遺伝子（Ptpsy::egfp）由来と考えられるEGFPの蛍光を、NIBAフィルター（励起フィルター470-490nm、ダイクロイックミラー505 nm、蛍光フィルター510-550 nm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan）を用いて検出し、導入遺伝子（Ptpsy::egfp）の発現の確認を行った。
観察は、複数回行った。その結果、表２のｂに示すように、17クローンにおいてEGFP蛍光が観察された。
【００５４】
EGFP蛍光の局在の確認、及び写真撮影には、共焦点レーザー顕微鏡（FV-1000D, Olympus Corporation, Tokyo, Japan）を用いた。
図５に、共焦点レーザー顕微鏡を用いた野生株と本例の形質転換体クローンの典型的な写真を示す。図５において、WTは野生株を、#数字は、形質転換体クローンを示している。また、左欄から、微分干渉像、EGFP蛍光、クロロフィル蛍光、EGFP蛍光とクロロフィル蛍光との重ね合せの写真である。
野生株では、EGFP蛍光の写真では黒色の背景のみ、クロロフィル蛍光の写真では黒色の背景に赤色が現れている。
形質転換体クローンでは、EGFP蛍光の写真では黒色の背景に緑色、クロロフィル蛍光の写真では黒色の背景に赤色の蛍光が現れている。
EGFP蛍光とクロロフィル蛍光との重ね合せの写真では形質転換体クローンにおいて、黒色の背景に若干黄味掛かった赤色の蛍光が現れている。それに対し、野生型においては、EGFP蛍光とクロロフィル蛍光との重ね合せの写真は、クロロフィル蛍光の赤色の蛍光のみである。
共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察の結果、形質転換体クローンのEGFP蛍光の局在は、図５に示すように、クロロフィル蛍光の局在と一致していた。
【００５５】
＜ゲノミックPCRによる形質転換体の確認＞
EGFP由来の蛍光が確認された形質転換体クローンの細胞を鋳型とし、ゲノミックPCRを行いプロモーターと導入遺伝子（Ptpsy::egfp）のゲノムへの挿入を確認した。48穴プレートを用いた培養系の形質転換体クローンの培養液300 μLを1.5 mLチューブに分注した。遠心分離（9,730 ×g, 3 min）により、細胞ペレットを得た後、細胞ペレットに300 μLの滅菌Milli-Q水を加え、遠心分離を行い、上澄みを取り除くことでPCRを阻害する塩の除去を行った。滅菌Milli-Q水による塩の除去を2回行い、2回目の洗浄後に得られた細胞ペレットに20 μLの滅菌Milli-Q水を加え、懸濁した後に-80℃に保存した。P. tricornutum NRIA-0065株の細胞溶液1 μLを鋳型として、ゲノミックPCRを行った。PCRは、Tks Gflex（登録商標）DNA Polymerase（Takara Bio Inc., Otsu, Japan）のプロトコルに従い、反応系を20 μLとすることで行った。PCR後の反応溶液5 μLをアガロース電気泳動により解析した。確認には、表３及び配列番号７及び８にそれぞれ示すプライマーPtfcpAPro-(attB1)F，EGFP(qPCR)-Rを用いた。ゲノミックPCRに用いた配列番号９のプライマーPtfcpAPro-(attB1)F及び配列番号１０のプライマーEGFP(qPCR)-Rの位置を、図６に示す。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
電気泳動の結果を、図７に示す。図７中の#数字は、形質転換体クローンを示す。四角で囲んだ#数字番号の形質転換体クローンは、予想サイズのPCR増幅産物が確認されたものであり、カロテノイド抽出に用いた。NCは、ネガティブコントロールを示し、鋳型である細胞を加えず、代わりに同量の滅菌Milli-Q水を加えてPCRを行った。
ゲノミックPCRの結果、表２のｃに示すように、EGFP蛍光が観察された形質転換体クローンの内、6クローンにおいて、プロモーターとPtpsy::egfpのゲノムへの挿入が確認された。
【００５８】
＜カロテノイド抽出＞
ゲノムへの導入遺伝子の挿入が確認されたクローンを用いてカロテノイド分析を行った。
300 μg/mLのZeocinTMを含むf/2液体培地6 mLが入った6穴プレート（MICROPLATE 6 Well/Flat Bottom, AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Shizuoka, Japan）の培養系において、定常期初期にある形質転換体クローン（5 mL分、約3 × 107細胞）を15 mLチューブ（15ml/Centrifuge Tube with Triple Seal Cap, AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Shizuoka, Japan）、及び1.5 mLチューブ（REACTION TUBE, greiner bio-one, Kremsmunster, Austria）を用いて遠心（3,000 ×g, 10 min）を繰り返すことによって集藻し、細胞ペレットを液体窒素を用いて凍結した。細胞ペレットは、カロテノイド抽出を行うまで-80℃で保存した。
【００５９】
細胞ペレットを凍結乾燥にかけた後、アセトン150 μLを加え1時間、室温、暗所で静置した。遠心（19,060 ×g, 3 min）の後、上澄みを溶媒蒸発用チューブ（Microtube No.1, Maruemu corporation, Osaka, Japan）に回収し、残渣にアセトン100 μLを加え30分間、暗所、室温で静置した。遠心（19,060 ×g, 3 min）の後、上澄みを溶媒蒸発用のチューブに回収する。上澄みが透明になるまでアセトン100 μLによる抽出を3回繰り返した。アセトン抽出4回後の残渣にメタノール100 μLを加え30分間、室温、暗所で静置した。
【００６０】
遠心（19,060 ×g, 3 min）の後、上澄みを溶媒蒸発用のチューブに回収し、残渣にメタノール100 μLを加え30分間、暗所、室温で静置した。上澄みが透明になるまでメタノールによる抽出を4回繰り返した。溶媒蒸発用チューブを40℃に加温したヒートブロックに静置し、窒素ガスを吹き付けながら溶媒を蒸発させた。残渣をメタノール400 μLにより懸濁し、溶液を1.5 mLチューブに移した。遠心（19,060 ×g, 5 min）の後、上澄み350 μLを2 mLの褐色スクリューバイアル（Agilent Technologies, CA）に回収し、分析に用いた。
【００６１】
＜吸光光度法によるカロテノイド総量の分析＞
カロテノイド抽出溶液をメタノールで希釈し、分光光度計DU730（Beckman Coulter, Inc., CA）を用いて、既報のカロテノイド総量を求める式（１）（Ryckebosch at al., 2011, Influence of drying and storage on lipid and carotenoid stability of the microalga Phaeodactylum tricornutum. J. Agric. Food Chem. 59(20):11063-11069.）を用いて、野生と形質転換体クローンにおけるカロテノイド総量を比較した。
【００６２】
【数１】
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【００６３】
式（１）において、Caは、クロロフィルaの量を示し、A665、A652とA470は、それぞれAbs665、Abs652とAbs470の値を示す。XCarotenoidsは、カロテノイド総量（μg）、DFは希釈率、Vは抽出液の液量を示す。各サンプルを3回測定して、得られた値を細胞当たりの量と培養液の当たりの量に換算し、野生株と形質転換体クローンのカロテノイド総量を比較した。
【００６４】
統計解析を行った結果を、図８に示す。
図８において、WTは野生株であり、#数字は、形質転換体クローンを示す。図８（Ａ）は、カロテノイドの総量を細胞当たりに換算した値のグラフ、図８（Ｂ）は、カロテノイドの総量を培養液量当たりに換算した値のグラフを示している。破線は、WTの平均値を示している。
一元配置分散分析とpooled variance t検定の結果、WTと有意差が見られた形質転換体クローンの#数字番号を、楕円で囲んで示している。他の組み合わせについては、有意差がみられても、図中に示していない。
図８の結果より、2クローン（#2-4と#2-12）において、培養液当たりのカロテノイドの総量が野生株と同程度または、野生株よりも多いことが示唆された。これらの2クローンについて、HPLCを用いてカロテノイド成分の解析を行った。
【００６５】
＜HPLCによるカロテノイド成分の分析＞
カロテノイド抽出溶液をメタノールで希釈し、HPLCによりカロテノイド成分の分析を行った。分析に使用したHPLC装置は、カラムにCrestPack C18T-5（4.6 mm I.D. × 250 mm L, JASCO Corporation, Tokyo, Japan）を、フォトダイオードアレイ検出器にProstar 335 PDA Detector（Agilent Technologies, CA）、ポンプにProstar 230（Agilent Technologies, CA）を用いた。
【００６６】
移動相として、アセトニトリル/メタノール/蒸留水＝75:15:10（0.1% (w/v) 酢酸アンモニウム含む）からなるA液と、酢酸エチル/メタノール＝30:70（0.1% (w/v) 酢酸アンモニウム含む）からなるB液を使用し、20分かけてA液/B液の比率を100:0から0:100に変化させた後、B液を15分間流すことでカロテノイド成分を展開させた。展開液の流量を1 mL/minとして、カラム温度は、40度とした。
【００６７】
フォトダイオードアレイ検出器の設定は、検出波長： 450 nm、取込波長：200-900 nm、スリット幅：4 nmとした。オートサンプラー460-LC（Agilent Technologies, CA）を用いて、μL Pickup injectionsの方法で抽出液10 μLを吸入し、成分分析を行った。フコキサンチン、及びβ-カロテンの標品の結果から、保持時間6.5付近のピークをフコキサンチン、28.5付近のピークをβ-カロテンとして解析を行った。標品のピーク面積比から検量線を作成し、抽出溶液中のフコキサンチン量、及びβ-カロテン量を求めた。各サンプルを3回測定して、得られた値を細胞当たりの量と培養液の量当たりの量に換算し、野生株と形質転換体クローンのそれぞれのカロテノイド成分の量を比較した。
【００６８】
HPLCを用いたカロテノイド成分の解析の結果を、図９に示す。図９は、HPLCにより得られたカロテノイド抽出溶液のクロマトグラムである。図９（Ａ）は、野生株（WT）の結果、図９（Ｂ）は、形質転換体クローン（#2-12）の結果を示す。保持時間6.5分付近のピークがフコキサンチン、28.5分付近のピークがβ-カロテンである。未同定であるが、9.5分付近のピークは、ジアジノキサンチンであると考えられる。
図９のように、野生株と形質転換体クローンにおいて、フコキサンチンとβ-カロテンが確認された。また、未同定であるが、P． tricornutumに含まれるカロテノイドを調べた文献（Dambek et al., 2012）におけるフコキサンチンとの保持時間の相対的な関係から、ジアジノキサンチンと思われるピークが9.5分付近に確認された。
【００６９】
＜統計解析＞
図１０は、HPLCを用いたカロテノイド含有量の分析結果を示すグラフであって、野生株、及び形質転換体クローンのフコキサンチン量とβ-カロテン量を細胞当たりの量、及び培養液当たりの量に換算し、統計解析を行った結果を示している。
図１０（Ａ）（Ｂ）は、β-カロテン量、図１０（Ｃ）（Ｄ）は、フコキサンチン量を示す。図１０（Ｂ）（Ｄ）に107細胞当たりの量、図１０（Ａ）（Ｃ）に培養液当たりの量を示す。
図１０において、WTは野生株であり、#数字は、形質転換体クローンを示す。
【００７０】
図１０において、College Analysis Ver. 5.4を用いて正規性、及び等分散性が得られる場合は、一元配置分散分析とpooled variance t検定、いずれかが得られない場合は、Kruskal-Wallis検定とjoint ranking Wilcoxon順位和検定を行った。
β-カロテンでは、一元配置分散分析とpooled variance t検定の結果、WTと有意差が見られた形質転換体クローンの#数字番号を楕円で囲んで示している。フコキサンチンでは、Kruskal-Wallis検定とjoint ranking Wilcoxon順位和検定の結果、WTと有意差が見られた形質転換体クローンの#数字番号を楕円で囲んで示している。他の組み合わせについては、有意差がみられても、図中に示していない。
図１０の形質転換体クローン#2-12において、細胞当たりのフコキサンチン量とβ-カロテン量が野生株よりも有意に増加しており、野生株に対して、それぞれ1.29倍、1.36倍となった。また、培養液当たりのβ-カロテン量は、有意に増加しており、1.19倍となった。培養液当たりのフコキサンチン量は、有意差が見られなかったが、1.13倍となった。
以上のように、本例の形質転換体によれば、フコキサンチン生産能が、野生株よりも向上されていることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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