(57)【要約】【課題】ビフィズス菌のなかから一次胆汁酸であるコール酸を減少させずに二次胆汁酸であるデオキシコール酸の増加を抑制する性質、及び、既に存在するデオキシコール酸を減少させる性質を有する菌を見出し、当該乳酸菌を有効成分とするデオキシコール酸低減剤を提供することを本発明の課題とした。【解決手段】本発明は、ビフィズス菌菌体及び／又はその培養物を有効成分とするデオキシコール酸低減剤を提供する。ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム又はビフィドバクテリウム・シュードロンガムに属する菌が好ましい。さらに本発明は、前記デオキシコール低減剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料も提供する。【選択図】図１
2017066087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィズス菌菌体及び／又はその培養物並びに糖質を有効成分とするデオキシコール酸低減剤。
【請求項２】
コール酸低減作用を有さない請求項１に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項３】
ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に属する菌である請求項１または２に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する菌がＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）である請求項３に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項５】
糖質がグルコース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース及びラクチュロースからなる群から選ばれる１以上である請求項３又は４に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項６】
糖質がビフィズス菌菌体に対して０．１３重量％以上含まれている請求項５に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項７】
ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）に属する菌である請求項１または２に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム・シュードロンガムに属する菌がＳＢＴ２９０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８）である請求項７に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項９】
糖質がグルコース、ガラクトース、ラクトース、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース及びラクチュロースからなる群から選ばれる１以上である請求項７又は８に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項１０】
糖質がビフィズス菌菌体に対して０．１３重量％以上含まれている請求項９に記載のデオキシコール酸低減剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビフィズス菌を有効成分とするデオキシコール酸低減剤に関する。詳しくは、ビフィズス菌菌体またはその培養物並びに糖質を有効成分とするデオキシコール酸低減剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は胆汁の主成分であり、主な役割は、消化管内でミセルの形成を促進し、食物脂肪をより吸収しやすくするというものである。
胆汁酸は、一次胆汁酸と二次胆汁酸からなる。一次胆汁酸は肝臓においてコレステロールから作られ、主に胆汁酸結合タンパクと細胞小胞系とを介して肝細胞から胆道系に分泌される。一次胆汁酸にはコール酸（以下、単にＣＡということがある）、ケノデオキシコール酸などがある。一次胆汁酸は正常ではグリシンまたはタウリンと抱合した状態で胆汁中に存在する。腸内に入ったこれら胆汁酸の一部は、腸内細菌によってグリシンやタウリンが離される（脱抱合）。脱抱合されたコール酸はデオキシコール酸（以下、単にＤＣＡということがある）へ、ケノデオキシコール酸はリトコール酸へと更に変換される。一次胆汁酸から変換されたこれらを二次胆汁酸と呼ぶ（非特許文献１）。
【０００３】
ところで、二次胆汁酸であるデオキシコール酸には大腸がん促進作用が報告されており（非特許文献２）、近年日本において大腸がんが増加している理由として、食生活の欧米化による脂質摂取量の増加と、それに伴う腸内胆汁酸量の増加との関連を指摘する文献もある（非特許文献３）。
【０００４】
さらにまた、デオキシコール酸について次のような報告もある（非特許文献４）。すなわち、マウスを用いた実験により、肥満になるとコール酸をもとにデオキシコール酸を合成する腸内細菌が著しく増加していること、デオキシコール酸産生菌を抗生物質投与により死滅させると細胞老化を起こした肝星細胞の数が減少し、肝がんの発症率も著しく低下すること、その際に人工的に合成したデオキシコール酸を同時に投与すると抗生物質による肝がん発症率の低下が認められなくなることを明らかにしている。そして、同様のメカニズムがヒトの肥満に伴う肝がん発症に関与していること、デオキシコール酸産生菌の増殖を抑制することが肝がんの予防につながる可能性について示唆している。
【０００５】
化合物を利用した二次胆汁酸の低減については、特許文献１、２が知られている。
特許文献１には、フマル酸などの電子受容体が、一次胆汁酸の酸化的代謝を促進し、特定の腸内細菌によって行われる一次胆汁酸のへの還元的代謝を抑制できることが記載されている。
特許文献２には、カフェ酸やカテキンなどのポリフェノールを摂取したラットの糞便中のデオキシコール酸が低下していることから、これらに二次胆汁酸低下作用があることが記載されている。
【０００６】
また、ビフィズス菌による二次胆汁酸の低減については、特許文献３が知られている。特許文献３には、グルコースを駆動力としてビフィズス菌菌体内に一次胆汁酸であるコール酸を取り込んで菌体外にはコール酸を排出しないという性質を有するビフィズス菌を利用する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１８４３１１号公報
【特許文献２】特開２００９−２２７６０９号公報
【特許文献３】特開２００１−０９７８７０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】シンプル生化学、南江堂、ｐ３２−３３、１９９８年
【非特許文献２】Ｈ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、第５８９巻、第４７〜６５頁、２００５年
【非特許文献３】公益社団法人日本生物工学会ホームページ  「研究部会  乳酸菌・腸内細菌工学研究部会講演会 (2010/05/14)  プログラム要旨集」URL http://www.sbj.or.jp/division/division_ferment_lab_sympo_20100514.html
【非特許文献４】独立行政法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）ホームページ  「公益財団法人がん研究会  独立行政法人 科学技術振興機構（ＪＳＴ）平成２５年６月２７日  共同発表」タイトル：肥満に伴う腸内細菌の変化が肝がんの発症を促進するURL http://www.jst.go.jp/pr/announce/20130627-2/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
フマル酸を用いた特許文献１に記載の方法では、一次胆汁酸から二次胆汁酸への変換は抑えられるため、二次胆汁酸の増加を抑えつつも有用な一次胆汁酸を減少させない点においては優れている。しかし、すでに存在している二次胆汁酸の低減効果については不明である。
また、乳酸菌菌体を用いた特許文献３の方法では、一次胆汁酸のコール酸を菌体内に取り込むことで、二次胆汁酸であるデオキシコール酸の産生を減らすことが期待されている。ただし、この方法ではコール酸の重要な機能である、消化管内でミセルの形成を促進し、食物脂肪をより吸収しやすくするという、生体内で必要な機能が制限されてしまう恐れがある。また、すでに存在しているデオキシコール酸を低減できるかどうかは不明である。
なお、特許文献２は、二次胆汁酸を抑制するものではあるが、ポリフェノールを有効成分とするものである。
そこで、本発明は、ビフィズス菌のなかから一次胆汁酸であるコール酸を減少させずに二次胆汁酸であるデオキシコール酸の増加を抑制する性質、及び、既に存在するデオキシコール酸を減少させる性質を有する菌を見出し、当該ビフィズス菌を有効成分とするデオキシコール酸低減剤を提供することを本発明の課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ビフィズス菌と特定の糖質存在下で一次胆汁酸であるコール酸を減少させることなく、二次胆汁酸であるデオキシコール酸の増加を抑制する性質、および／又はすでに存在するデオキシコール酸を減少させる性質を有することを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
ビフィズス菌菌体及び／又はその培養物並びに糖質を有効成分とするデオキシコール酸低減剤。
＜２＞
コール酸低減作用を有さない＜１＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜３＞
ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガムに属する菌である＜１＞または＜２＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜４＞
ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する菌がＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）である＜３＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜５＞
糖質がグルコース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース及びラクチュロースからなる群から選ばれる１以上である＜３＞又は＜４＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜６＞
糖質がビフィズス菌菌体に対して０．１３重量％以上含まれている＜５＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜７＞
ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・シュードロンガムに属する菌である＜１＞または＜２＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜８＞
ビフィドバクテリウム・シュードロンガムに属する菌がＳＢＴ２９０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８）である＜７＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜９＞
糖質がグルコース、ガラクトース、ラクトース、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース及びラクチュロースからなる群から選ばれる１以上である＜７＞又は＜８＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜１０＞
糖質がビフィズス菌菌体に対して０．１３重量％以上含まれている＜９＞に記載のデオキシコール酸低減剤。
＜１１＞
＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の剤を含有する栄養組成物、飲食品又は飼料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ビフィズス菌菌体及び／又はビフィズス菌培養物並びに糖質を有効成分とするデオキシコール酸低減剤を提供することができる。本発明のビフィズス菌菌体及び／又は培養物は特定の糖質存在下で、消化管内で重要な役割を果たすコール酸を低減することなく、デオキシコール酸を特異的に低減する作用を有することから、従来のコール酸を低減することによって副次的にデオキシコール酸を低減するビフィズス菌に比べて、有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ビフィズス菌菌体による反応液中のＣＡもしくはＤＣＡの残存率および、糖質添加（グルコース、ガラクトース、ラクトース）による影響を示すグラフである。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【図２】ビフィズス菌菌体による反応液中のＤＣＡの残存率および、オリゴ糖（ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース、ラクツロース）添加による影響を示すグラフである。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【図３】ビフィズス菌菌体による反応液中のＤＣＡの残存率および、糖質（グルコース、ラクトース）添加濃度（０〜０．６５％）による影響を示すグラフである。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【図４】ビフィズス菌菌体による反応液中のＣＡもしくはＤＣＡの残存率の経時変化（０〜２２時間）を示すグラフある。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【図５】ビフィズス菌培養物による反応液中のＣＡもしくはＤＣＡの残存率および、糖質添加（グルコース、ガラクトース、ラクトース）による影響を示すグラフである。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【図６】ビフィズス菌培養物による反応液中のＤＣＡの残存率および、オリゴ糖（ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース、ラクツロース）添加による影響を示すグラフである。Ａ．ビフィドバクテリウム・ロンガム、Ｂ．ビフィドバクテリウム・シュードロンガム
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のデオキシコール低減剤は、ビフィズス菌菌体及び／又はその培養物並びに糖質を有効成分とする。
ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフォドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）等が挙げられる。
このうちでもビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムが好ましい。
ビフィドバクテリウム・ロンガムとしては、ＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）、基準株ＪＣＭ１２１７が挙げられ、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムとしては、ＳＢＴ２９０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８）、基準株ＡＴＣＣ２５５２６が挙げられるが、本発明のＤＣＡ低減効果を有するビフィズス菌であれば特に限定されるものではない。
本発明のビフィズス菌は、常法に従って培養することができる。培地には、乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地など種々の培地を用いることができる。このような培地としては、還元脱脂乳培地などを例示することができる。
得られた培養物から遠心分離などの集菌手段によって分離された菌体をそのまま本発明の有効成分として用いることができる。濃縮、乾燥、凍結乾燥などした菌体を用いることもできるし、加熱乾燥などにより死菌体にしてもよい。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるＧＡＭ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、還元脱脂乳培地など一般的にビフィズス菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
さらに、得られた培養物から遠心分離、濾過操作などの方法を用いて、乳タンパク質沈殿や菌体成分を除去することによって調製した培養上清なども用いることができる。固形分が少ない上清であるため、飲食品などへの適用範囲が広くなる。例えば、還元脱脂乳培養物を５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより培養上清を調製することができる。
【００１４】
本発明のデオキシコール低減剤にビフィズス菌菌体及び／又はその培養物とともに含まれる糖質としては、当該ビフィズス菌と共存させることでＤＣＡ低減作用を発揮させるような糖質であればよく、グルコース、ガラクトース、ラクトースのほかガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース、ラクツロースなどのオリゴ糖が挙げられる。また、これらの糖質は菌体培養物から持込まれたものでもよいし、後から添加されたものであってもよく、その両者の組み合わせであってもよい。
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムと、グルコース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース又はラクチュロースのうちいずれか1つ以上との組合せ、並びにビフィドバクテリウム・シュードロンガムと、グルコース、ガラクトース、ラクトース、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース及びラクチュロース糖のうちいずれか1つ以上と組み合わせることでＤＣＡ低減作用が発揮されるので好ましい。
糖質の添加量は、一緒に用いられるビフィズス菌のＤＣＡ低減効果が増強されるような量であればよく、菌体重量に対して０．１３重量％以上が好ましく、０．２６重量％以上がより好ましく、０．６重量％以上がもっとも好ましい。
【００１５】
本発明におけるＤＣＡ低減作用とは、ＤＣＡの量を減少させる作用である。本発明のＤＣＡ低減剤は、ＤＣＡ低減作用の他に、さらにＣＡについては、その低減作用を有さないかあるいは少なくともＤＣＡの低減作用よりも小さいことを特徴としている。すなわち、本発明のＤＣＡ低減剤は、有用なＣＡを極力低減させることなくＤＣＡを低減させることを特徴としている。
【００１６】
本発明のデオキシコール低減剤の製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥するほか、加熱乾燥して死菌体にしてもよい。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ビフィズス菌のＤＣＡ低減作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
【００１７】
本発明のＤＣＡ低減剤はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明のＤＣＡ低減剤は、これを有効成分とするがん予防薬として利用することができる。
さらに、本発明のＤＣＡ低減剤を飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
【００１９】
ビフィズス菌の菌体又は培養物を配合して、ＤＣＡ低減剤あるいは、ＤＣＡ低減用飲食品、栄養組成物、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させて使用する場合、ビフィズス菌の菌体または培養物の配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。投与対象者の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、ビフィズス菌の菌体培養物を１０〜２００ｇ、あるいは菌体自体を０．１〜５，０００ｍｇ摂取できるように配合量などを調整すればよい。このようにして摂取することにより所望の効果を発揮することができる。
以下、本発明を実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定して解釈されるものではない。
【００２０】
[試験例１]ＤＣＡ低減菌のスクリーニング
各種のビフィズス菌について、ＤＣＡを含む培地で一定期間培養し、ＤＣＡの低減作用があるビフィズス菌を選別した。
１．試験方法
（１）供試菌
ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum） 、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、 ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、 ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、種未同定のビフィドバククテリウム属の菌、合計110株のビフィズス菌を供試菌とした。
【００２１】
（２）スクリーニング方法
上記（１）の各供試菌をＧＡＭ（１％グルコース添加）培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。培養菌体を遠心分離（１，９１２×ｇ，４℃，１５ｍｉｎ）し、上清を廃棄した。菌体はリン酸緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有）に再懸濁した。スクリーニング用の反応条件として下記２条件（Ａ）及び（Ｂ）を用意し、反応は３７℃にて一昼夜行った。
条件（Ａ）：菌体懸濁液に１ｍＭデオキシコール酸（ＤＣＡ）を混合
条件（Ｂ）：菌体懸濁液に１ｍＭデオキシコール酸（ＤＣＡ）と０．１３重量％のグルコースを混合
【００２２】
（３）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるＤＣＡ低減効果の確認
反応液を遠心分離（２０，４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎ）し、得られた上清を回収した。ＴＬＣ（シリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ）上に反応液を５iＬスポットして乾燥し、酢酸エチル：シクロヘキサン：酢酸＝６９：２１：９の組成を持つ溶媒にて展開した後、乾燥した。１０％モリブドリン酸−エタノール溶液（東京化成）に表面を浸漬させた。再度、ＴＬＣ表面を乾燥した後、加熱することによりＤＣＡに由来するスポットを検出する。ＴＬＣにおける１ｍＭＤＣＡ標準化合物を添加して展開されたスポットと各反応液のスポットを比較し、ＤＣＡに由来するスポットの減少が認められれば、反応後の上清中に含まれるＤＣＡが低減されたと判断することができる。
【００２３】
２．試験結果
ＴＬＣにおけるスポットの目視観察の結果、グルコースを添加した条件Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（ＡＴＣＣ１５７０３等）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＳＢＴ２９２８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７等）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＪＣＭ１２１７等）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（ＳＢＴ２９０８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８等）を中心にＤＣＡに由来するスポットの減少が認められた。
スクリーニング結果ならびに各菌株の保有する胃酸耐性、生残性を考慮し（データは示していない）、有用なＤＣＡ低減菌としてビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７）およびビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８）を選抜し、以下の実施例に用いた。
なお、ＦＥＲＭＰ−１０６５７、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。ＡＴＣＣ１５７０３はAmerican Type Culture Collectionから入手可能である。ＪＣＭ１２１７は独立行政法人理化学研究所から入手可能である。
【実施例１】
【００２４】
（ビフィズス菌菌体溶液の調製）
ビフィズス菌菌体の調整
供試ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（以下、ＳＢＴ２９２８とも言う）及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８（以下、ＳＢＴ２９０８とも言う）を使用した。ビフィズス菌はＧＡＭ（１％グルコース添加）液体培地にて３７℃、１６時間静置培養した。菌体を遠心回収後（１０，０００×ｇ，４℃，１５  ｍｉｎ）、リン酸緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，含１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で３回洗浄した。得られた洗浄菌体をリン酸緩衝液に再懸濁し、Ｏ．Ｄ．６００  ＝４．５に調整した。
【００２５】
［試験例２］ビフィズス菌菌体によるＤＣＡ低減効果の検証（１）
実施例１で得られたビフィドバクテリウムロンガム及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムについてＤＣＡおよびＣＡの低減効果並びに当該効果に及ぼす各糖質添加の影響について検証した。
１．試験方法
ＣＡおよびＤＣＡの低減における糖質の効果
組成として、終濃度で実施例１の菌体懸濁液（Ｏ．Ｄ．６００＝４）、基質（１ｍＭ）、糖質（０．６５％）を含む反応液を調製し、３７℃で１８時間静置した。基質にはＣＡおよびＤＣＡを使用した。糖質にはグルコース、ガラクトース又はラクトースを使用した。反応液は回収後、速やかに冷却して遠心分離（２０，４００×ｇ，４℃，１０ｍｉｎ）し、上清を回収した。反応液中のＣＡおよびＤＣＡは総胆汁酸テストワコー（和光純薬）を用いて、添付文書のプロトコールに従って定量し、添加した初期濃度を１００（％）として残存率（％）を算出した。
【００２６】
２．試験結果
各種条件における反応液中のＣＡ及びＤＣＡの残存率を図１に示す。ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム菌体には、ＣＡについては糖質の有無に関わらず低減効果は認められなかった。
一方、ＤＣＡについてはグルコース、ガラクトース又はラクトースの何れを添加しても低減効果が認められた。
以上の結果より、ビフィドバクテリウム・ロンガム又はビフィドバクテリウム・シュードロンガム菌体と糖類の組合せにより、ＣＡを低減せずにＤＣＡを低減させることが出来ることが分かった。過去の研究報告においてビフィズス菌による糖質を駆動力としたＣＡの低減効果については報告されていたが（特許文献３）、ＣＡではなくＤＣＡ特異的な低減効果を確認したのは本願が初めてである。
【００２７】
［試験例３］ビフィズス菌菌体によるＤＣＡ低減に及ぼすオリゴ糖添加の影響
実施例１で得られたビフィズス菌菌体についてＤＣＡ低減効果に及ぼすオリゴ糖添加の影響について検証した。
１．試験方法
供試ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８を使用した。基質はＤＣＡのみとし、糖質をグルコース、ラクトースに加えて、オリゴ糖を使用した以外は試験１と同様の試験方法によりＤＣＡの低減効果を試験した。オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ラフィノース、ラクツロースを使用した。
【００２８】
２．試験結果
各種条件における反応液中のＤＣＡの残存率を図２に示した。図２よりオリゴ糖においても添加効果が認められた。ビフィドバクテリウム・ロンガムではラフィノース、ラクチュロース、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムではイソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖を利用した際に低減効果が大きかった。
【００２９】
[試験例４] ビフィズス菌菌体によるＤＣＡ低減効果に及ぼす糖質濃度の影響
実施例１で得られたビフィズス菌菌体について、ＤＣＡ低減効果に及ぼす糖質濃度の影響について検証した。
１．試験方法
基質はＤＣＡのみとし、糖質はグルコースとラクトースを使用し、糖質の濃度を０，０．０３，０．０７，０．１３，０．２６，０．６５％として試験を行った。その他の条件は試験例２の試験方法により行った。
【００３０】
２．試験結果
各種条件における反応液中のＤＣＡの残存率を図３に示した。両供試菌とも糖質濃度が０．２６％以上において顕著なＤＣＡ低減効果が認められた。特にビフィドバクテリウム・シュードロンガムではグルコースを０．６５％添加した場合にＤＣＡは残存率が３０％未満であり７０％以上低減したことになる。
【００３１】
［試験例５］ビフィズス菌菌体によるＤＣＡ低減効果の検証（２）
実施例１で得られたビフィズス菌菌体について、ＤＣＡ及びＣＡの低減の経時変化について検証した。
１．試験方法
糖質としてビフィドバクテリウム・ロンガムではラクトース、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムではグルコースをそれぞれ０．６５％添加し、試験例２と同様に試験した。反応液中のＣＡおよびＤＣＡを０，０．２５，０．５，１，２，４，６，１２，１４，１６，１８，２０，２２時間において定量した。
【００３２】
２．試験結果
各種条件における反応液中のＣＡもしくはＤＣＡの残存率を図４に示す。両供試菌において、ＣＡ濃度がほぼ一定に保たれている一方で、ＤＣＡは顕著に低減されていた。ＤＣＡの低減においてフィドバクテリウム・ロンガムでは反応２０時間、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムでは反応１６時間位で低減効果が平衡に達していた。      
以上のように、今回取得した両菌株は体内で重要な働きをするＣＡを低減させることなく、ＤＣＡのみを低減可能であることが示された。
【実施例２】
【００３３】
ビフィズス菌菌体培養物の調整
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８をＧＡＭ（１％  Ｇｌｃ添加）培地にて培養した。対数増殖期にある各培養液を、０．５％酵母エキス、０．１％アスコルビン酸ナトリウム、０．０４％システインを添加した１１．５５％還元脱脂乳（１１５℃、２０分間滅菌）に１％接種し、個々マザーカルチャーを作成した。これをヨーグルトミックス（１０％の還元脱脂乳を添加し、１００℃にて１０分間加熱したもの）に各３％添加して調製した。発酵は３７℃で行い、乳酸酸度０．８５に到達した時点で冷却し、発酵を終了させ、発酵乳を調製した。得られた発酵乳を凍結乾燥してビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８菌体培養物の粉末を得た。得られた菌体培養物をリン酸緩衝液に再懸濁し、１×１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。
【００３４】
[試験例６] ビフィズス菌培養物によるＤＣＡ低減効果の検証
実施例２で得られたビフィズス菌の菌体培養物についてＤＣＡおよびＣＡの低減効果並びに当該効果に及ぼす各糖質添加の影響について検証した。
１．試験方法
ＣＡおよびＤＣＡの低減における糖質の効果
実施例２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８の菌体培養物を用い、試験例２と同様に試験して反応液中のＣＡおよびＤＣＡを定量した。
２．試験結果
各種条件における反応液中のＣＡもしくはＤＣＡの残存率を図５に示す。ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム菌体培養物には、ＣＡについては糖質の有無に関わらず低減効果は認められなかった。
一方、ＤＣＡについてはガラクトース及びラクトースの何れを添加しても低減効果が認められた。
以上の結果より、ビフィドバクテリウム・ロンガム又はビフィドバクテリウム・シュードロンガム菌体培養物と糖類の組合せにより、ＣＡを低減せずにＤＣＡを低減させることが出来ることが分かった。
【００３５】
[試験例７] ビフィズス菌菌体によるＤＣＡ低減に及ぼすオリゴ糖添加の影響
実施例２で得られたビフィズス菌菌体についてＤＣＡの低減効果に及ぼすオリゴ糖添加の影響について検証した。
１．試験方法
実施例２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８及びビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８の菌体培養物を用い、試験例３と同様に試験して反応液中のＤＣＡを定量した。
【００３６】
２．試験結果
各種条件における反応液中のＤＣＡの残存率を図６に示した。図６よりオリゴ糖においても添加効果が認められた。ビフィドバクテリウム・ロンガムではラフィノース、ラクチュロース、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムではイソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖を利用した際に低減効果が大きかった。
【実施例３】
【００３７】
（ビフィズス菌菌体の調製）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８又はビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８をそれぞれＧＡＭ（１％Ｇｌｃ添加）培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。液体培養物を、それぞれ４℃、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。その後、凍結乾燥することによりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８又はビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８粉末をそれぞれ得た。
【実施例４】
【００３８】
（錠剤の製造）
実施例３にて調製した菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８又はビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳＢＴ２９０８の菌体２００ｍｇを含む錠剤をそれぞれ調製した。
【実施例５】
【００３９】
（散剤の製造）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８をＧＡＭ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社）５Ｌに摂取後、３７℃、１８時間静置培養を行った。培養終了後、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、培養液の１／５０量の濃縮菌体を得た。次いで、この濃縮菌体を、脱脂粉乳１０重量％、グルタミン酸ソーダ１重量％を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を６０メッシュのふるいで整粒化し、凍結乾燥菌末を製造した。第１３改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、この凍結乾燥菌末１ｇにラクトース（日局）４００ｇ、バレイショデンプン（日局）６００ｇを加えて均一に混合し、散剤を得た。
【実施例６】
【００４０】
（カプセル剤の製造）
表１に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに10ｍｇずつ充填して、カプセル剤を製造した。
【００４１】
【表１】
2017066087.tif 000003
【実施例７】
【００４２】
（スティック状健康食品の製造）
実施例３で得られたビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８の粉末30gに、ビタミンCとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、スティック健康食品を製造した。
【実施例８】
【００４３】
（飲料の製造）
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、果汁飲料を製造した。
【００４４】
【表２】
2017066087.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、ビフィズス菌菌体及び／又は乳酸菌培養物を有効成分とするデオキシコール酸低減剤を提供することができる。また、当該デオキシコール酸低減剤を含む栄養組成物、飲食品又は飼料を摂取することにより、肝がんや大腸がんの予防になりうる。
【受託番号】
【００４６】
ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６５７
ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８
[寄託生物材料への言及]
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ２９２８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成元年４月１３日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１０６５７
（２）ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）ＳＢＴ２９０８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
昭和６３年７月２０日（１９８８年７月２０日）（原寄託日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１３８
【図１】
2017066087.tif 000005
【図２】
2017066087.tif 000006
【図３】
2017066087.tif 000007
【図４】
2017066087.tif 000008
【図５】
2017066087.tif 000009
【図６】
2017066087.tif 000010