(57)【要約】【課題】慢性膿皮症とニキビとを精度よく分類（区別）できる、慢性膿皮症の簡便かつ高精度な診断方法や、かかる方法に用いる慢性膿皮症の診断用キットを提供すること。【解決手段】被験者の皮膚、好ましくは、顔面、頭部、又は臀部の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス（Dermacoccus）属菌を、ＰＣＲ法や次世代シークエンシング解析法等の方法を用いて検出し、ダーマコッカス属菌の有無や存在比の増加レベルを指標として、上記被験者が慢性膿皮症に罹患しているか否かを診断する。また、当該試料における細菌叢多様性の低下を指標として、上記被験者が慢性膿皮症に罹患しているか否かを診断する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス（Dermacoccus）属菌を検出することを特徴とする、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法。
【請求項２】
皮膚が、顔面、頭部、又は臀部の皮膚であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ダーマコッカス属菌が、ダーマコッカス・バラスリ（Dermacoccus barathri）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ダーマコッカス属菌の検出が、ＰＣＲ法、又は次世代シークエンシング解析法を用いて行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
さらに、試料における細菌叢多様性の低下を検出することを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細菌叢多様性が、健常者と比較して有意に低いことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
次世代シークエンシング解析法が、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする請求項４に記載の方法。
（Ａ）ダーマコッカス属菌、及びダーマコッカス属菌以外の少なくとも１種の菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチドを、ＰＣＲ法により増幅させる工程；
（Ｂ）前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、超並列シークエンサーを用いて決定する工程；
（Ｃ）前記ヌクレオチド配列に基づいて、細菌叢中のダーマコッカス属菌の存在比を算出し、当該存在比が０．７％以上であるときに、慢性膿皮症に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集する工程；
【請求項８】
以下の工程（Ｄ１）をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
（Ｄ１）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢多様性を計算し、当該細菌叢多様性が健常者と比較して有意に低下している場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【請求項９】
以下の工程（Ｄ２）をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
（Ｄ２）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のアルファ多様性を計算し、多様度指数が２００００以下である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【請求項１０】
以下の工程（Ｄ３）をさらに含むことを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
（Ｄ３）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のベータ多様性を計算し、健常者を基準としたＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅが０．２以上である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【請求項１１】
ダーマコッカス属菌を検出するための抗体、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、慢性膿皮症の診断用キット。
【請求項１２】
ダーマコッカス属菌が、ダーマコッカス・バラスリ（Dermacoccus barathri）であることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
被験者の皮膚から採取された試料における細菌叢多様性の低下を検出することを特徴とする、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス（Dermacoccus）属細菌を検出することを含む、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法や、当該試料における細菌叢多様性の低下を検出することを含む、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法や、かかる方法に用いる慢性膿皮症の診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性膿皮症は皮膚が硬化、肥厚、隆起し膿を伴う一群の皮膚疾患である（非特許文献１）。初期段階は小さな膿疱であるが、炎症反応が繰り返し起こることで病変部の皮膚が硬化する疾患であり、発汗性の高い頭部や臀部に発症する傾向が高いと言われている。また、月経不順などで発症頻度の影響を受けることなどが知られている。本疾患は、いくつかの亜型が存在しており、例えば臀部慢性膿皮症や頭部乳頭状皮膚炎、禿髪性毛包炎などが知られている。
【０００３】
慢性膿皮症は尋常性ざ瘡（ニキビ）と類似した発症形態であり、一部のニキビは慢性膿皮症の亜型と考えられる場合もある。これらは、いずれも常在菌が関与し、皮疹に膿をもつ慢性皮膚疾患である。ニキビは主に顔面に生じ、毛包の閉塞により毛包内の嫌気度が上昇することにより菌叢の代謝系の変動が生じて発症する。大部分のヒトにおいて人生のある時期に発症するので、宿主の免疫異常は関与しないと考えられる。一方、慢性膿皮症は、頭部と臀部に生じ、毛包の閉塞とは直接の関連なく発症する。慢性膿皮症は醜形を残しＱＯＬを著しく低下させる疾患であるにもかかわらず、症例数が少ないため非培養法の解析が行われていない。培養法の解析では、この疾患にはStaphylococcus aureusやStreptococcus pyogenesが発症に関わるという説もあるが（非特許文献２）、実際の培養による解析ではこれらの菌種が検出されないことが大部分であり、他の皮膚常在菌が関与していることが示唆される。また、病原因子だけでなく、免疫システムやＴ細胞システムの欠如や乱れも発症に関与していることが示唆されており（非特許文献３、４）、発症メカニズムは未解明な部分が多い。
【０００４】
現在の治療法は抗生物質の塗布や植皮による手術が一般的であるが、繰り返し発症することや感染症を伴うことが問題視されている。また、現在は、慢性膿皮症の診断は発症部位や形態の観察により行われているが、ニキビと診断された患者において、ニキビが慢性化して慢性膿皮症様の形態を呈することもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jemec,G.B. and Hansen,U. (1996) Histology of hidradenitis suppurativa. J.Am.Acad.Dermatol., 34, 994-999.
【非特許文献２】Feingold,D.S. (1993) Staphylococcal and streptococcal pyodermas. Semin.Dermatol., 12, 331-335.
【非特許文献３】Brehm,G. and Gebhardt,R. (1970) Dermatitis ulcerosa und γA-Mangel. Archiv fur klinische und experimentelle Dermatologie, 239, 266-274.
【非特許文献４】Brachtel,R. and Lemmel,E.M. (1976) Chronic vegetating pyodermia in cellular immune deficiency. Hautarzt, 27, 488-491.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、慢性膿皮症とニキビとを精度よく分類（区別）できる、客観性が高くかつ高精度な慢性膿皮症の診断方法や、かかる方法に用いる慢性膿皮症の診断用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、慢性膿皮症及びニキビに罹患した患者の皮膚から採取された試料中の菌叢を解析したところ、慢性膿皮症に罹患した患者の複数部位（頭部、顔面、臀部）において、ダーマコッカス（Dermacoccus）属菌がニキビに罹患した患者よりも有意に多く存在していることを見いだした。さらに、本発明者らは、慢性膿皮症に罹患した患者の皮膚や患部においては、細菌叢多様性の低下（ディスバイオーシス）が起きていることを見いだした。これらのことから、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス（Dermacoccus）属菌を検出することを特徴とする、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法。
（２）皮膚が、顔面、頭部、又は臀部の皮膚であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）ダーマコッカス属菌が、ダーマコッカス・バラスリ（Dermacoccus barathri）であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ダーマコッカス属菌の検出が、ＰＣＲ法、又は次世代シークエンシング解析法を用いて行われることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）さらに、試料における細菌叢多様性の低下を検出することを含むことを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）細菌叢多様性が、健常者と比較して有意に低いことを特徴とする、上記（５）に記載の方法。
（７）次世代シークエンシング解析法が、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする上記（４）に記載の方法。
（Ａ）ダーマコッカス属菌、及びダーマコッカス属菌以外の少なくとも１種の菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチドを、ＰＣＲ法により増幅させる工程；
（Ｂ）前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、超並列シークエンサーを用いて決定する工程；
（Ｃ）前記ヌクレオチド配列に基づいて、細菌叢中のダーマコッカス属菌の存在比を算出し、当該存在比が０．７％以上であるときに、慢性膿皮症に罹患している可能性が高いと診断するためのデータを収集する工程；
（８）以下の工程（Ｄ１）をさらに含むことを特徴とする、上記（７）に記載の方法。
（Ｄ１）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢多様性を計算し、当該細菌叢多様性が健常者と比較して有意に低下している場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
（９）以下の工程（Ｄ２）をさらに含むことを特徴とする、上記（７）又は（８）に記載の方法。
（Ｄ２）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のアルファ多様性を計算し、多様度指数が２００００以下である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
（１０）以下の工程（Ｄ３）をさらに含むことを特徴とする、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（Ｄ３）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のベータ多様性を計算し、健常者を基準としたＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅが０．２以上である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
（１１）ダーマコッカス属菌を検出するための抗体、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする、慢性膿皮症の診断用キット。
（１２）ダーマコッカス属菌が、ダーマコッカス・バラスリ（Dermacoccus barathri）であることを特徴とする上記（１１）に記載のキット。
（１３）被験者の皮膚から採取された試料における細菌叢多様性の低下を検出することを特徴とする、慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、観察による従来の診断方法と比較して、慢性膿皮症患者とニキビ患者とを、客観性高くかつ高精度に区別できるため、慢性膿皮症の適切な治療を行う上で有用である。また、本発明によると、ダーマコッカス属菌が慢性膿皮症の原因菌であることが示唆されたため、ダーマコッカス属菌を標的とした慢性膿皮症の治療又は予防剤の開発につながることも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】慢性膿皮症患者（図１Ａ）及びニキビ患者（図１Ｂ）における皮膚常在菌叢を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を基に解析した結果を示す図である。
【図２】慢性膿皮症患者及びニキビ患者における皮膚常在菌叢を、ＯＰＬＳ−ＤＡにより統計解析した結果を示す図である。
【図３】慢性膿皮症患者及びニキビ患者の頭部（図３Ａ）、顔面（図３Ｂ）、及び臀部（図３Ｃ）におけるDermacoccus属菌の割合を解析した結果を示す図である。図中の「＊」は、統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図４】Dermacoccus属菌の割合を解析した慢性膿皮症患者３名（図中の「Ｃ１〜Ｃ３」）、及びニキビ患者３名（図中の「Ａ１〜Ａ３」）について、Dermacoccus barathri菌をＰＣＲにより検出した結果を示す図である。図中の矢頭は、Dermacoccus barathri菌由来のＰＣＲ産物を示す。なお、コントロールとして、ＤＮＡの抽出工程が未実施のＣ３（慢性膿皮症患者）サンプル（図中の「Ｃ３’」）、及び滅菌水（図中の「ＮＣ」）を用いた。
【図５】皮膚細菌叢のベータ多様性解析の結果を示す図である。健常者をHealthy、ニキビ患者をAcne、慢性膿皮症患者をＣＰと記載した。図５Ａは、主座標分析（ＰＣｏＡ）の結果を示す図である。白は健常者、グレーはニキビ患者、黒は慢性膿皮症患者を示し、四角は頭部、三角は顔、丸は膿の細菌叢を示す。ＰＣ１の寄与率は４３．５％，ＰＣ２の寄与率は１３．９％であった。図５Ｂは、他人の同一部位におけるＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅを示す図である。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ法を用いた多重検定を行った。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
【図６】皮膚細菌叢のアルファ多様性解析の結果を示す図である。健常者をHealthy、ニキビ患者をAcne、慢性膿皮症患者をＣＰと記載した。図６Ａ及び６Ｂは、頭部（Ａ）、顔面（Ｂ）における皮膚細菌叢多様性を示す。図６Ｃは、膿における細菌叢多様性を示す。２群比較はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて行った。多群比較はＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ法を用いた多重検定を行った。＊Ｐ＜０．０５を示す。
【図７】膿細菌叢と患部周囲の皮膚細菌叢との類似度を示す図である。ニキビ患者をAcne、慢性膿皮症患者をＣＰと記載した。図７Ａは、ＰＣｏＡの結果を示す。グレーはニキビ患者、黒は慢性膿皮症患者を示し、三角は患部周囲、丸は膿の細菌叢を示す。同一個人のサンプル同士は、線で結んだ。ＰＣ１の寄与率は４３．５％、ＰＣ２の寄与率は１３．９％であった。図７Ｂは膿と発症部位の細菌叢類似度を、Ｕｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅをもとに計算した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の慢性膿皮症を診断するためのデータを収集する方法としては、被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス属菌を検出することを含む方法（以下、「本件収集方法１」ということがある）や、被験者の皮膚から採取された試料における細菌叢多様性の低下を検出することを含む方法（以下、「本件収集方法２」ということがある）（以下、「本件収集方法１」及び「本件収集方法２」を合わせて「本件収集方法」ということがある）であれば特に制限されず、ここで、被験者には、慢性膿皮症に罹患している患者の他、慢性膿皮症の罹患が疑われるヒト対象者も含まれる。また、本発明において「慢性膿皮症を診断する」ことや、「慢性膿皮症の診断」には、慢性膿皮症に罹患している可能性の高低を診断することのほか、慢性膿皮症に罹患するリスクの高低を診断することも便宜上含まれる。
【００１２】
また、本発明の慢性膿皮症の診断用キットとしては、ダーマコッカス属菌を検出するための抗体、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件診断用キット」ということがある）であれば特に制限されず、本発明の慢性膿皮症の診断用キットは、慢性膿皮症を診断するためのキットに関する用途発明であり、かかるキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、慢性膿皮症を診断するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
【００１３】
本発明において、「慢性膿皮症」とは、菌の侵入増殖により、皮膚が硬化、肥厚、隆起し、膿を伴う一群の皮膚疾患を意味する。慢性膿皮症は、その初期段階においては、膿疱や小さな皮疹等のニキビと似た症状が生じるものの、炎症反応が繰り返し起こることで病変部の皮膚が硬化する点でニキビとは異なる。
【００１４】
上記ダーマコッカス属菌としては、具体的にはダーマコッカス・アビシ（Dermacoccus abyssi）、ダーマコッカス・バラスリ（Dermacoccus barathri）、ダーマコッカス・ニシノミヤエンシス（Dermacoccus nishinomiyaensis）、ダーマコッカス・プロファンディ（Dermacoccus profundi）、ダーマコッカス・ルテア（Dermacoccus lutea）を例示するこ
とができ、好ましくはダーマコッカス・バラスリである。
【００１５】
本件収集方法における試料としては、被験者の皮膚表面の菌が含まれるように採取された試料であれば特に制限されず、例えば、溶媒を含むか又は含まない多孔質材料で被験者の皮膚表面をこすり、その多孔質材料を別に用意した溶媒に浸すことにより調製された試料を挙げることができる。かかる溶媒としては、ＴＥ１０バッファー（１〜１００ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）  Ｔｒｉｓ，１〜１００ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）  ＥＤＴＡ）などのトリス緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline；ＴＢＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液など）等の緩衝液や、水を挙げることができ、中でも、緩衝液を好ましく挙げることができ、ＴＥ１０バッファーを好適に例示することができる。上記の多孔質材料としては、脱脂綿、布、スポンジ、ペーパーなどを挙げることができ、中でも、脱脂綿を好ましく挙げることができ、綿棒を好適に例示することができる。なお、これらの多孔質材料は、コンタミネーションを回避する観点から、滅菌処理された多孔質材料であることが好ましい。また、皮膚は、慢性膿皮症や、類似の疾患であるニキビを発症し得る部位の皮膚であればよく、例えば顔面、頭部、又は臀部の皮膚を挙げることができる。また、試料の採取は、病変部位で行っても、病変部位以外の部位で行ってもよく、病変部位から採取した膿であってもよい。
【００１６】
本件収集方法１において、ダーマコッカス属菌を検出する方法としては、顕微鏡検査、生化学性状検査、血清学的検査及び遺伝子学的検査を例示することができ、培養困難菌種の微量検出を簡便に行う観点から、遺伝子学的検査が好ましく、中でもＰＣＲ法、及び次世代シークエンシング解析法が特に好ましい。
【００１７】
ＰＣＲ法によってダーマコッカス属菌を検出する場合、通常、ダーマコッカス属菌の遺伝子領域又は非遺伝子領域を特異的に増幅する。該遺伝子領域には、遺伝子をコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）及び／又はその相補的なポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）が含まれ、全長の遺伝子のほか、遺伝子の一部の領域も便宜上含まれる。ＰＣＲに用いるプライマーは、増幅対象とする遺伝子領域又は非遺伝子領域の両端の塩基配列に基づいて任意に設計することができ、１組のプライマー対を用いてＰＣＲを行ってもよいが、非特異的な増幅を減らし、最終的な判定精度を高めるために、２組以上のプライマー対を用いたネステッドＰＣＲ法により行うことが好ましい。また、増幅したＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動を行い、切り出したバンドから抽出してもよく、また、公知のＰＣＲ産物精製方法（ＧＥヘルスケア社製「NAP Columns」、「MicroSpin Columns」、ベックマンコールター社製「Agencourt AMPure XP」等）を用いて精製してもよい
【００１８】
上記ダーマコッカス属菌に特異的な遺伝子領域又は非遺伝子領域の種類としては、該領域に特異的な配列と相補的な配列を含むように設計したプライマーを含むプライマーセットによって増幅される領域や、増幅されるヌクレオチド長に基づいてダーマコッカス属菌を検出できるように設計したプライマーセットによって増幅される領域を挙げることができる。これらのプライマーセットは、ｐｒｉｍｅｒ３（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）等の公知のプライマー設計ツールを用いて設計することができる。プライマーのヌクレオチド数は、好ましくは１７〜２５個である。プライマーのＴｍ値はフォワードプライマーとリバースプライマーで概ね揃えて、５５〜６５℃くらいに設定することが好ましい。プライマー同士がアニールしないように、プライマー間の相補性が少ないプライマーペアを選択することが好ましい。特にプライマーダイマーの形成による増幅効率の低下を防ぐため、各プライマーの３’末端同士がヌクレオチド３個以上連続して相補的にならないように設計することが好ましい。また、通常、プライマー内の二次構造形成を避けるために、ヌクレオチド４個以上の自己相補配列を含まないようにすることが好ましい。ＧＣ含量は４０〜６０％前後とし、部分的にＧＣリッチあるいはＡＴリッチにならないようにすることが好ましい。また、プライマーの３’末端と鋳型ＤＮＡが安定して結合するように、特にプライマーの３’側がＡＴリッチ又はＧＣリッチにならないようにすることが好ましい。
【００１９】
例えば、ダーマコッカス属菌がダーマコッカス・バラスリである場合、上記プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、当業者であれば、ダーマコッカス・バラスリのゲノム配列に基づいて設計することができる。ダーマコッカス・バラスリを特異的に検出するプライマーセットとしては、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとからなるプライマーセットを好ましく例示することができる。
【００２０】
本件収集方法２において、細菌叢多様性の低下とは、被験者の皮膚から採取された試料における細菌叢多様性が、健常者又はニキビ患者の皮膚から採取された試料における細菌叢多様性と比較して低下していることを意味する。細菌叢多様性は、いかなる多様度指数を用いて比較してもよいが、例えばアルファ多様性、ベータ多様性、ガンマ多様性、シンプソン指数及びシャノン指数、好ましくはアルファ多様性及びベータ多様性を挙げることができる。被験者の細菌叢多様性が、健常者やニキビ患者の細菌叢多様性と比較して有意に低下しているときに、被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断することができる。より具体的には、被験者の細菌叢多様性が、健常者やニキビ患者の細菌叢多様性と比較して有意に低下している場合は、有意に低下していない場合と比較して、その被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断することができる。また、アルファ多様性を指標として用いる場合、多様度指数（推定種数）が２００００以下、好ましくは１５０００以下、さらに好ましくは１００００以下であるときに、被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断してもよい。また、ベータ多様性を指標として用いる場合、健常者を基準としたＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅが０．２以上、好ましくは０．２５以上、より好ましくは０．３以上であるときに、被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断してもよい。細菌叢多様性を計算するためのデータの取得方法としては、細菌叢の構成菌種を同定することができる方法であれば制限されないが、次世代シークエンシング解析法を好適に例示することができる。なお、前述のα多様性、β多様性、γ多様性、シンプソン指数、シャノン指数、Ｕｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅは、Caporaso JGら“QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data”（Nat Methods. 2010 May;7(5):335-6）に記載の方法により算出することができる。
【００２１】
本件収集方法において、次世代シークエンシング解析法とは、超並列シーケンサーを用いた配列決定を意味する。超並列シーケンサーとしては、例えばイルミナ社製のMiSeq、HiSeq2000、Genome Analyzer IIx（GAIIx）や、ロシュ社製のGenome Sequencer-FLX（GS-FLX）を挙げることができる。超並列シーケンサーは、１度に決定できる配列数（リード数）が１億〜数十億の機器もあり、きわめて多数の増幅産物のヌクレオチド配列を迅速かつ簡便に決定することができる。したがって、決定した試料中のヌクレオチド配列をクエリ配列として、ＢＬＡＳＴ等を用いて配列データベースに対してアラインメントを行うことで、試料中にダーマコッカス属菌に特異的な遺伝子領域又は非遺伝子領域が含まれているかどうかを判定することによる、ダーマコッカス属菌の検出が可能である。
【００２２】
次世代シークエンシング解析法の一態様としては、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする方法を挙げることができる。
（Ａ）ダーマコッカス属菌、及びダーマコッカス属菌以外の少なくとも１種の菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチドを、ＰＣＲ法により増幅させる工程；
（Ｂ）前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、超並列シークエンサーを用いて決定する工程；
（Ｃ）前記ヌクレオチド配列に基づいて、細菌叢中のダーマコッカス属菌の存在比を算出し、当該存在比が０．７％以上であるときに、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【００２３】
上記工程（Ｃ）に代えて、又は上記工程（Ｃ）に加えて、以下の工程（Ｄ１）を含んでもよい。
（Ｄ１）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢多様性を計算し、当該細菌叢多様性が健常者と比較して有意に低下している場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【００２４】
上記工程（Ｃ）に代えて、又は上記工程（Ｃ）に加えて、以下の工程（Ｄ２）を含んでもよい。
（Ｄ２）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のアルファ多様性を計算し、多様度指数が２００００以下である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【００２５】
上記工程（Ｃ）に代えて、又は上記工程（Ｃ）に加えて、以下の工程（Ｄ３）を含んでもよい。
（Ｄ３）前記ヌクレオチド配列に基づいて細菌叢のベータ多様性を計算し、健常者を基準としたＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅが０．２以上である場合、慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集する工程；
【００２６】
上記工程（Ａ）において、ダーマコッカス属菌以外の菌としては、公知のいかなる皮膚常在菌を挙げることができ、具体的にはAnaerococcus属菌、Mycobacterium属菌、Finegoldia属菌、Knoellia属菌、Janibacter属菌、Microbacterium属菌、Clostridium属菌、Pseudomonas属菌、Streptococcus属菌、Micrococcus属菌、Bacillales目菌、Bacillus属菌、Bifidobacterium属菌、Renibacterium属菌、Staphylococcus属菌、Corynebacterium属菌、Ralstonia属菌、Actinomycetales目菌、Propionibacterium属菌、Trichophyton属菌から選択される菌を例示することができる。好ましくは、「ダーマコッカス属菌、及びダーマコッカス属菌以外の少なくとも１種の菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチド」は、菌特異的なユニバーサルプライマーセット（例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列［5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’］からなる２７Ｆ＿ｍｏｄプライマー、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列［5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’］からなる３３８Ｒプライマー)によって増幅されるすべての遺伝子である。
【００２７】
上記工程（Ｃ）において、存在比は０．７％以上であればよく、０．８％以上、０．９％以上、１．０％以上、１．５％以上、２．０％以上、３．０％以上、４．０％以上、５．０％以上、６．０％以上、７．０％以上、８．０％以上であればより好ましい。
【００２８】
上記工程（Ｄ２）において、多様度指数が２００００以下であればよく、１５０００以下であればより好ましく、１００００以下であればさらに好ましい。また、上記工程（Ｄ３）において、健常者を基準としたＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅが０．２以上であればよく、０．２５以上であればより好ましく、０．３以上であればさらに好ましい。
【００２９】
本件収集方法は、ダーマコッカス属菌の有無や、ダーマコッカス属菌の存在比の増加レベル（本件収集方法１）、或いは、細菌叢多様性の低下（本件収集方法２）を指標として、被験者が慢性膿皮症であると診断したり、慢性膿皮症とニキビとを精度よく分類（区別）するためのデータを収集することができる。また、ダーマコッカス属菌が慢性膿皮症の原因菌であることや、慢性膿皮症に罹患すると細菌叢多様性が低下することが示唆されたため、本件収集方法は、ダーマコッカス属菌の有無や、ダーマコッカス属菌の存在比の増加レベルや、被験者の細菌叢多様性の低下を指標として、慢性膿皮症に罹患する前の段階であっても、慢性膿皮症に罹患するリスクの高低を診断するためのデータを収集することができると考えられる。すなわち、被験者の皮膚から採取された試料中に、ダーマコッカス属菌が検出された場合、或いは、被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス属菌の存在比が増加していた場合、或いは、被験者の細菌叢多様性が健常者と比較して低下していた場合、被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が高い、又は、慢性膿皮症に罹患するリスクが高いと診断するためのデータを収集することができ、また、被験者の皮膚から採取された試料中に、ダーマコッカス属菌が検出されなかった場合、或いは、被験者の皮膚から採取された試料中のダーマコッカス属菌の存在比が増加していない場合、被験者は慢性膿皮症に罹患している可能性が低い、又は、慢性膿皮症に罹患するリスクが低いと診断するためのデータを収集することができる。本件収集方法１及び２は、単独で行っても、組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
本件診断用キットにおいて、ダーマコッカス属菌を検出するための抗体としては、公知のいかなる方法を用いて作製した抗ダーマコッカス属菌抗体を挙げることができ、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
また、本件診断用キットにおいて、ダーマコッカス属菌を検出するためのプライマーセットとしては、ダーマコッカス属菌の遺伝子領域又は非遺伝子領域を特異的に増幅できるように設計したプライマーを含むプライマーセットや、増幅される遺伝子長に基づいてダーマコッカス属菌を検出できるように設計したプライマーセットを例示することができる。
また、本件診断用キットにおいて、ダーマコッカス属菌を検出するためのプローブとしては、ダーマコッカス属菌の遺伝子領域又は非遺伝子領域に特異的に結合（ハイブリダイズ）することができるポリヌクレオチドを例示することができる。
また、本件診断用キットにおいて、上記抗体、プライマーセット、及びプローブの標識物としては、例えばビオチン、酵素、蛍光色素、又は放射性同位体による標識物を挙げることができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
１．慢性膿皮症診断用バイオマーカーの同定
［サンプル採取及びＤＮＡ抽出］
慢性膿皮症患者５名（発症部位は４名が頭部、１名が臀部）、及びニキビ患者１７名（発症部位は顔面）のそれぞれについて、疾患発症部位でない部位（頭部、顔面、及び臀部）に、ＴＥ１０緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸した滅菌綿棒を３０秒間こすりつけ、５００μＬのＴＥ１０緩衝液に浸したものをサンプルとし、−８０℃で冷凍保存した。サンプル中に含まれる皮膚常在菌由来のＤＮＡの抽出は、以下の手順〔１〕〜〔６〕にしたがって行った。
〔１〕サンプルを常温に融解した後、２５μＬのリゾチーム（３００ｍｇ／ｍＬ）（Sigma-Aldrich社製）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。
〔２〕１５μＬのアクロモペプチダーゼ（２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)（和光純薬社製）を加え、３７℃で８時間インキュベートした後、５０μＬの１０％ ＳＤＳと、１５μＬのプロテイナーゼＫ（２５ｍｇ／ｍＬ)（Sigma-Aldrich社製）を加え、５５℃で一晩インキュベートした。
〔３〕６００μＬのフェノール、クロロホルム、及びイソアミルアルコールの３種混合液を加え、マイクロシェーカーを用いて３分間撹拌し、１７，８００×ｇ、２０℃の条件で１０分間の遠心分離を行った。
〔４〕上清（水層）を回収し、再度６００μＬの上記３種混合液を加え、１，５００ｒｐｍで３分間撹拌し、１７，８００×ｇ、２０℃の条件で１０分間の遠心分離を行った。
〔５〕水層を回収し、６０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えた後、１．２ｍＬの１００％エタノールを加えて−８０℃で１時間冷却した。
〔６〕１７，８００×ｇ、４℃の条件で１０分間の遠心分離した後、上清を除去して７０％エタノールを５００μＬ加えた。さらに１７，８００×ｇ、４℃の条件で５分間遠心分離した後、上清を除去して５０μＬのＴＥ１０緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、マイクロシェーカーを用いて５分間撹拌し、ＤＮＡを溶解した。
【００３３】
［シークエンシング用ＤＮＡサンプルの調製］
皮膚常在菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、MiSeqを用いたシークエンシングを行うために、以下の手順〔１〕〜〔４〕にしたがってシークエンシング用ＤＮＡサンプルを調製した。
〔１〕上記［サンプル採取及びＤＮＡ抽出］の方法で得られた皮膚常在菌由来のＤＮＡ１μＬをテンプレートとして、菌特異的なユニバーサルプライマーセット（配列番号１で示されるヌクレオチド配列［5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’］からなる２７Ｆ＿ｍｏｄプライマー、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列［5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’］からなる３３８Ｒプライマー)を用いたＰＣＲを、以下の（i）〜（iii）に示す条件下で行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。なお、ポリメラーゼは、Tks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いた。
（i）初期変性反応：９４℃で２分間
（ii）９６℃を１０秒間、６４℃を１５秒間、６８℃を３０秒間の３ステップを２０回繰り返す
（iii）最終伸長反応：６８℃で２分間
〔２〕ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物５０μＬに対して９０μＬのAgencourt AMPure XP試薬（ベックマンコールター社製）を加え、ＤＮＡを精製し、Picogreen（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて二本鎖ＤＮＡの濃度定量を行い、最終濃度が１ｎＭになるよう各サンプルを希釈し、１回目ＰＣＲ産物を得た。Index PCRのテンプレートに用いた。
〔３〕MiSeqでシークエンスをする際に必要なアダプター配列、及びIndex配列を付加するためにＰＣＲを行った。すなわち、上記１回目ＰＣＲ産物１μＬをテンプレートとして、プライマーセット（配列番号３で示されるヌクレオチド配列［5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-NNNNNNNN-TATGGTAATTGTAGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3’］からなるフォワードプライマー１、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列［5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-AGTCAGTCAGCCTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’］からなるリバースプライマー１）を用いた２回目のＰＣＲ（Index PCR）を、以下の（i）〜（iii）に示す条件下で行った。なお、上記プライマーのヌクレオチド配列中の「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」は、Index配列を示し、サンプルごとに異なるヌクレオチド配列となる。また、ポリメラーゼは、Tks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いた。
（i）初期変性反応：９８℃で１分間
（ii）９８℃を１０秒間、５５℃を１５秒間、６８℃を３０秒間の３ステップを８回繰り返す
（iii）最終伸長反応：６８℃で３分間
〔４〕ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物５０μＬに対して９０μＬのAMPure XP試薬（ベックマンコールター社製）を加え、ＤＮＡを精製し、バイオアナライザ２１００（アジレント社製）を用いて、アダプター配列及びIndex配列が付加されていることを確認した。また、得られたＰＣＲ産物（Index PCR産物）の絶対量は、アダプター配列の末端に設計したプライマーセット（配列番号５で示されるヌクレオチド配列［5’-GCGACCACCGAGATCTACAC-3’］からなるフォワードプライマー２、及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列［5’CAAGCAGAAGACGGCATAC-3’］からなるリバースプライマー２）を用いた定量ＰＣＲにより確認した。その際、濃度が既知であり、末端側に同様のアダプターが付加されているＤＮＡ (PhiX Control v3)を用いた。
【００３４】
［シークエンシング］
上記Index PCR産物を４ｎＭとなるように調整し、MiSeq（イルミナ社製）を用いたシークエンシングを、イルミナ社のプロトコールにしたがって行った。すなわち、４ｎＭのIndex PCR産物に、２Ｎの水酸化ナトリウムを加えることによりＤＮＡを一本鎖に変性させた。変性後のＤＮＡサンプル溶液に、Hybridization buffer（イルミナ社製）を加え、８ｐＭ又は１０ｐＭとなるように希釈し、同様の操作で調製したコントロールＤＮＡであるPhiX DNAを混合し、９６℃で２分間インキュベートし熱変性した。その後、氷上で５分間静置し、６００μＬのライブラリー溶液をシークエンス解析に用いた。
【００３５】
［データ解析］
まず初めに、ペアエンドでシークエンスされた塩基配列をＦＬＡＳＨ（Version 1.2.11）によってアセンブルした。平均Ｑ−ｖａｌｕｅが２５以下の塩基配列は解析の対象から除いた。その後シークエンスされた塩基配列からフォワードプライマー１及びリバースプライマー１のプライマー配列を除去した。得られたデータを、Ｑｉｉｍｅ（Version 1.8.0）を用いて解析した。その後サンプルごとに完全に一致する塩基配列の出現回数を数え、その上で重複する塩基配列は除去した（相同性１００％を閾値としたOperational Taxonomic Units（ＯＴＵ）を作成した）。２群間（慢性膿皮症群、及びニキビ群）での差異に寄与する因子（菌体）を特定するため、統計解析ソフトＸＬＳＴＡＴ(v2014.6.04)によるOrthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis（ＯＰＬＳ−ＤＡ）を実施し、統計評価はノンパラメトリック検定であるMann-WhitneyのＵ検定を用いた。統計検定の結果、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。系統樹はBootstrap法を用いて作成した。統計手順はMev (v4.8) [38]、XLSTAT (v2014.6.04)およびR (v3.1.2)を用いて実施した。
【００３６】
［結果］
Dermacoccus属菌は、ニキビ患者の頭部及び顔面では、検出されなかったのに対して、慢性膿皮症患者の頭部及び顔面では検出された（図１〜３、及び表１〜２参照）。また、Dermacoccus属菌の存在比は、ニキビ患者の臀部では、０．６％であったのに対して、慢性膿皮症患者の臀部では、８．４％と高かった（図１〜３、及び表１〜２参照）。一方、Dermacoccus属菌以外の皮膚常在菌については、ニキビ患者と慢性膿皮症患者との間で大きな違いは認められなかった（図１〜３、表１〜２参照）。
以上の結果は、頭部、顔面等の部位の皮膚におけるDermacoccus属菌の有無や、頭部、顔面、臀部等の部位の皮膚におけるDermacoccus属菌の存在比が少なくとも０．７％となることを指標として、慢性膿皮症患者とニキビ患者とを区別できることを示している。
【００３７】
【表１】
2017189166.tif 000002
【００３８】
【表２】
2017189166.tif 000003
【実施例２】
【００３９】
２．Dermacoccus属菌の菌種の特定
慢性膿皮症患者において検出されたDermacoccus属菌の菌種を特定するために、ＲＤＰ（Ribosomal Database Project）データベースを用いて解析を行った。
その結果、頭部、顔面及び臀部におけるDermacoccus属菌は、大部分（９９〜１００％）がDermacoccus barathri菌であることが明らかとなった。なお、次に割合が高いDermacoccus属菌は、Dermacoccus lutea菌（０〜１％）であることも明らかとなった。
【実施例３】
【００４０】
３．Dermacoccus barathri菌
慢性膿皮症患者において検出されたDermacoccus属菌の大部分が、Dermacoccus barathri菌であることがわかったので、Dermacoccus barathri菌を検出することにより、慢性膿皮症患者とニキビ患者とを区別できるかどうかを検討した。
【００４１】
［方法］
上記実施例１の［サンプル採取及びＤＮＡ抽出］の項目に記載の方法にしたがって、慢性膿皮症患者３名及びニキビ患者３名由来の頭部、顔面、臀部の皮膚からＤＮＡを抽出し、D. barathri菌検出用プライマーセット（配列番号７で示されるヌクレオチド配列［5’-AACGATGAAGCGCCAGCT-3’］からなるフォワードプライマー３、及び配列番号８で示されるヌクレオチド配列［5’-ACACCAGTCCGAAGACGCAC-3’］からなるリバースプライマー３）と、Tks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを、以下の（i）〜（iii）に示す条件下で行い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した後、アガロースゲル電気泳動法によりＰＣＲ産物を検出した。
（i）初期変性反応：９４℃で２分間
（ii）９６℃を１０秒間、６４℃を１５秒間、６８℃を３０秒間の３ステップを２０回繰り返す
（iii）最終伸長反応：６８℃で２分間
【００４２】
［結果］
Dermacoccus barathri菌は、ニキビ患者の頭部、顔面、臀部では、ほとんど検出されなかったのに対して、慢性膿皮症患者の頭部、顔面、臀部では検出された（図４参照）。
この結果から、Dermacoccus barathri菌特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲを行うことにより、Dermacoccus barathri菌の有無や増加レベルを指標として、慢性膿皮症患者とニキビ患者とを区別できることを示している。
【実施例４】
【００４３】
４．皮膚細菌叢のベータ多様性解析
実施例１によってシークエンスされた塩基配列を用いて、健常者、ニキビ患者、慢性膿皮症患者における皮膚細菌叢のベータ多様性を解析した。データ解析は、Ｑｉｉｍｅ（Version 1.8.0）を用いて行った。結果を図５に示す。健常者をＨｅａｌｔｈｙ、ニキビをＡｃｎｅ、慢性膿皮症をＣＰと記載した。図５Ａは、主座標分析（ＰＣｏＡ）の結果を示す図である。ＰＣ１の寄与率は４３．５％、ＰＣ２の寄与率は１３．９％であった。図５Ｂは、他人の同一部位におけるＵｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅを示す図である。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ法を用いた多重検定を行った。＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
ＰＣｏＡの結果、被験者群ごとにクラスタリングされるほどの大きな違いは見受けられなかった（図５Ａ）。一方で他人の同一部位の細菌叢が慢性膿皮症患者群において有意に異なっていることが明らかとなった（図５Ｂ）。
【実施例５】
【００４４】
５．皮膚細菌叢のアルファ多様性解析
実施例１によってシークエンスされた塩基配列を用いて、健常者、ニキビ患者、慢性膿皮症患者における皮膚細菌叢のアルファ多様性を、Ｃｈａｏ１によって計算した。データ解析は、Ｑｉｉｍｅ（Version 1.8.0）を用いて行った。結果を図６に示す。図６Ａ及び６Ｂは、頭部（Ａ）、顔面（Ｂ）における皮膚細菌叢多様性を示す。図６Ｃは、膿細菌叢多様性を示す。２群比較はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて行った。多群比較はＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ法を用いた多重検定を行った。＊Ｐ＜０．０５を示す。
各サンプルにおける多様性を検証した結果、ニキビ患者と慢性膿皮症患者は健常者と比較して皮膚常在菌の多様性が有意に低く、膿の細菌叢多様性はニキビ患者よりも慢性膿皮症患者において低い傾向にあった。
【実施例６】
【００４５】
６．膿と発症部位の細菌叢類似度
実施例１によってシークエンスされた塩基配列を用いて、膿細菌叢と発症部位の皮膚細菌叢の類似度を計算した。データ解析は、Ｑｉｉｍｅ（Version 1.8.0）を用いて行った。結果を図７に示す。ニキビをＡｃｎｅ、慢性膿皮症をＣＰと記載した。図７Ａは、ＰＣｏＡの結果を示す。ＰＣ１の寄与率は４３．５％，ＰＣ２の寄与率は１３．９％であった。図７Ｂは、膿と発症部位の細菌叢類似度を、Ｕｎｉｆｒａｃ  Ｄｉｓｔａｎｃｅをもとに計算した結果を示す。
結果より、膿細菌叢と発症部位細菌叢が、慢性膿皮症において類似する傾向にあることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
従来は、慢性膿皮症とニキビ患者とを区別できる客観的な診断方法が確立されていなかった。本発明の方法を用いることで、慢性膿皮症を簡便かつ高精度に診断することができ、慢性膿皮症の適切な治療に資する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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