(57)【要約】【課題】配管や機器に損傷を与えることがなく、かつ人体にも安全なバイオフィルム形成抑制剤の提供。【解決手段】水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を有効成分とする、バイオフィルム形成抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を有効成分とする、バイオフィルム形成抑制剤。
【請求項２】
前記ヒドロキノンが式（I）で示される化合物であり、かつ前記ｐ−ベンゾキノンが式（II）で示される化合物である、請求項１記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【化１】
2017218388.tif 000008
（式中、Ｒ1及びＲ5は、それぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に水素又はメチル基を表す。）
【請求項３】
前記式（I）中、Ｒ1が水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ2、Ｒ3及びＲ4がともに水素であるか；Ｒ1がメチル基であり、Ｒ3が水素であり、かつＲ2及びＲ4は一方がメチル基で他方が水素、もしくはともにメチル基であるか；又は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がともにメチル基である、請求項２記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項４】
前記式（II）中、Ｒ5が炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8がともに水素である、請求項２記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項５】
前記キノン化合物が、ｐ−トルキノン、２−メチルヒドロキノン、エチルキノール、２−ブチルヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、２，６−ジメチルヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、２，３，５−トリメチルヒドロキノン、テトラメチルヒドロキノン、ヒドロキシヒドロキノン、３，５−ジメチルベンゾキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項６】
対象水中での前記キノン化合物の濃度が２７０ｐｐｍ以下である、請求項１〜５のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項７】
バイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻害率が２０％以下となる濃度の前記キノン化合物を有効成分とする、請求項１〜６のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項８】
水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を対象水中に添加することを含む、バイオフィルム形成抑制方法。
【請求項９】
前記ヒドロキノンが式（I）で示される化合物であり、かつ前記ｐ−ベンゾキノンが式（II）で示される化合物である、請求項８記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【化２】
2017218388.tif 000009
（式中、Ｒ1及びＲ5は、それぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に水素又はメチル基を表す。）
【請求項１０】
前記式（I）中、Ｒ1が水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ2、Ｒ3及びＲ4がともに水素であるか；Ｒ1がメチル基であり、Ｒ3が水素であり、かつＲ2及びＲ4は一方がメチル基で他方が水素、もしくはともにメチル基であるか；又は、Ｒ1がメチル基であり、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がともにメチル基である、請求項９記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【請求項１１】
前記式（II）中、Ｒ5が炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8がともに水素である、請求項９記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【請求項１２】
前記キノン化合物が、ｐ−トルキノン、２−メチルヒドロキノン、エチルキノール、２−ブチルヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、２，６−ジメチルヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、２，３，５−トリメチルヒドロキノン、テトラメチルヒドロキノン、ヒドロキシヒドロキノン、３，５−ジメチルベンゾキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【請求項１３】
前記キノン化合物が前記対象水中に２７０ｐｐｍ以下の濃度で添加される、請求項９〜１２のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【請求項１４】
前記キノン化合物が、前記対象水中に、バイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻害率が２０％以下となる濃度で添加される、請求項８〜１３のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム形成抑制剤及びバイオフィルム形成抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、固体や液体の表面に付着した細菌やカビ等の微生物の群落が分泌物等と共に形成した構造体である。家庭又は工場の排水設備や水循環システムなどに発生したバイオフィルムは、配管のぬめりやつまり及び悪臭の原因となる。バイオフィルムはまた、下水管の腐食など、設備の劣化を引き起こす。海水の淡水化プラントで使用される逆浸透膜、製紙工場の配管設備などにおいても、バイオフィルム形成による弊害が問題視されている。さらに、バイオフィルムは微生物汚染の原因となる。温泉施設等に発生したバイオフィルムが感染症を引き起こす場合がある。医療分野では、透析等のチューブや内視鏡、コンタクトレンズ等の医療器具に形成されたバイオフィルムが感染源となることがある。また皮膚や口腔内でのバイオフィルム形成が疾病を引き起こすことがある。食品分野では、食品又は調理器具に形成されたバイオフィルムが腐敗や食中毒の原因となることがある。
【０００３】
微生物がバイオフィルムを形成すると、通常の洗浄や殺菌方法に対して耐性となるため、その排除は容易ではない。排水設備や水循環システムにおけるバイオフィルム形成防止のためには、定期的な水の入れ替えや清掃が必要であるが、これらは当該設備やシステムのメンテナンスコストを上昇させる。
【０００４】
水循環システム等におけるバイオフィルムには、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等のPseudomonas属、Sphingomonas属、Sphingopyxis属などのグラム陰性微生物が存在する。さらに、水冷式冷却塔におけるバイオフィルムから、Klebsiella属、Flavobacterium属及びRoseomonas属微生物が見つかったという報告がある（非特許文献１及び２）。従来、排水設備や水循環システムなどにおけるバイオフィルム防止には、塩素系薬剤、有機窒素硫黄系薬剤などの殺菌剤が用いられている。しかし、塩素系薬剤には配管や機器への損傷の問題があり、有機窒素硫黄系薬剤には皮膚損傷などの問題がある。そのため、何れの薬剤も十分に殺菌できる濃度では使用することができず、バイオフィルム形成を長期間抑制することができない。
【０００５】
特許文献１には、Ｎ−アルキル置換ヒドロキシルアミンとアルカリ金属水酸化物をキノン誘導体とともに含有するｐＨ１２以上の液体組成物をボイラー防食のために使用することが開示されている。またキノン化合物は、抗菌性物質として知られている。例えば、特許文献２〜３には、ベンゾキノン又はヒドロキノンがブドウ球菌、アクネ菌、又はプロピオン酸菌に対する抗菌活性を有することが開示されている。特許文献４には、ベンゾキノン又はヒドロキノンの誘導体が黄色ブドウ球菌及びアクネ菌に対する抗菌活性を有することが開示されている。非特許文献３には、２位がアルキル又はアルケニル基で置換されたキノン又はヒドロキノンが、枯草菌、ミクロコッカス属又はカンジダ属菌に対する抗菌活性を示したことが開示されている。非特許文献４には、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンが、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有し、該菌によるバイオフィルムの形成を阻止したことが開示されている。一方、上記化合物のグラム陰性菌に対する抗菌作用については、これまで報告は少なく、また報告されている抗菌活性も大きいものではなかった。非特許文献３には、グラム陰性菌に対する最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）は明記されておらず、非特許文献４には、大腸菌に対するｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンの最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）が５１２ｐｐｍであると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−６８６３１号公報
【特許文献２】国際公開公報第２００７／０９６６０１号
【特許文献３】特表２００８−５３５８１４号公報
【特許文献４】国際公開公報第２００６／１００４９６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biofouling 2011,27(4)393-402
【非特許文献２】Biocontrol Science 2013,18(4)205-209
【非特許文献３】J Nat Prod, 1994, 57(12):1711-1716
【非特許文献４】J Antimicrob Chemother, 2013, 68(6):1297-1304
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、配管や機器に損傷を与えることがなく、かつ人体にも安全でありながら、バイオフィルム形成を効果的に抑制することができる、バイオフィルム形成抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、特定のキノン化合物が、微生物の生育を阻害しない低濃度で使用した場合であっても、バイオフィルム形成を効果的に抑制できることを見出した。
【００１０】
したがって、本発明は、水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を有効成分とする、バイオフィルム形成抑制剤を提供する。
また本発明は、水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を対象水中に添加することを含む、バイオフィルム形成抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、殺菌又は抗菌作用によらずにバイオフィルム形成を抑制することができる。したがって、本発明によれば、人体に対してより安全にバイオフィルム形成を抑制することができる。また本発明によれば、殺菌剤や抗菌剤を用いた場合のような菌の耐性獲得による効果の低減を防止することができるので、長期にわたり使用しても有効にバイオフィルム形成を抑制することができる。さらに、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、従来の殺菌剤と比べて配管や機器を損傷しにくいため、より経済的である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験化合物によるバイオフィルム形成抑制。Ａ；生育量（ＯＤ６００）、Ｂ；バイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）。横軸：１）ＥｔＯＨ対照；２）２−メチルヒドロキノン；３）ｐ−トルキノン；４）次亜塩素酸ナトリウム。各サンプルの棒グラフは、左から試験化合物濃度が７、２０、３３、６７、２００及び３３３ｐｐｍでのデータを表す。
【図２】試験化合物ａ〜ｋによるバイオフィルム形成抑制。Ａ；生育量（ＯＤ６００）、Ｂ；バイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）。各サンプルの棒グラフは、左から化合物溶液の添加量が１、２、４、６、７、８μＬのときのデータを表す。
【図３】水系システムモデルにおけるｐ−トルキノンによるバイオフィルム形成抑制。（ａ）溶媒コントロール；（ｂ）ｐ−トルキノン、ｎ＝２。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、家庭又は工場設備などの様々な環境下におけるバイオフィルム形成の抑制に使用される。好ましくは、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、水の流れる配管、水を貯留するタンクやプール、水循環システム、及びそれらに付属する機器などの、そこに水を流す又は貯留することによって機能する設備におけるバイオフィルム形成の抑制に使用される。上記設備のなかでも、少なくともその一部がバイオフィルムが形成しやすい温度、例えば２０℃以上、好ましくは２５℃以上に達する設備で、本発明のバイオフィルム形成抑制剤が好適に使用される。本発明のバイオフィルム形成抑制剤が適用される設備の好適な例としては、水冷式冷却塔を用いた工場設備やビルの冷却システム、工業用の冷却プール、工業用の給水、貯水もしくは排水経路、流湯式暖房システム、排水処理設備、海水の淡水化プラントで使用される逆浸透膜、製紙工場の配管設備などが挙げられる。
【００１４】
本明細書において、「対象水」とは、本発明のバイオフィルム形成抑制剤が適用される水をいう。好ましくは、「対象水」としては、上述した水を流す又は貯留することによって機能する設備に流れる又は貯留されている水、例えば、水冷式冷却塔を用いた工場設備やビルの冷却システムに用いられる水、工業用の冷却プールの水、工業用の給水、貯水もしくは排水経路内の水、流湯式暖房システムで使用される湯、排水処理設備の排水、海水の淡水化プラントで使用される逆浸透膜を通る水、製紙工場の配管設備内の水、などが挙げられる。本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、上記対象水に対して添加される。
【００１５】
上記のような設備に発生するバイオフィルムには、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等のPseudomonas属、Sphingomonas属、Sphingopyxis属などのグラム陰性微生物が含まれている。さらに、Klebsiella属、Flavobacterium属及びRoseomonas属のグラム陰性微生物が、水冷式冷却塔におけるバイオフィルムに存在する微生物として報告されている（非特許文献１及び２）。
【００１６】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を有効成分として使用する。
【００１７】
本発明で有効成分として使用される上記ヒドロキノン及びｐ−ベンゾキノンとしては、それぞれ下記の式（I）及び式（II）で示される化合物が挙げられる。
【００１８】
【化１】
2017218388.tif 000002
【００１９】
上記式（I）中、Ｒ1は、水酸基、又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に、水素又はメチル基を表す。また上記式（II）中、Ｒ5は、水酸基、又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に、水素又はメチル基を表す。
【００２０】
好ましい実施形態において、Ｒ1は、水酸基、又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ2、Ｒ3及びＲ4はともに水素である。別の好ましい実施形態において、Ｒ1はメチル基であり、Ｒ3が水素であり、かつＲ2及びＲ4は、一方がメチル基で他方が水素であるか、もしくはともにメチル基である。別の好ましい実施形態において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はともにメチル基である。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、Ｒ5は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8はともに水素である。
【００２２】
本発明で有効成分として使用されるキノン化合物は、上記に例示された式（I）及び（II）で示される化合物のうちのいずれか１種であってもよく、又はそれらのいずれか２種以上の組み合わせであってもよい。
【００２３】
本発明で有効成分として使用されるキノン化合物の好ましい例としては、ｐ−トルキノン、２−メチルヒドロキノン、エチルキノール、２−ブチルヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、２，６−ジメチルヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、２，３，５−トリメチルヒドロキノン、テトラメチルヒドロキノン、ヒドロキシヒドロキノン、３，５−ジメチルベンゾキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンが挙げられる。本発明においては、これらのいずれか１種又はいずれか２種以上の組み合わせを使用することができる。
【００２４】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、上記キノン化合物以外の他の成分を含有していてもよい。当該他の成分の例としては、上記キノン化合物の溶媒、本発明のバイオフィルム形成抑制剤が適用される機器や設備の洗浄もしくは劣化防止のための物質、抗菌もしくは殺菌剤などが挙げられる。しかし、当該他の成分の種類やその濃度は、上記キノン化合物のバイオフィルム形成抑制作用を阻害しない限り、特に限定されない。
【００２５】
好ましくは、本発明のバイオフィルム形成抑制剤はキレート剤を含有しない。キレート剤としては、カルボン酸系、リン酸系、又はホスホン酸系のキレート剤等が挙げられる。カルボン酸系キレート剤としては、多価カルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノカルボン酸、ホスホノカルボン酸、及びそれらの塩、等が挙げられる。多価カルボン酸としては、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、マレイン酸等が挙げられる。ヒドロキシカルボン酸としては、クエン酸、リンゴ酸等の脂肪族ヒドロキシカルボン酸等が挙げられる。アミノカルボン酸としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチル−エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、アスパラギン酸二酢酸（ＡＳＤＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）等が挙げられる。ホスホノカルボン酸としては、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸等が挙げられる。リン酸系キレート剤としては、トリポリリン酸及びその塩等が挙げられる。ホスホン酸系キレート剤としては、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）等のヒドロキシホスホン酸、アミノトリメチレンホスホン酸（ＡＴＭＰ）等のアミノホスホン酸、及びそれらの塩等が挙げられる。当該塩としてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アミン塩が挙げられる。
【００２６】
また好ましくは、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は有機溶媒を含有しない。有機溶媒としては、例えば、ＣｌｏｇＰが−３〜４、−３〜３．５、−３〜３、−２．５〜４、−２．５〜３．５、−２．５〜３、−２〜４、−２〜３．５又は−２〜３であるものが挙げられる。ここでＣｌｏｇＰとは、ＥＰＩＷＥＢ４．１（ＵＳ  ＥＰＡ）に従って求められるオクタノール−水−分配係数（ｌｏｇＰ）の計算値を表す。有機溶媒の詳細な例としては、アルコール系有機溶媒又はエーテル系有機溶媒、より詳細には、脂肪族アルコール系有機溶媒、脂肪族エーテル系有機溶媒及びグリコール系有機溶媒が挙げられる。グリコール系有機溶媒の例としては、モノ又はポリアルキレングリコールモノアルキルエーテルが挙げられる。さらに詳細な例としては、エチレングリコールモノ（２−エチルヘキシル）エーテル、１−フェノキシ−２−プロパノール、２−フェノキシエタノール、１−ブトキシ−２−プロパノール、エチレングリコールモノブチルエーテル、２−イソブトキシエタノール、２−（２−ｎ−ブトキシエトキシ）エタノール、プロピレングリコール、２−（２−イソブトキシエトキシ）エタノール）、トリエチレングリコールモノブチルエーテル、ジアセトンアルコール、２−エトキシエタノール）、１−メトキシ−２−ｐ−プロパノール、ジプロピレングリコール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、２−メトキシエタノール、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールモノメチルエーテル）、及びジエチレングリコールモノメチルエーテルが挙げられる。
【００２７】
従来、バイオフィルムは、殺菌剤を用いて、バイオフィルムの原因微生物を殺菌することによって防止されていた。一方、本発明は、後述の実施例に示すとおり、上記のキノン化合物を用いて、バイオフィルムの原因微生物の生育を阻止することによらずにバイオフィルム形成を抑制する点で、殺菌又は抗菌作用によってバイオフィルム形成を抑える従来の方法とは異なる。したがって、本発明のバイオフィルム形成抑制剤の好ましい一側面は、非抗菌性バイオフィルム形成抑制剤である。ここで「非抗菌性バイオフィルム形成抑制」とは抗菌（又は殺菌）作用によらずにバイオフィルム形成を抑制する作用をいう。
【００２８】
したがって、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、バイオフィルム原因微生物に対して抗菌活性を示すことのできない低濃度のキノン化合物を有効成分として使用することができる。好ましい実施形態において、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、対象水中における上記キノン化合物の濃度が２７０ｐｐｍ（質量ｐｐｍ、本明細書において以下同様）以下となる量で使用される。より好ましい実施形態において、上記キノン化合物がｐ−トルキノン、２−メチルヒドロキノン、エチルキノール、２−ブチルヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ヒドロキシヒドロキノン、３，５−ジメチルベンゾキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種である場合、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、対象水中における該キノン化合物の濃度が２７０ｐｐｍ以下、好ましくは２００ｐｐｍ以下となる量で使用される。別のより好ましい実施形態において、上記キノン化合物が２，６−ジメチルヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン及び２，３，５−トリメチルヒドロキノンからなる群より選択される少なくとも１種である場合、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、対象水中における該キノン化合物の濃度が６０ｐｐｍ以下、好ましくは３０ｐｐｍ以下となる量で使用される。
【００２９】
上記キノン化合物がｐ−トルキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは５ｐｐｍ以上、より好ましくは７ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１５ｐｐｍ以上、なお好ましくは２０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２００ｐｐｍ未満、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１４０ｐｐｍ以下、なお好ましくは１００ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、５ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、５〜１５０ｐｐｍ、５〜１４０ｐｐｍ、５〜１００ｐｐｍ、７ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、７〜１５０ｐｐｍ、７〜１４０ｐｐｍ、７〜１００ｐｐｍ、１５ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、１５〜１５０ｐｐｍ、１５〜１４０ｐｐｍ、１５〜１００ｐｐｍ、２０ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、２０〜１５０ｐｐｍ、２０〜１４０ｐｐｍ、又は２０〜１００ｐｐｍである。
【００３０】
上記キノン化合物が２−メチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上、なお好ましくは４０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２００ｐｐｍ未満、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１３０ｐｐｍ以下、なお好ましくは１００ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、１０ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、１０〜１５０ｐｐｍ、１０〜１３０ｐｐｍ、１０〜１００ｐｐｍ、１５ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、１５〜１５０ｐｐｍ、１５〜１３０ｐｐｍ、１５〜１００ｐｐｍ、３０ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、３０〜１５０ｐｐｍ、３０〜１３０ｐｐｍ、３０〜１００ｐｐｍ、４０ｐｐｍ以上２００ｐｐｍ未満、４０〜１３０ｐｐｍ、４０〜１４０ｐｐｍ、又は４０〜１００ｐｐｍである。
【００３１】
上記キノン化合物がエチルキノールの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは７ｐｐｍ以上、より好ましくは２０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１２０ｐｐｍ以下、なお好ましくは８０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、７〜２００ｐｐｍ、７〜１５０ｐｐｍ、７〜１２０ｐｐｍ、７〜８０ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、２０〜１５０ｐｐｍ、２０〜１２０ｐｐｍ、２０〜６７ｐｐｍ、３０〜２００ｐｐｍ、３０〜１５０ｐｐｍ、３０〜１２０ｐｐｍ、又は３０〜８０ｐｐｍである。
【００３２】
上記キノン化合物が２−ブチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは７ｐｐｍ以上、より好ましくは２０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２７０ｐｐｍ以下、より好ましくは２００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１８０ｐｐｍ以下、なお好ましくは１５０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、７〜２７０ｐｐｍ、７〜２００ｐｐｍ、７〜１８０ｐｐｍ、７〜１５０ｐｐｍ、２０〜２７０ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、２０〜１８０ｐｐｍ、２０〜１５０ｐｐｍ、３０〜２７０ｐｐｍ、３０〜２００ｐｐｍ、３０〜１８０ｐｐｍ、又は３０〜１５０ｐｐｍである。
【００３３】
上記キノン化合物がｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは７ｐｐｍ以上、より好ましくは２０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２７０ｐｐｍ以下、より好ましくは２００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１８０ｐｐｍ以下、なお好ましくは１５０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、７〜２７０ｐｐｍ、７〜２００ｐｐｍ、７〜１８０ｐｐｍ、７〜１５０ｐｐｍ、２０〜２７０ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、２０〜１８０ｐｐｍ、２０〜１５０ｐｐｍ、３０〜２７０ｐｐｍ、３０〜２００ｐｐｍ、３０〜１８０ｐｐｍ、又は３０〜１５０ｐｐｍである。
【００３４】
上記キノン化合物が２，６−ジメチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは２ｐｐｍ以上、より好ましくは５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは６０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは３５ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、２〜６０ｐｐｍ、２〜４０ｐｐｍ、２〜３５ｐｐｍ、５〜６０ｐｐｍ、５〜４０ｐｐｍ、５〜３５ｐｐｍ、１０〜６０ｐｐｍ、１０〜４０ｐｐｍ又は１０〜３５ｐｐｍである。
【００３５】
上記キノン化合物が２，３−ジメチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは２０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上、なお好ましくは３５ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは６０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは３５ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、１０〜６０ｐｐｍ、１０〜４０ｐｐｍ、１０〜３５ｐｐｍ、２０〜６０ｐｐｍ、２０〜４０ｐｐｍ、２０〜３５ｐｐｍ、３０〜６０ｐｐｍ、３０〜４０ｐｐｍ、３０〜３５ｐｐｍ、３５〜６０ｐｐｍ又は３５〜４０ｐｐｍである。
【００３６】
上記キノン化合物が２，３，５−トリメチルヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは２ｐｐｍ以上、より好ましくは５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは３０ｐｐｍ以下、より好ましくは２０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、２〜３０ｐｐｍ、２〜２０ｐｐｍ、５〜３０ｐｐｍ、５〜２０ｐｐｍ、１０〜３０ｐｐｍ、又は１０〜２０ｐｐｍである。
【００３７】
上記キノン化合物がヒドロキシヒドロキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは２０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３０ｐｐｍ以上、なお好ましくは３５ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１３０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、１０〜２００ｐｐｍ、１０〜１５０ｐｐｍ、１０〜１３０ｐｐｍ、２０〜２００ｐｐｍ、２０〜１５０ｐｐｍ、２０〜１３０ｐｐｍ、３０〜２００ｐｐｍ、３０〜１５０ｐｐｍ、３０〜１３０ｐｐｍ、３５〜２００ｐｐｍ、３５〜１５０ｐｐｍ又は３５〜１３０ｐｐｍである。
【００３８】
上記キノン化合物が３，５−ジメチルベンゾキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは６ｐｐｍ以上、より好ましくは１５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１８ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは６０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは３５ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、６〜６０ｐｐｍ、６〜４０ｐｐｍ、６〜３５ｐｐｍ、１５〜６０ｐｐｍ、１５〜４０ｐｐｍ、１５〜３５ｐｐｍ、１８〜６０ｐｐｍ、１８〜４０ｐｐｍ又は１８〜３５ｐｐｍである。
【００３９】
上記キノン化合物がｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンの場合、対象水中におけるその濃度は、好ましくは５０ｐｐｍ以上、より好ましくは１５０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１６０ｐｐｍ以上であって、かつ好ましくは２７０ｐｐｍ以下、より好ましくは２００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１８０ｐｐｍ以下であるか、あるいは、好ましくは、５０〜２７０ｐｐｍ、５０〜２００ｐｐｍ、５０〜１８０ｐｐｍ、１５０〜２７０ｐｐｍ、１５０〜２００ｐｐｍ、１５０〜１８０ｐｐｍ、１６０〜２７０ｐｐｍ、１６０〜２００ｐｐｍ又は１６０〜１８０ｐｐｍである。
【００４０】
生物学的な安全性及び経済性を考慮すると、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、対象水中での上記キノン化合物の濃度が、バイオフィルムの主要な原因微生物（例えば緑膿菌）の生育阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）未満となる量で使用されることが好ましい。あるいは、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、対象水中での上記キノン化合物の濃度が、バイオフィルムの主要な原因微生物（例えば緑膿菌）の生育阻害率が２０％以下となる量で使用されることが好ましい。ここで、微生物の生育阻害率とは、バイオフィルム形成抑制剤非添加の対象水中での微生物の生育量を１００％としたときの、バイオフィルム形成抑制剤を添加した対象水中での該微生物の生育量の減少分（％）[１−（剤添加群での微生物の生育量／剤非添加群での微生物の生育量）｝×１００]をいう。微生物の生育量は、例えばＯＤ６００を基準に測定することができる。
【００４１】
本発明に従ってバイオフィルム形成抑制を実施する場合、対象水中に、上記キノン化合物を、該対象水中におけるその濃度が上述した所定の範囲になる量で添加することが好ましい。本発明においては、対象水中における上記キノン化合物の濃度を常時上述した所定の範囲に維持しておく必要はなく、必要なときに、又は定期的に、対象水中における上記キノン化合物の濃度を上述した所定の範囲に調整し、一定時間維持すればよい。バイオフィルム形成抑制効果の観点からは、該対象水中における該キノン化合物の濃度を、上述した所定の範囲に２４時間以上維持することが好ましい。対象水中に添加する該キノン化合物の量や頻度は、対象水の総容量及び入れ換わる容量、対象水を含む機器又は設備の使用頻度、内部温度、汚染状況又はメンテナンスのスケジュール、などにあわせて適宜設定することができる。
【００４２】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途又は方法を包含する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４３】
〔１〕水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を有効成分とする、バイオフィルム形成抑制剤。
【００４４】
〔２〕好ましくは、２７０ｐｐｍ以下の上記キノン化合物を有効成分とする、〔１〕記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【００４５】
〔３〕好ましくは、バイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻止濃度未満の濃度の上記キノン化合物を有効成分とする、〔１〕又は〔２〕記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【００４６】
〔４〕好ましくは、バイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻害率が２０％以下となる濃度の上記キノン化合物を有効成分とする、〔１〕又は〔２〕記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【００４７】
〔５〕好ましくは非抗菌性バイオフィルム形成抑制剤である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【００４８】
〔６〕水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物を対象水中に添加することを含む、バイオフィルム形成抑制方法。
【００４９】
〔７〕好ましくは、上記キノン化合物を上記対象水中に２７０ｐｐｍ以下の濃度で添加することを含む、〔６〕記載の方法。
【００５０】
〔８〕好ましくは、上記キノン化合物が上記対象水中にバイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻止濃度未満の濃度で添加される、〔６〕又は〔７〕記載の方法。
【００５１】
〔９〕好ましくは、上記キノン化合物が上記対象水中にバイオフィルムの主要な原因微生物の生育阻害率が２０％以下となる濃度で添加される、〔６〕又は〔７〕記載の方法。
【００５２】
〔１０〕好ましくは、上記対象水中での上記キノン化合物の濃度が２４時間以上維持される、〔６〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。
【００５３】
〔１１〕好ましくは、非抗菌性にバイオフィルム形成を抑制する、〔６〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
【００５４】
〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ヒドロキノンが式（I）で示される化合物であり、かつ上記ｐ−ベンゾキノンが式（II）で示される化合物である：
【化２】
2017218388.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ5は、それぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を表し、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に水素又はメチル基を表す。）
【００５５】
〔１３〕上記〔１２〕において、好ましくは、上記式（I）中、
Ｒ1が水酸基又は炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ2、Ｒ3及びＲ4がともに水素であるか、
Ｒ1がメチル基であり、Ｒ3が水素であり、かつＲ2及びＲ4は一方がメチル基で他方が水素、もしくはともにメチル基であるか、又は
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がともにメチル基である。
【００５６】
〔１４〕上記〔１２〕において、好ましくは、上記式（II）中、Ｒ5が炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8がともに水素である。
【００５７】
〔１５〕上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項において、好ましくは、上記キノン化合物が、ｐ−トルキノン、２−メチルヒドロキノン、エチルキノール、２−ブチルヒドロキノン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、２，６−ジメチルヒドロキノン、２，３−ジメチルヒドロキノン、２，３，５−トリメチルヒドロキノン、テトラメチルヒドロキノン、ヒドロキシヒドロキノン、３，５−ジメチルベンゾキノン及びｔｅｒｔ−ブチルベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００５８】
〔１６〕上記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項において、上記バイオフィルムは、
好ましくはグラム陰性微生物を含むバイオフィルムであり、
より好ましくは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、Sphingomonas属、Sphingopyxis属、Klebsiella属微生物、Flavobacterium属微生物、及びRoseomonas属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を含むバイオフィルムである。
【００５９】
〔１７〕上記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項において、上記バイオフィルムは、
好ましくは、水を流す又は貯留することによって機能する設備におけるバイオフィルム、又は該設備に流れる又は貯留される水におけるバイオフィルムである。
【００６０】
〔１８〕水酸基又はアルキル基で置換されたヒドロキノン、及び水酸基又はアルキル基で置換されたｐ−ベンゾキノンからなる群より選択される少なくとも１種のキノン化合物の、バイオフィルム形成抑制のための使用。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６２】
試験例１  バイオフィルム形成抑制活性の測定
１）試験菌の調製
緑膿菌ＰＡＯ１株（ＡＴＣＣ  １５６９２）をＬＢ培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  社製）で３７℃、２４時間静置培養した。得られた培養液の濁度（ＯＤ６００）を測定し、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＢＢＬ社製）で希釈して、濁度（ＯＤ６００）が１／１０6の懸濁液を１５ｍＬ調製した。
【００６３】
２）培養
９６ｗｅｌｌマイクロプレート（３５１１７２；日本ベクトンディキンソン社製）の各ｗｅｌｌに、６μＬのＤＭＳＯ（東京化成）と、試験化合物のエタノール溶液１μＬ、３μＬ、又は５μＬを添加した後、室温に５時間放置することによってエタノールを揮発させた。上記１）で調製した緑膿菌の懸濁液を各ｗｅｌｌに１４５μＬ添加して培養を開始した。試験化合物としては、２−メチルヒドロキノン（シグマアルドリッチ）、ｐ−トルキノン（東京化成）、及び参考化合物として次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬社製）を用いた。対照には、エタノール溶媒のみ（ＥｔＯＨ対照）を用いた。エタノール溶液における試験化合物の濃度は、１，０００ｐｐｍ又は１０，０００ｐｐｍであり、培養液中における試験化合物の終濃度は、約７〜３３３ｐｐｍであった。
【００６４】
３）測定
上記９６ｗｅｌｌマイクロプレートを３０℃、２４時間静置培養した後、濁度（ＯＤ６００）を測定して生育状況を確認した。続いて、各ｗｅｌｌを０．１％クリスタルバイオレットで染色した後、生理食塩水で２回洗浄し、２００μＬのエタノールを添加し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定することによってバイオフィルム形成量を求めた。
【００６５】
４）結果
試験菌の生育量（ＯＤ６００）を表１に、バイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）を表２に示す。またこれらの結果を図１に示す。次亜塩素酸ナトリウムは、菌の生育抑制とバイオフィルム形成抑制をパラレルに引き起こしたことから、殺菌の結果としてバイオフィルム形成抑制をもたらしたと推定された。これに対し、２−メチルヒドロキノン及びｐ−トルキノンは、２００ｐｐｍ以上の高濃度域では菌の生育抑制とバイオフィルム形成抑制をパラレルに引き起こしたが、それより低い濃度域では、菌の生育抑制作用と対応しないバイオフィルム形成抑制作用が観察された。したがって、２−メチルヒドロキノン及びｐ−トルキノンが、殺菌又は抗菌によらずにバイオフィルム形成を抑制する作用を有することが示された。
【００６６】
【表１】
2017218388.tif 000004
【００６７】
【表２】
2017218388.tif 000005
【００６８】
試験例２  バイオフィルム形成抑制活性の測定
表３に記載の化合物を、試験例１と同様の手順で試験菌に添加して培養し、生育量（ＯＤ６００）及びバイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）を測定した。化合物ａ、ｂ、ｃ、ｆ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋについては、２０ｍＭエタノール溶液を調製し、化合物ｄ、ｅ、ｇについては、５ｍＭエタノール溶液を調製し各々、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１〜８μＬ加えて評価した。各化合物の終濃度を表３に記載する。
【００６９】
【表３】
2017218388.tif 000006
【００７０】
測定したＯＤ６００をもとに、下記式に従って対照（エタノールのみ）に対する生育阻害率を計算した。またＯＤ５７０をもとに、下記式に従って対照（エタノールのみ）に対するびバイオフィルム（ＢＦ）抑制率を計算した：
生育阻害（％）＝｛１−（化合物添加群ＯＤ６００／対照群ＯＤ６００）｝×１００
ＢＦ抑制（％）＝｛１−（化合物添加群ＯＤ５７０／対照群ＯＤ５７０）｝×１００
生育量（ＯＤ６００）及びバイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）を図２に、生育阻害（％）及びＢＦ抑制（％）を表４に示す。表４においては、生育阻害率又はＢＦ抑制率が０以下の場合は阻害なしと表している。表３記載の化合物は、特に低い濃度域で、菌の生育阻害率よりも明らかに高いＢＦ抑制率を示す傾向があった。また表３記載の化合物は、菌の生育阻害率が２０％以下となるような抗菌効果のない濃度でもバイオフィルム形成抑制作用を示した。したがって、表３記載の化合物が、殺菌又は抗菌によらずにバイオフィルム形成を抑制する作用（すなわち、非抗菌性バイオフィルム形成抑制作用）を有することが示された。
【００７１】
【表４】
2017218388.tif 000007
【００７２】
試験例２  水系システムモデルを用いたバイオフィルム形成抑制活性の評価
１００ｍＬ容量の培養槽を有するアニュラーリアクター（アート科学社製）を用いた水系システムモデルにより、ｐ−トルキノン（東京化成）のバイオフィルム形成抑制活性を評価した。アニュラーリアクターの培養槽には、毎分１６０回転の速度で回転する円筒形の回転体が設置され、この回転体に予め取り付けた１２枚のテストピースを経時的に取り出してそこに形成されたバイオフィルムを定量した。建物屋上に設置された、実際に使用中の水冷式冷却塔から採取した冷却水を、毎分１０ｍＬの流速でアニュラーリアクター培養槽（３０℃に維持）に供給しながら、別途、ｐ−トルキノンのエタノール溶液（１５ｇ／Ｌ）を、シリンジポンプＹＳＰ−２０１（ＹＭＣ社製）を使って毎分１０μＬの流速で該アニュラーリアクター培養槽に供給した（培養槽内冷却水中におけるｐ−トルキノン濃度は１５ｐｐｍ）。培養槽から経時的に取り出したテストピース（ｎ＝２）を０．１％クリスタルバイオレットで染色し、生理食塩水で２回洗浄した後、１５ｍＬのエタノールに回収し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定することによってバイオフィルム形成量を求めた。テストピースの取得と同時に、リアクターの入口と出口から水をサンプリング（ｎ＝２）してＲ２Ａ寒天（日本製薬）に塗沫し、３０℃、７日間培養した後、菌数を測定した。溶媒コントロールとして、エタノールのみを添加した系で同様の実験を行った。
【００７３】
結果を図３に示す。リアクター入口及び出口の菌数は、溶媒コントロール系（図３（ａ））及びｐ−トルキノン添加系（図３（ｂ））ともに１０４個／ｍＬ近辺を維持しており、ｐ−トルキノンが菌数を減少させなかったことが示された。一方で、バイオフィルム形成量（ＯＤ５７０）は、溶媒コントロール系では最終的に０．７を超えたのに対し、ｐ−トルキノン添加系では０．２以下に抑えられていた。これらの結果より、ｐ−トルキノンが、水中の菌数を減少させることなく、バイオフィルム形成を抑制したことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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