(57)【要約】      （修正有）【課題】ベツリンよりも高い水溶性と抗腫瘍効果を有するベツリン誘導体。【解決手段】式(1)で示されるベツリン誘導体及び／又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。2017081915.tif 000006[n1及びn2は各々独立に1又は2]【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)で示されるベツリン誘導体及び／又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【化１】
2017081915.tif 000005
(式中、n1及びn2は、独立に1又は2である。)
【請求項２】
n1及びn2が1である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
n1及びn2が2である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記一般式(1)で示されるベツリン誘導体及び／又はその薬学的に許容される塩が溶媒和物である請求項１〜３のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記腫瘍が皮膚がんである請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの局所では、がん細胞から分泌される様々な免疫抑制因子（TGF-β、PGE2等）が複雑に絡み合い免疫抑制環境が形成されている。近年、このことが、がん治療、とりわけ、がん免疫療法の治療効果を低下させる要因となっていることが分かってきた。そのため、治療効果の向上には免疫抑制因子の作用を効果的に阻止する薬剤が必要とされている。本研究では上記課題を解決するため、「免疫抑制因子」の働きを解除(阻止)する物質の探索研究に着手した。
【０００３】
免疫抑制に対する解除作用を示す化合物を見出すため、本発明者らは先にTGF-βあるはPGE2により抑制されたマウスNK細胞のがん細胞傷害活性を指標に約800種の天然物をスクリーニングした。その結果、白樺成分のベツリンに目的とする有効性を見出した。ベツリンは既知化合物であったが、免疫抑制解除作用については報告がなされておらず、新しい作用機序に基づくがん治療薬になる可能性があると考え特許を出願した（平成26年5月30日 特許登録、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５５４８８７４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、ベツリンは水に非常に溶けにくい性質であるため、マウス体内では消化管からの吸収や血液への移行性が極めて低く、その血中濃度が有効域に到達しないことが懸念された。実際、LC/MS/MSを用いた分析から、経口投与されたベツリンは消化管からほとんど吸収されないこと、静脈内に投与しても血液中にはほとんど検出されないこと、さらに、がん移植マウスモデルでの抗腫瘍効果は50%程度しか認められないこと等を明らかにしてきた。このため、動物実験においてより高い有効性を得るには、水に溶けやすく血液移行性が良好な誘導体を開発する必要があった。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、ベツリンよりも高い水溶性と抗腫瘍効果を有するベツリン誘導体を見出し、優れた抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべくベツリン誘導体82種を合成し、主要な誘導体53種についてがん移植マウスモデルを用いて有効性を比較検討した。より具体的には、ベツリンよりも水溶性を向上させた各種のベツリン誘導体を合成し、がん移植マウスモデルにおけるがん抑制効果、及び、試験管内でのがん細胞に対する細胞毒性を比較評価した。その結果、ベツリンの３位及び28位にコハク酸を付加した誘導体（BD-17）及びマロン酸を付加した誘導体（TPU-29）に顕著な抑制作用を認め、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ベツリンよりも高い水溶性と抗腫瘍効果を有するベツリン誘導体を有効成分とする優れた抗腫瘍剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ベツリン及びベツリン誘導体(BD-17)の抗腫瘍効果を示す。
【図２】癌細胞の増殖能に与えるベツリンあるいはベツリン誘導体(BD-17)の影響を示す。
【図３】Scidマウスにおけるベツリン誘導体(BD-17)の抗腫瘍効果を示す。
【図４】コントロール及びベツリン誘導体(TPU-29)の抗腫瘍効果を示す。
【図５】癌細胞の増殖能に与えるベツリン誘導体(TPU-29)の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、下記一般式(1)で示されるベツリン誘導体及び／又はその薬学的に許容である塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤に関する。
【００１１】
【化１】
2017081915.tif 000002
(式中、n1及びn2は、独立に1又は2である。)
【００１２】
本発明者らは、ベツリンの３位及び28位の一方又は両方に、アミノ酸(グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、チロシン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸)、有機酸(安息香酸)、あいはその他の官能基を付加した89種の誘導体を合成し、がん細胞を用いて試験管内における細胞毒性をベツリンと比較検討した。その結果、上記一般式(1)中のn1及びn2が2である化合物BD-17及び一般式(1)中のn1及びn2が1である化合物TPU-29、が、水溶性に優れ、かつ特異的に、顕著ながん抑制効果を示し、ベツリンよりも細胞毒性が大幅に低下していることが分かった。さらに、これらの化合物BD-17及びTPU-29のがん抑制効果への免疫系の関与について検討したところ、獲得免疫系が大きく寄与していることが明らかになり、化合物BD-17及びTPU-29のがん抑制効果が、獲得免疫系が関与する効果であることも明らかになった。
【００１３】
一般式(1)中のn1及びn2が2である化合物BD-17、下記式中にはベツリンの主骨格の3位及び28位を示す。
【化２】
2017081915.tif 000003
【００１４】
一般式(1)中のn1及びn2が1である化合物TPU-29
【化３】
2017081915.tif 000004
化合物BD-17及びTPU-29の合成方法は、実施例1及び2に記載する。
【００１５】
本発明は、一般式(1)中のn1が1、n2が2である化合物及び一般式(1)中のn1が2、n2が1である化合物も包含する。ベツリンを適切な反応条件下でエステル化剤と反応させ28位をエステル化したのち、カルボン酸部位を保護し、さらにエステル化剤と反応させたのち、脱保護を行うことで合成できる。これらの化合物は、実施例1及び2に記載の方法を参照して適宜合成できる。
【００１６】
本明細書において、薬学的に許容できる塩としては、塩基性塩が挙げられる。塩基性塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、アンモニウム塩、脂肪族アミン塩、アラルキルアミン塩、ヘテロ環芳香族アミン塩、第４級アンモニウム塩、塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。具体的には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、鉄塩、アンモニウム塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、エチレンジアミン塩、メグルミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩等が用いられる。
【００１７】
また、一般式(1)で示される化合物及びその薬学的に許容できる塩は、溶媒和物を含むことができ、溶媒和物とは、任意の数の有機溶媒分子を配位する有機溶媒和物及び任意の数の水分子を配位する水和物を包含する。本明細書における「溶媒和物」としては、例えば、前記一般式(1)で示される化合物又はその薬学的に許容できる塩の溶媒和物を意味し、例えば、１有機溶媒和物、２有機溶媒和物、１水和物、２水和物、２．５水和物、７水和物等が挙げられる。なお、薬学的に許容できる塩、及びそれらの溶媒和物は、公知の方法に従って合成することができる。
【００１８】
本発明の抗腫瘍剤は、一般式(1)のベツリン誘導体等に加えて薬学的に許容可能なキャリアを含有することができる。本発明の抗腫瘍剤に使用され得る薬学的に許容可能なキャリアとして、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の抗腫瘍剤は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内にまたはインプラントされたリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。
【００２０】
本発明の抗腫瘍剤は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的な許容可能な剤形で経口的に投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとして、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態の経口投与のための有用な希釈剤として、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、所定の甘味、風味付け、または着色剤もまた添加することができる。
【００２１】
あるいは、本発明の抗腫瘍剤は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することもできる。これらは、薬剤と、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料として、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００２２】
本発明の抗腫瘍剤は、特に、処置の標的が眼、皮膚、もしくは下部腸管の疾患を含む局所投与によって容易にアクセス可能な領域または器官を含む場合、局所的に投与することができる。適切な局所処方は、これらの領域または器官のそれぞれについて容易に調製される。
【００２３】
下部腸管のための局所適用は、直腸用坐剤処方（上記を参照のこと）または適切な浣腸処方で行うことができる。局所用経皮パッチも使用することができる。
【００２４】
局所適用のために、組成物は、１つもしくはそれ以上のキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含有する適切な軟膏において処方してもよい。本発明の一般式(1)のベツリン誘導体等の局所投与のためのキャリアとして、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、１つもしくはそれ以上の薬学的に許容されたキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含有する適切なローションまたはクリームにおいて処方することができる。適切なキャリアとして、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベイト６０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ６０）、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
眼科用途のために、組成物を、等張性、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微粉化懸濁液、または好ましくは、等張性、ｐＨ調整した食塩水中の溶液として、塩化ベンザルコニウムのような保存剤を伴うもしくは伴わずに、処方してもよい。あるいは、眼科用途として、組成物を、ワセリン（ｐｅｔｒｏｐａｔｕｍ）のような軟膏において処方してもよい。
【００２６】
本発明の抗腫瘍剤はまた、経鼻エアゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、薬学的処方の分野に周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いる食塩水中の溶液として調製してもよい。
【００２７】
本発明の抗腫瘍剤についての投与レジメン（即ち、処方および／または用量および／または投与プロトコル）は適宜選択できる。例えば、本発明の抗腫瘍剤の投与のためのスケジュールおよび用量は、患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度、投与経路などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定されるが、例えば、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用のバイアルのいずれかにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生成物は、等張化剤、ｐＨ調整剤、および可溶化剤として、一般的に用いられるものであれば制限はないが、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびポリソルベイト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０を用いて、注射用滅菌水により静脈内投与のために処方される。ｐＨは３〜８に調整される。本発明の抗腫瘍剤における一般式(1)のベツリン誘導体のための例示的に適切な用量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ2〜５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは約２０ｍｇ／ｍ2〜３００ｍｇ／ｍ2であり得る。これを１日１回または数回に分けて投与する。しかし、これらのスケジュールは例示的であること、至適スケジュールおよびレジメンは、臨床治験において決定されなければならない。２４時間、４８時間、７２時間または１週間もしくは１箇月間、ＮＫ細胞、T細胞、またはその他免疫治療薬の薬効発現に関わるあらゆる免疫細胞を飽和する本発明の抗腫瘍剤における一般式(1)のベツリン誘導体の注入の量およびスケジュールは、適宜決定される。それ故、前記の好適な用量範囲、処方およびスケジュールはいかなる意味でも本発明を限定する意図を示すものではない。
【００２８】
例えば、多くの治療剤が癌の処置のために利用可能である。本発明の抗腫瘍剤および方法は、特定の疾患、特定の腫瘍、癌疾患、または患者が示す他の疾患もしくは他の障害の処置において一般に用いられる他の任意の方法と併用してもよい。特定の治療アプローチが、患者の状態自体に有害であることが知られておらず、本発明の薬学的組成物における一般式(1)のベツリン誘導体の活性を有意に妨げない限り、本発明との併用が考慮される。
【００２９】
固形腫瘍の処置に関連して、本発明の抗腫瘍剤は、手術、放射線療法、化学療法などのような古典的なアプローチと組み合わせて使用してもよい。従って、本発明は、本発明の薬学的組成物が手術または放射性処置と同時、前、または後に使用されるか；あるいは従来の化学療法、放射線治療剤もしくは抗血管新生剤または標的化された免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と共に、前または後に患者に投与される併用療法を提供する。
【００３０】
１つもしくはそれ以上の薬剤を、治療レジメンにおいて本発明の抗腫瘍剤と組み合わせて使用する場合、組み合わされた結果が、それぞれの処置を個別に行う場合に観察される効果の相加を求める要件は存在しない。少なくとも相加的効果は一般に所望されるが、単回治療のうちの１つを超える増加した抗癌効果は、有益であり得る。また、併用処置が相乗効果を示すことを求める特定の要件は存在しないが、このことは間違いなく可能であり、有利である。
【００３１】
併用抗癌治療を実践するためには、患者に本発明の抗腫瘍剤を、患者内において併用抗癌作用が生じる有効な様式で、別の抗癌剤と併用して、簡単に投与する。従って、薬剤は、腫瘍の脈管構造内においてそれらが組み合わされた形で存在し、腫瘍環境においてそれらが組み合わされて作用するのに有効な量ならびに有効な期間、提供される。この目的を達成するために、本発明の抗癌剤は、単一の組み合わされた組成物、または異なる投与経路を使用する２つの異なる組成物としてのいずれか一方で、患者に同時に投与することができる。
【００３２】
手術について、任意の外科的介入は、本発明の抗腫瘍剤と組み合わせて実践することができる。放射線療法に関して、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波および電子放射などのように、癌細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発する任意の機構が考慮される。放射性同位元素の癌細胞への指令された送達もまた考慮され、これは、標的化抗体または他の標的化手段とあわせて使用され得る。
【００３３】
がんの治療は、これまで手術、放射線療法、抗癌剤療法の三大療法を中心になされてきた。とくに、高用量の抗癌剤を用いてがん細胞を殺すことのみに主眼を置いた治療法は、効果が期待される一方で、重篤な副作用を伴い患者の生活の質（QOL）を大きく低下させることからしばしば問題視されてきた。
【００３４】
この点において、本研究において見出した一般式(1)のベツリン誘導体は、がん移植マウスモデルにおいて免疫系を介して顕著な有効性を示すとともに、細胞毒性をほとんど示さないことから副作用の大幅な軽減が期待できる。
【００３５】
より具体的には、BD-17及びTPU-29の抗腫瘍効果に獲得免疫系が関与していることを考えると、獲得免疫系が薬効に関与するがん治療剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤（PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、B7-H5、TIGITなどの免疫抑制性分子の作用を阻害する抗体医薬や低分子化合物）、免疫抑制因子阻害剤（TGF-β、プロスタグランジンE2、VEGF、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ-1などによる免疫抑制作用を阻害する抗体医薬や低分子化合物）、抗CCR4抗体などの制御性T細胞を除去する薬剤、抗CD137抗体や抗OX40抗体などの抗腫瘍免疫を活性化する薬剤、癌ワクチン、癌抗原特異的T細胞移入療法、等の抗腫瘍効果を、BD-17及びTPU-29などの一般式(1)のベツリン誘導体は相乗的に増強することが期待できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００３７】
実施例１
〈実験方法〉
ベツリン誘導体（BD-17）の合成
融点(m.p.)は、柳本融点測定器を用いて測定し、数値は未補正である。比旋光度([α])は、ナトリウムD線を用い、Atago製で測定した。1H及び13C NMRスペクトルは、Bruker Biospin製AVANCE II 400を用いて測定した。化学シフト値(ppm)は、tetramethylsilaneまたは測定溶媒の残留プロトンを内標準とし、スピン結合定数はJ値(Hz)で示した。IRスペクトル(ATR-IR)は、PerkinElmer製Spectrum 100を用いて測定した。LRMS及びHRMSは、Burker Dartonics製micrOTOF focusを用いて測定した。全ての反応は、Merck製silica gel 60F254を用いてモニタリングした。カラムクロマトグラフィーは、関東化学製silica gel 60N(63-210 mm)を用いた。
【００３８】
〈3,28-bis[(3-carboxypropanoyl)oxy]betulin (BD-17)>
ベツリン(1, 0.50 g, 1.13 mmol)とDMAP(19.5 mg, 0.16 mmol)をピリジン(20 mL)に溶解し、この溶液にコハク酸無水物(1.13 g, 11.3 mmol)を加え、無水条件下、85℃（オイルバス）で24時間攪拌した。TLCにてベツリンの消失を確認したのち、氷冷し、水(250 mL)を加えた。10% 塩酸を用いて溶液を酸性にしたのち、ベンゼンで抽出した。全有機層を水、5% 塩酸、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。乾燥剤をろ過により除き、ろ液を減圧下にて留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(10% MeOH in CHCl3)で精製し、目的の化合物(BD-17)を639 mg(88%)で淡橙色結晶として得た。得られた化合物の機器スペクトルは文献記載値とよい一致を示した。
【００３９】
Rf = 0.33 (10% MeOH in CHCl3). M.p. = 110-112℃ (EtOAc). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 0.62-1.80 (44H, m), 1.90 (1H, m), 2.37 (1H, dt, J = 10.8 and 10.0 Hz), 2.57-2.70 (7H, m), 3.84 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.27 (1H, d, J = 10.4 Hz), 4.46 (1H, dd, J = 16.4 and 9.2 Hz), 4.56 (1H, s), 4.66 (1H, d, J = 1.6 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 12.6, 15.0, 16.2, 16.4, 16.7, 18.4, 19.3, 21.0, 23.2, 23.8, 25.4, 27.2, 28.1, 29.3, 29.6, 29.8, 29.9, 34.3, 34.6, 37.3, 37.8, 38.0, 38.6, 41.1, 42.9, 46.6, 47.9, 49.0, 50.5, 55.6, 63.4, 81.8, 110.1, 150.3, 172.0, 172.6, 178.2. ATR-IR ν (cm-1) = 2942, 2872, 1730, 1709, 1642, 1452, 1390, 1363, 1235, 1159, 1106, 1043, 1007, 975, 915, 882, 843, 802, 748. LRMS (ESI+)m/z 665 ([M+Na]+, 31). HRMS (ESI+)m/z calcd for C38H58O8Na 665.4024; found 665.4052.
【００４０】
実施例２
〈実験方法〉
ベツリン誘導体（TPU-29）の合成
ベツリン(100 mg, 0.226 mmol) をトルエン(0.23ml)に溶解し、0℃でメルドラム酸(98 mg, 0.678 mmol)を加え、113℃で１時間撹拌した。TLCにて原料スポットの消失を確認した後、反応液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5% MeOH in CHCl3)で精製すると、TPU-29(134 mg, 95%)が黄白色の固体として得られた。
活性試験に供するため、黄白色固体をエタノールに溶解し、0℃にて水を少量ずつ加えると粉末状結晶が析出した。これらを吸引ろ過により集めると、精TPU-29(86 mg, 64%)が白色粉末状結晶として得られた。
【００４１】
Rf : 0.32 (EtOAc : Hex = 3 : 1 dropped TFA). Mp: 134-136℃(EtOH-H2O). [α]D26: +11.4 (c 0.88, CHCl3). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ =0.76-1.86 (m, 25H), 0.83 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.91-2.02 (m, 1H), 2.43 (td, J = 10.8 and 5.9 Hz, 1H), 3.41-3.50 (m, 4H), 3.94 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.52-4.62 (m, 1H), 4.56 (s, 1H), 4.69 (s, 1H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ = 15.0, 16.2, 16.3, 16.6, 18.3, 19.3, 21.0, 23.7, 25.3, 27.2, 28.1, 29.69, 29.74, 34.3, 34.6, 37.3, 37.9, 38.1, 38.5, 40.9, 41.1, 42.9, 46.7, 47.9, 49.0, 50.5, 55.6, 64.7, 83.4, 110.2, 150.1, 167.3, 167.8, 170.7, 170.8. IR (neat, cm-1) ν = 2943, 2872, 1980, 1715, 1643, 1454, 1391, 1375, 1350, 1321, 1194, 1147, 1006, 982, 881, 797, 745, 661. LRMS (ESI-): m/z = 613 ([M-H]-). HRMS (ESI-): m/z calcd for C36H53O8 613.3746; found 613.3722.
【００４２】
実施例３
がん移植マウスモデルを用いた評価
マウス悪性黒色腫細胞(B16F10)を2×105個/0.05mlPBSに調製し、C57BL/6マウス(8週令、雌、8-10匹/群)あるいはC.B-17 Icr scid/scidマウス(7-9週令、雌、10匹/群)に1匹当たり0.05mlずつ下腹部皮下に接種した。化合物はがん接種後2日目から16日目（実験終了日前日）まで1日1回、腫瘍内に投与した。対照群には溶媒(0.1% Tween 80を含む生理緩衝食塩水)を同様に投与した(50μl/マウス)。腫瘍径は2日あるいは3日ごとに測定し、見かけの腫瘍体積は、長径×短径×短径/2で算出した。
【００４３】
細胞毒性の評価
10%FBSを含むDMEM培地(GIBCO)でB16F10細胞を4×104個/mlに調製し、96ウェルプレート(Corning)に各ウェル当たり4×103個を播種した。細胞がプレートに接着後、化合物を各濃度で添加し、インキュベーター内(37℃，5%CO2)で48時間培養した。コントロールにはジメチルスルホキシドを同様に添加した。培養終了後、各ウェルの培地を、WST-1(Wako)を5%含む10%FBS‐DMEM培地に交換し、さらに4時間培養した後、波長450 nmにおける吸光度を測定した。
【００４４】
〈結果〉
マウスB16F10悪性黒色腫細胞の皮下移植モデルを用いて、ベツリン及びベツリン誘導体の抗腫瘍効果を検討した(図1(BD-17)及び図4(TPU-29))。17日目における抑制率は、ベツリン45nmolあるいは150nmol投与群ではそれぞれ31.5%あるいは47.7%であった。一方、BD-17投与群では97.2%であり、TPU-29投与群では91.6%であり、いずれもベツリン投与群よりも明らかに強い抗腫瘍効果が認められた。
【００４５】
次に、BD-17の抗腫瘍効果に細胞毒性が関与しているかを明らかにするために、マウスB16F10悪性黒色腫細胞の増殖能に対する影響を試験管内においてベツリンと比較検討した。その結果、ベツリンは濃度に依存して細胞増殖を阻害したが、BD-17及びTPU-29はほとんど影響を与えなかった(図2(BD-17)及び図5(TPU-29))。このことから、BD-17及びTPU-29の抗腫瘍効果は、がん細胞に対する直接的な細胞毒性とは異なることが示唆された。
【００４６】
そこで、BD-17の抗腫瘍効果に免疫系が関与しているかを明らかにするため、T細胞及びB細胞を欠損するscidマウスを用いて、BD-17の抗腫瘍効果を検討した。図1で示した野生型マウスでの場合と同様に、マウスB16F10悪性黒色腫細胞を皮下移植しBD-17を投与したところ、17日目における抑制率は30.9%であり、図1で示した野生型マウスでの結果に比べて明らかに抑制効果が減弱した(図3)。このことから、BD-17の抗腫瘍効果には獲得免疫系が大きく寄与していることが明らかとなった。これらのことから、BD-17は主に獲得免疫系を介して抗腫瘍効果を発揮しており、その副作用は極めて少ないことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は抗腫瘍薬剤の分野に有用である。
【図１】
2017081915.tif 000007
【図２】
2017081915.tif 000008
【図３】
2017081915.tif 000009
【図４】
2017081915.tif 000010
【図５】
2017081915.tif 000011