(57)【要約】【課題】本発明の課題は、澱粉や澱粉分解物を含む原料から製造されるα−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質に関して、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物を提供することである。【解決手段】本発明によって、α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物が提供される。本発明に係る糖組成物は、（ａ）糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合と糖組成物をデキストラナーゼ処理した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合との差分が１０〜３０％であり、（ｂ）糖組成物を構成するグルコースのうち、α−１，６結合を有するグルコースの割合が３５〜８０％である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物であって、
（ａ）  糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合と糖組成物をデキストラナーゼ処理した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合との差分が１０〜３０％であり、
（ｂ）  糖組成物に含まれるグルコース間の結合様式のうち、α−１，６結合の割合が３５〜８０％である、上記糖組成物。
【請求項２】
糖組成物のＤＥが１５〜７５である、請求項１に記載の糖組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の糖組成物を含む、飲食品用改良剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の糖組成物を飲食品に添加することを含む、飲食品の改良方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の糖組成物を製造する方法であって、
澱粉分解物を基質として、ＧＨファミリー３１に属する酵素を５０℃以上で作用させることを含む、上記方法。
【請求項６】
前記酵素のデキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率が０．０６以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、アスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、アスペルギルス属フラビ節由来のα−グルコシダーゼである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、アスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）由来又はアスペルギルス ソヤ（Aspergillus sojae）由来のα−グルコシダーゼである、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
基質である澱粉分解物のＤＥが５〜６０である、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の糖組成物の還元物。
【請求項１２】
請求項１１の還元物を含む飲食品用改良剤。
【請求項１３】
請求項１１に記載の還元物を飲食品に添加することを含む、飲食品の改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖組成物及びその製造方法、その還元物、当該糖組成物を含む食品の改良剤に関する。特に本発明に係る糖組成物は、α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含むものであって、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含んでおり、食品用途に好適である。
【背景技術】
【０００２】
澱粉は、α−１，４結合によってグルコースが直鎖状に結合したアミロースと、α−１，４結合が連なった直鎖の途中でα−１，６結合により分岐した構造を有するアミロペクチンとの混合物である。また、澱粉や澱粉分解物は広く飲食品に使用されており、澱粉や澱粉分解物に転移酵素を作用させて結合様式を変換した各種糖質も開発されている。
【０００３】
α−１，６結合を有する糖質としては、主に基質よりも重合度が１つ大きい糖質を生成するアスペルギルス ニジュール（Aspergillus niger）由来のα−グルコシダーゼを澱粉加水分解物に作用させて得られるもの（特許文献１、２、３）や、発酵生産及び加水分解を組合せて製造されるデキストランが知られている。デキストランは、アミロースや澱粉の分解物にデキストリンデキストラナーゼを作用させること（特許文献４、５、６、７）や、少なくとも２つのα−１→４結合Ｄ−グルコース単位をその非還元末端に含む多糖基質及び／又はオリゴ糖基質にα−グルカノトランスフェラーゼを作用させること（特許文献８）、α−グルコシド結合を有するオリゴ糖、α−グルカン及びその分解物にデキストラングルカナーゼを作用させること（特許文献９）によっても得られることが知られている。
【０００４】
α−１，６結合を有する糖質は、加工食品の品質改良効果があることが知られている。低分子を主成分とする糖組成物では、畜肉及び／又は魚肉を主体とするタンパク質系食品に添加することで肉が持つジューシーでソフトな食感を強める効果（特許文献１０）、野菜加工飲食物、卵加工飲食物に添加すると冷凍耐性が向上し保形性や離水性を保持する効果（特許文献１１）が知られている。また、高分子を主成分とする糖組成物では、パンやクッキーなどに配合することでふんわりとした食感やしっとりした食感になる効果（特許文献２）、揚げ物用バッターに配合することで油ちょう後の揚げ物が軽い食感になる効果（特許文献１２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１４８７２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／０３２５１０
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００９／１１３６５２
【特許文献４】特開平４−２９３４９３号公報
【特許文献５】特開平５−２３６９８２号公報
【特許文献６】特開２００１−２５８５８９号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００６／０５４４７４
【特許文献８】特表２０１２−５２５８４０号公報
【特許文献９】特開２０１２−０９５６０６号公報
【特許文献１０】特開２０００−２１７５１８号公報
【特許文献１１】特開２００６−２８０３０９号公報
【特許文献１２】特開２０１２−０８５５７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した通り、α−１，６結合を有する糖質の製造方法や機能は知られているが、アスペルギルス ニジュール由来のα−グルコシダーゼを利用して製造されるα−１，６結合を有する低分子成分を主成分とする糖組成物は、単糖類〜三糖類が主成分であり四糖類以上の成分は少ない（「食品と容器」第５２巻  第２号  ７２ページ〜  ２０１１年）。α−１，６結合を有する四糖類以上の成分を主成分とする糖組成物は、アスペルギルス ニジュール由来のα−グルコシダーゼを高分子の澱粉分解物に作用することで調製可能であるが、α−１，６結合の含有量は高くなく、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分はほとんど含まれない。また、デキストランは、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を主成分とするが、発酵生産は製造工程が複雑でコストが高く、食品分野への利用は進んでいない。デキストランを澱粉から酵素を利用して製造する技術的な知見もあるが、その場合、酵素の耐熱性が４０℃以下のため、低温で反応を行う必要があり、雑菌汚染の観点から衛生面や効率面で課題があるため、実用化されてはいない。
【０００７】
このように、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物について、その利用は進んでいない。
【０００８】
本発明の課題は、澱粉や澱粉分解物を含む原料から製造されるα−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物に関して、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物を提供することである。また、本発明は、このような糖組成物の製造方法を提供することもその課題とする。
【０００９】
さらに本発明は、前記糖組成物の還元物、前記糖組成物を含む飲食品の製造方法、並びに前記糖組成物を含む飲食品の改良剤を提供することもその課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物として、発酵生産及び加水分解を組み合わせて製造されるデキストランが知られている。しかし、デキストランは、上述した通り、製造工程が複雑でコストが高く、食品分野において広く利用されるには至っていない。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の検討を進めたところ、α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物であって、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物を安定して製造する技術を確立することに成功した。
【００１２】
本発明は、これに限定されるものではないが、以下の態様を包含する。
（１）  α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物であって、（ａ）糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合と糖組成物をデキストラナーゼ処理した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合との差分が１０〜３０％であり、（ｂ）糖組成物に含まれるグルコース間の結合様式のうち、α−１，６結合の割合が３５〜８０％である、上記糖組成物。
（２）  糖組成物のＤＥが１５〜７５である、（１）に記載の糖組成物。
（３）  （１）又は（２）に記載の糖組成物を含む、飲食品用改良剤。
（４）  （１）又は（２）に記載の糖組成物を飲食品に添加することを含む、飲食品の改良方法。
（５）  （１）又は（２）に記載の糖組成物を製造する方法であって、
澱粉分解物を基質として、ＧＨファミリー３１に属する酵素を５０℃以上で作用させることを含む、上記方法。
（６）  前記酵素のデキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率が０．０６以上である、（５）に記載の方法。
（７）  前記酵素が、アスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼである、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）  前記酵素が、アスペルギルス属フラビ節由来のα−グルコシダーゼである、（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  前記酵素が、アスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）由来又はアスペルギルス ソヤ（Aspergillus sojae）由来のα−グルコシダーゼである、（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  基質である澱粉分解物のＤＥが５〜６０である、（５）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  （１）又は（２）に記載の糖組成物の還元物。
（１２）  （１１）の還元物を含む飲食品用改良剤。
（１３）  （１１）に記載の還元物を飲食品に添加することを含む、飲食品の改良方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含む糖組成物であって、α−１，６結合を比較的多く含み、かつ、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む、食品用途に好適な糖組成物を、澱粉や澱粉分解物を含む原料から製造することができる。
【００１４】
また、本発明に係る糖組成物は、澱粉老化抑制、タンパク質変性抑制、油脂酸化抑制といった効果を奏するものであり、当該糖組成物の還元物も同様の効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実験３（１）で用いたベクターの設計図である。
【図２】図２は、実験３（１）の電気泳動の分析結果である（左：Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、右：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。
【図３】図３は、実験３（２）に係る酵素のマルトース分解活性に対する温度の影響を示すものである。
【図４】図４は、実験３（２）に係る酵素のマルトース分解活性に対するｐＨの影響を示すものである。
【図５】図５は、実験３（２）に係る酵素のマルトース分解活性に対する温度の影響を示す結果である。
【図６】図６は、実験３（２）に係る酵素のマルトース分解活性に対するｐＨの影響を示す結果である。
【図７】図７は、実験９（３）においてサンプルＡの分析に用いた1Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【図８】図８は、実験１０（１）の処理条件を示すものである。
【図９Ａ】図９Ａは、実験１０（１）の結果を示すものである（ＤＥ５０以上）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実験１０（１）の結果を示すものである（ＤＥ３０〜５０）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実験１０（１）の結果を示すものである（ＤＥ２０〜３０）。
【図１０】図１０は、実験１０（２）の結果を示すものである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実験１０（３）の結果を示すものである（ＤＥ５０以上）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実験１０（３）の結果を示すものである（ＤＥ３０〜５０）。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、実験１０（３）の結果を示すものである（ＤＥ２０〜３０）。
【図１２】図１２は、実験１０（４）の結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
糖組成物
本発明に係る糖組成物は、α−１，６結合によって連続して結合したグルコースを含んで構成される糖質を含むものである。本発明に係る糖組成物は、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含み、かつ、α−１，６結合を比較的多く含む。具体的には、（ａ）糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合（Ａ）と糖組成物をデキストラナーゼ処理した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合（Ｂ）との差分（Ｙ＝Ａ−Ｂ）が１０〜３０％であり、（ｂ）糖組成物に含まれるグルコース間の結合様式のうち、α−１，６結合の割合が３５〜８０％である。
【００１７】
本発明に係る糖組成物は、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含むが、この点は、上記（ａ）によって定義される。すなわち、糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合から、糖組成物をデキストラナーゼ処理によって消化した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合を差し引いた差分が１０〜３０％である。デキストラナーゼは、ケトミウム（Chaetomium）属の細菌などの培養液から精製することができる酵素であり、グルコースがα−１，６結合した多糖デキストランに作用してグルコースや少糖類のイソマルトオリゴ糖を生成する。そのため、糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合から、糖組成物をデキストラナーゼ処理によって消化した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合を差し引くことによって、糖組成物に含まれる連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分の量を評価することができる。本発明の糖組成物は、糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合から、糖組成物をデキストラナーゼ処理によって消化した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合を差し引いた差分が１０〜３０％であるが、１０〜２８％でもよく、１０〜２６％であってもよい。
【００１８】
また、本発明の糖組成物は、糖組成物に含まれるグルコース間の結合様式のうち、α−１，６結合の割合が３５〜８０％である。すなわち、本発明に係る糖組成物は、α−１，６結合を比較的多く含むところ、グルコース間の結合様式のうち、α−１，６結合の割合は、好ましくは３５〜７８％であり、より好ましくは３９〜７８％でありさらに好ましくは３９〜７０％である。
【００１９】
糖の結合様式については、メチル化分析法（Journal of Biochemistry, 第５５巻、２０５ページ〜、１９６４年）やＮＭＲ分析法などにより測定することができる。
【００２０】
なお、本発明の糖組成物に含まれる連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分は、グルコースを含んで構成されるが、グルコースのみから構成されるものであってもよく、α−１，６結合が三糖以上または四糖以上連続して結合した成分を含んでもよい。
【００２１】
さらに、本発明に係る糖組成物は、そのＤＥ（Dextrose Equivalent）が１５〜７５であり、好ましくは１８〜７１、より好ましくは２０〜７０である。一般に、ＤＥは澱粉分解物の分解度を示す指標であり、ＤＥの値が大きい程、澱粉分解物が低分子であることを示す。具体的には、ＤＥが０であれば澱粉、ＤＥが１００であればグルコースを示す。本発明の好ましい態様において、糖組成物のＤＥは５０以下であるが、４２以下であるとさらに好ましく、４０以下としてもよい。糖組成物のＤＥは、「澱粉糖関連工業分析法」（澱粉糖技術部会編、５〜６ページ）に記載のレインエイノン法に基づいて測定することができる。
【００２２】
一つの態様において、本発明に係る糖組成物は、その重量平均分子量（Ｍｗ）が６００００以下であり、態様によっては５５０００以下や４００００以下、３００００以下とすることもできる。重量平均分子量（Ｍｗ）の下限は特に制限されないが、４００以上であることが好ましく、１０００以上であることがより好ましい。
【００２３】
本発明に係る糖組成物は、その数平均分子量（Ｍｎ）が２５０〜１５００であることが好ましく、３００〜１３００がより好ましく、４００〜１２００がさらに好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．０〜５０．０であることが好ましく、１．３〜５０．０がより好ましく、１．３〜３０．０がさらに好ましい。
【００２４】
また本発明に係る糖組成物は、糖組成物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合と、糖組成物をデキストラナーゼ処理によって消化した後の処理物に含まれる四糖類以上の成分の重量割合との差分をＹ、ＤＥをＸとしたとき、Ｙ≦−０．５５Ｘ＋５１であることが好ましい。また、Ｙ≦０．７３Ｘ＋４であると、さらに好ましい。
【００２５】
本発明の糖組成物は、後述の本発明の製造方法にて製造が可能であるが、酵素分解条件の調整や分離／精製によって、上記のパラメーターを調整することが可能である。
また、糖組成物については、クロマト分離などを用いて生成し、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分の含有量を適宜調製できる。
【００２６】
本発明の糖組成物及びその還元物は、飲食品（本明細書において単に食品ともいう）に適宜使用することができる。すなわち、一つの観点において、本発明に係る糖組成物やその還元物を食品に添加することができる。また、上記した糖組成物及び／又はその還元物を含む飲食品用改良剤も本発明の一形態である。さらに、一つの観点において本発明は、上記した糖組成物及び／又はその還元物を飲食品に添加することを含む、飲食品の改良方法である。特に本発明に係る糖組成物は、澱粉老化抑制、タンパク質変性抑制、油脂酸化抑制といった効果を奏するものであり、当該糖組成物の還元物も同様の効果を有するため、飲食品において使用すると大変好ましい。
【００２７】
本発明において、飲食品は特に制限されず、液体の食品であっても固体の食品であってもよく、ゲル状などの食品であってもよい。また、飲食品の例としては、例えば、米加工品、小麦加工品、大麦加工品、じゃがいも加工品、コーン加工品などを好適に挙げることができる。米加工品の例としては、米飯、もち、清酒、甘酒、米粉を原料とする和菓子等を挙げることができるが、これらに限定されない。小麦加工品の例としては、パン、麺、中華饅頭や餃子の皮、ビザ生地、パイ生地、焼菓子、生菓子等を挙げることができるが、これらに限定されない。大麦加工品の例としては、ビール、ビール様飲料等が挙げられるが、これらに限定されない。じゃがいも加工品の例としては、マッシュポテト、フライドポテト、ハッシュドポテト、ニョッキ、ポテトチップス等が挙げられるが、これらに限定されない。コーン加工品の例としては、コーンミール、コーンフレーク、コーンウィスキー等が挙げられるが、これらに限定されない。その他、本発明に係る糖組成物やその還元物が、例えば、畜肉加工食品、水産加工食品、乳加工食品、調味料などにも適用できることは当然である。
【００２８】
本発明に係る糖組成物およびその還元物については、澱粉の老化抑制機能によって飲食品の食感などを改善することが可能になる。本発明に係る糖組成物およびその還元物は、使用する目的や効果を考慮して、飲食品の製造のいずれの段階において使用してもよい。例えば、飲食品の原料に本発明に係る糖組成物やその還元物を添加してもよいし、飲食品の製造又は加工の工程に供してよい。また、飲食品の中間製造物または中間加工品に本発明に係る糖組成物やその還元物を添加してもよい。さらに、飲食品の製造又は加工の最終段階で本発明に係る糖組成物やその還元物を添加してもよい。
【００２９】
なお、本発明の糖組成物やその還元物を飲食品用の改良剤として用いる場合、賦形剤、保存剤、香味料、抗酸化剤、ビタミン類などの追加の成分を含むものであってよい。また、このような飲食品用の改良剤は、調製後、必要に応じて殺菌処理を行った後、飲食品の食感や物性の改良剤として、種々の飲食品に使用することができる。
【００３０】
糖組成物の製造方法
本発明の糖組成物の製造方法は特に限定されないが、好ましい態様において、澱粉分解物等の糖原料に酵素を作用させて製造することができる。
【００３１】
本発明の糖組成物の製造に使用可能な酵素は、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む澱粉分解物（澱粉を部分的に分解物したものを含む）等の糖原料に作用して、連続したα−１，６結合を生じるような酵素である。例えば、転移酵素などが挙げられる。糖組成物を工業的に製造することを考慮すると、反応温度を５０℃以上とすることが好ましいため（GLUCOSE SYRUPS: SCIENCE AND TECHNOLOGY、ELSEVIER APPLIED SCIENCE PUBLISHERS、８２ページ〜、１９８４年）、本発明で使用する酵素は、５０℃以上の温度で酵素反応可能なものが好ましい。反応温度は５０℃以上であればよいが、温度が高くなると製造時に菌の繁殖が生じにくいため、５５℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。特に基質の粘度が高い場合、反応温度が低いとハンドリングが悪くなることがあり、基質濃度を下げる必要が生じるところ、基質濃度が下がると製造効率が低下し、また、菌の繁殖リスクも高まってしまう。反応に用いられる温度の上限は特に制限されないが、酵素が反応液中で安定である温度域ならばよく、９０℃以下が望ましく、８０℃以下がより望ましく、７０℃以下としてもよい。したがって、本発明で使用する酵素の温度安定性は、５０℃以上で反応が可能であることが好ましく、より好ましくは５５℃以上、さらに好ましくは６０℃以上で反応が可能であることが好ましい。
【００３２】
一般に、澱粉糖におけるグルコース間の結合様式としては、α−１，２結合、α−１，３結合、α−１，４結合、α−１，６結合などが知られているが、本発明の糖組成物は、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分が含まれるものである。後述するように、本発明で定義される酵素を使用すると、連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物を効率的に得ることが可能になる。
【００３３】
本発明においては、基質である澱粉分解物に作用して、連続したα−１，６結合を生成する酵素として、ＧＨ（Glycoside Hydrolase：糖質加水分解酵素）ファミリー３１に属する酵素を使用するとよいが、糖組成物を食品用途に用いることを踏まえると、食品製造において使用例のある微生物由来のものが望ましい。そのような微生物としては、例えば、糸状菌（Absidia、Acremonium、Actinomadura、Alternaria、Aspergillus、Chaetomium、Coprinus、Coriolus、Geotrichum、Humicola、Monascus、Mortierella、Mucor、Nocardiopsis、Oidiodendron、Penicillium、Rhizomucor、Rhizopus、Trichoderma、Verticillium）、担子菌（Coliolus、Corticium、Cyathus、Irpexs、Polyporus、Pycnoporus、Trametes）、細菌（Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Alteromonas、Arthrobacter、Bacillus、Brevibacterium、Chromobacterium、Corynebacterium、Crypnohectria、Erwinia、Escherichia、Flavobacterium、Klebsiella、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Microbacterium、Micrococcus、Pimelobacter、Plesiomonas、Protaminobacter、Pseudomonas、Serratia、Streptococcus、Streptoverticillium、Sulfolobus、Thermus、Xanthomonas）、放線菌（Actinomadura、Actinomyces、Actinoplanes、Amycolatopsis、Eupenicillium、Nocardiopsis、Streptomyces、Thermomonospora）、酵母（Aureobasidium、Candida、Irpex、Kluyveromyces、Pycnoporus、Saccharomyces、Trichosporon）などが望ましい。
【００３４】
本発明で使用する連続したα−１，６結合を生成する酵素としては、中でも、アスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼが好ましく、特にアスペルギルス属フラビ節由来であることがより好ましく、アスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）由来又はアスペルギルス ソヤ（Aspergillus sojae）由来であることがさらに好ましい。使用する酵素は、公知の方法によって精製して利用することができる。例えば、培養液の処理物を濃縮した粗酵素標品を透析後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどによって、電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００３５】
アスペルギルス属の菌を用いて、目的とする酵素を得るに際しては、その培養には、公知の手法が適宜に採用され、例えば液体培養及び固体培養の何れもが任意に用いられ得るものである。使用する微生物は野生株に限らず、上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、各種薬品［ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）等］などを用いる人工的変異手段で変異した変異株や、遺伝子組換え技術を利用して得られた遺伝子組換え株も使用できる。
【００３６】
アスペルギルス属の菌を用いた培養に際して用いられる培地の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、レシチン等が、単独で又は組み合わせて用いられ、また、窒素源としては、有機及び無機の窒素源の何れもが利用可能であり、そのうち、有機窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、大豆、きなこ、米ぬか、コーンスティープリカー、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられ、一方、無機窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸‐アンモニウム、リン酸二アンモニウム、塩化アンモニウム等が用いられることとなる。更に、そのような培地に添加される無機塩や微量栄養素としては、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガンの塩類の他、ビタミン等を挙げることが出来る。また、上記の各種成分を含有する培地成分として小麦ふすま等の天然物を用いることも可能である。
【００３７】
培養に必要な期間は、菌体濃度、培地ｐＨ、培地温度、培地の構成等によって異なるが、通常、３日〜９日程度であり、目的物とする酵素が最大に達した頃に、その培養を停止すればよい。
【００３８】
酵素を反応させる際の基質濃度は、反応液中に溶解する濃度であればよく、１〜８０重量％の範囲、より効率よく糖質を得るためには１０〜６０重量％、より好ましくは２０〜４５重量％の条件で行うのが望ましい。反応に使用する酵素濃度は濃いほうが反応時間の短縮が図れて都合がよい。
【００３９】
酵素を反応させる期間は特に制限されないが、例えば１０分〜７日間、望ましくは３〜１２０時間、より望ましくは２４〜１２０時間が適当である。
【００４０】
反応に用いられるｐＨは、通常ｐＨ３．５〜７．０、望ましくはｐＨ４．０〜６．５、より望ましくはｐＨ４．０〜６．０で行うのが適当である。複数の酵素を反応に使用する場合には、使用する酵素及び酵素反応工程に応じて、適宜、上記の反応温度及び反応ｐＨを調整してもよい。
【００４１】
本発明で使用する連続したα−１，６結合を生成する酵素は、デキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率（デキストラン分解活性／マルトース分解活性）が０．０６以上であることが好ましく、０．１以上であることがより好ましい。このような特性を有する酵素を使用すると、本発明に係る連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分を含む糖組成物を得ることが容易である。ここで、デキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率は、それぞれの活性を測定した上で両者の比を求めることにより算出することが可能であり、後述する実施例において具体的に説明するように測定すればよい。
【００４２】
本発明においては、ＧＨファミリー３１（ＧＨ３１）に属する酵素を使用するが、ＧＨ３１に属する酵素が共通に持つ保存領域（POSITE：PS00129）に含まれる触媒残基の１０残基下流のアミノ酸残基は、ヒスチジン以外であることが好ましく、アルギニンであることがより好ましい。
【００４３】
本発明で使用する連続したα−１，６結合を生成する酵素は、後述する実施例などを踏まえて当業者が適宜得ることができるが、例えば、液体培養および固体培養等の公知の培養方法を用いて培養し、その培養物から公知の方法によって酵素を選抜することによって、本発明に係る糖組成物の製造に適した酵素を適宜得ることができる。例えば、培養液の処理物を濃縮した粗酵素液を、カラムクロマトグラフィー等に供して所望の特性を有する画分を回収することによって精製し、続いて、電気泳動などによってさらに精製することにより、単一の精製された酵素を得ることができる。
【００４４】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本発明で使用する連続したα−１，６結合を生成する酵素に関して適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明で使用する酵素の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができる。タンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている残基および領域を同定することもできる。さらに、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
【００４５】
公開されているアスペルギルス属などの菌のゲノム配列から、例えば、ＧＨ３１ファミリーに属する酵素のａｇｄＣの配列と同一性が一定以上（例えば、９０％以上や８５％以上、８０％以上など）となる配列を探索した上で、適宜ベクターを用いて遺伝子組換え株を作製することができる。
【００４６】
なお、当業者であれば、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明で使用するタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造およびアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明で使用するタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明で使用するタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明で使用するタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
【００４７】
本発明の製造方法においては、基質として、澱粉又はその分解物を使用するが、基質である澱粉分解物のＤＥは５〜６０が好ましく、５〜４０がより好ましく、５〜３５がさらに好ましい。また、澱粉の由来は特に限定されないが、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、小麦澱粉、コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、ハイアミロースコーンスターチ、えんどう豆澱粉、米澱粉などが挙げられ、これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００４８】
澱粉を、酸又はα−アミラーゼを用いて液化することにより、澱粉分解物を調製することができる。澱粉を部分的に加水分解するアミラーゼとしては、例えば、「Handbook of Amylases and Related Enzymes」（パーガモン・プレス社、東京、１９８８年）に記載されている、α−アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼなどが用いられる。これらアミラーゼとプルラナーゼ及びイソアミラーゼなどの枝切酵素を併用することも有利に実施できる。
【００４９】
本発明で使用する連続したα−１，６結合を生成する酵素を基質（糖原料）に作用させる際に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼなどで加水分解したり、ブランチングエンザイム、グルコシルトランスフェラーゼ、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼなどを作用させて、分子量や、甘味性、還元力などを調整したり、粘性を低下させたりすることも可能である。
【００５０】
これらの酵素の中でも、５０℃以上の温度でも反応が可能な耐熱性酵素を選択すれば、連続したα−１，６結合を生成する酵素と一緒に作用させる際に、５０℃を超える高温で処理できる。併用する酵素は、連続したα−１，６結合を生成する酵素と同時に作用させても良いし、別々に反応させても良い。他の酵素が澱粉分解酵素の場合、連続したα−１，６結合を生成する酵素と同時に作用させると、澱粉分解物の生成と、当該分解物からの糖組成物の生成とが同時に進行する。
【００５１】
本発明の糖組成物の調製に関して、酵素反応の反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品とすることもできる。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００５２】
必要ならば、更に、高度な精製（分離精製）をすることも随意である。これにより、糖組成物中の連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分の含有量の調整や、グルコースを構成糖とする糖組成物の全重量に対する、グルコースを構成糖とする連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分の含量の調整も行うこともできる。
【００５３】
例えば、イオン交換（陽イオン交換及び陰イオン交換）カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる分画をすることにより、高純度化することもできる。
【００５４】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去して高含有画分を採取する方法が有利に実施できる。塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー法にて、糖組成物中の連続したα−１，６結合を有する四糖類以上の成分の含有量等の調整を行うのが望ましい。
【００５５】
この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【実施例】
【００５６】
以下、実験例を示しつつ本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記の実験例に限定されるものではない。また、特に記載しない限り、本明細書において濃度などは重量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
【００５７】
実験１：分析方法
（１）酵素活性の測定
＜マルトース分解活性＞
マルトースを基質とした加水分解活性は、以下のように分析した。２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した２０ｍＭ  マルトース  ５０μＬと、同緩衝液で希釈した酵素溶液５０μＬとを混合し、４０℃で３０分間反応させた後、１０％シュウ酸溶液を１μＬ添加し１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。反応液に生成したグルコース量をグルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬工業製）にて分析した。１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する酵素量を１Ｕと定義した。
【００５８】
＜デキストラン分解活性＞
上記したマルトース分解活性の分析方法において、２０ｍＭ  マルトースに替えて２％デキストランを用い、酵素の反応温度を４０℃から５０℃に替えた以外は同様の方法によって、デキストランを基質とした加水分解活性を測定した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００５９】
＜デキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率＞
デキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率は、各酵素のデキストラン分解活性をマルトース分解活性で割ることによって算出した。その際、マルトース分解活性は、上記したマルトース分解活性の分析方法において、酵素の反応温度を４０℃から５０℃に替えて測定した。
【００６０】
（２）糖組成物の分析
＜ＤＥ（Dextrose Equivalent）＞
糖組成物のＤＥは、「澱粉糖関連工業分析法」（澱粉糖技術部会編、５〜６ページ）に記載のレインエイノン法に従って算出した。
【００６１】
＜糖組成物の重合度分布＞
糖組成物の重合度（ＤＰ）は、糖組成物を以下の条件でゲル濾過カラムにより分析した。ＤＰ１、２、３、４、５以上の成分は、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース試薬をスタンダードとして分析した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０４Ｓ（三菱化学製）
カラム温度：  ６５℃
移動相：  超純水
検出器：  ＲＩ（示差屈折検出器）
流量：  ０．３５ｍＬ／分
【００６２】
＜糖組成物の分子量分布＞
糖組成物の分子量分布は、糖組成物を以下の条件でゲル濾過カラムにより分析した。なお、糖組成物重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧＰＣ  ソフトウェア（島津製作所製）を用いて、既知のプルラン（プルランスタンダードＰ−８２；昭和電工製）、グルコース、マルトトリオース、マルトペンタオースにより検量線を作成して算出した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４とＳｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０２．５（共に昭和電工製）とを連結
カラム温度：  ３５℃
移動相：  ２０ｍＭ  ＮａＣｌ
検出器：  ＲＩ（示差屈折検出器）
流量：  ０．８ｍＬ／分
【００６３】
＜糖組成物における連続α−１，６結合糖質量＞
糖組成物の連続α−１，６結合糖質量は、デキストラナーゼ分解による評価法により分析した。
糖組成物を固形分濃度３０％に調製した液３０μＬに対して、１０００倍希釈のデキストラナーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム製）３０μＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）３９０μＬを混合し、５０℃で１６時間反応させた後、１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。
【００６４】
デキストラナーゼＬ「アマノ」処理前後の糖組成物の重合度分布を、前述の＜糖組成物の重合度分布＞にてそれぞれ分析し、四糖類以上の成分の重量割合の差分を連続α−１，６結合糖質量とした。
【００６５】
なお、上記分析で用いるデキストラナーゼＬ「アマノ」は、グルコースがα−１，６結合で結合した多糖デキストランを分解する酵素として知られている。デキストラナーゼＬ「アマノ」の生産菌であるケトミウム・エラティカム（Chaetomium erraticum）由来のデキストラナーゼは、デキストランを分解し、イソマルトース、イソマルトトリオースと少量のグルコースを主に生成することが知られている（International Journal of Biological Macromolecules、第５９巻、２４６ページ〜、２０１３年）。また、本発明者らは、デキストラナーゼＬ「アマノ」が、四糖類以上の連続α−１，６結合を含有する糖質（イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、デキストラン）に作用し、三糖類以下の成分が同様に生成することを確認済である。
【００６６】
＜糖組成物に含まれるα−１，６結合の割合＞
糖組成物に含まれるα−１，６結合の割合は、1Ｈ−ＮＭＲ測定によって得られるチャートに基づき、ピークの積分値より算出した。ピークの同定は、Carbohydrate Research（第３４３巻、１０１ページ〜、２００８）を参照して行った。
【００６７】
実験２：α−１，６結合を生成する市販酵素を使用して得られる糖組成物の分析（参考例）
α−１，６結合を生成する酵素として市販されているトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム製）を用いて糖組成物を製造して分析した。本実験においては、重合度の異なる市販の澱粉分解物として、（１）ＭＲ７５０（ＤＥ５７）、（２）ＳＰＤ（ＤＥ３０）、（３）Ｍ−ＳＰＤ（ＤＥ２０）、（４）Ｊ−ＳＰＤ（ＤＥ１３）を使用した（いずれも昭和産業製）。
【００６８】
各澱粉分解物を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たりそれぞれ０．８Ｕ、１Ｕ、１Ｕ、２Ｕ添加し作用させた。さらに、ＳＰＤ、Ｍ−ＳＰＤ、Ｊ−ＳＰＤについては、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たりそれぞれ１．５Ｕ、２Ｕ、３Ｕ添加し、同時に枝切酵素としてプルラナーゼ（クライスターゼＰＬＦ、天野エンザイム製）を各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５％、及び、イソアミラーゼ（ＧＯＤＯ−ＦＩＡ、合同酒精製）を各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．０７％添加し作用させた。
【００６９】
なお、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」のマルトース分解活性は、実験１に記載の方法に基づいて分析した。２４、４８、９６、１６８、２６４時間反応時にサンプリングし、実験１に記載の方法に従って連続α−１，６結合糖質量を分析した。
【００７０】
各反応において連続α−１，６結合糖質量が最大となった反応時間の分析値を、表１に示す。トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」を用いて得られる糖組成物の連続α−１，６結合糖質量はすべて９％以下であった。
【００７１】
【表１】
2017190427.tif 000002
【００７２】
実験３：アスペルギルス・ソヤＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの取得並びにその性質の評価
（１）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの取得
＜α−グルコシダーゼの遺伝子配列の定義＞
公開されているアスペルギルス属菌のゲノム配列から、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０由来のＧＨ３１ファミリーに属するα−グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＸＰ＿００１８２５３９０）と同一性が９０％以上となる配列を探索し、アスペルギルス・ソヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＢＡＣＡ００００００００）より定義した（配列番号１）。
【００７３】
＜染色体ＤＮＡの抽出＞
５０ｍＬチューブに、滅菌したＹＰＤ培地５ｍＬを入れ、ＮＢＲＣ４２３９株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。そして培養菌体を回収し、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で染色体ＤＮＡを抽出した。なお菌体は前述のＫｉｔのＡＰ１緩衝液を添加し、マルチビーズショッカー（安井器械製）で破砕した。
【００７４】
＜遺伝子組換え株の作成＞
定義した遺伝子配列の終止コドンの前に、１０残基のヒスチジンタグを付加するように塩基配列を挿入したＰＣＲ産物を得るためのプライマーセットを設計した。抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック製）を用いて、高発現プロモーターとしてＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、ターミネーターとして本酵素の遺伝子配列の終止コドンより下流３００ｂｐの領域とともに、制限酵素ＫｐｎI、ＨｉｎｄIIIで消化したｐＰＴＲII（タカラバイオ製）に導入したベクターを構築した。ベクターの設計を図１に示す。そして、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＡＴＣＣ３８１６３株を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法（Agricultural and Biological Chemistry、第５１巻、２５４９ページ〜、１９８７年）を行い、遺伝子組換え株を作製した。
【００７５】
上記α−グルコシダーゼの遺伝子、ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、及びターミネーター領域を増幅するために用いたプライマーは以下のとおりである。
（ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼＦ：配列番号２）
５´−ＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣ−３´
（ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼＲ：配列番号３）
５´−ＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＧＣ−３´
（プロモーターＦ：配列番号４）
５´−ＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡ−３´
（プロモーターＲ：配列番号５）
５´−ＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＧＡＡＣＴ−３´
（ターミネーターＦ（ヒスチジンタグの塩基配列を含む）：配列番号６）
５´−ＧＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧ−３´
（ターミネーターＲ：配列番号７）
５´−ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡ−３´
【００７６】
＜ｃＤＮＡの配列解析＞
得られた酵素の遺伝子のｃＤＮＡ配列を確認するために上記遺伝子組換え株から、前述した＜染色体ＤＮＡ抽出＞と同様の操作で菌体を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）でＲＮＡの抽出を行った。得られたＲＮＡからＲｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ（東洋紡製）を用いて逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ反応で酵素遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡをＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＫｉｔでＰＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（いずれもインビトロジェン製）に導入した後、シーケンス解析を行いｃＤＮＡの全長配列を決定した（配列番号８；ヒスチジンタグの塩基配列は除いた）。得られたｃＤＮＡからアミノ酸配列を決定した（配列番号９；ヒスチジンタグ部分は除いた）。
【００７７】
得られた酵素のアミノ酸配列は、ＲＩＢ４０由来のＧＨ３１ファミリーに属するα−グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列と同一性が９９％であり、かつＧＨ３１ファミリーが共通に持つ２つの保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９、ＰＳ００７０７）における配列がａｇｄＣと完全に一致するため、本酵素はＧＨ３１ファミリーに属する酵素と考えられた。
【００７８】
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの生産＞
２Ｌ三角フラスコにツァペック  ドックス培地１Ｌを入れて蒸気滅菌した後、ピリチアミンを添加し、上記遺伝子組換え株を植菌、３７℃で４日間振とう培養を行った。そして、ミラクロス（メルク・ミリポア製）で集菌、蒸留水で洗浄後、水分をよく搾った。
【００７９】
得られた菌体のうち１００ｇに、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾールを含んだ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を２００ｍＬ加え、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所製）を用いて２００００ｒｐｍで３０秒の破砕を５回繰り返した。そして、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離を行って上清を回収し、粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵素活性を実験１（１）に記載の＜マルトース分解活性＞に従って測定した結果、９７Ｕだった。
【００８０】
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの精製＞
得られた粗酵素液を、以下の２段階のクロマト分離に供した。下記のクロマト分離で得られた画分を、Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）で分析した結果、１１００００ダルトンの単一バンドが見られた（図２左）。
（第１段階）  Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー
粗酵素液を０．２μｍのフィルターに通した後、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア製）に供し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。これにより、ヒスチジンタグが付加されたタンパク質を選択的に回収した。
（第２段階）  ゲル濾過クロマトグラフィー
第１段階のアフィニティークロマトフィーで得られた溶出液を、限外濾過により２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア製）による分離を行い、マルトース分解活性の高い画分を回収した。得られた画分からマルトース分解活性として１７Ｕのα−グルコシダーゼを得た。
【００８１】
（２）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの評価
得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼについて、その性質を下記の手順によって評価した。
【００８２】
＜分子量及び等電点＞
精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果を図２（右方）に示す。分子量６５０００、７６０００ダルトンの２本のバンドが検出された。Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による結果と比較すると、本酵素はヘテロダイマーの構造を持つと考えられた。
【００８３】
また、等電点電気泳動（ＧＥヘルスケア製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果、本酵素の等電点は４．９〜５．５（中心値は５．２）であった。
【００８４】
＜至適温度、至適ｐＨ＞
本酵素のマルトース分解活性に対する温度、ｐＨの影響を調べた。マルトース分解活性は実験１に記載の＜マルトース分解活性＞に準じて分析した。その結果を図３（温度の影響）、図４（ｐＨの影響）に示す。本酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間の反応で５５℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間の反応で５．５であった。
【００８５】
なおｐＨの影響の評価では、ｐＨ３．０〜５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５〜８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。
【００８６】
＜温度安定性、ｐＨ安定性＞
本酵素のマルトース分解活性について温度安定性、ｐＨ安定性を調べた。マルトース分解活性は実験１に記載の＜マルトース分解活性＞に準じて分析した。その結果を図５（温度安定性）、図６（ｐＨ安定性）に示す。本酵素の温度安定性は、５０℃で活性が９０％以上残存していた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ４．５〜１０の範囲で活性が８０％以上、ｐＨ６．０〜１０．０の範囲で活性が９０％以上残存していた。
【００８７】
温度安定性は酵素溶液（２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）を各温度で１時間保持し、氷水にて冷却後、残存する酵素活性を評価した。ｐＨ安定性は酵素溶液（各ｐＨの４０ｍＭ緩衝液）を４℃で２４時間保持し、ｐＨを６．０に調整した後、残存する酵素活性を評価した。
【００８８】
なおｐＨ安定性の評価では、ｐＨ２．０〜５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。
【００８９】
＜基質特異性＞
本酵素の基質特異性を４０℃、ｐＨ６．０の条件にて評価した。結果を表２に示す。
【００９０】
マルトースやコージビオース、ニゲロース、イソマルトースなどの二糖類、及びマルトトリオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉などには良好に作用してグルコースを生成した。特にα−１，６結合を有するイソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオースが最も良好な基質であった。
【００９１】
マルトテトラオース、γ−シクロデキストリンについては作用性がやや低かった。トレハロース、グリコーゲン、デキストランについてはわずかに反応がみられた。
【００９２】
【表２】
2017190427.tif 000003
【００９３】
実験４：ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを用いて得られる糖組成物の分析
（１）各重合度の基質にＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを作用させて得られる糖組成物の分析
重合度の異なる市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７、ＳＰＤ：ＤＥ３０、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０、Ｊ−ＳＰＤ：ＤＥ１３（いずれも昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たりそれぞれ０．８Ｕ、１Ｕ、１．５Ｕ、２．５Ｕ添加し作用させた。２４、４８、９６、１６８、２６４時間反応時にサンプリングし、ＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量を分析した。
【００９４】
連続α−１，６結合糖質量が最大となった反応時間と２６４時間の分析値を表３に示す。ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼにより、ＤＥ３０〜６１、Ｍｗ５５０〜１００６７、Ｍｎ３２５〜７１５、Ｍｗ／Ｍｎ１．７〜１５．１、連続α−１，６結合糖質量１３〜２３％の糖組成物を得ることができた。
【００９５】
【表３】
2017190427.tif 000004
【００９６】
（２）重合度の異なる基質にＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼと枝切酵素を同時に作用させて得られる糖組成物の分析
重合度の異なる市販の澱粉分解物（ＳＰＤ：ＤＥ３０、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０、Ｊ−ＳＰＤ：ＤＥ１３（いずれも昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たりそれぞれ１．５Ｕ、２Ｕ、３Ｕ添加し、同時に枝切酵素としてプルラナーゼ（クライスターゼＰＬＦ、天野エンザイム製）を各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５％、及び、イソアミラーゼ（ＧＯＤＯ−ＦＩＡ、合同酒精製）を固形分１ｇ当たり０．０７％を添加し作用させた。２４、４８、９６、１６８、２６４時間反応時にサンプリングし、実験１（２）に記載の分析方法に従ってＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量を分析した。
【００９７】
連続α−１，６結合糖質量が最大となった反応時間と２６４時間の分析値を表４に示す。ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼと枝切り酵素を組み合わせることで、ＤＥ３４〜５１、Ｍｗ７５２〜２７１７、Ｍｎ３９７〜６３１、Ｍｗ／Ｍｎ１．８〜５．０、連続α−１，６結合糖質量１６〜２６％の糖組成物を得ることができた。
【００９８】
【表４】
2017190427.tif 000005
【００９９】
実験５：ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを含有する酵素製剤及び部分精製酵素の調製
（１）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを含有する酵素製剤の調製
５００ｍＬの三角フラスコに小麦ふすま１０ｇを入れて蒸気滅菌した後、ＮＢＲＣ４２３９株をＹＰＤ培地で培養した前培養液を１０ｍＬ添加し、水分が均一になるようによく撹拌した後、３０℃で４日間、固体培養を行った。培養終了後、１００ｍＬの滅菌水で小麦ふすまを洗浄し、ミラクロス（メルク・ミリポア製）による濾過、３５００ｒｐｍ、２０分間で２回遠心分離後、上清を回収し粗酵素液とした。この粗酵素液を凍結乾燥しＮＢＲＣ４２３９株由来酵素製剤とした。この酵素製剤についてマルトース分解活性を測定したところ、２４Ｕであった。
【０１００】
（２）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを含有する部分精製酵素の調製
前述した手法で得られた粗酵素液を０．２μｍのフィルターで濾過したものを陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。分離樹脂はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー製）を用い、樹脂量（以降はＣＶと記載）は１００ｍＬとした。０．１２Ｍ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬで洗浄、０．２２Ｍ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、０．１２→０．２２Ｍ  塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（１０ＣＶ）で溶出し、実験１（１）に記載の＜デキストラン分解活性＞に従って活性測定し、デキストラン分解活性の高い画分を回収した。この回収液を凍結乾燥しＮＢＲＣ４２３９株由来部分精製酵素とした。この酵素についてマルトース分解活性を測定したところ、１１Ｕであった。
【０１０１】
実験６：アスペルギルス・オリゼー株由来α−グルコシダーゼの取得並びに当該α−グルコシダーゼを作用させて得られる糖組成物の分析
（１）ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされている推定α−グルコシダーゼの取得並びに当該α−グルコシダーゼを作用させて得られる糖組成物の分析
＜ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされている推定α−グルコシダーゼの取得＞
実験３（１）に記載の手法に準じて、ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされている推定α−グルコシダーゼの遺伝子組換え株を作製、培養・菌体破砕後に精製し、Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示すＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされている推定α−グルコシダーゼを得た。当該α−グルコシダーゼのマルトース分解活性は１１Ｕであった。
【０１０２】
＜ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼを用いて得られる糖組成物の分析＞
得られたＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼをマルトペンタオースへ作用させた。精製酵素液０．２ｍＬ（マルトース分解活性７．２Ｕ／ｍＬ）を４５％マルトペンタオース溶液（ｐＨ６．０）０．４ｍＬに加え、４０℃で７２時間反応を行った。反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。得られた糖組成物の連続α−１，６結合糖質量を実験１（２）に記載の＜糖組成物における連続α−１，６結合糖質量＞に従って分析した結果、連続α−１，６結合糖質はほとんど検出されなかった。
【０１０３】
（２）ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼのアミノ酸配列と、ＮＢＲＣ４２３９株由来のα−グルコシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列の比較
実験３（１）に記載した通り、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼ遺伝子とＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼのアミノ酸配列の同一性は９９％であり、かつＧＨ３１ファミリーが共通に持つ２つの保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９、ＰＳ００７０７）における配列が完全に一致する。触媒残基を含む保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）付近のアミノ酸配列を比較したところ、触媒残基の１０残基下流がアルギニンとヒスチジンで異なることがわかった（表５）。この違いが、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼとＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼとの連続α−１，６結合糖質を生成する活性の違いに寄与すると考えられた。
【０１０４】
【表５】
2017190427.tif 000006
【０１０５】
（３）ＮＢＲＣ４２６１由来α−グルコシダーゼの取得並びに当該α−グルコシダーゼを作用させて得られる糖組成物の分析
＜ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼの、ＧＨ３１ファミリーが共通に持つ保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）付近のアミノ酸配列の推定＞
アスペルギルス・オリゼーＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼの染色体ＤＮＡの抽出は、実験３（１）に記載の＜染色体ＤＮＡの抽出＞のＮＢＲＣ４２３９株に替えてＮＢＲＣ４２６１株を用いた以外は同様の試験を行った。
【０１０６】
また、ＧＨ３１ファミリーが共通に持つ保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）付近のアミノ酸配列を推定するため、ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣの遺伝子配列を基に下記のプライマーセットを設計した。抽出した染色体ＤＮＡを鋳型に設計した下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらにＰＣＲ産物を鋳型にプライマーを用いてシーケンス解析した。
【０１０７】
その結果、ＮＢＲＣ４２６１株の推測アミノ酸配列において、ＧＨ３１ファミリーが共通に持つ保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）はＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼのものと完全に一致し、また、触媒残基の１０残基下流はアルギニンであった。
【０１０８】
上記プライマーセットは以下のとおりである。
（シーケンス解析用プライマーＦ：配列番号１０）
５´−ＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＴ−３´
（シーケンス解析用プライマーＲ：配列番号１１）
５´−ＧＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴ−３´
【０１０９】
＜ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ遺伝子配列の解析＞
ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ遺伝子のシーケンス解析を行うため、ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣの３００ｂｐ上流付近と３００ｂｐ下流付近の塩基配列から下記のプライマーセットを設計した。ＮＢＲＣ４２６１株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型に設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、さらにＰＣＲ産物を鋳型にプライマーセットを用いてシーケンス解析した。解析した塩基配列を用いてさらにプライマーを設計し、ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ遺伝子の全配列を解析した（配列番号１２）。ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの遺伝子配列とｃＤＮＡ配列からＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ遺伝子のイントロンを推測し、アミノ酸配列を予想した（配列番号１３）。ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼは、ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているＧＨ３１ファミリーに属するα−グルコシダーゼの配列と同一性が９９％であり、かつＧＨ３１ファミリーが共通に持つ２つの保存領域（ＰＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９、ＰＳ００７０７）における配列がＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼと完全に一致するため、ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼはＧＨ３１ファミリーに属する酵素と考えられた。
【０１１０】
上記プライマーセットは以下のとおりである。
（ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣ上流３００ｂｐＦ：配列番号１４）
５´−ＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴ−３´
（ＲＩＢ４０由来ａｇｄＣ下流３００ｂｐＲ：配列番号１５）
５´−ＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣ−３´
【０１１１】
＜ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼの取得＞
実験３（１）に記載の手法に準じて、ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼの遺伝子組換え株を作製、培養・菌体破砕、精製し、Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示すＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼを得た。
当該α−グルコシダーゼのマルトース分解活性は１０Ｕであった。
【０１１２】
＜ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼを用いて得られる糖組成物の分析＞
市販の澱粉分解物（Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０（昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、上記で得られたＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で澱粉分解物の固形分１ｇ当たり１．５Ｕ添加し４８時間作用させた。
【０１１３】
表６に、ＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量を分析した結果を示す。ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼを用いても、ＤＥ２６、Ｍｗ８４６５、Ｍｎ８３５、Ｍｗ／Ｍｎ１０．１、連続α−１，６結合糖質量が１８％である糖組成物が得られた。
【０１１４】
【表６】
2017190427.tif 000007
【０１１５】
実験７：ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼを含有する酵素製剤及び部分精製酵素の調製
実験５に記載の手法に準じて、ＮＢＲＣ４２６１株を培養し、粗酵素液を取得、凍結乾燥してマルトース分解活性で２６ＵのＮＢＲＣ４２６１株由来酵素製剤得た。また、粗酵素液からマルトース分解活性で１１ＵのＮＢＲＣ４２６１株由来部分精製酵素を調製した。
【０１１６】
実験８：各重合度の基質にＮＢＲＣ４２３９株及び、ＮＢＲＣ４２６１株由来のα−グルコシダーゼ、酵素製剤、部分精製酵素を作用させて得られる糖組成物の分析
（１）ＮＢＲＣ４２３９株及び、ＮＢＲＣ４２６１株由来のα−グルコシダーゼ、酵素製剤、部分精製酵素のデキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率
下記の酵素について、実験１（１）＜デキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率＞に記載の活性測定方法で、デキストラン分解活性とマルトース分解活性を測定し、両者の比率（デキストラン分解活性／マルトース分解活性）を算出した。結果を表７に示す。
・実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼ
・実験５で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来酵素製剤
・実験５で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来部分精製酵素
・実験６（３）で得られたＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ
・実験７で得られたＮＢＲＣ４２６１株由来酵素製剤
・実験７で得られたＮＢＲＣ４２６１株由来部分精製酵素
・市販酵素であるトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」
・実験６（１）で得られたＲＩＢ４０由来ａｇｄＣにコードされているα−グルコシダーゼ
【０１１７】
【表７】
2017190427.tif 000008
【０１１８】
（２）各重合度の基質にＮＢＲＣ４２３９株及び、ＮＢＲＣ４２６１株由来のα−グルコシダーゼ、酵素製剤、部分精製酵素を作用させて得られる糖組成物の分析
重合度の異なる市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７、ＳＰＤ：ＤＥ３０、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０、Ｊ−ＳＰＤ：ＤＥ１３（いずれも昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、それぞれの基質に実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼ、実験５で得られた酵素製剤、部分精製酵素、及び、実験６（３）で得られたＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ、実験７で得られた酵素製剤、部分精製酵素について、マルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５Ｕ、０．５Ｕ、１Ｕ、２Ｕと添加量をふり６４時間作用させた。実験１（２）に記載の分析方法に従ってＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量を分析した。
【０１１９】
各反応について、連続α−１，６結合糖質量が１０％以上になる最も少ない添加量の酵素を作用させた時の分析値と２Ｕ添加した時の分析値を表８に示す。各澱粉分解物にＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼ、酵素製剤、部分精製酵素、及び、ＮＢＲＣ４２６１株由来α−グルコシダーゼ、酵素製剤、部分精製酵素を５０℃で作用させることで、ＤＥ２３〜７０、Ｍｗ４０７〜１６３６５、Ｍｎ２７５〜９８９、Ｍｗ／Ｍｎ１．５〜１８．８、連続α−１，６結合糖質量１０〜２３％の糖組成物を得ることができた。特にα−グルコシダーゼのデキストラン分解活性とマルトース分解活性の比率が概ね０．０６以上であると、本発明の糖組成物を効率良く得ることができた。
【０１２０】
【表８】
2017190427.tif 000009
【０１２１】
実験９：連続したα−１，６結合を多く含む糖組成物の調製
（１）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼを用いた糖組成物の調製
＜サンプルＡ〜Ｄ＞
重合度の異なる市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７、マルデックＰＨ４００：ＤＥ３５、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０（いずれも昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で各澱粉分解物の固形分１ｇ当たりそれぞれ１Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物をそれぞれサンプルＡ、サンプルＢ、サンプルＣとした。さらに、ＭＲ７５０に作用させて得られた糖組成物の一部については、固形分５０％の水溶液を調製し、６０℃に加熱した強酸性カチオン交換樹脂（ＦＸ１０４０、オルガノ製）を充填した連続式クロマト分離装置（トレソーネ、オルガノ製）に供し、グルコースを除去した。回収した溶液は活性炭・イオン精製処理した後凍結乾燥し、サンプルＤとした。
【０１２２】
＜サンプルＥ＞
市販の澱粉分解物（Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０（昭和産業製））を濃度３０％になるように水に溶解し、温度５０℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で澱粉分解物の固形分１ｇ当たり１Ｕ添加し、同時に枝切酵素としてプルラナーゼ（クライスターゼＰＬＦ、天野エンザイム製）を澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５％、及び、イソアミラーゼ（ＧＯＤＯ−ＦＩＡ、合同酒精製）を澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．０７％を添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＥとした。
【０１２３】
＜サンプルＦ＞
固形分３０％のとうもろこし澱粉液化液（ＤＥ１３）を温度５５℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で固形分１ｇ当たり４Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＦとした。
【０１２４】
＜サンプルＧ＞
固形分３０％の甘蔗澱粉液化液（ＤＥ８）を温度５５℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で固形分１ｇ当たり４Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＧとした。
【０１２５】
＜サンプルＨ＞
固形分３０％のワキシーコーン澱粉液化液（ＤＥ５）を温度５５℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で固形分１ｇ当たり４Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＨとした。
【０１２６】
（２）ＮＢＲＣ４２３９株由来酵素製剤を用いた糖組成物の調製
固形分３０％のとうもろこし澱粉液化液（ＤＥ２０）を温度５５℃、ｐＨ６．０に調整した後、実験５（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来酵素製剤をマルトース分解活性で固形分１ｇ当たり４Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＩとした。
【０１２７】
（３）調製した糖組成物の分析
調製した糖組成物サンプルＡ〜Ｉについて、実験１（２）に記載の分析方法に従ってＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量、α−１，６結合の割合を分析した。その結果を表９に示す。なお、サンプルＡのα−１，６結合の割合の算出に用いた1Ｈ−ＮＭＲ測定によって得られるチャートを図７に示す。
【０１２８】
得られたサンプルは、ＤＥ２２〜６０、Ｍｗ５４１〜５１５７０、Ｍｎ３３４〜１０５９、Ｍｗ／Ｍｎ１．４〜４８．７、連続α−１，６結合糖質量１０〜２２％、α−１，６結合の割合は３９〜７８％の範囲であった。
【０１２９】
【表９】
2017190427.tif 000010
【０１３０】
実験１０：連続したα−１，６結合を含む糖組成物の食品への応用
実験９で取得した糖組成物について、以下の試験を実施し、主に食品用途における有用性を評価した。
【０１３１】
（１）澱粉の老化抑制機能
本発明の糖組成物の添加が澱粉の老化性に与える影響を検討した。固形分１２％の小麦澱粉溶液と固形分１０％の糖液を等量で混合し、ＲＶＡ４５００（Ｐｅｒｔｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて澱粉の老化性を評価した。糖液は、サンプルＡ〜Ｉ、グルコース、トレハロース、及び市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７、マルデックＰＨ４００：ＤＥ３５、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０（いずれも昭和産業製））、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００：ＤＥ４４（昭和産業製））に水を加えて調製した。また試験は、図８に示す条件で処理し、セットバック値（最終粘度と糊化後の最小粘度の差）を算出、その値で老化性を評価した。結果はＤＥ別に図９に示す。
【０１３２】
ＤＥ５０以上では、グルコースや市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０）の添加区に比べ、トレハロース、サンプルＡ、Ｉの添加区はセットバック値が小さい値であった。また、トレハロースとサンプルＡ、Ｉを比較すると、サンプルＡ、Ｉを添加した方が小さい値を示した。
【０１３３】
ＤＥ３０〜５０では、市販の澱粉分解物（マルデックＰＨ４００）の添加区に比べ、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００）、サンプルＢ、Ｄ、Ｅの添加区はセットバック値が小さい値であった。また、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００）とサンプルＢ、Ｄ、Ｅを比較すると、サンプルＢ、Ｄ、Ｅを添加した方が小さい値を示した。
【０１３４】
ＤＥ２０〜３０では、市販の澱粉分解物（Ｍ−ＳＰＤ）の添加区に比べ、サンプルＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈの添加区はセットバック値が小さい値であった。
【０１３５】
以上の結果より、重合度が同程度のもので比較した場合、本発明の糖組成物はグルコース、トレハロース、澱粉分解物、既存のイソマルトオリゴ糖より澱粉老化抑制機能が高いことが明らかになった。
【０１３６】
（２）パンへの添加効果
実際にパンを作製して、糖組成物の澱粉老化抑制機能を検証した。表１０に示す配合の製パン原料を用いて、ホームベーカリーＳＤ−ＢＨ１０５（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ製）の食パン・早焼きコースにて食パンを作製した。試験区は、コントロール、サンプルＩ添加区、市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７（昭和産業製））添加区とした。
【０１３７】
作製した食パンは、２５℃まで放冷し２５℃で１日及び２日保存したものを厚さ１０ｍｍにスライスし、クラム部分を３３ｍｍ四方にカットして物性測定を行った。測定にはＳＵＮ  ＲＨＥＯ  ＭＥＴＥＲ  ＣＯＭＰＡＣ−１００ＩＩ（ＳＵＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製）を用い、直径４０ｍｍのフラットプランジャー、架台スピード６０ｍｍ／ｍｉｎの条件で、厚さ５ｍｍまで圧縮したときの応力を測定し、食パンの硬さとした。各試験区について１０点測定しその平均を求めた。結果を図１０に示す。
【０１３８】
１日保存後において、コントロール、澱粉分解物（ＭＲ７５０）添加区に比べ、サンプルＩを添加した食パンは柔らかかった。また、２日保存後においても、サンプルＩ添加区は柔らかさを保っていた。これらの結果から、前述した本発明の糖組成物の澱粉老化抑制機能は、食品中でも効果を発揮していることが考えられる。本発明の糖組成物を添加することで、柔らかさが持続する食パンを得ることができた。
【０１３９】
【表１０】
2017190427.tif 000011
【０１４０】
（３）タンパク質の変性抑制機能
本発明の糖組成物の添加がタンパク質の変性に与える影響を検討した。卵から卵黄を分け、卵黄の重量に対して２／３量の７．５％糖液と混合し、冷解凍による粘度上昇を指標にタンパク質の変性を評価した。糖液は、サンプルＡ〜Ｉ、市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７、マルデックＰＨ４００：ＤＥ３５、Ｍ−ＳＰＤ：ＤＥ２０（いずれも昭和産業製））、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００：ＤＥ４４（昭和産業製））に水を加えて調製した。結果は冷凍前の粘度に糖液による差は認められなかったので、解凍後の粘度のみをＤＥ別に図１１に示す。
【０１４１】
ＤＥ５０以上では、澱粉分解物（ＭＲ７５０）の添加区に比べ、サンプルＡ、Ｉの添加区は解凍後の粘度が小さい値であった。
【０１４２】
ＤＥ３０〜５０では、澱粉分解物（マルデックＰＨ４００）の添加区に比べ、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００）、サンプルＢ、Ｄ、Ｅの添加区は粘度が小さい値であった。また、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００）とサンプルＢ、Ｄ、Ｅを比較すると、サンプルＢ、Ｄ、Ｅを添加した方が小さい値を示した。
【０１４３】
ＤＥ２０〜３０では、澱粉分解物（Ｍ−ＳＰＤ）の添加区に比べ、サンプルＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈの添加区は粘度が小さい値であった。
【０１４４】
以上の結果より、重合度が同程度のもので比較した場合、本発明の糖組成物は、澱粉分解物、既存のイソマルトオリゴ糖よりタンパク質変性抑制機能が高いことが明らかになった。
【０１４５】
（４）卵加工品への添加効果
上記のタンパク質変性抑制機能を、全卵を加熱調理した試験で検証した。全卵に全卵の重量に対し２／３量の１５％糖液を混ぜ、１０ｇをアルミカップに量りとり、３０分間加熱した。放冷後、−２５℃で１日保存し、解凍後の離水量を測定、離水の割合を評価した。試験区は、サンプルＩ添加区、砂糖、トレハロース、市販の澱粉分解物（ＭＲ７５０：ＤＥ５７（昭和産業製））添加区とした。結果を図１２に示す。
【０１４６】
サンプルＩを添加することにより、砂糖、トレハロース、澱粉分解物（ＭＲ７５０）を添加した試験区に比べ、離水の割合は低くなっていた。この結果から、前述した本発明の糖組成物のタンパク質変性抑制機能は卵加工品中でも効果を発揮していることが考えられる。本発明の糖組成物を添加することで、離水の少ない卵料理を得ることができる。
【０１４７】
（５）油脂の酸化抑制機能
本発明の糖組成物の添加が油脂の酸化に与える影響を検討した。大豆油に１．５倍量の３３％糖液、全量の１％量のカルボキシメチルセルロースを添加し、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所製）を用いて２００００ｒｐｍで３０秒の混合を５回繰り返した。この混合物を加圧条件下で１２０℃、９０分間加熱し、酸化臭を評価した。糖液は、サンプルＡ〜Ｉ、砂糖、トレハロース、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ９００：ＤＥ４４（昭和産業製））を用いた。また、比較として糖を添加しない無添加区も実施した。評価は１０人の被験者により無添加に対して酸化臭が抑えられていると答えた人数とした。結果を表１１に示す。
【０１４８】
無添加に比べ、サンプルＡ〜Ｉを添加することで酸化臭を抑える結果となった。また、砂糖、トレハロースの添加よりも好ましい結果であった。ＩＭＯ９００と比べると、いくつかのサンプルで変わらない結果になったものがみられたが、大半は好ましい結果であった。本発明の糖組成物を添加することで、油脂の酸化が抑制される可能性がある。
【０１４９】
【表１１】
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【０１５０】
実験１１：クロマト分離による連続α−１，６結合糖質量を高めた糖組成物の調製並びに食品への利用
（１）クロマト分離による連続α−１，６結合糖質量を高めた糖組成物の調製
＜クロマト分離による糖組成物の調製：サンプルＪ＞
固形分３０％とうもろこし澱粉液化液（ＤＥ１３）を温度５５℃、ｐＨ６．０に調整し、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で澱粉液化液の固形分１ｇ当たり４Ｕ添加し、同時に枝切酵素としてプルラナーゼ（クライスターゼＰＬＦ、天野エンザイム製）を各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５％、及び、イソアミラーゼ（ＧＯＤＯ−ＦＩＡ、合同酒精製）を固形分１ｇ当たり０．０７％を添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し固形分５０％まで濃縮した。６０℃に加熱した強酸性カチオン交換樹脂（ＦＸ１０４０、オルガノ製）を充填した連続式クロマト分離装置（トレソーネ、オルガノ製）に供し、グルコースを除去した。回収した溶液は活性炭・イオン精製処理後凍結乾燥した。得られた糖組成物はサンプルＪとした。
【０１５１】
＜クロマト分離による糖組成物の調製：サンプルＫ〜Ｍ＞
固形分３０％とうもろこし澱粉液化液（ＤＥ１２）を温度６０℃、ｐＨ５．０に調整した後、β−アミラーゼ（β−アミラーゼ＃１５００Ｓ、ナガセケムテックス製）を澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．３％、及び、プルラナーゼ（クライスターゼＰＬＦ、天野エンザイム社製）を各澱粉分解物の固形分１ｇ当たり０．２５％を添加し２４時間反応させた。約１００℃で１０分加熱処理した後、温度５５℃、ｐＨ６．０に調整し、実験３（１）で得られたＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトース分解活性で固形分１ｇ当たり３Ｕ添加し４８時間作用させ、ｐＨ４．０に調整後約１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止させた。不溶物を濾過して除去した後、活性炭・イオン精製処理し固形分５０％まで濃縮した。６５℃に加熱したゲル濾過樹脂Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２（バイオラッド製）を充填したカラム（φ６ｃｍ×１００ｃｍ）に供し、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３成分を除去した。回収した溶液は活性炭・イオン精製処理して凍結乾燥し、サンプルＫとした。
【０１５２】
また、サンプルＫを濃度１０％になるように水に溶解し、１０％グルコース溶液と５０：５０及び６０：４０で混ぜたものを凍結乾燥し、サンプルＬ、Ｍとした。
【０１５３】
（２）調製した糖組成物の分析
調製した糖組成物サンプルＪ〜Ｍについて、実験１（２）に記載の分析方法に従ってＤＥ、分子量分布、連続α−１，６結合糖質量を分析した。その結果を表１２に示す。
【０１５４】
得られたサンプルは、ＤＥ２６〜７１、Ｍｗ５９７〜２２２５、Ｍｎ２７３〜８４４、Ｍｗ／Ｍｎ１．３〜２．６、連続α−１，６結合糖質量２２〜４４％の範囲であった。
【０１５５】
【表１２】
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【０１５６】
（３）調製した糖組成物の食品への利用
実験１０（２）に記載した方法と同様の方法で、サンプルＩに替えてサンプルＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍを用いて食パンを作製した。サンプルＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍの澱粉老化抑制機能により柔らかさが持続する食パンを得ることができた。
【０１５７】
実験１２：糖組成物の還元物の調製並びに食品への利用
（１）糖組成物の還元物の調製
サンプルＩの固形分５０％水溶液を調製し、固形分当たり４％のラネーニッケル触媒の存在下で、水素圧５０ｋｇ／ｃｍ２、温度１１０℃、反応時間９０分にて還元した。得られた溶液は活性炭・イオン精製処理して凍結乾燥し、サンプルＮとした。
【０１５８】
（２）調製した還元物の食品への利用
実験１０（２）に記載した方法と同様の方法で、サンプルＩに替えてサンプルＮを用いて食パンを作製した。サンプルＮの添加により柔らかさが持続する食パンを得ることができた。還元物でも澱粉老化抑制機能を持つことが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【配列表】
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