(57)【要約】      （修正有）【課題】椎間板変性症の治療に有効な椎間板変性症治療薬、及び該治療薬のスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３阻害剤、特にＣＰ６９０５５０を有効成分とする治療薬。酸化ストレスを誘導した線維輪（ＡＦ）細胞に、候補物質を接触させ、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標としたスクリーニング方法、更に前記スクリーニング方法によって選択された候補物質を、げっ歯類椎間板変性モデル動物に摂取させ、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標とした、該治療薬のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬。
【請求項２】
前記ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３阻害剤が、
ＣＰ６９０５５０又はこの薬理学的に許容される塩、若しくはエステル誘導体であることを特徴とする請求項１の椎間板変性症治療薬。
【請求項３】
酸化ストレスを誘導した線維輪（ＡＦ）細胞に、
候補物質を接触させ、
ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標として椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項４】
請求項３記載のスクリーニング方法によって選択された候補物質を
さらに、げっ歯類椎間板変性モデル動物に摂取させ、
ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は椎間板変性症、及びこれを誘因とする腰痛等の疾患を改善するための組成物に関する。特に、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３阻害剤であるＣＰ６９０５５０を有効成分として含む医薬組成物に関する。さらに、椎間板変性症、及びこれを誘因とする疾患を改善するための治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
椎骨の間に存在する椎間板は、中央の髄核と、髄核を取り囲むように存在する外側の線維輪から構成されている。髄核は水分を多く含むゲル状の物質からなっているが、老化などにより髄核の水分が減少して弾力性が失われ変性が生じる。椎間板が変性した状態を椎間板変性症という。こうした老化現象によって、椎間板の支持性が失われ、クッションとしての機能が低下すると、周囲の神経を刺激したり、靭帯、関節、筋肉などの周囲の組織に負担がかかり痛みの原因となることがある。
【０００３】
椎間板変性症は、腰痛、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症、脊柱変形といった多くの脊髄変性症状（degenerative spinal condition）の要因となることが知られている（非特許文献１）。椎間板変性症は、上述のように老化、機械的ストレス、遺伝など様々なことが関与して発症するものと考えられている。
【０００４】
椎間板変性症の治療は現在のところ腰痛などの症状が出た場合に、手術療法と対症療法によって処置される。対症療法は薬物治療と物理療法が中心であり、薬物治療としては抗疼痛薬が主として投与され、症状の緩和を目指すことが基本の治療法となっている。さらに、ストレスが著しい場合には抗不安薬／抗うつ薬などが併用される場合もある。
【０００５】
抗疼痛薬による治療は、椎間板変性症の進行を抑止できるものではなく、現在のところ腰痛や、腰痛の原因となっている椎間板変性症それ自体を根本的に治療する薬物療法はない。また、現在使用されている抗疼痛薬の中でも非ステロイド性抗炎症薬は胃腸障害、腎障害などの副作用が多い。また、近年多用される鎮痛薬には吐き気、便秘、めまい、眠気などの副作用も多い。また、手術療法に至る患者数を減らすことは、医療経済の観点からも大変有意義であり、脊椎変性疾患の進行予防効果を持つ薬剤が求められている。
【０００６】
椎間板変性は老化をはじめとする種々の要因によって生じることから、各要因による発生機序についての詳細な研究はないものの、椎間板変性時に炎症性サイトカインＩＬ‐６の産生が高まることが報告されている（非特許文献２〜４）。しかしながら、ＩＬ‐６の産生と椎間板変性との関係については明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】UrbanJ.P., Roberts S. 2003, Arthritis Res. Ther. Vol.5, p.120-130.
【非特許文献２】Mohammed,F. et al., 2010, Arthritis Rheum., Vol.62(7), p.1974-1982.
【非特許文献３】Sainoh,T. et al., 2015, J. Orthop. Res. Vol.33(10), p.1508-1514.
【非特許文献４】Risbud,M.V. and Shapiro, I.M., 2014, Nat. Rev. Rheumatol., Vol.10(1), p.44-56.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は椎間板変性症を治療する薬剤を提供することを課題とする。また、新しい薬剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは椎間板変性症の発症に、ＩＬ‐６によって活性化されるＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系が介在することを明らかにした。本発明は、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系を阻害することによって、椎間板変性症、また、これに伴う腰痛、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症を治療する組成物に関する。また、新たに見出した椎間板変性症の発症の機序から、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系を標的とする医薬のスクリーニング方法に関する。
【００１０】
（１）ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬。
（２）前記ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤が、ＣＰ６９０５５０又はこの薬理学的に許容される塩、若しくはエステル誘導体であることを特徴とする（１）の椎間板変性症治療薬。
（３）酸化ストレスを誘導した線維輪（ＡＦ）細胞に、候補物質を接触させ、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標として椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
（４）(３)記載のスクリーニング方法によって選択された候補物質を、さらに、げっ歯類椎間板変性モデル動物に摂取させ、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の変化を指標とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１１】
今まで根本的な薬物治療を行うことのできなかった椎間板変性症に対して、進行予防効果を持つ薬剤を提供することができる。また、新たな治療薬の開発を行うことも期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】椎間板変性症において、ＩＬ‐６発現が増強していることを示す。図１Ａはラット繊維輪細胞において炎症性サイトカインによるＩＬ‐６の発現誘導を示す図。図１Ｂ〜Ｃは、椎間板変性モデル動物におけるＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３の発現を示す図。図１Ｄは、椎間板変性モデル動物におけるＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３の免疫組織染色を示す図。図１Ｅは、ヒト椎間板変性症患者のＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３の免疫組織染色を示す図。
【図２】ＩＬ‐６により誘導される遺伝子、タンパク質発現の解析を示す。図２ＡはＩＬ‐６により誘導される遺伝子発現を示す図。図２Ｂは、ＩＬ‐６により誘導されるタンパク質発現を示す図。
【図３】ＩＬ‐６の下流のシグナル伝達系の解析結果を示す図。
【図４】ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤の効果を示す。図４Ａは、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤ＣＰ６９０５５０によるシグナル伝達系に対する効果を示す図。図４Ｂは、ＣＰ６９０５５０の遺伝子発現に対する効果を示す図。図４Ｃは、ＣＰ６９０５５０のタンパク質発現に対する効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、ＩＬ‐６によって活性化されるＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系が椎間板変性症に関与することを示した。したがって、椎間板変性症治療薬としては公知のＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤を用いることができる。公知のＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤としては、ＣＰ６９０５５０（ＣＡＳ  ５４０７３７−２９−９）、Ｃｐｄ１８８（ＣＡＳ  ８２３８２８−１８−８）、５，１５−ＤＰＰ（ＣＡＳ  ２２１１２−８９−６）、ＮＳＣ−７４８５９（Ｓ３Ｉ−２０１、ＣＡＳ  ５０１９１９−５９−１）、ＷＰ１０６６（ＣＡＳ  ８５７０６４−３８−１）、Ｓｔａｔｔｉｃ（ＣＡＳ  １９９８３−４４−９）、Ｅｔｈｙｌ−１−（４−ｃｙａｎｏ−２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−６，７，８−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ−４−ｏｘｏ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＣＡＳ  １０４１４３８−６８−９）、４-（Ｎ-（４-Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｂｅｎｓｙｌ）-２-（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏ-Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏ）ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２-Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、５−Ｈｙｄｒｏｘｙ−９，１０-ｄｉｏｘｏ−９，１０-ｄｉｈｙｄｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ-１-ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ、Ｎ-（５-（Ｆｕｒａｎ-２-ｙｌ）-１，３，４−ｏｘａｄｉａｚｏｌ-２-ｙｌ）-２−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎｅ-４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、１７-Ｈｙｄｒｏｘｙ-ｊｏｌｋｉｎｏｌｉｄｅ  Ｂ、Ｎ-（１´，２-Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ-１，２´−ｂｉｎａｐｈｔａｌｅｎ−４´-ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（Ｆ１１１３−０７８９）、ａｒｙｌｓｕｌｐｈｏｎａｍｉｄｙｌ  ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  ａｍｉｄｅ等が挙げられる。なかでも、ＣＰ６９０５５０はすでにリウマチ薬として多くの患者に経口投与されている薬剤である。したがって、安全性の点で問題なく使用することができる。
【００１４】
本発明者らによって、椎間板変性症発症の機構におけるＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の関与が明らかになった。したがって、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の過剰な活性化を抑制する薬剤であればどのような薬剤を使用してもよい。現在のところ臨床応用に至っていない上記ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤も今後の研究によってヒトへの安全性が確認できれば、椎間板変性症の薬剤として使用することができる。また、新たに開発されるＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤も使用することができる。
【００１５】
ＣＰ６９０５５０が単独で製剤化されているとき、その製剤形態はどのような形態でもよいが、通常は錠剤が使用される。錠剤の場合、ＣＰ６９０５５０を有効成分として５ｍｇ〜１０ｍｇ／日投与すればよい。ＣＰ６９０５５０の椎間板変性症に対しての投与量は、上記投与量に基づいて投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。製剤化はＣＰ６９０５５０を担体、賦形剤、助剤等、医薬用に使用される添加剤とともに定法にしたがって混合し、所望の剤型に製剤化することができる。また、上記阻害剤に関しても、適宜剤型、投与量を設定することができる。
【００１６】
担体や賦形剤は、どのようなものを使用してもよいが、例えば、乳糖、トウモロコシデンプン若しくはその誘導体、タルク又はステアリン酸若しくはその塩などが挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤に使用される適切な賦形剤の例には、植物油、ロウ、脂肪、半固体又は液体ポリオール等が挙げられる。液剤及びシロップ剤の調製のための賦形剤の例には、水、ポリオール、サッカロース、転化糖及びグルコースなどが挙げられる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、線維輪（ａｎｎｕｌｕｓ  ｆｉｂｒｏｓｕｓ；ＡＦ）細胞に、候補物質を接触させ、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系により誘導されるシグナルや変動する遺伝子発現、タンパク質発現を指標とすればよい。線維輪細胞としては、マウス、ラット等げっ歯類から単離培養した初代線維輪細胞を用いれば良い。また、初代培養細胞として入手可能なヒト線維輪細胞等を用いても良い。さらに、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系により誘導されるシグナルや変動する遺伝子発現、タンパク質発現が、線維輪細胞と同様の挙動を示す培養細胞であれば好適に用いることができる。
【００１８】
ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系によって誘導される遺伝子、タンパク質発現としてはどのようなものを検出してもよいが、後述するＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、ＳＯＣＳ３、ＣＯＸ‐２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−１３のようなＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系によって誘導されることが知られている遺伝子やタンパク質発現を指標とすることができる。また、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の活性化によってリン酸化することが確認されたキナーゼ、あるいはＳＴＡＴ３自体を指標として用いても良い。
【００１９】
遺伝子発現の変化を検出するには、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等、ＲＮＡを定量的に測定することができる公知の方法を用いることができる。特に、ＲＴ‐ＰＣＲは感度良くｍＲＮＡ発現を定量することができる。また、タンパク質発現を定量するのであれば、免疫染色、ウェスタンブロッティング等、タンパク質発現を定量できる公知の方法を用いればよい。また、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の活性化によってリン酸化することが確認されたキナーゼやＳＴＡＴ３を検出する場合には、リン酸化型キナーゼやリン酸化型ＳＴＡＴ３を検出する抗体を用いて、免疫染色、ウェスタンブロッティングを行えばよい。シグナル伝達に関わるリン酸化されたタンパク質を検出することによって、活性化されたタンパク質を感度良く検出することができる。また、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３や、ＩＬ‐６により活性化するＭＡＰＫシグナル伝達系のキナーゼの活性化を公知の基質を用いて定量してもよい。
【００２０】
スクリーニングを行う化合物としては一般的に使用されているケミカルライブラリーを用いてもよいが、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系が標的であることが明らかであることから、既存の化合物の中からＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系を阻害することが知られている化合物をスクリーニングし椎間板変性症に効果のあるものを選択してもよい。さらに培養細胞で一次スクリーニングした化合物を椎間板変性症のモデル動物に適用し、その効果を検討してもよい。
以下、実施例を示しながら本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００２１】
［培養細胞を用いた検討］
椎間板変性症の患者において、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βといった炎症性サイトカインが検出されることはよく知られている。ＩＬ‐６がこれら炎症性サイトカインにより誘導されるかラット繊維輪細胞を用いて検討を行なった。
【００２２】
１．ラット線維輪細胞の調製
ラット線維輪細胞は以下のようにして調整した。ラット線維輪組織は、８週齢のメスのウィスターラットの腰部、及び尾骨の椎間板から分離し、０．０４％プロナーゼＥ（ＳＥＲＶＡ社製）を含むＤＭＥＭで３７℃、１時間処理し、引き続き０．０２５％コラゲナーゼＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で３７℃、４時間処理し単離した。単離した細胞は、非働化処理した５％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ  Ｌｅｎｅｘａ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製）で洗浄した。単離した線維輪細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。細胞は第５継代までを解析に用いた。
【００２３】
２．ＲＴ‐ＰＣＲによる解析
ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βを培地に添加して、ＩＬ‐６の遺伝子発現をＲＴ‐ＰＣＲにより解析した。ＴＮＦ‐αは０、１０、５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βは、０、５、２０ｎｇ／ｍＬで培地に添加し、２０時間後に細胞を集め以下のようにしてＲＴ‐ＰＣＲを行い解析した。
【００２４】
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、又はＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて調整した。ｃＤＮＡはＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）を用いて合成した。
【００２５】
ＲＴ‐ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）を用い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）によって増幅を行った。発現は、β−アクチン、又はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）によって正規化した。また、結果はｄｄＣｔ法によって解析を行った。
【００２６】
用いたＰＣＲプライマーは下記のとおりである。
ＩＬ‐６（Ｆ）    5′-ATTGTATGAACAGCGATGATGCA-3′（配列番号１）
（Ｒ）    5′-CCAGGTAGAAACGCAACTCCAGA-3′（配列番号２）
β‐アクチン（Ｆ）5′-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′  （配列番号３）
（Ｒ）5′-AAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAG-3′  （配列番号４）
ＨＰＲＴ（Ｆ）    5′-TCCTCATGGACTGATTATGGACA-3′（配列番号５）
（Ｒ）    5′-TAATCCAGCAGGTCAGCAAAGA-3′（配列番号６）
【００２７】
結果を図１Ａに示す。ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βどちらの刺激によっても濃度依存的にＩＬ‐６遺伝子の発現量の増加が観察された。培養細胞系で炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βによってＩＬ‐６が誘導されたことから、次に椎間板変性症の動物モデルを用いて検討を行なった。
【００２８】
［椎間板変性症モデル動物の検討］
本発明者らは、ＭＲＩ等を用いた解析結果より、ラット尾椎椎間板を穿刺することにより作成したモデル動物は、椎間板変性モデル動物としてヒト椎間板変性症と同様の性質を備えていることをすでに検証している。ＩＬ‐６発現について、椎間板変性モデル動物で発現が増加しているか確認した。
【００２９】
１．椎間板変性モデル動物の作成
８週齢のウィスターラットの３〜１０番目の尾椎椎間板を２３Ｇ針で穿刺することで椎間板変性モデル動物を作成した。また、展開のみで穿刺を行っていない群（Ｓｈａｍ群）をコントロール群とした。穿刺２ヶ月後にＭＲＩでＴ２髄内高輝度領域を測定し、ヒト椎間板変性症と同等の症状を呈していることを確認した（図示せず。）。すなわち、Ｔ２強調ＭＲＩの結果、穿刺群の椎間板は、コントロールの椎間板に比べ、有意にシグナルが低く、穿刺群の椎間板の高輝度領域の比は、コントロール群に対して有意に低い値であった。ＭＲＩによる結果は、ラット尾椎椎間板穿刺モデルの椎間板がヒト患者の椎間板変性症のモデルとなり得ることを示している。
【００３０】
２．椎間板変性モデル動物による、遺伝子発現、タンパク質発現の検討
ラット椎間板変性症モデル（Ｐｕｎｃｔｕｒｅ群）、及びコントロール群（Ｓｈａｍ群）から、穿刺１週後に椎間板組織を単離し、上記培養細胞の系と同様にしてＲＮＡを抽出し、ＲＴ‐ＰＣＲにより遺伝子発現の解析を行なった。ＩＬ‐６及びＩＬ‐６により発現が誘導されることが知られているＳＯＣＳ３の遺伝子発現の解析を行った。ＳＯＣＳ３のプライマーは以下の配列を用いた。
【００３１】
ＳＯＣＳ３（Ｆ）  5′-TCAACGGTCACCTGGACTCCTA-3′    （配列番号７）
（Ｒ）  5′-GGTCCAGGAACTCCCGAATG-3′      （配列番号８）
【００３２】
ＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３いずれもコントロール群に比べ、穿刺群では有意に高い遺伝子発現が観察された（図１Ｂ）。ＩＬ‐６だけではなく、ＳＯＣＳ３遺伝子の発現も誘導されていることから、ＩＬ‐６により誘導されるシグナル伝達系の活性化が示唆される。
【００３３】
次に、ウェスタンブロッティングにより解析を行なった（図１Ｃ）。穿刺後４週後に、椎間板組織を単離し、タンパク質をｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて抽出した。タンパク質抽出溶液、洗浄液には、タンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ロシュ社製）、１Ｍ  ＮａＦ、５０μＭ  ＮＡ３ＶＯ４添加して用いた。定法によりウェスタンブロッティングを行い解析した。一次抗体として、抗ＩＬ‐６抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗ＳＯＣＳ３抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗アクチン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用し、二次抗体としてＡｎｔ‐ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、ＥＣＬ検出試薬（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検出を行った。
【００３４】
図１Ｃに示すように、タンパク質レベルでも穿刺群（+）はコントロール群（-）に比べて、ＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３発現の増強が確認された。したがって、ラット動物モデルにおいても、培養細胞系と同様にＩＬ‐６、及びＳＯＣＳ３発現が増加している。
【００３５】
３．免疫組織染色による解析
次に、ラット動物モデル、及びヒト試料を用いて免疫組織染色を行った。ラット椎間板は穿刺後８週後の組織から得た。ヒト組織はインフォームドコンセントが得られた１０名の患者から外科手術によって得た。８名は変性腰椎側弯症（degenerative lumbar scoliosis）、１名は変性腰椎後弯症（degenerative lumbar kyphosis）、１名は成人突発性側弯症（adult idiopathic scoliosis）の患者である。変性していない椎間板は１７歳男性の剖検試料から得た。椎間板変性の程度は、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類によった。
【００３６】
免疫組織染色は以下のようにして行った。サンプルは４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、パラフィン包埋の後、４μｍの厚さで薄切した。ＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３の検出は、上記で用いた抗ＩＬ‐６抗体、抗ＳＯＣＳ３抗体を一次抗体として用い、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と反応させた後に検出を行った。検出はジアミノベンジジン（ナカライタスク社製）により行った。核はヘマトキシリンにより染色した。ラットモデルを用いた結果を図１Ｄに、ヒト患者組織を用いた結果を図１Ｅに示す。ラット動物モデル、ヒト患者いずれの場合においてもＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３は、コントロール群に比べ、穿刺群、あるいは患者群で強く染色しているのが観察された。特に、患者群ではＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類のグレードが高くなるほど、ＩＬ‐６、ＳＯＣＳ３ともに強い発現が観察された。
【００３７】
［ＩＬ‐６により誘導される遺伝子、タンパク質の解析］
ラット繊維輪培養細胞を用い、ＩＬ‐６により誘導される遺伝子の解析を行なった。ＩＬ‐６を１０、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培地に添加し、ＳＯＣＳ３、ＴＮＦ‐α、ＩＬ-１β、ＩＬ‐６、ＣＯＸ‐２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ‐１３の発現をＲＴ‐ＰＣＲによって解析した。解析は、上述のプライマー、及び下記のプライマーを用いて行なった。
【００３８】
ＴＮＦ‐α（Ｆ）  5′-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3′  （配列番号９）
（Ｒ）  5′-GGCTGACTTTCTCCTGGTATG-3′  （配列番号１０）
ＩＬ‐１β（Ｆ）  5′-GGACAGAAGATAAGCCAACAAG-3′（配列番号１１）
（Ｒ）  5′-TTCATCACACAGGACAGGTATAG-3′（配列番号１２）
ＣＯＸ‐２（Ｆ）  5′-TGAACACGGACTTGCTCACTTTG-3′  （配列番号１３）
（Ｒ）  5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′  （配列番号１４）
ＶＥＧＦ（Ｆ）    5′-TCCTGCAGCATAGCAGATGTGA-3′（配列番号１５）
（Ｒ）  5′-CCAGGATTTAAACCGGGATTTC-3′  （配列番号１６）
ＭＭＰ‐１３（Ｆ）5′-CCCTGATGTTTCCCATCTATACC-3′  （配列番号１７）
（Ｒ）5′-ATCTCCTGGACCATAGAGAGAC-3′  （配列番号１８）
【００３９】
発現は、上記と同様、β‐アクチン、又はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）によって正規化し、結果はｄｄＣｔ法によって解析を行った。結果を図２Ａに示す。
【００４０】
ＩＬ‐６により誘導されることが知られているＳＯＣＳ３、炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐α、ＩＬ-１βについて解析した。また、ＩＬ‐６はオートクリンに分泌されることが知られていることから、ＩＬ‐６自体についても解析を行なった。ＳＯＣＳ３、ＩＬ-１βの発現は、培地に添加するＩＬ‐６の濃度依存的に有意に増加していた。しかし、ＴＮＦ‐αの発現はＩＬ‐６を添加しても変化がなかった。炎症性サイトカインの制御は細胞種等によっても異なるが、一般にＴＮＦ-αによって、ＩＬ‐６等の炎症性サイトカインが誘導されることが示されている。ラット繊維輪細胞でもＴＮＦ‐αによりＩＬ‐６は誘導されるものの（図１参照。）、ＩＬ‐６によりＴＮＦ-αの誘導が生じないことが確認された。また、ＩＬ‐６自体の遺伝子発現も増加し、オートクリンに発現が制御されていることが確認された。
【００４１】
さらに、椎間板変性の患者で発現の増加が確認されているＣＯＸ-２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ‐１３は、ＩＬ‐６により濃度依存的に発現の増加が確認された。したがって、ＩＬ‐６によって、椎間板変性に伴って増加する遺伝子発現が誘導されている可能性が示唆された。
【００４２】
次に、ＩＬ‐６を添加することによるタンパク質発現の変化を解析した。ＩＬ‐６により誘導されることが知られているＳＯＣＳ３、椎間板変性で増加が認められるＣＯＸ-２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ‐１３についてウェスタンブロッティングにより解析した。コントロールはアクチンを用いて確認した（図２Ｂ）。ＩＬ‐６を１０、又は１００ｎｇ／ｍＬで培地に添加し２４時間後に、上記と同様にしてタンパク質を調整し、抗ＣＯＸ‐２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＶＥＧＦ抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製）、抗ＭＭＰ-１３抗体（ＰＲＯＴＥＩＮＴＥＣＨ社製）、上述の抗ＳＯＣＳ３抗体、抗アクチン抗体を一次抗体として用いて解析した。遺伝子発現同様、いずれのタンパク質もＩＬ‐６により濃度依存的に発現増強が確認された。
【００４３】
［ＩＬ‐６により誘導されるシグナル伝達系の解析］
１．ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３シグナル伝達系の関与
ＩＬ‐６の下流のシグナル伝達系の検討を行った。ＩＬ‐６によるシグナル伝達系としてＳＴＡＴ３、ＭＡＰＫ（ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫ）、さらに下流のＮＦ−κＢ（ｐ６５）が関与することが知られている。そこでこれらシグナル伝達系の関与について解析を行った。線維輪細胞を１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ‐６で処理し、０、５、１０、３０、６０分後に細胞を集めタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングにより解析を行った。タンパク質抽出、ウェスタンブロッティングは前記と同様にして行った。
【００４４】
抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、抗リン酸化ｐ３８抗体、抗ｐ３８抗体、抗リン酸化ＪＮＫ抗体、抗ＪＮＫ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ＮＦ-κＢ  ｐ６５抗体、抗ＮＦ-κＢ  ｐ６５抗体（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、ＥＣＬ検出試薬を用いて検出を行った。ＩＬ‐６添加１０分後に、ＳＴＡＴ３、ｐ３８、ＥＲＫが強くリン酸化していることが認められた（図３左）。
【００４５】
ＳＴＡＴ３は活性化するとリン酸化し、核内に移行し標的遺伝子を活性化することが知られている。ＳＴＡＴ３のリン酸化が確認されたことから、ＳＴＡＴ３の核内移行が起こっているか解析を行なった（図３右）。ラット繊維輪細胞に１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ‐６を添加し、３０分後にメタノール原液で固定した。抗ＳＴＡＴ３抗体、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を一次抗体として使用し、二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、蛍光免疫細胞染色を行なった。ＩＬ‐６を添加することによって、リン酸化したＳＴＡＴ３が核へ移行しているのが観察された。したがって、ＩＬ‐６によるシグナルはＳＴＡＴ３の経路によって伝達されているものと考えられる。
【００４６】
［ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３阻害剤の効果］
１．ＩＬ‐６に対するＣＰ６９０５５０に対する効果
ＩＬ‐６によるシグナル伝達がＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３を介して生じていることから、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤であるＣＰ６９０５５０の効果を調べた。ＩＬ‐６単独、あるいは１００ｎｇ／ｍＬのＣＰ６９０５５０で３０分前処理した後に、１００ｎｇ／ｍＬ濃度でＩＬ‐６を添加して、下流のシグナル伝達系に対して、どのような影響があるかを解析した（図４Ａ）。
【００４７】
ＩＬ‐６を単独で添加した場合には、ＩＬ‐６の添加によって、添加１５分後にはリン酸化ＳＴＡＴ３が著しく増加している。これに対し、リン酸化ＥＲＫの増加はごくわずかであることから、ＩＬ‐６によるシグナルは主としてＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３の系を介して伝達されていると考えられる。さらに、ＣＰ６９０５５０を添加することによってＳＴＡＴ３のリン酸化が抑制されるのが観察された、また、ＥＲＫのリン酸化はほとんど影響を受けないことから、ＣＰ６９０５５０がＳＴＡＴ３に特異的な阻害剤であることが確認された。
【００４８】
次に、遺伝子発現、タンパク質発現に対するＣＰ６９０５５０の効果を解析した。上記と同様にＣＰ６９０５５０で３０分前処理した後に、ＣＰ６９０５５０の存在下でＩＬ‐６を１００ｎｇ／ｍＬで添加し、ＳＯＣＳ３、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＣＯＸ‐２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ‐１３の遺伝子発現の変化をＲＴ‐ＰＣＲにより解析した（図４Ｂ）。ＳＯＣＳ３、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ‐１３は、ＣＰ６９０５５０添加により有意に発現の低下が観察された。ＣＯＸ‐２発現は有意ではないものの低下が観察された。
【００４９】
次に、ＣＯＸ‐２、ＳＯＣＳ３、ＭＭＰ‐１３タンパク質発現についても解析を行なった（図４Ｃ）。同様にＣＰ６９０５５０を３０分前処理した後に、ＣＰ６９０５５０の存在下でＩＬ‐６を１００ｎｇ／ｍＬで添加し、２４時間後に細胞を回収し、タンパク質を抽出した。遺伝子発現解析の結果同様、ＣＯＸ‐２、ＳＯＣＳ３、ＭＭＰ‐１３発現はＣＰ６９０５５０を添加することにより減少が観察された。
【００５０】
前述のように、ラット線維輪細胞による結果は、ヒト椎間板変性症のモデルとなるものである。したがって、ＳＴＡＴ３阻害剤であるＣＰ６９０５５０の効果がラット線維輪細胞培養系で認められたことは、ＣＰ６９０５５０がヒト椎間板変性症患者においても椎間板変性症に伴う遺伝子発現、タンパク質発現を抑制し得ることを意味している。さらに、ＣＰ６９０５５０によって、椎間板変性に伴う遺伝子、タンパク質発現を抑制することができることから、ＣＰ６９０５５０をはじめとするＪＡＫ‐ＳＴＡＴ３阻害剤を椎間板変性症に対する医薬として使用すれば椎間板変性症の進行を抑止し、症状の改善に寄与すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤、ＣＰ６９０５５０を椎間板変性症の治療に使用できる。ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３阻害剤は、椎間板変性症が要因である、腰痛、椎間板ヘルニア等の疾患の治療薬としても有効であると考えられる。また、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ３シグナル伝達系が椎間板変性の原因となることを明らかにしたことから、新たなスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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