(57)【要約】【課題】  Ｔｒｅｇ細胞を活性化して、自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び／又は治療に有用なＴｒｅｇ細胞活性組成物を提供する。【解決手段】メリンジョ種子成分のスチルベン類を有用成分とするＴｒｅｇ細胞活性組成物を自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び治療のために利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血制御性Ｔ細胞の割合を増加させるための下記式（１）及び（２）で表されるスチルベン類の少なくとも１つを有用成分とするメリンジョエキスを含有してなることを特徴とする制御性Ｔ細胞活性組成物
【化１】
2017081891.tif 000005
（式中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は水素原子，水酸基，Ｃ１〜Ｃ６の低級アルコキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基である）
【化２】
2017081891.tif 000006
（式中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は水素原子，水酸基，Ｃ１〜Ｃ６の低級アルコキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基である）
【請求項２】
前記スチルベン類の式（１）中のＲ１，Ｒ２，Ｒ６及びＲ８が水酸基であり，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７及びＲ９が水素原子，水酸基及びメトキシ基から選ばれることを特徴とする請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物
【請求項３】
前記スチルベン類の式（２）中のＲ１，Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６及びＲ８が水酸基であり，Ｒ３，Ｒ５，Ｒ７及びＲ９が水素原子，水酸基及びメトキシ基から選ばれることを特徴とする請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物
【請求項４】
前記スチルベン類の式（１）中のＲ１及びＲ６が水酸基であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９が水素原子，水酸基，メトキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基であることを特徴とする請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物
【請求項５】
前記スチルベン類の式（２）中のＲ１及びＲ６が水酸基であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９が水素原子，水酸基，メトキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基であることを特徴とする請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物
【請求項６】
前記スチルベン類の式（１）中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ４，Ｒ６及びＲ８が水酸基であってＲ３，Ｒ５，Ｒ７及びＲ９が水素原子であるグネチンＣ及び／又はＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ６及びＲ８が水酸基，Ｒ５がメトキシ基であってＲ４，Ｒ７及びＲ９が水素原子であるグネチンＬであることを特徴とする請求項２記載の制御性Ｔ細胞活性組成物
【請求項７】
請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物を添加してなることを特徴とする飲食品
【請求項８】
請求項１記載の制御性Ｔ細胞活性組成物を薬効物質として配合してなることを特徴とする予防および治療剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、末梢血制御性Ｔ細胞の割合を増加させるためのスチルベン類を有用成分とするメリンジョエキスを含有してなる制御性Ｔ細胞活性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  生体防御機構である免疫は外部から侵入する病原菌やウイルスおよび腫瘍細胞の排除を司るが，免疫系の過剰な働きは自己反応性により自己免疫疾患をもたらす。この免疫異常反応から生体を守るために制御性Ｔ細胞（以下，Ｔｒｅｇ細胞と略する）は免疫系の崩壊を抑制して免疫の恒常性維持に重要な役割を果たしている。Ｔｒｅｇ細胞は自己免疫だけでなく炎症，アレルギー性疾患，腫瘍免疫，感染免疫などについても抑制作用を示すことが明らかにされている。【０００３】  Ｔｒｅｇ細胞の数的又は機能的な異常は自己免疫疾患やアレルギー疾患に繋がると言われており，自己免疫疾患，炎症性腸疾患，アレルギー疾患などの免疫疾患が若年層を中心に急速に増加している。炎症性腸疾患マウスにＴｒｅｇ細胞を移入すると、疾患が治癒することから、Ｔｒｅｇ細胞は炎症性腸疾患の抑制に重要な役割を担っていると考えられている（非特許文献１）。Ｔｒｅｇ細胞の除去によって誘導される炎症性腸炎が腸内細菌に対する過剰免疫応答による可能性が指摘されていることから、Ｔｒｅｇ細胞は慢性感染症においては病原微生物に対する免疫応答を抑制していると考えられている（非特許文献２）。最近，クロストリジウム属細菌の利用によるＴｒｅｇ細胞の増殖及び集積を誘導する組成物が特許文献１に開示され，自己免疫疾患の治療及び予防剤としてのペプチドが特許文献２に開示されているが，植物エキスによるＴｒｅｇ細胞活性化に関しては未だ開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２３７６９０号公報
【特許文献２】特開２０１５−３８０８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｔｔｅｔ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：３９３９‐３９４３（２００３）
【非特許文献２】Ｋｏｈ，ＷＰ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：７２０８−７２１６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は，食品として使用されている安全な食材を利用することによりＴｒｅｇ細胞を活性化して、自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び／又は治療に有用なＴｒｅｇ細胞活性組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは，上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果，インドネシア産グネツム科植物のメリンジョ（Ｇｎｅｔｕｍ  ｇｎｅｍｏｎ）の種子に含まれる成分にＴｒｅｇ細胞の循環数を増加させる作用を見出し，本発明を完成するに至った。即ち，自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び治療のためにメリンジョ種子成分のスチルベン類を有用成分として利用するＴｒｅｇ細胞活性組成物に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】  本発明によると，東南アジアでよく食されているメリンジョ種子は安全であり，その成分であるスチルベン類がＴｒｅｇ細胞の活性化に関与するので，自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び治療に貢献できる。また，このような作用を有するスチルベン類の飲用だけでなくそれらを含有するメリンジョ種子エキス及び飲食品の摂取は，日常生活の中で自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び治療に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図の縦軸は、ＣＤ２５高ＣＤ１２７−／低細胞割合（単位はパーセント）を示す。横軸は、左から順に飲用直前（０週）、飲用開始２週後、４週後、６週後（飲用中止２週後）の測定を示す。ｎｓは、「有意差無し」を示す。数値は有意差の存在（Ｐ値）を示す。
【図２】図の縦軸は、Ｔｒｅｇ細胞の割合（単位はパーセント）を示す。横軸は、メリンジョエキス粉末の濃度を表し，左から順に０μｇ／ｍＬ（対照），２μｇ／ｍＬ，５μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明で言う下記式（１）で表されるスチルベン類とは，
【化３】
2017081891.tif 000002
（式中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は水素原子，水酸基，Ｃ１〜Ｃ６の低級アルコキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基である）
ジヒドロベンゾフラン環及び二重結合がそれぞれトランス及び／又はシスである化合物を指し，
式（１）の２量体である下記式（３）で表されるスチルベン類とは，
【化４】
2017081891.tif 000003
（式中，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は水素原子，水酸基，Ｃ１〜Ｃ６の低級アルコキシ基及びグルコキシ基から選ばれる基である）
ジヒドロベンゾフラン環及び二重結合がそれぞれトランス及び／又はシスである化合物を指し，これらの少なくとも１種が有効成分として含有することが好ましい。【００１１】  本発明で言うスチルベン類は，２量体のグネチンＣ，グネチンＬ，ε‐ビニフェリン，シルプシンＢ，グネモノシドＡ，グネモノシドＢ，グネモノシドＣ，グネモノシドＤ，グネモノシドＬ，ε‐ビニフェリングルコピラノシドなどが挙げられる。【００１２】  本発明で使用するスチルベン類は，食用植物であるメリンジョ，ブドウ，ブルーベリーやリンゴンベリーなどのベリー類，パッションフルーツなどに含まれているので，果実，種，根茎，茎，幹皮，花，葉，全草などの固形状物，破砕状物，粉末状物，スライス状物及びペースト状物を通常の一般的抽出により抽出物の形態で容易に得ることができる。【００１３】  植物の抽出には有機溶剤を使用するが，水と混合し得る極性溶剤としては，メタノール，エタノール，１‐プロパノール，２‐プロパノール，１‐ブタノール，エチレングリコール，プロピレングリコール，グリセリンなどのアルコール類（ジオール，トリオールを含む），ジエチルエーテル，セロソルブ，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類（環状エーテルを含む），酢酸メチル，酢酸エチル，セロソルブアセテートなどのエステル類，アセトンなどのケトン類，酢酸，氷酢酸，プロピオン酸などの常温で液体の有機酸，及びエチレンジアミン，ピリジン，モノメタノールアミンなどのアミン類などを挙げることができ，非極性溶剤としてはヘキサン，石油エーテル，ベンゼン，トルエンなどの炭化水素類，ジクロロメタン，クロロホルム，ジクロロエタンなどのハロゲン系溶剤を挙げることができて単一若しくは混合して混合して用いる。極性溶剤の場合は水を混合して使用できる。【００１４】  上記植物抽出物はペースト状物，固形物などの形態で得られ，シリカゲル，ポーラスポリマー，逆相カラムクロマトグラフ法又はゲル濾過クロマトグラフ法などにより各成分を分離することができる。さらに通常の方法により精製して前記式（１）および（２）の化合物を単離することができる。【００１５】  本発明のＴｒｅｇ細胞活性組成物は，服用の目的や服用者の状況（性別、年齢、体重、肥満度、総合的健康度合いなど）により異なるが、通常、１日の服用量として、１０〜２０００ｍｇ／人の範囲で飲用することができる。原料の植物は常食されているので２０００ｍｇ／人を超える飲用も何ら問題はない。また、動物にあっても同様に適用することができる。【００１６】  本発明のＴｒｅｇ細胞活性組成物は，澱粉類，デキストリン，微結晶セルロース，糖類などの賦形剤，メチルセルロース，ポリビニールピロリドンなどの結合剤などを配合して通常の方法により粉末及び顆粒の製造，その粉末及び顆粒にステアリン酸マグネシウム，ショ糖脂肪酸エステル，シリカゲルなどの滑沢剤及びカルボキシメチルセルロースカルシウム，寒天などの崩壊剤を配合して通常の方法により錠剤の製造，その粉末及び顆粒にタルクなどの滑沢剤を配合して硬カプセルの製造に用いることができる。Ｔｒｅｇ細胞活性組成物にショ糖脂肪酸エステル，グリセリン脂肪酸エステル，大豆レシチンなどの乳化剤及��ココナッツオイル，オリーブオイル，エゴマ油などの油脂を配合して軟カプセルを製造することができる。また，Ｔｒｅｇ細胞活性組成物を含有する抽出物を上記と同様に処理・操作して粉末，顆粒，錠剤，カプセル剤などを製造することができる。【００１７】  また，飲用及び摂取の目的，即ち飲食の容易さ，水溶性の改善，脂溶性の改善，腸管吸収の改善などに応じてブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖などの甘味料、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸などの酸味料、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウムなどの酸化防止剤、グリセリン、プロピレングリコールなどの品質改良剤、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルなどの乳化剤、α‐シクロデキストリン，β‐シクロデキストリン，γ‐シクロデキストリン，分枝シクロデキストリンなどの環状オリゴ糖，アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天などの糊料（増粘剤、安定剤、ゲル化剤）、ビタミン類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウムなどの強化剤、アミノ酸などの調味料、カルシウム塩類、着色料、膨張剤、着香料、保存料など、一般的飲食品原料として使用されているものを適宜配合して飲食品を製造することもできる。さらに，食品素材と混合して加工食品を製造することもできる。【００１８】  口腔粘膜および皮膚からの吸収をよくするために上記乳化剤および環状オリゴ糖を配合して口腔剤および経皮剤にすることもできる。
【実施例】
【００１９】  以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００２０】実施例１（粉末の製造）
メリンジョ種子の内乳粉末１部を５０％エタノール３部に２日間浸漬後，濾過した濾液を減圧濃縮して樹脂状のメリンジョエキス０．０９３部を得た。このエキスに３０％エタノール０．２部を加えて加熱溶解後，分枝シクロデキストリン０．１部およびデキストリン０．１部を水１部に溶解した熱溶液を加えて９０℃で３０分間加熱殺菌した。この殺菌液を８０メッシュフィルター濾過しながらスプレードライしてメリンジョエキス粉末０．２８部を得た。【００２１】実施例２（錠剤の製造）
実施例１の粉末１部に崩壊剤及び滑沢剤を加えて打錠して１錠３００ｍｇのメリンジョエキス錠１．１４部を製造した。
本錠剤は，高速液体クロマトグラフ法（ＯＤＳカラム，氷酢酸１％含有アセトニトリル／１％酢酸＝１〜２．４：４））による定量の結果，主成分としてグネチンＣを７．７ｍｇ含有していた。また，グネチンＣの配糖体であるグネモノシドＡ及びＤもそれぞれ３．４及び４．７ｍｇ含まれており，それらの配糖体は腸内細菌叢で加水分解されてアグリコンであるグネチンＣに変換されることが期待できる。その他次のような上記以外のスチルベン類の面積比は，グネチンＣ１００に対してグネモノシドＣが２７．３，グネチンＬが１０．１，レスベラトロール‐４‘‐Ο‐β‐Ｄ−グルコピラノシドが７．９，イソラポンチゲニン‐３‐Ο‐β‐Ｄ−グルコピラノシドが６．６，トランス‐レスベラトロールが６．３，イソラポンチゲニンが３．５，パイシードが３．０，ε‐ビニフェリンが２．８であった。
2017081891.tif 000004
【００２２】実施例３（臨床試験）
健常な被験者５名が実施例２の錠剤２０錠を１日１回４週間飲用した後，２週間休止した。末梢血を飲用直前，飲用開始２週後，飲用開始４週後，および６週後（４週後に飲用中止してから２週後）に採取し，単核球を収集して凍結保存した。本凍結保存単核球を温浴で解凍後，洗浄し，抗原ＡＰＣ，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ２５およびＣＤ１２７のそれぞれに対応する蛍光色素標識抗体を加え，３０分間室温静置して染色した。洗浄後，生理食塩水で浮遊させてマルチカラーフローサイトメーターで末梢血Ｔｒｅｇ細胞割合を測定した。（１）前方散乱と側方散乱におけるリンパ球分画，（２）ＡＰＣ陰性、（３）ＣＤ３陽性、（４）ＣＤ４陽性、（５）ＣＤ２５強陽性（高）、（６）ＣＤ１２７陰性または弱陽性（−／低）の全条件を満たす細胞をＴｒｅｇと定義し，（１）乃至（４）の全条件を満たす細胞のうち、（５）および（６）の両条件を満たす細胞（ＣＤ２５高ＣＤ１２７−／低）の割合を各被検者毎経日的に測定して記録した。その結果は図１の通りであり，経日的に細胞（ＣＤ２５高ＣＤ１２７−／低）の割合が増加して末梢血Ｔｒｅｇの活性化が認められ，飲用中止２週後には飲用開始前の状態に戻った。【００２３】実施例４（試験管内試験）
健常人３名の血液から調製された末梢血単核球を，ＩＬ−１５および抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを補った培養液中で４日間培養した。培養液には実施例２で製造した錠剤を粉砕した粉末（終濃度：０，２，５，１０μｇ／ｍＬ）または実施例１と同様に操作して得られるメリンジョエキスをシリカゲルカラムに付して分離精製した含量９８％のグネチンＣ（終濃度：０，０．０５１，０．１２８，０．２５７μｇ／ｍＬ，エキス粉末における濃度に対応する量）を共存させた。培養後，それぞれの培養液から細胞を収集し，実施例２と同様に蛍光色素標識抗体で染色してマルチカラーフローサイトメーターで末梢血Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５高ＣＤ１２７−／低）割合を測定した。その結果，いずれも濃度依存的にＴｒｅｇ細胞割合が増加してＴｒｅｇの活性化が認められたが，グネチンＣの場合は濃度全般的に粉末の割合に対して平均８１％であった。このことはグネチンＣだけでなくメリンジョエキス中の他の成分もＴｒｅｇの活性化に関与していることを示唆している。【００２４】実施例５（乳化製剤の製造）
実施例１と同様に操作して得られるメリンジョエキスを三菱化学製セパビーズで精製してグネチンＣを９０％含有するメリンジョエキスを得た。本エキス１部をエタノール２部に溶解後，ショ糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１５）０．４部を添加して加熱溶解し，デキストリン１部を溶解した水７部の水溶液にホモジナイザーでかき混ぜながら加えて乳化液を調製した。本乳化液を凍結乾燥して粉体状の乳化製剤２．３部を製造した。【００２５】実施例６（包接製剤の製造）
実施例５と同様に操作して得たメリンジョエキス１部エタノール２部に溶解後，分枝シクロデキストリン２部を溶解した水７部の加熱水溶液にかき混ぜながら加えて溶解し，冷後，凍結乾燥して粉体状の包接製剤２．９部を製造した。【００２６】実施例７（乳化製剤の製造）
実施例１と同様に操作して得られるメリンジョエキス１部を，ポリグリセリン脂肪酸エステル（ＨＬＢ１２）０．２部およびソルビタン脂肪酸エステル（ＨＬＢ３）０．５部を加温ココナッツオイル５部に溶かした溶液に加えて混合して粘性のある乳化製剤６．７部を製造した。【００２７】実施例８（チョコレートの製造）
実施例７の乳化製剤１部を加温しながらショ糖０．５部，全脂粉乳０．７部およびココア１．５部の混合粉を加えて混練りした後，冷却して固形チョコレート３．７部を製造した。【００２８】実施例９（クッキーの製造）
実施例１のメリンジョエキス粉末１部、薄力粉２．３部、全卵１．６部、ココナッツオイル１部，バター１部、上白糖２．５部、ベーキングパウダー０．０２及び水０．７３部を混練りして型取りし，オーブンで加熱してクッキー８．０部を製造した。【００２９】実施例１０（プリンの製造）
実施例５の乳化製剤１部および砂糖４部の混合粉を牛乳４０部にかき混ぜながら加えて溶かした後，裏漉しした全卵液２５部を混合してバニラエッセンスを適量添加し，湯煎で加熱してプリン７０部を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  本発明のＴｒｅｇ細胞活性組成物は，食されて安全なメリンジョ種子の成分のスチルベン類を含有するメリンジョエキスからなり，飲食品ならびに予防および治療剤に配合することにより，自己免疫疾患，炎症性疾患，アレルギー性疾患，腫瘍免疫疾患，感染性疾患などの免疫疾患の予防及び治療に有用である。本組成物はペットや家畜などの動物の飼料に添加して使用することもできる。
【図１】
2017081891.tif 000007
【図２】
2017081891.tif 000008