(57)【要約】【課題】核酸分子をナノ流路内に１分子ずつ効率的に誘導することのできる流路デバイスを用いた観察装置を提供する。【解決手段】核酸分子の観察・分析に用いられる観察装置は、核酸分子が流動可能な流路デバイス、流路デバイスを保持する保持部、電圧印加部及び流路デバイス内を流動する核酸分子を観察する観察部を備え、流路デバイスは、核酸分子を導入可能な複数の導入部と、複数の導入部のうちの２つの導入部の間を接続する案内流路と、案内流路の途中から分岐する少なくとも１つ分岐流路と、少なくとも１つの排出部と、分岐流路と排出部との間を接続するナノ流路部とを有し、電圧印加部は、２つの導入部間に電圧を印加する第１電圧印加部及び一方の導入部・排出部間に電圧を印加する第２電圧印加部を含み、第１電圧印加部及び第２電圧印加部は、それぞれ独立して電圧を印加可能に構成される。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の観察・分析に用いられる観察装置であって、
前記核酸分子が流動可能な流路デバイスと、前記流路デバイスを保持する保持部と、電圧印加部と、前記流路デバイス内を流動する前記核酸分子を観察する観察部とを備え、
前記流路デバイスは、前記核酸分子を導入可能な複数の導入部と、前記複数の導入部のうちの２つの導入部の間を接続する案内流路と、前記案内流路の途中から分岐する少なくとも１つ分岐流路と、少なくとも１つの排出部と、前記分岐流路と前記排出部との間を接続するナノ流路部とを有し、
前記電圧印加部は、前記複数の導入部のうちの少なくとも２つの導入部の間に電圧を印加する第１電圧印加部、及び当該２つの導入部のうちの一方の導入部と前記排出部との間電圧を印加する第２電圧印加部を含み、
前記第１電圧印加部及び前記第２電圧印加部は、それぞれ独立して電圧を印加可能であることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記第１電圧印加部は、印加電圧を変化させ得ることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記第２電圧印加部は、印加電圧を変化させ得ることを特徴とする請求項１又は２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第１電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項５】
前記第２電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得ることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項６】
前記流路デバイスは、複数の前記排出部を有し、
前記電圧印加部は、前記複数の排出部のうちの少なくとも２つの排出部の間に電圧を印加する第３電圧印加部をさらに含み、
前記第２電圧印加部は、前記２つの導入部のうちの一方の導入部と前記２つの排出部のうちの一方の排出部との間に電圧を印加することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項７】
前記第３電圧印加部は、印加電圧を変化させ得ることを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
【請求項８】
前記第３電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得ることを特徴とする請求項６又は７に記載の観察装置。
【請求項９】
前記分岐流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１０】
前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いことを特徴とする請求項９に記載の観察装置。
【請求項１１】
前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化することを特徴とする９又は１０に記載の観察装置。
【請求項１２】
前記分岐流路のうち、前記案内流路に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１３】
前記分岐流路の深さが、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１４】
前記ナノ流路部が、互いに平行に並ぶ複数の管状構造により構成されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１５】
前記流路デバイスの平面視において、前記分岐流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記案内流路側から前記ナノ流路部に向かって徐々に拡幅する拡幅部を有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１６】
前記分岐流路は、前記案内流路の流路方向の略中央に接続していることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１７】
前記案内流路と前記分岐流路の接続部及び／又は前記導入部と前記案内流路の接続部における側壁面が、曲面形状を有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１８】
前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路の幅は、前記２つの導入部との接続部分から、前記分岐流路との接続部分に向けて漸減することを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１９】
前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路が前記分岐流路との接続部側に向けて凸状に湾曲していることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２０】
前記案内流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２１】
前記導入部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２２】
前記流路デバイスは、前記ナノ流路部と前記排出部との間を接続する排出流路をさらに有し、
前記排出流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２３】
前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いことを特徴とする請求項２２に記載の観察装置。
【請求項２４】
前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化することを特徴とする請求項２２又は２３に記載の観察装置。
【請求項２５】
前記排出流路のうち、前記排出部に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いことを特徴とする請求項２２〜２４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２６】
前記排出流路の深さが、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化することを特徴とする請求項２２〜２５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２７】
前記流路デバイスの平面視において、前記排出流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記ナノ流路部側から前記排出部に向かって徐々に幅が狭くなる減幅部を有することを特徴とする請求項２２〜２６のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２８】
前記流路デバイスは、複数の前記排出部と、前記複数の排出部のうちの２つの排出部の間を接続する排出分岐流路を有し、
前記排出流路は、前記排出分岐流路の流路方向の略中央に接続していることを特徴とする請求項２２〜２７のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２９】
前記排出分岐流路と前記排出流路との接続部及び／又は前記排出部と前記排出分岐流路との接続部における側壁面が、曲面形状を有することを特徴とする請求項２８に記載の観察装置。
【請求項３０】
前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路の幅は、前記排出流路との接続部分から、前記各排出部との接続部分に向けて漸増することを特徴とする請求項２８又は２９に記載の観察装置。
【請求項３１】
前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路が前記排出流路との接続部側に向けて凸状に湾曲していることを特徴とする請求項２８〜３０のいずれかに記載の観察装置。
【請求項３２】
前記排出分岐流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項２８〜３１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項３３】
前記排出部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有することを特徴とする請求項１〜３１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項３４】
前記流路デバイスは、ガラス製であることを特徴とする請求項１〜３３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項３５】
前記核酸分子の異常部位を検出するために用いられることを特徴とする請求項１〜３４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項３６】
前記観察部は、倒立光学系により構成されることを特徴とする請求項１〜３５のいずれかに記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関し、特に核酸分子を１分子レベルで観察し、分析するために用いられる観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡを増幅させることなく、１分子のＤＮＡの塩基配列を短時間に、低コストで解析するために用いられるＤＮＡシーケンサーは、学術的な研究の分野にとどまらず、医療、創薬等の分野においても盛んに開発されており、今後の技術進歩に益々関心が寄せられている。がん細胞においては、がん抑制遺伝子のＣｐＧサイト（シトシン−グアニン配列に富む５００〜２０００塩基対領域）に異常なＤＮＡメチル化が発生することが知られており、上記ＤＮＡシーケンサーを用い、がん細胞に特有の遺伝子異常を有するＤＮＡの塩基配列を１分子レベルで解析することができれば、がんの早期発見に応用することができる。
【０００３】
かかるＤＮＡシーケンサーにおいて、ＤＮＡを１分子レベルで流動させるためのデバイスとして、近年、半導体微細加工技術を利用し、ナノ流路等の微細構造体が基板上に設けられてなる流路デバイスの開発が進められている。この流路デバイスを用い、ＤＮＡの高次構造をほどいて１分子レベルで分離・抽出し、ＤＮＡを伸長させた状態で流路を通過させることにより、ＤＮＡの１分子レベルでの観察・分析が可能となる。
【０００４】
このようなＤＮＡシーケンサーに用いられる流路デバイスとして、２つのリザーバ（導入口及び排出口）と、２つのリザーバ間を連通するナノ流路とを備えるものが提案されており（特許文献１参照）、２つのリザーバ間に電圧を印加することで、ＤＮＡをナノ流路に導き、ナノ流路を通過するＤＮＡ分子を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−９７０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡ分子を伸長させて１分子レベルで解析するためには、リザーバに導入されたＤＮＡを効率的にナノ流路に誘導することが必要となる。しかしながら、上記特許文献１に記載の流路デバイスにおいて、２つのリザーバ間に電圧を印加すると、一方のリザーバに導入されたＤＮＡ分子が、ナノ流路の入口において詰まってしまい（滞留してしまい）、ＤＮＡ分子を１分子ずつナノ流路内に効率的に誘導することが困難であるという問題がある。
【０００７】
また、ＤＮＡシーケンサーにおいては、上記流路デバイスのナノ流路を通過するＤＮＡ分子を観察・分析するが、リザーバにナノ流路が直接接続していると、ナノ流路を通過するＤＮＡ分子の速度（泳動速度）が速すぎてしまうという問題もある。ＤＮＡ分子の泳動速度を遅くするために印加電圧を小さくすると、ＤＮＡ分子がリザーバからナノ流路の入口まで移動するのに時間がかかってしまい、ＤＮＡ分子のナノ流路への効率的な誘導が困難となるという問題がある。
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明は、核酸分子をナノ流路内に１分子ずつ効率的に誘導することのできる流路デバイスを用いた観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、核酸分子の観察・分析に用いられる観察装置であって、前記核酸分子が流動可能な流路デバイスと、前記流路デバイスを保持する保持部と、電圧印加部と、前記流路デバイス内を流動する前記核酸分子を観察する観察部とを備え、前記流路デバイスは、前記核酸分子を導入可能な複数の導入部と、前記複数の導入部のうちの２つの導入部の間を接続する案内流路と、前記案内流路の途中から分岐する少なくとも１つ分岐流路と、少なくとも１つの排出部と、前記分岐流路と前記排出部との間を接続するナノ流路部とを有し、前記電圧印加部は、前記複数の導入部のうちの少なくとも２つの導入部の間に電圧を印加する第１電圧印加部、及び当該２つの導入部のうちの一方の導入部と前記排出部との間に電圧を印加する第２電圧印加部を含み、前記第１電圧印加部及び前記第２電圧印加部は、それぞれ独立して電圧を印加可能であることを特徴とする観察装置を提供する（発明１）。
【００１０】
上記発明（発明１）によれば、核酸分子を含む試料が導入され得る２つの導入部間を接続する案内通路の途中に、分岐流路を介してナノ流路部が接続するとともに、第１及び第２電圧印加部が、２つの導入部間と、導入部・排出部間とにそれぞれ電圧を独立して印加することができることで、導入部に導入された核酸分子が、案内流路を移動して、分岐流路を介してナノ流路部に１分子ずつ案内されるため、ナノ流路部にて核酸分子を１分子ごとに観察することができる。
【００１１】
上記発明（発明１）において、前記第１電圧印加部は、印加電圧を変化させ得るのが好ましく（発明２）、前記第２電圧印加部は、印加電圧を変化させ得るのが好ましく（発明３）、前記第１電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得るのが好ましく（発明４）、前記第２電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得るのが好ましい（発明５）。
【００１２】
上記発明（発明１〜５）において、前記流路デバイスは、複数の前記排出部を有し、前記電圧印加部は、前記複数の排出部のうちの少なくとも２つの排出部の間に電圧を印加する第３電圧印加部をさらに含み、前記第２電圧印加部は、前記２つの導入部のうちの一方の導入部と前記２つの排出部のうちの一方の排出部との間に電圧を印加するのが好ましい（発明６）。
【００１３】
上記発明（発明６）において、前記第３電圧印加部は、印加電圧を変化させ得るのが好ましく（発明７）、前記第３電圧印加部は、印加電圧の極性を反転させ得るのが好ましい（発明８）。
【００１４】
上記発明（発明１〜８）において、前記分岐流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく（発明９）、前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いのが好ましく（発明１０）、前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい（発明１１）。
【００１５】
上記発明（発明１〜１１）において、前記分岐流路のうち、前記案内流路に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いのが好ましく（発明１２）、前記分岐流路の深さが、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい（発明１３）。
【００１６】
上記発明（発明１〜１３）において、前記ナノ流路部が、互いに平行に並ぶ複数の管状構造により構成されるのが好ましい（発明１４）。
【００１７】
上記発明（発明１〜１４）において、前記流路デバイスの平面視において、前記分岐流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記案内流路側から前記ナノ流路部に向かって徐々に拡幅する拡幅部を有するのが好ましく（発明１５）、前記分岐流路は、前記案内流路の流路方向の略中央に接続しているのが好ましい（発明１６）。
【００１８】
上記発明（発明１〜１６）において、前記案内流路と前記分岐流路の接続部及び／又は前記導入部と前記案内流路の接続部における側壁面が、曲面形状を有するのが好ましく（発明１７）、前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路の幅は、前記２つの導入部との接続部分から、前記分岐流路との接続部分に向けて漸減するのが好ましく（発明１８）、前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路が前記分岐流路との接続部側に向けて凸状に湾曲しているのが好ましい（発明１９）。
【００１９】
上記発明（発明１〜１９）において、前記案内流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく（発明２０）、前記導入部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましい（発明２１）。
【００２０】
上記発明（発明１〜２１）において、前記流路デバイスは、前記ナノ流路部と前記排出部との間を接続する排出流路をさらに有し、前記排出流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく（発明２２）、前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いのが好ましく（発明２３）、前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい（発明２４）。
【００２１】
上記発明（発明２２〜２４）において、前記排出流路のうち、前記排出部に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いのが好ましく（発明２５）、前記排出流路の深さが、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい（発明２６）。
【００２２】
上記発明（発明２２〜２６）において、前記流路デバイスの平面視において、前記排出流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記ナノ流路部側から前記排出部に向かって徐々に幅が狭くなる減幅部を有するのが好ましい（発明２７）。
【００２３】
上記発明（発明２２〜２７）において、前記流路デバイスは、複数の前記排出部と、前記複数の排出部のうちの２つの排出部の間を接続する排出分岐流路を有し、前記排出流路は、前記排出分岐流路の流路方向の略中央に接続しているのが好ましく（発明２８）、前記排出分岐流路と前記排出流路との接続部及び／又は前記排出部と前記排出分岐流路との接続部における側壁面が、曲面形状を有するのが好ましく（発明２９）、前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路の幅は、前記排出流路との接続部分から、前記各排出部との接続部分に向けて漸増するのが好ましく（発明３０）、前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路が前記排出流路との接続部側に向けて凸状に湾曲しているのが好ましい（発明３１）。
【００２４】
上記発明（発明２８〜３１）において、前記排出分岐流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく（発明３２）、前記排出部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましい（発明３３）。
【００２５】
上記発明（発明１〜３３）において、前記流路デバイスは、ガラス製であるのが好ましく（発明３４）、前記核酸分子の異常部位を検出するために用いられるのが好ましく（発明３５）、前記観察部は、倒立光学系により構成されるのが好ましい（発明３６）。
【００２６】
なお、本発明における核酸分子の観察・分析に用いられる流路デバイスは、核酸分子を導入可能な複数の導入部と、前記複数の導入部のうちの２つの導入部の間を接続する案内流路と、前記案内流路の途中から分岐する少なくとも１つ分岐流路と、少なくとも１つの排出部と、前記分岐流路と前記排出部との間を接続するナノ流路部とを備え、前記分岐流路には、複数の柱状体を有するピラーアレイ構造体が形成されていることを特徴とする。
【００２７】
上記流路デバイスにおいて、前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いのが好ましく、前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましく、前記分岐流路のうち、前記案内流路に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いのが好ましく、前記分岐流路の深さが、前記案内流路側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい。
【００２８】
また、上記流路デバイスにおいて、前記ナノ流路部が、互いに平行に並ぶ複数の管状構造により構成されるのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記分岐流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記案内流路側から前記ナノ流路部に向かって徐々に拡幅する拡幅部を有するのが好ましく、前記分岐流路は、前記案内流路の流路方向の略中央に接続しているのが好ましく、前記案内流路と前記分岐流路の接続部及び／又は前記導入部と前記案内流路の接続部における側壁面が、曲面形状を有するのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路の幅は、前記２つの導入部との接続部分から、前記分岐流路との接続部分に向けて漸減するのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記案内流路が前記分岐流路との接続部側に向けて凸状に湾曲しているのが好ましい。
【００２９】
上記流路デバイスにおいて、前記案内流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく、前記導入部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく、前記ナノ流路部と前記排出部との間を接続する排出流路をさらに有し、前記排出流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく、前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側にて最も広く、前記ナノ流路部側にて最も狭いのが好ましく、前記排出流路が有する前記ピラーアレイ構造体の隣接する前記柱状体の間隔が、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって狭くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましい。
【００３０】
上記流路デバイスにおいて、前記排出流路のうち、前記排出部に接続する部分の深さが最も深く、前記ナノ流路部に接続する部分の深さが最も浅いのが好ましく、前記排出流路の深さが、前記排出部側から前記ナノ流路部側に向かって浅くなるように、連続的に又は段階的に変化するのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記排出流路は、前記ナノ流路部に接続し、前記ナノ流路部側から前記排出部に向かって徐々に幅が狭くなる減幅部を有するのが好ましい。
【００３１】
上記流路デバイスは、複数の前記排出部と、前記複数の排出部のうちの２つの排出部の間を接続する排出分岐流路を有し、前記排出流路は、前記排出分岐流路の流路方向の略中央に接続しているのが好ましく、前記排出分岐流路と前記排出流路との接続部及び／又は前記排出部と前記排出分岐流路との接続部における側壁面が、曲面形状を有するのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路の幅は、前記排出流路との接続部分から、前記各排出部との接続部分に向けて漸増するのが好ましく、前記流路デバイスの平面視において、前記排出分岐流路が前記排出流路との接続部側に向けて凸状に湾曲しているのが好ましい。
【００３２】
上記流路デバイスにおいて、前記排出分岐流路は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく、前記排出部は、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましく、前記流路デバイスは、ガラス製であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、核酸分子をナノ流路内に１分子ずつ効率的に誘導することのできる流路デバイスを用いた観察装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における流路デバイス概略構成を示す平面図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態における流路デバイスの概略構成を示す、図１におけるＩ−Ｉ線切断端面図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態における流路デバイスの分岐流路近傍の概略構成を示す拡大平面図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その１）である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その２）である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その３）である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その４）である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その５）である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その６）である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態における流路デバイスの製造方法の一部の工程を示す、図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図（その７）である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態に係る観察装置の概略構成を示す斜視図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態における電圧印加部の回路構成を示す概略図である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態における分岐流路の他の態様を概略的に示す切断端面図である。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態における流路デバイスの他の態様を概略的に示す平面図である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態における排出流路の他の態様を概略的に示す平面図である。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態における流路デバイスの他の態様を概略的に示す平面図である。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態における分岐流路の他の態様を概略的に示す部分拡大平面図である。
【図１８】図１８（Ａ）は、比較例１における流路デバイスの概略構成を示す平面図であり、図１８（Ｂ）は図１８（Ａ）におけるII−II線切断端面図である。
【図１９】図１９は、実施例１における観察結果を示す写真である。
【図２０】図２０は、実施例２における観察結果を示す写真である。
【図２１】図２１は、比較例１における観察結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。
〔流路デバイス〕
図１は、本実施形態における流路デバイスの概略構成を示す平面図であり、図２は、本実施形態における流路デバイスの概略構成を示す、図１におけるＩ−Ｉ線切断端面図であり、本実施形態における流路デバイスの分岐流路近傍の概略構成を示す拡大平面図である。
【００３６】
図１及び図２に示すように、本実施形態における流路デバイス１は、２つの導入口１１、２つの導入口１１間を接続する案内流路１２、案内流路１２の途中に接続する分岐流路１３、分岐流路１３に接続する複数のナノ流路１４及び当該ナノ流路１４に排出流路１５を介して接続する排出口１６を有する透明基材１０と、当該透明基材１０の第１面１０Ａ側に接合されている封止基材２０とを備える。透明基材１０と封止基材２０との接合方法としては、プラズマ雰囲気に曝して表面を活性化させることで両者を接合する方法、熱融着させて両者を接合する方法等が挙げられる。導入口１１及び排出口１６は、透明基材１０に形成された貫通孔の一の開口（第１面１０Ａ側の開口）が封止基材２０により封止され、第２面１０Ｂ側に開放する空間として構成され、案内流路１２、分岐流路１３、ナノ流路１４及び排出流路１５は、透明基材１０の第１面１０Ａ側に形成された凹部の開口が封止基材２０により封止されてなる空間として構成される。本実施形態における流路デバイス１は、後述する観察装置１００（図１１参照）にて、核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を１分子レベルで泳動させ、当該核酸分子、特に核酸分子の異常部位（異常メチル化等）を観察・分析するために用いられる。
【００３７】
透明基材１０及び封止基材２０を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリイミド等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができ、特に石英ガラス等のガラス材料が好適である。透明基材１０及び封止基材２０が石英ガラス等のガラス材料により構成されることで、後述する観察装置１００（図１１参照）の第１電圧印加部１０５及び第２電圧印加部１０６から高電圧が印加された場合であっても、流路デバイス１が破壊されることがない。
【００３８】
なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０〜８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては流路デバイス１）の片側（透明基材１０の第２面１０Ｂ側又は封止基材２０側）から照射した際、照射された側とは反対側（封止基材２０側又は透明基材１０の第２面１０Ｂ側）へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
【００３９】
透明基材１０及び封止基材２０の形状（平面視形状）は、特に限定されるものではないが、好適には、平面視略矩形状である。また、平面視における透明基材１０及び封止基材２０の大きさは、特に限定されるものではないが、例えば、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度である。透明基材１０の厚みは、例えば、０．５〜７ｍｍ程度であり、封止基材２０の厚みは、例えば、５０〜１０００μｍ程度である。本実施形態における流路デバイス１が高倍率での観察に用いられる場合、封止基材２０の厚みは、５０〜３００μｍ程度であるのが好ましい。流路デバイス１の厚み（透明基材１０の厚みと封止基材２０の厚みとの合計）を厚くすることで、流路デバイス１内（導入口１１、案内流路１２、分岐流路１３、ナノ流路１４、排出流路１５、排出口１６）に収容される溶液量を多くすることができ、長時間の観察に適する。一方、封止基材２０の厚みを厚くしすぎると、後述する観察装置１００（図１１参照）の観察部１０２からナノ流路１４を泳動する核酸分子までの距離が長くなり、高倍率での観察が困難となるおそれがある。
【００４０】
本実施形態における流路デバイス１は、核酸分子を含む溶液を注液可能な２つの導入口１１と、ナノ流路１４内を泳動した核酸分子が排出される１つの排出口１６とを備える。本実施形態において、導入口１１及び排出口１６は、平面視において、直径１〜５ｍｍ程度の略円形状の内部空間を有し、透明基材１０の第１面１０Ａ側の開口が封止基材２０により封止され、第２面１０Ｂ（第１面１０Ａに対向する面）側には内部空間よりも小径の開口が形成された構成を有する。透明基材１０の第２面１０Ｂ側における導入口１１の開口は、核酸分子を含む溶液の注入口としての役割を果たす。また、第２面１０Ｂ側における導入口１１及び排出口１６の開口は、当該核酸分子を電気泳動させるために用いられる電極の挿入口としての役割を果たす。
【００４１】
２つの導入口１１のそれぞれに接続する案内流路１２は、導入口１１に導入された核酸分子をナノ流路１４に向けて案内するための流路である。案内流路１２の途中（好適には案内流路１２の流路方向の略中央）には、ナノ流路１４に続く分岐流路１３が接続しており、これにより、案内流路１２を流動する核酸分子を、分岐流路１３を介してナノ流路１４に誘導させることができる。なお、案内流路１２は、平面視において、分岐流路１３側に向けて凸の湾曲形状を有する。
【００４２】
本実施形態において、導入口１１近傍における案内流路１２の幅Ｗ121は、分岐流路１３近傍における案内流路１２の幅Ｗ122よりも大きい。好適には、案内流路１２の幅は、導入口１１から分岐流路１３（案内流路１２の流路方向の略中央）に向けて漸減している。案内流路１２の導入口１１近傍の幅Ｗ122が相対的に大きいことで、導入口１１に導入された核酸分子を案内流路１２に誘導させやすい一方、案内流路１２の分岐流路１３近傍の幅Ｗ121が小さくなっていることで、核酸分子を分岐流路１３に効率的に誘導させることができる。
【００４３】
導入口１１と案内流路１２との接続部Ｃ１（接続部Ｃ１の側壁面）は、平面視において湾曲形状を有する（Ｒ形状の連続面（湾曲面）により構成される）のが好ましい。当該接続部Ｃ１が湾曲形状を有することで、導入口１１から案内流路１２に向けて流動する核酸分子が当該接続部Ｃ１に引っ掛かり詰まってしまう（核酸分子が接続部Ｃ１近傍に滞留してしまう）のを抑制することができる。
【００４４】
案内流路１２の途中に接続する分岐流路１３は、案内流路１２から分岐する第１分岐流路１３１と、第１分岐流路１３１に接続する第２分岐流路１３２と、第２分岐流路１３２及びナノ流路１４の間に位置する第３分岐流路１３３とを有する。
【００４５】
第１分岐流路１３１、第２分岐流路１３２及び第３分岐流路１３３のそれぞれの深さＴ131，Ｔ132，Ｔ133（透明基材１０の厚さ方向における長さ）は、分岐流路１３の流路方向に沿って段階的に変化する（Ｔ131＞Ｔ132＞Ｔ133）。
【００４６】
第１〜第３分岐流路１３１〜１３３の深さＴ131〜Ｔ133が分岐流路１３の流路方向（案内流路１２からナノ流路１４に向かう方向）に沿って浅くなるように段階的に変化することで、案内流路１２から分岐流路１３に向けて流動した核酸分子を、分岐流路１３内に詰まらせる（滞留させる）ことなくナノ流路１４に向けて効率的に誘導することができる。
【００４７】
第１分岐流路１３１の深さＴ131は、０．２〜２０μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜１０μｍ程度であるのが特に好ましい。第２分岐流路１３２の深さＴ132は、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．２〜１μｍ程度であるのが特に好ましい。第３分岐流路１３３の深さＴ133は、１０〜２００ｎｍ程度であるのが好ましく、３０〜１００ｎｍ程度であるのが特に好ましい。観察対象である核酸分子は、その由来となる細胞種、生物種や抽出方法に応じ、粒状に折り畳まれるようにして高次構造体をなす核酸分子の大きさ（粒径）が異なる。例えば、ＤＮＡは、一般に、１００ｎｍ〜１０μｍ程度の粒径を有する高次構造体をなす。そのため、観察対象となる核酸分子に応じて案内流路１２及び分岐流路１３の深さを適宜調整するのが望ましい。
【００４８】
図３に示すように、第１分岐流路１３１及び第２分岐流路１３２の幅は流路方向に沿って実質的に同一であるが、第３分岐流路１３３の幅は、第２分岐流路１３２からナノ流路１４に向かって漸増する。すなわち、第３分岐流路１３３は、ナノ流路１４に向かって徐々に拡幅する拡幅部として構成される。第３分岐流路１３３の幅がナノ流路１４に向かって漸増することで、本実施形態における流路デバイス１におけるナノ流路１４の数を増大させることができる。その結果、ナノ流路１４の流路方向に直交する方向における断面積（各ナノ流路１４の断面積の合計）を増大させることができるため、本実施形態における流路デバイス１を用いて核酸分子を電気泳動させるときに、ナノ流路１４を泳動する核酸分子の速度を遅くすることができる。
【００４９】
本実施形態において、第１〜第３分岐流路１３１〜１３３には、複数の柱状体が配列されてなる第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３が形成されている。第１〜第３分岐流路１３１〜１３３に第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３が形成されていることで、核酸分子の高次構造をほどきながら１分子レベルで伸長させ、伸長した核酸分子を１分子レベルでナノ流路１４に誘導することができる。
【００５０】
なお、本実施形態において、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３のそれぞれが有する柱状体の形状（平面視形状）は、略円形状であるが（図３参照）、このような態様に限定されるものではなく、略矩形状（好ましくは角丸矩形状）等の他の形状であってもよい。
【００５１】
第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の間隔Ｐ171〜Ｐ173（隣接する柱状体間の距離）は、分岐流路１３の流路方向に沿って段階的に変化する（案内流路１２からナノ流路１４に向かう方向に沿って段階的に小さくなる）のが好ましい（Ｐ171＞Ｐ172＞Ｐ173）。間隔Ｐ171〜Ｐ173が段階的に変化することによって、核酸分子の高次構造を徐々にほどきながら１分子レベルで伸長させ、伸長させた核酸分子を１分子レベルでナノ流路１４に誘導することができる。
【００５２】
本実施形態において、第１ピラーアレイ構造体１７１の間隔Ｐ171は、０．５〜５μｍ程度であるのが好ましく、第２ピラーアレイ構造体１７２の間隔Ｐ172は、０．３〜３μｍ程度であるのが好ましく、第３ピラーアレイ構造体１７３の間隔Ｐ173は、５０〜５００ｎｍ程度であるのが好ましい。前述したように、観察対象である核酸分子は、その由来となる細胞種、生物種や抽出方法に応じ、粒状に折り畳まれるようにして高次構造体をなす核酸分子の大きさ（粒径）が異なる。例えば、ＤＮＡは、一般に、１００ｎｍ〜１０μｍ程度の粒径を有する高次構造体をなす。そのため、観察対象となる核酸分子に応じて第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の間隔Ｐ171〜Ｐ173を調整するのが望ましい。
【００５３】
第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の柱状体の間隔Ｐ171〜Ｐ173を段階的に変化させるために、本実施形態においては、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３のそれぞれが有する柱状体の寸法Ｄ171〜Ｄ173（柱状体の平面視形状が円形状である場合には、当該円の直径、矩形状である場合には、当該矩形の対角長さ。）を、分岐流路１３の流路方向に沿って段階的に変化させるとともに（Ｄ171＞Ｄ172＞Ｄ173）、各間隔Ｐ171〜Ｐ173を各寸法Ｄ171〜Ｄ173と同一にしている。
【００５４】
第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の柱状体の寸法Ｄ171〜Ｄ173と間隔Ｐ171〜Ｐ173とを同一とし、当該寸法Ｄ171〜Ｄ173を分岐流路１３の流路方向（案内流路１２からナノ流路１４に向かう方向）に沿って小さくなるように段階的に変化させることで、分岐流路１３内を流路方向に沿って流動する核酸分子の高次構造を徐々にほどきつつ、当該核酸分子を１分子レベルで伸長させてナノ流路１４に効率的に誘導することができる。なお、上記態様に限定されず、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の柱状体の寸法Ｄ171〜Ｄ173を同一とし、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の柱状体の間隔Ｐ171〜Ｐ173が分岐流路１３の流路方向に沿って小さくなるようにしてもよい。
【００５５】
第１ピラーアレイ構造体１７１の柱状体の寸法Ｄ171は、０．５〜５μｍ程度であるのが好ましく、第２ピラーアレイ構造体１７２の柱状体の寸法Ｄ172は、０．３〜３μｍ程度であるのが好ましい。第３ピラーアレイ構造体１７３の柱状体の寸法Ｄ173は、５０〜５００ｎｍ程度であるのが好ましい。
【００５６】
第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３において、柱状体は、正六角形アレイにおける六角形の各頂点及び中心に配置するようにして形成されているのが好ましい（図３参照）。柱状体がこのような配置で形成されていることで、核酸分子の高次構造を効率的にほどくことができるとともに、分岐流路１３内で核酸分子が詰まってしまう（滞留してしまう）のを抑制することができる。
【００５７】
案内流路１２と分岐流路１３（第１分岐流路１３１）との接続部Ｃ２は、平面視において湾曲形状を有する（Ｒ形状の連続面（湾曲面）により構成される）のが好ましい。当該接続部Ｃ２が湾曲形状を有することで、案内流路１２から分岐流路１３に向かって流動する核酸分子が当該接続部Ｃ２に引っ掛かってしまうのを抑制し、当該接続部Ｃ２近傍にて核酸分子が詰まってしまうのを抑制することができる。
【００５８】
複数のナノ流路１４は、互いに平行に並列した管状構造を有する。各ナノ流路１４が管状構造であることで、一のナノ流路１４に誘導され泳動する核酸分子が、ナノ流路１４の途中で隣接するナノ流路１４に移動してしまうことなく、そのまま当該ナノ流路１４を排出口１６に向かって泳動させることができる。
【００５９】
各ナノ流路１４の寸法（短手方向の幅）は、１分子の伸長した核酸分子が泳動可能な程度の寸法であればよく、例えば、１０〜３００ｎｍ程度、好ましくは３０〜１００ｎｍ程度である。流路方向に沿った各ナノ流路１４の長さ（長手方向の長さ）は、特に限定されるものではなく、例えば、１０〜２０００μｍ程度、好ましくは５０〜１０００μｍ程度である。各ナノ流路１４の深さは、特に限定されるものではなく、例えば、１０〜３００ｎｍ程度、好ましくは３０〜１００ｎｍ程度である。隣接するナノ流路１４のピッチ（隣接するナノ流路１４の間隔）は、１００〜２０００ｎｍ程度、好ましくは３００〜１０００ｎｍ程度である。
【００６０】
第３分岐流路１３３側におけるナノ流路１４の側壁端部Ｃ３は、湾曲形状を有している（Ｒ形状の連続面（湾曲面）である）のが好ましい。かかる側壁端部Ｃ３が湾曲形状を有することで、ナノ流路１４の入口近傍にて核酸分子を詰まらせる（滞留させる）ことなく、第３分岐流路１３３からナノ流路１４に核酸分子を誘導させ易くなる。
【００６１】
互いに平行に並列するナノ流路１４の数は、特に限定されるものではないが、当該ナノ流路１４の数を増大させ、各ナノ流路１４の断面積の合計を大きくした方が、核酸分子の泳動速度を遅くすることができる点で有利である。
【００６２】
〔流路デバイスの製造方法〕
上述した構成を有する流路デバイス１は、以下のようにして製造することができる。図４〜１０は、本実施形態における流路デバイス１を製造する各工程を示す切断端面図（図１におけるＡ−Ｂ−Ｃ線に相当する切断線にて切断した切断端面図）である。
【００６３】
［導入口及び排出口形成工程］
第１面ＳＴ１及び第１面ＳＴ１に対向する第２面ＳＴ２を有する、石英ガラス等の透明基板ＳＴを準備し、当該透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１における、導入口１１及び排出口１６に相当する位置に、導入口１１及び排出口１６の内部空間に相当する凹部ＨＬ11，ＨＬ16を形成する（図４参照）。凹部ＨＬ11，ＨＬ16を形成する方法は、特に限定されるものではなく、導入口１１及び排出口１６に対応するレジストパターンをマスクとしたウェットエッチング法又はドライエッチング法により貫通孔を形成する方法であってもよいし、レーザー、工具、型等を用いて物理的に凹部ＨＬ11，ＨＬ16を形成する方法であってもよい。なお、当該凹部ＨＬ11，ＨＬ16の底面略中央に、透明基板ＳＴの第２面ＳＴ２側に開口する開口部を形成する。これにより、導入口１１及び排出口１６に相当する空間が形成される。
【００６４】
［案内流路及び排出流路形成工程］
上記透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１上にレジスト層ＲＭ１を形成する（図５（Ａ）参照）。レジスト層ＲＭ１を構成するレジスト材料としては、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
【００６５】
次に、レジスト層ＲＭ１をパターニングして、案内流路１２及び排出流路１５に対応する開口を有するレジストパターンＲＰ１を形成する（図５（Ｂ）参照）。レジストパターンＲＰ１を形成する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、電子線リソグラフィー法、フォトリソグラフィー法、インプリントリソグラフィー法等によりレジストパターンＲＰ１を形成することができる。
【００６６】
そして、当該レジストパターンＲＰ１をマスクとして透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側をドライエッチング法によりエッチングし、案内流路１２及び排出流路１５を形成する（図５（Ｃ）参照）。
【００６７】
［分岐流路形成工程］
案内流路１２及び排出流路１５が形成された透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１上にレジスト層ＲＭ２を形成する（図６（Ａ）参照）。レジスト層ＲＭ２を構成するレジスト材料としては、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
【００６８】
次に、レジスト層ＲＭ２をパターニングして、第１分岐流路１３１及び第１ピラーアレイ構造体１７１に対応するレジストパターンＲＰ２を形成する（図６（Ｂ）参照）。レジストパターンＲＰ２を形成する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、電子線リソグラフィー法、フォトリソグラフィー法、インプリントリソグラフィー法等によりレジストパターンＲＰ２を形成することができる。
【００６９】
そして、当該レジストパターンＲＰ２をマスクとして透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側をドライエッチング法によりエッチングし、第１分岐流路１３１及び第１ピラーアレイ構造体１７１を形成する（図６（Ｃ）参照）。
【００７０】
続いて、第１分岐流路１３１及び第１ピラーアレイ構造体１７１が形成された透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１上にレジスト層ＲＭ３を形成し（図７（Ａ）参照）、レジスト層ＲＭ３をパターニングして、第２分岐流路１３２及び第２ピラーアレイ構造体１７２に対応するレジストパターンＲＰ３を形成する（図７（Ｂ）参照）。その後、当該レジストパターンＲＰ３をマスクとして透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側をドライエッチング法によりエッチングし、第２分岐流路１３２及び第２ピラーアレイ構造体１７２を形成する（図７（Ｃ）参照）。
【００７１】
第２分岐流路１３２及び第２ピラーアレイ構造体１７２が形成された透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１上にレジスト層ＲＭ４を形成し（図８（Ａ）参照）、レジスト層ＲＭ４をパターニングして、第３分岐流路１３３及び第３ピラーアレイ構造体１７３に対応するレジストパターンＲＰ４を形成する（図８（Ｂ）参照）。その後、当該レジストパターンＲＰ４をマスクとして透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側をドライエッチング法によりエッチングし、第３分岐流路１３３及び第３ピラーアレイ構造体１７３を形成する（図８（Ｃ）参照）。
【００７２】
［ナノ流路形成工程］
分岐流路１３（第１〜第３分岐流路１３１〜１３３）が形成された透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１上にレジスト層ＲＭ５を形成する（図９（Ａ）参照）。レジスト層ＲＭ５を構成するレジスト材料としては、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
【００７３】
次に、レジスト層ＲＭ５をパターニングして、複数のナノ流路１４に対応するレジストパターンＲＰ５を形成する（図９（Ｂ）参照）。レジストパターンＲＰ５を形成する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、電子線リソグラフィー法、フォトリソグラフィー法、ナノインプリントリソグラフィー法等によりレジストパターンＲＰ５を形成することができる。
【００７４】
そして、当該レジストパターンＲＰ５をマスクとして透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側をドライエッチング法によりエッチングし、複数のナノ流路１４を形成する（図９（Ｃ）参照）。
【００７５】
なお、上述した導入口及び排出口形成工程、案内流路及び排出流路形成工程、分岐流路形成工程、並びにナノ流路形成工程はこの順に実施しなくてもよく、例えば、案内流路１２及び排出流路１５を形成し、次に分岐流路１３及びナノ流路１４を形成し、最後に導入口１１及び排出口１６を形成してもよい。
【００７６】
［封止基材貼付工程］
最後に、導出口１１及び排出口１６に対応する凹部ＨＬ11，ＨＬ16、並びに案内流路１２、分岐流路１３、ナノ流路１４及び排出流路１５が形成された透明基板ＳＴの第１面ＳＴ１側に、凹部ＨＬ11，ＨＬ16、案内流路１２、分岐流路１３、ナノ流路１４及び排出流路１５の開口を封止するようにして封止基材２０を接合する（図１０参照）。封止基材２０の接合方法は、特に限定されるものではないが、例えば、当面基板ＳＴの第１面ＳＴ１側及び／又は封止基材２０をプラズマ雰囲気に曝して表面を活性化させることで両者を接合する方法、透明基板ＳＴと封止基材２０との当接面を熱融着させる方法等が挙げられる。これにより、本実施形態における流路デバイス１が製造される。
【００７７】
〔観察装置〕
上述した構成を有する流路デバイス１は、観察装置１００にて核酸分子、特に核酸分子の異常部位（異常メチル化部位等）を観察・分析するために用いられ得る。図１１は、本実施形態に係る観察装置１００の概略構成を示す斜視図である。
【００７８】
本実施形態における観察装置１００は、本実施形態における流路デバイス１を保持可能な保持部１０１と、保持部１０１の下方に位置し、流路デバイス１のナノ流路１４を泳動する核酸分子を観察可能な、倒立型蛍光顕微鏡等の観察部１０２と、流路デバイス１の２つの導入口１１のそれぞれに、第２面１０Ｂ側の開口から挿入される第１電極対１０３と、一方の導入口１１及び排出口１６のそれぞれに、第２面１０Ｂ側の開口から挿入される第２電極対１０４と、第１電極対１０３に電圧を印加する第１電圧印加部１０５と、第２電極対１０４に電圧を印加する第２電圧印加部１０６とを備える。
【００７９】
第１電圧印加部１０５及び第２電圧印加部１０６は、それぞれ、第１電極対１０３及び第２電極対１０４に印加する電圧を変化させることができる。第１電圧印加部１０５及び第２電圧印加部１０６のそれぞれから第１電極対１０３及び第２電極対１０４に印加する電圧を変化させることで、導入口１１内の核酸分子を、案内流路１２及び分岐流路１３を介してナノ流路１４に効率的に誘導させることができる。例えば、まず、第１電圧印加部１０５より第１電極対１０３に印加される電圧を相対的に高く設定し、第２電圧印加部１０６より第２電極対１０４に印加される電圧を相対的に低く設定する。そして、第１電圧印加部１０５より第１電極対１０３に電圧を印加する。これにより、導入口１１内の核酸分子が、分岐流路１３近傍にまで流動させることができる。核酸分子が分岐流路１３近傍にまで流動したときに、第２電圧印加部１０６より第２電極対１０４に電圧を印加する。このとき、第１電圧印加部１０５から第１電極対１０３に印加される電圧は、低減させるのが好ましい。これにより、分岐流路１３近傍に集合した核酸分子を、分岐流路１３を介してナノ流路１４に効率的に流動させることができる。
【００８０】
なお、第１電圧印加部１０５及び第２電圧印加部１０６からの印加電圧値は、核酸分子の種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）等による流動性（流動しやすさ）を考慮して適宜設定されればよいが、第２電圧印加部１０６から第２電極対１０４に印加される電圧を上昇させすぎてしまうと、核酸分子のナノ流路１４での泳動速度が速くなりすぎてしまい、観察部１０２による観察が困難となるおそれがある。
【００８１】
第１電圧印加部１０５は、第１電極対１０３に対して印加される電圧の極性を反転させることができる。具体的には、図１２に示すように、第１電圧印加部１０５は、直流電源１０５Ａと、スイッチ素子１０５Ｂとを含み、スイッチ素子１０５Ｂのスイッチ切り替えにより第１電極対１０３への印加電圧の極性を反転させることができる。
【００８２】
なお、第２電圧印加部１０６も、第１電圧印加部１０５と同様に、直流電源１０６Ａとスイッチ素子１０６Ｂとを含み（図１２参照）、スイッチ素子１０６Ｂのスイッチ切り替えにより第２電極対１０４への印加電圧の極性を変化させ得る態様であってもよい。これにより、導入口１１からナノ流路１４を流動して排出口１６に排出され、ナノ流路１４を流動する際に観察部１０２により観察・分析された核酸分子を、導入口１１に戻すことができるため、本実施形態に係る観察装置１００を用いて、核酸分子の観察・分析を繰り返し行うことができる。
【００８３】
上記構成を有する観察装置１００において、核酸分子を含む試料溶液を導入口１１に注液した流路デバイス１を、封止基材２０を観察部１０２に対向させるようにして、保持部１０１に保持させる。そして、第１電圧印加部１０５から第１電極対１０３に対し電圧を印加する。これにより、核酸分子が、一の導入口１１から他の導入口１１に向かって案内流路１２内を流動する。このとき、第１電極対１０３に印加させる電圧の極性を所定のタイミングで反転させることで、核酸分子は案内流路１２内を往復するようにして流動しながら、分岐流路１３の近傍に誘導される。
【００８４】
次に、第２電極対１０４への印加電圧により、案内流路１２内を分岐流路１３に向かって流動してきた核酸分子を、分岐流路１３内に誘導させる。このようにして分岐流路１３内に誘導された核酸分子は、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３により、その高次構造が徐々にほどかれて１分子ごとに伸長する。１分子ごとに伸長した核酸分子は、ナノ流路１４の入口で詰まることなく、各ナノ流路１４内を泳動し、観察部１０２により観察・分析される。
【００８５】
本実施形態の観察装置１００において、第１電極対１０３及び第２電極対１０４に印加される電圧値を変化させることができるため、導入口１１に導入された核酸分子を、案内流路１２及び分岐流路１３を介してナノ流路１４に効率的に誘導させることができるとともに、ナノ流路１４における核酸分子の泳動速度を、観察部１０２により観察可能な程度に遅くすることができる。また、第３分岐流路１３３の幅がナノ流路１４に向けて漸増していることで、ナノ流路１４の総断面積を大きくすることができるため、ナノ流路１４内を泳動する核酸分子の速度をより遅くすることができる。したがって、ナノ流路１４内を泳動する核酸分子を、容易に観察し、分析することができる。
【００８６】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【００８７】
上記実施形態において、第１〜第３分岐流路１３１〜１３３は、その深さＴ131〜Ｔ133が流路方向に沿って浅くなるように段階的に変化する構造、いわゆる階段形状を有している例を挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、第１〜第３分岐流路１３１〜１３３は、その深さが徐々に（連続的に）浅くなるテーパー状により構成されていてもよい（図１３参照）。
【００８８】
上記実施形態においては、第１〜第３分岐流路１３１〜１３３に第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３が形成されている態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、案内流路１２にもピラーアレイ構造体が形成されていてもよい。この場合において、案内流路１２に形成されているピラーアレイ構造体の柱状体の面積密度を、第１〜第３ピラーアレイ構造体１７１〜１７３の柱状体の面積密度よりも小さくするのが好ましい。これにより、案内流路１２内で核酸分子が詰まってしまう（滞留してしまう）のを抑制することができるとともに、当該核酸分子の高次構造をわずかにほどくことができるため、分岐流路１３にて核酸分子を１分子レベルで伸長させやすくなる。さらには、導入口１１内及び排出口１６内にも、ピラーアレイ構造体が設けられていてもよい。
【００８９】
上記実施形態においては、２つの導入口１１を備える態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではなく、例えば、３つ以上の導入口を備えていてもよい。この場合において、図１４に示すように、三角形の３つの頂点に導入口１１を位置させ、隣接する導入口１１同士を案内流路１２にて接続させ、各案内流路１２の途中に分岐流路１３、ナノ流路１４、排出流路１５及び排出口１６をこの順で接続させるのが好ましい。かかる流路デバイス１を用いて核酸分子の観察・分析を行う場合には、観察装置１００の保持部１０１又は観察部１０２を回転可能に構成し、保持部１０１又は観察部１０２を回転させて、各ナノ流路１４を泳動する核酸分子を観察するようにすればよい。
【００９０】
上記実施形態においては、ナノ流路１４と排出口１６との間に介在する排出流路１５は、一定の深さを有し、排出流路１５にピラーアレイ構造体が形成されていない態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではなく、排出流路１５は、分岐流路１３と同様の構成を有していてもよい。例えば、排出口１６からナノ流路１４に向けて深さが段階的に浅くなる第１〜第３排出流路１５１〜１５３を含み、ナノ流路１４に接続する第３排出流路１５３は、第２排出流路１５２に向けてその幅が漸減する狭幅部を構成し、第１〜第３排出流路１５１〜１５３には、それぞれ第１〜第３ピラーアレイ構造体１８１〜１８３が形成されていればよい（図１５参照）。このように、排出流路１５が第１〜第３排出流路１５１〜１５３を含み、それらに第１〜第３ピラーアレイ構造体１８１〜１８３が形成されていることで、導入口１１に導入された核酸分子が排出口１６に泳動した後、排出口１６から導入口１１に向けて効率的に泳動させることが可能であり、当該流路デバイス１を用いることで、導入口１１と排出口１６との間で核酸分子を往復させるようにして、繰り返し観察し、分析することができる。
【００９１】
上記実施形態においては、１つの排出口１６を備える態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではなく、例えば、図１６に示すように、排出流路１５から複数（２つ）に分岐する排出分岐流路１７を有し、その先に複数（２つ）の排出口１６がそれぞれ接続されていてもよい。このような態様の流路デバイス１を用いた観察装置１００は、２つの排出口１６のそれぞれに、第２面１０Ｂ側の開口から挿入される第３電極対と、第３電極対間に電圧を印加する第３電圧印加部とをさらに備える野が好ましい。かかる観察装置１００によれば、第２電圧印加部１０６及び第３電圧印加部からの印加電圧により、排出口１６から導入口１１に核酸分子を効率的に戻すことができる。なお、排出分岐流路１７は、案内流路１２と実質的に同様の構成、すなわち、排出口１６側から排出流路１５との接続部分に向かって幅が漸減し、排出流路１５側に向けて凸状に湾曲し、複数の柱状体が配列されてなるピラーアレイ構造体を有するのが好ましい。
【００９２】
上記実施形態において、第１電圧印加部１０５は、直流電源１０５Ａと、第１電極対１０３に印加される電圧の極性を反転させるためのスイッチ素子１０５Ｂとを有するが、本発明はこのような態様に限定されるものではなく、第１電圧印加部１０５は、交流電源を有していてもよい。この場合において、第１電圧印加部１０５は、第１電極対１０３に印加される電圧の周波数を変調させ得る手段を有していてもよい。
【００９３】
上記実施形態において、流路デバイス１は、案内流路１２から分岐する１つの分岐流路１３及びそれに接続するナノ流路１４を有するが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、図１７に示すように、流路デバイス１は、案内流路１２から分岐する複数の分岐流路１３及び各分岐流路１３に接続するナノ流路１４を有していてもよい。このような態様であれば、より多くの核酸分子をナノ流路１４に誘導することができ、より短時間に核酸分子の観察・分析が可能となる。
【００９４】
上記実施形態において、流路デバイス１の分岐流路１３の第１分岐流路１３１と第２分岐流路１３２との境界部分には、両者の深さＴ131，Ｔ132の違いにより段差が存在するが、第１ピラーアレイ構造体１７１の柱状体が当該段差の側壁に当接するように、第１ピラーアレイ構造体１７１が設けられていてもよい。第２分岐流路１３１と第３分岐流路１３３との境界部分においても同様の構成が採用され得る。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等に何ら限定されるものではない。
【００９６】
〔実施例１〕
図１〜３に示す構成を有する流路デバイス１を準備し、当該流路デバイス１のナノ流路１４を泳動する核酸分子（製品名：Ｔ４ＤＮＡ，タカラバイオ社製）を、図１１に示す構成を有する観察装置１００により観察した。
【００９７】
なお、流路デバイス１の分岐流路１３（第１〜第３分岐流路１３１〜１３３）の長さ（流路方向の長さ）を５０μｍ、第１分岐流路１３１の深さＴ131を１μｍ、第２分岐流路１３２の深さＴ132を０．５μｍ、第３分岐流路１３３の深さＴ133を０．０５μｍ、第１ピラーアレイ構造体１７１における平面視円形状の柱状体の寸法Ｄ171及び間隔Ｐ171を１μｍ、第２ピラーアレイ構造体１７２における平面視円形状の柱状体の寸法Ｄ172及び間隔Ｐ172を０．５μｍ、第３ピラーアレイ構造体１７３における平面視円形状の柱状体の寸法Ｄ173及び間隔Ｐ173を０．１μｍ、ナノ流路１４の数を１９本、ナノ流路１４のピッチを１．１μｍとした。
【００９８】
また、観察装置１００の観察部１０２として、倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製，製品名：ＴＥ３００）を用い、核酸分子を導入口１１に導入した後、第１電圧印加部１０５におけるスイッチ素子１０５Ｂを切り替えながら第１電極対１０３に対し１８Ｖの直流電圧を印加し、その後、第１電極対１０３に対し８Ｖの直流電圧を、第２電極対１０４に対し１７．６Ｖの直流電圧を印加した。
【００９９】
結果を図１９（Ａ）〜（Ｃ）に示す。なお、図１９（Ｂ）は、図１９（Ａ）の画像を撮像してから１／３０秒後に撮像した画像であり、図１９（Ｃ）は、図１９（Ｂ）の画像を撮像してから１／３０秒後に撮像した画像である。
【０１００】
〔実施例２〕
第３分岐流路１３３が、ナノ流路１４に向かって幅が漸増する拡幅部として構成され、ナノ流路１４の数が７２本、ナノ流路１４のピッチが５５０ｎｍである以外は、実施例１と同様の構成を有する流路デバイス１を準備し、当該流路デバイス１のナノ流路１４を泳動する核酸分子（製品名：Ｔ４ＤＮＡ，タカラバイオ社製）を、図１１に示す構成を有する観察装置１００により観察した。なお、観察装置１００の観察部１０２として、倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製，製品名：ＴＥ３００）を用い、核酸分子を導入口１１に導入した後、第１電圧印加部１０５におけるスイッチ素子１０５Ｂを切り替えながら第１電極対１０３に対し１８Ｖの直流電圧を印加し、その後、第１電極対１０３に対し８Ｖの直流電圧を、第２電極対１０４に対し８Ｖの直流電圧を印加した。
【０１０１】
結果を図２０（Ａ）及び（Ｂ）に示す。なお、図２０（Ｂ）は、図２０（Ａ）の画像を撮像してから１／５秒後に撮像した画像である。
【０１０２】
〔比較例１〕
図１８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、導入口１１’、導入口１１’に接続する案内流路１２’、案内流路１２’に接続するナノ流路１４’、ナノ流路１４’に接続する排出流路１５’及び排出流路１５’に接続する排出口１６’を備える流路デバイス１’を準備し、当該流路デバイス１’のナノ流路１４’を泳動する核酸分子（製品名：Ｔ４ＤＮＡ，タカラバイオ社製）を観察した。なお、上記流路デバイス１’において、導入口１１’の直径を２ｍｍ、案内流路１２’の大きさを３ｍｍＸ３ｍｍ、案内流路１２’の深さを１μｍ、導入口１１’からナノ流路１４’までの距離（流路デバイス１’の面内方向における長さ）を１ｍｍ、ナノ流路１４’の数を１０本、ナノ流路１４’のピッチを２μｍとした。
【０１０３】
核酸分子の観察は、図１１に示す構成を有する観察装置１００により行われ、観察部１０２として倒立型蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製，製品名：ＴＥ３００）を用い、導入口１１’及び排出口１６’のそれぞれに第２電極対１０４を挿入し、核酸分子を導入口１１’に導入した後、第２電極対１０４に対し５３Ｖの直流電圧を印加した。
【０１０４】
結果を図２１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。なお、図２１（Ａ）は、案内流路１２’及びナノ流路１４’の接続部近傍の撮像画像であり、図２１（Ｂ）は、案内流路１２’の角部近傍の撮像画像である。
【０１０５】
図１９〜２１は、倒立型蛍光顕微鏡にて撮像した写真である。図１９〜２０に示すように、実施例１及び２の流路デバイス１においては、ナノ流路１４において、伸長した核酸分子を１分子レベルで容易に観察可能であることが明らかとなった。また、実施例１及び２の流路デバイス１においては、導入口１１からナノ流路１４まで核酸分子を３０分以内で流動させることができた。
【０１０６】
一方、比較例１の流路デバイス１’においては、図２１（Ａ）に示すように、導入口１１’からナノ流路１４’までの間（特にナノ流路１４’の入口近傍）で核酸分子が滞留してしまい、核酸分子をナノ流路１４’に誘導させることができず、核酸分子の観察が困難であることが明らかとなった。また、図２１（Ｂ）に示す写真（図１８（Ａ）における案内流路１２’の右上に位置する角部近傍の写真）から明らかであるが、案内流路１２’の角部（湾曲形状ではない角部）の側壁面で核酸分子が引っ掛かり、詰まってしまった。さらに、案内流路１２’の断面積が大きい（幅１ｍｍ×深さ１μｍ）ために核酸分子の泳動速度が遅く、導入口１１’からナノ流路１４’まで核酸分子を流動させるのに１時間以上かかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、ＤＮＡシーケンサーにおける流路デバイスとして有用である。
【符号の説明】
【０１０８】
１…流路デバイス
１１…導入口（導入部）
１２…案内流路
１３…分岐流路
１４…ナノ流路
１６…排出口（排出部）
１７１…第１ピラーアレイ構造体
１７２…第２ピラーアレイ構造体
１７３…第３ピラーアレイ構造体
１００…観察装置
１０１…保持部
１０２…観察部
１０３…第１電極対
１０４…第２電極対
１０５…第１電圧印加部
１０６…第２電圧印加部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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