(57)【要約】【課題】本発明は、普遍遺伝暗号とは異なる遺伝暗号にしたがってタンパク質を発現させることができる翻訳系等を提供すること等を課題とする。【解決手段】本発明は、所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、普遍遺伝暗号とは異なる暗号にしたがって発現させる翻訳系であって、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、(i)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA、又は、(ii)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA若しくはこれをコードする核酸と、該アミノ酸と、該アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれをコードする核酸と、を含む翻訳系を提供する。【選択図】図１
2017063672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、普遍遺伝暗号とは異なる暗号にしたがって発現させる翻訳系であって、
前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、
(i)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA、又は、(ii)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA若しくはこれをコードする核酸と、該アミノ酸と、該アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれをコードする核酸と、
を含む翻訳系。
【請求項２】
請求項１に記載の翻訳系であって、
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとロイシンのコドンを入れ替えた配列を有し、
(i)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系。
【請求項３】
請求項１に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系。
【請求項４】
請求項１に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、ロイシンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系。
【請求項５】
請求項１に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをセリンのコドンに入れ替えた配列を有し；
(i)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；
(iii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(v)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(vi)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系。
【請求項６】
請求項１に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをセリンのコドンに入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；
(iii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(v)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(vi)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の翻訳系を含む細胞。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載の翻訳系を含む生物。
【請求項９】
所定のタンパク質を製造する方法であって、
請求項１から６のいずれか１項に記載の翻訳系において、前記鋳型核酸から前記所定のタンパク質を発現させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、普遍遺伝暗号とは異なる新遺伝暗号を用いてタンパク質を製造する翻訳系等に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上では、ほとんどの生物において共通の遺伝暗号「普遍遺伝暗号」に従って核酸からタンパク質が翻訳されており。生物は、生物間における遺伝子の水平伝播により、有用な遺伝子を他の生物から得ることかできる。また、この共通の遺伝暗号は、工学的には、任意の生物から得られた遺伝子を大腸菌などに導入して、タンパク質の生産を行うことを可能にした。一方で、有害な遺伝子が伝播して他の生物を侵襲することもあるため、例えば、研究に用いる微生物等に導入した遺伝子が自然界の微生物に拡散する、遺伝子組換え植物がもつ改変された遺伝子が、自然界の周囲の植物に伝播することが危惧されている。
【０００３】
遺伝暗号が他の生物と大きく異なる生物は、その遺伝子が地球上の他の生物に伝播しても機能をもつタンパク質をコードしないため、安全な人工生命体となると考えられる。例えば、研究に用いる微生物や遺伝子組換え植物の遺伝暗号が天然のものと大きく異なっていれば、改変された遺伝子が意味のあるものとして、自然界の生物に伝播するおそれはない。
また、無細胞翻訳系や大腸菌等においても、普遍遺伝暗号と異なる新しい遺伝暗号を用いれば、遺伝子の取り扱いに注意を要するタンパク質も安全に合成することができる。
そのため、普遍遺伝暗号とは異なる新しい遺伝暗号にしたがう、既存の生物と直交する遺伝子、すなわち既存の生物においては機能性のタンパク質をコードしない遺伝子を用いてタンパク質を製造する方法が求められていた。
【０００４】
普遍遺伝暗号とは異なる遺伝暗号を利用とした例として、大腸菌ゲノム中の314個のTAG終止コドンをすべてTAA終止コドンに置き換える研究が報告されている（非特許文献１−３）。同研究では、TAG終止に関わるRF1遺伝子をこの大腸菌ゲノムから除くことにより、TAGコドンを空白にし、TAGコドンに非タンパク質性アミノ酸を指定することも提案されている。しかし、この遺伝暗号に基づく遺伝子は、生物がTAGコドンを読む抑制tRNAを獲得するだけで簡単に翻訳可能になるため、既存の生物と直交する遺伝子とはいえない。
【０００５】
一方、本発明者らは、tRNALeuのアンチコドンループをtRNAAlaと同じものに置き換えることでAlaのコドンにLeuを指定することに成功している（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】F. J. Isaacs et al., Science Vol.333, p.348-353 (2011)
【非特許文献２】M. J. Lajoie et al., Science Vol.342, p.357-360 (2013)
【非特許文献３】D. J. Mandell et al., doi:10.1038/nature14121
【非特許文献４】H. Murakami et al., Nature Structural & Molecular Biology Vol.16, p.353-358 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、普遍遺伝暗号とは異なる遺伝暗号にしたがってタンパク質を発現させることができる翻訳系を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは、コドンとアミノ酸の関係を入れ替えて、普遍遺伝暗号とは異なる新遺伝暗号を作製することを検討した。そして、セリルtRNA合成酵素、ロイシルtRNA合成酵素、及びアラニルtRNA合成酵素は、アミノ酸とtRNAが結合する反応を触媒する際、tRNAのアンチコドン部分を認識しないことに着目し、これらの酵素のアンチコドンループを入れ替えることによって、セリン、ロイシン、及びアラニンのコドンを入れ替えることを試みた。
すなわち、タンパク質をコードする核酸におけるこれらのアミノ酸のコドンを入れ替える一方、それぞれのアミノアシルtRNAにおけるアンチコドンとアミノ酸の関係を入れ替えたところ、普遍遺伝暗号とは異なる新遺伝暗号にしたがって、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、普遍遺伝暗号とは異なる暗号にしたがって発現させる翻訳系であって、
前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、
(i)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA、又は、(ii)前記入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA若しくはこれをコードする核酸と、該アミノ酸と、該アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれをコードする核酸と、
を含む翻訳系；
〔２〕上記〔１〕に記載の翻訳系であって、
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとロイシンのコドンを入れ替えた配列を有し、
(i)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系；
〔３〕上記〔１〕に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系；
〔４〕上記〔１〕に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、ロイシンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(iii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系；
〔５〕上記〔１〕に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをセリンのコドンに入れ替えた配列を有し；
(i)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；
(iii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(v)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(vi)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系；
〔６〕上記〔１〕に記載の翻訳系であって：
前記鋳型核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをセリンのコドンに入れ替えた配列を有し；
(i)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにセリンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(ii)アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；
(iii)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにアラニンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(iv)ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸；及び
(v)セリンのコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡにロイシンが結合したアミノアシルｔＲＮＡ、又は、(vi)セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるｔＲＮＡ又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素又はこれをコードする核酸、
を含む翻訳系；
〔７〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の翻訳系を含む細胞；
〔８〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の翻訳系を含む生物；及び
〔９〕所定のタンパク質を製造する方法であって、
上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の翻訳系において、前記鋳型核酸から前記所定のタンパク質を発現させる工程を含む、方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る翻訳系によれば、普遍遺伝暗号とは異なる新遺伝暗号にしたがって、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることができる。かかる翻訳系に含まれる遺伝子は、自然界の遺伝子と直交性を保つことができるので、有害な遺伝子の水平伝播を防ぐことができる。本発明に係る翻訳系を、無細胞翻訳系や大腸菌などを用いた翻訳系に応用すれば、遺伝子の取り扱いに注意を要するタンパク質も安全に合成することができる。
また、本発明に係る翻訳系を遺伝子組換え微生物や遺伝子組換え植物などの遺伝子組換え生物に応用すれば、自然界の植物に改変された遺伝子が伝播して有害なタンパク質が発現されることも防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、普遍遺伝暗号以外の遺伝暗号を使うことによる遺伝的ファイアーウォールを示す概念図である。天然の翻訳系においては、普遍遺伝暗号にコードされる遺伝子からは機能的なタンパク質が発現するが、別の遺伝暗号を用いる翻訳系からは非機能的なタンパク質しか発現しない（Firewall A）。一方、別の遺伝暗号を用いる翻訳系においては、別の遺伝暗号にコードされた遺伝子から機能的なタンパク質が発現し、天然の翻訳系では非機能的なタンパク質しか発現しない（Firewall B）。
【図２】図２は、普遍遺伝暗号と、コドンシャッフル型遺伝暗号を示す。（Ａ）は普遍遺伝暗号を示す。tRNAAla、tRNALeu、及びtRNASerは、本来のアンチコドンループを有する。（Ｂ）は、コドンシャッフル型遺伝暗号1を示す。SerにはCUU及びCUCコドン、LeuにはUCU及びUCCコドンが割り当てられるとともに、アンチコドンループを交換したキメラtRNALeu、及びキメラtRNASerが用いられる。（Ｃ）はコドンシャッフル型遺伝暗号2を示す。SerにはGCU及びGCCコドン、AlaにはCUU及びCUCコドン、LeuにはUCU及びUCCコドンが割り当てられるとともに、アンチコドンループを交換したキメラtRNAAla、キメラtRNALeu、及びキメラtRNASerが用いられる。
【図３】図３は、普遍遺伝暗号（Can）、コドンシャッフル型遺伝暗号1（CS1）、及びコドンシャッフル型遺伝暗号2（CS2）を用いたストレプトアビジンの直交発現を示す。上段がトリシンSDS PAGE解析の結果を示す。タンパク質は、[14C]-Aspで標識し、オートラジオグラフィで検出した。また、ビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（biotin-HRP）を用いたドットブロットアッセイでビオチン結合活性を調べた（下段）。Lane 1, dot 1：ネイティブtRNA、普遍ストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 2, dot 2：ネイティブtRNA、普遍ストレプトアビジン遺伝子不使用。Lane 3, dot 3：in vitro 転写した普遍tRNAセット、普遍ストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 4, dot 4：in vitro転写した普遍tRNAセット、コドンシャッフル型1のストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 5, dot 5：in vitro転写した普遍tRNAセット、コドンシャッフル型2のストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 6, dot 6：in vitro転写したコドンシャッフル型1のtRNAセット、普遍ストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 7, dot 7：in vitro転写したコドンシャッフル型1のtRNAセット、コドンシャッフル型1のストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 8, dot 8：in vitro転写したコドンシャッフル型1のtRNAセット、コドンシャッフル型2のストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 9, dot 9：in vitro転写したコドンシャッフル型2のtRNAセット、普遍ストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 10, dot 10：in vitro転写したコドンシャッフル型2のtRNAセット、コドンシャッフル型1のストレプトアビジン遺伝子を使用。Lane 11, dot 11：in vitro転写したコドンシャッフル型2のtRNAセット、コドンシャッフル型2のストレプトアビジン遺伝子を使用。エラーバーは、3回の実験のから求めた標準偏差を表す。
【図４】ペプチド発現アッセイによるtRNA活性解析。（Ａ）は、鋳型DNA（上段）及び発現したペプチド（下段）の配列を示す。（Ｂ）は、in vitro転写したtRNAセット（tRNAfMET、tRNAAsp、tRNATyr、及びtRNAXaa）を用いる翻訳系で発現したペプチドのトリシンSDS PAGE解析の結果を示す。ペプチドは、[14C]-Aspで標識し、オートラジオグラフィで検出した。各ペプチドの発現レベルはゲルのバンドで確認した。（Ｃ）は、ネイティブtRNAを用いる翻訳系で発現したペプチドのトリシンSDS PAGE解析とオートラジオグラフィ解析の結果を示す。
【図５】図５は、ネイティブtRNAで発現させたペプチドのMALDI-TOF-MS解析の結果を示す。[14C]-Aspに代えてAspを用いた。かっこ内のアミノ酸と数字は、それぞれ図４のXaaとLane番号を示す。
【図６】図６は、in vitro転写したtRNAfMet、tRNAAsp、tRNATyr、及びtRNAXaaで発現させたペプチドのMALDI-TOF-MS解析の結果を示す。[14C]-Aspに代えてAspを用いた。かっこ内のアミノ酸と数字は、それぞれ図４のXaaとLane番号を示す。
【図７】図７は、天然のtRNAセットと、in vitro転写したtRNAセットにおける翻訳の正確性の解析結果を示す。（Ａ）は、鋳型DNA（上段）と発現したペプチド（下段）の配列を示す。ペプチドの翻訳は、NNNコドンに対応するXaaの非存在下で行ったので、NNNコドンの解読ミス活性が示される。発現したペプチドは、[14C]-Aspで標識した。（Ｂ）は、ネイティブtRNAでペプチドを発現させたときのSDS-PAGE解析の結果を示す。（Ｃ）は、in vitro転写した普遍tRNAセット（表５のtRNA No.0〜20）でペプチドを発現させたときのSDS-PAGE解析の結果を示す。
【図８】図８は、ストレプトアビジン遺伝子の配列のアライメントを示す。上段は普遍遺伝暗号による配列、中段はコドンシャッフル型遺伝暗号1による配列、下段はコドンシャッフル型遺伝暗号2による配列である。各遺伝子は、T7プロモータ、シャイン−ダルガーノ（SD）配列を5'非翻訳領域に共通して含む。
【図９】図９は、タンパク質の配列のアライメントを示す。上段が普遍遺伝暗号による配列、中段がコドンシャッフル型遺伝暗号1による配列、下段がコドンシャッフル型遺伝暗号2による配列である。アスタリスクは保存されたアミノ酸残基を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る翻訳系の概要を説明する。本発明に係る翻訳系は、普遍遺伝暗号とは異なる暗号にしたがって所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させるものであり、
上記ポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、
入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNAと、を含む。
【００１２】
本明細書において、「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合によって結合することで構成される分子をいい、そのアミノ酸数は特に限定されない。ポリペプチドには、タンパク質やペプチドと呼ばれるものも含まれる。本明細書において、「所定のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、アミノ酸配列が既知であって、本発明に係る翻訳系で発現させるポリペプチドをいう。
【００１３】
本明細書において、「ポリペプチドを発現させる」とは、特に断りがない限り、DNAの配列に基づいてmRNAが合成される転写と、mRNAの配列に基づいてポリペプチドが合成される翻訳の双方の概念を含む用語として用いられる。
【００１４】
本明細書において、「入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA」とは、例えば、セリンのコドンをロイシンのコドンと入れ替えた場合、入れ替え後のロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸であるセリンを結合したアミノアシルtRNAを意味する。かかるアミノアシルtRNAを用いることによって、コドンを入れ替えた鋳型核酸に基づいて、本来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが発現する。したがって、この翻訳系では、コドンとアミノ酸との関係は、普遍遺伝暗号とは異なる遺伝暗号に従うことになる。
【００１５】
また、本発明に係る翻訳系は、「入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA」に代えて、入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA若しくはこれをコードする核酸と、該アミノ酸と、該アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれをコードする核酸と、を含んでいてもよい。かかる構成によれば、翻訳系の中で、アミノアシルtRNA合成酵素により、「入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNA」が産生される。
【００１６】
本明細書において、tRNAは、転移RNAを意味する。本明細書において、セリルtRNA（tRNASer）、ロイシルtRNA（tRNALeu）、及びアラニルtRNA（tRNAAla）は、それぞれ、セリン、ロイシン、及びアラニンを運搬する天然のtRNAを意味する。したがって、それぞれ、セリン、ロイシン、及びアラニンのコドンに対するアンチコドンを有している。
【００１７】
本明細書において「コドン」とは、DNAの場合には、T（チミン）、C（シトシン）、A（アデニン）、及びG（グアニン）から選択される3つの塩基からなる、1つのアミノ酸を指定する配列を意味する。mRNAの場合、コドンは、T（チミン）がU（ウラシル）に置き換えられる。
【００１８】
本明細書において「Xをコードする核酸配列」とは、Xのアミノ酸配列を、普遍遺伝暗号表にしたがってコードする核酸配列を意味する。本明細書において、「核酸」は、DNAであってもRNAであってもよく、本発明の課題が解決される限り、DNAとRNAのキメラや人工核酸を含んでいてもよい。
【００１９】
本明細書において、「普遍遺伝暗号表」とは、DNAの場合、以下の遺伝暗号表をいい、地球上の大部分の生物種の遺伝子が、これに従ってアミノ酸配列をコードしている。RNAの場合には、TがUに置き換えられる。以下、本明細書において、コドンは基本的にDNA配列として記載されるが、RNAの場合には、TをUに置き換えればよい。
なお、本明細書において、普遍遺伝暗号表にしたがって解読される遺伝子を普遍遺伝子、普遍遺伝暗号表にしたがってmRNAを解読するtRNAを普遍tRNAと呼ぶこともある。
【表１】
2017063672.tif 000003
以下、第一の態様として、セリンとロイシンのコドンを入れ替える場合、第二の態様として、セリンとアラニンのコドンを入れ替える場合、第三の態様として、ロイシンとアラニンのコドンを入れ替える場合、第四の態様として、セリンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをセリンのコドンに入れ替える場合、第五の態様として、セリンのコドンをアラニンのコドンに、アラニンのコドンをロイシンのコドンに、ロイシンのコドンをセリンのコドンに入れ替える場合について、それぞれ詳細に説明する。
【００２０】
本発明に係る翻訳系の第一の態様は、所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとロイシンのコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸を含む。
【００２１】
普遍遺伝暗号において、セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCでコードされる。一方、ロイシンは、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGでコードされる。所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンとロイシンのコドンを入れ替えた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCが、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGのいずれかに置き換えられ、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGが、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCのいずれかで置き換えられている。
このような核酸は、通常の核酸合成方法によって合成することができる。
【００２２】
本発明に係る翻訳系の第一の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、ロイシンのコドン、すなわちTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGがセリンに翻訳される。上記のとおり、第一の態様の核酸配列においては、セリンのコドンとロイシンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にセリンのコドンがあった位置がセリンに翻訳される。
【００２３】
なお、本発明において、セリンのコドンとロイシンのコドンが入れ替わっているという場合、そのすべてが入れ替わっていなくてもよい。たとえば、一部のセリンとロイシンのコドンを入れ替えた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるAGT、AGCが、TTA、TTGに置き換えられ、TTA、TTGが、AGT、AGCのいずれかで置き換えられている。この際、これらのコドンに対応するtRNASerとtRNALeuのアンチコドンを入れ替えることにより、正しいタンパク質が翻訳できる。セリンとアラニン、アラニンとロイシン、セリンとアラニンとロイシンのコドンを入れ替える場合も同様である。
【００２４】
本発明に係る翻訳系の第一の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、セリルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとセリンが結合する結果、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００２５】
「ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNASerのアンチコドンアームの配列を、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列も改変してもよい。例えば、tRNASerのアンチコドンループを、tRNALeuのアンチコドンループに交換してもよいし、tRNASerのアンチコドンアームを、tRNALeuのアンチコドンアームに交換してもよい。セリンをtRNASerに結合させるセリルtRNA合成酵素は、tRNASerのアンチコドンアーム以外の部分を認識するので、アンチコドンアームの配列を改変した改変tRNASerにもセリンを結合させることができる。
【００２６】
本発明に係る翻訳系の第一の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、セリンのコドン、すなわちTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCがロイシンに翻訳される。上記のとおり、第一の態様の核酸配列においては、セリンのコドンとロイシンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にロイシンのコドンがあった位置がロイシンに翻訳される。
【００２７】
本発明に係る翻訳系の第一の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、ロイシルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、ロイシルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとロイシンが結合する結果、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００２８】
「セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNALeuのアンチコドンアームの配列を、セリンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列を改変してもよい。例えば、tRNALeuのアンチコドンループを、tRNASerのアンチコドンループに交換してもよいし、tRNALeuのアンチコドンアームを、tRNASerのアンチコドンアームに交換してもよい。ロイシンをtRNALeuに結合させるロイシルtRNA合成酵素も、tRNALeuのアンチコドンアーム以外の部分を認識するので、アンチコドンアームの配列を改変した改変tRNALeuにもロイシンを結合させることができる。
【００２９】
本発明に係る第二の態様は、所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸を含む。普遍遺伝暗号において、セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCでコードされ、アラニンは、GCT、GCC、GCA、又はGCGでコードされる。したがって、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンとアラニンのコドンを入れ替えた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCが、GCT、GCC、GCA、及びGCGのいずれかに置き換えられ、GCT、GCC、GCA、及びGCGが、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCのいずれかで置き換えられている。
【００３０】
本発明に係る翻訳系の第二の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、アラニンのコドンがセリンに翻訳される。上記のとおり、第二の態様の核酸配列においては、セリンのコドンとアラニンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にセリンのコドンがあった位置がセリンに翻訳される。
【００３１】
本発明に係る翻訳系の第二の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、セリルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとセリンが結合する結果、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００３２】
「アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNASerのアンチコドンアームの配列を、アラニンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列も改変してもよい。例えば、tRNASerのアンチコドンループを、tRNAAlaのアンチコドンループに交換してもよいし、tRNASerのアンチコドンアームを、tRNAAlaのアンチコドンアームに交換してもよい。
【００３３】
本発明に係る翻訳系の第二の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、セリンのコドンがアラニンに翻訳される。上記のとおり、第二の態様の核酸配列においては、セリンのコドンとアラニンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にアラニンのコドンがあった位置がアラニンに翻訳される。
【００３４】
本発明に係る翻訳系の第二の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、アラニルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとアラニンが結合する結果、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００３５】
「セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNAAlaのアンチコドンアームの配列を、セリンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列を改変してもよい。例えば、tRNAAlaのアンチコドンループを、tRNASerのアンチコドンループに交換してもよいし、tRNAAlaのアンチコドンアームを、tRNASerのアンチコドンアームに交換してもよい。アラニンをtRNAAlaに結合させるアラニルtRNA合成酵素も、tRNAAlaのアンチコドンアーム以外の部分を認識するので、アンチコドンアームの配列を改変した改変tRNAAlaにもアラニンを結合させる。
【００３６】
本発明に係る「所定のタンパク質を製造するための翻訳系」の第三の態様は、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、ロイシンとアラニンのコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸を含む。普遍遺伝暗号において、ロイシンは、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGでコードされ、アラニンは、GCT、GCC、GCA、又はGCGでコードされる。したがって、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、ロイシンとアラニンのコドンを入れ替えた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGが、GCT、GCC、GCA、及びGCGのいずれかに置き換えられ、GCT、GCC、GCA、及びGCGが、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGのいずれかで置き換えられている。
【００３７】
本発明に係る翻訳系の第三の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、アラニンのコドンがロイシンに翻訳される。上記のとおり、第三の態様の核酸配列においては、アラニンのコドンとロイシンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にロイシンのコドンがあった位置がロイシンに翻訳される。
【００３８】
本発明に係る翻訳系の第三の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、ロイシルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとロイシンが結合する結果、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００３９】
「アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNALeuのアンチコドンアームの配列を、アラニンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列も改変してもよい。
【００４０】
本発明に係る翻訳系の第三の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAを含む。かかるアミノアシルtRNAによれば、ロイシンのコドンがアラニンに翻訳される。上記のとおり、第三の態様の核酸配列においては、ロイシンのコドンとアラニンのコドンが入れ替わっているので、これにより、入れ替え前にアラニンのコドンが位置した場所がアラニンに翻訳される。
【００４１】
本発明に係る翻訳系の第三の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、アラニルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとアラニンが結合する結果、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００４２】
「ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA」は、tRNAAlaのアンチコドンアームの配列を、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを含む配列に改変して作製することができる。アンチコドンアームのアンチコドンの部分の配列のみ改変してもよく、周囲の配列を改変してもよい。例えば、tRNAAlaのアンチコドンループを、tRNALeuのアンチコドンループに交換してもよいし、tRNAAlaのアンチコドンアームを、tRNALeuのアンチコドンアームに交換してもよい。
【００４３】
本発明に係る「所定のタンパク質を製造するための翻訳系」の第四の態様は、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられた配列を有する鋳型核酸を含む。普遍遺伝暗号において、セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCでコードされ、ロイシンは、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGでコードされ、アラニンは、GCT、GCC、GCA、又はGCGでコードされる。したがって、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCが、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGのいずれかに置き換えられ、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGが、GCT、GCC、GCA、及びGCGのいずれかに置き換えられ、GCT、GCC、GCA、及びGCGが、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCのいずれかに置き換えられている。
【００４４】
本発明に係る翻訳系の第四の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNA、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNA、及びセリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAを含む。これにより、ロイシンのコドンがセリンに翻訳され、アラニンのコドンがロイシンに翻訳され、セリンのコドンがアラニンに翻訳される。上記のとおり、第四の態様では、セリンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられているので、これにより、入れ替え前にセリンのコドンがあった位置がセリンに翻訳され、ロイシンのコドンがあった位置がロイシンに翻訳され、アラニンのコドンがあった位置がアラニンに翻訳される結果、当該鋳型核酸から、本来のアミノ酸配列を有する所定のポリペプチドが翻訳される。
【００４５】
本発明に係る翻訳系の第四の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、セリルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとセリンが結合する結果、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００４６】
本発明に係る翻訳系の第四の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、ロイシルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとロイシンが結合する結果、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００４７】
本発明に係る翻訳系の第四の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、アラニルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとアラニンが結合する結果、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００４８】
本発明に係る「所定のタンパク質を製造するための翻訳系」の第五の態様は、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられた配列を有する鋳型核酸を含む。普遍遺伝暗号において、セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCでコードされ、アラニンは、GCT、GCC、GCA、又はGCGでコードされ、ロイシンは、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGでコードされる。したがって、所定のタンパク質をコードする核酸配列において、セリンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられた配列では、当該タンパク質をコードする核酸配列におけるTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCが、GCT、GCC、GCA、及びGCGのいずれかに置き換えられ、GCT、GCC、GCA、及びGCGが、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGのいずれかに置き換えられ、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTGが、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGCのいずれかに置き換えられている。
【００４９】
本発明に係る翻訳系の第五の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNA、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNA、及びセリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAを含む。これにより、アラニンのコドンがセリンに翻訳され、ロイシンのコドンがアラニンに翻訳され、セリンのコドンがロイシンに翻訳される。上記のとおり、第五の態様では、セリンのコドンがアラニンのコドンに、アラニンのコドンがロイシンのコドンに、ロイシンのコドンがセリンのコドンに入れ替えられているので、これにより、入れ替え前にセリンのコドンがあった位置がセリンに翻訳され、ロイシンのコドンがあった位置がロイシンに翻訳され、アラニンのコドンがあった位置がアラニンに翻訳される結果、当該鋳型核酸から、本来のアミノ酸配列を有する所定のポリペプチドが翻訳される。
【００５０】
本発明に係る翻訳系の第五の態様は、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、セリンと、セリルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有し、セリルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、セリルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとセリンが結合する結果、アラニンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにセリンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００５１】
本発明に係る翻訳系の第五の態様は、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、アラニンと、アラニルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有し、アラニルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、アラニルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとアラニンが結合する結果、ロイシンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにアラニンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００５２】
本発明に係る翻訳系の第五の態様は、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAに代えて、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA又はこれをコードする核酸と、ロイシンと、ロイシルtRNA合成酵素又はこれをコードする核酸を含んでいてもよい。これにより、翻訳系において、セリンのコドンに対するアンチコドンを有し、ロイシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAと、ロイシルtRNA合成酵素が発現し、当該酵素が触媒することによって、当該tRNAとロイシンが結合する結果、セリンのコドンに対するアンチコドンを有するtRNAにロイシンが結合したアミノアシルtRNAが産生される。
【００５３】
本発明に係る翻訳系は、細胞を用いた翻訳系又は無細胞翻訳系であってもよく、生体内の翻訳系であってもよい。
例えば、本発明の翻訳系は、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物由来の培養細胞等を用いた翻訳系とすることができる。例えば、大腸菌の場合、そのゲノムの既存のtRNA遺伝子を、入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA遺伝子に置き換えることで、翻訳系を得ることができる。アミノアシルtRNA合成酵素とtRNAに結合させるアミノ酸は、本来大腸菌が有するものを利用することができる。タンパク質を得るためには、所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸を挿入した発現ベクターにより、当該大腸菌を形質転換する。
【００５４】
本発明の翻訳系を、昆虫細胞などの真核細胞を用いた翻訳系とする場合、(i)所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、(ii)入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAをコードする核酸と、を保持する組換えバキュロウイルスや組換えアデノウイルスを公知の方法に従って作製し、当該ウイルスを細胞に感染させる。この際、対応する遺伝暗号に応じてゲノムも改変する必要がある。アミノアシルtRNA合成酵素等、その他の成分は、昆虫細胞が元来有しているものを利用して、所望のポリペプチドを発現させることができる。
【００５５】
本発明の翻訳系を、動物細胞を用いた翻訳系とする場合、(i)所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、(ii)入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNAをコードする核酸と、を発現ベクターに挿入し、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などで当該発現ベクターを動物細胞に導入する。この際、対応する遺伝暗号に応じてゲノムも改変する必要がある。アミノアシルtRNA合成酵素等、その他の成分は、動物細胞が元来有しているものを利用して、所望のポリペプチドを発現させることができる。
【００５６】
無細胞翻訳系の場合、例えば、大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を用いる公知の系を利用することができる。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を用いてもよい。この場合、コドンを入れ替えたアミノ酸が、自然界において当該アミノ酸と結合するtRNAとは結合しないよう工夫する必要がある。すなわち、上記第一の態様の翻訳系においては、セリンがtRNASerと結合したアミノアシルtRNA、及びロイシンがtRNALeuと結合したアミノアシルtRNAが、翻訳系に含まれないように、且つ、翻訳系で生成されないようにする。
【００５７】
本発明の翻訳系は、再構成型無細胞翻訳系であってもよい。再構成型無細胞翻訳系は、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した翻訳系である。DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。
【００５８】
本発明の翻訳系を、再構成型無細胞翻訳系とする場合、当該翻訳系には、上述した、 (i)所定のポリペプチドをコードする核酸配列において、セリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのアミノ酸をコードするコドンを入れ替えた配列を有する鋳型核酸と、(ii)入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNAを加える。(ii)入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、且つ入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸が結合したアミノアシルtRNAに代えて、(iii)入れ替え後のコドンに対するアンチコドンを有し、入れ替え前のコドンがコードするアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素に認識されるtRNA若しくはこれをコードする核酸と、該アミノ酸と、該アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれをコードする核酸、を加えてもよい。
その他のアミノ酸については、自然界において結合するtRNAと結合させてアミノアシルtRNAとして翻訳系に加えてもよく、自然界において結合する各アミノ酸に対応するtRNA若しくはこれらをコードする核酸と、アミノアシルtRNA合成酵素若しくはこれらをコードする核酸と、各アミノ酸と、を翻訳系に加えてもよい。後者の場合、アミノアシルtRNA合成酵素により、アミノ酸と対応するtRNAが結合して、アミノアシルtRNAが産生される。
【００５９】
再構成型無細胞翻訳系の場合、目的に合わせて不要な成分が含まれないようにすることができるので、例えば、第一の態様の翻訳系では、tRNASerとtRNALeuを最初から除いておくことができる。これにより、入れ替えたコドンにしたがって、セリンとロイシンが入れ替わってタンパク質が翻訳されるのを防ぐことができる。
【００６０】
本発明の翻訳系が無細胞翻訳系である場合、タンパク質が発現する条件でインキュベートすることにより、コドンを入れ替えたアミノ酸以外は、通常通り普遍遺伝暗号にしたがって翻訳され、セリン、ロイシン、及び又はアラニンは、入れ替えたコドンによってコードされる結果、所定のタンパク質が、本来のアミノ酸配列どおりに翻訳される。
【００６１】
本発明に係る翻訳系が、細胞を用いる翻訳系、又は無細胞翻訳系は、遺伝子の自然界への拡散が心配されるタンパク質（例えば、抗生物質耐性酵素や毒素タンパク質）の安全な発現を可能にする。
【００６２】
本発明に係る翻訳系は、生体内の翻訳系とすることもできる。例えば、J. Craig Venterらは、化学合成したゲノムをもつ細菌を作製した。具体的には、106塩基対からなるMycoplasma mycoidesのゲノムを細分化して化学合成し、酵母を用いて貼り合わせてゲノムを作製した（Gibson DG et al., Science Vol.329, p.52-56 (2010)）。この方法で、ゲノム上のセリン、ロイシン、及びアラニンのうち少なくとも2つのコドンを入れ替え、アンチコドンを改変したtRNAの遺伝子もゲノム上に配置すれば、新遺伝暗号に従う生物（菌などの微生物や植物、動物）を作製することも可能である。
【００６３】
本発明に係る翻訳系を有する生物は、地球上の他の生物とは遺伝子交換を行わない安全な人工生命体である。
【００６４】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
１．遺伝暗号とtRNAの設計の概要
本実施例で用いた新遺伝暗号1及び2の概要を図２に示す。普遍遺伝暗号（図２Ａ）では、Alaは、GCUコドンとGCCコドンに、LeuはCUUコドンとCUCコドンに、Serは、UCUコドンとUCCコドンにそれぞれコードされている。
新遺伝暗号1（図２Ｂ下段）では、Alaは普遍遺伝暗号と同様にGCUコドンとGCCコドンにコードされ、LeuはUCUコドンとUCCコドンに、Serは、CUUコドンとCUCコドンにそれぞれコードされている。新遺伝暗号1を用いて翻訳を行うために、tRNASerとtRNALeuのアンチコドンループを交換したtRNAを作製した（図２Ｂ上段）。
新遺伝暗号2（図２Ｃ下段）では、AlaはCUUコドンとCUCコドンにコードされ、LeuはUCUコドンとUCCコドンに、Serは、GCUコドンとGCCコドンにそれぞれコードされている。新遺伝暗号2を用いて翻訳を行うために、tRNAAlaとtRNASerとtRNALeuのアンチコドンループを図のように交換したtRNAを作製した（図２Ｃ上段）。以下に具体的な実験方法を記載する。
【００６７】
２．方法
２−１．再構成無細胞翻訳系の調製
クレアチンキナーゼ、クレアチンホスファターゼ、及び大腸菌tRNAはRoche Diagnosticsより購入した。ミオキナーゼは、Sigma-Aldrich社より購入した。リボソームは、Clemonsらの方法（Clemons, W. M. et al. J. Mol. Biol. 310, 827-843, doi:10.1006/jmbi.2001.4778 (2001).）に準ずる方法を用いてE. coli A19株から精製した。翻訳のための化合物及びタンパク質も公知の方法にしたがって調製した（Josephson, K., Hartman, M. C. T. & Szostak, J. W., J. Am. Chem. Soc. 127, 11727-11735, doi:10.1021/ja0515809 (2005).; Baggott, J. E., Biochem. J. 308, 1031-1036 (1995).; Shimizu, Y. et al. Nat. Biotechnol. 19, 751-755, doi:10.1038/90802 (2001).）。これらの翻訳因子はIshizawaらの方法（Ishizawa, T., Kawakami, T., Reid, P. C. & Murakami, H., J. Am. Chem. Soc. 135, 5433-5440 (2013).）にしたがって保存し、最終濃度は、下表のとおりとした。
【表２】
2017063672.tif 000004
【００６８】
２−２．C5タンパク質の発現と精製
常法により、C5タンパク質の遺伝子を含むpET21aプラスミドで、大腸菌（E. coli Rosetta 2）を形質転換した。形質転換された大腸菌を100 μg/mLのアンピシリン、20 μg/mLのクロラムフェニコール、及び1%(w/v)のグルコースを含むアガープレート上で懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。大腸菌の培養物は、37℃で、100 μg/mLのアンピシリン、20 μg/mLのクロラムフェニコール、及び1%(w/v)のグルコースを含むLB培地（40mL）で、OD590が約2.0を超えるまで増殖させた。大腸菌の培養物20 mLを、100 μg/mLのアンピシリン、20 μg/mLのクロラムフェニコール、及び1%(w/v)のグルコースを含むLB培地（500mL）に加え、OD590が0.79になるまで37℃で増殖させた。0.5 mMのIPTGを加えてC5タンパク質の発現を誘導し、25℃で一晩インキュベートした。4℃で2分、9000rpmの遠心分離で細胞を回収し、600μLエタノールに溶解させた12 mgのフッ化フェニルメチルスルホニルを含む70mLのB1バッファ（300 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM imidazole pH 7.5, 0.2 mM DTT, 10 mM MgCl2, 1 M NH4Cl, 0.25% (v/v) Tween20）に再懸濁した。細胞を6分間の超音波処理で破砕し、細胞破砕物を13,000 rpm、15分、4℃で遠心分離した。上清を回収し、21 gの(NH4)2SO4を加え、13,000 rpm、5分、4℃で遠心分離した。沈殿物を10 mLのB1バッファに溶解させた。C5タンパク質は、Ni-アフィニティカラムで精製し、溶出バッファ（300 mM KCl, 20 mM Hepes-K pH 7.5, 250 mM imidazole pH 7.5, 0.2 mM DTT, 10 mM MgCl2, 1 M NH4Cl, 0.25% (v/v) Tween20）で溶出させた。C5タンパク質の濃度を280nmの吸光度で測定した後、20％グリセロール中、-80℃で保存した。
【００６９】
２−３．tRNAの調製
伸長反応（10 μL）は以下の条件で行った：1×PCRバッファ（10 mM Tris-HCl pH 8.4, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 2 mM MgSO4, 0.2 mM each dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)）, 各1 μMのeX.F primer, 各1 μMのeX.R primer, 1.6 nM Phusion DNA polymerase（下表参照）。
【表３】
2017063672.tif 000005
【表４】
2017063672.tif 000006
上記溶液を94℃で3分加熱した後、50℃で1分、72℃で2分を5サイクル繰り返すことにより伸長反応を行った。
【００７０】
２−４．増幅
pre-tDNAGln、pre-tDNAPro、及びpre-tDNATrpを調製するために、最初のPCR（800μL）を次の条件で行った：1 × PCR buffer、0.5 μM T7pro-leader.F36、各0.5 μMのPCR1.R primer、1.6 nM Phusion DNA polymerase、2.5% (v/v) of the extension mixture（上表参照）。他のtDNAの調製のために、最初のPCR（200μL）を次の条件で行った：1 × PCR buffer、0.5 μM T7ex5.F22、各0.5 μMのPCR1.R primer、1.6 nM Phusion DNA polymerase、2.5% (v/v) of the extension mixture。
上記溶液を94℃で3分加熱した後、94℃で20秒、50℃で20秒、72℃で30秒を12サイクル繰り返しDNAを増幅した。
2回目のPCR（3.2 mLのtDNALys、2.4 mLのpre-tDNAGln、pre-tDNAPro、pre-tDNATrp、1.6 mLのその他のtDNAs）は次の条件で行った：1 × PCR buffer、1 μM T7ex5.F22、各1 μMのPCR2.R primer、1.6 nM Phusion DNA polymerase、0.5% (v/v)の最初のPCR溶液（表３、４参照）。
この溶液を94℃で3分加熱した後、94℃で20秒、50℃で20秒、72℃で30秒を12サイクル繰り返してDNAを増幅した。
【００７１】
２−５．in vitro転写及び精製
in vitro転写（tRNALys：24 mL、pre-tRNAGln：12 mL、pre-tRNAPro、pre-tRNATrp、及びその他のtRNA：8 mL）は次の条件で行った：1 × T7 buffer（40 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM spermidine、5 mM KCl、0.01% (v/v) Triton X-100、10 mM DTT）、22.5 mM MgCl2、各3.25 mMのNTP (ATP, TTP, GTP, CTP)、5 mM GMP、0.3 μM T7 RNA polymerase、約20% (v/v)の2回目のPCR溶液。反応溶液を37℃で12時間インキュベートした。pre-tRNAGln、pre-tRNAPro、及びpre-tRNATrpはRNase P (下記参照)で切断した。他のtRNAは、16 μLのDNase I (10 u/μL)及び16 μLの3 M MgCl2と混合し、37℃で36時間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出後、400 μLの0.5 M EDTA pH8.0、及び800 μLの3 M NaClを溶液に加えた。8 mLの2-プロパノールを加えてtRNAを沈殿させた。沈殿物を10mLの0.3M NaClに溶解させ、8 mLの2-プロパノールを加えて沈殿させた。70％エタノールによる洗浄後、tRNAを超純水500μLに溶解させた。各tRNAの濃度を260 nmの吸光度で測定した。in vitro転写されたtRNAのすべての配列を下表に示す。
【表５】
2017063672.tif 000007
【００７２】
２−６．M1 RNAの調製
最初のPCR（50μL）は次の条件で行った：1 × KOD -Plus- PCR Buffer (TOYOBO)、1.5 mM MgSO4、各0.2 mMのdNTP、0.25 μM pGEM-Tseq.R20、0.25 μM M1RNA.R22、8 ngのM1 RNA template plasmid、0.05 U/μLのKOD DNA polymerase (TOYOBO)。
この溶液を、94℃で3分加熱した後、94℃で15秒、55℃で30秒、68℃で1分を25サイクル繰り返して、DNAを増幅した。
2回目のPCR（1.6 mL）は次の条件で行った：1 × PCR buffer、0.5 μM T7ex5.F22、0.5 μM M1RNA.R22、1.6 nM Phusion DNA polymerase。
この溶液を94℃で3分加熱した後、94℃で30秒を、50℃で30秒、72℃で1分を25サイクル繰り返し、DNAを増幅した。
in vitro転写（8 mL）は、次の条件で行った：1 × T7 buffer、30 mM MgCl2、20% (v/v)の2回目のPCR溶液、0.3 μM T7 RNA polymerase。
tRNAの精製と同様の方法でM1 RNAを精製した。M1 RNAの濃度は、260nmの吸光度で測定した。
【００７３】
２−７．RNase PによるPre-tRNAの切断
M1 RNAを、次の条件でリフォールディングさせた：7.5 μM M1 RNA、1× T7 buffer、100 mM NH4Cl。
溶液を94℃で1分加熱し、0.5℃/秒で37℃まで冷却し、5分インキュベートした。5 mMのMgCl2と5 μMのC5タンパク質を加えた後、溶液を25℃で5分インキュベートした。得られたRNase P溶液1080μL、500 μLの3 M NH4Cl、30 μLの3 M MgCl2、及び240 μLのDNase I (1 u/μL, Roche)を、12 mLのpre-tRNAGln、pre-tRNAPro又はpre-tRNATrp溶液に加えた。溶液を37℃で12時間インキュベートした。前述の方法でtRNAの精製を行った。tRNAの濃度は260 nmの吸光度で測定した。
【００７４】
２−８．DNA鋳型の調製とペプチドの発現
ペプチド発現のためのDNA鋳型は、以下の方法で調製した。伸長反応（5μL）を次の条件で行った：1 × KOD PCR Buffer (TOYOBO)、1.5 mM MgSO4、0.2 mM each dNTP、1 μM T7esD6MYYY.F55、1 μM MYYYxDDuaaAS.R38 [5′-CGAAG CTTAG TCGTC X GTAGT AGTAC ATGTT TTTCT-3′; (x, X) = (gcu, AGC), (cgu, ACG), (aau, ATT), (gau, ATC), (ugu, ACA), (cag, CTG), (gag, CTC), (ggu, ACC), (cau, ATG), (auu, AAT), (cuu, AAG), (aag, CTT), (aug, CAT), (uuu, AAA), (ccu, AGG), (ucu, AGA) (acu, AGU), (ugg, CCA), (uau, ATA), or (guu, AAC)]、(下表参照)、0.05 U/μL のKOD DNA polymerase。
【表６】
2017063672.tif 000008
【表７】
2017063672.tif 000009
伸長反応は、上記溶液を94℃で3分加熱した後、50℃で1分、68℃で1分を5サイクル繰り返して行った。
PCR（200μL）は次の条件で行った：10 mM Tris-HCl pH 8.4、50 mM KCl、0.1% (v/v) Triton X-100、2 mM MgCl2、各0.25 mMのdNTP、0.5 μM T7ex5.F22、0.5 μM each MYYYxDDuaaAS.R38、0.05% (v/v)の伸長したDNA、1% (v/v) Taq DNA polymerase。
94℃で40秒、60℃で40秒、72℃で40秒を12サイクル繰り返しDNAを増幅した。フェノール／クロロホルム抽出後、DNA産物をエタノール沈殿により回収し、20μLの超純水に溶解させた。
【００７５】
２−９．ストレプトアビジン遺伝子DNAの調製
ストレプトアビジン遺伝子は、Eurofins Genomicsが合成した。対応する遺伝暗号にしたがって、遺伝子をそれぞれCGC.stv、NGC1.stv、及びNGC2.stvと名付けた。
ストレプトアビジン遺伝子の配列は図８に示す。
最初のPCR（5μL）は次の条件で行った：1 × KOD -Plus- PCR Buffer、1.5 mM MgSO4、各0.2 mMのdNTP、2 ngのCGC.stv、NGC1.stv、又はNGC2.stv template plasmid、1 μM T7g10M.F48、1 μM CGCStv.R20、NGC1Stv.R20、又はNGC2Stv.R20、0.05 U/μL のKOD DNA polymerase。
この溶液を、94℃で3分加熱した後、94℃で20秒、55℃で30秒、68℃で1分を15サイクル繰り返しDNAを増幅した。
2回目のPCR（10μL）は、次の条件で行った：1 × KOD -Plus- PCR Buffer、1.5 mM MgSO4、各0.2 mMのdNTP、0.025% (v/v)の最初のPCR溶液、1 μM T7g10.F26、1 μM CGCStv.R20、NGC1Stv.R20、又はNGC2Stv.R20、0.05 U/μLのKOD DNA polymerase。
この溶液を94℃で3分加熱した後、94℃で20秒、55℃で30秒、68℃で1分を15サイクル繰り返してDNAを増幅した。
3回目のPCR（8 mL）は、次の条件で行った：1 × PCR buffer、0.05% (v/v)の2回目のPCR溶液、1 μM T7g10.F26、1 μM CGCStv.R20、NGC1Stv.R20、又はNGC2Stv.R20、1.6 nM Phusion DNA polymerase。
この溶液を94℃で3分加熱した後、94℃で20秒、55℃で30秒、72℃で1分を12サイクル繰り返してDNAを増幅した。フェノール／クロロホルム抽出後、DNA産物を2-プロパノール沈殿で回収し、200μLの超純水に溶解させた。
【００７６】
２−１０．ネイティブ及びin vitro転写したtRNA活性及び正確性の解析
20種類のタンパク質性アミノ酸を含まない再構成無細胞翻訳系を公知の方法にしたがって調製した。in vitro転写されたtRNAfMet、tRNAAsp、tRNATyr、及びtRNAXaaを混合し、5倍に希釈した。95℃で3分間加熱した後、エタノール沈殿によりtRNAを沈殿させ、超純水に溶解させた。
翻訳（1μL）は次の条件で行った：20% (v/v)のDNA template solution、各250 μMの19のタンパク質性アミノ酸(Asp以外)、50 μM [14C]-Asp、及び1.5 μ/μLのネイティブtRNA又は各12 μMのin vitro転写されたtRNAfMet、tRNAAsp、tRNATyr、及びtRNAXaa。
翻訳の正確性の解析では、ｘコドンを割り当てられたアミノ酸を、各反応液のDNA鋳型から除いた。他の成分の濃度は上記表２に示す。
上記溶液を、37℃で2時間インキュベートした。得られた産物をトリシン−SDS PAGE及びオートラジオグラフィ（FLA-5100, Fuji）で解析した。また、[14C]-Aspに代えてAspを用いて同様の実験を行い、得られた産物を公知の方法にしたがってautoflex II（BRUKER DALTONICS）で測定した。
【００７７】
２−１１．ストレプトアビジンの直交発現
普遍遺伝暗号、新遺伝暗号1、及び新遺伝暗号2のために、in vitro転写された21のtRNAを調製した。in vitro転写（1.5μL）は、次の条件で行った：20% (v/v)のストレプトアビジン遺伝子、各250 μMの19のタンパク質性アミノ酸（Asp以外）、50 μM [14C]-Asp、及び1.5 μg/μLのネイティブtRNA又は各12 μMのin vitro転写されたtRNA。
この溶液を37℃で2時間インキュベートした。得られた産物をトリシン−SDS PAGE及びオートラジオグラフィで解析した。また、[14C]-Aspの代わりにAspを用いて同様の実験を行い、得られた産物を、0.01％（w/v）のBSAを含むTBST（25 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、0.1% Tween20）で20倍に希釈した。希釈後の産物2μLを、ニトロセルロース膜（GE Healthcare UK Ltd.）にスポットし（トリプリケート）、0.2% (w/v) BSAを含むTBSTで10分間ブロッキングした後、0.2% (w/v) BSAを含むTBST中の15μgのビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（Invitrogen。3回限外ろ過したもの）で30分標識し、TBSTでの洗浄を5分ずつ3回行った。ビオチンに結合したストレプトアビジンを検出するため、ニトロセルロース膜をLuminata（商標） Western HRP Substrate (MILLIPORE)と共にインキュベートした。Ez-Capture MG (ATTO)を使用して蛍光を測定した。各スポットの蛍光強度はImage Jを用いて解析した。
【００７８】
３．結果
３−１．in vitro転写したtRNAの調製及び翻訳反応における活性の評価
in vitro転写により20種類のタンパク質性アミノ酸に対応するtRNA（表５）を調製した。また、3つのtRNA(tRNATrp, tRNAGln, tRNAPro)について、これらのtRNAは1位と72位の塩基がアミノアシルtRNA合成酵素による認識に関与しているため、追加のRNase P13処理を行い調製した。原則として、in vitro転写したtRNAは、Escherichia coli K12株のネイティブtRNAの配列を基にして設計し、いくつかのtRNAには次のような変異を加えた。tRNALysUUU及びtRNAGluUUCのU34のチオウリジン誘導体が翻訳に重要であることから、tRNALysUUU及びtRNAGluUUCのwobble position 34をUからCに置換した。これにより、アミノアシル化のKcat/Kmは著しく低下するものの、正しいコドンの翻訳活性が回復することが知られている。また、tRNAAsnGUUの1U72AとtRNAIleGAUの1A72Uを1G72Cに、tRNAfMetCAUの1Cを1Gに変異させることにより、RNase Pを操作しないでこれらのtRNAをin vitro転写で調製した。さらに、tRNAArgACGのA34をG34に変異させることにより、tRNAArgGCGを調製した。図２Ｂ及び２Ｃに示すコドンシャッフル型遺伝暗号（codon-shuffled genetic code）1及び2を用いた翻訳系を構築するために、アンチコドンのみでなく、アンチコドンループ全体を交換したキメラtRNAAla、tRNALeu、及びtRNASerも調製した。この設計は、 tRNAによる翻訳の正確性には、アンチコドンループの塩基配列が重要であるという知見に基づく。
再構成型翻訳系における、これらのin vitro転写されたtRNAの正しいコドンの解読能力を調べるために、次のペプチド発現アッセイを行った。すなわち、in vitro転写されたtRNAfMetCAU、tRNAAspGUC、tRNATyrGUA、tRNAXaa、及びペプチドの鋳型5′-UTR-ATG-(TAC)3-NNN-(GAC)2-TAA-UTR-3′（UTRは非翻訳領域を示し、XaaはNNNコドンに対応するアミノ酸を示す。)（図４Ａ）。[14C]-Aspを加えて正しい NNNコドンをtRNAXaaで解読すると、[14C]-Aspで標識されたぺプチドMet-(Tyr)3-Xaa-(Asp)2が産生される。実際、トリシンSDS PAGEとオートラジオグラフィを用いた解析により、ペプチドが、それぞれの鋳型DNAから発現したことが確認された（図４Ｂ）。
NNNの位置がTACコドンである鋳型を除いて、ゲルには1本のバンドが見られた。TACコドンの場合には、期待されたメインのバンドのほかに、tRNATyrGUAによるUAAストップコドンの解読ミスにより生じたと考えられる小さなバンドが見られた。より重要なことは、各ペプチドの移動度が、ネイティブtRNAを用いて翻訳したペプチドと同じであったことである（図5C）。ペプチドに、対応するアミノ酸が存在することを確認するために、[14C]-Aspの代わりにAsp用いて、鋳型DNAを同じように翻訳し、翻訳産物をMALDI-TOF-MSで解析した。予想どおり、発現したペプチドの質量は、計算で求めた質量と一致した。トリシンSDS PAGEの移動度及びMALDI-TOF-MSの質量分析データは、in vitro転写されたtRNAが正しいコドンを翻訳できることを示した。
キメラtRNAの翻訳能力を調べるために、キメラtRNALeuGGA、tRNASerGAG、tRNAAlaGAG、tRNASerGCC、及び対応するDNA鋳型を用いて同様の実験を行った。トリシンSDS PAGEの結果とMALDI-TOF-MSによる質量分析の結果から、すべての翻訳反応で期待どおりのペプチドが発現したことが示された（図４−６）。これにより、それぞれtRNALeuGGA、tRNASerGAG、tRNAAlaGAG、tRNASerGCCを用いることにより、LeuにUCCコドン、SerにCUCコドン、AlaにCUCコドン、SerにGGCコドンを割り当てられることが明らかとなった。
【００７９】
３−２．ネイティブtRNAセット及びin vitro転写されたtRNAセットの翻訳の正確性
in vitro転写したtRNAの塩基は修飾を受けないため、ネイティブtRNAに比較して、in vitro転写したtRNAによる翻訳の正確性の低下が懸念された。この点を確認するため、ネイティブtRNAセット及びin vitro転写されたtRNAセットの解読ミスを比較した。
まず、普遍遺伝暗号を用いる翻訳のために、in vitro転写されたtRNAセットとして、20種類のタンパク質性アミノ酸に対応するin vitro転写した20種類のtRNAとtRNAfMetを混合して使用した。また、ネイティブなtRNAセットとして、E. coli MRE600から抽出したtRNAを用いた。これらのRNAセットを、tRNAを除いた再構成型翻訳系に加え、NNNコドンに対応するXaaの非存在下でペプチド翻訳を行った（図７）。この翻訳反応では、tRNAセットが正しいコドンのみを正確に翻訳する場合には、ペプチドが発現しないが、翻訳の正確性が低く、間違ったコドンを翻訳する場合は、いくつかのペプチドが発現する。
その結果、ネイティブtRNAでも、いくつかのペプチドの発現が見られた。このことは、ネイティブtRNAも、この極端な条件においてはいくつかのコドンを誤翻訳することを示す。これらのバンドの移動度及び質量分析の結果、Alaの代わりにSerが誤って取り込まれたこと、Proの代わりにMetが誤って取り込まれたこと、及びValの代わりにAsnが誤って取り込まれたことがわかった（データ示さず）。これらの結果から、tRNASerGGAは、GCUを誤翻訳し、tRNAMetCAUはCCUを誤翻訳し、tRNAAsnGUUはGUUを誤翻訳することが示唆された。
そこで、次に同じアッセイ系を用いて、in vitro転写されたtRNAのセットのによる翻訳の正確性を調べた。トリシンSDS PAGEの解析結果から、ネイティブtRNAセットと同じ効率で、いくつかのコドンの誤翻訳が生じることが示された（図７）。
以上の結果から、in vitro転写されたtRNAのセットもネイティブtRNAと同様の正確性を持ち、タンパク質発現に用いることができると考えられた。
【００８０】
３−３．普遍遺伝暗号の解読によるストレプトアビジンの発現
ストレプトアビジンをモデルタンパク質として、普遍遺伝暗号にしたがってストレプトアビジンをコードする遺伝子を構築した。
コントロールとして、普遍遺伝子の存在下又は非存在下で、ネイティブtRNAと[14C]-Aspを用いた翻訳を行った。トリシンSDS PAGE解析により、普遍遺伝子存在下でストレプトアビジンが発現すること（図３、Lane 1）、及び、普遍遺伝子非存在下ではタンパク質が発現しないこと（図３、Lane 2）が明らかになった。
ビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（biotin-HRP）を用いたドットブロットアッセイも行って、ストレプトアビジンのビオチン結合活性を調べたところ、遺伝子の存在下では結合活性が見られたが（図３、dot 1）、遺伝子の非存在下では見られなかった（図３、dot 2）。これらの結果から、この翻訳系で、普遍ストレプトアビジン遺伝子から活性のあるストレプトアビジンが産生されることが示された。
次に、普遍in vitro転写tRNAセット（普遍tRNAセット；表５のtRNA No. 0-20）を用いて、普遍ストレプトアビジン遺伝子を翻訳した。ネイティブtRNAセットを用いた場合に比較して、ストレプトアビジンの産生率は約70％低下したが（図３、Lane 3）、これは、in vitro転写tRNAセットでは塩基の修飾がなされていないことによるものと考えられた。重要なことに、遺伝子存在下ではビオチン結合活性が見られ（図３、dot 3）、正確な翻訳が行われたことが示唆された。
【００８１】
３−４．コドンシャッフル型遺伝暗号の解読によるストレプトアビジンの発現
次に、コドンシャッフル型の遺伝暗号1（CS1 tRNAセット）を解読するために、tRNALeuGGA (tRNA No. 11 in Supplementary Table 1)及びtRNASerGAG (tRNA No. 16)に代えて、tRNALeuGGA (tRNA No. 21) と tRNASerGAG (tRNA No. 22)を用いるin vitro転写されたtRNAセットを調製した。
CS1 tRNAセットを用いた翻訳系では、LeuにはUCU及びUCCコドン、SerにはCUU及びCUCコドンが割り当てられたので（図２Ｂ）、ストレプトアビジン遺伝子におけるすべてのLeuコドンとSerコドンが交換されたことになる（図８のCS1 gene参照）。
翻訳系におけるCS1 tRNAセットを用いたCS1遺伝子の翻訳により、普遍遺伝子及び普遍tRNAセットを用いた場合と同程度の量のストレプトアビジンが産生された（図３、Lane 7）。ビオチン結合活性も観察されたが、強度はやや低下していた（図３、Lane 7）。
【００８２】
さらに、tRNAAlaGGC (tRNA No. 1)、tRNALeuGGA (tRNA No. 11)、及びtRNASerGAG (tRNA No. 16)に代えて、tRNAAlaGAG (tRNA No. 23)、tRNALeuGGA (tRNA No. 21)、及びtRNASerGGC (tRNA No. 24)を用いて、コドンシャッフル型遺伝暗号2のためのin vitro転写tRNAセット（CS2 tRNAセット）を用意した。
CS2 tRNAセットを用いたこの翻訳系では、AlaにはCUU及びCUCコドン、LeuにはUCU及びUCCコドン、SerにはGCU及びGCCコドンを割当てた（図２Ｃ）。したがって、ストレプトアビジン遺伝子におけるすべてのLeuコドン、Serコドン、及びAlaコドンが入れ替えられた（図８のCS2遺伝子参照）。
CS2 tRNAセットを用いた翻訳系におけるCS2遺伝子の翻訳により、普遍遺伝子及び普遍tRNAセットを用いた場合の約3分の1の量のストレプトアビジンが産生された（図３、Lane 11、dot 11）。これらの実験結果から、コドンシャッフル型遺伝暗号によって、活性のあるストレプトアビジンが発現することが示された。
【００８３】
３−５．コドンシャッフル型遺伝暗号の解読によるストレプトアビジンの直交発現
本発明の最も重要な側面として、コドンシャッフル型遺伝暗号によりコードされる遺伝子の直交性が挙げられる。普遍遺伝暗号に対するコドンシャッフル型遺伝暗号1の直交性を実証するために、普遍tRNAセットを用いた翻訳系でCS1遺伝子を翻訳した。トリシンSDS PAGE解析により、CS1遺伝子からタンパク質が発現したことが示された（図３、Lane 4）。ストレプトアビジン遺伝子には、Serを指定するコドンが14個、Leuを指定するコドンが8個存在するため、産生されたタンパク質では22個のアミノ酸置換が生じることになり（図９）、これはタンパク質のビオチン結合活性を低下させるのに十分な変異であると考えられた。期待されたとおり、普遍tRNAセットを用いた翻訳系でCS1遺伝子を翻訳した産物に、ビオチン結合活性は見られなかった（図３、dot 4）。
【００８４】
さらに、普遍遺伝暗号に対するコドンシャッフル型遺伝暗号2の直交性を調べるため、同様に、普遍tRNAセットを用いてCS2遺伝子を翻訳した。ストレプトアビジン遺伝子にはAlaを指定するコドンが25個あるため、産生されるタンパク質は全部で47個のアミノ酸置換を有することになる（図９）。実際、タンパク質は発現したものの、ビオチン結合活性は見られなかった（図３、Lane 5、dot 5）。
【００８５】
以上の結果から、CS1及びCS２遺伝子の直交性の発現が得られること、すなわち遺伝的ファイアーウォール（genetic firewall）が形成されたことが実証された（図１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月19日(2016.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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