(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚角層中に存在する酸化蛋白分解酵素（ＯＰＨ）活性成分を精製すると共に、様々な植物エキスについてＯＰＨ様活性増強成分を探索し、化粧料等へ好適に応用し得る新たなＯＰＨ活性増強剤の提供。【解決手段】アセンヤク、オウゴン、ゲンノショウコ、コメヌカ、サルビア、マジョラム、アロエ、ウスベニアオイ、エンメイソウ、オウレン、オノニス、ローズヒップ、サンシン、及びヒハツから選択される少なくとも一種の植物からＯＰＨ活性増強成分を抽出し、該植物抽出物をＯＰＨ活性増強剤として配合した化粧料。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセンヤク、オウゴン、ゲンノショウコ、コメヌカ、サルビア、マジョラム、アロエ、ウスベニアオイ、エンメイソウ、オウレン、オノニス、ローズヒップ、サンシン、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種の植物抽出物を含む、ＯＰＨ活性増強剤。
【請求項２】
前記植物抽出物が、オノニス、エンメイソウ、コメヌカ、サンシン及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤。
【請求項３】
前記植物抽出物が、エンメイソウ、コメヌカ、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤。
【請求項４】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む化粧料。
【請求項５】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む飲食品。
【請求項７】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む食品添加物。
【請求項８】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む医薬品。
【請求項９】
請求項１記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化蛋白質を分解する生体内酵素である酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：ＯＰＨ）の作用を活性化させるＯＰＨ活性増強剤、及び当該ＯＰＨ活性増強剤を含有する化粧料等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での蛋白質糖化反応が皮膚老化、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などの加齢による機能低下や疾病に関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより肌などにくすみが生じることになる。このような加齢により生じる疾病や機能低下をもたらす要因となる糖化反応を阻害するための研究が種々行われている（特許文献１）。
【０００３】
また、加齢による疾病や機能低下をもたらす他の要因として、蛋白質の酸化反応も注目されている。生体内における蛋白質の酸化反応がもたらす細胞や組織への影響としては、例えば、組織コラーゲンなどの加齢変化、アルツハイマー病、白内障、皮膚老化などさまざまな疾患や機能低下が挙げられる。
【０００４】
生体内において蛋白質の酸化反応により生成される酸化蛋白質は、酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：以下、ＯＰＨと記す）という生体内酵素により分解除去される。ＯＰＨは生体組織中に広く分布し、酸化蛋白質を優先的に分解するセリンプロテアーゼの一種であり、蛋白質のＮ末端アシル化アミノ酸を遊離する酵素であるアシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino-acid-releasing enzyme：ＡＡＲＥ）として知られている。
【０００５】
ＯＰＨは加齢とともにその活性が低下してしまう。従って、その活性低下により上記のような皮膚老化や疾病などをもたらすことになる。そこで、疾患や老化を予防するためにＯＰＨの活性を促進させる作用物質についての研究がなされている（特許文献２）。
【０００６】
また、蛋白質の糖化反応と酸化反応のいずれをも抑制しあるいはいずれの反応生成物をも分解し得る作用物質についての研究も進められており、酸化蛋白質を分解する酵素であるＯＰＨの、蛋白質の糖化反応による最終生成物であるＡＧＥｓに対する分解作用の存在を示すとともに、その分解作用を活性化するＯＰＨのＡＧＥｓ分解活性増強剤がいくつか提案されている（特許文献３）。
【０００７】
このように、生体中の酸化蛋白分解酵素（ＯＰＨ）は、生体の糖化ストレス亢進により生成・蓄積し老化や疾患の進展に影響を及ぼす糖化蛋白質や糖化最終生成物（ＡＧＥｓ）に対する分解作用を有し、糖尿病や老化進展の抑制に働く可能性が示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４１９５８４０号公報
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ２０１１／００４７３３
【特許文献３】特開２０１４−１１８４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは上述した技術的背景のもと、皮膚角層中にＯＰＨ様活性が存在していることを見いだし、角層中ＯＰＨ様活性成分を精製すると共に、様々な植物エキスについてＯＰＨ様活性増強成分を探索し、化粧料等への応用を検討した。本発明は、化粧料等へ好適に応用し得る新たなＯＰＨ活性増強剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、化粧料に好適に使用可能な特定の植物抽出物（植物エキス）に、ＯＰＨ活性を高める作用があること、特にヒト皮膚角層中のＯＰＨ様活性を高めることを見いだし、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下に示すＯＰＨ活性増強剤に関する。
１）アセンヤク、オウゴン、ゲンノショウコ、コメヌカ、サルビア、マジョラム、アロエ、ウスベニアオイ、エンメイソウ、オウレン、オノニス、ローズヒップ、サンシン、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種の植物抽出物を含む、ＯＰＨ活性増強剤。
【００１２】
２）前記植物抽出物が、オノニス、エンメイソウ、コメヌカ、サンシン及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種である、１）記載のＯＰＨ活性増強剤。
３）前記植物抽出物が、エンメイソウ、コメヌカ、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種である、１）記載のＯＰＨ活性増強剤。
【００１３】
４）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む化粧料。
５）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む皮膚外用剤。
【００１４】
６）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む飲食品。
７）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む食品添加物。
８）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む医薬品。
９）１）記載のＯＰＨ活性増強剤を１種以上含む医薬部外品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＯＰＨ活性増強剤は、疾患や老化を予防しうるＯＰＨ、特にヒト皮膚角層中のＯＰＨ様活性成分を増強しうるものである。よって、本発明のＯＰＨ活性増強剤を化粧料や皮膚外用剤に配合することにより、皮膚角層中のＯＰＨ様活性を増強し、皮膚老化進展を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各部位のヒト皮膚角層抽出液のＯＰＨ酵素比活性を表すグラフである。
【図２】各植物エキスのＯＰＨ活性増強作用２次スクリーニングの結果を示すグラフである。
【図３】植物エキス濃度とＯＰＨ活性率との関係を示すグラフである。
【図４】エンメイソウ抽出液濃度とヒＯＰＨ活性増強率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のＯＰＨ活性増強剤は、アセンヤク、オウゴン、ゲンノショウコ、コメヌカ、サルビア、マジョラム、アロエ、ウスベニアオイ、エンメイソウ、オウレン、オノニス、ローズヒップ、サンシン、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種の植物抽出物（植物エキス）を含む。
【００１８】
（１）植物抽出物
以下に、本発明で用いられる植物を説明する。
「アセンヤク」はUncaria gambir Roxburgh （Rubiaceae；アカネ科） の葉及び若枝から得た乾燥水製エキスである。
「オウゴン」は、コガネバナScutellaria baicalensis Georgi （Labiatae；シソ科）の周皮を除いた根を乾燥したものである。
「ゲンノショウコ」はゲンノショウコGeranium thunbergii Siebold et Zuccarini （Geraniaceae；フウロソウ科）の地上部である。
「コメヌカ」Oryza sativa Linne（Gramineae）は、イネ科植物のコメを精白した際に出る果皮、種皮、胚芽などの部分である。
「サルビア」Salvia officinalis Linne （Labiatae）は、シソ科の植物である。
「マジョラム」Origanum majorana Linne （Labiatae）は、シソ科の植物である。
「アロエ」Aloe arborescens Millerは、ユリ科の植物である。
「ウスベニアオイ」Malva sylvestris Linne （Malvaceae）は、アオイ科の植物である。
「エンメイソウ」Isodon japonicus Hara （Labiatae）は、シソ科の植物である。
「オウレン」Coptis japonica Makino （Ranunculaceae）は、キンポウゲ科の植物である。
「オノニス」Ononis spinosa （Leguminosae）は、マメ科の植物である。
「ローズヒップ」Rosa canina Linne（Rosaceae）は、バラ科の植物である。
「サンシン」Gardenia jasminoides Ellis （Rubiaceae）は、アカネ科属の植物である。
「ヒハツ」Piper longum Linneは、コショウ科コショウ属の植物である。
【００１９】
上記植物のうち、好ましくはオノニス、エンメイソウ、コメヌカ、サンシン及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種であり、更に好ましくはエンメイソウ、コメヌカ、及びヒハツからなる群から選択される少なくとも一種であり、特に好ましくはエンメイソウである。
【００２０】
本発明に用いられる植物抽出物は、上述した植物のどの部位から抽出したものであってもよく、例えば、全草、花、種子、果実、枝、茎、樹皮、根などから抽出したものであってよい。具体的には、エンメイソウについては地上部から、オノニスについては根から、コメヌカについては種皮から、サンシンについては果実から、ヒハツについては果実から、それぞれ抽出することが望ましい。また、抽出物の性状も特に限定されるものではなく、液体や固体などいずれでもよい。
【００２１】
植物抽出物の作製方法すなわち植物からエキスを抽出する方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、水、エタノールなどのアルコール類、エーテル類等、あるいはこれらの混合液など公知の抽出用溶媒を用いて抽出することができる。より好ましくは、水、エタノール、水とエタノールの混液を用いて抽出する方法が挙げられる。
【００２２】
（２）化粧料又は皮膚外用剤
本発明の、上述した植物から得られる抽出物の少なくとも１種（あるいは一種又は二種以上の組み合わせ）からなるＯＰＨ活性増強剤は、これを含有する化粧料や皮膚外用剤などとして応用することができる。
【００２３】
化粧料に配合する場合、上記ＯＰＨ活性増強剤の配合割合は剤形、用途、使用態様などに応じて適宜選択することができるが、好ましくは化粧料全量に対し０．００１〜１０．０重量％、より好ましくは０．０１〜５．０重量％、特に好ましくは０．１〜１．０重量％程度である。
【００２４】
化粧料の剤形は任意であり、本発明の効果を損なわない範囲でどのような剤形であっても構わない。例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類、パウダー類、エアゾール類等の剤形とすることができる。これらのうちで好ましい剤形は乳液・クリーム類である。
【００２５】
また、化粧料の用途も任意であり、本発明の効果を損なわない範囲でどのような用途であっても構わない。例えば化粧水、乳液、クリーム、サンスクリーン等のスキンケア用化粧料、化粧下地、コンシーラー、ファンデーション、プレストパウダーなどのメーキャップ用化粧料などが挙げられる。特に顔ほほ部へ適用するものが好ましい。
【００２６】
本発明の化粧料には、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて種々の任意成分を適宜配合することができる。そのような任意成分としては、例えば溶剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料、清涼化剤、紫外線吸収剤、増粘剤等が挙げられる。
【００２７】
そのような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ、鉱物油（ミネラルオイル）等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；
【００２８】
イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット、水添ココグリセリル、ステアリン酸ポリグリセリル、パラオキシ安息香酸メチル（メチルパラベン）等のエステル類；
【００２９】
ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；
【００３０】
脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類等の界面活性剤類；
【００３１】
ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；
ステアリン酸等の高級脂肪酸類；
ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；
【００３２】
グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、ポリアクリル酸ナトリウム等のポリアクリル酸及び／又はその塩、ポリエチレングリコール、ベントナイト、微粒子セルロースゲル等の増粘剤；
【００３３】
表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；表面を処理されていても良いベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；
【００３４】
パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；
【００３５】
エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；
ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；などが好ましく例示できる。
【００３６】
また、清涼剤としてメントール、クーリングエージェントなどを使用することもできる。
また、美白剤として、Ｌ‐アスコルビン酸、Ｌ‐アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸硫酸エステルナトリウム、アスコルビン酸グリセリル（ポリグリセリル）エーテル類、アスコルビン酸グリセリル（ポリグリセリル）エステル類、アスコルビン酸グルコシド（グリコシド）類、アスコルビン酸アルキルエステル類、アスコルビン酸アルキルエーテル類等のビタミンＣ類およびその誘導体、コウジ酸、アルプチン、イオウ等を用いることができる。
【００３７】
皮膚外用剤に配合する場合、上記ＯＰＨ活性増強剤の配合割合は剤形、用途、使用態様などに応じて適宜選択することができるが、好ましくは皮膚外用剤全量に対し０．００１〜１０．０重量％、より好ましくは０．０１〜５．０重量％、特に好ましくは０．１〜１．０重量％程度である。
【００３８】
皮膚外用剤としては、例えば軟膏剤、液剤、貼付剤、噴霧剤、リニメント剤等が挙げられ、経皮投与により有効成分を体内に吸収させることができる。
【００３９】
軟膏剤の場合は、上記ＯＰＨ活性増強剤以外の任意成分として一般的な軟膏剤に用いられるものを必要に応じて適宜配合することができるが、例えば基材として脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、ろう、樹脂、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、乳化剤、懸濁化剤等を配合することができる。
【００４０】
液剤の場合は、上記ＯＰＨ活性増強剤以外の任意成分として、一般的な液剤に用いられるものを必要に応じて適宜配合することができるが、例えば保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル）、糖類、甘味剤、エタノール、脂肪油、石けん、グリセリン、乳化剤、懸濁化剤等を配合することができる。
【００４１】
貼付剤の場合は、上記ＯＰＨ活性増強剤以外の任意成分として、一般的な貼付剤に用いられるものを必要に応じて適宜配合することができるが、例えばカオリン、精油成分、メントール、ハッカ油、ユーカリ油、グリセリン、プロピレングリコール、懸濁化剤、乳化剤、水等を配合することができる。
【００４２】
（３）飲食品又は食品添加物
本発明のＯＰＨ活性増強剤はまた、これらを一種以上含有する飲食品や食品添加物などとして応用することができる。飲食品の具体例としては、ハーブ茶、清涼飲料水等が挙げられる。食品添加物の具体例としては、パン、菓子類等が挙げられる。
【００４３】
飲食品や食品添加物に配合する場合、上記ＯＰＨ活性増強剤の配合割合は用途や使用態様などに応じて適宜選択することができるが、好ましくはそれら全量に対し０．００１〜１０．０重量％、より好ましくは０．０１〜５．０重量％、特に好ましくは０．１〜１．０重量％程度である。
【００４４】
（４）医薬品又は医薬部外品
本発明のＯＰＨ活性増強剤はまた、これらを一種以上含有する医薬品や医薬部外品などとして応用することができる。医薬品の具体例としては、抗糖尿病薬等が挙げられる。医薬部外品の具体例としては、美白化粧品等が挙げられる。
【００４５】
医薬品や医薬部外品に配合する場合、上記ＯＰＨ活性増強剤の配合割合は用途や使用態様などに応じて適宜選択することができるが、好ましくはそれら全量に対し０．００１〜１０．０重量％、より好ましくは０．０１〜５．０重量％、特に好ましくは０．１〜１．０重量％程度である。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例により何らの制限を受けるものではない。
＜実施例１＞
（１）皮膚角質層中のＯＰＨ活性成分の抽出
以下に、皮膚角層中にＯＰＨ様活性が存在していることを確認し、皮膚角層中のＯＰＨ様活性成分を精製する方法を示す。
【００４７】
一人の被験者（男性；４０代）の上腕内側部、下腕外側部及び顔ホホ部の各部位の皮膚表面に、透明粘着テープ（ニチバンセロテープ（ＣＴ−２４）：２４ｍｍ×８０ｍｍ）を貼付したのち、テープストリッピング法に基づいて剥離し角層を採取した。これを同一部位において３回繰り返し、２回目（２層目）及び３回目（３層目）を使用した。なお、被験者には事前に試験内容を十分に説明し、本人の自由意思による同意を得た。
【００４８】
角層を採取したセロテープを、ハサミを用いて裁断し、角層抽出バッファー２ｍＬを加えて超音波処理（４０KHz；２０秒×４回）し、ヒト皮膚角層抽出液を得た。ここで、用いた超音波装置はアズワン社製、製品名；US CREANERである。また、使用した角層抽出バッファーは、トリスバッファー（0.2M Tris-HCl Buffer；pH7.4；containing 0.14M-NaCl, 0.1%-TritonX100）（和光純薬工業株式会社製）である。
【００４９】
（２）ＯＰＨ酵素比活性の測定
上で得られたヒト皮膚角層抽出液について、酸化蛋白分解酵素（ＯＰＨ）活性を、以下の方法で測定した。
【００５０】
９６穴マイクロプレート（透明）に、前記ヒト皮膚角層抽出液；１８０μＬを、次いで５０ｍＭ−ＡＡＰＡ（acetyl-L-alanine p-nitroaniline）５０％−ＥｔＯＨ溶液；２０μＬを注入し、３７℃で６０分間インキュベートし、粗酵素・基質混合液を得た。インキュベート前後において、当該粗酵素・基質混合液についてＡｂｓ．４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５１】
ＯＰＨ酵素であるAcylamino-acid-releasing enzyme（ＡＡＲＥ；タカラバイオ社製）を用いた検量線により、酵素活性を算出した。一方でDC protein assay（lowry法）にて蛋白量を測定し、ＯＰＨ様比活性（μUnit／μg）を算出した。
【００５２】
結果を図１に示す。図１は、各部位のヒト皮膚角層抽出液のＯＰＨ酵素比活性を表すグラフである。この結果によれば、ヒト皮膚角層中のＯＰＨ様活性成分は特に顔部に多く含まれることがわかる。
【００５３】
＜実施例２；各種植物抽出物によるＯＰＨ活性増強作用１次スクリーニング＞
各種植物抽出物（以下、「植物エキス」という）について、ＯＰＨ活性増強作用に関する１次スクリーニングを、以下の方法で行った。
【００５４】
９６穴マイクロプレート（黒色）に、トリスバッファー（0.2M Tris-HCl Buffer；ｐＨ７．４）１５０〜２４０μＬを、次いで各種植物エキス（強熱乾固物量として１ｍｇ／ｍＬ）の７０％−ＥｔＯＨ溶液；１０μＬを、次いでＡＡＲＥ（０．５Ｕ／ｍＬ）；１０μＬを、次いでＡＧＥ−ＨＳＡ；８０μＬを注入し、３７℃で１８時間インキュベートし、酵素・基質混合液を得た。
【００５５】
ここで、上記ＡＧＥ−ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン最終糖化生成物）は、４０ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したヒト血清アルブミン水溶液２０ｍＬに、２ｍｏｌ／Ｌ濃度のグルコース１０ｍＬ、０．１Ｍ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）５０ｍＬ、水２０ｍＬを加えて６０℃で４０時間インキュベートして得たものである。
【００５６】
上記インキュベート後に得られた酵素・基質混合液について、蛍光強度（Ｅｘ；３７０ｎｍ、Ｅｍ；４３０ｎｍ）を、蛍光強度測定装置（TECAN社製、製品名；infinite F200PRO）にて測定した。植物エキス無添加時の蛍光強度減少量を基準（０％）としたときの、植物エキス添加時の減少量増加率をＯＰＨ活性化率として示した。結果を表１＜各種植物エキスのＯＰＨ活性増強作用１次スクリーニング結果＞に示す。
【００５７】
【表１】
2017190310.tif 000003
【００５８】
＜実施例３；ＯＰＨ活性増強作用２次スクリーニング＞
植物エキスとしてアセンヤク、オウゴン、ゲンノショウコ、コメヌカ、サルビア、マジョラム、アロエ、ウスベニアオイ、エンメイソウ、オウレン、オノニス、及びローズヒップを選択した。
【００５９】
上記で選択した各植物エキス、ＡＧＥ−ＨＳＡ、及びトリスバッファーを混合した後、最後にＡＡＲＥを添加して３７℃で１時間インキュベートした以外は、実施例２と同様の方法で酵素・基質混合液を得た。
【００６０】
ＡＡＲＥ添加直後、および３７℃で１時間インキュベートした後の蛍光強度を測定し、植物エキス無添加時のＯＰＨ活性を１００％とした時の活性増強率を算出した。結果を図２に示す。図２は、各植物エキスのＯＰＨ活性増強作用２次スクリーニングの結果を示すグラフである。
【００６１】
＜実施例４＞
植物エキスとしてアセンヤク、コメヌカ、エンメイソウ、ヒハツを選択した。
実施例２において、上記で選択した各植物エキス、ＡＧＥ−ＨＳＡ、及びトリスバッファーを、混合した後、最後にＡＡＲＥを添加して３７℃で１時間インキュベートした以外は、実施例２と同様の方法で糖化生成物混合物を得た。各植物エキスの濃度（ｍｇ／ｍＬ）を変化させた糖化生成物混合物を同様に調製し、ＯＰＨ活性率を測定した。なお、ＯＰＨ活性率とは、植物エキス無添加時の蛍光強度減少量を１００％としたときの、植物エキス添加時の減少量増加率を表したものである。
【００６２】
得られた結果を図３に示す。図３は植物エキス濃度とＯＰＨ活性率との関係を示すグラフである。これによれば、エンメイソウ、ヒハツ、コメヌカに濃度依存性が確認された。
【００６３】
＜実施例５＞
植物エキスとしてエンメイソウを選択し、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１２５μｇ／ｍＬ（各々強熱乾固物量として）の３種の濃度の抽出液を用意した。実施例３において、植物エキスとして当該３種の濃度のエンメイソウ抽出液を用いた以外は同様に行い、ＯＰＨ活性増強率を求めた。結果を図４に示す。図４はエンメイソウ抽出液濃度とヒＯＰＨ活性増強率との関係を示すグラフである。それによれば、少なくともエンメイソウ抽出液は、皮膚角層中から抽出したＯＰＨ活性を増強する作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
ヒト皮膚角層中において確認されたＯＰＨ様活性成分は、ＯＰＨであるＡＡＲＥと活性画分が一致した事から、ヒト皮膚角層中にＯＰＨが存在していると考えられる。また、化粧料に好適に使用可能な特定の植物抽出物（植物エキス）にＯＰＨ活性を高める作用のあるものが確認され、特にヒト皮膚角層中のＯＰＨ活性を高めることが分かった。
よって、本発明の特定の植物抽出物（植物エキス）を含むＯＰＨ活性増強剤を化粧料や皮膚外用剤に配合することにより、化粧料や皮膚外用剤による皮膚ＯＰＨ活性増強をはかり、皮膚老化進展を抑制することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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