(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な血管内皮機能改善剤の提供。【解決手段】アシル化ステロール配糖体を含む発芽玄米又は玄米の糠抽出物を有効成分とする、血管内皮機能改善剤。該アシル化ステロール配糖体は、２質量％以上、特に、２．７〜４．１質量％含有することが好ましい。該血管内皮機能改善剤は、さらに、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有するものであることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化ステロール配糖体を含む発芽玄米又は玄米の糠抽出物を有効成分とする、血管内皮機能改善剤。
【請求項２】
アシル化ステロール配糖体を２質量％以上含有する請求項１記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項３】
アシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％含有する請求項２記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項４】
さらに、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有するものである請求項３記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項５】
血管内皮機能の改善の指標が、血流依存性血管拡張反応を測定するものである請求項１〜４のいずれかに記載の血管内皮機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮機能改善作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞は、血管の内腔を覆っている一層の細胞群である。血管内皮細胞は、様々な生理活性物質を産生することが知られている。
血管内皮細胞が産生及び分泌する生理活性物質として、血管平滑筋を弛緩させる一酸化窒素（ＮＯ）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、及び内皮由来過分極因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＤＨＦ）などの内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）、血管平滑筋を収縮させるエンドセリンなどの内皮由来収縮因子（ＥＤＣＦ）、トロンボモジュリンやヘパラン酸などの抗血栓性因子、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、及び血小板活性化因子などの血栓形成因子、並びにＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びセレクチンなどの血球の内皮付着因子を挙げることができる。
【０００３】
このような生理活性物質を産生及び分泌する血管内皮細胞の機能が低下すると、冷え性、更年期障害、腰痛、関節痛、ほてり、眼精疲労、肩凝り、発汗、皮膚掻痒感、肌荒れなどの種々の症状をひき起こす。また、内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）及び内皮由来収縮因子（ＥＤＣＦ）の産生及び分泌の異常が起こると、糖尿病、高血圧、心疾患、脳梗塞、及びインスリン抵抗性などの疾患の原因となる。さらにまた、多臓器不全及び敗血症などの疾患においては、抗血栓性因子、血栓形成因子、及び血球の内皮付着因子の産生や分泌が乱れ、生体に重大な影響を及ぼす。従って、血管内皮機能低下を防ぎ、血管内皮機能を改善することは、様々な疾患の予防及び治療において重要である。
血管内皮機能の測定は、血管内皮機能検査法として標準化されており、わが国の健康保険における診療報酬にも収載されている。具体的な方法は、非特許文献１に記載されている。
【０００４】
血管は生体の全域に分布する器官であり、このため血管の内皮機能は、生体内のホメオスタシスに重要な役割を果たしている。血管内皮の機能を改善する薬剤として、ニトログリセリンや硝酸塩が著名である。また、大豆の麹菌培養物（特許文献１）、酢酸・酢酸イオン及び酢酸塩（特許文献２）、球形活性炭（特許文献３）、タマネギ又はタマネギ処理物（特許文献４）、パッションフルーツ由来のピセアタンノール（特許文献５）などが知られている。
【０００５】
生活習慣や食生活の変化により、虚血性心疾患、脳血管疾患、糖尿病などのいわゆる血管内皮機能の不全が関わる生活習慣病患者が増加している。このため、血管内皮機能を改善する物質が広く探索されている。
【０００６】
一方、発芽玄米から抽出されたアシル化ステロールを含有する組成物に様々な作用効果が発見されている。特許文献６には抗疲労作用が記載され、特許文献７にはＴＮＦ−α産生抑制作用が記載されている。また特許文献８にはＧＬＰ−１産生促進作用、特許文献９にはＶＬＤＬ分泌抑制作用が記載されている。アシル化ステロール配糖体は、アシル基や糖鎖の異なる化合物の総称であり、天然物中には通常複数の成分の混合物として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−８８４６号公報
【特許文献２】特開２００７−１３７８０３号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２０９３６号公報
【特許文献４】特開２０１３−５３０８４号公報
【特許文献５】特開２０１３−２２７２５６号公報
【特許文献６】特開２０１４−１３３７１６号公報
【特許文献７】特開２０１４−１５６４３２号公報
【特許文献８】特開２０１５−０６３５０８号公報
【特許文献９】特開２０１５−０８６１５３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】血管機能の非侵襲的評価法に関するガイドライン  Guidelines for non-invasive vascular function test  １１７−１１９頁 (JCS 2013) http://www.j-circ.or.jp/guideline/pdf/JCS2013_yamashina_d.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新たな血管内皮機能改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、発芽玄米や玄米の糠に多く含有されるアシル化ステロール配糖体について研究を行っている。その研究の過程で、アシル化ステロール配糖体を含有する組成物に血管内皮機能改善作用を見いだし、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、以下の構成である。
（１）アシル化ステロール配糖体を含む発芽玄米又は玄米の糠抽出物を有効成分とする、血管内皮機能改善剤。
（２）アシル化ステロール配糖体を２質量％以上含有する（１）記載の血管内皮機能改善剤。
（３）アシル化ステロール配糖体を２．７〜４．１質量％含有する（２）記載の血管内皮機能改善剤。
（４）さらに、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％、ステアロ・オレオ・レシチン換算で、リン脂質を１８〜２８質量％含有し、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸、１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有するものである（３）記載の血管内皮機能改善剤。
（５）血管内皮機能の改善の指標が、血流依存性血管拡張反応を測定するものである（１）〜（４）のいずれかに記載の血管内皮機能改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規な血管内皮機能改善剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の剤を、６ヶ月間継続投与したヒト臨床試験におけるヒトの血流依存性血管拡張反応（Flow Mediated Dilation：ＦＭＤ）の変化を測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、アシル化ステロール配糖体を含む発芽玄米又は玄米の糠抽出物を有効成分とする、血管内皮機能改善剤に係るものである。
本発明の血管内皮機能改善剤の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物に含まれるアシル化ステロール配糖体は、アシル基や糖鎖の異なる化合物の総称であり、天然物中には通常複数の成分の混合物として存在する。アシル化ステロール配糖体の構成糖は主にグルコースである。また構成ステロールはβ−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール等である。アシル化は主にグルコースの６位が、脂肪酸によってアシル化されており、構成脂肪酸は主にリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸であることが明らかになっている（帯大研報，10，（1977）507〜514）。そして本発明の改善剤にはアシル化ステロール配糖体を２質量％以上含有する。
【００１５】
本発明に用いられる発芽玄米又は玄米の糠抽出物中のアシル化ステロール配糖体の含有量の測定は、以下の方法により行うことができる。
（１）発芽玄米又は玄米の糠抽出物を適量秤取し、クロロホルム／メタノール混液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を加え、メスフラスコにてメスアップする。
（２）（１）で得られた溶液は成分濃度に応じて適宜希釈し、分析用試料溶液とする。
（３）標品はＥｓｔｅｒｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｙｌ  Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（フナコシ）とし、高速液体クロマトグラフ法によりアシル化ステロール配糖体の濃度を算出する。
（４）高速液体クロマトグラフ法による分析条件
分析装置      ：ＨＰＬＣ
移動相Ａ      ：メタノール：水＝９５：５（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ      ：クロロホルム＝１００（ｖ／ｖ）
ポンプ        ：Ｍｏｄｅｌ  ５８２  
ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ
分析カラム    ：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｉ６０（５μｍ）
ＨＰＬＣ−Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＭＥＲＣＫ）
検出器        ：荷電化粒子検出器（コロナ  ダイオネクス社）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
カラムオーブン：４０℃（ＦＬＯ社  ｍｏｄｅｌ  ５０２）
分析時間      ：４０ｍｉｎ
脱泡装置      ：ｕｎｉｆｌｏｗｓ  Ｄｅｇａｓｙｓ  
Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＤＶ  ３００３
流速          ：１ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント条件
以下に示すとおり
０−１５分
移動相Ａ：  １％→２５％、移動相Ｂ：９９％→７５％
１５−２０分
移動相Ａ：２５％→９０％、移動相Ｂ：７５％→１０％
２０−２５分
移動相Ａ：９０％、        移動相Ｂ：１０％
２５−３０分
移動相Ａ：９０％→  １％、移動相Ｂ：１０％→９９％
３０−４０分
移動相Ａ：  １％、        移動相Ｂ：９９％
【００１６】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物は、γ−オリザノールを１．４〜２．１質量％含有するものが好ましい。
γ−オリザノールは、糠の脂質に含有されるフェルラ酸とステロールのエステルであり、またフェルラ酸２４−メチレンシクロアルテニル、フェルラ酸シクロアルテニル、フェルラ酸カンペステリル、フェルラ酸β−シトステリル等の混合物である。
【００１７】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物中のγ−オリザノールの含有量は、高速液体クロマトグラフィーにて、逆相カラムを用い、紫外線検出器で検出することができる。
【００１８】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物は、ステアロ・オレオ・レシチン（ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン）換算でリン脂質を１８〜２８質量％含有するものが好ましい。
【００１９】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物中のリン脂質の含量はモリブデンブルー吸光光度法により、リンの濃度を測定し、ステアロ・オレオ・レシチン量に換算して求めることができる。具体的には、発芽玄米又は玄米の糠抽出物からＦｏｌｃｈ法で脂質を抽出し、灰化後、モリブデンブルー吸光光度法により、リンの濃度を測定する。
【００２０】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物は、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して２０〜３０質量％のリノール酸、２４〜３７質量％のオレイン酸、１１〜１７質量％のパルミチン酸を含有するものが好ましい。
【００２１】
前記した加水分解後のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸の量は、以下の方法により測定できる。発芽玄米又は玄米の糠抽出物に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を加えてケン化し、三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノール溶液を添加してメチルエステル化する。ヘキサンと飽和食塩水を加えて脂肪酸のメチルエステル化物を分配抽出し、ガスクロマトグラフィーで水素炎イオン検出器を用いて定量分析する。
【００２２】
本発明の有効成分である発芽玄米又は玄米の糠抽出物は、加水分解したときに、加水分解前の質量に対して１．７〜２．６質量％の植物ステロールを含有するものが好ましい。植物ステロールの主成分は、β−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロールである。
【００２３】
加水分解後の植物ステロールの量は、以下の方法により測定できる。発芽玄米又は玄米の糠抽出物に塩化ナトリウム水溶液、ピロガロール−エタノール溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カリウムを順次加えて、ケン化する。塩化ナトリウム水溶液とヘキサン、酢酸エチル混液を添加して、不ケン化物を分配抽出する。不ケン化物からシリカカートリッジカラムを用いて植物ステロール画分を分離し、植物ステロール画分中の植物ステロールをガスクロマトグラフィーで水素炎イオン検出器を用いて定量分析する。
本発明の発芽玄米又は玄米糠抽出物の抽出方法としては、溶媒抽出法、超臨界抽出法、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。
また、具体的な抽出操作を以下に示す。
【００２４】
＜抽出方法＞
発芽玄米を搗精した糠又は市場に流通している米糠に含まれている外皮などの異物を選別除去した後に、ノルマルヘキサンを用いて脱脂する。得られた油、脱脂糠等の粗原料を蒸留装置により脱溶媒し、さらにノルマルヘキサン、アセトン、エタノール、水などの溶媒によって抽出する。かくして得られた抽出液を、脱溶剤装置を用いて再度脱溶剤することで本発明の有効成分である発芽玄米または玄米の糠抽出物を得ることができる。
【００２５】
本発明に係る発芽玄米又は玄米の糠抽出物は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口摂取（投与）することができる。カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤として投与する。
本発明の改善剤の投与量は、投与方法と、対象者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、成人では体重１ｋｇ当たり通常、１日当たり有効成分として０．１〜５００ｍｇが適当である。
【実施例】
【００２６】
以下に、参考例、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
＜参考例：アシル化ステロール配糖体含有米糠抽出物の調製（溶媒抽出）＞
市場に流通している米糠を選別し胚乳や異物を除いた米糠を得た。得られた選別済みの米糠１０ｋｇに対して５０Ｌのノルマルヘキサンを用い脱脂した。この脱脂作業をもう一度繰り返し、脱脂米糠を得た。得られた脱脂米糠から蒸留装置により溶媒を除去した。
得られた脱脂米糠８ｋｇに対し、５０Ｌのエタノールを用いて７０±３℃の温度条件にて１時間還流抽出した。これを３回繰り返し、得られた抽出液について、脱溶剤装置を用いてエタノールを除去した。なお以上の抽出操作は特開２０１５−８６１５１号公報に開示されている。
米糠抽出物中のアシル化ステロール配糖体、γ−オリザノール、ステアロ・オレオ・レシチン換算のリン脂質の濃度並びに、加水分解前の質量に対する、加水分解後のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、植物ステロールの濃度を下記の表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
＜実施例：ヒト臨床試験による血管内皮機能改善効果の評価＞
参考例で得た抽出物をソフトカプセル剤とし、プラセボとの比較ヒト臨床試験を行った。
（１）試験デザイン
一重盲検、無作為化、並行群間比較試験とし、本発明品投与群とプラセボ投与群の２群とした。
【００２９】
（２）被験者
閉経後の女性、年齢４５〜６５歳、血清ＬＤＬコレステロールが１４０ｍｇ／ｄｌ以上の者６０名（各群３０名）を対象とした。
【００３０】
（３）投与方法
１日３回毎食後にカプセル剤２粒／１包（１日６粒）を６ヶ月間毎日経口投与する。
なお、カプセル剤には米糠抽出物が５０ｍｇ／日となるように添加物を配合して製剤設計を行った。
【００３１】
（４）血管内皮機能評価スケジュール
投与開始前、投与開始後６０日（２ヶ月）、１２０日（４ヶ月）、１８０日（６ヶ月）にそれぞれ、血流依存性血管拡張反応（Flow Mediated Dilation：ＦＭＤ）を測定し血管内皮機能を評価した。ＦＭＤの測定は株式会社ユネスク製のＦＭＤ測定装置を用いた。なお測定に当たっては非特許文献１に記載されたガイドラインにしたがって実施した。
【００３２】
（５）その他調査項目
背景調査：年齢、脂質異常症に関する家族歴、喫煙歴、治療歴等
理学検査：身長、体重、血圧、ＣＡＶＩ、体脂肪率（インピーダンス法）、ウエスト周囲径
血液検査：Ｔｏｔａｌ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ、ＬＤＬ−Ｃ（直接法）、ＴＧ、空腹時血糖、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度ＴＮＦ−α、Ｈｓ−ＣＲＰ、ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＰＯＮ−１活性、安全性評価項目
その他：食事調査、ＱＯＬ調査、活動量、生活日誌、問診
【００３３】
（６）結果
測定結果は、統計解析を行い、平均値を求め、対応のないｔ−検定（JMP11）でプラセボと本発明品群間の有意差検定を行った。
ＦＭＤ値の測定結果を下記表２及び図１に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
本発明の改善剤を投与した群は、投与開始前のＦＭＤに比して２、４、６ヶ月いずれの測定時点でも増加しており、血管内皮機能が改善していることが明らかであった。
一方プラセボ投与群は、いずれの測定時点でも投与開始前のＦＭＤに比して明らかに低下していた。プラセボ群のＦＭＤの低下は、血管内皮機能が時間の経過とともに悪化していることを意味している。また投与群とプラセボ投与群では投与６０日目及び１２０日目では、有意水準１％で明らかな差が認められ、さらに投与１８０日目では、有意水準５％で明らかな差が認められた。
この結果から、被験者における血管内皮機能は、時間の経過とともに低下するが、本発明の改善剤は、低下を抑制または改善することが確認できた。
【図１】
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