(57)【要約】【課題】  標的核酸を増幅させる核酸増幅反応においてフォワードプライマーとリバースプライマーの量に偏りが生じ、量が多い方のプライマー由来の一本鎖が余剰に生成されたような場合でも、その標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する場合において、偽陰性の判定を生じることなく、検出することを可能とする。【解決手段】  標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する方法であって、ハイブリダイゼーション工程前に、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程を含む方法とする。【選択図】  図３
2017063760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する方法であって、
ハイブリダイゼーション工程前に、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程を含む
ことを特徴とするハイブリダイゼーションによる核酸検出方法。
【請求項２】
前記一本鎖核酸の分解または除去を、一本鎖核酸に選択的に作用する、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはこれらの混合物により行う
ことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法。
【請求項３】
前記一本鎖核酸の分解または除去を、カラムによる精製法を用いて行うことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法。
【請求項４】
前記プローブが、担体上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、食中毒菌やカビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
例えば、カビの検査では、一般的に、環境中からカビを採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、微生物を同定する形態観察法（培養法）が行われている。
【０００３】
また、最近は、微生物の検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取したカビを培養した後、培養されたカビからＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いる方法などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５１９６８９号公報
【特許文献２】特開２００６−２９６２７９号公報
【特許文献３】特開平６−９８７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＣＲ法などの核酸増幅反応によって標的核酸を増幅する場合、増幅起点となるプライマー量に偏りが生じると、量が多い方のプライマー由来の一本鎖が余剰に生成される。すなわち、プライマーセットを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーが同量ではないケースが生じると、核酸増幅反応において、一方のプライマーが先に枯渇し、他方のプライマーから伸長する一本鎖核酸が合成される。そして、反応液中に含まれる標的配列をプローブとのハイブリダイゼーションにより検出しようとすると、この余剰に生成された一本鎖核酸がプローブと競合して、標的核酸とプローブのハイブリダイゼーションが阻害され、偽陰性の判定を引き起こすことがあるという問題があった。
【０００６】
ハイブリダイゼーションによる核酸検出の精度向上に関連する技術としては、特許文献１に記載の方法がある。その方法によれば、ハイブリダイズされていないプローブをヌクレアーゼを用いて基板から除去することにより、バックグラウンドノイズを減少させることが可能とされている。
また、特許文献２に記載のハイブリダイゼーション検出方法によれば、ハイブリダイズされていない標的核酸やプローブをヌクレアーゼを用いて分解することにより、バックグラウンドノイズを減少させることが可能とされている。
さらに、特許文献３に記載の核酸検出方法では、標的核酸の二本鎖核酸のうち一方のみを分解して一本鎖核酸にし、この一本鎖核酸を相補的な塩基配列を有するプローブにハイブリダイズさせることで、標的核酸の再会合の問題を除去できるとされている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１および２に記載の方法では、プライマー量に偏りが生じて量が多い方のプライマー由来の一本鎖核酸が余剰に生成される場合には、この一本鎖核酸と、基板上のプローブとがハイブリダイゼーションにおいて競合するため、上述の偽陰性判定の問題を解消することができない。
また、特許文献３に記載の方法は、標的である二本鎖核酸の一方を事前に特定して分解するものであるところ、本来は同量であるべきフォワードプライマーとリバースプライマーが誤って同量ではなくなっているケースでは、二本鎖核酸のいずれを分解すべきかを事前に特定することはできず、上述の偽陰性判定の問題の解消に適用することができない。さらに、特許文献３の方法では、二本鎖核酸の一方に分解の感受性または抵抗性を付与する必要があるため、試薬コストが高くなるという問題もあった。また、二本鎖核酸の一方を分解するものであるため、二本鎖核酸の両方からプローブを設計することができず、設計の自由度が低くなるという問題もあった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、標的核酸を増幅させる核酸増幅反応においてフォワードプライマーとリバースプライマーの量に偏りが生じ、量が多い方のプライマー由来の一本鎖が余剰に生成されたような場合でも、その標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する場合において、偽陰性の判定を生じることなく、検出することが可能なハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法は、標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する方法であって、ハイブリダイゼーション工程前に、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程を含む方法としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、標的核酸を増幅させる核酸増幅反応においてフォワードプライマーとリバースプライマーの量に偏りが生じ、量が多い方のプライマー由来の一本鎖が余剰に生成されたような場合でも、その標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する場合において、偽陰性の判定を生じることなく、検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験１（サルモネラ属菌の核酸検出）で使用したプライマーおよびプローブの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験１における酵素処理前のＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験１におけるマイクロアレイおよびその蛍光検出画像を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験１における蛍光検出結果（蛍光強度，Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験２（カビの核酸検出）で使用したプライマーおよびプローブの塩基配列を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験２における酵素処理前および酵素処理後のＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験２におけるマイクロアレイおよびその蛍光検出画像を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を検証するための試験２における蛍光検出結果（蛍光強度，Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態および後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
最初に、本発明の実施形態が案出された経緯について説明する。食中毒菌やカビなどの微生物の検査方法において、環境中からサンプルを採取して培養し、培養した微生物からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲによって標的領域を増幅し、その増幅産物に相補的に結合可能なプローブを予め固定化したマイクロアレイやＤＮＡチップなどの担体に、得られた増幅産物を滴下してプローブ（プローブ核酸）にハイブリダイズさせ、増幅産物に付された蛍光標識を検出することによって、微生物を検出する方法が存在する。
【００１３】
ここで、ＰＣＲにおいて、その反応液に標的核酸を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットが含有され、かつ検出対象の微生物から抽出されたＤＮＡが含有されており、核酸増幅反応が適切に行われると、標的核酸の増幅産物が得られる。この得られた増幅産物は、電気泳動法などにより検出することが可能である。
ところが、より高い精度で分析を行うために、増幅産物にハイブリダイズするプローブが固定化されたマイクロアレイなどの担体を用いて検出を行う場合、増幅産物が適切に得られているにも拘わらず、検出できない事象が生じていた。すなわち、電気泳動の結果から増幅産物が得られていることが確認されていても、その増幅産物の蛍光標識が検出できないことがあった。
【００１４】
その原因を調査するために、ＰＣＲ反応液における試薬を分析したところ、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーに濃度差があり、これらの量に偏りが生じていることが判明した。
ここで、プライマーセットを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーに濃度差がない場合には、ＰＣＲサイクルの終盤において、これらのプライマーは同時に枯渇するため、それ以上増幅産物は増えず、増幅産物は二本鎖核酸のみから構成される。
一方、プライマーセットを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーに濃度差がある場合には、ＰＣＲサイクルの終盤において、量が少ない方のプライマーが先に枯渇し、量が多い方のプライマーは標的核酸の一方の鎖の伸長に用いられて、余剰な一本鎖核酸が合成され、増幅産物には標的核酸の二本鎖核酸の他、一本鎖核酸も含まれることとなる。
【００１５】
このようにして得られた増幅産物を担体に滴下した場合、増幅産物が二本鎖核酸のみからなる場合には、プローブとハイブリダイズすることによって、強い蛍光強度を得ることができる。
一方、増幅産物に余剰な一本鎖核酸が含まれる場合、その一本鎖核酸とプローブとが競合する結果、蛍光強度が弱くなって検出することができず、偽陰性の判定が生じ得ることが判明した。
【００１６】
ここで、プライマーセットにおけるフォワードプライマーとリバースプライマーに濃度差があっても、増幅産物として標的核酸の二本鎖核酸は合成されるため、電気泳動法によって増幅産物を検出することは可能である。
しかしながら、マイクロアレイなどの担体を用いて、より高い精度で検出を行う場合には、フォワードプライマーとリバースプライマーの濃度に１／１０程度の差異が生じただけでも、増幅産物として合成される一本鎖核酸がプローブと競合する結果、偽陰性判定が生じ得ることが分かった。
そこで、このようにして増幅産物として生じた一本鎖核酸を、ハイブリダイゼーションを行う前に分解または除去することによって、蛍光強度を増加させ、偽陰性の判定を防止できるかを検証して、本発明の実施形態が完成された。
【００１７】
すなわち、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法は、標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する方法であって、ハイブリダイゼーション工程前に、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程を含むことを特徴とする。
また、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法は、標的核酸が核酸増幅反応によって得られた二本鎖核酸であり、一本鎖核酸が核酸増幅反応においてフォワードプライマーとリバースプライマーの量に偏りが生じて量が多い方のプライマーにもとづき生成されたものとすることも好ましい。
【００１８】
本実施形態において、ハイブリダイゼーションは、標的核酸とプローブとの相補的結合を意味する。標的核酸は、検出対象生物のＤＮＡなどにおける検出対象領域の核酸を意味する。また、標的核酸をＰＣＲによって増幅する場合、標的核酸は、プライマーセットにより増幅対象領域を増幅して得られる二本鎖核酸である。
標的核酸とプローブとが相補的に結合する場合、プローブは、標的核酸における一本鎖に解離した、相補的な塩基配列を備えた一方と結合する。この一本鎖に解離したとは、標的核酸における全配列が解離した場合のみを意味するものではなく、部分的に解離する場合も含む。この部分的に解離した領域がプローブと相補的な塩基配列を備える場合、標的核酸とプローブとはハイブリダイゼーションを行うことができる。
本実施形態において、ハイブリダイゼーションには、プローブを固定化したマイクロアレイやＤＮＡチップなどの担体を用いたハイブリダイゼーション、ニトロセルロース膜やナイロン膜等の担体にプローブを固定して用いたハイブリダイゼーション、および液相ハイブリダイゼーション等が含まれる。
【００１９】
本実施形態において、ハイブリダイゼーション工程前は、標的核酸とプローブをハイブリダイズさせる前を意味する。また、標的核酸を核酸増幅反応によって増幅させる場合は、この核酸増幅工程の後であって、かつ標的核酸とプローブをハイブリダイズさせる前を意味する。
【００２０】
本実施形態において、試料は、広くは検査対象のサンプルを意味し、より詳細には検査対象のサンプルを含む溶液を意味する。具体的には、試料は、ハイブリダイゼーション工程において、担体に滴下する標的核酸を含む溶液であり、標的核酸を核酸増幅反応によって増幅させる場合、その核酸増幅反応によって得られた増幅産物を含む溶液は、試料に相当する。
【００２１】
本実施形態において、フォワードプライマーとリバースプライマーの量の偏りは、核酸増幅反応液中におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの濃度に差異があることを意味し、その差異には例えば１／２〜１／２０などの範囲が含まれる。
【００２２】
本実施形態において、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程は、例えば一本鎖核酸に選択的に作用する、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはこれらの混合物により、行うことができる。
エキソヌクレアーゼは核酸をその配列の末端から分解する酵素であり、一本鎖を特異的に分解するもの、二本鎖を特異的に分解するもの、および両方を分解するものが存在する。本実施形態では、一本鎖核酸を選択的に分解するものが好適に用いられる。このエキソヌクレアーゼとしては、例えば市販の一本鎖ＤＮＡ分解酵素（エキソヌクレアーゼＩ）などを用いることができる。
エンドヌクレアーゼは核酸をその配列の内部から分解する酵素であり、一本鎖を特異的に分解するもの、二本鎖を特異的に分解するもの、および両方を分解するものが存在する。本実施形態では、一本鎖核酸を選択的に分解するものが好適に用いられる。
【００２３】
また、本実施形態において、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去して、二本鎖核酸に対比して一本鎖核酸が実質的に存在しない状態にする工程は、例えばカラムによる精製法を用いて、行うこともできる。
カラムによる精製法は、例えばＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（BenevBio社製、品番PPS0001S）を用いて行うことができる。これは、カラムを用いてＰＣＲ産物から二本鎖ＤＮＡを精製するキットである。また、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Zymo  Research社製、品番7010）を用いて行うこともできる。これは、本来は、カラム精製により二本鎖核酸を除去して一本鎖核酸を得るためのキットであるが、廃棄画分を用いることで二本鎖核酸のみを取り出すことが可能である。
【００２４】
本実施形態において、核酸検出の精度向上は、ハイブリダイズした標的核酸（またはプローブ）に付された蛍光標識などの識別標識の検出感度を向上させて、偽陰性の判定や偽陽性の判定が生じることを抑制することを意味する。特に、本実施形態では、標的核酸とプローブのハイブリダイゼーションに競合が生じることを防止して、偽陰性の判定が生じることを抑制することを意味する。
【００２５】
本実施形態は、その構成の特徴から明らかなように、検出対象生物は、食中毒菌やカビなどの微生物に限定されるものではなく、ＤＮＡやＲＮＡを有する全ての生物やウイルスを対象とすることが可能である。すなわち、以下の実施例では、食中毒菌とカビを検出対象として試験を行っているが、検出対象はこれらに限定されない。また、以下の実施例では、食中毒菌やカビを検出するための特定のプライマーおよびプローブを用いて試験を行っているが、本実施形態は、これら特定のプライマーおよびプローブを用いる場合に限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２６】
本実施形態において使用可能なマイクロアレイやＤＮＡチップなどの担体は、プローブを用いて既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、石英やプラスチック、シリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００２７】
本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法は、所定のプライマーセットと検出対象生物のＤＮＡとを含有する核酸増幅反応液を用いて、そのＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を担体に滴下して相補的な塩基配列を有するプローブと結合させることにより行うことができる。例えば、検出対象生物の採取工程、ＤＮＡの抽出工程、標的領域の増幅工程、およびハイブリダイゼーションによる増幅産物の確認工程等を含むものとすることができる。
【００２８】
検出対象生物の採取とＤＮＡの抽出には、種々の方法があり特に限定されないが、例えば環境中のカビを検出する場合には、エアーサンプラーで空中浮遊カビ胞子を寒天培地に採取して、培養後にＤＮＡを抽出することができる。
また、土壌中の微生物を検出する場合には、採取した土壌を適当量の水に懸濁し、その後任意の倍率で段階希釈して、それぞれの段階希釈液を培地に塗布して培養した後に、培養された微生物からＤＮＡを抽出することができる。
【００２９】
カビの培養を行う場合、その培地としては、ＰＤＡのような一般的なものを使用してもよく、また捕集対象カビがあらかじめ決まっている場合は、抗生物質等を加えた、いわゆる選択培地と呼ばれるものを使用してもよい。また、培養条件としては、２０℃〜２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。そして、培養されたカビのコロニーをコロニー毎に個別にまたは二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００３０】
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。
ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
ＰＣＲによる核酸増幅反応は、例えば以下のような反応条件で行うことができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００３１】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）など）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、検出対象生物のゲノムＤＮＡ、緩衝液、および残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ(登録商標)（株式会社島津製作所製）などを用いることができる。
【００３２】
次に、増幅産物を担体に滴下し、担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ(登録商標)を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はない。
【００３３】
また、測定結果として、蛍光強度の他、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）を算出することも好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が3.0以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００３４】
以上説明したように、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によれば、標的核酸を増幅させる核酸増幅反応においてフォワードプライマーとリバースプライマーの量に偏りが生じ、量が多い方のプライマー由来の一本鎖核酸が余剰に生成されたような場合でも、その一本鎖核酸がハイブリダイゼーション工程においてプローブと競合することを防止でき、偽陰性の判定が生じることを抑制して、核酸検出の精度を向上させることが可能である。
また、標的核酸が酸増幅反応によって得られたものではない場合であっても、ハイブリダイゼーション工程においてプローブと競合するような一本鎖核酸が試料中に含まれる場合には、本実施形態によれば、このような一本鎖核酸をハイブリダイゼーション工程前に除去することができるため、同様に核酸検出の精度を向上させることが可能である。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施形態に係るハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００３６】
［試験１］
まず、サルモネラ属菌を用いて、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果の確認を行った。
具体的には、サルモネラ属菌（Salmonella  abony，菌株番号：ACM5080株）を、ＢＤ  ＢａｃｔｏTM  トリプティックソイブロス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて、３７℃で一晩培養して得られた純粋培養液を検体とした。
【００３７】
次に、培養液を１ｍＬ回収し、５０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
【００３８】
次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。意図的に偽陰性の判定を生じさせるために、フォワードプライマーの濃度をリバースプライマーの濃度より高くしている。プライマーの合成はシグマアルドリッチジャパン合同会社に委託し、その他の試薬はタカラバイオ株式会社のものを使用した。
また、プライマーの塩基配列は、図１に示す通りである。同図において、配列番号１に示す塩基配列はフォワードプライマー、配列番号２に示す塩基配列はリバースプライマーである。これらは上記サルモネラ属菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｉｎｖＡ）を増幅するためのプライマーセットであり、増幅産物の推定サイズは、１７７ｂｐである。
【００３９】
・緩衝液（10×Ex Taq buffer）                          （2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture,  2.5mM each）            （1.6μl）
・テンプレート                                         （1.0μl）
・10μMフォワードプライマー                            （0.12μl）
・10μMリバースプライマー（5’末端をCy5標識）         （0.1μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa Ex Taq Hot Start Version）      （0.2μl）
・滅菌水                                               （残量）
（全量  20μl）
【００４０】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（（２）〜（４）を４０サイクル）
（５）７２℃  ２分
【００４１】
次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ(登録商標)（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図２における２のバンドに示す。このＰＣＲ反応液に対して、一本鎖核酸の除去はまだ行われておらず、２のバンドは酵素処理前のＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示している。なお、図２における１のバンドはサイズマーカーを示している。
【００４２】
図２に示されるように、電気泳動の結果、サルモネラ属菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｉｎｖＡ）を増幅するためのプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ  １７７ｂｐ）が検出された。一方、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
【００４３】
また、ＰＣＲ産物に対して、illustra(登録商標) ExoStar Enzymatic PCR and Sequencing Clean-Up（ＧＥヘルスケア）に含まれるエキソヌクレアーゼ（Exonuclease 1 ）を1.0μl添加し、サーマルサイクラーｅｐグラジエントを用いて３７℃で１５分間インキュベートすることによって、一本鎖ＤＮＡのみを選択的に分解した。次いで、８０℃で１５分間インキュベートすることによって、酵素を失活させた。
【００４４】
次に、予め、図１に示す配列番号３〜８に示す塩基配列からなる各プローブを固定化したスポットを有するマイクロアレイを準備した。
具体的には、図３に示すマイクロアレイにおいて、スポット２６〜３１に配列番号３〜８に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されている。なお、スポット５７，６４は基準位置スポットであり、基準位置プローブが固定化されている。基準位置プローブは、φ-X174バクテリオファージから選択された塩基配列からなっている。
【００４５】
次に、基準位置プローブにハイブリダイズするマーカーポリヌクレオチド（配列番号１５：ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT（5’末端をCy5標識））の原液（１００μＭ）１μＬを９９９μＬの滅菌水に加えることにより１０００倍希釈して、１００ｎＭ溶液を調製した。そして、このマーカーポリヌクレオチドの１００ｎＭ溶液４μＬをハイブリダイズに用いる緩衝液９６μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）と混合して、１００μＬの混合液を調製した。そして、得られた混合液２μＬとＰＣＲ反応液４μＬを混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
【００４６】
反応後、マイクロアレイを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器ＢＩＯＳＨＯＴにより各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Cy5）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。マイクロアレイにおける蛍光検出画像を図３に示す。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度を得た。さらに、Ｓ／Ｎ比値を算出した。その結果を図４に示す。
【００４７】
これらの図に示されるように、サルモネラ属菌を検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行わなかったものは、30未満（S/N比値で0.1未満）の弱い蛍光強度しか得られなかった。これに対して、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行ったものは、各スポットの蛍光強度が酵素処理を行わなかったものよりも顕著に高くなっており、6000以上（S/N比値で18以上）の強い蛍光強度が観察されたスポットも存在するなど、陽性判定の閾値3.0を超えるスポットが複数存在していた（スポット２９〜３１）。
このように、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によれば、試料中にプローブと競合する一本鎖核酸をハイブリダイゼーション工程の前に除去できるため、偽陰性の判定が生じる問題を改善できることが確認された。
【００４８】
［試験２］
次に、コウジカビの一種であるアスペルギルス・バージカラー（Aspergillus  versicolor）を用いて、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法の効果の確認を行った。
具体的には、アスペルギルス・バージカラー（菌株番号：JCM10258株）を、Ｍ４０Ｙ培地（麦芽エキス２０g、酵母エキス５g、スクロース４００g、寒天粉末２０g、蒸留水１０００mL）を用いて２５℃で１週間培養して得られたコロニーを検体とした。
【００４９】
次に、コロニーを回収し、イージービーズ（エーエムアール株式会社）とミニビード・ビーターBSP-3110BX（BIOSPEC）を用いて２５００ｒｐｍで２０秒の条件でコロニーを破砕した。破砕物にQuickGene ＤＮＡ tissue kit S（クラボウ）付属の試薬を加え、以下QuickGene-810（クラボウ）のプロトコル通りに操作してＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液を希釈し、Quant-iT PicoGreen dsＤＮＡ Assay Kit（Life Technologies）とマイクロプレートリーダSH-9000（株式会社日立ハイテクノロジーズ）で測定を行い、検量線の値と比較することでＤＮＡ濃度を算出した。ＤＮＡ濃度を10pg/μlに調製したものをＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
【００５０】
次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。意図的に偽陰性の判定を生じさせるために、ＩＴＳ領域検出用フォワードプライマーの濃度をＩＴＳ領域検出用リバースプライマーの濃度より高くしている。プライマーの合成はシグマアルドリッチジャパン合同会社に委託した。また、緩衝液は株式会社島津製作所のものを使用し、核酸合成基質は東洋紡株式会社のものを使用し、蛍光標識はＧＥヘルスケアのものを使用し、核酸合成酵素はNovagen社のものを使用した。
【００５１】
また、プライマーの塩基配列は、図５に示す通りである。同図において、配列番号９に示す塩基配列はＩＴＳ領域検出用フォワードプライマー、配列番号１０に示す塩基配列はＩＴＳ領域検出用リバースプライマーである。これらは上記アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおける標的遺伝子（ＩＴＳ領域）を増幅するためのプライマーセットであり、増幅産物の推定サイズは、４２５ｂｐである。また、配列番号１１に示す塩基配列はβ−チューブリン検出用フォワードプライマー、配列番号１２に示す塩基配列はβ−チューブリン検出用リバースプライマーである。これらは上記アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおける標的遺伝子（β−チューブリン）を増幅するためのプライマーセットであり、増幅産物の推定サイズは、２８０ｂｐである。
【００５２】
・Ampdirect G/Cリッチ用                                      （4.0μl）
・Ampdirect addition-4                                       （4.0μl）
・dNTPs（1.0mM dATP, 0.8mM dCTP, 1.0mM dGTP, 1.0mM dTTP）    （1.0μl）
・1.0 mM Cy5-dCTP                                            （0.2μl）
・3.0μM ＩＴＳ領域検出用フォワードプライマー                （1.0μl）
・2.5μM ＩＴＳ領域検出用リバースプライマー                  （1.0μl）
・10μM β−チューブリン検出用フォワードプライマー           （1.0μl）
・10μM β−チューブリン検出用リバースプライマー             （1.0μl）
・テンプレート                                               （1.0μl）
・核酸合成酵素（Nova Taq Hot Start Polymerase）              （0.2μl）
・滅菌水                                                     （残量）
（全量  20μl）
【００５３】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、PCR Thermal Cycler Dice（タカラバイオ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃  １０分
（２）９５℃  ３０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５６℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ６０秒（ＤＮＡ合成工程）
（（２）〜（４）を４０サイクル）
（５）７２℃  １０分
【００５４】
次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡに供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図６における２のバンドに示す。このＰＣＲ反応液に対して、一本鎖核酸の除去はまだ行われておらず、２のバンドは酵素処理前のＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示している。なお、図６における１のバンドはサイズマーカーを示している。
【００５５】
また、ＰＣＲ産物に対して、illustra ExoStar Enzymatic PCR and Sequencing Clean-Up（ＧＥヘルスケア）に含まれるエキソヌクレアーゼ（Exonuclease 1 ）を1.0μl添加し、サーマルサイクラーｅｐグラジエントを用いて３７℃で１５分間インキュベートすることによって、一本鎖ＤＮＡのみを選択的に分解した後に、８０℃で１５分間インキュベートすることにより酵素を失活させた。
【００５６】
次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡに供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図６における３のバンドに示す。このＰＣＲ反応液は、上記の通り、一本鎖核酸が除去されたものであり、３のバンドは酵素処理後のＰＣＲ増幅産物の電気泳動結果を示している。
【００５７】
図６に示されるように、電気泳動の結果、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおける標的遺伝子（ＩＴＳ領域，β−チューブリン）を増幅するためのプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ４２５ｂｐ，２８０ｂｐ）が各々検出された。また、プライマーのものと推測される低分子のバンドが酵素処理により分解されたことも確認できる。一方、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
【００５８】
次に、予め、図５に示す配列番号１３〜１４に示す塩基配列からなる各プローブを固定化したスポットを有するマイクロアレイを準備した。
具体的には、図７に示すマイクロアレイにおいて、スポット２１〜２２にアスペルギルス・バージカラーの標的とする増幅対象領域（ＩＴＳ領域）から選択されたプローブ（配列番号１３）が固定化され、スポット２３〜２４にアスペルギルス・バージカラーの標的とする増幅対象領域（β−チューブリン）から選択されたプローブ（配列番号１４）が固定化されている。なお、スポット４９，５６は基準位置スポットであり、基準位置プローブが固定化されている。基準位置プローブは、φ-X174バクテリオファージから選択された塩基配列からなっている。
【００５９】
次に、試験１と同じマーカーポリヌクレオチドの原液（１００μＭ）１μＬを９９９μＬの滅菌水に加えることにより１０００倍希釈して、１００ｎＭ溶液を調製した。そして、このマーカーポリヌクレオチドの１００ｎＭ溶液４μＬをハイブリダイズに用いる緩衝液９６μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）と混合して、１００μＬの混合液を調製した。そして、得られた混合液２μＬとＰＣＲ反応液４μＬを混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
【００６０】
反応後、試験１と同様に、マイクロアレイを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器ＢＩＯＳＨＯＴにより各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。マイクロアレイにおける蛍光検出画像を図７に示す。また、蛍光強度を得て、Ｓ／Ｎ比値を算出した。その結果を図８に示す。
【００６１】
これらの図に示されるように、アスペルギルス・バージカラーを検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行わなかったものは、ＩＴＳ領域のスポット２１と２２が1000程度の弱い蛍光強度であり、Ｓ／Ｎ比値が約２．０しか得られず、陰性と判定された。これに対して、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行ったものは、ＩＴＳ領域のスポット２１と２２が40000以上の強い蛍光強度でＳ／Ｎ比値が７０以上となっており、陽性と判定された。
【００６２】
β-チューブリン遺伝子用のプライマーについては、フォワードプライマーとリバースプライマーに濃度差がないため、そのＰＣＲ産物に一本鎖核酸は生じておらず、β-チューブリン遺伝子のスポット２３と２４では、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行わなかったものでも40000以上の強い蛍光強度が観察されている。また、ハイブリダイゼーション工程前に酵素処理を行ったものにも30000以上の強い蛍光強度が観察されている。
【００６３】
以上の通り、本実施形態のハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によれば、試料中にプローブと競合し得る一本鎖核酸をハイブリダイゼーション工程の前に除去できるため、ハイブリダイゼーションにおいて偽陰性の結果が生じていた問題を改善できることが確認された。
【００６４】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、試料中に含まれる一本鎖核酸を選択的に分解または除去するために、上記実施形態では、一本鎖核酸に選択的に作用するエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼもしくはこれらの混合物、またはカラムによる精製法を用いているが、その他の手法を用いても良い。また、実施例で用いたプライマー、ＰＣＲ反応液、プローブおよびマイクロアレイは、本発明の効果を確認するために用いたものであって、本発明はこれらに限定されず、その他のものを用いても良い。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応を行って、その標的核酸をプローブとのハイブリダイセーションにより検出する場合に、好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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