(57)【要約】【課題】本発明は、試料中の標的物質の有無を高い精度で判定することができる、及び／又は、試料中の標的物質の定量を可能とするクロマト分析用ストリップを提供することを目的とする。【解決手段】基材の上に、試料を添加するためのサンプルパッド、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体、及び吸収パッドが順次配置されてなる、クロマト分析用ストリップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の上に、試料を添加するためのサンプルパッド、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体、及び吸収パッドが順次配置されてなる、クロマト分析用ストリップ。
【請求項２】
捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、上流側の捕捉領域ほど多い、請求項１に記載のクロマト分析用ストリップ。
【請求項３】
捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、下流側の捕捉領域ほど多い、請求項１に記載のクロマト分析用ストリップ。
【請求項４】
試料中に含まれる標的物質を定量するための方法であって、
試料を、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体と接触させ、該試料中の捕捉対象を該捕捉物質にて捕捉する工程、
該捕捉物質にて捕捉された捕捉対象を検出することによって標的物質を検出する工程、
該複数の捕捉領域における標的物質の検出結果を含む検出パターンを得る工程、ならびに、
得られた検出パターンに基づいて試料中に含まれる標的物質の量を判定する工程、
を含む、上記方法。
【請求項５】
捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、上流側の捕捉領域ほど多い固相担体を用いて実施され、標的物質を検出する工程がサンドイッチ法により行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、下流側の捕捉領域ほど多い固相担体を用いて実施され、標的物質を検出する工程が競合法により行われる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の標的物質の有無及び量を判定することができるクロマト分析用ストリップ及びそれを用いた試料中の標的物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料中の標的物質を検出するための手法としてイムノクロマト法が注目されている。例えば、標的物質と特異的に結合することが可能な捕捉手段が所定の領域に限局して配置・固定されているニトロセルロース膜のような固相担体に試料を滴下して、試料が毛細管現象により固相担体を移動する際に試料中の標的物質と捕捉手段とが接触し、標的物質が捕捉手段に結合する。次いで、捕捉手段に結合した標的物質を検出することにより、試料中の標的物質の有無を判定することができる。本方法は、迅速性及び簡便性に優れた手法であり、今日では本方法の原理を利用して、ウイルス、細菌、ホルモンや各種疾患関連バイオマーカーを検出するためのクロマト分析用ストリップが開発されており、様々な分野において利用されている。
【０００３】
一方、クロマト分析用ストリップにおける標的物質の検出においては、例えば、一カ所にライン状に配置・固定された捕捉手段に結合した標的物質に基づく検出シグナルの強度に依拠しており、検出シグナルの強度が低い場合には、試料中の標的物質の有無について誤判定を生じる虞があった。
【０００４】
また、その操作の迅速性及び簡便性から、クロマト分析用ストリップを用いた検出系にて試料中の標的物質の量を分析したいとのニーズが存在するが、標的物質の定量を可能とするほど検出感度が十分ではなく実現は困難であった。
【０００５】
したがって、当該分野においては、試料中の標的物質の有無を高い精度で判定することができ、及び／又は、試料中の標的物質の定量を可能とするクロマト分析用ストリップが切望されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試料中の標的物質の有無を高い精度で判定することができるクロマト分析用ストリップを提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、試料中の標的物質の定量を可能とするクロマト分析用ストリップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、試料中の標的物質等の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて、複数の領域に配置・固定されてなる固相担体を調製し、これを用いて試料中の標的物質の検出を行ったところ、試料中の標的物質の量及び各領域における捕捉対象の捕捉効率に基づいて、当該複数の領域のそれぞれにて異なる検出シグナル強度が得られ、全体として、試料中の標的物質の量に対応した検出シグナル強度のパターン（以下、「検出パターン」と呼ぶ場合がある）が得られることを見出した。当該検出パターンを用いることにより、試料中の標的物質の有無を高い精度で判定することができ、ならびに、試料中の標的物質の量を判定できることを見出した。
【０００９】
本発明はこれらの知見に基づいてなされたものであり、以下の発明を包含する。
［１］  基材の上に、試料を添加するためのサンプルパッド、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体、及び吸収パッドが順次配置されてなる、クロマト分析用ストリップ。
［２］  捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、上流側の捕捉領域ほど多い、［１］のクロマト分析用ストリップ。
［３］  捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、下流側の捕捉領域ほど多い、［１］のクロマト分析用ストリップ。
［４］  試料中に含まれる標的物質を定量するための方法であって、
試料を、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体と接触させ、該試料中の捕捉対象を該捕捉物質にて捕捉する工程、
該捕捉物質にて捕捉された捕捉対象を検出することによって標的物質を検出する工程、
該複数の捕捉領域における標的物質の検出結果を含む検出パターンを得る工程、ならびに、
得られた検出パターンに基づいて試料中に含まれる標的物質の量を判定する工程、
を含む、上記方法。
［５］  捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、上流側の捕捉領域ほど多い固相担体を用いて実施され、標的物質を検出する工程がサンドイッチ法により行われる、［４］の方法。
［６］  捕捉領域に配置・固定されている捕捉物質の量が、下流側の捕捉領域ほど多い固相担体を用いて実施され、標的物質を検出する工程が競合法により行われる、［４］の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、試料中の標的物質の検出を複数の領域における検出シグナルに基づいて判定することができるため、試料中の標的物質の有無を高い精度で判定することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、試料中の標的物質を検出して得られた、複数の領域における検出シグナル強度のパターン（検出パターン）は、当該試料中の標的物質の量と相関関係を有することから、当該検出パターンに基づいて試料中の標的物質の量を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はラテラルフロー型クロマト分析用ストリップの一例を示す模式図を示す。（１）基材、（２）サンプルパッド、（３）固相担体、（４）吸収パッド、（５）捕捉領域（ライン１）、（６）捕捉領域（ライン２）、（７）捕捉領域（ライン３）。
【図２】図２は実施例１で作製した各クロマト分析用ストリップを用いた、競合法による試料中の標的物質（コルチゾール）の検出結果を示す写真図である。
【図３】図３は実施例１で作製した各クロマト分析用ストリップを用いた、競合法による試料中の標的物質（コルチゾール）の検出により得られた各ラインの着色量と試料中のコルチゾール量との関係を示すグラフ図である。着色量（縦軸）は、未着色の値を「１」とする相対値にて示す。
【図４】図４は実施例２で作製した各クロマト分析用ストリップを用いた、サンドイッチ法による試料中の標的物質（インフルエンザＡ型抗原）の検出結果を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．クロマト分析用ストリップ
本発明に係るクロマト分析用ストリップは、基材の上に、試料を添加するためのサンプルパッド、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体、ならびに吸収パッドが順次配置されてなる構造を有する。
【００１４】
以下、本発明のクロマト分析用ストリップについて模式図に記載される実施形態を用いて説明する場合があるが、本発明のクロマト分析用ストリップは本実施形態に限定されるものではない。なお、各部材に付された符号は、図中に示される符号に対応する。
【００１５】
図１のクロマト分析用ストリップは、基材（１）の上に、試料を添加するためのサンプルパッド（２）、固相担体（３）及び吸収パッド（４）が順次配置されてなる。固相担体（３）には、捕捉対象を捕捉するための捕捉領域（ライン１）（５）、捕捉領域（ライン２）（６）、捕捉領域（ライン３）（７）が配置されてなる構造を有する。「上流」とは、サンプルパッドに滴下された試料が、毛細管現象により固相担体及び吸収パッドへと順次展開する方向に対する上流、すなわちサンプルパッド側の領域を意味する。また、「下流」とは、サンプルパッドに滴下された試料が、毛細管現象により固相担体及び吸収パッドへと順次展開する方向に対する下流、すなわち吸収パッド側の領域を意味する。
【００１６】
基材はその上に配置された各種部材を支持することができればよく、例えば樹脂（プラスチック、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、塩化ビニル樹脂等）、金属、無機材料（ガラス、シリコン、セラミック等）からなるものを利用することができる（これらに限定はされない）。基材は、クロマト分析用ストリップの操作を容易にするものであればよく、形状は特に限定されず、例えば、平板、平膜、フィルムなどの平坦な形状を有するものや、その他の部材を包含し得る立体的な形状（例えばハウジングケース）を有するものであってもよい。
【００１７】
サンプルパッド、固相担体及び吸収パッドは、サンプルパッドに滴下された試料が、これら部材の中及び間を毛細管現象により展開できるものであればよく、例えば樹脂（プラスチック、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、塩化ビニル樹脂等）、金属、無機材料（ガラス、シリコン、セラミック等）、天然高分子（キチン、キトサン、セルロース等）からなるものを利用することができる（これらに限定はされない）。これら部材は孔質構造を有するものが好ましく、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、ろ紙や乾燥させた各種ゲル（ゼラチンゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、シリカゲル）等を利用することができる。
【００１８】
サンプルパッド、固相担体及び吸収パッドは、それぞれ異なる材料から構成されていてもよいし、同一の材料から構成されていてもよい。サンプルパッド、固相担体及び吸収パッドの大きさや形態は、クロマト分析用ストリップの操作や標的物質の検出に適切なものを適宜選択することができる。
【００１９】
サンプルパッド、固相担体及び吸収パッドは、滴下された試料がサンプルパッドから固相担体に、次いで固相担体から吸収パッドに順次展開できるように配置されていればよく、隣接する部材の一部が直接、又は間接的に接触するように配置される。例えば、図１に示すように、サンプルパッド（２）、固相担体（３）及び吸収パッド（４）は、順次重ねて配置することができる。
【００２０】
試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質は、捕捉対象と特異的に結合することが可能なものであればよく、捕捉対象との相互作用により特異的に結合する物質が挙げられる。捕捉対象と捕捉物質との相互作用には、例えば抗体−抗原、核酸−その相補配列を有する核酸、アプタマー−その標的分子、アビジン−ビオチン、又はレクチン−糖鎖等の相互作用が含まれ（これらに限定はされない）、捕捉対象に応じて適当な物質を捕捉物質として選択することができる。例えば、捕捉物質として、捕捉対象と特異的に結合することが可能な抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）やその断片、あるいは捕捉対象が抗体やその断片である場合には、その抗原やその断片を利用することができる。
【００２１】
下記に詳述される、本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」がサンドイッチ法に基づく場合、「捕捉対象」とは試料中の標的物質とすることができる。「標的物質」とは、試料中におけるその存否、及びその含有量を判定することが望まれる物質を意味し、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化合物等が挙げられるが、特にこれらに限定はされない。標的物質としては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、肝炎ウイルス等の各種ウイルス及びその抗原や抗体、黄色ぶどう球菌、大腸菌、緑膿菌、レンサ球菌、肺炎双球菌等の各種細菌及びその抗原や抗体や代謝産物、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン等の各種ホルモン、ＤｉＡｃＳｐｍ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＰＳＡ、便潜血等の各種腫瘍マーカー、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−６等やＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２等のケモカインを含む各種サイトカイン、ＣＫ−８、ＣＫ−１８等の各種サイトケラチン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ等の各種増殖因子、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、アルブミン等の各種血清タンパク質成分等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２２】
一方、下記に詳述される、本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」が、競合法に基づく場合、「捕捉対象」とは試料中の標的物質に限定されず、標的物質と競合して捕捉物質に結合する物質、又は、標的物質と捕捉物質とが競合して結合する物質とすることができる。「標的物質と競合して捕捉物質に結合する物質」は、標的物質と競合して捕捉物質に結合することができればよく、少なくとも捕捉物質に結合するのに必要とされる標的物質の部位を含む物質であればよく、好ましくは標的物質と同一の物質である。「標的物質と捕捉物質とが競合して結合する物質」は、標的物質と捕捉物質の両方に結合することができる物質であればよく、このような物質としては、標的物質及び捕捉物質のそれぞれと相互作用により特異的に結合する物質が挙げられる。このような相互作用には、例えば抗体−抗原、核酸−その相補配列を有する核酸、アプタマー−その標的分子、アビジン−ビオチン、又はレクチン−糖鎖等の相互作用が含まれ（これらに限定はされない）、標的物質及び捕捉物質に応じて適当な物質を選択することができる。例えば、「標的物質と捕捉物質とが競合して結合する物質」として、標的物質及び捕捉物質と特異的に結合することが可能な抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）やその断片、あるいは標的物質及び捕捉物質が抗体やその断片である場合には、その抗原やその断片を利用することができる。以下、本明細書において「標的物質と競合して捕捉物質に結合する物質」、及び「標的物質と捕捉物質とが競合して結合する物質」のことを、「競合物質」と呼ぶ場合がある。
【００２３】
捕捉物質の固相担体への配置・固定は、用いる捕捉物質及び固相担体に応じて適宜選択することができ、適当なペプチド、タンパク質、核酸、官能基（アミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルフィド基、メルカプト基、ジチオール基等）等を介して行ってもよいし、静電的相互作用、疎水的な相互作用、水素結合、共有結合等を利用して行ってもよい。
【００２４】
捕捉物質の固相担体への配置・固定は、インクジェット法、印刷法、スプレー塗布法等を用いて、特定の領域に限局してなされることが好ましい。捕捉物質が特定の領域に限局して配置・固定されることによって、捕捉された捕捉対象は所定の領域のみに限局されるため、捕捉対象の結合の有無を容易に判定することができる。本明細書において、捕捉物質が固相担体へ限局して配置・固定されている領域のことを「捕捉領域」又は「ライン」と呼ぶ場合がある。
【００２５】
複数の捕捉領域には、それぞれ異なる量にて捕捉物質を固定することができる。捕捉領域ごとに異なる量の捕捉物質を固定することによって、捕捉領域ごとに捕捉対象の結合に基づく検出シグナルの強度に変化をもたせることができる。各捕捉領域にて得られた検出シグナルは全体として、試料中の標的物質の量に対応した検出パターンを示すことができる。なお、本発明は、固定される捕捉物質の量が同一である捕捉領域が一部に含まれることを除外するものではない。
【００２６】
捕捉領域の数、ならびに捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、下記に詳述される、本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」に基づいて、試料中の標的物質の検出・定量を良好に行うことができる量に調整することができる。例えば、捕捉領域の数は２又はそれ以上、３又はそれ以上、４又はそれ以上、５又はそれ以上、６又はそれ以上、７又はそれ以上、あるいは、８又はそれ以上とすることができる（特にこれらに限定はされない）。また、捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、試料中に含まれ得る捕捉対象の量に基づいて決定することができる。例えば、上流側の捕捉領域ほど多くの捕捉物質を固定してもよいし、下流側の捕捉領域ほど多くの捕捉物質を固定してもよい。例えば既知量の捕捉対象を含むサンプルを用いて試験した場合に、複数の捕捉領域にて捕捉対象の捕捉・検出を可能とし、かつサンプル中の捕捉対象の量に応じた検出パターンを生じる得る捕捉領域の数、及び／又は、固定される捕捉物質の量を適宜選択・決定することができる。このとき既知量の捕捉対象を含むサンプルを用いて得られた検出パターンを参照検出パターンとすることができ、下記に詳述される、本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」において利用することができる。
【００２７】
本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」が、サンドイッチ法に基づく場合、上流側の捕捉領域ほど多くの捕捉物質を固定することができ、固定される捕捉物質の量は上流側の捕捉領域より段階的に減少させることができる。例えば、複数の捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、最も上流側の捕捉領域にて固定される捕捉物質の量を１として場合に、その他の捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、上流側の捕捉領域より段階的に減少させるように、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、又は０．１の割合となる量を適宜選択することができる（特にこれらに限定はされない）。なお、ここで「上流側の捕捉領域より段階的に減少させる」とは、固定される捕捉物質の量が同一である捕捉領域が一部に含まれることを除外するものではない。
【００２８】
サンドイッチ法によれば、固定される捕捉物質の量を上流側の捕捉領域より段階的に減少させることにより、一般的に、上流側の捕捉領域ほど検出シグナル強度が高く、下流側の捕捉領域ほど検出シグナル強度が低くなる検出パターンを得ることができる。各捕捉領域の検出シグナル強度は、試料中の捕捉対象の量に基づいて変化し得、検出パターンは試料中の捕捉対象の量と対応する。
【００２９】
また、本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」が、競合法に基づく場合、下流側の捕捉領域ほど多くの捕捉物質を固定することができ、固定される捕捉物質の量は上流側の捕捉領域より段階的に増大させることができる。例えば、複数の捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、最も下流側の捕捉領域にて固定される捕捉物質の量を１として場合に、その他の捕捉領域に固定される捕捉物質の量は、下流側より段階的に減少するように、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、又は０．１の割合となる量を選択することができる（特にこれらに限定はされない）。なお、ここで「上流側の捕捉領域より段階的に増大させる」とは、固定される捕捉物質の量が同一である捕捉領域が一部に含まれることを除外するものではない。
【００３０】
競合法によれば、試料中には標的物質と共に、一定量の上記競合物質が含まれる。競合物質は、試料中に含まれる標的物質の量に応じて、一定の割合で捕捉領域に存在する捕捉物質に結合することができる。すなわち、試料中に存在する標的物質が存在しない場合には、競合物質は標的物質の影響を受けることなく捕捉領域に存在する捕捉物質と結合することができが、試料中に標的物質が存在する場合には、競合物質の捕捉領域に存在する捕捉物質への結合は標的物質による影響を受け、その結合量は標的物質の量に応じて減少する。標的物質による影響を受けた競合物質は、試料の展開に伴い次の（下流側の）捕捉領域に移動しそこに存在する捕捉物質と、標的物質の量に応じて、結合することがきる。したがって、固定される捕捉物質の量を上流側の捕捉領域より段階的に増大させることによって、複数の捕捉領域にわたって試料中の競合物質の捕捉・検出をしやすくすることができる。各捕捉領域の競合物質に基づく検出シグナル強度は、試料中の標的物質の量に基づいて変化し得、試料中の標的物質の量に対応した検出パターンを得ることができる。
【００３１】
本発明のクロマト分析用ストリップにはさらに、標識部位を備えることができる。
本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」がサンドイッチ法に基づく場合、標識部位には試料中の捕捉対象（すなわち、標的物質）を標識するための、標識となる物質で標識された、捕捉対象と特異的に結合することが可能な物質（以下、「標識物質」と記載する）を含めることができる。ここで用いられる「捕捉対象と特異的に結合することが可能な物質」としては、捕捉対象との相互作用により特異的に結合する物質が挙げられる。捕捉対象と当該物質との相互作用には、例えば抗体−抗原、核酸−その相補配列を有する核酸、アプタマー−その標的分子、アビジン−ビオチン、又はレクチン−糖鎖等の相互作用が含まれ（これらに限定はされない）、捕捉対象に応じて適当な物質を選択することができる。例えば、「捕捉対象と特異的に結合することが可能な物質」として、捕捉対象と特異的に結合することが可能な抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）やその断片、あるいは捕捉対象が抗体やその断片である場合には、その抗原やその断片を利用することができる。好ましくは、捕捉対象と捕捉物質との結合を妨げないものを選択する。
【００３２】
「標識となる物質」としては例えば、金属コロイド（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）、低分子化合物（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ等）等を利用することができる。標識となる物質は、標識物質と結合した捕捉対象の移動や捕捉物質との結合を妨げるものではなく、検出の際に明瞭に検出できるものであればよく、特に限定はされない。好ましくは、金属コロイド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子や色素等、検出に際して更なる処理を要することなく目視で検出の有無を確認できるものが好ましい。このような標識となる物質としては、例えば粒径がおよそ５００ｎｍ以下、好ましく１０ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の大きさのものを利用することができる。
【００３３】
本発明のクロマト分析用ストリップを用いて行われる「試料中の標的物質の検出・定量方法」が競合法に基づく場合、標識部位には上記の競合物質を含めることができる。競合物質は、標識となる物質で標識することができる。ここで「標識となる物質」としては上記したものを利用することができ、好ましくは、標的物質や捕捉物質への結合を妨げないものを選択する。
【００３４】
いずれの標識部位も、最も上流側の捕捉領域よりも上流のいずれかの位置に含めることができる。例えば、図１のクロマト分析用ストリップにおいて、標識部位はサンプルパッド（２）中に含めてもよいし、固相担体（３）中に含めてもよい。あるいは、サンプルパッド（２）及び固相担体（３）とは別の固相担体を準備し、これに標識物質を含めて標識部位とし、サンプルパッド（２）と固相担体（３）との間のいずれかの位置に配置してもよい。
【００３５】
標識部位が標識物質を含む場合、試料中の捕捉対象は、標識部位を通過する際に標識物質と接触及び相互作用により結合する。これにより、捕捉対象は標識物質により標識される。また、標識部位が競合物質を含む場合、試料が標識部位を通過する際に、試料中に競合物質を含めることができる。
【００３６】
標識物質又は競合物質はインクジェット法、印刷法、スプレー塗布法、含侵法等を用いてサンプルパッド又は固相担体中に含めることができる。標識物質又は競合物質は特定の領域に限局して配置・固定されていてもよいし、限局されていなくてもよい。
【００３７】
２．試料中の標的物質の検出・定量方法
本発明に係る試料中の標的物質の検出・定量方法は、以下の工程：
試料を、試料中の捕捉対象を捕捉するための捕捉物質が異なる量にて配置・固定されている複数の捕捉領域を含む固相担体と接触させ、当該試料中の捕捉対象を当該捕捉物質にて捕捉する工程、
次いで、当該捕捉物質にて捕捉された捕捉対象を検出することによって標的物質を検出する工程、
次いで、当該複数の捕捉領域における標的物質の検出結果を含む検出パターンを得る工程、ならびに、
次いで、得られた検出パターンに基づいて試料中に含まれる標的物質の量を判定する工程、
を含む。
本方法は上記本発明に係るクロマト分析用ストリップを用いて行うことができる。
【００３８】
「試料」とは、標的物質を含み得る任意のものを利用することができ、例えば、被験者の組織、細胞、体液（血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等）、粘膜や粘液、便等が挙げられるが、これらに限定はされない。試料は、標的物質が抽出、精製、又は粗精製され得る処理に付されたものであってもよい。
【００３９】
試料はそのまま用いてもよいし、適当な緩衝液（又は展開液）中に希釈、又は懸濁されたものを用いてもよい。緩衝液（又は展開液）としては精製水、生理食塩水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液等を利用することができる。緩衝液（又は展開液）には必要に応じて、界面活性剤（非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤等）、タンパク質成分（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン等）、変性剤（尿素、グアニジン塩酸、チオシアン酸塩等）等を含めることができる。
【００４０】
また、クロマト分析用ストリップが上記標識部位を備えない場合には、試料中の標的物質の検出・定量方法（サンドイッチ法又は競合法）に従って、緩衝液（又は展開液）中に上記標識物質又は上記競合物質を添加することができる。これにより試料中の標的物質は、標識物質と接触及び相互作用により結合し、標識物質により標識すること、あるいは、試料中に競合物質を含めることができる。
【００４１】
サンプルパッドに滴下された試料はサンプルパッドから固相担体に、次いで固相担体から吸収パッドに向かって毛細管現象により展開する。
【００４２】
クロマト分析用ストリップが上記標識部位を備える場合には、試料が標識部位を通過する際に、標的物質は標識物質と接触及び相互作用により結合し、標識物質により標識すること、あるいは、試料中に競合物質を含めることができる。
【００４３】
試料中に含まれる捕捉対象は、複数の捕捉領域に到達し、固定された捕捉物質と接触及び相互作用により結合する。
【００４４】
本方法において、試料中の標的物質の検出はサンドイッチ法又は競合法に基づいて行うことができる。
【００４５】
サンドイッチ法によれば、得られる検出パターンは一般的に、上流側の捕捉領域ほど陽性の結果、また高い検出シグナル強度を得ることができる。したがって、試料中に標的物質が存在しない場合には、最も上流側の捕捉領域も含め、全ての捕捉領域において検出シグナルを得ることはなく、一方、試料中に標的物質が多量に存在するほど、より下流側まで多数の捕捉領域にて検出シグナルを得ることができ、また上流側の捕捉領域ほど高い検出シグナル強度を得ることができる。
【００４６】
各捕捉領域の捕捉物質にて捕捉された標的物質の検出は、用いた標識となる物質に応じた手法により標識物質を検出することによって行うことができる。用いた標識となる物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して捕捉領域が呈色する。これにより、各捕捉領域における標的物質の検出の有無や程度（例えば、呈色の強弱等）を含む検出パターンを得ることができる。
【００４７】
一方、競合法によれば、試料中には標的物質と共に、一定量の競合物質が含まれる。これにより捕捉領域に存在する捕捉物質には、競合物質が試料中に含まれる標的物質の量に応じて、一定の割合で結合することができる。競合物質に基づいて得られる検出パターンは標的物質の量に応じて変化し得、例えば、試料中に標的物質が存在しない場合には、最も上流側の捕捉領域における捕捉物質に競合物質が結合することから、最も上流側の捕捉領域にて高い検出シグナル強度を得ることができる。一方、試料中に標的物質が含まれる場合にはその量に応じて、競合物質の捕捉領域における捕捉物質に対する結合が制限される。競合物質は試料が展開していく過程でより下流側の捕捉領域まで運ばれ、試料中に含まれる標的物質の量に応じて、そこで捕捉される。このため、下流側の捕捉領域においても検出シグナルを得ることができ、また上流側の捕捉領域への競合物質の結合が制限されることにより、上流側の捕捉領域ほど検出シグナル強度の低下、又は消失を生じ得る。試料中の標的物質の量がさらに多い場合には、競合物質と捕捉領域における捕捉物質との結合が低下することから、捕捉領域における検出シグナル強度は低下又は消失を生じ得る。
【００４８】
各捕捉領域の捕捉物質にて捕捉された競合物質の検出は、用いた標識となる物質に応じた手法により競合物質を検出することによって行うことができる。用いた標識となる物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して捕捉領域が呈色する。これにより、各捕捉領域における競合物質の検出の有無や程度（例えば、呈色の強弱等）を含む検出パターンを得ることができる。
【００４９】
上記のとおり、複数の捕捉領域における検出シグナル強度に基づく検出パターンは、標的物質の量に応じて決定される。したがって、得られた検出パターンは試料中の標的物質の量と相関関係を有する。
【００５０】
得られた検出パターンを、予め既知量の標的物質を含むサンプルを用いて得られた「参照検出パターン」と対比させることで、試料中の標的物質の量を判定することができる。
【００５１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）競合法による試料中の標的物質（コルチゾール）の検出・定量
１−１．クロマト分析用ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン（メルクミリポア社）を固相担体とし、その上に抗コルチゾール抗体を捕捉するための捕捉物質としてコルチゾール抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）を３か所にライン状に塗布した（以下、各ラインを上流側より、「ライン１」、「ライン２」、「ライン３」と記載する）。ライン１、ライン２、ライン３にはコルチゾール抗原をそれぞれ０．２ｍｇ／ｃｍ、０．５ｍｇ／ｃｍ、０．７５ｍｇ／ｃｍの量にて塗布・固定した。
【００５３】
次いで、得られた固相担体を５０℃で３０分間乾燥させ、捕捉領域であるライン１、ライン２、ライン３を備えた固相担体を得た。グラスファイバー製のサンプルパッド（メルクミリポア社）及びセルロース製の吸収パッド（メルクミリポア社）を、図１に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型クロマト分析用ストリップを作製した。
【００５４】
１−２．試料中の標的物質（コルチゾール）の検出・定量
ＰＢＳに金コロイドで標識した抗コルチゾール抗体（ラットモノクローナル抗体）０．１ｍｇ／ｍＬと、コルチゾール抗原（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）を０μｇ／ｄＬ、５μｇ／ｄＬ、１０μｇ／ｄＬ、１５μｇ／ｄＬ、２０μｇ／ｄＬ、２５μｇ／ｄＬ、３０μｇ／ｄＬ、又は４０μｇ／ｄＬの量で添加して試料とした。
【００５５】
上記１−１．で作製したクロマト分析用ストリップのサンプルパッドに、試料（１００μＬ）を添加し、室温にて１０分間展開した。
次いで、固相担体上のライン１、ライン２、ライン３における着色の有無／程度（検出パターン）を確認した。また、各ラインの着色量はイムノリーダー（トラストメデイカル社  ＴＯＲ−５００）を用いて測定した。
【００５６】
固相担体上の各ラインの着色の様子を図２に示す。また、各ラインの着色量と試料中のコルチゾール量との関係を図３に示す。
各ラインの着色量は試料中のコルチゾール量に応じて変化することが確認された。
【００５７】
着色量が最も高くなる試料中のコルチゾール量は、ライン１、ライン２、ライン３でそれぞれ異なっており（図３）、そのため試料中のコルチゾール量に応じて、ライン１、ライン２及びライン３の着色量に違いが認められた（図２）。
【００５８】
すなわち、試料中のコルチゾール量が０μｇ／ｄＬである場合にはライン１のみが強く着色する検出パターンが示された。
【００５９】
試料中のコルチゾール量が５μｇ／ｄＬである場合には、ライン１及びライン２のみが着色し、かつライン１がライン２よりも強く着色する検出パターンが示された。
【００６０】
試料中のコルチゾール量が１０μｇ／ｄＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３で着色が認められ、かつライン１、ライン２及びライン３の順で強く着色する検出パターンが示された。
【００６１】
試料中のコルチゾール量が１５μｇ／ｄＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３が同程度に着色する検出パターンが示された。
【００６２】
試料中のコルチゾール量が２０μｇ／ｄＬ、２５μｇ／ｄＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３で着色が認められ、かつライン３、ライン２及びライン１の順で強く着色する検出パターンが示された。
【００６３】
試料中のコルチゾール量が３０μｇ／ｄＬである場合には、ライン２、及びライン３で着色が認められ、ライン１の着色はほぼ認められない検出パターンが示された。
【００６４】
試料中のコルチゾール量が４０μｇ／ｄＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３のいずれも着色がほぼ認められない検出パターンが示された。
【００６５】
試料中にコルチゾールが存在しない場合（０μｇ／ｄＬ）には、ライン１のみに着色が認められた。これは、試料中に存在する抗コルチゾール抗体が、捕捉物質である固相担体上のコルチゾール、特にその塗布量の大きなライン１にてその多くが捕捉されたことを示す。
【００６６】
試料中にコルチゾールが存在する場合（５μｇ／ｄＬ〜１５μｇ／ｄＬ）には、ライン１だけでなく、下流のラインにおいても着色が認められた。当該コルチゾールが試料中に存在する抗コルチゾール抗体のライン１への結合に影響を及ぼし、ライン１に結合できなかった抗コルチゾール抗体がより下流のラインにて結合を生じたことを示す。
【００６７】
試料中にコルチゾールが多量に存在する場合（２０μｇ／ｄＬ〜４０μｇ／ｄＬ）には、ライン１より着色の低下が認められた。これは試料中のコルチゾール含量の増加に伴い、抗コルチゾール抗体のラインへの結合量が低下したことを示す。コルチゾールが多量に存在する場合においても明瞭な検出パターンを得る必要があれば、ラインの数を増やすか、及び／又は各ラインにおいて捕捉手段として固定されるコルチゾールの量を増大することができる。
【００６８】
以上の結果より、ライン１、ライン２、及びライン３の検出パターンは、試料中のコルチゾール量に対応して異なることから、当該検出パターンに基づいて、試料中のコルチゾール量を判定できることが確認された。
【００６９】
（実施例２）サンドイッチ法による試料中の標的物質（インフルエンザＡ型抗原）の検出・定量
２−１．クロマト分析用ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン（メルクミリポア社）を固相担体とし、その上に標的物質（インフルエンザＡ型抗原）を捕捉するための捕捉物質として抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社  ＩｎｆｌｕｅｎｚＡ）を３か所にライン状に塗布した（以下、各ラインを上流側より、「ライン１」、「ライン２」、「ライン３」と記載する）。ライン１、ライン２、ライン３には当該抗体をそれぞれ０．７５ｍｇ／ｃｍ、０．５ｍｇ／ｃｍ、０．２ｍｇ／ｃｍの量にて塗布・固定した。
【００７０】
次いで、得られた固相担体を５０℃で３０分間乾燥させ、捕捉領域であるライン１、ライン２、ライン３を備えた固相担体を得た。グラスファイバー製のサンプルパッド（メルクミリポア社）及びセルロース製の吸収パッド（メルクミリポア社）を、図１に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型クロマト分析用ストリップを作製した。
【００７１】
また、比較対照として、ライン１、ライン２、ライン３に固定される抗体量を全て０．７に変更したラテラルフロー型クロマト分析用ストリップを作製した。
【００７２】
２−２．試料中の標的物質（インフルエンザＡ型抗原）の検出・定量
ＰＢＳを検体抽出液としてインフルエンザＡ型抗原（Ａ―カリフォルニア  ０７／２００９）を１００ｎｇＰ／ｍＬ、２００ｎｇＰ／ｍＬ、４００ｎｇＰ／ｍＬ、８００ｎｇＰ／ｍＬ、又は１２００ｎｇＰ／ｍＬの量で添加して試料とした。
【００７３】
上記２−１．で作製したクロマト分析用ストリップのサンプルパッドに、試料（１００μＬ）を添加し、室温にて１５分間展開した。
【００７４】
次いで、固相担体上のライン１、ライン２、ライン３における着色の有無／程度（検出パターン）を確認した。各ラインの検出は、固相担体上に固定されている抗インフルエンザＡ抗体マウスモノクローナル抗体とは異なる部位でインフルエンザＡ型抗原と結合する、金コロイドで標識された抗インフルエンザウイルスＡ抗体マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社  ＩｎｆｌｕｅｎｚＡ）を用いて行った。
【００７５】
結果を図４に示す。
各ラインの着色量は試料中のインフルエンザＡ抗原量に応じて変化することが確認された。
【００７６】
試料中のインフルエンザＡ抗原量が増加するに伴い、ライン１、ライン２、及びライン３の順に着色されるラインが推移すると共に、また、各ラインの着色は試料中のインフルエンザＡ抗原量が増加するに伴い強くなることが確認された。
【００７７】
すなわち、試料中のインフルエンザＡ抗原量が１００ｎｇＰ／ｍＬである場合にはライン１のみが着色する検出パターンが示された。
【００７８】
試料中のインフルエンザＡ抗原量が２００ｎｇＰ／ｍＬである場合には、ライン１が強く着色し、かつライン２がやや着色する検出パターンが示された。
【００７９】
試料中のインフルエンザＡ抗原量が４００ｎｇＰ／ｍＬである場合には、ライン１が強く着色し、次いでライン２の着色が認められ、かつライン３がやや着色する検出パターンが示された。
【００８０】
試料中のインフルエンザＡ抗原量が８００ｎｇＰ／ｍＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３で着色が認められ、かつライン１、ライン２及びライン３の順で強く着色する検出パターンが示された。
【００８１】
試料中のインフルエンザＡ抗原量が１２００ｎｇＰ／ｍＬである場合には、ライン１、ライン２、及びライン３で着色が認められ、特にライン１及びライン２が強く着色する検出パターンが示された。
【００８２】
以上の結果より、ライン１、ライン２、及びライン３の検出パターンは、試料中のインフルエンザＡ抗原量に対応して異なることから、当該検出パターンに基づいて、試料中のインフルエンザＡ抗原量を判定できることが確認された。
【００８３】
一方、ライン１、ライン２、ライン３に同量の抗体を固定した比較対照においては、試料中のインフルエンザＡ抗原量の多少に関わらず、ライン１、ライン２、ライン３にて同時に、また同程度の着色が認められた。試料中のインフルエンザＡ抗原量に対応した異なる検出パターンが得られなかったことから、比較対照のクロマト分析用ストリップにおいては試料中の当該抗原量を判定することはできなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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