(57)【要約】【課題】TAGEが細胞内に蓄積することにより、細胞内糖化ストレスが上昇し、その結果引き起こされる細胞傷害のメカニズムを解析して、疾患発症や進展を抑制するターゲット因子を発見し、さらに発見されたターゲット因子を指標として、疾患発症や進展を抑制し得る物質をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】細胞内に存在するカスパーゼ-3の異常高分子化を抑制または抑止する物質のスクリーニング法。候補物質の存在下、カスパーゼ-3発現能を有する細胞を培養すること、前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量に比べて減少したか、及び／又は、前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3より低分子量のカスパーゼ-3（プロカスパーゼ-3）の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量に比べて少なくとも減少しないことを確認する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に存在するカスパーゼ-3の異常高分子化を抑制または抑止する物質のスクリーニング法であって、
候補物質の存在下、カスパーゼ-3発現能を有する細胞を培養すること、
前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量に比べて減少したか否かを確認すること、及び／又は、前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3より低分子量のカスパーゼ-3（以下、プロカスパーゼ-3と呼ぶ）の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量に比べて少なくとも減少しないことを確認すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記カスパーゼ-3発現能を有する細胞は、TAGE(toxic advanced glycation end-products)又はAGEs(advanced glycation end-products)を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、TAGEを含む細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、肝臓由来の細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
異常高分子化したカスパーゼ-3の分子量は、６０〜１００ｋＤａの範囲であり、プロカスパーゼ-3の分子量は、２５〜３５ｋＤａである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
異常高分子化したカスパーゼ-3の量、及びプロカスパーゼ-3の量の計測は、ウエスタンブロッティングにより行う、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
候補物質は、カスパーゼ-3を活性化する物質を事前に検索することで選択する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、カスパーゼ-3の活性化促進物質及びカスパーゼ-3の活性化促進を抑制する物質を共存させた細胞を事前検索候補物質の存在下で培養し、事前検索候補物質の存在により、活性化促進を抑制する物質によるカスパーゼ-3の活性化促進阻害を抑制できるか否かを基準に行う、
但し、前記細胞は、カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞である、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、マルチウエルプレートを使用し、複数の事前検索候補物質に対して並列的に行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
カスパーゼ-3の高分子化を抑制または抑止する物質は、異常高分子化した活性化機能を喪失したカスパーゼ-3の回復を促す物質である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
非アルコール性脂肪肝炎に関連する生活習慣病の発症及び／又は進展の予防に有効な物質のスクリーニング方法である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ-3の異常高分子化を抑制または抑止する物質のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでにブドウ糖などの過剰摂取により、体内での糖濃度の上昇が引き起こされ、それが原因の一つとなり、非アルコール性脂肪肝炎NASH(Non-alcoholic steatohepatitis)を含む生活習慣病の発症や進展に関与していることが報告されている。この体内での糖濃度の上昇では、グルコースなどの還元糖やその代謝産物と、タンパク質との非酵素的な糖化反応を経て生成される構造体である多種多様な種類のAGEs(advanced glycation end-products)が生成し、生体内に存在する。AGEsは、終末糖化産物または最終糖化産物とも呼ばれる化合物群である。
【０００３】
このAGEsは疾患との関連が深く、高血糖によって発生して病変を誘発する化合物群であると考えられる。特に毒性の強いAGEsであるTAGE(toxic advanced glycation end-products)とNASHとの関係は、臨床検体での解析により明らかにされており、健常人と比較してNASH患者では血清中のTAGE量が多いこと、及びNASH患者の肝臓ではTAGEが蓄積していることが報告されている。
【０００４】
具体的には、TAGEの血中レベルがNASHの発症、進展へのバイオマーカーとなる可能性を記載する報告（非特許文献1）、及びTAGE-RAGEのNASHへの関与について記載する報告がある（非特許文献2）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Med. Hypotheses, 84 (2015) 490-493
【非特許文献２】World J. Hepatol., 2014, 6(12): 880-893
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記報告は、いずれも、AGEsあるいはTAGEと疾患との関係を示す内容である。AGEsあるいはTAGEと疾患との関係から、疾患発症や進展を抑制する方法や手段を提供することができれば、AGEsあるいはTAGEが関連する疾患の治療や予防に寄与することができる。
【０００７】
そこで本発明は、TAGEが細胞内に蓄積することにより、細胞内糖化ストレスが上昇し、その結果引き起こされる細胞傷害のメカニズムを解析することによって、疾患発症や進展を抑制するターゲット因子を発見すること、さらに発見されたターゲット因子を指標として、疾患発症や進展を抑制し得る物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らの検討の結果、カスパーゼ-3がTAGEに関連する疾患発症や進展に関与するターゲット因子あるいは指標であること、異常カスパーゼ-3の形成が疾患発症や進展に関与することを見出した。さらに、異常カスパーゼ-3の形成を抑制し得る物質を見出すことができれば、TAGEに関連する疾患発症や進展を抑制し得る物質をスクリーニングすることができることに想到した。これらの知見に基づいて、異常カスパーゼ-3の形成を抑制し得る物質を選別できる方法を開発して本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］
細胞内に存在するカスパーゼ-3の異常高分子化を抑制または抑止する物質のスクリーニング法であって、
候補物質の存在下、カスパーゼ-3発現能を有する細胞を培養すること、
前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量に比べて減少したか否かを確認すること、及び／又は、前記細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3より低分子量のカスパーゼ-3（以下、プロカスパーゼ-3と呼ぶ）の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量に比べて少なくとも減少しないことを確認すること、
を含む、前記方法。
［２］
前記カスパーゼ-3発現能を有する細胞は、TAGE(toxic advanced glycation end-products)又はAGEs(advanced glycation end-products)を含む［１］に記載の方法。
［３］
カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、TAGEを含む細胞である、［２］に記載の方法。
［４］
カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、肝臓由来の細胞である［２］に記載の方法。
［５］
異常高分子化したカスパーゼ-3の分子量は、６０〜１００ｋＤａの範囲であり、プロカスパーゼ-3の分子量は、２５〜３５ｋＤａである［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
異常高分子化したカスパーゼ-3の量、及びプロカスパーゼ-3の量の計測は、ウエスタンブロッティングにより行う、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
候補物質は、カスパーゼ-3を活性化する物質を事前に検索することで選択する［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、カスパーゼ-3の活性化促進物質及びカスパーゼ-3の活性化促進を抑制する物質を共存させた細胞を事前検索候補物質の存在下で培養し、事前検索候補物質の存在により、活性化促進を抑制する物質によるカスパーゼ-3の活性化促進阻害を抑制できるか否かを基準に行う、
但し、前記細胞は、カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞である、
［７］に記載の方法。
［９］
カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、マルチウエルプレートを使用し、複数の事前検索候補物質に対して並列的に行う、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］
カスパーゼ-3の高分子化を抑制または抑止する物質は、異常高分子化した活性化機能を喪失したカスパーゼ-3の回復を促す物質である［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法である［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
非アルコール性脂肪肝炎に関連する生活習慣病の発症及び／又は進展の予防に有効な物質のスクリーニング方法である［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、TAGEに関連する疾患発症や進展を抑制し得る物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるカスパーゼ-3の活性化回復効果確認試験結果。
【図２】実施例１におけるカスパーゼ-3の活性化回復効果確認試験結果（スペルミン添加）。
【図３】実施例１におけるカスパーゼ-3の活性化回復効果確認試験結果（アミノグアニジン添加）。
【図４−１】実施例２における、異常高分子化カスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-3の抑制効果確認試験（ウエスタンブロッティング）結果（スペルミン添加）。
【図４−２】実施例２における、異常高分子化カスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-3の抑制効果確認試験結果（スペルミン濃度依存性）。
【図５−１】実施例２における、異常高分子化カスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-3の抑制効果確認試験（ウエスタンブロッティング）結果（アミノグアニジン添加）。
【図５−２】実施例２における、異常高分子化カスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-3の抑制効果確認試験結果（アミノグアニジン濃度依存性）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、まず、細胞内の糖化ストレスが上昇する条件下を作製し、その結果引き起こされる現象について解析を行った。正常な細胞であれば、アポトーシス誘導因子により、もともと不活性型であるカスパーゼ-3（プロカスパーゼ３）が活性化され、正常な細胞機能としてのアポトーシスを引き起こす。ところが細胞内の糖化ストレスが高い条件下ではネクローシスが引き起こされることが分かった。
【００１３】
次に、このネクローシスを引き起こす原因として、これまで報告されていないカスパーゼ-3の異常な高分子化形成に伴い、活性化機能を喪失していることを発見した。その結果、アポトーシスを引き起こせずネクローシス細胞死を引き起こすことが予想された。異常高分子化したカスパーゼ-3の形成を抑制する物質が見つかれば、異常細胞死としてのネクローシスから、アポトーシスへ移行することにより疾患予防に有効である可能性があると考えた。さらに、このカスパーゼ-3の機能喪失を予防する食品成分やビタミンなどが見つかれば、それを摂取していることで生体内の糖化ストレスが上昇するような環境にあってもカスパーゼ-3の機能は維持され、疾患予防に有効である可能性があると考えた。
【００１４】
これらの知見に基づいて、本発明のスクリーニング方法は、開発された。
本発明は、細胞内に存在するカスパーゼ-3の異常高分子化を抑制または抑止する物質のスクリーニング法である。この方法は、
（１）候補物質の存在下、カスパーゼ-3発現能を有する細胞、好ましくはカスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞を培養すること、
（２ａ）（１）における細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量に比べて減少したか否かを確認すること、及び／又は、（２ｂ）（１）における細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3より低分子量のカスパーゼ-3（以下、プロカスパーゼ-3と呼ぶ）の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量に比べて少なくとも減少しないことを確認すること、を含む。
【００１５】
（１）候補物質の存在下、カスパーゼ-3発現能を有する細胞を培養する。カスパーゼ-3発現能を有する細胞は、好ましくはカスパーゼ-3発現能を有する細胞及びし、かつTAGE又はAGEsを含む細胞である。カスパーゼ-3発現能を有する細胞、及びカスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は特に制限はないが、例えば、肝臓由来の細胞であることができる。また、カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、特に、TAGEを含む細胞であることができる。細胞の培養は、細胞の種類に応じて、常法により実施できる。
【００１６】
カスパーゼ-3は、細胞にアポトーシスを起こさせるシグナル伝達経路を構成する、一群のシステインプロテアーゼである。カスパーゼ-3の機能が低下すると細胞がアポトーシスしにくくなり、その結果、疾患に関連する異常な細胞のアポトーシスによる排除が機能しなくなり、疾患の発生に繋がる。
【００１７】
AGEsは、前述のように、体内での糖濃度の上昇によりグルコースなどの還元糖やその代謝産物と、タンパク質との非酵素的な糖化反応を経て生成される構造体であり、高血糖値を有する生体内において健常時と比較して濃度が上昇する。さらに、TAGEは、特に毒性の強いAGEsである。これらAGEsやTAGEは、NASHを発症する患者の細胞において多く含まれる。従って、カスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞は、例えば、NASHを発症する患者の肝臓由来の細胞であることができる。
【００１８】
候補物質には特に制限はない。
但し、効率的にスクリーニングを行うためには、候補物質は事前に絞っておくことが好ましい。候補物質の事前の絞り込みは、例えば、カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索により行うことができる。カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、カスパーゼ-3の活性化促進物質及びカスパーゼ-3の活性化促進を抑制する物質を共存させた細胞を事前検索候補物質の存在下で培養し、事前検索候補物質の存在により、活性化促進を抑制する物質によるカスパーゼ-3の活性化促進阻害を抑制できるか否かを基準に行うことができる。カスパーゼ-3の活性化促進物質としては、例えば、カンプトテシン(CPT)、エトポシド、アクチノマイシンD、シクロヘキシミド、メナジオンを挙げることができ、カスパーゼ-3の活性化促進を抑制する物質としては、例えば、グリセルアルデヒド(GA)を挙げることができる。また、使用する細胞は、前記(1)のステップと同様のカスパーゼ-3発現能を有し、かつTAGE又はAGEsを含む細胞である。
【００１９】
事前検索候補物質の存在により、活性化促進を抑制する物質によるカスパーゼ-3の活性化促進阻害を抑制できるか否かは、例えば、活性化Caspase-3により認識されるDEVD配列を含む発光前駆基質を含むキットを用いることで実施することができる。
【００２０】
カスパーゼ-3を活性化する物質の事前検索は、マルチウエルプレートを使用し、複数の事前検索候補物質に対して並列的に行うことができ、それにより一度に多数の事前検索候補物質を処理することができる。
【００２１】
細胞培養後に、（２ａ）細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれる異常高分子化したカスパーゼ-3の量に比べて減少したか否かを確認すること、及び／又は、（２ｂ）細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量が、候補物質の非存在下での細胞培養により産生されたタンパク質に含まれるプロカスパーゼ-3の量に比べて少なくとも減少しないことを確認する。尚、プロカスパーゼ-3とは、通常状態の不活性型のカスパーゼ-3を表す。活性型のカスパーゼ-3（１７，１９ｋDa)と区別する意味で、「プロ」を付して表記する。
【００２２】
異常高分子化したカスパーゼ-3の分子量は、６０〜１００ｋＤａの範囲であり、プロカスパーゼ-3の分子量は、２５〜３５ｋＤａである。また、異常高分子化したカスパーゼ-3の量、及びプロカスパーゼ-3の量の計測は、例えば、ウエスタンブロッティングにより行うことができる。ウエスタンブロッティングによれば、上記分子量を有する異常高分子化したカスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-3の量の計測を一度に行うこともできる。ウエスタンブロッティングに用いる標識抗体の例としては、例えば、カスパーゼ-3 mAb（内在性レベルのプロカスパーゼ-3を検出することが出来るラビットモノクローナル抗体）を挙げることができる。
【００２３】
異常高分子化したカスパーゼ-3及び／又はプロカスパーゼ-3の量の計測の結果、異常高分子化したカスパーゼ-3の量が、候補物質の共存により減少した場合、及び／又はプロカスパーゼ-3の量が、候補物質の共存により少なくとも減少しない場合、その候補物質を、細胞内に存在するカスパーゼ-3の高分子化を抑制または抑止する物質として選択することができる。
【００２４】
異常高分子化したカスパーゼ-3及び／又はプロカスパーゼ-3の量の計測は、細胞培養時に共存させる候補物質の濃度が異なる複数の系で行うことで、より計測及び候補物質の選択の精度を挙げることができる。
【００２５】
このようにして選択された、カスパーゼ-3の高分子化を抑制または抑止する物質は、異常高分子化して活性化機能を喪失したカスパーゼ-3の回復を促す物質であり、生体内でも、カスパーゼ-3の高分子化を抑制または抑止することが期待される。
本発明の方法によれば、非アルコール性脂肪肝炎の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングすることができ、また、非アルコール性脂肪肝炎に関連する生活習慣病の発症及び／又は進展の予防に有効な物質をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００２７】
実施例１
カスパーゼ-3活性測定プロトコル
(目的)
細胞内TAGE化ストレスによる毒性を抑制する物質の事前探索のためのスクリーニングである。薬剤添加により変動するカスパーゼ-3の酵素活性を指標にスクリーニングをおこなう。探索物質の効果として、“グリセルアルデヒド＋カンプトテシン”処理時の値と比較して、“探索物質＋グリセルアルデヒド＋カンプトテシン”のカスパーゼ-3活性値が高いものを陽性とみなす。また、その効果に対する濃度依存的な効果を観察する。
【００２８】
カスパーゼ-3の活性値比較は、カスパーゼ-3の活性化指標(Caspase-Glo 3/7 Assayでの発光量)を生存細胞数指標(Cell Titer-Glo 2.0 Assayでの発光量)で割ることにより求める。
【数１】
2017063614.tif 000002
【００２９】
細胞への試薬添加のバリエーションと、その組み合わせの目的としては、
・薬剤無処理（basal levelでのカスパーゼ-3活性）
・グリセルアルデヒド（TAGE前駆体のみの効果を確認）
・カンプトテシン (カスパーゼ-3活性化誘導剤により上昇するカスパーゼ-3活性値の確認)
・グリセルアルデヒド＋カンプトテシン（カンプトテシン処理により上昇したカスパーゼ-3活性値がTAGE前駆体処理により抑制される事を確認）
・探索物質（探索物質自体にカスパーゼ-3に対する影響が少ない、もしくはないことを確認）
・探索物質＋グリセルアルデヒド（探索物質自体がグリセルアルデヒド処理によって抑制されるカスパーゼ-3自体に対する影響が少ない、もしくはないことを確認）
・探索物質＋グリセルアルデヒド＋カンプトテシン（探索物質存在下において、TAGE前駆体処理によるカスパーゼ-3の不活性化を抑制できるかを確認）
である。
【００３０】
実験材料、試薬
・ヒト肝癌由来細胞(HepG2)
・DMEM (low glucose) with 10% FBS、DMEM (low glucose) with 2% FBS
・検出薬として、Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega)およびCellTiter-Glo 2.0 Assay (Promega)
・multiple well plate (ルミノメーター用)
・CO2インキュベーター
・測定用ルミノメーター
・グリセルアルデヒド、カンプトテシン、各種探索物質、（スペルミン、アミノグアニジン）
【００３１】
実験方法
1．HepG2細胞を1ウエルあたり3.0×104cells/cm2播種する。37℃ 5% CO2インキュベーターでDMEM (low glucose) + 10% FBS培地中で24時間培養。
2．細胞を培養しているウエルから培地を抜き、DMEM (low glucose)+2% FBSに交換。さらに、添加する試薬が検出薬に影響を与える事を考慮して、細胞培養を行っていないウエルにもDMEM (low glucose)+2% FBSを加えておく。その後、それぞれのウエルに探索したい物質を加えた後、37℃ 5% CO2インキュベーターで2時間培養する。
3．細胞培養液中に、最終濃度 4mMになるようにグリセルアルデヒドを加える。37℃ 5% CO2インキュベーターで2時間培養する。
4．細胞培養液中に、最終濃度10μMになるようにカンプトテシンを加える。37℃ 5% CO2インキュベーターで22時間培養する。
5．・生細胞数測定では、室温に戻したCellTiter-Glo 2.0 Reagentを、各ウエルに100μlずつ添加し、２分間振とうさせる。その後、遮光して１０分間室温で反応させ、ルミノメーターで測定する。
・カスパーゼ-3活性化の測定では、室温に戻したCaspase-Glo 3/7 Reagentを、各ウエルに100μlずつ添加し、30秒振とう。遮光して30分〜3時間室温で反応させた後、ルミノメーターで測定する。
6．それぞれの試薬処理別に、細胞を培養しているウェルから得られた実測値から、培地のみのウェルから得られた実測値を引き、実際の値とする。
【００３２】
それぞれの試薬処理別に、Caspase-Glo 3/7 Assayで得られた値を、CellTiter-Glo 2.0 Assayで得られた値で割り算し、生存細胞数あたりのカスパーゼ-3活性値を求める。
【００３３】
実験結果
AGEs形成阻害剤としてすでに報告のあるスペルミン(Spermine)、アミノグアニジン(AG)を用い、細胞内TAGEタンパク質蓄積による細胞毒性と連動したカスパーゼ-3の活性化異常が抑制できると予想して実験を行った。コントロール実験として行った、無処理時／グリセルアルデヒド（GA）／スペルミン／AGそれぞれの単独処理と比較して、カスパーゼ-3活性化誘導試薬であるカンプトテシン(CPT)では細胞あたりのカスパーゼ-3活性が高く、なおかつCPTによるカスパーゼ-3活性化効果はGA処理により抑制されていた。
【００３４】
さらに、GAによるカスパーゼ-3の活性化抑制作用を軽減できる作用を持つ物質探索のためにスペルミン、AGを用いた予備実験を行った結果、GA+CPT処理時と比較して、スペルミン、AGを追加することによりカスパーゼ-3の活性化は回復している（図1斜線グラフ）。また、これらのスペルミン、AGの回復効果は濃度依存的であった（図２，図３）。
【００３５】
したがって、本スクリーニング系においてスペルミンもしくはAGを陽性とみなし、ポジティブコントロールとして用いることが可能である。
【００３６】
実施例２
カスパーゼ-3高分子化検出プロトコル
目的
細胞内TAGE化ストレスによる毒性を抑制する物質探索のための本発明のスクリーニングである。薬剤添加により修飾を受け、タンパク質の大きさが変動するカスパーゼ-3をウエスタンブロッティングにより検出する。このウエスタンブロッティングによりTAGE前駆体(グリセルアルデヒド)処理時に検出されるカスパーゼ-3の高分子化を抑制できる、物質のスクリーニングを行う。また、その効果に対する探索物質の濃度依存的な効果を観察する。
【００３７】
細胞への試薬添加のバリエーションと、その組み合わせの目的としては、
・薬剤無処理(basal levelのカスパーゼ-3のタンパク質の挙動確認)
・探索物質（探索物質自体にカスパーゼ-3に対する影響がないことを確認）
・グリセルアルデヒド（TAGE前駆体のみの効果を確認）
・探索物質＋グリセルアルデヒド（探索物質存在下において、TAGE前駆体処理によるカスパーゼ-3の異常高分子化を抑制できるかを確認）
である。
【００３８】
実験材料、試薬
・ヒト肝癌由来細胞(HepG2)
・DMEM (low glucose) with 10% FBS、DMEM (low glucose) with 2% FBS
・細胞培養用ディッシュ
・CO2インキュベーター
・ウエスタンブロッティング用装置
・抗体(Caspase-3 Rabbit mAb (CST), anti-Rabbit IgG (CST),β-tubulin Mouse mAb (Wako), anti-Mouse IgG (CST))
・メンブレン検出機器（LAS-4000等）
・グリセルアルデヒド、カンプトテシン、各種探索物質、（スペルミン、アミノグアニジン）
【００３９】
実験方法
1．HepG2細胞を1ウエルあたり3.0×104cells/cm2播種する。37℃ 5% CO2インキュベーターでDMEM (low glucose) + 10% FBS培地中で 24時間培養。
2．培地を抜き、DMEM (low glucose)+2% FBSに交換。その後、探索したい物質を加えた後、37℃ 5% CO2インキュベーターで2時間培養する。
3．細胞培養液中に、最終濃度 4mMになるようにグリセルアルデヒドを加える。37℃ 5% CO2インキュベーターで24時間培養する。
4．接着細胞および遠心して回収した浮遊細胞をPBSで三回洗い、その後ペレットにした細胞を2×SDS Sample bufferで懸濁する。
5．タンパク質定量を行い、1ウエルあたり5〜10(gのタンパク質量をSDS-PAGEゲルで電気泳動を行う。（各実験によりアプライするタンパク質量は揃える。）
6．泳動後のSDS-PAGEゲルのタンパク質はPVDF膜にトランスファーし、ブロッキング後、1次抗体(Caspase-3 Rabbit mAb)、２次抗体( anti-Rabbit IgG)で反応させる。
7．ブロッティング検出試薬にメンブレンを反応後、メンブレン検出機器でカスパーゼ-3の挙動を確認する。
8．メンブレンはストリッピング後、一次抗体（β-tubulin Mouse mAb）、二次抗体（anti-Mouse IgG）でリプローブし、メンブレン検出機器でβ-チューブリンの量を確認する（loading control）。
9．検出したバンドの定量はImage-Jで行い、異常高分子化したカスパーゼ-3、もしくはプロカスパーゼ-3のバンドのインテンシティを、β-チューブリンのバンドのインテンシティで割り算することにより測定を行う。
【００４０】
結果
実施例1で陽性とみなされたスペルミンおよびAGがカスパーゼ-3に及ぼす影響についてウエスタンブロッティングを用いて本実施例を行った。コントロール実験として行った無処理時／スペルミン／AGそれぞれの単独処理では、２５〜３５ｋＤａ付近に検出されるプロカスパーゼ-3のタンパク質バンドが、GA処理時には６０ｋＤａ〜付近においてカスパーゼ-3の異常高分子化バンドも一緒に観察された。さらに、GAによるカスパーゼ-3の異常高分子化を保護できる作用を持つ物質探索のためにスペルミン、AGを用いた実験を行った結果、GA処理時と比較して、スペルミン、AGを追加することにより異常高分子化したカスパーゼ-3の形成が抑制されている。また、これらのスペルミン、AGの回復効果は濃度依存的であった（それぞれ図4-1，図5-1）。さらにloadingタンパク質量あたりのプロカスパーゼ-3の量も少なくとも減少しないことから、この回復効果は全体のカスパーゼ-3量が減少したことが原因ではない（それぞれ図4-2、図5-2）。
【００４１】
したがって、本スクリーニング系においてスペルミンもしくはAGを陽性とみなし、ポジティブコントロールとして用いることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、TAGEに関連する疾患発症や進展を抑制し得る物質の開発に関連する分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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