(57)【要約】【課題】細胞に酸素と栄養分とを供給することができるバインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法を提供する。【解決手段】第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との間には膜状に形成されているバインダ材１５が設けられている。バインダ材１５には、孔が複数形成されており、孔は、第１細胞シート１１の一方のシート面に接する第１膜面に開口している。孔は、厚み方向と第１膜面に沿った面方向とに貫通している。バインダ材１５の空隙率は少なくとも５０％とされている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１細胞群と第２細胞群との間に配されて用いられ、
膜状に形成されており、
一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、
前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、
空隙率が少なくとも５０％であるバインダ材。
【請求項２】
前記第１細胞群及び前記第２細胞群は、
細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方である請求項１に記載のバインダ材。
【請求項３】
前記細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドである請求項２に記載のバインダ材。
【請求項４】
前記複数の孔が厚み方向に貫通しており、
厚みが１μｍ以上５０μｍ以下の範囲内である請求項１〜３のいずれか１項に記載のバインダ材。
【請求項５】
前記一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げられており、前記第１細胞群が前記バインダ材に挟まれた状態に配されて用いられる請求項１〜４のいずれか１項に記載のバインダ材。
【請求項６】
第１細胞群と、
第２細胞群と、
前記第１細胞群と前記第２細胞群との間に設けられている請求項１〜４のいずれか１項に記載のバインダ材と、
を備える細胞集積体。
【請求項７】
前記バインダ材は前記一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げられており、前記第１細胞群は前記バインダ材に挟まれている請求項６に記載の細胞集積体。
【請求項８】
第１細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも５０％であるバインダ材とを、前記第１細胞群と前記一方の膜面とが接触する状態に重ねる第１ステップと、
第２細胞群と前記バインダ材とを、前記第２細胞群と前記バインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ねる第２ステップと、
を有する細胞集積方法。
【請求項９】
前記バインダ材は、前記複数の孔が厚み方向に貫通しており、
前記バインダ材の厚みは１μｍ以上５０μｍ以下の範囲内である請求項８に記載の細胞集積方法。
【請求項１０】
前記第１細胞群及び前記第２細胞群は、
細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方である請求項８または９に記載の細胞集積方法。
【請求項１１】
前記細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドである請求項１０に記載の細胞集積方法。
【請求項１２】
前記第１細胞群は前記細胞凝集体であり、前記第１細胞群の厚みは大きくとも２００μｍである請求項１０または１１に記載の細胞集積方法。
【請求項１３】
前記第２細胞群は前記細胞凝集体であり、前記第２細胞群の厚みは大きくとも２００μｍであり、
前記バインダ材の前記複数の孔は厚み方向に貫通している請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞集積方法。
【請求項１４】
前記バインダ材を前記一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げ、前記第１細胞群を前記バインダ材に挟まれた状態に配する請求項８ないし１３のいずれか１項に記載の細胞集積方法。
【請求項１５】
第１細胞群と第２細胞群とを重ねて細胞を保存する細胞保存方法において、
前記第１細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも５０％であるバインダ材とを、前記第１細胞群と前記一方の膜面とが接触する状態に重ね、
前記第２細胞群と前記バインダ材とを、前記第２細胞群と前記バインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ね、
前記バインダ材を介して前記第１細胞群と前記第２細胞群とが重なっている前記細胞集積体を、前記細胞の培養液に接した状態で保持することを特徴とする細胞保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓や肝臓などの立体臓器の再生医療の実現においては、十分な厚みを有するいわゆる三次元に形成された細胞群で形成された組織体（以下、三次元細胞組織体と称する）の形成が不可欠である。三次元細胞組織体を形成する方法としては、スフェロイドと呼ばれる球状の細胞凝集体を面状に並べる方法や、シート状の細胞凝集体である複数の細胞シートを厚み方向に複数重ねる方法や、細胞シートを折りたたむことで三次元化する方法がある。細胞シートを折りたたむ方法は、大面積に細胞シートを作ることができれば、比較的簡単に三次元化ができるという利点がある。
【０００３】
細胞シートは、通常、シャーレなどの培養容器内でつくられるが、積層化に際して取り扱うためには、培養容器から破損させずに取り出すことが要求される。そこで、例えば特許文献１では、一定の温度範囲内で水和力が変化するいわゆる温度応答性ポリマーを表面に被覆した培養支持体上で細胞を培養して細胞シートをつくり、得られた細胞シートを剥離して複数重ねる手法を用いている。具体的には、温度応答性ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、温度応答性ポリマーの水和力が強い状態になる温度に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離する。
【０００４】
上記のように破損することなく細胞シートを得ても、これを積層化して厚くするほど、酸素や培地中の培養液からの栄養分などの細胞への供給が不足するために、細胞が死滅してしまうという問題がある。そこで、特許文献１は、重ねられる複数の細胞シート間及び細胞シート内に血管網を形成する手法を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０３６２２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スフェロイドを面状に並べる方法は、得られる細胞凝集体の厚みに限界があり、三次元細胞組織体として利用可能なレベルではない。そしてスフェロイドを面状に並べたものを用いてさらに細胞を培養し、厚くしようとしても、酸素や培地中の培養液からの栄養分などの細胞への供給が不足するために、細胞が死滅してしまう。また、特許文献１のように細胞シートの利用で血管網を形成する手法は、複雑で時間がかかるという問題があり、簡易な別手法が望まれる。
【０００７】
そこで本発明は、細胞に酸素と栄養分とを供給することができるバインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のバインダ材は、第１細胞群と第２細胞群との間に配されて用いられ、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも５０％である。
【０００９】
第１細胞群及び第２細胞群は、細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方であることが好ましい。細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドであることが好ましい。
【００１０】
複数の孔が厚み方向に貫通しており、厚みが１μｍ以上５０μｍ以下の範囲内であることが好ましい。
【００１１】
一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げられており、第１細胞群がバインダに挟まれた状態に配されて用いられてもよい。
【００１２】
本発明の細胞集積体は、第１細胞群と、第２細胞群と、第１細胞群と第２細胞群との間に設けられている上記バインダ材とを備える。
【００１３】
細胞集積体は、バインダ材が一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げられており、第１細胞群がバインダ材に挟まれていてもよい。
【００１４】
本発明の細胞集積方法は、以下の第１ステップと第２ステップとを有する。第１ステップは、第１細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも５０％であるバインダ材とを、第１細胞群と一方の膜面とが接触する状態に重ねる。第２ステップは、第２細胞群とバインダ材とを、第２細胞群とバインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ねる。
【００１５】
第１細胞群は上記の細胞凝集体であり、第１細胞群の厚みは大きくとも２００μｍであることが好ましい。第２細胞群は上記の細胞凝集体であり、第２細胞群の厚みは大きくとも２００μｍであり、バインダ材の複数の孔は厚み方向に貫通していることが好ましい。バインダ材を一方の膜面の第１領域と第２領域とが対向する状態に折り曲げ、第１細胞群をバインダに挟まれた状態に配することが好ましい。
【００１６】
本発明の細胞保存方法は、第１細胞群と第２細胞群とを重ねて細胞を保存する細胞保存方法であり、第１細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも５０％であるバインダ材とを、第１細胞群と一方の膜面とが接触する状態に重ね、第２細胞群とバインダ材とを、第２細胞群とバインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ね、バインダ材を介して第１細胞群と第２細胞群とが重なっている細胞集積体を、細胞の培養液に接した状態で保持する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細胞に酸素と栄養分とを供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明を実施した細胞集積体である。
【図２】バインダ材の平面図である。
【図３】図２のIII−III線の沿う断面図である。
【図４】図２のIV−IV線に沿う断面図である。
【図５】細胞集積体の製造方法の説明図である。
【図６】別の細胞集積体の層構造を示す説明図である。
【図７】別の細胞集積体を示す概略図である。
【図８】別の細胞シートの層構造を示す説明図である。
【図９】複合バインダ材の概略断面図である。
【図１０】別の細胞集積体を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１において、細胞集積体１０は、第１細胞シート１１と、第２細胞シート１２と、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との間に配されているバインダ材１５とを備える。第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とは、複数の細胞がシート状に凝集した細胞凝集体であり、細胞外マトリックスを含む。複数の細胞はこの細胞外マトリックスの介在によりシート形状を成している。バインダ材１５は、第１細胞シート１１の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものであり、この例では、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との両方の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものとなっている。バインダ材１５ついての詳細は、別の図面を用いて後述する。
【００２０】
第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とバインダ材１５とは、図１における上方から見た場合、すなわち細胞集積体１０を第１細胞シート１１側の表面に対して垂直な方向から見た場合において、この例では径が２０μｍの円形としているが、径はこれに限られず、また、円形以外の形状、たとえば楕円形、矩形、多角形、不定形などでもよい。
【００２１】
第１細胞シート１１の厚みＴ１１と第２細胞シート１２の厚みＴ１２とは、この例では１００μｍとしているが、これに限定されない。ただし、厚みＴ１１と厚みＴ１２とは、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２の取り扱いの容易性などの観点では少なくとも５０μｍ、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞に酸素や栄養分とをより確実に供給する観点では大きくても２００μｍ以下、すなわち５０μｍ以上２００μｍ以下の範囲内であることが好ましい。厚みＴ１１と厚みＴ１２とは、６０μｍ以上１８０μｍ以下の範囲内であることがより好ましく、７０μｍ以上１６０μｍ以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、図１においては、厚みＴ１１と厚みＴ１２と詳細を後述するバインダ材１５の厚みＴ１５とについて、大きく誇張して描いてある。
【００２２】
第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞の種類は、互いに同じであってもよいし、異なるものであってもよく、本実施形態では同じにしている。本実施形態における細胞は肝細胞であるが、これに限られず、細胞は、例えば、心臓組織、肝組織、腎組織、副腎組織、皮膚組織、粘膜組織をそれぞれ構成する細胞であって、それぞれの組織において複数種類の細胞が混在している場合にはそれらのうちのいずれか１種であってもよいし、もしくは２種以上の混合であってもよい。
【００２３】
第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２の細胞は、例えば培地において播種された細胞の培養による培養細胞であり、この例では、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２は、培養する際に用いられていた培養液を含んでいる。しかし、培養の際の培養液に代えて、新たな培養液であってもよく、またはこれらの混合液でもよい。
【００２４】
バインダ材１５は、前述の通り、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものである。バインダ材１５は、膜状に形成されており、一方の膜面（以下、第１膜面と称する）が第１細胞シート１１の一方のシート面に接触した状態に、他方の膜面（以下、第２膜面と称する）が第２細胞シート１２の一方のシート面に接触した状態に、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２と重なっている。
【００２５】
バインダ材１５について、図２〜図４を参照しながら説明する。なお、図２は第１膜面を示す。なお、図３，図４においては、第１膜面に符号１５ａを付し、第２膜面には符号１５ｂを付してある。
【００２６】
バインダ材１５は、第１膜面１５ａに開口した孔２１を複数備える。孔２１は、第１膜面１５ａ上に配された第１細胞シート１１（図１参照）に酸素と栄養分とを案内するためのものである。この例では、孔２１は、第１膜面１５ａに加えて第２膜面１５ｂにも開口しており、第１細胞シート１１のみならず、第２膜面１５ｂ上に配された第２細胞シート１２にも酸素と栄養分とを案内するためのものでもある。孔２１は、第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとに対して垂直な方向、すなわち厚み方向にバインダ材１５を貫通しており、第１膜面１５ａ，第２膜面１５ｂにそれぞれ開口して開口部（以下、表面開口部と称する）２１ａを形成している。
【００２７】
複数の孔２１は、第１膜面１５ａに沿って規則的に、この例では、より具体的にはマトリクス状に配列されている。各孔２１は、その大きさ、形状が一定であり、表面開口部２１ａの大きさ、形状も一定である。このようなバインダ材１５は、第１膜面１５ａに垂直な方向から見たときに、任意の１つの孔２１を中心にした６角形の各頂点に周囲の６個の孔２１が配された状態に、各孔２１が密に配列されている。これによりバインダ材１５は、蜂の巣状となるハニカム構造となっている。
【００２８】
ハニカム構造は、表面開口部２１ａの形状や、孔２１の第１膜面１５ａに平行な断面の形状が６角形である必要はない。この例では、表面開口部２１ａの形状は円形となっている。第１膜面１５ａの単位面積当たりの孔２１の密度や隣り合う孔２１同士の距離等に応じて、表面開口部２１ａと、第１膜面１５ａに平行な断面での孔２１との各形状は、例えば丸みを帯びた略６角形や略８角形等になる場合もあり、ハニカム構造とはこのような態様も含む。また、ハニカム構造は、各孔２１が互いに独立している構造の他、この例のように隣接した孔２１同士がバインダ材１５の内部で繋がっている構造をも含む。さらに、孔２１の配列は、上記のものに限定されない。任意の１つの孔２１の周囲に３〜５個、あるいは７個以上の孔２１が配されてもよく、孔２１が正方配列されてもよい。
【００２９】
図３，図４では、バインダ材１５の厚みＴ１５に対して、隣り合う孔２１と孔２１との間の隔壁２２の厚みを誇張して描いてある。隣り合う孔２１と孔２１とを隔てる隔壁２２は、この例では、第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとのそれぞれから厚み方向での中央に向かうに従い厚みが漸減している。
【００３０】
この例では、隔壁２２は、厚み方向での概ね中央に隔壁開口部２２ａが形成されており、これにより、隣接した孔２１同士はバインダ材１５の内部で第１膜面１５ａに沿った方向（以下、面方向と称する）に繋がっている。ただし、隔壁２２は、隔壁開口部２２ａが形成されていない場合もあり、その場合には孔２１は個々に独立している。隔壁開口部２２ａは、各孔２１に酸素と栄養分とを案内するためのものである。
【００３１】
孔２１は、第１細胞シート１１へ酸素と栄養分とを案内する観点では、厚み方向と面方向とのいずれか一方に貫通していればよい。ただし、酸素と栄養分との第１細胞シート１１へのより確実な案内や、第１細胞シート１１に加えて第２細胞シート１２へ対しても案内する観点では、本実施形態のように、厚み方向と面方向との両方に貫通している方が好ましい。
【００３２】
表面開口部２１ａの径、すなわち、孔２１の第１膜面１５ａにおける開口径φａは、２μｍ以上１００μｍ以下の範囲内とされ、本実施形態では２０μｍである。開口径φａは、５μｍ以上７０μｍ以下の範囲内であることがより好ましく、１０μｍ以上５０μｍ以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、孔２１のように厚み方向に貫通した孔が形成されている場合には、その孔の第２膜面１５ｂにおける開口径φｂについても同様に２μｍ以上１００μｍ以下の範囲内とされることが好ましく、本実施形態では２０μｍである。
【００３３】
また、隔壁開口部２２ａの開口径φｃは、２μｍ以上８０μｍ以下の範囲内とされることが好ましい。
【００３４】
バインダ材１５の空隙率は少なくとも５０％、すなわち５０％以上とされている。この空隙率は、バインダ材１５に孔２１が形成されていない場合の体積をＶ１、複数の孔２１の体積の和をＶ２とするときに、（Ｖ２／Ｖ１）×１００で算出して求める。体積Ｖ２は、ＳＥＭ（Scanning Electron Microscope、走査型電子顕微鏡）での画像により、バインダ材１５の内部における孔２１の最大径、開口径φａ，開口径φｂから算出して求めることができる。バインダ材１５の空隙率は、５０％以上９０％以下の範囲内であることが好ましい。
【００３５】
第１膜面１５ａにおいて隣り合う表面開口部２１ａと表面開口部２１ａとの距離（以下、開口部ピッチと称する）Ｐは、特に限定されないが、３μｍ以上１２０μｍ以下の範囲内であることが好ましく、本実施形態では２４μｍである。開口部ピッチＰは、５μｍ以上１００μｍ以下の範囲内であることがより好ましく、１０μｍ以上６０μｍ以下の範囲内であることがさらに好ましい。開口径φａと開口部ピッチＰとは、例えばＳＥＭの画像から求めている。
【００３６】
バインダ材１５の厚みＴ１５は、孔２１が厚み方向に貫通している場合には、１μｍ以上５０μｍ以下の範囲内であることが好ましく、本実施形態では１０μｍとしている。孔２１が厚み方向に貫通している場合の厚みＴ１５は、１μｍ以上５０μｍ以下の範囲内であることがより好ましく、２μｍ以上４０μｍ以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、孔２１が面方向にのみ貫通している場合には、厚みＴ１５は特に限定されない。
【００３７】
バインダ材１５は、この例では疎水性ポリマーから形成されている。疎水性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリヒドロキシブチレート、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリスチレン（ＰＳ、ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、およびこれらの繰り返し単位を含む共重合体等が好ましく、本実施形態ではポリ乳酸を用いている。生体内での使用により経時での分解や吸収性の機能を付与する観点では、上記の中でもポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、これらの共重合体が特に好ましい。また、屈曲部、伸縮部に適用、例えば屈曲部や伸縮部に貼り付けて使用する観点では、伸縮性を有するポリカプロラクトン、ポリブタジエンが特に好ましい。
【００３８】
バインダ材１５は、疎水性ポリマーに加えて、例えば両親媒性化合物を含んでいてもよく、両親媒性化合物はポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれでもよい。両親媒性化合物が含まれる場合の両親媒性化合物の質量は、バインダ材１５の質量１００に対して１０以下であることが好ましい。
【００３９】
上記構成の作用を説明する。第１細胞シート１１は一方のシート面がバインダ材１５の第１膜面１５ａに接触した状態に、第２細胞シート１２は一方のシート面がバインダ材１５の第２膜面１５ｂに接触した状態にそれぞれ配されており、バインダ材１５の孔２１は第１膜面１５ａに開口するとともに、厚み方向に貫通しているから、第２細胞シート１２が培養液に接した状態にされている場合に、第２細胞シート１２からバインダ材１５の孔２１へ案内され、孔２１を通じて第１細胞シート１１へ案内される。培養液は、栄養分と溶存酸素が含まれているから、第１細胞シート１１の細胞へ栄養分と酸素とが供給される。また、第１細胞シート１１の他方のシート面１１ｂが外部に露呈した状態にされている場合には、外部の雰囲気中の酸素も第１細胞シート１１へ案内される。またこの場合には、外部の雰囲気中の酸素は、第１細胞シート１１からバインダ材１５へと案内され、バインダ材１５の孔２１を通じて第２細胞シート１２へ案内される。これにより、第２細胞シート１２の細胞へ酸素が供給される。
【００４０】
以上のようにバインダ材１５の孔２１は厚み方向に貫通しているから、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とのいずれか一方が酸素に接触することにより他方へ酸素が案内されて第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞に供給される。栄養分についても同様に、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とのいずれか一方が培養液に接触することにより他方へ培養液の栄養分が案内されて、他方の細胞に供給される。この供給により、細胞が生存した状態に保存される。また、老廃物についても同様に案内されるから、代謝の観点で細胞はより確実に生存が維持された状態に保存される。
【００４１】
孔２１は面方向に貫通しているから、バインダ材１５の例えば側縁部などから内部に取り込まれた酸素や栄養分が、隔壁開口部２２ａを介して個々の孔２１を案内される。個々の孔２１は第１膜面１５ａに開口しているから、孔２１内に案内されてきた酸素や栄養分は第１細胞シート１１へ向かう。これにより、第１細胞シート１１の細胞へ酸素や栄養分が供給される。また、この例では個々の孔２１が第２膜面１５ｂにも開口しているから、第２細胞シート１２へも同様に酸素や栄養分が案内されて、第２細胞シート１２の細胞にも酸素や栄養分が供給される。
【００４２】
この例の孔２１は厚み方向と面方向との両方に貫通しているから、バインダ材１５の内部に取り込まれた酸素や栄養分は、バインダ材１５の内部全体へより拡散しやすくなり、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との両方に対してより確実に案内されて、両方の細胞に、より確実に供給される。以上のように、バインダ材１５は細胞を生存した状態に保存するための細胞保存材料として機能する。
【００４３】
開口径φａが２μｍ以上とされているから、酸素と栄養分、特に、酸素よりも大きい分子を含む栄養分が、確実に第１細胞シート１１へ案内される。第１膜面１５ａにおける開口径φａが１００μｍ以下とされているから、バインダ材１５が第１細胞シート１１を支える際の強度が十分となる。開口径φｂも同様に２μｍ以上１００μｍ以下の範囲内とされているから、酸素と栄養分、特に栄養分が、確実に第２細胞シート１２へ案内され、細胞の保存効果が高まる。
【００４４】
開口径φｃが２μｍ以上であることから、２μｍ未満であるよりも酸素と栄養分、特に栄養分が、第１細胞シート１１へより十分に案内される。開口径φｃが８０μｍ以下であるから、８０μｍよりも大きい場合に比べてバインダ材１５の圧縮に対する耐久性の点で有利である。
【００４５】
バインダ材１５の空隙率が５０％以上であるから、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とのシート面全域の細胞に対して酸素と栄養分とが確実に案内される。
【００４６】
開口部ピッチＰが３μｍ以上であるから、３μｍよりも小さい場合に比べて、バインダ材１５の強度が高い。開口部ピッチＰが１２０μｍ以下であるから、１２０μｍよりも大きい場合に比べて、第１細胞シート１１、第２細胞シート１２のシート面全体の細胞に対して酸素と栄養分がより確実に案内される。
【００４７】
ところで、細胞群は、安定状態を図るように姿勢を変化させる傾向があり、培養されて増殖する間も同様に、細胞群としてより安定状態となるように姿勢を変化させる傾向がある。したがって、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞は、孔２１が厚み方向に貫通している場合においては、この孔２１の空隙を利用して、互いに増殖、遊走、自己組織化を図るようになる。これにより、一定時間経過後に、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との各細胞から培養細胞が新生されてバインダ材１５の内部で一体化することがある。孔２１が厚み方向に貫通している本実施形態では、バインダ材１５の厚みＴ１５を５０μｍ以下としているから、５０μｍよりも大きい場合に比べて、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２との細胞同士が互いの存在を認識しやすくなり、上記の一体化が起こりやすい。また。厚みＴ１５を１μｍ以上としているから、１μｍ未満である場合に比べて細胞集積体１０としての強度の点でより優れる。
【００４８】
バインダ材１５による第１細胞シート１１の細胞への酸素や栄養分の供給の効果は、第１細胞シート１１の厚みが大きい場合ほど大きく、第１細胞シート１１が５０μｍ以上の厚みであるときに、特に顕著である。同様に、バインダ材１５による第２細胞シート１２の細胞への酸素や栄養分の供給の効果は、第２細胞シート１２の厚みが大きい場合ほど大きく、第２細胞シート１２が５０μｍ以上の厚みであるときに、特に顕著である。
【００４９】
細胞集積体１０の製造方法について、図５を参照しながら説明する。細胞集積体１０は、第１細胞シート１１とバインダ材１５とを重ねる第１ステップと、第２細胞シート１２とバインダ材１５とを重ねる第２ステップとを有する。例えば、以下である。
【００５０】
前述のように第１細胞シート１１，第２細胞シート１２は、それぞれ、培養細胞から形成されている。第２細胞シート１２がつくられた培養容器３０中には、第２細胞シート１２が底部に収容された状態とされており、培養の際に用いられた培養液３１もこの培養容器３０内に収容されている。第１細胞シート１１も、培養容器３０と同様の培養容器（図示無し）でつくられており、その培養容器から取り出される。培養容器３０内の第２細胞シート１２の上に、バインダ材１５は、第２膜面１５ｂが図５における下方を向けた姿勢で配される。これにより、第２細胞シート１２の一方のシート面１２ａにバインダ材１５の第２膜面１５ｂが接した状態に、バインダ材１５と第２細胞シート１２とが重ねられる。第１細胞シート１１は、バインダ材１５の上に配される。これにより、第１細胞シート１１の一方のシート面１１ａがバインダ材１５の第１膜面１５ａに接した状態に、バインダ材１５と第１細胞シート１１とが重ねられる。
【００５１】
上記の製造方法の例は、第２ステップ、第１ステップの順に細胞集積体１０を製造しているが、第１細胞シート１１とバインダ材１５とを重ねてから、第１細胞シート１１が重なった状態のバインダ材１５を第２細胞シート１２に重ねるというように、第１ステップ、第２ステップの順で細胞集積体１０を製造してもよい。
【００５２】
また、上記の製造方法の例では、第２細胞シート１２の上に、バインダ材１５、第１細胞シート１１を順に積み上げているが、これに代えて、第１細胞シート１１の上に、バインダ材１５、第２細胞シート１２を順に積み上げてもよい。
【００５３】
第１細胞シート１１と第２細胞シート１２の細胞を保存する方法は、上記の製造方法で製造した細胞集積体１０を、培養液３１に接した状態に接した状態で保持する。上記の製造方法の例によると、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とバインダ材１５とのうち少なくとも第２細胞シート１２は、培養液３１に接した状態になり、孔２１はバインダ材１５を厚み方向に貫通しているから、第２細胞シート１２の培養液３１はバインダ材１５を通過して第１細胞シート１１へ案内される。これにより培養液３１中の栄養分と溶存酸素とは、第１細胞シート１１の細胞へ供給される。また、第１細胞シート１１の他方のシート面１１ｂ、この例では図５における上面が培養液３１の液面よりも高く位置している場合には、第１細胞シート１１の細胞には外部の雰囲気からも酸素が供給される。この場合には、厚み方向に貫通した孔２１を通じて、第２細胞シート１２にも酸素が案内される。
【００５４】
培養液３１の液面がバインダ材１５の第２膜面１５ｂよりも高い場合には、バインダ材１５の側縁からも培養液３１がバインダ材１５内へ取り込まれる。バインダ材１５は面方向に貫通した孔２１を備え、孔２１は第１膜面１５ａに開口するから、この孔２１を通じて、培養液３１は第１細胞シート１１へ案内される。また、バインダ材１５の孔２１は厚み方向にも貫通しているから、第２細胞シート１２の厚みが大きくても、孔２１を通じてバインダ材１５と接している一方のシート面１２ａから培養液３１が案内される。
【００５５】
なお、培養容器中の第１細胞シート１１の上に、バインダ材１５，第２細胞シート１２の順に重ねて細胞集積体１０を製造した場合であって、バインダ材１５の孔２１が、厚み方向に貫通せず、面方向にのみ貫通している場合には、製造した細胞集積体１０を、第２細胞シート１２が最下層になるような姿勢で、培養液を収容した容器内に保持する。
【００５６】
上記の例は、２枚の細胞シートを重ねる態様であるが、重ねる細胞シートの数は２に限られず、３以上であってもよい。ただし、連続して重ね併せられている複数の細胞シート（集積部と称する）の厚みの合計が２００μｍ以下となるように、第１の集積部と第２の集積部との間にバインダ材１５を設けた態様にすることが好ましい。例えば、以下である。
【００５７】
図６において、細胞集積体５０は、図６における下から順に、第２細胞シート１２、第１細胞シート１１が連続して重なっている第１集積部５１、バインダ材１５、第１細胞シート１１が連続して重なっている第２集積部５２、バインダ材１５、第１細胞シート１１が重なっている構成を有する。第１集積部５１と第２集積部５２とにおける第１細胞シート１１の数はそれぞれ５とされている。第１集積部５１と第２集積部５２との各厚みＴＳは大きくとも２００μｍ、すなわち２００μｍ以下にされることが好ましく、本実施形態では、それぞれ１００μｍとしている。バインダ材１５は、第２細胞シート１２と第１集積部５１との間と、第１集積部５１と第２集積部５２との間と、第２集積部５２と図６における最も上部の第１細胞シート１１との間とに、それぞれ配されている。このように、第１集積部５１，第２集積部５２の厚みを２００μｍ以下に抑えた態様でバインダ材１５を設けておくことで、酸素と栄養分とが各細胞シートに確実に案内されて、各細胞シートの細胞に供給される。
【００５８】
この例では、第１集積部５１と第２集積部５２とにおける第１細胞シート１１の数はそれぞれ５とされているが、この数は５に限られない。また、第１集積部５１と第２集積部５２とは、それぞれ第１細胞シート１１から形成されているが、互いに異なる細胞シートから形成されていてもよい。
【００５９】
バインダ材１５は、折り曲げて使用することができる。図７に示す細胞集積体６０は、バインダ材１５と第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とを備える。なお、図７においても、バインダ材１５、第１細胞シート１１、第２細胞シート１２の厚みを大きく誇張して描いてある。この例のバインダ材１５、第１細胞シート１１、第２細胞シート１２は、矩形に形成されている以外は、図１におけるバインダ材１５、第１細胞シート１１、第２細胞シート１２と同じであるので同じ符号を用いる。なお、この例においても、バインダ材１５、第１細胞シート１１、第２細胞シート１２は円形などの他の形状でもよい。
【００６０】
バインダ材１５は、第１膜面１５ａの第１領域Ｓ１と第２領域Ｓ２とが対向する状態に、第１細胞シート１１側に折り曲げられている。この例では、第１細胞シート１１を第１膜面１５ａに配してからバインダ材１５を折り曲げており、これにより第１細胞シート１１も折り曲げられて重なった状態とされ、バインダ材１５に挟まれている。なお、バインダ材１５を折り曲げてから、第１領域Ｓ１と第２領域Ｓ２との間に第１細胞シート１１を配してもよい。第１領域Ｓ１と第２領域Ｓ２との間で重ねられる細胞シートの枚数は２枚以上であってもよいが、重なった状態での厚みは大きくとも２００μｍ以下にすることが好ましい。この例では、バインダ材１５の折り曲げ回数を１回としているが、２回以上の回数にしてもよい。
【００６１】
バインダ材１５は、第２膜面１５ｂの第１領域と第２領域とが対向する状態に、折り曲げてもよい。この場合には、孔２１は、バインダ材１５の厚み方向に貫通していることが好ましい。
【００６２】
なお、バインダ材１５はロール状に巻いて使用してもよい。ロール状に巻かれた場合の細胞集積体（図示無し）は、バインダ材１５と第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とを備える。バインダ材１５は、第１膜面１５ａの第１領域と第２領域とが互いに同じ向きで重なる状態に、第１細胞シート１１側を内側にして巻かれている。第１細胞シート１１を第１膜面１５ａに配してからバインダ材１５をロール状に巻くことにより、第１細胞シート１１も巻かれてバインダ材１５を介して重なった状態とされ、バインダ材１５に挟まれている。第１領域と第２領域との間で重ねられる細胞シートの枚数は２枚以上であってもよいが、重なった状態での厚みは大きくとも２００μｍ以下にすることが好ましい。ロール状に巻く場合のバインダ材１５は、孔２１は、バインダ材１５の厚み方向に貫通していることが好ましい。なお、ロール状に巻く巻き数は、２以上でもよい。バインダ材１５は、第２膜面１５ｂの第１領域と第２領域とが互いに同じ向きで重なる状態に、第２細胞シート１２側を内側にして巻かれてもよい。この場合にも、孔２１は、バインダ材１５の厚み方向に貫通していることが好ましい。
【００６３】
図１及び図６の細胞集積体１０，５０は、第１細胞シート１１と第２細胞シート１２とに代えて、支持体を備える細胞シートを備えてもよい。例えば、図７に示す第３細胞シート７０は、細胞層７１と、支持体７２とを備える。細胞層７１は、前述の第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２と同様に、複数の細胞と細胞マトリックスとを含み、細胞群がシート形状を成している。なお、細胞層７１は、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２と同様に、培養液などの他の物質を含んでいてもよい。
【００６４】
支持体７２は、細胞層７１をシート形状に保持した状態で支持するためのものであり、シート形状とされている。支持体７２は、バインダ材１５と同様に、厚み方向と面方向とに貫通し、細胞層７１と接する表面に開口する孔（図示せず）が複数形成されているものとされている。
【００６５】
この第３細胞シート７０を前述の細胞集積体１０の第１細胞シート１１に代えて用いる場合には、支持体７２とバインダ材１５とが接した状態に、第３細胞シート７０とバインダ材１５とが重ねられる。なお、支持体７２として、厚み方向には貫通せず、面方向のみに貫通し、細胞層７１と接する表面に開口する孔が複数形成されているものを用いた場合には、細胞層７１とバインダ材１５とが接した状態に、第３細胞シート７０とバインダ材１５とが重ねられる。
【００６６】
この第３細胞シート７０を前述の細胞集積体１０の第２細胞シート１２に代えて用いる場合には、支持体７２と細胞層７１とのいずれか一方とバインダ材１５とが接した状態に、第３細胞シート７０とバインダ材１５とが重ねられる。なお、支持体７２として、厚み方向には貫通せず、面方向のみに貫通し、細胞層７１と接する表面に開口する孔が複数形成されているものを用いた場合も同様に、支持体７２と細胞層７１とのいずれか一方とバインダ材１５とが接した状態に、第３細胞シート７０とバインダ材１５とが重ねられる。第３細胞シート７０の厚みは、第１細胞シート１１の厚みＴ１１及び第２細胞シート１２の厚みＴ１２と同様に、取り扱いの容易性などの観点では少なくとも５０μｍ、第３細胞シート７０の細胞層７１の細胞に酸素や栄養分とをより確実に供給する観点では大きくても２００μｍ以下、すなわち５０μｍ以上２００μｍ以下の範囲内であることが好ましい。
【００６７】
バインダ材１５に代えて、図８に示す複合バインダ材８０を用いてもよい。複合バインダ材８０は、バインダ材１５と、細胞非接着部８２とを備える。細胞非接着部８２は、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２の細胞がバインダ材１５に接着することを一定期間抑制するためのものである。
【００６８】
細胞非接着部８２は、バインダ材１５の第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとにそれぞれ形成されており、複合バインダ材８０の表面８０ａ，８０ｂを成しているが、表面開口部２１ａには形成されていない。この例では、細胞非接着層８２は、表面開口部２１ａを除く第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとを覆っているが、一部のみ覆った態様でもよい。細胞非接着層８２は、第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとのいずれか一方にのみ設けられていてもよい。また、この例では、細胞非接着層８２は、孔２１と孔２１との間の隔壁の表面には設けられていないが、隔壁の表面にも設けられていてよい。細胞非接着部８２は、例えば周知のディップコート法により、形成することができる。例えば、細胞非接着部８２を構成する素材を溶媒に溶かして溶液をつくり、この溶液にバインダ材１５を浸漬してバインダ材１５に溶液を塗布した後、塗膜を乾燥することで、形成することができる。細胞非接着部８２が形成されていることにより、第１細胞シート１１及び第２細胞シート１２の細胞とバインダ材１５との一体化が一定期間抑制されるから、酸素と栄養分との流路が確保されて細胞がより確実に保存される。
【００６９】
細胞非接着層８２を構成する素材としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーが好ましい。
【００７０】
上記の例は、細胞凝集体が細胞シートである場合であるが、細胞凝集体は細胞シートに限られず、複数の細胞が球状に凝集したスフェロイドであってもよい。例えば、図１０に示す細胞集積体９０は、複数の第１スフェロイド９１と、複数の第２スフェロイド９２と、第１スフェロイド９１と第２スフェロイド９２との間に配されているバインダ材１５とを備える。バインダ材１５は、細胞集積体１０におけるものと同じである。第１スフェロイド９１と第２スフェロイド９２とは、複数の細胞が球状に凝集した細胞凝集体であり、細胞マトリックスを含む。複数の細胞はこの細胞外マトリックスの介在により球状を成している。第１スフェロイド９１は、バインダ材１５の第１膜面１５ａに、散在して配されている。第２第１スフェロイド９２は、バインダ材１５の第２膜面１５ｂに、散在して配されている。バインダ材１５は、第１スフェロイド９１の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものであり、この例では、第１スフェロイド９１と第２スフェロイド９２との両方の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものとなっている。このように複数のスフェロイドが散在した状態でバインダ材１５に配された細胞集積体９０も、第１スフェロイド９１と第２スフェロイド９２との細胞に酸素と栄養分とが供給されるから、細胞が生存した状態に保存される。
【００７１】
また、細胞シートやスフェロイドなどの細胞凝集体に代えて、細胞（シングル）であってもよい。この場合には、第１膜面１５ａと第２膜面１５ｂとに、複数の細胞が散在した状態で配される。このように複数の細胞が散在した状態でバインダ材１５に配された細胞集積体も、細胞に酸素と栄養分とが供給されるから、細胞が生存した状態に保存される。
【符号の説明】
【００７２】
１０，５０  細胞集積体
１１，１２  第１細胞シート，第２細胞シート
１５    バインダ材
２１    孔
２１ａ  表面開口部
２２    隔壁
２２ａ  隔壁開口部
３１    培養液
８２    細胞非接着部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2017063645.tif 000008
【図７】
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【図８】
2017063645.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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