(57)【要約】【課題】酵素を検出する新規化合物及びこれを使用した酵素の検出方法を得ること。以下の構造を有する化合物：【化１】2017190301.tif 000022（上記式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基であり、ｎは２〜１２であり、Ｘはアミノ酸残基である。）【選択図】図２
2017190301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物：
【化１】
2017190301.tif 000018
（上記式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基であり、ｎは２〜１２であり、Ｘはアミノ酸残基である。）
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載する化合物の製造方法：
（１）以下のＡ〜Ｃの３つのブロックを準備する工程：
ブロックＡ：以下の構造の化合物、
【化２】
2017190301.tif 000019
ブロックＢ：アミノ酸（Ｘ’）、及び
ブロックＣ：以下の構造の化合物、
【化３】
2017190301.tif 000020
（ｎ＝２〜１２）
（２）ブロックＡとＢとを反応させてＡ−Ｂ複合体を得、次いで前記Ａ−Ｂ複合体とブロックＣとを反応させ、又はブロックＢとＣとを反応させてＢ−Ｃ複合体を得、次いで前記Ｂ−Ｃ複合体とブロックＡとを反応させて、以下の構造の化合物を得る工程、
【化４】
2017190301.tif 000021
（ｎは２〜１２で、Ｘはアミノ酸残基である）
次いで、
（３）（２）で得られた化合物とＮＨＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基である）とを反応させて、前記化合物におけるブロックＡ由来のカルボキシル基をアミド化する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を検出する新規化合物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を同定することは、微生物学等の学術的な目的に限らず、医療目的においても非常に重要である。例えば、細菌やウイルスによる感染症の治療においては、患者が感染した細菌やウイルスの同定をいかに素早く行うことが出来るか、が的確な治療を行うための鍵となる。患者から採取したサンプルに、細菌やウイルス特有の酵素が含まれているか否かを素早く判断できれば、早期に的確な治療方針を立てることが出来る。
【０００３】
近年、酵素を検出する方法として、蛍光エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（以下、ＦＲＥＴ）技術を利用した酵素検出法が検討されている。ＦＲＥＴとは、励起光を与えた蛍光体（ドナー蛍光体）に別の蛍光体（アクセプター蛍光体）が近接しているときに、電子共鳴によってドナー蛍光体からアクセプター蛍光体へ励起エネルギーが移動する現象を言う。ＦＲＥＴを用いて酵素を検出する方法は、例えば、以下の方法が検討されている。前記ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体とをペプチドを介して結合させたプローブを調製する。前記プローブは、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体とが近接しているため、プローブに励起光を照射した場合、ドナー蛍光体が発光し、ドナー蛍光体が発した光によってアクセプター蛍光体が発光し又はアクセプター蛍光体の蛍光発光がドナー蛍光体の光によって打ち消される。このプローブに、前記ペプチドを認識して切断する酵素を加えると、前記ペプチドの位置でプローブが切断される。プローブが切断された結果、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体との間の距離が広がり、ＦＲＥＴが発生しないため、アクセプター蛍光体の発光特性が変動する。このような発光特性の変動を観察することにより、特定の酵素が検出できる。非特許文献１は、このようなプローブを用いた酵素の検出法を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Highly Specific Protease-Based Approach for Detection of Porphyromonas gingivalis in Diagnosis of Periodontitis (Journal of Clinical Microbiology, January 2012, Volume 50 Number 1, p104-112)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
酵素をより感度高く、より容易に検出できる化合物が求められている。また、前記化合物をより容易に製造できる方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、特定の構造を有する化合物により、上記課題が解決できることを見いだし本発明に至った。
すなわち、本発明は、
［１］以下の構造を有する化合物：
【化１】
2017190301.tif 000003
（上記式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基であり、ｎは２〜１２であり、Ｘはアミノ酸残基である。）、並びに
［２］以下の工程を含む、［１］に記載する化合物の製造方法：
（１）以下のＡ〜Ｃの３つのブロックを準備する工程、
ブロックＡ：以下の構造の化合物、
【化２】
2017190301.tif 000004
ブロックＢ：アミノ酸（Ｘ’）、及び
ブロックＣ：以下の構造の化合物、
【化３】
2017190301.tif 000005
（ｎ＝２〜１２）
次いで、
（２）ブロックＡとＢとを反応させてＡ−Ｂ複合体を得、次いで前記Ａ−Ｂ複合体とブロックＣとを反応させ、又はブロックＢとＣとを反応させてＢ−Ｃ複合体を得、次いで前記Ｂ−Ｃ複合体とブロックＡとを反応させて、以下の構造の化合物を得る工程、
【化４】
2017190301.tif 000006
（ｎは２〜１２で、Ｘはアミノ酸残基である）
次いで、
（３）（２）で得られた化合物とＮＨＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基である）とを反応させて、前記化合物におけるブロックＡ由来のカルボキシル基をアミド化する工程、
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の化合物により、特定の酵素を高い感度で且つ容易に検出出来る。また、本発明の方法により、本発明の化合物を高い収率で容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の化合物の合成経路例
【図２】本発明の化合物とトリプシンとの反応において測定した発光強度の経時変化を表すグラフ
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の化合物
本発明の化合物は、以下の式で表される化合物である。
【化５】
2017190301.tif 000007
上記式におけるＲ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基である。Ｒ１及びＲ２の具体的な例としては、それぞれ独立に、Ｈ、メチル基、エチル基、エチレン基、エチニル基、フェニル基等が挙げられる。好ましくは、Ｒ１及びＲ２の両方がＨである。
【００１０】
上記式におけるｎは、直鎖炭素鎖を形成する炭素原子の数を意味する。ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６である。ｎが前記数値範囲であることにより、ＦＲＥＴ現象を利用した酵素の検出が可能となる。また、ｎが前記数値範囲であることにより、本発明の化合物における蛍光発光を生じる２つの部分（後述するドナー蛍光体部及びアクセプター蛍光体部）が過度に近接することがなく、本発明の化合物と酵素との反応においてこれら２つの部分が立体障害となる可能性を低く抑えることが出来る。また、ｎが前記数値範囲であることにより、後述のように本発明の化合物を合成する際、ブロックＡ〜Ｃだけでなく、ブロックＡ−Ｂ複合体又はブロックＢ−Ｃ複合体をも同一の溶媒に溶解させることができる。なお、ｎにより規定される炭素鎖は、本発明の化合物と酵素との反応の立体障害とならない程度で置換基を有することが出来る。このような置換基の例として、例えば、アルキル基（炭素数１〜４）、アルケニル基（炭素数２〜４）、アルキニル基（炭素数２〜４）、カルボキシル基及びアミノ基等が挙げられる。
【００１１】
上記式中Ｘは、アミノ酸残基である。前記アミノ酸残基は、例えば、アラニン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、バリン残基、β−アラニン残基、サルコシン残基、オルニチン残基、シトルリン残基、クレアチン残基、γ−アミノ酪酸残基、オパイン残基、トリメチルグリシン残基、テアニン残基、トリコロミン酸残基、カイニン酸残基、ドウモイ酸残基、イボテン酸残基及びアクロメリン酸残基等の天然アミノ酸残基並びに人工的に合成されたアミノ酸のアミノ酸残基から選択される。尚、天然由来の酵素を検出する際には、上記Ｘを、天然アミノ酸残基、好ましくはαアミノ酸残基、より好ましくはアラニン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基又はバリン残基から選択することが好ましい。
【００１２】
例えば、Ｘがリジン残基であり、Ｒ１及びＲ２がＨである場合の本発明の化合物は、以下の構造を有する。
【化６】
2017190301.tif 000008
（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６である）。
【００１３】
本発明の化合物を用いた酵素の検出
本発明の化合物の構造を、上記「化５」の式に基づいて説明する。本発明の化合物の左端に存在する４−(４−(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ安息香酸（以下、「ダブシル」）（アクセプター蛍光体）部が、アミノ酸残基Ｘやｎで規定される炭素鎖等を介して、右端に存在するフルオレセイン−５−イソチオシアネート（以下、「ＦＩＴＣ」）（ドナー蛍光体）部と結合している。本発明の化合物に対して、４００〜５５０ｎｍの波長を有する光（以下、励起光）を照射すると、ドナー蛍光体部及びアクセプター蛍光体部が前記光により励起されて蛍光発光する。一方で、前記ドナー蛍光体部が発した蛍光は、前記アクセプター蛍光体部に吸収され、アクセプター蛍光体部の蛍光発光を打ち消す。従って、本発明の化合物としての蛍光発光の強度は、ドナー蛍光体又はアクセプター蛍光体単体での発光強度よりも弱くなる。
【００１４】
一方、本発明の化合物と、当該化合物を分解できる酵素とを反応させると、前記アミノ酸残基ＸのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミド結合が当該酵素によって切断される。前記切断によって、アクセプター蛍光体部とドナー蛍光体部との間の距離が広がり、ＦＲＥＴが生じなくなる。ＦＲＥＴが生じないと言うことは、ドナー蛍光体部の発光によってアクセプター蛍光体部の発光が打ち消されなくなることを意味する。つまり、サンプルを添加する前の発光強度と、添加した後の発光強度とを比較して、後者の発光強度が強くなっている場合、前記サンプルに本発明の化合物を分解できる酵素が含まれていることを意味する。
【００１５】
本発明の化合物を用いた酵素の検出は、前記メカニズムを利用する。すなわち、本発明の化合物を用いた酵素の検出方法は、
（１）本発明の化合物と、サンプルとを混合させて、本発明の化合物とサンプルとの混合物を得る工程（以下、第一工程）、及び
（２）前記混合物に励起光を照射し、発光を観察する工程（以下、第二工程）、
から成る。
【００１６】
第一工程は、本発明の化合物と、サンプルとを混合させて、本発明の化合物とサンプルとの混合物を得る工程である。ここで、本発明における「混合」とは、方法のいかんを問わず、本発明の化合物とサンプルとが混ざり合う状況を作り出す工程を言う。すなわち、本発明の化合物とサンプルとを溶媒中で混ざり合うように攪拌することは勿論のこと、例えば、紙、布及び不織布等の浸透性のある素材に本発明の化合物又はサンプルを浸透させ及び／又は固定化し、当該素材を本発明の化合物又はサンプルを溶解させた溶液に浸漬し又は浸透圧を利用して前記溶液を吸い上げて、前記素材中の化合物又はサンプルと溶液中の化合物又はサンプルとを混ぜ合わせることも、本発明における「混合」に含まれる。サンプルに対しては、あらかじめ酵素を抽出する際に行われる前処理を施すことが出来る。例えば、採取した細胞を超音波で破砕等することにより、当該細胞内に含まれる酵素が、本発明の化合物と接触出来るようにすることが好ましい。
【００１７】
尚、第二工程の蛍光の観察において分光光度計を使用する場合には、溶媒に本発明の化合物とサンプルとを溶解させて、混合溶液を調製することが好ましい。前記溶媒は、本発明の化合物と、サンプルとを溶解できる溶媒であれば特に制限は無い。このような溶媒として、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）等が挙げられる。前記混合溶液における本発明の化合物の濃度は、対象となる酵素の種類やサンプルの濃度等によって変動し得るが、一般的には、１〜１０００μＭ、好ましくは１〜５００μＭ、より好ましくは１〜１００μＭである。本発明の化合物の濃度が前記範囲内であることにより、定量的に酵素活性を検出することができる。
本発明の化合物の構造及び検出しようとする酵素の種類によって、酵素と本発明の化合物との反応条件が変わり得る。従って、混合物が得られた後、直ちに第二工程に移る場合もあれば、得られた混合物に加熱、攪拌等の処理を行いつつ、一定時間反応させる場合もあり得る。また、混合物の加熱、攪拌等の処理を行いつつ、第二工程における観察を行うことができる。
【００１８】
第二工程は、前記混合物に励起光を照射し、発光を観察する工程である。前記励起光は、４００〜５５０ｎｍの波長を有する光である。当該光を照射し、目視及び／又は分光光度計を用いて、蛍光発光強度の変化を観察する。分光光度計は、例えば、島津製作所社製蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００）を用いる。
目視で観察する場合には、例えば、第一工程で調製した混合物と、本発明の化合物とを並べた状態で励起光を照射し、目視にて混合物の発光強度の方が強いことを確認することにより、前記サンプルに本発明の化合物を分解できる酵素が含まれていたことがわかる。
分光光度計を用いて蛍光の観察をする場合には、例えば以下の方法により観察できる。前記混合溶液の溶媒と同じ溶媒に本発明の化合物のみを溶解させた溶液（標準試料）を調製し、この標準試料についてあらかじめ発光強度を測定する。次いで、調製後の前記混合溶液の発光強度を測定し、両者の発光強度を比較する。比較の結果、後者の発光強度が強くなっていれば、前記サンプルが本発明の化合物を分解できる酵素を含んでいることを意味する。また、別の方法として、混合溶液を調製した直後の発光強度と、混合溶液を調製して一定時間をおいた後の発光強度とを比較することにより酵素の存在を確認しても良い。
【００１９】
本発明の方法により検出できる酵素は、天然由来の酵素及び合成された酵素のいずれも検出可能である。尚、検出可能な天然酵素の例として、ペプチダーゼ様活性を有する酵素、例えば、トリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、エラスターゼ、テルモリシン、ペプシン、エンドペプチダーゼＶ８、パパイン、キモトリプシン、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ及びマトリックスメタロプロテアーゼ類が挙げられる。例えば、Ｘがリジン残基である場合には、トリプシン様活性を有する酵素、例えばトリプシン及びリジルエンドペプチダーゼ等を検出出来る。
【００２０】
本発明の化合物の製造方法
本発明の化合物は、
（１）以下のＡ〜Ｃの３つのブロックを準備する工程、
ブロックＡ：以下の構造の化合物、
【化７】
2017190301.tif 000009
ブロックＢ：アミノ酸（Ｘ’）、及び
ブロックＣ：以下の構造の化合物、
【化８】
2017190301.tif 000010
（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６である）
次いで、
（２）ブロックＡとＢとを反応させてＡ−Ｂ複合体を得、次いで前記Ａ−Ｂ複合体とブロックＣとを反応させ、又はブロックＢとＣとを反応させてＢ−Ｃ複合体を得、次いで前記Ｂ−Ｃ複合体とブロックＡとを反応させて、以下の構造の化合物を得る工程、
【化９】
2017190301.tif 000011
（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６であり、Ｘはアミノ酸残基である）
次いで、
（３）（２）で得られた化合物とＮＨＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基である）とを反応させて、前記化合物におけるブロックＡ由来のカルボキシル基をアミド化する工程、
により製造される。
【００２１】
本発明の方法は、本発明の化合物を３つの比較的大きなブロックを用いて合成することにより、副生成物の生成を防ぐことが可能になり、より高純度の本発明の化合物をより高収率で製造できる。また、ブロックＡ及びＣを、任意のアミノ酸からなるブロックＢに付加することで、あらゆるペプチダーゼ様活性を検出できる化合物を効率よく合成できる。
【００２２】
尚、副生成物の生成等を防ぐことを目的として、上記ブロックＡ〜Ｃにおけるアミノ基やカルボキシル基を、あらかじめ保護基によりブロックしても良い。保護基は、アミノ基及びカルボキシル基を保護するために通常に用いられている保護基を特に制限無く使用できる。
アミノ基を保護する保護基として、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃ基）や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（以下、ＦＭＯＣ基）が挙げられる。前記保護基を導入する化合物は、例えば、クロロぎ酸９−フルオレニルメチル（以下、ＦＭＯＣ−Ｃｌ）や、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（以下、Ｂｏｃ−Ｏ−Ｂｏｃ）等があげられる。尚、ＦＭＯＣ基を脱保護する際には、例えば、ジエチルアミン（以下、ＤＥＡ）及びピペリジン等が使用できる。また、Ｂｏｃ基を脱保護する際には、例えば、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡ）が使用できる。前記の通り、ＦＭＯＣ基を脱保護する条件と、Ｂｏｃ基を脱保護する条件は異なる。従って、ブロックＢとして後述するようなアミノ基を複数有するアミノ酸を使用する場合には、これらアミノ基をそれぞれＢｏｃ基及びＦＭＯＣ基で保護することにより、反応を容易にコントロールできる。
【００２３】
また、カルボキシル基を保護する保護基として、例えばメチルエステル基、ベンジルエステル基が挙げられる。前記保護基を導入する化合物として、例えば、(トリメチルシリル)ジアゾメタン、ベンジルアルコール等が挙げられる。メチルエステル基は、例えばアルカリ加水分解反応により脱保護できる。また、ベンジルエステル基は、例えばアルカリ加水分解反応やパラジウム触媒による水素添加反応等により脱保護できる。
【００２４】
ブロックＡ〜Ｃの準備（第一工程）
１．ブロックＡの準備
ブロックＡは、例えば、リジンのε位のアミノ基に、アクセプター蛍光体であるダブシルを結合させて得られる。以下に、合成経路の一例を示す。
【化１０】
2017190301.tif 000012
ダブシル（１）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＨＯＳｕ）（２）とを反応させて、３の化合物を合成する。１と２の反応に際しては、縮合剤、例えば、1−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（以下、ＥＤＣ）を使用する。次いで、上記得られた３と、リジン（４）とを反応させる。
【化１１】
2017190301.tif 000013
リジンは、α位とε位の両方にアミノ基を有している。また、本発明の化合物において、ダブシルはε位のアミノ基を介してリジンと結合する。従って、上記反応経路においては、α位のアミノ基をＦＭＯＣ基により保護している。３と４との反応においては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（以下、ＤＩＥＡ）を添加して、３と４とを反応させる。上記ブロックＡは、保護基としてのＦＭＯＣ基をそのまま残してある。ブロックＡは、単離精製が容易であり、高い収率での製造が可能である（収率７０〜８５％）。
【００２５】
２．ブロックＢの準備
ブロックＢはアミノ酸（Ｘ’）である。アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、シトルリン、クレアチン、γ−アミノ酪酸、オパイン、トリメチルグリシン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸及びアクロメリン酸等の天然アミノ酸並びに人工的に合成されたアミノ酸から選択される。これらアミノ酸は、合成しても良いし、市販のものを使用してもよい。尚、天然由来の酵素を検出する際には、上記Ｘ’を、天然アミノ酸、好ましくはαアミノ酸、より好ましくはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンから選択することが好ましい。なお、本発明の化合物を合成する際には、副生成物の発生を防止する等の目的で、前記アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基をあらかじめ前記保護基により保護しても良い。
【００２６】
３．ブロックＣの準備
ブロックＣの合成経路例を以下に示す。
【化１２】
2017190301.tif 000014
アミノ基を持つ脂肪族カルボン酸（５）（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６である）とＦＩＴＣ（６）とを溶媒に溶解させて、一定時間攪拌させることにより反応させて、ブロックＣを調製する。アミノ基を持つ脂肪族カルボン酸（５）は、炭素数が３〜１３、好ましくは４〜１０、より好ましくは５〜７個であるアミノカルボン酸が挙げられる。具体例としては、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸、１１−アミノウンデカン酸及び１２−アミノドデカン酸及び１３−アミノトリデカン酸等が挙げられる。
【００２７】
中間体の合成（第二工程）
第二工程は、ブロックＡとＢとを反応させてＡ−Ｂ複合体を得、次いで前記Ａ−Ｂ複合体とブロックＣとを反応させ、又はブロックＢとＣとを反応させてＢ−Ｃ複合体を得、次いで前記Ｂ−Ｃ複合体とブロックＡとを反応させて、以下の構造の化合物（中間体）を得る工程である。
【化１３】
2017190301.tif 000015
（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６であり、Ｘはアミノ酸残基である）
ＡとＢ（又はＢ−Ｃ複合体）との反応、Ｂ（又はＡ−Ｂ複合体）とＣとの反応は、例えば、ペプチド合成において、アミノ酸同士を反応させてアミド結合を形成するために使用する化合物及び方法を特に制限無く使用できる。使用できる化合物としては、例えば、Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（以下、ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＢｔ）、ＤＩＥＡ等が使用できる。
【００２８】
Ａ〜Ｃを反応させる際には、液相で反応させても良いし、固相で反応させても良い。液相で反応させる際には、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦ）、ジクロロメタン等の溶媒中でＡ〜Ｃを反応させることができる。特に、脱保護、付加反応及び洗浄などの工程をより効率的に行うことができるため、固相反応により反応させることがより好ましい。本発明の化合物を合成する際に使用する固相合成用の樹脂は、ブロックＡのカルボキシル基と反応して、エステル結合を形成するヒドロキシル基を有する樹脂が挙げられる。このような樹脂として、例えば、Ｗａｎｇレジン、ＨＭＰＢレジン及びＴｒｉｔｙｌアルコールレジン等が挙げられる。液相反応及び固相反応のいずれの反応においても、ペプチド合成で利用されている化合物及び方法を利用可能である。
【００２９】
本発明の化合物の合成（第三工程）
第三工程は、第二工程で得られた中間体とＮＨＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、炭素数１〜２のアルキル基、炭素数２のアルケニル基又は炭素数２のアルキニル基又はフェニル基である）（アミン）とを反応させて、前記中間体におけるブロックＡ由来のカルボキシル基をアミド化する工程である。ここで、ＮＨＲ１Ｒ２の例は、例えば、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンアミン、エチニルアミン及びフェニルアミン等が挙げられる。また、ブロックＡ由来のカルボキシル基とは、以下の構造式において破線で囲まれているカルボキシル基を意味する。
【化１４】
2017190301.tif 000016
（ｎは、２〜１２、好ましくは３〜９、より好ましくは４〜６であり、Ｘはアミノ酸残基である）
【００３０】
前記の通り、合成に使用するアミノ酸（Ｘ’）の種類によっては、複数のカルボキシル基を有するため、アミノ酸残基Ｘが未反応のカルボキシル基を有する場合がある。従って、前記アミノ酸残基Ｘにおける未反応のカルボキシル基をそのまま残したい場合には、前記アミンと反応させる前に、あらかじめ、アミノ酸残基Ｘにおける未反応のカルボキシル基を保護基により保護しておくことが好ましい。カルボキシル基の保護基としては、前記の保護基を特に制限無く使用できる。
【００３１】
通常、第二工程と第三工程は別々に行われるが、特定の樹脂を用いた固相反応においては、第二工程と第三工程を同時に行うことが出来る。当該特定の樹脂は、当該樹脂を用いたペプチド合成の終了後、当該樹脂から合成したペプチドを切り離す際に、前記ペプチドのＣ末端のアミノ酸におけるカルボキシル基をアミド化する樹脂である。前記のような樹脂は、ブロックＡのカルボキシル基と反応してアミド結合を形成できるアミノ基（−ＮＨ２）を有する樹脂である。このような樹脂の具体例として、リンクアミドレジン及びＰＡＬレジン等が挙げられる。第二工程と第三工程を同時に行うことを目的として、前記固相合成用樹脂を用いて本発明の化合物を製造する具体的な方法は、例えば、（ａ）樹脂とブロックＡとを反応させて樹脂−Ａ複合体を得、（ｂ）樹脂−Ａ複合体とブロックＢとを反応させ樹脂−Ａ−Ｂ複合体を得、（ｃ）樹脂−Ａ−Ｂ複合体とブロックＣとを反応させ樹脂−本発明の化合物の複合体を得、次いで（ｄ）樹脂から本発明の化合物を切り離す工程から成る方法である。
【００３２】
図１は、第二工程と第三工程を同時に行うことを目的として、リンクアミドレジンを用いて前記方法により本発明の化合物を合成する経路の例を示している。リンクアミドレジンの構造が、以下の化１５に示される。
【化１５】
2017190301.tif 000017
図１において「Ｒｅｓｉｎ」と言う記載は、上記構造の化合物を指す。
【００３３】
まず、ブロックＡを、リンクアミドレジンに結合させる。ブロックＡのリンクアミドレジンへの結合は、ペプチド合成において、アミノ酸をリンクアミドレジンに結合させる際に使用する化合物及び方法を特に制限無く使用できる。使用できる化合物としては、例えば、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ等が使用できる。具体的な方法としては、例えば、ＤＭＦに、ブロックＡ、上記化合物及びリンクアミドレジンを添加して、一晩室温で攪拌することにより、ブロックＡのカルボキシル基がリンクアミドレジンのアミノ基（−ＮＨ２）に結合した化合物７が得られる。
【００３４】
次いで、得られた化合物７にＤＥＡ又はピペリジンを加えてＦＭＯＣ基を脱保護させ、次いでブロックＢを添加して、ブロックＢを化合物７に付加させる。ブロックＢとして、複数箇所にアミノ基及び／又はカルボキシル基を有するアミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びリジン等）を使用する場合には、これらアミノ基及び／又はカルボキシル基を、保護基により保護しても良い。付加させる際には、ブロックＡとリンクアミドレジンとを結合させた際に使用した前記化合物を特に制限無く使用できる。ブロックＢを付加させることにより、化合物８が得られる。付加させた後は、必要に応じて洗浄しても良い。洗浄は、例えば、ＤＭＦやジクロロメタンを用いて洗浄できる。
【００３５】
次いで、化合物８に、ブロックＣを付加させる。ブロックＣの付加においては、ブロックＡとリンクアミドレジンとを結合させた際に使用した前記化合物を特に制限無く使用できる。付加させた後は、必要に応じて洗浄しても良い。付加によって化合物９が得られる。
化合物９から、リンクアミドレジンを切り離すことにより本発明の化合物が得られる。化合物９からリンクアミドレジンを切り離す際には、例えば、ＴＦＡ、トリイソプロピルシラン及び４規定塩酸−酢酸エチル溶液等が使用できる。リンクアミドレジンを用いることにより、第二工程と第三工程とを同時に行うことが出来、大幅な工程短縮が可能である。
【００３６】
上記各反応において、反応の種類によっては、アルゴンや窒素等の不活性ガスの存在下で反応を行っても良い。また、反応の種類によっては、発熱等の急激な温度変化が発生する場合や、反応の開始・進行に加熱が必要な場合もある。これらの場合には、必要に応じて、前記各反応系を加熱、水冷、氷冷等しても良い。
【００３７】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明する。なお、実施例が本発明の範囲に影響を与えないことは言うまでも無い。
【実施例】
【００３８】
使用した機器等
1) 薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレート (ＴＬＣ)：Ｍｅｒｃｋ社製  シリカゲル６０  プレート Ｆ２５４
2) カラムクロマトグラフィー用シリカゲル：和光純薬工業株式会社製  ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ
3) 島津蛍光分光光度計：島津製作所社製  ＲＦ−５３００
試薬や溶媒は和光純薬工業、ナカライテスク、東京化成工業から購入したものをそのまま使用した。反応は反応容器、固相合成用反応容器、シュレンク管を使用し、空気下またはアルゴン下で実験を行った。カラムクロマトグラフィーは、３００ｍｅｓｈのシリカゲル (ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ)を用いて行った。ＴＬＣは、シリカゲル６０プレートＦ２５４をガラスシートの上にプレコートしたものをＭｅｒｃｋ社から購入し、そのまま使用した。
【００３９】
ブロックＡの合成
ダブシル（０．５４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＭＦ中で加熱し、６０°Cに設定したオイルバスで固形物が無くなるまで加熱撹拌した。完全に溶解したことを確認してからＨＯＳｕ(０．２３ｇ、２．０ｍｍｏｌ)、縮合剤であるＥＤＣ（０．４２ｇ、２．２ｍｍｏｌ)を加え室温で一晩撹拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール=８：１)により単離精製し、化合物３を得た (収率８２％)。
次いで、得られた化合物３(０．３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ)、N−α−ＦＭＯＣ−L−リジンハイドロクロライド (０．４０ｇ、１．０ｍｍｏｌ)及びＤＩＥＡ(０．１４ｇ、１．１ｍｍｏｌ)を１５ｍｌのＤＭＦに添加し、室温で一晩撹拌した。攪拌終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン：メタノール= ４：１)により単離精製し、ブロックＡを得た(収率７２%)。  
【００４０】
ブロックＣの合成
アルゴン雰囲気下で、６−アミノヘキサン酸(０．０９１ｇ、０．７０ｍｍｏｌ)及びＦＩＴＣ（０．２７ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＭＦに加え、５５℃で一晩撹拌した。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン：メタノール=９：１)により単離精製し、ブロックＣを得た(収率５１%)。
【００４１】
本発明の化合物の合成
図１に図示される合成経路に準じて本発明の化合物を合成した。
反応容器にリンクアミドレジン（商品名：Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＮｏｖａＧｅｌ  ｒｅｓｉｎ、Ｍｅｒｃｋ社製）（０．０７０ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ） とＤＭＦ ３．０ ｍｌを加え、室温で一晩撹拌して膨潤させた。膨潤させたレジンに、ブロックＡ（０．０６０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０７５ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０２７ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．０５０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ３．０ｍｌを加えて室温で一晩撹拌して化合物７を得た。
化合物７にピペリジン０．５ｍｌとＤＭＦ２．０ ｍｌを加えて３分間攪拌した後、化合物７から溶媒を除去した。次いで、再度前記量のピペリジン及びＤＭＦを化合物７に加えて３分間攪拌した後、化合物７から溶媒を除去した。最後に前記量のピペリジンとＤＭＦを化合物７に加えて１５分間攪拌させた後、化合物７から溶媒を除去して、ＦＭＯＣ基の脱保護を完了させた。脱保護した後の化合物７に（ε−Ｂｏｃ）（α−ＦＭＯＣ）リジン（ブロックＢ）（０．０４７ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０７５ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０２７ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．０５０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ３．０ｍｌを加え、室温で一晩攪拌してＸが（ε−Ｂｏｃ）（α−ＦＭＯＣ）リジンである化合物８を得た。
【００４２】
次いで、化合物８にピペリジン０．５ｍｌとＤＭＦ２．０ ｍｌを加えて３分間攪拌した後、化合物８から溶媒を除去した。次いで、再度前記量のピペリジン及びＤＭＦを化合物８に加えて３分間攪拌した後、化合物８から溶媒を除去した。最後に前記量のピペリジンとＤＭＦを化合物８に加えて１５分間攪拌させた後、化合物８から溶媒を除去して、ＦＭＯＣ基の脱保護を完了させた。脱保護した後の前記化合物８にブロックＣ（０．０７８ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０７５ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０２７ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．０５０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ３．０ｍｌを加えて室温で一晩攪拌して化合物９を得た。なお、副反応を抑えるため、ブロックＢ及びブロックＣを付加させる前後でカイザーテストを行い、未反応のアミノ基の有無を確認して合成を行った。
【００４３】
すべての原料を付加させた後、Ｂｏｃ基を脱保護するとともに、本発明の化合物をリンクアミドレジンから切り離すために、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：蒸留水 = ９５：２．５：２．５の混合液を作り、レジンに３０分間浸透させて撹拌した。1回撹拌するごとにメタノールで反応溶液を回収し、ジエチルエーテルを用いてデカンテーションした。その後、減圧留去し、真空乾燥して、ｎが５でありＸがリジン残基である本発明の化合物を得た。
【００４４】
本発明の化合物を用いたトリプシン活性の検出
合成した本発明の化合物に酵素溶液を加えて、ＦＩＴＣの最大蛍光波長５１６nmの蛍光強度を経時的に測定した。ｐＨ７．４のＰＢＳ（−）緩衝液により、１０μＭの本発明の化合物溶液と、トリプシン溶液 (１０μＭ、１．０μＭ、０．１０μＭ)とを調製した。酵素の至適温度３７℃に維持した測定用石英セルに、本発明の化合物溶液２．０ｍｌとトリプシン溶液１．０ｍｌを添加した。測定条件はＦＩＴＣの励起波長である４８８ｎｍの励起光を照射し、ＦＩＴＣの最大蛍光波長５１６ｎｍの蛍光強度を測定した。酵素添加後における蛍光強度の経時変化が図２に示されている。
図２に示すように、酵素を添加することで時間依存的にＦＩＴＣに由来する蛍光が増加することが明らかである。さらに、添加する酵素量に依存して、蛍光強度が増加する初速度が増加していた。図２の結果から、トリプシン非存在下ではＦＲＥＴにより蛍光強度が抑えられており、トリプシン存在下では供与体の蛍光が増加したことが明らかである。従って、本発明の化合物を用いればわずか数分でトリプシンを検出出来ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
ペプチダーゼ様活性を有する酵素をより感度高く、より容易に検出できる化合物が得られた。また、前記化合物をより容易に且つより高い収率で製造できる方法が得られた。本発明により、酵素の検出を素早く行うことが出来る化合物を、効率よい方法で提供できるため、これら化合物の利用範囲をより広げることが出来る。
【図１】
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【図２】
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