(57)【要約】【課題】  本発明は、グリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ幹細胞の増殖を抑制することができるグリオーマ治療剤、及びグリオーマ患者に対する前記治療剤の有効性を判定するための方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルを有効成分とするグリオーマ治療剤に関する。また本発明は、グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡ、並びに／又はサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現の有無を指標とする、ＥＵｒｄの有効性を判定する方法を提供する。【選択図】図３
2017081861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルを有効成分とするグリオーマ治療剤。
【請求項２】
グリオーマがグリオブラストーマである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
グリオーマが薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性である、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルを有効成分とする、グリオブラストーマ幹細胞に対する増殖抑制剤。
【請求項５】
グリオブラストーマ幹細胞が薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性である、請求項４に記載の増殖抑制剤。
【請求項６】
グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡ、並びに／又はサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現を確認する工程、並びに
前記工程においてウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現が確認され、並びに／又はサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現が確認されなかった場合、前記患者に対する１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルの投薬が有効であると判定する工程
を含む、グリオーマ患者に対する１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルの有効性を判定する方法。
【請求項７】
グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡ、並びに／又はサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現を確認する手段を含む、グリオーマ患者に対する１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシルの有効性を判定するためのキット。
【請求項８】
ウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質若しくはサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質を検出するための特異抗体、又はウリジン−シチジンキナーゼ様１タンパク質若しくはサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出するためのプライマー核酸若しくはプローブ核酸のいずれかを少なくとも含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）ウラシル（以下、ＥＵｒｄと表す）のグリオーマ（神経膠腫）、特にグリオブラストーマ（多型性膠芽腫、ＧＢＭと表す）に対する治療用途、並びにグリオーマ治療に対するＥＵｒｄの有効性を判定するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリオーマ（神経膠腫）は脳に発生する悪性腫瘍であり、世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従って４つのグレード（グレードＩ〜ＩＶ）に分類される。グレードＩＩＩ及びＩＶのグリオーマは高悪性度グリオーマと呼ばれ、高い増殖能、浸潤能を持つ。高悪性度グリオーマのうち、最も悪性度が高いのは、グレードＩＶに分類されるＧＢＭであり、予後生存期間は平均で１５ヶ月と極めて短い。なお、本明細書では、用語「グリオーマ」は単独で用いられたときは全てのグレードのグリオーマ、高悪性度グリオーマ及びグリオブラストーマを包含するものとする。
【０００３】
グリオーマ、特にＧＢＭの治療としては、手術により可能な限り腫瘍を摘出し、放射線療法及びテモゾロマイド（ＴＭＺ）による化学療法を行うことが標準的である。しかし、ＧＢＭは放射線照射、さらにはＴＭＺなどの薬剤に対して高い抵抗性を示すために、前述のような標準的治療法によっても予後生存期間はこの数十年ほとんど改善されていないのが現状である。
【０００４】
ＧＢＭの治療抵抗性は、ＧＢＭ幹細胞（ＧＢＭ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、以下ＧＩＣと表す）の放射線及び／又は薬剤に対する抵抗性によってもたらされると考えられている（例えば非特許文献１など）。したがって、ＧＩＣのかかる抵抗性を克服してその増殖を抑制することができれば、ＧＢＭの予後改善に資することができると期待される。しかしながら、放射線耐性及び／又は薬剤耐性の詳細な分子機構が解明されていないこともあって、ＧＩＣの増殖を効果的に抑制することができる薬剤は未だ見いだされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｉｅｒ  Ｄら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１；１０；１２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＧＩＣの増殖を抑制することができる治療剤、及びグリオーマ患者に対する前記治療剤の有効性を判定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＴＭＺに抵抗性を示すＧＩＣ（以下、ＧＩＣＲと表す）の単離に成功した。さらに、かかる細胞を利用してその増殖を抑制することができる化合物を探索した結果、核酸アナログの一種であるＥＵｒｄがＧＩＣＲの増殖を抑制することができることを見いだした。また、ＥＵｒｄのＧＩＣＲに対する増殖抑制効果の発現メカニズムを解析し、リン酸化酵素の一種であるウリジン−シチジンキナーゼ様１（ｕｒｉｄｉｎｅ−ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｌｉｋｅ  １、ＵＣＫＬ１）及び脱リン酸化酵素の一種であるサイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩＩ（５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＩＩＩ、ＮＴ５Ｃ３）が関与していることを見いだした。
【０００８】
以上の知見から、本発明者らは、下記の各発明を完成させた。
【０００９】
（１）ＥＵｒｄを有効成分とするグリオーマ治療剤。
（２）グリオーマがＧＢＭである、（１）に記載の治療剤。
（３）グリオーマが薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性である、（１）又は（２）に記載の治療剤。
（４）ＥＵｒｄを有効成分とする、ＧＩＣに対する増殖抑制剤。
（５）ＧＩＣが薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性である、（４）に記載の増殖抑制剤。
（６）グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡ、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現を確認する工程、並びに
前記工程においてＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現が確認され、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現が確認されなかった場合、前記患者に対するＥＵｒｄの投薬が有効であると判定する工程
を含む、グリオーマ患者に対するＥＵｒｄの有効性を判定する方法。
（７）グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡ、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはこれをコードするｍＲＮＡの発現を確認する手段を含む、グリオーマ患者に対するＥＵｒｄの有効性を判定するためのキット。
（８）ＵＣＫＬ１タンパク質若しくはＮＴ５Ｃ３タンパク質を検出するための特異抗体、又はＵＣＫＬ１タンパク質若しくはＮＴ５Ｃ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを検出するためのプライマー核酸若しくはプローブ核酸のいずれかを少なくとも含む、（７）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、グリオーマ患者特にＴＭＺなどを用いた化学療法に耐性を示すＧＢＭ患者に対する有効かつ安全な治療薬としてＥＵｒｄを利用することができる。また、患者由来のグリオーマ細胞におけるＵＣＫＬ１及び／又はＮＴ５Ｃ３の発現の有無を指標とすることで、ＥＵｒｄの有効性を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＧＩＣ及びＧＩＣＲの幹細胞特性を示す図である。（Ａ）ＧＩＣ及びＧＩＣＲにおける神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー及び分化マーカーの発現を示すグラフである。縦軸は全細胞に対する各マーカーを発現している細胞の割合を表す。（Ｂ）ＧＩＣ及びＧＩＣＲの増殖速度を比較したグラフである。（Ｃ）ＧＩＣ及びＧＩＣＲにおけるサイドポピュレーション（ＳＰ）細胞の割合を示すグラフである。（Ｄ）ＧＩＣ又はＧＩＣＲを脳内に移植したマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図２】ＥＵｒｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制効果を示す図である。（Ａ）ＥＵｒｄの添加濃度に依存したＥ３、Ｅ３Ｒ及びマウスＮＳＣ（ｍＮＳＣ）の生存率変化を示すグラフである。（Ｂ）ＥＵｒｄの添加濃度に依存したＥ６、Ｅ６Ｒ及びｍＮＳＣの生存率変化を示すグラフである。（Ｃ）ＥＵｒｄの添加濃度に依存したヒトＧＢＭ細胞株及びｍＮＳＣの生存率変化を示すグラフである。（Ｄ）ＥＵｒｄ非存在下（上段パネル）又は存在下（下段パネル）でのｍＮＳＣ、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒの細胞周期を解析したプロット図である。（Ｅ）ＥＵｒｄ非存在下（左パネル）又は存在下（右パネル）でのＥ３Ｒの代表的ＨＥ染色像である（スケールバー：１００μｍ）。各パネル左下に、点線枠内の拡大像を示す。白色及び黒色の矢印はそれぞれ核小体消失及びピクノーシスを示す。
【図３】ＥＵｒｄのｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖抑制効果を示す図である。（Ａ）ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＥＵｒｄを投与したＥ３Ｒ移植マウスの腫瘍体積の推移を示すグラフである。Ｄａｙ１はＥＵｒｄの投与開始日に相当する。（Ｂ）ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ、左パネル）又はＥＵｒｄ（右パネル）を投与したＥ３Ｒ移植マウスの腫瘍組織の代表的ＨＥ染色像である。上段パネルは弱拡大像（スケールバー：１００μｍ）、下段パネルは上段パネル点線枠内の強拡大像（スケールバー：２０μｍ）であり、下段パネルの左下は下段パネル点線枠内の拡大像である。上段パネルの星印は壊死領域を示す。下段パネルの黒色及び白色の矢印はそれぞれピクノーシス及び核小体消失を示す。
【図４】ＥＵｒｄの作用メカニズム解析の結果を示す図である。（Ａ）ＥＵｒｄを各ヌクレオチド／デオキシヌクレオチドと共存させた場合のＥ３Ｒの生存率を示すグラフである。（Ｂ）ｍＮＳＣ、Ｕ８７ＭＧ、ＧＩＣ及びＧＩＣＲにおけるｕｃｋ１、ｕｃｋ２、ｕｃｋｌ１及びｎｔ５ｃ３の発現を示す図である。ｇａｐｄｈを内部対照として用いた。（Ｃ）ＥＵｒｄの添加濃度に依存した、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｈ（ｃｏｎｔｓｈ）又はｕｃｋｌ１  ｓｈ（ｕｃｋｌ１ｓｈ２）を発現させたＧＩＣＲの生存率変化を示すグラフである（左パネル：Ｅ３Ｒ、右パネル：Ｅ６Ｒ）。（Ｄ）ＥＵｒｄの添加濃度に依存した、ｎｔ５ｃ３を過剰発現させたＧＩＣＲの生存率変化を示すグラフである（左パネル：Ｅ３Ｒ、右パネル：Ｅ６Ｒ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第一の態様は、ＥＵｒｄを有効成分とするグリオーマ治療剤、特にＧＢＭ治療剤、さらには薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性ＧＢＭ治療剤に関する。第一の態様におけるＥＵｒｄは、ＧＩＣ、特に薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性ＧＩＣに対する増殖抑制剤と表すこともできる。
【００１３】
ＥＵｒｄは、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  １６２６１１−３０−５として登録されている既知化合物である。ＥＵｒｄの別名（ｓｙｎｏｎｙｍ）としては、３’−エチニルウリジン、１−（３−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボ−ペントフラノシル）ウリジンなどがあり、またその合成方法は、ＷＯ９６／１８６３６及びＪｕｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９５；３６（７）；１０３１−４などに記載されている。
【００１４】
ＥＵｒｄは、ウリジン／シチジンキナーゼ（ＵＣＫ）の酵素作用を介して活性化され、ＲＮＡポリメラーゼ阻害作用を示す核酸アナログの一種であり、種々のがんに対して抗がん作用を示すことが報告されている（例えばＭｕｒａｔａら、ＤＲＵＧ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ＡＮＤ  ＤＩＳＰＯＳＩＴＩＯＮ  ２０１４；３２（１０）；１１７８−１１８２）。しかし、グリオーマ、特に薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性ＧＢＭに対する治療効果に関する報告はない。
【００１５】
後の実施例において示すように、薬剤耐性、特にＴＭＺ耐性を獲得したＧＩＣＲの増殖は、１ｍＭという高濃度のＴＭＺの存在下でも抑制されない。ＧＢＭ治療におけるＴＭＺの推奨血中濃度は５０μＭとされているので、上記の結果は、臨床上の用量ではＧＩＣＲの増殖は全くと言ってよいほど抑制されないことを意味する。一方、本発明にかかるＥＵｒｄは、上記のような高度なＴＭＺ耐性を示すＧＩＣＲの増殖をも抑制することができる。したがって、本発明にかかるＥＵｒｄは、高度な薬剤耐性を示すＧＩＣＲの増殖抑制剤として、さらにかかるＧＩＣＲによって薬剤耐性及び／又は放射線治療耐性が発揮されるとされているＧＢＭに対する治療薬として有効であると期待される。
【００１６】
本明細書において用いられる用語「治療」は、疾患の治癒、一時的寛解などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。すなわちグリオーマの治療とは、グリオーマの進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００１７】
本発明の治療剤は、ＥＵｒｄ及び／又はその誘導体を有効成分として含有する。ＥＵｒｄの誘導体としては、例えば血液脳関門を透過させるために脂溶性を向上させた誘導体が挙げられる。
【００１８】
本発明の治療剤は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００１９】
本発明の治療剤はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含む組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２０】
本発明の治療剤の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、静脈内投与により生体に投与される。また、本発明の治療剤は、グリオーマの治療に有益なその他の医薬と併用して使用してもよい。
【００２１】
本発明の治療剤の投与量は、用法、患者の年齢、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜選択されるが、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０μｇ〜２０００μｇ／日、好ましくは５０μｇ〜１０００μｇ／日、より好ましくは１００μｇ〜５００μｇ／日であり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００２２】
本発明の第二の態様は、ＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはＵＣＫＬ１をコードするｍＲＮＡ、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはＮＴ５Ｃ３をコードするｍＲＮＡを、ＥＵｒｄの有効性の判定のためのバイオマーカーとして利用するものである。具体的には、グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはＵＣＫＬ１をコードするｍＲＮＡ、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはＮＴ５Ｃ３をコードするｍＲＮＡの発現の有無を、ＥＵｒｄの有効性を判定するための指標とするものである。
【００２３】
以下、本発明において、ＵＣＫＬ１タンパク質、ＵＣＫＬ１をコードするｍＲＮＡ、ＮＴ５Ｃ３タンパク質及びＮＴ５Ｃ３をコードするｍＲＮＡをまとめて検出対象となるバイオマーカーの意味で表すときは「本バイオマーカー」と記し、個々のタンパク質及びｍＲＮＡの意味で表すときは「ＵＣＫＬ１タンパク質」、「ＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡ」、「ＮＴ５Ｃ３タンパク質」、「ＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡ」とそれぞれ記すこととする。ＵＣＫＬ１タンパク質のアミノ酸配列、ＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡの塩基配列、ＮＴ５Ｃ３タンパク質のアミノ酸配列及びＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡの塩基配列は、それぞれアクセッション番号ＮＰ＿０６０３２９、ＮＰ＿００１１８０３０８、ＮＭ＿０１７８５９、ＮＭ＿００１１９３３７９、 ＮＲ＿１２６５２６、ＮＰ＿００１００２０１０、ＮＰ＿００１００２００９、ＮＰ＿０５７５７３、ＮＰ＿００１１５９５９０、ＮＭ＿００１００２０１０、ＮＭ＿００１００２００９、ＮＭ＿０１６４８９、及びＮＭ＿００１１６６１１８として、それぞれＮＣＢＩに登録されている。
【００２４】
従来、ＴＭＺ耐性はＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）によって発揮される（Ｂｏｂｏｌａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；２（４）；７３５−４１）と考えられていた。しかし、後の実施例に示されるように、ＧＩＣＲではＭＧＭＴの発現は確認されない（実験データは示さず）一方、ＥＵｒｄのＧＩＣＲに対する増殖抑制にはＧＩＣＲにおけるＵＣＫＬ１及びＮＴ５Ｃ３の発現が関与していることが実験的に確認された。具体的には、ＥＵｒｄによって増殖が抑制されるＧＩＣＲ及び幾つかのＧＩＣ株では、キナーゼの一種であるＵＣＫＬ１の発現が亢進している一方、脱リン酸化酵素の一種であるＮＴ５Ｃ３の発現が消失していることが確認された。
【００２５】
このことから、グリオーマ患者において本バイオマーカーの発現の有無を確認することによって、ＥＵｒｄの有効性を判定することができると期待される。
【００２６】
本発明に関する限定的な解釈を与えるものではないが、ＥＵｒｄのＧＩＣＲに対する増殖抑制効果の発現メカニズムは、ＥＵｒｄがＵＣＫＬ１タンパク質によってリン酸化されてＥＵＭＰ（Ｅｔｈｉｎｙｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）となることで核酸合成が阻害される一方、ＮＴ５Ｃ３を欠くためにＥＵＭＰはＥＵｒｄその他の脱リン酸化化合物へと変換されず、その結果ＥＵＭＰの核酸合成阻害作用が長く発揮される、と推察される。
【００２７】
本発明において検出対象とされるＵＣＫＬ１タンパク質のアミノ酸配列、ＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡの塩基配列、ＮＴ５Ｃ３タンパク質のアミノ酸配列及びＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡの塩基配列は、前記アクセッション番号で登録されているアミノ酸配列及び塩基配列には限定されず、例えば一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を有する塩基配列からなるｍＲＮＡ及びかかる塩基置換によって生じ得るアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列からなるＮＴ５Ｃ３タンパク質も検出対象に包含される。
【００２８】
本バイオマーカーは、患者から採取されたグリオーマ細胞において検出される。グリオーマ細胞は、患者から採取した細胞そのままの状態で用いてもよく、タンパク質若しくはｍＲＮＡの検出を目的とした一般的な処置を施した後に用いてもよい。
【００２９】
本発明に係る本バイオマーカーは、ＵＣＫＬ１タンパク質、ＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡ、ＮＴ５Ｃ３タンパク質又はＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡのいずれか一つのみを検出しても、又は２以上を検出してもよい。
【００３０】
グリオーマ細胞中の本バイオマーカーは、公知の方法によって検出することができる。例えば、タンパク質を検出対象とする場合は、これに特異的な抗体を用い、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法によって対象タンパク質を検出することができる。この場合、特異抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はＦａｂ断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片などの部分断片などでもよい。
【００３１】
タンパク質に対する特異抗体は、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００３２】
ｍＲＮＡを検出対象とする場合は、その塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたＰＣＲ法、ｍＲＮＡの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、ｍＲＮＡの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法その他の、ｍＲＮＡの発現を検出することができる公知の方法によって対象ｍＲＮＡを検出することができる。前記核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質、放射性同位体、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００３３】
本発明の第二の態様である方法は、ＥＵｒｄの有効性を判定する方法にかかるものであり、患者から採取されたグリオーマ細胞中でＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡが発現している場合、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡが発現していない場合、ＥＵｒｄが有効であると判定する工程を含む。なお、本発明の第二の態様である方法は、ＥＵｒｄの有効性を判定するための、あるいは判定に供するための、患者から採取されたグリオーマ細胞中でＵＣＫＬ１タンパク質、ＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡ、ＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／又はＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡＮＴ５Ｃ３の発現に関するデータを収集又は提供する方法と表すこともできる。
【００３４】
なお、本発明における判定は本バイオマーカーの発現の有無を検出できれば足りる。発現の有無は、用いた検出方法毎の検出感度において本バイオマーカーが発現しているとは事実上認められないか又は検出限界以下であった場合に発現していない又は陰性と判定し、かかる程度を越える場合に発現している又は陽性と判定すればよい。
【００３５】
本発明の第三の態様は、グリオーマ患者から採取されたグリオーマ細胞におけるＵＣＫＬ１タンパク質及び／若しくはＵＣＫＬ１−ｍＲＮＡ、並びに／又はＮＴ５Ｃ３タンパク質及び／若しくはＮＴ５Ｃ３−ｍＲＮＡの発現を確認する手段を含む、グリオーマ患者に対するＥＵｒｄの有効性を判定するためのキットに関する。
【００３６】
前記第三の態様のキットは、本バイオマーカーの検出に利用可能な物質、例えば対象タンパク質に対する特異抗体又は対象ｍＲＮＡを検出するためのプライマー核酸若しくはプローブ核酸などのいずれかを少なくとも含むことが好ましく、また免疫学的反応又はＰＣＲ反応等を行う際に用いられる緩衝液、発色試薬、ｄＮＴＰその他の任意の試薬類を含んでいてもよい。
【００３７】
さらに、本発明はグリオーマを治療する方法、具体的には、グリオーマ患者に有効量のＥＵｒｄ又はこれを含む治療剤を投与して患者におけるグリオーマを治療する方法を提供する。この治療方法は、前述のＥＵｒｄの有効性の判定方法を伴うことが好ましい。ここにおける判定方法及び治療方法の詳細は、本発明の第一の態様である治療剤及び第二の態様である判定方法において説明したとおりである。
【００３８】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３９】
＜材料及び方法＞
１）動物、細胞及び試薬
以下の実施例において、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはホクドー株式会社から入手した。ｍＮＳＣはＣ５７ＢＬ６胎仔脳から分離・培養したものを、ＧＩＣは愛媛大学でヒトＧＢＭから単離樹立された株化ＧＩＣであるＥ３及びＥ６を使用し、既存のヒトＧＢＭ細胞株であるＡ１７２、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ及びＵ２５１はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。化学因子及び増殖因子は、特に示さない限り、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社又はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。
【００４０】
２）細胞培養
ｍＮＳＣ、Ｅ３及びＥ６は、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；７５：１１２３−３４に記載の方法に従って、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヘパリン（５μＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ２培地（Ｓｉｇｍａ）（以下、ＮＳＣ培地とする）で培養した。また、Ｅ３及びＥ６は、ＦＣＳ（１０％）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＦＣＳ培地とする）とＮＳＣ培地との混合培地（以下、ハーフ培地とする）で維持した。Ｅ３及びＥ６は、ハーフ培地中で幹細胞特性を維持することが確認されている。Ｅ３及びＥ６由来のＴＭＺ耐性株であるＥ３Ｒ及びＥ６Ｒは、５０μＭのＴＭＺを含むハーフ培地で維持した。またＡ１７２、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ及びＵ２５１はＦＣＳ培地で培養した。全ての細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、ＣＯ２インキュベーター内で行った。
【００４１】
３）免疫染色
細胞の固定及び免疫染色は、Ｋｏｎｄｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４；１８：２９６３−７２に記載の方法に従って行った。１次抗体としてマウスモノクローナル抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（１：２００、ＢＤ）、ビオチン化ヤギポリクローナル抗ヒトＳｏｘ２抗体（１：２００、Ｒ＆Ｄ）、マウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：４００）又はマウスモノクローナル抗ＭＡＰ２抗体（Ｓｉｇｍａ、１：４００）を使用し、２次抗体としてＡｌｅｘａ  ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ  ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ  ５６８ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５００）を使用した。核を可視化するため、ＤＡＰＩ（５μｇ／ｍｌ）で対比染色した。
【００４２】
４）ハイスループットスクリーニング
１，０００細胞／ｗｅｌｌのＥ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒを含むハーフ培地、又は３，０００細胞／ｗｅｌｌのｍＮＳＣを含むＮＳＣ培地を９６ウェルプレートに播種し、北海道大学創薬科学研究教育センターが所蔵する化合物ライブラリーの各化合物（２ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液）を終濃度１０μＭになるようにウェルに加え、３日間培養した。培養後、１０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ）をウェルに添加し、さらに３時間培養した。培地を１００μＬのＤＭＳＯに換え、５７０ｎｍの吸光度をＢｅｎｃｈｍａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又はＥｎ  ｓｐｉｒｅマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定し、化合物を添加しないコントロールと比較したときの細胞生存率を算出した。
【００４３】
５）ＲＴ−ＰＣＲ
Ｉｓｏｇｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ニッポンジーン）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて逆転写反応を行った。ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて行った。各遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーは以下の通りである。
【表１】
2017081861.tif 000003
【００４４】
６）ｓｉＲＮＡによるｕｃｋ１、ｕｃｋ２又はｕｃｋｌ１のノックダウン
ヒトｕｃｋ１、ｕｃｋ２又はｕｃｋｌ１のノックダウンのため、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎのｓｉＲＮＡ  Ｗｉｚａｒｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／）を用いてショートヘアピン（ｓｈ）配列を作成した。それぞれの配列情報は下の通りである。
【表２】
2017081861.tif 000004
【００４５】
これらのｓｈ配列をｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ  Ｇ１発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）内に挿入し、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ−ｈｕｃｋ１ｓｈ、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ−ｈｕｃｋ２ｓｈ及びｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ−ｈｕｃｋｌ１ｓｈを作成し、Ｎｕｃｅｌｏｆｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＥ３Ｒ又はＥ６Ｒに導入した。
【００４６】
７）ｎｔ５ｃ３の過剰発現
ヒトグリオーマ細胞株Ｕ８７ＭＧのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを使い、特異的な５‘プライマーと３’プライマーを使いｎｔ５ｃ３  ｃＤＮＡを増幅し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖｅｒ．３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて塩基配列を確認後、ｎｔ５ｃ３  ｃＤＮＡをｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ  ｖｅｃｔｏｒに挿入した。クローニングに使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下のものである。
５’プライマー：5’-GGGGATCCGCCACCATGAGGGCCCCGTCCATGGAC-3’（配列番号２９）
３’プライマー：5’-GGCTCGAGTAGAATCTTCTGTAAAATAGAGTTGGCTACTTCTA-3’（配列番号３０）
【００４７】
８）データ解析
対となる２群間の有意差の検定にはｔ−検定を用いた（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。各グラフのエラーバーは±標準誤差を表す。
【００４８】
＜実施例１  ＴＭＤ耐性ＧＩＣ（ＧＩＣＲ）の作成及び特性解析＞
１）耐性株の確立
Ｅ３及びＥ６を、ＴＭＺ（２００μＭ）を含むハーフ培地で３週間培養した。殆どの細胞は１０日目までに死滅したが、僅かに生存した細胞をＴＭＺ耐性ＧＩＣ（ＧＩＣＲ）として回収した。以下、Ｅ３由来のＧＩＣＲをＥ３Ｒと、Ｅ６由来のＧＩＣＲをＥ６Ｒとそれぞれ表す。Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒはいずれも、１ｍＭのＴＭＺ存在下でも増殖するという高いＴＭＺ耐性を示した。
【００４９】
２）各種マーカータンパク質の発現解析
Ｅ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒにおける、ＮＳＣマーカーであるＮｅｓｔｉｎ及びＳｏｘ２、並びに分化マーカーであるｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＡＰ２）及びｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）の発現を、免疫染色法を用いて確認した。分化マーカーの発現解析は、分化培地で培養した細胞を用いて行った。図１Ａに示されるように、Ｅ３Ｒ及びＥ６ＲのＮＳＣマーカー及び分化マーカーの発現パターンは、親株であるＥ３及びＥ６のそれとほぼ同じであった。
【００５０】
３）細胞増殖能の評価
Ｅ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒの細胞増殖能を評価した（図１Ｂ）。Ｅ３ＲはＥ３と比べて増殖速度が低下しており、幹細胞は細胞周期が遅いという知見（Ｄｅｍｂｉｎｓｋｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．２００９；２６：６１１−２３）と一致していた。
【００５１】
４）サイドポピュレーション（ＳＰ）解析
サイドポピュレーション細胞は、多様な化学物質や色素を排出する能力を持った、幹細胞を濃縮した細胞群であると考えられている。Ｅ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒのサイドポピュレーションを、Ｋｏｎｄｏら（ＰＮＡＳ．２００４；１０１：７８１−６）に記載された方法に従って解析した（図１Ｃ）。ＳＰ細胞はいずれの細胞においても存在が確認されたが、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒでより多く存在していた。
【００５２】
５）腫瘍形成能の評価
Ｅ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ及びＥ６Ｒの腫瘍形成能を評価した。３μＬのハーフ培地にＥ３、Ｅ６、Ｅ３Ｒ又はＥ６Ｒ（１×１０５）を懸濁し、６〜８週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脳に１０％ペントバルビタール麻酔下で上記懸濁液を注射することで移植を行った。移植後、通常の飼育環境化で飼育したところ、移植マウスはいずれも脳に腫瘍が生じ、移植から１２０〜１２５日目までに死亡した（図１Ｄ）。また、死亡したマウスの腫瘍組織をＨＥ染色したところ、いずれの細胞を移植したマウスの腫瘍組織においても細胞過形成、多形性及び壊死といったヒトＧＢＭの特徴が観察された。
【００５３】
以上の結果から、Ｅ３Ｒ及びＥ６ＲはＧＩＣとして親株であるＥ３及びＥ６と同様の特性を有していることが確認された。
【００５４】
＜実施例２  スクリーニング及び候補化合物ＥＵｒｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制効果の評価＞
１）スクリーニング
ＧＩＣＲの増殖を抑制する薬剤を見いだすため、１，３４２種の化合物を含む北海道大学創薬科学研究教育センターの化合物ライブラリーを用いてハイスループットドラッグスクリーニングを行った。ＧＩＣＲに対する細胞毒性が強く、ｍＮＳＣに対する細胞毒性が弱く、かつ分子量が血液脳関門を介した受動拡散下限分子量の３００ダルトン未満であるという基準で化合物をスクリーニングした結果、ＥＵｒｄが最も高いＧＩＣＲ増殖抑制効果を示す化合物として選出された。
【００５５】
２）ＥＵｒｄの濃度依存的な増殖抑制効果
様々な濃度のＥＵｒｄの存在下でのｍＮＳＣ、ＧＩＣ及びＧＩＣＲの細胞生存率を１）のスクリーニングと同様にＭＴＴアッセイにより測定した。また、既存のＧＢＭ細胞株であるＴ９８Ｇ、Ａ１７２、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１に対するＥＵｒｄの増殖抑制効果の濃度依存性を、培地としてＦＣＳ培地を用いる以外は同様にして測定した。結果を図２Ａ〜Ｃに示す。ＥＵｒｄは、１μＭでもｍＮＳＣの生存率を５０％超までしか低下させないのに対して、全てのＧＢＭ細胞株の生存率を５０％以下まで、特にＴＭＺ耐性であるＥ３Ｒ及びＥ６Ｒの生存率を１０％程度まで低下させることが確認された。
【００５６】
３）細胞周期解析
ｍＮＳＣ及びＧＩＣＲについて、Ｍａら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０１１；２６：５４３−５０に記載された方法に従って、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ  ＩＩ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による細胞周期解析を行った。ＥＵｒｄはｍＮＳＣよりもＧＩＣＲにおいてより効果的にＧ０／Ｇ１期での細胞周期停止を引き起こすことが観察された（図２Ｄ）。
【００５７】
４）細胞形態観察
ＥＵｒｄ処理したＥ３Ｒの細胞形態を観察したところ、ＲＮＡ合成の中心である核小体の消失及びピクノーシスが認められ、ＥＵｒｄはＥ３Ｒの細胞死を誘導することが確認された（図２Ｅ）。
【００５８】
＜実施例３  ＥＵｒｄのｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖抑制効果の評価＞
Ｅ３Ｒ（１ｘ１０６）を５０μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ）に懸濁し、５〜８週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの臀部皮下に１０％ペントバルビタール麻酔下で上記懸濁液を注射して移植を行った。腫瘍が増殖して腫瘍塊の長さ及び幅が５〜６ｍｍになったら、１．０ｍｇ／ｋｇ／日のＥＵｒｄを１００μＬのＰＢＳに溶解して、毎日、１０日間連続で静脈内注射し、腫瘍体積を測定した。ＥＵｒｄに代えてＰＢＳのみを投与したマウスをコントロールとした。
【００５９】
結果を図３Ａに示す。ＥＵｒｄは移植されたＥ３Ｒによる腫瘍塊の体積増加を顕著に抑制することが確認された。また、飼育終了後のマウスから腫瘍塊を摘出し、組織切片のＨＥ染色を行ったところ、コントロールマウスではネクローシスが観察されたが、ＥＵｒｄ投与マウスではネクローシスの代わりに核小体の消失及びピクノーシスが観察された（図３Ｂ）。
【００６０】
＜実施例４  ＥＵｒｄの作用メカニズム解析＞
１）ウリジン、シチジンに対する拮抗作用
ＥＵｒｄがウリジンアナログとしてＲＮＡ合成を阻害することにより細胞増殖抑制効果を発揮することを検証するため、Ｅ３ＲをＥＵｒｄ単独又はＥＵｒｄ＋ヌクレオチド／デオキシヌクレオチドと共に培養し、細胞生存率を測定した。過剰量（５００μＭ）のウリジン又はシチジンの添加によりＥＵｒｄによる細胞増殖抑制はほぼ完全に抑制されたことから（図４Ａ）、ＥＵｒｄはウリジン及びシチジン代謝経路を介して細胞増殖抑制効果を発揮することが確認された。
【００６１】
２）ウリジンのリン酸化／脱リン酸化に関与する酵素遺伝子の発現解析
ｍＮＳＣ、Ｕ８７ＭＧ、ＧＩＣ及びＧＩＣＲにおいて、ウリジンのリン酸化／脱リン酸化に関与する酵素遺伝子であるｕｃｋ１、ｕｃｋ２、ｕｃｋｌ１及びｎｔ５ｃ３の発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。ｕｃｋ１、ｕｃｋ２及びｕｃｋｌ１は試験された全ての細胞において発現しており、特にｕｃｋｌ１はＧＩＣと比べてＧＩＣＲにおいてより強く発現していた。一方、ｎｔ５ｃ３はｍＮＳＣ及びＵ８７ＭＧで発現していたが、ＧＩＣ及びＧＩＣＲで発現が認められなかった（図４Ｂ）。
【００６２】
３）ノックダウン及び過剰発現によるリン酸化／脱リン酸化酵素遺伝子の機能評価
ウリジンリン酸化酵素の機能をさらに評価するため、Ｅ３Ｒ及びＥ６ＲにｓｉＲＮＡを導入することでこれらの遺伝子をノックダウンし、ＥＵｒｄの細胞増殖抑制効果に及ぼす影響を調べた。ｕｃｋｌ１のノックダウンはＥＵｒｄの細胞増殖抑制効果を弱めたが（図４Ｃ）、ｕｃｋ１又はｕｃｋ２をノックダウンした場合は影響が認められなかった。
また、ｎｔ５ｃ３を過剰発現させ、ＥＵｒｄの細胞増殖抑制効果に及ぼす影響を調べた。ｎｔ５ｃ３の過剰発現もｕｃｋｌ１ノックダウンと同様にＥＵｒｄの細胞増殖抑制効果を弱めることが見いだされた（図４Ｄ）。
【００６３】
＜実施例５  ＥＵｒｄとＥＣｙｄとの比較試験＞
１−（３−エチニル−β−Ｄ−リボペントフラノシル）シトシン（ＥＣｙｄ）はＥＵｒｄと同様にＲＮＡ合成を阻害することにより細胞増殖抑制効果を発揮することが知られている（Ａｂｄｅｌｒａｈｉｍら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１３；８５：３５６−６３）。Ｅ３、Ｅ３Ｒ、Ｕ８７ＭＧ及びｍＮＳＣに対するＥＵｒｄ及びＥＣｙｄの細胞増殖抑制効果を評価し、ＥＵｒｄとＥＣｙｄとの比較を行った。
【００６４】
結果を表３に示す。ＥＣｙｄは試験された全てのＧＢＭ細胞に対してＥＵｒｄと同程度の細胞増殖抑制を示したが、正常細胞であるｍＮＳＣに対してはＥＵｒｄのそれよりも顕著に強い細胞増殖抑制を示した。これらの結果から、ＥＵｒｄはＥＣｙｄと比べて正常細胞に対する細胞増殖抑制効果が弱く、ＧＢＭ細胞に対してより選択的に作用することが明らかになった。
【表３】
2017081861.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、ＥＵｒｄを有効成分とする医薬の製造、ＥＵｒｄの有効性を判定するためのデータの提供サービス、及びＥＵｒｄの有効性を判定するためのキットの製造などにおいて、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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