(57)【要約】【課題】  化学発光用材料溶液のみ独立した供給容器を提供することを目的とし、また酵素免疫測定用基質試薬としても使用可能な、保存安定性に優れ、高感度測定を可能にする化学発光用材料溶液を提供する。【解決手段】  化学発光基質溶液を収容した収容部一つ以上と、前記化学発光基質の発光増強試薬溶液を収容した収容部一つ以上と、からなる化学発光用材料の供給容器であって、収容部の内底面の形状がいずれも略半球状であり、光透過性のない前記容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光基質溶液を収容した収容部一つ以上と、
前記化学発光基質の発光増強試薬溶液を収容した収容部一つ以上と、
からなる化学発光用材料の供給容器であって、
収容部の内底面の形状がいずれも略半球状であり、光透過性のない前記容器。
【請求項２】
容器に備えた化学発光基質溶液および発光増強試薬溶液の収容部がそれぞれ一つである、請求項１に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素免疫測定などに用いられる化学発光用材料の供給容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素免疫測定には様々な化学発光用材料が用いられている。これらの中で自動分析装置に用いられているものは、ほとんどにおいて液状品であり、従来、供給容器の容量は５０ｍＬから１００ｍＬであり、場合によって２００ｍＬということもある。容量が多いことは化学発光用材料溶液の交換頻度が少なくなるというメリットがある。しかし、化学発光用材料溶液が汚染されてしまうと、残量にかかわらず廃棄するしかない。さらに測定数が少ない場合には化学発光用材料溶液の消費量も少なく、開封後に一定期間経過した後に残量にかかわらず廃棄する場合もある。また、酵素免疫測定に必要な試薬一式を一体型カートリッジに封入しているものも考案されている（特許文献１参照）。しかし、一体型カートリッジであることは、化学発光用材料以外の試薬の保存安定性に依存して、例えば化学発光用材料溶液の保存安定性が１年であっても、酵素標識試薬の保存安定性が６か月の場合には、一体型カートリッジの有効期間は６か月と設定されてしまう弊害があった。よって、化学発光用材料溶液のみ独立して小型化した供給容器が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−３１６２２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、化学発光用材料溶液のみ独立した供給容器を提供することを目的とする。また本発明は、酵素免疫測定用基質試薬としても使用可能な、保存安定性に優れ、高感度測定を可能にする化学発光用材料溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、以下の通りである。
（１）化学発光基質溶液を収容した収容部一つ以上と、
前記化学発光基質の発光増強試薬溶液を収容した収容部一つ以上と、
からなる化学発光用材料の供給容器であって、
収容部の内底面の形状がいずれも略半球状であり、光透過性のない前記容器。
（２）容器に備えた化学発光基質溶液および発光増強試薬溶液の収容部がそれぞれ一つである、（１）に記載の容器。
【０００６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【０００７】
本発明の供給容器は、化学発光基質の溶液を収容した化学発光基質溶液収容部一つ以上と、化学発光基質の化学発光を増強する試薬溶液を収容した発光増強試薬溶液（以下、エンハンサー溶液ともいう）収容部一つ以上と、を備えている。化学発光基質溶液収容部およびエンハンサー溶液収容部の配置は、１列に複数個の収容部が連続した並びであってもよいし、複数列に複数個の収容部が連続した並びであってもよい。ただし、装置上での操作性を考慮に入れると、１列に２個から２０個の収容部が連続した並びからなる測定容器が好ましく、一つの化学発光基質溶液収容部と一つのエンハンサー溶液収容部とが一列に並び、かつ一体に成形された測定容器が特に好ましい。
【０００８】
本発明の供給容器における各収容部の大きさは、測定規模や装置の大きさにより適宜選択すればよく、一例として内径（円筒型の場合）または一辺（角筒型の場合）が１ｍｍから２０ｍｍ程度で、深さが１ｍｍから５０ｍｍ程度からなる収容部をあげることができる。
【０００９】
本発明の供給容器における各収容部の外部形状および大きさは、同じであってもよいし、試料（検体）や試薬の量に応じて外部形状および／または大きさを変化させてもよい。
ただし、供給容器を成形する際の容易性を考慮すると、同じ外部形状および大きさを有した複数の収容部が一体に成形された測定容器が好ましい。
【００１０】
本発明の供給容器において、収容部の内底面はいずれ略半球状である。これにより、平底と比較して化学発光基質溶液及びエンハンサー溶液のデッドボリュームを低減することができる。
【００１１】
本発明の供給容器の材質は、熱可塑性樹脂（例えばオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、ビニル系樹脂、カーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂）やガラス等が例示できる。ただし、取り扱いの面を考慮すると熱可塑性樹脂が材質として好ましい。また、熱可塑性樹脂の中でも、容器や樹脂成形品の製造に通常用いられている、オレフィン系単独重合体（ホモポリマー）または共重合体（コポリマー）が材質として特に好ましい。前記特に好ましい材質の一例として、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、線状低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン−１、ポリ４−メチルペンテン−１、プロピレン−エチレン共重合体、アイオノマー、エチレン−アクリル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体があげられる。
【００１２】
本発明の供給容器は光透過性が無いものである。例えば白色顔料（二酸化チタン等）を練りこんでいる白色容器や、白色顔料（二酸化チタン等）と黒色顔料（カーボンブラック等）とを練りこんでいる灰色容器や、黒色顔料（カーボンブラック等）を練りこんでいる黒色容器が好ましい。この中でも灰色容器と黒色容器が特に好ましい。
【００１３】
化学発光基質溶液としては特に限定されるものではないが、例えば
一般式（Ｉ）
【００１４】
【化１】
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で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、Ｒ１、Ｒ２は一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基を形成することもできる。Ｒ３はアルキル基又はアリール基であり、Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは一般式（ＩＩ）
【００１５】
【化２】
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であり、Ｒ４はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９（ただし、Ｒ９はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）の溶液を用いることができる。
【００１６】
置換基のアルキル基としては、炭素数１〜２０個の直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基（例えばｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基等）、または環状になった基を例示することができる。これらのアルキル基は、さらに置換基を有していてもよく、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリール基等が置換していてもよい。
【００１７】
アリール基としては、例えばフェニル、ナフチル基等の炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素基、および、フリル、チエニル、ピリジル基等のように環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。アルコキシル基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基等の炭素数１〜２０個のアルコキシル基が直鎖状または分枝状に１〜５個結合したもの等を挙げることができる。アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ基等の炭素数７〜２０の基が例示でき、ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素等が例示できる。
【００１８】
またＲ１、Ｒ２が一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基としては、例えばアダマンチル基をあげることができる。Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環としては、例えばフラン環、ピラン環をあげることができる。またＲ４のリン酸塩基としては、例えばＰＯ４３−のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等をあげることができる。
【００１９】
このような置換基の中で、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２は炭素数１〜２０個の直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル基であり、Ｒ４はヒドロキシル基またはリン酸塩基であり、Ｒ５は水素原子またはハロゲン原子である。
【００２０】
このような置換基を有する一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体として、具体的には、リン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニル、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩、リン酸モノ−［５−（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプト−１−イル）−２−クロロフェニル］エステル  ジナトリウム塩などがあげられる。中でもリン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニル、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩が好ましく、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩が更に好ましい。
【００２１】
発光増強試薬溶液（エンハンサー溶液）としては例えばカチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有する溶液を用いることができる。例えばカチオン性界面活性剤は、市販のＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ（ＴＲＯＰＩＸ社製）に含有されるポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリドや一般式（ＩＩＩ）
【００２２】
【化３】
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（式中、Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２およびＲ１３のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍは窒素原子またはリン原子を示す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩をあげることができる。
【００２３】
一般式（ＩＩＩ）において、炭素数８〜２０のアルキル基としては、炭素数８〜２０個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数１〜８のアルキル基としては、炭素数１〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数８〜２０のアリール基としては、例えばナフチル基等の炭素数８〜２０個の芳香族炭化水素基、又は環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が例示できる。
【００２４】
以上のような置換基を有する、一般式（ＩＩＩ）で表される第４級アンモニウム塩の好適な例として、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムがあげられる。また第４級ホスホニウム塩の好適な例は、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム、臭化エチルトリフェニルホスホニウム、臭化トリヘプチルフェニルホスホニウムおよび臭化テトラデシルトリフェニルホスホニウムがあげられる。その中でも、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムがきわめて望ましい。
【００２５】
本発明で用いられる蛍光性物質としては、カチオン性界面活性剤と共に一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光を増強する効果を持つものであれば特に限定はないが、例えばフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体（フルオレセインナトリウム、アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）色素、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、Ｒｈｏｄｏｌ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）およびヒドラジド、５−（および−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセインが挙げられる。その中でも、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソシアネートが好ましく、フルオレセインが特に望ましい。
【００２６】
本発明の化学発光用材料の供給容器は、前述の溶液を有するものである。その溶媒としては、例えば水や水性緩衝液などのプロトン性溶媒が用いられる。また溶液中の化学発光基質や発光増強試薬の濃度は特に限定されるものではないが、酵素免疫測定の基質として使用する場合には、使用時にその好適な濃度範囲をとれるものであることが好ましい。また化学発光基質の溶液は、実質的に発光増強試薬を含有せず、これによって化学発光基質の高い保存安定性が得られる。一方、ｐＨ調整剤や、保存安定性を確保するためにアジ化ナトリウムなどの保存剤を適宜含有していてもよい。
【００２７】
本発明では、化学発光基質を、活性化剤により化学発光させる際に、発光増強試薬を添加する。これにより従来法と同等以上の発光量を得ることができる。
【００２８】
ここで使用される活性化剤は、化学発光基質に応じて適宜選択すればよいが、化学発光基質が一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の場合は、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択されるものが使用される。これは一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の基Ｒ４に作用して不安定なオキシド中間体を経てカルボニル化合物に変化させると同時に化学発光を生じさせることのできるものである。例えばＲ４がヒドロキシル基ならば塩基が、またＲ４が−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基ならばテトラブチルアンモニウムフルオライドが活性化剤として好適に使用できる。一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を酵素免疫測定の基質として使用する場合は、活性化剤として各種酵素たとえば、アルカリ性ホスファターゼ、アリールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼおよびガラクトシダーゼなどが好適に使用できる。特にＲ４がリン酸塩基の場合は、アルカリ性ホスファターゼが好適に使用できる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、保存安定性を有している化学発光用材料の供給容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】内底面が略半球状の化学発光基質溶液収容部および発光増強試薬溶液（エンハンサー溶液）収容部を備えた、化学発光用材料の供給容器の平面図および正面図（断面図）である。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
図１に示される内底面が略半球状収容部を２つ有する、各収容部の最大容量が５００μＬである、白色顔料（二酸化チタン）と黒色顔料（カーボンブラック）とを練りこんでいる光透過性のない灰色のポリプロピレン製容器を用意した。１，２−ジオキセタン誘導体として、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩を０．８ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５０ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を調製し、内底面が略半球状の収容部に３５０μＬ分注した。蛍光性物質としてフルオレセインを０．３ｍＭ、カチオン性界面活性剤として臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを２．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５００ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を調製し、もう一方の内底面が略半球状の収容部に３５０μＬ分注した。その後、アルミシールにて２つの収容部を封入し、４℃又は２０℃に７日間保管した。保管する際にアルミシール面を上面としてそのまま静置した。
【００３３】
７日間経過後アルミシールをシールブレークし、各溶液を２５μＬとり混合したのちに、バックグラウンド測定を行った。また、アルカリ性ホスファターゼ０．００５μｇ／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬと反応させ、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（検出器：シングルフォトンカウンター；測定波長領域：３８０〜６３０ｎｍ）を使用し、測光条件は上述のように化学発光用材料と酵素の溶液とを混合した５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。
【００３４】
（実施例２）
アルミシール面を下面としてアルミシール面に内容液が接触するように転倒させて保管した以外は、実施例１と同様の方法にて実施した。
【００３５】
（比較例１）
顔料を練りこんでいない半透明のポリプロピレン製容器を使用し、２０℃に３日間保管した以外は、実施例１と同様の方法にて実施した。
【００３６】
実施例１および実施例２の結果と合わせて表１に示す。
【００３７】
【表１】
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灰色不透明で光透過性の無い小型容器を使用した場合には、保存温度が２０℃にて７日間の保管において、静置（アルミシール面に液が接触しない）と転倒（アルミシール面に液が接触する）の二つの条件（実施例２）において、バックグラウンドに大きな変動はなかった。またアルカリ性ホスファターゼ酵素反応もリファレンスである４℃静置（実施例１）と比較して、４℃転倒で１００．１％（実施例１）、２０℃静置で９８．４％（実施例２）、２０℃転倒で１０１．７％（実施例２）と非常に良好な結果となっている。それに対して顔料を練りこまない半透明で光透過性の有る小型容器を使用した場合には、保存温度が２０℃にて３日間と保管期間が短く、静置（アルミシール面に液が接触しない）条件（比較例１）にもかかわらず、アルカリ性ホスファターゼ酵素反応が９３．７％となる結果であった。
【００３８】
以上の結果から、光透過性の無い容器を使用することにより、保存安定性を有している化学発光用材料を提供することができる。
【符号の説明】
【００３９】
１：化学発光用材料の供給容器
２ａ，２ｂ：供給容器開口部
３ａ：化学発光基質溶液
３ｂ：発光増強試薬溶液
４：アルミシール
【図１】
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