(57)【要約】【課題】  本発明は、酵素によって簡便かつ正確にＬ−キヌレニンを測定できる測定方法、及び測定キットを提供する。【解決手段】    Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下でキヌレニン３−モノオキシゲナーゼを反応させ、（１）該反応により変化する物質、又は（２）該反応後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類の濃度変化を測定する、試料中のＬ−キヌレニン測定方法。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下にキヌレニン３−モノオキシゲナーゼを酵素反応させる工程、及び
（Ｂ）（１）該酵素反応により濃度が変化する物質、又は
（２）該反応後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類
の濃度変化を測定する工程
を含む、試料中のＬ−キヌレニン測定方法。
【請求項２】
前記の反応による濃度変化を、吸光度の変化によって測定する、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記（１）の酵素反応による濃度変化が、前記電子供与体又は前記電子供与体の酸化体である電子受容体の濃度変化である、請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
前記（１）の酵素反応により変化する物質である、前記電子供与体の濃度変化又は前記電子受容体の濃度変化を、直接測定するか、又は酵素サイクリングにより増幅させて測定する請求項１記載の測定方法。
【請求項５】
前記（２）の酸化剤がフェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム又は２価銅化合物である、請求項１記載の測定方法。
【請求項６】
発色増強剤共存下で酸化剤処理する、請求項５項記載の測定方法。
【請求項７】
前記発色増強剤が２−アミノフェノール系化合物である、請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
前記酵素反応前に、Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を反応させて試料中のトリプトファンを低減させる請求項１〜７のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項９】
Ｌ−トリプトファンに作用する酵素が、トリプトファンオキシダーゼ及びトリプトファナーゼからなる群より選択される酵素である請求項８記載の測定方法。
【請求項１０】
キヌレニン３−モノオキシゲナーゼと、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体を含む、Ｌ−キヌレニン測定用キット。
【請求項１１】
さらにＬ−トリプトファンに作用する酵素を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
さらにキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、キナーゼ阻害剤、ＮＡＤもしくはＮＡＤＨ依存型酵素及び対応する基質、電荷キャリア、並びに還元系発色試薬を含む、請求項１０又は１１記載のキット。
【請求項１３】
前記ＮＡＤもしくはＮＡＤＨ依存型酵素及び対応する基質の組合せが、グルコース６リン酸脱水素酵素及びグルコース６リン酸の組合せ、又はエタノール脱水素酵素及びエタノールの組合せである、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
前記電荷キャリアがＰＭＳ、１−ｍ−ＰＭＳ又はジアホラーゼである、請求項１２又は１３記載のキット。
【請求項１５】
前記還元系発色物質がＷＳＴ−１である、請求項１２又は１３記載のキット。
【請求項１６】
ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体、
キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、
並びにフェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム及び２価銅化合物からなる群より選択される酸化剤を含む、Ｌ−キヌレニン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いたＬ−キヌレニンの測定方法及び測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−キヌレニンは、Ｌ−トリプトファンの代謝物として生体内に存在することが知られており、医療分野において測定意義が各種検討されている。Ｌ−キヌレニンは、液体クロマトグラフィーによる測定が一般的だが、この測定は煩雑であり、汎用性に乏しい。その他の測定法として、抗体法、Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬を用いた比色法及び酵素法が知られているが、抗体法は煩雑であり、また比色法は特異性が低い。酵素法としては、Ｌ−キヌレニンにキヌレニナーゼやキヌレニンアミノトランスフェラーゼを作用させ、蛍光検出する測定法が知られている（非特許文献１、２）が、臨床検査の場で一般的に使用されている生化学自動分析装置が使用できないという問題がある。また、キヌレニナーゼを用いる酵素法は、酵素反応液を酢酸エチルで抽出した液に対して蛍光法で測定するという手法であり大変煩雑という問題がある。
【０００３】
一方、Ｌ−キヌレニンを基質とするキヌレニン３−モノオキシゲナーゼとして、シュードモナス由来、ヒト由来、ラット由来、蚊又は酵母由来の酵素が知られている（非特許文献３〜７）。しかし、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼをＬ−キヌレニンの測定に用いることができるか否かについては報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．，４７（３），３８９−３９６，１９７３
【非特許文献２】友安彩子、外２名、第１２回合同地方会（第６１回日本臨床検査医学会中国・四国支部総会、第１５６回日本臨床化学会中国支部例会・総会、第２６回日本臨床化学会四国支部例会・総会）  抄録集、日本臨床化学会、２０１６、ｐ．２６
【非特許文献３】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，５１，３２４−３３３，２００７
【非特許文献４】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，１０９２−１０９９，２０００
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７８，５７３−５８１，１９７５
【非特許文献６】Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２（５），４８３−４９０，２００３
【非特許文献７】Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１４３（３），１３２５−１３３３，１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素を用いることにより簡便かつ正確にＬ−キヌレニンを測定できる測定方法及び測定キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、酵素を用いたキヌレニンの測定法について検討した結果、Ｌ−キヌレニンにＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下でキヌレニン３−モノオキシゲナーゼを反応させ、該酵素反応により変化する物質の濃度変化を測定することで、簡便かつ正確にＬ−キヌレニンを定量できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１６］を提供するものである。
［１］（Ａ）Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下でキヌレニン３−モノオキシゲナーゼを酵素反応させる工程、及び
（Ｂ）（１）該酵素反応により濃度が変化する物質、又は（２）該反応後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類
の濃度変化を測定する工程
を含む、試料中のＬ−キヌレニン測定方法。
［２］  前記の反応による濃度変化を、吸光度の変化によって測定する、前項［１］記載の測定方法。
［３］  前記（１）の酵素反応による濃度変化が、前記電子供与体又は前記電子供与体の酸化体である電子受容体の濃度変化である、前項［１］又は［２］記載の測定方法。
［４］  前記（１）の酵素反応により変化する物質である、前記電子供与体又は前記電子受容体の濃度変化を、直接測定するか、又は酵素サイクリングにより増幅させて測定する前項［１］記載の測定方法。
［５］  前記（２）の酸化剤がフェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム又は２価銅化合物である、前項［１］記載の測定方法。
［６］  発色増強剤共存下で酸化剤処理する、前項［５］記載の測定方法。
［７］  前記発色増強剤が２−アミノフェノール系化合物である、前項［６］記載の測定方法。
［８］  前記酵素反応前に、Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を反応させて試料中のトリプトファンを低減させる前項［１］〜［７］のいずれか１項記載の測定方法。
［９］  Ｌ−トリプトファンに作用する酵素が、トリプトファンオキシダーゼ及びトリプトファナーゼからなる群より選択される酵素である前項［８］記載の測定方法。
［１０］  キヌレニン３−モノオキシゲナーゼと、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体を含む、Ｌ−キヌレニン測定用キット。
［１１］  さらにＬ−トリプトファンに作用する酵素を含む、前項［１０］記載のキット。
［１２］  さらにキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、キナーゼ阻害剤、ＮＡＤもしくはＮＡＤＨ依存型酵素及び対応する基質、電荷キャリア、並びに還元系発色試薬を含む、前項［１０］又は［１１］記載のキット。
［１３］  前記ＮＡＤもしくはＮＡＤＨ依存型酵素及び対応する基質の組合せが、グルコース６リン酸脱水素酵素及びグルコース６リン酸の組合せ、又はエタノール脱水素酵素及びエタノールの組合せである、前項［１２］記載のキット。
［１４］  前記電荷キャリアがＰＭＳ、１−ｍ−ＰＭＳ又はジアホラーゼである、前項［１２］又は［１３］記載のキット。
［１５］  前記還元系発色試薬がＷＳＴ−１である、前項［１２］又は［１３］記載のキット。
［１６］  ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、並びにフェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム及び２価銅化合物からなる群より選択される酸化剤を含む、Ｌ−キヌレニン測定用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、簡便かつ正確にＬ−キヌレニンを定量することができる。該方法は、吸光度による測定が可能で、現在普及している生化学自動分析装置を使用できるため、多検体の測定に適しており、さらに臨床検査現場で早期に実用化可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト由来キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｈ−ＫＭＯ）及びＮＡＤＰＨを用いて、ＯＤ３４０ｎｍでＮＡＤＰＨを測定することによるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）測定結果を示した図である。
【図２】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｐ−ＫＭＯ）Ｐ−ＫＭＯ、及びＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを用いて、ＯＤ３４０ｎｍでＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを測定することによる、Ｌ−Ｋｙｎ測定結果を示した図である。
【図３】Ｐ−ＫＭＯ、及びＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを用いて、ＯＤ３４０ｎｍでＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを測定する上で、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）の影響を示した図である。
【図４】トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼによる処理工程を含む、Ｐ−ＫＭＯ及びＮＡＤＰＨを用いたＬ−Ｋｙｎ測定において、Ｌ−Ｔｒｐの影響を示した図である。
【図５】トリプトファナーゼによる処理工程を含む、Ｐ−ＫＭＯ及びＮＡＤＰＨを用いたＬ−Ｋｙｎ測定において、Ｌ−Ｔｒｐの影響を示した図である。
【図６】Ｈ−ＫＭＯ及びＮＡＤＰＨを用いたＬ−Ｋｙｎ測定において、酸化剤処理工程を含み、ＯＤ４５０ｎｍでキサントマチン類を測定することによるＬ−Ｋｙｎ測定結果を示した図である。
【図７】Ｐ−ＫＭＯ及びＮＡＤＰＨを用いたＬ−Ｋｙｎ測定において、酸化剤処理工程のみ又は発色増強剤を併用した酸化剤処理工程を含み、ＯＤ４５０ｎｍでキサントマチン類を測定することによるＬ−Ｋｙｎ測定結果を示した図である。
【図８】Ｐ−ＫＭＯ及びＮＡＤＨを用いたＬ−Ｋｙｎ測定において、酵素サイクリング反応を用いた測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、Ｌ−キヌレニンを含有する試料に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下でキヌレニン３−モノオキシゲナーゼを反応させる工程（Ａ）、及び（１）該酵素反応により濃度が変化する物質又は（２）該反応後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類の濃度変化を測定する工程（Ｂ）を含む、試料中のＬ−キヌレニン測定方法に関する。
【００１１】
（工程（Ａ））
本発明は、Ｌ−キヌレニンを含む試料にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体とキヌレニン３−モノオキシゲナーゼとを反応させる工程（Ａ）を含む。
【００１２】
（Ｌ−キヌレニンを含む試料）
本発明に用いられる試料は、Ｌ−キヌレニンを含む可能性のある試料であれば特に限定されず、例えば人を含む哺乳類の生体試料、例えば、血液（血清、血漿）、唾液、尿、脳脊髄液等が挙げられる。このうち、血液が好ましく、血液を試料とする場合、血清又は除蛋白した液を用いるのがより好ましい。
【００１３】
（前処理工程）
生体試料の測定では、測定に支障となる可能性のある還元物質、夾雑蛋白質、金属イオン等の少なくとも１つを公知の方法で除去する前処理工程を含んでもよい。還元物質としては例えば、ビリルビン、アスコルビン酸、尿酸等が挙げられる。ビリルビンの低減のためにビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸の低減のためにアスコルビン酸オキシダーゼ、尿酸の低減のためにウリカーゼなどの酵素を使用した前処理等がそれぞれ例示される。さらに、過酸化水素やペルオキシダーゼによる処理も行うことができる。また、使用又は産生した過酸化水素の低減のために、カタラーゼを使用することもできる。なお、酵素の使用量、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、それぞれの酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて、適宜設定することができる。酵素の使用量は、前処理液中の濃度が、例えば０．１〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬである。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは５〜４０分である。
【００１４】
夾雑蛋白質は例えば、過塩素酸やトリクロロ酢酸等の除蛋白剤で低減することができる。処理後、炭酸カリウム等を用いて中和を行うことで、試料として使用することが可能となる。なお、除蛋白剤処理によってビリルビンやヘモグロビン等の還元物質の低減も可能である。
【００１５】
金属イオンは、例えば、金属キレート剤で低減することができる。金属キレート剤は特に限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸）等が好適に用いられる。なお、金属キレート剤の使用濃度は、適宜設定することができる。例えば、工程（Ｂ）の第２の態様において２価銅化合物を使用する場合、使用する２価銅化合物の等量以下のモル濃度、更に好ましくは１／２以下の濃度であることが望ましい。また、マグネシウムイオン等は、リン酸を添加することで低減することも可能である。
【００１６】
上述の前処理をした液については、前処理後直ぐに測定に使用してもよく、また冷蔵又は冷凍で保管後に使用してもよい。
【００１７】
（トリプトファンの影響の低減）
本発明のＬ−キヌレニン測定方法を、より正確に行うために、試料中の夾雑物の影響を実質的に除くことが好ましい。例えば、一般に生体試料中のＬ−トリプトファン濃度は、Ｌ−キヌレニン濃度と比べ１０〜１００倍程度高いと考えられるため、Ｌ−トリプトファンのＬ−キヌレニン測定への影響を抑えることが好ましい。電子供与体としてＮＡＤＨを使用したＬ−キヌレニン測定方法が好ましく、ＮＡＤＨのみを使用した測定方法がより好ましい。
【００１８】
又は、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素により、試料中のＬ−トリプトファンを低減する工程を含む、Ｌ−キヌレニン測定方法が好ましい。該工程は、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼによる反応に先立ち、前処理として行うのが好ましい。
【００１９】
前記のＬ−トリプトファン低減工程のため、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を使用することが好ましい。Ｌ−トリプトファンに作用する酵素は、Ｌ−キヌレニンに実質的に作用しない酵素であれば特に制限されないが、トリプトファンオキシダーゼやトリプトファナーゼ等が例示できる。トリプトファンオキシダーゼはカタラーゼと組み合わせて使用するのが好ましい。
【００２０】
酵素使用量は、Ｌ−トリプトファンを低減できれば特に限定されないが、トリプトファンオキシダーゼの場合、前処理液中の濃度が０．１〜１００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファンオキシダーゼにカタラーゼを組み合わせる場合、前処理液中の濃度が０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１，０００Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファナーゼの場合、前処理液中の濃度が０．０１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、０．１〜２Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。また、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、それぞれの酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは５〜４０分である。
【００２１】
（キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ））
キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）としては、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等の原核生物由来、又はヒト、ラット、蚊若しくは酵母等の真核生物由来の公知の酵素を使用することができる。用いる酵素は組換え酵素でも良く、合成した酵素でもよい。この酵素は可溶性酵素であることが好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせてもよく、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でもよい。この酵素としては、公知のアミノ酸配列を有する酵素を利用でき、例えば、配列番号１、２、３、４又は５に記載の配列を有する酵素を使用できる。さらに、配列番号１、２、３、４又は５に記載の配列において１又は数アミノ酸を置換、付加若しくは欠失し、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ活性を有する改変酵素でもよい。配列番号１、２、３、４又は５と例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の類似性又は同一性を有する配列を有し、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ活性を有する蛋白質を使用してもよい。
【００２２】
（電子供与体）
本発明の工程（Ａ）は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体の存在下に行われる。
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体とは、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの安定性向上、モル吸光係数の上昇等のために使用することができる。本発明においては、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼによる反応が進むのであれば、これらの誘導体の種類は特に限定されず、例えば、チオＮＡＤＨや特開２０１２−２２４６３８公報で示されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体等、公知のものを使用することができる。
【００２３】
（酵素反応）
工程（Ａ）に用いる酵素反応中の酵素量は、試料中のＬ−キヌレニンが３−ヒドロキシキヌレニンに変換できていれば特に限定されないが、１試料あたり０．０００１〜１００Ｕ程度が好ましく、０．００１〜１０Ｕ程度がより好ましい。工程（Ａ）中の電子供与体濃度は、試料中のＬ−キヌレニン測定ができれば特に制限はないが、０．０１〜１ｍＭが好ましく、０．０１〜０．５ｍＭがより好ましい。また、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは５〜４０分である。
【００２４】
（工程（Ｂ））
本発明は、
（１）前記工程（Ａ）により濃度が変化する物質、又は
（２）前記工程（Ａ）後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類
の濃度変化を測定する工程（Ｂ）を含む。
【００２５】
（１）第１の態様では、前記酵素反応により濃度が変化する物質を測定する。濃度が変化する物質としては、前記電子供与体、又は前記電子供与体の酸化体である電子受容体が挙げられる。より詳細には、電子供与体としては、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びこれらの誘導体が挙げられ、電子受容体としては、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋及びこれらの誘導体が挙げられる。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の誘導体とは、それぞれ前記ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体の酸化体に相当する。例えば、３４０ｎｍ周辺で測定できるＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、又は４０５ｎｍ周辺で測定できるチオＮＡＤＨが例示でき、該物質の濃度変化（増加乃至減少）を測定するのが好ましい。
【００２６】
濃度変化の測定手段は特に限定されないが、例えば分光光度計による吸光度変化の測定、蛍光検出器による蛍光の測定、ＩＳＦＥＴ（イオン感応性電界効果トランジスタ）電極によるｐＨ変化の測定等が例示できる。分光光度計による測定では、レート法又はエンドポイント法から適宜選択するのが好ましい。測定に用いられる分光光度計としては、日本分光、日立ハイテクノロジーズ、島津製作所等各社から販売されている市販品が例示できる。
【００２７】
また、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼによる反応後に得られたＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋とアセトフェノン等のメチルケトン誘導体とをアルカリ条件下で反応させ、得られた化合物の吸光度や蛍光を測定する方法を用いることもできる。
【００２８】
（２）第２の態様では、前記酵素反応後に生じた３−ヒドロキシキヌレニンに酸化剤を反応させることによって生成するキサントマチン類等の濃度変化を測定する。前記工程（Ａ）の酵素反応によって生成した３−ヒドロキシキヌレニンを酸化剤と反応させることによって、キサントマチン類が生成する。酸化剤は特に限定されないが、フェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム、２価銅化合物等が好適に用いられる。なお、フェノールを基質とする酸化酵素としては、チロシナーゼ、カテコールオキシダーゼ等が挙げられる。
【００２９】
本測定中の酸化剤の濃度は、キサントマチン類が増加すれば特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜０．４Ｍが好ましい。例えば、フェリシアン化カリウムの場合は、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ程度が好ましく、０．１ｍＭ〜０．４ｍＭ程度がより好ましい。亜硝酸ナトリウムの場合、０．１Ｍ〜０．４Ｍ程度が好ましく、０．１Ｍ〜０．２Ｍ程度がより好ましい。２価銅化合物の場合、０．０１〜２.０ｍＭが好ましく、０．０２〜１.０ｍＭがより好ましい。フェノールを基質とする酸化酵素の場合、０．０１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、０．１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましい。
また、測定時のｐＨは、キサントマチン類が生じれば特に限定されないが、ｐＨ３．０〜１１．０が好ましい。例えば、フェリシアン化カリウムの場合、ｐＨ５．０〜９．５が好ましく、ｐＨ５．０〜９．０がより好ましく、ｐＨ５．５〜８．５が更に好ましい。亜硝酸ナトリウムの場合、ｐＨ４．０〜６．５が好ましく、ｐＨ５．０〜５．５がより好ましい。フェノールを基質とする酸化酵素又は２価銅化合物の場合、ｐＨ３．０〜１１．０が好ましく、ｐＨ４．０〜１０．０がより好ましい。
反応温度としては、酸化剤の種類によらず、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４５℃がより好ましく、２５〜４０℃が更に好ましい。反応時間としては、キサントマチン類の安定性の問題から、２０分以内が好ましく、１０分以内がより好ましく、５分以内が更に好ましい。
【００３０】
（発色増強剤）
この酸化剤による処理は、発色増強剤共存下で行うのがより好ましい。該発色増強剤は、３−ヒドロキシキヌレニン存在下でキサントマチン類の吸光物質を生じる反応を増強する化合物であれば特に限定されないが、２−アミノフェノール系化合物が好ましい。２−アミノフェノール系化合物は２位にアミノ基を有するフェノール構造を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、３−ヒドロキシアントラニル酸がより好ましい。該発色増強剤を共存させることで、測定感度を向上することができる。本測定中の発色増強剤の濃度は、キサントマチン類が増加すれば特に限定されないが、０．１〜１００μＭが好ましく、１〜５０μＭがより好ましい。
【００３１】
第２の態様における測定手段は、第１の態様と同様のものを用いることができる。また、生成したキサントマチン類を定量するために、４００〜５００ｎｍの間の測定波長で測定することができる。例えば、酸化型キサントマチンであれば、４５０ｎｍ付近の測定波長で測定することが好ましい。
【００３２】
（酵素サイクリング反応）
第１の態様においては、酵素サイクリング反応を組み合わせて、前記酵素反応により変化する物質（電子供与体又はその酸化体である電子受容体）の濃度変化を増幅させた後、測定することが好ましい。
詳細には、Ｌ−キヌレニンを基質として、電子供与体としてＮＡＤＨを使用し、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ反応（ＫＭＯ反応）終了後に、（ａ）生成したＮＡＤ＋又は（ｂ）残存したＮＡＤＨを用いて、酵素サイクリング反応を行うのが好ましいが、（ａ）生成したＮＡＤ＋を用いる方がより好ましい。この場合、濃度変化する物質として、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ＋が例示でき、電荷キャリア及び還元系発色物質を用いて最終的に生成する色素を測定できる。ＫＭＯ反応を行った時と行わなかった時の両方の反応液について酵素サイクリング反応を実施し、その差をもってＬ−キヌレニン濃度を算出することができる。前記（ａ）又は（ｂ）を用いる場合、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の酵素サイクリング反応を組み合わせることができる。
【００３３】
（ｉ）反応液中のＮＡＤ＋又はＮＡＤＨにリン酸基を付加してＮＡＤＰ＋又はＮＡＤＰＨに変換後、公知のＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの酵素サイクリング反応で増幅させる。
（ｉｉ）反応液中のＮＡＤＨ又はＮＡＤ＋の何れかを公知の手法等で除去後、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨを公知のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ＋のサイクリング反応で増幅させる。
酵素サイクリング反応は、公知の方法で行えばよく特に限定されないが、例えば以下の方法（ｉ）−ａ、（ｉ）−ｂ、（ｉｉ）−ａ及び（ｉｉ）−ｂが例示できる。
（ｉ）−ａ：ＫＭＯ反応で生成したＮＡＤ＋を用いて、ＮＡＤ＋に特異的に作用するキナーゼ、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を作用させ、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの酵素サイクリング反応を行う場合
（ｉ）−ｂ：ＫＭＯ反応で残存したＮＡＤＨを用いて、ＮＡＤＨに特異的に作用するキナーゼ、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を作用させ、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの酵素サイクリング反応を行う場合
（ｉｉ）−ａ：反応液中のＮＡＤＨに、ＮＡＤＨに特異的に作用するキナーゼ、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を作用させて、ＮＡＤＨを除去後、ＫＭＯ反応で生成したＮＡＤ＋を用いてＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの酵素サイクリング反応を行う場合
（ｉｉ）−ｂ：反応液中のＮＡＤ＋に、ＮＡＤ＋に特異的に作用するキナーゼ、ＡＴＰ及びＭｇ２＋を作用させて、ＮＡＤ＋を除去後、ＫＭＯ反応で残存したＮＡＤＨを用いてＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの酵素サイクリング反応を行う場合
【００３４】
ＮＡＤ＋に特異的に作用するキナーゼとしては特に限定されないが、グラム陰性菌由来のＮＡＤ＋キナーゼが好ましく、大腸菌由来のＮＡＤ＋キナーゼが例示できる。
ＮＡＤＨに特異的に作用するキナーゼとしては特に限定されないが、酵母由来のＮＡＤＨキナーゼが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属及びＰｉｃｈｉａ属由来のＮＡＤＨキナーゼが例示できる。
【００３５】
反応液における前記キナーゼの濃度としては、試料中のＬ−キヌレニン測定ができれば特に限定されないが、１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、５Ｕ／ｍＬ以上がより好ましい。また、ＡＴＰ濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、３ｍＭがより好ましい。マグネシウム（Ｍｇ２＋）イオン濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、３ｍＭ以上がより好ましい。また、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは５〜４０分である。
【００３６】
酵素サイクリング反応の前に、ＮＡＤＨキナーゼ又はＮＡＤ＋キナーゼの阻害剤を添加するのが好ましい。例えば、大腸菌由来のＮＡＤ＋キナーゼを使用する場合は、キナーゼ反応の阻害剤として、前記金属キレート剤を添加するのが好ましい。キナーゼ反応が阻害されればその種類は限定されないが、例えばＥＤＴＡを使用する場合は、反応液中に１ｍＭ以上添加するのが好ましく、５ｍＭ以上添加しておくのがより好ましい。
【００３７】
前記（ｉ）−ａ及び（ｉ）−ｂに記載の酵素サイクリング反応に使用する酵素としては、補酵素としてＮＡＤＰ＋に作用するが、ＮＡＤ＋には作用しない酵素（ＮＡＤＰ依存型酵素）を使用するのが好ましい。本目的を満たせば、酵素やその基質の種類は制限されないが、例えばグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）（ＥＣ１．１．１．４９）が例示でき、基質としてグルコース６リン酸を使用する。その他には、グリセロール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．７２）とグリセロール、リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．８２）とリンゴ酸等も使用することができる。
【００３８】
前記（ｉｉ）−ａ及び（ｉｉ）−ｂに記載の酵素サイクリング反応に使用する酵素としては、補酵素としてＮＡＤ＋に作用するが、ＮＡＤＰ＋には作用しない酵素（ＮＡＤ依存型酵素）を使用するのが好ましい。本目的を満たせば、酵素やその基質の種類は制限されないが、例えばアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．１）が例示でき、基質としてエタノール等のアルコールを使用する。その他には、グリセロール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．６）とグリセロール、リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．３７）とリンゴ酸等も知られている。
【００３９】
この酵素サイクリング反応においては、Ｇ６ＰＤを用いることがより好ましい。Ｇ６ＰＤの酵素量としては、試料中のＬ−キヌレニン測定ができれば特に限定されないが、反応液におけるグルコース６リン酸脱水素酵素濃度としては５〜１５Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、５〜７．５Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。また、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、それぞれの酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは３〜４５分、より好ましくは５〜３０分である。
【００４０】
（電荷キャリア）
酵素サイクリング反応で使用する電荷キャリアとしては、試料中のＬ−キヌレニン測定ができれば特に限定されないが、例えば、５―メチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−ｍ−ＰＭＳ）等の有機化合物や、ジアホラーゼのようにＮＡＤＨをＮＡＤ＋に、ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換する酵素が例示される。１−ｍ−ＰＭＳの反応液における濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、１μｇ／ｍＬが更に好ましい。またジアホラーゼの反応液における濃度は０．２Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、２Ｕ／ｍＬ以上がより好ましい。
【００４１】
（還元系発色試薬）
酵素サイクリング反応で使用する還元系発色試薬については、試料中のＬ−キヌレニン測定ができれば特に限定されないが、例えば、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  クロリド］（ＮＴＢ）、２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４）、レサズリン等が使用可能である。例えば、ＷＳＴ−１の場合、反応液における濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。なお、ＭＴＴのような水に対する溶解性の低い発色試薬を使用する際や高濃度のホルマザン色素が生じる場合は、可溶化のためにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の界面活性剤や有機溶剤を使用してもよい。
【００４２】
前記（ｉ）−ａ及び（ｉｉ）−ａの方法に加えて、反応液中の未反応ＮＡＤＨを酸性条件下で処理する工程を含んでいてもよく、さらに加熱する方が好ましい。詳細には、反応液中に酸を添加し、加熱することができ、該処理を行うことで未反応ＮＡＤＨを分解でき、反応液中の未反応ＮＡＤＨの影響を低減できる。添加する酸の種類としては、例えば、塩酸、硫酸、過塩素酸等の無機酸が例示できるが、特に限定されない。濃度としては、０．０１Ｎ以上が好ましく、０．１Ｎ以上がより好ましい。
【００４３】
前記（ｉ）−ｂ及び（ｉｉ）−ｂの方法に加えて、反応液中のＮＡＤ＋をアルカリ条件下で処理する工程を含んでいてもよく、さらに加熱する方が好ましい。詳細には、反応液中にアルカリを添加し、加熱することができ、該処理を行うことでＮＡＤ＋を分解でき、反応液中のＮＡＤ＋の影響を低減できる。添加するアルカリの種類としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機アルカリが例示できるが、特に限定されない。濃度としては、０．０１Ｎ以上が好ましく、０．１Ｎ以上がより好ましい。
【００４４】
（任意成分）
本発明のＬ−キヌレニン測定方法において、当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めてもよい。任意成分は測定に影響のない成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤、酵素と反応しないアミノ酸類等が例示できる。特に、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼは、塩濃度が高い方が安定性や活性が増す傾向にあることから、例えば、試薬組成物の緩衝液や塩化ナトリウムの終濃度を２０ｍＭ以上にするのが好ましく、１００ｍＭ以上にするのがより好ましい。
【００４５】
（キット）
本発明の測定は、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、並びにＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体からなる群より選択される電子供与体を含む、Ｌ−キヌレニン測定用キットを使用して行うことができる。該キットに含まれる該キヌレニン３−モノオキシゲナーゼは、Ｌ−キヌレニンを３−ヒドロキシキヌレニンに変換する酵素であればよい。詳細には、Ｌ−キヌレニンを基質として、前記電子供与体、Ｈ＋及び酸素存在下で、３−ヒドロキシキヌレニン、前記電子受容体及び水を生成する反応を触媒する酵素であればよい。
【００４６】
また、本発明のキットには、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を含有させてもよい。
【００４７】
第１の好ましい態様では、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、前記電子供与体に加え、キナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、キナーゼ阻害剤、ＮＡＤ＋依存性酵素もしくはＮＡＤＨ依存性酵素及び対応する基質、電荷キャリア、並びに還元系発色試薬を含有させてもよい。
【００４８】
前記ＮＡＤ＋依存性酵素及び基質の組合せとしては、グルコール６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）及びグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）の組合せ、また前記ＮＡＤＨ依存性酵素及び基質の組合せとしては、エタノール脱水素酵素及びエタノールの組合せであることが好ましい。また、前記電荷キャリアとしては、ＰＭＳ、１−ｍ−ＰＭＳ又はジアホラーゼが好ましい。前記還元系発色試薬としては、ＷＳＴ−１が好ましい。
【００４９】
第２の好ましい態様では、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、前記電子供与体に加え、酸化剤（フェノールを基質とする酸化酵素、フェリシアン化カリウム、亜硝酸ナトリウム及び二価銅化合物からなる群より選択される）を含有させてもよい。
［実施例］
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
実施例１
（１．ＮＡＰＤＨ又はＮＡＤＨ測定によるＬ−キヌレニンの定量）
（１−１．ヒト由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｈ−ＫＭＯ）による測定）
ヒト由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｈ−ＫＭＯ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、各濃度のＬ−キヌレニンを測定した。試薬混合液０．０７５ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温後に、Ｈ−ＫＭＯ  ０．０２５ｍＬを添加し、酵素反応を開始した。反応開始前（０分）及び６０分後に、３４０ｎｍにおける吸光度を各々プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定した。なお、得られる値が光路長１ｃｍの値になるようにプレートリーダーを設定した。
【００５２】
酵素反応液の組成は、３７ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．７３％（ｗ／ｖ）界面活性剤（Ｂｒｉｊ−３５）、５、１０又は２０μＭ  Ｌ−キヌレニン、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、及び０．００２Ｕ／ｍＬ  Ｈ−ＫＭＯとした。コントロールとして、基質の代わりに超純水を使用した。
【００５３】
各Ｌ−キヌレニン濃度における０分の測定値から、コントロールにおける０分の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各Ｌ−キヌレニン濃度における６０分後の測定値から、コントロールにおける６０分後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各Ｌ−キヌレニン濃度において、減算値Ａから減算値Ｂを各々減算した値を、ＯＤ３４０としてプロットした結果を図１に示した。図１より、Ｌ−キヌレニンの濃度上昇に従いＯＤ３４０の値が高くなっており、Ｈ−ＫＭＯによりＬ−キヌレニンの定量が可能であることが示された。
【００５４】
（１−２．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｐ−ＫＭＯ）による測定）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｐ−ＫＭＯ）を用いて、各濃度のＬ−キヌレニンを測定した。試薬混合液０．１９ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温後に、Ｐ−ＫＭＯ  ０．０１ｍＬを添加し、酵素反応を開始した。反応開始前（０分）及び１５分後に、３４０ｎｍにおける吸光度を各々プレートリーダーで測定した。なお、得られる値が光路長１ｃｍの値になるようにプレートリーダーを設定した。
【００５５】
酵素反応液の組成は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、５、１０又は２０μＭ  Ｌ−キヌレニン、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、及び０．０４５Ｕ／ｍＬ  Ｐ−ＫＭＯとした。なお、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨを用いた測定も行った。コントロールとして、基質の代わりに超純水を使用した。
【００５６】
なお、Ｐ−ＫＭＯは、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ＵｎｉＰｒｏｔでＱ８４ＨＦ５（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/ｕｎｉｐｒｏｔ/Ｑ８４ＨＦ５）として公開されている。配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え微生物を培養し、培養物からＰ−ＫＭＯを回収した後、精製した酵素である。
【００５７】
各Ｌ−キヌレニン濃度における０分の測定値から、コントロールにおける０分の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各Ｌ−キヌレニン濃度における１５分後の測定値から、コントロールにおける１５分後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各Ｌ−キヌレニン濃度において、減算値Ａから減算値Ｂを各々減算した値を、ＯＤ３４０としてプロットした結果を図２に示した。図２より、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの何れを用いても、Ｌ−キヌレニンの濃度上昇に従いＯＤ３４０の値が高くなっており、Ｐ−ＫＭＯによりＬ−キヌレニンの定量が可能であることが示された。
【００５８】
以上より、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの吸光度変化を測定することで、Ｌ−キヌレニンが定量できることが分かった。
【００５９】
実施例２
（２．Ｌ-トリプトファン存在下でのＬ−キヌレニンの定量）
（２−１．ＮＡＤＨ使用によりＬ−トリプトファンの影響を低減するＬ−キヌレニンの定量）
Ｐ−ＫＭＯを用いて、Ｌ−トリプトファン存在下でＬ−キヌレニンを測定した。試薬混合液２．９ｍＬを光路長１ｃｍの石英セルに入れ、２５℃で５分間保温後に、Ｐ−ＫＭＯ  ０．１ｍＬを添加し、酵素反応を開始した。反応開始前（０分）及び２０分後に、３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光社製）で測定した。
【００６０】
酵素反応液の組成は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、基質、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ、及び０．０４５Ｕ／ｍＬ  Ｐ−ＫＭＯとした。なお、基質には、終濃度１０μＭ  Ｌ−キヌレニン、終濃度２００μＭ  Ｌ−トリプトファン又はそれらの混合物（終濃度１０μＭ  Ｌ−キヌレニン及び２００μＭ  Ｌ−トリプトファン）を使用した。コントロールとして、基質の代わりに超純水を使用した。
【００６１】
各基質を用いた測定における０分の測定値から、コントロールにおける０分の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各基質における２０分後の測定値から、コントロールにおける２０分後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各基質において、減算値Ａから減算値Ｂを各々減算した値を、各基質に対する測定値とした。なお、１０μＭ  Ｌ−キヌレニンにおいては、２０分後以降において３４０ｎｍにおける吸光度変化はほとんど認められず、Ｌ−キヌレニンに対する反応は終了していると判断した。
【００６２】
１０μＭ  Ｌ−キヌレニンを基質としたときの測定値を１００％とし、各基質に対する相対値を算出し、図３に示した。図３より、Ｌ−トリプトファンへの作用性は、ＮＡＤＰＨを使用した場合３４％、ＮＡＤＨを使用した場合８％と、ＮＡＤＨを使用した方が約４分の１となった。さらに、Ｌ−トリプトファン存在下でのＬ−キヌレニンへの作用性は、ＮＡＤＰＨを使用した場合１２６％、ＮＡＤＨを使用した場合１１８％と、ＮＡＤＨを使用した方が、Ｌ−トリプトファンの影響を約６．３％抑えられることが分かった。
【００６３】
以上より、Ｌ−トリプトファン存在下では、電子供与体として、ＮＡＤＰＨよりＮＡＤＨを使用した方が、Ｌ−トリプトファンの影響を低減したＬ−キヌレニン定量が可能であることが分かった。
【００６４】
（２−２．トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼ処理工程を含むＬ−キヌレニンの定量）
Ｐ−ＫＭＯを用いて、Ｌ−トリプトファン存在下でＬ−キヌレニンを測定した。Ｌ−キヌレニン測定の前処理として、トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼ処理を行った。試薬混合液２．７７ｍＬを光路長１ｃｍの石英セルに入れ、２５℃で５分間保温後に、トリプトファンオキシダーゼ０．１ｍＬ及びカタラーゼ（ウシ肝臓由来、和光純薬工業社製）０．０３ｍＬを添加した。反応開始後、２５℃、３０分間インキュベートし、前処理を実施した。
【００６５】
酵素反応液の組成は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、基質、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、３．６Ｕ／ｍＬトリプトファンオキシダーゼ及び１０Ｕ／ｍＬカタラーゼとした。なお、基質及びコントロールは、２−１と同じである。トリプトファンオキシダーゼは、特開２０１５−２３８５９号公報に記載の方法で取得した精製トリプトファンオキシダーゼを使用した。
【００６６】
前処理終了後、３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。該測定値を０分の測定値とした。続いて、Ｐ−ＫＭＯ  ０．１ｍＬ（終濃度０．０４５Ｕ／ｍＬ）を添加し、２５℃で酵素反応を開始した。反応開始２０分後に、３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光社製）で測定した。
【００６７】
各基質を用いた測定における０分の測定値から、コントロールにおける０分の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各基質における２０分後の測定値から、コントロールにおける２０分後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各基質において、減算値Ａから減算値Ｂを各々減算した値を、各基質に対する測定値とした。なお、１０μＭ  Ｌ−キヌレニンにおいては、２０分後以降において３４０ｎｍにおける吸光度変化はほとんど認められず、Ｌ−キヌレニンに対する反応は終了していると判断した。
【００６８】
１０μＭ  Ｌ−キヌレニンを基質としたときの測定値を１００％とし、各基質に対する相対値を算出し、図４に示した。図４より、Ｌ−トリプトファンへの作用性は、前処理を実施しなかった場合３４％、前処理を実施した場合７％と、前処理を実施した方が約５分の１となった。さらに、Ｌ−トリプトファン存在下でのＬ−キヌレニンへの作用性は、前処理を実施しなかった場合１２６％、前処理を実施した場合９６％と、前処理を実施した方が、Ｌ−トリプトファンの影響を約２４％抑えられることが分かった。
【００６９】
以上より、Ｌ−トリプトファン存在下では、トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼ処理工程を行う方が、Ｌ−トリプトファンの影響を低減したＬ−キヌレニン定量が可能であることが分かった。
【００７０】
（２−３．トリプトファナーゼ処理工程を含むＬ−キヌレニンの定量）
Ｐ−ＫＭＯを用いて、Ｌ−トリプトファン存在下でＬ−キヌレニンを測定した。Ｌ−キヌレニン測定の前処理として、トリプトファナーゼ処理を行った。試薬混合液２．８ｍＬを光路長１ｃｍの石英セルに入れ、２５℃で５分間保温後に、トリプトファナーゼ０．１ｍＬを添加した。反応開始後、２５℃、３２分間インキュベートし、前処理を実施した。
【００７１】
酵素反応液の組成は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、基質、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ及び１．１Ｕ／ｍＬトリプトファナーゼとした。基質及びコントロールは、２−１と同じである。
【００７２】
前処理終了後、３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。該測定値を０分後の測定値とした。続いて、Ｐ−ＫＭＯ  ０．１ｍＬ（終濃度０．０４５Ｕ／ｍＬ）を添加し、２５℃で酵素反応を開始した。反応開始１０分後に、３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。
【００７３】
各基質を用いた測定における０分の測定値から、コントロールにおける０分の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各基質における１０分後の測定値から、コントロールにおける１０分後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各基質において、減算値Ａから減算値Ｂを各々減算した値を、各基質に対する測定値とした。なお、１０μＭ  Ｌ−キヌレニンにおいては、１０分後以降において３４０ｎｍにおける吸光度変化はほとんど認められず、Ｌ−キヌレニンに対する反応は終了していると判断した。
【００７４】
１０μＭ  Ｌ−キヌレニンを基質としたときの測定値を１００％とし、各基質に対する相対値を算出し、図５に示した。図５より、Ｌ−トリプトファンへの作用性は、前処理を実施しなかった場合２１％、前処理を実施した場合１２％と、前処理を実施した方が約２分の１となった。さらに、Ｌ−トリプトファン存在下でのＬ−キヌレニンへの作用性は、前処理を実施しなかった場合１１４％、前処理を実施した場合１０７％と、前処理を実施した方が、Ｌ−トリプトファンの影響を約６．１％抑えられることが分かった。
【００７５】
以上より、Ｌ−トリプトファン存在下では、トリプトファナーゼ処理工程を行う方が、Ｌ−トリプトファンの影響を低減したＬ−キヌレニン定量が可能であることが分かった。
【００７６】
実施例３
（キサントマチン類測定によるＬ−キヌレニンの定量）
（３−１．酸化剤処理工程の検討）
酸化剤処理により３−ヒドロキシキヌレニンからキサントマチン類を生成させるため、酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いた処理条件の検討を行った。９６穴プレートを使用し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、２０μＭ  ３−ヒドロキシキヌレニンに対し、終濃度２５〜１０００μＭになるようにフェリシアン化カリウムを添加し、添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）にて測定した。コントロールとして、３−ヒドロキシキヌレニンの代わりに超純水を使用した。
【００７７】
各測定値からコントロールの測定値を減算した結果、終濃度２５〜１０００μＭになるようにフェリシアン化カリウムを添加することで吸光度の増加が見られ、キサントマチン類の生成が確認できた。フェリシアン化カリウム濃度が１００μＭまでは濃度依存的に吸光度の増加が見られたが、１００〜１０００μＭでは何れも同じ増加量だった。よって、フェリシアン化カリウムを用いたキサントマチン類測定においては、濃度を１００μＭ以上とするのが良いと思われた。
【００７８】
次に、各ｐＨにおいて、２０μＭ  ３−ヒドロキシキヌレニンに対し、終濃度４００μＭになるようにフェリシアン化カリウムを添加し、添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
【００７９】
各測定値からコントロールの測定値を減算した結果、ｐＨ５．０〜９．５で吸光度の増加が見られ、キサントマチン類の生成が確認できた。特に、ｐＨ５．５〜８．５で良好な測定値が得られた。よって、フェリシアン化カリウムを用いたキサントマチン類測定においては、ｐＨを５．５〜８．５に設定するのが良いと思われた。
【００８０】
また、酸化剤処理により３−ヒドロキシキヌレニンからキサントマチン類を生成させるため、酸化剤として亜硝酸ナトリウムを用いた処理条件の検討を行った。１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、２０μＭ  ３−ヒドロキシキヌレニンに対し、終濃度５０、１００及び２００ｍＭになるように亜硝酸ナトリウムを添加し、添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。コントロールとして、３−ヒドロキシキヌレニンの代わりに超純水を使用した。
【００８１】
各測定値からコントロールの測定値を減算した結果、終濃度１００及び２００ｍＭになるように亜硝酸ナトリウムを添加することで吸光度の増加が見られ、キサントマチン類の生成が確認できた。よって、亜硝酸ナトリウムを用いたキサントマチン類測定においては、濃度を１００ｍＭ以上とするのが良いと思われた。
【００８２】
次に、各ｐＨにおいて、２０μＭ  ３−ヒドロキシキヌレニンに対し、終濃度１００ｍＭになるように亜硝酸ナトリウムを添加し、添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。コントロールとして、３−ヒドロキシキヌレニンの代わりに超純水を使用した。
【００８３】
各測定値からコントロールの測定値を減算した結果、ｐＨ４．０〜６．５で吸光度の増加が見られ、キサントマチン類の生成が確認できた。特に、ｐＨ５．０〜６．０で良好な測定値が得られた。よって、亜硝酸ナトリウムを用いたキサントマチン類測定においては、ｐＨを５．５付近に設定するのが良いと思われた。
【００８４】
（３−２．キヌレニン３−モノオキシゲナーゼによるＬ−キヌレニンの定量）
（３−２−１．ヒト由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｈ−ＫＭＯ）による測定）
Ｈ−ＫＭＯ、及び酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いて、生じるキサントマチン類を測定することで、各濃度のＬ−キヌレニンを定量した。
試薬混合液０．０７５ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温後に、Ｈ−ＫＭＯ  ０．０２５ｍＬを添加し、酵素反応を開始した。なお、酵素反応液の組成は、３７ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．７３％（ｗ／ｖ）界面活性剤（Ｂｒｉｊ−３５）、５、１０又は２０μＭ  Ｌ−キヌレニン、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、及び０．００２Ｕ／ｍＬ  Ｈ−ＫＭＯとした。コントロールとして、基質の代わりに超純水を使用した。
反応開始から９０分後に、酸化剤であるフェリシアン化カリウムの終濃度が０．４ｍＭとなるよう添加し、酸化剤添加前と添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。なお、得られる値が光路長１ｃｍの値になるようにプレートリーダーを設定した。
【００８５】
各Ｌ−キヌレニン濃度における酸化剤添加前の測定値から、コントロールにおける酸化剤添加前の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各Ｌ−キヌレニン濃度における酸化剤添加直後の測定値から、コントロールにおける酸化剤添加直後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各Ｌ−キヌレニン濃度において、減算値Ｂから減算値Ａを各々減算した値を、ＯＤ４５０としてプロットした結果を図６に示した。図６より、Ｈ−ＫＭＯ及び酸化剤を用いて生じるキサントマチン類を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの定量が可能であることが示された。
【００８６】
（３−２−２．シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のキヌレニン３−モノオキシゲナーゼ（Ｐ−ＫＭＯ）及びフェリシアン化カリウムによる測定）
Ｐ−ＫＭＯ及び酸化剤（フェリシアン化カリウム）を用いて、生じるキサントマチン類を測定することで、各濃度のＬ−キヌレニン定量した。
試薬混合液２．８２ｍＬを光路長１ｃｍの石英セルに入れ、２５℃で５分間保温後に、Ｐ−ＫＭＯ  ０．０６ｍＬを添加し、酵素反応を開始した。なお、酵素反応液の組成は、電子供与体として０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨのみで試験をした以外は、前記１−２と同じである。反応開始から４０分後に、酸化剤であるフェリシアン化カリウムの終濃度が０．４ｍＭとなるよう添加し、酸化剤添加前と添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光社製）で測定した。
【００８７】
他に、前記試薬にさらに発色増強剤を併用した測定法も行った。前記と同様に酵素反応を開始し、反応開始から４０分後に、発色増強剤である３−ヒドロキシアントラニル酸の終濃度が０．０２ｍＭとなるように添加後、酸化剤であるフェリシアン化カリウムの終濃度が０．４ｍＭとなるように添加し、酸化剤添加前と添加直後の４５０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。
【００８８】
いずれの測定も、各Ｌ−キヌレニン濃度における酸化剤添加前の測定値から、コントロールにおける酸化剤添加前の測定値を各々減算した（減算値Ａ）。また、各キヌレニン濃度における酸化剤添加直後の測定値から、コントロールにおける酸化剤添加直後の測定値を各々減算した（減算値Ｂ）。続いて、各Ｌ−キヌレニン濃度において、減算値Ｂから減算値Ａを各々減算し算出した値を、ＯＤ４５０としてプロットした結果を図７に示した。図７より、Ｐ−ＫＭＯ及び酸化剤を用いて生じるキサントマチン類を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの定量が可能であることが示された。さらに、発色増強剤の併用により、酸化剤のみの場合と比べて吸光度変化が大きくなったことが分かった。
【００８９】
以上より、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ及び酸化剤を用いて、４５０ｎｍにおけるキサントマチン類の吸光度変化を測定することで、Ｌ−キヌレニンが定量できることが分かった。さらに、発色増強剤共存下で酸化剤処理することで、測定感度を上げることが可能なことが分かった。
【００９０】
実施例４
（４．酵素サイクリングを用いたＬ−キヌレニンの定量）
（４−１．酵素サイクリングの手法の概要）
酵素サイクリング法は以下の手順で行った。
第１段階：キヌレニン３−モノオキシゲナーゼによる反応
キヌレニン３−モノオキシゲナーゼを添加し、ＮＡＤＨを補酵素としてＬ−キヌレニンを３−ヒドロキシキヌレニンに変換する。このとき、Ｌ−キヌレニン量に応じたＮＡＤ＋が生じる。
第２段階：酸処理及び中和
第１段階で得られた反応液を酸性にし、未反応ＮＡＤＨの分解を行う。その後、中和する。
第３段階：ＮＡＤキナーゼによる反応
第２段階で得られた反応液にＮＡＤキナーゼを作用させＮＡＤ＋をＮＡＤＰ＋に変換する。その後、ＥＤＴＡを加えＮＡＤキナーゼ反応を阻害する。
第４段階：ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋の酵素サイクリング反応
第３段階で得られた反応液に対し、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋の酵素サイクリングを行い、得られた発色物質の吸光度から、試料中のＬ−キヌレニン濃度を算出する。
【００９１】
（４−２．第１段階の反応）
１．５ｍＬ容チューブにＬ−キヌレニン溶液１２０μＬ、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２４μＬ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ  ２４μＬ、３Ｕ／ｍＬ  Ｐ−ＫＭＯ  ２４μＬ及び超純水  ４８μＬを加え、２５℃で１０分間保温して反応を行った。Ｌ−キヌレニン溶液は０．１、０．５、１、２又は３μＭの溶液を用い、Ｌ−キヌレニンの代わりに超純水を加えたサンプルをコントロールとした。
【００９２】
（４−３．第２段階の反応）
第1段階で得られた反応液０．２４ｍＬに対し、１Ｎ  ＨＣｌを８０μＬ加え、３７℃で１０分間加温した。加温後、ギ酸エチル４．８μＬ、１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３２．２μＬ、２Ｎ  ＮａＯＨ  ４３μＬの順で加え中和した。
【００９３】
（４−４．第３段階の反応）
第２段階で得られた反応液０．４ｍＬを光路長１ｃｍの石英セルに移し、１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）  ８０μＬ、７０Ｕ／ｍＬ  ＮＡＤキナーゼ  ８０μＬ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム  ８０μＬ、５０ｍＭ  ＡＴＰ  ８０μＬ及び超純水  ８０μＬを加えた。転倒混和し、３７℃で１０分間加温した。
【００９４】
ＮＡＤキナーゼは、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８，４３５９−４３６５，２００１に記載の方法に従って取得した。
【００９５】
（４−５．第４段階の反応）
第３段階で得られた反応液０．８ｍＬに、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．２ｍＬを添加しＮＡＤキナーゼ反応を停止した。さらに電荷キャリアである１ｍｇ／ｍＬ  １−ｍ−ＰＭＳを０．２ｍＬ加えた後、１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍＬ、２０ｍＭ  グルコース−６−リン酸  ０．２ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製）  ０．２ｍＬ、及び還元系発色試薬である２ｍｇ／ｍＬ  ＷＳＴ−１  ０．２ｍＬを混合した測定試薬０．８ｍＬを加え、転倒混和後、反応を開始した。
【００９６】
反応開始後、３７℃で１０分間加温した。酵素サイクリング反応前と、５分後及び１０分後の４２０ｎｍの吸光度を各々分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光社製）で測定した。コントロールの反応５分後又は１０分後の測定値から、酵素サイクリング反応前の測定値を減算した（減算値Ｅ）。同様にＬ−キヌレニンを含む各サンプルの反応５分後又は１０分後の測定値から酵素サイクリング反応前の測定値を減算した（減算値Ｆ）。続いて、それぞれの減算値Ｆから共通の減算値Ｅを差し引いた値を、ＯＤ４２０としてプロットした結果を図８に示した。
【００９７】
図８に示すように、Ｌ−キヌレニンを０．１μＭから３μＭの範囲の濃度で含む検体において、Ｌ−キヌレニンの濃度上昇に従いＯＤ４２０が増加していた。以上より、酵素サイクリング反応によって、高感度なＬ−キヌレニン定量が可能であることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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