(57)【要約】【課題】血液試料からＤ体及びＬ体のアミノ酸量に基づき、対象において腎臓病の予後を予測する方法、及び予後予測を判定する分析システムの提供を目的とする。【解決手段】腎臓病の予後を予測するために、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アロ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アスパラギン、及びＬ−アスパラギンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を使用することにより、本発明の目的を達成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、腎臓病の予後を予測する方法であって、
血液試料中のＤ−セリン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アロ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アスパラギン、及びＬ−アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸の量を測定する工程；及び
前記アミノ酸量に基づく指標値と、前記対象における予後との関連付けをする工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記関連付け工程において、予め決定された前記指標値のカットオフ値より、予後が決定される、請求項１に記載の予後予測方法。
【請求項３】
前記カットオフ値が、カプランマイヤー曲線分析により予め決定される、請求項２に記載の予後予測方法。
【請求項４】
前記カットオフ値が、Ｄ−セリンでは５．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アスパラギンでは０．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−プロリンでは４．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アラニンでは５．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−ロイシンでは０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−リジンでは０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アロ−イソロイシンでは０．１μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸では６５．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アラニンでは４６０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−トリプトファンでは４２．４μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギンでは６７．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸では３２μｍｏｌ／Ｌである、請求項２又は３に記載の予後予測方法。
【請求項５】
前記アミノ酸の対応する異性体の量を測定する工程をさらに含み、前記指標値が、前記アミノ酸の量と対応する異性体の量との比である、請求項１に記載の予後予測方法。
【請求項６】
前記指標値が、コックス比例ハザード分析により、さらにｅＧＦＲ、尿タンパクレベル、糖尿病、年齢、性別、ヘモグロビンレベル、平均血圧、心血管事象の病歴、及び高血圧薬物治療の有無からなる群から選択される１以上の変数により調節される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の予後予測方法。
【請求項７】
記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含む予後予測分析システムであって、
入力部から、腎臓病の予後を判別するための、血中キラルアミノ酸量に基づく指標値のカットオフ値と予後情報が入力され、記憶部に記憶し、
入力部から、対象の血中キラルアミノ酸量の測定量が入力され、記憶部に記憶し、
データ処理部が、記憶されたキラルアミノ酸の測定量に基づき指標値を計算し、指標値を記憶されたカットオフ値と比較して、対象の予後情報を決定し；
予後情報を出力部に出力する
を含み、前記血中キラルアミノ酸が、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アロ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アスパラギン、及びＬ−アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である、前記予後予測分析システム。
【請求項８】
分析測定部をさらに含み、該分析測定部が、対象の血液試料から、血中キラルアミノ酸を分離して定量して測定量を決定し、入力部に代わり又は入力部を介して測定量を入力する、請求項７に記載の予後予測分析システム。
【請求項９】
前記カットオフ値が、カプランマイヤー曲線分析により予め決定される、請求項７又は８に記載の予後予測分析システム。
【請求項１０】
前記カットオフ値が、Ｄ−セリンでは５．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アスパラギンでは０．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−プロリンでは４．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アラニンでは５．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−ロイシンでは０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−リジンでは０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アロ−イソロイシンでは０．１μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸では６５．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アラニンでは４６０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−トリプトファンでは４２．４μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギンでは６７．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸では３２μｍｏｌ／Ｌである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の予後予測分析システム。
【請求項１１】
前記入力部から、前記アミノ酸の対応する異性体の量の測定量をさらに入力し、前記指標値が、前記アミノ酸の量と対応する異性体の量との比である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の予後予測分析システム。
【請求項１２】
前記指標値が、コックス比例ハザード分析により、さらにｅＧＦＲ、尿タンパクレベル、糖尿病、年齢、性別、ヘモグロビンレベル、平均血圧、心血管事象の病歴、及び高血圧薬物治療の有無からなる群から選択される１以上の変数により調節される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の予後予測分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中のＤ体及び／又はＬ体のアミノ酸量に基づき腎臓病の予後を予測する方法、並びに腎臓病についての予後予測システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、血液からの老廃物や余分な水分を濾過し、尿として排出することで、体液の恒常性を維持することを主な役割とする臓器である。腎臓は、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水などの要因により障害を受け、腎機能が低下する。腎障害により腎機能が著しく低下した場合に腎不全と呼び、腎機能低下の進行速度の違いにより、急性腎不全（ＡＫＩ）と慢性腎不全（ＣＫＤ）に大別される。
【０００３】
急性腎不全（ＡＫＩ）は、発症までの期間として数時間から数週間である腎不全をいう。急性腎不全は、虚血、薬剤、エンドトキシンショックなどの原因によって腎機能が急激に低下した状態である。急性腎不全を患う患者では、体内代謝産物である尿素窒素やクレアチニンの血中濃度上昇、電解質代謝の異常及びアシド-シスなどの症状が認められ、一般に血清クレアチニン値の急上昇により急性腎不全と診断される。急性腎不全は、治療により回復が期待されるため、より早期の急性腎不全を判別できる診断マーカーの開発が望まれている。しかしながら、診断マーカーとして一般に用いられている血清中クレアチニン濃度は、年齢、性別、筋肉量及び服用する医薬等の条件により変動するので、特異的な診断マーカーとはいえず（非特許文献１）、また好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腎障害分子（ＫＩＭ−１）、肝脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰｓ）、シスタチンＣ等のタンパク質と、ホモバニリン酸硫酸、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド等の代謝低分子化合物などが報告されているが、より早くより正確に病態を検出できる診断マーカーの開発が期待されている。
【０００４】
慢性腎不全（ＣＫＤ）は、各種腎障害により、糸球体濾過量で表される腎機能の低下があるか、もしくは腎臓の障害を示唆する所見が慢性的（３カ月以上）に持続する腎不全をいう。慢性腎不全は、日本国の成人人口の約１３％に相当する１，３３０万人が罹患する疾患であり、末期腎不全（ＥＳＫＤ）に至るリスクが高いことから国民の健康を脅かしている。慢性腎不全に有効な治療法はなく、慢性腎不全が進行して腎機能低下が進むと尿毒症の危険があり、人工透析や腎移植が必要となり、医療経済上大きな負担となる（非特許文献２）。慢性腎不全は、自覚症状がないまま病状が進行するため、慢性腎不全の早期発見及び進行抑制のためには、腎不全の早期診断マーカーによる診断が必要である。しかし、糸球体濾過量で表される腎機能の変化が起こるより早い時期から腎障害の進行を正確に反映する診断マーカーとして満足できるものは、現在の所いまだ存在しない。
【０００５】
腎臓病の予後予測やリスクの予測は、腎臓病のマーカーであるクレアチニンやシスタチンＣ値から算出された推定糸球体濾過量（eGFR)により行われているが、その精度をより高める予後予測マーカーの開発が必要とされている（非特許文献７:New england Jounral）。
【０００６】
従来、哺乳類の生体には存在しないと考えられていたＤ-アミノ酸が、様々な組織において存在することが明らかにされてきており、何らかの生理機能を担うことが予測されていた。また、血清中のＤ−アミノ酸のうち、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸の濃度が、腎不全の診断マーカーとして機能しうることが示されてきている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。さらに、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン、アロＤ−スレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−プロリン及びＤ−フェニルアラニンからなるグループから選択される１種類又は２種類以上のアミノ酸が、腎臓病の病態指標値とすることができることが開示されている（特許文献１）。しかしながら、Ｄ-アミノ酸を慢性腎障害の予後予測に使用することについては、未だ知見が得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４０７８５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｌｏｃｕｍ，  Ｊ．  Ｌ．ら、Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  １５９：２７７  （２０１２）
【非特許文献２】ＫＤＩＧＯ  ２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  １  （２０１３）
【非特許文献３】Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １８：  １１３０（１９９５）
【非特許文献４】Ｎａｇａｔａ．Ｙ  Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  Ｖｏｌ．１８（Ｎｏ．２）  （１９９０）第１５回学術講演会講演要旨集
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｄａら、北里医学  ２３：５１〜６２  （１９９３）
【非特許文献６】Ｙｏｎｇ  Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２１：（２）１５６-１６２（１９９８）
【非特許文献７】Ｓｈｌｉｐａｋ  ＭＧら、  Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１３  Ｓｅｐ  ５；３６９（１０）：９３２−４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度などの既存の腎臓病の予後予測マーカーとは、異なる腎臓病の予後予測マーカーを同定し分析する技術、並びにそれにより腎臓病の予後を正確に判定する技術の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、慢性腎不全患者を含むコホートの血液試料中のキラルアミノ酸プロファイルを解析したところ、いくつかのキラルアミノ酸により患者の予後を高い精度で予測することができることを見いだし、本発明に至った。
【００１１】
したがって、本発明は、対象における腎臓病の予後予測方法であって、
対象の血液試料中のキラルアミノ酸の量を測定する工程；及び
前記キラルアミノ酸量に基づき前記対象における腎臓病の予後を決定する工程
を含む、方法に関する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明の予後予測方法を実施することができる試料分析システムに関する。このような試料分析システムは、記憶部と、入力部と、分析測定部と、データ処理部と、出力部とを含んでおり、血液試料を分析し、予後の情報を出力することができる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明の試料分析システムにインストールされうるプログラム及び当該プログラムを格納する記憶媒体にも関する。
【発明の効果】
【００１４】
腎臓病の予後を予測することが可能とする、対象の血液試料中のキラルアミノ酸量に基づく予後予測マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−アスパラギンの量（ａ）、Ｄ−アスパラギンの量（ｂ）、及びＤ−アスパラギン／Ｌ−アスパラギン（ｃ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図２】図２は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−セリンの量（ａ）、Ｄ−セリンの量（ｂ）、及びＤ−セリン／Ｌ−セリン（ｃ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図３】図３は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−アラニンの量（ａ）、Ｄ−アラニンの量（ｂ）、及びＤ−アラニン／Ｌ−アラニン（ｃ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図４】図４は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−プロリンの量（ａ）、Ｄ−プロリンの量（ｂ）、及びＤ−プロリン／Ｌ−プロリン（ｃ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図５】図５は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−イソロイシンの量（ａ）及びＤ−アロ−イソロイシンの量（ｂ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図６】図６は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−ロイシンの量（ａ）及びＤ−ロイシンの量（ｂ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図７】図７は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−リジンの量（ａ）及びＤ−リジンの量（ｂ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図８】図８は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−アスパラギン酸の量（ａ）及びＤ−アスパラギン酸の量（ｂ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図９】図９は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−グルタミン酸の量（ａ）及びＤ−グルタミン酸の量（ｂ）を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図１０】図１０は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−トリプトファンの量を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図１１】図１１は、１０８名の腎臓病患者を含むコホートにおいて、ベースライン時のＬ−アルギニンの量（ａ）、Ｄ−アルギニンの量（ｂ）、及びＤ−アルギニン／Ｌ−アルギニン（ｃ）の量を３分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図１２】図１２は、２０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ2の以上のｅＧＦＲを有する４２名の腎臓病患者を含むコホートに分け、当該コホートにおいて、ベースライン時のＤ−アスパラギンの量（ａ）及びＤ−プロリンの量（ｂ）を２分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図１３】図１３は、２０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ2以下のｅＧＦＲを有する６６名の腎臓病患者を含むコホートに分け、当該コホートにおいてベースライン時のＤ−セリンの量を２分位に分け、その予後をカプランマイヤー解析に供した結果を示す。
【図１４】図１４は、本発明の予後予測分析システムの構成図である。
【図１５】図１５は、腎臓病の予後を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
【図１６−Ａ】図１６−Ａは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ａｓｎ値、（２）Ｄ−Ａｓｎ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ａｓｎ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｂ】図１６−Ｂは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｓｅｒ値、（２）Ｄ−Ｓｅｒ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ｓｅｒ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｃ】図１６−Ｃは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ａｓｐ値、（２）Ｄ−Ａｓｐ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ａｓｐ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｄ】図１６−Ｄは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ａｌａ値、（２）Ｄ−Ａｌａ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ａｌａ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｅ】図１６−Ｅは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｉｌｅ値、及び（２）Ｄ−アロ−Ｉｌｅ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｆ】図１６−Ｆは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｐｈｅ値、（２）Ｄ−Ｐｈｅ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ｐｈｅ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｇ】図１６−Ｇは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｌｙｓ値、（２）Ｄ−Ｌｙｓ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ｌｙｓ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｈ】図１６−Ｈは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｔｈｒ値、及び（２）Ｄ−アロ−Ｔｈｒ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｉ】図１６−Ｉは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｐｒｏ値、（２）Ｄ−Ｐｒｏ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ｐｒｏ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｊ】図１６−Ｊは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｌｅｕ値、（２）Ｄ−Ｌｅｕ値、及び（３）Ｄ／Ｌ−Ｌｅｕ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｋ】図１６−Ｋは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｔｒｐ値との相関を示す図である。
【図１６−Ｌ】図１６−Ｌは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ−Ｔｙｒ値との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る腎臓病の予後予測方法は、対象の血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を測定する工程、及び前記キラルアミノ酸の測定量と前記対象における予後との関連付けをする工程を含む。
【００１７】
キラルアミノ酸の量を測定する工程は、目的のキラルアミノ酸のみを測定してもよいし、他のキラルアミノ酸とまとめて測定することもできる。キラルアミノ酸は、腎臓病以外のマーカーにもなりうることから、複数の疾患を一度に解析する観点からは、血液試料中の２０種のタンパク質構成アミノ酸について、Ｄ体及びＬ体をまとめて測定することが好ましい。キラルアミノ酸の量を測定する工程の前に、血液試料を取得する工程、取得された血液試料を処理する工程が行われてもよい。
【００１８】
キラルアミノ酸の測定量と前記対象における予後との関連付けをする工程とは、キラルアミノ酸の測定量を用いて対象における予後とを関連づける限りにおいて任意の手法を用いてよい。キラルアミノ酸の測定量のみから関連付けを行ってもよいし、キラルアミノ酸の測定量を、任意の変数や定数で加工した指標値を用いて関連付けを行ってもよい。本発明では、指標値とは、アミノ酸の測定量であってもよいし、測定量に基づいて計算されてもよく、例えば対応する異性体（すなわち、Ｄ体ならＬ体、Ｌ体ならＤ体）との濃度比、割合等であってもよい。変数としては、対応する異性体の量の他に、年齢、体重、性別、ＢＭＩ、ｅＧＦＲなど、キラルアミノ酸量に影響しうる任意の変数を利用することができる。
【００１９】
対象の予後との関連付けをする工程は、特定のキラルアミノ酸量がカットオフ値を超えた場合に腎臓病の予後不良と関連付け、特定のキラルアミノ酸量がカットオフ値を超えない場合に腎臓病の予後良好と関連づけることができる。カットオフ値を高値側又は低値側のどちらに超えるかについては、使用するキラルアミノ酸が、腎臓病を患う場合に増加するのか減少するのかに応じて適宜選択できる。例えば、Ｄ−アミノ酸の場合、腎臓病患者では増加するため、高値群に属した場合に、腎臓病の予後不良と関連付け、低値群に属した場合に、腎臓病の予後良好と関連づけられる。対象の予後との関連付けをする工程には、高値群に属するかを決定するために、予め決定されたカットオフ値と比較する工程を含んでもよく、さらに比較結果に基づき予後を判定する判定工程を含んでもよい。
【００２０】
予後とは、罹病した場合において、その病気のたどる経過についての医学上の見通しをいうが、本発明においては、罹病していないか、又は罹病が判明していない対象についても、腎臓病のたどる経過について見通しを予測することができる。したがって、本明細書にいう対象とは、腎臓病の患者、腎臓病と未だ診断されていない対象、及び健常者を包含するものとする。このような対象には、腎臓病以外の疾患を患っている患者が含まれてもよい。
【００２１】
腎臓病の予後の予測は、将来における腎臓病に対するリスク分類又は層別化ということもできる。予後予測により予測される予後不良としては、特に限定されないが、例えば腎臓アウトカム、すなわち末期腎臓病（ＥＳＫＤ）及び死亡、が挙げられる。死亡には全死因が含まれてもよいし、より好ましくは腎臓病に関連する死因である。末期腎臓病（ＥＳＫＤ）とは、慢性腎臓病の末期状態であり、腎代替療法、例えば透析や腎移植を必要とする状態である。本発明の予後予測は、現在の罹病状態に関わらず、将来における、対象が腎代替療法の必要性や死亡を決定することができる。予後が予測される時点は任意の時点であってよく、使用するコホート及びその調査期間に応じて任意に選択することができる。予後が予測される時点としては、例えば、三ヶ月先、半年先、１年先、２年先、３年先、４年先、５年先、６年先及び１０年先からなる群から任意に選択することができる。
【００２２】
予後予測は、具体的に、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を、２又はそれ以上の群に分類し、その分類に応じて予後を予測することができる。本発明者らにより、血液中のキラルアミノ酸のうち、D-アミノ酸の量が高値になると、腎臓病の予後が悪くなることが見いだされていることから、高値群に属する場合に、予後が不良となると関連づけることができ、これにより予後予測又は予後判定される。したがって、予後予測方法は、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行うこともできる。したがって、本発明の予後予測方法は、診断の予備的方法又は補助方法と言うこともできる。
【００２３】
高値群の境界は、コホートを解析し、統計処理することで任意に決定することができる。統計処理の手法は、当業者に周知のものを使用すればよく、例えばカプランマイヤー解析、コックス比例ハザードモデルなどが用いられる。コホートの種類によって、境界を定めるカットオフ値は異なるが、一例として、本願実施例で使用したコホートをカプランマイヤー解析により、Ｄ−セリンでは５．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アスパラギンでは０．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−プロリンでは４．７μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アラニンでは５．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−ロイシンでは０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−リジンでは０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ−アロ−イソロイシンでは０．１μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸では６５．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アラニンでは４６０μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−トリプトファンでは４２．４μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギンでは６７．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸では３２μｍｏｌ／Ｌをカットオフ値として使用することができる。また、腎臓アウトカム（腎代替療法を必要とする末期腎臓病及び全死因の死亡）に至る対象では、Ｄ−アロ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、及びＤ−Ｌｙｓが観察される一方で、腎臓アウトカムに至らない対象ではほとんど観察されないことから、これらのキラルアミノ酸については検出感度以上で存在すれば、予後不良であると判定することができる。対象の血中Ｄ−アミノ酸濃度が、これらのカットオフ値より高い場合に、将来的に対象が末期腎臓病（ＥＳＫＤ）に陥るか、又は死亡する可能性が高く、予後不良であると判定することができる。しかしながら、使用されるカットオフ値を、上記カットオフ値に限定されることを意図するものではない。
【００２４】
本発明において、特定のキラルアミノ酸とは、タンパク質構成アミノ酸のＤ体又はＬ体のことをいう。Ｄ体とＬ体は体内の動態や代謝が異なるため、Ｄ体とＬ体を識別することにより高い精度で予後予測が可能となる。タンパク質構成アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。このうち、より高い精度で予後予測を可能にする観点から、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−リジン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−アロ−イソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−ｔｒｐ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、及びＬ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）が好ましい。さらにより高い精度で予後予測を可能にする観点から、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−リジン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−アロ−イソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）がより好ましい。さらにより高い精度で予後予測を可能にする観点から、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）がさらにより好ましい。
【００２５】
試料中のキラルアミノ酸量の測定は、当業者に周知でありいかなる方法を用いて実施してもよい。例えば、予めｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法により、アミノ酸のＤ−体及びＬ−体の同時測定に用いることができる。また、予め４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）のような蛍光試薬でＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割する方法が、タンパク質を構成するアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７−６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系は、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。より具体的に、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々をマルチループユニットにおいて個別に保持するステップ、前記マルチループユニットにおいて個別に保持された前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に流路を通じて供給し、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする光学異性体の分析方法を用いることにより、試料中のＤ-／Ｌ-アミノ酸濃度を測定することができる（特許第４２９１６２８号）。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ−アミノ酸を定量することができる（特開２００９−１８４９８１号）。
【００２６】
本発明では、血液試料中のキラルアミノに基づく指標値を単独で予後予測に用いてもよいし、予後予測に用いることができる他の１以上のキラルアミノ酸量に基づく指標値と組み合わせて予後予測に用いることもできる。また、本発明の予後予測方法は、さらに腎臓病に関する変数を測定する工程を含んでもよく、キラルアミノ酸量に基づく指標値と、かかる変数とを組み合わせて、予後との関連付けをすることができる。このような変数として、糖尿病の病歴、年齢、性別、ヘモグロビンレベル、平均血圧、心血管事象の病歴、及び抗高血圧薬の使用の有無が挙げられ、更には既知の腎臓病診断又は予後予測マーカーも挙げられる。このような既知の腎臓病診断又は予後予測マーカーとしては、ｅＧＦＲ、血中クレアチニン濃度、シスタチンＣ、尿タンパク質レベルなどが挙げられる。これらの変数を考慮にいれることは、統計分析の定法に基づいて実施することができる。例えばＳＴＡＴＡ統計ソフトウェアversion 11（STATA Corporation, College Station, TX, USA）において、多変量コックス回帰分析において、変数として考慮入れることができる。
【００２７】
本発明の予後予測方法で予後を予測又は判定した場合に、さらにその予後に応じて治療が行われる。以下のものに限定されるものではないが、例えば予後不良と予測又は判定された場合には、生活習慣の改善、食事指導、血圧管理、血糖値管理、脂質管理などの治療をさらに行うことが必要となる。生活習慣の改善としては、例えば禁煙やＢＭＩ値の低下のための運動が推奨される。食事指導として、高血圧の改善を目的として塩分摂取の低下が推奨される。血圧管理としては、高血圧の改善を目的として、ＡＣＥ阻害剤やＡＲＢの投与が推奨される。血糖値管理としては、ＨｂＡ１ｃの低下を目的として、インスリン投与が推奨される。脂質管理としては、ＬＤＬコレステロールの低下を目的として、高脂血症薬の投与が推奨される。これらの治療方針は、キラルアミノ酸量に基づいて、医師との問診を受けた上で決定される。したがって、本発明の別の態様では、本発明の予後予測方法を実施し、さらに腎臓病の治療行うことを含む、腎臓病の治療方法に関する。
【００２８】
腎障害の判定は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量に基づき行われる。
本発明者らにより、血液中のＤ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アロ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンからなる群から選ばれる少なくとも１のキラルアミノ酸の量が、ｅＧＦＲ値と相関することが見出されている（図４Ａ−Ｌ）ことから、これらのキラルアミノ酸量を用いて、腎障害を判別できる。より具体的には、腎障害は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を、予め分類された２又はそれ以上の群に当てはめることにより腎障害を判定でき、さらなる態様では腎障害の重篤度を判定することができる。
【００２９】
腎障害の判定のための境界も同様にコホートを解析し、統計処理することで任意に決定することができる。統計処理の手法は、当業者に周知のものを使用すればよく、例えばＲＯＣ解析、ｔ検定などが用いられてもよいし、健常者群又は患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することもできる。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。カットオフ値は１つであってもよいし、疾患の重篤度に応じて病態を分類することもできる。腎障害の判定に用いられるキラルアミノ酸としては、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アロ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンが挙げられ、それぞれのカットオフ値はコホート解析を行い任意に決定することができる。対象の血中Ｄ−アミノ酸濃度が、カットオフ値より高い場合に、腎障害と判定することができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量に基づき、ｅＧＦＲ値を決定する方法に関する。この方法では、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を測定する工程、及び当該少なくとも１のキラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程を含む。一の態様では、キラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程は、予め決定された回帰曲線に基づいて決定することができる。さらに別の態様では、キラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程は、予めコホートをキラルアミノ酸の量に応じて複数の群に分け、当該群とｅＧＦＲ値又はその範囲とが予め関連づけておき、測定値を当該群に分類すればよい。このようなキラルアミノ酸としては、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アロ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を使用することができる。
【００３１】
本発明の試料分析システム及びプログラムは、発明の予後予測方法を実施するように構成される。図１４は、本発明の試料分析システムの構成図である。このような試料分析システム１０は、記憶部１１と、入力部１２、分析測定部１３と、データ処理部１４と、出力部１５とを含んでおり、血液の試料を分析し、予後情報を出力することができる。より具体的に、本発明の試料分析システム１０において、
記憶部１１は、入力部１２から入力された腎臓病の予後を判別するための、血中キラルアミノ酸量に基づく指標値のカットオフ値と予後情報を記憶し、
分析測定部１３は、前記対象の血液試料中のタンパク質構成アミノ酸のうちの少なくとも１のキラルアミノ酸を分離して定量し、
データ処理部１４は、前記少なくとも１のキラルアミノ酸の測定量に基づき指標値を計算し、当該指標値を、記憶部１１に記憶されたカットオフ値と比較することにより、対象の腎臓病の予後情報を決定し、
出力部１５が対象の腎臓病の予後についての病態情報を出力することができる。
【００３２】
記憶部１１は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等のメモリ装置、ハードディスクドライブ等の固定ディスク装置、又はフレキシブルディスク、光ディスク等の可搬用の記憶装置などを有する。記憶部は、分析測定部で測定したデータ、入力部から入力されたデータ及び指示、データ処理部で行った演算処理結果等の他、情報処理装置の各種処理に用いられるコンピュータプログラム、データベースなどを記憶する。コンピュータプログラムは、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体や、インターネットを介してインストールされてもよい。コンピュータプログラムは、公知のセットアッププログラム等を用いて記憶部にインストールされる。
【００３３】
入力部１２は、インターフェイス等であり、キーボード、マウス等の操作部も含む。これにより、入力部は、分析測定部１３で測定したデータ、データ処理部１４で行う演算処理の指示等を入力することができる。また、入力部１２は、例えば分析測定部１３が外部にある場合は、操作部とは別に、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を介して入力することができるインターフェイス部を含んでもよい。
【００３４】
分析測定部１３は、血液試料中のキラルアミノ酸の量の測定工程を行う。したがって、分析測定部１３は、キラルアミノ酸の分離及び測定を可能にする構成を有する。アミノ酸は、１つずつ分析されてもよいが、一部又は全ての種類のアミノ酸についてまとめて分析することができる。分析測定部１３は、以下のものに限定されることを意図するものではないが、例えば試料導入部、光学分割カラム、検出部を備えた高速液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）であってもよい。分析測定部１３は、試料分析システムとは別に構成されていてもよく、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を用いて入力部１２を介して入力されてもよい。
【００３５】
データ処理部１４は、測定されたキラルアミノ酸の測定量から、指標値を計算し、得られた指標値を記憶部１１に記憶されたカットオフ値と比較することにより、腎臓病の予後を判別するように構成される。データ処理部１４は、記憶部に記憶しているプログラムに従って、分析測定部１３で測定され記憶部１１に記憶されたデータに対して、各種の演算処理を実行する。演算処理は、データ処理部に含まれるＣＰＵによりおこなわれる。このＣＰＵは、分析測定部１３、入力部１２、記憶部１１、及び出力部１５を制御する機能モジュールを含み、各種の制御を行うことができる。これらの各部は、それぞれ独立した集積回路、マイクロプロセッサ、ファームウェアなどで構成されてもよい。
【００３６】
出力部１５は、データ処理部で演算処理を行った結果である病態指標値及び／又は病態情報を出力するように構成さる。出力部１５は、演算処理の結果を直接表示する液晶ディスプレイ等の表示装置、プリンタ等の出力手段であってもよいし、外部記憶装置への出力又はネットワークを介して出力するためのインターフェイス部であってもよい。
【００３７】
図１５は、本発明のプログラムによる予後を決定するための動作の例を示すフローチャートであり、図１５は、本発明のプログラムによる予後情報を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
具体的に、本発明のプログラムは、入力部、出力部、データ処理部、記憶部とを含む情報処理装置に予後情報を決定させるプログラムである。本発明のプログラムは、以下の：
入力部から入力された少なくとも１のキラルアミノ酸の予め決定された指標値のカットオフ値と予後情報を記憶させ；
入力部から入力された少なくとも１のキラルアミノ酸の量の測定値を記憶部に記憶させ、
データー処理部において、記憶部に記憶させた測定値に基づき指標値を計算し、当該指標値と記憶部に記憶されたカットオフ値とを比較させて、予後情報を決定し；
予後情報を記憶部に記憶させ、そして
記憶された予後情報を出力部に出力させる
ことを前記情報処理装置に実行させるための指令を含む。本発明のプログラムは、記憶媒体に格納されてもよいし、インターネット又はＬＡＮ等の電気通信回線を介して提供されてもよい。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、本発明は、本発明のｅＧＦＲ値を決定する方法を実行するｅＧＦＲ値の決定システムにも関する。このシステムは、記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含み、以下の：
入力部から、ｅＧＦＲ値を判定するための血中キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量と、ｅＧＦＲ値との回帰曲線又はカットオフ値が入力され、記憶部に記憶し、
入力部から、対象の血液試料中のキラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量の測定値が入力され、記憶部に記憶し、
データ処理部が、記憶された前記アミノ酸の量の測定値と、前記回帰曲線又はカットオフ値とに基づいて、対象のｅＧＦＲ値を決定し；
ｅＧＦＲ値を出力部に出力する
ことができる。
【００３９】
情報処理装置が、分析測定部を備える場合、入力部から少なくとも１のキラルアミノ酸の量の値を入力させる代わりに、分析測定部が、血液試料からキラルアミノ酸を分離して測定し、測定値を記憶部に記憶させることを情報処理装置に実行させるための指令を含んでもよい。
【００４０】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００４１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
集団及びサンプルの分析
本発明者らは、２００５年８月〜２００９年１月にわたり、りんくう総合医療センター（Rinku General Medical Centre）の第一腎臓内科から、透析を受けていないＣＫＤステージ３、４及び５を患う１１８名の継続患者を、前向き調査に登録した。一晩の絶食後に、患者からベースライン血液試料を取得し、プラスチック製チューブに入れて血漿を調製した。不十分な血液試料しか取得できなかった患者を先んじて取り除いた。
本試験は、りんくう総合医療センターの倫理委員会により承認された試験であり、そしてヘルシンキ宣言に基づいて行われた。
【００４３】
ベースラインの包含基準は、年齢９０歳未満、悪性腫瘍についての合併症無し、及び感染症への感染無しとした。不完全なベースラインデータしか得られなかった患者（ｎ＝２）又は不十分な量の血漿試料しか取得できなかった患者（ｎ＝４）、及び登録後１月以内に腎代替療法を開始した患者（ｎ＝４）を取り除いた。本試験は、りんくう総合医療センターの施設内倫理委員会及び大阪総合医療センターにより承認され、そして全ての患者に対して、本試験に参加することについて記入式のインフォームドコンセントを得た。腎機能は、日本人に対して新たに開発された等式に基づいて推定糸球体濾過量（eGFR)を使用して、本医院を最初に受診した際のベースラインデータから評価した。
式は以下の通りである：
【数１】
2017207489.tif 000003
｛式中、年齢の単位は年であり、ＳＣｒの単位はｍｇ／ｄＬであり、そして糸球体濾過量（ＧＦＲ）の単位は、ｍＬ／min/1.73m2体表面である｝。
女性患者には、数式の計算値に補正係数０．７３９をかけた。
【００４４】
血清クレアチニンを、同施設内の酵素方法により計測した。ランダムな尿試料（１０ｍｌ）をベースライン決定時に回収して、尿タンパクとクレアチニンの比率を測定した。ベースラインにおける他の変数は、年齢、性別、国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ１０）のコードＥ１０〜Ｅ１４に従って定義される糖尿病、収縮期血圧、拡張期血圧、ヘモグロビン、及びレニン-アンギオテンシ系阻害剤、βブロッカー、及びカルシウムブロッカーの使用であった。患者のベースライン特徴は以下のとおりである：
【表１】
2017207489.tif 000004
【００４５】
本試験において「腎臓アウトカム（kidney outcome）」として定義される最初のエンドポイントは、腎代替療法を必要とする末期腎臓病（ＥＳＫＤ）と、全死因死亡の合計とした。患者は、外来で通常のフォローアップケアを受けた。データーを、２０１１年末にソース文書として回収した。ベースライン及びフォローアップデータを、病院の医療記録及び退院サマリー、外来記録、初診及び透析ケア医師との面会、及び死亡診断書から回収した。エンドポイントは、少なくとも２名の医師により確認された。患者のフォローアップは、正確に利用できた。なぜなら（i)本施設が、大阪府の南部の中央病院であり、そしてこの地方に他の中央病院が無いこと、及び（ii)初診及び透析ケアの医師との地域的パートナーシップが良好であったからである。
【００４６】
サンプル調製
ヒト血漿からのサンプル調製は、Journal of Chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 966, 187-192 (2014)の記載に従い改変して行った。簡潔に記載すると、２０倍量のメタノールを血漿に加え、そして一定量（メタノールホモジネートから得た１０μｌの上清）を、褐色管にとり、そしてＮＢＤ誘導化した（０．５μｌの血漿を反応に用いた）。溶液を減圧下で乾燥し、２０μｌの２００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び５μｌの蛍光標識試薬（４０ｍＭの４-フルオロ-７-ニトロ２，１，３-ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）をいれた無水ＭｅＣＮ）を加え、次に６０℃で２分間加熱した。０．１％ＴＦＡ水溶液（７５μｌ）を加え、そして２μｌの反応混合液を２Ｄ-ＨＰＬＣに供した。
【００４７】
２Ｄ-ＨＰＬＣによるアミノ酸エナンチオマーの測定
アミノ酸のエナンチオマーを、J Chromatogr A 1217, 1056-1062 (2010)やJournal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 877, 2506-2512 (2009)に記載される通りに、マイクロ２Ｄ-ＨＰＬＣプラットフォームを用いて定量した。簡潔に記載すると、アミノ酸のＮＢＤ-誘導体を、逆相カラム（モノリシックＯＤＳカラム、０．５３ｍｍi.d.×１００ｍｍ；資生堂）を用い、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ及びＴＦＡを含む水性移動相を用いて勾配溶出した。Ｄ体及びＬ体を分離して測定するために、標的アミノ酸の画分をマルチループバルブを用いて自動的に回収し、そしてエナンチオ選択カラム（ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ又はＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ｏＡ−３２００，  １．５ｍｍi.e. ×２５０ｍｍ；自己充填、材料を資生堂及びSumika Chemical Analysis Serviceから取得した））に供した。４種の立体異性体（Ｌ体、Ｄ体、Ｌ-アロ体、Ｄ-アロ体）を有するＩｌｅやＴｈｒの計測には、Ｌ体及びＤ体と、ジアステレオ異性体（Ｌ-アロ体及びＤアロ体）とを第一次元の逆相モードにより分離した（これらのジアステレオ異性体は、逆相モードで分離される）。次にそのエナンチオマー（ＬとＤ、Ｌ−アロとＤ−アロ）をエナンチオ選択カラムにより二次元で分離した。移動相は、クエン酸又はギ酸を含むＭｅＯＨ-ＭｅＣＮの混合溶液であり、そしてＮＢＤ-アミノ酸の蛍光を、４７０ｎｍで励起し、５３０ｎｍで検出した。全ての定量データを蛍光検出により取得した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、実際の生物的マトリクス中のＤ-アミノ酸の存在を確認した。
【００４８】
統計処理
連続変数は、中央値と範囲として、又は四分位範囲（ＩＱＲ）として示した。不連続なデータは、カウント及び比（％）として与えた。代謝物は、中央値（四分位）として示した。相関は、スピアマンランク回帰分析を用いて評価した。複数のＣｏｘ比例ハザードモデルを作成して、ベースラインの特性で調節することにより、代謝物の診断的役割を評価した。ログランク検定を用いて、中央値により層別化された生存分布の同等性を評価した。統計的有意差をＰ＜０．０５で定義した。統計分析をＳＴＡＴＡ統計ソフトウェアversion 11（STATA Corporation, College Station, TX, USA）を用いて行った。
【００４９】
結果
コホートのアミノ酸メタボロームプロファイル
本発明者らは、ＣＫＤ患者からなる長期コホートに対してキラルアミノ酸メタボロームプロファイリングを行った。フォローアップ期間の中央値が４．３年（四分位範囲、２．４〜５．５年）である１０８名の参加者からデータが生成された。フォローをやめた患者はいなかった。ベースラインの特徴を表１に示す。これらの患者のうち、５８名が腎代替療法を開始し、そして１５名が死亡し、そのうち４名が腎代替療法を開始前に死亡した。このコホートについて、２次元ＨＰＬＣ法を用いてキラルアミノ酸メタボロームプロファイリングを行った。このシステムは、内因性の物質からの重大な干渉を伴わずに、キラル選択性をもって、タンパク質構成アミノ酸のエナンチオマーを約１ｆmol〜１００ｐmolの範囲で検出を可能にする。実験間の相対標準偏差（ｎ＝４）は、１．１０〜８．１９％であった。ヒト血漿サンプルを分析する際の再現性を考慮して、幾つかのサンプルを用いて二回の分析を行い、そしてほとんど同じ結果を得た。幾つかのＤ体アミノ酸をエナンチオ選択２Ｄ-ＨＰＬＣ分析により、ＣＫＤ患者の血漿において観察した。Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｒｏ、及びＤ−Ａｓｎが、多くの患者において検出された（８９〜１００％）、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−アロ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｒｇ及びＤ−Ｈｉｓを１０〜４０％の患者で検出し、そしてＤ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、及びＤ−アロ−Ｉleが散発的に検出された（１０％未満の患者で検出）。注釈として、このコホートで検出されたアロ−Ｔｈｒは、Ｄ−アロ−Ｔｈｒのみからなった。生体では、α炭素の変換が主に生じており、Ｄ−アロ体が、Ｌ−Ｔｈｒ及びＬ−Ｉｌｅから生じる。その結果、Ｄ−アロ体は、これらの二つのアミノ酸のＤ体よりも多くなる。
【００５０】
キラルアミノ酸と、臨床パラメーターとの相関
本発明者らは、臨床パラメーターとキラルアミノ酸との間のベースラインとの相関を評価した。Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｐｒｏ、及びＤ−Ａｓｎのレベルが、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と強い逆相関性を示した。一方他のＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｐ、及びＤ−アロ−Ｔｈｒは弱い相関性を示した。特筆すべきは、Ｌ−Ｓｅｒのレベルが、ｅＧＦＲと正の相関を示し、したがってＤ／Ｌ-Ｓｅｒが、ｅＧＦＲとさらに強い相関を示した（図１６Ａ−Ｌ）。
【００５１】
腎臓アウトカムとキラルアミノ酸の相関
カプランマイヤー曲線分析により、多く検出されるＤ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｒｏ、及びＤ−Ａｓｎの全てを高いレベルで有する患者が、腎臓アウトカム（腎代替療法を必要とする末期腎臓病及び全死因の死亡）に、他の群の患者と比較してより高頻繁に達することが示された（図１〜図４）。患者を腎機能により分けた場合、腎臓アウトカムの分離は、２０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ2のｅＧＦＲを有する患者のＤ−Ａｌａ及びＤ−Ｐｒｏにいて見られたが（図３及び図４）、同様の結果がＤ−Ｓｅｒ及びＤ−Ａｓｎにおいても見られた（図２及び図１）。あまり検出されていないＤ−アミノ酸（Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、及びＤ−アロ-Ｉｌｅ）の幾つか、並びに幾つかのＬ-アミノ酸（Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｔｒｐ、及びＬ−Ｌｙｓ）も、腎臓の予後を分離した（図５〜図１３）。
【００５２】
本発明者らは、多変量（multiple）コックス回帰分析を行い、多く検出されるＤアミノ酸と腎臓アウトカムとの相関を評価した。測定量を調節せずに用いたコックス分析では、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｒｏの最も高い三分位に属する患者は、最も低い三分位に属する患者と比較して、腎臓アウトカムについて３．０５−５．６８倍高いハザード比を有した（表２、未調節モデル）。Ｄ−Ｓｅｒ及びＤ−Ａｓｎの最も高い三分位に属する患者は、最も低い三分位に属する患者と比較して、腎機能や尿タンパク質レベルで調節後の腎臓アウトカムについて２．７〜３．７倍高い調節ハザード比を有した（表２、モデル１）。これらの発見は、Ｄ−アミノ酸のレベルについて幾らかの影響を与える年齢や糖尿病の有無などの併存疾患でさらに調節させた場合も同じであった（表２モデル２）。したがって、これらのＤ−アミノ酸は、ＣＫＤ患者における腎臓病の進行に関連した。
【表２】
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【図１】
2017207489.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−Ａ】
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【図１６−Ｂ】
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【図１６−Ｃ】
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【図１６−Ｄ】
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【図１６−Ｅ】
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【図１６−Ｆ】
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【図１６−Ｇ】
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【図１６−Ｈ】
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【図１６−Ｉ】
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【図１６−Ｊ】
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【図１６−Ｋ】
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【図１６−Ｌ】
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