(57)【要約】【課題】検体に含まれる細菌を検出する方法であって、細菌の細胞内抗原を免疫測定に供するものであり、様々な細菌において簡易に、精度よく実施可能な方法を提供する。【解決手段】検体に含まれる細菌を検出する方法であって、該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、を含み、該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる細菌を検出する方法であって、
該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、
該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。
【請求項２】
前記免疫測定法が免疫クロマトグラフィー法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検体が上気道検体である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記上気道検体が咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰のいずれかである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記中和物のｐＨが１０．０以下である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記中和液が、該偽陽性反応の抑制上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
検体に含まれる細菌を検出するキットであって、
該キットが、
該検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、中和物が供され、細胞内抗原を検出するための免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌の細胞内抗原に対する抗体を含む、
検出キット。
【請求項１４】
前記免疫測定装置が免疫クロマトグラフィー装置である、請求項１３に記載の検出キット。
【請求項１５】
前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、請求項１３又は１４に記載の検出キット。
【請求項１６】
前記検体が上気道検体であって、前記検体を採取するための用具をさらに含む、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項１７】
前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項１８】
前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項１９】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、請求項１８に記載の検出キット。
【請求項２０】
前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２１】
前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２０に記載の検出キット。
【請求項２２】
前記中和液が中和物のｐＨを１０．０以下にするものである、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２３】
前記中和液が、該偽陽性反応上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、請求項１３から２２のいずれか１項に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれる細菌を、細胞内抗原を利用して免疫測定法で検出する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染症は、通常、感染部位等における原因菌の検出、又は血液もしくは体液中の原因菌に対する抗体の検出結果に基づいて診断される。特に、この診断のためには、原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
【０００３】
感染症原因菌の検出には、原因菌の分離培養を経てその生化学的性状をもとに該原因菌の同定を行う培養法、原因菌に特異的な遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子法、原因菌の表面抗原マーカー等と抗体との特異的反応を利用して原因菌検出を行う免疫法に大別できる。しかしながら、培養法及び遺伝子法は検出結果を得るまでに時間がかかるので、短時間にしかも高感度に原因菌を検出できる免疫法が、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で利用価値が高い。従来の免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
【０００４】
特許文献１は、種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬装置を提案する。この中では、各種の微生物について細胞内のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて微生物を検出している。特許文献２は、呼吸器感染症の原因菌のひとつであるクラミジア・ニューモニエに属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応する抗体を用いて、クラミジア・ニューモニエに属する細菌を他の属の細菌と識別する方法を提供する。特許文献３は、細菌の一種であるマイコプラズマ・ニューモニアをリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて検出する方法について述べており、この中でリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２のような菌体内（細菌の細胞内）に存在する抗原の検出にはマイコプラズマ・ニューモニア自体に前処理を施し破砕することが必須であるとされている。またこの文献の中で引例として参照されている特許文献４は、多剤耐性ブドウ球菌の抗原を作成する方法について述べており、この中でブドウ球菌をｐＨ１１以上の抽出液に晒すことで抗原が得られるとしている。また特許文献５は、ミュータンス連鎖球菌の同定・定量をするための唾液の前処理キットとして、水酸化ナトリウムを含有する水溶液(Ａ)と、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液(Ｂ)と、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤(Ｃ)とから構成され、界面活性剤(Ｃ)が、水溶液(Ａ)及び／又は緩衝液(Ｂ)に予め混合されているか、又は水溶液(Ａ)及び緩衝液(Ｂ)とは別になっていることを特徴とする唾液の前処理用キットを提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報（特許第５２１９０７５号）
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／０６７０８９号公報
【特許文献３】特開２０１４−１６７４３９号公報
【特許文献４】特開平１０−７８３８２（特許第３６３８７３１号）
【特許文献５】特開２００２−３５７５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、検体に含まれる細菌を検出する方法であって、細菌の細胞内抗原を免疫測定に供するものであり、様々な細菌において簡易に、精度よく実施可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のような細胞内抗原は、細菌の細胞内に存在するため、測定に利用するためには検体に含まれる細菌の細胞内からタンパク質を抽出する処理が必要となる。その方法の一つとして、特許文献４ではアルカリ性の抽出液に細菌を晒す方法が挙げられている。この方法で得た抽出液を免疫測定法に供する際には、抽出液のｐＨを中性（抗原抗体反応が働く範囲）に調整する必要がある。一方、本発明者らの検討によると、検体をアルカリ性の抽出液に晒すと、その際に生じた成分がその後につづく抗体を用いた免疫測定法において偽陽性反応を引き起こすことが新たにわかった。そこで本発明者らは、アルカリ溶液を抽出に用いる場合には、偽陽性反応を抑制するために有効な手段を講じることにより、細菌を精度よく検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は以下を提供する。
［１］検体に含まれる細菌を検出する方法であって、
該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、
該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。
［２］前記免疫測定法が免疫クロマトグラフィー法である、１に記載の方法。
［３］前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、１又は２に記載の方法。
［４］前記検体が上気道検体である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記上気道検体が咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰のいずれかである、４に記載の方法。
［６］前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、１から５のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、１から６のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、７に記載の方法。
［９］前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、１から９のいずれか１項に記載の方法。
［１０］前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、９に記載の方法。
［１１］前記中和物のｐＨが１０．０以下である、１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［１２］前記中和液が、該偽陽性反応の抑制上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、１から１１のいずれか１項に記載の方法。
［１３］検体に含まれる細菌を検出するキットであって、
該キットが、
該検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、中和物が供され、細胞内抗原を検出するための免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌の細胞内抗原に対する抗体を含む、
検出キット。
［１４］前記免疫測定装置が免疫クロマトグラフィー装置である、１３に記載の検出キット。
［１５］前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、１３又は１４に記載の検出方法。
［１６］前記検体が上気道検体であって、前記検体を採取するための用具をさらに含む、１３から１５のいずれか１項に記載の検出キット。
［１７］前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、１３から１６のいずれか１項に記載の検出キット。
［１８］前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、１３から１７のいずれか１項に記載の検出キット。
［１９］前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、１８に記載の検出キット。
［２０］前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、１３から１９のいずれか１項に記載の検出キット。
［２１］前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、２０に記載の検出キット。
［２２］前記中和液が中和物のｐＨを１０．０以下にするものである、１３〜２１のいずれか１項に記載の検出キット。
［２３］前記中和液が、該偽陽性反応上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、１３から２２のいずれか１項に記載の検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、検体に含まれる細菌を精度よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】イムノクロマトグラフィー装置の一例を示す断面模式図である。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材、６は細菌の細胞内抗原に対する抗体が固定された捕捉部位（判定部）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の方法は、検体に含まれる細菌を検出する方法であって、該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、を含み、該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、方法を提供する。
なお、「検出する」とは、細菌の存在の有無又はその量を分析することをいう。したがって、検出の結果、細菌が検出されなかった場合も、検出された場合と同様、本発明の方法の実施に該当する。
【００１２】
［検体について］
本発明において用いられる検体は、ヒトの生体の任意の場所から採取することができ、細菌を含む可能性があるものであればよい。好ましくは上気道から採取された検体であり、より好ましくは咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰等である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、唾液、喀痰は綿棒を用いて採取することができ、また鼻腔吸引液は吸引カテーテルを用いて採取することができる。
検体には測定対象である細菌以外にも様々な物質が含まれている。例えば咽頭ぬぐい液にはヒト由来の組織片や分泌物の他、検出対象である細菌以外の細菌等の組織が含まれている場合がある。これらの一部は検体を処理した溶液中に浮遊又は溶解した状態で存在する。
これらを含んだ状態で免疫測定法、特に免疫クロマトグラフィー法による測定に供すると、非特異反応により偽陽性が発生する場合がある。
【００１３】
［細胞内成分の抽出］
細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に代表されるような、細胞内抗原を免疫測定法等で検出する場合には、該タンパク質が細胞内に存在することから、細胞を覆っている外膜等を破壊して該タンパク質を露出させる必要がある。
本発明者らは、検討の結果、細菌をアルカリ溶液で処理することで、簡易に細胞内成分であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を抽出できることを見出した。
【００１４】
［抽出液］
本発明で用いることができるアルカリ溶液として、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の、第１族元素又は第２族元素の水酸化物の水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは１１．０〜１３．５であることが好ましい。アルカリ金属の濃度は、５〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭとすることができる。
【００１５】
また、本発明はアルカリ溶液と同時に陰イオン性界面活性剤を用いることができる。陰イオン性界面活性剤は、細胞膜を可溶化する働きがあるので好ましい。本発明で使用できる陰イオン性界面活性剤は、細菌の外膜を破壊することができる限り特に限定されないが、好ましい例として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムを挙げることができる。なかでもコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムがより好ましい。
【００１６】
本発明の陰イオン性界面活性剤はアルカリ溶液に対して０．１％〜２．０％添加することが好ましく、０．３％〜１．０％添加することがより好ましい。濃度が低いと期待される効果が十分に得られない可能性があり、また濃度が高いと特異性（抗原と抗体の反応）を阻害したり、逆に非特異的な反応を誘発・促進したりする場合がある。
【００１７】
必要に応じ陰イオン性界面活性剤を含んだアルカリ溶液と検体との接触は、環境温度において行うことができ、必要に応じ、タンパク質等の成分の劣化がより生じにくい冷却条件下で行ってもよい。接触は、細胞内抗原が十分抽出できる時間、例えば数秒〜数時間行うことができ、接触の際には必要に応じ、撹拌、振とうを行ってもよい。
【００１８】
［中和液について］
本発明では、検体に含まれる細菌の細胞内成分であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を、アルカリ溶液を用いて抽出できることを先記した。この抽出液を免疫クロマトグラフィー法に直接用いると免疫クロマトグラフィー法で用いる抗体が変性してしまい、検出することができない。そこで免疫クロマトグラフィー法で測定する前に抽出液のｐＨを中和することが好ましい。
【００１９】
中和後のｐＨは、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体が適切に機能する範囲であれば特に限定はされないが、本発明者らの検討によると、ｐＨは、１０．０以下とすることができ、９．８以下であることが好ましい。ｐＨ値が１０を超えると、抗体が変性する恐れがあるからである。ｐＨの下限値は、主として中和液に含まれる緩衝液の能力によって定まる。中和後のｐＨは、例えば６．９以上、ｐＨ７．０以上、又はｐＨ７．２以上であり得る。
【００２０】
ところで、本発明者らの検討では、検体をアルカリ溶液に接触させた後、特定の条件で中和して得た中和物を免疫測定法で測定した場合、偽陽性反応が発生することが新たに判った。検体をアルカリ溶液で処理することで、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体と非特異反応を起こす成分が生じたものと推測される。また、このような偽陽性反応は、検体が咽頭ぬぐい液以外でも鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰でも同様に生じた。
【００２１】
そのため、本発明者らは本発明の方法においては、この偽陽性反応を抑制する手段を講じることが有効であることを見出した。本発明においては、中和液は、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む。「偽陽性反応抑制上有効」とは、検体をアルカリで処理する際に発生する偽陽性反応を防止又は低減する効果があることをいう。偽陽性反応抑制上有効な手段は、当業者であれば予備実験を行い、適宜既存の手段（例えば、緩衝液）の中から、試行錯誤を要さず選択することができる。既存のものから選択するというこの行為自体は一般的であるが、本発明で用いる検体がアルカリ処理すると偽陽性を示すことは本発明者らによって初めて確認されたものであり、その偽陽性反応の抑制が、特定の緩衝液等によって達成できることも本発明者らによって初めて発見されたものである。偽陽性反応は、本発明者らの検討によるとアルカリ溶液と検体が接触することで生じ、アルカリ溶液中の陰イオン性界面活性剤の有無には関わらない。偽陽性反応抑制上有効な手段が講じやすいとの観点からは、抗体として、細胞内抗原に対する抗体を用いることが好ましく、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を用いることがさらに好ましい。偽陽性反応抑制上有効な手段の例は、検出対象となる細菌がクラジミア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、又はヘモフィルス・インフルエンザであり、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する場合、中和液がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含むことである。このような中和液を用いることで、検体がアルカリ溶液と接触することで生じる成分に起因する偽陽性反応を抑制し、高い検出精度を達成することが可能となる。
【００２２】
また、本発明の中和液には、緩衝液の他に非イオン性界面活性剤を添加することもできる。非イオン性界面活性剤を添加することで、後工程の免疫クロマトグラフィー法で試験液の流れ性が向上する。
【００２３】
本発明で中和液に添加して用いることができる非イオン性界面活性剤は、免疫クロマトグラフィー法で溶液の展開性を向上せしめるものであればよく、具体的には例えば、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートなどを用いることが可能であり、中でもポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテルが好ましい。
【００２４】
アルカリ溶液による検体抽出物と中和液との接触は、環境温度において行うことができ、必要に応じ、タンパク質等の成分の劣化がより生じにくい冷却条件下で行ってもよい。接触は、中和に必要な時間、例えば数秒〜数時間行うことができ、接触の際には必要に応じ、撹拌、振とうを行ってもよい。
【００２５】
［方法、装置及びキットについて］
本発明の方法は、免疫測定法により、細菌の細胞内抗原を検出するものである。本発明に用いられる免疫測定法には特に限定はなく、例えば、免疫クロマトグラフィー法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、又は蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）などを挙げることができる。
【００２６】
［免疫クロマトグラフィー装置及びキットについて］
本発明の方法は、好ましい態様の一つにおいて、免疫クロマトグラフィー法（「免疫クロマト法」ということもある）を利用した装置又はキットを用いる。キットは、免疫クロマトグラフィー装置を含み、それ以外に、検体と接触させ、検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液、及び／又は検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液を含んでいてもよい。アルカリ溶液及び中和液については、上述した。キットはさらに、検体を採取するための用具、例えば綿棒、及び／又は吸引カテーテルを含んでいてもよい。
【００２７】
免疫クロマトグラフィー装置は、細菌の有無を判定するための判定部を有し、判定部上には抗原である細菌の細胞内抗原、例えばリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体が固定される。キット又は免疫クロマトグラフィー装置は、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いるサンドイッチアッセイ（「サンドイッチ免疫アッセイ」ということもある。）を利用したものでもよい。
【００２８】
より詳細には、抗原である細菌の細胞内抗原は、判定部に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体と、判定部に固定化された抗体とを用いてサンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは、標識された抗原と、判定部上に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
【００２９】
図１に、免疫クロマトグラフィー装置の例の、断面模式図を示した。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示す。６は細菌の細胞内抗原と反応する抗体が固定された判定部であり、ここに抗原である細菌の細胞内抗原が捕捉されることから、捕捉部位ということもある。
【００３０】
免疫クロマトグラフィー装置は、公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。以下のその具体例を示す。
【００３１】
［基材について］
装置基材としては、水溶液と界面を形成することが可能な固体、ならびにそれらの表面を改質してなる固体である。基材の材質としては、入手のしやすさや安定性、安全性、成形性及び滅菌性に優れるという点でポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子自体ならびにそれを架橋した構造体や改質した構造体、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属を用いることができる。中でも合成高分子や天然高分子誘導体が好ましい。また基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、３次元成型体（ブロック状）等で用いることができ、中でも平板が好ましい。
【００３２】
［標識抗体、及び標識抗体含浸部材について］
標識抗体含浸部材には標識化された抗体が保持されている。標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子（金コロイド粒子、白金コロイド粒子ということもある。）、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられ、好ましくは金コロイド粒子であるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。
標識抗体含浸部材に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等であり、より好ましくはガラス繊維である。
【００３３】
［クロマト展開用担体について］
クロマト展開用担体に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
【００３４】
［判定部について］
前述したクロマト展開用担体には判定部を設けてあり、ここには細菌の細胞内抗原に結合する抗体が固定化されている。この判定部（すなわちクロマト展開用担体）への抗体の固定化においては、基材表面に抗体分子が直接結合していてもよいし、又は活性基を介して結合していてもよい。基材から抗体分子又は活性基が基材表面に固定化された状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合又は疎水結合の単独又はこれら複数の合力があげられる。特に抗体溶液と基材表面との単純な接触による物理的な吸着法は、簡便で本発明に特に好適に用いられる。また抗体の吸着後に基材表面を洗浄や乾燥させること、あるいは基材表面に抗体溶液を塗布後に水分を蒸発せしめて基材表面に抗体を固定化する方法も、本発明に極めて好適に使用することができる。
【００３５】
検体に含まれる細菌の細胞内抗原が、前述した標識化された抗体と結合しながらクロマト展開用担体を展開した後、判定部にて標識化された抗体とは異なる部位で結合する抗体と抗原を挟んでサンドイッチを形成することにより、細菌の細胞内抗原を検出できる（サンドイッチアッセイ法）。
なお、判定部に固定化された抗体と、標識化された抗体は、いずれも細菌の細胞内抗原と反応する抗体であり、１つの該タンパク質に同時に結合できることができる抗体である。したがって一方の抗体が結合するエピトープは、他方の抗体が結合するエピトープとは異なることが好ましい。
また、判定部に標識された抗原が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる（競合アッセイ法）。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましい。
【００３６】
［抗体の作製方法］
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが好ましくはモノクローナル抗体である。
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体は、国際公開第００／０６６０３号公報（前掲特許文献１）に記載の方法で作製することができる。抗体は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、又はキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、特定の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応し、特定の細菌とは異なる種に属する細菌、又は異なる属に属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合も、同様に抗体を作成することができる。なお以下では、本発明を、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する態様を例に説明することがあるが、その説明は、当業者であれば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合にも適宜あてはめて理解することができる。
【００３７】
本発明では検体に含まれる細菌が抗体を用いて検出される。ここで用いられる抗体は、該細菌の細胞内抗原、例えばリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と種特異的又は属選択的に反応する抗体である。ここで、「種に特異的」とは、該細菌が属するある特定の種の細菌とのみ反応し、該細菌が属する属以外の、他の属に属する細菌、並びに該細菌が属する属の、上記特定の種以外の種の細菌とは反応しないことを意味する。また、「属に選択的」とは、該細菌が属する属の一部又はすべての細菌とのみ反応し、該細菌が属する属以外の他の属に属する細菌とは反応しないことを意味する。
【００３８】
本態様で用いる抗体は、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができる。細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列は公知である。
例えば、クラミジア・ニューモニエではＷＯ０１／０５７０８９に記載されており、レジオネラ・ニューモフィラでは特開２００４−２０１６０５に記載されている。また、ヘモフィルス・インフルエンザではＷＯ００／０６６０３に記載されている。
【００３９】
本態様で用いる細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体は、以下のａ）又はｂ）記載の方法、あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００４０】
ａ）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は公知であるため、他のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が公知な微生物における該タンパク質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００４１】
ｂ）また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他のタンパク質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョンタンパク質として用いたタンパク質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現タンパク質を精製することにより目的とするタンパク質抗原を取得することができる。
【００４２】
この場合、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質が抗原となるため、異なる微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。したがって、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００４３】
抗原となるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の精製度が不足している場合は、公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後、すでに作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の溶出画分を同定しさらに精製度の高いタンパク質を得ることができる。得られた精製細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を取得し、同様に目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【実施例】
【００４４】
［実施例１：免疫測定用キットの作製］
（抗体の準備）
例としてクラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体の作製方法を述べる。なお、他の細菌についても同様の手順でリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を作製することが可能である。
【００４５】
クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体は国際公開第０１／０５７０８９号公報に記載の方法で作製することができる。具体的には、例えば、クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列の全部又は一部をコードしたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで形質転換した大腸菌をＬＢ培地等を用いて培養し、アフィニティカラムにより発現ベクター由来のタグ配列を利用して融合タンパク質として精製する。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質を必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種する。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にモノクローナル抗体を得る場合にはマウスが好ましい。マウスの脾臓細胞を摘出して骨髄腫細胞と細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ法等を用いて選別し、クラミジア・ニューモニエと特異的に反応するモノクローナル抗体を取得する。
なお他の細菌についても上述した方法を用いてリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を作製することができる。
【００４６】
（免疫クロマトグラフィー装置の作製）
例としてクラミジア・ニューモニエ用免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置）の作製手順を下記に述べる。なお他の細菌についても同様の手順で免疫クロマトグラフィー装置を作製することが可能である。
【００４７】
＜クロマト展開用膜担体の作製＞
クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体及びトレハロースをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌ及び３％（ｖ／ｖ）となるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に希釈した。これを、市販のニトロセルロース膜を幅２．５ｃｍ、長さ３０ｃｍにカットしたものに１ｃｍあたり１μｌ液量で塗布し、その後乾燥させて、クロマト展開用膜担体とした。
【００４８】
＜金コロイド標識抗体及び標識抗体含浸部材の作製＞
金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）に１／１０量の０．１Ｍ感作Ｂｕｆｆｅｒとクラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を加えて混合し、室温で３０分間静置して抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が０．１％となるように１％ウシ血清アルブミン水溶液を加えてブロッキングし、金コロイド標識クラミジア・ニューモニエ・リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体液を調製した。
この液を市販のガラス繊維シートに浸み込ませた後、湿度０〜６０％の乾燥庫にて一晩乾燥させて、標識抗体浸潤部材とした。
＜免疫クロマトグラフィー装置の組み立て＞
上述した手順で作製したクロマト展開用膜担体及び金コロイド標識抗体含浸部材に加えて、さらに試料添加用部材として綿布と、吸収用部材として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材に貼り合せた後、６ｍｍ幅に切断し、図１と同様の免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
【００４９】
［実施例２：抽出液の調製］
５０ｍＭ水酸化ナトリウム（和光純薬）にコール酸ナトリウム（和光純薬）を０．５％濃度になるように溶解した。
【００５０】
［実施例３：中和液の調製１］
リン酸水素二カリウム（和光純薬）３４．８４ｇを蒸留水に溶解して４００ｍｌにメスアップし０．５Ｍリン酸水素二カリウム水溶液とした。さらにリン酸二水素カリウム（和光純薬）１７．０１ｇを蒸留水に溶解して２５０ｍｌにメスアップし０．５Ｍリン酸二水素カリウム水溶液とした。これらを混合して０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を調製した。
ビーカーに塩化ナトリウム（和光純薬）０．５８ｇ、ウシ血清アルブミン０．２５ｇ（ＳＩＧＭＡ）、アジ化ナトリウム（和光純薬）０．０２５ｇ、ＰＢＣ−４４（日光ケミカルズ）０．５ｇをそれぞれ量りとり、上記の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して５０ｍｌにメスアップした（中和液(1)）。
【００５１】
最終組成は下記のとおりである。
中和液(1)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．５Ｍ  リン酸Ｋ／ｐＨ６．８
【００５２】
［実施例４：中和液の調製２］
ビーカーに塩化ナトリウム（和光純薬）０．５８ｇ、ウシ血清アルブミン０．２５ｇ（ＳＩＧＭＡ）、アジ化ナトリウム（和光純薬）０．０２５ｇ、ＰＢＣ−４４（日光ケミカルズ）０．５ｇをそれぞれ量りとり、４０ｍｌの蒸留水に溶解した。これを８本調製した。
【００５３】
８本のうち１本に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．０３ｇを加え、塩酸を滴下してｐＨ６．６に合わせた後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(2)）。
８本のうち１本にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．０３ｇを加え、リン酸を滴下してｐＨ６．６に合わせた後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(3)）。
８本のうち１本にＨＥＰＥＳ（同仁堂）２．３８ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(4)）。
８本のうち１本にホウ酸（和光純薬）１．５５ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(5)）。
８本のうち１本にＢｉｃｉｎｅ（同仁堂）２．０４ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(6)）
８本のうち１本にＢＥＳ（同仁堂）２．６７ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(7)）。
８本のうち１本にＴＥＳ（同仁堂）２．８７ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(8)）。
８本のうち１本にＴＡＰＳＯ（同仁堂）３．２４ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(9)）。
【００５４】
各中和液の最終組成は下記のとおりである。
中和液(2)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．３Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ／ｐＨ６．６
中和液(3)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．３Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−リン酸／ｐＨ６．６
中和液(4)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ、１．０％  ＰＢＣ−４４、０．０５％  ＮａＮ３、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ
中和液(5)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ、１．０％  ＰＢＣ−４４、０．０５％  ＮａＮ３、０．２５Ｍホウ酸
中和液(6)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ、１．０％  ＰＢＣ−４４、０．０５％  ＮａＮ３、０．２５ＭＢｉｃｉｎｅ
中和液(7)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＢＳＡ、１．０％  ＰＢＣ−４４、０．０５％  ＮａＮ３、０．２５Ｍ  ＢＥＳ
中和液(8)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．２５Ｍ  ＴＥＳ
中和液(9)：０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．２５Ｍ  ＴＡＰＳＯ
【００５５】
［実施例５：検体をアルカリ溶液及び中和液で処理することによる偽陽性の発生、及び中和液を構成する緩衝液による偽陽性の抑制効果］
（検体の採取）
滅菌綿棒（平和メディク製、咽頭用）を用いてヒトの咽頭後壁を擦過し、これを検体とした。
【００５６】
（検体を含んだサンプルの調製）
≪工程１：検体をアルカリ溶液で処理した後に中和する工程≫
低密度ポリエチレン製のチューブの中に実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ。ここに実施例４で調製した中和液(1)〜(9)のいずれかを２００μｌ添加した後、綿棒を取り出した。得られた溶液を工程１のサンプルとした。
【００５７】
≪工程２：検体をアルカリ溶液と中和液の混合溶液で処理する工程≫
低密度ポリエチレン製のチューブの中に実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、ここに実施例４で調製した中和液(1)〜(9)のいずれかを２００μｌ添加した。この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ後、綿棒を取り出した。得られた溶液を工程２のサンプルとした。
【００５８】
（免疫クロマトグラフィー装置での測定）
サンプルを実施例１に記載の手順で作製したクラミジア・ニューモニエ用免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置）及びレジオネラ・ニューモフィラ用免疫クロマトグラフィー装置（ＬＰ用装置）、ヘモフィルス・インフルエンザ用免疫クロマトグラフィー装置（ＨＩ用装置）に１４０μｌずつ滴下し、１５分後に目視で判定を行った。結果を次に示す。
【００５９】
【表１】
2017207333.tif 000002
【００６０】
中和液(4)〜(9)（緩衝液の成分として、ＨＥＰＥＳ、ホウ酸、Ｂｉｃｉｎｅ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯのいずれかを含む中和液）を用いた場合、検体を≪工程１≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置、ＬＰ用装置、ＨＩ装置）でも偽陽性が高い頻度で発生した。一方、検体を≪工程２≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置でも偽陽性は全く発生しなかった。
これらの結果から、検体がまずアルカリ溶液と接触する（いわゆる≪工程１≫）ことで、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２マウスモノクローナル抗体と非特異反応を起こす成分が生じているものと推測される。
【００６１】
一方、中和液(1)〜(3)（緩衝液の成分として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び／又はリン酸を含む中和液）を用いた場合、検体を≪工程２≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置でも偽陽性は全く発生しなかったのは上述した中和液(4)〜(9)と同じ結果であるが、検体を≪工程１≫で処理した場合は上述した中和液(4)〜(9)とは異なり、いずれの免疫クロマトグラフィーでも偽陽性は全く発生しなかった。
すなわち、中和液(1)〜(3)を用いた場合には、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２マウスモノクローナル抗体と非特異反応を起こす成分の影響を抑制できるという結果が得られた。
【００６２】
［実施例６：各細菌の試験菌液の調製］
（クラミジア・ニューモニエ（ＣＰ）の試験菌液の調製）
市販のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  Ａｎｔｉｇｅｎ  （Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（２６５  Ｗａｔｌｉｎｅ  Ａｖｅｎｕｅ  Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ  Ｌ４Ｚ  １Ｐ３）より購入）を用いた。
【００６３】
（レジオネラ・ニューモフィラ（ＬＰ）の試験菌液の調製）
レジオネラ・ニューモフィラ（ＡＴＣＣ３３１５２株）をＢＣＹＥ寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン）で３７℃、４日間培養した。増殖した菌体を白金耳を用いて回収し、生理食塩水に懸濁したものを試験菌液として用いた。
【００６４】
（ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩ）の試験菌液の調製）
ヘモフィルス・インフルエンザ（ＡＴＣＣ１０２１１株）をポアメディア チョコレート寒天培地（栄研化学）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１８時間培養した。増殖した菌体を白金耳を用いて回収し、生理食塩水に懸濁したものを試験菌液として用いた。
【００６５】
［実施例７：各種細菌の試験菌液を用いた評価］
（測定用の陽性サンプルの調製）
マイクロチューブに実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中に実施例６で調製した各種細菌の試験菌液のいずれかひとつを１０μｌ添加した。ここに実施例４で調製した中和液(3)を２００μｌ添加し、得られた溶液を陽性サンプルとした。
上記手順を実施例６で調製した３種類の試験菌液について行った。
【００６６】
（測定用の陰性サンプルの調製）
マイクロチューブに実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中にＰＢＳ（和光純薬）を１０μｌ添加した。ここに実施例４で調製した中和液(3)を２００μｌ添加し、得られた溶液を陰性サンプルとした。
【００６７】
（免疫クロマトグラフィー装置での測定）
陽性サンプル又は陰性サンプルを、実施例１で作製したクラミジア・ニューモニエ（ＣＰ）用免疫クロマトグラフィー装置、同様に作製したレジオネラ・ニューモフィラ（ＬＰ）用免疫クロマトグラフィー装置、ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩ）用免疫クロマトグラフィー装置のそれぞれに１４０μｌずつ滴下し、１５分後に目視で判定を行った。結果を次に示す。
【００６８】
【表２】
2017207333.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、細菌感染症の診断において利用することができる。
【図１】
2017207333.tif 000004