(57)【要約】【課題】骨疾患の予防又は治療に有効な骨疾患改善剤を提供する。【解決手段】ゾウの母乳中に含まれる分子量８万〜６０万ダルトンの多糖類であって、構成糖として少なくともグルコサミン及び／又はＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を、骨疾患改善剤の有効成分とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の母乳中に含まれる分子量８万〜６０万ダルトンの多糖類であって、構成糖として少なくともグルコサミン及び／又はＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を有効成分として含む、骨疾患改善剤。
【請求項２】
前記哺乳動物はゾウである、請求項１に記載の骨疾患改善剤。
【請求項３】
前記多糖類は高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示す、請求項１又は２に記載の骨疾患改善剤。
【請求項４】
経口摂取用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨疾患改善剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨疾患改善剤を、前記多糖類の含有量として固形物換算で０．１質量％以上含む飲食品。
【請求項６】
哺乳動物の母乳から、分子量８万〜６０万ダルトンの多糖類を分画し、得られた多糖類画分を経口組成物として製剤化する、骨疾患改善剤の製造方法。
【請求項７】
前記哺乳動物はゾウである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示す多糖類を分画する、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨疾患改善剤とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、子ゾウの哺育には、母ゾウのストレスや、群れを形成できないことによる社会的教育の欠如により、母乳による哺育が困難な場合は、人工乳が使われてきた。人工乳としては、ウシ生乳及び乳製品を基にゾウ母乳の一般組成に近づけたものや、他の動物等の栄養要求性に基づいて組成を類推したビタミン、ミネラル配合物が用いられている。
【０００３】
しかしながら、これまで、人工乳では月齢が６ヶ月から１２ヶ月近辺で子ゾウが骨折をすることが多く、その対策を求められてきた（非特許文献１）。
【０００４】
子ゾウの哺育に関し、日本国内におけるアジアゾウ（インドゾウ）の繁殖例を挙げると、神戸市立王子動物園で飼育中の雌ゾウ「Ｚ」が2004年3月に「Ｍ」を出産し、2007年10月には「Ｏ」を出産したが、どちらの出産においても「Ｚ」が育児を放棄してしまったため母乳哺育ができず、２頭は人工乳で育てられた。そして、「Ｍ」は生後８かヶ月、「Ｏ」は１歳１ヶ月の時点で、それぞれ骨折が確認された（非特許文献２、３）。
【０００５】
一方、千葉県の市原ぞうの国においては、雌ゾウ「Ｐ」が2007年5月に「Ｙ」を出産し、2013年9月には「Ｒ」を出産した。「Ｙ」、「Ｒ」はどちらも「Ｐ」による自然哺育（母乳哺育）が行われ、２頭は母乳で育てられることにより現在まで骨折することなく、順調に成長している（非特許文献４）。
【０００６】
神戸市立王子動物園の「Ｚ」はその後、市原ぞうの国に移転し、2014年6月に「Ｕ」を出産したが、そこでも育児を放棄してしまった。そこで「Ｐ」が代わりに「Ｕ」に授乳を行うことになり、「Ｕ」は「Ｐ」の母乳と人工乳の混合栄養によって、現在まで骨折することなく順調に成長している（非特許文献５）。
【０００７】
以上のように、人工乳を用いたゾウの育児においては、自然哺育（母乳哺育）と比べて骨折発症リスクが高いと考えられている。骨折の原因としては、日照量、運動量の不足の他、人工乳と母乳との摂取栄養の組成や量の違い等が考えられるが、従来使用されてきた人工乳においては、骨成長に関わるとされる栄養素は考慮されており、不足する栄養素があるとは考えられていなかった。
尚、非特許文献６には、骨を形成する重要な栄養素として、カルシウム、リンおよびビタミンDが挙げられている。
【０００８】
ところで、グルコサミンが卵巣摘出マウスの骨密度低下を抑制すること（非特許文献７）、骨関節炎モデル動物における軟骨下骨の変化に対するグルコサミン塩酸の効果（非特許文献８）、及び、グルコサミンの骨関節炎（OA）における軟骨代謝に対する効果（非特許文献９）等、グルコサミンと骨や軟骨との関連について報告されている。さらに、ヒアルロン酸を経口投与することにより、変形性関節症の痛みを緩和するとの報告がある（非特許文献１０）。
尚、グルコサミンを含む多糖類に関しては、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸の混合物が、関節軟骨の変性を示す関節の治療に用いられることが報告されている（特許文献１）。
【０００９】
また、ゾウの母乳中のオリゴ糖等についていくつかの報告があるが（例えば非特許文献
１１）、その構成糖の含量を測っている例はなく、加水分解物中のグルコサミン含量も知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００３／０４１７２４号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Emanuelson, K., Neonatal care and hand rearing. In: Fowler, M. E., and S. K. Mikota (Eds.), Biology, Medicine, and Surgery of Elephants. Blackwell Publishing, Ames, Iowa. p.233-241, 2006
【非特許文献２】”モモ（象）”、［online］、［平成２７年９月１７日検索］、インターネット〈URL：https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%A2%E3%83%A2_(%E8%B1%A1)〉
【非特許文献３】”オウジ（象）”、［online］、［平成２７年９月１７日検索］、インターネット〈URL：https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%AA%E3%82%A6%E3%82%B8_(%E8%B1%A1)〉
【非特許文献４】”プーリー（象）”、［online］、［平成２７年９月１７日検索］、インターネット〈URL：https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%97%E3%83%BC%E3%83%AA%E3%83%BC_(%E8%B1%A1)〉
【非特許文献５】”市原ゾウの国”、［online］、［平成２７年９月１７日検索］、インターネット〈URL：http://www.zounokuni.com/animals/〉
【非特許文献６】森本宏著「改著  家畜栄養学  訂正第三版」養賢堂、1971年11月10日、p.338-339
【非特許文献７】Yamazaki, H. et al., Chitin and chitosan research 13(2):222, 2007
【非特許文献８】Wang S.X., Arthritis Rheum. 56(5):1537-1548, 2007
【非特許文献９】Jerosch, J., Int J Rheumatol. Volume 2011, Article ID 969012.
【非特許文献１０】Tashiro T. et al., The Scientific World Journal,  Volume 2012, Article ID 167928
【非特許文献１１】Uemura Y. et al., Comp. Biochem. Physiol. part A Mol. Integr. Physiol., 145:468-478, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、骨疾患の予防又は治療に有効な骨疾患改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、哺乳動物の母乳について検討を行った結果、特定の多糖類が著量含まれていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、哺乳動物の母乳中に含まれる分子量８万〜６０万ダルトンの多糖類であって、構成糖として少なくともグルコサミン及び／又はＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を有効成分として含む、骨疾患改善剤を提供する。
前記骨疾患改善剤は、前記哺乳動物がゾウであることを好ましい態様としている。
また、前記骨疾患改善剤は、前記多糖類が高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示すことを好ましい態様としている。
また、前記骨疾患改善剤は、経口摂取用であることを好ましい態様としている。
【００１５】
本発明はまた、前記骨疾患改善剤を、前記多糖類の含有量として固形物換算で０．１質量％以上含む飲食品を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ゾウの母乳から、分子量８万〜６０万ダルトンの多糖類を分画し、得られた多糖類画分を経口組成物として製剤化する、骨疾患改善剤の製造方法を提供する。
前記方法は、前記哺乳動物がゾウであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示す多糖類を分画することを好ましい態様としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の骨疾患改善剤は、骨疾患の予防又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ゾウ母乳の高速液体クロマトグラム。
【図２】ヒアルロン酸標品（分子量約215,000ダルトン）の高速液体クロマトグラム。
【図３】人工乳の高速液体クロマトグラム。
【図４】ヒアルロン酸標品（分子量154万〜745万ダルトン）の分子量に対する高速液体クロマトグラフィーにおける溶出時間の検量線。縦軸はlog分子量、横軸は溶出時間（分）。
【図５】ゾウ母乳の加水分解サンプルのLC-MSにおける保持時間8.6分のピークのMS/MSスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００２０】
本発明の骨疾患改善剤は、哺乳動物の母乳中に含まれる分子量８万〜６０万ダルトン、好ましくは１２万〜５４万ダルトン、より好ましくは１８万〜４４万ダルトンの多糖類であって、構成糖として少なくともグルコサミン及び／又はＮ−アセチルグルコサミンを含む多糖類を有効成分として含有する。なお、哺乳動物としては、有性生殖を行い、乳で子を育てる特徴を有する動物を含むものであり、例えばカモノハシ、オポッサム、チロエオポッサム、フクロネコ、バンディクート、フクロモグラ、カンガルー、ハネジネズミ、アフリカトガリネズミ、ツチブタ、イワダヌキ、ゾウ、ジュゴン、アルマジロ、ナマケモノ、アリクイ、ツパイ、ヒヨケザル、キツネザル、ガラゴ、サル、テナガザル、オラウータン、ゴリラ、チンパンジー、ボノボ、ヒト、ウサギ、ネズミ、ラット、マウス、モルモット、リス、ヤマアラシ、ヌートリア、ハリネズミ、モグラ、ラクダ、イノシシ、キリン、シカ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、カバ、クジラ、イルカ、センザンコウ、ネコ、タヌキ、トラ、オオカミ、イタチ、クマ、アザラシ、ウマ、サイ、バク、コウモリ等が挙げられる。これらの哺乳動物の中では、ゾウが好ましい。ゾウとしては、アジアゾウ、及びアフリカゾウが挙げられる。
以下、上記のような多糖類を、「本発明の多糖類」又は単に「多糖類」と記載することがある。多糖類は、高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示すことが好ましい。
【００２１】
本発明の多糖類は、上記のような哺乳動物、例えば、ゾウの母乳から、分子量８万〜６０万ダルトン、好ましくは１２万〜５４万ダルトン、より好ましくは１８万〜４４万ダルトンの多糖類を分画することにより、得ることができる。分子量分画は、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、精密ろ過（ＭＦ濾過）膜や限外濾過（ＵＦ濾過）膜を用いた膜分離等により、行うことができる。分子量測定に用いるスタンダードとしては、ヒアルロン酸、例えば分子量約215,000のヒアルロン酸が挙げられる。得られた画分に多糖類が含まれていることは、例えば、ヨウ素デンプン法、カルバゾール硫酸法、ポストラベル反応試薬として過ヨウ素酸およびグアニジンを用いる方法（特開平８−６
２２２０号公報）等により確認することができる。本発明の多糖類は、精製物又は粗精製物であってもよく、他の成分との混合物であってもよい。多糖類画分における本発明の多糖類の純度は、特に制限されないが、通常、０．１％、好ましくは１％である。
【００２２】
本発明の多糖類は、そのまま骨疾患改善剤（以下、「本発明の薬剤」とも記載する。）、または飲食品もしくは飼料の有効成分として利用することが可能である。
本発明の薬剤は、一態様として、医薬又はその有効成分として利用することができる。本発明の薬剤は、多糖類をそのまま、若しくはこれらを製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。投与経路は経口であることが好ましい。尚、本発明は、子ゾウ用の人工乳を除くことが好ましい。
【００２３】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されず、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。製剤化にあたっては製剤成分として通常の経口薬剤に汎用される、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、溶剤等の添加剤を使用できる。また、本発明の効果を損わない限り、多糖類と、公知の、もしくは将来的に見出される骨疾患改善作用を有する薬剤、又は医薬組成物とを併用してもよい。併用する医薬組成物は、本発明の薬剤中に有効成分の一つとして含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。
【００２４】
上記の製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を、それぞれ例示することができる。
【００２５】
また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を例示することができる。
【００２６】
更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を例示することができる。
【００２７】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
【００２８】
本発明の一態様は、哺乳動物、例えばゾウの母乳から、分子量８万〜６０万ダルトン、好ましくは１２万〜５４万ダルトン、より好ましくは１８万〜４４万ダルトンの多糖類、又は、高速液体クロマトグラフィーにより約２７万ダルトンの分子量を示す多糖類を分画し、得られた多糖類画分を経口組成物として製剤化する、骨疾患改善剤の製造方法である。製剤化は、前記と同様にして行うことができる。多糖類画分は、精製又は粗精製された多糖類であってもよい。「約２７万ダルトンの分子量を示す」とは、例えば、画分のピークの分子量が約２７万ダルトン、例えば２４万ダルトン〜３０万ダルトンであって、クロ
マトグラムにおけるピーク面積の４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上が、分子量１８万〜４４万ダルトンに収まることをいう。
また、本発明の他の態様は、骨疾患改善用の医薬の製造における、本発明の多糖類の使用である。また、本発明の他の態様は、骨疾患改善に用いられる前記多糖類である。また、本発明の他の態様は、前記多糖類を哺乳動物に投与する、骨疾患の改善法である。
【００２９】
本発明の薬剤中に含まれる多糖類の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、固形物換算で０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、更に好ましくは５０質量％以上とするのがよい。多糖類の含有量の上限は特に制限されないが、例えば９０質量％以下、８０質量％以下、又は７０質量％以下であってよい。
【００３０】
本発明の薬剤は、骨疾患の改善に有用である。骨疾患の改善には、骨疾患の予防又は治療が含まれる。骨疾患としては、骨折（fracture）、再骨折（refracture）、骨欠損（bone defect）、変形性骨関節症（osteoarthropathy）、線維性骨炎（osteitis fibrosa）、骨粗鬆症（osteoporosis）、骨軟化症（osteomalacia）、骨ページェット病（Paget's disease of bone）、くる病（rachitis）等が挙げられる。さらに、骨疾患の予防には、骨折発症リスクの低減、例えば、骨密度の増加、破骨細胞の抑制等が挙げられる。
【００３１】
本発明の薬剤の投与時期は特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能である。
本発明の薬剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択される。本発明の多糖類の量として、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日での範囲となる量を目安とするのが良い。
また、投与期間が長い場合、例えば１ヶ月から数ヶ月、又はそれ以上の場合は、薬剤の投与量は上記範囲の１／１０〜１／１００程度でも効果が期待できる。
投与期間にかかわらず、薬剤は１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００３２】
本発明の薬剤、又はその有効成分である多糖類は、飲食品（飲料又は食品）に含有させることもできる。
【００３３】
また、多糖類、又は本発明の薬剤を有効成分として飲食品に含有させ、骨疾患改善剤の一態様として、筋萎縮抑制作用を有する飲食品として加工することも可能である。
【００３４】
飲食品としては、骨疾患改善の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、多糖類を含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
【００３５】
上記のような食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食等のほか、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類； 農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品； 水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他
の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。
【００３６】
さらに、多糖類、又は本発明の薬剤を有効成分として飼料中に含有させ、骨疾患改善剤の一態様として、骨疾患改善作用を有する飼料として加工することも可能である。
【００３７】
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００３８】
本発明の飲食品（飼料を含む）中に含まれる本発明の多糖類の量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上とするのが良い。本発明の多糖類の含有量の上限は特に制限されないが、例えば９０質量％以下、８０質量％以下、又は７０質量％以下であってよい。
【００３９】
また、本発明の飲食品（飼料を含む）は、単回摂取あたり、本発明の多糖類を、固形物換算で０．０１ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上含むことが望ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
神戸市立王子動物園で飼育されたアジアゾウ「Ｍ」の哺育に用いた人工乳（和光堂株式会社「はいはい」75.2g＋パーム油6g＋お湯200g）と、同動物園で飼育されているアジアゾウ「Ｚ」（2014年6月12日出産）、及び、千葉県の市原ぞうの国で飼育されているアジアゾウ「Ｐ」（2013年9月3日出産）の母乳中の一般栄養成分（たんぱく質、脂質、ミネラル、ビタミン）を公定法（公益社団法人 日本食品衛生協会編「食品衛生検査指針 理化学編2015」）に準じて分析した。その結果を表１に示す。森本宏著「改著  家畜栄養学  訂正第三版」養賢堂、1971年11月10日、p.338-339には、骨を形成する重要な養分として、カルシウム、リンおよびビタミンDが挙げられているが、上記人工乳はいずれの栄養素も母乳測定の平均値以上の量を含んでいた。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
次に、ゾウ母乳（「Ｚ」）と人工乳の多糖類分析を行った。ゾウ母乳、人工乳をそれぞれ遠心分離（12000g、10分）して脂肪画分を除去し、得られた脱脂乳を0.2μmのフィルターでろ過したものを分析サンプルとした。サンプル中の成分を高速液体クロマトグラフィーにより分子量の大きさに従って分離させた後、ポストカラム法で多糖類を選択的に検出した（分離カラム：「TSKgel G5000 PWXL」、「TSKgel G6000 PWXL」（以上東ソー（株））、「PLRP-S 1000Å」（アジレント・テクノロジー（株））を３本連結、カラム温度：40℃、移動相：0.195M塩化ナトリウム/2%アセトニトリル混合液、移動相流速：０．８ｍｌ／分、反応液：45mMグアニジン塩酸塩/4.5mM過ヨウ素酸ナトリウム/150mMホウ酸混合液 (pH9.5)、反応液流速：０．４ｍｌ／分、反応温度：170℃)。分子量スタンダードとして分子量約215,000ダルトンのヒアルロン酸（R & D System製）を用いた。
分析結果を図１〜３に示す。分子量が大きいほど早く溶出されるこの系において、ゾウ母乳サンプルからは高分子多糖類のピーク（23.5分）が検出された（図１）。このピークの分子量は、分子量154万〜745万ダルトンのヒアルロン酸標品を用いて作成した、分子量に対する溶出時間の検量線（図４）から、およそ27万ダルトンと推測された。また、このピークの立ち上がり、及び、立ち下がりは、それぞれ分子量約8万ダルトン及び約60万ダルトンであり、半値幅は約18万〜約44万ダルトンであった。一方、人工乳からは当該ピークは検出されなかった。
また、ゾウ母乳中のピーク分子量27万ダルトンの多糖類の含量は、固形物換算で0.045質量％と算出された。
【００４４】
次に、ゾウ母乳から検出された分子量27万ダルトンのピークを分取し、塩酸で加水分解（6N HCl、110℃、3時間）したサンプル（以下、「加水分解サンプル」と記載する。）を液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）で分析した（カラム：Intrada Amino Acid (3μm) 2.0mm I.D. × 150mm L.、カラム温度：40℃、移動相Ａ：0.2% ギ酸/アセトニトリル、移動相Ｂ：100mM 酢酸アンモニウム水溶液、流速：0.2ml／min、グラジェント：Ａ／Ｂ： 50/50→（10分)→0/100→（5分)→0/100→（1分)→50/50→（分)）。併せて、グ
ルコサミン溶液（100mM食塩を添加）の分析も行った。
【００４５】
その結果、加水分解サンプルの分析において、グルコサミン（100mM食塩添加）の分析時と同じ保持時間（8.6分）にピークが検出され、そのピークのMS/MSスペクトルもそれぞれ一致した（図５）。
よって、加水分解サンプルにはグルコサミンが含まれていることが明らかとなった。ゾウ母乳由来の分子量27万ダルトンの高分子多糖類は、その構成糖として少なくともグルコサミン、又はＮ−アセチルグルコサミンを含むと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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