(57)【要約】      （修正有）【課題】タキキニン類の分泌の過剰もしくは欠乏に伴う疾患の治療薬、例えば、疼痛、性ホルモン分泌の過剰・欠乏にともなう性機能障害の改善に向けた薬剤等として有用な、高活性・高選択的かつ生体内で持続的に作用することが期待される新規ニューロキニン３受容体（ＮＫ３受容体）選択的リガンドの提供。【解決手段】式（Ｉ）でで示される化合物又はその医薬上許容される塩。式（Ｉ）Ｘ１−Ａ２−Ａ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｍｅｔ−ＮＨ２［Ｘ１は１又は２の分子量５００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で直接又はリンカーを介して修飾された、Ｒ１−Ａ１或いはジカルボン酸残基を表し；Ｒ１はＨ又は特定の化学基；Ａ１及びＡ２は特定のＤ又はＬアミノ酸残基；Ａ３はＮメチル化された特定のＬアミノ酸、Ｘ４及びＸ５は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ或いは、そのジペプチド等価体］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2017081917.tif 000047
［式中、Ｘ１は、１又は２の分子量５００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で直接又はリンカーを介して修飾された、Ｒ１−Ａ１もしくはジカルボン酸残基を表し；
Ｒ１は、水素原子、アセチル基、オキサリル基、スクシニル基、アミノカルボニル基、ヒドロキシアミノカルボニル基、ヒドラジノカルボニル基、メトキシジカルボニル基、アミノジカルボニル基、アミノスルホニル基、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルアスパラギン酸残基、もしくは、Ｎ−カルボキシメチルアスパラギン酸残基を表し；
Ａ１は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、もしくは、Ｌ−α−アミノアジピン酸残基を表し；
Ａ２は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、もしくは、Ｄ−グルタミン酸残基を表し；
Ａ３は、Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルチロシン、もしくは、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン残基を表し；
Ｘ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、もしくは、そのジペプチド等価体を表し；
Ｇｌｙは、グリシン残基を表し；
Ｌｅｕは、ロイシン残基を表し；
Ｍｅｔ−ＮＨ２は、メチオニンアミドを表す］で示される化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項２】
ＰＥＧ又はその誘導体による修飾が、エステル結合又はアミド結合によるものである、請求項１に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項３】
リンカーが下記式で表される基である請求項１又は２に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【化２】
2017081917.tif 000048
［式中、ｍは１又は２であり；
＊ａはＸ１との結合部位を示し；
＊ｂはＰＥＧ又はその誘導体との結合部位を示す。
【請求項４】
Ｒ１がスクシニル基、Ａ１がＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン残基、Ａ２がＬ−フェニルアラニン残基、Ａ３がＬ−Ｎ−メチルフェニルアラニン残基、Ｘ４−Ｘ５がＧｌｙ−Ｌｅｕである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項５】
ＰＥＧ又はその誘導体の分子量が７５０〜２０００である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項６】
ＰＥＧ又はその誘導体が、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコールモノプロピルエーテル、及びメトキシポリエチレングリコールアミンから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩を含有してなる医薬。
【請求項８】
ニューロキニン受容体アゴニストである、請求項７記載の医薬。
【請求項９】
ニューロキニン受容体が、ＮＫ３受容体である、請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
繁殖中枢制御剤である、請求項７記載の医薬。
【請求項１１】
卵胞発育促進及び／又は改善用である、請求項７記載の医薬。
【請求項１２】
タキキニン類及び／又はニューロキニン受容体がその発症や進行に関与する疾患の治療薬である、請求項７記載の医薬。
【請求項１３】
該疾患が、疼痛又は性ホルモン分泌の過剰・欠乏にともなう性機能障害である、請求項１２記載の医薬。
【請求項１４】
請求項１記載の化合物又はその生理学的に許容される塩を含有してなる試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロキニン３受容体（ＮＫ３受容体）アゴニスト作用を有するペプチド及びその用途に関する。より詳細には本発明は、ＮＫ３受容体への選択的且つ強力な結合親和性及びアゴニスト作用を有し、且つ生体内で持続的に作用することが可能なペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
視床下部前方のキスペプチンニューロン集団は、エストロジェンの正のフィードバック作用により性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のサージ状分泌を制御する排卵中枢であり、キスペプチン類は排卵誘発を調節する新しい薬剤として期待されている。
一方、近年、卵胞発育に関与するとされるＧｎＲＨのパルス状分泌に関する種々の報告がなされており、視床下部弓状核のキスペプチンニューロンがニューロキニンＢ（ＮＫＢ）およびダイノルフィンを同時に発現し（非特許文献１）、ＧｎＲＨのパルス状分泌を促す中枢としての役割を担っていることが報告された（非特許文献２）。また、このニューロンにおける発火活動を、多ニューロン発火活動（ＭＵＡ）の一過性の上昇（ＭＵＡボレー）として記録することに成功し、ＭＵＡボレーは黄体形成ホルモン（ＬＨ）パルスと完全に同期していることが報告されている（非特許文献３及び４）。
こうした背景のもと、本発明者らは、ＮＫＢの受容体として知られるＮＫ３受容体リガンド（アゴニスト）が、ＧｎＲＨパルスおよびＬＨパルスを調節し、卵胞発育を制御する薬剤になりうると想定し、新規ＮＫ３受容体リガンドの創製に着手した。
これまでに報告されているＮＫ３受容体選択的アゴニストとして、［ＭｅＰｈｅ７］−ＮＫＢおよびsenktideが挙げられる（非特許文献５及び６）。すでに研究用試薬として市販されているこれらのペプチドは、タキキニン類およびニューロキニン受容体が関連する各種基礎研究等に利用されている。本発明者らは、これまでに［ＭｅＰｈｅ７］−ＮＫＢの活性および受容体選択性の構造要求特性に関する知見を得る目的で構造活性相関研究を展開し、この過程でＮＫ３受容体に対し高活性かつ高選択性で作用する新規ＮＫＢ誘導体を見出している（特許文献１及び２、非特許文献７〜９）。
これまでに見出したペプチドは優れたＮＫ３受容体選択的リガンドではあるが、その効果を維持するためには反復投与の必要があった。畜産をはじめとする生殖生理の制御を必要とする臨床応用を考えた場合、薬剤投与後の持続的効果の提供は重要な課題となる。また、持続的効果を期待して薬剤の連続投与や適切な基剤に封入した持続性製剤を利用することが想定されるが、クリアランスが速い薬剤の場合には相当量の原薬を必要とすることから、同等の活性を維持しつつクリアランスの遅い薬剤の開発が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１４／０６１７７２号
【特許文献２】国際公開２０１５／０８３８１６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Goodman RL, Lehman MN, Smith JT, Coolen LM, de Oliveira CV, Jafarzadehshirazi MR, Pereira A, Iqbal J, Caraty A, Ciofi P, Clarke IJ. Endocrinology, 148, 5752-5760 (2007)
【非特許文献２】Maeda K, Ohkura S, Uenoyama Y, Wakabayashi Y, Oka Y, Tsukamura H, Okamura H. Brain Res. 1364, 103-115 (2010)
【非特許文献３】Ohkura S, Takase K, Matsuyama S, Mogi K, Ichimaru T, Wakabayashi Y, Uenoyama Y, Mori Y, Steiner RA, Tsukamura H, Maeda KI, Okamura H. J. Neuroendocrinol. 21, 813-821(2009)
【非特許文献４】Wakabayashi Y, Nakada T, Murata K, Ohkura S, Mogi K, Navarro VM, Clifton DK, Mori Y, Tsukamura H, Maeda KI, Steiner RA, Okamura H. J. Neurosci. 30, 3124-3132 (2010)
【非特許文献５】Drapeau G, D'Orleans-Juste P, Dion S, Rhaleb NE, Rouissi NE, Regoli D. Neuropeptides. 10(1) 43-54 (1987)
【非特許文献６】Laufer R, Gilon C, Chorev M, Selinger Z. J Biol Chem. 261:10257-10263 (1986)
【非特許文献７】Misu R, Noguchi T, Ohno H, Oishi S, Fujii N. Bioorg. Med. Chem. 21(8) 2413-2417 (2013)
【非特許文献８】Misu R, Oishi S, Yamada A, Yamamura T, Matsuda F, Yamamoto K, Noguchi T, Ohno H, Okamura H, Ohkura S, Fujii N. J Med Chem. 57(20) 8646-8651 (2014)
【非特許文献９】Misu R, Yamamoto K, Yamada A, Noguchi T, Ohno H, Yamamura T, Okamura H, Matsuda F, Ohkura S, Oishi S, Fujii N. MedChemComm, 6(3) 469-476 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高活性・高選択的かつ生体内で持続的に作用することが期待される新規ＮＫ３受容体選択的リガンドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでにＮＫ３受容体選択的アゴニストの１つとしてsenktideが報告されている。本発明者らは、これまでに報告されているタキキニン類の構造活性相関情報に基づき、senktideのアスパラギン酸（Asp１）をグルタミン酸（Glu）に置換した誘導体が、強力かつ高選択的なＮＫ３受容体アゴニスト活性を示すことを見出している。そこで、このようなペプチドをリード化合物として、より生体内で持続的に作用し得る誘導体の開発を試みた。
まず、本発明者らは、血中のエステラーゼにより切断され得るsenktide誘導体として、エステル結合を介してGlu側鎖に種々の鎖長からなるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を共有結合した誘導体を作成した。これらのペプチドは予想に反して血漿中での分解を受けず、senktide誘導体を再生しなかった。しかしながら、これらのペプチドは、ＰＥＧ鎖がペプチド配列に共有結合したままの構造においても、ＮＫ３受容体アゴニスト活性を維持していることが判明した。
かかる知見に基づいて、本発明者らは、ＰＥＧ修飾した種々のsenkitide誘導体を作成し、ＮＫ３受容体アゴニスト活性を評価するとともに、in vivo評価を行った。その結果、senktideと同等の生物活性を維持しつつ、長時間にわたるin vivo活性の持続が認められる新規誘導体を見出して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
2017081917.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｘ１は、１又は２の分子量５００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で直接又はリンカーを介して修飾された、Ｒ１−Ａ１もしくはジカルボン酸残基を表し；
Ｒ１は、水素原子、アセチル基、オキサリル基、スクシニル基、アミノカルボニル基、ヒドロキシアミノカルボニル基、ヒドラジノカルボニル基、メトキシジカルボニル基、アミノジカルボニル基、アミノスルホニル基、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルアスパラギン酸残基、もしくは、Ｎ−カルボキシメチルアスパラギン酸残基を表し；
Ａ１は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、もしくは、Ｌ−α−アミノアジピン酸残基を表し；
Ａ２は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、もしくは、Ｄ−グルタミン酸残基を表し；
Ａ３は、Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルチロシン、もしくは、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン残基を表し；
Ｘ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、もしくは、そのジペプチド等価体を表し；
Ｇｌｙは、グリシン残基を表し；
Ｌｅｕは、ロイシン残基を表し；
Ｍｅｔ−ＮＨ２は、メチオニンアミドを表す］で示される化合物又はその生理学的に許容される塩。
［２］ＰＥＧ又はその誘導体による修飾が、エステル結合又はアミド結合によるものである、上記［１］に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
［３］リンカーが下記式で表される基である請求項１又は２に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【０００９】
【化２】
2017081917.tif 000003
【００１０】
［式中、ｍは１又は２であり；
＊ａはＸ１との結合部位を示し；
＊ｂはＰＥＧ又はその誘導体との結合部位を示す。
［４］Ｒ１がスクシニル基、Ａ１がＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン残基、Ａ２がＬ−フェニルアラニン残基、Ａ３がＬ−Ｎ−メチルフェニルアラニン残基、Ｘ４−Ｘ５がＧｌｙ−Ｌｅｕである、上記［１］〜［３］に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
［５］ＰＥＧ又はその誘導体の分子量が７５０〜２，０００である、上記［１］〜［４］に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
［６］ＰＥＧ又はその誘導体が、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコールモノプロピルエーテル、及びメトキシポリエチレングリコールアミンから選択される、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物又はその生理学的に許容される塩。
［７］上記［１］〜［６］に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩を含有してなる医薬。
［８］ニューロキニン受容体アゴニストである、上記［７］記載の医薬。
［９］ニューロキニン受容体が、ＮＫ３受容体である、上記［８］記載の医薬。
［１０］繁殖中枢制御剤である、上記［７］記載の医薬。
［１１］卵胞発育促進及び／又は改善用である、上記［７］記載の医薬。
［１２］タキキニン類及び／又はニューロキニン受容体がその発症や進行に関与する疾患の治療薬である、上記［７］記載の医薬。
［１３］該疾患が、疼痛又は性ホルモン分泌の過剰・欠乏にともなう性機能障害である、上記［１２］記載の医薬。
［１４］上記［１］記載の化合物又はその生理学的に許容される塩を含有してなる試薬。
［１５］下記式で表される化合物又はその生理学的に許容される塩。
【００１１】
【化３】
2017081917.tif 000004
【００１２】
【化４】
2017081917.tif 000005
【００１３】
【化５】
2017081917.tif 000006
【発明の効果】
【００１４】
本発明化合物は、senktideと同等以上の生物活性を維持しつつ、長時間にわたるin vivo活性の持続が認められる。従って、本発明により得られた高活性・高選択的ＮＫ３受容体アゴニストは、タキキニン類の分泌の過剰もしくは欠乏に伴う疾患の治療薬、例えば、疼痛、性ホルモン分泌の過剰・欠乏にともなう性機能障害の改善に向けた薬剤、これらの疾患の治療薬開発に向けた基礎科学実験用試薬等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＧｎＲＨをパルス状に分泌させる弓状核キスペプチンニューロンの神経活動を反映するＭＵＡボレーに対するsenktide（対照ペプチド）及び本発明のペプチド（ペプチド９；実施例２）の影響を調べた結果を示す図である。縦軸は２０秒当たりのスパイクの数を示し、横軸は経過時間（秒）を示す。矢印の時点で試験化合物を投与した。Ｒ値は作用持続時間を、Ｖ値はＭＵＡボレーの数を示している。
【図２】卵胞期のヤギの血中黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度に対する本発明のペプチド（ペプチド１２；実施例５）の影響を調べた結果を示す図である。縦軸は血中のＬＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、横軸は経過時間（時間）を示す。矢印の時点で試験化合物を投与した。
【図３】黄体期のヤギの血中黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度に対する本発明のペプチド（ペプチド１２；実施例５）の影響を調べた結果を示す図である。縦軸は血中のＬＨ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し、横軸は経過時間（時間）を示す。矢印の時点で試験化合物を投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、「L-」と示される場合はL体を示し（例えば、「L-Ala」はL体のAla）、「D-」と示される場合はD体を示し（例えば、「D-Ala」はD体のAla）、「DL-」と示される場合はD体及びL体のラセミ体を示すものとする(例えば、「DL-Ala」はD体のAla及びL体のAlaのラセミ体混合物)。本発明においてアミノ酸残基はD体であってもL体であってもよいが、好ましくはL体である。
Ｇｌｙ又はＧ    ：グリシン
Ａｌａ又はＡ    ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ    ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ    ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ    ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ    ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ    ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ    ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ    ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ    ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ    ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ    ：リジン
Ａｒｇ又はＲ    ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ    ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ    ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ    ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ    ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ    ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ    ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ    ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
ＭｅＰｈｅ      ：Ｎ−メチルフェニルアラニン
ＭｅＶａｌ      ：Ｎ−メチルバリン
ＭｅＩｌｅ      ：Ｎ−メチルイソロイシン
ＭｅＴｙｒ      ：Ｎ−メチルチロシン
ＭｅＴｒｐ      ：Ｎ−メチルトリプトファン
ＭｅＬｅｕ      ：Ｎ−メチルロイシン
ＭｅＡｓｐ      ：Ｎ−メチルアスパラギン酸
Ａａｄ          ：２−アミノアジピン酸
【００１７】
さらに、本明細書中で使用する略語は特に断りの無い限り下記に示すものを意味する。
Me              ：メチル基（-CH3）
Succinyl        ：-CO-CH2CH2-COOH
Oxalyl          ：-CO-COOH
Ac              ：アセチル基（-COCH3）
Ph              ：フェニル基（-C6H5）
【００１８】
本発明は、ニューロキニン受容体、具体的にはＮＫ３受容体に特異的なアゴニスト作用を有する化合物を提供する。具体的には、式（Ｉ）
【００１９】
【化６】
2017081917.tif 000007
【００２０】
［式中、Ｘ１は、１又は２の分子量５００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で直接又はリンカーを介して修飾された、Ｒ１−Ａ１もしくはジカルボン酸残基を表し；好ましくは、
Ｒ１は、水素原子、アセチル基、オキサリル基、スクシニル基、アミノカルボニル基、ヒドロキシアミノカルボニル基、ヒドラジノカルボニル基、メトキシジカルボニル基、アミノジカルボニル基、アミノスルホニル基、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルアスパラギン酸残基、もしくは、Ｎ−カルボキシメチルアスパラギン酸残基を表し；
Ａ１は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、もしくは、Ｌ−α−アミノアジピン酸残基を表し；
Ａ２は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、もしくは、Ｄ−グルタミン酸残基を表し；
Ａ３は、Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルチロシン、もしくは、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン残基を表し；
Ｘ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、もしくは、そのジペプチド等価体を表し；
Ｇｌｙは、グリシン残基を表し；
Ｌｅｕは、ロイシン残基を表し；
Ｍｅｔ−ＮＨ２は、メチオニンアミドを表す］で示される化合物（本明細書中、化合物（Ｉ）とも称する）又はその生理学的に許容される塩を提供する。
【００２１】
式（Ｉ）中、Ｘ１は、１又は２の分子量５００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で直接又はリンカーを介して修飾された、Ｒ１−Ａ１もしくは、ジカルボン酸残基を表す。ここで、Ｒ１は任意の基であり得るが、好ましくは、Ｒ１は、水素原子、アセチル基、オキサリル基、スクシニル基、アミノカルボニル基、ヒドロキシアミノカルボニル基、ヒドラジノカルボニル基、メトキシジカルボニル基、アミノジカルボニル基、アミノスルホニル基、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルアスパラギン酸残基、もしくは、Ｎ−カルボキシメチルアスパラギン酸残基を表し、Ａ１は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、もしくは、Ｌ−α−アミノアジピン酸残基を表す。Ｘ１としてのジカルボン酸残基としては、２つのカルボキシル基もしくはこれに相当する修飾基を有する構造であれば特に限定されない。好ましくは、Ｒ１はスクシニル基であり、Ａ１はＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン残基である。
【００２２】
本発明において、式（Ｉ）中、Ｘ１は、１又は２の分子量５００〜５，０００、好ましくは７５０〜５，０００、より好ましくは７５０〜２，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で修飾されていることを特徴とする（以下、ＰＥＧ修飾あるいはＰＥＧ化とも称する）。Ｘ１におけるＰＥＧ修飾は修飾可能な任意の位置で行われるが、好ましくはＲ１又はＡ１に対して、より好ましくはＡ１に対して行われる。ＰＥＧによる修飾はＸ１、即ちＲ１又はＡ１（好ましくはＡ１）に対して直接あるいはリンカーを介して行われる。ここで、リンカーとしては、１又は２のＰＥＧと結合し得る部位及びＲ１又はＡ１（好ましくはＡ１）と結合し得る部位を有していれば特に限定されないが、具体的には下記式で表される基が挙げられる。
【００２３】
【化７】
2017081917.tif 000008
【００２４】
［式中、ｍは１又は２であり；
＊ａはＸ１との結合部位を示し；
＊ｂはＰＥＧ又はその誘導体との結合部位を示す。
例えばアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基、より好ましくはアスパラギン酸残基が挙げられる。ＰＥＧの分子量が小さすぎる／大きすぎる場合には、生殖中枢における神経活動の持続的な亢進作用が得られにくい。
【００２５】
ここでＰＥＧ又はその誘導体とは、通常、下記式にて表される。ペプチド鎖（又はリンカー）への結合には水酸基（−ＯＨ）あるいはアミノ基（−ＮＨ２）が用いられる。
【００２６】
【化８】
2017081917.tif 000009
【００２７】
式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基（例、メチル、エチル、プロピル）を示す。
ＰＥＧの誘導体としては、上記以外に、ＰＥＧを基本骨格に有し、その両末端にチオール基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等の官能基を有する化合物も例示される。
一般に市販で入手可能なＰＥＧはエチレンオキシド等のモノマーを重合し得られたポリマー混合物をおおまかな分子量ごとに分離した混合物であり、高分子ＰＥＧには分子量分布があり、±１０〜３０％程度の分子量のばらつきがある。その平均分子量を用いて表記するのが一般的であり、例えばＰＥＧ１０００は平均分子量が１，０００のものを、ＰＥＧ２ｋは平均分子量が２，０００のものを意味する。
ＰＥＧの１単位（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）の構造（以下、ＰＥＧの単位構造とも称する）の分子量は４４であり、従って、例えばＰＥＧ５００の場合は、ＰＥＧの単位構造の数（ｎ）は５００／４４≒１１.４となる。実験的にもｎ＝１１やｎ＝１２を頂点する、正規分布上のｎの値が観測される。同様にＰＥＧ５０００の場合のＰＥＧの単位構造の数は５０００／４４≒１１３．６となりｎ＝１１３やｎ＝１１４を頂点する、正規分布上のｎの値が観測される。
【００２８】
ＰＥＧ化がＲ１に対して行われる場合には、Ｘ１の一例として以下の構造が挙げられる（Ｒがメチル基、Ｒ１がオキサリル基、Ａ１がグルタミン酸又はグルタミン残基の場合）。
【００２９】
【化９】
2017081917.tif 000010
【００３０】
式中、ｎは、ＰＥＧの単位構造を示し、分子量５００〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１１〜１１３である。好ましくは分子量７５０〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜１１３である。より好ましくは分子量７５０〜２，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜４６である。Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
【００３１】
ＰＥＧ化がＡ１に対して行われる場合には、Ｘ１の一例として以下の構造が挙げられる（Ｒがメチル基、Ｒ１がスクシニル基、Ａ１がグルタミン酸又はグルタミン残基の場合）。
【００３２】
【化１０】
2017081917.tif 000011
【００３３】
式中、ｎは、ＰＥＧの単位構造を示し、分子量５００〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１１〜１１３である。好ましくは分子量７５０〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜１１３である。より好ましくは分子量７５０〜２，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜４６である。Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
【００３４】
ＰＥＧ化がリンカーを介してＡ１に対して行われる場合には、Ｘ１の一例として以下の構造が挙げられる（Ｒがメチル基、Ｒ１がスクシニル基、Ａ１がグルタミン酸又はグルタミン残基、リンカーがアスパラギン酸残基の場合）。
【００３５】
【化１１】
2017081917.tif 000012
【００３６】
式中、ｎは、ＰＥＧの単位構造を示す。ｎ個のＰＥＧは同一でも異なっていてもよいが同一であることが好ましく、又、簡便である。ｎは、ＰＥＧ１分子が、分子量５００〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１１〜１１３である。好ましくは分子量７５０〜５，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜１１３である。より好ましくは分子量７５０〜２，０００となるように設定される任意の整数であり、通常１７〜４６である。２個のＸは同一で−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
【００３７】
上記式（Ｉ）中、Ａ２は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、もしくは、Ｄ−グルタミン酸残基を表す。好ましくはＬ−フェニルアラニン残基である。
【００３８】
上記式（Ｉ）中、Ａ３は、Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルチロシン、もしくは、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン残基を表す。好ましくはＬ−Ｎ−メチルフェニルアラニン残基である。
【００３９】
上記式（Ｉ）中、Ｘ４−Ｘ５は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、もしくは、そのジペプチド等価体を表す。Ｇｌｙ−Ｌｅｕはグリシンとロイシンがペプチド結合によって結合したジペプチドの残基を表し、以下の構造で示される。
【００４０】
【化１２】
2017081917.tif 000013
【００４１】
Ｇｌｙ−Ｌｅｕのジペプチド等価体とはＧｌｙ−Ｌｅｕのペプチド結合(-CONH-)が他の結合に置き換えられたものであって、当該他の結合としては、-CH=CH-, -CH2-CH2-, -CH2-CH=, -C(=N-OH)-NH-, -C(=NH)-NH-等が挙げられる。このようなジペプチド等価体を本明細書中ＧｌｙψＬｅｕと表記する場合がある。
Ｘ４−Ｘ５として、好ましくはＧｌｙ−Ｌｅｕである。
【００４２】
化合物（Ｉ）として、好ましくはＸ１であるＲ１−Ａ１においてＲ１がスクシニル基、Ａ１がグルタミン酸又はグルタミン残基であり、Ａ２がＬ−フェニルアラニン残基、Ａ３がＮ−メチルフェニルアラニン残基、Ｘ４−Ｘ５がＧｌｙ−Ｌｅｕであり、Ａ１がＰＥＧ修飾されている化合物であり、より好ましくは下記表に示す式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）とも称する）である。
【００４３】
【表１】
2017081917.tif 000014
【００４４】
ＭＰＥＧ５００、ＭＰＥＧ７５０、ＭＰＥＧ１ｋ、ＭＰＥＧ２ｋ、及びＭＰＥＧ５ｋは、それぞれ平均分子量５００、７５０、１，０００、２，０００及び５，０００のポリエチレングリコールモノメチルエーテルから誘導される残基を意味する。（ＡＡ）は式（Ｉ）中のＡ１に対応するアミノ酸の種類を意味し、当該アミノ酸が直接もしくはアミノ酸等のリンカーを介してＰＥＧ修飾されている。
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）を含め、以下、本発明化合物あるいは本発明のペプチドとも称する。
【００４５】
本発明化合物は塩の形態であってもよい。このような塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等）等の無機塩、アンモニウム塩等が、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸を伴う無機酸との塩、又は酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩が好ましい。
【００４６】
本発明化合物は、ペプチドであり、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ＰＥＧ化はアミノ酸原料に対して行っても、合成後のペプチドに対して行ってもよいが、好ましくは、アミノ酸原料に対して行うことが簡便である。ＰＥＧ化は、当分野で通常実施されている方法を用いて行うことができ、具体的には通常縮合反応により行われる。以下の反応が例示されるが、所望するペプチド乃至使用する原料に応じて適宜代替可能な試薬に変更することができ、容量や反応温度、反応時間等の反応条件も適宜設定することができる。
【００４７】
Ｒ１をＰＥＧ化する場合、例えばＲ１がオキサリル基の場合にはＰＥＧ又はその誘導体と塩化オキサリルとを有機溶媒（例、乾燥ジエチルエーテル等）中で反応させる。
Ａ１をＰＥＧ化する場合、例えばＡ１がグルタミン酸残基の場合には両末端を保護基（例、Fmoc及びBn）で保護したグルタミン酸とＰＥＧ又はその誘導体とを、有機溶媒中（例、ジクロロメタン等）、塩基（例、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）等）及び縮合剤（例、HATU、DCC、EDCl・HCl/HOBt）の存在下反応させ、次いで所望によりパラジウム炭素等の触媒を用いた水素化により脱保護する。
より詳細には実施例に記載の方法及びそれに準じた方法によって実施することができる。
【００４８】
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明化合物を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを所望配列通りに縮合させることを繰り返し、目的のペプチドを製造することができる。所望配列を有する生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離法としてはたとえば、以下の（１）〜（５）に記載された方法が挙げられる。
（１）M. Bodanszky 及び M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966年)
（２）Schroeder及びLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（４）矢島治明 及び榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
なお、原料化合物は塩であってもよく、このような塩としては、本発明のペプチドの塩として上述したものと同様のものが挙げられる。
【００４９】
保護されたアミノ酸又はペプチドの縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、トリスフォスフォニウム塩類、テトラメチルウロニウム塩類、カルボジイミド類等がよい。トリスフォスフォニウム塩類としてはベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス（ピロリジノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyBOP)、ブロモトリス（ピロリジノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyBroP)、7-アザベンゾトリアゾール-１-イルオキシトリス（ピロリジノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェイト(PyAOP)、テトラメチルウロニウム塩類としては2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-ヘキサフルオロフォスフェイト(HBTU)、2-(7-アザベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-ヘキサフルオロフォスフェイト(HATU)、2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TBTU)、2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TNTU)、O-(N-スクシミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト(TSTU)、カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI・HCl)等が挙げられる。これらによる縮合にはラセミ化抑制剤（例えば、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド(HONB), 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt), 1−ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt), 3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(HOOBt)等）の添加が好ましい。縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえば無水又は含水のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノール、フェノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ピリジン等の三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５から６倍過剰で用いられる。固相合成の場合にはニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸又はアセチルイミダゾール等を用いて未反応アミノ酸をアシル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００５０】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル(Ｚ)、tert-ブトキシカルボニル(Boc)、tert-ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリチル（Trt）等が挙げられる。
原料アミノ酸のカルボキシル基の保護基としては、例えば、tert-ブチル（But）基、ベンジル(Bzl)基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基の他、アリル、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル及びベンジルオキシカルボニルヒドラジド、tert-ブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジド等が挙げられる。
セリン及びスレオニンの水酸基は、例えばエステル化又はエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えばアセチル基等の低級（Ｃ２−４）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基等、及び有機酸から誘導される基等が挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、例えばベンジル、テトラヒドロピラニル、But、Trt等である。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えばBzl、2,6-ジクロルベンジル、２−ニトロベンジル、Br-Z、But等が挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えばp-トルエンスルホニル(Tos)、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)、2,4-ジニトロフェニル(DNP)、ベンジルオキシメチル(Bom)、tert-ブトキシメチル(Bum)、Boc、Trt、Fmoc等が挙げられる。
アルギニンのグアニジノ基の保護基としては、例えばTos、Z、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルフォニル(Mtr)、p-メトキシベンゼンスルフォニル(MBS)、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル(Pmc)、メシチレン-2-スルフォニル(Mts)、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル(Pbf)、Boc、Z、NO2等が挙げられる。
リジンの側鎖アミノ基の保護基としては、例えばZ、Cl-Z、トリフルオロアセチル、Boc、Fmoc、Trt、Mtr、4,4-ジメチル-2,6-ジオキソサイクロヘキシリデンエイル（Dde）等が挙げられる。
トリプトファンのインドリル保護基としては、例えばホルミル(For)、Z、Boc、Mts、Mtr等が挙げられる。
アスパラギン、グルタミンの保護基としては、例えばTrt、キサンチル(Xan)、4,4'-ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、2,4,6-トリメトキシベンジル(Tmob)等が挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、HOBt、HOAtとのエステル）等が挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応する亜リン酸アミドが挙げられる。
【００５１】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えばPd黒あるいはPd炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、臭化トリメシルシラン（TMSBr）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、テトラフルオロホウ酸、トリス(トリフルオロ)ホウ素、三臭化ホウ素あるいはこれらの混合液等による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等も挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾールのようなカチオン捕捉剤や、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオール等の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護及び保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化等は公知の保護基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
【００５２】
本発明化合物は、Ｃ末端にメチオニンアミドを有する。ペプチドのアミド体を得る方法としては、アミド体合成用樹脂を用いて固相合成するか又はカルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（又はアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
【００５３】
本発明化合物が、エナンチオマー、ジアステレオマー等のコンフィギュレーショナル  アイソマー（配置異性体）、コンフォーマー（配座異性体）等として存在する場合には、これらも本発明化合物として含有されると共に、所望により、自体公知の手段、前記の分離、精製手段によりそれぞれを単離することができる。また、本発明化合物がラセミ体である場合には、通常の光学分割手段によりＳ体及びＲ体に分離することができる。本発明化合物に立体異性体が存在する場合には、この異性体が単独の場合及びそれらの混合物の場合も本発明化合物に含まれる。
また、本発明化合物は、溶媒和物（例、水和物）又は無溶媒和物（例、非水和物）であってもよい。
本発明化合物は、同位元素（例、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ）等で標識されていてもよい。
さらに、本発明化合物は、１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体であってもよい。
【００５４】
本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。ペプチドのＮ末端アミノ酸において「Ｈ−」と標記された場合は、末端アミノ基が誘導体化されていないことを示す。ペプチドのＣ末端アミノ酸において「−ＮＨ２」と標記された場合は末端カルボキシル基がアミド化されていることを示す。
【００５５】
本発明化合物は、結晶であってもよく、該結晶の結晶形は単一であっても複数であってもよい。結晶は、自体公知の結晶化法を用いて製造することができる。
本発明化合物は、薬学的に許容され得る共結晶または共結晶塩であってもよい。ここで、共結晶または共結晶塩とは、各々が異なる物理的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解性および安定性等）を持つ、室温で二種またはそれ以上の独特な固体から構成される結晶性物質を意味する。共結晶または共結晶塩は、自体公知の共結晶化法に従い製造することができる。
本発明化合物の結晶は、物理化学的性質（例、融点、溶解度、安定性）及び生物学的性質（例、体内動態（吸収性、分布、代謝、排泄）、薬効発現）に優れ、医薬として極めて有用である。
【００５６】
本発明化合物は、ＮＫ３受容体アゴニスト作用を有する。該作用から、本発明化合物は、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等）に対し、タキキニン類及び／又はニューロキニン受容体がその発症や進行に関与する疾患や病態の予防又は治療薬として有用である。従って、本願発明は、本発明化合物の有効量を、それを必要とする対象（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等；特にヒト）に投与することを含む、タキキニン類及び／又はニューロキニン受容体がその発症や進行に関与する疾患を治療する方法を提供する。
このような疾患、病態としては、例えば、性ホルモン分泌の過剰・欠乏、過少による性機能不全症・発育不全、良性腫瘍、悪性腫瘍、代謝異常等が挙げられる。
さらに、本発明化合物は、卵胞発育を制御する繁殖中枢に対して刺激作用を有し、中枢性に作用してキスペプチン／ニューロキニン神経の神経活動を持続的に亢進する。該作用から、本発明化合物は、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等）に対し、卵胞発育促進及び／又は改善用の医薬として有用である。また、化合物（Ｉ）は繁殖中枢に作用する繁殖中枢制御剤として有用であり、従って、本願発明は、本発明化合物の有効量を家畜（例、ウシ、ヤギ、ヒツジ等）に投与することを含む、該家畜の繁殖を制御する方法を提供する。本願発明により卵胞発育に関与するＬＨパルスの頻度を亢進させることができ、家畜（例、ウシ、ヤギ、ヒツジ等）の生産サイクルの短縮が可能となる。
【００５７】
本発明化合物は、そのままあるいは薬理学的に許容される担体とともに、自体公知の手段、例えば、日本薬局方に記載の方法に従って製剤化することによって、医薬として用いられる。
【００５８】
本発明化合物を含有してなる医薬は、毒性が低く、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている自体公知の手段に従って、本発明化合物をそのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等）、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点滴剤等の医薬製剤として、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。
また、これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤等の放出制御製剤（例、徐放性マイクロカプセル）であってもよい。
なお、医薬製剤中の本発明化合物の含有量は、製剤全体の約０.０１ないし約１００重量％である。
本発明化合物の投与量は、投与対象、症状、投与方法等により適宜選択される。例えば、本発明化合物を経口投与する場合、ヒト（体重６０ｋｇとして）に対する投与量は、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。本発明化合物を非経口的に投与する場合、ヒト（体重６０ｋｇとして）に対する投与量は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜１０ｍｇである。この量を１日１〜数回に分けて投与することができる。
【００５９】
本発明の医薬の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
着色剤としては、例えば水溶性食用タール色素（例、食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号等の食用色素）、水不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ）等が挙げられる。
甘味剤としては、例えばサッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビア等が挙げられる。
吸着剤としては、例えば有孔デンプン、ケイ酸カルシウム（商品名：フローライトＲＥ）、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム（商品名：ノイシリン）、軽質無水ケイ酸（商品名：サイリシア）が挙げられる。
湿潤剤としては、例えばプロピレングリコールモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ジエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。
【００６０】
経口剤を製造する際には、必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティングを行ってもよい。
【００６１】
コーティングに用いられるコーティング基剤としては、例えば、糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤が挙げられる。
【００６２】
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウ等から選ばれる１種又は２種以上を併用してもよい。
【００６３】
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース等のセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＥ〔オイドラギットＥ（商品名）〕、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；プルラン等の多糖類が挙げられる。
【００６４】
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース等のセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーＬ〔オイドラギットＬ（商品名）〕、メタアクリル酸コポリマーＬＤ〔オイドラギットＬ−３０Ｄ５５（商品名）〕、メタアクリル酸コポリマーＳ〔オイドラギットＳ（商品名）〕等のアクリル酸系高分子；セラック等の天然物が挙げられる。
【００６５】
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えば、エチルセルロース等のセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＲＳ〔オイドラギットＲＳ（商品名）〕、アクリル酸エチル−メタクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットＮＥ（商品名）〕等のアクリル酸系高分子が挙げられる。
【００６６】
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば、酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。
【００６７】
ＮＫ３受容体は、種々の生体内現象に関与していることが知られている。従ってＮＫ３受容体アゴニスト作用を有する化合物（Ｉ）は、ＮＫ３受容体が関与する種々の生体内現象を解明するのに役立つツールとなり得る。従って本発明化合物は、研究用試薬としても有用である。
【００６８】
本発明は、更に以下の実施例および試験例によって詳しく説明されるが、これらの例は単なる実施であって、本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
【実施例】
【００６９】
製造例１  保護ペプチド樹脂の構築
NovaSyn（登録商標）TGR樹脂(384.6 mg, 0.10 mmol)またはRink Amide樹脂(166.6 mg, 0.10 mmol)上、Fmoc保護アミノ酸(0.30 mmol)もしくはFmoc保護ジペプチド等価体、HOBt・H2O (46.0 mg, 0.30 mmol)及びDIC (46.4 μL, 0.30 mmol)を用いたFmoc固相合成法により保護ペプチド樹脂を構築した。Ｎ−メチルアミノ酸へのアシル化には、Fmoc保護アミノ酸(0.30 mmol)、HATU (114.0 mg, 0.30 mmol)/(i-Pr)2NEt (52.2 μL, 0.30 mmol)を用いた。
【００７０】
製造例２  ペプチド鎖Ｎ末端のスクシニル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂(0.10 mmol)を構築後、20% ピペリジン/DMFでFmoc基を除去し、DMF中、無水コハク酸(50.0 mg, 0.50 mmol)及び(i-Pr)2NEt(87.2 μL, 0.50 mmol)を添加し、室温下1.5時間反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得た。
【００７１】
製造例３  保護ペプチド樹脂の脱保護と精製
得られた樹脂をTFA/m-cresol/thioanisole/EDT/H2O(80:5:5:5:5)の反応溶液中、２時間処理し、側鎖保護基の除去を伴う樹脂からの切り出しを行った。樹脂を濾去し、濾液中のTFAをトルエンと共沸することにより留去した後、冷ジエチルエーテルを加えることでペプチドを析出させた。得られた粗ペプチドの洗浄操作を３回行った後、HPLCにより精製し、目的のペプチドを得た。
【００７２】
製造例４  ペプチド鎖Ｎ末端のアセチル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、DMF中、無水酢酸とピリジンを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７３】
製造例５  ペプチド鎖Ｎ末端のオキサリル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、ジクロロメタン中、tert-butyl chloro(oxo)acetateと(i-Pr)2NEtを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７４】
製造例６  ペプチド鎖Ｎ末端のカルバモイル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、ジクロロメタン中、chlorosulfonyl isocyanateとピリジンを添加し、室温下で反応させる。その後H2Oを添加して反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７５】
製造例７  ペプチド鎖Ｎ末端のヒドロキシカルバモイル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、THF/ジクロロメタン(1:1)中、p-nitrophenyl chloroformateと(i-Pr)2NEtを添加し、室温下で反応させた。その後DMF溶媒中、ヒドロキシルアミン塩酸塩と(i-Pr)2NEtを添加して反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７６】
製造例８  ペプチド鎖Ｎ末端のヒドラジンカルボニル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、THF中、p-nitrophenyl chloroformate、tert-butyl carbazateとN-methylmorpholineを混合した溶液とトリエチルアミンを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖（Boc保護体）を得る。
【００７７】
製造例９  ペプチド鎖Ｎ末端のメチルオキサリル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、ジクロロメタン中、methyl oxalyl chlorideとピリジンを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７８】
製造例１０  ペプチド鎖Ｎ末端のオキサミド化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、ジクロロメタン中、oxamic acid、DICとHOBt・H2Oを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖を得る。
【００７９】
製造例１１  ペプチド鎖Ｎ末端のスルホンアミド化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、ジクロロメタン中、chlorosulfonyl isocyanateとtert-ブタノールを混合した溶液とトリエチルアミンを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖（Boc保護体）を得る。
【００８０】
製造例１２  ペプチド鎖Ｎ末端のカルボキシメチル化
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂を構築後、DMF中、tert-butyl bromoacetateと(i-Pr)2NEtを添加し、室温下で反応させることにより、目的の修飾保護ペプチド鎖（tert-Bu保護体）を得る。
【００８１】
製造例１３  ペプチド鎖Ｎ末端のビス（カルボキシメチル）化
DMF溶媒中、N-Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OH、トリエチルアミンと臭化ベンジルを混合し、室温下で反応させることにより、N-Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OBnを得る。生成物に対して、DMF中、ジエチルアミンを添加し、室温下で反応させることにより、H-L-Asp(O-tBu)-OBnを得る。その後、生成物に対して、無水DMF溶媒中、tert-butyl bromoacetateと炭酸カリウムを添加し、室温下で反応させることにより、N,N-ビス(tert-ブチルオキシカルボニルメチル)-L-アスパラギン酸 4-tert-ブチル 1-ベンジルを得る。生成物にEtOH溶媒中、10％ Pd/Cを添加し、水素雰囲気下、室温下で反応させることにより、N,N-ビス（tert-ブチルオキシカルボニルメチル）-L-アスパラギン酸4-tert-ブチルを得る。これを製造例１のFmoc固相合成法に適用し、保護ペプチド樹脂に導入することで、目的の修飾保護ペプチド樹脂（tert-Bu保護体）を構築する。
【００８２】
式（Ｉ）中、Ｘ１におけるＡ１がＰＥＧ修飾（−Ｏ−を介してペプチド鎖に結合）している化合物（式（ＩＩ）中、Ｘが−Ｏ−；実施例１〜３）を下記スキーム１に従って合成した。
［スキーム１］
【００８３】
【化１３】
2017081917.tif 000015
【００８４】
実施例１  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のエステル結合を介したMPEG750修飾
【００８５】
【化１４】
2017081917.tif 000016
【００８６】
Fmoc-Glu-OBn(2.0 g, 4.36 mmol)、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル750(3.59 g, 4.79 mmol)、DCC(1.12 g, 5.45 mmol)及びDMAP(53.3 mg, 0.436 mmol)をジクロロメタン中で反応させることで、目的とするFmoc-Glu(O-MPEG750)-OBnを4.17 g得た。
次に得られた生成物(2.0 g, 1.68 mmol)に対し、脱水エタノール(29.2 mL)溶媒中、10% Pd/C(350 mg, 0.33 mmol)を水素雰囲気下で反応させることで目的のFmoc-Glu(O-MPEG750)-OHを955 mg得た。続いて、上記アミノ酸を用い、製造例１、製造例２、製造例３の手順により目的のペプチド８を得た。
【００８７】
実施例２  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のエステル結合を介したMPEG2k修飾
【００８８】
【化１５】
2017081917.tif 000017
【００８９】
Fmoc-Glu-OBn(1.0 g, 2.17 mmol)、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル2k(4.79 g, 2.39 mmol)、DCC(560 mg, 2.72 mmol)及びDMAP(26.6 mg, 0.217 mmol)をジクロロメタン中で反応させることで、目的とするFmoc-Glu(O-MPEG2k)-OBnを5.10 g得た。得られた生成物(5.10 g, 2.09 mmol)に対し、エタノール(30 mL)-クロロホルム(5.0 mL)混合溶媒中、10% Pd/C(222 mg, 0.209 mmol)を水素雰囲気下で反応させることで目的のFmoc-Glu(O-MPEG2k)-OHを3.89 g得た。続いて、製造例１の手順により得られた保護ペプチド樹脂Ａ(0.5 mmol)に対し、上記アミノ酸(3.53 g, 1.5 mmol)、HATU(570 mg, 1.5 mmol)及び(i-Pr)2NEt(261 μL, 1.5 mmol)を用いた縮合、製造例２、製造例３の手順により目的のペプチド９（PEG2k ester）を得た。
【００９０】
実施例３  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のエステル結合を介したMPEG5k修飾
【００９１】
【化１６】
2017081917.tif 000018
【００９２】
Fmoc-Glu-OtBu(531 mg, 1.25 mmol)、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル5k(6.87 g, 1.37 mmol)、DCC(322 mg, 1.56 mmol)及びDMAP(15.3 mg, 0.125 mmol)をジクロロメタン中で反応させることで、目的とするFmoc-Glu(O-MPEG5k)-OBnを6.21 g得た。次に得られた生成物(2.0 g, 0.37 mmol)に対し、TFA(20 mL)溶媒中で反応させることで目的のFmoc-Glu(O-MPEG5k)-OHを1.92 g得た。続いて、製造例１の手順により得られた保護ペプチド樹脂Ａ(0.05 mmol)に対し、上記アミノ酸(1.05 g, 0.20 mmol)、HOBt・H2O(459 mg, 3.0 mmol)及びDIC(464 μL, 3.0 mmol)を用いて60℃で２度縮合した。さらに製造例２の手順でＮ末端のスクシニル化を２度行い、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド１０を得た。
【００９３】
式（Ｉ）中、Ｘ１におけるＡ１がＰＥＧ修飾（−ＮＨ−を介してペプチド鎖に結合）している化合物（式（ＩＩ）中、Ｘが−ＮＨ−；実施例４〜８）を下記スキーム２に従って合成した。
［スキーム２］
【００９４】
【化１７】
2017081917.tif 000019
【００９５】
実施例４  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のアミド結合を介したMPEG500修飾
【００９６】
【化１８】
2017081917.tif 000020
【００９７】
製造例１及び製造例３の手順で得られたペプチド（ｉｖ）(150 mg, 0.153 mmol)に対し、メトキシポリエチレングリコールアミン500(69 mg, 0.138 mmol)、WSC・HCl(44.1 mg, 0.230 mmol)、HOBt・H2O(35.2 mg, 0.230 mmol)及び(i-Pr)2NEt (40.1 μL, 0.230 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、HPLC精製により目的物を得た。得られた生成物に対し、50% ジエチルアミン/ジクロロメタンを加え、1時間反応させることで、Fmoc基の脱保護を行った。そして製造例２の手順でペプチドＮ末端をスクシニル化することで目的のペプチド１１を得た。
【００９８】
実施例５  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のアミド結合を介したMPEG750修飾
【００９９】
【化１９】
2017081917.tif 000021
【０１００】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン750を使用する以外は、実施例４と同様にして、目的のペプチド１２を得た。
【０１０１】
実施例６  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のアミド結合を介したMPEG1k修飾
【０１０２】
【化２０】
2017081917.tif 000022
【０１０３】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン1kを使用する以外は、実施例４と同様にして、目的のペプチド１３を得た。
【０１０４】
実施例７  ペプチド鎖Ｎ末端のアミド結合を介したMPEG2k修飾
【０１０５】
【化２１】
2017081917.tif 000023
【０１０６】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン2kを使用する以外は、実施例４と同様にして、目的のペプチド１４を得た。
【０１０７】
実施例８  ペプチド鎖Ｎ末端のアミド結合を介したMPEG5k修飾
【０１０８】
【化２２】
2017081917.tif 000024
【０１０９】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン5kを使用する以外は、実施例４と同様にして、目的のペプチド１５を得た。
【０１１０】
実施例９  ペプチド鎖Ｎ末端にオキサリル基を介したMPEG750修飾
【０１１１】
【化２３】
2017081917.tif 000025
【０１１２】
式（Ｉ）中、Ｘ１におけるＲ１がＰＥＧ修飾（−Ｏ−を介してペプチド鎖に結合）している化合物を下記スキーム３に従って合成した。
［スキーム３］
【０１１３】
【化２４】
2017081917.tif 000026
【０１１４】
塩化オキサリル(0.65 ml, 7.6 mmol)をジエチルエーテルに溶解した後、アルゴン雰囲気下でポリエチレングリコールモノメチルエーテル750(2.85 g, 3.8 mmol)をゆっくり滴下し、室温で3時間撹拌した。製造例１の手順により構築した保護ペプチド樹脂Ｂ(0.10 mmol)に、得られたオキサリル化MPEG750 (858 mg, 1.0 mmol)及び(i-Pr)2NEt(176 μL, 1.0 mmol)を添加し、室温下2時間反応させた。続いて、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド６を得た。
【０１１５】
式（Ｉ）中、Ｘ１におけるＡ１がその側鎖官能基上にリンカーを介してＰＥＧ修飾（−ＮＨ−を介してリンカーに結合）している化合物（実施例１０〜１３）を下記スキーム４に従って合成した。
［スキーム４］
【０１１６】
【化２５】
2017081917.tif 000027
【０１１７】
実施例１０  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にアスパラギン酸を介した２分子のMPEG500修飾
【０１１８】
【化２６】
2017081917.tif 000028
【０１１９】
Fmoc-Asp-OH (35.5 mg, 0.10 mmol)、メトキシポリエチレングリコールアミン500(110 mg, 0.22 mmol)、WSC・HCl(96 mg, 0.50 mmol)、HOBt・H2O(76.5 mg, 0.50 mmol) 及び(i-Pr)2NEt(87 μl, 0.50 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、シリカゲルクロマトグラフィー精製することでFmoc-Asp(NH-MPEG500)-NH-MPEG500を得た。次に、Fmoc-Asp(NH-MPEG500)-NH-MPEG500に対し50% ジエチルアミン／ジクロロメタン溶液を加え、1時間反応させることでFmoc基を脱保護した。逆相クロマトグラフィー精製により、H-Asp(NH-MPEG500)-NH-MPEG500(ｖ、90.5 mg)を得た。製造例１及び製造例３の手順で得られたペプチド（ｉｖ）(88.9 mg, 0.091 mmol)に対し、H-Asp(NH-MPEG500)-NH-MPEG500 (90.5 mg, 0.082 mmol)、WSC・HCl(23.9 mg, 0.124 mmol)、HOBt・H2O(19.0 mg, 0.124 mmol)及び(i-Pr)2NEt (21.6 μL, 0.124 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、逆相クロマトグラフィー精製により目的物を得た。得られた生成物に50% ジエチルアミン／ジクロロメタン溶液を加え、1時間反応させることで、Fmoc基の脱保護を行った。引き続き、製造例２の手順でペプチドＮ末端をスクシニル化することで目的のペプチド１８を得た。
【０１２０】
実施例１１  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にアスパラギン酸を介した２分子のMPEG750修飾
【０１２１】
【化２７】
2017081917.tif 000029
【０１２２】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン750を使用する以外は、実施例１０と同様にして、目的のペプチド１９を得た。
【０１２３】
実施例１２  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にアスパラギン酸を介した２分子のMPEG1k修飾
【０１２４】
【化２８】
2017081917.tif 000030
【０１２５】
メトキシポリエチレングリコールアミン500に代えてメトキシポリエチレングリコールアミン1kを使用する以外は、実施例１０と同様にして、目的のペプチド２０を得た。
【０１２６】
実施例１３  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にアスパラギン酸を介した２分子のMPEG2k修飾
【０１２７】
【化２９】
2017081917.tif 000031
【０１２８】
ペプチド（ｉｖ）(97.7 mg, 0.10 mmol)に対し、H-Asp(OtBu)-OtBu・HCl(31.0 mg, 0.11 mmol)、WSC・HCl(29.0 mg, 0.15 mmol)、HOBt・H2O(23.0 mg, 0.15 mmol)及び(i-Pr)2NEt (26.1 μL, 0.15 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、HPLC精製により目的物(122.6 mg)を得た。得られた生成物に対し、TFA中で1時間反応させることで、tBu基の脱保護を行った。得られたペプチド(43.7mg, 0.04 mmol)に対し、メトキシポリエチレングリコールアミン2k(160.0 mg, 0.08 mmol)、WSC・HCl(23.2 mg, 0.12 mmol)、HOBt・H2O(18.4 mg, 0.12 mmol) 及び(i-Pr)2NEt(20.8 μl, 0.12 mmol)をジクロロメタン中で反応させた。溶媒を留去した後、HPLC精製により目的物(98.7 mg)を得た。これに50% ジエチルアミン/ジクロロメタン溶液を加え、1時間反応させることで、Fmoc基の脱保護を行った。引き続き製造例２の手順でペプチドＮ末端をスクシニル化することで目的のペプチド２１を得た。
【０１２９】
比較例１  ペプチド鎖Ｎ末端のMPEG（分子量５００未満）修飾
【０１３０】
【化３０】
2017081917.tif 000032
【０１３１】
Methyl-PEG12-NHS（NHS：N-ヒドロキシスクシンイミド活性エステル）を用いてＰＥＧ修飾したペプチドを下記スキーム５に従って合成した。
［スキーム５］
【０１３２】
【化３１】
2017081917.tif 000033
【０１３３】
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂Ｂ(0.05 mmol)を構築後、DMF溶媒中、methyl-PEG12-NHS(50.3 mg, 0.075 mmol)及び(i-Pr)2NEt (26.2 μL, 0.15 mmol)を添加し、室温下1.5時間反応させた。続いて、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド４を得た。
【０１３４】
比較例２
製造例１〜３の手順と同様にして目的のペプチド１を合成した。
【０１３５】
【化３２】
2017081917.tif 000034
【０１３６】
ＰＥＧ修飾以外の化学修飾を施したペプチド（比較例３〜８）を下記スキーム６およびスキーム７に従って合成した。
［スキーム６］
【０１３７】
【化３３】
2017081917.tif 000035
【０１３８】
比較例３  ペプチド鎖Ｎ末端アミノ酸への糖鎖修飾
【０１３９】
【化３４】
2017081917.tif 000036
【０１４０】
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂Ａ(0.025 mmol)を構築後、DMF溶媒中、Fmoc-Asn(Ac3AcNH-β-Glc)-OH(17.1 mg, 0.025 mmol)、HOBt・H2O(5.75 mg, 0.038 mmol)及びDIC(5.76 μL, 0.038 mmol)を添加し、室温下1.5時間反応させた。次に、DMF溶媒中、無水酢酸(11.8 μL, 0.125 mmol)、ピリジン(20.1 μL, 0.25 mmol)を加えて10分間反応に付し、糖鎖修飾アミノ酸が導入されなかったペプチドＮ末端をアセチル基で保護した。続いて、実施例２の手順によりスクシニル化を行った後、DMF-メタノール混合溶媒中で、ナトリウムメトキシド(20.25 mg, 0.375 mmol)による脱アセチル化を行った。最後に、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド２を得た。
【０１４１】
比較例４  ペプチド鎖Ｎ末端の脂肪酸修飾
【０１４２】
【化３５】
2017081917.tif 000037
【０１４３】
製造例１の手順により保護ペプチド樹脂Ｂ(0.10 mmol)を構築後、DMF溶媒中、パルミチン酸(76.5 mg, 0.30 mmol)、HOBt・H2O (46.0 mg, 0.30 mmol)及びDIC(46.4 μL, 0.30 mmol)を添加し、室温下1.5時間反応した。続いて、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド３を得た。
【０１４４】
比較例５  ペプチド鎖Ｎ末端にオキサリル基を介した長鎖アルキル修飾
【０１４５】
【化３６】
2017081917.tif 000038
【０１４６】
塩化オキサリル(2.6 ml, 29.2 mmol)をジエチルエーテルに溶解した後、アルゴン雰囲気下でヘキサデカノール(3.6 g, 14.6 mmol)をゆっくり滴下し、室温下で4時間撹拌した。次に製造例１の手順により保護ペプチド樹脂Ｂ(0.05 mmol)を構築後、ジクロロメタン溶媒中、得られたオキサリル化ヘキサデカノール(83.5 mg, 0.25 mmol)及び(i-Pr)2NEt(88 μL, 0.5 mmol)を添加し、室温下2時間反応させた。続いて、製造例３の手順で樹脂から切り出すことにより目的のペプチド５を得た。
【０１４７】
比較例６  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖のエステル結合を介した長鎖アルキル修飾
【０１４８】
【化３７】
2017081917.tif 000039
【０１４９】
Fmoc-Glu-OBn(459.5 mg, 1.0 mmol)、ヘキサデカノール(291mg, 1.2 mmol)、EDCI・HCl(230.0 mg, 1.2 mmol)及びDMAP(12.2 mg, 0.1 mmol)を、ジクロロメタン中室温下で2.5時間撹拌することで、Fmoc-Glu(O-C16H33)-OBnを得た。得られた生成物(210 mg, 0.30 mmol)に対し、エタノール(6.0 mL)-酢酸エチル(3.0 mL)混合溶媒中、10% Pd/C(16 mg, 0.015 mmol)存在下水素雰囲気下で反応させることでFmoc-Glu(O-C16H33)-OHを233 mg得た。続いて、上記アミノ酸を用い、製造例１、製造例２、製造例３の手順によりペプチド７を得た。
［スキーム６］
【０１５０】
【化３８】
2017081917.tif 000040
【０１５１】
比較例７  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にアスパラギン酸の修飾
【０１５２】
【化３９】
2017081917.tif 000041
【０１５３】
ペプチド（ｉｖ）(97.7 mg, 0.10 mmol)に対し、H-Asp(OtBu)-OtBu・HCl(31.0 mg, 0.11 mmol)、WSC・HCl(29.0 mg, 0.15 mmol)、HOBt・H2O(23.0 mg, 0.15 mmol)及び(i-Pr)2NEt (26.1 μL, 0.15 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、溶媒を留去後シリカゲルクロマトグラフィーにより目的物(61.2 mg)を得た。得られた生成物にTFAを加えて1時間反応させ、tBu基を脱保護した。このペプチド (33.2 mg, 0.028 mmol)に対し、50% ジエチルアミン/ジクロロメタンを加えて1時間反応させ、Fmoc基を脱保護した。製造例２の手順でペプチドＮ末端のスクシニル化を行った後、TFA中で1時間反応させることで、目的のペプチド１６を得た。
【０１５４】
比較例８  ペプチド鎖Ｎ末端グルタミン酸側鎖にN,N’-ジメチルアスパラギンの修飾
【０１５５】
【化４０】
2017081917.tif 000042
【０１５６】
Fmoc-Asp-OH(86.8 mg, 0.245 mmol)、メチルアミン水溶液(63.5 μL, 0.735 mmol)、WSC・HCl(141 mg, 0.735 mmol)、HOBt・H2O(112 mg, 0.735 mmol) 及び(i-Pr)2NEt(127 μl, 0.735 mmol)をジクロロメタン中で反応させ、溶媒を留去後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製した。次に、得られた生成物に対して50%ジエチルアミン/DMF溶液を加えて1時間反応させることで、Fmoc基を脱保護した。ペプチド（ｉｖ）(239 mg, 0.245 mmol)に対し、上記アミノ酸、WSC・HCl(56.7 mg, 0.294 mmol)、HOBt・H2O(45.0 mg, 0.294 mmol)及び(i-Pr)2NEt (51.2 μL, 0.294 mmol)をDMF中で反応させ、目的物のペプチドを得た。得られた生成物に50%ジエチルアミン/ジクロロメタンを加え、1時間反応させることで、Fmoc基を脱保護した。製造例２の手順でペプチドＮ末端をスクシニル化することで目的のペプチド１７を得た。
【０１５７】
実施例１〜９及び比較例１〜６、並びに実施例１０〜１３及び比較例７〜８の各ペプチドをその質量分析値（MALDI-TOF MSによる分析）とともに下記表２-１、表２−２及び表３にまとめる。senktideは公知のＮＫ３受容体アゴニストである。
【０１５８】
【表２−１】
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【０１５９】
【表２−２】
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【０１６０】
【表３】
2017081917.tif 000045
【０１６１】
試験例１  本発明化合物によるＮＫ３受容体アゴニスト活性の評価
ＮＫ３受容体を強制発現したFlp-In CHO細胞を各種ペプチドで刺激した時における細胞内カルシウム濃度の変化を定量した。
まず、ＮＫ３受容体発現CHO細胞を、トリプシンを用いて回収し、4×104 cells／ウェルとなるように９６穴プレートに播種した。３７℃で一晩培養後、カルシウム指示薬100 μLを添加し、さらに１時間培養した。続いて、５倍濃縮で調製したペプチド溶液25 μLを滴下し、FlexStationにより細胞内カルシウム濃度の経時的変化を６０秒間観察した。
【０１６２】
試験例２  ヤギ血清中における本発明化合物の安定性評価
氷冷下、各動物組織液49 μLに対してペプチド溶液を1 μL加えて混合し、37℃でインキュベーションした。次に、インキュベーションの間、評価液を対応時間毎に20μL採取した。採取した評価液に対して、氷冷下でアセトニトリル60 μLを加えて組織タンパクを沈殿させた。振盪した後、遠心し(4℃, 13000 g, 10 min)、得られた上清をHPLCにて解析した。いずれも優れた安定性を示した。
【０１６３】
試験例３  本発明化合物のヤギの生殖中枢の神経活動に及ぼす活性評価
卵巣摘出ヤギ４頭を供試し、外科的に記録電極を視床下部弓状核のキスペプチンニューロン近傍に留置した。約１ヶ月の回復期をおき、覚醒したヤギにおいて神経活動をＭＵＡとしてリアルタイムに計測し、約２分程度続く一過性の神経活動の上昇（ＭＵＡボレー）が規則正しい周期で起きていることを確認した。ＭＵＡボレーは、ＧｎＲＨをパルス状に分泌させるキスペプチンニューロンの神経活動を反映している。卵巣摘出ヤギでは、内因性のＭＵＡボレーの周期の長さは約２５分（±５分程度）であり、個体により多少異なるが、同一個体内では周期の長さはほぼ一定である。
試験当日、ＭＵＡ計測機器をセットし、終日ＭＵＡを連続的に記録した。また、試料投与用の頚静脈カテーテルを留置した。まず、それぞれの個体で約２時間のコントロール時間中に起きた内因性ＭＵＡボレーを数本確認し、そのボレー間隔（分）の平均値（Ｔ）を計算した。次に、任意のＭＵＡボレー発現後、１／２Ｔ分のタイミングで被検試料溶液を頚静脈内に一気に投与した。薬剤投与後、ＭＵＡボレーが4分以内に発現した場合をＮＫ３受容体アゴニスト活性陽性とし、薬剤投与時点からボレー間隔がＴの80%に回復するまでの時間を薬剤による効果の持続時間（Ｒ）とした。また、この持続時間Ｒ中に観測されたボレーの数（Ｖ）を計数した。
被検試料溶液は以下のように調製した。試験当日、ＤＭＳＯ中に10 mMの濃度で調整された被検試料50 μLを滅菌蒸留水4.45 mLに溶解した。析出せず、完全に溶解したことを確認後、0.5 mLの滅菌９％ＮａＣｌを加え、溶液の最終濃度を被検試料：500 nmol/5 mL、ＮａＣｌ：０．９％、ＤＭＳＯ：１％とした。ここから2 mL (200 nmol)を注射筒にとり、活性評価に供した。また、原則として、１被検試料について２〜３頭を用いて活性評価を行った。
一例として、本発明のペプチド（ペプチド９；実施例２）と対照ペプチドとしてのSenktideとを比較したチャートを図１に示す。さらに、試験例１及び３に基づいて、Senktide及び本発明化合物との生物活性を比較した結果を表４に示す。
【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
ＰＥＧ修飾、特に分子量５００、好ましくは分子量７５０を超える鎖長、より好ましくは分子量７５０〜２，０００の鎖長からなるＰＥＧ鎖を付したペプチドにおいて、ヤギへの末梢投与において中枢神経活動の持続的な活性化が認められた。
【０１６６】
試験例４  本発明化合物のヤギへの投与による血中黄体形成ホルモン濃度に与える影響の評価
ペプチド１２（200 nmol）を、卵胞期および黄体期のシバヤギ静脈血中に単回投与した。投与前２時間から投与後６時間後にわたって後数時間にわたって10分間隔で採血し、血中黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度を定量した。試験例４に基づいて、ペプチド１２を卵胞期および黄体期のシバヤギへ投与した結果をそれぞれ図２および図３に示す。
【０１６７】
ペプチド１２の投与直後からＬＨ濃度の上昇が認められ、この上昇効果は同量の既存の作動薬を投与した場合には見られなかったことから、ペプチド１２が、既存の作動薬と比較して生体内安定性に優れ、長期にわたって性腺刺激ホルモンの分泌を促進したと考えられた。
【０１６８】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１；ペプチド１
配列番号２；ペプチド２
配列番号３；ペプチド３
配列番号４；ペプチド４
配列番号５；ペプチド５
配列番号６；ペプチド６
配列番号７；ペプチド７
配列番号８；ペプチド８
配列番号９；ペプチド９
配列番号１０；ペプチド１０
配列番号１１；ペプチド１１
配列番号１２；ペプチド１２
配列番号１３；ペプチド１３
配列番号１４；ペプチド１４
配列番号１５；ペプチド１５
配列番号１６；ペプチド１６
配列番号１７；ペプチド１７
配列番号１８；ペプチド１８
配列番号１９；ペプチド１９
配列番号２０；ペプチド２０
配列番号２１；ペプチド２１
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明により得られた高活性・高選択的ＮＫ３受容体アゴニストは、タキキニン類の分泌の過剰もしくは欠乏に伴う疾患の治療薬、例えば、疼痛、性ホルモン分泌の過剰・欠乏にともなう性機能障害の改善に向けた薬剤、これらの疾患の治療薬開発に向けた基礎科学実験用試薬等として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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