(57)【要約】【課題】迅速で、かつ検出感度の高い被検物質の定量方法を提供する。【解決手段】本発明の一形態に係る被検物質の定量方法は、電気化学信号を発する電気化学物質を内包するリポソームの表面に付加された第１の反応物質、及び上記第１の反応物質に特異的に結合する第２の反応物質のいずれか一方を被検物質とする被検物質の定量方法であり、  上記第１の反応物質を上記第２の反応物質と反応させる工程と、  上記第１の反応物質と上記第２の反応物質とが反応した上記リポソーム、及び上記第１の反応物質と上記第２の反応物質とが反応しなかった上記リポソームのいずれか一方から上記電気化学物質を放出させる工程と、  を含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学信号を発する電気化学物質を内包するリポソームの表面に付加された第１の反応物質、及び前記第１の反応物質に特異的に結合する第２の反応物質のいずれか一方を被検物質とする被検物質の定量方法であって、
前記第１の反応物質を前記第２の反応物質と反応させ、
前記第１の反応物質と前記第２の反応物質とが反応した前記リポソーム、及び前記第１の反応物質と前記第２の反応物質とが反応しなかった前記リポソームのいずれか一方から前記電気化学物質を放出させ、
放出された前記電気化学物質に基づく前記電気化学信号を検出する
被検物質の定量方法。
【請求項２】
請求項１に記載の被検物質の定量方法であって、
前記被検物質は、前記第２の反応物質である
被検物質の定量方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の被検物質の定量方法であって、
前記第１の反応物質を前記第２の反応物質と反応させる工程では、前記第２の反応物質を基板上に固定し、
前記電気化学物質を放出させる工程では、前記第１の反応物質と前記第２の反応物質とが反応した前記リポソームから前記電気化学物質を放出させる
被検物質の定量方法。
【請求項４】
請求項３に記載の被検物質の定量方法であって、
前記第１の反応物質を前記第２の反応物質と反応させる工程では、ブロッキング操作を行わない
被検物質の定量方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の被検物質の定量方法であって、
前記リポソーム中に内包される前記電気化学物質の濃度は、0.1 M以上である
被検物質の定量方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の被検物質の定量方法であって、
前記リポソーム中に内包される前記電気化学物質は、室温（２５℃）における酸化還元電位が0 V以上0.6 V vs. Ag/AgCl 以下の化合物である
被検物質の定量方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の被検物質の定量方法であって、
前記第１の反応物質は、抗体又は前記抗体の機能性断片であり、
前記第２の反応物質は、前記第１の反応物質に特異的に結合する抗原又は前記抗原の機能性断片である
被検物質の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の被検物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野において、タンパク質を定量することによって腫瘍マーカ、アレルゲン物質、ウイルス等が検出されており、タンパク質の定量方法は非常に重要な技術である。現在、タンパク質の定量方法としては、Biuret法、lowry法、BCA法、Bradford法、ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 法、イムノクロマト法等が知られている。
ELISA法は、上記のタンパク質の定量方法の中でも特に広く用いられている。しかしながら、ELISA法は、例えば、タンパク質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３工程から構成されており（例えば、特許文献１及び２参照）、迅速性の点で問題を有する。さらに、ELISA法の検出下限は一般に10-6 g/mL程度であり、近年、より感度の高い方法が求められている。
【０００３】
また、迅速性という観点からは、イムノクロマト法も広く用いられている（特許文献３参照）。イムノクロマト法は、ウイルスの迅速診断テスト（POCT）等に用いられ、例えば２０分程度の短時間でタンパク質を検出できる。一方で、検出感度は低く、ウイルス感染の早期診断等の高い精度が要求される場合には用いることができなかった。
【０００４】
そこで、これらに代わる高感度なタンパク質の迅速定量法が強く望まれている。
例えば、非特許文献１には、グラフェン／金微粒子／グラファイト電極上でペルオキシダーゼ内包イムノリポソームを利用して腫瘍マーカ−を電気化学的に検出する方法が記載されている。
また、非特許文献２には、金電極上にミオグロビン結合性ペプチドを固定し、抗原抗体反応を行った後、電位走査し、タンパクの結合による電流低下に基づいてミオグロビンを検出する方法が記載されている。
非特許文献３には、DNA内包イムノリポソームを用いELISAを行った後、DNAをPCRで増幅することによりコレラ毒を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−５０２９５８号公報
【特許文献２】特表２０００−５０９４９４号公報
【特許文献３】特開２０１１−２７６９３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shenguang Ge  他２名、Analyst、2012年10月7日、第137巻、第１９号、p.4440-4447
【非特許文献２】Hyeoung Yun Lee  他４名、Analytical Sciences、2015年7月、第31巻、p.699-704
【非特許文献３】Jeffrey T Masan  他３名、Nature Biotechnology、2006年5月、第24巻、第5号、p.555-557
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、検出感度は高いものの、１時間以上の測定時間が必要となるとともに、イムノリポソーム、２つの抗体、金微粒子さらにグラフェンを活用しており高コストになるおそれがある。
また、非特許文献２に記載の方法の検出下限は5 x 10-10 molであり、十分な感度を得られない。
さらに非特許文献３に記載の方法は、やはり検出感度は高いものの、２時間程度の測定時間と煩雑な操作が必要である。
【０００８】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、迅速で、かつ検出感度の高い被検物質の定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る被検物質の定量方法は、電気化学信号を発する電気化学物質を内包するリポソームの表面に付加された第１の反応物質、及び上記第１の反応物質に特異的に結合する第２の反応物質のいずれか一方を被検物質とする被検物質の定量方法であり、
上記第１の反応物質を上記第２の反応物質と反応させる工程と、
上記第１の反応物質と上記第２の反応物質とが反応した上記リポソーム、及び上記第１の反応物質と上記第２の反応物質とが反応しなかった上記リポソームのいずれか一方から上記電気化学物質を放出させる工程と、
を含む。
上記定量方法によれば、比較的時間を要する特異的結合の反応工程を１回に抑えることができ、迅速な定量が可能となる。また、電気化学物質に基づいて電気化学信号を検出するため、十分な検出感度を得ることができる。
【００１０】
上記被検物質は、上記第２の反応物質であってもよい。
これにより、被検物質をリポソームに付加させることなく分析に供することができ、より精度の高い定量分析が可能となる。
【００１１】
また、上記第１の反応物質を上記第２の反応物質と反応させる工程では、上記第２の反応物質を基板上に固定し、
上記電気化学物質を放出させる工程では、上記第１の反応物質と上記第２の反応物質とが反応した上記リポソームから上記電気化学物質を放出させてもよい。
これにより、基板上に固定されたリポソーム複合体を用いて定量分析することができ、反応液の除去及び基板の洗浄等の操作で、第１の反応物質と第２の反応物質とが反応したリポソームを容易に分離することができる。
【００１２】
この場合、上記第１の反応物質を上記第２の反応物質と反応させる工程では、ブロッキング操作を行わなくてもよい。
非特異的反応を防止するためのブロッキング操作を省略することで、より迅速な定量分析が可能となる。
【００１３】
また、上記リポソーム中に内包される上記電気化学物質の濃度は、0.1 M以上であってもよい。
溶解性の高い電気化学物質を用いることで、高い濃度の電気化学物質を含むリポソームを生成することができ、検出感度を高めることができる。
【００１４】
上記リポソーム中に内包される上記電気化学物質は、室温（２５℃）における酸化還元電位が0 V以上0.6 V vs. Ag/AgCl 以下の化合物であってもよい。
これにより、電気化学信号をより精度よく検出することができる。
【００１５】
上記第１の反応物質は、抗体又は上記抗体の機能性断片であり、
上記第２の反応物質は、上記第１の反応物質に特異的に結合する抗原又は上記抗原の機能性断片であってもよい。
これにより、比較的簡便な抗原抗体反応を適用することができる。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明によれば、迅速で、かつ感度の高い被検物質の定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例に係る、リポソームに付加される第１の反応物質（抗体）の修飾経路を模式的に示す図である。
【図２】上記実施例に係る活性型リポソームを模式的に示す図である。
【図３】上記実施例に係る活性型リポソームと抗体との結合の様子を模式的に示す図である。
【図４】上記実施例に係る電気化学信号の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
＜被検物質の定量方法＞
本発明の定量方法は、電気化学信号を発する電気化学物質を内包するリポソームの表面に付加された第１の反応物質、及び第１の反応物質に特異的に結合する第２の反応物質のいずれか一方を被検物質とする被検物質の定量方法である。本発明の定量方法は、例えば10-5 〜10-8 g/mLの微量な被検物質を定量することができる。
本発明の定量方法は、
（i）第１の反応物質を第２の反応物質と反応させる工程と、
（ii）第１の反応物質と第２の反応物質とが反応したリポソーム、及び第１の反応物質と第２の反応物質とが反応しなかったリポソームのいずれか一方から電気化学物質を放出させる工程と、
（iii）放出された電気化学物質に基づく上記電気化学信号を検出する工程と、
を含む。
【００２０】
＜被検物質／第１の反応物質／第２の反応物質＞
本発明の被検物質は、第１の反応物質と第２の反応物質のいずれか一方であり、好ましくは被検物質を第２の反応物質とすることができる。これにより、被検物質と特異的に結合する第１の反応物質をリポソームに付加させることができる。
第１の反応物質は、抗体又は当該抗体の機能性断片であり、第２の反応物質は、第１の反応物質に特異的に結合する抗原又は当該抗原の機能性断片であってもよい。ここでいう抗原の機能性断片とは、抗体との結合活性を有する抗原の部分断片をいい、例えば抗原のエピトープを含む。また、抗体の機能性断片とは、抗原又は抗原の機能性断片との結合活性を有する抗体の部分断片をいう。この機能性断片は、抗原蛋白質又は抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体蛋白質又は抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。これにより、第１の反応物質と第２の反応物質とを抗原抗体反応させることができる。
第１の反応物質と第２の反応物質の組み合わせは、上記に限定されない。例えば、酵素と基質、受容体とリガンド、アプタマーとその結合分子、特異的結合性タンパクとその結合分子等を適用することができる。
このように、本発明の被検物質は、典型的にはタンパク質であるが、これに限定されず、核酸や脂質等のタンパク質以外の分子であってもよい。
【００２１】
＜リポソーム＞
本発明で使用されるリポソームは、例えば多重膜リポソーム、単一膜リポソームのいずれであってもよいが、好ましくは単一膜リポソームである。上記リポソームは、脂質膜の成分として、修飾された不活性または負に帯電したリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等を含んでいてもよく、さらにコレステロール等の他の脂質やタンパク質を含んでいてもよい。
本発明のリポソームは、上記第１の反応物質が表面に付加されたイムノリポソームとして構成される。第１の反応物質をリポソームの表面に付加する方法は特に限定されず、共有結合、あるいは物理的・生物学的親和性に基づく非共有結合を形成していればよい。
また、本発明のリポソームは、電気化学物質を内包する。ここでいう「内包」とは、脂質膜によって区画された領域に封入されることをいうものとする。
【００２２】
＜電気化学物質＞
本発明の電気化学物質は、電気化学信号を発する物質である。より具体的には、公知の電気化学検出器により電気化学信号が検出される物質であり、かつ、リポソームに内包されることが可能な水溶性の高い物質である。
電気化学信号は、酸化還元反応の結果生じる電流又は電位として検出される信号である。
さらに、上記電気化学物質は、室温（25 ℃）における酸化還元電位が0 V以上0.6 V vs. Ag/AgCl以下の化合物とすることができ、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、フェロセン化合物、ルテニウム錯体等を用いることができる。なお、上記の「vs. Ag/AgCl」は、銀−塩化銀電極を基準にして測定されたことを表す。また、上記電気化学物質は、電子の授受を効率的に行える物質であれば上記に限定されず、例えばフラーレン等を用いることができる。
【００２３】
＜電気化学物質の濃度＞
上記リポソーム中に内包される電気化学物質の濃度は、例えば0.1 M以上とすることができる。これにより、明確な電気化学信号を検出することができ、被検物質の定量を精度よく行うことができる。例えば本発明者らは、電気化学物質としてフェリシアン化カリウムを用いた場合に、0.4 M以上の濃度でリポソームに内包できることを確認している。なお、被検物質のアッセイが可能であれば、電気化学物質の濃度は上記に限定されない。
また、以下の説明において、「M」は、SI単位においてmol/m3、すなわち mol/Lを表すものとする。
【００２４】
＜（i）反応工程＞
本発明の反応工程では、上記リポソームの表面に付加された第１の反応物質を第２の反応物質と反応させる。この反応は、典型的にはリポソームの表面上で行われる。また、本工程では、第１の反応物質及び第２の反応物質各々の、特異的結合反応に関与する少なくとも一部が反応すればよい。
上記反応としては、第１の反応物質及び第２の反応物質、並びにリポソームの特性に応じて、公知の方法を適用することができる。すなわち上記反応は、上述のように抗原抗体反応であってもよいし、酵素反応、その他の反応であってもよい。また、競合的な反応であってもよいし、非競合的な反応であってもよい。
本工程の反応条件は、第１の反応物質と第２の反応物質の特性等の因子を考慮して当業者が適宜選択・決定することができる。例えば、該反応が抗原抗体反応に基づくものである場合には、通常、例えば4℃〜室温において、5〜120分間行うことにより反応が完了する。
また、本発明の反応工程では、第２の反応物質を基板上に固定し、かつ、ブロッキング操作を行わないことを特徴とすることができる。ここでいう「基板」とは、例えばマイクロプレート等の反応が行われる基板をいうものとする。第２の反応物質を基板上に固定する方法は特に限定されず、マイクロプレート等にタンパク質等をコーティングする際に通常行われる方法を適用することができる。また、「ブロッキング操作」とは、基板上に固定された第２の反応物質と第１の反応物質以外の物質との非特異的反応を防止するための操作をいうものとする。本発明の定量方法によれば、ブロッキング操作を行わずとも精度の高い定量分析が可能となる。また、ブロッキング操作を省略できることにより、より迅速なアッセイを可能とすることができる。
【００２５】
＜（ii）電気化学物質の放出工程＞
本発明の電気化学物質の放出工程では、第１の反応物質と第２の反応物質とが反応したリポソーム、及び第１の反応物質と第２の反応物質とが反応しなかったリポソームのいずれか一方から電気化学物質を放出させる。
本工程では、電気化学物質の放出前に、２つの反応物質が反応したリポソームと、２つの反応物質が反応しなかったリポソームとを分離することができる。分離する方法は特に限定されない。第２の反応物質を基板上に固定した場合には、例えば、反応工程後の反応液の除去及び基板の洗浄等により、第１の反応物質と第２の反応物質とが反応しなかったリポソームを除去することで、これらを容易に分離することができる。あるいは、反応したリポソームと反応しなかったリポソームとの間に物理化学的差異（例えば、荷電状態の相違、重さの相違、サイズの相違など）があることを利用して、これらを分離してもよい。この場合、具体的には、電気泳動、ゲルろ過などのクロマトグラフィ、遠心分離などの方法を用いることができる。
さらに本工程では、電気化学物質を放出させるためにリポソームを破壊する。リポソームは、例えば、界面活性剤を添加することで破壊されてもよいし、クロロホルム等の溶剤を入れて水相と溶剤相とに分離することで破壊されてもよい。界面活性剤を添加する場合は、電解質溶液に界面活性剤を添加し、当該溶液をリポソームに加えることで、リポソームを容易に破壊することができる。
【００２６】
＜（iii）電気化学信号の検出工程＞
本発明の電気化学信号の検出工程では、放出された電気化学物質に基づく電気化学信号を検出する。本工程では、例えば放出工程によって得られた反応液に対し、電気化学検出器を用いて電気化学信号を測定することができる。分析方法は特に限定されず、例えば測定の迅速化や精度向上の観点からフローインジェクション分析法を適用することができる。
被検物質を定量的に分析するためには、例えば基準試料の結果に基づいて検量線を作成することができる。すなわち、複数の既知の濃度（量）の被検物質（基準試料）の電気化学的な応答と、分析対象となる未知の濃度（量）の被検物質を含む試料の応答とを比較することにより、未知の濃度（量）の被検物質の定量分析を行うことができる。
【００２７】
＜本発明の作用効果＞
以上、本発明によれば、比較的時間を要する特異的結合の反応工程を１回に抑えることができ、迅速な定量分析を可能とすることができる。さらに、電気化学物質を用いて定量分析することで、検出感度の高い分析が可能となる。また、特殊な設備や装置を用いる必要がないため、分析コストを抑制しつつ、簡便で精度の高い定量分析を可能とすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例では、タンパク質である牛血清アルブミン（BSA）を被検物質とした検出操作を示し、段階希釈したBSA溶液を用いて検量線を作成する操作を示す。
【００２９】
［イムノリポソームの調製］
本実施例において、イムノリポソームは、以下の３段階の調整工程を経て調製される。
１．抗体へのSPDPの化学修飾
２．活性型リポソームの調製
３．活性型リポソームと抗体との結合
以下、各工程の詳細を説明する。
【００３０】
（１．抗体へのSPDPの化学修飾）
図１Ａ，Ｂは、本工程の抗体の修飾経路を模式的に示す図である。
1 mg (3.2×10-6 mol) のSPDP (N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate) を脱水メタノール500 μLに溶解した。SPDP溶液 5 μL (3.2×10-5 mol) を1 mg/mL抗BSA抗体ウサギIgG溶液に加え、室温で30分間撹拌した。未結合のSPDPを除去するために、ダイアライシスメンブラン20（分画分子量：14,000）に抗体溶液を加え、100 mM酢酸緩衝液（pH4.5）を用いて4℃の冷暗所で透析した。これにより、図１Ａに示すように、SPDP修飾抗体が生成された。3〜5
続いて、SPDP修飾抗体溶液に、50 mMのDTT (Dithiothreitol) 溶液500 μL (2.5×10-5 mol) を加え、室温で30分間撹拌した。その後、この溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィ（担体：Sephadex G-25、分画範囲：1×103〜5×103 Da、カラムの内径：1.2 cm×25 cm、溶出バッファー：10 mM pH 7.4リン酸緩衝液）により分画した。これにより、図１Ｂに示すように、活性型のSPDP修飾抗体が生成された。
【００３１】
（２．活性型リポソームの調製）
続いて、50 mLナス型フラスコに、150 μLのDPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholine：ジパルミトイルホスファチジルコリン) (10 μmol) 、62.5μLのDTP-DPPE (SPDP修飾したジパルミトイルエタノールアミン、図２中の化合物３) (0.05 μmol) 、20 μLのコレステロール (2.5 μmol) をそれぞれ加えた。さらに、このフラスコに、蒸留したCHCl3と蒸留したMeOH とをそれぞれ 9：1の割合で混合した溶液を4 mL加え、窒素置換したエバポレーター（冷却機1℃、恒温槽40℃）で溶媒を留去した。その後、窒素置換した真空デシケーターにナス型フラスコを入れて常温で2時間減圧乾燥させ、脂質フィルムを得た。
脂質フィルムが生成されたフラスコに、1 mLの0.1 M フェロセンジカルボン酸２ナトリウム塩 / 10-5 Mカルセイン溶液を加えた。フェロセンジカルボン酸２ナトリウム塩は、本実施例における電気化学物質であり、フェロセン化合物の一種である。その後、上記フラスコを60℃で2分間温浴させ、ボルテックスミキサーによる2分間の攪拌を室温で3回繰り返した。さらに、攪拌された溶液を50℃のホットプレートで温めたエクストルーダー（ポアサイズ0.05 μm）に10回繰り返して供した。この溶液を、ゲルろ過クロマトグラフィ（担体：Sephadex G-50 Fine、カラムの内径：2.5 cm×34 cm、溶出バッファー：0.01 M pH7.4 リン酸緩衝液）で分画した。
続いて、マイクロプレートにフラクション溶液を200 μLずつ加え、カルセインの吸光度（λ1=492 nm、λ2=620 nm）を測定した。大きな吸光度が確認できる5つのフラクションをCENTRIPREP-10K（分画分子量10,000NMWL）（ミリポア社）により回収し、4℃、2500 rpmで全量が約600 μL程度になるように遠心濃縮した。調製後は窒素置換を行い、4℃、遮光下で保存した。
【００３２】
図２は、本実施例に係る活性型リポソーム１０を模式的に示す図である。符号１はDPPC、符号２はコレステロール、符号３はDTP-DPPE、符号４は本実施例の電気化学物質であるフェロセンジカルボン酸２ナトリウム塩をそれぞれ示す。このように、活性型リポソーム１０は、DPPC１、コレステロール２、DTP-DPPE３から構成された脂質膜と、当該脂質膜に内包されたフェロセンジカルボン酸２ナトリウム塩４を有する。また、リポソーム１０においては、DTP-DPPE３のジチオピリジル基が活性化され、次工程の抗体との結合時に作用する。
【００３３】
（３．活性型リポソームと抗体との結合）
図３は、本工程の活性型リポソームと抗体との結合の様子を模式的に示す図である。
まず、活性型リポソームと活性型SPDP修飾抗体を混合し、窒素雰囲気下で24時間振とうした。振とうは、室温・遮光の条件下で行った。次に、未結合の抗体を除去するため、ゲルろ過クロマトグラフィ（担体：Sepharose 4B、カラムの内径：2.4 cm × 40 cm、溶出バッファー：10 mM pH 7.4 リン酸緩衝液）を行った。マイクロプレートにフラクション溶液を200 μLずつ加え、カルセインの吸光度 (λ1=492 nm、λ2=620 nm) を測定した。大きな吸光度が確認できる5つのフラクションをCENTRIPREP-10K (分画分子量10,000NMWL)（ミリポア社）により回収し、4℃、2500 rpmで全量が約1 mL程度になるように遠心濃縮した。調製後は窒素置換を行い、4℃、遮光下で保存した。これにより、図３に示すように、本実施例のイムノリポソームが調製された。
【００３４】
［BSAの検出］
調製されたイムノリポソームを用いて、BSAを検出した。
【００３５】
まず、第１の反応物質である抗BSA抗体と、第２の反応物質（被検物質）であるBSAとの抗原抗体反応を行った。
具体的には、マイクロプレートに10 μg/mL BSA/PBS溶液200 μLを加え、4℃、暗所で一晩静置してコーティングを行った。アスピレーターで溶液を除去した後、PBS 350 μLで2回洗浄した。段階希釈したBSA/PBS溶液80 μLと該イムノリポソーム20 μLを加えてピペッティングを行った後、30 ℃、遮光下で30分静置した。
【００３６】
続いて、リポソームから電気化学物質を放出させた。
具体的には、アスピレーターで溶液を除去した後、PBS 350 μLで3回洗浄した。洗浄後のマイクロプレートに200 ppm TritonX-100 / 0.1 M リン酸緩衝液 100 μLを加えて5分ほど静置した。
【００３７】
最後に、電気化学検出器（「NANOSPACE  SI-2」、資生堂製）によるフローインジェクション分析法を用いて電気化学信号の測定を行った。測定条件について、印加電圧は+0.500 V vs. Ag/AgCl、測定温度30℃、カラムはTSK gel guard column PHW (内径7.5 mm ×長さ75 mm) （東ソー株式会社）とした。
なお、抗体が結合されていないリポソームを用いて同様に電気化学信号の測定を行い、比較例（コントロール）とした。
【００３８】
［結果］
図４は、電気化学信号の測定結果を示すグラフであり、横軸は段階希釈されたBSA/PBS溶液のBSA濃度（M）を示し、縦軸はピーク面積を示す。また、四角でプロットした点が本発明の実施例の結果を示し、丸でプロットした点が本発明の比較例の結果を示す。
ここではマイクロプレートにコーティング（固定）されたBSAと段階希釈して添加されたBSAとの競合的な反応によりBSAを検出しており、固定されたBSAと抗原抗体反応したイムノリポソームに基づく電気化学信号を測定している。したがって、良好な応答が見られる場合、添加されたBSA濃度が高くなるに従って測定される信号強度が低下し、ピーク面積も低下することとなる。
同図に示すように、実施例では、10-8 〜10-6  g/mLの濃度域で良好な応答が観測された。また、サンプル毎のバラつきも小さかった。一方、比較例では、明確な応答が見られないことが確認された。したがって、同図に示す実施例のグラフが、本発明の定量方法におけるBSAの検量線として機能することが確認された。
【００３９】
以上より、本発明の定量方法により、高感度の検出が可能となった。また、被検物質と特異的に結合するイムノリポソームを準備すれば、１回のみの抗原抗体反応の後、即電気化学信号を検出することができ、定量にかかる時間を大きく短縮することができる。
【００４０】
以上、本発明について説明したが、本発明は上述の説明及び実施例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【図１】
2017161317.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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