(57)【要約】【課題】  本発明は、炎症性腸疾患の治療における抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクを判定する技術の確立を目的とするものである。【解決手段】  本発明は、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の患者から採取した生物学的試料において一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定方法に関する。  本発明によれば、望ましくない投与時反応が生じるおそれのある（抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがある）炎症性腸疾患患者には抗ＴＮＦα抗体の投与を回避した方がよい等の、治療上有益な情報を提供することが可能となる。【選択図】図１
2017189121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα抗体適応疾患の患者から採取した生物学的試料において、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示される一塩基多型であって、
ヒト第３番染色体上のＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子におけるｒｓ３４５５００７４、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−Ａ遺伝子におけるｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７及びｒｓ１１２２５６３５５、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子におけるｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及びｒｓ１１６１１９０８１、
ヒト第５染色体上のＰＣＳＫ１遺伝子におけるｒｓ６２３５、
ヒト第１３染色体上のＢＲＣＡ２遺伝子におけるｒｓ１４４８４８、
ヒト第１染色体上のＦＣＲＬ３遺伝子におけるｒｓ２２８２２８４、
ヒト第１１染色体上のＰ２ＲＸ３遺伝子におけるｒｓ２２７６０３８、
ヒト第１染色体上のＩＬ６Ｒ遺伝子におけるｒｓ２２２８１４５、並びに
ヒト第２染色体上のＧＣＫＲ遺伝子におけるｒｓ１２６０３２６
よりなる群から選択される一以上の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を検出する工程を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定方法。
【請求項２】
ｒｓ３４５５００７４、ｒｓ１１２２５６３５５及び／若しくはｒｓ２２７６０３８の塩基がチミンの場合に、
ｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１及び／若しくはｒｓ６２３５の塩基がグアニンの場合に、
ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及び／若しくはｒｓ１１６１１９０８１の塩基がアデニンの場合に、並びに／又は
ｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１４４８４８、ｒｓ２２８２２８４、ｒｓ２２２８１４５及び／若しくはｒｓ１２６０３２６の塩基がシトシンの場合に、
抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがあると判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
ｒｓ３４５５００７４の塩基がチミンの場合に、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがあると判定する、請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
抗ＴＮＦα抗体適応疾患が炎症性腸疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定用キット。
ａ）請求項１に記載の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド
ｂ）請求項１に記載の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
【請求項６】
炎症性腸疾患の患者から採取した生物学的試料に対して用いられる、請求項５に記載の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療における抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクを判定する方法、並びに該判定用オリゴヌクレオチドキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患は、大腸及び小腸の粘膜に慢性の炎症又は潰瘍を引き起こす原因不明の疾患の総称であり、根治治療はない。主に潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ：ＵＣ）及びクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＤ）が知られており、両者はいずれも若年者に発生することが多く、厚生労働省によって難病に指定されている。潰瘍性大腸炎は大腸粘膜にびらんや潰瘍ができ下血を伴う下痢や、頻繁に起こる腹痛が特徴的な症状として現れる。病変は直腸から連続的に、そして上行性（口側）に拡がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に拡がる。一方、クローン病は全消化管に深い潰瘍が発生し、しばしば種々の臓器に瘻孔を形成する。痔瘻や難治性の膿瘍を形成することもある。
【０００３】
炎症性腸疾患の患者には、原則的には薬による内科的治療が行われる。現在、腸の炎症を抑制する治療方法として、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）製剤、副腎皮質ステロイド剤等の薬物治療が知られている（特許文献１等）。また、炎症性腸疾患を含む炎症性疾患に対しては炎症性メディエーターの一種であるＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）の活性を中和し得る抗ＴＮＦα抗体の投与が有効であることが知られており、臨床的にもインフリキシマブ（製品名：レミケード（登録商標））が関節リウマチ、ベーチェット病、乾癬、強直性脊椎炎、川崎病、クローン病及び潰瘍性大腸炎の治療薬として使用されている。
【０００４】
しかし、上記のような抗ＴＮＦα抗体の投与が有効であるとされる疾患、すなわち抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療において、抗ＴＮＦα抗体の投与によって症状が緩和する患者がいる一方で、低血圧、粘膜過敏、喉頭痙攣、頭痛、眩暈、嘔気、顔面紅潮、胸痛、呼吸苦等の急性症状又は関節痛や筋肉痛、熱発等の遅発性症状といった望ましくない投与時反応を示す患者も存在することが報告されている（非特許文献１及び２等）。このような抗ＴＮＦα抗体による投与時反応を回避するため、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療にあたり、抗ＴＮＦα抗体の投与を開始する前に投与時反応の発症リスクを判定することは有益である。
【０００５】
しかし、生物学的製剤の投与時反応の原因は多岐にわたることもあり、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応に関係するリスク因子は依然として不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｕｇａｔｈａｓａｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ９７（６）：１４０８−１４（２００２）
【非特許文献２】Ｈａｎａｕｅｒ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９（９３１７）：１５４１−９（２００２）
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５０９６１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療に際し、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクを判定する技術の確立を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抗ＴＮＦα抗体に対して投与時反応を示した炎症性腸患者における遺伝子多型の存在を解析することで、前記投与時反応と関連性のある複数の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１０】
（１）抗ＴＮＦα抗体適応疾患の患者から採取した生物学的試料において、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示されるＳＮＰであって、
ヒト第３番染色体上のＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子におけるｒｓ３４５５００７４、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−Ａ遺伝子におけるｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７及びｒｓ１１２２５６３５５、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子におけるｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及びｒｓ１１６１１９０８１、
ヒト第５染色体上のＰＣＳＫ１遺伝子におけるｒｓ６２３５、
ヒト第１３染色体上のＢＲＣＡ２遺伝子におけるｒｓ１４４８４８、
ヒト第１染色体上のＦＣＲＬ３遺伝子におけるｒｓ２２８２２８４、
ヒト第１１染色体上のＰ２ＲＸ３遺伝子におけるｒｓ２２７６０３８、
ヒト第１染色体上のＩＬ６Ｒ遺伝子におけるｒｓ２２２８１４５、並びに
ヒト第２染色体上のＧＣＫＲ遺伝子におけるｒｓ１２６０３２６
よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定方法。
（２）ｒｓ３４５５００７４、ｒｓ１１２２５６３５５及び／若しくはｒｓ２２７６０３８の塩基がチミンの場合に、
ｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１及び／若しくはｒｓ６２３５の塩基がグアニンの場合に、
ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及び／若しくはｒｓ１１６１１９０８１の塩基がアデニンの場合に、並びに／又は
ｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１４４８４８、ｒｓ２２８２２８４、ｒｓ２２２８１４５及び／若しくはｒｓ１２６０３２６の塩基がシトシンの場合に、
抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがあると判定する工程をさらに含む、（１）に記載の判定方法。
（３）ｒｓ３４５５００７４の塩基がチミンの場合に、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがあると判定する、（２）に記載の判定方法。
（４）抗ＴＮＦα抗体適応疾患が炎症性腸疾患である、（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定用キット。
ａ）（１）に記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド
ｂ）（１）に記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
（６）炎症性腸疾患の患者から採取した生物学的試料に対して用いられる、（５）に記載の判定用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明におけるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療における抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクを判定するためのマーカーとして利用可能である。これにより、抗ＴＮＦα抗体を投与したときに望ましくない投与時反応が生じるか否かを事前に予測することが可能となる。その結果、投与時反応が生じるおそれのある抗ＴＮＦα抗体適応疾患の患者には抗ＴＮＦα抗体の投与を回避した方がよい等の、治療上有益な情報を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＢＳ（コントロール群）、マウスＩｇＧ抗体及び抗ＴＮＦα抗体をそれぞれ投与したマウスのプロスタグランジンＤ２の血中濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明におけるＳＮＰは、ヒトのゲノム配列において、国際標準配列（ＧＲＣｈ３７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｇｒｃ／、又はｈｇ１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｄｂ＝ｈｇ１９）と比較して母集団中１％以上の頻度で存在する、一塩基の多様性をいう。本明細書では、ＳＮＰは、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ）のリファレンス番号であるｒｓ番号によって特定される。また、連鎖不平衡とは２つの密に連鎖した遺伝子座における特定の対立遺伝子の組み合わせ出現頻度が、それぞれの遺伝子頻度から推定される期待値と異なる場合をいい、本発明において連鎖不平衡にあるＳＮＰとは、本発明においてｒｓ番号で特定されるいずれかのＳＮＰとの間の連鎖不平衡係数（ｒ２）が０．８以上であるＳＮＰをいう。
【００１４】
本発明は、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の患者から採取した生物学的試料において、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示されるＳＮＰであって、
ヒト第３番染色体上のＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子におけるｒｓ３４５５００７４、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−Ａ遺伝子におけるｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７及びｒｓ１１２２５６３５５、
ヒト第６染色体上のＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子におけるｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及びｒｓ１１６１１９０８１、
ヒト第５染色体上のＰＣＳＫ１遺伝子におけるｒｓ６２３５、
ヒト第１３染色体上のＢＲＣＡ２遺伝子におけるｒｓ１４４８４８、
ヒト第１染色体上のＦＣＲＬ３遺伝子におけるｒｓ２２８２２８４、
ヒト第１１染色体上のＰ２ＲＸ３遺伝子におけるｒｓ２２７６０３８、
ヒト第１染色体上のＩＬ６Ｒ遺伝子におけるｒｓ２２２８１４５、並びに
ヒト第２染色体上のＧＣＫＲ遺伝子におけるｒｓ１２６０３２６
よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定方法、特に炎症性腸疾患の治療における抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクの判定方法に関する。
【００１５】
後の実施例に詳細に説明するように、上記ＳＮＰは、抗ＴＮＦα抗体を投与されたときに、低血圧、粘膜過敏、喉頭痙攣、頭痛、眩暈、嘔気、顔面紅潮、胸痛、呼吸苦等の急性症状又は関節痛や筋肉痛、熱発等の遅発性症状といった望ましくない投与時反応を示した炎症性腸疾患患者において高い頻度で存在することが確認されたＳＮＰである。各ＳＮＰについて、遺伝子名、ｒｓ番号、染色体上の位置、塩基置換、及びＰ−ｖａｌｕｅを表１に示す。
【００１６】
【表１】
2017189121.tif 000003
【００１７】
本発明の判定方法は、表１に示されたｒｓ番号で示されるＳＮＰの少なくとも一つにおいて、同表中のＡｌｌｅｌｅに示される塩基置換が確認されたとき、そのＳＮＰを有する患者の治療において抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクがあると判定するものである。具体的には、ｒｓ３４５５００７４、ｒｓ１１２２５６３５５及び／若しくはｒｓ２２７６０３８の塩基がチミン（Ｔ）の場合に、ｒｓ１１３７０７８、ｒｓ１１５２７０９２６、ｒｓ１１４４６２６９８、ｒｓ１０４２１５１及び／若しくはｒｓ６２３５の塩基がグアニン（Ｇ）の場合に、ｒｓ１１２８９３６８５、ｒｓ７６４１１９４７、ｒｓ１０４２１５３、ｒｓ７８３７７１８８及び／若しくはｒｓ１１６１１９０８１の塩基がアデニン（Ａ）の場合に、並びに／又はｒｓ１０４２１３３、ｒｓ１１６７６８０１０、ｒｓ１４４８４８、ｒｓ２２８２２８４、ｒｓ２２２８１４５及び／若しくはｒｓ１２６０３２６の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に、抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクがあると判定する。特に、ｒｓ３４５５００７４において塩基がＴであることが確認されたときは、高確度で抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクがあると判定することができる。判定は表中のいずれか一つのＳＮＰを確認することで行ってもよく、又は任意の２以上のＳＮＰを確認することで行ってもよい。
【００１８】
本発明において、抗ＴＮＦα抗体適応疾患とは、臨床的に抗ＴＮＦα抗体の投与の有効性が認められている疾患又はＴＮＦαが炎症の発症に関与している疾患をいい、例として関節リウマチ、ベーチェット病、乾癬、強直性脊椎炎、川崎病、炎症性腸疾患等の炎症性疾患を挙げることができる。本発明の判定方法は、特に炎症性腸疾患において有効である。
【００１９】
本発明において、投与時反応とは、薬剤、すなわち抗ＴＮＦα抗体の投与により引き起こされる低血圧、粘膜過敏、喉頭痙攣、頭痛、眩暈、嘔気、顔面紅潮、胸痛、呼吸苦等の急性症状又は関節痛や筋肉痛、熱発等の遅発性症状をいう。また、「抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクがある」は、「抗ＴＮＦα抗体に対する投与時反応が生じるおそれがある」ことを意味し、これらの表現は交換可能に用いられる。
【００２０】
本発明の判定方法において利用されるＳＮＰのうち、当該ＳＮＰを含む遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸置換を伴うものは、かかるタンパク質の何らかの機能変化が抗ＴＮＦα抗体による投与時反応に関与するものと推察される。
【００２１】
例えば、ｒｓ３４５５００７４は、プロスタグランジンのトランスポーターであるｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２Ａ１（ＳＬＣＯ２Ａ１）のエクソン領域にある多型であり、したがってＳＬＣＯ２Ａ１の機能変化は抗ＴＮＦα抗体による投与時反応に関与するものと推察される。
【００２２】
本発明の方法による判定対象は、ヒト、特にアジア人種とりわけ日本人である。また、ＳＮＰの検出は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれの核酸について行ってもよい。かかる核酸は、被験者から採取される任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液等の体液、又はバイオプシー等によって得られる組織細胞等から、常法にしたがって抽出、精製、調製することができる。
【００２３】
本発明により特定されるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、当業者に知られた従来の方法にしたがって検出することができる。そのような方法としては、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ等の、ＰＣＲによる増幅断片を利用する方法、ＤＮＡシーケンサー等を用いたＳＮＰを含む塩基配列を直接決定する方法、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むマイクロアレイによる検出方法、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）又はインベーダー法等を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００２４】
増幅断片を利用する方法の一つは、目的となるＳＮＰを有する場合にのみ増幅断片が生じるよう、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がそのＳＮＰにハイブリダイズするように設計されたプライマーセットを用いた方法を挙げることができる。かかるプライマーセットを使用することにより、増幅断片が生じたかどうかで目的とするＳＮＰを検出することが可能となる。
【００２５】
また、増幅断片を利用する別の方法は、目的とするＳＮＰを含む領域が増幅されるように設計されたプライマーセットを用いた方法である。かかるプライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅断片のサイズ、塩基配列、高次構造等の差異に基づいて、ＳＮＰを検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を用いたときの増幅断片の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２６】
また、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。例えば、適当なプライマーセットを用いてＳＮＰを含む増幅断片を調製し、目的とするＳＮＰに応じて独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で増幅断片を切断し、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を用いたときの切断物の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２７】
なお、上記の増幅断片又は切断物の塩基配列を直接決定することによって、目的とするＳＮＰを検出してもよい。また、増幅断片又は切断物を熱変性によって一本鎖ＤＮＡとした後、これをゲル電気泳動によって分離し、塩基配列の変化による移動度の変化を解析する、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）によって目的とするＳＮＰを検出してもよい。
【００２８】
ＳＮＰは、一のＳＮＰに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって検出することもできる。プローブは、前記のＳＮＰを含み、生物学的試料から調製したＤＮＡ等とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り、いかなるものでもよい。
【００２９】
プローブとしては、例えば前記ＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、ＳＮＰがプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の遺伝子多型の配列とハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。
【００３０】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型を区別するのに十分な条件である。例えば、生物学的試料から調製したＤＮＡ等が遺伝子多型の一のアレルである場合にはハイブリダイズするが、他のアレルである場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
【００３１】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、遺伝子多型の一のアレルに対応するプローブのみが固定されていても、遺伝子多型の複数のアレルに対応するプローブが固定されていてもよい。
【００３２】
本発明において好ましい方法は、ＰＣＲによる遺伝子増幅を用いた方法、特に操作が簡便で且つ信頼性の高いＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲである。具体的には、目的とするＳＮＰを含む領域を増幅できるプライマーオリゴヌクレオチドセットと、各アレルに相補的な配列を有する、ＳＮＰの塩基変異に対応するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ２種類を用いて、ＰＣＲを行なう。
【００３３】
上記のＳＮＰを検出する方法の多くは、それぞれの原理に応じたオリゴヌクレオチド、例えば遺伝子増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチド、又はハイブリダイゼーション用のプローブオリゴヌクレオチドを必要とする。これらは、各方法の原理及び検出対象となるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。本発明にかかる特定のＳＮＰの検出のためのオリゴヌクレオチドもまた、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３４】
本発明は、抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクの判定用キットを提供し、該キットは、ａ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド、又はｂ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチドを含む。本発明のキットは、抗ＴＮＦα抗体適応疾患、特に炎症性腸疾患の患者から採取した生物学的試料に対して用いられる。
【００３５】
本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰの検出方法において説明したように、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３６】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドの他に、遺伝子多型を検出する各方法に適した試薬、反応成分その他を含んでいてもよい。例えば、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチド等）、標識用又は検出用試薬、固相支持体、説明書等が挙げられる。また、上記オリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されたマイクロアレイとしてキットに含まれてもよい。
【００３７】
本発明の判定方法及び判定用キットにより、抗ＴＮＦα抗体適応疾患、特に炎症性腸疾患の治療における抗ＴＮＦα抗体投与時反応の発症リスクを簡便かつ迅速に診断することが可能となり、その診断結果に応じて適切な処置を施すことができる。
【００３８】
本発明はまた、上述のＳＮＰを検出する工程、該ＳＮＰが検出された場合に投与時反応の発症リスクが高いと判定する工程、及び投与時反応の発症リスクが高いと判定された患者に対して抗ＴＮＦα抗体投与前に投与時反応を抑制する薬剤を投与する、又は抗ＴＮＦα抗体を中止してこれ以外の治療を行う工程を含む、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療方法を提供する。本発明はさらに、上述のＳＮＰを検出する工程、該ＳＮＰが検出されない場合に投与時反応の発症リスクが低いと判定する工程、及び投与時反応の発症リスクが低いと判定された患者に対して抗ＴＮＦα抗体を投与する工程を含む、抗ＴＮＦα抗体適応疾患の治療方法を提供する。
【００３９】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
２００２年２月〜２０１５年４月の期間に抗ＴＮＦα抗体投与の治療歴を有するクローン病患者を検討対象とし、抗ＴＮＦα抗体投与を２年以上継続できており、投与時反応が観察されなかったクローン病患者２０名をコントロール群として、及び症状出現の時期を問わず抗ＩＦＮα抗体投与後に急性あるいは遅発性の投与時反応（頭痛・悪心・嘔吐・発熱・発汗・皮疹・胸苦・関節痛の症状）を示し、抗ＴＮＦα抗体の使用中止もしくはステロイドの前投与を要したクローン病患者２０名を症例群として、それぞれ選別した。コントロール群及び症例群それぞれから末梢血８ｍＬを採取し、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法により単核球を分離後、シリカゲルカラムを用いてＤＮＡを抽出、精製した。なお、上記患者はいずれも、ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針を準拠し、旭川医科大学の倫理委員会で審査され承認された本研究の内容を理解し、研究協力に同意した者である。
【００４１】
炎症性腸疾患、膵疾患、肝疾患症、血液疾患及び金属代謝疾患の各疾患との関連性が報告されている遺伝子、ならびに前記各疾患に関連する代謝、免疫又はシグナル伝達に関連する遺伝子を選出し、ここから重複する遺伝子及びアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の設定が不可能な遺伝子を削除した計１０３１遺伝子を、ＳＮＰを解析する対象遺伝子として決定した。対象遺伝子の全エクソン領域をカバーするように、計１２６０９個のアンプリコンに分割し、それぞれに対するプライマーセットを作成した。
【００４２】
５０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとし、５つのプライマープールを用いてＰＣＲを行ってアンプリコンを作成した後、製造者のプロトコルに従って高出力シークエンサーＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用してＤＮＡ配列を解析し、上記１０３１遺伝子に関するＳＮＰ解析を行った。解析にあたって、予備的シークエンスを２回施行し、各アンプリコンの解析長と被覆率が検討に十分なことを確認した。
【００４３】
全サンプルで国際標準配列（リファレンス）とシークエンス配列とを比較し、コントロール群と症例群において計４０４３のリファレンスとの相違を検出した。この相違から、コントロール群と症例群との遺伝子異常の出現頻度の差をフィッシャー検定におけるｐ値＜０．０５を有意として、かつアミノ酸置換を伴う遺伝子多型を候補遺伝子として、前記表１に示す１９種類のＳＮＰが抽出された。
【００４４】
１９種類のＳＮＰのうち、コントロール群と症例群との間で最も発現頻度に差があったＳＮＰはｒｓ３４５５００７４であった。ｒｓ３４５５００７４について、コントロール群及び症例群それぞれの患者の末梢血から調製されたＤＮＡを鋳型としたＲｅａｌ  ｔｉｍｅＰＣＲ法及びシークエンサーでの塩基配列解析を行って検証を行ったところ、いずれの方法を用いた場合にもコントロール群においてヘテロ型のＳＮＰが１名、症例群においてヘテロ型のＳＮＰが１０名、及びホモ型のＳＮＰが１名それぞれ確認された。この結果から、ｒｓ３４５５００７４を指標とした投与時反応発症予測における感度は約７０％、特異度が９３．８％と算出された。
【００４５】
＜試験例＞
ＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子内にｒｓ３４５５００７４と同じＳＮＰを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）３０匹を３群に分け、ＰＢＳ（コントロール群）、ラットＩｇＧ抗体（コントロール抗体投与群）、ラット抗マウスＴＮＦα抗体（抗ＴＮＦα抗体投与群）をそれぞれ腹腔内投与した。各抗体の投与量は１００μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙである。
【００４６】
投与後、マウスから血液、皮膚、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃、小腸、大腸及び骨格筋をそれぞれ摘出し、プロスタグランジンＤ２の血中濃度、遺伝子発現、タンパク質発現及び組織像を分析した。その結果、コントロール群のマウスと比較して、抗ＴＮＦα抗体投与群でアレルギー関連物質であるプロスタグランジンＤ２の血中濃度が有意に上昇していることが確認された（図１）。以上から、ＳＬＣＯ２Ａ１遺伝子の多型が投与時反応の病態へ関与している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、特定のＳＮＰの有無を評価することで抗ＴＮＦα抗体による投与時反応の発症リスクを判定することができ、投与時反応の発症リスクがあると判定された患者に対して、抗ＴＮＦα抗体投与前に抗ヒスタミン薬やステロイドの予防投与を行う、又は抗ＴＮＦα抗体の投与を中止する等の、医師による判断の参考情報を提供する手段としての産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2017189121.tif 000004