(57)【要約】      （修正有）【課題】真菌特異的生合成遺伝子クラスター由来のペプチド性二次代謝産物であるリボソームペプチドの提供。【解決手段】下記式(Ｉ)で表されるポリペプチドまたはその塩。2017081887.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(Ｉ)で表されるポリペプチドまたはその塩。
【化１】
2017081887.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドまたはその塩を含む抗酸化剤。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを合成するための核酸を含むベクターであって、下記(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれかに記載の４つの核酸の組み合わせを含むベクター：
（ｉ）配列番号１〜４のそれぞれに示される塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせ、
（ｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸とそれぞれ90％以上の同一性を有する塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせであって、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ、又は、
（ｉｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸のそれぞれと相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
（ｉ）配列番号１〜４のそれぞれに示される塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせ、
（ｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸とそれぞれ90％以上の同一性を有する塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせであって、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ、又は、
（ｉｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸のそれぞれと相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせのいずれかの４つの核酸の組み合わせを宿主細胞内または無細胞タンパク質合成系に導入して当該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることにより、請求項１に記載のポリペプチドを合成する工程と、
前記合成したポリペプチドを単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記４つの核酸の組み合わせが、AFLA_041370、AFLA_041380、AFLA_041390、及び、AFLA_041400である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌特異的な生合成遺伝子クラスターを利用したペプチド性二次代謝産物である新規リボソームペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌、放線菌及び細菌を含む微生物が産生する二次代謝産物は、医薬又は医薬原料を含む様々な用途に用いられている。
【０００３】
真菌(代表的にはアスペルギルス(Aspergillus)属)には、ポリケタイド化合物、非リボソーム型ペプチド(リボソームを経由せずに非リボソームペプチド合成酵素によりアミノ酸から合成される、ペプチド結合を有する化合物)、テルペン類又はアルカロイドなどを含む多様な二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子クラスター(生合成遺伝子クラスター)が存在していることが明らかにされている。
【０００４】
しかしながら、この様な遺伝子クラスターの半数以上は真菌細胞内において殆ど発現されていないか、あるいは極めて微量の二次代謝産物しか産生されない程度にしか発現されていないのが現実である。
【０００５】
このことは、未だその具体的な構造や機能が特定されていない多数の未知の二次代謝産物を生産する能力を真菌が潜在的に有していることを意味する。そこで、真菌の潜在的な二次代謝産物の生産能力を発揮させるために、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの発現を人為的に誘導し、十分な量の二次代謝産物を合成させようとする試みが提唱されている。
【０００６】
その１つは、目的となる二次代謝産物生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子クラスターの転写因子を過剰発現させ、二次代謝産物の合成量を高める方法である。もう一つは、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターのcDNAを構築し、これを適当な宿主発現系を用いて高発現させて二次代謝産物を合成させる方法である。特に後者の場合、複数の生合成遺伝子クラスターの間で各クラスターの構成遺伝子を組み換えて非天然の二次代謝産物を合成しようとする試みも提唱されている。
【０００７】
本発明者らは、塩基配列情報を基にして二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの存在を推定するバイオインフォマティクス的手法を提唱している(特許文献１)。そして、本発明者らは、当該手法を用いることで、黄色麹菌(Aspergillus flavus)におけるウスチロキシンＢ生合成遺伝クラスターを同定することに成功し、さらに黄色麹菌のゲノム中における他の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを同定することに成功している(特許文献２)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０３９４８４号
【特許文献２】特願２０１４−２３２２６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、真菌特異的な生合成遺伝子クラスター由来のペプチド性二次代謝産物である新規リボソームペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、本発明者らは、黄色麹菌(Aspergillus flavus)におけるウスチロキシンＢ生合成遺伝クラスター、及び、黄色麹菌のゲノム中における他の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを同定することに成功している。本発明者らは、この同定された遺伝子クラスターより合成される新規リボソームペプチドの構造および機能を同定することに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕下記式(Ｉ)で表されるポリペプチドまたはその塩に関する。
【化１】
2017081887.tif 000002
また、本発明の別の態様によれば、
〔２〕上記〔１〕に記載のポリペプチドまたはその塩を含む抗酸化剤に関する。
【００１１】
また、本発明の別の態様によれば、
〔３〕上記〔１〕に記載のポリペプチドを合成するための核酸を含むベクターであって、下記(ｉ)〜(ｉｉｉ)のいずれかに記載の４つの核酸の組み合わせを含むベクターに関する：
（ｉ）配列番号１〜４のそれぞれに示される塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせ、
（ｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸とそれぞれ90％以上の同一性を有する塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせであって、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ、又は、
（ｉｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸のそれぞれと相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ。
また、本発明の別の態様によれば、
〔４〕上記〔３〕に記載のベクターを含む形質転換体。
また、本発明の別の態様によれば、
〔５〕上記〔１〕に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
（ｉ）配列番号１〜４のそれぞれに示される塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせ、
（ｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸とそれぞれ90％以上の同一性を有する塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせであって、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ、又は、
（ｉｉｉ）上記(ｉ)の４つの核酸のそれぞれと相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、請求項１に記載のポリペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ
のいずれかの４つの核酸の組み合わせを宿主細胞内または無細胞タンパク質合成系に導入して当該４つの核酸によりコードされる各ポリペプチドを発現させることにより、請求項１に記載のポリペプチドを合成する工程と
前記合成したポリペプチドを単離する工程と
を含む、方法に関する。
【００１２】
ここで、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔５〕に記載の方法であって、前記４つの核酸の組み合わせが、AFLA_041370、AFLA_041380、AFLA_041390、及び、AFLA_041400であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、新規の二次代謝産物であるリボソームペプチドを提供する。なお、本発明により提供されるリボソームペプチドは抗酸化活性を有するものであり、例えば、抗酸化剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】重ジメチルスルホキシド中、600MHzで測定した1H-NMRスペクトルを示した。
【図２】重ジメチルスルホキシド中、150MHzで測定した13C-NMRスペクトルを示した。
【図３】本発明のリボソームペプチドの抗酸化活性試験(DPPHラジカル消去活性作用)の結果を示す。図３中、AF650RiPS4が本発明のリボソームペプチドを示す。また、比較対照としてαトコフェロールのDPPHラジカル消去活性作用の結果も示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、真菌特異的な生合成遺伝子クラスター由来のペプチド性二次代謝産物である新規リボソームペプチドに関するものであり、特に黄色麹菌のゲノム中に存在する二次代謝産物生合成遺伝子クラスター由来のリボソームペプチドに関する。なお、本発明のリボソームペプチドは、抗酸化活性を有する真菌類である黄色麹菌によって生合成されるものであり、当該リボソームペプチド自体も抗酸化活性を有する。従って、本発明のリボソームペプチドは、抗酸化剤として使用することができる。
【００１６】
なお、リボソームペプチドは、タンパク質合成の場であるリボソームを介して生合成されるが、環状構造、枝状構造あるいは非天然アミノ酸を含むなど、通常の構成タンパク質や酵素タンパク質にはあまり見られない化学的特徴を伴った、ペプチド結合を有する化合物である。放線菌や真菌の一部では、このような二次代謝産物としてリボソームペプチドと称される化合物を生成することが知られている。
【００１７】
また、本発明のリボソームペプチドは、黄色麹菌のゲノム中に存在する下記表１の遺伝子クラスターの関与により生合成される(特許文献２参照)。なお、本発明のリボソームペプチドは、前駆体タンパク質(AFLA_041400によりコードされるタンパク質)が有するアミノ酸配列FYYTGYが環状化された構造を持つ。分子量は809である。
【表１】
2017081887.tif 000003
【００１８】
本発明のリボソームペプチドは、下記の実施例で示すように、例えば、黄色麹菌の培養抽出物からクロマトグラフィーを用いて分離・精製することができる。また、本発明のリボソームペプチドは、表１に列挙する遺伝子クラスターの各遺伝子に対応する核酸を宿主細胞に導入して発現させるか、無細胞タンパク質合成系にて発現させることにより、当該宿主細胞中又は無細胞タンパク質合成系に合成されたものを単離してもよい。遺伝子クラスターに含まれる各遺伝子によりコードされるペプチドを発現させて、本発明のリボソームペプチドを合成する方法は、当業者であれば公知の方法により行うことができる。
【００１９】
なお、表１に列挙する遺伝子クラスターの各遺伝子を用いて本発明のリボソームペプチドを合成する際、当該遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を発現させる核酸は、例えば、配列番号１〜４のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であるか、配列番号１〜４のいずれかで示される塩基配列と、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて)を用いて計算したときに、少なくとも90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは98％以上の配列同一性を有している核酸であるか、または前記核酸によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列(配列番号５〜８)に対して１または複数もしくは数個(１〜10個、好ましくは１〜5個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸も用いることができる。
【００２０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「1XSSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待し得る。ただし、上記のSSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、DNAの濃度、DNAの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２１】
表１の遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を発現させる核酸としては、具体的には、下記の核酸の組み合わせを挙げることができる。
(ｉ)配列番号１〜４のそれぞれに示される塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせ、
(ｉｉ)上記(ｉ)の４つの核酸とそれぞれ90％以上の同一性を有する塩基配列からなる４つの核酸の組み合わせであって、かつ、本発明のリボソームペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ、又は、
(ｉｉｉ)上記(ｉ)の４つの核酸のそれぞれと相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明のリボソームペプチドの生合成活性を有するポリペプチドをコードする４つの核酸の組み合わせ。
なお、「本発明のリボソームペプチドの生合成活性」とは、当該４つの核酸によりコードされるポリペプチドのそれぞれについて、他の３つの核酸によりコードされるポリペプチドと共に発現されることにより、本発明のリボソームペプチドを合成可能な活性をいう。
【００２２】
本発明に係るリボソームペプチドの物理学的性状を表２に示す。
【表２】
2017081887.tif 000004
表２中、
（１）「Appearance」は物質の性状を示し、「colorless amorphous powder」は無色非結晶質固体であることを示す。
（２）［α］は、比旋光度を示す。「23」は測定温度を示し、「D」はナトリウムＤ線を用いて測定したことを示す。「c0.06」は溶液濃度を、「MeOH」はメタノール中で測定したことを示す。
（４）「Molecular formula」は分子式を示す。
（５）「HR-ES MS(High-Resolution Electronspray Ionaization Mass Spectra)」は高分解能ESI質量分析装置によって測定した精密質量(m/z)を示す。「found」は実測値([M-H]-)を、「calcd」は計算値を示す。
（６）「UV」は紫外線吸収スペクトルを、「λmax nm(logε)」は極大吸収波長およびモル吸光係数を、「MeOH」はメタノール中で測定したことを示す。
（７）「IR」は赤外線吸収スペクトルを、「νmax cm-1」は極大吸収波数を、「ATR」は全反射減衰法で測定したことを示す。
【００２３】
また、本発明に係るリボソームペプチドの13C-核磁気共鳴スペクトル及び1H-核磁気共鳴スペクトルを表３に示す。測定は重DMSO中で行った。
【表３】
2017081887.tif 000005
【００２４】
本発明のリボソームペプチドの塩は、抗酸化作用を有するペプチドとしての使用を許容する塩であれば特に制限されず、公知の塩の形態をとることができる。
なお、本発明のリボソームペプチドまたは塩を抗酸化剤として使用する際には、食品添加物、化粧品や医薬品の抗酸化剤として用いてもよい。また、抗酸化剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、液剤等、用途に適した剤型とすることができる。また、抗酸化剤には、適宜、通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等を添加して使用することができる。
【００２５】
また、本発明は、本発明のリボソームペプチドを合成するための核酸を含むベクターを提供する。なお、当該ベクターとしては、４つの核酸を含む１つのベクターを用いてもよいし、１つ、２つ、又は、３つの核酸を含む複数のベクターを用いてもよい。また、本発明は、上記のベクターを含む形質転換体も提供する。ベクターや形質転換体の作製については、公知のベクターや公知の方法を用いて行うことができる。
【実施例】
【００２６】
（１．リボソームペプチドの単離・精製）
（１）Aspergillus flavusの培養
まず、ポテトデキストロースブロス(三光純薬)24gを水1Lに溶解し前培養培地とした。滅菌処理を行った前培養培地5mlを12mlの試験管に分注後、本菌株の分生胞子1×10６個/mLを懸濁し、30℃、1日間、培養したものを種母とした。
【００２７】
30mLの蒸留水を加えて滅菌処理をした30gの粉砕とうもろこしを直径10cm、高さ12cmのプラスチック容器に入れ、これに前記種母培養液からろ過した菌体を加えて27℃、14日間、静置培養した。化合物精製にあたり、本プラスチック容器を合計250個使用した。
【００２８】
（２）化合物の分離・精製
培養終了後、培養菌体を80%アセトン各200mlで抽出した。濾過後、培養菌体をメタノール各100mlで抽出した。濾過後、抽出液を合わせて濃縮した。得られた培養抽出液を用いて、下記のように複数回のカラムクロマトグラフィーの工程を行った。
【００２９】
培養抽出物を、水―酢酸エチルで分画し、水相をブタノールで抽出した。ブタノール層を減圧濃縮して、油状物質175gを得た。
【００３０】
上記で得られた油状物質をODSカラム(Purif-Pack ODS-100; 昭光サイエンティフィック社)に供した。中圧カラムクロマトグラフィーにより、水−メタノール(0%-100%メタノール)の混合溶媒で順に溶出した。この操作を繰り返し、10-60%メタノールで溶出した画分を合わせて減圧濃縮し、44mgの褐色油状物質を得た。
【００３１】
得られた褐色油状物質をODSカラム(Purif-Pack ODS-100; 昭光サイエンティフィック社)に供した。中圧カラムクロマトグラフィーにより、水−メタノール(0、10、20、40、60% メタノール)の混合溶媒で順に溶出した。この操作を繰り返し、10、20、40%メタノールで溶出した画分を合わせて減圧濃縮し、5.6gの褐色物質を得た。
【００３２】
得られた褐色物質をODSカラム(Purif-Pack ODS-100; 昭光サイエンティフィック社)に供した。中圧カラムクロマトグラフィーにより、水−メタノール(0%-100%メタノール)の混合溶媒で順に溶出した。この操作を繰り返し、20%メタノールで溶出した画分を合わせて減圧濃縮し、143mgの褐色物質を得た。
【００３３】
得られた褐色物質をODSカラム(CAPCELL PAK C18 MGII column, 5.0μm, 20i.d. × 150mm; 資生堂社)に供し、分取HPLC-MSシステム(Waters社)を用いて分画した。1%ギ酸入り水―メタノール混合溶媒(0-50%メタノール)で溶出(流速毎分10ml、30分間)し、保持時間25.8分の目的画分を合わせて減圧濃縮し、14.3mgの物質を得た。
【００３４】
得られた油状物質をODSカラム(CAPCELL PAK C18 MGII column, 5.0μm, 20i.d. × 150mm; 資生堂社)に供し、分取HPLC-MSシステム(Waters社)を用いて分画した。1%ギ酸入り水−メタノール混合溶媒(30%メタノール)で溶出し、保持時間16.9分の目的画分を合わせて減圧濃縮し、7.4mgの物質を得た。
【００３５】
前項で得られた物質をODSカラム(XBridge C18, 5.0μm, 19i.d. × 150mm; Waters社)に供し、分取HPLC-MSシステム(Waters社)を用いて分画した。1%ギ酸入り水−アセトニトリル混合溶媒(17%アセトニトリル)で溶出し、溶出時間21.8分の目的画分を合わせて減圧濃縮し、2.7mgの物質を得た。
【００３６】
得られた物質の構造解析を高分解能質量分析並びに13C-核磁気共鳴スペクトル及び1H-核磁気共鳴スペクトルにより行った。高分解能質量分析により当該物質の分子式はC42H43N5O12であると決定され、かつ、13C-核磁気共鳴スペクトル及び1H-核磁気共鳴スペクトルの結果により(表３)、当該物質は、下記式で示されるペプチドであると決定された。
【化２】
2017081887.tif 000006
【００３７】
（２．リボソームペプチドの活性評価）
上記「１．リボソームペプチドの単離・精製」で取得したペプチドの抗酸化活性を調べた。抗酸化活性を評価するために、DPPHラジカル消去活性作用を調べた。
具体的に以下のようにして行った。まず、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200、400mＭのペプチド溶液(DMSO)を調製し、PBS buffer 19.8μLに各ペプチド溶液を0.2μL添加した。次いで、各ペプチドを含むPBS bufferに400μM DPPH溶液(EtOH)を10μL添加して室温で30分間反応させた後、570nmの吸光度を測定した。なお、ポジティブコントロールとして、α-トコフェロールを使用した。
その結果を図３に示す。図３に示すように、α-トコフェロールと比較すると弱い活性であったが、抗酸化活性が観察された。
【図１】
2017081887.tif 000009
【図２】
2017081887.tif 000010
【図３】
2017081887.tif 000011
【配列表】
2017081887000001.app