(57)【要約】【課題】焦点面前後における蛍光強度差を低減した３次元画像を取得する。【解決手段】標本Ｘに励起光を照射する照明光学系２，３と、照明光学系２，３により励起光が照射されることにより標本Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ７、対物レンズ７により集光された蛍光を撮影する撮像素子１６および撮像素子１６と対物レンズ７との間に配置されたマイクロレンズアレイ１５とを備える検出光学系４とを備え、照明光学系２，３が、標本Ｘ内に配置される対物レンズ７の焦点面Ａを挟んで両側から励起光を照射するライトフィールド顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に励起光を照射する照明光学系と、
該照明光学系により励起光が照射されることにより前記標本において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備える検出光学系とを備え、
前記照明光学系が、前記標本内に配置される前記対物レンズの焦点面を挟んで両側から前記励起光を照射するライトフィールド顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光学系が、前記対物レンズを介して前記標本に前記励起光を照射する落射照明光学系と、
前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側に配置されたコンデンサレンズを介して前記標本に前記励起光を照射する透過照明光学系とを備える請求項１に記載のライトフィールド顕微鏡。
【請求項３】
前記透過照明光学系が、前記コンデンサレンズの前記標本とは反対側の略焦点位置に配置され、輪帯光を形成するスリット部材を備え、
前記コンデンサレンズから前記標本に射出される前記励起光の射出角が、前記対物レンズの開口数に相当する角度より大きい請求項２に記載のライトフィールド顕微鏡。
【請求項４】
前記落射照明光学系および前記透過照明光学系の少なくとも一方に、前記励起光の強度を調節する強度調節部を備える請求項２または請求項３のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。
【請求項５】
前記強度調節部が、前記標本に対する前記対物レンズの焦点面の位置に基づいて、前記励起光の強度を調節する請求項４に記載のライトフィールド顕微鏡。
【請求項６】
前記強度調節部が、前記落射照明光学系を介して前記励起光を前記標本に照射したときに前記撮像素子により取得された蛍光画像の輝度と、前記透過照明光学系を介して前記励起光を前記標本に照射したときに前記撮像素子により取得された蛍光画像の輝度とが略同等となるように前記励起光の強度を調節する請求項４に記載のライトフィールド顕微鏡。
【請求項７】
前記コンデンサレンズを介して明視野照明光を前記標本に入射させる透過明視野照明光学系と、前記標本を透過した前記明視野照明光を撮影する明視野用撮像素子とを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライトフィールド顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本の深部に焦点を合わせて１回の画像取得を行うことにより、標本の３次元画像データを構築することができるライトフィールド顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７７２３６６２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のライトフィールド顕微鏡は、落射照明により、励起光の照射方向に戻る蛍光を検出するため、励起光の焦点位置より深い位置での励起光量が標本の光吸収や散乱の影響によって低下し、焦点面よりも深い部分における蛍光強度の低い３次元画像が取得されてしまうという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、焦点面前後における蛍光強度差を低減した３次元画像を取得することができるライトフィールド顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本に励起光を照射する照明光学系と、該照明光学系により励起光が照射されることにより前記標本において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備える検出光学系とを備え、前記照明光学系が、前記標本内に配置される前記対物レンズの焦点面を挟んで両側から前記励起光を照射するライトフィールド顕微鏡を提供する。
【０００６】
本態様によれば、照明光学系により標本に対して励起光が照射されると、標本において発生した蛍光が対物レンズにより集光され、マイクロレンズアレイを通過した後に撮像素子によって撮影される。これにより、標本内における対物レンズの焦点面のみならず、励起光が通過した標本の各部の情報を撮像素子により取得することができ、取得された画像情報に基づいて、標本の３次元画像を取得することができる。
この場合において、照明光学系が、標本内に配置される対物レンズの焦点面を挟んで両側から励起光を照射することにより、焦点面に対して対物レンズ側のみならず対物レンズとは反対側の各位置においても十分な強度の蛍光を発生させることができ、焦点面前後における蛍光強度差を低減した３次元画像を取得することができる。
【０００７】
上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズを介して前記標本に前記励起光を照射する落射照明光学系と、前記標本を挟んで前記対物レンズとは反対側に配置されたコンデンサレンズを介して前記標本に前記励起光を照射する透過照明光学系とを備えていてもよい。
このようにすることで、落射照明光学系により、対物レンズを介して、対物レンズ側から標本に励起光が照射され、透過照明光学系により、コンデンサレンズを介して対物レンズとは反対側から標本に励起光が照射される。これにより、対物レンズの焦点面を挟んで両側から励起光を照射することができ、焦点面前後における蛍光強度差を低減した３次元画像を取得することができる。
【０００８】
また、上記態様においては、前記透過照明光学系が、前記コンデンサレンズの前記標本とは反対側の略焦点位置に配置され、輪帯光を形成するスリット部材を備え、前記コンデンサレンズから前記標本に射出される前記励起光の射出角が、前記対物レンズの開口数に相当する角度より大きいことが好ましい。
このようにすることで、透過照明光学系により、スリット部材を通過することによって輪帯光に形成された励起光が、コンデンサレンズによって集光されて標本に照射される。コンデンサレンズから標本に射出される励起光の射出角を対物レンズの開口数に相当する角度より大きくすることにより、標本を透過したコンデンサレンズ側からの励起光が対物レンズによって集光されることを防止して、良好な蛍光画像を取得することができる。
【０００９】
また、上記態様においては、前記落射照明光学系および前記透過照明光学系の少なくとも一方に、前記励起光の強度を調節する強度調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、強度調節部によって落射照明光学系により標本に照射する励起光の強度または透過照明光学系により標本に照射する励起光の強度の少なくとも一方を調節して、対物レンズの焦点面前後の蛍光強度差をなくすように微調整することができる。
【００１０】
また、上記態様においては、前記強度調節部が、前記標本に対する前記対物レンズの焦点面の位置に基づいて、前記励起光の強度を調節してもよい。
このようにすることで、対物レンズの焦点面の位置が変化した場合等、落射照明光学系側の標本の厚さと透過照明光学系側の標本の厚さとの比率が変化した場合であっても、対物レンズの焦点面前後の蛍光強度差をなくすように微調整することができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記強度調節部が、前記落射照明光学系を介して前記励起光を前記標本に照射したときに前記撮像素子により取得された蛍光画像の輝度と、前記透過照明光学系を介して前記励起光を前記標本に照射したときに前記撮像素子により取得された蛍光画像の輝度とが略同等となるように前記励起光の強度を調節してもよい。
このようにすることで、対物レンズの焦点面の位置を検出することなく、焦点面前後の蛍光強度差を低減することができる。
【００１２】
また、上記態様においては、前記コンデンサレンズを介して明視野照明光を前記標本に入射させる透過明視野照明光学系と、前記標本を透過した前記明視野照明光を撮影する明視野用撮像素子とを備えていてもよい。
このようにすることで、透過明視野照明光学系により、コンデンサレンズを介して標本に明視野照明光を入射させ、明視野用撮像素子によって標本を透過した明視野照明光を撮影することにより、励起光によって標本にダメージを与えることなく、明視野照明によって、標本内の対物レンズの焦点面を決定することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、焦点面前後における蛍光強度差を低減した３次元画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図２】本発明の第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図３】本発明の第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図４】本発明の第４の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明の第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１について図１を参照して説明する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１は、図１に示されるように、ステージに載置された標本Ｘに対し、一方向、例えば上方から励起光を入射させる落射照明光学系（照明光学系）２と、標本Ｘに対して他方向、例えば下方から励起光を入射させる透過照明光学系（照明光学系）３と、標本Ｘにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系４とを備えている。
【００１６】
落射照明光学系２は、励起光を発生する第１光源５と、該第１光源５から発せられた励起光を集光する照明レンズ６と、該照明レンズ６により集光された励起光を標本Ｘに照射する一方、標本Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ７とを備えている。
透過照明光学系３は、励起光を発生する第２光源８と、該第２光源８から発せられた励起光を集光する照明レンズ９と、該照明レンズ９により集光された励起光を標本Ｘに照射するコンデンサレンズ１０とを備えている。落射照明光学系２および透過照明光学系３は、例えば、ケーラー照明のような一般の明視野照明光学系である。
【００１７】
落射照明光学系２および透過照明光学系３は、各光源５，８からの励起光を同時に標本Ｘに照射するようになっている。
図中、符号１１は、透過照明光学系３の光路を形成するためのミラーである。
【００１８】
検出光学系４は、対物レンズ７により集光された蛍光を励起光の光路から分岐するダイクロイックミラー１２と、該ダイクロイックミラー１２によって分岐された蛍光を透過させ、励起光を遮断するエミッションフィルタ１３と、該エミッションフィルタ１３を透過した蛍光を集光する結像レンズ１４と、該結像レンズ１４の焦点位置近傍に配置されたマイクロレンズアレイ１５と、該マイクロレンズアレイ１５を通過した蛍光を撮影する撮像素子１６とを備えている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１を用いて標本Ｘの３次元画像を取得するには、落射照明光学系２の第１光源５を作動させて励起光を射出させるとともに、透過照明光学系３の第２光源８を作動させて励起光を射出させる。
【００２０】
第１光源５から射出された励起光は、照明レンズ６、ダイクロイックミラー１２を経由して対物レンズ７により、標本Ｘを落射照明する。
一方、第２光源８から射出された励起光は、照明レンズ９、ミラー１１を経由してコンデンサレンズ１０により、標本Ｘを透過照明する。
【００２１】
標本Ｘには予め蛍光標識をしておくことにより、照射された励起光によって標本Ｘ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。標本Ｘにおいて発生した蛍光は対物レンズ７により集光された後に、ダイクロイックミラー１２によって励起光の光路から分離される。そして、エミッションフィルタ１３を通過させられることにより、励起光が除去された後に、結像レンズ１４によって集光され、マイクロレンズアレイ１５を通過して撮像素子１６により撮影される。
【００２２】
撮像素子１６により取得された蛍光画像には、マイクロレンズアレイ１５によって標本Ｘ内の対物レンズ７の焦点面Ａ内のみならず、対物レンズ７の光軸に沿う方向の各位置の情報が含まれている。したがって、取得された蛍光画像に対して、ソフトウェアによるデコンボリューション処理を行うことにより、３次元的な各位置とその位置から発せられた蛍光強度とを対応づけて抽出することが可能となり、３次元の蛍光画像を生成することができる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１によれば、標本Ｘ内の深部に配置される対物レンズ７の焦点面Ａを挟んで両側から励起光を入射させるので、標本Ｘ内の各部において発生する蛍光の強度の差を低減することができる。
すなわち、落射照明光学系２のみあるいは透過照明光学系３のみで励起光を照射した場合には、標本Ｘ内における散乱や吸収によって、深部に行くに従って励起光の強度が低減するため、対物レンズ７の焦点面Ａ前後で発生する蛍光強度に大きな差が発生することがある。
【００２４】
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１のように、落射照明光学系２および透過照明光学系３の両方から標本Ｘに対して励起光を同時に照射することにより、焦点面前後における蛍光強度の差を低減し、見やすい３次元画像を生成することができるという利点がある。
【００２５】
次に、本発明の第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１７について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００２６】
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１７は、図２に示されるように、透過照明光学系１８のコンデンサレンズ１０の前段に、リング状のスリット１９を有するスリット部材２０が配置されている点で、第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と相違している。
スリット部材２０は、コンデンサレンズ１０の標本Ｘとは反対側の（後ろ側）焦点位置近傍に配置されている。スリット１９の大きさは、該スリット１９を通過することにより輪帯状に形成された励起光がコンデンサレンズ１０により集光されて標本Ｘに対して射出されることとなる射出角αが、対物レンズ７の開口数（ＮＡ）に相当する角度より大きくなるように設定されている。
【００２７】
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１７によれば、透過照明光学系１８から標本Ｘに照射される励起光は、図２に示されるように、標本Ｘを透過した後に対物レンズ７に入射することがない。すなわち、対物レンズ７により集光される蛍光に、透過照明光学系３によって入射された励起光の直接光を含まないようにすることができる。
【００２８】
ダイクロイックミラー１２やエミッションフィルタ１３のみでは、それらの光学特性によって励起光を十分に除去できない場合もあるが、本実施形態によれば、透過照明光学系１８により照射される励起光の直接光が蛍光とともに撮影されてしまう不都合を防止して、ノイズの少ない良好な３次元画像を取得することができるという利点がある。
【００２９】
次に、本発明の第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２１について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００３０】
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２１は、図３に示されるように、落射照明光学系２２および透過照明光学系２３に、第１光源５および第２光源８から射出された励起光の強度を調節する強度調節部２４，２５を備えるとともに、これらの強度調節部２４，２５を制御する制御部２６を備えている点において、第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と相違している。
【００３１】
強度調節部２４，２５は、例えば、第１光源５と照明レンズ６との間の光路および第２光源８と照明レンズ９との間の光路上にそれぞれ配置されたディスク状のＮＤフィルタ２７，２８と、該ＮＤフィルタ２７，２８を光軸に略平行な軸線回りに回転させるモータ２９，３０とを備えている。ＮＤフィルタ２７，２８は周方向に沿って透過率を変化させており、モータ２９，３０によって回転させられることにより、照明レンズ６，９に入射する励起光の強度を連続的に変化させることができるようになっている。
【００３２】
制御部２６は、例えば、撮像素子１６により取得された蛍光画像の強度に基づいて各強度調節部２４，２５のモータ２９，３０を作動させるようになっている。
すなわち、観察者が対物レンズ７の焦点面Ａを標本Ｘ内の所望の位置に設定すると、制御部２６が、まず予備処理によってＮＤフィルタ２７，２８の透過率を設定し、設定された透過率で本撮影を行うようになっている。
【００３３】
具体的には、予備処理において、制御部２６は、透過照明光学系２３側の強度調節部２５のモータ３０を作動させて、ＮＤフィルタ２８を透過率ゼロの遮断位置に配置し、落射照明光学系２２側の強度調節部２４のモータ２９を作動させて、ＮＤフィルタ２７の透過率を所定値に設定し、仮画像を取得する。次いで、制御部２６は、落射照明光学系２２側の強度調節部２４のモータ２９を作動させて、ＮＤフィルタ２７を透過率ゼロの遮断位置に配置し、透過照明光学系２３側の強度調節部２５のモータ３０を作動させて、仮画像と略同等の輝度となる蛍光画像が取得されるようにＮＤフィルタ２８の透過率を調節する。
【００３４】
これにより予備処理が終了する。予備処理により落射照明光学系２２からの励起光と透過照明光学系２３からの励起光との強度比が求められるので、制御部２６は、本撮影においては、予備処理により求められた強度比が変化しないように、ＮＤフィルタ２７，２８を調節して蛍光画像を取得する。これにより、焦点面前後における蛍光強度の差をさらに精度よく低減し、見やすい３次元画像を生成することができるという利点がある。
【００３５】
なお、本実施形態においては、強度調節部２４，２５を落射照明光学系２２および透過照明光学系２３の両方に設けることとしたが、これに代えて、いずれか一方に設けることにしてもよい。また、撮像素子１６により取得された蛍光画像の強度に基づいて、強度調節部２４，２５を設定することとしたが、これに代えて、対物レンズ７の焦点面Ａの位置を検出して、焦点面Ａの位置に応じて強度調節部２４，２５を設定することにしてもよい。
【００３６】
また、本実施形態においては、制御部２６により強度調節部２４，２５を自動調節することとしたが、これに代えて、手動により調節することにしてもよい。
【００３７】
次に、本発明の第４の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡３１について図４を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００３８】
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡３１は、図４に示されるように、明視野透過観察用の明視野照明光を標本Ｘに照射する透過明視野照明光学系３２および標本Ｘを透過した明視野照明光を撮影する明視野用撮像素子３３を備えている点において、第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２１と相違している。
【００３９】
透過明視野照明光学系３２は、明視野照明光を射出する第３光源３４と、該第３光源３４から射出された明視野照明光を集光する照明レンズ３５と、透過照明光学系２３における第２光源８からの励起光の光路上に挿脱可能に設けられたミラー３６とを備えている。
ミラー３６は、透過照明光学系２３の光路上に挿入されることによって、明視野照明光を透過照明光学系２３の光路に入射させ、第２光源８からの励起光を遮断するようになっている。
【００４０】
明視野用撮像素子３３は、結像レンズ１４の焦点位置近傍に撮像面を配置しており、検出光学系４の光路上に挿脱可能に設けられたミラー３７が光路上に挿入されることによって、標本Ｘを透過し、対物レンズ７および結像レンズ１４によって集光された明視野照明光を撮影することができるようになっている。
【００４１】
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡３１によれば、作業者が標本Ｘの観察場所を探索する際に、２つのミラー３６，３７を光路上に挿入することにより、第３光源３４からの明視野照明光を照明レンズ９およびコンデンサレンズ１０を介して標本Ｘに照射させ、標本Ｘを透過した明視野照明光を対物レンズ７および結像レンズ１４を介して明視野用撮像素子３３によって撮影することができる。
【００４２】
このようにすることで、明視野照明光としては標本Ｘにダメージを与えない可視光等を用いることができ、観察場所の探索によって標本Ｘにダメージが与えられることを防止することができるという利点がある。
観察場所が探索された後には、２つのミラー３６，３７を光路上から離脱させることにより、第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡３１を構成して、標本Ｘの３次元画像を取得することができる。
【符号の説明】
【００４３】
１，１７，２１，３１  ライトフィールド顕微鏡
２，２２  落射照明光学系（照明光学系）
３，１８，２３  透過照明光学系（照明光学系）
４  検出光学系
７  対物レンズ
１０  コンデンサレンズ
１５  マイクロレンズアレイ
１６  撮像素子
２０  スリット部材
２４，２５  強度調節部
３２  透過明視野照明光学系
３３  明視野用撮像素子
Ｘ  標本
α  射出角
【図１】
2017161740.tif 000003
【図２】
2017161740.tif 000004
【図３】
2017161740.tif 000005
【図４】
2017161740.tif 000006