(57)【要約】      （修正有）【課題】多型シトクロム（Ｐ４５０）媒介酸化的生体内活性化を必要とする欠点を有するプロドラッグである、一般的に使用される抗血小板剤のクロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）及びプラスグレル（エフィエント）に代わる医薬化合物の提供。【解決手段】チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体、例えば下式に示す化合物。2017081968.tif 000032【選択図】図１
2017081968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2017081968.tif 000031
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、得られた化合物を、内在性グルタチオン（ＧＳＨ）との相互作用の後に活性チエノピリジン代謝物を生成することができるようにする任意の化学的部分を含む）を有する、薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／またはプロドラッグを含む、化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＡＡ０２００９０およびＣＡ０１６９５４の下で、政府支援によりなされた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、医薬品化学の分野に含まれる。特に、本発明は、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体、ならびに心血管疾患の治療、改善、および予防のための治療剤としてのそれらの使用に関する。
【０００３】
〔緒言〕
チエノピリジニル化合物は、心臓発作および脳卒中を予防するために、抗血小板剤として広く使用されている。このカテゴリーにおいて、クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）およびプラスグレル（エフィエント）が、３つの一般的に使用されるプロドラッグである。これらの薬剤は、多型シトクロム（Ｐ４５０）媒介酸化的生体内活性化を必要とする。そのような酸化的生体内活性化は、遅い治療効果の開始、ならびに好中球減少症および血栓性血小板減少性紫斑病を含むいくつかの副作用をもたらす。
【０００４】
多型シトクロム（Ｐ４５０）媒介酸化的生体内活性化を必要としない改善された抗血小板剤が必要とされている。
【０００５】
〔発明の概要〕
クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）およびプラスグレル（エフィエント）は、心臓発作および脳卒中を防止するための抗血小板剤として広く使用されるチエノピリジニル化合物のクラスに属する。しかしながら、応答の欠如、毒性および過度の出血を含むいくつかの重大な欠点が、これらの薬剤に関連している。これらの欠点は、それらが全て多型シトクロムＰ４５０酵素（Ｐ４５０）による酸化的生体内活性化を必要とするプロドラッグであるという事実に密接に関連している。
【０００６】
チエノピリジン化合物（クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）およびプラスグレル（エフィエント））に関連した欠点を克服するために、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が開発された。実際に、本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験では、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が、Ｐ４５０の生体内活性化を必要とせず、内因性グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で活性チエノピリジン代謝物（例えば、抗血小板活性が可能な活性チエノピリジン代謝物）を生成することができることが実証された。このアプローチは、Ｐ４５０による酸化的生体内活性化プロセスを避けるだけでなく、チエノピリジニル薬に関連する欠点の多くを回避する。例えば、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、結合体からの活性代謝物の生成が予測可能であるため、投与の一貫性を改善する。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体の抗血小板剤としての使用は、チオール交換反応により毒性反応性代謝物が生成されないため、毒性を低減する。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体の治療開始時間が短縮され、これは、急性心血管イベントを経験する患者に大きな利益をもたらす。例えば、摂取されたチエノピリジンのごくわずかな割合が活性代謝物に変換されるため、チエノピリジンの標準的な投薬計画は、患者に３〜５日間連続的に投薬することを必要とする。対照的に、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、３０分未満で高収率で活性代謝物を放出する。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、活性代謝物に対する優れた安定性を有し、したがってそれらを使用して、インビトロの基礎的および臨床的研究のために活性代謝物を定量的に生成することができる。
【０００７】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、抗血小板剤として広く使用されるチエノピリジニル化合物（例えば、クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）およびプラスグレル（エフィエント））に関連したそのような欠点を克服することができる、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を提供する。本発明は、チエノピリジン化合物の特定の混合ジスルフィド結合体に限定されない。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む、式Ｉ：
【０００８】
【化１】
2017081968.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、得られた化合物を、内因性グルタチオン（ＧＳＨ）（例えば、抗血小板活性が可能な活性チエノピリジン代謝物）との相互作用の後に活性チエノピリジン代謝物を生成することができるようにする任意の化学的部分を含む）により記述される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＯ−ＯＣＨ３および
【００１１】
【化２】
2017081968.tif 000004
【００１２】
からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、塩素またはフッ素である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
【００１５】
【化３】
2017081968.tif 000005
【００１６】
からなる群から選択される。
【００１７】
ある特定の実施形態において、本発明は、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
ある特定の実施形態において、本発明は、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、アテローム血栓症の治療、改善および予防に使用される。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、血小板凝集の迅速な阻害のために使用される。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、経皮的冠動脈インターベンション処置（例えば、冠動脈形成術）中に、血小板凝集の迅速な阻害のために使用される。
【００１９】
ある特定の実施形態において、本発明は、心血管疾患を治療、改善、または予防する方法であって、治療有効量のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与は、静脈内投与である。いくつかの実施形態において心血管疾患は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および脳血管疾患からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、化合物は、血小板の凝集を低減する（例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体への不可逆的結合を介して）（例えば、ＡＤＰ受容体の遮断を介して）。いくつかの実施形態において、化合物は、Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせずに内因性グルタチオンの存在下で活性チエノピリジン代謝物を生成することができる。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、血小板凝集阻害剤、多価不飽和脂肪酸、フィブリン酸誘導体、胆汁酸封鎖剤、酸化防止剤、および抗狭心症薬からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の同時投与をさらに含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、本発明は、患者における血管上の血小板の凝集を治療、改善または予防する方法であって、治療有効量のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与は、静脈内投与である。いくつかの実施形態において、患者は、心血管疾患（例えば、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および脳血管疾患）を有する、またはそのリスクを有する。いくつかの実施形態において、血小板の凝集の治療、改善または予防は、Ｐ２Ｙ１２受容体への不可逆的結合を介して生じる。いくつかの実施形態において、血小板の凝集の治療、改善または予防は、ＡＤＰ受容体の遮断を介して生じる。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせずに内因性グルタチオンの存在下で活性チエノピリジン代謝物を生成することができる。
【００２１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、クロピドグレルの活性代謝物（ＡＭ）の形成に対するチオール還元剤の効果を示すグラフである。ＡＭは、０．２ｍｇ／ｍｌのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレル、ＮＡＤＰＨ再生系、およびチオール還元剤を含有する０．１ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中で生成された。チオール還元剤の濃度は１ｍＭであったが、但しＣＰＴ、ＤＦＴおよびＮＰＴはそれぞれ０．３ｍＭであった。５単位のＧ６ＰＤの添加により反応を開始させ、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、活性代謝物を、材料および方法の項に記載のようにＭＰ誘導体として定量した。報告された率は、３回の別個の測定にわたり平均化した。チオール化合物に関する略語は、表１に記載されている。
【００２２】
図２は、クロピドグレルの代表的混合ジスルフィド結合体の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）である。混合ジスルフィド結合体は、１ｍｇ／ｍｌのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレル、各種チオール還元剤、およびＮＡＤＰＨ再生系を含有する０．２ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、３７℃で３０分間生成された。ＭＳ分析は、材料および方法の項に記載のように行った。（Ａ）ｍ／ｚ  ４３２．０６でのＢＭＥ結合体のＥＩＣ；（Ｂ）ｍ／ｚ  ４８２．０８でのＤＦＴ結合体のＥＩＣ；（Ｃ）ｍ／ｚ  ４９９．９９でのＣＰＴ結合体のＥＩＣ；（Ｄ）ｍ／ｚ  ５１０．０８でのＮＰＴ結合体のＥＩＣ。
【００２３】
図３は、ＨＬＭにより生成されたクロピドグレルのＡＭおよびチオール結合体の相対量を示すグラフである。図２で説明したように、ＡＭおよび結合体は、０．２ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰ（ｐＨ７．４）中で生成された。これらの分析のために、５０ｐモルの（Ｓ）−クロピドグレルをＩＳとして各試料に注入した。材料および方法の項に記載のように、ＡＭおよびチオール結合体は両方とも、依存スキャンモードでＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。凡例：白抜きのバー、ｍ／ｚ  ３２２（ＩＳ）に対するｍ／ｚ  ３５６（ＡＭ）のＡＵＣ比；黒のバー、ＩＳのそれぞれの結合体のＡＵＣ比。
【００２４】
図４は、ＣＰＴの混合ジスルフィド結合体のＭＳおよびＭＳ２スペクトルである。結合体は、図２で説明したように生成された。材料および方法の項に記載のように、ＭＳおよびＭＳ２スペクトルは、依存スキャンモードでＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して得られた。（Ａ）ＣＰＴ結合体のＭＳスペクトル；（Ｂ）ＣＰＴ結合体の親イオンのｍ／ｚ  ４９９．９９のＭＳ２スペクトル；（Ｃ）ＣＰＴ結合体の親イオンｍ／ｚ  ５０１．９４のＭＳ２スペクトル；（Ｄ）図４Ｂに示される断片化パターンの帰属。
【００２５】
図５は、ＧＳＨによるクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の還元の反応速度を示すグラフである。混合ジスルフィド結合体は、材料および方法の項に記載のように、１ｍｇ／ｍｌのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレル、ＮＡＤＰＨ再生系、および各種チオール還元剤を含有する反応混合物から調製され、ＳＰＥ  Ｃ１８カートリッジを使用して精製された。精製された結合体は、次いで、１ｍＭのＧＳＨおよび０．２ｍｇ／ｍｌの細胞質ゾル（存在する場合）と混合された。残りの結合体および形成されたＡＭは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。凡例：（Ａ）０．２ｍｇ／ｍｌの細胞質ゾルの存在下での１ｍＭ  ＧＳＨによる、ＢＭＥ（白丸）、ＣＰＴ（黒四角）、ＮＡＣ（黒逆三角）、ＤＦＴ（黒三角）、およびＮＰＴ（白四角）の結合体の還元。（Ｂ）０．２ｍｇ／ｍｌの細胞質ゾルの存在下および非存在下での１ｍＭのＧＳＨによるＣＰＴ結合体の還元。凡例：（白丸）細胞質ゾルの非存在下でのＡＭの形成；（白三角）、細胞質ゾルの存在下でのＡＭの形成；（黒丸）細胞質ゾルの非存在下での結合体の還元；（黒三角）細胞質ゾルの存在下での結合体の還元。実線および破線は、単一指数関数への非線形曲線フィッティングである。
【００２６】
図６は、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体からの活性代謝物Ｈ４の形成を示す、ｍ／ｚ５０４において観察される抽出イオンクロマトグラムである。混合ジスルフィド結合体は、図３において説明したように、ＨＬＭ中で生成され、ＳＰＥカートリッジで精製された。ＭＳ分析の前に、混合ジスルフィド結合体は、ＡＭを放出するようにＤＴＴで処理され、次いでＡＭはその後ＭＰＢで誘導体化された。ＡＭ−ＭＰ誘導体は、材料および方法の項に記載のように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。凡例：Ａ、ｔｒａｎｓ−（破線）およびｃｉｓ−クロピドグレル−ＭＰ（実線）標準；Ｂ、１ｍＭのＧＳＨ（破線）および１ｍＭのアスコルビン酸（実線）の存在下で得られたＡＭ−ＭＰ；Ｃ、ＣＰＴ結合体から得られたＡＭ−ＭＰ；Ｄ、ＮＰＴ結合体から得られたＡＭ−ＭＰ；Ｅ、ＤＦＴ結合体から得られたＡＭ−ＭＰ。振幅は２倍された。
【００２７】
図７は、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体による血小板凝集の阻害を示すグラフである。混合ジスルフィド結合体は、１ｍＭのＧＳＨを含有する、チオール還元剤を含有しない、またはＧ６ＰＤを含有しない３つの対照試料と共に、０．３ｍＭのＣＰＴおよびＮＰＴの存在下で反応混合物から調製および精製された。全ての試料は０．５ｍＬのＰＰＰに再懸濁され、その一部は、ＡＭを放出するために１ｍＭのＧＳＨに処理された。血小板凝集は、１０μＭのＡＤＰの添加により開始し、血小板凝集計で記録した。凝集の割合は、ＰＲＰの割合に対して正規化し、４回の別個の測定にわたり平均化した。詳細については、材料および方法の項を参照されたい。凡例：ＰＲＰ、未処理多血小板血漿；ＧＳＨ、ＰＲＰ中１ｍＭのＧＳＨ；−Ｇ６ＰＤ、Ｇ６ＰＤの非存在下で生成された代謝物；−ＳＨ、任意のチオール還元剤の非存在下で生成された代謝物；ＧＳＨ、１ｍＭのＧＳＨの存在下で生成された代謝物；ＣＰＴ、０．３ｍＭのＣＰＴの存在下で生成された代謝物；ＣＰＴ＋ＧＳＨ、０．３ｍＭのＣＰＴの存在下で生成され、次いで１ｍＭのＧＳＨで処理された代謝物；ＮＰＴ、０．３ｍＭのＮＰＴの存在下で生成された代謝物；ＮＰＴ＋ＧＳＨ、０．３ｍＭのＮＰＴの存在下で生成され、次いで１ｍＭのＧＳＨで処理された代謝物。
【００２８】
図８は、実施例１０に記載のような再構成系においてバイオ合成された純粋（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴの全イオンクロマトグラムである。（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴの３つのジアステレオマーは、７．９、８．６および９．５分で溶出された。
【００２９】
図９は、実施例１０に記載のような（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴのＩＶ注射後の雄ＮＺ白ウサギの血小板活性を示すグラフである。
【００３０】
〔定義〕
「チエノピリジン化合物」という用語は、本明細書において使用される場合、その抗血小板活性のために使用されるＡＤＰ受容体／Ｐ２Ｙ１２阻害剤のクラスを指す。その例は、クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）、およびプラスグレル（エフィエント）を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
「チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体」という用語は、本明細書において使用される場合、内因性グルタチオン（ＧＳＨ）との相互作用の後に活性チエノピリジン代謝物を生成することができる修飾チエノピリジン化合物を指す。
【００３２】
「プロドラッグ」という用語は、本明細書において使用される場合、プロドラッグを放出する、またはそれを活性薬物に変換する（例えば、酵素的、生理学的、機械的、電磁的に）ために標的の生理学系内の生体内変化（例えば、自発的または酵素的）を必要とする親「薬物」分子の薬理学的に不活性な誘導体を指す。プロドラッグは、安定性、水溶性、毒性、特異性の欠如、または限定された生物学的利用能に関連した問題を克服するように設計される。例示的プロドラッグは、活性薬物分子自体、および化学マスキング基（例えば、薬物の活性を可逆的に抑制する基）を含む。いくつかのプロドラッグは、代謝条件下で切断可能な基を有する化合物の変形型または誘導体である。プロドラッグは、当該技術分野において知られている方法、例えばＡ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  （ｅｄｓ．），Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ，  １９９１、特にＣｈａｐｔｅｒ  ５：  ”Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”；Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  （ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８５；Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｋ．Ｂ．Ｓｌｏａｎ  （ｅｄ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  １９９８；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．  ４２，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５、特にｐｐ．  ３０９−３９６；Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍ．Ｗｏｌｆｆ  （ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９５、特に  Ｖｏｌ．  １ならびにｐｐ．  １７２−１７８およびｐｐ．  ９４９−９８２；Ｐｒｏ−Ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ  （ｅｄｓ．），Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  １９７５；ならびにＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ  （ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８７に記載の方法を使用して、親化合物から容易に調製され得る。
【００３３】
例示的プロドラッグは、生理学的条件下で加溶媒分解を受ける、または酵素分解もしくは他の生化学的変換（例えば、リン酸化、水素化、脱水素化、グリコシル化）を受けると、インビボまたはインビトロで薬学的に活性となる。プロドラッグは、しばしば、哺乳類生物において、水溶性、組織適合性または遅延放出の利点を提供する。（例えば、Ｂｕｎｄｇａｒｄ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  ｐｐ．  ７−９，  ２１−２４，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８５）；およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，  ｐｐ．  ３５２−４０１，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９２）を参照されたい。）一般的なプロドラッグは、酸誘導体、例えば親の酸と好適なアルコール（例えば、低級アルコール）との反応により調製されるエステル、もしくは親のアルコールと好適なカルボン酸（例えば、アミノ酸）との反応により調製されるエステル、親の酸化合物とアミンとの反応により調製されるアミド、反応してアシル化塩基誘導体（例えば、低級アルキルアミド）を形成する塩基性基、またはリン含有誘導体、例えば、環状ホスフェート、ホスホネート、およびホスホルアミデートを含む、ホスフェート、ホスホネートおよびホスホルアミデートエステル（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２４９５６４Ａ１号を参照されたい）を含む。
【００３４】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書において使用される場合、標的動物（例えば、哺乳類）において生理学的に忍容性である本発明の化合物の任意の塩（例えば、酸または塩基との反応により得られる）を指す。本発明の化合物の塩は、無機または有機酸および塩基から得られてもよい。酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン‐ｐ‐スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン‐２‐スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を含むが、これらに限定されない。シュウ酸等の他の酸は、それら自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際に、中間物として有用な塩の調製において利用されてもよい。
【００３５】
塩基の例は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１−４アルキルである）の化合物等を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩等を含むが、これらに限定されない。塩の他の例は、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、およびＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１−４アルキル基である）等の好適なカチオンと配合される、本発明の化合物のアニオンを含む。本発明の化合物の塩は、治療的使用に薬学的に許容されることが企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用されてもよい。
【００３７】
「溶媒和物」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の化合物の、有機または無機を問わない１種以上の溶媒分子との物理的会合を指す。この物理的会合は、しばしば、水素結合を含む。ある特定の場合において、溶媒和物は、例えば１種以上の溶媒和分子が結晶固体の結晶格子内に組み込まれている場合、単離が可能である。「溶媒和物」は、溶液相および単離可能な溶媒和物の両方を包含する。例示的溶媒和物は、水和物、エタノレート、およびメタノレートを含む。
【００３８】
「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、障害の１つ以上の症状の寛解をもたらす、または障害の進行を防止する、または障害の退行を引き起こすのに十分な治療薬剤の量を指す。例えば、血管上の血小板凝集の治療および／または予防に関して、一実施形態において、治療有効量は、血小板凝集を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少、低減および／または予防する治療薬剤（例えば、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体）の量を指す。
【００３９】
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、標準的な医薬担体、溶媒、界面活性剤、またはビヒクルのいずれかを包含する。好適な薬学的に許容されるビヒクルは、水性ビヒクルおよび非水性ビヒクルを含む。標準的な薬学的担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９ｔｈ  ｅｄ．  １９９５に記載されている。
【００４０】
〔発明を実施するための形態〕
チエノピリジニル抗血小板剤は、３つの臨床的に使用される薬物、クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）、およびプラスグレル（エフィエント）を含む。クロピドグレル（プラビックス）、チクロピジン（チクリド）、およびプラスグレル（エフィエント）の化学構造およびＩＵＰＡＣ名は、以下の通りである：
【００４１】
【化４】
2017081968.tif 000006
【００４２】
チエノピリジニル抗血小板剤は、急性心血管症候群および末梢血管疾患を有する患者、特に心臓発作および脳卒中を予防するために経皮的冠動脈インターベンション（例えば、冠動脈血管形成術）を受けている者の間で、広く使用されている。米国では毎年約２百万人の患者が、冠状動脈および頸動脈ステントを受け、プラビックスの年間売上高は２０１０年だけで６５億ドルに相当した。
【００４３】
広範な使用にもかかわらず、クロピドグレルは、その効率において著しい個体間変動を示している（例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＪＥ  ａｎｄ  Ｈｙｌｅｋ  ＥＭ  （２００９）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０（４）：４１１−４１３；Ｇｕｒｂｅｌ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｔａｎｔｒｙ  ＵＳ  （２００７）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １２０（３）：３１１−３２１；Ｓｏｆｉ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  １１（３）：１９９−２０６を参照されたい）。患者の約３分の１は、クロピドグレル療法に応答しない（例えば、Ｍａｓｏｎ  ＰＪ，  Ｊａｃｏｂｓ  ＡＫ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＪＥ  （２００５）  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４６（６）：９８６−９９３を参照されたい）。この個体間変動を克服する目的で、応答の欠如と相関する遺伝子マーカーを同定することを試みて、多くの研究が行われている。クロピドグレルは、突然変異ＣＹＰ２Ｃ１９＊２遺伝子を有する患者においてはより効果的でないことが示されている（例えば、Ｄｉｃｋ  ＲＪ，  Ｄｅａｒ  ＡＥ  ａｎｄ  Ｂｙｒｏｎ  ＫＡ  （２０１１）  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｃｉｒｃ  ２０（１０）：６５７−６５８；Ｓｈｕｌｄｉｎｅｒ  ＡＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  ＪＡＭＡ  ３０２（８）：８４９−８５７；Ｓｏｆｉ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  １１（３）：１９９−２０６を参照されたい）。しかしながら、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２突然変異遺伝子は、応答における変動のわずか１２％を占める（例えば、Ｓｈｕｌｄｉｎｅｒ  ＡＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  ＪＡＭＡ  ３０２（８）：８４９−８５７を参照されたい）。他の要因も関与している可能性があるが、同定されていない。
【００４４】
実際、抗血小板剤として広く使用されているものの、チエノピリジニル抗血小板剤に関連する欠点が存在する。クロピドグレルの主な欠点は、投薬の非一貫性である。例えば、患者の約３分の１は、クロピドグレル治療に応答しない。チクロピジンは、皮膚の発疹や下痢の中程度の症状から、好中球減少症および骨髄形成不全等の重篤な、時には致命的なものに至るまでの、一連の副作用を引き起こす可能性がある。稀なケースでは、無顆粒球症の重度の特異イベントをもたらす。過度の出血は、特に高齢患者において、プラスグレルの使用に関連している。
【００４５】
チエノピリジニル抗血小板剤に関連するそのような欠点は、これら３つの薬物が全て、スキーム１に示されるように、多型シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）による活性代謝物（ＡＭ）への酸化的生体内活性化を必要とするプロドラッグであるという事実に密接に関連している。この酸化的生体内活性化プロセスにより、Ｐ４５０により生成される活性代謝物の量は、各患者の肝臓Ｐ４５０の遺伝子構成に応じて変動する。さらに、これらの薬物は、Ｐ４５０により広範囲に代謝されて複数の代謝物を生成し、そのいくつかは極めて反応性であり、潜在的に毒性である。チクロピジンに起因する重度の特異イベントは、反応性代謝物の生成と関連していることが報告されている。
【００４６】
【化５】
2017081968.tif 000007
【００４７】
前述のように、クロピドグレル療法に対する変動する応答は、クロピドグレルが、シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）によるその薬理学的活性代謝物（ＡＭ）への酸化的生体内活性化を必要とするプロドラッグであるという事実に密接に関連している（例えば、Ｋａｚｕｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３８（１）：９２−９９；Ｓａｖｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８４（５）：８９１−８９６を参照されたい）。Ｐ４５０媒介生体内活性化には、２つの連続した酸化ステップが関与することが十分に説明されており（例えば、Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｔｈｅｂａｕｌｔ  Ｓ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２０１０）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２３（７）：１２６８−１２７４；Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｒｏｓｉ  Ｊ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２０１２）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２５（２）：３４８−３５６を参照されたい）、クロピドグレルはまず２−オキソクロピドグレルに一酸化され、一方でこれが第２ステップにおいてＡＭに酸化される。エステラーゼＰＯＮ１が２−オキソクロピドグレルからＡＭへの変換を担うことが議論されている（例えば、Ｂｏｕｍａｎ  ＨＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７（１）：１１０−１１６を参照されたい）が、２−オキソクロピドグレルは、スキーム２に示されるように、スルフェン酸中間体を介してＡＭに変換されるという考えを裏付ける証拠が増えてきている（例えば、Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｌｉｂｒａｉｒｅ  Ｊ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２００９）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２２（２）：３６９−３７３；Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｒｏｓｉ  Ｊ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２０１２）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２５（２）：３４８−３５６；Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｒｏｓｉ  Ｊ，  Ｄｅｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｊ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２０１２）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２５（５）：１０５８−１０６５；Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  Ｔｈｅｂａｕｌｔ  Ｓ，  Ｂｅｒｔｈｏ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｕｙ  Ｄ  （２０１０）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２３（７）：１２６８−１２７４を参照されたい）。
【００４８】
【化６】
2017081968.tif 000008
【００４９】
スキーム２によれば、２−オキソクロピドグレルは、まずＰ４５０によりスルフェン酸中間体に酸化される。次いで、極めて不安定なスルフェン酸は、グルタチオン（ＧＳＨ）により急速に還元されて、混合ジスルフィド結合体（ＲＳ−ＳＧ）を形成し、これがその後別のＧＳＨ分子により還元されてＡＭを形成する。これは、ＧＳＨがヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）におけるＡＭの形成に必要であるという観察と一致している（例えば、Ｋａｚｕｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３８（１）：９２−９９を参照されたい）。ＡＭは、血小板Ｐ２Ｙ１２受容体の共有結合修飾を介した血小板凝集の阻害を担うことが広く認められている（例えば、Ｄｉｎｇ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１（１０）：３９０８−３９１４；Ａｌｇａｉｅｒ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６（１１）：１９０８−１９１４を参照されたい）。混合ジスルフィド結合体ＲＳ−ＳＧの抗血小板活性は、依然として試験されていない。
【００５０】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）およびＬ−システインの存在下での２−オキソクロピドグレルの代謝は、ＡＭおよび混合ジスルフィド結合体の両方の形成をもたらす（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｌａｕ  ＷＣ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＰＦ  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８２：３０２−３０９を参照されたい）。さらに、ＮＡＣおよびＬ−システインの混合ジスルフィド結合体は、チオールをＧＳＨと交換すること、ならびにＡＭ、ＡＭ結合体およびＧＳＨの間の平衡は、それらの酸化還元電位により左右されることが実証された。スルフェン酸中間体は反応性酸化剤であるため、その酸化還元電位が高くなる可能性がある。
【００５１】
チエノピリジン化合物に関連する欠点を克服するために、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が開発された。本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験では、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が、スキーム３に示されるように、Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせず、内因性グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で活性代謝物を生成することができることが実証された。このアプローチは、Ｐ４５０による酸化的生体内活性化プロセスを避けるだけでなく、チエノピリジニル薬の欠点の多くを回避する。例えば、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、結合体からの活性代謝物の生成が予測可能であるため、投与の一貫性を改善する。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体の抗血小板剤としての使用は、チオール交換反応により毒性反応性代謝物が生成されないため、毒性を低減する。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体の治療開始時間が短縮され、これは、急性心血管イベントを経験する患者に大きな利益をもたらす。摂取されたチエノピリジンのごくわずかな割合が活性代謝物に変換されるため、チエノピリジンの標準的な投薬計画は、患者に３〜５日間連続的に投薬することを必要とする。対照的に、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、３０分未満で高収率で活性代謝物を放出し得る。さらに、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、活性代謝物に対する優れた安定性を有し、したがってそれらを使用して、インビトロの基礎的および臨床的研究のために活性代謝物を定量的に生成することができる。
【００５２】
【化７】
2017081968.tif 000009
【００５３】
スキーム３内において、ＳＲの例は、
【００５４】
【化８】
2017081968.tif 000010
【００５５】
を含むが、それらに限定されない。
【００５６】
したがって、本発明は、Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせずに内因性グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で活性チエノピリジン代謝物を生成することができる、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体に関する。本発明は、さらに、患者における心血管障害、例えば抗血小板剤（クロピドグレル、チクロピジン、およびプラスグレル等）に応答性であるものを治療、改善、または予防する方法であって、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を患者に投与することを含む方法に関する。そのような障害は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および脳血管疾患を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、例えばＡＤＰ受容体を遮断することにより血小板膜の機能を改変することによって血小板凝集を阻害する（例えば、それにより、フィブリノゲンへの血小板結合を可能にする糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの構造変化を防止する）ために使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、Ｐ２Ｙ１２受容体への不可逆的な結合により血小板の凝集（「クランピング」）を低減する。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、静脈内（ＩＶ）投与用に構成される医薬組成物内に使用される（例えば、抗血小板剤のＩＶ投与を必要とする医学的状況（例えば、冠動脈血管形成術）において）。
【００５７】
本発明は、チエノピリジン化合物の特定の混合ジスルフィド結合体に限定されない。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、および／またはプロドラッグを含む、式Ｉ：
【００５８】
【化９】
2017081968.tif 000011
【００５９】
により記述される。
【００６０】
式Ｉは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に関して特定の化学的部分に限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、得られた化合物を、Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせずに内因性グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で活性チエノピリジン代謝物を生成することができるようにする、任意の化学的部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、得られた化合物を、患者における心血管障害（例えば、冠動脈疾患、末梢血管疾患、および脳血管疾患）、例えば抗血小板剤（クロピドグレル、チクロピジン、およびプラスグレル等）に応答性のものを治療、改善、または予防することができるようにする、任意の化学的部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、得られた化合物を、例えばＡＤＰ受容体を遮断することにより血小板膜の機能を改変することによって血小板凝集を阻害する（例えば、それにより、フィブリノゲンへの血小板結合を可能にする糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの構造変化を防止する）ことができるようにする、任意の化学的部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、得られた化合物を、Ｐ２Ｙ１２受容体への不可逆的な結合により血小板の凝集（「クランピング」）を低減することができるようにする、任意の化学的部分を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｈ、−ＣＯ−ＯＣＨ３、または
【００６２】
【化１０】
2017081968.tif 000012
【００６３】
である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、塩素またはフッ素である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
【００６６】
【化１１】
2017081968.tif 000013
【００６７】
から選択されるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、以下のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が式Ｉに企図される：
【００６８】
【化１２】
2017081968.tif 000014
【００６９】
2017081968.tif 000015
【００７０】
2017081968.tif 000016
【００７１】
2017081968.tif 000017
【００７２】
2017081968.tif 000018
【００７３】
いくつかの実施形態において、以下のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が式Ｉに企図される：
【００７４】
【化１３】
2017081968.tif 000019
【００７５】
2017081968.tif 000020
【００７６】
2017081968.tif 000021
【００７７】
2017081968.tif 000022
【００７８】
2017081968.tif 000023
【００７９】
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ。
【００８０】
いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、動物（例えば、ヒトおよび獣医学的動物を含むがそれらに限定されない哺乳動物患者）における心血管障害、例えば抗血小板剤（クロピドグレル、チクロピジン、およびプラスグレル等）に応答性のものを治療、改善、または予防するために使用され、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を患者に投与することを含む。そのような障害は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、アテローム血栓症、および脳血管疾患を含むが、それらに限定されない。実際に、いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、血小板凝集を減少させる、および／または血栓形成を阻害するために使用される。この点で、そのような疾患および病状は、本発明の方法およびチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を使用した治療または予防に適している。
【００８１】
いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、症候性アテローム性動脈硬化症を有する患者における血管の虚血性イベントの予防において使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、ＳＴ上昇のない急性冠症候群の治療または予防に使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、冠動脈内ステント留置後の血栓症の予防に使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、例えばＡＤＰ受容体を遮断することにより血小板膜の機能を改変することによって血小板凝集を阻害する（例えば、それにより、フィブリノゲンへの血小板結合を可能にする糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの構造変化を防止する）ために使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、Ｐ２Ｙ１２受容体への不可逆的な結合により血小板の凝集（「クランピング」）を低減する。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、出血時間を延長するために使用される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、高リスク患者における発作の発生率を減少させるために使用される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、アテローム血栓症の治療、改善および予防に使用される。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、血小板凝集の迅速な阻害のために使用される。いくつかの実施形態において、静脈内（ＩＶ）投与用に構成されるチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含むそのような医薬組成物は、経皮的冠動脈インターベンション処置（例えば、冠動脈形成術）中に、血小板凝集の迅速な阻害のために使用される。実際に、抗血小板療法は、アテローム血栓症の予防および治療の基礎である。プラーク破裂やステントからのせん断圧力応力などのアゴニストによる血小板活性化は、アテローム血栓症の発症に重要な役割を果たす。患者が急性心血管症候群に罹患している、または経皮的心血管インターベンションを受けているある特定の臨床状況下では、血小板凝集の迅速かつ完全な阻害が、心血管死および虚血性合併症を予防するために必要である。そのような医療シナリオは、短い開始時間を有する抗血小板剤の静脈内投与を必要とする。しかしながら、現在使用されている抗血小板剤は、遅い開始時間を有するか、または静脈内投与できないため、これはまだ満たされていない医学的必要性である（例えば、Ｓｉｌｖａｉｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍｏｎｔａｌｅｓｃｏｔ，  Ｇ．，  （２０１２）  Ｃｉｒｃ．Ｃａｒｉｏｖａｓｃ．Ｉｎｔｅｒｖ．５：３２８−３３１を参照されたい）。本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、経口的および静脈内の両方で投与され得、短い開始時間を有し得るため、そのような化合物はこの満たされていない医学的必要性を満足させる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態は、有効量の本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体および少なくとも１種の追加の治療薬剤（心血管障害を治療、改善または予防することが知られている治療薬剤を含むが、それに限定されない）を投与するための方法、ならびに／または治療技術（例えば、外科的介入）を提供する。心血管障害を治療、改善、または予防することが知られているいくつかの治療薬剤が、本発明の方法における使用に企図される。実際に、本発明は、心血管障害を治療、改善、または予防することが知られているいくつかの治療薬剤の投与を企図するが、それらに限定されない。その例は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、アトルバスタチン（リピトール）、プラバスタチン（プラバコール）、シンバスタチン（ゾコール）、ロスバスタチン（クレストール）、ピタバスタチン（リバロ）、ロバスタチン（メバコール、アルトコール）、フルバスタチン（レスコール））、ＡＣＥ阻害剤（例えば、ラミプリル（アルテース）、キナプリル（ＡＣＣＵＰＲＩＬ）、カプトプリル（カポテン）、エナラプリル（バソテック）、リシノプリル（ゼストリル））、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン（ノルバスク）、ニフェジピン（プロカルディア）、ベラパミル（カラン）、フェロジピン（プレンジル）、ジルチアゼム（カルディゼム））、血小板凝集阻害剤（チクロピジン、クロピドグレル以外と、プラスグレル）（例えば、アブシキシマブ（レオプロ）、アスピリン、ワルファリン（ワーファリン）、ヘパリン）、多価不飽和脂肪酸（例えば、オメガ−３多価不飽和脂肪酸（フィッシュオイル））、フィブリン酸誘導体（例えば、フェノフィブラート（ＴＲＩＣＯＲ）、ゲムフィブロジル（ロピッド））、胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、コレスチポール（コレスチド）、コレスチラミン（クエストラン））、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ）、ニコチン酸誘導体（例えば、ナイアシン（ＮＩＡＳＰＡＮ）、血栓溶解剤（例えば、アルテプラーゼ（アクチバーゼ））、および抗狭心症薬（例えば、ラノラジン（ラネクサ）を含むが、それらに限定されない。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体および１種以上の追加の治療薬剤が、以下の条件の１つ以上において患者に投与される：異なる周期性、異なる期間、異なる濃度、異なる投与経路等。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、追加の治療薬剤の前、例えば、追加の治療薬剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、もしくは１８時間、１、２、３、４、５、もしくは６日、または１、２、３、もしくは４週間前に投与される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、追加の治療薬剤の後、例えば、追加の治療薬剤の投与から０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、もしくは１８時間、１、２、３、４、５、もしくは６日、または１、２、３、もしくは４週間後に投与される。いくつかの実施形態において、チエノピリジン化合物化合物の混合ジスルフィド結合体および追加の治療薬剤は、同時ではあるが異なるスケジュールで投与され、例えば、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は毎日投与されるが、追加の治療薬剤は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。他の実施形態において、チエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、週１回投与されるが、追加の治療薬剤は、毎日、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。
【００８５】
本発明の範囲内の組成物は、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体が意図される目的を達成するために効果的な量で含有される全ての組成物を含む。個々の必要性は変動するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該分野の技術内である。典型的には、化合物は、哺乳動物、例えばヒトに、１日当たり０．００２５から５０ｍｇ／ｋｇ（アポトーシスの誘導に応答性の障害の治療を受けている哺乳動物の体重）の用量で、またはその薬学的に許容される塩の相当量で経口的に投与され得る。一実施形態において、約０．０１から約２５ｍｇ／ｋｇが、そのような障害を治療、改善、または予防するために経口投与される。筋肉内注射の場合、用量は一般に経口用量の約半分である。例えば、好適な筋肉内用量は、約０．００２５から約２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１から約５ｍｇ／ｋｇとなる。
【００８６】
単位経口用量は、約０．０１から約１０００ｍｇ、例えば、約０．１から約１００ｍｇのチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を含んでもよい。単位用量は、それぞれ約０．１から約１０ｍｇ、好都合には約０．２５から５０ｍｇの化合物またはその溶媒和物を含有する１つ以上の錠剤またはカプセルとして１日に１回以上投与されてもよい。
【００８７】
局所製剤においては、化合物は、担体１グラム当たり約０．０１から１００ｍｇの濃度で存在してもよい。一実施形態において、チエノピリジン化合物化合物の混合ジスルフィド結合体は、約０．０７〜１．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、また一実施形態においては約０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００８８】
未加工化学物質としてチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体を投与することに加えて、本発明の化合物は、薬学的に使用することができる調製物への化合物の処理を促進する賦形剤および助剤を含む好適な薬学的に許容される担体を含有する薬学的調製物の一部として投与されてもよい。調製物、特に経口的または局所的に投与され得、また１つの種類の投与に使用され得る調製物、例えば錠剤、糖衣錠、徐放性トローチおよびカプセル、口内洗浄液およびマウスウォッシュ、ゲル、懸濁液、ヘアリンス、ヘアジェル、シャンプー、さらに直腸投与され得る調製物、例えば座剤、ならびに、静脈内注入、注射、局所または経口による投与に好適な溶液は、賦形剤と共に、約０．０１から９９パーセント、一実施形態において約０．２５から７５パーセントの活性化合物（複数種可）を含有する。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体の有益な効果を経験し得る任意の患者に投与され得る。何よりも、哺乳動物、例えばヒトがそのような患者に含まれるが、本発明はそのように限定されることを意図しない。他の患者は、獣医学的動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等）を含む。
【００９０】
化合物およびその医薬組成物は、それらの意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、口腔内、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内または局所経路によるものであってもよい。代替として、または同時に、投与は経口経路によるものであってもよい。投与される用量は、受容者の年齢、健康状態、および体重、該当する場合には併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。
【００９１】
本発明の医薬調製物は、それ自体知られている様式で、例えば従来の混合、顆粒化、糖衣錠製造、溶解、または凍結乾燥プロセスを用いて製造される。したがって、活性化合物を固体賦形剤と合わせ、得られた混合物を随意に粉砕し、所望または必要な場合には好適な助剤の添加後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって、経口使用のための医薬調製物を得ることができる。
【００９２】
好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖、例えばラクトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、ならびに結合剤、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン等を使用したデンプンペーストである。所望により、上述のデンプンおよびカルボキシメチル−デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤が添加されてもよい。助剤は、とりわけ、流動調節剤および滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸もしくはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアには、所望により、胃液に耐性のある好適なコーティングが提供される。この目的のため、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を随意に含有してもよい濃縮糖溶液が使用されてもよい。胃液に耐性のコーティングを生成するために、アセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の好適なセルロース調製物の溶液が使用される。例えば識別のため、または活性化合物用量の組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または顔料が添加されてもよい。
【００９３】
経口的に使用され得る他の医薬調製物は、ゼラチンで作製された押込嵌めカプセル、ならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤で作製された軟質密封カプセルを含む。押込嵌めカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、および随意に安定剤と混合されてもよい顆粒の形態の活性化合物を含有してもよい。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、一実施形態において、好適な液体、例えば脂肪油または流動パラフィン中に溶解または懸濁される。さらに、安定剤が添加されてもよい。
【００９４】
直腸内に使用することができる可能な医薬調製物は、例えば、座剤基材を有する活性化合物の１種以上の組合せからなる座剤を含む。好適な坐剤基材は、例えば、天然または合成トリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。さらに、活性化合物と基材との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。可能な基材の材料は、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素を含む。
【００９５】
非経口投与に好適な製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液、例えば、水溶性塩およびアルカリ溶液を含む。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはポリエチレングリコール−４００を含む。水性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。随意に、懸濁液はまた安定剤を含有してもよい。
【００９６】
本発明の局所用組成物は、一実施形態において、適切な担体の選択により、油、クリーム、ローション、軟膏等として製剤化される。好適な担体は、植物油または鉱物油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分岐鎖脂肪または油、動物性脂肪および高分子量アルコール（Ｃ１２より高級）を含む。担体は、活性成分が可溶性であるものであってもよい。所望により、乳化剤、安定剤、湿潤剤および酸化防止剤もまた、色または香りを付与する薬剤と同様に含まれてもよい。さらに、経皮浸透促進剤が、これらの局所製剤において使用され得る。そのような促進剤の例は、米国特許第３，９８９，８１６号および米国特許第４，４４４，７６２号に見出すことができる。
【００９７】
軟膏は、アーモンド油等の植物油中の活性成分と暖かい軟パラフィンとの溶液を混合し、混合物を冷却することによって製剤化され得る。そのような軟膏の典型的な例は、約３０重量％のアーモンド油および約７０重量％の白色軟パラフィンを含むものである。ローションは、好都合に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等の好適な高分子量アルコール中に活性成分を溶解することによって調製され得る。
【００９８】
上記は、単に本発明のある特定の好ましい実施形態の詳細な説明を表すものであることが、当業者には容易に理解される。上述の組成物および方法の様々な修正および変更は、当該技術分野において利用可能な専門知識を使用して容易に達成され得、また本発明の範囲内である。
【００９９】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明の化合物、組成物、および方法の例示であり、限定するものではない。臨床治療において通常遭遇し、また当業者に明らかである様々な条件およびパラメータの他の好適な修正および適合は、本発明の精神および範囲内にある。
【０１００】
〔実施例１〕
本実施例は、クロピドグレルおよびチクロピジンの混合ジスルフィド結合体の合成を説明する。
【０１０１】
スキーム４に従い、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を使用して、クロピドグレルおよびチクロピジンの混合ジスルフィド結合体の合成を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で行った。
【０１０２】
【化１４】
2017081968.tif 000024
【０１０３】
スキーム４内において、ＲＳ（または−ＳＲ）は、
【０１０４】
【化１５】
2017081968.tif 000025
【０１０５】
2017081968.tif 000026
【０１０６】
から選択されるがそれらに限定されないチオール含有試薬である。スキーム４内において、ＡＭ−ＳＲは、本発明の混合ジスルフィド結合体を表す。
【０１０７】
結果は、１０種類のＲＳ化合物のすべてが、それぞれの結合体を形成することを示した。さらに、タンデム質量分析法を使用して、反応体ＲＳが混合ジスルフィド結合を介して活性代謝物と結合体を形成することが確認された。結合体は、逆相クロマトグラフィーを使用して、反応混合物から精製された。
【０１０８】
〔実施例２〕
本実施例は、混合ジスルフィド結合体化合物からの活性代謝物の生成を説明する。結合体Ｃｌｏｐ−ＣＰＴ
【０１０９】
【化１６】
2017081968.tif 000027
【０１１０】
［（Ｚ）−２−（１−（２−クロロフェニル）−２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−（（６−クロロピリダジン−３−イル）ジスルファニル）ピペリジン−３−イリデン）酢酸］およびＴｉｃ−ＮＰＴ
【０１１１】
【化１７】
2017081968.tif 000028
【０１１２】
［（Ｚ）−２−（１−（２−クロロベンジル）−４−（（３−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）ピペリジン−３−イリデン）酢酸］を、さらなる研究に選択した。
【０１１３】
次に、グルタチオンの存在下で活性代謝物（ＡＭ）を生成する混合ジスルフィド結合体Ｃｌｏｐ−ＣＰＴおよびＴｉｃ−ＮＰＴの能力を試験した。Ｃｌｏｐ−ＣＰＴは、１ｍＭのＧＳＨにより、クロピドグレルのＡＭの量の同時増加と共に急速に還元された。ｃｌｏｐ−ＣＰＴ結合体からのクロピドグレルのＡＭの生成の半減期は、わずか１．８分であった。ｔｉｃ−ＮＰＴ結合体に対しても同様であったが、半減期は１４．７分であった。
【０１１４】
〔実施例３〕
本実施例は、本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体による血小板凝集の阻害を説明する。
【０１１５】
本発明のチエノピリジン化合物の混合ジスルフィド結合体は、ＧＳＨの存在下で血小板凝集を阻害することができることを実証するために、血小板凝集アッセイを行った。約２０ｍｌの血液をウサギから採取して、遠心分離により血小板を回収し、一方上清を乏血小板血漿（ＰＰＰ）として回収した。阻害アッセイの前に、Ｃｌｏｐ−ＣＰＴおよびＴｉｃ−ＮＰＴの結合体を０．５ｍｌのＰＰＰ中に溶解し、１ｍＭのＧＳＨと共に３７℃で３０分間インキュベートして、活性代謝物を生成した。次いで、活性代謝物を含有するＰＰＰ中に、血小板を穏やかに再懸濁させた。３７℃で１時間インキュベートした後、５μＭのアゴニストＡＤＰの添加により、血小板凝集を開始した。次いで、凝集計を使用して血小板凝集を記録した。
【０１１６】
Ｃｌｏｐ−ＣＰＴおよびＴｉｃ−ＮＰＴの結合体は、結合体を含有しない陰性対照と比較して、１ｍＭのＧＳＨの存在下で、約６０％血小板凝集を阻害した。この阻害レベルは、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）から生成された活性代謝物含有する陽性対照とほぼ同じであった。
【０１１７】
〔実施例４〕
本実施例は、実施例５〜９のための材料および方法を説明する。
【０１１８】
化学薬品。（Ｓ）−クロピドグレル、ラセミ２−オキソクロピドグレル、およびｃｉｓ−クロピドグレル−ＭＰを、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。グルタチオン（ＧＳＨ）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（ＧＣ）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＣＧ）、Ｌ−システイン、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システアミン（ＣＹＡ）塩酸塩、２，５−ジメチルフラン−３−チオール、６−クロロピリダジン−３−チオール、３−ニトロピリジン−２−チオール、および２−ブロモ−３’−メトキシアセトフェノン（ＭＰＢ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。プールされたＨＬＭおよび細胞質ゾルは、ＸｅｎｏＴｅｃｈ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）から購入した。
【０１１９】
各種チオール還元剤の存在下でのＨＬＭによるＡＭの形成速度の決定。活性代謝物（ＡＭ）の形成に対する各種チオール還元剤の効果を検査するために、ＡＭが生成される速度を決定した。０．２ｍｇ／ｍＬのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレル、ＮＡＤＰＨ再生系、および１ｍＭの各チオール還元剤（但し、ＣＰＴ、ＤＦＴ、またはＮＰＴは０．３ｍＭを使用）を含有する０．１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＡＭの生成を行った。５単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の添加により反応を開始し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いでＡＭを室温で１０分間、４ｍＭのＭＰＢで誘導体化し、続いて酢酸により３％（ｖ／ｖ）まで酸性化した。定量化のために、内部標準（ＩＳ）として５０ｐモルの（Ｓ）−クロピドグレルを各反応混合物に添加した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、誘導体化されたＡＭ（ＡＭ−ＭＰ）を定量した。
【０１２０】
以前に報告されたように（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、イオントラップ質量分析計（ＬＣＱ  ＤｅｃａＸＰ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で反応混合物のＭＳ分析を行った。簡潔に説明すると、２−オキソクロピドグレルの代謝物を、０．２ｍｌ／分の流量で２成分移動相を使用して逆相Ｃ１８カラム（２×１００ｍｍ、３μｍ、Ｐｈｅｎｅｍｏｎｅｘ、ＣＡ）で分離した。Ｃ１８カラムの温度は、カラムヒーター（Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用して４０℃に維持した。以下の設定により、質量分析計をポジティブエレクトロスプレーイオン化モードで操作した：加熱キャピラリー温度、２００℃、スプレー電圧、＋４．５ｋＶ；、シースガス流量、６０（任意単位）；補助ガス、２０（任意単位）。ＡＭ−ＭＰおよびＩＳは、３５％のエネルギーレベルでの衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介してＭＳ中で断片化した。ＡＭ−ＭＰに対するｍ／ｚ  ５０４→ｍ／ｚ  ３５４、およびＩＳに対するｍ／ｚ  ３２２→ｍ／ｚ  ２１２の遷移を使用して、様々な濃度のｃｉｓ−クロピドグレル−ＭＰからなる較正曲線に基づいてＡＭ−ＭＰの量を定量化した。
【０１２１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用したクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の分析。構造的および半定量的分析の両方のために、ＨＬＭにより混合ジスルフィド結合体を生成した。上述のように０．２ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、２−オキソクロピドグレルの代謝を行ったが、但し、ＨＬＭの濃度を１ｍｇ／ｍｌに増加させた。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、０．１ｍｌのアセトニトリル中１０％酢酸の添加によりクエンチした。クエンチした試料を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＨＬＭを除去した。５０μｌの上清のアリコートを、質量分析計に投入し、活性および結合体代謝物の両方を分析した。
【０１２２】
上述のようにＭＳ分析を行ったが、但し、ＭＳ検出器は依存スキャンモードで操作した。前駆体イオンは、ｍ／ｚ  ３００〜７００でスキャンし、一方ＭＳ２スペクトルは、４つの最も豊富なイオンに対してｍ／ｚ  １００〜７００で得られた。半定量的分析のために、５０ｐモルのＩＳを、クエンチされた各試料に注入した。ＡＭおよび各結合体の相対量を、ＩＳのＡＵＣに対する代謝物のＡＵＣ比として計算した。
【０１２３】
混合ジスルフィド結合体からＡＭへの変換の反応速度の決定。混合ジスルフィド結合体の反応性を検査するために、ＧＳＨによる混合ジスルフィド結合体の還元の反応速度を決定した。１ｍｇ／ｍｌのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレルおよび０．３または１ｍＭのチオール還元剤を含有する１ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．４）緩衝液中で、混合ジスルフィド結合体を生成した。Ｇ６ＰＤの添加により開始した後、反応物を３７℃で５０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を１３，０００×ｇで遠心分離してＨＬＭを除去し、事前に調整されたＳＰＥカートリッジ（Ｃ１８、１００ｍｇ／１ｍｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）に上清を投入し、混合ジスルフィド結合体を２ｍｌのメタノールで溶出した。次いで、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器を使用して溶出液を乾燥させ、乾燥試料を使用するまで−８０℃で保存した。反応速度測定の前に、乾燥試料をまず０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．４）中に再溶解し、次いで３７℃で５分間平衡化した。ストックＧＳＨおよび細胞質ゾル（存在する場合）溶液の少量のアリコート（１〜５μｌ）を、それぞれ１ｍＭおよび０．２ｍｇ／ｍｌで結合体試料に添加し、チオール−ジスルフィド交換反応を開始した。指定された時間に、５０μｌの反応混合物のアリコートを採取し、２５μｌのアセトニトリル中１０％酢酸と混合して、チオール−ジスルフィド交換反応を停止させた。ｔ＝０試料は、ＧＳＨの添加の直前に調製した。上述のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、混合ジスルフィド結合体およびＡＭの量を分析した。
【０１２４】
クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体からの活性代謝物Ｈ４の形成。ＡＭの抗血小板活性はその立体化学と密接に関連しているため、ＣＰＴ、ＤＦＴまたはＮＰＴの存在下で形成された混合ジスルフィド結合体の立体化学を、それらの比較的高い酸化還元電位のために調査した。ＡＭの立体異性体の真の標準の欠如のために、ＧＳＨとの混合ジスルフィド結合体を、まずＡＭを放出するように処理し、次いで、ＡＭ−ＭＰ誘導体をｃｉｓ−クロピドグレル−ＭＰ標準と比較するために、ＭＰＢでＡＭを誘導体化した。ＧＳＨとの結合体の調製および還元を、上述のように行った。１ｍＭのＧＳＨとの３７℃で２０分間のインキュベーション後、ＭＰＢを４ｍＭで添加し、ＡＭをアルキル化した。アセトニトリル中１０％酢酸の半分の体積の添加により、アルキル化反応を１０分で停止させた。ＡＭの定量化に関して上述したように、５０μｌの反応混合物のアリコートを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【０１２５】
クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の抗血小板活性。十分な量の混合ジスルフィド結合体を生成するために、１ｍｇ／ｍｌのＨＬＭ、０．１ｍＭの２−オキソクロピドグレル、ＮＡＤＰＨ再生系、および０．３ｍＭのＣＰＴもしくはＮＰＴまたは１ｍＭのＧＳＨを含有する２ｍｌの反応混合物中で、２−オキソクロピドグレルの代謝を行った。１０単位のＧ６ＰＤの添加により反応を開始させ、３７℃で５０分間インキュベートした。２つの対照試料を並行して調製した。１つの対照試料はいかなるＧ６ＰＤ（−Ｇ６ＰＤ）も含有せず、これは、２−オキソクロピドグレルおよびＨＬＭ中に存在する他の成分が抗血小板活性に寄与するかどうかを検査するために設計された。他方の対照（−ＳＨ）はいかなるチオール還元剤も含有せず、これは、ＡＭおよび結合体以外の任意の代謝物が、抗血小板活性アッセイに干渉するかどうかを検査することを意図していた。５０分のインキュベーションの後、反応混合物を１３，０００×ｇで遠心分離して、ＨＬＭを除去した。上清をＳＰＥ  Ｃ１８カートリッジに投入して、混合ジスルフィド結合体を濃縮した。水で十分に洗浄して塩および他の水溶性代謝物を除去した後、結合体試料を２ｍｌのメタノールで溶出した。Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮器を使用してメタノール画分を乾燥させ、次いで乾燥試料を１ｍｌの乏血小板血漿（ＰＰＰ）中に再懸濁した。抗血小板活性アッセイの前に、再懸濁した結合体を２つの等量（各０．５ｍｌ）に分割し、その一方を３７℃で３０分間１ｍＭのＧＳＨで処理してＡＭを生成した。次いで、両方の試料を、使用するまで氷上に設置した。
【０１２６】
生体外での抗血小板活性を決定するために使用される手順は、以前に報告されている（例えば、Ａｂｅｌｌ  ＬＭ  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ＥＣ  （２０１１）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３３９（２）：５８９−５９６）を参照されたい）。
【０１２７】
雄ニュージーランド白ウサギ（２．２〜２．９キロ）を血液ドナーとして使用した。抗凝固剤として３．７％クエン酸ナトリウムを含有する（クエン酸対血液の体積比１：１０）プラスチックシリンジ内に、中央耳動脈から全血を採取した。全血球数を、Ｍｅｄｏｎｉｃ  ＣＡ６２０血液分析器（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ、ＵＳＡ）で決定した。１００×ｇで１０分間の全血の遠心分離後に存在する上清である多血小板血漿（ＰＲＰ）を、約３００，０００／μｌの血小板数に達するようにＰＰＰで希釈した。残りの血液を１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、底部の細胞層を廃棄することにより、乏血小板血漿を調製した。希釈したＰＲＰを０．５ｍｌ試料に分割し、１７０×ｇで１０分間再度遠心分離し、得られた上清を廃棄した。上述のように調製された様々な化学阻害剤を含有する貧血小板血漿中に血小板ペレットを再懸濁し、穏やかに振盪しながら３７℃で６０分間インキュベートして、Ｐ２Ｙ１２受容体を修飾した。生体外での血小板凝集を、４チャネル血小板凝集計（ＢｉｏＤａｔａ  ＰＡＰ−４；ＢｉｏＤａｔａ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃に維持されたＰＲＰの撹拌懸濁液を通る光透過率の増加を記録することによって、確立された比濁法により評価した。血小板凝集は、ＡＤＰ（１０μＭ）で誘導した。エピネフリンの凝集下濃度（５５０ｎＭ）を使用して、アゴニストの添加前に血小板をプライミングした。
【０１２８】
〔実施例５〕
本実施例は、クロピドグレルの活性代謝物（ＡＭ）の形成に対するチオール還元剤の効果を説明する。チオール還元剤の効果を検査するために、各種チオール還元剤の存在下でのＡＭの形成のための定常状態の速度を決定した。代謝反応物中に存在するチオール還元剤の濃度は、ＣＰＴ、ＤＰＴおよびＮＰＴを除いて１ｍＭであった。その代わりに、これらの３種類のチオール還元剤の濃度は、それらの低いＫｍ値のために０．３ｍＭであった。図１に示されるように、ＡＭは、３種類のチオール還元剤を除く全ての存在下で形成される。ＡＭの形成のための最高速度は、人体中の内因性還元剤であるＧＳＨの存在下で観察された。具体的には、１ｍＭのＧＳＨの存在下、ＡＭは、１６７ｐモルＡＭ／分／ｍｇ  ＨＬＭの速度で生成される。同様に、Ｌ−システインは、ＡＭの生成においてＧＳＨの約８４％活性である。以前に観察されたように（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８２：３０２−３０９を参照されたい）、ごく低レベルのＡＭが１ｍＭのＮＡＣの存在下で形成された。速度は、１ｍＭのＧＳＨの存在下で観察されるもののわずか約７％である。ＣＰＴ、ＤＦＴ、およびＮＰＴの存在下ではＡＭは観察されなかった。ＡＭの形成速度は、全体的にＧＳＨ＞ＣＹＳ＞ＣＧ＞ＧＣ＞ＣＹＡ＞ＢＭＥ＞ＮＡＣ＞ＣＰＴまたはＤＦＴまたはＮＰＴの順で減少した。この広範な速度は、ＡＭの形成におけるチオール還元剤の重要な役割を強調している。
【０１２９】
〔実施例６〕
本実施例は、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の分析を説明する。ＡＭの形成は、存在するチオール還元剤により大きく影響された。本実施例において、混合ジスルフィド結合体の形成に対するチオール還元剤の効果を検査した。これは、ＣＰＴ、ＤＦＴ、およびＮＰＴの存在下で形成された任意のＡＭの不足の原因を理解するために特に重要である。ＡＭに関して観察されたものとは著しく対照的に、混合ジスルフィド結合体は、検査された全てのチオール還元剤の存在下で形成された。親イオンＭＨ＋のｍ／ｚおよびこれらの混合ジスルフィド結合体の保持時間は表１に要約され、４つの選択された混合ジスルフィド結合体の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）は図２に示される。観察された親イオンＭＨ＋は、これらの結合体の理論値とよく一致している。β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下では、４つの結合体のピークは、ｍ／ｚ  ４３２で観察され、８．９から９．７２分で溶出した（図２Ａ）。これらの４つのＡＭピークは、以前に報告されたように（例えばＰｅｒｅｉｌｌｏ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３０（１１）：１２８８−１２９５を参照されたい）、クロピドグレルの複数の立体異性体の形成に起因し得る。２つの主要な結合体ピークが、ＣＰＴおよびＮＰＴの存在下で観察された（それぞれ図２Ｃおよび図４Ｄ）。しかしながら、ＤＦＴの存在下では、ｍ／ｚ  ４８２の１つの優勢な結合体ピークが１５．８分で観察された（図２Ｂ）。ＣＰＴ、ＮＰＴおよびＤＦＴ結合体の形成のＫｍ値は、それぞれ２３、５１および３０μＭと決定されたが、これは、以前に報告されたＧＳＨの３００μＭのＫｍより大幅に低い（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８２：３０２−３０９を参照されたい）。
【０１３０】
【表１】
2017081968.tif 000029
【０１３１】
結合体の各ＥＩＣに対する曲線下面積（ＡＵＣ）の積分により、生成された混合ジスルフィド結合体の相対量が得られた。図３に示されるように、混合ジスルフィド結合体の相対量は、互いに大きく変動した。低レベルのグルタニオニル結合体のみが形成されたが、これは、ＧＳＨの存在下での２−オキソクロピドグレルの代謝がＡＭの形成に極めて有利であることを示している。ＡＭおよび混合ジスルフィド結合体の両方がＢＭＥの存在下で形成されたが、結合体の形成がＡＭよりも有利であることが明らかである。ＡＭの形成の欠如にもかかわらず、ＣＰＴ、ＤＦＴおよびＮＰＴの混合ジスルフィド結合体は、大量に形成された。これらの結合体の真の標準がないことにより、これらの結合体の絶対量を定量することはできなかった。これらの結合体は、ＭＳ検出器に対して異なる応答を示す可能性があるため、ＡＵＣ比に基づいて結合体の絶対量を比較する際には注意すべきである。
【０１３２】
これらの結合体の化学構造を決定するために、ＭＳおよびＭＳ２スペクトルを得た。１０個全ての結合体のＭＳスペクトルは、表１において要約されるように、クロピドグレル中の１つのＣｌ原子の存在の特徴である３５Ｃｌ／３７Ｃｌ同位体ピークの対と共に、予測されるｍ／ｚ比で主要なＭＨ＋ピークを示した。この唯一の例外は、２個の塩素原子を含有するＣＰＴ結合体である。そのＭＳおよびＭＳ２スペクトルを、図４に示す。この結合体は、５００．０３の予測ｍ／ｚ値の８０ｐｐｍの実験誤差の範囲内であるｍ／ｚ  ４９９．９９で観察された。さらに、５０１．９４において、この結合体中の２つの塩素原子の存在を示す強力な同位体ピークがまた、ベースピークの強度の約７５％で観察された。ｍ／ｚ  ４９９．９９における親イオンのＭＳ２は、複数の娘イオンの形成を示した。優勢な娘イオンは、ｍ／ｚ  ４６５．９０、２１１．９３および１８３．３４における他の小さなものと共に、ｍ／ｚ  ３５３．９９で観察された。この断片化パターンは、３５Ｃｌ／３７Ｃｌ同位体ピークの存在に加えて、図４Ｄに示される混合ジスルフィド結合を有する結合体の化学構造と一致している。優勢な娘イオンｍ／ｚ  ３５３．９９は、以前にＧＳＨ、ＮＡＣおよびＬ−システインとクロピドグレルとの結合体に関して報告したように  （例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８２：３０２−３０９を参照されたい）、混合ジスルフィド結合において切断されたより大きな断片に帰属された。ｍ／ｚ  ２１２および１８３における娘イオンもまた、クロピドグレルの特徴である（例えば、Ｄａｎｓｅｔｔｅ  ＰＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２３（７）：１２６８−１２７４；  Ｐｅｒｅｉｌｌｏ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３０（１１）：１２８８−１２９５）を参照されたい。ｍ／ｚ  ５０１．９４における同位体ピークのＭＳ２スペクトルは、この帰属のためのさらなる証拠を提供する。図４Ｃに示されるように、単一イオンの代わりに、娘イオンの対が２質量単位離れて観察されたが、これは２個の塩素原子の存在を裏付けている。結合体の残りのＭＳ２スペクトルは、ｍ／ｚ  ３５４において特徴的な娘イオンと非常に類似した断片化パターンを示した。
【０１３３】
〔実施例７〕
本実施例は、ＧＳＨによるクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の還元の反応速度を説明する。様々な混合ジスルフィド結合体とＧＳＨとの間のチオール−ジスルフィド交換反応の反応速度を決定したが、その結果を図５に示す。結合体のＧＳＨおよび細胞質ゾルとのインキュベーションは、混合ジスルフィド結合体の量における時間依存性の減少をもたらした（図５Ａ）。反応速度データを単一指数関数にフィッティングすると、ＢＭＥ、ＰＴ、ＮＡＣ、ＤＦＴおよびＮＰＴの混合ジスルフィド結合体の損失に対して、それぞれ０．０７、０．７９、０．４３、１．６５および０．１３分−１の一次速度定数が得られた。これらの反応速度は、過剰のＧＳＨ（１ｍＭ）による擬似１次条件下で決定されたため、これらの速度定数は、それぞれ１．２、１３、７．２、２８および２．２Ｍ−１ｓ−１の２次速度定数に等しい。データはまた、ＧＳＨに対するこれらの結合体の可変の反応性を実証した。ＤＦＴおよびＣＰＴ結合体は、ＢＭＥ結合体よりもそれぞれ１０倍から２０倍反応性が高い。例えば、４０分間のインキュベーション後であってもＢＭＥ結合体の約５０％がまだ残っていたようであり、これは、例えば、この結合体のためのチオール−ジスルフィド交換が平衡に達したことを示している。
【０１３４】
細胞質ゾルの効果を検査するために、ならびに結合体およびＡＭを同時に監視するために、ＡＭの形成、ならびに細胞質ゾルの存在および非存在下でのＣＰＴ結合体の還元の両方の反応速度を決定した。図５Ｂに示されるように、ＣＰＴ結合体の量の減少は、ほぼ同一の速度定数で、ＡＭの量の同時増加と共に生じた。細胞質ゾルの存在下では、結合体の還元およびＡＭの形成の速度定数は、それぞれ０．７３および０．５０分−１である。細胞質ゾルの非存在下では、ＣＰＴ結合体の還元は、結合体の還元に対して０．３９分−１、ＡＭの形成に対して０．３５分−１の速度定数で約半分の速さである。これは、以前に観察されたように（例えば、Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ４０（９）：１８５４−１８５９；Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３９（２）：２０８−２１４を参照されたい）、チオール−ジスルフィド交換反応の還元を促進する。
【０１３５】
〔実施例８〕
本実施例は、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体からの活性代謝物Ｈ４の形成を説明する。スキーム２に示されるように、活性代謝物は、２つのキラル中心（Ｃ７およびＣ４）ならびに１つの二重結合（Ｃ３−Ｃ１６）を含有する。したがって、ラセミ２−オキソクロピドグレルの代謝は、潜在的に８つまでの立体異性体を生成し得る。しかしながら、歴史的にＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４と呼ばれるジアステレオマーの４つのみが、従来の逆相Ｃ１８カラムで分離され得、一方他の４つの立体異性体は、鏡像異性体として共溶出する。Ｈ４は、人間における抗血小板活性を担い、Ｈ４の二重結合は、シス配置にあることが確立されている（例えば、Ｐｅｒｅｉｌｌｏ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３０（１１）：１２８８−１２９５；Ｓａｖｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８４（５）：８９１−８９６；Ｔｕｆｆａｌ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０５（４）：６９６−７０５を参照されたい）。これらの結合体の治療可能性を評価するために、Ｈ４が混合ジスルフィド結合体において形成されるかどうかを検査したが、その結果を図６に示す。
【０１３６】
ＧＳＨの存在下でのＨＬＭによる２−オキソクロピドグレルの代謝は、８から１１分の間で溶出する４つの立体異性体の形成をもたらした（破線、図６Ｂ）。逆相Ｃ１８カラムでのＡＭ−ＭＰ誘導体の溶出順序に基づいて（例えば、Ｔｕｆｆａｌ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０５（４）：６９６−７０５を参照されたい）、１０．２分で溶出する異性体はＨ４のシス異性体と考えられる。これは、図６Ａ（実線）に示されるｃｉｓ−クロピドグレル−ＭＰ標準の保持時間と一致する。同様に、ＤＦＴ結合体のＭＰ誘導体もまた、ＧＳＨの存在下で観察されたものと類似した４つのピークを示したが、これは、ＤＦＴ結合体がチオール交換反応後にＡＭのシス異性体を生成したことを示している。対照的に、ＣＰＴおよびＮＰＴ結合体のＭＰ誘導体は、９．４および１０．２分に２つの主要なピークを示したが、これは、活性異性体Ｈ４の選択的形成と一致している（図６ＣおよびＤ）。
【０１３７】
〔実施例９〕
本実施例は、ＣＰＴおよびＮＰＴの混合ジスルフィド結合体の抗血小板活性を説明する。概念の実証として、２つの混合ジスルフィド結合体、ＣＰＴおよびＮＰＴ結合体の抗血小板活性を、いくつかの理由から検査した。第一に、両方の結合体は、いかなるＡＭの形成もなしに生成され得る、これにより抗血小板活性アッセイ中にＡＭからのいかなる干渉も排除される。第二に、両方の結合体は、比較的速い速度でＧＳＨとチオールを交換し、これによりＡＭの電位減衰が回避される。第三に、２つの結合体の還元は、ヒトにおける抗血小板活性を担うものとして知られているＨ４異性体を生成する。生体外抗血小板活性アッセイの結果を、図７に示す。凝集のパーセンテージは、血液源、ＰＲＰ調製物等の環境因子に起因する任意の変化を補償するために、ＰＲＰのものに対して正規化した。示されるように、３つの対照試料は、血小板凝集の阻害を示さなかった。第１の対照は、遊離ＧＳＨが１ｍＭの濃度では血小板凝集に影響を与えないことを示し（ＧＳＨ、図７）、第２の対照は、２−オキソクロピドグレルおよび関連不純物等の反応混合物中に存在する非代謝物成分が、血小板凝集を阻害しないことを示した（−Ｇ６ＰＤ、図７）。クロピドグレルは、非酵素的酸化により副生成物に分解し得ることが知られている（例えば、Ｍｏｈａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  ４７（１）：１８３−１８９；Ｆａｙｅｄ  ＡＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  ４９（２）：１９３−２００を参照されたい）。これらの副生成物は、血小板凝集に対していかなる阻害効果も有さないようである。第３の対照Ｉにおいて、任意のチオール還元剤の非存在下での反応混合物からの代謝物も、血小板凝集に対する影響を有さないことが実証された。しかしながら、ＧＳＨを含有する反応混合物から調製された試料中の血小板凝集の約６０％の阻害が観察された（ＡＭ、図７）。１ｍＭのＧＳＨの存在下での２−オキソクロピドグレルの代謝は、図１に示されるようにＡＭを生成するため、これは予期されるものである。ＣＰＴおよびＮＰＴ結合体とのＰＲＰのインキュベーションは、血小板凝集を阻害しなかったが、これは、結合体自体は抗血小板活性を有さないことを示している（ＣＰＴ＆ＮＰＴ、図７）。著しく対照的に、１ｍＭのＧＳＨで処理されたＣＰＴおよびＮＰＴ結合体とのＰＲＰのインキュベーションは、それぞれ約５０および７０％血小板凝集を大きく阻害した。この阻害活性は、ＧＳＨにより結合体から放出されたＡＭから生じる可能性が最も高い。これらの結果は、クロピドグレルの結合体が、抗血小板活性を有さないことを実証しており、またＡＭのみが血小板凝集の阻害を担うことを確証した。さらに、これらの結果は、多型Ｐ４５０による生体内活性化を必要とせずにＡＭを提供することが可能であることを実証している。ＧＳＨ、ＣＰＴ＋ＧＳＨ、およびＮＰＴ＋ＧＳＨ試料において観察された凝集のパーセンテージの変化は、ＡＭの濃度の変化に起因する可能性が最も高いことが指摘されるのが注目に値する。これらの試料中のＡＭの濃度は、１〜４μＭの範囲内であると推定された。
【０１３８】
〔実施例１０〕
本実施例は、クロピドログレルの混合ジスルフィド結合体のインビボ抗血小板活性を説明する。クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の抗血小板活性は、雄のニュージーランド（ＮＺ）白ウサギにおいて、静脈内注射により決定した。混合ジスルフィド結合体は、以下の技術を使用して生合成した。
【０１３９】
〔第１部  クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の生合成〕
組換えシトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）および他の必須成分を含有する再構成系において、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体を合成した。ＣＹＰ２Ｃ１９は、再構成系において、各チオール化合物の存在下で２−オキソクロピドグレルを混合ジスルフィド結合体に変換した。スキーム５は、ｃｌｏｐＮＰＴと呼ばれる、クロピドグレルと３−ニトロピリジン−２−チオールとの間の混合ジスルフィド結合体の生合成を示す。
【０１４０】
〔スキーム５  クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体ｃｌｏｐＮＰＴの生合成〕
【０１４１】
【化１８】
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【０１４２】
典型的な反応において、５０ｎモルのＣＹＰ２Ｃ１９、１５０ｎモルのＰ４５０還元酵素および２５０ｎモルのシトクロムｂ５がリン脂質小胞内で再構成され、活性タンパク質複合体を形成した。２−オキソクロピドグレルおよび３−ニトロピリン−２−チオールを、それぞれ０．０５および０．３ｍＭの最終濃度で添加した。ｃｌｏｐＮＰＴの生合成は、１ｍＭのＮＡＤＰＨの添加により開始させた。反応物を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１４３】
ｃｌｏｐＮＰＴを精製するために、ｃｌｏｐＮＰＴを含有する反応混合物を、まず１０ｋＤａのカットオフを有する膜を通して濾過し、すべてのタンパク質成分を除去した。次いで、ｃｌｏｐＮＰＴを含有する濾液を、固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジで濃縮した。ＣｌｏｐＮＰＴを、８０％メタノール／２０％水でＳＰＥカートリッジから溶出させた。真空下、５０℃で、溶出液を約５ｍｌに濃縮した。濃縮混合物を分取逆相Ｃ１８カラムに投入し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してＣｌｏｐＮＰＴを精製した。ＣｌｏｐＮＰＴは、４２％メタノール／３５％アセトニトリル／２２．９％水／０．１％ギ酸からなるアイソクラチック移動相により、３ｍｌ／分の流量で分取Ｃ１８カラムから溶出された。ｃｌｏｐＮＰＴを含有するＨＰＬＣ画分をプールし、真空下で乾燥させた。最終収率は約２５％であった。ｃｌｏｐＮＰＴの純度は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により推定され、図８に示すように＞９０％であった。
【０１４４】
〔第２部  クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の抗血小板活性〕
クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の抗血小板活性を、雄のＮＺ白ウサギ（１．２〜１．２５ｋｇ）を使用して決定した。
【０１４５】
静脈注射用溶液を調製するために、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００、および生理食塩水の５、１５および８０（ｖ／ｖ）比の混合物中に、（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴを０．７ｍｇ／ｍｌで溶解した。雄のＮＺ白ウサギに、２つの異なる方法を使用して（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴを２ｍｇ／ｋｇで投薬した。方法１では、静脈注射用溶液を、まず５ｍＭのグルタチオンと混合した。（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴを活性化するために３７℃で１５分インキュベーションした後、頸静脈を介してウサギに混合物を静脈注射した。方法２では、細胞グルタチオン濃度を増加させるために、雄のＮＺ白ウサギに３日間１日１回、Ｒｅａｄｉｓｏｒｂグルタチオン溶液５ｍｌを与えた。３日目に、ＤＭＡ／ＰＥＧ４００／生理食塩水に溶解した（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴを、Ｒｅａｄｉｓｏｒｂ処理したウサギに静脈内注射した。陰性対照として、（Ｓ）−クロピドグレルも同様に２ｍｇ／ｋｇで雄ＮＺ白ウサギに静脈内投薬した。（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴの投薬前、ならびに投薬から１および２時間後、抗凝固剤として３．７％クエン酸ナトリウムを含有するプラスチックシリンジ内に、頸動脈から全血を採取した（１：１０体積比のクエン酸塩対血液）。全血球数を、Ｍｅｄｏｎｉｃ  ＣＡ６２０血液分析器（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＦＬ、ＵＳＡ）で決定した。１００×ｇで１０分間の全血の遠心分離後に存在する上清である多血小板血漿（ＰＲＰ）を、約３００，０００／μｌの血小板数に達するように乏血小板血漿（ＰＰＰ）で希釈した。残りの血液を１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、底部の細胞層を廃棄することにより、乏血小板血漿を調製した。希釈したＰＲＰを０．５ｍｌ試料に分割し、１７０×ｇで１０分間再度遠心分離し、得られた上清を廃棄した。血小板凝集を、４チャネル血小板凝集計（ＢｉｏＤａｔａ  ＰＡＰ−４；ＢｉｏＤａｔａ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃に維持されたＰＲＰの撹拌懸濁液を通る光透過率の増加を記録することによって、確立された比濁法により評価した。血小板凝集は、ＡＤＰ（１０μＭ）で誘導した。エピネフリンの凝集下濃度（５５０ｎＭ）を使用して、アゴニストの添加前に血小板をプライミングした。
【０１４６】
結果を図９に示す。示されるように、（Ｓ）−クロピドグレルは、２ｍｇ／ｋｇの用量では血小板凝集を阻害しなかった。しかしながら、（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴがグルタチオンまたはＲｅａｄｉｓｏｒｂグルタチオンと共に投薬されたかとは無関係に、血小板凝集の５０％超が（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴにより阻害されたため、（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴは血小板凝集を強く阻害した。これらの結果は、（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴ結合体が、外因性グルタチオンまたは内因性グルタチオンにより活性化され得ることを実証している。Ｒｅａｄｉｓｏｒｂ処理されたウサギの血小板活性は、ＩＶ注射から１時間以内に約７０％阻害されるため、内因性グルタチオンは（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴを活性化する上でより効果的であることが明らかである。多くの研究が、心臓病および脳卒中、抗酸化ストレス、加齢等におけるグルタチオンの有益な効果を示している。グルタチオンおよびクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の同時投与は、抗血小板剤としての（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴの利益だけでなく、グルタチオン単独の使用に関連した利益も提供し得る。
【０１４７】
これらの結果は、クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体が、クロピドグレルよりも効果的な抗血小板剤であることを実証している。
【０１４８】
本発明を十分に説明したが、本発明の範囲またはその任意の実施形態に影響を与えることなく、条件、製剤、およびその他のパラメータの広範かつ同等の範囲内で同様のことが実行され得ることが、当業者に理解される。本明細書において引用されるすべての特許、特許出願および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に完全に組み込まれる。
【０１４９】
〔参照による組み込み〕
本明細書において言及される特許文献および科学論文のそれぞれの開示全体は、全ての目的において参照により組み込まれる。
【０１５０】
〔均等物〕
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書に記載の本発明を限定するのものではなく、例示的とみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内となる全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】クロピドグレルの活性代謝物（ＡＭ）の形成に対するチオール還元剤の効果を示すグラフである。
【図２】クロピドグレルの代表的混合ジスルフィド結合体の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）である。
【図３】ＨＬＭにより生成されたクロピドグレルのＡＭおよびチオール結合体の相対量を示すグラフである。
【図４】ＣＰＴの混合ジスルフィド結合体のＭＳおよびＭＳ２スペクトルである。
【図５Ａ】ＧＳＨによるクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の還元の反応速度を示すグラフである。
【図５Ｂ】ＧＳＨによるクロピドグレルの混合ジスルフィド結合体の還元の反応速度を示すグラフである。
【図６】クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体からの活性代謝物Ｈ４の形成を示す、ｍ／ｚ５０４において観察される抽出イオンクロマトグラムである。
【図７】クロピドグレルの混合ジスルフィド結合体による血小板凝集の阻害を示すグラフである。
【図８】実施例１０に記載のような再構成系においてバイオ合成された純粋（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴの全イオンクロマトグラムである。
【図９】実施例１０に記載のような（Ｓ）−ｃｌｏｐＮＰＴのＩＶ注射後の雄ＮＺ白ウサギの血小板活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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