(57)【要約】【課題】  十分な強度と、改善された生着状態及び耐久性とを有する気管再生用軟骨移植キット、及び気管再生用軟骨移植体を提供する。【解決手段】  実施形態に従う気管再生用軟骨移植キット及び気管再生用軟骨移植体は、再生軟骨体、膜状部材、および前記再生軟骨体を前記膜状部材に固定するマトリックス部材を備える。再生軟骨体は、生分解性多孔質体からなる足場部材と、その表面にハイドロゲルを介して固定されている軟骨細胞とを備える。マトリックス部材は、組織誘導性物質を含む。膜状部材は生分解性物質である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生軟骨体と、生分解性の膜状部材と、前記再生軟骨体を前記膜状部材に固定するマトリックス部材とを備える気管再生用軟骨移植キットであって、
前記再生軟骨体は、生分解性多孔質体からなる足場部材と、前記足場部材の表面にハイドロゲルを介して固定されている軟骨細胞とを含み、
前記マトリックス部材は、組織誘導性物質を含む
ことを特徴とする気管再生用軟骨移植キット。
【請求項２】
前記足場部材が、前記再生軟骨体の移植されるべき気管の形状に沿ったアーチ形状の曲面体である請求項１に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項３】
前記再生軟骨体を複数個含む請求項１又は２に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項４】
前記気管再生用軟骨移植キットが、複数の当該再生軟骨体を含み、それらが組み合わされて、移植されるべき気管における一つの気管欠損部を補うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項５】
前記再生軟骨体と、前記膜状部材と、前記マトリックス部材とがそれぞれ個別に容器に収容されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項６】
前記組織誘導性物質が、成長因子及び組織誘導性ハイドロゲルを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項７】
前記マトリックス部材に含まれる前記成長因子、前記組織誘導性ハイドロゲル、及びその他の成分が、それぞれ個別に容器に収容されていることを特徴とする請求項６に記載の気管再生用軟骨移植キット。
【請求項８】
膜状部材層と、その主面に接触して存在しているマトリックス部材層と、前記マトリックス部材層に接触して存在している再生軟骨体とを備える気管再生用軟骨移植体であって、
前記再生軟骨体は、生分解性多孔質体からなる足場部材とその表面にハイドロゲルを介して固定されている軟骨細胞とを含み、
前記マトリックス部材層は、組織誘導性物質を含む
ことを特徴とする気管再生用軟骨移植体。
【請求項９】
前記足場部材が、前記再生軟骨体の移植されるべき気管の形状に沿ったアーチ形状の曲面体であり、前記足場部材の凹面が前記マトリックス部材層によって前記膜状部材層の１つの主面に固定されていることを特徴とする請求項８に記載の気管再生用軟骨移植体。
【請求項１０】
前記気管再生用軟骨移植体が、複数の当該再生軟骨体を含み、それらが組み合わされて、移植されるべき気管における一つの気管欠損部を補うことを特徴とする請求項８又は９に記載の気管再生用軟骨移植体。
【請求項１１】
前記組織誘導性物質が、成長因子及び組織誘導性ハイドロゲルを含む請求項８〜１０のいずれか１項に記載の気管再生用軟骨移植体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気管再生用軟骨移植キット及び気管再生用軟骨移植体に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性気管形成不全、気管切開後狭窄又は気管外傷等の治療では、組織の修復および再建が必要とされる。そのための技術として自家組織移植等が用いられている。例えば、自家組織移植の場合では、採取できる組織の大きさに限界があり、また移植後の肉芽の形成や石灰化などが生じることが問題となっている。
【０００３】
一方、軟骨再生医療は再生医療の中でも比較的、臨床応用が進んでいる分野である。現在、自家軟骨細胞を用いた移植法（ＡＣＩ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））も世界的に普及している。気管の治療に関しては、再生軟骨を用いた人工気管が提案されている。例えば、非生分解材料からなる部材と軟骨細胞を含む軟骨組織とからなる人工気管（例えば、特許文献１）がその例である。
【０００４】
特許文献１の人工気管は、人工材料からなる基材に、アテロコラーゲンなどの保持剤に分散させた軟骨細胞を取り付けたものである。この人工気管が移植されると、その周りに繊維芽細胞とコラーゲンからなるカプセル状の結合組織体が誘導され、より強固な人工気管が形成される。このような人工材料の素材で作られた人工気管移植片は、強固である一方、移植対象において生じる拒絶反応によって生着が妨げられることもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−４３８９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような従来の技術では、移植片の周囲環境の悪化、並びに移植片の脱落及び位置のずれ等を引き起こし得る。また、気管軟骨は、外界と隣接する部位に存在するため、気管軟骨を再生させるためには、再生軟骨組織の保護も考慮される必要がある。
【０００７】
本発明は、十分な強度と、改善された生着状態及び耐久性とを有する気管再生用軟骨移植キット、及び気管再生用軟骨移植体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態に従う気管再生用軟骨移植キットは、再生軟骨体、膜状部材、及び前記再生軟骨体を前記膜状部材に固定するためのマトリックス部材を備える。再生軟骨体は、生分解性多孔質体からなる足場部材と、その表面にハイドロゲルを介して固定されている軟骨細胞とを備える。マトリックス部材は、組織誘導性物質を含む。膜状部材は生分解性物質である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の実施形態によれば、十分な強度と、改善された生着状態及び耐久性とを有する気管再生用軟骨移植キット及び気管再生用軟骨移植体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施形態の気管再生用軟骨移植キットの一例を示す図である。
【図２】実施形態の再生軟骨体の一例の透視図である。
【図３】実施形態の一例である再生軟骨移植方法に従って気管を切開する工程を示す図である。
【図４】実施形態の一例である再生軟骨移植方法に従って気管に界面パーツを移植する工程を示す図である。
【図５】実施形態の一例である再生軟骨移植方法に従って気管に再生軟骨体を移植する工程を示す図である。
【図６】実施形態の一例である再生軟骨移植方法に従って気管に複数の再生軟骨体を移植する工程を示す図である。
【図７】実施形態の再生軟骨体の一例の図である。
【図８】例の再生軟骨体の移植により再生された軟骨のスケッチである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施の形態について図面を参照して説明する。図面は模式的なものであり、正確な縮尺ではない。
【００１２】
実施形態に従うと、拒絶反応の起こり得る人工材料を用いることなく、十分な強度と、改善された生着状態及び耐久性を有する気管再生用軟骨移植キットおよび気管再生用軟骨移植体が提供される。
【００１３】
気管再生用軟骨移植キットは、外傷等により生じた気管損傷若しくは気管欠損、または先天性気管形成不全、気管切開後狭窄若しくは外傷等を治療するための外科的処置により形成した気管開口部を塞ぎ、気管を再建するために使用され得る。
【００１４】
図１（ａ）に示すように気管再生用軟骨移植キット１は、再生軟骨体１０と、膜状部材２と、この膜状部材２に対して再生軟骨体１０を固定するためのマトリックス部材３とを含む。この気管再生用軟骨移植キット１は、例えば、再建されるべき気管の開口部（または欠損部分）に対して、気管の開口を覆うように膜状部材２をセットし、開口から露出している膜状部材２の表面にマトリックス部材３を介して再生軟骨体１０を固定することにより使用される。
【００１５】
更なる実施形態に従う気管再生用軟骨移植キット１は、再生軟骨体１０と、界面パーツ４とを含む。界面パーツ４は、膜状部材２の層と、膜状部材２の主面２ａに固定されているマトリックス部材層３ａとを含む。
【００１６】
更なる実施形態に従う気管再生用軟骨移植体は、図２（ｂ）に示すように、膜状部材２と、膜状部材２の主面２ａに固定されているマトリックス部材層３ａと、マトリックス部材層３ａに固定されている再生軟骨体１０とを含む。
【００１７】
１．再生軟骨体
図２（ａ）および（ｂ）を用いて再生軟骨体について説明する。再生軟骨体１０は、足場部材１００と、足場部材１００に固定されている軟骨細胞１２０とを含む。
【００１８】
軟骨細胞１２０の足場部材１００への固定は、足場部材１００の表面を覆うハイドロゲル１１０により達成されており、軟骨細胞１２０は、ハイドロゲル１１０に分散している。
【００１９】
軟骨細胞１２０は、詳しくは後述するが、移植に適した軟骨特性を有している細胞であり、例えば、耳介軟骨細胞であり得る。軟骨細胞１２０の由来は、再生軟骨体１０が移植されるべき対象の動物種に応じて選択され得る。
【００２０】
再生軟骨体１０が移植されるべき対象となる動物、即ち、移植対象は、例えば、マウス及びラット等の齧歯類、ウサギ、イヌ及びネコ等の愛玩動物、ウマ及びウシ等の家畜、サル及びヒト等の霊長類等の何れかの哺乳動物であり得る。
【００２１】
軟骨細胞１２０は、移植されるべき対象から採取された軟骨細胞、即ち、自家由来の軟骨細胞であってもよく、移植されるべき対象以外から採取された軟骨細胞、即ち、他家由来の軟骨細胞であってもよい。
【００２２】
ヒトが移植の対象になる場合には、軟骨細胞１２０は、好ましくはヒト由来の耳介軟骨細胞（以下、「ヒト耳介軟骨細胞」）であり、より好ましくはヒト由来の自家耳介軟骨細胞であり得る。例えば、自家耳介軟骨細胞は、再生軟骨体１０が最終的に移植されるべき対象の耳介から、再生軟骨体１０の製造に先駆けて採取された細胞である。
【００２３】
図２（ｂ）を用いて足場部材１００の一例について説明する。正常な気管は一般的に略円筒状または略楕円筒状である。足場部材１００は、このような気管の形状に沿った曲面体であり得る。足場部材１００は、Ｘ軸に沿って長手方向（即ち、長さ方向）に延びる二つの辺１００ａ，ｂと、Ｘ軸に直交するＹ軸方向（即ち、幅方向）に沿って延びる更なる二つの辺１０１ａ，ｂとで規定され、且つＹ軸方向に延びる二つの辺１０１ａ，ｂの中心を結ぶ領域がＺ軸方向（厚さ方向）に突出している。足場部材１００は、全体としてアーチ形状をなす曲面体である。
【００２４】
再生軟骨体の形状は、足場部材の形状に依存する。再生軟骨体の全体的な形状は、再建されるべき気管の形状、並びにそこに開口している欠損部分（または開口部）の形状および大きさに応じて選択され得る。再建されるべき気管の形状は、移植対象の動物種、性別および年齢等によって決定され得る。また、再生軟骨体の大きさは、それが移植されるべき気管の開口の大きさよりも小さい、又は気管の開口した部分に収まる大きさであればよい。また、再生軟骨体は、それ自身に含まれる軟骨細胞が増殖することによって気管を再建する。従って、再生軟骨の大きさは、気管の欠損部分を補い、気管の再建を可能にするために十分または必要な大きさを有し得る。
【００２５】
また、１本の気管または１つの欠損部分（または開口部）を修復、再建、又は補うために複数の再生軟骨体が組み合わされて用いられてもよい。その場合、複数の再生軟骨体が、移植されるべき対象である１本の気管または１つの欠損部分に適用され得る。
【００２６】
足場部材の形状は、平面体形状、曲面体形状、例えば、アーチ形状またはＲ形状、中空または中実のドーム形状、回転体の一部分を平面で切り取った中空または中実の形体等であり得る。例えば、足場部材は、何れも平面である２つの主面を備える平面体、凸面である一方の主面と、凹面である他方の主面とを備えるアーチ形状の曲面体、凸面である一方の主面と、凹面領域を有する他方の主面とを備える曲面体、凸面領域を有する一方の主面と、凹面領域を有する他方の主面とを備える曲面体、凸面である一方の主面と、平面である他方の主面とを備える曲面体等であり得る。また、再生軟骨体の主面は、矩形、例えば、四角形、長方形、多角形等、略円形、例えば、円形、楕円形等、またはそれらの形状の一部分の組合せ、例えば、一部分が矩形の一部分であり他部分が略円形の一部分であってもよい。
【００２７】
足場部材は、例えば、移植されるべき開口または欠損部分の形状のアスペクト比が大きい場合や、複数の再生軟骨体が１つの開口に対して用いられる場合、棒形状、例えば、円柱形状、楕円柱形状、角柱形状、又はそれらの一部分、例えば、それらを長手方向に平行な平面で切断して得られる切片等であってもよく、更にそれらは一部分または一つの面が開口している中空体であり得る。それらの一部、例えば、開口近くの縁部に肉厚部があってもよい。また棒形状の端部がテーパを有してもよく、端部または先端部が丸みを帯びていてもよく、帯びていなくともよい。
【００２８】
足場部材が、凸面および／または凹面を備える場合、その曲率は、Ｒ３以上であってもよい。足場部材の大きさは、２ｍｍ〜３０ｍｍ×５ｍｍ〜１００ｍｍであってもよく、例えば、５ｍｍ〜１０ｍｍ×１０ｍｍ〜２０ｍｍであってもよい。厚さは０．５ｍｍ〜３ｍｍ、例えば、１ｍｍ〜２ｍｍであってもよい。足場部材の厚さは、均一であっても不均一であってもよい。また、足場部材の縁部に肉厚部があってもよく、中心部、軸部または対向する二辺の中央を結ぶ領域付近等に肉厚部があってもよい。
【００２９】
足場部材は、生分解性多孔質体により形成されている固体形態の部材である。足場部材を構成する多孔質体は、生分解性ポリマーをスポンジ状（例えば、気孔率：８５％〜９１％、平均孔径：約４００μｍ）に加工したものである。生分解性ポリマーは、例えば、ＰＬＬＡ（ポリＬ乳酸）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｉｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ポリグリコール酸）、ＰＬＧＡ（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｌ ａｃｉｄ：乳酸グリコール酸共重合体）などであり得る。多孔質体は、いずれか公知の方法を用いて製造され得る。
【００３０】
軟骨細胞は、足場部材の表面に固定されている。足場部材の表面とは、足場部材の外部表面と足場部材が備える複数の孔内表面の両方を指す。
【００３１】
軟骨細胞の足場部材表面への固定は、例えば、ハイドロゲルを介して達成されている。この場合、軟骨細胞は、ハイドロゲルに分散された状態で足場部材に固定されている。再生軟骨体は、その構成から細胞固定多孔質体とも称されてよい。
【００３２】
ハイドロゲルの例は、アテロコラーゲンハイドロゲルであり得る。アテロコラーゲンハイドロゲルは低温で液状化し、体温付近でゲル化する性質を有している。軟骨細胞を足場部材に固定することは、液状のハイドロゲルに軟骨細胞を懸濁し、得られた懸濁液を足場部材の表面を覆うように添加し、その後、液状のハイドロゲルをゲル化することにより行われ得る。
【００３３】
再生軟骨体が移植対象に移植された後、軟骨細胞は、足場部材を足場として増殖していき、気管軟骨を再生する。このとき、足場部材は、移植対象体内で緩徐に加水分解される。結果として、移植対象内で増殖した軟骨細胞によって気管軟骨が再生され、気管が再建される。
【００３４】
２．マトリックス部材
マトリックス部材は、再生軟骨体と膜状体を固定する役割を持つと共に、移植片の生着のための組織（例えば、気管軟骨、粘膜上皮、血管等）の形成を促す。即ち、マトリックス部材は、再生軟骨体と膜状体とを接着するための接着剤または固定剤として機能すると共に、組織誘導性物質として、再生軟骨体と膜状体との間およびその周辺に再建されるべき気管領域の三次元的な組織を再建し得る。
【００３５】
マトリックス部材の粘度は、特に特定されるものではなく、マトリックス部材の存在により、再生軟骨体が膜状体に一時的に固定できればよい。気管再生のための外科的手術にて気管再生用軟骨移植キットを移植対象に取り付ける際には、膜状体の１つの面が気管内部の気道に向くように残存する気管内面の気管上皮面膜に取り付ける。その後、気管開口部を覆う膜状体のもう一方の面上に再生軟骨体を置く。更に、再生軟骨体上に移植対象の筋組織を被せる。従って、再生軟骨体の膜状体への一時的な固定とは、例えば、膜状体の当該もう一方の面上に再生軟骨体を配置してから、筋組織を被せるまでの間に亘って膜状体上の所望の位置に再生軟骨体を維持できることであればよい。実質的には、再生軟骨体は、膜状体と筋組織によって物理的に抑えられて気管内部の所定の位置に維持される。例えば、再生軟骨体の膜状体への固定は、再生軟骨体と膜状体との間に表面張力により達成され得る。或いはマトリックス部材の粘性によって達成され得る。
【００３６】
マトリックス部材は、そこに細胞や水分等の生体由来成分を維持することが可能なマトリックスを有する物質であればよい。例えば、成長因子と組織誘導性ハイドロゲルとの混合物であり得る。
【００３７】
成長因子は、粘膜上皮細胞、軟骨細胞、血管平滑筋、血管内皮細胞などの気管の成長を促進する物質であればよく、例えば、繊維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２）等であり得る。ＦＧＦ−２は、例えば、マトリックス部材の総量に対して１０ｎｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ程度の濃度で使用され得る。
【００３８】
組織誘導性ハイドロゲルは、例えば、自己組織化ペプチド、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルジネート、アガロース等又はそれらの何れか２つ以上の成分の混合物等からなるゲル化された半固体であり得る。これらは生物学的成分からなる複数の繊維体が集合して組織体を形成し、そこに細胞および水分などの生体由来成分を保持することが可能な物質である。自己組織化ペプチドの例は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）等であり得る。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）は、例えば約０．０３％〜約３％（ｖ／ｖ）で使用され得る。マトリックス部材は、成長因子及び組織誘導性ハイドロゲルに加えて、生理活性物質等を含んでいてもよい。
【００３９】
成長因子、組織誘導性ハイドロゲル、及びその他の成分は、混合されずにそれぞれ個別にアンプル、シリンジ、チューブ、パックなどの容器に収容された状態でキットに含まれていてもよいし、それらの少なくとも２つ以上が互いに混合された状態でキットに含まれていてもよい。また、気管再生用軟骨移植キットには、上記の組織誘導性物質の構成要素を溶解させるための溶媒が含まれていてもよい。前記溶媒は、公知の方法で滅菌され、保存及び流通に適切な状態で容器に収容されてキットに含まれ得る。
【００４０】
３．膜状部材
膜状部材は、再生軟骨体が外界と接触すること防ぎ、再生軟骨体を乾燥、感染、陰陽圧から保護し、移植片の耐久性を高め得る。更に膜状部材は、気管に移植された後に移植片が気管内部に脱落するのを防ぎ得る。膜状部材の材料は、生分解性物質である。移植後に気管粘膜と徐々に置き換わることが可能である。膜状部材が、移植後に生体内で分解された後には、形成された気管粘膜とマトリックス部材等が、移植片である気管軟骨体の脱落を防ぐ。膜状部材は、例えば、生分解性ポリマーであってもよく、例えば、ＰＬＧＡ（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｌ ａｃｉｄ：乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＬＬＡ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ａｃｉｄ：ポリＬ乳酸）、ＰＬＡ／ＣＬ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ：ポリ乳酸／カプロラクトン共重合体）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｉｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ポリグリコール酸）、コラーゲン等であってもよい。これらは、例えば、シームデュラ（登録商標）、ＰＬＬＡフィルム、ＰＬＬＡメンブレン、ネオベール（登録商標）シート等の市販の生分解性ポリマー部材であってもよい。また、膜状部材は、シート状、膜状、フィルム状であってよく、その形状および大きさは、移植されるべき気管の開口部の形状および大きさに応じて選択されればよい。例えば、膜状部材の大きさは、２ｍｍ〜３５ｍｍ×５ｍｍ〜１５０ｍｍであってもよい。また例えば膜状部材の厚さは、０．０１ｍｍ〜２ｍｍであってもよい。
【００４１】
膜状部材は、再建されるべき気管の開口部（または欠損部分）に対して、気管の開口部を覆うように開口部を取り囲む領域の気管にセットされる。膜状部材の気管へのセットは、縫い付け、接着、ステイプラーによる固定、またはそれらの組み合わせ等により達成され得る。
【００４２】
４．気管再生用軟骨移植キット
再生軟骨体、マトリックス部材及び膜状部材は、それぞれ個別に保存及び流通に適切な状態で容器に収容されて気管再生用軟骨移植キットに含まれ得る。
【００４３】
使用され得る容器は、アンプル、シリンジ、チューブ、パック等の何れかの収納体であり得る。また容器は、再生軟骨体、マトリックス部材及び膜状部材を無菌状態で維持できるものが好ましい。
【００４４】
マトリックス部材は、膜状部材の一つの主面上に塗布された状態で、即ち、膜状部材とマトリックス部材層とを含む界面パーツとして、保存及び流通に適切な状態で容器に収容されて気管再生用軟骨移植キットに含まれ得る。その際、塗布されたマトリックス部材層の厚さは、０．０１ｍｍ〜３ｍｍであり得る。
【００４５】
マトリックス部材に含まれる組織誘導性ハイドロゲル、成長因子及びその他の材料は、混合された状態で容器に収容されてキットに含まれてもよく、混合されずに成分毎に別個に容器に収容されてキットに含まれてもよく、二つ以上の成分が混合された状態で混合物又は成分毎に容器に収容されてキットに含まれてもよい。また、マトリックス部材は、ゲル化された半固体状態でキットに含まれてもよく、乾燥された状態でキットに含まれてもよい。キットに含まれているマトリックス部材の状態に応じて、容器から取り出した後にそのまま使用、即ち、膜状部材および／または気管軟骨体の主面に与えられてもよく、例えば、塗布されてもよく、或いは、キットに含まれるマトリックス部材のための成分を溶解または懸濁等による調製を行った後に使用されてもよい。気管再生用軟骨移植キットには、上記の組織誘導性物質の構成要素を溶解させるための溶媒が含まれていてもよい。前記溶媒は、公知の方法で滅菌され、保存及び流通に適切な状態で容器に収容されてキットに含まれ得る。
【００４６】
５．気管再生用軟骨移植キットの使用方法
次に、気管再生用軟骨移植キットの使用方法の一例について図面を用いて説明する。図３〜５は、図２（ａ）に示したアーチ形状の曲面体形状の足場部材を備える再生軟骨体１０を含む気管再生用軟骨移植キットを用いて、気管に対して再生軟骨体を移植する工程の一例を示す。
【００４７】
まず、移植対象の喉の前方部を切開し、気管を露出する（図示せず）。次に気管６の気管損傷部６ａの前方部を気管６の軸に沿って切開する（図３（ａ−１））。その後、気管の軸と直交する方向に向けて切開部６ｂを広げて開口する（図３（ｂ−１）、図４（ａ−１））。開口された状態の気管６を線（ａ−２）−（ａ−２）’に沿って切断した断面を図４（ａ−２）に示す。気管６の前方部には開口部６ｃが形成されており、気管内部が開口から露出している。次に、この開口部６ｃを覆い、開口を塞ぐように、気管６の内側から界面パーツ４を気管に宛がう（図４（ｂ−１））。この時、界面パーツ４は、マトリックス部材層３ａの存在する面（例えば、マトリックス部材３が塗布された面）が気管６の外側を向くように配置される。これにより気管の開口からマトリックス部材層３ａが露出する。この状態で、膜状部材２を開口部６ｃ周囲の気管上皮粘膜７に縫い付ける（図示せず）。図４（ｂ−１）の線（ｂ−２）−（ｂ−２）’に沿った断面を図４（ｂ−２）に示す。図４（ｂ−２）に示すように、界面パーツ４は、気管の内側から開口を覆うように気管内に固定されている。膜状部材２の１つの主面に存在するマトリックス部材層３ａは、気管の厚さ方向において、残された気管の気管上皮粘膜７のレベルに相当する位置にある（図４（ｂ−２））。
【００４８】
このとき、開口部６ｃから露出している界面パーツ４の面積は、開口部の面積よりも大きいものであり得る。開口部６ｃから露出している部分の界面パーツ４の長手方向に直交する長さ（即ち、幅）は、開口部６ｃを規定する気管の対向する２点の差渡しの長さよりも長いものであり得る。従って、図４（ｂ−２）に示すように、界面パーツ４は、再建されるべき気管の形状に沿って外部に向けて突出している。これにより、再建される気管の内径が維持されてもよい。
【００４９】
続いて、アーチ形状が、再建されるべき気管の周面の曲線に沿うように、再生軟骨体１０の凹面を開口から露出しているマトリックス部材層３ａに接触させて配置する。これにより再生軟骨体１０を気管に移植する（図５（ａ−１）、（ｂ−１））。その後、筋組織を再生軟骨体１０の凸面上に被せ、表皮を縫合する（図示せず）。このようにして、気管再生用軟骨移植キットの移植は行われる。この後、一定の時間の経過の後に、移植されたキットを基礎として気管が再建される。
【００５０】
ここにおいて図４（ｂ−２）では、界面パーツ４を開口部から外部に向けて突出させる例を示したが、これに限定されるものではなく、開口部６ｃから露出している部分の界面パーツ４の幅は、開口部６ｃを規定する気管の対向する２点の差渡しとおおよそ等しくてもよい。このような構成により、再建される気管の内径が維持されてもよい。これらの何れも再建されるべき気管の形状に沿った形状である。
【００５１】
上記においては、曲面体形状の足場部材１００を備え、それにより曲面体形状を有する再生軟骨体１０を用いた気管軟骨の移植工程を説明した。次に、曲面体形状を有する再生軟骨体１０の代わりに、複数の再生軟骨体１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄを備える気管再生用軟骨移植キットを用いた気管軟骨の移植工程について図６を用いて説明する。移植対象の喉を切開する工程から界面パーツ４を気管上皮粘膜にセットする工程は、上述した曲面体の場合と同じである。その後、複数の再生軟骨体１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄを開口部６ｃから露出している界面パーツ４に接触させて並べて配置する。再生軟骨体１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄは、長方形の棒体であり、その端面のアスペクト比は比較的小さい。それらは、それらの全ての軸が平行になるように、またそれらの軸が気管の軸に平行になるように、両端部を揃えて界面パーツ４上に並べて配置される（図６（ｂ−１））。その後、上述の曲面体と同様に筋組織を再生軟骨体に被せ、表皮を縫合する。その後、一定期間の後に気管の再建が達成される。このようにして、再生気管軟骨移植は行われ得る。
【００５２】
前記気管再生用軟骨移植キットにより、移植組織の乾燥及び感染を防止することが可能である。それに伴う周囲組織の血行不全及び炎症等の移植組織周囲の環境の悪化並びに、周囲組織の形成不良等の生物学的問題を防止することが可能である。さらに、陰陽圧による移植組織の破壊、位置の移動、及び脱落等の力学的問題も防止することが可能である。
【００５３】
６．再生軟骨体の製造方法
前記再生軟骨体は、軟骨細胞の単離及び培養、並びにそれにより得られた細胞を足場部材に固定することにより再生軟骨体を形成することを含む工程を経て調製される。得られた再生軟骨体は、使用時まで無菌的に密封保存される。以下にその詳細を説明する。
【００５４】
（１）軟骨細胞の単離および培養
軟骨細胞の単離は、例えば、次のように行われ得る。まず、ドナーである動物から耳介軟骨片を外科的に採取する。次に採取された耳介軟骨細胞から脂肪、血管および血液等を除去する。その後、軟骨片を細片化し、必要に応じて所望の消化酵素、例えば、コラゲナーゼ及び／又はゼラチナーゼ、トリプシン、ペプシン、アグリカナーゼ等により消化する。それにより、個々に遊離したそれぞれの細胞からなる細胞群及び／又は複数の細胞からなる微細組織片を形成する細胞群を単離軟骨細胞として得る。次に、これらの単離軟骨細胞の培養を行う。
【００５５】
軟骨細胞を生体外に取り出して二次元培養すると、活発に分裂及び増殖し、大量の細胞が入手可能である。しかし、軟骨細胞は平面培養を行うと急速な脱分化を起こし、その特性である細胞外マトリックスの分泌能を失う。したがって、例えば、単離軟骨細胞の初代培養で１４日間、一度継代した後に２１日間に亘って二次元培養を行う。これにより、軟骨細胞はコンフルエント以上に増殖されて重層化され、それにより脱分化が抑制され、約１０００倍に増やすことができ得る。
【００５６】
培養は、再生軟骨体の製造に用いることのできる状態の生細胞を必要数得ることのできる限りにおいて、当業者に既知のいずれかの方法で行われてよい。培養は、例えば、必要な生細胞数を得るために継代培養であってよい。培養の形態は、目的に応じて適宜選択することができ得る。培養の形態は、例えば、ボトル中での浮遊培養、培養皿での平面及び／又は浮遊培養（単層培養）、ペレット培養等でよく、また、ハイドロゲル等による三次元培養を行ってもよい。
【００５７】
軟骨細胞の培養に使用できる培地（ここでは「細胞増殖用培地」と記載する）は、それ自身公知の何れの軟骨細胞の培養に適した培地であればよい。好ましい基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ及び血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ等であり得る。
【００５８】
前記基礎培地に、増殖促進因子として移植の対象由来の自己血清、ＦＧＦ−２、及びインスリンを加えてもよい。
【００５９】
また、培養条件は、例えば、３％〜７％のＣＯ２存在下で、湿度８０％〜１００％、温度３６℃〜３８℃であり得る。培養中に培地を攪拌しても、しなくてもよい。しかしながら、培養中に攪拌を行うことが好ましい。
【００６０】
ここで、前記再生軟骨体の製造のために、生細胞数は２億４千万個以上あるのが好ましい。また、生存率は８０％以上であることが好ましい。生存率は、それ自身公知の何れの方法により測定されてもよい。例えば、ＰＥ測定法によりヌクレオカウンターによって測定してもよい。生存率が８０％未満であると、健全な軟骨の再生が見込まれない可能性がある。
【００６１】
ここで、培養軟骨細胞は、互いに結合した少なくとも部分的に組織を形成した軟骨細胞群であってもよく、又は個々に遊離した軟骨細胞からなる軟骨細胞群であってもよい。また、培養軟骨細胞は、初代培養物及び／又は継代培養物であってもよい。
【００６２】
（２）再生軟骨体製造方法の概要
上述のように単離された耳介軟骨からの単離軟骨細胞を用いて、再生軟骨体を製造する。以下に本発明の再生軟骨体の詳細な製造方法の一例を記載する。
【００６３】
（３）再生軟骨体の調製
前記単離軟骨細胞を足場部材に固定し、再生軟骨体を調製する工程を以下に説明する。
【００６４】
（ａ）単離軟骨細胞とハイドロゲルとの混合及び足場部材への投与
単離軟骨細胞が、それのみで足場部材に投与された場合、前記細胞が前記足場部材の孔の一部に接着し平面的に培養される可能性がある。単離軟骨細胞は、平面的に培養されると急速に脱分化してその特性を失う性質がある。そのことから、単離軟骨細胞をハイドロゲルに混合し浮遊させた細胞懸濁液を足場部材に投与する方法によって、三次元的に培養することにより安定した再生軟骨体を得ることが可能である。また、ハイドロゲルとの混合は、単離軟骨細胞を足場部材の表面に固定し、留置する役目も果たす。ハイドロゲルは、例えば、アテロコラーゲンハイドロゲルであってよい。アテロコラーゲンハイドロゲルは低温で液状化し、体温付近でゲル化する。
【００６５】
細胞懸濁液は、単離軟骨細胞を、アテロコラーゲンハイドロゲル及び基礎培地を含むアテロコラーゲン液に懸濁して得ることができる。細胞懸濁液中のアテロコラーゲンの濃度は１％であり得る。アテロコラーゲン液は、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質を含み得る。前記基礎培地は、ＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ等であり得る。細胞懸濁液は、単離軟骨細胞を５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで含み得る。
【００６６】
足場部材への前記細胞懸濁液の投与は、足場部材の上方から、細胞懸濁液をピペットにより投与することにより行われ得る。
【００６７】
（ｂ）ハイドロゲルのゲル化
足場部材に細胞懸濁液を投与した後、ハイドロゲルをゲル化することにより、細胞が足場部材の表面に固定され、再生軟骨体が得られる。
【００６８】
アテロコラーゲンハイドロゲルのゲル化は、例えば、細胞が投与された足場部材を、十分に湿度のある環境（例えば、培地を含むシャーレに入れ、蓋を閉めた状態）で３７℃のインキュベータ内に静置して約２時間維持することによって行われ得る。
【００６９】
これらの工程により、再生軟骨体が得られる。
【００７０】
（ｃ）無菌試験
再生軟骨体は、生体への移植に先駆けて無菌であることを試験する必要がある。
【００７１】
無菌試験は、一つのロットについて、同じ軟骨に由来する複数の再生軟骨体を作製し、そのロットに含まれる一部の再生軟骨体について無菌試験を行えばよい。無菌試験は、いずれか公知の方法を用いて行われてよく、例えば、目視、ＰＣＲ法、ＤＮＡ染色法、メンブランフィルター法、及び直接法等によって行われ得る。
【００７２】
（ｄ）密封保存
無菌試験に供されない再生軟骨体は、無菌試験を受けている再生軟骨体と並行して密閉容器に密封保存される。密封保存は、少なくとも無菌試験の期間中維持される。密封保存は、例えば、再生軟骨体を保存用培地中で振盪しながら、２６℃〜３７℃で維持する条件下で行われる。
【００７３】
保存用培地は、基礎培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ中に、インスリン、繊維芽細胞成長因子及び５％以上の血清を含む培地でよく、更に、抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含み得る。
【００７４】
密封保存は、例えば、滅菌された、開口縁部の外面にネジ切り加工された片封じ筒体と、開口縁部の内面にネジ切り加工され、片封じ筒体のネジ部に螺着されるキャップとを備える密閉容器の、片封じ筒体の内部に保存用培地を収容し、続いて、片封じ筒体の内部に再生軟骨体を前記保存用培地に沈むように収納し、片封じ筒体の開口部にキャップを螺着して片封じ筒体内部を密閉する方法により行われてもよい。
【００７５】
無菌試験により当該ロットが無菌であることが確認された後に、密封保存されていた再生軟骨体が移植に用いられる。
【００７６】
（ｅ）保存用培地の振盪
保存用培地の振盪は、例えば、以下のような方法で行われてよい。移動可能なスライド台を内部に配置した恒温振盪器を用意し、前記スライド台上に前記密閉容器をその容器の軸方向がスライド台の表面に対して略平行になるように載置する。その後、恒温振盪器の内部を２６〜３７℃の環境に設定し、スライド台を運動させる。スライド台の動きは、楕円運動、往復運動及び／又は八の字型運動等であり得る。スライド台の運動により保存用培地が容器内で振盪される。振盪は、振り幅が直線の場合には、少なくとも一方向に１０ｍｍ〜５０ｍｍであり、円方向の場合であってもその直径が１０ｍｍ〜５０ｍｍであり、振盪速度１５ｒｐｍ〜９０ｒｐｍの範囲であってもよい。そのような振盪環境は、例えば、超小型恒温振盪培養機（タイテック社製、Ｖ・ＢＲ−３６）を用いて１５ｒｐｍ〜９０ｒｐｍの設定により生じる楕円運動により達成され得る。また、それ自身公知の振盪機により、例えばスライド台を例えば傾斜角度０°〜１５°で繰り返して傾斜させることによって同様の振盪効果を達成することも可能である。
【００７７】
（ｆ）細胞投与機による再生軟骨体の調製及び包装
細胞とハイドロゲルとの懸濁から、ゲル化後に再生軟骨体を個装容器へ封入するまでの工程は、細胞投与機によって行われる。前記細胞投与機は、細胞とハイドロゲルとを懸濁するシリンジ混合機器部分と、細胞懸濁液をＰＬＬＡ足場材料へ投与する分注機器部分、投与後に細胞懸濁液入りＰＬＬＡ足場材料をゲル化するゲル化恒温庫部分、ゲル化後に細胞懸濁液入りＰＬＬＡ足場材料を個装容器に封入する広口ボトル締付け機器部分から構成される。細胞投与機による投与によって軟骨細胞が足場部材表面に均一に投与されるとともに、細胞投与機内で行われる工程を無菌的に行うことができる。
【００７８】
本発明の方法に従うと、培地交換を行うことなく、再生軟骨体を長期に、少なくとも１４日間に亘り保存することが可能になる。それにより、再生軟骨体の無菌状態を確認するための無菌試験を行うことが可能である。また、当該方法は、長期保存中に再生軟骨体の過増殖を防ぎ、長期保存後における死細胞数を少なくすることが可能である。従って、長期保存後であっても移植に好適な状態の再生軟骨体を提供することが可能である。
【００７９】
上記の方法により調製された再生軟骨体は、形及び十分な強度を有し、移植対象体内で形を保つことができる。さらに、人工材料の素材で作られた人工気管移植片よりも、移植対象に生着しやすい。
【００８０】
例１  再生軟骨体の製造
再生軟骨体を次のように製造した。
【００８１】
１．血清調製
血清調製に用いる血液を、医療機関で採血し、抗凝固剤入り血液バッグ（テルモ株式会社製テルモ血液バッグＣＰＤＡ）で輸送した。その血液から血漿を回収し、塩化カルシウム溶液（富田製薬株式会社製塩化カルシウム水和物：２．９４ｇ、及び扶桑薬品工業株式会社製注射用水ＰＬ「フソー」：２０ｍＬを含む）を用いて凝固因子を除いて血清を作製した。
【００８２】
２．軟骨組織の採取と単離
用いる耳介軟骨組織を医療機関で無菌操作により採取し、ビアスバン−ＰＳＡ（アステラス製薬株式会社製ビアスバン（臓器保存液）：５０ｍＬ、ノボノルディスクファーマ株式会社製ノボリン（登録商標）Ｒ注１００単位／ｍＬ（ヒトインスリン）：０．２ｍＬ、ＭＳＤ株式会社製デカドロン注射液３３ｍｇ／ｍＬ：０．２４ｍＬ、ペニシリン水溶液：０．０５ｍＬ、ストレプトマイシン水溶液０．０２５ｍＬ、及びアムホテリシンＢ水溶液２．５μＬを含む）に浸漬して輸送した。前記耳介軟骨組織から脂肪や血液などを除去した。次に、得られた軟骨から軟骨膜を除去し、細片化した。細片化された軟骨を１．２％のコラゲナーゼ溶液に入れて、超小型恒温振盪培養機（タイテック社製、Ｖ・ＢＲ−３６）を用いて３７℃で１４〜１６時間、１２０ｒｐｍ（長径が２０ｍｍの円運動、以下、特に記載がない場合、振盪の動きは同じ）で振盪して、細胞を単離した。単離軟骨細胞を所望の細胞数で５μｇ／ｍＬのインスリン、０．１μｇ／ｍＬのＦＧＦ−２、５％血清、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２：５００ｍＬ、ペニシリン水溶液：０．２５ｍＬ、及びストレプトマイシン水溶液０．２５ｍＬを含む）を含む細胞増殖用培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でゼラチンコートフラスコ（株式会社ニッピ製２５ｃｍ２ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋ）に播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベータで１４日間インキュベートした。
【００８３】
コラゲナーゼ溶液は次のように調製した。コラゲナーゼ（ロシュダイアグノスティックス株式会社製Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＭＮＰ−Ｓ ５ｍｇ ＧＭＰ）を０．３ｇ量り、５０ｍＬチューブに加えた。これに対してＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳを１３．４ｍＬ添加し、完全に溶かした。
【００８４】
前記細胞増殖用培地は次のように調製した。培地瓶に５０ｍＬピペットでＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳを４５０ｍＬ加えた。次に、５ｍＬピペットで１００ユニット／ｍＬペニシリン−０．１ｍｇ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを５ｍＬ加えた。更に、１０００μＬチップで１００μｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を５００μＬ加えた。更に、１０００μＬチップでノボリンＲをインスリンとして７１０μＬ加えた。これに対して２５ｍＬピペットで血清を２５ｍＬ加えてよく混合した。
【００８５】
３．Ｐ０細胞培地交換
上記の細胞についての培地交換は次の通りに行った。上記の細胞を含む培養中のゼラチンコートフラスコから、アスピレーターにより培地を除去した。次に、前記細胞増殖用培地を各１０ｍＬ加えた。これを更に、３７℃、ＣＯ２インキュベータでインキュベートした。培地交換は、３日〜４日に１回（計３回）行った。
【００８６】
４．継代
次のように継代を行った。初代培養中の細胞を含むゼラチンコートフラスコから細胞をトリプシン様酵素（ライフテクノロジージャパン株式会社製ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ（１×））処理により剥がし、１本のチューブに纏めた。回収された細胞を増殖培地（５μｇ／ｍＬのインスリン＋０．１μｇ／ｍＬのＦＧＦ−２＋５％血清＋ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＰＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液を８．６×１０２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でゼラチンコートフラスコ（株式会社ニッピ製１７５ｃｍ２ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋ）１８枚に播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２条件に設定したインキュベータで２１日間インキュベートした。
【００８７】
５．継代中の培地交換
継代培養中の培地交換は次のように行った。ゼラチンコートフラスコから、アスピレーターを用いて培地を除去した。次に、増殖培地をそのゼラチンコートフラスコに２０ｍＬ加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータでインキュベートした。培地交換は、３日〜４日に１回（計５回）行った。
【００８８】
６．細胞回収と再生軟骨体の作製
トリプシン様酵素を用いてゼラチンコートフラスコ１８枚から細胞を剥がし、１本のチューブに纏めて細胞を回収した。回収された細胞懸濁液を遠心分離した後、ペニシリン水溶液：０．２５ｍＬ、ストレプトマイシン水溶液０．２５ｍＬ、及びＭＥＭ（ライフテクノロジージャパン株式会社製ＭＥＭ（１×）Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：５００ｍＬ）を含む細胞懸濁培地に懸濁して、その一部を用いて細胞数を測定した。測定された細胞に基づいて、２．２５×１０８ｃｅｌｌｓに相当する量の細胞懸濁液を２５ｍＬのチューブに移し取り、遠心分離後、その上清を除去した。得られた細胞ペレットを、最終液量が３．０ｍＬになるようにペニシリン−ストレプトマイシンを含むＭＥＭに懸濁した。これを３％アテロコラーゲン（株式会社高研製コーケンアテロコラーゲンインプラント）１．５ｍＬと混合した。ここで、細胞懸濁液：アテロコラーゲン＝２：１であり、混合後のアテロコラーゲンの最終濃度は１％である。１ｍＬのシリンジで７００μＬを採取し、ポリＬ乳酸製のアーチ形状の曲面体の足場部材（６（幅、Ｗ）×５０（長さ、Ｌ）×３（高さ、Ｈ））（気孔率（重量換算）：８５〜９１％、強度（圧縮強度）：０．１ＭＰａ、分子量：Ｍｗ．８５０００〜１１５０００）に投与した。多孔質に添加するアテロコラーゲンを含む細胞懸濁液中の量は、足場部材の大きさに従って決定した。例えば足場部材の大きさが、６（Ｗ）×５０（Ｌ）×３（Ｈ）の場合は、投与液量を７０μＬとし、１０（Ｗ）×５（Ｌ）×３（Ｈ）の場合は１２０〜１５０μＬを投与した。
【００８９】
次に、細胞を投与した足場部材をペニシリン−ストレプトマイシンを含む保存用培地を入れたシャーレに配置して、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベータ内で２時間静置することによりアテロコラーゲンハイドロゲルをゲル化して再生軟骨体を得た。
【００９０】
７．細胞数計測方法
例における細胞懸濁液に含まれる細胞数の計測は、ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製のＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）を使用して、細胞処理試薬としてＲｅａｇｅｎｔ  Ａ１００およびＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ１００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）並びに専用サンプルカセットであるヌクレオカウンターカセット（ＮｕｃｌｅｏＣａｓｓｅｔｔｅ、登録商標）を用いて行った。
【００９１】
全細胞濃度測定は次の通りに行った。
【００９２】
・サンプルの調製
測定しようとする細胞の懸濁液の５０μＬを試験管に採取し、細胞処理試薬Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ１００およびＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ１００をそれぞれ５０μＬ加えてサンプルを調製した。
【００９３】
・全細胞濃度の測定
全細胞濃度の測定は、上記の「サンプルの調製」の項で調製されたサンプルをヌクレオカウンターカセット（登録商標）に吸引し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）にセットした。次にＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）の「Ｒｕｎ」のボタンを押して、全細胞数の測定を開始し、計測結果を得た。
【００９４】
・死細胞濃度の測定
死細胞濃度の測定は次のように行った。培養細胞１００μＬをチューブにとりヌクレオカウンターカセット（登録商標）に吸引し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）にセットした。次にＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）の「Ｒｕｎ」のボタンを押し、死細胞数の測定を開始し、計測結果を得た。
【００９５】
細胞生存率は次の計算式を用いて算出した：
生細胞濃度＝全細胞濃度―死細胞濃度
細胞生存率＝生細胞濃度／全細胞濃度。
【００９６】
８．長期保存
次に、再生軟骨体の長期保存について検討した。
【００９７】
・再生軟骨体の作製
試験に用いた再生軟骨体は、次のように作製した。まず、上述の通りに細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液は、投与細胞濃度５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、これによって投与生細胞数ｗが３．５×１０７ｃｅｌｌｓとなるように調製した。足場部材として、大きさ６（Ｗ）×５０（Ｌ）×３（Ｈ）のアーチ形状の曲面体であるポリ乳酸製の多孔質体を準備した。この足場部材に対して上記の細胞懸濁液を投与した。これを３７℃のインキュベータ内に２時間静置することによりアテロコラーゲンをゲル化して再生軟骨体を得た。
【００９８】
得られた再生軟骨体を５μｇ／ｍＬのインスリン、０．１μｇ／ｍＬのＦＧＦおよび１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を２５０ｍＬ収容した片封じ筒体に収容して、キャップを閉めた。これにより密閉容器に再生軟骨体を収容した。
【００９９】
これを、超小型恒温振盪培養機（タイテック社製、Ｖ・ＢＲ−３６）を用いて、環境温度３２℃、振盪速度９０ｒｐｍで振盪しながら保存した。
【０１００】
上記の条件で再生軟骨体を保存した後に、同じロットで製造された複数の再生軟骨体において、目視によって破損、穴、欠損等がないことを確認した。その後、振盪培養を開始して２時間後に、そのうちの１本の再生軟骨体を無菌試験に用いた。振盪培養を開始して１４日後に、メスを用いて再生軟骨体の１本を１／２本、１／４本、１／８本、１／８本に等分した。これらのそれぞれを細胞数測定及びｍＲＮＡ検査、エンドトキシン試験、生化学試験、並びに保管に用いた。各試験は、３人のヒト（ＨＡＢ３６、ＨＡＢ３７、ＨＡＢ３８）の耳介軟骨を使用して作製された複数の再生軟骨体についてそれぞれ行われた。
【０１０１】
・無菌試験
上記のように製造された再生軟骨体を１／２本、１／４本、１／４本にメスを用いて分割し、それぞれを振盪培地と共に別々のチューブにそれぞれ分取した。これらをチューブ毎に直接法による無菌試験、ＰＣＲ法によるマイコプラズマ否定試験、及び保管に使用した。
【０１０２】
直接法による無菌検査を以下のように行った。再生軟骨体を小スパーテルで壊した後、０．４５μｍフィルターを通したコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ）（０．０７５×２５０／ユニット数（ｇ））の１×ＰＢＳ（１２．５ｍＬ）溶液に加えた。続いて、３７℃、１２０ｒｐｍ、で２０分間振盪し、ろ過した。その濾液を１５００ｒｐｍ、室温で遠心した。その後、上清を取り除き、１×ＰＢＳ（１０ｍＬ）を加えて懸濁した。その懸濁液を、液状チオグリコール培地、及びソイビーンカゼインダイジェスト培地のそれぞれに１ｍＬずつ加え、それぞれ３５℃、２５℃の条件下で１４日間培養した。その後、培養物について、目視によって、培地中に濁りが無いことをもって無菌（陰性）であると判断する試験を行った。その結果、行った３反復の試験全ての培養物は、陰性であると判定された。
【０１０３】
ＰＣＲ法によるマイコプラズマ否定試験を以下のように行った。分取した再生軟骨体の入ったチューブを、先端医療振興財団先端医療センター（兵庫県神戸市中央区港島南町）に送付した。そこでＤＮＡ染色法によるマイコプラズマ（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）否定試験を行った。その結果として、細胞１０００個あたりの平均陽性細胞数を先端医療振興財団先端医療センターから受領した。受領した結果について、試験対象の核外蛍光斑点を持つ細胞が１０００個中５個以下であることをもって陰性であるとする判定を行った。その結果、行った３反復の試験は、その全てが陰性であることが明らかとなった。
【０１０４】
・細胞数測定
生細胞数測定及び細胞の生存率の算出を上述した「７．細胞数計測方法」に従って行った。具体的には次の通りである。
【０１０５】
再生軟骨体を小スパーテルで壊した後、０．４５μｍフィルターを通したコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ）（０．０７５×２５０／ユニット数（ｇ））のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ａｂ（１２．５ｍＬ）溶液に加えた。続いて、３７℃、１２０ｒｐｍで２０分間振盪した。この混合物をチューブＡ、Ｂにそれぞれ１ｍＬずつ、チューブＡ’、Ｂ’にそれぞれ５０μＬずつ分注した。チューブＡ’、Ｂ’に細胞処理試薬Ａ１００（５０μＬ）加えてピペッティングした後、細胞処理試薬Ｂ（５０μＬ）を加えて更にピペッティングした。チューブＡ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’のサンプルをヌクレオカウンターカセット（登録商標）により採取し、チューブＡ、Ｂからのサンプルの死細胞濃度を、チューブＡ’、Ｂ’からのサンプルの全細胞濃度をそれぞれ計測した。得られた結果から、上述の通り、生細胞濃度と生存率とその平均値とをそれぞれ算出した。その後、再生軟骨体１本あたりの生細胞数を算出した。生細胞数が２．１×１０７個以上、生存率７０パーセント以上のときに合格であると判断した。結果を表１に示す。
【表１】
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【０１０６】
ここで、６（Ｗ）×５０（Ｌ）×３（Ｈ）の大きさの足場部材が実際に保持できる細胞数は３．０×１０７個である。足場部材が実際に保持できる細胞数は、計算式；５．０×１０７個／ｍＬ×０．５９ｍＬ＝３．０×１０７個により算出され得る。
【０１０７】
表１より、細胞数測定において算出された３反復の平均生細胞数は、３．１５×１０７であるので、足場部材が実際に保持できる細胞数に対する実際に再生軟骨体に存在する生細胞の割合は、約１０５％である。したがって、実施形態によって作製された再生軟骨体は、培養１３日目において十分な生細胞数を有していることが分かった。
【０１０８】
・ｍＲＮＡ検査
再生軟骨体の特性試験としてｍＲＮＡ検査を以下のように行った。
【０１０９】
再生軟骨体から、採取した約１×１０６個分の細胞をｍＲＮＡチューブに入れた。この時に、極力、足場部材が入らないように注意した。これらを１５０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心し、上清を取り除いた。得られた細胞ペレットを検査時まで−２０℃で保存した。まず、前記細胞ペレットからＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いて以下のようにＲＮＡ抽出を行った。
【０１１０】
細胞ペレットにＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６００μＬ）を加え、ピペッティングした後、６０％ＥｔＯＨ（６００μＬ）を加えた。この懸濁液の半量をフィルターチューブに入れ、通常のチューブに重ねて１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、チューブに落下した液を捨てた。同じフィルターチューブに懸濁液の残りの量をさらに加え、１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、チューブに落下した液を捨てた。その後、フィルターチューブにＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃１（７００μＬ）を加え、１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、チューブに落下した液を捨てた。次に、フィルターチューブにＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃２／３（５００μＬ）を加え、１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、チューブに落下した液を捨てる工程を２回繰り返した。続いて、１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心した。その後、フィルターチューブをコレクションチューブに重ね、７０℃〜８０℃に熱したＥｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０μＬ）をフィルターチューブに加えた後、１２０００ｒｐｍで１分、室温で遠心した。コレクションチューブに落下したサンプルにＬｉＣｌ（５０μＬ）を加え、−２０℃で３０分以上冷却した。このサンプルを１５０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、上清を取り除いた。その後、−２０℃の７０％ＥｔＯＨ（５００μＬ）を加え、１５０００ｒｐｍで１分、室温で遠心し、上清を取り除いた。コレクションチューブの蓋を開け、ＥｔＯＨを乾燥させた後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（５０μＬ）を加え、得られたＲＮＡを溶解した。
【０１１１】
次に、上記のようにして得られたＲＮＡサンプルから以下のようにｃＤＮＡを調製した。ＲＮＡサンプル（５μＬ）をＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ（４μＬ）、及び２×ＲＴＢｕｆｆｅｒ（１０μＬ）混合溶液に加え、更に２０×ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１μＬ）を加えた。この反応液をＭｉｃｒｏＡｍｐ９６ｗｅｌｌプレートに入れ、サーマルサイクラーを用いて、３７℃で６０分、９５℃で５分、４℃で∞の処理を行った。得られたｃＤＮＡサンプルを１．５ｍＬチューブに移し、−２０℃で保存した。
【０１１２】
次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡサンプルを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｈｓ００２０２９７１＿ｍ１ ＡＣＡＮ）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）により以下のようにリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。蒸留水（Ｄ．Ｗ．、２８μＬ）に２×Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（３３μＬ）、２０×Ｐｒｉｍｅｒ＆Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ（３．３μＬ）、及びｃＤＮＡサンプル（２μＬ）を加えよく撹拌した。これらのサンプルをＲＴ−ＰＣＲ用９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ３０μＬずつ分注した。これらを以下の条件でＲＴ−ＰＣＲ装置にかけた。まず５０℃を２分間、初期熱変性を９５℃、１０分間、サイクリングは、熱変性を９５℃、１５秒間、アニーリングを６０℃、１分で、５０サイクルとした。
【０１１３】
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣ上で結果を表示し、サンプルのＱｕａｎｔｉｔｉｙの平均を取り、アグリカンの値を標準サンプルであるβ−アクチン濃度で割った値を結果として得た。結果を表２に示す。
【表２】
2017086665.tif 000004
【０１１４】
・生化学実験
生化学実験として、ＭＩＡ（メラノーマインヒビトリー活性）試験、ｓＧＡＧ試験、ヒアルロン酸試験及びアグリカン試験を行った。
【０１１５】
ＭＩＡ試験は以下のように行った。再生軟骨体を４２０ｇ、５分、４℃で遠心した後、上清（１ｍＬ）を１５０００ｇ、１０分間、４℃で遠心した。その上清（２００μＬ）にＥＤＴＡ（２μＬ）及び１％（ｗ／ｖ）プロテアーゼインヒビター（２μＬ）を加え、混合した。この混合液のＭＩＡの測定をＭＩＡ測定キット（ＭＩＡ ＥＬＩＳＡ、ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）を用いて行った。吸光度として得られた測定結果を、検量線と比較し、ＭＩＡ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ以上であることをもって合格と判断した。結果を表２に示す。
【０１１６】
ｓＧＡＧ試験は以下のように行われた。再生軟骨体を、１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｉｇｈｔａｓｅ−Ｃ（ニッピ社）（９．６μＬ）のＰＢＳ（９９０．４μＬ）溶液に加え、３０℃で３時間処理した。次に、再生軟骨体を新しいチューブに移し、遠心して、細胞液と足場部材を分離した。その細胞液をチューブに移し、１５０００ｇ、５分間、４℃で遠心し、上清を回収し、サンプルとした。
【０１１７】
ｓＧＡＧの４０、２０、１０、５、２．５、及び０ｎｇ／ｍＬ標準液と、サンプルを２０μＬずつ分注し、ｏ−ｐｈｅ含有色素液を２００μＬずつ加えた。これらの吸光スペクトルを５３０ｎｍで測定した。検量線を作製し、サンプルのｓＧＡＧ含有量を算出し、再生軟骨体１本あたりのｓＧＡＧ含有量（μｇ）を算出した。結果を表２に示す。
【０１１８】
ヒアルロン酸試験は、Ｈｕａｌｕｅｏｎｉｃ Ａｃｉｄ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔバイオテック トレーディングパートナーズ社）を用いて以下のように行った。
【０１１９】
再生軟骨体を保存した振盪培地（３０μＬ）をＡｓｓａｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂａｆｆｅｒで１００倍に希釈してサンプルとした。１０倍に希釈した標準溶液とサンプルを１００μＬずつウェルプレートに分注し、室温で１時間処理した後、Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０μＬ）で各ウェル４回洗浄した。残った水分を取り除き、各ウェルにＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＨＡＢＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＬ）を加え、室温で３０分間処理した。それらをＷａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０μＬ）で各ウェル４回洗浄した。残った水分を取り除き、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｉｔｉｏｎ（１００μＬ）を各ウェルに加え、室温で３０分間処理した。その後、Ｓｔｏｐ ｓｏｌｉｔｉｏｎを各ウェルに１００μＬずつ加えた。それらの吸光度を４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで測定し、ＯＤ４５０−ＯＤ６５０の値を算出した。検量線を作製し、サンプルのヒアルロン酸含有量を算出し、再生軟骨体１本を含む振盪培地中のヒアルロン酸含有量（ｎｇ）を算出した。結果を表２に示す。
【０１２０】
アグリカン試験は、Ａｇｇｒｅｃａｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ユーエスシーエヌライフサイエンス社）を用いて以下のように行った。再生軟骨体を、１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｉｇｈｔａｓｅ−Ｃ（９．６μＬ）のＰＢＳ（９９０．４μＬ）溶液に加えて、３０℃で３時間処理した。次に、再生軟骨体を新しいチューブに移し、遠心して、細胞液と足場部材を分離した。その細胞液をチューブに移し、１５０００ｇ、５分間、４℃で遠心し、上清を回収し、サンプルとした。
【０１２１】
アグリカンの２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６ｎｇ／ｍＬ標準溶液と、サンプルを１００μＬずつウェルプレートに分注し、３７℃で２時間インキュベートし、各ウェルから液体を取り除いた。次に、Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ａ（３．６ｍＬ）、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（３６μＬ）の混合液を各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルをＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０ｍＬ）で４回洗浄し、各ウェルから液体を取り除いた。続いて、Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂ（３．６ｍＬ）、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ（３６μＬ）の混合液を各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルをＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３５０ｍＬ）で５回洗浄し、各ウェルから液体を取り除いた。次に、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｉｔｉｏｎ（９０μＬ）を各ウェルに加え、遮光しながら３７℃で１５分間インキュベートし、続いて、Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０μＬ）を各ウェルに加えて、プレートリーダーで撹拌した後４５０ｎｍと６００ｎｍで吸光度を測定した。検量線を作製し、サンプルのアグリカン含有量を算出し、再生軟骨体１本あたりのアグリカン含有量（ｎｇ）を算出した。結果を表２に示す。
【０１２２】
検査結果を得て、それらの結果が出荷基準を満たしている場合に、同じロットで作製された複数の再生軟骨体の内残りの再生軟骨体は、密閉容器に収納された状態で再生軟骨体を移植に使用するために出荷される。出荷基準は、実施者が所望に応じて決定すればよい。
【０１２３】
このように保存された再生軟骨体は、無菌状態であり、良好な細胞生存率を示した。足場部材に細胞を固定することにより作製された再生軟骨体は日本薬局方で定められた無菌試験の期間、即ち、１４日間に亘り、培地交換を行わずに軟骨細胞を良好な状態で保存することが可能である。
【０１２４】
なお、本例では振盪の動作を直径が２０ｍｍの円運動の場合を例に挙げて説明したが、これに限定するものではなく、円運動の直径を１０ｍｍないし５０ｍｍに設定してもよく、また、円運動ではなく往復運動やスライド台を用いた傾斜による振盪により再生軟骨体に内包された細胞へ培地が供給されれば同様の効果を達成することができる。
【０１２５】
さらに、振盪の動作を円運動の直径１０ｍｍないし５０ｍｍに設定した場合、培地の流速が円運動の直径に比例すると仮定すると、流速は０を超え７ｃｍ／ｓ程度の範囲となり、足場部材が破損しない限りこの範囲の流速を与えることで好ましい結果を得ることができると予想される。また振盪の動作を直線運動にした場合には、円運動と比較して培地が密閉容器の内壁に勢い良く当たり、瞬間的に一部の培地では流速が高い部分が生じているように見受けられたが、培地全体の流速としてはほぼ同じ範囲と考えられる。
【０１２６】
また、本実施例に用いた基礎培地の成分は、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の無機塩、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン・ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン等のアミノ酸、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキサール・ＨＣｌ、リボフラビン、チアミン・ＨＣｌ等のビタミン及びグルコース等の糖を含むものであるが、これら全ての成分が必須のものではなく、細胞を培養するための培地であれば、同様の効果を発揮する。
【０１２７】
例２  足場部材の製造
多孔質のポリ乳酸により足場部材１０３を製造した。足場部材１０３の形状は、図７（ａ）〜（ｄ）に示すように長手方向に平行な面で楕円柱を切断して得られる切断片であり、一つの面が開口している（１０４）中空曲面体であり、端部１０５は丸みを帯びている。また、端部１０５には肉厚部１０６が存在している。
【０１２８】
この足場部材の大きさは、１０ｍｍ〜２０ｍｍであった。
【０１２９】
この足場部材に添加するアテロコラーゲンを含む細胞懸濁液の量は、１２０μＬ〜１５０μＬであり、そこに含まれる軟骨細胞の数は、１０５〜１０８個／ｍＬであった。
【０１３０】
例３  生体における再生軟骨体の軟骨再生能試験
上記のように製造された再生軟骨体の生体における軟骨再生能試験を以下のように行った。生体は、ビーグル犬（ｎ＝３）を用いた。
【０１３１】
まず、血清調製を例１と同様に行い、血清が総量で１１５ｍＬ以上となるように調製した。次に、ビーグル犬から耳介軟骨を採取し、軟骨細胞の単離を例１と同様に行った。軟骨細胞の培養は、Ｐ０培養を１４日間、Ｐ１培養を２１日間、例１と同様に行った。６（Ｗ）×５０（Ｌ）×３（Ｈ）の大きさの足場部材に、軟骨細胞を投与し、例１と同様に再生軟骨体を作製した。再生軟骨体は、例１と同様に１４日間保存された。
【０１３２】
再生軟骨体を、保存１４日目に、ビーグル犬の背部皮下に自家移植した。
【０１３３】
移植が行われてから８週間後に、移植した組織を周辺の組織とともに取り出し、染色を行った。その結果、図８に黒く示されるメタクロマジー領域（Ｍ）で示されるように軟骨が再生していることが確認された。これにより、上記のように製造された再生軟骨体が軟骨再生能を有することが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１３４】
１  再生軟骨体        １ａ  再生軟骨体      ２  膜状部材
２ａ  膜状部材２の主面      ３  マトリックス部材      ３ａ  マトリックス部材層
４  界面パーツ      ５  気管再生用軟骨移植体      ６  気管    ６ａ  気管損傷部
６ｂ  切開部      ６ｃ  開口部      ７  気管上皮粘膜      １０  再生軟骨体
１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ  再生軟骨体      １００  足場部材
１００ａ、１００ｂ  足場部材の長手方向に伸びる辺
１０１ａ、１０１ｂ  足場部材の幅方向に伸びる辺
１１０  ハイドロゲル      １２０  軟骨細胞
【図１】
2017086665.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2017086665.tif 000009
【図６】
2017086665.tif 000010
【図７】
2017086665.tif 000011
【図８】
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