(57)【要約】      （修正有）【課題】人工授精の増加により、最近妊娠高血圧腎症は増加傾向にあるため、妊娠高血圧症候群の本質である血管内皮障害を改善し、妊娠高血圧腎症やそれに伴う胎児発育不全を予防・治療するための新たな手段を開発するために、ヒトの臨床状態を反映した新規な妊娠高血圧症候群、特に妊娠高血圧腎症のモデル動物及びその製造方法の提供。【解決手段】妊娠中の非ヒト哺乳動物であって、子宮動静脈が結紮されている非ヒト哺乳動物の妊娠高血圧症候群のモデル動物。妊娠中の非ヒト哺乳動物において、妊娠後期に子宮に至る動静脈を結紮する、妊娠高血圧症候群のモデル動物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の非ヒト哺乳動物であって、子宮動静脈が結紮又は狭窄されていることを特徴とする、非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
妊娠高血圧症候群のモデル動物である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
血管内皮障害を呈する、請求項１又は２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
妊娠中の非ヒト哺乳動物において、妊娠中期から後期に子宮に至る動静脈を結紮又は狭窄することを特徴とする、妊娠高血圧症候群のモデル動物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠高血圧症候群のモデル動物及びその製造方法に関する。より詳細には、妊娠高血圧症候群の病態の本質である血管内皮障害を呈し、ヒトの臨床状態を忠実に再現できる妊娠高血圧症候群モデル動物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主として妊娠後期にみられる、高血圧を主体とし、浮腫、蛋白尿を来す病態を妊娠高血圧症候群と呼ぶ。妊娠高血圧症候群は、さらに、妊娠高血圧、妊娠高血圧腎症、加重型妊娠高血圧腎症、子癇に病型分類される。妊娠高血圧腎症（PE）は、高血圧に尿蛋白を伴う妊娠高血圧症候群の病型で、妊婦の５〜１０％に生じ、脳卒中や心不全による妊婦死亡、胎児死亡、未熟児発生の大きな原因となる。妊娠高血圧症候群の根本的原因は、胎盤の虚血、低酸素状態による血管内皮障害と考えられている。
【０００３】
妊娠高血圧症候群では、まず安静・食事療法による改善を試み、安静・食事療法で改善が望めない場合に降圧薬を投与する。しかし、降圧薬には妊婦に禁忌になっているものが多く、投与可能な降圧薬で十分な降圧が望めず、また妊娠高血圧症候群の本質である血管内皮障害による血流低下を改善しない。そのため、降圧薬で効果がない場合、妊娠高血圧症候群の最終的な治療手段は帝王切開による妊娠の中断となる。
【０００４】
妊娠高血圧症候群のモデル動物としては、子宮内かん流圧低下（RUPP）モデルラットが知られている。RUPPモデルラットは、大動脈を結紮し、下位卵巣動静脈をクリップする方法（非特許文献１）や、腎大動脈、卵巣に分岐後の下位卵巣動脈（左右）を結紮する方法（非特許文献２）により作製される。しかし、RUPPモデルラットは、「高血圧、蛋白尿、胎仔発育不全」を発症するが、妊娠高血圧腎症の症状である「胎盤形成不全、腎動脈内皮障害」を発症せず（非特許文献１及び２）、それゆえ妊娠高血圧症腎症のモデル動物としては十分なものではない。
【０００５】
腎動脈へ分岐後の大動脈を結紮することでRUPPを生じさせた妊娠中毒症（妊娠高血圧症候群）モデルサルが報告されている。このモデルサルでは、血管内皮が拡張する内皮障害が発症することが報告されているが、サルは価格・場所などの問題から、必要な数をそろえることが困難である。また、大動脈を結紮する術式なので、自律神経系の障害や歩行困難などの問題は依然としてある。さらに、サルでは遺伝子改変動物の作成はまだ少なく、遺伝子の役割を明らかにするのに有用とは言えない。以上より、妊娠高血圧症候群のモデル動物として、サルは不十分である。
【０００６】
このほか、sFlt-1をアデノウイルスあるいはレンチウイルスを用いて過剰発現させることで作製した妊娠高血圧症候群類モデルマウスも知られている（特許文献１、非特許文献４）。しかし、ウイルスの力価によって表現型が異なり、病態解析・薬効解析に最適なウイルス量の調節が困難である。また、ウイルスベクターを用いてsFlt-1を過剰発現させるため、P2実験となり、サンプルの解析場所が制限される。
【０００７】
人工授精の増加により、最近妊娠高血圧腎症は増加傾向にある。よって、妊娠高血圧症候群の本質である血管内皮障害を改善し、妊娠高血圧腎症やそれに伴う胎児発育不全を予防・治療するための新たな手段を開発するために、ヒトの臨床状態を反映した妊娠高血圧症群のモデル動物が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2011/108711
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Intapad S. et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, (2014) vol.307, R1353-R1357,
【非特許文献２】Li J. et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, (2012) vol.303, H1-H8,
【非特許文献３】Abitbol M.M. et al., Am J Pathol (1977) vol.86 p573-590
【非特許文献４】Maynard S.E. et al., J Clin Invest. (2003) vol.111 (5) p649-658
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、新規な妊娠高血圧症候群、特に妊娠高血圧腎症のモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、妊娠中のマウスについて、子宮動静脈を結紮することで、ヒトの妊娠高血圧腎症によく似た表現型を呈するマウスが得られることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）に関する。
（１）妊娠中の非ヒト哺乳動物において、子宮動静脈が結紮又は狭窄されていることを特徴とする、非ヒト哺乳動物。
（２）妊娠高血圧症候群のモデル動物、とくに妊娠高血圧腎症のモデル動物である、上記（１）に記載の非ヒト哺乳動物。
（３）血管内皮障害を呈する、上記（１）又は（２）に記載の非ヒト哺乳動物。なお、用いられる非ヒト哺乳動物としては、齧歯類、とくにマウス又はラットが好ましい。
（４）妊娠中の非ヒト哺乳動物において、妊娠後期に子宮に至る動静脈を結紮又は狭窄することを特徴とする、妊娠高血圧症候群のモデル動物の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒトの臨床状態をより忠実に反映したモデル動物が提供される。本発明の妊娠高血圧腎症モデル動物は、公知のRUPPモデルラットでは再現できなかった腎動脈内皮障害を呈し、自律神経障害も惹起されないため、妊娠高血圧腎症の治療研究に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１の（Ａ）結紮手術の模式図、及び（Ｂ）実験の概要を示す。図中、A、A'は下位卵巣動静脈を示し、B、B'は子宮動静脈を示す。
【図２】図２は、各群：(i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（A、A'＋B、B'）結紮マウス、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における、妊娠の維持率（％）を結紮（14.5日目）後、２４時間おきに観察した結果を示す。
【図３】図３は、各群：(i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（A、A'＋B、B'）結紮マウス、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における、18.5日目の（Ａ）胎仔重量（g）及び（Ｂ）胎盤重量（g）を示す。
【図４】図４は、各群：(i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（A、A'＋B、B'）結紮マウス、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における、（Ａ）血圧の変化（14.5日〜18.5日）及び（Ｂ）17.5日目の平均血圧を示す。
【図５】図５は、各群：(i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（A、A'＋B、B'）結紮マウス、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における、18.5日目の尿中アルブミン／クレアチニン比を示す。
【図６】図６は、各群：(i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（A、A'＋B、B'）結紮マウス、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における、（Ａ）腎組織のＰＡＳ染色像、及び（Ｂ）腎糸球体毛細血管内腔割合（％）を示す。
【図７】図７は、 (i)子宮動静脈結紮マウス（B、B'）、（iii）下位卵巣動静脈結紮マウス（A、A'）、（iv）結紮を施さないマウス（sham）における（Ａ）HIF-1α及び（Ｂ）sFlt-1の発現を示す。
【図８】図８は、（Ａ）結紮前及び（Ｂ）結紮後の子宮動静脈の血流の超音波検査結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、妊娠中の非ヒト哺乳動物であって、子宮動静脈が結紮されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物、及びその妊娠高血圧腎症モデル動物としての利用に関する。
【００１６】
「妊娠高血圧症候群」とは、高血圧を主体とし、浮腫、蛋白尿を来す病態であり、日本産科婦人科学会よれば「妊娠20週以降，分娩後12週までに高血圧が見られる場合，または高血圧に蛋白尿を伴う場合のいずれかで，かつこれらの症状が単なる妊娠の偶発合併症によるものではないものをいう」と定義されている。
【００１７】
「妊娠高血圧腎症」は、高血圧に尿蛋白を伴う妊娠高血圧症候群の病型で、脳卒中や心不全による妊婦死亡、胎児死亡、未熟児発生の大きな原因となる。妊娠高血圧症候群、とくに妊娠高血圧腎症の原因は、主として母体の血管内皮異常にある。最近では、この血管内皮異常には、虚血胎盤から放出される可溶性因子：可溶性fms様チロシンキナーゼ1（soluble fms-like tyrosine kinase 1: sFlt-1）、可溶性エンドグリン（sEng）、トランスフォーミング増殖因子β１（TGF-β1）のアンバランスが寄与していること、特にsFlt-1の増加が深く関与していることがわかってきている。
【００１８】
従来妊娠高血圧症候群のモデル動物として利用されていた子宮内かん流圧低下（RUPP）モデルラットは、高血圧、蛋白尿、胎仔発育不全等は発症するが、妊娠高血圧腎症の根本的な原因である血管内皮障害を発症せず、妊娠高血圧症症候群のモデル動物として十分なものではない。
【００１９】
これに対し、本発明の非ヒト哺乳動物は、血管内皮障害を発症し、ヒトの妊娠高血圧腎症に特徴的な病態：高血圧、蛋白尿、流産早産、及び胎児発育不全を再現できる。それゆえ、本発明の非ヒト哺乳動物は、妊娠高血圧症候群のモデル動物、とくに妊娠高血圧腎症のモデル動物として利用できる。なお、血管内皮障害は全身におこり、通常、腎臓の糸球体血管内皮障害で評価する。ただし、血管内皮障害が軽度な場合、観察可能な範囲内で腎糸球体に病変が同定できず、腎糸球体以外の部位で認められる場合もある。本発明の非ヒト哺乳動物は、子宮動静脈を結紮又は狭窄後、いずれかの臓器で血管内皮障害が認められればよい。
【００２０】
本発明の非ヒト哺乳動物は、妊娠中の非ヒト哺乳動物において、子宮に至る動静脈（「子宮動静脈」と記載する）を結紮又は狭窄することによって作製できる。結紮又は狭窄を施す時期は実験の目的によっても異なるが、通常妊娠中期〜後期、例えば、マウスの場合であれば妊娠9.5日〜出産前日まで、ラットの場合であれば妊娠10.5日〜出産前日に結紮又は狭窄を施す。
【００２１】
子宮動静脈の「結紮又は狭窄」は、子宮動静脈から子宮への血流を阻害するものであればよく、縫合糸で子宮動静脈を結紮するほか、医療用のクリップで挟むなど、いずれの方法を用いてもよい。
【００２２】
本発明で用いられる「非ヒト哺乳動物」は特に限定されないが、齧歯類が好ましく、扱いやすさの点からマウスやラットがより好ましく、マウスが特に好ましい。
【００２３】
本発明の非ヒト哺乳動物を、妊娠高血圧症候群のモデル動物、とくに妊娠高血圧腎症のモデル動物として利用することで、当該疾患の病態メカニズムを明らかにし、その新たな予防・治療手段を開発することができる。
【００２４】
本発明の非ヒト哺乳動物を用いることで、発明者らは胎児（胎仔）の生存・発育には、子宮動静脈から子宮への血流が重要であることを実証しており、この結果により、子宮動静脈の血流改善を指標として、妊娠高血圧症候群における流産・早産、及び子宮内胎児発育遅延を改善する新たな手段を開発可能なことが確認できた。このように、本発明の非ヒト哺乳動物を用いることで、妊娠高血圧症候群の病態メカニズムを解明し、その新たな予防・治療手段の開発につなげることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１：
１．方法
妊娠14.5日目のICR (CD1)マウスを４群に分け、（i）縫合糸を用いて子宮への動静脈（図１のB及びB’）を結紮したマウス（n=11）、（ii）子宮動静脈及び下位卵巣動静脈（左右：図１のA及びA’）を結紮したマウス（n=9）、（iii）下位卵巣動静脈（左右）のみ結紮したマウス（n=14）、（iv）結紮を施さないマウス（n=10）を作製した。
【００２７】
マウスは、妊娠14.5日から18.5日まで連日観察及び体重及び血圧測定を行い、流産・早産がないかを確認した。胎仔の数・生死を手術時と解剖時に測定し、胎仔体重を測定した。18.5日目にマウスを安楽死させ、蛋白尿・生化学的検査、病理学的解析、遺伝子発現解析を行った。試験の概要を図１に示す。
【００２８】
血圧測定
血圧測定は、tail-cuff法により、自動血圧測定装置を用いて測定した。
【００２９】
蛋白尿・生化学的検査
尿中アルブミン量はAlbuwell-M kits (Exocell Inc., Philadelphia, PA)を用いて測定し、尿中クレアチニン量はLC-MS/MSを用いて発明者らの開発した方法により測定した(N. Takahashi et al. Kidney Int 71, 266 (Feb 2007))。尿蛋白は尿中アルブミン濃度を尿中クレアチン濃度で補正したアルブミン・クレアチニン比(ACR)で表した。
【００３０】
病理学的解析
マウスの腎組織の病理学的変化を観察した。腎組織切片をＰＡＳ染色し、腎糸球体の損傷と毛細血管内腔の面積・メサンギウム基質の面積を既報にしたがって測定した（F. Li et al., J Am Soc Nephrol 23, 652 (Apr, 2012)）。また、電子顕微鏡にて腎糸球体毛細血管内腔の狭小化をもたらす内皮細胞の肥厚を明らかにした。
【００３１】
遺伝子発現解析
マウスより摘出した胎盤から常法にしたがいRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRにより、遺伝子発現を解析した。
【００３２】
超音波検査
2匹の妊娠14.5目の子宮動静脈に縫合糸をかけ、結紮前後の子宮動静脈の血流を測定した。
【００３３】
２．結果
（１）妊娠の維持
(i)子宮動静脈結紮マウス及び(ii)子宮動静脈＋下位卵巣動静脈結紮マウスでは、(iii)下位卵巣動静脈結紮マウス及び(iv)非結紮マウスに比較して高頻度の流産・早産が認められた（図２）。
【００３４】
（２）胎仔発育への影響
(i)子宮動静脈結紮マウス、(ii)子宮動静脈＋下位卵巣動静脈結紮マウス、及び(iii)下位卵巣動静脈結紮マウスでは、(iv)非結紮マウスに比較して胎仔重量が有意に低値となり、胎仔発育不全が認められた（図３）。
【００３５】
（３）血圧
(i)子宮動静脈結紮マウス、(ii)子宮動静脈＋下位卵巣動静脈結紮マウス、(iii)下位卵巣動静脈結紮マウスでは、(iv)非結紮マウスに比較して有意に高い血圧が認められた（図４）。
【００３６】
（４）蛋白尿・生化学的検査
(i)子宮動静脈結紮マウスでは、(ii)子宮動静脈＋下位卵巣動静脈結紮マウス、(iii)下位卵巣動静脈結紮マウス、及び(iv)非結紮マウスに比較して有意に高い蛋白尿が認められた（図５）。
【００３７】
（５）糸球体血管内皮
(i)子宮動静脈結紮マウス、(ii)子宮動静脈＋下位卵巣動静脈結紮マウス、及び(iii)下位卵巣動静脈結紮マウスでは、(iv)非結紮マウスに比較して、有意な腎糸球体毛細血管の内腔の減少、メサンギウム基質増加及び血管内皮障害が認められた（図６）。
【００３８】
（６）遺伝子解析
(i)子宮動静脈結紮マウスでは、(iv)非結紮マウスに比較して、有意なHIF-1α, sFlt-1の発現上昇が認められた（図７）。
【００３９】
（７）超音波検査
図１のB及びB'の結紮直後から子宮血流の低下が見られ、逆流や徐脈が確認された（図８）。
【００４０】
３．考察
子宮動静脈を結紮したマウスでは、高血圧、蛋白尿、腎糸球体血管内皮障害が認められるとともに、流産早産の増加及び胎仔発育不全が見られた。これは、ヒトの妊娠高血圧腎症に非常によく似た病態であり、当該マウスは妊娠高血圧腎症のモデル動物として利用できることが確認された。また、結紮部位と胎仔死亡率及び胎仔重量との関係から、胎仔の生存・発育には、子宮動静脈から子宮への血流が重要であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のモデル動物によれば、従来のRUPPモデルラットでは再現できなかった母体の血管内皮障害、及びこれに起因する高血圧や子宮内胎仔発育不全が再現できる。よって、本発明のモデル動物は妊娠高血圧腎症モデル動物として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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