(57)【要約】【課題】  新規な糖尿病または糖尿病合併症に用いる治療薬を提供すること。【解決手段】  プロテインS（Protein S）、またはプロテインSと96％以上の相同性を備え、同等の生物活性を有するタンパク質を含有する糖尿病または糖尿病合併症に用いる治療薬によって達成される。このとき、糖尿病合併症としては、糖尿病性腎症、腎線維症、脳卒中、心筋梗塞、心不全、末梢血管障害及び腎障害などが含まれる。また、投与剤型が、皮下、筋肉内、静脈内、気管支内、腹腔内、肝臓内、子宮内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される１つであることが好ましい。【選択図】          図１６
2017200890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインS(Protein S）、またはプロテインSと96％以上の相同性を備えるタンパク質、または同等の生物活性を有するタンパク質を含有する糖尿病および糖尿病合併症に用いる治療薬。
【請求項２】
投与剤型が、皮下、筋肉内、静脈内、気管支内、腹腔内、肝臓内、子宮内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
請求項１または２に記載の治療薬について、更にスルホニル尿素、グリニド、ビグアニド、チアゾリジンジオン、グリコシダーゼ、DPP-4、インクレチン及びナトリウム・グルコース輸送体２からなる群から選択される少なくとも一つの薬剤を併用することを特徴とする治療薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の治療薬は、糖尿病、糖尿病性腎症、腎線維症、肺線維症、脳卒中、心筋梗塞、心不全、末梢血管障害及び腎障害からなる群から選択される少なくとも一つに投与されることを特徴とする治療薬。
【請求項５】
前記治療薬の投与量が、体重１ｋｇあたり0.1mg／日〜10mg／日である請求項１〜４のいずれか一つに記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインS（本明細書中において、「Protein S」または「PS」と表示することがある。また、hPSは、ヒトPSを意味する。）等の生物活性を有するタンパク質を含有する糖尿病治療薬または糖尿病合併症に用いる治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の糖尿病人口は爆発的に増え続け、2010年には2億8500万人に増加し、2030年までに4億人を超えると予測されている。糖尿病患者における死亡率は非糖尿病の人の2倍高く、中年の糖尿病患者では余命が5-10年短いと報告されている。糖尿病の死亡率の増加は主に心血管系合併症(脳卒中、心筋梗塞、心不全、末梢血管障害)、腎障害、および悪性疾患の進展によるものである。糖尿病性腎症により透析導入を余儀なくされる患者は増加しているが、腎症に対しては対症的な治療薬が用いられているのみで、根本的な治療薬が確立されてない。
1型糖尿病は遺伝的、環境的および自己免疫的要因により膵β細胞が選択的に破壊され発症する。2型糖尿病はインスリン抵抗性とインスリン分泌不全により相対的なインスリン不足となり発症するが、時間の経過とともにβ細胞の量の減少しインスリン分泌不全につながることが示唆されている。β細胞のアポトーシスは 1型糖尿病、2型糖尿病の両者において共通するメカニズムであると考えられる。しかしながらβ細胞のアポトーシスを食い止める有用な治療法は未だ確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１１−５１４８８１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Takagi T, Taguchi O, Aoki S, Toda M, Yamaguchi A, Fujimoto H, Boveda-Ruiz D, Gil-Bernabe P, Ramirez AY, Naito M, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Fujiwara A, Takei Y, Morser J, Gabazza EC: Direct effects of protein S in ameliorating acute lung injury. J Thromb Haemost 2009;7:2053-2063
【非特許文献２】Chelakkot-Govindalayathil AL, Mifuji-Moroka R, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, Matsuda Y, Gil-Bernabe P, Roeen Z, Yasuma T, Yano Y, Gabazza EC, Iwasa M, Takei Y: Protein S exacerbates alcoholic hepatitis by stimulating liver natural killer T cells. J Thromb Haemost 2015;13:142-154
【非特許文献３】Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, Boveda Ruiz D, Miyake Y, Suzuki T, Onishi Y, Morser J, Gabazza EC, Takei Y, Yano Y: Exogenous activated protein C inhibits the progression of diabetic nephropathy. J Thromb Haemost 2012;10:337-346
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書中において本発明者は、（１）糖尿病患者は、血中PSが低下しておりHbA1c値と逆相関を示すこと、（２）STZ誘発糖尿病マウスモデルにおいてhPS（ヒト・プロテインＳ）の過剰発現および外因性hPS投与により膵β細胞のアポトーシスを抑制すること、及び（３）2型糖尿病マウスモデルにおいてはインスリン抵抗性を改善することで糖尿病の病態を改善することを示した。
hPSの過剰発現および外因性hPS投与により糖尿病性糸球体硬化症の進展を抑制することを示した。これらの結果からプロテインSはβ細胞の抗アポトーシス作用、インスリン抵抗性改善作用を有し、さらに未だに有効な治療法が確立されていない糖尿病性腎症に対しても有効な、画期的な糖尿病治療薬として応用できる。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な糖尿病治療薬及び／または糖尿病性腎症等の合併用治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するための発明に係る糖尿病及び／または糖尿病合併症に用いる治療薬は、プロテインS（Protein S）、またはプロテインSと96％以上の相同性を備えるタンパク質、または同等の生物活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする。
また、別の発明に係る糖尿病性腎症治療薬は、プロテインS（Protein S）、またはプロテインSと96％以上の相同性を備え、同等の生物活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする。二つのアミノ酸配列の相同性は、例えばNCBI＜http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi＞などで計算できる。一般に、相同性が高いと類似の生物活性を有し、相同性が低くなると別の生物活性を持つことが知られている。本願発明では、プロテインSと96％以上の相同性を備えるタンパク質、または、ほぼ同等の生物活性を有するタンパク質が含まれる。
上記治療薬の投与剤経は、皮下、筋肉内、静脈内、気管支内、腹腔内、肝臓内、子宮内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻内および経皮からなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
本発明の治療薬が投与されうる疾患としては、糖尿病及び／または糖尿病合併症である。糖尿病合併症としては、例えば糖尿病性腎症、腎線維症、肺線維症、脳卒中、心筋梗塞、心不全、末梢血管障害及び腎障害が含まれる。
現在、１型糖尿病及び２型糖尿病に対して様々な治療薬が施されているが、すべて対象的な治療に留まる。糖尿病患者では糖尿病の進行に伴いインスリンを分泌するβ細胞のアポトーシスが起こり、β細胞数が徐々に少なくなってくる。現在、β細胞のアポトーシスを予防できる薬剤が存在しないため、糖尿病とその合併症の進行を抑制できない。本発明では、in vitroとin vivoの実験によって、プロテインＳはβ細胞のアポトーシスを抑制することが証明された。また、本発明では、プロテインＳが糖尿病性腎症に有効であることが示された。従って、従来の薬剤に代えて、または従来の薬剤に加えてプロテインＳを用いることにより、糖尿病及び／または糖尿病性腎症または糖尿病合併症の進行を予防できる。
【０００７】
併用可能な薬剤としては、例えば、スルホニル尿素、グリニド、ビグアニド、チアゾリジンジオン、グリコシダーゼ、DPP-4、インクレチン及びナトリウム・グルコース輸送体２からなる群から選択される少なくとも一つの薬剤が例示される。具体的には、(a)スルホニル尿素（インスリン分泌促進）としては、グリメピリド、グリピジド、グリブリドが、(b)グリニド（インスリン分泌促進）としては、ナテグリニド、レパグリニドが、(c)ビグアニド（肝臓の糖産生低下）としては、メトホルミンが、(d)チアゾリジンジオン（グリタゾン）（インスリン抵抗性低下）としては、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンが、(e)グルコシダーゼ（糖吸収抑制）としては、アカルボース、ミグリトールが、(f)DPP-4 (ジペプチジルペプチダーゼ-4)阻害薬（糖によるインスリン分泌促進）としては、アログリプチン、リナグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチンが、(g)インクレチン製剤（糖によるインスリン分泌促進）としては、エクセナチド、リラグルチドが、(h)ナトリウム・グルコース輸送体2（尿路での糖排泄促進）としては、カナグリフロジン、ダパグリフロジンが、それぞれ併用薬として使用できる。
本発明の糖尿病治療薬または糖尿病性腎症治療薬の投与量としては、特に限定されないが、一人あたり0.1ｍg／ｋｇ・日〜10ｍg／ｋｇ・日（好ましくは0.5mg／ｋｇ・日〜5ｍg／ｋｇ・日）である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規な糖尿病治療薬及び／または糖尿病腎症治療薬を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】hPS-TGマウスがSTZ誘導糖尿病に対して抵抗性があることを示すグラフである。Ａ：STZ投与後の血糖値の推移を示すグラフ、B：グルコース投与後の血糖値の推移を示すグラフ、C：インスリン投与後の血糖値の推移を示すグラフ、Ｄ：グルコース投与後の血中インスリン濃度の推移を示すグラフである。
【図２】db/dbマウスにインスリンまたは生理食塩水を投与したときのインスリン感受性を調べた結果を示すグラフである。Ａ：インスリン投与後の血糖値の推移を示すグラフ、Ｂ：HOMA-IR試験の結果を示すグラフである。
【図３】L6ラット筋肉細胞、HepG2ヒト肝細胞及び3T3 L1マウス脂肪細胞にhPSを添加したときのインスリン感受性の変化を調べた結果を示すグラフである。Ａ：インスリン及び／またはhPSの有無によるグルコース取り込み（uptake）または放出（release）を示すグラフ、Ｂ：インスリン、hPS及び／または抗hPS抗体の有無によるグルコース取り込みまたは放出を示すグラフである。
【図４】hPS-TGマウスがβ細胞のアポトーシスを抑制することを示す写真図（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図５】hPS-TGマウスがβ細胞のアポトーシスを抑制することを示すグラフである。Ａ：インスリン染色領域、Ｂ：グルカゴン染色領域、Ｃ：アポトーシス領域の変化を示すグラフである。
【図６】hPS-TGマウスが炎症反応及びβ細胞のアポトーシスを抑制することを示す顕微鏡写真図（Ａ）及びグラフ（Ｂ，Ｃ）である。
【図７】hPSを投与すると膵島のアポトーシスが抑制されることを示すインビボ（in vivo）試験の結果である。Ａ：STZ投与後の血糖値の変化を示すグラフ、Ｂ：STZ/SAL群及びSTZ/hPS群におけるアネクシンV（Annexin V：アポトーシスの度合いを示す）及びPropidium Iodide（死細胞の核酸染色色素）の強度を示すグラフ、Ｃ：STZ/SAL群及びSTZ/hPS群における死細胞割合を示すグラフである。
【図８】hPSがβ細胞のアポトーシスを抑制することを示す結果である。左上はアネクシンV（Annexin V：アポトーシスの度合いを示す）及びPropidium Iodide（死細胞の核酸染色色素）の強度を示すグラフ、右上はアポトーシスした細胞割合を示すグラフ、中央は顕微鏡写真図、下段はhPSによってカスパーゼ３の切断が抑制されることを示すゲル濾過データ及びグラフである。
【図９】hPSがβ細胞のアポトーシスを抑制することを示す結果である。MIN6細胞のAkt/PKB及びIκBのリン酸化を増加することを示す結果である。Ａ：Akt/PKB、IκBのリン酸化をフローサイトメトリーで調べた図、グラフ化した図及びウェスタンブロット法の結果を示す図、Ｂ：BIRC3の発現をウェスタンブロットで調べた結果を示すグラフ、Ｃ：BIRC3の発現をRT-PCR法で調べた結果を示すグラフである。
【図１０】初代β細胞のAkt/PKB及びIκBのリン酸化がhPSによって促進されることを示すデータである。Ａ：Akt/PKBをフローサイトメトリーで調べた結果を示すグラフ、Ｂ：IκBをフローサイトメトリーで調べた結果を示すグラフである。
【図１１】３種類のTAM PS受容体（Tyro3, Axl, Mer）と、hPSによるアポトーシスとの関連をフローサイトメトリーで調べた結果を示すグラフである。
【図１２】３種類のTAM PS受容体（Tyro3, Axl, Mer）と、hPSによるアポトーシスとの関連について抗体を使ってフローサイトメトリーで調べた結果を示すグラフである。
【図１３】マウスBIRC（IAP）ファミリーに属する全遺伝子（BIRC1a, BIRC1b, BIRC2, BIRC3, BIRC4, BIRC5, BIRC6及びBIRC７）の発現の変化を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】siRNAを用いて特異的にBIRC遺伝子を抑制したときのアポトーシスの変化を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】hPS と、Blc2, Bax, BclxL及びApaf1の発現量との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１６】hPSが糖尿病性腎症の改善効果を示すことを確認した結果を示すデータである。Ａ：試験プロトコール、Ｂ：試験中の体重変化及び血糖値の変化を示すグラフ、Ｃ：組織中コラーゲン、ヒドロキシプロリン及び血中クレアチニン濃度を示すグラフ、Ｄ：尿中L-FABPを示すグラフ、Ｅ：TGFβ1及びポドシンの発現量を調べたグラフである。
【図１７】糸球体メサンギウム拡大（Mesangial expression）、線維化面積（Fibrotic area）及びアポトーシス面積（Apoptotic area）を調べた顕微鏡写真図及びグラフである。
【図１８】血中TAT量（凝固活性化マーカー）の変化を示すグラフである。
【図１９】hPSが糖尿病性腎症の改善効果を示すことを確認した別の試験結果を示すデータである。Ａ：試験プロトコール、Ｂ：試験中の血糖値の変化を示すグラフ、Ｃ：ヒドロキシプロリン、血中クレアチニン濃度及び尿中L-FABPを示すグラフ、Ｄ：糸球体メサンギウム拡大及び線維化面積を調べた顕微鏡写真図及びグラフである。
【図２０】凝固因子（TF）、線維素溶解（PAI-1）及びt-PAの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく、様々な形態で実施できる。
PSは、抗凝固因子として知られており、炎症やアポトーシスにも関与している。PSが糖尿病に及ぼす効果については、これまでのところ知られていない。本発明者は、野生型マウスとhPSを過剰発現するトランスジェニックマウス（hPS-TG）との間で糖尿病の進行を比較した。また、野生型マウスを用い、hPSの投与の有無が糖尿病性腎症の進行に与える影響、及び野生型マウスとhPS-TGとの間で糖尿病性腎症の進行が相違するかについて調べた。hPS-TGは、野生型マウスに比べると、血中グルコース濃度、グルコース耐性、インスリン感受性及びインスリン分泌において、有意に優れた結果を示した。ヒトの肥満型糖尿病に類似した症状を発現するインスリン非依存型(2型)糖尿病モデル動物・ホモ個体であるdb/dbマウス、マウス脂肪細胞、ラット筋肉細胞及びヒト肝細胞に対し、PSを投与すると、インスリン感受性が向上した。膵β細胞にPSを与えると、BIRC3及びBcL-2の発現量の増加、及びAkt/PKBの活性向上を伴い、有意にアポトーシスの抑制が認められた。PSを投与した糖尿病の野生型マウス及びhPS-TG糖尿病マウスは、コントロール群に比べて有意に糖尿病性腎症の進行が抑制された。健常者に比較すると、2型糖尿病患者は、有意に血中の遊離PS濃度が低かった。本研究によれば、PSはβ細胞のアポトーシスを抑制し、糖尿病性腎症の進行を抑える効果があることが分かった。
【００１１】
PSは、分子量69,000のビタミンK依存性に肝臓で産生される糖蛋白である。活性型プロテインC（APC）の阻害活性を数倍に高めることで抗凝固因子として働く。APCは直接的にプロトロンビナーゼ複合体およびテナーゼの活性を阻害するのに対して、PSはそれ自体が組織因子経路の阻害を刺激する。PSの抗凝固因子としての生理学的重要性は、先天性PS欠損症患者が重篤な血栓性合併症に苦しんでいる事実から説明される。抗凝固作用とは別に、PSはTyro3, Axl及びMer（TAM）チロシンキナーゼ受容体を介して、炎症反応およびアポトーシス経路を制御している。また、PSはin vitroでの多様な細胞およびLPS誘発急性肺障害マウスモデルにおいて、炎症性サイトカインの発現を抑制すると共に、APCの神経保護作用を示す（非特許文献１）。血漿中では、PSは遊離型と古典的補体活性経路のインヒビターであるC4b結合タンパク質（C4b-binding protein:C4BP）と結合した複合型として存在する。C4BPが細胞膜に局在化することによって、補体が活性化されて引き起こされる炎症をPSが抑制する可能性が報告されている。加えて、PSはマクロファージによるアポトーシス細胞のクリアランスを促進し、炎症・免疫反応を抑制する。さらに、PSは直接的にAkt伝達経路の活性化を介してアポトーシスを抑制する。本発明者は、PSの抗アポトーシス作用に注目し、PSが膵β細胞のアポトーシスを抑制することにより、糖尿病に対し保護的に働き、更に糖尿病性腎症の進展を抑制するとの仮説を証明した。
【００１２】
１．試験方法
＜被験者＞
血液サンプルは、血糖治療を受けている6名の1型糖尿病、26名の2型糖尿病患者、及び37名の健常者から採取した。各血液サンプル中のPS及びC4BP濃度を測定した（表１）。糖尿病患者は、いずれも糖尿病性神経障害及びその他の神経障害を発症していなかった。全患者及び健常者は、インフォームドコンセントを受け、試験プロトコールは、三重大学の倫理委員会によって承認された（No.2194）。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
＜被験動物＞
本発明者は、C57BL/6系マウスからホモ接合性ヒトPSトランスジェニックマウス（hPS-TG）を作製した（非特許文献２）。簡単に説明すると、次の通りである。CAGプロモータとウサギβグロビン・ポリアデニレーション部位を持つpCAGプラスミド（cytomegalovirus enhancer+chicken+β-actin promoter）に対し、全長hPS cDNAを組み込んだ。このプラスミドを所定の位置で切断し、精製後にC57BL/6Jマウスから得た受精卵にマイクロインジェクションし、サザンブロッティングによって形質転換マウスを検出した。hPS-TGの多くの器官はhPSを発現しており、血漿中hPS濃度は85±3μg/mlであった（非特許文献２）。野生型(WT)同腹仔を対照として用いた。WTとhPS-TGとの間で、膵島質量には相違が認められなかった。19-22gのオス野生型マウス（8-10週齢）と、31-33gのdb/dbオスマウス（6週齢）は、日本SLC（浜松市）から購入した。全動物は、特定病原体の無い環境で維持し、12時間毎の明暗サイクルを持つ三重大学動物施設で飼育した。本明細書中の試験は、動物試験のためのARRIVEガイドラインに従って実施した。各試験プロトコールは、三重大学動物調査委員会によって承認され(Approval No:24-50)、動物の処理手順は、施設のガイドラインに従って実施した。マウスは無作為に群分けされ、測定者は各群の詳細について知らされなかった。
【００１５】
＜糖尿病の誘導＞
糖尿病の誘導に対する感受性を評価するために、hPS-TG（hPS-TG/STZ）及び野生型同腹仔（WT/ STZ）に対し、200μL（40 mg / kg体重）のストレプトゾトシン（STZ：Sigma社製）を5日間連続して腹腔内投与した。対照マウスには、5日間連続して200μLの食塩水を腹腔内投与した（hPS/ SAL、WT/ SAL）。
＜糖尿病の評価＞
1週間に1回のSTZ投与（hPS TG/STZ, WT/STZ）または食塩水投与（hPS/SAL, WT/SAL）を4週間に渡って実施した後、空腹時血中グルコース濃度を測定した。STZまたは食塩水の投与から3週間目に、腹腔内グルコース（1g/kg体重）投与から16時間後に腹腔内グルコース耐性試験（IPGT）を実施した。血糖測定用として、0, 7, 14,21及び28日目に、尾静脈から血液サンプルを採取した。非絶食マウスに腹腔内インスリン（1U/kg体重）を投与することによってインスリン感受性試験を行い、16時間絶食後のマウスに腹腔内グルコース（3g/kg体重）を投与することによってインスリン分泌試験を行った。グルコースまたはインスリン濃度を測定するために、尾静脈から血液サンプルを採取した。全群の動物はSTZまたは生理食塩水投与から4週間後に屠殺し、組織化学染色に用いるために膵臓組織を切除した。
【００１６】
＜糖尿病性神経障害の誘導＞
hPS-TGマウス及びWT同腹仔に対して片側腎摘出術を行った後、4週間の回復期間を経過後に、WT（WT/STZ）及びhPS-TG（hPS-TG/STZ）に5日間連続してSTZを腹腔内投与し、更にhPS-TGについては、WTと同程度の糖尿病を誘導するために、5日間追加してSTZの腹腔内投与を行った。対照群（hPS TG/SAL, WT/SAL）については、同量の生理食塩水を腹腔内投与した。マウスは、STZまたは生理食塩水の投与から8週間後に屠殺した。また、別の試験において、片側腎摘出術を行ったWTマウスに対し、4週間の回復期間後に、5日間連続してSTZまたは生理食塩水の腹腔内投与を行い、4週間に渡って浸透圧ミニポンプからhPSまたは生理食塩水を経皮投与した。
＜組織処理及び染色＞
マウスは、ペントバルビタールの過剰投与によって安楽死させた後、膵臓と腎臓を取り出し、脱水及びパラフィン包埋し、3μm厚の切片に切断した後、膵臓についてはヘマトキシリン／エオシン（H＆E）染色及び免疫染色を、腎臓については過ヨウ素酸シッフ（PAS）とマッソン・トリクローム染色を、それぞれ実施した。治療群を知らされない測定者によって、H＆E染色した膵島の面積、及びPASまたはトリクロームで染色した糸球体（>30個／マウス）を、オリンパスBX50顕微鏡を用い、オリンパスDP70デジタルカメラ及びWinROOF画像処理ソフトを組み合わせて計算した。
【００１７】
＜免疫組織化学＞
インスリン、グルカゴン及びF4/80免疫染色は、DAKOコーポレーション（アメリカ・カリフォルニア州）及びノーバス・バイオロジカルズ（アメリカ・コロラド州）から入手した特異的抗体を用い、標準的な方法に従って、バイオパソロジー研究所にて測定した。上述のように、実験群を知らされない研究者によって、4個の膵臓切片（40〜50視野／マウス）からすべての可視膵島におけるインスリンまたはグルカゴンの免疫反応面積を測定した。
＜生化学的解析＞
血中グルコースは、グルコースオキシダーゼ法により、インスリンはALPCO診断（アメリカ・ニューハンプシャー州）のキットを使用して測定した。トロンビ・アンチトロンビン複合体（TAT：セダレーン研究所（カナダ・オンタリオ州））及び総プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（PAI-1： E1 / PAI-1、R＆D、アメリカ・ミネソタ州）は、EIAキット、総コラーゲン及びヒドロキシプロリンを用いて測定した。補体C4BPは、アッセイプロ（アメリカ・ミズーリ州）のEIAキットを用いて測定した。全hPSは既報に従って測定した（非特許文献２）。遊離hPSを測定するために、96穴マイクロプレートをC4BP（ATGen社：韓国Sampyeong洞）でコートし、洗浄及びブロッキング処理後、ビオチン標識ポリクローナルウサギ抗hPS抗体（DakoCytomation社：デンマーク・グロストラップ）を添加した。糖尿病性腎症の重症度を評価するマーカーである尿中肝臓型脂肪酸結合タンパク質（L-FABP）はEIAキット（R＆D）を用い、組織因子は一次ビオチン化抗体を使用したEIA（サンタクルーズバイオテクノロジー：米国・カリフォルニア州）を用い、組織プラスミノーゲンアクチベーター活性因子（tPA：イギリス・ノッティンガム）は発色基質（S-2288）を用い、それぞれ測定した。インスリン抵抗性を評価するためのホメオスタシス・モデル・アセスメント（HOMA-IR）は、既報に従い、HOMA-IR = [fasting insulin (μU/mL) × fasting glucose (mmol/L)]/22.5で求めた。
【００１８】
＜細胞培養＞
マウス膵β細胞株のMIN6は大阪大学から、L6ラット骨格筋肉細胞は神戸大学から、HepG2細胞は理研細胞バンクから、齧歯類3T3 L1及びラットRAW264細胞はATCCから、それぞれ入手し、10%熱非活性化FCSを含むDMEM（シグマ・アルドリッチ）中にて培養した。脂肪細胞への分化は、0.5mmol/l 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、4 mg/ml デキサメタゾン、1mg / mlインスリンおよび10％FCSで処理することにより誘導した。
＜グルコース取り込み／放出試験＞
細胞はDMEM（低濃度グルコース）+1％BSA中で6時間インキュベートし、高濃度グルコース（1g/L）含有DMEMに移した後、血漿由来hPS（20μg/ml：エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ、アメリカ・インディアナ州：純度95%以上）を添加し、30分後にインスリン（200 nM）を添加し4時間培養した。培養上清中のグルコース量は、グルコース比色アッセイキット（バイオビジョン）を用いて測定した。
＜初代マウス膵島細胞の単離＞
膵臓組織は、腹腔内にSTZまたは生理食塩水を投与し4週間後に安楽死させたマウス（WT及びhPS-TG）から摘出し、1〜2ミリメートルに切断した後、1mg/ml コラゲナーゼ中にて37°C、30分間インキュベートした。アッセイで使用する前に、遠心分離および再懸濁後、不連続パーコール勾配上に細胞を載置し、遠心分離した後、膵島細胞層を回収し、洗浄後にトリプシン／EDTA溶液を用いて分散させた。
【００１９】
＜アポトーシスの評価＞
膵島の組織学的サンプル中のアポトーシスは、市販のキット（ケミコン・インターナショナル：アメリカ・カリフォルニア州）を使用して、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識法（TUNEL）によって測定した。上述の通り、膵島内のTUNEL陽性細胞数は、サンプルの内容を知らない研究者によって、マウス当たり6切片（40-50視野）で計数した。初代膵β細胞及びMIN6 β細胞株をFITCアネクシンV（BDファルミンゲン）及びヨウ化プロピジウムで染色後、フローサイトメトリー（BDバイオサイエンシズ：イギリス・オックスフォード）で解析した。更に、MIN6 β細胞株のアポトーシスは、上記と同様の染色後に免疫蛍光顕微鏡によって評価した。アポトーシス・リピート含有バキュロウイルス・インヒビター（BIRC）3／アポトーシス・インヒビター（IAP）、B細胞リンパ腫2（Bcl-2）調節タンパク質ファミリー及びアポトーシス・プロテアーゼ活性化因子1（APAF1）のインヒビターのmRNA発現を測定した。
＜インスリン感受性及びβ細胞アポトーシスのin vivo での評価＞
外部投与したhPSのインスリン感受性に対する影響をdb/dbマウスで評価した。hPS（2mg/kg; n=5）または生理食塩水（n=5）を皮下投与した絶食db/dbマウスについて、0, 1, 2, 4及び6時間後にインスリン感受性試験及びHOMA-IR測定を実施した。STZによって誘導されたβ細胞アポトーシスに対するhPSの効果を in vivo で評価するために、野生型マウスに対し、外因性hPS（2mg/kg：n=6）または生理食塩水（n=6）をSTZ投与の1時間前に5日間に渡って経皮投与し、最後のSTZ投与から9日後に安楽死させた。膵島を採取し、トリプシン含有EDTA溶液中にて37℃でインキュベートし、優しく分散後に、アポトーシスをフローサイトメトリーで評価した。
【００２０】
＜マクロファージの表現型評価試験＞
hPS（20μg/ml）を添加または無添加にてRAW264.7細胞を30分間処理し、高濃度グルコースを添加または無添加にて24時間培養した。NOシンターゼ誘導M1マーカー及びM2マーカー・アルギナーゼ1の発現をRT-PCRで解析した。
＜TAM受容体媒介の評価＞
MIN6細胞を抗Tyro3、抗Axl、抗MerまたはアイソタイプIgGにて30分間処理後、20μg/ml hPS及び2mM STZを添加し、24時間培養した後、アポトーシスを調べた。全抗体にはヤギIgGを用い、R＆D（アメリカ・ミネソタ州）から購入した。
＜RIRC3ノックダウンの効果＞
MIN6細胞に33nmol BIRC3 siRNAまたはスクランブルsi RNAを導入し、hPSの添加または無添加にて30分間培養し、3mM STZの添加または無添加にて24時間培養した。アポトーシス細胞をフローサイトメトリーで調べた。
【００２１】
＜Akt/PKB及び NFκB 活性＞
MIN6細胞におけるAkt/PKB及びNFκBの活性をp-Akt/PKB、Akt/PKB、p-IκB、カ切断型カスパーゼ3及びβアクチン（セル・シグナリング：アメリカ・マサチューセッツ州）に対する抗体並びにヒト／マウスcIAP-2/HIAP-1に対する抗体（R＆D：アメリカ・ミネソタ州）を用いた一般的な方法を実施した後にウェスタンブロットで調べた。初代膵β細胞にhPSを添加したときのAkt/PKB 及び NFκBの活性を抗hPSの添加または無添加にて、フローサイトメトリーで調べた。
＜遺伝子発現解析＞
トリゾール試薬（インビトロージェン：アメリカ・カリフォルニア州）によって膵組織から全RNAを抽出し、オリゴdTプライマーを用いて逆転写酵素で処理し、スーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システムキット（インビトロージェン）を用いたPCRで増幅した。アプライド・バイオシステム・ステップ・ワン・リアルタイム・PCRシステム、タックマン・マスター・ミックス及びSYBRグリーンを用いて、定量的増幅反応を行った。表２には、プライマーの塩基配列を示した。データは、アプライド・バイオシステムズの7500ソフトウェアで解析し、遺伝子発現は、GAPDH転写レベルで標準化した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
＜統計解析＞
データは特記しない限り、平均値±標準誤差（S.E.M）で示した。複数の群間における統計的な差は、テューキー法を使用し、事後解析を用いたANOVAによって計算し、2群間における差違は、マン・ホイットニーU検定によって計算した。統計解析には、マッキントッシュ用スタット・ビュー（StatView）4.1パッケージ・ソフトウェア（アバカス・コンセプト：アメリカ・カリフォルニア州）を用いた。危険率5%未満（p＜0.05）を統計的に有意とした。
【００２４】
２．試験結果
＜糖尿病患者の血中には遊離型hPSが少ない＞
2型糖尿病患者と健常者との間において、BMI及び年齢には有意差が認められなかった（表１）。血中遊離型hPS濃度は、1型糖尿病患者と2型糖尿病患者のいずれにおいても、健常者との間で有意に少なく、C4BP濃度は2型糖尿病患者において有意に高値であった。性差については、有意差は認められなかった。2型糖尿病患者において、遊離型PSとヘモグロビンA1c（HbA1C）との間には有意な負の相関が認められ、C4BPとHbA1cとの間には有意な正の相関が認められた（表３）。2型糖尿病患者において、年齢は遊離型PSとC4BPにおいて有意な相関を示した。1型糖尿病患者においては、パラメータ間で有意差は認められなかった（表４）。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
【表４】
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【００２７】
＜hPS TGマウスは、STZ誘導糖尿病に対する抵抗性が強い＞
hPS-TGマウスと野生型マウスに対し、STZで糖尿病を誘導し、糖尿病の重症度を比較した。マウスに5日間連続でSTZまたは生理食塩水を、腹腔内注射した。A. STZまたは生理食塩水を注射後の血糖値の推移(WT/SAL n=3, hPS/SAL n=4, WT/STZ n=7, hPS TG/STZ n= 6)、B. STZ注射3週間後に16時間絶食下で行った腹腔内注射ブドウ糖負荷試験( WT/SAL n=3, hPS/SAL n=3, WT/STZ n=7, hPS TG/STZ n= 7) 、C. インスリン感受性試験 (WT/SAL n=3, hPS/SAL n=3, WT/STZ n=5, hPS TG/STZ n= 3) 、D. 16時間絶食下でブドウ糖腹腔内投与後の血清インスリン濃度(WT/SAL n=3, hPS/SAL n=4, WT/STZ n=7, hPS TG/STZ n=5)を示す。データは全てmean±S.E.M.で示し、3回の独立した実験より代表的な結果を示した。また、グラフ中、WTは野生型; STZはストレプトゾトシン; hPSはプロテインS; SALは生理食塩水を示す。また、統計的有意性は、*p＜0.005 vs hPS/STZ; ‡p＜0.01 vs WT/SALを示した。
図１Ａに示すように、初回のSTZ投与から14、21及び28日後の非絶食時における血中グルコース濃度は、野生型マウスに比べ、hPS-TGマウスでは有意に低下した。STZ投与から7日後には、野生型マウスにSTZを投与したときの血中グルコース濃度は、生理食塩水を投与したコントロール野生型マウスに比べ有意に増加した。一方、STZ投与から21日後には、hPS-TGマウスにSTZを投与した群では、生理食塩水を投与したhPS-TGマウスに比べ、有意に増加した。IPGT試験の結果、全地点において、STZ投与hPS-TGマウスは、STZ投与野生型マウスに比べ、有意に血糖値が低下した。また、STZを投与したhPS-TGマウスと野生型マウスは、生理食塩水を投与したマウスに比べ、有意に血糖値が上昇した（図１Ｂ）。グルコース投与後のインスリン感受性試験において、STZを投与した野生型マウスは、STZを投与したhPS-TGマウスに比べ、有意に血糖値が高く（図１Ｃ）、腹腔内グルコース投与から30分後の血中インスリン濃度は、STZ投与野生型マウスに比べ、hPS-TGマウスの方が有意に高かった（図１Ｄ）。
＜hPSを投与するとインスリン感受性が改善する＞
hPSを投与したdb/dbマウスでは、コントロールマウスに比べ、インスリン投与から15分後においてインスリン感受性が有意に改善し、その状態が持続した。hPSを投与したdb/dbマウスは、HOMA-IRにおいても改善傾向を示したが、有意的な差違は認められなかった（図２）。
図３Ａには、L6ラット筋肉細胞, 3T3-L1脂肪細胞 HepG2細胞を低グルコース培地および高グルコース(1g/L)培地でインスリンのみ(200 nM)、hPSのみ(20 μg/ml)または両方存在下で4時間培養し培地中のグルコース濃度を測定した結果を、Ｂには、インスリンおよびhPSで刺激する前に抗hPS抗体(20μg/ml)を加えた結果を示した。2回の独立した実験のうち代表的なデータを示した。図中、1群はｎ=3であり、 *p＜0.005 vs insulin (-), hPS (-);**p＜0.05 vs insulin (+), hPS (-); ‡p＜0.02 vs insulin (-), hPS (-), anti-hPS (-); ¶p＜0.01 vs insulin (+), hPS (-), anti-hPS (-); §p＜0.001 vs insulin (+), hPS (+), anti-hPS (-).を意味する。
L6ラット筋肉細胞、HepG2ヒト肝細胞及び3T3 L1マウス脂肪細胞にhPSを添加すると、インスリン感受性が改善した（図３Ａ）。hPSの効果は、抗hPS抗体によって阻害されたので、特異的なものであることが確認された（図３Ｂ）。
【００２８】
＜hPS-TGマウスは、炎症反応及び膵島β細胞のアポトーシスを抑制する＞
図５には、STZまたは生理食塩水を腹腔内注射して28日後に膵臓を摘出し、インスリン(緑)・グルカゴン(赤)の二重免疫染色を行った(各群当たりn=3) 。TUNEL法によりアポトーシス細胞の染色を行った (WT/SAL n=3; hPS/SAL n=3; WT/STZ n=6; hPS/STZ n=6)。インスリン、グルカゴン、アポトーシス陽性細胞の面積についてソフトウェア(WinROOF)を用いて定量化した。比較のためWT/SALの平均値を100％とした。 データは、全て平均±S.E.M.で示し、3回の実験のうち代表的なデータを示した。図中、WT, 野生型; STZ,ストレプトゾトシン; hPS,プロテインＳ; SAL, 生理食塩水を示す。統計的相違は、 *p＜0.05 vs WT/SAL 及びhPS/SAL群; **p＜0.05 vs WT/STZ群を示す。
STZ投与から28日後に屠殺後のSTZ投与野生型マウスは、生理食塩水投与野生型マウス、生理食塩水投与hPSマウス及びSTZ投与hPSマウスに比べると、膵島面積及びインスリン特異的染色領域が有意に減少し（図４）、アポトーシス細胞の領域が有意に増加した（図５）。STZ投与野生型マウスは、生理食塩水投与野生型マウスに比べると、有意にインスリン染色領域の減少とグルカゴン染色領域の増加が認められたが、生理食塩水投与hPS-TGマウスとSTZ投与hPS-TGマウスとの間には有意差は見られなかった（図５）。
STZ投与野生型マウス及び生理食塩水投与野生型マウスに比べ、STZ投与hPSマウスでは、膵島へのマクロファージの浸潤が有意に減少したものの、生理食塩水投与hPSマウスとSTZ投与hPSマウスの間には有意差は見られなかった（図６Ａ，Ｂ）。インビトロでは、hPSはM2型マクロファージの分化を促進した（図６Ｃ）。
＜インビボにおいて、hPSを投与すると膵島のアポトーシスが抑制される＞
C57BL/6野生型マウスに対し、STZ投与中及び投与後に、hPSまたは生理症塩水を皮下投与した後、膵臓細胞のアポトーシスを調べた。hPSを投与したマウスでは、生理食塩水を投与したコントロールに比べ、有意にβ細胞のアポトーシスが抑制された（図７Ａ，Ｂ，Ｃ）。
＜hPSは、アポトーシスを抑制し、膵β細胞のAkt/PKB及びNFκBを活性化する＞
図８及び図９には、hPS(20μg/ml)または生理食塩水の存在下で、STZによりマウスβ細胞株MIN6のアポトーシスを誘導し、アネクシン-FITCおよびヨードプロピディウムで染色しフローサイトメトリーで評価した結果を示した。フローサイトメトリー（図８左上）、蛍光顕微鏡（図８中央）の結果を示した。hPS(20μg/ml)で30分間、60分間処理した後に Akt/PKB、IκBのリン酸化をフローサイトメトリー (図９Ａ) および ウェスタンブロット法(図９Ｂ)で評価した。また、mBIRC3の発現をウェスタンブロット法で解析した(図９Ｂ)。野生型およびhPS TGマウスより糖尿病誘発後に膵島細胞を単離し、mBIRCの発現を定量的RT-PCR法で評価した(９Ｃ)。データは、全て平均値±S.E.Mで示し、3回の独立した実験の内で代表的なデータを示した（各群ｎ=3）。図中、STZ, ストレプトゾトシン; hPS,プロテインＳ; SAL, 生理食塩水SAL/SAL,生理食塩水のみ; hPS/SAL,プロテインＳで前処置し生理食塩水を投与; SAL/STZ,生理食塩水で前処置後にSTZを投与; hPS/STZ, hPSで前処置後にSTZを投与したことを示す。また、統計マーカーは、*p＜0.05 vs SAL/SAL and hPS/SAL groups; **p＜0.05 vs SAL/STZ group; ¶p＜0.05 vs hPS (-)を示す。
MIN6細胞をhPSで前処理すると、コントロールに比べ、STZを投与したときのアポトーシスは有意に抑制され、カスパーゼ3の切断はhPSによって有意に抑制された（図８）。MIN6細胞のAkt/PKB及びIκBのリン酸化は、コントロールに比べ、hPSで処理すると有意に増加した（図９Ａ）。初代β細胞のAkt/PKB及びIκBは、hPSによってリン酸化が有意に促進された（図１０Ａ，Ｂ）。MIN6細胞は、3種類のTAM PS受容体を発現していたが（図１１）、このうちMerのみがhPSによるアポトーシスの抑制効果を仲介した（図１２Ａ，Ｂ）。
【００２９】
＜hPSは、IAP及びBcl2タンパク質を制御する＞
STZ単独、hPS単独及びSTZとhPSの両者で処理したMIN6細胞において、マウスBIRC（IAP）ファミリーに属する全遺伝子の発現の変化を調べた。BIRC1b及びBIRC3のmRNA発現量は、生理食塩水で処理した細胞(SAL/SAL)に比べ、hPSで処理した細胞では(hPS/SAL)有意に増加した。STZ投与前に生理食塩水で処理した細胞(SAL/STZ)に比べ、hPSで処理した細胞(hPS/STZ)では、BIRC3の発現量は有意に増加し、BIRC1bは増加傾向（p=0.05）を示した（図１３）。ウェスタンブロットによれば、コントロールに比べるとhPSで処理したMIN6細胞(hPS/SAL, hPS/STZ)では、BIRC3のmRNA発現量が有意に増加した（図９B）。BIRC3をsiRNAによって特異的にブロックすると、hPSが示すMIN6細胞のアポトーシス抑制効果は減少した（図１４Ａ，Ｂ，Ｃ）。STZで処理した野生型マウス（WT/STZ）から単離した細胞に比べ、STZで処理したhPS-TGマウス（hPS-TG/STZ）から単離した細胞では、BIRC3のmRNA発現量は有意に増加した（図９C）。MIN6細胞を用いたインビトロ試験では、hPSはアポトーシスを抑制するBcL2の発現を増加したが、細胞内にあるタンパクであってアポトーシスを進行させるBaxの発現を抑制した（図１５）。
【００３０】
＜hPSは、糖尿病性糸球体硬化症を改善する＞
次に、hPSが示すβ細胞のアポトーシス抑制効果とは別に、糖尿病性腎症の改善効果を示すかどうかを調べた。
図１６Ａに示すように、片腎摘出マウスにSTZ(40mg/kg)を腹腔内注射し、4週後より皮下ポンプ埋め込みによりhPSを投与した。体重と血糖値の推移を（図１６Ｂ）、腎組織中のコラーゲンとヒドロキシプロリンを比色分析法で測定した結果を（図１６Ｃ）、糸球体メサンギウム領域の拡大をPAS染色（図１７上段４枚）、コラーゲン沈着をマッソン・トリクローム染色(図１７中段４枚)で、 アポトーシスをTUNEL法(図１７下段４枚)で評価した。定量化はソフトウェア(WinROOF)を用いて行った。比較のためSAL/SAL群を100％とした。腎組織で TGFβ1、podocin のmRNA発現をRT-PCR により（図１６Ｅ）、血漿中TATをELISAにより測定した（図１８）。データは、全て平均値±S.E.Mで示した。顕微鏡写真中のスケールバーは20 μmである。2回の実験を行い代表的なデータを示した。各群についてN=5であった。図中、WT,野生型; STZ,ストレプトゾトシン; hPS, プロテインS; SAL, 生理食塩水をそれぞれ示す。
【００３１】
野生型C57BL/6マウスの片側の腎臓摘出手術を行い、術後に完全に回復期間を経過した後、STZによる糖尿病を誘導した。コントロールには、生理食塩水を投与した。STZまたは生理食塩水を投与後4週間して、同等の糖尿病の重症度を示すSTZ投与術後hPS群（STZ/p-hPS）とSTZ投与術後生理食塩水群（STZ/p-SAL）及び糖尿病を持たない生理食塩水投与術後hPS群（SAL/p-hPS）と生理食塩水投与術後生理食塩水群（SAL/p-SAL）の4群に対し、次の4週間に渡って、浸透圧ミニポンプを用い皮下にhPSまたは生理食塩水を投与した（図１６Ａ）。生理食塩水を与えた群に比べ、STZを投与した2群（STZ/SAL及びSTZ/hPS）は、糖尿病を発生し、有意な体重減少と血糖値上昇を示した。このとき、STZを投与した2群（STZ/SAL及びSTZ/hPS）間においては、有意な体重の相違が認められたが、血糖値には相違が無かった（図１６Ｂ）。腎組織中コラーゲンとヒドロキシプロリン、血中クレアチニン、L-FABP、腎組織PAS染色領域及びアポトーシス細胞領域において、STZ/SAL群は、STZ/hPS群に比べて有意に増加した（図１６Ｃ，Ｄ、図１７）。コントロール群及びSTZ/hPS群に比べ、STZ/SAL群では、TGFβ1 mRNA発現量が有意に増加し、ポドシンの発現量が有意に低下した（図１６Ｅ）。一方、凝固活性化マーカーのTAT量には、相違がなかった（図１８）。
【００３２】
別の実験において、片側腎摘出手術を受けたhPS-TGマウス（hPS/STZ）及び野生型マウスにSTZ（WT/STZ）で糖尿病を誘導する際に、血糖値に基づく糖尿病の重症度を同等とするために、前者のマウスに対するSTZ投与量は、後者のマウスに対するSTZ投与量よりも大量とした（図１９Ａ）。予想通り、WT/STZとhPS/STZの間で血糖値の相違は認められなかった（図１９Ｂ）。一方、血糖値、血漿クレアチニン、L-FABP及び腎ヒドロキシプロリンが同程度のレベルであったにも拘わらず、糸球体メサンギウム拡大とコラーゲン沈着は、WT/STZに比べ、hPS/STZでは有意に減少した（図１９Ｂ，Ｃ）。また、hPSは、STZによって起こる線維化を大幅に抑制できることが分かった（図１９D右側）。このため、糖尿病によって起こされる線維症（腎線維症、肺線維症など）に対しても有効である。また、腎組織中において、F4/80+マクロファージシグナルは、各群間において有意差は認められなかった。凝固因子（TF）及び線維素溶解（PAI-1、t-PA）マーカーについては、有意差は見られなかった（図２０）。
【００３３】
上記実施形態に示すように、hPSは、膵島β細胞のアポトーシスを抑制し、糖尿病合併症の進展を抑制することが分かった。
＜hPSはアポトーシスを抑制することによって糖尿病の増悪を抑える＞
hPSは、分子量69kDAの糖タンパク質であり、抗凝固・抗炎症及び抗アポトーシス活性などの生物活性を示す。具体的には、白血球からのサイトカイン（IL-6, TNFα）やケモカイン（MCP-1）の放出抑制、マクロファージの貪食作用によるアポトーシスの抑制、TAM受容体やAkt/PKBを介したアポトーシスの抑制などのメカニズムを介して、上記生物活性を発現する。本発明者によれば、PSは上記メカニズムに基づき、STZが誘導する糖尿病マウスの実験を介して、糖尿病及び糖尿病合併症を抑制することが示された。特に、hPSが糖尿病によって起こされる膵島β細胞のアポトーシスを抑制する点については、初めての知見である。
【００３４】
＜hPSによるアポトーシスの制御＞
β細胞のアポトーシスは、特に１型糖尿病では重要な現象であることが知られているが、2型糖尿病では、その関連は明確ではない。2型糖尿病では、インスリン抵抗性、高インスリン濃度及びβ細胞の過形成が認められる。臨床的には、相対的なインスリン欠乏が認められる。これは、β細胞が大量にアポトーシスを起こすことに依ると考えられる。β細胞のアポトーシスは、アポトーシス誘導因子と抗アポトーシス因子とのバランスのずれによって起こると考えられ、具体的にはカスパーゼ3によって活性化された3種類のアポトーシスを誘導する経路（Tyro3, Axl, Mer）の影響が存在している。糖尿病によるβ細胞のアポトーシスを抑制する経路としては、Akt/PKB経路、NFκβ経路、並びにIAPタンパク質及びBcl-2ファミリー中のいくつかのタンパク質が関与する経路が存在する。このうち、hPSがTAM受容体/Akt/PKBシグナルによるアポトーシス経路を抑制することが知られているが、IAP又はBcl-2ファミリータンパク質に対する知見はなかった。今回の試験により、hPSがβ細胞において、カスパーゼ3の活性化を抑制し、Akt/PKB及びIκBのリン酸化を増加させ、抗アポトーシス因子（BIRC3及びBcl-2ファミリータンパク）の発現を増加させ、アポトーシス誘導因子（Bax）の発現を減少させることが示された。また、hPSによる抗アポトーシス効果は、抗Mer受容体抗体によって阻害された。（図１２Ａ、Ｂ）これらの結果は、hPSが、Akt/PKB及びNFκBシグナルの活性化を増強し、IAP及びBcl-2タンパク質の発現を誘導することでTAM受容体のうち主にＭｅｒを介したメカニズムに基づき、糖尿病によって誘導されるβ細胞のアポトーシスを抑制することを示している。
【００３５】
＜hPSはインスリン抵抗性を抑制する＞
2型糖尿病の特徴として、インスリンの過放出とインスリン抵抗性の増加が認められ、筋肉及び脂肪細胞への血中グルコースの取り込み低下、肝臓からのグルコース放出の減少が伴う。Akt/PKB経路は、インスリン感受性及び血中グルコース濃度の恒常性の維持に重要である。β細胞からのインスリン放出とは別に、Akt/PKB経路の活性化が、グリコーゲ・シンターゼ・キナーゼ3の非活性化・グルコース・トランスポーターの発現増加・6-ホスホフルクト-2-キナーゼの活性化による解糖系の活性化によって、グルカゴン合成を増加する。これらのメカニズムを介して、Akt/PKBは周辺組織において、インスリン感受性を増強する。hPSを全身投与すると、低減したHOMA-IR値を示すdb/dbマウスのインスリン感受性を向上し、脂肪細胞・骨格筋及び肝細胞に対するインスリンの効果を増強することにより、インスリン抵抗性を改善することを示した。（図２、３）こうして、hPSはAkt/PKB経路を活性化することにより、インスリン感受性を改善することが分かった。
【００３６】
＜hPSは糖尿病性糸球体硬化症を改善する＞
糸球体基底膜の肥厚を伴うマトリックスタンパク質の腎沈着、メサンギウム拡大及び結節性硬化症は、糖尿病性腎症の特徴である。TGF-β1などの成長因子及びケモカインは、腎細胞の糸球体のアポトーシスに続く筋線維芽細胞からのマトリックスタンパク質の放出を刺激する。今回の試験によれば、hPSは、β細胞の保護機能とは別に、糖尿病性腎症を保護することが明らかとなった。後者のメカニズムについては、明らかではないものの、糸球体細胞のアポトーシスを抑制することが関連している可能性がある。
【００３７】
＜臨床的応用について＞
今回の試験によって、（１）1型糖尿病及び2型糖尿病患者において、遊離PS濃度が有意に減少していること、及び（２）2型糖尿病患者において、HbA1c値と遊離PSが有意な逆相関を示すことの二点を見出した。遊離PSとHbA1cが有意な逆相関を示すことから、遊離PS濃度が低いことと糖尿病患者の臨床像とが関連しているものと考えられる。すなわち、遊離PS濃度を増加する方策を採用することによって、糖尿病患者の重篤性を解消したり、治療に結びつけられる可能性が高い。そのような方策としては、例えばPSを投与すること、PSとC4bpとの結合を阻止する抗C4bp抗体を投与すること、PSの発現量を増加させる薬剤を投与することなどが例示される。
このように本実施形態によれば、新規な糖尿病治療薬及び／または糖尿病腎症の合併症治療薬を提供できた。
【００３８】
なお、本実施形態については、次のように変形して実施できる。
（１）本実施形態では、hPS（ヒト・プロテインS）を中心として、生物活性を調べたが、96％以上の相同性を備え、PSと同等の生物活性を有するタンパク質を用いて実施できる。相同性については、例えばNCBI＜http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi＞などで計算できる。相同性が高いと類似の生物活性を有し、相同性が低くなると別の生物活性を持つことが知られている。
（２）本実施形態では、PS及びPSと96％以上の相同性を備え、同等の生物活性を有するタンパク質（以下、「PS等」という）と、所定の併合薬を用いることができる。そのような併合薬としては、例えばスルホニル尿素、グリニド、ビグアニド、チアゾリジンジオン、グリコシダーゼ、DPP-4、インクレチン及びナトリウム・グルコース輸送体２からなる群から選択される少なくとも一つの薬剤が例示される。具体的には、(a)スルホニル尿素（インスリン分泌促進）としては、グリメピリド、グリピジド、グリブリドが、(b)グリニド（インスリン分泌促進）としては、ナテグリニド、レパグリニドが、(c)ビグアニド（肝臓の糖産生低下）としては、メトホルミンが、(d)チアゾリジンジオン（グリタゾン）（インスリン抵抗性低下）としては、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンが、(e)グルコシダーゼ（糖吸収抑制）としては、アカルボース、ミグリトールが、(f)DPP-4 (ジペプチジルペプチダーゼ-4)阻害薬（糖によるインスリン分泌促進）としては、アログリプチン、リナグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチンが、(g)インクレチン製剤（糖によるインスリン分泌促進）としては、エクセナチド、リラグルチドが、(h)ナトリウム・グルコース輸送体2（尿路での糖排泄促進）としては、カナグリフロジン、ダパグリフロジンが、例示される。
（３）本実施形態によれば、PS等は、糖尿病及び／または糖尿病合併症（例えば、糖尿病性腎症、腎線維症、肺線維症、脳卒中、心筋梗塞、心不全、末梢血管障害及び腎障害など）に有効である。
（４）PS等の投与形態としては、腹腔内投与、皮下投与について実施したが、これ以外の投与形態（例えば、筋肉内、静脈内、気管支内、肝臓内、子宮内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻内、経皮など）を用いても同様の効果を奏することができる。また、PS等の投与量としては、特に限定されないが、例えば、一人あたり0.1mg／kg・日〜10mg／kg・日（好ましくは0.5mg／kg・日〜5ｍg／kg・日）である。上記してきた実験で用いたマウスへのhPS投与量が２ｍｇ／ｋｇ・日であることから効果をもたらす量として強く推定されるが、最終的な最適投与量範囲は臨床試験を待つことになる。
（５）PS等は、線維症の予防・治療についても有効である（例えば、図１９Ｄの右側を参照）
（６）血中でC4bpと結合していない遊離型PS等を増やすことにより、PS等の効果を増強させたり、PS等の投与量軽減（またはPS等の投与をなくす）を行える。そのような方策として、例えば抗C4bp抗体をPS等と共に、またはPS等に代えて投与することが例示される。この方策により、上記実施形態と同様に、糖尿病及び／または糖尿病合併症の改善と同等の効果が期待できる。
（７）PS等に代えて、または併用してGAS6（growth-arrest specific gene 6）を投与することで、膵β細胞アポトーシスの抑制を期待できる。GAS6は、PS等と非常に類似した構造を持っており、PS等と類似の生物活性を持っていることから、本実施形態の知見を用いれば、GAS6を糖尿病及び／または糖尿病合併症の治療薬として用いられることが理解される。
以上のように、PS等の生物活性を有するタンパク質を糖尿病または糖尿病の合併症に用いることにより、糖尿病および糖尿病合併症の予防や、発症後においても進行、増悪化を抑えることができ、患者数の削減や発症患者の負担軽減、寿命延長等に大きな効果を奏するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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