(57)【要約】【課題】  ＰＤＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ）技術の重大な課題である残留光毒性の問題を解決可能な光応答性細胞殺傷剤および光線力学療法用薬剤を提供する。【解決手段】  本発明の光応答性細胞殺傷剤は、ヘテロ５員環をアリール基として有するジアリールエテン化合物を有効成分として含み、前記化合物は、特定の第１の波長の光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化し、前記閉環体は、前記第１の波長とは異なる第２の波長の光照射によって細胞毒性を示す化合物であり、前記閉環体は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の光照射によって、開環体に異性化して前記細胞毒性が無害化されることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ５員環をアリール基として有するジアリールエテン化合物を有効成分として含み、
前記化合物は、特定の第１の波長の光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化し、
前記閉環体は、前記第１の波長とは異なる第２の波長の光照射によって細胞毒性を示す化合物であり、
前記閉環体は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の光照射によって、開環体に異性化して前記細胞毒性が無害化されることを特徴とする光応答性細胞殺傷剤。
【請求項２】
前記ジアリールエテン化合物が窒素を含んでいることを特徴とする、請求項１記載の光応答性細胞殺傷剤。
【請求項３】
前記ジアリールエテン化合物が、開環体が下記の一般構造式で表されるジアリールエテン化合物である、請求項２記載の光応答性細胞殺傷剤。
【化１】
2017001964.tif 000016
上記一般構造式において、Ｘのうち１か所以上が窒素Ｎであり、ｎ＝１またはｎ＝２であり、Ｒは各々独立にアルキル基またはアルコキシ基を表す。
【請求項４】
前記ジアリールエテン化合物が、開環体が下記の構造式で表されるジアリールエテン化合物の少なくとも一つであることを特徴とする、請求項２記載の光応答性細胞殺傷剤。
【化２】
2017001964.tif 000017
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の光応答性細胞殺傷剤を含むことを特徴とする、光線力学療法用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光応答性細胞殺傷剤および光線力学療法用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ジアリールエテン類を細胞培養、死滅、特性制御等の分野に適用する技術の開発が進んでいる。例えば、ジアリールエテン構造を含む光応答性基を有し、光照射によって照射部の細胞接着性が変化する温度応答性高分子を用いた細胞培養基材および細胞培養方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、特定のジアリールエテン化合物と白金（Ｐｔ）との錯体が、光照射によってジアリールエテン化合物の構造変化を生じ、この構造変化によってＤＮＡとの相互作用およびがん細胞死滅能が変化することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、がんなどの腫瘍、血管新生など、細胞の異常による疾患の先端的な治療法として、光線力学療法（Ｐｈｏｔｏ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ）が開発されている。このＰＤＴ技術は、ポルフィリン骨格を有する化合物を患者に注射した後、患部に集まった当該化合物に光照射することにより、患部の異常細胞を死滅させるもので、種々のがんや加齢黄斑変性などへの臨床適用がすでになされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−８８３１６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２０１５，５４，ｐ４５６１−ｐ４５６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現状のＰＤＴ技術においては、毒性あるいは外部刺激応答性が高い化合物が体内に残存するため、患者は、例えば３日から６週間という長時間に亘り外光照射を避けなければならない。このように、ＰＤＴ技術等の先端医療技術においては、患者に大きな負担を与えているという重大な課題が未解決である。そこで、本発明は、従来のＰＤＴ技術の重大な課題である残留光毒性の問題を解決可能な光応答性細胞殺傷剤および光線力学療法用薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の光応答性細胞殺傷剤は、ヘテロ５員環をアリール基として有するジアリールエテン化合物を有効成分として含み、前記化合物は、特定の第１の波長の光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化し、前記閉環体は、前記第１の波長とは異なる第２の波長の光照射によって細胞毒性を示す化合物であり、前記閉環体は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の光照射によって、開環体に異性化して前記細胞毒性が無害化されることを特徴とする。
【０００９】
本発明の光応答性細胞殺傷剤において、前記ジアリールエテン化合物が窒素を含んでいることが好ましい。
【００１０】
本発明の光応答性細胞殺傷剤において、前記ジアリールエテン化合物としては、開環体が下記の一般構造式で表されるジアリールエテン化合物を用いることができる。下記の一般構造式において、Ｘのうち１か所以上が窒素Ｎであり、フルオロシクロアルケン部分はフルオロシクロペンテン（ｎ＝１）またはフルオロシクロヘキセン（ｎ＝２）である。Ｒは、各々独立に、メチル基、エチル基などのアルキル基やメトキシ基などのアルコキシ基を表す。
【化１】
2017001964.tif 000002
【００１１】
前記一般構造式のジアリールエテン化合物は開環体であるが、紫外光の照射により閉環体に異性化する。またこの開環体は、可視光の照射により開環体に異性化する。前記一般構造式のジアリールエテン化合物の開環体の、開環／閉環反応を次式に示す。
【化２】
2017001964.tif 000003
【００１２】
本発明の光応答性細胞殺傷剤において、前記ジアリールエテン化合物として、開環体が下記の構造式で表されるジアリールエテン化合物の少なくとも一つであることが好ましい。
【化３】
2017001964.tif 000004
【００１３】
本発明の光線力学療法用薬剤は、前記本発明の光応答性細胞殺傷剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、従来のＰＤＴ技術の重大な課題である残留光毒性の問題を解決可能な光応答性細胞殺傷剤および光線力学療法用薬剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に用いることのできるジアリールエテン化合物の一例の開環体（１ｏ）のＵＶ光照射前後のエタノール／水混合溶媒（体積比７／３）中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体（１ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（１ｃ）の吸収スペクトルである。
【図２】図２は、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）をコーティング処理した基材表面に播種したＭＤＣＫ細胞の光によるダメージの様子を示した写真である。図２（ａ）は、光照射前、図２（ｂ）は４３６ｎｍの光照射中、図２（ｃ）は、４３６ｎｍの光照射後の基材表面の写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、ジアリールエテン化合物を含有するポリマーの一例の開環体ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）のＵＶ光照射前後の吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体ｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）の吸収スペクトルである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）をコーティング処理した基材表面に播種したＭＤＣＫ細胞の、光照射による影響を示した図である。
【図４】図４は、ＤＮＡ−ＥＢ錯体に、ジアリールエテン化合物の開環体（１ｏ）または閉環体（１ｃ）の濃度を５μＭから２５μＭの範囲で変えて加えたときの蛍光強度の推移（Ｉ０／Ｉ）を示すグラフである。
【図５】図５は、細胞死（アポトーシス）のメカニズムの解析結果を説明する図であり、ＭＤＣＫ細胞の光によるダメージの様子を示した写真である。図５（ａ）はカスパーゼ阻害剤を添加していない状態、図５（ｂ）はカスパーゼ阻害剤を添加している状態での、光照射後のＭＤＣＫ細胞を観察した結果である。
【図６Ａ】図６Ａは、ジアリールエテン化合物の開環体（２ｏ）のＵＶ光照射前後のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体（２ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（２ｃ）の吸収スペクトルである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ジアリールエテン化合物の開環体（６ｏ）のＵＶ光照射前後のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体（６ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（６ｃ）の吸収スペクトルである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ジアリールエテン化合物の開環体（７ｏ）のＵＶ光照射前後のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体（７ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（７ｃ）の吸収スペクトルである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ジアリールエテン化合物の開環体（８ｏ）のＵＶ光照射前後のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体（８ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（８ｃ）の吸収スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
つぎに、本発明について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載により制限されない。
【００１７】
本発明の光応答性細胞殺傷剤は、光照射によって開環／閉環反応が起こる、ヘテロ５員環をアリール基として有するジアリールエテン化合物を有効成分として含んでいる。前記化合物は、閉環体が細胞毒性を有しており、開環体が細胞毒性を有していないという特徴を有する。前記化合物は、第１の波長の光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化する。前記閉環体は、前記第１の波長とは異なる第２の波長の光照射によって細胞毒性を示す。そして、前記閉環体は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の光照射によって、開環体に異性化する。すなわち、前記閉環体は、前記第３の波長の光照射によって、前記細胞毒性が無害化される。
【００１８】
本発明に用いることのできるジアリールエテン化合物の一例の開環体（１ｏ）と、その閉環体（１ｃ）との開環／閉環反応を次式に示す。前記ジアリールエテン化合物開環体（１ｏ）は、紫外光の照射により閉環体（１ｃ）に変換される。また、この閉環体（１ｃ）は、可視光の照射により開環体（１ｏ）に変換される。
【化４】
2017001964.tif 000005
【００１９】
ジアリールエテン化合物（１ｏ）は有機溶媒中でフォトクロミズムを示す。化合物（１ｏ）は大量の水を含む溶媒中でもフォトトクロミズムを示すことができる。図１に、化合物（１ｏ）のエタノール／水混合溶媒（体積比７／３）中でのＵＶ光照射前後の吸収スペクトル変化を示す。図１において、実線は開環体（１ｏ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（１ｃ）の吸収スペクトルである。開環異性体である開環体（１ｏ）から閉環異性体である閉環体（１ｃ）への変換効率は、波長３１３ｎｍのＵＶ光を照射したときは、ほぼ１００％である。可視光線（波長が４３６ｎｍまたは５４６ｎｍ）を照射すると開環反応が起こり、元の開環体（１ｏ）に戻る。
【００２０】
前記ジアリールエテン化合物の細胞への影響を確認した実験結果を図２に示す。図２は、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）をコーティング処理した基材表面に播種したＭＤＣＫ細胞の光によるダメージの様子を示した写真である。ここで、ＭＤＣＫ細胞とは、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）由来の細胞株である。ＭＤＣＫ細胞は、単層に培養すると円柱上皮に分化し、タイトジャンクションを形成し、塩や水を能動的に輸送することから、上皮細胞の研究材料になっている。
【００２１】
まず、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）を０．６μｇ／ｃｍ２の密度でコーティング処理した基材表面に、ＭＤＣＫ細胞を散布し、１日培養した。
【００２２】
この培養後の基材表面（図２（ａ））の一部領域に、青色光（波長４３６ｎｍ、強度１４０ｍＷ／ｃｍ２）を２分間照射した。前記一部領域は、図２（ｂ）に示すように、「４３６」の文字にパターン化された領域である。すると、波長４３６ｎｍの光照射を受けた領域では、図２（ｃ）に示すように、ＭＤＣＫ細胞の大半は死滅して脱着した。
【００２３】
また、別の培養後の基材表面に、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）の開環反応を誘起する緑色光（波長５４６ｎｍ）を照射したところ、照射量を２倍にしても、細胞に変化は認められなかった。このように、波長５４６ｎｍの光照射では細胞にダメージがみられないが、対照的に波長４３６ｎｍの光照射は明らかに細胞にダメージを与え、細胞死に至らせていることがわかる。
【００２４】
一方、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）に代えて、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）の異性体である開環体（１ｏ）を用いたときは、波長４３６ｎｍの光照射および開環体（１ｏ）の閉環反応を誘起する波長３６５ｎｍの光照射のいずれによっても、ＭＤＣＫ細胞に対するダメージは認められなかった。したがって、波長４３６ｎｍの光は、前記ジアリールエテン化合物の異性体のうち閉環体（１ｃ）を投与した細胞に致命的なダメージを与えていることがわかる。なお、このような細胞死は、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）をコーティング処理した基材上でのＭＤＣＫ細胞においての現象に限られない。例えば、細胞培養皿に０．２ｐｐｍのジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）のエタノール溶液を添加し、波長４３６ｎｍの光照射を行った場合でも、ＭＤＣＫ細胞の細胞死は観察された。
【００２５】
すなわち、前記ジアリールエテン化合物は、特定の第１の波長として、例えば３１３ｎｍの光照射による光異性化反応によって開環体（１ｏ）から閉環体（１ｃ）に異性化する。閉環体（１ｃ）は、前記第１の波長とは異なる第２の波長（例えば、４３６ｎｍ）の光照射によって細胞毒性を示す化合物である。そして、閉環体（１ｃ）は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長（例えば、５４６ｎｍ）の光照射によって、開環体（１ｏ）に異性化して前記細胞毒性が無害化される。
【００２６】
このように、前記ジアリールエテン化合物に特定の第１の波長の光を照射して閉環体に異性化させた状態で、ある波長の光（第２の波長の光）を照射することで標的とする細胞を殺傷した後に、別の波長の光（第３の波長の光）を照射して、速やかに無害な状態（開環体）に戻すことが可能となる。
【００２７】
本発明に用いることのできるジアリールエテン化合物は、窒素を含んでいることが好ましい。具体的には、下記構造式で表されるジアリールエテン化合物の少なくとも一つであることが好ましい。
【化５】
2017001964.tif 000006
【００２８】
これらのジアリールエテン化合物の開環／閉環反応を次式に示す。これらのジアリールエテン化合物は、いずれも、開環体は紫外光の照射により閉環体に変換され、閉環体は、可視光の照射により開環体に変換される。そして、いずれの閉環体も、第２の波長の光照射による細胞毒性を有している。これらのジアリールエテン化合物は、本発明の光応答性細胞殺傷剤の有効成分として効果的に作用する。
【００２９】
【化６】
2017001964.tif 000007
【００３０】
さらに、本発明に用いることのできるジアリールエテン化合物は、フッ素を含んでいることが好ましく、パーフルオロ環を含んでいることがより好ましい。パーフルオロ環は、フルオロシクロアルケンであることが好ましく、五角形のフルオロシクロペンテン（一般構造式においては、ｎ＝１）または六角形のフルオロシクロヘキセン（一般構造式においては、ｎ＝２）であることが好ましい。
【００３１】
ＭＤＣＫ細胞の前記細胞死が、ジアリールエテン化合物分子のＭＤＣＫ細胞中への取り込みによるものかを判定する目的で、ジアリールエテン化合物開環体（１ｏ）の分子構造を側鎖にもつ、次式のようなモノマーＭｏを合成し、このモノマーＭｏを、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）と、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を用いてラジカル重合させる方法で共重合し、ポリマーｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）を合成した。元素分析を行った結果より、ポリマー中のモノマーＭｏとＭＭＡとの重合比は、６２％：３８％であった。
【化７】
2017001964.tif 000008
【００３２】
このポリマーｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）およびポリマーｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）も紫外光照射と可視光照射を交互に行うと、可逆的に色が変わりフォトクロミズムを示した。図３Ａは、ジアリールエテン化合物を含有するポリマーの一例の開環体ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）のＵＶ光照射前後の、アセトニトリル溶媒中での吸収スペクトル変化を示す図である。実線は開環体ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）の吸収スペクトル、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体ｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）の吸収スペクトルである。ポリマーｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）中のジアリールエテン化合物開環体（１ｏ）の分子構造をジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）の分子構造に異性化したｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）を得るために、ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）で被覆された培養基材に、ＵＶ光（波長２５４ｎｍ）を光安定状態（ＰＳＳ）に到達するまで照射した。上記可逆反応においては、閉環反応の量子収率が高く（０．３７）、逆向きの開環反応の量子収率が低い（０．０２）ため、ＰＳＳではｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）が主体であった。
【００３３】
図３Ｂは、閉環体ｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）をコーティング処理した基材表面に播種したＭＤＣＫ細胞の、光照射による影響を示した図である。同図において、中央部の領域には波長４３６ｎｍの光を、図２における試験と同量照射した（強度１４０ｍＷ／ｃｍ２、２分間）。この光照射により、光照射した領域においては色の変化が起こり、閉環体ｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）は、開環体ｐｏｌｙ（Ｍｏ−ＭＭＡ）に異性化していることがわかる。ここで、前記ジアリールエテン化合物を含有する前記ポリマーを被覆したＭＤＣＫ細胞の培養基材上におけるジアリールエテン化合物の面積密度は、単分子（１ｃ）の場合の１００倍以上であった。しかし、波長４３６ｎｍの光を、図２における試験と同量（強度１４０ｍＷ／ｃｍ２、２分間）照射しても、ＭＤＣＫ細胞のダメージは認められず、光照射領域と非照射領域のいずれにおいても、ＭＤＣＫ細胞は残存していた。すなわち、ポリマーに固定された前記ジアリールエテン化合物は、ＭＤＣＫ細胞に対して何らのダメージも与えなかった。
【００３４】
この結果から、分子状態のジアリールエテン化合物の存在が、光照射による細胞の死滅の誘起に必須であることがわかる。ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）は、投与されることでＭＤＣＫ細胞内に取り込まれて特異サイトに結合し、波長４３６ｎｍの光照射によってＭＤＣＫ細胞に致命的な影響を及ぼしたと考えられる。
【００３５】
これらのジアリールエテン化合物による細胞死は、閉環体が、細胞のＤＮＡにインターカレーションすることによって起こると考えられる。このことは、次の実験結果によって確認された。
【００３６】
図４は、ＤＮＡ−ＥＢ（エチジウムブロマイド）錯体に、ジアリールエテン化合物の開環体（１ｏ）または閉環体（１ｃ）の濃度を５μＭから２５μＭの範囲で変えて加えたときの蛍光強度の推移（Ｉ０／Ｉ）を示すグラフである。Ｉ０は、ジアリールエテン化合物の開環体（１ｏ）および閉環体（１ｃ）を加えていない（０μＭ）ときのＤＮＡ−ＥＢ錯体の蛍光強度である。ＤＮＡとしては、サケの白子由来ＤＮＡを用いた。ＤＮＡ−ＥＢ錯体は、ＤＮＡを１５μＭ、ＥＢを７５μＭ混合したものである。
【００３７】
ＤＮＡとエチジウムブロマイド（ＥＢ）の錯体は、ＤＮＡにＥＢがインターカレーションされており、発光波長６１０ｎｍの蛍光を発する。これに、ＤＮＡとインターカレーションをする試薬を加えると、ＤＮＡ中のＥＢが前記試薬と置き換わることによって、６１０ｎｍの蛍光強度が減少する。
【００３８】
ＤＮＡ−ＥＢ錯体に、ジアリールエテン化合物の開環体（１ｏ）または閉環体（１ｃ）を添加したところ、図４に示すように開環体（１ｏ）の添加では蛍光減少が見られなかったが、閉環体（１ｃ）を添加すると蛍光減少が見られた。この結果は、閉環体（１ｃ）のみがＤＮＡに作用（インターカレーション）していることを示している。
【００３９】
以上をまとめると、ＭＤＣＫ細胞への、ジアリールエテン化合物投与および光照射の影響は、以下のとおりである。
［１］閉環体（１ｃ）をＭＤＣＫ細胞に投与し、波長４３６ｎｍの光照射を行うと、細胞死滅が観察された。
［２］閉環体（１ｃ）に誘起される細胞死滅は、波長５４６ｎｍの光照射では起こらなかった。
［３］開環体（１ｏ）をＭＤＣＫ細胞に投与した後に、波長３６５ｎｍの光を照射して開環体（１ｏ）を閉環体（１ｃ）に異性化し、ついで波長４３６ｎｍの光照射を行ったときには、ジアリールエテン化合物はＭＤＣＫ細胞に対して致命的影響は及ぼさなかった。
［４］閉環体（１ｃ）を固定化したｐｏｌｙ（Ｍｃ−ＭＭＡ）上では、波長４３６ｎｍの光照射による細胞死滅は観察されなかった。
【００４０】
前記［１］〜［４］の結果から、閉環体（１ｃ）状態のジアリールエテン化合物のみが、たとえば、ＤＮＡまたはミトコンドリア等の細胞の特異サイトに到達して、光照射に対応して細胞に致命的な影響を及ぼすことが考えられる。いったんジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）分子が特異サイトに結合すると、ジアリールエテン化合物が閉環体（１ｃ）状態あるいは開環体（１ｏ）状態のいずれであるかに関わらず、細胞は波長４３６ｎｍの光照射によってダメージを受ける。一方、［３］の結果によれば、開環体（１ｏ）状態の分子は前記特異サイトに結合していないと考えられる。さらに、［４］の結果から、培養細胞の近傍にあるが細胞の外部にある培地表面に固定されたジアリールエテン化合物は、光に誘起されて致命的な影響を及ぼすことはないと考えられる。
【００４１】
開環体（１ｏ）および閉環体（１ｃ）についてみられたＭＤＣＫ細胞に対する光照射の影響と同様の現象は、開環体（３ｏ）および閉環体（３ｃ）、開環体（６ｏ）および閉環体（６ｃ）、開環体（７ｏ）および閉環体（７ｃ）についてもみられ、これらのジアリールエテン化合物は、光応答性細胞殺傷剤の有効成分として用いることが可能であることがわかった。しかし、本発明における有効成分としてのジアリールエテン化合物はこれら化合物に限定されず、前記現象がみられる他のジアリールエテン化合物も用いることができる。
【００４２】
なお、以下の解析結果により、前記の細胞死のメカニズムとしては、細胞のＤＮＡやミトコンドリアに光応答性細胞殺傷剤が作用して損傷を起こすことによりアポトーシスに至るものであると考えられる。
【００４３】
図５は、細胞死（アポトーシス）の解析結果を説明する図であり、ＭＤＣＫ細胞の光によるダメージの様子を示した写真である。図５（ａ）はカスパーゼ阻害剤を添加していない状態、図５（ｂ）はカスパーゼ阻害剤を添加している状態での、光照射後のＭＤＣＫ細胞を観察した結果である。カスパーゼ阻害剤としては、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（下記構造式）を用いた。
【００４４】
【化８】
2017001964.tif 000009
【００４５】
ＭＤＣＫ細胞の培養液に０．２ｐｐｍのジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）を加え、アポトーシス検知試薬およびネクローシス検知試薬を添加後、図５の各図における下半分の領域にのみ波長４３６ｎｍの光照射を２分間行った。前記アポトーシス検知試薬および前記ネクローシス検知試薬の存在下では、アポトーシスが起これば、細胞は緑の蛍光を発し、ネクローシスが起これば細胞は赤い蛍光を発する。細胞のＤＮＡやミトコンドリアに薬剤による損傷が起こると、カスパーゼ経路が活性化され細胞死（アポトーシス）に至ることが知られている。このとき、カスパーゼ阻害剤が存在すると、カスパーゼ経路の活性化は起こらず、アポトーシスに至ることはない。
【００４６】
波長４３６ｎｍの光照射の２時間後の細胞の様子を示したものが図５である。図５において、下段の図は、上段の写真で緑色の部分を黒色で示した説明図である。カスパーゼ阻害剤が添加されていない図５（ａ）の条件では、光照射を行った領域においてアポトーシスを示す緑の蛍光が顕著に観察されたが、カスパーゼ阻害剤を加えた図５（ｂ）の条件では緑の発光が見られなかった。このことは、ジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）存在下での光照射による細胞死は、カスパーゼ経路から引き起こされたものであることを示している。すなわち、この細胞死は、ＤＮＡかミトコンドリアが損傷を受けたことによるものであることが確認された。
【００４７】
本発明の光線力学療法用薬剤は、前記本発明の光応答性細胞殺傷剤を含むことを特徴とする。
【００４８】
従来、ＰＤＴ技術においては、残留する薬剤による皮膚や目の過敏症が起こるため、治療後約６週間以上、直射日光や明るい室内光を避けるように指導されるが、これは、患者には負担となるものであり、ＱＯＬの観点からも解決が望まれている。前記第１の波長が日常生活における影響が少ない波長領域、例えば紫外領域等の可視光領域外にあり、かつ、閉環体が細胞毒性を示すようなジアリールエテン化合物を用いることで、残留光毒性の問題がより効果的に解決可能となる。
【００４９】
本発明の光線力学療法用薬剤は、がん細胞殺傷用薬剤として用いることができる。特に、正常細胞と比較してがん細胞に対して選択的に蓄積される化合物（あるいは官能基）と前記本発明の光応答性細胞殺傷剤とを組み合わせることが好ましい。前記がん細胞殺傷用薬剤は、がん細胞中に前記本発明の光応答性細胞殺傷剤を取り込ませ、前記第２の波長の光照射を行うことにより、そのがん細胞をアポトーシスに至らせるというメカニズムを有する。そして、ＰＤＴ技術によるがん細胞の殺傷後には、前記第３の波長の光照射を行うことで、がん細胞外部に残存するがん細胞殺傷用薬剤の細胞毒性を無害化させることが可能である。
【００５０】
前記光線力学療法用薬剤を用いる場合、その投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する投与単位としての製剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等をあげることができる。非経口投与に適する投与単位としての製剤としては、例えば、皮下、静脈内もしくは筋肉内注射用の注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤または貼付剤等をあげることができる。前記光線力学療法用薬剤は、一般的には１種又は２種以上の製剤用添加物を用いて医薬用組成物として調製することが望ましい。製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤または粘着剤等をあげることができるが、これらに限定されることはない。これらの製剤用添加物は当業者に汎用されており、製剤形態に応じて適宜の製剤用添加物を選択できる。前記光線力学療法用薬剤の使用量は、ＰＤＴのための周知の薬剤等の投与量に準じて適宜選択すればよい。
【実施例】
【００５１】
つぎに、以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、本発明は、下記の実施例によってなんら限定ないし制限されない。
【００５２】
（ジアリールエテン化合物の合成）
構造式（１ｏ）および構造式（１ｃ）の構造をもつジアリールエテン化合物は、文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，６６２７−６６３８）の記載に従って合成した。
【００５３】
構造式（２ｏ）および構造式（２ｃ）の構造をもつ下記ジアリールエテン化合物は、文献（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，８３０５−８３０９）の記載に従って合成した。図６Ａに、このジアリールエテン化合物（２ｏ）のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す。図６Ａにおいて、実線は開環体（２ｏ）の吸収スペクトルである。また、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（２ｃ）の吸収スペクトルである。
【化９】
2017001964.tif 000010
【００５４】
構造式（３ｏ）および構造式（３ｃ）の構造をもつジアリールエテン化合物は、文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０００，５６，６９７９−６９８４）の記載に従って合成した。
【００５５】
構造式（４ｏ）および構造式（４ｃ）の構造をもつ下記ジアリールエテン化合物は、文献（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，１５５−１６６）の記載に従って合成した。
【化１０】
2017001964.tif 000011
【００５６】
構造式（５ｏ）および構造式（５ｃ）の構造をもつ下記ジアリールエテン化合物は、文献（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００６，１６，３６８５−３６９２およびＣｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００３，９，４８７８−４８８６）の記載に従って合成した。
【化１１】
2017001964.tif 000012
【００５７】
構造式（６ｏ）および構造式（６ｃ）の構造をもつジアリールエテン化合物は、次のように合成した。
構造式（６ｏ）の構造をもつジアリールエテン化合物の合成スキームを以下に示した。
【化１２】
2017001964.tif 000013
【００５８】
［化合物１０の合成］
化合物９をＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，ｐｐ．６６２７−６６３８（１９９８）に記載された方法で合成した。アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ四ッ口フラスコに化合物９を１．００ｇ（３．９３ｍｍｏｌ）と乾燥ＴＨＦ１５ｍＬを加え、ドライアイス−メタノール浴（−７０℃）撹拌した。ｎ−ＢｕＬｉの１．６Ｍヘキサン溶液２．７ｍＬ（４．３４ｍｍｏｌ）を１０分間かけてゆっくり加え、１時間撹拌を行った。その後、ペルフルオロシクロヘキセンを１．２９ｇ（４．９２ｍｍｏｌ）加え、３時間撹拌した。１時間かけてゆっくりと室温まで昇温し、水５ｍＬを加えて反応を止めた。ジエチルエーテル８０ｍＬを加えて有機層と水層に分離し、水層をジエチルエーテル（２０ｍＬ×６）で抽出した。有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより１５分間乾燥させた。硫酸ナトリウムを濾別後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（関東化学  中性球状シリカ（粒径６３−２１０μｍ），展開溶媒  ヘキサン：クロロホルム＝４：１，φ＝２ｃｍ，ｈ＝１５ｃｍ）により分離精製し、淡黄色固体の化合物１０を０．７２ｇ得た（粗収率４５％）。ヘキサンで再結晶し、白色結晶の化合物１０を０．５４ｇ得た（収率３４％）。
ｍ．ｐ．：５７．８−５８．７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：δ   ２．４３（ｓ，３Ｈ），７．４４−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．８９−７．９１（ｍ，２Ｈ）．
【００５９】
［化合物６ｏの合成］
アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ三口フラスコに化合物９を０．６４ｇ（２．５２ｍｍｏｌ）と乾燥ＴＨＦ２５ｍＬを加え、ドライアイス−メタノール浴（−７０℃）撹拌した。ｎ−ＢｕＬｉの１．６Ｍヘキサン溶液１．９ｍＬ（３．０４ｍｍｏｌ）を５分間かけてゆっくり加え、３０分間撹拌を行った。その後、乾燥ＴＨＦ１０ｍＬに化合物１０を１．００ｇ（２．４８ｍｍｏｌ）を加えた溶液を加え、１時間撹拌した。その後、−５０℃まで１時間かけてゆっくりと昇温し、ドライアイス−アセトニトリル浴（−４０℃）に換えた。６．５時間後、ＴＬＣにより反応の進行を確認し、水１５ｍＬを加えて反応を止めた。ジエチルエーテル１００ｍＬを加えて有機層と水層に分離し、水層をジエチルエーテル（５０ｍＬ×４）で抽出した。有機層を合わせて、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより１時間乾燥させた。硫酸ナトリウムを濾別後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（関東化学  中性球状シリカ（粒径６３−２１０μｍ），展開溶媒  ヘキサン：ジクロロメタン＝３：１，φ＝２ｃｍ，ｈ＝１５ｃｍ）により分離精製したが、分離出来なかったため、分取ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，１２ＰＬＣ  Ｐｌａｔｅｓ  ２０×２０ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０  Ｆ２５４，２ｍｍ，１．０５７１７．０００９，展開溶媒  ヘキサン：ジクロロメタン＝４：１）により、分離精製した。しかし、分離できなかった為、分取ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，２５ＰＬＣ  Ｐｌａｔｅｓ  ２０×２０ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０  Ｆ２５４  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｚｏｎｅ  ２０×２．５ｃｍ，１．１１７９８．０００１，展開溶媒  ヘキサン：ジクロロメタン＝５：１）により分離精製し、ヘキサンで再結晶し、無色透明結晶の化合物６ｏを０．１３ｇ得た（収率９％）。
ｍ．ｐ．：１５７．２−１５８．１℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）  δ  ２．２４（ｓ，６Ｈ），７．４１−７．４２（ｍ，６Ｈ），７．８４−７．８５（ｍ，４Ｈ）．
【００６０】
図６Ｂに、このジアリールエテン化合物（６ｏ）のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す。図６Ｂにおいて、実線は開環体（６ｏ）の吸収スペクトルである。また、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（６ｃ）の吸収スペクトルである。
【００６１】
構造式（７ｏ）および構造式（７ｃ）の構造をもつジアリールエテン化合物は、文献（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４３，４８２−４８９）の記載に従って合成した。図６Ｃに、このジアリールエテン化合物（７ｏ）のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す。図６Ｃにおいて、実線は開環体（７ｏ）の吸収スペクトルである。また、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（７ｃ）の吸収スペクトルである。
【００６２】
構造式（８ｏ）および構造式（８ｃ）の構造をもつ下記ジアリールエテン化合物は、次のように合成した。
【化１３】
2017001964.tif 000014
【００６３】
構造式（８ｏ）の構造をもつジアリールエテン化合物の合成スキームを以下に示した。
【化１４】
2017001964.tif 000015
【００６４】
アルゴン雰囲気下、５００ｍＬ四つ口フラスコに化合物１１を２．００ｇ（４．５７ｍｍｏｌ）、乾燥エーテル３２０ｍＬを加えて、ドライアイス−メタノール浴で−２０℃にした。ｎ−ＢｕＬｉヘキサン溶液（１．２２Ｎ）を８．２４ｍＬ（１０．１ｍｍｏｌ，２．２ｅｑ．）、ゆっくりと滴下し、−５℃の氷塩水中で１時間撹拌した。イソニコチンアルデヒド１．０８ｇ（１０．１ｍｍｏｌ，２．２ｅｑ．）の乾燥エーテル５ｍＬ希釈液を加えて、ドライアイス−メタノール浴（−２０℃）で１時間撹拌した。０℃まで昇温し、水２０ｍＬを加えた。１ＭのＨＣｌを１５．４ｍＬ加えてｐＨ＝７にして、酢酸エチル３０ｍＬ×５で抽出した。有機層をまとめて、飽和食塩水５０ｍＬで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、硫酸ナトリウムを濾別した。ロータリーエバポレーターで溶媒を留去させ、黄色固体を得た。黄色固体をクロロホルムで洗浄して、溶けなかった固体を減圧濾過で回収し、白色固体を得た。白色固体をメタノールで再結晶し、化合物８の針状結晶１．１７ｇ（収率４４．０％）を得た。
ｍ．ｐ．：２０７．５−２０８．６℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  １．８５（ｓ，６Ｈ），５．９５（ｓ，２Ｈ），６．８９（ｓ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），８．４８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ）．
【００６５】
図６Ｄに、このジアリールエテン化合物（８ｏ）のエタノール中での吸収スペクトル変化を示す。図６Ｄにおいて、実線は開環体（８ｏ）の吸収スペクトルである。また、破線はＵＶ光照射後の吸収スペクトルであり、閉環体（８ｃ）の吸収スペクトルである。
【００６６】
（細胞毒性の確認）
［実施例１−１］
前記構造式に示すジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）を０．２ｗｔ％含有するエタノール溶液を、密度が０．６μｇ／ｃｍ２となるよう組織培養用ポリスチレン基板上にスピンコーティングし、８８℃で３時間乾燥させて、細胞培養基材を作製した。ここで、前記構造式に示すジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）は、ジアリールエテン化合物の合成後に、ＵＶ光（波長３１３ｎｍ）を光安定状態に到達するまで照射し、閉環体に異性化させた後単離したものを用いた。
【００６７】
得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した。その後、細胞培養基材表面の一部領域に、青色光（波長４３６ｎｍ、強度１４０ｍＷ／ｃｍ２）を２分間照射した。青色光の照射を止めて２時間後、ＭＤＣＫ細胞の状態を観察した。光照射領域のＭＤＣＫ細胞はダメージを受けており、細胞培養基材表面から脱離した。
【００６８】
［実施例１−２］
ジアリールエテン化合物閉環体として（３ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、光照射領域のＭＤＣＫ細胞はダメージを受けており、細胞培養基材表面から脱離した。
【００６９】
［実施例１−３］
ジアリールエテン化合物閉環体として（６ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、光照射領域のＭＤＣＫ細胞はダメージを受けており、細胞培養基材表面から脱離した。
【００７０】
［実施例１−４］
ジアリールエテン化合物閉環体として（７ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、光照射領域のＭＤＣＫ細胞はダメージを受けており、細胞培養基材表面から脱離した。
【００７１】
［比較例１−１］
ジアリールエテン化合物閉環体として（２ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、細胞にダメージは観察されなかった。
【００７２】
［比較例１−２］
ジアリールエテン化合物閉環体として（４ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、細胞にダメージは観察されなかった。
【００７３】
［比較例１−３］
ジアリールエテン化合物閉環体として（５ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、細胞にダメージは観察されなかった。
【００７４】
［比較例１−４］
ジアリールエテン化合物閉環体として（８ｃ）を用いた以外は、実施例１−１と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、ＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例１−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、細胞にダメージは観察されなかった。
【００７５】
実施例１−１〜１−４のジアリールエテン化合物は、特定の第１の波長の光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化し、前記閉環体は、前記第１の波長とは異なる第２の波長の光照射によって細胞毒性を示していることがわかる。なお、前記閉環体は、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の光照射によって、開環体に異性化して前記細胞毒性が無害化される。
【００７６】
それに対して、比較例１−１〜１−４のジアリールエテン化合物は、光照射による光異性化反応によって閉環体に異性化するが、前記閉環体は、光照射によって細胞毒性を示していないことがわかる。なお、比較例１−３のジアリールエテン化合物閉環体（５ｃ）は、ＤＮＡ−ＥＢ（エチジウムブロマイド）錯体に添加して蛍光強度の測定を行うと、ジアリールエテン化合物閉環体（１ｃ）について図４で示したのと同様の結果が得られた。この結果は、ジアリールエテン化合物閉環体（５ｃ）は、ＤＮＡとインターカレーションしていることを示している。しかし、ジアリールエテン化合物閉環体（５ｃ）は、細胞毒性を示さないことから、前記結果は、インターカレーションが細胞毒性発現のための十分条件であるとはいえないことを示唆している。
【００７７】
（Ｈｅ−Ｌａ細胞に対する細胞毒性の確認）
人のがん細胞であるＨｅ−Ｌａ細胞を用いて、前記実施例１−１〜１−４および比較例１−１〜１−４で用いたジアリールエテン化合物閉環体およびこれらのジアリールエテン化合物の開環体のそれぞれについて、細胞毒性の有無を検討した。
【００７８】
［実施例２−１］
前記構造式に示すジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）および開環体（１ｏ）を、それぞれ、濃度０．１ｐｐｍ〜２ｐｐｍ含有する培地０．２ｍｌを用意した。これらの培地に、Ｈｅ−Ｌａ細胞を各々約１０万個播種し、１８時間培養した。培養後、波長４３６ｎｍ、強度１４０ｍＷ／ｃｍ２の青色光を２分間照射し、細胞死の有無を調べた。
【００７９】
開環体（１ｏ）の存在下で４３６ｎｍの光照射を行った場合には、開環体（１ｏ）の濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死は見られず、光毒性は確認されなかった。一方、閉環体（１ｃ）の存在下で４３６ｎｍの光照射を行った場合には、閉環体（１ｃ）の濃度が０．２ｐｐｍ以上の培地において細胞死が観察された。
【００８０】
［実施例２−２］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（３ｃ）および開環体（３ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（３ｏ）の存在下では、開環体（３ｏ）の濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。一方、閉環体（３ｃ）の存在下では、閉環体（３ｃ）の濃度が０．５ｐｐｍ以上の培地において細胞死が観察された。
【００８１】
［実施例２−３］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（６ｃ）および開環体（６ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（６ｏ）の存在下では、開環体（６ｏ）の濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。一方、閉環体（６ｃ）の存在下では、閉環体（６ｃ）の濃度が２ｐｐｍの培地において細胞死が観察された。
【００８２】
［実施例２−４］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（７ｃ）および開環体（７ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（７ｏ）の存在下では、開環体（７ｏ）の濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。一方、閉環体（７ｃ）の存在下では、閉環体（７ｃ）の濃度が０．２ｐｐｍ以上の培地において細胞死が観察された。
【００８３】
［比較例２−１］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（２ｃ）および開環体（２ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（２ｏ）および閉環体（２ｃ）の存在下では、いずれも、濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。
【００８４】
［比較例２−２］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（４ｃ）および開環体（４ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（４ｏ）および閉環体（４ｃ）の存在下では、いずれも、濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。
【００８５】
［比較例２−３］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（５ｃ）および開環体（５ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（５ｏ）および閉環体（５ｃ）の存在下では、いずれも、濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。
【００８６】
［比較例２−４］
ジアリールエテン化合物として、閉環体（８ｃ）および開環体（８ｏ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして培地を作製した。得られた培地にＨｅ−Ｌａ細胞を播種し、培養した後に実施例２−１と同条件で青色光照射を行い、観察を行ったところ、開環体（８ｏ）および閉環体（８ｃ）の存在下では、いずれも、濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死が見られず、光毒性は確認されなかった。
【００８７】
実施例２−１〜２−４および比較例２−１〜２−４に示すように、ジアリールエテン化合物の開環体の存在下で４３６ｎｍ照射を行った場合には、ジアリールエテン化合物の濃度が２ｐｐｍまでの全ての濃度範囲で細胞死は見られず、光毒性は確認されなかった。一方、実施例２−１〜２−４のジアリールエテン化合物の閉環体では細胞死が観測され、実施例２−１（閉環体（１ｃ））および実施例２−４（閉環体（７ｃ））では、わずか０．２ｐｐｍの閉環体濃度から細胞死が観察された。比較例２−１〜２−４では、検討したいずれの閉環体濃度においても細胞死は観測されず、光毒性は確認されなかった。
【図１】
2017001964.tif 000018
【図３Ａ】
2017001964.tif 000019
【図４】
2017001964.tif 000020
【図６Ａ】
2017001964.tif 000021
【図６Ｂ】
2017001964.tif 000022
【図６Ｃ】
2017001964.tif 000023
【図６Ｄ】
2017001964.tif 000024
【図２】
2017001964.tif 000025
【図３Ｂ】
2017001964.tif 000026
【図５】
2017001964.tif 000027