(57)【要約】【課題】  ＴＲＡｂ測定試薬において、反応性向上および非特異吸着を抑制し、測定感度が良好となる試薬および製造方法を提供する【解決手段】  固相化ＴＳＨレセプターとＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液とを共存させて凍結乾燥し、かつ標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体と、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸溶液とを共存させて凍結乾燥することにより、抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬を製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を共存させた固相化ＴＳＨレセプター、及び
Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を共存させた、標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体
を有することを特徴とする、抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬。
【請求項２】
凍結乾燥状態である、請求項１に記載の抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬。
【請求項３】
固相化ＴＳＨレセプターとＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸とを共存させ、かつ
標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体と、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸とを共存させる
ことを特徴とする、抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬の製造方法。
【請求項４】
固相化ＴＳＨレセプターとＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸溶液とを共存させて凍結乾燥し、かつ
標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体と、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸溶液とを共存させて凍結乾燥する
請求項３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外診断薬等に使用される抗ＴＳＨレセプター抗体（ＴＲＡｂ）測定試薬およびその製造方法であって、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＡＣＥＳとする）を共存させることにより免疫反応性、測定再現性さらに測定感度を向上させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺刺激ホルモン（以下、ＴＳＨ）レセプターは分子量約１００ｋＤａの糖蛋白で甲状腺細胞膜上に存在し、ＴＳＨが結合すると細胞内のｃＡＭＰが増加し、甲状腺ホルモンの合成を促進する。このレセプターに対する自己抗体を抗ＴＳＨレセプター抗体（以下、ＴＲＡｂとする）という。ＴＲＡｂはＴＳＨと同様に甲状腺ホルモンの合成を促進するものがあるが、ネガティブフィードバックによるコントロールを受けないため、バセドウ病のような甲状腺機能亢進状態をもたらす。このことからＴＲＡｂの測定は、甲状腺疾患の鑑別に有用であり、特にバセドウ病と無痛性甲状腺炎及び亜急性甲状腺炎の鑑別診断、治療経過観察に利用されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
ＴＲＡｂの測定は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。ラジオ・レセプター・アッセイ法（ＲＲＡ法）や競合酵素免疫測定法（競合ＥＩＡ法）が知られている。中でも競合ＥＩＡ法は、放射線取扱施設を必要視せず、さらに迅速性にすぐれていることから、臨床目的でのＴＲＡｂ測定において多用されている。
【０００４】
競合ＥＩＡ法によりＴＲＡｂを測定する方法としては、以下の例があげられる：
（１）プレートや微粒子などの固相に固定化されたＴＳＨレセプターに検体を添加することにより、検体中のＴＲＡｂとＴＳＨレセプターとの間で免疫反応が開始され、
（２）それをインキュベートした後、洗浄水で洗浄することにより、遊離の検体成分を除去し（Ｂ／Ｆ分離）、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、酵素標識された、ヒト由来のＴＳＨ又はヒト由来の抗ＴＳＨレセプター抗体を加えることにより反応が開始され、
（４）それをインキュベートした後、洗浄水で洗浄することにより、遊離の酵素標識ＴＳＨ又は酵素標識抗体を除去し（Ｂ／Ｆ分離）、
（５）Ｂ／Ｆ分離後、固相に結合した標識の酵素活性を測定するために基質を添加し、化学発光、生物発光、蛍光、比色測定等により、検体中のＴＲＡｂ濃度を知ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本臨床検査医学会  臨床検査のガイドライン  ２００５／２００６第２章  疾患編・内分泌／甲状腺機能亢進症・機能低下症
【非特許文献２】Ｂ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ｈａｌｌ、Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎ  Ｇｒａｖｅｓ’  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｌａｎｃｅｔ  ２４；４２７−４３１（１９７４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
甲状腺機能検査においてＴＲＡｂ測定は非常に重要な検査である。このＴＲＡｂは甲状腺のＴＳＨレセプターに作用し、甲状腺を刺激し甲状腺ホルモンの生成を亢進するのでバセドウ病の原因物質と考えられており、健常人にはＴＲＡｂが存在しない。また、バセドウ病の投薬治療にてＴＲＡｂ値は低下するが、バセドウ病の原因であるＴＲＡｂが陰性にならないと投薬は中止できないので、測定感度が非常に重要となっている。
【０００７】
そこで本発明の目的は、体外診断薬等のにＴＲＡｂ測定試薬において、反応性向上および非特異吸着を抑制し、測定感度が良好となる試薬および製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、免疫反応試薬に共存させる物質を選定することにより、反応性向上および非特異吸着を抑制し、測定感度が良好であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を共存させた固相化ＴＳＨレセプター、及び
Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸を共存させた、標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体
を有することを特徴とする、抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬。
（２）凍結乾燥状態である、（１）に記載の抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬。
（３）固相化ＴＳＨレセプターとＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸とを共存させ、かつ
標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体と、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸とを共存させる
ことを特徴とする、抗ＴＳＨレセプター抗体測定試薬の製造方法。
（４）固相化ＴＳＨレセプターとＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸溶液とを共存させて凍結乾燥し、かつ
標識化ＴＳＨ又は標識化抗ＴＳＨレセプター抗体と、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸溶液とを共存させて凍結乾燥する
（３）に記載の製造方法。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明のＴＲＡｂ測定試薬は、ＡＣＥＳを固相化ＴＳＨレセプター、及び標識化ＴＳＨ又は標識化ＴＲＡｂと共存させたものである。標識としては特に限定はないが、酵素が好ましい。固相としては特に限定はないが、ポリマーやガラス製などのプレート、粒子、微粒子等があげられる。
【００１２】
本発明の測定試薬は凍結乾燥状態のものがそのましいが、液状であってもよい。液状の場合は、ＡＣＥＳとしてＡＣＥＳ緩衝液を用いることが好ましい。その緩衝液濃度は１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲とすることが好ましく、さらに５〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲とすることが好ましく、特に１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲とすることが好ましい。ＡＣＥＳ緩衝液のｐＨは５．５〜８．５の範囲とすることが好ましく、さらに６．０〜８．０の範囲とすることが好ましく、特に６．５〜７．５の範囲とすることが好ましい。
【００１３】
本発明の測定試薬には、糖、蛋白質や塩類を共存させてもよく、それらは特に限定されるものではないが、糖としては、例えばマンニトール、マルトース、ラクトースやトレハロース等を使用することができる。蛋白質としては、例えばヒト血清、ヒト血清アルブミン、ウシ血清、ウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド、スキムミルク等を使用することができる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。なお、これら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。
【００１４】
本発明の測定試薬は、固相化ＴＳＨレセプターとＡＣＥＳとを共存させ、かつ標識化ＴＳＨ又は標識化ＴＲＡｂと、ＡＣＥＳとを共存させることで製造することができる。本発明の測定試薬が液状の場合は、ＡＣＥＳ緩衝液等のＡＣＥＳ溶液を使用することができる。その際の濃度、ｐＨ、共存物質については前述と同様である。また本発明の測定試薬が凍結乾燥状態の場合は、ＡＣＥＳ溶液を共存させた後に凍結乾燥すればよい。
【００１５】
このようにして、体外診断薬等に使用されるＴＲＡｂ測定試薬を製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、反応性向上および非特異吸着を抑制し、測定感度が良好である体外診断薬等に使用されるＴＲＡｂ測定試薬を得ることが可能となる。例えば、本発明で得られた測定試薬は感度よく測定することができるので、本発明によって高感度な測定も実現できる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）と免疫測定用試薬として当該装置用免疫反応試薬を用い、２ステップ競合法により各測定を行った。なお、ＴＲＡｂ測定試薬は後述したようにして調製した。
【００１８】
（実施例１）
ＴＳＨレセプター固定化磁性微粒子をコラーゲンペプチド、トレハロース、デキストラン、ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）に加えて凍結乾燥を行った。さらにアルカリ性ホスファターゼ標識ヒト由来のＴＳＨをウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド、トレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、デキストランを含むＡＣＥＳ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。ＡＣＥＳ緩衝液の濃度およびｐＨは以下の通りである。
試薬Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＣＥＳ（ｐＨ６．５）
試薬Ｂ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０）
試薬Ｃ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＣＥＳ（ｐＨ７．５）
（比較例１）
ＴＳＨレセプター固定化磁性微粒子をコラーゲンペプチド、トレハロース、デキストラン、ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）に加えて凍結乾燥を行った。さらにアルカリ性ホスファターゼ標識ヒト由来のＴＳＨをウシ血清アルブミン、トレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、デキストランを含む緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。緩衝液の種類、濃度およびｐＨは以下の通りである。
試薬Ｄ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸（ｐＨ７．０）
試薬Ｅ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
試薬Ｆ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）
（実施例２）
前記自動免疫測定装置で試薬Ａ、試薬Ｄ、試薬Ｅおよび試薬ＦにてＴＲＡｂの標準品１（０ＩＵ／Ｌ）、標準品２（２．１４ＩＵ／Ｌ）および陰性検体の３種類を測定し、アルカリ性ホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各サンプルは５回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。
結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2017173113.tif 000002
ＡＣＥＳ緩衝液を用いた試薬Ａにおいて、標準品１と標準品２の発光強度の比が７９．７％であるが、他の緩衝液である試薬Ｄ、試薬Ｅおよび試薬Ｆにおいては、８３．５〜８５．８％であった。このことから試薬Ａは試薬Ｄ，Ｅ，Ｆと比べて検量線の形状が良好であることがわかる。
【００２０】
さらに陰性検体測定において、試薬Ａでは標準品１（０ＩＵ／Ｌ）と同等の発光強度を示し、陰性検体のＴＲＡｂ濃度は０ＩＵ／Ｌに近い値として測定される結果であった。それに対して試薬Ｄ、試薬Ｅおよび試薬Ｆにおいては、標準品２（２．１４ＩＵ／Ｌ）と同等の発光強度を示し、陰性検体であるにも関わらず、ＴＲＡｂ濃度は約２ＩＵ／Ｌに近い値として測定される結果となった。ＴＲＡｂ測定値の参考基準値として、陰性検体は２．０ＩＵ／Ｌ未満との知見があり、試薬Ｄ、試薬Ｅおよび試薬Ｆにおいては、陰性検体にもかかわらず、陽性と判定される危険性がある。
【００２１】
これらのことからＡＣＥＳ緩衝液を用いた試薬が、他の緩衝液を用いた試薬と比較して競合酵素免疫測定法（競合ＥＩＡ法）として性能が良好であることがわかる。
【００２２】
（実施例３）
前記自動免疫測定装置で試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄに対して陰性検体８種類を測定し、アルカリ性ホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定し、さらに検量線からＴＲＡｂ濃度を算出した。
結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
2017173113.tif 000003
ＡＣＥＳ緩衝液を用いた試薬Ａ、試薬Ｂおよび試薬Ｃにおいては、１．０ＩＵ／Ｌ未満である検体が大きな割合を占め、かつ全ての検体において、ＴＲＡｂ測定値の参考基準値の２．０ＩＵ／Ｌ未満として測定される結果であった。
【００２４】
それに対して、リン酸緩衝液である試薬Ｄにおいては、すべての検体において１．０ＩＵ／Ｌ以上と測定され、さらにＴＲＡｂ測定値の参考基準値の２．０ＩＵ／Ｌを超える測定値として検出される検体もある結果となった。
【００２５】
これらのことからＡＣＥＳ緩衝液を用いた試薬が、他の緩衝液を用いた試薬と比較して競合酵素免疫測定法（競合ＥＩＡ法）として性能が良好であることがわかる。