(57)【要約】【課題】生理活性物質の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供する。【解決手段】生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式（１）で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。    ［化１］2017218408.tif 000013［式（１）中、Ｒ１はニトロ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは０〜３の整数を表し、＊は結合手を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式（１）で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。
【化１】
2017218408.tif 000012
［式（１）中、Ｒ１はニトロ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは０〜３の整数を表し、＊は結合手を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
【請求項２】
前記生理活性物質が、阻害性核酸又は低分子医薬である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記生体適合性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミドである、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項４】
前記生理活性物質が阻害性核酸であり、前記生体適合性高分子の重量平均分子量が３０，０００〜２００，０００である、請求項２又は３に記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外で安定であり、薬理活性部位である細胞内でのみ活性を発揮する薬物送達システムが検討されている。例えば、非特許文献１には、エンドソーム内の酸性ｐＨで切断されるマレイン酸アミド誘導体リンカーを用いて、ｓｉＲＮＡとポリマーとを結合した、ｓｉＲＮＡの送達システムが記載されている。また、非特許文献２には、細胞内の高い還元環境に応答して切断されるジスルフィド結合を用いて、ｓｉＲＮＡとポリマーとを結合した、ｓｉＲＮＡの送達システムが記載されている。非特許文献１や非特許文献２に記載された送達システムは、ｓｉＲＮＡに結合したポリマーにより、細胞外ではｓｉＲＮＡが安定に存在し、細胞内においてポリマーとｓｉＲＮＡとが切断され、ｓｉＲＮＡが活性を発揮することを目指したものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Takemoto H., et al., Acidic pH-responsive siRNA conjugate for reversible carrier stability and accelerated endosomal escape with reduced IFN-alpha-associated immune response, Angew. Chem. Int. Ed., 52 (24), 6218-6221, 2013.
【非特許文献２】Takemoto H., et al., Polyion complex stability and gene silencing efficiency with a siRNA-grafted polymer delivery system. Biomaterials, 31 (31), 8097-8105, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１や２に記載されたポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体では、細胞外環境におけるｓｉＲＮＡとポリマー間のリンカーの安定性が不十分な場合がある。例えば、ジスルフィド結合は細胞外における低還元環境においても切断されてしまうため（半減期にして数時間）、ポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体が細胞内に取り込まれる前にポリマーとｓｉＲＮＡが切断されてしまい、期待された機能を十分に発揮できない場合がある。
【０００５】
そこで、本発明は、生理活性物質の結合体の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式（１）で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。
【化１】
2017218408.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１はニトロ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは０〜３の整数を表し、＊は結合手を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［２］前記生理活性物質が、阻害性核酸又は低分子医薬である、［１］に記載の結合体。
［３］前記生体適合性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミドである、［１］又は［２］に記載の結合体。
［４］前記生理活性物質が阻害性核酸であり、前記生体適合性高分子の重量平均分子量が３０，０００〜２００，０００である、［２］又は［３］に記載の結合体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生理活性物質の結合体の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１における、細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
【図２】実験例１における、細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】実験例２のリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例３のルシフェラーゼアッセイにおける発光量の測定結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４のルシフェラーゼアッセイにおける発光量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１実施形態において、本発明は、生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式（１）で表される基を含むリンカーで結合した、結合体を提供する。
【００１０】
【化２】
2017218408.tif 000003
【００１１】
式（１）中、Ｒ１はニトロ基又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは０〜３の整数を表し、＊は結合手を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。
【００１２】
上記式（１）で表される基を含むリンカーは、上記式（１）で表される基からなる２価の連結基であってもよく、上記式（１）で表される基と他の基を含む２価の連結基であってもよい。
【００１３】
本実施形態の結合体において、上記式（１）中に２つ存在する結合手の一方に直接的に又は間接的に生理活性物質が結合し、他方に直接的に又は間接的に生体適合性高分子化合物が結合している。上記の結合手と生理活性物質との結合、又は上記の結合手と生体適合性高分子化合物との結合が間接的である場合、上記の結合手と生理活性物質との間、又は上記の結合手と生体適合性高分子化合物との間には、他の基が存在している。上記の他の基は、例えば、実施例において後述するように、生理活性物質と、生体適合性高分子化合物とを結合させる過程で導入される基であってもよい。
【００１４】
本実施形態の結合体は、細胞外環境では生体適合性高分子化合物と生理活性物質との結合体が安定に存在することができる。ここで、安定に存在するとは、生体適合性高分子化合物と生理活性物質との結合体が、例えば、既存のジスルフィド結合により結合した結合体に比べて、その結合状態をより長時間維持することを意味する。実施例において後述するように、本実施形態の結合体は、細胞外環境において安定である。また、細胞内では選択的にリンカーが切断して生理活性物質が放出され、その活性を発揮することができる。したがって、本実施形態の結合体は、薬物送達システムであるということもできる。
【００１５】
本実施形態の結合体において、生理活性物質としては、阻害性核酸又は低分子医薬が挙げられる。阻害性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。阻害性核酸の標的遺伝子は特に制限されず、目的に応じて選択すればよい。
【００１６】
阻害性核酸がｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡは、例えば１８〜２５塩基対、例えば２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、各ＲＮＡ鎖の３’末端部分が２塩基分突出していることが好ましい。また、突出した２塩基分はＤＮＡにより構成されていてもよい。
【００１７】
低分子医薬としては、分子量が概ね１０００以下である医薬が挙げられる。低分子医薬は、例えば、抗癌剤、造影剤、免疫抑制剤等であってもよい。抗癌剤としては、例えば、パクリタクセル、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン等が挙げられる。
【００１８】
一般に、細胞内及び細胞外では、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度が数百倍異なっている。発明者らは、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合が、細胞外に相当する環境下では安定であり、細胞内に相当する還元環境下では切断されることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
実施例において後述するように、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合により生理活性物質と生体適合性高分子化合物とが結合した結合体は、還元環境に応答して切断される。更に、実施例において後述するように、癌細胞において過剰発現しているグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の存在下では、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の切断が促進され、結合体からの生理活性物質の放出が促進される。したがって、本実施形態の結合体は、例えば抗癌剤の送達に好適に利用することができる。
【００２０】
本明細書において、生体適合性高分子化合物とは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくい高分子化合物を意味する。生体適合性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミド等が挙げられる。
【００２１】
生体適合性高分子化合物がポリエチレングリコールである場合、生体適合性高分子化合物の末端にはアルコキシ基が結合していてもよい。
【００２２】
生体適合性高分子化合物の重量平均分子量は１，０００〜２００，０００であってもよく、１０，０００〜１００，０００であってもよく、３０，０００〜５０，０００であってもよい。また、生理活性物質が阻害性核酸である場合、生体適合性高分子の重量平均分子量は、３０，０００〜２００，０００であることが好ましく、３０，０００〜１００，０００であることがより好ましく、３０，０００〜５０，０００であることが更に好ましい。
【００２３】
ここで、生体適合性高分子化合物の重量平均分子量としては、ゲルパーメーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定した値を用いることができる。具体的には、生体適合性高分子化合物を溶媒に溶かした後、細孔（ポア）が数多く存在する充てん剤を用いたカラム内に移動相溶液と共に通液し、カラム内で分子量の大小によって分離させ、それを示差屈折率計やＵＶ計、粘度計、光散乱検出器等を検出器として用いて検出する。ＧＰＣ専用装置が広く市販されており、標準ポリエチレングリコール換算によって測定することが一般的である。本明細書における重量平均分子量は、この標準ポリエチレングリコール換算によって測定されたものである。
【００２４】
実施例において後述するように、生体適合性高分子化合物の分子量が上記の範囲であると、結合体に含まれる生理活性物質の生理活性を抑制することができる。これは、生理活性物質が生体適合性高分子化合物により適度にマスクされていることによると考えられる。そして、生理活性物質と生体適合性高分子化合物が切断された場合に初めて生理活性物質が生理活性を発揮することが可能となる。これにより、薬理活性部位である細胞内でのみ生理活性物質の活性を発揮することができる。その結果、例えば、生理活性物質による副作用等を低減することができる。
【００２５】
本実施形態の結合体の合成方法は特に制限されない。例えば、実施例において後述するように、生理活性物質及び生体適合性高分子化合物にそれぞれ反応性の官能基を導入し、これらを反応させることにより、生理活性物質と生体適合性高分子化合物とを結合させてもよい。
【００２６】
このような反応性の官能基の組み合わせとしては、例えばアジド基とジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）の組み合わせ、スクシンイミド基とアミノ基の組み合わせ、チオール基とマレイミド基の組み合わせ、アジド基とアルキン基の組み合わせ、ビオチン基とストレプトアビジン基の組み合わせ等が挙げられる。これらの組み合わせのうちいずれか一方を生理活性物質に導入し、他方を生体適合性高分子化合物に導入し、これらを反応させるとよい。
【実施例】
【００２７】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
（ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成）
下記合成スキーム（１）により、メトキシ−ポリエチレングリコールとｓｉＲＮＡとを２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【００２９】
【化３】
2017218408.tif 000004
【００３０】
《４−（クロロスルホニル）−３−ニトロベンゾエートの合成》
まず、下記合成スキーム（２）により、４−（クロロスルホニル）−３−ニトロベンゾエートを合成した。
【００３１】
【化４】
2017218408.tif 000005
【００３２】
０．１３ｇのグリシルグリシン（０．００１ｍｏｌ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。続いて、上記の溶液に０℃で０．８１ｍＬのチオ酢酸（０．０１１ｍｏｌ）及び７．３ｇの炭酸セシウムを添加し、０℃で１０分間撹拌した。続いて、上記の溶液に１．６１ｇのメチル４−クロロ−３−ニトロベンゾエート（０．００７５ｍｏｌ）を添加し、暗条件下、氷上で一晩撹拌した。続いて、酢酸エチル及び１Ｍ塩酸を用いて生成物を抽出し、脱イオン水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。続いて、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、黄色粉末を得た。
【００３３】
続いて、得られた黄色粉末を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、溶液を３．９ｇのＮ−クロロスクシンイミド（０．０２９ｍｏｌ）を含む２０ｍＬのアセトニトリルと４ｍＬの２Ｍ塩酸の混合液に注いだ。得られた反応液を０℃で１時間撹拌した。続いて、上記と同様の抽出プロセスを行い、ロータリーエバポレーターを用いて有機相を除去し、粗生成物を得た。
【００３４】
続いて、粗生成物を、ジクロロメタンを溶離液とするシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、１，４−ジオキサンを用いて凍結乾燥し、１．５３６８ｇの黄色粉末としてメチル４−（クロロスルホニル）−３−ニトロベンゾエートを得た（収率７０．８％）。生成物は、ＣＤＣｌ３中の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより確認した。８．３−８．５ｐｐｍ（３Ｈ，Ａｒ）；４．０４ｐｐｍ（３Ｈ，Ｍｅｔｈｙｌ）。
【００３５】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯの合成》
続いて、下記合成スキーム（３）により、メトキシ−ポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ）−スルホンアミド−ＤＢＣＯを合成した。
【００３６】
【化５】
2017218408.tif 000006
【００３７】
まず、ＰＥＧの末端にスルホンアミド結合によりメチル３−ニトロベンゾエートを導入した。２００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量４０，０００、０．００５ｍｍｏｌ）を３ｍＬのピリジンに溶解し、０℃で１０分間撹拌した。続いて、１４．０ｍｇのメチル４−（クロロスルホニル）−３−ニトロベンゾエート（０．０２５ｍｍｏｌ）を０℃の２ｍＬピリジンに溶解し、上記のメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２の溶液に添加し、０℃で一晩撹拌した。
【００３８】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）し、過剰の反応物及びピリジンを除去した。透析後の溶液を凍結乾燥し、メチル３−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したＰＥＧ誘導体を１９０．３ｍｇの白色粉末として得た（収率８８．９％）。目的の生成物が得られたことを１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで３．２ｐｐｍのメチル基由来のピークが検出されることにより確認した。
【００３９】
得られたＰＥＧ誘導体の末端のメチルエステルを更なる修飾のために加水分解した。メチル３−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したＰＥＧ誘導体１８０ｍｇ（０．００４５ｍｍｏｌ）を、１８ｍＬの水／メタノール／５Ｍ水酸化ナトリウム（重量比：１／８／０．０５）の混合物に溶解し、室温で一晩撹拌した。
【００４０】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）し、透析後の溶液を凍結乾燥し、３−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したＰＥＧ誘導体を１５６．８ｍｇの白色粉末として得た（収率８７．１％）。メチルベンゾエートが完全に加水分解したことを、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで４．０ｐｐｍのメチルプロトンのプロトンのシグナルが消失したことにより確認した。
【００４１】
続いて、ＰＥＧ誘導体にジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を導入し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯを得た。まず、３−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したＰＥＧ誘導体１３８ｍｇ（０．００３４ｍｍｏｌ）を７ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、ジベンゾシクロオクチンアミン９．６ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を３ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、上記のＰＥＧ誘導体の溶液に添加した。この溶液に、３ｍＬのテトラヒドロフランに懸濁した９．６ｍｇのＤＭＴＭＭ（０．０３４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。
【００４２】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）し、フィルターを通して、未反応のジベンゾシクロオクチンアミンを除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯを１１７．４ｍｇの白色粉末として得た（収率７９．６％）。ＤＢＣＯの導入は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで７．３〜７．７ｐｐｍにピークが出現したことにより確認した。
【００４３】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成》
続いて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯの末端のＤＢＣＯとアジド−ｓｉＲＮＡのアジド基との間のクリック反応によりＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡを合成した。６ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯ（０．０００１５ｍｍｏｌ）を５００μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）に溶解した。
【００４４】
６５μＬのｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）を上記のＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−ＤＢＣＯの溶液に添加し、更に３３５μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を添加した。
【００４５】
ｓｉＲＮＡとしては、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ、及び対照のｓｉＲＮＡとしてスクランブル配列からなるｓｉＲＮＡを使用した。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示す。また、対照のｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示す。いずれのｓｉＲＮＡも、センス鎖の５’末端がアジド基で修飾されていた。
【００４６】
続いて、溶液を−２０℃で一晩凍結し、４℃で１時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。ＨＰＬＣのカラムにはＭｏｎｏ  Ｑ（商標）５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。検出は波長２６０ｎｍにおけるＵＶ検出により行った。溶離液には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、１M塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡが得られたことが確認された。
【００４７】
［参考例１］
（ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成）
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量４０，０００）の代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量２０，０００）を使用した点以外は実施例１と同様にして、参考例１のＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡを合成した。ｓｉＲＮＡとしては、実施例１と同様に、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ及びスクランブル配列からなるｓｉＲＮＡ（対照）を使用した。
【００４８】
［比較例１］
（ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成）
下記合成スキーム（４）により、ＭｅＯ−ＰＥＧとｓｉＲＮＡとをカルボン酸アミド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【００４９】
【化６】
2017218408.tif 000007
【００５０】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯの合成》
まず、下記合成スキーム（５）により、ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯを合成した。
【００５１】
【化７】
2017218408.tif 000008
【００５２】
１００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量４０，０００、０．００２５ｍｍｏｌ）を４ｍＬのジクロロメタンに溶解した。続いて、上記の溶液に１６．２ｍｇのＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル（０．０２５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。トリエチルアミン２滴を添加し、反応を活性化させた。
【００５３】
続いて、反応液をメタノール及び脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）した。透析後の溶液を凍結乾燥し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯを８０．８ｍｇの白色粉末として得た（収率６９．５％）。目的の生成物が得られたことを１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで７．３〜７．７ｐｐｍにピークが出現したことにより確認した。
【００５４】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成》
続いて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯの末端のＤＢＣＯとアジド−ｓｉＲＮＡのアジド基との間のクリック反応によりＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡを合成した。６ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯ（０．０００１５ｍｍｏｌ）を５００μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）に溶解した。
【００５５】
６５μＬのｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）を上記のＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−ＤＢＣＯの溶液に添加し、更に３３５μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を添加した。ｓｉＲＮＡとしては、実験例１と同様のものを用いた。
【００５６】
続いて、溶液を−２０℃で一晩凍結し、４℃で１時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、ＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣのカラムにはＭｏｎｏ  Ｑ（商標）５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。検出は波長２６０ｎｍにおけるＵＶ検出により行った。溶離液には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、１Ｍ塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡが得られたことが確認された。
【００５７】
［比較例２］
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡの合成》
下記合成スキーム（６）により、ＭｅＯ−ＰＥＧとｓｉＲＮＡとをジスルフィド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【００５８】
【化８】
2017218408.tif 000009
【００５９】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＣＯＯＨの合成》
まず、下記合成スキーム（７）により、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＣＯＯＨを合成した。
【００６０】
【化９】
2017218408.tif 000010
【００６１】
３，３’−ジチオジプロピオン酸をＭｅＯ−ＰＥＧの末端に導入した。１００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量４０，０００、０．００２５ｍｍｏｌ）を４ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、５．３ｍｇの３，３’−ジチオジプロピオン酸（０．０２５ｍｍｏｌ）を１ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、上記のＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２の溶液に添加した。この溶液に、２ｍＬのテトラヒドロフランに懸濁した６．９ｍｇのＤＭＴＭＭ（０．０２５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。
【００６２】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）し、フィルターを通して、未反応の３，３’−ジチオジプロピオン酸を除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＣＯＯＨを８７．５ｍｇの白色粉末として得た（収率８３．１％）。３，３’−ジチオジプロピオン酸の導入は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで２．６〜３．０ｐｐｍにピークが出現したことにより確認した。
【００６３】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯの合成》
続いて、下記合成スキーム（８）により、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯを合成した。
【００６４】
【化１０】
2017218408.tif 000011
【００６５】
まず、ジスルフィド結合を末端に導入した上記のＰＥＧ誘導体６０ｍｇ（０．００１５ｍｍｏｌ）を３ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、ジベンゾシクロオクチンアミン４．１ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）を１ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、上記のＰＥＧ誘導体の溶液に添加した。この溶液に、２ｍＬのテトラヒドロフランに懸濁した４．２ｍｇのＤＭＴＭＭ（０．０１５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。
【００６６】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析（分画分子量３５００）し、フィルターを通して、未反応のジベンゾシクロオクチンアミンを除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯを４５．５ｍｇの白色粉末として得た（収率７０．９％）。ＤＢＣＯの導入は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで７．３〜７．７ｐｐｍにピークが出現したことにより確認した。
【００６７】
《ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡの合成》
続いて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯの末端のＤＢＣＯとアジド−ｓｉＲＮＡのアジド基との間のクリック反応によりＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡを合成した。６ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯ（０．０００１５ｍｍｏｌ）を５００μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）に溶解した。
【００６８】
６５μＬのｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）を上記のＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−ＤＢＣＯの溶液に添加し、更に３３５μＬのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を添加した。ｓｉＲＮＡとしては、実験例１と同様のものを用いた。
【００６９】
続いて、溶液を−２０℃で一晩凍結し、４℃で１時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。ＨＰＬＣのカラムにはＭｏｎｏ  Ｑ（商標）５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。検出は波長２６０ｎｍにおけるＵＶ検出により行った。溶離液には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、１M塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡが得られたことが確認された。
【００７０】
［比較例３］
（ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡの合成）
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量４０，０００）の代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（重量平均分子量２０，０００）を使用した点以外は比較例１と同様にして、比較例３のＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡを合成した。ｓｉＲＮＡとしては、実施例１と同様に、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ及びスクランブル配列からなるｓｉＲＮＡ（対照）を使用した。
【００７１】
［実験例１］
（リンカー切断アッセイ１）
実施例１及び比較例２のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ及びＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡ）を用いてリンカー切断アッセイを行った。アッセイ条件としては、細胞内環境及び細胞外環境を模倣した条件を用いた。
【００７２】
細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイでは、５μＬのＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ（１０μＭ  ｓｉＲＮＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を、２０μＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含む４９５μＬのリン酸バッファー（０．１Ｍｍ、ｐＨ７．４）に添加し、３７℃でインキュベートした。
【００７３】
細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイでは、５μＬのＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ（１０μＭ  ｓｉＲＮＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を、１０ｍＭのＧＳＨを含む４９５μＬのリン酸バッファー（０．１Ｍｍ、ｐＨ７．４）に添加し、３７℃でインキュベートした。
【００７４】
ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡからのｓｉＲＮＡの遊離の割合はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。カラムにはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（ＧＥヘルスケア社）を用いた。検出は波長２６０ｎｍにおけるＵＶ検出により行った。溶離液には、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いた。
【００７５】
遊離したｓｉＲＮＡの割合は、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ及び遊離したｓｉＲＮＡのピーク強度比により計算した。
【００７６】
図１及び図２は、リンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。図１は、細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示し、図２は、細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示す。
【００７７】
その結果、図１に示すように、細胞外環境に相当するＧＳＨ濃度（２０μＭ）においては、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡ（比較例２、図１中、「ジスルフィド結合」と示す。）は６時間後に１２％、７２時間後に３８％のｓｉＲＮＡを放出した。
【００７８】
これに対し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ（実施例１、図１中、「２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合」と示す。）は７２時間たっても６％しかｓｉＲＮＡを放出しなかった。このことから、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を用いることで、細胞外環境において安定に核酸を結合出来ることが証明された。
【００７９】
また、図２に示すように、細胞内環境に相当するＧＳＨ濃度（１０ｍＭ）では、ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ（実施例１、図２中、「２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合−ｓｉＲＮＡ」と示す。）は６時間後に４０％、７２時間後に約９５％のｓｉＲＮＡを放出した。
【００８０】
以上の結果から、細胞内における高いＧＳＨ濃度に応答して、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合が切断されてｓｉＲＮＡが放出されることが確認された。
【００８１】
［実験例２］
（リンカー切断アッセイ２）
続いて、癌細胞内において過剰発現しているＧＳＴの存在下及び非存在下でリンカー切断アッセイを行った。５μＬのＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ（実施例１、１０μＭ  ｓｉＲＮＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を、１ｍＭのＧＳＨ及び０．００１９ｍｇ／ｍＬのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む又は含まない、４９５μＬのリン酸バッファー（０．１Ｍｍ、ｐＨ７．４）に添加し、３７℃でインキュベートした。続いて、ｓｉＲＮＡの遊離の割合を実験例１と同様にして測定した。
【００８２】
図３は、リンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。その結果、図３に示すように、ＧＳＴの存在下では、ＧＳＴの非存在下と比較して、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の壊裂が促進されることが明らかとなった。この結果から、癌細胞内では２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の切断が促進されることが明らかとなった。
【００８３】
［実験例３］
（ルシフェラーゼアッセイ）
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制効果をルシフェラーゼアッセイにより検討した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞）を１５００個／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを１ウェルあたり１００μＬ用いた。続いて、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００８４】
続いて、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ、又は対照のｓｉＲＮＡがそれぞれ結合した、実施例１、比較例１及び比較例２のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ（ＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ、ＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡ、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ジスルフィド−５’−ｓｉＲＮＡ、ＰＥＧの重量平均分子量はいずれも４０，０００）を、ｓｉＲＮＡの濃度が１〜１００ｎＭとなるように、リポフェクトアミンＲＮＡｉ  ＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて上記の細胞に導入し、更に７２時間インキュベートした。
【００８５】
続いて、培地を除去し、各細胞を１００μＬのリン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄した。続いて、２０μＬ／ウェルの溶解バッファー（プロメガ社）を添加した。続いて、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）及びルミノメーター（型式「Ｇｌｏｍａｘ９６」、プロメガ社）を用いて各細胞の発光量を測定した。ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞の発光量を基準として、各細胞の発光量（相対値）を計算した。図４（ａ）〜（ｃ）は、発光量の測定結果を示すグラフである。グラフの値は、６試料の平均値±標準誤差で示す。
【００８６】
その結果、比較例１（カルボン酸アミド結合、図４（ｂ））及び比較例２（ジスルフィド結合、図４（ｃ））のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡは目立った薬理活性を示さなかったのに対し、実施例１（２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合、図４（ａ））のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡは、有意な遺伝子発現抑制を示した。この結果は、２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を有するＰＥＧ−ｓｉＲＮＡが細胞内選択的に切断され、生理活性を発揮することを示す。
【００８７】
［実験例４］
（ＰＥＧの分子量の検討）
実施例３で用いたＰＥＧ−ｓｉＲＮＡとはＰＥＧの分子量が異なるＰＥＧ−ｓｉＲＮＡを用いて実験例３と同様の検討を行った。具体的には、参考例１のＭｅＯ−ＰＥＧ−スルホンアミド−５’−ｓｉＲＮＡ（ＰＥＧの重量平均分子量は２０，０００）、及び比較例３のＭｅＯ−ＰＥＧ−カルボン酸アミド−５’−ｓｉＲＮＡ（ＰＥＧの重量平均分子量は２０，０００）をＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞に導入し、実験例３と同様の条件下でルシフェラーゼアッセイを行った。図５（ａ）及び（ｂ）は、ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。グラフの値は、６試料の平均値±標準誤差で示す。
【００８８】
その結果、参考例１（２−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合、図５（ａ））のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡだけでなく、比較例３（カルボン酸アミド結合、図５（ｂ））のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡにおいても、対照のＰＥＧ−ｓｉＲＮＡと比較して有意な遺伝子発現抑制が認められた。
【００８９】
この結果は、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡにおけるＰＥＧの重量平均分子量が４０，０００であった実験例３の結果と比較して、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡにおけるＰＥＧの重量平均分子量が２０，０００では、細胞内におけるｓｉＲＮＡの活性阻害が非効率的であることを示す。つまり、リンカーが切断された場合にのみｓｉＲＮＡの活性を発現させるためには、ＰＥＧの重量平均分子量は２０，０００を超えるものである必要があることが明らかとなった。なお、生理活性物質がｓｉＲＮＡ以外の低分子医薬等である場合には、最適なＰＥＧの重量平均分子量はより小さくなる可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、生理活性物質の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することができる。
【図１】
2017218408.tif 000014
【図２】
2017218408.tif 000015
【図３】
2017218408.tif 000016
【図４】
2017218408.tif 000017
【図５】
2017218408.tif 000018
【配列表】
2017218408000001.app