(57)【要約】【課題】  より効果的な糖尿病の予防または治療用組成物を提供する。【解決手段】  本発明者らは、ロズマリン酸が1型様糖尿病および2型様糖尿病の両方の群において、グルコースホメオスタシスを改善すること、インスリン抵抗性の高い群におけるインスリン抵抗性を改善できること、肝臓におけるPEPCK発現を減少させ、かつ骨格筋におけるGLUT4発現を著しく増加させることを見出した。本発明は、ロズマリン酸を有効成分として含有する、糖尿病の予防または治療用組成物を提供する。【選択図】      図1
2017218410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロズマリン酸を有効成分として含有する、糖尿病の予防または治療用組成物。
【請求項２】
前記ロズマリン酸がシソ科の植物として含有される、請求項1に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
【請求項３】
医薬品の形態である、請求項1または2に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
【請求項４】
食品の形態である、請求項1または2に記載の糖尿病の予防または治療用組成物。
【請求項５】
ロズマリン酸を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の予防または治療用組成物およびインスリン抵抗性の改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（DM：Diabetes mellitus）は、最も一般的な代謝性疾患の1つである。糖尿病は、高カロリー食品の消費の増加および座り続ける生活スタイルの増加によって増大してきた。糖尿病に対する薬理学的アプローチは、主にその病態を調節するために多剤を服用している患者において薬物に関連する問題を引き起こすことがある。糖尿病の治療では、生薬化合物などの補完的あるいは代替的治療が多用される（非特許文献1）。実際に、最も一般的に用いられる薬剤の1つであるメトホルミンは、植物由来である。したがって、生薬は、既存の薬物より効果的でありかつ害が少ない化合物の有望な供給源であり、糖尿病を治療するための革新的な治療薬を構成しうる。
【０００３】
ロズマリン酸（RA：Rosmarinic acid）は、シソ科（Lamiaceae）、ムラサキ科（Boraginaceae）およびツノゴケ科（Anthocerotaceae）などの、多くの一般的な料理用のハーブに存在する強力な抗酸化剤である。ロズマリン酸は、最初に、広く料理に用いられる植物であるローズマリー（Rosmarinus officinalis）から分離された（非特許文献2）。近年、糖尿病の治療に対するロズマリン酸投与の有用性の研究により、ロズマリンが糖尿病によって誘発された障害および合併症を低減しうることが示唆された。糖尿病の動物において、ロズマリン酸の最初の研究によって、ロズマリン酸は、腸の刷毛縁膜を通過するナトリウム-グルコース共輸送体1（SGLT1）を調節することにより、血漿グルコースを制御し、高血糖を改善しうることが示された（非特許文献3、4）。さらに、ロズマリン酸は、主にその抗酸化作用を介して、内皮機能を保護し（非特許文献5）、かつ血漿テストステロンレベルを上昇させることによって、糖尿病に誘発された性的障害を防止することが示された（非特許文献6）。さらにまた、ロズマリン酸は、糖尿病の糸球体悪化および腎症から保護し（非特許文献7、8）、虚血条件下で、糖尿病神経障害において神経保護効果を与えることも報告されている（非特許文献9、10）。加えて、ロズマリン酸は、糖尿病により誘発された酸化的な脳損傷を緩和する（非特許文献11）。ロズマリン酸はまた、膵細胞をグルコリポ毒性から保護する（非特許文献12）。これらの知見は、ロズマリン酸が糖尿病によって誘発された障害および合併症を改善しうることを示す。しかしながら、ロズマリン酸による糖尿病の改善の基礎となるメカニズムは不明のままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yeh GY, et al.、Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes.、“Diabetes Care”、2003年、26（4）巻、p.1277-1294
【非特許文献２】Petersen M.、Rosmarinic acid：new aspects.、“Phytochemistry Reviews”、2013年、12（1）巻、p.207-227
【非特許文献３】Azevedo MF, et al.、Rosmarinic acid, major phenolic constituent of Greek sage herbal tea, modulates rat intestinal SGLT1 levels with effects on blood glucose.、“Molecular Nutrition and Food Research”、2011年、55(Suppl 1)巻、S15-S25
【非特許文献４】Jayanthy G, et al.、Rosmarinic acid, a polyphenol, ameliorates hyperglycemia by regulating the key enzymes of carbohydrate metabolism in high fat diet - STZ induced experimental diabetes mellitus.、“Biomedicine and Preventive Nutrition”、2014年、4(3)巻、p.431-437
【非特許文献５】Sotnikova R, et al.、Rosmarinic acid administration attenuates diabetes-induced vascular dysfunction of the rat aorta.、“Journal of Pharmacy Pharmacology”、2013年、65(5)巻、p.713-723
【非特許文献６】Farzadi L, et al.、Effect of rosmarinic acid on sexual behavior in diabetic male rats.、“African Journal of Pharmacy and Pharmacology”、2011年、5(16)巻、p.1906-1910
【非特許文献７】Tavafi M, et al.、Rosmarinic Acid ameliorates diabetic nephropathy in uninephrectomized diabetic Rats.、“Iranian Journal of Basic Medical Sciences”、2011年、14(3)巻、p.275-283
【非特許文献８】Jiang WL, et al.、Effect of rosmarinic acid on experimental diabetic nephropathy.、“Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology”、2012年、110(4)巻、p.390-395
【非特許文献９】Luan H, et al.、Rosmarinic acid protects against experimental diabetes with cerebral ischemia: Relation to inflammation response.、“Journal of Neuroinflammation”、2013年、10巻、p.28
【非特許文献１０】Hasanein P, et al.、Effects of rosmarinic acid on an experimental model of painful diabetic neuropathy in rats.、“Pharmaceutical Biology”、2014年、52(11)巻、p.1398-1402
【非特許文献１１】Mushtaq N, et al.、Rosmarinic acid prevents lipid peroxidation and increase in acetylcholinesterase activity in brain of streptozotocin-induced diabetic rats.、Cell Biochemistry and Function”、2014年、32(3)巻、p.287-293
【非特許文献１２】Govindaraj J, et al.、Rosmarinic acid modulates the antioxidant status and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats.、“Molecular and Cellular Biochemistry、2015年、404(1-2)巻、p.143-159
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、より効果的な糖尿病の予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、糖尿病治療におけるロズマリン酸の役割を調べるために、以下の糖尿病の2つの動物モデルにおけるグルコースホメオスタシスおよびインスリン調節に対するロズマリン酸の効果を調べた：ストレプトゾシン（STZ：streptozocin）により誘発された1型様糖尿病のラットおよび高脂肪食（HFD）により誘発された2型様糖尿病のラット。本発明者らは、グルコース負荷試験（GTTs）および摂食後グルコース試験（PGTs）を行い、グルコース利用を評価した。また、本発明者らは、インスリン耐性試験（ITTs）を用いてインスリン感受性を評価し、ホメオスタシスモデル評価（HOMA）を用いてインスリン抵抗性を同定した。さらに、ウェスタンブロット解析を用いてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）およびグルコーストランスポータータイプ4（GLUT4）のタンパク質発現レベルを決定し、グルコースホメオスタシスに対するロズマリン酸の効果の基礎となる潜在的メカニズムを調査した。
【０００７】
その結果、本発明者らは、ロズマリン酸が1型様糖尿病および2型様糖尿病の両方の群において、グルコースホメオスタシスを改善することを見出した。また本発明者らは、ロズマリン酸が、インスリン抵抗性の高い群におけるインスリン抵抗性を改善できることを見出した。さらに、本発明者らは、ロズマリン酸が、肝臓におけるPEPCK発現を減少させ、かつ骨格筋におけるGLUT4発現を著しく増加させることを見出した。
【０００８】
肝臓は、血糖値の調節に関与し、グルコースの取り込みおよび貯蔵（グリコーゲン生成）とグルコース放出（グリコーゲン分解および糖新生）のバランスをとることによりこれを行う。肝グルコース生成（HGP）は、グリコーゲンの分解および糖新生を経た非炭水化物前駆体からのグルコースの新規合成によって起こる。HGPおよび糖新生遺伝子発現が抑制される急性高血糖とは対照的に、慢性高血糖は、基底のHGPにおける漸進性増加が特徴であり、糖尿病において観察される高血糖の主要な型である。糖新生の速度は、PEPCK、フルクトース-1,6-ビホスファターゼおよびグルコース-6-ホスファターゼを含む酵素によって調整される。しかしながら、肝糖新生における初期ステップはPEPCKによって触媒され、PEPCKは慢性高血糖の間、上方制御される。加えて、PEPCKは、インスリンから独立しており、そのため、インスリン感受性の増加とは別に、高血糖の改善効果を調査するために分析することができる。本発明者らは、肝臓におけるPEPCK発現レベルが、ロズマリン酸処理後に著しく低くなることを見出した。このロズマリン酸の効果は、糖尿病における高血糖の低減に関与していた。
【０００９】
また、骨格筋は、グルコース処理活性のための重要な部位である。骨格筋におけるグルコース取り込みは、インスリンによって、細胞内の沈着部位から膜までGLUT4が移行することにより、増加する。したがって、GLUT4移行が損なわれると、インスリン抵抗性が増加する。骨格筋における急性のグルコース誘導型インスリン抵抗性の一部は、形質膜におけるGLUT4の急な減少によって起こる。グルコースは、インスリン抵抗性が伴う高血糖の間の過剰なグルコース取り込みに対する保護機構として、GLUT4の形質膜レベルにおける減少を誘発する。インスリン感受性は、骨格筋におけるGLUT4発現の増加によって増強される。本発明者らは、ロズマリン酸が骨格筋においてGLUT4発現を増加させ、このプロセスがインスリン抵抗性を改善させることを見出した。
【００１０】
本発明は、ロズマリン酸を有効成分として含有する、糖尿病の予防または治療用組成物を提供する。
【００１１】
また本発明は、上記組成物において、上記ロズマリン酸がシソ科の植物として含有される上記組成物を提供する。
【００１２】
また本発明は、医薬品の形態である上記組成物を提供する。
【００１３】
また本発明は、食品の形態である上記組成物を提供する。
【００１４】
また本発明は、ロズマリン酸を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の改善用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る組成物は、インスリン抵抗性を改善する効果を有するため、糖尿病を効果的に予防および治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】STZラットにおける血漿グルコースレベルに対するRAの用量依存的な効果を示すグラフ。
【図２】正常ラットおよびSTZラットにおける経口グルコース負荷試験（OGTT）に対するRAの効果を示すグラフ。図2Aは、正常ラットにおけるOGTTを示し、図2Bは糖尿病ラットにおけるOGTTを示す。また、図2C〜Dは、対応する相対的なグルコース濃度曲線下面積（AUC）を示す。
【図３】HFDで生育させた糖尿病のラットについて、指定用量のRA処理を行って7日後に行ったインスリン耐性試験の結果を示すグラフ。
【図４】HFDで生育させた糖尿病のラットにおける7日の実験期間後のHOMA-IRの分析の結果を示すグラフ。
【図５】STZによって誘発された糖尿病のラットの肝臓におけるPEPCKタンパク質レベルおよび骨格筋におけるGLUT4タンパク質レベルに対するRAの効果を示す。図5Aは、肝臓におけるPEPCK発現レベルを示す。図5Bは、骨格筋サンプルのサイトゾルおよび膜画分におけるGLUT4レベルのイムノブロットを示す。
【図６】HFDラットの肝臓におけるPEPCKタンパク質レベルおよび骨格筋におけるGLUT4タンパク質レベルに対するRAの効果を示す。図6Aは、肝臓におけるPEPCK発現レベルを示す。図6Bは、骨格筋サンプルのサイトゾルおよび膜画分におけるGLUT4レベルのイムノブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、糖尿病の予防または治療用組成物を提供する。本発明の組成物は、1型糖尿病および2型糖尿病において、グルコースホメオスタシスを改善させることができる。
【００１８】
また、本発明の組成物は、インスリン抵抗性の高い対象においてインスリン抵抗性を改善することにより糖尿病を予防または治療することができる。そのため、本発明の組成物は、たとえばインスリン抵抗性の高い対象のための糖尿病の予防または治療用組成物であることができる。
【００１９】
本明細書において「インスリン抵抗性が高い」とは、インスリンが効きづらく、インスリンを投与しても血糖値が下がりにくいことを意味する。インスリン抵抗性は、たとえばグルコースクランプ法、SSPG（stedy state plasma glucose）法およびHOMA-IR（homeostasis model assessment as an index of insulin resistance）などにより評価することができる。本明細書において「インスリン抵抗性を改善する」とは、インスリン抵抗性を低減させることをいう。
【００２０】
また、本発明の組成物は、肝臓におけるPEPCK発現を低減させることにより、肝臓における糖新生を抑制し、その結果糖尿病における高血糖を低減させることができる。また、本発明の組成物は、骨格筋においてGLUT4発現を増加させることにより、骨格筋におけるグルコース取り込みを増加させ、インスリン抵抗性を改善することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、ロズマリン酸（以下「RA」ともいう。）を有効成分として含有する。ロズマリン酸は、α-O-カフェオイル-3,4-ジヒドロキシフェニル乳酸ともいい、カフェイン酸（CA）と3,4-ジヒドロキシフェニル乳酸とのエステルである。
【００２２】
ロズマリン酸は、シソ科（Lamiaceae）、ムラサキ科（Boraginaceae）およびツノゴケ科（Anthocerotaceae）などの植物に含まれる化合物である。シソ科の植物には、たとえばシソ、バジル、ミント、ローズマリー、ラベンダー、セージ、サルビア、タイム、レモンバーム、クミスクチン、オウゴン、オドリコソウ、スペアミント（ミドリハッカ）、セイヨウハッカ、ハッカ、ヒキオコシおよびメリッサなどが含まれる。本発明において用いるロズマリン酸は、これらの植物由来であってもよい。また、ロズマリン酸は、これらの植物として含有されてもよい。
【００２３】
本発明の組成物は、医薬品、医薬部外品および食品などの形態であることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、必要に応じて、薬学的に許容される基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤および着色剤などの任意の成分をさらに含むことができる。任意の成分には、たとえば、乳糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、トウモロコシでんぷん、結晶セルロース、カルメロースカルシウム、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウムおよびステアリン酸マグネシウムなどが含まれる。
【００２５】
本発明の組成物は、任意の製剤であることができ、経口投与製剤であっても非経口投与製剤であってもよい。本発明の組成物は、経口投与製剤として、たとえば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤および散剤などの固形製剤並びに懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤などの液剤などであることができる。また、本発明の組成物は、非経口投与のために、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮投与、経鼻投与、経肺投与、経腸投与、口腔内投与および経粘膜投与などの投与のための製剤であることができる。
【００２６】
また、本発明の組成物は、苦味を有する植物（生薬等）を含有する場合、苦みをマスキングした製剤であることができる。マスキングの方法としては、薬物を被覆剤で被覆する方法（フィルムコーティング法）あるいは薬物を基剤中に分散させてマトリックス状にする方法（マトリックス法）等の公知のマスキング方法を用いることができる。
【００２７】
フィルムコーティング法は、たとえば錠剤、顆粒剤、細粒剤または散剤等に、胃溶性、腸溶性ポリマーまたは水溶性、水不溶性ポリマー等の被覆剤を用いて皮膜を施すことによって容易に行うことができる。被覆剤の具体例としては、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、ポリビニルアセチルジエチルアミノアセテート、セルロースアセテートフタレート、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、メチルセルロースおよびエチルセルロース等が挙げられる。
【００２８】
マトリックス法は、たとえば生薬またはその抽出エキスを、水不溶性のポリマーおよび／または水膨潤性のポリマーよりなる基剤と練合し、造粒して、生薬またはその抽出エキスが、該ポリマーよりなる基剤中に分散されたマトリックス状とした後、常法により錠剤、顆粒剤、細粒剤あるいは散剤等に調製することによって行うことができる。
【００２９】
上記水不溶性のポリマーの具体例としては、エチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等が挙げられる。また、水膨潤性のポリマーの具体例としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウムおよびカルボキシビニルポリマー等が挙げられる。
【００３０】
また、上記基剤中に、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性のポリマー、硬化油またはステアリン酸等の高級脂肪酸および／またはショ糖脂肪酸エステル等の医薬添加物を適宜、添加することができる。
【００３１】
本発明の組成物におけるロズマリン酸の含有量は、糖尿病の予防または治療に有効な投与量となるように設定することができる。たとえば、１日当り10mg/kg体重以上、好ましくは50mg/kg以上、より好ましくは100mg/kg以上、さらに好ましくは200mg/kg以上の投与量に設定することができる。
【００３２】
本明細書において、「食品」には、一般食品、健康食品、栄養機能食品、特定保健用食品、サプリメント、機能性表示食品および病者用食品などが含まれる。一般的な飲食品には、たとえば各種飲料、各種食品、加工食品、液状食品（スープ等）、調味料、栄養ドリンクおよび菓子類などが含まれる。本明細書において「加工食品」とは、天然の食材（動物および植物など）に対し加工および／または調理を施したものをいい、たとえば肉加工品、野菜加工品、果実加工品、冷凍食品、レトルト食品、缶詰食品、瓶詰食品およびインスタント食品などが含まれる。本発明の組成物は、食品の形態である場合、糖尿病を予防する旨の表示を付した食品であってもよい。また、本発明の組成物は、袋および容器等に封入された形態で提供されてもよい。本発明において使用する袋および容器は、食品に通常使用される任意の袋および容器であることができる。
【００３３】
本発明はまた、ロズマリン酸を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の改善用組成物を提供する。本発明のインスリン抵抗性の改善用組成物は、上述した糖尿病の予防または治療用組成物と同様に構成することができる。本発明のインスリン抵抗性の改善用組成物は、インスリンの抵抗性の高い対象に適用することにより、インスリン抵抗性を低減させ、インスリンの効力を高めることができる。本発明のインスリン抵抗性の改善用組成物は、医薬品、医薬部外品および食品などの形態であることができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（動物）
体重170〜210gの7週目の雄Wistarラットは、日本エスエルシー株式会社から入手した。ラットは、病原体フリーの温度（25℃）および湿度がコントロールされた部屋で、12時間明／12時間暗サイクル（午前7時に点灯）にて、個別に収容した。ラットは、餌および水道水を自由にとることができた。
【００３６】
（糖尿病の導入）
1型様糖尿病は、動物を48時間絶食させた後、クエン酸バッファー（10mM、pH4.5）に溶解してすぐのストレプトゾシン（STZ：streptozocin）（65mg/kg; Sigma-Aldrich、USA）を腹腔内に単回投与して誘発させた。STZ投与後7日目に、血糖メーターを用いて、尾から得た血液試料における血糖値を測定した。基底の血糖値が300mg/dLを超えるラットのみを糖尿病とみなした。
【００３７】
インスリン抵抗性モデルは、ラットに高脂肪食（HFD）（60％kcal fat；D12492、Research Diets Inc.、USA）を8週間自由に与えることによって誘導した。変化した動物について次いで検証した：HFDラットは、体重の有意な増加を示し、体脂肪を蓄積させ、かつ耐糖能を損なった（空腹時グルコース≧130mg/dL）。
【００３８】
（実験手順および薬物投与）
一旦高血糖（HG）を達成すると、ラットは作業群（n=8）に割り当てられ、各群には7日間指定用量のロズマリン酸（RA）を処理した。ロズマリン酸（≧98%、HPLC；Sigma-Aldrich、USA）は、生理食塩水に溶解させ、1日1回7日間腹腔内注射によって投与した。対照群には、生理食塩水を投与した。また、ロズマリン酸の慢性的な効果を調べるため、高血糖を示したさらなるSTZ群およびHFD群に、28日間指定用量のロズマリン酸を処理した。そして、28日目に、体重の変化と、日々の餌および水の摂取の変化とを評価し、1日目のロズマリン酸処理前の値と比較した。なお、ロズマリン酸処理の間、注入関連の副作用は観察されなかった。
【００３９】
一旦処理が完了すると、ラットは8時間絶食させ、次いで麻酔をかけて心臓穿刺により血液サンプルを採取した。血清は、ヘパリンを含むチューブに採取した。試料は3000×gにて15分間4℃で遠心分離し、表面の黄色のプラズマ層を新しいチューブに移した。肝臓試料は、右の腹葉ヒラメ筋から採取した。
【００４０】
（生化学パラメータの測定）
ロズマリン酸の低血糖活性を調整する効果を異なる用量で研究するため、STZラットにおいてロズマリン酸処理期間、毎日、摂取後の血糖（PGT）を算定した。絶食したラット（8時間）にグルコースのボーラス（180mg/dL）を与え、2時間後に血液を抜いて、グルコース濃度を測定した。
【００４１】
グルコース変調に対するロズマリン酸の急性効果を調べるため、正常群およびSTZ群において経口グルコース負荷試験（OGTT）を行った。ラットを8時間絶食させ、次いで各ラットにD-グルコース（2g/kg）を胃管栄養法により投与した。グルコース投与後0、30、60、120および180分後、各ラットの尾静脈から血液試料を採取し、グルコースレベルを測定した。経口グルコース負荷試験（OGTT）は、ロズマリン酸処理の7日後に行った。グルコースの曲線下面積（AUC）は、サンプリング期間の0〜120分の全AUCを用いて算出した。
【００４２】
血漿グルコース量は、血糖メーター（ニプロ株式会社）を用いて測定した。インスリンレベルは、ラットインスリンELISAキット（Mercodia AB、スウェーデン）を用いて酵素結合免疫吸着法（ELISA）により、製造業者の指示にしたがって測定した。ロズマリン酸処理がインスリン抵抗性を改善するかどうか調べるために、ロズマリン酸処理の最初と最後の日におけるインスリン耐性試験（ITT）およびインスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（HOMA-IR）の結果を評価した。ITT試験では、ラットを8時間絶食させた後、0.5IU/kg体重のインスリンを腹膜内に注射し、0、15、30および60分に血液試料を採取してグルコースレベルを測定した。HOMA指数は、上述したように、正常な被験体のインスリン抵抗性を1として、空腹時グルコース濃度（mmol/L）×空腹時インスリン濃度（U/mL）／22.5として算出した。
【００４３】
（ウェスタンブロット解析）
PEPCK（phosphoenolpyruvate carboxykinase）およびGLUT4（glucose transporter type 4）の発現は、ウェスタンブロット解析を用いて同定した。凍結した筋肉試料（100mg）を1ml溶解バッファーでホモジナイズした。ホモジネートを1000×gで5分遠心し、核および不溶性物質をペレット化した。上清を新しいチューブに移し、100,000×gでさらに遠心して膜をペレット化した。この工程での上清は、解析に用いるサイトゾル画分として回収した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量法（Thermo Fisher Scientific社、USA）を用いて測定した。タンパク質試料を濾過し、BioRad Trans-BlotシステムにおいてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（10%アクリルアミドゲル）により膜に転写した。膜は、ほぼ1時間、0.1%Tween20を含むTris-緩衝食塩水（TBS-T）中の5%脱脂乳に浸漬した。次いでTBS-Tで洗浄し、1次抗体（TBSで希釈した）と16時間ハイブリダイズした。以下の特異抗体を用いてタンパク質発現を同定した：PEPCK（抗ウサギ、1/1000希釈）（Santa Cruz Biotechnology、USA）およびGLUT4（抗マウス、1:1000希釈）（Abcam plc、UK）。加えて、膜は、内部標準としてβ-アクチンに対する抗体（Sigma-Aldrich、USA）（1:5000希釈）とともにインキュベートした。二次抗体とのインキュベーションおよび抗原抗体複合体検出は、ECLキット（Thermo Fisher Scientific社、USA）を使用して行った。PEPCK（62kDa）、GLUT4（30kDa）およびβ-アクチン（42kDa）に対する免疫ブロットは、内部標準として用いた抗β-アクチン（1:1,000；Santa Cruz Biotechnology）に対する免疫ブロットと比較した。
【００４４】
（統計解析）
統計解析は、SPSSソフトウェア（SPSS社、USA）を用いて行った。グループ間の違いは、一元配置分散分析法（ANOVA）を用いて分析し、その後Dunnett法またはTukey-Kramer法による多重比較試験を行った。事後の最小有意差（LSD）試験を用いてインスリンおよびHOMA-IRを分析した。OGTT反応は、反復測定ANOVAを用いて分析した。結果は、平均±SEMとして記録し、p＜0.05にて有意であるとみなした。
【００４５】
（試験例1：RAは、糖尿病群におけるグルコースホメオスタシスを改善した）
図1は、STZラットにおける血漿グルコースレベルに対するRAの用量依存的な効果を示す。STZラットに、腹腔内注射により生理食塩水またはRA（120、160または200mg/kg）を処理した。血漿グルコースレベルは、RA処理120分後に決定した。値は、平均±平均値の標準誤差を表す。データは、平均値±SE（n＝8）として表される。「＊＊」は、p＜0.01を表し、それぞれ生理食塩水を投与したSTZラット（対照）における値とは有意に異なることを意味する（Dunnett法）。
【００４６】
摂取後グルコース試験（PGT）は、STZ投与の1週後に20%グルコース溶液（2mg/g体重）を腹腔内注射することにより行った。血漿グルコースレベルは減少し、120分にて最小値に達した。高用量のRA（200mg/kg）では、160mg/kgの用量より低いグルコースレベルとなった。したがって、200mg/kgのRAがSTZラットのPGTに対して最も有効であると思われる。このように、本願発明者らは、RAが顕著に用量依存的な低血糖性効果を有することを見出した。
【００４７】
薬学研究において、STZラットおよび正常なラットをRAで処理した後、その治療的な有効性を示すために、OGTTを測定した。図2は、正常ラットおよびSTZラットにおける経口グルコース負荷試験（OGTT）に対するRAの効果を示す。8時間の絶食後、正常ラットおよびSTZによって誘発された糖尿病のラットに、0.9%生理食塩水の等しい量またはRAの異なる用量（120mg/kg、160mg/kg、200mg/kg）を胃内に投与した。15分後、D-グルコース（2g/kg）をOGTTのために経口投与した。図2Aは、正常ラットにおけるOGTTを示し、図2Bは糖尿病ラットにおけるOGTTを示す。また、図2C〜Dは、対応する相対的なグルコース濃度曲線下面積（AUC）を示す。結果は、平均値±SEM（n＝8）として表した;対照群と比較して、「＊」はp＜0.05、「＊＊」はp＜0.01を表す（Tukey-Kramer法）。
【００４８】
OGTTにおいて、グルコース投与して30分後の最大血糖値は、正常なラットにおいて183±5.12mg/dLであり、糖尿病のラットにおいて522±11.99mg/dLであった。正常なラットおよび糖尿病のラットの両方において、RAでの前処理は、用量依存的に耐糖能を改善し（図2A、図2B）、相対的なグルコース濃度曲線下面積（AUC）を著しく減少させた（図2C、図2D）。
【００４９】
HFD群において、インスリン感受性に対するRAの効果を決定するために、一旦高血糖状態を確認すると、インスリン耐性試験（ITT）を行った。図3は、HFDで生育させた糖尿病のラットについて、指定用量のRA処理を行って7日後に行ったインスリン耐性試験の結果を示す。値は、平均±SEM（n=8）を示す。統計解析は、独立したスチューデントのt検定を使用して実行した。生理食塩水を投与したHFDラット対照群（同量の溶媒を投与した）と比較して、「＊」は、p＜0.05を表し、「＊＊」は、p＜0.01を表し、「＊＊＊」は、p＜0.005を表す（Tukey-Kramer法）。
【００５０】
RA投与群（160mg/kg、200mg/kg）における血糖値は、糖尿病のラットにおけるレベルと比較して有意差があり、インスリン注入後15分および30分の時点で低いままだった（図3）。これらの結果は、RAが糖尿病のラットにおいてインスリン感受性を増強したことを示す。インスリン感受性に対するRAの効果は、高用量にてより大きかった。
【００５１】
（試験例2：RAは、インスリン抵抗性群におけるインスリン抵抗性を逆転させた）
血漿グルコースレベルおよびインスリンレベルを測定して、HFDで生育させたラットにおけるインスリン感受性に対するRAの効果を調べた。RA投与前に、すべての群におけるラットが著しく高血糖性、すなわち空腹時血漿グルコースレベル＞130mg/dLであることを確認した。RA処理の7日後のインスリンレベルおよび血漿グルコースレベルは、対照群におけるレベルより著しく低かった（インスリン537.76±20.71対409.79±26.49pmol/L、空腹時血漿グルコース133±3.61対120±2.41mg/dL、どちらもRA処理前対RA処理7日後を示す；p＜0.05）。一旦高血糖状態を確認すると、インスリン耐性試験（ITT）を行い、インスリン感受性に対するRAの効果を調べた。固形試料を摂取した群と比較して、HFDで生育させたラットは、インスリン抵抗性だった。HFD群において、RAを投与した群（160mg/kg、200mg/kg）における血糖値は、インスリン注入後、有意差があり、15分および30分の時点で、糖尿病のラットにおけるレベルより低いままだった（図3）。7日の実験期間後の実験した群における分析パラメータ（血糖、インスリン、HOMA-IR）の平均値を表1に示す。値は、平均±S.D.（n=8）として示される。一方向のANOVAの後、post hoc test（LSD）を行った。これらのデータは、RAが糖尿病のラットにおけるインスリン感受性を強化したことを示す。インスリン感受性に対するRAの効果は、高用量にてより大きかった
【００５２】
【表１】
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【００５３】
加えて、RAの最低および最高の用量（120および200mg/kg）の効果を比較すると、血漿インスリンレベルおよびグルコースレベル（データは示さない）に対する用量依存的効果が明らかとなった。さらにまた、HFDで生育させた糖尿病のラットにおいて、RAは、用量依存的にHOMA-IRを減少させた（図4）。図4は、HFDで生育させた糖尿病のラットにおける7日の実験期間後のHOMA-IRの分析の結果を示す。値は、平均±SEM（n=8）を表す。同量の溶媒を投与したHFD群と比較して、「＊」は、p＜0.05を表し、「＊＊」は、p＜0.01を表す。したがって、7日間のRA処理は、HFDで生育させたネズミにおけるインスリン抵抗性を逆転させた。すなわち、RAは、インスリン抵抗性を改善することができることが示された。
【００５４】
（試験例3：PEPCK発現を介する肝糖新生活性に対する、およびGLUT4発現を介するインスリン感受性に対するRAの効果）
PEPCKおよびGLUT4のタンパク質発現レベルは、STZによって誘発された糖尿病のラットおよびHFDで生育させた糖尿病のラットにおいて、ウェスタンブロット解析を用いて分析した。
【００５５】
図5は、STZによって誘発された糖尿病のラットの肝臓におけるPEPCKタンパク質レベルおよび骨格筋におけるGLUT4タンパク質レベルに対するRAの効果を示す。試料抽出物は、NC、STZおよびSTZ＋RA群から調製した。HFDラットは、腹腔内注射により7日間RA（200mg/kg）で処理した。図5Aは、肝臓におけるPEPCK発現レベルを示す。図5Bは、骨格筋サンプルのサイトゾルおよび膜画分におけるGLUT4レベルのイムノブロットを示す。対照の食事を与えたラットにおけるGLUT4タンパク質レベルを、定量化のための対照として用いた。各バーは、平均±SEM（n=6）を表す。一方向のANOVAを行った後、Fisher's LSD post hoc testを行った。「＊」p＜0.05対NC、「＃」p＜0.05対STZ。
【００５６】
図6は、HFDラットの肝臓におけるPEPCKタンパク質レベルおよび骨格筋におけるGLUT4タンパク質レベルに対するRAの効果を示す。試料抽出物は、NC、HFDおよびHFD＋RA群から調製した。HFDラットは、腹腔内注射により7日間RA（200mg/kg）で処理した。図6Aは、肝臓におけるPEPCK発現レベルを示す。図6Bは、骨格筋サンプルのサイトゾルおよび膜画分におけるGLUT4レベルのイムノブロットを示す。対照の食事を与えたラットにおけるGLUT4タンパク質レベルを、定量化のための対照として用いた。各バーは、平均±SEM（n=6）を表す。一方向のANOVAを行った後、Fisher's LSD post hoc testを行った。「＊」p＜0.05対NC、「＃」p＜0.05対HFD。
【００５７】
PEPCK発現は、STZによって誘発された糖尿病のラットおよびHFDで生育させた糖尿病のラットから単離された肝細胞において、著しく増加した（図5A、図6A）。RA処理は、両群における肝PEPCK発現を減少させた。これは、RAが糖尿病のラットの肝臓における糖新生を増加させたことを示唆する。しかしながら、STZ群におけるPEPCKレベルの減少は、HFD群における減少より顕著であった。加えて、グルコース取り込みにおける変化を調査するために、筋肉組織におけるGLUT4タンパク質発現を検討した（図5B、図6B）。その結果、GLUT4発現がSTZによって誘発された糖尿病のラットおよびHFDで生育させた糖尿病のラットにおいて著しく低いことを見出した。RA処理は、両群におけるGLUT4発現を著しく増加させた。したがって、RAは、骨格筋におけるGLUT4発現を増加させた。
【００５８】
（試験例4：体重、水分摂取および食物摂取に対するRAの効果）
糖尿病のラットにおけるRAの長期間の効果を調査するために、体重並びに一日の食物および水の摂取における変化を、STZ群およびHFD群において測定した。その結果を表2に示す。データは、平均±平均値の標準誤差（n=8）として提示される。統計解析は、独立したスチューデントのt検定を使用して実行した。無処理群（溶媒）と比較して、「＊」はp＜0.05を表す。28日間のRAの投与（120、160または200mg/kg）は、HFD群において体重の顕著な減少を引き起こしたが、一日の食物または水の摂取については有意差が見られなかった。さらにまた、RAは、正常（対照）群およびSTZ群では、体重または一日の食物もしくは水の摂取に対する顕著な効果を有しなかった
【００５９】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、インスリン抵抗性を改善させることにより、糖尿病を効果的に予防または治療できるため、糖尿病のための医薬、医薬部外品および食品に好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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