(57)【要約】【課題】  本発明は、肺前駆細胞を体細胞から直接作製する方法及び本方法で作製した肺前駆細胞を提供する。【解決手段】  本発明は、体細胞にFoxa2, Gata6, Irx3, Sox21, Nmyc転写因子からなる４因子、好ましくはさらにIrx3転写因子を加えた５因子の遺伝子、タンパク質、さらにはこれら因子を発現誘導する活性のある低分子化合物やmiRNAを導入することで、直接肺前駆細胞を作製する方法を提供した。このようにして作製した肺前駆細胞、さらにそれを分化させた肺上皮細胞など各種肺細胞を、機能性肺細胞への分化を評価したり、毒性評価を行う上で優れたin vitro及びin vivoの評価用細胞材料又はキットとして用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a)〜(d)の転写因子ファミリー内の転写因子からそれぞれ１つ以上選択された４種の転写因子を含む、体細胞からの肺前駆細胞作製用試薬；
(a)  Foxファミリー、
(b)  Gataファミリー、
(c)  Soxファミリー、及び
(d)  mycファミリー。
【請求項２】
(a)  Foxファミリーから選択された転写因子がFoxa1, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Foxd2, Foxd3, Foxd4, Foxd5, Foxd6, Foxd7, Foxd8, Foxe1, Foxe2, Foxe3, Foxf1, Foxf2, Foxg1, Foxh1, Foxi1, Foxj1, Foxj2, Foxj3, Foxk1, Foxm1, Foxn1, Foxn2, Foxn3, Foxn4, Foxn5, Foxn6, Foxo1, Foxo3a, Foxo4, Foxp1,Foxp2, Foxp3又はFoxq1のいずれかの転写因子を含み、
(b)  Gataファミリーから選択された転写因子がGata1, Gata2, Gata3, Gata4, Gata5，又はGata6のいずれかの転写因子を含み、
(c)  Soxファミリーから選択された転写因子がSox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, Sox30又はSryのいずれかの転写因子を含み、そして
(d)  mycファミリーから選択された転写因子がcMyc, LMyc又はNmycのいずれかの転写因子を含む、
請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
少なくともFoxa2, Gata6, Sox21及びNmyc遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
さらに(e) Irxファミリーに属する転写因子ファミリー内の転写因子から１つ以上選択された転写因子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
(e)  Irxファミリーから選択された転写因子がIrx1, Irx2, Irx3, Irx4, Irx5又はIrx6のいずれかの転写因子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
少なくともFoxa2, Gata6, Sox21, Nmyc及びIrx3遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
体細胞から肺前駆細胞を作製する方法であって、下記の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、方法；
（１）下記の(a)〜(d)の転写因子ファミリーからそれぞれ１つ以上の転写因子を選択する工程、
(a)  Foxファミリー、
(b)  Gataファミリー、
(c)  Soxファミリー、及び
(d)  mycファミリー、
（２）標的体細胞内で、前記４種類の転写因子を含む転写因子群を作用させる工程、
（３）転写因子作用後の細胞でNkx2.1遺伝子を発現していることを確認する工程。
【請求項８】
(a)  Foxファミリーから選択された転写因子がFoxa1, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Foxd2, Foxd3, Foxd4, Foxd5, Foxd6, Foxd7, Foxd8, Foxe3, Foxe1, Foxe2, Foxe3, Foxf1, Foxf2, Foxg1, Foxh1, Foxi1, Foxj1, Foxj2, Foxj3, Foxk1, Foxm1, Foxn1, Foxn2, Foxn3, Foxn4, Foxn5, Foxn6, Foxo1, Foxo3a, Foxo4, Foxp1,Foxp2, Foxp3又はFoxq1のいずれかの転写因子を含み、
(b)  Gataファミリーから選択された転写因子がGata1, Gata2, Gata3, Gata4, Gata5，又はGata6のいずれかの転写因子を含み、
(c)  Soxファミリーから選択された転写因子がSox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, Sox30又はSryのいずれかの転写因子を含み、そして
(d)  mycファミリーから選択された転写因子がcMyc, LMyc又はNmycのいずれかの転写因子を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記転写因子群が、少なくともFoxa2, Gata6, Sox21及びNmycを含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（１）において、さらに(e) Irxファミリーに属する転写因子ファミリー内の転写因子から１つ以上の転写因子を選択する工程を含み、工程（２）において、当該転写因子も含めた５種類の転写因子を含む転写因子群を作用させることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
(e)  Irxファミリーから選択された転写因子がIrx1, Irx2, Irx3, Irx4, Irx5又はIrx6のいずれかの転写因子を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１２】
前記転写因子群が、少なくともFoxa2, Gata6, Sox21, Nmyc及びIrx3遺伝子を含むことを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記転写因子群を前記体細胞内で作用させるにあたり、各転写因子をコードする遺伝子を当該細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
体細胞に対して請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法を適用して肺前駆細胞を作製し、次いで、得られた肺前駆細胞を所望の肺組織細胞への分化誘導用培地で培養することを特徴とする、分化された肺組織細胞の製造方法。
【請求項１５】
肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤のスクリーニング方法であって、下記の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、方法；
（１）体細胞に対して請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法を適用して肺前駆細胞を作製する工程、
（２）得られた肺前駆細胞の１部を、所望の肺組織細胞への分化誘導用培地で培養する工程、
（３）肺前駆細胞の他の１部を、工程（２）で用いた分化誘導用培地に被検物質を添加した培地で培養するか、又は肺前駆細胞内に被検物質を導入後に工程（２）で用いた分化誘導用培地で培養する工程、
（４）工程（２）及び工程（３）で用いた肺前駆細胞の一定時間経過後の分化状態を比較して、後者の分化が進んでいる場合、被検物質を肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤の候補物質となると評価して、選択する工程。
【請求項１６】
肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤のスクリーニング用キットであって、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法により作製した肺前駆細胞を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺の前駆細胞を特異的に作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療を安全・確実に遂行するためには、治療対象となる組織細胞やその前駆細胞などを安定して調製することが必要となる。例えば肺の組織に関して、喫煙などと関わりが深い慢性閉塞性肺疾患は肺胞が不可逆的に破壊される慢性疾患であり、現在のところ気管支拡張薬、去痰薬、鎮咳薬などを使用して症状の進行を遅らせることは可能であるが、肺機能を組織レベルで回復させる方法が存在しない。近年、iPS細胞などの多能性幹細胞を利用して特定の組織細胞への特異的分化を目的とした研究が進んでいるが、目的組織の細胞のみを選択的に分化させ、移植部位に適した細胞集団を調製する技術開発が進められている。
例えば肺前駆細胞の分化方法については、幹細胞を内胚葉細胞に分化させ、そしてさらに肺を構成する組織細胞へと分化する手法が周知である。例えば、in vitroでES細胞を培養し、凝集させて胚様体と呼ばれる細胞塊を形成させる方法や平面培養で分化誘導し、内胚葉細胞を形成する手法が従来から広く行われている（非特許文献９、特許文献３）。特に高濃度のアクチビンなどを添加して内胚葉細胞を効率的に作成させる方法が利用されている（非特許文献１０）。また、iPS細胞から分化させた内胚葉細胞を元に分化制御する作製方法の検討も進んでいる（非特許文献１）。さらに、内胚葉細胞を前方内胚葉に分化誘導するためには、DorsomorphinとSB431542などのBMPシグナル阻害剤とTGF-beta/activinシグナル阻害剤を添加して培養した後、BMPやFGFを含む培地で培養する方法（非特許文献１１）で肺前駆細胞を作製することも可能である。しかし、未だES/iPS細胞を使用した分化方法は、奇形腫などの腫瘍化を排除する方法が確立しておらず、また、非常に未分化なiPS細胞を作製した後、多くのステップを踏んで再び目的組織細胞へと厳密なコントロールにより再分化させるため、細胞の調製に長い時間と労力がかかるとともに、目的外の細胞の混入などいくつもの課題が残っている。そのため、iPS細胞から分化させた細胞を利用した臨床応用は、特にその安全性の検証や分化細胞の信頼性、分化効率の安定性などの検証に時間を要している。
一方、腫瘍化の危険性を回避する目的でES/iPS細胞を使用しない細胞治療法も検討されている。例えば、間葉系幹細胞を移植することにより、主にその分泌因子を介したパラクライン作用により、過剰な炎症反応を抑制し、血管新生を促すことで組織の正常化を促進することが報告されている（非特許文献２）。また、成体の肺組織には幹細胞が存在することを示唆する報告があり、これらの細胞を利用して肺の組織再生を促すという考え方もあるが（特許文献１〜４）、まだ実用的な方法は確立していない。
また、ES/iPS細胞を使用しないで目的細胞を作製する方法として、近年新たな方法が開発されつつある。iPS細胞はOct4, Sox2, Klf4, cMycの4つの遺伝子を導入することにより、ES細胞に非常によく似た未分化状態の多能性幹細胞を、分化細胞である線維芽細胞から転換させる方法で作られたが(非特許文献４)、目的とする分化細胞毎に適切な遺伝子を選択して導入することで、線維芽細胞からiPS細胞を経由することなく直接的に神経(非特許文献５)、肝臓(非特許文献６、７)、軟骨(非特許文献８)などの細胞が作製できることが報告されてきており、これらの新しい分化方法は「ダイレクトリプログラミング法」と呼ばれている。この方法では、遺伝子を導入して細胞の運命を転換する過程で、iPS細胞様の多能性幹細胞は経由しないことから、奇形腫などへの癌化の危険性がない安全な細胞であると期待されている。しかしながら、肺組織細胞に関しては、これまでこのような直接分化させる方法は存在しなかった。慢性閉塞性肺疾患患者や肺切除後の患者のQOLを高めるためにも、安全な肺細胞の作製方法が望まれており、肺組織細胞の直接分化法の開発が急務であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１０−１１９８１９（WO2010119819A1）
【特許文献２】国際公開２０１３−６６８０２（WO2013066802A2）
【特許文献３】米国公開公報２０１４−１７６９１（US20140017691A1）
【特許文献４】特表２００５−５２０５１９
【０００４】
【非特許文献１】Longmire, TA. Cell Stem Cell (2012) 10, 398-411.
【非特許文献２】Fung, ME. Pediatr Res. (2014) 75, 2-7.
【非特許文献３】Lee, JH. Cell (2014) 156, 440-455.
【非特許文献４】Takahashi, K. Cell (2006) 126, 663-676.
【非特許文献５】Vierbuchen, T. Nature (2010) 463, 1035-1041.
【非特許文献６】Huang, P. Nature (2011) 475, 386-389.
【非特許文献７】Sekiya, S. Nature (2011) 475, 390-393.
【非特許文献８】Hiramatsu, K. J Clin Invest. (2011) 121, 640-657.
【非特許文献９】Keller, G M. Curr. Opin. Cell Biol. (1995) 7, 862-869.
【非特許文献１０】Kubo, A. Development (2004) 131, 1651-1662.
【非特許文献１１】Huang, SX. Nat Biotechnol.(2014) 32, 84-91.
【非特許文献１２】D’Amour K.A. et al, Nature Biotechnol. (2005) 23, 1534-1541.
【非特許文献１３】Ha, E. J Pineal Res. (2006) 41, 67-72.
【非特許文献１４】Baroukh, N. J Biol Chem. (2007) 282, 19575-19588.
【非特許文献１５】Cole, KA. Mol Cancer Res (2008) 6, 735-742.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、肺の再生医療において、幹細胞から肺組織細胞を分化させる安全で精度の高い方法はこれまで提供されてきたとは言い難い。特に、ES細胞やiPS細胞を用いる場合、多段階の分化段階を経て正確に肺組織に分化させることが必要であるが、その分化効率や安定性が不十分である上に、腫瘍化の問題が未解決である。本発明は、このような技術背景を踏まえ、新たな肺前駆細胞の作製方法として、体細胞から直接肺前駆細胞を作製する肺細胞における「ダイレクトリプログラミング法」を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、肺の発生過程で特異的に発現する転写因子に注目し、肺の組織が形成され始める胎児期の肺前駆体組織で、その時期に特異的に発現する遺伝子について文献情報やデータベースの情報を総合的に検討した結果、2000種類以上存在する転写因子の中から、将来肺組織を構成する様々な細胞に分化する肺細胞の元となる前駆細胞中で高発現している遺伝子を絞り込み、特にFoxa2, Gata6, Sox21及びNmycの４種類の転写因子、さらにIrx3を加えた５種類の転写因子を選択した。そして線維芽細胞で当該４転写因子又は５転写因子を発現させることで、線維芽細胞を肺前駆細胞へと分化転換することに成功した。これらの因子は、マウス胎児由来の線維芽細胞や成体マウスの表皮の線維芽細胞に遺伝子導入することにより、2-3週間で肺前駆細胞特異的に発現する転写因子Nxk2.1陽性の肺前駆細胞へと直接分化させることができる。これら４つの転写因子から一つの因子でも抜くと、Nkx2.1タンパク質を発現する肺前駆細胞が全く出現しないことから、Foxa2, Gata6, Sox21及びNmycの転写因子はいずれも必須因子であると考えられる。さらにIrx3転写因子を加えた５転写因子が効率よく肺前駆細胞への直接分化を促すことも確認できたことから、Irx3転写因子は、肺前駆細胞への直接分化促進には欠かせない因子であると考えられる。Irx3転写因子を加えたこれら５つの転写因子で直接分化させた肺前駆細胞はin vitroでの培養により、肺胞上皮Ｉ型細胞などを含む肺組織細胞へと分化する能力を持っていることを確認できた。このような知見をもとに、これまでにない肺胞上皮細胞などへの分化能を持つ肺前駆細胞作製方法に係る本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記の(a)〜(d)の転写因子ファミリー内の転写因子からそれぞれ１つ以上選択された４種の転写因子を含む、体細胞からの肺前駆細胞作製用試薬；
(a)  Foxファミリー、
(b)  Gataファミリー、
(c)  Soxファミリー、及び
(d)  mycファミリー。
〔２〕  (a)  Foxファミリーから選択された転写因子がFoxa1, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Foxd2, Foxd3, Foxd4, Foxd5, Foxd6, Foxd7, Foxd8, Foxe1, Foxe2, Foxe3, Foxf1, Foxf2, Foxg1, Foxh1, Foxi1, Foxj1, Foxj2, Foxj3, Foxk1, Foxm1, Foxn1, Foxn2, Foxn3, Foxn4, Foxn5, Foxn6, Foxo1, Foxo3a, Foxo4, Foxp1,Foxp2, Foxp3又はFoxq1のいずれかの転写因子を含み、
(b)  Gataファミリーから選択された転写因子がGata1, Gata2, Gata3, Gata4, Gata5，又はGata6のいずれかの転写因子を含み、
(c)  Soxファミリーから選択された転写因子がSox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, Sox30又はSryのいずれかの転写因子を含み、そして
(d)  mycファミリーから選択された転写因子がcMyc, LMyc又はNmycのいずれかの転写因子を含む、
前記〔１〕に記載の試薬。
〔３〕  少なくともFoxa2, Gata6, Sox21及びNmyc遺伝子を含む、前記〔１〕又は〔２〕に記載の試薬。
〔４〕  さらに(e) Irxファミリーに属する転写因子ファミリー内の転写因子から１つ以上選択された転写因子を含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の試薬。
〔５〕  (e)  Irxファミリーから選択された転写因子がIrx1, Irx2, Irx3, Irx4, Irx5又はIrx6のいずれかの転写因子を含む、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の試薬。
〔６〕  少なくともFoxa2, Gata6, Sox21, Nmyc及びIrx3遺伝子を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の試薬。
〔７〕  体細胞から肺前駆細胞を作製する方法であって、下記の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、方法；
（１）下記の(a)〜(d)の転写因子ファミリーからそれぞれ１つ以上の転写因子を選択する工程、
(a)  Foxファミリー、
(b)  Gataファミリー、
(c)  Soxファミリー、及び
(d)  mycファミリー、
（２）標的体細胞内で、前記４種類の転写因子を含む転写因子群を作用させる工程、
（３）転写因子作用後の細胞でNkx2.1遺伝子を発現していることを確認する工程。
〔８〕    (a)  Foxファミリーから選択された転写因子がFoxa1, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Foxd2, Foxd3, Foxd4, Foxd5, Foxd6, Foxd7, Foxd8, Foxe3, Foxe1, Foxe2, Foxe3, Foxf1, Foxf2, Foxg1, Foxh1, Foxi1, Foxj1, Foxj2, Foxj3, Foxk1, Foxm1, Foxn1, Foxn2, Foxn3, Foxn4, Foxn5, Foxn6, Foxo1, Foxo3a, Foxo4, Foxp1,Foxp2, Foxp3又はFoxq1のいずれかの転写因子を含み、
(b)  Gataファミリーから選択された転写因子がGata1, Gata2, Gata3, Gata4, Gata5，又はGata6のいずれかの転写因子を含み、
(c)  Soxファミリーから選択された転写因子がSox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, Sox30又はSryのいずれかの転写因子を含み、そして
(d)  mycファミリーから選択された転写因子がcMyc, LMyc又はNmycのいずれかの転写因子を含む、
前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕  前記転写因子群が、少なくともFoxa2, Gata6, Sox21及びNmycを含むことを特徴とする、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  工程（１）において、さらに(e) Irxファミリーに属する転写因子ファミリー内の転写因子から１つ以上の転写因子を選択する工程を含み、工程（２）において、当該転写因子も含めた５種類の転写因子を含む転写因子群を作用させることを特徴とする、前記〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕  (e)  Irxファミリーから選択された転写因子がIrx1, Irx2, Irx3, Irx4, Irx5又はIrx6のいずれかの転写因子を含む、前記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の試薬。
〔１２〕  前記転写因子群が、少なくともFoxa2, Gata6, Sox21, Nmyc及びIrx3遺伝子を含むことを特徴とする、前記〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕  前記転写因子群を前記体細胞内で作用させるにあたり、各転写因子をコードする遺伝子を当該細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする、前記〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕  体細胞に対して前記〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法を適用して肺前駆細胞を作製し、次いで、得られた肺前駆細胞を所望の肺組織細胞への分化誘導用培地で培養することを特徴とする、分化された肺組織細胞の製造方法。
〔１５〕  肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤のスクリーニング方法であって、下記の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、方法；
（１）体細胞に対して前記〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法を適用して肺前駆細胞を作製する工程、
（２）得られた肺前駆細胞の１部を、所望の肺組織細胞への分化誘導用培地で培養する工程、
（３）肺前駆細胞の他の１部を、工程（２）で用いた分化誘導用培地に被検物質を添加した培地で培養するか、又は肺前駆細胞内に被検物質を導入後に工程（２）で用いた分化誘導用培地で培養する工程、
（４）工程（２）及び工程（３）で用いた肺前駆細胞の一定時間経過後の分化状態を比較して、後者の分化が進んでいる場合、被検物質を肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤の候補物質となると評価して、選択する工程。
〔１６〕  肺前駆細胞から所望の肺組織細胞への分化誘導促進剤のスクリーニング用キットであって、前記〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法により作製した肺前駆細胞を含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、体細胞から直接肺前駆細胞を作製することができる。この方法で作製した肺前駆細胞は肺胞上皮細胞など肺組織の様々な細胞に分化する能力を有しているので、in vitroで分化させた肺胞上皮細胞などを、肺組織に対する毒性試験用の細胞キットに応用できる。また、肺前駆細胞をより成熟した肺組織細胞へと分化させる際の分化薬剤のスクリーニング用細胞としても利用できる。さらに肺癌など遺伝子変異を伴う疾患の原因遺伝子を保持した細胞から肺前駆細胞を作製することにより、肺癌などの遺伝子変異を伴う疾患の治療薬候補をスクリーニングするための細胞キットとしても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】転写因子を線維芽細胞に導入することにより肺前駆細胞を作製する方法の作製条件検討。a．マウス胎児線維芽細胞に胎児肺組織で発現する転写因子13種類をレトロウイルスで感染させ、肺前駆細胞を作製する基本条件。b．マウス胎児（11.5日胚）の肺前駆組織で特異的に発現するNkx2.1遺伝子は、線維芽細胞に13種類の転写因子を導入すると発現開始し、線維芽細胞（MEF）を肺前駆細胞へと直接分化可能であることが確認された。c．マウス線維芽細胞から直接分化させた肺前駆細胞のコロニー状の形態。d．線維芽細胞から直接分化させたコロニー状の肺前駆細胞集団は転写因子Nkx2.1を発現した。e．13個の転写因子から１因子ずつ除去した転写因子の組合せで、肺前駆細胞を作製する必須因子の絞り込みを行った際の肺前駆細胞特異的転写因子Nkx2.1遺伝子の発現。f．eのサンプルにおけるE-cadherinの発現。g．上記efで絞り込んだ6因子から、再び必須因子の洗い出しをNkx2.1遺伝子の発現を指標に行った。h．gのサンプルにおけるE-cadherinの発現。i．上記ghで絞り込んだ5因子からさらに必須因子の洗い出しをNkx2.1遺伝子の発現を指標に行った。j．iのサンプルにおけるE-cadherinの発現。
【図２】線維芽細胞から直接作製した肺前駆細胞が、肺特異的前駆細胞であることの検証。a．5種類の転写因子で作製した肺前駆細胞の位相差顕微鏡像。b．5種類の転写因子で作製した肺前駆細胞におけるNkx2.1の発現。c．マウス胎児におけるNkx2.1陽性細胞の局在部位。d．肺前駆細胞特異的マーカータンパク質の発現。e．作製した肺前駆細胞で脳や甲状腺特異的遺伝子発現が見られないことの検証。f．各種線維芽細胞からのNkx2.1陽性の肺前駆細胞コロニーの出現頻度。
【図３】作製した肺前駆細胞のマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析。a．E11.5胎児由来肺、繊維芽細胞及び作製した肺前駆細胞の遺伝子発現パターンを階層クラスタリング解析法により比較。b．aの結果の内、各サンプルにおける肺前駆細胞マーカー遺伝子Nkx2.1, SP-C, Foxa1, Foxa2, Gata6、上皮細胞マーカー遺伝子E-cadherin, EpCAM、繊維芽細胞マーカー遺伝子Tgfb1i1, Thy1, Twist2, Zeb1, Zen2の遺伝子発現パターン。
【図４】作製した肺前駆細胞のマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析の続き。E11.5胎児由来肺、作製した肺前駆細胞及び成体由来気管支、肺、胃、腸、肝臓、心臓、腎臓、視床下部、骨格筋、脂肪の遺伝子発現パターンを階層クラスタリング解析法により比較。
【図５】マウス線維芽細胞から作製した肺前駆細胞の分化能力の検証。a．肺前駆細胞のin vitro分化誘導条件。b．in vitroで分化させた肺前駆細胞の免疫蛍光染色によるマーカー発現の検証。15日間直接分化誘導した肺前駆細胞をさらに51日間培養した後、肺細胞分化能を免疫蛍光染色により検証した。粘液分泌細胞マーカー(Muc5AC)、肺胞上皮I型細胞(AQP5)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の肺前駆細胞を作製する特異的な転写因子
本発明の肺前駆細胞を作製する特異的な転写因子は、少なくとも、Foxファミリー転写因子、Gataファミリー転写因子、Soxファミリー転写因子、及びmycファミリー転写因子に属する、それぞれの転写因子遺伝子又はその発現産物としてのタンパク質を含み、好ましくはさらにIrxファミリー転写因子又はその発現産物としてのタンパク質を含んでいる。Foxファミリー転写因子としては、Foxa1, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Foxd2, Foxd3, Foxd4, Foxd5, Foxd6, Foxd7, Foxd8, Foxe3, Foxe1, Foxe2, Foxe3, Foxf1, Foxf2, Foxg1, Foxh1, Foxi1, Foxj1, Foxj2, Foxj3, Foxk1, Foxm1, Foxn1, Foxn2, Foxn3, Foxn4, Foxn5, Foxn6, Foxo1, Foxo3a, Foxo4, Foxp1,Foxp2, Foxp3及びFoxq1を挙げることができ、好ましくはその機能ドメインが高度に保存されたFoxa1, Foxa2, Foxa3転写因子である。これら転写因子のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列は、公共データベースから入手でき、例えば、GenBank（NCBI）のhuman-Foxa2(Protein：NP_068556)、mouse-Foxa2（Protein: NP_034576）を用いることができる。Gataファミリー転写因子としては、Gata1, Gata2, Gata3, Gata4, Gata5，及びGata6を挙げることができ、好ましくはその機能ドメインが高度に保存されたGata6, Gata5, Gata4転写因子であり、例えばhuman-Gata6（Protein: NP_005248）、mouse-Gata6（Protein: NP_034388）を用いることができる。Soxファミリー転写因子としては、Sox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, Sox30及びSryを挙げることができ、好ましくはその機能ドメインが高度に保存されたSox21, Sox3, Sox1, Sox15, Sox2転写因子であり、例えばhuman-Sox21（Protein: NP_009015)、mouse-Sox21（Protein: NP_808421）を用いることができる。mycファミリー転写因子としては、その機能ドメインが高度に保存されたcMyc, LMyc,及びNmyc挙げることができ、好ましくはNmyc転写因子であり、例えばhuman-Nmyc gene（mRNA: NM_005378）、mouse-Nmyc gene（mRNA: NM_008709）を用いることができる。
また、Irxファミリー転写因子としては、Irx1, Irx2, Irx3, Irx4, Irx5及びIrx6を挙げることができ、好ましくはその機能ドメインが高度に保存されたIrx3，Irx1, Irx2, Irx4及びIrx6転写因子であり、例えばhuman-Irx3（Protein: NP_077312）、mouse-Irx3（Protein: NP_032419）を用いることができる。
これらの転写因子群、すなわちFoxファミリー転写因子、Gataファミリー転写因子、Soxファミリー転写因子、及びmycファミリー転写因子、さらにはIrxファミリー転写因子を含む転写因子群、好ましくはFoxa2, Gata6, Sox21及びNmyc転写因子、より好ましくはFoxa2, Gata6, Irx3, Sox21及びNmyc転写因子を含む転写因子群を遺伝子導入などによって線維芽細胞などの体細胞（組織細胞）内で発現させてネットワークを再構築させることで、体細胞を肺前駆細胞へと直接分化させることができる。
これら４又は５種類を含む転写因子は、典型的には、それぞれの遺伝子をウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを用いて、又は用いずに線維芽細胞などの体細胞内に導入して同時に発現させる。
ここで、これら４又は５種類の転写因子のうち、いずれか１つ以上を遺伝子導入に代えて遺伝子の発現産物のタンパク質として体細胞内に導入してもよく、さらにはこれら転写因子を発現誘導する活性のある低分子化合物（例えばFoxa2の発現誘導活性があるメラトニン（非特許文献１３））やmiRNA及びその阻害剤（例えばFoxa2の発現誘導活性があるanti-miR124a2やN-Mycの発現誘導活性がある anti-miR-34a（非特許文献１４、１５））を体細胞に作用させることで代替することもできる。
【００１１】
Foxa2転写因子、またはそれをコードする遺伝子は、上述のように公共データベース（GenBank（NCBI）など）からアミノ酸配列、塩基配列を入手できる。例えば、Foxa2アミノ酸配列は、human-Foxa2(Protein：NP_068556)、mouse-Foxa2（Protein: NP_034576）であり、Foxa2遺伝子は当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を用いることができる。また、その全長を用いる必要はなくFoxa2転写因子としての活性が保持されていれば、その部分長であっても、アミノ酸レベルで１個〜数個程度（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）改変（欠失・置換・付加・挿入）されている場合であっても、Foxa2転写因子として用いることができる。ここで、ヒトFoxa2及びマウスFoxa2のアミノ酸配列レベルのホモロジーは約97％であるのに対して、Foxa2と同じFoxaファミリー内でFoxa2ときわめてよく似た性質を有するFoxa1及びFoxa3についてみると、ヒトFoxa2及びヒトFoxa1は約53％、ヒトFoxa2及びヒトFoxa3は約42％、ヒトFoxa2及びヒトFoxb1は約48％、ヒトFoxa2及びヒトFoxb2は約43％である。したがって、例えばヒトFoxa1、ヒトFoxa2、ヒトFoxa3、ヒトFoxb1及びヒトFoxb2それぞれの共通配列が保存され、かついずれかのアミノ酸配列と40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジー（同一性）のあるアミノ酸配列もFoxa2と同様に用いることができる。
【００１２】
Gata6転写因子、またはそれをコードする遺伝子についても同様であり、例えば、GenBank（NCBI）などから得られるhuman-Gata6（Protein: NP_005248）もしくはmouse-Gata6（Protein: NP_034388）のアミノ酸配列からなるGata6又は当該アミノ酸配列をコードするGata6遺伝子を用いることができる。また、その全長を用いる必要はなくGata6転写因子としての活性が保持されていれば、その部分長であっても、アミノ酸レベルで１個〜数個程度（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）改変（欠失・置換・付加・挿入）されている場合であっても、Gata6転写因子として用いることができる。ここで、ヒトGata6及びマウスGata6のアミノ酸配列レベルのホモロジーは約88％であるのに対して、Gata6と同じGataファミリー内でGata6ときわめてよく似た性質を有するGata4及びGata5についてみると、ヒトGata6及びヒトGata4は約50％、ヒトGata6及びヒトGata5は約44％である。したがって、例えばヒトGata6、ヒトGata4及びヒトGata5それぞれの共通配列が保存され、かついずれかのアミノ酸配列と40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジー（同一性）のあるアミノ酸配列もGata6と同様に用いることができる。
【００１３】
Sox21転写因子、またはそれをコードする遺伝子についても同様であり、例えば、GenBank（NCBI）などから得られるhuman-Sox21（Protein: NP_009015)、mouse-Sox21（Protein: NP_808421）のアミノ酸配列からなるSox21又は当該アミノ酸配列をコードするSox21遺伝子を用いることができる。また、その全長を用いる必要はなくSox21転写因子としての活性が保持されていれば、その部分長であっても、アミノ酸レベルで１個〜数個程度（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）改変（欠失・置換・付加・挿入）されている場合であっても、Sox21転写因子として用いることができる。ここで、ヒトSox21（配列番号７）及びマウスSox21（配列番号８）のアミノ酸配列レベルのホモロジーは約99％であるのに対して、Sox21と同じSoxファミリー内でSox21ときわめてよく似た性質を有するSox14、Sox3、Sox1、Sox15、Sox2及びについてみると、ヒトSox21及びヒトSox14は約58％、ヒトSox21及びヒトSox3は約48％、ヒトSox21及びヒトSox1は約47％、ヒトSox21及びヒトSox15は約44％、ヒトSox21及びヒトSox2は約43％である。したがって、例えばヒトSox21、ヒトSox14及びヒトSox2それぞれの共通配列が保存され、かついずれかのアミノ酸配列と40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジー（同一性）のあるアミノ酸配列もSox21と同様に用いることができる。
【００１４】
Nmyc転写因子、またはそれをコードする遺伝子についても同様であり、例えば、GenBank（NCBI）などから得られるhuman-Nmyc gene（mRNA: NM_005378）、mouse-Nmyc gene（mRNA: NM_008709）の塩基配列からなるNmyc遺伝子又は当該塩基配列がコードするNmycを用いることができる。また、その全長を用いる必要はなくNmyc転写因子としての活性が保持されていれば、その部分長であっても、アミノ酸レベルで１個〜数個程度（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）改変（欠失・置換・付加・挿入）されている場合であっても、Nmyc転写因子として用いることができる。ここで、ヒトNmyc及びマウスNmycのアミノ酸配列レベルのホモロジーは約85％であるのに対して、Nmycと同じmycファミリー内でNmycときわめてよく似た性質を有するL-Myc及びcMycについてみると、ヒトNmyc及びヒトL-Mycは約37％、ヒトNmyc及びヒトcMycは約32％である。したがって、例えばヒトNmyc、ヒトL-Myc及びヒトcMycそれぞれの共通配列が保存され、かついずれかのアミノ酸配列と40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジー（同一性）のあるアミノ酸配列もNmycと同様に用いることができる。
【００１５】
Irx3転写因子、またはそれをコードする遺伝子についても同様であり、例えば、GenBank（NCBI）などから得られるhuman-Irx3（Protein: NP_077312）、mouse-Irx3（Protein: NP_032419）のアミノ酸配列からなるGata6又は当該アミノ酸配列をコードするGata6遺伝子を用いることができる。また、その全長を用いる必要はなくIrx3転写因子としての活性が保持されていれば、その部分長であっても、アミノ酸レベルで１個〜数個程度（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）改変（欠失・置換・付加・挿入）されている場合であっても、Irx3転写因子として用いることができる。ここで、ヒトIrx3及びマウスIrx3のアミノ酸配列レベルのホモロジーは約86％であるのに対して、Irx3と同じIrxファミリー内でIrx3ときわめてよく似た性質を有するIrx1及びIrx2についてみると、ヒトIrx3及びヒトIrx1は約45％、ヒトIrx3及びヒトIrx2は約38％である。したがって、例えばヒトIrx3、ヒトIrx1及びヒトIrx2それぞれの共通配列が保存され、かついずれかのアミノ酸配列と40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上のホモロジー（同一性）のあるアミノ酸配列もIrx3と同様に用いることができる。
【００１６】
２．肺前駆細胞の作製方法
（２−１）肺前駆細胞について
本発明において、「肺前駆細胞」というとき、肺を構成する様々な組織細胞への分化多能性を有する前駆細胞であって、肺前駆細胞マーカーであるNkx2.1陽性の細胞を指す。典型的には、初期発生期の消化管から肺の原基が出芽して形態形成が始まる分化段階（マウスでは、受精後10日前後）で、肺の予定領域で出現する胎児性の肺前駆細胞（肺幹細胞）が含まれる。
【００１７】
（２−２）肺前駆細胞への分化方法
本発明では、線維芽細胞などの体細胞（組織細胞）から１ステップで肺前駆細胞を作製する方法を開発した。Foxファミリー転写因子、Gataファミリー転写因子、Soxファミリー転写因子、及びmycファミリー転写因子、さらにはIrxファミリー転写因子を含む転写因子群、好ましくはFoxa2, Gata6, Sox21及びNmycの４つの転写因子、より好ましくはFoxa2, Gata6, Irx3, Sox21及びNmycの５つの転写因子を含む転写因子群を線維芽細胞などの体細胞に遺伝子導入し、2-3週間培養することで肺前駆細胞マーカー陽性の細胞を容易に作製することができる。線維芽細胞などの体細胞内で遺伝子導入などによって外来遺伝子を発現させて肺前駆細胞特異的な転写因子ネットワークを作って働かせることで、体細胞を肺前駆細胞へと直接分化させることができる。
【００１８】
本発明において「体細胞」とは、ヒト、マウスを含む哺乳動物由来の体細胞であり、胎児由来の体細胞、成人由来の体細胞、患者由来の体細胞の場合を含む。好ましくは、ヒト又はマウスなどの哺乳動物由来の線維芽細胞である。
【００１９】
前記遺伝子を体細胞へ導入する手段としては、レトロウイルスを用いる他に、レンチウイルスやアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、さらにはセンダイウイルスなど任意のウイルスを用いることができる。また、通常のプラスミドベクターや染色体外で独立に維持されるエピソーマルベクターなど任意のベクターを用いることも可能である。さらに、遺伝子導入方法として、リポフェクション法やエレクトロポレーション、ハイドロダイナミック法など様々な方法が可能である。
【００２０】
（２−３）培養方法
遺伝子導入後の体細胞は、2-3週間培養することで肺前駆細胞マーカー陽性の細胞を容易に作製することができる。また、遺伝子導入の際に、薬剤選択マーカー遺伝子も同時に導入することで、前記４又は５種類の転写因子遺伝子が導入された細胞のみを容易に選択できる。
【００２１】
本発明において用いる培地は、遺伝子導入をする体細胞の培養に適した培地を用いることが好ましい。例えば、線維芽細胞の場合は、10%ウシ胎児血清含有DMEM培地、又は市販の線維芽細胞培養培地などが適している。
このようにして作製した肺前駆細胞はある程度の増殖性があり、必要なだけ増殖させて使用することができる。
【００２２】
（２−４）肺前駆細胞の検出方法
本発明において、前記４又は５種類の転写因子遺伝子導入後に培養工程を経た体細胞が、iPS細胞様の未分化細胞を経由せずに、直接肺前駆細胞に分化したことは、もとの体細胞特有のマーカー遺伝子、例えば線維芽細胞の場合はThy1などの発現がみられず、かつES/iPS細胞特有の各種マーカー、例えばOct4、Nanog及びKlf4などが発現せずに、肺前駆細胞特有のマーカーであるNkx2.1が発現していることを確認すればよい。さらに、肺組織特異性マーカーであるSPCに加えてE-cadherinなどの発現を確認することが好ましく、他の組織特異性マーカーが発現していないことを確認することがより好ましい。
各マーカーの発現を確認するためには、それぞれの抗体、例えばNkx2.1やE-cadherin特異的抗体を用いることができ、他にウエスタンブロッティング法、免疫蛍光染色法、免疫組織化学染色、フローサイトメトリーなどの方法などを用いることができる。
【００２３】
３．本発明で作製した肺前駆細胞の用途
本発明の肺前駆細胞は、肺を構成する様々な組織細胞への分化多能性を有している。したがって、それぞれの肺組織細胞への既知の分化誘導法を適用することで、望みの肺組織細胞に分化させることができる。
例えば、肺上皮細胞を得ようとする場合は、本発明で得られた肺前駆細胞を、0.2%ウシ胎児血清を添加したAdvanced RPMI1640培地で培養することで、増殖培養が可能であり、肺上皮細胞や粘液分泌細胞を得ようとする場合は、本発明で得られた肺前駆細胞を、0.2%ウシ胎児血清を添加したAdvanced RPMI1640培地でさらに長期間培養すればよい。また、培地に各種細胞増殖因子を添加した分化誘導により、繊毛細胞、基底細胞やクララ細胞等に分化するという報告もある（非特許文献１、非特許文献１１）。
これらの分化誘導工程は、in vitroのみならず、マウスなど実験動物を用いたin vivo条件下でも様々な肺組織細胞へと分化させることができる（非特許文献１１）。例えば毛細血管が発達し、移植した細胞の生着効率が高い腎皮膜下に移植することで、本肺前駆細胞を肺胞上皮細胞などへ分化させることができる。
【００２４】
本発明の肺前駆細胞は、成熟した肺組織細胞へと分化させる工程で用いる分化薬剤のスクリーニング用細胞としても利用できる。例えば、望みの肺組織細胞への分化工程で被検物質、被検薬剤を添加し、分化状態を観察することで、被検薬剤を評価できる。ここで、被検物質が被検遺伝子など核酸の場合は、肺前駆細胞内に発現ベクターを用いるなどの既知の核酸導入法を適用して細胞内に導入しておくことが好ましいが、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、糖類など他の被検物質、被検薬剤の場合は分化誘導培地中に添加する。
その際、肺前駆細胞を２つのグループに分け、片方に被検物質を投与し、他方には投与せずに分化誘導処理を施し、両者の分化状態を比較する手法を採ることが好ましい。
また、本発明の肺前駆細胞は、通常の細胞移植技術を応用することで、肺組織の損傷部位などに対する肺組織細胞の移植治療に供することができる。
一方、本発明の肺前駆細胞をin vitroで分化させた肺胞上皮細胞など肺組織細胞は、肺組織に対する毒性試験用の細胞キットに応用できる。例えば、これら細胞をマルチウエルディッシュに播種した多検体サンプルを、薬剤の毒性試験、安全性試験に用いることができる。
さらに、本発明の肺前駆細胞製造方法によって、各種肺癌の原因遺伝子を導入した線維芽細胞から肺前駆細胞を作製することにより、得られた肺癌原因遺伝子を保持した肺前駆細胞は各種抗癌剤効果の評価系として、すなわち肺癌治療薬候補をスクリーニングするための細胞キットとして用いることができる。
また、同様に、他の肺疾患の原因遺伝子を導入した線維芽細胞から肺前駆細胞を作製することにより、肺疾患治療薬候補をスクリーニングするための細胞キットとして用いることもできる。
【００２５】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
また、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）転写因子の組合せを利用した線維芽細胞から肺前駆細胞への直接分化法
初期肺の肺形成期に特異的に発現する転写因子13種類を、機知の文献やデータベースから選び出し、マウス線維芽細胞にレトロウイルスにより遺伝子導入し、肺前駆細胞への直接分化を肺前駆細胞特異的マーカー遺伝子であるNkx2.1と上皮マーカーのひとつであるE-cadherinの発現が陽性であるコロニーの出現を指標に評価した(図１a)。その結果、2−3週間後に上皮細胞様のコロニー状に増殖する細胞を検出し、それらはNkx2.1陽性の細胞集団であることを確認できた（図１b−d）。次に13種類の転写因子の中から、肺前駆細胞への直接分化に必須の転写因子洗い出すため、13因子の組合せから１因子ずつ順番に除いた組合せを検討し、転写因子を除去すると特にNkx2.1の発現が上昇する、抑制作用が見られた転写因子７個を捨て、その他の６個の転写因子を選択した（図１ef）。次にこれら６因子からさらに１因子ずつ除去して不要因子を探索したところ、Sox9を除去してもNkx2.1の発現が減少しないことからFoxa2, Gata6, Irx3, Sox21及びNmycの5因子に絞り込んだ（図１gh）。さらに5因子から１因子ずつ差し引いて必須因子を探索したところ、Foxa2, Gata6, Sox21及びNmyc因子の場合は、これら何れの因子を除去した場合でもNkx2.1の発現がほぼ消失した。一方、Irx3因子を除去した場合は、Nkx2.1の発現が大幅に減少するものの、50％以上発現している様子が観察された（図１ij）。また、免疫染色によるNkx2.1陽性コロニー解析においても、他の因子のいずれを除去した場合ではコロニーが全く観察できなかったのに対し、Irx3を除去した場合には小さなコロニーであるが、少数のコロニーが明確に観察された（データは示していない）。これらの結果からみて、少なくともFoxa2, Gata6, Sox21及びNmycの４因子は必須因子であり、Irx3因子については、必須因子ではないが、肺前駆細胞への直接分化を促進するためには欠かせない因子であり、効率よくNkx2.1陽性の肺前駆細胞を作製するには、上記４因子にIrx3を加えた５因子を用いることが好ましいという結論が得られた。
以上のことから、本発明の転写因子としては、Foxa2, Gata6, Sox21及びNmycの４因子の組み合わせが必要遺伝子の最少の組合せであるが、以下の実施例では、これら４因子にIrx3因子を加えた５因子を含む組み合わせを用いたNkx2.1陽性の肺前駆細胞についての検討を行った。
【００２７】
（実施例２）転写因子の遺伝子導入により作製した肺前駆細胞の特異性の検証
上記（実施例１）で選定した５つの転写因子により作製した肺前駆細胞の肺組織特異性について免疫蛍光染色により検証を行った。５つの転写因子をマウス胎児由来線維芽細胞に遺伝子導入すると２−３週間後に上皮様の細胞からなるコロニーが出現し始め（図２a）、それらは肺前駆細胞マーカーNkx2.1陽性の細胞であることが確認された（図２b）。しかし、Nkx2.1は、胎生期に肺前駆細胞以外にも同じく前方内胚葉から発生する甲状腺組織や脳の間脳でも発現することが知られている（図２c）。そこで、転写因子により作製した肺前駆細胞の肺組織特異性についてそれぞれ、甲状腺組織で特異的に発現するPax8や間脳で発現するTuj1、上皮細胞で発現するE-cadherinなどを指標に免疫蛍光染色により検証を行ったところ、Nkx2.1陽性で、かつ、E-cadherin (+)、Tuj1(-)、Pax8(-)であり、甲状腺や間脳などの細胞ではなく、肺前駆細胞であることが示唆された（図２de）。さらに、マウス胎児の背側表皮や手足由来の線維芽細胞でも、さらには大人のマウスの表皮の線維芽細胞でもNkx2.1陽性の肺前駆細胞コロニーが直接分化されることが確認された(図２f)。
【００２８】
（実施例３）５つの転写因子を導入して作製した肺前駆細胞の遺伝子発現解析
さらにマウス線維芽細胞から作製した肺前駆細胞の特異性を検証するため、マイクロアレイで網羅的遺伝子解析を行った。その結果、本マウス線維芽細胞から作製した肺前駆細胞の遺伝子発現は、マウス繊維芽細胞と比較してマウス胎児肺組織細胞に類似した遺伝子発現パターンを示すことが明らかとなった（図３ab）。また作製した肺前駆細胞と成体気管支、肺、胃、腸、肝臓、心臓、腎臓、視床下部、骨格筋、脂肪といった他の組織との比較を行った。結果作製した肺前駆細胞の遺伝子発現パターンは、E11.5胎児由来の肺に最もよく類似してり、成体の気管支、肺及び他の組織とは似ていないことが明らかになった（図４）。
【００２９】
（実施例４）５つの転写因子を導入して作製した肺前駆細胞の分化能の解析
上記（実施例１）で選定した5つの転写因子を用いて作製した肺前駆細胞の分化能を検討した。in vitroの分化は、マウス胎児線維芽細胞に5因子を導入後、内胚葉細胞を維持できるAdvanced RPMI1640に0.2%血清を添加した培地を利用して51日間培養した（図５a）。その結果、Nkx2.1陰性の細胞でMuc5ac陽性の粘液分泌細胞やAQP5陽性の肺胞上皮Ｉ型細胞が分化することを見出した（図５b）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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