(57)【要約】      （修正有）【課題】個体における川崎病を検出するための方法。【解決手段】川崎病検出用キットは、測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ又はｍｉＲ−１８３−５ｐから選択される一つ又は複数のｍｉＲＮＡを配列決定する、又はそのｍｉＲＮＡの発現量を測定する試薬を含む。その方法は、個体におけるｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−１８３−５ｐから選択される一つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現量を測定する。更に、測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量を非川崎病のサンプルにおけるｍｉＲＮＡに対応する発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病の指標となることを特徴とする、個体における川崎病を検出するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における川崎病を検出するための方法であって、前記個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ又はｍｉＲ−９４１から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量を測定する工程を含み、
前記測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量を非川崎病のサンプルにおける前記ｍｉＲＮＡに対応する発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病の指標となることを特徴とする、個体における川崎病を検出するための方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−１８３−５ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｍｉＲ−９４１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−９４１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｍｉＲ−９４１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡを測定することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡの発現量は、リアルタイムＰＣＲによって測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ又はｍｉＲ−１８３−５ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡを配列決定する、又は前記ｍｉＲＮＡの発現量を測定する試薬を含むことを特徴とする、川崎病検出用キット。
【請求項９】
前記測定サンプルは、血清であることを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記試薬は、リアルタイムＰＣＲのためのものであることを特徴とする、請求項８に記載のキット
【請求項１１】
前記試薬は、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ又はｍｉＲ−１８３−５ｐに特異的なオリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡを測定する試薬を含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記試薬は、リアルタイムＰＣＲのためのものであることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記試薬は、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐに特異的なオリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記ｍｉＲＮＡを測定する前記試薬が川崎病の検出用に用いることを示すタグをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１６】
（ａ）非川崎病の個体からの標準サンプル群及び川崎病の個体からの標準サンプル群におけるｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号１）、ｍｉＲ−１８２−５ｐ（配列番号２）、ｍｉＲ−１８３−５ｐ（配列番号３）、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ（配列番号４）、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ（配列番号５）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（配列番号７）、ｍｉＲ−９４１（配列番号８）、ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号９）又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ（配列番号１０）から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を測定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で測定した非川崎病の個体からの前記標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つと、川崎病の個体からの前記標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つとを機械学習アルゴリズムに登録するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記機械学習アルゴリズムでバイナリ分類モデルを作成するステップと、
を含むことを特徴とする、川崎病特異の機械学習アルゴリズムを確立する方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の川崎病特異の機械学習アルゴリズムを使用する、川崎病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年４月３日に出願された米国特許出願第６２／１４２，７４２号の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景技術のセクションで考察される主題は、本背景技術で単に言及することで従来技術であるとみなされるべきではない。同様に、背景技術のセクションにおいて言及される問題及び当該問題の原因に対する理解は、従来技術で既に認識されているとみなされるべきではない。背景技術のセクションの主題は、それ自体が発明でもあってよい様々な複数のアプローチを単に代表している。
【０００３】
川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＫＤ）とは、血管炎症を起こす小児病であり、すべての人種や民族に発症が見られるが、アジア人の子供に発症しやすい傾向がある。
【０００４】
川崎病の初期症状や明らかな症状は、５日以上続く発熱がある。治療しなければ、発症の子供において約２０〜２５％が冠動脈瘤につながることがある。また、川崎病は、先進国における小児の後天性心疾患の最大の原因になっている。発熱から１０日以内に川崎病を検出して、免疫グロブリン大量点滴静注療法（ＩＶＩＧ）により冠動脈病変の発生率を大幅に低下させることができる。
【０００５】
川崎病の診断は、アメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＡＨＡ）が２００４に提案された診断基準に基づいて、５日以上続く発熱、両眼の非化膿性結膜炎、粘膜の変化、手足の硬結血管性浮腫、不定形発疹（ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｋｉｎ  ｒａｓｈｅｓ）及び直径が１．５ｃｍ以上の急性の非化膿性頸部のリンパ節腫脹（ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｐｕｒｕｌｅｎｔ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）という臨床診断が主な診断基準であるが、川崎病に対する実験室診断法がまだ確立されていない。
【０００６】
しかし、ＡＨＡの基準は日本循環器学会のガイドラインと若干異なるので、川崎病の臨床診断が複雑になっている。また、伝染性疾病、例えば、ブドウ球菌又はレンサ球菌の感染は川崎病の症状に類似することもある。故に、臨床医師は、罹患した小児の川崎病を正確に診断して、冠動脈疾患の予防のためにＩＶＩＧを速やかに投与することが困難である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、安価且つ正確な川崎病に対する実験室診断法の需要に応じて、これら及び他の需要を満たすものである。
【０００８】
一実施例では、本発明に開示された個体における川崎病を検出するための方法は、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ（配列番号２）の発現量を測定するステップを含む。個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐの発現量を非川崎病又は対照サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐの発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病に罹患した個体を示す。
【０００９】
もう一つの実施例では、本発明に開示された個体における川崎病を検出するための方法は、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１（配列番号８）の発現量を測定するステップを含む。個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１の発現量を非川崎病又は対照サンプルにおけるｍｉＲ−９４１の発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病に罹患した個体を示す。
【００１０】
もう一つの実施例では、本発明に開示された個体における川崎病を検出するための方法は、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８３−５ｐ（配列番号３）の発現量を測定するステップを含む。個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８３−５ｐの発現量を非川崎病又は対照サンプルにおけるｍｉＲ−１８３−５ｐの発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病に罹患した個体を示す。
【００１１】
本発明の特定の実施例によれば、個体における川崎病を検出するための方法を提供し、その方法は、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ又はｍｉＲ−９４１から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量を測定するステップを含む。測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ又はｍｉＲ−９４１から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量を非川崎病又は対照サンプルにおけるｍｉＲＮＡに対応する発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病に罹患した個体を示す。
【００１２】
本発明の一実施例によれば、個体における川崎病を検出するための方法を提供し、その方法は、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ又はｍｉＲ−９４１から選択される少なくとも二つのｍｉＲＮＡの発現量を測定するステップを含む。測定サンプルにおける上述したｍｉＲＮＡの少なくとも二つの発現量を非川崎病又は対照サンプルにおけるｍｉＲＮＡに対応する発現量と比較して、非川崎病のサンプルより高い結果が川崎病に罹患した個体を示す。
【００１３】
本発明は、個体における川崎病を検出するためのキットも開示され、そのキットは、測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ又はｍｉＲ−１８３−５ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡを配列決定する、又はそれらの発現量を測定する試薬を含む。一実施例では、キットにはｍｉＲＮＡを測定する試薬が川崎病の検出用であることを示すタグをさらに含む。
【００１４】
本発明は、川崎病検出用キットの製造におけるｍｉＲＮＡの配列決定又は測定する試薬も提供する。そのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１８２−５ｐ又はｍｉＲ−１８３−５ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡである。
【００１５】
もう一つの実施例では、川崎病特異の機械学習アルゴリズムを確立する方法を提供し、その方法は、（ａ）非川崎病の個体からの標準サンプル群及び川崎病に罹患した個体からの標準サンプル群におけるｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号１）、ｍｉＲ−１８２−５ｐ（配列番号２）、ｍｉＲ−１８３−５ｐ（配列番号３）、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ（配列番号４）、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ（配列番号５）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（配列番号７）、ｍｉＲ−９４１（配列番号８）、ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号９）又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ（配列番号１０）から選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を測定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で測定した非川崎病の個体からの標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つと、川崎病の個体からの標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つとを機械学習アルゴリズムに登録する（ｒｅｇｉｓｔｅｒｉｎｇ）ステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における機械学習アルゴリズムでバイナリ分類モデル（ｂｉｎａｒｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）を作成するステップとを含む。
【００１６】
もう一つの実施例では、本文に記述した川崎病に特異的な機械学習アルゴリズムによる川崎病の診断方法を提供する。
【００１７】
本出願で用いる「発明」、「当該発明」、「この発明」及び「本発明」という用語は、本出願の全ての主題及び後述する特許請求の範囲を代表することを意図するものである。これらの用語を含む記載は、本出願の主題又は後述する特許請求の範囲の解釈や範囲を限定するものではない。本出願における本発明の実施形態は、発明の概要に定義されるものではなく、後述する特許請求の範囲に定義されるものである。発明の概要は、本発明の様々な態様の上位概念であり、さらに後述する発明を実施するための形態に係る概念を導入する。発明の概要は、請求される主題の重要又は必要な特徴を特定する、または請求される主題の範囲を単独で判断することを意図するものではない。本出願の主題は、明細書全体、いずれも又は全ての図面、及び特許請求の範囲の適切な部分を参照して理解されるべきである。
【００１８】
本発明は、添付の図面を参照して、下記の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の例示的な実施例は、以下の図面を参照して、詳細に説明する。
【図１】ｑＰＣＲにより熱性対照サンプル３１例（Ｘ軸上に「Ｃ」と表示される）及び川崎病のサンプル３７例（Ｘ軸上に「Ｄ」と表示される）におけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐのｍｉＲＮＡの発現量（ΔＣｔ）を分析する棒グラフである。＊＊＊＊、＊＊＊、＊＊、及び＊は、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５をそれぞれ示す。
【図２】図１における１０種のｍｉＲＮＡの発現量（ΔＣｔ）に基づくサポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ，ＳＶＭ）による分類モデルのＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願で用いる「一（ａ）」という用語は、一つ又は複数（即ち、少なくとも一つ）の態様を指す。
【００２１】
「個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、疑似の川崎病を患う脊椎動物を指す。個体としては、温血動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類動物、好ましくはヒトである。非ヒト霊長類も個体に含まれる。「個体」という用語は、飼育動物、例えば、猫、犬等、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）が含まれる。
【００２２】
本明細書中で交換可能に使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」、「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ｍｉＲ遺伝子からの未処理（例えば、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ））又は処理済み（例えば、成熟（ｍａｔｕｒｅ））のＲＮＡ転写物を指している。マイクロＲＮＡは、約２２塩基長の内因性非コードの一本鎖ＲＮＡｓであり、新規な遺伝子調節因子の新規なクラスを構成するものである（Ｃｈｕａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：１８９−１９９）。
【００２３】
本発明における全ての数字は、「約」という用語で修飾することができると理解される。
【００２４】
（川崎病の診断方法）
本発明の一部は、特定ｍｉＲＮＡの同定に基づき、測定サンプルの特定ｍｉＲＮＡの発現量が非川崎病のサンプルにおける対応のｍｉＲＮＡの所定量と比較して増加している。本発明の一部の実施例は、個体が川崎病を有するか又は川崎病の発症リスクを有するかどうかを診断するための方法である。その方法は、個体からの測定サンプルにおける少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量を測定することと、非川崎病又は対照サンプルからの対応のｍｉＲＮＡの発現量と比較することを含む。測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量が、当該対照サンプルより高いとなれば、当該個体が川崎病を患うことの指標となる。
【００２５】
非川崎病又は対照サンプルにおける所定ｍｉＲＮＡの発現量は非川崎病の個体からの標準サンプル群であり、非川崎病又は対照サンプルの平均、中央値または他の統計学的に操作され、または他の方法で要約もしくは統合された代表的なｍｉＲＮＡの発現量である。
【００２６】
より高いｍｉＲＮＡの発現量は、相対的な用語であり、測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量を非川崎病の個体からの標準サンプル群のｍｉＲＮＡの発現量と比較することにより定義されたものである。一部の実施例では、測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量は、非川崎病の個体からの標準サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％より高いものである。
【００２７】
一実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐからの少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。
【００２８】
もう一つの実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ又はｍｉＲ−９４１からの一つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。
【００２９】
一例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。もう一つの例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８３−５ｐの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。もう一つの例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−９４１の発現量を測定することにより、川崎病を診断する。
【００３０】
もう一つの実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから二つ又はその以上のｍｉＲＮＡの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。
【００３１】
一部の実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３３−３ｐ又はｍｉＲ−１４０−３ｐからの一つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。
【００３２】
一例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−１８３−５ｐの発現量を測定することにより、川崎病を診断する。もう一つの例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現量を測定することにより、川崎病を診断する。もう一つの例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現量を測定することにより、川崎病を診断する。もう一つの例示的な実施例では、個体の測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｍｉＲ−９４１の発現量を測定することにより、川崎病を診断する。一部の実施例では、二つ又はその以上のｍｉＲＮＡの発現量の組合せにより、川崎病の診断を一層高い精度、感度又は特異性を提供する。
【００３３】
ｍｉＲＮＡの発現量の測定は、サンプル中に存在するｍｉＲＮＡの量を定量化することを指す。特定または任意のｍｉＲＮＡの発現量は、当業者に周知または本明細書で記載される方法を用いて、例えばリアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット分析、又は当業者に周知の他の技術により達成することができる。検出されるｍｉＲＮＡの発現量は、ｍｉＲＮＡの成熟形態またはｍｉＲＮＡの発現と相関している前駆体形態の発現の検出が含まれる。
【００３４】
特定の実施例では、少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現量はノーザンブロット分析により測定される。例えば、細胞の全ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）による処理および沈殿により除去する。続いてそのＲＮＡ分子を標準的な技術に従ってアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて達成される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（編者），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，  第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
【００３５】
一部の実施例では、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学的試料の並行分析を可能にする、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の微視的な整列したアレイである。マイクロアレイは、微細に尖ったピンによるスライドガラス上への印刷、予め作られたマスクを用いたフォトリソグラフィー、動的マイクロミラー装置（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いたフォトリソグラフィー、インクジェット印刷、または微小電極アレイ上での電気化学が含まれる様々な技術を用いて製作することができる。
【００３６】
ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は、例えば、当業者に周知の技術により達成することができる。一実施例では、ＲＮＡを細胞またはサンプルから抽出し、低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドのＲＮＡ）を全ＲＮＡから変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてサイズ選択する。オリゴヌクレオチドリンカーをその低分子ＲＮＡの５’および３’末端に結合させ、得られたライゲーション産物を、１０サイクルの増幅を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応のための鋳型として用いる。センス鎖ＰＣＲプライマーはその５’末端に結合した蛍光体を有し、それによりそのＰＣＲ産物のセンス鎖を蛍光標識する。そのＰＣＲ産物を変性させ、次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。そのアレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的である、標的核酸と呼ばれるＰＣＲ産物は、塩基対合によりその捕捉プローブが固定されているスポットにハイブリダイズする。そのスポットはマイクロアレイレーザースキャナー（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ）を用いて励起した際に蛍光を発する。次いでそれぞれのスポットの蛍光強度を、いくつかの陽性および陰性対照ならびにアレイデータ正規化法を用いて特定のｍｉＲＮＡのコピー数に換算して評価し、それは結果として特定のｍｉＲＮＡの発現量の評価を達成することができる。
【００３７】
一実施例では、マイクロアレイは、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ又はそれらの組合せから選択されるｍｉＲＮＡを配列決定又は測定するｍｉＲＮＡ−特異性オリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００３８】
一部の実施例では、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために用いられる、ポリメラーゼ連鎖反応の改変である。ｑＲＴ−ＰＣＲは一般に、ある遺伝子配列、例えばｍｉＲがサンプル中に存在するかどうか、そしてそれが存在する場合、その試料中のコピー数を決定する目的で用いられる。ｍｉＲＮＡを含め、核酸分子の発現を測定可能なＰＣＲの方法は本発明の範囲内に含まれる。当業者に周知のｑＲＴ−ＰＣＲ法にいくつかの変化が存在し、その方法には、アガロースゲル電気泳動、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、および蛍光レポータープローブの使用による方法も含まれるが、それらに限定されない。
【００３９】
川崎病及び非川崎病の個体に差次的に発現されるｍｉＲＮＡの同定はいくつの方法でこの情報の使用が可能である。例えば、特定の処理方法（例えば、川崎病の個体に対する特定の治療が冠状動脈合併症を有効に防止するかどうかを測定する）を評価することができる。同様に、測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量を非川崎病サンプルからの発現プロファイルとの比較により診断の完了又は確認を行う。また、これらのｍｉＲＮＡの発現プロファイルは、ｍｉＲＮＡ発現を抑制する薬剤候補のスクリーニング、又は予後不良なプロフィールを予後良好なプロフィールに変換することが可能である。
【００４０】
一例示的な実施例では、川崎病特異の機械学習アルゴリズムを確立する方法を提供し、その方法は、（ａ）非川崎病の個体からの標準サンプル群及び川崎病の個体からの標準サンプル群におけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐから選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を測定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で測定した非川崎病の個体からの標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つと、川崎病の個体からの標準サンプル群のΔＣｔ値の少なくとも一つとを機械学習アルゴリズムに登録するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における機械学習アルゴリズムでバイナリ分類モデルを作成するステップとを含む。
【００４１】
もう一つの実施例では、川崎病の診断方法を提供し、その方法は、（ａ）測定サンプルにおけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐからの少なくとも二つのｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を測定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で測定したΔＣｔ値からの一つ又は複数を本文に記述した川崎病に特異的な機械学習アルゴリズムに登録するステップとを含む。
【００４２】
機械学習ネットワークの非限定的な例には、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、人工ニューラルネットワーク（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、決定木の学習（ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）、例えば、ＣＡＲＴ、ＩＤ３、Ｃ４．５、ＣＨＡＩＤ、ＭＡＲＳ及び条件推論木（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｒｅｅｓ））、事例に基づく学習（ｉｎｓｔａｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）（例えば、ｋ最近傍法（Ｋ−Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ））、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、遺伝的アルゴリズム及びアンサンブル学習（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）（例えば、バギング（Ｂａｇｇｉｎｇ）及びブースティング（Ｂｏｏｓｔｉｎｇ））が含まれる。
【００４３】
一例示的な実施例では、川崎病の診断方法を提供し、その方法は、（ａ）測定サンプルにおけるｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１からの少なくとも一つのｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を測定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で測定したΔＣｔ値からの一つ又は複数を本文に記述した川崎病に特異的な機械学習アルゴリズムに登録するステップとを含む。一実施例では、機械学習アルゴリズムは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）である。
【００４４】
（川崎病の診断のためのキット）
本発明はさらに川崎病の診断のためのキットを提供する。そのキットは、測定サンプルにおけるｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐ又はｍｉＲ−３０ｅ−３ｐからの一つ又は複数のｍｉＲＮＡを配列決定する、又はそれらの発現量を測定する試薬を含む。
【００４５】
非川崎病サンプルにおける対応のｍｉＲＮＡの発現量に対して、測定サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現量がより高い場合、川崎病はキットにより診断される。測定サンプルの非限定的な例には、体液（例えば、血清、血液、滲出液）及び組織が含まれる。
【００４６】
一実施例では、キットは、川崎病診断のための指示をさらに含む。もう一つの実施例では、試薬はＲＴ−ＲＣＲ用の試薬である。もう一つの実施例では、試薬は、配列決定又は測定される配列番号１から配列番号１０のｍｉＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブである。試薬は、当業者に周知の特異的な又は任意のｍｉＲＮＡの発現量を測定する試薬であってもよい。
【実施例】
【００４７】
本発明の実施例は、下記の実例によっても説明され、それは如何なる形式でもその範疇に何らかの制限を加えると解釈されるべきではない。逆に、本発明の他の様々な実施形態、それらの変更、および等価物は、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な変更及び修正が可能であることは、当業者に明らかである。下記の実例に述べる研究において、別途説明されない限り、慣習的手順に従うべきである。いくつの手順は、説明の目的で下文に記述する。
【００４８】
（実例に用いられる材料と方法の記述）
全血サンプルは、台湾の高雄長庚記念病院（Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ  Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔａｉｗａｎ）で川崎病及び非川崎病（有熱対照群又は「ＦＣ」）の患者から採取したものである。内科医師による川崎病の臨床診断は、本研究でのゴールドスタンダードとして認定されている。ＦＣは、５日以上の熱が続く非川崎病の患者である。
【００４９】
川崎病３１例及びＦＣ個体３７例はトレーニング群に参加し、川崎病１９例及びＦＣ個体３３例は盲検群に分かれた。川崎病患者の３０％に冠動脈病変があった。血液サンプル中の赤血球を廃棄又は除去した。残りの白血球（ＷＢＣ）から一部のＲＮＡをｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ抽出キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により抽出して、そしてＮＧＳ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析で処理された。
【００５０】
（結果）
（ＮＧＳによるｍｉＲＮＡ発現プロファイル）
ＦＣ１２例からのＷＢＣサンプル及び川崎病１２例からのＷＢＣサンプルはトレーニング群からランダムに選択され、抽出したＲＮＡを４つのＲＮＡライブラリー（２つの川崎病用のＲＮＡプール・ライブラリー及び２つのＦＣのＲＮＡプール・ライブラリー）を作成するためにプールした。プールされたライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）サンプル調製プロトコルに従って調製して、次いで次世代配列決定法（ＮＧＳ）プラットフォームを用いて配列決定し、各ライブラリーは５００万個以上の配列読み取りが必要であった。ＦＡＳＴＱ形式の初期配列読み取りをｍｉＲＳｅｑ（ＣＴ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｕｓｅｒ−Ｆｒｉｅｎｄｌｙ  Ｓｔａｎｄａｌｏｎｅ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ  ２０１４；２０１４：４６２１３５）に従って分析することにより、全体配列決定の品質を評価すると共にｍｉＲＮＡ発現プロファイルを測定し、そのＮＧＳデータが高品質で一貫性のあることを示した。検出且つ除去される３’アダプターの読み取りの多数が２２ｎｔの長さであり、分析された配列読み取りの多数（８０％以上）がｍｉＲＮＡ遺伝子であった。
【００５１】
クラスター解析を行うことにより、ＦＣ及び川崎病サンプルはｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づいて区分するかどうかを判定した。ヒートマップ図には、２０個以上のｈｓａ−ｍｉＲＮＡは、ＦＣ及び川崎病サンプルで有意に発現して（川崎病サンプルで有意に発現が増強した）、その中から選択される１０個をｑＰＣＲでさらに確認した。
【００５２】
（ｑＰＣＲによる確認）
ｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ転写キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により調製した。逆転写反応はＶｅｒｉｔｉ９６ウェルサーマルサイクラー（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でメーカーの説明書に従って行われた。逆転写産物を１０倍希釈して、希釈した産物５μｌをｑＰＣＲ反応に使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＵＮＧなし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスター混合液ＩＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行われた。リアルタイムＰＣＲのサイクル条件は、９０℃で１０分、９５で１５秒の４０サイクル及び６０℃で１分であった。ＭｉｃｒｏＲＮＡ発現豊度は小さな核小体ＲＮＡ  Ｕ６を内因性対照群のΔＣｔ値として測定された。
【００５３】
ｑＰＣＲによる確認は、１０個のｍｉＲＮＡの発現量がＮＧＳの発現量と一致することを示した。図１に示すように、８個のｍｉＲＮＡのΔＣｔ値は、川崎病サンプルと非川崎病サンプルとの間に差次的に発現された（ｐ値）：
１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（ｐ＜０．０００１）。
２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（ｐ＜０．００１）。
３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ（ｐ＜０．０１）。
４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ（ｐ＜０．０５）。
【００５４】
ｈｓａ−ｍｉＲ−２３３−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量は、川崎病サンプルと熱性対照サンプルとの間に有意差はないが、差次的発現の傾向が観察された（対照サンプルと比較して、川崎病サンプルのΔＣｔ値がより低い）（図１を参照）。
【００５５】
（ＫＤに特異的なＳＶＭのアライメントモデルの性能）
ＫＤに特異的なＳＶＭのアライメントモデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）のｌｉｂｓｖｍモジュールを用いて作成することにより、ｍｉＲＮＡの発現に基づいてＦＣと川崎病サンプルとを区別した。ＦＣ３７例及び川崎病３１例のサンプルからの１０個のｍｉＲＮＡのΔＣｔ値（サイクル閾値）を使用してＫＤに特異的なＳＶＭのアライメントモデルを作成し、５倍の交差確認法により過適合（ｏｖｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）及び当てはめ不足（ｕｎｄｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）を防止した。１０個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−１４０−３ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ）のΔＣｔ値は、ＳＶＭのアライメントモデルを用いて総合得点を算出するように合計且つ計算する。合計得点が０と１との間の範囲となった。総合得点が０．５に等しい又はそれ以上である場合、陽性（川崎病）となり、総合得点が０．５未満である場合、陰性（ＦＣ）となる。図２に示すように、川崎病診断のための最終ＳＶＭのアライメントモデルは、８３．３％の感度及び９２．５％の特異性を有することにより、８７．９％の全体の精度になる。また、ａｕＲＯＣ値が０．９までに達する。
【００５６】
独立な盲検は独立コホートで行われ、当該独立コホートはＦＣ３３例及び川崎病１９例の個体を含む。上述した手順に従って血液サンプル中からＲＮＡを抽出して、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてｍｉＲＮＡ発現プロファイルを測定した。ＫＤに特異的なＳＶＭのモデルをアライメントした後、川崎病サンプル１９例中の１６例は、川崎病と診断され、ＦＣサンプル３３例中の２７例は、非川崎病と診断され、その結果として６例の偽陽性があった。よって、測定された１０個のｍｉＲＮＡのΔＣｔ値は、医師診断による川崎病（ゴールドスタンダード）と比較して、盲検において８４．２０％の感度及び８１．８％の特異性が示されることにより、８２．７％の全体の精度になった。
【００５７】
表２
【表１】
2017018088.tif 000002
【００５８】
上記から導出される川崎病に特異的なＳＶＭのアライメントモデルは、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｍｉＲ−９４１のΔＣｔ値に基づいてｍｉＲＮＡの単独又は組合せの感度、特異性及び精度を計算した。その結果を表３に示す。
【００５９】
表３は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−９４１に対する川崎病診断の感度、特異性及び精度を示す。
【００６０】
【表２】
2017018088.tif 000003
【００６１】
その結果は、ｍｉＲ−１８２−５ｐに対する川崎病診断の精度が６９．１６％であり、ｍｉＲ−９４１に対する川崎病診断の精度が７０．８１％である。これに対して、ｍｉＲ−１８２−５ｐとｍｉＲ−９４１との組合せに対する川崎病診断の精度が７５．２２％に増加した。
【００６２】
ｍｉＲ−１８３−５ｐに対する川崎病診断の感度が７５．７１％であり、ｍｉＲ−１８２−５Ｐに対する川崎病診断の感度が５８．５７％である。これに対して、ｍｉＲ−１８２−５ｐとｍｉＲ−１８３−５９との組合せに対する川崎病診断の感度が９０．４８％に増加した。
【００６３】
ｍｉＲ−１８２−５に対する川崎病診断の特異性が７８．２１％であり、ｍｉＲ−１８３−５ｐに対する川崎病診断の特異性が８３．９３％である。これに対して、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５９及びｍｉＲ−９４の組合せに対する川崎病診断の特異性が８７．１４％に増加した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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