(57)【要約】【課題】  エルゴチオネインの生理作用に関する新たな知見に基づき、新規な用途を提供する。【解決手段】  エルゴチオネインを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物、ならびに、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法およびＴｈ１７細胞の分化を促進する方法。本発明によれば、生体の免疫応答を活性化して、あるいは生体のＴＨ１７細胞による免疫応答を活性化して、健康増進、各種疾病の改善や治癒、予防に寄与することができる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネインを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項２】
さらにＴｏｌｌ様受容体リガンドを含む、請求項１に記載の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項３】
Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するための、請求項１または請求項２に記載の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項４】
エルゴチオネインがタモギタケから抽出したエルゴチオネインである、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項５】
エルゴチオネインを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法（医療行為を除く）；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
【請求項７】
エルゴチオネインを有効成分とする、Ｔｈ１７細胞分化促進剤。
【請求項８】
さらに抗原ペプチドを含む、請求項７に記載のＴｈ１７細胞分化促進剤。
【請求項９】
エルゴチオネインがタモギタケから抽出したエルゴチオネインである、請求項７または請求項８に記載のＴｈ１７細胞分化促進剤。
【請求項１０】
エルゴチオネインを有効成分とする、Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物。
【請求項１１】
下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する方法（医療行為を除く）；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エルゴチオネインを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物、ならびに、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法およびＴｈ１７細胞の分化を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エルゴチオネインは硫黄原子を含むアミノ酸の一種であり、肝臓や血液細胞などの生体内に広く存在している。また、タモギタケなどのキノコ類にも多く含まれている。エルゴチオネインは、従来、抗酸化機能を有することが知られており、この機能を期待して化粧品や健康食品として利用されている。エルゴチオネインの機能としては、その他に、特許文献１には、β−ディフェンシンの産生を促進することが（［０００７］、［図７］および［図１７］など）、特許文献２には、パネト細胞において抗菌物質の産生を促進することが（特許請求の範囲など）、それぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４８３１７１１号公報
【特許文献２】特許第５０８８９１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、エルゴチオネインの生理作用については未だ十分に解明されておらず、生理作用の解明およびこれに基づくエルゴチオネインの新規な用途の開発が望まれていた。本発明は、係る課題を解決するためになされたものであって、エルゴチオネインの生理作用に関する新たな知見に基づき、新規な用途として、免疫応答活性化サイトカイン産生促進作用およびＴｈ１７細胞分化促進作用を奏する発明を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、エルゴチオネインが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激することによって誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進すること、ならびに抗原ペプチドによって誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することを見出した。そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
【０００６】
（１）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、エルゴチオネインを有効成分とする。
【０００７】
（２）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、さらにＴｏｌｌ様受容体リガンドを含むことが好ましい。
【０００８】
（３）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するための剤であってもよい。
【０００９】
（４）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤において、エルゴチオネインはタモギタケから抽出したエルゴチオネインであってもよい。
【００１０】
（５）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、エルゴチオネインを有効成分とする。
【００１１】
（６）本発明に係る免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
【００１２】
（７）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤は、エルゴチオネインを有効成分とする。
【００１３】
（８）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤は、さらに抗原ペプチドを含むことが好ましい。
【００１４】
（９）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤において、エルゴチオネインはタモギタケから抽出したエルゴチオネインであってもよい。
【００１５】
（１０）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、エルゴチオネインを有効成分とする。
【００１６】
（１１）本発明に係るＴｈ１７細胞の分化を促進する方法は、下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤等によれば、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することができるため、生体の免疫応答を活性化して、健康増進、各種疾病の改善や治癒、予防に寄与することができる。
また、本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤等によれば、Ｔｈ１７細胞の分化を促進することができるため、生体のＴＨ１７細胞による免疫応答を活性化して、健康増進、各種疾病の改善や治癒、予防に寄与することができる。
また、エルゴチオネインは、食用キノコに多く含有されることから、安全性の高い物質であるといえる。したがって、本発明によれば、免疫応答活性化サイトカインの産生やＴｈ１７細胞の分化を効果的に促進することができ、かつ、安全性も高く、日常的に簡便に摂取することができる様々な食品や医薬品等を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】骨髄由来マクロファージの培養上清に含まれるサイトカインの濃度を示す棒グラフである。ＡはＩＬ−６、ＢはＩＬ−１２、ＣはＩＬ−１０の濃度をそれぞれ示す。図中、「ＥＧＴ（ｍＭ）」は培地におけるエルゴチオネインの濃度を、「培養時間」はエルゴチオネインの事前投与における培養時間を、それぞれ示す。
【図２】各種のＴＬＲリガンド（Ｐａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＬＰＳおよびガーディキモド）で刺激した骨髄由来マクロファージの培養上清に含まれるサイトカインの濃度を示す棒グラフである。ＡはＩＬ−６、ＢはＩＬ−１２、ＣはＩＬ−１β、ＤはＩＬ−１０の濃度をそれぞれ示す。図中、「ＥＧＴ（ｍＭ）」は培地におけるエルゴチオネインの濃度を示す。また、「*」はＰ値＜０．０５、「**」はＰ値＜０．００５、「***」はＰ値＜０．０００５、「ｎ．ｓ．」は有意差無し、「ｎ．ｄ．」は検出限界以下をそれぞれ示す。
【図３】各種のＴＬＲリガンド（Ｐａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＬＰＳおよびガーディキモド）で刺激した骨髄由来マクロファージにおける、各種のサイトカインの遺伝子発現量を示す棒グラフである。ＡはＩＬ−６、ＢはＩＬ−１２、ＣはＩＬ−１β、ＤはＩＬ−１０、ＥはＩＬ−１２ｐ３５、ＦはＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量をそれぞれ示す。図中、「ＥＧＴ（ｍＭ）」は培地におけるエルゴチオネインの濃度を示す。また、「*」はＰ値＜０．０５、「**」はＰ値＜０．００５、「***」はＰ値＜０．０００５、「ｎ．ｓ．」は有意差無しをそれぞれ示す。
【図４】共培養したＦ４／８０陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の培養上清に含まれるＩＬ−１７Ａの濃度を示す棒グラフである。図中、「ＥＧＴ（ｍＭ）」は培地におけるエルゴチオネインの濃度を示す。また、「*」はＰ値＜０．０５、「**」はＰ値＜０．００５、「ｎ．ｄ．」は検出限界以下をそれぞれ示す。
【図５】エルゴチオネインまたはＰＢＳを摂取させた後Ｐａｍ２ＣＳＫ４を注射したマウスの、血清に含まれるＩＬ−６の濃度を示す折れ線グラフである。「*」はＰ値＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物、ならびに、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法およびＴｈ１７細胞の分化を促進する方法について詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する剤をいう。また、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する食品組成物をいう。
【００２１】
本発明の「Ｔｈ１７細胞分化促進剤」とは、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する剤をいう。また、「Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物」とは、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する食品組成物をいう。
【００２２】
ここで、「サイトカイン」とは、免疫システムの細胞が産生して分泌するタンパク質であって、細胞間情報伝達を担う一群の液性因子をいう。サイトカインは、細胞表面の膜上に存在する受容体に結合して、特有の細胞内シグナル伝達経路の引き金を引き、結果的に細胞に生化学的あるいは形態的な変化をもたらす。サイトカインには、多くの種類が存在し、そのような種類としては、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などの造血因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）や繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）やリンフォトキシンα（ＬＴ−α）、ＬＴ−βなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レプチンやＴＮＦ−αなどのアディポカイン、神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子、インターロイキン（ＩＬ）、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）などを挙げることができる。
【００２３】
本発明の「免疫応答活性化サイトカイン」とは、これらのうち、特に、ヒトや動物における免疫応答を活性化させる働きを有するサイトカインをいう。免疫応答活性化サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン６（ＩＬ−６）やインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＴＮＦ−α、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）などの炎症性サイトカイン（炎症症状を引き起こすサイトカイン）や、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）などを挙げることができる。
【００２４】
一方、免疫応答を抑制するサイトカインとしては、インターロイキン４（ＩＬ−４）やインターロイキン１０（ＩＬ−１０）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）などを挙げることができ、これらは、「抗炎症性サイトカイン」あるいは「抑制性サイトカイン」と総称される。
【００２５】
本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤および免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、後述する実施例１、２および４で示すように、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進し、抑制性サイトカインの産生を抑制することができる。特に、免疫応答活性化サイトカインのうち、Ｔｈ１７細胞の分化誘導に寄与することが知られているＩＬ−６、および、Ｔｈ１７細胞の生存や機能維持に寄与することが知られているＩＬ−２３の産生を促進することから、本発明は、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するために用いることができる。
【００２６】
ここで、「Ｔｈ１７細胞」は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）を産生するヘルパーＴ細胞をいい、ナイーブＴ細胞から分化する。ＩＬ−１７産生細胞は、細胞内寄生菌（マイコバクテリウム）感染症への防御に寄与することが確認されている（Elena Zenaro et. al., Journal of Leukocyte Biology, Vol. 86, Dec. 2009, 1393-1401; 第１４００頁第６段落など）。また、ＩＬ−１７は、ヒトおよびマウスにおいて、真菌感染症への防御に寄与することが確認されている（Eva Bar et. al., Immunity 40, 117-127, Jan. 16, 2014; Summaryなど）。
【００２７】
従って、本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、Ｔｈ１７細胞の分化を促進することにより、細菌や真菌の感染症の予防や治療に用いることができる。同様に、本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤および免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物もまた、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進することにより、細菌や真菌の感染症の予防や治療に用いることができる。
【００２８】
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物はいずれも、エルゴチオネインを有効成分とする。
【００２９】
本発明において、「エルゴチオネイン」は、試薬や健康食品などとして市販されているものを用いてもよく、キノコなどの天然物質から抽出・精製等したものを用いてもよい。エルゴチオネインはキノコの中でもタモギタケに多く含有されるため、本発明のエルゴチオネインを天然物質から得る場合、タモギタケから抽出することが好ましい。
【００３０】
エルゴチオネインをタモギタケから抽出する方法としては、下記の方法を挙げることができる。まず、 生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得る。この濾液について、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って１３５Ｌの上清を回収する。５×３０ｃｍのカラムに充填したイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０Ｂ Ｈ型；オルガノ社）に、回収した上清のうちの７．５Ｌを入れ、一晩自然落下させる。続いて、イオン交換樹脂を回収し、蒸留水２．５Ｌを用いて洗浄して糖質成分を除去した後、０．２８％（ｗ／ｗ）アンモニア水１０Ｌを用いて溶出し、イオン交換樹脂に吸着していた陽イオン性化合物を含む溶出液１０ｍＬを得る。ロータリーエバポレーターを用いてこの溶出液を濃縮した後、下記の条件により定法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、流出開始３〜４分に検出されるピークの画分を分取する。分取した画分を合わせた後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥することにより、粉末状のタモギタケ由来エルゴチオネイン１．７ｇ（７．４ｍｍｏｌ）を得ることができる。
【００３１】
ＨＰＬＣの条件
ＨＰＬＣシステム；日立高速液体クロマトグラフＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
溶離溶媒；０〜１％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−ＳＰ（ジーエルサイエンス社）
検出器；ＵＶ検出器
検出条件；２５０ｎｍ
【００３２】
また、本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、エルゴチオネインの他に、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（Toll-like receptor ligand；ＴＬＲリガンド）を含むことが好ましい。
【００３３】
「Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲリガンド）」とは、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor；ＴＬＲ）」のリガンドであり、「ＴＬＲアゴニスト」ともいう。ここで、ＴＬＲは、一般に、ヒトまたは動物の細胞表面またはエンドソームに存在する受容体タンパク質であり、種々の病原体をリガンドとして結合して、シグナル伝達系を活性化し、サイトカイン産生などの免疫反応を作動させる機能を有する。ＴＬＲには複数の種類が存在し、例えば、ヒトでは１０種類が知られていて、ＴＬＲ１〜１０と呼ばれる。
【００３４】
本発明の「ＴＬＲリガンド」は、ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させる物質であればよい。ここで、ある物質が、「ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させるか否か」は、定法に従って確認することができる。すなわち、後述する実施例１（３）および（４）に示すように、マクロファージなどのＴＬＲを発現している培養細胞の培地に、被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。その後、培養上清中の免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはフローサイトメーターを用いたビーズアレイ法（Cytometric Bead Array；ＣＢＡ）により測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較して当該濃度が大きければ、被検物質は「ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させる」と判断することができる。
【００３５】
本発明の「ＴＬＲリガンド」として、具体的には、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）などのＴＬＲ１／４リガンド、合成ジアシル化リポタンパク質などのＴＬＲ２／６リガンド、合成トリアシル化リポタンパク質などのＴＬＲ１／２リガンド、加熱処理細菌（Heat-Killed Bacteria）やリポグリカン、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、合成リポタンパク質、ザイモサンなどのＴＬＲ２リガンド、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）やウイルス二本鎖ＤＮＡなどのＴＬＲ３リガンド、リピドＡ（Monophosphoryl Lipid A）などのＴＬＲ４リガンド、フラジェリンなどのＴＬＲ５リガンド、イミダノキノリン化合物（ガーディキモド、イミキモドなど）やグアノシンアナログなどのＴＬＲ７リガンド、一本鎖ＲＮＡや大腸菌ＲＮＡなどのＴＬＲ８リガンド、チアゾロキノリン化合物やイミダゾキノリン化合物、ウイルス一本鎖ＲＮＡなどのＴＬＲ７／８リガンド、ＣｐＧモチーフをもつＤＮＡなどのＴＬＲ９リガンドを挙げることができる。本発明において、ＴＬＲリガンドは、例えば、試薬として市販されているものを用いることができる他、定法に従って化学合成してもよく、細菌やウイルスから定法に従って抽出・精製等したものを用いてもよい。
【００３６】
本発明において「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生量を増大させることをいう。被検物質が「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進するか否か」は、定法に従って確認することができる。すなわち、後述する実施例１（１）〜（４）に示すように、まず、マクロファージなどの免疫応答活性化サイトカインを産生する能力を有する培養細胞の培地に被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。続いて、ＴＬＲリガンドを添加して所定の時間培養する。その後、培養上清中の免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較して当該濃度が大きければ、被検物質は「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する」と判断することができる。
【００３７】
本発明において、被検物質が「Ｔｈ１７細胞の分化を促進するか否か」は、ＩＬ−１７の産生量を測定することにより確認することができる。すなわち、後述する実施例３（１）〜（４）に示すように、まず、Ｆ４／８０陽性細胞などの抗原提示細胞の培地に被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。続いて、当該抗原提示細胞とナイーブＴ細胞とを、抗原ペプチドの存在下で所定の時間共培養する。その後、培養上清中のＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較してＩＬ−１７の濃度が大きければ、被検物質は「Ｔｈ１７細胞の分化を促進する」と判断することができる。
【００３８】
ここで、「抗原ペプチド」とは、一般に、生体にとって異物として認識される抗原タンパク質のアミノ酸配列に由来するペプチドであって、抗原提示細胞の細胞表面に抗原提示されるペプチドをいう。
【００３９】
本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、エルゴチオネインの他に、抗原ペプチドを含むことが好ましい。
【００４０】
本発明の抗原ペプチドは、抗原提示細胞の細胞表面に抗原提示されうる限り、そのアミノ酸配列および配列長は特に限定されない。抗原ペプチドとして、具体的には、例えば、細菌やウイルス、原虫などの抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドの他、トリ卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）の３２３〜３３９番目のアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。ここで、抗原タンパク質として、具体的には、例えば、サルモネラ菌やネズミチフス菌のフラジェリンタンパク質、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質、マラリア原虫のＳＥＲＡ（Serine Repeat Antigen）タンパク質、Ｂ群連鎖球菌のＧＢＳ８０タンパク質、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のｐｇ４０エンベロープタンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質、ヒトパピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、またはＬ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶのＥ２・ＮＳ１エンベロープ糖タンパク質、フラビウイルス属のＮＳ１非構造タンパク質またはＤＩ・ＩＩ・ＩＩＩタンパク質、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、ペスチウイルス属のｇｐ５３タンパク質、豚コレラウイルスのｇｐ５５エンベロープタンパク質、パルポウイルスのＶＰ２カプシドタンパク質、ホワイトスポット症候群ウイルスのＶＰ２８エンベロープタンパク質などを挙げることができる。
【００４１】
本発明の抗原ペプチドは、試薬として市販されているものを用いてもよく、上述の抗原タンパク質の公知のアミノ酸配列情報に基づいて、その一部に相当するアミノ酸配列からなる抗原ペプチドを、化学合成または遺伝子工学的に合成して用いてもよい。化学合成する場合は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法により合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。また、遺伝子工学的に合成する場合は、例えば、抗原ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを大腸菌等の適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して当該ＤＮＡを発現させることにより、抗原ペプチドを得ることができる。
【００４２】
本発明に係る免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
なお、本方法において、上述した「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」および「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」と同じまたは相当する構成については、再度の説明は省略する。
【００４３】
本発明において、「ヒトまたは動物」には、ヒトまたは動物に由来する培養細胞も含まれる。
【００４４】
（ａ）の工程は、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、エルゴチオネインをそのまま、あるいは飲食物や飼料、医薬品などの形態で、経口摂取させることにより行うことができる。また、エルゴチオネインを含有する液体状、ゲル状ないしクリーム状の組成物を塗布、貼付あるいは噴霧するなどして経皮吸収させてもよく、座薬や注射により摂取させてもよい。また、ヒトまたは動物に由来する培養細胞に対しては、エルゴチオネインを培地に添加することにより摂取させることができる。
【００４５】
（ｂ）の工程は、エルゴチオネインを摂取させたヒトまたは動物において、ＴＬＲの刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程である。すなわち、当該ヒトまたは動物において、ＴＬＲが刺激された結果、免疫応答活性化サイトカインが産生された状態となればよい。
【００４６】
なお、本発明において「ＴＬＲが刺激される」とは、ＴＬＲを発現しているヒト、動物ないし培養細胞においてＴＬＲにＴＬＲリガンドが結合することをいう。すなわち、「ＴＬＲを刺激する」とは、ＴＬＲにＴＬＲリガンドを結合させることをいう。
【００４７】
ＴＬＲの刺激は、例えば、当該ヒトまたは動物に、ＴＬＲリガンドを摂取させることにより行うことができる。ＴＬＲリガンドを摂取させる方法は、上述した（ａ）の工程におけるエルゴチオネインを摂取させる方法と同様の方法を挙げることができる。    
【００４８】
（ｃ）の工程において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生が促進されたか否かは、定法に従って確認することができる。すなわち、培養細胞に対しては、上述の「被検物質が免疫応答活性化サイトカインの産生を促進するか否かを確認する方法」で確認することができる。一方、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、後述する実施例４に示すように、血清を採取して、当該血清に含まれる免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。エルゴチオネインを摂取した場合の方が、摂取しない場合と比較して当該濃度が大きければ、「摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生が促進された」と判断することができる。
【００４９】
本発明に係るＴｈ１７細胞の分化を促進する方法は、下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。
なお、本方法において、上述した「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」、「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」、「Ｔｈ１７細胞分化促進剤」および「Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物」と同じまたは相当する構成については、再度の説明は省略する。
【００５０】
（ｄ）の工程は、上述した「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」の（ａ）の工程と同様に行うことができる。
【００５１】
（ｅ）の工程は、エルゴチオネインを摂取させたヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程である。すなわち、当該ヒトまたは動物が抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化した状態となればよい。ここで、「抗原ペプチドの刺激を受ける」とは、当該ヒトまたは動物における抗原提示細胞が抗原ペプチドに接触することをいう。
【００５２】
（ｅ）の工程は、簡便には、当該ヒトまたは動物に、抗原ペプチドを摂取させることにより行うことができる。抗原ペプチドを摂取させる方法は、上述した「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」の（ａ）の工程におけるエルゴチオネインを摂取させる方法と同様の方法を挙げることができる。
【００５３】
「抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化したか否か」は、ＩＬ−１７の産生量を測定することにより確認することができる。すなわち、培養細胞については培養上清中の、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物については血清中のＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。抗原ペプチドの刺激を受けた場合の方が、抗原ペプチドの刺激を受けない場合と比較してＩＬ−１７の濃度が大きければ、「抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化した」と判断することができる。
【００５４】
（ｆ）の工程において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化が促進されたか否かは、定法に従って確認することができる。すなわち、培養細胞に対しては、上述の「被検物質がＴｈ１７細胞の分化を促進するか否かを確認する方法」で確認することができる。一方、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、血清を採取して、当該血清に含まれるＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。エルゴチオネインを摂取した場合の方が、摂取しない場合と比較して当該濃度が大きければ、「摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化が促進された」と判断することができる。
【００５５】
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進剤（以下、まとめて「本発明の剤」という場合がある。）の具体的な態様としては、例えば、医薬品や医薬部外品、食品添加物、サプリメントなどの健康食品などを挙げることができる。本発明の剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。
【００５６】
本発明の剤を医薬品や医薬部外品、サプリメントとして用いる場合の剤型としては、例えば、液剤、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、コーティング剤、懸濁剤、ジェル剤、吸入剤、注射剤、点滴剤、糖衣剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏、クリームなどを挙げることができる。
本発明の剤の摂取量は、摂取させる対象の年齢や体重、症状、摂取方法などによって適宜設定することができる。
【００５７】
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物（以下、まとめて「本発明の食品組成物」という場合がある。）の具体的な態様としては、例えば、食用に供するペースト、水煮、レトルト食品、ベビーフード、発酵食品、保存食、乳製品、水産加工品、食肉加工品、穀物加工品などの加工食品や飲料、食品添加物、サプリメントなどの健康食品、動物飼料などを挙げることができる。
本発明の食品組成物は、各種の飲食品や動物飼料、食品添加物の通常の製造過程において、その有効成分を添加して製造することができる。
【００５８】
次に、本発明の各実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例において、エルゴチオネインは、試薬のＬ−エルゴチオネイン（TETRAHEDRON社）を用いた。また、特に記載の無い場合、細胞の培養は３７℃、５（ｖ／ｖ）％ＣＯ２条件下で行った。
【００６０】
＜実施例１＞サイトカイン産生に対する効果の検討
（１）骨髄由来マクロファージの調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）由来の骨髄細胞を６日間培養し、これを骨髄由来マクロファージ（bone marrow-derived macrophages；ＢＭＤＭ）とした。培地は、１０（ｖ／ｖ）％（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、１００ｍＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび３０（ｖ／ｖ）％のＬ９２９細胞ならし培地（conditioned medium）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。培地は３日毎に新しいものに交換した。
【００６１】
（２）エルゴチオネインの事前投与
本実施例１（１）のＢＭＤＭの培地に１ｍＭまたは１０ｍＭとなるようＬ−エルゴチオネイン（TETRAHEDRON社）を添加して、３〜２４時間培養した。また、比較対照として、エルゴチオネインに代えて同量のリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）を添加し、同様に培養した。
【００６２】
（３）Ｔｏｌｌ様受容体の刺激
Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲリガンド）により、ＢＭＤＭのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激した。具体的には、本実施例１（２）のＢＭＤＭの培地に、ガーディキモド（インビトロジェン社）を１μｇ／ｍＬとなるよう添加して２４時間培養し、これをＴＬＲリガンド有り」の試料とした。また、ＴＬＲを刺激しない比較対照として、ガーディキモドに代えて同量のＰＢＳを培地に添加して同様に培養し、これを「ＴＬＲリガンド無し」の試料とした。
【００６３】
（４）サイトカイン濃度の測定
本実施例１（３）のＢＭＤＭの培養上清に含まれるＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０の濃度を測定した。ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度は、BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse IL-6 Flex SetおよびMouse IL-10 Flex Set（BD Bioscience社）を用いて、フローサイトメーターを用いたビーズアレイ法（ＣＢＡ）を使用書に従って行うことにより測定した。また、ＩＬ−１２ｐ４０の濃度は、Mouse IL-12/23 p40 ELISA MAX Deluxe（Biolegend社）を用いて、エライザを使用書に従って行うことにより測定した。測定値について、各条件における３試料の平均値および標準偏差を求めた。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、培地におけるエルゴチオネインの濃度が０、１および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０が検出されなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインの有無に関わらず、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０が検出されなかった。
【００６５】
その一方で、ＴＬＲリガンド有りの場合は、培地におけるエルゴチオネインの濃度が０、１および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０のいずれも検出された。そして、エルゴチオネインの濃度が大きいほど、あるいは事前投与の培養時間が長いほど、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が大きく、ＩＬ−１０の濃度が小さかった。特に、エルゴチオネインの事前投与の培養時間が１２時間以上または濃度が１０ｍＭ以上において、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が顕著に大きかった。
【００６６】
すなわち、エルゴチオネインは、ＴＬＲの刺激により誘導されるＩＬ−６およびＩＬ−１２の産生を促進し、ＩＬ−１０の産生を抑制することが示された。また、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の産生促進効果は、エルゴチオネインの事前投与の培養時間が２４時間以上または濃度が１０ｍＭ以上である場合に、顕著に大きくなることが示された。これらの結果から、エルゴチオネインはＴＬＲの刺激により誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。
【００６７】
＜実施例２＞サイトカイン産生促進効果におけるＴＬＲリガンドの検討
（１）サイトカイン濃度の測定
実施例１（１）〜（４）に記載の方法により、ＢＭＤＭにエルゴチオネインを投与した後ＴＬＲを刺激し、培養上清のサイトカイン濃度を測定した。ただし、エルゴチオネインの濃度は０または１０ｍＭとした。また、ＴＬＲリガンドは、合成ジアシル化リポタンパク質（Ｐａｍ２ＣＳＫ４；CS Bio社）（５０ｎＭ）、合成トリアシル化リポタンパク質（Ｐａｍ３ＣＳＫ４；；Boehringer Mannheim社）（１００ｎｇ／ｍＬ）、リポ多糖（ＬＰＳ；シグマ社））（１００ｎｇ／ｍＬ）およびイミダゾキノリン化合物（ガーディキモド；インビトロジェン社）（１μｇ／ｍＬ）を、括弧内の濃度となるよう培地に添加して用いた。また、サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の濃度を測定した。ＩＬ−１βの濃度は、CBA Mouse IL-1β Flex set（BD Bioscience社）を用いてＣＢＡを使用書に従って行うことにより測定した。その結果を図２に示す。
【００６８】
図２に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、エルゴチオネインの濃度が０および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０が検出されなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインの有無に関わらず、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０が検出されなかった。
【００６９】
その一方で、ＴＬＲリガンド有りの場合は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０のいずれも検出された。そして、ＴＬＲリガンドとしてＰａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４およびガーディキモドを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１βの濃度が大きく、ＩＬ−１０の濃度が小さかった。ＴＬＲリガンドとしてＬＰＳを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が大きく、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の濃度が小さかった。
【００７０】
すなわち、エルゴチオネインは、各種のＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導されるＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１βの産生を促進し、ＩＬ−１０の産生を抑制することが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは、幅広いＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。
【００７１】
（２）サイトカイン遺伝子の発現量の測定
本実施例２（１）のＢＭＤＭについて、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。具体的には、まず、RNeasy  Mini  prep  Kit（キアゲン社）を用いて、ＢＭＤＭから全ＲＮＡを抽出した。続いて、この全ＲＮＡを鋳型として、High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems社)およびランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡを作製した。次に、このｃＤＮＡを鋳型として、各サイトカイン遺伝子に特異的なプライマー（配列は以下に示す）、ＰＣＲ試薬「SYBR GREEN PCR Master Mix」（Applied Biosystems社）およびＰＣＲ装置「StepOne Real-Time PCR system」（Applied Biosystems社）を用いて定量ＰＣＲを行った。定量結果はマウスＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正し、「エルゴチオネインの濃度が０ｍＭかつＴＬＲリガンド無し」の場合の遺伝子発現量を１として、それに対する増加量（倍数）で表した。その結果を図３に示す。
【００７２】
《遺伝子特異的なプライマーの配列》
マウスＧＡＰＤＨ  フォワード；5’-GCCTGGAGAAACCTGCCA-3’（配列番号１）
マウスＧＡＰＤＨ  リバース；5’-CCCTCAGATGCCTGCTTCA-3’（配列番号２）
マウスＩＬ−１２ｐ３５フォワード；5’-ATGTGTCTCCCAAGGTCAGC-3’（配列番号３）
マウスＩＬ−１２ｐ３５リバース；5’-ATGACCCTGGCCAAACTGAG-3’（配列番号４）
マウスＩＬ−１２ｐ４０フォワード；5’-AATGTCTGCGTGCAAGCTCA-3’（配列番号５）
マウスＩＬ−１２ｐ４０リバース；5’-ATGCCCACTTGCTGCATGA-3’（配列番号６）
マウスＩＬ−２３ｐ１９フォワード；5’-TCTGCATGCTAGCCTGGAAC-3’（配列番号７）
マウスＩＬ−２３ｐ１９リバース；5’-TGGCTGTTGTCCTTGAGTCC-3’（配列番号８）
マウスＩＬ−６  フォワード；5’-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3’（配列番号９）
マウスＩＬ−６  リバース；5’-TCCAGTTTGGTAGCATCCATC-3’（配列番号１０）
マウスＩＬ−１０  フォワード；5’-GGCGCTGTCATCGATTTCTC-3’（配列番号１１）
マウスＩＬ−１０  リバース；5’-TGCTCCACTGCCTTGCTCTTA-3’（配列番号１２）
マウスＩＬ−１β  フォワード；5’-TGACGGACCCCAAAAGATGA-3’（配列番号１３）
マウスＩＬ−１β  リバース；5’-TGCTGCTGCGAGATTTGAAG-3’（配列番号１４）
【００７３】
図３に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭにおいて、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の遺伝子発現量の増加は認められなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインを添加しても、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の遺伝子発現量は増加しなかった。
【００７４】
その一方で、ＴＬＲリガンド無しの場合でも、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭにおいて、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量の増加が認められた。この結果から、エルゴチオネインは、単独で、マクロファージからのＩＬ−１２およびＩＬ−２３の遺伝子発現を促進することが明らかになった。
【００７５】
また、ＴＬＲリガンドとしてＰａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＬＰＳおよびガーディキモドを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が０および１０ｍＭのいずれにおいても、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量の増加が認められた。そして、この場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現の増加量が大きく、ＩＬ−１０の遺伝子発現の増加量が小さかった。
【００７６】
すなわち、エルゴチオネインは、各種のＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導されるＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２３の遺伝子発現を促進し、ＩＬ−１０の遺伝子発現を抑制することが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは幅広いＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。
【００７７】
＜実施例３＞Ｔｈ１７細胞分化に対する効果の検討
（１）Ｆ４／８０陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の調製
抗原提示細胞として、Ｆ４／８０陽性細胞を調製した。Ｆ４／８０陽性細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）由来の脾臓細胞をビオチン結合Ｆ４／８０抗体（Biolegend社）で標識し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（MiltenyBiotec社）を用いて単離することにより調製した。
【００７８】
また、ナイーブＴ細胞として、ＣＤ４陽性細胞を調製した。ＣＤ４陽性細胞は、トリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対するＴ細胞受容体を発現するＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス（北里大学の岩淵博士より供与）の脾臓から、ＣＤ４抗体結合マイクロビーズ（MiltenyBiotec社）を用いて単離した。
【００７９】
（２）抗酸化物質の事前投与
本実施例３（１）のＦ４／８０陽性細胞の培地に、エルゴチオネインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ；シグマ社）を添加して２４時間培養した。エルゴチオネインは３０ｍＭ、ＮＡＣは１０ｍＭとなるよう添加した。なお、ＮＡＣは抗酸化物質として知られているグルタチオンの前駆物質である。また、抗酸化物質を投与しない比較対照の試料として、エルゴチオネインおよびＮＡＣに代えて同量のＰＢＳを添加して同様に培養した。培地は、１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ、１ｍＭの4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ）、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１００ｍＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００８０】
（３）ＣＤ４陽性細胞との共培養
文献（Yabu Mら、IL-23-dependent and -independent enhancement pathways of IL-17A production by lactic acid. Int Immunol. 2011;23: 29-41. doi:10.1093/intimm/dxq455）に記載の方法に従って、Ｆ４／８０陽性細胞とＣＤ４陽性細胞との共培養を行った。すなわち、本実施例３（２）のＦ４／８０陽性細胞と本実施例３（１）のＣＤ４陽性細胞とを同数（１×１０５個ずつ）混合し、抗原ペプチドおよびＴＬＲリガンドの存在下または非存在下で３．５日間共培養した。なお、「抗原ペプチドの存在下」とする場合は、トリ卵白アルブミンの３２３〜３３９番目のアミノ酸配列（ISQAVHAAHAEINEAGR；配列番号１５）からなるペプチド（ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド；ＭＢＬライフサイエンス社）を、０．１μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。「抗原ペプチドの非存在下」とする場合は、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに代えて同量のＰＢＳを添加した。また、「ＴＬＲリガンドの存在下」とする場合は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４（CS Bio社）を５０ｎＭとなるよう培地に添加した。「ＴＬＲリガンドの非存在下」とする場合は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４に代えて同量のＰＢＳを添加した。
【００８１】
（４）サイトカイン濃度の測定
本実施例３（３）の培養上清中のＩＬ−１７Ａの濃度を、CBA Mouse IL-17A Flex set（BD Bioscience社）を用いてＣＢＡを使用書に従って行うことにより測定した。その結果を図４に示す。
【００８２】
図４に示すように、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加しない場合は、培地におけるエルゴチオネインまたはＮＡＣの濃度が０、１０ｍＭまたは３０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−１７Ａが検出されなかった。すなわち、抗原ペプチドの非存在下では、エルゴチオネインまたはＮＡＣの有無に関わらず、ＩＬ−１７Ａが検出されなかった。
【００８３】
その一方で、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加した場合は、培地におけるエルゴチオネインまたはＮＡＣの濃度が０ｍＭならびにエルゴチオネインの濃度が３０ｍＭの試料でＩＬ−１７Ａが検出され、ＮＡＣの濃度が１０ｍＭの試料ではＩＬ−１７Ａがほとんど検出されなかった。そして、エルゴチオネインを添加したものと添加しないものとを比較すると、エルゴチオネインを添加した方が、ＩＬ−１７Ａの濃度が大きかった。これに対して、ＮＡＣを添加したものと添加しないものとを比較すると、ＮＡＣを添加した方がＩＬ−１７Ａの濃度が小さかった。また、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加し、かつエルゴチオネインを事前投与した場合において、Ｐａｍ２ＣＳＫ４を添加したものと添加しないものとを比較すると、Ｐａｍ２ＣＳＫ４を添加した方がＩＬ−１７Ａの濃度が大きかった。
【００８４】
すなわち、ＮＡＣはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を抑制するのに対して、エルゴチオネインはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することが示された。また、エルゴチオネインによるＴｈ１７細胞の分化促進効果は、ＴＬＲリガンドが存在する場合に、より大きくなることが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは抗原ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することが明らかになった。
【００８５】
＜実施例４＞生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）における検討
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）に、１５ｍｇのエルゴチオネインまたは同量のＰＢＳを、カニュラを用いて経口摂取させた。２４時間後、１０ｎｍｏｌのＰａｍ２ＣＳＫ４（CS Bio社）を腹腔内注射することによりＴＬＲを刺激した。続いて、０、１、３、５、７、９および２４時間後に尾静脈より血液を採取して、血清を回収した。血清の回収方法は、まず、血液を３７℃で６０分間インキュベートして凝固させた後、４℃で６０分間静置した。次に、２４００×ｇで３分間遠心分離を行って上清を回収し、これをさらに６２００×ｇで３分間遠心分離に供して上清を回収し、これを血清とした。血清に含まれるＩＬ−６の濃度を、実施例１（４）に記載の方法により測定した。測定値について、各条件における３個体の平均値および標準偏差を求めた。その結果を図５に示す。
【００８６】
図５に示すように、エルゴチオネインを摂取させたものとＰＢＳを摂取させたものとを比較すると、エルゴチオネインを摂取させたものの方が、３時間後、５時間後および７時間後のＩＬ−６濃度が大きかった。すなわち、エルゴチオネインは、ＴＬＲの刺激により誘導されるＩＬ−６の産生を促進することが示された。この結果から、エルゴチオネインはＴＬＲの刺激により誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。
【図１】
2017218431.tif 000003
【図２】
2017218431.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2017218431000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月7日(2017.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネインと、リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、合成トリアシル化リポタンパク質およびイミダノキノリン化合物から選択されるいずれかのＴｏｌｌ様受容体リガンドとを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項２】
Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するための、請求項１に記載の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項３】
エルゴチオネインがタモギタケから抽出したエルゴチオネインである、請求項１または請求項２に記載の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤。
【請求項４】
エルゴチオネインと、リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、合成トリアシル化リポタンパク質およびイミダノキノリン化合物から選択されるいずれかのＴｏｌｌ様受容体リガンドとを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法（医療行為を除く）；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインと、リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、合成トリアシル化リポタンパク質およびイミダノキノリン化合物から選択されるいずれかのＴｏｌｌ様受容体リガンドとを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
【請求項６】
エルゴチオネインと、配列番号１５のアミノ酸配列からなる抗原ペプチドとを有効成分とする、Ｔｈ１７細胞分化促進剤。
【請求項７】
エルゴチオネインがタモギタケから抽出したエルゴチオネインである、請求項６に記載のＴｈ１７細胞分化促進剤。
【請求項８】
エルゴチオネインと、配列番号１５のアミノ酸配列からなる抗原ペプチドとを有効成分とする、Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物。
【請求項９】
下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する方法（医療行為を除く）；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインと、配列番号１５のアミノ酸配列からなる抗原ペプチドとを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。