(57)【要約】【課題】有機酸生産性の高いリゾプス属菌の提供。【解決手段】アルコールデヒドロゲナーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールデヒドロゲナーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌。
【請求項２】
ａｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項１記載の変異リゾプス属菌。
【請求項３】
前記ａｄｈ遺伝子が、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２記載の変異リゾプス属菌。
【請求項４】
アルコールデヒドロゲナーゼの活性が、変異前と比べて５０％以下に低減されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【請求項５】
前記リゾプス属菌がＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅである、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【請求項６】
有機酸生産性が向上している、請求項１〜５のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【請求項７】
リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法。
【請求項８】
リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法。
【請求項９】
前記リゾプス属菌におけるａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記ａｄｈ遺伝子が、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ａｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化が、人工ＤＮＡ切断酵素を用いたａｄｈ遺伝子座のゲノム編集によって行われる、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノム編集が、ＴＡＬＥＮ、Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９システム、又はＺＦＮによって行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノム編集が、前記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＡＬＥＮが下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなる請求項１２又は１３記載の方法：
ポリペプチド（Ｌ）：
１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
該１７個のリピートうちの上流から１〜１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
該ＴＡＬエフェクターは、配列番号９で示される配列を認識する、
ポリペプチド（Ｒ）：
１６個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
該１６個のリピートうちの上流から１〜１５個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
該１６個のリピートうちの上流から１６個目のリピートは、配列番号４３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
該ＴＡＬエフェクターは、配列番号１０で示される配列を認識する。
【請求項１５】
前記ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが以下のi）及びii）である、請求項１２又は１３記載の方法：
i） 配列番号３で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
配列番号４で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
及び
ii）配列番号５で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項１６】
前記リゾプス属菌にエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記リゾプス属菌がＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅである、請求項７〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法。
【請求項２０】
前記有機酸がフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα−ケトグルタル酸である、請求項１９記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異リゾプス属菌、及びそれを用いた有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸などの有機酸は、食品製造に使用されたり、合成樹脂や生分解性ポリマーの原料として用いられるなど、工業的な価値が高い物質である。
【０００３】
近年、微生物や酵素を用いた生物学的な有用物質生産が行われている。しかしながら、微生物による物質の工業生産においては、生産性の向上が重要な課題の一つである。生産性向上のため、従来、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学及びバイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な微生物学的な物質生産方法の開発が注目されている。
【０００４】
例えば、特許文献１〜３には、糸状菌であるリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）のプロモーターを導入した微生物を用いた乳酸生産法が開示されている。また、非特許文献１には、フマル酸生産量が多く、副産物であるエタノール産生の少ない変異リゾプス属菌が報告されている。しかし、リゾプス属菌の遺伝学的背景は未だ十分に研究されていないことから、現状では、有用物質生産に適したリゾプス属菌を遺伝子組換え技術によって開発することは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６２６８１８９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００１／７３０８３号
【特許文献３】国際公開第２００１／７２９６７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Korean J Chem Eng, 2010, 27(1):183-186
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、有機酸生産性の高い変異リゾプス属菌、及びそれを用いた有機酸の製造方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上について検討した。その結果、本発明者らは、アルコールデヒドロゲナーゼの活性が低減したリゾプス属菌において、有機酸生産性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌を提供する。
【００１０】
また本発明は、リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法を提供する。
【００１１】
また本発明は、リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、上記変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、有機酸生産性が高い変異リゾプス属菌を提供する。本発明の変異リゾプス属菌によれば、効率のよい有機酸の微生物学的生産が実現する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さら好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１６】
本明細書において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下、なお好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上９０個以下、好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは１個以上１５個以下、なお好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は複数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１７】
また本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１８】
本明細書において、別途限定がない限り、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の位置又は領域は、当該任意の領域に「相当する位置」又は「相当する領域」とみなされる。
【００２０】
本明細書において、「ａｄｈ遺伝子」は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を包含する。配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとしては、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）（配列番号２）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２１】
したがって、本明細書における「ａｄｈ遺伝子」はまた、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を包含する。
【００２２】
本明細書において、変異微生物における「アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低減」とは、変異微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、変異前の株（親株）の活性の５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低減していることをいう。微生物のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１６４：１３０５−１３２２、又は後述の実施例に記載された方法に従って測定することができる。
【００２３】
本発明の変異リゾプス属菌は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減した変異リゾプス属菌である。
【００２４】
本発明の変異リゾプス属菌の親株としては、リゾプス属に属する糸状菌、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒなどが挙げられる。このうち、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒが好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒがより好ましい。当該親株を、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減するように改変することにより、本発明の変異リゾプス属菌を作製することができる。
【００２５】
リゾプス属菌におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性の低減は、該リゾプス属菌の細胞におけるアルコールデヒドロゲナーゼの発現量を低下させることによって実現することができる。例えば、該リゾプス属菌のａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化させること、ａｄｈ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化すること、又はａｄｈ遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害することによって、アルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減させることができる。あるいは、リゾプス属菌中で発現したアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低下させることによっても、アルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減させることができる。上記の改変は、分子生物学的又は遺伝子工学的手法を用いて、人工的に行うことができる。
【００２６】
細胞中のａｄｈ遺伝子のｍＲＮＡを不活性化させる方法としては、ｓｉＲＮＡを用いた標的特異的なｍＲＮＡ阻害が挙げられる。ｓｉＲＮＡの基本的な手順は当業者によく知られており（例えば、特表２００７-５１２８０８号公報参照）、またｓｉＲＮＡのための試薬又はキットが市販されている。当業者は、公知の文献や市販の製品のマニュアルに基づいて、所望の標的特異的なｓｉＲＮＡを調製し、標的ｍＲＮＡを阻害することができる。
【００２７】
アルコールデヒドロゲナーゼの活性を低下させる方法としては、ＡＤＨ阻害剤を用いる方法が挙げられる。ＡＤＨ阻害剤としては、４−メチルピラゾール、１，２−ジアゾール、２，２，２−トリフルオロエタノールなどが挙げられる（Ａｌｃｏｈｏｌ，１９９５，１２：３５１−３５５、及びＡｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，１６４：１３０５−１３２２等を参照）。
【００２８】
細胞中のａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、ａｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換える方法、ａｄｈ遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入する方法、ａｄｈ遺伝子の転写又は翻訳開始領域に変異を与える方法、などが挙げられる。好適には、ａｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化させる。より具体的な例としては、細胞のゲノム上のａｄｈ遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び細胞中の遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、ａｄｈ遺伝子にコードされるアルコールデヒドロゲナーゼの発現量や活性評価、又は遺伝子解析を行って、所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。
【００２９】
細胞中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。不活性化した遺伝子を作製する方法としては、部位特異的変異導入があり、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒTM  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販のキットを利用することができる。上記の方法で得られたランダムな変異を有する細胞のゲノム配列を確認することにより、ａｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化された細胞を選択することができる。あるいは、細胞のアルコールデヒドロゲナーゼの発現量又は活性を指標に、ａｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化された細胞を選択することができる。
【００３０】
ゲノム中の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法の例としては、これに限定されるものではないが、人工ＤＮＡ切断酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集が挙げられる。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明によるリゾプス属菌ａｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化は、ａｄｈ遺伝子座のゲノム編集によって行われる。本明細書において、「ａｄｈ遺伝子座」とは、ａｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列と、その５’側１０００ｂｐ領域及びその３’側１０００ｂｐ領域とを含むゲノム上の領域をいう。
【００３２】
ゲノム編集は、ゲノム上の標的遺伝子座のＤＮＡ２重鎖を特異的に切断し、切断したＤＮＡの修復の過程でヌクレオチドの欠失や挿入、置換を誘導したり、外来ポリヌクレオチドを挿入するなどして、ゲノムを部位特異的に改変する技術である。このような技術は、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、又はＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓ９システムとして知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，１５：３２１−３３４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３９：ｅ８２）。これらの技術に基づくゲノム編集のためのキットは市販されており、例えばＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから購入することができる。
【００３３】
ゲノム編集技術の例示のみを目的として、ＴＡＬＥＮについて詳述する。ＴＡＬＥＮは、植物病原性細菌であるキサントモナス属のＤＮＡ結合ドメインに由来する転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターと、ＤＮＡヌクレアーゼＦｏｋ１からなるＤＮＡ切断ドメインとを有するタンパク質である。ＴＡＬＥＮのＴＡＬエフェクターは、約３４アミノ酸からなる繰り返し配列（リピート）を約１７個連結した構造を取り、各リピートが１ヌクレオチドを認識する。各リピートが特異的に認識する塩基の種類は、各リピート中の特定位置にある連続する２個のアミノ酸残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ；ＲＶＤと称される）の種類に依存する。４種の塩基ＡＴＧＣに対応するＲＶＤのアミノ酸残基ペアの種類は公知である。したがって当業者は、標的ゲノムＤＮＡ配列を特異的に認識するＴＡＬＥＮを構築することができる。ＴＡＬＥＮによるゲノム編集では、切断したいゲノムＤＮＡ領域の近傍の上流及び下流の配列をそれぞれ特異的に認識する１組のＴＡＬＥＮを設計し、細胞内で発現させる。一般的には、標的特異的なＴＡＬＥＮをコードする遺伝子を構築し、細胞に導入して、細胞内で該ＴＡＬＥＮを発現させる。発現した各ＴＡＬＥＮが対応するゲノムＤＮＡに結合すると、それぞれに含まれるＦｏｋ１が切断標的ゲノムＤＮＡ領域上で２量体を形成し、ＤＮＡ２重鎖を切断する。
【００３４】
リゾプス属菌ａｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化のためのＴＡＬＥＮの例としては、下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなるＴＡＬＥＮのペアが挙げられる。
【００３５】
ポリペプチド（Ｌ）：ａｄｈ遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号９）で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するＴＡＬＥＮポリペプチド。好ましくは、該ポリペプチド（Ｌ）に含まれるＴＡＬエフェクター（以下、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）とも称する）は、１７個の繰り返し配列（リピート）が連結したポリペプチドを含み、５’−ＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号９）で示される配列を認識する。
【００３６】
ポリペプチド（Ｒ）：ａｄｈ遺伝子のアンチセンス鎖中の５’−ＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１０）で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するＴＡＬＥＮポリペプチド。好ましくは、該ポリペプチド（Ｒ）に含まれるＴＡＬエフェクター（以下、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）とも称する）は、１６個の繰り返し配列（リピート）が連結したポリペプチドを含み、５’−ＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１０）で示される配列を認識する。
【００３７】
上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中の１７個のリピートのうちの上流から１〜１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。好ましくは、該上流から１〜１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して、後述するＲＶＤ以外の部分で、３個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中のリピートのうち最下流に位置する１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００３８】
上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中の１６個のリピートのうちの上流から１〜１５個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。好ましくは、該上流から１〜１５個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して、後述するＲＶＤ以外の部分で、３個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中のリピートのうち最下流に位置する１６個目のリピートは、配列番号４３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００３９】
好ましくは、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置に、塩基認識部位である２つのアミノ酸残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ；ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号９で示される配列の２〜１８番塩基を認識する。また好ましくは、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中の１６個のリピートは、それぞれ、配列番号２８で示されるアミノ酸配列の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置にＲＶＤを有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号１０で示される配列の２〜１７番塩基を認識する。ＲＶＤのアミノ酸残基の種類は、下記に示すとおり、標的とする塩基の種類に依存する。
標的塩基         ＲＶＤ
Ａ              ＮＩ
Ｃ              ＨＤ
Ｇ／Ａ          ＮＮ
Ｔ              ＮＧ
【００４０】
ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）が配列番号９で示される配列を認識できる限り、上記１７個のリピートのうちの２個以下、好ましくは１個は、配列番号９に対応するＲＶＤを有していなくともよい。言い換えれば、上記１７個のリピートのうち１５個以上、好ましくは１６個以上が配列番号９に対応するＲＶＤを有していればよい。また上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）が配列番号１０で示される配列を認識できる限り、上記１６個のリピートのうちの２個以下、好ましくは１個は、配列番号１０に対応するＲＶＤを有していなくともよい。言い換えれば、上記１６個のリピートのうち１４個以上、好ましくは１５個以上が配列番号１０に対応するＲＶＤを有していればよい。
【００４１】
さらに好ましい実施形態において、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）の１７個のリピートの各々は、上流から順に、以下の（１）〜（１７）のアミノ酸配列からなる：
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８）配列番号１８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９）配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１）配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３）配列番号２３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１５）配列番号２５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１６）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１７）配列番号２７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４２】
なお好ましくは、上記（１）〜（１７）のアミノ酸配列は、各々、以下のアミノ酸残基ペアからなるＲＶＤを有する：
（１）配列番号１１の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（２）配列番号１２の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（３）配列番号１３の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（４）配列番号１４の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（５）配列番号１５の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（６）配列番号１６の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（７）配列番号１７の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（８）配列番号１８の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（９）配列番号１９の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１０）配列番号２０の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１１）配列番号２１の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１２）配列番号２２の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１３）配列番号２３の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１４）配列番号２４の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１５）配列番号２５の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１６）配列番号２６の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１７）配列番号２７の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）。
ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）が５’−ＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号９）で示される配列を認識できる限り、上記（１）〜（１７）のリピートのうちの１５個以上、好ましくは１６個以上が上記ＲＶＤを有していればよい。
【００４３】
別のさらに好ましい実施形態において、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）の１６個のリピートの各々は、上流から順に、以下（１'）〜（１６'）のアミノ酸配列からなる：
（１'）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２'）配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３'）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４'）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５'）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６'）配列番号３３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７'）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８'）配列番号３５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９'）配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０'）配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１'）配列番号３８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２'）配列番号３９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３'）配列番号４０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４'）配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１５'）配列番号４２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１６'）配列番号４３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４４】
なお好ましくは、上記（１'）〜（１６'）のアミノ酸配列は、各々、以下のアミノ酸残基ペアからなるＲＶＤを有する：
（１'）配列番号２８の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（２'）配列番号２９の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（３'）配列番号３０の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（４'）配列番号３１の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（５'）配列番号３２の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（６'）配列番号３３の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（７'）配列番号３４の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（８'）配列番号３５の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（９'）配列番号３６の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１０'）配列番号３７の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１１'）配列番号３８の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１２'）配列番号３９の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１３'）配列番号４０の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（１４'）配列番号４１の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（１５'）配列番号４２の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１６'）配列番号４３の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）。
ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）が５’−ＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１０）で示される配列を認識できる限り、上記（１'）〜（１６'）のリピートのうちの１４個以上、好ましくは１５個以上が上記ＲＶＤを有していればよい。
【００４５】
上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）に含まれるＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼとは、２量体化してＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼをいう。好ましくは、該Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼとは、配列番号３の２４１６〜３００６番ヌクレオチドで示される配列、又はこれと少なくとも９５％同一な配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ２量体化してＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼである。
【００４６】
上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）の好ましい例としては、下記が挙げられる：
ポリペプチド（Ｌ）：
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド、
ポリペプチド（Ｒ）：
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
【００４７】
上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）の別の好ましい例としては、それぞれ、下記ポリヌクレオチド（ｌ）及び（ｒ）にコードされるポリペプチドが挙げられる：
ポリヌクレオチド（ｌ）：
配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチド（ｒ）：
配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記ポリペプチド（Ｌ）は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドである。また好ましい実施形態において、上記ポリペプチド（Ｒ）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドである。
【００４９】
上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなるＴＡＬＥＮは、リゾプス属菌ゲノム上のａｄｈ遺伝子座を含むＤＮＡ（配列番号６８）のセンス鎖とアンチセンス鎖とにそれぞれ特異的に結合して、ａｄｈ遺伝子座のＤＮＡを切断し、ａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化する。
【００５０】
したがって、好ましい実施形態においては、リゾプス属菌親株に、上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを導入することによって、該リゾプス属菌のａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化して、本発明の変異リゾプス属菌を作製する。該ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、それぞれ、上述したポリヌクレオチド（ｌ）及び（ｒ）が挙げられる。
【００５１】
細胞内でＴＡＬＥＮとともに外来エキソヌクレアーゼを発現させることにより、ＴＡＬＥＮの標的ＤＮＡの破壊が促進される（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，３：１２５３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１２５３、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９：９７３−９７５）。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、リゾプス属菌親株に、上記ＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドに加えて、さらにエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入する。エキソヌクレアーゼとしては、リゾプス属菌に由来するエキソヌクレアーゼであれば特に限定されないが、好ましくはエキソヌクレアーゼ１又はエキソヌクレアーゼ２に属するものが挙げられ、より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ属菌由来、例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼが挙げられる。
【００５２】
さらに好ましいエキソヌクレアーゼの例としては、配列番号７又は配列番号６９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来エキソヌクレアーゼ（配列番号８）が挙げられる。したがって、本発明で使用されるエキソヌクレアーゼのさらに好ましい例としては、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされたエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；配列番号６９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；及び、配列番号６９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされたエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
【００５３】
細胞内でのＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼの発現には、ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼのペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入すればよい。好ましくは、各ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞内に導入し、該細胞内でＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼを発現させる。各ＴＡＬＥＮ及びエキソヌクレアーゼのポリヌクレオチドは、同じベクターに含まれていてもよいが、別々のベクターに含まれていてもよい。発現ベクターは、それを導入する細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであれば特に限定されない。リゾプス属菌に適した発現ベクターとしては、例えばｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＰＴＲ１／２（ＴａＫａＲａ）、ｐＲＩ９０９／９１０（ＴａＫａＲａ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１，１９８５）、ｐＡＢ４−１（ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１−７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５−３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７−４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７−４５１，１９９０）等が挙げられる。
【００５４】
細胞内でのＴＡＬＥＮの効率的な発現のために、上記ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、リゾプス属菌で働くプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。リゾプス属菌で働くプロモーターの例としては、ｌｄｈＡプロモーター（米国特許第６２６８１８９号）、ｐｇｋ１プロモーター（国際公開第２００１／７３０８３号）、ｐｇｋ２プロモーター（国際公開第２００１／７２９６７号）、ｐｄｃＡプロモーター及びａｍｙＡプロモーター（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１８６：４１−５０）、ｔｅｆ及び１８ＳｒＲＮＡプロモーター（米国特許出願公開第２０１０／１１２６５１号）、ならびにａｄｈ１プロモーター（特願２０１５−１５５７５９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
上記ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含む発現ベクターは、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などを用いて細胞に導入することができる。
【００５６】
ＴＡＬＥＮの導入により標的遺伝子が欠失又は不活性化した細胞は、ランダム変異の場合と同様に、細胞のゲノム配列の確認、又はアルコールデヒドロゲナーゼの発現量若しくは活性に基づいて選択することができる。
【００５７】
以上の手順により、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減された本発明の変異リゾプス属菌を作製することができる。本発明の変異リゾプス属菌は、その変異前の株（親株）と比べて有機酸の生産性が向上している。したがって、本発明の変異リゾプス属菌を培養すれば、有機酸を効率よく生産することができる。したがって、本発明は、本発明の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法を提供する。有機酸としては、好ましくは乳酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸及びα−ケトグルタル酸が挙げられる。
【００５８】
本発明の変異リゾプス属菌を用いた有機酸の製造は、本発明の変異リゾプス属菌を、一般的なリゾプス属菌の培養方法に従って培養し、次いで培養物から有機酸を回収することにより行うことができる。例えば、本発明の変異リゾプス属菌を、適切な培地で１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３５℃にて、数日間培養することで、有機酸を生産することができる。培養日数は目的の有機酸が充分に産生される期間であればよい。例えば、目的の有機酸が乳酸であれば、前述の温度にて、１〜１６８時間、好ましくは２〜７２時間、より好ましくは４〜２４時間培養することにより、乳酸が生産される。あるいは目的の有機酸がフマル酸であれば、前述の温度にて、１〜１６８時間、好ましくは２〜７２時間、より好ましくは４〜３６時間培養することにより、フマル酸が生産される。コハク酸、リンゴ酸、及びα−ケトグルタル酸の場合も同様である。
【００５９】
本発明の変異リゾプス属菌を培養するための培地は、リゾプス属菌が健全に生育し、且つ目的の有機酸を生産することが可能な培地である限り特に限定されない。例えば、培地としては、グルコース、キシロースなどの単糖；シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖；デンプン等の多糖などを基質とした固体培地若しくは液体培地、又は市販のＰＤＢ培地（ポテトデキストロース培地；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＰＤＡ培地（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；日本製薬社製（商標名「ダイゴ」）等）、ＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＳＢ培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地；ＯＸＯＩＤ社製等）などを使用することができる。さらに培地には、グリセリン、クエン酸などの生体成分；アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素等、アミノ酸等、大豆ペプチドなどの天然窒素源等の窒素源；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、などを適宜添加することができる。
【００６０】
培養後、培地から培養上清を回収することにより、有機酸を得ることができる。必要に応じて、傾斜法、膜分離、遠心分離、電気透析法、イオン交換樹脂の利用、蒸留、塩析等の方法、又はこれらの組み合わせにより、当該培養液中の有機酸を有機酸塩として回収した後、回収された有機酸塩から有機酸を単離又は精製してもよい。
【００６１】
一実施形態において、より効率的に有機酸を生産するには、以下に示すような工程で生産を行ってもよい。すなわち、本発明の変異リゾプス属菌の胞子懸濁液を調製し（工程Ａ）、それを培養液で培養して胞子を発芽させ菌糸体を調製し（工程Ｂ１）、好適にはさらに当該菌糸体を増殖させ（工程Ｂ２）、次いで調製した菌糸体を培養して有機酸を生産させること（工程Ｃ）により、効率よく有機酸を製造することができる。
【００６２】
＜工程Ａ：胞子懸濁液の調製＞
本発明の変異リゾプス属菌の胞子を、例えば、無機寒天培地（組成例：２％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、１．５％寒天、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））、ＰＤＡ培地、等の培地に接種し、１０〜４０℃、好ましくは２７〜３０℃にて、７〜１０日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれてもよいし、含まれなくてもよい。
【００６３】
＜工程Ｂ１：菌糸体の調製＞
工程Ａで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、１×１０2〜１×１０8個−胞子／ｍＬ−培養液、好ましくは１×１０2〜５×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、より好ましくは５×１０2〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、さらに好ましくは１×１０3〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液である。
【００６４】
本工程で使用する胞子発芽用の培養液には、市販の培地、例えば、ＰＤＢ培地、ＬＢ培地、ＮＢ培地、ＳＢ培地などが利用できる。また、当該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素等、アミノ酸等、大豆ペプチドなどの天然窒素源等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、窒素源の好ましい濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００６５】
工程Ｂ１においては、上記培養液を用いて、本発明の変異リゾプス属菌を培養する。培養は、通常の手順にて行なえばよい。例えば、培養液を含む培養容器に、糸状菌胞子を接種し、好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００〜３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、糸状菌胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
【００６６】
＜工程Ｂ２：菌糸体の増殖＞
有機酸生産能向上の観点から、工程Ｂ１で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（工程Ｂ２）を行うことが好ましい。工程Ｂ２で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．０５〜２％硫酸アンモニウム、０．０３〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．１％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜３００ｍＬ、好ましくは１００〜２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程Ｂ１で培養した菌体を、湿重量として１〜２０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地、好ましくは３〜１０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地となるよう接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、１２〜１２０時間、好ましくは１６〜７２時間培養する。
【００６７】
＜工程Ｃ：有機酸生産＞
上記の手順（Ｂ１又はＢ２）で得られた糸状菌の菌糸体を培養して当該菌に有機酸を生産させ、その後生産された有機酸を回収することができる。
工程（Ｃ）で使用される有機酸生産用培養液は、グルコース等の炭素源、アンモニウム塩等の窒素源及び各種金属塩等を含み、有機酸を生産できる培養液であればよい。当該工程（Ｃ）に使用される培養液としては、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．０５〜２％硫酸アンモニウム、０．０３〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．１％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０〜１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。
【００６８】
工程（Ｃ）で使用する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０〜８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜２００ｍＬ程度であればよい。この培養液に、工程Ｂ１又はＢ２で得られた菌体を、湿重量として５ｇ〜９０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液、好ましくは５ｇ〜５０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液の量となるように接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４５℃の培養温度制御下で、２時間〜７２時間、好ましくは４時間〜３６時間培養する。
【００６９】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７０】
〔１〕アルコールデヒドロゲナーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌。
【００７１】
〔２〕好ましくは、ａｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔１〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７２】
〔３〕好ましくは、上記ａｄｈ遺伝子が、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、〔２〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７３】
〔４〕好ましくは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが導入されている、〔２〕又は〔３〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７４】
〔５〕好ましくは、エキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドがさらに導入されている、〔４〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７５】
〔６〕上記エキソヌクレアーゼが、
好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
より好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼである、
〔５〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７６】
〔７〕好ましくは、上記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、〔５〕記載の変異リゾプス属菌。
【００７７】
〔８〕アルコールデヒドロゲナーゼの活性が、変異前と比べて、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０%以下、さらに好ましくは１０％以下に低減されている、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【００７８】
〔９〕上記リゾプス属菌が、
好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒであり、
より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒである、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【００７９】
〔１０〕有機酸生産性が向上している、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
【００８０】
〔１１〕リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法。
【００８１】
〔１２〕リゾプス属菌においてアルコールデヒドロゲナーゼの活性を低減することを含む、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法。
【００８２】
〔１３〕好ましくは、リゾプス属菌におけるａｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
【００８３】
〔１４〕好ましくは、上記ａｄｈ遺伝子が、以下：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、〔１３〕記載の方法。
【００８４】
〔１５〕好ましくは、上記ａｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化が、人工ＤＮＡ切断酵素を用いたａｄｈ遺伝子座のゲノム編集によって行われる、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
【００８５】
〔１６〕好ましくは、上記ゲノム編集が、ＴＡＬＥＮ、Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９システム、又はＺＦＮによって行われる、〔１５〕記載の方法。
【００８６】
〔１７〕上記ゲノム編集が、
好ましくは、上記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することであり、
より好ましくは、上記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを導入することである、
〔１６〕記載の方法。
【００８７】
〔１８〕好ましくは、上記ＴＡＬＥＮが下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなる、〔１７〕記載の方法：
ポリペプチド（Ｌ）：
１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
該１７個のリピートうちの上流から１〜１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
該ＴＡＬエフェクターは、配列番号９で示される配列を認識する、
ポリペプチド（Ｒ）：
１６個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
該１６個のリピートうちの上流から１〜１５個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
該１６個のリピートうちの上流から１６個目のリピートは、配列番号４３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
該ＴＡＬエフェクターは、配列番号１０で示される配列を認識する。
【００８８】
〔１９〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｌ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置にｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号９で示される配列の２〜１８番塩基を認識する、〔１８〕記載の方法。
【００８９】
〔２０〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｒ）のＴＡＬエフェクター中の１６個のリピートは、それぞれ、配列番号２８で示されるアミノ酸配列の１２〜１３番アミノ酸に相当する位置にｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号１０で示される配列の２〜１７番塩基を認識する、〔１８〕記載の方法。
【００９０】
〔２１〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｌ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、上流から順に、以下の（１）〜（１７）のアミノ酸配列からなる、〔１８〕記載の方法。
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（２）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（６）配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（７）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（８）配列番号１８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（９）配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１０）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１１）配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１２）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１３）配列番号２３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１４）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１５）配列番号２５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１６）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１７）配列番号２７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
【００９１】
〔２２〕上記（１）〜（１７）の配列のうちの好ましくは１５個以上、より好ましくは１６個以上が、以下のアミノ酸残基を有する、〔２１〕記載の方法。
（１）について：配列番号１１の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（２）について：配列番号１２の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（３）について：配列番号１３の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（４）について：配列番号１４の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（５）について：配列番号１５の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（６）について：配列番号１６の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（７）について：配列番号１７の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（８）について：配列番号１８の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（９）について：配列番号１９の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１０）について：配列番号２０の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１１）について：配列番号２１の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１２）について：配列番号２２の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１３）について：配列番号２３の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１４）について：配列番号２４の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１５）について：配列番号２５の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１６）について：配列番号２６の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１７）について：配列番号２７の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
【００９２】
〔２３〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｒ）のＴＡＬエフェクター中の１６個のリピートは、上流から順に、以下の（１'）〜（１６'）のアミノ酸配列からなる、〔１８〕記載の方法。
（１'）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（２'）配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（３'）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（４'）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（５'）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（６'）配列番号３３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（７'）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（８'）配列番号３５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（９'）配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１０'）配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１１'）配列番号３８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１２'）配列番号３９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１３'）配列番号４０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１４'）配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１５'）配列番号４２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１６'）配列番号４３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
【００９３】
〔２４〕上記（１'）〜（１６'）の配列のうちの好ましくは１４個以上、より好ましくは１５個以上が、以下のアミノ酸残基を有する、〔２３〕記載の方法。
（１'）について：配列番号２８の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（２'）について：配列番号２９の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（３'）について：配列番号３０の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（４'）について：配列番号３１の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（５'）について：配列番号３２の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（６'）について：配列番号３３の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（７'）について：配列番号３４の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（８'）について：配列番号３５の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（９'）について：配列番号３６の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１０'）について：配列番号３７の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１１'）について：配列番号３８の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１２'）について：配列番号３９の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１３'）について：配列番号４０の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（１４'）について：配列番号４１の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（１５'）について：配列番号４２の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１６'）について：配列番号４３の１２−１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
【００９４】
〔２５〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｌ）が以下のポリペプチドである、〔１８〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の方法：
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
【００９５】
〔２６〕好ましくは、上記ポリペプチド（Ｒ）が以下のポリペプチドである、〔１８〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の方法：
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
【００９６】
〔２７〕好ましくは、上記ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが以下のi）及びii）である、〔１７〕記載の方法。
i） 配列番号３で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
配列番号４で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
及び
ii）配列番号５で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【００９７】
〔２８〕好ましくは、上記リゾプス属菌にエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、〔１７〕〜〔２７〕のいずれか１項記載の方法。
【００９８】
〔２９〕上記エキソヌクレアーゼが、
好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
より好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼである、
〔２８〕記載の方法。
【００９９】
〔３０〕好ましくは、上記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号６９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、〔２８〕記載の方法。
【０１００】
〔３１〕上記リゾプス属菌が、
好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒであり、
より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒである、
〔１１〕〜〔３１〕のいずれか１項記載の方法。
【０１０１】
〔３２〕上記リゾプス属菌におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性の低減が、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０%以下、さらに好ましくは１０％以下への低減である、〔１１〕〜〔３１〕のいずれか１項記載の方法。
【０１０２】
〔３３〕〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法。
【０１０３】
〔３４〕好ましくは、培養後の培養物から有機酸を回収することをさらに含む、〔３３〕記載の有機酸の製造方法。
【０１０４】
〔３５〕好ましくは、上記有機酸がフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα−ケトグルタル酸である、〔３３〕又は〔３４〕記載の有機酸の製造方法。
【０１０５】
〔３６〕有機酸の製造のための、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌の使用。
【０１０６】
〔３７〕好ましくは、上記有機酸がフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα−ケトグルタル酸である、〔３６〕記載の使用。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０８】
実施例１  変異リゾプス属菌の作製
（１）トリプトファン栄養要求性株の作製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）由来のトリプトファン栄養要求性株を、ａｄｈ遺伝子欠失のための親株として用いた。トリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて12Ｃ5＋を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００〜１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、ｔｒｐＣ遺伝子領域に１塩基欠損変異を有し、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ０２Ｔ６株を取得した。この株を、以降の実施例で変異リゾプス属菌の親株として用いた。
【０１０９】
（２）プラスミドベクター作製
５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号４４）及びｏＪＫ１６３（配列番号４５）を用いたＰＣＲにてｔｒｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号４６）及びｏＪＫ１６５（配列番号４７）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを作製した。
【０１１０】
次いで、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ａｄｈ１のプロモーター断片とターミネーター断片を、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号４８）及びｏＪＫ２０４（配列番号４９）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号５０）及びｏＪＫ２１６（配列番号５１）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、上記で構築したプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号５２）及びｏＪＫ２１１（配列番号５３）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを作製した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にａｄｈ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。
【０１１１】
（３）ａｄｈ１遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に依頼し、Ｃｕｓｔｏｍ  ＸＴＮ  ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を作製した。これは、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）をコードする遺伝子（ａｄｈ１遺伝子；配列番号１）を標的とするＴＡＬＥＮのためのキットであり、２つのポリヌクレオチドＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈ（配列番号３）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈ（配列番号５）を含み、ａｄｈ１遺伝子を含む領域（配列番号６８）に結合する。ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈは、ａｄｈ１遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号９）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードし、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈは、アンチセンス鎖中の５’−ＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１０）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。
【０１１２】
上記ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドの各々を、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号５４）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号５５）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号５６）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号５７）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈ断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを得た。同様に、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号５６）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号５７）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈ断片を増幅し、ベクター断片と連結してＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを含むプラスミドｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈを得た。
【０１１３】
（４）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ）を鋳型に、プライマーｐＰＴＲ１−ｓａｌ１−Ｆ（配列番号５８）及びｐＰＴＲ１−ｓａｌ１−Ｒ（配列番号５９）を用いたＰＣＲにてｐＵＣ１８ベクター断片を増幅した。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＲＢＣ５３８４株（以下、５３８４株と表記）の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーｓａｌ１−ｌｄｈｐｒｏ−Ｆ３（配列番号６０）及びｌｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号６１）を用いてｌｄｈプロモーター断片を、プライマーｌｄｈｐｒｏ−ｅｘｏ１−Ｆ２（配列番号６２）及びｅｘｏ１−ｐｄｃｔｅｒ−Ｒ２（配列番号６３）を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片（配列番号６９）を、ならびにプライマーｐｄｃＴｅｒ−Ｆ（配列番号６４）及びｐｄｃＴｅｒ−ｓａｌ１−Ｒ（配列番号６５）を用いてｐｄｃターミネーター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記４断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を作製した。
【０１１４】
（５）パーティクルガンによる遺伝子導入
上記（３）で作製したプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈ及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ａｄｈをそれぞれ制限酵素ＳｃａＩで、ならびに上記（４）で作製したプラスミドｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を制限酵素Ｐｓｔ１で処理し、濃度が１：１：１になるよう混合してＤＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）を調製した。該ＤＮＡ溶液１０μＬを金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、ＩＮＢＩＯ  ＧＯＬＤ社、粒子径１μｍ）１００μＬに加え混合した。さらに０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。２．５ＭのＣａＣｌ2を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。
【０１１５】
上記（１）で取得した０２Ｔ６株の胞子に対し、上記のＤＮＡ−金粒子溶液を用い、ＧＤＳ−８０（ネッパジーン）にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）上で、３０℃にて１週間ほど静置培養した。
【０１１６】
（６）ａｄｈ遺伝子欠損株の選択
上記（５）で培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ３に調製したトリプトファン添加無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、０．００２％トリプトファン、１５ｇ／Ｌ寒天）で培養した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーａｄｈ−ｕｐ（配列番号６６）とａｄｈ−ｄｏｗｎ（配列番号６７）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。０２Ｔ６株と比較して増幅バンド長がシフトした菌株を、ａｄｈ１遺伝子欠失株０２Ｔ６Δａｄｈ株として取得した。
【０１１７】
本実施例で用いたＰＣＲプライマーを表１に示す。
【０１１８】
【表１】
2017121184.tif 000002
【０１１９】
実施例２  変異リゾプス属菌におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性の評価
実施例１で取得した０２Ｔ６株及び０２Ｔ６Δａｄｈ株を培養し、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を測定した。
【０１２０】
（１）菌体の培養
５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコ（旭硝子製）に、２００ｍＬのシード培地（組成：１％Ｄｉｆｃｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソン）、０．１％酵母エキスＢ２（オリエンタル酵母工業）、０．１％グルタミン酸ナトリウム、０．００２％トリプトファン、０．０２８％オレイン酸、０．５％ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０、花王製）、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を供し、０２Ｔ６株又は０２Ｔ６Δａｄｈ株の胞子懸濁液を１×１０3個−胞子／ｍＬ−培地となるように接種し、２７℃にて約７２時間、１７０ｒｐｍで撹拌培養した。次いで、上記の培養物を、滅菌処理した網目２５０μｍの金網を用いて濾過し、菌体をフィルター上に回収した。回収した菌体を５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、０．００２％トリプトファン、０．０２８％オレイン酸、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に６．０〜８．０ｇを接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて撹拌培養した。上記培養物を、滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて培養物を濾過し、フィルター上に菌体を回収し、このフィルターホルダー上で約５０ｍＬの生理食塩水にて菌体を２回洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。得られた菌体５ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液４０ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、０．００２％トリプトファン、０．０２８％オレイン酸、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し３５℃、１７０ｒｐｍにて８時間、振盪培養を行った。
【０１２１】
（２）アルコールデヒドロゲナーゼ活性の評価
上記（１）で得られた培養物から、滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて菌体を濾過し、フィルター上に菌体を回収した。さらに、このフィルターホルダー上で約５０ｍＬの生理食塩水にて菌体を２回洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。菌体０．３ｇを３ｍＬ破砕チューブ（安井器械社製）に回収し、３ｍＬ用メタルコーン（安井器械社製）を入れ、蓋を閉めた後、液体窒素で凍結した。凍結した３ｍＬ破砕チューブをマルチビーズショッカー（安井器械社製）に供し、１７００ｒｐｍで１０秒間菌体を破砕した。その後、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＵＬＴＲＡ  Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，ＥＡＳＹ  ｐａｃｋ（ロシュ社）を添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて懸濁後、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を菌体破砕液とした。菌体破砕液のタンパク質濃度は、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて測定した。
【０１２２】
菌体破砕液のＡＤＨ活性は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１６４：１３０５−１３２２を参考に、以下の手順で行った。１５０μＬの反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液１００μＬと７００μＭ  ＮＡＤ+溶液５０μＬの混合液）に、適宜希釈した各菌体破砕液を１０μＬ添加し、３５℃で５分インキュベートした。次いで、予め３５℃に保温した４１０ｍＭエタノール溶液を４０μＬ添加して、酵素反応を開始した。ＡＤＨ活性１Ｕは、３５℃で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量として定義した。
【０１２３】
結果を表２に示す。親株である０２Ｔ６株と比較して、０２Ｔ６Δａｄｈ株では、ＡＤＨ活性が約６％に減少していた。
【０１２４】
【表２】
2017121184.tif 000003
【０１２５】
実施例３  変異リゾプス属菌における有機酸生産性評価
実施例２（１）と同様の手順で０２Ｔ６株及び０２Ｔ６Δａｄｈ株を培養した。但し、培養期間は２日間とした。培養開始０、４、８、１０、２４及び３２時間後に、培養液上清のサンプリングを行い、後述の参考例１に記載の手順にて該上清中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールを定量し、次いで各物質の選択率を求めた。
【０１２６】
グルコースの完全消費が確認された時点（０２Ｔ６株は２４時間後、０２Ｔ６Δａｄｈ株は３２時間後）での各物質の選択率を表３に示す。親株である０２Ｔ６株と比較して、０２Ｔ６Δａｄｈ株では、エタノール選択率が９１％に減少し、フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸の選択率がそれぞれ１０６％、１６１％及び１０８％に向上した。
【０１２７】
【表３】
2017121184.tif 000004
【０１２８】
参考例１  培養物中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールの定量
＜分析条件＞
培養上清中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールの定量は、ＨＰＬＣ装置ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて行なった。分析カラムには、ガードカラムＩＣＳｅｐ  ＩＯＮ−３００  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｅ（４．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２０ｍｍ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を接続した有機酸分析用ポリマーカラムＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を用い、溶離液０．０１Ｎ硫酸、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃の条件にて溶出した。グルコース及びエタノールの検出には示唆屈折率検出器（ＲＩ検出器）を、フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いた。ＨＰＬＣ分析に供する培養上清試料は、予め０．８６Ｍ硫酸ナトリウム溶液で３倍希釈し、その後３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＡｃｒｏＰｒｅｐ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅｓ（０．２μｍ  ＧＨＰ膜、ポール社製）を用いて不溶物を除去した。
【０１２９】
＜選択率の算出＞
物質の選択率とは、培養物のグルコース消費量から計算される該培養物から理論上得ることが可能な該物質の最大当量（理論最大量）に対する、該培養物から実際に得られた該物質の当量の比率をいう。すなわち、選択率は以下の式で求められる。
選択率  ＝  生成物当量／理論最大量
（ここで、理論最大量＝グルコース消費当量 ×〔補正係数〕）
測定対象物質の理論最大量及び補正係数は以下のとおりである：
〔理論最大量〕                       〔補正係数〕
エタノール：グルコース１ｍｏｌから最大２ｍｏｌ    １／２
フマル酸  ：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ    ２／３
リンゴ酸  ：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ    ２／３
コハク酸  ：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ    ２／３
【配列表】
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