(57)【要約】      （修正有）【課題】クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の製造方法、及び該製造方法により製造されたクロストリジウムセルロボランスの形質転換体の提供。【解決手段】クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質を選択し、該抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドを作製する。該プラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を経ることにより、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウム  セルロボランスに導入する工程を含む、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法。
【請求項２】
クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質が、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールから選ばれるいずれか一種以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子がクロストリジウム属由来である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子が配列表配列番号１に示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって製造されるクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体。
【請求項６】
クロストリジウム  セルロボランスの形質転換用であるクロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロストリジウム  セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）の形質転換体、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属）にはクロストリジウム  アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）やクロストリジウム  ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）のように、ブタノール、アセトン、エタノール等のソルベントを生産するブタノール生産性クロストリジウム属が存在する。また、クロストリジウム  セルロボランスやクロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のように、セルロソームと呼ばれる超タンパク質複合体を形成し、リグノセルロースを分解することのできるセルロソーム生産性クロストリジウム属も存在する。
【０００３】
クロストリジウム  セルロボランスは稲わらなどのソフトバイオマスを直接分解することができる微生物であり、近年、ゲノム解析やバイオマス分解に関与する糖質分解酵素の諸性質の解析が行われてきた（特許文献１、非特許文献１、２、参照）。
クロストリジウム  セルロボランスの主な代謝産物はギ酸、酢酸、酪酸、乳酸等の有機酸であり、既存の技術において、乳酸からポリ乳酸等の石油系プラスチックに近い特性を持つ化成品の原料を作製することが可能である。
また、クロストリジウム  セルロボランスは再生可能なセルロース系バイオマスから直接乳酸を生産できるが、生産量が少なく遺伝子改変による生産量増大が期待されている。
【０００４】
近年、次世代型の遺伝子改変方法として脚光を浴びているゲノム編集は、細胞種や生物種を問わず、ゲノム情報を自在に書き換えることのできる技術として急速に広がっている。中でも、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いた第３世代のゲノム編集ツールであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）の開発により、ゲノム編集の敷居は格段に低くなった（非特許文献３、参照）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は元来真正細菌や古細菌が有する外来ＤＮＡの排除機構であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部をゲノム編集に応用したものである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子編集の研究はＨｕｍａｎ細胞やマウス細胞にはじまり、コオロギや小型魚類に至るまで、幅広く報告されている（非特許文献４、５、参照）。元来排除機構として持っている細菌類についても、近年いくつかの細菌についてはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの利用が報告されている。
【０００５】
目的遺伝子の遺伝子改変を行うためには宿主となる菌に遺伝子を導入する手法、すなわち形質転換法が必要である。クロストリジウム属で初めに形質転換方法を確立したのはブタノール生産菌であるクロストリジウム  アセトブチリカムであり、Ｏｕｌｔｒａｍらによってクロストリジウム  アセトブチリカムのホスト−ベクター系である大腸菌−クロストリジウム  アセトブチリカム（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のシャトルベクターが作製された（非特許文献６、参照）。
その後クロストリジウム  アセトブチリカムにセルロース分解能力を付与させるために、クロストリジウム  セルロボランス由来のエンドβ−１，４−Ｄ−グルカナーゼの発現をさせることがＫｉｍらによって行われた（非特許文献７、参照）。また、Ｍｉｎｔｏｎらのグループは、ＣｌｏｓＴｒｏｎというベクターを開発し、クロストリジウム  アセトブチリカムをはじめ、いくつかのクロストリジウム属の微生物において、形質転換が可能となった（非特許文献８、参照）。
【０００６】
同じブタノール生産菌であるクロストリジウム  ベイジェリンキではＬｏｐｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓらによってクロストリジウム  アセトブチリカムと同種のシャトルベクターを用いて、クロストリジウム  ベイジェリンキにカビ由来のセルラーゼを形質転換させることに成功している（非特許文献９、参照）。さらにＢｌａｓｃｈｅｋのグループでは、クロストリジウム  ベイジェリンキにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集を成功させている（非特許文献１０、参照）。
【０００７】
一方で、セルロソーム生産性クロストリジウム属では、クロストリジウム  サーモセラムにおいてＬｙｎｄらによってホスト−ベクター系の作製が行われ、形質転換方法が確立されている（非特許文献１１、参照）。その後、その形質転換方法を応用しＴｒｉｐａｔｈｉらによってクロストリジウム  サーモセラムの標的遺伝子の破壊が報告された（非特許文献１２、参照）。これらの経緯から、セルロソーム生産性クロストリジウム属においても形質転換方法の確立によって遺伝改変を行うことが期待できる。
【０００８】
なお、特許文献２においても、クロストリジウム  アセトブチリカム等のブタノール生産性クロストリジウム属や、クロストリジウム  サーモセラム等のセルロソーム生産性クロストリジウム属のいずれをも対象として、ＤＮＡ配列を置換する方法として、クロストリジウム菌で複製可能な複製起点と標的ＤＮＡ配列のまわりの選択された領域と相同な２つの配列に挟まれた第１のマーカー遺伝子を含んでなる置換カセット、および第２のマーカー遺伝子を含むベクターで形質転換する方法等も開示されている。
【０００９】
しかし、これらの従来の技術においてはクロストリジウム  セルロボランスを形質転換することについて報告されておらず、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換を目的とするホスト−ベクター系も確立していない。そこで、本願発明者らは、クロストリジウム  セルロボランスのホスト−ベクター系の構築と形質転換方法の確立を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１０／５３３６３号パンフレット
【特許文献２】特許第５２３３７５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｍａｒｕ，Ｙ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ａ．，Ｋａｗａｄｅ，Ｙ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．，Ｄｏｉ，Ｒ．Ｈ．，Ｕｅｄａ，Ｍ．  “Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ  ７４３Ｂ．”  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９２（３），９０１−９０２．（２０１０）
【非特許文献２】Ｔａｍａｒｕ，Ｙ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，Ｕｅｄａ，Ｍ．，Ｄｏｉ，Ｒ．Ｈ．  “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．”  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（８−９），８８９−９０３．（２０１０）
【非特許文献３】Ｌｅ，Ｃ．，Ｆ．Ａｎｎ，Ｒ．，Ｄａｖｉｄ，Ｃ．，Ｓｈｕａｉｌｉａｎｇ，Ｌ．，  ａｎｄ  Ｆｅｎｇ，Ｚ．  “Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３．（２０１３）
【非特許文献４】Ｆｕｊｉｈａｒａ，Ｙ．，  ａｎｄ  Ｉｋａｗａ，Ｍ．  “ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５４６，３１９−３３６．（２０１４）
【非特許文献５】Ａｎｓａｉ，Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｍ．  “Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｍｅｄａｋａ．”  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  ３，３６２−３７１．（２０１４）
【非特許文献６】Ｏｕｌｔｒａｍ，Ｊ．，Ｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．，Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，Ｔ−Ｊ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．  “Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５６，８３−８８．（１９９８）
【非特許文献７】Ｋｉｍ，Ａ．Ｙ．，Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｇ．Ｔ．，Ｈｏｌｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．，Ｂｌａｓｃｈｅｋ，Ｈ．Ｐ．  “Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏ−β−１，４−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｇＢ  ｇｅｎｅ．”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０，３３７−３４０．（１９９３）
【非特許文献８】Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．  “Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．”  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７８（１）  ７９−８５．（２００９）
【非特許文献９】Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｍｉｄｔ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ，Ｊ．，Ｃｌａａｓｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ，Ｈ．，  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ，Ｗ．  Ｍ．  “Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｓｈｏｗ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｉｃｈｅｎａｎ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７，５１２７−５１３３．（２００１）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ  Ｚ．Ｔ．，Ｓｅｏ，Ｓ．Ｏ．，Ｃｈｏｉ，Ｋ．，Ｌｕ，Ｔ．，Ｊｉｎ，Ｙ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｈｅｋ，Ｈ．Ｐ．  “Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００  １−５．（２０１５）
【非特許文献１１】Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．  “Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０，８８３−８９０．（２００４）
【非特許文献１２】Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．Ａ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ａｒｇｙｒｏｓ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｂ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｆ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｍ．，ＭｃＣｏｏｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｒａｉｇａｒｈｉａ，Ｖ．Ｂ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｈｏｇｓｅｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｃａｉａｚｚａ，Ｎ．Ｃ．  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｙｒＦ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｔａ  ｍｕｔａｎｔ．”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７６，６５９１−６５９９．（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体の製造方法、および該製造方法により製造されたクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、様々な抗生物質の中からクロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質を選択し、該抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドを作製した。そして、該プラスミドをクロストリジウム  セルロボランスに導入する工程を経ることにより、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（６）に示される、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法等に関する。
（１）クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウム  セルロボランスに導入する工程を含む、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法。
（２）クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質が、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールから選ばれるいずれか一種以上である上記（１）に記載の方法。
（３）クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子がクロストリジウム属由来である上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子が配列表配列番号１に示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法によって製造されるクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体。
（６）クロストリジウム  セルロボランスの形質転換用であるクロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。クロストリジウム  セルロボランスは、セルロース系バイオマスを直接糖化できることから、本発明により、クロストリジウム  セルロボランスに目的とする遺伝子を導入することによって代謝関連酵素の改変等を行うことが可能となる。これによって、バイオ燃料や化成品の原料として有用なブタノールやコハク酸などの化合物をセルロース系バイオマスから直接製造することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】クロラムフェニコール添加培地におけるクロストリジウム  セルロボランスの増殖の状態を示した図である（実施例１）。
【図２】クロストリジウム  セルロボランス用プラスミドｐＭＴＬ５００Ｃの概要を示した図である（実施例１）。
【図３】クロラムフェニコール添加培地におけるクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体のコロニーの検出を確認した図である（実施例１）。
【図４】クロストリジム  セルロボランスの形質転換体における、クロラムフェニコール耐性遺伝子の検出を確認した図である（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法」とは、クロストリジウム  セルロボランスに外来遺伝子等を導入することにより、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換を行い、その形質転換体を得る方法のことをいう。
この方法は、クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウム  セルロボランスに導入する工程を含むことを必須とする。本発明の「クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法」は、この工程とともに、例えば、目的とする遺伝子を該プラスミドに導入し、その上でこのプラスミドをクロストリジウム  セルロボランスに導入する工程等、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体の製造にあたり有用な他の方法を含むものであっても良い。
【００１８】
ここで、「クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質」とは、これらの抗生物質が存在しない成育環境と比較して、これらの抗生物質が存在する成育環境におけるクロストリジウム  セルロボランスの増殖が抑制される作用を示す抗生物質のことをいう。
このような抗生物質として、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコール等が挙げられる。これらのいずれか一種以上、または２つ以上を組み合わせて、本発明の抗生物質としても良い。
【００１９】
これらの抗生物質の耐性遺伝子は、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体の選択マーカーとして使用し得るものであれば、従来知られているいずれの塩基配列からなる耐性遺伝子であっても良いが、クロストリジウム属由来の耐性遺伝子であることが好ましい。
例えば、クロラムフェニコールの耐性遺伝子であれば、クロストリジウム  パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であって、配列表配列番号１に示されるもの等を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の「クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド」は、上述のような抗生物質の耐性遺伝子が、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換に有用な発現ベクターに組み込まれたプラスミドのことをいう。このような発現ベクターには、従来知られているいずれの発現ベクターを用いることもできるが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ-Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ用のシャトルベクターであるｐＭＴＬ５００Ｅ（非特許文献６、参照）等を用いることもできる。
【００２１】
本発明の「クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド」は、例えば、ｐＭＴＬ５００Ｅからクロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制しない抗生物質の耐性遺伝子を除き、そこにクロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を組み込むことによって作製することができる。
このようなプラスミドとして、ｐＭＴＬ５００Ｅからエリスロマイシン耐性遺伝子を除き、そこに配列表配列番号１で示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子を組み込んだｐＭＴＬ５００Ｃ等を挙げることができる。
【００２２】
本発明の「クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体」とは、本願発明のクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造する方法によって製造されるクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体のことをいう。
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００２４】
〔実施例１〕
１．クロストリジウム  セルロボランスの抗生物質耐性の検討
複数の抗生物質耐性遺伝子から、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体の製造に当たり遺伝子組換えのスクリーニングの目印として最適な選択マーカーを検討した。
【００２５】
１）試料
（１）宿主細胞
クロストリジウム  セルロボランス  ７４３Ｂ（ＡＴＣＣ  ３５２９６）を宿主細胞とした。
この宿主細胞の培養にあたり、Ｓｌｅａｔらの方法（参考文献１）を参考として、炭素源に３ｇ／Ｌのセロビオース、４ｇ／Ｌの酵母エキス、１２ｇ／ＬのＮａＣｌ、種々の微量元素をリン酸緩衝液に溶解し培地を作製した。
作製した培地を嫌気培養用の１６×１２５ｍｍの試験管に１０ｍＬ入れ、嫌気培養装置  （三紳工業株式会社）を用いて二酸化炭素を約３分間吹き込み、試験管内を二酸化炭素で置換した。その後、ブチルゴム栓とスクリューキャップを施し、１２１℃、４０分間オートクレーブし滅菌した。
クロストリジウム  セルロボランスの植菌も嫌気培養装置を用いて行った。二酸化炭素発射口から１ｍＬ容の注射器内を二酸化炭素に置換し、０．２ｍＬの二酸化炭素を満たした状態で種菌の入った試験管に注射針を刺し、二酸化炭素を試験管内に出した。その後０．２ｍＬの種菌を取り出し、作製した試験管培地に迅速に植菌し、３７℃で培養した。
参考文献１：Ｓｌｅａｔ，Ｒ．，Ｍａｈ，Ｒ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ，  Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ  ｓｐ．  Ｎｏｖ．”  Ａｐｐｌｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８，８８−９３．（１９８４）
【００２６】
（２）抗生物質
クロラムフェニコール、エリスロマイシン、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコール（全て、和光純薬工業株式会社）を抗生物質として使用した。このうち、クロラムフェニコールとエリスロマイシンは９９．５％エタノールに溶解させ、使用時まで冷凍保存した。また、スペクチノマイシンとチアンフェニコールは蒸留水に溶解させ、使用時まで冷凍保存した。
【００２７】
２）クロストリジウム  セルロボランスの培養
上記１）（２）にて調製した各抗生物質のストック溶液を使用時に解凍し、表１に示された濃度となるように嫌気チャンバー内で１０ｍＬの液体培地に加えた。その後、上記（１）にて培養したクロストリジウム  セルロボランスの培養液０．２ｍＬを植菌し、３７℃で培養を行った。
また、クロラムフェニコールについては培地中の最終濃度が１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ液体培地に加え、培養を行った。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
３）結果
抗生物質耐性下で培養を行った結果、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールを加えた液体培地では、クロストリジウム  セルロボランスは増殖できなかった。従って、これらの結果より、クロストリジウム  セルロボランスはクロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールの抗生物質耐性を保持していないことが推測された。
このうち特に、クロラムフェニコールを添加した液体培地では、図１に示したように、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬという低い濃度であってもクロストリジウム  セルロボランスは増殖できなかった（図１、クロラムフェニコールの添加量、Ａ：１μｇ／ｍＬ、Ｂ：１０μｇ／ｍＬ、Ｃ：１５μｇ／ｍＬ）。
【００３０】
２．クロストリジウム  セルロボランス用プラスミドの構築
上記１．の結果より、クロストリジウム  セルロボランスの増殖を抑制する抗生物質であるクロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールの中から、クロラムフェニコールを選択し、これをクロストリジウム  セルロボランスの形質転換体のスクリーニングのために用いることとした。
【００３１】
１）試料
（１）ｐＭＴＬ５００Ｅ
アンピシリン耐性遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ-Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ用のシャトルベクターであるｐＭＴＬ５００Ｅをクロストリジウム  セルロボランス用プラスミドのベースとして使用した。ｐＭＴＬ５００Ｅの増幅には大腸菌を用い、アンピシリンによるセレクションを行った。
【００３２】
（２）クロラムフェニコール耐性遺伝子
クロラムフェニコール耐性遺伝子は、クロストリジウム  パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれるｐＪＩＲ４１８（参考文献２、参照）からクローニングした。
クロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列を配列表配列番号１に示した。
参考文献２：Ｓｌｏａｎ，Ｊ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｔ．Ａ．，ＳｃｏｔｔＰ．Ｔ．，Ｂａｎｎａｍ，Ｔ．Ｌ．，Ｂｅｒｒｙｍａｎ，Ｄ．，  ａｎｄ  Ｒｏｏｄ  ＪＩ．  “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄ．”  Ｐｌａｓｍｉｄ．２７，２０７−２１９．（１９９２）
【００３３】
２）クロストリジウム  セルロボランス用プラスミドの構築
ｐＭＴＬ５００Ｅに含まれるエリスロマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換え、クロストリジウム  セルロボランス用プラスミドを構築した。
即ち、ｐＭＴＬ５００Ｅのエリスロマイシン耐性遺伝子以外の領域を含む線状化ベクターをＰＣＲによって作製した。この時、５’末端、３’末端にＰｍｅＩとＦｓｅＩの制限酵素サイトが付加するようにプライマーを設計し線状化ベクターを作製した。
また、ｐＪＩＲ４１８（参考文献２、参照）からＰｍｅＩおよびＦｓｅＩの制限酵素サイトが付加するようにプライマーを設計し、上流のプロモーター領域を含めクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。
これらのｐＭＴＬ５００Ｅ線状化ベクターと、クロラムフェニコール耐性遺伝子をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで制限処理し、それぞれの遺伝子をアガロースゲルで分画し、精製した。
精製したＤＮＡ断片と線状化ベクターについて、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。その後、ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５α株へ形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩静置培養した。
【００３４】
ＬＢ寒天培地に生じたコロニーに選択マーカーであるクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されているかを確認するためにコロニーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を用いてＰＣＲ産物を確認することでクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されているコロニーを選択した。そのコロニーをＬＢ液体培地で培養し、その後、プラスミドＤＮＡを抽出し、このクロストリジウム  セルロボランス用プラスミドをｐＭＴＬ５００Ｃとした（図２）。図２のＡｐＲはアンピシリン耐性遺伝子を示し、ＣｍＲはクロストリジウム  パーフリンゲンス由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を示している。
【００３５】
３．形質転換体の製造方法
上記１、２の工程を経て作製したｐＭＴＬ５００Ｃを、エレクトロポレーション法によりクロストリジウム  セルロボランス  ７４３Ｂ（ＡＴＣＣ  ３５２９６）に形質転換した。
即ち、１０ｍＬのクロストリジウム  セルロボランス  ７４３Ｂ（ＡＴＣＣ  ３５２９６）の培養液を５ｍＬ容のチューブに入れ、５分間遠心分離を行った。その後、上清を取り除き、沈殿させた菌体に対して冷えたエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭ  スクロース，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，４．４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．０）を１ｍＬ加えて菌体を懸濁し、再び５分間遠心分離を行った。再び上清を取り除き、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の含まれていない冷えたエレクトロポレーション緩衝液を０．２ｍＬ加えて懸濁させ、氷上で１０分間静置した。
【００３６】
滅菌済みの１．５ｍＬ容エッペンチューブに２０μＬの菌体懸濁液と４４０ｎｇのｐＭＴＬ５００Ｃを加え、氷上で１０分間静置した。その後、この混合液２０μＬを氷上で冷やした０．１ｃｍ滅菌済みエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に移し、混合液をキュベット底に流し入れ、キュベット外側の水滴を拭き取った。
キュベットをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に設置し、６００Ｖ，２００Ω，２５μＦの条件で形質転換を行った。形質転換後、キュベットごと氷上で１０分間静置した。その後、培地１７０μＬを加え、混合し、２ｍＬ容のクライオチューブに移し、３７℃で２時間静置培養を行った。この培養液を転倒混和させ菌体を懸濁させた後、試験管に培養液が入った状態で濁度測定し、ＯＤ５９０＝０．５に到達した時に培養した試験管を嫌気チャンバーに入れた。
【００３７】
嫌気チャンバーから培養液の入ったクライオチューブを取り出し、７ｍＬの培地に１．５％Ａｇａｒを含んだ培地を一度溶解させた。嫌気培養装置から出た二酸化炭素を培地に吹き込みながら終濃度が１５μｇ／ｍＬとなるようにクロラムフェニコールを培地に加え、その後、クライオチューブに入っている培養液を、二酸化炭素を吹き込みながら素早く植菌した。ブチル栓を施し、ロールチューブ作成器（三紳工業株式会社）でロールチューブを作製した。作製したロールチューブを３７℃で静置培養した。その結果、培養開始から４日後にコロニーを検出することができた（図３、右、丸で囲った箇所）。
【００３８】
このロールチューブに生じたコロニーに目的遺伝子が挿入されているか確認するために、コロニーダイレクトＰＣＲを行った。プライマーはクロラムフェニコールを含む領域で設計し、コロニーを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図４に示されるように、クロラムフェニコール耐性遺伝子を検出することができた。
図４のＬａｎｅＭは１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）を示し、Ｌａｎｅ１は野生株クロストリジウム  セルロボランス（ネガティブコントロール）を示し、Ｌａｎｅ２はｐＭＴＬ５００Ｃ形質転換体クロストリジウム  セルロボランスを示し、また、Ｌａｎｅ３はｐＭＴＬ５００Ｃ（ポジティブコントロール）を示す。
【００３９】
従って、この結果より、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換用であるクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列を含むプラスミドを用いることにより、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、クロストリジウム  セルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。本発明により、クロストリジウム  セルロボランスに目的とする遺伝子導入をすることにより、代謝関連酵素の改変等を行うことが可能となる。これによって、バイオ燃料や化成品の原料として有用なブタノールやコハク酸などの化合物をセルロース系バイオマスから直接製造することも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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