(57)【要約】      （修正有）【課題】認知機能向上のための運動療法において使用するための組成物の提供。【解決手段】認知機能向上のための運動療法、特には海馬神経新生のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む組成物。カロテノイドが、アスタキサンチンであることが、好ましく、アスタキサンチンがヘマトコッカス由来であることが更に好ましい、組成物。少なくとも４週間連続摂取することが好ましい、組成物。運動療法が低強度運動であることが好ましく、特に換気性作業閾以下の運動であることが望ましい、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む認知機能向上組成物。
【請求項２】
記憶機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む記憶機能向上組成物。
【請求項３】
学習機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む学習機能向上組成物。
【請求項４】
海馬神経新生のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む海馬神経新生組成物。
【請求項５】
カロテノイドが、アスタキサンチンである、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
アスタキサンチンが、ヘマトコッカス藻由来である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも４週間連続摂取するための、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
運動療法が、低強度運動療法である、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
低強度運動が、換気性作業閾値以下の運動である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
Ｉｇｆ１ｒ、Ｌｅｐ及びＣｘｃｒ４遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御による、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
医薬又は食品である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む認知機能向上組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトに対する有効性や安全性が高い上に副作用もない天然由来成分のなかでも、身体の健康維持に役立つ作用に加えて脳機能を高める効果が明らかとされているブレインフードの開発が注目を集めている。カロテノイドであるアスタキサンチンは、エビ、カニなどの甲殻類やサケに豊富に含まれている天然の赤い色素であり、強力な抗酸化効果をもたらす次世代の天然サプリメントとして期待されている。アスタキサンチンは、血液脳関門を通過して脳内へ移動する。
【０００３】
インビトロでは、アスタキサンチンが神経前駆細胞の増殖を高めることが報告されている（非特許文献１）。また、アスタキサンチンは、てんかんによる神経損傷から保護することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、アスタキサンチンが、海馬機能にもたらす効果については、知られていない。
【０００４】
これまで、脳機能への運動効果を検討した研究は、とりわけ記憶・学習を司る海馬機能
に着目したものが多い。特に、海馬の歯状回では、生涯にわたって新たな神経細胞が生ま
れており（成体海馬神経新生；adult hippocampal neurogenesis, AHN）、この新生細胞は４週間程で成熟し、既存の神経回路に組み込まれることで記憶の形成に重要な役割を果たす。成体海馬神経新生が慢性的ストレスなどにより抑制されると、うつ病や認知障害を引き起こす要因となる。
【０００５】
動物のみならずヒトにおいても、運動は海馬の体積を増やし、記憶能を向上させることが知られている (非特許文献３)。また、急性の軽い運動が、覚醒に関する前頭前野の活性を介した実行機能を高めることも知られている（非特許文献４）。
【０００６】
また、ニュートリゲノミクスの研究分野では、マイクロアレイを用いた遺伝子発現の網羅的解析が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kim J. H., Nam S.W., Kim B, W., Choi W. et al., Astaxanthin improves stem cell potency via an increase in the proliferation of neural progenitor cells. Int. J. mol. Sci. 2010, 11, 5109-5119
【非特許文献２】Lu Y., Xie T., He X. X., Mao Z. F. et al., Astaxanthin rescues neuron loss and attenuates oxidative stress induced by amygdala kindling in adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2015, 597, 49-53.
【非特許文献３】Erickson KI, Voss MW, Prakash RS, Basak C, Szabo A, Chaddock L, Kim JS, Heo S, Alves H, White SM, Wojcicki TR, Mailey E, Vieira VJ, Martin SA, Pence BD, Woods JA, McAuley E, Kramer AF. Exercise training increases size of hippocampus and improves memory. Proc Natl Acad Sci USA 108: 3017-3022, 2011.
【非特許文献４】Byun K, Hyodo K, Suwabe K, Ochi G, Sakairi Y, Kato M, Dan I, Soya. Positive effect of acute mild exercise on executive function via arousal-related prefrontal activations: an fNIRS study, Neuroimage 98: 336-345, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
認知機能向上のための運動療法、特には脳、より具体的には海馬神経新生のための運動療法において使用するためのカロテノイド、特にはアスタキサンチンの機能は、これまでよく知られていなかった。本発明の目的は、認知機能向上のための運動療法、特には脳、より具体的には海馬神経新生のための運動療法において使用するためのカロテノイド、特にはアスタキサンチンの機能を解明し、アスタキサンチンの新たな用途を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意研究の末、カロテノイド、特にはアスタキサンチンを、認知機能向上のための運動療法、特には海馬神経新生のための運動療法において使用することにより、海馬神経を新生させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下である。
【００１１】
［１］認知機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む認知機能向上組成物。
［２］記憶機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む記憶機能向上組成物。
［３］学習機能向上のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む学習機能向上組成物。
［４］海馬神経新生のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む海馬神経新生組成物。
［５］カロテノイドが、アスタキサンチンである、前記［１］〜［４］のいずれか記載の組成物。
［６］アスタキサンチンが、ヘマトコッカス藻由来である、前記［５］記載の組成物。
［７］少なくとも４週間連続摂取するための、前記［１］〜［６］のいずれか記載の組成物。
［８］運動療法が、低強度運動療法である、前記［１］〜［７］記載の組成物。
［９］低強度運動が、換気性作業閾値以下の運動である、前記［８］記載の組成物。
［１０］Ｉｇｆ１ｒ、Ｌｅｐ及びＣｘｃｒ４遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御による、前記［１］〜［９］のいずれか記載の組成物。
［１１］医薬又は食品である、前記［１］〜［１０］記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来には知られていなかった、認知機能向上のための運動療法、特には記憶・学習機能向上のための運動療法、より特には海馬神経新生のための運動療法において使用するための、カロテノイド、特にはアスタキサンチンの新たな用途が提供される。本発明による組成物は、濃度依存的に海馬神経新生を促進し、それにより認知機能、特には記憶・学習機能を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例における実験設計を示す。
【図２】実施例におけるトレッドミルによる漸増負荷運動におけるＶＯ２、ＶＣＯ２及びＲＥＲを示す。
【図３】実施例におけるＶ-slope法によるＶＴ測定を示す。
【図４】実施例におけるトレッドミルによる急性運動後の血液パラメータの応答を示す。
【図５】実施例における実験設計を示す。
【図６】実施例における低強度運動とアスタキサンチン摂取の成体海馬神経新生に及ぼす効果を示す。
【図７】実施例における低強度運動とアスタキサンチンの空間学習に及ぼす効果を示す。
【図８】実施例における低強度運動とアスタキサンチンの空間記憶に及ぼす効果を示す。
【図９】実施例における低強度運動に応答するトップ２つの遺伝子ネットワークを示す。
【図１０】実施例における低強度運動＋アスタキサンチンに応答するトップ2つの遺伝子ネットワークを示す。
【図１１】実施例におけるＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の確認を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、海馬神経新生のための運動療法において使用するための、カロテノイドを含む海馬神経新生組成物を提供する。
【００１５】
本発明における認知機能とは、内的・外的環境からの刺激を認識する一連の作業であり、知覚、判断、注意、記憶、思考、言語理解などの知的活動として総合的な能力と定義される。
【００１６】
カロテノイドは、黄色から赤のテルぺノイド類の色素であり、植物類、藻類およびバクテリア由来のものを含む。
【００１７】
本発明におけるカロテノイドとしては、アスタキサンチン、アクチニオエリスロール、ビキシン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、β−８’−アポ−カロテナール（アポカロテナール）、β−１２’−アポ−カロテナール、α−カロテン、β−カロテン、カロテン（α−及びβ−カロテン類の混合物）、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、リコピン、ビオレリトリン、ゼアキサンチン、フィトエン、フィトフルエン及びそれらのヒドロキシル基又はカルボキシル基を含有するもののエステル類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるカロテノイドは、好ましくはアスタキサンチン、リコピン、β−カロテン、γ−カロテン、フィトフルエン、フィトエン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン又はそれらの脂肪酸エステルであり、最も好ましくはアスタキサンチンである。
【００１８】
アスタキサンチンは、天然アスタキサンチン又は合成アスタキサンチンであればよい。好ましくは、アスタキサンチンは、天然アスタキサンチンであり、より好ましくは、ヘマトコッカス藻（Haematococcus）由来である。
【００１９】
天然アスタキサンチンは、例えばヘマトコッカス藻、具体的にはヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（Haematococcus capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバゲンシス（Haematococcus deroebakensis）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Haematococcus zimbabwiensis）などから抽出されるが、これらに限定されない。
【００２０】
前記ヘマトコッカス藻の培養方法は、特開平８−１０３２８８号公報に開示された様々な方法などを採用することができるが、これらに限定されず、栄養細胞から休眠細胞であるシスト細胞に形態変化していればよい。
【００２１】
前記ヘマトコッカス藻を、必要に応じて、特開平５−６８５８５号公報に開示された方法などにより細胞壁を破砕して、アセトン、エーテル、クロロホルム及びアルコール（エタノール、メタノールなど）などの有機溶剤や、超臨界状態の二酸化炭素などの抽出溶剤を加えて抽出する。
【００２２】
ヘマトコッカス藻抽出物は、主にアスタキサンチン類及びアシルグリセロールからなる。ヘマトコッカス藻抽出物におけるアスタキサンチン含量は、３重量％以上、好ましくは３〜４０重量％、より好ましくは５〜１２重量％である。
【００２３】
ヘマトコッカス藻から高含量のアスタキサンチンを得る方法としては、異種微生物の混入・繁殖がなく、その他の夾雑物の混入が少ない密閉型の培養方法が好ましく、培養液から常法に従って得ることができる。
【００２４】
本発明の組成物におけるアスタキサンチン又はアスタキサンチン原料としては、市販品、例えばＡＳＴＯＴＳ−Ｓ、ＡＳＴＯＴＳ−１０Ｏ、ＡＳＴＯＴＳ−ＥＣＳ、ＡＳＴＯＴＳ−２．０ＰＷ、ＡＳＴＯＴＳ−３．０ＭＢ（登録商標）（武田紙器株式会社、千葉県）、アスタリールオイル５０Ｆ、アスタリールオイル５Ｆ、アスタリールパウダー２０Ｆ、水溶性アスタリール液、アスタリールＷＳ液、アスタリール１０ＷＳ液（登録商標）（富士化学工業株式会社、富山県）、ＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標）（東洋酵素化学株式会社、千葉県）、Ａｓｔａｚｉｎｅ  ＴＭ（ＢＧＧ  Ｊａｐａｎ株式会社）、アスタキサンチンパウダー１．５％、２．５％、アスタキサンチンオイル５％、１０％（バイオアクティブズジャパン株式会社）、アスタキサンチン（オリザ油化株式会社）、サンアクティブＡＸ（登録商標）（太陽化学株式会社）又はヘマトコッカスＷＳ３０（ヤエガキ発酵技研）などを利用することもできる。
【００２５】
合成アスタキサンチンとしては、ＡｓｔａＳａｎａ（商標）（ＤＳＭ、スイス）、Ｌｕｃａｎｔｉｎ  Ｐｉｎｋ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ドイツ）などを利用することもできる。
【００２６】
本発明の組成物におけるアスタキサンチン含量は、アスタキサンチンフリー体に換算した重量に基づく。
【００２７】
本発明の組成物は、少なくとも４週間摂取するとよく、長期に摂取すればするほどよい。また、一日あたりの摂取は一度でもよいが、複数に別けてもよい。
【００２８】
本発明の組成物における、カロテノイド、特にはアスタキサンチンの含量は、例えば医薬品においては、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜９０重量％の量で含有させることができる。また、飲食品においては、０．００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％の量で含有させることができる。
【００２９】
一日当たりのアスタキサンチン摂取量は、成人では、アスタキサンチンフリー体換算で０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜３０ｍｇであればよい。
【００３０】
本発明の組成物は、摂取期間が長ければ長いほど、含量が高ければ高いほど、一日当たりの摂取量が多ければ多いほど、高い空間認知機能を発揮する。
【００３１】
本発明の組成物は、海馬神経新生のための運動療法において使用される。
【００３２】
本発明における海馬神経新生のための運動療法は、任意の運動療法でよいが、例えば歩行、ジョギング、マラソン、自転車、水泳、筋肉トレーニング、ストレッチ、球技、スキー、テニス、階段昇降などによる療法が挙げられ、これらに限定されない。
【００３３】
運動時は強度が高くなるにつれて活動筋の解糖系が促進され、グリコゲンやグルコース−６−リン酸（血中由来のグルコースの代謝産物）からピルビン酸や乳酸が産生される。乳酸（ＣＨ３ＣＨＯＨＣＯＯＨ）が発生すると、水素イオンが解離するが、重炭酸イオンと結合し炭酸（Ｈ２ＣＯ３）になる。これは、炭酸脱水酵素の触媒作用によりＨ２ＯとＣＯ２に解離し、汗や尿、呼気ガスを通じて体外に排出される一方、血中のＮａと結合し重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）となり中和される。その際、呼気中のＣＯ２が脳幹に作用し換気を刺激するため、酸素摂取量（ＶＯ２）の上昇に比べ、換気量及び二酸化炭素排出量（ＶＣＯ２）は著しく上昇する。こうした運動時の代謝−循環応答の結果、ＶＯ２に対してＶＣＯ２が著しく上昇する閾値が見出される。これを換気性作業閾値（ＶＴ：ventilatory threshold）（Beaver WL, Wasserman K, Whipp BJ. A New Method for Detecting Anaerobic Threshold by Gas-Exchange. J Appl Physiol 60: 2020-2027, 1986）と定義するが、個人の最大酸素摂取量の５０〜７０％程度の強度に相当することが明らかとなっている。現在の運動療法の現場では、持久力の指標としては最大酸素摂取量が用いられているが、その測定が困難な場合、換気性作業閾値がよく使われる。
【００３４】
本発明における海馬神経新生のための運動療法は、好ましくは低強度運動療法である。ＶＴはヒトの体力水準に応じた運動強度の国際的な指標として臨床において、よく用いられている。本発明における低強度運動療法とは、ＶＴ以下の強度の運動による療法をいう（Mateika JH, Duffin J. Ventilatory responses to exercise performed below and above the first ventilatory treshold. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 68: 327-335, 1994）。ＶＴは、最大努力を必要とせずに測定可能であることから、高齢者や疾患者、あるいは動物実験などに利用できる。
【００３５】
ヒトにおける前記低強度運動療法のモデルとしては、自転車エルゴメータの場合、最大酸素摂取量の３５％強度で一回４０〜５０分間の運動が挙げられる。
【００３６】
本発明の組成物は、好ましくは、Ｉｇｆ１ｒ（インスリン様成長因子１受容体）、Ｌｅｐ（レプチン）及びＣｘｃｒ４（ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフ受容体４）遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御により、海馬神経を新生させる。
【００３７】
本発明の組成物は、医薬又は食品であってよい。
【００３８】
前記医薬としては、常法により、カプセル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤、坐剤、吸入剤、経鼻剤、経皮剤などに製剤化されるとよいが、これらに限定されない。
【００３９】
前記食品としては、常法により、サプリメント、固形食品、流動食品、飲料などに製造されるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４０】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
本発明者らは、海馬機能を高めるＡＳＸの単独効果を検討し、その分子機構を推定した。さらに、低強度運動による海馬機能向上効果がＡＳＸ摂取によって増強されるかどうかを検討するため、まずマウスにおける換気性作業閾値（ＶＴ, ventilatory threshold）を基準とした低強度運動モデルを確立し、ＶＴ以下の低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮおよび海馬の空間認知機能に及ぼす影響を検討し、その分子機構を推定した。
【００４２】
Ａ．換気性作業閾値を基準とする低強度運動モデルの確立
１．目的
ＶＴを基準とする走運動モデルを確立するため、小動物用代謝チャンバートレッドミルを用い、マウスの走運動時のＶＴを測定し、ＶＴ以下の低強度の運動強度を設定することを目的とした。  
【００４３】
２．方法
２−１.  被験動物および飼育条件 
本実験は、筑波大学動物実験指針に基づき、動物実験委員会の承認を得て行われた。実験動物には、１１週齢の C57BL/6J 系雄マウス（２６〜２８ｇ、ＳＬＣ、日本）を用いた。飼育環境は室内温度２２±２℃、室内湿度６０±１０％に常時維持した。飼料には実験動物用固形飼料（MF、オリエンタル酵母工業、日本）を、飲料水には蒸留水を用い、ともに２４時間自由摂取とした。照明は、午前７時と午後７時を境とする明暗サイクルとした。マウスの体重管理のために、体重を毎日測定した。
【００４４】
２−２.  走行学習 
マウスには予備飼育後、１０日間にマウス用のチャンバートレッドミルを用いた走行学習を施行した。走行学習は１日３０分、週５回の頻度で合計７回行った。走行学習の運動速度は７回の施行中に５m/分から２５m/分まで徐々に増加させた。走行学習のプロトコルを表１に示す。
【００４５】
【表１】
2017218424.tif 000002
【００４６】
２−３.  漸増負荷走行テスト 
マウスは代謝チャンバーに投入された後、呼気ガス正常値（50 ml/kg/分以下）に安定するまで１時間安静にした(Schefer and Talan, 1996)。呼気ガスが安定した後、走行テストは分速３mから開始し、そこから３分毎に2.5 m/分ずつ漸増する運動様式でおこない、マウスがペースを維持できなくなったところで走行テストを終了した（図１）。この走運動は、疲労因憊に至るまで漸増した。 
【００４７】
漸増負荷走行中、呼気ガスを１分後ごとに測定した。測定には代謝チャンバートレッドミルおよび Oxymax 等流量システム（Coloumbus Instrument、Colombus、OH）を用いた。混合ガス（20.98%Ｏ２、0.48%ＣＯ２）でキャリブレーションをおこない、あらかじめ設定したエアー流量でチャンバー内のガスを強制的に置換した。その後、設定したエアー流量に基づき、流し込んだガスの基準値と排出されたチャンバー内のガス濃度の変動からＶＯ２（酸素摂取量）、ＶＣＯ２（二酸化炭素排出量）、呼気ガス交換比（RER=respiratory exchange ratio）を算出した。ＶＴの算出はBeaverら(1986)のV-slope法を参考にして、得られた呼気ガスデータ（ＶＯ２、ＶＣＯ２）から、運動開始時と激運動中のデータを排除したＶＯ２vs ＶＣＯ２の値を、最小自乗法により直線回帰し、交点をＶＴとした。
【００４８】
２−４.  固定負荷走運動テスト 
ＶＴを基準とする異なる運動強度の妥当性を検討するため、固定負荷走運動テストを行った。走行学習２日後に、安静群（SED、n=7）、ＶＴ以下の強度である（sub-VT、n=7）とＶＴ以上の強度である（supra-VT、n=7）の運動負荷を用いて３０分間の固定負荷走運動テストを行った。マウスはトレッドミルに１５分間安静させた後、走運動を開始し、３０分間の走運動終了直後に安静群および走運動を断頭し、採血を行った（図１）。採血した血液はヘパリン処理後にグルコース/ラクテートアナライザー（2300 Stat Plus、YSI、米国）を用いて、血中の乳酸値と血糖値を測定した。
【００４９】
２−５.  統計処理 
データはすべて各サンプルの平均値±標準誤差で示した。乳酸値と血糖値の統計処理には一元配置分散分析（One-way ANOVA）のあと、post-hoc テストとして Bonferroni’s tests法を用いた。なお、有意水準はすべて５%未満とした。
【００５０】
３.  結果 
３−１.  呼気ガスパラメーターの動態 
漸増負荷走運動時のＶＯ２、ＶＣＯ２、ＲＥＲの経時的変化を図２に示した。どの測定項目とも強度依存的に増加した。ＲＥＲは10 m/分から12.5 m/分の間で急激に増加した。   
【００５１】
３−２.  換気性作業閾値の評価 
漸増負荷運動中に得られたＶＯ２とＶＣＯ２を用いて、V-slope方法でＶＴを算出した（図３）。この個体のVTは12.5m/分であった。この V-slope 方法をもとに、各個体のＶＴおよび、その時のＲＥＲを表２に示す。
【００５２】
【表２】
2017218424.tif 000003
【００５３】
各個体の平均を算出した結果、本研究で用いた漸増負荷走行時の平均 ＶＴは12.1 m/分、その時のＲＥＲの平均値は0.82であった。ＶＴ以下の強度である。
【００５４】
３−３. ＶＴ 基準の異なる運動の妥当性 
ＶＴを基準にした一過性のＶＴ以下（７m/分）とＶＴ以上（１７m/分）で固定負荷走運動直後に血中乳酸値と血糖値を測定した（図１）。ＶＴ以上の運動群の乳酸値は、安静群とＶＴ以下の運動群に比べて、有意に増加した。さらにＶＴ以上の運動群とＶＴ以下の運動群では、安静群に比較して血糖値が有意に増加した（図４）。
【００５５】
４.  考察 
ここでは、本研究の実験動物である健康なマウスにおける低強度運動の強度を確立するために、非侵襲的に測定可能なＶＴに着目し、小動物用代謝チャンバートレッドミルを用いてＶＴを測定し、ＶＴ以下の低強度運動の妥当性を確認した。 
【００５６】
その結果、マウスのＶＴは、分速12.1±1.7mの走速度で出現し、そのＶＴ時のＲＥＲは 0.82であった（図２）。これまでに、ＶＴ時のヒトのＲＥＲは約0.85〜0.9であることから、本研究で明らかにしたマウスのＶＴは正しく測定され、信頼性は十分であったことを示している。続けて、このＶＴを基準とする運動強度の妥当性を確認するために、Soyaら(Soya H, Mukai A, Deocaris CC, Ohiwa N, Chang H, Nishijima T, Fujikawa T, Togashi K, Sai to  T. Threshold-like pattern of neuronal activation in the hypothalamus during treadmill running: establishment of a minimum running stress (MRS) rat model. Neurosci Res 58: 341-348, 2007)により報告されたようにＶＴを基準とした異なる一過性運動による血中乳酸の変化から検討した。ＶＴを基準にした一過性の低強度（７m/分）と高強度（17 m/分）を課した直後に、低強度運動では血中乳酸が増加せず、高強度運動のみで上昇が見られた（図４）。
【００５７】
したがって、マウスのＶＴを基準とした走運動モデルの妥当性が確認された。さらに、ラットにおける ＬＴを基準とした低強度運動がＡＨＮと空間認知機能向上と同様に、本研究で設定したＶＴ以下の低強度運動はＡＨＮを促進し、空間認知機能を向上させると想定された。 
【００５８】
５.  要約 
ここでは、健康なマウスを用いて、非侵襲的運動指標であるＶＴを基準とする低強度モデルを確立した。その結果以下の知見が得られた。  
１）マウスにおける ＶＴ 時の速度は 12.1m/分であり、ＶＴ以下の速度は７m/分で、ＶＴ以上の速度は 17m/分で設定した。 
２）血中乳酸値は、安静群とＶＴ以下の運動群に比べてＶＴ以上の運動群で有意な上昇が認められた。   
３）血糖値は安静群に比較してＶＴ以上の運動群とＶＴ以下の運動群で有意な上昇が認められた。  
以上のことから、マウスを用いて運動強度指標の一つであるＶＴが明らかとなり、ＶＴ以下の低強度運動モデルが確立された（７m/分）。
【００５９】
Ｂ．低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮと空間認知機能に及ぼす影響 
１.  目的
低強度運動により海馬機能向上効果が増強するかどうかを明らかにすることを目的とし、ＶＴ 以下の低強度運動（７m/分）とＡＳＸ摂取（０．５重量%）の併用がＡＨＮおよび空間認知機能に及ぼす影響を検討した。 
【００６０】
２．方法 
２−１.  被験動物および飼育条件 
前記同様とした。
【００６１】
２−２． 群分け 
本実験に用いた全てのマウスは、予備飼育終了点で体重が均等となるように分けた。プラセボ＋安静（ＣＯＮ）、プラセボ＋低強度運動（ＭＥ）、0.5%のＡＳＸ 摂取＋安静（ＡＳＸ）、低強度運動＋0.5%の ＡＳＸ 摂取（ＭＥ＋ＡＳＸ）の４群に分けた（図５）。マウスは１ケージに１匹ずつ飼育した。
【００６２】
２−３.   ＡＳＸ 混餌またはプラセボの摂取 
0.5%のＡＳＸ摂取またはプラセボ摂取を実施した。 
【００６３】
２−４.  低強度運動のトレーニング 
走運動トレーニングプロトコルを表３に示す。
【００６４】
【表３】
2017218424.tif 000004
【００６５】
低強度運動群のマウスは７m/分のトレッドミル走運動を１日３０分間課した。また、安静群のマウスは走運動トレーニングと等時間だけトレッドミル上に乗せ、一切の運動はさせないものとした（対照実験）。走運動トレーニングは、小動物用トレッドミル（KN-73、Natsume、日本）を用いた。いずれの群も１日１回、マウスにとって活動的になる暗期にトレーニングあるいは対照実験を課した。 
【００６６】
２−５.  新生細胞マーカーBrdU の投与 
BrdU（bromodeoxyuridine）はチミジンのアナログ分子として細胞周期の S 期に細胞核へ取り込まれ、細胞の分裂や増殖、その後の生存を評価するのに用いられる。そこで、走運動と0.5%のＡＳＸ摂取の開始前３日間に、すべてのマウスに対して、BrdU（100 mg/kg BW）を腹腔内投与した（図５）。なお、投与は１日１回だけ（AM8:00）実施した。 
【００６７】
２−６.  生体還流固定 
生体灌流固定を実施した。 
【００６８】
２−７.  脳組織切片の作成 
脳組織切片の作成を実施した。  
【００６９】
２−８.  海馬歯状回体積の算出 
海馬歯状回体積を算出した。
２−９.  新生細胞およびその成熟段階の評価 
免疫組織化学染色法とは抗原抗体反応を利用して組織上で目的とするＤＮＡやタンパク質を標識し、可視化する方法である。可視化には、抗原に結合する抗体にマーカーとなる酵素や蛍光物質などを標識し、そのマーカーと反応させることで抗体付着部を発色させて行われる。本実験では、増殖細胞、生存細胞および新生成熟神経細胞の評価には蛍光抗体法を用いた。 
【００７０】
[BrdU/NeuN] 
本実験では、新生細胞の評価のために BrdU を同定した。同定には、一次抗体としてラット抗 BrdU 抗体（Rat anti-BrdU、AbD Serotec）を二次抗体に CyTM3ロバ抗ラット IgG 抗体（Cy3 Donkey Anti-Rat IgG、JACKSON）を用いて赤色に蛍光標識し、可視化した。また、成熟神経細胞の同定には一次抗体にマウス抗 NeuN 抗体（Mouse Anti-Neuronal  Nuclei monoclonal antibody、Chemicon）を用い、可視化には蛍光標識した二次抗体 AMCA ロバ抗マウス IgG 抗体（AMCA Donkey Anti-Mouse IgG、JACKSON）を使用し、青色に染色した。
これにより、新生成熟細胞を BrdU+/NeuN+反応（赤色+青白色）で評価した。蛍光抗体法の手順を以下に示した。  
Ａ）一次抗体反応     
1)  PB（0.1 Mリン酸緩衝液）で洗浄する。５分間×２回 
2)  PB-T（1% Triton-X 及び 1% BSA in 0.1 Mリン酸緩衝液)で洗浄する。５分間×３回 
3)  ＤＮＡ二重鎖の切断：２M HCI に３７℃で３０分間反応させる。 
4)  PB-Tで洗浄する。１０分間×３回 
5)  非特異的結合の除去（ブロッキング）：2% NDS/PB-T（2% normal donkey serum in PB-T）に室温で３０分間反応させる。 
6)  一次抗体を２％NDS/PB-T で希釈し（希釈倍率;  抗BrdU抗体: 500倍、抗NeuN抗体: 500倍）、２時間の室温でのインキュベート後、４℃で４８時間反応させる。 
Ｂ）視覚化（蛍光法） 
7)  PB-Tで洗浄する。１０分間×３回 
8)  蛍光標識された二次抗体を２％ NDS/PB-Tで希釈し（希釈倍率; Cy3：500倍、AMCA：500倍）、４℃で ２４時間反応させる。なお、反応中は遮光した。 
9)  PB-Tで洗浄する。１０分間×２回 
10) PBで洗浄する。５分間×２回 
11) スライドグラスに貼り付け、封入する。 
【００７１】
[Ki67/NeuN] 
本実験では、細胞増殖の評価には、Ki67で同定した。同定には、一次抗体としてウサギ
抗Ki67抗体（Rabbit anti-Ki67、Abcam）を二次抗体に Alexa 555 抗ウサギ IgG 抗体（Goat Alexa 555 anti-rabbit IgG、Biotium）を用いて赤色に蛍光標識し、可視化した。また、成熟神経細胞の同定には一次抗体にマウス抗NeuN抗体（Mouse Anti-Neuronal  Nuclei monoclonal antibody、Chemicon）を用い、可視化には蛍光標識した二次抗体 AMCAロバ抗マウス IgG抗体（AMCA Donkey Anti-Mouse IgG、JACKSON）を使用し、青色に染色した。これにより、新生成熟細胞をKi67+/NeuN+反応（赤色+青白色）で評価した。蛍光抗体法の手順を以下に示した。 
Ａ）一次抗体反応     
1)  PB（0.1 Mリン酸緩衝液）で洗浄する。５分間×２回 
2)  PB-T（1% Triton-X及び1% BSA in 0.1 Mリン酸緩衝液）で洗浄する。５分間×３回 
3)  PB-Tで洗浄する。１０分間×３回 
4)  非特異的結合の除去（ブロッキング）：２％ NDS/PB-T（2% normal donkey serum in PB-T）に室温で３０分間反応させる。 
5)  一次抗体を２％NDS/PB-Tで希釈し（希釈倍率; 抗Ki67抗体: 500倍、抗NeuN抗体: 500倍）、２時間の室温でのインキュベート後、４℃で４８時間反応させる。  
Ｂ）視覚化（蛍光法） 
12) PB-Tで洗浄する。１０分間×３回 
13) 蛍光標識された二次抗体を２％NDS/PB-Tで希釈し（希釈倍率; Alexa 555：250倍、AMCA：250倍）、４℃で２４時間反応させる。なお、反応中は遮光した。 
14) PB-Tで洗浄する。１０分間×２回 
15) PBで洗浄する。５分間×２回 
16) スライドグラスに貼り付け、封入する。
【００７２】
２−１０.  細胞数の推定方法 
細胞数の推定方法を実施した。 
【００７３】
２−１１.  空間学習記憶能の評価：モリス水迷路（MWM) 
空間学習記憶能の評価を実施した。 
【００７４】
２−１２.  統計処理 
データはすべて各サンプルの平均値±標準誤差で示した。神経神経の統計処理は二元配置分散分析（Two-way ANOVA）を用い、必要に応じて Bonferroni’s post-hocを行った。なお、有意水準はすべて５%未満とした。 
【００７５】
３.  結果 
３−１.  新生細胞数の変化
低強度運動とＡＳＸ摂取が海馬の神経新生に及ぼす影響について図６に示した。細胞増殖マーカーである Ki67 陽性細胞数は、運動の主効果（F (1,26)=34.20、P<0.001）およびＡＳＸの主効果（F (1,26)=25.90、P<0.001）が認められた。さらに、Bonferroni’s post-hoc testの結果、ＣＯＮ群に比べてＭＥ群とＡＳＸ群で有意な増加が認められ（P<0.05）、ＭＥ  ＋ＡＳＸ群はＭＥ群とＡＳＸ 群に比較して有意な増加が認められた（P<0.001）。BrdU 陽性細胞数は、運動の主効果（F (1,24) =17.20、P<0.001）およびＡＳＸの主効果（F (1,24)=16.05、P<0.001）が認められた。さらに、Bonferroni’s post-hoc testの結果、ＭＥ群とＡＳＸ群はＣＯＮ群に比べて有意な増加が認められ（P<0.05）、ＭＥ＋ＡＳＸ群はＭＥ群とＡＳＸ群に比較して有意な増加が認められた（P<0.05）。BrdU/NeuN陽性細胞数は、運動の主効果（F (1,24)=19.50、P<0.001）およびＡＳＸの主効果（F (1,24)=18.39、P<0.001）が認められた。Bonferroni’s pos-hoc testの結果、ＭＥ群とＡＳＸ群はＣＯＮ群に比べて有意な増加が認められ（P<0.05）、ＭＥ群とＡＳＸ群はＣＯＮ群に比べて有意な増加が認められ（P<0.01）。一方、ＡＨＮの結果において、運動×ＡＳＸの交互作用は見られなかった。
【００７６】
３−２.  MWMの成績：空間学習逃避訓練 
場所学習逃避訓練時の逃避時間を図７に示した。遊泳時間は、Dayの主効果（F (3,33)= 109.50、P<0.0001）および Groupの主効果（F (3,33)= 5.70、P<0.01）が認められた。全ての群において学習を重ねるごとに逃避時間の有意な短縮が認められた。さらに、  post-hoc testの結果、ＣＯＮと比較して、ＭＥ群とＭＥ＋ＡＳＸ群では３日目に有意な短縮が認められた（P<0.05）。ＡＳＸ群は４日目に有意な短縮が認められた（P<0.05）。遊泳速度について群間での有意差は認められなかった（図７Ａ）。 
【００７７】
３−３. MWM の成績：プローブテスト 
各群において、プラットフォームがあった四分円内を遊泳した累積時間の総遊泳時間に対する割合を図８に示した。累積時間の割合は、運動の主効果（F (1,34)= 11.49、P<0.01）およびＡＳＸの主効果（F (1,34)= 5.55、P<0.05）が認められた。post-hoc testの結果、ＭＥ＋ＡＳＸ群（39.9%）はＡＳＸ群（30.5%）に比較して、総遊泳時間の延長が確認された（P<0.05）。さらに、Bonferroni’s multiple comparison testの結果、ＭＥ＋ＡＳＸ群における累積時間の割合がＣＯＮ群（24.8%）に比較して有意に高かった（P<0.01）。
【００７８】
４.  考察 
ここでは、低強度運動による海馬機能向上がＡＳＸ摂取によって増強されるかどうかを明らかにするために、ＶＴ以下の低強度運動と0.5%のＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮおよび空間学習記憶能に及ぼす影響を検討した。なお、ＡＨＮの評価には免疫組織化学染色法を用いて増殖細胞（Ki67+）、生存細胞（BrdU+）、新生成熟細胞（BrdU+/NeuN+）の数をカウントし、その結果はＣＯＮ群に対する変化率で示した。また、空間学習記憶能はMWMを用いて、４日間の場所学習逃避訓練により記憶の獲得能力（学習）、５日目にプローブテストで記憶の保持・想起能力を評価した。
【００７９】
ＣＯＮ群と比較して、ＭＥ群で増殖細胞数（+20.5%）、生存細胞数（+46.6%）、新生成熟細胞数（+47.8%）が有意に増加し、この時、記憶の獲得能力（学習）および記憶の保持・想起能力の成績が有意に向上することを確認した。ＬＴ以下の低強度運動を用いて先行研究(Inoue K,  Hanaoka Y, Nishijima T, Okamoto M, Chang H, Saito T, Soya H. Long-term mild exercise training enhances hippocampus-dependent memory in rats. Int J Sports Med 36: 280-285, 2015; Inoue K, Okamoto M, Shibato J, Lee MC, Matsui T, Rakwal R, Soya H. Long-term mild, rather than intense, exercise enhances adult  hippocampal neurogenesis and greatly changes the transcriptomic profile of the hippocampus. PLoS One 10: e0133089, 2015)と同様に、ＶＴ以下の低強度運動でもＡＨＮおよび海馬機能を向上させることが示されており、本研究で実施した低強度運動が妥当であったといえる。また、ＡＳＸ群で増殖細胞数（+16.9%）、生存細胞数（+44.9%）、新生成熟細胞数（+46.3%）が有意に増加し、MWMの成績が有意に向上することを確認した。よって、0.5%のＡＳＸ摂取がＡＨＮおよび海馬機能を高める再現性が確認された。
【００８０】
ＭＥ＋ＡＳＸは、ＣＯＮ群と比較して、増殖細胞数（+52.3%）、生存細胞数（+95.7%）、新生成熟細胞数（+102.9%）を有意に増加させた。さらに低強度運動とＡＳＸ摂取の併用は、それぞれの単独群（ＭＥ群、ＡＳＸ群）を合わせたものを上回る効果をもたらすことが明らかとなった。また、空間記憶能の向上効果においても、ＣＯＮ群に対する増加率は、ＭＥ群は 33.5%、ＡＳＸ群は 25.9%の増加が確認され、さらにＭＥ＋ＡＳＸ群では60.6%であり、ＡＨＮと同様の結果であった。先行研究では、抗酸化物質と豊かな行動（運動、学習）の併用は、アルツハイマー病原因の一つであるアミロイドβの減少に対して、それぞれの単独効果の合算を上回る相乗効果を示している(Pop V, Head E, Hill MA, Gillen D, Berchtold NC, Muggenburg BA, Milgram NW, Murphy MP, Cotman CW. Synergistic effects of long-term antioxidant diet and behavioral enrichment on beta-amyloid load  and non-amyloidogenic processing in aged canines. J Neurosci 30: 9831-9839, 2010.)。本研究でも、ＭＥ＋ＡＳＸ群のＡＨＮならびに記憶能向上効果はそれぞれの単独群（ＭＥ群、ＡＳＸ群）の合算を上回っていたことから、低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮおよび海馬機能を相乗的に高めることが初めて明らかとなった。   
【００８１】
５.  要約 
ここでは、ＶＴ以下の低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮおよび空間認知機能に及ぼす影響を検討したところ、以下の結果が得られた。
１）低強度運動と ＡＳＸ摂取の単独によるＡＨＮ（増殖細胞、生存細胞、新生成熟神経細胞）の促進が確認された。   
２）低強度運動によるＡＨＮ促進効果がＡＳＸ摂取との併用によって増強され、相乗的な効果をもたらした。
３）低強度運動と ＡＳＸ摂取の単独による記憶の獲得（学習）と記憶保持・想起における課題成績の向上が認められた（主効果）。
４）低強度運動による記憶保持・想起の向上はＡＳＸ摂取によって増強され、相乗的な効果をもたらした。 
以上の結果から、ＡＳＸ摂取（0.5%）は単独で海馬機能を高めるだけでなく、低強度運動による海馬機能向上効果を増強し相乗効果をもたらすことが初めて明らかとなった。
【００８２】
Ｃ．低強度運動とＡＳＸ摂取の併用による海馬機能向上の分子機構の検討
１．目的
マイクロアレイ法を用いて海馬遺伝子発現の変化を網羅的に検討した。なお、マイクロアレイで同定された全ての遺伝子発現をベースにして、最先端の機能的解析手法であるＩＰＡ解析を用いて、低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮならびに記憶能を相乗的に高める分子機構を推定することを目的とした。
【００８３】
２.  方法 
２−１.  被験動物および飼育条件 
前記同様の実験動物と飼育条件で実験を行った。 
【００８４】
２−２.  群分け 
本実験に用いた全てのマウスは、予備飼育終了時点で体重が均等になるように分けた。プラセボ＋安静（ＣＯＮ）、プラセボ＋低強度運動（ＭＥ）、低強度運動＋0.5%のＡＳＸ摂取（ＭＥ＋ＡＳＸ）の３群に分けた（各n=８）。マウスは１ケージに１匹ずつ飼育した。
【００８５】
２−３.  海馬の摘出 
４週間のトレーニングとＡＳＸ摂取から２日後に、脳の摘出を行った。採取した脳から、海馬を分画した(Hirano M, Rakwal R, Shibato J, Sawa H, Nagashima K, Ogawa Y, Yoshida Y, Iwahashi H, Niki E, Masuo Y. Proteomics- and transcriptomics-based  screening of differentially expressed proteins and genes in brain of Wig rat: a model for attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) research. J Proteome Res 7: 2471-2489, 2008)。海馬は液体窒素で即座に凍結させ、−８０℃の冷凍庫で保存した。 
【００８６】
２−４.  均質化（ホモジナイズ） 
海馬を粉砕し、2 mlの試験管に保存した。 
【００８７】
２−５.  海馬ＲＮＡの抽出 
海馬ＲＮＡ抽出を行った。 
【００８８】
２−６．ＲＮＡの濃度測定と性状確認 
抽出したＲＮＡの濃度とクオリティーを確認した。 
【００８９】
２−７.  海馬遺伝子発現の網羅的解析：マイクロアレイ 
本実験では、ＲＮＡ解析に SurePrint G3 mouse８×６０K whole genome DNA microarray chip（G4858A、Agilent Technologies、Palo Alto、CA、米国）を使用した。以下に、その手順を示す。 
１）ＲＮＡの混和：各個体の海馬サンプルから抽出したＲＮＡ（n=8、250 ng/1 個体）を群ごとに混和した。
２）ＲＮＡの標識：各サンプルから抽出したＲＮＡをAgilent Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（Agilent Technologies）を用いてCy3とCy5の色素で標識する（Two-color labeling）。 
３）ハイブリダイゼーション：蛍光標識した対照群（ＣＯＮ群）と実験群（ＭＥ群、ＭＥ＋ＡＳＸ群）のサンプルを同一の Microarrayチップ上にアッセイし、スライドグラス上の６０塩基対のプローブとハイブリダイズさせる。なお、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は製造者の条件に準じた。 
４）スキャン：ハイブリダイズした MicroarrayチップをAgilent Microarray scanner  G2505Cでスキャンした。 
５）スキャンデータの加工：対照群をコントロールとし、実験群での遺伝子発現の変化を明らかにするために、Agilent Feature Extraction software を用いて、スライドイメージを加工した。なお、この時のプログラムでは全プローブのCy3およびCy5の発色強度が
測定された。 
６）データの標準化：データの標準化には LOWESS（locally weighted linear regression）を用い、Cy3とCy5シグナルから標準化された対数値および対数値のエラー率を算出した。なお、この時の有意水準は１％とした。 
７）データの取得：６）までで出てきた遺伝子のリストをGeneSpring version GX 10（Agilent）を用いて作成した。なお、遺伝子リストは、対照群をコントロールとして、両強度で遺伝子発現が1.5倍以上増強された遺伝子および0.75倍以下に抑制された遺伝子のみを抽出し、作成した。この段階で、遺伝子発現の増減およびその強さが表に示される。
【００９０】
２−８．ＩＰＡ解析 
ＩＰＡ（Ingenuity Pathways Analysis、www.ingenuity.com）は、マイクロアレイ実験より得られたデータをベースにして生物学的な機能の解釈やネットワーク解析を行うことができるソフトウェアである。ＭＥやＭＥ＋ＡＳＸで変化が見られた遺伝子発現のデータをＩＰＡに入力した。特に、今回のＩＰＡ解析は海馬の遺伝子発現に限定し、過去の論文を基に開発したIngenuity Knowledge Baseにより大量の遺伝子発現を生理機能別に分類された。また、各遺伝子間のネットワークが予測され、統計的（P<0.05、right-tailed Fisher’s exact test）に重要と思われるネットワーク順にランク付けされた。ここでは、ＩＰＡ解析により構築されたネットワークの中から、過去の論文においてＡＨＮおよび空間学習記憶に関係することが報告されている遺伝子に着目し、低強度運動とＡＳＸ摂取の併用が海馬適応を生じさせる分子機構を推定することとした。
【００９１】
２−９．RT-PCR 
マイクロアレイとＩＰＡ解析で推定した分子機構について再現性と妥当性を確認するために、遺伝子１２個をピックアップし、RT-PCR によりそれらの遺伝子発現の変化を再検討した。
【００９２】
２−１０.  統計処理 
データはすべて平均値±標準誤差で示した。RT-PCRの統計処理には一元配置分散分析（One-way ANOVA）のあと、post-hocとしてBonferroni’s tests法を用いた。なお、有意水準はすべて５%未満とした。 
【００９３】
３.  結果 
３−１. ＲＮＡの濃度測定とコンタミネーションの有無 
各個体のＯＤ比（A260:280、A260:230）と全ＲＮＡの電気泳動の結果を得た。すべての個体について、A260:280 および A260:230 のＯＤ比は基準値の 1.8 以上であった。なお、すべての個体について、18Sと28SのリボソームＲＮＡバンドが確認された。
【００９４】
３−２.  海馬遺伝子発現の変化：マイクロアレイとIPA 
マイクロアレイにおける、ＣＯＮ群と比較して、1.5倍以上増強された遺伝子、または 0.75倍以下に抑制された遺伝子の数の変化を得た。マイクロアレイのチップ上に配置された遺伝子55681個のうち、ＭＥで発現が増強された遺伝子は2209個、抑制された遺伝子は564個であった。一方、ＭＥ＋ＡＳＸで増強された遺伝子は3891個、抑制された遺伝子は411個であった。海馬の遺伝子のみに焦点をあて、マイクロアレイで得られた遺伝子変化をＩＰＡに入力した結果、ＭＥでのみ発現が増強された遺伝子は123個、抑制された遺伝子は32個であった。ＭＥ＋ＡＳＸ のみで発現が増強された遺伝子は108個、抑制された遺伝子は14個であった。両群とも発現が増強された遺伝子は134個、抑制された遺伝子は3個であった。
【００９５】
３−３.  ネットワーク解析：ＩＰＡ
ＩＰＡ解析によるネットワーク解析の結果を図９（ＭＥ）と図１０（ＭＥ＋ＡＳＸ）に示した。ＭＥ群ではLep（レプチン）、Cxcr4（ケモカイン受容体４）とStat3（Signal transducer and activator of transcription 3）遺伝子の増強を示した（図９Ｂ）。ＭＥ＋ＡＳＸ群では、ＭＥ群と同様にLepとCxcr4遺伝子の増強が示されており、さらにIgf1r（インスリン様成長因子１受容体）遺伝子発現を増強することが推定された（図１０Ｂ）。 
【００９６】
３−４．RT-PCR による遺伝子発現の検討 
DNAマイクロアレイとＩＰＡネットワーク解析の結果から、注目した遺伝子についてはRT-PCRを用いてmRNA発現を確認した（図１１）。その結果、ＭＥ群およびＭＥ＋ＡＳＸ群でCxcr4、Stat3、Mapk1、Jak2のmRNA発現が有意に増加した。Psen1、Notch2、Igf1r、Igf1、Pi3k、CrebのmRNA発現はＭＥ＋ＡＳＸ群でのみ有意に増加した。
【００９７】
４.  考察 
ここでは、海馬遺伝子発現を網羅的に分析できるマイクロアレイを用いて、低強度運動とＡＳＸ効果による相乗効果の分子機構を網羅的に解析し、運動単独による効果と共通する機構と異なる機構を推定することとした。マイクロアレイ実験では、４週間の低強度運動（ＭＥ群）とそれにＡＳＸ摂取との併用（ＭＥ＋ＡＳＸ群）に伴う海馬の遺伝子発現をスクリーニングし、遺伝子ネットワーク、パスウェイや生物学的機能情報を得るために、ＩＰＡ解析を行った。 
【００９８】
まず、マイクロアレイ実験に使用する前に、各群の海馬から抽出したＲＮＡの純度と完全性（integrity）を検討した。その結果、すべてのサンプルで 18S と 28S のリボソームＲＮＡバンドが現れ、ＲＮＡの純度指標であるＯＤ比（A260:280、A260:230）はすべてのサンプルで 1.8 の以上であることを確認した。
【００９９】
これらの結果は、海馬からＲＮＡを抽出する過程で分解が起こってないことを示しており、マイクロアレイ解析に適したＲＮＡを抽出できたことを証明している。マイクロアレイ実験から、ＭＥ群で発現が増強された遺伝子は2209個、抑制された遺伝子は 564 個、ＭＥ＋ＡＳＸ群で増強された遺伝子は3891個、抑制された遺伝子は411個であることを見出した。さらに分子機構を最も正確に推定するために、過去の論文ベースから海馬特異的に発現する遺伝子に対してＩＰＡ解析を行った。その結果、ＭＥ群とＭＥ＋ＡＳＸ群で共通してCxcr4とLep遺伝子発現が増強した（図９Ｂ、図１０Ｂ）。ケモカインの受容体であるCXCR4は胚発生における歯状回の顆粒細胞の発達だけでなく(Lu M, Grove EA,  Miller RJ. Abnormal development of the hippocampal dentate gyrus in mice lacking the CXCR4 chemokine receptor. Proc Natl Acad Sci USA 99: 7090-7095, 2002)、空間記憶能力の向上に寄与することが報告されている(Kolodziej A, Schulz S, Guyon A,  Wu DF, Pfeiffer M, Odemis V, Hollt V, Stumm R. Tonic activation of CXC chemokine  receptor 4 in immature granule cells supports neurogenesis in the adult dentate gyrus. J Neurosci 28: 4488-4500, 2008)。さらにCXCR4は、PI3K-Akt経路や MAPK経路を活性化して神経の生存に働く(Chalasani SH, Baribaud F, Coughlan CM, Sunshine MJ, Lee VM, Doms RW, Littman DR, Raper JA. The chemokine stromal cell-derived factor-1 promotes the survival of embryonic retinal 2003; Floridi F, Trettel F, Di Bartolomeo S, Ciotti MT, Limatola C. Signalling pa1thways involved in the chemotactic activity of CXCL12 in cultured rat cerebellar neurons and  CHP100 neuroepithelioma cells. J Neuroimmunol 135: 38-46, 2003)。また、エネルギー消費亢進を調節するLEPの投与はＡＨＮを促進し(Garza JC, Guo M,  Zhang W, Lu XY. Leptin increases adult hippocampal neurogenesis in vivo and in vitro. J Biol Chem 283: 18238-18247, 2008)、LEPの欠損動物では記憶低下が生じることから、LEPが海馬機能の維持・向上に重要な役割を果たすことが示されている(Li XL, Aou S, Oomura Y, Hori N, Fukunaga K, Hori T. Impairment of long-term potentiation and spatial memory in leptin receptor-deficient rodents. Neuroscience 113: 607-615, 2002; Harvey J. Leptin regulation of neuronal excitability and cognitive function. Curr Opin Pharmacol 7, 643-647, 2007)。さらにLEPは、JAK/STAT3を介して細胞の生存に寄与することも明らかになっている(Guo Z, Jiang H,  Xu X, Duan W, Mattson MP. Leptin-mediated cell survival signaling in hippocampal neurons mediated by JAK STAT3 and mitochondrial stabilization. J Biol Chem 283: 1754-1763, 2008)。
【０１００】
ＭＥによるStat3遺伝子発現の増強はマイクロアレイ解析で確認されており（図９Ｂ）、RT-PCRでもＭＥ群ならびにＭＥ＋ＡＳＸ群ともにStat3とJak2 mRNA発現の増加が確認された（図１１）。以上のことから、ＭＥならびにＭＥ＋ＡＳＸがＡＨＮおよび認知機能向上効果をもたらす共通の分子機構としてCxcr4やLep遺伝子の発現とその下流因子が推定された。 
【０１０１】
興味深いことに、Igf1r遺伝子の発現は、ＭＥ＋ＡＳＸ群のみで高まることが確認され（図１０Ｂ）、RT-PCRの結果もME+ＡＳＸ群でのみIgf1r mRNAの発現が有意に増加した（図１１）。
【０１０２】
IGF1RはIGF-1、IGF-2、Insulinをリガンドとするチロシンキナーゼ型受容体である  (Lammers R, Gray A, Schlessinger J, Ullrich A. Differential signalling potential of insulin-and IGF-1-receptor cytoplasmic domains. EMBO J 8: 1369-1375, 1989)。IGF1は血液から脳内に移行し、運動によるＡＨＮの促進への関与や(Trejo  JL, Carro E, Torres-Aleman I. Circulating insulin-like growth factor I mediates exercise-induced increases in the number of new neurons in the adult hippocampus. J Neurosci 21: 1628-1634, 2001)、海馬が司る空間記憶能の向上に関わることが既に報告されている(Sonntag WE, Ramsey M, Carter CS. Growth hormone and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and their influence on cognitive aging. Ageing Res Rev 4: 195-212, 2005)。これらのことから、MEとＡＳＸの併用によるＡＨＮや空間記憶能の相乗的な向上効果は、IGF1Rを介したIGF1の下流因子が関与する可能性が示唆された。 
【０１０３】
5.  要約 
ここでは、ＡＳＸ摂取と低強度運動の併用による海馬機能向上の相乗効果に関わる分子機構を解明するために、ＤＮＡマイクロアレイを用いて海馬の遺伝子発現を網羅的に検討し、IPA によるネットワーク解析を行ったところ、以下の知見を得た。  
１）ＭＥ群（2209 個）に比べ、ＭＥ＋ＡＳＸ群（3891個）ではより多くの遺伝子に発現の増加が認められた。   
２）ＭＥ群およびＭＥ＋ＡＳＸ群はcell death and survivalという機能に関わる遺伝子ネットワークを制御しており、その共通遺伝子としてCxcr4とLep遺伝子の発現増強が推定された。 
３）ＭＥ群で遺伝子の変化は見られず、ＭＥ＋ＡＳＸ群のみで神経の成長や生存に関わる IGF1の受容体であるIgf1r遺伝子が増強していることが明らかになった。   
４）RT-PCR 分析により、ＭＥ群およびＭＥ＋ＡＳＸ群ともにCxcr4、Stat3、Mapk1、Jak2 のmRNA発現を有意に高めた。一方、Psen1、Notch2、Igf1r、Igf1、Pi3k、CrebのmRNA発現はＭＥ＋ＡＳＸ群のみで有意な増加が認められた。 
以上の結果から、低強度運動とＡＳＸ摂取の併用がＡＨＮおよび空間記憶の相乗的な向上効果をもたらす分子機構として、それぞれの単独の分子機構とは異なり、IGF1R を介した作用が推定された。
【０１０４】
Ｄ．総合討論
低強度運動とＡＳＸ摂取の併用は、それぞれの単独効果に比べて海馬が担う認知機能を支えるＡＨＮをより促進し、空間記憶能もより高まることを明らかにした。これは、ＡＳＸ摂取および低強度運動単独がもたらす効果の合算を超える相乗効果であった。さらにそれらがＡＨＮおよび空間記憶能力を相乗的に高めることを初めて明らかにした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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