(57)【要約】【課題】前記基板結合部位にて環状アルキンを有し、基板表面と共有結合を形成するようになっているため、触媒として銅を用いる必要がなく、もって例えば被固定化物質が細胞である場合、当該細胞の損傷を低減することができる物質固定化基板を提供する。【解決手段】物質固定化剤を介して被固定化物質が固定化された物質固定化基板であって、  前記物質固定化剤は、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化基板。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質固定化剤を介して被固定化物質が固定化された物質固定化基板であって、
前記物質固定化剤は、基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化基板。
【請求項２】
前記環状アルキンが、ベンゾシクロオクチニル基、ジフルオロシクロオクチニル基、ジベンゾシクロオクチニル基、アザジベンゾシクロオクチニル基、ビアリールアザシクロオクチノニル基、またはそれらの誘導体からなる群から選択される構造を含む、請求項１記載の物質固定化基板。
【請求項３】
前記光応答性部位が、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノールおよびジアリールエテンからなる群から選択される一又は二以上の構造を含む、請求項２記載の物質固定化基板。
【請求項４】
前記親水性部位が、ポリエチレンオキサイド又はポリアルキレンオキサイドを含む、請求項３記載の物質固定化基板。
【請求項５】
前記物質固定化剤が、下記化（１）〜（７）の何れか一つの構造式を有する、請求項４記載の物質固定化基板。
【化１】
2017218422.tif 000035
【化２】
2017218422.tif 000036
【化３】
2017218422.tif 000037
【化４】
2017218422.tif 000038
【化５】
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【化６】
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【化７】
2017218422.tif 000041
各式中、R1〜R8は、各々独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルコキシ基、炭素原子数1〜10のアルキル基からなる群から選択され、R9は前記被固定化物質であり、X1はCH2、C=O、C=N-OR10、C=N-NR10R11、CHOR10及びCHNHR10からなる群から選択され、X2, X3は水素、ハロゲンのいずれか一方又は両方であり、R10及びR11は、水素又は炭素原子数1〜10のアルキル基であり、jは1〜5の整数, kは2〜100の整数, lは1〜2の整数, mは1〜3の整数, nは2〜100の整数である。
【請求項６】
前記被固定化物質は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質又はその一部を含むペプチド及び糖からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項５記載の物質固定化基板。
【請求項７】
前記基板の表面には、前記基板結合部位に結合されるアジド基が修飾されている、請求項６記載の物質固定化基板。
【請求項８】
基板上に被固定化物質を固定化するための物質固定化剤であって、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化剤。
【請求項９】
基板の表面にアジド基を修飾する修飾工程と、
前記基板に対して、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位、当該基板結合部位に結合される親水性部位、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位及び被固定化物質が接着される接着部位を備える物質固定化剤を塗布する塗布工程と、
を含む、物質固定化基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、物質固定化基板及びその製造方法、物質固定化基板に用いられる物質固定化剤に関する。より詳しくは、被固定化物質の物性損傷を低減することが可能な物質固定化基板等に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質固定化基板の技術は、例えば、稀少細胞の選別や多機能性幹細胞（iPS細胞やES細胞など）の品質管理などの目的で利用されている。
この物質固定化基板を用いた技術としては、例えば、物質固定化剤として光分解性リンカーや光異性化材を用いてこれを基板表面に固定し、光刺激により被固定化物質の接着・剥離を可能とするものが知られている。
【０００３】
この種の物質固定化基板を用いた技術としては、非特許文献１に開示されたものが知られている。この非特許文献１に開示された技術では、物質固定化剤としてのアゾベンゼン骨格を含む光異性化材を基板上に固定している。具体的には、光異性化材を構成するアルキンと、基板表面に修飾されたアジド基とのクリック反応により、光異性化材を基板上に固定している。
【０００４】
また、特許文献１には、安定したトリアゾールを与える、末端アルキンを有するアジドの１，３−双極子付加環化を触媒するＣｕ（Ｉ）は、タンパク質、核酸、脂質、及び単糖を含む様々な生体分子にタグを付けるために使用されている、旨が開示されている。これと同様の技術が非特許文献２〜６にも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５０４５０７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】E. Vaselli, ChemPlusChem, 80, 1547-1555, 2015
【非特許文献２】N. J. Agard, C.R. Bertozzi et al., J. Am. Chem. Soc., 126, 15046-15047, 2004
【非特許文献３】J. M. Baskin, C.R. Bertozzi et al., PNAS, 104, 43, 16793-116797, 2007
【非特許文献４】J. A. Codelli,, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc., 130, 11486-11493, 2008
【非特許文献５】M. F. Debets, F. L. van Delft et al., Chem. Commun., 46, 97-99, 2010
【非特許文献６】J. C. Jewett, C. R. Bertozzi et al., J. Am. Chem. Soc., 132, 3688-3690, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来の物質固定化基板を用いた技術、特に非特許文献１に開示される技術では、被固定化物質を細胞とした場合、当該細胞に対して毒性を備える銅を触媒として用いているため、仮に細胞を剥離することができたとしても、剥離された細胞が損傷を受けてしまうとの課題があり、ひいては剥離回収後の培養などの二次利用することができないとの課題もあった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本技術は、物質固定化剤を介して被固定化物質が固定化された物質固定化基板であって、前記物質固定化剤は、基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化基板を提供する。
本技術に係る物質固定化基板において、前記環状アルキンが、ベンゾシクロオクチニル基、ジフルオロシクロオクチニル基、ジベンゾシクロオクチニル基、アザジベンゾシクロオクチニル基、ビアリールアザシクロオクチノニル基、またはそれらの誘導体からなる群から選択される構造を含んでいてもよい。
また、本技術に係る物質固定化基板において、前記光応答性部位が、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノールおよびジアリールエテンからなる群から選択される一又は二以上の構造を含んでいてもよい。
更に、本技術に係る物質固定化基板において、前記親水性部位が、ポリエチレンオキサイド又はポリアルキレンオキサイドを含んでいてもよい。
また、本技術に係る物質固定化基板において、前記物質固定化剤が、下記化学式１〜７の何れか一つの構造式を有してもいてもよい。ここで、各式中、R1〜R8は、各々独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルコキシ基、炭素原子数1〜10のアルキル基からなる群から選択され、R9は前記被固定化物質であり、X1はCH2、C=O、C=N-OR10、C=N-NR10R11、CHOR10及びCHNHR10からなる群から選択され、X2, X3は水素、ハロゲンのいずれか一方又は両方であり、R10及びR11は、水素又は炭素原子数1〜10のアルキル基であり、jは1〜5の整数, kは2〜100の整数, lは1〜2の整数, mは1〜3の整数, nは2〜100の整数である。
【０００９】
【化１】
2017218422.tif 000002
【００１０】
【化２】
2017218422.tif 000003
【００１１】
【化３】
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【００１２】
【化４】
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【００１３】
【化５】
2017218422.tif 000006
【００１４】
【化６】
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【００１５】
【化７】
2017218422.tif 000008
【００１６】
また、本技術に係る物質固定化基板において、前記被固定化物質は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質又はその一部を含むペプチド及び糖からなる群から選択される少なくとも一種であってもよい。
更に、本技術に係る物質固定化基板において、前記基板の表面には、前記基板結合部位に結合されるアジド基が修飾されていてもよい。
【００１７】
また、本技術は、基板上に被固定化物質を固定化するための物質固定化剤であって、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化剤をも提供する。
【００１８】
更に、本技術は、基板の表面にアジド基を修飾する修飾工程と、前記基板に対して、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位、当該基板結合部位に結合される親水性部位、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位及び被固定化物質が接着される接着部位を備える物質固定化剤を塗布する塗布工程と、を含む、物質固定化基板の製造方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本技術によれば、前記基板結合部位にて環状アルキンを有し、基板表面と共有結合を形成するようになっているため、触媒として銅を用いる必要がなく、もって例えば被固定化物質が細胞である場合、当該細胞の損傷を低減することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本技術に係る物質固定化基板の第一実施形態を模式的に示す模式図である。
【図２】図１に示す物質固定化基板が備える物質固定化剤を模式的に示す模式図である。
【図３】本技術に係る物質固定化基板の製造方法を示すフローチャートである。
【図４】本技術に係る物質固定化基板を用いた被固定化物質選別方法を示すフローチャートである。
【図５】図４に示す被固定化物質選別方法を模式的に示す模式概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．本技術に係る物質固定化基板
（１）基板
（２）物質固定化剤層
（２−１）基板結合部位
（２−２）親水性部位
（２−３）光応答性部位
（２−４）接着部位
（３）被固定化物質
２．本技術に係る物質固定化基板の製造方法
（１）修飾工程
（２）塗布工程
３．本技術に係る被固定化物質選別方法
（１）被固定化物質接着工程
（２）薬物投入工程
（３）第一光照射工程
（４）第二光照射工程
（５）送液工程
（６）回収工程
（７）第三光照射工程
【００２２】
＜１．本技術に係る物質固定化基板＞
図１及び２を用いて、本技術に係る物質固定化基板について説明する。本技術に係る物質固定化基板１は、基板２と、物質固定化剤層３と、を備える。この物質固定化基板１は、その表面に被固定化物質４が接着され、該被固定化物質４の回収をするために使用される。
尚、図１に示す物質固定化基板１は平板状の形状をなしているが、基板１の表面に物質固定化剤層３が設けられる形状であればよく、他の形状、例えば、粒子状の形状などであってもよい。
以下、基板２及び物質固定化剤層３について説明する。
【００２３】
（１）基板
基板２は、平坦な表面を有し、且つ光を透過する材料が好ましく、例えばガラス板、石英板又は各種プラスチック板等の材料を用いることができる。光を透過する材料を用いることにより、基板２を介して光を照射又は接着された被固定化物質４を観察することができる。
【００２４】
また、この基板２において、前記物質固定化剤層３に接する表面は、当該物質固定化剤層３を構成する物質固定化剤が接着されるようになっている。
具体的には、シランカップリング剤等の結合部材により、当該基板２の表面にアジド基又は芳香族アジド基が修飾され、これらアジド基又は芳香族アジド基と前記物質固定化剤の末端が共有結合を形成する。このようにして接着された物質固定化剤に対して、被固定化物質４が接着されるようになっている。
このため、本技術に係る基板２においては、当該基板２に対して被固定化物質４を投入するための投入孔、及び当該被固定化物質４を回収するための回収孔を備えていてもよい。
【００２５】
（２）物質固定化剤層
一方、物質固定化剤層３は、前記基板２に固定される物質固定化剤によって構成される。この物質固定化剤３１は図２に示すように、大別して、基板結合部位３２と、親水性部位３３と、光応答性部位３４と、接着部位３５と、を備える。各部位について以下に説明する。
【００２６】
（２−１）基板結合部位
基板結合部位３２は、基板２と物質固定化剤３１とを結合させるための部位である。この基板結合部位３２としては、前記接着部位３５に含まれる被固定化物質接着性末端による被固定化物質４の接着を阻害しないように、被固定化物質４との接着性が低い基を含むことが好ましい。一方、基板２との結合部分として、前記基板２の表面に修飾されたアジド基又は芳香族アジド基とクリック反応により結合されやすい、環状アルキンを含むことが好ましい。
更に、環状アルキンが、ベンゾシクロオクチニル基、ジフルオロシクロオクチニル基、ジベンゾシクロオクチニル基、アザジベンゾシクロオクチニル基、ビアリールアザシクロオクチノニル基、またはそれらの誘導体からなる群から選択される構造を備えていることがさらに好ましい。
このような、少なくとも環状アルキンを含む基板結合部位３２としては、例えば、下記化学式８〜１８に示されるものが挙げられる。尚、下記化学式８〜１８に示される構造式は一例に過ぎない。
【００２７】
【化８】
2017218422.tif 000009
【００２８】
【化９】
2017218422.tif 000010
【００２９】
【化１０】
2017218422.tif 000011
【００３０】
【化１１】
2017218422.tif 000012
【００３１】
【化１２】
2017218422.tif 000013
【００３２】
【化１３】
2017218422.tif 000014
【００３３】
【化１４】
2017218422.tif 000015
【００３４】
【化１５】
2017218422.tif 000016
【００３５】
【化１６】
2017218422.tif 000017
【００３６】
【化１７】
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【００３７】
【化１８】
2017218422.tif 000019
【００３８】
（２−２）親水性部位
次に、前記物質固定化剤３１に含まれる親水性部位３３について、説明する。
親水性部位３３は、前記基板結合部位３２に結合される。この親水性部位３３としては特に限定されないものの、例えば、ポリエチレンオキサイド又は他のポリアルキレンオキサイドを含むことが好ましい。
【００３９】
（２−３）光応答性部位
本技術に係る物質固定化剤は、光照射により異性化する光応答性部位３４を含む。
この光応答性部位３４は、前記親水性部位３３に結合される一方、光照射により構造変化する作用を有する基（以下、「光応答性基」という）を含む。
すなわち、光照射により、光応答性部位３４が構造変化（異性化）することで、基板２から被固定化物質４を回収することができる。
【００４０】
前記光応答性基としては特に限定されないものの、例えば、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノールおよびジアリールエテン、又はこれらの誘導体などが挙げられ、これらから一又は二以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、光異性化の反応速度が比較的早い、アゾベンゼンを含むことが好ましい。
また、光応答性部位３４が光応答性基を二以上含む場合、光応答性基を直列に連なるように配置することができる。かかる場合、光照射により、光異性化が少なくとも二以上の箇所で生じる結果、前記被固定化物質４が基板２から解離されやすくなる。
【００４１】
（２−４）接着部位
本技術に係る物質固定化剤は、前記光応答性部位３４に結合される接着部位３５を含む。この接着部位３５は、一端が前記光応答性部位３４に結合される一方、末端が被固定化物質接着性末端として形成され、前記被固定化物質４に結合される。前記被固定化物質接着性末端に対して被固定化物質４を選択的に接着させるために、前記被固定化物質接着性末端が被固定化物質４との接着性が高い基で形成され、それ以外の部分は被固定化物質４との接着性が低い基で形成されていることが好ましい。
前記被固定化物質接着性末端を形成するための基としては特に限定されず、例えば、アミノ基やカルボキシルキなどのイオン性の官能基や、オレイル基などのアルケニル基、ＧＲＧＤＳ配列（Gly-Arg-Asp-Ser）ペプチド、タンパク質等が挙げられる。
【００４２】
以上のような基板結合部位３２と、親水性部位３３と、光応答性部位３４と、接着部位３５と、を備える物質固定化剤３１としては、以下の化学式１９〜２５に示されるものが考えられる。
ここで、各式中、R1〜R8は、各々独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルコキシ基、炭素原子数1〜10のアルキル基からなる群から選択され、R9は前記被固定化物質であり、X1はCH2、C=O、C=N-OR10、C=N-NR10R11、CHOR10及びCHNHR10からなる群から選択され、X2, X3は水素、ハロゲンのいずれか一方又は両方であり、R10及びR11は、水素又は炭素原子数1〜10のアルキル基であり、jは1〜5の整数, kは2〜100の整数, lは1〜2の整数, mは1〜3の整数, nは2〜100の整数である。
【００４３】
【化１９】
2017218422.tif 000020
【００４４】
【化２０】
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【００４５】
【化２１】
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【００４６】
【化２２】
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【００４７】
【化２３】
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【００４８】
【化２４】
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【００４９】
【化２５】
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【００５０】
特に、前記物質固定化剤３１としては、下記化学式２６で示されるものが好ましい。
【００５１】
【化２６】
2017218422.tif 000027
【００５２】
（３）被固定化物質
本技術に係る物質固定化基板１には、被固定化物質４が接着される。
この被固定化物質４としては特に限定されないものの、例えば、細胞、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質又はその一部を含むペプチド及び糖などが挙げられる。これら細胞、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質又はその一部を含むペプチド及び糖に、本技術の物質固定化基板を適用することにより、これらの被固定化物質４の回収及び選別作業を効率的に行うことができる。
【００５３】
以上の本技術に係る物質固定化基板１では、基板結合部位３２は少なくとも環状アルキンを含むことから、触媒として銅を用いずに基板２と物質固定化剤層３を結合させることができる。このため、例えば、被固定化物質４が細胞である場合には、当該細胞の損傷を低減することができ、もって細胞の増殖能を維持することができる。また、触媒として銅を必要としないことから、回収された細胞の増殖能をも維持することができる。
更に、前記アゾベンゼンは、紫外光が照射されるとトランス体からシス体へと構造が変化する一方、可視光が照射されるとシス体からトランス体へと戻る、可逆的変化を起こす。このため、前記光応答性部位３４に含まれる光応答性基がアゾベンゼンである場合、本技術に係る物質固定化基板１は、紫外領域の光と可視領域の光を交互に繰り返し照射することにより、被固定化物質４の剥離・回収を繰り返し行うことができ、もって物質固定化基板１の使用コストを抑えることができる。
【００５４】
＜２．本技術に係る物質固定化基板の製造方法＞
次に、図３を用いて、本技術に係る物質固定化基板の製造方法について説明する。
この製造方法は、少なくとも、修飾工程Ｓ１と、塗布工程Ｓ２と、を含む。各工程について、以下に説明する。
【００５５】
（１）修飾工程
この修飾工程Ｓ１では、前記物質固定化剤３１が接着される基板２の表面に対して、アジド基又は芳香族アジド基（以下、「アジド基等」という）を修飾する。
アジド基等を修飾する方法としては限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、シランカップリング剤を用いる方法が挙げられる。以下、修飾方法の一例について操作手順に沿って説明する。尚、以下の説明では、基板２がガラス板である場合の修飾工程について説明する。
すなわち、ガラス板である基板２をアセトンに投入し、超音波処理によりその表面を洗浄する。その後、アセトン内から基板２を取り出し、乾燥させる。
その後、基板２に対して酸素プラズマ処理を行った後、シランカップリング剤である、４v/v%の(3-ブロモプロピル)トリメトキシシラン  （3-(bromopropyl) trimethoxysilane）／トルエンと一晩反応させる。
その後、基板２をトルエン、エタノール、アセトンで洗浄後、真空乾燥させる。そして、50 mM アジ化ナトリウム/ジメチルホルムアミド中で基板２を一晩振盪させる。
その後に、基板２をジメチルホルムアミド、エタノール、アセトンで洗浄後、真空乾燥させる。これらの工程により、基板２の表面に対して、アジド基が修飾される。
【００５６】
（２）塗布工程
本技術に係る製造方法では、修飾工程Ｓ１により、基板２の表面がアジド化された後、当該基板２に対して前記物質固定化剤３１を塗布する、塗布工程Ｓ２が行われる。
この塗布工程Ｓ２における、物質固定化剤３１の塗布方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
ここで、物質固定化剤３１の基板結合部位３２に環状アルキンが含まれる場合、クリック反応により、前記基板２の表面に修飾されたアジド基又は芳香族アジド基と、環状アルキンとが共有結合を形成する。その結果、物質固定化剤３１が基板２の表面に接着される。
【００５７】
＜３．本技術に係る被固定化物質選別方法＞
次に、本技術に係る物質固定化基板１を用いた細胞選別方法について説明する。
この細胞選別方法は、被固定化物質接着工程Ｓ１１と、薬物投入工程Ｓ１２と、第一光照射工程Ｓ１３と、第二光照射工程Ｓ１４、送液工程Ｓ１５と、回収工程Ｓ１６と、を含み、必要に応じて、第三光照射工程Ｓ１７を含んでいてもよい。各工程について、以下に説明する。
尚、以下の説明では、被固定化物質４が細胞である場合の説明を行うが、本技術に係る選別方法は、被固定化物質４が細胞以外のものであっても適用することができる。
【００５８】
（１）被固定化物質接着工程
本技術に係る被固定化物質選別方法では先ず、被固定化物質接着工程Ｓ１１が行われる。
この被固定化物質接着工程Ｓ１１では、基板２に対して細胞４を注入し、当該細胞４と基板２とを接着させる。例えば、遠心分離やインキュベート等の処理を行い、細胞４を基板２に接着させる。
【００５９】
（２）薬物投入工程
被固定化物質接着工程Ｓ１１が行われた後、基板２に特定の薬物を投入する薬物投入工程Ｓ１２が行われる。
この薬物投入工程Ｓ１２では、基板２に対し、回収目的外の細胞４に有害な薬品を投入する。この薬物の種類としては特に限定されず、細胞４の種類に応じて公知の物質を一又は二以上を組み合わせて用いることができる。例えば、被固定化物質４がヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞である場合には、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤であるイマニチブ（商品名：グリベック）を用いることができる。
この薬物投入工程Ｓ１２により、例えば、回収目的外の細胞４ｂ（図５中黒い丸で示す細胞）を死滅させ、回収目的の細胞４ａ（図５中白い丸で示す細胞）に関しては死滅させず、前記回収工程Ｓ１６にて回収することができる。
【００６０】
（３）第一光照射工程
薬物投入工程Ｓ１２が行われた後、当該薬物投入工程Ｓ１２により死滅した細胞４ｂに対して光を照射する第一光照射工程Ｓ１３を行う。
この第一光照射工程Ｓ１３では、前記物質固定化剤３１に含まれる光応答性部位の光応答性基の種類に応じた、当該光応答性基の光異性化を誘発する波長帯の光を、目的外細胞４ｂに対して照射する。
例えば、前記光応答性基がアゾベンゼンの構造を含む場合、当該アゾベンゼンは、紫外領域の光を強く吸収するため、照射する光の波長は、１０〜４００ｎｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは、３４０〜３８０ｎｍの範囲である。
【００６１】
この第一光照射工程Ｓ１３において、光照射の露光強度は、前記光応答性部位３４における光異性化を誘発し、且つ、細胞４に対して損傷を与えない範囲であればよく、例えば、光の波長が３６５ｎｍである場合には、１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２の範囲であることが好ましい。
また、光の照射時間に関しても、前記光応答性部位３４における光異性化を誘発し、且つ、細胞４に対して損傷を与えない範囲であればよく、例えば、１０秒〜３０分である。
更に、第一光照射工程Ｓ１３における光の照射方向は特に限定されず、光応答性部位３４に含まれる光応答性基の種類に応じて、適宜変更することできる。すなわち、前記光応答性基がアゾベンゼンである場合には、
【００６２】
この第一光照射工程Ｓ１３により、目的外細胞４に接着された物質固定化剤３１の光応答性部位３４が光異性化するため、目的外細胞４と接着部位３５との結合が切断される。その結果、目的外細胞４が基板２から剥離される。
ここで、前記光応答性基がアゾベンゼンである場合には、紫外領域の光を照射することにより、当該アゾベンゼンがトランス体から不安定なシス体へと異性化する。その結果、目的外細胞４と接着部位３５との結合が切断される。
【００６３】
この第一光照射工程Ｓ１３において、目的外細胞４ｂに対して光を照射する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることはできる。
例えば、光照射を行う光源と基板２との間に液晶シャッタを設け、当該液晶シャッタに電圧をかけて光の透過率を制御することにより、光の照射位置を選択的に制御する方法などが挙げられる。
【００６４】
（４）第二光照射工程Ｓ１４
本技術に係る選別方法では、第一光照射工程Ｓ１３が行われた後、第二光照射工程Ｓ１４が行われる。
この第二光照射工程Ｓ１４では、前記物質固定化剤３１に含まれる光応答性部位の光応答性基の種類に応じた、当該光応答性基の光異性化を誘発する波長帯の光を、目的細胞４ａのみが接着された基板２に対して照射する。
第一光照射工程Ｓ１３と同様、例えば、前記光応答性基がアゾベンゼンの構造を含む場合、当該アゾベンゼンは、紫外領域の光を強く吸収するため、照射する光の波長は、１０〜４００ｎｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは、３４０〜３８０ｎｍの範囲である。
【００６５】
また、この第二光照射工程Ｓ１４における、光照射の露光強度は、第一光照射工程Ｓ１３と同様、前記光応答性部位３４における光異性化を誘発し、且つ、目的細胞４ａに対して損傷を与えない範囲であればよく、例えば、光の波長が３６５ｎｍである場合には、１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２の範囲であることが好ましい。また、光の照射時間に関しても、前記光応答性部位３４における光異性化を誘発し、且つ、目的細胞４ａに対して損傷を与えない範囲であればよく、例えば、１０秒〜３０分が好ましい。
【００６６】
この第二光照射工程Ｓ１４により、目的細胞４ａに接着された物質固定化剤３１の光応答性部位３４が光異性化するため、目的細胞４ａと接着部位３５との結合が切断される。その結果、目的細胞４ａが基板２から剥離される。
【００６７】
（５）送液工程
本技術に係る選別方法では、第二光照射工程Ｓ１４が行われた後、送液工程Ｓ１５が行われる。
具体的には、基板２に対して緩衝液を流し込み、第二光照射工程Ｓ１４により基板２から剥離された目的細胞４ａを当該緩衝液中に流出させて流出画分を得る。
この送液工程Ｓ１５において、緩衝液等の流体を送液する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば、ペリスタルティック・ドージングポンプなどの既知の送液ポンプを用いて前記流体を基板２内に送液する方法などが挙げられる。
【００６８】
（６）回収工程
本技術に係る選別方法では、送液工程Ｓ１５を行った後、回収工程Ｓ１６を行う。
この回収工程Ｓ１６では、送液工程Ｓ１５により流出された前記流出画分を回収画分として回収する。この回収方法としては特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００６９】
（７）第三光照射工程
本技術に係る選別方法では、前記光応答性部位３４がアゾベンゼンの構造を含む場合、第三光照射工程Ｓ１７を含んでいることが好ましい。
すなわち、前述の如く、アゾベンゼンは、紫外光が照射されるとトランス体からシス体へと構造が変化する一方、可視光が照射されるとシス体からトランス体へと戻る、可逆的変化を起こす。
このため、前記第一光照射工程Ｓ１３及び第二光照射工程Ｓ１４において、アゾベンゼンがシス体へと構造変化している場合には、第三光照射工程Ｓ１７により可視光を照射することにより、アゾベンゼンをトランス体へと可逆的に構造変化させる。
【００７０】
この第三光照射工程Ｓ１７における照射する光の波長は４００ｎｍ以上であることが好ましく、より好ましくは、４００〜５００ｎｍの範囲である。また、第三光照射工程Ｓ１７における光照射の露光強度は、例えば、光の波長が４４０ｎｍである場合には、１〜２００ｍＷ／ｃｍ２の範囲であることが好ましい。更に、光の照射時間に関しては、例えば、５〜１８００秒が好ましい。
尚、図４に示すフローチャートでは、第三光照射工程Ｓ１７が回収工程Ｓ１６の後に行われるように示されているが、第二光照射工程Ｓ１４により目的細胞４が剥離した状態であれば、例えば、送液工程Ｓ１５の前に行われても差し支えない。
また、アゾベンゼンは、熱により異性化することも知られている。このため、第三光照射工程の替わりに、本技術に係る物質固定化基板１を加熱してアゾベンゼンの構造変化を実現する工程を設けてもよい。但し、アゾベンゼンにおいて、光異性化の反応速度は熱異性化の反応速度よりも速いため、被固定化物質選別方法の迅速化を達成するためには、アゾベンゼンに対して光を照射する工程の方が好ましい。
【００７１】
以上の本技術に係る被固定化物質選別方法によれば、物質固定化基板１における基板接合部位３２が少なくとも環状アルキンを含むことから、触媒として銅を用いずに基板２と物質固定化剤層３を結合させることができる。このため、例えば、被固定化物質４が細胞である場合には、当該細胞の損傷を低減することができ、もって細胞の増殖能を維持することができる。また、触媒として銅を必要としないことから、回収された細胞の増殖能をも維持することができる。
更に、前記光応答性部位３４に含まれる光応答性基がアゾベンゼンである場合、被固定化物質４の剥離・回収を繰り返し行うことができ、もって使用コストを抑えることができる。
【００７２】
尚、図４に示す本技術に係る被固定化物質選別方法では、薬物投入工程Ｓ１２により、目的外の被固定化物質４の排除し、目的の被固定化物質４の選別を行っている。
しかし、目的の被固定化物質４の選別方法は薬物投入による方法に限定されず、例えば、送液工程Ｓ１５と別に、基板２に対して緩衝液などの流体を流し込んで、被固定化物質接着工程Ｓ１１にて基板２に接着されなかった被固定化物質を基板２外部へと流出された後、基板２上の被固定化物質４を観察し、特定の被固定化物質４に対して第一光照射工程Ｓ１３を行うなどの方法も考えられる。
【００７３】
なお、本技術に係る物質固定化基板は、以下のような構成も取ることができる。
（１）
物質固定化剤を介して被固定化物質が固定化された物質固定化基板であって、
前記物質固定化剤は、前記基板の表面と共有結合を形成すると共に少なくとも環状アルキンを有する基板結合部位と、当該基板結合部位に結合される親水性部位と、当該親水性部位に結合されると共に光照射により骨格変化する光応答性部位と、前記被固定化物質が接着される接着部位と、を備える、物質固定化基板。
（２）
前記環状アルキンが、ベンゾシクロオクチニル基、ジフルオロシクロオクチニル基、ジベンゾシクロオクチニル基、アザジベンゾシクロオクチニル基、ビアリールアザシクロオクチノニル基、またはそれらの誘導体からなる群から選択される構造を含む、（１）記載の物質固定化基板。
（３）
前記光応答性部位が、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノールおよびジアリールエテンからなる群から選択される一又は二以上の構造を含む、（１）または（２）記載の物質固定化基板。
（４）
前記親水性部位が、ポリエチレンオキサイド又はポリアルキレンオキサイドを含む、（１）〜（３）のいずれか一つに記載の物質固定化基板。
（５）
前記物質固定化剤が、下記化学式２７〜３３の何れか一つの構造式を有する、（１）〜（４）のいずれか一つに記載の物質固定化基板。
【００７４】
【化２７】
2017218422.tif 000028
【００７５】
【化２８】
2017218422.tif 000029
【００７６】
【化２９】
2017218422.tif 000030
【００７７】
【化３０】
2017218422.tif 000031
【００７８】
【化３１】
2017218422.tif 000032
【００７９】
【化３２】
2017218422.tif 000033
【００８０】
【化３３】
2017218422.tif 000034
各式中、R1〜R8は、各々独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルコキシ基、炭素原子数1〜10のアルキル基からなる群から選択され、R9は前記被固定化物質であり、X1はCH2、C=O、C=N-OR10、C=N-NR10R11、CHOR10及びCHNHR10からなる群から選択され、X2, X3は水素、ハロゲンのいずれか一方又は両方であり、R10及びR11は、水素又は炭素原子数1〜10のアルキル基であり、jは1〜5の整数, kは2〜100の整数, lは1〜2の整数, mは1〜3の整数, nは2〜100の整数である。
（６）
前記被固定化物質は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質又はその一部を含むペプチド及び糖からなる群から選択される少なくとも一種である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載の物質固定化基板。
（７）
前記基板の表面には、前記基板結合部位に結合されるアジド基が修飾されている、（１）〜（６）のいずれか一つに記載の物質固定化基板。
【符号の説明】
【００８１】
１  物質固定化基板
２  基板
４  被固定化物質
３１  物質固定化剤
３２  基板結合部位
３３  親水性部位
３４  光応答性部位
３５  接着部位
【図１】
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【図２】
2017218422.tif 000043
【図３】
2017218422.tif 000044
【図４】
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【図５】
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