(57)【要約】【課題】本発明は、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断するための手法を提供することを目的とする。【解決手段】腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法。
【請求項２】
腫瘍患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品の感受性を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍患者由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいてリツキシマブに対する該患者の感受性の有無を予測する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ２０陽性である微小胞がエキソソームである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
解析の結果において、基準値と比べてＣＤ２０の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、請求項４又は５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
解析の結果において、基準値と比べてＣＤ５９の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
解析の結果において、基準値と比べてＣＤ８１の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
解析の結果において、基準値と比べてＰＤ−Ｌ１の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
発現量の解析をフローサイトメトリー法によって行う、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する該患者の感受性の有無を予測する方法において使用するためのキットであって、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーのそれぞれに対する抗体を含む、上記キット。
【請求項１２】
さらに、ＣＤ２０陽性である微小胞を捕捉するための、固相担体に結合された抗ＣＤ２０抗体を含む、請求項１１に記載のキット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより薬物感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０はプレＢ細胞から成熟Ｂ細胞に至るＢ細胞において発現される３３〜３７ｋＤａの分子量を有する膜貫通型タンパク質であり、正常細胞だけでなく、大部分のＢ細胞性リンパ腫においても発現が認められる。
【０００３】
今日、Ｂ細胞性リンパ腫の治療においては、このＣＤ２０を標的とする抗ＣＤ２０抗体医薬品が用いられている。中でもリツキシマブ（リツキサン（登録商標））は第一選択薬となっており、広く世界中において利用されている。
【０００４】
一方で、抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療に対して抵抗性を有する患者が報告されており、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も確認されている。リツキシマブに対する抵抗性のメカニズムは全て解明されてはいないものの、腫瘍細胞からのＣＤ２０抗原の消失や、補体不活性化因子（例えば、ＣＤ５５、ＣＤ５９等）の発現による補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の低下等による要因が挙げられる（非特許文献１、２）。リツキシマブは、免疫組織染色法又はフローサイトメトリー法等によりＣＤ２０抗原の検査を行い、陽性であることが確認されている患者のみに投与するとされているが（非特許文献３）、ＣＤ２０が陽性であることが確認された患者であっても、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も認められる。
【０００５】
このため、当該分野においては、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｉｌａｎｉ  Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｎｏｖ  １５；１０２（１０）：３５１４−２０．
【非特許文献２】Ｇｏｌａｙ  Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００１  Ｄｅｃ  １；９８（１２）：３３８３−９．
【非特許文献３】医薬品インタビューフォーム「抗ＣＤ２０モノクローナル抗体  リツキサン（登録商標）注１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  リツキシマブ（遺伝子組換え）製剤」、２０１５年５月改訂（第１６版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を指標にして、当該腫瘍に罹患する患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法。
［２］  腫瘍患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品の感受性を予測する、［１］の方法。
［３］  抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである、［１］又は［２］の方法。
［４］  腫瘍患者由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいてリツキシマブに対する該患者の感受性の有無を予測する工程を含む、［３］の方法。
［５］  ＣＤ２０陽性である微小胞がエキソソームである、［４］の方法。
［６］  解析の結果において、基準値と比べてＣＤ２０の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］又は［５］のいずれかの方法。
［７］  解析の結果において、基準値と比べてＣＤ５９の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  解析の結果において、基準値と比べてＣＤ８１の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［７］のいずれかの方法。
［９］  解析の結果において、基準値と比べてＰＤ−Ｌ１の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］  発現量の解析をフローサイトメトリー法によって行う、［４］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］  患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する該患者の感受性の有無を予測する方法において使用するためのキットであって、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーのそれぞれに対する抗体を含む、上記キット。
［１２］  さらに、ＣＤ２０陽性である微小胞を捕捉するための、固相担体に結合された抗ＣＤ２０抗体を含む、［１１］のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することを可能とする新たな手法を提供することができる。
【００１１】
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者を選別することができる。これにより、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さない患者に対して、当該医薬品による治療を用いることを回避して、別の治療を適用することができ、患者の時間的及び経済的な負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞（図１中、「Ｓ」と記載）及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞（図１中、「Ｒ」と記載）に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおける、ＣＤ２０（Ａ）、ＣＤ５９（Ｂ）、ＣＤ８１（Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１（Ｄ）の発現量をフローサイトメーターを用いて比較解析した結果を示す。Ｃｏｎｔ．：陰性対照。
【図２】図２は患者Ｎｏ．２３に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおける、ＣＤ２０（Ａ）、ＣＤ５９（Ｂ）、ＣＤ８１（Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１（Ｄ）の発現量をフローサイトメーターを用いて比較解析した結果を示す。Ｃｏｎｔ．：陰性対照。
【図３】図３は患者Ｎｏ．３０に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおける、ＣＤ２０（Ａ）、ＣＤ５９（Ｂ）、ＣＤ８１（Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１（Ｄ）の発現量をフローサイトメーターを用いて比較解析した結果を示す。Ｃｏｎｔ．：陰性対照。
【図４】図４は健常者血清における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の各タンパク質マーカーについての測定値とパーセンタイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測する方法
本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法に関する。
【００１４】
より詳細には、本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を解析し、次いで、得られた当該解析の結果に基づいて、当該腫瘍に罹患する患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することを含む、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する当該患者の感受性又は抵抗性の予測方法に関する。
【００１５】
（タンパク質マーカー発現量の解析）
本発明において「腫瘍」とは、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部位の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、輪卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくは抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療対象となる腫瘍が挙げられ、例えば、リンパ腫（ＣＤ２０陽性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ増殖性疾患等）、ヴェゲナ肉芽腫症等が挙げられる。
【００１６】
本発明において「患者」とは、上記腫瘍の患者が挙げられるが、好ましくは抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療対象となるヒト患者、より好ましくはリツキシマブ投与による治療対象となるヒト患者が挙げられる。
【００１７】
本発明において「微小胞」とは、腫瘍細胞より放出される微粒子、エクトソーム、アルゴソーム、エキソソーム、腫瘍小胞等の膜小胞体を意味する。微小胞は腫瘍細胞にて発現されるｍｉＲＮＡやタンパク質を含む。特に、腫瘍細胞の膜表面上に発現するタンパク質と微小胞の膜表面上に発現するタンパク質とは相関関係を有し、微小胞の膜表面上に発現するタンパク質の発現プロファイルを得ることによって、腫瘍細胞のプロファイルを得ることができる。好ましくは「微小胞」は、ＣＤ２０陽性である微小胞である。
【００１８】
本発明において、微小胞は患者における腫瘍細胞又は体液由来のものを利用することができる。
【００１９】
「患者における腫瘍細胞」としては、上記腫瘍由来の細胞を利用することができる。
【００２０】
また、患者の「体液」としては、腫瘍由来の微小胞を含み得る体液であればよく、このような体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、血液、血清、又は血漿であり、より好ましくは血清である。
【００２１】
本発明においては、採取された腫瘍細胞又は体液をそのまま微小胞を含む試料として利用してもよいし、あるいは採取された腫瘍細胞又は体液より精製もしくは粗精製された形態の微小胞を試料として利用してもよい。
【００２２】
腫瘍細胞又は体液からの微小胞の精製もしくは粗精製は、微小胞の精製もしくは粗精製に一般的に用いられる手法により行うことができ、細胞を破砕して得られた破砕液又は体液中に含まれる微小胞を、例えば、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過カラム、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）、フィルター法、ポリマーによる沈殿法、抗体やレクチンによる吸着法等の一又は複数を組み合わせた手法により行うことができる。
【００２３】
特に、ＣＤ２０陽性の微小胞の精製もしくは粗精製には抗ＣＤ２０抗体を「捕捉手段」として用いた吸着法を含む手法を利用することができる。抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０陽性の微小胞を高効率に、捕捉、精製又は分離するために用いることができる。すなわち、ＣＤ２０陽性の微小胞を含む試料と抗ＣＤ２０抗体とを接触させて、試料中のＣＤ２０陽性の微小胞を抗ＣＤ２０抗体で捕捉し、当該試料から分離することにより、ＣＤ２０陽性の微小胞をより精製された形態で得ることができる。
【００２４】
本発明において「捕捉手段」として利用可能な抗ＣＤ２０抗体は、微小胞上に発現するＣＤ２０と結合可能なものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、ＣＤ２０の特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。抗ＣＤ２０抗体には、微小胞上に発現するＣＤ２０と結合することが可能な抗体断片も含まれる、本発明において利用可能な「抗体断片」には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｃｂ、Ｆｄ等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００２５】
本発明において抗ＣＤ２０抗体は、後述する手法によって製造されたものを用いても良いし、あるいは市販のものを用いても良い。
【００２６】
抗ＣＤ２０抗体は、固相担体に結合されていてもよい。固相担体には、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等（これらに限定はされない）の材質、ならびにこれらの組み合わせからなるものを利用することができる。固相担体の形状は特に限定されることなく、ビーズ、プレート、球、スティック等の形状とすることができ、好ましくは、ビーズである。ビーズの大きさは特に限定されないが、例えば、直径７．０から８．０μｍ程度、例えば７．５μｍ程度の大きさのものを利用することができる。具体的には、ラテックスビーズ、磁性体ビーズ等が挙げられる。固相担体への抗ＣＤ２０抗体の結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。
【００２７】
本発明において「タンパク質マーカー」とは、微小胞の膜表面にて発現するタンパク質を意味し、このようなタンパク質にはＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１等が挙げられ、これらより選択される一又は複数のタンパク質を「タンパク質マーカー」として利用することができる。なお、ここで「複数」とは、２、３、又は４つの組み合わせを意味する。このような組み合わせには、ＣＤ２０及びＣＤ５９；ＣＤ２０及びＣＤ８１；ＣＤ２０及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ５９及びＣＤ８１；ＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ２０、ＣＤ５９及びＣＤ８１；ＣＤ２０、ＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１；；ＣＤ２０、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ならびにＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１、が含まれる。
【００２８】
微小胞における各タンパク質マーカーの発現量の定量は、タンパク質の定量解析において一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、各タンパク質マーカーに結合可能な抗体を「標識抗体」として利用する免疫学的手法を用いた定量解析方法により行うことができる。
【００２９】
「標識抗体」として利用する、各タンパク質マーカーに対する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、各タンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。各タンパク質マーカーの抗体には、微小胞上に発現する各タンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。このような抗体断片には、上述したものが挙げられる。
【００３０】
各タンパク質マーカーに対する抗体の製造は、抗体製造において一般的に用いられる手法（Ｋｅｎｎｅｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）に基づいて行うことができる。
【００３１】
すなわち、各タンパク質マーカーについて、免疫原（抗原）となるタンパク質又はポリペプチド（以下、「抗原ペプチド」と記載する）を調製する。ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースにその遺伝子配列情報及びアミノ酸配列情報等が開示されている。例えば、ヒトＣＤ２０はＣＢＧ７６６９５．１やＸ１２５３０．１に、ヒトＣＤ５９はＣＡＧ４６５２３．１やＡＨ００３３５２．１に、ヒトＣＤ８１はＥＡＸ０２５０８．１やＢＣ０９３０４７．１に、ヒトＰＤ−Ｌ１はＱ９ＮＺＱ７．１やＢＣ０６９３８１．１に、それぞれ登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。抗原ペプチドのアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列情報に基づいて決定することができ、予測される二次構造、表面への露出のしやすさ、柔軟性、抗原性、溶媒との接触率、親水性、極性等の要素を考慮して、さらに他のタンパク質との配列同一性がないかまたは低い領域から、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなる領域を選択することができる。抗原ペプチドは、公知のペプチド合成手法（例えば固相ペプチド合成法等）を利用して合成されたものを用いてもよい。あるいは、抗原ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターにより形質転換された微生物より産生された抗原ペプチドを精製して用いてもよい。
【００３２】
ポリクローナル抗体は、抗原ペプチドを用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等の動物を免疫感作し、一定期間経過後血清を採取し、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原ペプチドなどを固相化したカラムなどを用いて、各タンパク質に結合する抗体を精製することにより得ることができる。
【００３３】
モノクローナル抗体は、上記と同様に動物を免疫感作して一定期間経過した後、例えば脾臓細胞を採取し、当該脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたハイブリドーマをスクリーニングし、各タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマから抗体を採取・精製することにより得ることができる。
【００３４】
各タンパク質マーカーに対する抗体は上述のとおり製造されたものだけでなく、市販の抗体も使用することができる。
【００３５】
「標識抗体」として利用される抗体は、検出可能な標識化合物により標識されていてもよい。このような標識化合物としては、例えば蛍光色素（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリオジニンクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性物質、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３６】
なお、本発明において、ＣＤ２０陽性の微小胞を捕捉するための「捕捉手段」として利用される抗ＣＤ２０抗体と、当該微小胞におけるＣＤ２０の発現量を定量解析するための「標識抗体」として利用される抗ＣＤ２０抗体とは、ＣＤ２０に対する互いの結合が干渉しないように両者の結合部位（エピトープ）は異なるものであることが好ましい。また、本発明において、当該「捕捉手段」として利用される抗ＣＤ２０抗体と、当該「標識抗体」として利用される抗ＣＤ２０抗体とは、両者を区別して検出できるように、異なる動物種から産生されたものを利用することができる。
【００３７】
免疫学的手法を用いたタンパク質マーカーの定量解析方法としては、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、ナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標）)等を利用する方法が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくは迅速かつ簡便であり、また定量性に優れたフローサイトメトリー法やナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標）)を利用することができる。
【００３８】
本発明の一例においては、固相担体であるビーズに結合された「捕捉抗体」である抗ＣＤ２０抗体を、ＣＤ２０陽性の微小胞を含む試料と接触させ、また、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体である「標識抗体」を接触させ、これにより捕捉抗体−ＣＤ２０陽性の微小胞−標識抗体からなるサンドイッチ複合体を形成する。次いで、当該複合体における標識抗体をフローサイトメーターを用いて検出・定量することによって、ＣＤ２０陽性の微小胞にて発現するＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を定量することができる。標識抗体の検出は、標識抗体に付された標識化合物を当該化合物の検出に適した方法で検出することによって行ってもよいし、あるいは標識抗体に結合することが可能な二次抗体を上述した標識化合物で標識し、当該二次抗体を用いて標識抗体を検出してもよい。「二次抗体」としては、標識抗体を産生した動物種の免疫グロブリンに対する、別の動物種によって産生された抗体を利用することができる。
【００３９】
（判定基準）
上述の手法により、定量解析されたＣＤ２０陽性の微小胞における、タンパク質マーカーの発現量の値を、「基準値」と比較することによって、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができる。
【００４０】
本発明において「抗ＣＤ２０抗体医薬品」としては、リツキシマブ、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１等が挙げられるが、好ましくはリツキシマブである。
【００４１】
本発明の一例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。
【００４２】
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有することが公知である、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＬ細胞、Ｕ２９３２細胞、Ｇｒａｎｔａ細胞、ＨＢＬ−２細胞、Ｊｅｋｏ−１細胞、Ｍｉｎｏ細胞、Ｒｅｃ１細胞、Ｚ−１３８細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有することが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められた患者等が挙げられる。
【００４３】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ）ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉ）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉｉ）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；ならびに、
（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
【００４４】
ここで「低下している」とは、基準値の発現量未満又は以下であること、例えば、基準値の発現量に対して、例えば、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又はそれ以下に発現量が低下していることを意味する。また、「増加している」とは、基準値の発現量を超える又は以上であること、例えば、基準値の発現量に対して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、５００％以上、又はそれ以上に発現量が増大していることを意味する。なお、本明細書において「低下している」と「低い」なる用語は、相互互換的に用いることができる。また、本明細書において「増加している」と「高い」なる用語は、相互互換的に用いることができる。
【００４５】
あるいは、本発明の別の例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。
【００４６】
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるＲＣ−Ｋ８細胞、Ｒａｊｉ−２Ｒ細胞、Ｒａｊｉ ４ＲＨ細胞、ＲＬ−４ＲＨ細胞、Ｕ２９３２−４ＲＨ細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＲＣ−Ｋ８細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められなかった患者等が挙げられる。
【００４７】
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ’）ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、増加している場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉ’）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉｉ’）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；ならびに、
（ｉｖ’）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する。
【００４８】
ここで「低下している」及び「増加している」とは、上述したとおりである。
あるいは、本発明の別の一例において、「基準値」とは、対照となる健常者又は患者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、ＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。あるいは、基準値は各タンパク質マーカーの発現量の測定値の分布における、１０パーセンタイル、又は５パーセンタイルに対応する値、あるいは９０パーセンタイル、又は９５パーセンタイルに対応する値とすることができる。
【００４９】
例えば、基準値として以下のものを用いることができる：
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ２０の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０（１０パーセンタイルに対応する値）、又は３．６０（５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ５９の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、５．１１（９０パーセンタイルに対応する値）、又は５．２５（９５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ８１の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．０４（１０パーセンタイルに対応する値）、又は３．０２（５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０（９０パーセンタイルに対応する値）、又は３．７３（９５パーセンタイルに対応する値）とすることができる。
【００５０】
この場合、抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ）ＣＤ２０の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０未満、好ましくは３．６０以下である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉ）ＣＤ５９の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、５．１１を超える、好ましくは５．２５以上である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉｉ）ＣＤ８１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．０４未満、好ましくは３．０２以下である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；ならびに、
（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０を超える、好ましくは３．７３以上である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
【００５１】
なお、上記基準値はいずれも毎回測定する必要はなく、一旦、基準値が得られれば、以降は当該基準値に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性、又は抵抗性の有無の予測・判断に用いることができる。
【００５２】
また、いずれの例においてもＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質の発現量は、平均値又は中央値とすることができる。
【００５３】
（患者の選別・治療の最適化）
本発明は、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができることから、本発明方法を利用することにより、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有する患者、又は抵抗性を有する患者を選別することができる。
【００５４】
本発明により、リツキシマブに対して感受性を有さない、またはリツキシマブに対して抵抗性を有すると予測・判断された患者の治療には、リツキシマブに代えて、別の抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１）を当該患者に投与して治療することができる。
【００５５】
２．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測するためのキット
本発明はまた、上述の方法において使用するためのキットに関する。本キットには、上述の標識手段としての抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体より選択される一又は複数の抗体を含めることができる。本キットにはまた、上述の捕捉手段としての抗ＣＤ２０抗体、好ましくは固相担体に結合されている抗ＣＤ２０抗体を含めることができる。本キットにはさらに、患者由来の細胞又は体液由来の微小胞を抽出するのに適当な緩衝液、非特異的な抗体結合を阻害するためのブロッキング試薬等を含めることができる。
【００５６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：細胞からのエキソソームの抽出
細胞はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞を用いた。細胞をそれぞれ細胞培養用フラスコにて培養し、回収の前日に無血清培地に培地交換し、一晩培養した。次いで、細胞１×１０７個をそれぞれ回収し、遠心分離を行い（２０℃、１，０００ｇ、５分間）、上清を回収した。
【００５８】
回収した上清に対して、その半分量のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で一晩静置した後、遠心分離を行い（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去してペレットを回収した。得られたペレットを、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、ペレットを溶解した。次いで、このペレット溶解液を遠心分離し（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去して再びペレットを回収した。
【００５９】
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、各細胞由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。
【００６０】
実施例２：抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製
抗ＣＤ２０抗体がビーズに固定化されてなる抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｅａｄ  Ａ４ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ.５５８５７８）とＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅａｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ.５５８５５６）を製造元の指示書に従い使用して作製した。すなわち、直径７．５μｍのラテックスビーズ（ベクトン・ディッキンソン）７５μＬに１Ｍ  ＤＴＴ（１．９μＬ）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加して混合した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）を添加して、ビーズを再浮遊させビーズ懸濁液を調製した。
【００６１】
ＰＢＳに抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍｇ／ｍＬの量にて加え、そこに２μＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＤＩ  Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、未反応のＳＭＣＣをスピンカラムを用いて除去し、抗ＣＤ２０抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を調製した。
【００６２】
ビーズ懸濁液に、抗ＣＤ２０抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液の全量を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、２μＬ  ＮＥＭ（ＤＭＳＯ中にＮ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１５間、インキュベーションした。Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＬ）を添加して、抗ＣＤ２０抗体が結合したビーズ（抗ＣＤ２０抗体ビーズ）を再浮遊させ、抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液を調製した。得られた抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液は使用するまで４℃にて保管した。
【００６３】
実施例３：エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製
実施例１で調製した各エキソソーム懸濁液（２５μＬ）をマイクロチューブに分取し、そこに実施例３で調製した抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液（１μＬ）をそれぞれ加えて、プレートミキサーを使い８００ｒｐｍにて攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【００６４】
次いで、１０ｍＭ  ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、エキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させた。
【００６５】
インキュベート後、１００ｍＭグリシン（１ｍＬ）及び、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【００６６】
インキュベート後、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、再び遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、ビーズのブロッキングを行った。
【００６７】
次いで、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ピペッティングして沈降したビーズをリンスした後、再び、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨てた後、１００μＬ  ＰＢＳを添加して沈降したビーズを懸濁し、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。
【００６８】
実施例４：エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの標識
エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液に、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された以下のいずれかの抗体の溶液（２０μＬ）を添加して、ローテーターを使い攪拌しながら、４℃にて３０分間、インキュベートした。
【００６９】
抗体：
抗ＣＤ２０抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ５９抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ５９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ８１抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ８１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＰＤ−１抗体：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２７４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
陰性対照には、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
【００７０】
インキュベーション後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、上清を捨てた後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。
【００７１】
実施例５：フローサイト測定
（方法）
フローサイトメトリーを使用して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体をそれぞれ検出・定量した。
【００７２】
測定条件は、Ｌａｓｅｒ：４８８ｎｍ（Ｂｌｕｅ Ｌａｓｅｒ） ５０ｍＷ ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅで励起し、検出器（ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、５３３±１５ｎｍまたは、５８５±２０ｎｍで検出した。５３３±１５ｎｍはＦＩＴＣ検出用フィルターとして、５８５±２０ｎｍはＰＥ検出用フィルターとして用いた。
【００７３】
（結果）
リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞のそれぞれ由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図１に示す。
【００７４】
ＣＤ２０の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて高いことが確認された（図１（Ａ））。
【００７５】
ＣＤ５９の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて低いことが確認された（図１（Ｂ））。
【００７６】
ＣＤ８１の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて高いことが確認された（図１（Ｃ））。
【００７７】
ＰＤ−Ｌ１の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞において発現は認められず、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞においては発現が確認された（図１（Ｄ））。
【００７８】
なお、上記タンパク質に加えて、ＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ５５及びＣＤ４６の発現量を測定したが、これらタンパク質の発現量はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞及びＲＣ−Ｋ８細胞において違いは認められなかった。
【００７９】
これらの結果より、リツキシマブに対する感受性の有無によって、ＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量には違いがあり、これらタンパク質の発現量を指標にして、リツキシマブに対する感受性の有無を判定できることが明らかになった。
【００８０】
実施例６：血清からのエキソソームの抽出
リンパ腫患者（Ｎｏ．２３及びＮｏ．３０）から採取した血液を遠心分離（２０℃、２，０００ｇで３０分間）して血清を採取した。
【００８１】
得られた血清２，０００μＬに対して、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００μＬを添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で３０分静置した後、遠心分離を行い（室温、１０，０００ｇ、１０分間）、上清を除去してペレットを回収した。
【００８２】
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、血清由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。
【００８３】
次いで、上記実施例３に記載した手法と同様にして、各エキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させ、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。得られたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を、上記実施例４に記載した手法と同様にして、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体及び抗ＰＤ−１抗体とそれぞれ反応させ、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。
【００８４】
得られた各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体における各タンパク質マーカーついて、上記実施例５に記載した手法と同様にして、フローサイトメトリーを使用してそれぞれ検出・定量した。
【００８５】
（結果）
患者ＮＯ．２３に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図２に示す。また、患者ＮＯ．３０に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図３に示す。
【００８６】
ＣＤ２０の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差は認められなかった（図２（Ａ）及び図３（Ａ））。
【００８７】
ＣＤ５９の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差が認められ、患者ＮＯ．３０における発現量が、患者ＮＯ．２３における発現量と比べて高いことが確認された（図２（Ｂ）及び図３（Ｂ））。
【００８８】
ＣＤ８１の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差は認められなかった（図２（Ｃ）及び図３（Ｃ））。
【００８９】
ＰＤ−Ｌ１の発現量に関し、患者ＮＯ．３０における発現量が、患者ＮＯ．２３における発現量と比べて高いことが確認された（図２（Ｄ）及び図３（Ｄ））。
【００９０】
患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で差異が認められたＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１の発現量を、上記ＲＣ−Ｋ８細胞及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞におけるそれらの発現量（図１）と比較すると、患者ＮＯ．３０の発現パターンはリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞における発現パターンとより近似していること、また患者ＮＯ．２３はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現パターンとより近似していることが示された。
【００９１】
以上の結果より、患者ＮＯ．３０はＲＣ−Ｋ８細胞と同様に、リツキシマブに対して感受性を有さないことが示唆され、また患者ＮＯ．２３はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞と同様に、リツキシマブに対して感受性を有することが示唆された。
【００９２】
実施例７：健常者血清からのエキソソームの抽出
健常者１９名（２５歳から７０歳）から採取した血液を遠心分離（２０℃、２，０００ｇで３０分間）して血清を採取した。
【００９３】
得られた血清１，０００μＬに対して、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００μＬを添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で３０分静置した後、遠心分離を行い（室温、１０，０００ｇ、１０分間）、上清を除去してペレットを回収した。
【００９４】
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、血清由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。
【００９５】
次いで、上記実施例３に記載した手法と同様にして、各懸濁液中のエキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させ、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。得られたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を、上記実施例４に記載した手法と同様にして、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体及び抗ＰＤ−１抗体とそれぞれ反応させ、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。
【００９６】
得られた各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体における各タンパク質マーカーついて、上記実施例５に記載した手法と同様にして、フローサイトメトリーを使用してそれぞれ検出・定量した。
【００９７】
（結果）
図４は健常者血清における各タンパク質マーカーについての測定値とパーセンタイルを示す図である。図４中、各タンパク質マーカーの測定値は点で示している。各測定値に付された箱の下端部及び上端部はそれぞれ２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示しており、そして、下端部及び上端部に付されたひげはそれぞれ５パーセンタイル及び９５パーセンタイルに配置されている。箱内の線は、中央値を示している。
【００９８】
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ２０をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ２０発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で４．０２であった。また、９５パーセンタイルが４．４７に、１０パーセンタイルが３．７０に、５パーセンタイルが３．６０にそれぞれ対応した。
【００９９】
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ５９をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ５９発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で４．２７であった。また、９０パーセンタイルが５．１１に、９５パーセンタイルが５．２５に、５パーセンタイルが３．３１にそれぞれ対応した。
【０１００】
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ８１をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ８１発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．３０であった。また、９５パーセンタイルが３．７３に、１０パーセンタイルが３．０４に、５パーセンタイルが３．０２にそれぞれ対応した。
【０１０１】
健常者血清中の微小胞に発現しているＰＤ−Ｌ１をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＰＤ−Ｌ１発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．２３であった。また、９０パーセンタイルが３．７０に、９５パーセンタイルが３．７３に、５パーセンタイルが２．９９にそれぞれ対応した。
【０１０２】
これらの結果より、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ２０の発現量が低いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を基準値として、判断することができる。
【０１０３】
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ５９の発現量が高いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で５．１１を基準値として、判断することができる。
【０１０４】
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ８１の発現量が低いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．０４を基準値として、判断することができる。
【０１０５】
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現量が高いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を基準値として、判断することができる。
【０１０６】
これら基準値を用いて、各タンパク質マーカーの発現量の高低を判定することができ、当該判定結果に基づいて、試験対象となる患者におけるリツキシマブに対する感受性の有無を判定することができる。
【０１０７】
実施例８：基準値に基づく患者のリツキシマブに対する感受性の有無の評価
上記実施例５の各タンパク質マーカー発現量の高低の結果、及び実施例７にて求めた基準値より、患者のリツキシマブに対する感受性は以下のとおり評価することができる：
・解析の結果において、ＣＤ２０の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０未満である場合、当該発現量は低いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＣＤ５９の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で５．１１を超える場合、当該発現量は高いと判断され、当該者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＣＤ８１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．０４未満である場合、当該発現量は低いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＰＤ−Ｌ１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を超える場合、当該発現量は高いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
【０１０８】
上記判定のいずれか一以上に該当する場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断することができる。
【０１０９】
上記判定に基づいて、実施例６に記載のリンパ腫患者（Ｎｏ．２３及びＮｏ．３０）を評価した。
【０１１０】
実施例６で得られた、各患者における各タンパク質マーカー発現量の測定値（中央値）を対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で以下の表１に示す。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
この結果、患者Ｎｏ．２３は上記判定のいずれにも該当しないことから、患者Ｎｏ．２３はリツキシマブに対して感受性を有することが示唆される。
【０１１３】
一方、患者Ｎｏ．３０は上記判定のうちＰＤ−Ｌ１の判定項目に該当することから、患者Ｎｏ．３０はリツキシマブに対して感受性を有さないことが示唆される。
この結果は、上記実施例６の判定結果に矛盾しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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