(57)【要約】【課題】所与の有機組成物を含有する有機混合液の微生物毒性（Blog P）を制御する方法を提供する。【解決手段】第１の有機組成物のBlog P値よりも高く、かつ標的Blog P値よりも高いBlog P値を有する第２の有機組成物を、有機混合液に含有させて、有機混合液のBlog Pを標的Blog P値に上方調節する。あるいは、第１の有機組成物のBlog P値よりも低く、かつ標的Blog P値よりも低いBlog P値を有する第２の有機組成物を、有機混合液に含有させて、有機混合液のBlog Pを標的Blog P値に下方調節する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、標的Blog P値に上方調節する方法であって、前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも高く、かつ前記標的Blog P値よりも高いlog P値またはBlog P値を有する第２の有機組成物を、前記有機混合液に含有させて、前記標的Blog P値を得ることを含む、方法。
【請求項２】
第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、標的Blog P値に下方調節する方法であって、前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも低く、かつ前記標的Blog P値よりも低いlog P値またはBlog P値を有する第２の有機組成物を、前記有機混合液に含有させて、前記標的Blog P値を得ることを含む、方法。
【請求項３】
前記標的Blog P値に相当する生育限界log P値を有する微生物を、前記有機混合液の存在下で培養して、生育可能であるか否かを確認することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
あらかじめ、前記第１の有機組成物と前記第２の有機組成物とを複数の混合比で混合して、それらの複数の混合液のBlog P値を決定することにより、検量曲線を作成することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記標的Blog P値に調節された前記有機混合液は、前記第１の有機組成物を少なくとも１０％（ｖ／ｖ）以上含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の有機組成物は、炭化水素、アルコール、精油、天然樹脂、脂質、植物油、動物油、および生体成分のうちの１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により、第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を標的Blog P値に上方調節する工程、および
前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも高く、かつ、前記標的Blog P値以下である生育限界log P値を有する微生物を、前記標的Blog P値に調節された前記有機混合液に接触させる工程
を含む、微生物の培養方法。
【請求項８】
第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値以下であり、かつ、標的Blog P値より高い生育限界log P値を有する微生物の生育を、前記第１の有機組成物の存在下で抑制する方法であって、
請求項２に記載の方法により、第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を標的Blog P値に下方調節する工程
を含む方法。
【請求項９】
６．０以下のlog P値またはBlog P値を有する有機液に生体成分を添加することにより、前記有機液を含有する有機混合液のBlog P値を上方調節する方法。
【請求項１０】
前記生体成分は、細菌細胞の溶解物に含まれる成分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体成分は、ＬＰＳ、細胞膜成分、細胞質成分、またはこれらいずれかの組合せである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機混合液の微生物毒性を制御する方法に関する。本発明は特に、液状有機組成物を利用するバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、微水系、疎水系、二相系等の、液状有機組成物が存在する環境下で微生物または酵素を培養ないし維持して反応を行わせるバイオリアクターおよびバイオセンサーの分野に関する。本発明はさらに、各種の液状有機組成物を活用するコスメチック分野、医薬品分野、食品分野、石油化学分野等にも関する。本発明はさらに、汚染浄化や廃棄物処理などを行う環境分野にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物および酵素は、産業的に有用な様々な機能を提供することができ、これまでに、発酵による各種製品（酒類、アミノ酸、核酸、有機酸など）の製造、物質変換による化成品製造、環境浄化など、幅広い分野に応用されてきた。しかしながら、微生物機能の産業的利用は十分に開発され尽くされているとは言いがたく、いまだに無限ともいえる発展の可能性を秘めている。特に、微生物機能の利用のさらなる拡大という観点からは、非水系、すなわち有機溶媒等の液状有機組成物が関与する微水系、疎水系、二相系等における培養・反応が非常に大きな潜在的利用価値を有していると考えられる。
【０００３】
例えば、特定の有機化合物が関与したり、特定の有機溶媒の存在が必要とされたりする化学反応を行う際に、微生物由来の生物学的活性を介在させることが考えられる。また、有機組成物による環境汚染（例えば産業廃棄物による埋め立てや工場からの産業廃液、または事故による原油流出など）の浄化あるいは防止において微生物の分解能力を利用することが考えられる。
【０００４】
しかしながら、液状有機組成物の多くは、微生物に対する毒性すなわち微生物毒性を有する。例えば、トルエンなどの有機溶媒は、尿検査のための尿試料の保存において雑菌汚染防止のために添加されるように、きわめて低濃度（０．１％（ｖ／ｖ）以下）で微生物を死滅させることが知られている。
【０００５】
このことはすなわち、微水系や二相系などのバイオリアクター等で微生物や酵素を利用しようとしても、通常は、液状有機組成物への接触によって微生物の生育や生存が抑制されたり、タンパク質変性が起こって酵素活性が失われたりすることを意味する。
【０００６】
従って、有機溶媒の存在下で微生物や酵素を利用するためには、微生物毒性による失活を回避するために、使用される特定の有機溶媒に対する耐性を有する耐性微生物や耐性酵素を用いる必要があった（非特許文献１〜３）。有機溶媒存在下での微生物反応が注目されるようになったのは、トルエン（特に毒性の強い有機溶媒である）に対して耐性であるトルエン耐性菌の発見が１９８９年に報告されてからである（非特許文献４）。その後、多数の有機溶媒耐性菌や耐性酵素が発見されるようになった。これらの耐性菌および耐性酵素は、それらの耐性に応じた有機溶媒を選択して用いなければならないという制約は残るものの、水系における反応とは異なる全く新しい応用の可能性を提供するものである（非特許文献２、６）。
【０００７】
微生物の有機溶媒耐性の獲得または向上は、自然界からの分離（耐性を有する微生物を分離する）あるいは微生物の育種（微生物の変異処理によって耐性を誘導する）によって達成し得る。しかしながら、前者に関しては分離の確率は低く、また育種における変異処理による微生物株の改良は多大な労力を要し、かつ、目的の有機溶媒耐性を有する微生物の取得に至らない場合も多い。また、有機溶媒耐性に関与する遺伝子を用いて有機溶媒耐性を向上させる試みもあるが、著しい向上には至っていない（非特許文献５、６）。
【０００８】
有機溶媒の微生物毒性の強弱は、有機溶媒の種類により様々である。一般的に、生体の構成成分であるタンパク質の変性・失活や脂質などの溶出等による生体機能の低下が、微生物毒性の作用機序であると考えられているが、有機溶媒の生体への作用は多岐にわたり得るので、微生物毒性のはっきりとしたメカニズムは不明である。また、有機溶媒耐性微生物が何故に有機溶媒存在下で生育可能であるかに関しても、明確な結論は得られていない（非特許文献８、９）。
【０００９】
以上のように、活きた微生物または酵素を、液状有機組成物を含む系において利用するという可能性は、産業的に非常に魅力的であり、耐性菌・耐性酵素という側面から微生物毒性に対処することによってそのような可能性を実現するための試みがなされてきているが、微生物毒性に関する基礎的な理解自体がまだ乏しく、上記のような利用法の実現範囲も現時点ではごく限られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第4181838号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Abe A, Inoue A, Usami R, Moriya K, Horikoshi K. Degradation of polyaromatic hydrocarbons by organic solvent-tolerant bacteria from deep sea. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1154-1156 (1995)
【非特許文献２】Kawata T, Ogino H. Enhancement of the organic solvent-stability of the LST-03 lipase by directed evolution. Biotechnol. Prog. Nov-Dec;25(6):1605-11 (2009)
【非特許文献３】Sardessai TN, Bhosle S. Industrial potential of organic solvent tolerant bacteria. Biotechnol. Prog. May-Jun;20(3):655-60 (2004)
【非特許文献４】Inoue A, Hrikoshi K. A Pseudomonas putida thrives in high concentration of toluene. Nature 338:264-266 (1989)
【非特許文献５】Doukyu N, Shibata K, Ogino M, Sagemann M. Purification and characterization of Chromobacterium sp. DS-1 cholesterol oxidase with thermal, organic solvent, and detergent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 80:59-70 (2008)
【非特許文献６】Salleh AB, Basri M, Taib M, Jasmani H, Rahman RN, Rahman MB, Razak CN. Modified enzymes for reactions in organic solvents. Appl. Biochem. Biotechnol. Jul-Dec;102-103(1-6):349-57 (2002)
【非特許文献７】Ogino H, Uchiro T, Doukyu N, Yasuda M, Ishimi K, Ishikawa H. Effect of exchange of amino acid residues of the surface region of the PST-01 protease on its organic solvent-stability. Biochem. Biophys. Res. Commun. Jul 13;358(4) 1028-33 (2007)
【非特許文献８】Ramos JL, Duque E, Gallegos MT, Godoy P, Ramos-Gonzales MI, Rojas A, Teran W, Sequra A. Mechanisms of solvent tolerance in gram-negative bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 56:743-68. Jan 30 (2002)
【非特許文献９】Ramos JL, Duque E, Godoy P, Sequra A. Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonas putida DOT-T1E. J. Bacteriol. Jul; 180(13):3323-9 (1998)
【非特許文献１０】Inoue A, Horikoshi K. Estimation of solvent-tolerance of bacteria by the solvent parameter log P. J. Ferment. Bioeng. 71:194-196 (1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、液状有機組成物の微生物毒性自体を外部要因により化学的かつ人為的に制御し、あるいは軽減させるという、まったく新しい発想を提供するものである。本発明は、微生物・酵素の側の耐性を高めるという従来の方向性から大きく転換するものであり、微生物・酵素の応用範囲を格段に拡大し得るものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、所与の液状有機組成物に別の液状有機組成物を適量混合することにより、有機混合液の微生物毒性の強弱を人為的に制御できることを見出し、本発明に至った。本発明は、例えば、微生物にとって本来致死的であるはずの有機化合物の存在下でその微生物の生育を可能にすることができる画期的な技術である。本発明では、使用を意図する有機組成物（本明細書において「標的有機組成物」あるいは「第１の有機組成物」ともいう）の他に、その標的有機組成物とは毒性の度合いが異なる少なくとももう１つの有機組成物（本明細書において「第２の有機組成物」ともいう）が添加される。本発明により、標的有機組成物を含有する有機混合液の毒性を、所望のレベル（標的レベル）まで低減させることができ、標的有機組成物を構成する有機化合物への接触により従来は生育停止ないし死滅していた微生物を、その化合物の高濃度存在下で培養することができるようになる。あるいは逆に、標的有機組成物を含有する有機混合液の毒性を、所望のレベル（標的レベル）まで上昇させることも可能であり、この場合はすなわち有機混合液の抗菌性の上昇を意味するので、例えば油脂混合により腐敗防止効果が付与されたドレッシングの開発などの応用例が考えられる。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の側面を含む。
［１］
第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、標的Blog P値に上方調節する方法であって、前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも高く、かつ前記標的Blog P値よりも高いlog P値またはBlog P値を有する第２の有機組成物を、前記有機混合液に含有させて、前記標的Blog P値を得ることを含む、方法。
［２］
第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、標的Blog P値に下方調節する方法であって、前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも低く、かつ前記標的Blog P値よりも低いlog P値またはBlog P値を有する第２の有機組成物を、前記有機混合液に含有させて、前記標的Blog P値を得ることを含む、方法。
［３］
前記標的Blog P値に相当する生育限界log P値を有する微生物を、前記有機混合液の存在下で培養して、生育可能であるか否かを確認することをさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
あらかじめ、前記第１の有機組成物と前記第２の有機組成物とを複数の混合比で混合して、それらの複数の混合液のBlog P値を決定することにより、検量曲線を作成することをさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記標的Blog P値に調節された前記有機混合液は、前記第１の有機組成物を少なくとも１０％（ｖ／ｖ）以上含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記第１の有機組成物は、炭化水素、アルコール、精油、天然樹脂、脂質、植物油、動物油、および生体成分のうちの１種以上を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
［１］に記載の方法により、第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を標的Blog P値に上方調節する工程、および
前記第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値よりも高く、かつ、前記標的Blog P値以下である生育限界log P値を有する微生物を、前記標的Blog P値に調節された前記有機混合液に接触させる工程
を含む、微生物の培養方法。
［８］
第１の有機組成物のlog P値またはBlog P値以下であり、かつ、標的Blog P値より高い生育限界log P値を有する微生物の生育を、前記第１の有機組成物の存在下で抑制する方法であって、
［２］に記載の方法により、第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を標的Blog P値に下方調節する工程
を含む方法。
［９］
６．０以下のlog P値またはBlog P値を有する有機液に生体成分を添加することにより、前記有機液を含有する有機混合液のBlog P値を上方調節する方法。
［１０］
前記生体成分は、細菌細胞の溶解物に含まれる成分である、［９］に記載の方法。
［１１］
前記生体成分は、ＬＰＳ、細胞膜成分、細胞質成分、またはこれらいずれかの組合せである、［１０］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、二成分系有機溶媒混合液におけるBlog P値の変化の例を示す。
【図２】図２は、三成分系有機溶媒混合液におけるBlog P値の変化の例を示す。
【図３】図３は、脂質を含む有機混合液におけるBlog P値の変化の例を示す。
【図４】図４は、有機混合液における微生物毒性軽減の確認の例を示す。
【図５】図５は、ＬＰＳ添加による有機混合液のBlog P値調節の例を示す。
【図６】図６は、細胞膜成分添加による有機混合液のBlog P値調節の例を示す。
【図７】図７は、細胞質成分添加による有機混合液のBlog P値調節の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「有機組成物」とは、有機化合物の組合せからなる組成物を意味する。「有機組成物」という用語は、複数種の有機化合物の混合物のほか、単一種の有機化合物のみを含むものも包含するものとする。すなわち、一般的な有機溶媒は有機組成物の一例である。
【００１７】
有機組成物のうち、微生物の培養条件（通常は３０℃または３７℃）において、水相とは区別されうる有機相として液状であるものを特に「有機液」という。有機液のうち、複数種の有機化合物を含むものを特に「有機混合液」という。
【００１８】
本発明において使用される有機組成物の種類は、下記において説明するBlog P値を定義し得るものである限り特に限定されず、炭化水素、アルコール、精油や天然もしくは合成の樹脂（例えば香料の成分となるもの）、脂質、植物油、動物油、生体成分、あるいはこれらのいずれかの混合物等、あらゆる有機組成物であり得る。
【００１９】
炭化水素の例としては、脂肪族炭化水素（ｎ−デカン、ｎ−ノナン、ｎ−オクタン、イソオクタン、１−オクテン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、２−ペンテン、１，５−ヘキサジエン等）、脂環式炭化水素（ブチルシクロヘキサン、シクロオクタン、メチルシクロヘキサン、シクロヘキサン、シクロペンタン等）、芳香族炭化水素（１，２，４−トリクロロベンゼン、プロピルベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、エチルベンゼン、ｐ−キシレン、スチレン、トルエン、フルオロベンゼン、ベンゼン、ニトロベンゼン等）、エーテル類（ｎ−ヘキシルエーテル、ジフェニルエーテル、ｎ−ブチルフェニルエーテル、ベンジルエーテル等）、ケトン類（メチルエチルケトン、アセトン等）、およびクロロホルム、フェノール等その他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
アルコールの例としては、オクタノール、ヘプタノール、プロパノール、ブタノール、エタノール、メタノール等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
脂質の例としては、単純脂質（グリセリド、ワックス、ステロールエステル等）、複合脂質（グリセロリン脂質またはスフィンゴリン脂質のようなリン脂質、糖脂質等）、誘導脂質、飽和脂肪酸（ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、モンタン酸、イソパルミチン酸、ツベルクロステアリン酸等）、不飽和脂肪酸（ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、リノール酸、α−またはγ−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等）、環状脂肪酸（ゴルリン酸、ラクトバシル酸等）、二塩基脂肪酸（トリコサン二酸等）、およびステロイド類（ステロイド、ステロール、胆汁酸、ステロイドホルモン等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
植物油の例としては、ココナッツオイル、コーン油、オリーブオイル、パーム油、ピーナッツオイル、菜種油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、ナッツ油、アンズ油、ココアバター油、コメ油、ツバキ油、コムギ油、アマニ油、ヒマシ油、トール油等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
動物油の例としては、ラード（豚脂）、ヘッド（牛脂）、および魚油類が挙げられるが、これらに限定されない。生体成分の例としては、細胞の溶解物またはその画分に由来するもの、例えば細胞膜成分、細胞質成分、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生体成分の例は、細菌細胞の溶解物中の有機成分またはＬＰＳ（Lipopolysaccharide：リポ多糖）、細胞膜成分、細胞質成分、もしくはこれらいずれかの組合せである。
【００２４】
本明細書における微生物とは単細胞生物（細菌、放線菌、酵母、カビなど）であり、好ましくは細菌である。細菌はグラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。本明細書において、異なる微生物について述べる場合には、異なる種の微生物を意味することもあれば、同種の微生物の異なる単離株を意味する場合もある。例えば、ある有機溶媒に対し、ある細菌種の１つの株は感受性であり（その有機溶媒の存在下で生育できず）、同じ種の別の株は耐性である（その有機溶媒の存在下で生育できる）場合もあり得る。
【００２５】
本明細書において、有機組成物の微生物毒性の程度を表すパラメータとして、log P値またはBlog P値が用いられる。有機溶媒の微生物毒性に関しては、log P値が小さい溶媒ほど強毒性を示すことが実験的に確認されており、各有機溶媒（実質的に単一種の有機化合物からなる有機液）は固有のlog P値、すなわち固有の微生物毒性度を有している（非特許文献４、１０）。
【００２６】
まず、log Pについて説明する。
本来的に、log Pとは、水−オクタノールの二相系にある化合物を溶かし、平衡に達した時のその二相における濃度の分配比Pを対数で表した、各物質に固有の物性値である。このlog P値は水への馴染みを示す指標であり、この値が大きいほど、その物質は油に溶けやすい。一般に、単一成分有機溶媒のlog P値の測定法として、（１）計算により求める方法、および（２）実験により求める方法が知られている。
【００２７】
（１）計算によりlog P値を求める方法
log P値は、化合物分子を構成している各構造的成分の疎水性の和として表わされる。
基準物質（H）に置換基Xを導入した化合物において、疎水性置換基定数πXは次式で表わされる。
【数１】
2017121185.tif 000002
n個の置換基を有する化合物のlog Pは次式により算出される。
【数２】
2017121185.tif 000003
【００２８】
ここで、log Pまたはπ値は実験的に求めることが望ましいが、分配に影響を与える構成因子（例えば、環化、枝分かれ、多重結合、置換基）に関する疎水性フラグメント定数（hydrophobic fragmental constant）fを定め、log P=Σfからlog Pを算出することもできる（Nys GG, Rekker RF. Chim. Ther. 5, 521 (1971)；Rekker RF. The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, NewYork (1977)）。この計算を自動的に行うプログラムも当業者に利用可能である（BioByte社のBio-Loom；http://biobyte.com/index.html）。
【００２９】
（２） 実験によりlog P値を求める方法（Flask shaking法）
有機溶媒（例えばn-オクタノール）と水との間で分配された物質aの濃度比を求めることにより決定する。相手の相で予め飽和しておいた有機溶媒と水とをそれぞれ一定体積ずつとり、フラスコ中にいれる。通常は、いずれかの相に予め測定対象物質を溶解しておき、平衡後の両相におけるその物質の濃度を適切な方法（通常は比色法）で定量し、分配係数Pを求める。すなわち以下の通りである。
【数３】
2017121185.tif 000004
このとき、物質aの添加濃度を変化させて測定し、添加濃度によってPの値が変わらない領域での値を採用する（寺田弘、化学の領域、増刊122号、p. 73（1979））。
【００３０】
有機溶媒に関する他の様々な物理化学的パラメータ（特定の基の有無、水への可溶性、等々）については微生物毒性との相関が見出されてこなかったが、log P値だけは、非常に普遍的に微生物毒性との相関（逆相関）を示すこと、すなわち微生物毒性の指標となることが、経験的に確かめられてきた（非特許文献４、１０）。これはつまり、log P値が低い有機溶媒ほど、その存在下で生育できる微生物株の種類が少なくなることを意味し、また、ある有機溶媒の存在下で生育できない微生物株は、その有機溶媒より低いlog P値を有する有機溶媒の存在下でも生育できないこと、および、ある有機溶媒の存在下で生育できる微生物株は、その有機溶媒より高いlog P値を有する有機溶媒の存在下でも生育できることを意味する。log P値が微生物毒性と相関するという経験的事実は確立されているものの、相関のメカニズムは解明されていない。
【００３１】
微生物の生育の可否は、その微生物を播いた寒天培地上にその有機溶媒を直接注ぎ入れてインキュベートすることによって試験される。液体培地における液体培養についても同様である。つまり、耐性のある微生物は有機溶媒原液に接触していても生育することができる。逆に、耐性のない微生物は、その有機溶媒が０．１％（ｖ／ｖ）以下の低濃度で培地に溶解されていたり、あるいは培地を囲む空気中に蒸気として存在しているだけの場合であっても、生育することができず、少量であってもその有機溶媒分子に細胞が接触すること自体で生育能力が阻害されると見られる。つまり、有機溶媒の微生物毒性は濃度依存性が乏しいことが理解される。
【００３２】
上述したlog P値は、単一種の有機化合物からなる有機組成物について決定されるパラメータである。二種以上の有機化合物からなる有機組成物のlog P値は、現在のところ上記の方法で求めることはできない。そこで、二種以上の有機化合物からなるものを含めて、より一般的に有機組成物の微生物毒性を表すことができるパラメータが考案された（特許文献１）。このパラメータを本明細書ではBlog Pと呼ぶ。 Blog Pは、log P値と関連し、あるいはlog P値に準じ、微生物毒性の尺度としてlog P値と対比することが可能なパラメータであるが、指標微生物（Type strainと呼ばれるものを含む）を用いて定義されるという点においてlog P値と異なる。
【００３３】
指標微生物とは、特定の有機溶媒耐性度を有する微生物であり、有機溶媒耐性を示すあらゆる微生物株を指標微生物として活用し得る。上述のように、各有機溶媒は固有のlog P値を有し、log P値が低く毒性が高いものからlog P値が高く毒性の低いものまで、多様な有機溶媒が存在する。そこで、所与の微生物株を異なる有機溶媒の存在下で培養することにより、その微生物株がどれほど低いlog P値の有機溶媒まで生育のために耐えることができるかという限界値、すなわち、その微生物株に固有の「生育限界log P値」を決定することができる。いったん生育限界log P値が決定されれば、今度は逆にその微生物株を指標微生物として利用することができる。すなわち、既知の生育限界log P値を有するその指標微生物を、所与の有機液（有機混合液であってもよい）の存在下で培養し、生育の可否を見ることにより、その有機液の見かけ上のlog P値、すなわちBlog P値を決定することができる。
【００３４】
例えば、既知の生育限界log P値（仮に４．０とする）を有する指標微生物を、所与の有機混合液の存在下で培養し、もし生育可能であればその有機混合液のBlog P値は４．０以上と決定され、生育不可能であればその有機混合液のBlog P値は４．０未満と決定される。異なる生育限界log P値を有する複数の指標微生物を用いて同様の判定を行うことにより、所与の有機混合液のBlog P値をより正確に特定することができる（特許文献１）。
【００３５】
特許文献１において実証されているように、Blog P値は、炭化水素からなるいわゆる有機溶媒に限らず、原油、ガソリン、灯油、潤滑油、植物油など、あらゆる有機液一般に適用できる。
【００３６】
以上のことから理解されるように、Blog P値は、log P値と同様、微生物毒性度と逆相関するパラメータである。すなわち、Blog P値が低い有機液ほど微生物毒性度が高い。log P値は単一種の有機化合物からなる有機液のみについて決定することができるのに対し、Blog P値は、単一種の有機化合物からなるか複数種の有機化合物の混合物であるかに関わらず、有機液一般について決定することができる。しかしながら、上記の定義に基づけば、単一種の有機化合物からなる有機液のBlog P値はそのlog P値と一致するため、以下の説明では、有機液の微生物毒性の尺度としてのBlog P値とlog P値とをまとめて「Blog P値」と呼ぶこともある。
【００３７】
広範囲の生育限界log P値域を網羅する多くの微生物株が知られており、かつ当業者に利用可能である（非特許文献４および１０ならびに特許文献１参照）。また、各種有機溶媒のlog P値が知られており、あるいは知られていなくても容易に決定することができるため、所与の微生物株の生育限界log P値を決定して新たな指標微生物株とすることもできる。従って、Blog P値の測定は当業者の通常の技量の範囲内である。
【００３８】
当業者に利用可能な指標微生物の例としては、以下のものが挙げられる（特許文献１参照）。
（１）シュードモナス・プチダ（ＦＥＲＭ  Ｐ−９２２８）
（２）クレブシエラ・ニューモニア（ＩＦＯ  ３３１８）
（３）エスシェリキア・コーリ（ＩＦＯ  ３８０６）
（４）コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（ＩＦＯ  １２０７２）
（５）エスシェリキア・コーリ（ＩＦＯ  ０３５４８）
（６）プロテウス・ウバラム（ＩＦＯ  ３１６７）
（７）コクリア・ロゼア（ＩＦＯ  ０３７６４）
（８）スタフィロコッカス・アウレウス（ＩＦＯ  ０３１８３）
（９）エンテロコッカス・ファエシウム（ＩＦＯ  ３８２６）
（１０）コリネバクテリウム・フラベスセンス（ＩＡＭ１６４２）
（１１）コリネバクテリウム・ハイドロカルボオキシダンス（ＡＴＣＣ２１７６７）
（１２）コリネバクテリウム・ヘルカラス（ＡＴＣＣ１３８６８）
（１３）クロモバクテリウム・クロコラタミ（ＩＦＯ  ３７５８）
（１４）コリネバクテリウム・グルタミカム（ＪＣＭ１３１８）
【００３９】
本明細書において微生物の「培養」とは、微生物に培地を供給してインキュベートあるいは振とうすることをいう。個々の微生物種にとって適切な培養環境（例えば培養温度や培地組成）は、当業者に知られているか、または当業者が適宜決定することができる。本明細書でいう微生物の「生育」とは、その微生物が分裂して増殖することを意味する。微生物が生育すると、固形培地（例えば寒天培地）での培養の場合にはコロニーが形成され、液体培地での培養の場合には、液の濁度が上昇したり、細胞の乾燥重量の増加がみられたりし得る。液の濁度の上昇は、肉眼で確認することもできるし、吸光度に基づいて測定することもできる。細胞の乾燥重量は、培養後の液体培地を遠心分離して水分（液相）を除去した後、乾燥（１０５℃）して一定の衡量に達した重量により測定することができる。
【００４０】
有機液の存在下における指標微生物の生育の可否を判定するためには、指標微生物を接種した通常の液体培地に有機液を加え、栓をして振とう培養して、液の濁度の上昇または細胞の乾燥重量の上昇の有無を評価すればよい。ここで、有機液の添加量は、液体培地と合わせた合計体積を基準として例えば１０〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０〜４０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは２５〜３５％（ｖ／ｖ）とする。あるいは、その指標微生物を通常の寒天培地上に播き、続いてその培地表面を覆うように有機液を入れ、通常の培養温度にて密閉容器内で培養して、コロニー形成の有無を評価すればよい。ここで、複数の有機液について微生物の生育への個別の影響を調べるためには、有機液毎に個別の密閉容器を用意して培養を行わなければならない。同じ密閉容器内で異なる有機液の培養を行うと、蒸気の拡散により混合状態の影響が出てしまうからである。
【００４１】
これらの培養法では、有機液を構成する分子に微生物細胞が必然的に接触するであろうことは当業者に理解される。有機液の存在下では、耐性微生物は増殖するとしてもその増殖速度が通常より遅くなり得る場合もある。従って、生育可否の判定をするための培養時間は、少なくとも１２時間、好ましくは１８時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上とし、３〜５日間あるいは１週間程度としてもよい。
【００４２】
本発明の一実施態様によれば、相対的に強毒性である（Blog P値がより低い）第１の有機組成物に対し、相対的に弱毒性である（Blog P値がより高い）第２の有機組成物を適宜混合して有機混合液を調製することにより、上記第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、目標とする値まで上昇させて調節（上方調節）することができる。この技術により、例えば、ある強毒性の有機液（第１の有機液）の存在が関わる化学反応を行う際に、本来その強毒性有機液に接触すると生育できないはずの微生物の存在を伴わせることが可能となる。本発明の別の実施態様によれば、相対的に弱毒性である（Blog P値がより高い）第１の有機組成物に対し、相対的に強毒性である（Blog P値がより低い）第２の有機組成物を適宜混合して有機混合液を調製することにより、上記第１の有機組成物を含有する有機混合液のBlog P値を、目標とする値まで低下させて調節（下方調節）することができる。この態様により、例えば、ある有機液（第１の有機液）を主成分として含有する製品（例えば化粧品や液状食品調味料）を生産する際に、本来ならばその有機液の接触下で生育が許容されてしまう雑菌の繁殖を抑制することが可能となる。このような観点から、本明細書においては、第１の有機組成物を、ターゲットとする有機組成物という意味合いで「標的有機組成物」ともいう。
【００４３】
また、最終的な有機混合液が達成するべき目標のBlog P値を「標的Blog P値」という。標的Blog P値は、１つの特定の数値である場合もあるし（例えば「４．０」）、一定の数値範囲（例えば、「４．０以上」、「３．８〜４．０」等）である場合もある。
【００４４】
このようにBlog Pが標的Blog P値までに調節された有機混合液は、少なくとも１％（ｖ／ｖ）以上、あるいは少なくとも５％（ｖ／ｖ）以上、あるいは少なくとも１０％（ｖ／ｖ）以上、あるいは少なくとも２０％（ｖ／ｖ）以上の標的有機組成物を含み得る。体積％として表したこれらの数値は、質量％であってもよい。
【００４５】
標的有機組成物のBlog P値よりも高い標的Blog P値を得ようとする場合（以下、Blog P値の「上方調節」という）には、標的Blog P値に調節するために標的有機組成物に加えられる第２の有機組成物のBlog P値は、標的有機組成物のBlog P値より高く、かつ、標的Blog P値よりも高い必要がある。つまり、（イ）標的有機組成物のBlog P値、（ロ）標的Blog P値、および（ハ）第２の有機組成物のBlog P値の間には、イ＜ロ＜ハという関係がある。また逆に、標的有機組成物のBlog P値よりも低い標的Blog P値を得ようとする場合（以下、Blog P値の「下方調節」という）には、第２の有機組成物のBlog P値は、標的有機組成物のBlog P値より低く、かつ標的Blog P値よりも低い必要がある。
【００４６】
Blog P値上方調節の場合、有機混合液を標的Blog P値に調節するためには、標的有機組成物に対して、第２の有機組成物を、標的Blog P値に相当する生育限界log P値を有する指標微生物株が生育可能となる量だけ加えて混合すればよい。例えば、一実施態様では、標的有機組成物に対する第２の有機組成物の添加量を順次増加させていき、そのつど上記指標微生物株の生育の可否を判定しながら、最終的に、上記指標微生物株が生育可能となる第２の有機組成物の量を決定することによりBlog P値の調節を行うことがきる。同様の考え方で、Blog P値下方調節の場合も、第２の有機組成物の添加量を順次増加させていき、（標的Blog P値より高い生育限界log P値を有する）指標微生物株が生育不可能となる第２の有機組成物の量を決定することによりBlog P値の調節を行うことがきる。
【００４７】
あるいは、別の実施態様では、あらかじめ標的有機組成物と第２の有機組成物とを複数の異なる混合比で混合して、それら複数の混合液のBlog P値をそれぞれ決定することにより検量線を作成しておき、その検量線を参照することによって、標的Blog P値に対応する両有機組成物の適切な混合比を予知でき、有機混合液のBlog P値を標的Blog P値にただちに調整することができる。
【００４８】
標的有機組成物に第２の有機組成物を混合することにより調製される有機混合液のBlog P値が標的有機組成物とは異なったものになる（Blog P値上方調節の場合は、より高くなる）メカニズムは不明だが、有機化合物同士の間で生じる何らかの相互作用によるものと考えられる。いずれにしても、有機混合液のBlog P値の上昇（すなわち毒性の低下）は、標的有機組成物のいわゆる「希釈」という概念では説明できないことは当業者に理解される。なぜならば、上述のように、微生物が有機溶媒に対して感受性であれば、その有機溶媒分子がたとえ０．１％（ｖ／ｖ）という低い濃度で提供される場合であっても、微生物細胞がその分子に接触するかぎり生育が阻害されるからである。その有機溶媒分子が細胞に接触する蓋然性がなくなるほど極端に低い濃度にまで希釈されつくしたならば論外であるが、有機混合液が例えば１０パーセント程度の標的有機溶媒を含んでいるとすると、その有機混合液で培地を覆えば、培地上の微生物細胞が必然的に多量の標的有機溶媒分子に接触することは明らかである。従って、標的有機液が第２の有機液との関係において相対的に薄められたからといって、その多少薄まったという事実によって、標的有機液の接触下で生育不可能だった微生物が生育可能になることを説明することはできない。
【００４９】
特許文献１の表５には、キシレン、デカン、ノナンという３つの有機溶媒からなる有機混合液について、これら三成分の比率が異なるとBlog P値も異なることが記載されている。しかしながら、特許文献１の三成分有機混合液中では、キシレン対デカン、デカン対ノナン、ノナン対キシレン、キシレン対（デカン＋ノナン）、デカン対（ノナン＋キシレン）、キシレン対デカン対ノナン等々というように、多数の相互作用が混在しており、そのいずれがBlog P値の変動をもたらしているのかの分析はなされていないし、この特定の三成分の組合せ以外に適用され得る何らかの一般的知見が得られているわけでもない。
【００５０】
有機溶媒のlog P値と微生物毒性とが相関するメカニズム自体がそもそも理解されていない以上、従来、有機溶媒同士を混合した場合にどのような相互作用が起こりどのようにBlog P値に反映されるかということは全く理解されておらず、有機混合液についてある特定のBlog P値が観察された根拠を理論的に説明したり、有機溶媒同士を混合した場合のBlog P値の挙動を予測したりすることはできなかった。ましてや、任意のBlog P値に調節することはできず、そのような発想すらなかった。本発明者らは、１度に２種類ずつの有機組成物を組み合わせて微生物の生育の可否を調べる実験を、多種多様な有機組成物を用いて多数積み重ねた結果、種類を問わずあらゆる有機組成物同士の混合液において適用され得る、Blog P値に関する普遍的かつシンプルな法則性を見出し、本発明を完成するに至った。つまり本発明は、有機混合液の「種類」を問わない共通尺度であるBlog P値によって規定される概念のなかに新たな統一的法則を見出して成し得たものである。
【００５１】
例えばバイオリアクター分野において、ある特定の有機溶媒Ａにのみ溶解可能な有機化合物を微生物変換（微生物の活性を用いた変換）に付したい場合、従来は、その特定の有機溶媒Ａに耐性を有する特定の微生物を用いることしか選択肢がなかった。しかしながら、本発明においては、log P値がより高い第２の有機溶媒Ｂ（有機溶媒Ａのlog P値＜有機溶媒Ｂのlog P値）を用いることにより、混合系有機溶媒の微生物毒性を低減することができる。その重要な結果として、有機溶媒Ａのlog P値よりも高い生育限界log P値を有する微生物（すなわち、従来は有機溶媒Ａ非耐性とされていた微生物）を有機溶媒Ａに接触させながら培養することが可能となる。従って、そのような従来想定されていなかった微生物を用いて上記微生物変換を行う可能性が開かれ、多様な機能を有する有用微生物を広く有効に利用できるようになる。つまり、有機溶媒耐性微生物だけでなく非耐性微生物ないし低耐性微生物も積極的に活用することが可能になる。同様に、有機溶媒耐性酵素だけでなく非耐性酵素ないし低耐性酵素も活用することが可能になる。
【００５２】
別の例として、化粧品分野で使用される香料などは殺菌力（微生物毒性）が強いものが多いが、他の疎水性物質（顔料など）と混合してBlog P値を制御することにより、生体への悪影響（常在菌やヒト生細胞などに対する毒性）を弱めることが可能となる。同様に、これまでになかった有機液成分（油脂類など）を選択して食品（例えばドレッシング等）に含ませることによって微生物毒性を「低減」でなく「向上」させ、安全に防腐効果（抗菌性向上）を得るというような応用例も考えられる。また、本発明によるBlog P値の調節により、殺傷すべき細胞を殺傷し保護すべき細胞を保護し得るため、医薬品への応用も考えられる。
【００５３】
すなわち本発明は、疎水系／微水系あるは二相系における微生物反応・酵素反応に関して、使用する標的有機液に合わせて耐性微生物・耐性酵素を選択するという従来の考え方を脱して、利用したい微生物・酵素に合わせて有機液のほうを設定・調製するという新たな展開を提供するものであり、様々な応用分野において、これまで想定されていなかった幅広い種類の微生物・酵素の利用可能性を切り開くものである。
【実施例】
【００５４】
以下において、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００５５】
［有機液の微生物毒性の評価（測定）のための指標微生物］
それぞれ固有の有機溶媒耐性度（生育限界log P値）を有する指標微生物を用いれば、有機液の未知の微生物毒性値（Blog P値）を推定することが可能になる。ここでいう、微生物の固有の有機溶媒耐性度とは、既知のlog P値を有する有機溶媒の存在下における生育の可否に基づいて決定されるものである。例として選定した指標微生物を表１に示した。表１においては、各種有機溶媒の既知log P値、それらの存在下における指標微生物の生育の可否、およびそれぞれの指標微生物について決定された生育限界log P値も示している。
【００５６】
【表１】
2017121185.tif 000005
【００５７】
上記表１において、例えばPseudomonas putida IH-2000指標微生物株は、試験に使用した有機溶媒のうち最も低い２．８というlog P値を有するトルエンの存在下でも生育可能であることから、その生育限界log P値は２．８以下であるといえる。別の一例として、Escherichia coli NBRC 3806指標微生物株は、３．８に至るほど低いlog P値を有する有機溶媒（メチルシクロヘキサン）には耐えるものの、それより低いlog P値の有機溶媒には耐えられないことから、生育可能と確認された有機溶媒のうち最もlog P値が低いもののlog P値である３．８という数値が、生育限界log P値として決定される。
【００５８】
［有機混合液のB log P値の測定］
毒性（Blog P値）を測定しようとする有機混合液の存在下で指標微生物の培養（固体培養或いは液体培養）を行い、その指標微生物が生育可能か否かを、固体培養の場合は視覚的にコロニー出現の有無に基づいて観察・評価し、あるいは液体培養の場合はその生育菌体の分光光学的手法（吸光度）による濁度に基づいて評価する。指標微生物が生育可能であれば、有機混合液のB log P値は、その指標微生物の生育限界log P値以上の値であると評価される。また逆に、その指標微生物が生育不可能な場合は、有機混合液はその指標微生物の生育限界log P値よりも低いB log P値を有すると評価される。
【００５９】
有機混合液のBlog P値を決定するために  表１に示された指標微生物を有機混合液の存在下で培養した。固体（固形培地）培養法と液体培養法とにおける培養結果には相関性があり、同じ結果が得られていることから、実験手順と生育の判断がより容易な固体培養法を常法として採用した。ただし、試験対象となる有機組成物の絶対量が少ない場合には、スケール縮小が容易な液体培養法がより有用となり得る。固体培養は、通常の細菌培養に用いられる培地組成（ＬＢ培地：グルコース０．１重量％、酵母エキス０．２５重量％、ペプトン０．５重量％、ｐＨ７．０）に基づいて固体培地を作製（寒天１．５重量％を添加）した後、指標微生物を播種して有機混合液の存在下で３０℃にて培養することによって行った。
【００６０】
表２にその結果の一例を示す。表２において、この有機混合液は、生育限界log P値が４．５以下である指標微生物（Pseudomonas putida IH-2000からE. coli NBRC 3548まで）の生育は許容したが、生育限界log P値が４．９以上である指標微生物（Achromobacter denitrificans NBRC 15125からCorynebacterium ammoniagenes NBRC 12071まで）の生育は許容しなかったことがわかる。従ってこの有機混合液には、生育が確認された指標微生物のうち最も生育限界log P値が高いものの生育限界log P値に相当する、４．５というBlog P値が割り当てられる。このような手法により、この有機混合液の毒性度Blog P値は４．５と決定される。
【００６１】
【表２】
2017121185.tif 000006
【００６２】
［二成分系有機混合液におけるBlog P値の変化（その１）］
図１において、２種類ずつの有機溶媒を使用した本発明の実施例を示す。第１の有機組成物として、トルエン（log P＝２．８）、ｐ−キシレン（log P＝３．１）、シクロヘキサン（log P＝３．４）のうちのいずれかを用い（図１においてＢ液として示す）、第２の有機組成物としてデカン（log P＝６．０）を用い（図１においてＡ液として示す）、両組成物を異なる比率で混合して得られた各有機混合液のBlog P値を、上記指標微生物株を用いて決定した。
【００６３】
図１に示されるように、有機混合液のBlog P値は、第１および第２の両有機組成物の混合比に対応して変化した。例えば、トルエンに対してデカンを混合する比率を高くするに従い、Blog P値が高くなる（毒性が低下する）方向において有機混合液のBlog P値が変化した。ｐ−キシレンまたはシクロヘキサンを第１の有機組成物とする場合も、デカンの混合比率を高くするに従いBlog P値が上昇するという点において同様な挙動を示した。しかしながら、そのBlog P値変化の推移を表す曲線のかたちは、有機溶媒の組合せの種類によって異なっていた。かたちが異なるこれらの曲線は、第２の有機組成物の存在による有機混合液のBlog P値の変化が「希釈」の概念に基づく考え方では推測できないことを明らかに示している。微生物毒性（Blog P値）のメカニズムは解明されておらず、本開示および下記の例における開示は、有機混合液の微生物毒性特性の新たな知見を提供するものである。
【００６４】
観察された曲線の非直線性および非同一性から、有機組成物同士の相互作用の複雑さが窺い知れる。その相互作用の本質は未解明であるものの、低log P値（相対的に高毒性）の有機組成物に高log P値（相対的に低毒性）の有機組成物を添加することにより、両者のlog P値のあいだに位置するBlog P値を有する有機混合液が得られるという、シンプルかつ普遍的な法則性が見出された。前者および後者の有機組成物をそれぞれ本発明の「標的有機組成物」および「第２の有機組成物」ととらえることができる。また逆に、高log P値（相対的に低毒性）の有機組成物を「標的有機組成物」、低log P値（相対的に高毒性）の有機組成物を「第２の有機組成物」とすることもできる。
【００６５】
図１に基づけば、例えば標的有機組成物としてのトルエンを２０％（ｖ／ｖ）含む有機混合液が、トルエン自体よりも大幅に高い４．５のBlog P値を有することがわかり、トルエンに接触することに伴う微生物毒性が大幅に緩和されているといえる。これにより、トルエン（log P＝２．８）の存在が関与する化学反応を行う際に、生育限界log Pが２．８より高くかつ４．５以下である微生物（本来トルエン非耐性とされてきた微生物）をトルエンに接触させながら培養してその活性を反応に利用することが可能になる。
【００６６】
また、図１に示されるような曲線を検量曲線として事前に取得することにより、新たに得た有機混合液（この例ではトルエンとデカンの混合液）のBlog P値を推定したり、あるいは有機混合液を新たに調製する際に所望のBlog P値（標的Blog P値）にただちに調節することが可能になる。
【００６７】
［三成分系有機混合液におけるBlog P値の変化］
三成分系の有機混合液におけるBlog P値の変化も、一般的に二成分系の要素に分解して理解できることが明らかになった。図２では、図１で示したシクロヘキサンとデカンとの組合せまたはトルエンとデカンとの組合せに、一定割合（混合液全体の５０％（ｖ／ｖ））のノナンをさらに組み合わせた、三成分系有機混合液のBlog P値の測定結果を示している。図１と図２の比較から、この三成分系有機混合液のBlog P値は、概して、図１の二成分系有機混合液のBlog P値とノナンのlog P値（５．５）との間に位置する値となっている。つまり図１の結果も踏まえると、見かけ上、シクロヘキサンまたはトルエンを標的有機組成物ととらえて、デカン添加によるBlog P値の調節とノナン添加によるBlog P値の調節との合算が得られたと解したり、あるいは、シクロヘキサンまたはトルエンとデカンとの有機混合液を標的有機組成物ととらえて、ノナン添加によるBlog P値の調節が得られたと解するなど、二成分系に分解したシンプルな理解が可能である。
【００６８】
［二成分系有機混合液におけるBlog P値の変化（その２）］
上記の例では、比較的Blog P値が低い（６以下）飽和炭化水素または芳香族炭化水素を用いていたが、この例では、７を超えるlog P値を有する脂質成分であるオレイン酸を使用した。標的有機組成物（低Blog P）としてｐ−キシレン（Blog P値３．１）またはシクロヘキサン（Blog P値３．４）を用い（図３においてＢ液として示す）、第２の有機組成物（高Blog P）として脂質成分であるオレイン酸（Blog P値＞７）を用いて（図３においてＡ液として表す）、これらを異なる比率で混合して調製した各有機混合液のBlog P値を決定した。その結果を図３に示した。
【００６９】
有機混合液のBlog P値は、実施例１の場合と同様に、加えられる脂肪酸の割合に対応して変化した。例えば、ｐ−キシレンに対してオレイン酸を加える割合を高くするに従い、有機混合液のBlog P値の上昇が達成された。しかしながら、そのBlog P値の変化の推移を表す曲線のかたちは、実施例１における有機溶媒の組合せの場合とはさらに異なっていた。この結果は、Blog P値の調節は特定の種類の有機溶媒の添加による態様に限られず、統一的尺度であるBlog P値が定義されうる有機組成物一般に適用されうることを裏付けている。
【００７０】
［有機混合液における微生物毒性軽減の確認］
図１〜３に示されるような検量曲線に基づいて、有機混合液を標的Blog P値に調節した後、あるいは、有機混合液のBlog P値を推定した後、既知の生育限界log P値を有する微生物株を用いて、有機混合液のBlog P値の確認を行うことができる。この際に用いる微生物株は、検量曲線の作成に用いた指標微生物株であってもよいし、それとは異なる微生物株であってもよい。また、検量曲線を作成せずにBlog P値の調節を行う場合にも同様に最終的Blog P値の確認を行うことができる。
【００７１】
本実施例は、そのような確認工程の例を示すものである。この例では、標的有機組成物シクロヘキサン（log P値＝３．４）に第２の有機組成物デカン（log P値＝６．０）を適宜添加して、有機混合液を標的Blog P値３．８に調節した後に、E. coli  NBRC3806（生育限界log P＝３．８）を指標微生物として用いてそのBlog P値の確認を行った。この実験では、液体培地に３０％（ｖ／ｖ）の有機混合液を含有させて一晩振とう培養を行った後の細胞の乾燥重量（ｇ／Ｌ（すなわち液体培地１Ｌあたりの乾燥細胞重量））として生育能力を表した（図４）
【００７２】
図４によれば、推定Blog P値が３．８未満であるシクロヘキサン７０％（ｖ／ｖ）・デカン３０％（ｖ／ｖ）の混合液の存在下では、この指標微生物は死滅したが、推定Blog P値が３．８であるシクロヘキサン６０％（ｖ／ｖ）・デカン４０％（ｖ／ｖ）の混合液の存在下では、この指標微生物の生育が確認された。従ってBlog P値の推定値の妥当性が確認された。
【００７３】
［生体成分を含む有機混合液におけるBlog P値の変化］
（１）生体成分（ＬＰＳ、細胞膜、細胞質）の調製
（１−１）ＬＰＳ（リポ多糖）の調製
菌体懸濁液（菌株：Pseudomonas putida IH-2000）に、同体積の９０％フェノール溶液を加えて撹拌して菌体を溶解した後、遠心分離により上清を分離した。この上清に対して透析処理（３日間）を行った後、凍結乾燥してＬＰＳ標品を調製した。以下にＬＰＳの調製方法の詳細を示す。  
＜ＬＰＳの調製方法＞
１７５ｍｌの蒸留水（６５℃）中に１０ｇの凍結乾燥細胞を加えて細胞（菌体）懸濁液を用意した。これに１７５ｍｌの９０％フェノール溶液（６８℃）を加え、１５分間撹拌混合した後、１０，０００ｒｐｍにおける遠心分離によって上相と下相とに分離した。上相の方に蒸留水５ｍｌを加え、試験管中で６８℃にて１５分間撹拌した後、蒸留水中で３日間透析処理した。透析後の試料を凍結乾燥することによりＬＰＳ標品を得た。ＬＰＳ標品を１ｍｌの蒸留水に加えて−８０℃にて凍結した。
【００７４】
（１−２）細胞膜および細胞質成分の調製
細胞培養液（定常期菌体）にＤＮａｓｅを添加して、フレンチプレス（圧力２００００ｐｓｉ×２回）で細胞破砕を行った後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ／１０分間、１０，０００ｒｐｍ／３０分間×２回）を行って上清を回収し、更に超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ／９０分間）を行って細胞質成分（上清）と細胞膜成分（ペレット）とを得た。細胞質成分および細胞膜成分は凍結（−８０℃）保存した。使用時には氷上解凍して使用した。以下に詳細を示す。
＜細胞膜および細胞質成分の調製方法＞  
すべての手順を通して、試料は氷上または４℃に維持した。２５ｍｌの培養液に、１００μｌのＤＮａｓｅを加えて混合した。その後、フレンチプレスにより細胞を破砕した（２００００ｐｓｉを２回）。８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を回収し、これに対して１００００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離処理を２回行い、上清を回収した。この上清に対して５００００ｒｐｍ、９０分間の超遠心分離を行い、上清として細胞質画分を、ペレットとして細胞膜（外膜＋内膜）画分を取得した。細胞膜画分には１ｍｌのＴＣＤＧバッファーを加えてホモジェナイザーで均質化した。両試料ともに−８０℃で凍結・保存した。
【００７５】
（２）有機溶媒と生体成分との有機混合液のBlog P値の測定手順
有機溶媒と上記生体成分を混合して有機混合液とし、これを液体培養に加えた場合における菌体の増殖度に基づいてBlog P値の測定を行った。具体的には、液体培地２ｍｌに指標微生物を接種し、さらに有機溶媒０．５ｍｌと滅菌処理した各生体成分（ＬＰＳ、細胞膜、細胞質）試料０．４ｍｌとの混合液（すなわち生体成分試料は有機溶媒１００体積部に対して８０体積部相当）を添加した後、培養を行って、指標微生物の生育（液体培地の濁化）の有無に基づいて、混合液のBlog P値を求めた。下記にこれらの手順の詳細を示す。
【００７６】
なお、上記の生体成分試料は水溶液ないし水分散液の形態で保存されていたが、有機溶媒との混合に際して有機溶媒への生体成分の溶解が起こって有機混合液が生じ、その一方で水相の方は液体培地に加えられた際に液体培地と一体化する。結果として、実質的に、有機溶媒と生体成分そのものとからなる有機混合液のBlog P値が測定されることとなる。このように、水中に存在する有機化合物の組合せについても、間接的にBlog P値を推定することができる。また、一例として、細胞質成分試料単独を、通常の有機溶媒のBlog P値測定手順と同様に液体培地に添加して、生育限界log P値がそれぞれ６．０および７．０である指標微生物Paenibacills polymyxa EPS-2000およびCorynebacterium glutamicum NBRC 12168を培養した結果、生育に阻害が無かったことから、細胞質成分のBlog P値が７．０以上であるという推定が裏付けられる。
【００７７】
＜有機溶媒と生体成分との混合液のBlog P値測定＞
５ｍｌのバイアルに２ｍｌの液体培地を入れ、事前に培養していた指標微生物の培養液２０μｌをこれに加えて接種した。上記（１）で調製したＬＰＳ、細胞膜、細胞質の各試料をポアサイズ０．２２μｍのフィルターで滅菌処理し、この滅菌試料０．４ｍｌと下記に示す有機溶媒０．５ｍｌとを上記液体培地に追加した。３０℃で振とうしながら４８時間培養を行った。複数の指標微生物について生育（液体培地の濁化）の有無を調べ、有機混合液のBlog P値を求めた。
有機溶媒は以下のものを用いた。
（有機溶媒）          （log P値）
デカン                ６．０
ノナン                ５．５
オクタン              ４．９
シクロオクタン        ４．５
メチルシクロヘキサン  ３．８
シクロヘキサン        ３．４
ｐ−キシレン          ３．１
トルエン              ２．８
【００７８】
（３）結果
（３−１）有機溶媒／ＬＰＳ混合系におけるBlog P値の評価
トルエン（log P値２．８）〜デカン（log P値６．０）の各有機溶媒１００体積部に対して、ＬＰＳ成分試料８０体積部をそれぞれ混合して調製された有機混合液のBlog P値を、指標菌株を用いて決定した。その結果を図５に示した。図５および後述する図６、７において、横軸は、元の有機溶媒に固有のlog P値を示す。
【００７９】
各有機溶媒にＬＰＳを混合することにより、Blog P値は元の有機溶媒のものと比較して上昇した。例えば、log P値３．８のメチルシクロヘキサンに対してＬＰＳ（Blog P値＞６．０）を混合すると、Blog P値は４．５に上昇し、シクロオクタンと同等の微生物毒性に低減された。従って、ＬＰＳも有機液との混合によってBlog P値を変化させることが分かった。
【００８０】
（３−２）有機溶媒／細胞膜成分混合系おけるBlog P値の評価
トルエン（log P値２．８）〜デカン（log P値６．０）の各有機溶媒１００体積部に対して、細胞膜成分試料８０体積部をそれぞれ混合して調製された有機混合液のBlog P値を、指標菌株を用いて決定した。その結果を図６に示した。
【００８１】
各有機溶媒に細胞膜成分を混合することにより、Blog P値は元の有機溶媒のものと比較して上昇した。例えば、log P値３．８のメチルシクロヘキサンに対して細胞膜成分を混合すると、Blog P値は４．５に上昇し、シクロオクタンと同等の微生物毒性に低減された。従って、細胞膜成分も有機液との混合によってBlog P値を変化させることが分かった。
【００８２】
（３−３）有機溶媒／細胞質成分混合系おけるBlog P値の評価
トルエン（log P値２．８）〜デカン（log P値６．０）の各有機溶媒１００体積部に対して、細胞質成分試料８０体積部をそれぞれ混合して調製された有機混合液のBlog P値を、指標菌株を用いて決定した。その結果を図７に示した。
【００８３】
各有機溶媒に細胞質成分を混合することにより、Blog P値は元の有機溶媒のものと比較して上昇した。例えば、log P値３．８のメチルシクロヘキサンに対して細胞質成分を混合すると、Blog P値は４．５に上昇し、シクロオクタンと同等の微生物毒性に低減された。従って、細胞質成分も有機液との混合によってBlog P値を変化させることが分かった。なお、細胞膜成分を使用した上記実験、および細胞質成分を使用した本実験のいずれにおいても、有機溶媒にこれらの成分を添加することによって、生育限界log P値が１段階だけ高い指標微生物の生育が可能になったことから、図６および図７は結果として同様の形状のグラフとなっている。
【００８４】
（４）考察
以上の結果から、生体成分の添加により有機混合液のBlog P値を調節できることが示された。具体的には、ＬＰＳ、細胞膜成分、および細胞質成分はそれぞれ６以上の高いBlog P値を有し、よりBlog P値が低い他の有機液を含有する有機混合液のBlog P値を高く調節するために利用し得ることが示された。すなわち、ＬＰＳ、細胞膜成分、および細胞質成分は有機混合液の微生物毒性を低下させ得ることが示された。これらの結果は、異なるBlog P値を有する有機組成物を適宜混合することにより有機混合液のBlog P値を調節するという本発明の実施態様の一般性をさらに実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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