(57)【要約】【課題】新たな抗インフルエンザウイルス薬の提供。【解決手段】ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤を有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤を有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬。
【請求項２】
ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤が、次の一般式（１）で表される化合物又はその塩である請求項１記載の抗インフルエンザウイルス薬。
【化１】
2017218448.tif 000009
（式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基、アミノスルホニル基又はＣ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基を示し；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基を示し；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基を示し、他の３個は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基を示し；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）又はＮを示し；
破線は二重結合があってもよいことを示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイスル薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在市販されている抗インフルエンザウイスル薬としては、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナビル、ペラミビル、アマンタジン及びファビピラビルが知られている。これらの薬剤の作用メカニズムは、インフルエンザウイルスがコードするタンパク質であるノイラミニダーゼ、Ｍ２タンパク、イオンチャンネル又はＲＮＡポリメラーゼを阻害することである（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Current Opinion in Virology 2011, 1:563-573
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、広く使用されているオセルタミビルやザナミビル等のノイラミニダーゼ阻害薬に対しては、既に耐性ウイルスが出現している（非特許文献１）。またＲＮＡポリメラーゼ阻害薬については、未だ広く使用されていないため耐性の報告はないが、インフルエンザウイルスがコードするタンパク質を標的とすることから、変異速度の高いウイルスタンパク質に耐性変異が起きることで薬剤耐性ウイルスが容易に出現し、予防治療効果が減弱する懸念がある。
従って、インフルエンザウイルスがコードするタンパク質を標的としない、すなわち耐性発現の懸念のない抗インフルエンザウイルス薬が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、インフルエンザウイルスがコードするタンパク質でない分子を標的とする抗インフルエンザウイルス薬を開発すべく検討した結果、インフルエンザウイルスの宿主であるヒト細胞の遺伝子の発現の制御機構のひとつであるヒストンのアセチル化レベルでの制御に着目した。種々検討した結果、アセチル化酵素を阻害することでアセチル化レベルの低下を起こすとインフルエンザウイルスの増殖阻害が起こることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤を有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬。
〔２〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤が、次の一般式（１）で表される化合物又はその塩である〔１〕記載の抗インフルエンザウイルス薬。
【０００８】
【化１】
2017218448.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基、アミノスルホニル基又はＣ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基を示し；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基を示し；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基を示し、他の３個は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基を示し；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）又はＮを示し；
破線は二重結合があってもよいことを示す。）
〔３〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤の抗インフルエンザウイルス薬製造のための使用。
〔４〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤が、次の一般式（１）で表される化合物又はその塩である〔３〕記載の使用。
【００１０】
【化２】
2017218448.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基、アミノスルホニル基又はＣ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基を示し；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基を示し；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基を示し、他の３個は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基を示し；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）又はＮを示し；
破線は二重結合があってもよいことを示す。）
〔５〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害の有効量を投与することを特徴とするインフルエンザウイルス感染症の予防又は治療法。
〔６〕ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤が、次の一般式（１）で表される化合物又はその塩である〔５〕記載の予防又は治療法。
【００１２】
【化３】
2017218448.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基、アミノスルホニル基又はＣ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基を示し；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基を示し；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基を示し、他の３個は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基を示し；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）又はＮを示し；
破線は二重結合があってもよいことを示す。）
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗インフルエンザ薬は、インフルエンザウイルスの宿主であるヒト細胞の遺伝子の発現機構の一つであるｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素を阻害することにより、インフルエンザウイルスの増殖を抑制するものであることから、耐性発現の可能性がほとんどない。また、本発明の抗インフルエンザ薬は、インフルエンザウイルスの増殖を強力に抑制し、かつ安全性も高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト由来インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の増殖に対するＣ６４６の効果を示す。
【図２】パンデミックウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）の増殖に対するＣ６４６の効果を示す。
【図３】インフルエンザウイルスＡ／Ｔｏｋｙｏ／ＵＴＩＭＳ２−１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）の増殖に対するＣ６４６の効果を示す。
【図４】鳥インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）の増殖に対するＣ６４６の効果を示す。
【図５】パンデミックウイルスＡ／Ｓａｐｐｏｒｏ／１１４／２０１３（Ｈ１Ｎ１）の増殖に対するＣ６４６の効果を示す。
【図６】ウイルス感染５時間後にＣ６４６を添加した場合の抗インフルエンザウイルス効果を示す。
【図７】Ｃ６４６経鼻投与スケジュールを示す。
【図８】マウス肺でのウイルス力価を示す。
【図９】マウスの体重減少率を示す。
【図１０】マウスの死亡率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗インフルエンザウイルス薬の有効成分は、ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害剤である。ヒストンアセチル転移酵素（ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＡＴ）は、真核生物が有する酵素であり、転写活性化機能等を有する。このうち、ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴは、線虫からヒト細胞に存在し、転写活性化を有することが知られている。ＨＡＴ阻害剤が転写活性を抑制することから、抗がん剤として期待されているが（例えば、国際公開公報第２０１１／０８５０３９号）、インフルエンザウイルスの増殖に対する作用は全く知られていない。
【００１７】
前記のｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴ阻害剤としては、例えば国際公開公報第２０１１／０８５０３９号記載の化合物、すなわち一般式（１）で表される化合物又はその塩が挙げられる。
【００１８】
【化４】
2017218448.tif 000005
【００１９】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基、アミノスルホニル基又はＣ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基を示し；
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基を示し；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基を示し、他の３個は同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基を示し；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）（カルボニル）又はＮ（窒素原子）を示し；
破線は二重結合があってもよいことを示す。）
【００２０】
Ｒ1〜Ｒ7で表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。このうち、フッ素原子、塩素原子又は臭素原子が好ましい。
Ｃ1−Ｃ4アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。
Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ1−Ｃ4アルキルアミノスルホニル基としては、メチル部分アミノスルホニル基、エチルアミノスルホニル基、ｎ−プロピルアミノスルホニル基、イソプロピルアミノスルホニル基、ｎ−ブチルアミノスルホニル基等が挙げられる。
【００２１】
ハロゲノＣ1−Ｃ4アルキル基としては、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基等が挙げられる。
Ｃ1−Ｃ4アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基等が挙げられる。
ＹはＣ（Ｏ）又はＮを示す。ＹがＣ（Ｏ）（カルボニル基）を示す場合、破線部分は単結合である。ＹがＮを示す場合、破線部分は二重結合となる。
【００２２】
Ｒ1及びＲ2としては、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基又はアミノスルホニル基がより好ましく、Ｒ1及びＲ2の一方が水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基であり、他方がカルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル基又はアミノスルホニル基であるのがさらに好ましい。
Ｒ3としては、Ｃ1−Ｃ4アルキル基、トリフルオロメチル基、フェニル基又はフェニルチオメチル基がより好ましく、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はトリフルオロメチル基がさらに好ましい。
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のうちの１個はニトロ基であり、他の３個は同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ4アルキル基又はＣ1−Ｃ4アルコキシ基であるが、１個がニトロ基であり、他の３個が同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル基又はメトキシ基であるのがより好ましい。
Ｙは、Ｎ（窒素原子）であり、破線部分は二重結合であるのがより好ましい。
【００２３】
一般式（１）で表される化合物の塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩等の塩基塩；塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸塩等が挙げられる。
【００２４】
また、一般式（１）で表される化合物には、シス−トランス等の幾何異性体、光学異性体が存在し、これらの異性体のいずれもが含まれる。
【００２５】
一般式（１）で表される化合物の具体例を、表１及び表２に示す。表１及び表２中、ｃｉｓ、ｔｒａｎｓの記載がない化合物は、シス体とトランス体の混合物である。
【００２６】
【表１】
2017218448.tif 000006
【００２７】
【表２】
2017218448.tif 000007
【００２８】
一般式（１）で表される化合物は、例えば国際公開公報第２０１１／０８５０３９号記載の方法によって製造することができる。
【００２９】
後記実施例に示すように、ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてインフルエンザウイルスの増殖を抑制し、インフルエンザウイルス感染症の予防及び／又は治療薬として有用である。ここで、本発明の抗インフルエンザウイルス薬の対象となるインフルエンザウイルスは、特に限定されず、Ａ型及びＢ型のいずれも含まれ、また新型インフルエンザウイルスも含まれる。また、ＨＡ及びＮＡの型にも限定されず、例えばＡ型ではＨ１〜Ｈ１６及びＮ１〜Ｎ９のいずれにも有効である。また、インフルエンザウイルス由来のタンパクを標的とするものでないため、変異インフルエンザウイルスの感染に対しても有効である。「予防」とはインフルエンザウイルス感染による症状の発症、又はその重症化を防止することを意味し、インフルエンザ感染の危険性が予期される時期、又は感染初期の軽症時に本発明の薬剤を投与する。また「治療」とはインフルエンザウイルス感染による症状、特に重症化症状が軽減又は消失することを意味し、インフルエンザウイルス感染が確認された時点で本発明の薬剤を投与する。
【００３０】
本発明の抗インフルエンザウイルス薬は、経口または非経口的に投与することができる。経口的に投与する製剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、液剤、トローチ剤、ゼリー剤等を挙げることができる。また、非経口的に投与する製剤としては、注射剤、硬膏剤、酒精剤、エキス剤、座剤、懸濁剤、チンキ剤、軟膏剤、パップ剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤等を挙げることができる。
【００３１】
これらの製剤（組成物）は当業者に公知慣用の製剤方法により製造でき、またこのような種々の剤形の医薬製剤（医薬組成物）を調製するには、他の薬学的に許容される担体を所望に応じて添加することが可能である。担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、乳化剤、安定化剤等を挙げることができる。
【００３２】
本発明の抗インフルエンザウイルス薬の患者への投与量は、患者の性別、年齢、症状、投与方法、投与回数、投与時期等により異なるが、例えば、経口投与の場合、１日当たりｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴ阻害剤を０．１〜１００ｍｇ投与することが好ましい。また、本発明の抗インフルエンザウイルス薬を点鼻剤又は吸入剤として投与する場合、製剤中のｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴ阻害剤の濃度を０．０１〜５．０ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５〜３．０ｗ／ｗ％として製したものを、１日１〜３回程度点鼻又は吸入するのが好ましい。本発明の抗インフルエンザウイルス薬を注射剤として投与する場合、製剤中のｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なＨＡＴ阻害剤の濃度を０．０５〜５．０ｗ／ｗ％として製したものを、１日１回程度注射するのが好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下に、実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらにのみ限定されるべきものではない。
【００３４】
実施例１
ヒト肺胞上皮由来Ａ５４９細胞におけるＣ６４６（化合物番号１）の抗インフルエンザウイルス効果を調べた。ＤＭＳＯで溶解したＣ６４６（５μＭもしくは１０μＭ）をＡ５４９細胞に添加しその１０時間後にウイルスをＭＯＩ＝２もしくは１で感染させた。その際に、ＤＭＳＯは濃度０．１％に維持し、０．４μｇ／ｍＬになるようにＴＰＣＫ−ｔｒｙｐｓｉｎを添加した。経時的（感染６、１２、１８、２４時間後）に培養上精を採取しウイルス力価を測定した。マウスに適応したヒト由来インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の増殖をＣ６４６の濃度依存的に抑制した（図１）。また、同様に２００９年パンデミックウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）の増殖も抑制した（図２）。２００９年パンデミックウイルスと同じく季節性インフルエンザの原因となるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスＡ／Ｔｏｋｙｏ／ＵＴＩＭＳ２−１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）についても検討した結果、Ｃ６４６はウイルスの増殖を抑制することができた（図３）。さらに、高病原性鳥インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）の増殖も抑えたことから（図４）、Ｃ６４６は様々なサブタイプのインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができることが明らかとなった。
近年、抗インフルエンザウイルス薬耐性ウイルスの出現が問題となっている。そこで、オセルタミビル耐性の２００９年パンデミックウイルスＡ／Ｓａｐｐｏｒｏ／１１４／２０１３（Ｈ１Ｎ１）に対するＣ６４６の効果も検討した。その結果、薬剤耐性ウイルスに対しても同等の増殖抑制効果が認められた（図５）。
次に、Ｃ６４６の治療効果を検討するために、Ａ５４９細胞にＭＯＩ＝２でＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を感染後にＣ６４６を５μＭもしくは１０μＭ投与し、感染２４時間後に培養上精中のウイルス力価を測定した。その結果、ウイルス感染５時間後にＣ６４６を添加してもウイルス増殖を抑制することができた（図６）。従って、Ｃ６４６はインフルエンザの予防だけでなく治療効果も期待できる。
【００３５】
実施例２
培養細胞を用いた検討結果から、Ｃ６４６の抗インフルエンザ効果が明らかとなった。そこで、個体レベルでのＣ６４６の抗インフルエンザ効果を検討するために、インフルエンザウイルス感染マウスモデルを用いた。感染４８及び２４時間前に１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇのＣ６４６を経鼻投与し、致死量（５×１０3ＰＦＵ）のＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）をＢＡＬＢ／ｃマウスに感染させた。感染２、２４及び４８時間後にも感染前と同じ量のＣ６４６を経鼻投与した（図７）。Ｃ６４６の個体レベルでのウイルス増殖抑制効果を検討するために、感染３及び６日後の肺におけるウイルス力価をＭＤＣＫ細胞を用いて測定した。その結果、感染後３及び６日ともにＣ６４６投与量依存的に、肺でのウイルス力価の低下を認めた（図８）。従って、Ｃ６４６は個体レベルでもインフルエンザウイルス増殖抑制効果があることが明らかとなった。
また、これらのマウスの体重と生残を連日モニタリングした。Ｃ６４６を投与しなかったマウスは感染９日までに全て死亡したにも関わらず、Ｃ６４６を投与したマウスは、体重減少率の抑制が認められ（図９）、死亡率も低下した（図１０）。また、ＤＭＳＯ単体もしくはＤＭＳＯとＣ６４６のみを投与したマウスでは、体重の減少が認められなかったことから（図９）、今回の動物実験に用いたＣ６４６とＤＭＳＯの投与量ではマウスに対して明らかな毒性はないと考えられる。
【００３６】
実施例３
（１）ＩＣ50アッセイ方法（阻害活性）
ＤＭＳＯで溶解した被験化合物を終濃度で１００μＭ〜１ｎＭとなるようにＡ５４９細胞に添加し、インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株をｍｏｉ＝０．００１で感染させた。感染４８時間後に培養上清中のウイルスの有無をモルモット赤血球を用いてＨＡ価を調べる方法で検出した。被験化合物の１濃度につき３穴で行い、半分の穴にウイルスが無くなる被験化合物濃度をＩＣ50として算出した。
（２）ＣＣ50アッセイ方法（細胞毒性）
ＩＣ50アッセイ方法と同様の方法でＡ５４９細胞に被験化合物を添加し、４８時間後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）を用いて４５０ｎｍの吸光度を指標に生細胞数を測定し、５０％の細胞が死亡する被験化合物濃度をＣＣ50として算出した。
（３）活性化合物判定方法
ＣＣ50値が１００μＭ以上で、かつＩＣ50値より低い被験化合物を活性化合物と判定した。結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
2017218448.tif 000008
【００３８】
表３から明らかなように、一般式（１）で表される化合物は、ｐ３００／ＣＲＥＢ結合タンパクに特異的なヒストンアセチル転移酵素阻害作用に基づき抗インフルエンザウイルス作用を示す。
【図１】
2017218448.tif 000010
【図２】
2017218448.tif 000011
【図３】
2017218448.tif 000012
【図４】
2017218448.tif 000013
【図５】
2017218448.tif 000014
【図６】
2017218448.tif 000015
【図７】
2017218448.tif 000016
【図８】
2017218448.tif 000017
【図９】
2017218448.tif 000018
【図１０】
2017218448.tif 000019