(57)【要約】      （修正有）【課題】膜タンパク質の産生のための、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡと称される修飾ポリヌクレオチドの提供。【解決手段】単離ポリヌクレオチドであって、（ａ）結合ヌクレオシドの第１の領域であって、前記第１の領域が目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチドが特定の配列からなる結合ヌクレオシドの第１の領域と、（ｂ）前記第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域であって、（ｉ）特定の配列からなる、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然５’ＵＴＲからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの５’末端キャップと、を含む、第１の隣接領域と、（ｃ）前記第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域を含む、単離ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ポリヌクレオチドであって、
（ａ）結合ヌクレオシドの第１の領域であって、前記第１の領域が目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチドが配列番号８１４４〜１６１３１からなる群から選択される、結合ヌクレオシドの第１の領域と、
（ｂ）前記第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域であって、
（ｉ）配列番号８１４４〜１６１３１、配列番号１〜４、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然５’ＵＴＲからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つの５’末端キャップと、を含む、第１の隣接領域と、
（ｃ）前記第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域であって、
（ｉ’）配列番号８１４４〜１６１３１、配列番号５〜２１、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然３’ＵＴＲからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
（ｉｉ’）結合ヌクレオシドの３’尾部配列と、を含む、第２の隣接領域と、を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記結合ヌクレオシドの第１の領域が核酸配列の少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列が配列番号１６１３２〜５６１３７からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記結合ヌクレオシドの３’尾部配列が、約１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部およびポリＡ〜Ｇ四重項からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
精製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記結合ヌクレオシドのうちの少なくとも１つが、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドの化学構造と比較して、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１つの前記修飾がヌクレオシド塩基および／または糖部分に位置する、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第１の領域が、式（Ｉａ）：
【化１】
2017121240.tif 000885
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【化２】
2017121240.tif 000886
が、一重または二重結合であり、
【化３】
2017121240.tif 000887
が、一重結合であるか、または不在であり、
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、Ｒ４と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを提供し得、
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任
意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
Ｂが、核酸塩基であり、ＢとＲ１’の組み合わせ、ＢとＲ２’の組み合わせ、ＢとＲ１”の組み合わせ、もしくはＢとＲ２”の組み合わせが、それらが結合する炭素と一緒になって、二環式基を任意に形成し得るか、またはＢとＲ１”とＲ３の組み合わせもしくはＢとＲ２”とＲ３の組み合わせが、三環式もしくは四環式基を任意に形成し得る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｂが、シュードウリジン（ψ）でも５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）でもない、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
Ｕが、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”の各々が、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
Ｒ３およびＲ４の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり、
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Ｙ５が、独立して、Ｏまたは任意に置換されたアルキレンであり、
ｎが、１０〜１０，０００の整数である、請求項８または９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”の各々が、存在する場合、Ｈである、請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”の各々が、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”の各々が、存在する場合、Ｈである、請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”の各々が、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである、請求項１３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記第１の領域が、式（ＩＩａ）：
【化４】
2017121240.tif 000888
を有するｎ個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記第１の領域が、式（ＩＩｂ）もしくは（ＩＩｃ）を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
前記第１の領域が、式（ＩＩｄ）：
【化５】
2017121240.tif 000889
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記第１の領域が、式（ＩＩｅ）もしくは（ＩＩｆ）を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
前記第１の領域が、ｎ個の結合ヌクレオチドであって、前記結合ヌクレオチドの各々が、独立して、式（ＩＩｇ）〜（ＩＩｊ）：
【化６】
2017121240.tif 000890
のうちの１つを有するｎ個の結合ヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記第１の領域が、式（ＩＩｋ）：
【化７】
2017121240.tif 000891
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記第１の領域が、式（ＩＩｌ）：
【化８】
2017121240.tif 000892
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記第１の領域が、式（ＩＩｍ）：
【化９】
2017121240.tif 000893
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、およびＲ２”の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、Ｒ２’とＲ３の組み合わせまたはＲ２”とＲ３の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る、請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
Ｕが、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
Ｒ１およびＲ２の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
Ｒ３およびＲ４の各々が、独立して、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、  
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Ｙ５が、独立して、Ｏまたは任意に置換されたアルキレンであり、
ｎが、１０〜１０，０００の整数である、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記第１の領域が、式（ＩＩｎ）：
【化１０】
2017121240.tif 000894
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Ｕが、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
Ｒ１およびＲ４の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
Ｒ３’が、Ｏ、Ｓ、または−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
Ｒ３”が、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
ｎが、１０〜１０，０００の整数である、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ｎ個のＢにおいて、各Ｂが、独立して、式（ｂ１）〜（ｂ５）：
【化１１】
2017121240.tif 000895
から選択される式、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
式（ｂ１）における、Ｖ１とＶ２を連結する
【化１２】
2017121240.tif 000896
が、一重または二重結合であり、
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’とＴ１”の組み合わせもしくはＴ２’とＴ２”の組み合わせが一緒になって、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し、
Ｖ１およびＶ２の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｂ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｂ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｂが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
Ｒ１０が、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
Ｒ１１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
Ｒ１２ｃが、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項８〜２４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ｎ個のＢが、式（ｂ６）〜（ｂ９）：
【化１３】
2017121240.tif 000897
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
【化１４】
2017121240.tif 000898
が、一重または二重結合であり、
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’とＴ１”の組み合わせもしくはＴ２’とＴ２”の組み合わせが一緒になって、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し、
Ｗ１およびＷ２の各々が、独立して、Ｎ（ＲＷａ）ｎｗまたはＣ（ＲＷａ）ｎｗであり、式中、ｎｗが、０〜２の整数であり、各ＲＷａが、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、
各Ｖ３が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶａ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶａ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶａが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、ＲＶａおよびＲ１２ｃが、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、
Ｒ１２ｂが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノ酸であり、Ｒ１２ｂとＴ１’の組み合わせまたはＲ１２ｂとＲ１２ｃの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
Ｒ１２ｃが、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノアルキルである、請求項８〜２５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、Ｒ１２ｃ、もしくはＲＶａが、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ
２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’で置換され、式中、ｓ１が、１〜１０の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０の整数であり、Ｒ’が、ＨもしくはＣ１〜２０アルキルであるか、または−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１で置換され、式中、ｓ１が、１〜１０の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素もしくは任意に置換されたＣ１〜６アルキルである、請求項２６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ｎ個のＢが、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）：
【化１５】
2017121240.tif 000899
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
Ｔ３’およびＴ３”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ３’とＴ３”の組み合わせが一緒になって、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し、
各Ｖ４が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｃ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｃ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｃが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、Ｒ１３ｂとＲＶｃの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂとＲ１４の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各Ｒ１４が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
Ｒ１５およびＲ１６の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換
されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、請求項８〜２７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ｎ個のＢが、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）：
【化１６】
2017121240.tif 000900
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
Ｔ４’、Ｔ４”、Ｔ５’、Ｔ５”、Ｔ６’、およびＴ６”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｔ４’とＴ４”の組み合わせまたはＴ５’とＴ５”の組み合わせまたはＴ６’とＴ６”の組み合わせが一緒になって、Ｏ、Ｓ、またはＳｅを形成し、
Ｖ５およびＶ６の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｄが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアミノ酸である、請求項７〜２７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ｎ個のＢが、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）：
【化１７】
2017121240.tif 000901
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、
各Ｖ７が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｅ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｅ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｅが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシであり、
各Ｒ２５が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、または任意に置換されたアルコキシであり、
各Ｒ２７が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Ｒ２８が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各Ｒ２９が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノである、請求項８〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
Ｒ２６ａ、Ｒ２６ｂ、またはＲ２９が、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’で置換され、式中、ｓ１が、１〜１０の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０の整数であり、Ｒ’が、ＨもしくはＣ１〜２０アルキル）であるか、または−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１で置換され、式中、ｓ１が、１〜１０の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素もしくは任意に置換されたＣ１〜６アルキルである、請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ｎ個のＢが、式（ｂ２１）：
【化１８】
2017121240.tif 000902
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、
式中、Ｘ１２が、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、ｘａが、０〜３の整数であり、Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、Ｔ２が、Ｏ、Ｓ、またはＳｅである、請求項８〜３１のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
ｎ個のＢが、式（ｂ２２）：
【化１９】
2017121240.tif 000903
、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｒ１０’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、Ｒ１１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、Ｔ１およびＴ２の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＳｅである、請求項８〜３２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
ｎ個のＢが、式（ｂ２３）：
【化２０】
2017121240.tif 000904
を有し、式中、Ｒ１０が、任意に置換されたヘテロシクリルまたは任意に置換されたアリールであり、Ｒ１１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、Ｒ１２ａが、Ｈ、任
意に置換されたアルキル、任意に置換されたアミノアルキルであるか、または不在であり、Ｔ１およびＴ２の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＳｅである、請求項８〜３３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
ｎ個のＢが、式（ｂ２４）：
【化２１】
2017121240.tif 000905
を有し、式中、
Ｔ３が、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂとＲ１４の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
Ｒ１４’が、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
各Ｒ１５が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである、請求項８〜３４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
標的部分をさらに含み、前記標的部分が前記ポリヌクレオチドに共有結合される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記標的部分が、抗体、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、またはアプタマーである、請求項３６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
前記賦形剤が、溶媒、水性溶媒、非水溶媒、分散媒、希釈剤、分散剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、脂質、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、コアシェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックスペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物から選択される、請求項３９に記載の薬学的組
成物。
【請求項４１】
前記薬学的組成物が脂質を含み、前記脂質が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧ化脂質、ならびにこれらの混合物から選択される、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
哺乳類細胞、組織、または生物体において目的とするポリペプチドを産生する方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４３】
前記単離ポリヌクレオチドが製剤化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記製剤が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ化脂質、およびこれらの混合物または組み合わせのうちの１つから選択される脂質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離ポリヌクレオチドが１μｇ〜１５０μｇの総１日用量で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
投与が注入による、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
投与が、皮内もしくは皮下または筋肉内または硝子体内である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも２時間後、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも７２時間後、５０ｐｇ／ｍＬを超えたままである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物の血清中の前記目的とするポリペプチドの濃度が、投与の少なくとも７２時間後、６０ｐｇ／ｍＬを超えたままである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
結果として生じるポリヌクレオチド製剤が、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの平均粒径、０．０２〜０．２０のＰＤＩ、および１０〜２０の脂質：ポリヌクレオチド比（重量／重量）を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳類細胞、組織、または生物体において配列番号８１４４〜１６１３１からなる群から選択される増加した濃度の目的とするポリペプチドを産生するための方法であって、前記細胞、組織、または生物体に、請求項４〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の薬学的組成物の総１日用量を２回以上に均等または不均等に分割された用量で投与することを含む、方法。
【請求項５３】
前記投与に応答して産生されたポリペプチドの濃度が、同一の総１日用量の前記単離ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物を単回投与で投与することによって産生される濃度よりも高い、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類生物体は、増加した濃度の前記目的とするポリペプチドを必要とするヒト患者である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記増加した濃度の前記目的とするポリペプチドが、前記患者の体液中で検出可能である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、ならびに臍帯血からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記体液が血清であり、単位薬物当たり（ＰＵＤ）の前記ポリペプチドが１を超える、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
用量分割因子（ＤＳＦ）が４を超える、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
投与が経皮である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
経皮投与が、パッチ、クリーム、軟膏、機械デバイス、針、スポンジ、デポー、および織物からなる群から選択される１つ以上の要素の利用を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
投与が、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年間にわたって行われる投薬レジメンに従う、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記２回以上に分割された用量が、Ｔ１時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第１の用量と、その後のＴ２時点で投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の第２の用量と、を含み、前記Ｔ１時点および前記Ｔ２時点が、１分より長く隔てられることはなく、前記第１の用量および前記第２の用量が、前記目的とするポリペプチドをもたらす量のポリヌクレオチドまたは薬学的組成物が単回単位用量で一度に投与された場合よりも高い濃度の前記目的とするポリペプチドをもたらす前記量で前記対象に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の複数の用量をＴｎ時点でＮｘ回投与することをさらに含み、式中、ｘおよびｎが、３〜約１０００から独立して選択され、ＴｎとＴｎ＋１との間の時間が、１０秒より長い増分で隔てられることはない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
投与が直接注入により行われる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
直接注入が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、および硝子体内からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の用量が前記第２の用量または複数の用量に対して近位に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の用量が前記第２の用量または複数の用量に対して遠位に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の用量の注入部位と第２の用量または複数の用量のうちのいずれかの注入部位との間の距離が約１ｍｍ〜約１０ｃｍである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
注入が０．１ｍｍ〜約１ｃｍの深度で行われる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
直接注入が、多針注入システム、カテーテルまたは管腔システム、および超音波、電気、または放射線に基づくシステムから選択される１つ以上のデバイスを用いることによって達成される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
任意の用量において投与される前記ポリヌクレオチドまたは薬学的組成物の量が実質的に等しい、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
Ｔ１時点およびＴ２時点が、３０秒より長く隔てられることはない、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
Ｔ１時点およびＴ２時点が、１０秒より長く隔てられることはない、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１の用量、前記第２の用量、および複数の用量のうちのいずれも、実質的に同時に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
前記単回単位用量が約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
前記単回単位用量が約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
前記単回単位用量が約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤を調製する方法であって、第１のエタノール溶液を第２の水溶液中に迅速に注入することを含み、
（ａ）前記第１のエタノール溶液が、５０：１０：３８．５：１．５のモル比をもたらし、かつ約２５ｍＭの最終脂質濃度を有する脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧの混合物を含み、
（ｂ）前記第２の水溶液が、１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度および約３のｐＨを有する前記目的とするポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドのクエン酸ナトリウム緩衝液を含み、
前記迅速な注入が、３３％のエタノールを含有し、かつ少なくとも１０：１の総脂質：ポリヌクレオチドの重量比の懸濁液をもたらす、方法。
【請求項７９】
前記迅速な注入が、手動（ＭＩ）で、またはシリンジポンプ（ＳＰ）を用いてのいずれかで行われる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
結果として生じる懸濁液をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
透析が２回以上行われる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記透析した懸濁液を０．２μｍの滅菌フィルターを通して濾過することをさらに含む
、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記脂質が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧ化脂質からなる群から選択される、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ポリヌクレオチドが、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の方法によって産生され、かつ８０ｎｍ〜１６０ｎｍの粒径、０．０２〜０．２０のＰＤＩ、および１０〜３０の脂質：ポリヌクレオチド比（重量／重量）を有する、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子製剤。
【請求項８６】
前記ポリヌクレオチドが、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項８５に記載の脂質ナノ粒子製剤。
【請求項８７】
ポリヌクレオチドのｒｅＬＮＰ製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、ｒｅＬＮＰ製剤。
【請求項８８】
前記ポリヌクレオチドが請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項８７に記載のｒｅＬＮＰ製剤。
【請求項８９】
ポリヌクレオチドの持続放出製剤であって、前記ポリヌクレオチドが目的とするポリペプチドをコードする、持続放出製剤。
【請求項９０】
前記ポリヌクレオチドが請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから選択される、請求項８９に記載の持続放出製剤。
【請求項９１】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記第１のポリペプチドが、Ｆｃ受容体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＩｇＡドメイン、ＩｇＤドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＤドメイン、ＩｇＭドメイン、ＩｇＶドメイン、ＩｇＣ１ドメイン、ＩｇＣ２ドメイン、およびＩｇＩドメインからなる群から選択され、前記第２のポリペプチドが、目的とするポリペプチドである、請求項９１に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願発明は、ハードコピーの複製の代わりにＣＤ−Ｒで提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「長い」配列表を含む。これは、最初に出願された主題の一部として配列表のテキストファイルを含み、出願された主題は以下の通りである：ファイル名：Ｍ３０５．２０−２０３０．１３０５ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ；ファイルサイズ：１２９，４９５，０４０バイト；作成日：２０１３年３月４日。これらのＣＤ−Ｒは、それぞれ「ＣＲＦ」、「コピー１」及び「コピー２」と呼ばれ、各々は上記で識別された通りに、１つの同一ファイルのみを有する。各ＣＤ−Ｒの機械可読フォーマットはＩＢＭ−ＰＣであり、各コンパクトディスクのオペレーティングシステムはＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）である。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡｓ」、２０１２年１２月１４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ
Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈ
ｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９６１号、表題「Ｄｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ」、２０１２年５月１７日出願の米国仮特許出願第６１／６４８，２８６号、表題「Ｄｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ」に対する優先権を主張するものであり、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、２０１２年１０月３日出願の国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５８５１９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６９６１０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」にも関連する。
【０００４】
本出願は、同時係属出願にも関連し、それぞれ、２０１３年３月９日に本出願と共に同時に出願され、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」の代理人整理番号Ｍ３
００．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、の代理人整理番号第Ｍ３０４．２０号（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」の代理人整理番号Ｍ３０１．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」の代理人整理番号Ｍ３０６．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」の代理人整理番号Ｍ３０８．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」の代理人整理番号Ｍ３０９．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ
Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」の代理人整理番号Ｍ３１０．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」の代理人整理番号ＭＮＣ１．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）、および表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」の代理人整理番号ＭＮＣ２．２０（ＰＣＴ／ＵＳ１３／ＸＸＸＸＸ）を有し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００５】
発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾ｍＲＮＡ分子（ｍｍＲＮＡ）の組成、これらの設計、調製、製造、および／または製剤化の方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。
【背景技術】
【０００６】
タンパク質発現を生じさせる従前の方法には多くの問題がある。例えば、導入されたＤＮＡは、ある頻度で宿主細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれて、宿主細胞ゲノムＤＮＡの変性および／または損傷をもたらし得る。あるいは、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、娘細胞（異種ＤＮＡが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず）に、または子孫に継承され得る。
【０００７】
加えて、適切に送達され、かつ宿主ゲノムの損傷も組み込みもないと仮定して、コードされたタンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、ＤＮＡは、それがＲＮＡ転写される核内に輸送されなければならない。その後、ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。投与されたＤＮＡからタンパク質までの複数の処理ステップが機能タンパク質の生成前に時間差を生み出すだけでなく、各ステップは、細胞のエラーおよび損傷の機会にもなる。さらに、ＤＮＡが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるＤＮＡ発現を達成することが困難であることが知られている。これは、ＤＮＡが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。
【０００８】
１９９０年代初めに、Ｂｌｏｏｍおよび同僚は、インビトロで転写されたバソプレシンｍＲＮＡを視床下部に注入することによってバソプレシン欠乏ラットの救助に成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：９９６−９９８；１９９２）。しかしながら、低レベルの翻訳
および分子の免疫原性が治療薬としてのｍＲＮＡの開発を妨害し、それ以来、むしろこれらの落とし穴を利用し得る代替用途、すなわち、癌抗原をコードするｍＲＮＡでの免疫化に労力を集中させている。
【０００９】
他者は、目的とするポリペプチドを送達するためのｍＲＮＡの使用を研究しており、ｍＲＮＡ分子のある特定の化学修飾、具体的には、シュードウリジンおよび５−メチル−シトシンが免疫刺激作用を低下させたことを示している。
【００１０】
これらの研究は、例えば、Ｒｉｂｏｓｔｅｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄの２００３年７月９日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願第０３１６０８９．２号、国際公開第ＷＯ２００５００５６２２号として公開されている２００４年７月９日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２９８１号、米国特許第ＵＳ２００６０２４７１９５号として公開され、現在は放棄されている２００６年６月８日出願の米国特許出願国内段階登録第１０／５６３，８９７号、および欧州特許ＥＰ１６４６７１４号として公開され、現在撤回されている２００４年７月９日出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００４７４３３２２号；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｉｎｃ．の国際公開第ＷＯ２００８１４０６１５号として公開された２００７年１２月１９日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／８８０６０号、米国特許第ＵＳ２０１０００２８９４３号として公開された２００９年７月２日出願の米国特許出願国内段階登録第１２／５２０，０７２号、および欧州特許第ＥＰ２１０４７３９号として公開された２００９年７月７日出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００７８７４３７６号；ロチェスター大学の国際公開第ＷＯ２００７０６４９５２号として公開された２００６年１２月４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４６１２０号、および米国特許第ＵＳ２００７０１４１０３０号として公開された２００６年１２月１日出願の米国特許出願第１１／６０６，９９５号；ＢｉｏＮＴｅｃｈ  ＡＧの２００７年１２月１４日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願第ＥＰ２００７０２４３１２号、国際公開第ＷＯ２００９０７７１３４号として公開された２００８年１２月１２日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０５９号、欧州特許第ＥＰ２２４０５７２号として公開された２０１０年６月２日出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００８８６１４２３号、米国特許第ＵＳ２０１１００６５１０３号として公開された２０１０年１１月２４日出願の米国特許出願国内段階第１２／，７３５，０６０号、２００５年９月２８日出願の独国特許出願第ＤＥ  １０  ２００５  ０４６  ４９０号、国際公開第ＷＯ２００７０３６３６６号として公開された２００６年９月２８日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０４４８号、２０１２年３月２１日出願の国内段階欧州特許第１９３４３４５号、および第２０１００１２９８７７号として公開された２００９年８月１４日出願の国内段階米国特許出願第１１／９９２，６３８号；Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．の米国特許第ＵＳ２０１２００４６３４６号として公開された２０１１年４月１５日出願の米国特許出願第１３／０８８，００９号および国際公開第ＷＯ２０１１０１３０６２４号として公開された２０１１年４月１５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３２６７９号；Ｓｈｉｒｅ  ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの米国特許第ＵＳ２０１１０２４４０２６号として公開された２０１０年１１月２０日出願の米国特許出願第１２／９５７，３４０号；Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  Ｉｎｃ．の国際公開第ＷＯ１９９９０１４３４６号として公開された１９９８年９月１８日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４９２号；Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの国際公開第ＷＯ２０１００９８８６１号として公開された２０１０年２月２４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００５６７号、および米国特許第ＵＳ２０１２００５３３３３号として公開された２０１１年１１月３日出願の米国特許出願国内段階登録第１３／２０３，２２９号；ルートヴィヒ・マクシミリアン大学の国際公開第ＷＯ２０１１０１２３１６号として公開された２０１０年７月３０日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４６８１号；Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．の２００８年６月３０日に出願され、２０１１年１０月１
８日に許可された米国特許第８，０３９，２１４号、米国特許第ＵＳ２０１１０１４３４３６号として公開された２０１０年１２月７日出願の米国特許出願第１２／９６２，４９８号、米国特許第ＵＳ２０１１０１４３３９７号として公開された２０１０年１２月７日出願の同第１２／９６２，４６８号、米国特許第ＵＳ２０１２０００９６４９号として公開された２０１１年９月２０日出願の同第１３／２３７，４５１号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１１０７１９３１号として公開された２０１０年１２月７日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３０５、および国際公開第ＷＯ２０１１０７１９３６号として公開された２０１０年１２月７日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３１７号；ペンシルベニア大学理事会の国際公開第ＷＯ２００７０２４７０８号として公開された２００６年８月２１日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／３２３７２号、および米国特許第ＵＳ２００９０２８６８５２号として公開された２００９年３月２７日出願の米国特許出願国内段階第１１／９９０，６４６号；Ｃｕｒｅｖａｃ  ＧＭＢＨの２００１年６月５日出願の独国特許出願第ＤＥ１０  ２００１  ０２７  ２８３．９号、２００１年１２月１９日出願の同第ＤＥ１０  ２００１  ０６２  ４８０．８号、および２００６年１０月３１日出願の同第ＤＥ  ２０  ２００６  ０５１  ５１６号（これらすべて放棄されている）、２００５年３月３０日に許可された欧州特許第ＥＰ１３９２３４１号、および２００８年１月２日に許可された欧州特許第ＥＰ１４５８４１０号、国際公開第ＷＯ２００２０９８４４３号として公開された２００２年６月５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００２／０６１８０号、国際公開第ＷＯ２００３０５１４０１号として公開された２００２年１２月１９日出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００２／１４５７７号、国際公開第ＷＯ２００８０５２７７０号として公開された２００７年１２月３１日出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０９４６９号、国際公開第ＷＯ２００９１２７２３０号として公開された２００８年４月１６日出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０３０３３号、国際公開第ＷＯ２００６１２２８２８号として公開された２００５年５月１９日出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４７８４号、国際公開第ＷＯ２００８０８３９４９号として公開された２００７年１月９日出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００８１号、ならびに米国特許第ＵＳ２００５００３２７３０号として公開された２００３年１２月５日出願の米国特許出願第１０／７２９，８３０号、米国特許第ＵＳ２００５００５９６２４号として公開された２００４年６月１８日出願の同第１０／８７０，１１０号、米国特許第ＵＳ２００８０２６７８７３号として公開された２００８年７月７日出願の同第１１／９１４，９４５号、米国特許第ＵＳ２０１００４７２６１号として公開され、現在は放棄されている２００９年１０月２７日出願の同第１２／４４６，９１２号、米国特許第ＵＳ２０１００１８９７２９号として公開された２０１０年１月４日出願の同第１２／５２２，２１４号、米国特許第ＵＳ２０１１００７７２８７号として公開された２０１０年５月２６日出願の同第１２／７８７，５６６��、米国特許第ＵＳ２０１００２３９６０８号として公開された２０１０年５月２６日出願の同第１２／７８７，７５５号、米国特許第ＵＳ２０１１０２６９９５０号として公開された２０１１年７月１８日出願の同第１３／１８５，１１９号、および米国特許第ＵＳ２０１１０３１１４７２号として公開された２０１１年５月１２日出願の同第１３／１０６，５４８号に記載されており、これらはすべて、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００１１】
シュードウリジンおよび５−メチル−シトシンを含む化学修飾の選択に限定されているこれらの報告書にもかかわらず、細胞内翻訳の効果的な調節およびポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の処理を取り巻く無数の障壁に対処する治療法が当技術分野において依然として必要とされている。
【００１２】
この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾ｍＲＮＡ配列が、単に免疫応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬としての可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、２０１１年８月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６８６１号および２０１
１年１０月３日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６３６号、２０１１年１０月３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６１７号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本発明は、目的とするポリペプチド（例えば、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）をコードし、当技術分野における課題のうちの１つ以上を回避する構造的および／または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期、および／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および／または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供することによって、この必要性に対処する。
【発明の概要】
【００１４】
修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子の組成、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子の設計、調製、製造、および／または製剤化方法、プロセス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。
【００１５】
本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【００１６】
前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一次構築物の概略図である。
【図２−１】本発明において有用な先行技術における脂質構造を図示する。９８Ｎ１２−５（ＴＥＴＡ５−ＬＡＰ）、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、およびＣ１２−２００の構造を示す。
【図２−２】同上。
【図３】本明細書に教示されるＩＶＴ反応において有用な代表的なプラスミドである。このプラスミドは、本発明者らによって設計された挿入物６４８１８を含有する。
【図４】ＰＬＧＡマイクロスフェアにカプセル封入された修飾ｍＲＮＡのゲルプロファイルである。
【図５】第ＩＸ因子タンパク質産生ＰＬＧＡ製剤第ＩＸ因子修飾ｍＲＮＡのヒストグラムである。
【図６−１】様々な用量での修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション後のヒトケラチノサイト細胞におけるＶＥＧＦタンパク質産生を示すヒストグラムである。図６Ａは、天然ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）を含む修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
【図６−２】図６Ｂは、シュードウリジン（シュードＵ）および５−メチルシトシン（５ｍＣ）で完全に修飾された修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
【図６−３】図６Ｃは、Ｎ１−メチル−シュードウリジン（Ｎ１−メチル−シュードＵ）および５−メチルシトシン（５ｍＣ）で完全に修飾された修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦタンパク質産生のヒストグラムである。
【図８−１】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＶＥＧＦ修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション後のＶＥＧＦ発現およびＩＦＮ−α誘導のヒストグラムである。図８Ａは、ＶＥＧＦ発現を示す。
【図８−２】図８Ｂは、ＩＦＮ−α誘導を示す。
【図９】ＶＥＧＦ修飾ｍＲＮＡからのＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦタンパク質産生のヒストグラムである。
【図１０】マウスにおけるリポプレックス化ＶＥＧＦ修飾ｍＲＮＡからのＶＥＧＦタンパク質産生のヒストグラムである。
【図１１】Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡからのＨｅＬａ細胞におけるＧ−ＣＳＦタンパク質産生のヒストグラムである。
【図１２】第ＩＸ因子修飾ｍＲＮＡからのＨｅＬａ細胞上清における第ＩＸ因子タンパク質産生のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
治療薬、診断、試薬の分野、および生物学的アッセイにおいて、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされた目的とするポリペプチドの産生を引き起こすために、インビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）を送達することができることは大変興味深いことである。非組み込みポリヌクレオチドの送達および機能が特に重要である。
【００１９】
１個以上の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組成物（薬学的組成物を含む）、ならびにその設計、調製、製造、および／または製剤化方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択、設計、および／または利用するためのシステム、プロセス、デバイス、およびキットも提供される。
【００２０】
本発明に従って、これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野の他のポリペプチドをコードする分子の欠陥を回避するように修飾される。したがって、これらのポリヌクレオチドは、修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡと称される。
【００２１】
抗体、ウイルス、獣医学における適用の分野、および様々なインビボ環境における修飾ポリヌクレオチドの使用が本発明者らによって研究されており、これらの研究は、例えば、同時係属および共同所有の、ｍｍＲＮＡのインビボ適用を教示する２０１１年３月３１日出願の米国仮特許出願第６１／４７０，４５１号；抗体ポリペプチドの産生のために操作された核酸を教示する２０１１年４月２６日出願の同第６１／５１７，７８４号；ｍｍＲＮＡ技術の獣医学における適用を教示する２０１１年５月１７日出願の同第６１／５１９，１５８号；ｍｍＲＮＡ技術の抗菌剤における適用を教示する２０１１年９月１２日出願の同第６１／５３３，５３７号；ｍｍＲＮＡ技術のウイルス適用を教示する２０１１年９月１２日出願の同第６１／５３３，５５４号；ｍｍＲＮＡ技術で用いる様々な化学修飾を教示する２０１１年１０月３日出願の同第６１／５４２，５３３号；ｍｍＲＮＡ技術の作製および使用で用いるモバイルデバイスを教示する２０１１年１２月１４日出願の同第６１／５７０，６９０号；救急治療状況下でのｍｍＲＮＡの使用を教示する２０１１年１２月１４日出願の同第６１／５７０，７０８号；ｍｍＲＮＡの末端修飾構造を教示する２０１１年１２月１６日出願の同第６１／５７６，６５１号；リピドイドを用いたｍｍＲＮＡの送達方法を教示する２０１１年１２月１６日出願の同第６１／５７６，７０５号；ｍｍＲＮＡを用いて器官または組織の生存率を増加させるための方法を教示する２０１１年１２月２１日出願の同第６１／５７８，２７１号；細胞透過性ペプチドをコードするｍｍＲＮＡを教示する２０１１年１２月２９日出願の同第６１／５８１，３２２号；ｍｍＲＮＡへの細胞傷害性ヌクレオシドの組み込みを教示する２０１１年１２月２９日出願の同第６１／５８１，３５２号；および血液脳関門を横断するためにｍｍＲＮＡを用いる方法を
教示する２０１２年１月１０日出願の同６１／６３１，７２９号に開示されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００２２】
組織における安定性および／もしくは排除、受容体の取り込みおよび／もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、ｍＲＮＡ半減期、翻訳の効率、免疫回避、タンパク質産生能力、分泌の効率（適用される場合）、血液循環への到達可能性、タンパク質半減期、ならびに／または細胞の状態、機能、および／もしくは活性の調節のうちの１つ以上を改善するように設計された、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡが本明細書の一部分に提供される。
【００２３】
Ｉ．本発明の組成物（ｍｍＲＮＡ）
本発明は、１個以上の目的とするポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示の核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
好ましい実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用するとき、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、目的とするポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボで、コードされた目的とするポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
【００２５】
従来、ｍＲＮＡ分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む、有用な特性をポリヌクレオチドに付与する１つ以上の構造および／もしくは化学修飾または改変を含むポリヌクレオチドまたは一次ＲＮＡ構築物を提供することによって従来のｍＲＮＡ分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子は、「ｍｍＲＮＡ」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、２個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
【００２６】
ｍｍＲＮＡ構造
本発明のｍｍＲＮＡは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および／または構造的設計特徴において野生型ｍＲＮＡと区別される。
【００２７】
図１は、本発明の代表的なポリヌクレオチド一次構築物１００を示す。本明細書で使用するとき、「一次構築物」または「一次ｍＲＮＡ構築物」という用語は、１個以上の目的とするポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および／または化学的特徴を保持する、ポリヌクレオチド転写物を指す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、一次構築物は、ｍｍＲＮＡと称され得る。
【００２８】
図１を参照して、ここで、一次構築物１００は、第１の隣接領域１０４および第２の隣接領域１０６に隣接する結合ヌクレオチド１０２の第１の領域を含有する。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。この第１の領域は、コードされた目的とするポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とするポリペプチドは、その５’末端に、シグナル配列領域１０３によってコードされた１つ以上のシグナル配列を含み得る。隣接領域１０４は、１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０４は、５’末端キャップ１０８も含み得る。第２の隣接領域１０６は、１つ以上の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０６は、３’尾部配列１１０も含み得る。
【００２９】
第１の領域１０２と第１の隣接領域１０４の５’末端の架橋は、第１の操作領域１０５である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
【００３０】
第１の領域１０２と第２の隣接領域１０６の３’末端の架橋は、第２の操作領域１０７である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続終止コドンも使用され得る。
【００３１】
概して、本発明の一次構築物の第１の領域の最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態において、この長さは、２〜３０個のアミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０個のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５、もしくは３０個のアミノ酸のペプチド、または４０個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１、もしくは１０個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
概して、本発明の目的とするポリペプチドをコードする第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、もしくは１００，０００ヌクレオチド長（１００，０００を含む）まで、またはそれらを超える）。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約１００，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、および２，０００〜１００，０００個）を含む。
【００３４】
本発明に従って、第１および第２の隣接領域は、独立して、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、および９００を超えるヌクレオチド長、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、および１，０００ヌクレオチド長）であり得る。
【００３５】
本発明に従って、尾部配列は、０〜５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド長）であり得る。尾部領域がポリＡ尾部である場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決定され得る。この実施形態において、ポリＡ尾部は、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質の単量体は、一続きの約３８個のヌクレオチドに結合する。したがって、約８０個のヌクレオチドおよび１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部が機能的であることが観察されている。
【００３６】
本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、もしくは１０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である。
【００３７】
本発明に従って、第１および第２の操作領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０の範囲、１５、または少なくとも４、もしくは３０以下のヌクレオチド長であり得、開始コドンおよび／または終止コドンに加えて、１つ以上のシグナルおよび／または制限配列を含み得る。
【００３８】
環状ｍｍＲＮＡ
本発明に従って、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路、すなわち１）化学的経路、２）酵素的経路、および３）リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された５’／３’連結は、分子内または分子間であり得る。
【００３９】
第１の経路において、核酸の５’末端および３’末端は、接近しているときに分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有する。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳ−エステル部分上で求核攻撃を経て新たな５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応基を含有し得、３’末端は、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
【００４０】
第２の経路において、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素結合させて、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。反応の例において、１μｇの核酸分子が、製造業者のプロトコルに従って、１〜１０単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と３７℃で１時間インキュベートされる。連結反応が、５’領域および３’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂したオリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。
【００４１】
第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端または３’末端のいずれかは、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、Ｉ群イントロン、Ｉ群イントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得るか、またはＳＥＬＥＸ（試験管内進化法、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間かかり得る。
【００４２】
ｍｍＲＮＡ多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、ＨｅｐＧ２細胞に１：１の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種に３’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種にＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて転写後に添加される。３’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら２個のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
【００４３】
別の例において、３個以上のポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用いて結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３等）を含有して３’−官能化ｍＲＮＡ分子上の同族部分（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）と反応するように化学修飾され得る。この
修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御されて、複合体化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの化学量論比を直接制御し得る。
【００４４】
ｍｍＲＮＡ複合体および組み合わせ
タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
【００４５】
複合体化は、安定性および／または半減期の増加をもたらし得、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを、細胞、組織、または生物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。
【００４６】
本発明に従って、ｍｍＲＮＡまたは一次構築物は、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、もしくはベクター等のうちの１つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。
【００４７】
二機能性ｍｍＲＮＡ
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド（例えば、二機能性一次構築物または二機能性ｍｍＲＮＡ）である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有するか、または少なくとも２つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
【００４８】
二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能は、ＲＮＡによってコードされ得る（この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない）か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら２つの機能は、ｍｍＲＮＡおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。
【００４９】
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性ペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長であり得る。それらは、５〜４０、１０〜３０、または約１５アミノ酸長であり得る。それらは、一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の多ユニット構造を形成し得る。
【００５０】
非コードポリヌクレオチドおよび一次構築物
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コ
ード領域は、一次構築物の「第１の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第１の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等の１つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの１つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における１つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、１個以上の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡもしくはｌｉｎｃＲＮＡ）もしくはその部分、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＰｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
【００５１】
目的とするポリペプチド
本発明に従って、一次構築物は、１個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、１個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約５０個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【００５２】
「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。通常、変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用するとき、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する１個以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび／またはホスホロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換としての機能を果たし得る。
【００５４】
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第２の配列のアミノ酸配列内の残
基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合（％）と定義される。整列させるための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得ることが理解される。
【００５５】
「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列に対してかなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
【００５６】
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持する、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。
【００５７】
本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ／または変化した分子を指す。
【００５８】
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に対して置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得る（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にする。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持体に結合され得る。
【００５９】
「置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の１個のアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の２個以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存置換の例には、イソロイシン、バリン、およびロイシン等の非極性（疎水性）残基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性（親水性）残基の別の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性（親水性）残基との置換、および／または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。
【００６１】
「挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、１個以上のアミノ酸が天然配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。
【００６２】
「欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列内の１個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、１個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。
【００６３】
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物学的活性、免疫学的アッセイ、または調製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度の実験なく行われる。
【００６４】
ある特定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産生されたポリペプチドに存在し得る。
【００６５】
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））。
【００６６】
「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本発明のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００６７】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
【００６８】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。
【００６９】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。
【００７０】
本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、１、２、または３個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
【００７１】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させる場合、これは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。Ｏｌｉｖａらは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを特定している（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６６（４）：８１４−８３０；１９９７）。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含み得るか、またはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ  ａｇｅｎｔ）等の非タンパク質系のものであり得る。
【００７２】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ループと特定されたループは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ループをもたらし得る。
【００７３】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質間の相互作用の部位としての役割を果たす）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【００７４】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る）ことも理解される。
【００７５】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、アミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【００７６】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第１または最終部位に限定されるだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、Ｎ末端（アミノ酸によって遊離アミノ基（ＮＨ２）で終端する）もＣ末端（アミノ酸に
よって遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）で終端する）もいずれも有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖から成り得る。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終了するように修飾され得る。
【００７７】
これらの特徴のうちのいずれかが本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作および／または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす。
【００７８】
修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。
【００７９】
本発明に従って、ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、１つ以上の部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。
【００８０】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的とするポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片（少なくとも１個のアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する）が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一の一続きの約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００個のアミノ酸を含む任意のタンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の変異を含む。
【００８１】
コードされたポリペプチド
本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはいかなる治療指標も特定されていないにもかかわらず、研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これらに限定されないいくつかの標的カテゴリーのうちのいずれかから選択される目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。
【００８２】
一実施形態において、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、別の配列の設計において参照される野生型配列または任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、本明細書に開示の配列番号８１４４〜１６１３１のうちのいずれか１つ、例えば、配列番号８１４４、８１４５、８１４６、８１４７、８１４８、８１４９、８１５０
、８１５１、８１５２、８１５３、８１５４、８１５５、８１５６、８１５７、８１５８、８１５９、８１６０、８１６１、８１６２、８１６３、８１６４、８１６５、８１６６、８１６７、８１６８、８１６９、８１７０、８１７１、８１７２、８１７３、８１７４、８１７５、８１７６、８１７７、８１７８、８１７９、８１８０、８１８１、８１８２、８１８３、８１８４、８１８５、８１８６、８１８７、８１８８、８１８９、８１９０、８１９１、８１９２、８１９３、８１９４、８１９５、８１９６、８１９７、８１９８、８１９９、８２００、８２０１、８２０２、８２０３、８２０４、８２０５、８２０６、８２０７、８２０８、８２０９、８２１０、８２１１、８２１２、８２１３、８２１４、８２１５、８２１６、８２１７、８２１８、８２１９、８２２０、８２２１、８２２２、８２２３、８２２４、８２２５、８２２６、８２２７、８２２８、８２２９、８２３０、８２３１、８２３２、８２３３、８２３４、８２３５、８２３６、８２３７、８２３８、８２３９、８２４０、８２４１、８２４２、８２４３、８２４４、８２４５、８２４６、８２４７、８２４８、８２４９、８２５０、８２５１、８２５２、８２５３、８２５４、８２５５、８２５６、８２５７、８２５８、８２５９、８２６０、８２６１、８２６２、８２６３、８２６４、８２６５、８２６６、８２６７、８２６８、８２６９、８２７０、８２７１、８２７２、８２７３、８２７４、８２７５、８２７６、８２７７、８２７８、８２７９、８２８０、８２８１、８２８２、８２８３、８２８４、８２８５、８２８６、８２８７、８２８８、８２８９、８２９０、８２９１、８２９２、８２９３、８２９４、８２９５、８２９６、８２９７、８２９８、８２９９、８３００、８３０１、８３０２、８３０３、８３０４、８３０５、８３０６、８３０７、８３０８、８３０９、８３１０、８３１１、８３１２、８３１３、８３１４、８３１５、８３１６、８３１７、８３１８、８３１９、８３２０、８３２１、８３２２、８３２３、８３２４、８３２５、８３２６、８３２７、８３２８、８３２９、８３３０、８３３１、８３３２、８３３３、８３３４、８３３５、８３３６、８３３７、８３３８、８３３９、８３４０、８３４１、８３４２、８３４３、８３４４、８３４５、８３４６、８３４７、８３４８、８３４９、８３５０、８３５１、８３５２、８３５３、８３５４、８３５５、８３５６、８３５７、８３５８、８３５９、８３６０、８３６１、８３６２、８３６３、８３６４、８３６５、８３６６、８３６７、８３６８、８３６９、８３７０、８３７１、８３７２、８３７３、８３７４、８３７５、８３７６、８３７７、８３７８、８３７９、８３８０、８３８１、８３８２、８３８３、８３８４、８３８５、８３８６、８３８７、８３８８、８３８９、８３９０、８３９１、８３９２、８３９３、８３９４、８３９５、８３９６、８３９７、８３９８、８３９９、８４００、８４０１、８４０２、８４０３、８４０４、８４０５、８４０６、８４０７、８４０８、８４０９、８４１０、８４１１、８４１２、８４１３、８４１４、８４１５、８４１６、８４１７、８４１８、８４１９、８４２０、８４２１、８４２２、８４２３、８４２４、８４２５、８４２６、８４２７、８４２８、８４２９、８４３０、８４３１、８４３２、８４３３、８４３４、８４３５、８４３６、８４３７、８４３８、８４３９、８４４０、８４４１、８４４２、８４４３、８４４４、８４４５、８４４６、８４４７、８４４８、８４４９、８４５０、８４５１、８４５２、８４５３、８４５４、８４５５、８４５６、８４５７、８４５８、８４５９、８４６０、８４６１、８４６２、８４６３、８４６４、８４６５、８４６６、８４６７、８４６８、８４６９、８４７０、８４７１、８４７２、８４７３、８４７４、８４７５、８４７６、８４７７、８４７８、８４７９、８４８０、８４８１、８４８２、８４８３、８４８４、８４８５、８４８６、８４８７、８４８８、８４８９、８４９０、８４９１、８４９２、８４９３、８４９４、８４９５、８４９６、８４９７、８４９８、８４９９、８５００、８５０１、８５０２、８５０３、８５０４、８５０５、８５０６、８５０７、８５０８、８５０９、８５１０、８５１１、８５１２、８５１３、８５１４、８５１５、８５１６、８５１７、８５１８、８５１９、８５２０、８５２１、８５２２、８５２３、８５２４、８５２５、８５２６、８５２７、８５２８、８５２９、８５３０、８５３１、８５３２、８５３３、８５３４、８５３５、８５３６、８５３７、８５３８、８５３９、８５４０、８５４１、８５４２、８５４３、８５４４、８５４５、８５４６、８５４７、８５４８、８５４９、８５５０
、８５５１、８５５２、８５５３、８５５４、８５５５、８５５６、８５５７、８５５８、８５５９、８５６０、８５６１、８５６２、８５６３、８５６４、８５６５、８５６６、８５６７、８５６８、８５６９、８５７０、８５７１、８５７２、８５７３、８５７４、８５７５、８５７６、８５７７、８５７８、８５７９、８５８０、８５８１、８５８２、８５８３、８５８４、８５８５、８５８６、８５８７、８５８８、８５８９、８５９０、８５９１、８５９２、８５９３、８５９４、８５９５、８５９６、８５９７、８５９８、８５９９、８６００、８６０１、８６０２、８６０３、８６０４、８６０５、８６０６、８６０７、８６０８、８６０９、８６１０、８６１１、８６１２、８６１３、８６１４、８６１５、８６１６、８６１７、８６１８、８６１９、８６２０、８６２１、８６２２、８６２３、８６２４、８６２５、８６２６、８６２７、８６２８、８６２９、８６３０、８６３１、８６３２、８６３３、８６３４、８６３５、８６３６、８６３７、８６３８、８６３９、８６４０、８６４１、８６４２、８６４３、８６４４、８６４５、８６４６、８６４７、８６４８、８６４９、８６５０、８６５１、８６５２、８６５３、８６５４、８６５５、８６５６、８６５７、８６５８、８６５９、８６６０、８６６１、８６６２、８６６３、８６６４、８６６５、８６６６、８６６７、８６６８、８６６９、８６７０、８６７１、８６７２、８６７３、８６７４、８６７５、８６７６、８６７７、８６７８、８６７９、８６８０、８６８１、８６８２、８６８３、８６８４、８６８５、８６８６、８６８７、８６８８、８６８９、８６９０、８６９１、８６９２、８６９３、８６９４、８６９５、８６９６、８６９７、８６９８、８６９９、８７００、８７０１、８７０２、８７０３、８７０４、８７０５、８７０６、８７０７、８７０８、８７０９、８７１０、８７１１、８７１２、８７１３、８７１４、８７１５、８７１６、８７１７、８７１８、８７１９、８７２０、８７２１、８７２２、８７２３、８７２４、８７２５、８７２６、８７２７、８７２８、８７２９、８７３０、８７３１、８７３２、８７３３、８７３４、８７３５、８７３６、８７３７、８７３８、８７３９、８７４０、８７４１、８７４２、８７４３、８７４４、８７４５、８７４６、８７４７、８７４８、８７４９、８７５０、８７５１、８７５２、８７５３、８７５４、８７５５、８７５６、８７５７、８７５８、８７５９、８７６０、８７６１、８７６２、８７６３、８７６４、８７６５、８７６６、８７６７、８７６８、８７６９、８７７０、８７７１、８７７２、８７７３、８７７４、８７７５、８７７６、８７７７、８７７８、８７７９、８７８０、８７８１、８７８２、８７８３、８７８４、８７８５、８７８６、８７８７、８７８８、８７８９、８７９０、８７９１、８７９２、８７９３、８７９４、８７９５、８７９６、８７９７、８７９８、８７９９、８８００、８８０１、８８０２、８８０３、８８０４、８８０５、８８０６、８８０７、８８０８、８８０９、８８１０、８８１１、８８１２、８８１３、８８１４、８８１５、８８１６、８８１７、８８１８、８８１９、８８２０、８８２１、８８２２、８８２３、８８２４、８８２５、８８２６、８８２７、８８２８、８８２９、８８３０、８８３１、８８３２、８８３３、８８３４、８８３５、８８３６、８８３７、８８３８、８８３９、８８４０、８８４１、８８４２、８８４３、８８４４、８８４５、８８４６、８８４７、８８４８、８８４９、８８５０、８８５１、８８５２、８８５３、８８５４、８８５５、８８５６、８８５７、８８５８、８８５９、８８６０、８８６１、８８６２、８８６３、８８６４、８８６５、８８６６、８８６７、８８６８、８８６９、８８７０、８８７１、８８７２、８８７３、８８７４、８８７５、８８７６、８８７７、８８７８、８８７９、８８８０、８８８１、８８８２、８８８３、８８８４、８８８５、８８８６、８８８７、８８８８、８８８９、８８９０、８８９１、８８９２、８８９３、８８９４、８８９５、８８９６、８８９７、８８９８、８８９９、８９００、８９０１、８９０２、８９０３、８９０４、８９０５、８９０６、８９０７、８９０８、８９０９、８９１０、８９１１、８９１２、８９１３、８９１４、８９１５、８９１６、８９１７、８９１８、８９１９、８９２０、８９２１、８９２２、８９２３、８９２４、８９２５、８９２６、８９２７、８９２８、８９２９、８９３０、８９３１、８９３２、８９３３、８９３４、８９３５、８９３６、８９３７、８９３８、８９３９、８９４０、８９４１、８９４２、８９４３、８９４４、８９４５、８９４６、８９４７、８９４８、８９４９、８９５０
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７４０、１５７４１、１５７４２、１５７４３、１５７４４、１５７４５、１５７４６、１５７４７、１５７４８、１５７４９、１５７５０、１５７５１、１５７５２、１５７５３、１５７５４、１５７５５、１５７５６、１５７５７、１５７５８、１５７５９、１５７６０、１５７６１、１５７６２、１５７６３、１５７６４、１５７６５、１５７６６、１５７６７、１５７６８、１５７６９、１５７７０、１５７７１、１５７７２、１５７７３、１５７７４、１５７７５、１５７７６、１５７７７、１５７７８、１５７７９、１５７８０、１５７８１、１５７８２、１５７８３、１５７８４、１５７８５、１５７８６、１５７８７、１５７８８、１５７８９、１５７９０、１５７９１、１５７９２、１５７９３、１５７９４、１５７９５、１５７９６、１５７９７、１５７９８、１５７９９、１５８００、１５８０１、１５８０２、１５８０３、１５８０４、１５８０５、１５８０６、１５８０７、１５８０８、１５８０９、１５８１０、１５８１１、１５８１２、１５８１３、１５８１４、１５８１５、１５８１６、１５８１７、１５８１８、１５８１９、１５８２０、１５８２１、１５８２２、１５８２３、１５８２４、１５８２５、１５８２６、１５８２７、１５８２８、１５８２９、１５８３０、１５８３１、１５８３２、１５８３３、１５８３４、１５８３５、１５８３６、１５８３７、１５８３８、１５８３９、１５８４０、１５８４１、１５８４２、１５８４３、１５８４４、１５８４５、１５８４６、１５８４７、１５８４８、１５８４９、１５８５０、１５８５１、１５８５２、１５８５３、１５８５４、１５８５５、１５８５６、１５８５７、１５８５８、１５８５９、１５８６０、１５８６１、１５８６２、１５８６３、１５８６４、１５８６５、１５８６６、１５８６７、１５８６８、１５８６９、１５８７０、１５８７１、１５８７２、１５８７３、１５８７４、１５８７５、１５８７６、１５８７７、１５８７８、１５８７９、１５８８０、１５８８１、１５８８２、１５８８３、１５８８４、１５８８５、１５８８６、１５８８７、１５８８８、１５８８９、１５８９０、１５８９１、１５８９２、１５８９３、１５８９４、１５８９５、１５８９６、１５８９７、１５８９８、１５８９９、１５９００、１５９０１、１５９０２、１５９０３、１５９０４、１５９０５、１５９０６、１５９０７、１５９０８、１５９０９、１５９１０、１５９１１、１５９１２、１５９１３、１５９１４、１５９１５、１５９１６、１５９１７、１５９１８、１５９１９、１５９２０、１５９２１、１５９２２、１５９２３、１５９２４、１５９２５、１５９２６、１５９２７、１５９２８、１５９２９、１５９３０、１５９３１、１５９３２、１５９３３、１５９３４、１５９３５、１５９３６、１５９３７、１５９３８、１５９３９、１５９４０、１５９４１、１５９４２、１５９４３、１５９４４、１５９４５、１５９４６、１５９４７、１５９４８、１５９４９、１５９５０、１５９５１、１５９５２、１５９５３、１５９５４、１５９５５、１５９５６、１５９５７、１５９５８、１５９５９、１５９６０、１５９６１、１５９６２、１５９６３、１５９６４、１５９６５、１５９６６、１５９６７、１５９６８、１５９６９、１５９７０、１５９７１、１５９７２、１５９７３、１５９７４、１５９７５、１５９７６、１５９７７、１５９７８、１５９７９、１５９８０、１５９８１、１５９８２、１５９８３、１５９８４、１５９８５、１５９８６、１５９８７、１５９８８、１５９８９、１５９９０、１５９９１、１５９９２、１５９９３、１５９９４、１５９９５、１５９９６、１５９９７、１５９９８、１５９９９、１６０００、１６００１、１６００２、１６００３、１６００４、１６００５、１６００６、１６００７、１６００８、１６００９、１６０１０、１６０１１、１６０１２、１６０１３、１６０１４、１６０１５、１６０１６、１６０１７、１６０１８、１６０１９、１６０２０、１６０２１、１６０２２、１６０２３、１６０２４、１６０２５、１６０２６、１６０２７、１６０２８、１６０２９、１６０３０、１６０３１、１６０３２、１６０３３、１６０３４、１６０３５、１６０３６、１６０３７、１６０３８、１６０３９、１６０４０、１６０４１、１６０４２、１６０４３、１６０４４、１６０４５、１６０４６、１６０４７、１６０４８、１６０４９、１６０５０、１６０５１、１６０５２、１６０５３、１６０５４、１６０５５、１６０５６、１６０５７、１６０５８、１６０５９、１６０６０、１６０６１、１６０６２、１６０６３、１６０６４、１６０６５、１６０６６、１６０６７、１６０６８、１６０６９、１６０７０、１６０７１、１６０７２、１６０７
３、１６０７４、１６０７５、１６０７６、１６０７７、１６０７８、１６０７９、１６０８０、１６０８１、１６０８２、１６０８３、１６０８４、１６０８５、１６０８６、１６０８７、１６０８８、１６０８９、１６０９０、１６０９１、１６０９２、１６０９３、１６０９４、１６０９５、１６０９６、１６０９７、１６０９８、１６０９９、１６１
００、１６１０１、１６１０２、１６１０３、１６１０４、１６１０５、１６１０６、１６１０７、１６１０８、１６１０９、１６１１０、１６１１１、１６１１２、１６１１３、１６１１４、１６１１５、１６１１６、１６１１７、１６１１８、１６１１９、１６１２０、１６１２１、１６１２２、１６１２３、１６１２４、１６１２５、１６１２６、１６１２７、１６１２８、１６１２９、１６１３０、１６１３１のうちのいずれかであり得る。
【００８３】
当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される２個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、２個以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されるギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合（％）を測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照ポリペプチドと比較して変化（例えば、増加または減少）した活性を有し得る。概して、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形は、本明細書に記載され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、ＢＬＡＳＴプログラム一式を含む（Ｓｔｅｐｈｅｎ
Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ
Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ
ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂｅｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
【００８５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、線形ギャップコストを含む。任意のフィルター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用され得る。
【００８６】
生物製剤
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の生物製剤をコードし得る。本明細書で使用するとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法によって産生され、かつ重病もしくは命にかかわる疾患または病状を治療、治癒、軽減、予防、または診断するために用いられ得るポリペプチド系分子である。生物製剤には、本発明に従って、アレルゲン抽出物（例えば、アレルギー注射および試験用）、血液成分、遺伝子治療産物、移植に用いられるヒト組織または細胞産物、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、ならびに免疫調節因子等が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の１つ以上の生物製剤が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的には、特異性、純度、および／または構築物設計の選択性により、既知の生物製剤をコードするポリヌクレオチドの本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
【００８８】
抗体
本明細書に開示の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１個以上の抗体またはその断片をコードし得る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、および一本鎖分子）、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は、本明細書において「抗体」と同義に使用される。本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一であるその集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。
【００８９】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片を明確に含む。本明細書における目的とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれるが、これに限定されない。
【００９０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二特異性抗体；線形抗体；ナノボディ；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。
【００９１】
α、δ、ε、γ、およびμと指定される重鎖を含む、それぞれ、免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つのクラスのうちのいずれかが本発明のｍｍＲＮＡによってコードされ得る。サブクラス、γおよびμをコードするポリヌクレオ
チド配列も含まれる。したがって、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を含む抗体のサブクラスのうちのいずれかが、部分的または全体的にコードされ得る。
【００９２】
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の１個以上の抗体または断片が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、およびｍｍＲＮＡ設計の選択性により、本発明の一次構築物への組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいてコードされる抗体を利用して、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科学、内分泌学、胃腸、医療画像、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
【００９４】
一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、モノクローナル抗体および／またはその変異形をコードし得る。抗体の変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および／または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。別の実施形態において、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、変異形免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。非限定的な例として、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２１７，１４７号に記載の変異形免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体をコードし得る。
【００９５】
ワクチン
本明細書に開示の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１個以上のワクチンをコードし得る。本明細書で使用するとき、「ワクチン」は、特定の疾患または感染体に対する免疫を高める生物学的調製物である。本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の１個以上のワクチンが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいてコードされるワクチンを利用して、心臓血管、ＣＮＳ、皮膚科学、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
【００９７】
治療用タンパク質またはペプチド
本明細書に開示の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１個以上の有効なまたは「試験用の」治療用タンパク質またはペプチドをコードし得る。
【００９８】
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の１個以上の治療用タンパク質またはペプチドが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいてコードされる治療
用タンパク質およびペプチドを利用して、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科学、内分泌学、遺伝学、泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、および免疫学、呼吸器、知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
【０１００】
細胞透過性ポリペプチド
本明細書に開示の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、１個以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」またはＣＰＰは、分子の細胞取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、１つ以上の検出可能な標識を含有し得る。ポリペプチドは、部分的に標識化され得るか、または完全に全体を通して標識化され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、検出可能な標識を完全にコードし得るか、部分的にコードし得るか、または全くコードし得ない。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を用いて、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。
【０１０１】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、融合タンパク質もコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に動作可能に結合させることによって作成され得る。本明細書で使用するとき、「動作可能に結合する」とは、治療用タンパク質および荷電タンパク質が細胞に導入されたときに複合体の発現を可能にするような形で結合していることを指す。本明細書で使用するとき、「荷電タンパク質」は、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を持つタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成時に荷電タンパク質に共有結合され得る。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比率は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９であり得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによってコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳された後に複合体を形成し得る。この複合体は、細胞透過性ポリペプチドに結合、例えば、共有結合された荷電タンパク質を含み得る。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されたときに、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発するタンパク質を指す。
【０１０３】
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質結合パートナー」は、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドを含むが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーの細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが導入され得る細胞から分泌されることができ得る。細胞透過性ポリペプチドは、第１の細胞に浸透することもでき得る。
【０１０４】
さらなる実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第２の細胞に浸透することができる。第２の細胞は、第１の細胞と同一の領域に由来し得るか、または異なる領域に由来し得る。この領域は、組織および器官を含み得るが、これらに限定されない。第２の細胞は、第１の細胞の近位にあるか、またはその遠位にあり得る。
【０１０５】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。タンパク質結合パートナーは、抗体、超荷電抗体、または機能的断片を含み得るが、これらに限定されない
。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入され得る。
【０１０６】
分泌タンパク質
ヒトおよび他の真核細胞は、膜によって多くの機能的にはっきりと異なる区画に細分される。各膜結合型区画、または小器官は、小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。この細胞は、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を用いて、タンパク質を特定の細胞小器官に標的化する。
【０１０７】
シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる一種の選別シグナルは、タンパク質のクラスを小胞体（ＥＲ）と呼ばれる小器官に指向する。
【０１０８】
シグナル配列によってＥＲに標的化されたタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出され得る。同様に、細胞膜上に存在するタンパク質は、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解切断によって細胞外空間に分泌され得る。理論によって束縛されることを望まないが、上述の細胞輸送を利用するために本発明の分子が用いられ得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、分泌タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。分泌タンパク質は、本明細書または米国特許公開第２０１００２５５５７４号に記載のものから選択され得、その内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
一実施形態において、これらは、大量の有益なヒト遺伝子産物の製造時に用いられ得る。
【０１１０】
原形質膜タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、原形質膜のタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１１】
細胞質または細胞骨格タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、細胞質または細胞骨格タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１２】
細胞内膜結合タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、細胞内膜結合タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１３】
核タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、核タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１４】
ヒト疾患に関連したタンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト疾患に関連したタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１５】
種々のタンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、現在未知の治療的機能を有するタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。
【０１１６】
標的部分
本発明のいくつかの実施形態において、標的部分を発現するポリヌクレオチド、一次構
築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。これらには、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体が含まれる。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分もしくは生体分子の合成および細胞外局在化を指向することができる。
【０１１７】
ポリペプチドライブラリ
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、ポリペプチドライブラリを生成することができる。これらのライブラリは、それぞれ、様々な構造または化学修飾設計を有する、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの集団の生成から生じ得る。この実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの集団は、本明細書に教示されるか、または当技術分野で既知の抗体もしくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および他のポリペプチドを含むが、これらに限定されない複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、その後にコードされたポリペプチドを合成し得る標的細胞または培養物への直接導入に好適であり得るｍｍＲＮＡを含む本発明の一次構築物である。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、それぞれ異なるアミノ酸修飾（複数可）を有するタンパク質の複数の変異形は、薬物動態、安定性、生体適合性、および／もしくは生物学的活性、または発現レベル等の生物物理学的特性の点で最善の変異形を決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０９を超える可能な変異形（１個以上の残基の置換、欠失、および１個以上の残基の挿入を含むが、これらに限定されない）を含有し得る。
【０１１９】
抗菌性および抗ウイルス性ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、１個以上の抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルス性ペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計され得る。ＡＭＰおよびＡＶＰは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚、および哺乳動物等であるが、これらに限定されない様々な動物から単離され、説明されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９；３７（データベース刊行）：Ｄ９３３−７）。例えば、抗菌性ポリペプチドは、抗菌性ペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９；３７（データベース刊行）：Ｄ９３３−７）、ＣＡＭＰ：Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｃｎｉｒｒｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ／）；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０；３８（データベース刊行）：Ｄ７７４−８０）、米国特許第ＵＳ５２２１７３２号、同第ＵＳ５４４７９１４号、同第ＵＳ５５１９１１５号、同第ＵＳ５６０７９１４号、同第ＵＳ５７１４５７７号、同第ＵＳ５７３４０１５号、同第ＵＳ５７９８３３６号、同第ＵＳ５８２１２２４号、同第ＵＳ５８４９４９０号、同第ＵＳ５８５６１２７号、同第ＵＳ５９０５１８７号、同第ＵＳ５９９４３０８号、同第ＵＳ５９９８３７４号、同第ＵＳ６１０７４６０号、同第ＵＳ６１９１２５４号、同第ＵＳ６２１１１４８号、同第ＵＳ６３００４８９号、同第ＵＳ６３２９５０４号、同第ＵＳ６３９９３７０号、同第ＵＳ６４７６１８９号、同第ＵＳ６４７８８２５号、同第ＵＳ６４９２３２８号、同第ＵＳ６５１４７０１号、同第ＵＳ６５７３３６１号、同第ＵＳ６５７３３６１号、同第ＵＳ６５７６７５５号、同第ＵＳ６６０５６９８号、同第ＵＳ６６２４１４０
号、同第ＵＳ６６３８５３１号、同第ＵＳ６６４２２０３号、同第ＵＳ６６５３２８０号、同第ＵＳ６６９６２３８号、同第ＵＳ６７２７０６６号、同第ＵＳ６７３０６５９号、同第ＵＳ６７４３５９８号、同第ＵＳ６７４３７６９号、同第ＵＳ６７４７００７号、同第ＵＳ６７９０８３３号、同第ＵＳ６７９４４９０号、同第ＵＳ６８１８４０７号、同第ＵＳ６８３５５３６号、同第ＵＳ６８３５７１３号、同第ＵＳ６８３８４３５号、同第ＵＳ６８７２７０５号、同第ＵＳ６８７５９０７号、同第ＵＳ６８８４７７６号、同第ＵＳ６８８７８４７号、同第ＵＳ６９０６０３５号、同第ＵＳ６９１１５２４号、同第ＵＳ６９３６４３２号、同第ＵＳ７００１９２４号、同第ＵＳ７０７１２９３号、同第ＵＳ７０７８３８０号、同第ＵＳ７０９１１８５号、同第ＵＳ７０９４７５９号、同第ＵＳ７１６６７６９号、同第ＵＳ７２４４７１０号、同第ＵＳ７３１４８５８号、および同第ＵＳ７５８２３０１号に記載されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が組み込まれる。
【０１２０】
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、１個以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）による細胞融合および／またはウイルス侵入をブロックし得る。例えば、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。ＨＩＶ−１
ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）“ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，”Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。
【０１２２】
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、カプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、カプシド結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。
【０１２３】
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ二量体化をブロックし、機能的タンパク質へのウイルスプロタンパク質（例えば、ＨＩＶ  Ｇａｇ−ｐｏｌ処理）の切断を阻害し、それによって、１個以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）の放出を阻止し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
【０１２４】
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
【０１２５】
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、ウイルス性病原体に対して指向されるインビトロで進化したポリペプチドを含み得る。
【０１２６】
抗菌性ポリペプチド
抗菌性ポリペプチド（ＡＭＰ）は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、および腫瘍／癌細胞を含むが、これらに限定されない様々な微生物に対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚａｉｏｕ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００７；８５：３１７を参照のこと）。ＡＭＰが広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約６〜約１００個のアミノ酸、例えば、約６〜約７５個のアミノ酸、約６〜約５０個のアミノ酸、約６〜約２５個のアミノ酸、約２５〜約１００個のアミノ酸、約５０〜約１００個のアミノ酸、または約７５〜約１００個のアミノ酸からなる。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約１５〜約４５個のアミノ酸からなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性および両親媒性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍および／または癌細胞）に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍および／または癌細胞）に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト腫瘍または癌細胞）に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、分泌ポリペプチドであり得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、デフェンシンを含むか、またはそれからなる。例示のデフェンシンには、α−デフェンシン（例えば、好中球デフェンシ
ン１、デフェンシンα１、好中球デフェンシン３、好中球デフェンシン４、デフェンシン５、デフェンシン６）、β−デフェンシン（例えば、β−デフェンシン１、β−デフェンシン２、β−デフェンシン１０３、β−デフェンシン１０７、β−デフェンシン１１０、β−デフェンシン１３６）、およびθ−デフェンシンが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、カテリシジン（例えば、ｈＣＡＰ１８）を含むか、またはそれからなる。
【０１３０】
抗ウイルス性ポリペプチド
抗ウイルス性ポリペプチド（ＡＶＰ）は、様々なウイルスに対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである。例えば、Ｚａｉｏｕ，Ｊ  Ｍｏｌ
Ｍｅｄ，２００７；８５：３１７を参照されたい。ＡＶＰ広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約６〜約１００個のアミノ酸、例えば、約６〜約７５個のアミノ酸、約６〜約５０個のアミノ酸、約６〜約２５個のアミノ酸、約２５〜約１００個のアミノ酸、約５０〜約１００個のアミノ酸、または約７５〜約１００個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなる。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約１５〜約４５個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性および両親媒性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）細胞傷害性およびに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。
【０１３１】
細胞傷害性ヌクレオシド
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１個以上の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込み得る。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、例えば、二機能性修飾ＲＮＡまたはｍＲＮＡに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗癌剤には、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロキシウリジン、ＦＴＯＲＡＦＵＲ（登録商標）（テガフールおよびウラシルの組み合わせ）、テガフール（（ＲＳ）−５−フルオロ−１−（テトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）、および６−メルカプトプリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
いくつかの細胞傷害性ヌクレオシド類似体は、臨床で用いられているか、または抗癌剤として臨床試験の対象になっている。そのような類似体の例には、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、クラドリビン、クロファラビン、５−アザシチジン、４’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、および１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）−シトシンが含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物の別の例には、リン酸フルダラビンがある。これらの化合物は、全身投与され得、正常細胞の増殖時の腫瘍細胞に対する特異性がほとんどまたは全くないといった副作用等であるが、これに限定されない細胞傷害性薬剤の典型的な副作用を有し得る。
【０１３３】
細胞傷害性ヌクレオシド類似体のいくつかのプロドラッグも当技術分野において報告されている。例には、Ｎ４−ベヘノイル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−オクタデシル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−パルミトイル−１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン、およびＰ−４０５５（シタラビン５’−エライジン酸エステル）が含まれるが、これらに限定されない。概して、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環において活性薬物に変換され、腫瘍組織における活性薬物の選択的放出をほとんどまたは全く呈しない。例えば、５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（最終的に、５−フルオロウラシル）のプロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含有する一連のカペシタビン類似体は、Ｆｕｊｉｕら（米国特許第４，９６６，８９１号）によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｕｊｉｕによって説明されるこの一連のカペシタビン類似体は、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンのＮ４アルキルおよびアラルキルカルバミン酸塩を含み、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、５’−デオキシ−５−フルオロシチジンをもたらすことを暗示する。
【０１３４】
一連のシタラビンＮ４−カルバミン酸塩が、Ｆａｄｌら（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ．１９９５，５０，３８２−７）によって報告されており、そこで、化合物は、肝臓および血漿においてシタラビンに変換するように設計された。参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４／０４１２０３号は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、そこで、プロドラッグのうちのいくつかは、Ｎ４−カルバミン酸塩である。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計されており、無傷プロドラッグを胃腸管から吸収した後に、肝臓および血漿における加水分解放出によってゲムシタビンを提供するよう意図された。Ｎｏｍｕｒａら（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，１１，２４５３−６１）は、生体内還元時に酸性条件下でさらなる加水分解を必要とした中間体を産生して、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を産生した１−（３−Ｃ−エチニル−β−Ｄ−リボ−ペントファラノシル）シトシンのアセタール誘導体を説明している。
【０１３５】
化学療法薬であり得る細胞傷害性ヌクレオチドには、ピラゾロ［３，４−Ｄ］−ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、６−チオグアニン、アシクロビル、アラ−アデノシン、リバビリン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、６−アザ−ウラシル、６−アザ−シチジン、チミジンリボヌクレオチド、５−ブロモデオキシウリジン、２−クロロ−プリン、およびイノシン、またはこれらの組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。  
【０１３６】
隣接領域：非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲが転写開
始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてＵＴＲが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。ＵＴＲの制御特徴は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。
【０１３７】
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【０１３８】
特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生を高めることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓で発現したｍＲＮＡの５’ＵＴＲ導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのｍｍＲＮＡ等の核酸分子の発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いてその組織での発現を高めることは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）において可能である。
【０１３９】
他の非ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
【０１４０】
３’ＵＴＲおよびＡＵ豊富な要素
３’ＵＴＲは、それらに包理される一続きのアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）およびウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）を有することで知られている。これらのＡＵ豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、ＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類され得る（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕ豊富な領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２個以上の重複したＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵ豊富な領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。Ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の２つである。ＡＲＥに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、中でも注目すべきＨｕＲがｍＲＮＡの安定性を向上させることが実証されている。ＨｕＲは、これら３つのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を操作して核酸分子の３’ＵＴＲに入れることで、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
【０１４１】
３’ＵＴＲのＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを操作するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが導入されて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させ得る。同様に、ＡＲＥは、特定および除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるＡＲＥ操作分子でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いてトランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０１４２】
マイクロＲＮＡ結合部位の組み込み
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡ種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
マイクロＲＮＡ配列は、「種」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域における配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡ種は、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるこの種相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における種相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたく、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。マイクロＲＮＡ種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を操作して、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている（それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７
１２９：１４０１−１４１４）。
【０１４４】
例えば、核酸分子がｍＲＮＡであり、肝臓に送達されることが意図されないが、そこで落ち着く場合、肝臓中に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が操作されて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れられると、目的とする遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。
【０１４５】
本明細書で使用するとき、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、あるいはマイクロＲＮＡ部位に、またはマイクロＲＮＡ部位に隣接して標的配列を有するマイクロＲＮＡの任意の安定した会合を示し得ることを理解されたい。
【０１４６】
逆に、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの目的のために、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために自然に生じるマイクロＲＮＡ結合部位を操作して配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位が除去されて、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。複数の組織での発現の制御は、１つまたはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。
【０１４７】
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、その結果タンパク質発現を制御することで知られている組織の例には、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ−１３２）等の複雑な生物学的プロセスも制御し得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいて、そのようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連した細胞型に対して、または関連生物学的プロセスに関連してポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの発現を調整するために除去または導入され得る。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列、およびｍｉＲ結合部位の一覧が、２０１３年１月１７日出願の米国特許仮出願第６１／７５３，６６１号の表９、２０１３年１月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７５４，１５９号の表９、および２０１３年１月３１日出願の米国特許仮出願第６１／７５８，９２１号の表７に列記されており、それぞれ、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
組織または疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのマイクロＲＮＡの使用例が列記されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２，８０：３９３−４０３）。加えて、マイクロＲＮＡ種部位は、ｍＲＮＡに組み込まれてある特定の細胞における発現を低下させ得、これは、生物学的改善をもたらす。これについての例は、ｍｉＲ−１４２部位のＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへの組み込みである。ｍｉＲ−１４２種部位の存在が造血細胞での発現を低下させ、結果として抗原提示細胞での発現を低下させ、ウイル
スによって発現したＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答の不在をもたらした（いずれも参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；１３９：９９９−１００７、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０，１３９：７２６−７２９）。ｍｉＲ−１４２部位の修飾ｍＲＮＡへの組み込みが、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低下させることができただけでなく、ｍＲＮＡでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低下または無効にすることもできた。ｍｉＲ−１４２種部位（１つまたは複数）のｍＲＮＡへの組み込みは、完全なタンパク質欠乏症を有する患者（Ｉ型ＵＧＴ１Ａ１、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性Ｐｏｍｐｅ患者等）の治療時に重要である。
【０１４９】
最後に、異なる細胞型におけるマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を通じて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、特定の細胞型におけるより標的化された発現または特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入によって、組織でのタンパク質発現または生物学的条件に関連したタンパク質発現に最適なポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが設計され得る。
【０１５０】
操作されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるマイクロＲＮＡ結合部位操作ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡでトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いてトランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いたインビボ実験を行って、製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの組織特異的発現の変化を試験することもできる。
【０１５１】
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を向上させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。このキャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位のイントロンの除去を支援する。
【０１５２】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合をもたらし得る。その後、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介する５’デキャッピングは、分解するためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とし得る。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、その結果ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応中に用いられ得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに用いて、５’−ｐｐｐ−５’キャップにおけるホスホロチオエート結合を引き起こすことができる。
α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチド等のさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを用いることができる。
【０１５４】
さらなる修飾には、糖環の２’−ヒドロキシル基におけるｍＲＮＡの５’末端および／または５’前末端ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述のもの）が含まれるが、これに限定されない。複数のはっきりと異なる５’−キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子等の核酸分子の５’キャップを生成することができる。
【０１５５】
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なるが、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）もしくは酵素的に合成され、かつ／または核酸分子に結合され得る。
【０１５６】
例えば、反逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−トリホスフェート基によって結合される２個のグアニンを含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基、ならびに３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは同等に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）を含有する。他方の未修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０１５７】
別の例示のキャップには、ｍＣＡＰがあり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）を有する。
【０１５８】
キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％がキャップされないままであり得る。これ、ならびに内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０１５９】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、より真正の５’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にもキャップされ得る。本明細書で使用するとき、「より真正の」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型特徴を酷似させるか、または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正の」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体等と比較して、より良好に内因性、野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能および／もしくは構造を表しているか、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴を１つ以上の点においてしのぐ。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例には、当技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、または生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、強化されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、低下した５’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および／または低下した５’デキャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の５’−５’−トリホスフェート結合を生成し得、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定
性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが転写後にキャップされ得、かつこのプロセスがより効率的であるため、ほぼ１００％のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡがキャップされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でｍＲＮＡに結合されるときの約８０％とは大いに異なる。
【０１６１】
本発明に従って、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
ウイルス配列
大麦縞萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、および／または地方病性鼻腫瘍ウイルス（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１２９６４８号を参照のこと）等であるが、これらに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。
【０１６３】
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得るポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスＲＮＡと特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの１つの役割を果たし得る。２個以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、リボソーム（「多シストロン性核酸分子」）によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供されるとき、第２の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るＩＲＥＳ配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
【０１６４】
ポリＡ尾部
ＲＮＡ処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖（ポリＡ尾部）が、安定性を向上させるためにｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後、転写物の３’末端が切断されて３’ヒドロキシルを遊離させ得る。その後、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、約１００〜２５０残基長であり得るポリＡ尾部を付加する。
【０１６５】
特有のポリＡ尾部の長さが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにある特定の利点を提供することが見出されている。
【０１６６】
概して、本発明のポリＡ尾部の長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチド長であるか、またはこれらを超える）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約３，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００個）を含む。
【０１６７】
一実施形態において、ポリＡ尾部は、全体のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの長さに対して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さ（第１もしくは隣接領域等）に基づき得るか、またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡから発現した最終産物の長さに基づき得る。
【０１６８】
この文脈において、ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ、またはその特徴よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％長い長さであり得る。ポリＡ尾部は、それが属するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの画分としても設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長または構築物の全長からポリＡ尾部を差し引いた長さの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上であり得る。さらに、結合部位の操作、およびポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのポリＡ結合タンパク質への複合体化は、発現を高め得る。
【０１６９】
さらに、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ポリＡ尾部の３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に結合され得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。
【０１７０】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド一次構築物は、ポリＡ〜Ｇ四重項を含むように設計される。Ｇ四重項は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧ豊富な配列によって形成され得る４個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇ四重項は、ポリＡ尾部の終端に組み込まれる。結果として生じるｍｍＲＮＡ構築物は、安定性、タンパク質産生、および様々な時点での半減期他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡ〜Ｇ四重項が、１２０個のヌクレオチドのポリＡ尾部を単独で用いてもたらされるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をも
たらすことが見出されている。
【０１７１】
定量化
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
【０１７２】
定量化方法において、２ｍＬ未満の試料が対象から得られ、エクソソームが、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離される。分析において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断、または改変であり得る。このレベルを１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関させることは、有利である。このアッセイが、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて行われ得る一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫組織化学法を用いて単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによっても単離され得る。
【０１７３】
これらの方法は、残存しているか、または送達されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのレベルをリアルタイムで監視する能力を研究者に提供する。これは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが構造または化学修飾に起因して内因性形態とは異なるといった理由から、可能である。
【０１７４】
ＩＩ．ｍｍＲＮＡの設計および合成
本発明に従って用いるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、化学合成、一般にインビトロ転写（ＩＶＴ）と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。ＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において既知である（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４、およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照のこと）。
【０１７５】
本発明の一次構築物の設計および合成のプロセスは、概して、遺伝子構築ステップ、ｍＲＮＡ産生ステップ（修飾を伴うか、または伴わない）、および精製ステップを含む。酵素合成方法において、目的とするポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、増幅されてｃＤＮＡ鋳型を産生するベクターへの組み込みのために最初に選択される。
任意に、標的ポリヌクレオチド配列および／または任意の隣接配列は、コドン最適化され得る。その後、ｃＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によってｍＲＮＡを産生する。産生後、ｍＲＮＡは、精製および浄化プロセスを経り得る。これらのステップは、以下でより詳細に提供される。
【０１７６】
遺伝子構築
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにｃＤＮＡ鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
【０１７７】
遺伝子合成
目的とするポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて構築され得る。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、目的とするポリペプチドをコードすることができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すよう意図される。ＯＲＦは、多くの場合、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
【０１７８】
さらに、第１の領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。コドン最適化方法は、当技術分野において既知であり、いくつかの目標のうちの１つ以上を達成する取り組みにおいて有用であり得る。これらの目標には、標的および宿主生物体におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確実にすること、ＧＣ含量を付勢させてｍＲＮＡの安定性を高めるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するか、または欠失させること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはｍＲＮＡ内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において既知であり、非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔのサービス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）、および／または所有権を有する方法が挙げられる。一実施形態において、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢が表１に提供される。
表１．コドン選択肢
【表０００１】
2017121240.tif 000002
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態において有益であると見なされ得る特徴は、一次構築物によってコードされ得、第１または第２の隣接領域としてＯＲＦに隣接し得る。この隣接領域は、ＯＲＦの最適化前および／または後に一次構築物に組み込まれ得る。一次構築物が５’隣接領域と３’隣接領域の両方を含有する必要はない。そのような特徴の例には、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位も挙げられ得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが、隣接領域として提供され得る。複数の５’または３’ＵＴＲが、隣接領域に含まれ得、同一または異な
る配列であり得る。隣接領域の任意の部分（そのような部分がない場合を含み）が、コドン最適化され得、それらのいずれも、独立して、コドン最適化の前および／または後に１つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。特徴の組み合わせは、第１および第２の隣接領域に含まれ得、他の特徴内に含有され得る。例えば、ＯＲＦは、ポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲおよび／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲに隣接し得る。参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号に記載の５’ＵＴＲ等の５’ＵＴＲは、同一および／または異なる遺伝子由来の第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含み得る。
【０１８１】
表２および３は、隣接領域として本発明の一次構築物において利用され得る例示のＵＴＲの一覧を提供する。本発明の５’非翻訳領域の一覧が表２に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される５’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表２．５’非翻訳領域
【表０００２】
2017121240.tif 000003
【０１８２】
本発明の３’非翻訳領域の代表的な一覧が表３に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される３’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表３．３’非翻訳領域
【表０００３−１】
2017121240.tif 000004
【表０００３−２】
2017121240.tif 000005
【表０００３−３】
2017121240.tif 000006
【表０００３−４】
2017121240.tif 000007
【表０００３−５】
2017121240.tif 000008
【表０００３−６】
2017121240.tif 000009
【表０００３−７】
2017121240.tif 000010
【表０００３−８】
2017121240.tif 000011
【０１８３】
先の表に列記されるものは例であり、任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが一次構築物のそれぞれの第１または第２の隣接領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型遺伝子の変異形ではない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲもしくはその部分は、それらが選択され得る転写物のＵＴＲもしくはその部分と同一の配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を変更し得る。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転し、短縮され、延長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲでキメラにされ得る。本明細書で使用する「変更される」という用語は、ＵＴＲ配列に関するとき、ＵＴＲが参照配列との関連である点において変化したことを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上で教示される配向もしくは位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更され得るか、またはさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転置によって変更され得る。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’
にかかわらず）をもたらすこれらの変化のうちのいずれかは、変異形ＵＴＲを含む。
【０１８４】
一実施形態において、５’または３’ＵＴＲ等の二重、三重、または四重ＵＴＲが用いられ得る。本明細書で使用するとき、「二重」ＵＴＲは、同一のＵＴＲの２つのコピーが連続して、または実質的に連続してのいずれかでコードされるものである。例えば、内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載の二重β−グロビン３’ＵＴＲが用いられ得る。
【０１８５】
パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用するとき、「パターン化されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回以上繰り返された繰り返しまたは交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変異形を示すＵＴＲである。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルでの異なるＵＴＲを表す。
【０１８６】
一実施形態において、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特性特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的とするポリペプチドは、特定の細胞、組織で発現するか、または発生中のある時点で発現するタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のうちのいずれのＵＴＲも、同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換されて、新たなキメラ一次転写物を作成し得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２個以上の目的とするポリペプチドの群を指すために用いられる。
【０１８７】
最適化後（所望の場合）、一次構築物成分は、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体等であるが、これらに限定されないベクターに再構築および変換され得る。例えば、最適化された構築物は、化学的にコンピテントな大腸菌、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ等に再構築および変換され得、高コピー数のプラスミド様または染色体構造は、本明細書に記載の方法によって生じる。
【０１８８】
非翻訳領域は、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥには、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載のＴＥＥ、および当技術分野で既知のＴＥＥが含まれ得る。
【０１８９】
終止コドン
一実施形態において、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから選択され得る。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンＴＧＡおよびもう１つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう１つの終止コドンは、ＴＡＡであり得る。別の実施形態において、本発明の一次構築物は、３つの終止コドンを含む。
【０１９０】
ベクター増幅
一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
【０１９１】
プラスミド線形化
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ
，ＣＡ）、ならびに強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを生成する。
【０１９２】
ｃＤＮＡ鋳型合成
ｃＤＮＡ鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経させることによって合成され得る。表４は、本発明のＰＣＲ反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、５−メチル−シチジン、２、６−ジ−アミノ−プリン、２’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表４．プライマーおよびプローブ
【表０００４】
2017121240.tif 000012
＊ＵＦＰはユニバーサル順方向プライマーであり、ＵＲＰはユニバーサル逆方向プライマーである。
【０１９３】
一実施形態において、ｃＤＮＡは、転写を経る前に配列決定分析のために提出され得る。
【０１９４】
ｍＲＮＡ産生
ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ産生のプロセスは、インビトロ転写、ｃＤＮＡ鋳型除去およびＲＮＡ浄化、ならびにｍＲＮＡキャッピングおよび／またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
【０１９５】
インビトロ転写
先のステップで産生されたｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。ＮＴＰは、天然および非天然（修飾された）ＮＴＰを含む本明細書に記載のＮＴＰから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、および修飾された核酸を組み込むことができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
【０１９６】
ＲＮＡポリメラーゼ
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異形が本発明の一次構築物の設計において用いられ得る。
【０１９７】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するか、または欠失させることによって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む能力の向上を示すように修飾され得る（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号および米国特許第８，１０１，３８５号を参照のこと）。
【０１９８】
変異形は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸および／または核酸配列を最適化し、かつ／または当技術分野で既知の他の方法を用いることによって得られ得る。非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、Ｅｓｖｅｌｔら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３）によって立案された連続指向進化システムを用いて進化させられ得、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、９３位のリジンがトレオニンで置換された変異（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２００２４号および同第２００７０１１７１１２号に記載の少なくとも１つの変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および／または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１９９】
一実施形態において、一次構築物は、野生型または変異形ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。そうすることで、一次構築物は、野生型または親一次構
築物由来の配列変化部位または領域を含有するように修飾され得る。
【０２００】
一実施形態において、一次構築物は、５’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲの前、および／または５’ＵＴＲの後に、少なくとも１つの置換および／または挿入を、一次構築物のＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、ＴＡＴＡボックス配列の下流であるが、一次構築物のコーディング領域の上流に含むように設計され得る。
【０２０１】
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、同一の塩基のヌクレオチドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、このヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、このヌクレオチド基は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および／またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０２０２】
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれか、および／またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基を挿入し、その後、５〜８個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例において、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基を挿入し、その後、５〜８個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
【０２０３】
一実施形態において、一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流（＋１〜＋６等であるが、これらに限定されない）の領域内の少なくとも１個の核酸を置換することによって転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけ上のヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応一定値を増加させ、かつ初期転写物を硬化させることによる転写複合体からの短い転写物の解離を高め得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９）。少なくとも１個の核酸の修飾、置換、および／または挿入は、核酸配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
【０２０４】
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位の下流で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０２０５】
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧ
Ａであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、もしくは少なくとも４個のチミン、および／または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
【０２０６】
一実施形態において、一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確化のために、当業者は、開始コドンがタンパク質コーディング領域の第１のコドンである一方で、転写開始部位が転写が始まる部位であることを理解する。一次構築物は、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４、もしくは少なくとも５つの位置に挿入または置換され得る。挿入および／または置換されたヌクレオチドは、同一の塩基（例えば、すべてＡもしくはすべてＣもしくはすべてＴもしくはすべてＧ）、２個の異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、もしくはＣおよびＴ）、３個の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、およびＴ、もしくはＡ、Ｃ、およびＴ）、または少なくとも４個の異なる塩基であり得る。非限定的な例として、一次構築物内のコーディング領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例において、一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、かつ開始コドンの前の領域に１個のグアニン塩基を残すように設計され得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照のこと）。非限定的な例として、少なくとも５個のヌクレオチドは、転写開始部位の下流および開始コドンの上流の１つの位置に挿入され得、少なくとも５個のヌクレオチドは、同一の塩基型であり得る。
【０２０７】
ｃＤＮＡ鋳型除去および浄化
ｃＤＮＡ鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。ＲＮＡ浄化は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）のＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ＣＬＥＡＮＳＥＱ（登録商標）システム；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
【０２０８】
キャッピングおよび／またはテーリング反応
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、キャッピングおよび／またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、５’キャップを一次構築物の５’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の使用が含まれるが、これに限定されない。
【０２０９】
ポリＡテーリング反応は、２’Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび本明細書に記載の方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。ｃＤＮＡから生成された一次構築物がポリＴを含まない場合、一次構築物が浄化される前にポリＡテーリング反応を行うことは有益であり得る。
【０２１０】
ｍＲＮＡ精製
一次構築物またはｍｍＲＮＡ精製は、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）；ポリＴビーズ；ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）；または強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも１つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
【０２１１】
品質保証および／または品質管理検査は、ゲル電気泳動、紫外線吸収、または分析的ＨＰＬＣ等であるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
【０２１２】
別の実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、逆転写ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法を用いて配列決定され得る。
【０２１３】
一実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等であるが、これに限定されない方法を用いて定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例には、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）がある。定量化されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが適切な大きさであり得るかを決定し、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。ｍＲＮＡおよび／またはｍｍＲＮＡの分解は、アガロースゲル電気泳動；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法；液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）；キャピラリー電気泳動（ＣＥ）；ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等であるが、これらに限定されない方法を用いて確認され得る。
【０２１４】
シグナル配列
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の１つに、シグナル配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれる、それぞれ、約９〜２００ヌクレオチド長（３〜６０アミノ酸長）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の分泌経路を通るコードされたポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０２１５】
表５は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡをコードするために組み込まれ得るタンパク質シグナル配列の代表的な一覧である。
表５．シグナル配列
【表０００５−１】
2017121240.tif 000013
【表０００５−２】
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【表０００５−３】
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【表０００５−４】
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【表０００５−５】
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【表０００５−６】
2017121240.tif 000018
【０２１６】
この表において、ＳＳは分泌シグナルであり、ＭＬＳはミトコンドリアリーダーシグナルである。本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、配列番号９４〜１５５のシグナル配列のうちのいずれか、またはその断片もしくは変異形をコードするように設計され得る。これらの配列は、ポリペプチドコーディング領域の最初、中間、もしくは最後に含まれ得るか、またはあるいは隣接領域に含まれ得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド一次構築物のうちのいずれかは、配列番号３２〜９３によって定義される配列のうちの１つ以上も含み得る。これらは、第１の領域またはいずれかの隣接領域に存在し得る。
【０２１７】
本発明において利用され得るさらなるシグナル配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／で見出されるデータベース等のデータベースに教示されるシグナル配列を含む。米国特許第８，１２４，３７９号、同第７，４１３，８７５号
、および同第７，３８５，０３４号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
標的選択
本発明に従って、一次構築物は、少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの少なくとも１つの第１の領域を含む。本発明の目的とするポリペプチドまたは「標的」が表６に列記される。目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明（標的説明）に加えて、ＥＮＳＥＭＢＬ転写物配列番号（ＥＮＳＴ）、ＥＮＳＥＭＢＬタンパク質配列番号（ＥＮＳＰ）、および利用可能な場合、最適化されたオープンリーディングフレーム配列番号（最適化されたＯＲＦ配列番号）も表６に示される。任意の特定の遺伝子について、１つ以上の変異形またはアイソフォームが存在し得る。これらが存在する場合、それらも同様に表に示される。当業者であれば、表に開示されるものが可能性のある隣接領域であることを理解する。これらは、各ＥＮＳＴ転写物におけるＯＲＦまたはコーディング領域の５’（上流）または３’（下流）のいずれかにコードされる。コーディング領域は、ＥＮＳＰ配列を教示することによって断定的かつ具体的に開示される。その結果として、タンパク質をコードする隣接する教示の配列が隣接領域と見なされる。１つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することによって５’および３’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ＥＮＳＴ転写物の隣接領域に含有される特徴に注釈を付けており、これらは、当技術分野において利用可能である。
表６．膜タンパク質標的
【表０００６−１】
2017121240.tif 000019
【表０００６−２】
2017121240.tif 000020
【表０００６−３】
2017121240.tif 000021
【表０００６−４】
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【表０００６−５】
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【表０００６−６】
2017121240.tif 000024
【表０００６−７】
2017121240.tif 000025
【表０００６−８】
2017121240.tif 000026
【表０００６−９】
2017121240.tif 000027
【表０００６−１０】
2017121240.tif 000028
【表０００６−１１】
2017121240.tif 000029
【表０００６−１２】
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【表０００６−１３】
2017121240.tif 000031
【表０００６−１４】
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【表０００６−１５】
2017121240.tif 000033
【表０００６−１６】
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【表０００６−１７】
2017121240.tif 000035
【表０００６−１８】
2017121240.tif 000036
【表０００６−１９】
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【表０００６−２０】
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【表０００６−２１】
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【表０００６−２２】
2017121240.tif 000040
【表０００６−２３】
2017121240.tif 000041
【表０００６−２４】
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【表０００６−２５】
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【表０００６−２６】
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【表０００６−２７】
2017121240.tif 000045
【表０００６−２８】
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【表０００６−２９】
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【表０００６−３０】
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【表０００６−３１】
2017121240.tif 000049
【表０００６−３２】
2017121240.tif 000050
【表０００６−３３】
2017121240.tif 000051
【表０００６−３４】
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【表０００６−３５】
2017121240.tif 000053
【表０００６−３６】
2017121240.tif 000054
【表０００６−３７】
2017121240.tif 000055
【表０００６−３８】
2017121240.tif 000056
【表０００６−３９】
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【表０００６−４０】
2017121240.tif 000058
【表０００６−４１】
2017121240.tif 000059
【表０００６−４２】
2017121240.tif 000060
【表０００６−４３】
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【表０００６−４４】
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【表０００６−４５】
2017121240.tif 000063
【表０００６−４６】
2017121240.tif 000064
【表０００６−４７】
2017121240.tif 000065
【表０００６−４８】
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【表０００６−４９】
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【表０００６−５０】
2017121240.tif 000068
【表０００６−５１】
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【表０００６−５２】
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【表０００６−５３】
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【表０００６−５４】
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【表０００６−５５】
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【表０００６−５６】
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【表０００６−５７】
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【表０００６−５８】
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【表０００６−５９】
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【表０００６−６０】
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【表０００６−６１】
2017121240.tif 000079
【表０００６−６２】
2017121240.tif 000080
【表０００６−６３】
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【表０００６−６４】
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【表０００６−６５】
2017121240.tif 000083
【表０００６−６６】
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【表０００６−６７】
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【表０００６−６８】
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【表０００６−６９】
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【表０００６−７０】
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【表０００６−７１】
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【表０００６−７２】
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【表０００６−７３】
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【表０００６−７４】
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【表０００６−７５】
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【表０００６−７６】
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【表０００６−７７】
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【表０００６−７８】
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【表０００６−７９】
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【表０００６−８０】
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【表０００６−８１】
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【表０００６−８２】
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【表０００６−８３】
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【表０００６−８４】
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【表０００６−８５】
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【表０００６−８６】
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【表０００６−８７】
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【表０００６−８８】
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【表０００６−８９】
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【表０００６−９０】
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【表０００６−９１】
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【表０００６−９２】
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【表０００６−９３】
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【表０００６−９４】
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【表０００６−９５】
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【表０００６−９６】
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【表０００６−９７】
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【表０００６−９８】
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【表０００６−９９】
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【表０００６−１００】
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【表０００６−１０１】
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【表０００６−１０２】
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【表０００６−１０３】
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【表０００６−１０４】
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【表０００６−１０５】
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【表０００６−１０６】
2017121240.tif 000124
【表０００６−１０７】
2017121240.tif 000125
【表０００６−１０８】
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【表０００６−１０９】
2017121240.tif 000127
【表０００６−１１０】
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【表０００６−１１１】
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【表０００６−１１２】
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【表０００６−１１３】
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【表０００６−１１４】
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【表０００６−１１５】
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【表０００６−１１６】
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【０２１９】
一実施形態において、目的とするポリペプチドは原形質膜タンパク質である。１つの非制限的な例として、ポリヌクレオチド類、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、配列番号８１４４、８１４５、８１４６、８１４７、８１４８、８１５５、８１５６、８１６３、８１７８、８１７９、８１８０、８１８１、８１８２、８１８３、８１８５、８１８６、８１８９、８１９０、８１９１、８１９２、８１９５、８１９６、８１９７、８２００、８２０２、８２０４、８２１１、８２１２、８２１６、８２１８、８２２３、８２３１、８２３２、８２３３、８２３６、８２３７、８２３９、８２４０、８２４１、８２４２、８２４８、８２４９、８２５０、８２５１、８２５２、８２５３、８２５４、８２５５、８２５６、８２５７、８２５８、８２５９、８２６０、８２６２、８２６４、８２６５、８２６６、８２６７、８２６８、８２７５、８２８０、８２８１、８２８２、８２８３、８２８４、８２８５、８２８６、８２８７、８２８８、８２９０、８２９２、８２９３、８３０８、８３０９、８３１０、８３１１、８３１２、８３１４、８３１５、８３１
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５、１４７６６、１４７６８、１４７６９、１４７７０、１４７７１、１４７７２、１４７７３、１４７７４、１４７７５、１４７７６、１４７７７、１４７８０、１４７８４、１４７８５、１４７９３、１４７９５、１４７９８、１４７９９、１４８００、１４８０１
、１４８０２、１４８０３、１４８０４、１４８０５、１４８０６、１４８０８、１４８１１、１４８１２、１４８１５、１４８１７、１４８１８、１４８２３、１４８２４、１４８２５、１４８２６、１４８２８、１４８２９、１４８３１、１４８３３、１４８３５、１４８３８、１４８３９、１４８４０、１４８４１、１４８４４、１４８４６、１４８４７、１４８４８、１４８５１、１４８５３、１４８５５、１４８５７、１４８５９、１４８６０、１４８６５、１４８６７、１４８７３、１４８７４、１４８７６、１４８７９、１４８８０、１４８８５、１４８８６、１４８８７、１４８９０、１４８９３、１４８９８、１４８９９、１４９００、１４９０１、１４９０２、１４９０３、１４９０４、１４９１１、１４９１２、１４９１３、１４９１４、１４９１５、１４９１６、１４９１８、１４９１９、１４９２０、１４９２１、１４９２２、１４９２３、１４９３３、１４９３４、１４９３５、１４９３６、１４９４９、１４９５０、１４９５２、１４９５３、１４９５５、１４９５８、１４９６２、１４９６３、１４９６４、１４９６５、１４９６６、１４９６７、１４９７０、１４９７５、１４９７６、１４９７８、１４９７９、１４９８０、１４９８１、１４９８２、１４９８３、１４９８４、１４９８５、１４９８６、１４９８８、１４９８９、１４９９０、１４９９１、１４９９３、１４９９４、１４９９９、１５０００、１５００１、１５００２、１５００３、１５００４、１５００５、１５００７、１５００８、１５００９、１５０１０、１５０１３、１５０１５、１５０１６、１５０１７、１５０１８、１５０１９、１５０２２、１５０２８、１５０２９、１５０３１、１５０３２、１５０３４、１５０３５、１５０３６、１５０３７、１５０３８、１５０４０、１５０４１、１５０４２、１５０４５、１５０４６、１５０４７、１５０４８、１５０４９、１５０５５、１５０５６、１５０５７、１５０６４、１５０６８、１５０６９、１５０７３、１５０７４、１５０７８、１５０７９、１５０８０、１５０８１、１５０８２、１５０９２、１５０９９、１５１００、１５１０２、１５１０３、１５１０７、１５１１０、１５１１１、１５１１３、１５１１４、１５１１６、１５１１７、１５１１８、１５１１９、１５１２０、１５１２２、１５１２３、１５１２５、１５１２６、１５１２７、１５１３１、１５１３４、１５１３８、１５１３９、１５１４３、１５１４４、１５１４６、１５１４７、１５１４８、１５１４９、１５１５０、１５１５１、１５１５２、１５１５４、１５１５５、１５１５６、１５１５７、１５１５９、１５１６１、１５１６４、１５１６６、１５１６７、１５１６８、１５１７３、１５１７５、１５１７６、１５１７７、１５１７８、１５１８０、１５１８１、１５１８２、１５１８７、１５１８８、１５１８９、１５１９０、１５１９３、１５１９８、１５１９９、１５２００、１５２０１、１５２０２、１５２０３、１５２０５、１５２０８、１５２１０、１５２１２、１５２１３、１５２１４、１５２１５、１５２１８、１５２１９、１５２２０、１５２２１、１５２２２、１５２２３、１５２２４、１５２２６、１５２２７、１５２２８、１５２２９、１５２３１、１５２３６、１５２３７、１５２３９、１５２４０、１５２４１、１５２４２、１５２４３、１５２４４、１５２４６、１５２４７、１５２５２、１５２６３、１５２６６、１５２６７、１５２７０、１５２７１、１５２７２、１５２７３、１５２７４、１５２７５、１５２７６、１５２７８、１５２７９、１５２８１、１５２８２、１５２８４、１５２８５、１５２８６、１５２８８、１５２８９、１５２９１、１５２９２、１５２９４、１５２９５、１５２９６、１５２９８、１５３００、１５３０２、１５３０３、１５３０５、１５３０６、１５３０７、１５３０８、１５３０９、１５３１０、１５３１１、１５３１３、１５３１４、１５３１５、１５３１７、１５３１８、１５３２０、１５３２１、１５３２２、１５３２３、１５３２４、１５３２６、１５３２７、１５３２８、１５３３２、１５３３３、１５３３４、１５３３５、１５３３６、１５３３７、１５３３９、１５３４０、１５３４１、１５３４２、１５３４４、１５３４６、１５３４９、１５３５０、１５３５１、１５３５７、１５３５８、１５３５９、１５３６３、１５３
６４、１５３６５、１５３６６、１５３６７、１５３６８、１５３６９、１５３７３、１５３７５、１５３７６、１５３７７、１５３７９、１５３８０、１５３８４、１５３８５、１５３８７、１５３８９、１５３９１、１５３９２、１５３９４、１５３９６、１５３９７、１５３９８、１５３９９、１５４００、１５４０１、１５４０２、１５４０４、１５４０６、１５４０７、１５４０８、１５４０９、１５４１０、１５４１２、１５４１３、１５４１５、１５４２２、１５４２４、１５４２５、１５４２６、１５４３０、１５４３１、１５４３３、１５４３４、１５４３５、１５４３６、１５４３７、１５４３８、１５４３９、１５４４０、１５４４１、１５４４２、１５４４３、１５４４４、１５４４５、１５４４８、１５４４９、１５４５０、１５４５１、１５４５２、１５４５５、１５４５７、１５４５９、１５４６２、１５４６３、１５４６５、１５４６６、１５４６７、１５４６８、１５４７４、１５４７５、１５４７６、１５４７７、１５４７８、１５４７９、１５４８０、１５４８１、１５４８２、１５４８７、１５４８８、１５４９０、１５４９１、１５４９２、１５４９３、１５４９４、１５４９６、１５４９７、１５４９８、１５４９９、１５５００、１５５０２、１５５０６、１５５１０、１５５１１、１５５１２、１５５１３、１５５１４、１５５１５、１５５１６、１５５１７、１５５１８、１５５２０、１５５２１、１５５２２、１５５２３、１５５２４、１５５２５、１５５２６、１５５２７、１５５２８、１５５２９、１５５３０、１５５３１、１５５３５、１５５３６、１５５３７、１５５３８、１５５３９、１５５４０、１５５４１、１５５４２、１５５４３、１５５４６、１５５４７、１５５４８、１５５４９、１５５５０、１５５５１、１５５５２、１５５５４、１５５５５、１５５５７、１５５６０、１５５６１、１５５６２、１５５６３、１５５６４、１５５６６、１５５６７、１５５６８、１５５６９、１５５７０、１５５７１、１５５７２、１５５７３、１５５７４、１５５７５、１５５７６、１５５７７、１５５８０、１５５８１、１５５８３、１５５９１、１５５９４、１５５９５、１５５９６、１５５９７、１５５９８、１５６００、１５６０８、１５６０９、１５６１１、１５６１３、１５６１４、１５６１５、１５６１６、１５６１７、１５６１８、１５６１９、１５６２１、１５６２２、１５６２４、１５６２５、１５６２６、１５６２７、１５６２９、１５６３１、１５６３２、１５６３３、１５６３４、１５６３６、１５６３７、１５６３８、１５６４１、１５６４２、１５６４３、１５６４４、１５６４５、１５６４６、１５６４７、１５６４８、１５６５０、１５６５１、１５６５９、１５６６０、１５６６１、１５６６２、１５６６３、１５６６４、１５６６７、１５６６８、１５６７０、１５６７１、１５６７２、１５６７４、１５６７５、１５６７８、１５６８１、１５６８２、１５６８７、１５６８８、１５６９１、１５６９３、１５７０５、１５７１９、１５７２２、１５７２４、１５７２５、１５７３２、１５７３３、１５７３５、１５７３７、１５７４５、１５７４６、１５７５０、１５７５６、１５７６３、１５７６５、１５７６６、１５７６７、１５７６８、１５７７０、１５７７１、１５７７６、１５７８１、１５７８２、１５７８９、１５７９０、１５７９２、１５７９４、１５７９５、１５７９６、１５７９７、１５８０５、１５８０７、１５８０８、１５８１０、１５８１１、１５８１３、１５８１４、１５８１５、１５８１６、１５８１８、１５８１９、１５８２０、１５８２１、１５８２４、１５８２６、１５８２７、１５８２８、１５８２９、１５８３１、１５８３２、１５８３６、１５８３８、１５８３９、１５８４１、１５８４２、１５８４３、１５８４４、１５８４７、１５８４９、１５８５０、１５８５１、１５８５３、１５８５４、１５８５５、１５８５６、１５８５７、１５８５８、１５８５９、１５８６３、１５８６６、１５８６７、１５８６８、１５８７０、１５８７１、１５８７２、１５８７３、１５８７４、１５８７５、１５８７６、１５８７７、１５８７８、１５８７９、１５８８０、１５８８１、１５８８３、１５８８４、１５８８５、１５８８６、１５８８７、１５８８８、１５８８９、１５８９０、１５８９２、１５８９６、１５８９９、１５９００、１５９０２、１５９０４、１５９０５、１５９０６、１５９０７、１５９１９、１５９２０、１５９２３、１５９２４、１５９２８、１５９２９、１５９３０、１５９３２、１５９３３、１５９３５、１５９３６、１５９３８、１５９４３、１５９４５、１５９４６、１５９５０、１５９５２、１５９５４、１５９５６、１５９６０、１５９６１
、１５９６９、１５９７３、１５９７４、１５９７７、１５９７９、１５９８５、１５９９０、１５９９１、１５９９２、１５９９４、１５９９５、１５９９７、１６０００、１６００１、１６００３、１６００４、１６００５、１６００６、１６００７、１６００８、１６０１９、１６０２２、１６０２３、１６０２４、１６０２５、１６０２８、１６０２９、１６０３３、１６０３５、１６０３６、１６０３７、１６０４１、１６０４９、１６０５０、１６０５１、１６０５６、１６０５９、１６０６０、１６０６１、１６０６２、１６０６８、１６０７６、１６０７７、１６０８２、１６０８３、１６０８４、１６０８７、５６１３８、５６１４１、１６０９２、１６０９５、１６０９７、１６０９８、１６１０１、１６１０２、１６１０３、１６１０４、１６１０５、１６１０６、１６１０８、１６１１１、１６１１２、１６１１４、１６１１５、１６１１６、１６１１７、１６１２０、１６１２２、１６１２５、１６１２６、１６１２８、１６１２９、１６１３０、１６１３１のいずれかのうちの原形質膜タンパク質をコードし得るが、これらに限定されない。
【０２２０】
一実施形態において、目的のポリペプチドは細胞内膜タンパク質である。１つの非制限的な例として、ポリヌクレオチド類、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、配列番号８１６６、８１６７、８１６８、８１６９、８１７１、８１７３、８１７４、８１７６、８１９９、８２０５、８２０６、８２０７、８２１０、８２２０、８２２１、８２２２、８２７１、８２７７、８２７８、８２７９、８２９７、８３０３、８３０６、８３２４、８３２６、８３３４、８３３６、８３３７、８４２９、８４４３、８４８３、８４８４、８４８５、８４８６、８４８７、８４９１、８４９２、８４９３、８４９４、８５０２、８５０３、８５０７、８５９０、８５９１、８５９２、８５９３、８６２６、８６３０、８６３１、８６３４、８６７３、８６７４、８６７５、８６７７、８６７９、８６８１、８６８２、８６９０、８７８３、８８２８、８８２９、８８３１、８８５１、８８５４、８８６３、８８６５、８９３５、８９４５、８９８６、９０２１、９０８２、９０９８、９１１１、９１１２、９１３３、９１７３、９１８６、９１８８、９１８９、９１９９、９２００、９２０１、９２０２、９２１４、９２３８、９２３９、９２４９、９２５７、９２５８、９２５９、９２７２、９２９０、９３０２、９３１７、９３２０、９３６８、９３６９、９３８４、９３８５、９３８６、９４３６、９４５５、９４５６、９４６７、９５０４、９５７８、９５８２、９５８９、９５９３、９５９４、９５９５、９５９６、９５９９、９６２６、９６２９、９６３０、９６３１、９６３５、９６４０、９６４１、９６４３、９６４４、９６４６、９６８３、９７１９、９７２０、９７２１、９７２３、９７２７、９７２８、９７４４、９７７１、９７７２、９７７３、９７７４、９７７８、９７７９、９７８１、９７８６、９８１９、９８２３、９８２４、９８４７、９８４８、９８４９、９８５５、９８５６、９８５９、９８７９、９８８５、９８８６、９８８７、９８８８、９８８９、９９５３、９９５６、９９７５、９９７８、９９８８、９９８９、９９９０、９９９１、９９９２、９９９５、１００２６、１００５９、１００７０、１００７３、１００７４、１００７６、１００７７、１００７８、１００９７、１０１０２、１０１０３、１０１１２、１０１１３、１０１１４、１０１１５、１０１４７、１０１５３、１０３０２、１０３０４、１０３６５、１０３９１、１０３９２、１０４１３、１０４１４、１０４１６、１０４１７、１０４３４、１０４４４、１０４４７、１０４４９、１０４５０、１０４５１、１０６０６、１０６０７、１０６２９、１０６３０、１０６３３、１０６３４、１０６３５、１０６３６、１０６４７、１０６４９、１０６５６、１０６５７、１０６６０、１０６６７、１０６６８、１０６６９、１０６７１、１０６７２、１０６９５、１０７０８、１０７１２、１０７１７、１０７１９、１０７２２、１０７２３、１０７４０、１０７４１、１０７４２、１０７４５、１０７８１、１０８０９、１０８６９、１０８９３、１０８９９、１０９１３、１０９１７、１０９１８、１０９２２、１０９５３、１０９８４、１０９８６、１０９８７、１１０５６、１１２２６、１１２２７、１１２２８、１１２２９、１１２３０、１１２３１、１１２３３、１１２３４、１１２３５、１１２３６、１１２３７、１１２５３、１１６８２、１１６８３、１１７２０、
１１７２１、１１７５１、１１７５２、１１７５６、１１７５７、１１７５８、１１７５９、１１７６０、１１７６１、１１７６６、１１８１３、１１８４２、１１８４８、１１８５４、１１８５６、１１８６６、１１８６７、１１８６８、１１８６９、１１８７０、１１８７２、１１８７７、１１９２３、１１９２５、１１９２６、１１９２７、１１９２８、１１９２９、１１９３３、１１９８９、１２００２、１２００３、１２００４、１２００５、１２００６、１２０１３、１２０１７、１２０２３、１２０２５、１２０３１、１２０５５、１２１０８、１２１４２、１２１４４、１２１４５、１２７２０、１２７２３、１２７２６、１２７２８、１２７３４、１２７３７、１２７３８、１２７３９、１２７４０、１２７７４、１２７７５、１２７７６、１２７７７、１２７７８、１２７８０、１２７８２、１２７８３、１２７９６、１２８１７、１２８３３、１２８３５、１２８３７、１２８３８、１２８４０、１２８５２、１２８６２、１２８７０、１２８８８、１２８８９、１２９１４、１３０４７、１３０４９、１３０８０、１３０９９、１３１６２、１３１９４、１３１９５、１３１９６、１３１９７、１３１９８、１３２０２、１３２０３、１３２０４、１３２０６、１３２０７、１３２３０、１３２３２、１３２４０、１３３２３、１３３２９、１３３３０、１３３４８、１３３４９、１３３５１、１３３５２、１３３５３、１３３６８、１３５４２、１３５４３、１３５６３、１３５７６、１３５７７、１３６５０、１３６５１、１３６５２、１３７４４、１３７４６、１３７４７、１３７４８、１３７５９、１３８８１、１３８８２、１３８８３、１３９５８、１３９５９、１３９７３、１３９７８、１４０１８、１４０２１、１４０５２、１４０５４、１４０５６、１４０７０、１４０８７、１４０８８、１４０８９、１４０９４、１４１０２、１４１０４、１４１０５、１４１０６、１４５７５、１４５７６、１４５７７、１４５７８、１４６０６、１４６２２、１４６２８、１４６６５、１４６６６、１４６６９、１４６７３、１４７４６、１４７７９、１４８５２、１４８６１、１４８６２、１４８６３、１４８７０、１４８７１、１４８７２、１４９２４、１４９２５、１４９２６、１４９２７、１４９２８、１４９２９、１４９３０、１４９３１、１４９３７、１４９３８、１４９４０、１４９４２、１４９４３、１４９４４、１４９４７、１４９６０、１４９６１、１４９６９、１４９７３、１４９７４、１４９７７、１５７０４、１５７１０、１５７１１、１５７１２、１５７１３、１５７１４、１５７１５、１５７１６、１５７４９、１５７７５、１５７７８、１５７７９、１５７８０、１５７８３、１５７８４、１５７８５、１５７８６、１５８０１、１５８０３、１５８８２、１５９１４、１５９７５、１５９８７、１６０１３、１６０１５、１６０１８、１６０３８、１６０４４、１６０９９のいずれかのうちの細胞内膜結合タンパク質をコードし得るが、これらに限定されない。
【０２２１】
一実施形態において、目的のポリペプチドは原形質膜タンパク質または細胞内膜タンパク質である。１つの非制限的な例として、ポリヌクレオチド類、一次構築物および／またはｍｍＲＮＡは、配列番号８１４４〜１６１３１のいずれのうちの原形質膜タンパク質または細胞内膜タンパク質をコードし得るが、これらに限定されない。
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、Ｎ末端とＣ末端の真ん中、Ｎ末端と中間点との間、中間点とＣ末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないＮ末端とＣ末端との間の任意の空間で、Ｎ末端、Ｃ末端に位置し得る。
【０２２２】
本発明のポリペプチドは、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フーリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）、およびＰＣ７として既知の酵母ケキシンに関連した７個の塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンアイソザイム１（ＳＫ
Ｉ−１）およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる非塩基性残基で切断する他の２個のサブチラーゼを含む９個のプロテイナーゼのファミリーである。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非限定的な例が表７に列記される。表７において、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指し、「ｎ」は、０、２、４、または６個のアミノ酸であり得、「＊」は、タンパク質切断部位を指す。表７において、配列番号５６１４０は、ｎが４であるときを指し、配列番号５６１４１は、ｎが６であるときを指す。
表７．タンパク質切断部位配列
【表０００７】
2017121240.tif 000581
【０２２３】
一実施形態において、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、一次構築物またはｍｍＲＮＡが少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作され得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コーディング領域の前、コーディング領域内に位置し得、例えば、コーディング領域の中間、開始コドンと中間点との間、中間点と終止コドンとの間、コーディング領域の後、終止コドンの後、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない。
【０２２４】
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含み得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、プロタンパク質コンバターゼ（もしくはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、および／または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。当業者であれば、上の表１または他の既知の方法を用いて、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡに含める適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、表７のシグナルから始め、表１のコドンを考慮して、結果として生じるポリペプチドにおいてタンパク質シグナルを生成し得る一次構築物のシグナルを設計することができる。
【０２２５】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグ
ナルおよび／または部位を含む。
【０２２６】
非限定的な例として、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，９３０号および米国特許公開第２００９０２２７６６０号は、フーリン切断部位を用いて、発現産物におけるＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から切断する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、ポリペプチドがＧＬＰ−１ではないことを条件とする。
【０２２７】
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
【０２２８】
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、一次構築物またはｍｍＲＮＡがＧＬＰ−１をコードしないことを条件とする。
【０２２９】
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、２つ以上のコーディング領域を含み得る。複数のコーディング領域が本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡに存在する場合、複数のコーディング領域は、コードされたタンパク質切断部位によって分離され得る。非限定的な例として、一次構築物またはｍｍＲＮＡは、順序付けられたパターンで書き込まれ得る。そのようなパターンは、ＡＸＢＹ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第２のそのようなパターンは、ＡＸＹＢＺ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、Ｘ、Ｙ、およびＺは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第３のパターンは、ＡＢＸＣＹ形態に従い、Ａ、Ｂ、およびＣは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。
【０２３０】
一実施形態において、ポリペプチド、一次構築物および、ｍｍＲＮＡは、ポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡがタンパク質切断部位に特異的なプロテアーゼでの処理によって担体領域または融合パートナーから放出され得るように、前述のタンパク質切断部位をコードする配列も含有し得る。
【０２３１】
一実施形態において、本発明のポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、２Ａペプチドをコードする配列を含み得る。一実施形態において、この配列を用いて、２個以上の目的とするポリペプチドのコーディング領域を分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は、コーディング領域Ａとコーディング領域Ｂとの間に存在し得る（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）。２Ａペプチドの存在は、１個の長いタンパク質のタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、および２Ａペプチドへの切断をもたらす。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂは、同一または異なる目的とするポリペプチドであり得る。別の実施形態において、２Ａペプチドを本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡで用いて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のタンパク質を産生することができる。
【０２３２】
転写後制御調節因子の組み込み
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの転写後制御調節因子を含み得る。これらの転写後制御調節因子は、小分子、化合物、および制御配列であり得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、転写後制御は、ＧＥＭＳ（商標）（小分子による遺伝子発現調節（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｌｕｅｓ））スクリーニング技術を用いてＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって特定された小分子を用いて達成され得る。
【０２３３】
転写後制御調節因子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００６０２２７１２号に詳述される方法によってスクリーニングされる遺伝子発現調節因子、またはこれに記載の遺伝子発現調節因子であり得る。翻訳制御に関与するＲＮＡ制御配列を特定する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０６７７２８号に記載されており、遺伝子の非翻訳領域依存的発現を調節する化合物を特定する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０６５５６１号に記載されている。
【０２３４】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡの５’および／または３’非翻訳領域に位置する少なくとも１つの転写後制御調節因子を含み得る。
【０２３５】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、未熟な翻訳終結を調節するために少なくとも１つの転写後制御調節因子を含み得る。転写後制御調節因子は、それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０１０１０６号、同第ＷＯ２００６０４４４５６号、同第ＷＯ２００６０４４６８２号、同第ＷＯ２００６０４４５０３号、および同第ＷＯ２００６０４４５０５号に記載の化合物、またはこれらに概説の方法によって見出される化合物であり得る。非限定的な例として、この化合物は、未熟な翻訳終結を調節するために、２８ＳリボソームＲＮＡの領域に結合し得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００４０１０１０６号を参照のこと）。
【０２３６】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、タンパク質発現を変化させるために少なくとも１つの転写後制御調節因子を含み得る。非限定的な例として、ＶＥＧＦの発現は、それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００５１１８８５７号、同第ＷＯ２００６０６５４８０号、同第ＷＯ２００６０６５４７９号、および同第ＷＯ２００６０５８０８８号に記載の化合物、またはこれらに記載の方法によって見出され得る化合物を用いて制御され得る。
【０２３７】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、翻訳を制御するために少なくとも１つの転写後制御調節因子を含み得る。一実施形態において、転写後制御調節因子は、ＲＮＡ制御配列であり得る。非限定的な例として、ＲＮＡ制御配列は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００６０７１９０３号に記載の方法によって特定され得る。
【０２３８】
ＩＩＩ．修飾
本明細書におけるポリヌクレオチド（一次構築物またはｍＲＮＡ分子等）において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の２０個のアミノ酸（部分）と比較した修飾を指す。
【０２３９】
この修飾は、様々なはっきりと異なる修飾であり得る。いくつかの実施形態において、コーディング領域、隣接領域、および／または末端領域は、１つ、２つ、または２つ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。いくつかの実施形態において、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと比較して、細胞における分解の減少を呈し得る。
【０２４０】
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、結合リン酸／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格への）等に対する任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１個以上の原子は、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル（例えば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（例えば、クロロもしくはフルオロ）と置き換えれ得るか、またはこれらで置換され得る。ある特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合の各々において存在する。本発明に従う修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッド）に対するリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【０２４１】
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導された自然免疫応答の特徴には、１）炎症誘発性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等の活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結もしくは減少が含まれる。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましくあり得る。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合に好ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、指向された様式で細胞内で作用され得る、分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、ポリヌクレオチドとの主溝相互作用（例えば、結合）パートナーの結合を攪乱し得るヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する（例えば、修飾ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドと比較して、主溝相互作用パートナーに対して低下した結合親和性を有する場合）。
【０２４３】
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、他の作用物質（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター等）を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１個以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および１個以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含み得る。これらのポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡについての詳細は、以下に続く。
【０２４４】
ポリヌクレオチドおよび一次構築物
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域、および第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域を含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉａ）もしくは式
（Ｉａ−１）：
【化１】
2017121240.tif 000582
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２４６】
式中、
【０２４７】
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【０２４８】
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
【０２４９】
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々が、独立して、存在する場合、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ３の組み合わせ、Ｒ１”とＲ３の組み合わせ、Ｒ２’とＲ３の組み合わせ、Ｒ２”とＲ３の組み合わせ、またはＲ５とＲ３の組み合わせ）が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し得、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ５の組み合わせ、Ｒ１”とＲ５の組み合わせ、Ｒ２’とＲ５の組み合わせ、またはＲ２”とＲ５の組み合わせ）が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し得、Ｒ４と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し得、ｍ’およびｍ”の各々が、独立して、０〜３（例えば、０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）の整数であり、
【０２５０】
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
【０２５１】
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０２５２】
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
【０２５３】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０２５４】
Ｂが、核酸塩基（例えば、プリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）であり、ＢとＲ１’の組み合わせ、ＢとＲ２’の組み合わせ、ＢとＲ１”の組み合わせ、もしくはＢとＲ２”の組み合わせが、それらが結合する炭素と一緒になって、二環式基（例えば、二環式ヘテロシクリル）を任意に形成し得るか、またはＢ、Ｒ１”、およびＲ３の組み合わせ、もしくはＢ、Ｒ２”、およびＲ３の組み合わせが、三環式もしくは四環式基（例えば、本明細書の式（ＩＩｏ）−（ＩＩｐ）等の三環式または四環式ヘテロシクリル）を任意に形成し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉａ−２）〜（Ｉａ−５）を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
【化２】
2017121240.tif 000583
【０２５５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例
えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉｂ）もしくは式（Ｉｂ−１）：
【化３】
2017121240.tif 000584
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２５６】
式中、
【０２５７】
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【０２５８】
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
【０２５９】
Ｒ１、Ｒ３’、Ｒ３”、およびＲ４の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、Ｒ１とＲ３’の組み合わせまたはＲ１とＲ３”の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得（例えば、ロックド核酸を産生するために）、
【０２６０】
各Ｒ５が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、
【０２６１】
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
【０２６２】
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０２６３】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０２６４】
Ｂが、核酸塩基である。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉｃ）：
【化４】
2017121240.tif 000585
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２６６】
式中、
【０２６７】
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【０２６８】
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
【０２６９】
Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３の各々が、独立して、核酸塩基（例えば、本明細書に記載のプリン、ピリミジン、またはその誘導体）、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３のうちの１つのみが核酸塩基であり、
【０２７０】
Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒ３、およびＲ５の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０２７１】
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
【０２７２】
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０２７３】
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
【０２７４】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０２７５】
Ｕを含む環が、１つ以上の二重結合を含み得る。
【０２７６】
特定の実施形態において、Ｕを含む環は、Ｕ−ＣＢ３Ｒｂ３間またはＣＢ３Ｒｂ３−ＣＢ２Ｒｂ２間に二重結合を有しない。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉｄ）：
【化５】
2017121240.tif 000586
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２７８】
式中、
【０２７９】
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【０２８０】
各Ｒ３が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０２８１】
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
【０２８２】
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０２８３】
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
【０２８４】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０２８５】
Ｂが、核酸塩基（例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉｅ）：
【化６】
2017121240.tif 000587
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２８７】
式中、
【０２８８】
Ｕ’およびＵ”の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
【０２８９】
各Ｒ６が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０２９０】
各Ｙ５’が、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレンもしくはエチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
【０２９１】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０２９２】
Ｂが、核酸塩基（例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（Ｉｆ）もしくは（
Ｉｆ−１）：
【化７】
2017121240.tif 000588
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０２９４】
式中、
【０２９５】
Ｕ’およびＵ”の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり（例えば、Ｕ’がＯであり、Ｕ”がＮである）、
【０２９６】
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
【０２９７】
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ３、およびＲ４の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、Ｒ１’とＲ３の組み合わせ、Ｒ１”とＲ３の組み合わせ、Ｒ２’とＲ３の組み合わせ、またはＲ２”とＲ３の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得（例えば、ロックド核酸を産生するため）、ｍ’およびｍ”の各々が、独立して、０〜３（例えば、０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）の整数であり、
【０２９８】
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
【０２９９】
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０３００】
各Ｙ５が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
【０３０１】
ｎが、１〜１００，０００の整数であり、
【０３０２】
Ｂが、核酸塩基（例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０３０３】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）、（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−３）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ）、および（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ））、Ｕを含む環は、１つまたは２つの二重結合を有する。
【０３０４】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”の各々は、存在する場合、Ｈである。さらなる実施形態において、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”の各々は、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、アルコキシアルコキシは、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである。いくつかの実施形態において、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである。
【０３０５】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”の各々は、存在する場合、Ｈである。さらなる実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”の各々は、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、アルコキシアルコキシは、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである。いくつかの実施形態において、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである。
【０３０６】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＨであるか、またはＲ３、Ｒ４、およびＲ５のすべてがＨである。特定の実施形態において、Ｒ３がＣ１〜６アルキルであり、Ｒ４がＣ１〜６アルキルであり、Ｒ５がＣ１〜６アルキルであるか、またはＲ３、Ｒ４、およびＲ５のすべてがＣ１〜６アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ３もＲ４もいずれもＨであり、Ｒ５はＣ１〜６アルキルである。
【０３０７】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ３およびＲ５が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、かつそれらが結合する炭素と一緒になって、トランス−３’，４’類似体等の任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、Ｒ３およびＲ５が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−であって、式中、ｂ１、ｂ２、およびｂ３の各々が、独立して、０〜３の整数である）。
【０３０８】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうちの１つ以上が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうちの１つ以上が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−であって、式中、ｂ１、ｂ２、およびｂ３の各々が、独立して、０〜３の整数である）。
【０３０９】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つ以上が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つ以上が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−であって、式中、ｂ１、ｂ２、およびｂ３の各々が、独立して、０〜３の整数である）。
【０３１０】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、各Ｙ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、または−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールである。特定の実施形態において、Ｙ２は、ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル）である。
【０３１１】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、各Ｙ３は
、独立して、ＯまたはＳである。
【０３１２】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｒ１は、Ｈであり、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキルであり、例えば、式中、ｓ２が０であり、ｓ１が１または２であり、ｓ３が０または１であり（例えば、Ｒ’が、Ｃ１〜６アルキルであり）、各Ｙ２は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり（例えば、式中、ＲＮ１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル）であり）、各Ｙ３は、独立して、ＯまたはＳ（例えば、Ｓ）である。さらなる実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。なおさらなる実施形態において、各Ｙ１は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり（例えば、式中、ＲＮ１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル）であり）、各Ｙ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
【０３１３】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、各Ｒ１は、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルであり（例えば、式中、ｓ２が０であり、ｓ１が１または２であり、ｓ３が０または１であり、Ｒ’がＣ１〜６アルキルであり）、Ｒ２がＨであり、各Ｙ２は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり（例えば、式中、ＲＮ１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル）であり）、各Ｙ３は、独立して、ＯまたはＳ（例えば、Ｓ）である。さらなる実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。なおさらなる実施形態において、各Ｙ１は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、式中
、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり（例えば、式中、ＲＮ１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ−プロピル）であり）、各Ｙ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
【０３１４】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）−（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｕを含む環は、β−Ｄ（例えば、β−Ｄ−リボ）配置である。
【０３１５】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｕを含む環は、α−Ｌ（例えば、α−Ｌ−リボ）配置である。
【０３１６】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、１つ以上のＢがシュードウリジン（ψ）または５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）であることはない。いくつかの実施形態において、ｎ個のＢ核酸塩基の約１０％〜約１００％は、ψでもｍ５Ｃでもない（例えば、ｎ個のＢの１０％〜２０％、１０％〜３５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７５％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜９８％、１０％〜９９％、２０％〜３５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７５％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜９８％、２０％〜９９％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７５％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜９８％、５０％〜９９％、５０％〜１００％、７５％〜９０％、７５％〜９５％、７５％〜９８％、７５％〜９９％、および７５％〜１００％は、ψでもｍ５Ｃでもない）。いくつかの実施形態において、Ｂは、ψでもｍ５Ｃでもない。
【０３１７】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態において（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））、Ｂが、シトシン、グアニン、ウラシル、およびアデニンから選択される未修飾核酸塩基であるとき、Ｙ１、Ｙ２、またはＹ３のうちの少なくとも１つは、Ｏではない。
【０３１８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｃ）：
【化８】
2017121240.tif 000589
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。特定の実施形態において、Ｕは、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルである（例えば、Ｕが、−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり（例えば、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、Ｒ５は、Ｈまたはヒドロキシであり）、−−−は、一重結合または二重結合である。
【０３１９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｂ−１）〜（ＩＩｂ−２）：
【化９】
2017121240.tif 000590
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体
を含む。いくつかの実施形態において、Ｕは、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルである（例えば、Ｕは、−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２  の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在である（例えば、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシである）。特定の実施形態において、Ｒ２は、ヒドロキシまたは任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、または本明細書に記載のいずれか）である。
【０３２０】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−４）：
【化１０】
2017121240.tif 000591
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態において、Ｕは、ＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、式中、ｎｕが、０〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されたアルキルである（例えば、Ｕが、−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在である（例えば、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、Ｈ、ハロ、ヒ
ドロキシ、アルキル、またはアルコキシであり、各Ｒ３は、独立して、Ｈまたは任意に置換されたアルキル）である）。特定の実施形態において、Ｒ２は、任意に置換されたアルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ、または本明細書に記載のいずれか）である。特定の実施形態において、Ｒ１は、任意に置換されたアルキルであり、Ｒ２は、ヒドロキシである。他の実施形態では、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２は、任意に置換されたアルキルである。さらなる実施形態において、Ｒ３は、任意に置換されたアルキルである。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、非環式修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（ＩＩｄ）〜（ＩＩｆ）：
【化１１】
2017121240.tif 000592
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、非環式修飾ヘキシトールを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（ＩＩｇ）〜（ＩＩｊ）：
【化１２】
2017121240.tif 000593
のｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
【０３２３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、短縮または延長したリボース環を有する糖部分を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式
（ＩＩｋ）〜（ＩＩｍ）：
【化１３】
2017121240.tif 000594
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、およびＲ２”の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、Ｒ２’とＲ３の組み合わせまたはＲ２”とＲ３の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ロックド修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（ＩＩｎ）：
【化１４】
2017121240.tif 000595
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ３’が、Ｏ、Ｓ、または−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、Ｒ３”が、任意に置換されたアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）または任意に置換されたヘテロアルキレン（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−）である（例えば、Ｒ３’がＯであり、Ｒ３”が任意に置換されたアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）である）。
【０３２５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｎ−１）〜（ＩＩ−ｎ２）：
【化１５】
2017121240.tif 000596
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ３’が、Ｏ、Ｓ、または−ＮＲＮ１−であり、式中、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、Ｒ３”が、任意に置換されたアルキレン（例え
ば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）または任意に置換されたヘテロアルキレン（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−）である（例えば、Ｒ３’がＯであり、Ｒ３”が任意に置換されたアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）である）。
【０３２６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、四環式ヘテロシクリルを形成するロックド修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）は、式（ＩＩｏ）：
【化１６】
2017121240.tif 000597
を有するｎ個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｃ、Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、Ｔ２”、Ｖ１、およびＶ３は、本明細書に記載の通りである。
【０３２７】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの式のうちのいずれかは、本明細書に記載の１個以上の核酸塩基（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３））を含み得る。
【０３２８】
一実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式（Ｉａ）：
【化１７】
2017121240.tif 000598
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式（ＩＩＩａ）：
【化１８】
2017121240.tif 000599
の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
【０３２９】
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、この方法は、本明細書で定義される式（ＩＩＩａ）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０３３０】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式（Ｉａ）：
【化１９】
2017121240.tif 000600
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式（ＩＩＩａ−１）：
【化２０】
2017121240.tif 000601
の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
【０３３１】
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、この方法は、
【０３３２】
本明細書で定義される式（ＩＩＩａ−１）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０３３３】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾ｍＲＮＡを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式（Ｉａ−２）：
【化２１】
2017121240.tif 000602
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式（ＩＩＩａ−２）：
【化２２】
2017121240.tif 000603
の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
【０３３４】
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾ｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、この方法は、
【０３３５】
本明細書で定義される式（ＩＩＩａ−２）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、反応は、１〜約７，０００回繰り返され得る。本明細書の実施形態のうちのいずれかにおいて、Ｂは、式（ｂ１）〜（ｂ４３）の核酸塩基であり
得る。
【０３３７】
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の５’および／または３’隣接領域を任意に含み得る。
【０３３８】
修飾ＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子
本発明は、修飾ＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの調製に有用であり得る。いくつかの実施形態において、ビルディングブロック分子は、式（ＩＩＩａ）もしくは（ＩＩＩａ−１）：
【化２３】
2017121240.tif 000604
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、置換基は、本明細書に記載のもの（例えば、式（Ｉａ）および（Ｉａ−１））であり、Ｂが、シトシン、グアニン、ウラシル、およびアデニンから選択される未修飾核酸塩基であるとき、Ｙ１、Ｙ２、またはＹ３のうちの少なくとも１つは、Ｏではない。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＶａ）〜（ＩＶｂ）：
【化２４】
2017121240.tif 000605
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜
（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）：
【化２５】
2017121240.tif 000606
2017121240.tif 000607
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４１】
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（Ｖａ）もしくは（Ｖｂ）：
【化２６】
2017121240.tif 000608
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。
【０３４２】
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）：
【化２７】
2017121240.tif 000609
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４３】
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）：
【化２８】
2017121240.tif 000610
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４４】
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）：
【化２９】
2017121240.tif 000611
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Ｂは、本明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４５】
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）：
【化３０】
2017121240.tif 000612
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、各ｒ１およびｒ２は、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数であり、Ｂは、本
明細書に記載のもの（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）である。特定の実施形態において、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。特定の実施形態において、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わせられる。
【０３４６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化３１】
2017121240.tif 000613
2017121240.tif 000614
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化３２】
2017121240.tif 000615
2017121240.tif 000616
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数であり、ｓ１は、本明細書に記載の通りである。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ）に組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾ウリジンである（例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６、およびｒは、本明細書に記載の通りである（例えば、各ｒは、独立して、０〜５、例えば、０〜３、１〜３、または１〜５の整数である）：
【化３３】
2017121240.tif 000617
2017121240.tif 000618
2017121240.tif 000619
2017121240.tif 000620
2017121240.tif 000621
2017121240.tif 000622
2017121240.tif 000623
2017121240.tif 000624
2017121240.tif 000625
2017121240.tif 000626
2017121240.tif 000627
2017121240.tif 000628
2017121240.tif 000629
2017121240.tif 000630
2017121240.tif 000631
2017121240.tif 000632
2017121240.tif 000633
2017121240.tif 000634
2017121240.tif 000635
【０３４９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾シチジンである（例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６、およびｒは、本明細書に記載の通りである（例えば、各ｒは、独立して、０〜５、例えば、０〜３、１〜３、または１〜５の整数である）：
【化３４】
2017121240.tif 000636
2017121240.tif 000637
2017121240.tif 000638
2017121240.tif 000639
2017121240.tif 000640
2017121240.tif 000641
例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化３５】
2017121240.tif 000642
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾アデノシンである（例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６、およびｒは、本明細書に記載の通りである（例えば、各ｒは、独立して、０〜５、例えば、０〜３、１〜３、または１〜５の整数である）：
【化３６】
2017121240.tif 000643
2017121240.tif 000644
2017121240.tif 000645
2017121240.tif 000646
2017121240.tif 000647
2017121240.tif 000648
2017121240.tif 000649
【０３５１】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾グアノシンである（例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６、およびｒは、本明細書に記載の通りである（例えば、各ｒは、独立して、０〜５、例えば、０〜３、１〜３、または１〜５の整数である）：
【化３７】
2017121240.tif 000650
2017121240.tif 000651
2017121240.tif 000652
2017121240.tif 000653
2017121240.tif 000654
2017121240.tif 000655
【０３５２】
いくつかの実施形態において、化学修飾は、（例えば、ピリミジンヌクレオシド、例えば、シトシンまたはウラシルの）環のＣ−５のＣ基のＮとの置換（例えば、Ｃ−５の＞ＣＨ基の＞ＮＲＮ１基との置換（式中、ＲＮ１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである））を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化３８】
2017121240.tif 000656
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
【０３５３】
別の実施形態において、化学修飾は、シトシンのＣ−５の水素のハロ（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、もしくはＩ）または任意に置換されたアルキル（例えば、メチル）との置換を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化３９】
2017121240.tif 000657
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
【０３５４】
なおさらなる実施形態において、化学修飾は、Ｃ−４位でＮＨ２によって、かつＣ−５位で炭素原子によって形成される縮合環を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
【化４０】
2017121240.tif 000658
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各ｒは、独立して、０〜５（例えば、０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。  
【０３５５】
糖における修飾
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、リボ核酸の糖において修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。２’位での例示の置換には、Ｈ、ハロ、任意に置換されたＣ１〜６アルキル、任意に置換されたＣ１〜６アルコキシ、任意に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ、任意に置換されたＣ３〜８シクロアルキル、任意に置換されたＣ３〜８シクロアルコキシ、任意に置換されたＣ６〜１０アリールオキシ、任意に置換されたＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、任意に置換されたＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ、糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、ＲがＨまたは任意に置換されたアルキルであり、ｎが０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数である）、２’−ヒドロキシルがＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一のリボース糖の４’−炭素に結合される「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（例示の架橋には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる）、本明細書で定義されるアミノアルキル、本明細書で定義されるアミノアルコキシ、本明細書で定義されるアミノ、および本明細書で定義されるアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。概して、ＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖類リボースを含む。非限定的な例示の修飾ヌクレオチドには、リボースの酸素の（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンとの）置換、二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルと置換するため）、リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するため）、リボースの環拡大（例えば、無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホラミデート骨格も有するモルホリノ等のさらなる炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成するため）、多環式形態（例えば、トリシクロ、および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、リボースがホスホジエステル結合に結合するグリコール単位で置換される部分）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される部分）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ、２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置換する部分）が挙げられる。糖基は、リボースの対応する炭素の立体化学配置とは逆の立体化学配置を有する１個以上の炭素も含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る���
【０３５６】
核酸塩基における修飾
本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。修飾ヌクレオチドは、（１個以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるために、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に）本明細書に記載の任意の有用な方法によって合成され得る。
【０３５７】
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準のアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、ま
たはグアノシン−シトシン塩基対のみならず、非標準塩基または修飾塩基を含むヌクレオチド間および／または修飾ヌクレオチド間に形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーおよび水素結合受容体の配置は、非標準塩基および標準塩基間または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。
【０３５８】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。ＲＮＡに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、強化された特性、例えば、主溝結合パートナーの結合の破壊によるヌクレアーゼへの耐性を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子を提供し得る。以下の表８は、各基準のヌクレオチドの化学的外観を特定する。円は、それぞれの化学領域を含む原子を特定する。
表８
【表０００８】
2017121240.tif 000659
【０３５９】
いくつかの実施形態において、Ｂは、修飾ウラシルである。例示の修飾ウラシルは、式
（ｂ１）〜（ｂ５）：
【化４１−１】
2017121240.tif 000660
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０３６０】
式中、
【０３６１】
【化４１−２】
2017121240.tif 000661
が、一重または二重結合であり、
【０３６２】
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’とＴ１”の組み合わせもしくはＴ２’とＴ２”の組み合わせが一緒になって（例えば、Ｔ２にあるような）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し、
【０３６３】
Ｖ１およびＶ２の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｂ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｂ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｂが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、または任意に置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書に記載のいずれかの置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択された置換基で任意に置換されたもの）であり、
【０３６４】
Ｒ１０が、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたア
ミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
【０３６５】
Ｒ１１が、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
【０３６６】
Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシで任意に置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
【０３６７】
Ｒ１２ｃが、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルである。
【０３６８】
他の例示の修飾ウラシルは、式（ｂ６）〜（ｂ９）：
【化４２−１】
2017121240.tif 000662
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０３６９】
式中、
【０３７０】
【化４２−２】
2017121240.tif 000663
が、一重または二重結合であり、
【０３７１】
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’とＴ１”の組み合わせが一緒になって（例えば、Ｔ１にあるような）、またはＴ２’とＴ２”の組み合わせが一緒になって（例えば、Ｔ２にあるような）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成するか、または各Ｔ１およびＴ２が、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）であり、
【０３７２】
Ｗ１およびＷ２の各々が、独立して、Ｎ（ＲＷａ）ｎｗまたはＣ（ＲＷａ）ｎｗであり、式中、ｎｗが、０〜２の整数であり、各ＲＷａが、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、
【０３７３】
各Ｖ３が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶａ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶａ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶａが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよび／もしくはＯ−保護基で任意に置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキル（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）であり、ＲＶａおよびＲ１２ｃが、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、５もしくは６員環）を形成し得、
【０３７４】
Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよび／もしくはＯ−保護基で任意に置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、任意に置換されたカルバモイルアルキルであるか、または不在であり、
【０３７５】
Ｒ１２ｂは、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換
されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよび／もしくはＯ−保護基で任意に置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
【０３７６】
Ｒ１２ｂとＴ１’の組み合わせまたはＲ１２ｂとＲ１２ｃの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
【０３７７】
Ｒ１２ｃは、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルである。
【０３７８】
さらなる例示の修飾ウラシルは、式（ｂ２８）〜（ｂ３１）：
【化４３】
2017121240.tif 000664
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０３７９】
式中、
【０３８０】
Ｔ１およびＴ２の各々が、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり、
【０３８１】
各ＲＶｂ’およびＲＶｂ”が、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、
ヒドロキシおよび／もしくはＯ−保護基で任意に置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキル（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）であり（例えば、ＲＶｂ’が、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキル、例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたものであり）、
【０３８２】
Ｒ１２ａが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０３８３】
Ｒ１２ｂが、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル（例えば、例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、
【０３８４】
任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルである。
【０３８５】
特定の実施形態において、Ｔ１は、Ｏ（オキソ）であり、Ｔ２は、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。他の実施形態では、Ｔ１は、Ｓ（チオ）であり、Ｔ２は、Ｏ（オキソ）またはＳｅ（セレノ）である。いくつかの実施形態において、ＲＶｂ’は、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシである。
【０３８６】
他の実施形態では、各Ｒ１２ａおよびＲ１２ｂは、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたヒドロキシアルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１２ａは、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ１２ａもＲ１２ｂもいずれもＨである。
【０３８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ１２ｂの各ＲＶｂ’は、独立して、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、または任意に置換されたアシルアミノアルキル（例えば、Ｎ−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの）である。いくつかの実施形態において、任意に置換されたアミノアルキルのアミノおよび／またはアルキルは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたスルホアルキル、任意に置換されたカルボキシ（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたヒドロキシ（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたカルボキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、またはＮ−保護基のうちの１つ以上で置換される。いく
つかの実施形態において、任意に置換されたアミノアルキルは、任意に置換されたスルホアルキルまたは任意に置換されたアルケニルで置換される。特定の実施形態において、Ｒ１２ａもＲＶｂ”もいずれもＨである。特定の実施形態において、Ｔ１は、Ｏ（オキソ）であり、Ｔ２は、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。
【０３８８】
いくつかの実施形態において、ＲＶｂ’は、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキルまたは任意に置換されたカルバモイルアルキルである。
【０３８９】
特定の実施形態において、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、Ｒ１２ｃ、またはＲＶａの任意の置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６もしくは１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、もしくは１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨもしくはＣ１〜２０アルキルである）、またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であり、式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６もしくは１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、もしくは１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素もしくは任意に置換されたＣ１〜６アルキルである）である。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、Ｂは、修飾シトシンである。例示の修飾シトシンは、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）：
【化４４】
2017121240.tif 000665
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
【０３９１】
Ｔ３’およびＴ３”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ３’とＴ３”の組み合わせが一緒になって（例えば、Ｔ３にあるような）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し、
【０３９２】
各Ｖ４が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｃ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｃ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｃが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に
置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）であり、Ｒ１３ｂとＲＶｃの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
【０３９３】
各Ｖ５が、独立して、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｄが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）であり（例えば、Ｖ５が、−ＣＨまたはＮであり）、
【０３９４】
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂとＲ１４の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
【０３９５】
各Ｒ１４が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ（例えば、−ＮＨＲ（式中、Ｒが、Ｈ、アルキル、アリール、もしくはホスホリルである））、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
【０３９６】
Ｒ１５およびＲ１６の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである。
【０３９７】
さらなる例示の修飾シトシンは、式（ｂ３２）〜（ｂ３５）：
【化４５】
2017121240.tif 000666
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０３９８】
式中、
【０３９９】
Ｔ１およびＴ３の各々が、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり、
【０４００】
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂとＲ１４の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
【０４０１】
各Ｒ１４が、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ（例えば、−ＮＨＲ（式中、Ｒが、Ｈ、アルキル、アリール、もしくはホスホリルである）、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル）、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０４０２】
Ｒ１５およびＲ１６の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである（例えば、Ｒ１５が、Ｈであり、Ｒ１６が、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである）。
【０４０３】
いくつかの実施形態において、Ｒ１５は、Ｈであり、Ｒ１６は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１４は、Ｈ、アシル、またはヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１４は、ハロである。いくつかの実施形態において、Ｒ１４もＲ１５もいずれもＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１５もＲ１６もいずれもＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１４およびＲ１５およびＲ１６の各々は、Ｈである。さらなる実施形態において、Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂの各々は、独立して、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである。
【０４０４】
修飾シトシンのさらなる非限定的な例には、式（ｂ３６）：
【化４６】
2017121240.tif 000667
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体が挙げられ、
【０４０５】
式中、
【０４０６】
各Ｒ１３ｂが、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂとＲ１４ｂの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
【０４０７】
各Ｒ１４ａおよびＲ１４ｂが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されたもの）、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ（例えば、−ＮＨＲ（式中、Ｒが、Ｈ、アルキル、アリール、ホスホリル、任意に置換されたアミノアルキル、もしくは任意に置換されたカルボキシアミノアルキルである））、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
【０４０８】
Ｒ１５の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである。
【０４０９】
特定の実施形態において、Ｒ１４ｂは、任意に置換されたアミノ酸（例えば、任意に置換されたリジン）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１４ａは、Ｈである。
【０４１０】
いくつかの実施形態において、Ｂは、修飾グアニンである。例示の修飾グアニンは、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）：
【化４７】
2017121240.tif 000668
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０４１１】
式中、
【０４１２】
Ｔ４’、Ｔ４”、Ｔ５’、Ｔ５”、Ｔ６’、およびＴ６”の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、Ｔ４’とＴ４”の組み合わせ（例えば、Ｔ４にあるような）またはＴ５’とＴ５”の組み合わせ（例えば、
Ｔ５にあるような）またはＴ６’とＴ６”の組み合わせ（例えば、Ｔ６にあるような）が一緒になって、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）を形成し、
【０４１３】
Ｖ５およびＶ６の各々が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｄが、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、任意に置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０４１４】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノ酸である。
【０４１５】
例示の修飾グアノシンは、式（ｂ３７）〜（ｂ４０）：
【化４８】
2017121240.tif 000669
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０４１６】
式中、
【０４１７】
Ｔ４’の各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各Ｔ４が、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり、
【０４１８】
Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、およびＲ２１の各々が、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノ酸である。
【０４１９】
いくつかの実施形態において、Ｒ１８は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである。さらなる実施形態において、Ｔ４は、オキソである。いくつかの実施形態において、Ｒ１９ａおよびＲ１９ｂの各々は、独立して、Ｈまたは任意に置換されたアルキルである。
【０４２０】
いくつかの実施形態において、Ｂは、修飾アデニンである。例示の修飾アデニンは、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）：
【化４９】
2017121240.tif 000670
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、各Ｖ７が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｅ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｅ）ｎｖであり、式中、ｎｖが、０〜２の整数であり、各ＲＶｅが、独立して、Ｈ、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの（１）〜（２１）から選択される置換基で任意に置換されたもの）であり、
【０４２１】
各Ｒ２５が、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０４２２】
Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、またはポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキル）である））、またはアミノポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素または任意に置換されたＣ１〜６アルキルである））であり、
【０４２３】
各Ｒ２７が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０４２４】
各Ｒ２８が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
【０４２５】
各Ｒ２９が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
【０４２６】
例示の修飾アデニンは、式（ｂ４１）〜（ｂ４３）：
【０４２７】
【化５０】
2017121240.tif 000671
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
【０４２８】
式中、
【０４２９】
各Ｒ２５が、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
【０４３０】
Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂの各々が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、またはポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである））、またはアミノポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素または任意に置換されたＣ１〜６アルキルである））であり、
【０４３１】
各Ｒ２７が、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
【０４３２】
いくつかの実施形態において、Ｒ２６ａは、Ｈであり、Ｒ２６ｂは、任意に置換されたアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂの各々は、独立して、任意に置換されたアルキルである。特定の実施形態において、Ｒ２７は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。他の実施形態では、Ｒ２５は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。
【０４３３】
特定の実施形態において、Ｒ２６ａ、Ｒ２６ｂ、またはＲ２９の任意の置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’が、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである））、またはアミノポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１が、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々が、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１が、独立して、水素または任意に置換されたＣ１〜６アルキルである））である。
【０４３４】
いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ｂ２１）：
【化５１】
2017121240.tif 000672
を有し得、式中、Ｘ１２は、独立して、Ｏ、Ｓ、任意に置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、ｘａは、０〜３の整数であり、Ｒ１２ａおよびＴ２は、本明細書に記載の通りである。
【０４３５】
いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ｂ２２）：
【化５２】
2017121240.tif 000673
を有し得、式中、Ｒ１０’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換され
たヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、Ｒ１１、Ｒ１２ａ、Ｔ１、およびＴ２は、本明細書に記載の通りである。
【０４３６】
いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ｂ２３）：
【化５３】
2017121240.tif 000674
を有し得、式中、Ｒ１０は、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、任意に置換されたフリル、任意に置換されたチエニル、もしくは任意に置換されたピロリル）、任意に置換されたアリール（例えば、任意に置換されたフェニルもしくは任意に置換されたナフチル）、または本明細書に記載の任意の置換基（例えば、Ｒ１０のもの）であり、Ｒ１１（例えば、Ｈまたは本明細書に記載の任意の置換基）、Ｒ１２ａ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載の任意の置換基）、Ｔ１（例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基）、およびＴ２（例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基）は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ｂ２４）：
【化５４】
2017121240.tif 000675
を有し得、式中、Ｒ１４’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、Ｒ１３ａ、Ｒ１３ｂ、Ｒ１５、およびＴ３は、本明細書に記載の通りである。
【０４３７】
いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ｂ２５）：
【化５５】
2017121240.tif 000676
を有し得、式中、Ｒ１４’は、任意に置換されたヘテロシクリル（例えば、任意に置換されたフリル、任意に置換されたチエニル、もしくは任意に置換されたピロリル）、任意に置換されたアリール（例えば、任意に置換されたフェニルもしくは任意に置換されたナフチル）、または本明細書に記載の任意の置換基（例えば、Ｒ１４またはＲ１４’のもの）であり、Ｒ１３ａ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載の任意の置換基）、Ｒ１３ｂ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載の任意の置換基）、Ｒ１５（例えば、Ｈまたは本明細書に記載の任意の置換基）、およびＴ３（例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基）は、本明細書に記載の通りである。
【０４３８】
いくつかの実施形態において、Ｂは、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルからなる群から選択される核酸塩基である。いくつかの実施形態において、Ｂは、
【化５６】
2017121240.tif 000677
であり得る。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（
τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン（１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）としても既知のもの）、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’‐Ｆ‐アラ‐ウリジン、２’‐Ｆ‐ウリジン、２’‐ＯＨ‐アラ‐ウリジン、５‐（２‐カルボメトキシビニル）ウリジン、および５‐［３‐（１‐Ｅ‐プロペニルアミノ）ウリジンが挙げられる。
【０４４０】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−ｔｒｉメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’‐Ｆ‐アラ‐シチジン、２’‐Ｆ‐シチジン、および２’‐ＯＨ‐アラ‐シチジンが挙げられる。
【０４４１】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、２−アミノ−プリン、２、６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、
８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−ｔｒｉメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’‐Ｆ‐アラ‐アデノシン、２’‐Ｆ‐アデノシン、２’‐ＯＨ‐アラ‐アデノシン、およびＮ６‐（１９‐アミノ‐ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０４４２】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、および２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））が挙げられる。
【０４４３】
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン、またはピリミジン類似体から独立して選択され得る。例えば、核酸塩基はそれぞれ、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから独立して選択され得る。別の実施形態において、
核酸塩基には、例えば、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン、および１，３，５トリアジンを含む塩基の天然に存在する合成誘導体も含み得る。ヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵの略語を用いて示されるとき、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニン、または、例えば、７−デアザアデニンのようなアデニン類似体を含む。
【０４４４】
ヌクレオシド間結合における修飾
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの１個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によっても修飾され得る。
【０４４５】
α−チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡおよびＤＮＡポリマーに安定性を付与するように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性の増加、続いて細胞環境においてより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子は、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答も低下させることが見込まれている。
【０４４６】
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、または５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シュードウリジン）を含む。
【０４４７】
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合は、以下の本明細書に記載される。
【０４４８】
修飾糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか１つ以上の修飾を含み得る。例えば、式（Ｉａ）、（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−３）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ）における本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかは、本明細書に記載の核酸塩基のうちのいずれ（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３）または本明細書に記載の任意の他のもの）とも組み合わせられ得る。
【０４４９】
ポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子の合成
本発明に従って用いるポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載の任意の有用な技法に従って調製され得る。本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子の合成において用いられる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なプロセス条件または好ましいプロセス条件（例えば、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力等）が提供される場合、当業者であれば、さらなるプロセス条件を最適化および開発することができるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順を用いて当業者によって決定され得る。
【０４５０】
本明細書に記載のプロセスは、当技術分野で既知の任意の好適な方法に従って監視され得る。例えば、産物形成は、核磁気共鳴分光学（例えば、１Ｈもしくは１３Ｃ）、赤外線分光学、分光測光（例えば、紫外線可視）、もしく質量分析等の分光学的手段、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって監視され得る。
【０４５１】
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ分子の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１において見出され得る。
【０４５２】
本明細書に記載のプロセスの反応は、有機合成分野の技術者によって容易に選択され得る好適な溶媒において行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸点の範囲であり得る温度で、出発物質（反応物）、中間体、または産物とは実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、１つの溶媒または２つ以上の溶媒の混合物において行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに好適な溶媒が選択され得る。
【０４５３】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分解は、当技術分野で既知の多数の方法のうちのいずれかによって行われ得る。方法の例には、光学活性の塩形成有機酸である「キラル分解酸」を用いた分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に好適な分解酸には、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ形態等の光学活性酸がある。ラセミ混合物の分解は、光学活性分解剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラム上での溶出によっても行われ得る。好適な溶出溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、各々が
参照によりそれらの全体が組み込まれる、Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７４：２５８５−２５８８（２００９）、Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１）：７２−７８，（１９９４）、Ｆｕｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（４）：５６３−５６８（１９６２）、およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（９）：１７２９−１７４０（１９９２）に記載の合成方法に従って調製され得る。
【０４５４】
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、１種類以上またはすべての種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずか１つ以上もしくはすべて）は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の既定の配列領域（例えば、図１に表される配列領域のうちの１つ以上）において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドＸが修飾され、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
【０４５５】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの様々な位置で存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの機能が実質的に低下するように、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの任意の位置（複数可）に位置し得ることを認識する。修飾は、５’または３’末端修飾でもあり得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量または１種類以上のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上のいずれかと関連したもの）または任意の中間の割合（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含有し得る。
【０４５６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のウラシルまたはウリジン（概して、Ｕ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリ
ジン）と置換され得る。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ分子中のシトシンまたはシチジン（概して、Ｃ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）と置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉａ−１）：
【化５７】
2017121240.tif 000678
を有するｎ個の結合ヌクレオシドを含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接領域、または第２の隣接領域）を合成する方法を提供し、この方法は、
ａ）式（ＩＶ−１）：
【化５８】
2017121240.tif 000679
のヌクレオチドを、式（Ｖ−１）：
【化５９−１】
2017121240.tif 000680
のホスホラミダイト化合物と反応させて（式中、Ｙ９が、Ｈ、ヒドロキシ、ホスホリル、ピロリン酸塩、硫酸塩、アミノ、チオール、任意に置換されたアミノ酸、またはペプチド（例えば、２〜１２個のアミノ酸を含む）であり、各Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３が、独立して、好適な保護基であり、
【化５９−２】
2017121240.tif 000681
が、固体支持体を示す）、
式（ＶＩ−１）のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを提供することと、
【化６０】
2017121240.tif 000682
、および
ｂ）式（Ｖ）のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを酸化または硫化して、式（ＶＩＩ−１）のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを産出することと、
【化６１】
2017121240.tif 000683
、および
ｃ）保護基を除去して、式（Ｉａ）のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを産出することとを含む。
【０４５７】
いくつかの実施形態において、ステップａ）およびｂ）は、１〜約１０，０００回繰り返される。いくつかの実施形態において、この方法は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ（アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシル）からなる群から選択されるヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、ピリミジンまたはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、翻訳可能であり得る。
【０４５８】
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの他の成分は任意であり、いくつかの実施形態において有益である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲが提供され、これらのいずれか、または両方ともに、独立して、１つ以上の異なるヌクレオチド修飾を含有し得る。そのような実施形態において、ヌクレオチド修飾は、翻訳可能な領域においても存在し得る。コザック配列を含有するポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡも提供される。
【０４５９】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡ、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡに組み込まれる修飾ヌクレオチドの例示の合成は、以下のスキーム１〜スキーム１１で提供される。スキーム１は、修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシドのリン酸化の一般的な方法を提供する。
スキーム１
【化６２】
2017121240.tif 000684
【０４６０】
様々な保護基を用いて、反応を制御することができる。例えば、スキーム２は、２’および３’ヒドロキシル基ではなく、糖の５’位のリン酸化を促進するための複数の保護ス
テップおよび脱保護ステップの使用を提供する。
スキーム２
【化６３】
2017121240.tif 000685
【０４６１】
修飾ヌクレオチドは、任意の有用な方法で合成され得る。スキーム３、４、および７は、修飾プリン核酸塩基を有する修飾ヌクレオチドを合成するための例示の方法を提供し、スキーム５および６は、それぞれ、修飾シュードウリジンまたはシュードイソシチジンを有する修飾ヌクレオチドを合成するための例示の方法を提供する。スキーム３
【化６４】
2017121240.tif 000686
スキーム４
【化６５】
2017121240.tif 000687
スキーム５
【化６６】
2017121240.tif 000688
スキーム６
【化６７】
2017121240.tif 000689
スキーム７
【化６８】
2017121240.tif 000690
【０４６２】
スキーム８および９は、修飾ヌクレオチドの例示の合成を提供する。スキーム１０は、ヌクレオチドを産生するための非限定的な生体触媒方法を提供する。
スキーム８
【化６９】
2017121240.tif 000691
スキーム９
【化７０】
2017121240.tif 000692
スキーム１０
【化７１】
2017121240.tif 000693
【０４６３】
スキーム１１は、修飾ウラシルの例示の合成を提供し、そこでは、Ｎ１位は、他の箇所で提供されるように、Ｒ１２ｂで修飾され、リボースの５’位は、リン酸化される。Ｔ１、Ｔ２、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、およびｒは、本明細書に提供される通りである。この合成ならびにその最適化されたバージョンを用いて、他のピリミジン核酸塩基およびプリン核酸塩基（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３）を参照のこと）を修飾し、かつ／または１個以上のリン酸基を（例えば、糖の５’位に）導入することができる。このアルキル化反応を用いて、本明細書に記載の任意の核酸塩基における任意の反応基（例えば、アミノ基）（例えば、シトシン、ウラシル、アデニン、およびグアニンのワトソン・クリック塩基対合面のアミノ基）に１個以上の任意に置換されたアルキル基を含むこともできる。
スキーム１１
【化７２】
2017121240.tif 000694
【０４６４】
ｍｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの組み合わせ
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表９に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明のポリペプチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを形成することができる。別途述べられない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡの天然ヌクレオチドと完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示の修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つで部分的に置換され得る（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）。
表９
【表０００９−１】
2017121240.tif 000695
【表０００９−２】
2017121240.tif 000696
【０４６５】
修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表１０に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明のポリペプチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを形成することができる。
表１０
【表００１０】
2017121240.tif 000697
【０４６６】
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）の化合物に置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０４６７】
いくつかの実施形態において、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物に置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０４６８】
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）に化合物に置換され、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物に置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０４６９】
ＩＶ．薬学的組成物
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの組成物および複合体を提供する。薬学的組成物は、任意に、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および／または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る。
【０４７０】
いくつかの実施形態において、組成物は、ヒト、すなわちヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という表現は、一般に、本明細書に記載の送達対象のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを指す。
【０４７１】
本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、原則的に、ヒトへの投与に好適である薬学的組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物への、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適であるようにするための、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、よく理解されており、獣医薬理学の専門家は、たとえ用いるとしても単なる通常の実験法を用いて、そのような修飾を設計および／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット等の商業的に関連性のある哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／または家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウ等の商業的に適切な鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【０４７２】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発さ
れる、任意の方法によって調製されて得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合し、次いで、必要かつ／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位へと分割、成形、および／またはパッケージ化するステップを含む。
【０４７３】
本発明に従う薬学的組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１等の、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０４７４】
本発明に従う薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療される対象の素性、大きさ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するあろう。例として、組成物は、０．１％〜１００ｗ／ｗ％、例えば、０．５〜５０ｗ／ｗ％、１〜３０ｗ／ｗ％、５〜８０ｗ／ｗ％、少なくとも８０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得る。
【０４７５】
製剤化
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、：（１）安定性を増加させ、（２）細胞トランスフェクションを増加させ、（３）（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのデポー製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能にし、（４）生体分布を変化させ（例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの標的を特定の組織または細胞型に定める）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ／または（６）コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ（例えば、対象への移植のために）でトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を含むことができ、各々は一緒にポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの安定性を増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および／またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の一次構築物およびｍｍＲＮＡは、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
【０４７６】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合するステップを含む。
【０４７７】
本開示による薬学的組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１を含むが、
これらに限定されない、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０４７８】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療されている対象の素性、サイズ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するであろう。例えば、組成物は、０．１ｗ／ｗ％〜９９％の活性成分を含み得る。
【０４７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのｍｍＲＮＡを含有し得る。非限定的な例として、製剤は、１、２、３、４、または５つのｍｍＲＮＡを含有してもよい。一実施形態において、製剤は、ヒトタンパク質、獣医学的タンパク質（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、細菌タンパク質、生体タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療的ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内（ｉｎｔｒａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質および／または非ヒト疾患に関連したタンパク質等であるが、これらに限定されないカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有し得る。一実施形態において、製剤は、少なくとも３つの修飾ｍＲＮＡがコードするタンパク質を含有する。一実施形態において、製剤は、少なくとも５つの修飾ｍＲＮＡがコードするタンパク質を含有する
【０４８０】
薬学的製剤は、所望される特定の剤形に適している、本明細書で使用されるときにありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと）。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図され得る。
【０４８１】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の粒径は、増加および／または減少し得る。粒径の変化は、炎症等であるが、これらに限定されない生体反応に対抗する一助となることが可能であり得るか、または哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生体効果を増加させ得る。
【０４８２】
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に本発明の薬学的製剤に含まれてもよい。
【０４８３】
リピドイド
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達に特に適している（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  ２１：１４４８−１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０  ２６７：９−２１、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７
：１８６４−１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１１０８：１２９９６−３００１を参照のこと）。
【０４８４】
これらのリピドイドを用いて、齧歯類および非ヒト霊長類において２本鎖低分子干渉ＲＮＡが有効に送達されているが（これらすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  １０５：１１９１５−１１９２０、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照のこと）、本開示は、１本鎖ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを送達することにおけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子が調製され得、したがって、局所および／または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注入後に、コードされたタンパク質の産生によって判定するとき、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない、種々の手段によって投与することができる。
【０４８５】
核酸のインビボ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチド対脂質比を含むが、これらに限定されない多くのパラメータ、および粒径等であるが、これらに限定されない生物物理学的パラメータによって影響を受け得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９
１７：８７２−８７９）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長のわずかな変化が、インビボ有効性に対する大きな効果をもたらし得る。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ（９８Ｎ１２−５としても知られる）、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照のこと）、Ｃ１２−２００（誘導体および変異形を含む）、およびＭＤ１を含むが、これらに限定されない、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
【０４８６】
本明細書において「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、参照によりその全体が組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９（図２を参照のこと）によって開示されている（図２を参照のこと）。
【０４８７】
本明細書において「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、両方ともに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９（図２を参照のこと）およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０  ６６９−６７０（図２を参照のこと）によって開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３つもしくは４つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、９８Ｎ１２−５を含むが、これらに限定されず、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、Ｃ１２−２００を含むが、これらに限定されず、５０％リピドイド、１０％ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
【０４８８】
一実施形態において、全身静脈内投与のためにリピドイドとともに製剤化されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、肝臓を標的とすることができる。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを使用し、４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール、および１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含み、約７．５〜１の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの最終重量比、およびＰＥＧ脂質上のＣ１４アルキル鎖長を有し、概ね５０〜６０ｎｍの平均粒径を有する、最終的な最適化された静脈内製剤は、肝臓への９０％超の製剤の分布をもたらし得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９を参照のこと）。別の例において、Ｃ１２−２００（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／１７５，７７０号および公開された国際出願第ＷＯ２０１０１２９７０９号を参照のこと）リピドイドを使用し、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有し得、７対１の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの重量比、および８０ｎｍの平均粒径を有する静脈内製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを肝細胞に送達するのに有効であり得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９を参照のこと）。別の実施形態において、ＭＤ１リピドイド含有製剤を用いて、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを肝細胞に有効に送達し得る。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型、および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。内皮窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）のサイズに起因して、１５０ｎｍ未満の粒径が有効な肝細胞送達のために所望され得るが（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９を参照のこと）、製剤を、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。ｓｉＲＮＡをインビボで骨髄細胞および内皮等の他の非肝細胞細胞に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９：１００５−１０１０、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９  １９：３１１２−３１１８、８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ８−９，��０１０を参照のこと）。単球等の骨髄細胞への有効な送達、リピドイド製剤は、同様の構成成分モル比を有し得る。リピドイドと、ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含むが、これらに限定されない他の構成成分との異なる比率を用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの製剤を、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のために最適化し得る。例えば、構成成分モル比は、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％のコレステロール、および１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得るが、これらに限定されない（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照のこと）。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した、核酸の細胞（脂肪細胞および筋肉細胞等であるが、これらに限定されない）への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成成分のすべてを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのみを含んでも
よい。
【０４８９】
リピドイドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの指示によるタンパク質産生の有効性を改善し得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：１６８８−１６９４を参照のこと）。
【０４９０】
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの薬学的組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含有してもよい。
【０４９１】
リポソームの形成は、封入される薬学的製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達中に伴われる任意のさらなるプロセス、意図される適用のための小胞の最適化サイズ、多分散性、および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間の再現性および大規模産生の可能性等であるが、これらに限定されない、物理化学特性に依存し得る。
【０４９２】
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によるＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００３２４１２０号）から形成されるもの等のリポソーム、ならびにＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）によるＤＯＸＩＬ（登録商標）等であるが、これらに限定されない小分子薬物を送達し得るリポソームを含んでもよい。
【０４９３】
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、以前に記載されており、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示された、安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるもの等のリポソームを含んでもよい（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：２７１−２８１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：１４３８−１４４７、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００５  ２２：３６２−３７２、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２：１００２−１００７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６  ４４１：１１１−１１４、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００５  １０７：２７６−２８７、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２を参照のこと）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）であり、それは後にＪｅｆｆｓらによって改善され、自発的小胞形成法（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３〜４つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Ｊｅｆｆｓらによって記載されるように、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Ｈｅｙｅｓらによって記載されるように、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
【０４９４】
一実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１つの免疫原をコードし得るｍｍＲＮＡを送達するために形成され得る、リポソームを含んでもよい。ｍｍＲＮＡは、リポソームによってカプセル封入されてもよく、かつ／またはそれは、水性コアに含有されてもよく、それが次いでリポソームによってカプセル封入されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、および同第ＷＯ２０１２００６３７８号を参照のこと）。別の実施形態において、免疫原をコードし得るｍｍＲＮＡは、カチオン性水中油型エマルション中で製剤化されてもよく、そのエマルション粒子は、ｍｍＲＮＡと相互作用して分子をエマルション粒子に固着させることができる油中子およびカチオン性脂質を含む（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号を参照のこと）。さらに別の実施形態において、脂質製剤は、トランスフェクションを向上させ得る脂質である少なくともカチオン性脂質、および脂質部分に連結された親水性頭頂基を含有する少なくとも１つの脂質を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０７６８０７号および米国公開第２０１１０２００５８２号を参照のこと）。別の実施形態において、免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１７７７２４号を参照のこと）。
【０４９５】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい。
【０４９６】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化されてもよい。リポソームは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３００６８２５号に記載されるように、１：１〜２０：１のカチオン性脂質中の窒素原子：ＲＮＡ中のリン酸塩（Ｎ：Ｐ比）のモル比を有し得る。別の実施形態において、リポソームは、２０：１超または１：１未満のＮ：Ｐ比を有し得る。
【０４９７】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法によって、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０１７８７０２号に記載されるように遂行されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンには、ポリリジン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニン等であるが、これらに限定されないカチオン性ペプチドまたはポリペプチド、ならびに参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号に記載のカチオン性ペプチドが含まれてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等であるが、これらに限定されない中性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。
【０４９８】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、すべての構成成分の比率、およびサイズ等の生物物理学的パラメータによって影響を受け得るが、これらに限定されない。Ｓｅｍｐｌｅら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６）による一例において、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、ｓｉＲＮＡを種々の抗原提示細胞により有効に送達することができた（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００）。
【０４９９】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧの比率は、増加もしくは減少し得、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長がＣ１４からＣ１８に修飾されて、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／もしくは生体分布を変化させ得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して、１〜５％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態において、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）等であるが、これらに限定されないＰＥＧ脂質と置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の脂質から選択されてもよい。
【０５００】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０９３０号に記載の脂質ナノ粒子等に製剤化されてもよい。
【０５０１】
一実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、同第ＷＯ２０１０２１８６５号、および同第ＷＯ２００８１０３２７６号、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、および同第８，２８３，３３３号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号、および同第ＵＳ２０１２０２０２８７１号に記載のカチオン性脂質から選択されてもよいが、これらに限定されない。別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの
全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、および同第ＷＯ２０１２０４４６３８号に記載の式Ａから選択されてもよいが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８１０３２７６号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩ、および米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号の式Ｉ−ＶＩから選択されてもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ζ，１８Ζ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１  Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ（ｅｐｔ��ｃｏｓ）−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル
−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ν，Ν−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−ｌ３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−��ルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、および（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択されてもよい。
【０５０２】
一実施形態において、脂質は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載の脂質等の切断可能な脂質であってもよい。
【０５０３】
一実施形態において、カチオン性脂質は、当技術分野で既知の方法によって、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、および同第ＷＯ２０１０２１８６５号に記載されるように合成されてもよい。
【０５０４】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、３％脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態において、ＬＮＰ製剤ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、１．５％脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
【０５０５】
一実施形態において、薬学的の組成物ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【０５０６】
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００および少なくとも１つの他の構成成分を含有してもよい。別の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、２：４０：１０：４８のモル比で、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ  ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照のこと）。別の非限定的な例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０２０７８４５号に記載されるように、非経口経路によって送達されるナノ粒子中に製剤化されてもよい。
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載の方法によって製剤化されてもよい。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号および／または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されるように、ＬＮＰ製剤中にカプセル封入されてもよい。
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号の式１〜６０から選択されてもよい。別の実施形態において、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡのインビボおよび／またはインビトロでの送達に使用されてもよい。
【０５０７】
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性促進剤分子をさらに含んでもよい。非限定的な透過性促進剤分子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されている。
【０５０８】
一実施形態において、薬学的組成物は、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌に対するｓｉＲＮＡ送達（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６  ５（１２）１７０８−１７１３））、およびヒアルロナンコーティングリポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
【０５０９】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体および修飾核酸分子（例えば、ｍｍＲＮＡ）を含む、炭水化物ナノ粒子であってもよい。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物で修飾された植物グリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、植物グリコーゲン（ｐｈｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）オクテニルコハク酸塩、植物グリコーゲンβ−デキストリン、無水物で修飾された植物グリコーゲンβ−デキストリンを含んでもよいが、これらに限定されない。（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号を参照のこと）。
【０５１０】
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速排出（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られている生分解性カチオン性脂質と置き換えることによって改善されてもよい。ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、イオン化できるカチオン性脂質は、時間とともに血漿および組織中に蓄積することが示されてきており、潜在的な毒性の源であり得る。急速排出脂質の急速な代謝は、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ用量〜１０ｍｇ／ｋｇ用量の１桁分、脂質ナノ粒子の耐性および治療指数を改善することができる。酵素的に分解されるエステル結合の組み込みは、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性構成成分の分解および代謝プロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置することができるか、またはそれは、脂質鎖の末端において末端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖内の任意の炭素を置き換えてもよい。
【０５１１】
一実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。ｒｅＬＮＰの非限定的な例としては、
【化７３】
2017121240.tif 000698
が挙げられる。
【０５１２】
一実施形態において、免疫応答が、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、誘発され得る。（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１８９７００号および国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号）。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル封入しても、ナノ化学種を部分的にカプセル封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾ＲＮＡ、および／または一次構築物であってもよい。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、病原体に対するもの等であるが、これらに限定されないワクチンにおいて使用するために製剤化されてもよい。
【０５１３】
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変化させるように操作されてもよい。粘液は、口腔（例えば、周口膜および食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、経鼻、咽頭、気管、および気管支膜）、生殖器（例えば、膣内、子宮頚部、および尿道膜）上に位置する粘膜組織等であるが、これらに限定されない。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜（ｍｕｃｏｓｌａ）組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか４〜６倍低く、粘液を通って拡散した（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００７  １０４（５）：１４８２−４８７、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００９  ６１（２）：１５８−１７１）。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度多数粒子追跡（ＭＰＴ）を含むが、これらに限定されない、透過速度および／または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。非限定的な例として、粘膜関門を透過し得る組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４１，６７０号に記載されるように作製されてもよい。
【０５１４】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわちポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミン複合体および／またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートが含まれてもよいが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。ポリマー材料は、さらに照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、γ照射されてもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１２８２１６５号を参照のこと）。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピル
メタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）等のアクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０１２４７６号に記載の分岐状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー等）、および（ポリ（エチレングリコール）−（ポリ（プロピレンオキシド）−（ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマー（例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１２１７１８号および米国公開２０１００００３３３７号ならびに米国特許第８，２６３，６６５号を参照のこと）等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングＰＬＧＡナノ粒子を含んでもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ
ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１  ５０：２５９７−２６００）。
【０５１５】
ポリマー−ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンＥであってもよい。この複合体のビタミン部分は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分または疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、およびアルキレンオキシド鎖）等であるが、これらに限定されない他の好適な構成成分で置換されてもよい。
【０５１６】
粘液に透過するように操作された脂質ナノ粒子には、ｍｍＲＮＡ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブドミド等の、例えば、カチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、餅草、ブロメライ、パパイン、クレロデンドロン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）、およびｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅ等であ
るが、これらに限定されない表面変質剤が含まれてもよい。表面変質薬剤は、粒子の表面に包埋されるもしくは絡ませられるか、または脂質ナノ粒子の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。（例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開２０１００２１５５８０号および米国公開２００８０１６６４１４号を参照のこと）。
【０５１７】
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのｍｍＲＮＡを含んでもよい。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中にカプセル封入され、かつ／または粒子の表面上に配置されてもよい。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合されてもよい。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性および／または付着特性を、粘膜付着を減少させるように変質させ得、それにより粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させ得る、粒子を含有してもよい。
【０５１８】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、制限なく、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）によるＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、および他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によるＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的を定めたおよび標的を定めない核酸送達等の、リポプレックスとして製剤化される（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  ６８：９７８８−９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  ５０：７６−７８、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  ３２：４９８−５０７、Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  ３１：１８０−１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  ６；１０４：４０９５−４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２）。
【０５１９】
一実施形態において、そのような製剤は、それらが受動的または能動的に、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むが、これらに限定されない異なる細胞型をインビボで指向するようにも構築され得るか、または組成を変化し得る（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、Ｋａｕｆｍａｎｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００、Ｆｅｎｓｋｅ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐ
ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８  ５：２５−４４、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４）。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｌｈａｔｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ８：１９７−２０６、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１  １６：１３８８−１４１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０１０  ２７：２８６−２９８、Ｐａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２００８  ２５：１−６１、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８
５：３０９−３１９、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ．２０１２  ８２０：１０５−１１６、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  ７５７：４９７−５０７、Ｐｅｅｒ  ２０１０  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：４０９５−４１００、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１  ７２１：３３９−３５３、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０
１８：２０２８−２０３７、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。
【０５２０】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤により安定化され得る、固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合性脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ  １６９６−１７０２を参照のこと）。
【０５２１】
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの指示によるタンパク質産生の有効性を改善するために使用されてもよい。１つのそのような例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にするための脂質カプセル封入の使用を伴う（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００７  １５：７１３−７２０）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させるためにも使用され得る。
【０５２２】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、制御放出および／または標的を定めた送達のために製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、特定の放出パターンに適合して治療成果をもたらす、薬学的組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、制御放出および／または標的を定めた送達のために、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の送達剤中にカプセル封入されてもよい。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入する、包囲する、または包み込むことを意味する。それが本発明の化合物の製剤に関するとき、カプセル封入は、実質的、完全、または部分的であってもよい。「実質的にカプセル封入される」という用語は、本発明の薬学的組成物または化合物の少なくとも５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．９％超、９９．９％超、または９９．９９９％超が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。「部分的カプセル封入」は、本発明の薬学的組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０以下が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。有利なことに、カプセル封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を用いて、本発明の薬学的組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定されてもよい。例えば、本発明の薬学的組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、送達剤中にカプセル封入される。
【０５２３】
一実施形態において、制御放出製剤は、トリブロックコポリマーを含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、製剤は、２つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含んでもよい（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１３１１０４号および同第ＷＯ２０１２１３１１０６号）。
【０５２４】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中にカプセル封入されてもよく、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子は次いで、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知のポリマー、ヒドロゲル、および／または手術用シーリング材中にカプセル封入されてもよい。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲル、または手術用シーリング材は、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）等の手術用シーリング材であってもよい。
【０５２５】
別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のポリマー中にカプセル封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス中にカプセル封入されてもよい。
【０５２６】
一実施形態において、制御放出および／または標的を定めた送達のためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティング剤も含んでもよい。制御放出コーティング剤には、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ（登録商標）、およびエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））等のセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２７】
一実施形態において、制御放出および／または標的を定めた送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０５２８】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、治療的ナノ粒子中にカプセル封入されてもよい。治療的ナノ粒子は、本明細書に記載の方法、ならびに各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、米国公開第第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、および同第ＵＳ２０１２０２８８５４１、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、および同第８，３１８，２１１号等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法によって製剤化されてもよい。別の実施形態において、治療的ポリマーナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０１４０７９０号に記載の方法によって特定されてもよい。
【０５２９】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、持続放出のために製剤化されてもよい。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の一定期間にわたる放出速度に適合する薬学的組成物または化合物を指す。一定期間は、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、および数年間を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、ならびに本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡ等であるが、それらに限定されない治療剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、および同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号を参照のこと）。
【０５３０】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的（ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ）ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照のこと）。一実施形態において、治療的ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、および同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０５３１】
一実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリ
アミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない２つ以上のポリマーを含んでもよい。
【０５３２】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。一実施形態において、ジブロックコポリマーには、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないポリマーと組み合わせたＰＥＧが含まれてもよい。
【０５３３】
非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）。別の非限定的な例において、治療的ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含む、ステルスナノ粒子である（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号および国際公開第ＷＯ２０１２１６６９２３号を参照のこと）。
【０５３４】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２６３，６６５号および同第８，２８７，９１０号を参照のこと）。
【０５３５】
一実施形態において、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマーミセルおよびブロックコポリマーを含む、ポリイオン複合体に含まれてもよい。（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２００７６８３６号を参照のこと）。
【０５３６】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含んでもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０５３７】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含んでもよい。
【０５３８】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２８７，８４９号を参照のこと）、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを
含んでもよい。
【０５３９】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０５４０】
別の実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドの複合体化を含んでもよい。標的化リガンドは、モノクローナル抗体等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意のリガンドであってもよい。（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  ６６：６７３２−６７４０）。
【０５４１】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、水溶液中で製剤化されてもよく、それを用いて癌を標的としてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１３号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９４７１７号を参照のこと）。
【０５４２】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、合成ナノ担体中にカプセル封入され、それと連結され、かつ／またはそれと会合されてもよい。合成ナノ担体には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１２１３５０１号、同第ＷＯ２０１２１４９２５２号、同第ＷＯ２０１２１４９２５５号、同第ＷＯ２０１２１４９２５９号、同第ＷＯ２０１２１４９２６５号、同第ＷＯ２０１２１４９２６８号、同第ＷＯ２０１２１４９２８２号、同第ＷＯ２０１２１４９３０１号、同第ＷＯ２０１２１４９３９３号、同第ＷＯ２０１２１４９４０５号、同第ＷＯ２０１２１４９４１１号、同第ＷＯ２０１２１４９４５４号、および同第ＷＯ２０１３０１９６６９号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、および同第ＵＳ２０１２０２４４２２２号に記載の合成ナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。合成ナノ担体は、当技術分野で既知のおよび／または本明細書に記載の方法を用いて製剤化され得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、および同第ＷＯ２０１２１３５０１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、および同第ＵＳ２０１２０２４４２２号に記載の方法によって製剤化され得る。別の実施形態において、合成ナノ担体製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０７２２１８号および米国特許第８，２１１，４７３号に記載の方法によって凍結乾燥させ得る。
【０５４３】
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを放出するための反応性基を含有してもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号および米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照のこと）。
【０５４４】
一実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達による免疫応答を向上させるための免疫刺激性薬剤を含有してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈ１ベースの応答を向上させ得るＴｈ１免疫刺激性薬剤を含んでもよい（各々が参
照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１２３５６９号および米国公開第ＵＳ２０１１０２２３２０１号を参照のこと）。
【０５４５】
一実施形態において、合成ナノ担体は、標的を定めた放出のために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、指定されるｐＨで、かつ／または所望の時間間隔の後にポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、２４時間後にかつ／または４．５のｐＨでポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを放出するように製剤化されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号、および同第ＷＯ２０１０１３８１９４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号、および同第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照のこと）。
【０５４６】
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡの制御放出および／または持続放出のために製剤化されてもよい。非限定的な例として、持続放出のための合成ナノ担体は、当技術分野で既知であり、本明細書に記載され、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９２および米国公開第２０１００３０３８５０号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
【０５４７】
一実施形態において、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡをカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原およびワクチン剤形のため賦形剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２６４号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７２３号を参照のこと）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形が、同じまたは異なる抗原を有する少なくとも２つの合成ナノ担体、および賦形剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４９号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７０１号を参照のこと）。ワクチン剤形は、本明細書に記載され、当技術分野で既知であり、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号および米国公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号に記載の方法によって、選択されてもよい。
【０５４８】
一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−クロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−リン酸塩、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム−酢酸塩（ＤＤＡ）、およびマイコバクテリウム属の総脂質抽出物の無極性画分または該無極性画分の一部を含んでもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４１，６１０号を参照のこと）。別の実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡ、ならびにアジュバントを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
【０５４９】
一実施形態において、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片、または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡをカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体には、各々が参照により
それらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０２４６２１号、同第ＷＯ２０１２０２６２９号、同第ＷＯ２０１２０２４６３２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、同第ＵＳ２０１２００５８１５３号、および同第ＵＳ２０１２００５８１５４号に記載のナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５５０】
一実施形態において、合成ナノ担体は、体液性応答および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を触発することが可能であり得るポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに連結されてもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０１９６６９号を参照のこと）。
【０５５１】
一実施形態において、ナノ粒子は、経口投与のために最適化されてもよい。ナノ粒子は、キトサンまたはその誘導体等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０２８２３４３号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
【０５５２】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、天然および／または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＲｏｃｈｅ
Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅａｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製剤、制限なく、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等のＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ならびにＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等であるが、これらに限定されないｐＨ応答性ブロックコポリマー（ｃｏ−ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）が挙げられる。
【０５５３】
キトサン製剤の非限定的な例としては、正電荷性のキトサンのコア、ならびに負電荷性の基質の外側部分が挙げられる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０２５８１７６号）。キトサンには、Ｎ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０５５４】
一実施形態において、本発明において使用されるポリマーは、細菌等であるが、これらに限定されない望ましくない物質のポリマーの表面への結合を低減し、かつ／または阻害するためのプロセシングを経ている。ポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ／または当技術分野で記載され、かつ／または参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１５０４６７号に記載の方法によって処理されてもよい。
【０５５５】
ＰＬＧＡ製剤の非限定的な例としては、ＰＬＧＡ注入用デポーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＬＧＡを、６６％のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させることによって形成され、残りの部分が水性溶媒およびロイプロリドである
、ＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。一旦注入されると、ＰＬＧＡおよびロイプロリドペプチドは、皮下腔に沈殿する）。
【０５５６】
これらのポリマーアプローチのうちの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に送達することにおいて有効性を実証している（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２において概説される）。核酸（この実例では小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）の強固なインビボ送達をもたらした２つのポリマーアプローチは、動的ポリ複合体（ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチのうちの第１のアプローチは、動的ポリ複合体を使用し、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その主要な特長として、核酸（この実例ではｓｉＲＮＡ）がジスルフィド結合を介して共有結合され、ＰＥＧ（電荷遮蔽のため）基およびＮ−アセチルガラクトサミン（肝細胞標的化のため）基の両方がｐＨ感受性結合を介して連結される、膜活性ポリマーが含まれる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は、低ｐＨ環境において解体し、このポリマーがその陽電荷を露出して、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのｓｉＲＮＡの放出をもたらす。Ｎ−アセチルガラクトサミン基の、マンノース基との置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞へと標的合わせを変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞において、ＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的を定めたサイレンシングを実証してきており（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  ６５：８９８４−８９８２）、これらのナノ粒子中に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において耐性が良好であった（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｉｄｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７  １０４：５７１５−２１）。これらの送達戦略の両方は、標的を定めた送達機構およびエンドソームからの脱出機構の両方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
【０５５７】
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの持続放出または遅延放出を可能にし得る（例えば、筋肉内または皮下注入後に）。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡについての変化した放出プロファイルは、例えば、長期間にわたってコードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤をまた使用して、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させ得る。生分解性ポリマーが、ｍｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために以前に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  ７：１４３３−１４４６、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１０  Ｏｃｔ  １、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｊａｎ  １３、Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２  ３３：２３０１−２３０９、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｓｉｎｇｈａ
ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２０１１  ２：１３３−１４７、
ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２、Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １６：１１３１−１１３８、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１  ８：１４５５−１４６８、Ｄａｖｉｓ、Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０５５８】
一実施形態において、薬学的組成物は、持続放出製剤であってもよい。さらなる実施形態において、持続放出製剤は、皮下送達のためであってもよい。持続放出製剤には、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）等の手術用シーリング材が含まれ得る。
【０５５９】
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、調整可能な放出速度を有する（例えば、数日間および数週間）ＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、修飾ｍＲＮＡを、カプセル封入プロセス中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、ＰＬＧＡミクロスフェア中にカプセル封入することによって、ＰＬＧＡミクロスフェア中に製剤化されてもよい。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出埋込物適用において広範に使用される、非生分解性（ｎｏｎ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）の、生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障に対するピロカルピン眼内挿入物である持続放出製品Ｏｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内器具であるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、およびＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）。ポロキサマー  Ｆ−４０７  ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有する、親水性の非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの手術用シーリング材は、１分間で調製することができ、３分間でシーリングし、３０日以内に再吸収される、送達デバイスにおいて混合された２つの合成ＰＥＧ構成成分を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位におけるインサイツのゲル化が可能である。それらは、イオン性相互作用（ｉｎｅｒａｃｔｉｏｎ）を介してタンパク質およびペプチド治療候補と相互作用して、安定化効果を提供することが示されている。
【０５６０】
ポリマー製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例として示されるが、これらによって限定されない異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０５６１】
本発明の修飾核酸、およびｍｍＲＮＡは、ポリマー化合物とともにまたはポリマー化合物中に製剤化されてもよい。ポリマーには、ポリエテン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅｓ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレン
イミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、弾力のある生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、マルチブロックコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのポリマーが含まれてもよい。
【０５６２】
非限定的な例として、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７７，２７４号に記載のＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに製剤化されてもよい。製剤は、インビトロで細胞をトランスフェクトするため、または修飾核酸およびｍｍＲＮＡのインビボ送達のために使用されてもよい。別の例において、修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、カチオン性ポリマーを含む溶液もしくは媒体中に、乾燥した薬学的組成物中に、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号および同第２００９００４２８２５号に記載の乾燥させることができる溶液中に懸濁させてもよい。
【０５６３】
別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００４，５７３号を参照のこと）とともに製剤化されてもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号を参照のこと）。
【０５６４】
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達するか、または疾患を治療および／もしくは予防するか、または埋込型もしくは注入型デバイスに含めてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００２６０８１７号）。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾核酸およびｍｍＲＮＡ、ならびに内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００２６０８１７号に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、炭水化物ジアジドモノマーを、オリゴアミンを含むジルキン（ｄｉｌｋｙｎｅ）単位と組み合わせることによって調製される１，３−双極性付加ポリマーを含むポリマー等であるが、これらに限定されない、ポリアミドポリマーを用いて送達されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２３６，２８０号）。
【０５６５】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１１５８６２号、同第ＷＯ２０１２０８２５７４号、および同第ＷＯ２０１２０６８１８７号、ならびに米国公開第２０１２０２８３４２７号に記載の少なくとも１つのポリマーおよ
び／またはその誘導体とともに製剤化されてもよい。別の実施形態において、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１１５８６２号に記載の式Ｚのポリマーとともに製剤化されてもよい。さらに別の実施形態において、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０８２５７４号または同第ＷＯ２０１２０６８１８７号および米国公開第２０１２０２８３４２号に記載の式Ｚ、Ｚ’、またはＺ’’のポリマーとともに製剤化されてもよい。本発明の修飾ＲＮＡとともに製剤化されるポリマーは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０８２５７４号または同第ＷＯ２０１２０６８１８７号に記載の方法によって合成されてもよい。
【０５６６】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのアクリルポリマーとともに製剤化されてもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０５６７】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの製剤は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
【０５６８】
例えば、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはこれらの組み合わせを含む薬学的化合物中に製剤化されてもよい。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９６，０３８号、米国出願第２００３００７３６１９号、および同第２００４０１４２４７４号に記載の方法によって作製されてもよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１５号に記載の方法を用いて作製されてもよい。生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂａｌｅ）ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または内容がそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５１７，８６９号および同第６，２６７，９８７号に記載の方法を用いて作製されてもよい。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ／または米国特許第６，６５２，８８６号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，９１２号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、共重合して、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５７，８２１もしくは米国公開第２０１２００９１４５号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線
状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または薬学的組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００００４３１５号もしくは米国特許第６，２６７，９８７号および同第６，２１７，９１２号に記載の方法によって作製されてもよい。
【０５６９】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルとともに製剤化されてもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０５７０】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの架橋性ポリエステルとともに製剤化されてもよい。架橋性ポリエステルは、当技術分野で既知であり、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０２６９７６１号に記載の架橋性ポリエステルを含む。
【０５７１】
一実施形態において、本明細書に記載のポリマーは、脂質末端を有する（ｌｉｐｉｄ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ＰＥＧに複合体化されてもよい。非限定的な例として、ＰＬＧＡは、脂質末端を有するＰＥＧに複合体化されて、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成してもよい。別の非限定的な例として、本発明とともに使用するためのＰＥＧ複合体は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されている。ポリマーは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２７３，３６３号に記載の複合体等であるが、これらに限定されないリガンド複合体を用いて接合されてもよい。
【０５７２】
一実施形態において、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、別の化合物と複合体化されてもよい。複合体の非限定的な例は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９６４，５７８号および同第７，８３３，９９２号に記載されている。別の実施形態において、本発明の修飾ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９６４，５７８号および同第７，８３３，９９２号に記載の式１〜１２２の複合体と複合体化されてもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、金等であるが、これらに限定されない金属と複合体化されてもよい。（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９  １３１（６）：２０７２−２０７３を参照のこと）。別の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、金ナノ粒子中と複合体化および／またはカプセル封入されてもよい。（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１６２６９号および米国公開第２０１２０３０２９４０号）。
【０５７３】
参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１３号に記載されるように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｉｔｉｏｎ）の修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、米国公開第２０１００００４３１３号に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物において使用されてもよい。
【０５７４】
一実施形態において、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロール基およびポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオン性
リポポリマーと接触させることによって、安定化されてもよい。ポリマー製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体には、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウムＤＯＤＡＣ）、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
【０５７５】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のポリマーのポリプレックス中に製剤化されてもよい（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０２３７５６５号および同第２０１２０２７０９２７号）。一実施形態において、ポリプレックスは、２つ以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性（ｃａｔｉｏｉｎｉｃ）ポリマーは、線状ＰＥＩ等のポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含んでもよい。
【０５７６】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリマー、脂質、および／またはリン酸カルシウム等であるが、これらに限定されない他の生分解性薬剤の組み合わせを用いてナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの送達が向上し得るようにナノ粒子の微調整を可能にするために、コア−シェル、ハイブリッド、および／または交互積層アーキテクチャとして組み合わされてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２００６  ５：７９１−７９６、Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８  ２９：１５２６−１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１１  ６３：７４８−７６１、Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：７７２１−７７３１、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７）。非限定的な例として、ナノ粒子は、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、および／または親水性ポリマー等であるが、これらに限定されない複数のポリマーを含んでもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号）。
【０５７７】
脂質および／またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達することが示されている。一実施形態において、アニスアミド等の標的化リガンドもまた含有し得る、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子
が使用された（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２０１０  １４２：４１６−４２１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２０１２  １５８：１０８−１１４、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．２０１２  ２０：６０９−６１５）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
【０５７８】
一実施形態において、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーとともにリン酸カルシウムを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００４  ９７：３４５−３５６、Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ
Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００６  １１１：３６８−３７０）。
【０５７９】
一実施形態において、ＰＥＧ電荷変換型ポリマー（Ｐｉｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：３１０６−３１１４）を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達するためのナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
【０５８０】
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを合成するための高処理アプローチにさらに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１２９９６−１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内在化は、ナノ粒子のコア構成成分およびシェル構成成分の両方の化学組成を変化させることによって精密に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達し得る。
【０５８１】
一実施形態において、中間のＰＬＧＡ層およびＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を含む、中空の脂質コアを用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい。非限定的な例として、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒｅａｓｅ）発現腫瘍を担持するマウスにおいて、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子が、従来のリポプレックスと比較して、ルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが確認された（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．２０１１  ５０：７０２７−７０３１）。
【０５８２】
一実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸分子のコア、およびポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれでもあり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸を保護し得る。
【０５８３】
本発明の修飾核酸分子とともに使用するためのコア−シェルナノ粒子が記載されており、これは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１３，７７７号に記載の方法によって形成されてもよい。
【０５８４】
一実施形態において、コア−シェルナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸分子のコア、およびポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれでもあり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸分子を保護し得る。非限定的な例として、コア−シェルナノ粒子を用いて、眼疾患または障害を治療し得る（例えば、参照により全体
が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０３２１７１９号を参照のこと）。
【０５８５】
一実施形態において、本明細書に記載の製剤とともに使用されるポリマーは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１２００５３号に記載の修飾ポリマー（修飾ポリアセタール等であるが、これらに限定されない）であってもよい。
【０５８６】
ペプチドおよびタンパク質
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを増加させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドである（例えば、すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８（２００１）、Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ，２００２）、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１（２００３）、およびＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９（２００５）を参照のこと）。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、細胞内送達を可能にするために、Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびＰｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によるペプチドおよび／またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび／またはタンパク質に複合体形成されてもよい（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ
ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０  ５：７４７−７５２、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００９  １０６：６１１１−６１１６、Ｓａｗｙｅｒ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２００９  ７３：３−６、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３−３３）。
【０５８７】
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
【０５８８】
ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変化させ（例えば、具体的な組織または細胞型を標的とすることによって）、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができる。（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号を参照のこと）。
【０５８９】
細胞
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、エクスビボで細胞中にトランスフェクトすることができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で送達するためのビロソーム、ならびにＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）による細胞、およびＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾ＲＮＡを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。ｍｍＲＮＡ以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｄｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：１２７−１３３、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：３８５−３８９、Ｈｕ  ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１０９８０−１０９８５、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１０  ２７：４００−４２０、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００７；１７：３９−４７、Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２００６  ２：１−７、ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  １３：４００−４１１）。
【０５９０】
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号および米国公開第２０１１０１７１２４８号に記載の方法によって合成される合成ＶＬＰ中で送達されてもよい。
【０５９１】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの細胞ベースの製剤を用いて、細胞トランスフェクションを確実にし（例えば、細胞担体中の）、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡの生体分布を変化させ（例えば、細胞担体の標的を具体的な組織または細胞型に定めることによって）、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させてもよい。
【０５９２】
ウイルスおよび非ウイルス媒介性技法を含む、核酸の細胞内への導入に好適である多様な方法が当技術分野で知られている。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９３】
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技法は、細胞原形質膜の透過性修飾するために音（例えば、超音波周波数）を使用するものである。ソノポレーション法は、当業者に知られており、インビボで核酸を送達するために使用される（すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  ７：３２１−３３０、Ｐｏｓｔｅｍａ  ａｎｄ  Ｇｉｌｊａ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  ８：３５５−３６１、Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７  １４：４６５−４７５）。ソノポレーション法は、当技術分野で知られており、また、例えば、それが細菌に関する場合には、米国特許公開第２０１００１９６９８３号において、それが他の細胞型に関する場合には、例えば、米国特許公開２０１００００９４２４号において教
示され、これらの各々は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０５９４】
エレクトロポレーション技法もまた、当技術分野で周知であり、インビボでおよび臨床的に核酸を送達するために使用される（すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：２６７−２８０、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：２８１−２８６、Ｈｏｊｍａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １０：１２８−１３８）。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、実施例８に記載されるようにエレクトロポレーションによって送達され得る。
【０５９５】
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０）。それらの分散およびトランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに曝露される細胞の数を増加させることができる。
【０５９６】
ナノ粒子模倣体
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ／またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン（ｖｉｒｏｎ）粒子中にカプセル封入されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号を参照のこと）。
【０５９７】
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基（ｔｗｉｎ  ｂａｓｅｓ）を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび／または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも１つのナノチューブに付着または結合され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、立体（ｓｔｅｒｉｃ）力、イオン力、共有結合力、および／または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
【０５９８】
一実施形態において、ナノチューブは、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを細胞内に放出することができる。少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造を、体内でナノチューブの相互作用を制御し、かつ／または本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡに付着または結合するように変化させることができる。一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブのビルディングブロックおよび／またはそのビルディングブロックに結合される官能基を、ナノチューブの寸法および／または特性を調整するように変化させることができる。非限定的な例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管の壁の穴を通過するのを妨害するが、依然として腫瘍組織の血管におけるより大きい穴を通過するのに十分
に小さくあるように変化させてもよい。
【０５９９】
一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブは、ポリエチレングリコール等であるが、これらに限定されないポリマーを含む送達向上化合物でコーティングされてもよい。別の実施形態において、少なくとも１つのナノチューブおよび／またはポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、薬学的に許容される賦形剤および／または送達ビヒクルと混合されてもよい。
【０６００】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合される。ロゼットナノチューブは、当技術分野で既知のプロセスによって、かつ／または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって形成され得る。少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合されてもよく、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも１つのポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡと混合される。
【０６０１】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのカーボンナノチューブに付着および／または結合されてもよい。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、連結剤に結合されてもよく、この連結された薬剤が、カーボンナノチューブに結合されてもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９９５号を参照のこと）。カーボンナノチューブは、単層ナノチューブであってもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９９５号を参照のこと）。
【０６０２】
複合体
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する）、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ等の複合体を含む。
【０６０３】
本発明の複合体は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質等の、天然に生じる物質を含む。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）等の組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル（ａｃｒｙｌｌｉｃ）酸）、Ｎ−イソプロピルａｃｒｙｌアミドポリマー、またはポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの
第四級塩、αヘリックスペプチドが挙げられる。
【０６０４】
ポリヌクレオチド複合体の調製、特にＲＮＡへのの調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号、同第６，２９４，６６４号、同第６，３２０，０１７号、同第６，５７６，７５２号、同第６，７８３，９３１号、同第６，９００，２９７号、同第７，０３７，６４６号が含まれるが、これらに限定されない。
【０６０５】
一実施形態において、本発明の複合体は、本発明の修飾核酸およびｍｍＲＮＡのための担体として機能し得る。複合体は、ポリ（エチレングリコール）でグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミン等であるが、これらに限定されないカチオン性ポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、複合体は、ポリマー複合体と同様であってもよく、ポリマー複合体を合成する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号に記載されている。
【０６０６】
複合体は、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎臓細胞等の指定される細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０６０７】
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）に対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞等の指定される細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基には、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。それらには、等の脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはア
プタマー等の非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８
ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０６０８】
標的化基は、具体的な受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例としては、制限なく、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒｓ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態において、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、修飾されていないことも、本明細書に開示の修飾の任意の組み合わせを有することもあり得る。
【０６０９】
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、ロックト核酸と同様の修飾等であるが、これらに限定されない化学修飾を含んでもよい。
【０６１０】
Ｓａｎｔａｒｉｓによるもの等のロックト核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０８４，１２５号、および同第７，３９９，８４５号が含まれるが、これらに限定されない。
【０６１１】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見出すことができる。
【０６１２】
本発明の特色をなすいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、ならびに他の修飾骨格、特に、上に参照される米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然ホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、および上に参照される米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅｓ）は、上に参照される米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０６１３】
２’位における修飾もまた、送達を補助し得る。好ましくは、２’位における修飾は、ポリペプチドコード配列には位置しない、すなわち、翻訳可能領域にない。２’位における修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／または尾部領域に位置してもよい。２’位における修飾は、２’位において次のうちの１つを含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。例示の好適な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、２’位において次のうち
の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）としても知られている）（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示の修飾は、本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および同様に本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾は、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位で、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、および同第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【０６１４】
依然として他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的に複合体化される。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本発明の複合体は、増加した安定性、増加した細胞トランスフェクション、および／または変化した生体分布（例えば、具体的な組織または細胞型に標的を定められる）を有するように設計することができる。
【０６１５】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、送達を向上させるための薬剤に複合体化されてもよい。非限定的な例として、薬剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１０６２９６５号に記載の標的化ブロックを有する標的化モノマーまたはポリマー等のモノマーまたはポリマーであってもよい。別の非限定的な例において、薬剤は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに共有結合された輸送剤であってもよい（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８３５．３９３号および同第７，３７４，７７８号を参照のこと）。さらに別の非限定的な例において、薬剤は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７３７，１０８号および同第８，００３，１２９号に記載される薬剤等の膜関門輸送向上剤であってもよい。
【０６１６】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に複合体化されてもよい。
【０６１７】
自己集合性ナノ粒子
核酸自己集合性ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、２０ｎｍ超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、２０〜１００ｎｍである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いＤＮＡ断片および治療的ｓｉＲＮＡのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは、１ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を生成した。（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  ７：３８９−３９３）。
【０６１８】
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、自己集合性ナノ粒子として製剤化され得る。非限定的な例として、核酸を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのための送達系に使用され得るナノ粒子を作製してもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１２５９８７号を参照のこと）。
【０６１９】
一実施形態において、核酸自己集合性ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのコア、およびポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物（ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）、およびｍｍＲＮＡを保護してもよい。
【０６２０】
ポリマーベースの自己集合性ナノ粒子
ポリマーを用いて、ナノ粒子へと自己集合したシートを形成してもよい。これらのナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを送達してもよい。一実施形態において、これらの自己集合性ナノ粒子は、マイクロスポンジへと自己集合する前に結晶質の「ひだ状」のシートを形成するＲＮＡヘアピンの長いポリマーで形成される、マイクロスポンジであってもよい。これらのマイクロスポンジは、効率的な担体として機能し得、積荷を細胞に送達することが可能であり得る、密に充填されたスポンジ様の微粒子である。マイクロスポンジは、直径１μｍ〜３００ｎｍであり得る。マイクロスポンジは、当技術分野で既知の他の薬剤と複合体形成されて、より大きいマイクロスポンジを形成することができる。非限定的な例として、マイクロスポンジは、ポリカチオンポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｅ）（ＰＥＩ）等の、細胞取り込みを促進するための外側層を形成する薬剤と複合体形成され得る。この複合体は、高温（１５０℃）で安定したままであり得る、２５０ｎｍ直径の粒子を形成することができる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒａｂｏｗ  ａｎｄ  Ｊａｅｇａｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１２，１１：２６９−２６９）。さらにこれらのマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼによる分解からの並外れた保護度を示すことが可能であり得る。
【０６２１】
別の実施形態において、マイクロスポンジ等であるが、これらに限定されないポリマーベースの自己集合性ナノ粒子は、完全にプログラミング可能なナノ粒子であり得る。ナノ粒子の形状、サイズ、および化学量を、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／または
ｍｍＲＮＡ等であるが、これらに限定されない積荷の送達に最適なナノ粒子を作り出すために、精密に制御することができる。
【０６２２】
一実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのコア、ならびにポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを保護してもよい。
【０６２３】
さらに別の実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３００９７３６号に記載されるモノマー等の複数の不均一なモノマーを含む非核酸ポリマーを含んでもよい。
【０６２４】
無機ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、無機ナノ粒子中に製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２５７，７４５号）。無機ナノ粒子は、水膨潤性である粘土物質を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から作製される合成スメクタイト粘土を含んでもよい（例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８５，１０８号および同第８，２５７，７４５号を参照のこと）。
【０６２５】
一実施形態において、無機ナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸のコア、およびポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸を保護してもよい。
【０６２６】
半導性および金属性ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、半導性または金属性材料を含む水分散性ナノ粒子中に製剤化されるか（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０２２８５６５号）、または磁性ナノ粒子中に形成されてもよい（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０２６５００１号および同第２０１２０２８３５０３号）。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても親水性ナノ粒子であってもよい。
【０６２７】
一実施形態において、半導性および／または金属性ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのコア、ならびにポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを保護してもよい。
【０６２８】
ゲルおよびヒドロゲル
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のヒドロゲル中にカプセル封入されてもよい。ヒドロゲルは、親水性であり、ときには、水が分散媒体であるコロイド状ゲルとして見出される、ポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルは、高度に吸収性の（それらは、９９％超の水を含有することができる）天然または合成ポリマーである。ヒドロゲルは、それらのかなりの含水量のため、天然組織と非常に類似した柔軟度も有する。本明細書に記載のヒドロゲルを用いて、生体適合性、生分解
性、かつ／または多孔質である脂質ナノ粒子をカプセル封入してもよい。
【０６２９】
非限定的な例として、ヒドロゲルは、アプタマー官能化ヒドロゲルであってもよい。アプタマー官能化ヒドロゲルは、核酸ハイブリダイゼーションを用いて１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを放出するようにプログラミングされてもよい。（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．２０１２  １３４：１２４１０−１２４１３）。
【０６３０】
別の非限定的な例として、ヒドロゲルは、反転オパールとして成形されてもよい。オパールヒドロゲルは、より高い膨潤率を示し、その膨潤速度もまた１桁分より速い。オパールヒドロゲルを生成する方法およびオパールヒドロゲルの説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１４８６８４号に記載されている。
【０６３１】
さらに別の非限定的な例において、ヒドロゲルは、抗菌性ヒドロゲルであってもよい。抗細菌性ヒドロゲルは、医薬品等級および／または医療等級の銀塩およびアロエベラゲルもしくは抽出物等であるが、これらに限定されない、薬学的許容される塩または有機材料を含んでもよい。（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１５１４３８号）。
【０６３２】
一実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中にカプセル封入されてもよく、次いでこの脂質ナノ粒子が、ヒドロゲル（ｈｙｒｄｏｇｅｌ）中にカプセル封入されてもよい。
【０６３３】
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で既知の任意のゲル中にカプセル封入されてもよい。非限定的な例として、ゲルは、フルオロウラシル注入用ゲル、または当技術分野で既知の化学化合物および／もしくは薬物を含有するフルオロウラシル注入用ゲルであってもよい。別の例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、エピネフリンを含有するフルオロウラシルゲル中にカプセル封入されてもよい（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９９  ４４（４）：２６７−２７４を参照のこと）。
【０６３４】
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入されてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入される前に、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、フィブリンゲル、ヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入される前に、リポプレックスとして製剤化されてもよい。フィブリンゲル、ヒドロゲル、および糊は、２つの構成成分、すなわちフィブリノーゲン溶液およびカルシウムが豊富であるトロンビン溶液を含む（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０．１４８：４９−５５、Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．１５７：８０−８５を参照のこと）。フィブリンゲル、ヒドロゲル、および／または糊の構成成分の濃度は、フィブリンゲル、ヒドロゲル、および／または糊の放出特性を変更すること等であるが、これらに限定されない、ゲル、ヒドロゲル、および／または糊の特性、ネットワークメッシュサイズ、および／または分解特性を変更するように変化させることができる。（例えば、各
々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０．１４８：４９−５５、Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．１５７：８０−８５、Ｃａｔｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００８．１４：１１９−１２８を参照のこと）。この特長は、本明細書に開示の修飾ｍＲＮＡを送達するために使用されるときに有利であり得る。（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．１５７：８０−８５、Ｃａｔｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
２００８．１４：１１９−１２８を参照のこと）。
【０６３５】
カチオンおよびアニオン
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡの製剤は、カチオンまたはアニオンを含んでもよい。一実施形態において、製剤は、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない金属カチオンを含む。非限定的な例として、製剤は、ポリマー、ならびに金属カチオンと錯化されたポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを含んでもよい（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６５，３８９号および同第６，５５５，５２５号を参照のこと）。
【０６３６】
成形されたナノ粒子および微粒子
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、ナノ粒子および／または微粒子中に製剤化されてもよい。これらのナノ粒子および／または微粒子は、任意のサイズ形および化学組成へと成形され得る。例として、ナノ粒子および／または微粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を用いて作製することができる（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００７０２４３２３号を参照のこと）。
【０６３７】
一実施形態において、成形されたナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡのコア、ならびにポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを保護してもよい。
【０６３８】
ナノジャケット（ＮａｎｏＪａｃｋｅｔｓ）およびナノリポソーム（ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅｓ）
本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）によるナノジャケットおよびナノリポソーム中に製剤化されてもよい。ナノジャケットは、体内で自然に見つけられ、カルシウム、リン酸塩を含み、また少量のケイ酸塩も含み得る、化合物で作製される。ナノジャケットは、サイズが５〜５０ｎｍの範囲であり得、これを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡ等であるが、これらに限定されない親水性および疎水性化合物を送達することができる。
【０６３９】
ナノリポソームは、体内で天然に生じる脂質等であるが、これらに限定されない脂質で作製される。ナノリポソームは、サイズが６０〜８０ｎｍの範囲であり得、これを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡ等であるが、これらに限定されない親水性および疎水性化合物を送達することができる。一態様において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、セラミドナノリ
ポソーム等であるが、これらに限定されないナノリポソーム中に製剤化される。
【０６４０】
賦形剤
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６は、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびこれらの調製のための既知の技法を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図される。
【０６４１】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ））、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＥＰ））、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たしている。
【０６４２】
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、分散化剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に薬学的組成物中に含まれてもよい。
【０６４３】
例示の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、ショ糖、セルロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４４】
例示の造粒剤および／または分散化剤には、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微小結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４５】
例示の界面活性剤および／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン（ｔｒｉａｃｅｔｉｎ
ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮｎ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ  ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４６】
例示の結合剤には、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖類（例えば、ショ糖、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガッチガム（ｇｈａｔｔｉ  ｇｕｍ）、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微小結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール等；ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４７】
例示の防腐剤には、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および／または他の防腐剤が含まれ得るが、これらに限定されない。例示の酸化防止剤には、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコ
ルビル（ａｓｃｏｒｂｉｃ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。例示のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。例示の抗菌性防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール（ｃｈｌｏｒｏｘｙｌｅｎｏｌ）、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジ、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。例示の抗真菌性防腐剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。例示のアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
【０６４８】
例示の緩衝剤には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、二炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６４９】
例示の滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸（ｂｅｈａｎａｔｅ）グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６５０】
例示の油には、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラ
ックカラント種子油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェイ油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラの肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セボリー、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、胡桃油、および小麦胚芽油が含まれるが、これらに限定されない。例示の油には、ブチルステアリン酸、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６５１】
調合者の判断に従って、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤等の賦形剤が、組成物中に存在し得る。
【０６５２】
送達
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
【０６５３】
ネイキッド送達
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を用いずにポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
【０６５４】
製剤化された送達
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ／または修飾されていない場合があるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
【０６５５】
組成物は、直接浸水または浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または液滴によって、組成物でコーティングまたは含浸された織物または生分解性材料等の基質を使用することによって等を含むが、これらに限定されない当技術分野におけるいくつかの方法のうちのいずれかにおける器官または組織への直接送達のためにも製剤化され得る。
【０６５６】
投与
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、治療上有効成果をもた
らす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚上への適用）、皮内、（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内輸注（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹腔の中への輸注または注入）、膀胱内輸注、硝子体内（眼を介して）、空洞内注入（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚（ｉｎｔａｃｔ
ｓｋｉｎ）を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、ガス注入（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのための非限定的な投与経路が以下に記載される。
【０６５７】
非経口および注入による投与
非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
【０６５８】
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて製剤化されてもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中の、滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてのものであってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無刺激の固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
【０６５９】
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【０６６０】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を緩徐化することがしばしば望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。薬物の吸収速度は次いで、その溶解速度に依存し、溶解速度が今度は、結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって遂行される。注入用デポー形態は、薬物のマイクロカプセルマトリックス
（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）を、ポリラクチド−ポリグリコライド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注入用製剤は、薬物を、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製される。
【０６６１】
直腸および膣内投与
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができるる。
【０６６２】
経口投与
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒等、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
【０６６３】
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、および／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア）、保水剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、ならびに滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
【０６６４】
局所または経皮投与
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
【０６６５】
送達された組成物の皮膚発現の部位は、核酸送達の経路に依存する。次の３つの経路がポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを皮膚へと送達するために考慮される：（ｉ）局所適用（例えば、局所／局部治療および／または美容用途のため）、（ｉｉ）経皮注入（例えば、局所／局部治療および／または美容用途のため）、ならびに（ｉｉｉ）全身送達（例えば、皮膚領域および皮膚外領域の両方を侵す皮膚疾患の治療のため）。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で既知のいくつかの異なるアプローチによって皮膚に送達することができる。非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介性（遺伝子銃）、穿刺媒介性遺伝子トランスフェクション、およびウイルス送達アプローチ等であるが、これらに限定されない、ほとんどの局所送達アプローチが、ＤＮＡの送達に有効であることが示されている。核酸の送達後に、遺伝子産物が、基底角化細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞、および真皮マクロファージを含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる皮膚細胞型において検出されている。
【０６６６】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法を好都合にかつ／または有効に行うための多様なドレッシング（例えば、創傷ドレッシング）または包帯（例えば、粘着包帯）を提供する。典型的に、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象（複数可）の複数の治療を行うことを可能にするために、本明細書に記載の十分な量の薬学的組成物および／またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡを含むことができる。
【０６６７】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入で送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物を提供する。
【０６６８】
一実施形態において、局所および／または経皮投与の前に、皮膚等の少なくとも１つの組織の領域が、透過性を増加させ得るデバイスおよび／または溶液に供されてもよい。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるために、研磨デバイスに供されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００８０２７５４６８号を参照のこと）。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供されてもよい。超音波強化デバイスには、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，４９１，６５７号および同第６，２３４，９９０号に記載のデバイスが含まれてもよいが、これらに限定されない。組織の透過性を向上させる方法は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０６６９】
一実施形態において、デバイスを用いて、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡ製剤を送達する前に組織の透過性を増加させてもよい。皮膚の透過性は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の方法によって測定することができる。非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の薬物送達方法によって送達されてもよい。
【０６７０】
別の非限定的な例において、組織は、透過性を増加させ得るデバイスに組織が供され得る前、その間および／またはその後に、局所麻酔薬の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームで処理されてもよい。Ｋａｔｚら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ（２００４）；９８：３７１−７６）は、ＥＭＬＡクリームを低エネルギーと組み合わせて使用して、表在性皮膚鎮痛の発生が低エネルギー超音波での前処理の早くも５分後に見られたことを示した。
【０６７１】
一実施形態において、透過性を増加させるために組織が処理される前、その間、および／またはその後に、促進剤が組織に適用されてもよい。促進剤には、輸送促進剤、物理的促進剤、および空洞形成（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）促進剤が含まれるが、これらに限定されない。促進剤の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０６７２】
一実施形態において、デバイスを用いて、免疫応答を呼び起こす物質をさらに含有し得る、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させてもよい。別の非限定的な例において、免疫応答を呼び起こす物質を含有する製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号に記載の方法によって送達されてもよい。
【０６７３】
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチが含まれてもよい。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、必要とされ得る通りに薬学的に許容される賦形剤ならびに／または任意の必要とされる防腐剤および／もしくは緩衝液と混和される。
【０６７４】
さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、それはしばしば、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有し得る。そのような剤形は、例えば、化合物を適正な媒体中に溶解させるおよび／または分与することによって、調製することができる。あるいは、またはさらに、速度は、速度制御膜を提供することかつ／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散させることによってのいずれかで制御することができる。
【０６７５】
局所投与に好適な製剤には、リニメント剤、ローション等の液体および／もしくは半液体調製物、クリーム、軟膏、および／もしくはペースト等の水中油型および／もしくは油中水型エマルション、ならびに／または溶液および／もしくは懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。
【０６７６】
局所的に投与可能な製剤は、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、最大で溶媒中の活性成分の可溶性の限度まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０６７７】
デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織（「標的組織」）が、投与のための標的とされる。
【０６７８】
本発明のいくつかの態様において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、標的組織内またはその近位で空間的に保持される。標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物、特に組成物の核酸構成成分（複数可）が標的組織内に実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が標的組織内に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法が提供される。有利なことに、保持は、１つ以上の標的細胞に進入する、組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、投与の一定期間後に、対象に投与される核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、細胞内に存在する。例えば、哺乳
類対象への筋肉内注入が、リボ核酸およびトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて行われ、組成物の保持は、筋肉細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。
【０６７９】
本発明の態様は、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物が標的組織内に実質的に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法を対象とする。組成物は、目的とするポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で産生されるように、有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する。組成物は一般に、細胞透過剤、および薬学的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」核酸（細胞透過剤または他の薬剤を含まない核酸等）もまた企図される。
【０６８０】
いくつかの状況において、組織内の細胞によって産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加される。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内における目的とするタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。標的組織の既定体積内に含有される細胞の実質的な割合（％）において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が提供される。
【０６８１】
いくつかの実施形態において、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含み、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのうちの１つ以上が目的とするポリペプチドをコードする。任意に、組成物は、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。標的組織の既定体積内に含有される細胞のかなりの割合（％）において目的とするポリペプチドを産生する（一般に、既定体積に隣接した、または標的組織に遠位の組織において、目的とするポリペプチドの大幅な産生を誘導することなく）のに必要とされる組成物の用量の決定が行われる。この決定に次いで、決定された用量が哺乳類対象の組織に直接導入される。
【０６８２】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入でまたは分割用量注入によって送達される対象となるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを提供する。
【０６８３】
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバ、パッチポンプ、または浸透圧ポンプを用いて、標的組織の付近で保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、ＢＤ（登録商標）（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（例えば、ＭｉｎｉＭｅｄ）、ＵｎｉＬｉｆｅ（Ｙｏｒｋ，ＰＡ）、Ｖａｌｅｒｉｔａｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって製造および／または販売されるものが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定的な例としては、ＤＵＲＥＣＴ（登録商標）（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）（例えば、ＤＵＲＯＳ（登録商標）およびＡＬＺＥＴ（登録商標））によって製造されるものが挙げられる。
【０６８４】
肺投与
薬学的組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ／または密封容器中の低沸点噴射剤中に
溶解および／もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒／粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数量）が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％は、１ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数量）は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
【０６８５】
低沸点噴射剤には一般に、大気圧で６５°Ｆ（約１８．３℃）を下回る融点を有する液体噴射剤が含まれる。一般に、噴射剤は、組成物の５０ｗ／ｗｖ％〜９９．９ｗ／ｗｖ％を構成し得、活性成分は、組成物の０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ規模の粒径を有し得る）等のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０６８６】
非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２５７，６８５号に記載の方法によって肺送達のために製剤化されてもよい。
【０６８７】
肺送達のために製剤化される薬学的組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。そのような製剤は、任意に滅菌された、活性成分を含む、水性および／または希釈アルコール溶液および／または懸濁液として調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよく、好都合に、任意の噴霧および／または微粒化デバイスを用いて投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウム等の香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／または安息香酸メチルヒドロキシ等の防腐剤を含むが、これらに限定されない１つ以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
【０６８８】
鼻腔内、経鼻、および頬側投与
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
【０６８９】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗｖ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態にあってもよく、また、例えば、０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分であってもよく、残りが経口的に溶解性および／または分解性の組成物、ならびに任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含む。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０６９０】
眼内投与
薬学的組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、０．１／１．０ｗ／ｗ％の活性成分の溶液および／または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう１つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および／または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。眼および／または包囲組織への送達のために、多層薄膜デバイスが、薬学的組成物を含有するように調製されてもよい。
【０６９１】
ペイロード投与：検出可能な薬剤および治療剤
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、物質（「ペイロード」）の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法（ＢＬＩ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング／染色／画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０６９２】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、任意の有用な定位でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、２つの末端を有するリンカーを用いて、デアザ−アデノシンもしくはデアザ−グアノシンのＣ−７もしくはＣ−８位において、またはシトシンもしくはウラシルのＮ−３もしくはＣ−５位に等、一方の末端がペイロードに、および他方の末端が核酸塩基に結合される。本発明のポリヌクレオチドは、１つを超えるペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、ならびに切断可能リンカーを含むことができる。一実施形態において、修飾ヌクレオチドは、切断可能リンカーの一方の末端が７−デアザ−アデニンのＣ７位に結合され、リンカーの他方の末端が阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位）に結合され、標識（例えば、Ｃｙ５）がリンカーの中心に結合される、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号の図５におけるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１ならびに第９および１０欄を参照のこと）。修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩がコード領域へと組み込まれると、結果として生じる切断可能リンカーを有するポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に結合される。リンカーが切断されると（例えば、切断可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により）、標識および阻害剤が放出される。さらなるリンカーおよびペイロード（例えば、治療剤、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード）が本明細書に記載される。
【０６９３】
下記のスキーム１２は、核酸塩基であるアデニンが７−デアザアデニンのＣ−７炭素においてリンカーに結合される、例示の修飾ヌクレオチドを描写する。さらに、スキーム１２は、リンカーおよびペイロード、例えば、検出可能な薬剤がｍＲＮＡの３’末端上に組み込まれた、修飾ヌクレオチドを描写する。ジスルフィド切断およびプロパルギルエステル上へのチオール基の１，２−付加により、検出可能な薬剤が放出される。残りの構造（例えば、スキーム１２におけるｐＡｐＣ５Ｐａｒｇとして描写される）は、阻害剤である。修飾ヌクレオチドの構造に対する理論的根拠は、係留された阻害剤が、第２の塩基を組み込むポリメラーゼの能力を立体的に干渉することである。したがって、係留物がこの機能に影響を及ぼすのに十分に長いこと、および阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ）が、第２か
つ後続のヌクレオチドが伸長しているポリヌクレオチド鎖へと加わることを阻害するまたは禁止する立体化学的定位にあることが必要不可欠である。
スキーム１２
【化７４】
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【０６９４】
例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を再プログラミングするのに使用することができ、それによりクラスター中の総細胞と比較して、トランスフェクトされる細胞を直接追跡することが
できる。別の例において、リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに結合され得、また蛍光標識され得る薬物を用いて、薬物をインビボで、例えば、細胞内で追跡することができる。他の例としては、細胞内への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９５】
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤の、特定の細胞小器官への細胞内標的化において使用することができる。例示の細胞内標的には、高度なｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結された核局在化配列（ＮＬＳ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０６９６】
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、例えば、生存動物において、治療剤を細胞または組織に送達することができる。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、癌細胞を死滅させるために高極性化学療法剤を送達することができる。リンカーを介して治療剤に結合されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、部材の透過を容易にすることにより、治療剤が細胞内に移動して細胞内標的に到達することを可能にし得る。
【０６９７】
一例において、リンカーは、リボース環の２’位においてならびに／またはポリヌクレオチド、一次構築物ｍｍＲＮＡの３’および／もしくは５’位において結合される（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０３０６８３号を参照のこと）。リンカーは、本明細書に開示され、当技術分野で既知であり、かつ／または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０３０６８３号に開示の任意のリンカーであってもよい。
【０６９８】
別の例において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、切断可能リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡウイルス阻害性ペプチド（ＶＩＰ）に結合され得る。切断可能リンカーは、ＶＩＰおよび色素を細胞内に放出することができる。別の例において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素等のいくつかの細菌毒素の作用に関与する、ＡＤＰ−リボシレートに結合され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシレートＧタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
【０６９９】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤であってもよい。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であり得るいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、および同第５，８４６，５４５号を参照のこと）、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられるが
、これらに限定されない。放射性イオンには、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）およびｄオキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）が含まれるが、これらに限定されない。
【０７００】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、またはｒ９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−として）、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体（イオヘキソール（Ｉｏｈｅｘｏｌ））、微小気泡、またはペルフルオロ炭素）等の検出可能な薬剤であり得る。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、４−アセトアミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアン酸フェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアン酸スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオロセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２
−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミン（１：１）（ＩＲ１４４）との化合物；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（ＣＩＢＡＣＲＯＮ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（ｒｈｏｄａｒｎｉｎｅ）（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ａｌｅｘａ  ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが含まれる。
【０７０１】
いくつかの実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ））であってもよい。酵素標識組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０７０２】
組み合わせ
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ／または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび／または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および／もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ／またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、核酸またはｍｍＲＮＡは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６４，５７１号において、リポポリマーとともにインターロイキン−１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む薬学的組成物を使用し、また少なくとも１つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の核酸およびｍｍＲＮＡは、リポポリマーとともに薬学的組成物中にあってもよい（例えば、抗増殖性分子をコードするＤ
ＮＡプラスミドおよびリポポリマーを含む薬学的組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１１０２１８２３１号を参照のこと）、それは少なくとも１つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
【０７０３】
組み合わせて利用される治療上、予防上、診断上、または撮像活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されても、異なる組成物中で別個に投与されもよいことがさらに理解されよう。一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。いくつかの実施形態において、組み合わせて利用されるレベルは、個々に利用されるレベルよりも低いであろう。一実施形態において、組み合わせは、各々または一緒に、本明細書に記載の分割投薬レジメンに従って投与されてもよい。
【０７０４】
投薬
本発明は、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および／または状態）の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度；治療の持続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物；医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
【０７０５】
ある特定の実施形態において、本発明に従う組成物は、所望の治療的、診断的、予防的、または画像効果を得るために、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を１日１回以上送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、２日おきに、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達されてもよい。ある特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回以上の投与）によって送達されてもよい。複数回の投与が用いられるとき、本明細書に記載の分割投薬レジメン等の分割投薬レジメンが使用され得る。
【０７０６】
本発明に従って、分割用量レジメンでのｍｍＲＮＡの投与が哺乳類対象においてより高いレベルのタンパク質を産生することが見出されている。本明細書で使用されるとき、「分割用量」とは、単回単位用量または総１日用量の２つ以上の用量、例えば、単回単位用量の２回以上の投与への分割である。本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、１回用量で／一度に／単一経路で／単一接触点で、すなわち、単回投与事象で投与され
る任意の治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間内に所与または処方される量である。これは、単回単位用量として投与されてもよい。一実施形態において、本発明のｍｍＲＮＡは、分割用量で対象に投与される。ｍｍＲＮＡは、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化されてもよい。
【０７０７】
剤形
本明細書に記載の薬学的組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
【０７０８】
液体剤形
非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
【０７０９】
注入物
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注入用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌され得る。長活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。その後、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの遅延吸収は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって遂行され得る。注入用デポー形態は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡとポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられるが、これらに限定されない。
デポー注入用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製されてもよい。
【０７１０】
肺
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
【０７１１】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態であってもよく、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分を含有してもよく、この平衡物は、経口溶解性および／または分解性組成物と、任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上とを含んでもよい。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０７１２】
医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る。
【０７１３】
コーティング剤またはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分（複数可）のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
【０７１４】
薬学的組成物の特性
本明細書に記載の薬学的組成物は、生物学的利用能、治療域、および／または分布量のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る。
【０７１５】
生物学的利用能
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、生物学的利用能の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、変化していない形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定
することによって評価され得る。ＡＵＣは、縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対してプロットした曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に既知の方法、および参照により全体が本明細書に組み込まれるＧ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９６に記載の方法を用いて算出され得る。
【０７１６】
Ｃｍａｘ値は、化合物を哺乳動物に投与した後に哺乳動物の血清または血漿において達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に既知の方法を用いて測定され得る。「生物学的利用能の増加」または「薬物動態の改善」という表現は、哺乳動物においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定された第１のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの全身利用能が、本明細書に記載の送達剤と共投与された場合、本明細書に記載の送達剤との共投与が行われない場合よりも高いことを意味する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加し得る。
【０７１７】
治療域
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域と比較して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ組成物の治療域の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療上活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの治療域は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加し得る。
【０７１８】
分布量
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、分布量（Ｖｄｉｓｔ）の改善、例えば、低減または標的化を呈し得る。分布量（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書で使用されるとき、「分布量」という用語は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度で体内の薬物の総量を含有するよう要求される液量を指し、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量１０ｍｇおよび血漿濃度１０ｍｇ／Ｌの場合、分布量は、１リットルである。分布量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布量は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Ｖｄｉｓｔを用いて負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの分布量は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約２％
、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少し得る。
【０７１９】
生物学的効果
一実施形態において、動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類され得る。タンパク質発現は、本発明の修飾ｍＲＮＡを投与した哺乳動物から収集された生体試料を分析することによって決定され得る。一実施形態において、哺乳動物に投与される修飾ｍＲＮＡによってコードされた少なくとも５０ｐｇ／ｍＬの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の５０〜２００ｐｇ／ｍＬの発現タンパク質が、哺乳動物における治療上有効量のタンパク質と見なされ得る。
【０７２０】
質量分析による修飾核酸の検出
質量分析（ＭＳ）は、分子のイオン変換後の分子の構造質量および分子量／濃度情報を提供することができる分析的技法である。分子は、最初に、イオン化されて正電荷または負電荷を得て、次いで、それらは、質量分析器を通って移動して、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って検出器の異なる領域に到達する。
【０７２１】
質量分析は、分画された試料をイオン化し、かつさらなる分析のために荷電分子を作成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／血漿スプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施され得る。当業者であれば、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、正モードと負モードの選択等に基づいて決定され得ることを理解する。
【０７２２】
試料がイオン化された後、その結果作成される正電荷イオンまたは負電荷イオンが分析されて、質量対電荷比（すなわち、ｍ／ｚ）を決定することができる。質量対電荷比の決定に好適な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が含まれる。イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンは、検出され得る（すなわち、選択的イオン監視モード（ＳＩＭ）を用いて）か、またはあるいは、イオンは、走査モード、例えば、多重反応監視（ＭＲＭ）もしくは選択反応監視（ＳＲＭ）を用いて検出され得る。
【０７２３】
ペプチド標準物の安定した同位体標識化希釈と連動した液体クロマトグラフィー−多重反応監視（ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭ）が、タンパク質の検証に有効な方法であることが示されている（例えば、これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００９
８：２３３９−２３４９、Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９  ５５：１１０８−１１１７、Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１０
５６：２８１−２９０）。バイオマーカー発見の研究で頻繁に用いられる標的化されていない質量分析とは異なり、標的化されたＭＳ方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十〜何百もの選択されたペプチドに集中させるＭＳのペプチド配列に基づくモードである。検出および断片化を目的とするタンパク質に由来するペプチドのみに制限することによって、感受性および再現性は、発見モードのＭＳ方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析に基づく多重反応監視（ＭＲＭ）定量化方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカー
の発見および定量化に劇的に影響を与えることができる。
【０７２４】
一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、ＭＲＭ−ＭＳ法によって分析され得る。生体試料の定量化は、内部標準物として同位体標識ペプチドまたはタンパク質をさらに含むことができるが、これらに限定されない。
【０７２５】
本発明に従って、生体試料は、対象から得られた時点で、酵素消化に供されてもよい。本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より短いペプチドに分裂することを意味する。本明細書で使用されるとき、「タンパク質を消化するために試料を処理する」という表現は、試料中のタンパク質を解体するような方法で試料を操作することを意味する。これらの酵素には、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、およびキモトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料は、酵素を用いて消化され得る。
【０７２６】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、エレクトロスプレーイオン化を用いてタンパク質について分析され得る。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析（ＥＳＩＭＳ）は、それらが質量分析によって分析される前に溶液から気相へのイオンの移動を支援するために電気的エネルギーを用いる。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００３  ２４（１）：３−１２）。溶液に含有されるイオン種は、液滴の微粒スプレーを分散させ、溶媒を蒸発させ、高度に帯電した液滴の噴霧を生成するためにイオンを液滴から排出させることによって気相に移動し得る。高度に帯電した液滴の噴霧は、四重極質量分析器等であるが、これに限定されない、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの質量分析器を用いて分析され得る。さらに、質量分析法には、精製ステップが含まれ得る。非限定的な例として、第１の四重極は、単一ｍ／ｚ比を選択するように設定されてもよく、従って、異なるｍ／ｚ比を有する他の分子イオンを濾去することができ、これは、ＭＳ分析前に複雑で時間のかかる試料精製手順を排除し得る。
【０７２７】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、タンデムＥＳＩＭＳ系（例えば、ＭＳ／ＭＳ）において、タンパク質について分析され得る。非限定的な例として、液滴は、産物スキャン（もしくは娘スキャン）、前駆体スキャン（親スキャン）、中性損失、または多重反応監視を用いて分析され得る。
【０７２８】
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＡＬＤＩＭＳ）を用いて分析され得る。ＭＡＬＤＩは、タンパク質等の巨大分子および小分子の両方の非破壊蒸発およびイオン化を提供する。ＭＡＬＤＩ分析において、分析物は、最初に、紫外線吸収弱有機酸も含み得るが、これに限定されない高モル過剰のマトリックス化合物と共結晶化される。ＭＡＬＤＩに用いられるマトリックスの非限定的な例としては、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸、および２，５−ジヒドロキシ安息香酸がある。分析物−マトリックス混合物のレーザー放射は、マトリックスおよび分析物の蒸発をもたらし得る。レーザー誘起脱離は、無傷の分析物の高イオン収率を提供し、高精度の化合物の測定を可能にする。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｗｉｓ，Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００：５８８０−５８９４）。非限定的な例として、ＭＡＬＤＩ分析に用いられる質量分析器には、線形飛行時間（ＴＯＦ）、ＴＯＦリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器が含まれ得る。
【０７２９】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、乾燥液滴法を用いて形成され得る。生体試料は、マトリックスと混合されて飽和マトリックス溶液を作成し、マトリックスと試料の比率は、およそ５０００：１である。その後、一定分量（およそ０．５〜２．０μＬ）の飽和マトリックス溶液が、乾燥させられて分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０７３０】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、薄層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜が最初に形成され、その後、その試料が適用され、マトリックスによって吸収されて分析物−マトリックス混合物を形成し得る。
【０７３１】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、厚層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜は、ニトロ−セルロースマトリックス添加剤で形成される。均一なニトロ−セルロースマトリックス層が得られた時点で、試料が適用され、マトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０７３２】
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、サンドイッチ法を用いて形成され得る。マトリックス結晶の薄層が、薄層法にあるように調製され、その後、水性トリフルオロ酢酸、試料、およびマトリックスの液滴が添加される。その後、試料はマトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
【０７３３】
Ｖ．本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡの使用
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、好ましい実施形態において、免疫応答および／もしくは分解経路等の有害な生体応答の回避（ａｖｏｉｄａｎｃｅ）もしくは回避（ｅｖａｓｉｏｎ）、発現の閾値の克服および／もしくはタンパク質産生能力の改善、改善された発現率もしくは翻訳効率、改善された薬物もしくはタンパク質半減期および／もしくはタンパク質濃度、最適化されたタンパク質局在化を提供して、組織内の安定性および／もしくはクリアランス、受容体による取り込みおよび／もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、分泌効率（該当する場合）、血液循環への到達可能性、ならびに／または細胞の状態、機能、および／もしくは活性の調節のうちの１つ以上を改善するように設計される。
【０７３４】
治療薬
治療剤
本明細書に記載される、修飾核酸および修飾ＲＮＡ等の本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、インビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、治療、または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡを含有する細胞、またはポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを含む。
【０７３５】
ある特定の実施形態において、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質とともに、
哺乳類対象の免疫性を後押しするタンパク質（単数または複数）をコードする翻訳可能領域を含有する、１つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する、組み合わせ治療薬が本明細書に提供される。例えば、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする１つ以上の核酸を含有する治療薬が本明細書に提供される。具体的には、そのような組み合わせ治療薬は、トラスツズマブへの誘導耐性を発達するＨｅｒ２＋乳癌患者において有用である。（例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２（６）：７９５−８（２０１０）を参照のこと）。
【０７３６】
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が、本明細書に提供される。そのような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させられる。集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触させられる。
【０７３７】
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な、タンパク質産生を提供する。増加した効率は、増加した細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合（％））、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の増加した持続期間によって実証される）、または宿主細胞の低減された自然免疫応答によって実証され得る。
【０７３８】
本発明の態様は、必要性のある哺乳類対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも１つの構造修飾または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する、有効量の組成物が、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１周期以上の核酸投与により標的とされ得る。
【０７３９】
ある特定の実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織、または生物内で実質的に不在である機能的活性を提供する、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。例えば、欠損した機能的活性は、酵素的活性、構造的活性、または遺伝子調節活性の性質を有し得る。関連する実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を増加させる（例えば、相乗的に）、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。
【０７４０】
他の実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に不在である１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置き換える、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。そのような不在性は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因し得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ、そのような増加は、内因性タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
【０７４１】
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、内因性タンパク質の突然変異が変化した活性または局在化をもたらすことに起因して、対象に有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される生体部分の活性に、直接的または間接的に拮抗する。拮抗対象の生体部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低比重リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素等のタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素等の小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗対象の生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性等の望ましくない活性を示す内因性タンパク質である場合がある。
【０７４２】
本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内、可能性としては核等の特定の区画内での局在化のために操作されてもよく、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために操作される。
【０７４３】
いくつかの実施形態において、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたポリペプチドは、次のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない多様な疾患、障害、および／または状態のいずれの治療に使用されてもよい：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓、凝固障害、血管新生障害等の黄斑変性）；増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、胃潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患）；精神的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ系障害（例えば、貧血症、血友病）等。
【０７４４】
機能不全のまたは異常なタンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血症、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症が含まれる。本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する核酸または細胞ベースの治療薬導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、またはそれに打ち勝つタンパク質をコードする。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の機能不全のタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス突然変異変異形が挙げられる。
【０７４５】
欠損した（または適正な（正常なまたは生理学的タンパク質機能が生じないほどに実質的に低下した）タンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、ニーマン・ピック病Ｃ型、重症型βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Ａが含まれる。そのようなタンパク質は、存在しない場合があるか、または本質的に非機能的である。本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する核酸または細胞ベースの治療薬導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、対象の標的細胞から
欠損したタンパク質活性を置き換える。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の非機能的なタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス突然変異変異形が挙げられる。
【０７４６】
したがって、対象の細胞を、有効量のＣＴＦＲポリペプチドが細胞内に存在するような条件下で、機能的ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触させることによって、哺乳類対象において嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺等の上皮、内皮、および中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定され、すなわち、肺送達に関して、ＲＮＡ分子は、吸入による投与のために製剤化される。
【０７４７】
別の実施形態において、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究によって最近特徴付けられたタンパク質であるＳｏｒｔｉｌｉｎをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を用いて導入し、それによって対象において高脂血症を寛解させることによって、対象において高脂血症を治療するための方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、Ｓｏｒｔｉｌｉｎと呼ばれるトランスゴルジ網（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質をコードする。遺伝子研究は、５人に１人の個人が、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座において、低レベルの低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の素因を付与する一塩基多型ｒｓ１２７４０３７４を有することを示している。人々の約３０％において存在するこのマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬだけ変化させる一方で、集団の約５％において存在するこのマイナー対立遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。このマイナー対立遺伝子の保因者は、心筋梗塞の４０％減少した危険性を有することも示されている。マウスにおける機能的インビボ研究は、マウス肝臓組織内のＳＯＲＴ１の過剰発現が、最大８０％より低い、有意により低いＬＤＬ−コレステロールレベルをもたらし、ＳＯＲＴ１のサイレンシングがＬＤＬコレステロールをおよそ２００％増加させることを記載する（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ２０１０；４６６：７１４−７２１）。
【０７４８】
別の実施形態において、本発明は、造血障害、心血管疾患、腫瘍学（ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、糖尿病、嚢胞性線維症、神経疾患、先天性代謝異常、皮膚および全身障害、ならびに失明を治療するための方法を提供する。これらの具体的な疾患を治療するための分子標的が記載されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｄ．，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｔａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０７４９】
感染および／または敗血症を発症する危険性がある対象において感染および／または敗血症を予防するための方法が本明細書に提供され、本方法は、そのような予防を必要とする対象に、感染および／または敗血症を予防するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ前駆体を含む組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態において、感染および／または敗血症を発症する危険性がある対象は、癌患者であり得る。ある特定の実施形態において、癌患者は、前処置レジメンを経た場合がある。いくつかの実施形態において、前処置統制（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）は、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、プロテインＣ、そのチモーゲンもしくはプレプロタンパク質、またはプロテインＣの活性化型（ＡＰ
Ｃ）もしくはプロテインＣの変異形をコードし得、それらは当技術分野で知られている。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、化学修飾され、細胞に送達されてもよい。本発明の化学修飾されたｍＲＮＡ内でコードされ得るポリペプチドの非限定的な例としては、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２２６，９９９号、同第７，４９８，３０５号、同第６，６３０，１３８号に教示されるものが挙げられる。これらの特許は、プロテインＣ様分子、変異形、および誘導体を教示し、これらのうちのいずれも、本発明の化学修飾された分子内でコードされ得る。
【０７５０】
対象において感染および／または敗血症を治療するための方法が本明細書にさらに提供され、本方法は、そのような治療を必要とする対象に、感染および／または敗血症を治療するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチド、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ前駆体を含む組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態において、治療を必要とする対象は、癌患者である。ある特定の実施形態において、癌患者は、前処置レジメンを経ている。いくつかの実施形態において、前処置統制（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）は、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。
【０７５１】
ある特定の実施形態において、対象は、急性または慢性微生物感染（例えば、細菌感染）を呈する場合がある。ある特定の実施形態において、対象は、治療を受けた場合があるか、または受けている場合がある。ある特定の実施形態において、治療には、放射線療法、化学療法、ステロイド、紫外線放射、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、患者は、微小血管障害を患っている場合がある。いくつかの実施形態において、微小血管障害は、糖尿病であり得る。ある特定の実施形態において、患者は、創傷を有し得る。いくつかの実施形態において、創傷は、潰瘍であり得る。具体的な実施形態において、創傷は、糖尿病性足部潰瘍であり得る。ある特定の実施形態において、対象は、１つ以上の熱傷創を有し得る。ある特定の実施形態において、投与は、局所であっても全身であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、皮下であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、静脈内であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、経口であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、局所であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、吸入によるものであってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、直腸であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、膣内であってもよい。
【０７５２】
本開示の他の態様は、哺乳類対象への、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する細胞の移植に関する。哺乳類対象への細胞の投与は、当業者に知られており、局所（局所）移植（例えば、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）または皮下投与）、器官送達または全身埋込（例えば、静脈内注入または吸入）、および薬学的に許容される担体中の細胞の製剤を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有するそのような組成物は、筋肉内に、経動脈的に、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、内視鏡的に、経皮的に、または髄腔内に投与するために製剤化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のために製剤化されてもよい。
【０７５３】
治療剤が投与され得る対象は、疾患、障害、または有害な状態を患うか、またはそれを発症する危険性があり得る。これらに基づいて、対象を特定する、診断する、および分類する方法が提供され、それは臨床診断、バイオマーカーレベル、全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）、および当技術分野で既知の他の方法を含んでもよい。
【０７５４】
創傷管理
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、創傷治療、例えば、治癒の遅延を呈する創傷の治療に使用されてもよい。創傷の治療を管理するためにポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの投与を含む方法が本明細書に提供される。本明細書における方法は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの投与の前、それと同時、またはその後のいずれかに行われるステップをさらに含んでもよい。例えば、創傷床は、創傷治癒を容易にし、望ましくは創傷の閉鎖を得るために、清浄にされ、準備される必要があり得る。創傷治癒を促進し、創傷閉鎖を達成するために、次のものを含むが、これらに限定されない、いくつかの戦略が使用され得る：（ｉ）壊死組織除去（任意に反復される）、鋭利な壊死組織除去（死滅または感染組織の創傷からの外科的除去）、任意に、壊死組織を除去するための酵素等の化学的壊死組織除去剤、（ｉｉ）創傷に湿潤した温暖な環境を提供し、組織修復および治癒を促進するための創傷ドレッシング。
【０７５５】
創傷ドレッシングを製剤化する際に使用される材料の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヒドロゲル（例えば、ＡＱＵＡＳＯＲＢ（登録商標）；ＤＵＯＤＥＲＭ（登録商標））、ヒドロコロイド（例えば、ＡＱＵＡＣＥＬ（登録商標）；ＣＯＭＦＥＥＬ（登録商標））、泡状物質（例えば、ＬＹＯＦＯＡＭ（登録商標）；ＳＰＹＲＯＳＯＲＢ（登録商標））、およびアルギン酸塩（例えば、ＡＬＧＩＳＩＴＥ（登録商標）；ＣＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標））、（ｉｉｉ）細胞分裂および増殖を刺激し、創傷治癒を促進するためのさらなる成長因子、例えば、神経障害性足部潰瘍の治療のためにＦＤＡによって認可されているヒト組換え血小板由来成長因子である、ベカプレルミン（ＲＥＧＲＡＮＥＸゲル（登録商標））、（ｉｖ）清浄な、治癒していない創傷の被覆を得るために、軟組織創傷被覆、すなわち皮膚移植片が必要であり得る。軟組織被覆に使用され得る皮膚移植片の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：自家皮膚移植片、屍体皮膚移植片、生物工学によって作られた代用皮膚（例えば、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）；ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標））。
【０７５６】
ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡには、ヒドロゲル（例えば、ＡＱＵＡＳＯＲＢ（登録商標）；ＤＵＯＤＥＲＭ（登録商標））、ヒドロコロイド（例えば、ＡＱＵＡＣＥＬ（登録商標）；ＣＯＭＦＥＥＬ（登録商標））、泡状物質（例えば、ＬＹＯＦＯＡＭ（登録商標）；ＳＰＹＲＯＳＯＲＢ（登録商標））、および／またはアルギン酸塩（例えば、ＡＬＧＩＳＩＴＥ（登録商標）；ＣＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標））がさらに含まれてもよい。ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、自家皮膚移植片、屍体皮膚移植片、または生物工学によって作られた代用皮膚（例えば、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）；ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標））を含むが、これらに限定されない皮膚移植片とともに使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、創傷（ｗｏｕｌｄ）ドレッシング製剤および／もしくは皮膚移植片とともに適用されてもよく、またはそれはた、浸漬もしくは散布等であるが、これらに限定されない方法を除いて別個に適用されてもよい。
【０７５７】
いくつかの実施形態において、創傷管理のための組成物は、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）および／または抗ウイルス性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含んでもよい。抗菌性ポリペプチドの前駆体または部分的もしくは完全にプロセシングされた形態がコードされてもよい。組成物は、包帯（例えば、粘着包帯）を用いた投与のために製剤化されてもよい。抗菌性ポリペプチドおよび／または抗ウイルス性ポリペプチドは、ドレッシング組成物と相互混合されてもよく、または別個に、例えば、浸漬もしくは散布によって適用されてもよい。
【０７５８】
抗体の産生
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、
抗体およびそのような抗体の断片をコードし得る。これらは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されてもよい。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭ等であるが、これらに限定されない、免疫グロブリンの異なるサブクラスまたはアイソタイプのうちのいずれか、または他のサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明に従って調製され得る例示の抗体分子および断片には、免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有し得る免疫グロブリン分子の部分が含まれるが、これらに限定されない。パラトープを含有し得る抗体のそのような部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）および当技術分野で既知の部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０７５９】
本発明のポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有し得るか、または参照ポリペプチド配列と似ているもしくは似ていない結合特徴を有し得る、変異形抗体ポリペプチドをコードし得る。
【０７６０】
本発明の方法によって得られる抗体は、免疫された動物に由来する非ヒト抗体由来可変領域（複数可）配列、およびヒト抗体由来定常領域（複数可）配列を含む、キメラ抗体であってもよい。加えて、それらは、免疫された動物に由来する非ヒト抗体の相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）ならびにヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含む、ヒト化抗体でもあり得る。別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおいて抗体タンパク質産物の収率を向上させるために有用であり得る。
【０７６１】
感染を管理する
一実施形態において、抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを投与することによって、対象において、微生物感染（例えば、細菌感染）および／または微生物またはウイルス感染に関連した疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を治療するまたは予防するための方法が提供される。該投与は、抗菌性薬剤（例えば、抗細菌剤）、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドまたは小分子抗菌性化合物と組み合わせられてもよい。抗菌性薬剤には、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫薬剤、抗寄生虫剤、および抗プリオン剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０７６２】
薬剤は、同時に、例えば、組み合わせた単位用量（例えば、両方の薬剤の同時送達を提供する）で投与することができる。薬剤は、数分間、数時間、数日間、または数週間の間隔等であるが、これらに限定されない、指定される時間間隔で投与することもできる。一般に、薬剤は、対象において、並行して生物学的に利用可能、例えば、検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、本質的に同時に、例えば、同時に投与される２つの単位投薬量、または２つの薬剤の組み合わせた単位投薬量で、投与されてもよい。他の実施形態において、薬剤は、別個の単位投薬量で送達されてもよい。薬剤は、任意の順序で、または２つ以上の薬剤を含む１つ以上の調製物により、投与されてもよい。好ましい実施形態において、薬剤のうちの１つ、例えば、第１の薬剤の、少なくとも１回の投与は、他方の薬剤、例えば、第２の薬剤の数分、１、２、３、もしくは４時間以内に、またはさらに１日もしくは２日以内に行われてもよい。いくつかの実施形態において、組み合わせは、相乗的結果、例えば、相加的結果を超える、例えば、相加的結果の少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００％超を達成することができる。
【０７６３】
細菌感染に関連した状態
細菌感染に関連し得る疾患、障害、または状態には、膿瘍、放線菌症、急性前立腺炎、エロモナス・ハイドロフィラ、一年生草ライグラス中毒、炭疽病、桿菌性紫斑症、菌血症
、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、細菌関連皮膚状態、バルトネラ症、ＢＣＧ腫、ボトリオミセス症、ボツリヌス症、ブラジル紫斑熱、ブローディー膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂窩織炎、クラミジア感染、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、歯周−歯内病変（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃ−ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ）、牛肺疫、ジフテリア、ジフテリア性口内炎、エーリキア症、丹毒、喉頭蓋炎（ｐｉｇｌｏｔｔｉｔｉｓ）、丹毒、フィッツ・ヒュー・カーチス症候群、ノミ媒介性斑点熱、腐蹄症（感染性足皮膚炎）、Ｇａｒｒｅ硬化性骨髄炎、淋病、鼠径肉芽腫、ヒト顆粒球性アナプラズマ症、ヒト単球向性エーリキア症、百日咳（ｈｕｎｄｒｅｄ  ｄａｙｓ’ｃｏｕｇｈ）、膿痂疹、晩期先天性梅毒性眼病、レジオネラ症、レミエール症候群、ライ病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染、マイコバクテリウム複合体（ＭＡＩ）、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、水癌（ｎｏｍａ）（水癌（ｃａｎｃｒｕｍ
ｏｒｉｓ）または壊疽性口内炎）、臍炎、眼窩蜂巣炎、骨髄炎、脾臓摘出後重症感染（ＯＰＳＩ）、ヒツジブルセラ症、パスツレラ病、眼窩周囲蜂巣炎、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））、ペスト、肺炎球菌肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Ｑ熱、再帰熱（回帰熱）、リウマチ熱、ロッキー山斑点熱（ＲＭＳＦ）、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染、細菌性赤痢、南部ダニ紅斑病（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｔｉｃｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒａｓｈ  ｉｌｌｎｅｓｓ）、ブドウ球菌性皮膚剥脱症候群、連鎖球菌咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒素性ショック症候群（ＴＳＳ）、トラコーマ、塹壕熱、熱帯性潰瘍、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路性器結核、尿路感染、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染、ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群、偽性結核（エルシニア）症、およびエルシニア症のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。細菌感染に関連した他の疾患、障害、および／または状態は、例えば、アルツハイマー病、神経性食欲不振症、喘息、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自己免疫疾患、双極性障害、癌（例えば、結腸直腸癌、胆嚢癌、肺癌、膵臓癌、および胃癌）、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、冠動脈心疾患、認知症、うつ病、ギラン・バレー症候群、内臓脂肪症候群、多発性硬化症、心筋梗塞、肥満、強迫障害、パニック障害、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、脳卒中、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、およびトゥレット症候群を含むことができる。
【０７６４】
細菌性病原体
本明細書に記載の細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。細菌性病原体には、アシネトバクター・バウマンニ、バチルス・アントラシス、バチルス・スブチリス、ボルデテラ・パータシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジアトラコーマｔｉｓ、クラミドフィラ・シタッシ、クロストリジウムボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウムテタニ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、コリネバクテリウムジフテリア、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、エンテロバクター種、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インテロガンス、リステリア・モノサイトゲネス、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・レプレ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレー、ナイセリア・メニンギティディス、プレテウス・ミラビリス（Ｐｒｅｔｅ
ｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス属、シュードモナス・エルジノーサ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｅｎｓ）、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ソネイ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、トレポネーマー・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌性病原体は、耐性菌感染を引き起こす細菌、例えば、クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシル、フルオロキノロン耐性クロストリジウム・ディフィシル、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、多剤耐性エンテロコッカス・フェカリス、多剤耐性エンテロコッカス・フェシウム、多剤耐性シュードモナス・エルジノーサ、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、およびバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）も含み得る。
【０７６５】
抗生物質の組み合わせ
一実施形態において、本発明の修飾ｍＲＮＡは、１つ以上の抗生物質と組み合わせて投与され得る。これらには、アクニロックス、アムビゾーム、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン、アベロックス、アジスロマイシン、バクトロバン、ベタジン、ベトノベート、ブレファミド（Ｂｌｅｐｈａｍｉｄｅ）、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフェピム、セフィックス（Ｃｅｆｉｘ）、セフィキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフロキシム、セフジル（Ｃｅｆｚｉｌ）、セファレキシン、セファゾリン（Ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、セプタズ（Ｃｅｐｔａｚ）、クロラムフェニコール、クロルヘキシジン、クロロマイセチン、クローシグ（Ｃｈｌｏｒｓｉｇ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダゲル（Ｃｌｉｎｄａｇｅｌ）、クリンダマイシン、クリンダテック（Ｃｌｉｎｄａｔｅｃｈ）、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ジクロシル（Ｄｉｃｌｏｃｉｌ）、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、デュリセフ（Ｄｕｒｉｃｅｆ）、エリスロマイシン、フラマジン（Ｆｌａｍａｚｉｎｅ）、フロキシン（Ｆｌｏｘｉｎ）、フラミセチン、フシジン（Ｆｕｃｉｄｉｎ）、フラダンチン、フシジック（Ｆｕｓｉｄｉｃ）、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲミフロキサシン、イロソン、ヨード、ラバキン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マクサクイン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、メフォキシン、メロネム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ミヤンブトール（Ｍｙａｍｂｕｔｏｌ）、マイコスタチン、ネオスポリン、ネトロマイシン（Ｎｅｔｒｏｍｙｃｉｎ）、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、ノリレット（Ｎｏｒｉｌｅｔ）、フロキサシン、オムニカフ（Ｏｍｎｉｃｅｆ）、オスパモックス（Ｏｓｐａｍｏｘ）、オキシテトラサイクリン、パラキシン（Ｐａｒａｘｉｎ）、ペニシリン、ニューモバックス、ポリファックス（Ｐｏｌｙｆａｘ）、ポビドン、リファジン、リファンピン、リファキシミン、リファナフ（Ｒｉｆｉｎａｈ）、リマクタン、ロセフィン、ロキシスロマイシン、セロマイシン、ソフラマイシン（Ｓｏｆｒａｍｙｃｉｎ）、スパルフロキサシン、スタフレックス（Ｓｔａｐｈｌｅｘ）、タゴシッド、テトラサイクリン、テトラドックス（Ｔｅｔｒａｄｏｘ）、テトラリサル（Ｔｅｔｒａｌｙｓａｌ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、トレケーター（Ｔｒｅｃａｔｏｒ）、タイガシル、バンコシン、ベロセフ（Ｖｅｌｏｓｅｆ）、ビブラマイシン、キファサン（Ｘｉｆａｘａｎ）、ザガム（Ｚａｇａｍ）、ジトロテク（Ｚｉｔｒｏｔｅｋ）、ゾデルム（Ｚｏｄｅｒｍ）、ジマー（Ｚｙｍａｒ）、およびザイボックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６６】
抗細菌剤
例示の抗細菌剤には、アミノグリコシド（例えば、アミカシン（ＡＭＩＫＩＮ（登録商標））、ゲンタマイシン（ＧＡＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、カナマイシン（ＫＡＮＴ
ＲＥＸ（登録商標））、ネオマイシン（ＭＹＣＩＦＲＡＤＩＮ（登録商標））、ネチルマイシン（ＮＥＴＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、トブラマイシン（ＮＥＢＣＩＮ（登録商標））、パロモマイシン（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標））、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ（ＬＯＲＡＢＩＤ（登録商標））、カルバペネム（例えば、エルタペネム（ＩＮＶＡＮＺ（登録商標））、ドリペネム（ＤＯＲＩＢＡＸ（登録商標））、イミペネム／シラスタチン（ＰＲＩＭＡＸＩＮ（登録商標））、メロペネム（ＭＥＲＲＥＭ（登録商標））、セファロスポリン類（第１世代）（例えば、セファドロキシル（ＤＵＲＩＣＥＦ（登録商標））、セファゾリン（ＡＮＣＥＦ（登録商標））、セファロチンまたはセファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（ＫＥＦＬＩＮ（登録商標））、セファレキシン（ＫＥＦＬＥＸ（登録商標））、セファロスポリン類（第２世代）（例えば、セファクロル（ＣＥＣＬＯＲ（登録商標））、セファマンドール（ＭＡＮＤＯＬ（登録商標））、セフォキシチン（ＭＥＦＯＸＩＮ（登録商標））、セフプロジル（ＣＥＦＺＩＬ（登録商標））、セフロキシム（ＣＥＦＴＩＮ（登録商標）、ＺＩＮＮＡＴ（登録商標））、セファロスポリン類（第３世代）（例えば、セフィキシム（ＳＵＰＲＡＸ（登録商標））、セフジニル（ＯＭＮＩＣＥＦ（登録商標）、ＣＥＦＤＩＥＬ（登録商標））、セフジトレン（ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ（登録商標））、セフォペラゾン（ＣＥＦＯＢＩＤ（登録商標））、セフォタキシム（ＣＬＡＦＯＲＡＮ（登録商標））、セフポドキシム（ＶＡＮＴＩＮ（登録商標））、セフタジジム（ＦＯＲＴＡＺ（登録商標））、セフチブテン（ＣＥＤＡＸ（登録商標））、セフチゾキシム（ＣＥＦＩＺＯＸ（登録商標））、セフトリアクソン（ＲＯＣＥＰＨＩＮ（登録商標））、セファロスポリン類（第４世代）（例えば、セフェピム（ＭＡＸＩＰＩＭＥ（登録商標））、セファロスポリン類（第５世代）（例えば、セフトビプロール（ＺＥＦＴＥＲＡ（登録商標））、グリコペプチド（例えば、テイコプラニン（ＴＡＲＧＯＣＩＤ（登録商標））、バンコマイシン（ＶＡＮＣＯＣＩＮ（登録商標））、テラバンシン（ＶＩＢＡＴＩＶ（登録商標））、リンコサミド系（例えば、クリンダマイシン（ＣＬＥＯＣＩＮ（登録商標））、リンコマイシン（ＬＩＮＣＯＣＩＮ（登録商標））、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン（ＣＵＢＩＣＩＮ（登録商標））、マクロライド系（例えば、アジスロマイシン（ＺＩＴＨＲＯＭＡＸ（登録商標）、ＳＵＭＡＭＥＤ（登録商標）、ＺＩＴＲＯＣＩＮ（登録商標））、クラリスロマイシン（ＢＩＡＸＩＮ（登録商標））、ジリスロマイシン（ＤＹＮＡＢＡＣ（登録商標））、エリトロマイシン（ＥＲＹＴＨＯＣＩＮ（登録商標）、ＥＲＹＴＨＲＯＰＥＤ（登録商標））、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン（ＴＡＯ（登録商標））、テリスロマイシン（ＫＥＴＥＫ（登録商標））、スペクチノマイシン（ＴＲＯＢＩＣＩＮ（登録商標））、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム（ＡＺＡＣＴＡＭ（登録商標））、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標））、ニトロフラントイン（ＭＡＣＲＯＤＡＮＴＩＮ（登録商標）、ＭＡＣＲＯＢＩＤ（登録商標））、ペニシリン系（例えば、アモキシシリン（ＮＯＶＡＭＯＸ（登録商標）、ＡＭＯＸＩＬ（登録商標））、アンピシリン（ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ（登録商標））、アズロシリン、カルベニシリン（ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、クロキサシリン（ＴＥＧＯＰＥＮ（登録商標））、ジクロキサシリン（ＤＹＮＡＰＥＮ（登録商標））、フルクロキサシリン（ＦＬＯＸＡＰＥＮ（登録商標））、メズロシリン（ＭＥＺＬＩＮ（登録商標））、メチシリン（ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、ナフシリン（ＵＮＩＰＥＮ（登録商標））、オキサシリン（ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ（登録商標））、ペニシリンＧ（ＰＥＮＴＩＤＳ（登録商標））、ペニシリンＶ（ＰＥＮ−ＶＥＥ−Ｋ（登録商標））、ピペラシリン（ＰＩＰＲＡＣＩＬ（登録商標））、テモシリン（ＮＥＧＡＢＡＮ（登録商標））、チカルシリン（ＴＩＣＡＲ（登録商標））、ペニシリンの組合せ（例えば、アモキシシリン／クラブラン酸（ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標））、アンピシリン／スルバクタム（ＵＮＡＳＹＮ（登録商標））、ピペラシリン／タゾバクタム（ＺＯＳＹＮ（登録商標））、チカルシリン／クラブラネート（ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標））、ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン（ＣＯＬＹ−ＭＹＣＩＮ−Ｓ（登録商標））、ポリミキシンＢ、キノロン系（例えば、シプロフロキサシン（ＣＩＰ
ＲＯ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＸＩＮ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＢＡＹ（登録商標））、エノキサシン（ＰＥＮＥＴＲＥＸ（登録商標））、ガチフロキサシン（ＴＥＱＵＩＮ（登録商標））、レボフロキサシン（ＬＥＶＡＱＵＩＮ（登録商標））、ロメフロキサシン（ＭＡＸＡＱＵＩＮ（登録商標））、モキシフロキサシン（ＡＶＥＬＯＸ（登録商標））、ナリジクス酸（ＮＥＧＧＲＡＭ（登録商標））、ノルフロキサシン（ＮＯＲＯＸＩＮ（登録商標））、オフロキサシン（ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）、ＯＣＵＦＬＯＸ（登録商標））、トロバフロキサシン（ＴＲＯＶＡＮ（登録商標））、グレパフロキサシン（ＲＡＸＡＲ（登録商標））、スパルフロキサシン（ＺＡＧＡＭ（登録商標））、テマフロキサシン（ＯＭＮＩＦＬＯＸ（登録商標））、スルホンアミド類（例えば、マフェニド（ＳＵＬＦＡＭＹＬＯＮ（登録商標））、スルホンアミドクリソイジン（ＰＲＯＮＴＯＳＩＬ（登録商標））、スルファセタミド（ＳＵＬＡＭＹＤ（登録商標）、ＢＬＥＰＨ−１０（登録商標））、スルファジアジン（ＭＩＣＲＯ−ＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、スルファジアジン銀（ＳＩＬＶＡＤＥＮＥ（登録商標））、スルファメチゾール（ＴＨＩＯＳＵＬＦＩＬ
ＦＯＲＴＥ（登録商標））、スルファメトキサゾール（ＧＡＮＴＡＮＯＬ（登録商標））、スルファニルイミド（ｓｕｌｆａｎｉｌｉｍｉｄｅ）、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標））、スルファフラゾール（ＧＡＮＴＲＩＳＩＮ（登録商標））、トリメトプリム（ＰＲＯＬＯＰＲＩＭ（登録商標））、ＴＲＩＭＰＥＸ（登録商標））、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）（ＢＡＣＴＲＩＭ（登録商標）、ＳＥＰＴＲＡ（登録商標））、テトラサイクリン系（例えば、デメクロサイクリン（ＤＥＣＬＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、ドキシサイクリン（ＶＩＢＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮ（登録商標））、オキシテトラサイクリン（ＴＥＲＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、テトラサイクリン（ＳＵＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＡＣＨＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標）Ｖ、ＳＴＥＣＬＩＮ（登録商標））、マイコバクテリアに対する薬物（例えば、クロファジミン（ＬＡＭＰＲＥＮＥ（登録商標））、ダプソン（ＡＶＬＯＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、カプレオマイシン（ＣＡＰＡＳＴＡＴ（登録商標））、サイクロセリン（ＳＥＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、エタンブトール（ＭＹＡＭＢＵＴＯＬ（登録商標））、エチオナミド（ＴＲＥＣＡＴＯＲ（登録商標））、イソニアジド（Ｉ．Ｎ．Ｈ．（登録商標））、ピラジナミド（ＡＬＤＩＮＡＭＩＤＥ（登録商標））、リファンピン（ＲＩＦＡＤＩＮ（登録商標）、ＲＩＭＡＣＴＡＮＥ（登録商標））、リファブチン（ＭＹＣＯＢＵＴＩＮ（登録商標））、リファペンチン（ＰＲＩＦＴＩＮ（登録商標））、ストレプトマイシン）、ならびにその他（例えば、アルスフェナミン（ＳＡＬＶＡＲＳＡＮ（登録商標））、クロラムフェニコール（ＣＨＬＯＲＯＭＹＣＥＴＩＮ（登録商標））、ホスホマイシン（ＭＯＮＵＲＯＬ（登録商標））、フシジン酸（ＦＵＣＩＤＩＮ（登録商標））、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ（登録商標））、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、ムピロシン（ＢＡＣＴＲＯＢＡＮ（登録商標））、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＳＹＮＥＲＣＩＤ（登録商標））、リファキシミン（ＸＩＦＡＸＡＮ（登録商標））、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ＴＩＧＡＣＹＬ（登録商標））、チニダゾール（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標）、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６７】
ウイルス感染に関連した状態
別の実施形態において、抗ウイルス剤、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドまたは小分子抗ウイルス剤と組み合わせて、一次構築物をコードするポリヌクレオチド、またはｍｍＲＮＡ抗ウイルス性ポリペプチド、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドを投与することによって、対象において、ウイルス感染および／もしくはウイルス感染に関連した疾患、障害、または状態、またはそれらの症状を治療するか、または予防する方法が提供される。
【０７６８】
ウイルス感染に関連した疾患、障害、または状態には、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、
流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染、感染性単核球症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次ＨＳＶ−１感染（例えば、小児における歯肉口内炎、成人における扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎）、潜在性ＨＳＶ−１感染（例えば、口唇ヘルペスおよび単純ヘルペス）、一次ＨＳＶ−２感染、潜在性ＨＳＶ−２感染、無菌性髄膜炎、感染性単核球症、巨細胞封入体症、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性体液性リンパ腫、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、ライ症候群、麻疹、感染後脳脊髄炎、流行性耳下腺炎、過形成性上皮性病変（例えば、尋常性、扁平、足底および肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症）、子宮頸癌、扁平上皮癌、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、細気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、ドイツ麻疹、先天性風疹、水痘およびヘルペス帯状疱疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６９】
ウイルス性病原体
ウイルス性病原体には、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザ、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、および黄熱病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性病原体は、耐性ウイルス感染を引き起こすウイルスも含む。
【０７７０】
抗ウイルス剤
例示の抗ウイルス剤には、アバカビル（ＺＩＡＧＥＮ（登録商標））、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン（ｔｒｉｚｉｖｉｒ（登録商標））、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）またはアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＣＹＣＬＯＶＩＲ（登録商標）、ＨＥＲＰＥＸ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（Ｐｒｅｖｅｏｎ（登録商標）、Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標））、アマンタジン（ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ（登録商標））、アンプレナビル（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標））、アンプリゲン（ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール、アタザナビル（ＲＥＹＡＴＡＺ（登録商標））、ボセプレビル、シドフォビル、ダルナビル（ＰＲＥＺＩＳＴＡ（登録商標））、デラビルジン（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標））、ジダノシン（ＶＩＤＥＸ（登録商標））、ドコサノール（ＡＢＲＥＶＡ（登録商標））、エドクスジン、エファビレンツ（ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）、ＳＴＯＣＲＩＮ（登録商標））、エムトリシタビン（ＥＭＴＲＩＶＡ（登録商標））、エムトリシタビン／テノホビル／エファビレンツ（ＡＴＲＩＰＬＡ（登録商標））、エンフビルチド（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標）、ＥＮＴＡＶＩＲ（登録商標））、ファムシクロビル（ＦＡＭＶＩＲ（登録商標））、ホミビルセン（ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（登録商標））、ホスアンプレナビル（ＬＥＸＩＶＡ（登録商標）、ＴＥＬＺＩＲ（登録商標））、ホスカルネット（ＦＯＳＣＡＶＩＲ（登録商標））、ホスホネット、ガンシクロビル（ＣＹＴＯＶＥＮＥ（登録商標）、ＣＹＭＥＶＥＮＥ（登録商標）、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標））、ＧＳ９１３７（ＥＬＶＩＴＥＧＲＡＶＩＲ（登録商標））、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標）、ＺＹＣＬＡＲＡ（登録商標）、ＢＥＳＥＬＮＡ（登録商標））、インジナビル（ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標））、イノシン、イノシンプラノベクス（ＩＭＵＮＯＶＩＲ（登録商標））、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、クタプレシン（ｋｕｔａｐｒｅｓｓｉｎ）（ＮＥＸＡＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン（ＺＥＦＦＩＸ（登録商標）、ＨＥＰＴＯＶＩＲ（登録商標）、ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン／ジドブジン（ＣＯＭＢＩＶＩＲ（登録商標））、ロピナビル、ロビライド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク（ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ（登録商標）、ＣＥＬ
ＳＥＮＴＲＩ（登録商標））、メチサゾン、ＭＫ−２０４８、モロキシジン、ネルフィナビル（ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標））、ネビラピン（ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標））、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ペグインターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））、ペンシクロビル（ＤＥＮＡＶＩＲ（登録商標））、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン（ＣＯＮＤＹＬＯＸ（登録商標））、ラルテグラビル（ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ（登録商標））、リバビリン（ＣＯＰＥＧＵｓ（登録商標）、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）、ＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（登録商標）、ＶＩＬＯＮＡ（登録商標）ＡＮＤＶＩＲＡＺＯＬＥ（登録商標））、リマンタジン（ＦＬＵＭＡＤＩＮＥ（登録商標））、リトナビル（ＮＯＲＶＩＲ（登録商標））、ピラミジン（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サクイナビル（ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）、ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標））、スタブジン、ティーツリーオイル（メラレウカ（ｍｅｌａｌｅｕｃａ）油）、テノホビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、テノホビル／エムトリシタビン（ＴＲＵＶＡＤＡ（登録商標））、チプラナビル（ＡＰＴＩＶＵＳ（登録商標））、トリフルリジン（ＶＩＲＯＰＴＩＣ（登録商標））、トロマンタジン（ＶＩＲＵ−ＭＥＲＺ（登録商標））、バラシクロビル（ＶＡＬＴＲＥＸ（登録商標））、バルガンシクロビル（ＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標））、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））、ならびにジドブジン（アジドミジン（ＡＺＴ）、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）、ＲＥＴＲＯＶＩＳ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７１】
真菌感染に関連した状態
真菌感染に関連した疾患、障害、または状態には、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、および足白癬が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、免疫不全を有する人は、アスペルギルス、カンジダ、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ）、ヒストプラズマ、およびニューモシスチス等の真菌属による疾患に特に罹患しやすい。他の真菌は眼、爪、髪、および特に皮膚を攻撃し得る、いわゆる皮膚糸状真菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｉｃ  ｆｕｎｇｉ）および好角質性真菌と呼ばれ、それは足部白癬等の環蠕虫が一般的である多様な状態を引き起こす。菌類胞子もまた、アレルギーの主要な原因であり、異なる分類群からの幅広い真菌が、一部の人々にアレルギー反応を誘起し得る。
【０７７２】
真菌性病原体
真菌性病原体には、子嚢菌門（例えば、フザリウムオキシスポルム、ニューモシスチス・ジロベシ、アスペルギルス属、コクシジオイデス・イミチス／ポサダシ、カンジダ・アルビカンス）、担子菌門（例えば、フィロバジエラ・ネオフォルマンス、トリコスポロン）、微胞子虫門（例えば、エンセファリトゾーン・クニクリ、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ）、およびケカビ亜門（例えば、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリーゼ、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７３】
抗真菌剤
例示の抗真菌剤には、ポリエン抗真菌薬（例えば、ナタマイシン、リモシジン（ｒｉｍｏｃｉｄｉｎ）、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシン（ｃａｎｄｉｃｉｎ）、ハマイシン）、イミダゾール抗真菌薬（例えば、ミコナゾール（ＭＩＣＡＴＩＮ（登録商標）、ＤＡＫＴＡＲＩＮ（登録商標））、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＯＲＡＬ（登録商標）、ＳＥＢＩＺＯＬＥ（登録商標））、クロトリマゾール（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）、ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）ＡＦ、ＣＡＮＥＳＴＥＮ（登録商標））、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール
（ＥＲＴＡＣＺＯ（登録商標））、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール抗真菌薬（例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール）、チアゾール抗真菌薬（例えば、アバファンギン（ａｂａｆｕｎｇｉｎ））、アリルアミン（例えば、テルビナフィン（ＬＡＭＩＳＩＬ（登録商標））、ナフチフィン（ＮＡＦＴＩＮ（登録商標））、ブテナフィン（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）ウルトラ）、エキノキャンディン（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、およびその他（例えば、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート（ＴＩＮＡＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＥＳＥＮＥＸ（登録商標）、ＡＦＴＡＴＥ（登録商標））、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、炭酸水素ナトリウム、アリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７４】
原虫感染に関連した状態
原虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症（カラアザール）、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎、およびバベシア症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７５】
原虫病原体
原虫性病原体には、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉｌａ）、腟トリコモナス、トリパノソーマ・ブルセイ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、大腸バランチジウム、トキソプラズマ・ゴンディ、プラスモジウム属、およびネズミバベシアが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７６】
抗原虫剤
例示の抗原虫剤には、エフロールニチン、フラゾリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標）、ＤＥＰＥＮＤＡＬ−Ｍ（登録商標））、メラルソプロール、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、オルニダゾール、パロモマイシン硫酸塩（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標））、ペンタミジン、ピリメタミン（ＤＡＲＡＰＲＩＭ（登録商標））、およびチニダゾール（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標）、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７７】
寄生虫感染に関連した状態
寄生虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症（ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、施毛虫症、および鞭虫症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７８】
寄生虫性病原体
寄生虫性病原体には、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウシバエ、大腸バランチジウム、南京虫、条虫、恙虫、コクリオミイヤ・ホミニボラキス（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、赤痢アメーバ、肝蛭ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、サナダムシ、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、バンクロフト糸状虫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７９】
抗寄生虫剤
例示の抗寄生虫剤には、抗線虫薬（ａｎｔｉｎｅｍａｔｏｄｅｓ）（例えば、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン）、抗条虫薬（ａｎｔｉｃｅｓｔｏｄｅｓ）（例えば、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール）、抗吸虫薬（ａｎｔｉｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）（例えば、プラジカンテル）、抗アメーバ薬（ａｎｔｉａｍｏｅｂｉｃｓ）（例えば、リファンピン、アンホテリシンＢ）、および抗原虫薬（例えば、メラルソプロール、エフロールニチン、メトロニダゾール、チニダゾール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８０】
プリオン感染に関連した状態
プリオン感染に関連した疾患、障害、または状態には、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、医原性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｉＣＪＤ）、異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｆＣＪＤ）、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｓＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、クールー病、スクラピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、慢性消耗病（ＣＷＤ）、ネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）、外来性有蹄類脳症（ＥＵＥ）、および海綿状脳症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８１】
抗プリオン剤
例示の抗プリオン剤には、フルピルチン、ペントサンポリ硫酸（ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｐｈａｔｅ）、キナクリン、およびテトラ環状化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８２】
免疫応答の調節
免疫応答の回避（ａｖｏｉｄａｎｃｅ）
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの有用な特長は、細胞の自然免疫応答を低減させるか、逃れるか、または回避する能力である。一態様において、細胞に送達されるとき、参照化合物、例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡ、または本発明の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはｍｍＲＮＡに対応する未修飾ポリヌクレオチドによって誘起される応答と比較して、低減された宿主からの免疫応答をもたらす、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが本明細書に提供される。本明細書で使用されるとき、「参照化合物」は、哺乳動物に投与されるとき、既知の程度、レベル、または量の免疫刺激を有する自然免疫応答をもたらす任意の分子または物質である。参照化合物は、核酸分子である必要はなく、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのいずれかである必要もない。よって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡによる免疫応答の誘起の回避（ａｖｏｉｄａｎｃｅ）、回避（ｅｖａｓｉｏｎ）、または失敗の測定は、そのような応答を誘起することが知られている任意の化合物または物質と比較することで示され得る。
【０７８３】
「自然免疫応答」という用語は、一般的にはウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を含む。本明細書で使用されるとき、自然免疫応答またはインターフェロン応答は、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全般的阻害、細胞ＲＮＡの全般的破壊、主要な組織適合性分子の上方制御、および／またはアポトーシス死の誘導、アポトーシス、抗成長、ならびに自然および適応免疫細胞活性化に関与する遺伝子の遺伝子転写の誘導を引き起こす単細胞レベルで機能する。Ｉ型ＩＦＮによって誘導されるいくつかの遺伝子には、ＰＫＲ、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）、ＯＡＳ（２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ）、ＲＮａｓ
ｅ  Ｌ、およびＭｘタンパク質が挙げられる。ＰＫＲおよびＡＤＡＲは、それぞれ、翻訳開始およびＲＮＡ編集の阻害をもたらす。ＯＡＳは、ｓｓＲＮＡを分解するためのエンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ  Ｌを活性化するｄｓＲＮＡ依存性シンテターゼである。
【０７８４】
いくつかの実施形態において、自然免疫応答は、Ｉ型またはＩＩ型インターフェロンの発現を含み、そのＩ型またはＩＩ型インターフェロンの発現は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触していない細胞からの参照と比較して２倍を超えては増加されない。
【０７８５】
いくつかの実施形態において、自然免疫応答は、１つ以上のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現を含み、その１つ以上のＩＦＮシグネチャー遺伝子は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触していない細胞からの参照と比較して３倍を超えては増加しない。
【０７８６】
いくつかの状況では、細胞内の自然免疫応答を排除することは利益であり得るが、本発明は、投与すると、そのような応答を完全には排除することなく、実質的に低減された（著しく低い）インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答をもたらすポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡを提供する。
【０７８７】
いくつかの実施形態において、免疫応答は、参照化合物に誘導される免疫応答と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超低い。免疫応答自体は、１型インターフェロンの発現または活性のレベル、またはトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）等のインターフェロン制御遺伝子の発現を決定することにより測定され得る。自然免疫応答の低減は、細胞集団への１つ以上の投与に従って減少された細胞死のレベルを測定することによっても測定され得る。例えば、細胞死は、参照化合物で観察された細胞死頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。さらに、細胞死は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触した細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、または０．０１％未満に影響し得る。
【０７８８】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、同じ配列を有する未修飾インビトロ合成ＲＮＡ分子ポリヌクレオチドもしくは一次構築物、または参照化合物よりも著しく低い免疫原性である。本明細書で使用されるとき、「著しく低い免疫原性」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態では、本用語は、免疫原性における倍数減少を指す。別の実施形態において、本用語は、有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが検出可能な免疫応答を誘起することなく投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、本用語は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが、組換えタンパク質の発現を検出可能に低減させるのに十分な免疫応答を誘発することなく繰り返し投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、この減少は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するのに十分な免疫応答を誘発することなく繰り返し投与され得るような減少である。
【０７８９】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、その未修飾対応物または参照化合物よりも２倍低い免疫原性である。別の実施形態において、免疫原性は、３倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、５倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、７倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、１０倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、１５倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、ある倍数だけ低減する。別の実施形態において、免疫原性は、５０倍低減
する。別の実施形態において、免疫原性は、１００倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、２００倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、５００倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、１０００倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、２０００倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、別の倍数だけ低減する。
【０７９０】
免疫原性を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８）の分泌を測定すること、ＤＣ活性化マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の発現を測定すること、または適応免疫応答のアジュバントとして作用する能力を測定すること、が挙げられる。
【０７９１】
本明細書で教示される修飾の組み合わせを含む本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、それらを治療法としてより好適にする優れた特性を有し得る。
【０７９２】
当技術分野における「全か無か」のモデルは、修飾ｍＲＮＡの治療有用性に関連した生物学的現象を説明するのにひどく不十分であることが確定されている。本発明者らは、タンパク質産生を改善するためには、特定の修飾ｍＲＮＡの効果およびリスクプロファイルを判定するように、修飾もしくは修飾の組み合わせの性質、修飾の割合（％）を考慮し、１つを超えるサイトカインもしくは測定基準を検査し得ることを確認した。
【０７９３】
本発明の一態様において、未修飾と比較して修飾ｍＲＮＡの有効性を決定する方法は、その発現が本発明の外因性核酸の投与によって誘起される１つ以上のサイトカインの測定および分析を含む。これらの値は、未修飾核酸の投与と、またはサイトカイン応答、ポリＩＣ、Ｒ−８４８等の標準的な測定基準もしくは当技術分野で既知の他の標準と比較される。
【０７９４】
本明細書で開発される標準的な測定基準の１つの例は、細胞、組織、または生物内で産生されるコードされたポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量の、修飾核酸の投与または修飾核酸との接触の結果として、その発現が細胞、組織、または生物内で誘起されるサイトカインの１つ以上のレベルまたは量（またはパネル）に対する比率の測定である。そのような比率は、本明細書において、タンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と称される。ＰＣ比が高いほど、修飾核酸（測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の効果がより高い。本発明のサイトカインによる好ましいＰＣ比は、１を超える、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１０，０００を超える、またはそれ以上であり得る。異なるまたは未修飾の構築物の修飾核酸よりも高いＰＣ比を有する修飾核酸が、好ましい。
【０７９５】
ＰＣ比は、ポリヌクレオチドに存在する修飾の割合（％）によってさらに評価され得る。例えば、１００％修飾された核酸に対して正規化され、サイトカイン（もしくはリスク）の機能またはサイトカインプロファイルとしてのタンパク質産生が、判定され得る。
【０７９６】
一実施形態において、本発明は、修飾核酸（ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ）のＰＣ比を比較することで、化学、サイトカイン、または修飾の割合（％）にわたって、任意の特定の修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの相対的効果を決定するための方法を提供する。
【０７９７】
増加したタンパク質産生および減少した免疫刺激可能性を維持する、様々なレベルの核酸塩基置換を含有するｍｍＲＮＡが産生され得る。任意の修飾ヌクレオチドのその天然に生じるヌクレオチド対応物に対する相対的割合（％）は、ＩＶＴ反応中に変化し得る（例
えば、１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％の５メチルシチジン使用対シチジン；１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％のシュードウリジンまたはＮ１−メチル−シュードウリジン使用対ウリジン）。また、２つ以上の異なるヌクレオチドを同じ塩基に対して使用することによる異なる比率（例えば、シュードウリジンおよびＮ１−メチル−シュードウリジンの異なる比率）を利用するｍｍＲＮＡを作製することもできる。ｍｍＲＮＡは、同時に、５メチルシチジン／シチジンおよびシュードウリジン／Ｎ１−メチル−シュードウリジン／ウリジンの比率等の１つを超える「塩基」位置における混合した比率で作製されることもできる。修飾ヌクレオチドの変化した比率で修飾ｍＲＮＡを使用することは、化学的修飾ヌクレオチドへの可能な曝露の低減において、有益であり得る。最後に、タンパク質産生もしくは免疫刺激可能性のいずれか、またはその両方を調節するｍｍＲＮＡへの修飾ヌクレオチドの位置的な導入もまた可能である。これらの改善された特性を実証するそのようなｍｍＲＮＡの能力を、（本明細書に記載のＰＢＭＣアッセイ等のアッセイを用いて）インビトロで評価することができ、また、ｍｍＲＮＡでコードされたタンパク質の産生およびサイトカイン等の自然免疫認識のメディエーターの両方の測定を通してインビボで評価することもできる。
【０７９８】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、その未修飾対応物との相対的免疫原性は、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物の所与の量と同じ程度の上記応答のうちの１つを誘発するのに必要とされるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの量を決定することによって、決定することができる。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡよりも２倍多いポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡが同じ応答を誘発するために必要とされる場合、そのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物よりも２倍低い免疫原性である。
【０７９９】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと、その未修飾対応物との相対的免疫原性は、同じ量の未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物に対するポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの投与に応じて分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、またはＩＬ−８）の量を決定することによって、決定される。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの２分の１のサイトカインが分泌される場合、そのポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、未修飾ヌクレオチドよりも２倍低い免疫原性である。別の実施形態において、刺激のバックグラウンドレベルは、上記の方法において免疫原性を算出する前に減算する。
【０８００】
細胞内、または細胞の集団における免疫応答の滴定、低減、または排除を実施するための方法がまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は異なる用量の同じポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触させられ、用量応答が評価される。いくつかの実施形態において、細胞は、同じまたは異なる用量でいくつかの異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡと接触させられ、所望の効果をもたらすための最適な組成物を決定する。免疫応答に関して、所望の効果は、細胞の免疫応答を回避すること、逃れること、または低減させることであり得る。所望の効果は、タンパク質産生の効率を変化させることでもあり得る。
【０８０１】
本発明のポリヌクレオチド、一時構築物および／またはｍｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３００３４７５号に記載の方法を用いて免疫応答を低減するために使用されてもよい。
【０８０２】
免疫応答の活性化：ワクチン
さらに、ある特定の修飾ヌクレオシド、またはその組み合わせは、本発明のポリヌクレ
オチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに導入されると、自然免疫応答を活性化する。そのような活性化分子は、ポリペプチドおよび／または他のワクチンと組み合わせられる場合、アジュバントとして有用である。ある特定の実施形態において、活性化分子は、ワクチンとして有用であるポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含有し、このようにして、自己アジュバントとなる能力を提供する。
【０８０３】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、免疫原をコードし得る。免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡの送達は、免疫応答を活性化し得る。非限定的な例として、免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、複数の自然応答経路を誘起するように細胞へ送達され得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７７号を参照のこと）。別の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡは、脊椎動物に対する免疫原性となるのに十分に大きい投与量で脊椎動物に送達され得る（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７２号および同第ＷＯ２０１２００６３６９号を参照のこと）。
【０８０４】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、ワクチンのためのポリペプチド配列をコードし得、それは阻害剤をさらに含んでもよい。阻害剤は、抗原提示を損なうか、および／または当技術分野で既知の様々な経路を阻害し得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、抗原提示を損なうことができる阻害剤と組み合わせてワクチンに使用されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０８９２２５号および同第ＷＯ２０１２０８９３３８号を参照のこと）。
【０８０５】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであり得る。自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ送達の効率および封入された遺伝子産物の発現を向上させることができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の少なくとも１つの修飾を含み得る。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡが感染性ウイルス粒子の産生を誘導しないように設計され得る。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１１０３００２０５号および国際公開第ＷＯ２０１１００５７９９号に記載の方法によって設計されてもよい。
【０８０６】
一実施形態において、本発明の自己複製ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、免疫応答を生じさせ得るタンパク質をコードし得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの抗原をコードし得る自己複製ｍＲＮＡであり得る（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１１０３００２０５号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１１００５７９９号、同第ＷＯ２０１３００６８３８号、および同第ＷＯ２０１３００６８４２号を参照のこと）。
【０８０７】
一実施形態において、本発明の自己複製ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知の方法を用いて製剤化することができる。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、Ｇｅａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ  ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４）に記載の方法によって送達用に製剤化されてもよい。
【０８０８】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドをコードし得る。
【０８０９】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの製剤は、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドをさらに含んでもよい。非限定的な例として、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドを含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１１０２５０２３７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１０００９２７７号および同第ＷＯ２０１０００９０６５号に記載されるように製剤化されてもよい。
【０８１０】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、免疫刺激性であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、陽性センスまたは陰性センス鎖ＲＮＡウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードし得る（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０９２５６９号および米国公開第ＵＳ２０１２０１７７７０１号を参照のこと）。別の非限定的な例において、本発明の免疫刺激性ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の投与用賦形剤を用いて製剤化されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０６８２９５号および米国公開第ＵＳ２０１２０２１３８１２号を参照のこと）。
【０８１１】
一実施形態において、本明細書に記載の方法によって製剤化されたワクチンの応答は、治療的効果を誘導するための様々な化合物の添加によって向上され得る。非限定的な例として、ワクチン製剤は、ＭＨＣＩＩ結合ペプチドまたはＭＨＣＩＩ結合ペプチドと類似の配列を有するペプチドを含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０２７３６５号、同第ＷＯ２０１１０３１２９８号、および米国公開第ＵＳ２０１２００７０４９３号、同第ＵＳ２０１１０１１０９６５号を参照のこと）。別の例として、ワクチン製剤は、対象においてニコチン残基に対する抗体応答を生成し得る修飾ニコチン化合物を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０６１７１７号および米国公開第ＵＳ２０１２０１１４６７７号を参照のこと）。
【０８１２】
天然に生じる変異体
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを用いて、増加した生物学的活性、改善された患者予後、または保護機能等を含む、改善された疾患修飾活性を有する天然に生じるタンパク質の変異形を発現することができる。多くのそのような修飾遺伝子が、哺乳動物において記載されている（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｄｅａｕ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００３  １３：２９０−２９５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｙｕ，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２０１２；８：ｅ１００２６４４；Ｃｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９４  ７：１８０−１８４）。ヒトにおける例には、アポＥ２タンパク質、アポＡ−Ｉ変異形タンパク質（アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ、アポＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓ）、機能亢進性第ＩＸ因子タンパク質（第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ  Ａｒｇ３３８Ｌｙｓ）、トランスサイレチン変異体（ＴＴＲ
Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）が挙げられる。アポＥ２（ｃｙｓ１１２、ｃｙｓ１５８）の発現は、アルツハイマー病および心血管疾患等の可能性のある他の状態に対する易罹患性を低減することによって、他のアポＥアイソフォーム（アポＥ３（ｃｙｓ１１２、ａｒｇ１５８）およびアポＥ４（ａｒｇ１１２、ａｒｇ１５８））と比較して保護を与えることが示されている（すべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｒｄｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９４  ７：１８０−１８４、Ｓｅｒｉｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．２０１１  １４：４９１−５００、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３  ９：１０６−１１８）。アポＡ−Ｉ変異形の発現は、低減されたコレステロールを伴った（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅＧｏｍａ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２０１１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ８：２６６−２７１、Ｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  ＪＡＭＡ  ２９０：２２９２−２３００）。ある特定の集団におけるアポＡ−Ｉのアミノ酸配列は、アポＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏにおいて（Ａｒｇ１７３がＣｙｓに変更された）、およびアポＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓにおいて（Ａｒｇ１５１がＣｙｓに変更された）、システインに変更された。位置Ｒ３３８Ｌ（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ）における第ＩＸ因子突然変異は、約１０倍に増加された活性を有する第ＩＸ因子タンパク質をもたらす（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｉｍｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００９  ３６１：１６７１−１６７５、Ｆｉｎｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２  １２０：４５２１−４５２３、Ｃａｎｔｏｒｅ
ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２  １２０：４５１７−２０）。位置１０４または１１９（Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）におけるトランスサイレチンの突然変異は、疾患をもたらすＶａｌ３０Ｍｅｔ突然変異も有する患者に保護を提供することも示されている（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｒａｉｖａ，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００１  １７：４９３−５０３、ＤＡＴＡ  ＢＡＳＥ  ＯＮ  ＴＲＡＮＳＴＨＹＲＥＴＩＮ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｍｃ．ｕｐ．ｐｔ／ｍｊｓａｒａｉｖａ／ｔｔｒｍｕｔ．ｈｔｍｌ）。それぞれ、Ｍｅｔ１１９およびＨｉｓ１０４突然変異体を有するポルトガル人および日本人のＭｅｔ３０患者における臨床所見および症状の重症度の差異が、分子にさらなる安定性を与える非病原性変異体によって発現される明らかな保護作用を伴い観察される（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ
Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ）６：Ｓ２０、Ｔｅｒａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６４：３６５−３７０）。これらの保護ＴＴＲ対立遺伝子をコードする修飾ｍＲＮＡは、ＴＴＲアミロイド症患者において発現され得、それにより病原性変異体ＴＴＲタンパク質の効果を低減させる。
【０８１３】
主溝相互作用パートナー
本明細書に記載されるように、「主溝相互作用パートナー」という表現は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば結合を通して、ＲＮＡリガンドを検出し、それに応答するＲＮＡ認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ等の修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むＲＮＡリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、ゆえに、自然免疫応答を減少させる。
【０８１４】
例示の主溝相互作用、例えば結合パートナーには、以下のヌクレアーゼおよびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。膜内において、ＴＬＲ（トール様受容体（（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））３、７、および８は、一本鎖および二重鎖ＲＮＡに応答することができる。細胞質内において、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼのスーパーファミリー２クラスのメンバーは、抗ウイルス応答を開始するＲＮＡを感知することができる。これらのヘリカーゼには、ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ）Ｉ）およびＭＤＡ５（メラノーマ分化関連遺伝子（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）５）を含む。他の例には、遺伝学と生理学の研究所（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）２（ＬＧＰ２）、ＨＩＮ−２００ドメイン含有するタンパク質、またはヘリカーゼドメイン含有タン
パク質が挙げられる。
【０８１５】
病原性生物または疾患細胞の標的化
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを用いて、細菌、酵母、原虫、蠕虫等の病原性微生物または癌細胞等の疾患細胞を標的化するための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるｍＲＮＡは、治療の見込まれるオフターゲット諥鲞苣躽룦閁臣讂臣膂臣膀꣦蒚韧龎胦龔觧ꮁ臣蒁臣銎믤蒚臣龁臣ꪄ藥蒚臣뮿꣨閁苣龁뿤뺣菣꾂菣ꪂ苣覃臣龁臣隻臣뢠藩超裥꺿ꏩ銂郥肂胣鶁臣袂臣ꪁ雦閳臣膀ꇨ늶胣뺲뛦膀跥邭胣ꪁ苣뎁臣骃胣蒵맧膀臣袂臣ꢙ껥銂郥肂꟧趤鷦首苣ꮐ苣뮻蓦꺁铧鎽鷦首臣讦苣貂苣薗軥Ꞁ铧ꦉ苣꒙軥馁苣讁胣뺁臣꾁雧ꎂ듧麃苣뮭믦閁臣讂臣ꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖邃苣ꪂ菣궃苣랂菣낂戼㹲 겜飦내鯦ꮁ迦鮾臣貂苣릖돦꾁胣내菨릟ꓩ鞃菣뮂苣ꮁ臣醁苣뾂菣醃苣ꪳ铧ꦉ迥螎苣醐룤閁臣讂臣ꮁ鳦ꢔ臣芁苣鞾苣芀ꓨ낕臣뾮룤내菨銂郥覜臣讂듧麃鿥誤臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣鶃菣貃苣것苣膃菣膀룤ꆬ꟦覯觧膀臣龁臣趽뷯늼볯ꆼ臣躰藥꾁胣뺯뿥馁苣ꪜ뿤뺣ꃦ뢅臣钯臣ꚁꋥꂊ臣龁苣뎃菣꾂돨ꎔ铧릊軧銂苣龁苣馁胣鶁臣袂臣ꪁꋥꂊ臣龁苣뎃菣꾂돨ꎔ铧릊軧꾁胣设臣낁胣鞢諥鞁臣내菨袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣肸곦讧꿧ꦉ胣뺁臣꾁뷯趽볯꺼볯讁苣꺁ꋥꂊ臣龁苣뎃菣꾂돨뮿꣨膀룦醰臣龁ꃦ뢅裥ꎧ胣誁苣뎁볯뺁臣꾁뷤鮸臣貂臣뾮룤내菨꺁蟨뚄藥ꮖ뿥钭苣몤臣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣龮꣨馁苣鎁臣貁臣趁苣芀苣뎃菣꾂돨ꎔ铧꾁藩ꂴ뗧袐藥ꮖ郥肝苣莃苣ꒂ볯ꖼ볯ꦼ볯ꆼ볯ꮁ苣ꎁ臣겸껥馁苣鎁臣貁臣趁胣뾂菣醃苣ꪳ듦Ꞁ臣鎽諦鎡裥躇臣ꊗ鿧꺁꟦薀臣龩菨蒚苣莃苣ꒂ臣袂臣ꚁ룦骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ铧龔臣膀胩骶髧뺁臣꾁뗦ꂊ볯芽뷯钽뷯袽裢蚽뷯蒽볯몓매麡菣궃苣릂臣誁臣ꚁ铧邈臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀뷦ꢜ髧뺯뇨꺁듧麃ꃦ뺁臣꾁듧麃ꃦ꺁迥蚛觧ꮁ臣蒁臣膀觧骮臣鶃菣骃菣膃菣膀觧ꮁ韦ꖟ臣뮴胦銂鳦馁苣芏藧뾂菣醃苣ꪳ臣뾂菣醃苣ꪳꓥ낕뷥覭臣꺛髧ꢁ臣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣몙迧銂鳦ꦁ賥馁苣鎁臣꾁鳦ꢔ臣芁苣芀룤龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀ꓨ낕臣馨髧내菨讞苣邏뻤馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀臣袂臣겋ꯧ鞁臣膀臣꺁ꓨ낕臣馨髧내菨讞臣鶁苣麁苣ꢁ鯧蒚臣馁苣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣膀룤ꆬ꟦覯觧膀臣龁臣趽뷯늼볯ꆼ臣銂軦ꚧ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀꣦蒚듧麃臣誁臣ꚁ鯧蒚臣馁苣鶃菣骃菣膃菣꺁駧뺏苣肜臩隌臣讂雦閳臣邏뻤閁苣讂胣내菨꾁胣貐駦ꮁ臣龁臣蚠곦ꮁ胣銼臣ꖻ룤꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣肸곦讧꿧ꦉ胣뺁臣꾁뷯趽볯꺼볯ꞁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁雦閳臣螤闦ꦃ苣뎃菣銂铧蒁臣膀鯧蒚臣馁苣醼臣ꖻ룤꺁ꃦ뢅臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ臣鞢諥鞁臣몙迧銂鳦馁苣내菨銂뻥讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣设臣낁胣내菨꾁胣꺛髧ꢁ臣讂ꃦ뢅臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂볯ꒁ믤誸臣鶃菣貃苣것苣膃菣膀룤ꆬ꟦覯觧膀臣龁臣趽뷯늼볯ꆼ臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣閁苣ꚁ苣袂臣芀듧麃臣膀蛥뎁跥ꊛ臣貂苣趉臣꺛髧ꢁ臣讂ꃦ뢅臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂볯ꒁ믤誸臣隻臣뢠藩ꮁ苣讂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣閁苣ꪁ苣ꦃ苣뎃菣ꮁ뻤閁苣讂觥ꮁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣릖돦ꮁ뻥ꎁ臣颍鯩閁苣ꚁ苣袂臣芀臣꺁雦閳臣膀苣뎃菣꾂돨꺁ꓨ袐뷤膀郥颁臣龁臣ꊖ胩馁苣龔뷤貵럨궸臣뢠藩뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨膀뫤蒁臣誸뗦뺁臣꾁룤膵臣鲽铧馁苣뢠藩뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨膀뫤蒁臣뾪꿧膀듦Ꞁ賥膀臣龁臣醊裥龩菨銂鳦馁苣뢠藩뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨膀ꧦ붃臣龁臣뮴胦ꮁ雩鞁臣銺臣ꮁ뻤颭臣讂ꃦ뢅臣龁臣뾂菣醃苣ꪳ胣芁苣蒁臣뢛郥Ꞁ苣놅鳦馁苣뢠藩뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨꺁ꋥꂊ臣龁駧뺏苣覜臣讂듧麃苣龔裦馁苣꺁臣覜铧ꞁ臣誂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀鿥誤鷦뚻苣覤賥閁臣膀苣뎃菣꾂돨ꎔ铧릊軧銂ꋥꂊ臣鮁苣鎁臣貁臣趁苣芀뛧蒁臣膀ꓨ낕臣馨髧내菨讞臣誁臣讂鯧蒚臣馁苣鶃菣骃菣膃菣꺁귥ꢜ臣袂臣込臣龁臣것菣ꮃ苣鲤蟥誁苣뎁볯뺁臣꾁껥辇臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣몙迧ꮁ雩馁苣릊軧蒚臣馨髧내菨誁苣뎁듧麃鿥誤鷦뚻臣뢁諦ꮁ苣誂胣鶁臣肜臩隌苣꾏菨ꮁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ雦閳臣膀臣낁臣낁諥螎髧ꪁ苣뎃菣㲑牢ਾ苣ꪳ铧龔苣螤鯩隌臣讂諧膳臣芁苣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣醼臣ꖻ룤꺁뿧뎨뻥꺿ꏩ銂郥覜臣讂臣膀臣龁臣龮돨蒚臣覸곦讧胩銂鳦馁苣뒠郥ꮁ胣릉臣覜铧ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꺁雦閳臣ꢔ臣覂苣讂듧麃臣膀鿥誤臣貂뻥讂胣내菨꾁胣뢇뿦늶룤ꞁ胣뺁臣꾁軦肝鿥誤觧ꢁ臣ꚁ鿥誤臣貂뻥讂胣내菨꾁胣邃苣ꪂ菣ꊂ苣뾂菣膀듧麃菣莃苣膀苣Ꞃ菣隃菣莃苣膀鿥誤菣것菣袃胣閃菣릂苣膀臣袂臣鎽ꗦ薀臣ꢑ鿧꺁믤꺁껥ꢙ苣ꮐ苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣膀꟦薀臣릮駥薆臣릟ꓩ閁苣鞾苣芀듧麃臣膀볯궼볯궼볯ꦼ뷯隽뷯钽뷯辽뷯薽뷯膀苣뾂菣낂闧랏볯銼볯钼볯銈볯鎼볯뺁臣꾁韦ꖟ뗧邈鿥난藩袐觧銂郥肂胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣뮻蓦꺁믤꺁ꗥꦁ臣릟鳥薆臣릟ꓩ閁苣鞾苣芀臣龁胣ꦸ뫥蒂ꓥ鞰뗧邈귧꺁듧麃鿥誤臣붥臩ꪁ釥늛鷦뚻臣膀뷥궥胨ꮁ苣辁鿧覂苣ꚁ臣讂胣겜駧躘臣릖돦꾁胣뾂菣醃苣ꪳ铧龔臣뾽铧馁苣꺁臣붥臩ꪁ믤辄臣내菨ꞁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꾁胣设臣낁胣ꒂ菣鎃菣궃胣ꢂ苣릂菣鲃胣ꒂ菣떂苣蒃胣뺁臣꾁苣뎃菣鲃臣꺿ꏩ뢠藩꺁꣦蒚듧麃鯩ꎛ臣꺁迥ꦾ냥ꖅ볯设臣낁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣覼苣邏뻤馁苣芀뻤袁臣膀郥颁듧麃鯩ꎛ臣꺁軦ꚧ臣膀볯麛믤誸볯銼胣鎼胣钼胣閼胣뺁臣꾁볯麛苣薶臣讂귧覼迥ꦾ臣貂뻥讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣내菨蚛鯥銂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣肸곦讧꿧ꦉ胣뺁臣꾁뷯趽볯꺼볯ꢁ軦ꚧ臣讂苣蚃菣鞃臣膀듧麃鯩ꎛ臣誁臣讂苣뎃菣꾂돨뮿꣨꺁韦骮臣릊軧銂臩邈臣讂臣ꮁ跥蚈臣芁苣袂臣ꮁ闦麛迥ꦾ臣貂苣芀꣦蒚듧麃鯩ꎛ臣뮠맧ꮁ뷤鮸臣貂臣내菨랂껥Ꞁ苣뢠藩꺿ꏩꮁ苣ꎁ臣邏뻤鞁臣ꢁ믤骮臣讂臣膀鳦躘듧뢛臣邏뻤閁苣讂苣蚁臣膀迥ꦾ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣骤꟦ꪁ룤ꎀ臣내菨讞臣誁臣ꚁ胣誁苣뎁ꓥ颧臣蒵맧薆臣钁裦꾏菨ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꺁菣ꒂ苣鞃菣뮂苣뎃苣릖돦銂铧蒁臣膀諦鎽臣龁臣鶁臣龩菨蒚雦螉苣ꎔ铧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꧦ붃髧궖觧꾁胣ꚼ뷯芽胣ꚼ뷯芽胢膀볯袼뷯芽胢覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢胣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣膀뷯莽볯隽胣뺁臣꾁뫤릉闧Ꞁ諦鎽苣ꮐ臣鞾苣芀臣貂苣꾁胣뢛ꏨꞀ뇦骮ꃩ龟볯ꎼ볯늼볯銂郥肂믤辄臣颠鿥ꮁ臣蒁臣꾏ꓥꞁ臣誂뻥讂胣肸껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꎼ볯늼볯颠鿥ꮁ臣貮藥ꪁꓥ颧胦貁臣讂胣ꖈ臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀諦鎽臣膀볯꒼볯鎼ꃩ龟蛥銂駩蒁臣龮돨蒚臣鶿귥閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†뗨邺臣銃菣薗軥Ꞁ臣芁苣讁鷩銃菣ꞁ臣讂臣ꮁ臣讁苣覂臣膀믤辄臣龔뷤蚈귥ꮁ뗧袐臣讂臣膀臣龁臣鶁苣ꮁ볤袐臣讂諦鎽臣鲽ꏨ閁苣鞾苣芀韧龎뷤꾁胣麝菣袃鏥뎹该ꦉ胣ꢇ뫥馨鳦膀臣龁臣隌닧膓臣龁臣뮌雨膓鷦首귧꺁룥ꦲꏨ膓臣颭鳥鞁뻥讂胣鶁苣覂臣膀蟨誺꣦겜臣龁臣뮻蓦꺁铧ꦉ臣覂臣蒵맧ꚩ雦銂郥肂믤辄臣馨鳦뺁臣꾁ꧨ首臣节뗧袐臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꖎ꟨릂菣莃菣꾁胣隼駦鎖駦鎖胣醼볯芙雩膀볯钼駦鎖胣鎼볯芙雩膀볯颼駦鎖胣鞼볯芙雩膀볯钼駦鎖胣馼볯芙雩膀臣袂臣醼볯颼駦鎖臣覂臣讂뻧讁苣뢁諦閁苣讂ꃩꚺ臣膀臣覂臣ꮁ볯邼뷯궼鳦肺胣閼볯躽볯ꪜ뫦膀볯邼뷯궼鳦肺胣뺁臣꾁볯邼볯躽볯ꪜ뫦꺁뿦ꚺ臣膀ꓨ낕鯥趏뻥閁苣讂胣蒵裦ꦉ臣膀볯趽볯ꪜ뫦膀볯趽볯ꪜ뫦膀볯邼뷯궼鳦肺胣醼볯邼뷯궼鳦肺胣뺁臣꾁볯邼볯趽볯ꪜ뫦ꞁ苣閊룤閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣鶃菣貃苣것苣膃菣膀룤ꆬ꟦覯觧膀臣龁臣趽뷯늼볯ꆼ臣膀듧麃뷥龁苣閼볯蚈귥膀볯邼볯蚈귥込듧麃胣銼볯邼裥邭볯내菨膀볯邼볯蚈귥込듧麃胣钼볯邼裥邭볯내菨膀볯邼볯蚈귥込듧麃胣隼볯邼裥邭볯내菨膀볯邼볯蚈귥込듧麃胣颼볯邼裥邭볯내菨膀볯邼볯蚈귥込듧麃胣醼볯邼볯蚈귥込듧麃胣銼볯邼볯蚈귥込듧麃胣뺁臣꾁볯邼볯邼裥邭볯내菨꺁蟩ꞁ럦ꂊ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 隻臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃胣肸곦讧꿧ꦉ胣뺁臣꾁뷯趽볯꺼볯꾁胣邼볯邼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯躼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯躼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯躼볯閼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣醼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣銼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣閼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣醼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯邼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣鎼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯邼뷯趽뷯貽볯醼볯隼듧麃胣閼볯蚽뷯辽뷯込볯邼볯내菨膀볯邼뷯趽戼㹲辽뷯込볯邼볯내菨膀볯邼볯蚽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