(57)【要約】【課題】  均一サイズの液滴を早い速度で生成できるインクジェットを用いたIVC用液滴生成装置及び液滴生成方法を提供する。【解決手段】  本発明のIn-vitro compartmentalization 用の液滴生成装置は、液体1の駆動機構を有する微小なノズルと、液体1と混ざりあわない液体2を保持することのできる容器からなり、ノズルより噴出した液体1の液滴を液体2で回収する機構を有することを特徴とする。インクジェットのノズルを用いることにより、均一なサイズの液滴を大量に生成し、生成した液滴を油中に回収する。また油中には必要に応じて界面活性剤等を入れ、必要に応じて油を移動させることにより、生成した液滴の再結合を防ぐ。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体1の駆動機構を有する微小なノズルと、液体1と混ざりあわない液体2を保持することのできる容器からなり、ノズルより噴出した液体1の液滴を液体2で回収する機構を有することを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用の液滴生成装置。
【請求項２】
請求項１の液滴生成装置であって、ノズル内あるいはノズルの上流で液体1に接触する電極と、ノズル下流に存在する導電物質の間に生じる電界によって液体1の駆動機構が駆動されることを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成装置。
【請求項３】
請求項1の液滴生成装置であって、微小なノズルと液体2の間に空気が存在する状態で液体1の駆動機構を断続的に駆動することを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成装置。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項に記載する液滴生成装置であって、液滴同士が接触して再結合することを抑制するために、液体2とノズルの相対的位置関係を変化させる機構をもつことを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成装置。
【請求項５】
微小なノズルから強制的な駆動力によって断続的あるいは連続的に液体１を噴出させ、ノズルより噴出した液体1の液滴を、液体1と混ざりあわない液体2で回収することを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成方法。
【請求項６】
請求項5記載の液滴生成方法において、液体1もしくは液体2の中に界面を安定化させる薬品を混入し、液滴の再結合を抑制することを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成方法。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載する液滴生成装置であって、液体１の中にゲル化するポリマーを含むことを特徴とするIn-vitro compartmentalization 用液滴生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野において、in-vitro compartmentalization（IVC）用の液滴生成装置及び液滴生成方法に関する。更に詳しくは、液体１の駆動機構を有する微小なノズルと、液体1と混ざりあわない液体２を保持することのできる容器からなり、ノズルより噴出した液体1の液滴を液体2で回収する機構を有するIVC用液滴生成装置及び液滴生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA断片の個別のPCR増幅など、多数のサンプルに同じ処理を施す場合、油中に分散した直径数ミクロン〜数百ミクロンの水溶液滴に、個々のサンプルを封入する方法（In vitro compartmentalization: IVC）が良く用いられている。IVCの生成法としては、エマルジョンを用いる方法(非特許文献1)や、微小流体デバイス中で油と水溶液を接触させる方法（非特許文献2）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】A. Musyanovych, V. Mailander, and K. Landfester, “Miniemulsion droplets as single molecule nanoreactors for polymerase chain reaction”. Biomacromolecules 2005, 6, 1824-1828.
【非特許文献２】P. Kumaresan, C.J. Yang, S.A. Cronier, R.G. Blazej, and R.A. Mathies, “High-throughput single copy DNA amplification and cell analysis in engineered nanoliter droplets”. Anal. Chem. 2008, 80, 3522-3529.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献1のエマルジョンを用いる方法では、液滴のサイズが数ミクロンから数百ミクロンと大きくばらつき、均一なサイズの液滴が得られないため、行わせたい処理にばらつきができると言う欠点があった。また非特許文献2の微小流体デバイス中で油と水溶液を接触させる方法では、均一なサイズの液滴ができるが、1秒間に百個程度の液滴しか生成できず、液滴の生成速度が遅い。仮にこれを100本並列化し、3時間をかけても、せいぜい108個程度の液滴しか生成できないという欠点があった。
分子進化工学のライブラリの生成等に用いるには、均一なサイズの、1011〜1012個程度の液滴の数が必要で、これまでの方法では生成できなかった。
本発明は、上述の問題を考慮し、均一サイズの液滴を早い速度で生成できるインクジェットを用いたIVC用液滴生成装置及び液滴生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のIn-vitro compartmentalization 用の液滴生成装置は、液体1の駆動機構を有する微小なノズルと、液体1と混ざりあわない液体2を保持することのできる容器からなり、ノズルより噴出した液体1の液滴を液体2で回収する機構を有することを特徴とする。
また、ノズル内あるいはノズルの上流で液体1に接触する電極と、ノズル下流に存在する導電物質の間に生じる電界によって液体1の駆動機構が駆動されることを特徴とする。
また、微小なノズルと液体2の間に空気が存在する状態で液体1の駆動機構を断続的に駆動することを特徴とする。
また、液滴同士が接触して再結合することを抑制するために、液体2とノズルの相対的位置関係を変化させる機構をもつことを特徴とする。
また、液体１の中にゲル化するポリマーを含むことを特徴とする。
本発明のIn-vitro compartmentalization 用液滴生成方法は、微小なノズルから強制的な駆動力によって断続的あるいは連続的に液体１を噴出させ、ノズルより噴出した液体1の液滴を、液体1と混ざりあわない液体2で回収することを特徴とする。
また、液体1もしくは液体2の中に界面を安定化させる薬品を混入し、液滴の再結合を抑制することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明では、インクジェットのノズルを用いることにより、均一なサイズの液滴を大量に生成し、生成した液滴を油中に回収する。
また油中には必要に応じて界面活性剤等を入れ、必要に応じて油を移動させることにより、生成した液滴の再結合を防ぐ。
また、水溶液の液滴が油中に分散したIVC用の液滴を高速・大量に生成し回収することにより、1本のノズルあたり1秒間に数万個の液滴を生成することができた。
本発明によって、初めて分子進化工学のライブラリの作成で利用できるような、直径数ミクロン〜数十ミクロンの均一なサイズの、1011〜1012個程度の液滴を、実用的な時間で生成することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】油中水型の液滴を生成するインクジェットノズルと液滴を回収する容器
【図２】スーパーインクジェットを利用した油中水型のIVC液滴生成の例
【図３】fluorescentを封入した油中水型液滴の蛍光顕微鏡画像
【図４】油中水型の液滴生成における粘度の影響
【図５】液滴の大きさと体積
【図６】Tegosoft油を用いた場合の液滴の大きさの分布
【図７】一秒あたりの液滴の生成数
【図８】緑蛍光タンパク（GFP）を封入した油中水型の液滴の画像
【図９】本法により生成した液滴中でGFPを無細胞タンパク合成系により合成させた液滴の画像
【図１０】GFPを無細胞タンパク合成させた液滴の蛍光強度比較
【図１１】アガロースを封入させゲル化させたIVCとその粒度分布
【図１２】ゲルの有り無しでのGFP発現量の比較
【図１３】ゲルIVC中の蛍光DNAの洗浄
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、本発明は下記の具体的な実施形態に何等限定されるものではない。
図1に本発明の構成を示す。液体の駆動機構付きノズル101の中に封入された液体1（102）は、駆動機構により強制的にノズルより噴出される。駆動装置は、ピエゾ型、バブルジェット型、電界型等あるがこれに限らない。駆動力は、液滴の生成速度に合わせて強弱をつけるのが望ましいが必須ではない。ノズルは液体2容器（105）に封入された液体2（103）の中に差し込まれている。なお、ノズルを液体2（103）の中に差し込まずに、空気層を挟んで液体2（103）に対向する位置に保持しておいてもよい。
生成されたIVC液滴（104）は、液体2（103）の中に導入される。液体1（102）と液体2（103）は互いに混ざり合わないので、そのまま保持され、回収される。
【０００９】
生成されたIVC液滴（104）同士が接触すると合体してしまうので、これを避けるために、液体1（102）または、液体2（103）に界面を安定化させる薬剤を入れることが有効である。液体1として水溶液、液体2として油、安定化剤として界面活性剤が良く用いられるが、この限りではない。合体を避けるために液体2（103）とノズルのどちらかに移動機構を設けて、相対位置を連続的に変化させることも有効である。液体１にゲル化するポリマーを含有させることで、ゲルIVCを作成することもできる。このようなポリマーは液体１の粘性を著しく上げるので、通常の微小流体デバイスや、ピエゾ式インクジェットでは取り扱うことは難しかったが、静電式の本法では容易に可能である。ゲルIVCは、油中から水溶液中に取り出し、界面を安定化させる界面活性剤を取り払っても、安定に孤立して存在できる。またゲルのネットワークよりも小さな分子は、大きな分子または粒子をIVC中に保持しながら、出し入れが可能である。これにより、水溶液中でIVCをハンドリングし、IVCを保持しながら必要に応じて分子を追加、除去、洗浄が可能となり、とても有用である。またゲルポリマーに酵素を固定化し、機能化させることもできる。ゲルの存在が酵素等の様々な反応を加速することが知られており有用である。
【実施例１】
【００１０】
図1及び2に本発明のIVC液滴生成装置の一例を示す。この装置は、液体1として水溶液、液体2として油、液体1の駆動装置付きノズル101として、電界を用いたスーパーインクジェット方式のノズルを用いている。先端を数ミクロン〜数十ミクロンの大きさに細めた絶縁性の管をノズル101とし、その中に液滴として封入したい液体1として水溶液をつめる。この水溶系に電気的に接触するように、電極201がノズル中に挿入されており、電源203より1,000 V 程度の電圧を印加する。電圧は直流成分と交流成分からなり、交流成分の周波数は可変である。駆動機構付きノズル101の先は液体1（102）の中に挿入されている。液体2（103）は電気的に設置されたステージ202の上に搭載されており、ステージと、電極が挿入された液体1の間の電界により駆動され、液滴となる。ここでは液体2（103）として油を用いる。ステージ202は電動で移動することができ、生成された液体が合体するのを防ぐことができる。電圧波形、強度、ステージの移動は制御用コンピュータ206で制御される。液滴の生成の様子は観察用カメラ204や照明205により観察できる。
【００１１】
液体2（103）として、3種類の油（tegosoft、ABIL、ミネラルオイル）を混合して用いた。油は 7mmの大きさの容器に3 mm の深さまで注いだ。Tegosoftの濃度を 10 % to 90 % ( v / v )の間で変化させて粘度を調整する。残りの体積は、ABILとミネラルオイルの比が1 : 3になるように調整混合する。 液体1（102）としては、70 mM のfluorescentを溶かした水溶液を用いた。電圧を印加することにより、油中水型のfluorescentを内包したIVC用液滴が生成した。
【００１２】
図3に生成されたfluorescentを封入した油中水型液滴の蛍光顕微鏡画像を示す。この液滴はSIJテクノロジー社のスーパーインクジェット装置を用い、先端の直径が65ミクロンのノズルを使用して、500 V の直流成分と25 Hz の交流成分の電圧を印加して生成したものである。液滴の直径を、ImageJソフトウエアを用いて算出すると、4.1 ± 0.8 μmであり、均一な液滴が生成されていることがわかる。
図4に、tegosoft の濃度を変えた時のオイルの粘性が、液滴の大きさに及ぼす影響を示す。他の条件は図3と同じである。粘性が大きくなると、液滴の平均サイズが大きくなる傾向があることが分る。
【００１３】
図5に電圧印加の周波数を1,000 Hz、ノズル先端の直径を4ミクロンにした時の、生成された液滴の蛍光像を示す。液滴の大きさは0.92 ± 0.4 μmであり、約1 fLの体積を持つことがわかる。Tegosoft oilの中で生成された液滴のサイズ分布を図6に示す。
図7に液滴生成中のノズル先端を高速ビデオカメラで顕微撮影した画像を示す。電圧の印加条件を、１Hzから1,000 Hzへ変化させると、液滴の生成速度が、250個／秒から、25,000個／秒まで変化した。
図8に緑蛍光タンパク（GFP）を封入した油中水型の液滴の生成例を示す。電圧は100V 50Hzであり平均直径 3.6 ミクロンの液滴が生成されている。タンパク質は緑色の蛍光を出しており、このような方法で液滴を生成してもタンパクの機能が失われていなことを示している。
【００１４】
次に、実際に本法で生成した液滴の中でたんぱく質が合成できるかを確かめた実験結果を示す。今回はGFPではなく、GFPをコーディングしたｃDNAと無細胞タンパク合成系を封入した油中水型の液滴を生成した。封入に用いたcDNAの濃度は2 x 1011 DNA molecule / μlであり、無細胞タンパク合成系は、ジーンフロンティア株式会社のpure systemを用いた。液滴の生成条件は100 V、50 Hzである。内径5ミクロンのノズルを用いた。2時間後の蛍光顕微鏡像、およびその明視野像を図9に示す。本液滴の中でGFPタンパクが合成され、緑色の蛍光を発していることが分る。直径約4ミクロンの液滴の蛍光強度と、比較径としてGFPのcDNAを入れないで同じことを行った液滴の蛍光強度を比較したものを図10に示す。明らかにGFP-cDNA有の方が蛍光が強く、液滴中で無細胞タンパク合成が可能なことが確かめられた。これより、本発明がIVC用の液滴生成法として機能することが分った。
【実施例２】
【００１５】
本方法では、溶液１にゲル化するポリマーを含有させることで、ゲル状のIVCを生成することができる。7℃以上で液体のままで25℃以下で急速にゲル化する低融点アガロース溶液を0.5％の濃度で液体１に加え、実施例１と同様にIVCを生成し、４℃に冷却してゲル化させるたIVCの顕微鏡写真とその粒径分布を図11に示す。この時に用いたノズルの先端の内径は15μｍ、溶液２の組成は、50% ABIL, 36% Tegosoft, 14% ミネラルオイルであった。印加した電圧は1000 Vであった。図11より、均一な粒度分布のゲル状のIVCが得られていることが分かる。
【００１６】
図12は、上記ゲル状IVCの中に、実施例１と同様に GFP-cDNAとpure systemを封入し、通常のIVC (water droplets)、アガロースを加えゲル化させていないIVC (Agarose droplet)、一度低温にしてゲル化させたIVC (Agarose gel beads)について、37℃で緑色の蛍光物質を蛍光強度をプロットしたものである。ゲルの中では、たんぱく質等の活性が上昇することが報告されており、図12でも同様の効果が得られた。
【００１７】
図13は、ゲル状IVCの選択的洗浄可能性を確かめたものである。ゲル状IVCは、表面を覆っている界面活性剤の膜を壊すことにより、ゲルのネットワークの大きさよりも小さい分子はIVCから出入りができるようになり、ゲルのネットワークの大きさよりも大きい分子はIVCの中に保持されたままであることが期待できる。図13では、ゲル状IVCに蛍光物質 Cy5で標識したDNAを封入し、これをアセトンとIPAで洗浄を試みたものである。アセトンとIPAによりIVCを覆っている界面活性剤の膜が除去され、洗浄前では、IVCの中にCy5-DNAの蛍光が観察されるが、洗浄後では観察されず、DNAのようなある程度大きい分子も洗浄が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、1010〜1012オーダの個別の分子や細胞を解析する In-vitro compartmentalization （IVC）に用いることができる。これまでのIVCでは、液滴の大きさが不均一か、数が少なかった。本発明により、均一な液滴としては2桁以上の生成速度が得られ、進化分子工学や創薬の分野での応用が期待される。本発明は産業上の利用性が非常に高い。
【符号の説明】
【００１９】
101    駆動機構付きノズル
102    液体１
103    液体２
104    IVC用液滴
105    液体２容器
201    電極
202    ステージ
203    電源
204    観察用カメラ
205    照明
206    制御用コンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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