(57)【要約】      （修正有）【課題】１つ又はそれ以上の褐色中肋（ＢＭＲ）突然変異を有するトウモロコシ植物の接合状態を決定するための組成物及び方法、並びに、ＢＭＲトウモロコシについての育種プロセスの向上に有用である方法の提供。【解決手段】トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び／又は存在／不在を決定するための方法であって、ゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、特定配列のポリヌクレオチドの特定の領域において、ハイブリダイズができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１８ヌクレオチド長である少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び前記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び／又は存在／不在を決定す
るための方法であって、
単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高ス
トリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも
１つの核酸分子と接触させる工程、及び
前記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの核酸分子、及び高
ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる２つの核
酸分子と接触させる工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配
列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記
２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間
で増幅する工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配
列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記
２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間
で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０に
ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、及
び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１に
ハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子を、前記増幅反応に含める工
程、及び
前記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のレポーター及び前記第二のレポーターが、区別可能な励起／発光スペクトル
を有する蛍光色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のレポーターがＦＡＭであり、及び前記第二のレポーターがＶＩＣである、請
求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも１つの核酸分子が、１０ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さである、請求項
１に記載の方法。
【請求項６】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも１つの核酸分子が、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さである、請求項
５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも１つの核酸分子の１つが、配列番号：１０の１０と３５の間の連続したヌクレオチド
と少なくとも９５％同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも１つの核酸分子が、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６からなる群より
選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌク
レオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリン
ジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの
核酸分子が、区別可能な励起／発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、請
求項１に記載の方法。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌク
レオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、ＦＡＭで標識され、及び高ストリンジ
ェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核
酸分子が、ＶＩＣで標識される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、ＰＣＲ反応での増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、非ＰＣＲベースの反応での増幅を含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項１３】
ジーメイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）におけるＣＯＭＴ突然変異を同定するための方法であ
って、配列番号：６を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。
【請求項１４】
植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための
方法であって、
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
前記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得る工
程、
前記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイ
ズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子と、接触させる
工程、及び
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させる
ことにより、高ストリンジェンシーで少なくとも１つの核酸分子を結合する後代を選択す
る工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が前記遺伝
子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え
植物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコ
シ植物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコ
シ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１０年５月１２日に出願された「USE OF BROWN MIDRIB-3 GENE SPECIFI
C MARKERS IN MAIZE FOR TRAIT INTROGRESSION」についての米国特許仮出願第６１／３３
４，０７３号の出願日の恩恵を主張するものである。
【０００２】
本開示は、一般に、植物育種に関する。褐色中肋３（ｂｍ３）突然変異を有する植物の
接合状態を決定するための方法を提供する。さらに、本開示の方法は、ＢＭＲ含有植物系
統についての育種プロセスの向上に有用である。
【背景技術】
【０００３】
リグニンは、炭水化物、例えば細胞壁内のヘミセルロースと架橋を形成する、植物中の
普遍的成分である。リグニンポリマーは、反芻動物における繊維消化を低下させ、リグニ
ン化の程度は、粗飼料作物可消化率に反比例し得る。Cherney et al. (1991) Adv. Agron
. 46: 157-98。褐色中肋（ＢＭＲ）突然変異を有するトウモロコシは、有意に低減された
リグニン含有率、改変されたリグニン組成及び改善された可消化率に関連づけられる、葉
の中肋の赤褐色着色を呈示する。少なくとも４つの独立したＢＭＲ突然変異が、トウモロ
コシにおいて同定されている。Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7: 1435-6。これらの
突然変異は、「ｂｍ１、ｂｍ２、ｂｍ３、及びｂｍ４」と呼ばれており、すべて、対照ト
ウモロコシと比較したときに減少されたリグニン含有率を呈示する。ｂｍ３突然変異は、
コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッ
ション番号Ｍ７３２３５）遺伝子内の挿入（ｂｍ３−１）、欠失（ｂｍ３−２）、及び挿
入／欠失（ｂｍ３−３）を含む。Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7; Vigno
ls et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16。
【０００４】
ＣＯＭＴ遺伝子は、リグニン生合成に関与する酵素活性を制御する。ＣＯＭＴは、Ｓ−
アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｙｌｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を利用してコー
ヒー酸のメチル基を転移させ、その結果、フェルラ酸が生産される。そのフェルラ酸から
最終的にコニフェリルアルコール及びシナピルアルコールが生成される。遊離ラジカルの
存在下でのコニフェリルアルコールとフェルラ酸アルコールとシナピルアルコールのこの
組み合わせが、リグニン生産をもたらす。ｂｍ３突然変異は、特性決定されており、遺伝
子不活性化によってコーヒー酸のメチル基転移を阻害すると考えられている。Guillet-Cl
aude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35; Piquemal et al. (2002) Plant 
Physiology 130:1-11; He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51; Morrow et al. (1997)
Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16。しかし、ｂｍ
３遺伝子座での特定の植物の接合状態を特異的に検出及び試験するための迅速な方法は、
開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46: 157-98
【非特許文献２】Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7: 1435-6
【非特許文献３】Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7
【非特許文献４】Vignols et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16
【非特許文献５】Guillet-Claude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35
【非特許文献６】Piquemal et al. (2002) Plant Physiology 130:1-11
【非特許文献７】He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51
【発明の概要】
【０００６】
ＢＭＲ含有系統についての育種プロセスを大きく向上させることができるＢＭＲトウモ
ロコシ品種（例えば、ｂｍ３突然変異体）のハイスループットＰＣＲベース分子特性決定
方法を本明細書に開示する。ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子の存在又は
不在を決定することによる、植物組織サンプル、及び従って該サンプルを調製した植物の
接合状態の決定方法を開示する。従って、ｂｍ３遺伝子座における接合状態ステータスを
特異的に検出及び試験する、エンドポイント加水分解プローブＰＣＲベース接合状態アッ
セイ（これを本明細書ではＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとして言及する）を提供す
る。アッセイであって、ｂｍ３突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生
型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスを同じアッセイにおいて利用する
ものであるアッセイを開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ｂｍ３突然変異を有するＣＯＭＴ遺伝子及びＣＯＭＴ遺伝子（約１．８ｋｂｐ）の部分的増幅のために設計されたオリゴヌクレオチドの略図を含む。
【図２】図２は、１２のｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３系統（野生型系統）からの部分ＣＯＭＴ遺伝子配列の増幅の描写を含む。ＰＣＲ生成物を２％ Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）で視覚化し、その後、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターへの配列クローニングのために０．８％  Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ＣｌｏｎｅＷｅｌｌによって抽出した。
【図３ａ】図３は、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ遺伝子からのコンセンサス配列のアラインメントを含む。３つの以前に記載された欠失／挿入突然変異に下線を引く。
【図３ｂ】図３は、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ遺伝子からのコンセンサス配列のアラインメントを含む。３つの以前に記載された欠失／挿入突然変異に下線を引く。
【図４】図４は、ｂｍ３突然変異に特異的なプライマーを有するＣＯＭＴ遺伝子及びインタクトＣＯＭＴ遺伝子の略図を含む。（Ａ）点線がｂｍ３欠失を表すＣＯＭＴ遺伝子。ＣＯＭＴ遺伝子特異的プライマーが、その欠失部位内にある。（Ｂ）ｂｍ３突然変異遺伝子。ｂｍ３特異的オリゴヌクレオチドは、欠失部位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわたる、ジャンクションにある。
【図５ａ】図５ａは、ｂｍ３については（ａ）ＦＭＡに関する及び（ｂ）野生型ＣＯＭＴについては（リアルタイムＰＣＲ機の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣに関する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを含む。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。
【図５ｂ】図５ｂは、ｂｍ３については（ａ）ＦＭＡに関する及び（ｂ）野生型ＣＯＭＴについては（リアルタイムＰＣＲ機の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣに関する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを含む。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。
【図６】図６は、サイクル３０でＦＡＭの相対蛍光単位に基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて行った、対立遺伝子１（ホモ接合性ｂｍ３）との遺伝子型決定、及びサイクル３０で（機械の制約のためＨｅｘで置換した）ＶＩＣの相対蛍光単位に基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて行った、対立遺伝子２（ホモ接合性野生型ＣＯＭＴ）との遺伝子型決定を含む。
【図７】図７は、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いて行ったｂｍ３接合状態決定を含む。ＰＣＲ読取値と蛍光読取値を比較して、下で説明するように分布グラフを生成した：ＳＯＢ１＝ＦＡＭのバックグラウンドを超えるシグナル（５３５ｎｍでのバックグラウンドシグナルの平均値を超えるサンプルシグナル）、ＳＯＢ２＝ＶＩＣのバックグラウンドを超えるシグナル（５６０ｎｍでのバックグラウンドシグナルの平均値を超えるサンプルシグナル）。対数目盛で、野生型についてはＳＯＢ１／ＳＯＢ２＜１、ヘミ接合体については１＜ＳＯＢ１／ＳＯＢ２＜５、及びホモ接合体についてはＳＯＢ１／ＳＯＢ２＞５で遺伝子型決定を行った。
【図８】図８は、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いて行ったｂｍ３接合状態決定を含む。ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ：ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）で、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｘ軸にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。
【０００８】
配列表
添付の配列表に載っている核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において定義
されているとおりの、ヌクレオチド塩基についての標準的文字略記を用いて示されている
。各核酸配列の一方の鎖しか示されていないが、表示されている鎖へ任意の参照によりそ
の相補鎖が含まれると解される。添付の配列表において：
配列番号：１は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子を増幅するために使用したフォワー
ドプライマー配列（ＢＭ３５＿Ｆ）：ＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧＣを
示す。
配列番号：２は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子を増幅するために使用したリバース
プライマー配列（ＢＭ３５＿Ｒ）：ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＡ
ＣＡＴＧＧを示す。
配列番号：３は、トウモロコシＣＯＭＴ部分遺伝子をシークエンスするために使用した
ＣＯＭＴ遺伝子からオリゴヌクレオチド配列（ＢＭ１２３４Ｒ）：ＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡ
ＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧを示す。
配列番号：４は、突然変異体ｂｍ３対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプ
ライマー配列（ＢＭ３＿Ｆ）：ＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡを
示す。
配列番号：５は、突然変異体ｂｍ３対立遺伝子を同定するために使用したリバースプラ
イマー配列（ＢＭ３＿Ｒ）：ＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧを示す。
配列番号：６は、５’末端にＦＭＡ及び３’末端にＭＧＢＮＦＱを有する突然変異体ｂ
ｍ３対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列（ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ）：ＦＡＭ
−ＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＧ−ＭＧＢＮＦＱを示す。
配列番号：７は、野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプラ
イマー配列（ＣＯＭＴ＿Ｆ）：ＣＧＣＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣを示す。
配列番号：８は、野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子を同定するために使用したリバースプライ
マー配列（ＣＯＭＴ＿Ｒ）：ＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＡを示す。
配列番号：９は、５’末端にＶＩＣ及び３’末端にＭＧＢＮＦＱを有する野生型ＣＯＭ
Ｔ対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列（ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ）：ＶＩＣ
−ＣＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣ−ＭＧＢＮＦＱを示す。
配列番号：１０は、ｂｍ３ヌクレオチド配列を示す。
配列番号：１１は、部分ＣＯＭＴヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Ｉ．幾つかの実施形態の概観
ＢＭＲ含有植物系統についての育種プロセスを大いに向上させることができるｂｍ３ト
ウモロコシ品種のハイスループットＰＣＲベース分子特性決定方法を本明細書に開示する
。特定の実施形態において、該方法は、単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコ
シ植物から得る工程、該単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列
番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの
核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることが
できるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び該トウ
モロコシ植物からの単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工
程を含む。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハ
イブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高
ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオ
チド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、１０ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間
の長さである。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０
にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は
、配列番号：１０の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一であ
る。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、配列番号
：１１の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一である。一部の
実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズする
ことができるヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイ
ブリダイズすることができない。一定の実施形態において、配列番号：１０又は配列番号
：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸
分子は、配列番号：１〜９からなる群より選択される。
【００１０】
トウモロコシ植物におけるＢＭＲ突然変異を同定するための方法も開示する。一部の実
施形態において、該方法は、トウモロコシ植物からのゲノムＤＮＡを、高ストリンジェン
シー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができる核酸分子に暴露する工程
を含むことができる。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号
：１０にハイブリダイズすることができる核酸分子は、配列番号：４、配列番号：５、及
び配列番号：６からなる群より選択することができる。
【００１１】
植物生殖質に（例えば、ｂｍ３対立遺伝子の遺伝子移入によって）低リグニン含有率の
形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法をさらに開示する。一部の実施
形態において、該方法は、ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と戻
し交配する工程、該交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサン
プルを得る工程、単離されたゲノムＤＮＡの該サンプルを、高ストリンジェンシー条件下
で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも
１つの核酸分子と接触させる工程、及び単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得た植物を
繁殖させることにより、ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配種から、高ストリン
ジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
を含む少なくとも１つの核酸分子に高ストリンジェンシーで結合する後代を選択する工程
、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が該遺伝子組換え
植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程を含むこと
ができる。
【００１２】
本開示のハイスループットＰＣＲベース分子法に従って決定された遺伝子型及び／又は
接合状態を有するトウモロコシ植物、並びに低リグニン含有率の形質をトウモロコシ植物
生殖質に確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための本開示の方法に従って生産される
、低リグニン含有率の形質を呈示する遺伝子組換えトウモロコシ植物も開示する。
【００１３】
ＩＩ．略語
ＢＭＲ  褐色中肋
ＭＧＢＮＦＱ  Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｎ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅ
ｎｃｅ    Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｉ
ＦＡＭ  ６−カルボキシ−フルオレセイン
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＦＵ  相対蛍光単位
ＶＩＣ  ６−カルボキシ−ローダミン
【００１４】
ＩＩＩ．用語
後に続く説明及び表において多数の用語を用いる。そのような用語が与えられている範
囲を含む、本明細書及び特許請求の範囲の明確な及び一致した理解をもたらすために、以
下の定義を提供する：
戻し交配：戻し交配は、育種家が、親の１つに雑種後代、例えばＦ１雑種の親遺伝子型
の１つを有する第一世代雑種Ｆ１を戻すように繰り返し交配するプロセスである。
ＢＭＲトウモロコシ：本明細書において用いる場合、用語「ＢＭＲトウモロコシ」は、
褐色中肋突然変異、例えばｂｍ１、ｂｍ２、ｂｍ３及びｂｍ４として特性決定される突然
変異を有するトウモロコシ品種を指す。ＢＭＲトウモロコシ品種は、概して、葉の中肋の
赤褐色着色を呈示する。ＢＭＲトウモロコシは、概して、より低いリグニン含有率、より
高い繊維可消化率及びより高い乾物摂取量も特徴とする。ＢＭＲトウモロコシ品種の非限
定的な例としては、Ｆ２Ｆ２９７、Ｆ２Ｆ３８３、Ｆ２Ｆ４８８、Ｆ２Ｆ４４９、Ｆ２Ｆ
５６６、Ｆ２Ｆ６１０、Ｆ２Ｆ６２２、Ｆ２Ｆ６６５、Ｆ２Ｆ６３３、Ｆ２Ｆ６８２、Ｆ
２Ｆ７２１、Ｆ２Ｆ７００、及びＦ２Ｆ７９７が挙げられる。
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体は、相補塩基間で、
ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅ
ｅｎ）又は逆フーグスティーン水素結合を含む、水素結合によってハイブリダイズする。
一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びチミン（Ｔ）
）又はプリン（アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基から
なる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジ
ンのプリンへの結合は、「塩基対合」と呼ばれる。より具体的には、Ａは、Ｔ又はＵに水
素結合することとなり、Ｇは、Ｃに結合することとなる。「相補的」は、２つの異なる核
酸配列間で又は同じ核酸配列の２つの異なる領域間で発生する塩基対合を指す。
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「特異的に相補的な」は、安定した特異的な結
合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとの間で発生するような十分な相
補性度を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるた
めにそのターゲット配列に１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、該
オリゴヌクレオチドのターゲットＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が、該ターゲットＤＮＡ
又はＲＮＡの正常な機能に干渉するとき、及び特異的結合が望まれる条件下、例えばイン
ビボアッセイ又は系の場合に生理条件下で非ターゲット配列への該オリゴヌクレオチドの
非特異的結合を回避するために十分な相補性度が存在するとき、特異的にハイブリダイズ
可能である。そのような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
特定のストリンジェンシー度を生じさせる結果となるハイブリダイゼーション条件は、
選択されるハイブリダイゼーション法の性質、並びにハイブリダイズする核酸配列の組成
及び長さに依存して、様々である。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリ
ダイゼーション緩衝液のイオン強度（とりわけ、Ｎａ＋及び／又はＭｇ２＋濃度）は、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーの一因となるが、洗浄時間もストリンジェン
シーに影響を及ぼす。特定のストリンジェンシー度を達成するために必要とされるハイブ
リダイゼーション条件についての計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: 
A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11において論じられている。
本開示のために、「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子とターゲ
ット配列の間に２５％未満のミスマッチがある場合にハイブリダイゼーションが発生する
条件を包含する。「ストリンジェント条件」は、特定のストリンジェンシーレベルにさら
に定義することができる。従って、本明細書において用いる場合、「中程度（ｍｏｄｅｒ
ａｔｅ）ストリンジェンシー」条件は、２５％より多くのミスマッチを有する分子がハイ
ブリダイズしない条件である。「中（ｍｅｄｉｕｍ）ストリンジェンシー」の条件は、１
５％より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、及び「高ス
トリンジェンシー」の条件は、１０％より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイ
ズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」の条件は、６％より多くのミスマッチ
を有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態において、ストリンジェント条件は、製造業者の説示に従って希釈され
たＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定用マスターミックス（カリフォルニア州フォス
ター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３７１３５５）
中、６０℃でのハイブリダイゼーションを含み得る。
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸又はタンパク質）は、該成分が天
然に存在する生物の細胞内の他の生体成分、すなわち他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及び
ＲＮＡ並びにタンパク質から実質的に分離された、該他の生体成分とは別に生産された、
又は該他の生体成分から精製された。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的
な精製法によって精製された核酸分子及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞にお
ける組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子
、タンパク質及びペプチドも包含する。
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレ
オチドは、より長い核酸セグメントの切断によって、又は個々のヌクレオチド前駆体を合
成することによって形成され得る。自動合成装置は、数百塩基対までの長さのオリゴヌク
レオチドの合成を可能にする。オリゴヌクレオチドは相補ヌクレオチド配列に結合するこ
とができるので、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのプローブとしてそれらを使用するこ
とができる。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオ
チド）をＰＣＲ、小さいＤＮＡ配列の増幅のための技術において使用することができる。
ＰＣＲにおいて、該オリゴヌクレオチドは、概して、「プライマー」と呼ばれ、これは、
ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長すること及び相補鎖を複製することを可
能にするものである。
接合状態：本明細書において用いる場合、用語「接合状態」は、生物における遺伝形質
のための遺伝子の対立遺伝子の類似性又はそれらの欠失を指す。両方の対立遺伝子が同じ
である場合、その生物は、その形質について「ホモ接合性」である。両方の対立遺伝子が
異なる場合、その生物は、その形質について「ヘテロ接合性」である。一方の対立遺伝子
が欠けている場合、それは、「ヘミ接合性」である。両方の対立遺伝子が欠けている場合
、それは、「ヌル接合性」である。
特に別の説明がない限り、本明細書において用いるすべての専門用語及び科学用語は、
本開示が属する分野の通常の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する
。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford Univ
ersity Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia
of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及びMey
ers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Refere
nce, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる
。
【００１５】
ＩＶ．ｂｍｒトウモロコシの遺伝子型及び接合状態決定のためのハイスループット方法
Ａ．概観
ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子
特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイをここで説明する。特定
の実施例は、同じアッセイにおいてｂｍ３欠失に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する
野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスとを利用する。これらの実施
例では、ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子の存在／不在によって、接合状
態を決定することができる。該アッセイをさらなる実行のためにハイスループットゲノム
分析グループに付託した。該アッセイは、ＢＭＲ遺伝子移入プロジェクトの育種プロセス
を大きく向上させることができる。
【００１６】
Ｂ．褐色中肋トウモロコシ
褐色中肋（ＢＭＲ）トウモロコシ植物は、Ｖ４からＶ６期における葉の中肋の褐色着色
及び房を付けた後の髄の淡褐色呈色を特徴とする。褐色中肋ハイブリッドトウモロコシは
、トウモロコシ植物組織中のリグニン含有率を低下させる遺伝子突然変異、例えば、ｂｍ
２突然変異又はｂｍ３突然変異を有する。褐色中肋３遺伝子は、染色体４の短いアーム上
に位置し、ｂｍ３対立遺伝子は、劣性である。褐色中肋２遺伝子は、染色体１の長いアー
ム上に位置し、ｂｍ２対立遺伝子も劣性である。リグニンポリマーは、トウモロコシ植物
中の繊維の可消化性を制限する。褐色中肋トウモロコシ中の低減されたリグニンは、結果
として、通常のトウモロコシより可消化性が高い繊維を有するサイレージを生じさせる。
動物飼養試験により、通常のサイレージと比較して、ＢＭＲトウモロコシサイレージでの
約１０パーセント多い摂取量及び増加された産乳量が証明された。
【００１７】
ｂｍ３突然変異を同定する方法を提供する。本開示の方法は、例えば、特定のトウモロ
コシ植物、又は特定のトウモロコシ品種をＢＭＲトウモロコシとして同定するのに有用で
あり得る。開示する方法は、ＢＭＲトウモロコシと他のトウモロコシ品種を交配させるこ
とによる、又は第一のＢＭＲ突然変異を有するＢＭＲトウモロコシと第二のＢＭＲ突然変
異を有するＢＭＲトウモロコシとを交配させること（例えば、ｂｍ１トウモロコシ品種と
ｂｍ３トウモロコシ品種を交配させること）による、トウモロコシ生殖質へのＢＭＲ形質
の信頼できる及び予測できる遺伝子移入にも有用であり得る。多くのＢＭＲ突然変異が当
業者に公知であり、一部のＢＭＲ突然変異は特性決定（例えば、マッピング及びシークエ
ンシング）されている。本開示の方法は、ＢＭＲ突然変異を同定するために、ＢＭＲトウ
モロコシ植物又は品種の遺伝子型及び／又は接合状態を決定するために、並びにトウモロ
コシ生殖質への任意のＢＭＲ突然変異の遺伝子移入に、用いることができる。
【００１８】
Ｃ．エンドポイントＰＣＲ検出アッセイ
ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子
特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイをここで説明する。特定
の実施形態では、遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ
を用いて、トウモロコシの接合状態をｂｍ３突然変異について分析することができる。
遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて使用す
るためのプライマー及びプローブを、対象の遺伝子における公知突然変異に基づいて、設
計することができる。例えば、ｂｍ３特異的アッセイ用のプライマー及びプローブを、コ
ーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）遺伝子の３’末端での９７８ｂｐ欠
失に基づいて、設計することができる。突然変異（例えば、ｂｍ３）に特異的なオリゴヌ
クレオチド及び破壊されていない野生型遺伝子（例えば、ＣＯＭＴ）に特異的なオリゴヌ
クレオチドを同じアッセイにおいて使用するバイプレックス反応において、該特異的オリ
ゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡサンプル中に存在する該突然変異遺伝子及び／又は該野
生型遺伝子のいずれか又は両方からの配列を選択的に増幅する。
【００１９】
一部の実施形態において、ｂｍ３特異的アッセイは、長さが７１ｂｐであるフラグメン
トであって、９７８ｂｐのヌクレオチド配列が野生型ＣＯＭＴ遺伝子から欠失されたジャ
ンクション部位に固有であるものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態におい
て、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ（配列
番号：６））は、２つのＰＣＲプライマー（例えば、ＢＭ３＿Ｆ（配列番号：４）及びＢ
Ｍ３＿Ｒ（配列番号：５））の間のゲノムＤＮＡサンプル中のターゲット配列に、高スト
リンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００２０】
一部の実施形態において、野生型ＣＯＭＴ遺伝子特異的アッセイは、長さが６５ｂｐで
あるＣＯＭＴ遺伝子のフラグメントであって、ＣＯＭＴ遺伝子座の非ｂｍ３配列を増幅す
ることができないように（ｂｍ３突然変異体では欠失されている）エキソン２内に位置す
るものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ（配列番号：９））は、２つの
ＰＣＲプライマー（例えば、ＣＯＭＴ＿Ｆ（配列番号：７）及びＣＯＭＴ＿Ｒ（配列番号
：８））の間のゲノムＤＮＡサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズする。
【００２１】
ターゲット特異的オリゴヌクレオチドを、例えば蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、
及びＭＧＢＮＦＱ）で、標識することができ、それによってターゲット特異的蛍光シグナ
ルの迅速な定量を可能にすることができる。所定数のサイクルの後、例えば、反応が初期
指数関数的増幅期にあるときに、ＰＣＲ生成物を測定することができる。陰性対照サンプ
ルは、例えばｂｍ３突然変異を有さない、任意のトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを
含むことができる。陽性対照サンプルは、ＢＭＲ突然変異、例えばＣＯＭＴ遺伝子におけ
るｂｍ３欠失突然変異を有するトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを含むことができる
。対照ヘミ接合性サンプルは、ｂｍ３突然変異についてヘミ接合性であると前もって判定
されたトウモロコシ品種からのゲノムＤＮＡを含むことができ、又はヘミ接合性サンプル
は、ｂｍ３についてホモ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのＤＮ
Ａと同じ割合の陰性対照ＤＮＡを含むことができる。
【００２２】
当業者に公知の方法によって、ＤＮＡをトウモロコシ植物組織から単離する（例えば、
抽出する、及び精製する）ことができる。ＤＮＡ単離用の市販のキット、例えばＱｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．からのものを利用することができる。一部の実施形態では、特定の植物か
らの葉ディスクを打ち抜き、コレクションチューブに移す。各サンプリング後にパンチャ
ーを７０％アルコールで浄化し、水ですすぎ、乾燥させることができる。ＤＮＡ抽出用緩
衝液を、製造業者の推奨に従って調製することができる。その後、キットを製造業者の説
示に従って使用して、ＤＮＡを単離することができる。最後に、その単離されたＤＮＡの
濃度を、例えば、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）定量キット
（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び分光光度計を使用して
、又は任意の他の適する技術によって、決定することができる。
【００２３】
プライマー、プローブ及びゲノムＤＮＡサンプルを調製すると、又は別様に利用可能に
すると、ＰＣＲ反応を行って該ゲノムＤＮＡサンプル中の対象の核酸配列（例えば、ＢＭ
Ｒ突然変異に特有の配列）を同定することができる。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡ
サンプルを除いてすべての反応成分を含有する個々のＰＣＲ反応混合物を調製する。ｂｍ
３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴトウモロコシのためのプライマー及び遺伝子特異的プロ
ーブを含むバイプレックス反応のための反応混合物は、酵素、反応用緩衝液、ｂｍ３突然
変異のためのフォワード及びリバースプライマー、野生型ＣＯＭＴ遺伝子のためのフォワ
ード及びリバースプライマー、ｂｍ３突然変異のための遺伝子特異的プローブ、ＣＯＭＴ
遺伝子のための遺伝子特異的プローブ、並びに水を含み得る。一部のＰＣＲアッセイ系（
例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）において、酵素及び緩衝液は、単一
のキット構成要素（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定用マスターミックス
；カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カ
タログ＃４３７１３５５）中に存在することがある。
【００２４】
反応混合物を別様に調製すると、ゲノムＤＮＡサンプルを添加し、反応を開始させるこ
とができる。サンプル中のゲノムＤＮＡの量を正規化する必要はない。しかし、当業者は
、比較的等濃度のゲノムＤＮＡサンプルを使用することにより、最良の結果を獲得するこ
とができる。
【００２５】
一部の実施形態では、適切な対照を用いてＰＣＲアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登
録商標）ＰＣＲアッセイ）を構成することができる。例えば、（１）試薬を有するがＤＮ
Ａサンプルを有さない陰性対照、（２）ｂｍ３トウモロコシゲノムＤＮＡを含むホモ接合
性陽性対照、（３）及び上で説明したようなヘミ接合性陽性対照を含む対照ウエルを伴う
マルチ・ウエル・プレートにおいて反応を行うことができる。その後、適するサイクル条
件下でＰＣＲによってＤＮＡを増幅する。例えば、ＧｅｎＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓ
ｙｓｔｅｍ  ９７００を使用する一部の実施形態では、９５℃で１５分間の単一の初期変
性サイクルがあり、それに３０サイクルの変性（９２℃で１５秒間）そしてアニーリング
／伸長（６０℃で６０秒間）というサイクルが続き得る。ＰＣＲサイクル条件を現場の人
間の自由裁量によって変えて、匹敵する結果を得ることができることは、当業者には理解
される。
【００２６】
Ｄ．遺伝子型及び／又は接合状態の決定
ＰＣＲアッセイ（例えば、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）
を、ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの遺伝子型及び／又は接合状態分析
に使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブをレポーター（例えば、蛍光部分）で標識することができる。蛍光検出を用いるアッセ
イについては、プローブの検出に適している励起及び発光波長設定を用いて分光蛍光光度
計（例えば、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ（商標）；スイス、メンネドルフ）でＰＣＲ反応
生成物を分析することができる。例えば、蛍光色素、ＦＡＭを、４８５ｎｍの励起波長及
び５３５ｎｍの発光波長で測定することができる。あるいは、蛍光色素、ＶＩＣを、５２
５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長で測定することができる。
【００２７】
ＰＣＲ反応及びプローブ検出の完了後、例えば任意の適するコンピュータ・グラフィッ
ク・ソフトウェアを使用して、表及び分布グラフを生成することができる。類似した遺伝
子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性ＤＮＡで得られた結果は、陰
性及び陽性対照として使うことができる。ある分離集団において、データ点の３つのクラ
スタを得、それによって、それらの分離されたクラスタの１つに属する可能性が高いとい
うサンプル結果の視覚的決定を可能にすることができる。あるいは、データ解析コンピュ
ータソフトウェアを使用して、サンプル結果がそれぞれの分離されたクラスタに属する尤
度を計算することができ、最も尤度の高いクラスタがそのサンプルの名称になる。視覚的
決定を行うとき、例えばデータ点の３つのクラスタが明瞭に見えるとき、各クラスタの境
界は任意であり得る。
【００２８】
適する分析パッケージ、例えばＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理シ
ステム）を使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析することもで
きる。突然変異体対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナル
の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を一方の軸にプロットし、野生型対立遺伝子についての特異的
プローブによって生成された蛍光シグナルのＲＦＵを他方の軸にプロットして、グラフを
生成することができる。その後、データのグラフィック表示でのクラスタ分離に基づいて
、接合状態決定を行うことができる。
【００２９】
突然変異体ゲノムＤＮＡ（例えば、ＢＭＲ突然変異）を含有しないサンプルは、結果と
して、野生型ＰＣＲ生成物の蛍光読取値しかもたらすことができない。ヘミ接合性又はホ
モ接合性突然変異体ゲノムＤＮＡを含有するサンプルは、結果として、陰性バックグラウ
ンド対照のものより高い突然変異体特異的プローブについてのＲＦＵ読取値をもたらすこ
とができる。サンプルが妥当な結果を生じさせない場合、そのサンプル中のゲノムＤＮＡ
は、妥当な質及び／又は量のものでないことがあり、新たなＤＮＡ調製及び／又は新たな
ＰＣＲ反応を行うべきである。好ましくは、ＤＮＡサンプルを含有しない陰性対照サンプ
ルは、遺伝子特異的プローブの非常に低い検出を示す。公知ホモ接合性対照が、該対照中
の突然変異体ＤＮＡ又は野生型ＤＮＡの高い検出のみを示すこと、及び公知ヘミ接合性対
照が、突然変異体ＤＮＡと野生型ＤＮＡの両方の高い検出を示すことも好ましい。
【００３０】
サンプルのスクリーニングの前に、すべての適切な対照を用いてＰＣＲ法並びに遺伝子
型及び／又は接合状態決定の「試験ラン」を行うことができる。該方法のさらなる最適化
は、用い方（例えば、ゲノムＤＮＡ調製方法、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌク
レオチド、実験装置など）によって差があることがある成分には望ましいものであり得る
。許容可能なプローブ検出レベル（例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブについ
ての許容可能なＲＦＵ）で、公知ゲノムＤＮＡテンプレートにおいて突然変異体配列及び
／又は野生型配列の両方を増幅する、ＰＣＲ及び熱サイクリング条件を確立することがで
きる。
【００３１】
Ｅ．植物生殖質への低リグニン含有率の形質の遺伝子移入
有性生殖を含む従来の植物育種によって、リグニン含有率が低いトウモロコシ植物（例
えば、ＢＭＲトウモロコシ）を生産するための方法をここで説明する。方法は、ＢＭＲ突
然変異の少なくとも１つのコピー（例えば、ｂｍ３、ｂｍ３−１、ｂｍ３−２）をそのゲ
ノム内に含む第一の親トウモロコシ植物を第二の親トウモロコシ植物に交配させて、Ｆ１
後代を生産することを含み得る。該第一の植物は、例えば、ＢＭＲトウモロコシ品種Ｆ２
Ｆ２９７、Ｆ２Ｆ３８３、Ｆ２Ｆ４８８、Ｆ２Ｆ４４９、Ｆ２Ｆ５６６、Ｆ２Ｆ６１０、
Ｆ２Ｆ６２２、Ｆ２Ｆ６６５、Ｆ２Ｆ６３３、Ｆ２Ｆ６８２、Ｆ２Ｆ７２１、Ｆ２Ｆ７０
０及びＦ２Ｆ７９７を含む、任意のＢＭＲトウモロコシ植物であり得る。該第二の親トウ
モロコシ植物は、該第一のトウモロコシ植物と交配させたときに生育可能な後代トウモロ
コシ植物（すなわち、種子）を生産することができる任意のトウモロコシ植物であり得る
。該第一及び第二の親トウモロコシ植物は、同じトウモロコシ種（例えば、ジーメイズ（
Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ））のものであってもよい。該方法は、Ｆ１後代を自
家受粉させてＦ２後代を生産することをさらに含むことができる。方法は、Ｆ１又はＦ２
後代植物を第一又は第二いずれかの親トウモロコシ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物へ
と戻し交配することから１又はそれ以上の世代をさらに含むことができる。あるいは、第
一の交配のＦ１後代、又は任意の後続の交配種を、第一又は第二いずれかの植物とは異な
る系統又は遺伝子型のものである第三のトウモロコシ植物に交配させることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、後代植物を本開示の遺伝子型及び／又は接合状態決定に付す。後
代植物の遺伝子型を判定すると、及び／又はそれらの接合状態を決定すると、当業者は、
所望の遺伝子構成を有する後代植物を選択することができる。そのような選択された後代
植物を、さらなる交配、自家受粉、又は栽培に使用することができる。本開示の方法によ
って導かれるＢＭＲ突然変異の遺伝子移入方法は、所望の遺伝子構成を有さない植物の栽
培及び／又は繁殖を低減又は排除し、それによって、（予想されるメンデル遺伝様式によ
り）望ましい信頼性及び予測性をもたらす。
【００３３】
ある特定の特徴及び／又は実施形態を例証するために以下の実施例を提供する。以下の
実施例を、説明する特定の特徴又は実施形態に本開示を限定するものと解釈すべきでない
。
【実施例】
【００３４】
実施例１：材料及び方法
植物及び遺伝物質。ホモ接合性ｂｍ３対立遺伝子及びホモ接合性野生型ＣＯＭＴ対立遺
伝子を含有するトウモロコシ葉サンプルを用意した。
【００３５】
全ゲノムＤＮＡの単離及び定量。１サンプルあたり８つの葉ディスクを打ち抜き、Ｇｅ
ｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（登録商標）２０００を使用して微粉に粉砕した。ＤＮＡをＱｉａｇ
ｅｎ  ＤＮｅａｓｙ（商標）９６ウエルキット（カリフォルニア州バレンシア）で抽出し
た。ＰＣＲの前に、製造業者の説示を用いてＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅ
ｎ（登録商標）定量キット（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
で定量した。
【００３６】
部分ＣＯＭＴ遺伝子のクローニング及びシークエンシング。オリゴＢＭ３５＿Ｆ（５’
−ＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧＣ−３’；配列番号：１）及びＢＭ３４
＿Ｒ（５’−ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＡＣＡＴＧＧ−３’；配
列番号：２）を用い、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７
００（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）を使用して、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）（日本、滋賀県のＴａ
ｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）と４００ｎＭ ｄＮＴＰと２００ｎＭ フォワード（ＢＭ３
５＿Ｆ）及びリバースプライマー（ＢＭ３４＿Ｒ）と３０ｎｇのゲノムＤＮＡとを含有す
る反応物で、１２のｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３サンプル（表１を参照のこと）から部
分ＣＯＭＴ遺伝子のトウモロコシゲノムＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲプログラ
ムを９４℃で２分の変性で開始し、それに３０サイクルの９４℃で４５秒間、５５℃で４
５秒間そして７２℃で２分間というサイクルが続いた。ＰＣＲ生成物を２％ Ｅ−Ｇｅｌ
（登録商標）（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化し
、その後、０．８％ Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ＣｌｏｎｅＷｅｌｌｓ（商標）で抽出した
。その後、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（カリフ
ォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、その製造業者の説示に従って
、クローニングした。選択されたコロニーを、一晩、１Ｘフリーザー培地（ｆｒｅｅｚｅ
ｒ  ｍｅｄｉａ）で成長させ、この培地は、２．５％ ＬＢ（１Ｌ ＬＢ培地に１０ｇ ト
リプトン、１０ｇ ＮａＣｌ及び５ｇ 酵母エキス）、３６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１３ｍＭ 
ＫＨ２ＰＯ４、１．７ｍＭ クエン酸ナトリウム、６．８ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４．
４％ グリセロール、０．４ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２．５μｇ／ｍＬ クロラム
フェニコール（使用直前に添加）及び５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含有した。その後
、選択されたコロニーを、Ｔ７及びＴ３プロモーター、並びにＣＯＭＴ遺伝子内に位置す
るＢＭ１２３４Ｒ（５’−ＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧ−３’；配列番号
：３）でのシークエンシングのために、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（登録商標）（テキサス州ヒュ
ーストン）に送った。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）４．８ソフトウェアを使用して
、配列を分析した。ｂｍ３系統からのコンセンサス配列を野生型ＣＯＭＴサンプルと比較
することにより、ｂｍ３突然変異を同定した。
【表１】
2017018114.tif 000002
【００３７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ設計及び検証。ｂｍ３系統からのＤＮＡコン
センサス配列に基づいて、プライマー（ＢＭ３＿Ｆ；配列番号：４及びＢＭ３＿Ｒ：配列
番号：５）、及び突然変異体対立遺伝子を同定するためのＣＯＭＴ遺伝子の部分配列の３
’末端を欠失させたジャンクションに特異的なプローブ（ＢＭ３＿Ｐｒｏｂｅ；配列番号
：６）；プライマー（ＣＯＭＴ＿Ｆ及びＣＯＭＴ＿Ｒ）及び野生型対立遺伝子を同定する
ための該欠失領域内のプローブ（ＣＯＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ）を設計した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ  ３．０を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ設計に使用した。すべての
プライマー、及びＦＡＭ又はＶＩＣとＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｎ
Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｉ（ＭＧＢＮＦＱ）色素とを有
する二重標識プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フ
ォスター・シティー）によって合成された。すべてのプライマー及びプローブを１Ｘ  Ｔ
ｒｉｓ−ＥＤＴＡに溶解して１００μＭにした。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定
用マスターミックス（カリフォルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３７１３５５）をすべてのＰＣＲ反応に使用した。
【００３８】
９６ウエルプレートを使用し、ｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）光学システム（カリフォル
ニア州ハーキュリーズのＢｉｏＲａｄ）を用いて、９５℃で１５分の変性で開始し、それ
に５０サイクルの９２℃で１５秒間そして６０℃で１分間というサイクルが続く、２０μ
Ｌ容量でのリアルタイムＰＣＲ反応を表２に従って構成した。各サイクル終了時に蛍光シ
グナルを記録した。
【表２】
2017018114.tif 000003
【００３９】
３８４ウエルプレートを使用する１０μＬ 容量でのエンドポイントＴａｑＭａｎ（登
録商標）ＰＣＲアッセイを表３に従って構成した。９５℃で１５分の変性で開始し、それ
に３０サイクルの９２℃で１５秒間そして６０℃で１分間というサイクルが続く増幅のた
めに、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（カリフォ
ルニア州フォスター・シティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
最適な数のサイクルの後、反応が初期指数関数的増幅期にあるとき、分光蛍光光度計（Ｔ
ｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ（商標）、スイス、メンネドルフ）によって推奨計器設定（ＦＡ
Ｍ（ｂｍ３突然変異体）：励起−４８５ｎｍ、発光−５３５ｎｍ；ＶＩＣ（野生型ＣＯＭ
Ｔ）：励起−５２５ｎｍ、発光−５６０ｎｍ）でＰＣＲ生成物を測定した。
【表３】
2017018114.tif 000004
【００４０】
データ解析。リアルタイムＰＣＲのために、その値がバックグラウンドよりわずかに上
である蛍光閾値をｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアによって自動計算した。規定
閾値より上の蛍光を発生させるために必要とされるサイクル数により、閾値サイクル（Ｃ
ｔ値）を決定した。その後、対立遺伝子識別アッセイを用いて遺伝子型を決定した。
【００４１】
エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ及び蛍光読み取りの完了後、レポート
色素１のバックグラウンドを超えるシグナル（ＳＯＢ１）及びレポート色素２のバックグ
ラウンドを超えるシグナル（ＳＯＢ２）を計算した。サンプル数と対数尺度でのＳＯＢ１
／ＳＯＢ２の絶対比の間の分布グラフを生成した。類似した遺伝子型バックグラウンドの
野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性植物のサンプルを対照として使用した。クラスタ分離
に基づいて遺伝子型判定を行った。
【００４２】
また、ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）を使用して、プ
レートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位
）をｘ軸にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフ
を生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。
【００４３】
実施例２：ＣＯＭＴ遺伝子の部分ｂｍ３突然変異の配列分析
ｂｍ３突然変異体についての遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを設計す
るために、正確な配列情報を必要とした。そのために、２つのオリゴヌクレオチドを設計
して、１２のｂｍ３及び３つの非ｂｍ３系統からのゲノムＤＮＡからの部分ＣＯＭＴ遺伝
子（図１）を増幅した。図２。これらのフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）
ベクターにクローニングし、Ｔ７及びＴ３プロモーター、並びにＢＭ１２３４Ｒ（配列番
号：３）でのシークエンシングのためにＣｏｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．に送った。ＢＭ１２
３４Ｒは、ＣＯＭＴ遺伝子の中央に位置し、それを使用して完全長配列情報を獲得した。
Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）４．８を使用して、９つのｂｍ３系統からの高品質配
列を分析及びアラインした。ｂｍ３系統からのコンセンサス配列を野生型サンプルと比較
した。ＣＯＭＴ遺伝子の３’末端において複数の欠失／挿入突然変異が同定された。例え
ば、３つの突然変異が確認され、それらに下線を引いた。図３。
【００４４】
遺伝子特異的アッセイ設計及び検証。本発明者らが試験したすべてのｂｍ３系統は、Ｃ
ＯＭＴ遺伝子の３’エキソンに大きな欠失突然変異を有する。そこでこの突然変異を遺伝
子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ設計のために使用した。図４は、オリゴヌク
レオチドの位置を示す略図を含む。野生型ＣＯＭＴ遺伝子特異的プライマー及びプローブ
は、９７８ｂｐ欠失部位内に位置する。ｂｍ３特異的プライマー及びプローブは、欠失部
位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわ
たる、ジャンクションに位置する。
【００４５】
１２の公知ｂｍ３系統及び３つの非ｂｍ３系統を使用して、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ
（登録商標）アッセイを試験した。ｂｍ３系統からのＤＮＡと非ｂｍ３系統からのＤＮＡ
の同量を併せることにより、６つのヘミ接合性サンプルを作製した。リアルタイムＰＣＲ
を用いて、アッセイの効率を試験した。ｂｍ３突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチド
と対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて併用した。
ＦＡＭを使用してｂｍ３のアンプリコンをモニターし、及びＶＩＣを使用して野生型ＣＯ
ＭＴについてのアンプリコンをモニターした。指数関数的増幅期が、ｂｍ３遺伝子と野生
型ＣＯＭＴ遺伝子の両方についてサイクル２２から３６まで観察された。図５ａ及び５ｂ
。サイクル３０において、ＦＡＭに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子１
と、及びＶＩＣに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子２と、正しい遺伝子
型決定を生じさせた。図６。
【００４６】
エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）接合状態分析の検証。ホモ接合性、ヘミ接合
性及びヌル（野生型）として分離するｂｍ３集団を含有するＤＮＡサンプルの１つの９６
ウエルプレートを使用して、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを
試験及び検証した。エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲの１つの利点は、使
用の容易さである。エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、より高価なリア
ルタイムＰＣＲ機を必要としない。いずれの常用ＰＣＲ機も９６又は３８４ウエルプレー
トに適合し、アッセイを行うには、相対蛍光シグナルを読み取ることができるプレートリ
ーダーで十分である。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲからの結果に基づいて、３０サイクルのＰＣＲ反応は、野生型ＣＯ
ＭＴ遺伝子からｂｍ３遺伝子を効率的に分離することができる。サイクル３０でＰＣＲ反
応を停止させた。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ及び蛍光読み取りの完了後、バックグ
ラウンド（Ｈ２Ｏ）を超えるＦＡＭ（ｂｍ３）の蛍光シグナルを、バックグラウンド１を
超えるシグナル（ＳＯＢ１）として、及びバックグラウンド２を超えるＶＩＣ（野生型Ｃ
ＯＭＴ）（ＳＯＢ２）を計算した。対数尺度でのＳＯＢ１／ＳＯＢ２を用いて、分布グラ
フを生成した。図７。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ
接合性対照は、陰性及び陽性対照となった。ある分離集団において、データ点の３つのク
ラスタを得、それによってカットオフ点を視覚的に決定することができた。図７における
実施例では、データ点の３つのクラスタが明瞭に見えた。野生型についてのデータ点は、
１未満であり、ヘミ接合性サンプルについてのものは、１から５の範囲であり、及びホモ
接合性のものについてのものは、５より上である。
【００４８】
また、ＫＬＩＭＳ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究室情報管理システム）で、プレートリ
ーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。ＦＡＭのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｘ軸
にプロットし及びＶＩＣのＲＦＵ（相対蛍光単位）をｙ軸にプロットしてグラフを生成し
た。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。図８。ＦＡＭを
使用してｂｍ３の増幅をモニターし、ＶＩＣを使用して野生型ＣＯＭＴの増幅をモニター
したので、ＦＡＭの強いシグナルを有し、ＶＩＣのシグナルを殆ど又は全く有さないサン
プルは、ホモ接合性ｂｍ３であり、ＶＩＣの強いシグナルを有し、殆ど又は全くＦＡＭを
有さないサンプルは、野生型ＣＯＭＴ（ヌル）であり、及びＦＡＭとＶＩＣの両方の強い
シグナルを有するサンプルは、ヘミ接合性であった。
【００４９】
このｂｍ３遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイから
の遺伝子型及び接合状態決定は、当分野において収集された表現型データと１００％一致
した。このアッセイは、ハイスループット様式でｂｍ３接合状態ステータスを特性決定す
る簡単かつ正確な方法を提供する。
【００５０】
実施例３：ｂｍ３突然変異の遺伝子移入
ｂｍ３突然変異に関してのトウモロコシ植物の接合状態を上で説明したように決定する
。トウモロコシ植物がｂｍ３突然変異についてホモ接合性であることを決定する。植物を
、従来の植物育種により、野生型ＣＯＭＴ遺伝子についてホモ接合性であることが公知で
あるトウモロコシ植物、及びｂｍ３突然変異についてホモ接合性のトウモロコシ植物と交
配させる。その交配種のＦ１後代を生産する。その後、該交配種のＦ１後代を自家受粉さ
せてＦ２後代を生産する。Ｆ２後代のゲノムＤＮＡのサンプルを調製し、Ｆ２後代植物の
接合状態を上で説明したように決定する。
【００５１】
ｂｍ３突然変異についてホモ接合性であるＦ２後代植物を選択する。その後、選択され
た後代を低リグニン含有率についてアッセイし、望ましく低いリグニンレベルを呈示する
後代を交配及び自家受粉によってさらに繁殖させ、得られた後代を栽培する。
【００５２】
本発明を本明細書において一定の好ましい実施形態に関して説明したが、本発明がその
とおり限定されないことは当業者にはわかるし、理解される。むしろ、下の特許請求の範
囲に記載する本発明の範囲を逸脱することなく、それらの好ましい実施形態に多くの付加
、欠失及び修飾を施すことができる。加えて、１つの実施形態からの特徴を別の実施形態
の特徴と組み合わせることができるが、本発明者らが考える本発明の範囲内になお包含さ
れる。
【図１】
2017018114.tif 000005
【図２】
2017018114.tif 000006
【図３ａ】
2017018114.tif 000007
【図３ｂ】
2017018114.tif 000008
【図４】
2017018114.tif 000009
【図５ａ】
2017018114.tif 000010
【図５ｂ】
2017018114.tif 000011
【図６】
2017018114.tif 000012
【図７】
2017018114.tif 000013
【図８】
2017018114.tif 000014
【配列表】
2017018114000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月1日(2016.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び／又は存在／不在を決定するための方法であって、
単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０のポリヌクレオチドに配列番号：１０のヌクレオチド６８６及びヌクレオチド６８７を含む前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む、少なくとも１８ヌクレオチド長である少なくとも１つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１のポリヌクレオチドに配列番号：１１のヌクレオチド７１５とヌクレオチド１６６２との間の前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む、少なくとも１８ヌクレオチド長である少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び
前記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
トウモロコシ植物組織を用いて対立遺伝子の接合状態を決定するための方法であって、
トウモロコシ植物組織由来の前記単離されたゲノムＤＮＡを、
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、少なくとも１８ヌクレオチド長である２つの核酸分子であって、前記核酸分子の一方が、配列番号：１０のヌクレオチド１とヌクレオチド６８６との間の前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズし、前記核酸分子の他方が、配列番号：１０のヌクレオチド６８７とヌクレオチド８２５との間の前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズする、核酸分子、及び
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、少なくとも１８ヌクレオチド長である２つの核酸分子であって、前記核酸分子の一方が、配列番号：１１のヌクレオチド１とヌクレオチド７１５との間の前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズし、前記核酸分子の他方が、配列番号：１１のヌクレオチド１６６２とヌクレオチド１８００との間の領域においてハイブリダイズする、核酸分子、と接触させる工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができる前記２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる前記２つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０のポリヌクレオチドに配列番号：１０のヌクレオチド６８６とヌクレオチド６８７を含む前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブ核酸分子、及び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１のポリヌクレオチドに配列番号：１１のヌクレオチド１７５とヌクレオチド１６６２との間の前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブ核酸分子を、前記増幅反応に含める工程、及び
ゲノムＤＮＡにハイブリダイズしている前記第一及び第二のレポーターのレベルを検出し、それにより前記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記第一のレポーター及び前記第二のレポーターが、区別可能な励起／発光スペクトルを有する蛍光色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のレポーターがＦＡＭであり、及び前記第二のレポーターがＶＩＣである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、１８ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、１８ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子の１つが、配列番号：１０の１８〜３５の連続したヌクレオチドまたはその逆相補鎖と少なくとも９５％同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つの核酸分子が、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、区別可能な励起／発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、ＦＡＭで標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、ＶＩＣで標識される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、ＰＣＲ反応での増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列の増幅が、非ＰＣＲベースの反応での増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ジーメイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）におけるＣＯＭＴ突然変異を同定するための方法であって、配列番号：６を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。
【請求項１４】
植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法であって、
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
前記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程、
前記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０のポリヌクレオチドに配列番号：１０のヌクレオチド６８６およびヌクレオチド６８７を含む前記ポリヌクレオチドの領域においてハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子と、接触させる工程、及び
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させることにより、高ストリンジェンシーで少なくとも１つの核酸分子を結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が前記遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は以下を提供する。
［１］トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び／又は存在／不在を決定するための方法であって、
単離されたゲノムＤＮＡのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
上記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子と接触させる工程、及び
上記単離されたゲノムＤＮＡ中のｂｍ３突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。
［２］上記単離されたゲノムＤＮＡを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの核酸分子、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる２つの核酸分子と接触させる工程、
上記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む上記２つの核酸分子にハイブリダイズする上記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
上記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む上記２つの核酸分子にハイブリダイズする上記単離されたゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、及び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子を、上記増幅反応に含める工程、及び
上記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程
をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記第一のレポーター及び上記第二のレポーターが、区別可能な励起／発光スペクトルを有する蛍光色素である、上記［２］に記載の方法。
［４］上記第一のレポーターがＦＡＭであり、及び上記第二のレポーターがＶＩＣである、上記［３］に記載の方法。
［５］配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも１つの核酸分子が、１０ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さである、上記［１］に記載の方法。
［６］配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも１つの核酸分子が、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さである、上記［５］に記載の方法。
［７］配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも１つの核酸分子の１つが、配列番号：１０の１０と３５の間の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％同一である、上記［５］に記載の方法。
［８］配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも１つの核酸分子が、配列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６からなる群より選択される、上記［７］に記載の方法。
［９］高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、区別可能な励起／発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、上記［１］に記載の方法。
［１０］高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、ＦＡＭで標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１１にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸分子が、ＶＩＣで標識される、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記ヌクレオチド配列の増幅が、ＰＣＲ反応での増幅を含む、上記［１］に記載の方法。
［１２］上記ヌクレオチド配列の増幅が、非ＰＣＲベースの反応での増幅を含む、上記［１］に記載の方法。
［１３］ジーメイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）におけるＣＯＭＴ突然変異を同定するための方法であって、配列番号：６を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。
［１４］植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法であって、
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
上記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程、
上記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１０にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子と、接触させる工程、及び
ＣＯＭＴ遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させることにより、高ストリンジェンシーで少なくとも１つの核酸分子を結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が上記遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。
［１５］上記［１］に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
［１６］上記［２］に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
［１７］上記［１４］に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え植物。
［１８］上記［１４］に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
［１９］上記［１４］に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
ＢＭＲ含有系統についての育種プロセスを大きく向上させることができるＢＭＲトウモロコシ品種（例えば、ｂｍ３突然変異体）のハイスループットＰＣＲベース分子特性決定方法を本明細書に開示する。ｂｍ３突然変異体及び野生型ＣＯＭＴ対立遺伝子の存在又は不在を決定することによる、植物組織サンプル、及び従って該サンプルを調製した植物の接合状態の決定方法を開示する。従って、ｂｍ３遺伝子座における接合状態ステータスを特異的に検出及び試験する、エンドポイント加水分解プローブＰＣＲベース接合状態アッセイ（これを本明細書ではＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとして言及する）を提供する。アッセイであって、ｂｍ３突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスを同じアッセイにおいて利用するものであるアッセイを開示する。
【外国語明細書】
2017018114000001.pdf