(57)【要約】【課題】粒径、細孔径、比表面積等を容易に制御可能な方法で製造することができる、生体分子の分離に適した吸着剤を提供する。【解決手段】一実施形態によると、リン酸カルシウム系粒子の集合体を含み、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍの平均細孔径および４０〜９０ｍ２／ｍＬの比表面積を有する吸着剤が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム系粒子の集合体を含み、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍの平均細孔径および４０〜９０ｍ２／ｍＬの比表面積を有する吸着剤。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム系粒子が、ハイドロキシアパタイト粒子である請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
前記リン酸カルシウム系粒子が、２０〜５０ｎｍの平均長径を有する請求項１または２に記載の吸着剤。
【請求項４】
生体分子を分離精製するためのクロマトグラフィー用充填剤として使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項５】
前記生体分子がタンパク質である、請求項４に記載の吸着剤。
【請求項６】
前記タンパク質が、６０ｋＤａ未満の重量平均分子量を有する請求項５に記載の吸着剤。
【請求項７】
前記タンパク質の動的結合容量が、４分の滞留時間で３０ｍｇ／ｍＬ以上である請求項６に記載の吸着剤。
【請求項８】
前記タンパク質が断片化抗体であり、前記動的結合容量が３０ｍｇ／ｍＬ以上である請求項７に記載の吸着剤。
【請求項９】
前記タンパク質がリゾチームであり、前記動的結合容量が３５ｍｇ／ｍＬ以上である請求項７に記載の吸着剤。
【請求項１０】
前記タンパク質がα−キモトリプシノーゲンＡであり、前記動的結合容量が７０ｍｇ／ｍＬ以上である請求項７に記載の吸着剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の吸着剤を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の吸着剤を用いて生体分子を分離精製することを含む、生体分子の精製方法。
【請求項１３】
前記生体分子がタンパク質である、請求項１２に記載の精製方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が断片化抗体である、請求項１３に記載の精製方法。
【請求項１５】
前記断片化抗体がＦａｂ断片である、請求項１４に記載の精製方法。
【請求項１６】
（ａ）平均長径２０〜５０ｎｍのリン酸カルシウム系粒子を含むスラリーを噴霧乾燥して、リン酸カルシウム系粒子の集合体を得ることと、
（ｂ）前記リン酸カルシウム系粒子の集合体を１００〜７００℃の温度で焼成することと
を含む、吸着剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウム系粒子を含む吸着剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
吸着作用を有する物質をクロマトグラフィー用充填剤として用いて種々の物質の精製を行うことは、広く知られており、充填剤と分離対象物質との間の種々の分子間相互作用を利用して、目的物と不純物の分離が行われる。例えば、液体クロマトグラフィー用充填剤の材料としては、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア等の無機材料、セルロース等の天然高分子、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレート等の合成高分子、カーボン等が使用されている。
【０００３】
加えて、リン酸カルシウム系化合物、特にハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０(ＰＯ４)６(ＯＨ)２）を吸着剤として利用する試みも行われている。ハイドロキシアパタイトは、アミノ酸、タンパク質、脂質、糖のような生体分子に対して高い吸着性を示すことが知られている。このような特性を利用し、ハイドロキシアパタイトは、生体分子等の分離に用いられるカラムクロマトグラフィー用充填剤、余分な脂質や老廃物を吸着し除去することを目的とした化粧品等に利用されている。
【０００４】
リン酸カルシウム系化合物をクロマトグラフィー用充填剤として使用することは、特許文献１〜７および非特許文献１に開示されている。所望の分離特性を有する充填剤を得るべく、特異な結晶構造を有するハイドロキシアパタイト（特許文献１および２）、基材の表面にリン酸カルシウム系化合物をコーティングした充填剤（特許文献４および６）、２種類の大きさの連続気孔構造を有するリン酸カルシウム系多孔質顆粒を使用した吸着分離剤（特許文献５）、ハイドロキシアパタイト粒子の集合体からなるクロマトグラフィー用充填剤（特許文献７）等が開発されている。また、充填剤の製造方法にも種々の工夫がなされており、例えば、特許文献３には、リン酸カルシウム系粒子に熱分解性粒子を混合して造粒した後、高温で焼成することにより液体クロマトグラフィー用充填剤を得る方法が開示されている。また、特許文献７には、リン酸カルシウムの一次粒子を溶媒中に投入することにより集合させて、クロマトグラフィー用充填剤として使用可能なリン酸カルシウム集合体を得る方法が開示されている。
【０００５】
このように多数の充填剤が開発されているが、クロマトグラフィー用充填剤の分野においては、種々の対象物質に応じて、その物質に適した吸着力、細孔径、比表面積等の吸着および／または分離特性を有する吸着剤を開発することは、尽きることのない課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−７０２１２号公報
【特許文献２】特開昭６２−９１４１０号公報
【特許文献３】特開昭６３−１６０４５号公報
【特許文献４】特開昭６３−１６０４４号公報
【特許文献５】特開平３−２１３４２号公報
【特許文献６】特開２００５−３１３１５０号公報
【特許文献７】特開２００５−８２４６５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ruth Freitag, “Isolation and purification of recombinant proteins, antibodies and plasmid DNA with hydroxyapatite chromatography”, Biotechnology Journal, 2012, vol.7, p.90-102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような背景のもと、対象物質に適した吸着および／または分離特性を有する吸着剤が求められている。また、様々な物質に対して適用可能な複数種の吸着剤を容易に得るためには、粒径、細孔径、比表面積等を容易に制御可能な方法で、吸着剤を製造することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、平均長径２０〜５０ｎｍのリン酸カルシウム系粒子を含むスラリーを噴霧乾燥させ、焼成条件をコントロールすることで、対象物質に応じた所望の細孔径および比表面積を有したタンパク質等の生体分子に対する吸着剤を提供することができることを見出した。本発明は、例えば以下のとおりである。
［１］  リン酸カルシウム系粒子の集合体を含み、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍの平均細孔径および４０〜９０ｍ２／ｍＬの比表面積を有する吸着剤。
［２］  前記リン酸カルシウム系粒子が、ハイドロキシアパタイト粒子である［１］に記載の吸着剤。
［３］  前記リン酸カルシウム系粒子（一次粒子）が、２０〜５０ｎｍの平均長径を有する［１］または［２］に記載の吸着剤。
［３−１］  前記リン酸カルシウム系粒子の集合体（二次粒子）が、１０〜２００μｍの平均粒径を有する［１］〜［３］のいずれかに記載の吸着剤。
［３−２］  前記吸着剤が、１０〜２００μｍの平均粒径を有する［１］〜［３−１］のいずれかに記載の吸着剤。
［４］  生体分子を分離精製するためのクロマトグラフィー用充填剤として使用される、［１］〜［３−２］のいずれかに記載の吸着剤。
［５］  前記生体分子がタンパク質である、［４］に記載の吸着剤。
［６］  前記タンパク質が、６０ｋＤａ未満の重量平均分子量を有する［５］に記載の吸着剤。
［７］  前記タンパク質の動的結合容量が、４分の滞留時間で３０ｍｇ／ｍＬ以上である［６］に記載の吸着剤。
［８］  前記タンパク質が断片化抗体であり、前記動的結合容量が３０ｍｇ／ｍＬ以上である［７］に記載の吸着剤。
［９］  前記タンパク質がリゾチームであり、前記動的結合容量が３５ｍｇ／ｍＬ以上である［７］に記載の吸着剤。
［１０］  前記タンパク質がα−キモトリプシノーゲンＡであり、前記動的結合容量が７０ｍｇ／ｍＬ以上である［７］に記載の吸着剤。
［１１］  ［１］〜［１０］のいずれかに記載の吸着剤を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
［１２］  ［１］〜［１０］のいずれかに記載の吸着剤を用いて生体分子を分離精製することを含む、生体分子の精製方法。
［１３］  前記生体分子がタンパク質である、［１２］に記載の精製方法。
［１４］  前記タンパク質が断片化抗体である、［１３］に記載の精製方法。
［１５］  前記断片化抗体がＦａｂ断片である、［１４］に記載の精製方法。
［１６］  （ａ）平均長径２０〜５０ｎｍのリン酸カルシウム系粒子（一次粒子）を含むスラリーを噴霧乾燥して、リン酸カルシウム系粒子の集合体（二次粒子）を得ることと、
（ｂ）前記リン酸カルシウム系粒子の集合体（二次粒子）を１００〜７００℃の温度で焼成することと
を含む、吸着剤の製造方法。
［１６−１］  前記吸着剤は、［１］〜［１０］のいずれかに記載の吸着剤である［１６］に記載の方法。
［１６−２］  前記スラリーは、前記リン酸カルシウム系粒子を溶媒に対して１０〜５０重量％の量で含む、［１６］または［１６−１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特に生体分子の分離に適した吸着剤を提供することができる。また、本発明の吸着剤は、粒径、細孔径、比表面積等を容易に制御可能な方法で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
１．吸着剤の製造方法
まず、吸着剤の製造方法について説明する。本発明の実施形態に係る吸着剤の製造方法は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を、この順で含む：
（ａ）平均長径２０〜５０ｎｍのリン酸カルシウム系粒子を含むスラリーを噴霧乾燥して、リン酸カルシウム系粒子の集合体を得ることと、
（ｂ）前記リン酸カルシウム系粒子の集合体を１００〜７００℃の温度で焼成すること。
【００１２】
上記方法によって製造された吸着剤は、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍの平均細孔径および４０〜９０ｍ２／ｍＬの比表面積を有し、例えばクロマトグラフィー用充填剤として使用することができる。得られる吸着剤の粒径、細孔径、比表面積等の特性から、この吸着剤は特に生体分子の分離において優れた性能を発揮すると言える。また、噴霧乾燥させるスラリー中のリン酸カルシウム系化合物の濃度や噴霧乾燥条件を調整することにより、得られる集合体の粒径を制御することができ、さらに、焼成温度を変化させることにより、得られる吸着剤の細孔径、比表面積等を制御することができる。そのため、様々な物質に対して適用可能な複数種の吸着剤を容易に得ることができる。
【００１３】
以下、上記各工程について順に説明する。
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）においては、リン酸カルシウム系化合物を含むナノ粒子（以下、「一次粒子」または「リン酸カルシウム系粒子」とも称する）を溶媒に分散させてスラリーを調製し、得られたスラリーを噴霧乾燥することによって、リン酸カルシウム系粒子が複数個集まって形成されるリン酸カルシウム系粒子の集合体（以下、「二次粒子」とも称する）を得る。
【００１４】
〔一次粒子およびその製造方法〕
一次粒子は、平均長径が２０〜５０ｎｍであることが好ましく、２０〜４０ｎｍであることがより好ましく、２０〜３０ｎｍであることが特に好ましい。平均長径が上記範囲にある粒子を使用することにより、生体分子、特にタンパク質の精製において優れた吸着能を有する吸着剤を得ることができる。
【００１５】
ここで、一次粒子の平均長径とは、以下に記載する方法で測定された値を意味する。
（一次粒子の平均長径の測定方法）
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いてリン酸カルシウム系粒子群を１，０００倍で撮影した画像において、略直上から撮影されている粒子を選択する。次いで、当該粒子上に、その両端が粒子の外周上に位置する２本の線分を引く。このとき、一方の線分は、その長さが最大となるものとする。更に、２本の線分が各々の中点で互いに直交するように、もう一方の線分を引く。このようにして引かれた２本の線分のうち、短い方の線分の長さを短径、長い方の線分の長さを長径とする。長径の大きなものから順に１００個の粒子を取り出し、１００個の粒子における長径の平均値（相加平均）を求めて、得られた値を一次粒子の平均長径とする。但し、輪郭がぼやけて見える粒子、他の粒子に接近し過ぎていて他の粒子との境界が曖昧な粒子、粒子の一部が他の粒子の影に隠れている粒子等は測定対象から除外する。なお、ここでの一次粒子は、複数のハイドロキシアパタイト粒子が凝集した状態で存在する粒子を意味する。従って、一次粒子の平均長径は、複数のハイドロキシアパタイト粒子が凝集して形成された粒子の平均長径を意味する。
【００１６】
リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０(ＰＯ４)６(ＯＨ)２）、フッ素アパタイト（Ｃａ１０(ＰＯ４)６Ｆ２）、塩素アパタイト（Ｃａ１０(ＰＯ４)６Ｃｌ２）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３(ＰＯ４)２）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でも、機械的強度が高いという点で、ハイドロキシアパタイトが好ましい。
【００１７】
一次粒子におけるリン酸カルシウム系化合物の含量は、好ましくは５０重量％以上であり、より好ましくは７０重量％以上であり、特に好ましくは９０重量％以上である。一次粒子がリン酸カルシウム系化合物の単結晶粒子であることが最も好ましい。
【００１８】
一次粒子としては、市販されているものを購入して使用してもよく、あるいは製造してから使用してもよい。リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトである場合、一次粒子としては株式会社ソフセラ製のハイドロキシアパタイト粒子（平均長径２４ｎｍ）等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、上記平均長径を有するリン酸カルシウム系粒子であれば、適宜使用することができる。
【００１９】
一次粒子を製造する場合、その製造方法は、リン酸カルシウム系化合物を含むナノ粒子を製造できる方法であれば特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム系化合物の種類、目的とする粒径等に応じて適宜選択すればよい。例えば、特開２００２−１３７９１０号公報に記載のように、界面活性剤／水／オイル系エマルジョン相にカルシウム溶液およびリン酸溶液を可溶化して混合し、界面活性剤の曇点以上の温度で反応させることにより、ハイドロキシアパタイトのナノ粒子を製造できる。この際、界面活性剤の官能基および親水性／疎水性比を変えることにより、ハイドロキシアパタイト粒子の大きさを制御することができる。ハイドロキシアパタイト以外のリン酸カルシウム系化合物を使用する場合についても、上記と同様の方法で一次粒子を製造することができる。
【００２０】
界面活性剤のミセルを作る場合には、界面活性剤の官能基（特に、親水性部位）および分子内の親水性／疎水性比が重要であり、これらによってミセルの安定性および曇点に違いが生じる。また、界面活性剤の曇点は、界面活性剤の種類によっても異なる。よって、使用する界面活性剤の種類を適宜変更することにより、ミセルの安定性および曇点を変えることができ、その結果としてリン酸カルシウム系粒子の大きさを制御することができる。
【００２１】
なお、使用する界面活性剤の種類は特に限定されず、例えば特開平５−１７１１１号公報に開示された公知の陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、非イオン性界面活性剤の中から適宜選択して用いることができる。中でも、結晶の形状制御のし易さの観点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的には、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、オキシエチレン−オキシプロピレンブロックコポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、ステアリルアミン塩酸塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルベンゼンジメチルアンモニウムクロライド等の四級アンモニウム塩等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、ラウリルアルコール硫酸エステルナトリウム、オレイルアルコール硫酸エステルナトリウム等の高級アルコール硫酸エステル塩類、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸塩類、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウム等のアルキルアリールスルホン酸塩類等が挙げられる。両性イオン性界面活性剤としては、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、アミンオキサイド型等が挙げられる。これら界面活性剤を、１種単独で、または２種以上を組み合わせて使用することができる。曇点および溶解性の点から、特にペンタエチレングリコールドデシルエーテルを使用することが好ましい。
【００２２】
上記方法におけるオイル相として使用可能な物質としては、例えば、トルエン、キシレン、ヘキサン、ドデカン、シクロヘキサン等の炭化水素類、クロロベンゼン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、ブタノール等のアルコール類、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類が挙げられる。これら物質の中から、水の溶解性が小さく、使用する界面活性剤を溶解するようなものを、１種以上選択して使用する。水および界面活性剤の溶解性の観点から、特にドデカンを使用することが好ましい。
【００２３】
反応温度（すなわち、界面活性剤の曇点以上の温度）、反応時間、原料の添加量等は、所望の一次粒子の構造に応じて適宜最適な条件を採用することができる。ただし、反応温度の上限は、溶液が沸騰しない温度であることが好ましく、例えば９０℃以下である。
上記のように得られた一次粒子を、任意に、水での洗浄工程、遠心分離工程、ろ過工程等に供することができる。
【００２４】
〔二次粒子およびその製造方法〕
続いて、上記のようにして得られた一次粒子を溶媒に分散させてスラリーを調製する。そのスラリーを噴霧乾燥することによって複数の一次粒子が集合し、二次粒子（すなわち、リン酸カルシウム系粒子の集合体）が形成される。
【００２５】
一次粒子を分散させる溶媒としては、水が好ましいが、これに限定されるものではない。
上記溶媒中に、一次粒子を溶媒に対して１０〜５０重量％の量で分散させることが好ましく、より好ましくは１０〜３０重量％である。このような量で溶媒中に分散させることにより、適切な粒径を有する二次粒子が得られる。すなわち、分散させる一次粒子の量が少なすぎると二次粒子の粒径が所望の値よりも小さくなり、一方、一次粒子の量が多すぎると二次粒子の粒径が所望の値よりも大きくなる虞がある。
【００２６】
噴霧乾燥は、公知の噴霧乾燥装置を用いて行うことができるが、二次粒子の粒径を容易に制御することができるという点から、ロータリーアドマイザー方式の噴霧乾燥装置が好適に使用される。ロータリーアドマイザーのディスク形状や回転数を変更することにより、所望の粒径を有する二次粒子を得ることができる。
【００２７】
二次粒子の平均粒径は、好ましくは１０〜２００μｍであり、より好ましくは２０〜１００μｍであり、特に好ましくは３０〜８０μｍである。平均粒径が上記範囲にある二次粒子を使用することにより、生体分子、特にタンパク質の精製において優れた吸着能と分離能を有する吸着剤を得ることができる。ここで、二次粒子の平均粒径とは、レーザー回折・散乱法で測定される体積平均径のことである。
【００２８】
噴霧乾燥は、１９０〜２８０℃で行うことが好ましく、より好ましくは１９０〜２５０℃である。上記範囲の温度で噴霧乾燥することで、収率よく二次粒子を得ることができる。
【００２９】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、二次粒子を焼成して、吸着剤を得る。焼成温度は、１００〜７００℃であることが好ましく、例えば、１００〜６００℃、１００〜５００℃、１００〜４００℃、１００〜３００℃、１００〜２００℃、２００〜７００℃、２００〜６００℃、２００〜５００℃、２００〜４００℃、２００〜３００℃、３００〜７００℃、３００〜６００℃、３００〜５００℃、３００〜４００℃、４００〜７００℃、４００〜６００℃、４００〜５００℃、５００〜７００℃、５００〜６００℃、６００〜７００℃であってよい。上記温度範囲のうち、例えば、２００〜６００℃または３００〜５００℃で焼結することが、吸着および／または分離特性と粒子の安定性との両立という観点でより好ましい。
焼成工程における昇温速度、最高温度、保持時間等は、吸着剤の特性（特に、粒径、気孔率、細孔径、比表面積等）を決定付ける重要な因子である。従って、これらの条件を適切に設定することにより、所望の特性を有する吸着剤を得ることができる。焼成温度を高く設定することや、焼成時間を長くすることにより、吸着剤の細孔径は大きくなる傾向にあり、一方、比表面積は小さくなる傾向にある。このように、上記方法によれば、焼成温度や焼成時間を調節することにより種々の細孔径および比表面積を有する吸着剤を製造することができる。よって、簡便な方法で、対象物質に適した吸着および／または分離特性を有する種々の吸着剤を得ることができる。
【００３０】
焼成時の昇温速度は、５〜２０℃／分であることが好ましい。また、最高温度での保持時間は、５〜２４０分であることが好ましく、３０〜１２０分であることがより好ましい。上記のような好ましい条件で焼成することにより、生体分子、特にタンパク質の精製において優れた分離能を有する吸着剤を得ることができる。
【００３１】
焼成工程の後、任意に、洗浄工程および乾燥工程等を行ってもよい。また、得られた吸着剤を分級し、所望のサイズの吸着剤のみを選別して使用することもできる。
【００３２】
２．吸着剤
本発明の一実施形態によると、上記方法で製造され得る吸着剤が提供される。すなわち、リン酸カルシウム系粒子の集合体を含み、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍの平均細孔径および４０〜９０ｍ２／ｍＬの比表面積を有する吸着剤が提供される。上記吸着剤は、生体分子、特にタンパク質の精製において優れた吸着能および分離能を有し、タンパク質を分離精製するために好適に使用される。特に、タンパク質を分離精製するためのクロマトグラフィー用充填剤として優れた性能を発揮する。分離対象のタンパク質は特に限定されるものではないが、比較的分子量の低いタンパク質が好ましく、例えば、重量平均分子量が６０ｋＤａ未満のタンパク質である。タンパク質の重量平均分子量は、好ましくは１０ｋＤａ以上６０ｋＤａ未満であり、より好ましくは２０〜５５ｋＤａである。具体的には、リゾチーム、断片化抗体（例えばＦａｂ断片）、ｓｃＦＶ、Ｄｉａｂｏｄｙ、エリスロポエチン、インシュリン、インターフェロン類、アルブミン、キモトリプシノーゲン等が挙げられる。
対象物質はこれらに限定されるわけではなく、上述したように、焼成温度および／または焼成時間を変更することにより種々の吸着および／または分離特性を有する吸着剤を容易に得られるため、種々の物質を対象とすることが可能である
【００３３】
吸着剤の平均粒径は、好ましくは１０〜２００μｍであり、より好ましくは２０〜１００μｍであり、特に好ましくは３０〜８０μｍである。平均細孔径は、水銀圧入法によって測定した場合に１５〜３６ｎｍであることが好ましく、１６〜２４ｎｍであることがより好ましい。比表面積は、水銀圧入法によって測定した場合に４０〜９０ｍ２／ｍＬであることが好ましく、５０〜８０ｍ２／ｍＬであることがより好ましく、５５〜７０ｍ２／ｍＬであることが特に好ましい。ここで、吸着剤の平均粒径とは、レーザー回折・散乱法で測定される体積平均径のことである。
ここで、平均細孔径は、水銀圧入時に０．００１８〜０．９５μｍの範囲で下記式（１）（Ｗａｓｈｂｕｒｎの式）より算出される細孔直径の平均値（相加平均）である。また、比表面積は、下記式（２）より算出した値である。
式（１）：｛細孔直径｝＝−４×｛水銀の表面張力｝×ｃｏｓ｛水銀と試料の接触角｝／｛圧力｝
式（２）：｛比表面積｝＝２×｛水銀の圧入体積｝／｛細孔半径｝／｛試料重量｝／｛膨潤度｝
【００３４】
本発明によると、上記範囲の平均粒径、平均細孔径および比表面積を有する吸着剤が得られ、このような平均粒径、平均細孔径および比表面積の値が、タンパク質の分離精製においては好ましい。
【００３５】
重量平均分子量が６０ｋＤａ未満のタンパク質を分離する場合、リゾチーム、断片化抗体およびα−キモトリプシノーゲンＡを例にとると、本発明の吸着剤に対するリゾチームの動的結合容量は、４分の滞留時間で３５ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、３５〜７０ｍｇ／ｍＬまたは３５〜６０ｍｇ／ｍＬ）、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、４０〜７０ｍｇ／ｍＬまたは４０〜６０ｍｇ／ｍＬ）、特に好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、５０〜７０ｍｇ／ｍＬまたは５０〜６５ｍｇ／ｍＬ）である。また、断片化抗体の動的結合容量は、４分の滞留時間で３０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、３０〜６０ｍｇ／ｍＬまたは３０〜５０ｍｇ／ｍＬ）、好ましくは３５ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、３５〜６０ｍｇ／ｍＬまたは３５〜５０ｍｇ／ｍＬ）、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、４０〜６０ｍｇ／ｍＬまたは４０〜５０ｍｇ／ｍＬ）、特に好ましくは４５ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、４５〜６０ｍｇ／ｍＬまたは４５〜５０ｍｇ／ｍＬ）である。さらに、α−キモトリプシノーゲンＡの動的結合容量は、４分の滞留時間で７０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、７０〜１１０ｍｇ／ｍＬまたは７０〜１００ｍｇ／ｍＬ）、好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、８０〜１１０ｍｇ／ｍＬまたは８０〜１００ｍｇ／ｍＬ）、より好ましくは９０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、９０〜１１０ｍｇ／ｍＬまたは９０〜１００ｍｇ／ｍＬ）、特に好ましくは９５ｍｇ／ｍＬ以上（例えば、９５〜１１０ｍｇ／ｍＬまたは９５〜１００ｍｇ／ｍＬ）である。
なお、本明細書において、「動的結合容量」とは、後述する実施例に記載のように測定した１０％動的結合容量を意味するものとする。
【００３６】
このように、本発明の吸着剤は、比較的分子量の低いタンパク質、特に重量平均分子量が６０ｋＤａ未満のタンパク質（具体的には、リゾチーム、断片化抗体、α−キモトリプシノーゲンＡ等）に対して優れた吸着および／または分離特性を有しており、従って、これらのタンパク質の分離精製に特に有用である。
本発明の一実施形態によると、上記吸着剤を用いて生体分子（特にタンパク質）を分離精製することを含む、生体分子の精製方法が提供される。また、他の実施形態によると、上記吸着剤を含むクロマトグラフィー用充填剤が提供される。
【００３７】
しかしながら、本発明の吸着剤の用途は、クロマトグラフィー用充填剤に限定されるものではない。リン酸カルシウム系化合物、特にハイドロキシアパタイトは生体親和性が高いので、医療分野において、例えば、骨充填剤、歯科用充填剤、薬物徐放剤等として広く用いることができる。また、菌体、酵母等に対する固定化担体、消臭剤等としても好適に用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。
＜実施例１＞
（ハイドロキシアパタイト粒子の集合体の製造）
平均長径２４ｎｍのハイドロキシアパタイト球状粒子（株式会社  ソフセラ製）（一次粒子）を、２０重量％の濃度になるよう水中に分散させて、スラリーを調製した。得られたスラリーをSPRAY DRYER LB-8（大川原化工機株式会社製）を用いて噴霧乾燥することにより、ハイドロキシアパタイト粒子の集合体（二次粒子）を造粒した。造粒の際、噴霧による微粒子化は、所望の粒径が得られるようにロータリーアドマイザーの回転数を１２８００回転として行った。また、噴霧乾燥は、乾燥室入口での熱風温度が１９０℃、風速が６ｍ３/分、SPRAY DRYERLB-8へのスラリー供給量が１７００ｍＬ／ｈｒの条件で実施した。
【００３９】
（焼成工程）
上記で製造したハイドロキシアパタイト二次粒子２００ｇをアルミナ製坩堝に量りとり、焼成炉内に入れた。炉内の温度を、１分間に１０℃の割合で１００℃まで昇温した。そのまま１００℃で１時間保持した後、室温程度に冷えるまで放置した。この焼成ハイドロキシアパタイト粒子に対して重量ベースで１０倍量の１％（ｗ／ｖ）硝酸アンモニウム水溶液を加え、５分間攪拌しながら超音波洗浄を行った。続いて、減圧濾過によりろ液を除き、さらに焼成ハイドロキシアパタイト粒子に対して重量ベースで１０倍量の純水を加えて超音波洗浄を行った。純水による洗浄を３回繰り返した後、６０℃で乾燥して、焼成ハイドロキシアパタイト粒子に含まれる水分を除去した。一晩乾燥した後、焼成ハイドロキシアパタイト粒子を目開き１００μｍ、３８μｍの順に篩にかけ、３８μｍの篩上に残ったものを回収し、吸着剤を得た。
【００４０】
＜実施例２＞
焼成温度を２００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜実施例３＞
焼成温度を３００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜実施例４＞
焼成温度を４００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜実施例５＞
焼成温度を５００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜実施例６＞
焼成温度を６００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜実施例７＞
焼成温度を７００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜比較例１＞
焼成工程を省略したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。比較例１で得られた粒子は不安定で、そのままでは吸着剤としての実際の使用に耐えなかった。
＜比較例２＞
焼成温度を８００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜比較例３＞
焼成温度を９００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜比較例４＞
焼成温度を１０００℃に変更したことを除き、実施例１と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜比較例５＞
（ハイドロキシアパタイト粒子の集合体の製造）
平均長径１３５ｎｍのハイドロキシアパタイト粒子（株式会社  ソフセラ製）（一次粒子）を、１３重量％の濃度になるよう水中に分散させて、スラリーを調製した。得られたスラリーをSPRAY DRYER LB-8（大川原化工機株式会社製）を用いて噴霧乾燥することにより、ハイドロキシアパタイト粒子の集合体（二次粒子）を造粒した。造粒の際、噴霧による微粒子化は、所望の粒径が得られるようにロータリーアドマイザーの回転数を１４，０００回転として行った。また、噴霧乾燥は、乾燥室入口での熱風温度が２００℃、風速が６ｍ３/分、SPRAY DRYERLB-8へのスラリー供給量が１７００ｍＬ／ｈｒの条件で実施した。
（焼成工程）
上記で製造したハイドロキシアパタイト二次粒子２００ｇをアルミナ製坩堝に量りとり、焼成炉内に入れた。炉内の温度を、１分間に１０℃の割合で４００℃まで昇温した。そのまま４００℃で１時間保持した後、室温程度に冷えるまで放置した。この焼成ハイドロキシアパタイト粒子に対して重量ベースで１０倍量の１％（ｗ／ｖ）硝酸アンモニウム水溶液を加え、５分間攪拌しながら超音波洗浄を行った。続いて、減圧濾過によりろ液を除き、さらに焼成ハイドロキシアパタイト粒子に対して重量ベースで１０倍量の純水を加えて超音波洗浄を行った。純水による洗浄を３回繰り返した後、６０℃で乾燥して、焼成ハイドロキシアパタイト粒子に含まれる水分を除去した。一晩乾燥した後、焼成ハイドロキシアパタイト粒子を目開き１００μｍ、３８μｍの順に篩にかけ、３８μｍの篩上に残ったものを回収した。
＜比較例６＞
焼成温度を６００℃に変更したことを除き、比較例５と同様の方法で吸着剤を製造した。
＜比較例７および８＞
比較例７および８では、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から購入したＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，４０μｍ，Ｔｙｐｅ ＩおよびＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，４０μｍ，Ｔｙｐｅ ＩＩを、それぞれ吸着剤として使用した。
【００４１】
＜試験例１：平均細孔径および比表面積の測定＞
実施例１〜７および比較例２、４〜８の吸着剤について、平均細孔径および比表面積を測定した。測定は、オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を使用して、水銀圧入法にて行った。前処理として、吸着剤を１２０℃で４時間、恒温乾燥した。乾燥後の試料０．３９２ｍＬに最大圧力４．４５ｐｓｉａまで加圧し、水銀の表面張力を４８０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ、水銀と試料との接触角を１４０ｄｅｇｒｅｅｓとして、平均細孔径および比表面積を算出した。
ここで、平均細孔径は、水銀圧入時に０．００１８〜０．９５μｍの範囲で下記式（１）（Ｗａｓｈｂｕｒｎの式）より算出される細孔直径の平均値である。また、比表面積は、式（２）より算出される値の平均値である。
式（１）：｛細孔直径｝＝−４×｛水銀の表面張力｝×ｃｏｓ｛水銀と試料の接触角｝／｛圧力｝
式（２）：｛比表面積｝＝２×｛水銀の圧入体積｝／｛細孔半径｝／｛試料重量｝／｛膨潤度｝
【００４２】
結果を、表１に示す。
【表１】
2017119230.tif 000002
【００４３】
＜試験例２：リゾチームの動的結合容量の測定＞
実施例１〜７および比較例２〜８の吸着剤について、リゾチームの動的結合容量を測定した。各吸着剤を、オムニフィットガラスカラムφ６．６ｍｍに高さ３ｃｍとなるように充填し、中圧液体クロマトグラフィーシステムに接続した。接続したカラムに５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を１０ＣＶ（カラムボリューム）通液した後、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を通液することにより、カラム流出液の２８０ｎｍ吸光度および電気伝導度が安定するまで平衡化を行った。次に、リゾチーム（和光純薬製、重量平均分子量：１４ｋＤａ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、リゾチーム溶液を調製した。このリゾチーム溶液を、吸着剤を充填したカラムに流速０．２５ｍＬ／分で流し（滞留時間：４分）、カラム流出液の２８０ｎｍの吸光度を指標として、以下の式を用いて１０％動的結合容量を算出した。ここで、「１０％動的結合容量」とは、カラム流出液の吸光度を測定して、カラムに負荷したリゾチーム溶液の濃度の１０％の濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるカラム体積当りのリゾチーム負荷量（すなわち、カラムに吸着したリゾチーム量）を意味する。
【００４４】
｛０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるリゾチーム負荷量（ｍｌ）−デッドボリューム（ｍｌ）｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍｌ）であり、システム配管体積は、カラムと液体クロマトグラフィーシステムとを接続するための配管、液体クロマトグラフィーシステム内の配管、バルブ、ＵＶ計の流路等の体積を足し合わせたものである。
リゾチームの動的結合容量の測定結果を表２に示す。
【表２】
2017119230.tif 000003
【００４５】
表２に示したとおり、本発明の吸着剤は、より多くのリゾチームを吸着させることが可能であり、リゾチームと同程度の分子量のタンパク質の精製に有用であると言える。
【００４６】
＜試験例３：断片化抗体（Ｆａｂ断片）の動的結合容量の測定＞
（Ｆａｂ断片の調製）
γ−グロブリン（ヒト血清由来；Ｗａｋｏ製）３ｇを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌシステイン、および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。得られた溶液中に、Ｐａｐａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘ（ＳＩＧＭＡ製）を１００ｍＵとなるように加え、３７℃で酵素分解を行った。４時間後、最終濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにヨードアセトアミド（Ｗａｋｏ製）を加えて、酵素反応を停止した。この反応液を、限外ろ過モジュールＡＣＰ−１０１３（Ａｓａｈｉ ＫＡＳＥＩ）使って、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウムおよび１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で置換し、タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌ程度となるように、ポリクローナル抗体酵素分解物を調製した。
【００４７】
次に、プロテインＡ固定化担体ＫａｎＣａｐＡ（カネカ製）をガラスカラムφ１１ｍｍに高さ１８ｃｍとなるように充填し、中圧液体クロマトグラフィーシステムに接続した。接続したカラムに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムおよび１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を通液することにより、カラム流出液の２８０ｎｍ吸光度および電気伝導度が安定するまで平衡化を行った。続いて、上記で調製したポリクローナル抗体酵素分解物を流速３．０ｍｌ／分でカラムに流し、その流出液を回収した。この回収液を、限外ろ過モジュールＡＣＰ−１０１３（Ａｓａｈｉ ＫＡＳＥＩ製）を使って、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で置換し、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌ程度となるように、プロテインＡ担体溶出画分を調製した。
【００４８】
さらに精製を行うため、比較例２の充填剤をガラスカラムφ２２ｍｍに高さ７．５ｃｍとなるように充填し、中圧液体クロマトグラフィーシステムに接続した。接続したカラムに５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を通液することにより、カラム流出液の２８０ｎｍ吸光度および電気伝導度が安定するまで平衡化を行った。続いて、上記で調製したプロテインＡ担体溶出画分を流速５．０ｍｌ／分でカラムに流した後、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で非吸着物を洗浄した。さらに、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムおよび１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を流し、溶出物を回収した。この回収液を、分画分子量１２，０００〜１４，０００のセルロース膜を使って、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で透析し、得られたＦａｂ断片（重量平均分子量：５０ｋＤａ）を動的結合容量の測定に使用した。
【００４９】
（動的結合容量の測定）
実施例１〜７および比較例２〜８の吸着剤を、オムニフィットガラスカラムφ６．６ｍｍに高さ３ｃｍとなるように充填し、中圧液体クロマトグラフィーシステムに接続した。５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を１０ＣＶ（カラムボリューム）通液した後、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を通液することにより、カラム流出液の２８０ｎｍ吸光度および電気伝導度が安定するまで平衡化を行った。一方、上記で調製したＦａｂ断片サンプルを、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、Ｆａｂ断片溶液を調製した。このＦａｂ断片溶液を、吸収剤を充填したカラムに流速０．２５ｍｌ／分で流し（滞留時間：４分）、カラム流出液の２８０ｎｍの吸光度を指標として、以下の式を用いて１０％動的結合容量を算出した。ここで、「１０％動的結合容量」とは、カラム流出液の吸光度を測定して、カラムに負荷したＦａｂ断片溶液の濃度の１０％の濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるカラム体積当りのＦａｂ断片負荷量（すなわち、カラムに吸着したＦａｂ断片量）を意味する。
【００５０】
｛０．１ｍｇ／ｍＬのＦａｂ断片濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるＦａｂ断片の負荷量（ｍｌ）−デッドボリューム（ｍｌ）｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍｌ）である。結果を表３に示す。
【表３】
2017119230.tif 000004
【００５１】
表３に示したとおり、本発明の吸着剤は、より多くのＦａｂ断片を吸着させることが可能であり、Ｆａｂ断片と同程度の分子量を有するタンパク質の精製に有用であると言える。
【００５２】
＜試験例４：α−キモトリプシノーゲンＡの動的結合容量の測定＞
実施例１〜７および比較例２〜８の吸着剤について、α−キモトリプシノーゲンＡの動的結合容量を測定した。各吸着剤を、オムニフィットガラスカラムφ６．６ｍｍに高さ３ｃｍとなるように充填し、中圧液体クロマトグラフィーシステムに接続した。接続したカラムに５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を１０ＣＶ（カラムボリューム）通液した後、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を通液することにより、カラム流出液の２８０ｎｍ吸光度および電気伝導度が安定するまで平衡化を行った。次に、α−キモトリプシノーゲンＡ（シグマ社製、重量平均分子量：２５ｋＤａ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解して、α−キモトリプシノーゲンＡ溶液を調製した。このα−キモトリプシノーゲンＡ溶液を、吸着剤を充填したカラムに流速０．２５ｍＬ／分で流し（滞留時間：４分）、カラム流出液の２８０ｎｍの吸光度を指標として、以下の式を用いて１０％動的結合容量を算出した。ここで、「１０％動的結合容量」とは、カラム流出液の吸光度を測定して、カラムに負荷したα−キモトリプシノーゲンＡ溶液の濃度の１０％の濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるカラム体積当りのα−キモトリプシノーゲンＡ負荷量（すなわち、カラムに吸着したα−キモトリプシノーゲンＡ量）を意味する。
【００５３】
｛０．１ｍｇ／ｍＬのα−キモトリプシノーゲンＡ濃度に相当する吸光度が検出された時点におけるα−キモトリプシノーゲンＡ負荷量（ｍｌ）−デッドボリューム（ｍｌ）｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍｌ）であり、システム配管体積は、カラムと液体クロマトグラフィーシステムとを接続するための配管、液体クロマトグラフィーシステム内の配管、バルブ、ＵＶ計の流路等の体積を足し合わせたものである。
α−キモトリプシノーゲンＡの動的結合容量の測定結果を表４に示す。
【表４】
2017119230.tif 000005
【００５４】
表４に示したとおり、本発明の吸着剤は、より多くのα−キモトリプシノーゲンＡを吸着させることが可能であり、α−キモトリプシノーゲンＡと同程度の分子量を有するタンパク質の精製に有用であると言える。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。