(57)【要約】【課題】Ｍ２様マクロファージ組成物原料およびＭ２様マクロファージ組成物の製造方法を提供する。【解決手段】本実施形態に従うＭ２様マクロファージ組成物の製造方法は、マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で培養することにより、Ｍ２様マクロファージ組成物を得ることを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で培養することにより、Ｍ２様マクロファージ組成物を得ることを含むＭ２様マクロファージ組成物を製造する方法。
【請求項２】
前記マクロファージ原料細胞が、未分化のマクロファージおよび／またはマクロファージ前駆細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロファージ原料細胞が治療対象起源であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脾臓細胞を一次培養してマクロファージ原料細胞を得ること、並びに
前記一次培養により得られた前記マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で二次培養し、これによりＭ２様マクロファージ組成物を得ることを含むＭ２様マクロファージ組成物を製造する方法。
【請求項５】
前記マクロファージ原料細胞が、未分化のマクロファージおよび／またはマクロファージ前駆細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記脾臓細胞が治療対象起源であることを特徴とする請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で培養し、マクロファージ群を得ること、並びに前記培養により得られた前記マクロファージ群をゲルに分散することにより、Ｍ２様マクロファージ組成物を得ること
を含む創傷治癒のための組成物の製造方法。
【請求項８】
前記マクロファージ原料細胞が治療対象起源であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記高分子量ヒアルロン酸が、分子量１５０万〜３９０万であることを特徴とする請求項１〜８の何れか1項に記載の方法。
【請求項１０】
マクロファージ原料細胞、並びにマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地を含むＭ２様マクロファージ組成物原料。
【請求項１１】
前記マクロファージ原料細胞が脾臓細胞、未分化マクロファージ、またはマクロファージ前駆細胞である請求項１０に記載の組成物原料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法、およびＭ２様マクロファージ組成物原料に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の創傷治癒の過程では、炎症性のＭ１マクロファージの出現と、それに続く、創傷治癒性のＭ２マクロファージの出現が必須であると考えられている（非特許文献１）。糖尿病における創傷や慢性静脈性下腿潰瘍においては、Ｍ２へのサブクラス変換に障害があり、創傷治癒が阻害されるとの報告がある（非特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lucas T, Waisman A, Ranjan R, Roes J, Krieg T, Mueller W, Roers A, Eming SA., "Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair.", J Immunol. 2010 Apr 1;184(7):3964-77.
【非特許文献２】Okizaki S, Ito Y, Hosono K, Oba K, Ohkubo H, Amano H, Shichiri M, Majima M., " Suppressed recruitment of alternatively activated macrophages reduces TGF-β1 and impairs wound healing in streptozotocin-induced diabetic mice.e", Biomed Pharmacother. 2015 Mar;70:317-25.
【非特許文献３】Sindrilaru A, Peters T, Wieschalka S, Baican C, Baican A, Peter H, Hainzl A, Schatz S, Qi Y, Schlecht A, Weiss JM, Wlaschek M, Sunderkoetter C, Scharffetter-Kochanek K., " An unrestrained proinflammatory M1 macrophage population induced by iron impairs wound healing in humans and mice.", J Clin Invest. 2011 Mar;121(3):985-97.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の状況に鑑み、本願発明の目的は、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法、およびＭ２様マクロファージ組成物原料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本実施形態に従うＭ２様マクロファージ組成物の製造方法は、マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で培養することにより、Ｍ２様マクロファージ組成物を得ることを含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法、およびＭ２様マクロファージ組成物原料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図２】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図３】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図４】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図５】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図６】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【図７】実施形態の例における実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【０００９】
実施形態に従うＭ２様マクロファージ組成物の製造方法は、マクロファージ原料細胞をマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地中で培養することにより、Ｍ２様マクロファージ組成物を得ることを含む。
【００１０】
一般的なマクロファージ原料細胞は、未分化マクロファージおよび／またはマクロファージ前駆細胞であり得る。未分化マクロファージは、例えば、サブクラスへ分化していないマクロファージまたは非活性型マクロファージなどであり得る。マクロファージ前駆細胞は、例えば、単球などであり得る。また、マクロファージ原料細胞は、後述するような、脾臓細胞から調製されたものであり得る。
【００１１】
マクロファージ原料細胞は、治療対象起源であり得る。例えば、マクロファージ原料細胞は、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造に先駆けて、Ｍ２様マクロファージ組成物により治療されるべき対象から採取され得る。
【００１２】
治療対象起源のマクロファージ原料細胞は、言い換えれば、自家由来のマクロファージ原料細胞である。マクロファージ原料細胞は、自家由来であってもよく、他家由来であってもよい。他家由来のマクロファージ原料細胞が使用される場合には、例えば、それは、治療対象と適合するマクロファージ原料細胞であることが好ましい。治療対象と適合する他家由来のマクロファージ原料細胞とは、治療対象に対して望まない影響、例えば、悪影響を及ぼさないものであり得る。そのような他家由来のマクロファージ原料細胞であるか否かの判断は、それ自体公知の基準に従い、例えば、免疫に関する専門知識を有する者が行うことが可能である。そのような判断は、例えば、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造前若しくは後、またはＭ２様マクロファージ組成物の使用前に、治療対象の血液型または血球の型と照合することにより行われ得る。
【００１３】
対象または対象以外の起源動物若しくは起源組織若しくは起源臓器からのマクロファージ原料細胞を採取する方法は、それ自体公知の何れかの手段が使用され得る。例えば、それは、採血、脾臓からの細胞採取または骨髄からの細胞採取などであり得る。
【００１４】
治療対象は、哺乳類であってよく、例えば、ヒト、サル、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスおよびウサギなどであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
脾臓細胞を出発物質として、上述のようなマクロファージ原料細胞を得て、それを用いてＭ２様マクロファージ組成物が製造されてもよい。また、脾臓細胞を出発物質として、Ｍ２様マクロファージ組成物が製造されてもよい。脾臓細胞は、治療対象を基準として、自家由来であっても他家由来であってもよい。
【００１６】
脾臓細胞を出発物質として用いて、Ｍ２様マクロファージ組成物を製造する方法は、例えば、脾臓細胞を一次培養してマクロファージ原料細胞を得ること、および一次培養により得られたマクロファージ原料細胞をＭ−ＣＳＦと５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸とを含む培地中で二次培養し、これによりＭ２様マクロファージ組成物を得ることを含み得る。前記一次培養は、例えば、脾臓細胞をＭ−ＣＳＦの存在下で培養することにより行われ得る。
【００１７】
このような方法により用いられる脾臓細胞は、治療対象起源であり得る。例えば、出発物質としての脾臓細胞は、Ｍ２様マクロファージ組成物の製造に先駆けて、Ｍ２様マクロファージ組成物により治療されるべき対象から採取され得る。脾臓細胞の採取方法は、それ自身公知の何れかの方法により行われ得る。
【００１８】
マクロファージ原料細胞の培養に使用される基礎培地は、一般的にマクロファージを培養するために使用される何れの基礎培地であり得る。出発物質としての脾臓細胞を培養するための基礎培地は、一般的に脾臓細胞を培養するために使用される何れの基礎培地であってもよい。例えば、マクロファージ原料細胞および／または脾臓細胞の培養に使用され得る基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０等であり得る。あるいは、培養されるマクロファージ原料細胞および脾臓細胞の起源となる動物種に応じてより適切な培地が選択されてもよい。
【００１９】
Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法において使用される培地は、基礎培地中に更に血清を含み得る。血清は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清などであってもよい。しかしながら、血清を含まない無血清培地を基礎培地として使用してもよい。
【００２０】
マクロファージ原料細胞を培養するための培地および脾臓細胞を一次培養するための培地に含まれ得るＭ−ＣＳＦの濃度は、例えば、培地中に１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであり得るが、この範囲に限定されない。
【００２１】
マクロファージ原料細胞を培養するための培地に含まれ得る高分子量ヒアルロン酸は、例えば、分子量約１５０万〜３９０万、または分子量約５０万〜６００万のヒアルロン酸であり得る。また、ヒアルロン酸の培地中の濃度は、例えば、５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば、５ｍｇ／ｍＬ〜９ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００２２】
マクロファージ原料細胞および脾臓細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内で行われ得る。例えば、マクロファージ原料細胞の培養は２日〜１４日間に亘り行われればよく、例えば、３、７、１０または１４日間に亘り行われ得る。脾臓細胞の培養は２日〜７日間に亘り行われ、例えば、６日間行われ得る。マクロファージ原料細胞の培養および脾臓細胞の培養においては、２〜３日に一度、新鮮な培地を用いて培地交換が行われ得る。
【００２３】
Ｍ２様マクロファージ組成物に含まれるマクロファージの数は、例えば１×１０４個〜１×１０６個、５×１０４個〜１×１０６個、１×１０５個〜１×１０６個、約１×１０５個であり得る。
【００２４】
本実施形態に従うＭ２様マクロファージ組成物に含まれるマクロファージは、Ｍ２マクロファージを含む。Ｍ２様マクロファージ組成物に含まれるＭ２マクロファージの数は、例えば１×１０４個〜１×１０６個、５×１０４個〜１×１０６個、１×１０５個〜１×１０６個、約１×１０５個であり得る。
【００２５】
このようなＭ２様マクロファージ組成物に含まれるマクロファージの細胞数は従来の方法によって製造される生細胞数よりも多い。それにより、本実施形態に従うマクロファージの製造方法は、従来よりも多くの生細胞が得られる。また、実施形態によれば、簡便な工程でＭ２様マクロファージ組成物を得ることが可能である。
【００２６】
更なる実施形態において、本実施形態に従うＭ２様マクロファージ組成物は、Ｍ２様マクロファージ組成物原料を用いて製造されうる。Ｍ２様マクロファージ組成物原料は、マクロファージ原料細胞、並びにＭ−ＣＳＦおよび５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸を含む培地を含む。Ｍ２様マクロファージ組成物原料の培地は、さらに、血清を含み得る。Ｍ２様マクロファージ組成物原料に含まれ得る、マクロファージ原料細胞、Ｍ−ＣＳＦ、５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の高分子量ヒアルロン酸、培地および血清は、それぞれ上述したものと同様のものであり得る。Ｍ２様マクロファージ組成物原料に含まれるマクロファージ原料細胞は、脾臓細胞であってもよい。
【００２７】
Ｍ２様マクロファージ組成物原料を用いてＭ２様マクロファージ組成物を製造する場合、Ｍ２様マクロファージ組成物原料が、上述と同様の方法で培養されてＭ２様マクロファージ組成物が得られ得る。
【００２８】
上述の製造方法により得られたＭ２様マクロファージ組成物も本発明の実施形態として提供される。以下に、Ｍ２様マクロファージ組成物の特徴について説明する。
【００２９】
マクロファージから一般的に発現されるＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｄｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）は、マクロファージのサブタイプのマーカーとして用いられ得る。当該マーカーは、公知のマクロファージのサブタイプＭ２、即ち、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃおよびＭ２ｄ、並びに公知のサブタイプＭ１において発現が確認されるマーカーである。
【００３０】
Ｍ２様マクロファージ組成物に含まれるマクロファージ群は、ＴＧＦ−βおよびＤｅｃｔｉｎ−１の発現量が少なく、ＶＥＧＦの発現量が多いという特徴を有する。
【００３１】
Ｍ２様マクロファージ組成物に含まれるマクロファージ群の特徴を以下の表１に示す。
【表１】
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【００３２】
ＴＮＦ−αは、腫瘍壊死因子であり、炎症を発生させる因子として知られている。これは、間接リウマチ、糖尿病などの疾患をもつ対象においてその発現が確認されている。ＴＧＦ−βは、腫瘍増殖因子であり、骨芽細胞の増殖およびコラーゲンなどの結合組織の合成および増殖を促進する因子として知られている。これらのＴＮＦ−αは炎症性因子として知られ、それに対してＴＧＦ−βは、抗炎症性因子として知られている。Ｄｅｃｔｉｎ−１は、免疫を高め、腫瘍などの悪性因子を攻撃するβグルカンのレセプターであり、真菌の防御因子として働く物質であることが知られている。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞増殖因子として知られ、血管形成に関与する糖蛋白質である。
【００３３】
表１に示されるように、Ｍ１マクロファージでは、ＴＮＦ−αの発現量が多く、Ｄｅｃｔｉｎ−１の発現量が少ない。Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃマクロファージでは、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦの発現量が少なく、Ｄｅｃｔｉｎ−１の発現量が多い。Ｍ２ｄマクロファージは、Ｄｅｃｔｉｎ−１の発現量が少なく、ＶＥＧＦの発現量が多い。
【００３４】
実施形態に従うマクロファージ組成物に含まれるマクロファージ群には、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂもしくはＭ２ｃマクロファージ、Ｍ２ｄマクロファージ、またはその他のマクロファージが何れかの組み合わせで混合して含まれ得る。そして４つの蛋白質の発現量の特徴は、上述のＭ１マクロファージ、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂもしくはＭ２ｃマクロファージの何れとも異なっているように見える。Ｄｅｃｔｉｎ−１の値が低く、ＶＥＧＦ値が高い点は、実施形態に従うマクロファージ組成物は、Ｍ２ｄクラスのマクロファージと類似しているように見える。ここでは、このような実施形態に従うマクロファージ組成物を「Ｍ２様マクロファージ」と称している。
【００３５】
従来では、創傷治癒効果を有するＭ２マクロファージ組成物はなく、創傷治癒においてＭ２マクロファージの誘導剤が提案されているのみである。このような誘導剤を用いた治療は、間接的にＭ２マクロファージを利用し得る治療である。そのため、Ｍ２マクロファージの効果を有効に利用しにくいと考えられる。これに対して実施形態のマクロファージ組成物では、目的とするマクロファージ自身を直接に用いることができるので、創傷治癒の目的や効果に応じて適切な治療が可能となる。従って、より効率的な効果が期待できる。また、実施形態のマクロファージ組成物は、製造において複雑な操作を必要とせず、簡便に製造することができるため、利便性に優れる。簡便に得られることから、Ｍ２様マクロファージ組成物は、Ｍ２マクロファージの基礎研究においても有用である。
【００３６】
実施形態に従うマクロファージ組成物は、創傷治癒を促進する効果を有し得る。従って、創傷部位に適用する医薬組成物として使用され得る。
【００３７】
Ｍ２様マクロファージ組成物は、上述のように得られたマクロファージ群をゲルに分散することによって製造されてもよい。
【００３８】
このような組成物は、マクロファージとそれを含むゲルとを含む。使用され得るゲルは、マクロファージを担持し得る担体であればよい。また当該ゲルは、ゲル中のマクロファージが治療部位へ遊走可能な程度の軟性または流動性を有する。そのようなゲルの例は、例えば、高分子ゲルであればよく、ヒアルロン酸ゲル、コラーゲンゲル、寒天ゲルおよびゼラチンゲルなどであり得る。
【００３９】
また、高分子ゲルが、ヒアルロン酸ゲル以外である場合には、マクロファージと共にヒアルロン酸を含有してもよい。その場合、ヒアルロン酸濃度は、例えば、５ｍｇ／ｍＬ〜９ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００４０】
高分子量ヒアルロン酸の分子量は、分子量約５０万〜６００万であってもよい。
【００４１】
実施形態に従う組成物は、マクロファージおよびゲルに加えて、更なる成分を含んでもよい。更なる成分の例は、医薬組成物を維持するための成分、例えば、防腐剤、安定化剤、ｐＨ調整剤などであってもよい。当該組成物は、更に第２の活性成分などを含んでもよい。第２の活性成分は、マクロファージの創傷治癒効果を妨げることのなく、創傷治癒を促進する第２の薬理効果を有する成分または創傷部を保護する成分であり得る。例えば、第２の活性成分は、抗菌剤、ヒアルロン酸ゲル、基礎培地、血清、抗生物質、Ｍ−ＣＳＦなどであってもよい。
【００４２】
また、マクロファージを含有するゲルは、被覆材、例えば、ガーゼ、フィルム、シートおよびテープなどの医療用布、不織布、樹脂および紙などの医療用として用いられる面状体に塗布されて提供されてもよい。
【００４３】
当該マクロファージの適用は、ゲルに含有された状態で創傷部位に塗布されればよい。また、マクロファージ含有のゲルを塗布した部位を更に被覆材で覆ってもよい。或いはマクロファージ含有ゲルは、被覆材に塗布された状態で患部に適用されてもよい。
【００４４】
治療に使われるマクロファージは、他家マクロファージであっても、自家マクロファージであってもよい。
【００４５】
実施形態に従うマクロファージにより治療され得る疾患は、創傷、例えば、外傷、褥瘡、治療や疾患に伴う難治性創傷、例えば、糖尿病性潰瘍、静脈鬱滞性潰瘍、動脈性潰瘍、虚血性潰瘍、膠原病に伴う潰瘍、放射線潰瘍、壊疽治療に伴う潰瘍などを含む。実施形態のマクロファージによれば、例えば、Ｍ１マクロファージによる炎症遷延による難治性創傷の治癒を促進することが可能である。
【００４６】
［例］
例１．ヒアルロン酸の有無による生細胞率の比較と、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ＶＥＧＦの発現量の比較
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、６週〜８週）を頸椎脱臼により安楽死させ、背部皮膚を切開して脾臓を採取した。この脾臓をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中において、Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒを用いて濾過し、回収したＰＢＳを遠心して脾臓細胞ペレットを得た。
【００４７】
得られた細胞ペレットを、ＤＭＥＭを基礎培地とし、そこに１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを含ませた培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で６日に亘り一次培養した。
【００４８】
次に、一次培養で得られた細胞をトリプシンまたはＣｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミリポア社）を用いて剥離して回収した。得られた培地懸濁液を、遠心し、細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを５×１０３個〜１０×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、細胞培養用プレートに播種した。これを１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、高濃度ヒアルロン酸（５〜６．７ｍｇ／ｍｌ，分子量１５０万−３９０万）に、Ｍ−ＣＳＦ（１０−１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日に亘り二次培養した。
【００４９】
二次培養は、上記の培地に細胞を混和させた状態（以下「Ｍｉｘ」と記す）、あるいは付着した細胞の上に上記の培地を加えた状態（以下「Ａｄｈ」と記す）で行った。対照群として、同様の付着した細胞に、ヒアルロン酸を含まないこと以外は上記と同様の培地を加えて二次培養したもの（以下、「ｃｏｎｔ」と記す）を用いた。ヒアルロン酸を含んだ培地の乾燥を防ぐため、ヒアルロン酸を除いた上記培地を、上記培地の１０−１００％量加えた。
【００５０】
上記条件で培養したマクロファージを二次培養開始から７日後に、トリプシンまたはＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミリポア社）を用いて剥がした。この細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡ合成し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｄｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦの遺伝子発現量を評価した。この実験を２０１５年８月１８日、２０１５年８月２５日および２０１５年９月１０日に行い、これらの３回の実験結果の平均値を算出した。２０１５年８月１８日に行った実験の二次培養には、細胞培養用プレートとして６ウェルプレートを用いた。他の日に行った実験の二次培養には、細胞培養用プレートとして６０ｍｍディッシュを用いた。
【００５１】
図１にｃｏｎｔにおける値を１としたときのＭｉｘおよびＡｄｈの相対値を示した。図１に示されるように、ＭｉｘおよびＡｄｈのＴＧＦ−βおよびＤｅｃｔｉｎ−１の値は、コントロールより有意に低い値であった。
【００５２】
図２に培養開始時の値を１としたときのｃｏｎｔおよびＡｄｈの相対値を示した。図２に示されるように、ＡｄｈのＴＧＦ−βおよびＤｅｃｔｉｎ−１の値はｃｏｎｔと比べて有意に低かった。ｃｏｎｔのＴＧＦ−βの値は、培養開始時より有意に高かった。
【００５３】
したがって、実施形態に従うマクロファージ組成物製造方法によって、ＴＧＦ−β（ｌｏｗ）、Ｄｅｃｔｉｎ−１（ｌｏｗ）細胞群を製造できることが明らかとなった。
【００５４】
例２．ヒアルロン酸の有無によるマクロファージ生細胞の割合の比較
例１で用いたマクロファージ（ｃｏｎｔ、Ａｄｈ、Ｍｉｘ）の二次培養開始から７日後のものをトリプシンまたはＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて剥がし、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により細胞数の測定を行った。その結果を表２に示す。表２に、上述した各例の実験に用いたマクロファージの死細胞数（ｎｏｎ ｖｉａｂｌｅ）、全細胞数（ａｌｌ）、生細胞数（ｖｉａｂｌｅ）、生細胞率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、溶液量、全ウェルまたは全ディッシュの総細胞数（ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌｓ）、１ウェルまたは１ディッシュあたりの細胞数（１ｗｅｌｌまたは１ｄｉｓｈ）、培養０日目の生細胞数に対する培養７日目の生細胞数の割合（７ｄ／０ｄ）、および生細胞率の３回の実験における平均値（平均生細胞率）を示した。
【００５５】
図３は、平均生細胞数を表した棒グラフである。ＭｉｘおよびＡｄｈでは、ｃｏｎｔよりも得られた生細胞率が有意に高かった。
【００５６】
したがって、実施形態のマクロファージ製造方法は、ヒアルロン酸を含まない培養法よりも得られる生細胞の割合が高いことが明らかとなった。
【表２】
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【００５７】
例３．ヒアルロン酸の有無によるＤｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦの発現評価
例１の２０１５年８月２６日に調製したマクロファージ（Ｍｉｘ、Ａｄｈおよびｃｏｎｔ）を用いて、Ｄｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦの発現評価を行った。各マクロファージの二次培養開始時および二次培養開始７日後に、細胞をトリプシンまたはＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて剥がした。この細胞を用いて、Ｄｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦ抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を行った。
【００５８】
ＦＣＭの結果を図４〜図６に示す。図４がｃｏｎｔ、図５がＡｄｈ、図６がＭｉｘの結果を示している。各図の上段がアイソタイプコントロール、下段が、Ｄｅｃｔｉｎ−１およびＶＥＧＦ抗体を用いた二重染色の結果を示している。Ｄｅｃｔｉｎ−１（−）およびＶＥＧＦ（＋）細胞の割合は（Ｑ１）、Ａｄｈで最も高く、４６．６％であった。また、Ａｄｈにおける細胞数Ｄｅｃｔｉｎ−１（−）ＶＥＧＦ（＋）細胞の数は、ｃｏｎｔの約３倍であった。
【００５９】
したがって、実施形態に従うマクロファージ組成物製造方法によって、Ｄｅｃｔｉｎ−１（−）ＶＥＧＦ（＋）細胞をより多く製造できることが明らかとなった。
【００６０】
例４．Ｉｎ ｖｉｖｏにおける創傷治癒効果
例１の２０１５年９月１０日に調製したマクロファージ（Ｍｉｘ、Ａｄｈおよびｃｏｎｔ）を用いてそれらの創傷治癒効果の評価を行った。二次培養開始時および培養開始７日後に、これらの細胞をヒアルロン酸ゲルと混合し、マウスの皮膚損傷部に塗布した。その後、損傷部を上から透明なフィルムを添付したサージット（登録商標）で覆った。これらの損傷部を１日毎に観察し、損傷部の面積を記録した。コントロールとして、ヒアルロン酸のみを塗布した損傷部（ＨＡ）および治療を施さない損傷部（Ｎｏｎｅ）の観察も行った。その結果を図７に示した。Ａｄｈにおける損傷部面積が細胞を付与しないＨＡと比べて小さくなる傾向にあった。
【００６１】
以上のように、実施形態によれば、Ｍ２様マクロファージ組成物を製造方法が提供される。また上述の実験データにより示されるように、実施形態に従う製造方法によれば、得られる生細胞数が多いことが明らかとなった。また、当該製造方法によって得られるＭ２様マクロファージ組成物によれば、創傷治癒が促進できることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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