(57)【要約】      （修正有）【課題】反応液中の補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを取得することで、酵素の活性を高精度かつ高効率に定量し、これにより阻害剤又は賦活剤の同定を行う方法を提供する。【解決手段】補酵素及び被験化合物、又は酵素、補酵素、基質及び被験化合物を含む溶液を反応させ、反応後の溶液に含まれる未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトル及び／又は補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを測定する。補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、又はそれらの比を、被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標として求める。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素阻害剤又は賦活剤のスクリーニングのための方法であって、
酵素、補酵素及び被験化合物、又は酵素、補酵素、基質及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトル及び／又は補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、又はそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法。
【請求項２】
酵素阻害剤又は賦活剤を同定するための方法であって、
酵素、補酵素及び被験化合物、又は酵素、補酵素、基質及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトル及び／又は補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、又はそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法。
【請求項３】
酵素がキナーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
キナーゼがＰＩＰキナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＩＰキナーゼがＰＩ５Ｐ４Ｋである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
補酵素がＧＴＰ又はＡＴＰであり、補酵素由来の反応生成物がＧＤＰ又はＡＤＰである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
補酵素がＧＴＰであり、補酵素由来の反応生成物がＧＤＰである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が酵素の基質を含まない、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＧＴＰアーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性又はアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質の阻害剤又は賦活剤のスクリーニングのための方法であって、
該タンパク質、ＧＴＰ又はＡＴＰ、及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトル、及び／又はＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
ＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、あるいはそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法。
【請求項１０】
ＧＴＰアーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性又はアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質の阻害剤又は賦活剤を同定するための方法であって、
該タンパク質、ＧＴＰ又はＡＴＰ、及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトル、及び／又はＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
ＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、あるいはそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法。
【請求項１１】
ＧＴＰアーゼ活性又はＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質が、Ｇタンパク質もしくはＧタンパク質共役受容体複合体、チューブリン又はＲａｓである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＭＲが１Ｈ−ＮＭＲである、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰの８位のプロトンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのシグナル強度が比較される、請求項６、７及び９から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液が複数種の被験化合物を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液が５〜１５種の被験化合物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
既知薬のドラッグリポジショニングのための方法である、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液ＮＭＲ（核磁気共鳴）を用いた薬剤のスクリーニング方法（薬剤の探索方法）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発において、標的タンパク質の機能を制御する生理活性物質の創製は、欠くことのできない重要な段階である。創薬標的タンパク質の広範化や分子標的薬開発の必要性に対応して、様々な標的タンパク質に対して、多様な低分子化合物や既存の薬剤のスクリーニングを行う技術の開発が進んできた。特に既存薬剤を用いる手法はドラッグリポジショニングとして知られ、安全性の担保された薬剤候補化合物が獲得できることから、近年注目を集めている。
【０００３】
従来、酵素阻害剤又は賦活剤のスクリーニング手法として、未反応の基質やＡＴＰ等に蛍光等の標識を施したり、それらに結合し、蛍光もしくは発光を生ずる別の酵素（ルシフェラーゼなど）を用いたりして定量する方法が報告されていた。例えば、ＡＴＰを補酵素とするキナーゼにおいて、キナーゼ活性を測定する手法として、生成するＡＤＰ量を、ルシフェラーゼを用いた蛍光定量法により定量する手法が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、ＮＭＲ法は、薬剤等の研究開発において、従来、主に同位体元素で標識されたタンパク質を用いて、化合物とタンパク質との相互作用の解析による構造活性相関の導出や薬剤のスクリーニングに用いられてきた（非特許文献２）。ＮＭＲ法による解析では、化合物‐タンパク質複合体の相互作用情報とともに、結合部位などの構造情報、複合体の可溶性などの物性情報なども得られることから、高付加価値な化合物‐タンパク質相互作用解析手法として広く用いられている。
【０００５】
【非特許文献１】PLoS One. 2013;8(1):e54127. doi: 10.1371/journal.pone.0054127. Epub 2013 Jan 10.A homogeneous, high-throughput assay for phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase with a novel, rapid substrate preparation.Davis MI, Sasaki AT, Shen M, Emerling BM, Thorne N, Michael S, Pragani R, Boxer M, Sumita K, Takeuchi K, Auld DS, Li Z, Cantley LC, Simeonov A
【非特許文献２】Science. 1996 Nov 29;274(5292):1531-4.Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR by NMR.Shuker SB, Hajduk PJ, Meadows RP, Fesik SW.
【非特許文献３】Curr Protoc Chem Biol. 2013;5(4):251-68. doi: 10.1002/9780470559277.ch130118.Saturation transfer difference NMR for fragment screening.Begley DW, Moen SO, Pierce PG, Zartler ER.
【非特許文献４】Methods Mol Biol. 2014;1140:305-13. doi: 10.1007/978-1-4939-0354-2_22.Ligand screening using NMR.Ramirez BE, Antanasijevic A, Caffrey M.
【非特許文献５】Rameh L.E., et al., Nature 390, 192-196
【非特許文献６】Emerling, B.M., Cell 155, 844-857
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載された方法等、従来の手法においては、反応系に本来存在しない蛍光標識等の導入や、定量のための別のタンパク質が必要なことから、標的とする酵素でなく、ルシフェラーゼを阻害する薬剤が見つかるなど、ＦａｌｓｅＰｏｓｉｔｉｖｅが生じやすいという問題点があった。また、被験化合物自体に蛍光があることも多いことから、対象にすることのできる被験化合物が限定されるなどといった課題も存在した。さらに、反応液をそのまま測定に用いるのではなく、検出試薬の添加やそれに伴う化学反応などで侵襲的な処理を施してから測定する必要があることも多く、その際に生じる人為的な影響を排除できないという課題もあった。また、サンプルの経時変化をリアルタイムで測定できないことから、条件設定に多くのサンプルを要するという問題もあった。加えて、それぞれの酵素に対して、特徴を考慮した異なる検出系を準備する必要があることから、汎用性を担保することも困難でもあった。
【０００７】
また、ＮＭＲ法を用い、タンパク質を測定対象とした従来のスクリーニングにおいては、安定同位体によるタンパク質の標識が必要であることや、タンパク質が凝集しない状態で測定しなければならないこと、タンパク質の分子量が巨大になると測定が困難になること等の問題が存在した。一方で、被験化合物自体を解析の対象とするＳＴＤ法、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法といった方法も知られているが（非特許文献５及び６）、Ｋｉで数１０μＭ〜１ｍＭ程度の比較的結合の弱い化合物しか対象とできなかったり、対象をより強いものに拡張しようとすると、結合定数の算出が難しかったりといった問題が存在した。また、これらはすべて対照スペクトルと実験スペクトルの差引により優位なシグナルを検出するため、直接ＮＭＲシグナルを観測するよりも原理的に時間がかかり、短時間で終了しようとすると精度が上がらないという問題が存在した。またこれらの方法は、タンパク質に対する結合のみを指標にしているため、同定された被験化合物に必ずしも阻害（賦活）効果が期待できるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、反応液中の補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを取得することで、酵素の活性を高精度かつ高効率に定量し、これにより阻害剤又は賦活剤の同定を行うものであり、上記課題を解決するものである。
【０００９】
すなわち、本発明によると、酵素阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングのための、又は酵素阻害剤もしくは賦活剤を探索もしくは同定するための方法が提供される。この方法は好ましくは、酵素、補酵素及び被験化合物、又は酵素、補酵素、基質及び被験化合物を含む溶液を反応させること、及び／あるいは、反応後の溶液に含まれる未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトル及び／又は補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを測定することを含む。この方法では好ましくは、補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、又はそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標とされる。
【００１０】
上記発明において、酵素は好ましくはキナーゼであり、より好ましくはＰＩＰキナーゼ、例えばＰＩ５Ｐ４Ｋキナーゼである。
上記発明において、補酵素は、好ましくはＧＴＰ又はＡＴＰである。また、補酵素由来の反応生成物は、好ましくはＧＤＰ又はＡＤＰである。
上記発明において、溶液は、好ましくは酵素の基質を含まない。
【００１１】
また、本発明によると、ＧＴＰアーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性又はアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質の阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングのための、又は阻害剤もしくは賦活剤を探索もしくは同定するための方法が提供される。この方法は好ましくは、上述のタンパク質、ＧＴＰ又はＡＴＰ、及び被験化合物を含む溶液を反応させること、及び／あるいは、反応後の溶液に含まれる未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトル、及び／あるいはＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルを測定することを含む。この方法では好ましくは、ＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、あるいはそれらの比が、被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標とされる。
【００１２】
上記発明において、ＧＴＰアーゼ活性又はＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質は、好ましくは、Ｇタンパク質もしくはＧタンパク質共役受容体複合体、チューブリン又はＲａｓである。
【００１３】
本発明において、ＮＭＲは、好ましくは１Ｈ−ＮＭＲである。
本発明において、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰのシグナル強度が指標に用いられる場合、好ましくは、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰの８位のプロトンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのシグナル強度が指標に用いられる。
本発明において、溶液は好ましくは複数種の被験化合物を含み、さらに好ましくは被験化合物の数は５〜１５種である。
本発明は、既知薬のドラッグリポジショニングのためにも好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、反応液中の補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを直接観測することにより、非特許文献１に記載された方法等、従来の手法に比べてＦａｌｓｅＰｏｓｉｔｉｖｅのより低い薬剤のスクリーニングを行うことができる。また、蛍光標識等、対象に合わせた個別の追加処置や検出系等も必要なく、非侵襲的な試験が可能であり、信頼性や汎用性がより高い。さらに、対象酵素の同位体等を用いた標識も必要なく、ＮＭＲ測定する酵素（タンパク質）の性状による影響（高分子量の対象は測定できないなど）も小さい。また被験化合物自体を解析の対象とする方法に比べても、高感度、高精度で、幅広い阻害（賦活）定数を有する化合物を同定することができるという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＩ５Ｐ４Ｋβを用いたＧＴＰ及びＡＴＰ加水分解の実験におけるＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】ＰＩ５Ｐ４Ｋβを用いたリアルタイムＧＴＰ及びＡＴＰ加水分解の実験におけるＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性評価系に用いるバッファーを検討した結果を示す図である。
【図４】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性阻害活性を検出可能であることを示す図である。
【図５】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤の既存薬からのスクリーニングを示す図である。
【図６】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤の既存薬スクリーニングヒット化合物の絞り込みを示す図である。
【図７】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤の既存薬ヒット化合物の同定を示す図である。
【図８】同定された酵素阻害剤及び賦活剤の化学構造を示す図である。
【図９】ＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤の既存薬ヒット化合物の個々の阻害定数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
〔用語の説明〕
本明細書中においては、特記のない限り、次の用語は以下に示す意味を有する。
【００１７】
「（酵素）阻害剤」という用語は、一般に、標的（酵素）系によって示される生物活性を阻害する化合物を意味し、好ましくは、直接的に酵素等に結合し、その活性を阻害する化合物を意味する。本発明における阻害剤は、その阻害様式には限定されず、競合阻害でも、アロステリックな様式等の非競合阻害であってもよい。複数の別個のタンパク質からなる酵素系が対象の場合は、酵素機能を担うタンパク質より上流の別のタンパク質を阻害する阻害剤であってもよい。阻害剤の阻害強度は、阻害剤の目的やスクリーニング等の目的・系等により多様（例えば、Ｋｉ１００μＭ以下、２５μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、又は０．１μＭ以下等）で有り得る。
【００１８】
「（酵素）賦活剤」という用語は、一般に標的（酵素）系によって示される生物活性を増強する化合物を意味し、好ましくは、直接的に酵素等に結合し、その活性を増強する化合物を意味する。本発明における賦活剤は、その賦活様式には限定されず、補酵素等の代わりに働くものであっても、アロステリックな様式で作用するものであってもよい。複数の別個のタンパク質からなる酵素系が対象の場合は、酵素機能を担うタンパク質より上流の別のタンパク質を賦活する阻害剤であってもよい。
【００１９】
「被験化合物」という用語は、本発明において、阻害剤又は賦活剤の候補として試験される化合物を意味する。本発明に用いられる被験化合物は複数であってよく、複数の被験化合物の混合物としての被験化合物（ライブラリー等）であってもよい。
「基質」という用語は、酵素によって化学反応を触媒される物質を意味する。本発明で反応に供される基質は、複数であってよい。
「基質由来の反応生成物」という用語は、酵素によって触媒された化学反応により、基質から直接的又は間接的に生成された物質を意味する。
【００２０】
本発明を適用可能な阻害剤、賦活剤もしくはそれらの候補化合物（被験化合物）又は基質は、その構造・由来・物性等により限定されるものではなく、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、核酸、高分子化合物、又は低分子化合物等、任意の物質が含まれる。その由来についても、天然由来であっても、人工物であってもよい。また、新規化合物であっても、公知化合物であってもよい。
【００２１】
「酵素」という用語は、主に生体で起こる化学反応に対して触媒として機能する分子（多くの場合、タンパク質）を意味する。本発明を適用可能な酵素は、その構造・大きさ・由来等により限定されるものではなく、天然の酵素であっても、改変した酵素であってもよい。また、生体から分離した酵素であっても、遺伝子組み換えにより製造した酵素であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成した酵素であってもよい。更に、複数のサブユニットからなる複合体であっても、複数の別個のタンパク質が相互作用して活性を発揮するもの（この場合、特に酵素系と称する場合もある）であってもよい。酵素の用途も問わず、疾患や治療薬のスクリーニングに関わるものであっても、工業製品やその製造等に関わるものであってもよい。
酵素としては、これに限定されるものではないが、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、及びエステラーゼ等が挙げられる。
【００２２】
キナーゼは、ヒドロキシル基へのリン酸基の転移反応を触媒する酵素であり、細胞内シグナル伝達を担う重要な酵素群である。具体的なキナーゼとしては、これに限定されるものではないが、低分子基質キナーゼ（例えば、ＰＩキナーゼ、ＰＩＰキナーゼ又はＰＩ３キナーゼ等）及びプロテインキナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ又はセリンスレオニンキナーゼ等）が挙げられる。
ＰＩＰキナーゼは、ホスファチジルイノシトール一リン酸を更にリン酸化する反応を触媒するキナーゼであり、具体的には、これに限定されるものではないが、ＰＩ（５）ＰをＰＩ（４，５）Ｐ２に変換するＰＩ５Ｐ４Ｋ（ホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼ）、及びＰＩ（４）ＰをＰＩ（４，５）Ｐ２に変換するＰＩ４Ｐ５Ｋ（ホスファチジルイノシトール４−リン酸５−キナーゼ）が挙げられる。
【００２３】
本発明に特に好適な標的酵素の一つは、ＰＩ５Ｐ４Ｋ（ファミリー）であり、より具体的には、ＰＩ５Ｐ４Ｋα、β及びγが挙げられる。例えば、ＰＩ５Ｐ４Ｋβは、基質であるＰＩ（５）Ｐの４位ＯＨ基に対して補酵素であるＡＴＰのγリン酸を転移させることで基質由来生成物ＰＩ（４，５）Ｐ２と補酵素由来生成物ＡＤＰを生ずる酵素として同定されたものであり（非特許文献５）、セカンドメッセンジャーであるＰＩ（５）Ｐの量をコントロールすることで、インスリンシグナル伝達において重要な役割を果たす代謝制御タンパク質として知られている。近年、本発明者らにより、ＰＩ５Ｐ４Ｋβが細胞増殖・腫瘍の個体生着・細胞の腫瘍形成に寄与する因子であることが見出され、抗癌剤の標的としても注目されている（非特許文献６）。本発明者らは、ＰＩ５Ｐ４Ｋβが、ＰＩ（５）Ｐの４位ＯＨ基に対してリン酸を付加する反応を、補酵素としてＧＴＰを用いることで、ＡＴＰに比べて効率的に遂行できることを見出し、その生物学的意義を明らかにした論文を投稿中である。
【００２４】
また、本発明者らは、ＰＩ５Ｐ４Ｋβが、基質であるＰＩ（５）Ｐがなくとも、ＡＴＰ又はＧＴＰのγリン酸をＰＩ（５）Ｐの４位ＯＨ基の代わりに水に転移させる活性（加水分解活性又はＡＴＰアーゼ／ＧＴＰアーゼ活性）を示すことを見出しており、上記補酵素加水分解反応の遂行が阻害剤や賦活剤により影響を受けるか否かを観測することで、基質が存在しない条件下でも阻害、賦活効果を確認することが可能である。さらに、ＰＩ５Ｐ４ＫβのアイソタイプであるＰＩ５Ｐ４Ｋα及びＰＩ５Ｐ４Ｋγについても同様の活性を確認している。また、プロテインキナーゼであるｐ３８αについても同様の手法で酵素活性を評価できることを確認している。また、生理的意義は不明であるが、ＰＩ５Ｐ４Ｋβはｄｅｏｘｙ−ＧＴＰに対しても加水分解活性を示すことが、同様のＮＭＲ実験により確認されている。
【００２５】
「ＧＴＰアーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性又はアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質」という用語は、酵素の中でも特に、ＧＴＰ加水分解活性（ＧＴＰアーゼ活性）、ＡＴＰ加水分解活性（ＡＴＰアーゼ活性）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）から環状グアノシン一リン酸を生成するグアニル酸シクラーゼ活性、又はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から環状アデノシン一リン酸を生成するアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質を意味する。これらにおいては、ＡＴＰ及びＧＴＰは補酵素ではなく、基質となる。ＧＴＰアーゼ活性を有するタンパク質には、例えば、Ｇタンパク質又はＧタンパク質結合受容体複合体（Ｇタンパク質結合受容体とＧタンパク質との複合体）、低分子量ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒａｓ（Ｒａｓスーパーファミリー））、及びチューブリン等が含まれる。ＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質には、例えば、ＡＢＣ  ＡＴＰアーゼ（例えば、ＡＢＣトランスポーター）、イオン輸送性ＡＴＰアーゼ、及び運動性タンパク質ＡＴＰアーゼ（例えば、ミオシン、ダイニン、キネシン又はダイナミンＡＴＰアーゼ）が含まれる。グアニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質には、例えば、膜結合性グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ−Ａ、ＧＣ−Ｃ又はＧＣ−Ｄ等のＡＮＰ受容体）、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）が含まれる。アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質としては、様々なアデニル酸シクラーゼが挙げられる。
【００２６】
なお、上述した酵素のうち、特定の酵素名で表した酵素については、特記のない限り、天然に最も多く存在する野生型のみならず、天然（生理的もしくは病理的状態）に存在する変異型、あるいは、実験や工業的手法のために人工的に作製された変異型も含まれる。変異型の酵素は、例えば、野生型の酵素のアミノ酸配列と、例えば、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＰＩ５Ｐ４Ｋとしては、例えば、配列番号：１（ＰＩ５Ｐ４Ｋα）、配列番号：２（ＰＩ５Ｐ４Ｋβ）もしくは配列番号：３（ＰＩ５Ｐ４Ｋγ）に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、配列番号：１（ＰＩ５Ｐ４Ｋα）、配列番号：２（ＰＩ５Ｐ４Ｋβ）もしくは配列番号：３（ＰＩ５Ｐ４Ｋγ）に示されるアミノ酸配列と、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００２７】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、ポリペプチド（タンパク質）のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、二つのアミノ酸配列間のアミノ酸残基が同一であるアミノ酸残基数パーセントとして定義される。％アミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。
また、一定の配列同一性を有するポリペプチドは、１又は数個のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含み得る。対象ポリペプチドが所望する特徴を保持する範囲内であれば、欠失、挿入及び置換はどのように組合せてもよい。ある配列に対し、変異を導入する方法としては、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸／ヌクレオチド配列変異体の場合）、部位特異的変異、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット変異導入などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
「補酵素」という用語は、酵素反応の化学基の授受に機能する低分子化合物を意味し、特に本発明では、酵素のタンパク質部分と強い結合を行わず可逆的に解離して遊離型となる低分子化合物を意味する。補酵素には、これに限定されるものではないが、例えば、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）又はその天然誘導体（例えば、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ））、ＴＰＰ（チアミン二リン酸）、テトラヒドロ葉酸、アデノシルコバラミン、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ）、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸；ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ）、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、ＦＡＤＨ２、ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、ＦＭＮＨ、及びＦＭＮＨ２が含まれる。
【００２９】
「補酵素由来の反応生成物」という用語は、酵素反応において補酵素が利用されて変化した化合物を意味する。ある酵素反応で補酵素由来の生成物であるものが、別の酵素反応では補酵素となり得る。すなわち、補酵素と補酵素由来の反応生成物とは、物質として区別されるものではなく、注目される酵素反応において、どのような位置にあるかによって区別されるものである。補酵素には、これに限定されるものではないが、例えば、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）及びＡＤＰ（アデノシン二リン酸）等が含まれる。
【００３０】
「ＮＭＲ（核磁気共鳴）」又は「ＮＭＲ法」は、核磁気共鳴現象を利用した、生理的条件下における生体高分子の立体構造情報を提供する分光法である。本発明に用いられるＮＭＲ法は、測定の目的とする補酵素又は基質等の目的のシグナルの強度を測定できるものであれば、具体的な手法や条件には限定されない。目的のシグナル強度を測定できる限り、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ又はそれ以上の多次元ＮＭＲを用いることができ、核種も、１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、３１Ｐ、等、限定されず用いることができる。測定条件も、そのシグナルを通常ＮＭＲにて測定する場合の条件を用いることができる。
【００３１】
例示的な測定条件として、これに限定されるものではないが、例えば、以下のものが挙げられる。１Ｈの測定を行う場合、リン酸緩衝液を始めとする様々な緩衝液条件において、タンパク質、補酵素、基質、被験化合物を必要に応じて混合し４００μＬ程度の溶液としたものを測定に用いる。測定する核種の濃度は感度に直結するため、補酵素又は基質等の目的のシグナルは強度が十分得られることが好ましく、本願明細書の実施例において、実施例に記載した条件下で、測定に用いた７００ＭＨｚ―ＮＭＲ測定装置と室温３重共鳴プローブの組み合わせにおいて十分な測定効率を確保するためには、１Ｈシグナルの検出に１０、２５、又は５０μＭ程度かそれ以上の濃度が必要であった。ただし、低温測定プローブなど、より高感度なプローブを用いる場合は、より低濃度での測定も可能となる。スクリーニングを行う場合、典型的な測定時間は５〜１０分程度となる。また核種によって相対感度が異なるため、必要となる濃度、測定時間は変化する。なお、シグナルを観測しない、被験化合物、タンパク質等は、一般に、より低濃度でサンプル中に加えられる。
【００３２】
「粗精製」とは、目的とする分子以外の分子がより低濃度に存在するように、少なくとも一の精製工程を経て対象を精製することを意味する。具体的な精製手段は、精製対象等により常法に従って適切に選択することができるが、例えば、サイズ排除カラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００３３】
〔実施形態〕
以下、本発明を実施するための形態を用いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
これらの態様は、単独でも、複数を組み合わせてもよい。また、各態様の定義や詳細については、前述の「用語の説明」も参照できる。
本明細書で用いられる公知の技術及び手順は、当業者には十分に理解されるものであり、常法に従い実施することができる。
【００３４】
本発明のある態様は、酵素阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングのための、又は酵素阻害剤もしくは賦活剤を探索もしくは同定するための方法であって、
酵素、補酵素及び被験化合物、又は酵素、補酵素、基質及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトル及び／又は補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
補酵素もしくは基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度、又はそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法である。
【００３５】
本発明のある態様は、ＧＴＰアーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性又はアデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質の阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングのための、又は阻害剤もしくは賦活剤を探索もしくは同定するための方法であって、
該タンパク質、ＧＴＰ又はＡＴＰ、及び被験化合物を含む溶液を反応させ、
反応後の溶液に含まれる未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトル、及び／あるいはＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルを測定することを含み、
ＧＤＰもしくはＡＤＰ又はｃＧＭＰもしくはｃＡＭＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、未反応のＧＴＰ又はＡＴＰのＮＭＲスペクトルのシグナル強度、あるいはそれらの比が、該被験化合物の酵素阻害又は賦活活性の指標となる、方法である。
【００３６】
上記態様の方法は、被験化合物（薬剤候補化合物）を対象とし、目的の薬剤（例えば、酵素阻害剤又は賦活剤）の探索のためのスクリーニングを行うための方法であり、被験化合物（薬剤候補化合物）のスクリーニングのための方法、及び被験化合物（薬剤候補化合物）をスクリーニングするための方法、と表現される発明も含む。上記態様の方法では、反応液中の補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを直接観測することにより、非特許文献１に記載された方法等の従来の手法に比べて、被験化合物自体の蛍光やルシフェラーゼの阻害等に起因するＦａｌｓｅＰｏｓｉｔｉｖｅのより低いスクリーニングを行うことができる。また、蛍光標識等、対象に合わせた個別の追加処置や検出系等も必要なく、非侵襲的な試験が可能であり、信頼性及び汎用性がより高い。さらに、サンプルの経時変化をリアルタイムで測定することもでき、条件設定もより少数のサンプルで行うことができる。
また、同位体等を用いた対象酵素の標識も必要なく、補酵素や基質等を測定対象とするため、ＮＭＲ測定する酵素（タンパク質）の性状による影響（高分子量の対象は測定できないなど）も小さく、測定する酵素（タンパク質）の分子量や被験化合物やタンパク質の凝集性による悪影響を受けにくい。さらに、補酵素や基質の量は、酵素や被験化合物の量よりも多いため、酵素や被験化合物を測定対象とする場合と比較して、感度が高く、高いスループットで阻害剤及び賦活剤を同定することが可能となる。
また被験化合物自体を解析の対象とする方法に比べても、高感度、高精度で、幅広い阻害（賦活）定数を有する化合物を同定することができるという利点を有する。
【００３７】
上記態様の方法は、補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物が、反応前後で異なるＮＭＲスペクトルを与えることを利用する。上記態様の発明の実施前に、被験化合物を含まない状態で、補酵素、酵素及び基質等を混合した上で、反応前後のＮＭＲスペクトルを個別に、あるいは反応中のＮＭＲスペクトルを連続的に測定することで、反応に伴いＮＭＲスペクトルに違いが生じる部位を同定することができる。そのような部位として、例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＧＤＰ又はＡＤＰにおけるグアニン又はアデニン塩基の８位のプロトン（１Ｈ−ＮＭＲ）が挙げられる。
【００３８】
シグナル強度については、他の夾雑物及び溶媒等のＮＭＲスペクトル（化学シフト）も考慮に入れながら、感度よく測定することができるピークを選択し、その目的のピークのピーク高さ又は積分値を常法により得ることで測定することができる。場合によっては、常法によるピークの積分値の代わりに、比較するサンプル間（例えば、ネガティブコントロールと被験化合物処理群）でほぼ同一のシグナル強度算定基準を用いることで代用してもよい。また、被験化合物を含まない状態のＮＭＲスペクトルを測定し、目的のピーク位置に相当する化学シフトにおけるシグナル強度をバックグラウンドとして、差分をシグナル強度として用いてもよい。
【００３９】
上記態様の方法では、反応液中に賦活剤が存在すると補酵素又は基質の酵素による利用が増加する（阻害剤では逆に減少する）ため、補酵素又は基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度が高い場合及び未反応の補酵素又は基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度が低い場合は、被験化合物が酵素賦活剤であることが示され、補酵素又は基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度が低い場合及び未反応の補酵素又は基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度が高い場合は、被験化合物が酵素阻害剤であることが示される。これに限定されるものではないが、例えば、被験化合物が存在しない場合でのシグナル強度の平均値および標準偏差と比較して、平均値＋０．５×標準偏差以上もしくは平均値−０．５×標準偏差以下、平均値＋標準偏差以上もしくは平均値−標準偏差以下、平均値＋１．５×標準偏差以上もしくは平均値−１．５×標準偏差以下、又は、平均値＋２．０×標準偏差以上もしくは平均値−２．０×標準偏差以下のシグナル強度の増加又は減少が、上記指標として用いられる。
なお、上記態様には、補酵素と基質の双方のＮＭＲスペクトルのシグナル強度を組み合わせて指標として用いる態様も含まれる。
【００４０】
上記態様の方法では、補酵素又は基質由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルのシグナル強度と、未反応の補酵素もしくは基質のＮＭＲスペクトルのシグナル強度との比（または、その他の計算値）を用いて指標としてもよい。これらの比を用いることで、長時間測定に伴うわずかなＮＭＲ測定感度の変動や化合物添加に伴う沈殿生成などにより、サンプルに酵素活性以外による経時的な変化が生じた場合においても、正確な酵素活性の評価を行うことが可能となる。これに限定されるものではないが、例えば補酵素であるＧＴＰが酵素のＧＴＰアーゼ活性によりＧＤＰに変換される場合、ＧＤＰ／ＧＴＰのシグナル強度比により酵素のＧＴＰアーゼ活性を評価できる。これに限定されるものではないが、例えば、被験化合物が存在しない場合でのシグナル強度比の平均値および標準偏差と比較して、平均値＋０．５×標準偏差以上もしくは平均値−０．５×標準偏差以下、平均値＋標準偏差以上もしくは平均値−標準偏差以下、平均値＋１．５×標準偏差以上もしくは平均値−１．５×標準偏差以下、又は、平均値＋２．０×標準偏差以上もしくは平均値−２．０×標準偏差以下のシグナル強度比の増加又は減少が、上記指標として用いられる。
【００４１】
上記態様の方法における反応条件及び測定条件（例えば、被験化合物濃度、酵素濃度、補酵素濃度、基質濃度、反応温度、反応時間、測定温度、ｐＨ及び溶液の具体的な組成等）については、当業者は、対象となる酵素反応に一般的に用いられる反応条件、補酵素又は基質等に一般的に用いられる測定条件、ＮＭＲスペクトル測定の分野における通常の技術知識、及び本明細書における実施例等の開示等を参考にして、適切に設定することができる。複数の被験化合物を混合して本発明の対象とする場合、被験化合物の濃度の条件設定の際には、複数の被験化合物の合計濃度を用いてもよい。本発明の効果を損なわない範囲で、溶液には、塩（ＮａＣｌ等）、界面活性剤、緩衝剤及び被験化合物を溶解するための溶媒（ＤＭＳＯ等）等を加えることができる。
【００４２】
これに限定されるものではないが、これらの諸条件の一例としては、被験化合物濃度０．１〜５００μＭ、１〜３００μＭもしくは２．５〜２５０μＭ、酵素濃度０．１〜２０μＭもしくは１〜１０μＭ、補酵素濃度１０μＭ〜１０ｍＭ、２０μＭ〜５ｍＭもしくは５０μＭ〜１ｍＭ、酵素の補酵素に対するモル量比０．1〜２０％、０．１〜５％もしくは０．２〜２％、反応温度０〜５０℃、４〜３７℃、約２５℃、約３７℃もしくは室温、反応時間１〜５０時間、５〜３０時間もしくは１５〜２５時間、ｐＨ２〜１２又は６〜８、リン酸緩衝液（水素を含まないため１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には特に適する）などの緩衝液、及び／又は被験化合物を溶解するための溶媒濃度０．１〜１０％もしくは０．１〜５％等が挙げられる。タンパク質および被験化合物は過大な沈殿が生じない程度にサンプル中に加えるのが好ましいが、沈殿の発生は解析を大きく妨げるものにならない。また活性の指標に用いるシグナルを十分な感度で測定し、被験化合物、タンパク質等のシグナルがその妨げにならないようにするため、タンパク質および被験化合物の濃度が観測に用いる補酵素、基質よりも低濃度であることが好ましい。
【００４３】
上記態様の方法では、反応前後で補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物の量が十分に変化する範囲内で、酵素に対する補酵素又は基質の量比を過剰にした条件に設定することで、より高感度のＮＭＲ測定が可能になり、酵素量を抑えることで、一般的に入手が困難な酵素の使用量を最小限に抑えることも可能となる。このような過剰量の条件としては、例えば、酵素の補酵素に対するモル量比５％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．２％以下又は０．１％以下等が挙げられる。
【００４４】
補酵素あるいは補酵素由来の反応生成物があらかじめ予測、入手可能である場合においては、それらのスペクトルを単独で個別に取得することで、前記反応液のＮＭＲスペクトル中で解析に使用可能なシグナルをあらかじめ選定しておくことも可能である。例えば補酵素であるＧＴＰが酵素のＧＴＰアーゼ活性によりＧＤＰに変換される場合、ＧＴＰもしくはＧＤＰをあらかじめ購入するなどして入手し、それらのＮＭＲスペクトルを測定することで、どの部位が反応前後で異なる位置にシグナルを与え、ゆえに酵素活性をモニターするのに適切であるかを選定することが可能になる。
【００４５】
本発明の好ましい態様は、酵素がキナーゼである、上記何れかの態様の方法である。キナーゼは、ＡＴＰ又はＧＴＰを補酵素として用いる酵素であるため、本発明の測定対象として適しており、様々な疾患に関与しているため、創薬の観点からも非常に重要な標的である。
本発明の更に好ましい態様では、キナーゼはＰＩＰキナーゼであり、更に好ましい態様では、ＰＩＰキナーゼはＰＩ５Ｐ４Ｋ（ＰＩ５Ｐ４Ｋファミリー）である。これらの酵素を対象とする場合、実施例にて確認されるように、より確実かつ簡便に本発明を実施することができる。また、より確実に、基質の非存在下で本発明を実施することもできる。さらに、これらの酵素は、腫瘍・がん、糖尿病などの生活習慣病又は炎症性疾患等に関与しており、創薬の標的としても重要である。
【００４６】
本発明の好ましい他の態様は、ＧＴＰアーゼ活性又はＡＴＰアーゼ活性を有するタンパク質が、Ｇタンパク質もしくはＧタンパク質共役受容体複合体（Ｇタンパク質とＧタンパク質共役受容体との複合体）、チューブリン又はＲａｓ（Ｒａｓスーパーファミリー）である、上記何れかの態様の方法である。これらのタンパク質は性状が詳細に知られているため、本発明の実施がより簡便であり、また、様々な疾患に関与しているため、創薬の観点からも非常に重要な標的である。
【００４７】
本発明の好ましい他の態様は、酵素が補酵素を用いる酵素である、上記何れかの態様の方法であり、他の好ましい態様は、測定対象として補酵素が用いられる、上記何れかの態様の方法である。基質は、補酵素と比較して多様性に富み、低分子でない場合も多いため、低分子であり、かつ種類の限られた補酵素を測定対象とすることで、より確実かつ簡便な測定を行うことができる。特に、補酵素（又は基質）の溶解度が高い場合、感度の良い観測が可能で、高いスループットを確保できる（一般に補酵素の溶解度は高い）。
【００４８】
本発明の好ましい他の態様は、補酵素がＧＴＰ又はＡＴＰであり、補酵素由来の反応生成物がＧＤＰ又はＡＤＰである、上記何れかの態様の方法である。特に好ましい態様では、補酵素がＧＴＰであり、補酵素由来の反応生成物がＧＤＰである。ＡＴＰ及びＧＴＰなどのヌクレオチド（リボヌクレオチド）は溶解度が高く、感度の良い観測が可能で、高いスループットを確保できる。また、本実施例等に基づき、より簡便、確実に本発明を実施することもできる。またＰＩ５Ｐ４Ｋのように、標的酵素がＧＴＰに対してＡＴＰよりも高い活性を示す場合、ＧＴＰを解析対象に選択することで、反応時間を短く抑えることが可能になる。逆に反応が速過ぎる場合においてはＡＴＰを選択するなど、任意の補酵素を用いることのできる点は本発明の利点の一つである。
【００４９】
本発明の好ましい他の態様は、反応に供される溶液が酵素の基質を含まない、上記何れかの態様の方法である。多くの酵素（特にキナーゼ等）では、反応液中に基質を含まない場合でも、補酵素を消費する反応が進行するため、補酵素を測定対象として本発明を実施することができる。この場合、基質が必要ないことでコスト的に優れ、また、夾雑物を減らすことができるため、より好適に目的のシグナルを計測することができる。
【００５０】
本発明の好ましい他の態様は、ＮＭＲが１Ｈ−ＮＭＲである、上記何れかの態様の方法である。本発明は、目的のシグナル強度を測定できる限り、核種に限定されるものではないが、シグナルの測定のし易さや汎用性からは、１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐが好適に用いられる。特に好適には、最もＮＭＲ測定感度の高い１Ｈが用いられる。また、測定の簡便さからは、一次元ＮＭＲが好適に用いられる。
【００５１】
本発明の好ましい他の態様は、反応に供される溶液が複数種（２種以上）の被験化合物を含む、上記何れかの態様の方法である。本発明では、複数種の被験化合物をまとめて試験することができ、必要な合計測定時間を短縮することができる。また、被験化合物と他の化合物、又は複数の被験化合物が混合した組成物（例えば、植物抽出物、真菌抽出物や化合物ライブラリー）も、好適に試験することができる。この場合、阻害剤又は賦活剤を単一化合物として同定するには、混合物群を更に分割して試験するという工程が更に含まれてもよい。本発明の更に好ましい態様では、溶液は２〜５０種、３〜３０種、更により好ましい態様では５〜１５種の被験化合物を含む。被験化合物の数に原理的な制限は存在しないが、混合溶液中の多くにおいて、化合物の沈澱が見られないようにすることが好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい他の態様は、既知薬のドラッグリポジショニングのための方法である、上記何れかの態様の方法である。既知薬を対象とすることで、被験化合物の溶解性が多くの場合担保され、またスクリーニングによって同定された化合物が、毒性などの観点で医薬になりやすい特性を有することとなる。
【００５３】
なお、上記態様により説明される各方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００５４】
例えば、測定対象の溶液は、（測定の濾過作業は一般に行われ得るが）各種クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー等）により反応後に粗精製されてもよい。これらの追加工程を含む方法も、本発明（上記何れかの態様の方法）の技術的範囲に含まれる。さらに、標的酵素が単一酵素ではなく、複数の酵素等からなる標的酵素系であっても、本発明は適用可能であり、このような態様も、本発明（上記何れかの態様の方法）の技術的範囲に含まれる。
【００５５】
さらに、上記実施の形態では、創薬のための阻害剤・賦活剤のスクリーニングを念頭において説明したが、本発明をこのような目的に限定する趣旨ではない。本発明は、薬剤のスクリーニング以外にも、単一物質又は混合物の生理活性の分析、診断・検査、食品等の検査・分析、等などの幅広い用途が想定されるものであり、それらの用途を排除することを意図するものではない。また、本発明により阻害剤又は賦活剤を含むと判断された被験化合物の混合物又はライブラリーも本発明の態様の一つである。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により、本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明もしくは定法に従い使用した。
【００５７】
本発明の有効性を確認する系として、本発明者らが解析を進めているＰＩ５Ｐ４Ｋβを選択した。本実施例においては、反応をより効率的に進行させることによる反応時間の短縮、またＧＴＰを利用する酵素活性を特異的に阻害する化合物同定の期待から、用いる補酵素はＧＴＰのみとした。
【００５８】
「ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性評価法の確立」
〔ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性を評価するためのＮＭＲシグナルの選定〕
まずＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性を評価するためのＮＭＲシグナルの選定を行う目的で、１ｍＭのＧＴＰ及びＡＴＰに対して２μＭ（モル量比０．２％）、８μＭ（モル量比０．８％）のＰＩ５Ｐ４Ｋβを加え、８時間室温にてインキュベートした。反応前後で１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＧＴＰアーゼ活性に伴う、ＧＴＰ由来シグナルの減少及びＧＤＰ由来シグナルの増加が観察された（図１）。具体的には、図１は、上から１ｍＭのＧＴＰ／ＡＴＰ、１ｍＭのＧＤＰ／ＡＤＰの標品のスペクトル、１ｍＭのＧＴＰ／ＡＴＰをタンパク質なしで８時間室温でインキュベートした際のスペクトル、２μＭ（モル量比０．２％）、８μＭ（モル量比０．８％）のＰＩ５Ｐ４Ｋβを加え、８時間室温にてインキュベートした際のスペクトルを示す。２μＭ、８μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを加えた際のスペクトルでは、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ量に依存して、（１）、（２）、（３）と示した部分でＧＴＰ由来のシグナルがＧＤＰ由来のシグナルに変化している様子が観察される。なおこの条件では、ＡＴＰアーゼ活性は検出限界以下であった。反応前後で化学シフトに変化が見られたシグナルは複数存在したが、他のシグナルと離れており、また溶媒等の影響を受けずに感度良く測定することが可能であった（１）のシグナル（グアニン塩基８位のプロトン）を指標として、ＰＩ５Ｐ４Ｋβの活性を評価することにした。なお、今回は加水分解活性の評価に１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを利用したが、反応に伴って生ずる遊離リン酸基を３１Ｐ−１Ｄ−ＮＭＲで定量するなど他の方での活性評価も可能である。
【００５９】
図２には、５００μＭのＧＴＰ及びＡＴＰに対して５μＭ（モル量比１％）、１０μＭ（モル量比２％）のＰＩ５Ｐ４Ｋβを加え、ＧＴＰ及びＡＴＰの８位のプロトンシグナルが、ＰＩ５Ｐ４ＫβのＧＴＰ／ＡＴＰ加水分解活性により減少し（左）、ＧＤＰ及びＡＤＰの８位のプロトンシグナルが増大していく（右）経時変化を、リアルタイムＮＭＲ測定により示している。このように反応を長時間にわたってモニターすることは、反応に対して非侵襲的であるＮＭＲ実験でのみ可能であり、他の既存の手法では困難である。図ではＧＴＰの減少に伴い、ＧＤＰのシグナルが増大しており、ここからＧＴＰからＧＤＰへの加水分解活性速度を定量的に評価することができる。またＡＴＰに関しても、モル量比１％で長時間反応をトレースすることで、ＧＴＰに比べると弱いものの、その活性を評価することが可能であった。よって類似の反応条件で、化合物を添加した実験を行えば、たとえば１０時間後のＧＴＰ量の減少もしくはＧＤＰ量の増大を化合物無しの条件と比較することで、ＧＴＰ量の減少・ＧＤＰ量の増大が抑制されたならば、添加した化合物にＰＩ５Ｐ４Ｋβの阻害活性があったこと、逆にＧＴＰ量の減少・ＧＤＰ量の増大がより大きくなったのであれば、添加した化合物にＰＩ５Ｐ４Ｋβの賦活活性があったと判定することが可能であることが確認された。
【００６０】
〔ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性への干渉を評価する反応条件の選定〕
上記条件検討により、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性評価を検討するためのシグナルの選定、大まかな条件が決定できたことから、次にＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性への干渉を評価する反応条件の選定を行った。図３には、２５０μＭのＧＴＰ、５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを２種の異なる緩衝液中（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）−ＮａＣｌ１００ｍＭ、又は１０ｍＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）−ＮａＣｌ１００ｍＭ）で混合し、反応に対するＤＭＳＯの影響を調べるため、０％、５％、７％、１０％のＤＭＳＯを添加し、２５℃１５時間反応後、ＧＤＰ／ＧＴＰ比を８位シグナル強度から算出した結果を示す。２回の測定の誤差はエラーバーで示した。緩衝液に対する依存性は観察されなかったことから、水素を含まずＮＭＲ測定への干渉が最も少ないリン酸緩衝液を選択した。また被験化合物はＤＭＳＯに溶かして反応系に添加することになるため、酵素活性のＤＭＳＯ依存性を検討した結果、ＤＭＳＯ添加に伴い、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性の増大が見られた。ＤＭＳＯ７％以上の濃度においては測定間のばらつきも大きくなっていたことから、添加するＤＭＳＯ濃度は５％以内になることが望ましいと判断した。
【００６１】
次にこの条件で、阻害活性が観察可能か検討した。図４Ａでは、２５０μＭのＧＴＰ、５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを混合し、０．２５ｍＭ、１ｍＭのＧＭＰあるいは０．２５ｍＭ、１ｍＭのＡＭＰを添加し、２５℃で示された各反応時間反応させた後、１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを取得し、ＧＤＰ／ＧＴＰ比を８位シグナル強度から算出した。ＧＭＰ、ＡＭＰはＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性の活性を阻害することが、発明者らによる他の実験から明らかになっている。反応に伴うＧＤＰの生成及びＧＴＰの減少が抑えられた結果、ＧＤＰ／ＧＴＰ比がＧＭＰ、ＡＭＰありの条件では低下しているのが見て取れる。図４Ｂでは、ＧＭＰ、ＡＭＰありとなしで、２５℃で各反応時間反応させた後のＧＤＰ／ＧＴＰ比を算出し、それらの比をとることで阻害率の算出を行った。ＧＭＰはＡＭＰに比べて効率よくＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性を阻害することが、発明者らによる他の実験から明らかになっている。本実験においても、ＧＭＰ／ＡＭＰの違い、またその量に応じて異なる阻害率が観察されており、本手法を用いることで、阻害活性を定量的に評価できることが示されている。またその阻害率は、１５時間以上２５時間以内において大きく変化しておらず。反応時間１５〜２５時間の間では、信頼性の高い阻害活性の検証が可能であることが分かった。特にＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性を半分程度に阻害する条件においては、反応時間１５〜２５時間の間で、他の条件に比べてより安定的に、反応時間によらない一定の阻害活性が観察された。
【００６２】
阻害活性を判定可能な条件が決定されたことから、次に被験化合物添加条件を検討した。被験化合物ライブラリーは、米国で臨床試験まで到達した化合物１２８０種及びＩｎｄｅｘ  Ｎｏｍｉｎｕｍ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙに収載されている薬剤３２０種、合計１６００種の薬剤を含むＰｈａｒｍａｋｏｎ−１６００を用いた。先の条件検討において、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ活性を半分程度に阻害する条件が、最も安定な阻害効果の検証を可能にすることが分かった。そこで、ＰＩ５Ｐ４Ｋβの活性を半分以下に減少させる阻害剤を探索できるよう、条件を設定することとした。今回は５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを反応系に加えていることから、少なくとも２．５のμＭの化合物濃度が、ＰＩ５Ｐ４Ｋβの活性を半分に阻害するのに必要である。一方、化合物濃度を高くすると、化合物同士又は化合物酵素間の凝集が起こりやすくなり、また凝集した化合物による非特異的な活性阻害効果により、誤った化合物を阻害化合物と認定するリスクが増大する。これまでの知見で、８０％以上の医療用薬剤のｌｏｇＳ（溶解度指標）が−４以上であることが分かっている。一方、発明者らが独自に１３３化合物の２５０μＭにおけるＮＭＲシグナル強度を測定した結果、ｌｏｇＳ＞−４の化合物の９０％はＮＭＲによって観測可能であった。よって、Ｐｈａｒｍａｋｏｎ−１６００に含まれる医療用薬剤の多くは、その濃度が２５０μＭ以下であれば、十分な溶解度が期待される。以上の考察から、本実施例の系において設定可能な阻害剤濃度は２．５μＭ以上、２５０μＭ以下と判断できる。なお系に加える酵素量を制限すれば、化合物濃度の下限値を引き下げることは可能である。
【００６３】
一方、各反応液中に複数の阻害剤を同時に投入し、それらの化合物存在下で加水分解活性を測定することで、スクリーニングの効率を向上させることが可能である。例えば１０種の化合物を反応液中に同時に投入すれば、それらの中に阻害効果を示すものがあるか否かを、１０倍の効率で評価可能になる。スクリーニングに用いることのできる化合物の最大濃度が２５０μＭであるため、１０種の化合物を混合する場合、各化合物の濃度は最大２５μＭとなる。一方２５種の化合物を混合する場合、各化合物の濃度は最大１０μＭとなる。
【００６４】
化合物添加濃度をＸμＭとすると、添加濃度と同程度の阻害活性を持つ阻害剤は、ＰＩ５Ｐ４Ｋβの活性を半分に阻害することが期待される。よって化合物濃度を濃くすればより弱い阻害剤が、化合物濃度を薄くすればより強い阻害剤も発見できることになる。我々の以前の検討において、ＰＩ５Ｐ４Ｋβについてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行った化合物群の阻害活性の２次検討を行った際には、阻害定数１０μＭの阻害化合物が４００化合物から１種、阻害定数２５μＭの阻害化合物が６種見つかっていた。同等のヒット率を仮定すると、１０μＭ混合物から見つかる化合物は数種、２５μＭ混合物からは２０種程度であることが期待される。しかしながら、今回はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング後の２次検討ではなく、Ｐｈａｒｍａｋｏｎ−１６００を用いた１次スクリーニングであることから、ヒット率はさらに低下すると予想される。そこで、今回は期待される活性値をＫｉ＜２５μＭに設定し、２５μＭの阻害剤１０種を混合し、最大２０種程度の阻害剤同定を期待することとした。
【００６５】
〔ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性阻害剤のスクリーニング〕
Ｐｈａｒｍａｋｏｎ−１６００は、各薬剤が１０ｍＭ濃度でＤＭＳＯに溶解された形で購入した。そこで、まずこれらを１０種ずつ混合し、１６０サンプルからなるスクリーニング用プレートとした。スクリーニング用プレートの各ウェルには化合物が１０種類、それぞれ１ｍＭの濃度で溶解していることになる。次に各ウェルから１２．５μＬずつを３枚のディープウェル９６穴プレートに分注した。各ディープウェル９６穴プレート（セット−Ａ１、セット−Ｂ１及びセット−Ｃ１）にはそれぞれ５６、５６及び４８の薬剤混合液が分注され、それらの中に合計５６０、５６０及び４８０種の薬剤がそれぞれ含まれていることになる。次にディープウェル９６穴プレート：セット−Ａ１、セット−Ｂ１及びセット−Ｃ１のそれぞれのウェルに対して、２５０μＭのＧＴＰ及び５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを１０ｍＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）−ＮａＣｌ１００ｍＭに溶解した反応液を５００μＬずつ分注し、２５℃で２０−２５時間反応を行った。各薬剤の最終濃度は２５μＭである。反応後に１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲスペクトルを取得し、ＧＤＰ／ＧＴＰシグナル強度比を算出することで、化合物の活性評価を行った。ＮＭＲ測定には１サンプル約７分の時間を要し、一度に自動測定できるサンプルが１６本であることを考慮し、反応液の添加は１６ウェルずつとし、反応液添加後次の１６ウェルへの添加まで約２時間（７×１６分程度）の間隔を空けた。なおサンプル自動化の度合いや測定により、反応開始のスケジュールは任意に設定可能である。反応後のサンプルは、順次１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲ測定を行った。測定時に沈殿を認めたサンプルは、全部で１５本であった。また反応液中には被験根化合物に対してＧＴＰが１０倍量過剰に存在することから、被験化合物由来のシグナルがＧＴＰ又はＧＤＰの定量性に与える影響は、最小限に抑えられる。
【００６６】
ＮＭＲ測定はブルカー社ＡＶＡＮＣＥ７００型ＮＭＲ分光器を用い、常温ＴＸＩプローブによる測定を行った。測定自動化にはＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓＬｉｔｅを利用し、ＩＣＯＮ ＮＭＲプログラムによる自動制御下でデータを収集した。３−９−１９パルス系列による溶媒消去１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲ測定を行い、ＴＯＰＳＰＩＮプログラムによる自動データプロセスによりＧＤＰ／ＧＴＰシグナル強度比を得た。スクリーニングに要した測定時間は約２０時間であった。
【００６７】
図５にはＰｈａｒｍａｋｏｎ−１６００の化合物１０種ずつ１６０サンプル分を、５６、５６及び４８サンプルを含む、セット−Ａ１、Ｂ１及びＣ１として測定を行った結果を示す。それぞれのセットについて５６、５６及び４８回のＮＭＲ測定を行い、ＧＤＰ／ＧＴＰ比を算出した。図中の各ポイントは、各サンプルのＧＤＰ／ＧＴＰ比を示し、水平実線はそれぞれのセットでの平均値、水平点線は平均値±Ｓ．Ｄ．値に相当する。水平点線を下回ったサンプルには阻害剤が、上回ったサンプルには賦活剤が含まれる可能性がある。また沈殿を生じたサンプルについては、黒い枠を付与した。各セット右側の数字は阻害効果を認めたサンプル数（大文字）とそのうち沈殿を認めたものの数（下付）を示している。スクリーニングの結果、セット−Ａ１、Ｂ１及びＣ１からそれぞれ７＋７＋４＝１８サンプルの阻害効果を示す化合物群が同定された。またそれらの中には沈殿を生じたものが３＋２＋１＝６サンプル存在した。これらのサンプルは、凝集した化合物による非特異的な活性阻害効果を反映している可能性が考えられた。一方、活性を賦活する作用を持ったサンプルも１２種存在した。これらの中にはＰＩ５Ｐ４Ｋβの酵素活性を賦活するものが含まれると考えられる。なお、今回詳しくは述べないが、阻害剤同定と同じ手法により明確な賦活活性を示す化合物３種が同定された。
【００６８】
〔ＰＩ５Ｐ４Ｋβ酵素活性阻害剤の同定〕
１０種類混合反応液のスクリーニングにより、１８種の阻害効果を示す化合物群が同定されたことで、阻害剤候補化合物（被験化合物）を１８０化合物まで絞り込むことができた。そこで次にそれらの中で実際に阻害活性を示す化合物を同定するため、分割操作を行った。すべての化合物を、一つ一つ検証することも可能であるが、１８０回の測定が必要となり非効率的である。そこで、化合物同定を２段階に分けて行うことで、測定数の効率化を行った。１段階目でｎ個の化合物を混合して測定すると、それらの中から再び１８サンプル程度阻害効果を現すものが同定される。そのため２段階目では、１８サンプル×ｎ回の測定が必要となる。よって、化合物同定までに期待される測定回数は１８０／ｎ＋１８×ｎ程度となる。期待されるサンプル数の極小値はｎ＝３〜４の時である。なお１０種混合物に１種化合物が含まれることが期待されるため、４＋３＋３の分割を行った。
【００６９】
分割を行う化合物を保持するプレートは、１６００種を別々に保持したライブラリーから再度作成した。この時、３化合物しか含まない混合物については、他と化合物及びＤＭＳＯ濃度をそろえるため、１サンプル分に相当するＤＭＳＯを添加した。４−４−３混合プレート中の化合物濃度は２．５ｍＭである。次に４−４−３混合プレートの各ウェルから５μＬずつを３枚のディープウェル９６穴プレートに分注し、さらに７．５μＬのＤＭＳＯをそれぞれのウェルに添加した。こうしてできる４−４−３ディープウェル９６穴プレート（セット−Ａ２、セット−Ｂ２及びセット−Ｃ２）には、それぞれ２１、２１及び１２の薬剤混合液が分注され、それらの中に合計７０、７０及び４０種の薬剤が含まれていることになる。次に４−４−３ディープウェル９６穴プレート：セット−Ａ２、セット−Ｂ２及びセット−Ｃ２のそれぞれに対して、２５０μＭのＧＴＰ及び５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを１０ｍＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）−ＮａＣｌ１００ｍＭに溶解した反応液を５００μＬずつ添加し、２５℃で２０−２５時間反応を行った。各薬剤の最終濃度は２５μＭである。反応後のサンプルは順次ＮＭＲ測定を行った。分割実験に要したＮＭＲ測定時間は約８時間であった。
【００７０】
図６にはＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤のＰｈａｒｍａｋｏｎ−１６００スクリーニングにおける化合物絞り込み結果を示す。それぞれのサンプルについて２１＋２１＋１２＝５４回のＮＭＲ測定を行い、ＧＤＰ／ＧＴＰ比を算出した。図中の各ポイントは、各サンプルのＧＤＰ／ＧＴＰ比を示す。阻害活性を示さないサンプルと、阻害活性を示すサンプルの間には明確な分布の差異が観察された。図中には沈殿を生じたサンプルについて、黒い枠を付与した。各セット右側の数字は、阻害効果を認めたサンプル数（大文字）とそのうち沈殿を認めたサンプル数（下付）を示している。分割実験の結果、セット−Ａ２、Ｂ２及びＣ２から７＋５＋４＝１６サンプルの阻害効果を示す化合物群が同定された。またそれらの中には沈殿を生じたものが２＋１＋２＝５サンプル存在し、これらのサンプルは凝集した化合物による非特異的な活性阻害効果を反映している可能性が考えられた。薬剤の混合数が減ったことにより、サンプル中の薬剤総濃度が低下したことで、非特異的な活性阻害効果の可能性がわずかに減少した。例えば、セットＢで同定されたヒットサンプルの数が減ったのは、複数の薬剤の混合物が凝集し、阻害活性を示していたものが解消し、阻害活性を示さなくなったためと考えられる。
【００７１】
次に分割サンプル中のヒット化合物を同定するため、それぞれ一つの化合物のみを含むサンプルで、同様の実験を行った。１６００種を別々に保持したライブラリーから候補化合物１．２５μＬずつをディープウェル９６穴プレートに分注し、さらに１１．２５μＬのＤＭＳＯをそれぞれのウェルに添加した。化合物同定用ディープウェル９６穴プレート（セット−Ａ３、セット−Ｂ３及びセット−Ｃ３）にはそれぞれ２２、１６及び１６の候補薬剤が含まれることになる。次に化合物同定用ディープウェル９６穴プレート：セット−Ａ３、セット−Ｂ３、セット−Ｃ３のそれぞれに対して、２５０μＭのＧＴＰ及び５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを１０ｍＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）−ＮａＣｌ１００ｍＭに溶解した反応液を５００μＬずつ分注し、２５℃で２０−２５時間反応を行った。各薬剤の最終濃度は２５μＭである。反応後のサンプルは順次１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲ測定を行った。同定実験に要したＮＭＲ測定時間は約８時間であった。
【００７２】
図７にはＰＩ５Ｐ４Ｋβ阻害剤のＰｈａｒｍａｋｏｎ−１６００スクリーニングにおける化合物同定結果を示す。それぞれのサンプルについて２２＋１６＋１６＝５４回の１Ｈ−１Ｄ−ＮＭＲ測定を行い、ＧＤＰ／ＧＴＰ比を算出した。図中の各ポイントは、各サンプルのＧＤＰ／ＧＴＰ比を示す。阻害活性を示さないサンプルと示すサンプルの間には明確な分布の差異が観察された。また沈殿を生じたサンプルについては、黒い枠を付与した。各セット右側の数字は阻害効果を認めたサンプル数（大文字）とそのうち沈殿を認めたものの数（下付）を示している。スクリーニングの結果、セット−Ａ３、Ｂ３及びＣ３から５＋３＋４＝１２サンプルの阻害効果を示す化合物群が同定された。またそれらの中には沈殿を生じたものが２＋０＋２＝４サンプル存在し、これらのサンプルは凝集した化合物による非特異的な活性阻害効果が考えられたため、最終的なヒット化合物からは除外した。以上の結果、８種の阻害化合物を、合計３６時間のＮＭＲ測定により同定することに成功した。図８に、同定された酵素阻害剤及び賦活剤の化学構造を１例ずつ示す。
【００７３】
最後に、同定されたヒット化合物の阻害定数Ｋｉを同定するため、ヒット化合物について１．６μＭから１００μＭの７点希釈系列を作成し、２５０μＭのＧＴＰ及び２．５μＭのＰＩ５Ｐ４Ｋβを１０ｍＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．８）−ＮａＣｌ１００ｍＭに溶解した反応液を５００μＬと混合し、２５℃で２０−２５時間反応を行った。より小さな阻害定数に対応するため、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ濃度をスクリーニング時の半分とした。また各サンプル中のＤＭＳＯ濃度は、５％となるように調整した。ＧＤＰ／ＧＴＰ比の濃度依存性からＫｉ値を算出した結果を図９に示す。最も阻害効果の強かった化合物のＫｉ値は１μＭであり、１０μＭ以下の阻害活性を示した化合物６種が同定された。うち最も阻害効果が高かった２化合物については、ＰＩ５Ｐ４Ｋβ複合体のＸ線結晶構造解析により、ＰＩ５Ｐ４Ｋβの活性中心に結合していることが確認された。
【００７４】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
なお、本明細書に引用された特許、特許出願、及び出版物の開示内容は全て、参照により本明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
医薬品開発において、標的タンパク質の機能を制御する生理活性物質の創製は、欠くことのできない重要な段階である。創薬標的タンパク質の広範化や分子標的薬開発の必要性に対応して、様々な標的タンパク質に対して、多様な低分子化合物や既存の薬剤のスクリーニングを行う技術の開発が進んできた。特に既存薬剤を用いる手法はドラッグリポジショニングとして知られ、安全性の担保された薬剤候補化合物が獲得できることから、近年注目を集めている。本発明は、反応液中の補酵素もしくは基質又はそれら由来の反応生成物のＮＭＲスペクトルを直接観測することにより、非特許文献１に記載された方法等、従来の手法に比べてＦａｌｓｅＰｏｓｉｔｉｖｅのより低い薬剤のスクリーニングを行うことができる。また、蛍光標識等、対象に合わせた個別の追加処置や検出系等も必要なく、非侵襲的な試験が可能であり、信頼性や汎用性がより高い。さらに、対象酵素の同位体等を用いた標識も必要なく、ＮＭＲ測定する酵素（タンパク質）の性状による影響（高分子量の対象は測定できないなど）も小さい。また被験化合物自体を解析の対象とする方法に比べても、高感度、高精度で、幅広い阻害（賦活）定数を有する化合物を同定することができるという利点を有し、同定された化合物が結合のみで阻害効果を示さないなどといった問題も回避できる。よって、本手法は従来法と比較しても汎用性が高く、医薬品開発の初期において、阻害（賦活）活性を有する化合物を早期に得るという期待に応えるものになる。ＮＭＲ法による解析では、化合物‐タンパク質複合体の相互作用情報とともに、結合部位などの構造情報、複合体の可溶性などの物性情報なども得られることから、高付加価値な化合物‐タンパク質相互作用解析に応用展開が可能な点も利点となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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