(57)【要約】【課題】  キシリトールなどの発酵で作る物質を、簡便により効率よく分離精製する方法を提供する。【解決手段】  バイオマスを２段階で糖化し、キシリトールなどの発酵でできた物質を、少なくとも２種類の膜を使用して、発酵液から目的物質を分離精製する。この分離精製は、発酵液中の着色物質やオリゴペプチド類などの不純物を少なくとも２種類の膜の組み合わせ、もしくは活性炭粉末によるバッチ処理とナノろ過膜の組み合わせで除去することによる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の膜からなる分子篩により発酵生成物を分離精製する方法。
【請求項２】
膜が、精密ろ過膜、限外ろ過膜、およびナノろ過膜から選択された少なくとも２種である請求項１記載の方法。
【請求項３】
精密ろ過膜でろ過した発酵液を、孔径２０〜３０ｎｍの活性炭を用いて粗精製し、ナノろ過膜により発酵生成物を分離精製する請求項１記載の方法。
【請求項４】
精密ろ過膜でろ過した発酵液を分画分子量５０００〜１００００の限外ろ過膜で粗精製し、その透過液を分画分子量１５０〜３００、または６００〜８００のナノろ過膜で脱色、タンパク質除去、およびアミン類除去をする請求項１記載の方法。
【請求項５】
発酵生成物が、糖アルコール、糖、またはアミノ酸誘導体である請求項１記載の方法。
【請求項６】
発酵生成物が、バイオマスを酸で糖化し、その液を使用して発酵させた物質である請求項１記載の方法。
【請求項７】
バイオマスがセルロース系バイオマスである請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖アルコールなどの発酵で作りうる物質の新規な分離精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでキシリトールなどの発酵で作りうる物質について、発酵後の分離精製に関して活性炭、イオン交換樹脂カラムによる精製法が採られてきた。これらの精製法により高純度でキシリトールなどが分離された報告が数件なされている。本発明者が従来の活性炭カラム、イオン交換樹脂カラムによる精製を行った結果、発酵液の着色物質を活性炭で除くことができ、イオン交換樹脂で発酵液中のアミン類やタンパク質、オリゴペプチド類、カルシウムイオンなどの金属イオンを除去することができた。そして晶析により純度の高いキシリトールを得ることができ、食品規格に合格できた（純度９９．５％）。しかし、活性炭、イオン交換樹脂による精製でいくつか欠点があることがわかった。ひとつは活性炭において数ＢＶ通液するだけで破過に達し、また処理液にタンパク質の凝集によると
思われるにごりが発生する問題が生じた。さらにイオン交換樹脂においては数ＢＶ通液して破過に達することから多くの樹脂が必要になり、また再生する薬液量も多くなる。よって従来の方法であると操作が煩雑になりコスト高である。
【０００３】
そこで活性炭カラム、イオン交換樹脂カラムの代替として限外ろ過膜、ナノろ過膜などの膜を組み合わせた分離方法を立案し、検討した。これまで糖蜜を原料にして発酵させた液を限外ろ過膜で色素成分を除去する方法が検討されてきたが、限外ろ過膜での処理だけでは不十分でオゾン処理をしないと色素成分が除去できない（非特許文献１）。また、限外ろ過膜でキシリトールを含む発酵液を処理し、キシリトールの結晶化を試みたが純度が９０．３％と低く、この理由としてはまだ限外ろ過膜での処理ではまだオリゴペプチドなどの不純物が除去できないためである（非特許文献２）。非特許文献２では膜による分離構想を限外ろ過で大きい分子を除き、ナノろ過膜で糖などを阻止してイオン類を透過させる模式図が示されている。特許文献１ではバイオマスを糖化して発酵して残ったキシロースをナノろ過膜、逆浸透膜で分離しているがこの方法であると発酵液中にはアミン類とキシロースのメイラード生成物やグリセロールが多く、膜でメイラード生成物は分離できてもキシロースとグリセロールの分離は難しい。
また発酵液を直接ナノろ過膜で処理するにも多くの処理時間を有し、スケールアップが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２０５９８７公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】沖縄県工業技術センター研究報告書 第８号 ２００６，２５−３１
【非特許文献２】Thesis submitted to the Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University ２０００，１−１０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、発酵で作る物質の分離精製法を提供することを目的とする。より具体的には、バイオマスを２段階で糖化し、キシリトールなどの発酵でできた物質を、少なくとも２種類の膜を使用して発酵液から簡便により効率よく分離することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
バイオマスから発酵により有用物質を作り、その分離精製法を検討していた本発明者らは、活性炭カラム、イオン交換樹脂カラム代替の精製法開発に想到した。バイオマスをヘミセルロース優先糖化して、それを用いて発酵させた生成物を活性炭、イオン交換樹脂により精製した欠点を補うべく膜による精製法を検討した。この結果、発酵液中の着色物質やオリゴペプチド類などの不純物を２種類の膜の組み合わせ、もしくは活性炭粉末によるバッチ処理とナノろ過膜の組み合わせで除去し、目的物質を精製する膜分離法を開発して本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  少なくとも２種の膜からなる分子篩により発酵生成物を分離精製する方法。
［２］  項［１］に記載の膜が、精密ろ過膜、限外ろ過膜、およびナノろ過膜から選択された少なくとも２種である方法。
［３］  項［１］に記載の、精密ろ過膜でろ過した発酵液を孔径２０〜３０ｎｍの活性炭を用いて粗精製し、ナノろ過膜により発酵生成物を分離精製する方法。
［４］  項［１］に記載の、精密ろ過膜でろ過した発酵液を分画分子量５０００〜１００００の限外ろ過膜で粗精製し、その透過液を分画分子量１５０〜３００、または６００〜８００のナノろ過膜で脱色、タンパク質除去、およびアミン類除去をする方法。
［５］  項［１］に記載の発酵生成物が、糖アルコール、糖、またはアミノ酸誘導体である方法。
［６］  項［１］に記載の発酵生成物が、バイオマスを酸で糖化し、その液を使用して発酵させた物質である方法。
［７］  項［６］に記載のバイオマスが、セルロース系バイオマスである方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、バイオマスから発酵による有用物質を膜による分離精製法で精製できる。本発明の方法は発酵で作られる医薬品、またはその中間体、エリスリトールなどの糖類を分離するのに適用が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
セルロース系バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム空殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスであり、本発明ではこれらのバイオマスを原料に発酵で有用物質を生産する。具体的には、セルロース系バイオマスにはヘミセルロース、セルロース、芳香族高分子であるリグニンが含まれており、本発明では、セルロース系バイオマスを加水分解することで糖化液を作成し、発酵して得られた液を膜により有用物質を分離する。
【００１１】
本発明の発酵生成物の分離精製法では、前述セルロース系バイオマスを原料として、まず１％硫酸などの希酸でヘミセルロースを加水分解し、酵母で発酵して精密ろ過膜で菌体を除去した後、発酵液を得る。そして少量の活性炭粉末によるバッチ処理を行い、ナノろ過膜でろ過することで発酵生成物を分離する。また限外ろ過膜でろ過を行い、そのろ液をさらにナノろ過膜でろ過することで発酵生成物を分離でき、脱色も可能である。
【００１２】
まず、バイオマスの糖化に関して説明する。
以下にバイオマスの糖化方法の一例をあげるが、これに限定されない。
１）  細かく粉砕したモウソウチクに０．５〜１．０重量％の硫酸をスラリー濃度が２５〜３０重量％になるように加え、オートクレーブ処理する。なお加熱温度は１３０℃が好ましく、時間は１２０分〜１８０分、加える圧力は０．２〜１ＭＰａが好ましい。また、加熱と加圧を同時に行うことが好ましい。
２）  吸引ろ過または加圧ろ過を行い、ろ液を得る。
３）  得られたろ液をアンモニア水で中和する。
４）  エバポレーターで２倍濃縮する。
５）  ２）の残渣を乾燥し、７５％硫酸と混合してニーダーで混錬しながら６０℃で可溶化し、加水し８０℃に１時間加熱して糖化させてグルコースを得る。
その他に、粉砕したモウソウチクを希硫酸と混合し、マイクロ波照射によりヘミセルロースを加水分解することもできる。
【００１３】
次に発酵について説明する。ヘミセルロース加水分解液を用いて発酵させる場合、キシロースを炭素源としてキシリトールに資化する能力が高い微生物であれば何でもよい。こうした微生物としてピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびクルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
またサッカロマイセス族などのキシロースの資化能のない酵母にキシロースをキシリトールに変換できる遺伝子を組み込んだ微生物を用いてもよい。
【００１４】
ヘミセルロース加水分解の残渣を糖化して得た液を用いて発酵させる場合、グルコースを炭素源にして有用物質を生産する微生物であれば何でもよい。例としてＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属、またはそれに有用物質を作る遺伝子を組み込んだ株などがあげられる。
【００１５】
発酵させる場合、ヘミセルロースを加水分解した液を発酵させて発酵生成物を作製してヘミセルロース加水分解残渣を糖化した液を別途発酵に使用して発酵生成物を作製してもよく、バイオマスのセルロース、ヘミセルロースを同時糖化してその糖化液を発酵させてキシロースを資化しないサッカロマイセス属の酵母でエタノールを生成させてからその発酵液を再度カンジダ属の酵母で発酵させてキシリトールなどの発酵生成物を得てもよい。
【００１６】
微生物の培養は、通常、培養する微生物の至適ｐＨおよび至適温度の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００１７】
精密ろ過膜はメンブレンフィルトレーションと呼ばれ、圧力差を駆動力として、微粒子懸濁液から０．０１〜１０μｍ程度の粒子を分離除去できる分離膜である。すなわち精密ろ過膜の表面には０．０１〜１０μｍの範囲の細孔を有し、その細孔以上の微粒子成分は膜側に分離除去することができる。微生物を除去するには０．４５μｍの細孔を有する膜が好ましい。
【００１８】
限外ろ過膜とは、分画分子量１，０００〜２００，０００である膜のことであり、ウルトラフィルトレーション膜とも称され、ＵＦ膜などと略称される。限外ろ過膜の膜表面の細孔径は、非常に小さいので、電子顕微鏡等で計測することが困難である。よって、平均細孔径の代わりに、分画分子量が孔径の大きさの指標とされる。
【００１９】
精密ろ過膜および限外ろ過膜の材質は、上述した微生物の除去が可能であれば、特に限定されるものではない。具体的には、これらのろ過膜を構成する材料として、セルロース、セルロースエステル、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ四フッ化エチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））などが例示できる。精密ろ過膜および限外ろ過膜の材質は、発酵液の性状、あるいはランニングコストを鑑みて適宜選択すればよいが、取り扱いの容易性から考えて有機材料であることが好ましい。特に、親水性の有機材料として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが好ましい。
【００２０】
精密ろ過膜による精密ろ過、または限外ろ過膜による限外ろ過の方法としては、圧ろ過、真空ろ過、クロスフローろ過、遠心ろ過などがあるが、膜の目詰まりが少ないクロスフローろ過であることが好ましい。またろ過操作として、定圧ろ過、定流量ろ過、非定圧非定流量ろ過に大別されるが特に限定されない。
【００２１】
ナノろ過膜とはナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）と呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられ、色素成分の除去にも有効である。またナノろ過膜は分画分子量が１５０〜８００である膜である。
【００２２】
本発明で使用されるナノろ過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００２３】
ナノろ過膜は一般にスパイラル型の膜モジュールとして使用されるが、本発明で用いるナノろ過膜も、スパイラル型の膜モジュールとして好ましく使用される。ナノろ過膜によるろ過は、圧力をかけてもよく、そのろ過圧は、０．１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。ろ過圧が０．１ＭＰａより高ければ膜透過速度が上昇しろ過時間短縮でき、８ＭＰａより低ければ膜の損傷に影響を与えるおそれが少ない。また、ろ過圧が０．５〜７ＭＰａの範囲であれば、膜透過流束が高いことから、発酵液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１〜６ＭＰａの範囲であることが特に好ましい。
【００２４】
発酵液を膜で精製するには、精密ろ過で菌体を除去した後、限外ろ過でろ過をして、そのろ液をナノろ過膜でろ過するもしくは活性炭粉末による脱色処理後、ナノろ過膜によるろ過で行うのが膜による処理速度の観点から好ましい。また発酵液中にはメイラード反応生成物などの着色物質、タンパク質、オリゴペプチド、アミン類などの不純物が含まれているため直接ナノろ過膜で処理すると処理時間がかなりかかりスケールアップが難しい。
【００２５】
活性炭は、粉末活性炭、粒状活性炭、繊維状活性炭があげられるが、比表面積の観点から粉末活性炭が好ましい。材質はヤシ殻炭、石炭、木炭などが挙げられるが発酵液の性状をみて適宜選択するのがよい。細孔径は１〜３０ｎｍあるがタンパク質などの大きい分子を吸着する観点から２０〜３０ｎｍであるのが好ましい。
【００２６】
発酵生成物には、糖アルコール、糖、アミノ酸誘導体などが挙げられる。糖アルコールとしてはキシリトール、エリスリトール、ガラクチトール、Ｄ−アラビニトール、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。糖としては、シアル酸、Ｄ−ブシコース、Ｄ−アロースなどの希少糖が挙げられる。
アミノ酸誘導体は、アミノレブリン酸、フェニルアラニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。
【００２７】
バイオマスの糖化において用いる酸としては、例えば硫酸、塩酸、硝酸又はそれらの混合物が挙げられるが、このうち硫酸が好ましい。さらに反応に用いられる硫酸濃度であるが０．５〜３０％の範囲がよく、後処理で擬似移動床クロマトグラフィーによる酸糖分離、電気透析による脱酸工程を省略してアンモニア水で中和して硫安の形で発酵に仕込みことを考えると硫酸濃度は０．５〜１．０％が好ましい。反応温度は１２０〜１８０℃、特に１３０〜１５０℃が好ましい。反応時間は１２０〜１８０分が好ましい。糖化の残渣を糖化するには硫酸、塩酸、硝酸又はそれらの混合物が挙げられるが、このうち硫酸が好ましく、残渣にはセルロースが残っているのでこれを可溶化、糖化するには濃硫酸がこのましい。硫酸濃度は７０〜８０％の範囲で特に７５％が過分解を抑制する観点から好ましい。反応温度は濃硫酸による可溶化は６０℃、加水して糖化反応するときは８０℃が好ましい。反応時間に関して可溶化は１〜３０分、加水して糖化するときは３０〜６０分の範囲で可溶化の場合、ニーダーで混錬させながら連続的に処理する場合は７７〜１０３秒の範囲が好ましい。加水して糖化する場合、過分解を考えると１時間が好ましい。
上記よりヘミセルロースを効率的に加水分解し、糖を回収することができ、その残渣をさらに加水分解することでセルロースからグルコースを得ることができる。
【００２８】
次に上記酸処理工程の反応物は、まず希酸または中程度の酸でヘミセルロースを加水分解した後固液分離工程においてろ液と固形物残渣とに分離される。残渣は続く濃硫酸などの酸による糖化に供される。ろ液はヘミセルロース由来の糖を含んでおり、後述のように発酵によってキシリトールなどの糖アルコールに変換される。固液分離の方法はろ過、遠心分離などを用いることができるが、エネルギー消費の小さいろ過を用いることが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
＜１＞  タケの希硫酸によるヘミセルロース優先糖化
モウソウチクを３．３５ｍｍ以下程度に粉砕したチップ２，０００ｇに、１．０％硫酸  ６，０００ｇを加えて１３０℃で３００分間オートクレーブ処理した。これを加圧ろ過により固液分離を行い、糖化液（キシロース回収率６０％）を得た。この糖化液に２８〜３０％アンモニア水を添加してｐＨ６．８に中和して０．４５μｍメンブレンフィルター（オムニポアメンブレン、材質ＰＴＦＥ，メルクミリポア製）で沈殿物を除去した。
【００３１】
＜２＞  ヘミセルロース優先糖化を用いた発酵
種母培養
ＣＳＬ培地（コーンスティープリカー７５０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム９６ｇ／Ｌ，ｐＨ＝６．４に調製）を６７０μＬ、５０％キシロース水溶液を４ｍＬ，滅菌水を４５．３ｍＬ混ぜて計５０ｍＬの液体培地を調製した。これを３本作製し、それぞれの液体培地にＣａｎｄｉｄａ属酵母（ＡＴＣＣ１３８０３）のグリセロールストック１ｍＬを融解させてから全量添加して３０℃、１６０ｒｐｍで１６時間培養した。
【００３２】
本培養
種母培養液１５０ｍＬと＜１＞で調製した１．０％硫酸糖化液１，３５０ｍＬを混ぜて計１，５００ｍＬにして３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ）に仕込み、３０℃、３２０ｒｐｍ、１．０ｖｖｍで４８時間培養した。９時間目で通気量を１．０ｖｖｍから０．３３ｖｖｍに落とした。ｐＨの調整を行う場合のｐＨ調整剤は、１０％硫酸と１９％アンモニウム水溶液を使用した。ＡＴＣＣ１３８０３は増殖するとは発泡しやすいため、培養の様子を確認しながら消泡剤（ソルビタンモノオレエート：和光純薬）を添加した。
培養終了後、φ９５ｍｍのろ紙（Ｎｏ５Ｃ；桐山製作所製）を用いて吸引ろ過を行い、そしてろ液をさらに精密ろ過膜：０．４５μｍのメンブレンフィルター（オムニポアメンブレン、材質ＰＴＦＥ、メルクミリポア製）を用いて吸引ろ過することにより菌体を除去した。
【００３３】
糖濃度の測定
本発明のグルコース、キシロース、キシリトール濃度は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
分析計：島津高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所）
カラム；Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｓｕｇａｒ−Ｄカラム（逆相カラム）（ナカライテスク）
内径４．６ｍｍ  長さ２５０ｍｍ
本カラムを２本連結
試料注入量；５０μＬ
溶離液；アセトニトリル：水＝８５：１５
溶離液流速；１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度；４０℃
検出；ＲＩＤ（示差屈折率検出器）
【００３４】
＜３＞  タケの濃硫酸によるヘミセルロース、セルロース同時糖化
モウソウチクを長径２−３．３５ｍｍに粉砕したチップをフィーダー（マイクロンフィーダーＴＦ−７０−ＣＴ  アイシンナノテクノロジーズ製）でニーダー（Ｓ１ＫＲＣニーダー  栗本鐵工所製）へ５．５３ｇ／ｍｉｎでフィードし、７５％硫酸を７．４４ｇ／ｍｉｎでニーダーへフィードして混錬させて可溶化させた。可溶化物は排出させ、加水量に相当する水を張ったバケツに氷水で冷却しながら回収した。１日で４．６７ｋｇの可溶化物を作り、これに水を３．０８ｋｇ加えた。これを２日行い、可溶化物９．３４ｋｇに対し水は６．１６ｋｇを加えるようにした。これらを２０Ｌの糖化機（吉野製作所製）に仕込んで８０℃、１時間、１００．８ｒｐｍで糖化反応させた。反応後、糖化機から糖化液を抜き出してブフナーロート（桐山製作所製）とφ２４０ｍｍのＮｏ５Ｃのろ紙（桐山製作所製）を用いて吸引ろ過により固液分離した。糖回収率はグルコースが７７％、キシロースが７５％であった。
【００３５】
（活性炭による糖化液の脱色）
カラム（内径：９．１ｃｍ、高さ：５２．４ｃｍ：ａｍｉｃｏｎ製）にミリＱ水を予め張り、ミリＱ水と粒状活性炭（ＦＧ−３：日本エンバイロケミカルズ製）のスラリーを充填して３．４Ｌまで充填した。空間速度０．３ｈ−１で糖化液を連続通液して脱色した。脱色は色彩色差計（ＣＴ−２１０  ＫＯＮＩＣＡ  ＭＩＮＯＬＴＡ製）を用いて、彩度（Ｃ）を測定することで判定した。Ｃが１以下になれば脱色できていると判断した。
【００３６】
（酸糖分離）
脱色した糖化液を改良擬似移動床クロマト分離による酸糖分離装置（酸糖分離装置ＩＳＭＢ  Ｌａｂｏ−２ＬＴ  三菱レイヨンアクアソリューションズ製）で硫酸画分と糖画分に分離した。
2017051117.tif 000002
ＳＶ：液負荷
ＢＶ：Ｂｅｄ
Ｖｏｌｕｍｅ：負荷した液量（ｍＬ）／樹脂の体積（ｍＬ）
Ｐ／Ｒ：硫酸画分平均流量／糖画分平均流量
Ｗ／Ｆ：溶離水平均流量／原料平均流量
カラム温度：５０℃、溶離液：超純水
この操作により糖画分の糖回収率は８７％、硫酸画分の硫酸回収率は８８％であった。
【００３７】
（脱酸）
糖画分を電気透析（マイクロアシライザーＳ３  ＡＳＴＯＭ製）で硫酸を脱酸した。電気透析には電極液を４％硫酸ナトリウム水溶液、濃縮室にイオン交換水を仕込み、サンプル室に糖画分を仕込んだ。
電圧を電導度により自動的に切り替わるＡＵＴＯの条件でまず糖画分の電気伝導度を３２ｍＳ／ｃｍ（硫酸濃度が約１ｗｔ％）まで脱酸した。次に１２０℃、６０分の条件でオートクレーブ処理をしてオリゴ糖加水分解をした。オリゴ糖加水分解で濁りが出たのでφ９５ｍｍのＮｏ５Ｃのろ紙（桐山製作所製）を用いて吸引ろ過で除いた。また電圧を電導度により自動的に切り替わるＡＵＴＯの条件で電気伝導度が２ｍＳ／ｃｍになるまで電気透析で脱酸し、１．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液または０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ＝４．０にした。
【００３８】
（２段発酵・１段階目の発酵）
種母培養に関して、酵母エキス１０ｇ／Ｌ，ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，グルコース２０ｇ／Ｌの培地１００ｍＬを６本調製し、それぞれに凝集性酵母ＫＦ−７（熊本大学木田研究室より提供）のグリセロールストックを加えて  ３０℃、１６０ｒｐｍ、２２時間３０分培養した。種母培養終了後、菌体を自然沈降させた後、上澄みを抜き出して６００ｍＬから１００ｍＬに減容した。
本培養では脱酸液５００ｍＬに酵母エキス２０ｇ、ポリペプトン４０ｇを溶解させ、脱酸液１４００ｍｌと種母培養液１００ｍＬを加えて計２０００ｍＬとした。そして３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製）に仕込み３０℃、２５０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで６時間培養した。培養終了後、φ９５ｍｍのろ紙（Ｎｏ５Ｃ；桐山製作所製）を用いて吸引ろ過を行い、そしてろ液をさらに精密ろ過膜：０．４５μｍのメンブレンフィルター（オムニポアメンブレン、材質ＰＴＦＥ、メルクミリポア製）を用いて吸引ろ過することにより菌体を除去した。
ろ液１．８６ｋｇを３バッチに分けて１Ｌのエバポレーター（ＡＳ  ＯＮＥ）で３０℃に加温しながら約１．５倍に濃縮してエタノールを留去した。
【００３９】
（２段発酵・２段階目の発酵）
種母培養に関して、酵母エキス１０ｇ／Ｌ，ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，グルコース２０ｇ／Ｌの培地５０ｍＬを３本調製し、それぞれの培地にＣａｎｄｉｄａ属酵母（ＡＴＣＣ１３８０３）のグリセロールストック１ｍｌを融解させてから全量添加して３０℃、１６０ｒｐｍ、１６時間２０分培養した。
本培養では１段階目の発酵液（エタノール留去済み）を１３５０ｍＬ、種母培養液１５０ｍＬをジャーファーメンターに仕込み３０℃、３２０ｒｐｍ、１．０ｖｖｍで２４時間培養した。６時間後に通気量を１．０ｖｖｍから０．３３ｖｖｍに落とした。
培養終了後、φ９５ｍｍのろ紙（Ｎｏ５Ｃ；桐山製作所製）を用いて吸引ろ過を行い、そしてろ液をさらに精密ろ過膜：０．４５μｍのメンブレンフィルター（オムニポアメンブレン、材質ＰＴＦＥ、メルクミリポア製）を用いて吸引ろ過することにより菌体を除去した。
【００４０】
＜４＞  膜を用いた発酵液分離精製
（比較例１）
限外ろ過膜のみで発酵液を分離精製
２段発酵液を用いて、限外ろ過膜のみで分離精製を実施した。限外ろ過膜（Ｂｉｏｍａｘ１０、分画分子量１０，０００、有効膜面積５０ｃｍ２、材質ポリエーテルスルホン  メルクミリポア製）に発酵液１．３ｋｇを４０〜４５℃にウォーターバスで温めながらぺリスタリックポンプ（ＭＰ−２０００，ＥＹＥＬＡ製）で２０ｍＬ／ｍｉｎで送液することにより発酵液の分離精製を行った。
分画分子量の小さい膜（ＴＦＦミニメイト、分画分子量１，０００、有効膜面積５０ｃｍ２、材質ポリエーテルスルホン  日本ポール製）に発酵液を４０〜４５℃にウォーターバスで温めながらぺリスタリックポンプ（ＭＰ−２０００，ＥＹＥＬＡ製）で１９．１ｍＬ／ｍｉｎ、圧力を０．１ＭＰａで送液することによりろ過による発酵液の分離精製を行った。また圧力０．３ＭＰａの条件で発酵液をローラーポンプ（古江サイエンス製）で６３ｍＬ／ｍｉｎで送液して限外ろ過膜による発酵液の分離精製を行った。
各膜処理で得た液の糖分析、タンパク質分析、アミン分析を行いキシリトールの膜透過率、タンパク質、アミンの膜阻止率、色度阻止率を求めた。
【００４１】
表１
2017051117.tif 000003
−：未測定
【００４２】
表２
2017051117.tif 000004
−：  未測定
色度は彩度より次の式により求めた。
３６．１６７×Ｃ（彩度）−１０．６８１
【００４３】
表１および表２の結果、限外ろ過膜のみの分離精製ではタンパク質と色度の阻止率が極めて低く分離精製が十分とはいえない。
【００４４】
（実施例１）
限外ろ過膜、ナノろ過膜の組み合わせによる発酵液分離精製
希硫酸糖化液で発酵させた液６１５．８６ｇを用いてまず限外ろ過膜（ＵＦ膜：モジュール名：ＰＷ、有効膜面積３８ｃｍ２、分画分子量１０，０００、ＧＥ製）で分離精製を行った（圧力０．３５ＭＰａ、液回収率６０％、攪拌あり）。限外ろ過膜により膜濃縮液２４１．２６ｇと膜透過液３７１．５９ｇを得た。次に限外ろ過膜の透過液３０６．２ｇを用いてナノろ過膜（ＮＦ膜：モジュール名：ＮＦＸ、分画分子量１５０−３００、有効膜面積３２ｃｍ２、Ｓｙｎｄｅｒ製）で分離精製を行った（圧力１．０ＭＰａ、液回収率５０％、攪拌あり）。ＮＦ膜による分離精製で膜濃縮液１６０．０７ｇと膜透過液１４３．０５ｇを得た。
【００４５】
（参考例）
（逆浸透膜による処理）
最後にＮＦ膜透過液１２０．６２ｇを用いて逆浸透膜（ＲＯ膜：モジュール名：ＨＦ  中圧膜、有効膜面積３２ｃｍ２、ＬＡＮＸＥＳＳ製）で濃縮を行った（圧力２．０ＭＰａ、液回収率５０％、攪拌あり）。ＲＯ膜による分離精製で膜濃縮液６０．４２ｇと膜透過液５９．９５ｇを得た。
各膜処理で得た液の糖分析、タンパク質分析、アミン分析を行いキシリトールの膜透過率、タンパク質、アミンの膜阻止率、および色度阻止率を求めた。
【００４６】
表３
2017051117.tif 000005
【００４７】
表４
2017051117.tif 000006
【００４８】
表３および表４より、ＵＦ膜での処理にＮＦ膜、ＲＯ膜を組み合わせることにより発酵液の脱色ができ、かつタンパク質、アミンの量も減らすことができた。キシリトールはＵＦ膜、ＮＦ膜で膜透過側に回収でき、ＲＯ膜で濃縮できた。
【００４９】
＜５＞活性炭粉末による発酵液の脱色・脱タンパク質処理、ＮＦ膜による分離精製
（実施例２）
希硫酸糖化液で発酵させた液１２２３．９２ｇを活性炭粉末（銘柄：Ｐ−ＡＺＹＧ、孔径２０〜３０ｎｍ、クラレケミカル製）を２４．１１ｇ混合してインキュベーター(プログラム低温恒温器IN600；ヤマト科学)にて３７℃、１時間、１６０ｒｐｍでしんとうさせた。そしてしんとう後にメンブレンフィルター（オムニポアメンブレン、材質ＰＴＦＥ、０．４５μｍ、メルクミリポア製）を用いて吸引ろ過により活性炭粉末を除去した。活性炭脱色液の糖分析、タンパク質分析、アミン分析を行い、キシリトールの回収率、タンパク質の除去率ならびにアミン除去率を求めた。
活性炭で脱色・脱タンパク質処理した液を用いてＮＦ膜でキシリトールと残存色素成分の分離試験を行った。ＮＦ膜は３種類（ＮＦＸ：分画分子量１５０−３００、ＮＦＷ：分画分子量３００−５００、ＮＦＧ：分画分子量６００−８００、いずれもＳｙｎｄｅｒ製）用い、それぞれの膜の試験に液を約３００ｍＬ用いて分離試験をした（圧力１．０ＭＰａ、有効膜面積３２ｃｍ２、液回収率５０％、攪拌あり）。
【００５０】
表５
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【００５１】
表６
2017051117.tif 000008
【００５２】
表７
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【００５３】
表５、表６、および表７より発酵液を活性炭処理すると発酵液中のタンパク質が９０％以上除去され、ＮＦ膜による処理でタンパク質やアミンを阻止することができ、さらに色素成分を阻止してキシリトールを透過させて回収することが可能であった。
【００５４】
（タンパク質分析）
Ｌｏｗｒｙ法に従い、タンパク質濃度を測定した。Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質濃度は市販の測定キット（ＤＣプロテインアッセイキット、バイオラッド製）を用いて測定した。すなわちサンプルを１ｍＬ採取して超純水で１００倍希釈して１００ｍＬにメスアップした。希釈したサンプルを１００μＬ採取し、キットのＡ試薬を５００μＬ加えてボルテックスで攪拌した。さらにキットのＢ試薬を４ｍＬ加えてボルテックスで攪拌して１５分間室温で放置した。分光光度計で波長７５０ｎｍに固定して吸光度を測定した。
【００５５】
（アミン分析）
アミン分析はニンヒドリンによる呈色反応を利用した定量法で測定した。すなわちサンプルを１ｍＬ採取して超純水で１００倍希釈して１００ｍＬにメスアップした。希釈したサンプルを１ｍＬ採取してねじ口試験管にとり、ピリジン１ｍＬ、０．５％アスコルビン酸水溶液１ｍＬ、１．０％ニンヒドリン水溶液１ｍＬを添加してよく振り、ヒートブロック（サーモサイエンティフィック製）にて１００℃、２５分間加熱した。加熱後に２分間振りながら水冷し、５０ｍＬに超純水でメスアップした。分光光度計で波長５７０ｎｍに固定して吸光度を測定した。
【００５６】
（色度分析）
色彩色差計（ＣＴ−２１０  ＫＯＮＩＣＡ  ＭＩＮＯＬＴＡ製）を用いて、彩度（Ｃ）を測定することで色度に換算した。色度は彩度より次の式；色度＝３６．１６７×Ｃ（彩度）−１０．６８１により求めた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の分離精製法はバイオマスからの有用物質を生産する工程において分離精製する技術として適用するだけでなく、発酵で生産可能な医薬品、糖類やアミノ酸など食品成分の精製工程にも適用可能となる。