(57)【要約】      （修正有）【課題】病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出する方法の提供。【解決手段】特定の配列からなるプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化した病原性大腸菌検出用担体。病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された前記担体と、を含む病原性大腸菌検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(A)〜(F)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
(A)配列番号１〜５に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B)配列番号６〜７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(C)配列番号８〜１４に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(D)配列番号１５〜１９に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(E)配列番号２０〜２２に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(F)配列番号２３〜２７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
【請求項２】
以下の(A-1)〜(F-1)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
(A-1)配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B-1)配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(C-1)配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(D-1)配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(E-1)配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(F-1)配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
【請求項３】
以下の(A-2)〜(F-2)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
(A-2)配列番号１〜５に示す塩基配列、配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B-2)配列番号６〜７に示す塩基配列、配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(C-2)配列番号８〜１４に示す塩基配列、配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(D-2)配列番号１５〜１９に示す塩基配列、配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(E-2)配列番号２０〜２２に示す塩基配列、配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(F-2)配列番号２３〜２７に示す塩基配列、配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列、配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列、及び配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
【請求項４】
前記(A-2)〜(F-2)のプローブ群の全ての群からなるプローブを固定化したことを特徴とする請求項３記載の病原性大腸菌検出用担体。
【請求項５】
病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定化された担体を含む病原性大腸菌検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含む第一のプライマーセットと、
配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含む第二のプライマーセットと、を含み、
前記担体が、請求項１〜４のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体である
ことを特徴とする病原性大腸菌検出用キット。
【請求項６】
病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、
配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含む第一のプライマーセットと、
配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含む第二のプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１〜４のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、前記病原性大腸菌を検出する
ことを特徴とする病原性大腸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性大腸菌を検出するための病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛挽肉及び牛挽肉材料が含まれる食品に関する米国の細菌規格において、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすものとして、O157に加え、6つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145）が規定されている。このうち、O157については牛肉加工業者に対する検査義務があり、流通品で検出された場合はリコール勧告の対象となる。また、その他のものについては、一般に牛肉加工業者による自主検査が行われており、流通品で検出された場合には同様にリコール勧告の対象となっている。このため、検査でこれらの病原性大腸菌が検出されると、その牛挽肉や食品は不良品（adulterated）とされ、回収の対象となる。病原性大腸菌O26、O45、O103、O111、O121、O145は、通称ＢＩＧ６またはＴＯＰ６と呼ばれており、さらにこれにO157を加えたものは通称ＴＯＰ７と呼ばれている。
【０００３】
ＢＩＧ６の定義は、１個体で、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子（血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145のいずれかのもの）、インチミン遺伝子（eae）、及び志賀毒素遺伝子（stx）の３因子を全て保有している病原性大腸菌とされている。このため、これらの病原性大腸菌の検査は、これら３因子を分析することにより行うことができる。
【０００４】
これらの病原性大腸菌の検査方法として、例えば、Ｄｕ  Ｐｏｎｔ社の病原性大腸菌検査キットである「ＢＡＸ」を用いた方法が知られている（以下、公知技術１と称する）。この方法は、一次スクリーニングと二次スクリーニングの二段階で行われる。一次スクリーニングではリアルタイムＰＣＲによってインチミン遺伝子と志賀毒素遺伝子の検査が行われ、個体毎に片方のみが陽性の場合又は両方が陰性の場合には、陰性との判定が行われる。両方が陽性の場合には、二次スクリーニングが行われる。二次スクリーニングではリアルタイムＰＣＲによってＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の検査が行われる。Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の検査は、O157用のキット、O26, O111, O121用のキット、及びO45, O103, O145用のキットの３種類のキットを用いることにより、各個体のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の血清型の識別が行われる。したがって、この方法では、病原性大腸菌の検出のために、最大で４種類のキットを使用する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１５−５１９０７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、公知技術１は、上記の通り、病原性大腸菌の検出のために最大で４種類のキットを使用する必要があるため、労力を要するという問題があった。また、一次スクリーニングで陽性だったサンプルを選んで、次いで二次スクリーニングを行う必要があるため、操作が煩雑となり、検体を取り違える可能性があるという問題もあった。
【０００７】
また、病原性大腸菌の検出方法に関連する発明として、特許文献１に記載の腸出血性大腸菌を検出及び同定する方法を挙げることができる。この方法では、近縁種間でも配列の多様性に富むＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）領域を標的領域としてリアルタイムＰＣＲなどを行うことにより、同じＯ抗原を持つ大腸菌における規制対象菌（eaeとstxの両方を有するもの）と規制対象外の菌（eaeとstxの両方又は一方を有さないもの）を識別可能にしている。
しかしながら、この方法では、同じＯ抗原を持つ大腸菌における規制対象菌と規制対象外の菌をリアルタイムＰＣＲで識別可能にするために、規制対象菌のグループ毎に個別に設計されたプライマーセットを用いる必要があるため、プライマーセット毎に個別に適切に反応条件を設定することが必要となり、操作が煩雑になるという問題があった。また、検出ターゲットとする規制対象菌を増加させると、その度に対応するプライマーセットを設計すると共にその反応条件を設定する必要があるため、検出ターゲットを容易に増加できないという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、ＣＲＩＳＰＲ領域を標的領域としつつ、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを搭載したＤＮＡチップを開発することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能な病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の病原性大腸菌検出用担体は、以下の(A)〜(F)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化した構成としてある。
(A)配列番号１〜５に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群、(B)配列番号６〜７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群、(C)配列番号８〜１４に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群、(D)配列番号１５〜１９に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群、(E)配列番号２０〜２２に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群、(F)配列番号２３〜２７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
【００１０】
また、本発明の病原性大腸菌検出用キットは、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定化された担体を含む病原性大腸菌検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含む第一のプライマーセットと、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含む第二のプライマーセットと、を含み、前記担体が、上記の病原性大腸菌検出用担体である構成としてある。
【００１１】
また、本発明の病原性大腸菌の検出方法は、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含む第一のプライマーセットと、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含む第二のプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、前記病原性大腸菌を検出する方法としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されるプローブの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体により検出する対象の病原性大腸菌の標的領域を増幅させるためのプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O26、O45、O103用）における検出結果（当該プローブの検出対象の菌株を含む）を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O26、O45、O103用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO111、O121の菌株）を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O26、O45、O103用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO145、O157の菌株）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O26、O45、O103用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株）を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O26、O45、O103用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない菌株）を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O111、O121用）における検出結果（当該プローブの検出対象の菌株を含む）を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O111、O121用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103の菌株）を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O111、O121用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO145、O157の菌株）を示す図である。
【図１１】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O111、O121用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株）を示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O111、O121用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない菌株）を示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O145、O157用）における検出結果（当該プローブの検出対象の菌株を含む）を示す図である。
【図１４】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O145、O157用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103の菌株）を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O145、O157用）における検出結果（当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO111、O121の菌株）を示す図である。
【図１６】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O145、O157用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株）を示す図である。
【図１７】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（O145、O157用）における検出結果（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない菌株）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１５】
［病原性大腸菌検出用担体］
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、図１に示すプローブ（配列番号１〜２７）の少なくともいずれかを、基板上に固定化したものであれば特に限定されないが、以下の(A)〜(F)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したものとすることが好ましい。
(A)配列番号１〜５に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B)配列番号６〜７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(C)配列番号８〜１４に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(D)配列番号１５〜１９に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(E)配列番号２０〜２２に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(F)配列番号２３〜２７に示す塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
【００１６】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体により検出する対象の病原性大腸菌は、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157の７つの血清型（serotype）のいずれかであり、病原性大腸菌のＴＯＰ７と呼ばれるものである。
ここで、血清型とは、特異抗体を用いて細菌表面抗原の相違を検出することにより同種の細菌をより細かく分類する時に用いられる型を意味する。大腸菌のＯ抗原は、１８４種類が知られている。
【００１７】
また、ＴＯＰ７の定義は、１個体で、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子（血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157のいずれかのもの）、インチミン遺伝子（eae）、及び志賀毒素遺伝子（stx）の３因子を全て保有している病原性大腸菌である。
インチミン遺伝子は、腸管付着性因子というタンパク質をコードする遺伝子である。また、志賀毒素遺伝子（stx）は、「志賀毒素（Shiga  toxin）」というタンパク質をコードする遺伝子であり、志賀毒素１型遺伝子（stx1）と、志賀毒素２型遺伝子（stx2）の２種類が知られている。
【００１８】
図１に示すプローブ（配列番号１〜２７）は、大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
ＣＲＩＳＰＲは、原核生物でファージやプラスミドに対する獲得免疫機構として機能する領域であり、リピート配列とスペーサー配列という２種類の配列が繰り返された構成を備えている。リピート配列は同一のＣＲＩＳＰＲ内では共通した配列を示し、スペーサー配列はそれぞれ特異的な配列を示しており、これらの配列からなるＣＲＩＳＰＲは、近縁種間でも配列が多様性に富む領域となっている。
【００１９】
大腸菌のＣＲＩＳＰＲとしては、一般にＣＲＩＳＰＲ１とＣＲＩＳＰＲ２が存在する。本実施形態では、血清型毎に、ＣＲＩＳＰＲ１又はＣＲＩＳＰＲ２の領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを使用すると共に、その増幅産物とハイブリダイズ可能なプローブを設計して、これを固定化したＤＮＡチップを作成し、これを用いて、血清型毎に病原性大腸菌を特異的に検出することを可能とした。
【００２０】
具体的には、図１の配列番号１〜５に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO26の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、当該大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ２の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
また、同図の配列番号６〜７に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO45又はO103の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、これらの大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ１の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
【００２１】
また、同図の配列番号８〜１４に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO111の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、当該大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ２の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
また、同図の配列番号１５〜１９に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO121の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、当該大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ１の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
【００２２】
また、同図の配列番号２０〜２２に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO145の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、当該大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ２の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
また、同図の配列番号２３〜２７に示す塩基配列からなる各プローブは、血清型がO157の病原性大腸菌を特異的に検出するためのものであり、当該大腸菌のＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ１の領域の塩基配列に基づき設計したプローブである。
【００２３】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体によれば、このようにＴＯＰ７の病原性大腸菌を検出するためのプローブを固定化することにより、これらの病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能となっている。
なお、本実施形態による特異的な検出では、上述の通り、O26病原性大腸菌、O45又はO103病原性大腸菌、O111病原性大腸菌、O121病原性大腸菌、O145病原性大腸菌、及びO157病原性大腸菌の６つのグループの病原性大腸菌を識別可能にしている。
【００２４】
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、以下の(A-1)〜(F-1)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したものとすることも好ましい。
(A-1)配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B-1)配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(C-1)配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(D-1)配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(E-1)配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
(F-1)配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群に対して相補的な塩基配列からなるプローブ群
【００２５】
すなわち、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、ＣＲＩＳＰＲ１又はＣＲＩＳＰＲ２の領域をＰＣＲによりそれぞれ増幅するためのプライマーセットを使用して、その増副産物とプローブをハイブリダイズさせるものであるところ、配列番号１〜２７に示す塩基配列からなる各プローブに対して相補的な塩基配列からなる各プローブも当該増幅産物とハイブリダイズすることができるため、これらを固定化した病原性大腸菌検出用担体によっても、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能である。
【００２６】
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、以下の(A-2)〜(F-2)のプローブ群のうち少なくとも２群以上からなるプローブを固定化したものとすることも好ましい。
(A-2)配列番号１〜５に示す塩基配列、及び、配列番号１〜５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(B-2)配列番号６〜７に示す塩基配列、及び、配列番号６〜７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(C-2)配列番号８〜１４に示す塩基配列、及び、配列番号８〜１４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(D-2)配列番号１５〜１９に示す塩基配列、及び、配列番号１５〜１９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(E-2)配列番号２０〜２２に示す塩基配列、及び、配列番号２０〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
(F-2)配列番号２３〜２７に示す塩基配列、及び、配列番号２３〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列のうち少なくとも１以上で規定されるプローブ群
【００２７】
さらに、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、上記(A-2)〜(A-2)のプローブ群の全ての群からなるプローブを固定化したものとすることも好ましい。
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体をこのような構成にすれば、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能である。
【００２８】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも１５〜２７塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で病原性大腸菌検出用担体に固定化した配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号２８〜３２に示す塩基配列からなるプライマーも２１〜２４塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００２９】
また、本実施形態における配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜２７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブに対して、相補的な塩基配列からなるプローブを用いることもできる。
【００３０】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００３１】
なお、図２に示す配列番号２８〜３２の塩基配列からなる各プライマーについても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号２８〜３２に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号２８〜３２に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号２８〜３２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号２８〜３２に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。
【００３２】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができ、スポット型又は合成型のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどとして製造することができる。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００３３】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体として、配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブの全部を固定化したものとすることも好ましい。
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜２７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることも、配列番号１〜２７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜２７に示す塩基配列からなるプローブに対して、相補的な塩基配列からなるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもできる。
【００３４】
［病原性大腸菌検出用キット］
本実施形態の病原性大腸菌検出用キットには、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定化された病原性大腸菌検出用担体とが含まれる。
具体的には、プライマーセットとしては、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセットと、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセットとが含まれる。
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用キットにおいて、第一のプライマーセットについては、各リバースプライマーの５’末端を蛍光標識（Cy5）で修飾することが好ましく、第二のプライマーセットについては、フォワードプライマーの５’末端を蛍光標識（Cy5）で修飾することが好ましい。
【００３５】
さらに、第一のプライマーセットは、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含むことが好ましい。
また、第二のプライマーセットは、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含むことが好ましい。
【００３６】
本実施形態の病原性大腸菌検出用キットをこのような構成にすれば、蛍光標識（Cy5）で修飾したプライマーの濃度を、対応する他方のプライマーに対して所定レベルで相対的に高めることができる。このため、蛍光標識（Cy5）を有する増幅産物を十分に増加させることができ、陽性の場合に検出される増幅産物の蛍光強度を高めることが可能となる。
【００３７】
このような観点から、第一のプライマーセットは、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：３〜１０：３〜１０の濃度比で含むことがより好ましく、１：４〜１０：４〜１０の濃度比で含むことがさらに好ましく、１：５〜１０：５〜１０の濃度比で含むことが一層好ましい。
また、第二のプライマーセットは、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、３〜１０：１の濃度比で含むことがより好ましく、４〜１０：１の濃度比で含むことがさらに好ましく、５〜１０：１の濃度比で含むことが一層好ましい。
【００３８】
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用キットにおける病原性大腸菌検出用担体としては、上述した本実施形態の病原性大腸菌検出用担体を好適に用いることができる。
【００３９】
このような本実施形態の病原性大腸菌検出用キットは、上記の濃度比で含有されたプライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該病原性大腸菌検出用担体に滴下し、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによって病原性大腸菌を検出するために用いられる。
【００４０】
［病原性大腸菌の検出方法］
本実施形態の病原性大腸菌の検出方法は、検出対象の病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、１：２〜１０：２〜１０の濃度比で含む第一のプライマーセットと、列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを、２〜１０：１の濃度比で含む第二のプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、上記のＰＣＲ用反応液を使用して、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、病原性大腸菌を検出する方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば以下のような方法とすることができる。
【００４１】
病原性大腸菌を取得して必要に応じて増菌する。そして、得られた病原性大腸菌からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００４２】
本実施形態の病原性大腸菌の検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、病原性大腸菌の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  ２分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  １０秒、（ｃ）５５℃（アニーリング工程）  ２０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  １２０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  ２分
【００４３】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＥＸ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
【００４４】
次に、増幅産物を本実施形態の病原性大腸菌検出用担体に滴下し、この病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象に存在している病原性大腸菌を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋製罐グループホールディングス株式会社のGENOGATE readerを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００４５】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法によれば、ＴＯＰ７の病原性大腸菌の２つのＣＲＩＳＰＲ領域をＰＣＲによりそれぞれ増幅させるプライマーセットを使用すると共に、これらの病原性大腸菌を特異的に識別可能なプローブを固定化した担体を用いることによって、これらを迅速かつ精度高く特異的に検出することができる。このため、ＴＯＰ７の病原性大腸菌の検出の省力化が可能となる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００４７】
病原性大腸菌検出用担体としては、ジーンシリコン（登録商標）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１に示される配列番号１〜２７の塩基配列からなるプローブの全部を固定化したものを使用した。各プローブは、ライフテクノロジーズジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【００４８】
大腸菌としては、大阪大学微生物病研究所（Research Institute for Microbial Diseases (RIMD), Osaka University）から入手した菌株と、岐阜大学大学院医学系研究科  病原微生物遺伝子資源保存センター（Gifu Type Culture Collection (GTC), Department of Microbiology, Gifu University School of Medicine）から入手した菌株を使用した。具体的には、以下の３３種類の菌株を使用した。
【００４９】
（O26病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091877、RIMD 5091905の２菌株
（O45病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091858の１菌株
（O103病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091878、RIMD 05092043、IMD 05092050の３菌株
（O111病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05092015、RIMD 05091866、RIMD 05092026の３菌株
（O121病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091875、RIMD 05091859、RIMD 05092058の３菌株
（O145病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091870、RIMD 05092063の２菌株
（O157病原性大腸菌の菌株）
RIMD 05091860、RIMD 05091868、RIMD 05091906、RIMD 05091861、RIMD 05091053、RIMD 05091904、RIMD 05091918の７菌株
これらの菌株は、いずれもＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子（血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157のいずれかのもの）の他に、インチミン遺伝子（eae）と志賀毒素遺伝子（stx）を有しており、病原性を有するものである。
【００５０】
（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株）
GTC 03590、RIMD 0509463、RIMD 0509470、RIMD 0509481、RIMD 0509516の５菌株
これらの菌株は、インチミン遺伝子（eae）と志賀毒素遺伝子（stx）の両方を保有しないか、又は、一方のみを保有し、病原性を有さないものである。
【００５１】
（ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない菌株）
RIMD 05091872、RIMD 05092070、RIMD 05092071、RIMD 05092072、RIMD 05091862、RIMD 05091857の６菌株
これらのうち、RIMD 05091872、RIMD 05092070、RIMD 05092072の３菌株は、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の他に、インチミン遺伝子（eae）と志賀毒素遺伝子（stx）を有しており、病原性を有するものである。また、RIMD 05092071、RIMD 05091862、RIMD 05091857の３菌株は、インチミン遺伝子を保有せず、志賀毒素遺伝子（stx）を保有し、病原性を有さないものである。
【００５２】
これらの大腸菌の菌株をそれぞれ入れた各アンプルに、ニュートリエントブロス（日本ベクトン・ディッキソン株式会社）を注ぎ、均一な菌液になるまで静かなピペッティング操作で懸濁した。得られた菌懸濁液をハートインヒュージョン寒天培地（日水製薬株式会社）に塗抹し、３７℃で一晩好気培養して復生、増菌した。増菌した菌のコロニーを白金耳でかき集め、これらをＤＮＡ抽出用菌体とした。
次に、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用い、マニュアルに記載のグラム陰性菌の抽出方法に従って、上記各ＤＮＡ抽出用菌体からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
【００５３】
そして、ＰＣＲ法により、それぞれの増幅対象領域を菌株毎に増幅した。
具体的には、O45、O103、O121、O157病原性大腸菌の菌株と、ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株のうち、GTC 03590、RIMD 0509463、RIMD 0509481、RIMD 0509516の４菌株と、ＴＯＰ７ではない上記の６菌株については、それぞれＣＲＩＳＰＲ１の領域を増幅対象領域した。
また、O26、O111、O145病原性大腸菌の菌株と、ＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の菌株のうち、RIMD 0509470の１菌株については、それぞれＣＲＩＳＰＲ２の領域を増幅対象領域した。
【００５４】
このとき、プライマーセットとしては、図２に示す二組のプライマーセット（ＣＲＩＳＰＲ１領域増幅用、及びＣＲＩＳＰＲ２領域増幅用）を使用した。
ＣＲＩＳＰＲ１の領域を増幅するためのＰＣＲ用反応液には、配列番号２８に示す塩基配列からなるフォワードプライマー(F)、配列番号２９に示す塩基配列からなるリバースプライマー(R)1、及び、配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマー(R)2を、１：５：５の濃度比で含む第一のプライマーセットを含有させた。
また、ＣＲＩＳＰＲ２の領域を増幅するためのＰＣＲ用反応液には、配列番号３１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー(F)、及び、配列番号３２に示す塩基配列からなるリバースプライマー(R)を５：１の濃度比で含む第二のプライマーセットを含有させた。
【００５５】
これらのプライマーセットは、シグマアルドリッチジャパン合同会社により合成したものを使用した。なお、図２において、「Ｆ／Ｒ」は、フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）の区別を示している。また、「修飾」は、蛍光標識のCy5を用いて、フォワードプライマーとリバースプライマーのどちらの５’末端に標識を行ったかを示している。
【００５６】
ＣＲＩＳＰＲ１の領域を増幅するためのＰＣＲ用反応液としては、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、次の組成のものを作成した。
１．10x Ex Taq buffer(20mM Mg2+ plus)  2.5μl
２．dNTPmix  2.0μl
３．プライマー(F)   （終濃度が100nMとなるよう添加）
４．プライマー(R)1  （終濃度が500nMとなるよう添加）
５．プライマー(R)2  （終濃度が500nMとなるよう添加）
６．Ex  Taq  HotStart  DNA  polymerase  0.125μl
７．Template  DNA（20pg/μl）  5.0μl
８．水（全体が２５．０μｌになるまで加水）
【００５７】
また、ＣＲＩＳＰＲ２の領域を増幅するためのＰＣＲ用反応液としては、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、次の組成のものを作成した。
１．10x Ex Taq buffer(20mM Mg2+ plus)  2.5μl
２．dNTPmix  2.0μl
３．プライマー(F)  （終濃度が500nMとなるよう添加）
４．プライマー(R)  （終濃度が100nMとなるよう添加）
５．Ex  Taq  HotStart  DNA  polymerase  0.125μl
６．Template  DNA（20pg/μl）  5.0μl
７．水（全体が２５．０μｌになるまで加水）
【００５８】
上記ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（サーマルサイクラーｅｐグラジエント  エッペンドルフ株式会社製）により、菌株ごとに、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  ２分
（b）９５℃  １０秒
（c）５５℃  ２０秒
（d）７２℃  １２０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  ２分
【００５９】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記病原性大腸菌検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。この病原性大腸菌検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE reader）を用いて、菌株ごとに、病原性大腸菌検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図３〜図１７に示す。
【００６０】
図３〜図７は、O26、O45、O103病原性大腸菌検出用のプローブにおける検出結果をまとめたものであり、図８〜１２は、O111、O121病原性大腸菌検出用のプローブにおける検出結果をまとめたものであり、図１３〜１７は、O145、O157病原性大腸菌検出用のプローブにおける検出結果をまとめたものである。
なお、これらの図において、各菌株の志賀毒素遺伝子（stx）とインチミン遺伝子（eae）の保有状況を（stx, eae）の形式（保有しない場合は - ）で示している。これらの遺伝子の両方を保有する大腸菌が病原性を示し、両方又は一方のみを保有する大腸菌は病原性を示さない。
【００６１】
図３に示すように、O26病原性大腸菌を検出するための配列番号１〜５に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO26病原性大腸菌の２菌株について陽性となっており、これらを適切に検出できたことが示されている。また、これらのプローブにおいて、O45、O103病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図４、図５に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO111、O121、O145、O157の菌株ついても陰性となっている。また、図６に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図７に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性が生じなかったことが示されている。
【００６２】
また、図３に示すように、O45又はO103病原性大腸菌を検出するための配列番号６〜７に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO45、O103病原性大腸菌の２菌株についてほぼ陽性となっており、これらを概ね適切に検出できたことが示されている。また、これらのプローブにおいて、O26病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図４、図５に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO111、O121、O145、O157の菌株ついても陰性となっている。また、図６に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図７に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性が生じなかったことが示されている。
【００６３】
また、図８に示すように、O111病原性大腸菌を検出するための配列番号８〜１０，１２〜１４に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO111病原性大腸菌の３菌株について陽性となっており、これらを適切に検出できたことが示されている。また、同配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブにおいても１菌株について陽性となっている。また、これらのプローブにおいて、O121病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図９、図１０に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103、O145、O157の菌株ついても陰性となっている。また、図１１に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図１２に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性が生じなかったことが示されている。
【００６４】
また、図８に示すように、O121病原性大腸菌を検出するための配列番号１５〜１９に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO121病原性大腸菌の４菌株について陽性となっており、これらを適切に検出できたことが示されている。また、これらのプローブは、O111病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図９、図１０に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103、O145、O157の菌株ついても、陰性となっている。また、図１１に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図１２に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性が生じなかったことが示されている。
【００６５】
また、図１３に示すように、O145病原性大腸菌を検出するための配列番号２０〜２２に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO145病原性大腸菌の２菌株について陽性となっており、これらを適切に検出できたことが示されている。また、これらのプローブにおいて、O157病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図１４、図１５に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103、O111、O121の菌株ついても、陰性となっている。また、図１６示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図１７に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性が生じなかったことが示されている。
【００６６】
また、図１３に示すように、O157病原性大腸菌を検出するための配列番号２３〜２７に示す塩基配列からなるプローブにおいて、いずれもO157病原性大腸菌の７菌株について陽性となっており、これらを適切に検出できたことが示されている。また、これらのプローブにおいて、O145病原性大腸菌については陰性となっている。
さらに、図１４、図１５に示すように、当該プローブの検出対象以外の規制対象菌であるO26、O45、O103、O111、O121の菌株ついても陰性となっている。また、図１６示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持つ規制対象外の５菌株、及び図１７に示すＴＯＰ７と同じＯ抗原を持たない６菌株についても陰性となっており、偽陽性がほぼ生じなかったことが示されている。
【００６７】
以上の通り、実施例において、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法によれば、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に検出できることが確認された。
【００６８】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体において、各プローブを１スポットずつ、又は複数スポットずつ固定化することができる。また、本実施形態における病原性大腸菌以外の細菌を検出するためのその他のプローブを、本実施形態におけるプローブと共に固定化することもでき、適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌の検査を行う場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
2017136019.tif 000002
【図２】
2017136019.tif 000003
【図３】
2017136019.tif 000004
【図４】
2017136019.tif 000005
【図５】
2017136019.tif 000006
【図６】
2017136019.tif 000007
【図７】
2017136019.tif 000008
【図８】
2017136019.tif 000009
【図９】
2017136019.tif 000010
【図１０】
2017136019.tif 000011
【図１１】
2017136019.tif 000012
【図１２】
2017136019.tif 000013
【図１３】
2017136019.tif 000014
【図１４】
2017136019.tif 000015
【図１５】
2017136019.tif 000016
【図１６】
2017136019.tif 000017
【図１７】
2017136019.tif 000018
【配列表】
2017136019000001.app