(57)【要約】【課題】ワクチン等細胞が生産する目的物を効率よく大規模で生産する方法を提供する。【解決手段】  ０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を対数増殖後期または定常期に達するまで培養する第１の培養工程と、細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養し、これにより遊離細胞が目的物質を生産する、第２の培養工程と、を含む、目的物質の生産方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質の生産方法であって、
０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を対数増殖後期または定常期に達するまで培養する第１の培養工程と、
細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、
第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養し、これにより遊離細胞が目的物質を生産する、第２の培養工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
多孔性マイクロキャリアがセルロース製である請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
第１の培養工程および第２の培養工程がいずれも撹拌培養により行われる、請求項１または２に記載の生産方法。
【請求項４】
第１の培養工程および第２の培養工程における多孔性マイクロキャリアを含む培地が無血清培地である、請求項１ないし３のいずれかに記載の生産方法。
【請求項５】
細胞剥離用酵素が、トリプシンまたは遺伝子組換えプロテアーゼである、請求項１ないし４のいずれかに記載の生産方法。
【請求項６】
前記接着性細胞が、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれかに記載の生産方法。
【請求項７】
第２の培養工程で生産される目的物質が治療用タンパク質である、請求項１ないし６のいずれかに記載の接着性細胞の生産方法。
【請求項８】
第２の培養工程で生産される目的物質がウイルスである、請求項１ないし６のいずれかに記載の生産方法。
【請求項９】
接着性細胞の培養方法であって、
０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を対数増殖後期または定常期に達するまで培養する第１の培養工程と、
細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、
第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養する第２の培養工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的物質、特にタンパク質またはウイルスを生成するための細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬に代表されるような生物学的製剤の商業的生産において、抗体医薬を生産する哺乳動物細胞を効率的に大量培養することは重要である。接着性の哺乳動物細胞の大量培養を可能にする技術として、１９８０年代に開発されたマイクロキャリア培養技術がある。哺乳動物細胞の浮遊化培養技術が確立された近年においてもなお、一部の接着性細胞を用いる生物学的製剤の製造においては、マイクロキャリア培養は重要な技術と位置付けられている。
【０００３】
哺乳動物細胞の大量培養技術はまた、ワクチンの製造においても重要な技術である。ワクチン製造に用いられるウイルス株は、宿主となる哺乳細胞に感染させて増殖される。その宿主となる細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＭＲＣ−５細胞などの接着性細胞が有用である。非特許文献１では、それらの細胞を大規模培養するために、マイクロキャリアの適用が検討されていることが述べられている。
【０００４】
より経済的で品質の優れたワクチン生産のために、これまでさまざまなマイクロキャリア培養方法が検討されているが、ワクチン生産で用いられるマイクロキャリアは非多孔性のものが主に用いられている。これは、多孔性マイクロキャリアを用いた場合、細胞がマイクロキャリアの内部で生育するため、細胞剥離工程における細胞回収率の低下や、ウイルス株の感染効率の低下が懸念されるからである。たとえば特許文献１では、非多孔性のマイクロキャリア培養でコンフルエンスまで宿主細胞を培養した後、ウイルス株を感染させて増殖させる工程において、培養液を濃縮して細胞密度を高めることでウイルス生産性が向上する技術が示されている。特許文献２では、同一培養容器内にて、培地液量と非多孔性マイクロキャリア濃度とを増加させながら連続細胞継代を行う技術が示されている。これらの方法においては、マイクロキャリア培養で細胞継代する際に、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を使用してマイクロキャリアから細胞が剥離されており、この工程において細胞集団の同期化が行われる。
【０００５】
多孔性マイクロキャリアを用いて接着性細胞を培養してウイルス生産をした例としては、非特許文献２において狂犬病ウイルスを生産した例が知られている。また、特許文献３においてＡ型肝炎ウイルスの連続生産に用いた例も知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５０２１０００号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１５４７３公報
【特許文献３】特許第４５３７７０９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ｆｒｏｍ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【非特許文献２】Ａ．Ｙ．Ｙｏｋｏｍｉｚｏら、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、２００４、Ｖｏｌ．８５（５）、５０６−５１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献２の方法では、マイクロキャリア濃度が低く商業生産が可能な細胞密度は達成できていないまた、特許文献３の方法では、非多孔性マイクロキャリアを用いた方法と比べて生産されるウイルスの濃度が低く、多孔性マイクロキャリアを用いた効率の良い培養方法とはいえない。
【０００９】
多孔性マイクロキャリアは、非多孔性マイクロキャリアに比べて比表面積が高いことが特徴であり、多孔性マイクロキャリアの使用は、非多孔性マイクロキャリアよりも広い培養表面を提供し、宿主細胞をより高密度に培養することを可能にする。しかしながら、細胞剥離の効率性やウイルスの感染効率などの問題から、目的物質、特にタンパク質やウイルスの生産のための培養方法として、商業的な利用に耐える大規模な生産が可能な、多孔性マイクロキャリアを使用した培養方法は知られていない。
【００１０】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、大規模培養と目的物質の高回収率とを両立して目的物質を効率的に回収することのできる多孔性マイクロキャリアを用いた接着性細胞の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、より小さい規模の第１の培養工程とより大きい規模の第２の培養工程を含む培養工程において、両工程のそれぞれで所定の濃度の多孔性マイクロキャリアを用い、細胞を継代するために多孔性マイクロキャリアから細胞を剥離する際に細胞集団を同期化する工程を経ることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は以下のとおりである。
［１］
目的物質の生産方法であって、
０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を対数増殖後期または定常期に達するまで培養する第１の培養工程と、
細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、
第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養し、これにより遊離細胞が目的物質を生産する、第２の培養工程と、
を含む、方法。
［２］
多孔性マイクロキャリアがセルロース製である［１］に記載の生産方法。
［３］
第１の培養工程および第２の培養工程がいずれも撹拌培養により行われる、［１］または［２］に記載の生産方法。
［４］
第１の培養工程および第２の培養工程における多孔性マイクロキャリアを含む培地が無血清培地である、［１］ないし［３］のいずれかに記載の生産方法。
［５］
細胞剥離用酵素が、トリプシンまたは遺伝子組換えプロテアーゼである、［１］ないし［４］のいずれかに記載の生産方法。
［６］
前記接着性細胞が、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される、［１］ないし［５］のいずれかに記載の生産方法。
［７］
第２の培養工程で生産される目的物質が治療用タンパク質である、［１］ないし［６］のいずれかに記載の接着性細胞の生産方法。
［８］
第２の培養工程で生産される目的物質がウイルスである、［１］ないし［６］のいずれかに記載の生産方法。
［９］
接着性細胞の培養方法であって、
０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を対数増殖後期または定常期に達するまで培養する第１の培養工程と、
細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、
第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養する第２の培養工程と、
を含む、方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、多孔性マイクロキャリアを用いた接着性細胞の大規模高密度培養が可能となり、目的物質、特にタンパク質やウイルスを、高い生産性で生産、回収することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
本実施形態の方法は、ワクチン等の生物学的製剤に使用される目的物質の生産方法であって、多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、接着性細胞を培養する第１の培養工程と、細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養し、これにより遊離細胞が目的物質を生産する、第２の培養工程と、を含む。
【００１４】
第１の培養工程は、細胞増幅のための工程であり、第２の培養を開始するために十分な初期細胞数にまで細胞を増幅させる。第１の培養工程は、第２の培養よりも小さい規模で行われることが望ましく、例えば、１００ｍＬ程度〜数百Ｌ、特に、数Ｌから数百Ｌの規模で行われることが好ましい。
【００１５】
第１の培養工程は、多孔性マイクロキャリア当たりの細胞数が多くなるように実施されることが好ましく、例えば、第１の培養工程終了時点の多孔性マイクロキャリアの表面積あたりの細胞数が５〜１０ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなることが好ましい。多孔性マイクロキャリア当たりの細胞数が少ないと、続く工程で剥離した細胞がマイクロキャリアの細孔に捕捉され、細胞の回収率が低下することがある。
多孔性マイクロキャリア当たりの細胞数を高くするために、第１の培養工程は、０．１ｇ／Ｌ以上２．０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上０．８ｇ／Ｌ以下の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて行われる。マイクロキャリア濃度が低すぎると、培養槽あたりの細胞密度が低くなり、生産効率の観点から望ましくない。一方、マイクロキャリア濃度が高すぎるとマイクロキャリア同士の衝突回数が増えることによる細胞へのダメージが問題となることがある。
第１の培養工程における植え付け細胞数は、培養する細胞の比増殖速度にもよるため、事前に小スケールでの培養実験を行い、目標とする第１の培養工程終了時点の多孔性マイクロキャリアの表面積あたりの細胞数等を指標として決定することができる。
【００１６】
第１の培養工程は、接着性細胞が対数増殖後期または定常期に達する限り、静置培養で行っても撹拌培養で行ってもよいが、生産効率の観点から撹拌培養を用いることが望ましい。培養温度等の培養条件は、培養する細胞の種類に応じて適宜設定することができる。
【００１７】
本実施形態において第１の培養工程とは、以下で説明する遊離細胞を得る工程および第２の培養工程の直前に実施される培養を指す。一般的には、第２の培養工程で行われる大規模細胞培養は、数ｍＬ程度の保存細胞株を数十ｍＬ程度の培養ディッシュに植えつけて培養開始され、培養容器を拡大しながら継代を繰り返すことによって達成される。したがって、第１の培養の前に数段階の同様な細胞増幅のための培養を実施してもよい。
【００１８】
第１の培養工程は、接着性細胞が対数増殖後期または定常期に達するまで、好ましくは対数増殖後期または定常期に達する直前くらいまで培養される。例えば、細胞増殖の経過観察を行い、細胞の増殖速度の低下がみられた時点を定常期に達する直前と判断することができる。一般に細胞の継代培養は、定常期（コンフルエント）に達する前に継代されることが理想とされており、対数増殖後期から定常期に達する直前まで培養することで、細胞の増殖性を維持しつつ多くの細胞数を得ることができる。定常期に達する際の細胞数は、多孔性マイクロキャリアの添加濃度に依存する。
【００１９】
第１の培養工程後、第２の培養工程に先立って、第１の培養工程で使用した多孔性マイクロキャリアから増幅させた接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程を実施する。この工程により、続く第２の培養工程において細胞集団の「同期化」を達成することができる。第２の培養工程において細胞集団が「脱同期化」されている場合、生産物の生産性や品質低下を伴う恐れがある。多孔性マイクロキャリアからの接着性細胞の剥離には、細胞剥離用酵素を用いることができる。この酵素は、多孔性マイクロキャリアから細胞を剥離できるかぎり特に限定されないが、通常、トリプシンなどタンパク質分解酵素を使用することができる。トリプシンは、一般的にはブタ膵臓由来のものが使用されているが、遺伝子組換え大腸菌で発現させたものなど、トリプシン様の遺伝子組換えプロテアーゼを使用することもできる。細胞剥離用酵素を用いた接着性細胞の剥離は、用いる酵素及び剥離しようとする細胞の種類に応じて、公知の手法を用いて行うことができる。
【００２０】
第１の培養工程の後に細胞剥離用酵素を用いた処理を行って、多孔性マイクロキャリアから剥離させて得られた遊離細胞は、多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いる第２の培養工程に供される。酵素処理の後、通常は、第１の培養工程で用いた多孔性マイクロキャリアと遊離細胞を分離して遊離細胞のみを第２の培養工程に供するが、第１の培養工程で用いた多孔性マイクロキャリアと遊離細胞を分離することなく、一緒に第２の培養工程に供することもできる。また、酵素処理の後、多孔性マイクロキャリアに残存する遊離細胞を回収するために、リン酸緩衝生理食塩水などによる洗浄回収操作を追加することも可能である。さらに、得られた遊離細胞回収液を濃縮する操作や、新鮮培地等へ溶液置換する操作を追加することも可能である。
【００２１】
本実施形態において、遊離細胞を培養して目的物質を生産する第２の培養工程は、１Ｌ〜数千Ｌ規模、例えば数十Ｌ〜数千Ｌ規模の大規模培養を行うことが、物質生産を経済的に行う観点から望ましい。第１の培養工程は、遊離細胞から目的物が生産される限り、培養条件は特に制限されず、静置培養で行っても撹拌培養で行ってもよいが、生産効率の観点から撹拌培養を用いることが望ましく、通常、無菌空気供給のための配管と撹拌翼を備える撹拌培養槽を用いて行うことができる。また、第２の培養工程は、通常バッチ培養で行われるが、フェドバッチ培養や、潅流培養等による長期連続培養であってもよい。培養温度等の培養条件は、培養する細胞の種類や生産される目的物質に応じて適宜設定することができる。
【００２２】
第２の工程における培養は、より効率的に物質生産を行うため、可能な限り高細胞密度が達成されることが望ましい。そのため、多孔性マイクロキャリアの添加濃度は第１の培養工程と比較して高濃度であり、１．０ｇ／Ｌ以上８ｇ／Ｌ以下が好ましく、２ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
【００２３】
第２の培養工程において、遊離細胞が目的物質を生産する。目的物質の生産は、予め目的物質の生産能を有する細胞を培養して行うことができ、例えば、遺伝子組み換え等により目的物質生産能を有するよう改変した組換え体を培養して行うことができる。目的物質の生産は、第２の培養工程において、細胞に目的物質生産能を付与して行うこともでき、例えば、第２の培養工程において、細胞にウイルスを感染させ、ウイルスを生産することもできる。第２の培養工程は、目的物質が所望の量生産された時点で終了することができ、例えば、目的物質の濃度をモニタリングしながら培養を行い、目的物質の濃度が最大になったところで培養を終了することができる。培養物からの目的物質の単離精製は、公知の手法を用いて実施することができる。
【００２４】
本実施形態においては、接着性細胞を高細胞密度で培養するために、多孔性マイクロキャリアを使用する。多孔性マイクロキャリアの製品としては、セルロース製の製品やゼラチン製の製品が知られているが、機械的強度や動物由来原料の混入リスク回避の観点から、セルロース製の多孔性マイクロキャリアの使用が好ましい。細胞の増殖性および目的物質の生産性の観点から、多孔性マイクロキャリアの粒子径は、好ましくは１００〜４００μｍ、より好ましくは２００〜３００μｍ、さらにより好ましくは２００〜２８０μｍであり、平均細孔径は、好ましくは１０〜７０μｍ、より好ましくは２０〜４０μｍであり、有効表面積は、好ましくは５０００〜３００００ｃｍ2／ｇ、より好ましくは、８０００〜１５０００ｃｍ2／ｇである。
【００２５】
本実施形態において、第１の培養工程および第２の培養工程に使用される培地の成分等は特に限定されず、培養する細胞や生産される目的物質に応じて適宜選択することができる。本実施形態の一態様において、動物由来成分混入リスクの回避の観点から、血清や血清由来タンパク質を含まない、いわゆる無血清培地が好ましい。無血清培地は、植物や微生物由来のタンパク質やタンパク質加水分解物等を含むことものであってもよく、また、遺伝子組換え微生物や植物を用いて生産されるタンパク質や、インシュリンや成長因子などを含むものであってもよい。無血清培地を用いる場合、公知の手法を用いて細胞を無血清馴化してから培養に供することができる。
【００２６】
本実施形態の方法で培養される接着性細胞は特に限定されないが、接着性の哺乳動物細胞が好ましい。そのような接着性細胞は数多く知られているが、代表的な例としては、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞などがあげられる。これらの細胞は、ＡＴＣＣなどの細胞バンクから標準株を入手して使用することもできるし、生産性や生育能などに改良を加えた改良株として使用することもできる。
【００２７】
本実施形態において、生産される目的物質は特に限定されないが、生物学的製剤として有用な治療用タンパク質（ポリペプチド）やウイルスが対象となりうる。治療用タンパク質としては、モノクローナル抗体、血液凝固因子、サイトカイン、酵素、成長因子などがあげられる。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオウイルスなどがあげられる。
【００２８】
本実施の形態はまた、上記の第１の培養工程と、細胞剥離用酵素を用いて多孔性マイクロキャリアから接着性細胞を剥離して遊離細胞を得る工程と、第１の培養工程よりも高い濃度の多孔性マイクロキャリアを含む培地を用いて、遊離細胞を培養する第２の培養工程と、を含む、接着性細胞の培養方法にも関する。各工程は、第２の工程において必ずしも細胞から目的物質が生産される必要がないという点を除き、本実施の形態の生産方法について上述したとおりに実施することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例および比較例に基づいて本実施形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例および比較例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１：多孔性マイクロキャリアを用いた無血清培養）
（１−１）Ｖｅｒｏ細胞の無血清馴化
Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＣＬ−８１ＴＭ）の凍結細胞を最終濃度１０％のウシ胎児血清（以下ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで４日間培養した。増殖した細胞をトリプシン処理して回収し無血清馴化を行った。無血清培地としてＨｙｃｌｏｎｅTM ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒTM（以下ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた。回収した細胞を上記１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地）とＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒを５０：５０で混合した培地に植えつけて、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで４日間の継代培養を行った。以降、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地とＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地の混合比率を、２５：７５、１２．５：８７．５、６．２５：９３．７５、３．１３：９６．８７、１．５６：９８．４４、０．７８：９９．２２、０：１００の順に変えながら、継代培養を繰り返して、無血清馴化を行った。得られた無血清馴化細胞株をＣＣＬ−８１−ＳＦＭと命名した。
【００３１】
（１−２）多孔性マイクロキャリアを用いたＶｅｒｏ細胞の無血清培養
ＣＣＬ−８１−ＳＦＭの凍結細胞をＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒに播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、トリプシン処理して回収して細胞懸濁液を調製した。多孔性マイクロキャリアとして、ＢｉｏＣｒａｄｌｅ  Ｈ２０（以下ＢｉｏＣｒａｄｌｅ、旭化成メディカル社製、セルロース製、粒子径２００〜２８０μｍ、平均細孔径３０μｍ、有効表面積１．１ｍ2／ｇ）を用いた。１００ｍＬスピナーフラスコ（ＣｅｌｓｔｉｒTM、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）に懸濁して滅菌した多孔性マイクロキャリアを、乾燥重量として最終濃度が０．５ｇ／Ｌとなるように添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、ＰＢＳの上澄み液を取り除き、ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地を３０ｍＬ添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、培地の上澄み液を新しいＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地７０ｍＬに交換した。
【００３２】
上記細胞懸濁液を、細胞濃度２ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（総細胞数１．４ｘ１０7ｃｅｌｌｓ）となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で、５０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養３日目以降、培地交換率１００％で毎日培地交換を行いながら、７日間の培養を行った。培養３日目以降、毎日培養液をサンプリングして、細胞数を測定した。細胞数は、クリスタルバイオレットを含む脱核染色液を用いて細胞核数を計数して求めた。細胞増殖の経過観察を行い、培養７日目に細胞の増殖速度の低下がみられたことから定常期の前に達したと判断した。その時点で、培養液当たり細胞数が４．５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数３．２ｘ１０8ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数が９ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数が８．３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2に達した。スピナーフラスコを静置して、細胞の付着した多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、上澄み液を吸引して除いた。続いて、ＰＢＳを３５ｍＬ添加して撹拌後、静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、上澄み液を吸引して除く操作を３回繰り返した。１５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴｒｙｐＬＥTM  Ｓｅｌｅｃｔ（１０ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、トリプシン代替物である、遺伝子組換えプロテアーゼ）の２倍希釈溶液を３５ｍＬ添加後、３７℃、２０分間、１５０ｒｐｍで撹拌した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させ、遊離細胞を含む上澄み液を吸引して回収した。さらに、ＰＢＳを３５ｍ添加して撹拌後、静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させ、上澄み液を吸引して残存した遊離細胞を回収した。２つの回収液を合わせた細胞回収率は９２．７％であり、生細胞率は９０．３％であった。回収した細胞は、遠心分離によって濃縮し新たにＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地に置換し細胞懸濁液を調製した。
【００３３】
続いて、同期化した細胞を増殖させるため、さらに培養を行った。１Ｌスピナーフラスコ（ＣｅｌｓｔｉｒTM、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、ＰＢＳに懸濁して滅菌した多孔性マイクロキャリアを、乾燥重量として最終濃度が２ｇ／Ｌとなるように添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、ＰＢＳの上澄み液を取り除き、ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地を３００ｍＬ添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、培地の上澄み液を新しいＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地１０００ｍＬに交換した。上記細胞懸濁液の全量（初期細胞濃度およそ３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で、５０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養３日目以降、培地交換率１００％で毎日培地交換を行いながら、８日間の培養を行った。培養３日目以降、毎日培養液をサンプリングして、細胞数を測定した。１Ｌスピナーフラスコ培養８日目に、培養液当たり細胞数が１．１ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数１．１ｘ１０10ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数が５．５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数が５．０ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2に達し、従来の多孔性または非多孔性マイクロキャリアを用いた接着性細胞培養での培養液あたり細胞数（２〜５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と比較して、接着性細胞を効率よく培養することができた。
【００３４】
（実施例２：多孔性マイクロキャリアを用いたＶｅｒｏ細胞培養）
Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＣＬ−８１TM）の凍結細胞をＦＢＳ添加ＤＭＥＭに播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで４日間培養し、トリプシン処理して回収して細胞懸濁液を調製した。多孔性マイクロキャリアとして、実施例１と同様のＢｉｏＣｒａｄｌｅを用いた。１００ｍＬスピナーフラスコに、ＰＢＳに懸濁して滅菌した多孔性マイクロキャリアを、乾燥重量として最終濃度が０．８ｇ／Ｌとなるように添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、ＰＢＳの上澄み液を取り除き、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を３０ｍＬ添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、培地の上澄み液を新しいＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地７０ｍＬに交換した。上記細胞懸濁液を、細胞濃度２ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（総細胞数１．４ｘ１０7ｃｅｌｌｓ）となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で、５０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養３日目以降、培地交換率１００％で毎日培地交換を行いながら、７日間の培養を行った。培養３日目以降、毎日培養液をサンプリングして、細胞数を測定した。培養７日目に、培養液当たり細胞数が７．５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数５．３ｘ１０8ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数が１．５ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数が８．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2に達した。スピナーフラスコを静置して、細胞の付着した多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、上澄み液を吸引して除いた。続いて、ＰＢＳを３５ｍＬ添加して撹拌後、静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、上澄み液を吸引して除く操作を３回繰り返した。１５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴｒｙｐＬＥTM  Ｓｅｌｅｃｔ（１０ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の２倍希釈溶液を３５ｍＬ添加後、３７℃、２０分間、１５０ｒｐｍで撹拌した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させ、遊離細胞を含む上澄み液を吸引して回収した。さらに、ＰＢＳを３５ｍ添加して撹拌後、静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させ、上澄み液を吸引して残存した遊離細胞を回収した。２つの回収液を合わせた細胞回収率は９０．１％であり、生細胞率は９２．１％であった。回収した細胞は、遠心分離によって濃縮し新たにＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に置換した。
【００３５】
続いて、同期化した細胞を増殖させるため、さらに培養を行った。１Ｌスピナーフラスコに、ＰＢＳに懸濁して滅菌した多孔性マイクロキャリアを、乾燥重量として最終濃度が２ｇ／Ｌとなるように添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、ＰＢＳの上澄み液を取り除き、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を３００ｍＬ添加した。静置して多孔性マイクロキャリアを沈降させたのち、培地の上澄み液を新しいＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地１０００ｍＬに交換した。上記細胞懸濁液の全量を播種（初期細胞濃度としておよそ５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で、５０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養３日目以降、培地交換率１００％で毎日培地交換を行いながら、８日間の培養を行った。培養３日目以降、毎日培養液をサンプリングして、細胞数を測定した。１Ｌスピナーフラスコ培養８日目に、培養液当たり細胞数が１．２ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数１．２ｘ１０10ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数が６．０ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数が５．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2に達した。
【００３６】
（比較例１：多孔性マイクロキャリアを用いたＶｅｒｏ細胞培養）
１００ｍＬスピナーフラスコに、ＰＢＳに懸濁して滅菌した多孔性マイクロキャリアを、乾燥重量として最終濃度が２．０ｇ／Ｌとなるように添加した以外は、実施例２と同じ方法で培養を行った。１００ｍＬスピナーフラスコにおける培養７日目の培養液当たり細胞数は８．９ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数は６．２ｘ１０8ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数は４．５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数は４．０ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であった。遊離細胞の細胞回収率は５７．３％であり、生細胞率は９０．６％であった。１Ｌスピナーフラスコ培養８日目の培養液当たり細胞数は７．４ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数は７．４ｘ１０9ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数は３．７ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数は３．４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であった。
【００３７】
（比較例２：非多孔性マイクロキャリアを用いたＶｅｒｏ細胞培養）
１００ｍＬスピナーフラスコ培養と１Ｌスピナーフラスコ培養に用いるマイクロキャリアとして非多孔性マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、比表面積４４００ｃｍ2／ｇ）を最終濃度２ｇ／Ｌで用いた以外は実施例２と同じ方法で培養を行った。１００ｍＬスピナーフラスコにおける培養７日目の培養液当たり細胞数は３．５ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数は２．５ｘ１０8ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数は１．８ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数は４．０ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であった。遊離細胞の細胞回収率は８９．８％であり、生細胞率は９２．５％であった。１Ｌスピナーフラスコ培養８日目の培養液当たり細胞数は４．０ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総細胞数は４．０ｘ１０9ｃｅｌｌｓ、多孔性マイクロキャリアの乾燥重量当たりの細胞数は２．０ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、多孔性マイクロキャリアの表面積当たりの細胞数は４．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であった。
【００３８】
多孔性マイクロキャリアを用いて、第１の培養工程における多孔性マイクロキャリア濃度を調節することにより、接着性細胞であるＶｅｒｏ細胞を効率よく生産することができた。タンパク質生産能を有する接着性細胞を用いた培養を同様に行うことによって、また、公知の手法を用いて接着性細胞の培養途中でウイルスを感染させることによって、多孔性マイクロキャリアを用いてタンパク質やウイルス（ワクチン）等の目的物を効率よく生産することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、多孔性マイクロキャリアを用いた接着性細胞の大規模高密度培養が可能となり、目的物質、特にタンパク質やウイルスを、高い生産性で生産、回収することが可能となるため、本発明は、バイオ医薬等の分野で産業上の利用可能性を有する。