(57)【要約】【課題】自然発生型の緑内障の有用なモデルである緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法の提供。【解決手段】Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる緑内障モデルである。また、前記緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、（１）眼圧の低下が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含む評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。【選択図】図１９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなることを特徴とする緑内障モデル。
【請求項２】
前記非ヒト動物が、マウスである請求項１に記載の緑内障モデル。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載された緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、
（１）眼圧の低下、
（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、
（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、
（４）グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、
（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、
（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用、
（７）房水の産生抑制、及び
（８）房水の排出促進
の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項４】
前記評価対象薬剤の投与が、眼局所投与、経口投与、及び静脈内投与のいずれかである請求項３に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項５】
前記眼圧が、眼圧計により測定される請求項３から４のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項６】
前記網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制である請求項３から５のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項７】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、光干渉断層計により測定される請求項６に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項８】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少により測定される請求項６から７のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項９】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定される請求項６から８のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１０】
前記房水の産生乃至排出が、前房におけるフルオロフォトメトリーにより測定される請求項３から９のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１１】
前記評価対象薬剤が、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害剤、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害薬、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及びフラボノイド類の少なくともいずれかである請求項３から１０のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１２】
Ｎ，Ｎ”−１，４−ブタンジイルビス［Ｎ’−（３−イソチオシアネートフェニル）チオウレア、並びにその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物、及びプロドラッグの少なくともいずれかを含むことを特徴とする眼圧調整剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑内障モデル、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法、及び眼圧調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、本邦における失明原因第一位の疾患であり、４０歳以上の約５．０％が罹患している（非特許文献１参照）。緑内障の有病率は年齢とともに増加するが、症状の進行が遅いため、緑内障であることを気づかない人も多い。一般に、緑内障とは、眼内の静水圧（眼圧）が高くなることで視神経が圧迫されて傷害を受ける。日本人の平均眼圧は約１４．５ｍｍＨｇで、標準偏差２．５ｍｍＨｇの２倍よりも高い場合に高眼圧と診断される。慢性的な高眼圧の負荷によって視神経が圧迫され続けると次第に視覚伝達機能が不全となり、視野が欠損する。症状が進行すると最終的に失明に至る。現在のところ、根本的な治療法はなく、眼圧を下げることによって症状の進行を遅らせる処置がとられる。
【０００３】
眼圧は、房水と呼ばれる眼内を満たす液体の産生と排出のバランスによって調節されている。房水は、毛様体突起で産生され、虹彩の裏を通過して前房へ移動し、その後、線維柱帯を経てシュレム管から排出される。シュレム管は、房水排出の主経路であるが、ぶどう膜及び強膜経路を介した排出経路も存在する。眼圧の上昇は、房水の産生が過多となるか、あるいは排出が減少するなどの産生乃至排出のバランスが崩れることによって起こる。現行の緑内障治療薬は、房水の産生及び排出の少なくともいずれかの経路を標的としており、それらを制御することで眼圧を低下させる。
【０００４】
緑内障には、原発開放隅角緑内障、原発閉塞隅角緑内障、続発緑内障、発達緑内障などがあるが、日本人の場合は約８割が原発開放隅角緑内障（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｏｐｅｎ  Ａｎｇｌｅ  Ｇｌａｕｃｏｍａ，ＰＯＡＧ）である。ＰＯＡＧは、解剖学的な所見として、隅角が閉塞していないにも関わらず、緑内障に特徴的な形態的症状（視神経乳頭辺縁部の菲薄化、網膜神経線維層欠損など）や視野欠損が現れる。ＰＯＡＧには、その眼圧が正常値内（日本人の場合１０．０ｍｍＨｇ〜２１．０ｍｍＨｇ）であっても前記緑内障症状を呈する「正常眼圧緑内障」が約９０％含まれる（非特許文献１参照）。正常眼圧緑内障においても、さらに眼圧を降下させることによって症状の進行を遅らせることができることから、眼圧降下作用を有する薬剤は緑内障治療に必須である。したがって、緑内障治療薬の評価は、主に実験動物モデルにおける眼圧降下作用を指標として行われる。
【０００５】
緑内障モデル動物として、現在最も汎用されているのはＤＢＡ／２Ｊマウスであり、前記ＤＢＡ／２Ｊマウスでは老化に伴って眼圧上昇が生じるが、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｍｂ（Ｇｐｎｍｂ）及びＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（Ｔｙｒｐ１）の変異が原因であることがわかっている（非特許文献２〜３参照）。前記ＤＢＡ／２Ｊマウスでは、虹彩の色素細胞が炎症を伴う細胞死を起こし、その細胞破片などが線維柱帯につまることによって眼房水の排出抵抗が増大し、眼圧が上昇する。通常、ヒト緑内障では炎症や網膜神経節細胞以外の組織学的な変化を認めない（続発緑内障を除く）。このことから、前記ＤＢＡ／２Ｊマウスは、正確にヒトの緑内障症状を反映していない可能性が考えられる。
【０００６】
一方、細胞外ヌクレオチドに対する受容体であるＰ２受容体については、網膜を含む眼の組織には様々なサブタイプが発現し、眼房水にはＡＴＰなどヌクレオチドが含まれている（非特許文献４参照）。このことから、眼においてＰ２受容体は様々な生理機能に関与すると考えられる。実際、ヌクレオチドを点眼すると眼圧が一過的に変化することが報告されている。Ｐ２Ｙ２受容体作動薬であるウリジン三リン酸（ＵＴＰ）は眼圧を上昇させ、ｓｉＲＮＡによる同遺伝子発現のノックダウンは眼圧を降下させる（非特許文献５及び特許文献１参照）。一方、Ｐ２Ｙ１受容体やＰ２Ｙ６受容体の作動薬は眼圧を降下させる（非特許文献６〜７、及び特許文献２〜３参照）。ヒト緑内障患者では、眼房水のヌクレオチド濃度が増加している。（非特許文献８〜９参照）。Ｐ２Ｙ６受容体は、免疫細胞、上皮や内皮細胞の炎症応答に関与することが報告されており（非特許文献１０参照）、炎症は網膜神経節細胞のアポトーシスを誘導して緑内障発症に寄与すると考えられている（非特許文献１１〜１２参照）。したがって、緑内障発症とＰ２受容体機能異常に関連性が推察されるものの、それを直接的に示した報告は全くない。
【０００７】
したがって、ヒトの緑内障症状を反映した、自然発生型の緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法の研究開発、及び眼圧調整剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０１０２０８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１２／０７３２３７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１１／０７７４３５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｗａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００４，１１１：１６４１−１６４８．
【非特許文献２】Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．ＩＯＶＳ  １９９８，３９，９５１−９６２
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ（２００１）２，１．
【非特許文献４】Ｇｕｚｍａｎ−Ａｒａｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．ＪＰＥＴ（２０１３）３４５，３３１−３４１．
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎ−Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１２）１６５，１１６３−１１７２．
【非特許文献６】Ｅｌｉａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２０１０）５３，３３０５−３３０９．
【非特許文献７】Ｍａｒｋｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００８）５７９，９３−９７．
【非特許文献８】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ（２００７）８５，６３７−６４３．
【非特許文献９】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ（２０１１）９３，５２８−５３３．
【非特許文献１０】Ｉｄｚｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５０９，３１０−３１７．
【非特許文献１１】Ｖｏｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（２０１３）５８，３１１−３２０．
【非特許文献１２】Ａｌｍａｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  ＥｙｅＲｅｓ（２０１５）３１，１５２−１８１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、自然発生型の緑内障の有用なモデルである緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法、並びに眼圧調整剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成するために、鋭意検討した結果、１）生理条件下ではＰ２Ｙ６受容体を活性化又は抑制することにより、眼圧がそれぞれ下降又は上昇すること、２）Ｐ２Ｙ６受容体は眼房水産生を担う毛様体突起無色素上皮に発現すること、３）フルオロフォトメトリー法において房水産生の速度がウリジン二リン酸（ＵＤＰ）点眼で減速すること、４）Ｐ２Ｙ６受容体を欠損させたマウスでは定常時の眼圧が野生型に比べて高いこと、５）老化に伴い網膜神経節細胞が脱落することなどの、Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物が自然発症型の緑内障モデルとして有用であることを見出し、加えて、前記緑内障モデルが、現行の眼圧下降薬（例えば、ＰＧＦ２α類縁体）による眼圧降下作用に対して特に影響を与えず、臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法、並びに眼圧調整剤を提供することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなることを特徴とする緑内障モデルである。
＜２＞  前記非ヒト動物が、マウスである前記＜１＞に記載の緑内障モデルである。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載された緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、
（１）眼圧の低下、
（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、
（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、
（４）グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、
（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、
（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用、
（７）房水の産生抑制、及び
（８）房水の排出促進
の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜４＞  前記評価対象薬剤の投与が、眼局所投与、経口投与、及び静脈内投与のいずれかである前記＜３＞に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜５＞  前記眼圧が、眼圧計により測定される前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜６＞  前記網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制である前記＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜７＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、光干渉断層計により測定される前記＜６＞に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜８＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少により測定される前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜９＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定される前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１０＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記緑内障モデル動物において、蛍光シグナルの減少による測定される前記＜６＞から＜９＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１１＞  前記網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の軸索流の低下抑制である前記＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１２＞  前記網膜神経節細胞の軸索流が、硝子体に注入した順行性軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率により測定される前記＜１１＞に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１３＞  前記網膜神経節細胞の軸索流が、軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定される前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１４＞  前記網膜神経節細胞の軸索流が、前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定される前記＜１１＞から＜１３＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１５＞  前記大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用が、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野皮下に設置された電極から検出される電位変化により測定される前記＜３＞から＜１４＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１６＞  前記大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用が、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性により測定される前記＜３＞から＜１５＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１７＞  前記大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性が、前記神経細胞内のカルシウムイオン濃度の変化により測定される前記＜１６＞に記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１８＞  前記房水の産生乃至排出が、前房におけるフルオロフォトメトリーにより測定される前記＜３＞から＜１７＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１９＞  前記評価対象薬剤が、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害剤、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害薬、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及びフラボノイド類の少なくともいずれか前記＜３＞から＜１８＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜２０＞  Ｎ，Ｎ”−１，４−ブタンジイルビス［Ｎ’−（３−イソチオシアネートフェニル）チオウレア、並びにその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物、及びプロドラッグの少なくともいずれかを含むことを特徴とする眼圧調整剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、自然発生型の緑内障の有用なモデルである緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法、並びに眼圧調整剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１の野生型マウスに対するＵＤＰ（１０μＭ〜１，０００μＭ、５μＬ）点眼後３時間での眼圧降下作用を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１の野生型マウスに対するＵＤＰ（５００μＭ、５μＬ）による眼圧降下作用の時間依存性を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２の野生型マウスに対するＭＲＳ２５７８（３０μＭ、５μＬ）点眼後３時間での眼圧の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例３のＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するＵＤＰ（５００μＭ、５μＬ）点眼後３時間での眼圧への影響を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例４のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる毛様体突起におけるＰ２Ｙ６受容体ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図６】図６は、実施例４の免疫組織染色による毛様体突起におけるＰ２Ｙ６受容体蛋白質の発現を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例５の野生型マウスに対するＵＤＰ点眼後のフルオロフォトメトリー法による前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例５の野生型マウスに対するＵＤＰ点眼後のフルオロフォトメトリー法による前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図８】図８は、実施例５のＰ２Ｙ６受容体欠損マウスにおけるフルオロフォトメトリー法による前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例６の方法（１）のフルオロフォトメトリー法による野生型マウスに対するチモロール点眼後の前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例６の方法（１）のフルオロフォトメトリー法による野生型マウスに対するラタノプロスト点眼後の前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例６の方法（１）のフルオロフォトメトリー法による野生型マウスに対するＵＤＰ点眼群、チモロール点眼群、ラタノプロスト点眼群及び生理食塩水点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を示す図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、実施例６の方法（１）のフルオロフォトメトリー法によるＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するＵＤＰ点眼後の前房の蛍光強度経時変化を示す図である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、実施例６の方法（１）のフルオロフォトメトリー法によるＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するＵＤＰ点眼群、及び生理食塩水点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例６の方法（２）のフルオロフォトメトリー法による野生型マウスの生理食塩水点眼後の前房の蛍光強度変化を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例６の方法（２）のフルオロフォトメトリー法による野生型及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する生理食塩水点眼群、ＵＤＰ点眼群、チモロール点眼群、及びラタノプロスト点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例７の３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、及び１８ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおける眼圧を比較した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例８の光干渉断層計によりＰ２Ｙ６受容体欠損マウスの網膜神経節細胞の障害を検討した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例９の網膜のホールマウント標本におけるＢｒｎ３ａの免疫組織染色の結果、及びＢｒｎ３ａ陽性細胞数を指標とした網膜神経節細胞の脱落を定量した結果を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１０の３ヶ月齢、及び１２ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおける視神経乳頭部を含む組織のヘマトキシリン−エオジン染色像を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例１０の３ヶ月齢、及び１２ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおけるシュレム管及びぶどう膜−強膜を含む組織のヘマトキシリン−エオジン染色像を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例１１の野生型マウスに対するラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ）点眼後１０時間での眼圧降下作用を示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例１１のＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ）点眼後１０時間での眼圧降下作用を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例１１のラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ、１日１回）を４ヶ月間投与したＰ２Ｙ６受容体欠損マウスにおける眼圧を示すグラフである。
【図１８】図１８は、実施例１１のラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ、１日１回）を４ヶ月間投与したＰ２Ｙ６受容体欠損マウスにおける網膜神経節細胞の障害を検討した結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、実施例１１のラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ、１日１回）を４ヶ月間投与したＰ２Ｙ６受容体欠損マウスにおけるＢｒｎ３ａの免疫組織染色の結果、及びＢｒｎ３ａ陽性細胞数を指標とした網膜神経節細胞の脱落を定量した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（緑内障モデル）
本発明の緑内障モデルは、Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなることを特徴とする。
本発明は、Ｐ２Ｙ６受容体が欠損した非ヒト動物が、高眼圧及び老化に伴い網膜神経節細胞が脱落するという自然発症型の緑内障症状を呈するという未知の属性を見出し、この属性により、当該Ｐ２Ｙ６受容体が欠損した非ヒト動物が、自然発症型の緑内障モデルとしての新たな用途への使用に適することを見いだしたことに基づく発明である。
【００１６】
−Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物−
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した（無効化された）非ヒト動物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物は、野生型に比べて、眼圧が高く、老化に伴い眼圧が更に上昇し、老化に伴い網膜神経節細胞が脱落するという表現型を示す。
【００１７】
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、個体そのものであってもよく、前記個体に由来する、器官、組織及び細胞のいずれかの試料であってもよい。
前記器官としては、眼球、脳が好ましい。前記組織としては、毛様体、網膜、視神経、視中枢リレーニューロン脳視覚領域が好ましい。前記細胞としては、毛様体上皮細胞、網膜神経節細胞、眼グリア細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞が好ましい。
前記視中枢リレーニューロン脳視覚領域としては、外側膝状体から大脳皮質視覚野をつなぐニューロンであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、外側膝状体、上丘、視床後外側核、大脳皮質視覚野などが挙げられる。
【００１８】
−−Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子−−
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子は、Ｐ２Ｙ６受容体をコードする遺伝子である。
前記Ｐ２Ｙ６受容体は、細胞外ヌクレオチドによって活性化されるＧ蛋白質共役型受容体であるＰ２Ｙ受容体のサブタイプ６であり、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）応答性の受容体である。
【００１９】
−−非ヒト動物−−
前記非ヒト動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼブラフィッシュ等の魚類；マウス、ラット、モルモット等の齧歯類動物；ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、チンパンジー、マーモセットなどの、ヒトを除く哺乳類動物が挙げられる。これらの中でも、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモットが好ましく、マウスがより好ましい。
【００２０】
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損したマウスであることが好ましい。前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損したマウスとしては、ベルギーのブリュッセル自由大学のＢａｒらのグループにより確立され、Ｂａｒ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：７７７−７８４，２００８に記載された遺伝子改変マウスであることが好ましい。
前記遺伝子改変マウスは、前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子のコーディングエキソンの１６０ｂｐ上流から、前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子のポリアデニル化シグナルの１０５ｂｐ下流までの領域が欠損したマウスである。
前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子を欠損したマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ニューヨーク州、米国）から入手することができる。
【００２１】
（評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法）
本発明の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法は、本発明の前記緑内障モデルを用いた評価方法であり、薬剤投与工程と、評価工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の評価対象薬剤の緑内障予防乃至治療効果の評価方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの評価方法であってもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法であってもよい。
【００２２】
＜薬剤投与工程＞
前記薬剤投与工程は、前記緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程である。
【００２３】
−緑内障モデル−
前記緑内障モデルとしては、本発明の前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる緑内障モデルを好適に用いることができる。
【００２４】
−評価対象薬剤−
前記評価対象薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の治療薬、被検薬、及び医薬品候補となる試験化合物のいずれであってもよく、天然化合物及び合成化合物のいずれであってもよい。また、遺伝子薬であってもよい。
また、前記治療薬としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の緑内障治療薬を適宜選択することができ、例えば、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害薬、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害剤、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フラボノイド類などが挙げられる。
これらの中でも、本発明の前記緑内障モデルは、房水産生の異常により高眼圧の表現型を示すと考えられ、シュレム管やぶどう膜を介した房水排出経路は正常な機能を保っていると推定されることから、房水排出経路を標的とした治療薬の評価に適している点で、房水排出経路を標的とした治療薬であるプロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、ＲＯＣＫ阻害薬が好ましい。
【００２５】
−−副交感神経刺激薬−−
前記副交感神経刺激薬としては、例えば、ピロカルピン塩酸塩などが挙げられる。
【００２６】
−−抗コリンエステラーゼ薬−−
前記抗コリンエステラーゼ薬としては、例えば、ジスチグミン臭化物などが挙げられる。
【００２７】
−−プロスタグランジン製剤−−
前記プロスタグランジン製剤としては、例えば、ラタノプロスト、タフルプロスト、ビマトプロスト、トラバプロストなどが挙げられる。
【００２８】
−−α１遮断薬−−
前記α１遮断薬としては、例えば、ブナゾシン塩酸塩などが挙げられる。
【００２９】
−−α２刺激薬−−
前記α２刺激薬としては、例えば、ブリモニジン酒石酸塩などが挙げられる。
【００３０】
−−炭酸脱水酵素阻害剤−−
前記炭酸脱水酵素阻害剤としては、例えば、ドルゾラミド塩酸塩、ブリンゾラミド塩酸塩などが挙げられる。
【００３１】
−−β遮断薬−−
前記β遮断薬としては、例えば、カルテオロール塩酸塩、チモロール塩酸塩、ニプラジロールなどが挙げられる。
【００３２】
−−ＲＯＣＫ阻害剤−−
前記ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、リバスジル塩酸塩などが挙げられる。
【００３３】
−−カルシウムチャネル拮抗薬−−
前記カルシウムチャネル拮抗薬としては、例えば、塩酸イガニジピン、ニルバジピン、ニカルジピン塩酸塩、アゼルニジピンなどが挙げられる。
【００３４】
−−ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬−−
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬としては、例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチンカルシウム、ロバスタチン、フルバスタチン、エゼチミブなどが挙げられる。
【００３５】
−−フラボノイド類−−
前記フラボノイド類としては、例えば、アントシアニン、カテキン、クエルセチン、クロロゲン酸、コーヒー酸、ターメリック、クルクミンなどが挙げられる。
【００３６】
−−自律神経作動薬−−
前記自律神経作動薬としては、例えば、ジピベフリン塩酸塩などが挙げられる。
【００３７】
前記緑内障モデルに対し、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、眼局所投与、経口投与、静脈内投与が好ましい。
前記眼局所投与としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、角膜投与（例えば、点眼）、経強膜投与、経硝子体投与などが挙げられる。
前記投与タイミングとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記緑内障モデルにおいて老化に伴い緑内障症状が進行することから、緑内障症状の進行程度に応じたタイミングで投与することにより、所望の緑内障症状の進行程度における前記評価対象薬剤の評価を行うことができる。
【００３８】
前記投与条件としては、例えば、ラタノプロストを評価する場合は、０．０００５質量％〜０．０５質量％（例えば、０．００５質量％）の生理食塩水の溶液を０．５μＬ〜５０μＬ（例えば、５μＬ）点眼することが好ましい。
また、前記Ｐ２Ｙ６受容体作動薬であるＵＤＰを評価する場合は、１０μｍｏｌ／Ｌ〜５００μｍｏｌ／Ｌの生理食塩水の溶液を０．５μＬ〜５０μＬ（例えば、５μＬ）点眼することが好ましく、前記Ｐ２Ｙ６受容体拮抗薬であるＭＲＳ２５７８を評価する場合は、１０μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌ（例えば、３０μｍｏｌ／Ｌ）の生理食塩水の溶液を０．５μＬ〜５０μＬ（例えば、５μＬ）点眼することが好ましい。
【００３９】
或いは、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、評価しようとする投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。これにより、各々の薬剤について、適した投与条件を評価し選定することが可能となる。
【００４０】
本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記試料に前記評価対象薬剤を投与すればよい。
前記試料としては、前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物の個体に由来する、器官、組織及び細胞の少なくともいずれかの試料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、眼球、脳等の器官；毛様体、網膜、視神経、視中枢リレーニューロン脳視覚領野等の組織；毛様体上皮細胞、網膜神経節細胞、網膜神経細胞、眼グリア細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞等の細胞などが挙げられる。これらの中でも、毛様体、網膜神経節細胞が好ましい。
本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の各種条件を選択することができ、例えば、前記評価対象薬剤を含む培地を前記試料に投与すればよい。
【００４１】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法として、例えば、房水産生部位である毛様体突起の無色素上皮細胞（Ｍｏｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．ＩＯＶＳ  ２００１，４２：２０５６−２０６２）を用い、水分子のトランスサイトーシスを評価するシステム（Ｆｏｌｋｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １９９４，９１：４９７０−４９７４）を用いることができる。
【００４２】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、（１）眼圧の低下、（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、（４）グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用、（７）房水の産生抑制、及び（８）房水の排出促進の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程である。
ここで、「有意に観察される」とは、統計的解析により有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
前記統計的解析としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一元配置分散分析、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定、マンホイットニーＵテスト、二要因反復分散分析、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔなどが挙げられる。
また、緑内障の予防乃至治療効果とは、緑内障の予防効果、及び緑内障の治療効果の少なくともいずれかを意味する。
【００４３】
前記対照とは、前記評価対象薬剤に代えて、薬剤に用いた溶媒のみを投与したこと以外は、前記緑内障モデルと同様に処理した対照マウスである。
前記溶媒としては、前記評価対象薬剤を溶解することができ、薬理学的に許容されるものであれば、特に制限はなく、使用する前記評価対象薬剤に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩液などが挙げられる。
【００４４】
−（１）眼圧の低下−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、眼圧の低下が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００４５】
前記眼圧の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の測定方法を選択することができ、例えば、接触式眼圧計、非接触式眼圧計等の眼圧計を用いた測定方法；眼内圧を直接測定する方法などが挙げられる。
前記接触式眼圧計としては、例えば、リバウンド式トノメーター、ゴールドマン圧平式眼圧計、パーキンス眼圧計、トノペン眼圧計、眼内埋没型眼圧計、コンタクトレンズ型眼圧計などが挙げられる。前記非接触式眼圧計としては、例えば、空気眼圧計などが挙げられる。
眼内圧を直接測定する方法としては、前房にガラスキャピラリーを挿入し、キャピラリーに接続したｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒにて眼圧を計測する方法（Ａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．ＩＯＶＳ  ２００２）；眼内に埋没型の眼圧センサーを埋め込み、遠隔で眼圧を測定する方法などが挙げられる。
これらの中でも、侵襲性が低く、再現性、及び正確性が良好な点で、リバウンド式トノメーターが好ましい。
【００４６】
−（２）網膜神経節細胞の神経保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００４７】
前記網膜神経節細胞の神経保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制、前記網膜神経節細胞の軸索流の低下抑制などが挙げられる。
【００４８】
−−網膜神経節細胞の細胞死−−
前記網膜神経節細胞の細胞死の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、光干渉断層計により測定する方法、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少を測定する方法、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定する方法、網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記緑内障モデル動物において、蛍光シグナルの減少による測定する方法などが挙げられる。
【００４９】
前記光干渉断層計とは、光コヒーレンストモグラフィ（Ｏｐｔｉｃｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＣＴ）ともいい、赤外光を用いて生体内部の断層画像を高分解能で取得する技術であり、これにより、生体表皮から１ｍｍ〜２ｍｍの深さで、約１０μｍの高空間分解能を有する断層イメージが得られる。この技術を用いて、前記緑内障モデルにおける網膜の神経細胞の層構造を可視化し、神経節細胞層（ＧＣＬ）の面積及び内網状層（ＩＰＬ）の面積と、その他の網膜の神経細胞層（他の層）の面積との比（ＧＣＬ＋ＩＰＬ／他の層）を算出し、前記比の減少を指標として、前記網膜神経節細胞の細胞死を測定することができる。
【００５０】
前記網膜神経節細胞の細胞数は、前記網膜神経節細胞に特異的な細胞特異的マーカーを発現する細胞を指標として測定することができ、例えば、前記緑内障モデルから採取した網膜組織を用いた、免疫組織染色（蛋白質レベルでの検出）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡレベルでの検出）等により測定する方法などが挙げられる。
前記細胞特異的マーカーとしては、前記網膜神経節細胞に特異的に発現するｍＲＮＡ及び蛋白質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ／ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ａ（Ｂｒｎ３ａ）、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（ＲＢＰＭＳ）、γ−シヌクレイン（γ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）などが挙げられる。
【００５１】
前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量を測定する方法としては、例えば、前記緑内障モデルから採取した網膜試料を用いた、ウエスタンブロッティング（蛋白質レベルでの検出）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルでの検出；例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）等により測定する方法などが挙げられる。
【００５２】
前記網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記緑内障モデル動物において、蛍光シグナルの減少による測定する方法としては、例えば、蛍光蛋白質で標識された前記網膜神経節細胞に特異的な細胞特異的マーカーをコードする遺伝子（例えば、ＧＦＰ−Ｂｒｎ３ａ、Ｔｈｙ１−ＧＦＰなど）が組み込まれた、前記緑内障モデル動物を用いて前記薬剤投与工程を行い、前記網膜神経節細胞における前記蛍光蛋白質の蛍光シグナルの減少を指標として前記網膜神経節細胞の細胞死を測定する方法などが挙げられる。
【００５３】
−−網膜神経節細胞の軸索流−−
前記網膜神経節細胞の軸索流の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、硝子体に注入した軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率により測定する方法、中脳上丘に注入した軸索輸送マーカーの網膜の神経節細胞層への輸送効率により測定する方法、軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定する方法、前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法などが挙げられる。
【００５４】
前記硝子体に注入した軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率、又は中脳上丘に注入した軸索輸送マーカーの網膜の神経節細胞層への輸送効率により測定する方法によれば、前記軸索輸送マーカーが、前記網膜神経節細胞の軸索を経由して脳の入力部位である前記外側膝状体又は網膜の神経節細胞層へ輸送されるため、その輸送効率を指標として前記軸索流を測定することができる。
前記軸索輸送マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質で標識したコレラ毒素βサブユニット、カルボシアニン系蛍光色素（例えば、ＤｉＩ等）、フルオロゴールド、蛍光物質で標識したＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）などが挙げられる。
前記輸送効率としては、例えば、前記網膜神経節細胞の軸索を含む特定の領域における蛍光輝度、網膜組織を破砕した懸濁液における蛍光輝度、前記外側膝状体へ投影した前記網膜神経節細胞の軸索終末１つ当たりの蛍光輝度などにより測定することができる。
【００５５】
前記軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定する方法としては、例えば、Ｔａｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１５）等の文献に記載された方法などが挙げられる。
前記ミトコンドリアを標識する蛍光物質としては、例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ等の蛍光蛋白質などが挙げられる。前記ミトコンドリアを蛍光物質で標識する方法としては、例えば、シトクロムＣオキシダーゼＶＩＩＩと蛍光蛋白質との融合蛋白質を発現する発現ベクターを用いた強制発現などが挙げられる。前記ミトコンドリアの移動速度を測定する方法としては、例えば、二光子励起顕微鏡を用いた組織内ミトコンドリアのリアルタイムイメージングなどが挙げられる。
【００５６】
前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法としては、例えば、前記緑内障モデルから採取した網膜試料を用いた、ウエスタンブロッティング（蛋白質レベルでの検出）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルでの検出；例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）等；前記緑内障モデルから採取した網膜組織を用いた、免疫組織染色（蛋白質レベルでの検出）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡレベルでの検出）等；により測定する方法などが挙げられる。
前記正常軸索マーカーとしては、例えば、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（ＮＦ２００）、Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃβ−ＩＩＩ  Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｕｊｉ１）、Ｔａｕ１、ＳＭＩ３１２などが挙げられる。
前記障害軸索マーカーとしては、例えば、ＳＭＩ３２、β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（β−ＡＰＰ）などが挙げられる。
【００５７】
−（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００５８】
前記網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、細胞数の計測、マーカー蛋白質やｍＲＮＡの発現などが挙げられる。
前記網膜神経節細胞以外の網膜細胞としては、例えば、水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞などが挙げられる。
【００５９】
−（４）グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６０】
前記グリア細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法などが挙げられる。
【００６１】
−（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６２】
前記視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、細胞数、細胞マーカーの発現などが挙げられる。
前記視覚伝達系の上位リレー神経細胞としては、例えば、外側膝状体の神経細胞、上丘の神経細胞、視床後外側核のニューロンなどが挙げられる。
【００６３】
−（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、大脳皮質視覚野神経細胞及び周辺細胞の少なくともいずれかの保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６４】
前記大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野皮下に設置された電極から検出される電位変化により測定する方法、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性により測定する方法などが挙げられる。これらの方法は、例えば、Ａｄｒｉａｎ（Ａｄｒｉａｎ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｂｒａｉｎ  １９３４）；Ｏｈｋｉ（Ｏｈｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５、２００６）等の文献に基づいて行うことができる。
【００６５】
網膜へ照射する前記光としては、一定量であれば、その強度、波長、照射時間などの条件について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記強度としては、０．０１ｃｄ・ｓｅｃ／ｍ２〜１００ｃｄ・ｓｅｃ／ｍ２が好ましく、前記波長としては、３６０ｎｍ〜８５０ｎｍが好ましく、前記照射時間としては、０．１ｍｓｅｃ〜５００ｍｓｅｃが好ましい。
【００６６】
前記大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性は、前記神経細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を指標として評価できる。前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プローブを用いて蛍光輝度変化により測定する方法などが挙げられる。
前記プローブとしては、例えば、カルシウムイオン指示薬、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｃａ２＋  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＧＥＣＩ）などが挙げられる。
前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の、振幅の大きさ、起こる頻度、起こる細胞数などにより評価する方法などが挙げられる。
【００６７】
−（７）房水の産生抑制−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、房水の産生抑制が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６８】
−（８）房水の排出促進−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記緑内障モデルについて、房水の排出促進が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６９】
前記房水の産生及び前記房水の排出の少なくともいずれかを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前房内に導入した蛍光物質の蛍光輝度変化により前記房水の産生速度又は排出速度を測定する方法などが挙げられる。前記前房内に導入した蛍光物質の蛍光輝度変化を測定する方法としては、例えば、前房におけるフルオロフォトメトリーなどが挙げられる。
前記蛍光物質の前房内への導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、点眼、腹腔内投与、静脈内投与などが挙げられる。
前記蛍光物質としては、例えば、フルオロセイン塩酸塩、ローダミンなどが挙げられる。
【００７０】
（眼圧調整剤）
本発明の眼圧調整剤は、Ｎ，Ｎ”−１，４−ブタンジイルビス［Ｎ’−（３−イソチオシアネートフェニル）チオウレア、並びにその薬理学的に許容可能な、塩、溶媒和物及びプロドラッグの少なくともいずれかを含み、更に必要に応じて、薬理学的に許容可能な担体などのその他の成分を含む。
【００７１】
＜ＭＲＳ２５７８＞
前記Ｎ，Ｎ”−１，４−ブタンジイルビス［Ｎ’−（３−イソチオシアネートフェニル）チオウレアは、ＣＡＳ  Ｎｏ：７１１０１９−８６−２の下記構造式（１）で表される化合物であり、「ＭＲＳ２５７８」とも称される。
−構造式（１）−
【化１】
2017051181.tif 000003
【００７２】
前記ＭＲＳ２５７８は、選択的Ｐ２Ｙ６受容体拮抗剤である。本発明者らは、前記Ｐ２Ｙ６受容体が房水の産生に関わる毛様体突起に発現し、前記ＭＲＳ２５７８が前記Ｐ２Ｙ６受容体を介して、眼圧を上昇させることを見出した。したがって、本発明の眼圧調整剤は、前記ＭＲＳ２５７８が、Ｐ２Ｙ６受容体を標的とする眼圧調整剤として有用であることを見出したことに基づく発明である。
【００７３】
前記ＭＲＳ２５７８の薬理学的に許容可能な塩とは、前記ＭＲＳ２５７８と、無機酸、有機酸、無機塩基及び有機塩基の少なくともいずれかとを化学反応させることにより形成される塩である。
前記無機酸又は有機酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸、過塩素酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換基含有ベンゼンスルホン酸（例えば、p−トルエンスルホン酸）、イソニコチン酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、ウロン酸、サッカリン酸又はショ糖酸、蟻酸、安息香酸、グルタミン酸、ビスヒドロキシナフテン酸、ソルビン酸などが挙げられる。
前記無機塩基又は有機塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化第二鉄、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化アルミ二ウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア水、有機第四級アンモニウム水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、有機第四級アンモニウム炭酸塩、重曹、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素バリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素化有機第四級アンモニウムなどが挙げられる。
【００７４】
前記ＭＲＳ２５７８の薬理学的に許容可能な溶媒和物とは、前記ＭＲＳ２５７８が薬理学的に許容可能な溶媒と、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、錯体、インクルーションなどを形成して安定化したものである。前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アセトン、アセトニトリル、エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが挙げられる。
【００７５】
前記ＭＲＳ２５７８の薬理学的に許容可能なプロドラッグとは、化学合成又は物理的な方法により前記ＭＲＳ２５７８を他の化合物に転換させて、当該他の化合物を哺乳動物に投与してから、前記哺乳動物の体内で前記ＭＲＳ２５７８に転換し戻すことが可能なものである。前記ＭＲＳ２５７８のプロドラッグとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７６】
前記ＭＲＳ２５７８の前記眼圧調整剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３ｎｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、３０ｎｍｏｌ／Ｌ〜３００μｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００７７】
通常、緑内障の治療においては眼圧を低下させる薬剤が使用される。しかし、眼圧の至適範囲は狭く、例えば、日本人の正常値は、１０ｍｍＨｇ〜２１ｍｍＨｇであり、マウスの正常値は、１０ｍｍＨｇ〜２１ｍｍＨｇである。正常値未満の低眼圧は、前房消失による角膜内皮障害や白内障進行への影響のほか、房水循環低下による眼機能障害を引き起こす可能性がある。そのため、例えば、線維柱帯切除術後の低眼圧、毛様体機能低下症や低眼圧黄斑症において、至適な眼圧を維持することが困難であり、前記至適範囲よりも眼圧が下がり過ぎる場合には、前記眼圧調整剤により、眼圧を上げて前記至適範囲とすることが好ましい。
【００７８】
＜その他の成分＞
前記眼圧調整剤は、デキストリン、シクロデキストリンなどの薬理学的に許容可能な担体、助剤を用いて、常法に従い、液状、粉末状、顆粒状、錠剤状などの任意の剤形に製剤化して提供することができ、他の組成物（例えば、点眼薬、経口医薬品など）に配合して使用できる他、軟膏剤、外用液剤、貼付剤などとして使用することができる。
前記助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤などを用いることができる。
【００７９】
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００８０】
前記眼圧調整剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、眼局所投与（例えば点眼）、経口投与、静脈内投与が好ましい。
【００８１】
前記眼圧調整剤の投与量としては、特に制限はなく、処置を必要とする哺乳動物の疾患状態、体重等の要因に応じて適宜選択することができるが、一日当たり、０．００００６ｍｇ〜０．０２４ｍｇが好ましく、０．０００２ｍｇ〜０．００８ｍｇがより好ましい。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
なお、実施例中の単位「Ｍ」は、「ｍｏｌ／Ｌ」である。
【００８３】
（実施例１：野生型マウスの眼圧に対するＵＤＰの作用）
＜眼圧の測定方法＞
眼圧の測定は全て麻酔下にて行った。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８週齢）にペントバルビタールナトリウム（生理食塩水に溶解、共立製薬株式会社製）を腹腔内投与（５０ｍｇ／ｋｇ）し、正向反射が見られなくなったことを確認して計測を行った。眼圧の計測は、リバウンド式トノメーター（ＴｏｎｏＬａｂ、ｉＣａｒｅ社製）を用い、５回計測値の平均値を測定値として用いた。
【００８４】
＜点眼方法＞
点眼は全て覚醒下にて、１８時〜２４時に行った。ウリジン二リン酸（ＵＤＰ、シグマ−アルドリッチ社製）は生理食塩水に所望の濃度に希釈し、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８週齢）の右眼に５μＬ投与した。左眼にはコントロールとして生理食塩水５μＬを投与した。
【００８５】
＜結果＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８週齢）に対して５μＬのＵＤＰ（１０μＭ〜１，０００μＭ）を点眼後、３時間での眼圧降下作用を図１に示す。左眼に生理食塩水を点眼し、これを対照としてＵＤＰを点眼した右眼の眼圧を降下率として求めた。その結果、１０μＭ〜５００μＭの範囲で濃度依存性を示し、５００μＭで最大降下作用を示した。
また、図２に示すように、ＵＤＰ（５００μＭ、５μＬ）による眼圧降下作用の時間依存性は１．５時間をピークとし、その後緩やかに対照眼と同程度まで戻り、２４時間後には逆に対照眼よりも高くなった後、４８時間後に処置前のレベルまで戻った。最大眼圧降下作用はいずれの場合でも約１０％であった。なお、図１〜２中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊及び＊＊は、一元配置分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【００８６】
（実施例２：野生型マウスの眼圧に対するＰ２Ｙ６受容体拮抗薬の作用）
＜方法＞
点眼方法について、ＵＤＰを選択的Ｐ２Ｙ６受容体拮抗薬であるＭＲＳ２５７８（３０μＭ）に代えたこと以外は、実施例１の点眼方法と同様に行った。眼圧の測定方法は、実施例１と同様に行った。
【００８７】
＜結果＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８週齢）に対して５μＬのＭＲＳ２５７８（３０μＭ、選択的Ｐ２Ｙ６受容体拮抗薬）を点眼後、３時間での眼圧の変化を図３に示す。図１及び２と同様に、左眼に生理食塩水を同量添加して対照群とした。対照眼に比べて１０％程度眼圧が上昇した。なお、図３中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊は、マンホイットニーＵテストによる統計解析における有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【００８８】
（実施例３：ＵＤＰの作用に対するＰ２Ｙ６受容体遺伝子発現の影響）
＜方法＞
実施例１において、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８週齢）に代えてＰ２Ｙ６受容体を欠損した雄性マウス（８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６系統の遺伝的背景を有する）を用い、５μＬのＵＤＰ（５００μＭ）点眼後３時間での眼圧の変化を測定したこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００８９】
＜結果＞
Ｐ２Ｙ６受容体を欠損した雄性マウス（８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６系統の遺伝的背景を有する）では、ＵＤＰ（５００μＭ、５μＬ）を点眼後３時間において眼圧降下作用がみられなかった（図４）。したがって、ＵＤＰの点眼による眼圧降下作用はＰ２Ｙ６受容体を介した作用であることが明らかとなった。
【００９０】
（実施例４：Ｐ２Ｙ６受容体の発現部位の同定）
眼圧は眼房水の産生と排出のバランスで正常値が保たれている。つまり、ＵＤＰ／Ｐ２Ｙ６受容体の作用は、産生及び排出のいずれかに関する組織を介したものであると考えられた。そこで、眼房水産生に関わる毛様体突起、並びに排出に関わる線維柱帯網及びシュレム管でのＰ２Ｙ６受容体の発現パターンを検討した。
【００９１】
＜ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション＞
８週齢のＩＣＲマウスを用いた。マウスＰ２ｒｙ６遺伝子（ジェンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿１８３１１６８．２）の１１番目〜５９１番目の塩基に相当する５８１ｂｐのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｐ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ株式会社製）にサブクローニングし、センス鎖ＲＮＡプローブ及びアンチセンス鎖ＲＮＡプローブを作製した。
【００９２】
組織切片はキシレンにて脱パラフィンを行い、エタノール及びＰＢＳにて再水和した。切片を４質量％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、その後プロテアーゼＫ（８μｇ／ｍＬ、３０分間、３７℃）で処理した。その後、４質量％ＰＦＡにて再固定し、ＰＢＳで洗浄後、０．２Ｍ  ＨＣｌで１０分間処理した。切片を０．１Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０；０．２５質量％無水酢酸含有）にて１０分間処理した。ハイブリダイゼーションはプローブ濃度３００ｎｇ／ｍＬ、反応条件は６０℃、１６時間にて行った。切片はその後５×ＨｙｂｒｉＷａｓｈＴＭ（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ社製）にて洗浄し、５×ＳＳＣにて６０℃、２０分間反応させ、５０体積％ホルムアミド含有２×ＨｙｂｒｉＷａｓｈＴＭにて６０℃、２０分間反応させた。その後ＲＮａｓｅ処理（５０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ、１Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）を３７℃にて３０分間行った。
【００９３】
得られた切片をＧ−ｂｌｏｃｋ（ＧＢ−０１、Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ社製）にて３０分間処理し、アルカリフォスファターゼが付加した抗ジゴキシゲニン抗体（１：１，０００、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を含むＧ−ｂｌｏｃｋと室温にて２時間反応させた。切片はその後、ＴＢＳ／Ｔ（０．１体積％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１体積％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む溶液（ｐＨ９．５）に浸漬した。発色反応はＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）にて１晩反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。切片はＫｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ−アルドリッチ社製）にて対比染色を行い、マリノール（武藤化学株式会社製）にて封入した。
【００９４】
＜免疫組織染色＞
組織は、４質量％ＰＦＡにて固定（１２時間、４℃）し、ブロッキング溶液（２体積％ウシ血清アルブミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び２体積％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）にて室温で１時間処理した。組織標本は、毛様体突起については２０μｍ厚みの切片を作製した。１次抗体として抗Ｐ２Ｙ６抗体（１：１，０００、アブカム社製）を含むブロッキング溶液と３日間（４℃）にて反応させ、ＰＢＳ／Ｔ（０．３体積％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。その後切片を２次抗体（ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５４６  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ又はａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ｄｙｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、１：１，０００、ライフテクノロジーズ社製）を含むブロッキング溶液と１時間（室温）反応させた。切片はＰＢＳ／Ｔにて３回洗浄して観察を行った。
【００９５】
＜結果＞
図５に示すように、Ｐ２Ｙ６受容体のｍＲＮＡ発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで検討したところ、毛様体突起の無色素上皮に特に強いシグナルが確認された（図５中、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ、矢頭）。なお、図５中、「ｓｅｎｓｅ」は、センス鎖ＲＮＡプローブを用いた対照実験を示し、「ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＲＮＡプローブを用いない対照実験を示す。
図６に示すように、Ｐ２Ｙ６受容体の蛋白質発現を免疫組織染色法により検討したところ、図５の結果と一貫して、野生型マウスの毛様体突起の無色素上皮に特に強いシグナルが観察された（図６中、ＷＴ）。Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは、それらシグナルは観察されなかった（図６中、Ｐ２Ｙ６ＫＯ）。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びを免疫組織染色のいずれにおいても、線維柱帯網やシュレム管に相当する部位では顕著なＰ２Ｙ６受容体シグナルは観察されなかったことから（データ示さず）、Ｐ２Ｙ６受容体の機能は、眼房水産生に影響すると推察された。
【００９６】
（実施例５：Ｐ２Ｙ６受容体の眼房水産生速度に対する影響）
眼房水の産生及び排出ダイナミクスを、フルオロフォトメトリー法を用いて検討した。腹腔内に投与したフルオレセインは、投与、血管に吸収されたのちに緩やかに眼房内に移行する。したがって、眼房のフルオレセイン蛍光値の増加は眼房水の産生を反映するものと考えられる。
【００９７】
＜眼房水ダイナミクス観察＞
眼房水の産生及び排出ダイナミクスは、フルオロフォトメトリー法を用いて検討した。ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）にて麻酔をかけた野生型又はＰ２Ｙ６受容体欠損マウスの腹腔内に０．２質量％フルオレセイン（生理食塩水に溶解）を投与し、前房のフルオレセイン由来蛍光強度の変化をＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社）にて計測した。フルオレセイン投与の３０分間前に生理食塩水、ＵＤＰ（５００μＭ、生理食塩水に溶解）を右眼に５μＬ点眼し、野生型マウス及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する影響を評価した。フルオレセイン投与直後から２分間毎に撮影を行い、３０分間計測した。前房の蛍光強度はＩｍａｇｅ  Ｊ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｃ／ｉｊ／）を用いて計測（エリア選択−Ａｎａｌｙｚｅ−Ｍｅａｓｕｒｅ）した。
【００９８】
＜結果＞
野生型マウスに対するＵＤＰ点眼後のフルオロフォトメトリー法による前房の蛍光強度経時変化を図７Ａ〜Ｂに示す。図７Ａ中、左パネル（０ｍｉｎ）は、計測開始時刻（初期）の撮影写真を示し、右パネル（３０ｍｉｎ）は、計測３０分間経過後の撮影写真を示し、図７Ｂは、ＵＤＰ点眼群及び生理食塩水点眼群における初期値に対する前房の蛍光強度経時変化を示す。
また、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスにおけるフルオロフォトメトリー法による前房の蛍光強度経時変化を図８に示す。
その結果、ＵＤＰ（５００μＭ、５μＬ）を点眼すると、対照眼（生理食塩水、５μＬ）に比べてフルオレセインの増加速度が減弱した（図７）。一方、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウス（Ｐ２Ｙ６ＫＯ）では、野生型マウス（ＷＴ）に比べてフルオレセイン増加速度が上昇していた（図８）。この結果より、Ｐ２Ｙ６受容体は眼房水の産生を抑制的に制御することが明らかとなった。なお、図７〜８中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、図７Ｂ及び図８中、＊及び＊＊は、二要因反復分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【００９９】
（実施例６：緑内障治療薬、及びＰ２Ｙ６受容体の眼房水産生速度に対する影響）
眼房水の産生及び排出ダイナミクスを、フルオロフォトメトリー法を用いて検討した。フルオレセインを以下の２種類の方法にて投与し、眼房内の蛍光強度変化に対する各種薬剤の効果を評価した。
【０１００】
＜方法（１）＞
ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）にて麻酔をかけた野生型又はＰ２Ｙ６受容体欠損マウスの腹腔内に０．２質量％フルオレセイン（生理食塩水に溶解）を投与し、前房のフルオレセイン由来蛍光強度の変化をＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社）にて計測した。フルオレセイン投与直後から２分間毎に撮影を行い、３０分間計測した。前房の蛍光強度はＩｍａｇｅ  Ｊ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｃ／ｉｊ／）を用いて計測（エリア選択−Ａｎａｌｙｚｅ−Ｍｅａｓｕｒｅ）した。
【０１０１】
＜方法（２）＞
ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）にて麻酔をかけた野生型又はＰ２Ｙ６受容体欠損マウスの角膜に５μＬの０．０２質量％フルオレセイン（生理食塩水に溶解）を滴下し、５分間静置した後に５００μＬの生理食塩水にて洗浄後、前房のフルオレセイン由来蛍光強度の変化をＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社）にて計測した。フルオレセイン投与直後から２分間毎に撮影を行い、３０分間計測した。前房の蛍光強度はＩｍａｇｅ  Ｊ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｃ／ｉｊ／）を用いて計測（エリア選択−Ａｎａｌｙｚｅ−Ｍｅａｓｕｒｅ）した。
【０１０２】
方法（１）、及び方法（２）のいずれの場合においても、フルオレセイン投与の３０分間前に生理食塩水、ＵＤＰ（５００μＭ、生理食塩水に溶解）、ラタノプロストの市販品（センジュ（登録商標）、０．００５質量％、千寿製薬株式会社製）及びチモロールの市販品（テイカ（登録商標）、０．５質量％、日東メディック株式会社）を右眼に５μＬ点眼し、野生型マウス及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する影響を評価した。
【０１０３】
＜結果＞
方法（１）のフルオロフォトメトリー法を用いた場合の野生型マウスに対するチモロール、ラタノプロスト点眼後の前房の蛍光強度変化を図９Ａ〜Ｂに示す。図９Ｃは、野生型マウスに対するＵＤＰ点眼群、チモロール点眼群、ラタノプロスト点眼群、及び生理食塩水点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を示す。ＵＤＰの作用はチモロールの作用に類似しており、ラタノプロストの作用には類似していなかった。
方法（１）のフルオロフォトメトリー法を用いた場合のＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するＵＤＰ点眼後の前房の蛍光強度経時変化を図９Ｄに示す。また、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスに対するＵＤＰ点眼群、及び生理食塩水点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を図９Ｅに示す。ＵＤＰの作用は、野生型マウスに対しては観察されたが、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスに対しては観察されなかった。
【０１０４】
方法（２）のフルオロフォトメトリー法を用いた場合の野生型マウスの生理食塩水点眼後の前房の蛍光強度変化を図１０Ａに示す。また、図１０Ｂに野生型及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する生理食塩水点眼群、ＵＤＰ点眼群、チモロール点眼群、及びラタノプロスト点眼群における、初期値に対する計測開始から３０分間後の前房の蛍光強度経時変化の定量値を示す。
方法（２）のフルオロフォトメトリー法を用いた場合、方法（１）の結果と同様に、野生型マウスにおいて、ＵＤＰの作用はチモロールの結果に類似していたが、ラタノプロストの結果とは類似していなかった。また、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスにおいても、ＵＤＰの作用はチモロールの結果に類似していたが、ラタノプロストの結果とは類似していなかった。
【０１０５】
これら２種類の方法を用いた結果より、ＵＤＰの作用はチモロールの作用機序に類似したものであると考えられた。チモロールはβ受容体を抑制することにより、眼房水の産生を阻害することから、ＵＤＰやＰ２Ｙ６受容体の作用は眼房水産生に影響すると考えられる。一方で、ＵＤＰの作用はラタノプロストの結果とは一致しなかった。ラタノプロストはぶどう膜−強膜（副経路）を介した眼房水排出促進を誘導することが知られている。したがって、ＵＤＰやＰ２Ｙ６受容体の作用は、排出経路、少なくとも副経路を介した排出には影響しないと考えられた。
【０１０６】
なお、図９Ｃ〜Ｅ、及び図１０Ｂ中、ｃｏｎｔ、Ｌａｔ、ＵＤＰ、及びＴｉｍｏは、それぞれ生理食塩水点眼群、ラタノプロスト点眼群、ＵＤＰ点眼群、及びチモロール点眼群を示し、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、図９Ａ中、＊及び＊＊は、二要因反復分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示し、図９Ｃ、図９Ｅ、及び図１０Ｂ中、＊及び＊＊は、マンホイットニーＵテストによるによる統計解析において有意差（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０７】
（実施例７：Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスは高眼圧の表現型を示す）
３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、及び１８ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおける眼圧を比較した結果を図１１に示す。眼圧の測定方法は、実施例１と同様に行った。なお、図９中、３ｍｏ、６ｍｏ、１２ｍｏ及び１８ｍｏは、それぞれ３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、及び１８ヶ月齢のマウスであることを示す。
その結果、３ヶ月齢、６ヶ月齢、１２ヶ月齢、及び１８ヶ月齢のいずれの場合でもＰ２Ｙ６受容体欠損マウス（Ｐ２Ｙ６ＫＯ）は、各月齢の野生型マウス（ＷＴ）に比べて眼圧が高い傾向を示した（図１１）。野生型、欠損マウス共に老化に伴って眼圧が上昇していた。つまり、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは、眼圧が高いことにより、長期間に亘って視神経に対して機械的な負荷がかかった状態であることが推察された。なお、図１１中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、マンホイットニーＵテストによるによる統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０８】
（実施例８：Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは網膜における神経節細胞層及び内網状層の厚みが減少する）
＜光干渉断層計＞
抗コリン薬を点眼し、十分に散瞳したことを確認した後に、ケタミン（６ｍｇ／ｍＬ）及びキシラジン（０．４４ｍｇ／ｍＬ）の混合溶媒２００μＬをマウス腹腔内に投与した。マウス網膜の光干渉断層計像は、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ社製）を用いて取得した。マウス角膜に乾燥防止用のゲル（スコピゾル眼科用液、千寿製薬株式会社製）を添加し、対物レンズを視神経乳頭部が視野に入るように近づけ、計測した。断層は視神経乳頭部周囲を円状に取得した。取得画像における比（ＧＣＬ＋ＩＰＬ／他の層）は、Ｉｍａｇｅ  Ｊにて定量した（エリア選択−Ａｎａｌｙｚｅ−Ｍｅａｓｕｒｅ）。
なお、前記比（ＧＣＬ＋ＩＰＬ／他の層）は、神経節細胞層（ＧＣＬ）の面積及び内網状層（ＩＰＬ）の面積と、その他の網膜の神経細胞層（他の層）の面積との比を意味し、神経節細胞層及び内網状層の面積とその他の網膜面積をそれぞれ計測して、算出することにより求めた。前記比を神経細胞の細胞死（神経細胞障害）の指標として用いた。
【０１０９】
＜結果＞
図１２に、光干渉断層計により、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスの網膜神経節細胞の障害を検討した結果を示す。なお、図１２中、ＧＣＬは神経節細胞層、ＩＰＬは内網状層、ＩＮＬは内顆粒層、ＯＰＬは外網状層、ＯＮＬは外核層、ＩＯ／ＯＳは視細胞外接−内接接合部、ＲＰＥは網膜色素上皮をそれぞれ示す。また、３ｍｏ、６ｍｏ及び１２ｍｏは、それぞれ３ヶ月齢、６ヶ月齢、及び１２ヶ月齢のマウスであることを示す。また、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、一元配置分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’s  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１１０】
その結果、図１２に示すように、野生型マウスでは月齢に関わらず神経節細胞層と内網状層を合わせた領域（ＧＣＬ＋ＩＰＬ）の大きさは変化しなかった。一方、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは６ヶ月齢、及び１２ヶ月齢で顕著にその領域の大きさが顕著に減少した。その他の領域のサイズは変化しなかった。
【０１１１】
（実施例９：Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスは老化に伴って網膜神経節細胞が脱落する）
＜方法＞
免疫組織染色の方法としては、組織標本として、網膜取り出した後に網膜辺縁部に４箇所切り込みを入れることで平坦化した網膜展開標本を用い、一次抗体として、抗Ｂｒｎ３ａ抗体（１：３００、サンタクルズ社製）を用いたこと以外は、実施例４の免疫組織染色の方法と同様に行った。また、所定の領域（視神経乳頭部より１００μｍ〜５００μｍの距離に位置する任意の大きさの領域）当りのＢｒｎ３ａ陽性細胞数をカウントした。
【０１１２】
図１３に、網膜のホールマウント標本におけるＢｒｎ３ａの免疫組織染色の結果（左パネル）、及びＢｒｎ３ａ陽性細胞数を指標とした網膜神経節細胞の脱落を定量した結果（右パネル）を示す。
その結果、図１３に示すように、Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は、野生型マウスでは月齢によって変化は見られないが、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは６ヶ月齢及び１２ヶ月齢で大きく減少した。なお、図１３中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、一元配置分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１１３】
（実施例１０：Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスは老化によって視神経乳頭部の陥凹を示す）
＜方法＞
野生型マウス及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスの若齢（３ヶ月齢）及び老齢（１２ヶ月齢）の眼球を用いた。摘出した眼球を４質量％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて４℃で１晩処理した。その後、パラフィンに包埋後、マイクロトームにて１０μｍ厚の組織切片を作製した。組織切片を以下の手順で脱パラフィン、及びヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行った。
【０１１４】
＜脱パラフィン＞
１００体積％キシレン          ５分間
１００体積％キシレン          ５分間
１００体積％キシレン          ５分間
１００体積％エタノール        ５分間
１００体積％エタノール        ５分間
９０体積％エタノール          ５分間
８０体積％エタノール          ５分間
流水洗浄                      ５分間
蒸留水                        ２分間
【０１１５】
＜ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色＞
ヘマトキシリン（商品名：マイヤーヘマトキシリン＃８６５０、サクラファインテック
ジャパン株式会社）              ４分間
流水                        １０分間
蒸留水                        １分間
１質量％エオジン              ２分間
７０体積％エタノール          ３分間
９５体積％エタノール          １分間
１００体積％エタノール        １分間
１００体積％エタノール        １分間
１００体積％エタノール        １分間
１００体積％キシレン          １分間
１００体積％キシレン          １分間
１００体積％キシレン          １分間
【０１１６】
＜結果＞
図１４Ａに、３ヶ月齢、及び１２ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおける視神経乳頭部を含む組織のヘマトキシリン−エオジン染色像を示す。図１４Ａに示すように、野生型マウスでは若齢、老齢関わらず画像中央部に位置する視神経乳頭部の陥凹は観察されなかった。一方、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでは、若齢マウスにおいては顕著な差は見られなかったが、老齢マウスの一部では顕著な視神経乳頭部の陥凹が観察された（図１４Ａ中、＊で示す）。ヒト緑内障患者においても、当該部位の陥凹は緑内障発症や症状の進行の評価に用いられる。老齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウスで見られる視神経乳頭部の陥凹は、ヒトの解剖学的所見とも一致する緑内障症状を示す変化だと考えられる。
【０１１７】
図１４Ｂに、３ヶ月齢、及び１２ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス及び野生型マウスにおけるシュレム管及びぶどう膜−強膜を含む組織のヘマトキシリン−エオジン染色像を示す。図１４Ｂに示すように、シュレム管（主経路）及びぶどう膜−強膜（副経路）を含む眼房水の排出に関わる部位に関しては野生型、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウス共に老化に関わらず大きな違いは認められなかった。この結果は、実施例６の図１０の結果とも一致している。したがって、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスで観察された眼圧上昇は眼房水の産生過多が１つの原因であると考えられた。
【０１１８】
（実施例１１：ラタノプロストのＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する眼圧降下作用）
緑内障治療薬の１種であるラタノプロスト（プロスタグランジン製剤であるＰＧＦ２α）の作用に対してＰ２Ｙ６受容体欠損が影響するかどうかを検討した。
＜方法＞
点眼方法については、点眼薬としてラタノプロストの市販品（センジュ（登録商標）、０．００５質量％、千寿製薬株式会社製）をそのまま使用し、右眼に５μＬ点眼したこと以外は、実施例１の点眼方法と同様に行い、野生型マウス及びＰ２Ｙ６受容体欠損マウスに対する影響を評価した。
また、８週齢から４ヶ月間ラタノプロスト（０．００５質量％、５μＬ、１日１回）を点眼により投与した６ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス、未処理のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス、及び対照となる野生型マウスを用い、実施例８の光干渉断層計、及び実施例９の免疫組織染色により、ラタノプロストによる神経保護作用について評価した。
【０１１９】
＜結果＞
野生型マウスに対してラタノプロスト（５μＬ、０．００５質量％、図中「Ｌａｔａｎｏ」と表記）を投与すると、１０時間後において顕著に眼圧が低下した（図１５）。Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスでも同程度の眼圧降下作用が見られた（図１６）。これらの結果から、同遺伝子の欠損は、緑内障治療薬の評価に影響を与えないことが明らかとなった。
Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスにおいて傷害が見られない８週齢からラタノプロストを４ヶ月間投与した、６ヶ月齢のＰ２Ｙ６受容体欠損マウス（Ｐ２Ｙ６ＫＯ  ６ｍｏ）では、眼圧は同じ週齢の野生型マウス（６ｍｏ）と同程度に抑えられ（図１７）、実施例７のＯＣＴで観察されたＧＣＬ＋ＩＰＬ領域の菲薄化が有意に抑制されていた（図１８）。同様に、網膜展開標本でＢｒｎ３陽性細胞数を計測したところ、ラタノプロスト投与により傷害が有意に抑制されていた（図１９）。
なお、図１５〜１９中、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊及び＊＊は、一元配置分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１２０】
これらの結果から、Ｐ２Ｙ６受容体欠損マウスは、既存又は新規緑内障治療薬の有効な評価システムとして用いることができることが分かった。
【０１２１】
以上の実施例で示したように、Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物では、眼房水産生が過剰となることで恒常的に眼圧が高くなり、長期的に高眼圧に暴露されることによって網膜神経節細胞が障害される表現型を示す。したがって、前記Ｐ２Ｙ６受容体遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる本発明の緑内障モデルは、自然発症型の緑内障モデルと言える。緑内障モデルマウスとして現在最も汎用されるＤＢＡ２Ｊマウスは、虹彩の器質的な異常を伴うことから、ヒト緑内障患者の表現型とは異なる。また、本発明の緑内障モデルは、眼圧の変化が比較的緩徐であることから、よりヒト緑内障の表現型に近いと考えられる。Ｐ２Ｙ６受容体の作用点は、現行の緑内障治療薬の作用点と異なることから、それらの評価に影響を与えず、より正確な評価系として使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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