(57)【要約】【課題】ナットウキナーゼの新規な用途を提供する。【解決手段】ナットウキナーゼを含む血液凝固阻害用組成物であって、該ナットウキナーゼが、納豆菌（Ｂaｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ）を培養して得られ、ビタミンＫ２を除去する工程を含むことによりビタミンＫ２含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下である、血液凝固阻害用組成物。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナットウキナーゼを有効成分とする血液凝固阻害剤。
【請求項２】
ナットウキナーゼを成人１日当たり、１０００〜４０００ＦＵ投与することを特徴とする請求項１に記載の血液凝固阻害剤。
【請求項３】
全質量基準で、ナットウキナーゼに対するビタミンＫ２の含有率が０．０００１質量％以下である、請求項１または２に記載の血液凝固阻害剤。
【請求項４】
ナットウキナーゼを経口投与する、請求項１〜３のいずれかの血液凝固阻害剤。
【請求項５】
ナットウキナーゼを有効成分として含有する血液凝固阻害用組成物。
【請求項６】
ナットウキナーゼが、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ）を培養して得られ、ビタミンＫ２を除去する工程を含むことによりビタミンＫ２含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下である、請求項５の血液凝固阻害用組成物。
【請求項７】
前記血液凝固阻害用組成物が食品用組成物である、請求項５または６に記載の血液凝固阻害用組成物。
【請求項８】
油状物質を７５〜８０℃で攪拌・溶解する工程と、
該攪拌・溶解した油状物質を５０℃以下に冷却する工程と、
冷却した油状物質にナットウキナーゼおよび乳化剤をナットウキナーゼが失活しない速度で攪拌・混合する工程と、
該攪拌・混合物をカプセルに充填する工程を含む、
ナットウキナーゼ含有カプセルの製造方法。
【請求項９】
前記油状物質が、大豆油、グリセリン脂肪酸エステルおよびミツロウからなる群から選ばれる１または複数の油状物質である請求項８の製造方法。
【請求項１０】
前記乳化剤がレシチンである、請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ナットウキナーゼが、乾燥重量あたりビタミンＫ２を０．０００１質量％以下含むものである、請求項８〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
ナットウキナーゼ活性が２年間以上安定である、請求項８〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
油状物質の温度を５０℃以下で油状物質の融点より高い温度に下げた後に、ナットウキナーゼおよび乳化剤を混合し、カプセルに封入する工程を含む、カプセル内のナットウキナーゼの安定化方法。
【請求項１４】
全質量を基準として、大豆油を４０〜８０質量％、グリセリン脂肪酸エステルを１〜２０質量％、ミツロウを１〜２０質量％、ナットウキナーゼを１〜３０質量％、ビタミンＫ２を含まないかまたは０より多く０．０００１質量％以下、レシチンを１〜２０質量％含有する組成物。
【請求項１５】
前記組成物がカプセル製造用である、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
血栓溶解活性および血液凝固阻害活性を有する請求項１４または１５の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナットウキナーゼの新規用途、ナットウキナーゼを含む組成物およびその製造方法ならびにナットウキナーゼの安定化方法に関する。より詳しくはナットウキナーゼを用いて血液凝固を阻害する技術およびナットウキナーゼ含む組成物中のナットウキナーゼの安定化を含む製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆菌が血栓溶解酵素であるナットウキナーゼ（ＮＫ）を生産することは、須見らによって発見され（非特許文献１）、納豆の栄養価はもちろん、健康食品としての価値が見直されている。ナットウキナーゼは、それ自身が線溶酵素として作用することが知られており、食品として摂取されると、血栓を溶解する。このナットウキナーゼは、半減期が長く、長時間効果が持続するという、極めて優れた特徴を有している。そして、同じ血栓溶解作用を有するウロキナーゼでは明確でなかった切迫期網膜中心静脈閉塞症の治療効果が、ナットウキナーゼで明確に現れたことが報告されている（非特許文献２）。また、ナットウキナーゼの血栓溶解能力は血栓症の予防だけでなく治療においても優れていることが知られている（非特許文献３）。そこで、ナットウキナーゼを多量に含む食品、例えば、納豆菌培養物を粉末あるいはカプセル化した商品が健康食品として販売されている。
【０００３】
ナットウキナーゼは大豆には含まれず、納豆菌が大豆に作用し、醗酵する過程でつくられるものである。このナットウキナーゼには血液凝固因子のビタミンＫ２が同時に含まれているため、血栓予防等を目的として、血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを含む納豆あるいは納豆菌培養エキスを摂取すると、ビタミンＫ２も同時に摂取することになり、ビタミンＫ依存性凝固因子合成抑制剤（ワルファリンなど）の効果が打ち消される、という問題があった。そこで、このビタミンＫ２の含有量を１μｇ／ｇ乾燥重量以下にしたナットウキナーゼを製造する技術が開発されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、ナットウキナーゼの効果が感じられるまでには、数ヶ月間の摂取が必要であった。そこでより効率良く高力価のナットウキナーゼを摂取できる組成物が求められていた。また、ナットウキナーゼにより血液の凝固を阻害できるかについては知られておらず、ナットウキナーゼの新規用途の開発が望まれていた。
【０００５】
一方で、既存の血液凝固阻害薬としてはヘパリンやワルファリンがあるが、効果や副作用に個人差があり、これらに代替できる新規な薬剤の開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３８８１４９４号公報
【特許文献２】特許第３８３４０４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】須見ら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４３巻、１１１０頁（１９８７年）
【非特許文献２】西村ら、眼科臨床医報  第８８巻、第９号 ５３〜５７頁（１９９４年）
【非特許文献３】高岡晋作： ジャパンフードサイエンス、３巻、第９号、５５−６０頁（２０００年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ナットウキナーゼを含む組成物およびその製造方法、ならびにナットウキナーゼを有効成分とする血液凝固阻害剤、およびそれを含有する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、鋭意研究した結果、ナットウキナーゼを安定化できる組成物およびそれらの製造方法、ならびに血液凝固を阻害する効果を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）ナットウキナーゼを有効成分とする血液凝固阻害剤。
（２）ナットウキナーゼを成人１日当たり、１０００〜４０００ＦＵ投与することを特徴とする（１）の血液凝固阻害剤。
（３）全質量基準で、ナットウキナーゼに対するビタミンＫ２の含有率が０．０００１質量％以下である、（１）または（２）の血液凝固阻害剤。ここでは、ナットウキナーゼとは納豆菌培養エキスからのナットウキナーゼ精製物をいい、該精製物の乾燥粉末中にビタミンＫ２を０．０００１質量％以下含むという意味である。
（４）ナットウキナーゼを経口投与する、（１）〜（３）のいずれかの血液凝固阻害剤。
（５）ナットウキナーゼを有効成分として含有する血液凝固阻害用組成物。
（６）ナットウキナーゼが、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ）を培養して得られ、ビタミンＫ２を除去する工程を含むことによりビタミンＫ２含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下である、血液凝固阻害用組成物。
（７）前記血液凝固阻害用組成物が食品用組成物である、（５）または（６）に記載の血液凝固阻害用組成物。
（８）油状物質を７５〜８０℃で攪拌・溶解する工程と、該攪拌・溶解した油状物質を５０℃以下に冷却する工程と、冷却した油状物質にナットウキナーゼおよび乳化剤をナットウキナーゼが失活しない速度で攪拌・混合する工程と、該攪拌・混合物をカプセルに充填する工程を含む、ナットウキナーゼ含有カプセルの製造方法。
（９）前記油状物質が、大豆油、グリセリン脂肪酸エステルおよびミツロウからなる群から選ばれる１または複数の油状物質である（８）の製造方法。
（１０）前記乳化剤がレシチンである、（８）または（９）に記載の製造方法。
（１１）前記ナットウキナーゼが、乾燥重量あたりビタミンＫ２を０．０００１質量％以下含むものである、（８）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）  ナットウキナーゼ活性が２年間以上安定である、（８）〜（１１）のいずれかに記載の製造方法。
（１３）油状物質の温度を５０℃以下で油状物質の融点より高い温度に下げた後に、ナットウキナーゼおよび乳化剤を混合し、カプセルに封入する工程を含む、カプセル内のナットウキナーゼの安定化方法。
（１４）全質量を基準として、大豆油を４０〜８０質量％、グリセリン脂肪酸エステルを１〜２０質量％、ミツロウを１〜２０質量％、ナットウキナーゼを１〜３０質量％（比活性でもよい）、ビタミンＫ２を含まないかまたは０より多く０．０００１質量％以下、レシチンを１〜２０質量％含有する組成物。
（１５）前記組成物がカプセル製造用である、（１４）の組成物。この場合、カプセル製造用とはカプセル充填用という意味を含む。
（１６）血栓溶解活性および血液凝固阻害活性を有する（１４）または（１５）の組成物。
（１７）ナットウキナーゼを有効成分とする抗炎症剤。
（１８）ナットウキナーゼを有効成分とする血流増加剤。
（１９）ナットウキナーゼを有効成分とする抗炎症用組成物。
（２０）ナットウキナーゼを有効成分とする血流増加用組成物。
（２１）前記抗炎症用組成物または血流増加用組成物が食品用組成物である（１９）または（２０）の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ナットウキナーゼにより血液凝固を阻害できるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、血液凝固系と本願発明のナットウキナーゼの効果を示す図である。
【図２】図２は、ナットウキナーゼ投与実験の方法を示す図である。
【図３】図３は、ナットウキナーゼ投与実験の線溶系／凝固系のパラメータの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明者らは、健常なヒトにナットウキナーゼを摂取させることにより、フィブリノゲン／フィブリンの分解産物であるＦＤＰ（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ／ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，フィブリノーゲン／フィブリン分解産物）およびＤ−ダイマー（Ｄ−ｄｉｍｅｒ、フィブリン分解産物の１種）が時間とともに上昇すること、ならびに、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）が延長し、アンチトロンビン（ＡＴ）が有意に増加し、血液凝固第ＶＩＩＩ因子が有意に減少することを見出した（図１および図３）。
【００１４】
これらの結果のうち、フィブリノーゲン／フィブリンが分解され、ＦＤＰおよびＤ−ダイマーが増加することは血栓溶解作用と考えられる。一方、ａＰＴＴが延長し、アンチトロンビンが増加し、血液凝固第ＶＩＩＩ因子が有意に減少することは血液凝固阻害作用と考えられた。このことは、ナットウキナーゼが血液凝固を阻害ないし抑制する効果を有することを意味している。
【００１５】
ナットウキナーゼについては、従来から血栓溶解作用は知られていたが、血液凝固を阻害する作用については知られていなかった。従って、本発明はナットウキナーゼの新規な用途を提供するものである。すなわち、本発明は、ナットウキナーゼを有効成分とする、ａＰＴＴ延長剤、アンチトロンビン活性上昇剤、および／または血液凝固第ＶＩＩＩ因子減少剤を提供する。本明細書において、「組成物」には、試薬組成物、医薬組成物、化粧品組成物、および食品用組成物も含む。
【００１６】
また、本発明によれば、ナットウキナーゼを投与することにより、多数の線溶系および抗凝固経路を同時に直接または間接的に活性化することができるという効果が確認された（図１、表２）。この複合的な効果により、高い線溶および抗凝固効果を発揮するものと考えられる。すなわち、本発明は、ナットウキナーゼを有効成分とする、ＦＤＰおよび／またはＤ−ダイマー増加剤、ａＰＴＴ延長剤、アンチトロンビン活性上昇剤、ならびに／または血液凝固第ＶＩＩＩ因子減少剤をも提供する。
【００１７】
本発明により、ナットウキナーゼ摂取により、内因系血液凝固時間を延長し、アンチトロンビンが増加し、血液凝固第ＶＩＩＩ因子が有意に減少することが明らかになった。このことは、ナットウキナーゼが内因系血液凝固抑制剤（阻害剤）として有効であることを意味する。従って、ナットウキナーゼは、心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞等の治療薬や予防薬として有効であると思われる。さらに、血液凝固を阻害することから、血流を増加させる効果も有するため、スポーツマンのサプリメントや飲料としても有効と考えられる。
【００１８】
既存の血液凝固阻害薬としてはへパリンやワルファリンなどがあるが、これらには、出血の副作用があるが、ナットウキナーゼの場合は通常の５倍程度過剰投与しても十二指腸において出血が起こらない（特許第４３０９１０８号公報）ことから、ナットウキナーゼを血液凝固阻害剤として使用できれば副作用のない血液凝固阻害剤となり得る。また、ワルファリンは効果や副作用に個人差があり、長期連用により効果が変化する場合もあり、代用薬が求められていたことからもワルファリンの効果が低い患者に対する新規な血液凝固阻害剤としても有用と考えられる。
【００１９】
ナットウキナーゼは、そのまま用いることも可能ではあるが、血液凝固を促進するビタミンＫ２を除去したナットウキナーゼを用いることがより好ましい。ナットウキナーゼはナットウキナーゼを生産する納豆菌の培養エキスから精製することができる。本発明に使用するナットウキナーゼとしては、例えば、特許文献１または２に記載されているものが好ましく用いられる。これらの文献には納豆菌培養物をキトサンなどで処理することによりナットウキナーゼと１μｇ／ｇ以下の濃度のビタミンＫ２を含有する納豆菌培養エキスが開示されている。本発明に使用するナットウキナーゼについても、全質量基準で、ナットウキナーゼ中のビタミンＫ２含有率は乾燥重量で０．０００１質量％以下が好ましく、より好ましくは、０．００００１質量％以下、さらに好ましくは、０．０００００１質量％以下である。
【００２０】
ビタミンＫ２を除去した精製ナットウキナーゼの比活性としては、乾燥重量あたり、１４０００ＦＵ／ｇ以上が好ましく、より好ましくは１５０００ＦＵ／ｇ以上、さらに好ましくは１８０００ＦＵ／ｇ以上、特に好ましくは２００００ＦＵ／ｇ以上である。好ましい上限としては、２５０００ＦＵ／ｇ以下、３００００ＦＵ／ｇ以下、４００００ＦＵ／ｇ以下、５００００ＦＵ／ｇ以下、１０００００ＦＵ／ｇ以下、５０００００ＦＵ／ｇ以下、１００００００ＦＵ／ｇ以下などが挙げられるがこれらに限られない。なお、ＦＵはフィブリン分解ユニットを意味する。
【００２１】
本発明に用いられるナットウキナーゼとしては、納豆菌を培養して得られる培養液中に含まれるナットウキナーゼであって、血液凝固阻害作用のあるものであれば菌株、アミノ酸変異の有無によらず使用できる。好ましくは、ナットウキナーゼとして株式会社日本生物科学研究所製の納豆菌培養エキスを用いることである。納豆菌培養エキスは、血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子の合成促進活性を有するビタミンＫ２をキトサン、塩化カルシウム、またはポリ塩化アルミニウムにより除去する工程を含む製造方法により製造されており、ビタミンＫ２の含有量は乾燥エキス１ｇあたり、１μｇ以下である。ビタミンＫ２を除くことにより、ビタミンＫ２の血液凝固促進作用を有さないナットウキナーゼが調製されることから、より効率良く血液凝固を阻害できる。
【００２２】
発明者らは、新規なナットウキナーゼを含む組成物の製造方法を開発することにより、安定性に優れたナットウキナーゼ含有組成物を開発した。すなわち、本発明によれば、新規なナットウキナーゼを含む組成物およびその製造方法が提供される。本発明の組成物は、医薬、化粧品、食品用などに好ましく用いられる。
【００２３】
納豆菌培養液には血液凝固を促進するビタミンＫ２が含まれており、これがワルファリンなどの血液凝固阻害剤の効果を減少させるという問題があった。そこで、従来はキトサンにビタミンＫ２を吸着させて除去する方法（特許文献１）や、凝集剤である塩化カルシウムおよびポリ塩化アルミニウムで処理することにより除去する方法（特許文献２）などが使用されてきた。かかるビタミンＫ２を除去したナットウキナーゼの酵素活性の減少をも最小限に抑えるカプセル用組成物を開発した。
【００２４】
本発明の組成物中のナットウキナーゼは２年以上にわたって常温で活性を安定に保持し得る。保存条件としては、４℃〜３０℃、湿度３０％〜６０％であり、より好ましくは１５℃〜３０℃、湿度４０％〜６０％である。本明細書において、「ナットウキナーゼ活性が２年間以上安定」とは、初期の活性を１００％とすると、２年後においても、７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、とりわけ好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の活性を保持していることをいう。
【００２５】
本発明の組成物の製造方法によれば、ナットウキナーゼが２年以上にわたって活性を安定に保持できるが、その理由の一部は、油状物質を７５〜８０℃に加熱して攪拌・熔解させたのち、ナットウキナーゼが変性しない温度、例えば５０℃以下に油状物質の温度を下げてからナットウキナーゼを添加し、ナットウキナーゼが失活しない速度で攪拌するためである。ナットウキナーゼが失活しない速度とは、攪拌によりナットウキナーゼの変性が起こらない速度であり、緩やかな攪拌をいい、例えば、５〜２０ｒｐｍなどが挙げられるが、ナットウキナーゼが活性を低下させない限りこれに限られない。
【００２６】
本発明のナットウキナーゼは、ソフトカプセルの形態が好ましい。本発明においては、ナットウキナーゼを油状物質中に分散させることで、長期間、例えば、１年間以上、より好ましくは１年６ヶ月以上、さらに好ましくは２年以上、特に好ましくは２年６ヶ月以上、ナットウキナーゼ活性を保ったまま１５℃〜３０℃、湿度４０％〜６０％で保存可能であるという特徴を有する。
【００２７】
本発明のナットウキナーゼを分散させる油状物質としては、例えば、大豆油、グリセリン脂肪酸エステルおよびミツロウの群から選ばれる１または２以上の組合せなどが挙げられるがこれらに限られない。本発明においては、油状物質をその融点以上、例えば、７５℃〜８０℃に加温して攪拌することで油状物質を溶解させ、次に５０℃以下まで冷却させてからナットウキナーゼと乳化剤を混合するところに特徴がある。冷却は５０℃以下で、油状物質が固化しない温度であればよく、より好ましくは４０℃以下である。油状物質の冷却後の温度の下限は用いる油状物質の融点に依存し、油状物質の融点が下限温度になり得る。より好ましい下限温度は、油状物質の融点よりも１℃高い温度であり、より好ましくは油状物質の融点よりも２℃以上、さらに好ましくは３℃以上、特に好ましくは４℃以上高い温度である。
【００２８】
また、５０℃以下の油状物質にナットウキナーゼを混合する際には、ナットウキナーゼが変性などにより失活しないように、緩やかに攪拌する。
【００２９】
本発明の組成物の好ましい組成は、全質量を基準として、大豆油を４０〜８０質量％、グリセリン脂肪酸エステルを１〜２０質量％、ミツロウを１〜２０質量％、ナットウキナーゼを１〜３０質量％、ビタミンＫ２を含まないかまたは０より多く０．０００１質量％以下、レシチンを１〜２０質量％である。より好ましくは、大豆油を４５〜７５質量％、グリセリン脂肪酸エステルを５〜１５質量％、ミツロウを５〜１５質量％、ナットウキナーゼを１〜２５質量％、ビタミンＫ２を０〜０．０００１質量％、レシチンを１〜１５質量％であり、さらに好ましくは、大豆油を５０〜７０質量％、グリセリン脂肪酸エステルを５〜１３質量％、ミツロウを５〜１３質量％、ナットウキナーゼを１０〜２５質量％、ビタミンＫ２を０〜０．０００１質量％、レシチンを５〜１３質量％である。なお、ここで「ビタミンＫ２を０〜０．０００１質量％」とは、ビタミンＫ２を全く含まないか、または、０質量％よりも多く、かつ、０．０００１質量％以下という意味である。すなわち、ビタミンＫ２は本発明の組成物の必須構成要件ではなく、含まれていなくても本発明の効果を奏し得る。むしろ全く含まれていない方が好ましく、０．０００００１質量％以下であってもよく、これは検出限界以下とも表現し得る。
【００３０】
攪拌後、ナットウキナーゼを含む組成物をカプセルに充填する。カプセルについては、当業者に周知のカプセルの製造方法を用いることができる。ナットウキナーゼがタンパク質であるので、胃では溶けにくく、腸溶性のカプセルであることが好ましい。
【００３１】
本発明におけるナットウキナーゼの投与量は、好ましくは成人（体重６０ｋｇ〜６５ｋｇ）１日あたり１０００〜４０００ＦＵ（フィブリン分解ユニット）、より好ましくは２０００〜４０００ＦＵである。これらは、１日に何回かに分けて投与してもよい。特に好ましくは１回２０００ＦＵであるが、症状の程度、患者の年齢、体重及び処置期間等によって投与量を微調整することが好ましい。
【００３２】
本発明により、ナットウキナーゼに新たな用途が追加された。従来、線溶系酵素として、血栓溶解剤として有用であったナットウキナーゼに血液凝固を阻害できる作用があることが本発明により明らかになった。
【００３３】
従来の血液凝固阻害剤の場合、血栓の予防効果はあるが、全身出血が起こるという問題のある薬剤があった。本発明の凝固阻害剤によれば、出血のない（少ない）凝固阻害剤が提供できる可能性がある。
【００３４】
本発明の血液凝固阻害剤の形態としては、前記培養物を単体で、又は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等として患者に経口投与するのが一般的である。これら血液凝固阻害剤の形態は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択されるが、食品中に配合したものであっても良い。
【００３５】
本発明における血液凝固阻害剤を錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等の固形製剤とする場合には、前記培養物を、常法に従って適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成若しくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤又は希釈剤等と適宜混合して製造することができる。
【００３６】
また、錠剤等は、必要に応じて適当な被覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイルムコーティング等を施しても良い。
【００３７】
食品組成物としては、前記ナットウキナーゼ組成物をそのまま混合したり、水に溶かしたりして、通常食することのできる食品や飲料中に含有させたものであっても良く、サプリメントの形態であっても良い。あるいは、ソフトカプセルの形態であってもよい。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：ナットウキナーゼの調製）
ナットウキナーゼの製造は、特許文献１または２に従って行った。納豆菌を培養後、培養エキスにキトサン、塩化カルシウム、またはポリ塩化アルミニウムを添加してビタミンＫ２を除去することにより製造した。
【００３９】
（実施例２：カプセル製造）
ソフトカプセルは、例えば、表１に記載のように、１カプセルあたり、大豆油を１２９．３３ｍｇ、ミツロウを１７ｍｇ、グリセリン脂肪酸エステルを１７ｍｇを７５℃〜８０℃で混合した後、５０℃〜６０℃に冷却し、納豆菌培養エキス粉末（例えば、ＮＳＫ−ＳＤＰ、２００００ＦＵ／ｇ）を３６．６７ｍｇおよび大豆レシチンを１０ｍｇ添加し、ナットウキナーゼの活性が低下しない、または、失活しない速度で攪拌し、混合することで計２１０ｍｇの乳化液が得られる。この乳化液を内容液とし、ゼラチン９６．３ｍｇ、グリセリン３３．７ｍｇの計１３０ｍｇで構成された皮膜に充てんし、総重量３４０ｍｇのソフトカプセルを作成した。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、２０００〜４０００ＦＵ、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
（実施例３：投与試験）
投与試験は、立命館大学ＢＫＣ生命倫理審査委員会により研究内容に対する十分な審査が行われ、承認されたのち、ヘルシンキ宣言および文部科学省・厚生労働省「臨床研究に関する倫理指針」に則り、実施された。承認後、１２名の被験者には、本研究の趣旨、意義、方法について詳細な説明を行い、十分な納得が得られたため、研究協力に関する同意を文書で提出してもらった。全ての被験者は、日本人若年健常男性（年齢：２２．３±０．６歳、身長：１６９．３±１．０ｃｍ、体重：６１．９±１．５ｋｇ、ＢＭＩ：２１．６±０．５、体脂肪％：１２．７±０．９％）であり、薬の服用および静脈系／動脈系疾患の症状などがなく、血液疾患の既往症がない者とした。全ての被験者は、サプリメントとしてのナットウキナーゼを摂取したことがなく、かつまた本試験開始前２ヶ月から試験開始までの間、食品の納豆を摂取していない者とした。本実験で実施したサンプル採取および各種測定は、すべて同一のテクニックを用いて同一研究者が実施した。
【００４２】
（材料と方法）
二重盲検法による、クロスオーバー無作為化プラセボ比較試験でのナットウキナーゼ介入研究が、１２名の健常な被験者を対象に実施された。サプリメント摂取前のベースラインとなる血液試料は、潜在的な日内変動の影響を最小限にするために午前８時３０分〜午前９時３０分の間に収集した。血液のベースラインサンプルが得られた後、各々の患者は、ソフトゲルカプセル剤形の１回量２０００ＦＵのナットウキナーゼ（ＮＳＫ−ＳＤ、株式会社日本生物科学研究所、大阪、日本）または、プラセボ（Ｐ）を含むソフトゲルカプセルを受け取るためにランダム化された。被験者は、投与２、４、６および８時間後に、凝固／線溶パラメータを分析するための採血を行った。２週間以上のウォッシュアウト期間の後、異なるグループ割り当てで２回目の試験が開始された。試験中の水分摂取およびカロリー摂取の時間と量は、両グループで同一とした（図１）。すべての被験者において、副作用は認められなかった。
【００４３】
（血液採取と分析）
採血は肘正中皮静脈より行った。血液2mLを血液濃縮補正のための血球計算用採血管（EDTA-2K、ベノジェクト；テルモ株式会社、東京、日本）に分注し、残りをシリコン処理ガラス製試験管内に取り分け、3.8％クエン酸ナトリウム1容に対し静脈血9容の割合にし、静かに転倒混和した（ベノジェクト）。冷却遠心機（4〜8℃）3,000rpmにて20分間遠心し、乏血小板血漿を分離したのち測定まで-80℃冷凍庫で保管し、血液凝固・線溶系の各指標の測定を行った。また、同様の手順にてフッ化ナトリウム血漿（ベノジェクト）を分離し、血液中グルコース濃度測定に用いた。さらに、総タンパク質濃度測定のため、抗凝固剤を含まないプレーン採血管にて血液処理を行い、血清サンプルを採取した。抗凝固剤EDTA-2Kを含む全血液を用いて、血小板数／赤血球数／白血球数を測定した。前述の手順により得られたクエン酸血漿を用いて、フィブリン／フィブリノゲン分解物（ＦＤＰ、ラテックス凝集法、ＬＰＩＡ）、Ｄ−ダイマー（ＬＰＩＡ）、総プラスミノーゲンアクティベータインヒビタ−１（総ＰＡＩ−１、ラテックス凝集―比濁免疫測定法）、プラスミノーゲン活性（合成基質法）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ、透過法）、プロトロンビン時間（ＰＴ、クイック法）、フィブリノゲン（トロンビン法）、血液凝固因子ＶＩＩＩ活性（Ｆ  ＶＩＩＩ活性、ａＰＴＴ法）、血液凝固因子ＶＩＩ活性（Ｆ  ＶＩＩ活性、ＰＴ法）、抗トロンビン（ＡＴ、ＬＰＩＡ）、およびプラスミン−α２プラスミンインヒビタ複合体（ＰＩＣ、ＬＰＩＡ）を測定した。全血球計数（フローサイトメータ）、血小板数（ＰＬＴ）および赤血球計数（ＲＢＣ、電気抵抗測定）、血糖（酵素法、フッ化ナトリウム血漿）および血清総タンパク質濃度（ビウレット法、血清）も測定した。自動分析システム（株式会社ＬＳＩメディエンス、東京、日本）による全ての測定は、測定試薬のロット間誤差をなくすため、一度に行った。
【００４４】
（データ分析）
測定値は、すべて平均値±標準誤差として表記した。繰り返しのある二元配置分散分析を用い、ナットウキナーゼ摂取群およびプラセボ群の群間比較を行い、有意差が認められた場合、ボンフェローニ法による多重比較検定を実施した。統計学的分析にはSPSS  バージョン20（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用い、統計学的有意水準は5％未満とした。
【００４５】
（結果）
各々の血液パラメータは、投与後８時間まで測定された。結果を表２および図３に示す。表２中、Ｐはプラセーボ、ＮＫはナットウキナーゼを示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
Ｄ−ダイマー（架橋化フィブリンの分解産物）およびフィブリノゲン／フィブリン分解産物（ＦＤＰ）はナットウキナーゼ投与後に上昇した。（それぞれ、ベースラインと比較して、Ｄ−ダイマーでは６時間後に＋４４．５±１２．９％、８時間には＋３８．２±１９．２％、ＦＤＰでは４時間後に＋２１．２±６．３％となり、プラセボと比較してそれぞれｐ＜０．０５）（図３Ａ、Ｂ）。ａＰＴＴは、ナットウキナーゼサプリを与えた後、２時間、４時間において有意に延長した（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１、図３Ｄ）。血液凝固第ＶＩＩＩ因子活性は、ナットウキナーゼ摂取後４時間および６時間で低下した（それぞれ、ベースラインと比較して平均−７．４±１．９％および−７．６±１．６％であり、プラセボに対してｐ＜０．０５、図３Ｅ）。アンチトロンビン濃度は、ナットウキナーゼ摂取後、顕著に増加した（２時間、４時間について、ｐ＜０．０５、図３Ｆ）。しかしながら、ナットウキナーゼ投与後に有意な変化を示したこれらの指標の値は、すべて正常範囲内にあった（つまり、今回のナットウキナーゼ摂取により、変化は示したものの、異常値を示すものではなかった）。また、今回測定を行ったその他の指標については、サプリメント投与前後のいかなる時点においても、ナットウキナーゼ摂取群とプラセボ群の間に、差は認められなかった（図３Ｃ、表２）。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、医薬、食品産業などにおいて利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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