(57)【要約】【課題】一般的なマルチプレックスＰＣＲによる増幅産物は、周囲への汚染、又は、次のサンプルに混入して、誤判定を引き起こす原因となっていた。本発明では、ＰＣＲによる増幅産物の周囲への汚染、又は、次のサンプルへの混入を起こさずに、検出感度を向上させる技術を提供する。【解決手段】サンプルを２０回以下のＰＣＲによって予め増幅する第一ＰＣＲ工程と、第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物に対してさらにＰＣＲを行う第二ＰＣＲ工程と、第二ＰＣＲ工程の後に密閉型反応場で遺伝子検出を行う遺伝子検出工程と、を有し、第一ＰＣＲ工程及び第二ＰＣＲ工程の少なくとも一方を密閉型反応場で行う遺伝子検出方法によって、サンプル中に含まれる微量の変異遺伝子の検出を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に含まれる微量の変異遺伝子の検出を密閉型反応場で行う方法であって、
前記サンプルを２０回以下のＰＣＲによって予め増幅する第一ＰＣＲ工程と、
前記第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物に対してさらにＰＣＲを行う第二ＰＣＲ工程と、
前記第二ＰＣＲ工程の後に前記密閉型反応場で遺伝子検出を行う遺伝子検出工程と、
を有し、
前記第一ＰＣＲ工程及び前記第二ＰＣＲ工程の少なくとも一方を前記密閉型反応場で行う遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記第一ＰＣＲ工程を前記密閉型反応場外で行い、前記第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物を前記密閉型反応場に分注後に、前記第二ＰＣＲ工程のＰＣＲを行い、前記第二ＰＣＲ工程の後に前記密閉型反応場で遺伝子検出を行う請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記第一ＰＣＲ工程、前記第二ＰＣＲ工程及び前記遺伝子検出工程を前記密閉型反応場で行う請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記遺伝子検出工程での反応にインベーダー反応を用いる請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記第二ＰＣＲ工程でのＰＣＲに人工核酸を用いて特定の配列の増幅を調整する請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記変異遺伝子の量が１００コピー／μＬ以下である請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年より、低侵襲ながん診断やがん治療モニターのために、血清等のサンプルが用いられることが増えてきている。これらのサンプルの採取は患者にとって負担が少ないが、単位量当たりに含まれている核酸が少ないため、正確な診断のためには核酸増幅が必要である。また、犯罪現場などで回収されるサンプル中の核酸は微量であり、しかも破損している場合が多いため、このような法医学検査目的においても、核酸増幅は必要である。
これまでにもサンプル中の核酸量が少ない場合には、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（multiplex polymerase chain reaction（マルチプレックスＰＣＲ））によってターゲットの複数領域を一度に増幅する手段が取られていた。一般的にマルチプレックスＰＣＲにおいては、ターゲットの複数領域を一度に増幅するために、領域数に応じた上流プライマー及び下流プライマーが必要である。この選択を行う際に、ＰＣＲの熱サイクルを決定する変性（denature）、アニーリング（annealing）、伸長反応（elongation）の各温度及び時間は、すべての増幅領域において共通なので、プライマー類の溶解温度（Ｔｍ）をそろえる必要がある。
【０００３】
しかしながら、増幅領域によっては溶解温度を上昇させる要因となるシスチン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の含有量が多かったり、増幅外領域との相同性が高かったりして、プライマーの選択幅が限られることがあり、すべての増幅領域において溶解温度をそろえることが困難な場合があった。
また、全てのプライマーの溶解温度を近傍にそろえることができても、増幅効率に差が生じることがあり、すべての領域を同じ増幅効率で増幅することは困難であった。この結果として、検出段階において増幅率の不均一性に起因する偽陽性又は偽陰性の判定結果を得ることが起こるため、マルチプレックスＰＣＲの増幅領域が増えるほどプライマーの設計が困難となる。
【０００４】
さらに、マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物から特定変異の検出を行うには、個々の検出プローブを含む試薬に、増幅産物を分注する必要がある。その際には、増幅産物からのエアロゾルや、ピペットチップ交換時の残液の飛沫などによる増幅産物の周囲への汚染が問題となっていた。一方で、密閉空間内でマルチプレックスＰＣＲ及び検出を連続して行う機構も考え出されているが、機構が複雑であったりして実現が難しい。
特許文献１には、マルチプレックスＰＣＲでの増幅と蛍光検出を行う方法が開示されているが、マルチプレックスＰＣＲを行う核酸の分注を自動で行うことは開示されていない。
また、特許文献２には、核酸の抽出から増幅、蛍光検出までを自動で行う装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５１７６３２号公報
【特許文献２】特許第５００３８４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
マルチプレックスＰＣＲでは、核酸の中の複数の核酸配列部位について同時に増幅を行なうため、低濃度且つ低変異率の変異型遺伝子の検出が困難であった。なぜなら、低変異率の変異型部分をマルチプレックスＰＣＲで増幅しても、低変異率以外の核酸配列部位も同様に増幅される。このため、元のサンプルに含まれていた低変異率の変異型部分も、そうでない部分も同じように増幅されるため、低変異率の変異型部分を効率的に検出することは困難であった。
また、１コピーのゲノムには３０億塩基対（ｂｐ）が２ｎ含まれているので、１細胞あたり６０億塩基対（６×１０９ｂｐ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれている。この１細胞からのゲノムの１５０ｂｐをＰＣＲした場合は、３０サイクル後には３×１０１１ｂｐとなり、元のゲノム量の５０倍量のＤＮＡが含まれる。このため、一般的なマルチプレックスＰＣＲの増幅産物は、周囲への汚染、又は、次のサンプルへの混入により誤判定を引き起こす原因となっていた。
本発明は、ＰＣＲによる増幅産物の周囲への汚染、又は、次のサンプルへの混入を起こさずに、検出感度を向上させ、低濃度且つ低変異率の変異型遺伝子を高感度に検出できる技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様に係る遺伝子検出方法は、サンプル中に含まれる微量の変異遺伝子の検出を密閉型反応場で行う方法であって、サンプルを２０回以下のＰＣＲによって予め増幅する第一ＰＣＲ工程と、第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物に対してさらにＰＣＲを行う第二ＰＣＲ工程と、第二ＰＣＲ工程の後に密閉型反応場で遺伝子検出を行う遺伝子検出工程と、を有し、第一ＰＣＲ工程及び第二ＰＣＲ工程の少なくとも一方を密閉型反応場で行う。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＰＣＲによる増幅産物の周囲への汚染、又は、次のサンプルへの混入による誤判定が起こりにくく、低濃度且つ低変異率の変異型遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施例での測定結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例での測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に説明する本実施形態は、ＰＣＲ（例えばマルチプレックスＰＣＲ）による増幅産物（amplicon）の周囲への汚染、又は、次のサンプルへの混入の恐れなく、微量なサンプルから感度良く遺伝子検査を可能とさせる装置、方法、試薬、組成物に関する。
本実施形態の遺伝子検出方法は、サンプル中に含まれる微量の変異遺伝子の検出を密閉型反応場で行う方法であって、サンプルを限定された回数（例えば２０回以下、より好ましくは１０回以下）のＰＣＲによって予め増幅する第一ＰＣＲ工程と、第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物に対してさらにＰＣＲを行う第二ＰＣＲ工程と、第二ＰＣＲ工程の後に密閉型反応場で遺伝子検出を行う遺伝子検出工程と、を有し、第一ＰＣＲ工程及び第二ＰＣＲ工程の少なくとも一方を密閉型反応場で行う。
【００１１】
ただし、第一ＰＣＲ工程を密閉型反応場外で行い、第一ＰＣＲ工程で得た増幅産物を密閉型反応場に分注後に、第二ＰＣＲ工程のＰＣＲを行い、第二ＰＣＲ工程の後に密閉型反応場で遺伝子検出を行ってもよい。また、第一ＰＣＲ工程、第二ＰＣＲ工程及び遺伝子検出工程を密閉型反応場で行ってもよい。遺伝子増幅を密閉型反応場で行えば、増幅産物が外部に拡散することがない。
さらに、第一ＰＣＲ工程は、第二ＰＣＲ工程内に含まれていてもよい。さらに、第一ＰＣＲ工程又は第二ＰＣＲ工程でのＰＣＲにペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡ又はＢＮＡ（2',4'-Bridged Nucleic Acid）等の人工核酸を用いて、特定の配列の増幅を調整（抑制）することで、特定配列以外の遺伝子のサンプル中の割合を増大させてもよい。
【００１２】
また、遺伝子検出工程での反応にインベーダー反応を用いてもよい。さらに、変異遺伝子の量は１００コピー／μＬ以下であってもよい。
本実施形態の遺伝子検出方法について、以下にさらに詳細に説明する。
近年、がん患者からの検体に含まれる微量の変異遺伝子の検出が、抗がん剤の選択に重要な意義を持つようになってきている。この場合、「微量」とは割合を指し、正常な遺伝子の中に含まれる１％以下の変異遺伝子を指す。仮に０．１％の割合で存在する変異遺伝子を考えた場合、１コピーの変異遺伝子を得るには、野生型を含めた遺伝子は１０００コピー必要である。これをゲノムで考えた場合、１コピーの特定遺伝子変異型を得る場合には、ゲノム１セット約３ｐｇで有るので、トータルで３ｎｇのゲノムが必要である。
【００１３】
ＫＲＡＳ遺伝子内のコドン１２，１３における変異のように、複数種類の変異が考えられる場合は、変異の遺伝子型を同定するためには変異種の数だけの検出用ウェル（又はチューブ）が必要となる。ＫＲＡＳ遺伝子内のコドン１２，１３を考えた場合には、一般的に７種の変異が考えられるので、７個のウェル（チューブ）が遺伝子型の同定に必要となる。野生型の検出も行う場合は、合計８個のウェル（チューブ）が必要となる。
数の少ない変異遺伝子がウェル内に含まれる確率は、ポアソン分布に従う。ポアソン分布は、以下の計算式により算出できる。
【００１４】
【数１】
2017051111.tif 000002
【００１５】
ここで、λは、ある溶液中に存在する分子の平均値（平均個数）、ｋは、分子が正確にｋ個含まれる確率であり、ｅは、自然対数の底である。例えば、７２ｐｇのゲノム中には２４個（コピー）の変異遺伝子が含まれるため、このゲノム液を２４個のウェルに分配すると、各ウェルには平均で１個（コピー）の遺伝子が含まれることになるが、ポアソン分布によれば、ウェルの中に遺伝子を１コピーも含まない確率は、上記（式１）から（式２）のように計算でき、３７％となる。すなわち、２４個のウェルのうち約９個のウェルには、変異遺伝子が含まれない可能性がある。
【００１６】
【数２】
2017051111.tif 000003
【００１７】
このため、もっと濃度を上げていけば、１個もゲノムが含まれない空のウェルの発生確率は小さくなるが、３倍濃度で４．９８％、５倍濃度で０．６７％、７倍濃度で０．０９％となるので、７倍濃度のゲノムを用意したとしても、１０００回に１回は空のウェルが発生し、本来であれば変異陽性であったものを陰性と誤判定してしまう可能性がある。１０倍濃度の場合は、この確率が１万回に１回に減らせるので、予め変異遺伝子を１０倍に増やせれば、空のウェルの発生確率は減少するし、要求される検出感度も低くて済む。
ＰＣＲでは、理論上は、サイクル数と増幅率の関係は下記の（式３）で表される。
【００１８】
【数３】
2017051111.tif 000004
【００１９】
１回のＰＣＲで、すべてのターゲットが複製されるわけではないので、実際は式（３）で２より小さい値のｎ乗となるが、１０倍に増やすには４回、１００倍に増やしても８回ＰＣＲを行えば十分であることが分かる（表１を参照）。
【００２０】
【表１】
2017051111.tif 000005
【００２１】
この時に増加するＤＮＡ量としては、仮にＰＣＲ領域が１５０ｂｐであった場合には、１００倍に増えたとしても１５０００ｂｐに過ぎず、１細胞から取れる全ゲノムの６×１０９ｂｐに比較すると微々たるものであるので、ＰＣＲの増幅産物によるコンタミネーションを危惧するには当たらない。一方で、検出感度は１００分の１で済み（従来０．１％を検出しなくてはならなかったものが、１０％の検出感度で済む）、空のウェルの発生による誤判定の危険性も少なくて済む。さらに、この増幅濃度であれば、遺伝子解析装置内にＰＣＲの増幅産物をピペッティングすることが可能となるため、遺伝子解析装置の全自動化も容易である。
【００２２】
例えば、元サンプルの変異型の野生型に対する存在比は０．１％であり、ＤＮＡ濃度は１０コピー／μＬであるため、特許文献２の全自動遺伝子解析システムの遺伝子解析チップの場合は、チップの反応ウェル容量である１２．５μＬ中には平均で０．１２５個の変異型遺伝子が含まれるはずであるが、実際の配分はポアソン分布に従う。ウェル内に平均０．１２５個の濃度を持つ液体が、１個も含まれない確率は、０．８８２５であるため、遺伝子型判定に必要な８個のウェルのうち７．０６個は空のウェル、すなわち、変異型遺伝子を含まない可能性がある。一方で、１０サイクルのＰＣＲをかけた場合には、９０％の増幅効率を持っていたとしても、６４０倍程度には増えるため、１ウェル中に平均で８０個（＝０．１２５×６４０）の変異型遺伝子が含まれることとなり、空のウェルの発生する確率はほぼ０である。
【００２３】
検体（試料、サンプル）に含まれる微量の変異遺伝子の検出を行うために予め増幅（以下「プレ増幅」と記すこともある）を行うが、プレ増幅は、検出用のチップ、チューブなどの反応容器とは別の反応容器で行うこともできる。このとき、プレ増幅を行った試料溶液を、検出用の反応容器に分注する工程が必要になる。また、プレ増幅を、検出用の反応容器で行い、引き続き検出反応を行うこともできる。
本実施形態における「密閉型反応場」とは、少なくとも反応場（例えばウェル）が、コンタミネーションの可能性の高い空気中などに開放されていないことを指す。すなわち、ウェルの上面（上方空間）がフィルムや蓋材などで区切られており、コンタミネーションの原因となる外部空間と直接触れない構造が好ましい。例えば特許文献２のチップ構造は、試料の通過する流路、反応場であるウェルが外部と遮断されており、密閉型反応場の一例と言える。
本実施形態においては、検出を蛍光で行っているが、使用する検出試薬を選定することで、発光、濁度、吸光度の測定や、ｐＨ、電気伝導度などの電気的な測定でも検出することが可能である。
【実施例】
【００２４】
実施例を下記に示す。下記の実施例は本発明の一形態であり、本発明は下記の記載に限定されない。
〔実施例１〕
（低コピー数且つ低変異率の鋳型のプレ増幅について）
低コピー数且つ低変異率の鋳型として、合成した人工遺伝子プラスミドＤＮＡを用い、０．１％Ｇ１２Ａ変異型（０．１％Ｇ１２Ａ、９９．９％Ｗｔ）のサンプルを調製した。このサンプルの終濃度が１０コピー／μＬになるように、且つ、プライマー、ｄＮＴＰｍｉｘ、Ｈａｗｋ  Ｔａｑ、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を表１に記載の終濃度になるように混合した反応溶液を６００μＬ用意した。この段階で、反応溶液６００μＬには、Ｇ１２Ａ変異型が６コピー、野生型が５９９４コピー存在している。
【００２５】
この反応溶液を３００μＬずつに２分し、反応溶液Ｉと反応溶液IIとした。この段階で、各反応溶液３００μＬには、Ｇ１２Ａ変異型が３コピー、野生型が２９９７コピー存在している。
反応溶液Ｉのみ、鋳型のプレ増幅として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を１０サイクル分実施した。ポリメラーゼ連鎖反応は、市販のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。反応条件は、９５℃２分の後に、９５℃１５秒及び６６℃２０秒を１０サイクル行い、さらにその後に９９℃１０分を行うこととした。
反応溶液IIは、プレ増幅は行わず、上記と同様の方法で、９５℃２分、９９℃１０分の加熱のみ実施した。
【００２６】
（遺伝子解析チップの作製について）
ポリプロピレン樹脂を成型加工して、特許文献２に示される２３個のウェル（容量：１２．５μＬ）が存在するチップを用意した。そして、このチップのウェルに、ＰＣＲとインベーダー反応を行うのに必要な試薬（表２を参照）を、６０℃、７００ｇ、１５分間の条件で乾燥固化した後、熱圧着によりアルミシートで封をして、ＫＲＡＳ遺伝子変異検出を行う遺伝子解析チップ（ＫＲＡＳ遺伝子変異検出チップ）を複数枚作製した。このチップには、野生型の配列に相補なペプチド核酸（ＰＮＡ）を添加し、野生型の増幅を阻害する機能を付与した。プライマー類の配列情報を表３に示す。
【００２７】
【表２】
2017051111.tif 000006
【００２８】
【表３】
2017051111.tif 000007
【００２９】
（遺伝子解析チップによる低コピー数且つ低変異率の鋳型の検出について）
上記遺伝子解析チップの１枚に、反応溶液Ｉを流し込み、他の１枚に反応溶液IIを流し込み、全自動遺伝子解析装置（例えば特許文献２に記載のもの）を用いて、ＰＣＲとインベーダー反応を実施した。反応条件は、９５℃１２０秒の後に、９５℃１５秒及び６６℃２０秒を３５サイクル行い、その後に９９℃１２０秒と６３℃１０分を行うこととした。
ＰＣＲによるプレ増幅を実施しなかった反応溶液IIのＫＲＡＳ遺伝子変異検出チップの蛍光シグナルを図１に、ＰＣＲによるプレ増幅を実施した反応溶液ＩのＫＲＡＳ遺伝子変異検出チップの蛍光シグナルを図２に示す。図１、２中の実線はＫＲＡＳ遺伝子の野生型の配列を検出したシグナル、点線はＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ａ変異型の配列を検出したシグナルである。
【００３０】
反応溶液IIでは、プレ増幅を行っていないため、反応溶液３００μＬにはＧ１２Ａ変異型が３コピーのみしか存在せず、２３個全てのウェルにＧ１２Ａ変異型のプラスミドＤＮＡが存在することはなく、その後に各ウェルで増幅工程を経ても検出することができなかった（図１を参照）。反応溶液Ｉでは、プレ増幅を行ったため、理論上、反応溶液３００μＬにはＧ１２Ａ変異型が３０７２（３×２１０）コピー存在する。その状態で反応溶液をＫＲＡＳ遺伝子変異検出チップに流し込んだため、２３個全てのウェルにＧ１２Ａ変異型のプラスミドＤＮＡが存在し、且つ、ＰＮＡによる野生型の増幅阻害により、変異率を向上し、検出することができたと考えられる（図２を参照）。
上記の図にこの２枚の反応結果を示す。図１は、プレ増幅をかけなかった検体の結果、図２は、プレ増幅（１０サイクル）をかけた検体の結果である。これらの図の中で、実線は野生型のＫＲＡＳ遺伝子の反応、点線は変異型のＫＲＡＳ遺伝子の反応である。今回使用した密閉型ＫＲＡＳ遺伝子変異検出チップでは、変異検出感度を高めるために、野生型ＫＲＡＳ遺伝子の増幅を阻害する物質が含まれている。この結果より、明らかにプレ増幅を実施した場合のみ変異が検出できていることが確認された。
【００３１】
〔実施例２〕
実施例１では、チップ外で遺伝子をプレ増幅で増幅し、その後のＰＣＲと検出反応をチップ内で行ったが、実施例２では、プレ増幅、ＰＣＲ、検出反応の全てをチップ内で行った。詳述すると、プレ増幅用のＰＣＲ試薬と増幅対象サンプルの混合液をチップに注入し、チップの主流路部分に送液して、チップの主流路部分で混合液のプレ増幅を行った。プレ増幅の完了後にチップを遠心し、各反応ウェルにプレ増幅した溶液を送液した。
各反応ウェルには、ＰＣＲ試薬と検出反応用の試薬が予め固定化されているため、前記混合液を各反応ウェルに送液、加温することにより、固定化された各試薬が前記混合液と混合され、ＰＣＲ及び検出反応が行われる。ＰＣＲ、検出反応試薬の濃度、各反応温度、サイクル数は実施例１と同じとした。
このようにして、実施例１と同じ反応をチップ内で実施したところ、実施例１と同様に、プレ増幅を実施した場合のみ変異が検出できた。
【００３２】
〔実施例３〕
実施例３では、チップを改良してプレ増幅を行う部分を設けた。それ以外は実施例２と同様に、サンプルにプレ増幅用のＰＣＲ試薬を混合してチップに注入し、プレ増幅終了後、遠心により各反応ウェルにプレ増幅後の溶液を送液し、ＰＣＲと検出反応を各ウェルにて実施した。ＰＣＲ、検出反応試薬の濃度、各反応温度、サイクル数は実施例１と同じとした。
このようにして、実施例１と同じ反応をチップ内で実施したところ、実施例１と同様に、プレ増幅を実施した場合のみ変異が検出できた。
なお、これらの実施例１〜３では、プレ増幅用のＰＣＲ試薬をサンプル溶液と共にチップに注入したが、チップの所望の場所に固定化しておくことも可能である。
【図１】
2017051111.tif 000008
【図２】
2017051111.tif 000009
【配列表】
2017051111000001.app