(57)【要約】【課題】多環芳香族化合物を嫌気条件下で分解可能な新規の微生物を提供する。【解決手段】新規の微生物は，デスルフォビブリオ属に属するMC01株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  寄託番号NITE P-01790），又はその変異株であって嫌気環境で多環芳香族化合物の分解能を有するデスルフォビブリオ属に属する微生物である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスルフォビブリオ属に属するMC01株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  寄託番号NITE P-01790），又はその変異株であって嫌気環境で多環芳香族化合物の分解能を有するデスルフォビブリオ属に属する微生物。
【請求項２】
請求項1に記載の微生物を用いる多環芳香族化合物の分解方法。
【請求項３】
電極表面に請求項1に記載の微生物及び前記微生物による前記多環芳香族化合物の代謝物を電子供与体として利用する細胞外電子伝達能を有する微生物を保持する電極と，記多環芳香族化合物を含む電解質と，対極を備えることを特徴とする微生物燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，新規の嫌気性多環芳香族化合物分解菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物を使った環境浄化技術として，環境汚染物質分解能を有する微生物を用いた技術が実用化されている。これは，対象となる物質（環境汚染物質）を微生物が代謝することによって当該物質を分解することを基礎とする技術である。このとき，代謝に伴って生じた電子は，微生物の細胞外電子伝達能により電子受容体に受け渡される。
【０００３】
上述のように，環境汚染物質分解能を有する微生物を用いた技術は，微生物の代謝経路に依存するため，環境汚染物質の種類によって利用する微生物種が異なる。芳香族化合物を持つ環境汚染物質（ベンゼン，トルエン，エチルベンゼン，キシレンのような単環芳香族化合物やナフタレン，ビフェニル，PCBのような多環芳香族化合物など）について，現在，実用利用されている浄化技術は，殆どが酸素を電子受容体とする好気的条件下でターゲットとなる環境汚染物質を微生物により分解するものである。しかし，地下（10cm以下）や河川，海洋の底など，自然環境では嫌気的な環境の割合が多くを占めており，嫌気的環境へ汚染が拡散した場合には，既存の好気的条件での浄化技術では適用に限界がある。
【０００４】
一例を挙げると，ヘテロ環を有する多環芳香族化合物であるカルバゾールは，工業的に生産・利用されているものの，難分解性であることに加え，有害物質であることからその処理方法が切望されている。そして，カルバゾールを分解する微生物（細菌）として，Pseudomonas resinovorans NBRC 106553が知られている（非特許文献1）。しかし，Pseudomonas resinovorans NBRC 106553は好気的条件下でカルバゾールを分解する微生物である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shintani M. et al. (2013). Complete genome sequence of the carbazole degrader Pseudomonas resinovorans strain CA10 (NBRC 106553). Genome Announc. Jul 25;1(4).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多環芳香族化合物を嫌気条件下で分解可能な微生物は知られていなかった。また，嫌気条件下において多環芳香族化合物を分解して浄化する技術，あるいは嫌気条件下において多環芳香族化合物を原料としてエネルギーを生成する技術も知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは鋭意研究の結果，嫌気条件下で多環芳香族化合物を分解可能な微生物を自然界から単離・同定することに成功し，本発明の完成に至った。すなわち，本発明では多環芳香族化合物を嫌気的に分解可能な微生物を提供する。加えて，当該微生物を用いた環境浄化技術を提供する。さらに，当該微生物を用いたエネルギー生成技術を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
嫌気環境下において，微生物を用いて有害物質である多環芳香族化合物を分解し，環境浄化をすることができる。また，有害物質である多環芳香族化合物を原料として，微生物燃料電池により電気エネルギーを生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】カルバゾールを含む寒天培地にてMC01株を静置培養した状態の写真である。
【図２】MC01株の16S rDNAの遺伝子配列である。
【図３】微生物燃料電池の生成電圧を経時的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
微生物の取得
本発明の微生物は，下記の工程により自然界より分離し，入手することができる。
【００１１】
（1）嫌気環境（河川や水田の底泥等）からサンプルを採取する。
（2）不溶性の酸化鉄を含む培地をガス置換し，密閉後，滅菌処理を行う。分解対象となる多環芳香族化合物と採取したサンプルを加え，静置培養する。このとき，多環芳香族化合物が電子供与体，酸化鉄が電子受容体となる。
（3）前記培地において，酸化鉄から磁性鉄への変化が確認できたものに関して，対象となる多環芳香族化合物を加えた新たな酸化鉄培地に嫌気的に植え継ぎ，静置培養する。
（4）前記植え継ぎを数回以上，好ましくは4回以上繰り返した後，培養液を対象となる多環芳香族化合物を含む寒天培地に塗布する。これをコロニーが確認できるまで嫌気的に静置培養を行う。
（5）コロニーを採取し，酢酸が電子供与体，フマル酸が電子受容体となる寒天培地に塗布し，寒天培地上のクリアゾーンの形成を指標とし，生育したシングルコロニーを採取することで菌を純化する。
（6）多環芳香族化合物分解菌を得る。
【００１２】
上記（1）から（6）の工程により得られた微生物は，嫌気条件下で多環芳香族化合物を分解・代謝可能な微生物であり，多環芳香族化合物を唯一の電子供与体として利用するものである。
【００１３】
本発明では，この微生物としてDesulfovibrio（デスルフォビブリオ属）に属する新規微生物MC01株を提供する。MC01株は，独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに，寄託番号NITE P-01790として寄託されている。
【００１４】
本発明の微生物により分解される物質は，多環芳香族化合物である。多環芳香族化合物はベンゼン環が複数結合した化学構造を有し，カルバゾール，ジベンゾフラン，ジベンゾチオフェン，ナフタレン，アントラセン，フェナレン，フェナントレン等の多種の化合物が挙げられる。本発明にて用いられる多環芳香族化合物は，ヘテロ環を有する多環芳香族化合物であることが好ましく，特に，カルバゾールを用いることが最適である。
【００１５】
本発明の微生物はMC01株のみならず，その変異株であって嫌気環境で多環芳香族化合物の分解能を有する微生物も包含する。「変異株」とは，MC01株が変異誘発処理された変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで，「変異原」なる語は，その広義において，例えば変異原効果を有する薬剤のみならずUV照射のように変異原効果を有する処理をも含む。このような変異株として， MC01株の16S rDNAの遺伝子の部分配列の同一性が95%以上，好ましくは99%以上，より好ましくは100%のものが挙げられる。
【００１６】
本発明の微生物は，嫌気環境下で多環芳香族化合物，好ましくはヘテロ環を有する芳香族化合物，特にカルバゾールを分解することが可能であることから，汚染サイトへのバイオオーグメンテーションなど，嫌気的な状況における環境汚染物質の浄化技術に利用することができる。とりわけ，池，湿地，河川の底，海底など嫌気的になりやすい環境における浄化技術への応用が可能である。
【００１７】
さらに，本発明の微生物はエネルギー生成にも利用することができる。
【００１８】
エネルギー生成は，微生物燃料電池を用いることが好ましい。微生物燃料電池は，微生物を反応触媒として応用した燃料電池であり，触媒として利用する微生物によって代謝可能な多様な有機物を電力変換する技術である。微生物燃料電池は，有機物を分解して電子を放出する細胞外電子伝達能を有する微生物（発電微生物）を保持し，有機物を電子供与体としてその代謝過程において生じる電子を系へと供給するアノード部と，アノードからの電子を空気中の酸素や電解質（培地）中の水素イオンと反応させるカソード部，及び電解質を主要な構成要素とする。
【００１９】
ここで，本発明の微生物及び，本発明の微生物によるカルバゾールの代謝物を電子供与体として利用可能な他の発電微生物をカソードに保持（担持）すると，カルバゾールを原料として，電子を取り出すことが可能である。
【００２０】
かかる他の発電微生物として，鉄還元細菌が好適である。鉄還元細菌は嫌気的環境において，有機物を分解・代謝する過程で余剰に産生する電子を細胞外の不溶性酸化鉄（III）に伝達する能力を持ち，電子供与体として様々な有機化合物を利用することができることが知られている。
【００２１】
鉄還元細菌の代表的な例として，Geobacter sulfurreducens PCA株（ATCC No. 51573）を挙げることができる。
【００２２】
微生物をアノード部に保持させる方法として，電極表面に植菌する方法やバイオフィルムを形成する方法を用いることができ，当業者であれば使用する微生物に応じて適宜その方法を選択することができる。また，アノード部の材料，構造，寸法等も当業者が適宜設計することができる。カソード部についても同様である。
【００２３】
電解質には，本発明の微生物が分解することのできる多環芳香族化合物が含まれれば良く，他の原料や混合量は当業者が適宜設計して組成すれば良い。
【実施例】
【００２４】
微生物の取得
（1）宮崎県宮崎市清武町加納の河川底泥からサンプルを採取した。
（2）酸化鉄150mmol/L（終濃度）を含む培地（重炭酸緩衝液系）10mLを混合ガス（窒素：炭酸＝８：２）で置換し，密閉後，滅菌処理を行った。カルバゾール10mmol/Lと採取したサンプル1gを加え，30℃で静置培養した。
（3）前記培地において，酸化鉄から磁性鉄への変化を目視による色の変化，磁石による磁性の変化により確認した。酸化鉄の還元が確認された培養液0.3mLを，カルバゾール10mmol/Lを加えた新たな酸化鉄培地10mLに嫌気的に植え継ぎ，30℃で静置培養した。
（4）前記植え継ぎを8回繰り返した後，培養液100μLをカルバゾール10mmol/Lを含む寒天培地に塗布した。これをコロニーが確認できるまで嫌気的に30℃で6ヶ月間静置培養を行った。
（5）カルバゾールを含む寒天培地は，カルバゾールの低い水溶性により，白濁する。よって，カルバゾールが分解されるとカルバゾールの消失に伴い，寒天培地が透明に変化する性質を利用して，コロニーを探索し，採取した（図1）。酢酸が電子供与体，フマル酸が電子受容体となる寒天培地に塗布し，そこに生育したシングルコロニーを採取することで菌を純化した。
（6）カルバゾールを分解することのできる微生物を得た。
【００２５】
分析
得られた菌株の全DNAを抽出し，PCR法による16S rDNAの増幅と塩基配列決定を行った。
【００２６】
得られた菌株を表1に記載した組成の酢酸培地10mLで嫌気下にて培養し，培養後培養液を遠心し菌体を回収した。ここで表1の組成は，1Lあたりの量を表す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
Genomic DNA Buffer Set（QIAGEN）の試薬を用いて，菌体破砕・RNA分解・たんぱく質変性を行い，Genomic-tip（QIAGEN）にて菌体懸濁液からDNAのみを吸着させ，wash後，DNAを溶出・回収した。
【００２９】
抽出したDNAにTAKARA Ex-taq HSキット（TAKARA）と，27f primer（配列番号1）及び1492r primer（配列番号2）；
27f primer：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492r primer：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'
を用いて16S rRNA遺伝子のPCRを行った。反応条件は，（1）95℃を10分間，（2）94℃を30秒間，（3）55℃を1分間，（4）72℃を2分間とし，（2）から（4）のサイクルを40回，（5）72℃で7分間である。
【００３０】
そのPCR産物をTA Cloning Kit（invitrogen）を用いて，プラスミドベクターに連結させた。この16S rRNA遺伝子を含むプラスミドを大腸菌へ挿入し，培養したその大腸菌からプラスミドを回収した。
【００３１】
その後，BigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitと，M13 forward primer（配列番号3）及びM13 reverse primer（配列番号4）；
M13 forward primer：5'-GTAAA ACGACGGCCAGT-3'
M13 reverse primer：5'-CAGGA AACAGCTATGAC-3'
と，上記27f primer（配列番号1）及び1492r primer（配列番号2）を用いてシーケンス反応させ，DNAシーケンサー（ABI PRISM（登録商標）310 GENETIC Analyzer）にて塩基配列を読み取り，16S rRNA遺伝子のDNA塩基配列（配列番号5）を得た（図2）。
【００３２】
得られた塩基配列をもとに，代表的なDNA相同性検索エンジンであるBLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）にて検索を行った。その結果，表2に示すようにDesulfovibrio属に属する微生物と非常に高い同一性があることが明らかとなった。なお，Desulfovibrio属に属する微生物の中には，鉄還元を行う株もあり，単環芳香族化合物を分解する微生物も存在するが，多環芳香族化合物の分解能を有するとの報告はこれまでに無い。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
この特徴から、この株はDesulfovibrio属に属する新種であり，MC01株と命名した。MC01株は，独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに，寄託番号NITE P-01790として寄託されている。
【００３５】
得られたMC01株のみを酸化鉄培地において嫌気的に静置培養を行ったところ，MC01株を含む土壌サンプルの集積培養と比べて，MC01株のみでは酸化鉄から磁化鉄への還元の進行が遅いことが明瞭に確認された。このことから，得られたMC01株の鉄還元能力は低いことが分かった。
【００３６】
一方，MC01株を含むサンプルの集積培養においては，酸化鉄の還元が確認されたので，サンプル中に存在する他の発電微生物がMC01株のカルバゾール分解で生ずる代謝物を電子供与体として利用し，酸化鉄を電子受容体として利用していることが考えられる。
【００３７】
微生物燃料電池
MC01株と，発電能力（鉄還元能力）を有することで知られているGeobacter sulfurreducens PCA株（ATCC No. 51573）を，微生物燃料電池で共培養して発電能力を評価した。ここで，MC01株又はPCA株の単独株利用を対照とした。
【００３８】
アノードにはカーボンロッド（70×30×30mm，ミスミ）にステンレス線を固定したものを，カソード（対極）にはカーボンペーパー（100×100mm，東レ）で作製したエアカソードを用いた。エアカソードは外気と接する部分に30％ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）（アルドリッチ）とカーボンパウダー（アセチレンブラック）を混ぜたものを塗布し，乾燥させてから60％ PTFEを塗布してPTFE層を形成させた。
【００３９】
エアカソードの培養液と接する部分には20％白金含有カーボンパウダー（田中貴金属工業）と5％ Nafion（登録商標）溶液（アルドリッチ）を混ぜたものを塗布して乾燥させ，エアカソードと反応槽が接する部分にはシリコンゴムシートをシリコーン接着剤で接着させた。
【００４０】
カーボンロッド，エアカソードを取り付けた反応槽は密封せずに滅菌処理を行い，終了後はクリーンベンチの中に設置した。
【００４１】
クリーンベンチ内にて反応槽に滅菌した電子供与体を含まない電池用培地400 mlと唯一の電子供与体としてのカルバゾールを10 mmol/Lとなるように加えた。電池用培地の組成を表3に記す。ここで表3の組成は，1Lあたりの量を表す。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
次に，混合ガス（マジックキーパー）を用いて，反応槽内電池用培地の酸素除去を行った。除去後，反応槽を密閉し100mM  L-cysteine 10 mlを嫌気的に加え，残留酸素を除去した。培地中の酸素濃度は培地中のレサズリンによる色の変化で確認した。
【００４４】
十分に酸素除去が行われたことを確認してから，MC01株及びPCA株を各々40 ml嫌気的に植菌した。植菌後，30℃の恒温室に静置して，カーボンロッドに固定したステンレス線とエアカソードをデータロガー（GL820：グラフテック）と470Ω抵抗器に電線で繋ぎ，電圧計測を開始した。対照としてMC01株又はPCA株どちらか一方の菌株を滅菌処理して植菌した微生物燃料電池を構築し，培養と測定を行った。
【００４５】
測定結果を図3に示す。図3において，「PCA＋MC01＋」はMC01株及びPCA株の共存の，「PCA＋MC01−」はPCA株のみの，「PCA−MC01＋」はMC01株のみの条件での測定値を示す。
【００４６】
MC01株及びPCA株の両方が生存している電池の電圧値は2日目から有意に上昇している。微生物燃料電池は発電微生物の植菌直後は発電量が少ないが，アノード部分で発電微生物が定着し始めると安定した発電を行うことができるためである。本試験では電池用培地の補充を行っていないので，7日目に電圧低下が生じている。発電に必要な成分の減少が原因であると考えられる。電池用培地の補充を行えば，この電圧低下を防ぐことができる。
【００４７】
対照のMC01株又はPCA株どちらか一方のみが存在する微生物燃料電池は電圧が上昇することなく発電が行われなくなった。
【００４８】
この結果から，MC01株がカルバゾールを分解し，その代謝物をPCA株が電子供与体として利用することで，起電力を得られることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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