(57)【要約】【課題】高塩濃度条件において、かつコバルト（Ｃｏ）の共存下において、溶存ストロンチウム (Ｓｒ) を短時間に高度に除去できる微生物、並びに上記微生物を用いた放射性核種を固化する方法を提供すること。【解決手段】ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有する微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有する微生物。
【請求項２】
ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下かつコバルト（Ｃｏ）共存下において、放射性核種を固化する能力を有する微生物。
【請求項３】
ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有し、さらにＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下かつコバルト（Ｃｏ）共存下において放射性核種を固化する能力を有する、微生物。
【請求項４】
ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９５％以上を培養開始から１日以内に固化除去できる能力を有する、請求項１から３の何れか１項に記載の微生物。
【請求項５】
ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において、培養開始後１日目に、培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数まで増殖し、培養開始後３日目まで培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数が維持される、請求項１から４の何れか１項に記載の微生物。
【請求項６】
前記放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、請求項１から５の何れか１項に記載の微生物。
【請求項７】
ストロンチウム（Sr）とカルシウム（Ca）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
Sporosarcina 属に属する、請求項１から７の何れか１項に記載の微生物。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１９０である、微生物。
【請求項１０】
放射性核種を含む液体中で、請求項１から９の何れか１項に記載の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法。
【請求項１１】
放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
放射性核種を含む液体が、カルシウムイオンを含む液である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
放射性核種を含む液体が、コバルト（Ｃｏ）を含む液である、請求項１０から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、請求項１０から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０から１４の何れか１項に記載の方法により、放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化する工程、及び固化した放射性核種を回収する工程を含む、放射性核種の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種を固化する能力を有する好塩菌に関する。本発明はさらに、上記好塩菌による放射性核種の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が生成する炭酸カルシウム (カルサイト) やリン酸カルシウム (アパタイト) は、バイオ鉱物 (バイオカルサイト、バイオアパタイト) と称される。バイオ鉱物を用いた地下水や土壌中の放射性Ｓｒの共沈や吸着による浄化の研究などが進められている（非特許文献１〜４）。一方、海水 (塩濃度３％) などの高塩濃度条件下における放射性Ｓｒの微生物の代謝物による浄化の研究はほとんど行われていない。
【０００３】
バイオ鉱物の１種であるバイオカルサイトは、微生物が産生するウレアーゼによって尿素が加水分解されてできた炭酸イオンと溶液体中のＣａイオンが結合することで生成される (反応式１及び２)（非特許文献１及び５）。カルサイト生成の際に、溶存Ｓｒイオンは炭酸イオンと結合し、炭酸ストロンチウムとしてカルサイトと共沈し溶液体中から除去される (反応式２)。
Ｈ2ＮＣＯＮＨ2＋３Ｈ2Ｏ  →  ２ＮＨ4+＋ＨＣＯ3-＋ＯＨ-（反応式１）
Ｓｒ2+／Ｃａ2+＋２ＨＣＯ3-  →  Ｓｒ／ＣａＣＯ3＋ＣＯ2＋Ｈ2Ｏ（反応式２）
【０００４】
本発明者は、ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有するBacillus属に属する微生物としてTK2d株を報告している（Coprecipitation of radioactive strontium in sea water during formation of biogeneic calcite. T. Ohnuki, N. Kozai, F. Sakamoto, T. Saito, Q. Yu, M. Yamashita, T. Horiike, S. Utsunomiya. 15th International Conference on the Chemistry and Migration Behaviour of Actinides and Fission Products in the Geosphere. September 13-18, 2015, Santa Fe Community Convention Center, Santa Fe, NM, USA）。ＴＫ２ｄ株は、特願２０１５-１３３４１９号明細書に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Fujita,他、"Stimulation of microbial urea hydrolysis in groundwater to enhance calcite precipitation," Environ. Sci. Technol., vol. 42, no. 8, pp. 3025-3032, 2008
【非特許文献２】Y. Fujita,他、"Evaluating the potential of native ureolytic microbes to remediate a 90Sr contaminated environment," Environ. Sci. Technol., vol. 44, no. 19, pp. 7652-7658, 2010
【非特許文献３】V. Achal,他、"Bioremediation of strontium (Sr) contaminated aquifer quartz sand based on carbonate precipitation induced by Sr resistant Halomonas sp.," Chemosphere, vol. 89, no. 6, pp. 764-768, 2012
【非特許文献４】S. Handley-Sidhu,他、"Bacterially Produced Calcium Phosphate Nanobiominerals: Sorption Capacity, Site Preferences, and Stability of Captured Radionuclides," 2014
【非特許文献５】Y. Fujita, 他、"Strontium incorporation into calcite generated by bacterial ureolysis," Geochim. Cosmochim. Acta, vol. 68, no. 15, pp. 3261-3270, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、高塩濃度条件において、かつコバルト（Ｃｏ）の共存下において、溶存ストロンチウム (Ｓｒ) を短時間に高度に除去できる微生物、並びに上記微生物を用いた放射性核種を固化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決することを目的として、高塩濃度条件においてウレアーゼを産生する微生物を分離し、炭酸ストロンチウムとしてＳｒ固化物が生じるかどうかを調べた結果、上記微生物が高塩濃度条件において、かつコバルト（Ｃｏ）の共存下において、溶存ストロンチウム (Ｓｒ) を短時間に高度に除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
［１］  ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有する微生物。
［２］  ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下かつコバルト（Ｃｏ）共存下において、放射性核種を固化する能力を有する微生物。
［３］  ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有し、さらにＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下かつコバルト（Ｃｏ）共存下において放射性核種を固化する能力を有する、微生物。
［４］  ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９５％以上を培養開始から１日以内に固化除去できる能力を有する、［１］から［３］の何れかに記載の微生物。
［５］  ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において、培養開始後１日目に、培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数まで増殖し、培養開始後３日目まで培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数が維持される、［１］から［４］の何れかに記載の微生物。
［６］  前記放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、［１］から［５］の何れかに記載の微生物。
［７］  ストロンチウム（Ｓｒ）とカルシウム（Ｃａ）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、［６］に記載の微生物。
［８］  Sporosarcina 属に属する、［１］から［７］の何れかに記載の微生物。
［９］  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１９０である、微生物。
【０００９】
［１０］  放射性核種を含む液体中で、［１］から［９］の何れかに記載の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法。
［１１］  放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上である、［１０］に記載の方法。
［１２］  放射性核種を含む液体が、カルシウムイオンを含む液である、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］  放射性核種を含む液体が、コバルト（Ｃｏ）を含む液である、［１０］から［１２］の何れかに記載の方法。
［１４］  放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、［１０］から［１３］の何れかに記載の方法。
［１５］  ［１０］から［１４］の何れかに記載の方法により、放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化する工程、及び固化した放射性核種を回収する工程を含む、放射性核種の回収方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微生物は、放射性核種を回収する能力を有する新規微生物である。本発明の微生物を用いることにより、高塩濃度条件において、かつコバルト（Ｃｏ）の共存下において、放射性核種を短時間に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分解用平板培地の赤色ハローを示す。
【図２】図２は、候補株の溶存Ｓｒ除去能試験の結果を示す。
【図３】図３は、ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析に基づく系統樹を示す。
【図４】図４は、ＴＫ２ｄ株、ＫＷ３ｂ１株、ＫＷ３ｂ２株のＳｒ除去能の比較を示す。
【図５】図５は、ＮａＣｌの影響を調べるためのＫＷ３ｂ１株のＳｒ除去能試験の結果を示す。
【図６】図６は、ＮａＣｌの影響を調べるためのＫＷ３ｂ１株の菌体増殖試験の結果を示す。
【図７】図７は、ＴＫ２ｄ株、ＫＷ３ｂ１株、ＫＷ３ｂ２株のＣｏ耐性試験の結果を示す。
【図８】図８は、ＴＫ２ｄ株、ＫＷ３ｂ１株、ＫＷ３ｂ２株が合成した固化Ｓｒの観察の結果を示す。
【図９】図９は、ＫＷ３ｂ１株が合成した固化Ｓｒの観察の結果を示す。
【図１０】図１０は、ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株が合成した固化Ｓｒの観察の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の微生物は、ウレアーゼを産生し、以下の（１）及び／又は（２）に記載の能力を有する微生物である。
（１）ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種（例えば、ストロンチウム等）の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力；
（２）ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下かつコバルト（Ｃｏ）共存下において、放射性核種（例えば、ストロンチウム等）を固化する能力：
【００１３】
微生物のウレアーゼ産生能は、尿素の加水分解による培地のｐＨ上昇を微生物のウレアーゼ活性の指標とすることにより判定することができる。例えば、ｐＨ８以上で黄色から赤色に変化するＰｈｅｎｏｌ  ｒｅｄの呈色反応を利用することにより、培地のｐＨ上昇を可視化することができる。ウレアーゼ産生微生物は、コロニー周辺に赤色のハローを形成するので、赤色のハローの観察により微生物のウレアーゼ産生能を判定することができる。
【００１４】
本発明の微生物は、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において放射性核種を固化する能力を有することを特徴とする。ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下としては、他の塩が含まれていてもよく、また海水は、ＮａＣｌ濃度３％の条件下を満たす一例である。
【００１５】
本発明の微生物は、好ましくは、ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種（例えば、ストロンチウム等）の９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上を培養開始から１日以内に固化除去できる能力を有する。
【００１６】
本発明の微生物は、好ましくは、ＮａＣｌ濃度０．３％〜３％の条件下において、培養開始後１日目に、培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数まで増殖し、培養開始後３日目まで培養開始時の菌体数の１×１０6倍以上の菌体数が維持される。
【００１７】
放射性核種とは、放射能を有する核種を意味し、放射性同位体と称される場合もある。放射性核種としては、自然界に存在する天然放射性核種（ウラン２３８、カリウム４０及びラジウム２２６、トリウム２３２など）及び人工放射性核種（セシウム１３４、セシウム１３７、ヨウ素１３１、キセノン１３３、ストロンチウム８９、ストロンチウム９０、クリプトン８５、ジルコニウム９５、ルテニウム１０６、セリウム１４４、コバルト６０、炭素１４、トリウム２３２）などを挙げることができる。
【００１８】
本発明の微生物は、上記した放射性核種のうちの少なくとも１種以上を固化する能力を有すればよい。好ましくは、本発明の微生物は、人工放射性核種を固化する能力を有する微生物であり、より好ましくはストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する微生物である。
【００１９】
本発明の微生物は好ましくは、放射性核種を炭酸塩として固化することができる微生物であり、特にカルシウムイオンが存在する場合には、放射性核種とカルシウム（Ｃａ）の複合炭酸塩として、放射性核種を固化することができる微生物である。本発明の微生物の一例としては、ストロンチウム（Ｓｒ）とカルシウム（Ｃａ）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する微生物を挙げることができる。
【００２０】
本発明において、固化とは、液体中に溶存している放射性核種が不溶化することを意味する。微生物が放射性核種を固化する能力を有することは、実施例に記載の方法により確認することができる。具体的には、放射性核種を含む液を添加した微生物用培地に、微生物を含む試料を接種し、微生物を増殖できる条件下で培養した後、サンプリング試料の上清中における放射性核種を測定することによって、放射性核種を固化する能力を測定することができる。本発明の微生物は、上記又はそれに準じた方法により、野生株、変異株等の中からスクリーニングすることで単離採取することができる。
【００２１】
本発明の微生物が属する属は、特に限定されない。環境試料などから採取した微生物について、１６ＳｒＲＮＡの情報等に基づいて微生物を分類（属種の同定）する方法は公知である。本発明で使用する微生物は、野生株、変異株、遺伝子工学的手法等により作製される組換え体などの何れの微生物であってもよい。
【００２２】
本発明の微生物が属する属は、好ましくはSporosarcina 属に属する微生物である。本発明においては、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列において、Sporosarcina 属する微生物と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する微生物を使用することができる。
【００２３】
Sporosarcina 属に属する微生物の一例としては、本明細書の実施例で単離されたＫＷ３ｂ２株を挙げることができる。ＫＷ３ｂ２株は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１９０として、２０１６年１月１２日に独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。ＫＷ３ｂ２株は、桿菌（０．７−０．８ｘ１．５−２．５μｍ）、ＬＢ培地でコロニーは淡黄色・円形・スムーズ、カタラーゼとオキシダ−ゼは＋であるという微生物学的特徴を有している。ＫＷ３ｂ２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を配列番号５に示す。
【００２４】
ＫＷ３ｂ２株の培養に用いる培地としては、ＬＢ培地（Ｔｒｙｐｒｏｎ  １０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ，  ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ，  ＮａＣｌ  ３０ｇ／Ｌ）が好ましいが、Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｔｈ  ２２１６でも増殖可能である。培地のｐＨ（滅菌前）は７．６が好ましい。培養温度は３０℃が好ましく、培養期間は１〜２日間が好ましい。培養は、好気培養で、振とう培養が好ましい。
【００２５】
更に本発明によれば、放射性核種を含む液体中で、上記した本発明の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法が提供される。
放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上であることが好ましく、さらにカルシウムイオンを含む液体であることも好ましく、またコバルト（Ｃｏ）を含む液体であることも好ましい。上記の条件を満たす液体としては、海水を挙げることができる。固化する放射性核種の具体例は、上記の通りであり、特に好ましくはストロンチウム（Ｓｒ）である。
【００２６】
本発明の微生物を培養する方法は、放射性核種を固化できる限り特に限定されず、使用する微生物の性質に応じて好適な培養条件を適宜選択することができる。例えば、実施例で使用したＫＷ３ｂ２株の場合には、振とう培養などの好気条件下、温度２５〜４０℃、好ましくは温度２５〜３５℃、特に好ましくは２８〜３２℃で培養を行うことができる。
【００２７】
本発明によれば、上記した方法により放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化した後に、固化した放射性核種を回収することができる。放射性核種の回収は、遠心分離、フィルター濾過、又はそれらの組み合わせなど公知の方法で行うことができる。
【００２８】
本発明による放射性核種を固化する方法は、放射性核種を含む液体（たとえば、放射性核種で汚染された海水）などに適用することができる。
【００２９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
（１）試験方法
（１−１）海洋性環境試料
微生物の分離源として、鹿児島湾（４ヶ所）の海底泥が採取された。環境試料は滅菌生理食塩水（ＮａＣｌ０．９％（ｗ／ｖ））により１０％（ｗ／ｖ）に希釈され、ボルテックスにより混合された。これらの環境試料希釈液はスクリーニングに用いられた。
【００３１】
（１−２）培地
Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ  ２２１６（ＭＢ；３．７４ｇ／Ｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＭＤ、ＵＳＡ）にＮａＣｌ（３０ｇ／Ｌ）および尿素（２０ｇ／Ｌ）を添加した培地（ｐＨ７．６）が基本培地として用いられた。分離用培地として、ＭＢにｐＨ指示薬のＰｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（１２ｍｇ／Ｌ）を添加された。Ｓｒ除去試験用培地として、ＭＢにＳｒＣｌ2溶液をＳｒが終濃度１．０ｍＭとなるように添加された。スクリーニング時では静置培養、Ｓｒ除去試験では１２０ｒｐｍで振とう培養が共に温度３０oＣで行われた。Ｓｒ固化能の特徴付けには、オートクレーブ後に培地中に生じた不溶性成分をフィルター（０．４５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過して取り除いたＭＢ（ろ過済みＭＢ）が使用された。固体培地を作製する時は寒天（１５ｇ／Ｌ）が使用された。
【００３２】
（１−３）ウレアーゼ産生微生物の探索
海水中の放射性核種をバイオカルサイトにより除去するために、高塩濃度存在下においてウレアーゼを産生する微生物を海洋環境試料から分離を試みた。尿素の加水分解による培地のｐＨ上昇（反応式１）を微生物のウレアーゼ活性の指標とした。すなわち、ｐＨ８以上で黄色から赤色に変化するＰｈｅｎｏｌ  ｒｅｄの呈色反応を利用し、分離用平板培地のｐＨ上昇を可視化した。分離用平板培地でウレアーゼ産生微生物は、そのコロニー周辺に赤色のハローを形成すると思われる。この赤色のハローの観察により、その微生物のウレアーゼ活性の有無が判別される。希釈された環境試料溶液（２０μＬ）は分離用平板培地に塗抹され、コロニーが出現するまで３０oＣで静置培養された。出現したコロニーのうち、赤色ハローを形成した株のみ、新しい分離用平板培地に継代培養された。継代培養を２回繰り返した後、赤色ハローの再現性が得られた株を、ウレアーゼ産生候補株とした。これら候補株は、後述のＳｒ除去試験に供された。
【００３３】
（１−４）候補株によるＳｒ除去試験
候補株の溶存Ｓｒの除去時におけるＳｒを含むカルサイトの生成を明らかにするために、培養液体中のＳｒ濃度の経時変化を調べた。候補株は、１０ｍｌのＭＢが入ったガラス試験管に白金耳を用いて無菌的に植菌され、１２時間前培養（３０℃、１２０ｒｐｍ）された。前培養液は１２５ｍｌ三角フラスコ内の５０ｍｌ試験用培地に１％（ｖ／ｖ）植菌され、７日間本培養（３０℃、１２０ｒｐｍ、Ｓｒ１．０ｍＭ）された。サンプリングは適時行われた。サンプリングされた培養液は、遠心分離（２，１０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４oＣ）され、上清および沈殿に分画された。得られた上清は、フィルター（０．２μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、ＫＵＲＡＢＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）でろ過され、元素濃度の分析用試料として用いられた。沈殿物は、菌体観察および固体分析の試料として用いられた。候補株を接種していないＭＢを同条件下におけるコントロールとした。
【００３４】
ＮａＣｌの影響を調べるＳｒ除去試験では、ＮａＣｌ濃度を０．３％、３％、５％、１０％に設定して行った。
Ｃｏ耐性試験においては、以下の条件で実験を行った。
培地：
Ｍａｒｉｎｅ  ｂｒｏｔｈ；３．７ｇ／Ｌ（０．３％ＮａＣｌ含有）、
Ｕｒｅａ；２０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ添加；３０ｇ／Ｌ
Ｃｏ濃度：終濃度０．０６ｍＭ
Ｓｒ濃度：終濃度０．０１ｍＭ（培地由来）
植菌量：１％（ｖ／ｖ）植菌
培養条件：
５０ｍＬ  ｉｎ  １００ｍＬ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ
３０℃，１２０ｒｐｍ，ｐＨ７．６
【００３５】
（１−５）分離株によるＳｒの固化能の特徴付け
初発溶存Ｓｒ濃度の違いによるＳｒ固化能への影響を明らかにするために、ろ過済みＭＢを用いてＳｒ除去試験が行われた。試験は、初発溶存Ｓｒ濃度を５．０ｍＭ、１．０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０２ｍＭに設定して、上述のＳｒ除去試験と同様の方法で１０日間行われた。サンプリングは適時行われ、上述と同様の方法で分析試料が作られた、ろ過後の上清は元素濃度の分析用試料として用いられた。沈殿物は菌体観察および固体分析の試料として用いられた。分離株を接種していないろ過済みＭＢを同条件下においてコントロールとした。
【００３６】
（１−６）元素濃度分析
各分析用試料の原液を超純水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  ＮＡＮＯｐｕｒｅR  ＤＩａｍｏｎｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で適宜希釈し、誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ；ｉＣＡＰ６３００ＤＵＯ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により元素の定量を行った。検量線は検量線用標準溶液（ＸＳＴＣ−６２２：ＳＰＥＸ  ＣｅｔｒｉＰｒｅｐ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて作成された。１サンプルにつき３回繰り返し測定を行い、偏差が５％以内の値の平均値を測定結果とした。
【００３７】
（１−７）走査型電子顕微鏡による菌体観察とエネルギー分散型Ｘ線解析装置による元素分析
培養液から得られた沈殿物は、０．９％滅菌生理食塩水で３回洗浄した後、滅菌イオン交換水で１回洗浄されてから観察に用いられた。試料は観察用フィルター（Ｎａｎｏ−Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ、ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に滴下後に、シリンジで吸引され、電子顕微鏡観察用試料とした。観察に卓上型電子顕微鏡（ＳＥＭ；ＴＭ３０００：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用い、元素分析にはエネルギー分散型Ｘ線解析装置（ＥＤＸ；Ｑｕａｎｔａｘ７０：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が用いられた。
【００３８】
（１−８）分子生物学試験（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定）
分離株の属種を同定するために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。ＭＢで３日間培養された分離株は、遠心分離（２１，０００×ｇ、４℃、５分）により集菌され、０．９％滅菌生理食塩水を用いて２回洗浄された後に、ゲノムＤＮＡがＩＳＯＰＬＡＮＴ  （Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）のプロトコルに従って抽出された。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、９Ｆ  （5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')（配列番号１） と１５４１Ｒ (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')（配列番号２） のプライマーセットと、ＧＯ  Ｔａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用い９５℃で５分間保持後、次の条件（変性（９５℃、１分）、アニーリング（５６oＣ、１分）、伸長（７２℃、１分））を３０サイクルで行った。この反応はＰＣＲ増幅装置Ｍａｓｔｅｒｃｅｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて行われた。増幅されたＤＮＡは、ＷｉｚａｒｄRＳＶ  ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製された。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列は、精製ＤＮＡを鋳型として、複数のプライマー（９Ｆ、５１５Ｆ（5'-GTGCCAGCAGCCGCGGT-3'）（配列番号３）、１１１５Ｒ（5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3'）（配列番号４）、１５４１Ｒ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙ−ｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定、解析された。
【００３９】
（１−９）系統樹作成
決定した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、ＮＣＢＩの提供するＢＬＡＳＴ(S. F. Altschul, 他、"Basic local alignment search tool," J. Mol. Biol., vol. 215, no. 3, pp. 403-410, 1990)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Bla-st.cgi)により相同性検索が行われた。高い相同性を示した菌種の塩基配列を基に、ＣＬＡＳＴＡＬ  Ｗおよび系統樹作成ソフトＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧ５．０）を用いてｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ（N. Saitou,他、"The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees," Mol. Biol. Evol., vol. 4, no. 4, pp. 406-425, 1987）により系統樹を作成した。
【００４０】
（２）結果及び考察
（２−１）好塩性カルサイト生成微生物の分離
海底泥サンプルからウレアーゼ産生微生物の分離を試みた結果、分離用平板培地上で赤色ハロー（図１）を形成した８個のコロニーを得た。これらのコロニーは継代培養され、赤色ハローを繰り返し形成したことから安定してウレアーゼを産生する候補株と考えた。
【００４１】
これらの微生物候補株がＳｒ固化物を生成するかどうかを調べるために、候補８株の培養液体中における溶存Ｓｒの濃度を経時的に測定した。培養２日目の各培養液体中の溶存Ｓｒの濃度は初発濃度の１．０ｍＭから、ＫＷ３ｂ株では０．０２ｍＭまで減少し、ＫＷ３ｂ株は培養２日で溶存Ｓｒを９８％除去することが判明した。以下、最も溶存Ｓｒの減少量が大きいＫＷ３ｂ株について実験を行った。ＫＷ３ｂ株には、コロニーの色が異なる２種類の菌株が混在することが判明したので、コロニーアイソレーションによりＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株を単離した。
【００４２】
（２−２）ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株の系統分類学的同定
ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株を分子生物学的に同定するために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を解読し、相同性検索を行った。ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち１４３１塩基の部分配列（配列表の配列番号５）を明らかにした。ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株の塩基配列は１００％一致していた。
ＢＬＡＳＴのデーターベースとこの塩基配列を比較すると、Sporosarcina soli と９９．３％、Sporosarcina contaminansと９９．０％、及びSporosarcina ginsengisoliと９９．０％の相同性が認められた。これらの微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づいた系統樹は、ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株がSporosarcina属に分類されることを示した (図３)。
【００４３】
（２−３）ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株のＳｒ除去能
ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株のＳｒ除去能を試験した（図４）。ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株は、溶存Ｓｒを初発濃度の１ｍＭから培養１日目に０．０１ｍＭ以下まで減少させた。Ｓｒ初発濃度を１００％と考えると、ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株は、１日で溶存Ｓｒ９９％以上を除去した。ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株は、比較用のＴＫ２ｄ株よりＳｒ除去能が高かった。
【００４４】
（２−４）ＫＷ３ｂ１株のＳｒ除去能試験及び菌体増殖試験
ＮａＣｌ濃度を０．３％、３％、５％、１０％に設定して、ＫＷ３ｂ１株のＳｒ除去能及び菌体増殖を評価した。結果を図５及び図６に示す。
ＫＷ３ｂ１株のＳｒ除去率の最適ＮａＣｌ濃度は０．３％および３％であり、増殖の最適ＮａＣｌ濃度は３．０％であった。ＫＷ３ｂ２株も、ＫＷ３ｂ１株の場合と同じ結果であった。
【００４５】
（２−５）ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株のＣｏ耐性試験
ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株のＣｏ存在下におけるＳｒ除去能を評価した結果を図７に示す。
ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株はＣｏ溶存下でＳｒ除去可能であった。
なお、ＴＫ２ｄ株はＣｏ  ０．０６ｍＭ（３．５  ｍｇ／Ｌ）で増殖しなかった。
【００４６】
上記（２−３）〜（２−５）までの結果を以下の表１にまとめる。ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株は優れたＳｒ除去能（Ｓｒ除去率・ＮａＣｌ耐性・Ｃｏ耐性）を示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
（２−６）ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株が合成した固化Ｓｒの観察
ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株が培養５日目に生成した固化物をＳＥＭ−ＥＤＸにより解析した（図８〜図１０）。
図８は、ＴＫ２ｄ株、ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株が合成した沈殿物（固化Ｓｒ）の形状を比較したものである。沈殿物の立体構造が菌株により異なり、ＫＷ３ｂ１株及びＫＷ３ｂ２株では冠状であった。
【００４９】
図９は、ＫＷ３ｂ１株が合成した固化ＳｒのＳＥＭ画像とＥＤＸ解析の結果を示す。ＫＷ３ｂ１株は、約１０  μｍの冠状のＳｒ／Ｃａ固化物を合成することが示された。
図１０は、ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株が合成した固化Ｓｒの観察結果を示す。ＫＷ３ｂ１株とＫＷ３ｂ２株は同じ冠状のＳｒ固化物を合成することが示された。
【００５０】
（３）まとめ
本実施例により得られた成果は以下の通りである。
鹿児島湾海底泥試料から溶存Ｓｒの減少を示す菌株を分離した。このうちＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株は、０．３〜５％の塩濃度で使用可能でＳｒ除去能が高く、Ｃｏ存在下でも使用可能である。ＫＷ３ｂ１株およびＫＷ３ｂ２株は、迅速にＳｒを除去したい場合、Ｃｏ含有溶液中のＳｒを除去したい場合に特に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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